ＩＬ−１３に結合するリガンド
インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）にに対し、またはＩＬ−４とＩＬ−１３に対し特異的に結合するリガンドが開示されている。また、これらの使用方法も開示されている。特に、肺疾患、例えば、アレルギー性喘息、のようなＩＬ−１３媒介疾患の治療のためのこれらの使用が記載されている。このリガンドは、有力なＩＬ−１３結合速度を有している。リガンドが、ヒトＩＬ−１３と一つまたは複数の霊長類ＩＬ−１３の間の交差反応性を有することも記載されている。リガンドは、原核細胞中で良好に発現する。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
Ｔｈ２型免疫反応は抗体の産生および液性免疫の促進を行い、細胞外病原体を撃退するために作り出されている。Ｔｈ２細胞はＩｇ産生（液性免疫）のメディエーターであり、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３を産生する（Tanaka, et. al., Cytokine Regulation of Humoral Immunity, 251-272, Snapper, ed., John Wiley and Sons, New York (1996)）。Ｔｈ２型免疫反応は特定のサイトカイン（例えば、ＩＬ−３、ＩＬ−４）と特異的な型の抗体（ＩｇＥ、ＩｇＧ４）を産生し、アレルギー反応に特有の涙目、気道炎症や肺の気道筋収縮等の喘息症状を起こす可能性がある。
【０００２】
インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）は多面的なサイトカインで、免疫グロブリンのＩｇＧ４、ＩｇＥへのアイソタイプスイッチ、ＣＤ２３アップレギュレーション、ＶＣＡＭ−１発現を誘導し、例えば、好酸球や肥満細胞の直接活性化を行う。ＩＬ−１３は主にＴｈ２細胞により産生され、ＬＰＳ刺激単球細胞により炎症性サイトカイン（ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＴＮＦ、ＩＬ−８）の産生を阻害する。ＩＬ―１３はＩＬ−４の近縁種であり、アミノ酸レベルで２０〜２５％の配列上の類似性がある（Minty et. al., Nature, 363(6417):248-50 (1993)）。ＩＬ−１３の多くの作用はＩＬ−４に似ているが、ＩＬ−４に備わっている活性Ｔ細胞またはＴ細胞クローンに対する増殖促進作用は持っていない（Zurawski et al., EMBO J. 12:2663 (1993)）。
【０００３】
細胞表面受容体および受容体複合体は異なったアフィニティでＩＬ−１３と結合する。ＩＬ−１３と結合する受容体および受容体複合体の基本成分はＩＬ−４Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα１およびＩＬ−１３Ｒα２である。これらの鎖は細胞の表面にモノマーまたはＩＬ−４Ｒα／ＩＬ−１３Ｒα１またはＩＬ−４Ｒα／ＩＬ−１３Ｒα２のヘテロダイマーとして発現している。ＩＬ−４ＲαモノマーはＩＬ−４に結合するがＩＬ−１３には結合しない。ＩＬ−４Ｒα／ＩＬ−１３Ｒα１とＩＬ−４Ｒα／ＩＬ−１３Ｒα２ヘテロダイマーはＩＬ−４、ＩＬ−１３の両方に結合する。
【０００４】
ＩＬ−１３はその生物学的機能の故に治療上重要なタンパク質である。ＩＬ−１３には抗腫瘍免疫反応を促進する潜在能力が認められた。ＩＬ−１３はアレルギー疾患の原因に関与しているため、このサイトカインの阻害剤により治療上の恩恵が得られる。ＩＬ−１３の阻害剤はWO2007085815で開示されており、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。WO2007085815では、有効な抗ＩＬ−１３抗体単一可変ドメイン、ＤＯＭ１０−５３−４７４が開示されている。ＩＬ−１３の阻害試薬に対する改善要求があるため、本発明者はＤＯＭ１０−５３−４７４より性能、特に、ＩＬ−１３との結合反応速度、および／または中和能、および／またはＩＬ−１３種間交差反応性、の優れたＩＬ−１３阻害剤を見いだそうとしてきた。発明者は、このような利点が治療改善および抗ＩＬ−１３予防薬およびこれらの進展をもたらすであろうことを理解したからである。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、改善されたＩＬ−１３免疫グロブリン単一可変ドメイン、アンタゴニスト、およびこれらを含む組成物、方法、用途を提供する。
【０００６】
一つの態様では、本発明は、ＤＯＭ１０−５３−４７４（配列番号１）と比較して１、２、３、４または５のアミノ酸変化以外はＤＯＭ１０−５３−４７４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）と同一のアミノ酸配列を含む抗インターロイキンー１３（ＩＬ−１３）免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。ここで、単一可変ドメインは、Ｋａｂａｔ ナンバリング方式の位置２８にバリンを有し、また単一可変ドメインは任意選択でＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）からなるものではない。
【０００７】
第二の態様では、本発明は、ＤＯＭ１０−５３−４７４（配列番号１）と比較して１、２、３、４または５のアミノ酸変化以外はＤＯＭ１０−５３−４７４と同一のアミノ酸配列を含む抗インターロイキンー１３（ＩＬ−１３）免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。ここで、単一可変ドメインは配列ＸＧＸ’Ｘ’’を有し、ＧはＫａｂａｔ ナンバリング方式の位置５４にあり、
Ｘ＝ＨまたはＫであり；
Ｘ’＝ＧまたはＫであり；
Ｘ’’＝ＫまたはＩであり、
また、単一可変ドメインは任意選択でＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）からなるものではない。
【０００８】
さらなる態様では、本発明は、その可変ドメインがＤＯＭ１０−５３−５４６（配列番号２）；ＤＯＭ１０−５３−５６７（配列番号３）；ＤＯＭ１０−５３−５６８（配列番号４）；またはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）である、抗インターロイキンー１３（ＩＬ−１３）免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。
【０００９】
さらなる態様では、本発明は、その可変ドメインがＤＯＭ１０−５３−５４６（配列番号２）；ＤＯＭ１０−５３−５６７（配列番号３）またはＤＯＭ１０−５３−５６８（配列番号４）である、抗インターロイキンー１３（ＩＬ−１３）免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。
【００１０】
本発明の一つの態様では、ＤＯＭ１０−５３−５４６（配列番号６）；ＤＯＭ１０−５３−５６７（配列番号７）；ＤＯＭ１０−５３−５６８（配列番号８）；またはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号９）ヌクレオチド配列によりコードされる抗インターロイキンー１３（ＩＬ−１３）免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。ここで、単一可変ドメインは任意選択でＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）からなるものではない。
【００１１】
本発明の一つの態様では、ＤＯＭ１０−５３−５４６（配列番号２）；ＤＯＭ１０−５３−５６７（配列番号３）；ＤＯＭ１０−５３−５６８（配列番号４）；またはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）に対し少なくとも９９％同一、または１００％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。ここで、ポロペプチドは任意選択でＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）を含まないものである。
【００１２】
本発明はまた、当該単一可変ドメインを含むアンタゴニスト、融合タンパク質、およびデバイス、用途、方法、ならびに組成物に関する。アンタゴニストは、患者、例えばヒト患者における、ＩＬ−１３媒介疾患および症状の対処に、例えば、喘息、慢性閉塞性肺疾患またはインフルエンザ等の肺疾患の治療および／または予防に有効である。
【００１３】
別の観点による本発明のさらなる実施形態については、本明細書中で企図されており、以下に開示される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ｐＤＯＭ５ベクターマップ。
【図２】（ａ）本発明の抗ＩＬ−１３免疫グロブリン単一可変ドメインおよび従来技術のＩＬ−１３単一可変ドメインＤＯＭ１０−５３−４７４（配列番号１）のアミノ酸配列；ならびに（ｂ）単一可変ドメインのＣＤＲのヌクレオチド配列（Ｋａｂａｔによる）。
【図３】本発明の抗ＩＬ−１３免疫グロブリン単一可変ドメインおよび従来技術のＩＬ−１３単一可変ドメインＤＯＭ１０−５３−４７４をコードしているヌクレオチド配列。
【図４ａ】ＤＯＭ１０−５３−４７４（配列番号１）のアミノ酸配列と本発明の抗ＩＬ−１３免疫グロブリン単一可変ドメインのアミノ酸配列との比較。ナンバリングはＫａｂａｔによる。ＤＯＭ１０−５３−４７４（配列番号１）に対するアミノ酸残基の差は、差が発生している位置にアミノ酸（一文字形式）で示した。ＤＯＭ１０−５３−４７４に対して特定の位置にアミノ酸に差がない場合は、“．”で示した。ＣＤＲは下線で示した。
【図４ｂ】ＤＯＭ１０−５３−４７４（配列番号１）のアミノ酸配列と本発明の抗ＩＬ−１３免疫グロブリン単一可変ドメインのアミノ酸配列との比較。ナンバリングはＫａｂａｔによる。ＤＯＭ１０−５３−４７４（配列番号１）に対するアミノ酸残基の差は、差が発生している位置にアミノ酸（一文字形式）で示した。ＤＯＭ１０−５３−４７４に対して特定の位置にアミノ酸に差がない場合は、“．”で示した。ＣＤＲは下線で示した。
【図４ｃ】ＤＯＭ１０−５３−４７４（配列番号１）のアミノ酸配列と本発明の抗ＩＬ−１３免疫グロブリン単一可変ドメインのアミノ酸配列との比較。ナンバリングはＣｈｏｔｈｉａによる。ＤＯＭ１０−５３−４７４（配列番号１）に対するアミノ酸残基の差は、差が発生している位置にアミノ酸（一文字形式）で示した。ＤＯＭ１０−５３−４７４に対して特定の位置にアミノ酸に差がない場合は、“．”で示した。ＣＤＲは下線で示した。
【図４ｄ】ＤＯＭ１０−５３−４７４（配列番号１）のアミノ酸配列と本発明の抗ＩＬ−１３免疫グロブリン単一可変ドメインのアミノ酸配列との比較。ナンバリングはＣｈｏｔｈｉａによる。ＤＯＭ１０−５３−４７４（配列番号１）に対するアミノ酸残基の差は、差が発生している位置にアミノ酸（一文字形式）で示した。ＤＯＭ１０−５３−４７４に対して特定の位置にアミノ酸に差がない場合は、“．”で示した。ＣＤＲは下線で示した。
【図５】本発明の抗ＩＬ−１３免疫グロブリン単一可変ドメインおよび従来技術のＩＬ−１３単一可変ドメインＤＯＭ１０−５３−４７４（配列番号１）のトリプシン消化。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本明細書において本発明は実施形態を参照しながら簡明な明細書記述がなされるように記述されている。実施形態は、本発明を逸脱することなく種々に組合せまたは分離してしてもよいことは意図されており、また、理解されるべきである。
【００１６】
別に定義されていなければ、本明細書に使われている全ての技術と科学の用語は、通常の当業者（例えば、細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリダイゼーション技術、および生化学の分野）により共通に理解されているものと同じ意味を有する。標準的な技術は、分子、遺伝、および生化学の手法（一般的には、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. and Ausubel et al., 分子生物額に於ける簡易手法(1999) 4th Ed, John Wiley & Sons, Inc. を参照のこと。これらは参照して本明細書に組み込まれる）および化学的手法で使われている。
【００１７】
用語「DOM10-53-474 (配列番号１)と比較してアミノ酸配列の変化」は、各変化がアミノ酸の置換、欠損、または付加のいずれかであるアミノ酸の変化を含む。一実施形態では、アミノ酸の置換のみがこの用語の意味となっている。
【００１８】
本明細書で使われている用語「リガンド」は、少なくとも一つのＩＬ−１３に特異的に結合する結合部位を有するペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質部分を含む化合物を指す。本発明に係るリガンドは、別の結合特異性を有するが、標的化合物に対する結合部位を同時に形成する可変ドメインペアーを含まない（すなわち、同時にＩＬ−１３に対する結合部位を形成する免疫グロブリン重鎖可変ドメインと免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含まない）免疫グロブリン可変ドメインを任意選択的に含んでも良い。さらに任意選択で、標的に対し特異的に結合する結合部位を有する各ドメインが所望の標的（例えば、ＩＬ−１３）に特異的に結合を行う免疫グロブリン単一可変ドメイン（例えば、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（例えば、ＶＨ、ＶＨＨ）、免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（例えば、ＶＬ））であっても良い。標的（例えば、ＩＬ−１３）に対し特異的に結合する結合部位を有する各ポリペプチドドメインは、結合ドメインが標的に特異的に結合するように適切なフォーマットで所望の標的（例えば、ＩＬ−１３）に対し特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、免疫グロブリン単一可変ドメイン）の一つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでもよい。例えば、ＣＤＲは、アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）、ＳｐＡ足場、ＬＤＬ受容体クラスＡドメイン、またはＥＧＦドメイン等の適切なタンパク質の足場または骨格にグラフト結合してもよい。さらに、本明細書に記述されているようにリガンドは二価（ヘテロ二価）または多価（ヘテロ多価）であってもよい。このように、「リガンド」は２つのｄＡｂを含み、これらが別の標的（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−１３）に結合するポリペプチドを含む。また、リガンドは、抗体フォーマット（例えば、ＩｇＧ様のフォーマット、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２）、または、本明細書記載のアフィボディ、ＳｐＡ足場、ＬＤＬ受容体クラスＡドメイン、ＥＧＦドメイン、アビマー、二重特異的、多特異的リガンド等の適切なタンパク質足場や骨格のようなフォーマットで別の標的（またはｄＡｂのＣＤＲ）に結合するポリペプチドを含む。
【００１９】
また、標的（例えば、ＩＬ−１３）に特異的結合を行う結合部位を有するポリペプチドドメインは、所望の標的、例えばアフィボディ、ＳｐＡドメイン、ＬＤＬ受容体クラスＡドメイン、アビマー（例えば、U.S. Patent Application Publication Nos. 2005/0053973, 2005/0089932, 2005/0164301参照）から選ばれたタンパク質ドメインに対する結合部位を含むタンパク質ドメインであってもよい。必要に応じ、「リガンド」は、さらに一つまたは複数のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質部分や非ペプチド部分（例えば、ポリアルキレングリコール、脂質、炭水化物）等の付加的部分をそれぞれ独立に含んでもよい。例えば、リガンドは、本明細書に記述したように半減期延長部分を含んでもよい（例えば、ポリアルキレングリコール部分、アルブミン、アルブミン断片またはアルブミンバリアントを含む部分、トランスフェリン、トランスフェリン断片、またはトランスフェリンバリアントを含む部分、アルブミンに結合する部分、新生児ＦＣ受容体に結合する部分）。
【００２０】
「二重特異的リガンド」は、一番目の抗原またはエピトープ結合部位（例えば、一番目の免疫グロブリン単一可変ドメイン）および二番目の抗原またはエピトープ結合部位（例えば、二番目の免疫グロブリン単一可変ドメイン）であり、これらの結合部位または可変ドメインが２つの抗原（例えば、別の抗原もしくは同じ抗原の２つのコピー）または単一特異的免疫グロブリンでは本来結合されない同じ抗原上の２つのエピトープ、を含むリガンドを指す。例えば、２つのエピトープは同じ抗原上にあってもよいが、同じエピトープであっても、または単一特異的リガンドにより結合される程充分に近接していてもいけない。一実施形態では、本発明に係る二重特異的リガンドは、別の特異性を有する結合部位または可変ドメインを含むが、同じ特異性を有する（すなわち、単一結合部位を形成しない）相互に相補的な可変ドメインペアー（すなわち、ＶＨ／ＶＬペアー）を含まない。
【００２１】
本明細書で使われている用語「標的」は、結合部位を有するポリペプチドが結合する生体分子（例えば、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、脂質、炭水化物）を指す。例えば、標的は、細胞内標的（例えば、細胞内タンパク質標的）、可溶性性標的（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−１３等の分泌タンパク質）、または細胞表面標的（例えば、膜タンパク質、受容体タンパク質）であってもよい。一実施形態では、標的はＩＬ−４またはＩＬ−１３である。
【００２２】
用語「免疫グロブリン単一可変ドメイン」は、それぞれ別のまたは他のＶ領域やドメインの抗原やエピトープに特異的に結合する抗体の可変ドメイン（ＶＨ、ＶＨＨ、ＶＬ）を指す。免疫グロブリン単一可変ドメインは、単一免疫グロブリン可変ドメイン（すなわち、ここでは、免疫グロブリン単一可変ドメインは追加の可変ドメインの抗原と独立に結合する）による抗原結合が必要でない他の可変領域または可変ドメインを伴ったフォーマット（例えば、ホモまたはヘテロマルチマー）で存在してもよい。「ドメイン抗体」または「ｄＡｂ」は、本明細書でこの用語が使われる場合は、「免疫グロブリン単一可変ドメイン」である。「単一免疫グロブリン可変ドメイン」は、本明細書でこの用語が使われる場合は、「免疫グロブリン単一可変ドメイン」と同じである。「単一抗体可変ドメイン」または「抗体単一可変ドメイン」は、本明細書でこの用語が使われる場合は、「免疫グロブリン単一可変ドメイン」と同じである。免疫グロブリン単一可変ドメインは、一実施形態ではヒト抗体可変ドメインであるが、げっ歯類（例えば、WO 00/29004に開示されており、その内容全体は参照により本明細書に組み込まれる）、テンジクザメ、およびラクダ科動物のＶＨＨ ｄＡｂ等の他の種からの単一抗体可変ドメインも含有する。ラクダ科動物のＶＨＨは、ラクダ、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダおよびグアナコ、等の種から得られた免疫グロブリン単一可変ドメインポリペプチドで、生来軽鎖を欠損する重鎖抗体を産生する。ＶＨＨは、ヒト化可能である。
【００２３】
本明細書に記述されている免疫グロブリン単一可変ドメイン（ｄＡｂ）は、相補性決定ドメイン（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）を含む。ＣＤＲとフレームワーク（ＦＲ）ドメインの位置とナンバリング方式は、Ｋａｂａｔ等により決定されてきた（Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office (1991)）。本明細書で開示しているＶＨとＶＬ（Ｖκ）ｄＡｂのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）のアミノ酸配列は、よく知られたＫａｂａｔのアミノ酸配列ナンバリング方式とＣＤＲの定義に従えば当業者には容易にわかるであろう。Ｋａｂａｔのナンバリング方式に従って可変長、挿入を有する重鎖ＣＤＲ−Ｈ３は、残基Ｈ１００とＨ１０１の間でＫ迄の文字でナンバリングされる（すなわち、Ｈ１００、Ｈ１００Ａ．．．．Ｈ１００Ｋ、Ｈ１０１）。あるいは、ＡｂＭまたは次のコンタクト方法に従って、ＣＤＲはＣｈｔｈｉａ方式を用いて決定してもよい（Chothia et al., (1989) Conformations of immunoglobulin hypervariable regions（免疫グロブリン超可変ドメインの構造）; Nature 342, p877-883）。適切なＣＤＲ決定方法については http://www.bioinf.org.uk/abs/ を参照。
【００２４】
各残基をナンバリングした後、続くＣＤＲ定義に適用出来る（“−”はＫａｂａｔ方式で同じ残基を意味する）
Ｋａｂａｔ配列多様性に基づいて最もよく使われる方法
（Ｋａｂａｔナンバリングを使って)：
ＣＤＲＨ１：３１−３５／３５Ａ／３５Ｂ
ＣＤＲＨ２：５０−６５
ＣＤＲＨ３：９５−１０２
ＣＤＲＬ１：２４−３４
ＣＤＲＬ２：５０−５６
ＣＤＲＬ３：８９−９７
【００２５】
Ｃｈｏｔｈｉａ−構造のループドメインの位置に基づいて
（Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングを使って）：
ＣＤＲＨ１：２６−３２
ＣＤＲＨ２：５２−５６
ＣＤＲＨ３：９５−１０２
ＣＤＲＬ１：２４−３４
ＣＤＲＬ２：５０−５６
ＣＤＲＬ３：８９−９７
ＡｂＭ−ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａの中間
（Ｋａｂａｔナンバリングを使って）： （Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングを使って）：
ＣＤＲＨ１：２６−３５／３５Ａ／３５Ｂ ２６−３５
ＣＤＲＨ２：５０−５８ −
ＣＤＲＨ３：９５−１０２ −
ＣＤＲＬ１：２４−３４ −
ＣＤＲＬ２：５０−５６ −
ＣＤＲＬ３：８９−９７ −
Ｃｏｎｔａｃｔ−結晶構造と抗原との接触残基予測に基づいて
（Ｋａｂａｔナンバリングを使って）： （Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングを使って）：
ＣＤＲＨ１：３０−３５／３５Ａ／３５Ｂ ３０−３５
ＣＤＲＨ２：４７−５８ −
ＣＤＲＨ３：９３−１０１ −
ＣＤＲＬ１：３０−３６ −
ＣＤＲＬ２：４６−５５ −
ＣＤＲＬ３：８９−９６ −
【００２６】
本明細書で使われる「インターロイキン−４」（ＩＬ−４）は、自然発生または内在性の哺乳動物ＩＬ−４タンパク質および自然発生または内在性の対応する哺乳動物ＩＬ−４タンパク質（例えば、組換えタンパク質、合成タンパク質（すなわち、有機合成化学手法により合成された））の配列に同じアミノ酸配列を有するタンパク質を指す。従って、本明細書で定義されているように、この用語は成熟ＩＬ−４タンパク質、多形型または対立遺伝子変異型、およびその他のＬ−４のイソ型、ならびにこれらの修飾または非修飾型（例えば、脂質化、グリコシル化）を含む。自然発生または内在性のＩＬ−４は、成熟ＩＬ−４、多形型または対立遺伝子変異型および哺乳動物（例えば、ヒト、非ヒト霊長目）で自然発生している他のイソ型や変異型、等の野生型タンパク質を含む。例えば、このようなタンパク質は、ＩＬ−４を天然に作り出す元のソースから回収または単離することが出来る。これらのタンパク質および自然発生または内在性の対応するＩＬ−４と同じアミノ酸配列を有するタンパク質は、対応する哺乳動物の名前で参照される。例えば、対応する哺乳動物がヒトである場合は、タンパク質はヒトＩＬ−４と表される。WO 03/038041で開示されているような、いくつかの変異体ＩＬ−４が当業者には既知である。
【００２７】
本明細書で使われる「インターロイキン−１３」（ＩＬ−１３）は、自然発生または内在性の哺乳動物ＩＬ−１３タンパク質および自然発生または内在性の対応する哺乳動物ＩＬ−１３タンパク質（例えば、組換えタンパク質、合成タンパク質（すなわち、有機合成化学手法により合成された））の配列に同じアミノ酸配列を有するタンパク質を指す。従って、本明細書で定義されているように、この用語は成熟ＩＬ−１３タンパク質、多形型または対立遺伝子変異型、およびその他のＬ−１３のイソ型（例えば、選択的スプライシングや他の細胞過程で作られた）およびこれらの修飾または非修飾型（例えば、脂質化、グリコシル化）を含む。自然発生または内在性のＩＬ−１３は、成熟ＩＬ−１３、多形型または対立遺伝子変異型および哺乳動物（例えば、ヒト、人間以外の霊長目）で自然発生している他のイソ型や変異型、等の野生型タンパク質を含む。自然発生または内在性のＩＬ−１３は、成熟ＩＬ−１３、多形型または対立遺伝子変異型および哺乳動物（例えば、ヒト、人間以外の霊長目）で自然発生している他のイソ型や変異型、等の野生型タンパク質を含む。例えば、本明細書で使われているように、ＩＬ−１３は、ヒトＩＬ−１３変異体を包含する。これは、成熟ヒトＩＬ−１３の１１０の位置のＡｒｇが、喘息（アトピー性および非アトピー性喘息）および他のＩＬ−１３の変異体に関係（Heinzmann et al., Hum Mol Genet. 9:549-559 (2000)）しているＧｌｎ（成熟ＩＬ−１３の１１０の位置が前駆タンパク質の１３０の位置に対応する）で置換されている。このようなタンパク質は、ＩＬ−１３を天然に作り出す元のソースから回収または単離することが出来る。これらのタンパク質および自然発生または内在性の対応するＩＬ−１３と同じアミノ酸配列を有するタンパク質は、対応する哺乳動物の名前で参照される。例えば、対応する哺乳動物がヒトである場合は、タンパク質はヒトＩＬ−１３と表される。WO 03/038041で開示されているような、いくつかの変異体ＩＬ−１３が当業者には既知である。
【００２８】
「アフィニティ」と「アビディティ」は結合相互作用の強度を表す技術用語である。本発明のリガンドに対しては、アビディティは、細胞およびリガンド上の標的間（例えば、第一と第二の標的間）の全体の結合力を指す。アビディティは、個々の標的に対するそれぞれのアフィニティの合計より大きくなる。
【００２９】
本明細書で使われている「有毒成分」は、毒素を含む成分を指す。毒素は、細胞生理（例えば、細胞壊死、アポートシスを起こす、または細胞分裂を阻害する）に悪影響を及ぼす、および／またはそれを変える薬剤である。
【００３０】
本明細書で使われている用語「用量」は、被験者に一度に全投与（単位用量）する、または二回もしくはそれ以上の回数にわけ一定の時間間隔で投与するリガンドの量を指す。例えば、用量は１日（２４時間）（１日量）、２日、一週、二週、三週、または一ヶ月または二ヶ月以上のコース（例えば、一回投与、または二回以上の投与で）で被験者に投与するリガンドの量（例えば、リガンドは、ＩＬ−１３に結合する免疫グロブリン単一可変ドメイン）を指してもよい。投与間隔は任意の所望間隔とすることが出来る。
【００３１】
本明細書で使われている「相補的」は、２つの免疫グロブリンドメインが同族ペアーやグループを形成する構造のファミリーに属するか、またはこのファミリーから生成しこの特徴を維持する場合を指す。例えば、抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインは相補的である。２つのＶＨドメインは相補的ではない。また、２つのＶＬドメインも相補的ではない。相補的ドメインは、Ｔ細胞受容体のＶα、Ｖβ（またはγとδ）ドメイン、等の免疫グロブリンスーパーファミリーの他のメンバーにも認められる。操作しなければエピトープと結合しないタンパク質足場に基づくドメインのような人工のドメインは相補的ではない。同様に、（例えば）免疫グロブリンドメインおよびフィブロネクチンドメイン、に基づく２つのドメインは相補的ではない。
【００３２】
本明細書で使われている「免疫グロブリン」は、２つのβシートと、通常は保存されているジスルフィド結合を含む抗体分子の免疫グロブリン折りたたみ特性を維持しているポリペプチドファミリーを指す。免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーは生体内細胞性、および非細胞性相互作用の多くの側面に関わっている。これらの中には、免疫システムにおける広範囲の役割（例えば、抗体、Ｔ細胞受容体分子、等）、細胞間接着への関与（例えば、ＩＣＡＭ分子）、および細胞内信号伝達（例えば、ＰＤＧＦ受容体、等の受容体分子）が含まれる。本発明は、結合ドメインを有する全ての免疫グロブリンスーパーファミリー分子に適用できる。一実施形態では、本発明は抗体に関する。
【００３３】
本明細書で使われている「ドメイン」は、他のタンパク質とは独立に三次構造を保持している折り畳みタンパク質構造を指す。一般的には、ドメインはタンパク質個々の固有の機能特性に関与し、多くの場合、残りのタンパク質および／またはドメインの機能を失うことなく付加、削除、または他のタンパク質への移動が可能である。単一抗体に対して、可変ドメインは、抗体可変ドメインの配列特性を含む折り畳みポリペプチドドメインを意味する。従って、これは、抗体可変ドメインおよび変更可変ドメインの全体を含むが、後者の例としては、例えば一つまたは複数のループが抗体可変ドメインの特徴でない配列により置換され、または、切断され、またはＮ−もしくはＣ−末端伸長を含む抗体可変ドメイン、ならびに、少なくとも部分的には全長ドメイン時の結合活性および特異性を保持している可変ドメインの折り畳み断片、により置換された場合が含まれる。このように、各リガンドは少なくとも２つの別々のドメインを含む。
【００３４】
用語「ライブラリ」は、ヘテロポリペプチド、またはヘテロ核酸の混合物を指す。ライブラリは、単一ポリペプチドまたは核酸配列を有するメンバーから構成されている。この点では、ライブラリはレパートリーの同義語である。ライブラリメンバー間の配列の差はライブラリに存在する多様性によるものである。ライブラリは、ポリペプチドまたは核酸の単純な混合物の形を取ってもよく、あるいは、核酸のライブラリで形質転換した生物または細胞の形、例えばバクテリア、ウイルス、動物または植物等、を取ってもよい。各生物または細胞が、一つまたは限定された数のみのライブラリメンバーを含むようにすることも任意に選択可能である。好都合にも、核酸は発現ベクター中に組み込まれ、核酸によりコードされたポリペプチドを発現させる。一態様では、ライブラリは、宿主生物母集団の形を取って、各生物が発現して対応するポリペプチドメンバーを産生する核酸の形の単一メンバー発現ベクターの一つまたは複数のコピーを含んでもよい。このように、宿主生物母集団は、遺伝的に多様なポリペプチド変異体の大きなレパートリーをコードする可能性を有している。
【００３５】
本明細書で使われている「抗体」は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤやＩｇＥ、またはフラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、ｓｃＦｖ、閉構造多重特異性抗体、ジスルフィド結合ｓｃＦｖ、二重特異性抗体）であって、抗体を天然に産生する任意の種から誘導されるか、または組換えＤＮＡ技術により作製されるか、または、例えば血清、Ｂ細胞、ハイブリドーマ、トランスフェクト細胞、酵母、およびバクテリアから単離するか、のいずれかのものを指す。
【００３６】
本明細書で使われている「抗原」は、本発明に係る結合ドメインにより結合される分子である。通常は、抗原は抗体リガンドに結合され、生体内での抗体反応を促進することが出来る。例えば、抗原はペプチド、タンパク質、核酸、または他の分子であってもよい。一般的には、本発明において二重特異性リガンドは２つの特定標的（例えば、抗原）に対する標的特異性で選択される。通常の抗体とそのフラグメントの場合、可変ループ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＨ１、Ｈ２、Ｈ３）により決まる抗体結合部位が抗原に結合出来る。
【００３７】
「エピトープ」は、免疫グロブリンＶＨ／ＶＬペアーにより通常の方式で結合される構造単位である。エピトープは抗体に対し最小限の結合部位を決定し、抗体の特異性を有する標的を表す。単一ドメイン抗体の場合、エピトープは単独の可変ドメインにより結合される構造単位を表す。
【００３８】
「ユニバーサルフレームワーク」は、Ｋａｂａｔの定義（“Sequences of Proteins of Immunological Interest”, US Department of Health and Human Services）による配列に保存されている抗体のドメインに対応する単一抗体フレームワーク配列、または、ＣｈｏｔｈｉａとＬｅｓｋにより定義（(1987) J. Mol. Biol. 196:910-917）されているヒト生殖細胞系列免疫グロブリンレパートリーや構造を指す。本発明は単一フレームワークまたは一連の当該フレームワークの使用方法を提供する。これを使って超可変ドメインのみを変化させることにより実質的にほとんどの結合特異性を導出可能であることが明らかになっている。
【００３９】
用語「半減期」は、例えばリガンドの分解、および／または、自然の機構による二重特異性リガンドのクリアランスや隔離によって、リガンドの血清中濃度が体内で５０％減少するのに要する時間を指す。本発明のリガンドは体内で安定化され、半減期は分解および／またはクリアランスや隔離に耐える分子に結合することにより延長されている。通常は、この分子は自然発生タンパク質であり、それ自体、体内で長い半減期を有している。そのリガンドの体内機能活性が、半減期延長分子には特異的でない類似リガンドよりも長期間持続する場合、リガンドの半減期は延長される。このように、ＨＳＡに特異的なリガンドと２つの標的分子とを、ＨＳＡに対する特異性のない、同じリガンドで比較する。すなわち、このリガンドはＨＳＡに結合しないで他の分子に結合する。例えば、細胞上の第３の標的に結合する可能性もある。典型的には、半減期は、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％またはこれ以上延長される。２ｘ、３ｘ、４ｘ、５ｘ、１０ｘ、２０ｘ、３０ｘ、４０ｘ、５０ｘ、またはこれ以上の半減期延長も可能である。この代わりに、または、これに追加して３０ｘ、４０ｘ、５０ｘ、６０ｘ、７０ｘ、８０ｘ、９０ｘ、１００ｘ、１５０ｘの半減期延長も可能である。
【００４０】
本明細書で使われている「低度のストリンジェンシー（ｌｏｗ ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）」、「中度のストリンジェンシー（ｍｅｄｉｕｍ ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）」、「高度のストリンジェンシー（ｈｉｇｈ ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）」または「非常に高度のストリンジェンシー（ｖｅｒｙ ｈｉｇｈ ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）」の条件は、核酸ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を表している。ハイブリダイゼーション反応のためのガイダンスは、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6、で見ることが出来、この全体が参照により本明細書に組み込まれる。この文献に水相、および非水相法が記載されており、いずれの方法も使用可能である。本明細書で言及される具体的なハイブリダイゼーション条件は次のとおりである：（１）低度のストリンジェンシーでのハイブリダイゼーション条件は、６Ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中で約４５℃、続いて０．２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で少なくとも５０℃で２回洗浄（低度のストリンジェンシー条件の場合、洗浄温度を５５℃まで上げることができる）；（２）中度のストリンジェンシーでのハイブリダイゼーション条件は、６ＸＳＳＣ中で約４５℃、続いて０．２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で６０℃にて１回または複数回洗浄；（３）高度のストリンジェンシーでのハイブリダイゼーション条件は、６ＸＳＳＣ中で約４５℃、続いて０．２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で６５℃にて１回または複数回洗浄；および任意選択で、（４）非常に高度のストリンジェンシーでのハイブリダイゼーション条件は、０．５Ｍリン酸ナトリウム、７％ＳＤＳ中で６５℃、続いて０．２ＸＳＳＣ、１％ＳＤＳ中で６５℃にて１回または複数回洗浄である。非常に高度のストリンジェンシー条件（４）が好適な条件であり、特に断らない限り、採用すべき条件である。
【００４１】
本明細書に記載の配列と類似した配列または相同な配列（例えば、少なくとも約７０％の配列同一性）も本発明の一部である。ある実施形態では、アミノ酸レベルでの配列同一性は、約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上であってもよい。核酸レベルでは、配列同一性は約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上であってもよい。あるいは、核酸セグメントが選択的ハイブリダイゼーション条件（例えば、非常に高度のストリンジェンシーでのハイブリダイゼーション条件）下でその相補鎖とハイブリダイズする場合には、実質的同一性が存在する。核酸は細胞内にあっても、細胞溶解液中に存在しても、あるいは部分的に精製されたもしくは実質的に純粋な形態で存在してもよい。
【００４２】
2つの配列間の「相同性」または「配列同一性」または「類似性」（本明細書ではこれらの用語を互換的に用いる）の計算は次のように行う。最適な比較のために配列をアライメントする（例えば、最適なアライメントのために第1および第2のアミノ酸または核酸配列の一方または両方にギャップを導入することができ、また、比較のために非相同配列を無視することができる）。一実施形態では、比較のためにアライメントされる参照配列の長さは、その参照配列の長さの少なくとも30％、任意選択で少なくとも40％、任意選択で少なくとも50％、任意選択で少なくとも60％、任意選択で少なくとも70％、80％、90％、または100％である。その後、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第1の配列のある位置が、第2の配列の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占められている場合には、それらの分子はその位置で同一である（本明細書で用いるアミノ酸または核酸の「相同性」は、アミノ酸または核酸の「同一性」と同等である）。2つの配列間の同一性パーセントは、これら2つの配列の最適なアライメントのために導入する必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮して、これらの配列により共有される同一位置の数の関数である。
【００４３】
本明細書で定義されるアミノ酸およびヌクレオチド配列のアライメント、ならびに相同性、類似性または同一性は、任意選択として、デフォルトパラメーターを用いて、アルゴリズムＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓにより作製し、決定してもよい (Tatusova, T.A. et al., FEMS Microbiol Lett, 174:187-188 (1999))。あるいは、配列アライメントのためにBLASTアルゴリズム(バージョン２．０)を、デフォルト値に設定されたパラメーターと共に用いる。ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）はプログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、およびｔｂｌａｓｔｘに採用されている帰納的検索アルゴリズムである。これらのプログラムの有用性は、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌの統計的方法（1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87(6):2264-8）を使った検索結果の恩恵によるものである。
【００４４】
特に断らないかぎり、本明細書で用いる技術用語および科学用語はすべて、当分野（例えば、細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリダイゼーション技法および生化学）の通常の知識を有する者が普通に理解している意味と同じ意味を有する。分子的、遺伝学的および生化学的方法（一般的には、Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版 (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.およびAusubelら, Short Protocols in Molecular Biology (1999) 第4版, John Wiley & Sons, Inc.を参照されたい；これらを参照することにより本明細書に含める）、ならびに化学的方法については、標準的手法が使われる。
【００４５】
本明細書で使われている用語「ＩＬ−１３アンタゴニスト」または「抗ＩＬ−１３アンタゴニスト」等は、ＩＬ−１３に結合しＩＬ−１３の（すなわち、一つのまたは複数の）機能を阻害する薬剤（例えば分子や化合物）を指す。例えば、ＩＬ−１３アンタゴニストはＩＬ−１３受容体へのＩＬ−１３の結合を阻害し、および／または、ＩＬ−１３受容体経由のシグナル伝達を阻害することが出来る。従って、ＩＬ−１３媒介過程と細胞反応がＩＬ−１３アンタゴニストにより阻害され得る。
【００４６】
本明細書で使われている「ペプチド」は、ペプチド結合で結合した約２〜５０アミノ酸を指す。
【００４７】
本明細書で使われている「ポリペプチド」は、ペプチド結合で結合した少なくとも約５０アミノ酸を指す。ポロペプチドは通常三次構造を含み、折り畳まれて機能ドメインを形成している。
【００４８】
本明細書で使われている、「プロテアーゼ分解に耐性がある」は、ペプチドまたはポリペプチド（例えばドメイン抗体（ｄＡｂ））が、プロテアーゼ活性好適条件下でプロテアーゼとインキュベートした場合プロテアーゼにより実質的に分解されないということである。プロテアーゼ活性好適温度で約１時間プロテアーゼと一緒にインキュベーション後、このタンパク質がプロテアーゼにより分解されたのは、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１４％以下、約１３％以下、約１２％以下、約１１％以下、約１０％以下、約９％以下、約８％以下、約７％以下、約６％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下、約１％以下、にすぎない、または、実質的に分解されていない場合、ポリペプチド（例えばｄＡｂ）は実質的に分解されていないことになる。例えば、３７℃または５０℃である。タンパク質分解は、任意の好適な方法、例えば本明細書に記載のＳＤＳ−ＰＡＧＥまたは機能アッセイ（例えばリガンド結合）によって評価することができる。
【００４９】
本明細書で使われている「ディスプレイシステム」は、物理的、化学的または機能的特性、等の所望特性を基準にして選択する目的で、ポリペプチドやペプチドのコレクションにアクセス可能なシステムを指す。ディスプレイシステムはポリペプチドやペプチドの適切なレパートリー（例えば、溶液の形で、適切な担体上に固定されて）であってもよい。また、ディスプレイシステムは、細胞発現システム（例えば、形質転換、感染、核酸導入、または形質導入、等を行った細胞の核酸発現ライブラリ、および細胞表面へのコード化ポリペプチドのディスプレイ）、あるいは、無細胞発現システム（例えば、エマルジョン分画とディスプレイ）を採用してもよい。代表的なディスプレイシステムでは、核酸のコード機能と、核酸によりコードされたポリペプチドやペプチドの物理的、化学的、および／または、機能特性とを結びつける。このようなディスプレイシステムが採用されると、所望の物理的、化学的、および／または、機能特性を有するポリペプチドやペプチドが選択でき、選択されたポリペプチドやペプチドをコードする核酸を容易に単離、回収できる。核酸のコード機能とポリペプチドやペプチドの物理的、化学的、および／または、機能特性とを結びつけるいくつかのディスプレイシステムが当業者には既知であり、例えば、バクテリオファージディスプレイ（ファージディスプレイ、例えばファージミドディスプレイ）、リボソームディスプレイ、エマルジョン分画とディスプレイ、酵母ディスプレイ、ピューロマイシンディスプレイ、細菌ディスプレイ、プラスミド上のディスプレイ、共有結合ディスプレイ、等（例えば、EP 0436597 (Dyax), 米国特許第6,172,197号 (McCafferty et al.), 米国特許第6,489,103号 (Griffiths et al.)参照））がある。
【００５０】
本明細書で使われている「レパートリー」は、アミノ酸配列の多様性で特徴付けられるポリペプチドやペプチドのコレクションを指す。それぞれのレパートリーのメンバーは、共通の構造特性（例えば、共通のコア構造）、および／または共通の機能特性（例えば、共通のリガンド（例えば、包括的なリガンドや標的リガンド、ＩＬ−１３）に結合する能力）、等の共通の特徴を有する。
【００５１】
本明細書で使われている「機能的」は、特異的結合活性等の生物学的活性を有するポリペプチドやペプチドの特徴を説明する。例えば、用語「機能的ポリペプチド」は、抗原結合部位により標的抗原に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。
【００５２】
本明細書で使われている「包括的リガンド」は、所与のレパートリーの機能的メンバーの実質的部分（例えば、実質的に全部）に結合するリガンドを指す。包括的リガンド（例えば、包括的な共通リガンド）は、メンバーが共通標的リガンドに対し結合特異性を持っていなくても、所与のレパートリーの多くのメンバーと結合可能である。通常、ポリペプチド上の包括的な機能的リガンド結合部位が存在する（包括的リガンドに結合する能力で示されるように）と、ポリペプチドは正しく折り込まれ、機能する。包括的リガンドの適切な例には、超抗原や、レパートリーの一部の実質的な機能的メンバー上に発現したエピソードに結合した抗体、等を含む。
【００５３】
「超抗原」は、これらタンパク質の標的リガンド結合部位から離れた部位で、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーと相互作用する包括的リガンドを指す技術用語である。ブドウ球菌エンテロトキシンは、Ｔ細胞受容体と相互作用する超抗原の例である。抗体と結合する超抗原には、ＩｇＧ定常領域と結合するＧタンパク質（Bjorck and Kronvall, J. Immunol., 133:969 (1984)）、ＴｇＧ定常領域やＶＨドメインと結合するＡタンパク質（Forsgren and Sjoquist, J. Immunol., 97:822 (1966)）、およびＶＬドメインと結合するＬタンパク質（Bjorck, J. Immunol., 140:1194 (1988)）が含まれる。
【００５４】
本明細書で使われている「抗体フォーマット」は、その構造上の抗原に対する結合特異性を与えるために一つまたは複数の抗体可変ドメインが組み込まれている任意の適切なポリペプチド構造を指す。多様な好適抗体フォーマットが当業者には既知であり、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、単鎖抗体、二重特異性抗体、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体重鎖および／もしくは軽鎖のホモ二量体・ヘテロ二量体、上記いずれかの抗原結合フラグメント（例えばＦｖフラグメント(単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ)、ジスルフィド結合Ｆｖ等)、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２ フラグメント）、単一抗体可変ドメイン（例えば、ｄＡｂ、ＶＨ、ＶＨＨ、ＶＬ）、および上記いずれかの改変型(例えば、ポリエチレングリコール、または他の適切なポリマーやヒト化ＶＨＨの共有結合による改変)）がある。
【００５５】
本明細書で使われている「流体力学的サイズ」は、水溶液中の分子の拡散から求めた分子（例えば、タンパク質分子、リガンド）の見かけ上の大きさを指す。溶液中のタンパク質の拡散や運動を適切に処理してタンパク質の見かけ上の大きさを導き出すことが出来き、この方式ではタンパク質粒子の大きさが「ストークス半径」または「流体力学的半径」として得られる。タンパク質の「流体力学的サイズ」は、質量と形状（立体配座）に依存する。すなわち、同じ分子質量の２つのタンパク質がその全立体配座に依存して異なる流体力学的サイズを持ち得るということである。
【００５６】
本明細書で使われている「競合する」は、第1の標的（例えばＩＬ−１３）のそのコグネイトの標的結合ドメイン（例えば、免疫グロブリン単一可変ドメイン）への結合が、前記コグネイト標的に対し特異的な第２の結合ドメイン（例えば、免疫グロブリン単一可変ドメイン）が存在する場合に、阻害されることを意味する。例えば、結合ドメインの物理的ブロックにより、または標的に対するアフィニティやアビディティが低下するような結合ドメインの構造もしくは環境の変化により、結合が立体的に阻害され得る。競合的ＥＬＩＳＡ法および競合的ＢｉａＣｏｒｅ法の実験により第１と第２の結合ドメインの間での競合を測定する方法の詳細ついては、WO2006038027を参照のこと。この詳細は、参照により本明細書に組み込まれるが、ここには本発明における利用に関して明瞭な開示がなされている。
【００５７】
本発明者は、ＤＯＭ１０−５３−４７４（配列番号１）の位置２８（Ｋａｂａｔナンバリング）の変異が、ＩＬ−１３に対しさらに大きな効力のあるｄＡｂ派生体の提供を実現した。ヒトと少なくとも一つの非ヒト霊長類のＩＬ−１３（例えば、カニクイザルおよび／またはアカゲザル）の間の交差反応のような付加的な利点も生じる可能性がある。さらに、原核細胞での有益な発現も得られる可能性がある。
【００５８】
そのため、一つの態様では、本発明は、ＤＯＭ１０−５３−４７４（配列番号１）と比較して１、２、３、４または５のアミノ酸変化以外はＤＯＭ１０−５３−４７４（配列番号１）と同一のアミノ酸配列を含み、この単一可変ドメインがＫａｂａｔナンバリングで位置２８にバリンを有し、さらに任意選択で単一可変ドメインはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）からなるものではない、抗インターロイキンー１３（ＩＬ−１３）免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。
【００５９】
また、本明細書で用語「ｄＡｂ」（ドメイン抗体）に言及している。ｄＡｂは「免疫グロブリン単一可変ドメイン」のことである。
【００６０】
本発明者は、配列モチーフＸＧＸ’Ｘ”（ここで、ＧはＫａｂａｔナンバリングによる位置５４であり、Ｘ＝ＨまたはＫであり；Ｘ’＝ＧまたはＫであり；およびＸ”＝ＫまたはＩである）を有するＤＯＭ１０−５３−４７４ｄＡｂ派生体はＩＬ−１３結合に対しさらに有効であることも理解した。ヒトと少なくとも一つの非ヒト霊長類ＩＬ−１３（例えば、カニクイザルおよび／またはアカゲザル）の間の交差反応のような付加的な利点も生じる可能性もある。さらに、原核細胞での発現増加という利点も得られる可能性がある。
【００６１】
そのため、第二の態様では、本発明は、ＤＯＭ１０−５３−４７４（配列番号１）と比較して１、２、３、４または５のアミノ酸変化以外はＤＯＭ１０−５３−４７４と同一のアミノ酸配列を含み、この単一可変ドメインが配列ＸＧＸ’Ｘ”を有し、ここでＧはＫａｂａｔナンバリングによる位置５４であり、
Ｘ＝ＨまたはＫであり；
Ｘ’＝ＧまたはＫであり；
Ｘ”＝ＫまたはＩであり、
さらに任意選択で単一可変ドメインはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）からなるものではない、抗インターロイキンー１３（ＩＬ−１３）免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。
【００６２】
第二の態様の一実施形態では、可変ドメインは、Ｋａｂａｔナンバリングで位置２８にバリンを有する。
【００６３】
第二の態様の一実施形態では、単一可変ドメインは、
ＫＧＧＫ；
ＸＧＫＩ；または
ＨＧＫＩ；
を含み、ここでＧ（または、ＫＧＧＫに対する最初のＧ）はＫａｂａｔナンバリングで位置５４にある。
【００６４】
第二の態様の一実施形態では、単一可変ドメインのＣＤＲ２（Ｋａｂａｔによる）は、配列ＳＩＤＷ［Ｚ］ＴＹＹＡＤＳＶＫＧを有し、ここで［Ｚ］は前に定義したＸＧＸ’Ｘ”、ＫＧＧＫ、ＫＧＫＩおよびＨＧＫＩから選択される。
【００６５】
いずれの態様においても、可変ドメインは、任意選択で位置３０、５３、５５、５６（Ｋａｂａｔのナンバリングによる）の一つまたは複数のアミノ酸変化（ＤＯＭ１０−５３−４７４（配列番号１）に対して）を有することができる。任意選択として、可変ドメインは、
ａ）位置３０（Ｋａｂａｔナンバリングによる）にプロリン、および／または
ｂ）位置５３（Ｋａｂａｔナンバリングによる）にリシン、および／または
ｃ）位置５５（Ｋａｂａｔナンバリングによる）にグリシンまたはリシン、および／または
ｄ）位置５６（Ｋａｂａｔナンバリングによる）にイソロイシンまたはリシン
を有してもよい。
【００６６】
一実施形態として、単一可変ドメインは位置５５にリシンを、位置５６にイソロイシンを有する（Ｋａｂａｔナンバリングによる）。
【００６７】
一つの態様では、本発明は、抗インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。この可変ドメインでは、ＣＤＲ（例えば、Ｋａｂａｔの決定に従って）はＤＯＭ１０−５３−４７４（配列番号１）のＣＤＲと同一であり、単一可変ドメインが、Ｋａｂａｔナンバリングで位置２８にバリンを含む。任意選択で、単一可変ドメインのアミノ酸配列がＤＯＭ１０−５３−４７４（配列番号１）と比較して１、２、３、４または５のアミノ酸変化を有し、ここで、一つまたは複数の変化は、ＣＤＲ（例えば、ＫａｂａｔやＣｈｏｔｈｉａによるＣＤＲ２）中に任意に存在してもよい。また、任意選択として、単一可変ドメインはＤＯＭ１０−５３−６１６ (配列番号５)からなるものではない。
【００６８】
一つの態様では、本発明は、抗インターロイキンー１３（ＩＬ−１３）免疫グロブリン単一可変ドメインを提供し、この可変ドメインでは、ＣＤＲ（例えば、Ｋａｂａｔの決定に従って）は、単一可変ドメインが前に定義したＳＩＤＷ［Ｚ］ＴＹＹＡＤＳＶＫＧ、ＸＧＸ’Ｘ”、ＫＧＧＫ、ＸＧＫＩまたはＨＧＫＩモチーフを含むこと以外は、ＤＯＭ１０−５３−４７４（配列番号１）のＣＤＲと同一である。任意選択として、単一可変ドメインがＫａｂａｔナンバリングで位置２８にバリンを含んでもよい。さらに、任意選択として、単一可変ドメインはＤＯＭ１０−５３−６１６ (配列番号５)からなるものではない。
【００６９】
さらなる態様では、本発明は、抗インターロイキンー１３（ＩＬ−１３）免疫グロブリン単一可変ドメインを提供し、ここで、可変ドメインがＤＯＭ１０−５３−５４６（配列番号２）；ＤＯＭ１０−５３−５６７（配列番号３）；ＤＯＭ１０−５３−５６８（配列番号４）；またはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）である。さらなる態様では、本発明は、抗インターロイキンー１３（ＩＬ−１３）免疫グロブリン単一可変ドメインを提供し、ここで、可変ドメインがＤＯＭ１０−５３−５４６（配列番号２）；ＤＯＭ１０−５３−５６７（配列番号３）；またはＤＯＭ１０−５３−５６８（配列番号４）である。
【００７０】
一つの態様では、本発明は、ＤＯＭ１０−５３−５４６（配列番号６）；ＤＯＭ１０−５３−５６７（配列番号７）；ＤＯＭ１０−５３−５６８（配列番号８）；またはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号９）のヌクレオチド配列によりコードされる抗インターロイキンー１３（ＩＬ−１３）免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。任意選択として、単一可変ドメインはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）からなるものではない。
【００７１】
一つの態様では、本発明は、特異的にヒトＩＬ−１３、および少なくとも一つの非ヒト霊長類ＩＬ−１３に結合する抗インターロイキンー１３（ＩＬ−１３）免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。例えば、その可変ドメインは、特異的にヒトＩＬ−１３、およびカニクイザル、および／またはアカゲザルＩＬ−１３、および／またはヒヒＩＬ−１３、例えば、ヒトおよびカニクイザルＩＬ−１３、または、ヒトおよびアカゲザルＩＬ−１３、または、ヒトおよびヒヒＩＬ−１３、または、ヒト、アカゲザルおよびカニクイザルＩＬ−１３に結合する。単一可変ドメインは、任意選択で先のいずれかの態様に準じることが可能である。また、任意選択により、単一可変ドメインはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）からなるものではない。一実施態様では、可変ドメインは、ヒトＩＬ−１３および前記のまたは各非ヒト霊長類 ＩＬ−１３と、約５ｎＭ以下の解離定数（Ｋｄ）で結合する。任意選択として、解離定数は、約４ｎＭ以下、約３ｎＭ以下、約２ｎＭ以下、または約１ｎＭ以下であってもよい。一実施態様では、可変ドメインは、
（ｉ）ヒトＩＬ−１３と解離定数（Ｋｄ）約１ｎＭ以下、以降任意選択で約５００ｐＭ以下、約２５０ｐＭ以下、約１５０ｐＭ以下、約１００ｐＭ以下、約１ｎＭ〜約１０ｐＭ、約１ｎＭ〜約５０ｐＭ、約１ｎＭ〜約７０ｐＭ、約５００ｐＭ〜約１０ｐＭ、約５００ｐＭ〜約５０ｐＭ、約５００ｐＭ〜約７０ｐＭ、２５０ｐＭ〜約１０ｐＭ、約２５０ｐＭ〜約５０ｐＭ、約２５０ｐＭ〜約７０ｐＭ、約１５０ｐＭ〜約１０ｐＭ、約１５０ｐＭ〜約５０ｐＭ、約１５０ｐＭ〜約７０ｐＭ、約１００ｐＭ〜約１０ｐＭ、約１００ｐＭ〜約５０ｐＭまたは約１００ｐＭ〜約７０ｐＭ；
（ｉｉ）非ヒト (例えば、カニクイザル, アカゲザルまたはヒヒ) ＩＬ−１３と解離定数（Ｋｄ）５ｎＭ以下、以降任意選択として、４、３、２または１ｎＭ以下、５〜約１ｎＭ、
で結合する。一実施形態では、追加として、あるいは代わりとして、単一可変ドメインはＫａｂａｔナンバリングによる位置２８にバリンを含む。一実施形態では、追加として、あるいは代わりとして、単一可変ドメインは、配列ＸＧＸ’Ｘ”を含み、ここで、ＧはＫａｂａｔナンバリングで位置５４にあり、
Ｘ＝ＨまたはＫであり；
Ｘ’＝ＧまたはＫであり；
Ｘ”＝ＫまたはＩである。
【００７２】
一実施形態では、追加として、あるいは代わりとして、可変ドメインは、
ａ）位置３０（Ｋａｂａｔナンバリングによる）にプロリン、および／または
ｂ）位置５３（Ｋａｂａｔナンバリングによる）にリシン、および／または
ｃ）位置５５（Ｋａｂａｔナンバリングによる）にグリシンまたはリシン、および／または
ｄ）位置５６（Ｋａｂａｔナンバリングによる）にイソロイシンまたはリシン、
を有する。
【００７３】
一実施形態では、追加として、あるいは代わりとして、可変ドメインが、位置５５にリシンを、位置５６（Ｋａｂａｔナンバリングによる）にイソロイシンを有する。
【００７４】
全ての態様において以下にあるような一つまたは複数の利点が認められるため、本発明の単一可変ドメインは、有益である：
（ｉ） ヒトＩＬ−１３に対し優れた効能（ＤＯＭ１０−５３−４７４より良い効能）；
（ｉｉ） カニクイザルＩＬ−１３に対して優れた効力（ＤＯＭ１０−５３−４７４より良い効力）；
（ｉｉｉ）アカゲザルＩＬ−１３に対して優れた効力（ＤＯＭ１０−５３−４７４より良い効力）；
（ｉｖ） ヒトおよび非ヒト霊長類 （例えば、カニクイザル、アカゲザルまたはヒヒ)ＩＬ−１３に対して優れた効力（ＤＯＭ１０−５３−４７４より良い効力）；
（ｖ） ヒト、カニクイザル、およびアカゲザルＩＬ−１３に対して優れた効力（ＤＯＭ１０−５３−４７４より良い効力）；
（ｖｉ） 原核細胞で優れた発現（任意選択としてＤＯＭ１０−５３−４７４より良好）；
（ｖｉｉ）ヒトＩＬ−１３に対する優れた中和性能（ＤＯＭ１０−５３−４７４より良好）；
（ｖｉｉｉ）カニクイザルＩＬ−１３に対する優れた中和性能（ＤＯＭ１０−５３−４７４より良好）；
（ｉｘ） アカゲザルＩＬ−１３に対する優れた中和性能（ＤＯＭ１０−５３−４７４より良好）；
（ｘ） ヒトおよび非ヒト霊長類 (例えば、カニクイザル、アカゲザルまたはヒヒ) ＩＬ−１３に対する優れた中和性能（ＤＯＭ１０−５３−４７４より良好）；
（ｘｉ） ヒト、カニクイザル およびアカゲザルＩＬ−１３に対する優れた中和性能（ＤＯＭ１０−５３−４７４より良好）；
（ｘｉｉ）二種以上の霊長類ＩＬ−１３の間の交差反応性（任意選択で、ヒトとカニクイザル、および／またはアカゲザルＩＬ−１３、例えば、ヒトとカニクイザルＩＬ−１３；またはヒトとアカゲザルＩＬ−１３；またはヒトとヒヒＩＬ−１３；ならびに
（ｘｉｉｉ）プロテアーゼの安定性（任意選択として、トリプシンの安定性）。
【００７５】
利点（ｉ）〜（ｖ）は、一実施形態で、表面プラズモン共鳴法、例えば、ＢｉａｃｏｒｅＴＭ により測定できる。ある実施形態では、より優れた効力は解離定数（Ｋｄ）で判断できる。
【００７６】
利点（ｖｉ）は、一実施形態で、大腸菌における発現によって測定可能である。ある実施形態で、本発明の単一可変ドメインが良好に発現する（大腸菌中で、少なくとも３ ｍｇ／Ｌ、例えば少なくとも５、１０、１５、２０ ｍｇ／Ｌ）。
ある実施形態では、本発明の単一可変ドメインがピキア・パストリスまたは酵母類中で良好に発現する。
【００７７】
利点（ｖｉｉ）〜（ｘｉ）は、一実施形態において、ＥＬＩＳＡまたは標準的ＨＥＫ ＳＴＡＴアッセイにより測定した中和能力により決定できる。ある実施形態では、中和能力はＥＣ５０により表される。
【００７８】
利点（ｘｉｉ）は、一実施形態では、ＥＬＩＳＡ、ＢｉａｃｏｒｅＴＭ または標準的ＨＥＫ ＳＴＡＴアッセイにより測定できる。ある実施形態では、交差反応性は解離定数（Ｋｄ）で示される。
【００７９】
利点（ｘｉｉｉ）は、一実施形態では、以下のように測定可能である：
０．３ ｍｇ／ｍｌの単一可変ドメインをトリプシン（例えば、トリプシン活性 ＞５０００ｕｎｉｔ／ｍｇ）と２５：１のｄＡｂ：トリプシンの比率にして、ＰＢＳバッファー中で混合する。３０℃で２４時間インキュベーション後、インキュベーション後に残っている活性ｄＡｂが測定できる。
【００８０】
一実施形態では、活性ｄＡｂの存在は残っているｄＡｂ活性率として求められ、これは表面プラズモン共鳴（例えば、ＢｉａｃｏｒｅＴＭ）により測定される。少なくとも２０％（例えば、少なくとも３０％、４０％、または５０％）の活性率は、プロテーゼ安定性を示すものである。別の実施形態では、プロテーゼ安定性ｄＡｂはＥＬＩＳＡを使って求められ、この場合プロテーゼ安定性の可変ドメインはインキュベーション後のＥＬＩＳＡのＯＤ４５の読み値で少なくとも０．４０４を有する。別の実施形態では、活性ｄＡｂは、インキュベーション後に、ｄＡｂが特異的にＡタンパク質またはＬタンパク質に結合しているかどうかで決定される。別の実施形態では、活性ｄＡｂは、ゲル電気泳動により求められ、プロテーゼ安定性の可変ドメインはインキュベーション後のゲル電気泳動で実質的に単一のバンドとして現れる。
【００８１】
一実施形態では、本発明の単一可変ドメインは利点（ｉｖ）と（ｘ）を有する。別の実施形態では、本発明の単一可変ドメインは利点（ｖ）と（ｘｉ）を有する。任意選択として、単一可変ドメインはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）からなるものではない。
【００８２】
一実施形態では、本発明は、本明細書に開示されたあらゆる疾病や疾患を対象としたあらゆる用途、利点、治療および／または予防を目的とした本発明に係る単一可変ドメインを提供する。一実施形態では、本発明は、本明細書に開示されたあらゆる疾病や疾患を対象としたあらゆる用途、便宜、治療および／または予防のためのＩＬ−１３ アンタゴニストの製造における本発明に係る単一可変ドメインの使用を提供する。これらの記載は、本明細書の請求項への移入に際して明瞭な基礎となるものである。
【００８３】
本発明の単一可変ドメイン（ＤＯＭ１０−５３−５４６、ＤＯＭ１０−５３−５６７、ＤＯＭ１０−５３−５６８およびＤＯＭ１０−５３−６１６）は、表面プラズモン共鳴（例えば、ＢｉａｃｏｒｅＴＭ）により測定されたＩＬ−１３結合の解離定数（Ｋｄ）が示すように、ヒトおよびカニクイザル（ｃｙｎｏ）ＩＬ−１３の両方に対して優れた効能を示す。本発明の単一可変ドメインはＤＯＭ１０−５３−４７４よりずっと良い効力がある。ＤＯＭ１０−５３−５６７およびＤＯＭ１０−５３−５６８は、ヒトおよびカニクイザルＩＬ−１３の両方に対し最良の効力を示す。
【００８４】
本発明の単一可変ドメイン（ＤＯＭ１０−５３−５４６、ＤＯＭ１０−５３−５６７、ＤＯＭ１０−５３−５６８およびＤＯＭ１０−５３−６１６）は、一つまたは複数の霊長類ＩＬ−１３の間で交差反応性を示す。一つの態様では、本発明は、二種以上の霊長類ＩＬ−１３種間で交差反応する単一可変ドメインを提供するために単一可変ドメインを提供し、この組合せには、任意選択で、ヒトと非ヒト霊長類ＩＬ−１３間、さらに任意選択で（ｉ）ヒトとカニクイザルＩＬ−１３種、（ｉｉ）ヒトとアカゲザル ＩＬ−１３種、（ｉｉｉ）ヒト、カニクイザルと アカゲザルＩＬ−１３種、または（ｉｖ）ヒトとヒヒＩＬ−１３種、間がある。一つの態様では、本発明は、二種以上の霊長類ＩＬ−１３種間で交差反応を起こすＩＬ−１３ アンタゴニストの製造における本発明の単一可変ドメインの使用を提供し、この組合せには、任意選択で、ヒトと非ヒト霊長類ＩＬ−１３間、さらに任意選択で（ｉ）ヒトとカニクイザルＩＬ−１３種、（ｉｉ）ヒトとアカゲザル ＩＬ−１３種、（ｉｉｉ）ヒト、カニクイザルと アカゲザルＩＬ−１３種、または（ｉｖ）ヒトとヒヒＩＬ−１３種、間がある。可変ドメインは特異的にヒトおよび非ヒト霊長類 ＩＬ−１３（例えば、ヒト、カニクイザルと アカゲザルＩＬ−１３種が可変ドメインにより結合される）と結合する。薬剤開発では、通常、その薬剤をヒトで試験する前にカニクイザルやアカゲザル等の非ヒト霊長類系を使って主要候補薬剤の試験が必要なため、このことは特に有用である。ヒトや他の霊長類ＩＬ−１３種に結合する薬剤の提供によって、このシステムでの結果を試験することが出来、同じ薬剤を使ったデータの対照比較が可能となっている。これにより、非ヒトＩＬ−１３に支障となる薬剤、およびヒトＩＬ−１３に支障となる別の薬剤を見つけ出すことが必要という面倒を避けられ、また、非等価薬剤使ったヒトと非ヒト霊長類の結果の比較を回避出来る。
【００８５】
任意選択で、少なくとも一つの非ヒト霊長類（例えば、カニクイザルおよび／またはアカゲザルおよび／またはヒヒ）ＩＬ−１３に対する免疫グロブリン単一可変ドメインの結合アフィニティとヒトＩＬ−１３に対する免疫グロブリン単一可変ドメインの結合アフィニティは、１０、５０、１００、５００、または１０００の倍数以下で異なる。一つの態様では、本発明は、少なくとも一つの非ヒト霊長類（例えば、カニクイザルおよび／またはアカゲザルおよび／またはヒヒ）ＩＬ−１３に対する免疫グロブリン単一可変ドメインのアフィニティとヒトＩＬ−１３に対するアフィニティが１０、５０、１００、５００、または１０００の倍数以下で異なるという条件で、本発明に係る単一可変ドメインを提供する。一つの態様では、本発明はＩＬ−１３ アンタゴニストの製造にための本発明に係る単一可変ドメインの使用を提供し、この場合、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザルおよび／またはアカゲザルおよび／またはヒヒ）ＩＬ−１３に対する免疫グロブリン単一可変ドメインのアフィニティとヒトＩＬ−１３に対するアフィニティが１０、５０、１００、５００、または１０００の倍数以下で異なる。
【００８６】
本発明の単一可変ドメイン（ＤＯＭ１０−５３−５４６、ＤＯＭ１０−５３−５６７、ＤＯＭ１０−５３−５６８およびＤＯＭ１０−５３−６１６）は、二種以上の霊長類ＩＬ−１３を中和することが出来る。一つの態様では、本発明は、二種以上の霊長類ＩＬ−１３の中和のために本発明に係る単一可変ドメインを提供し、中和のための組合せの任意選択肢としては、（ｉ）ヒトとカニクイザルＩＬ−１３種、（ｉｉ）ヒトおよびアカゲザルＩＬ−１３種、（ｉｉｉ）ヒト、カニクイザルおよびアカゲザルＩＬ−１３種、または（ｉｖ）ヒトおよびヒヒＩＬ−１３種、がある。一つの態様では、本発明は、ＩＬ−１３ アンタゴニストの製造のため、また二種以上の霊長類種ＩＬ−１３の中和のため、任意選択で（ｉ）ヒトとカニクイザルＩＬ−１３種、（ｉｉ）ヒトとアカゲザルＩＬ−１３種、（ｉｉｉ）ヒト、カニクイザルおよびアカゲザルＩＬ−１３種、または（ｉｖ）ヒトおよびヒヒＩＬ−１３種の中和のための、本発明に係る単一可変ドメインの使用を提供する。後の実施例で示されるように、ＤＯＭ１０−５３−５４６、ＤＯＭ１０−５３−５６７、ＤＯＭ１０−５３−５６８およびＤＯＭ１０−５３−６１６は、ＥＬＩＳＡまたはＨＥＫ ＳＴＡＴアッセイで、試験した全ての形態のＩＬ−１３（ヒト、カニクイザルおよびアカゲザルＩＬ−１３）に対し中和作用を示した。ＤＯＭ１０−５３−５４６、ＤＯＭ１０−５３−５６７、およびＤＯＭ１０−５３−５６８は、ヒト、カニクイザルおよびアカゲザルＩＬ−１３に対しさらに良好な中和能を示した。ＤＯＭ１０−５３−６１６は、カニクイザルおよびアカゲザルＩＬ−１３に対しＤＯＭ１０−５３−４７４より優れた中和剤であり、ヒトＩＬ−１３に対しては概して同程度の効果であった。
【００８７】
単一可変ドメイン（ＤＯＭ１０−５３−５６７とＤＯＭ１０−５３−５６８）は、特にプロテアーゼに安定である。一つの態様では、本発明は、プロテアーゼに安定な単一可変ドメイン、またはＩＬ−１３ アンタゴニストを提供するための本発明の単一可変ドメインを提供する。一つの態様では、本発明は、プロテアーゼに安定なＩＬ−１３アンタゴニストを提供するためのＩＬ−１３ アンタゴニストの製造における本発明の単一可変ドメインの使用を提供する。プロテアーゼの安定性は次のようにして求められる：
０．３ ｍｇ／ｍｌの単一可変ドメインをトリプシン（例えば、トリプシン活性 ＞５０００ｕｎｉｔ／ｍｇ）と２５：１のｄＡｂ：トリプシンの比率にして、ＰＢＳバッファー中で混合する。３０℃で２４時間インキュベーション後、インキュベーション後残っている活性ｄＡｂ％が求まる（例えば、ＢｉａｃｏｒｅＴＭ を使って）。２４時間後の少なくとも２０％の活性率（例えば、少なくとも、３０％、４０％または５０％）は、ｄＡｂのプロテアーゼ安定性を示すものである。
【００８８】
ここでWO2008149143を参照する。参照によりこの出願の全体を本明細書に組み込み、本明細書で、プロテアーゼ耐性のポリペプチドおよびｄＡｂ；これらの選択方法（使用可能な別のプロテアーゼおよび選択条件の開示を含む）；これらの使用；組成物、リガンドおよびこれらを含む産物；当該ポリペプチドおよびｄＡｂの利点、に関するさらなる開示を行う。これらの開示は、本開示に明確に含まれ、本発明に使われる本開示の一部を形成する。
【００８９】
ポリペプチドおよびペプチドは、医療、治療、および診断用薬剤としての産業上の応用と利用を含む種々の応用に対して、ますます重要な薬剤になってきている。しかし、炎症状態（例えばＣＯＰＤ）、および癌、等の特定の生理学的状態では、組織、器官、または動物中（肺の中、腫瘍の中、または、腫瘍に近接した）に存在するプロテアーゼの量が増加する可能性がある。このプロテアーゼの増加により、内因性タンパク質や治療用ペプチド、ポリペプチド、および疾患治療に投与されたタンパク質の急速分解・失活が起こる。従って、体内での使用（例えば、ヒト等の哺乳動物の疾患の治療、診断または予防での使用）で効力のある一部の薬剤がプロテアーゼによって急速に分解・失活するという理由で、限られた効果しか持たないことになる。
【００９０】
プロテアーゼ耐性のポリペプチドはいくつかの利点がある。例えば、プロテアーゼ耐性ポリペプチドは、プロテアーゼ感受性の薬剤より体内で長い時間活性を維持し、従って、生化学的効果を生み出すのに充分な期間にわたって機能を維持出来る。プロテアーゼ分解に耐性を示し、また所望の生物学的活性を有するポリペプチドを選択する改良法を求める要望がある。肺を含む系統である消化管（ＧＩ ｔｒａｃｔ）および／または肺系統中の体液や組織中に分布するプロテアーゼへの耐性を有するペプチドやポリペプチドを提供することは特に有用であろう。消化管と肺系統は両方ともヒト等の哺乳動物の疾患や悪性状態に関係する部位であり、この意味でもプロテアーゼ耐性ペプチドとポリペプチド薬剤は有用であろう。
【００９１】
本発明の単一可変ドメイン（ＤＯＭ１０−５３−５４６およびＤＯＭ１０−５３−６１６）は原核細胞においてＤＯＭ１０−５３−４７４より遙かに良好な発現レベルを示した。一つの態様では、本発明は、原核細胞中でＤＯＭ１０−５３−４７４の発現より優れた発現を行う単一可変ドメインを提供するために本発明の単一可変ドメイン（例えば、ＤＯＭ１０−５３−５４６およびＤＯＭ１０−５３−６１６）を提供する。一つの態様では、ＩＬ−１３ アンタゴニストの製造における本発明の単一可変ドメイン（例えば、ＤＯＭ１０−５３−５４６およびＤＯＭ１０−５３−６１６）の使用を提供する。この場合、単一可変ドメインは、原核細胞中でＤＯＭ１０−５３−４７４の発現より優れた発現を行う。
【００９２】
先に述べた本発明のいずれの態様の実施形態でも、単一可変ドメインはヒト、カニクイザルおよびアカゲザルＩＬ−１３と特異的に結合する。特異的結合は、１０マイクロモル以下の解離定数 Ｋｄで表され、１マイクロモル以下のＫｄも任意に選択可能である。抗原結合タンパク質の抗原またはエピトープに対する特異的結合は、例えば、スキャッチャード解析、および／または競合的結合アッセイ、例えば放射性免疫検定法（ＲＩＡ）等、ＥＬＩＳＡおよびおよびサンドイッチ競合的アッセイ等の酵素免疫測定法、、ならびにこれらの様々な変種、を含む適切なアッセイによって測定可能である。
【００９３】
結合アフィニティは、任意選択肢として、Ｂｉａｃｏｒｅシステム（Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使って表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）やＢｉａｃｏｒｅ（Karlsson et al., 1991）により測定してもよい。Ｂｉａｃｏｒｅシステムは、表面プラズモン共鳴（SPR, Welford K. 1991, Opt. Quant. Elect. 23:1; Morton and Myszka, 1998, Methods in Enzymology 295: 268）を使いリアルタイムに生体分子間相互作用をモニターし、３００ｎｍの深さまでの屈折率の変化の結果としてガラス支持上の金薄膜表面の光の共鳴角度変化を検出することが可能な表面プラズモン共鳴を使う。Ｂｉａｃｏｒｅ解析は、好都合にも、会合速度定数、解離速度定数、平衡解離定数、および親和性定数を生成する。結合アフィニティは、Ｂｉａｃｏｒｅプラズモン共鳴システム（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｉｎｃ．社）を使って、会合と解離速度定数を評価することにより得られる。製造メーカー（Ｂｉａｃｏｒｅ）の説明書によれば、のバイオセンサーチップが標的の共有結合のために活性化される。次いで標的は希釈され、チップ越しに注入されて固定化物質の反応単位の信号を得る。共鳴単位（ＲＵ）で表示の信号は固定化物質の質量に比例するので、これは、マトリックス上の一連の固定化標的密度を表す。解離データは、１部位モデル（ｏｎｅ−ｓｉｔｅ ｍｏｄｅｌ）へのフィッティングでｋｏｆｆ＋／−ｓ．ｄ．（測定値の標準偏差）を得る。疑似一次反応速度定数（Ｋｄ）が、各解離曲線に対し計算され、タンパク質濃度の関数としてプロットしてｋｏｎ＋／−ｓ．ｅ．（フィットの標準誤差）を得る。結合の平衡解離定数Ｋｄは、ＳＰＲ測定からｋｏｆｆ／ｋｏｎとして計算される。
【００９４】
先に述べた本発明のいずれの態様の実施形態でも、可変ドメインは、標準的ＨＥＫ ＳＴＡＴアッセイのＥＣ５０値の約０．１〜０．２ ｎＭでヒトＩＬ−１３を中和する。ここで、ＥＣ５０値は、任意選択肢として、約０．２〜約２．０ ｎＭ、約０．３〜約１．５ ｎＭ、約０．２〜約１．０ ｎＭ、または約０．３〜約１．０ ｎＭであってもよい。一つの態様では、本発明は、標準的ＨＥＫ ＳＴＡＴアッセイのＥＣ５０値の約０．１〜０．２ ｎＭで、また、任意選択肢として、約０．２〜約２．０ ｎＭ、約０．３〜約１．５ ｎＭ、約０．２〜約１．０ ｎＭ、または約０．３〜約１．０ ｎＭで、ヒトＩＬ−１３を中和するために本発明の単一可変ドメインを提供する。一つの態様では、本発明は、標準的ＨＥＫ ＳＴＡＴアッセイのＥＣ５０値の約０．１〜０．２ ｎＭで、また、任意選択肢として、約０．２〜約２．０ ｎＭ、約０．３〜約１．５ ｎＭ、約０．２〜約１．０ ｎＭ、または約０．３〜約１．０ ｎＭで、可変ドメインまたはアンタゴニストがヒトＩＬ−１３を中和する場合の、ＩＬ−１３ アンタゴニストの製造における本発明の単一可変ドメインの使用を提供する。
【００９５】
先に述べた本発明のいずれの態様の実施形態でも、可変ドメインは、標準的ＨＥＫ ＳＴＡＴアッセイのＥＣ５０値の約１〜２０ ｎＭで、また、任意選択肢として、約１〜約１５ ｎＭ、約２〜約１５ ｎＭ、または約２〜約１１．５ ｎＭで、アカゲザルＩＬ−１３を中和する。一つの態様では、本発明は、標準的ＨＥＫ ＳＴＡＴアッセイのＥＣ５０値の約１〜２０ ｎＭで、また、任意選択肢として、約１〜約１５ ｎＭ、約２〜約１５ ｎＭ、または約２〜約１１．５ ｎＭで、アカゲザルＩＬ−１３を中和するための本発明の単一可変ドメインを提供する。一つの態様では、本発明は、標準的ＨＥＫ ＳＴＡＴアッセイのＥＣ５０値の約１〜２０ ｎＭで、また、任意選択肢として、約１〜約１５ ｎＭ、約２〜約１５ ｎＭ、または約２〜約１１．５ ｎＭで、可変ドメインまたはアンタゴニストがアカゲザル ＩＬ−１３を中和する場合の、ＩＬ−１３ アンタゴニストの製造における本発明の単一可変ドメインの使用を提供する。
【００９６】
先に述べた本発明のいずれの態様の実施形態でも、可変ドメインは、標準的ＨＥＫ ＳＴＡＴアッセイのＥＣ５０値の約１〜２０ ｎＭで、また、任意選択肢として、約５〜約１５ ｎＭ、または約５〜約１０ ｎＭで、カニクイザルＩＬ−１３を中和する。一つの態様では、本発明は、標準的ＨＥＫ ＳＴＡＴアッセイのＥＣ５０値の約１〜２０ ｎＭで、また、任意選択肢として、約５〜約１５ ｎＭ、または約５〜約１０ ｎＭで、カニクイザルＩＬ−１３を中和するための本発明の単一可変ドメインを提供する。一つの態様では、本発明は、標準的ＨＥＫ ＳＴＡＴアッセイのＥＣ５０値の約１〜２０ ｎＭで、また、任意選択肢として、約５〜約１５ ｎＭ、または約５〜約１０ ｎＭで、可変ドメインまたはアンタゴニストがカニクイザルＩＬ−１３を中和する場合の、ＩＬ−１３ アンタゴニストの製造における本発明の単一可変ドメインの使用を提供する。
【００９７】
標準的ＨＥＫ ＳＴＡＴアッセイの実施例を以下に示す：
（ｉ） 抗ＩＬ−１３ｄＡｂ（または、抗ＩＬ−１３ｄＡｂを含むアンタゴニスト）を６ ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１３と共に３７℃、５％ＣＯ２の条件下、１時間インキュベートする；
（ｉｉ） インキュベーション混合物を、ウエル当たり５ｘ１０４のＨＥＫＢｌｕｅＴＭ−ＳＴＡＴ６細胞（ＳＴＡＴ６遺伝子と分泌胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポーター遺伝子を形質移入されたＨＥＫ２９３細胞）を入れたマイクロタイタープレートのＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地）に添加する；
（ｉｉｉ）プレートを３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間インキュベートする；
（ｉｖ） レポーター遺伝子産物を検出し定量する。
【００９８】
ステップ （ｉ）で、任意選択肢として、等容積のｄＡｂと組換え型ＩＬ−１３を使って予備インキュベーションを行ってもよい。また、任意選択肢として、最高濃度の４００ ｎｍ（アッセイ中の最終濃度の２Ｘ）から１／２ログ希釈を使ってｄＡｂを滴定して８点用量反応曲線を作成し、次いでこれをＩＬ−１３とインキュベートしてもよい。ステップ（ｉｖ）で、任意選択肢として、培養上澄みをＱｕａｎｔｉＢｌｕｅ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社 ）と混ぜ、６４０ ｎｍで吸光度を読みとってもよい。
【００９９】
抗ＩＬ−１３ｄＡｂ活性は、ＩＬ−１３の刺激に比べＳＴＡＴ６活性化と対応するＡ６４０の減少をもたらす。ＥＣ５０値は当業者には既知の方法により計算できる。
【０１００】
「ＨＥＫ２９３細胞」とは、２９３と命名されたヒト胚腎細胞株（ＡＴＣＣ Ｎｕｍｂｅｒ ＣＲＬ−１５７３）またはその派生体を指す。例えば、２９３／ＳＦ細胞は（ＡＴＣＣ Ｎｕｍｂｅｒ ＣＲＬ−１５７３．１）は、ＨＥＫ２９３であり、無血清培地中で増殖するように適合されている。また、本発明で意図されているように、ＨＥＫ２９３細胞は、他の培養条件下でも、またはどのようなＨＥＫ２９３細胞種または派生体であっても増殖するように適合されている。ＨＥＫＢｌｕｅＴＭ−ＳＴＡＴ６細胞は、４つのＳＴＡＴ６結合部位に融合したＩＦＮβ最小プロモーターの制御下で、レポーター遺伝子分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）を安定的に発現する。ＨＥＫ２９３細胞操作およびＳＴＡＴ６遺伝子と分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポーター遺伝子を形質移入したＨＥＫ２９３細胞の操作に適用される適切な構築物の詳細については、Loignon et al, “Stable high volumetric production of glycosylated human recombinant IFNalpha2b in HEK293 cells”, BMC Biotechnology 2008, 8:65を参照のこと。
【０１０１】
ある態様では、本発明は、本発明に係る抗ＩＬ−１３免疫グロブリン単一可変ドメインを含むインターロイキンー１３（ＩＬ−１３）アンタゴニストを提供する。任意選択肢として、前記アンタゴニストはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）からなるものではない。任意選択肢として、前記アンタゴニストはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）を含むものではない。任意選択肢として、前記アンタゴニストは、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）に結合したＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）を含むものではなく、さらに任意選択しとして、ここでｍＡｂが抗ＩＬ−４ ｍＡｂまたは抗ＩＬ−５ ｍＡｂであってもよい。
【０１０２】
一実施形態では、アンタゴニストは、ＩＬ−１３との結合について、ＤＯＭ１０−５３−５４６（配列番号２）；ＤＯＭ１０−５３−５６７（配列番号３）；ＤＯＭ１０−５３−５６８（配列番号４）；またはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）と競合する。任意選択肢として、前記アンタゴニストは、ＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）からなるものではない。任意選択肢として、前記アンタゴニストは、ＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）を含むものではない。任意選択肢として、前記アンタゴニストは、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）に結合したＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）を含むものではなく、さらに任意選択肢として、ここでｍＡｂが抗ＩＬ−４ ｍＡｂまたは抗ＩＬ−５ ｍＡｂであってもよい。一実施形態では、ＩＬ−１３はヒトＩＬ−１３である。別の実施形態では、ＩＬ−１３はカニクイザルＩＬ−１３である。別の実施形態では、ＩＬ−１３はアカゲザルＩＬ−１３である。一実施形態では、アンタゴニストは、ヒトＩＬ−１３およびカニクイザルＩＬ−１３との結合について、ＤＯＭ１０−５３−５４６（配列番号２）；ＤＯＭ１０−５３−５６７（配列番号３）；ＤＯＭ１０−５３−５６８（配列番号４）；またはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）と競合する。
【０１０３】
別の実施形態では、アンタゴニストは、ヒトＩＬ−１３、カニクイザルＩＬ−１３およびアカゲザルＩＬ−１３との結合について、ＤＯＭ１０−５３−５４６（配列番号２）；ＤＯＭ１０−５３−５６７（配列番号３）；ＤＯＭ１０−５３−５６８（配列番号４）；またはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）と競合する。任意選択肢として、前記アンタゴニストは、ＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）からなるものではない。任意選択肢として、前記アンタゴニストは、ＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）を含むものではない。任意選択肢として、前記アンタゴニストは、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）に結合したＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）を含むものではなく、さらに任意選択肢として、ここでｍＡｂが抗ＩＬ−４ ｍＡｂまたは抗ＩＬ−５ ｍＡｂであってもよい。
【０１０４】
一つの態様では、本発明は、肺送達のための、本発明に係るあらゆる抗ＩＬ−１３単一可変ドメイン（例えば、ＤＯＭ１０−５３−６１６）もしくはアンタゴニスト、組成物、または融合タンパク質を提供する。一つの態様では、本発明は、患者の肺への送達のための抗ＩＬ−１３単一可変ドメインまたはアンタゴニストまたは融合タンパク質を提供する。一つの態様では、本発明は、肺送達のための医薬品の製造における、本発明に係るあらゆる抗ＩＬ−１３単一可変ドメイン（例えば、ＤＯＭ１０−５３−６１６）もしくはアンタゴニスト、組成物、または融合タンパク質の使用を提供する。一つの態様では、本発明は、患者の肺への送達のための医薬品の製造における、本発明に係るあらゆる抗ＩＬ−１３単一可変ドメイン（例えば、ＤＯＭ１０−５３−６１６）もしくはアンタゴニスト、組成物、または融合タンパク質の使用を提供する。一実施形態では、可変ドメインそれ自体で、またはアンタゴニストや融合タンパク質の一部として、ロイコザイム、および／またはトリプシンに耐性を示す。
【０１０５】
本発明は、他の肺疾患、例えば慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）または肺炎を治療、抑制または予防するための方法を提供する。本発明に従って治療、抑制または予防が可能な他の肺疾患には、例えば、嚢胞性繊維症および喘息（例えば、ステロイド耐性喘息）が含まれる。このように、別の態様では、本発明は肺疾患（例えば、嚢胞性繊維症、喘息）を治療、抑制または予防する方法であり、それを必要とする哺乳動物に、治療上有用な用量または用量の、本発明に係るポリペプチド、融合タンパク質、単一可変ドメイン (例えば、ＤＯＭ１０−５３−６１６）、アンタゴニスト、または組成物を投与することを含む。
【０１０６】
特定の実施形態では、本発明に係るポリペプチド、融合タンパク質、単一可変ドメイン （例えば、ＤＯＭ１０−５３−６１６）、アンタゴニスト、または組成物は、吸入（例えば、気管支内、鼻孔内投与、経口吸入、鼻腔内ドロップ）または全身送達（例えば、非経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下）等の肺送達経由で投与される。
【０１０７】
本発明のさらなる態様では、本発明に係るあらゆるポリペプチド、単一可変ドメイン（例えば、ＤＯＭ１０−５３−６１６）、組成物、またはアンタゴニストと、薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤とを含む組成物が提供される。
【０１０８】
さらに、本発明は、本発明に係るあらゆるポリペプチド、単一可変ドメイン（例えば、ＤＯＭ１０−５３−６１６）、組成物、またはアンタゴニストを用いた疾患の治療方法を提供する。ある実施形態では、疾患は、癌または炎症性疾患、例えば関節リウマチ、喘息、またはクローン病である。
【０１０９】
本発明のある態様では、本発明に係るあらゆるポリペプチド、単一可変ドメイン（例えば、ＤＯＭ１０−５３−６１６）、組成物、またはアンタゴニストが、ヒトのＩＬ−１３媒介疾患の治療および／または予防のために提供される。別の態様では、ヒトのＩＬ−１３媒介疾患の治療または予防のための医薬品の製造におけるポリペプチド、単一可変ドメイン、組成物、またはアンタゴニストの使用が提供される。別の態様では、ヒト患者のＩＬ−１３媒介疾患の治療および／または予防方法を提供し、この方法は、本発明に係るあらゆるポリペプチド、単一可変ドメイン（例えば、ＤＯＭ１０−５３−６１６）、組成物、またはアンタゴニストの患者への投与を含む。一実施態様では、ＩＬ−１３媒介疾患は呼吸症状である。一実施態様では、ＩＬ−１３媒介疾患は、以下から選択される：
肺炎症、慢性閉塞性肺疾患、喘息、肺炎、過敏性肺炎、好酸球増加を伴う肺湿潤物、環境性肺疾患、肺炎、気管支拡張症、嚢胞性線維症、間質性肺疾患、原発性肺高血圧症、肺血栓塞栓症、胸膜障害、縦隔障害、隔膜障害、換気低下、過呼吸、睡眠時無呼吸、急性呼吸促迫症候群、中皮腫、肉腫、移植片拒絶、移植片対宿主病、肺癌、アレルギー性鼻炎、アレルギー、石綿症、アスペルギルス腫、アスペルギルス症、気管支拡張症、慢性気管支炎、肺気腫、好球性肺炎、特発性肺線維症、侵襲性肺炎球菌疾患、インフルエンザ、非結核性抗酸菌、胸水、塵肺症、ニューモシスチス症、肺炎、肺放線菌症、肺胞タンパク症、肺炭疽、肺水腫、肺塞栓症、肺炎症、肺ヒスチオサイトーシスX、肺高血圧、肺ノカルジア症、肺結核症、肺静脈閉塞性疾患、リウマチ性肺疾患、サルコイドーシス、およびウェゲナー肉芽腫症。
【０１１０】
本発明のある態様では、本発明に係るポリペプチド、単一可変ドメイン（例えば、ＤＯＭ１０−５３−６１６）、組成物、またはアンタゴニストを含む肺送達デバイスを提供する。このデバイスは、吸入器、または鼻腔内投与デバイスであってもよい。
【０１１１】
本発明のリガンド（ポリペプチド、単一可変ドメイン、組成物、またはアンタゴニスト）は、ＩＬ−１３のＩＬ−１３Ｒα１および／またはＩＬ−１３Ｒα２への結合を阻害し、ＩＬ−１３の活性を抑制し、ならびに／あるいはＩＬ−１３のＩＬ−１３Ｒα１および／またはＩＬ−１３Ｒα２への結合を実質的に阻害することなくＩＬ−１３の活性を抑制する。一つの態様では、本発明は、ＩＬ−１３のＩＬ−１３Ｒα１および／またはＩＬ−１３Ｒα２への結合を阻害する、ＩＬ−１３の活性を抑制する、ならびに／あるいはＩＬ−１３のＩＬ−１３Ｒα１および／またはＩＬ−１３Ｒα２への結合を実質的に阻害することなくＩＬ−１３の活性を抑制するための本発明に係る単一可変ドメイン（例えば、ＤＯＭ１０−５３−６１６）を提供する。一つの態様では、本発明は、ＩＬ−１３のＩＬ−１３Ｒα１および／またはＩＬ−１３Ｒα２への結合を阻害する、ＩＬ−１３の活性を抑制する、ならびに／あるいはＩＬ−１３のＩＬ−１３Ｒα１および／またはＩＬ−１３Ｒα２への結合を実質的に阻害することなくＩＬ−１３の活性を抑制するためのＩＬ−１３アンタゴニストの製造における本発明に係る単一可変ドメイン（例えば、ＤＯＭ１０−５３−６１６）の使用を提供する。
【０１１２】
一実施形態では、ＩＬ−１３に結合するリガンド（例えば、免疫グロブリン単一可変ドメイン）は、ＩＬ−１３のＩＬ−１３受容体（例えば、ＩＬ−１３Ｒα１、ＩＬ−１３Ｒα２）との結合を、抑制濃度５０（ＩＣ５０）の値が、＜約１０μＭ、＜約１μＭ、＜約１００ｎＭ、＜約１０ｎＭ、＜約１ｎＭ、＜約５００ｐＭ、＜約３００ｐＭ、＜約１００ｐＭ、＜約１０ｐＭで阻害する。任意選択肢として、ＩＣ５をインビトロで本明細書に記載されているような受容体結合アッセイを使って測定してもよい。
【０１１３】
リガンド（例えば、免疫グロブリン単一可変ドメイン）は、適切なインビトロアッセイにおいて中和用量５０（ＮＤ５０）の値が、＜約１０μＭ、＜約１μＭ、＜約１００ｎＭ、＜約１０ｎＭ、＜約１ｎＭ、＜約５００ｐＭ、＜約３００ｐＭ、＜約１００ｐＭ、＜約１０ｐＭ、＜約１ｐＭ、＜約５００ｆＭ、＜約３００ｆＭ、＜約１００ｆＭ、＜約１０ｆＭ、でＩＬ−１３誘導機能を阻害することが任意に選択できることもまた意図されている。例えば、リガンドは、ＴＦ−１細胞を５ ｎｇ／ｍｌの最終濃度のＩＬ−１３と混合する本明細書記載のアッセイのようなインビトロアッセイでＩＬ−１３誘導ＴＦ−１細胞増殖（ＡＴＣＣ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＣＲＬ−２００３）を阻害できる。
【０１１４】
リガンドは、任意選択として、１ｘ１０５Ｂ細胞を１０または１００ ｎＭの抗ＩＬ−１３ｄＡｂでインキュベートした本明細書に記載のアッセイのようなインビトロアッセイでＩＬ−１３誘導Ｂ細胞増殖の、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％を阻害することが可能であることも意図されている。
【０１１５】
本発明のある態様では、本発明に係る単一可変ドメインを含む二重特異性リガンドが提供される。より具体的な実施形態では、リガンドは、ＩＬ−４およびＩＬ−１３に対する結合特異性をを有し、ＩＬ−４に対する結合について抗ＩＬ−４ドメイン抗体（ｄＡｂ）と競合するＩＬ−４に対する結合特異性を持つ免疫グロブリン単一可変ドメインを含む。このｄＡｂはWO2007085815に開示された抗ＩＬ−４ｄＡｂ群から選択されるが、ここに記載のｄＡｂの配列は全体が本明細書に組み込まれ本発明に係る二重特異性リガンドに適用される。任意選択で、前記リガンドはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）からなるものではない。任意選択で、前記リガンドはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）を含むものではない。前記リガンドは、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）として抗ＩＬ−４ ｍＡｂまたは抗ＩＬ−５ ｍＡｂから任意に選択されたｍＡｂに結合しているＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）を含むものではない。
【０１１６】
本発明の全態様において、特定の、またはそれぞれの免疫グロブリン単一可変ドメインは、抗体重鎖と軽鎖の単一可変ドメイン、例えばＶＨ、ＶＬ、ＶＨＨ、から独立に選択される。
【０１１７】
一部の実施形態では、二重特異性リガンドは、ＩＬ−１３に対する結合特異性を有する２つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（例えば、２つの互いに等価なドメイン）、および別の標的（例えばＩＬ−４）に対する結合特異性を有する２つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むＩｇＧ様フォーマットであってもよい。任意選択で、前記リガンドはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）からなるものではない。任意選択で、前記リガンドはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）を含むものではない。前記リガンドは、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）として抗ＩＬ−４ ｍＡｂまたは抗ＩＬ−５ ｍＡｂから任意に選択されたｍＡｂに結合しているＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）を含むものではない。
【０１１８】
一部の実施形態では、二重特異性リガンドは抗体ＦＣドメインを含んでもよい。任意選択で、前記リガンドはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）からなるものではない。任意選択で、前記リガンドはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）を含むものではない。前記リガンドは、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）として抗ＩＬ−４ ｍＡｂまたは抗ＩＬ−５ ｍＡｂから任意に選択されたｍＡｂに結合しているＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）を含むものではない。
【０１１９】
一部の実施形態では、二重特異性リガンドはＩｇＧ定常ドメインを含んでもよい。任意選択で、前記リガンドはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）からなるものではない。任意選択で、前記リガンドはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）を含むものではない。前記リガンドは、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）として抗ＩＬ−４ ｍＡｂまたは抗ＩＬ−５ ｍＡｂから任意に選択されたｍＡｂに結合しているＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）を含むものではない。
【０１２０】
他の実施形態では、本明細書に記述されたいずれのリガンドも（例えば、アンタゴニスト、または単一可変ドメイン）、半減期延長部分、例えばポリアルキレングリコール部分、血清アルブミンもしくはこれらの断片、トランスフェリン受容体もしくはそのトランスフェリン結合部分、または体内で半減期を延長するポリペプチドのための結合部位を含む部分、をさらに含む。一部の実施形態では、半減期延長部分は、体内で半減期を延長するポリペプチドのための結合部位を含む部分である。このポリペプチドは、アフィボディ、ＳｐＡドメイン、ＬＤＬ受容体クラスＡドメイン、ＥＧＦドメイン、およびアビマーからなる群から選ばれる。
【０１２１】
他の実施形態では、半減期延長部分は、ポリエチレングリコール部分である。一実施形態では、アンタゴニストは、ポリエチレングリコール部分（任意選択として、前記部分の大きさが約２０ 〜約５０ｋＤａ、任意選択として約４０ｋＤａ直鎖、または分岐ＰＥＧである）に結合している本発明の単一可変ドメインを含む（成分として含有を選択してもよい）。ｄＡｂと結合部分のＰＥＧ付加に関するより詳細はWO04081026を参照のこと。一実施形態では、アンタゴニストはＰＥＧに結合したｄＡｂモノマーから成る。ここで、ｄＡｂモノマーは本発明に係る単一可変ドメインであり、ＤＯＭ１０−５３−５４６（配列番号２）；ＤＯＭ１０−５３−５６７（配列番号３）；ＤＯＭ１０−５３−５６８（配列番号４）；またはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）も任意に選択できる。このアンタゴニストは、炎症性疾患、肺疾患（例えば、喘息、インフルエンザ、ＣＯＰＤ）、または癌の治療用に提供されるが、任意選択で静脈内投与用としてもよい。
【０１２２】
他の実施形態では、半減期延長部分は抗体または抗体フラグメント（例えば、免疫グロブリン単一可変ドメイン）で、血清アルブミンまたは新生児ＦＣ受容体のための結合部位を含む。
【０１２３】
また、本発明は、治療または診断に使用するための本発明のリガンド（例えば、アンタゴニスト、または単一可変ドメイン）、および、本明細書に記載された疾患（例えば、アレルギー疾患、Ｔｈ２媒介疾患、喘息、癌）の治療、予防または抑制のための医薬品の製造のための本発明のリガンドの使用に関する。任意選択で、前記リガンドはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）からなるものではない。任意選択で、前記リガンドはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）を含むものではない。前記リガンドは、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）として抗ＩＬ−４ ｍＡｂまたは抗ＩＬ−５ ｍＡｂから任意に選択されたｍＡｂに結合しているＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）を含むものではない。
【０１２４】
また、本発明は、Ｔｈ２型免疫反応を治療、抑制または予防に使用するための本発明のリガンド（例えば、アンタゴニスト、または単一可変ドメイン）に関する。任意選択で、前記リガンドはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）からなるものではない。任意選択で、前記リガンドはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）を含むものではない。前記リガンドは、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）として抗ＩＬ−４ ｍＡｂまたは抗ＩＬ−５ ｍＡｂから任意に選択されたｍＡｂに結合しているＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）を含むものではない。
【０１２５】
また、本発明は、必要に応じ被験者に治療効果のある本発明のリガンド（例えば、アンタゴニストまたは単一可変ドメイン）を投与すること含む治療方法に関する。一実施形態では、本発明は、必要に応じ被験者に本発明に係る治療上有用な量のリガンドを投与することを含むＴｈ２型免疫反応の阻害方法に関する。任意選択で、前記リガンドはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）からなるものではない。任意選択で、前記リガンドはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）を含むものではない。前記リガンドは、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）として抗ＩＬ−４ ｍＡｂまたは抗ＩＬ−５ ｍＡｂから任意に選択されたｍＡｂに結合しているＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）を含むものではない。
【０１２６】
他の実施形態では、本発明は、それを必要とする被験者に本発明に係る治療上有用な量のリガンド（例えば、アンタゴニストまたは単一可変ドメイン）を投与することを含む喘息を治療する方法に関する。任意選択で、前記リガンドはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）からなるものではない。任意選択で、前記リガンドはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）を含むものではない。前記リガンドは、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）として抗ＩＬ−４ ｍＡｂまたは抗ＩＬ−５ ｍＡｂから任意に選択されたｍＡｂに結合しているＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）を含むものではない。
【０１２７】
他の実施形態では、本発明は、それを必要とする被験者に本発明に係る治療上有用な量のリガンド（例えば、アンタゴニストまたは単一可変ドメイン）を投与することを含む癌を治療する方法に関する。任意選択で、前記リガンドはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）からなるものではない。任意選択で、前記リガンドはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）を含むものではない。前記リガンドは、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）として抗ＩＬ−４ ｍＡｂまたは抗ＩＬ−５ ｍＡｂから任意に選択されたｍＡｂに結合しているＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）を含むものではない。
【０１２８】
また、本発明は、本発明のリガンド（例えば、アンタゴニストまたは単一可変ドメイン）および生理学的に受容可能な担体を含む組成物（例えば、医薬組成物）に関する。一部の実施形態では、組成物は、静脈内、筋肉内、腹腔内、動脈内、硬腔内、関節内、皮下、肺、鼻腔内、膣、直腸への投与、のための賦形剤を含む。
【０１２９】
また、本発明は、本発明の組成物（例えば、医薬組成物）を含む薬剤送達デバイスに関する。一部の実施形態では、薬剤送達デバイスは、複数の治療効果のある用量のリガンドを含む。
【０１３０】
他の実施形態では、薬剤送達デバイスは、非経口送達デバイス、静脈内送達デバイス、筋肉内送達デバイス、腹腔内送達デバイス、経皮的送達デバイス、肺送達デバイス、動脈内送達デバイス、硬腔内送達デバイス、関節内送達デバイス、皮下送達デバイス、鼻腔内送達デバイス、膣送達デバイス、直腸内送達デバイス、注射器、経皮吸収デバイス、カプセル、タブレット、噴霧器、吸引器、霧吹き、エアロゾル投与器、噴霧器（ミスター）、ドライパウダー吸入器、定量吸入器、定量噴霧器、定量噴霧器（定量ミスター）、定量霧吹き、およびカテーテル、からなる群より選択される。
【０１３１】
本発明のリガンドはいくつかの利点を有する。例えば、本明細書で記載されているように、リガンドは体内における所望の血清半減期に合わせることが可能である。ドメイン抗体は通常の抗体より遙かに小さく、通常の抗体より組織への浸透性が優れた投与が可能である。このように、ｄＡｂとｄＡｂ含有リガンドは、Ｔｈ２媒介疾患、喘息、アレルギー性疾患、癌（例えば、腎細胞癌）、等の疾患治療のための投与に際し、通常の抗体に勝る利点を提供する。例えば、喘息（例えば、アレルギー性喘息）はＩｇＥ媒介でも非ＩｇＥ媒介でもよく、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、または、ＩＬ−４とＩＬ−１３の両方に対し、結合特異性を有するリガンドは、ＩｇＥ媒介および非ＩｇＥ媒介の両喘息の治療のために投与可能である。
【０１３２】
同様に、ＩＬ−４とＩＬ−１３の生物活性の重複と類似性により、ＩＬ−４およびＩＬ−１３に対する結合特異性を有するリガンドを使った治療で、患者（例えば、アレルギー性疾患（例えばアレルギー性喘息）の患者）に投与して単一治療薬剤を使って優れた治療を提供できる。
【０１３３】
本発明のリガンドは、本明細書で記載されているようなフォーマットにすることが出来る。例えば、本発明のリガンドは体内血清半減期を調整するフォーマットにできる。本明細書に記載されているように、必要に応じ、リガンドがさらに毒素または毒素部分を含むことも可能である。一部の実施形態では、リガンドは、フリーラジカル生成剤（例えば、セレニウム含有毒素）または放射性核種、等の表面活性毒素を含む。他の実施形態では、毒素または毒素成分は、細胞内標的に対し結合特異性のある結合部位を有するポリペプチドドメイン（例えばｄＡｂ）である。特定の実施形態では、リガンドは、ＩＬ−１３ (例えば、ヒトＩＬ−１３)に対する結合特異性を有するＩｇＧ様フォーマットである。
【０１３４】
また、本発明は、アレルゲン感作被験者の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）増殖を阻害する方法に関し、被験者に本発明のいずれかのリガンド（例えば、アンタゴニストまたは単一可変ドメイン）を含む医薬組成物を投与することを含む。一部の実施形態では、アレルゲンは、イエダニ、チリダニ類、猫アレルゲン、草アレルゲン、かびアレルゲン、花粉アレルゲン、から選択される。
【０１３５】
また、本発明は、被験者のＢ細胞増殖を阻害する方法に関し、本発明のリガンドを含む医薬組成物を被験者に投与することを含む。任意選択で、前記リガンドはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）からなるものではない。任意選択で、前記リガンドはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）を含むものではない。前記リガンドは、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）として抗ＩＬ−４ ｍＡｂまたは抗ＩＬ−５ ｍＡｂから任意に選択されたｍＡｂに結合しているＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）を含むものではない。
【０１３６】
また、本発明は、本明細書に記載されている疾患（例えば、Ｙｈ２媒介疾患、アレルギー性疾患、癌）を治療、予防または抑制するための医薬組成物に関し、活性成分として本明細書に記載のリガンドを含む。任意選択で、前記リガンドはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）からなるものではない。任意選択で、前記リガンドはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）を含むものではない。前記リガンドは、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）として抗ＩＬ−４ ｍＡｂまたは抗ＩＬ−５ ｍＡｂから任意に選択されたｍＡｂに結合しているＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）を含むものではない。
【０１３７】
ある態様では、本発明は、本発明の単一可変ドメインを含む融合タンパク質を提供する。可変ドメインは、例えばペプチドやポリペプチド、またはタンパク質と融合できる。一実施形態では、可変ドメインは、例えばモノクローナル抗体等の抗体、または抗体フラグメントと融合する。一般的に、融合は、単一核酸配列から融合産物を発現させるか、または、単一可変ドメインを含むポリペプチドを発現させ、次いで通常の技術を使って、このペプチドをより大きなタンパク質や抗体のフォーマットに組みあげることにより達成される。任意選択で、前記リガンドはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）からなるものではない。任意選択で、前記リガンドはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）を含むものではない。前記リガンドは、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）として抗ＩＬ−４ ｍＡｂまたは抗ＩＬ−５ ｍＡｂから任意に選択されたｍＡｂに結合しているＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）を含むものではない。
【０１３８】
一実施形態では、免疫グロブリン単一可変ドメイン、アンタゴニスト、または融合タンパク質は、抗体定常ドメインを含む。一実施形態では、免疫グロブリン単一可変ドメイン、アンタゴニスト、または融合タンパク質は、抗体ＦＣを含み、この場合、ＦＣのＮ末端が可変ドメインのＣ末端に結合（直接結合も任意選択できる）していることも任意に選択可能である。一実施形態では、免疫グロブリン単一可変ドメイン、アンタゴニスト、または融合タンパク質は、半減期延長部分を含む。半減期延長部分は、ポリエチレングリコール部分、血清アルブミンやその断片、トランスフェリン受容体やそのトランスフェリン結合部分、または生体内半減期を延長するポリペプチドへの結合部位を含む抗体や抗体フラグメントであってもよい。半減期延長部分は、血清アルブミン、または新生児ＦＣ受容体に対する結合部位を含む抗体や抗体フラグメントであってもよい。半減期延長部分は、ｄＡｂ、抗体または抗体フラグメントであってもよい。一実施形態では、免疫グロブリン単一可変ドメイン、アンタゴニスト、または融合タンパク質は、可変ドメイン（または、アンタゴニストや融合タンパク質に含まれる可変ドメイン）がさらに、ポリアルキレングリコール部分を含むように作られている。ポリアルキレングリコール部分は、ポリエチレングリコール部分であってもよい。これ以上のことは後で議論される。
【０１３９】
一実施形態では、本発明の単一可変ドメインは、表面プラズモン共鳴法で測定して約１０〜約１５０ｐＭ、任意選択で約５０〜約１５０ｐＭ、任意選択で約７０〜約１５０ｐＭ、の解離定数（Ｋｄ）でヒトＩＬ−１３と結合する。一つの態様では、本発明は、ヒトＩＬ−１３との結合のための本発明の単一可変ドメインを提供し、この解離定数（Ｋｄ）は、表面プラズモン共鳴法で測定して約１０〜約１５０ｐＭ、任意選択で約５０〜約１５０ｐＭ、任意選択で約７０〜約１５０ｐＭである。一つの態様では、本発明は、Ｉｌ−１３アンタゴニストの製造における本発明の単一可変ドメインの使用を提供し、ここで、可変ドメインまたはアンタゴニストは、表面プラズモン共鳴法で測定して約１０〜約１５０ｐＭ、任意選択で約５０〜約１５０ｐＭ、任意選択で約７０〜約１５０ｐＭ、の解離定数（Ｋｄ）でヒトＩＬ−１３と結合する。
【０１４０】
一実施形態では、本発明の単一可変ドメインは、表面プラズモン共鳴法で測定して約１〜約５ｎＭの解離定数（Ｋｄ）でカニクイザルＩＬ−１３と結合する。一つの態様では、本発明は、表面プラズモン共鳴法で測定して約１〜約５ｎＭの解離定数（Ｋｄ）でカニクイザルＩＬ−１３との結合のための本発明の単一可変ドメインを提供する。一つの態様では、本発明は、ＩＬ−１３アンタゴニストの製造における本発明の単一可変ドメインの使用を提供し、ここでは、表面プラズモン共鳴法で測定して約１〜約５ｎＭの解離定数（Ｋｄ）で可変ドメインまたはアンタゴニストがカニクイザルＩＬ−１３と結合する。
【０１４１】
一実施形態では、本発明の単一可変ドメイン（例えば、ＤＯＭ１０−５３−６１６）は、ｄＡｂモノマーとして提供される。ここで、フォーマットされていない（例えば、ＰＥＧ付加されていない、もしくは、半減期延長されていない）、または、ＰＥＧに結合した状態で、乾燥粉末製剤として、吸入による患者への送達（例えば、肺への送達）のために、肺疾患（例えば、喘息、ＣＩＯＤ、インフルエンザ）の治療および／または予防のために、という条件も任意選択として追加可能である。一実施形態では、本発明の単一可変ドメインは、吸入による患者への送達（例えば、肺への送達）のためのｄＡｂモノマー（ＰＥＧ付加されていない、または半減期延長されていない）として提供され、また、肺疾患（例えば、喘息、ＣＯＰＤ、インフルエンザ）の治療および／または予防のために、という条件も任意選択で入れることが可能である。
【０１４２】
一つの態様では、本発明は、下記の内の一つまたは複数の内容（明確な下記の２つまたは複数の組合せがこれにより開示され、特許請求の範囲の対照となりうる）を提供するための、本発明のいずれかの態様や実施形態で示された単一可変ドメイン（例えば、ＤＯＭ１０−５３−６１６）、タンパク質、ポリペプチド、アンタゴニスト、組成物、またはデバイスを提供する：
（ｉ）ヒトＩＬ−１３との効果的な結合（例えば、約１ｎＭ以下、以降任意選択で約５００ｐＭ以下、約２５０ｐＭ以下、約１５０ｐＭ以下、約１００ｐＭ以下、約１ｎＭ〜約１０、約５０、約７０ｐＭ、約５００ｐＭ〜約１０、約５０、約７０ｐＭ、２５０ｐＭ〜約１０、約５０、約７０ｐＭ、約１５０ｐＭ〜約１０、約５０、約７０ｐＭ、約１００ｐＭ〜約１０、約５０、約７０ｐＭの解離定数（Ｋｄ）で）；
（ｉｉ）非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル、アカゲザルまたはヒヒ）ＩＬ−１３との効果的な結合（例えば、約５ｎＭ以下、以降任意選択として、約４、約３、約２または約１ｎＭ以下、約１〜約５ｎＭの解離定数（Ｋｄ）で）；
（ｉｉｉ）ヒトＩＬ−１３との効果的な結合（例えば、約１ｎＭ以下、以降任意選択で約５００ｐＭ以下、約２５０ｐＭ以下、約１５０ｐＭ以下、約１００ｐＭ以下、約１ｎＭ〜約１０、約５０、約７０ｐＭ、約５００ｐＭ〜約１０、約５０、約７０ｐＭ、２５０ｐＭ〜約１０、約５０、約７０ｐＭ、約１５０ｐＭ〜約１０、約５０、約７０ｐＭ、約１００ｐＭ〜約１０、約５０、約７０ｐＭの解離定数（Ｋｄ）で）、および、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル、アカゲザルまたはヒヒ）ＩＬ−１３との効果的な結合（例えば、約５ｎＭ以下、以降任意選択として、約４、約３、約２または約１ｎＭ以下、約１〜約５ｎＭの解離定数（Ｋｄ）で）；
（ｉｖ）ヒト、カニクイザル、およびアカゲザルＩＬ−１３との効果的な結合（例えば、ヒトＩＬ−１３とは、約１ｎＭ以下、以降任意選択で約５００ｐＭ以下、約２５０ｐＭ以下、約１５０ｐＭ以下、約１００ｐＭ以下、約１ｎＭ〜約１０、約５０、約７０ｐＭ、約５００ｐＭ〜約１０、約５０、約７０ｐＭ、２５０ｐＭ〜約１０、約５０、約７０ｐＭ、約１５０ｐＭ〜約１０、約５０、約７０ｐＭ、約１００ｐＭ〜約１０、約５０、約７０ｐＭの解離定数（Ｋｄ）で；および、カニクイザルおよびアカゲザルＩＬ−１３とは、それぞれ約５ｎＭ以下、以降任意選択として、約４、約３、約２または約１ｎＭ以下、約１〜約５ｎＭの解離定数（Ｋｄ）で）；
（ｖ）原核生物で少なくとも約３ｍｇ／Ｌの優れた発現（例えば、原核生物での発現（例えば大腸菌））。
【０１４３】
（ｖｉ）患者のヒトＩＬ−１３に対する効果的な中和、例えば、単一可変ドメイン、タンパク質、ポリペプチド、アンタゴニスト、または組成物は、標準的ＨＥＫ ＳＴＡＴアッセイ法において、約０．１〜約２．０ｎＭ、以降任意選択で約０．２〜約２．０ｎＭ、約０．３〜１．５ｎＭ、約０．２〜約１．０ｎＭまたは約０．３〜約１．０ｎＭのＥＣ５０値を示しヒトＩＬ−１３を中和する；
（ｖｉｉ）患者のヒトＩＬ−１３に対する効果的な中和、例えば、単一可変ドメイン、タンパク質、ポリペプチド、アンタゴニスト、または組成物は、標準的ＨＥＫ ＳＴＡＴアッセイ法において、約１〜約２０ｎＭ、以降任意選択で約５〜約１５ｎＭ、または約５〜約１０ｎＭのＥＣ５０値を示しカニクイザルＩＬ−１３を中和する；
（ｖｉｉｉ）患者のヒトＩＬ−１３に対する効果的な中和、例えば、標準的ＨＥＫ ＳＴＡＴアッセイ法において、約１〜約１５ｎＭ、約２〜約１５ｎＭ、または約２〜約１１．５ｎＭのＥＣ５０値を示しアカゲザルＩＬ−１３を中和する単一可変ドメイン、タンパク質、ポリペプチド、アンタゴニスト、または組成物を用いた中和；
（ｉｘ）ヒトＩＬ−１３および非ヒト霊長類の効果的な中和、例えば、標準的ＨＥＫ ＳＴＡＴアッセイ法において、約０．１〜約２．０ｎＭ、以降任意選択で約０．２〜約２．０ｎＭ、約０．３〜１．５ｎＭ、約０．２〜約１．０ｎＭまたは約０．３〜約１．０ｎＭのＥＣ５０値を示してヒトＩＬ−１３を中和し；標準的ＨＥＫ ＳＴＡＴアッセイ法において、約１〜約２０ｎＭ、以降任意選択で約５〜約１５ｎＭ、または約５〜約１０ｎＭのＥＣ５０値を示し非ヒト霊長類ＩＬ−１３を中和する単一可変ドメイン、タンパク質、ポリペプチド、アンタゴニスト、または組成物を用いた中和；
（ｘ）２種以上の霊長類ＩＬ−１３間の交差反応の提供（任意選択として、ヒトとカニクイザル、および／またはアカゲザルＩＬ−１３、例えば、ヒトとカニクイザルＩＬ−１３、ヒトとアカゲザルＩＬ−１３、ヒトとヒヒＩＬ−１３）；ならびに
（ｘｉ）プロテアーゼ安定性の提供（任意選択として、トリプシン安定性）。
【０１４４】
一つの態様では、本発明は、直前の段落の（ｉ）〜（ｘｉ）の内の一つまたは複数の内容を提供するために、本発明のいずれかの態様や実施形態に示された単一可変ドメイン（例えば、ＤＯＭ１０−５３−６１６）、タンパク質、ポリペプチド、アンタゴニスト、組成物、またはデバイスの使用を提供する。また、本発明は対応する方法も提供する。
【０１４５】
ここで、WO2007085815を参照するが、これは抗ＩＬ−１３ 免疫グロブリン単一可変ドメインを開示している。本文書の開示内容はその全体が本明細書に組み込まれ、特に使用、フォーマット、選択方法、製造法、製剤方法、および抗ＩＬ−１３単一可変ドメイン、リガンド、アンタゴニストのアッセイ法を提供する。これにより、この開示内容が、本発明の審査請求項目に組み込める明確な記述が与えられることを含め、本明細書の内容に具体的かつ明確に適用される。
【０１４６】
抗ＩＬ−１３免疫グロブリン単一可変ドメインは、任意の適切な免疫グロブリン可変ドメインであってよく、任意選択として、ヒト可変ドメインであっても、またはヒトフレームワークドメイン（例えばＤＰ４７またはＤＰＫ９フレームワークドメイン）を含むか、もしくは、それから派生した可変ドメインであってもよい。特定の実施形態では、本明細書記載の可変ドメインはユニバーサルフレームワークを基準にしている。
【０１４７】
特定の実施形態では、ＩＬ−１３に対して結合特異性のある結合部位を有するポリペプチドドメイン（例えば、免疫グロブリン単一可変ドメイン）は、凝集、折り畳み可逆性に抵抗する（WO04101790を参照のこと。この文書の教示は参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１４８】
核酸分子、ベクターおよび宿主細胞
また、本発明は、本明細書に記載のリガンド（単一可変ドメイン、融合タンパク質、ポリペプチド、二重特異性リガンドおよび多重特異性リガンド）をコードする、単離された、および／または、組換え型の核酸分子を提供する。
【０１４９】
一つの態様では、本発明は、本発明に係る免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドをコードする単離されたまたは組換え型の核酸を提供する。一実施形態では、核酸はＤＯＭ１０−５３−５４６（配列番号６）；ＤＯＭ１０−５３−５６７（配列番号７）；ＤＯＭ１０−５３−５６８（配列番号８）；またはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号９）のヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、核酸はＤＯＭ１０−５３−５４６（配列番号６）；ＤＯＭ１０−５３−５６７（配列番号７）；またはＤＯＭ１０−５３−５６８（配列番号８）のヌクレオチド配列を含む。
【０１５０】
一つの態様では、本発明は単離されたまたは組換え型の核酸を提供し、ここで核酸はＤＯＭ１０−５３−５４６（配列番号６）；ＤＯＭ１０−５３−５６７（配列番号７）；ＤＯＭ１０−５３−５６８（配列番号８）；またはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号９）のヌクレオチド配列に対し少なくとも９９％同一のヌクレオチド配列を含み、また、核酸が、ＩＬ−１３に特異的に結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドをコードしている。任意選択肢として、核酸はヌクレオチド配列ＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号９）からなるものではない、または、含むものではない。
【０１５１】
一つの態様では、本発明は、本発明の核酸を含むベクターを提供する。一つの態様では、本発明は、本発明の核酸、またはベクターを含む宿主細胞を提供する。また、免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドを産生する方法および前記核酸またはベクターの発現に適切な条件下で宿主細胞を維持し、それにより免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドが産生される方法が提供される。任意選択として、この方法がさらにポリペプチドを単離するステップを含み、また、任意選択として、標準的ＨＥＫ ＳＴＡＴアッセイににおいて、単離ポリペプチドよりも改善されたアフィニティ（Ｋｄ）やＥＣ５０を有する変異体（例えば突然変異体）を産生するステップを含む。
【０１５２】
本明細書で「単離された」と呼んでいる核酸は、それらの元（例えば、細胞中に、またはライブラリーのように核酸の混合物中にある状態）のゲノムＤＮＡまたは細胞性ＤＮＡの核酸から分離された核酸であり、本明細書に記載された方法、または他の適切な方法により得られた核酸を含み、また、本質的に純粋な核酸、化学的合成により作られた核酸、生物学的・化学的方法の組合せにより作られた核酸、および単離された組換え型核酸（Daugherty, B.L. et al., Nucleic Acids Res., 19(9): 2471-2476 (1991); Lewis, A.P. and J.S. Crowe, Gene, 101: 297-302 (1991)を参照のこと）を含む。
【０１５３】
本明細書で「組換え型」と呼んでいる核酸は、組換えＤＮＡ手法により作られた核酸であり、ポロメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および／または制限酵素を使ってベクタにクローニングする、等の人工組換え法による手法により生成した核酸を含む。
【０１５４】
特定の実施形態では、単離されたおよび／または組換え型の核酸は、本明細書に記載されたリガンドをコードするヌクレオチド配列を含み、前記リガンドは、本明細書で開示のＩＬ−１３に結合するｄＡｂのアミノ酸配列、例えば、ＤＯＭ１０−５３−５４６（配列番号２）；ＤＯＭ１０−５３−５６７（配列番号３）；ＤＯＭ１０−５３−５６８（配列番号４）；またはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）と、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ヌクレオチド配列の同一性は、選択した抗ＩＬ−１３ｄＡｂをコードするヌクレオチド配列全長にわたり決定可能である。
【０１５５】
また本発明は、本発明の組換え型核酸分子を含むベクターを提供する。特定の実施形態では、ベクターは発現ベクターであり、本発明の組換え型核酸に機能的に連結された一つまたは複数の発現制御因子または配列を含む。また本発明は、本発明の組換え型核酸分子またはベクターを含む組換え型宿主細胞を提供する。適切なベクター（例えば、プラスミド、ファージミド）、発現制御因子、宿主細胞および本発明の組換え型宿主細胞を産生する方法は当業者にはよく知られており、実施例が後ほど本明細書中で記載される。
【０１５６】
適切な発現ベクターは多くの要素を含むことが可能で、例えば、複写起点、選択可能なマーカー遺伝子、一つもしくは複数の発現制御因子、転写調節因子（例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター）、および／または一つもしくは複数の翻訳シグナル、シグナル配列、またはリーダー配列、等を含むことができる。発現制御因子およびシグナル配列は、存在する場合には、ベクターまたは他のソースにより提供される。例えば、抗体鎖をコードするクローン核酸の転写、および／または翻訳調節因子は直接発現に使用可能である。
【０１５７】
プロモーターは所望の宿主細胞での発現に供することができる。プロモーターは構成型であっても誘導型であってもよい。例えば、プロモータ−は、抗体、抗体鎖、またはこれらの一部をコードする核酸に機能的に連結されていて、核酸を直接転写してもよい。種々の適切なプロモーターが、原核生物宿主用（例えば、大腸菌用ｌａｃ、ｔａｃ、Ｔ３、Ｔ７プロモーター）および真核生物宿主用（例えば、シミアンウイルス４０の初期や後期プロモーター、ラウス肉腫ウィルス長末端反復プロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、アデノウイルス後期プロモーター）として入手可能である。
【０１５８】
さらに、通常、発現ベクターはベクターを担持している宿主細胞を選別するために選択可能なマーカーを含み、さらに複製可能な発現ベクターの場合には、複製起点を含む。抗生物質耐性や薬剤耐性を与える産物をコードした遺伝子は、よく用いられる選択マーカーであり、原核生物細胞（例えば、ラクタマーゼ遺伝子（アンピシリン耐性）、テトラサイクリン耐性用Ｔｅｔ遺伝子）および真核生物細胞（例えば、ネオマイシン（Ｇ４１８やジェネテシン）、ｇｐｔ（ミコフェノール酸）、アンピシリン、またはハイグロマイシン耐性遺伝子）で使うことが可能できる。ジヒドロ葉酸還元酵素マーカー遺伝子は、多様な宿主中のメトトレキサートの選択を可能とする。宿主の栄養要求性マーカー（例えば、ＬＥＵ２、ＵＲＡ３、ＨＩＳ３）は、酵母の選択マーカーとして使われることが多い。ウイルスベクター（例えば、バキュロウイルス）、またはファージベクターの使用、および、レトロウイルスベクターのような宿主細胞のゲノムへ統合可能なベクターの使用もまた意図されているものである。哺乳動物細胞および原核生物細胞（大腸菌）、昆虫細胞（ショウジョウバエ Ｓｃｈｎｉｅｄｅｒ Ｓ２細胞、Ｓｆ９）および酵母（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）での発現に適切な発現ベクターは、当業者にはよく知られている。
【０１５９】
適切な宿主細胞は、大腸菌、枯草菌等の細菌性細胞、および／または他の適切な細菌を含む原核生物細胞であってもよく、また、真菌細胞や酵母細胞（例えば、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、または他の下等真核細胞および昆虫由来（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓｃｈｎｉｅｄｅｒ Ｓ２ 細胞、Ｓｆ９ 昆虫細胞（WO94/26087(O’Connor)）のような高等真核生物、哺乳動物（例えば、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ−１６５０）およびＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ−１６５１）等のＣＯＳ細胞、ＣＨＯ（例えば、ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ−９０９６、ＣＨＯＤＧ４４（Urlaub, G. and Chasin, LA., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 77(7):4216-4220 (1980)））、２９３（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ−１５７３）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＬ−２）、ＣＶ１（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＬ−７０）、ＷＯＰ（Dailey, L., et al., J. Virol., 54:739-749 (1985), ３Ｔ３、２９３Ｔ（Pear, W. S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90:8392-8396 (1993)）ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０、ＨｕＴ ７８細胞、等、または植物（例えば、たばこ）を含む真核生物細胞であってもよい。 （例えば、Ausubel, F.M. et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons Inc. (1993)を参照のこと）。一部の実施形態では、宿主細胞は単離された宿主細胞であり、多細胞生物（例えば、植物または動物）の一部ではない。特定の実施形態では、宿主細胞は非ヒト宿主細胞である。
【０１６０】
また、本発明は、組換え核酸の発現に適切な条件下で、本発明の組換え核酸を含む組換え宿主細胞の維持を含む、本発明のリガンド（例えば、二重特性リガンド、多重特異性リガンド）の製造法を提供する。これにより、組換え核酸が発現し、リガンドが産生される。一部の実施態様では、この方法がさらにリガンドの単離を含む。
【０１６１】
本発明の実施形態に適用可能な開示詳細に関しては、WO200708515の１６１ページ、２４行から１８９ページ、１０行を参照されたい。本開示は、参照によって本明細書に組み込まれ、本開示内容が明確になり、本発明の実施形態に関わるようになる。また、下記の特許請求の範囲への開示の組み込みに対する明確な裏付けを行う。これには、WO200708515の１６１ページ、２４行から１８９ページ、１０行にある「免疫グロブリンベースリガンドの合成」、「ライブラリベクターシステム」、「ライブラリ構築」、「単一可変ドメインの結合」、「リガンドのキャラクタリゼーション」、「リガンドの構造」、「骨格」、「タンパク質の骨組」、「リガンド構築における骨組の使用」、「基準の配列の多様性」、「治療と診断用組成物とその使用」、ならびに定義「機能的に連結された」、「ナイーブ」、「予防」、「抑制」、「治療」、「アレルギー性疾患」、「ＴＨ２媒介疾患」、「治療効果のある用量」、「有効な」、を詳細に提供している開示が含まれる。
【０１６２】
フォーマット
半減期の延長は、免疫グロブリンの生体内適用において有用である。サイズが小さい抗体では特に、また、抗体フラグメントでは殊更に有用である。このようなフラグメント（ＦＶＳ、ジスルフィド結合ＦＶＳ、Ｆａｂ、ＳＣＦＶＳ、ｄＡｂ）は身体から急速な除去作用を受ける。このように、それが身体の大抵の部分に早く到達できて、素早く産生でき、容易に扱えても、生体内での短い持続性だけのためにその生体内での適用には、限界があった。本発明の一実施態様では、体内でのリガンドの半減期延長、および、その結果、体内でのリガンドの機能活性のより長い持続時間を提供することによりこの問題が解決されている。
【０１６３】
薬物動態解析およびリガンドの半減期の測定方法は当業者にはよく知られている。詳細については、Kenneth, A et al: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for PharmacistsおよびPeters et al, Pharmacokinetc analysis: A Practical Approach (1996)で見られるであろう。また、ｔα、ｔβ半減期、曲線下面積（ＡＵＣ）等の薬物動態パラメーターについて記述されている次の文献を参照されたい：“Pharmacokinetics”, M Gibaldi & D Perron, published by Marcel Dekker, 2nd Rev. ex edition (1982)。
【０１６４】
半減期（ｔ1/2 α、ｔ1/2 β）および、ＡＵＣはリガンドの血清中濃度対時間の曲線から求められる。例えば、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ解析パッケージ（Pharsight Corp.社, Mountain View, CA94040, USA から入手可能）を使って、曲線をモデル化することができる。最初の相（α相）では、リガンドは主に患者の中で分配が行われている。第二相（β相）は、終末過程で、リガンドの分配が完了し、リガンドが患者から除去されるにつれ血清中濃度が減少していく。ｔ1/2 α半減期は、最初の相の半減期で、ｔ1/2 β半減期は、第二相の半減期である。従って、一実施形態では、本発明は、１５分以上の範囲のｔ1/2 α半減期を有する、本発明に係るリガンドまたは組成物を提供する。一実施態様では、前記範囲の下端が３０分、４５分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、１０時間、１１時間、または１２時間である。さらに追加して、または、その代わりに、本発明に係るリガンドまたは組成物は、１２時間までの範囲のｔ1/2 α半減期を有することになる。一実施形態では、前記範囲の上端が１１、１０、９、８、７、６、または５時間である。適切な範囲の実施例は、１〜６時間、２〜５時間、または３〜４時間である。
【０１６５】
一実施形態では、本発明は、本発明に係る約２．５時間以上範囲のｔ1/2 β半減期を有するリガンド（ポリペプチド、ｄＡｂまたはアンタゴニスト）または組成物を提供する。一実施態様では、前記範囲の下端が約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約１０時間、約１１時間、または約１２時間である。一実施形態では、さらに追加して、またはその代わりに、本発明に係るリガンドまたは組成物が２１日迄の範囲のｔ1/2 β半減期を有する。一実施形態では、前記範囲の上端が約１２時間、約２４時間、約２日、約３日、約５日、約１０日、約１５日、または約２０日である。一実施形態では、本発明に係るリガンドまたは組成物は、約１２〜約６０時間の範囲のｔ1/2 β半減期を有する。さらなる実施形態では、その範囲は、約１２〜４８時間の範囲である。またさらなる実施形態では、その範囲は１２〜２６時間の範囲である。
【０１６６】
上記基準に追加して、またはその代わりに、本発明は、約１ ｍｇ／ｍｌ以上の範囲のＡＵＣ値（曲線下面積）を有する、本発明に係るリガンドまたは組成物を提供する。一実施形態では、前記範囲の下端が約５、約１０、約１５、約２０、約３０、約１００、約２００、約３００ ｍｇ・ｍｉｎ／ｍｌである。追加して、またはその代わりとして、本発明に係るリガンドまたは組成物が約６００ ｍｇ・ｍｉｎ／ｍｌ迄の範囲のＡＵＣを有する。一実施形態では、前記範囲の下端が約５、約１０、約１５、約２０、約３０、約１００、約２００、または約３００ ｍｇ・ｍｉｎ／ｍｌである。追加して、またはその代わりとして、本発明に係るリガンドまたは組成物は、６００ ｍｇ・ｍｉｎ／ｍｌ迄の範囲のＡＵＣを有する。一実施形態では、前記範囲の上端が約５００、約４００、約３００、約２００、約１５０、約１００、約７５、または約５０ ｍｇ・ｍｉｎ／ｍｌである。一実施態様では、本発明に係るリガンドは、下記の事項からなる群から選ばれた範囲のＡＵＣ有する：約１５〜約１００ｍｇ・ｍｉｎ／ｍｌ、約１５〜約７５ｍｇ・ｍｉｎ／ｍｌ、約１５〜約５０ｍｇ・ｍｉｎ／ｍｌ。
【０１６７】
ポリペプチドとｄＡｂ、およびこれらを含むアンタゴニストは、例えば、ＰＥＧ基、血清アルブミン、トランスフェリン、トランスフェリン受容体または少なくともそれのトランスフェリン結合部、抗体ＦＣドメインの付加により、あるいは、抗体ドメインへのコンジュゲートにより、さらに大きな流体力学的サイズを持つようにフォーマットすることが可能である。例えば、より大きな抗体の抗原結合フラグメントとして、または抗体（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、ＩｇＧ、ｓｃＦｖとしてフォーマットされた）としてフォーマットされたポリペプチドｄＡｂおよびアンタゴニストがあり。
【０１６８】
本発明のリガンド（例えば、ｄＡｂモノマー、マルチマー）の流体力学的サイズは、当業者にはよく知られた方法により求めることができる。例えば、ゲル濾過クロマトグラフィーを使ってリガンドの流体力学的サイズを求めてもよい。架橋アガロースマトリックスのような流体力学的サイズ測定に適したゲル濾過マトリックスはよく知られ、容易に入手可能である。
【０１６９】
リガンドフォーマットのサイズ（例えば、ｄＡｂに結合したＰＥＧ部分のサイズ）は所望の用途に依存して変わりうる。例えば、リガンドが血液循環から抜け出て周辺細胞組織に入ることが意図されている場合、流体力学的サイズを小さく保ち、血流からの溢出を促進する。あるいは、リガンドを体循環中に長時間残すことが望まれる場合は、例えばＩｇ様タンパク質としてフォーマットすることにより、リガンドサイズを増やすことが可能である。
【０１７０】
生体内で半減期を延長する抗原またはエピトープを標的にすることによる半減期の延長
本明細書で記載されているように、本発明のＩＬ−１３結合ポリペプチド、ｄＡｂ、またはアンタゴニストを、生体内で半減期を延長する抗原とエピトープを結合した結合ドメイン（例えば、抗体または抗体フラグメント）にコンジュゲートまたは会合させることにより、リガンドの流体力学的サイズおよびその血清中半減期も増加させることができる。例えば、ＩＬ−１３結合薬剤（例えばポリペプチド）は、抗血清アルブミンや抗新生児ＦＣ受容体抗体または抗体フラグメント、例えば抗ＳＡまたは抗新生児ＦＣ受容体ｄＡｂ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはｓｃＦｖに、あるいは、抗ＳＡアフィボディもしくは抗新生児ＦＣ受容体アフィボディ、または抗ＳＡアビマー、または、これに限定されるものではないが、以下に示す群から選択された足場を含む抗ＳＡ結合ドメインへコンジュゲートまたは結合することができる：ＣＴＬＡ−４、リポカリン、ＤｐＡ、アフィボディ、アビマー、ＧｒｏＥｌおよびフィブロネクチン（これらの結合ドメインの開示については、WO2008096158を参照のこと。ここに示されたドメインと配列は参照により本明細書に組み込まれ、本明細書の開示の一部を形成する)。コンジュゲートとは、血清アルブミンに結合した結合ドメインに結合（共有結合的あるいは非共有結合的に）した本発明のポリペプチド、ｄＡｂ、またはアンタゴニストを含む組成物を指す。
【０１７１】
生体内での血清中半減期を延長する適切なポリペプチドには、例えば、トランスフェリン受容体特異的なリガンド神経医薬剤融合タンパク質（米国特許第5,977,307号参照のこと。この中の教示は参照により本明細書に組み込まれる）、脳毛細血管内皮細胞受容体、トランスフェリン、トランスフェリン受容体（例えば、可溶性トランスフェリン受容体）、インシュリン、インシュリン様成長因子１（ＩＧＦ１）受容体、インシュリン様成長因子２（ＩＧＦ２）受容体、インシュリン受容体、血液凝固第X因子、α１抗トリプシン、およびＨＮＦ１αが含まれる。さらに、血清内半減期を延長する適切なポリペプチドには、α１糖タンパク質（オロソムコイド；ＡＡＧ）、α１アンチキモトリプシン（ＡＣＴ）、α１ミクログロブリン（タンパク質ＨＣ；ＡＩＭ）、アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴ ＩＩＩ）、アポリポタンパク質Ａ−１（Ａｐｏ Ａ−１）、アポリポタンパク質Ｂ（Ａｐｏ Ｂ）、セルロプラスミン（Ｃｐ）、補体成分Ｃ３（Ｃ３）、補体成分Ｃ４（Ｃ４）、Ｃ１エステラーゼ阻害剤（Ｃ１ ＩＮＨ）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、フェリチン（ＦＥＲ）、ヘモペキシン（ＨＰＸ）、リポタンパク質（ａ）（Ｌｐ（ａ））、マンノース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ミオグロビン（Ｍｙｏ）、プレアルブミン（トランスチレチン；ＰＡＬ）、レチノール結合タンパク質（ＲＭＰ）、およびリウマチ因子（ＲＦ）が含まれる。
【０１７２】
細胞外マトリックスからの適切なタンパク質には、例えば、コラーゲン、ラミニン、インテグリン、およびフィブロネクチンが含まれる。コラーゲンは、細胞外マトリックスの主要タンパク質である。約１５の型のコラーゲン分子が現在知られており、身体の別々の部位で見つかっている。例えば、骨、皮膚、腱、靱帯、角膜、内臓器官で見つかったＩ型コラーゲン（身体コラーゲンの９０％に達する）、または、軟骨、椎間板、脊索、および眼球ガラス体液で見つかったＩＩ型コラーゲン。
【０１７３】
血液からの適切なタンパク質には、例えば、血漿タンパク質（例えば、フィブリン、α２マクログロブリン、血清アルブミン、フィブリノゲン（例えば、フィブリノゲンＡ、フィブリノゲンＢ）、血清アミロイドタンパク質Ａ、ハプトブロビン、プロフィリン、ユビキチン、）、ウテログロブリンおよびβ２ミクログロブリン）、酵素および酵素阻害剤（例えば、プラスミノーゲン、リゾチーム、シスタチンＣ、α１抗トリプシンおよび膵臓トリプシン阻害剤）、免疫グロブリンタンパク質（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、免疫グロブリン軽鎖（κ／λ））、等の免疫システムタンパク質、輸送タンパク質（例えば、レチノール結合タンパク質、α１ミクログロブリン）、ディフェンシン（例えば、βディフェンシン１、好中球ディフェンシン１、好中球ディフェンシン２、および好中球ディフェンシン３）等が含まれる。
【０１７４】
血液脳関門または神経組織で認めらる適切なタンパク質には、例えば、メラノコルチン受容体、ミエリン、アスコルビン酸塩トランスポーター、等が含まれる。
【０１７５】
また、生体内での血清中半減期を延長する適切なポリペプチドには、腎臓に局在化したタンパク質（例えば、ポリシスチン、ＩＶ型コラーゲン、有機アニオン輸送体Ｋ１、ハイマン抗原）、肝臓に局在化したタンパク質（例えば、アルコール脱水素酵素、Ｇ２５０）、肺に局在化したタンパク質（例えば、ＩｇＡに結合する分泌成分）、心臓に局在化したタンパク質（例えば、拡張型心筋症に関連したＨＳＰ２７）、皮膚に局在化したタンパク質（例えばケラチン）、形質転換増殖因子βスーパーファミリータンパク質（骨形成活性（例えば、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８）を示す）のサブセットである形態形成タンパク質（ＢＭＰ）等の骨特異的タンパク質、腫瘍特異性タンパク質（例えば、栄養膜抗原、ハーセプチン受容体、エストロゲン受容体、カテプシン（例えば、肝臓と脾臓で認められるカテプシンＢ））が含まれる。
【０１７６】
適切な疾患特異性タンパク質には、例えば、ＬＡＧ−３（リンパ球活性化遺伝子）、オステオプロテジェリンリガンド（ＯＰＧＬ；Nature 402, 304-309 (1999)参照）、ＯＸ４０（ＴＮＦ受容体ファミリーのメンバーで、活性化Ｔ細胞上で発現しヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−Ｉ）産生細胞中で特異的に発現上昇している；Immunol. 165 (1):263-70 (2000)参照）を含む活性Ｔ細胞上にのみ発現する抗原が含まれる。また、適切な疾患特異性タンパク質には、例えば、ショウジョウバエＣＧ６５１２、ヒトパラプレギン、ヒトＦｔｓＨ、ヒトＡＦＧ３Ｌ２、ネズミｆｔｓＨを含む金属プロテアーゼ（関節炎／癌に関連）；ならびに血管新生増殖因子、例えば酸性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−１）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２）、血管内皮増殖因子／血管透過性因子（ＶＥＧＦ／ＶＰＦ）、トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦα）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、アンギオジェニン、インターロイキン３（ＩＬ−３）、インターロイキン８（ＩＬ−８）、血小板由来内皮細胞増殖因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）、胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）、ミッドカイン血小板由来増殖因ＢＢ（ＰＤＧＦ）、およびフラクタルカインも含まれる。
【０１７７】
また、生体内での血清中半減期を延長する適切なポリペプチドには、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）のようなストレスタンパク質も含まれる。ＨＳＰは、通常は、細胞内で見つかる。それが細胞外で見つかる場合は、細胞が死亡し内容物をはき出したという指標になる。このプログラムされていない細胞死（壊死）は外傷、疾患、傷害のとき起こり、細胞外ＨＳＰは免疫系からの反応を誘発する。細胞外ＨＳＰに対する結合により本発明の組成物の疾患部位への局在化が生じる可能性がある。
【０１７８】
ＦＣ輸送にかかわる適切なタンパク質には、例えば、Ｂｒａｍｂｅｌｌ受容体（ＦＣＲＢとしても知られている）が含まれる。このＦＣ受容体は送達に潜在的に有用な２つの機能を有する。その機能は（１）胎盤経由で母から子供へＩｇＧの移送、（２）ＩｇＧの分解からの保護と、その結果の血清中半減期の延長、である。受容体はエンドソームからＩｇＧを再生利用すると考えられている。（Holliger et al, Nat Biotechnol 15(7):632-6 (1997)参照）。
【０１７９】
血清アルブミンに結合するｄＡｂ
一実施形態で、本発明は、ポリペプチドまたはアンタゴニスト（例えば、ＩＬ−１３に結合する抗ＩＬ−１３ｄＡｂ（第一のｄＡｂ）および血清アルブミン（ＳＡ）に結合する第二のｄＡｂ含む二重特異性リガンド）を提供し、第二のｄＡｂは表面プラズモン共鳴で測定したＫｄ値の、約１ｎＭ〜約１、約２、約３、約４、約５、約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約１００、約２００、約３００、約４００、または約５００μＭ（すなわち、ｘ１０−９ 〜５ｘ１０−４ Ｍ）、または、約１００ｎＭ〜約１０μＭ、または、約１〜約５μＭ、または、約３〜約７０ｎＭ、または、約１０ｎＭ〜約１、約２、約３、約４、約５μＭでＳＡに結合している。例えば、表面プラズモン共鳴により測定して約３０〜７０ｎＭである。一実施形態では、第一のｄＡｂ（またはｄＡｂモノマー）はＳＡ（例えば、ＨＳＡ）と表面プラズモン共鳴で測定したＫｄ値の約１、約５０、約７０、約１００、約１５０、約２００、約３００ｎＭ、または、約１、約２、約３μＭで結合している。一実施形態では、第一の抗ＳＡ ｄＡｂと第二のＩＬ−１３に対するｄＡｂを含む二重特異性リガンドに関して、第二のｄＡｂのその標的に対するアフィニティ（例えば、ＢｉａＣｏｒｅ等を使って表面プラズモン共鳴で測定したＫｄおよび／またはＫｏｆｆ）が、ＳＡに対する第一のｄＡｂのアフィニティの約１〜約１００００倍（例えば、約１００〜約１０００００、または約１０００〜１０００００、または約１００００〜１０００００倍）である。一実施形態では、血清アルブミンは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）である。例えば、第一のｄＡｂはＳＡと約１０μＭのアフィニティで結合し、第二のｄＡｂはその標的と約１００ｐＭのアフィニティで結合する。一実施形態では、血清アルブミンは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）である。一実施形態では、第一のｄＡｂはＳＡ（例えばＨＳＡ）とＫｄ値約５０、例えば、約７０、約１００、約１５０、または約２００ｎＭで結合する。二重特異性リガンドの詳細については、WO03002609、WO04003019、WO2008096158およびWO04058821で見付けることができる。
【０１８０】
一実施形態で、本発明のリガンドは、表面プラズモン共鳴で測定してＫｄ値約１ｎＭ〜約１、約２、約３、約４、約５、約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約１００、約２００、約３００、約４００、または約５００μＭ（すなわち、ｘ１０−９ 〜５ｘ１０−４ Ｍ）、または、約１００ｎＭ〜約１０μＭ、または、約１〜約５μＭ、または、約３〜約７０ｎＭ、または、約１０ｎＭ〜約１、約２、約３、約４、約５μＭで血清アルブミン（ＳＡ）と結合しているｄＡｂを含む。例えば、表面プラズモン共鳴で測定して約３０〜７０ｎＭである。一実施形態では、第一のｄＡｂ（またはｄＡｂモノマー）は、表面プラズモン共鳴で測定してＫｄ値約１、約５０、約７０、約１００、約１５０、約２００、約３００ｎＭまたは約１、約２または約３μＭでＳＡ（例えば、ＨＳＡ）と結合する。一実施形態では、第一および第二のｄＡｂは、リンカー、例えば１〜４アミノ酸、または１〜３のアミノ酸、または３を超えるアミノ酸、４、５、６、７、８、９、１０、１５、または２０を超えるアミノ酸のリンカー、で結合されている。一実施形態では、より長いリンカー（アミノ酸が３を超える）が効力（アンタゴニストの一つあるいは両方のｄＡｂのＫｄ）を高めるために使われる。
【０１８１】
リガンドとアンタゴニストの具体的な実施形態では、ｄＡｂはヒト血清アルブミンに結合し、以下からなる群から選択されるｄＡｂへの結合について競合する：
ＭＳＡ−１６、ＭＳＡ−２６(この配列の開示についてはWO04003019参照。この配列と対応する核酸は参照により本明細書に組み込まれ、本明細書の開示の一部を構成する）、
ＤＯＭ７ｍ−１６（配列番号４７３）、ＤＯＭ７ｍ−１２（配列番号４７４）、ＤＯＭ７ｍ−２６（配列番号４７５）、ＤＯＭ７ｒ−１（配列番号４７６）、ＤＯＭ７ｒ−３（配列番号４７７）、ＤＯＭ７ｒ−４（配列番号４７８）、ＤＯＭ７ｒ−５（配列番号４７９）、ＤＯＭ７ｒ−７（配列番号４８０）、ＤＯＭ７ｒ−８（配列番号４８１）、ＤＯＭ７ｈ−２（配列番号４８２）、ＤＯＭ７ｈ−３（配列番号４８３）、ＤＯＭ７ｈ−４（配列番号４８４）、ＤＯＭ７ｈ−６（配列番号４８５）、ＤＯＭ７ｈ−１（配列番号４８６）、ＤＯＭ７ｈ−７（配列番号４８７）、ＤＯＭ７ｈ−２２（配列番号４８９）、ＤＯＭ７ｈ−２３（配列番号４９０）、ＤＯＭ７ｈ−２４（配列番号４９１）、ＤＯＭ７ｈ−２５（配列番号４９２）、ＤＯＭ７ｈ−２６（配列番号４９３）、ＤＯＭ７ｈ−２１（配列番号４９４）、ＤＯＭ７ｈ−２７（配列番号４９５）、ＤＯＭ７ｈ−８（配列番号４９６）、ＤＯＭ７ｒ−１３（配列番号４９７）、ＤＯＭ７ｒ−１４（配列番号４９８）、ＤＯＭ７ｒ−１５（配列番号４９９）、ＤＯＭ７ｒ−１６（配列番号５００）、ＤＯＭ７ｒ−１７（配列番号５０１）、ＤＯＭ７ｒ−１８（配列番号５０２）、ＤＯＭ７ｒ−１９（配列番号５０３）、ＤＯＭ７ｒ−２０（配列番号５０４）、ＤＯＭ７ｒ−２１（配列番号５０５）、ＤＯＭ７ｒ−２２（配列番号５０６）、ＤＯＭ７ｒ−２３（配列番号５０７）、ＤＯＭ７ｒ−２４（配列番号５０８）、ＤＯＭ７ｒ−２５（配列番号５０９）、ＤＯＭ７ｒ−２６（配列番号５１０）、ＤＯＭ７ｒ−２７（配列番号５１１）、ＤＯＭ７ｒ−２８（配列番号５１２）、ＤＯＭ７ｒ−２９（配列番号５１３）、ＤＯＭ７ｒ−３０（配列番号５１４）、ＤＯＭ７ｒ−３１（配列番号５１５）、ＤＯＭ７ｒ−３２（配列番号５１６）、ＤＯＭ７ｒ−３３（配列番号５１７）（この配列の開示についてはWO2007080392参照。この配列と対応する核酸は参照により本明細書に組み込まれ、本明細書の開示の一部を構成する。本項の配列番号はWO2007080392中に記載されている）、
ｄＡｂ８（ｄＡｂ１０）、ｄＡｂ１０、ｄＡｂ３６、ｄＡｂ７ｒ２０（ＤＯＭ７ｒ２０）、ｄＡｂ７ｒ２１（ＤＯＭ７ｒ２１）、ｄＡｂ７ｒ２２（ＤＯＭ７ｒ２２）、ｄＡｂ７ｒ２３（ＤＯＭ７ｒ２３）、ｄＡｂ７ｒ２４（ＤＯＭ７ｒ２４）、ｄＡｂ７ｒ２５（ＤＯＭ７ｒ２５）、ｄＡｂ７ｒ２６（ＤＯＭ７ｒ２６）、ｄＡｂ７ｒ２７（ＤＯＭ７ｒ２７）、ｄＡｂ７ｒ２８（ＤＯＭ７ｒ２８）、ｄＡｂ７ｒ２９（ＤＯＭ７ｒ２９）、ｄＡｂ７ｒ２９（ＤＯＭ７ｒ２９）、ｄＡｂ７ｒ３１（ＤＯＭ７ｒ３１）、ｄＡｂ７ｒ３２（ＤＯＭ７ｒ３２）、ｄＡｂ７ｒ３３（ＤＯＭ７ｒ３３）、ｄＡｂ７ｒ３３（ＤＯＭ７ｒ３３）、ｄＡｂ７ｈ２２（ＤＯＭ７ｈ２２）、ｄＡｂ７ｈ２３（ＤＯＭ７ｈ２３）、ｄＡｂ７ｈ２４（ＤＯＭ７ｈ２４）、ｄＡｂ７ｈ２５（ＤＯＭ７ｈ２５）、ｄＡｂ７ｈ２６（ＤＯＭ７ｈ２６）、ｄＡｂ７ｈ２７（ＤＯＭ７ｈ２７）、ｄＡｂ７ｈ３０（ＤＯＭ７ｈ３０）、ｄＡｂ７ｈ３１（ＤＯＭ７ｈ３１）、ｄＡｂ２（ｄＡｂｓ４、７、４１）、ｄＡｂ４、ｄＡｂ７、ｄＡｂ１１、ｄＡｂ１２（ｄＡｂ７ｍ１２）、ｄＡｂ１３（ｄＡｂ１５）、ｄＡｂ１５、ｄＡｂ１６（ｄＡｂ２１、ｄＡｂ７ｍ１６）、ｄＡｂ１７、ｄＡｂ１８、ｄＡｂ１９、ｄＡｂ２１、ｄＡｂ２２、ｄＡｂ２３、ｄＡｂ２４、ｄＡｂ２５（ｄＡｂ２６、ｄＡｂ７ｍ２６）、ｄＡｂ２７、ｄＡｂ３０（ｄＡｂ３５）、ｄＡｂ３１、ｄＡｂ３３、ｄＡｂ３４、ｄＡｂ３５、ｄＡｂ３８（ｄＡｂ５４）、ｄＡｂ４１、ｄＡｂ４６（ｄＡｂｓ４７、５２および５６）、ｄＡｂ４７、ｄＡｂ５２、ｄＡｂ５３、ｄＡｂ５４、ｄＡｂ５５、ｄＡｂ５６、ｄＡｂ７ｍ１２、ｄＡｂ７ｍ１６、ｄＡｂ７ｍ２６、ｄＡｂ７ｒ１（ＤＯＭ７ｒ１）、ｄＡｂ７ｒ３（ＤＯＭ７ｒ３）、ｄＡｂ７ｒ４（ＤＯＭ７ｒ４）、ｄＡｂ７ｒ５（ＤＯＭ７ｒ５）、ｄＡｂ７ｒ７（ＤＯＭ７ｒ７）、ｄＡｂ７ｒ８（ＤＯＭ７ｒ８）、ｄＡｂ７ｒ１３（ＤＯＭ７ｒ１３）、ｄＡｂ７ｒ１４（ＤＯＭ７ｒ１４）、ｄＡｂ７ｒ１５（ＤＯＭ７ｒ１５）、ｄＡｂ７ｒ１６（ＤＯＭ７ｒ１６）、ｄＡｂ７ｒ１７（ＤＯＭ７ｒ１７）、ｄＡｂ７ｒ１８（ＤＯＭ７ｒ１８）、ｄＡｂ７ｒ１９（ＤＯＭ７ｒ１９）、ｄＡｂ７ｈ１（ＤＯＭ７ｈ１）、ｄＡｂ７ｈ２（ＤＯＭ７ｈ２）、ｄＡｂ７ｈ６（ＤＯＭ７ｈ６）、ｄＡｂ７ｈ７（ＤＯＭ７ｈ７）、ｄＡｂ７ｈ８（ＤＯＭ７ｈ８）、ｄＡｂ７ｈ９（ＤＯＭ７ｈ９）、ｄＡｂ７ｈ１０（ＤＯＭ７ｈ１０）、ｄＡｂ７ｈ１１（ＤＯＭ７ｈ１１）、ｄＡｂ７ｈ１２（ＤＯＭ７ｈ１２）、ｄＡｂ７ｈ１３（ＤＯＭ７ｈ１３）、ｄＡｂ７ｈ１４（ＤＯＭ７ｈ１４）、ｄＡｂ７ｐ１（ＤＯＭ７ｐ１）、ならびにｄＡｂ７ｐ２（ＤＯＭ７ｐ２）(この配列の開示についてはWO2008096158参照。この配列と対応する核酸は参照により本明細書に組み込まれ、本明細書の開示の一部を構成する)。代替名をカッコ内に示している。例えば、ｄＡｂ８は代替名ｄＡｂ１０があり、表記はｄＡｂ８（ｄＡｂ１０）となる。
【０１８２】
特定の実施形態では、ｄＡｂはヒト血清アルブミンに結合し、下記からなる群から選択されるｄＡｂのアミノ酸配列と少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含む：
ＭＳＡ−１６、ＭＳＡ−２６、
ＤＯＭ７ｍ−１６（配列番号４７３）、ＤＯＭ７ｍ−１２（配列番号４７４）、ＤＯＭ７ｍ−２６（配列番号４７５）、ＤＯＭ７ｒ−１（配列番号４７６）、ＤＯＭ７ｒ−３（配列番号４７７）、ＤＯＭ７ｒ−４（配列番号４７８）、ＤＯＭ７ｒ−５（配列番号４７９）、ＤＯＭ７ｒ−７（配列番号４８０）、ＤＯＭ７ｒ−８（配列番号４８１）、ＤＯＭ７ｈ−２（配列番号４８２）、ＤＯＭ７ｈ−３（配列番号４８３）、ＤＯＭ７ｈ−４（配列番号４８４）、ＤＯＭ７ｈ−６（配列番号４８５）、ＤＯＭ７ｈ−１（配列番号４８６）、ＤＯＭ７ｈ−７（配列番号４８７）、ＤＯＭ７ｈ−２２（配列番号４８９）、ＤＯＭ７ｈ−２３（配列番号４９０）、ＤＯＭ７ｈ−２４（配列番号４９１）、ＤＯＭ７ｈ−２５（配列番号４９２）、ＤＯＭ７ｈ−２６（配列番号４９３）、ＤＯＭ７ｈ−２１（配列番号４９４）、ＤＯＭ７ｈ−２７（配列番号４９５）、ＤＯＭ７ｈ−８（配列番号４９６）、ＤＯＭ７ｒ−１３（配列番号４９７）、ＤＯＭ７ｒ−１４（配列番号４９８）、ＤＯＭ７ｒ−１５（配列番号４９９）、ＤＯＭ７ｒ−１６（配列番号５００）、ＤＯＭ７ｒ−１７（配列番号５０１）、ＤＯＭ７ｒ−１８（配列番号５０２）、ＤＯＭ７ｒ−１９（配列番号５０３）、ＤＯＭ７ｒ−２０（配列番号５０４）、ＤＯＭ７ｒ−２１（配列番号５０５）、ＤＯＭ７ｒ−２２（配列番号５０６）、ＤＯＭ７ｒ−２３（配列番号５０７）、ＤＯＭ７ｒ−２４（配列番号５０８）、ＤＯＭ７ｒ−２５（配列番号５０９）、ＤＯＭ７ｒ−２６（配列番号５１０）、ＤＯＭ７ｒ−２７（配列番号５１１）、ＤＯＭ７ｒ−２８（配列番号５１２）、ＤＯＭ７ｒ−２９（配列番号５１３）、ＤＯＭ７ｒ−３０（配列番号５１４）、ＤＯＭ７ｒ−３１（配列番号５１５）、ＤＯＭ７ｒ−３２（配列番号５１６）、ＤＯＭ７ｒ−３３（配列番号５１７）（本項の配列番号はWO2007080392中に記載されている）、
ｄＡｂ８、ｄＡｂ１０、ｄＡｂ３６、ｄＡｂ７ｒ２０、ｄＡｂ７ｒ２１、ｄＡｂ７ｒ２２、ｄＡｂ７ｒ２３、ｄＡｂ７ｒ２４、ｄＡｂ７ｒ２５、ｄＡｂ７ｒ２６、ｄＡｂ７ｒ２７、ｄＡｂ７ｒ２８、ｄＡｂ７ｒ２９、ｄＡｂ７ｒ３０、ｄＡｂ７ｒ３１、ｄＡｂ７ｒ３２、ｄＡｂ７ｒ３３、ｄＡｂ７ｈ２１、ｄＡｂ７ｈ２２、ｄＡｂ７ｈ２３、Ａｂ７ｈ２４、Ａｂ７ｈ２５、Ａｂ７ｈ２６、ｄＡｂ７ｈ２７、ｄＡｂ７ｈ３０、ｄＡｂ７ｈ３１、ｄＡｂ２、ｄＡｂ４、ｄＡｂ７、ｄＡｂ１１、ｄＡｂ１２、ｄＡｂ１３、ｄＡｂ１５、ｄＡｂ１６、ｄＡｂ１７、ｄＡｂ１８、ｄＡｂ１９、ｄＡｂ２１、ｄＡｂ２２、ｄＡｂ２３、ｄＡｂ２４、ｄＡｂ２５、ｄＡｂ２６、ｄＡｂ２７、ｄＡｂ３０、ｄＡｂ３１、ｄＡｂ３３、ｄＡｂ３４、ｄＡｂ３５、ｄＡｂ３８、ｄＡｂ４１、ｄＡｂ４６、ｄＡｂ４７、ｄＡｂ５２、ｄＡｂ５３、ｄＡｂ５４、ｄＡｂ５５、ｄＡｂ５６、ｄＡｂ７ｍ１２、ｄＡｂ７ｍ１６、ｄＡｂ７ｍ２６、ｄＡｂ７ｒ１、ｄＡｂ７ｒ３、ｄＡｂ７ｒ４、ｄＡｂ７ｒ５、ｄＡｂ７ｒ７、ｄＡｂ７ｒ８、ｄＡｂ７ｒ１３、ｄＡｂ７ｒ１４、ｄＡｂ７ｒ１５、ｄＡｂ７ｒ１６、ｄＡｂ７ｒ１７、ｄＡｂ７ｒ１８、ｄＡｂ７ｒ１９、ｄＡｂ７ｈ１、ｄＡｂ７ｈ２、ｄＡｂ７ｈ６、ｄＡｂ７ｈ７、ｄＡｂ７ｈ８、ｄＡｂ７ｈ９、ｄＡｂ７ｈ１０、ｄＡｂ７ｈ１１、ｄＡｂ７ｈ１２、ｄＡｂ７ｈ１３、ｄＡｂ７ｈ１４、ｄＡｂ７ｐ１、およびｄＡｂ７ｐ２。
【０１８３】
例えば、ヒト血清アルブミンに結合しているｄＡｂは、以下と少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含みうる：
ＤＯＭ７ｈ−２（配列番号４８２）、ＤＯＭ７ｈ−３（配列番号４８３）、ＤＯＭ７ｈ−４（配列番号４８４）、ＤＯＭ７ｈ−６（配列番号４８５）、ＤＯＭ７ｈ−１（配列番号４８６）、ＤＯＭ７ｈ−７（配列番号４８７）、ＤＯＭ７ｈ−８（配列番号４９６）、ＤＯＭ７ｒ−１３（配列番号４９７）、ＤＯＭ７ｒ−１４（配列番号４９８）、ＤＯＭ７ｈ−２２（配列番号４８９）、ＤＯＭ７ｈ−２３（配列番号４９０）、ＤＯＭ７ｈ−２４（配列番号４９１）、ＤＯＭ７ｈ−２５（配列番号４９２）、ＤＯＭ７ｈ−２６（配列番号４９３）、ＤＯＭ７ｈ−２１（配列番号４９４）もしくはＤＯＭ７ｈ−２７（配列番号４９５）（本項の配列番号はWO2007080392中に記載されている）、または、
ｄＡｂ８、ｄＡｂ１０、ｄＡｂ３６、ｄＡｂ７ｈ２１、ｄＡｂ７ｈ２２、ｄＡｂ７ｈ２３、Ａｂ７ｈ２４、Ａｂ７ｈ２５、Ａｂ７ｈ２６、ｄＡｂ７ｈ２７、ｄＡｂ７ｈ３０、ｄＡｂ７ｈ３１、ｄＡｂ２、ｄＡｂ４、ｄＡｂ７、ｄＡｂ１１、ｄＡｂ１２、ｄＡｂ１３、ｄＡｂ１５、ｄＡｂ１６、ｄＡｂ１７、ｄＡｂ１８、ｄＡｂ１９、ｄＡｂ２１、ｄＡｂ２２、ｄＡｂ２３、ｄＡｂ２４、ｄＡｂ２５、ｄＡｂ２６、ｄＡｂ２７、ｄＡｂ３０、ｄＡｂ３１、ｄＡｂ３３、ｄＡｂ３４、ｄＡｂ３５、ｄＡｂ３８、ｄＡｂ４１、ｄＡｂ４６、ｄＡｂ４７、ｄＡｂ５２、ｄＡｂ５３、ｄＡｂ５４、ｄＡｂ５５、ｄＡｂ５６、ｄＡｂ７ｈ１、ｄＡｂ７ｈ２、ｄＡｂ７ｈ６、ｄＡｂ７ｈ７、ｄＡｂ７ｈ８、ｄＡｂ７ｈ９、ｄＡｂ７ｈ１０、ｄＡｂ７ｈ１１、ｄＡｂ７ｈ１２、ｄＡｂ７ｈ１３もしくはｄＡｂ７ｈ１４。
【０１８４】
特定の実施形態では、ｄＡｂはヒト血清アルブミンに結合し、下記からなる群から選択されるｄＡｂのアミノ酸配列と少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含む：
ＤＯＭ７ｈ−２（配列番号４８２）、ＤＯＭ７ｈ−６（配列番号４８５）、ＤＯＭ７ｈ−１（配列番号４８６）、ＤＯＭ７ｈ−７（配列番号４８７）、ＤＯＭ７ｈ−８（配列番号４９６）、ＤＯＭ７ｈ−２２（配列番号４８９）、ＤＯＭ７ｈ−２３（配列番号４９０）、ＤＯＭ７ｈ−２４（配列番号４９１）、ＤＯＭ７ｈ−２５（配列番号４９２）、ＤＯＭ７ｈ−２６（配列番号４９３）、ＤＯＭ７ｈ−２１（配列番号４９４）、ＤＯＭ７ｈ−２７（配列番号４９５）（本項の配列番号はWO2007080392中に記載されている）、
ｄＡｂ７ｈ２１、ｄＡｂ７ｈ２２、ｄＡｂ７ｈ２３、Ａｂ７ｈ２４、Ａｂ７ｈ２５、Ａｂ７ｈ２６、ｄＡｂ７ｈ２７、ｄＡｂ７ｈ３０、ｄＡｂ７ｈ３１、ｄＡｂ２、ｄＡｂ４、ｄＡｂ７、ｄＡｂ３８、ｄＡｂ４１、ｄＡｂ７ｈ１、ｄＡｂ７ｈ２、ｄＡｂ７ｈ６、ｄＡｂ７ｈ７、ｄＡｂ７ｈ８、ｄＡｂ７ｈ９、ｄＡｂ７ｈ１０、ｄＡｂ７ｈ１１、ｄＡｂ７ｈ１２、ｄＡｂ７ｈ１３、およびｄＡｂ７ｈ１４。
【０１８５】
さらに詳細な実施形態では、ｄＡｂは、ヒト血清アルブミンに結合し、下記からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶκｄＡｂである：
ＤＯＭ７ｈ−２（配列番号４８２）、ＤＯＭ７ｈ−６（配列番号４８５）、ＤＯＭ７ｈ−１（配列番号４８６）、ＤＯＭ７ｈ−７（配列番号４８７）、ＤＯＭ７ｈ−８（配列番号４９６）（本項の配列番号はWO2007080392中に記載されている）、
ｄＡｂ２、ｄＡｂ４、ｄＡｂ７、ｄＡｂ３８、ｄＡｂ４１、ｄＡｂ５４、ｄＡｂ７ｈ１、ｄＡｂ７ｈ２、ｄＡｂ７ｈ６、ｄＡｂ７ｈ７、ｄＡｂ７ｈ８、ｄＡｂ７ｈ９、ｄＡｂ７ｈ１０、ｄＡｂ７ｈ１１、ｄＡｂ７ｈ１２、ｄＡｂ７ｈ１３およびｄＡｂ７ｈ１４。
【０１８６】
さらに詳細な実施形態では、ｄＡｂは、ヒト血清アルブミンに結合し、ｄＡｂ７ｈ３０およびｄＡｂ７ｈ３１から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨｄＡｂである。
【０１８７】
さらに詳細な実施形態では、ｄＡｂは、ｄＡｂ７ｈ１１またはｄＡｂ７ｈ１４である。
【０１８８】
他の実施形態では、ｄＡｂ、リガンド、またはアンタゴニストはヒト血清アルブミンに結合し、前出のいずれかのアミノ酸配列の１つ、２つ、または３つのＣＤＲ、例えば、ｄＡｂ７ｈ１１またはｄＡｂ７ｈ１４の１つ、２つ、または３つのＣＤＲを含む。
【０１８９】
血清アルブミンに結合する適切なラクダ科動物ＶＨＨとしては、WO2004/041862（Ablynx N.V.社）およびWO2007080392（これらに開示されているＶＨＨ配列および対応する核酸は参照により本明細書に組み込まれ、本明細書の開示の一部を構成する）で開示されたものが含まれ、配列Ａ（配列番号５１８）、配列Ｂ（配列番号５１９）、配列Ｃ（配列番号５２０）、配列Ｄ（配列番号５２１）、配列Ｅ（配列番号５２２）、配列Ｆ（配列番号５２３）、配列Ｇ（配列番号５２４）、配列Ｈ（配列番号５２５）、配列Ｉ（配列番号５２６）、配列Ｊ（配列番号５２７）、配列Ｋ（配列番号５２８）、配列Ｌ（配列番号５２９）、配列Ｍ（配列番号５３０）、配列Ｎ（配列番号５３１）、配列Ｏ（配列番号５３２）、配列Ｐ（配列番号５３３）、配列Ｑ（配列番号５３４）がある。これらの配列番号はWO2007080392またはWO2004/041862(Ablynx N.V.社)で引用されたものに対応する。特定の実施形態では、ラクダ科動物ＶＨＨはヒト血清アルブミンに結合し、WO2007080392で開示されたＡＬＢ１、または、配列番号５１８〜５３４のいずれかと少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。これらの配列番号はWO2007080392またはWO2004/041862で引用されたものに対応する。
【０１９０】
一部の実施形態では、リガンドまたはアンタゴニストは、血清アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）との結合について、本明細書で開示されたいずれかの抗血清アルブミンと競合する抗血清アルブミンｄＡｂを含む。
【０１９１】
別の実施形態では、アンタゴニストまたはリガンドは、ＩＬ−１３（例えば、ヒトＩＬ−１３）に対して特異的な結合部分を含み、ここで、この部分はWO2008096158で記載されているように非免疫グロブリン配列を含む。これらの結合部分、その製造法と選択法（例えば、多様なライブラリからの）および配列の開示は、参照により本明細書の開示の一部として本明細書に組み込まれる。
【０１９２】
半減期延長部分（例えばアルブミン）へのコンジュゲート
一実施形態では、一つまたは複数の半減期延長部分（例えば、アルブミン、トランスフェリンと断片、およびそれらの類似体）が、本発明のＩＬ−１３結合ポリペプチド、ｄＡｂまたはアンタゴニストとコンジュゲートまたは会合する。ＩＬ−１３結合フォーマットでの使用のために適切なアルブミン、アルブミン断片、またはアルブミン変異体の実例は、WO2005077042に記載されており、この開示は参照により本明細書に組み込まれ本明細書の開示の一部を構成する。特に、下記のアルブミン、アルブミン断片、またはアルブミン変異体は本発明に使用可能である：
・配列番号１（WO2005077042に記載。この配列は参照により明示的に本明細書に組み込まれる）；
・WO2005077042に記載の配列番号１のアミノ酸１〜２８７を含むか、またはそれからなるアルブミン断片または変異体；
・アルブミン、または、これらのアルブミン断片やアルブミン変異体で、次の配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む：（ａ）WO2005077042記載の配列番号１のアミノ酸５４〜６１；（ｂ）WO2005077042記載の配列番号１のアミノ酸７６〜８９；（ｃ）WO2005077042記載の配列番号１のアミノ酸９２〜ｌ００；（ｄ）WO2005077042記載の配列番号１のアミノ酸１７０〜１７６；（ｅ）WO2005077042記載の配列番号１のアミノ酸２４７〜２５２；（ｆ）WO2005077042記載の配列番号１のアミノ酸２６６〜２７７；（ｇ）WO2005077042記載の配列番号１のアミノ酸２８０〜２８８；（ｈ）WO2005077042記載の配列番号１のアミノ酸３６２〜３６８；（ｉ）WO2005077042記載の配列番号１のアミノ酸４３９〜４４７；（ｊ）WO2005077042記載の配列番号１のアミノ酸４６２〜４７５；（ｋ）WO2005077042記載の配列番号１のアミノ酸４７８〜４８６；および（ｌ）WO2005077042記載の配列番号１のアミノ酸５６０〜５６６。
【０１９３】
ＩＬ−１３結合フォーマットでの使用のために適切なアルブミン、アルブミン断片、および類似体の実例はWO03076567に記載されている。この開示は参照により本明細書に組み込まれ、本明細書の開示の一部を構成する。特に、下記のアルブミン、断片または変異体は本発明に使うことができる：
・WO03076567記載のヒト血清アルブミン（この配列情報は参照により明示的に本明細書に組み込まれる）。図３に一例を示す。
【０１９４】
・５８５アミノ酸の単一非グルコシル化ポリペプチド鎖を含むヒト血清アルブミン（ＨＡ）で分子式量６６、５００（Meloun, et al., FEBS Letters 58:136 (1975); Behrens, et al., Fed. Proc. 34:591 (1975); Lawn, et al., Nucleic Acids Research 9:6102-6114 (1981); Minghetti, et al., J. Biol. Chem. 261:6747 (1986)参照）
・アルブミンの多形変異体または類似体または断片（Weitkamp, et al., Ann. Hum. Genet. 37:219 (1973)に記載されている）
・アルブミン断片または変異体（EP322094に記載されている）。例えば、ＨＡ（１−３７３）、ＨＡ（１−３８８）、ＨＡ（１−３８９）、ＨＡ（１−３６９）およびＨＡ（１−４１９）、ならびに、１−３６９と１〜４１９の間の断片。
【０１９５】
・アルブミン断片または変異体（EP399666に記載されている）。例えば、ＨＡ（１−１７７）およびＨＡ（１−２００）、ならびに、ＨＡ（１−Ｘ）間の断片。ここでＸは１７８〜１９９の任意の数字。
【０１９６】
（一つまたは複数の）半減期延長部分（例えば、アルブミン、トランスフェリンおと断片、およびその類似体）が、本発明のＩＬ−１３結合ポリペプチド、ｄＡｂおよびアンタゴニストをフォーマットするために使われる場合は、ＩＬ−１３結合部分（例えば、抗ＩＬ−１３ｄＡｂ）に任意の適切な方法を使ってコンジュゲート可能である。コンジュゲート法としては、例えば、融合タンパク質をコードしている単一ヌクレオチド構築物を使って直接融合する、等の方法があり、この場合、融合タンパク質は、ＩＬ−１３結合部分のＮまたはＣ末端位置に半減期延長部分をもつ単一ポリペプチド鎖としてコードされている。あるいは、コンジュゲートは、部分間でペプチドリンカーを使って達成可能である。例えば、ペプチドリンカーは、WO03076567またはWO2004003019に記載されている（このリンカーの開示は、参照により本開示に組み込まれ本発明での使用のための実例を提供する）。通常、生体内血清中半減期を延長するポリペプチドは本来生体内で発生するもので、生体（例えばヒト）から望ましくない物質を除く内因性機構による分解または除去に抵抗性を示す。例えば、生体内で血清中半減期を延長するポリペプチドは、細胞外マトリックスからのタンパク質、血液中で見つかったタンパク質、血液脳関門で見つかったタンパク質、または神経組織中、腎臓に局在化しているタンパク質、肝臓、肺、心臓、皮膚または骨、ストレスタンパク質、疾患特異性タンパク質、または、ＦＣ輸送に関わるタンパク質から選択可能である。
【０１９７】
本発明の本開示全体の実施形態では、本発明のアンタゴニストまたはリガンド中の抗ＩＬ−１３「ｄＡｂ」を使う代わりに、当業者は、ＩＬ−１３に結合した、本発明のｄＡｂの一つ、またはそれ以上、または全３つのＣＤＲ（例えば、適切なタンパク質足場や骨格上にグラフトしたＣＤＲ、例えば、アフィボディ、ＳｐＡ足場、ＬＤＬ受容体クラスＡドメイン、ＥＧＦドメイン）を含むポリペプチドまたはドメインを使うことが可能であるということが意図されている。従って、本開示は全体としてｄＡｂの代わりにこのドメインを使ったアンタゴニストの開示を提供すると理解されるべきである。（この点に関しては、WO2008096158を参照のこと。この開示は参照により組み込まれる）。
【０１９８】
従って、一実施形態では、本発明のアンタゴニストは、Ｉｌ−１３や適切なフォーマットのこのｄＡｂの相補性決定領域に特異的に結合する免疫グロブリン単一可変ドメインまたはドメイン抗体（ｄＡｂ）を含む。アンタゴニストはこのｄＡｂからなる、または、基本的にこのｄＡｂからなるポリペプチドであってもよい。アンタゴニストは、抗体フォーマット（例えば、ＩｇＧ様フォーマット、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２）等の適切なフォーマットのｄＡｂ（またはｄＡｂのＣＤＲ）であっても、ＩＬ−１３に結合したｄＡｂ、および他の標的タンパク質、抗原、またはエピトープ（例えば血清アルブミン）に結合した第二のｄＡｂを含む二重特異性リガンドであってもよい。
【０１９９】
本発明に係るポリペプチド、ｄＡｂ、およびアンタゴニストは、当業者には既知の多様な適切な抗体フォーマットとしてフォーマットされていてもよい。これらの抗体フォーマットの例としては、次のものがある。ＩｇＧ様フォーマット、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、単鎖抗体、二重特性抗体、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体重鎖および／または軽鎖のホモ二量体とヘテロ二量体、前出のいずれかの抗原結合フラグメント（例えば、ＦＶフラグメント（例えば、単鎖ＦＶ（ＳＣＦＶ）、ジスルフィド結合ＦＶ）、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２ フラグメント）、単一可変ドメイン（例えばＶＨ、ＶＬ）、ｄＡｂ、および前出のいずれかの修飾バージョン（例えば、ポリアルキレングリコール（例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリブチレングリコール）、または他の適切なポリマーの共有結合により修飾される）。
【０２００】
一部の実施形態では、本発明は、ＩｇＧフォーマットのリガンド（例えば、抗ＩＬ−１３アンタゴニスト）を提供する。この様なフォーマットは、通常のＩｇＧ分子４鎖構造（２つの重鎖と２つの軽鎖）を有し、一つまたは複数の可変領域（ＶＨおよび／またはＶＬ ）が本発明のｄＡｂで置換されている。一実施形態では、各可変領域（２ＶＨ領域と２ＶＬ領域）はｄＡｂまたは単一可変ドメインで置換されており、その内の少なくとも一つが本発明の抗ＩＬ−１３ｄＡｂである。ＩｇＧ様フォーマットで含まれているｄＡｂまたは単一可変ドメインは、同じ特異性でも異なる特異性でも持つことが可能である。一部の実施形態では、ＩｇＧ様フォーマットは４価であり、１つ（抗ＩＬ−１３のみ）、２つ（例えば、抗ＩＬ−１３と抗ＳＡ）、３つ、４つの特異性を有することが可能である。例えば、ＩｇＧ様フォーマットは、同じ特異性の４つのｄＡｂを含む単一特異性になることも；同じ特異性の３つのｄＡｂと異なる特異性の別のｄＡｂを含む二重特異性になることも；同じ特異性の２つのｄＡｂと共通だが異なる特異性の２つのｄＡｂを含む二重特異性になることも；同じ特異性の第一、第二のｄＡｂ、異なる特異性の第三のｄＡｂ、および第一、第二、第三のｄＡｂとは別の特異性を含む三重特異性になることも；または、それぞれ異なる特異性を持つ４つのｄＡｂを含む四重特異性になることもできる。ＩｇＧ様フォーマットの抗原結合フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２ 、Ｆａｂ’、Ｆｖ、ｓｃＦｖ）は作製可能である。一実施形態では、ＩｇＧ様フォーマットまたは抗原結合フラグメントはＩＬ−１３に対し単一特異性であることも可能である。補体活性化および／または抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）機能が必要な場合は、リガンドはＩｇＧ様フォーマットでよい。必要に応じ、ＩｇＧ様フォーマットは変異定常領域（変種ＩｇＧ重鎖定常領域）を含み、ＦＣ受容体への結合および／または補体結合能を最小化できる。（例えば、Winter et al., GB 2,209,757 B; Morrison et al., WO 89/07142; Morgan et al., WO 94/29351, December 22, 1994を参照のこと）。
【０２０１】
本発明のリガンド（例えば、ポリペプチド、ｄＡｂ、アンタゴニスト）は、第二の免疫グロブリン単一可変ドメインに直接融合した第一の免疫グロブリン単一可変ドメインを含む融合タンパク質としてフォーマットできる。必要なら、このフォーマットは、さらに半減期延長部分を含んでもよい。例えば、リガンドは、血清アルブミンに結合した免疫グロブリン単一可変ドメインに直接融合した第二の免疫グロブリン単一可変ドメインに直接融合した第一の免疫グロブリン単一可変ドメインを含んでもよい。
【０２０２】
通常、標的に対し結合特異性を持つ結合部位を有するポリペプチドドメインの配向、およびリガンドがリンカーを含むか否かは、設計上の選択事項である。しかし、リンカーがあってもなくても、一部の配向は他の配向よりもよい結合特性を与える可能性がある。全配向（例えば、ｄＡｂ１−リンカー−ｄＡｂ２；ｄＡｂ２−リンカー−ｄＡｂ１）は本発明に包含され、所望の結合特性を与える配向を含むリガンドはスクリーニングにより容易に特定可能である。
【０２０３】
ｄＡｂモノマー、二量体、三量体を含む本発明にのポリペプチドおよびｄＡｂは、１つまたは両方のＣＨ２およびＣＨ３ドメイン、ならびに、任意選択でヒンジ領域を含む抗体のＦＣ領域に結合できる。例えば、単一ヌクレオチド配列としてＦＣ領域に結合するリガンドをコードしているベクターを、このポリペプチドを生成するために使用することが可能である。
【０２０４】
さらに、本発明は、前出ｄＡｂモノマーの二量体、三量体、およびポリマーを提供する。
【０２０５】
毒素部分または毒素を含むリガンド
また、本発明は、毒素部分また毒素を含むリガンド（例えば、抗ＩＬ−１３ｄＡｂ、ｄＡｂモノマー）に関する。適切な毒素部分は毒素（例えば、表面活性毒素、細胞毒）を含む。毒素部分または毒素は適切な方法によりリガンドに結合またはコンジュゲートできる。例えば、毒素部分または毒素はリガンドに直接にまたは適切なリンカーを介して共有結合により結合できる。適切なリンカーには切断不可能な、または切断可能なリンカー、例えば、細胞性酵素（例えば、細胞エステラーゼ、カテプシンＢ等の細胞プロテアーゼ）の切断サイト含むｐＨ切断リンカー、を含めてもよい。このような切断可能リンカーは、リガンドが内部に取り入れられた後、毒素部分または毒素を開放するリガンドを作成するために使用可能である。
【０２０６】
リガンドに毒素部分または毒素を結合またはコンジュゲートするために種々の方法を使うことが可能である。結合またはコンジュゲートの詳細方法は結合またはコンジュゲートされる毒素部分または毒素およびリガンドに依存することになる。必要なら、末端機能基を含むリンカーを、リガンドと毒素部分または毒素を結合するために使用可能である。通常、コンジュゲートは、反応官能基を含む（または、反応官能基を含むように修飾した）毒素部分または毒素をリンカーと、または直接リガンドと反応させて成し遂げられる。適切な条件下で第二の化学基と反応し、それにより共有結合を形成する化学的部分または官能基を含む（または含むように修飾された）毒素部分または毒素を反応させて共有結合が形成される。必要なら、適切な反応化学基を任意の適切な方法を使ってリガンドまたはリンカーに追加可能である。（Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, CA (1996)参照）。多くの適切な化学基の組合せが当業者には既知であり、例えば、アミン基は、トシラート、メシラート、ハロゲン基（クロロ、ブロモ、フルオロ、ヨード）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル エステル（ＮＨＳ）、等の求電子基と反応可能である。チオールは、マレイミド、ヨードアセチル、アクリロリル、ピリジル、ジスルフィド、５−チオール−２−ニトロ安息香酸 チオール（ＴＮＢチオール）、等と反応可能である。アルデヒド機能基は、アミン−、またはヒドラジド−含有分子とカップリングでき、アジド基は、三価の亜リン酸基と反応しホスホルアミダートまたはホスホルイミド結合を作る。活性化基を分子に導入する適切な方法は、当業者には既知である（例えば、Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, CA (1996)を参照）。
【０２０７】
適切な毒素部分および毒素には、例えば、マイタンシノイド（例えば、マイタンシノール、例えば、ＤＭ１、ＤＭ４）、タキサン、カリケアマイシン、デュオカルマイシン、またはこれらの派生物が含まれる。マイタンシノイドは、例えば、マイタンシノールまたはその類似体であってもよい。マイタンシノール類似体の例には、修飾された芳香族環（例えば、Ｃ−１９−デクロロ、Ｃ−２０−デメトキシ、Ｃ−２０−アシルオキシ）を持つもの、および他の位置に修飾がなされたもの（例えば、Ｃ−９−ＣＨ、Ｃ−１４−アルコキシメチル、Ｃ−１４−ヒドロキシメチルまたはアセロキシメチル、Ｃ−１５−ヒドロキシ／アシルオキシ、Ｃ−１５−メトキシ、Ｃ−１８−Ｎ−デメチル、４、５−デオキシ）が含まれる。マイタンシノールおよびマイタンシノール類似体は、例えば、米国特許第5,208,020号および第6,333,410号に記載されており、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。マイタンシノールは、例えば、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロプリオナート（また、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノアート（またはＳＰＰ）として知られている）、４−スクシンイミジル−オキシカルボニル−ａ−（２−ピリジルジチオ）−トルエン（ＳＭＰＴ）、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）ブチラート（ＳＤＰＢ）、２イミノチオラン、またはＳ−アセチルコハク酸無水物、を使って抗体および抗体フラグメントにカップリング可能である。タキサンは、例えば、タクソール、タキソテール、または新規タキサンであってもよい（WO 01/38318参照）。カリケアマイシンは、例えば、ブロモ錯体カリケアマイシン（例えば、α、β、またはγブロモ錯体）、ヨード錯体カリケアマイシン（例えば、α、β、またはγヨード錯体）、または類似体、および、それらの模倣体であってもよい。ブロモ錯体カリケアマイシンには、Ｉ１−ＢＲ、Ｉ２−ＢＲ、Ｉ３−ＢＲ、Ｉ４−ＢＲ、Ｊ１−ＢＲ、Ｊ２−ＢＲおよびＫ１−ＢＲが含まれる。ヨード錯体カリケアマイシンには、Ｉ１−Ｉ、Ｉ２−Ｉ、Ｉ３−Ｉ、Ｊ１−Ｉ、Ｊ２−Ｉ、Ｌ１−ＩおよびＫ１−ＢＲが含まれる。カリケアマイシンおよびそれらの変異体、類似体、模倣体は、例えば、米国特許第4,970,198号；第5,264,586号；第5,550,246号；第5,712,374号、および第5,714,586号に記載があり、これらの内容は、参照により本明細書に組み込まれる。デュオカルマイシン類似体（例えば、ＫＷ−２１８９、ＤＣ８８、ＤＣ８９ＣＢＩ−ＴＭＩ、およびこれらの派生物）は、例えば、米国特許第5,070,092号、米国特許第5,187,186号、米国特許第5,641,780号、米国特許第5,641,780号、米国特許第4,923,990号、および米国特許第5,101,038号、に記載されており、これらの内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０２０８】
これに限定されないが、他の毒素の例には、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサート）、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパクロランブシル、ＣＣ−１０６５（米国特許第5,475,092号、第5,585,499号、第5,846,545号参照）、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリネス（例えば、ダウノルビシン（以前のダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前のアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、マイトマイシン、ピュロマイシンアントラマイシン（ＡＭＣ））、デュオカルマイシンおよび類似体またはこれらの派生体、および抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、タキソール、アウリスタチン（例えば、アウリスタチンＥ）およびマイタンシノイド、およびこれらの類似体または同族体、が含まれる。
【０２０９】
また、毒素は、フリーラジカルジェネレーター（例えば、セレニウム含有毒素部分）のような表面活性毒素または放射性核種含有部分であってもよい。適切な放射性核種含有部分には、例えば、放射性ヨウ素（１３１Ｉまたは１２５Ｉ）、イットリウム（９０Ｙ）、ルテニウム（１７７Ｌｕ）、アクチニウム（２２５Ａｃ）、プラセオジミウム、アスタチン（２１１Ａｔ）、レニウム（１８６Ｒｅ）、ビスマス（２１２Ｂｉまたは２１３Ｂｉ）、インジウム（１１１Ｉｎ）、テクネチウム（９９ｍＴｃ）、リン（３２Ｐ）、ロジウム（１８８Ｒｈ）、硫黄（３５Ｓ）、炭素（１４Ｃ）、トリチウム（３Ｈ）、クロミウム（５１Ｃｒ）、塩素（３６Ｃｌ）、コバルト（５７Ｃｏまたは５８Ｃｏ）、鉄（５９Ｆｅ）、セレニウム（７５Ｓｅ）、またはガリウム（６７Ｇａ）、を含む部分が含まれる。
【０２１０】
毒素は、細菌源からのタンパク質、ポリペプチド、またはペプチド（例えば、ジフテリア毒素、緑膿菌外毒素（ＰＥ））、および、植物タンパク質、例えば、リシンＡ鎖（ＲＴＡ）、リボソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ）ゲロニン、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、サポリン、ドデカンドロンであってもよく、これらは毒素として使用されることが意図されている。
【０２１１】
また、特定の標的タンパク質の生成を担うｍＲＮＡに対し、結合、無効化、分解促進、または産生の阻害を行うように設計した核酸のアンチセンス化合物も毒素として使用することもできる。アンチセンス化合物には、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡ、一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチド、あるいはそれらの類似体が含まれ、これらは、個々のｍＲＮＡ種と特異的にハイブリダイズし、ｍＲＮＡ種の転写および／またはＲＮＡプロセシング、および／またはコードされたポリペプチドの翻訳を阻害し、それによってそれぞれのコードされたポリペプチドの量を減少させることができる。Ching, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 10006-10010 (1989); Broder, et al., Ann. Int. Med. 113: 604-618 (1990); Loreau, et al., FEBS Letters 274: 53-56 (1990)。有用なアンチセンス治療剤には、例えば、ＶｅｇｌｉｎＴＭ（ＶａｓＧｅｎｅ社）およびＯＧＸ−０１１（Ｏｎｃｏｇｅｎｅｘ社）が含まれる。
【０２１２】
毒素は、光活性剤であってもよい。適切な光活性剤には、ポルフィリン基材、例えば、ポルフィマーナトリウム、葉緑素ポルフィリン、クロリンＥ６、ヘマトポルフィリン派生体それ自体、フタロシアニン、エチオプルプリン、テキサフリン、等が含まれる。
【０２１３】
毒素は、細胞内標的（細胞内抗体）に結合するｄＡｂ等の、細胞内標的に結合する抗体または抗体フラグメントであってよい。そのような抗体または抗体フラグメント（ｄＡｂ）は、所定の細胞内コンパートメントまたは標的を対象とすることができる。例えば、それらの抗体または抗体フラグメント（ｄＡｂ）は、ｅｒｂＢ２、ＥＧＦＲ、ＢＣＲ−ＡＢＬ、ｐ２１Ｒａｓ、カスパーゼ３、カスパーゼ７、Ｂｃｌ−２、ｐ５３、サイクリンＥ、ＡＴＦ−１／ＣＲＥＢ、ＨＰＶ１６Ｅ７、ＨＰ１、ＩＶ型コラゲナーゼ、カテプシンＬ、および、Kontermann, R.E., Methods, 34:163-170 (2004)（その全体を参照により本明細書に組み込む）に記載されているものから選択した細胞内標的と結合することができる。
【０２１４】
WO2007085815の実施例は参照により本明細書に組み込まれ、本発明のリガンドにも同様に適用可能な、関連アッセイ、フォーマッティングおよび実験の詳細を提供する。
【０２１５】
アッセイ
ＩＬ−１３
ＩＬ−１３サンドイッチＥＬＩＳＡ法
ＭＡＸＩＳＯＲＰＴＭプレート（高タンパク質結合ＥＬＩＳＡプレート、Ｎｕｎｃ社、デンマーク）を２．５μｇ／ｍｌのコーティング抗体（Ｍｏｄｕｌｅ Ｓｅｔ、Ｂｅｎｄｅｒ ＭｅｄＳｙｓｔｅｍｓ社、ウイーン、オーストリア）で一晩コートして、次に、ＰＢＳに入れた０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０で１回洗浄し、０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ と０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０のＰＢＳ溶液でブロッキングする。プレートを再度洗浄した後、１５０ｐｇ／ｍｌのＩＬ−１３（ＧＳＫ社）をＤＯＭ１０ｄＡｂ（すなわち、抗ＩＬ−１３ｄＡｂ）希釈系列またはＩＬ−１３単体と混合する。プレートを２回洗浄した後、ＩＬ−１３を捕捉抗体に結合させ、ビオチン結合検出抗体（Ｍｏｄｕｌｅ Ｓｅｔ、Ｂｅｎｄｅｒ ＭｅｄＳｙｓｔｅｍｓ社）、続いてペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（Ｍｏｄｕｌｅ Ｓｅｔ、Ｂｅｎｄｅｒ ＭｅｄＳｙｓｔｅｍｓ社）を使って検出する。最後に、プレートを３回洗浄し次いでＴＭＢ基質（ＫＰＬ社、ゲーサーズバーグ、米国）と共にインキュベートした後、ＨＣｌを添加して反応を停止し４５０ ｎｍでの吸光度を読みとる。抗ＩＬ−１３ｄＡｂはＩＬ−１３結合を減少させ、その結果ＩＬ−１３のみの対照と比べ吸光度を減少させる。
【０２１６】
８２００細胞検出システムを使ったＩＬ−１３受容体結合アッセイ（ＲＢＡ）
ＳＰＨＥＲＯＴＭヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ社）ポリスチレン粒子（０．５％ｗ／ｖ）（ヤギ抗ヒト粒子：Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ社、リバティービル、米国）を２０μｇのＩＬ−１３Ｒα１／Ｆｃキメラ、またはＩＬ−１３Ｒα２／Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ミネアポリス、米国）を用いて一晩コートする。その後、以下の試薬を、側面が黒で底面が透明な３８４ウェルのＦＭＡＴプレート（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、フォスターシティ、米国）内で混合する。当該試薬は、ＤＯＭ−１０ｄＡｂまたは０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡのＰＢＳによる希釈系列；０．５μｇ／ｍｌビオチン化抗ＩＬ−１３抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）；０．２５μｇ／ｍｌ ＳＴＲＥＰＴＡＶＩＤＩＮ ＡＬＥＸ ＡＦＬＵＯＲ(登録商標)６４７複合体（蛍光プローブ、分子プローブ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｔｄ社、ペーズリー、英国）；１０ｎｇ／ｍｌ組換えヒトＩＬ−１３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）；およびＩＬ−１３Ｒ２／Ｆｃ被覆粒子の１：１０希釈液である。プレートを７時間インキュベートした後、８２００細胞検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）で読み取る。ＩＬ−１３とレセプター被覆粒子との結合は、蛍光発光として８２００細胞検出システムにより検出される複合体を形成させる。抗ＩＬ−１３ｄＡｂ活性により、ＩＬ−１３結合の低下と、その結果、ＩＬ−１３のみの対照と比較して蛍光発光の減少が起こる。
【０２１７】
ＩＬ−１３細胞アッセイ
単離されたｄＡｂについて、培養したＴＦ−１細胞（ＡＴＣＣ(登録商標)カタログ番号ＣＲＬ−２００３）におけるＩＬ−１３誘導増殖を抑制する能力試験が可能である。簡単に説明すると、フェノールレッドを含まないＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｔｄ社、ペーズリー、英国）中の４００００個のＴＦ−１細胞を組織培養マイクロタイタープレートのウェル内に入れ、最終濃度５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ミネアポリス、米国）および検証対象ｄＡｂの希釈物を混合する。この混合物を３７℃、５％ＣＯ２で７２時間インキュベートする。その後、ＣＥＬＬＴＩＴＥＲ９６(登録商標)試薬（生存率測定用の比色定量試薬、Ｐｒｏｍｅｇａ社、マディソン、米国）を加え、ウェルあたりの細胞数を４９０ｎｍにおける吸光度を測定することによって定量する。抗ＩＬ−１３ｄＡｂ活性は、細胞増殖を低下させ、Ａ４９０もＩＬ−１３のみに比べ相当する低い値になる。
【０２１８】
ＢＩＡＣＯＲＥ(登録商標)解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）スクリーニング
ストレプトアビジン被覆ＳＡチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ）を約５００ＲＵのビオチン化ＩＬ−１３（Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ社、ミネアポリス、米国）でコートする。可溶性ＤＡＢを含む上清をランニングバッファで１：５に希釈する。５０〜１００μｌの希釈上清を５０μｌ／分の流速で注入（ｋｉｎｉｎｊｅｃｔ法）し、続いて、解離フェーズとして５分間保持する。親株と比較して改善された解離速度を有するクローンを、目視によって、またはＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアＶ４．１（Ｂｉａｃｏｒｅ社）を用いて測定することによって確認する。
【０２１９】
抗ＩＬ−１３ ｄＡｂとの競合ＢＩＡＣＯＲＥ(登録商標)
これらの実験は、約４００ＲＵのビオチン化ＩＬ−１３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）と結合させたストレプトアビジン被覆ＳＡチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ社）を用いて、ＢＩＡＣＯＲＥ(登録商標)３０００装置（表面プラズモン共鳴装置、Ｂｉａｃｏｒｅ社）で行う。ブランクのフローセルとインライン比較しながら、ＨＢＳ−ＥＰランニングバッファ（Ｂｉａｃｏｒｅ社）中を流速３０μｌ／分で抗原被覆フローセルに検体を通した。最初のｄＡｂを注入し、続いて、すぐに第二のｄＡｂをＢｉａｃｏｒｅの同時注入機能（ｃｏ−ｉｎｊｅｃｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を用いて注入する。この競合プロトコルは、通常、ＩＬ−１３との結合について被検抗体またはフラグメントと、既知ｄＡｂ（または他の抗体ポリペプチド）との間のＩＬ−１３に対する結合の競合を評価するのに使用される。
【０２２０】
競合とエピトープマッピング
抗ＩＬ−１３ｄＡｂのエピトープマッピング
抗ＩＬ−１３ｄＡｂのエピトープ特異性を調べるために、Ｂｉａｃｏｒｅ競合実験を行うことができる。ｄＡｂを注入し、続いて、すぐに第二のｄＡｂを注入する。既に他の（第一の）ｄＡｂが結合していると、ある（第二の）ｄＡｂが、ＩＬ−１３に結合できない場合、これは、これらのｄＡｂが同じエピトープに結合することを示している。本競合プロトコルは、通常、被検抗体またはフラグメントと、既知ｄＡｂ（または他の抗体ポリペプチド）との間のＩＬ−１３への結合に対する競合（およびエピトープマッピング）を評価するのに使用することができる。僅かに改変したＢＩＡｃｏｒｅプロトコルの使用も可能で、このプロトコルでは、第一のｄＡｂをＩＬ−１３表面に注入し、その後、高親和結合性ｄＡｂを、ＩＬ−１３表面を飽和させる高濃度（５μＭ）で注入し、最後に前記ｄＡｂを再度注入する。高親和結合性ｄＡｂで飽和する前と後で結合に差があれば、エピトープは少なくとも部分的に重複している。
【０２２１】
ＩＬ−１３誘導Ｂ細胞増殖
血液を正常な血液ドナーから集める。ＰＢＭＣをフィコール勾配で分離し、その後、Ｂ細胞をネガティブＢ細胞分離キット（ＥａｓｙＳｅｐ Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ社）を用いて分離する。純度（任意選択肢として、９８％を超える）は、フローサイトメトリー、並びにＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１９およびＣＤ２３での染色によって測定される。その後、Ｂ細胞を、放射線照射ＣＤ４０Ｌ＋Ｌ細胞で被覆されたプレートにＩＬ−１３（１０ｎｇ／ｍｌ）存在下１×１０５細胞／ウェルで蒔く。培養物を、最後の１８時間は３［Ｈ］チミジンを添加して、５日間インキュベートする。抗ＩＬ−１３ｄＡｂを培養開始時に１０ｎＭまたは１００ｎＭで添加する。
【０２２２】
Ｂ細胞増殖アッセイ
ＣＤ４０Ｌが、ＩＬ−１３に対して反応するように細胞を活性化できることは、以前に示されていた。実際、ドナーは、Ｂ細胞を放射線照射されたＣＤ４０Ｌ＋Ｌ細胞と共に、ＩＬ−１３の濃度を増加させてインキュベートしたときに、用量依存性増殖を示す試験が可能である。ネガティブ対照としてＢ細胞のみ、またはＣＤ４０Ｌで形質移入したＬ細胞のみを使用する。抗ＩＬ−１３ ｄＡｂの添加により、ドナー由来のＢ細胞のＩＬ−１３誘導増殖が抑制されるかどうか評価できる。
【０２２３】
抑制型ｄＡｂ（WO2007085815参照）の一例であるが、平均抑制率が１０ｎＭおよび１００ｎＭの濃度においてそれぞれ８０％および１００％であった。Ｂ細胞増殖の完全な抑制も、ポジティブ対照としての３μｇ／ｍｌの抗ＩＬ−１３ｍＡｂ（Ｒ＆Ｄ社）で観察された。ＩＬ−１３と結合しない対照ｄＡｂは、このＢ細胞増殖を抑制できなかった。
【０２２４】
ＩＬ−１３のＩＬ−１３Ｒα２に対する結合の抑制
競合アッセイにより、ＩＬ−１３のＩＬ−１３Ｒα２に対する結合を抑制する抗ＩＬ−１３ｄＡｂの能力に関する試験が可能である。
【０２２５】
変異型ＩＬ−１３（Ｒ１３０Ｑ）への結合
ＩＬ−１３の遺伝的変異体は、喘息（Heinzmann et al. Hum Mol Genet. (2000) 9549-59）および気管支過敏症（Howard et al., Am. J. Resp. Cell Molec. Biol. (2001) 377-384）のリスクの増加と関連している。それ故、抗ＩＬ−１３ ｄＡｂが変異型ＩＬ−１３ （Ｒ１３０Ｑ）と結合できるかどうかを測定するため、変異型ＩＬ−１３（Ｒ１３０Ｑ）を用いｄＡｂ量を増加させてＴＦ−１増殖アッセイが行われる。変異体に結合したｄＡｂは、変異型ＩＬ−１３誘導ＴＦ−１増殖を、例えば、約０．５〜１０ｎＭのＮＤ５０値で抑制できる可能性がある。
【０２２６】
アカゲザルおよびカニクイザルＩＬ−１３との交差反応性
ｄＡｂに求められる要件は、アカゲザルおよびカニクイザルＩＬ−１３との交差反応性であろう。この目的に対し、ｄＡｂをＴＦ−１細胞増殖アッセイ試験が行える。当該アッセイでは、細胞をヒトＩＬ−１３（５ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）、アカゲザルＩＬ−１３（５ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社）またはカニクイザルＩＬ−１３（当所で発現させたカニクイザルＩＬ−１３を含む上清の１：４０００希釈）で刺激する。ｄＡｂの用量反応により、本設定におけるＮＤ５０が測定される。
【０２２７】
ＩＬ−４
ＩＬ−４受容体結合アッセイ（ＲＢＡ）
ＭａｘｉＳｏｒｐＴＭ プレート（高タンパク質結合ＥＬＩＳＡプレート、Ｎｕｎｃ社、デンマーク）を０．５μｇ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−４Ｒ／Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ミネアポリス、米国）で一晩コートし、ウェルをＰＢＳに入れた０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄後、続いて、ＰＢＳで３回洗浄した後、２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡのＰＢＳ溶液でブロッキングする。プレートを再度洗浄した後、希釈系列のＩＬ−４または抗ＩＬ−４ｄＡｂと混合した１０ｎｇ／ｍｌのビオチン化ＩＬ−４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を添加する。ＩＬ−４の結合をペルオキシダーゼ標識抗ビオチン抗体（Ｓｔｒａｔｅｃｈ社、ソーハム、英国）により検出し、その後、ＴＢＭ基質（ＫＰＬ社、ゲーサーズバーグ、米国）で発色させる。反応を塩酸の添加によって停止させ、４５０ｎｍにおける吸光度を読み取る。抗ＩＬ−４ｄＡｂ活性は、受容体に対するＩＬ−４結合を減少させ、結果として、ＩＬ−４のみの対照と比較して吸光度が減少する。
【０２２８】
ＩＬ−４細胞アッセイ
単離したｄＡｂに対し、培養したＴＦ−１細胞（ＡＴＣＣ(登録商標)）カタログ番号ＣＲＬ−２００３）におけるＩＬ−４誘導増殖の抑制能力について試験できる。簡単に説明すると、フェノールレッドを含まないＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｔｄ社、ぺーズリー、英国）中の４００００個のＴＦ−１細胞を組織培養マイクロタイタープレートのウェル内に入れ、最終濃度１ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ミネアポリス、米国）および検証対象ｄＡｂの希釈物と混合する。混合物を３７℃、５％ＣＯ２で７２時間インキュベートし、その後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６(登録商標)試薬（生存能測定用の比色定量試薬、Ｐｒｏｍｅｇａ社、マディソン、米国）を加え、ウェルあたりの細胞数を４９０ｎｍにおける吸光度を測定することによって定量する。抗ＩＬ−４ｄＡｂ活性は、細胞増殖の低下を生じさせ、またＩＬ−４単独よりも、相当する低いＡ４９０値になる。
【０２２９】
抗ＩＬ−４ｄＡｂとの競合Ｂｉａｃｏｒｅ(登録商標)
これらの実験は、約４００ ＲＵのビオチン化ＩＬ−４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）と組み合わせたストレプトアビジン被覆ＳＡチップ（表面プラズモン共鳴システム、Ｂｉａｃｏｒｅ社）を用いて、競合Ｂｉａｃｏｒｅ(登録商標)３０００装置で行われる。ブランクのフローセルとインライン比較しながら、ＨＢＳ−ＥＰランニングバッファ（Ｂｉａｃｏｒｅ社）を使い流速３０μｌ／ｍｉｎで、検体を抗原被覆フローセル上に通過させる。第１のｄＡｂを注入し、続いて、直ちに第２のｄＡｂをＢｉａｃｏｒｅ社の同時注入機能（ｃｏ−ｉｎｊｅｃｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を用いて注入する。この競合プロトコルは、通常、被検抗体またはフラグメントの既知ｄＡｂ（または他の抗体ポリペプチド）とのＩＬ−４への結合に対する競合を評価するのに使用できる。
【０２３０】
実施例
実施例１：ＤＯＭ１０リードｄＡｂの選択
ＤＯＭ１０−５３−５４６
抗ＩＬ−１３ドメイン抗体（ｄＡｂ）であるＤＯＭ１０―５３−５４６を、ＩＬ−４とＩＬ−１３に対する二重標的分子を単離する試みとしてヒトＩＬ−１３に対して選択されたインライン融合ライブラリから単離した。ＡＳＴＫＧＰＳリンカーを使ってＩＬ−４結合ｄＡｂのＤＯＭ９−１１２−２１０をＤＯＭ−５３−４０９ｄＡｂと結合しＤＯＭ９−１１２−２１０−ＡＳＴＫＧＰＳ−ＤＯＭ１０−５３−４０９を作成した。ＤＯＭ９−１１２−２１０およびＤＯＭ１０−５３−４０９はWO2007085815に開示されている。ＡＳＴＫＧＰＳリンカーはWO2007085814に開示されている。ＤＯＭ９ｄＡｂを固定して、１２のＤＯＭ１０−５３−４０９ライブラリを構築し、より優れた効果と発現量を有するインライン融合物を選択するために、それぞれ全３つのＣＤＲおよびＣＤＲの周りのフレームワーク残基を含むＤＯＭ１０−５３−４０９の残基を多様化した。これらのライブラリは残基を多様化するためにＮＮＳコドンを組み込んだオリゴヌクレオチドを使って作成した。ＮＮＳコドンにより、２０アミノ酸または１つの終止コドンの合計３２コドンの内から任意に置換することよって標的残基のランダム化が行われる。Ｎは、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃの４つのヌクレオチドの内の１つを表し、Ｓは、ＧまたはＣを表す。これらのオリゴヌクレオチドを使って行った一次ＰＣＲを、次にアセンブリＰＣＲを使って組み合わせる。アセンブルＰＣＲ（「ｐｕｌｌ−ｔｈｒｏｕｇｈ」またはＳＯＥ（Ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｂｙ Ｏｖｅｒｌａｐ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）ＰＣＲとして知られている）は、２つの一次ＰＣＲ産物（一つは多様化されたもの、もう一つは不変のもの）を、分解やライゲーションなしに２つの一次ＰＣＲ産物の相補性末端を利用して結合させる。
【０２３１】
インライン融合ライブラリは、ストレプトアビジン被覆磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ社、ノルウェイ）と１０ｎＭのビオチン化ヒトＩＬ−１３を使った２ラウンドの選択に供される。ＩＬ−１３のビオチン化は、５倍モル過剰のＥＺ−Ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ社、ロックフォード、米国）を使って行った(Henderikx et al., 2002, Selection of antibodies against biotinylated antigens. Antibody Phage Display: Methods and protocols, Ed. O'Brien and Atkin, Humana Press) 。
【０２３２】
第２ラウンドの産物をｐＤＯＭ５ベクター（図１）に挿入した。ｐＤＯＭ５はｐＵＣ１１９ベースの発現ベクターで、ＬａｃＺプロモーターの制御下にある。上澄み中へのｄＡｂの発現は汎用ＧＡＳリーダーシグナルペプチドとのＮ末端での融合により確実に実行される。さらに、ｃ−ｍｙｃタグがｄＡｂのＣ末端に付加された。大腸菌ＨＢ２１５１の形質転換の後、クローンを、９６個の深底ウエルプレートに１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを添加したｏｖｅｒｎｉｇｈｔ ｅｘｐｒｅｓｓ ａｕｔｏ−ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ培地（ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ、Ｎｏｖａｇｅｎ社）０．５ｍｌ／ウエルでいれて９５０ｒｐｍ、３０℃、湿度８０％でｉｎｆｏｒｓ社の高速シェーカーを用いて２日間発現させた。次いで、プレートを４０００ｒｐｍで２０分、遠心分離を行い、できた上澄み液をHBSバッファーで１／５に薄め、１５００ＲＵ プロテインＡ ＣＭ５チップへの結合に対しＢｉａｃｏｒｅＴＭを用いてスクリーニングを行い、改善発現量を有するクローンを選別した。メーカーの推奨に従い、一級アミンカップリングによりプロテインＡをＣＭ５チップとカップリングした（アミンカップリングキット、Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）。試料をＢｉａｃｏｒｅで５０μｌ／分の流速で流した。上面を０．１Ｍのグリシン（ｐＨ２）を使ってベースラインまで戻した。改善発現量の任意のクローンを５０ｍｌのｏｖｅｒｎｉｇｈｔ ｅｘｐｒｅｓｓ ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ培地中、３０℃で４８時間発現させ、遠心分離（４、０００ｒｐｍ、２０分）で細胞を沈殿させた後、上澄みを４℃で一晩Ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅ−ｐｒｏｔｅｉｎ Ａビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、結合能力：5 mg ｄＡｂ／mLビーズ)と一緒にインキュベートした。次に、ビーズをドリップカラムに詰め、カラムの１０倍量のＰＢＳで洗浄した後、０．１Ｍの塩酸グリシン（ｐＨ２）で溶出させた。１Ｍトリス塩酸（ｐＨ８．０）で中和し、１２％アクリルアミドトリスグリシンゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）上でSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法を行った後、タンパク質の純度を目視で推定した。タンパク質濃度と収率（細菌培養物Ｌ当たりのｍｇで）を２８０ｎｍでのアミノ酸組成から計算した吸光係数を使って測定した。改善発現量を有するクローンの２００Ｒｕビオチン化ヒトＩＬ−１３ストレプトアビジンチップに対する結合についてＢｉａｃｏｒｅを使って解析し効力を評価した。これらのライブラリから選択された最も有効なクローンは、ＤＯＭ９−１１２−２１０−ＡＳＴＫＧＰＳ−ＤＯＭ１０−５３−５４６（フレームワーク残基２８〜３０が多様化されているライブラリからのもの）であった。これは、ＤＯＭ９−１１２−２１０−ＡＳＴＫＧＰＳ−ＤＯＭ１０−５３−４０９と類似の発現レベルであったが、ＩＬ−１３に対しては効力が改善されていた。次に、ＤＯＭ１０の一領域であるＤＯＭ１０−５３−５４６をｐＤＯＭ５ベクターに挿入しクローニングした。ＤＯＭ１０−５３−５４６のＤＮＡとアミノ酸配列を図２と図３にまとめる。
【０２３３】
ＤＯＭ１０−５３−５６７
ＤＯＭ１０−５３−５６７を、カニクイザルＩＬ−１３に対する改善効力を有するｄＡｂの選別の試みとして、ビオチン化したカニクイザル（ｃｙｎｏ）ＩＬ−１３のＤＯＭ１０−５３−４７４（このｄＡｂはWO2007085815に開示されている）のエラープローンライブラリに対して行った選別物から単離した。エラープローンＤＯＭ１０−５３−４７４のライブラリは、メーカーの説明書（カタログＮｏ．２００５５０）に従って、ＭｕｔａｚｙｍｅＴＭ ＤＮＡポリメラーゼを使用するＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＧｅｎｅＭｏｒｐｈ ＰＣＲ突然変異誘発キットを使って作成した。エラープローンＤＯＭ１０−５３−４７４のライブラリを使い１０ｎＭと５ｎＭのカニクイザルＩＬ−１３それぞれに対し２ラウンドの選別を行った。第２ラウンドの産物をｐＤＯＭ５ベクターに挿入し、前述の様に９６個の深底ウエルプレートにいれて大腸菌ＨＢ２１５１中で発現させた。プレートを遠心分離し、上澄みをHBSバッファーで１／５に薄め、Ｂｉａｃｏｒｅを使って２００Ｒｕ カニクイザルＩＬ−１３ストレプトアビジンチップで選別し、ＤＯＭ１０−５３−４７４に比べて改善されたカニクイザルＩＬ−１３への結合特性を持ったクローンを探した。ＤＯＭ１０−５３−５６７が、カニクイザルＩＬ−１３およびヒトＩＬ−１３の両方に対し改善された結合速度を有するクローンとして選択された。ＤＮＡとアミノ酸配列を図２と図３にまとめる。
【０２３４】
ＤＯＭ１０−５３−５６８
ＤＯＭ１０−５３−５６７の効力をさらに改善する試みとして、有力な抗ＩＬ−１３ｄＡｂのＤＯＭ１０−５３−３８６（このｄＡｂはWO2007085815で開示されている）のＣＤＲをＤＯＭ１０−５３−５６７に導入し、アセンブルＰＣＲを使ってＤＯＭ１０−５３−５６８を作成し、ｐＤＯＭ５ベクターに挿入しクローニングを行った。ＤＮＡとアミノ酸配列を図２と図３にまとめる。
【０２３５】
ＤＯＭ１０−５３−６１６
ＤＯＭ１０−５３−５４６の効力をさらに改善する試みとして、有力な抗ＩＬ−１３ｄＡｂであるＤＯＭ１０−５３−３８６のＣＤＲ２を導入しＤＯＭ１０−５３−５４６のＣＤＲ２と置換して、ＤＯＭ１０−５３−６１６作成した。これをｐＤＯＭ５ベクターに挿入しクローニングを行った。ＤＮＡとアミノ酸配列を図２と図３にまとめる。
【０２３６】
実施例２：配列解析
図４ａ、図４ｂ、図４ｃ及び図４ｄに示されるように、ＤＯＭ１０−５３−５４６は、ＤＯＭ１０−５３−４７４と比較して５位置にアミノ酸変化がある。それは、Ｎ末端からＣＤＲ１への位置２８（ＴからＶ）と３０（ＡからＰ）の２つのフレームワーク変異、および、ＣＤＲ２における位置５４（ＨからＫ）、５６（ＥからＧ）、５７（ＶからＫ）の３つの残基である。ＤＯＭ１０−５３−５６７はＤＯＭ１０−５３−４７４とは位置２８（ＴからＶ）で一つのアミノ酸が異なるのみである。
【０２３７】
ＤＯＭ１０−５３−５６８も同じ変異を持つが、さらに２つのアミノ酸変化がＣＤＲ２の位置５６（ＥからＫ）と５７（ＶからＩ）に追加される。ＤＯＭ１０−５３−６１６はＤＯＭ１０−５３−５６８と同じ３つの変異全部を持つが、さらに位置３０のアミノ酸が変化（ＡからＰ）している。位置２８のトレオニンからバリンへのアミノ酸変化は４つのｄＡｂ全部で共通である。ＤＯＭ１０−５３−４７４を含むこれら全てのｄＡｂは同じＣＤＲ１とＣＤＲ３を有する。全ナンバリングはＫａｂａｔによるものである。
【０２３８】
実施例３：ＤＯＭ１０ｄＡｂの発現と効力
以下に示すように、新ｄＡｂはＤＯＭ１０−５３−４７４より高い効力を有する。さらに、新ｄＡｂは、ヒトと非ヒト霊長類ＩＬ−１３との間の結合に対し種間交差反応性（および有効なＩＬ−１３種間中和特性）を有する。これにより、新ｄＡｂが、ＩＬ−１３媒介症状と疾患の治療および／または予防のための薬剤として、また薬剤開発のベースとして非常に有用になる。というのは、このような開発には、通常、非ヒト霊長類はヒトの良いモデルでありその後のヒトに対する研究の指針となるデータを与えてくれると信じられているので、ヒトでの試験に先立ち非ヒト霊長類種の最適候補の試験が必要となるからである。
【０２３９】
上記ＩＬ−１３ ＤＯＭ１０ｄＡｂの対照比較をするために、これらをｍｙｃタグ無しでｐＤＯＭ５ベクターに挿入し、Ｍａｃｈ１ケミカルコンピテントセル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に入れて、前述と同様にｏｖｅｒｎｉｇｈｔ ｅｘｐｒｅｓｓ ａｕｔｏ−ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ培地の５０ｍｌ培養物中で発現させた。前述のＳｔｒｅａｍｌｉｎｅ−ｐｒｏｔｅｉｎ Ａを使ってタンパク質を精製し、生成物をＳＤＳ ＰＡＧＥにより評価した。簡単に述べれば、ＳＤＳ ＰＡＧＥのために、５μｌのｄＡｂ、１５μｌのＨ２Ｏおよび６μｌのサンプルバッファを混合し、９０℃で２０分間インキュベートし、続いて、氷の上に２分置き、サンプルをＳＤＳ ＰＡＧＥゲルにローディングした。この結果、全ｄＡｂが純粋調製物であることがわかった。
【０２４０】
ＤＯＭ１０ｄＡｂの発現レベルを表１にまとめた。ＤＯＭ１０−５３−５４６とＤＯＭ１０−５３−６１６の発現レベルは、試験したＤＯＭ１０−５３−４７４や他の新ｄＡｂよりずっと良好であった。
【表１】
【０２４１】
精製ＤＯＭ１０ｄＡｂのヒトとカニクイザルＩＬ−１３に対するアフィニティはＢｉａｃｏｒｅ解析により評価した。解析は、ビオチン化ＩＬ−１３を使って行った。約１５０ＲＵのビオチン化ＩＬ−１３をストレプトアビジン（ＳＡ）チップ（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に被覆した。上表面を０．１Ｍグリシン（ｐＨ２）を使ってベースラインまで戻した。ｄＡｂをこの表面上を所定の濃度、５０μｌ／分の流量で流した。データをＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を使い解析して、１：１結合モデルにフィッティングした。Ｂｉａｃｏｒｅを２５℃で作動させた。ヒトおよびカニクイザルＩＬ−１３ｄＡｂに対するＫＤ値を表１にまとめた。新ｄＡｂ全てがヒトとカニクイザル両方のＩＬ−１３に対し優れた効力を示し、ＤＯＭ１０−５３−４７４よりずっと好結果であった。ＤＯＭ１０−５３−５６７およびＤＯＭ１０−５３−５６８がヒトとカニクイザル両方のＩＬ−１３に対し最良の効力を示した。
【０２４２】
また、ｄＡｂの試験を、ＤＯＭ１０のＥＬＩＳＡアッセイを使ってヒトＩＬ−１３に対する効力の評価のため、および細胞ベースのＨＥＫ Ｂｌｕｅ−ＳＴＡＴ６（ＨＥＫ ＳＴＡＴ）アッセイを使ってヒト、カニクイザル、アカゲザルＩＬ−１３に対する効力を評価するため行った。ＤＯＭ１０ ＥＬＩＳＡにより、ＤＯＭ１０ｄＡｂのＩＬ−１３に対する結合能力およびＩＬ−１３検出抗体に対する結合を抑制する能力を測定する。ＭＡＸＩＳＯＲＰＴＭプレート（高タンパク結合ＥＬＩＳＡプレート、Ｎｕｎｃ社、デンマーク）を２．５μｇ／ｍｌのコーティング抗体（Ｍｏｄｕｌｅ Ｓｅｔ、Ｂｅｎｄｅｒ ＭｅｄＳｙｓｔｅｍｓ社、ウイーン、オーストリア）で一晩コートして、次に、ＰＢＳに入れた０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０で１回洗浄し、０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ と０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０のＰＢＳ溶液を用い室温で２時間ブロッキングする。前に述べたように、プレートを２回洗浄した後、１５０ｐｇ／ｍｌのＩＬ−１３（ＧＳＫ社）をＤＯＭ１０ｄＡｂ（すなわち、抗ＩＬ−１３ｄＡｂ）希釈系列と混合し、１時間インキュベートする。プレートを２回洗浄した後、ＩＬ−１３を捕捉抗体に結合させ、ビオチンコンジュゲート検出抗体（Ｍｏｄｕｌｅ Ｓｅｔ、Ｂｅｎｄｅｒ ＭｅｄＳｙｓｔｅｍｓ社）、続いてペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（Ｍｏｄｕｌｅ Ｓｅｔ、Ｂｅｎｄｅｒ ＭｅｄＳｙｓｔｅｍｓ社）を使って検出する。最後に、プレートを３回洗浄し次いでＴＭＢ基質（ＫＰＬ社、ゲーサーズバーグ、米国）と共にインキュベートした後、ＨＣｌを添加して反応を停止し４５０ｎｍでの吸光度を読みとる。抗ＩＬ−１３ｄＡｂはＩＬ−１３結合を減少させ、その結果ＩＬ−１３のみの対照と比べ吸光度を減少させる。
【０２４３】
ＨＥＫ Ｂｌｕｅ−ＳＴＡＴ６アッセイは、ＨＥＫ Ｂｌｕｅ−ＳＴＡＴ６細胞中インビトロでヒトＩＬ−１３刺激アルカリフォスファターゼ産生を抑制するｄＡｂの能力を測定するものである。このアッセイは、ＳＴＡＴ６遺伝子を安定に形質移入したＨＥＫ２９３細胞、およびＳＥＡＰ（分泌胚性アルカリフォスファターゼ）レポーター遺伝子（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、サンジエゴ）を使用する。ＩＬ−１３で刺激すると、ＳＥＡＰが上澄み中に分泌され、これを比色法を使って測定する。可溶性ｄＡｂは、ＳＴＡＴ６経路経由によるＩＬ−１３のシグナル伝達を阻止する能力が試験される。
【０２４４】
簡潔に言えば、５ｘ１０４のＨＥＫ−Ｂｌｕｅ ＳＴＡＴ６細胞をＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｔｄ社、ペーズリー、英国）中で、組換えＩＬ１３１（ＧＳＫ社）と予め３７℃で１時間インキュベートしたｄＡｂと一緒に培養する。予備インキュベーションは等容量のｄＡｂと組換えＩＬ１３を使って実施した。この予備インキュベーション混合物は、次に、等容量のＨＥＫ−Ｂｌｕｅ ＳＴＡＴ６細胞に添加する。このようにして、このアッセイでのＩＬ１３の最終濃度は３μｇ／ｍｌになり、ｄＡｂを２００ｎＭ〜０．０５ｎＭの容量反応範囲で試験する。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートする。次いで、培養上澄みをＱｕａｎｔｉＢｌｕｅ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社）と混合し、６４０ｎｍで吸光度を読みとる。抗ＩＬ−１３ｄＡｂ活性は、ＳＴＡＴ６活性を減少させ、Ａ６４０値もＩＬ−１３刺激に比べ、相当する減少が生ずる。
【０２４５】
ＤＯＭ１０ｄＡｂのアッセイデータの結果を表１にまとめた。Ｂｉａｃｏｒｅでのデータと同じく、ＤＯＭ１０−５３−５６７はヒト、カニクイザル、アカゲザルＩＬ−１３に対して最良の効力を示した。ＤＯＭ１０−５３−５６８はＤＯＭ１０−５３−５６７と類似のＫＤ値を示したが、このアッセイでは効力は低かった。
【０２４６】
データが示すように、全新ｄＡｂは、ヒト、カニクイザルＩＬ−１３の間で交差反応性を示し、試験した全形式のＩＬ−１３に中和能を示した。全新ｄＡｂ（ＤＯＭ１０−５３−６１６を除いて）は、ヒト、カニクイザル、アカゲザルＩＬ−１３に対してＤＯＭ１０−５３−４７４よりもずっと大きな中和能力を示した。ＤＯＭ１０−５３−５６７はカニクイザルとアカゲザルＩＬ−１３に対してＤＯＭ１０−５３−４７４よりずっと効果の高い中和剤であったが、両者はヒトＩＬ−１３に対しては、大体同程度の中和能であった。
【０２４７】
実施例４：新ｄＡｂのプロテアーゼ安定性
同時係属中の特許出願PCT/GB2008/050399およびPCT/GB2008/050405に一般的に記載されている技術を用いて、新ｄＡｂのプロテアーゼ安定性を評価した。これらの出願の開示は、その全体が本明細書に組み込まれ、ｄＡｂのプロテアーゼ耐性試験法の詳細および本発明の組成物を提供し、また、本明細書における本発明のプロテアーゼ耐性ｄＡｂを使った方法の明確な開示を提供する。
【０２４８】
本発明のＤＯＭ１０クローンのトリプシン安定性を評価するために、０．３ｍｇ／ｍｌの精製タンパク質をシークエンシンググレードのトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用い、２５：１のｄＡｂ：トリプシン比でＰＢＳバッファに入れて消化した。反応は３０℃、反応時間１、２、４、および２４時間で実施し、プロテアーゼ阻害剤の混合物（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｔａｂｌｅｔ、Ｒｏｃｈｅ社）を添加して反応を停止した後、次の解析まで−２０℃で貯蔵した。
【０２４９】
消化したタンパク質は、ＨＢＳバッファで１／４００に希釈し、Ｂｉａｃｏｒｅの１５０Ｒｕビオチン化ヒトＩＬ−１３ストレプトアビジンチップ上を流速５０μｌ／ｍｌで流し、未消化ｄＡｂの量を評価した。チップ面は、０．１Ｍグリシン（ｐＨ２）を使って各注入サイクル間で元に戻した。各時点での消化されたｄＡｂの最大Ｒｕと未消化ｄＡｂの最大Ｒｕを比較して計算し未消化ｄＡｂの割合を求めた。結果を図５に示した。試験したｄＡｂの中で、ＤＯＭ１０−５３−５６７は、他のｄＡｂに比べトリプシン分解に対する耐性が高く、他よりＤＯＭ１０−５３−４７４に類似していた。ＤＯＭ１０−５３−５４６およびＤＯＭ１０−５３−６１６は他に比べトリプシン分解に対する耐性が低かった。プロテアーゼによる分解が少なくなる傾向があり、そのため長い半減期になると思われるため、我々は、トリプシン消化に対する耐性が生体内でのｄＡｂの安定性を示すと信じている。
【０２５０】
実施例５：ＤＳＣ（示差走査熱量測定）
ｄＡｂの熱安定性を示差走査熱量計（ＤＳＣ）を用いて測定した。試験は１ｍｇ／ｍｌのｄＡｂのＰＢＳバッファ溶液で行った。ｄＡｂを一晩ＰＢＳバッファ中へ透析した。ＰＢＳバッファは全サンプルで参照用として使われた。キャピラリーセルマイクロ熱量計ＶＰ−ＤＳＣ（Ｍｉｃｒｏｃａｌ社、マサッチューセッツ、米国）を使って、加熱速度１８０℃／時間でＤＳＣを行った。典型的な走査としては、通常、参照バッファとタンパク質サンプルの量法に対し、２５〜９０℃の範囲であった。参照とサンプル対毎に、キャピラリーセルをＤｅｃｏｎ（Ｆｉｓｈｅｒ−Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）の１％水溶液、続いてＰＢＳ溶液で洗浄した。データ出力結果をＯｒｉｇｉｎ ７ Ｍｉｃｒｏｃａｌソフトウエアで解析した。得られたサンプルのＤＳＣ出力から参照バッファのＤＳＣの出力を差し引いた。サンプルの正確な分子濃度をデータ解析ルーチンに入力し、融点（Ｔｍ）、エンタルピー（ΔＨ）、およびファントホッフエンタルピー（ΔＨｖ）値を得た。データを非2状態モデル（ｎｏｎ−２−ｓｔａｔｅ ｍｏｄｅｌ）でフィッティングした。結果は、表１にまとめた。ｄＡｂの融点は４９、９℃〜５５．５℃の範囲にある。ＤＯＭ１０−５３−５４６およびＤＯＭ１０−５３−５６７がそれぞれ５５．５℃と５４．５℃の最も高いＴｍを示した。試験したｄＡｂの中では、ＤＯＭ１０−５３−５６７は、最高の効力を有する利点のみならず、かなり高いＴｍも示し、ｄＡｂの相対的に高い安定性を示すものと見られる。ｄＡｂが有効性を最大化できる生体内の温度でより安定で、良好な有効期限を持つと思われるので、これは、メリットの多いことであろう。
【背景技術】
【０００１】
Ｔｈ２型免疫反応は抗体の産生および液性免疫の促進を行い、細胞外病原体を撃退するために作り出されている。Ｔｈ２細胞はＩｇ産生（液性免疫）のメディエーターであり、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３を産生する（Tanaka, et. al., Cytokine Regulation of Humoral Immunity, 251-272, Snapper, ed., John Wiley and Sons, New York (1996)）。Ｔｈ２型免疫反応は特定のサイトカイン（例えば、ＩＬ−３、ＩＬ−４）と特異的な型の抗体（ＩｇＥ、ＩｇＧ４）を産生し、アレルギー反応に特有の涙目、気道炎症や肺の気道筋収縮等の喘息症状を起こす可能性がある。
【０００２】
インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）は多面的なサイトカインで、免疫グロブリンのＩｇＧ４、ＩｇＥへのアイソタイプスイッチ、ＣＤ２３アップレギュレーション、ＶＣＡＭ−１発現を誘導し、例えば、好酸球や肥満細胞の直接活性化を行う。ＩＬ−１３は主にＴｈ２細胞により産生され、ＬＰＳ刺激単球細胞により炎症性サイトカイン（ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＴＮＦ、ＩＬ−８）の産生を阻害する。ＩＬ―１３はＩＬ−４の近縁種であり、アミノ酸レベルで２０〜２５％の配列上の類似性がある（Minty et. al., Nature, 363(6417):248-50 (1993)）。ＩＬ−１３の多くの作用はＩＬ−４に似ているが、ＩＬ−４に備わっている活性Ｔ細胞またはＴ細胞クローンに対する増殖促進作用は持っていない（Zurawski et al., EMBO J. 12:2663 (1993)）。
【０００３】
細胞表面受容体および受容体複合体は異なったアフィニティでＩＬ−１３と結合する。ＩＬ−１３と結合する受容体および受容体複合体の基本成分はＩＬ−４Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα１およびＩＬ−１３Ｒα２である。これらの鎖は細胞の表面にモノマーまたはＩＬ−４Ｒα／ＩＬ−１３Ｒα１またはＩＬ−４Ｒα／ＩＬ−１３Ｒα２のヘテロダイマーとして発現している。ＩＬ−４ＲαモノマーはＩＬ−４に結合するがＩＬ−１３には結合しない。ＩＬ−４Ｒα／ＩＬ−１３Ｒα１とＩＬ−４Ｒα／ＩＬ−１３Ｒα２ヘテロダイマーはＩＬ−４、ＩＬ−１３の両方に結合する。
【０００４】
ＩＬ−１３はその生物学的機能の故に治療上重要なタンパク質である。ＩＬ−１３には抗腫瘍免疫反応を促進する潜在能力が認められた。ＩＬ−１３はアレルギー疾患の原因に関与しているため、このサイトカインの阻害剤により治療上の恩恵が得られる。ＩＬ−１３の阻害剤はWO2007085815で開示されており、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。WO2007085815では、有効な抗ＩＬ−１３抗体単一可変ドメイン、ＤＯＭ１０−５３−４７４が開示されている。ＩＬ−１３の阻害試薬に対する改善要求があるため、本発明者はＤＯＭ１０−５３−４７４より性能、特に、ＩＬ−１３との結合反応速度、および／または中和能、および／またはＩＬ−１３種間交差反応性、の優れたＩＬ−１３阻害剤を見いだそうとしてきた。発明者は、このような利点が治療改善および抗ＩＬ−１３予防薬およびこれらの進展をもたらすであろうことを理解したからである。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、改善されたＩＬ−１３免疫グロブリン単一可変ドメイン、アンタゴニスト、およびこれらを含む組成物、方法、用途を提供する。
【０００６】
一つの態様では、本発明は、ＤＯＭ１０−５３−４７４（配列番号１）と比較して１、２、３、４または５のアミノ酸変化以外はＤＯＭ１０−５３−４７４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）と同一のアミノ酸配列を含む抗インターロイキンー１３（ＩＬ−１３）免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。ここで、単一可変ドメインは、Ｋａｂａｔ ナンバリング方式の位置２８にバリンを有し、また単一可変ドメインは任意選択でＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）からなるものではない。
【０００７】
第二の態様では、本発明は、ＤＯＭ１０−５３−４７４（配列番号１）と比較して１、２、３、４または５のアミノ酸変化以外はＤＯＭ１０−５３−４７４と同一のアミノ酸配列を含む抗インターロイキンー１３（ＩＬ−１３）免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。ここで、単一可変ドメインは配列ＸＧＸ’Ｘ’’を有し、ＧはＫａｂａｔ ナンバリング方式の位置５４にあり、
Ｘ＝ＨまたはＫであり；
Ｘ’＝ＧまたはＫであり；
Ｘ’’＝ＫまたはＩであり、
また、単一可変ドメインは任意選択でＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）からなるものではない。
【０００８】
さらなる態様では、本発明は、その可変ドメインがＤＯＭ１０−５３−５４６（配列番号２）；ＤＯＭ１０−５３−５６７（配列番号３）；ＤＯＭ１０−５３−５６８（配列番号４）；またはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）である、抗インターロイキンー１３（ＩＬ−１３）免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。
【０００９】
さらなる態様では、本発明は、その可変ドメインがＤＯＭ１０−５３−５４６（配列番号２）；ＤＯＭ１０−５３−５６７（配列番号３）またはＤＯＭ１０−５３−５６８（配列番号４）である、抗インターロイキンー１３（ＩＬ−１３）免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。
【００１０】
本発明の一つの態様では、ＤＯＭ１０−５３−５４６（配列番号６）；ＤＯＭ１０−５３−５６７（配列番号７）；ＤＯＭ１０−５３−５６８（配列番号８）；またはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号９）ヌクレオチド配列によりコードされる抗インターロイキンー１３（ＩＬ−１３）免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。ここで、単一可変ドメインは任意選択でＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）からなるものではない。
【００１１】
本発明の一つの態様では、ＤＯＭ１０−５３−５４６（配列番号２）；ＤＯＭ１０−５３−５６７（配列番号３）；ＤＯＭ１０−５３−５６８（配列番号４）；またはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）に対し少なくとも９９％同一、または１００％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。ここで、ポロペプチドは任意選択でＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）を含まないものである。
【００１２】
本発明はまた、当該単一可変ドメインを含むアンタゴニスト、融合タンパク質、およびデバイス、用途、方法、ならびに組成物に関する。アンタゴニストは、患者、例えばヒト患者における、ＩＬ−１３媒介疾患および症状の対処に、例えば、喘息、慢性閉塞性肺疾患またはインフルエンザ等の肺疾患の治療および／または予防に有効である。
【００１３】
別の観点による本発明のさらなる実施形態については、本明細書中で企図されており、以下に開示される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ｐＤＯＭ５ベクターマップ。
【図２】（ａ）本発明の抗ＩＬ−１３免疫グロブリン単一可変ドメインおよび従来技術のＩＬ−１３単一可変ドメインＤＯＭ１０−５３−４７４（配列番号１）のアミノ酸配列；ならびに（ｂ）単一可変ドメインのＣＤＲのヌクレオチド配列（Ｋａｂａｔによる）。
【図３】本発明の抗ＩＬ−１３免疫グロブリン単一可変ドメインおよび従来技術のＩＬ−１３単一可変ドメインＤＯＭ１０−５３−４７４をコードしているヌクレオチド配列。
【図４ａ】ＤＯＭ１０−５３−４７４（配列番号１）のアミノ酸配列と本発明の抗ＩＬ−１３免疫グロブリン単一可変ドメインのアミノ酸配列との比較。ナンバリングはＫａｂａｔによる。ＤＯＭ１０−５３−４７４（配列番号１）に対するアミノ酸残基の差は、差が発生している位置にアミノ酸（一文字形式）で示した。ＤＯＭ１０−５３−４７４に対して特定の位置にアミノ酸に差がない場合は、“．”で示した。ＣＤＲは下線で示した。
【図４ｂ】ＤＯＭ１０−５３−４７４（配列番号１）のアミノ酸配列と本発明の抗ＩＬ−１３免疫グロブリン単一可変ドメインのアミノ酸配列との比較。ナンバリングはＫａｂａｔによる。ＤＯＭ１０−５３−４７４（配列番号１）に対するアミノ酸残基の差は、差が発生している位置にアミノ酸（一文字形式）で示した。ＤＯＭ１０−５３−４７４に対して特定の位置にアミノ酸に差がない場合は、“．”で示した。ＣＤＲは下線で示した。
【図４ｃ】ＤＯＭ１０−５３−４７４（配列番号１）のアミノ酸配列と本発明の抗ＩＬ−１３免疫グロブリン単一可変ドメインのアミノ酸配列との比較。ナンバリングはＣｈｏｔｈｉａによる。ＤＯＭ１０−５３−４７４（配列番号１）に対するアミノ酸残基の差は、差が発生している位置にアミノ酸（一文字形式）で示した。ＤＯＭ１０−５３−４７４に対して特定の位置にアミノ酸に差がない場合は、“．”で示した。ＣＤＲは下線で示した。
【図４ｄ】ＤＯＭ１０−５３−４７４（配列番号１）のアミノ酸配列と本発明の抗ＩＬ−１３免疫グロブリン単一可変ドメインのアミノ酸配列との比較。ナンバリングはＣｈｏｔｈｉａによる。ＤＯＭ１０−５３−４７４（配列番号１）に対するアミノ酸残基の差は、差が発生している位置にアミノ酸（一文字形式）で示した。ＤＯＭ１０−５３−４７４に対して特定の位置にアミノ酸に差がない場合は、“．”で示した。ＣＤＲは下線で示した。
【図５】本発明の抗ＩＬ−１３免疫グロブリン単一可変ドメインおよび従来技術のＩＬ−１３単一可変ドメインＤＯＭ１０−５３−４７４（配列番号１）のトリプシン消化。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本明細書において本発明は実施形態を参照しながら簡明な明細書記述がなされるように記述されている。実施形態は、本発明を逸脱することなく種々に組合せまたは分離してしてもよいことは意図されており、また、理解されるべきである。
【００１６】
別に定義されていなければ、本明細書に使われている全ての技術と科学の用語は、通常の当業者（例えば、細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリダイゼーション技術、および生化学の分野）により共通に理解されているものと同じ意味を有する。標準的な技術は、分子、遺伝、および生化学の手法（一般的には、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. and Ausubel et al., 分子生物額に於ける簡易手法(1999) 4th Ed, John Wiley & Sons, Inc. を参照のこと。これらは参照して本明細書に組み込まれる）および化学的手法で使われている。
【００１７】
用語「DOM10-53-474 (配列番号１)と比較してアミノ酸配列の変化」は、各変化がアミノ酸の置換、欠損、または付加のいずれかであるアミノ酸の変化を含む。一実施形態では、アミノ酸の置換のみがこの用語の意味となっている。
【００１８】
本明細書で使われている用語「リガンド」は、少なくとも一つのＩＬ−１３に特異的に結合する結合部位を有するペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質部分を含む化合物を指す。本発明に係るリガンドは、別の結合特異性を有するが、標的化合物に対する結合部位を同時に形成する可変ドメインペアーを含まない（すなわち、同時にＩＬ−１３に対する結合部位を形成する免疫グロブリン重鎖可変ドメインと免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含まない）免疫グロブリン可変ドメインを任意選択的に含んでも良い。さらに任意選択で、標的に対し特異的に結合する結合部位を有する各ドメインが所望の標的（例えば、ＩＬ−１３）に特異的に結合を行う免疫グロブリン単一可変ドメイン（例えば、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（例えば、ＶＨ、ＶＨＨ）、免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（例えば、ＶＬ））であっても良い。標的（例えば、ＩＬ−１３）に対し特異的に結合する結合部位を有する各ポリペプチドドメインは、結合ドメインが標的に特異的に結合するように適切なフォーマットで所望の標的（例えば、ＩＬ−１３）に対し特異的に結合する抗体または抗体フラグメント（例えば、免疫グロブリン単一可変ドメイン）の一つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでもよい。例えば、ＣＤＲは、アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）、ＳｐＡ足場、ＬＤＬ受容体クラスＡドメイン、またはＥＧＦドメイン等の適切なタンパク質の足場または骨格にグラフト結合してもよい。さらに、本明細書に記述されているようにリガンドは二価（ヘテロ二価）または多価（ヘテロ多価）であってもよい。このように、「リガンド」は２つのｄＡｂを含み、これらが別の標的（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−１３）に結合するポリペプチドを含む。また、リガンドは、抗体フォーマット（例えば、ＩｇＧ様のフォーマット、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２）、または、本明細書記載のアフィボディ、ＳｐＡ足場、ＬＤＬ受容体クラスＡドメイン、ＥＧＦドメイン、アビマー、二重特異的、多特異的リガンド等の適切なタンパク質足場や骨格のようなフォーマットで別の標的（またはｄＡｂのＣＤＲ）に結合するポリペプチドを含む。
【００１９】
また、標的（例えば、ＩＬ−１３）に特異的結合を行う結合部位を有するポリペプチドドメインは、所望の標的、例えばアフィボディ、ＳｐＡドメイン、ＬＤＬ受容体クラスＡドメイン、アビマー（例えば、U.S. Patent Application Publication Nos. 2005/0053973, 2005/0089932, 2005/0164301参照）から選ばれたタンパク質ドメインに対する結合部位を含むタンパク質ドメインであってもよい。必要に応じ、「リガンド」は、さらに一つまたは複数のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質部分や非ペプチド部分（例えば、ポリアルキレングリコール、脂質、炭水化物）等の付加的部分をそれぞれ独立に含んでもよい。例えば、リガンドは、本明細書に記述したように半減期延長部分を含んでもよい（例えば、ポリアルキレングリコール部分、アルブミン、アルブミン断片またはアルブミンバリアントを含む部分、トランスフェリン、トランスフェリン断片、またはトランスフェリンバリアントを含む部分、アルブミンに結合する部分、新生児ＦＣ受容体に結合する部分）。
【００２０】
「二重特異的リガンド」は、一番目の抗原またはエピトープ結合部位（例えば、一番目の免疫グロブリン単一可変ドメイン）および二番目の抗原またはエピトープ結合部位（例えば、二番目の免疫グロブリン単一可変ドメイン）であり、これらの結合部位または可変ドメインが２つの抗原（例えば、別の抗原もしくは同じ抗原の２つのコピー）または単一特異的免疫グロブリンでは本来結合されない同じ抗原上の２つのエピトープ、を含むリガンドを指す。例えば、２つのエピトープは同じ抗原上にあってもよいが、同じエピトープであっても、または単一特異的リガンドにより結合される程充分に近接していてもいけない。一実施形態では、本発明に係る二重特異的リガンドは、別の特異性を有する結合部位または可変ドメインを含むが、同じ特異性を有する（すなわち、単一結合部位を形成しない）相互に相補的な可変ドメインペアー（すなわち、ＶＨ／ＶＬペアー）を含まない。
【００２１】
本明細書で使われている用語「標的」は、結合部位を有するポリペプチドが結合する生体分子（例えば、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、脂質、炭水化物）を指す。例えば、標的は、細胞内標的（例えば、細胞内タンパク質標的）、可溶性性標的（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−１３等の分泌タンパク質）、または細胞表面標的（例えば、膜タンパク質、受容体タンパク質）であってもよい。一実施形態では、標的はＩＬ−４またはＩＬ−１３である。
【００２２】
用語「免疫グロブリン単一可変ドメイン」は、それぞれ別のまたは他のＶ領域やドメインの抗原やエピトープに特異的に結合する抗体の可変ドメイン（ＶＨ、ＶＨＨ、ＶＬ）を指す。免疫グロブリン単一可変ドメインは、単一免疫グロブリン可変ドメイン（すなわち、ここでは、免疫グロブリン単一可変ドメインは追加の可変ドメインの抗原と独立に結合する）による抗原結合が必要でない他の可変領域または可変ドメインを伴ったフォーマット（例えば、ホモまたはヘテロマルチマー）で存在してもよい。「ドメイン抗体」または「ｄＡｂ」は、本明細書でこの用語が使われる場合は、「免疫グロブリン単一可変ドメイン」である。「単一免疫グロブリン可変ドメイン」は、本明細書でこの用語が使われる場合は、「免疫グロブリン単一可変ドメイン」と同じである。「単一抗体可変ドメイン」または「抗体単一可変ドメイン」は、本明細書でこの用語が使われる場合は、「免疫グロブリン単一可変ドメイン」と同じである。免疫グロブリン単一可変ドメインは、一実施形態ではヒト抗体可変ドメインであるが、げっ歯類（例えば、WO 00/29004に開示されており、その内容全体は参照により本明細書に組み込まれる）、テンジクザメ、およびラクダ科動物のＶＨＨ ｄＡｂ等の他の種からの単一抗体可変ドメインも含有する。ラクダ科動物のＶＨＨは、ラクダ、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダおよびグアナコ、等の種から得られた免疫グロブリン単一可変ドメインポリペプチドで、生来軽鎖を欠損する重鎖抗体を産生する。ＶＨＨは、ヒト化可能である。
【００２３】
本明細書に記述されている免疫グロブリン単一可変ドメイン（ｄＡｂ）は、相補性決定ドメイン（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）を含む。ＣＤＲとフレームワーク（ＦＲ）ドメインの位置とナンバリング方式は、Ｋａｂａｔ等により決定されてきた（Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office (1991)）。本明細書で開示しているＶＨとＶＬ（Ｖκ）ｄＡｂのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）のアミノ酸配列は、よく知られたＫａｂａｔのアミノ酸配列ナンバリング方式とＣＤＲの定義に従えば当業者には容易にわかるであろう。Ｋａｂａｔのナンバリング方式に従って可変長、挿入を有する重鎖ＣＤＲ−Ｈ３は、残基Ｈ１００とＨ１０１の間でＫ迄の文字でナンバリングされる（すなわち、Ｈ１００、Ｈ１００Ａ．．．．Ｈ１００Ｋ、Ｈ１０１）。あるいは、ＡｂＭまたは次のコンタクト方法に従って、ＣＤＲはＣｈｔｈｉａ方式を用いて決定してもよい（Chothia et al., (1989) Conformations of immunoglobulin hypervariable regions（免疫グロブリン超可変ドメインの構造）; Nature 342, p877-883）。適切なＣＤＲ決定方法については http://www.bioinf.org.uk/abs/ を参照。
【００２４】
各残基をナンバリングした後、続くＣＤＲ定義に適用出来る（“−”はＫａｂａｔ方式で同じ残基を意味する）
Ｋａｂａｔ配列多様性に基づいて最もよく使われる方法
（Ｋａｂａｔナンバリングを使って)：
ＣＤＲＨ１：３１−３５／３５Ａ／３５Ｂ
ＣＤＲＨ２：５０−６５
ＣＤＲＨ３：９５−１０２
ＣＤＲＬ１：２４−３４
ＣＤＲＬ２：５０−５６
ＣＤＲＬ３：８９−９７
【００２５】
Ｃｈｏｔｈｉａ−構造のループドメインの位置に基づいて
（Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングを使って）：
ＣＤＲＨ１：２６−３２
ＣＤＲＨ２：５２−５６
ＣＤＲＨ３：９５−１０２
ＣＤＲＬ１：２４−３４
ＣＤＲＬ２：５０−５６
ＣＤＲＬ３：８９−９７
ＡｂＭ−ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａの中間
（Ｋａｂａｔナンバリングを使って）： （Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングを使って）：
ＣＤＲＨ１：２６−３５／３５Ａ／３５Ｂ ２６−３５
ＣＤＲＨ２：５０−５８ −
ＣＤＲＨ３：９５−１０２ −
ＣＤＲＬ１：２４−３４ −
ＣＤＲＬ２：５０−５６ −
ＣＤＲＬ３：８９−９７ −
Ｃｏｎｔａｃｔ−結晶構造と抗原との接触残基予測に基づいて
（Ｋａｂａｔナンバリングを使って）： （Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングを使って）：
ＣＤＲＨ１：３０−３５／３５Ａ／３５Ｂ ３０−３５
ＣＤＲＨ２：４７−５８ −
ＣＤＲＨ３：９３−１０１ −
ＣＤＲＬ１：３０−３６ −
ＣＤＲＬ２：４６−５５ −
ＣＤＲＬ３：８９−９６ −
【００２６】
本明細書で使われる「インターロイキン−４」（ＩＬ−４）は、自然発生または内在性の哺乳動物ＩＬ−４タンパク質および自然発生または内在性の対応する哺乳動物ＩＬ−４タンパク質（例えば、組換えタンパク質、合成タンパク質（すなわち、有機合成化学手法により合成された））の配列に同じアミノ酸配列を有するタンパク質を指す。従って、本明細書で定義されているように、この用語は成熟ＩＬ−４タンパク質、多形型または対立遺伝子変異型、およびその他のＬ−４のイソ型、ならびにこれらの修飾または非修飾型（例えば、脂質化、グリコシル化）を含む。自然発生または内在性のＩＬ−４は、成熟ＩＬ−４、多形型または対立遺伝子変異型および哺乳動物（例えば、ヒト、非ヒト霊長目）で自然発生している他のイソ型や変異型、等の野生型タンパク質を含む。例えば、このようなタンパク質は、ＩＬ−４を天然に作り出す元のソースから回収または単離することが出来る。これらのタンパク質および自然発生または内在性の対応するＩＬ−４と同じアミノ酸配列を有するタンパク質は、対応する哺乳動物の名前で参照される。例えば、対応する哺乳動物がヒトである場合は、タンパク質はヒトＩＬ−４と表される。WO 03/038041で開示されているような、いくつかの変異体ＩＬ−４が当業者には既知である。
【００２７】
本明細書で使われる「インターロイキン−１３」（ＩＬ−１３）は、自然発生または内在性の哺乳動物ＩＬ−１３タンパク質および自然発生または内在性の対応する哺乳動物ＩＬ−１３タンパク質（例えば、組換えタンパク質、合成タンパク質（すなわち、有機合成化学手法により合成された））の配列に同じアミノ酸配列を有するタンパク質を指す。従って、本明細書で定義されているように、この用語は成熟ＩＬ−１３タンパク質、多形型または対立遺伝子変異型、およびその他のＬ−１３のイソ型（例えば、選択的スプライシングや他の細胞過程で作られた）およびこれらの修飾または非修飾型（例えば、脂質化、グリコシル化）を含む。自然発生または内在性のＩＬ−１３は、成熟ＩＬ−１３、多形型または対立遺伝子変異型および哺乳動物（例えば、ヒト、人間以外の霊長目）で自然発生している他のイソ型や変異型、等の野生型タンパク質を含む。自然発生または内在性のＩＬ−１３は、成熟ＩＬ−１３、多形型または対立遺伝子変異型および哺乳動物（例えば、ヒト、人間以外の霊長目）で自然発生している他のイソ型や変異型、等の野生型タンパク質を含む。例えば、本明細書で使われているように、ＩＬ−１３は、ヒトＩＬ−１３変異体を包含する。これは、成熟ヒトＩＬ−１３の１１０の位置のＡｒｇが、喘息（アトピー性および非アトピー性喘息）および他のＩＬ−１３の変異体に関係（Heinzmann et al., Hum Mol Genet. 9:549-559 (2000)）しているＧｌｎ（成熟ＩＬ−１３の１１０の位置が前駆タンパク質の１３０の位置に対応する）で置換されている。このようなタンパク質は、ＩＬ−１３を天然に作り出す元のソースから回収または単離することが出来る。これらのタンパク質および自然発生または内在性の対応するＩＬ−１３と同じアミノ酸配列を有するタンパク質は、対応する哺乳動物の名前で参照される。例えば、対応する哺乳動物がヒトである場合は、タンパク質はヒトＩＬ−１３と表される。WO 03/038041で開示されているような、いくつかの変異体ＩＬ−１３が当業者には既知である。
【００２８】
「アフィニティ」と「アビディティ」は結合相互作用の強度を表す技術用語である。本発明のリガンドに対しては、アビディティは、細胞およびリガンド上の標的間（例えば、第一と第二の標的間）の全体の結合力を指す。アビディティは、個々の標的に対するそれぞれのアフィニティの合計より大きくなる。
【００２９】
本明細書で使われている「有毒成分」は、毒素を含む成分を指す。毒素は、細胞生理（例えば、細胞壊死、アポートシスを起こす、または細胞分裂を阻害する）に悪影響を及ぼす、および／またはそれを変える薬剤である。
【００３０】
本明細書で使われている用語「用量」は、被験者に一度に全投与（単位用量）する、または二回もしくはそれ以上の回数にわけ一定の時間間隔で投与するリガンドの量を指す。例えば、用量は１日（２４時間）（１日量）、２日、一週、二週、三週、または一ヶ月または二ヶ月以上のコース（例えば、一回投与、または二回以上の投与で）で被験者に投与するリガンドの量（例えば、リガンドは、ＩＬ−１３に結合する免疫グロブリン単一可変ドメイン）を指してもよい。投与間隔は任意の所望間隔とすることが出来る。
【００３１】
本明細書で使われている「相補的」は、２つの免疫グロブリンドメインが同族ペアーやグループを形成する構造のファミリーに属するか、またはこのファミリーから生成しこの特徴を維持する場合を指す。例えば、抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインは相補的である。２つのＶＨドメインは相補的ではない。また、２つのＶＬドメインも相補的ではない。相補的ドメインは、Ｔ細胞受容体のＶα、Ｖβ（またはγとδ）ドメイン、等の免疫グロブリンスーパーファミリーの他のメンバーにも認められる。操作しなければエピトープと結合しないタンパク質足場に基づくドメインのような人工のドメインは相補的ではない。同様に、（例えば）免疫グロブリンドメインおよびフィブロネクチンドメイン、に基づく２つのドメインは相補的ではない。
【００３２】
本明細書で使われている「免疫グロブリン」は、２つのβシートと、通常は保存されているジスルフィド結合を含む抗体分子の免疫グロブリン折りたたみ特性を維持しているポリペプチドファミリーを指す。免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーは生体内細胞性、および非細胞性相互作用の多くの側面に関わっている。これらの中には、免疫システムにおける広範囲の役割（例えば、抗体、Ｔ細胞受容体分子、等）、細胞間接着への関与（例えば、ＩＣＡＭ分子）、および細胞内信号伝達（例えば、ＰＤＧＦ受容体、等の受容体分子）が含まれる。本発明は、結合ドメインを有する全ての免疫グロブリンスーパーファミリー分子に適用できる。一実施形態では、本発明は抗体に関する。
【００３３】
本明細書で使われている「ドメイン」は、他のタンパク質とは独立に三次構造を保持している折り畳みタンパク質構造を指す。一般的には、ドメインはタンパク質個々の固有の機能特性に関与し、多くの場合、残りのタンパク質および／またはドメインの機能を失うことなく付加、削除、または他のタンパク質への移動が可能である。単一抗体に対して、可変ドメインは、抗体可変ドメインの配列特性を含む折り畳みポリペプチドドメインを意味する。従って、これは、抗体可変ドメインおよび変更可変ドメインの全体を含むが、後者の例としては、例えば一つまたは複数のループが抗体可変ドメインの特徴でない配列により置換され、または、切断され、またはＮ−もしくはＣ−末端伸長を含む抗体可変ドメイン、ならびに、少なくとも部分的には全長ドメイン時の結合活性および特異性を保持している可変ドメインの折り畳み断片、により置換された場合が含まれる。このように、各リガンドは少なくとも２つの別々のドメインを含む。
【００３４】
用語「ライブラリ」は、ヘテロポリペプチド、またはヘテロ核酸の混合物を指す。ライブラリは、単一ポリペプチドまたは核酸配列を有するメンバーから構成されている。この点では、ライブラリはレパートリーの同義語である。ライブラリメンバー間の配列の差はライブラリに存在する多様性によるものである。ライブラリは、ポリペプチドまたは核酸の単純な混合物の形を取ってもよく、あるいは、核酸のライブラリで形質転換した生物または細胞の形、例えばバクテリア、ウイルス、動物または植物等、を取ってもよい。各生物または細胞が、一つまたは限定された数のみのライブラリメンバーを含むようにすることも任意に選択可能である。好都合にも、核酸は発現ベクター中に組み込まれ、核酸によりコードされたポリペプチドを発現させる。一態様では、ライブラリは、宿主生物母集団の形を取って、各生物が発現して対応するポリペプチドメンバーを産生する核酸の形の単一メンバー発現ベクターの一つまたは複数のコピーを含んでもよい。このように、宿主生物母集団は、遺伝的に多様なポリペプチド変異体の大きなレパートリーをコードする可能性を有している。
【００３５】
本明細書で使われている「抗体」は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤやＩｇＥ、またはフラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、ｓｃＦｖ、閉構造多重特異性抗体、ジスルフィド結合ｓｃＦｖ、二重特異性抗体）であって、抗体を天然に産生する任意の種から誘導されるか、または組換えＤＮＡ技術により作製されるか、または、例えば血清、Ｂ細胞、ハイブリドーマ、トランスフェクト細胞、酵母、およびバクテリアから単離するか、のいずれかのものを指す。
【００３６】
本明細書で使われている「抗原」は、本発明に係る結合ドメインにより結合される分子である。通常は、抗原は抗体リガンドに結合され、生体内での抗体反応を促進することが出来る。例えば、抗原はペプチド、タンパク質、核酸、または他の分子であってもよい。一般的には、本発明において二重特異性リガンドは２つの特定標的（例えば、抗原）に対する標的特異性で選択される。通常の抗体とそのフラグメントの場合、可変ループ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＨ１、Ｈ２、Ｈ３）により決まる抗体結合部位が抗原に結合出来る。
【００３７】
「エピトープ」は、免疫グロブリンＶＨ／ＶＬペアーにより通常の方式で結合される構造単位である。エピトープは抗体に対し最小限の結合部位を決定し、抗体の特異性を有する標的を表す。単一ドメイン抗体の場合、エピトープは単独の可変ドメインにより結合される構造単位を表す。
【００３８】
「ユニバーサルフレームワーク」は、Ｋａｂａｔの定義（“Sequences of Proteins of Immunological Interest”, US Department of Health and Human Services）による配列に保存されている抗体のドメインに対応する単一抗体フレームワーク配列、または、ＣｈｏｔｈｉａとＬｅｓｋにより定義（(1987) J. Mol. Biol. 196:910-917）されているヒト生殖細胞系列免疫グロブリンレパートリーや構造を指す。本発明は単一フレームワークまたは一連の当該フレームワークの使用方法を提供する。これを使って超可変ドメインのみを変化させることにより実質的にほとんどの結合特異性を導出可能であることが明らかになっている。
【００３９】
用語「半減期」は、例えばリガンドの分解、および／または、自然の機構による二重特異性リガンドのクリアランスや隔離によって、リガンドの血清中濃度が体内で５０％減少するのに要する時間を指す。本発明のリガンドは体内で安定化され、半減期は分解および／またはクリアランスや隔離に耐える分子に結合することにより延長されている。通常は、この分子は自然発生タンパク質であり、それ自体、体内で長い半減期を有している。そのリガンドの体内機能活性が、半減期延長分子には特異的でない類似リガンドよりも長期間持続する場合、リガンドの半減期は延長される。このように、ＨＳＡに特異的なリガンドと２つの標的分子とを、ＨＳＡに対する特異性のない、同じリガンドで比較する。すなわち、このリガンドはＨＳＡに結合しないで他の分子に結合する。例えば、細胞上の第３の標的に結合する可能性もある。典型的には、半減期は、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％またはこれ以上延長される。２ｘ、３ｘ、４ｘ、５ｘ、１０ｘ、２０ｘ、３０ｘ、４０ｘ、５０ｘ、またはこれ以上の半減期延長も可能である。この代わりに、または、これに追加して３０ｘ、４０ｘ、５０ｘ、６０ｘ、７０ｘ、８０ｘ、９０ｘ、１００ｘ、１５０ｘの半減期延長も可能である。
【００４０】
本明細書で使われている「低度のストリンジェンシー（ｌｏｗ ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）」、「中度のストリンジェンシー（ｍｅｄｉｕｍ ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）」、「高度のストリンジェンシー（ｈｉｇｈ ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）」または「非常に高度のストリンジェンシー（ｖｅｒｙ ｈｉｇｈ ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）」の条件は、核酸ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を表している。ハイブリダイゼーション反応のためのガイダンスは、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6、で見ることが出来、この全体が参照により本明細書に組み込まれる。この文献に水相、および非水相法が記載されており、いずれの方法も使用可能である。本明細書で言及される具体的なハイブリダイゼーション条件は次のとおりである：（１）低度のストリンジェンシーでのハイブリダイゼーション条件は、６Ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中で約４５℃、続いて０．２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で少なくとも５０℃で２回洗浄（低度のストリンジェンシー条件の場合、洗浄温度を５５℃まで上げることができる）；（２）中度のストリンジェンシーでのハイブリダイゼーション条件は、６ＸＳＳＣ中で約４５℃、続いて０．２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で６０℃にて１回または複数回洗浄；（３）高度のストリンジェンシーでのハイブリダイゼーション条件は、６ＸＳＳＣ中で約４５℃、続いて０．２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で６５℃にて１回または複数回洗浄；および任意選択で、（４）非常に高度のストリンジェンシーでのハイブリダイゼーション条件は、０．５Ｍリン酸ナトリウム、７％ＳＤＳ中で６５℃、続いて０．２ＸＳＳＣ、１％ＳＤＳ中で６５℃にて１回または複数回洗浄である。非常に高度のストリンジェンシー条件（４）が好適な条件であり、特に断らない限り、採用すべき条件である。
【００４１】
本明細書に記載の配列と類似した配列または相同な配列（例えば、少なくとも約７０％の配列同一性）も本発明の一部である。ある実施形態では、アミノ酸レベルでの配列同一性は、約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上であってもよい。核酸レベルでは、配列同一性は約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上であってもよい。あるいは、核酸セグメントが選択的ハイブリダイゼーション条件（例えば、非常に高度のストリンジェンシーでのハイブリダイゼーション条件）下でその相補鎖とハイブリダイズする場合には、実質的同一性が存在する。核酸は細胞内にあっても、細胞溶解液中に存在しても、あるいは部分的に精製されたもしくは実質的に純粋な形態で存在してもよい。
【００４２】
2つの配列間の「相同性」または「配列同一性」または「類似性」（本明細書ではこれらの用語を互換的に用いる）の計算は次のように行う。最適な比較のために配列をアライメントする（例えば、最適なアライメントのために第1および第2のアミノ酸または核酸配列の一方または両方にギャップを導入することができ、また、比較のために非相同配列を無視することができる）。一実施形態では、比較のためにアライメントされる参照配列の長さは、その参照配列の長さの少なくとも30％、任意選択で少なくとも40％、任意選択で少なくとも50％、任意選択で少なくとも60％、任意選択で少なくとも70％、80％、90％、または100％である。その後、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第1の配列のある位置が、第2の配列の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占められている場合には、それらの分子はその位置で同一である（本明細書で用いるアミノ酸または核酸の「相同性」は、アミノ酸または核酸の「同一性」と同等である）。2つの配列間の同一性パーセントは、これら2つの配列の最適なアライメントのために導入する必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮して、これらの配列により共有される同一位置の数の関数である。
【００４３】
本明細書で定義されるアミノ酸およびヌクレオチド配列のアライメント、ならびに相同性、類似性または同一性は、任意選択として、デフォルトパラメーターを用いて、アルゴリズムＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓにより作製し、決定してもよい (Tatusova, T.A. et al., FEMS Microbiol Lett, 174:187-188 (1999))。あるいは、配列アライメントのためにBLASTアルゴリズム(バージョン２．０)を、デフォルト値に設定されたパラメーターと共に用いる。ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）はプログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、およびｔｂｌａｓｔｘに採用されている帰納的検索アルゴリズムである。これらのプログラムの有用性は、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌの統計的方法（1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87(6):2264-8）を使った検索結果の恩恵によるものである。
【００４４】
特に断らないかぎり、本明細書で用いる技術用語および科学用語はすべて、当分野（例えば、細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリダイゼーション技法および生化学）の通常の知識を有する者が普通に理解している意味と同じ意味を有する。分子的、遺伝学的および生化学的方法（一般的には、Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版 (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.およびAusubelら, Short Protocols in Molecular Biology (1999) 第4版, John Wiley & Sons, Inc.を参照されたい；これらを参照することにより本明細書に含める）、ならびに化学的方法については、標準的手法が使われる。
【００４５】
本明細書で使われている用語「ＩＬ−１３アンタゴニスト」または「抗ＩＬ−１３アンタゴニスト」等は、ＩＬ−１３に結合しＩＬ−１３の（すなわち、一つのまたは複数の）機能を阻害する薬剤（例えば分子や化合物）を指す。例えば、ＩＬ−１３アンタゴニストはＩＬ−１３受容体へのＩＬ−１３の結合を阻害し、および／または、ＩＬ−１３受容体経由のシグナル伝達を阻害することが出来る。従って、ＩＬ−１３媒介過程と細胞反応がＩＬ−１３アンタゴニストにより阻害され得る。
【００４６】
本明細書で使われている「ペプチド」は、ペプチド結合で結合した約２〜５０アミノ酸を指す。
【００４７】
本明細書で使われている「ポリペプチド」は、ペプチド結合で結合した少なくとも約５０アミノ酸を指す。ポロペプチドは通常三次構造を含み、折り畳まれて機能ドメインを形成している。
【００４８】
本明細書で使われている、「プロテアーゼ分解に耐性がある」は、ペプチドまたはポリペプチド（例えばドメイン抗体（ｄＡｂ））が、プロテアーゼ活性好適条件下でプロテアーゼとインキュベートした場合プロテアーゼにより実質的に分解されないということである。プロテアーゼ活性好適温度で約１時間プロテアーゼと一緒にインキュベーション後、このタンパク質がプロテアーゼにより分解されたのは、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１４％以下、約１３％以下、約１２％以下、約１１％以下、約１０％以下、約９％以下、約８％以下、約７％以下、約６％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下、約１％以下、にすぎない、または、実質的に分解されていない場合、ポリペプチド（例えばｄＡｂ）は実質的に分解されていないことになる。例えば、３７℃または５０℃である。タンパク質分解は、任意の好適な方法、例えば本明細書に記載のＳＤＳ−ＰＡＧＥまたは機能アッセイ（例えばリガンド結合）によって評価することができる。
【００４９】
本明細書で使われている「ディスプレイシステム」は、物理的、化学的または機能的特性、等の所望特性を基準にして選択する目的で、ポリペプチドやペプチドのコレクションにアクセス可能なシステムを指す。ディスプレイシステムはポリペプチドやペプチドの適切なレパートリー（例えば、溶液の形で、適切な担体上に固定されて）であってもよい。また、ディスプレイシステムは、細胞発現システム（例えば、形質転換、感染、核酸導入、または形質導入、等を行った細胞の核酸発現ライブラリ、および細胞表面へのコード化ポリペプチドのディスプレイ）、あるいは、無細胞発現システム（例えば、エマルジョン分画とディスプレイ）を採用してもよい。代表的なディスプレイシステムでは、核酸のコード機能と、核酸によりコードされたポリペプチドやペプチドの物理的、化学的、および／または、機能特性とを結びつける。このようなディスプレイシステムが採用されると、所望の物理的、化学的、および／または、機能特性を有するポリペプチドやペプチドが選択でき、選択されたポリペプチドやペプチドをコードする核酸を容易に単離、回収できる。核酸のコード機能とポリペプチドやペプチドの物理的、化学的、および／または、機能特性とを結びつけるいくつかのディスプレイシステムが当業者には既知であり、例えば、バクテリオファージディスプレイ（ファージディスプレイ、例えばファージミドディスプレイ）、リボソームディスプレイ、エマルジョン分画とディスプレイ、酵母ディスプレイ、ピューロマイシンディスプレイ、細菌ディスプレイ、プラスミド上のディスプレイ、共有結合ディスプレイ、等（例えば、EP 0436597 (Dyax), 米国特許第6,172,197号 (McCafferty et al.), 米国特許第6,489,103号 (Griffiths et al.)参照））がある。
【００５０】
本明細書で使われている「レパートリー」は、アミノ酸配列の多様性で特徴付けられるポリペプチドやペプチドのコレクションを指す。それぞれのレパートリーのメンバーは、共通の構造特性（例えば、共通のコア構造）、および／または共通の機能特性（例えば、共通のリガンド（例えば、包括的なリガンドや標的リガンド、ＩＬ−１３）に結合する能力）、等の共通の特徴を有する。
【００５１】
本明細書で使われている「機能的」は、特異的結合活性等の生物学的活性を有するポリペプチドやペプチドの特徴を説明する。例えば、用語「機能的ポリペプチド」は、抗原結合部位により標的抗原に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。
【００５２】
本明細書で使われている「包括的リガンド」は、所与のレパートリーの機能的メンバーの実質的部分（例えば、実質的に全部）に結合するリガンドを指す。包括的リガンド（例えば、包括的な共通リガンド）は、メンバーが共通標的リガンドに対し結合特異性を持っていなくても、所与のレパートリーの多くのメンバーと結合可能である。通常、ポリペプチド上の包括的な機能的リガンド結合部位が存在する（包括的リガンドに結合する能力で示されるように）と、ポリペプチドは正しく折り込まれ、機能する。包括的リガンドの適切な例には、超抗原や、レパートリーの一部の実質的な機能的メンバー上に発現したエピソードに結合した抗体、等を含む。
【００５３】
「超抗原」は、これらタンパク質の標的リガンド結合部位から離れた部位で、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーと相互作用する包括的リガンドを指す技術用語である。ブドウ球菌エンテロトキシンは、Ｔ細胞受容体と相互作用する超抗原の例である。抗体と結合する超抗原には、ＩｇＧ定常領域と結合するＧタンパク質（Bjorck and Kronvall, J. Immunol., 133:969 (1984)）、ＴｇＧ定常領域やＶＨドメインと結合するＡタンパク質（Forsgren and Sjoquist, J. Immunol., 97:822 (1966)）、およびＶＬドメインと結合するＬタンパク質（Bjorck, J. Immunol., 140:1194 (1988)）が含まれる。
【００５４】
本明細書で使われている「抗体フォーマット」は、その構造上の抗原に対する結合特異性を与えるために一つまたは複数の抗体可変ドメインが組み込まれている任意の適切なポリペプチド構造を指す。多様な好適抗体フォーマットが当業者には既知であり、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、単鎖抗体、二重特異性抗体、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体重鎖および／もしくは軽鎖のホモ二量体・ヘテロ二量体、上記いずれかの抗原結合フラグメント（例えばＦｖフラグメント(単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ)、ジスルフィド結合Ｆｖ等)、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２ フラグメント）、単一抗体可変ドメイン（例えば、ｄＡｂ、ＶＨ、ＶＨＨ、ＶＬ）、および上記いずれかの改変型(例えば、ポリエチレングリコール、または他の適切なポリマーやヒト化ＶＨＨの共有結合による改変)）がある。
【００５５】
本明細書で使われている「流体力学的サイズ」は、水溶液中の分子の拡散から求めた分子（例えば、タンパク質分子、リガンド）の見かけ上の大きさを指す。溶液中のタンパク質の拡散や運動を適切に処理してタンパク質の見かけ上の大きさを導き出すことが出来き、この方式ではタンパク質粒子の大きさが「ストークス半径」または「流体力学的半径」として得られる。タンパク質の「流体力学的サイズ」は、質量と形状（立体配座）に依存する。すなわち、同じ分子質量の２つのタンパク質がその全立体配座に依存して異なる流体力学的サイズを持ち得るということである。
【００５６】
本明細書で使われている「競合する」は、第1の標的（例えばＩＬ−１３）のそのコグネイトの標的結合ドメイン（例えば、免疫グロブリン単一可変ドメイン）への結合が、前記コグネイト標的に対し特異的な第２の結合ドメイン（例えば、免疫グロブリン単一可変ドメイン）が存在する場合に、阻害されることを意味する。例えば、結合ドメインの物理的ブロックにより、または標的に対するアフィニティやアビディティが低下するような結合ドメインの構造もしくは環境の変化により、結合が立体的に阻害され得る。競合的ＥＬＩＳＡ法および競合的ＢｉａＣｏｒｅ法の実験により第１と第２の結合ドメインの間での競合を測定する方法の詳細ついては、WO2006038027を参照のこと。この詳細は、参照により本明細書に組み込まれるが、ここには本発明における利用に関して明瞭な開示がなされている。
【００５７】
本発明者は、ＤＯＭ１０−５３−４７４（配列番号１）の位置２８（Ｋａｂａｔナンバリング）の変異が、ＩＬ−１３に対しさらに大きな効力のあるｄＡｂ派生体の提供を実現した。ヒトと少なくとも一つの非ヒト霊長類のＩＬ−１３（例えば、カニクイザルおよび／またはアカゲザル）の間の交差反応のような付加的な利点も生じる可能性がある。さらに、原核細胞での有益な発現も得られる可能性がある。
【００５８】
そのため、一つの態様では、本発明は、ＤＯＭ１０−５３−４７４（配列番号１）と比較して１、２、３、４または５のアミノ酸変化以外はＤＯＭ１０−５３−４７４（配列番号１）と同一のアミノ酸配列を含み、この単一可変ドメインがＫａｂａｔナンバリングで位置２８にバリンを有し、さらに任意選択で単一可変ドメインはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）からなるものではない、抗インターロイキンー１３（ＩＬ−１３）免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。
【００５９】
また、本明細書で用語「ｄＡｂ」（ドメイン抗体）に言及している。ｄＡｂは「免疫グロブリン単一可変ドメイン」のことである。
【００６０】
本発明者は、配列モチーフＸＧＸ’Ｘ”（ここで、ＧはＫａｂａｔナンバリングによる位置５４であり、Ｘ＝ＨまたはＫであり；Ｘ’＝ＧまたはＫであり；およびＸ”＝ＫまたはＩである）を有するＤＯＭ１０−５３−４７４ｄＡｂ派生体はＩＬ−１３結合に対しさらに有効であることも理解した。ヒトと少なくとも一つの非ヒト霊長類ＩＬ−１３（例えば、カニクイザルおよび／またはアカゲザル）の間の交差反応のような付加的な利点も生じる可能性もある。さらに、原核細胞での発現増加という利点も得られる可能性がある。
【００６１】
そのため、第二の態様では、本発明は、ＤＯＭ１０−５３−４７４（配列番号１）と比較して１、２、３、４または５のアミノ酸変化以外はＤＯＭ１０−５３−４７４と同一のアミノ酸配列を含み、この単一可変ドメインが配列ＸＧＸ’Ｘ”を有し、ここでＧはＫａｂａｔナンバリングによる位置５４であり、
Ｘ＝ＨまたはＫであり；
Ｘ’＝ＧまたはＫであり；
Ｘ”＝ＫまたはＩであり、
さらに任意選択で単一可変ドメインはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）からなるものではない、抗インターロイキンー１３（ＩＬ−１３）免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。
【００６２】
第二の態様の一実施形態では、可変ドメインは、Ｋａｂａｔナンバリングで位置２８にバリンを有する。
【００６３】
第二の態様の一実施形態では、単一可変ドメインは、
ＫＧＧＫ；
ＸＧＫＩ；または
ＨＧＫＩ；
を含み、ここでＧ（または、ＫＧＧＫに対する最初のＧ）はＫａｂａｔナンバリングで位置５４にある。
【００６４】
第二の態様の一実施形態では、単一可変ドメインのＣＤＲ２（Ｋａｂａｔによる）は、配列ＳＩＤＷ［Ｚ］ＴＹＹＡＤＳＶＫＧを有し、ここで［Ｚ］は前に定義したＸＧＸ’Ｘ”、ＫＧＧＫ、ＫＧＫＩおよびＨＧＫＩから選択される。
【００６５】
いずれの態様においても、可変ドメインは、任意選択で位置３０、５３、５５、５６（Ｋａｂａｔのナンバリングによる）の一つまたは複数のアミノ酸変化（ＤＯＭ１０−５３−４７４（配列番号１）に対して）を有することができる。任意選択として、可変ドメインは、
ａ）位置３０（Ｋａｂａｔナンバリングによる）にプロリン、および／または
ｂ）位置５３（Ｋａｂａｔナンバリングによる）にリシン、および／または
ｃ）位置５５（Ｋａｂａｔナンバリングによる）にグリシンまたはリシン、および／または
ｄ）位置５６（Ｋａｂａｔナンバリングによる）にイソロイシンまたはリシン
を有してもよい。
【００６６】
一実施形態として、単一可変ドメインは位置５５にリシンを、位置５６にイソロイシンを有する（Ｋａｂａｔナンバリングによる）。
【００６７】
一つの態様では、本発明は、抗インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。この可変ドメインでは、ＣＤＲ（例えば、Ｋａｂａｔの決定に従って）はＤＯＭ１０−５３−４７４（配列番号１）のＣＤＲと同一であり、単一可変ドメインが、Ｋａｂａｔナンバリングで位置２８にバリンを含む。任意選択で、単一可変ドメインのアミノ酸配列がＤＯＭ１０−５３−４７４（配列番号１）と比較して１、２、３、４または５のアミノ酸変化を有し、ここで、一つまたは複数の変化は、ＣＤＲ（例えば、ＫａｂａｔやＣｈｏｔｈｉａによるＣＤＲ２）中に任意に存在してもよい。また、任意選択として、単一可変ドメインはＤＯＭ１０−５３−６１６ (配列番号５)からなるものではない。
【００６８】
一つの態様では、本発明は、抗インターロイキンー１３（ＩＬ−１３）免疫グロブリン単一可変ドメインを提供し、この可変ドメインでは、ＣＤＲ（例えば、Ｋａｂａｔの決定に従って）は、単一可変ドメインが前に定義したＳＩＤＷ［Ｚ］ＴＹＹＡＤＳＶＫＧ、ＸＧＸ’Ｘ”、ＫＧＧＫ、ＸＧＫＩまたはＨＧＫＩモチーフを含むこと以外は、ＤＯＭ１０−５３−４７４（配列番号１）のＣＤＲと同一である。任意選択として、単一可変ドメインがＫａｂａｔナンバリングで位置２８にバリンを含んでもよい。さらに、任意選択として、単一可変ドメインはＤＯＭ１０−５３−６１６ (配列番号５)からなるものではない。
【００６９】
さらなる態様では、本発明は、抗インターロイキンー１３（ＩＬ−１３）免疫グロブリン単一可変ドメインを提供し、ここで、可変ドメインがＤＯＭ１０−５３−５４６（配列番号２）；ＤＯＭ１０−５３−５６７（配列番号３）；ＤＯＭ１０−５３−５６８（配列番号４）；またはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）である。さらなる態様では、本発明は、抗インターロイキンー１３（ＩＬ−１３）免疫グロブリン単一可変ドメインを提供し、ここで、可変ドメインがＤＯＭ１０−５３−５４６（配列番号２）；ＤＯＭ１０−５３−５６７（配列番号３）；またはＤＯＭ１０−５３−５６８（配列番号４）である。
【００７０】
一つの態様では、本発明は、ＤＯＭ１０−５３−５４６（配列番号６）；ＤＯＭ１０−５３−５６７（配列番号７）；ＤＯＭ１０−５３−５６８（配列番号８）；またはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号９）のヌクレオチド配列によりコードされる抗インターロイキンー１３（ＩＬ−１３）免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。任意選択として、単一可変ドメインはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）からなるものではない。
【００７１】
一つの態様では、本発明は、特異的にヒトＩＬ−１３、および少なくとも一つの非ヒト霊長類ＩＬ−１３に結合する抗インターロイキンー１３（ＩＬ−１３）免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。例えば、その可変ドメインは、特異的にヒトＩＬ−１３、およびカニクイザル、および／またはアカゲザルＩＬ−１３、および／またはヒヒＩＬ−１３、例えば、ヒトおよびカニクイザルＩＬ−１３、または、ヒトおよびアカゲザルＩＬ−１３、または、ヒトおよびヒヒＩＬ−１３、または、ヒト、アカゲザルおよびカニクイザルＩＬ−１３に結合する。単一可変ドメインは、任意選択で先のいずれかの態様に準じることが可能である。また、任意選択により、単一可変ドメインはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）からなるものではない。一実施態様では、可変ドメインは、ヒトＩＬ−１３および前記のまたは各非ヒト霊長類 ＩＬ−１３と、約５ｎＭ以下の解離定数（Ｋｄ）で結合する。任意選択として、解離定数は、約４ｎＭ以下、約３ｎＭ以下、約２ｎＭ以下、または約１ｎＭ以下であってもよい。一実施態様では、可変ドメインは、
（ｉ）ヒトＩＬ−１３と解離定数（Ｋｄ）約１ｎＭ以下、以降任意選択で約５００ｐＭ以下、約２５０ｐＭ以下、約１５０ｐＭ以下、約１００ｐＭ以下、約１ｎＭ〜約１０ｐＭ、約１ｎＭ〜約５０ｐＭ、約１ｎＭ〜約７０ｐＭ、約５００ｐＭ〜約１０ｐＭ、約５００ｐＭ〜約５０ｐＭ、約５００ｐＭ〜約７０ｐＭ、２５０ｐＭ〜約１０ｐＭ、約２５０ｐＭ〜約５０ｐＭ、約２５０ｐＭ〜約７０ｐＭ、約１５０ｐＭ〜約１０ｐＭ、約１５０ｐＭ〜約５０ｐＭ、約１５０ｐＭ〜約７０ｐＭ、約１００ｐＭ〜約１０ｐＭ、約１００ｐＭ〜約５０ｐＭまたは約１００ｐＭ〜約７０ｐＭ；
（ｉｉ）非ヒト (例えば、カニクイザル, アカゲザルまたはヒヒ) ＩＬ−１３と解離定数（Ｋｄ）５ｎＭ以下、以降任意選択として、４、３、２または１ｎＭ以下、５〜約１ｎＭ、
で結合する。一実施形態では、追加として、あるいは代わりとして、単一可変ドメインはＫａｂａｔナンバリングによる位置２８にバリンを含む。一実施形態では、追加として、あるいは代わりとして、単一可変ドメインは、配列ＸＧＸ’Ｘ”を含み、ここで、ＧはＫａｂａｔナンバリングで位置５４にあり、
Ｘ＝ＨまたはＫであり；
Ｘ’＝ＧまたはＫであり；
Ｘ”＝ＫまたはＩである。
【００７２】
一実施形態では、追加として、あるいは代わりとして、可変ドメインは、
ａ）位置３０（Ｋａｂａｔナンバリングによる）にプロリン、および／または
ｂ）位置５３（Ｋａｂａｔナンバリングによる）にリシン、および／または
ｃ）位置５５（Ｋａｂａｔナンバリングによる）にグリシンまたはリシン、および／または
ｄ）位置５６（Ｋａｂａｔナンバリングによる）にイソロイシンまたはリシン、
を有する。
【００７３】
一実施形態では、追加として、あるいは代わりとして、可変ドメインが、位置５５にリシンを、位置５６（Ｋａｂａｔナンバリングによる）にイソロイシンを有する。
【００７４】
全ての態様において以下にあるような一つまたは複数の利点が認められるため、本発明の単一可変ドメインは、有益である：
（ｉ） ヒトＩＬ−１３に対し優れた効能（ＤＯＭ１０−５３−４７４より良い効能）；
（ｉｉ） カニクイザルＩＬ−１３に対して優れた効力（ＤＯＭ１０−５３−４７４より良い効力）；
（ｉｉｉ）アカゲザルＩＬ−１３に対して優れた効力（ＤＯＭ１０−５３−４７４より良い効力）；
（ｉｖ） ヒトおよび非ヒト霊長類 （例えば、カニクイザル、アカゲザルまたはヒヒ)ＩＬ−１３に対して優れた効力（ＤＯＭ１０−５３−４７４より良い効力）；
（ｖ） ヒト、カニクイザル、およびアカゲザルＩＬ−１３に対して優れた効力（ＤＯＭ１０−５３−４７４より良い効力）；
（ｖｉ） 原核細胞で優れた発現（任意選択としてＤＯＭ１０−５３−４７４より良好）；
（ｖｉｉ）ヒトＩＬ−１３に対する優れた中和性能（ＤＯＭ１０−５３−４７４より良好）；
（ｖｉｉｉ）カニクイザルＩＬ−１３に対する優れた中和性能（ＤＯＭ１０−５３−４７４より良好）；
（ｉｘ） アカゲザルＩＬ−１３に対する優れた中和性能（ＤＯＭ１０−５３−４７４より良好）；
（ｘ） ヒトおよび非ヒト霊長類 (例えば、カニクイザル、アカゲザルまたはヒヒ) ＩＬ−１３に対する優れた中和性能（ＤＯＭ１０−５３−４７４より良好）；
（ｘｉ） ヒト、カニクイザル およびアカゲザルＩＬ−１３に対する優れた中和性能（ＤＯＭ１０−５３−４７４より良好）；
（ｘｉｉ）二種以上の霊長類ＩＬ−１３の間の交差反応性（任意選択で、ヒトとカニクイザル、および／またはアカゲザルＩＬ−１３、例えば、ヒトとカニクイザルＩＬ−１３；またはヒトとアカゲザルＩＬ−１３；またはヒトとヒヒＩＬ−１３；ならびに
（ｘｉｉｉ）プロテアーゼの安定性（任意選択として、トリプシンの安定性）。
【００７５】
利点（ｉ）〜（ｖ）は、一実施形態で、表面プラズモン共鳴法、例えば、ＢｉａｃｏｒｅＴＭ により測定できる。ある実施形態では、より優れた効力は解離定数（Ｋｄ）で判断できる。
【００７６】
利点（ｖｉ）は、一実施形態で、大腸菌における発現によって測定可能である。ある実施形態で、本発明の単一可変ドメインが良好に発現する（大腸菌中で、少なくとも３ ｍｇ／Ｌ、例えば少なくとも５、１０、１５、２０ ｍｇ／Ｌ）。
ある実施形態では、本発明の単一可変ドメインがピキア・パストリスまたは酵母類中で良好に発現する。
【００７７】
利点（ｖｉｉ）〜（ｘｉ）は、一実施形態において、ＥＬＩＳＡまたは標準的ＨＥＫ ＳＴＡＴアッセイにより測定した中和能力により決定できる。ある実施形態では、中和能力はＥＣ５０により表される。
【００７８】
利点（ｘｉｉ）は、一実施形態では、ＥＬＩＳＡ、ＢｉａｃｏｒｅＴＭ または標準的ＨＥＫ ＳＴＡＴアッセイにより測定できる。ある実施形態では、交差反応性は解離定数（Ｋｄ）で示される。
【００７９】
利点（ｘｉｉｉ）は、一実施形態では、以下のように測定可能である：
０．３ ｍｇ／ｍｌの単一可変ドメインをトリプシン（例えば、トリプシン活性 ＞５０００ｕｎｉｔ／ｍｇ）と２５：１のｄＡｂ：トリプシンの比率にして、ＰＢＳバッファー中で混合する。３０℃で２４時間インキュベーション後、インキュベーション後に残っている活性ｄＡｂが測定できる。
【００８０】
一実施形態では、活性ｄＡｂの存在は残っているｄＡｂ活性率として求められ、これは表面プラズモン共鳴（例えば、ＢｉａｃｏｒｅＴＭ）により測定される。少なくとも２０％（例えば、少なくとも３０％、４０％、または５０％）の活性率は、プロテーゼ安定性を示すものである。別の実施形態では、プロテーゼ安定性ｄＡｂはＥＬＩＳＡを使って求められ、この場合プロテーゼ安定性の可変ドメインはインキュベーション後のＥＬＩＳＡのＯＤ４５の読み値で少なくとも０．４０４を有する。別の実施形態では、活性ｄＡｂは、インキュベーション後に、ｄＡｂが特異的にＡタンパク質またはＬタンパク質に結合しているかどうかで決定される。別の実施形態では、活性ｄＡｂは、ゲル電気泳動により求められ、プロテーゼ安定性の可変ドメインはインキュベーション後のゲル電気泳動で実質的に単一のバンドとして現れる。
【００８１】
一実施形態では、本発明の単一可変ドメインは利点（ｉｖ）と（ｘ）を有する。別の実施形態では、本発明の単一可変ドメインは利点（ｖ）と（ｘｉ）を有する。任意選択として、単一可変ドメインはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）からなるものではない。
【００８２】
一実施形態では、本発明は、本明細書に開示されたあらゆる疾病や疾患を対象としたあらゆる用途、利点、治療および／または予防を目的とした本発明に係る単一可変ドメインを提供する。一実施形態では、本発明は、本明細書に開示されたあらゆる疾病や疾患を対象としたあらゆる用途、便宜、治療および／または予防のためのＩＬ−１３ アンタゴニストの製造における本発明に係る単一可変ドメインの使用を提供する。これらの記載は、本明細書の請求項への移入に際して明瞭な基礎となるものである。
【００８３】
本発明の単一可変ドメイン（ＤＯＭ１０−５３−５４６、ＤＯＭ１０−５３−５６７、ＤＯＭ１０−５３−５６８およびＤＯＭ１０−５３−６１６）は、表面プラズモン共鳴（例えば、ＢｉａｃｏｒｅＴＭ）により測定されたＩＬ−１３結合の解離定数（Ｋｄ）が示すように、ヒトおよびカニクイザル（ｃｙｎｏ）ＩＬ−１３の両方に対して優れた効能を示す。本発明の単一可変ドメインはＤＯＭ１０−５３−４７４よりずっと良い効力がある。ＤＯＭ１０−５３−５６７およびＤＯＭ１０−５３−５６８は、ヒトおよびカニクイザルＩＬ−１３の両方に対し最良の効力を示す。
【００８４】
本発明の単一可変ドメイン（ＤＯＭ１０−５３−５４６、ＤＯＭ１０−５３−５６７、ＤＯＭ１０−５３−５６８およびＤＯＭ１０−５３−６１６）は、一つまたは複数の霊長類ＩＬ−１３の間で交差反応性を示す。一つの態様では、本発明は、二種以上の霊長類ＩＬ−１３種間で交差反応する単一可変ドメインを提供するために単一可変ドメインを提供し、この組合せには、任意選択で、ヒトと非ヒト霊長類ＩＬ−１３間、さらに任意選択で（ｉ）ヒトとカニクイザルＩＬ−１３種、（ｉｉ）ヒトとアカゲザル ＩＬ−１３種、（ｉｉｉ）ヒト、カニクイザルと アカゲザルＩＬ−１３種、または（ｉｖ）ヒトとヒヒＩＬ−１３種、間がある。一つの態様では、本発明は、二種以上の霊長類ＩＬ−１３種間で交差反応を起こすＩＬ−１３ アンタゴニストの製造における本発明の単一可変ドメインの使用を提供し、この組合せには、任意選択で、ヒトと非ヒト霊長類ＩＬ−１３間、さらに任意選択で（ｉ）ヒトとカニクイザルＩＬ−１３種、（ｉｉ）ヒトとアカゲザル ＩＬ−１３種、（ｉｉｉ）ヒト、カニクイザルと アカゲザルＩＬ−１３種、または（ｉｖ）ヒトとヒヒＩＬ−１３種、間がある。可変ドメインは特異的にヒトおよび非ヒト霊長類 ＩＬ−１３（例えば、ヒト、カニクイザルと アカゲザルＩＬ−１３種が可変ドメインにより結合される）と結合する。薬剤開発では、通常、その薬剤をヒトで試験する前にカニクイザルやアカゲザル等の非ヒト霊長類系を使って主要候補薬剤の試験が必要なため、このことは特に有用である。ヒトや他の霊長類ＩＬ−１３種に結合する薬剤の提供によって、このシステムでの結果を試験することが出来、同じ薬剤を使ったデータの対照比較が可能となっている。これにより、非ヒトＩＬ−１３に支障となる薬剤、およびヒトＩＬ−１３に支障となる別の薬剤を見つけ出すことが必要という面倒を避けられ、また、非等価薬剤使ったヒトと非ヒト霊長類の結果の比較を回避出来る。
【００８５】
任意選択で、少なくとも一つの非ヒト霊長類（例えば、カニクイザルおよび／またはアカゲザルおよび／またはヒヒ）ＩＬ−１３に対する免疫グロブリン単一可変ドメインの結合アフィニティとヒトＩＬ−１３に対する免疫グロブリン単一可変ドメインの結合アフィニティは、１０、５０、１００、５００、または１０００の倍数以下で異なる。一つの態様では、本発明は、少なくとも一つの非ヒト霊長類（例えば、カニクイザルおよび／またはアカゲザルおよび／またはヒヒ）ＩＬ−１３に対する免疫グロブリン単一可変ドメインのアフィニティとヒトＩＬ−１３に対するアフィニティが１０、５０、１００、５００、または１０００の倍数以下で異なるという条件で、本発明に係る単一可変ドメインを提供する。一つの態様では、本発明はＩＬ−１３ アンタゴニストの製造にための本発明に係る単一可変ドメインの使用を提供し、この場合、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザルおよび／またはアカゲザルおよび／またはヒヒ）ＩＬ−１３に対する免疫グロブリン単一可変ドメインのアフィニティとヒトＩＬ−１３に対するアフィニティが１０、５０、１００、５００、または１０００の倍数以下で異なる。
【００８６】
本発明の単一可変ドメイン（ＤＯＭ１０−５３−５４６、ＤＯＭ１０−５３−５６７、ＤＯＭ１０−５３−５６８およびＤＯＭ１０−５３−６１６）は、二種以上の霊長類ＩＬ−１３を中和することが出来る。一つの態様では、本発明は、二種以上の霊長類ＩＬ−１３の中和のために本発明に係る単一可変ドメインを提供し、中和のための組合せの任意選択肢としては、（ｉ）ヒトとカニクイザルＩＬ−１３種、（ｉｉ）ヒトおよびアカゲザルＩＬ−１３種、（ｉｉｉ）ヒト、カニクイザルおよびアカゲザルＩＬ−１３種、または（ｉｖ）ヒトおよびヒヒＩＬ−１３種、がある。一つの態様では、本発明は、ＩＬ−１３ アンタゴニストの製造のため、また二種以上の霊長類種ＩＬ−１３の中和のため、任意選択で（ｉ）ヒトとカニクイザルＩＬ−１３種、（ｉｉ）ヒトとアカゲザルＩＬ−１３種、（ｉｉｉ）ヒト、カニクイザルおよびアカゲザルＩＬ−１３種、または（ｉｖ）ヒトおよびヒヒＩＬ−１３種の中和のための、本発明に係る単一可変ドメインの使用を提供する。後の実施例で示されるように、ＤＯＭ１０−５３−５４６、ＤＯＭ１０−５３−５６７、ＤＯＭ１０−５３−５６８およびＤＯＭ１０−５３−６１６は、ＥＬＩＳＡまたはＨＥＫ ＳＴＡＴアッセイで、試験した全ての形態のＩＬ−１３（ヒト、カニクイザルおよびアカゲザルＩＬ−１３）に対し中和作用を示した。ＤＯＭ１０−５３−５４６、ＤＯＭ１０−５３−５６７、およびＤＯＭ１０−５３−５６８は、ヒト、カニクイザルおよびアカゲザルＩＬ−１３に対しさらに良好な中和能を示した。ＤＯＭ１０−５３−６１６は、カニクイザルおよびアカゲザルＩＬ−１３に対しＤＯＭ１０−５３−４７４より優れた中和剤であり、ヒトＩＬ−１３に対しては概して同程度の効果であった。
【００８７】
単一可変ドメイン（ＤＯＭ１０−５３−５６７とＤＯＭ１０−５３−５６８）は、特にプロテアーゼに安定である。一つの態様では、本発明は、プロテアーゼに安定な単一可変ドメイン、またはＩＬ−１３ アンタゴニストを提供するための本発明の単一可変ドメインを提供する。一つの態様では、本発明は、プロテアーゼに安定なＩＬ−１３アンタゴニストを提供するためのＩＬ−１３ アンタゴニストの製造における本発明の単一可変ドメインの使用を提供する。プロテアーゼの安定性は次のようにして求められる：
０．３ ｍｇ／ｍｌの単一可変ドメインをトリプシン（例えば、トリプシン活性 ＞５０００ｕｎｉｔ／ｍｇ）と２５：１のｄＡｂ：トリプシンの比率にして、ＰＢＳバッファー中で混合する。３０℃で２４時間インキュベーション後、インキュベーション後残っている活性ｄＡｂ％が求まる（例えば、ＢｉａｃｏｒｅＴＭ を使って）。２４時間後の少なくとも２０％の活性率（例えば、少なくとも、３０％、４０％または５０％）は、ｄＡｂのプロテアーゼ安定性を示すものである。
【００８８】
ここでWO2008149143を参照する。参照によりこの出願の全体を本明細書に組み込み、本明細書で、プロテアーゼ耐性のポリペプチドおよびｄＡｂ；これらの選択方法（使用可能な別のプロテアーゼおよび選択条件の開示を含む）；これらの使用；組成物、リガンドおよびこれらを含む産物；当該ポリペプチドおよびｄＡｂの利点、に関するさらなる開示を行う。これらの開示は、本開示に明確に含まれ、本発明に使われる本開示の一部を形成する。
【００８９】
ポリペプチドおよびペプチドは、医療、治療、および診断用薬剤としての産業上の応用と利用を含む種々の応用に対して、ますます重要な薬剤になってきている。しかし、炎症状態（例えばＣＯＰＤ）、および癌、等の特定の生理学的状態では、組織、器官、または動物中（肺の中、腫瘍の中、または、腫瘍に近接した）に存在するプロテアーゼの量が増加する可能性がある。このプロテアーゼの増加により、内因性タンパク質や治療用ペプチド、ポリペプチド、および疾患治療に投与されたタンパク質の急速分解・失活が起こる。従って、体内での使用（例えば、ヒト等の哺乳動物の疾患の治療、診断または予防での使用）で効力のある一部の薬剤がプロテアーゼによって急速に分解・失活するという理由で、限られた効果しか持たないことになる。
【００９０】
プロテアーゼ耐性のポリペプチドはいくつかの利点がある。例えば、プロテアーゼ耐性ポリペプチドは、プロテアーゼ感受性の薬剤より体内で長い時間活性を維持し、従って、生化学的効果を生み出すのに充分な期間にわたって機能を維持出来る。プロテアーゼ分解に耐性を示し、また所望の生物学的活性を有するポリペプチドを選択する改良法を求める要望がある。肺を含む系統である消化管（ＧＩ ｔｒａｃｔ）および／または肺系統中の体液や組織中に分布するプロテアーゼへの耐性を有するペプチドやポリペプチドを提供することは特に有用であろう。消化管と肺系統は両方ともヒト等の哺乳動物の疾患や悪性状態に関係する部位であり、この意味でもプロテアーゼ耐性ペプチドとポリペプチド薬剤は有用であろう。
【００９１】
本発明の単一可変ドメイン（ＤＯＭ１０−５３−５４６およびＤＯＭ１０−５３−６１６）は原核細胞においてＤＯＭ１０−５３−４７４より遙かに良好な発現レベルを示した。一つの態様では、本発明は、原核細胞中でＤＯＭ１０−５３−４７４の発現より優れた発現を行う単一可変ドメインを提供するために本発明の単一可変ドメイン（例えば、ＤＯＭ１０−５３−５４６およびＤＯＭ１０−５３−６１６）を提供する。一つの態様では、ＩＬ−１３ アンタゴニストの製造における本発明の単一可変ドメイン（例えば、ＤＯＭ１０−５３−５４６およびＤＯＭ１０−５３−６１６）の使用を提供する。この場合、単一可変ドメインは、原核細胞中でＤＯＭ１０−５３−４７４の発現より優れた発現を行う。
【００９２】
先に述べた本発明のいずれの態様の実施形態でも、単一可変ドメインはヒト、カニクイザルおよびアカゲザルＩＬ−１３と特異的に結合する。特異的結合は、１０マイクロモル以下の解離定数 Ｋｄで表され、１マイクロモル以下のＫｄも任意に選択可能である。抗原結合タンパク質の抗原またはエピトープに対する特異的結合は、例えば、スキャッチャード解析、および／または競合的結合アッセイ、例えば放射性免疫検定法（ＲＩＡ）等、ＥＬＩＳＡおよびおよびサンドイッチ競合的アッセイ等の酵素免疫測定法、、ならびにこれらの様々な変種、を含む適切なアッセイによって測定可能である。
【００９３】
結合アフィニティは、任意選択肢として、Ｂｉａｃｏｒｅシステム（Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使って表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）やＢｉａｃｏｒｅ（Karlsson et al., 1991）により測定してもよい。Ｂｉａｃｏｒｅシステムは、表面プラズモン共鳴（SPR, Welford K. 1991, Opt. Quant. Elect. 23:1; Morton and Myszka, 1998, Methods in Enzymology 295: 268）を使いリアルタイムに生体分子間相互作用をモニターし、３００ｎｍの深さまでの屈折率の変化の結果としてガラス支持上の金薄膜表面の光の共鳴角度変化を検出することが可能な表面プラズモン共鳴を使う。Ｂｉａｃｏｒｅ解析は、好都合にも、会合速度定数、解離速度定数、平衡解離定数、および親和性定数を生成する。結合アフィニティは、Ｂｉａｃｏｒｅプラズモン共鳴システム（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｉｎｃ．社）を使って、会合と解離速度定数を評価することにより得られる。製造メーカー（Ｂｉａｃｏｒｅ）の説明書によれば、のバイオセンサーチップが標的の共有結合のために活性化される。次いで標的は希釈され、チップ越しに注入されて固定化物質の反応単位の信号を得る。共鳴単位（ＲＵ）で表示の信号は固定化物質の質量に比例するので、これは、マトリックス上の一連の固定化標的密度を表す。解離データは、１部位モデル（ｏｎｅ−ｓｉｔｅ ｍｏｄｅｌ）へのフィッティングでｋｏｆｆ＋／−ｓ．ｄ．（測定値の標準偏差）を得る。疑似一次反応速度定数（Ｋｄ）が、各解離曲線に対し計算され、タンパク質濃度の関数としてプロットしてｋｏｎ＋／−ｓ．ｅ．（フィットの標準誤差）を得る。結合の平衡解離定数Ｋｄは、ＳＰＲ測定からｋｏｆｆ／ｋｏｎとして計算される。
【００９４】
先に述べた本発明のいずれの態様の実施形態でも、可変ドメインは、標準的ＨＥＫ ＳＴＡＴアッセイのＥＣ５０値の約０．１〜０．２ ｎＭでヒトＩＬ−１３を中和する。ここで、ＥＣ５０値は、任意選択肢として、約０．２〜約２．０ ｎＭ、約０．３〜約１．５ ｎＭ、約０．２〜約１．０ ｎＭ、または約０．３〜約１．０ ｎＭであってもよい。一つの態様では、本発明は、標準的ＨＥＫ ＳＴＡＴアッセイのＥＣ５０値の約０．１〜０．２ ｎＭで、また、任意選択肢として、約０．２〜約２．０ ｎＭ、約０．３〜約１．５ ｎＭ、約０．２〜約１．０ ｎＭ、または約０．３〜約１．０ ｎＭで、ヒトＩＬ−１３を中和するために本発明の単一可変ドメインを提供する。一つの態様では、本発明は、標準的ＨＥＫ ＳＴＡＴアッセイのＥＣ５０値の約０．１〜０．２ ｎＭで、また、任意選択肢として、約０．２〜約２．０ ｎＭ、約０．３〜約１．５ ｎＭ、約０．２〜約１．０ ｎＭ、または約０．３〜約１．０ ｎＭで、可変ドメインまたはアンタゴニストがヒトＩＬ−１３を中和する場合の、ＩＬ−１３ アンタゴニストの製造における本発明の単一可変ドメインの使用を提供する。
【００９５】
先に述べた本発明のいずれの態様の実施形態でも、可変ドメインは、標準的ＨＥＫ ＳＴＡＴアッセイのＥＣ５０値の約１〜２０ ｎＭで、また、任意選択肢として、約１〜約１５ ｎＭ、約２〜約１５ ｎＭ、または約２〜約１１．５ ｎＭで、アカゲザルＩＬ−１３を中和する。一つの態様では、本発明は、標準的ＨＥＫ ＳＴＡＴアッセイのＥＣ５０値の約１〜２０ ｎＭで、また、任意選択肢として、約１〜約１５ ｎＭ、約２〜約１５ ｎＭ、または約２〜約１１．５ ｎＭで、アカゲザルＩＬ−１３を中和するための本発明の単一可変ドメインを提供する。一つの態様では、本発明は、標準的ＨＥＫ ＳＴＡＴアッセイのＥＣ５０値の約１〜２０ ｎＭで、また、任意選択肢として、約１〜約１５ ｎＭ、約２〜約１５ ｎＭ、または約２〜約１１．５ ｎＭで、可変ドメインまたはアンタゴニストがアカゲザル ＩＬ−１３を中和する場合の、ＩＬ−１３ アンタゴニストの製造における本発明の単一可変ドメインの使用を提供する。
【００９６】
先に述べた本発明のいずれの態様の実施形態でも、可変ドメインは、標準的ＨＥＫ ＳＴＡＴアッセイのＥＣ５０値の約１〜２０ ｎＭで、また、任意選択肢として、約５〜約１５ ｎＭ、または約５〜約１０ ｎＭで、カニクイザルＩＬ−１３を中和する。一つの態様では、本発明は、標準的ＨＥＫ ＳＴＡＴアッセイのＥＣ５０値の約１〜２０ ｎＭで、また、任意選択肢として、約５〜約１５ ｎＭ、または約５〜約１０ ｎＭで、カニクイザルＩＬ−１３を中和するための本発明の単一可変ドメインを提供する。一つの態様では、本発明は、標準的ＨＥＫ ＳＴＡＴアッセイのＥＣ５０値の約１〜２０ ｎＭで、また、任意選択肢として、約５〜約１５ ｎＭ、または約５〜約１０ ｎＭで、可変ドメインまたはアンタゴニストがカニクイザルＩＬ−１３を中和する場合の、ＩＬ−１３ アンタゴニストの製造における本発明の単一可変ドメインの使用を提供する。
【００９７】
標準的ＨＥＫ ＳＴＡＴアッセイの実施例を以下に示す：
（ｉ） 抗ＩＬ−１３ｄＡｂ（または、抗ＩＬ−１３ｄＡｂを含むアンタゴニスト）を６ ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１３と共に３７℃、５％ＣＯ２の条件下、１時間インキュベートする；
（ｉｉ） インキュベーション混合物を、ウエル当たり５ｘ１０４のＨＥＫＢｌｕｅＴＭ−ＳＴＡＴ６細胞（ＳＴＡＴ６遺伝子と分泌胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポーター遺伝子を形質移入されたＨＥＫ２９３細胞）を入れたマイクロタイタープレートのＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地）に添加する；
（ｉｉｉ）プレートを３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間インキュベートする；
（ｉｖ） レポーター遺伝子産物を検出し定量する。
【００９８】
ステップ （ｉ）で、任意選択肢として、等容積のｄＡｂと組換え型ＩＬ−１３を使って予備インキュベーションを行ってもよい。また、任意選択肢として、最高濃度の４００ ｎｍ（アッセイ中の最終濃度の２Ｘ）から１／２ログ希釈を使ってｄＡｂを滴定して８点用量反応曲線を作成し、次いでこれをＩＬ−１３とインキュベートしてもよい。ステップ（ｉｖ）で、任意選択肢として、培養上澄みをＱｕａｎｔｉＢｌｕｅ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社 ）と混ぜ、６４０ ｎｍで吸光度を読みとってもよい。
【００９９】
抗ＩＬ−１３ｄＡｂ活性は、ＩＬ−１３の刺激に比べＳＴＡＴ６活性化と対応するＡ６４０の減少をもたらす。ＥＣ５０値は当業者には既知の方法により計算できる。
【０１００】
「ＨＥＫ２９３細胞」とは、２９３と命名されたヒト胚腎細胞株（ＡＴＣＣ Ｎｕｍｂｅｒ ＣＲＬ−１５７３）またはその派生体を指す。例えば、２９３／ＳＦ細胞は（ＡＴＣＣ Ｎｕｍｂｅｒ ＣＲＬ−１５７３．１）は、ＨＥＫ２９３であり、無血清培地中で増殖するように適合されている。また、本発明で意図されているように、ＨＥＫ２９３細胞は、他の培養条件下でも、またはどのようなＨＥＫ２９３細胞種または派生体であっても増殖するように適合されている。ＨＥＫＢｌｕｅＴＭ−ＳＴＡＴ６細胞は、４つのＳＴＡＴ６結合部位に融合したＩＦＮβ最小プロモーターの制御下で、レポーター遺伝子分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）を安定的に発現する。ＨＥＫ２９３細胞操作およびＳＴＡＴ６遺伝子と分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポーター遺伝子を形質移入したＨＥＫ２９３細胞の操作に適用される適切な構築物の詳細については、Loignon et al, “Stable high volumetric production of glycosylated human recombinant IFNalpha2b in HEK293 cells”, BMC Biotechnology 2008, 8:65を参照のこと。
【０１０１】
ある態様では、本発明は、本発明に係る抗ＩＬ−１３免疫グロブリン単一可変ドメインを含むインターロイキンー１３（ＩＬ−１３）アンタゴニストを提供する。任意選択肢として、前記アンタゴニストはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）からなるものではない。任意選択肢として、前記アンタゴニストはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）を含むものではない。任意選択肢として、前記アンタゴニストは、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）に結合したＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）を含むものではなく、さらに任意選択しとして、ここでｍＡｂが抗ＩＬ−４ ｍＡｂまたは抗ＩＬ−５ ｍＡｂであってもよい。
【０１０２】
一実施形態では、アンタゴニストは、ＩＬ−１３との結合について、ＤＯＭ１０−５３−５４６（配列番号２）；ＤＯＭ１０−５３−５６７（配列番号３）；ＤＯＭ１０−５３−５６８（配列番号４）；またはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）と競合する。任意選択肢として、前記アンタゴニストは、ＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）からなるものではない。任意選択肢として、前記アンタゴニストは、ＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）を含むものではない。任意選択肢として、前記アンタゴニストは、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）に結合したＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）を含むものではなく、さらに任意選択肢として、ここでｍＡｂが抗ＩＬ−４ ｍＡｂまたは抗ＩＬ−５ ｍＡｂであってもよい。一実施形態では、ＩＬ−１３はヒトＩＬ−１３である。別の実施形態では、ＩＬ−１３はカニクイザルＩＬ−１３である。別の実施形態では、ＩＬ−１３はアカゲザルＩＬ−１３である。一実施形態では、アンタゴニストは、ヒトＩＬ−１３およびカニクイザルＩＬ−１３との結合について、ＤＯＭ１０−５３−５４６（配列番号２）；ＤＯＭ１０−５３−５６７（配列番号３）；ＤＯＭ１０−５３−５６８（配列番号４）；またはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）と競合する。
【０１０３】
別の実施形態では、アンタゴニストは、ヒトＩＬ−１３、カニクイザルＩＬ−１３およびアカゲザルＩＬ−１３との結合について、ＤＯＭ１０−５３−５４６（配列番号２）；ＤＯＭ１０−５３−５６７（配列番号３）；ＤＯＭ１０−５３−５６８（配列番号４）；またはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）と競合する。任意選択肢として、前記アンタゴニストは、ＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）からなるものではない。任意選択肢として、前記アンタゴニストは、ＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）を含むものではない。任意選択肢として、前記アンタゴニストは、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）に結合したＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）を含むものではなく、さらに任意選択肢として、ここでｍＡｂが抗ＩＬ−４ ｍＡｂまたは抗ＩＬ−５ ｍＡｂであってもよい。
【０１０４】
一つの態様では、本発明は、肺送達のための、本発明に係るあらゆる抗ＩＬ−１３単一可変ドメイン（例えば、ＤＯＭ１０−５３−６１６）もしくはアンタゴニスト、組成物、または融合タンパク質を提供する。一つの態様では、本発明は、患者の肺への送達のための抗ＩＬ−１３単一可変ドメインまたはアンタゴニストまたは融合タンパク質を提供する。一つの態様では、本発明は、肺送達のための医薬品の製造における、本発明に係るあらゆる抗ＩＬ−１３単一可変ドメイン（例えば、ＤＯＭ１０−５３−６１６）もしくはアンタゴニスト、組成物、または融合タンパク質の使用を提供する。一つの態様では、本発明は、患者の肺への送達のための医薬品の製造における、本発明に係るあらゆる抗ＩＬ−１３単一可変ドメイン（例えば、ＤＯＭ１０−５３−６１６）もしくはアンタゴニスト、組成物、または融合タンパク質の使用を提供する。一実施形態では、可変ドメインそれ自体で、またはアンタゴニストや融合タンパク質の一部として、ロイコザイム、および／またはトリプシンに耐性を示す。
【０１０５】
本発明は、他の肺疾患、例えば慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）または肺炎を治療、抑制または予防するための方法を提供する。本発明に従って治療、抑制または予防が可能な他の肺疾患には、例えば、嚢胞性繊維症および喘息（例えば、ステロイド耐性喘息）が含まれる。このように、別の態様では、本発明は肺疾患（例えば、嚢胞性繊維症、喘息）を治療、抑制または予防する方法であり、それを必要とする哺乳動物に、治療上有用な用量または用量の、本発明に係るポリペプチド、融合タンパク質、単一可変ドメイン (例えば、ＤＯＭ１０−５３−６１６）、アンタゴニスト、または組成物を投与することを含む。
【０１０６】
特定の実施形態では、本発明に係るポリペプチド、融合タンパク質、単一可変ドメイン （例えば、ＤＯＭ１０−５３−６１６）、アンタゴニスト、または組成物は、吸入（例えば、気管支内、鼻孔内投与、経口吸入、鼻腔内ドロップ）または全身送達（例えば、非経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下）等の肺送達経由で投与される。
【０１０７】
本発明のさらなる態様では、本発明に係るあらゆるポリペプチド、単一可変ドメイン（例えば、ＤＯＭ１０−５３−６１６）、組成物、またはアンタゴニストと、薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤とを含む組成物が提供される。
【０１０８】
さらに、本発明は、本発明に係るあらゆるポリペプチド、単一可変ドメイン（例えば、ＤＯＭ１０−５３−６１６）、組成物、またはアンタゴニストを用いた疾患の治療方法を提供する。ある実施形態では、疾患は、癌または炎症性疾患、例えば関節リウマチ、喘息、またはクローン病である。
【０１０９】
本発明のある態様では、本発明に係るあらゆるポリペプチド、単一可変ドメイン（例えば、ＤＯＭ１０−５３−６１６）、組成物、またはアンタゴニストが、ヒトのＩＬ−１３媒介疾患の治療および／または予防のために提供される。別の態様では、ヒトのＩＬ−１３媒介疾患の治療または予防のための医薬品の製造におけるポリペプチド、単一可変ドメイン、組成物、またはアンタゴニストの使用が提供される。別の態様では、ヒト患者のＩＬ−１３媒介疾患の治療および／または予防方法を提供し、この方法は、本発明に係るあらゆるポリペプチド、単一可変ドメイン（例えば、ＤＯＭ１０−５３−６１６）、組成物、またはアンタゴニストの患者への投与を含む。一実施態様では、ＩＬ−１３媒介疾患は呼吸症状である。一実施態様では、ＩＬ−１３媒介疾患は、以下から選択される：
肺炎症、慢性閉塞性肺疾患、喘息、肺炎、過敏性肺炎、好酸球増加を伴う肺湿潤物、環境性肺疾患、肺炎、気管支拡張症、嚢胞性線維症、間質性肺疾患、原発性肺高血圧症、肺血栓塞栓症、胸膜障害、縦隔障害、隔膜障害、換気低下、過呼吸、睡眠時無呼吸、急性呼吸促迫症候群、中皮腫、肉腫、移植片拒絶、移植片対宿主病、肺癌、アレルギー性鼻炎、アレルギー、石綿症、アスペルギルス腫、アスペルギルス症、気管支拡張症、慢性気管支炎、肺気腫、好球性肺炎、特発性肺線維症、侵襲性肺炎球菌疾患、インフルエンザ、非結核性抗酸菌、胸水、塵肺症、ニューモシスチス症、肺炎、肺放線菌症、肺胞タンパク症、肺炭疽、肺水腫、肺塞栓症、肺炎症、肺ヒスチオサイトーシスX、肺高血圧、肺ノカルジア症、肺結核症、肺静脈閉塞性疾患、リウマチ性肺疾患、サルコイドーシス、およびウェゲナー肉芽腫症。
【０１１０】
本発明のある態様では、本発明に係るポリペプチド、単一可変ドメイン（例えば、ＤＯＭ１０−５３−６１６）、組成物、またはアンタゴニストを含む肺送達デバイスを提供する。このデバイスは、吸入器、または鼻腔内投与デバイスであってもよい。
【０１１１】
本発明のリガンド（ポリペプチド、単一可変ドメイン、組成物、またはアンタゴニスト）は、ＩＬ−１３のＩＬ−１３Ｒα１および／またはＩＬ−１３Ｒα２への結合を阻害し、ＩＬ−１３の活性を抑制し、ならびに／あるいはＩＬ−１３のＩＬ−１３Ｒα１および／またはＩＬ−１３Ｒα２への結合を実質的に阻害することなくＩＬ−１３の活性を抑制する。一つの態様では、本発明は、ＩＬ−１３のＩＬ−１３Ｒα１および／またはＩＬ−１３Ｒα２への結合を阻害する、ＩＬ−１３の活性を抑制する、ならびに／あるいはＩＬ−１３のＩＬ−１３Ｒα１および／またはＩＬ−１３Ｒα２への結合を実質的に阻害することなくＩＬ−１３の活性を抑制するための本発明に係る単一可変ドメイン（例えば、ＤＯＭ１０−５３−６１６）を提供する。一つの態様では、本発明は、ＩＬ−１３のＩＬ−１３Ｒα１および／またはＩＬ−１３Ｒα２への結合を阻害する、ＩＬ−１３の活性を抑制する、ならびに／あるいはＩＬ−１３のＩＬ−１３Ｒα１および／またはＩＬ−１３Ｒα２への結合を実質的に阻害することなくＩＬ−１３の活性を抑制するためのＩＬ−１３アンタゴニストの製造における本発明に係る単一可変ドメイン（例えば、ＤＯＭ１０−５３−６１６）の使用を提供する。
【０１１２】
一実施形態では、ＩＬ−１３に結合するリガンド（例えば、免疫グロブリン単一可変ドメイン）は、ＩＬ−１３のＩＬ−１３受容体（例えば、ＩＬ−１３Ｒα１、ＩＬ−１３Ｒα２）との結合を、抑制濃度５０（ＩＣ５０）の値が、＜約１０μＭ、＜約１μＭ、＜約１００ｎＭ、＜約１０ｎＭ、＜約１ｎＭ、＜約５００ｐＭ、＜約３００ｐＭ、＜約１００ｐＭ、＜約１０ｐＭで阻害する。任意選択肢として、ＩＣ５をインビトロで本明細書に記載されているような受容体結合アッセイを使って測定してもよい。
【０１１３】
リガンド（例えば、免疫グロブリン単一可変ドメイン）は、適切なインビトロアッセイにおいて中和用量５０（ＮＤ５０）の値が、＜約１０μＭ、＜約１μＭ、＜約１００ｎＭ、＜約１０ｎＭ、＜約１ｎＭ、＜約５００ｐＭ、＜約３００ｐＭ、＜約１００ｐＭ、＜約１０ｐＭ、＜約１ｐＭ、＜約５００ｆＭ、＜約３００ｆＭ、＜約１００ｆＭ、＜約１０ｆＭ、でＩＬ−１３誘導機能を阻害することが任意に選択できることもまた意図されている。例えば、リガンドは、ＴＦ−１細胞を５ ｎｇ／ｍｌの最終濃度のＩＬ−１３と混合する本明細書記載のアッセイのようなインビトロアッセイでＩＬ−１３誘導ＴＦ−１細胞増殖（ＡＴＣＣ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＣＲＬ−２００３）を阻害できる。
【０１１４】
リガンドは、任意選択として、１ｘ１０５Ｂ細胞を１０または１００ ｎＭの抗ＩＬ−１３ｄＡｂでインキュベートした本明細書に記載のアッセイのようなインビトロアッセイでＩＬ−１３誘導Ｂ細胞増殖の、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％を阻害することが可能であることも意図されている。
【０１１５】
本発明のある態様では、本発明に係る単一可変ドメインを含む二重特異性リガンドが提供される。より具体的な実施形態では、リガンドは、ＩＬ−４およびＩＬ−１３に対する結合特異性をを有し、ＩＬ−４に対する結合について抗ＩＬ−４ドメイン抗体（ｄＡｂ）と競合するＩＬ−４に対する結合特異性を持つ免疫グロブリン単一可変ドメインを含む。このｄＡｂはWO2007085815に開示された抗ＩＬ−４ｄＡｂ群から選択されるが、ここに記載のｄＡｂの配列は全体が本明細書に組み込まれ本発明に係る二重特異性リガンドに適用される。任意選択で、前記リガンドはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）からなるものではない。任意選択で、前記リガンドはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）を含むものではない。前記リガンドは、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）として抗ＩＬ−４ ｍＡｂまたは抗ＩＬ−５ ｍＡｂから任意に選択されたｍＡｂに結合しているＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）を含むものではない。
【０１１６】
本発明の全態様において、特定の、またはそれぞれの免疫グロブリン単一可変ドメインは、抗体重鎖と軽鎖の単一可変ドメイン、例えばＶＨ、ＶＬ、ＶＨＨ、から独立に選択される。
【０１１７】
一部の実施形態では、二重特異性リガンドは、ＩＬ−１３に対する結合特異性を有する２つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（例えば、２つの互いに等価なドメイン）、および別の標的（例えばＩＬ−４）に対する結合特異性を有する２つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むＩｇＧ様フォーマットであってもよい。任意選択で、前記リガンドはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）からなるものではない。任意選択で、前記リガンドはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）を含むものではない。前記リガンドは、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）として抗ＩＬ−４ ｍＡｂまたは抗ＩＬ−５ ｍＡｂから任意に選択されたｍＡｂに結合しているＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）を含むものではない。
【０１１８】
一部の実施形態では、二重特異性リガンドは抗体ＦＣドメインを含んでもよい。任意選択で、前記リガンドはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）からなるものではない。任意選択で、前記リガンドはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）を含むものではない。前記リガンドは、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）として抗ＩＬ−４ ｍＡｂまたは抗ＩＬ−５ ｍＡｂから任意に選択されたｍＡｂに結合しているＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）を含むものではない。
【０１１９】
一部の実施形態では、二重特異性リガンドはＩｇＧ定常ドメインを含んでもよい。任意選択で、前記リガンドはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）からなるものではない。任意選択で、前記リガンドはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）を含むものではない。前記リガンドは、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）として抗ＩＬ−４ ｍＡｂまたは抗ＩＬ−５ ｍＡｂから任意に選択されたｍＡｂに結合しているＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）を含むものではない。
【０１２０】
他の実施形態では、本明細書に記述されたいずれのリガンドも（例えば、アンタゴニスト、または単一可変ドメイン）、半減期延長部分、例えばポリアルキレングリコール部分、血清アルブミンもしくはこれらの断片、トランスフェリン受容体もしくはそのトランスフェリン結合部分、または体内で半減期を延長するポリペプチドのための結合部位を含む部分、をさらに含む。一部の実施形態では、半減期延長部分は、体内で半減期を延長するポリペプチドのための結合部位を含む部分である。このポリペプチドは、アフィボディ、ＳｐＡドメイン、ＬＤＬ受容体クラスＡドメイン、ＥＧＦドメイン、およびアビマーからなる群から選ばれる。
【０１２１】
他の実施形態では、半減期延長部分は、ポリエチレングリコール部分である。一実施形態では、アンタゴニストは、ポリエチレングリコール部分（任意選択として、前記部分の大きさが約２０ 〜約５０ｋＤａ、任意選択として約４０ｋＤａ直鎖、または分岐ＰＥＧである）に結合している本発明の単一可変ドメインを含む（成分として含有を選択してもよい）。ｄＡｂと結合部分のＰＥＧ付加に関するより詳細はWO04081026を参照のこと。一実施形態では、アンタゴニストはＰＥＧに結合したｄＡｂモノマーから成る。ここで、ｄＡｂモノマーは本発明に係る単一可変ドメインであり、ＤＯＭ１０−５３−５４６（配列番号２）；ＤＯＭ１０−５３−５６７（配列番号３）；ＤＯＭ１０−５３−５６８（配列番号４）；またはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）も任意に選択できる。このアンタゴニストは、炎症性疾患、肺疾患（例えば、喘息、インフルエンザ、ＣＯＰＤ）、または癌の治療用に提供されるが、任意選択で静脈内投与用としてもよい。
【０１２２】
他の実施形態では、半減期延長部分は抗体または抗体フラグメント（例えば、免疫グロブリン単一可変ドメイン）で、血清アルブミンまたは新生児ＦＣ受容体のための結合部位を含む。
【０１２３】
また、本発明は、治療または診断に使用するための本発明のリガンド（例えば、アンタゴニスト、または単一可変ドメイン）、および、本明細書に記載された疾患（例えば、アレルギー疾患、Ｔｈ２媒介疾患、喘息、癌）の治療、予防または抑制のための医薬品の製造のための本発明のリガンドの使用に関する。任意選択で、前記リガンドはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）からなるものではない。任意選択で、前記リガンドはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）を含むものではない。前記リガンドは、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）として抗ＩＬ−４ ｍＡｂまたは抗ＩＬ−５ ｍＡｂから任意に選択されたｍＡｂに結合しているＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）を含むものではない。
【０１２４】
また、本発明は、Ｔｈ２型免疫反応を治療、抑制または予防に使用するための本発明のリガンド（例えば、アンタゴニスト、または単一可変ドメイン）に関する。任意選択で、前記リガンドはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）からなるものではない。任意選択で、前記リガンドはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）を含むものではない。前記リガンドは、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）として抗ＩＬ−４ ｍＡｂまたは抗ＩＬ−５ ｍＡｂから任意に選択されたｍＡｂに結合しているＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）を含むものではない。
【０１２５】
また、本発明は、必要に応じ被験者に治療効果のある本発明のリガンド（例えば、アンタゴニストまたは単一可変ドメイン）を投与すること含む治療方法に関する。一実施形態では、本発明は、必要に応じ被験者に本発明に係る治療上有用な量のリガンドを投与することを含むＴｈ２型免疫反応の阻害方法に関する。任意選択で、前記リガンドはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）からなるものではない。任意選択で、前記リガンドはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）を含むものではない。前記リガンドは、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）として抗ＩＬ−４ ｍＡｂまたは抗ＩＬ−５ ｍＡｂから任意に選択されたｍＡｂに結合しているＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）を含むものではない。
【０１２６】
他の実施形態では、本発明は、それを必要とする被験者に本発明に係る治療上有用な量のリガンド（例えば、アンタゴニストまたは単一可変ドメイン）を投与することを含む喘息を治療する方法に関する。任意選択で、前記リガンドはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）からなるものではない。任意選択で、前記リガンドはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）を含むものではない。前記リガンドは、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）として抗ＩＬ−４ ｍＡｂまたは抗ＩＬ−５ ｍＡｂから任意に選択されたｍＡｂに結合しているＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）を含むものではない。
【０１２７】
他の実施形態では、本発明は、それを必要とする被験者に本発明に係る治療上有用な量のリガンド（例えば、アンタゴニストまたは単一可変ドメイン）を投与することを含む癌を治療する方法に関する。任意選択で、前記リガンドはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）からなるものではない。任意選択で、前記リガンドはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）を含むものではない。前記リガンドは、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）として抗ＩＬ−４ ｍＡｂまたは抗ＩＬ−５ ｍＡｂから任意に選択されたｍＡｂに結合しているＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）を含むものではない。
【０１２８】
また、本発明は、本発明のリガンド（例えば、アンタゴニストまたは単一可変ドメイン）および生理学的に受容可能な担体を含む組成物（例えば、医薬組成物）に関する。一部の実施形態では、組成物は、静脈内、筋肉内、腹腔内、動脈内、硬腔内、関節内、皮下、肺、鼻腔内、膣、直腸への投与、のための賦形剤を含む。
【０１２９】
また、本発明は、本発明の組成物（例えば、医薬組成物）を含む薬剤送達デバイスに関する。一部の実施形態では、薬剤送達デバイスは、複数の治療効果のある用量のリガンドを含む。
【０１３０】
他の実施形態では、薬剤送達デバイスは、非経口送達デバイス、静脈内送達デバイス、筋肉内送達デバイス、腹腔内送達デバイス、経皮的送達デバイス、肺送達デバイス、動脈内送達デバイス、硬腔内送達デバイス、関節内送達デバイス、皮下送達デバイス、鼻腔内送達デバイス、膣送達デバイス、直腸内送達デバイス、注射器、経皮吸収デバイス、カプセル、タブレット、噴霧器、吸引器、霧吹き、エアロゾル投与器、噴霧器（ミスター）、ドライパウダー吸入器、定量吸入器、定量噴霧器、定量噴霧器（定量ミスター）、定量霧吹き、およびカテーテル、からなる群より選択される。
【０１３１】
本発明のリガンドはいくつかの利点を有する。例えば、本明細書で記載されているように、リガンドは体内における所望の血清半減期に合わせることが可能である。ドメイン抗体は通常の抗体より遙かに小さく、通常の抗体より組織への浸透性が優れた投与が可能である。このように、ｄＡｂとｄＡｂ含有リガンドは、Ｔｈ２媒介疾患、喘息、アレルギー性疾患、癌（例えば、腎細胞癌）、等の疾患治療のための投与に際し、通常の抗体に勝る利点を提供する。例えば、喘息（例えば、アレルギー性喘息）はＩｇＥ媒介でも非ＩｇＥ媒介でもよく、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、または、ＩＬ−４とＩＬ−１３の両方に対し、結合特異性を有するリガンドは、ＩｇＥ媒介および非ＩｇＥ媒介の両喘息の治療のために投与可能である。
【０１３２】
同様に、ＩＬ−４とＩＬ−１３の生物活性の重複と類似性により、ＩＬ−４およびＩＬ−１３に対する結合特異性を有するリガンドを使った治療で、患者（例えば、アレルギー性疾患（例えばアレルギー性喘息）の患者）に投与して単一治療薬剤を使って優れた治療を提供できる。
【０１３３】
本発明のリガンドは、本明細書で記載されているようなフォーマットにすることが出来る。例えば、本発明のリガンドは体内血清半減期を調整するフォーマットにできる。本明細書に記載されているように、必要に応じ、リガンドがさらに毒素または毒素部分を含むことも可能である。一部の実施形態では、リガンドは、フリーラジカル生成剤（例えば、セレニウム含有毒素）または放射性核種、等の表面活性毒素を含む。他の実施形態では、毒素または毒素成分は、細胞内標的に対し結合特異性のある結合部位を有するポリペプチドドメイン（例えばｄＡｂ）である。特定の実施形態では、リガンドは、ＩＬ−１３ (例えば、ヒトＩＬ−１３)に対する結合特異性を有するＩｇＧ様フォーマットである。
【０１３４】
また、本発明は、アレルゲン感作被験者の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）増殖を阻害する方法に関し、被験者に本発明のいずれかのリガンド（例えば、アンタゴニストまたは単一可変ドメイン）を含む医薬組成物を投与することを含む。一部の実施形態では、アレルゲンは、イエダニ、チリダニ類、猫アレルゲン、草アレルゲン、かびアレルゲン、花粉アレルゲン、から選択される。
【０１３５】
また、本発明は、被験者のＢ細胞増殖を阻害する方法に関し、本発明のリガンドを含む医薬組成物を被験者に投与することを含む。任意選択で、前記リガンドはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）からなるものではない。任意選択で、前記リガンドはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）を含むものではない。前記リガンドは、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）として抗ＩＬ−４ ｍＡｂまたは抗ＩＬ−５ ｍＡｂから任意に選択されたｍＡｂに結合しているＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）を含むものではない。
【０１３６】
また、本発明は、本明細書に記載されている疾患（例えば、Ｙｈ２媒介疾患、アレルギー性疾患、癌）を治療、予防または抑制するための医薬組成物に関し、活性成分として本明細書に記載のリガンドを含む。任意選択で、前記リガンドはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）からなるものではない。任意選択で、前記リガンドはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）を含むものではない。前記リガンドは、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）として抗ＩＬ−４ ｍＡｂまたは抗ＩＬ−５ ｍＡｂから任意に選択されたｍＡｂに結合しているＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）を含むものではない。
【０１３７】
ある態様では、本発明は、本発明の単一可変ドメインを含む融合タンパク質を提供する。可変ドメインは、例えばペプチドやポリペプチド、またはタンパク質と融合できる。一実施形態では、可変ドメインは、例えばモノクローナル抗体等の抗体、または抗体フラグメントと融合する。一般的に、融合は、単一核酸配列から融合産物を発現させるか、または、単一可変ドメインを含むポリペプチドを発現させ、次いで通常の技術を使って、このペプチドをより大きなタンパク質や抗体のフォーマットに組みあげることにより達成される。任意選択で、前記リガンドはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）からなるものではない。任意選択で、前記リガンドはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）を含むものではない。前記リガンドは、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）として抗ＩＬ−４ ｍＡｂまたは抗ＩＬ−５ ｍＡｂから任意に選択されたｍＡｂに結合しているＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）を含むものではない。
【０１３８】
一実施形態では、免疫グロブリン単一可変ドメイン、アンタゴニスト、または融合タンパク質は、抗体定常ドメインを含む。一実施形態では、免疫グロブリン単一可変ドメイン、アンタゴニスト、または融合タンパク質は、抗体ＦＣを含み、この場合、ＦＣのＮ末端が可変ドメインのＣ末端に結合（直接結合も任意選択できる）していることも任意に選択可能である。一実施形態では、免疫グロブリン単一可変ドメイン、アンタゴニスト、または融合タンパク質は、半減期延長部分を含む。半減期延長部分は、ポリエチレングリコール部分、血清アルブミンやその断片、トランスフェリン受容体やそのトランスフェリン結合部分、または生体内半減期を延長するポリペプチドへの結合部位を含む抗体や抗体フラグメントであってもよい。半減期延長部分は、血清アルブミン、または新生児ＦＣ受容体に対する結合部位を含む抗体や抗体フラグメントであってもよい。半減期延長部分は、ｄＡｂ、抗体または抗体フラグメントであってもよい。一実施形態では、免疫グロブリン単一可変ドメイン、アンタゴニスト、または融合タンパク質は、可変ドメイン（または、アンタゴニストや融合タンパク質に含まれる可変ドメイン）がさらに、ポリアルキレングリコール部分を含むように作られている。ポリアルキレングリコール部分は、ポリエチレングリコール部分であってもよい。これ以上のことは後で議論される。
【０１３９】
一実施形態では、本発明の単一可変ドメインは、表面プラズモン共鳴法で測定して約１０〜約１５０ｐＭ、任意選択で約５０〜約１５０ｐＭ、任意選択で約７０〜約１５０ｐＭ、の解離定数（Ｋｄ）でヒトＩＬ−１３と結合する。一つの態様では、本発明は、ヒトＩＬ−１３との結合のための本発明の単一可変ドメインを提供し、この解離定数（Ｋｄ）は、表面プラズモン共鳴法で測定して約１０〜約１５０ｐＭ、任意選択で約５０〜約１５０ｐＭ、任意選択で約７０〜約１５０ｐＭである。一つの態様では、本発明は、Ｉｌ−１３アンタゴニストの製造における本発明の単一可変ドメインの使用を提供し、ここで、可変ドメインまたはアンタゴニストは、表面プラズモン共鳴法で測定して約１０〜約１５０ｐＭ、任意選択で約５０〜約１５０ｐＭ、任意選択で約７０〜約１５０ｐＭ、の解離定数（Ｋｄ）でヒトＩＬ−１３と結合する。
【０１４０】
一実施形態では、本発明の単一可変ドメインは、表面プラズモン共鳴法で測定して約１〜約５ｎＭの解離定数（Ｋｄ）でカニクイザルＩＬ−１３と結合する。一つの態様では、本発明は、表面プラズモン共鳴法で測定して約１〜約５ｎＭの解離定数（Ｋｄ）でカニクイザルＩＬ−１３との結合のための本発明の単一可変ドメインを提供する。一つの態様では、本発明は、ＩＬ−１３アンタゴニストの製造における本発明の単一可変ドメインの使用を提供し、ここでは、表面プラズモン共鳴法で測定して約１〜約５ｎＭの解離定数（Ｋｄ）で可変ドメインまたはアンタゴニストがカニクイザルＩＬ−１３と結合する。
【０１４１】
一実施形態では、本発明の単一可変ドメイン（例えば、ＤＯＭ１０−５３−６１６）は、ｄＡｂモノマーとして提供される。ここで、フォーマットされていない（例えば、ＰＥＧ付加されていない、もしくは、半減期延長されていない）、または、ＰＥＧに結合した状態で、乾燥粉末製剤として、吸入による患者への送達（例えば、肺への送達）のために、肺疾患（例えば、喘息、ＣＩＯＤ、インフルエンザ）の治療および／または予防のために、という条件も任意選択として追加可能である。一実施形態では、本発明の単一可変ドメインは、吸入による患者への送達（例えば、肺への送達）のためのｄＡｂモノマー（ＰＥＧ付加されていない、または半減期延長されていない）として提供され、また、肺疾患（例えば、喘息、ＣＯＰＤ、インフルエンザ）の治療および／または予防のために、という条件も任意選択で入れることが可能である。
【０１４２】
一つの態様では、本発明は、下記の内の一つまたは複数の内容（明確な下記の２つまたは複数の組合せがこれにより開示され、特許請求の範囲の対照となりうる）を提供するための、本発明のいずれかの態様や実施形態で示された単一可変ドメイン（例えば、ＤＯＭ１０−５３−６１６）、タンパク質、ポリペプチド、アンタゴニスト、組成物、またはデバイスを提供する：
（ｉ）ヒトＩＬ−１３との効果的な結合（例えば、約１ｎＭ以下、以降任意選択で約５００ｐＭ以下、約２５０ｐＭ以下、約１５０ｐＭ以下、約１００ｐＭ以下、約１ｎＭ〜約１０、約５０、約７０ｐＭ、約５００ｐＭ〜約１０、約５０、約７０ｐＭ、２５０ｐＭ〜約１０、約５０、約７０ｐＭ、約１５０ｐＭ〜約１０、約５０、約７０ｐＭ、約１００ｐＭ〜約１０、約５０、約７０ｐＭの解離定数（Ｋｄ）で）；
（ｉｉ）非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル、アカゲザルまたはヒヒ）ＩＬ−１３との効果的な結合（例えば、約５ｎＭ以下、以降任意選択として、約４、約３、約２または約１ｎＭ以下、約１〜約５ｎＭの解離定数（Ｋｄ）で）；
（ｉｉｉ）ヒトＩＬ−１３との効果的な結合（例えば、約１ｎＭ以下、以降任意選択で約５００ｐＭ以下、約２５０ｐＭ以下、約１５０ｐＭ以下、約１００ｐＭ以下、約１ｎＭ〜約１０、約５０、約７０ｐＭ、約５００ｐＭ〜約１０、約５０、約７０ｐＭ、２５０ｐＭ〜約１０、約５０、約７０ｐＭ、約１５０ｐＭ〜約１０、約５０、約７０ｐＭ、約１００ｐＭ〜約１０、約５０、約７０ｐＭの解離定数（Ｋｄ）で）、および、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル、アカゲザルまたはヒヒ）ＩＬ−１３との効果的な結合（例えば、約５ｎＭ以下、以降任意選択として、約４、約３、約２または約１ｎＭ以下、約１〜約５ｎＭの解離定数（Ｋｄ）で）；
（ｉｖ）ヒト、カニクイザル、およびアカゲザルＩＬ−１３との効果的な結合（例えば、ヒトＩＬ−１３とは、約１ｎＭ以下、以降任意選択で約５００ｐＭ以下、約２５０ｐＭ以下、約１５０ｐＭ以下、約１００ｐＭ以下、約１ｎＭ〜約１０、約５０、約７０ｐＭ、約５００ｐＭ〜約１０、約５０、約７０ｐＭ、２５０ｐＭ〜約１０、約５０、約７０ｐＭ、約１５０ｐＭ〜約１０、約５０、約７０ｐＭ、約１００ｐＭ〜約１０、約５０、約７０ｐＭの解離定数（Ｋｄ）で；および、カニクイザルおよびアカゲザルＩＬ−１３とは、それぞれ約５ｎＭ以下、以降任意選択として、約４、約３、約２または約１ｎＭ以下、約１〜約５ｎＭの解離定数（Ｋｄ）で）；
（ｖ）原核生物で少なくとも約３ｍｇ／Ｌの優れた発現（例えば、原核生物での発現（例えば大腸菌））。
【０１４３】
（ｖｉ）患者のヒトＩＬ−１３に対する効果的な中和、例えば、単一可変ドメイン、タンパク質、ポリペプチド、アンタゴニスト、または組成物は、標準的ＨＥＫ ＳＴＡＴアッセイ法において、約０．１〜約２．０ｎＭ、以降任意選択で約０．２〜約２．０ｎＭ、約０．３〜１．５ｎＭ、約０．２〜約１．０ｎＭまたは約０．３〜約１．０ｎＭのＥＣ５０値を示しヒトＩＬ−１３を中和する；
（ｖｉｉ）患者のヒトＩＬ−１３に対する効果的な中和、例えば、単一可変ドメイン、タンパク質、ポリペプチド、アンタゴニスト、または組成物は、標準的ＨＥＫ ＳＴＡＴアッセイ法において、約１〜約２０ｎＭ、以降任意選択で約５〜約１５ｎＭ、または約５〜約１０ｎＭのＥＣ５０値を示しカニクイザルＩＬ−１３を中和する；
（ｖｉｉｉ）患者のヒトＩＬ−１３に対する効果的な中和、例えば、標準的ＨＥＫ ＳＴＡＴアッセイ法において、約１〜約１５ｎＭ、約２〜約１５ｎＭ、または約２〜約１１．５ｎＭのＥＣ５０値を示しアカゲザルＩＬ−１３を中和する単一可変ドメイン、タンパク質、ポリペプチド、アンタゴニスト、または組成物を用いた中和；
（ｉｘ）ヒトＩＬ−１３および非ヒト霊長類の効果的な中和、例えば、標準的ＨＥＫ ＳＴＡＴアッセイ法において、約０．１〜約２．０ｎＭ、以降任意選択で約０．２〜約２．０ｎＭ、約０．３〜１．５ｎＭ、約０．２〜約１．０ｎＭまたは約０．３〜約１．０ｎＭのＥＣ５０値を示してヒトＩＬ−１３を中和し；標準的ＨＥＫ ＳＴＡＴアッセイ法において、約１〜約２０ｎＭ、以降任意選択で約５〜約１５ｎＭ、または約５〜約１０ｎＭのＥＣ５０値を示し非ヒト霊長類ＩＬ−１３を中和する単一可変ドメイン、タンパク質、ポリペプチド、アンタゴニスト、または組成物を用いた中和；
（ｘ）２種以上の霊長類ＩＬ−１３間の交差反応の提供（任意選択として、ヒトとカニクイザル、および／またはアカゲザルＩＬ−１３、例えば、ヒトとカニクイザルＩＬ−１３、ヒトとアカゲザルＩＬ−１３、ヒトとヒヒＩＬ−１３）；ならびに
（ｘｉ）プロテアーゼ安定性の提供（任意選択として、トリプシン安定性）。
【０１４４】
一つの態様では、本発明は、直前の段落の（ｉ）〜（ｘｉ）の内の一つまたは複数の内容を提供するために、本発明のいずれかの態様や実施形態に示された単一可変ドメイン（例えば、ＤＯＭ１０−５３−６１６）、タンパク質、ポリペプチド、アンタゴニスト、組成物、またはデバイスの使用を提供する。また、本発明は対応する方法も提供する。
【０１４５】
ここで、WO2007085815を参照するが、これは抗ＩＬ−１３ 免疫グロブリン単一可変ドメインを開示している。本文書の開示内容はその全体が本明細書に組み込まれ、特に使用、フォーマット、選択方法、製造法、製剤方法、および抗ＩＬ−１３単一可変ドメイン、リガンド、アンタゴニストのアッセイ法を提供する。これにより、この開示内容が、本発明の審査請求項目に組み込める明確な記述が与えられることを含め、本明細書の内容に具体的かつ明確に適用される。
【０１４６】
抗ＩＬ−１３免疫グロブリン単一可変ドメインは、任意の適切な免疫グロブリン可変ドメインであってよく、任意選択として、ヒト可変ドメインであっても、またはヒトフレームワークドメイン（例えばＤＰ４７またはＤＰＫ９フレームワークドメイン）を含むか、もしくは、それから派生した可変ドメインであってもよい。特定の実施形態では、本明細書記載の可変ドメインはユニバーサルフレームワークを基準にしている。
【０１４７】
特定の実施形態では、ＩＬ−１３に対して結合特異性のある結合部位を有するポリペプチドドメイン（例えば、免疫グロブリン単一可変ドメイン）は、凝集、折り畳み可逆性に抵抗する（WO04101790を参照のこと。この文書の教示は参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１４８】
核酸分子、ベクターおよび宿主細胞
また、本発明は、本明細書に記載のリガンド（単一可変ドメイン、融合タンパク質、ポリペプチド、二重特異性リガンドおよび多重特異性リガンド）をコードする、単離された、および／または、組換え型の核酸分子を提供する。
【０１４９】
一つの態様では、本発明は、本発明に係る免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドをコードする単離されたまたは組換え型の核酸を提供する。一実施形態では、核酸はＤＯＭ１０−５３−５４６（配列番号６）；ＤＯＭ１０−５３−５６７（配列番号７）；ＤＯＭ１０−５３−５６８（配列番号８）；またはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号９）のヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、核酸はＤＯＭ１０−５３−５４６（配列番号６）；ＤＯＭ１０−５３−５６７（配列番号７）；またはＤＯＭ１０−５３−５６８（配列番号８）のヌクレオチド配列を含む。
【０１５０】
一つの態様では、本発明は単離されたまたは組換え型の核酸を提供し、ここで核酸はＤＯＭ１０−５３−５４６（配列番号６）；ＤＯＭ１０−５３−５６７（配列番号７）；ＤＯＭ１０−５３−５６８（配列番号８）；またはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号９）のヌクレオチド配列に対し少なくとも９９％同一のヌクレオチド配列を含み、また、核酸が、ＩＬ−１３に特異的に結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドをコードしている。任意選択肢として、核酸はヌクレオチド配列ＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号９）からなるものではない、または、含むものではない。
【０１５１】
一つの態様では、本発明は、本発明の核酸を含むベクターを提供する。一つの態様では、本発明は、本発明の核酸、またはベクターを含む宿主細胞を提供する。また、免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドを産生する方法および前記核酸またはベクターの発現に適切な条件下で宿主細胞を維持し、それにより免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドが産生される方法が提供される。任意選択として、この方法がさらにポリペプチドを単離するステップを含み、また、任意選択として、標準的ＨＥＫ ＳＴＡＴアッセイににおいて、単離ポリペプチドよりも改善されたアフィニティ（Ｋｄ）やＥＣ５０を有する変異体（例えば突然変異体）を産生するステップを含む。
【０１５２】
本明細書で「単離された」と呼んでいる核酸は、それらの元（例えば、細胞中に、またはライブラリーのように核酸の混合物中にある状態）のゲノムＤＮＡまたは細胞性ＤＮＡの核酸から分離された核酸であり、本明細書に記載された方法、または他の適切な方法により得られた核酸を含み、また、本質的に純粋な核酸、化学的合成により作られた核酸、生物学的・化学的方法の組合せにより作られた核酸、および単離された組換え型核酸（Daugherty, B.L. et al., Nucleic Acids Res., 19(9): 2471-2476 (1991); Lewis, A.P. and J.S. Crowe, Gene, 101: 297-302 (1991)を参照のこと）を含む。
【０１５３】
本明細書で「組換え型」と呼んでいる核酸は、組換えＤＮＡ手法により作られた核酸であり、ポロメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および／または制限酵素を使ってベクタにクローニングする、等の人工組換え法による手法により生成した核酸を含む。
【０１５４】
特定の実施形態では、単離されたおよび／または組換え型の核酸は、本明細書に記載されたリガンドをコードするヌクレオチド配列を含み、前記リガンドは、本明細書で開示のＩＬ−１３に結合するｄＡｂのアミノ酸配列、例えば、ＤＯＭ１０−５３−５４６（配列番号２）；ＤＯＭ１０−５３−５６７（配列番号３）；ＤＯＭ１０−５３−５６８（配列番号４）；またはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）と、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ヌクレオチド配列の同一性は、選択した抗ＩＬ−１３ｄＡｂをコードするヌクレオチド配列全長にわたり決定可能である。
【０１５５】
また本発明は、本発明の組換え型核酸分子を含むベクターを提供する。特定の実施形態では、ベクターは発現ベクターであり、本発明の組換え型核酸に機能的に連結された一つまたは複数の発現制御因子または配列を含む。また本発明は、本発明の組換え型核酸分子またはベクターを含む組換え型宿主細胞を提供する。適切なベクター（例えば、プラスミド、ファージミド）、発現制御因子、宿主細胞および本発明の組換え型宿主細胞を産生する方法は当業者にはよく知られており、実施例が後ほど本明細書中で記載される。
【０１５６】
適切な発現ベクターは多くの要素を含むことが可能で、例えば、複写起点、選択可能なマーカー遺伝子、一つもしくは複数の発現制御因子、転写調節因子（例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター）、および／または一つもしくは複数の翻訳シグナル、シグナル配列、またはリーダー配列、等を含むことができる。発現制御因子およびシグナル配列は、存在する場合には、ベクターまたは他のソースにより提供される。例えば、抗体鎖をコードするクローン核酸の転写、および／または翻訳調節因子は直接発現に使用可能である。
【０１５７】
プロモーターは所望の宿主細胞での発現に供することができる。プロモーターは構成型であっても誘導型であってもよい。例えば、プロモータ−は、抗体、抗体鎖、またはこれらの一部をコードする核酸に機能的に連結されていて、核酸を直接転写してもよい。種々の適切なプロモーターが、原核生物宿主用（例えば、大腸菌用ｌａｃ、ｔａｃ、Ｔ３、Ｔ７プロモーター）および真核生物宿主用（例えば、シミアンウイルス４０の初期や後期プロモーター、ラウス肉腫ウィルス長末端反復プロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、アデノウイルス後期プロモーター）として入手可能である。
【０１５８】
さらに、通常、発現ベクターはベクターを担持している宿主細胞を選別するために選択可能なマーカーを含み、さらに複製可能な発現ベクターの場合には、複製起点を含む。抗生物質耐性や薬剤耐性を与える産物をコードした遺伝子は、よく用いられる選択マーカーであり、原核生物細胞（例えば、ラクタマーゼ遺伝子（アンピシリン耐性）、テトラサイクリン耐性用Ｔｅｔ遺伝子）および真核生物細胞（例えば、ネオマイシン（Ｇ４１８やジェネテシン）、ｇｐｔ（ミコフェノール酸）、アンピシリン、またはハイグロマイシン耐性遺伝子）で使うことが可能できる。ジヒドロ葉酸還元酵素マーカー遺伝子は、多様な宿主中のメトトレキサートの選択を可能とする。宿主の栄養要求性マーカー（例えば、ＬＥＵ２、ＵＲＡ３、ＨＩＳ３）は、酵母の選択マーカーとして使われることが多い。ウイルスベクター（例えば、バキュロウイルス）、またはファージベクターの使用、および、レトロウイルスベクターのような宿主細胞のゲノムへ統合可能なベクターの使用もまた意図されているものである。哺乳動物細胞および原核生物細胞（大腸菌）、昆虫細胞（ショウジョウバエ Ｓｃｈｎｉｅｄｅｒ Ｓ２細胞、Ｓｆ９）および酵母（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）での発現に適切な発現ベクターは、当業者にはよく知られている。
【０１５９】
適切な宿主細胞は、大腸菌、枯草菌等の細菌性細胞、および／または他の適切な細菌を含む原核生物細胞であってもよく、また、真菌細胞や酵母細胞（例えば、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、または他の下等真核細胞および昆虫由来（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓｃｈｎｉｅｄｅｒ Ｓ２ 細胞、Ｓｆ９ 昆虫細胞（WO94/26087(O’Connor)）のような高等真核生物、哺乳動物（例えば、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ−１６５０）およびＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ−１６５１）等のＣＯＳ細胞、ＣＨＯ（例えば、ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ−９０９６、ＣＨＯＤＧ４４（Urlaub, G. and Chasin, LA., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 77(7):4216-4220 (1980)））、２９３（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ−１５７３）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＬ−２）、ＣＶ１（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＬ−７０）、ＷＯＰ（Dailey, L., et al., J. Virol., 54:739-749 (1985), ３Ｔ３、２９３Ｔ（Pear, W. S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90:8392-8396 (1993)）ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０、ＨｕＴ ７８細胞、等、または植物（例えば、たばこ）を含む真核生物細胞であってもよい。 （例えば、Ausubel, F.M. et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons Inc. (1993)を参照のこと）。一部の実施形態では、宿主細胞は単離された宿主細胞であり、多細胞生物（例えば、植物または動物）の一部ではない。特定の実施形態では、宿主細胞は非ヒト宿主細胞である。
【０１６０】
また、本発明は、組換え核酸の発現に適切な条件下で、本発明の組換え核酸を含む組換え宿主細胞の維持を含む、本発明のリガンド（例えば、二重特性リガンド、多重特異性リガンド）の製造法を提供する。これにより、組換え核酸が発現し、リガンドが産生される。一部の実施態様では、この方法がさらにリガンドの単離を含む。
【０１６１】
本発明の実施形態に適用可能な開示詳細に関しては、WO200708515の１６１ページ、２４行から１８９ページ、１０行を参照されたい。本開示は、参照によって本明細書に組み込まれ、本開示内容が明確になり、本発明の実施形態に関わるようになる。また、下記の特許請求の範囲への開示の組み込みに対する明確な裏付けを行う。これには、WO200708515の１６１ページ、２４行から１８９ページ、１０行にある「免疫グロブリンベースリガンドの合成」、「ライブラリベクターシステム」、「ライブラリ構築」、「単一可変ドメインの結合」、「リガンドのキャラクタリゼーション」、「リガンドの構造」、「骨格」、「タンパク質の骨組」、「リガンド構築における骨組の使用」、「基準の配列の多様性」、「治療と診断用組成物とその使用」、ならびに定義「機能的に連結された」、「ナイーブ」、「予防」、「抑制」、「治療」、「アレルギー性疾患」、「ＴＨ２媒介疾患」、「治療効果のある用量」、「有効な」、を詳細に提供している開示が含まれる。
【０１６２】
フォーマット
半減期の延長は、免疫グロブリンの生体内適用において有用である。サイズが小さい抗体では特に、また、抗体フラグメントでは殊更に有用である。このようなフラグメント（ＦＶＳ、ジスルフィド結合ＦＶＳ、Ｆａｂ、ＳＣＦＶＳ、ｄＡｂ）は身体から急速な除去作用を受ける。このように、それが身体の大抵の部分に早く到達できて、素早く産生でき、容易に扱えても、生体内での短い持続性だけのためにその生体内での適用には、限界があった。本発明の一実施態様では、体内でのリガンドの半減期延長、および、その結果、体内でのリガンドの機能活性のより長い持続時間を提供することによりこの問題が解決されている。
【０１６３】
薬物動態解析およびリガンドの半減期の測定方法は当業者にはよく知られている。詳細については、Kenneth, A et al: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for PharmacistsおよびPeters et al, Pharmacokinetc analysis: A Practical Approach (1996)で見られるであろう。また、ｔα、ｔβ半減期、曲線下面積（ＡＵＣ）等の薬物動態パラメーターについて記述されている次の文献を参照されたい：“Pharmacokinetics”, M Gibaldi & D Perron, published by Marcel Dekker, 2nd Rev. ex edition (1982)。
【０１６４】
半減期（ｔ1/2 α、ｔ1/2 β）および、ＡＵＣはリガンドの血清中濃度対時間の曲線から求められる。例えば、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ解析パッケージ（Pharsight Corp.社, Mountain View, CA94040, USA から入手可能）を使って、曲線をモデル化することができる。最初の相（α相）では、リガンドは主に患者の中で分配が行われている。第二相（β相）は、終末過程で、リガンドの分配が完了し、リガンドが患者から除去されるにつれ血清中濃度が減少していく。ｔ1/2 α半減期は、最初の相の半減期で、ｔ1/2 β半減期は、第二相の半減期である。従って、一実施形態では、本発明は、１５分以上の範囲のｔ1/2 α半減期を有する、本発明に係るリガンドまたは組成物を提供する。一実施態様では、前記範囲の下端が３０分、４５分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、１０時間、１１時間、または１２時間である。さらに追加して、または、その代わりに、本発明に係るリガンドまたは組成物は、１２時間までの範囲のｔ1/2 α半減期を有することになる。一実施形態では、前記範囲の上端が１１、１０、９、８、７、６、または５時間である。適切な範囲の実施例は、１〜６時間、２〜５時間、または３〜４時間である。
【０１６５】
一実施形態では、本発明は、本発明に係る約２．５時間以上範囲のｔ1/2 β半減期を有するリガンド（ポリペプチド、ｄＡｂまたはアンタゴニスト）または組成物を提供する。一実施態様では、前記範囲の下端が約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約１０時間、約１１時間、または約１２時間である。一実施形態では、さらに追加して、またはその代わりに、本発明に係るリガンドまたは組成物が２１日迄の範囲のｔ1/2 β半減期を有する。一実施形態では、前記範囲の上端が約１２時間、約２４時間、約２日、約３日、約５日、約１０日、約１５日、または約２０日である。一実施形態では、本発明に係るリガンドまたは組成物は、約１２〜約６０時間の範囲のｔ1/2 β半減期を有する。さらなる実施形態では、その範囲は、約１２〜４８時間の範囲である。またさらなる実施形態では、その範囲は１２〜２６時間の範囲である。
【０１６６】
上記基準に追加して、またはその代わりに、本発明は、約１ ｍｇ／ｍｌ以上の範囲のＡＵＣ値（曲線下面積）を有する、本発明に係るリガンドまたは組成物を提供する。一実施形態では、前記範囲の下端が約５、約１０、約１５、約２０、約３０、約１００、約２００、約３００ ｍｇ・ｍｉｎ／ｍｌである。追加して、またはその代わりとして、本発明に係るリガンドまたは組成物が約６００ ｍｇ・ｍｉｎ／ｍｌ迄の範囲のＡＵＣを有する。一実施形態では、前記範囲の下端が約５、約１０、約１５、約２０、約３０、約１００、約２００、または約３００ ｍｇ・ｍｉｎ／ｍｌである。追加して、またはその代わりとして、本発明に係るリガンドまたは組成物は、６００ ｍｇ・ｍｉｎ／ｍｌ迄の範囲のＡＵＣを有する。一実施形態では、前記範囲の上端が約５００、約４００、約３００、約２００、約１５０、約１００、約７５、または約５０ ｍｇ・ｍｉｎ／ｍｌである。一実施態様では、本発明に係るリガンドは、下記の事項からなる群から選ばれた範囲のＡＵＣ有する：約１５〜約１００ｍｇ・ｍｉｎ／ｍｌ、約１５〜約７５ｍｇ・ｍｉｎ／ｍｌ、約１５〜約５０ｍｇ・ｍｉｎ／ｍｌ。
【０１６７】
ポリペプチドとｄＡｂ、およびこれらを含むアンタゴニストは、例えば、ＰＥＧ基、血清アルブミン、トランスフェリン、トランスフェリン受容体または少なくともそれのトランスフェリン結合部、抗体ＦＣドメインの付加により、あるいは、抗体ドメインへのコンジュゲートにより、さらに大きな流体力学的サイズを持つようにフォーマットすることが可能である。例えば、より大きな抗体の抗原結合フラグメントとして、または抗体（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、ＩｇＧ、ｓｃＦｖとしてフォーマットされた）としてフォーマットされたポリペプチドｄＡｂおよびアンタゴニストがあり。
【０１６８】
本発明のリガンド（例えば、ｄＡｂモノマー、マルチマー）の流体力学的サイズは、当業者にはよく知られた方法により求めることができる。例えば、ゲル濾過クロマトグラフィーを使ってリガンドの流体力学的サイズを求めてもよい。架橋アガロースマトリックスのような流体力学的サイズ測定に適したゲル濾過マトリックスはよく知られ、容易に入手可能である。
【０１６９】
リガンドフォーマットのサイズ（例えば、ｄＡｂに結合したＰＥＧ部分のサイズ）は所望の用途に依存して変わりうる。例えば、リガンドが血液循環から抜け出て周辺細胞組織に入ることが意図されている場合、流体力学的サイズを小さく保ち、血流からの溢出を促進する。あるいは、リガンドを体循環中に長時間残すことが望まれる場合は、例えばＩｇ様タンパク質としてフォーマットすることにより、リガンドサイズを増やすことが可能である。
【０１７０】
生体内で半減期を延長する抗原またはエピトープを標的にすることによる半減期の延長
本明細書で記載されているように、本発明のＩＬ−１３結合ポリペプチド、ｄＡｂ、またはアンタゴニストを、生体内で半減期を延長する抗原とエピトープを結合した結合ドメイン（例えば、抗体または抗体フラグメント）にコンジュゲートまたは会合させることにより、リガンドの流体力学的サイズおよびその血清中半減期も増加させることができる。例えば、ＩＬ−１３結合薬剤（例えばポリペプチド）は、抗血清アルブミンや抗新生児ＦＣ受容体抗体または抗体フラグメント、例えば抗ＳＡまたは抗新生児ＦＣ受容体ｄＡｂ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはｓｃＦｖに、あるいは、抗ＳＡアフィボディもしくは抗新生児ＦＣ受容体アフィボディ、または抗ＳＡアビマー、または、これに限定されるものではないが、以下に示す群から選択された足場を含む抗ＳＡ結合ドメインへコンジュゲートまたは結合することができる：ＣＴＬＡ−４、リポカリン、ＤｐＡ、アフィボディ、アビマー、ＧｒｏＥｌおよびフィブロネクチン（これらの結合ドメインの開示については、WO2008096158を参照のこと。ここに示されたドメインと配列は参照により本明細書に組み込まれ、本明細書の開示の一部を形成する)。コンジュゲートとは、血清アルブミンに結合した結合ドメインに結合（共有結合的あるいは非共有結合的に）した本発明のポリペプチド、ｄＡｂ、またはアンタゴニストを含む組成物を指す。
【０１７１】
生体内での血清中半減期を延長する適切なポリペプチドには、例えば、トランスフェリン受容体特異的なリガンド神経医薬剤融合タンパク質（米国特許第5,977,307号参照のこと。この中の教示は参照により本明細書に組み込まれる）、脳毛細血管内皮細胞受容体、トランスフェリン、トランスフェリン受容体（例えば、可溶性トランスフェリン受容体）、インシュリン、インシュリン様成長因子１（ＩＧＦ１）受容体、インシュリン様成長因子２（ＩＧＦ２）受容体、インシュリン受容体、血液凝固第X因子、α１抗トリプシン、およびＨＮＦ１αが含まれる。さらに、血清内半減期を延長する適切なポリペプチドには、α１糖タンパク質（オロソムコイド；ＡＡＧ）、α１アンチキモトリプシン（ＡＣＴ）、α１ミクログロブリン（タンパク質ＨＣ；ＡＩＭ）、アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴ ＩＩＩ）、アポリポタンパク質Ａ−１（Ａｐｏ Ａ−１）、アポリポタンパク質Ｂ（Ａｐｏ Ｂ）、セルロプラスミン（Ｃｐ）、補体成分Ｃ３（Ｃ３）、補体成分Ｃ４（Ｃ４）、Ｃ１エステラーゼ阻害剤（Ｃ１ ＩＮＨ）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、フェリチン（ＦＥＲ）、ヘモペキシン（ＨＰＸ）、リポタンパク質（ａ）（Ｌｐ（ａ））、マンノース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ミオグロビン（Ｍｙｏ）、プレアルブミン（トランスチレチン；ＰＡＬ）、レチノール結合タンパク質（ＲＭＰ）、およびリウマチ因子（ＲＦ）が含まれる。
【０１７２】
細胞外マトリックスからの適切なタンパク質には、例えば、コラーゲン、ラミニン、インテグリン、およびフィブロネクチンが含まれる。コラーゲンは、細胞外マトリックスの主要タンパク質である。約１５の型のコラーゲン分子が現在知られており、身体の別々の部位で見つかっている。例えば、骨、皮膚、腱、靱帯、角膜、内臓器官で見つかったＩ型コラーゲン（身体コラーゲンの９０％に達する）、または、軟骨、椎間板、脊索、および眼球ガラス体液で見つかったＩＩ型コラーゲン。
【０１７３】
血液からの適切なタンパク質には、例えば、血漿タンパク質（例えば、フィブリン、α２マクログロブリン、血清アルブミン、フィブリノゲン（例えば、フィブリノゲンＡ、フィブリノゲンＢ）、血清アミロイドタンパク質Ａ、ハプトブロビン、プロフィリン、ユビキチン、）、ウテログロブリンおよびβ２ミクログロブリン）、酵素および酵素阻害剤（例えば、プラスミノーゲン、リゾチーム、シスタチンＣ、α１抗トリプシンおよび膵臓トリプシン阻害剤）、免疫グロブリンタンパク質（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、免疫グロブリン軽鎖（κ／λ））、等の免疫システムタンパク質、輸送タンパク質（例えば、レチノール結合タンパク質、α１ミクログロブリン）、ディフェンシン（例えば、βディフェンシン１、好中球ディフェンシン１、好中球ディフェンシン２、および好中球ディフェンシン３）等が含まれる。
【０１７４】
血液脳関門または神経組織で認めらる適切なタンパク質には、例えば、メラノコルチン受容体、ミエリン、アスコルビン酸塩トランスポーター、等が含まれる。
【０１７５】
また、生体内での血清中半減期を延長する適切なポリペプチドには、腎臓に局在化したタンパク質（例えば、ポリシスチン、ＩＶ型コラーゲン、有機アニオン輸送体Ｋ１、ハイマン抗原）、肝臓に局在化したタンパク質（例えば、アルコール脱水素酵素、Ｇ２５０）、肺に局在化したタンパク質（例えば、ＩｇＡに結合する分泌成分）、心臓に局在化したタンパク質（例えば、拡張型心筋症に関連したＨＳＰ２７）、皮膚に局在化したタンパク質（例えばケラチン）、形質転換増殖因子βスーパーファミリータンパク質（骨形成活性（例えば、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８）を示す）のサブセットである形態形成タンパク質（ＢＭＰ）等の骨特異的タンパク質、腫瘍特異性タンパク質（例えば、栄養膜抗原、ハーセプチン受容体、エストロゲン受容体、カテプシン（例えば、肝臓と脾臓で認められるカテプシンＢ））が含まれる。
【０１７６】
適切な疾患特異性タンパク質には、例えば、ＬＡＧ−３（リンパ球活性化遺伝子）、オステオプロテジェリンリガンド（ＯＰＧＬ；Nature 402, 304-309 (1999)参照）、ＯＸ４０（ＴＮＦ受容体ファミリーのメンバーで、活性化Ｔ細胞上で発現しヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−Ｉ）産生細胞中で特異的に発現上昇している；Immunol. 165 (1):263-70 (2000)参照）を含む活性Ｔ細胞上にのみ発現する抗原が含まれる。また、適切な疾患特異性タンパク質には、例えば、ショウジョウバエＣＧ６５１２、ヒトパラプレギン、ヒトＦｔｓＨ、ヒトＡＦＧ３Ｌ２、ネズミｆｔｓＨを含む金属プロテアーゼ（関節炎／癌に関連）；ならびに血管新生増殖因子、例えば酸性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−１）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２）、血管内皮増殖因子／血管透過性因子（ＶＥＧＦ／ＶＰＦ）、トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦα）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、アンギオジェニン、インターロイキン３（ＩＬ−３）、インターロイキン８（ＩＬ−８）、血小板由来内皮細胞増殖因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）、胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）、ミッドカイン血小板由来増殖因ＢＢ（ＰＤＧＦ）、およびフラクタルカインも含まれる。
【０１７７】
また、生体内での血清中半減期を延長する適切なポリペプチドには、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）のようなストレスタンパク質も含まれる。ＨＳＰは、通常は、細胞内で見つかる。それが細胞外で見つかる場合は、細胞が死亡し内容物をはき出したという指標になる。このプログラムされていない細胞死（壊死）は外傷、疾患、傷害のとき起こり、細胞外ＨＳＰは免疫系からの反応を誘発する。細胞外ＨＳＰに対する結合により本発明の組成物の疾患部位への局在化が生じる可能性がある。
【０１７８】
ＦＣ輸送にかかわる適切なタンパク質には、例えば、Ｂｒａｍｂｅｌｌ受容体（ＦＣＲＢとしても知られている）が含まれる。このＦＣ受容体は送達に潜在的に有用な２つの機能を有する。その機能は（１）胎盤経由で母から子供へＩｇＧの移送、（２）ＩｇＧの分解からの保護と、その結果の血清中半減期の延長、である。受容体はエンドソームからＩｇＧを再生利用すると考えられている。（Holliger et al, Nat Biotechnol 15(7):632-6 (1997)参照）。
【０１７９】
血清アルブミンに結合するｄＡｂ
一実施形態で、本発明は、ポリペプチドまたはアンタゴニスト（例えば、ＩＬ−１３に結合する抗ＩＬ−１３ｄＡｂ（第一のｄＡｂ）および血清アルブミン（ＳＡ）に結合する第二のｄＡｂ含む二重特異性リガンド）を提供し、第二のｄＡｂは表面プラズモン共鳴で測定したＫｄ値の、約１ｎＭ〜約１、約２、約３、約４、約５、約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約１００、約２００、約３００、約４００、または約５００μＭ（すなわち、ｘ１０−９ 〜５ｘ１０−４ Ｍ）、または、約１００ｎＭ〜約１０μＭ、または、約１〜約５μＭ、または、約３〜約７０ｎＭ、または、約１０ｎＭ〜約１、約２、約３、約４、約５μＭでＳＡに結合している。例えば、表面プラズモン共鳴により測定して約３０〜７０ｎＭである。一実施形態では、第一のｄＡｂ（またはｄＡｂモノマー）はＳＡ（例えば、ＨＳＡ）と表面プラズモン共鳴で測定したＫｄ値の約１、約５０、約７０、約１００、約１５０、約２００、約３００ｎＭ、または、約１、約２、約３μＭで結合している。一実施形態では、第一の抗ＳＡ ｄＡｂと第二のＩＬ−１３に対するｄＡｂを含む二重特異性リガンドに関して、第二のｄＡｂのその標的に対するアフィニティ（例えば、ＢｉａＣｏｒｅ等を使って表面プラズモン共鳴で測定したＫｄおよび／またはＫｏｆｆ）が、ＳＡに対する第一のｄＡｂのアフィニティの約１〜約１００００倍（例えば、約１００〜約１０００００、または約１０００〜１０００００、または約１００００〜１０００００倍）である。一実施形態では、血清アルブミンは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）である。例えば、第一のｄＡｂはＳＡと約１０μＭのアフィニティで結合し、第二のｄＡｂはその標的と約１００ｐＭのアフィニティで結合する。一実施形態では、血清アルブミンは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）である。一実施形態では、第一のｄＡｂはＳＡ（例えばＨＳＡ）とＫｄ値約５０、例えば、約７０、約１００、約１５０、または約２００ｎＭで結合する。二重特異性リガンドの詳細については、WO03002609、WO04003019、WO2008096158およびWO04058821で見付けることができる。
【０１８０】
一実施形態で、本発明のリガンドは、表面プラズモン共鳴で測定してＫｄ値約１ｎＭ〜約１、約２、約３、約４、約５、約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約１００、約２００、約３００、約４００、または約５００μＭ（すなわち、ｘ１０−９ 〜５ｘ１０−４ Ｍ）、または、約１００ｎＭ〜約１０μＭ、または、約１〜約５μＭ、または、約３〜約７０ｎＭ、または、約１０ｎＭ〜約１、約２、約３、約４、約５μＭで血清アルブミン（ＳＡ）と結合しているｄＡｂを含む。例えば、表面プラズモン共鳴で測定して約３０〜７０ｎＭである。一実施形態では、第一のｄＡｂ（またはｄＡｂモノマー）は、表面プラズモン共鳴で測定してＫｄ値約１、約５０、約７０、約１００、約１５０、約２００、約３００ｎＭまたは約１、約２または約３μＭでＳＡ（例えば、ＨＳＡ）と結合する。一実施形態では、第一および第二のｄＡｂは、リンカー、例えば１〜４アミノ酸、または１〜３のアミノ酸、または３を超えるアミノ酸、４、５、６、７、８、９、１０、１５、または２０を超えるアミノ酸のリンカー、で結合されている。一実施形態では、より長いリンカー（アミノ酸が３を超える）が効力（アンタゴニストの一つあるいは両方のｄＡｂのＫｄ）を高めるために使われる。
【０１８１】
リガンドとアンタゴニストの具体的な実施形態では、ｄＡｂはヒト血清アルブミンに結合し、以下からなる群から選択されるｄＡｂへの結合について競合する：
ＭＳＡ−１６、ＭＳＡ−２６(この配列の開示についてはWO04003019参照。この配列と対応する核酸は参照により本明細書に組み込まれ、本明細書の開示の一部を構成する）、
ＤＯＭ７ｍ−１６（配列番号４７３）、ＤＯＭ７ｍ−１２（配列番号４７４）、ＤＯＭ７ｍ−２６（配列番号４７５）、ＤＯＭ７ｒ−１（配列番号４７６）、ＤＯＭ７ｒ−３（配列番号４７７）、ＤＯＭ７ｒ−４（配列番号４７８）、ＤＯＭ７ｒ−５（配列番号４７９）、ＤＯＭ７ｒ−７（配列番号４８０）、ＤＯＭ７ｒ−８（配列番号４８１）、ＤＯＭ７ｈ−２（配列番号４８２）、ＤＯＭ７ｈ−３（配列番号４８３）、ＤＯＭ７ｈ−４（配列番号４８４）、ＤＯＭ７ｈ−６（配列番号４８５）、ＤＯＭ７ｈ−１（配列番号４８６）、ＤＯＭ７ｈ−７（配列番号４８７）、ＤＯＭ７ｈ−２２（配列番号４８９）、ＤＯＭ７ｈ−２３（配列番号４９０）、ＤＯＭ７ｈ−２４（配列番号４９１）、ＤＯＭ７ｈ−２５（配列番号４９２）、ＤＯＭ７ｈ−２６（配列番号４９３）、ＤＯＭ７ｈ−２１（配列番号４９４）、ＤＯＭ７ｈ−２７（配列番号４９５）、ＤＯＭ７ｈ−８（配列番号４９６）、ＤＯＭ７ｒ−１３（配列番号４９７）、ＤＯＭ７ｒ−１４（配列番号４９８）、ＤＯＭ７ｒ−１５（配列番号４９９）、ＤＯＭ７ｒ−１６（配列番号５００）、ＤＯＭ７ｒ−１７（配列番号５０１）、ＤＯＭ７ｒ−１８（配列番号５０２）、ＤＯＭ７ｒ−１９（配列番号５０３）、ＤＯＭ７ｒ−２０（配列番号５０４）、ＤＯＭ７ｒ−２１（配列番号５０５）、ＤＯＭ７ｒ−２２（配列番号５０６）、ＤＯＭ７ｒ−２３（配列番号５０７）、ＤＯＭ７ｒ−２４（配列番号５０８）、ＤＯＭ７ｒ−２５（配列番号５０９）、ＤＯＭ７ｒ−２６（配列番号５１０）、ＤＯＭ７ｒ−２７（配列番号５１１）、ＤＯＭ７ｒ−２８（配列番号５１２）、ＤＯＭ７ｒ−２９（配列番号５１３）、ＤＯＭ７ｒ−３０（配列番号５１４）、ＤＯＭ７ｒ−３１（配列番号５１５）、ＤＯＭ７ｒ−３２（配列番号５１６）、ＤＯＭ７ｒ−３３（配列番号５１７）（この配列の開示についてはWO2007080392参照。この配列と対応する核酸は参照により本明細書に組み込まれ、本明細書の開示の一部を構成する。本項の配列番号はWO2007080392中に記載されている）、
ｄＡｂ８（ｄＡｂ１０）、ｄＡｂ１０、ｄＡｂ３６、ｄＡｂ７ｒ２０（ＤＯＭ７ｒ２０）、ｄＡｂ７ｒ２１（ＤＯＭ７ｒ２１）、ｄＡｂ７ｒ２２（ＤＯＭ７ｒ２２）、ｄＡｂ７ｒ２３（ＤＯＭ７ｒ２３）、ｄＡｂ７ｒ２４（ＤＯＭ７ｒ２４）、ｄＡｂ７ｒ２５（ＤＯＭ７ｒ２５）、ｄＡｂ７ｒ２６（ＤＯＭ７ｒ２６）、ｄＡｂ７ｒ２７（ＤＯＭ７ｒ２７）、ｄＡｂ７ｒ２８（ＤＯＭ７ｒ２８）、ｄＡｂ７ｒ２９（ＤＯＭ７ｒ２９）、ｄＡｂ７ｒ２９（ＤＯＭ７ｒ２９）、ｄＡｂ７ｒ３１（ＤＯＭ７ｒ３１）、ｄＡｂ７ｒ３２（ＤＯＭ７ｒ３２）、ｄＡｂ７ｒ３３（ＤＯＭ７ｒ３３）、ｄＡｂ７ｒ３３（ＤＯＭ７ｒ３３）、ｄＡｂ７ｈ２２（ＤＯＭ７ｈ２２）、ｄＡｂ７ｈ２３（ＤＯＭ７ｈ２３）、ｄＡｂ７ｈ２４（ＤＯＭ７ｈ２４）、ｄＡｂ７ｈ２５（ＤＯＭ７ｈ２５）、ｄＡｂ７ｈ２６（ＤＯＭ７ｈ２６）、ｄＡｂ７ｈ２７（ＤＯＭ７ｈ２７）、ｄＡｂ７ｈ３０（ＤＯＭ７ｈ３０）、ｄＡｂ７ｈ３１（ＤＯＭ７ｈ３１）、ｄＡｂ２（ｄＡｂｓ４、７、４１）、ｄＡｂ４、ｄＡｂ７、ｄＡｂ１１、ｄＡｂ１２（ｄＡｂ７ｍ１２）、ｄＡｂ１３（ｄＡｂ１５）、ｄＡｂ１５、ｄＡｂ１６（ｄＡｂ２１、ｄＡｂ７ｍ１６）、ｄＡｂ１７、ｄＡｂ１８、ｄＡｂ１９、ｄＡｂ２１、ｄＡｂ２２、ｄＡｂ２３、ｄＡｂ２４、ｄＡｂ２５（ｄＡｂ２６、ｄＡｂ７ｍ２６）、ｄＡｂ２７、ｄＡｂ３０（ｄＡｂ３５）、ｄＡｂ３１、ｄＡｂ３３、ｄＡｂ３４、ｄＡｂ３５、ｄＡｂ３８（ｄＡｂ５４）、ｄＡｂ４１、ｄＡｂ４６（ｄＡｂｓ４７、５２および５６）、ｄＡｂ４７、ｄＡｂ５２、ｄＡｂ５３、ｄＡｂ５４、ｄＡｂ５５、ｄＡｂ５６、ｄＡｂ７ｍ１２、ｄＡｂ７ｍ１６、ｄＡｂ７ｍ２６、ｄＡｂ７ｒ１（ＤＯＭ７ｒ１）、ｄＡｂ７ｒ３（ＤＯＭ７ｒ３）、ｄＡｂ７ｒ４（ＤＯＭ７ｒ４）、ｄＡｂ７ｒ５（ＤＯＭ７ｒ５）、ｄＡｂ７ｒ７（ＤＯＭ７ｒ７）、ｄＡｂ７ｒ８（ＤＯＭ７ｒ８）、ｄＡｂ７ｒ１３（ＤＯＭ７ｒ１３）、ｄＡｂ７ｒ１４（ＤＯＭ７ｒ１４）、ｄＡｂ７ｒ１５（ＤＯＭ７ｒ１５）、ｄＡｂ７ｒ１６（ＤＯＭ７ｒ１６）、ｄＡｂ７ｒ１７（ＤＯＭ７ｒ１７）、ｄＡｂ７ｒ１８（ＤＯＭ７ｒ１８）、ｄＡｂ７ｒ１９（ＤＯＭ７ｒ１９）、ｄＡｂ７ｈ１（ＤＯＭ７ｈ１）、ｄＡｂ７ｈ２（ＤＯＭ７ｈ２）、ｄＡｂ７ｈ６（ＤＯＭ７ｈ６）、ｄＡｂ７ｈ７（ＤＯＭ７ｈ７）、ｄＡｂ７ｈ８（ＤＯＭ７ｈ８）、ｄＡｂ７ｈ９（ＤＯＭ７ｈ９）、ｄＡｂ７ｈ１０（ＤＯＭ７ｈ１０）、ｄＡｂ７ｈ１１（ＤＯＭ７ｈ１１）、ｄＡｂ７ｈ１２（ＤＯＭ７ｈ１２）、ｄＡｂ７ｈ１３（ＤＯＭ７ｈ１３）、ｄＡｂ７ｈ１４（ＤＯＭ７ｈ１４）、ｄＡｂ７ｐ１（ＤＯＭ７ｐ１）、ならびにｄＡｂ７ｐ２（ＤＯＭ７ｐ２）(この配列の開示についてはWO2008096158参照。この配列と対応する核酸は参照により本明細書に組み込まれ、本明細書の開示の一部を構成する)。代替名をカッコ内に示している。例えば、ｄＡｂ８は代替名ｄＡｂ１０があり、表記はｄＡｂ８（ｄＡｂ１０）となる。
【０１８２】
特定の実施形態では、ｄＡｂはヒト血清アルブミンに結合し、下記からなる群から選択されるｄＡｂのアミノ酸配列と少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含む：
ＭＳＡ−１６、ＭＳＡ−２６、
ＤＯＭ７ｍ−１６（配列番号４７３）、ＤＯＭ７ｍ−１２（配列番号４７４）、ＤＯＭ７ｍ−２６（配列番号４７５）、ＤＯＭ７ｒ−１（配列番号４７６）、ＤＯＭ７ｒ−３（配列番号４７７）、ＤＯＭ７ｒ−４（配列番号４７８）、ＤＯＭ７ｒ−５（配列番号４７９）、ＤＯＭ７ｒ−７（配列番号４８０）、ＤＯＭ７ｒ−８（配列番号４８１）、ＤＯＭ７ｈ−２（配列番号４８２）、ＤＯＭ７ｈ−３（配列番号４８３）、ＤＯＭ７ｈ−４（配列番号４８４）、ＤＯＭ７ｈ−６（配列番号４８５）、ＤＯＭ７ｈ−１（配列番号４８６）、ＤＯＭ７ｈ−７（配列番号４８７）、ＤＯＭ７ｈ−２２（配列番号４８９）、ＤＯＭ７ｈ−２３（配列番号４９０）、ＤＯＭ７ｈ−２４（配列番号４９１）、ＤＯＭ７ｈ−２５（配列番号４９２）、ＤＯＭ７ｈ−２６（配列番号４９３）、ＤＯＭ７ｈ−２１（配列番号４９４）、ＤＯＭ７ｈ−２７（配列番号４９５）、ＤＯＭ７ｈ−８（配列番号４９６）、ＤＯＭ７ｒ−１３（配列番号４９７）、ＤＯＭ７ｒ−１４（配列番号４９８）、ＤＯＭ７ｒ−１５（配列番号４９９）、ＤＯＭ７ｒ−１６（配列番号５００）、ＤＯＭ７ｒ−１７（配列番号５０１）、ＤＯＭ７ｒ−１８（配列番号５０２）、ＤＯＭ７ｒ−１９（配列番号５０３）、ＤＯＭ７ｒ−２０（配列番号５０４）、ＤＯＭ７ｒ−２１（配列番号５０５）、ＤＯＭ７ｒ−２２（配列番号５０６）、ＤＯＭ７ｒ−２３（配列番号５０７）、ＤＯＭ７ｒ−２４（配列番号５０８）、ＤＯＭ７ｒ−２５（配列番号５０９）、ＤＯＭ７ｒ−２６（配列番号５１０）、ＤＯＭ７ｒ−２７（配列番号５１１）、ＤＯＭ７ｒ−２８（配列番号５１２）、ＤＯＭ７ｒ−２９（配列番号５１３）、ＤＯＭ７ｒ−３０（配列番号５１４）、ＤＯＭ７ｒ−３１（配列番号５１５）、ＤＯＭ７ｒ−３２（配列番号５１６）、ＤＯＭ７ｒ−３３（配列番号５１７）（本項の配列番号はWO2007080392中に記載されている）、
ｄＡｂ８、ｄＡｂ１０、ｄＡｂ３６、ｄＡｂ７ｒ２０、ｄＡｂ７ｒ２１、ｄＡｂ７ｒ２２、ｄＡｂ７ｒ２３、ｄＡｂ７ｒ２４、ｄＡｂ７ｒ２５、ｄＡｂ７ｒ２６、ｄＡｂ７ｒ２７、ｄＡｂ７ｒ２８、ｄＡｂ７ｒ２９、ｄＡｂ７ｒ３０、ｄＡｂ７ｒ３１、ｄＡｂ７ｒ３２、ｄＡｂ７ｒ３３、ｄＡｂ７ｈ２１、ｄＡｂ７ｈ２２、ｄＡｂ７ｈ２３、Ａｂ７ｈ２４、Ａｂ７ｈ２５、Ａｂ７ｈ２６、ｄＡｂ７ｈ２７、ｄＡｂ７ｈ３０、ｄＡｂ７ｈ３１、ｄＡｂ２、ｄＡｂ４、ｄＡｂ７、ｄＡｂ１１、ｄＡｂ１２、ｄＡｂ１３、ｄＡｂ１５、ｄＡｂ１６、ｄＡｂ１７、ｄＡｂ１８、ｄＡｂ１９、ｄＡｂ２１、ｄＡｂ２２、ｄＡｂ２３、ｄＡｂ２４、ｄＡｂ２５、ｄＡｂ２６、ｄＡｂ２７、ｄＡｂ３０、ｄＡｂ３１、ｄＡｂ３３、ｄＡｂ３４、ｄＡｂ３５、ｄＡｂ３８、ｄＡｂ４１、ｄＡｂ４６、ｄＡｂ４７、ｄＡｂ５２、ｄＡｂ５３、ｄＡｂ５４、ｄＡｂ５５、ｄＡｂ５６、ｄＡｂ７ｍ１２、ｄＡｂ７ｍ１６、ｄＡｂ７ｍ２６、ｄＡｂ７ｒ１、ｄＡｂ７ｒ３、ｄＡｂ７ｒ４、ｄＡｂ７ｒ５、ｄＡｂ７ｒ７、ｄＡｂ７ｒ８、ｄＡｂ７ｒ１３、ｄＡｂ７ｒ１４、ｄＡｂ７ｒ１５、ｄＡｂ７ｒ１６、ｄＡｂ７ｒ１７、ｄＡｂ７ｒ１８、ｄＡｂ７ｒ１９、ｄＡｂ７ｈ１、ｄＡｂ７ｈ２、ｄＡｂ７ｈ６、ｄＡｂ７ｈ７、ｄＡｂ７ｈ８、ｄＡｂ７ｈ９、ｄＡｂ７ｈ１０、ｄＡｂ７ｈ１１、ｄＡｂ７ｈ１２、ｄＡｂ７ｈ１３、ｄＡｂ７ｈ１４、ｄＡｂ７ｐ１、およびｄＡｂ７ｐ２。
【０１８３】
例えば、ヒト血清アルブミンに結合しているｄＡｂは、以下と少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含みうる：
ＤＯＭ７ｈ−２（配列番号４８２）、ＤＯＭ７ｈ−３（配列番号４８３）、ＤＯＭ７ｈ−４（配列番号４８４）、ＤＯＭ７ｈ−６（配列番号４８５）、ＤＯＭ７ｈ−１（配列番号４８６）、ＤＯＭ７ｈ−７（配列番号４８７）、ＤＯＭ７ｈ−８（配列番号４９６）、ＤＯＭ７ｒ−１３（配列番号４９７）、ＤＯＭ７ｒ−１４（配列番号４９８）、ＤＯＭ７ｈ−２２（配列番号４８９）、ＤＯＭ７ｈ−２３（配列番号４９０）、ＤＯＭ７ｈ−２４（配列番号４９１）、ＤＯＭ７ｈ−２５（配列番号４９２）、ＤＯＭ７ｈ−２６（配列番号４９３）、ＤＯＭ７ｈ−２１（配列番号４９４）もしくはＤＯＭ７ｈ−２７（配列番号４９５）（本項の配列番号はWO2007080392中に記載されている）、または、
ｄＡｂ８、ｄＡｂ１０、ｄＡｂ３６、ｄＡｂ７ｈ２１、ｄＡｂ７ｈ２２、ｄＡｂ７ｈ２３、Ａｂ７ｈ２４、Ａｂ７ｈ２５、Ａｂ７ｈ２６、ｄＡｂ７ｈ２７、ｄＡｂ７ｈ３０、ｄＡｂ７ｈ３１、ｄＡｂ２、ｄＡｂ４、ｄＡｂ７、ｄＡｂ１１、ｄＡｂ１２、ｄＡｂ１３、ｄＡｂ１５、ｄＡｂ１６、ｄＡｂ１７、ｄＡｂ１８、ｄＡｂ１９、ｄＡｂ２１、ｄＡｂ２２、ｄＡｂ２３、ｄＡｂ２４、ｄＡｂ２５、ｄＡｂ２６、ｄＡｂ２７、ｄＡｂ３０、ｄＡｂ３１、ｄＡｂ３３、ｄＡｂ３４、ｄＡｂ３５、ｄＡｂ３８、ｄＡｂ４１、ｄＡｂ４６、ｄＡｂ４７、ｄＡｂ５２、ｄＡｂ５３、ｄＡｂ５４、ｄＡｂ５５、ｄＡｂ５６、ｄＡｂ７ｈ１、ｄＡｂ７ｈ２、ｄＡｂ７ｈ６、ｄＡｂ７ｈ７、ｄＡｂ７ｈ８、ｄＡｂ７ｈ９、ｄＡｂ７ｈ１０、ｄＡｂ７ｈ１１、ｄＡｂ７ｈ１２、ｄＡｂ７ｈ１３もしくはｄＡｂ７ｈ１４。
【０１８４】
特定の実施形態では、ｄＡｂはヒト血清アルブミンに結合し、下記からなる群から選択されるｄＡｂのアミノ酸配列と少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含む：
ＤＯＭ７ｈ−２（配列番号４８２）、ＤＯＭ７ｈ−６（配列番号４８５）、ＤＯＭ７ｈ−１（配列番号４８６）、ＤＯＭ７ｈ−７（配列番号４８７）、ＤＯＭ７ｈ−８（配列番号４９６）、ＤＯＭ７ｈ−２２（配列番号４８９）、ＤＯＭ７ｈ−２３（配列番号４９０）、ＤＯＭ７ｈ−２４（配列番号４９１）、ＤＯＭ７ｈ−２５（配列番号４９２）、ＤＯＭ７ｈ−２６（配列番号４９３）、ＤＯＭ７ｈ−２１（配列番号４９４）、ＤＯＭ７ｈ−２７（配列番号４９５）（本項の配列番号はWO2007080392中に記載されている）、
ｄＡｂ７ｈ２１、ｄＡｂ７ｈ２２、ｄＡｂ７ｈ２３、Ａｂ７ｈ２４、Ａｂ７ｈ２５、Ａｂ７ｈ２６、ｄＡｂ７ｈ２７、ｄＡｂ７ｈ３０、ｄＡｂ７ｈ３１、ｄＡｂ２、ｄＡｂ４、ｄＡｂ７、ｄＡｂ３８、ｄＡｂ４１、ｄＡｂ７ｈ１、ｄＡｂ７ｈ２、ｄＡｂ７ｈ６、ｄＡｂ７ｈ７、ｄＡｂ７ｈ８、ｄＡｂ７ｈ９、ｄＡｂ７ｈ１０、ｄＡｂ７ｈ１１、ｄＡｂ７ｈ１２、ｄＡｂ７ｈ１３、およびｄＡｂ７ｈ１４。
【０１８５】
さらに詳細な実施形態では、ｄＡｂは、ヒト血清アルブミンに結合し、下記からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶκｄＡｂである：
ＤＯＭ７ｈ−２（配列番号４８２）、ＤＯＭ７ｈ−６（配列番号４８５）、ＤＯＭ７ｈ−１（配列番号４８６）、ＤＯＭ７ｈ−７（配列番号４８７）、ＤＯＭ７ｈ−８（配列番号４９６）（本項の配列番号はWO2007080392中に記載されている）、
ｄＡｂ２、ｄＡｂ４、ｄＡｂ７、ｄＡｂ３８、ｄＡｂ４１、ｄＡｂ５４、ｄＡｂ７ｈ１、ｄＡｂ７ｈ２、ｄＡｂ７ｈ６、ｄＡｂ７ｈ７、ｄＡｂ７ｈ８、ｄＡｂ７ｈ９、ｄＡｂ７ｈ１０、ｄＡｂ７ｈ１１、ｄＡｂ７ｈ１２、ｄＡｂ７ｈ１３およびｄＡｂ７ｈ１４。
【０１８６】
さらに詳細な実施形態では、ｄＡｂは、ヒト血清アルブミンに結合し、ｄＡｂ７ｈ３０およびｄＡｂ７ｈ３１から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨｄＡｂである。
【０１８７】
さらに詳細な実施形態では、ｄＡｂは、ｄＡｂ７ｈ１１またはｄＡｂ７ｈ１４である。
【０１８８】
他の実施形態では、ｄＡｂ、リガンド、またはアンタゴニストはヒト血清アルブミンに結合し、前出のいずれかのアミノ酸配列の１つ、２つ、または３つのＣＤＲ、例えば、ｄＡｂ７ｈ１１またはｄＡｂ７ｈ１４の１つ、２つ、または３つのＣＤＲを含む。
【０１８９】
血清アルブミンに結合する適切なラクダ科動物ＶＨＨとしては、WO2004/041862（Ablynx N.V.社）およびWO2007080392（これらに開示されているＶＨＨ配列および対応する核酸は参照により本明細書に組み込まれ、本明細書の開示の一部を構成する）で開示されたものが含まれ、配列Ａ（配列番号５１８）、配列Ｂ（配列番号５１９）、配列Ｃ（配列番号５２０）、配列Ｄ（配列番号５２１）、配列Ｅ（配列番号５２２）、配列Ｆ（配列番号５２３）、配列Ｇ（配列番号５２４）、配列Ｈ（配列番号５２５）、配列Ｉ（配列番号５２６）、配列Ｊ（配列番号５２７）、配列Ｋ（配列番号５２８）、配列Ｌ（配列番号５２９）、配列Ｍ（配列番号５３０）、配列Ｎ（配列番号５３１）、配列Ｏ（配列番号５３２）、配列Ｐ（配列番号５３３）、配列Ｑ（配列番号５３４）がある。これらの配列番号はWO2007080392またはWO2004/041862(Ablynx N.V.社)で引用されたものに対応する。特定の実施形態では、ラクダ科動物ＶＨＨはヒト血清アルブミンに結合し、WO2007080392で開示されたＡＬＢ１、または、配列番号５１８〜５３４のいずれかと少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。これらの配列番号はWO2007080392またはWO2004/041862で引用されたものに対応する。
【０１９０】
一部の実施形態では、リガンドまたはアンタゴニストは、血清アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）との結合について、本明細書で開示されたいずれかの抗血清アルブミンと競合する抗血清アルブミンｄＡｂを含む。
【０１９１】
別の実施形態では、アンタゴニストまたはリガンドは、ＩＬ−１３（例えば、ヒトＩＬ−１３）に対して特異的な結合部分を含み、ここで、この部分はWO2008096158で記載されているように非免疫グロブリン配列を含む。これらの結合部分、その製造法と選択法（例えば、多様なライブラリからの）および配列の開示は、参照により本明細書の開示の一部として本明細書に組み込まれる。
【０１９２】
半減期延長部分（例えばアルブミン）へのコンジュゲート
一実施形態では、一つまたは複数の半減期延長部分（例えば、アルブミン、トランスフェリンと断片、およびそれらの類似体）が、本発明のＩＬ−１３結合ポリペプチド、ｄＡｂまたはアンタゴニストとコンジュゲートまたは会合する。ＩＬ−１３結合フォーマットでの使用のために適切なアルブミン、アルブミン断片、またはアルブミン変異体の実例は、WO2005077042に記載されており、この開示は参照により本明細書に組み込まれ本明細書の開示の一部を構成する。特に、下記のアルブミン、アルブミン断片、またはアルブミン変異体は本発明に使用可能である：
・配列番号１（WO2005077042に記載。この配列は参照により明示的に本明細書に組み込まれる）；
・WO2005077042に記載の配列番号１のアミノ酸１〜２８７を含むか、またはそれからなるアルブミン断片または変異体；
・アルブミン、または、これらのアルブミン断片やアルブミン変異体で、次の配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む：（ａ）WO2005077042記載の配列番号１のアミノ酸５４〜６１；（ｂ）WO2005077042記載の配列番号１のアミノ酸７６〜８９；（ｃ）WO2005077042記載の配列番号１のアミノ酸９２〜ｌ００；（ｄ）WO2005077042記載の配列番号１のアミノ酸１７０〜１７６；（ｅ）WO2005077042記載の配列番号１のアミノ酸２４７〜２５２；（ｆ）WO2005077042記載の配列番号１のアミノ酸２６６〜２７７；（ｇ）WO2005077042記載の配列番号１のアミノ酸２８０〜２８８；（ｈ）WO2005077042記載の配列番号１のアミノ酸３６２〜３６８；（ｉ）WO2005077042記載の配列番号１のアミノ酸４３９〜４４７；（ｊ）WO2005077042記載の配列番号１のアミノ酸４６２〜４７５；（ｋ）WO2005077042記載の配列番号１のアミノ酸４７８〜４８６；および（ｌ）WO2005077042記載の配列番号１のアミノ酸５６０〜５６６。
【０１９３】
ＩＬ−１３結合フォーマットでの使用のために適切なアルブミン、アルブミン断片、および類似体の実例はWO03076567に記載されている。この開示は参照により本明細書に組み込まれ、本明細書の開示の一部を構成する。特に、下記のアルブミン、断片または変異体は本発明に使うことができる：
・WO03076567記載のヒト血清アルブミン（この配列情報は参照により明示的に本明細書に組み込まれる）。図３に一例を示す。
【０１９４】
・５８５アミノ酸の単一非グルコシル化ポリペプチド鎖を含むヒト血清アルブミン（ＨＡ）で分子式量６６、５００（Meloun, et al., FEBS Letters 58:136 (1975); Behrens, et al., Fed. Proc. 34:591 (1975); Lawn, et al., Nucleic Acids Research 9:6102-6114 (1981); Minghetti, et al., J. Biol. Chem. 261:6747 (1986)参照）
・アルブミンの多形変異体または類似体または断片（Weitkamp, et al., Ann. Hum. Genet. 37:219 (1973)に記載されている）
・アルブミン断片または変異体（EP322094に記載されている）。例えば、ＨＡ（１−３７３）、ＨＡ（１−３８８）、ＨＡ（１−３８９）、ＨＡ（１−３６９）およびＨＡ（１−４１９）、ならびに、１−３６９と１〜４１９の間の断片。
【０１９５】
・アルブミン断片または変異体（EP399666に記載されている）。例えば、ＨＡ（１−１７７）およびＨＡ（１−２００）、ならびに、ＨＡ（１−Ｘ）間の断片。ここでＸは１７８〜１９９の任意の数字。
【０１９６】
（一つまたは複数の）半減期延長部分（例えば、アルブミン、トランスフェリンおと断片、およびその類似体）が、本発明のＩＬ−１３結合ポリペプチド、ｄＡｂおよびアンタゴニストをフォーマットするために使われる場合は、ＩＬ−１３結合部分（例えば、抗ＩＬ−１３ｄＡｂ）に任意の適切な方法を使ってコンジュゲート可能である。コンジュゲート法としては、例えば、融合タンパク質をコードしている単一ヌクレオチド構築物を使って直接融合する、等の方法があり、この場合、融合タンパク質は、ＩＬ−１３結合部分のＮまたはＣ末端位置に半減期延長部分をもつ単一ポリペプチド鎖としてコードされている。あるいは、コンジュゲートは、部分間でペプチドリンカーを使って達成可能である。例えば、ペプチドリンカーは、WO03076567またはWO2004003019に記載されている（このリンカーの開示は、参照により本開示に組み込まれ本発明での使用のための実例を提供する）。通常、生体内血清中半減期を延長するポリペプチドは本来生体内で発生するもので、生体（例えばヒト）から望ましくない物質を除く内因性機構による分解または除去に抵抗性を示す。例えば、生体内で血清中半減期を延長するポリペプチドは、細胞外マトリックスからのタンパク質、血液中で見つかったタンパク質、血液脳関門で見つかったタンパク質、または神経組織中、腎臓に局在化しているタンパク質、肝臓、肺、心臓、皮膚または骨、ストレスタンパク質、疾患特異性タンパク質、または、ＦＣ輸送に関わるタンパク質から選択可能である。
【０１９７】
本発明の本開示全体の実施形態では、本発明のアンタゴニストまたはリガンド中の抗ＩＬ−１３「ｄＡｂ」を使う代わりに、当業者は、ＩＬ−１３に結合した、本発明のｄＡｂの一つ、またはそれ以上、または全３つのＣＤＲ（例えば、適切なタンパク質足場や骨格上にグラフトしたＣＤＲ、例えば、アフィボディ、ＳｐＡ足場、ＬＤＬ受容体クラスＡドメイン、ＥＧＦドメイン）を含むポリペプチドまたはドメインを使うことが可能であるということが意図されている。従って、本開示は全体としてｄＡｂの代わりにこのドメインを使ったアンタゴニストの開示を提供すると理解されるべきである。（この点に関しては、WO2008096158を参照のこと。この開示は参照により組み込まれる）。
【０１９８】
従って、一実施形態では、本発明のアンタゴニストは、Ｉｌ−１３や適切なフォーマットのこのｄＡｂの相補性決定領域に特異的に結合する免疫グロブリン単一可変ドメインまたはドメイン抗体（ｄＡｂ）を含む。アンタゴニストはこのｄＡｂからなる、または、基本的にこのｄＡｂからなるポリペプチドであってもよい。アンタゴニストは、抗体フォーマット（例えば、ＩｇＧ様フォーマット、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２）等の適切なフォーマットのｄＡｂ（またはｄＡｂのＣＤＲ）であっても、ＩＬ−１３に結合したｄＡｂ、および他の標的タンパク質、抗原、またはエピトープ（例えば血清アルブミン）に結合した第二のｄＡｂを含む二重特異性リガンドであってもよい。
【０１９９】
本発明に係るポリペプチド、ｄＡｂ、およびアンタゴニストは、当業者には既知の多様な適切な抗体フォーマットとしてフォーマットされていてもよい。これらの抗体フォーマットの例としては、次のものがある。ＩｇＧ様フォーマット、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、単鎖抗体、二重特性抗体、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体重鎖および／または軽鎖のホモ二量体とヘテロ二量体、前出のいずれかの抗原結合フラグメント（例えば、ＦＶフラグメント（例えば、単鎖ＦＶ（ＳＣＦＶ）、ジスルフィド結合ＦＶ）、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２ フラグメント）、単一可変ドメイン（例えばＶＨ、ＶＬ）、ｄＡｂ、および前出のいずれかの修飾バージョン（例えば、ポリアルキレングリコール（例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリブチレングリコール）、または他の適切なポリマーの共有結合により修飾される）。
【０２００】
一部の実施形態では、本発明は、ＩｇＧフォーマットのリガンド（例えば、抗ＩＬ−１３アンタゴニスト）を提供する。この様なフォーマットは、通常のＩｇＧ分子４鎖構造（２つの重鎖と２つの軽鎖）を有し、一つまたは複数の可変領域（ＶＨおよび／またはＶＬ ）が本発明のｄＡｂで置換されている。一実施形態では、各可変領域（２ＶＨ領域と２ＶＬ領域）はｄＡｂまたは単一可変ドメインで置換されており、その内の少なくとも一つが本発明の抗ＩＬ−１３ｄＡｂである。ＩｇＧ様フォーマットで含まれているｄＡｂまたは単一可変ドメインは、同じ特異性でも異なる特異性でも持つことが可能である。一部の実施形態では、ＩｇＧ様フォーマットは４価であり、１つ（抗ＩＬ−１３のみ）、２つ（例えば、抗ＩＬ−１３と抗ＳＡ）、３つ、４つの特異性を有することが可能である。例えば、ＩｇＧ様フォーマットは、同じ特異性の４つのｄＡｂを含む単一特異性になることも；同じ特異性の３つのｄＡｂと異なる特異性の別のｄＡｂを含む二重特異性になることも；同じ特異性の２つのｄＡｂと共通だが異なる特異性の２つのｄＡｂを含む二重特異性になることも；同じ特異性の第一、第二のｄＡｂ、異なる特異性の第三のｄＡｂ、および第一、第二、第三のｄＡｂとは別の特異性を含む三重特異性になることも；または、それぞれ異なる特異性を持つ４つのｄＡｂを含む四重特異性になることもできる。ＩｇＧ様フォーマットの抗原結合フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２ 、Ｆａｂ’、Ｆｖ、ｓｃＦｖ）は作製可能である。一実施形態では、ＩｇＧ様フォーマットまたは抗原結合フラグメントはＩＬ−１３に対し単一特異性であることも可能である。補体活性化および／または抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）機能が必要な場合は、リガンドはＩｇＧ様フォーマットでよい。必要に応じ、ＩｇＧ様フォーマットは変異定常領域（変種ＩｇＧ重鎖定常領域）を含み、ＦＣ受容体への結合および／または補体結合能を最小化できる。（例えば、Winter et al., GB 2,209,757 B; Morrison et al., WO 89/07142; Morgan et al., WO 94/29351, December 22, 1994を参照のこと）。
【０２０１】
本発明のリガンド（例えば、ポリペプチド、ｄＡｂ、アンタゴニスト）は、第二の免疫グロブリン単一可変ドメインに直接融合した第一の免疫グロブリン単一可変ドメインを含む融合タンパク質としてフォーマットできる。必要なら、このフォーマットは、さらに半減期延長部分を含んでもよい。例えば、リガンドは、血清アルブミンに結合した免疫グロブリン単一可変ドメインに直接融合した第二の免疫グロブリン単一可変ドメインに直接融合した第一の免疫グロブリン単一可変ドメインを含んでもよい。
【０２０２】
通常、標的に対し結合特異性を持つ結合部位を有するポリペプチドドメインの配向、およびリガンドがリンカーを含むか否かは、設計上の選択事項である。しかし、リンカーがあってもなくても、一部の配向は他の配向よりもよい結合特性を与える可能性がある。全配向（例えば、ｄＡｂ１−リンカー−ｄＡｂ２；ｄＡｂ２−リンカー−ｄＡｂ１）は本発明に包含され、所望の結合特性を与える配向を含むリガンドはスクリーニングにより容易に特定可能である。
【０２０３】
ｄＡｂモノマー、二量体、三量体を含む本発明にのポリペプチドおよびｄＡｂは、１つまたは両方のＣＨ２およびＣＨ３ドメイン、ならびに、任意選択でヒンジ領域を含む抗体のＦＣ領域に結合できる。例えば、単一ヌクレオチド配列としてＦＣ領域に結合するリガンドをコードしているベクターを、このポリペプチドを生成するために使用することが可能である。
【０２０４】
さらに、本発明は、前出ｄＡｂモノマーの二量体、三量体、およびポリマーを提供する。
【０２０５】
毒素部分または毒素を含むリガンド
また、本発明は、毒素部分また毒素を含むリガンド（例えば、抗ＩＬ−１３ｄＡｂ、ｄＡｂモノマー）に関する。適切な毒素部分は毒素（例えば、表面活性毒素、細胞毒）を含む。毒素部分または毒素は適切な方法によりリガンドに結合またはコンジュゲートできる。例えば、毒素部分または毒素はリガンドに直接にまたは適切なリンカーを介して共有結合により結合できる。適切なリンカーには切断不可能な、または切断可能なリンカー、例えば、細胞性酵素（例えば、細胞エステラーゼ、カテプシンＢ等の細胞プロテアーゼ）の切断サイト含むｐＨ切断リンカー、を含めてもよい。このような切断可能リンカーは、リガンドが内部に取り入れられた後、毒素部分または毒素を開放するリガンドを作成するために使用可能である。
【０２０６】
リガンドに毒素部分または毒素を結合またはコンジュゲートするために種々の方法を使うことが可能である。結合またはコンジュゲートの詳細方法は結合またはコンジュゲートされる毒素部分または毒素およびリガンドに依存することになる。必要なら、末端機能基を含むリンカーを、リガンドと毒素部分または毒素を結合するために使用可能である。通常、コンジュゲートは、反応官能基を含む（または、反応官能基を含むように修飾した）毒素部分または毒素をリンカーと、または直接リガンドと反応させて成し遂げられる。適切な条件下で第二の化学基と反応し、それにより共有結合を形成する化学的部分または官能基を含む（または含むように修飾された）毒素部分または毒素を反応させて共有結合が形成される。必要なら、適切な反応化学基を任意の適切な方法を使ってリガンドまたはリンカーに追加可能である。（Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, CA (1996)参照）。多くの適切な化学基の組合せが当業者には既知であり、例えば、アミン基は、トシラート、メシラート、ハロゲン基（クロロ、ブロモ、フルオロ、ヨード）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル エステル（ＮＨＳ）、等の求電子基と反応可能である。チオールは、マレイミド、ヨードアセチル、アクリロリル、ピリジル、ジスルフィド、５−チオール−２−ニトロ安息香酸 チオール（ＴＮＢチオール）、等と反応可能である。アルデヒド機能基は、アミン−、またはヒドラジド−含有分子とカップリングでき、アジド基は、三価の亜リン酸基と反応しホスホルアミダートまたはホスホルイミド結合を作る。活性化基を分子に導入する適切な方法は、当業者には既知である（例えば、Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, CA (1996)を参照）。
【０２０７】
適切な毒素部分および毒素には、例えば、マイタンシノイド（例えば、マイタンシノール、例えば、ＤＭ１、ＤＭ４）、タキサン、カリケアマイシン、デュオカルマイシン、またはこれらの派生物が含まれる。マイタンシノイドは、例えば、マイタンシノールまたはその類似体であってもよい。マイタンシノール類似体の例には、修飾された芳香族環（例えば、Ｃ−１９−デクロロ、Ｃ−２０−デメトキシ、Ｃ−２０−アシルオキシ）を持つもの、および他の位置に修飾がなされたもの（例えば、Ｃ−９−ＣＨ、Ｃ−１４−アルコキシメチル、Ｃ−１４−ヒドロキシメチルまたはアセロキシメチル、Ｃ−１５−ヒドロキシ／アシルオキシ、Ｃ−１５−メトキシ、Ｃ−１８−Ｎ−デメチル、４、５−デオキシ）が含まれる。マイタンシノールおよびマイタンシノール類似体は、例えば、米国特許第5,208,020号および第6,333,410号に記載されており、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。マイタンシノールは、例えば、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロプリオナート（また、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノアート（またはＳＰＰ）として知られている）、４−スクシンイミジル−オキシカルボニル−ａ−（２−ピリジルジチオ）−トルエン（ＳＭＰＴ）、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）ブチラート（ＳＤＰＢ）、２イミノチオラン、またはＳ−アセチルコハク酸無水物、を使って抗体および抗体フラグメントにカップリング可能である。タキサンは、例えば、タクソール、タキソテール、または新規タキサンであってもよい（WO 01/38318参照）。カリケアマイシンは、例えば、ブロモ錯体カリケアマイシン（例えば、α、β、またはγブロモ錯体）、ヨード錯体カリケアマイシン（例えば、α、β、またはγヨード錯体）、または類似体、および、それらの模倣体であってもよい。ブロモ錯体カリケアマイシンには、Ｉ１−ＢＲ、Ｉ２−ＢＲ、Ｉ３−ＢＲ、Ｉ４−ＢＲ、Ｊ１−ＢＲ、Ｊ２−ＢＲおよびＫ１−ＢＲが含まれる。ヨード錯体カリケアマイシンには、Ｉ１−Ｉ、Ｉ２−Ｉ、Ｉ３−Ｉ、Ｊ１−Ｉ、Ｊ２−Ｉ、Ｌ１−ＩおよびＫ１−ＢＲが含まれる。カリケアマイシンおよびそれらの変異体、類似体、模倣体は、例えば、米国特許第4,970,198号；第5,264,586号；第5,550,246号；第5,712,374号、および第5,714,586号に記載があり、これらの内容は、参照により本明細書に組み込まれる。デュオカルマイシン類似体（例えば、ＫＷ−２１８９、ＤＣ８８、ＤＣ８９ＣＢＩ−ＴＭＩ、およびこれらの派生物）は、例えば、米国特許第5,070,092号、米国特許第5,187,186号、米国特許第5,641,780号、米国特許第5,641,780号、米国特許第4,923,990号、および米国特許第5,101,038号、に記載されており、これらの内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０２０８】
これに限定されないが、他の毒素の例には、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサート）、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパクロランブシル、ＣＣ−１０６５（米国特許第5,475,092号、第5,585,499号、第5,846,545号参照）、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリネス（例えば、ダウノルビシン（以前のダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前のアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、マイトマイシン、ピュロマイシンアントラマイシン（ＡＭＣ））、デュオカルマイシンおよび類似体またはこれらの派生体、および抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、タキソール、アウリスタチン（例えば、アウリスタチンＥ）およびマイタンシノイド、およびこれらの類似体または同族体、が含まれる。
【０２０９】
また、毒素は、フリーラジカルジェネレーター（例えば、セレニウム含有毒素部分）のような表面活性毒素または放射性核種含有部分であってもよい。適切な放射性核種含有部分には、例えば、放射性ヨウ素（１３１Ｉまたは１２５Ｉ）、イットリウム（９０Ｙ）、ルテニウム（１７７Ｌｕ）、アクチニウム（２２５Ａｃ）、プラセオジミウム、アスタチン（２１１Ａｔ）、レニウム（１８６Ｒｅ）、ビスマス（２１２Ｂｉまたは２１３Ｂｉ）、インジウム（１１１Ｉｎ）、テクネチウム（９９ｍＴｃ）、リン（３２Ｐ）、ロジウム（１８８Ｒｈ）、硫黄（３５Ｓ）、炭素（１４Ｃ）、トリチウム（３Ｈ）、クロミウム（５１Ｃｒ）、塩素（３６Ｃｌ）、コバルト（５７Ｃｏまたは５８Ｃｏ）、鉄（５９Ｆｅ）、セレニウム（７５Ｓｅ）、またはガリウム（６７Ｇａ）、を含む部分が含まれる。
【０２１０】
毒素は、細菌源からのタンパク質、ポリペプチド、またはペプチド（例えば、ジフテリア毒素、緑膿菌外毒素（ＰＥ））、および、植物タンパク質、例えば、リシンＡ鎖（ＲＴＡ）、リボソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ）ゲロニン、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、サポリン、ドデカンドロンであってもよく、これらは毒素として使用されることが意図されている。
【０２１１】
また、特定の標的タンパク質の生成を担うｍＲＮＡに対し、結合、無効化、分解促進、または産生の阻害を行うように設計した核酸のアンチセンス化合物も毒素として使用することもできる。アンチセンス化合物には、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡ、一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチド、あるいはそれらの類似体が含まれ、これらは、個々のｍＲＮＡ種と特異的にハイブリダイズし、ｍＲＮＡ種の転写および／またはＲＮＡプロセシング、および／またはコードされたポリペプチドの翻訳を阻害し、それによってそれぞれのコードされたポリペプチドの量を減少させることができる。Ching, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 10006-10010 (1989); Broder, et al., Ann. Int. Med. 113: 604-618 (1990); Loreau, et al., FEBS Letters 274: 53-56 (1990)。有用なアンチセンス治療剤には、例えば、ＶｅｇｌｉｎＴＭ（ＶａｓＧｅｎｅ社）およびＯＧＸ−０１１（Ｏｎｃｏｇｅｎｅｘ社）が含まれる。
【０２１２】
毒素は、光活性剤であってもよい。適切な光活性剤には、ポルフィリン基材、例えば、ポルフィマーナトリウム、葉緑素ポルフィリン、クロリンＥ６、ヘマトポルフィリン派生体それ自体、フタロシアニン、エチオプルプリン、テキサフリン、等が含まれる。
【０２１３】
毒素は、細胞内標的（細胞内抗体）に結合するｄＡｂ等の、細胞内標的に結合する抗体または抗体フラグメントであってよい。そのような抗体または抗体フラグメント（ｄＡｂ）は、所定の細胞内コンパートメントまたは標的を対象とすることができる。例えば、それらの抗体または抗体フラグメント（ｄＡｂ）は、ｅｒｂＢ２、ＥＧＦＲ、ＢＣＲ−ＡＢＬ、ｐ２１Ｒａｓ、カスパーゼ３、カスパーゼ７、Ｂｃｌ−２、ｐ５３、サイクリンＥ、ＡＴＦ−１／ＣＲＥＢ、ＨＰＶ１６Ｅ７、ＨＰ１、ＩＶ型コラゲナーゼ、カテプシンＬ、および、Kontermann, R.E., Methods, 34:163-170 (2004)（その全体を参照により本明細書に組み込む）に記載されているものから選択した細胞内標的と結合することができる。
【０２１４】
WO2007085815の実施例は参照により本明細書に組み込まれ、本発明のリガンドにも同様に適用可能な、関連アッセイ、フォーマッティングおよび実験の詳細を提供する。
【０２１５】
アッセイ
ＩＬ−１３
ＩＬ−１３サンドイッチＥＬＩＳＡ法
ＭＡＸＩＳＯＲＰＴＭプレート（高タンパク質結合ＥＬＩＳＡプレート、Ｎｕｎｃ社、デンマーク）を２．５μｇ／ｍｌのコーティング抗体（Ｍｏｄｕｌｅ Ｓｅｔ、Ｂｅｎｄｅｒ ＭｅｄＳｙｓｔｅｍｓ社、ウイーン、オーストリア）で一晩コートして、次に、ＰＢＳに入れた０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０で１回洗浄し、０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ と０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０のＰＢＳ溶液でブロッキングする。プレートを再度洗浄した後、１５０ｐｇ／ｍｌのＩＬ−１３（ＧＳＫ社）をＤＯＭ１０ｄＡｂ（すなわち、抗ＩＬ−１３ｄＡｂ）希釈系列またはＩＬ−１３単体と混合する。プレートを２回洗浄した後、ＩＬ−１３を捕捉抗体に結合させ、ビオチン結合検出抗体（Ｍｏｄｕｌｅ Ｓｅｔ、Ｂｅｎｄｅｒ ＭｅｄＳｙｓｔｅｍｓ社）、続いてペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（Ｍｏｄｕｌｅ Ｓｅｔ、Ｂｅｎｄｅｒ ＭｅｄＳｙｓｔｅｍｓ社）を使って検出する。最後に、プレートを３回洗浄し次いでＴＭＢ基質（ＫＰＬ社、ゲーサーズバーグ、米国）と共にインキュベートした後、ＨＣｌを添加して反応を停止し４５０ ｎｍでの吸光度を読みとる。抗ＩＬ−１３ｄＡｂはＩＬ−１３結合を減少させ、その結果ＩＬ−１３のみの対照と比べ吸光度を減少させる。
【０２１６】
８２００細胞検出システムを使ったＩＬ−１３受容体結合アッセイ（ＲＢＡ）
ＳＰＨＥＲＯＴＭヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ社）ポリスチレン粒子（０．５％ｗ／ｖ）（ヤギ抗ヒト粒子：Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ社、リバティービル、米国）を２０μｇのＩＬ−１３Ｒα１／Ｆｃキメラ、またはＩＬ−１３Ｒα２／Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ミネアポリス、米国）を用いて一晩コートする。その後、以下の試薬を、側面が黒で底面が透明な３８４ウェルのＦＭＡＴプレート（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、フォスターシティ、米国）内で混合する。当該試薬は、ＤＯＭ−１０ｄＡｂまたは０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡのＰＢＳによる希釈系列；０．５μｇ／ｍｌビオチン化抗ＩＬ−１３抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）；０．２５μｇ／ｍｌ ＳＴＲＥＰＴＡＶＩＤＩＮ ＡＬＥＸ ＡＦＬＵＯＲ(登録商標)６４７複合体（蛍光プローブ、分子プローブ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｔｄ社、ペーズリー、英国）；１０ｎｇ／ｍｌ組換えヒトＩＬ−１３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）；およびＩＬ−１３Ｒ２／Ｆｃ被覆粒子の１：１０希釈液である。プレートを７時間インキュベートした後、８２００細胞検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）で読み取る。ＩＬ−１３とレセプター被覆粒子との結合は、蛍光発光として８２００細胞検出システムにより検出される複合体を形成させる。抗ＩＬ−１３ｄＡｂ活性により、ＩＬ−１３結合の低下と、その結果、ＩＬ−１３のみの対照と比較して蛍光発光の減少が起こる。
【０２１７】
ＩＬ−１３細胞アッセイ
単離されたｄＡｂについて、培養したＴＦ−１細胞（ＡＴＣＣ(登録商標)カタログ番号ＣＲＬ−２００３）におけるＩＬ−１３誘導増殖を抑制する能力試験が可能である。簡単に説明すると、フェノールレッドを含まないＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｔｄ社、ペーズリー、英国）中の４００００個のＴＦ−１細胞を組織培養マイクロタイタープレートのウェル内に入れ、最終濃度５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ミネアポリス、米国）および検証対象ｄＡｂの希釈物を混合する。この混合物を３７℃、５％ＣＯ２で７２時間インキュベートする。その後、ＣＥＬＬＴＩＴＥＲ９６(登録商標)試薬（生存率測定用の比色定量試薬、Ｐｒｏｍｅｇａ社、マディソン、米国）を加え、ウェルあたりの細胞数を４９０ｎｍにおける吸光度を測定することによって定量する。抗ＩＬ−１３ｄＡｂ活性は、細胞増殖を低下させ、Ａ４９０もＩＬ−１３のみに比べ相当する低い値になる。
【０２１８】
ＢＩＡＣＯＲＥ(登録商標)解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）スクリーニング
ストレプトアビジン被覆ＳＡチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ）を約５００ＲＵのビオチン化ＩＬ−１３（Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ社、ミネアポリス、米国）でコートする。可溶性ＤＡＢを含む上清をランニングバッファで１：５に希釈する。５０〜１００μｌの希釈上清を５０μｌ／分の流速で注入（ｋｉｎｉｎｊｅｃｔ法）し、続いて、解離フェーズとして５分間保持する。親株と比較して改善された解離速度を有するクローンを、目視によって、またはＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアＶ４．１（Ｂｉａｃｏｒｅ社）を用いて測定することによって確認する。
【０２１９】
抗ＩＬ−１３ ｄＡｂとの競合ＢＩＡＣＯＲＥ(登録商標)
これらの実験は、約４００ＲＵのビオチン化ＩＬ−１３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）と結合させたストレプトアビジン被覆ＳＡチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ社）を用いて、ＢＩＡＣＯＲＥ(登録商標)３０００装置（表面プラズモン共鳴装置、Ｂｉａｃｏｒｅ社）で行う。ブランクのフローセルとインライン比較しながら、ＨＢＳ−ＥＰランニングバッファ（Ｂｉａｃｏｒｅ社）中を流速３０μｌ／分で抗原被覆フローセルに検体を通した。最初のｄＡｂを注入し、続いて、すぐに第二のｄＡｂをＢｉａｃｏｒｅの同時注入機能（ｃｏ−ｉｎｊｅｃｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を用いて注入する。この競合プロトコルは、通常、ＩＬ−１３との結合について被検抗体またはフラグメントと、既知ｄＡｂ（または他の抗体ポリペプチド）との間のＩＬ−１３に対する結合の競合を評価するのに使用される。
【０２２０】
競合とエピトープマッピング
抗ＩＬ−１３ｄＡｂのエピトープマッピング
抗ＩＬ−１３ｄＡｂのエピトープ特異性を調べるために、Ｂｉａｃｏｒｅ競合実験を行うことができる。ｄＡｂを注入し、続いて、すぐに第二のｄＡｂを注入する。既に他の（第一の）ｄＡｂが結合していると、ある（第二の）ｄＡｂが、ＩＬ−１３に結合できない場合、これは、これらのｄＡｂが同じエピトープに結合することを示している。本競合プロトコルは、通常、被検抗体またはフラグメントと、既知ｄＡｂ（または他の抗体ポリペプチド）との間のＩＬ−１３への結合に対する競合（およびエピトープマッピング）を評価するのに使用することができる。僅かに改変したＢＩＡｃｏｒｅプロトコルの使用も可能で、このプロトコルでは、第一のｄＡｂをＩＬ−１３表面に注入し、その後、高親和結合性ｄＡｂを、ＩＬ−１３表面を飽和させる高濃度（５μＭ）で注入し、最後に前記ｄＡｂを再度注入する。高親和結合性ｄＡｂで飽和する前と後で結合に差があれば、エピトープは少なくとも部分的に重複している。
【０２２１】
ＩＬ−１３誘導Ｂ細胞増殖
血液を正常な血液ドナーから集める。ＰＢＭＣをフィコール勾配で分離し、その後、Ｂ細胞をネガティブＢ細胞分離キット（ＥａｓｙＳｅｐ Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ社）を用いて分離する。純度（任意選択肢として、９８％を超える）は、フローサイトメトリー、並びにＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１９およびＣＤ２３での染色によって測定される。その後、Ｂ細胞を、放射線照射ＣＤ４０Ｌ＋Ｌ細胞で被覆されたプレートにＩＬ−１３（１０ｎｇ／ｍｌ）存在下１×１０５細胞／ウェルで蒔く。培養物を、最後の１８時間は３［Ｈ］チミジンを添加して、５日間インキュベートする。抗ＩＬ−１３ｄＡｂを培養開始時に１０ｎＭまたは１００ｎＭで添加する。
【０２２２】
Ｂ細胞増殖アッセイ
ＣＤ４０Ｌが、ＩＬ−１３に対して反応するように細胞を活性化できることは、以前に示されていた。実際、ドナーは、Ｂ細胞を放射線照射されたＣＤ４０Ｌ＋Ｌ細胞と共に、ＩＬ−１３の濃度を増加させてインキュベートしたときに、用量依存性増殖を示す試験が可能である。ネガティブ対照としてＢ細胞のみ、またはＣＤ４０Ｌで形質移入したＬ細胞のみを使用する。抗ＩＬ−１３ ｄＡｂの添加により、ドナー由来のＢ細胞のＩＬ−１３誘導増殖が抑制されるかどうか評価できる。
【０２２３】
抑制型ｄＡｂ（WO2007085815参照）の一例であるが、平均抑制率が１０ｎＭおよび１００ｎＭの濃度においてそれぞれ８０％および１００％であった。Ｂ細胞増殖の完全な抑制も、ポジティブ対照としての３μｇ／ｍｌの抗ＩＬ−１３ｍＡｂ（Ｒ＆Ｄ社）で観察された。ＩＬ−１３と結合しない対照ｄＡｂは、このＢ細胞増殖を抑制できなかった。
【０２２４】
ＩＬ−１３のＩＬ−１３Ｒα２に対する結合の抑制
競合アッセイにより、ＩＬ−１３のＩＬ−１３Ｒα２に対する結合を抑制する抗ＩＬ−１３ｄＡｂの能力に関する試験が可能である。
【０２２５】
変異型ＩＬ−１３（Ｒ１３０Ｑ）への結合
ＩＬ−１３の遺伝的変異体は、喘息（Heinzmann et al. Hum Mol Genet. (2000) 9549-59）および気管支過敏症（Howard et al., Am. J. Resp. Cell Molec. Biol. (2001) 377-384）のリスクの増加と関連している。それ故、抗ＩＬ−１３ ｄＡｂが変異型ＩＬ−１３ （Ｒ１３０Ｑ）と結合できるかどうかを測定するため、変異型ＩＬ−１３（Ｒ１３０Ｑ）を用いｄＡｂ量を増加させてＴＦ−１増殖アッセイが行われる。変異体に結合したｄＡｂは、変異型ＩＬ−１３誘導ＴＦ−１増殖を、例えば、約０．５〜１０ｎＭのＮＤ５０値で抑制できる可能性がある。
【０２２６】
アカゲザルおよびカニクイザルＩＬ−１３との交差反応性
ｄＡｂに求められる要件は、アカゲザルおよびカニクイザルＩＬ−１３との交差反応性であろう。この目的に対し、ｄＡｂをＴＦ−１細胞増殖アッセイ試験が行える。当該アッセイでは、細胞をヒトＩＬ−１３（５ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）、アカゲザルＩＬ−１３（５ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社）またはカニクイザルＩＬ−１３（当所で発現させたカニクイザルＩＬ−１３を含む上清の１：４０００希釈）で刺激する。ｄＡｂの用量反応により、本設定におけるＮＤ５０が測定される。
【０２２７】
ＩＬ−４
ＩＬ−４受容体結合アッセイ（ＲＢＡ）
ＭａｘｉＳｏｒｐＴＭ プレート（高タンパク質結合ＥＬＩＳＡプレート、Ｎｕｎｃ社、デンマーク）を０．５μｇ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−４Ｒ／Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ミネアポリス、米国）で一晩コートし、ウェルをＰＢＳに入れた０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄後、続いて、ＰＢＳで３回洗浄した後、２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡのＰＢＳ溶液でブロッキングする。プレートを再度洗浄した後、希釈系列のＩＬ−４または抗ＩＬ−４ｄＡｂと混合した１０ｎｇ／ｍｌのビオチン化ＩＬ−４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を添加する。ＩＬ−４の結合をペルオキシダーゼ標識抗ビオチン抗体（Ｓｔｒａｔｅｃｈ社、ソーハム、英国）により検出し、その後、ＴＢＭ基質（ＫＰＬ社、ゲーサーズバーグ、米国）で発色させる。反応を塩酸の添加によって停止させ、４５０ｎｍにおける吸光度を読み取る。抗ＩＬ−４ｄＡｂ活性は、受容体に対するＩＬ−４結合を減少させ、結果として、ＩＬ−４のみの対照と比較して吸光度が減少する。
【０２２８】
ＩＬ−４細胞アッセイ
単離したｄＡｂに対し、培養したＴＦ−１細胞（ＡＴＣＣ(登録商標)）カタログ番号ＣＲＬ−２００３）におけるＩＬ−４誘導増殖の抑制能力について試験できる。簡単に説明すると、フェノールレッドを含まないＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｔｄ社、ぺーズリー、英国）中の４００００個のＴＦ−１細胞を組織培養マイクロタイタープレートのウェル内に入れ、最終濃度１ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ミネアポリス、米国）および検証対象ｄＡｂの希釈物と混合する。混合物を３７℃、５％ＣＯ２で７２時間インキュベートし、その後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６(登録商標)試薬（生存能測定用の比色定量試薬、Ｐｒｏｍｅｇａ社、マディソン、米国）を加え、ウェルあたりの細胞数を４９０ｎｍにおける吸光度を測定することによって定量する。抗ＩＬ−４ｄＡｂ活性は、細胞増殖の低下を生じさせ、またＩＬ−４単独よりも、相当する低いＡ４９０値になる。
【０２２９】
抗ＩＬ−４ｄＡｂとの競合Ｂｉａｃｏｒｅ(登録商標)
これらの実験は、約４００ ＲＵのビオチン化ＩＬ−４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）と組み合わせたストレプトアビジン被覆ＳＡチップ（表面プラズモン共鳴システム、Ｂｉａｃｏｒｅ社）を用いて、競合Ｂｉａｃｏｒｅ(登録商標)３０００装置で行われる。ブランクのフローセルとインライン比較しながら、ＨＢＳ−ＥＰランニングバッファ（Ｂｉａｃｏｒｅ社）を使い流速３０μｌ／ｍｉｎで、検体を抗原被覆フローセル上に通過させる。第１のｄＡｂを注入し、続いて、直ちに第２のｄＡｂをＢｉａｃｏｒｅ社の同時注入機能（ｃｏ−ｉｎｊｅｃｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を用いて注入する。この競合プロトコルは、通常、被検抗体またはフラグメントの既知ｄＡｂ（または他の抗体ポリペプチド）とのＩＬ−４への結合に対する競合を評価するのに使用できる。
【０２３０】
実施例
実施例１：ＤＯＭ１０リードｄＡｂの選択
ＤＯＭ１０−５３−５４６
抗ＩＬ−１３ドメイン抗体（ｄＡｂ）であるＤＯＭ１０―５３−５４６を、ＩＬ−４とＩＬ−１３に対する二重標的分子を単離する試みとしてヒトＩＬ−１３に対して選択されたインライン融合ライブラリから単離した。ＡＳＴＫＧＰＳリンカーを使ってＩＬ−４結合ｄＡｂのＤＯＭ９−１１２−２１０をＤＯＭ−５３−４０９ｄＡｂと結合しＤＯＭ９−１１２−２１０−ＡＳＴＫＧＰＳ−ＤＯＭ１０−５３−４０９を作成した。ＤＯＭ９−１１２−２１０およびＤＯＭ１０−５３−４０９はWO2007085815に開示されている。ＡＳＴＫＧＰＳリンカーはWO2007085814に開示されている。ＤＯＭ９ｄＡｂを固定して、１２のＤＯＭ１０−５３−４０９ライブラリを構築し、より優れた効果と発現量を有するインライン融合物を選択するために、それぞれ全３つのＣＤＲおよびＣＤＲの周りのフレームワーク残基を含むＤＯＭ１０−５３−４０９の残基を多様化した。これらのライブラリは残基を多様化するためにＮＮＳコドンを組み込んだオリゴヌクレオチドを使って作成した。ＮＮＳコドンにより、２０アミノ酸または１つの終止コドンの合計３２コドンの内から任意に置換することよって標的残基のランダム化が行われる。Ｎは、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃの４つのヌクレオチドの内の１つを表し、Ｓは、ＧまたはＣを表す。これらのオリゴヌクレオチドを使って行った一次ＰＣＲを、次にアセンブリＰＣＲを使って組み合わせる。アセンブルＰＣＲ（「ｐｕｌｌ−ｔｈｒｏｕｇｈ」またはＳＯＥ（Ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｂｙ Ｏｖｅｒｌａｐ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）ＰＣＲとして知られている）は、２つの一次ＰＣＲ産物（一つは多様化されたもの、もう一つは不変のもの）を、分解やライゲーションなしに２つの一次ＰＣＲ産物の相補性末端を利用して結合させる。
【０２３１】
インライン融合ライブラリは、ストレプトアビジン被覆磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ社、ノルウェイ）と１０ｎＭのビオチン化ヒトＩＬ−１３を使った２ラウンドの選択に供される。ＩＬ−１３のビオチン化は、５倍モル過剰のＥＺ−Ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ社、ロックフォード、米国）を使って行った(Henderikx et al., 2002, Selection of antibodies against biotinylated antigens. Antibody Phage Display: Methods and protocols, Ed. O'Brien and Atkin, Humana Press) 。
【０２３２】
第２ラウンドの産物をｐＤＯＭ５ベクター（図１）に挿入した。ｐＤＯＭ５はｐＵＣ１１９ベースの発現ベクターで、ＬａｃＺプロモーターの制御下にある。上澄み中へのｄＡｂの発現は汎用ＧＡＳリーダーシグナルペプチドとのＮ末端での融合により確実に実行される。さらに、ｃ−ｍｙｃタグがｄＡｂのＣ末端に付加された。大腸菌ＨＢ２１５１の形質転換の後、クローンを、９６個の深底ウエルプレートに１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを添加したｏｖｅｒｎｉｇｈｔ ｅｘｐｒｅｓｓ ａｕｔｏ−ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ培地（ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ、Ｎｏｖａｇｅｎ社）０．５ｍｌ／ウエルでいれて９５０ｒｐｍ、３０℃、湿度８０％でｉｎｆｏｒｓ社の高速シェーカーを用いて２日間発現させた。次いで、プレートを４０００ｒｐｍで２０分、遠心分離を行い、できた上澄み液をHBSバッファーで１／５に薄め、１５００ＲＵ プロテインＡ ＣＭ５チップへの結合に対しＢｉａｃｏｒｅＴＭを用いてスクリーニングを行い、改善発現量を有するクローンを選別した。メーカーの推奨に従い、一級アミンカップリングによりプロテインＡをＣＭ５チップとカップリングした（アミンカップリングキット、Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）。試料をＢｉａｃｏｒｅで５０μｌ／分の流速で流した。上面を０．１Ｍのグリシン（ｐＨ２）を使ってベースラインまで戻した。改善発現量の任意のクローンを５０ｍｌのｏｖｅｒｎｉｇｈｔ ｅｘｐｒｅｓｓ ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ培地中、３０℃で４８時間発現させ、遠心分離（４、０００ｒｐｍ、２０分）で細胞を沈殿させた後、上澄みを４℃で一晩Ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅ−ｐｒｏｔｅｉｎ Ａビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、結合能力：5 mg ｄＡｂ／mLビーズ)と一緒にインキュベートした。次に、ビーズをドリップカラムに詰め、カラムの１０倍量のＰＢＳで洗浄した後、０．１Ｍの塩酸グリシン（ｐＨ２）で溶出させた。１Ｍトリス塩酸（ｐＨ８．０）で中和し、１２％アクリルアミドトリスグリシンゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）上でSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法を行った後、タンパク質の純度を目視で推定した。タンパク質濃度と収率（細菌培養物Ｌ当たりのｍｇで）を２８０ｎｍでのアミノ酸組成から計算した吸光係数を使って測定した。改善発現量を有するクローンの２００Ｒｕビオチン化ヒトＩＬ−１３ストレプトアビジンチップに対する結合についてＢｉａｃｏｒｅを使って解析し効力を評価した。これらのライブラリから選択された最も有効なクローンは、ＤＯＭ９−１１２−２１０−ＡＳＴＫＧＰＳ−ＤＯＭ１０−５３−５４６（フレームワーク残基２８〜３０が多様化されているライブラリからのもの）であった。これは、ＤＯＭ９−１１２−２１０−ＡＳＴＫＧＰＳ−ＤＯＭ１０−５３−４０９と類似の発現レベルであったが、ＩＬ−１３に対しては効力が改善されていた。次に、ＤＯＭ１０の一領域であるＤＯＭ１０−５３−５４６をｐＤＯＭ５ベクターに挿入しクローニングした。ＤＯＭ１０−５３−５４６のＤＮＡとアミノ酸配列を図２と図３にまとめる。
【０２３３】
ＤＯＭ１０−５３−５６７
ＤＯＭ１０−５３−５６７を、カニクイザルＩＬ−１３に対する改善効力を有するｄＡｂの選別の試みとして、ビオチン化したカニクイザル（ｃｙｎｏ）ＩＬ−１３のＤＯＭ１０−５３−４７４（このｄＡｂはWO2007085815に開示されている）のエラープローンライブラリに対して行った選別物から単離した。エラープローンＤＯＭ１０−５３−４７４のライブラリは、メーカーの説明書（カタログＮｏ．２００５５０）に従って、ＭｕｔａｚｙｍｅＴＭ ＤＮＡポリメラーゼを使用するＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＧｅｎｅＭｏｒｐｈ ＰＣＲ突然変異誘発キットを使って作成した。エラープローンＤＯＭ１０−５３−４７４のライブラリを使い１０ｎＭと５ｎＭのカニクイザルＩＬ−１３それぞれに対し２ラウンドの選別を行った。第２ラウンドの産物をｐＤＯＭ５ベクターに挿入し、前述の様に９６個の深底ウエルプレートにいれて大腸菌ＨＢ２１５１中で発現させた。プレートを遠心分離し、上澄みをHBSバッファーで１／５に薄め、Ｂｉａｃｏｒｅを使って２００Ｒｕ カニクイザルＩＬ−１３ストレプトアビジンチップで選別し、ＤＯＭ１０−５３−４７４に比べて改善されたカニクイザルＩＬ−１３への結合特性を持ったクローンを探した。ＤＯＭ１０−５３−５６７が、カニクイザルＩＬ−１３およびヒトＩＬ−１３の両方に対し改善された結合速度を有するクローンとして選択された。ＤＮＡとアミノ酸配列を図２と図３にまとめる。
【０２３４】
ＤＯＭ１０−５３−５６８
ＤＯＭ１０−５３−５６７の効力をさらに改善する試みとして、有力な抗ＩＬ−１３ｄＡｂのＤＯＭ１０−５３−３８６（このｄＡｂはWO2007085815で開示されている）のＣＤＲをＤＯＭ１０−５３−５６７に導入し、アセンブルＰＣＲを使ってＤＯＭ１０−５３−５６８を作成し、ｐＤＯＭ５ベクターに挿入しクローニングを行った。ＤＮＡとアミノ酸配列を図２と図３にまとめる。
【０２３５】
ＤＯＭ１０−５３−６１６
ＤＯＭ１０−５３−５４６の効力をさらに改善する試みとして、有力な抗ＩＬ−１３ｄＡｂであるＤＯＭ１０−５３−３８６のＣＤＲ２を導入しＤＯＭ１０−５３−５４６のＣＤＲ２と置換して、ＤＯＭ１０−５３−６１６作成した。これをｐＤＯＭ５ベクターに挿入しクローニングを行った。ＤＮＡとアミノ酸配列を図２と図３にまとめる。
【０２３６】
実施例２：配列解析
図４ａ、図４ｂ、図４ｃ及び図４ｄに示されるように、ＤＯＭ１０−５３−５４６は、ＤＯＭ１０−５３−４７４と比較して５位置にアミノ酸変化がある。それは、Ｎ末端からＣＤＲ１への位置２８（ＴからＶ）と３０（ＡからＰ）の２つのフレームワーク変異、および、ＣＤＲ２における位置５４（ＨからＫ）、５６（ＥからＧ）、５７（ＶからＫ）の３つの残基である。ＤＯＭ１０−５３−５６７はＤＯＭ１０−５３−４７４とは位置２８（ＴからＶ）で一つのアミノ酸が異なるのみである。
【０２３７】
ＤＯＭ１０−５３−５６８も同じ変異を持つが、さらに２つのアミノ酸変化がＣＤＲ２の位置５６（ＥからＫ）と５７（ＶからＩ）に追加される。ＤＯＭ１０−５３−６１６はＤＯＭ１０−５３−５６８と同じ３つの変異全部を持つが、さらに位置３０のアミノ酸が変化（ＡからＰ）している。位置２８のトレオニンからバリンへのアミノ酸変化は４つのｄＡｂ全部で共通である。ＤＯＭ１０−５３−４７４を含むこれら全てのｄＡｂは同じＣＤＲ１とＣＤＲ３を有する。全ナンバリングはＫａｂａｔによるものである。
【０２３８】
実施例３：ＤＯＭ１０ｄＡｂの発現と効力
以下に示すように、新ｄＡｂはＤＯＭ１０−５３−４７４より高い効力を有する。さらに、新ｄＡｂは、ヒトと非ヒト霊長類ＩＬ−１３との間の結合に対し種間交差反応性（および有効なＩＬ−１３種間中和特性）を有する。これにより、新ｄＡｂが、ＩＬ−１３媒介症状と疾患の治療および／または予防のための薬剤として、また薬剤開発のベースとして非常に有用になる。というのは、このような開発には、通常、非ヒト霊長類はヒトの良いモデルでありその後のヒトに対する研究の指針となるデータを与えてくれると信じられているので、ヒトでの試験に先立ち非ヒト霊長類種の最適候補の試験が必要となるからである。
【０２３９】
上記ＩＬ−１３ ＤＯＭ１０ｄＡｂの対照比較をするために、これらをｍｙｃタグ無しでｐＤＯＭ５ベクターに挿入し、Ｍａｃｈ１ケミカルコンピテントセル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に入れて、前述と同様にｏｖｅｒｎｉｇｈｔ ｅｘｐｒｅｓｓ ａｕｔｏ−ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ培地の５０ｍｌ培養物中で発現させた。前述のＳｔｒｅａｍｌｉｎｅ−ｐｒｏｔｅｉｎ Ａを使ってタンパク質を精製し、生成物をＳＤＳ ＰＡＧＥにより評価した。簡単に述べれば、ＳＤＳ ＰＡＧＥのために、５μｌのｄＡｂ、１５μｌのＨ２Ｏおよび６μｌのサンプルバッファを混合し、９０℃で２０分間インキュベートし、続いて、氷の上に２分置き、サンプルをＳＤＳ ＰＡＧＥゲルにローディングした。この結果、全ｄＡｂが純粋調製物であることがわかった。
【０２４０】
ＤＯＭ１０ｄＡｂの発現レベルを表１にまとめた。ＤＯＭ１０−５３−５４６とＤＯＭ１０−５３−６１６の発現レベルは、試験したＤＯＭ１０−５３−４７４や他の新ｄＡｂよりずっと良好であった。
【表１】
【０２４１】
精製ＤＯＭ１０ｄＡｂのヒトとカニクイザルＩＬ−１３に対するアフィニティはＢｉａｃｏｒｅ解析により評価した。解析は、ビオチン化ＩＬ−１３を使って行った。約１５０ＲＵのビオチン化ＩＬ−１３をストレプトアビジン（ＳＡ）チップ（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に被覆した。上表面を０．１Ｍグリシン（ｐＨ２）を使ってベースラインまで戻した。ｄＡｂをこの表面上を所定の濃度、５０μｌ／分の流量で流した。データをＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を使い解析して、１：１結合モデルにフィッティングした。Ｂｉａｃｏｒｅを２５℃で作動させた。ヒトおよびカニクイザルＩＬ−１３ｄＡｂに対するＫＤ値を表１にまとめた。新ｄＡｂ全てがヒトとカニクイザル両方のＩＬ−１３に対し優れた効力を示し、ＤＯＭ１０−５３−４７４よりずっと好結果であった。ＤＯＭ１０−５３−５６７およびＤＯＭ１０−５３−５６８がヒトとカニクイザル両方のＩＬ−１３に対し最良の効力を示した。
【０２４２】
また、ｄＡｂの試験を、ＤＯＭ１０のＥＬＩＳＡアッセイを使ってヒトＩＬ−１３に対する効力の評価のため、および細胞ベースのＨＥＫ Ｂｌｕｅ−ＳＴＡＴ６（ＨＥＫ ＳＴＡＴ）アッセイを使ってヒト、カニクイザル、アカゲザルＩＬ−１３に対する効力を評価するため行った。ＤＯＭ１０ ＥＬＩＳＡにより、ＤＯＭ１０ｄＡｂのＩＬ−１３に対する結合能力およびＩＬ−１３検出抗体に対する結合を抑制する能力を測定する。ＭＡＸＩＳＯＲＰＴＭプレート（高タンパク結合ＥＬＩＳＡプレート、Ｎｕｎｃ社、デンマーク）を２．５μｇ／ｍｌのコーティング抗体（Ｍｏｄｕｌｅ Ｓｅｔ、Ｂｅｎｄｅｒ ＭｅｄＳｙｓｔｅｍｓ社、ウイーン、オーストリア）で一晩コートして、次に、ＰＢＳに入れた０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０で１回洗浄し、０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ と０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０のＰＢＳ溶液を用い室温で２時間ブロッキングする。前に述べたように、プレートを２回洗浄した後、１５０ｐｇ／ｍｌのＩＬ−１３（ＧＳＫ社）をＤＯＭ１０ｄＡｂ（すなわち、抗ＩＬ−１３ｄＡｂ）希釈系列と混合し、１時間インキュベートする。プレートを２回洗浄した後、ＩＬ−１３を捕捉抗体に結合させ、ビオチンコンジュゲート検出抗体（Ｍｏｄｕｌｅ Ｓｅｔ、Ｂｅｎｄｅｒ ＭｅｄＳｙｓｔｅｍｓ社）、続いてペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（Ｍｏｄｕｌｅ Ｓｅｔ、Ｂｅｎｄｅｒ ＭｅｄＳｙｓｔｅｍｓ社）を使って検出する。最後に、プレートを３回洗浄し次いでＴＭＢ基質（ＫＰＬ社、ゲーサーズバーグ、米国）と共にインキュベートした後、ＨＣｌを添加して反応を停止し４５０ｎｍでの吸光度を読みとる。抗ＩＬ−１３ｄＡｂはＩＬ−１３結合を減少させ、その結果ＩＬ−１３のみの対照と比べ吸光度を減少させる。
【０２４３】
ＨＥＫ Ｂｌｕｅ−ＳＴＡＴ６アッセイは、ＨＥＫ Ｂｌｕｅ−ＳＴＡＴ６細胞中インビトロでヒトＩＬ−１３刺激アルカリフォスファターゼ産生を抑制するｄＡｂの能力を測定するものである。このアッセイは、ＳＴＡＴ６遺伝子を安定に形質移入したＨＥＫ２９３細胞、およびＳＥＡＰ（分泌胚性アルカリフォスファターゼ）レポーター遺伝子（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、サンジエゴ）を使用する。ＩＬ−１３で刺激すると、ＳＥＡＰが上澄み中に分泌され、これを比色法を使って測定する。可溶性ｄＡｂは、ＳＴＡＴ６経路経由によるＩＬ−１３のシグナル伝達を阻止する能力が試験される。
【０２４４】
簡潔に言えば、５ｘ１０４のＨＥＫ−Ｂｌｕｅ ＳＴＡＴ６細胞をＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｔｄ社、ペーズリー、英国）中で、組換えＩＬ１３１（ＧＳＫ社）と予め３７℃で１時間インキュベートしたｄＡｂと一緒に培養する。予備インキュベーションは等容量のｄＡｂと組換えＩＬ１３を使って実施した。この予備インキュベーション混合物は、次に、等容量のＨＥＫ−Ｂｌｕｅ ＳＴＡＴ６細胞に添加する。このようにして、このアッセイでのＩＬ１３の最終濃度は３μｇ／ｍｌになり、ｄＡｂを２００ｎＭ〜０．０５ｎＭの容量反応範囲で試験する。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートする。次いで、培養上澄みをＱｕａｎｔｉＢｌｕｅ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社）と混合し、６４０ｎｍで吸光度を読みとる。抗ＩＬ−１３ｄＡｂ活性は、ＳＴＡＴ６活性を減少させ、Ａ６４０値もＩＬ−１３刺激に比べ、相当する減少が生ずる。
【０２４５】
ＤＯＭ１０ｄＡｂのアッセイデータの結果を表１にまとめた。Ｂｉａｃｏｒｅでのデータと同じく、ＤＯＭ１０−５３−５６７はヒト、カニクイザル、アカゲザルＩＬ−１３に対して最良の効力を示した。ＤＯＭ１０−５３−５６８はＤＯＭ１０−５３−５６７と類似のＫＤ値を示したが、このアッセイでは効力は低かった。
【０２４６】
データが示すように、全新ｄＡｂは、ヒト、カニクイザルＩＬ−１３の間で交差反応性を示し、試験した全形式のＩＬ−１３に中和能を示した。全新ｄＡｂ（ＤＯＭ１０−５３−６１６を除いて）は、ヒト、カニクイザル、アカゲザルＩＬ−１３に対してＤＯＭ１０−５３−４７４よりもずっと大きな中和能力を示した。ＤＯＭ１０−５３−５６７はカニクイザルとアカゲザルＩＬ−１３に対してＤＯＭ１０−５３−４７４よりずっと効果の高い中和剤であったが、両者はヒトＩＬ−１３に対しては、大体同程度の中和能であった。
【０２４７】
実施例４：新ｄＡｂのプロテアーゼ安定性
同時係属中の特許出願PCT/GB2008/050399およびPCT/GB2008/050405に一般的に記載されている技術を用いて、新ｄＡｂのプロテアーゼ安定性を評価した。これらの出願の開示は、その全体が本明細書に組み込まれ、ｄＡｂのプロテアーゼ耐性試験法の詳細および本発明の組成物を提供し、また、本明細書における本発明のプロテアーゼ耐性ｄＡｂを使った方法の明確な開示を提供する。
【０２４８】
本発明のＤＯＭ１０クローンのトリプシン安定性を評価するために、０．３ｍｇ／ｍｌの精製タンパク質をシークエンシンググレードのトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用い、２５：１のｄＡｂ：トリプシン比でＰＢＳバッファに入れて消化した。反応は３０℃、反応時間１、２、４、および２４時間で実施し、プロテアーゼ阻害剤の混合物（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｔａｂｌｅｔ、Ｒｏｃｈｅ社）を添加して反応を停止した後、次の解析まで−２０℃で貯蔵した。
【０２４９】
消化したタンパク質は、ＨＢＳバッファで１／４００に希釈し、Ｂｉａｃｏｒｅの１５０Ｒｕビオチン化ヒトＩＬ−１３ストレプトアビジンチップ上を流速５０μｌ／ｍｌで流し、未消化ｄＡｂの量を評価した。チップ面は、０．１Ｍグリシン（ｐＨ２）を使って各注入サイクル間で元に戻した。各時点での消化されたｄＡｂの最大Ｒｕと未消化ｄＡｂの最大Ｒｕを比較して計算し未消化ｄＡｂの割合を求めた。結果を図５に示した。試験したｄＡｂの中で、ＤＯＭ１０−５３−５６７は、他のｄＡｂに比べトリプシン分解に対する耐性が高く、他よりＤＯＭ１０−５３−４７４に類似していた。ＤＯＭ１０−５３−５４６およびＤＯＭ１０−５３−６１６は他に比べトリプシン分解に対する耐性が低かった。プロテアーゼによる分解が少なくなる傾向があり、そのため長い半減期になると思われるため、我々は、トリプシン消化に対する耐性が生体内でのｄＡｂの安定性を示すと信じている。
【０２５０】
実施例５：ＤＳＣ（示差走査熱量測定）
ｄＡｂの熱安定性を示差走査熱量計（ＤＳＣ）を用いて測定した。試験は１ｍｇ／ｍｌのｄＡｂのＰＢＳバッファ溶液で行った。ｄＡｂを一晩ＰＢＳバッファ中へ透析した。ＰＢＳバッファは全サンプルで参照用として使われた。キャピラリーセルマイクロ熱量計ＶＰ−ＤＳＣ（Ｍｉｃｒｏｃａｌ社、マサッチューセッツ、米国）を使って、加熱速度１８０℃／時間でＤＳＣを行った。典型的な走査としては、通常、参照バッファとタンパク質サンプルの量法に対し、２５〜９０℃の範囲であった。参照とサンプル対毎に、キャピラリーセルをＤｅｃｏｎ（Ｆｉｓｈｅｒ−Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）の１％水溶液、続いてＰＢＳ溶液で洗浄した。データ出力結果をＯｒｉｇｉｎ ７ Ｍｉｃｒｏｃａｌソフトウエアで解析した。得られたサンプルのＤＳＣ出力から参照バッファのＤＳＣの出力を差し引いた。サンプルの正確な分子濃度をデータ解析ルーチンに入力し、融点（Ｔｍ）、エンタルピー（ΔＨ）、およびファントホッフエンタルピー（ΔＨｖ）値を得た。データを非2状態モデル（ｎｏｎ−２−ｓｔａｔｅ ｍｏｄｅｌ）でフィッティングした。結果は、表１にまとめた。ｄＡｂの融点は４９、９℃〜５５．５℃の範囲にある。ＤＯＭ１０−５３−５４６およびＤＯＭ１０−５３−５６７がそれぞれ５５．５℃と５４．５℃の最も高いＴｍを示した。試験したｄＡｂの中では、ＤＯＭ１０−５３−５６７は、最高の効力を有する利点のみならず、かなり高いＴｍも示し、ｄＡｂの相対的に高い安定性を示すものと見られる。ｄＡｂが有効性を最大化できる生体内の温度でより安定で、良好な有効期限を持つと思われるので、これは、メリットの多いことであろう。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗インターロイキンー１３（ＩＬ−１３）免疫グロブリン単一可変ドメインであって、ＤＯＭ１０−５３−４７４（配列番号１）と比較して１、２、３、４または５のアミノ酸変化を有することを除いては、ＤＯＭ１０−５３−４７４と同一のアミノ酸配列を含み、該単一可変ドメインがＫａｂａｔナンバリングよる位置２８にバリンを有し、該単一可変ドメインがＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）ではない、単一可変ドメイン。
【請求項２】
抗インターロイキンー１３（ＩＬ−１３）免疫グロブリン単一可変ドメインであって、ＤＯＭ１０−５３−４７４（配列番号１）と比較して１、２、３、４または５のアミノ酸変化を有することを除いては、ＤＯＭ１０−５３−４７４と同一のアミノ酸配列を含み、該単一可変ドメインが配列ＸＧＸ’Ｘ’’を有し、ここでＧはＫａｂａｔナンバリングよる位置５４にあり、
Ｘ＝Ｈ、またはＫであり；
Ｘ’＝Ｇ、またはＫであり；
Ｘ’’＝Ｋ、またはＩであり、
該単一可変ドメインがＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）ではない、単一可変ドメイン。
【請求項３】
可変ドメインがＫａｂａｔナンバリングよる位置２８にバリンを有する、請求項２記載の単一可変ドメイン。
【請求項４】
可変ドメインが、Ｋａｂａｔナンバリングによる位置３０、５３、５５または５６の一つまたは複数にアミノ酸変化（ＤＯＭ１０−５３−４７４（配列番号１）に対して）を有する、請求項１〜３のいずれかに記載の単一可変ドメイン。
【請求項５】
可変ドメインが、Ｋａｂａｔナンバリングによる位置３０にプロリンを有する、請求項１〜４のいずれかに記載の単一可変ドメイン。
【請求項６】
可変ドメインが、Ｋａｂａｔナンバリングによる位置５３にリシンを有する、請求項１〜５のいずれかに記載の単一可変ドメイン。
【請求項７】
可変ドメインが、Ｋａｂａｔナンバリングによる位置５５にグリシンまたはイソロイシンを有する、請求項１〜６のいずれかに記載の単一可変ドメイン。
【請求項８】
可変ドメインが、Ｋａｂａｔナンバリングによる位置５６にイソロイシンまたはリシンを有する、請求項１〜７のいずれかに記載の単一可変ドメイン。
【請求項９】
可変ドメインが、Ｋａｂａｔナンバリングによる位置５５にリシン、および位置５６にイソロイシンを有する、請求項１〜８のいずれかに記載の単一可変ドメイン。
【請求項１０】
可変ドメインがＤＯＭ１０−５３−５４６（配列番号２）、ＤＯＭ１０−５３−５６７（配列番号３）、またはＤＯＭ１０−５３−５６８（配列番号４）である抗インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項１１】
ＤＯＭ１０−５３−５４６（配列番号６）、ＤＯＭ１０−５３−５６７（配列番号７）、またはＤＯＭ１０−５３−５６８（配列番号８）のヌクレオチド配列によりコードされる抗インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項１２】
可変ドメインが、ヒト、カニクイザル、およびアカゲザルＩＬ−１３に特異的に結合する、請求項１〜１１のいずれかに記載の単一可変ドメイン。
【請求項１３】
可変ドメインが、標準的ＨＥＫ ＳＴＡＴアッセイにおいて、０．１〜２．０ｎＭのＥＣ５０値でヒトＩＬ−１３を中和する、請求項１〜１２のいずれかに記載の単一可変ドメイン。
【請求項１４】
可変ドメインが、標準的ＨＥＫ ＳＴＡＴアッセイにおいて、１〜２０ｎＭのＥＣ５０値でアカゲザルＩＬ−１３を中和する、請求項１〜１３のいずれかに記載の単一可変ドメイン。
【請求項１５】
可変ドメインが、標準的ＨＥＫ ＳＴＡＴアッセイにおいて、１〜２０ｎＭのＥＣ５０値でカニクイザルＩＬ−１３を中和する、請求項１〜１４のいずれかに記載の単一可変ドメイン。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれかに記載の抗ＩＬ−１３免疫グロブリン単一可変ドメインを含むインターロイキン−１３（ＩＬ−１３）アンタゴニスト。
【請求項１７】
アンタゴニストが、ＩＬ−１３との結合について、ＤＯＭ１０−５３−５４６（配列番号２）、ＤＯＭ１０−５３−５６７（配列番号３）、ＤＯＭ１０−５３−５６８（配列番号４）、またはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）と競合する、請求項１６に記載のアンタゴニスト。
【請求項１８】
肺送達のためＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）を含む、請求項１６もしくは１７に記載のアンタゴニスト、またはインターロイキン−１３（ＩＬ−１３）アンタゴニスト。
【請求項１９】
肺送達のための医薬品の製造における、ＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）を含む請求項１６もしくは１７に記載のアンタゴニスト、またはインターロイキン−１３（ＩＬ−１３）アンタゴニストの使用。
【請求項２０】
ヒトのＩＬ−１３媒介疾患の治療または予防のための請求項１６または１７に記載のアンタゴニスト。
【請求項２１】
ヒトのＩＬ−１３媒介疾患の治療または予防のための医薬品の製造における、請求項１６または１７に記載のアンタゴニストの使用。
【請求項２２】
ヒト患者のＩＬ−１３媒介疾患の治療および／または予防方法であって、ＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）を含む請求項１６もしくは１７に記載のアンタゴニスト、またはインターロイキン−１３（ＩＬ−１３）アンタゴニストを患者に投与することを含む方法。
【請求項２３】
ＩＬ−１３媒介疾患が呼吸器疾患である請求項２０に記載のアンタゴニスト、請求項２１に記載の使用、または請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ＩＬ−１３媒介疾患が下記の中から選択される請求項２３に記載のアンタゴニスト、使用、または方法：肺炎症、慢性閉塞性肺疾患、喘息、肺炎、過敏性肺炎、好酸球増加を伴う肺湿潤物、環境性肺疾患、肺炎、気管支拡張症、嚢胞性線維症、間質性肺疾患、原発性肺高血圧症、肺血栓塞栓症、胸膜障害、縦隔障害、隔膜障害、換気低下、過呼吸、睡眠時無呼吸、急性呼吸促迫症候群、中皮腫、肉腫、移植片拒絶、移植片対宿主病、肺癌、アレルギー性鼻炎、アレルギー、石綿症、アスペルギルス腫、アスペルギルス症、気管支拡張症、慢性気管支炎、肺気腫、好球性肺炎、特発性肺線維症、侵襲性肺炎球菌疾患、インフルエンザ、非結核性抗酸菌、胸水、塵肺症、ニューモシスチス症、肺炎、肺放線菌症、肺胞タンパク症、肺炭疽、肺水腫、肺塞栓症、肺炎症、肺ヒスチオサイトーシスX、肺高血圧、肺ノカルジア症、肺結核症、肺静脈閉塞性疾患、リウマチ性肺疾患、サルコイドーシスおよびウェゲナー肉芽腫症。
【請求項２５】
請求項１６、１７、１８、２０、２３もしくは２４に記載のアンタゴニスト、またはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）を含むインターロイキン−１３（ＩＬ−１３）アンタゴニストを含む肺送達デバイス。
【請求項２６】
デバイスが、吸引器、または鼻腔内投与デバイスである請求項２５に記載のデバイス。
【請求項２７】
請求項１から１５のいずれかに記載の可変ドメインを含む二重特異性リガンド。
【請求項２８】
請求項１から１５のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドをコードする単離されたまたは組換え型の核酸。
【請求項２９】
核酸が、ＤＯＭ１０−５３−５４６（配列番号６）、ＤＯＭ１０−５３−５６７（配列番号７）、ＤＯＭ１０−５３−５６８（配列番号８）、またはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号９）のヌクレオチド配列を含む請求項２８に記載の核酸。
【請求項３０】
単離されたまたは組換え型の核酸であって、ＤＯＭ１０−５３−５４６（配列番号６）、ＤＯＭ１０−５３−５６７（配列番号７）、ＤＯＭ１０−５３−５６８（配列番号８）、またはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号９）のヌクレオチド配列と少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸であり、ＩＬ−１３に特異的に結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドをコードしている核酸。
【請求項３１】
請求項２８、２９または３０に記載の核酸を含むベクター。
【請求項３２】
請求項２８、２９もしくは３０に記載の核酸、または請求項に３１のベクターを含む宿主細胞。
【請求項３３】
免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドを産生する方法であって、核酸またはベクターの発現に適する条件の下、請求項３２に記載の宿主細胞を保持し、それにより免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドが産生されることを含む方法。
【請求項３４】
ポリペプチドを単離すること、および、任意選択肢として、標準的ＨＥＫ ＳＴＡＴアッセイにおいてＩＬ−１３中和特性に関して単離されたポリペプチドよりも改善されたアフィニティおよび／またはＥＣ５０値を有する変異体または突然変異体を産生すること、をさらに含む請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
請求項の１から１５のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン、または請求項の１６、１７、１８、２０、２３もしくは２４のいずれかに記載のアンタゴニスト、および薬学的に許容可能な担体、賦形剤、または希釈剤を含む医薬組成物。
【請求項３６】
請求項の１から１５のいずれかに記載の単一可変ドメインを含む融合タンパク質。
【請求項３７】
請求項３６に記載の融合タンパク質をコードする単離されたまたは組換え型の核酸。
【請求項３８】
抗体定常領域を含む、請求項の１から１５のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン、または請求項の１６、１７、１８、２０、２３もしくは２４のいずれかに記載のアンタゴニスト、または請求項３６に記載の融合タンパク質。
【請求項３９】
抗体ＦＣを含み、任意選択肢として、そこではＦＣのＮ末端が可変ドメインのＣ末端と結合（直接結合も任意選択可能）している、請求項３８に記載の可変ドメイン、アンタゴニスト、または融合タンパク質。
【請求項４０】
可変ドメインがさらに半減期延長部分を含む、請求項１から１５のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン、または請求項１６、１７、１８、２０、２３もしくは２４のいずれかに記載のアンタゴニスト、または請求項３６に記載の融合タンパク質。
【請求項４１】
半減期延長部分がポリエチレングリコール部分、血清アルブミンもしくはその断片、トランスフェリン受容体もしくはそのトランスフェリン結合部、または生体内で半減期を延長するポリペプチドの結合部位を含む抗体もしくはは抗体フラグメントである請求項４０に記載の可変ドメイン、アンタゴニスト、または融合タンパク質。
【請求項４２】
半減期延長部分が、血清アルブミンまたは新生ＦＣ受容体の結合部位を含む抗体または抗体フラグメントである請求項４１に記載の変異体ドメイン、アンタゴニスト、または融合タンパク質。
【請求項４３】
半減期延長部分がｄＡｂ、抗体、または抗体フラグメントである請求項４０に記載の変異体ドメイン、アンタゴニスト、または融合タンパク質。
【請求項１】
抗インターロイキンー１３（ＩＬ−１３）免疫グロブリン単一可変ドメインであって、ＤＯＭ１０−５３−４７４（配列番号１）と比較して１、２、３、４または５のアミノ酸変化を有することを除いては、ＤＯＭ１０−５３−４７４と同一のアミノ酸配列を含み、該単一可変ドメインがＫａｂａｔナンバリングよる位置２８にバリンを有し、該単一可変ドメインがＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）ではない、単一可変ドメイン。
【請求項２】
抗インターロイキンー１３（ＩＬ−１３）免疫グロブリン単一可変ドメインであって、ＤＯＭ１０−５３−４７４（配列番号１）と比較して１、２、３、４または５のアミノ酸変化を有することを除いては、ＤＯＭ１０−５３−４７４と同一のアミノ酸配列を含み、該単一可変ドメインが配列ＸＧＸ’Ｘ’’を有し、ここでＧはＫａｂａｔナンバリングよる位置５４にあり、
Ｘ＝Ｈ、またはＫであり；
Ｘ’＝Ｇ、またはＫであり；
Ｘ’’＝Ｋ、またはＩであり、
該単一可変ドメインがＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）ではない、単一可変ドメイン。
【請求項３】
可変ドメインがＫａｂａｔナンバリングよる位置２８にバリンを有する、請求項２記載の単一可変ドメイン。
【請求項４】
可変ドメインが、Ｋａｂａｔナンバリングによる位置３０、５３、５５または５６の一つまたは複数にアミノ酸変化（ＤＯＭ１０−５３−４７４（配列番号１）に対して）を有する、請求項１〜３のいずれかに記載の単一可変ドメイン。
【請求項５】
可変ドメインが、Ｋａｂａｔナンバリングによる位置３０にプロリンを有する、請求項１〜４のいずれかに記載の単一可変ドメイン。
【請求項６】
可変ドメインが、Ｋａｂａｔナンバリングによる位置５３にリシンを有する、請求項１〜５のいずれかに記載の単一可変ドメイン。
【請求項７】
可変ドメインが、Ｋａｂａｔナンバリングによる位置５５にグリシンまたはイソロイシンを有する、請求項１〜６のいずれかに記載の単一可変ドメイン。
【請求項８】
可変ドメインが、Ｋａｂａｔナンバリングによる位置５６にイソロイシンまたはリシンを有する、請求項１〜７のいずれかに記載の単一可変ドメイン。
【請求項９】
可変ドメインが、Ｋａｂａｔナンバリングによる位置５５にリシン、および位置５６にイソロイシンを有する、請求項１〜８のいずれかに記載の単一可変ドメイン。
【請求項１０】
可変ドメインがＤＯＭ１０−５３−５４６（配列番号２）、ＤＯＭ１０−５３−５６７（配列番号３）、またはＤＯＭ１０−５３−５６８（配列番号４）である抗インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項１１】
ＤＯＭ１０−５３−５４６（配列番号６）、ＤＯＭ１０−５３−５６７（配列番号７）、またはＤＯＭ１０−５３−５６８（配列番号８）のヌクレオチド配列によりコードされる抗インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項１２】
可変ドメインが、ヒト、カニクイザル、およびアカゲザルＩＬ−１３に特異的に結合する、請求項１〜１１のいずれかに記載の単一可変ドメイン。
【請求項１３】
可変ドメインが、標準的ＨＥＫ ＳＴＡＴアッセイにおいて、０．１〜２．０ｎＭのＥＣ５０値でヒトＩＬ−１３を中和する、請求項１〜１２のいずれかに記載の単一可変ドメイン。
【請求項１４】
可変ドメインが、標準的ＨＥＫ ＳＴＡＴアッセイにおいて、１〜２０ｎＭのＥＣ５０値でアカゲザルＩＬ−１３を中和する、請求項１〜１３のいずれかに記載の単一可変ドメイン。
【請求項１５】
可変ドメインが、標準的ＨＥＫ ＳＴＡＴアッセイにおいて、１〜２０ｎＭのＥＣ５０値でカニクイザルＩＬ−１３を中和する、請求項１〜１４のいずれかに記載の単一可変ドメイン。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれかに記載の抗ＩＬ−１３免疫グロブリン単一可変ドメインを含むインターロイキン−１３（ＩＬ−１３）アンタゴニスト。
【請求項１７】
アンタゴニストが、ＩＬ−１３との結合について、ＤＯＭ１０−５３−５４６（配列番号２）、ＤＯＭ１０−５３−５６７（配列番号３）、ＤＯＭ１０−５３−５６８（配列番号４）、またはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）と競合する、請求項１６に記載のアンタゴニスト。
【請求項１８】
肺送達のためＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）を含む、請求項１６もしくは１７に記載のアンタゴニスト、またはインターロイキン−１３（ＩＬ−１３）アンタゴニスト。
【請求項１９】
肺送達のための医薬品の製造における、ＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）を含む請求項１６もしくは１７に記載のアンタゴニスト、またはインターロイキン−１３（ＩＬ−１３）アンタゴニストの使用。
【請求項２０】
ヒトのＩＬ−１３媒介疾患の治療または予防のための請求項１６または１７に記載のアンタゴニスト。
【請求項２１】
ヒトのＩＬ−１３媒介疾患の治療または予防のための医薬品の製造における、請求項１６または１７に記載のアンタゴニストの使用。
【請求項２２】
ヒト患者のＩＬ−１３媒介疾患の治療および／または予防方法であって、ＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）を含む請求項１６もしくは１７に記載のアンタゴニスト、またはインターロイキン−１３（ＩＬ−１３）アンタゴニストを患者に投与することを含む方法。
【請求項２３】
ＩＬ−１３媒介疾患が呼吸器疾患である請求項２０に記載のアンタゴニスト、請求項２１に記載の使用、または請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ＩＬ−１３媒介疾患が下記の中から選択される請求項２３に記載のアンタゴニスト、使用、または方法：肺炎症、慢性閉塞性肺疾患、喘息、肺炎、過敏性肺炎、好酸球増加を伴う肺湿潤物、環境性肺疾患、肺炎、気管支拡張症、嚢胞性線維症、間質性肺疾患、原発性肺高血圧症、肺血栓塞栓症、胸膜障害、縦隔障害、隔膜障害、換気低下、過呼吸、睡眠時無呼吸、急性呼吸促迫症候群、中皮腫、肉腫、移植片拒絶、移植片対宿主病、肺癌、アレルギー性鼻炎、アレルギー、石綿症、アスペルギルス腫、アスペルギルス症、気管支拡張症、慢性気管支炎、肺気腫、好球性肺炎、特発性肺線維症、侵襲性肺炎球菌疾患、インフルエンザ、非結核性抗酸菌、胸水、塵肺症、ニューモシスチス症、肺炎、肺放線菌症、肺胞タンパク症、肺炭疽、肺水腫、肺塞栓症、肺炎症、肺ヒスチオサイトーシスX、肺高血圧、肺ノカルジア症、肺結核症、肺静脈閉塞性疾患、リウマチ性肺疾患、サルコイドーシスおよびウェゲナー肉芽腫症。
【請求項２５】
請求項１６、１７、１８、２０、２３もしくは２４に記載のアンタゴニスト、またはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号５）を含むインターロイキン−１３（ＩＬ−１３）アンタゴニストを含む肺送達デバイス。
【請求項２６】
デバイスが、吸引器、または鼻腔内投与デバイスである請求項２５に記載のデバイス。
【請求項２７】
請求項１から１５のいずれかに記載の可変ドメインを含む二重特異性リガンド。
【請求項２８】
請求項１から１５のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドをコードする単離されたまたは組換え型の核酸。
【請求項２９】
核酸が、ＤＯＭ１０−５３−５４６（配列番号６）、ＤＯＭ１０−５３−５６７（配列番号７）、ＤＯＭ１０−５３−５６８（配列番号８）、またはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号９）のヌクレオチド配列を含む請求項２８に記載の核酸。
【請求項３０】
単離されたまたは組換え型の核酸であって、ＤＯＭ１０−５３−５４６（配列番号６）、ＤＯＭ１０−５３−５６７（配列番号７）、ＤＯＭ１０−５３−５６８（配列番号８）、またはＤＯＭ１０−５３−６１６（配列番号９）のヌクレオチド配列と少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸であり、ＩＬ−１３に特異的に結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドをコードしている核酸。
【請求項３１】
請求項２８、２９または３０に記載の核酸を含むベクター。
【請求項３２】
請求項２８、２９もしくは３０に記載の核酸、または請求項に３１のベクターを含む宿主細胞。
【請求項３３】
免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドを産生する方法であって、核酸またはベクターの発現に適する条件の下、請求項３２に記載の宿主細胞を保持し、それにより免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドが産生されることを含む方法。
【請求項３４】
ポリペプチドを単離すること、および、任意選択肢として、標準的ＨＥＫ ＳＴＡＴアッセイにおいてＩＬ−１３中和特性に関して単離されたポリペプチドよりも改善されたアフィニティおよび／またはＥＣ５０値を有する変異体または突然変異体を産生すること、をさらに含む請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
請求項の１から１５のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン、または請求項の１６、１７、１８、２０、２３もしくは２４のいずれかに記載のアンタゴニスト、および薬学的に許容可能な担体、賦形剤、または希釈剤を含む医薬組成物。
【請求項３６】
請求項の１から１５のいずれかに記載の単一可変ドメインを含む融合タンパク質。
【請求項３７】
請求項３６に記載の融合タンパク質をコードする単離されたまたは組換え型の核酸。
【請求項３８】
抗体定常領域を含む、請求項の１から１５のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン、または請求項の１６、１７、１８、２０、２３もしくは２４のいずれかに記載のアンタゴニスト、または請求項３６に記載の融合タンパク質。
【請求項３９】
抗体ＦＣを含み、任意選択肢として、そこではＦＣのＮ末端が可変ドメインのＣ末端と結合（直接結合も任意選択可能）している、請求項３８に記載の可変ドメイン、アンタゴニスト、または融合タンパク質。
【請求項４０】
可変ドメインがさらに半減期延長部分を含む、請求項１から１５のいずれかに記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン、または請求項１６、１７、１８、２０、２３もしくは２４のいずれかに記載のアンタゴニスト、または請求項３６に記載の融合タンパク質。
【請求項４１】
半減期延長部分がポリエチレングリコール部分、血清アルブミンもしくはその断片、トランスフェリン受容体もしくはそのトランスフェリン結合部、または生体内で半減期を延長するポリペプチドの結合部位を含む抗体もしくはは抗体フラグメントである請求項４０に記載の可変ドメイン、アンタゴニスト、または融合タンパク質。
【請求項４２】
半減期延長部分が、血清アルブミンまたは新生ＦＣ受容体の結合部位を含む抗体または抗体フラグメントである請求項４１に記載の変異体ドメイン、アンタゴニスト、または融合タンパク質。
【請求項４３】
半減期延長部分がｄＡｂ、抗体、または抗体フラグメントである請求項４０に記載の変異体ドメイン、アンタゴニスト、または融合タンパク質。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４ａ】
【図４ｂ】
【図４ｃ】
【図４ｄ】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４ａ】
【図４ｂ】
【図４ｃ】
【図４ｄ】
【図５】
【公表番号】特表２０１２−５０９６５８（Ｐ２０１２−５０９６５８Ａ）
【公表日】平成２４年４月２６日（２０１２．４．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５３６７４４（Ｐ２０１１−５３６７４４）
【出願日】平成２０年１２月１７日（２００８．１２．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０６７７８９
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０６０４８６
【国際公開日】平成２２年６月３日（２０１０．６．３）
【出願人】（３９７００９９３４）グラクソ グループ リミテッド (832)
【氏名又は名称原語表記】ＧＬＡＸＯ ＧＲＯＵＰ ＬＩＭＩＴＥＤ
【住所又は居所原語表記】Ｇｌａｘｏ Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｈｏｕｓｅ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ａｖｅｎｕｅ Ｇｒｅｅｎｆｏｒｄ，Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ ＵＢ６ ０ＮＮ，Ｇｒｅａｔ Ｂｒｉｔａｉｎ
【出願人】（５０２１９７０４６）ドマンティス リミテッド (47)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年４月２６日（２０１２．４．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１２月１７日（２００８．１２．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０６７７８９
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０６０４８６
【国際公開日】平成２２年６月３日（２０１０．６．３）
【出願人】（３９７００９９３４）グラクソ グループ リミテッド (832)
【氏名又は名称原語表記】ＧＬＡＸＯ ＧＲＯＵＰ ＬＩＭＩＴＥＤ
【住所又は居所原語表記】Ｇｌａｘｏ Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｈｏｕｓｅ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ａｖｅｎｕｅ Ｇｒｅｅｎｆｏｒｄ，Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ ＵＢ６ ０ＮＮ，Ｇｒｅａｔ Ｂｒｉｔａｉｎ
【出願人】（５０２１９７０４６）ドマンティス リミテッド (47)
【Ｆターム（参考）】
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