IL−15受容体αおよび/またはそれをコードする核酸分子を含むワクチンおよび免疫治療薬、ならびにそれを用いる方法
IL−15Ra又はその機能性断片をコードする単離された核酸分子とともに免疫原をコードする単離された1又は2以上の核酸分子を含む、組成物、組換え体ワクチン、弱毒化生病原体が開示される。そのような組成物を用いて、個体において免疫原に対する免疫応答を誘発する方法も開示される。例えば、免疫原をコードする、単離された核酸分子と、IL−15Rα又はその機能性断片をコードする、単離された核酸分子とを含む組成物が提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
(関連出願の相互参照)
本願は、2009年9月14日出願の米国仮出願第61/242,210号に基づく優先権を主張するものであり、当該出願の全内容は引用により本明細書の一部とする。
【0002】
本発明は、免疫原に対して個体を予防的および/または治療的に免疫化するための改善されたワクチン、改善された方法、ならびに改善された免疫治療薬組成物および改善された免疫治療の方法に関する。
【背景技術】
【0003】
免疫治療とは、望ましい治療効果をあげるために個体の免疫応答を調節することをいう。免疫治療薬とは、個体に投与されたとき、望ましくない免疫応答に関連する症状を最終的に軽減する、または望ましい免疫応答を高めることによって症状を最終的に緩和するのに十分な程度に個体の免疫系を調節する組成物をいう。いくつかの事例においては、免疫治療は、個体にワクチンを投与して、免疫応答を生じる免疫原にその個体をさらすワクチン接種プロトコールの一部である。そのような場合、免疫治療によって、特定の状態、感染症、または疾病を治療または予防するために望ましい免疫応答が増加され、および/またはそのような免疫応答の一部(例えば、細胞性免疫または体液性免疫)が選択的に増強される。
【0004】
ワクチンプロトコールは、改善された免疫応答を誘発するように個体の免疫応答を調節する薬剤を与えることにより改善され得る。個体にワクチンを投与して、個体の免疫応答の対象となる免疫原にその個体をさらすワクチン接種プロトコールのなかには、特定の状態、感染症、または疾病を治療または予防するために望ましい免疫応答を増加させ、および/またはそのような免疫応答の一部(例えば、細胞性免疫または体液性免疫)を選択的に増強させる薬剤を用いるものがある。
【0005】
ワクチンは、アレルゲン、病原体抗原、またはヒトの疾病に関与する細胞に関連する抗原などの標的の抗原に対して個体を免疫化するのに有用である。ヒトの疾病に関与する細胞に関連する抗原には、癌関連腫瘍抗原や自己免疫疾患に関与する細胞に関連する抗原等がある。
【0006】
そのようなワクチンの設計において、ワクチン接種された個体の細胞で標的の抗原を作り出すワクチンが、免疫系の細胞性免疫を誘発するのに効果的であることが認識されてきた。具体的には、弱毒化生ワクチン、非病原性ベクターを用いた組換え体ワクチン、DNAワクチンのそれぞれは、ワクチン接種された個体の細胞での抗原の産生をもたらし、これにより免疫系の細胞性免疫が誘発される。一方、死菌即ち不活化ワクチン、タンパク質のみを含むサブユニットワクチンは、効果的な体液性応答を誘導するが、良好な細胞性の免疫応答は誘発しない。
【0007】
細胞性免疫応答は、病原体感染に対する防御を与えるため、そして病原体感染、癌、または自己免疫疾患の治療のための効果的な免疫介在性療法に必要となることが多い。従って、弱毒化生ワクチン、非病原性ベクターを用いた組換え体ワクチン、DNAワクチンのような、ワクチン接種された個体の細胞で標的の抗原を作り出すワクチンが、多くの場合好ましい。
【0008】
DNAワクチン技術による強力なCD8+T細胞の応答の発生は、DNAワクチンの開発者が求めてきた目標である。HIVモデル並びに他のウイルス感染において,ヒトモデル(Koupら,1994(非特許文献1);Caoら,1995(非特許文献2);、Museyら,1997(非特許文献3);Oggら,1998(非特許文献4);Bettsら,1999(非特許文献5))、および非ヒト霊長類モデル(Jinら,1999(非特許文献6);Schmitzら,1999(非特許文献7);Barouchら,2000(非特許文献8);Amaraら,2001(非特許文献9);Shiverら,2002(非特許文献10))の両方において、CD8+T細胞がウイルス複製コントロールに関係しているとの報告が行われている。
【0009】
DNAワクチン技術とともに、送達技術の改善、構造設計の強化、異種プライムブースト法、分子アジュバントの使用を含む多くの異なる戦略が用いられてきた。ケモカインやサイトカイン等の分子アジュバントをワクチン戦略に組み入れて、免疫応答を細胞性または体液性免疫に向けて傾斜させることができる。IL−12およびIL−15などのサイトカインは、マウスモデルや非ヒト霊長類モデルの両方で免疫応答を強化するのに効果的であった(MorrowおよびWeiner,2008(非特許文献11))。
【0010】
インターロイキン15(IL−15)は、IL−2にも利用されている共通のβ、γ鎖を通してシグナル伝達することからCD8+T細胞の生成と維持に一定の役割を果たすことがわかった。またIL−15は、ナチュラルキラー細胞およびCD8+T細胞のプライミングの間にIL−15Rαを介して抗原提示細胞の表面上でトランス提示されることがわかった(Duboisら,2002(非特許文献12);Kokaら,2004(非特許文献13);Lucasら,2007(非特許文献14);Satoら,2007(非特許文献15))。最近、IL−15Rαは、IL−15分泌の調節においてある役割を果たしていることが分かった(Duitmanら,2008(非特許文献16))。この細胞表面複合体は、IL−15がメモリCD8+T細胞上のβγ受容体を通してシグナル伝達できるようにし、これらの細胞の細胞分裂や生存を促進していると考えられる(Lodolceら,1998(非特許文献17);Kennedyら,2000(非特許文献18);Lodolceら,2001(非特許文献19);Burkettら,2003(非特許文献20);Burkettら,2004(非特許文献21);Sandauら,2004(非特許文献22);Schlunsら,2004a(非特許文献23);Schlunsら,2004b(非特許文献24))。IL−15およびIL−15Rαは合わせて1つの複合体として、それぞれの分子単体と比べて高い安定度と分泌を示す(Bergamaschiら,2008(非特許文献25))。
【0011】
ワクチン接種モデルにおけるその利用については、プラスミドにコードされたIL−15をHIV−1ワクチンアジュバントとして用いることによって、マウスにおける細胞障害性メモリCD8+T細胞の応答を増強することが以前に報告されている(Ohら,2003(非特許文献26);Kutzlerら,2005(非特許文献27);Zhangら,2006(非特許文献28);Calarotaら,2008(非特許文献29);Liら,2008(非特許文献30))。アカゲザルでの研究により、IL−15は、CD4+T細胞のエフェクタ機能を高め(Pickerら,2006(非特許文献31))、エフェクタCD4+およびCD8+T細胞の両方で二重IFN−γ/TNF応答をレスキューする能力(Halwaniら,2008(非特許文献32))も有することが分かった。重要な点として、アカゲザルにSIV/HIV抗原とともにpIL−15を加えると、SHIV89.6pの投与の後の防御が増強された(Boyerら,2007(非特許文献33))ことが挙げられる。
【0012】
そのようなワクチンは、多くの場合、病原体感染やヒトの疾病に対して予防的または治療的に個体を免疫化するために効果的であるが、より改善されたワクチンの必要性が存在する。また、より強化された免疫応答を発生させる組成物や方法の必要性も存在する。さらに、DNAワクチンに対する免疫応答を増強する新規なアジュバントなど、効果的なDNAワクチンを可能にするべく戦略を改善する必要性も依然として存在する。
【0013】
同様に、いくつかの免疫治療薬は患者の免疫応答を調節するのに有用であるが、より改善された免疫治療薬組成物や免疫治療方法の必要性も依然として存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0014】
【非特許文献1】KOUP,R.A.,SAFRIT,J.T.,CAO,Y.,ANDREWS,C.A.,MCLEOD,G.,BORKOWSKY,W.,FARTHING,C.,およびHO,D.D.(1994).Temporal association of cellular immune responses with the initial control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 syndrome. Journal of virology 68, 4650−4655.
【非特許文献2】CAO,Y.,QIN,L.,ZHANG,L.,SAFRIT,J.,およびHO,D.D.(1995).Virologic and immunologic characterization of long−term survivors of human immunodeficiency virus type 1 infection. The New England journal of medicine 332, 201−208.
【非特許文献3】MUSEY,L.,HUGHES,J.,SCHACKER,T.,SHEA,T.,COREY,L.,およびMCELRATH,M.J.(1997).Cytotoxic−T−cell responses, viral load, and disease progression in early human immunodeficiency virus type 1 infection. The New England journal of medicine 337, 1267−1274.
【非特許文献4】OGG,G.S.,JIN,X.,BONHOEFFER,S.,DUNBAR,P.R.,NOWAK,M.A.,MONARD,S.,SEGAL,J.P.,CAO,Y.,ROWLAND−JONES,S.L.,CERUNDOLO,V.,HURLEY,A.,MARKOWITZ,M.,HO,D.D.,NIXON,D.F.,およびMCMICHAEL,A.J.(1998).Quantitation of HIV−1−specific cytotoxic T lymphocytes and plasma load of viral RNA. Science (New York, N.Y 279, 2103−2106.
【非特許文献5】BETTS,M.R.,KROWKA,J.F.,KEPLER,T.B.,DAVIDIAN,M.,CHRISTOPHERSON,C.,KWOK,S.,LOUIE,L.,ERON,J.,SHEPPARD,H.,およびFRELINGER,J.A.(1999).Human immunodeficiency virus type 1−specific cytotoxic T lymphocyte activity is inversely correlated with HIV type 1 viral load in HIV type 1−infected long−term survivors. AIDS research and human retroviruses 15, 1219−1228.
【非特許文献6】JIN,X.,BAUER,D.E.,TUTTLETON,S.E.,LEWIN,S.,GETTIE,A.,BLANCHARD,J.,IRWIN,C.E.,SAFRIT,J.T.,MITTLER,J.,WEINBERGER,L.,KOSTRIKIS,L.G.,ZHANG,L.,PERELSON,A.S.,およびHO,D.D.(1999).Dramatic rise in plasma viremia after CD8(+) T cell depletion in simian immunodeficiency virus−infected macaques. The Journal of experimental medicine 189, 991−998.
【非特許文献7】SCHMITZ,J.E.,KURODA,M.J.,SANTRA,S.,SASSEVILLE,V.G.,SIMON,M.A.,LIFTON,M.A.,RACZ,P.,TENNER−RACZ,K.,DALESANDRO,M.,SCALLON,B.J.,GHRAYEB,J.,FORMAN,M.A.,MONTEFIORI,D.C.,RIEBER,E.P.,LETVIN,N.L.,およびREIMANN,K.A.(1999).Control of viremia in simian immunodeficiency virus infection by CD8+ lymphocytes. Science (New York, N.Y 283, 857−860.
【非特許文献8】BAROUCH,D.H.,SANTRA,S.,SCHMITZ,J.E.,KURODA,M.J.,FU,T.M.,WAGNER,W.,BILSKA,M.,CRAIU,A.,ZHENG,X.X.,KRIVULKA,G.R.,BEAUDRY,K.,LIFTON,M.A.,NICKERSON,C.E.,TRIGONA,W.L.,PUNT,K.,FREED,D.C.,GUAN,L.,DUBEY,S.,CASIMIRO,D.,SIMON,A.,DAVIES,M.E.,CHASTAIN,M.,STROM,T.B.,GELMAN,R.S.,MONTEFIORI,D.C.,LEWIS,M.G.,EMINI,E.A.,SHIVER,J.W.,およびLETVIN,N.L.(2000).Control of viremia and prevention of clinical AIDS in rhesus monkeys by cytokine−augmented DNA vaccination. Science (New York, N.Y 290, 486−492.
【非特許文献9】AMARA,R.R.,VILLINGER,F.,ALTMAN,J.D.,LYDY,S.L.,O’NEIL,S.P.,STAPRANS,S.I.,MONTEFIORI,D.C.,XU,Y.,HERNDON,J.G.,WYATT,L.S.,CANDIDO,M.A.,KOZYR,N.L.,EARL,P.L.,SMITH,J.M.,MA,H.L.,GRIMM,B.D.,HULSEY,M.L.,MILLER,J.,MCCLURE,H.M.,MCNICHOLL,J.M.,MOSS,B.,およびROBINSON,H.L.(2001).Control of a mucosal challenge and prevention of AIDS by a multiprotein DNA/MVA vaccine. Science(New York,N.Y 292,69−74.
【非特許文献10】SHIVER,J.W.,FU,T.M.,CHEN,L.,CASIMIRO,D.R.,DAVIES,M.E.,EVANS,R.K.,ZHANG,Z.Q.,SIMON,A.J.,TRIGONA,W.L.,DUBEY,S.A.,HUANG,L.,HARRIS,V.A.,LONG,R.S.,LIANG,X.,HANDT,L.,SCHLEIF,W.A.,ZHU,L.,FREED,D.C.,PERSAUD,N.V.,GUAN,L.,PUNT,K.S.,TANG,A.,CHEN,M.,WILSON,K.A.,COLLINS,K.B.,HEIDECKER,G.J.,FERNANDEZ,V.R.,PERRY,H.C.,JOYCE,J.G.,GRIMM,K.M.,COOK,J.C.,KELLER,P.M.,KRESOCK,D.S.,MACH,H.,TROUTMAN,R.D.,ISOPI,L.A.,WILLIAMS,D.M.,XU,Z.,BOHANNON,K.E.,VOLKIN,D.B.,MONTEFIORI,D.C.,MIURA,A.,KRIVULKA,G.R.,LIFTON,M.A.,KURODA,M.J.,SCHMITZ,J.E.,LETVIN,N.L.,CAULFIELD,M.J.,BETT,A.J.,YOUIL,R.,KASLOW,D.C.,およびEMINI,E.A.(2002).Replication−incompetent adenoviral vaccine vector elicits effective anti−immunodeficiency−virus immunity. Nature 415, 331−335.
【非特許文献11】MORROW,M.P.,およびWEINER,D.B.(2008).Cytokines as adjuvants for improving anti−HIV responses. AIDS (London, England) 22, 333−338.
【非特許文献12】DUBOIS,S.,MARINER,J.,WALDMANN,T.A.,およびTAGAYA,Y.(2002).IL−15Ralpha recycles and presents IL−15 In trans to neighboring cells. Immunity 17, 537−547.
【非特許文献13】KOKA,R.,BURKETT,P.,CHIEN,M.,CHAI,S.,BOONE,D.L.,およびMA,A.(2004).Cutting edge: murine dendritic cells require IL−15R alpha to prime NK cells. J Immunol 173, 3594−3598.
【非特許文献14】LUCAS,M.,SCHACHTERLE,W.,OBERLE,K.,AICHELE,P.,およびDIEFENBACH,A.(2007).Dendritic cells prime natural killer cells by trans−presenting interleukin 15. Immunity 26, 503−517.
【非特許文献15】SATO,N.,PATEL,H.J.,WALDMANN,T.A.,およびTAGAYA,Y.(2007).The IL−15/IL−15Ralpha on cell surfaces enables sustained IL−15 activity and contributes to the long survival of CD8 memory T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 104, 588−593.
【非特許文献16】DUITMAN,E.H.,ORINSKA,Z.,BULANOVA,E.,PAUS,R.,およびBULFONE−PAUS,S.(2008).How a cytokine is chaperoned through the secretory pathway by complexing with its own receptor: lessons from IL−15/IL−15R{alpha}. Molecular and cellular biology.
【非特許文献17】LODOLCE,J.P.,BOONE,D.L.,CHAI,S.,SWAIN,R.E.,DASSOPOULOS,T.,TRETTIN,S.,およびMA,A.(1998).IL−15 receptor maintains lymphoid homeostasis by supporting lymphocyte homing and proliferation. Immunity 9, 669−676.
【非特許文献18】KENNEDY,M.K.,GLACCUM,M.,BROWN,S.N.,BUTZ,E.A.,VINEY,J.L.,EMBERS,M.,MATSUKI,N.,CHARRIER,K.,SEDGER,L.,WILLIS,C.R.,BRASEL,K.,MORRISSEY,P.J.,STOCKING,K.,SCHUH,J.C.,JOYCE,S.,およびPESCHON,J.J.(2000).Reversible defects in natural killer and memory CD8 T cell lineages in interleukin 15−deficient mice. The Journal of experimental medicine 191, 771−780.
【非特許文献19】LODOLCE,J.P.,BURKETT,P.R.,BOONE,D.L.,CHIEN,M.,およびMA,A.(2001).T cell−independent interleukin 15Ralpha signals are required for bystander proliferation. The Journal of experimental medicine 194, 1187−1194.
【非特許文献20】BURKETT,P.R.,KOKA,R.,CHIEN,M.,CHAI,S.,CHAN,F.,MA,A.,およびBOONE,D.L.(2003).IL−15R alpha expression on CD8+ T cells is dispensable for T cell memory. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 100, 4724−4729.
【非特許文献21】BURKETT,P.R.,KOKA,R.,CHIEN,M.,CHAI,S.,BOONE,D.L.,およびMA,A.(2004).Coordinate expression and trans presentation of interleukin (IL)−15Ralpha and IL−15 supports natural killer cell and memory CD8+ T cell homeostasis. The Journal of experimental medicine 200, 825−834.
【非特許文献22】SANDAU,M.M.,SCHLUNS,K.S.,LEFRANCOIS,L.,およびJAMESON,S.C.(2004).Cutting edge: transpresentation of IL−15 by bone marrow−derived cells necessitates expression of IL−15 and IL−15R alpha by the same cells. J Immunol 173, 6537−6541.
【非特許文献23】SCHLUNS,K.S.,KLONOWSKI,K.D.,およびLEFRANCOIS,L.(2004a).Transregulation of memory CD8 T−cell proliferation by IL−15Ralpha+ bone marrow−derived cells. Blood 103, 988−994.
【非特許文献24】SCHLUNS,K.S.,NOWAK,E.C.,CABRERA−HERNANDEZ,A.,PUDDINGTON,L.,LEFRANCOIS,L.,およびAGUILA,H.L.(2004b).Distinct cell types control lymphoid subset development by means of IL−15 and IL−15 receptor alpha expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 101, 5616−5621.
【非特許文献25】BERGAMASCHI,C.,ROSATI,M.,JALAH,R.,VALENTIN,A.,KULKARNI,V.,ALICEA,C.,ZHANG,G.M.,PATEL,V.,FELBER,B.K.,およびPAVLAKIS,G.N.(2008).Intracellular interaction of interleukin−15 with its receptor alpha during production leads to mutual stabilization and increased bioactivity. The Journal of biological chemistry 283, 4189−4199.
【非特許文献26】OH,S.,BERZOFSKY,J.A.,BURKE,D.S.,WALDMANN,T.A.,およびPERERA,L.P.(2003).Coadministration of HIV vaccine vectors with vaccinia viruses expressing IL−15 but not IL−2 induces long−lasting cellular immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 100, 3392−3397.
【非特許文献27】KUTZLER,M.A.,ROBINSON,T.M.,CHATTERGOON,M.A.,CHOO,D.K.,CHOO,A.Y.,CHOE,P.Y.,RAMANATHAN,M.P.,PARKINSON,R.,KUDCHODKAR,S.,TAMURA,Y.,SIDHU,M.,ROOPCHAND,V.,KIM,J.J.,PAVLAKIS,G.N.,FELBER,B.K.,WALDMANN,T.A.,BOYER,J.D.,およびWEINER,D.B.(2005).Coimmunization with an optimized IL−15 plasmid results in enhanced function and longevity of CD8 T cells that are partially independent of CD4 T cell help. J Immunol 175, 112−123.
【非特許文献28】ZHANG,W.,DONG,S.F.,SUN,S.H.,WANG,Y.,LI,G.D.,およびQU,D.(2006).Coimmunization with IL−15 plasmid enhances the longevity of CD8 T cells induced by DNA encoding hepatitis B virus core antigen. World J Gastroenterol 12, 4727−4735.
【非特許文献29】CALAROTA,S.A.,DAI,A.,TROCIO,J.N.,WEINER,D.B.,LORI,F.,およびLISZIEWICZ,J.(2008).IL−15 as memory T−cell adjuvant for topical HIV−1 DermaVir vaccine. Vaccine.
【非特許文献30】LI,W.,LI,S.,HU,Y.,TANG,B.,CUI,L.,およびHE,W.(2008).Efficient augmentation of a long−lasting immune responses in HIV−1 gag DNA vaccination by IL−15 plasmid boosting. Vaccine 26, 3282−3290.
【非特許文献31】PICKER,L.J.,REED−INDERBITZIN,E.F.,HAGEN,S.I.,EDGAR,J.B.,HANSEN,S.G.,LEGASSE,A.,PLANER,S.,PIATAK,M.,JR.,LIFSON,J.D.,MAINO,V.C.,AXTHELM,M.K.,およびVILLINGER,F.(2006).IL−15 induces CD4 effector memory T cell production and tissue emigration in nonhuman primates. The Journal of clinical investigation 116, 1514−1524.
【非特許文献32】HALWANI,R.,BOYER,J.D.,YASSINE−DIAB,B.,HADDAD,E.K.,ROBINSON,T.M.,KUMAR,S.,PARKINSON,R.,WU,L.,SIDHU,M.K.,PHILLIPSON−WEINER,R.,PAVLAKIS,G.N.,FELBER,B.K.,LEWIS,M.G.,SHEN,A.,SILICIANO,R.F.,WEINER,D.B.,およびSEKALY,R.P.(2008).Therapeutic vaccination with simian immunodeficiency virus (SIV)−DNA+IL−12 or IL−15 induces distinct CD8 memory subsets in SIV−infected macaques. J Immunol 180, 7969−7979.
【非特許文献33】BOYER,J.D.,ROBINSON,T.M.,KUTZLER,M.A.,VANSANT,G.,HOKEY,D.A.,KUMAR,S.,PARKINSON,R.,WU,L.,SIDHU,M.K.,PAVLAKIS,G.N.,FELBER,B.K.,BROWN,C.,SILVERA,P.,LEWIS,M.G.,MONFORTE,J.,WALDMANN,T.A.,ELDRIDGE,J.,およびWEINER,D.B.(2007).Protection against simian/human immunodeficiency virus (SHIV) 89.6P in macaques after coimmunization with SHIV antigen and IL−15 plasmid. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 104, 18648−18653.
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0015】
本発明は、IL−15Raの免疫調節機能および/またはIL−15の結合機能および/またはIL−15受容体複合体の他のサブユニットへの結合機能を有するタンパク質をコードするSEQ ID NO:1またはその断片を含む核酸分子に関する。
【0016】
本発明は、免疫原をコードする単離された核酸分子を、IL−15Raまたはその機能性断片をコードする単離された核酸分子とともに含む組成物に関する。
【0017】
本発明はさらに、免疫原およびIL−15Raまたはその機能性断片の両方をコードする単離された核酸分子を含む組成物に関する。
【0018】
本発明は、免疫原をコードする単離された核酸分子を、IL−15Raまたはその機能性断片をコードする単離された核酸分子とともに含む注入可能な医薬組成物に関する。
【0019】
本発明はさらに、免疫原およびIL−Raまたはその機能性断片の両方をコードする単離された核酸分子を含む注入可能な医薬組成物に関する。
【0020】
本発明のいくつかの側面では、前記免疫原は病原体抗原、癌関連抗原、または自己免疫疾患に関連する細胞からの抗原である。いくつかの側面では、前記病原体は、慢性感染症を引き起こす病原体である。
【0021】
本発明はさらに、免疫原をコードする単離された核酸分子を、IL−15Raまたはその機能性断片をコードする単離された核酸分子とともに含む組成物を個体に対して投与する工程を含む、個体において免疫原に対する免疫応答を誘発する方法に関する。
【0022】
本発明はさらに、免疫原とIL−15Raまたはその機能性断片とをコードする核酸分子を個体に対して投与する工程を含む、個体において免疫原に対する免疫応答を誘発する方法に関する。
【0023】
本発明はさらに、調節エレメントに機能可能に結合された免疫原をコードするヌクレオチド配列、IL−15Raまたはその機能性断片をコードするヌクレオチド配列を含む組換え体ワクチン、およびそのような組換え体ワクチンを個体に対して投与する工程を含む、個体において免疫原に対する免疫応答を誘発する方法に関する。
【0024】
本発明はさらに、IL−15Raまたはその機能性断片をコードするヌクレオチド配列を含む弱毒化生ワクチン、およびその弱毒化生ワクチンを個体に対して投与する工程を含む、個体において病原体に対する免疫応答を誘発する方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【0025】
【図1A】図1A〜図1Eは、IL−15Rαモノクローナル抗体の産生に関連する結果と情報を示す図である。図1Aは、12.0乃至0.16μgタンパク質からの2倍希釈溶液における組換え体ヒトIL−15Rαタンパク質のクマシー染色を示す。図1Bは、市販の抗ヒトIL−15Rα抗体で、直接法のELISAで組換え体IL−15Rαタンパク質を検出できることを示す。図1Cは、BALB/cマウスにおける抗ヒトIL−15Rαモノクロナール抗体の産生のための免疫化スケジュールを示す。図1Dは、ELISAにより、クローンKK1.23からのハイブリドーマ上清が、組換え体IL−15Rαタンパク質に対する高力価抗体を有することを示す。図1Eは、精製されたモノクローナル抗体KK1.23がELISAにて組換え体IL−15Rαに結合することを示し、ウエスタンブロット法により結合が特異的であることを示す。
【図1B】図1A〜図1Eは、IL−15Rαモノクローナル抗体の産生に関連する結果と情報を示す図である。図1Aは、12.0乃至0.16μgタンパク質からの2倍希釈溶液における組換え体ヒトIL−15Rαタンパク質のクマシー染色を示す。図1Bは、市販の抗ヒトIL−15Rα抗体で、直接法のELISAで組換え体IL−15Rαタンパク質を検出できることを示す。図1Cは、BALB/cマウスにおける抗ヒトIL−15Rαモノクロナール抗体の産生のための免疫化スケジュールを示す。図1Dは、ELISAにより、クローンKK1.23からのハイブリドーマ上清が、組換え体IL−15Rαタンパク質に対する高力価抗体を有することを示す。図1Eは、精製されたモノクローナル抗体KK1.23がELISAにて組換え体IL−15Rαに結合することを示し、ウエスタンブロット法により結合が特異的であることを示す。
【図1C】図1A〜図1Eは、IL−15Rαモノクローナル抗体の産生に関連する結果と情報を示す図である。図1Aは、12.0乃至0.16μgタンパク質からの2倍希釈溶液における組換え体ヒトIL−15Rαタンパク質のクマシー染色を示す。図1Bは、市販の抗ヒトIL−15Rα抗体で、直接法のELISAで組換え体IL−15Rαタンパク質を検出できることを示す。図1Cは、BALB/cマウスにおける抗ヒトIL−15Rαモノクロナール抗体の産生のための免疫化スケジュールを示す。図1Dは、ELISAにより、クローンKK1.23からのハイブリドーマ上清が、組換え体IL−15Rαタンパク質に対する高力価抗体を有することを示す。図1Eは、精製されたモノクローナル抗体KK1.23がELISAにて組換え体IL−15Rαに結合することを示し、ウエスタンブロット法により結合が特異的であることを示す。
【図1D】図1A〜図1Eは、IL−15Rαモノクローナル抗体の産生に関連する結果と情報を示す図である。図1Aは、12.0乃至0.16μgタンパク質からの2倍希釈溶液における組換え体ヒトIL−15Rαタンパク質のクマシー染色を示す。図1Bは、市販の抗ヒトIL−15Rα抗体で、直接法のELISAで組換え体IL−15Rαタンパク質を検出できることを示す。図1Cは、BALB/cマウスにおける抗ヒトIL−15Rαモノクロナール抗体の産生のための免疫化スケジュールを示す。図1Dは、ELISAにより、クローンKK1.23からのハイブリドーマ上清が、組換え体IL−15Rαタンパク質に対する高力価抗体を有することを示す。図1Eは、精製されたモノクローナル抗体KK1.23がELISAにて組換え体IL−15Rαに結合することを示し、ウエスタンブロット法により結合が特異的であることを示す。
【図1E】図1A〜図1Eは、IL−15Rαモノクローナル抗体の産生に関連する結果と情報を示す図である。図1Aは、12.0乃至0.16μgタンパク質からの2倍希釈溶液における組換え体ヒトIL−15Rαタンパク質のクマシー染色を示す。図1Bは、市販の抗ヒトIL−15Rα抗体で、直接法のELISAで組換え体IL−15Rαタンパク質を検出できることを示す。図1Cは、BALB/cマウスにおける抗ヒトIL−15Rαモノクロナール抗体の産生のための免疫化スケジュールを示す。図1Dは、ELISAにより、クローンKK1.23からのハイブリドーマ上清が、組換え体IL−15Rαタンパク質に対する高力価抗体を有することを示す。図1Eは、精製されたモノクローナル抗体KK1.23がELISAにて組換え体IL−15Rαに結合することを示し、ウエスタンブロット法により結合が特異的であることを示す。
【図2A】図2A〜図2Gは、IL−15RαのDNAのプラスミドの構築と発現に関連する図である。図2Aは、ヒトIL−15RαのcDNAが、いかにしてpVAX1発現ベクターに挿入されたかを示す。図2Bおよび図2Cは、R&D社のモノクローナル抗ヒトIL−15Rα抗体およびKK1.23モノクローナル抗ヒトIL−15Rα抗体を用いた放射性元素を利用するin vitro翻訳により検出されたように、プラスミドのIL−15Rαが適切なサイズのタンパク質(〜30kDa)を発現していることを示す。図2Dは、モノクローナルKK1.23抗体(IgG1アイソタイプ)が、トランスフェクトされていないHeLa細胞には結合しないことを示す(20×)。図2Eは、マウスのIgG1アイソタイプの対照で(緑に)染色した、pTRACER−IL−15Rαトランスフェクト細胞を示す(20×)。図2Fおよび図2Gは、KK1.23抗ヒトIL−15Rα抗体(赤)が、pIL−15Rα−pTRACERトランスフェクト細胞に結合することを20×および60×でそれぞれ示す。
【図2B】図2A〜図2Gは、IL−15RαのDNAのプラスミドの構築と発現に関連する図である。図2Aは、ヒトIL−15RαのcDNAが、いかにしてpVAX1発現ベクターに挿入されたかを示す。図2Bおよび図2Cは、R&D社のモノクローナル抗ヒトIL−15Rα抗体およびKK1.23モノクローナル抗ヒトIL−15Rα抗体を用いた放射性元素を利用するin vitro翻訳により検出されたように、プラスミドのIL−15Rαが適切なサイズのタンパク質(〜30kDa)を発現していることを示す。図2Dは、モノクローナルKK1.23抗体(IgG1アイソタイプ)が、トランスフェクトされていないHeLa細胞には結合しないことを示す(20×)。図2Eは、マウスのIgG1アイソタイプの対照で(緑に)染色した、pTRACER−IL−15Rαトランスフェクト細胞を示す(20×)。図2Fおよび図2Gは、KK1.23抗ヒトIL−15Rα抗体(赤)が、pIL−15Rα−pTRACERトランスフェクト細胞に結合することを20×および60×でそれぞれ示す。
【図2C】図2A〜図2Gは、IL−15RαのDNAのプラスミドの構築と発現に関連する図である。図2Aは、ヒトIL−15RαのcDNAが、いかにしてpVAX1発現ベクターに挿入されたかを示す。図2Bおよび図2Cは、R&D社のモノクローナル抗ヒトIL−15Rα抗体およびKK1.23モノクローナル抗ヒトIL−15Rα抗体を用いた放射性元素を利用するin vitro翻訳により検出されたように、プラスミドのIL−15Rαが適切なサイズのタンパク質(〜30kDa)を発現していることを示す。図2Dは、モノクローナルKK1.23抗体(IgG1アイソタイプ)が、トランスフェクトされていないHeLa細胞には結合しないことを示す(20×)。図2Eは、マウスのIgG1アイソタイプの対照で(緑に)染色した、pTRACER−IL−15Rαトランスフェクト細胞を示す(20×)。図2Fおよび図2Gは、KK1.23抗ヒトIL−15Rα抗体(赤)が、pIL−15Rα−pTRACERトランスフェクト細胞に結合することを20×および60×でそれぞれ示す。
【図2D】図2A〜図2Gは、IL−15RαのDNAのプラスミドの構築と発現に関連する図である。図2Aは、ヒトIL−15RαのcDNAが、いかにしてpVAX1発現ベクターに挿入されたかを示す。図2Bおよび図2Cは、R&D社のモノクローナル抗ヒトIL−15Rα抗体およびKK1.23モノクローナル抗ヒトIL−15Rα抗体を用いた放射性元素を利用するin vitro翻訳により検出されたように、プラスミドのIL−15Rαが適切なサイズのタンパク質(〜30kDa)を発現していることを示す。図2Dは、モノクローナルKK1.23抗体(IgG1アイソタイプ)が、トランスフェクトされていないHeLa細胞には結合しないことを示す(20×)。図2Eは、マウスのIgG1アイソタイプの対照で(緑に)染色した、pTRACER−IL−15Rαトランスフェクト細胞を示す(20×)。図2Fおよび図2Gは、KK1.23抗ヒトIL−15Rα抗体(赤)が、pIL−15Rα−pTRACERトランスフェクト細胞に結合することを20×および60×でそれぞれ示す。
【図2E】図2A〜図2Gは、IL−15RαのDNAのプラスミドの構築と発現に関連する図である。図2Aは、ヒトIL−15RαのcDNAが、いかにしてpVAX1発現ベクターに挿入されたかを示す。図2Bおよび図2Cは、R&D社のモノクローナル抗ヒトIL−15Rα抗体およびKK1.23モノクローナル抗ヒトIL−15Rα抗体を用いた放射性元素を利用するin vitro翻訳により検出されたように、プラスミドのIL−15Rαが適切なサイズのタンパク質(〜30kDa)を発現していることを示す。図2Dは、モノクローナルKK1.23抗体(IgG1アイソタイプ)が、トランスフェクトされていないHeLa細胞には結合しないことを示す(20×)。図2Eは、マウスのIgG1アイソタイプの対照で(緑に)染色した、pTRACER−IL−15Rαトランスフェクト細胞を示す(20×)。図2Fおよび図2Gは、KK1.23抗ヒトIL−15Rα抗体(赤)が、pIL−15Rα−pTRACERトランスフェクト細胞に結合することを20×および60×でそれぞれ示す。
【図2F】図2A〜図2Gは、IL−15RαのDNAのプラスミドの構築と発現に関連する図である。図2Aは、ヒトIL−15RαのcDNAが、いかにしてpVAX1発現ベクターに挿入されたかを示す。図2Bおよび図2Cは、R&D社のモノクローナル抗ヒトIL−15Rα抗体およびKK1.23モノクローナル抗ヒトIL−15Rα抗体を用いた放射性元素を利用するin vitro翻訳により検出されたように、プラスミドのIL−15Rαが適切なサイズのタンパク質(〜30kDa)を発現していることを示す。図2Dは、モノクローナルKK1.23抗体(IgG1アイソタイプ)が、トランスフェクトされていないHeLa細胞には結合しないことを示す(20×)。図2Eは、マウスのIgG1アイソタイプの対照で(緑に)染色した、pTRACER−IL−15Rαトランスフェクト細胞を示す(20×)。図2Fおよび図2Gは、KK1.23抗ヒトIL−15Rα抗体(赤)が、pIL−15Rα−pTRACERトランスフェクト細胞に結合することを20×および60×でそれぞれ示す。
【図2G】図2A〜図2Gは、IL−15RαのDNAのプラスミドの構築と発現に関連する図である。図2Aは、ヒトIL−15RαのcDNAが、いかにしてpVAX1発現ベクターに挿入されたかを示す。図2Bおよび図2Cは、R&D社のモノクローナル抗ヒトIL−15Rα抗体およびKK1.23モノクローナル抗ヒトIL−15Rα抗体を用いた放射性元素を利用するin vitro翻訳により検出されたように、プラスミドのIL−15Rαが適切なサイズのタンパク質(〜30kDa)を発現していることを示す。図2Dは、モノクローナルKK1.23抗体(IgG1アイソタイプ)が、トランスフェクトされていないHeLa細胞には結合しないことを示す(20×)。図2Eは、マウスのIgG1アイソタイプの対照で(緑に)染色した、pTRACER−IL−15Rαトランスフェクト細胞を示す(20×)。図2Fおよび図2Gは、KK1.23抗ヒトIL−15Rα抗体(赤)が、pIL−15Rα−pTRACERトランスフェクト細胞に結合することを20×および60×でそれぞれ示す。
【図3A】図3A〜図3Cは、pIL−15とpIL−15Rαの組合せが、それぞれのプラスミド単体が与えられた場合と比較して免疫応答を一層増強することを示す図である。図3Aは、ベクター、抗原性プラスミド(HIV−1gagおよびpol)、pIL−15、および/またはpIL−15Rαの組合せを含むDNA調合物を注射したBALB/cマウスのグループに対する免疫化スケジュールを示す。pIL−15とpIL−15Rαの組合せは、マウスの同じ脚に与えられるか、または2つの異なる脚にそれぞれ分けて(一方にpIL−15、他方にpIL−15Rα)与えられた。筋肉内接種を、電気穿孔処理とともに3回行い、マウスは最終追加接種の1週間後に犠牲処置した。図3Bおよび図3Cは、細胞性の応答を示す。免疫化マウス由来の脾細胞を、IFN−γ ELISpotアッセイで用いた。脾細胞を、培地とともに(陰性対照)、コンカナバリンAとともに(陽性対照)、または抗原性ペプチド(HIV−1 gagおよびpolプール)とともに一晩刺激し、IFN−γスポット形成ユニット数をカウントした。
【図3B】図3A〜図3Cは、pIL−15とpIL−15Rαの組合せが、それぞれのプラスミド単体が与えられた場合と比較して免疫応答を一層増強することを示す図である。図3Aは、ベクター、抗原性プラスミド(HIV−1gagおよびpol)、pIL−15、および/またはpIL−15Rαの組合せを含むDNA調合物を注射したBALB/cマウスのグループに対する免疫化スケジュールを示す。pIL−15とpIL−15Rαの組合せは、マウスの同じ脚に与えられるか、または2つの異なる脚にそれぞれ分けて(一方にpIL−15、他方にpIL−15Rα)与えられた。筋肉内接種を、電気穿孔処理とともに3回行い、マウスは最終追加接種の1週間後に犠牲処置した。図3Bおよび図3Cは、細胞性の応答を示す。免疫化マウス由来の脾細胞を、IFN−γ ELISpotアッセイで用いた。脾細胞を、培地とともに(陰性対照)、コンカナバリンAとともに(陽性対照)、または抗原性ペプチド(HIV−1 gagおよびpolプール)とともに一晩刺激し、IFN−γスポット形成ユニット数をカウントした。
【図3C】図3A〜図3Cは、pIL−15とpIL−15Rαの組合せが、それぞれのプラスミド単体が与えられた場合と比較して免疫応答を一層増強することを示す図である。図3Aは、ベクター、抗原性プラスミド(HIV−1gagおよびpol)、pIL−15、および/またはpIL−15Rαの組合せを含むDNA調合物を注射したBALB/cマウスのグループに対する免疫化スケジュールを示す。pIL−15とpIL−15Rαの組合せは、マウスの同じ脚に与えられるか、または2つの異なる脚にそれぞれ分けて(一方にpIL−15、他方にpIL−15Rα)与えられた。筋肉内接種を、電気穿孔処理とともに3回行い、マウスは最終追加接種の1週間後に犠牲処置した。図3Bおよび図3Cは、細胞性の応答を示す。免疫化マウス由来の脾細胞を、IFN−γ ELISpotアッセイで用いた。脾細胞を、培地とともに(陰性対照)、コンカナバリンAとともに(陽性対照)、または抗原性ペプチド(HIV−1 gagおよびpolプール)とともに一晩刺激し、IFN−γスポット形成ユニット数をカウントした。
【図4A】図4Aおよび図4Bは、IL−15RαDNAプラスミドが、pIL−15の不存在下で用量に依存する免疫原性であることを示す図である。BALB/cマウスを、ベクター、5μgの抗原性プラスミド(HIV−1gagおよびpol)、および用量を漸次増加させたIL−15Rα(7.5、10、または15μg)の組合せを含むDNA調合物で図3Aに示すように免疫化した。R10で(陰性対照)、コンカナバリンAで(陽性対照)、およびHIV−1gagペプチドのプールまたはHIV−1polペプチドのプールで刺激した脾細胞に対してIFN−γ ELISpotを実施した。HIV−1gagペプチドのプールを用いた実験のデータを図4Aに示す。HIV−1polペプチドのプールを用いた実験のデータを図4Bに示す。
【図4B】図4Aおよび図4Bは、IL−15RαDNAプラスミドが、pIL−15の不存在下で用量に依存する免疫原性であることを示す図である。BALB/cマウスを、ベクター、5μgの抗原性プラスミド(HIV−1gagおよびpol)、および用量を漸次増加させたIL−15Rα(7.5、10、または15μg)の組合せを含むDNA調合物で図3Aに示すように免疫化した。R10で(陰性対照)、コンカナバリンAで(陽性対照)、およびHIV−1gagペプチドのプールまたはHIV−1polペプチドのプールで刺激した脾細胞に対してIFN−γ ELISpotを実施した。HIV−1gagペプチドのプールを用いた実験のデータを図4Aに示す。HIV−1polペプチドのプールを用いた実験のデータを図4Bに示す。
【図5A】図5Aおよび図5Bは、pIL−15Rαが、主にCD8+T細胞によるIFN−γの分泌を増加させることを示す図である。CD8+T細胞による分泌がIFN−γの分泌中のどの程度を占めるかを、Miltenyi社のビーズを用いて、免疫化されたマウスの脾細胞からのCD8+T細胞のex vivo除去処理によって測定した。図5Aは、全脾細胞に対するもの(黒色)と、CD8が欠乏した脾細胞(灰色)とに対する全抗原反応であって、IFN−γELISpotによって測定されたものを示す。図5Bでは、HIV−1gag p24抗原性タンパク質に対する抗体の力価を、[材料および方法]の項で説明する同一の構築物とスケジュールで免疫化されたBALB/cマウスの血清サンプルから決定した。犠牲時に採取されたサンプルの希釈液列を、p24でコーティングしたELISAプレート上で走らせて、抗マウスIgG−HRP抗体で検出し、抗原特異的なIgGのレベルを測定した。希釈液ウェルのみにおけるバックグラウンドの反応は、グラフに描く前にサンプルのOD値から差し引いた。
【図5B】図5Aおよび図5Bは、pIL−15Rαが、主にCD8+T細胞によるIFN−γの分泌を増加させることを示す図である。CD8+T細胞による分泌がIFN−γの分泌中のどの程度を占めるかを、Miltenyi社のビーズを用いて、免疫化されたマウスの脾細胞からのCD8+T細胞のex vivo除去処理によって測定した。図5Aは、全脾細胞に対するもの(黒色)と、CD8が欠乏した脾細胞(灰色)とに対する全抗原反応であって、IFN−γELISpotによって測定されたものを示す。図5Bでは、HIV−1gag p24抗原性タンパク質に対する抗体の力価を、[材料および方法]の項で説明する同一の構築物とスケジュールで免疫化されたBALB/cマウスの血清サンプルから決定した。犠牲時に採取されたサンプルの希釈液列を、p24でコーティングしたELISAプレート上で走らせて、抗マウスIgG−HRP抗体で検出し、抗原特異的なIgGのレベルを測定した。希釈液ウェルのみにおけるバックグラウンドの反応は、グラフに描く前にサンプルのOD値から差し引いた。
【図6A】図6A〜図6Cは、pIL−15とpIL−15Rαの組合せが、メモリ応答を増強させないことを示す図である。マウスは3回免疫化し、犠牲前に30週間おいた。図6Aは、IFN−γ ELISpotにより、免疫化されたマウスの脾細胞からIFN−γ分泌を測定したことを示す。図6Bは、免疫化されたマウスからのメモリ応答を決定するために用いた細胞内サイトカイン染色を示す。免疫化されたマウスの脾細胞を、培地において、PMA/イオノマイシンで、またはブレフェルジンAの存在下でドミナントな、およびサブドミナントなHIV−1gagおよびpol抗原ペプチドのそれぞれで5時間刺激した。図6Cでは、免疫化されたマウスから血清を採取し、HIV−1gag p24ELISAで走らせた。血清の希釈液列において抗原特異的IgGの有無を解析した。希釈液ウェルのみにおけるバックグラウンドの反応は、グラフに描く前にサンプルのOD値から差し引いた。
【図6B】図6A〜図6Cは、pIL−15とpIL−15Rαの組合せが、メモリ応答を増強させないことを示す図である。マウスは3回免疫化し、犠牲前に30週間おいた。図6Aは、IFN−γ ELISpotにより、免疫化されたマウスの脾細胞からIFN−γ分泌を測定したことを示す。図6Bは、免疫化されたマウスからのメモリ応答を決定するために用いた細胞内サイトカイン染色を示す。免疫化されたマウスの脾細胞を、培地において、PMA/イオノマイシンで、またはブレフェルジンAの存在下でドミナントな、およびサブドミナントなHIV−1gagおよびpol抗原ペプチドのそれぞれで5時間刺激した。図6Cでは、免疫化されたマウスから血清を採取し、HIV−1gag p24ELISAで走らせた。血清の希釈液列において抗原特異的IgGの有無を解析した。希釈液ウェルのみにおけるバックグラウンドの反応は、グラフに描く前にサンプルのOD値から差し引いた。
【図6C】図6A〜図6Cは、pIL−15とpIL−15Rαの組合せが、メモリ応答を増強させないことを示す図である。マウスは3回免疫化し、犠牲前に30週間おいた。図6Aは、IFN−γ ELISpotにより、免疫化されたマウスの脾細胞からIFN−γ分泌を測定したことを示す。図6Bは、免疫化されたマウスからのメモリ応答を決定するために用いた細胞内サイトカイン染色を示す。免疫化されたマウスの脾細胞を、培地において、PMA/イオノマイシンで、またはブレフェルジンAの存在下でドミナントな、およびサブドミナントなHIV−1gagおよびpol抗原ペプチドのそれぞれで5時間刺激した。図6Cでは、免疫化されたマウスから血清を採取し、HIV−1gag p24ELISAで走らせた。血清の希釈液列において抗原特異的IgGの有無を解析した。希釈液ウェルのみにおけるバックグラウンドの反応は、グラフに描く前にサンプルのOD値から差し引いた。
【図7A】図7A〜図7Cは、pIL−15Rαが、内生IL−15の不存在下でアジュバントとなり得ることを示す図である。IL−15Rαがアジュバントとして機能する機序を探るために、本発明者はヒトIL−15RαがマウスのIL−15に結合する能力を調べた。図7Aは、放射性標識したヒトIL−15RαがマウスのIL−15に結合し、抗マウスIL−15抗体と免疫共沈降したことを示す。図7Bに示すように対照のC57BL/6においても、また図7Cに示すようにIL−15ノックアウトマウスにおいても、図3Aのスケジュールに従って免疫化を反復し、脾細胞に対してはIFN−γ ELISpotを実施した。
【図7B】図7A〜図7Cは、pIL−15Rαが、内生IL−15の不存在下でアジュバントとなり得ることを示す図である。IL−15Rαがアジュバントとして機能する機序を探るために、本発明者はヒトIL−15RαがマウスのIL−15に結合する能力を調べた。図7Aは、放射性標識したヒトIL−15RαがマウスのIL−15に結合し、抗マウスIL−15抗体と免疫共沈降したことを示す。図7Bに示すように対照のC57BL/6においても、また図7Cに示すようにIL−15ノックアウトマウスにおいても、図3Aのスケジュールに従って免疫化を反復し、脾細胞に対してはIFN−γ ELISpotを実施した。
【図7C】図7A〜図7Cは、pIL−15Rαが、内生IL−15の不存在下でアジュバントとなり得ることを示す図である。IL−15Rαがアジュバントとして機能する機序を探るために、本発明者はヒトIL−15RαがマウスのIL−15に結合する能力を調べた。図7Aは、放射性標識したヒトIL−15RαがマウスのIL−15に結合し、抗マウスIL−15抗体と免疫共沈降したことを示す。図7Bに示すように対照のC57BL/6においても、また図7Cに示すようにIL−15ノックアウトマウスにおいても、図3Aのスケジュールに従って免疫化を反復し、脾細胞に対してはIFN−γ ELISpotを実施した。
【発明を実施するための形態】
【0026】
本明細書で使用される「IL−15Ra」という用語は、インターロイキン15受容体αタンパク質をさす。
【0027】
本明細書で使用される「機能性断片」とは、IL−15Raの断片であって、免疫原とともに与えられたときに誘発される免疫応答が、その断片なしに免疫原が与えられたときに誘発される免疫応答と比較して高い免疫応答となるものを意味する。断片は通常10個以上のアミノ酸からなる長さを有する。
【0028】
本明細書で使用される「標的タンパク質」という用語は、免疫応答の標的タンパク質として作用する、本発明の遺伝子構築物によってコードされるペプチドおよびタンパク質を意味する。「標的タンパク質」という用語と「免疫原」という用語は、互換的に用いられ、免疫応答が誘発される対象となるタンパク質をさす。標的タンパク質は免疫原性タンパク質であって、病原体または、免疫応答の対象となることが望ましい癌細胞または自己免疫疾患に関与する細胞などの望ましくない細胞型に由来するタンパク質と少なくとも1つのエピトープを共有する。標的タンパク質に対する免疫応答は、当該標的タンパク質が関連する特定の感染症や疾病に対して個体を防御および/または治療するものとなる。
【0029】
本明細書で使用される「遺伝子構築物」とは、標的タンパク質または免疫調節タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むDNAまたはRNA分子をさす。コード配列は、当該核酸分子が投与される個体の細胞での発現を誘導できるプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに機能可能に結合された開始シグナルおよび終止シグナルを含む。
【0030】
本明細書で使用される「発現可能な形態」という用語は、標的タンパク質または免疫調節タンパク質をコードするコード配列に機能可能に結合された、必要な調節エレメントを含み、個体の細胞に存在するとき、そのコード配列が発現されるように構成された遺伝子構築物をさす。
【0031】
本明細書で使用される「エピトープの共有」という用語は、他のタンパク質のエピトープと同一または実質的に類似なエピトープを少なくとも1つ含むタンパク質をさす。
【0032】
本明細書で使用される「実質的に類似なエピトープ」という用語は、別のあるタンパク質のエピトープと構造は同一ではないが、そのタンパク質と交差反応する細胞性免疫応答または体液性免疫応答を引き起こすエピトープを意味する。
【0033】
本明細書で使用される「細胞内病原体」という用語は、その生殖周期または生活周期の少なくとも一時期にホストの細胞内部に存在し、そこで病原体タンパク質を産生する、またはその産生を引き起こすウイルスまたは病原体を意味する。
【0034】
本明細書で使用される「過剰増殖性疾患」という用語は、細胞の過剰増殖によって特性化される疾病および障害を意味する。
【0035】
本明細書で使用される「過剰増殖関連タンパク質」という用語は、過剰増殖性疾患に関連するタンパク質を意味する。
【0036】
本発明は、IL−15Raとその機能性断片、およびそれらの組合せをコードする核酸分子が、ワクチンの成分として与えられたとき、免疫応答を調節するという発見から生まれたものである。従って、IL−15Raとその機能性断片、およびそれらの組合せをコードする核酸分子は、免疫治療薬としてワクチンと組合せて、またはワクチンの成分として投与され得る。
【0037】
さらに、本発明は、IL−15Raまたはその機能性断片、およびそれらの組合せをコードする核酸分子が、IL−15またはその機能性断片と組合せてワクチンの成分として与えられたとき免疫応答を調節するという発見から生まれたものである。従って、IL−15Raとその機能性断片、およびそれらの組合せをコードする核酸分子を、IL−15またはその機能性断片と組合せたものは、免疫治療薬としてワクチンと組合せて、またはワクチンの成分として投与され得る。
【0038】
本発明のいくつかの側面は、特にCD8+メモリT細胞応答が望ましくない場合における、治療用ワクチンでのIL−15Raの核酸コード配列の使用を提供する。そのような治療用ワクチンには、抗原標的が、疾病関連細胞のみならず正常な細胞でも発現される抗原であることにより、抗原を有する細胞が短時間で除去されると、抗原を発現する正常細胞を対象とする長期免疫応答を生じさせることなく治療効果をあげられるものが含まれる。従って、本発明のこの側面は、正常な細胞にも存在する癌細胞上の抗原を対象とする治療用ワクチン、正常な細胞にも存在する自己免疫疾患関連の細胞によって発現される抗原を対象とする治療用ワクチン、および継続的な免疫応答が生ずるのは望ましくない慢性感染症に関与する病原体抗原を対象とする治療用ワクチンにおいて特に有用である。慢性感染症とは、病原体が除去されない病原体感染症をさす。その例として、ポリオ、天然痘、流行性耳下腺炎等の急性感染症とは異なる、HCV、HSV、CMV、水疱瘡、HIV等が挙げられるが、これらに限定されない。
【0039】
本発明のいくつかの側面は、特に増強された急速な免疫応答が望ましい場合における、治療用ワクチンでのIL−15をコードする核酸コード配列と組合せたIL−15Raタンパク質をコードする核酸コード配列の使用を提供する。IL−15Raタンパク質の核酸コード配列と、IL−15をコードする核酸コード配列とを組合せると、免疫応答の初期の誘発時に付加的なアジュバント効果が得られる。付加的な免疫応答を達成するためには、IL−15Raタンパク質をコードする核酸コード配列とIL−15をコードする核酸コード配列とを同じ部位に投与しても、或いはIL−15Raタンパク質をコードする核酸コード配列と後者の核酸コード配列とを、それぞれ別の場所に与えてもよい。
【0040】
前記ヒトIL−15Raのヌクレオチド配列は、GenBank受託番号NM172200およびNM002189として開示されており、それぞれ引用により本明細書の一部とする。ヒトIL−15Raのタンパク質配列は、GenBank受託番号Q13261、NP002180およびNP751950として開示されおり、それぞれ引用により本明細書の一部とする。本発明のいくつかの実施形態では、IL−15Raタンパク質をコードする核酸コード配列は、発現レベルが高くなるように最適化される。本発明のいくつかの実施形態では、IL−15Raタンパク質をコードする核酸コード配列は、SEQ ID NO:1の配列のように最適化される。本発明のいくつかの実施形態では、IL−15Raタンパク質をコードする核酸コード配列は、SEQ ID NO:2の配列のように最適化される。
【0041】
ヒトIL−15のヌクレオチド配列は、GenBank受託番号NM172174およびNM000585として開示されており、それぞれ引用により本明細書の一部とする。ヒトIL−15のタンパク質配列は、GenBank受託番号CAA86100、CAA62616、AAI00964、CAA72044、AAH18149およびAAU21241として開示されており、それぞれ引用により本明細書の一部とする。本発明のいくつかの実施形態では、IL−15タンパク質をコードする核酸コード配列が、高い発現レベルとなるように最適化される。いくつかの実施形態では、改良型IL−15として、米国特許出願第10/560,650号明細書(米国特許出願公開第2007−0041941号)に記載されているようなものが構築される。この出願の内容は引用により本明細書の一部とする。いくつかの実施形態では、改良型IL−15として、米国特許出願第12/160,766号明細書に記載されているようなものが構築される。この出願の内容は引用により本明細書の一部とする。本発明のいくつかの実施形態では、IL−15タンパク質をコードする核酸コード配列はSEQ ID NO:3である。
【0042】
本発明のいくつかの実施形態では、IL−15Raタンパク質をコードする核酸コード配列および標的抗原をコードする核酸コード配列が、それぞれ同一のプラスミド上に組み入れられる。
【0043】
本発明のいくつかの実施形態では、2種のプラスミドを含む組成物が提供され、第1のプラスミドはIL−15Raタンパク質をコードする核酸コード配列を含み、第2のプラスミドは標的抗原をコードする核酸コード配列を含む(それぞれ同一のプラスミド上に)。
【0044】
本発明のいくつかの実施形態では、2種類の組成物が提供される。第1の組成物は、IL−15Raタンパク質をコードする核酸コード配列を含むプラスミドを含み、第2の組成物は、標的抗原をコードする核酸コード配列を含むプラスミドを含む(それぞれ同一のプラスミド上に)。前記2種類の組成物を別々の容器に入れ、キットとしてパッケージ化してもよい。
【0045】
本発明のいくつかの実施形態では、IL−15Raタンパク質をコードする核酸コード配列、IL−15をコードする核酸コード配列、および標的抗原をコードする核酸コード配列が、それぞれ同一のプラスミド上に存在する。
【0046】
本発明のいくつかの実施形態では、本発明は2種類のプラスミドを含む組成物を提供する。IL−15Raタンパク質をコードする核酸コード配列およびIL−15をコードする核酸コード配列が一方のプラスミド上に存在し、標的抗原をコードする核酸コード配列が第2のプラスミド上に存在する。
【0047】
本発明のいくつかの実施形態では、本発明は3種のプラスミドを含む組成物を提供する。IL−15Raタンパク質をコードする核酸コード配列は第1のプラスミド上に、IL−15をコードする核酸コード配列は第2のプラスミド上に、標的抗原をコードする核酸コード配列は第3のプラスミド上にある。
【0048】
本発明のいくつかの実施形態では、本発明が、1種類のプラスミドを含む第1の組成物と、1種類のプラスミドを含む第2の組成物からなる2種類の組成物を提供する。そのような実施形態のいくつかでは、第1の組成物がIL−15Raタンパク質をコードする核酸コード配列と標的抗原をコードする核酸コード配列とを含むプラスミドを含む。そして第2の組成物はIL−15をコードする核酸コード配列を含むプラスミドを含む。そのような実施形態のいくつかでは、第1の組成物がIL−15タンパク質をコードする核酸コード配列と、標的抗原をコードする核酸コード配列とを含むプラスミドを含む。そして第2の組成物はIL−15Raをコードする核酸コード配列を含むプラスミドを含む。そのような実施形態のいくつかでは、第1の組成物がIL−15タンパク質をコードする核酸コード配列と、IL−15Raをコードする核酸コード配列とを含むプラスミドを含む。そして第2の組成物は、標的抗原をコードする核酸コード配列を含むプラスミドを含む。これら複数種の組成物を別々の容器で提供し、それらがキットを構成するようにパッケージ化してもよい。
【0049】
本発明のいくつかの実施形態では、本発明は、2種類の組成物、即ち2種のプラスミドを含む第1の組成物と1種のプラスミドを含む第2の組成物とを提供する。そのような実施形態のいくつかでは、第1の組成物がIL−15Raタンパク質をコードする核酸コード配列を含む第1のプラスミドと、標的抗原をコードする核酸コード配列を含む第2のプラスミドとを含む。そして第2の組成物は、IL−15をコードする核酸コード配列を含むプラスミドを含む。そのような実施形態のいくつかでは、第1の組成物がIL−15タンパク質をコードする核酸コード配列を含む第1のプラスミドと、標的抗原をコードする核酸コード配列を含む第2のプラスミドとを含む。そして第2の組成物は、IL−15Raをコードする核酸コード配列を含むプラスミドを含む。そのような実施形態のいくつかでは、第1の組成物がIL−15タンパク質をコードする核酸コード配列を含む第1のプラスミドと、IL−15Raをコードする核酸コード配列を含む第2のプラスミドとを含む。そして第2の組成物は、標的抗原をコードする核酸コード配列を含むプラスミドを含む。これら複数種の組成物を別々の容器で提供し、それらがキットを構成するようにパッケージ化してもよい。
【0050】
本発明のいくつかの実施形態では、本発明は、1種類のプラスミドを含む第1の組成物と、1種類のプラスミドを含む第2の組成物と、1種類のプラスミドを含む第3の組成物とからなる3種類の組成物を提供する。そのような実施形態のいくつかでは、第1の組成物がIL−15Raタンパク質をコードする核酸コード配列と標的抗原をコードする核酸コード配列とを含むプラスミドを含む。そして第2の組成物は標的抗原をコードする核酸コード配列を含むプラスミドを含む。さらに第3の組成物はIL−15をコードする核酸コード配列を含むプラスミドを含む。これら複数種の組成物を別々の容器で提供し、それらがキットを構成するようにパッケージ化してもよい。
【0051】
免疫調節タンパク質をコードする単離されたcDNAは、その免疫調節タンパク質を産生し得る構築物の作製の開始材料として有用である。標準的な技術と入手容易な材料を用いて、免疫調節タンパク質をコードする核酸分子を作製し得る。
【0052】
その核酸分子は、DNA注入(DNAワクチン接種ともいう)や、組換え体ベクター(組換え体アデノウイルス、組換え体アデノウイルス関連ウイルス、および組換え体ワクシニアウイルスなど)を含むいくつかの周知技術のいずれかを用いて供給できる。
【0053】
DNAワクチンについては、米国特許第5,593,972号、同第5,739,118号、同第5,817,637号、同第5,830,876号、同第5,962,428号、同第5,981,505号、同第5,580,859号、同第5,703,055号、同第5,676,594号、ならびにこれらで引用される優先権基礎出願の各明細書中に記載され、それぞれ引用により本明細書の一部とする。上記の特許出願明細書中に記載された送達プロトコールに加えて、DNAを供給する別の方法が、米国特許第4,945,050号および同第5,036,006号の各明細書中に記載されており、ともに引用により本明細書の一部とする。
【0054】
投与経路としては、筋肉内投与、鼻腔内投与、腹腔内投与、皮内投与、皮下投与、静脈内投与、動脈内投与、眼内投与、および経口投与とともに、吸入又は座薬による、または洗浄などによる粘膜組織(膣、直腸、尿道、頬および舌下組織など)への経皮投与、局所投与が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい投与経路としては、粘膜組織への投与や、筋肉内、腹腔内、皮内、および皮下への注射等が挙げられる。遺伝子構築物は、従来型の注射器、無針注射器、または「微小遺伝子銃」などによって投与してもよいが、これらの手段に限定されない。
【0055】
別の投与経路として、遺伝子構築物を送達するために電気穿孔法を利用する手法が、米国特許第5,273,525号、同第5,439,440号、同第5,702,359号、同第5,810,762号、同第5,993,434号、同第6,014,584号、同第6,055,453号、同第6,068,650号、同第6,110,161号、同第6,120,493号、同第6,135,990号、同第6,181,964号、同第6,216,034号、同第6,233,482号、同第6,241,701号、同第6,347,247号、同第6,418,341号、同第6,451,002号、同第6,516,223号、同第6,567,694号、同第6,569,149号、同第6,610,044号、同第6,654,636号、同第6,678,556号、同第6,697,669号、同第6,763,264号、同第6,778,853号、同第6,865,416号、同第6,939,862号、および第6,958,060号の各明細書中に記載され、これらは引用により本明細書の一部とする。
【0056】
細胞に取り込まれたとき、遺伝子構築物は、機能する染色体外分子として細胞内に存在し続けることができる。DNAは細胞に導入され、そこに1つのプラスミドまたは複数のプラスミドの形で一時的に存在することもできる。あるいは、RNAを細胞に投与してもよい。セントロメア、テロメア、複製起点を含む直鎖状のミニ染色体として遺伝子構築物を提供することも意図されている。遺伝子構築物は、被験者に投与される弱毒化生微生物や組換え体微生物のベクターにおいて遺伝子材料の一部を構成し得る。遺伝子構築物は、遺伝子材料が染色体外に存在する組換え体ウイルスワクチンのゲノムの一部であり得る。遺伝子構築物は、核酸分子の遺伝子発現に必要な調節エレメントを含む。そのエレメントには、プロモーター、開始コドン、停止コドン、およびポリアデニル化シグナルが含まれる。加えて、標的タンパク質または免疫調節タンパク質をコードする配列の遺伝子発現にはエンハンサーが必要となることが多い。これらのエレメントは、必要なタンパク質をコードする配列に機能可能に結合されていること、調節エレメントが、投与対象の個体において機能できるものである必要がある。
【0057】
開始コドンおよび停止コドンは、必要なタンパク質をコードするヌクレオチド配列の一部であると一般的には考えられる。しかし、これらのエレメントは、遺伝子構築物が投与される個体において機能的である必要がある。開始コドンと終止コドンは、コード配列のフレーム内に入っていなければならない。
【0058】
使用されるプロモーターとポリアデニル化シグナルは、前記個体の細胞内で機能的でなければならない。
【0059】
本発明の実施、特にヒトの遺伝子ワクチンの製造において有用なプロモーターの例としては、シミアンウイルス40(SV40)由来のプロモーター、マウス乳癌ウイルス(MMTV)プロモーター、BIV末端反復配列(LTR)プロモーターのようなヒト免疫不全ウイルス(MV)由来のプロモーター、モロニーウイルス由来のプロモーター、ALV由来プロモーター、CMV前初期プロモーターのようなサイトメガロウイルス(CMV)由来のプロモーター、エプスタイン−バーウイルス(EBV)由来のプロモーター、ラウス肉腫ウイルス(RSV)由来のプロモーター、ならびにヒト遺伝子(ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒトの筋肉のクレアチン、およびヒトメタロチオネインなど)由来のプロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【0060】
本発明の実施、特にヒトの遺伝子ワクチンの製造において有用なポリアデニル化シグナルの例としては、SV40ポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモンポリアデニル化(bgh−PolyA)シグナル、およびLTRポリアデニル化シグナルが挙げられるが、これらに限定されない。特に、pCEP4プラスミド(Invitrogen,San Diego CA)(SV40ポリアデニル化シグナルともよばれる)に含まれているSV40ポリアデニル化シグナルが用いられる。
【0061】
DNAの発現に必要な調節エレメントに加えて、他のエレメントもDNA分子に含められ得る。そのような付加的エレメントにはエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチンのエンハンサーや、CMV、RSV、およびEBV由来のエンハンサーなどのウイルス由来エンハンサーからなる群から選択されたものであり得るが、これらに限定されない。
【0062】
遺伝子構築物は、当該構築物を染色体外に維持し、細胞内でその構築物の複数のコピーを作り出すために、哺乳類の複製起点を備える形で提供され得る。Invitrogen(San Diego,CA)から市販されているプラスミドpVAX1、pCEP4、およびpREP4は、エプスタイン−バーウイルスの複製起点、および融合なしで高コピーのエピソームの複製を作り出す核抗原EBNA−1コード領域を含む。
【0063】
免疫化の用途に関連する好ましい実施形態のいくつかでは、標的タンパク質、免疫調節タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、および、それに加えてそのような標的タンパク質に対する免疫応答をさらに増強するタンパク質の遺伝子が与えられる。そのような遺伝子の例として、例えばインターフェロンα、インターフェロンγ、血小板由来増殖因子(PDGF)、TNF、GM−CSF、上皮成長因子(EGF)、IL−1、IL−2、IL−4、IL−6、IL−10、IL−12およびIL−15(シグナル配列が除去され、選択に応じてIgE由来のシグナルペプチドを含むIL−15など)のような他のサイトカインやリンホカインをコードする遺伝子が挙げられる。
【0064】
前記方法で用いられる組成物はさらに、引用により本明細書の一部とする米国特許出願第10/139,423号明細書(米国特許出願公開第2003−0176378号に対応)に記載のような、以下に挙げるタンパク質および/またはそのようなタンパク質をコードする核酸分子の1種または2種以上を含み得る。即ち、主要組織適合性複合体抗原(主要組織適合複合体クラスI抗原、または主要組織適合遺伝子複合体クラスII抗原を含む);デスドメイン受容体(以下に限定されないが、APo−1、Fas、TNFR−1、p55、WSL−1、DR3、TRAMP、Apo−3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL−R2、TRICK2、およびDR6の各受容体を含む);デスシグナル即ちデスドメイン受容体と相互作用するタンパク質(以下に限定されないが、FADD、FAP−1、TRADD、RIP、FLICE、およびRAIDDを含む);またはデスドメイン受容体と結合し、アポトーシスを開始させるリガンドを含むデスシグナル(以下に限定されないが、FAS−LおよびTNFを含む);およびデスドメイン受容体と相互作用するメディエーター(以下に限定されないが、FADD、MORT1、およびMyD88を含む);細胞を殺すタンパク質を含む毒素(以下に限定されないが、昆虫やヘビの毒、緑膿菌の内毒素など細菌の内毒素、一本鎖毒素を含むリシンなどの二重鎖リボソーム不活性化タンパク質、およびゲロニンを含む)、および/またはそれらをコードする核酸分子の1種または2種以上を含み得る。
【0065】
前記方法で用いられる組成物はさらに、引用により本明細書の一部とする米国特許出願第10/560,650号明細書(米国特許出願公開第2007/0041941号明細書に対応)に記載のような、以下に挙げるタンパク質および/またはそのようなタンパク質をコードする核酸分子の1種または2種以上を含み得る。即ち、IL−15タンパク質配列に結合した非IL−15シグナルペプチドを含む融合タンパク質(IL15−タンパク質配列、CD40L、TRAILに結合したIgEシグナルペプチドを含む融合タンパク質など);TRAILrecDRC5、TRAIL−R2、TRAIL−R3、TRAIL−R4、RANK、RANKリガンド、Ox40、Ox40リガンド、NKG2D、F461811またはMICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、CD30、CD153(CD30L)、FOS、c−jun、Sp−1、Ap1、Ap−2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、NIK、SAP K、SAP1、JNK2、JNK1B2、JNK1B1、JNK2B2、JNK2B1、JNK1A2、JNK2A1、JNK3A1、JNK3A2、NF−κ−B2、p49スプライスフォーム、NF−κ−B2、p100スプライスアイソフォーム、NF−κ−B2、p105スプライスフォーム、NF−κ−B50K単鎖前駆体、NFkBのp50、ヒトIL−1α、ヒトIL−2、ヒトIL−4、マウスIL−4、ヒトIL−5、ヒトIL−10、ヒトIL−15、ヒトIL−18、ヒトTNF−α、ヒトTNF−β、ヒトIL−12、MAdCAM−1、NGF IL−7、VEGF、TNF−R、Fas、CD40L、IL−4、CSF、G−CSF、GM−CSF、M−CSF、LFA−3、ICAM−3、ICAM−2、ICAM−1、PECAM、P150.95、Mac−1、LFA−1、CD34、RANTES、IL−8、MIP−1α、E−セレクチン、CD2、MCP−1、L−セレクチン、P−セレクチン、FLT、Apo−1、Fas、TNFR−1、p55、WSL−1、DR3、TRAMP、Apo−3、AIR、LARD、NGRF、DR4(TRAIL)、DR5、KILLER、TRAIL−R2、TRICK2、DR6、ICE、VLA−1、およびCD86(B7.2)、および/またはそれらをコードする核酸分子の1種または2種以上を含み得る。
【0066】
前記方法で用いられる組成物はさらに、引用により本明細書の一部とする米国特許出願第10/560,653号明細書(米国特許出願公開第2007/0104686号明細書に対応)に記載のような、以下に挙げるタンパク質および/またはそのようなタンパク質をコードする核酸分子の1種または2種以上を含み得る。即ち、Fos、c−jun、Sp−1、Ap−1、Ap−2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、不活性なNIK、SAP K、SAP−1、JNK、インターフェロン応答遺伝子、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL−R3、TRAIL−R4、RANK、RANKリガンド、Ox40、Ox40リガンド、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1、およびTAP2、および/またはそれらをコードする核酸分子の1種または2種以上を含み得る。
【0067】
遺伝子構築物を受けた細胞を、なんらかの理由で除去することが望ましい場合には、細胞破壊のための標的として役立つ付加的なエレメントを加えてもよい。発現可能な形態でのヘルペスチミジンキナーゼ(tk)遺伝子を、遺伝子構築物に含めることができる。薬物のガングシクロビルが、個体に投与され得、そしてその薬が、tkを産生するあらゆる細胞を選択的に殺し、従って、その遺伝子構築物を持つ細胞の選択的な破壊の手段を提供する。
【0068】
タンパク質産生を最大にするために、その構築物が投与される細胞における遺伝子発現によく適合した調節配列が選択され得る。さらに、その細胞中で最も効果的に転写されるコドンが選択され得る。当業者は、その細胞中で機能するDNA構築物を作製できる。
【0069】
いくつかの実施形態において、遺伝子構築物が、IgEシグナルペプチドに結合された本明細書に記載の免疫調節タンパク質のコード配列を作りだすために提供され得る。
【0070】
本発明の方法の1つは、核酸分子を、筋肉内、鼻腔内、腹腔内、皮下、皮内に、または局所的にもしくは洗浄により、吸入、膣、直腸、尿道、頬および舌下からなる群から選択された粘膜組織へ投与する工程を含む。
【0071】
いくつかの実施形態では、その核酸分子は、ポリヌクレオチド機能エンハンサーまたは遺伝子ワクチン促進物質の投与と組合せて、細胞に送達される。ポリヌクレオチド機能エンハンサーは、米国特許第5,593,972号および同第5,962,428号の各明細書に記載されており、それぞれ引用により本明細書の一部とする。遺伝子ワクチン促進物質は、米国特許第5,739,118号明細書に記載されており、その内容は引用により本明細書の一部とする。核酸分子とともに投与される助剤は、その核酸分子との混合物として投与され得るか、または別々に、核酸分子の投与と同時、投与前もしくは投与後に、投与され得る。加えて、トランスフェクト剤、および/または複製剤、および/または炎症性物質として機能し得、かつポリヌクレオチド機能エンハンサーと同時投与され得る他の物質として、成長因子、サイトカインやリンホカイン(インターフェロンα、インターフェロンγ、GM−CSF、血小板由来増殖因子(PDGF)、TNF、上皮成長因子(EGF)、IL−1、IL−2、IL−4、IL−6、IL−10、IL−12、およびIL−15ならびに線維芽細胞増殖因子など)、免疫刺激複合体(ISCOMS)などの界面活性剤、モノホスホリルリピドA(WL)を含むLPSアナログ、ムラミルペプチド、キノンアナログならびにスクアレンやスクワレンなどの小胞、およびヒアルロン酸が挙げられ、これらはまた遺伝子構築物とともに用いられ投与され得る。いくつかの実施形態では、免疫調節タンパク質も、ポリヌクレオチド機能エンハンサーとして使用することができる。いくつかの実施形態において、核酸分子は、送達/取り込みを増強するためにポリ(ラクチド-co-グリコリド)(PLG)と結合した形で提供される。
【0072】
本発明による医薬組成物は、約1ng〜約2000μgのDNAを含む。いくつかの好ましい実施形態では、本発明による医薬組成物は、約5ng〜約1000μgのDNAを含む。いくつかの好ましい実施形態では、その医薬組成物は、約10ng〜約800μgのDNAを含む。いくつかの好ましい実施形態では、その医薬組成物は、約0.1μg〜約500μgのDNAを含む。いくつかの好ましい実施形態では、その医薬組成物は、約1μg〜約350μgのDNAを含む。いくつかの好ましい実施形態では、その医薬組成物は、約25μg〜約250μgのDNAを含む。いくつかの好ましい実施形態では、その医薬組成物は、約100μg〜約200μgのDNAを含む。
【0073】
本発明による医薬組成物は、用いられる投与の方式に応じて調合される。医薬組成物が、注入可能なものである場合、その医薬組成物は滅菌され、発熱物質を含まず、そして微粒子を含まない。等浸透圧性の調合物を用いるのが好ましい。一般的に、等浸透圧のための添加剤としては、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、および乳糖を挙げることができる。場合によっては、リン酸緩衝食塩水のような等浸透圧性の溶液が好ましい。安定剤としては、ゼラチンおよびアルブミンが挙げられる。いくつかの実施形態では、血管収縮剤がその調合物に加えられる。
【0074】
本発明のいくつかの実施形態によれば、免疫原に対する免疫応答を誘導する方法が、免疫原およびIL−15Rαまたはその機能性断片を個体に与えることによって提供される。ワクチンは、弱毒化生ワクチン、組換え体ワクチンまたは核酸ワクチンもしくはDNAワクチンであり得る。
【0075】
本発明は、標的たんぱく質、即ち病原体、アレルゲンまたは個体自身の「異常な」細胞に特異的に関連するタンパク質に対する増強された免疫応答を誘導するのに役立つ。本発明は、病原体タンパク質に対する免疫応答が病原体に対する防御免疫をもたらすように、病原性の物質や生物に対して個体を免疫化する上で有用である。本発明は、過剰増殖性細胞に特異的に関連する標的タンパク質に対する免疫応答を引き出すことによって癌などの過剰増殖性疾患や障害を治療するのに役立つ。本発明は、自己免疫状態に関与する細胞に特異的に関連する標的タンパク質に対する免疫応答を引き出すことによって自己免疫疾患や障害を治療するのに役立つ。
【0076】
本発明のいくつかの側面によれば、標的タンパク質および免疫調節タンパク質をコードするDNAまたはRNAが、発現される個体の組織の細胞に導入され、従って、そのコードされたタンパク質が産生される。標的タンパク質および免疫調節タンパク質をコードするDNA配列またはRNA配列が、個体の細胞中での発現に必要な調節エレメントに結合される。DNA発現のための調節エレメントには、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルが含まれる。加えて、コザック領域のような他のエレメントも、その遺伝子構築物中に含めることができる。
【0077】
いくつかの実施形態では、標的タンパク質をコードする配列の発現可能な形態、および両方の免疫調節タンパク質をコードする配列の発現可能な形態が、個体に与えられる同じ核酸分子上に存在する。
【0078】
いくつかの実施形態では、標的タンパク質をコードする配列の発現可能な形態は、免疫調節性のタンパク質をコードする配列の発現可能な形態を含むものとは別の核酸分子上に存在する。いくつかの実施形態では、標的タンパク質をコードする配列の発現可能な形態と、1種または2種以上の免疫調節性のタンパク質群をコードする配列の発現可能な形態とが、免疫調節タンパク質をコードする配列の発現可能な形態を含む核酸分子とは別の1つの核酸分子上に存在する。本発明によれば、複数の異なる核酸分子を作り出し、与えることができる。
【0079】
核酸分子は、組換え体ベクターの核酸分子であるプラスミドDNAとして、または弱毒化ワクチンで提供される遺伝子物質の一部として提供され得る。あるいは、いくつかの実施形態では、標的タンパク質および免疫調節タンパク質が、それらをコードする核酸分子に加えて、またはそれらをコードする核酸分子のかわりに、タンパク質として与えられ得る。
【0080】
遺伝子構築物は、標的タンパク質、または遺伝子発現に必要な調節エレメントに機能可能に結合された免疫調節タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み得る。本発明によれば、標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現可能な形態を含む構築物、および免疫調節タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現可能な形態を含む構築物を含む遺伝子構築物の組合せが提供される。遺伝子構築物の組合せを含む、DNA分子またはRNA分子を生細胞に導入することにより、そのDNAまたはRNAが発現し、標的タンパク質と1種または2種以上の免疫調節タンパク質が産生される。標的タンパク質に対する増強された免疫応答を結果として生じる。
【0081】
本発明は、ウイルス、原核生物と真核生物の病原性生物(例えば、単細胞病原生物や多細胞の寄生虫など)のような病原体に対して個体を免疫化するために用いられ得る。本発明は、特に、細胞に感染し、かつ被包性でない病原体(例えば、ウイルス)、および原核生物(淋菌、リステリア菌、および赤痢菌など)に対して個体を免疫化するために特に有用である。加えて、本発明は、原生動物病原体(それらが細胞内病原体である、生活周期上のステージを含む)に対して、個体を免疫化するためにも有用である。表1は、本発明によってワクチンが作られ得るウイルスの科および属のいくつかのリストを提供する。表に記載される抗原のような病原体抗原上に提示されるエピトープに同一または実質的に類似である少なくとも1つのエピトープを含むペプチドをコードするDNA配列を含むDNA構築物は、ワクチンにおいて有用である。さらに、本発明は、表2に記載されたような、原核生物および真核生物である原生動物病原体、ならびに多細胞寄生生物を含む他の病原体に対して、個体を免疫化するためにも役立つ。当業者は、慢性感染症を生じさせる病原体を容易に特定し、感染後除去されるもの(即ち急性感染症)から区別できる。
【0082】
[表]
表1−ウイルス
ピコナウイルス科
属:
ライノウイルス:(医学上)通常の感冒の50%の症例の原因となる。
エンテロウイルス:(医学上)ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルス、およびA型肝炎ウイルスなどのヒトエンテロウイルス
アフトウイルス:(獣医学上)これらは口蹄疫ウイルスである。
標的抗原: VP1、VP2、VP3、VP4、VPG
カリシウイルス科
属:
ノーフォークウイルス群:(医学上)これらのウイルスは流行性胃腸炎の重要な原因病原体である。
トガウイルス科
属:
アルファウイルス:(医学上および獣医学上)例としてシンドビスウイルス、ロスリバーウイルスならびに東部ウマ脳炎ウイルスおよび西部ウマ脳炎ウイルスが挙げられる。
レオウイルス:(医学上)風疹ウイルス
フラビウイルス科
例:
(医学上)デング熱、黄熱病、日本脳炎、セントルイス脳炎、およびダニ媒介脳炎ウイルス。
西ナイルウイルス(Genbank NC001563、AF533540、AF404757、AF404756、AF404755、AF404754、AF404753、AF481864、M12294、AF317203、AF196835、AF260969、AF260968、AF260967、AF206518およびAF202541)
代表的な標的抗原:
E
NS5
C
C型肝炎ウイルス:
(医学上)これらのウイルスは未だ科に位置づけられていないが、トガウイルスまたはフラビウイルスのいずれかであると考えられる。最も類似性が高いのはトガウイルス科である。
コロナウイルス科:(医学上および獣医学上)
伝染性気管支炎ウイルス(家禽)
ブタ伝染性胃腸炎ウイルス(ブタ)
ブタ血球凝集性脳脊髄炎ウイルス(ブタ)
ネコ伝染性腹膜炎ウイルス(ネコ)
ネコ腸コロナウイルス(ネコ)
イヌコロナウイルス(犬)
SARS関連コロナウイルス
ヒト呼吸器コロナウイルスは一般的な感冒の症例の約40%の原因となる。
EX. 224E、OC43
注−コロナウイルスは、非A型、非B型または非C型の肝炎を起こし得る。
標的抗原:
E1−Mまたはマトリックスタンパク質とも呼ばれる。
E2−Sまたはスパイクタンパク質とも呼ばれる。
E3−BEまたはヘマグルチンエルテロースとも呼ばれる。
糖タンパク質(すべてのコロナウイルスに存在するわけではない)
N−ヌクレオカプシド
ラブドウイルス科
属:
ベシクロウイルス
リッサウイルス(医学上および獣医学上)
狂犬病
標的抗原:
Gタンパク質
Nタンパク質
フィロウイルス科:(医学上)
マールブルグウイルスまたはエボラウイルスなどの出血熱ウイルス
パラミクソウイルス科:
属:
パラミクソウイルス:(医学上および獣医学上)流行性耳下腺炎ウイルス、ニューカッスル病ウイルス(ニワトリに重要な病原体)
麻疹ウイルス:(医学上および獣医学上)麻疹、イヌジステンパー
肺炎ウイルス:(医学上および獣医学上)呼吸器合胞体ウイルス
オルトミクソウイルス科:(医学上)インフルエンザウイルス
ブンヤウイルス科
属:
ブンヤウイルス:(医学上)カリフォルニア脳炎、ラクロスウイルス
フレボウイルス:(医学上)リフトバレー熱
ハンタウイルス:プレマーラ(puremala)はヘマハギン(hemahagin)熱ウイルスである。
ナイロウイルス:(獣医学上)ナイロビヒツジ病
さらに多くの未分類のブンヤウイルスが存在する。
アレナウイルス科(医学上)LCM、ラッサ熱ウイルス
レオウイルス科
属:
レオウイルス:ヒト病原体の可能性がある
ロタウイルス:小児の急性胃腸炎
オルビウイルス:(医学上および獣医学上)コロラドダニ熱、レボンボ(Lebombo)(ヒト)ウマ脳症、ブルータング
レトロウイルス科
亜科:
オンコウイルス亜科:(獣医学上)(医学上)ネコ白血病ウイルス、HTLVIおよびHTLVII
レンチウイルス亜科:(医学上および獣医学上)HIV、ネコ免疫不全ウイルス、ウマ伝染性貧血ウイルス
スプマウイルス亜科
パポーバウイルス科
亜科:
ポリオーマウイルス:(医学上)BKU及びJCUウイルス
亜科:
パピローマウイルス:(医学上)癌や乳頭腫の悪性進行に関連する多種のウイルス
アデノウイルス(医学上)
EX AD7、ARD、O.B.
−呼吸器疾患を引き起こす。
−275などいくつかのアデノウイルスは腸炎の原因となる。
パルボウイルス科(獣医学上)
ネコパルボウイルス:ネコ腸炎を引き起こす。
ネコパンロイコペニアウイルス
イヌパルボウイルス
ブタパルボウイルス
ヘルペスウイルス科
亜科:
アルファヘルペスウイルス亜科
属:
単純ヘルペスウイルス(医学上)
HSVI(Genbank X14112、NC001806)、HSVII(NC001798)
水痘帯状疱疹ウイルス(医学上および獣医学上):仮性狂犬病、水痘帯状疱疹
亜科:
ベータヘルペスウイルス亜科
属:
サイトメガロウイルス(医学上)
HCMV
ムロメガロウイルス
亜科:
ガンマヘルペスウイルス亜科
属:
リンフォクリプトウイルス(医学上)
EBV−(バーキットリンパ腫)
ポックスウイルス科
亜科:
コードポックスウイルス亜科(医学上および獣医学上)
属:
痘瘡(天然痘)
ワクシニア(牛痘)
パラポックスウイルス−獣医学上
アビポックスウイルス−獣医学上
カプリポックスウイルス
レポリポックスウイルス
スイポックスウイルス
亜科:
エントモポックスウイルス亜科
ヘパドナウイルス科
B型肝炎ウイルス
未分類
D型肝炎ウイルス
【0083】
表2
細菌性病原体
肺炎球菌、ブドウ球菌、および連鎖球菌を含む病原性グラム陽性球菌
髄膜炎菌および淋菌を含む病原性グラム陰性菌
病原性腸内グラム陰性桿菌には次のものが含まれる。
腸内細菌科;シュードモナス、アシネトバクタおよびエイケネラ、類鼻疽菌;サルモネラ属;赤痢菌;ヘモフィルス属;軟性下疳菌;ブルセラ症菌;野兎病菌;エルシニア属(パスツレラ属);ストレプトバシラスモニリフォルミスおよびスピリルム属;リステリア菌:豚丹毒菌;ジフテリア菌、コレラ菌、炭疽菌;ドノバノーシス(鼠径部肉芽腫)菌;およびバルトネラ症菌。
病原性嫌気性細菌には次のものが含まれる。
破傷風菌、ボツリヌス菌;他のクロストリジウム属;結核菌;らい菌;および他のマイコバクテリア。
病原性のスピロヘータ疾患には次のものが含まれる。
梅毒;−トレポネーマ症:フランベジア、ピンタと風土病性梅毒;およびレプトスピラ症の細菌。
高病原性細菌および病原性真菌による他の感染症には次のものが含まれる。
放線菌症;ノカルジア症;クリプトコッカス症、ブラストミセス症、ヒストプラスマ症、およびコクシジオイデス症;カンジダ症、アスペルギルス症、およびムコール症;スポロトリクム症;パラコクシジオイドミコーシス、ペトリエリジオーシス(petriellidiosis)、トルロプシス症、菌腫、およびクロモミコーシス;ならびに皮膚糸状菌症。
リケッチア感染は、リケッチア感染症およびリケッチア症を含む。
マイコプラズマおよびクラミジア感染症の例としては、マイコプラズマ肺炎;鼠径部リンパ肉芽腫;オウム病;および周産期のクラミジア感染症が挙げられる。
病原性真核生物
病原性原生動物および蠕虫による感染症には次のものが含まれる。
アメーバ症;マラリア;リーシュマニア症;トリパノソーマ症;トキソプラズマ症;ニューモシスティスカリニ;バベシア症;ジアルジア症;旋毛虫症;フィラリア症;住血吸虫症;線虫感染症;吸虫類感染症;および条虫(サナダムシ)感染症。
【0084】
病原体感染を防ぐ遺伝子ワクチンを作るため、防御免疫反応の対象となり得る免疫原タンパク質をコードする遺伝子物質が、標的のためのコード配列として、遺伝子構築物中に含められなければならない。DNAおよびRNAはともに比較的小さく、そして比較的容易に作製できるため、本発明は、多数の病原体抗原でワクチン接種することを可能にする付加的な利点を提供する。遺伝子ワクチンにおいて用いられる遺伝子構築物は、多くの病原体抗原をコードする遺伝子物質を含み得る。例えば、いくつかのウイルス遺伝子が、1つの構築物中に含まれ得、それにより複数の標的を提供する。
【0085】
表1および表2は、いくつかの病原体および病原性生物のリストを含み、それらによる感染から個体を防御するために遺伝子ワクチンを調製できる。いくつかの好ましい実施形態では、病原体に対して個体を免疫する方法が、ヒト免疫不全症ウイルス(HIV)、単純ヘルペスウイルス(HSV)、C型肝炎ウイルス(HCV)、西ナイルウイルス(WNV))、またはB型肝炎ウイルス(HBV)を対象とする。
【0086】
本発明の別の側面が、過剰増殖性の疾患に特徴的な過剰増殖細胞に対する防御免疫応答を付与する方法、および過剰増殖性疾患に罹患している個体を処置する方法を提供する。過剰増殖性疾患の例としては、全ての形態の癌および乾癬が挙げられる。
【0087】
免疫原である「過剰増殖細胞」関連タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物の、個体の細胞内への導入が、個体のワクチン接種された細胞でのこれらのタンパク質の産生をもたらすことが発見された。過剰増殖性疾患に対して免疫化するため、過剰増殖性疾患に関連するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物が、個体に投与される。
【0088】
過剰増殖関連タンパク質が有効な免疫原性標的であるためには、正常細胞と比較した場合、それが、過剰増殖細胞中で排他的に、または高レベルで産生されるタンパク質でなければならない。標的抗原はそのようなタンパク質、その断片およびペプチドを含み、それらは、そのようなタンパク質上に見出される少なくとも1つのエピトープを含む。場合によっては、過剰増殖関連タンパク質は、タンパク質をコードする遺伝子の変異の産物である。その変異した遺伝子は、正常なタンパク質では見られない異なるエピトープを生じる、わずかに異なるアミノ酸配列を持つこと以外は、正常なタンパク質とほぼ相同なタンパク質をコードする。そのような標的タンパク質としては、癌遺伝子(例えば、myb、myc、fyn、および転座遺伝子でもあるbcr/abl、ras、src、P53、neu、trk、ならびにEGRFなど)によりコードされるタンパク質が挙げられる。標的抗原としての癌遺伝子産物に加えて、抗癌処置および保護的レジメンのための標的タンパク質としては、B細胞リンパ腫により作られる抗体の可変領域およびT細胞リンパ腫のT細胞受容体の可変領域が挙げられ、それらはいくつかの実施形態では、自己免疫疾患のための標的抗原としても用いられる。他の腫瘍関連タンパク質がまた、標的タンパク質として用いられ得るが、それらは腫瘍細胞において高レベルで存在するタンパク質であり、モノクローナル抗体17−IAにより認識されるタンパク質および葉酸塩結合タンパク質またはPSAを含む。
【0089】
本発明は、1つまたはそれ以上の数のいくつかの形態の癌に対して、個体を免疫化するために用いられ得るが、本発明は特に、特定の癌を発症しやすいか、または過去に癌にかかり、従って再発しやすい個体を予防的に免疫化するために有用である。疫学とともに遺伝学および技術における発展によって、個体における癌の発症の見込みの決定およびリスクアセスメントが可能となる。遺伝子スクリーニングおよび/または家族の健康暦を用いて、特定の個体が、いくつかの型の癌のいずれかを発症する見込みを予測することができる。
【0090】
同様に、既に癌を発症した個体、および癌を除去する処置を受けたか、またはさもなければ寛解期の個体は、ぶり返しおよび再発を特に受けやすい。処置レジメンの一部として、そのような個体を、再発と戦うために、その個体が有したと診断された癌に対して免疫化し得る。従って、個体が、ある型の癌を有し再発のリスクがあると一度分かったならば、その個体を、あらゆる将来の癌の出現とも戦う免疫系を準備するべく免疫化し得る。
【0091】
本発明は、過剰増殖性疾患に罹患した個体を処置する方法を提供する。そのような方法において、遺伝子構築物の導入は、標的タンパク質を産生する過剰増殖細胞と戦うべく個体の免疫系を誘導し促進する免疫療法として役立つ。
【0092】
本発明は、自己免疫に関連する標的(細胞受容体、および「自己」に対する抗体を産生する細胞を含む)に対する広範囲にわたる防御免疫応答を与えることにより、自己免疫疾患および自己免疫障害に罹患した個体を処置する方法を提供する。
【0093】
T細胞媒介自己免疫疾患としては、慢性関節リウマチ(RA)、多発性硬化症(MS)、シェーグレン症候群、サルコイドーシス、インスリン依存性真性糖尿病(IDDM)、自己免疫性甲状腺炎、反応性関節炎、強直性脊椎炎、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、乾癬、脈管炎、ヴェーゲナー肉芽腫症、クローン病、および潰瘍性大腸炎が挙げられる。これらの疾患のそれぞれは、内生抗原に結合し、そして自己免疫疾患に関連する炎症カスケードを開始するT細胞受容体によって特性化される。T細胞の多様な領域に対するワクチンの接種は、それらのT細胞を除去するCTLを含む免疫応答を誘発する。
【0094】
RAでは、その疾患に関与するT細胞受容体(TCR)のいくつかの特異的な可変領域が特性化されている。これらのTCRとしては、Vβ−3、Vβ−14、20 Vβ−17、およびVa−17が挙げられる。従って、これらのタンパク質の少なくとも1つをコードするDNA構築物を用いたワクチン接種が、RAに関連するT細胞を標的とする免疫応答を誘発することになる。参照:Howell,M.D.,ら,1991 Proc.Nat.Acad.Sci.USA 88:10921−10925;Piliard,X.,ら,1991 Science 253:325−329;Williams,W.V.,ら,1992 J Clin.Invest.90:326−333;それぞれ引用により本明細書の一部とする。MSでは、その疾患に関与するTCRのいくつかの特異的な可変領域が特性化されている。これらのTCRには、VfPおよびVa−10が含まれる。従って、これらのタンパク質の少なくとも1つをコードするDNA構築物を用いるワクチン接種は、MSに関連するT細胞を標的とする免疫応答を誘発することになる。参照:Wucherpfennig,K.W.,ら,1990 Science 248:1016−1019;Oksenberg,J.R.,ら,1990 Nature 345:344−346;それぞれ引用により本明細書の一部とする。
【0095】
強皮症では、その疾患に関与するTCRのいくつかの特異的な可変領域が特性化されている。これらのTCRには、Vβ−6、Vβ−8、Vβ−14およびVa−16、Va−3C、Va−7、Va−14、Va−15、Va−16、Va−28およびVa−12が含まれる。従って、これらのタンパク質の少なくとも1つをコードするDNA構築物を用いるワクチン接種は、強皮症に関連するT細胞を標的とする免疫応答を誘発することになる。
【0096】
特にTCRの可変領域がまだ特性化されていないT細胞媒介自己免疫疾患に罹患している患者を処置するため、滑膜の生検を行い得る。存在するT細胞のサンプルを採取し、そしてそれらのTCRの可変領域を、標準的な技術を用いて特定し得る。遺伝子ワクチンは、この情報を用いて調製することができる。
【0097】
B細胞媒介自己免疫疾患としては、狼瘡(SLE)、グレーブズ病、重症筋無力症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少症、ぜん息、クリオグロブリン血症、原発性胆汁性硬化症、および悪性貧血が挙げられる。これらの疾患のそれぞれは、内生抗原に結合し、そして自己免疫疾患に関連する炎症カスケードを開始する抗体によって特性化される。抗体の可変領域に対するワクチン接種は、その抗体を産生するB細胞を除去するCTLを含む免疫応答を誘発する。
【0098】
B細胞媒介自己免疫疾患に罹患している患者を処置するため、自己免疫活性に関与する抗体の可変領域が同定されなければならない。生検を実行し得、そして、炎症部位に存在する抗体のサンプルを採取し得る。それらの抗体の可変領域を、標準的な技術を用いて同定し得る。遺伝子ワクチンは、この情報を用いて調製することができる。
【0099】
SLEの場合、1つの抗原はDNAであると考えられている。従って、SLEに対して免疫化される患者においては、患者の血清を抗DNA抗体についてスクリーニングし得、そして、その血清中にみとめられるそのような抗DNA抗体の可変領域をコードするDNA構築物を含むワクチンを調製し得る。
【0100】
TCRおよび抗体の両方の可変領域の中の、共通の構造的な特徴は周知である。特定のTCRまたは抗体をコードするDNA配列は、周知の方法(例えば、引用により本明細書の一部とするKabat,ら1987 Sequence of Proteins of Immunological Interest U.S. Department of Health and Human Services,Bethesda MDに記載された方法)に従って通常見出すことができる。加えて、抗体から機能性の可変領域をクローニングする一般的な方法は、引用により本明細書の一部とするChaudhary,V.K.,ら,1990 Proc.Natl.Acad Sci.USA 87:1066に見出すことができる。
【0101】
遺伝子ワクチンを改善するために免疫調節タンパク質コード配列の発現可能な形態を用いることに加えて、本発明は、改善された弱毒化生ワクチン、および抗原をコードする外来遺伝子を送達する組換えベクターを用いる改善されたワクチンに関する。弱毒化生ワクチンおよび外来抗原を送達する組換えベクターを用いるワクチンの例は、米国特許第4,722,848号;同第5,017,487号;同第5,077,044号;同第5,110,587号;同第5,112,749号;同第5,174,993号;同第5,223,424号;同第5,225,336号;同第5,240,703号;同第5,242,829号;同第5,294,441号;同第5,294,548号;同第5,310,668号;同第5,387,744号;同第5,389,368号;同第5,424,065号;同第5,451,499号;同第5,453,364号;同第5,462,734号;同第5,470,734号;および同第5,482,713号の各明細書に記載され、それぞれ引用により本明細書の一部とする。IL−R15αまたはその機能性断片をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物が提供され、そのヌクレオチド配列は、ワクチンにおいて、発現をもたらすように機能し得る調節配列に機能可能に連結される。本発明による改善されたワクチンを製造するために、遺伝子構築物は、弱毒化生ワクチンおよび組換え体ワクチン中に組み込まれる。
【0102】
本発明は、個体を免疫化する改善された方法であって、DNAワクチン、弱毒化生ワクチン、および組換え体ワクチンを含むワクチン組成物の部分として個体の細胞に遺伝子構築物を送達する工程を含む方法を提供する。その遺伝子構築物は、IL−15受容体αまたはその機能性断片をコードし、ワクチンにおいて、発現をもたらすように機能し得る調節配列に機能可能に連結されるヌクレオチド配列を含む。改善されたワクチンは、細胞性免疫応答を増強させる。
【実施例】
【0103】
マウスをpIL−15とpIL−15Rαで共免疫して、HIV−1 DNAワクチン抗原を用いて誘発された、増強された免疫応答を判定した。データによれば、IL−15とIL−15Rαの組合せは細胞全体の免疫応答を実際に増強したが、驚くべきことに、IL−15RαのプラスミドはIL−15とは無関係に免疫応答を増大させた。重要な点として、誘発されたメモリ応答は、pIL−15とpIL−15Rαとで共免疫されたマウスでのみ維持され、IL−15Rα単体では維持されなかった。初めて行われたこれらの試験から立証されるのは、IL−15Rαタンパク質が単独で、限定された免疫増殖の表現型でアジュバントとして機能し得るということである。
【0104】
[材料および方法]
(ウエスタンブロット法による解析)
標準的なプロトコールに従ってウエスタンブロット解析を行った。ウェル1つ当たり3μgの組換え体IL−15αまたはVPRタンパク質(Abgent)をSDS−PAGEゲル(Cambrex,Rockland,ME)上で走らせ、ニトロセルロースメンブランにブロットし、R&D製またはKK1.23抗ヒトIL−15Rα抗体のいずれかでプローブした。抗マウスIgG−HRP(Zymed)を用いてシグナルを増幅し、ECL(GE Healthcare,Chalfont St.Giles,United Kingdom)で検出した。
【0105】
(DNAプラスミド)
HIV−1gagおよびHIV−1polを発現するDNAワクチン構築物(Kimら、1998)とヒトIL−15(Kutzlerら,2005)を、前述したように準備した。ヒトIL−15Rαのオープンリーディングフレームを、pVAX1およびpTRACERベクター(Invitrogen,Carlsbad,CA)に移した。EcoRI/BamHIまたはNheI/EcoRI(New England Biolabs,Beverly,MA)を利用した制限酵素による消化をそれぞれ用いた。陽性のクローンをシーケンス解析により検証した。
【0106】
(In−vitro翻訳アッセイ)
TNT−T7 Quick Coupled Transcription/Translation Reticulocyte Lysate system(Promega,WI)と[35S]メチオニンを用いて、標識されたIL−15Rαタンパク質産物を作り出した。pVAXベクター単体(陰性対照)またはIL−15Rαおよび[35S]メチオニンを含むpVAXベクターを、製造元の指示に従って反応混合物に添加した。反応は30℃で1時間かけて行った。標識されたタンパク質を、5μgの精製モノクローナル抗IL−15Rα抗体(R&D Systems)またはクローンKK1.23を用いて、RIPAバッファ中で4℃で一晩、回転撹拌させて免疫沈降した。約5mgのプロテインGセファロースビーズ(GE Healthcare)(100mg/mLストックの50μL)を各免疫沈降反応物に添加し、そのサンプルを4℃で2時間、回転撹拌しながらインキュベートした。高濃度の塩とウシ血清アルブミンを含む結合バッファで3回洗浄し、最終的に2×のサンプルバッファに懸濁した。免疫沈降したタンパク質複合体を、5分間ボイルしてセファロースビーズから溶出させ、12%SDS−PAGEゲル(Cambrex)上を走らせた。ゲルを固定し、増幅溶液(GE Healthcare)で処理して、ゲル乾燥機(Bio−Rad,Hercules,CA)で2時間乾燥した。乾燥したゲルを−80度でX線フィルムに露出し、Kodak自動現像機(Kodak,Rochester,NY)を用いて現像した。
【0107】
(間接免疫蛍光アッセイ)
pIL−15Rαプラスミドの発現を確認するための間接免疫蛍光アッセイを、以前に説明された(Ramanathanら,2002)、以下のプロトコールに従って行った。スライドチャンバ(BD Biosciences,Bedford,MA)において、完全DMEM培地プラス10%FBS(Hyclone,Logan,UT)と抗生物質/抗真菌薬(GIBCO,Invitrogen,Carlsbad,CA)中で1チャンバ当たり100,000セルの密度で成長したHeLa細胞(ATCC,Rockville,MD)を、接着できるように一晩おいた。FuGENE 6 Transfection Reagent(Roche Diagnostics,Basel,Switzerland)を製造元のプロトコールに従って用いて、細胞にpIL−15Rα、pTRACER、またはpVAX−1(1μg/ウェル)をトランスフェクトした。トランスフェクトの24時間後に、細胞をPBSで洗浄し、室温で1時間かけて2%PFA/PBSを用いてスライド上に固定した。スライドを、発明者の研究室で作製した5μgのクローンKK1.23マウス抗ヒトIL−15Rα、またはIgG1アイソタイプの対照(R&D systems,Minneapolis,MN)とともに37度で90分間インキュベートした。二次抗体にコンジュゲートした抗マウスIgG−ローダミン(Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA)を1:200で添加し、そのスライドを室温で45分間インキュベートした。室温で10分間DAPI(Molecular Probes,Invitrogen)染色した後、スライドをFluoromount−G培地(Electron Microscopy Sciences,Hatfield,PA)に設置し、蛍光顕微鏡検査のためのPhase3 Image Pro Program(Media Cybernetics,Bethesda,MD)を用いて解析した。
【0108】
(プラスミド免疫化とマウス)
6乃至8週齢の雌BALB/c(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)、C57BL/6(Taconic,Germantown,NY)またはIL−15ノックアウト(Taconic)(Kennedyら、2000)マウスの前脛骨筋に、2週間の間隔をおいて3回注射し、CELLECTRA(登録商標)適応的定電流装置(VGX Pharmaceuticals,The Woodlands,TX)を用いて、以前に説明された(Khanら,2003;Laddyら,2008)電気穿孔処理を行った。全てのマウス実験のために、その動物を、35μgのpVAX1、5μgのHIV−1抗原プラスミド(gag、pol)、10μgのpIL−15、および/または7.5μgの、10μgの、または15μgのpIL−15Rα(各グループあたりn=3−7)で免疫化した。さまざまな遺伝子プラスミドの同時投与では、指定したDNAプラスミドの混合の後、等張クエン酸塩バッファ(Kimら,1998;Kutzlerら,2005)にいれた0.25%塩酸ブピバカイン(Sigma)に注入し,最終容量を40μlとした。全ての動物は、ペンシルベニア大学の温度制御、光サイクル機能付き施設に収容され、その世話は米国国立衛生研究所とペンシルベニア大学のガイドラインに従って行われた。
【0109】
(マウス犠牲処置、サンプル収集、および組織回収の方法)
免疫化スケジュールの指定された複数の時点で、動物を鎮痛剤を用いて沈静化し、血液を採取した後に、当該動物を頚部脱臼により犠牲処置した。各マウスの脾臓を採取して、R10培地(RPMI1640+10%ウシ胎仔血清、抗生物質/抗真菌薬およびB−メルカプトエタノール)を含む15mlの三角管に(実験グループごとに)プールした。滅菌組織培養フードでは、各実験グループからプールされた脾臓/培地混合物を、ストマッカー装置(Seward80、Metrohm,Riverview,FL)を用いて破砕し、単一細胞の懸濁液とした。細胞/組織間質は、40ミクロンのセルストレーナーに通し、R10で洗浄してペレット化して、ACK溶解バッファ(Lonza,Switzerland)中で5分間室温でインキュベートして、赤血球を溶解させた。その後脾細胞をカウントし、後述するように免疫アッセイにて利用した。
【0110】
(IFN−γ ELISPOTアッセイ)
IFN−γ ELISPOTアッセイを、前述したように(Kutzlerら,2005)行って、免疫化されたマウスからの抗原特異的なサイトカインの分泌を判定した。簡潔に説明すると、ELISpot96穴プレートを抗マウスIFN−γ捕捉抗体でコーティングし、4℃で24時間インキュベートする(R&D Systems)。免疫化したマウスからの2×105の脾細胞をELISpotプレートの各ウェルに加え、5%のCO2、37℃で一晩刺激した。この処置は、R10(陰性対照)、コンカナバリンA(陽性対照)、または特定のペプチド(HIV−1gagまたはpol)抗原(10μg/ml)の存在下で行った。11個のアミノ酸で重複し、それぞれのタンパク質の全体にまたがるHIV−1コンセンサスクレードBのサブタイプHIV−1gagおよびpolの15量体ペプチドを、AIDS Reagent and Reference Repository(Frederick、MD)から入手した。CD8欠失実験のために、CD8+T細胞を、抗CD8a(LY−2)抗体(Miltenyi Biotech、Germany)を製造元のプロトコールに従って用いて、ポジティブ磁気選択により全脾細胞から除去した。24時間の刺激の後、プレートを洗浄し、4℃で一晩ビオチン化抗マウスIFN−γ抗体(R&D Systems)とともにインキュベートした。次いでプレートを洗浄し、室温で2時間、ストレプトアビジンアルカリホスファターゼ(R&D Systems)とともにインキュベートした。さらにプレートを洗浄し、5−ブロモ−4−クロロ−3’−インドリルホスフェートp−トルイジン塩(BCIP)とニトロブルー塩化テトラゾリウム(NBT)(クロモゲン着色試薬、R&D Systems)を加えた。プレートを蒸留水でリンスし、室温で乾燥させた。そして、自動化されたELISpotリーダー(CTL Limited,Inc. Cleveland,OH)によってスポットをカウントした。生の値を決定しそれを5倍して、データが100万個の脾細胞あたりのセル形成スポットとして表現されるようにした。グラフに描く前に、グラフ各グループのR10ウェルでのバックグラウンド値をペプチド刺激されたウェルの値から差し引いた。
【0111】
細胞内サイトカイン染色HIV−1特異的T細胞応答も、Cytofix/Cytopermキットと標準プロトコール(BD Biosciences)を用いた細胞内サイトカイン染色により決定した。免疫化マウスからの脾細胞を、R10およびDMSO(陰性対照)、10ng/mlのPMAおよび250ng/mlのイオノマイシン(陽性対照)、またはHIV−1コンセンサスクレードBgagまたはpolの15量体のペプチドとともに、1ul/mlのGolgiPlug(BD Biosciences)の存在下で5時間刺激した。表面染色の前に、細胞を37℃で10分間 LIVE/DEAD fixable violetキット(分子プローブ、Invitrogen)で染色し、Fcブロック(BD)を加えて4度で15分間おきFc受容体をブロックした。全抗体はBD Biosciencesから購入し、試験1回あたり1μlを使用した。透過/固定化処理の前に細胞を、40℃で30分間、CD4−Alexa700およびCD8−PerCPで染色した。4度で45分間の細胞内染色では、CD3−PECy5およびIFN−γPE−Cy7を含めた。50000の生きたCD3+リンパ球作動性イベントからのデータを、LSRIIフローサイトメーター(BD Biosciences)を用いて取得し、FlowJoソフトウェア(Treestar,Inc.,Ashland、OR)を使用して解析した。グラフに描く前に、陰性対照ウェルからの応答を抗原刺激のものから差し引いた。
【0112】
(HIV−1Gag結合抗体の解析)
以前に説明されたように(Ogawaら,1989;Mesteckyら,2004)、ELISAを用いて、マウス血清中のHIV−1Gag特異的抗体IgGの有無を判定した。EIA/RIAプレート(Corning Costar,Cambridge,MA)を、ウェル当たり100μlの最終容量にPBS(Mediatech,Herndon,VA)で希釈した1μg/mlの組換え体HIV−1IIIBgag p24遺伝子(Immunodiagnostics,Woburn,MA)でコーティングした後、4℃で一晩インキュベートした。プレートをPBS−Tween(0.05%のTween20)で洗浄し、200μlのブロッキングバッファ/希釈液(PBS中3%BSA)を用いて室温で2時間かけて非特異的結合に対してブロックした。プレートを洗浄し、免疫化マウス由来のプールした血清の希釈液を、1/10から1/1600までの希釈度で3部づつ(ウェルあたり100μl)加え、室温で2時間インキュベートした。結合した抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識したヤギ抗マウスIgG(H+L)(Zymed)で検出し、基質TMB H2O2(Sigma−Aldrich)で現像検出した。呈色反応を2N H2SO4で停止し、450nmでの吸光度をEL312 Bio−Kineticsマイクロプレートリーダー(Bio−Tek Instruments Inc.、Winooski,VT)で読み取った。
【0113】
[結果]
(抗ヒトIL−15Rα抗体の生成)
市販の抗体は細胞上のIL−15Rαプラスミド(pIL−15Rα)の発現を検出する能力が不十分なので、ヒトIL−15Rαに対してモノクローナル抗体を生成した。組換え体ヒトIL−15Rαは、以下のように作製した。
【0114】
組換え体ヒトIL−15Rαタンパク質は、Abgent(San Diego,CA)に作製させた。ヒトIL−15Rαのオープンリーディングフレーム(Thomas Waldmann(NCI,NIH,Bethesda,MD)からの贈与)を、高発現細菌ベクターpET21a(EMD Biosciences,Gibbstown,NJ)にクローン化した。コンピテント細胞を、大腸菌内に形質転換して増幅し、組換え体タンパク質をNi−NTAカラムを用いて精製した。精製タンパク質の精製度は、抗ヒトIL−15Rα抗体(R&D Systems,Minneapolis,MN)を用いた直接ELISAにより確認した。
【0115】
新しく生成されたIL−15Rαタンパク質の大きさを確認するために、精製タンパク質の濃度を順次減らした希釈液を、SDS−PAGEゲル上を走らせて、クマシーブルー色素で染色した(図1A)。図1Aに示すように、生成されたタンパク質は、予想されたサイズである約30kDaに動いた。このタンパク質について、その適正な完全さの指標として、市販の抗体に結合する能力の有無を検査した。図1Bは、組換え体IL−15Rα、または陰性対照であるVPRタンパク質を結合したプレートのELISAアッセイを示す。VPRはIL−15Rαタンパク質と同様の方法によって製造されるので、これを用いた。図1Bは、市販の抗ヒトIL−15Rα抗体が、生成された組換えタンパク質を検出できることを示す。
【0116】
IL−15Rαに対する抗体を生成するため、組換え体ヒトIL−15Rαタンパク質を、以下に説明するように図1Cに示すBALB/cマウスに注射した。
【0117】
モノクローナル抗体を生成するため、組換え体ヒトIL−15Rαタンパク質をBALB/cマウス(n=4)に注射した。各注射のたびに、完全フロイントアジュバント(初回の接種のみ)や不完全フロイントアジュバント(その後の接種)に乳化した5μgの全タンパク質を与えた(Sigma,St.Louis,MO)。50μlをそれぞれの脇腹に皮下注射し、100μlを腹腔に注射した。細胞融合処理の3日前に、マウスに対して、滅菌したPBS中の35μgのタンパク質の静脈内への最終追加接種を行った。次に血清中の抗体標識を、組換え体IL−15Rαタンパク質と抗マウスIgG−HRP(Zymed,San Francisco,CA)を用いて直接ELISAにより測定した。IL−15Rαに対する抗体の力価が1:8,000のマウス1匹を、そこから切除された脾臓と骨髄腫細胞株との細胞融合を行うために犠牲処置した。1500のハイブリドーマ上清をELISAによってスクリーニングし、8個の陽性クローンを増殖し、そのうちの1つを硫酸アンモニウムのカラムと抗体KK1.23により精製した。モノクローナル抗体の作製と精製を、Wistar Institute Hybridoma FacilityのJulia Conicello(Philadelphia、PA)に依頼した。
【0118】
図1Dに示すように、ELISA法により約1500のハイブリドーマの培養上清をスクリーニングした後、1つのハイブリドーマKK1.23が抗体の力価(>1〜12,800)を示した。その後このハイブリドーマを、クローン化し増殖させて、精製した。精製した抗体KK1.23は、図1Eのウエスタンブロット解析によって示すように、ヒトIL−15Rαに特異的である。さらに、KK1.23は、市販の抗体(図1E)よりも高い親和性をもってヒトIL−15Rαに結合するとみられる。
【0119】
(pIL−15Rαによる生物活性タンパク質の発現)
ワクチン接種の試験に適するIL−15Rα発現ベクターを作製した。CMVプロモーターの制御の下、図2Aに示すようにヒトIL−15RαORFをpVAX1発現ベクターにクローン化した。IL−15Rαプラスミドが適切に発現していることを評価するため、in vitro翻訳アッセイを行った。予想通り、対照プラスミドのpVAXは一切の検出可能なタンパク質産物を作り出さなかったのに対し、S35放射性標識したタンパク質が概ね30.0kDに移行したことが図2B及び図2Cに示されている。ヒトIL−15Rαに対する市販のR&Dの抗体(図2B)またはKK1.23抗体(図2C)抗体を利用して、放射性標識タンパク質を免疫沈降した。
【0120】
プラスミドIL−15Rαの発現を確認するために、上述の実施例1のKK1.23抗体を用いて免疫蛍光アッセイを行った。ヒトIL−15RαのORFを、緑色蛍光タンパク質(GFP)レポーターもコードしているpTRACER発現ベクターにクローン化した。従って、緑色に蛍光発色する細胞(図2E−図2G)も、pIL−15Rαを発現している。KK1.23抗ヒトIL−15Rαは、抗マウスIgG−PEを用いて検出される(赤)。トランスフェクトされていない対照は図2Dに、アイソタイプ対照は図2Eに示されている。前記データは、pIL−15Rαプラスミドの発現能力、ならびに抗ヒトPIL−15Rα抗体の翻訳されたタンパク質産物を検出する能力を示している。pIL−15Rαプラスミドは、立体構造的に正確かつ表面局在したタンパク質をコードする。
【0121】
(pIL−15とアジュバントとしてのpIL−15Rαの結合)
pIL−15と比較したpIL−15Rαの免疫応答を増強する能力を調べるために、BALB/cマウスに対して、図3Aに示すスケジュールに従い、in vivoでの電気穿孔処理を伴う前脛骨筋への筋肉内免疫化処理を行った。マウスを、pVAX対照ベクター、または5μgの抗原性構築物(HIV−1gag、HIV−1pol)のいずれかとともに、10μgのpIL−15、15μgのpIL−15Rα、またはpIL−15とpIL−15Rαの両方の最終容量40μlのいずれかで免疫化した。これらの用量は、予備試験(データは示さず)において、最適な応答を与えるために予め決定された。図3Bに示すように、抗原性構築物の単体で免疫化すると、IFN−γELISpotにより測定したとき、106の脾細胞あたり2300のスポット形成細胞(SFC)が生じた。pIL−15の添加により3800SFCまで応答が増強したが、pIL−15RαとpIL−15とで共免疫すると抗原群単独に対して最も劇的な増加を示し、5900SFCとなった。これらの結果は、IL−15/IL−15Rα免疫複合体の形成が、IL−15単独よりも強力なアジュバントとして機能し得るという説を裏づけている。
【0122】
この免疫複合体が実際にin vivoで形成されたか否かを判定するため、pIL−15およびPpL−15Rαが(抗原とともに)それぞれ別々の脚に注射された、もう1つの免疫化グループを追加した。この分割供給方式では、プラスミドで供給されたIL−15およびIL−15Rαは、免疫複合体を形成できなくなる。別々の脚へのPIL−15およびIL−15Rαの共免疫化は、同じ組合せを同じ脚に供給したときに観察されたものと類似レベルのIFN−γ(それぞれ4562SFC、4072SFC)を誘発することが判明した。
【0123】
抗原性構築物とpIL−15Rαでの免疫化グループはまた、約3500SFCに抗原特異的IFN−γ分泌も増強する(図3B)ことに留意されたい。これらの結果を確認するため、本発明者は、pIL−15Rαが用量依存的に応答を誘発するか否かを確認するべく、抗原性構築物とともに漸次増加させた用量のpIL−15Rαプラスミドでマウスの新しい組を免疫化した。図4に示すように、pIL−15Rαを含めても、pGagに対する応答(パネルA)またはpPolに対する応答(パネルB)をそれぞれ測定した結果、誘導されるIFN−γ分泌は用量依存的に増加しなかった。HIV−1抗原性構築物の使用の有無にかかわらず、最高用量で使用したpIL−15Rαとの共免疫化によって細胞の免疫応答は1.5倍から2倍に増大した。注目すべき点として、IL−15Rαは、IL−15の不存在下であっても抗原特異的免疫応答を増強するとみられる。
【0124】
さらにpIL−15Rαのアジュバント特性を確認するため、ワクチン接種の後のCD4+およびCD8+T細胞のエフェクタ機能を調べた。IFN−γELISpotアッセイを実施する前に、CD8+T細胞を、前述のように各ワクチンの組合せで免疫化したマウスの脾細胞から除去した。図5Aに示すように、pIL−15、pIL−15Rα、または両方の組合せで免疫化されたマウスの脾細胞からのCD8+T細胞の除去処理により、検出されたIFN−γ分泌の量は有意に減少した。いずれの免疫化グループにおいても、全脾細胞において観察された全免疫応答(黒色)と比較したCD4+T細胞の占める程度(灰色)の間に差はみられなかった。以上を総合すると、ワクチン接種戦略におけるpIL−15RαとpIL−15の組合せは、それぞれ単独の構築物を用いた場合より大幅に免疫応答を増強する。この相加効果は、CD8+T細胞集団が除去された場合には当該効果は失われたことから、主としてCD8+T細胞に作用する。
【0125】
pIL−15Rαが体液性免疫応答にも影響を与えるか否かを判定する判断するため、各ワクチン接種戦略において誘発される免疫応答もELISAによって測定した。免疫化したマウスからの血清をアッセイして、HIV−1Gag(p24)タンパク質に対するIgG抗体のレベルを測定した(図5B)。細胞性免疫の誘発にはpIL−15とpIL−15Rαの組合せが最もよい結果が得られたが、pIL−15、pIL−15Rαのいずれか単体で免疫化したマウスでのHIV−1特異的抗体の力価(1:1600)は、pVAXで免疫化したマウスの場合(検出されず)、pGag単独でまたはpVAXとpGagの組合せで免疫化したマウスの場合(1:800)と比較して最も高くなった。
【0126】
(CD8+T細胞メモリを増強しないとみられるpIL−15Raアジュバント)
マウスは、本明明細書中で前述したように3回免疫したが、3回目の免疫の一週間後にこれらのマウスを犠牲処置する代わりに約30週間の無処置期間をおくと、観察される応答が主としてメモリ細胞の集団によるものであることが確実となる。図6Aに示すように、有意な無処置期間の後の応答は依然として非常に堅調であった。単独の抗原性構築物で免疫化したマウスは、概ね1700SFCの応答を有していた。最大の応答は、pIL−15との共免疫のグループであることは明らかであり、pIL−15と、pIL−15/pIL−15Raの組合せの両方で〜2800SFCであった。pIL−15の不存在下でのpIL−15Rαとの共免疫では、アジュバントの効果はもはや観察されなかった(〜1700SFC)。同じ傾向はまた、細胞内サイトカイン染色とフローサイトメトリー(図6B)によっても観察され、ここではCD8+T細胞によるIFN−γ産生のレベルは、pIL−15との共免疫化マウスにおいて最も顕著であった。pIL−15が大きな影響を与えることが観察されたのに対し、ワクチン接種戦略においてpIL−15Rαを追加しても、メモリ細胞の応答にはほとんど影響がないことが観察された。従って、pIL−15Rαはワクチン接種の直後には強力なアジュバントであったが、時間の経過とともに、IL−15がメモリCD8+T細胞の優れた誘発物質となるという理論が裏付けられる。
【0127】
メモリ細胞の抗体応答は、エフェクタ期で観察されたものと同様であった。図6Cに示すように、pIL−15で免疫したマウスでは、希釈列から検出可能なHIV−1Gag(P24)に対する抗体が1:1600まであったが、pIL−15とpIL−15Rαの組合せを含む他の全てのグループでは、希釈したものから検出された抗体が1:400であった。pIL−15は、細胞性のメモリ応答のみならず体液性の応答の発生においても効果的なアジュバントであることを示しているが、一方pIL−15Rαは、抗原に対する急性の免疫応答の促進に一定の役割を果たしているとみられる。
【0128】
(IL−15のないpIL−15Rαアジュバント)
ヒトIL−15Rαタンパク質は、内生のマウスIL−15と複合体を形成することにより、ワクチン接種したマウスの免疫応答を増強し得るか否かを調べるため、またはIL−15とは無関係に、IL−15ノックアウトマウスでワクチン接種を試験した。最初に、対照として、翻訳されたヒトIL−15Rαタンパク質のマウスIL−15への結合の有無について試験した。図7Aに示すように、マウスIL−15とともにインキュベートした、S35放射標識されたヒトIL−15Rαタンパク質は、抗マウスIL−15抗体とともに免疫沈降させることができ、このことは、マウスIL−15のヒトIL−15Rαに結合する能力を示唆している。
【0129】
マウスIL−15の不存在下でpIL−15Rαのアジュバントとなる能力を調べた。従って、IL−15ノックアウトマウスでの同様のワクチン接種の試験、即ち内生IL−15を欠いており、結果としてNK細胞およびメモリCD8+T細胞の欠失した条件でのワクチン接種の試験を行った(Kennedyら,2000)。図7Cは、ノックアウトマウスでの内生マウスIL−15の不存在下でpIL−15Rαは免疫応答を増強することが、IFN−γELISpotにより判明したことを示す。また、pIL−15とpIL−15Rαの組合せは、最初にBALB/cマウスで観察されたようにいずれかのアジュバントを単独で投与された場合より免疫応答を増強することはない。IL−15−/−マウスは、TaconicのC57/BL6バックグラウンド上で作製した。従って、適切なバックグラウンド対照マウスで、BALB/cで観察されたのと同様の免疫応答が得られるか否かを確認するため、同じ実験を反復した。図7Bは、同一のスケジュールで免疫化した対照マウスからの結果を示しており、BALB/c免疫化マウスと同様の傾向を示している。
【0130】
[結論]
ヒトIL−15およびHIV−1抗原性DNA構築物とIL−15Rα構築物との共免疫化は、抗原性構築物単体で免疫化した場合より、2.5倍のIFN−γ分泌レベルの増強をもたらした(図3B)。ELISpot上に置く前のCD8+T細胞の除去処理がIFN−γの分泌を10分の1に減らしたことから、IFN−γ分泌はCD8+T細胞によるものであった。pIL−15およびpIL−15Raを別々の脚に(抗原とともに)注射しても、同じ脚に供給した場合と類似の免疫応答が誘発されることから、IL−15/IL−15Rαの組合せを与えた場合に観察された効力の増加は、トランスフェクトされた細胞での安定な複合体の形成によるものではないとみられる。従って、pIL−15/pIL−15Rαの同時供給で観察された応答の増強は、2つの独立したアジュバントの相加効果である可能性が高い。これら2つのアジュバントを同時供給しても、血清中のIgG抗体によって測定される体液性免疫応答の増強もみられなかった。
【0131】
pIL−15/pIL−15Rαの組合せの免疫応答に対する長期的な影響も調べた。メモリの応答を観察するため、免疫の解析を実施する前に3回目の免疫化から30週間無処置においた。その結果から、これら2つのアジュバントの組合せは、免疫応答の初期段階で強力なCD8+T細胞応答を誘発するが、メモリT細胞への影響は主としてpIL−15と共に免疫化したマウスのみでしか観察されないことが分かった。抗原単独の場合よりメモリ応答を増強するためには、pIL−15を含めることが必要であった。同様に、IL−15Rαは、最初にIL−15と等しいかそれより大きいの免疫応答を誘発するが、それはメモリ応答を維持する助けにはならなかった。従って、IL−15Rαがバーストサイズまで増大しても、メモリに対するIL−15シグナルの不存在下でのバーストサイズは、長期的な応答を維持するために不十分であった。
【0132】
驚くべき所見としては、pIL−15Rαを含む抗原性プラスミドの供給によっても細胞性免疫応答は増強され、pIL−15によって誘発されたものに等しくなった。確認のため、複数の免疫化処理をpIL−15Rαの量を増加させながら行い、用量依存的な応答を観察した。これは、マウスIL−15はヒトIL−15と〜73%相同であるため(Andersonら,1995a)、ヒトIL−15Rαタンパク質は内生マウスIL−15に結合し、それを同様に転移させられるということであるとみられる。この仮説を調べるため、内生IL−15を欠くIL−15ノックアウトマウスを免疫化した。pIL−15Rαで免疫化されたIL−15ノックアウトマウスにおいて、抗原単独の場合のおよそ2倍の増加が観察された。6−8週齢IL−15−/−のメスのマウスを大量に得ることが困難であるため、これらの実験からpIL−15のグループは除外した。しかし、pIL−15/pIL−15Rαの組合せの増強効果はもはや観察されなかった。対照のC57/BL6マウスは、BALB/cマウスで見られたのと同じ傾向を示す(総スポット数は小さく、pVAXグループでのバックグラウンドは高いが)こと、およびIL−15ノックアウトマウスはC57/BL6マウスに比較した場合でも全体的に低い応答を示したことに留意すべきである。これらのマウスは、ワクシニアチャレンジ感染に対する防御ができないなど、多少欠陥のあるホストの防御応答を有することが以前に報告されている(Kennedyら,2000)。全体的な免疫応答が低いにもかかわらず、pIL−15Rαのアジュバント効果は、あらゆる内生IL−15の不存在下でも依然として観察された。この理論によって拘束されることを意図するものではないが、十分に結果を考慮すると、IL−15Rαは、IL−15から独立して応答を誘発することができる新規なアジュバントとして機能し得ると考えられる。この免疫応答の増幅は、ホストT細胞応答のメモリ期より急性期での免疫の増大に特に集中しているとみられる。
【0133】
(参考文献)
AMARA,R.R.,VILLINGER,F.,ALTMAN,J.D.,LYDY,S.L.,O’NEIL,S.P.,STAPRANS,S.I.,MONTEFIORI,D.C.,XU,Y.,HERNDON,J.G.,WYATT,L.S.,CANDIDO,M.A.,KOZYR,N.L.,EARL,P.L.,SMITH,J.M.,MA,H.L.,GRIMM,B.D.,HULSEY,M.L.,MILLER,J.,MCCLURE,H.M.,MCNICHOLL,J.M.,MOSS,B.,およびROBINSON,H.L.(2001).Control of a mucosal challenge and prevention of AIDS by a multiprotein DNA/MVA vaccine. Science(New York,N.Y 292,69−74.
ANDERSON,D.M.,JOHNSON,L.,GLACCUM,M.B.,COPELAND,N.G.,GILBERT,D.J.,JENKINS,N.A.,VALENTINE,V.,KIRSTEIN,M.N.,SHAPIRO,D.N.,MORRIS,S.W.,ら(1995a).Chromosomal assignment and genomic structure of Il15. Genomics 25, 701−706.
ANDERSON,D.M.,KUMAKI,S.,AHDIEH,M.,BERTLES,J.,TOMETSKO,M.,LOOMIS,A.,GIRI,J.,COPELAND,N.G.,GILBERT,D.J.,JENKINS,N.A.,ら(1995b).Functional characterization of the human interleukin−15 receptor alpha chain and close linkage of IL15RA and IL2RA genes. The Journal of biological chemistry 270, 29862−29869.
BAMFORD,R.N.,DEFILIPPIS,A.P.,AZIMI,N.,KURYS,G.,およびWALDMANN,T.A.(1998).The 5’ untranslated region, signal peptide, and the coding sequence of the carboxyl terminus of IL−15 participate in its multifaceted translational control. J Immunol 160, 4418−4426.
BAROUCH,D.H.,SANTRA,S.,SCHMITZ,J.E.,KURODA,M.J.,FU,T.M.,WAGNER,W.,BILSKA,M.,CRAIU,A.,ZHENG,X.X.,KRIVULKA,G.R.,BEAUDRY,K.,LIFTON,M.A.,NICKERSON,C.E.,TRIGONA,W.L.,PUNT,K.,FREED,D.C.,GUAN,L.,DUBEY,S.,CASIMIRO,D.,SIMON,A.,DAVIES,M.E.,CHASTAIN,M.,STROM,T.B.,GELMAN,R.S.,MONTEFIORI,D.C.,LEWIS,M.G.,EMINI,E.A.,SHIVER,J.W.,およびLETVIN,N.L.(2000).Control of viremia and prevention of clinical AIDS in rhesus monkeys by cytokine−augmented DNA vaccination. Science (New York, N.Y 290, 486−492.
BECKER,T.C.,WHERRY,E.J.,BOONE,D.,MURALI−KRISHNA,K.,ANTIA,R.,MA,A.,andAHMED,R.(2002).Interleukin 15 is required for proliferative renewal of virus−specific memory CD8 T cells. The Journal of experimental medicine 195, 1541−1548.
BERGAMASCHI,C.,ROSATI,M.,JALAH,R.,VALENTIN,A.,KULKARNI,V.,ALICEA,C.,ZHANG,G.M.,PATEL,V.,FELBER,B.K.,およびPAVLAKIS,G.N.(2008).Intracellular interaction of interleukin−15 with its receptor alpha during production leads to mutual stabilization and increased bioactivity. The Journal of biological chemistry 283, 4189−4199.
BETTS,M.R.,KROWKA,J.F.,KEPLER,T.B.,DAVIDIAN,M.,CHRISTOPHERSON,C.,KWOK,S.,LOUIE,L.,ERON,J.,SHEPPARD,H.,およびFRELINGER,J.A.(1999).Human immunodeficiency virus type 1−specific cytotoxic T lymphocyte activity is inversely correlated with HIV type 1 viral load in HIV type 1−infected long−term survivors. AIDS research and human retroviruses 15, 1219−1228.
BOYER,J.D.,ROBINSON,T.M.,KUTZLER,M.A.,VANSANT,G.,HOKEY,D.A.,KUMAR,S.,PARKINSON,R.,WU,L.,SIDHU,M.K.,PAVLAKIS,G.N.,FELBER,B.K.,BROWN,C.,SILVERA,P.,LEWIS,M.G.,MONFORTE,J.,WALDMANN,T.A.,ELDRIDGE,J.,およびWEINER,D.B.(2007).Protection against simian/human immunodeficiency virus (SHIV) 89.6P in macaques after coimmunization with SHIV antigen and IL−15 plasmid. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 104, 18648−18653.
BULANOVA,E.,BUDAGIAN,V.,POHL,T.,KRAUSE,H.,DURKOP,H.,PAUS,R.,およびBULFONE−PAUS,S.(2001).The IL−15R alpha chain signals through association with Syk in human B cells. J Immunol 167, 6292−6302.
BURKETT,P.R.,KOKA,R.,CHIEN,M.,CHAI,S.,BOONE,D.L.,およびMA,A.(2004).Coordinate expression and trans presentation of interleukin (IL)−15Ralpha and IL−15 supports natural killer cell and memory CD8+ T cell homeostasis. The Journal of experimental medicine 200, 825−834.
BURKETT,P.R.,KOKA,R.,CHIEN,M.,CHAI,S.,CHAN,F.,MA,A.,およびBOONE,D.L.(2003).IL−15R alpha expression on CD8+ T cells is dispensable for T cell memory. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 100, 4724−4729.
CALAROTA,S.A.,DAI,A.,TROCIO,J.N.,WEINER,D.B.,LORI,F.,およびLISZIEWICZ,J.(2008).IL−15 as memory T−cell adjuvant for topical HIV−1 DermaVir vaccine. Vaccine.
CAO,Y.,QIN,L.,ZHANG,L.,SAFRIT,J.,およびHO,D.D.(1995).Virologic and immunologic characterization of long−term survivors of human immunodeficiency virus type 1 infection. The New England journal of medicine 332, 201−208.
DUBOIS,S.,MARINER,J.,WALDMANN,T.A.,およびTAGAYA,Y.(2002).IL−15Ralpha recycles and presents IL−15 In trans to neighboring cells. Immunity 17, 537−547.
DUITMAN,E.H.,ORINSKA,Z.,BULANOVA,E.,PAUS,R.,およびBULFONE−PAUS,S.(2008).How a cytokine is chaperoned through the secretory pathway by complexing with its own receptor: lessons from IL−15/IL−15R{alpha}. Molecular and cellular biology.
FULLER,D.H.,LOUDON,P.,およびSCHMALJOHN,C.(2006).Preclinical and clinical progress of particle−mediated DNA vaccines for infectious diseases. Methods (San Diego, Calif 40, 86−97.
GAO,F.,LI,Y.,DECKER,J.M.,PEYERL,F.W.,BIBOLLET−RUCHE,F.,RODENBURG,C.M.,CHEN,Y.,SHAW,D.R.,ALLEN,S.,MUSONDA,R.,SHAW,G.M.,ZAJAC,A.J.,LETVIN,N.,およびHAHN,B.H.(2003).Codon usage optimization of HIV type 1 subtype C gag, pol, env, and nef genes: in vitro expression and immune responses in DNA−vaccinated mice. AIDS research and human retroviruses 19, 817−823.
GIRI,J.G.,AHDIEH,M.,EISENMAN,J.,SHANEBECK,K.,GRABSTEIN,K.,KUMAKI,S.,NAMEN,A.,PARK,L.S.,COSMAN,D.,およびANDERSON,D.(1994).Utilization of the beta and gamma chains of the IL−2 receptor by the novel cytokine IL−15. The EMBO journal 13, 2822−2830.
GIRI,J.G.,ANDERSON,D.M.,KUMAKI,S.,PARK,L.S.,GRABSTEIN,K.H.,およびCOSMAN,D.(1995).IL−15, a novel T cell growth factor that shares activities and receptor components with IL−2. Journal of leukocyte biology 57, 763−766.
HALWANI,R.,BOYER,J.D.,YASSINE−DIAB,B.,HADDAD,E.K.,ROBINSON,T.M.,KUMAR,S.,PARKINSON,R.,WU,L.,SIDHU,M.K.,PHILLIPSON−WEINER,R.,PAVLAKIS,G.N.,FELBER,B.K.,LEWIS,M.G.,SHEN,A.,SILICIANO,R.F.,WEINER,D.B.,およびSEKALY,R.P.(2008).Therapeutic vaccination with simian immunodeficiency virus (SIV)−DNA+IL−12 or IL−15 induces distinct CD8 memory subsets in SIV−infected macaques. J Immunol 180, 7969−7979.
HOKEY,D.A.,およびWEINER,D.B.(2006).DNA vaccines for HIV: challenges and opportunities. Springer seminars in immunopathology 28, 267−279.
JIN,X.,BAUER,D.E.,TUTTLETON,S.E.,LEWIN,S.,GETTIE,A.,BLANCHARD,J.,IRWIN,C.E.,SAFRIT,J.T.,MITTLER,J.,WEINBERGER,L.,KOSTRIKIS,L.G.,ZHANG,L.,PERELSON,A.S.,およびHO,D.D.(1999).Dramatic rise in plasma viremia after CD8(+) T cell depletion in simian immunodeficiency virus−infected macaques. The Journal of experimental medicine 189, 991−998.
KENNEDY,M.K.,GLACCUM,M.,BROWN,S.N.,BUTZ,E.A.,VINEY,J.L.,EMBERS,M.,MATSUKI,N.,CHARRIER,K.,SEDGER,L.,WILLIS,C.R.,BRASEL,K.,MORRISSEY,P.J.,STOCKING,K.,SCHUH,J.C.,JOYCE,S.,およびPESCHON,J.J.(2000).Reversible defects in natural killer and memory CD8 T cell lineages in interleukin 15−deficient mice. The Journal of experimental medicine 191, 771−780.
KHAN,A.S.,SMITH,L.C.,ABRUZZESE,R.V.,CUMMINGS,K.K.,POPE,M.A.,BROWN,P.A.,およびDRAGHIA−AKLI,R.(2003).Optimization of electroporation parameters for the intramuscular delivery of plasmids in pigs. DNA and cell biology 22, 807−814.
KIM,J.J.,NOTTINGHAM,L.K.,SIN,J.I.,TSAI,A.,MORRISON,L.,OH,J.,DANG,K.,HU,Y.,KAZAHAYA,K.,BENNETT,M.,DENTCHEV,T.,WILSON,D.M.,CHALIAN,A.A.,BOYER,J.D.,AGADJANYAN,M.G.,およびWEINER,D.B.(1998).CD8 positive T cells influence antigen−specific immune responses through the expression of chemokines. The Journal of clinical investigation 102, 1112−1124.
KOKA,R.,BURKETT,P.,CHIEN,M.,CHAI,S.,BOONE,D.L.,およびMA,A.(2004).Cutting edge: murine dendritic cells require IL−15R alpha to prime NK cells. J Immunol 173, 3594−3598.
KOUP,R.A.,SAFRIT,J.T.,CAO,Y.,ANDREWS,C.A.,MCLEOD,G.,BORKOWSKY,W.,FARTHING,C.,およびHO,D.D.(1994).Temporal association of cellular immune responses with the initial control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 syndrome. Journal of virology 68, 4650−4655.
KU,C.C.,MURAKAMI,M.,SAKAMOTO,A.,KAPPLER,J.,およびMARRACK,P.(2000).Control of homeostasis of CD8+ memory T cells by opposing cytokines. Science (New York, N.Y 288, 675−678.
KUTZLER,M.A.,ROBINSON,T.M.,CHATTERGOON,M.A.,CHOO,D.K.,CHOO,A.Y.,CHOE,P.Y.,RAMANATHAN,M.P.,PARKINSON,R.,KUDCHODKAR,S.,TAMURA,Y.,SIDHU,M.,ROOPCHAND,V.,KIM,J.J.,PAVLAKIS,G.N.,FELBER,B.K.,WALDMANN,T.A.,BOYER,J.D.,およびWEINER,D.B.(2005).Coimmunization with an optimized IL−15 plasmid results in enhanced function and longevity of CD8 T cells that are partially independent of CD4 T cell help. J Immunol 175, 112−123.
LADDY,D.J.,YAN,J.,KUTZLER,M.,KOBASA,D.,KOBINGER,G.P.,KHAN,A.S.,GREENHOUSE,J.,SARDESAI,N.Y.,DRAGHIA−AKLI,R.,およびWEINER,D.B.(2008).Heterosubtypic protection against pathogenic human and avian influenza viruses via in vivo electroporation of synthetic consensus DNA antigens. PLoS ONE 3, e2517.
LEIFERT,J.A.,RODRIGUEZ−CARRENO,M.P.,RODRIGUEZ,F.,およびWHITTON,J.L.(2004).Targeting plasmid−encoded proteins to the antigen presentation pathways. Immunological reviews 199, 40−53.
LI,W.,LI,S.,HU,Y.,TANG,B.,CUI,L.,およびHE,W.(2008).Efficient augmentation of a long−lasting immune responses in HIV−1 gag DNA vaccination by IL−15 plasmid boosting. Vaccine 26, 3282−3290.
LODOLCE,J.P.,BOONE,D.L.,CHAI,S.,SWAIN,R.E.,DASSOPOULOS,T.,TRETTIN,S.,およびMA,A.(1998).IL−15 receptor maintains lymphoid homeostasis by supporting lymphocyte homing and proliferation. Immunity 9, 669−676.
LODOLCE,J.P.,BURKETT,P.R.,BOONE,D.L.,CHIEN,M.,およびMA,A.(2001).T cell−independent interleukin 15Ralpha signals are required for bystander proliferation. The Journal of experimental medicine 194, 1187−1194.
LUCAS,M.,SCHACHTERLE,W.,OBERLE,K.,AICHELE,P.,およびDIEFENBACH,A.(2007).Dendritic cells prime natural killer cells by trans−presenting interleukin 15. Immunity 26, 503−517.
MESTECKY,J.,JACKSON,S.,MOLDOVEANU,Z.,NESBIT,L.R.,KULHAVY,R.,PRINCE,S.J.,SABBAJ,S.,MULLIGAN,M.J.,およびGOEPFERT,P.A.(2004).Paucity of antigen−specific IgA responses in sera and external secretions of HIV−type 1−infected individuals. AIDS Res Hum Retroviruses 20, 972−988.
MOORE,A.C.,KONG,W.P.,CHAKRABARTI,B.K.,およびNABEL,G.J.(2002).Effects of antigen and genetic adjuvants on immune responses to human immunodeficiency virus DNA vaccines in mice. Journal of virology 76, 243−250.
MORROW,M.P.,およびWEINER,D.B.(2008).Cytokines as adjuvants for improving anti−HIV responses. AIDS (London, England) 22, 333−338.
MUSEY,L.,HUGHES,J.,SCHACKER,T.,SHEA,T.,COREY,L.,およびMCELRATH,M.J.(1997).Cytotoxic−T−cell responses, viral load, and disease progression in early human immunodeficiency virus type 1 infection. The New England journal of medicine 337, 1267−1274.
OGAWA,T.,TARKOWSKI,A.,MCGHEE,M.L.,MOLDOVEANU,Z.,MESTECKY,J.,HIRSCH,H.Z.,KOOPMAN,W.J.,HAMADA,S.,MCGHEE,J.R.,およびKIYONO,H.(1989).Analysis of human IgG and IgA subclass antibody−secreting cells from localized chronic inflammatory tissue. J Immunol 142, 1150−1158.
OGG,G.S.,JIN,X.,BONHOEFFER,S.,DUNBAR,P.R.,NOWAK,M.A.,MONARD,S.,SEGAL,J.P.,CAO,Y.,ROWLAND−JONES,S.L.,CERUNDOLO,V.,HURLEY,A.,MARKOWITZ,M.,HO,D.D.,NIXON,D.F.,およびMCMICHAEL,A.J.(1998).Quantitation of HIV−1−specific cytotoxic T lymphocytes and plasma load of viral RNA. Science (New York, N.Y 279, 2103−2106.
OH,S.,BERZOFSKY,J.A.,BURKE,D.S.,WALDMANN,T.A.,およびPERERA,L.P.(2003).Coadministration of HIV vaccine vectors with vaccinia viruses expressing IL−15 but not IL−2 induces long−lasting cellular immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 100, 3392−3397.
OH,S.,PERERA,L.P.,BURKE,D.S.,WALDMANN,T.A.,およびBERZOFSKY,J.A.(2004).IL−15/IL−15Ralpha−mediated avidity maturation of memory CD8+ T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 101, 15154−15159.
OH,S.,PERERA,L.P.,TERABE,M.,NI,L.,WALDMANN,T.A.,およびBERZOFSKY,J.A.(2008).IL−15 as a mediator of CD4+ help for CD8+ T cell longevity and avoidance of TRAIL−mediated apoptosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 105, 5201−5206.
ONU,A.,POHL,T.,KRAUSE,H.,およびBULFONE−PAUS,S.(1997).Regulation of IL−15 secretion via the leader peptide of two IL−15 isoforms. J Immunol 158, 255−262.
PICKER,L.J.,REED−INDERBITZIN,E.F.,HAGEN,S.I.,EDGAR,J.B.,HANSEN,S.G.,LEGASSE,A.,PLANER,S.,PIATAK,M.,JR.,LIFSON,J.D.,MAINO,V.C.,AXTHELM,M.K.,およびVILLINGER,F.(2006).IL−15 induces CD4 effector memory T cell production and tissue emigration in nonhuman primates. The Journal of clinical investigation 116, 1514−1524.
RAMANATHAN,M.P.,CURLEY,E.,3RD,SU,M.,CHAMBERS,J.A.,およびWEINER,D.B.(2002).Carboxyl terminus of hVIP/mov34 is critical for HIV−1−Vpr interaction and glucocorticoid−mediated signaling. The Journal of biological chemistry 277, 47854−47860.
SANDAU,M.M.,SCHLUNS,K.S.,LEFRANCOIS,L.,およびJAMESON,S.C.(2004).Cutting edge: transpresentation of IL−15 by bone marrow−derived cells necessitates expression of IL−15 and IL−15R alpha by the same cells. J Immunol 173, 6537−6541.
SATO,N.,PATEL,H.J.,WALDMANN,T.A.,およびTAGAYA,Y.(2007).The IL−15/IL−15Ralpha on cell surfaces enables sustained IL−15 activity and contributes to the long survival of CD8 memory T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 104, 588−593.
SCHLUNS,K.S.,KLONOWSKI,K.D.,およびLEFRANCOIS,L.(2004a).Transregulation of memory CD8 T−cell proliferation by IL−15Ralpha+ bone marrow−derived cells. Blood 103, 988−994.
SCHLUNS,K.S.,NOWAK,E.C.,CABRERA−HERNANDEZ,A.,PUDDINGTON,L.,LEFRANCOIS,L.,およびAGUILA,H.L.(2004b).Distinct cell types control lymphoid subset development by means of IL−15 and IL−15 receptor alpha expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 101, 5616−5621.
SCHMITZ,J.E.,KURODA,M.J.,SANTRA,S.,SASSEVILLE,V.G.,SIMON,M.A.,LIFTON,M.A.,RACZ,P.,TENNER−RACZ,K.,DALESANDRO,M.,SCALLON,B.J.,GHRAYEB,J.,FORMAN,M.A.,MONTEFIORI,D.C.,RIEBER,E.P.,LETVIN,N.L.,およびREIMANN,K.A.(1999).Control of viremia in simian immunodeficiency virus infection by CD8+ lymphocytes. Science (New York, N.Y 283, 857−860.
SCHOENLY,K.A.,およびWEINER,D.B.(2008).Human immunodeficiency virus type 1 vaccine development: recent advances in the cytotoxic T−lymphocyte platform “spotty business”. Journal of virology 82, 3166−3180.
SHIVER,J.W.,FU,T.M.,CHEN,L.,CASIMIRO,D.R.,DAVIES,M.E.,EVANS,R.K.,ZHANG,Z.Q.,SIMON,A.J.,TRIGONA,W.L.,DUBEY,S.A.,HUANG,L.,HARRIS,V.A.,LONG,R.S.,LIANG,X.,HANDT,L.,SCHLEIF,W.A.,ZHU,L.,FREED,D.C.,PERSAUD,N.V.,GUAN,L.,PUNT,K.S.,TANG,A.,CHEN,M.,WILSON,K.A.,COLLINS,K.B.,HEIDECKER,G.J.,FERNANDEZ,V.R.,PERRY,H.C.,JOYCE,J.G.,GRIMM,K.M.,COOK,J.C.,KELLER,P.M.,KRESOCK,D.S.,MACH,H.,TROUTMAN,R.D.,ISOPI,L.A.,WILLIAMS,D.M.,XU,Z.,BOHANNON,K.E.,VOLKIN,D.B.,MONTEFIORI,D.C.,MIURA,A.,KRIVULKA,G.R.,LIFTON,M.A.,KURODA,M.J.,SCHMITZ,J.E.,LETVIN,N.L.,CAULFIELD,M.J.,BETT,A.J.,YOUIL,R.,KASLOW,D.C.,およびEMINI,E.A.(2002).Replication−incompetent adenoviral vaccine vector elicits effective anti−immunodeficiency−virus immunity. Nature 415, 331−335.
SPRENT,J.(2003).Turnover of memory−phenotype CD8+ T cells. Microbes and infection / Institut Pasteur 5, 227−231.
TAGAYA,Y.,BAMFORD,R.N.,DEFILIPPIS,A.P.,およびWALDMANN,T.A.(1996).IL−15: a pleiotropic cytokine with diverse receptor/signaling pathways whose expression is controlled at multiple levels. Immunity 4, 329−336.
WALDMANN,T.(2002).The contrasting roles of IL−2 and IL−15 in the life and death of lymphocytes: implications for the immunotherapy of rheumatological diseases. Arthritis research 4 Suppl 3, S161−167.
WALDMANN,T.A.,およびTAGAYA,Y.(1999).The multifaceted regulation of interleukin−15 expression and the role of this cytokine in NK cell differentiation and host response to intracellular pathogens. Annual review of immunology 17, 19−49.
YAJIMA,T.,NISHIMURA,H.,ISHIMITSU,R.,WATASE,T.,BUSCH,D.H.,PAMER,E.G.,KUWANO,H.,およびYOSHIKAI,Y.(2002).Overexpression of IL−15 in vivo increases antigen−driven memory CD8+ T cells following a microbe exposure. J Immunol 168, 1198−1203.
ZHANG,W.,DONG,S.F.,SUN,S.H.,WANG,Y.,LI,G.D.,およびQU,D.(2006).Coimmunization with IL−15 plasmid enhances the longevity of CD8 T cells induced by DNA encoding hepatitis B virus core antigen. World J Gastroenterol 12, 4727−4735.
ZHANG,X.,SUN,S.,HWANG,I.,TOUGH,D.F.,およびSPRENT,J.(1998).Potent and selective stimulation of memory−phenotype CD8+ T cells in vivo by IL−15. Immunity 8, 591−599.
【0134】
【表3−1】
【0135】
【表3−2】
【技術分野】
【0001】
(関連出願の相互参照)
本願は、2009年9月14日出願の米国仮出願第61/242,210号に基づく優先権を主張するものであり、当該出願の全内容は引用により本明細書の一部とする。
【0002】
本発明は、免疫原に対して個体を予防的および/または治療的に免疫化するための改善されたワクチン、改善された方法、ならびに改善された免疫治療薬組成物および改善された免疫治療の方法に関する。
【背景技術】
【0003】
免疫治療とは、望ましい治療効果をあげるために個体の免疫応答を調節することをいう。免疫治療薬とは、個体に投与されたとき、望ましくない免疫応答に関連する症状を最終的に軽減する、または望ましい免疫応答を高めることによって症状を最終的に緩和するのに十分な程度に個体の免疫系を調節する組成物をいう。いくつかの事例においては、免疫治療は、個体にワクチンを投与して、免疫応答を生じる免疫原にその個体をさらすワクチン接種プロトコールの一部である。そのような場合、免疫治療によって、特定の状態、感染症、または疾病を治療または予防するために望ましい免疫応答が増加され、および/またはそのような免疫応答の一部(例えば、細胞性免疫または体液性免疫)が選択的に増強される。
【0004】
ワクチンプロトコールは、改善された免疫応答を誘発するように個体の免疫応答を調節する薬剤を与えることにより改善され得る。個体にワクチンを投与して、個体の免疫応答の対象となる免疫原にその個体をさらすワクチン接種プロトコールのなかには、特定の状態、感染症、または疾病を治療または予防するために望ましい免疫応答を増加させ、および/またはそのような免疫応答の一部(例えば、細胞性免疫または体液性免疫)を選択的に増強させる薬剤を用いるものがある。
【0005】
ワクチンは、アレルゲン、病原体抗原、またはヒトの疾病に関与する細胞に関連する抗原などの標的の抗原に対して個体を免疫化するのに有用である。ヒトの疾病に関与する細胞に関連する抗原には、癌関連腫瘍抗原や自己免疫疾患に関与する細胞に関連する抗原等がある。
【0006】
そのようなワクチンの設計において、ワクチン接種された個体の細胞で標的の抗原を作り出すワクチンが、免疫系の細胞性免疫を誘発するのに効果的であることが認識されてきた。具体的には、弱毒化生ワクチン、非病原性ベクターを用いた組換え体ワクチン、DNAワクチンのそれぞれは、ワクチン接種された個体の細胞での抗原の産生をもたらし、これにより免疫系の細胞性免疫が誘発される。一方、死菌即ち不活化ワクチン、タンパク質のみを含むサブユニットワクチンは、効果的な体液性応答を誘導するが、良好な細胞性の免疫応答は誘発しない。
【0007】
細胞性免疫応答は、病原体感染に対する防御を与えるため、そして病原体感染、癌、または自己免疫疾患の治療のための効果的な免疫介在性療法に必要となることが多い。従って、弱毒化生ワクチン、非病原性ベクターを用いた組換え体ワクチン、DNAワクチンのような、ワクチン接種された個体の細胞で標的の抗原を作り出すワクチンが、多くの場合好ましい。
【0008】
DNAワクチン技術による強力なCD8+T細胞の応答の発生は、DNAワクチンの開発者が求めてきた目標である。HIVモデル並びに他のウイルス感染において,ヒトモデル(Koupら,1994(非特許文献1);Caoら,1995(非特許文献2);、Museyら,1997(非特許文献3);Oggら,1998(非特許文献4);Bettsら,1999(非特許文献5))、および非ヒト霊長類モデル(Jinら,1999(非特許文献6);Schmitzら,1999(非特許文献7);Barouchら,2000(非特許文献8);Amaraら,2001(非特許文献9);Shiverら,2002(非特許文献10))の両方において、CD8+T細胞がウイルス複製コントロールに関係しているとの報告が行われている。
【0009】
DNAワクチン技術とともに、送達技術の改善、構造設計の強化、異種プライムブースト法、分子アジュバントの使用を含む多くの異なる戦略が用いられてきた。ケモカインやサイトカイン等の分子アジュバントをワクチン戦略に組み入れて、免疫応答を細胞性または体液性免疫に向けて傾斜させることができる。IL−12およびIL−15などのサイトカインは、マウスモデルや非ヒト霊長類モデルの両方で免疫応答を強化するのに効果的であった(MorrowおよびWeiner,2008(非特許文献11))。
【0010】
インターロイキン15(IL−15)は、IL−2にも利用されている共通のβ、γ鎖を通してシグナル伝達することからCD8+T細胞の生成と維持に一定の役割を果たすことがわかった。またIL−15は、ナチュラルキラー細胞およびCD8+T細胞のプライミングの間にIL−15Rαを介して抗原提示細胞の表面上でトランス提示されることがわかった(Duboisら,2002(非特許文献12);Kokaら,2004(非特許文献13);Lucasら,2007(非特許文献14);Satoら,2007(非特許文献15))。最近、IL−15Rαは、IL−15分泌の調節においてある役割を果たしていることが分かった(Duitmanら,2008(非特許文献16))。この細胞表面複合体は、IL−15がメモリCD8+T細胞上のβγ受容体を通してシグナル伝達できるようにし、これらの細胞の細胞分裂や生存を促進していると考えられる(Lodolceら,1998(非特許文献17);Kennedyら,2000(非特許文献18);Lodolceら,2001(非特許文献19);Burkettら,2003(非特許文献20);Burkettら,2004(非特許文献21);Sandauら,2004(非特許文献22);Schlunsら,2004a(非特許文献23);Schlunsら,2004b(非特許文献24))。IL−15およびIL−15Rαは合わせて1つの複合体として、それぞれの分子単体と比べて高い安定度と分泌を示す(Bergamaschiら,2008(非特許文献25))。
【0011】
ワクチン接種モデルにおけるその利用については、プラスミドにコードされたIL−15をHIV−1ワクチンアジュバントとして用いることによって、マウスにおける細胞障害性メモリCD8+T細胞の応答を増強することが以前に報告されている(Ohら,2003(非特許文献26);Kutzlerら,2005(非特許文献27);Zhangら,2006(非特許文献28);Calarotaら,2008(非特許文献29);Liら,2008(非特許文献30))。アカゲザルでの研究により、IL−15は、CD4+T細胞のエフェクタ機能を高め(Pickerら,2006(非特許文献31))、エフェクタCD4+およびCD8+T細胞の両方で二重IFN−γ/TNF応答をレスキューする能力(Halwaniら,2008(非特許文献32))も有することが分かった。重要な点として、アカゲザルにSIV/HIV抗原とともにpIL−15を加えると、SHIV89.6pの投与の後の防御が増強された(Boyerら,2007(非特許文献33))ことが挙げられる。
【0012】
そのようなワクチンは、多くの場合、病原体感染やヒトの疾病に対して予防的または治療的に個体を免疫化するために効果的であるが、より改善されたワクチンの必要性が存在する。また、より強化された免疫応答を発生させる組成物や方法の必要性も存在する。さらに、DNAワクチンに対する免疫応答を増強する新規なアジュバントなど、効果的なDNAワクチンを可能にするべく戦略を改善する必要性も依然として存在する。
【0013】
同様に、いくつかの免疫治療薬は患者の免疫応答を調節するのに有用であるが、より改善された免疫治療薬組成物や免疫治療方法の必要性も依然として存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0014】
【非特許文献1】KOUP,R.A.,SAFRIT,J.T.,CAO,Y.,ANDREWS,C.A.,MCLEOD,G.,BORKOWSKY,W.,FARTHING,C.,およびHO,D.D.(1994).Temporal association of cellular immune responses with the initial control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 syndrome. Journal of virology 68, 4650−4655.
【非特許文献2】CAO,Y.,QIN,L.,ZHANG,L.,SAFRIT,J.,およびHO,D.D.(1995).Virologic and immunologic characterization of long−term survivors of human immunodeficiency virus type 1 infection. The New England journal of medicine 332, 201−208.
【非特許文献3】MUSEY,L.,HUGHES,J.,SCHACKER,T.,SHEA,T.,COREY,L.,およびMCELRATH,M.J.(1997).Cytotoxic−T−cell responses, viral load, and disease progression in early human immunodeficiency virus type 1 infection. The New England journal of medicine 337, 1267−1274.
【非特許文献4】OGG,G.S.,JIN,X.,BONHOEFFER,S.,DUNBAR,P.R.,NOWAK,M.A.,MONARD,S.,SEGAL,J.P.,CAO,Y.,ROWLAND−JONES,S.L.,CERUNDOLO,V.,HURLEY,A.,MARKOWITZ,M.,HO,D.D.,NIXON,D.F.,およびMCMICHAEL,A.J.(1998).Quantitation of HIV−1−specific cytotoxic T lymphocytes and plasma load of viral RNA. Science (New York, N.Y 279, 2103−2106.
【非特許文献5】BETTS,M.R.,KROWKA,J.F.,KEPLER,T.B.,DAVIDIAN,M.,CHRISTOPHERSON,C.,KWOK,S.,LOUIE,L.,ERON,J.,SHEPPARD,H.,およびFRELINGER,J.A.(1999).Human immunodeficiency virus type 1−specific cytotoxic T lymphocyte activity is inversely correlated with HIV type 1 viral load in HIV type 1−infected long−term survivors. AIDS research and human retroviruses 15, 1219−1228.
【非特許文献6】JIN,X.,BAUER,D.E.,TUTTLETON,S.E.,LEWIN,S.,GETTIE,A.,BLANCHARD,J.,IRWIN,C.E.,SAFRIT,J.T.,MITTLER,J.,WEINBERGER,L.,KOSTRIKIS,L.G.,ZHANG,L.,PERELSON,A.S.,およびHO,D.D.(1999).Dramatic rise in plasma viremia after CD8(+) T cell depletion in simian immunodeficiency virus−infected macaques. The Journal of experimental medicine 189, 991−998.
【非特許文献7】SCHMITZ,J.E.,KURODA,M.J.,SANTRA,S.,SASSEVILLE,V.G.,SIMON,M.A.,LIFTON,M.A.,RACZ,P.,TENNER−RACZ,K.,DALESANDRO,M.,SCALLON,B.J.,GHRAYEB,J.,FORMAN,M.A.,MONTEFIORI,D.C.,RIEBER,E.P.,LETVIN,N.L.,およびREIMANN,K.A.(1999).Control of viremia in simian immunodeficiency virus infection by CD8+ lymphocytes. Science (New York, N.Y 283, 857−860.
【非特許文献8】BAROUCH,D.H.,SANTRA,S.,SCHMITZ,J.E.,KURODA,M.J.,FU,T.M.,WAGNER,W.,BILSKA,M.,CRAIU,A.,ZHENG,X.X.,KRIVULKA,G.R.,BEAUDRY,K.,LIFTON,M.A.,NICKERSON,C.E.,TRIGONA,W.L.,PUNT,K.,FREED,D.C.,GUAN,L.,DUBEY,S.,CASIMIRO,D.,SIMON,A.,DAVIES,M.E.,CHASTAIN,M.,STROM,T.B.,GELMAN,R.S.,MONTEFIORI,D.C.,LEWIS,M.G.,EMINI,E.A.,SHIVER,J.W.,およびLETVIN,N.L.(2000).Control of viremia and prevention of clinical AIDS in rhesus monkeys by cytokine−augmented DNA vaccination. Science (New York, N.Y 290, 486−492.
【非特許文献9】AMARA,R.R.,VILLINGER,F.,ALTMAN,J.D.,LYDY,S.L.,O’NEIL,S.P.,STAPRANS,S.I.,MONTEFIORI,D.C.,XU,Y.,HERNDON,J.G.,WYATT,L.S.,CANDIDO,M.A.,KOZYR,N.L.,EARL,P.L.,SMITH,J.M.,MA,H.L.,GRIMM,B.D.,HULSEY,M.L.,MILLER,J.,MCCLURE,H.M.,MCNICHOLL,J.M.,MOSS,B.,およびROBINSON,H.L.(2001).Control of a mucosal challenge and prevention of AIDS by a multiprotein DNA/MVA vaccine. Science(New York,N.Y 292,69−74.
【非特許文献10】SHIVER,J.W.,FU,T.M.,CHEN,L.,CASIMIRO,D.R.,DAVIES,M.E.,EVANS,R.K.,ZHANG,Z.Q.,SIMON,A.J.,TRIGONA,W.L.,DUBEY,S.A.,HUANG,L.,HARRIS,V.A.,LONG,R.S.,LIANG,X.,HANDT,L.,SCHLEIF,W.A.,ZHU,L.,FREED,D.C.,PERSAUD,N.V.,GUAN,L.,PUNT,K.S.,TANG,A.,CHEN,M.,WILSON,K.A.,COLLINS,K.B.,HEIDECKER,G.J.,FERNANDEZ,V.R.,PERRY,H.C.,JOYCE,J.G.,GRIMM,K.M.,COOK,J.C.,KELLER,P.M.,KRESOCK,D.S.,MACH,H.,TROUTMAN,R.D.,ISOPI,L.A.,WILLIAMS,D.M.,XU,Z.,BOHANNON,K.E.,VOLKIN,D.B.,MONTEFIORI,D.C.,MIURA,A.,KRIVULKA,G.R.,LIFTON,M.A.,KURODA,M.J.,SCHMITZ,J.E.,LETVIN,N.L.,CAULFIELD,M.J.,BETT,A.J.,YOUIL,R.,KASLOW,D.C.,およびEMINI,E.A.(2002).Replication−incompetent adenoviral vaccine vector elicits effective anti−immunodeficiency−virus immunity. Nature 415, 331−335.
【非特許文献11】MORROW,M.P.,およびWEINER,D.B.(2008).Cytokines as adjuvants for improving anti−HIV responses. AIDS (London, England) 22, 333−338.
【非特許文献12】DUBOIS,S.,MARINER,J.,WALDMANN,T.A.,およびTAGAYA,Y.(2002).IL−15Ralpha recycles and presents IL−15 In trans to neighboring cells. Immunity 17, 537−547.
【非特許文献13】KOKA,R.,BURKETT,P.,CHIEN,M.,CHAI,S.,BOONE,D.L.,およびMA,A.(2004).Cutting edge: murine dendritic cells require IL−15R alpha to prime NK cells. J Immunol 173, 3594−3598.
【非特許文献14】LUCAS,M.,SCHACHTERLE,W.,OBERLE,K.,AICHELE,P.,およびDIEFENBACH,A.(2007).Dendritic cells prime natural killer cells by trans−presenting interleukin 15. Immunity 26, 503−517.
【非特許文献15】SATO,N.,PATEL,H.J.,WALDMANN,T.A.,およびTAGAYA,Y.(2007).The IL−15/IL−15Ralpha on cell surfaces enables sustained IL−15 activity and contributes to the long survival of CD8 memory T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 104, 588−593.
【非特許文献16】DUITMAN,E.H.,ORINSKA,Z.,BULANOVA,E.,PAUS,R.,およびBULFONE−PAUS,S.(2008).How a cytokine is chaperoned through the secretory pathway by complexing with its own receptor: lessons from IL−15/IL−15R{alpha}. Molecular and cellular biology.
【非特許文献17】LODOLCE,J.P.,BOONE,D.L.,CHAI,S.,SWAIN,R.E.,DASSOPOULOS,T.,TRETTIN,S.,およびMA,A.(1998).IL−15 receptor maintains lymphoid homeostasis by supporting lymphocyte homing and proliferation. Immunity 9, 669−676.
【非特許文献18】KENNEDY,M.K.,GLACCUM,M.,BROWN,S.N.,BUTZ,E.A.,VINEY,J.L.,EMBERS,M.,MATSUKI,N.,CHARRIER,K.,SEDGER,L.,WILLIS,C.R.,BRASEL,K.,MORRISSEY,P.J.,STOCKING,K.,SCHUH,J.C.,JOYCE,S.,およびPESCHON,J.J.(2000).Reversible defects in natural killer and memory CD8 T cell lineages in interleukin 15−deficient mice. The Journal of experimental medicine 191, 771−780.
【非特許文献19】LODOLCE,J.P.,BURKETT,P.R.,BOONE,D.L.,CHIEN,M.,およびMA,A.(2001).T cell−independent interleukin 15Ralpha signals are required for bystander proliferation. The Journal of experimental medicine 194, 1187−1194.
【非特許文献20】BURKETT,P.R.,KOKA,R.,CHIEN,M.,CHAI,S.,CHAN,F.,MA,A.,およびBOONE,D.L.(2003).IL−15R alpha expression on CD8+ T cells is dispensable for T cell memory. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 100, 4724−4729.
【非特許文献21】BURKETT,P.R.,KOKA,R.,CHIEN,M.,CHAI,S.,BOONE,D.L.,およびMA,A.(2004).Coordinate expression and trans presentation of interleukin (IL)−15Ralpha and IL−15 supports natural killer cell and memory CD8+ T cell homeostasis. The Journal of experimental medicine 200, 825−834.
【非特許文献22】SANDAU,M.M.,SCHLUNS,K.S.,LEFRANCOIS,L.,およびJAMESON,S.C.(2004).Cutting edge: transpresentation of IL−15 by bone marrow−derived cells necessitates expression of IL−15 and IL−15R alpha by the same cells. J Immunol 173, 6537−6541.
【非特許文献23】SCHLUNS,K.S.,KLONOWSKI,K.D.,およびLEFRANCOIS,L.(2004a).Transregulation of memory CD8 T−cell proliferation by IL−15Ralpha+ bone marrow−derived cells. Blood 103, 988−994.
【非特許文献24】SCHLUNS,K.S.,NOWAK,E.C.,CABRERA−HERNANDEZ,A.,PUDDINGTON,L.,LEFRANCOIS,L.,およびAGUILA,H.L.(2004b).Distinct cell types control lymphoid subset development by means of IL−15 and IL−15 receptor alpha expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 101, 5616−5621.
【非特許文献25】BERGAMASCHI,C.,ROSATI,M.,JALAH,R.,VALENTIN,A.,KULKARNI,V.,ALICEA,C.,ZHANG,G.M.,PATEL,V.,FELBER,B.K.,およびPAVLAKIS,G.N.(2008).Intracellular interaction of interleukin−15 with its receptor alpha during production leads to mutual stabilization and increased bioactivity. The Journal of biological chemistry 283, 4189−4199.
【非特許文献26】OH,S.,BERZOFSKY,J.A.,BURKE,D.S.,WALDMANN,T.A.,およびPERERA,L.P.(2003).Coadministration of HIV vaccine vectors with vaccinia viruses expressing IL−15 but not IL−2 induces long−lasting cellular immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 100, 3392−3397.
【非特許文献27】KUTZLER,M.A.,ROBINSON,T.M.,CHATTERGOON,M.A.,CHOO,D.K.,CHOO,A.Y.,CHOE,P.Y.,RAMANATHAN,M.P.,PARKINSON,R.,KUDCHODKAR,S.,TAMURA,Y.,SIDHU,M.,ROOPCHAND,V.,KIM,J.J.,PAVLAKIS,G.N.,FELBER,B.K.,WALDMANN,T.A.,BOYER,J.D.,およびWEINER,D.B.(2005).Coimmunization with an optimized IL−15 plasmid results in enhanced function and longevity of CD8 T cells that are partially independent of CD4 T cell help. J Immunol 175, 112−123.
【非特許文献28】ZHANG,W.,DONG,S.F.,SUN,S.H.,WANG,Y.,LI,G.D.,およびQU,D.(2006).Coimmunization with IL−15 plasmid enhances the longevity of CD8 T cells induced by DNA encoding hepatitis B virus core antigen. World J Gastroenterol 12, 4727−4735.
【非特許文献29】CALAROTA,S.A.,DAI,A.,TROCIO,J.N.,WEINER,D.B.,LORI,F.,およびLISZIEWICZ,J.(2008).IL−15 as memory T−cell adjuvant for topical HIV−1 DermaVir vaccine. Vaccine.
【非特許文献30】LI,W.,LI,S.,HU,Y.,TANG,B.,CUI,L.,およびHE,W.(2008).Efficient augmentation of a long−lasting immune responses in HIV−1 gag DNA vaccination by IL−15 plasmid boosting. Vaccine 26, 3282−3290.
【非特許文献31】PICKER,L.J.,REED−INDERBITZIN,E.F.,HAGEN,S.I.,EDGAR,J.B.,HANSEN,S.G.,LEGASSE,A.,PLANER,S.,PIATAK,M.,JR.,LIFSON,J.D.,MAINO,V.C.,AXTHELM,M.K.,およびVILLINGER,F.(2006).IL−15 induces CD4 effector memory T cell production and tissue emigration in nonhuman primates. The Journal of clinical investigation 116, 1514−1524.
【非特許文献32】HALWANI,R.,BOYER,J.D.,YASSINE−DIAB,B.,HADDAD,E.K.,ROBINSON,T.M.,KUMAR,S.,PARKINSON,R.,WU,L.,SIDHU,M.K.,PHILLIPSON−WEINER,R.,PAVLAKIS,G.N.,FELBER,B.K.,LEWIS,M.G.,SHEN,A.,SILICIANO,R.F.,WEINER,D.B.,およびSEKALY,R.P.(2008).Therapeutic vaccination with simian immunodeficiency virus (SIV)−DNA+IL−12 or IL−15 induces distinct CD8 memory subsets in SIV−infected macaques. J Immunol 180, 7969−7979.
【非特許文献33】BOYER,J.D.,ROBINSON,T.M.,KUTZLER,M.A.,VANSANT,G.,HOKEY,D.A.,KUMAR,S.,PARKINSON,R.,WU,L.,SIDHU,M.K.,PAVLAKIS,G.N.,FELBER,B.K.,BROWN,C.,SILVERA,P.,LEWIS,M.G.,MONFORTE,J.,WALDMANN,T.A.,ELDRIDGE,J.,およびWEINER,D.B.(2007).Protection against simian/human immunodeficiency virus (SHIV) 89.6P in macaques after coimmunization with SHIV antigen and IL−15 plasmid. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 104, 18648−18653.
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0015】
本発明は、IL−15Raの免疫調節機能および/またはIL−15の結合機能および/またはIL−15受容体複合体の他のサブユニットへの結合機能を有するタンパク質をコードするSEQ ID NO:1またはその断片を含む核酸分子に関する。
【0016】
本発明は、免疫原をコードする単離された核酸分子を、IL−15Raまたはその機能性断片をコードする単離された核酸分子とともに含む組成物に関する。
【0017】
本発明はさらに、免疫原およびIL−15Raまたはその機能性断片の両方をコードする単離された核酸分子を含む組成物に関する。
【0018】
本発明は、免疫原をコードする単離された核酸分子を、IL−15Raまたはその機能性断片をコードする単離された核酸分子とともに含む注入可能な医薬組成物に関する。
【0019】
本発明はさらに、免疫原およびIL−Raまたはその機能性断片の両方をコードする単離された核酸分子を含む注入可能な医薬組成物に関する。
【0020】
本発明のいくつかの側面では、前記免疫原は病原体抗原、癌関連抗原、または自己免疫疾患に関連する細胞からの抗原である。いくつかの側面では、前記病原体は、慢性感染症を引き起こす病原体である。
【0021】
本発明はさらに、免疫原をコードする単離された核酸分子を、IL−15Raまたはその機能性断片をコードする単離された核酸分子とともに含む組成物を個体に対して投与する工程を含む、個体において免疫原に対する免疫応答を誘発する方法に関する。
【0022】
本発明はさらに、免疫原とIL−15Raまたはその機能性断片とをコードする核酸分子を個体に対して投与する工程を含む、個体において免疫原に対する免疫応答を誘発する方法に関する。
【0023】
本発明はさらに、調節エレメントに機能可能に結合された免疫原をコードするヌクレオチド配列、IL−15Raまたはその機能性断片をコードするヌクレオチド配列を含む組換え体ワクチン、およびそのような組換え体ワクチンを個体に対して投与する工程を含む、個体において免疫原に対する免疫応答を誘発する方法に関する。
【0024】
本発明はさらに、IL−15Raまたはその機能性断片をコードするヌクレオチド配列を含む弱毒化生ワクチン、およびその弱毒化生ワクチンを個体に対して投与する工程を含む、個体において病原体に対する免疫応答を誘発する方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【0025】
【図1A】図1A〜図1Eは、IL−15Rαモノクローナル抗体の産生に関連する結果と情報を示す図である。図1Aは、12.0乃至0.16μgタンパク質からの2倍希釈溶液における組換え体ヒトIL−15Rαタンパク質のクマシー染色を示す。図1Bは、市販の抗ヒトIL−15Rα抗体で、直接法のELISAで組換え体IL−15Rαタンパク質を検出できることを示す。図1Cは、BALB/cマウスにおける抗ヒトIL−15Rαモノクロナール抗体の産生のための免疫化スケジュールを示す。図1Dは、ELISAにより、クローンKK1.23からのハイブリドーマ上清が、組換え体IL−15Rαタンパク質に対する高力価抗体を有することを示す。図1Eは、精製されたモノクローナル抗体KK1.23がELISAにて組換え体IL−15Rαに結合することを示し、ウエスタンブロット法により結合が特異的であることを示す。
【図1B】図1A〜図1Eは、IL−15Rαモノクローナル抗体の産生に関連する結果と情報を示す図である。図1Aは、12.0乃至0.16μgタンパク質からの2倍希釈溶液における組換え体ヒトIL−15Rαタンパク質のクマシー染色を示す。図1Bは、市販の抗ヒトIL−15Rα抗体で、直接法のELISAで組換え体IL−15Rαタンパク質を検出できることを示す。図1Cは、BALB/cマウスにおける抗ヒトIL−15Rαモノクロナール抗体の産生のための免疫化スケジュールを示す。図1Dは、ELISAにより、クローンKK1.23からのハイブリドーマ上清が、組換え体IL−15Rαタンパク質に対する高力価抗体を有することを示す。図1Eは、精製されたモノクローナル抗体KK1.23がELISAにて組換え体IL−15Rαに結合することを示し、ウエスタンブロット法により結合が特異的であることを示す。
【図1C】図1A〜図1Eは、IL−15Rαモノクローナル抗体の産生に関連する結果と情報を示す図である。図1Aは、12.0乃至0.16μgタンパク質からの2倍希釈溶液における組換え体ヒトIL−15Rαタンパク質のクマシー染色を示す。図1Bは、市販の抗ヒトIL−15Rα抗体で、直接法のELISAで組換え体IL−15Rαタンパク質を検出できることを示す。図1Cは、BALB/cマウスにおける抗ヒトIL−15Rαモノクロナール抗体の産生のための免疫化スケジュールを示す。図1Dは、ELISAにより、クローンKK1.23からのハイブリドーマ上清が、組換え体IL−15Rαタンパク質に対する高力価抗体を有することを示す。図1Eは、精製されたモノクローナル抗体KK1.23がELISAにて組換え体IL−15Rαに結合することを示し、ウエスタンブロット法により結合が特異的であることを示す。
【図1D】図1A〜図1Eは、IL−15Rαモノクローナル抗体の産生に関連する結果と情報を示す図である。図1Aは、12.0乃至0.16μgタンパク質からの2倍希釈溶液における組換え体ヒトIL−15Rαタンパク質のクマシー染色を示す。図1Bは、市販の抗ヒトIL−15Rα抗体で、直接法のELISAで組換え体IL−15Rαタンパク質を検出できることを示す。図1Cは、BALB/cマウスにおける抗ヒトIL−15Rαモノクロナール抗体の産生のための免疫化スケジュールを示す。図1Dは、ELISAにより、クローンKK1.23からのハイブリドーマ上清が、組換え体IL−15Rαタンパク質に対する高力価抗体を有することを示す。図1Eは、精製されたモノクローナル抗体KK1.23がELISAにて組換え体IL−15Rαに結合することを示し、ウエスタンブロット法により結合が特異的であることを示す。
【図1E】図1A〜図1Eは、IL−15Rαモノクローナル抗体の産生に関連する結果と情報を示す図である。図1Aは、12.0乃至0.16μgタンパク質からの2倍希釈溶液における組換え体ヒトIL−15Rαタンパク質のクマシー染色を示す。図1Bは、市販の抗ヒトIL−15Rα抗体で、直接法のELISAで組換え体IL−15Rαタンパク質を検出できることを示す。図1Cは、BALB/cマウスにおける抗ヒトIL−15Rαモノクロナール抗体の産生のための免疫化スケジュールを示す。図1Dは、ELISAにより、クローンKK1.23からのハイブリドーマ上清が、組換え体IL−15Rαタンパク質に対する高力価抗体を有することを示す。図1Eは、精製されたモノクローナル抗体KK1.23がELISAにて組換え体IL−15Rαに結合することを示し、ウエスタンブロット法により結合が特異的であることを示す。
【図2A】図2A〜図2Gは、IL−15RαのDNAのプラスミドの構築と発現に関連する図である。図2Aは、ヒトIL−15RαのcDNAが、いかにしてpVAX1発現ベクターに挿入されたかを示す。図2Bおよび図2Cは、R&D社のモノクローナル抗ヒトIL−15Rα抗体およびKK1.23モノクローナル抗ヒトIL−15Rα抗体を用いた放射性元素を利用するin vitro翻訳により検出されたように、プラスミドのIL−15Rαが適切なサイズのタンパク質(〜30kDa)を発現していることを示す。図2Dは、モノクローナルKK1.23抗体(IgG1アイソタイプ)が、トランスフェクトされていないHeLa細胞には結合しないことを示す(20×)。図2Eは、マウスのIgG1アイソタイプの対照で(緑に)染色した、pTRACER−IL−15Rαトランスフェクト細胞を示す(20×)。図2Fおよび図2Gは、KK1.23抗ヒトIL−15Rα抗体(赤)が、pIL−15Rα−pTRACERトランスフェクト細胞に結合することを20×および60×でそれぞれ示す。
【図2B】図2A〜図2Gは、IL−15RαのDNAのプラスミドの構築と発現に関連する図である。図2Aは、ヒトIL−15RαのcDNAが、いかにしてpVAX1発現ベクターに挿入されたかを示す。図2Bおよび図2Cは、R&D社のモノクローナル抗ヒトIL−15Rα抗体およびKK1.23モノクローナル抗ヒトIL−15Rα抗体を用いた放射性元素を利用するin vitro翻訳により検出されたように、プラスミドのIL−15Rαが適切なサイズのタンパク質(〜30kDa)を発現していることを示す。図2Dは、モノクローナルKK1.23抗体(IgG1アイソタイプ)が、トランスフェクトされていないHeLa細胞には結合しないことを示す(20×)。図2Eは、マウスのIgG1アイソタイプの対照で(緑に)染色した、pTRACER−IL−15Rαトランスフェクト細胞を示す(20×)。図2Fおよび図2Gは、KK1.23抗ヒトIL−15Rα抗体(赤)が、pIL−15Rα−pTRACERトランスフェクト細胞に結合することを20×および60×でそれぞれ示す。
【図2C】図2A〜図2Gは、IL−15RαのDNAのプラスミドの構築と発現に関連する図である。図2Aは、ヒトIL−15RαのcDNAが、いかにしてpVAX1発現ベクターに挿入されたかを示す。図2Bおよび図2Cは、R&D社のモノクローナル抗ヒトIL−15Rα抗体およびKK1.23モノクローナル抗ヒトIL−15Rα抗体を用いた放射性元素を利用するin vitro翻訳により検出されたように、プラスミドのIL−15Rαが適切なサイズのタンパク質(〜30kDa)を発現していることを示す。図2Dは、モノクローナルKK1.23抗体(IgG1アイソタイプ)が、トランスフェクトされていないHeLa細胞には結合しないことを示す(20×)。図2Eは、マウスのIgG1アイソタイプの対照で(緑に)染色した、pTRACER−IL−15Rαトランスフェクト細胞を示す(20×)。図2Fおよび図2Gは、KK1.23抗ヒトIL−15Rα抗体(赤)が、pIL−15Rα−pTRACERトランスフェクト細胞に結合することを20×および60×でそれぞれ示す。
【図2D】図2A〜図2Gは、IL−15RαのDNAのプラスミドの構築と発現に関連する図である。図2Aは、ヒトIL−15RαのcDNAが、いかにしてpVAX1発現ベクターに挿入されたかを示す。図2Bおよび図2Cは、R&D社のモノクローナル抗ヒトIL−15Rα抗体およびKK1.23モノクローナル抗ヒトIL−15Rα抗体を用いた放射性元素を利用するin vitro翻訳により検出されたように、プラスミドのIL−15Rαが適切なサイズのタンパク質(〜30kDa)を発現していることを示す。図2Dは、モノクローナルKK1.23抗体(IgG1アイソタイプ)が、トランスフェクトされていないHeLa細胞には結合しないことを示す(20×)。図2Eは、マウスのIgG1アイソタイプの対照で(緑に)染色した、pTRACER−IL−15Rαトランスフェクト細胞を示す(20×)。図2Fおよび図2Gは、KK1.23抗ヒトIL−15Rα抗体(赤)が、pIL−15Rα−pTRACERトランスフェクト細胞に結合することを20×および60×でそれぞれ示す。
【図2E】図2A〜図2Gは、IL−15RαのDNAのプラスミドの構築と発現に関連する図である。図2Aは、ヒトIL−15RαのcDNAが、いかにしてpVAX1発現ベクターに挿入されたかを示す。図2Bおよび図2Cは、R&D社のモノクローナル抗ヒトIL−15Rα抗体およびKK1.23モノクローナル抗ヒトIL−15Rα抗体を用いた放射性元素を利用するin vitro翻訳により検出されたように、プラスミドのIL−15Rαが適切なサイズのタンパク質(〜30kDa)を発現していることを示す。図2Dは、モノクローナルKK1.23抗体(IgG1アイソタイプ)が、トランスフェクトされていないHeLa細胞には結合しないことを示す(20×)。図2Eは、マウスのIgG1アイソタイプの対照で(緑に)染色した、pTRACER−IL−15Rαトランスフェクト細胞を示す(20×)。図2Fおよび図2Gは、KK1.23抗ヒトIL−15Rα抗体(赤)が、pIL−15Rα−pTRACERトランスフェクト細胞に結合することを20×および60×でそれぞれ示す。
【図2F】図2A〜図2Gは、IL−15RαのDNAのプラスミドの構築と発現に関連する図である。図2Aは、ヒトIL−15RαのcDNAが、いかにしてpVAX1発現ベクターに挿入されたかを示す。図2Bおよび図2Cは、R&D社のモノクローナル抗ヒトIL−15Rα抗体およびKK1.23モノクローナル抗ヒトIL−15Rα抗体を用いた放射性元素を利用するin vitro翻訳により検出されたように、プラスミドのIL−15Rαが適切なサイズのタンパク質(〜30kDa)を発現していることを示す。図2Dは、モノクローナルKK1.23抗体(IgG1アイソタイプ)が、トランスフェクトされていないHeLa細胞には結合しないことを示す(20×)。図2Eは、マウスのIgG1アイソタイプの対照で(緑に)染色した、pTRACER−IL−15Rαトランスフェクト細胞を示す(20×)。図2Fおよび図2Gは、KK1.23抗ヒトIL−15Rα抗体(赤)が、pIL−15Rα−pTRACERトランスフェクト細胞に結合することを20×および60×でそれぞれ示す。
【図2G】図2A〜図2Gは、IL−15RαのDNAのプラスミドの構築と発現に関連する図である。図2Aは、ヒトIL−15RαのcDNAが、いかにしてpVAX1発現ベクターに挿入されたかを示す。図2Bおよび図2Cは、R&D社のモノクローナル抗ヒトIL−15Rα抗体およびKK1.23モノクローナル抗ヒトIL−15Rα抗体を用いた放射性元素を利用するin vitro翻訳により検出されたように、プラスミドのIL−15Rαが適切なサイズのタンパク質(〜30kDa)を発現していることを示す。図2Dは、モノクローナルKK1.23抗体(IgG1アイソタイプ)が、トランスフェクトされていないHeLa細胞には結合しないことを示す(20×)。図2Eは、マウスのIgG1アイソタイプの対照で(緑に)染色した、pTRACER−IL−15Rαトランスフェクト細胞を示す(20×)。図2Fおよび図2Gは、KK1.23抗ヒトIL−15Rα抗体(赤)が、pIL−15Rα−pTRACERトランスフェクト細胞に結合することを20×および60×でそれぞれ示す。
【図3A】図3A〜図3Cは、pIL−15とpIL−15Rαの組合せが、それぞれのプラスミド単体が与えられた場合と比較して免疫応答を一層増強することを示す図である。図3Aは、ベクター、抗原性プラスミド(HIV−1gagおよびpol)、pIL−15、および/またはpIL−15Rαの組合せを含むDNA調合物を注射したBALB/cマウスのグループに対する免疫化スケジュールを示す。pIL−15とpIL−15Rαの組合せは、マウスの同じ脚に与えられるか、または2つの異なる脚にそれぞれ分けて(一方にpIL−15、他方にpIL−15Rα)与えられた。筋肉内接種を、電気穿孔処理とともに3回行い、マウスは最終追加接種の1週間後に犠牲処置した。図3Bおよび図3Cは、細胞性の応答を示す。免疫化マウス由来の脾細胞を、IFN−γ ELISpotアッセイで用いた。脾細胞を、培地とともに(陰性対照)、コンカナバリンAとともに(陽性対照)、または抗原性ペプチド(HIV−1 gagおよびpolプール)とともに一晩刺激し、IFN−γスポット形成ユニット数をカウントした。
【図3B】図3A〜図3Cは、pIL−15とpIL−15Rαの組合せが、それぞれのプラスミド単体が与えられた場合と比較して免疫応答を一層増強することを示す図である。図3Aは、ベクター、抗原性プラスミド(HIV−1gagおよびpol)、pIL−15、および/またはpIL−15Rαの組合せを含むDNA調合物を注射したBALB/cマウスのグループに対する免疫化スケジュールを示す。pIL−15とpIL−15Rαの組合せは、マウスの同じ脚に与えられるか、または2つの異なる脚にそれぞれ分けて(一方にpIL−15、他方にpIL−15Rα)与えられた。筋肉内接種を、電気穿孔処理とともに3回行い、マウスは最終追加接種の1週間後に犠牲処置した。図3Bおよび図3Cは、細胞性の応答を示す。免疫化マウス由来の脾細胞を、IFN−γ ELISpotアッセイで用いた。脾細胞を、培地とともに(陰性対照)、コンカナバリンAとともに(陽性対照)、または抗原性ペプチド(HIV−1 gagおよびpolプール)とともに一晩刺激し、IFN−γスポット形成ユニット数をカウントした。
【図3C】図3A〜図3Cは、pIL−15とpIL−15Rαの組合せが、それぞれのプラスミド単体が与えられた場合と比較して免疫応答を一層増強することを示す図である。図3Aは、ベクター、抗原性プラスミド(HIV−1gagおよびpol)、pIL−15、および/またはpIL−15Rαの組合せを含むDNA調合物を注射したBALB/cマウスのグループに対する免疫化スケジュールを示す。pIL−15とpIL−15Rαの組合せは、マウスの同じ脚に与えられるか、または2つの異なる脚にそれぞれ分けて(一方にpIL−15、他方にpIL−15Rα)与えられた。筋肉内接種を、電気穿孔処理とともに3回行い、マウスは最終追加接種の1週間後に犠牲処置した。図3Bおよび図3Cは、細胞性の応答を示す。免疫化マウス由来の脾細胞を、IFN−γ ELISpotアッセイで用いた。脾細胞を、培地とともに(陰性対照)、コンカナバリンAとともに(陽性対照)、または抗原性ペプチド(HIV−1 gagおよびpolプール)とともに一晩刺激し、IFN−γスポット形成ユニット数をカウントした。
【図4A】図4Aおよび図4Bは、IL−15RαDNAプラスミドが、pIL−15の不存在下で用量に依存する免疫原性であることを示す図である。BALB/cマウスを、ベクター、5μgの抗原性プラスミド(HIV−1gagおよびpol)、および用量を漸次増加させたIL−15Rα(7.5、10、または15μg)の組合せを含むDNA調合物で図3Aに示すように免疫化した。R10で(陰性対照)、コンカナバリンAで(陽性対照)、およびHIV−1gagペプチドのプールまたはHIV−1polペプチドのプールで刺激した脾細胞に対してIFN−γ ELISpotを実施した。HIV−1gagペプチドのプールを用いた実験のデータを図4Aに示す。HIV−1polペプチドのプールを用いた実験のデータを図4Bに示す。
【図4B】図4Aおよび図4Bは、IL−15RαDNAプラスミドが、pIL−15の不存在下で用量に依存する免疫原性であることを示す図である。BALB/cマウスを、ベクター、5μgの抗原性プラスミド(HIV−1gagおよびpol)、および用量を漸次増加させたIL−15Rα(7.5、10、または15μg)の組合せを含むDNA調合物で図3Aに示すように免疫化した。R10で(陰性対照)、コンカナバリンAで(陽性対照)、およびHIV−1gagペプチドのプールまたはHIV−1polペプチドのプールで刺激した脾細胞に対してIFN−γ ELISpotを実施した。HIV−1gagペプチドのプールを用いた実験のデータを図4Aに示す。HIV−1polペプチドのプールを用いた実験のデータを図4Bに示す。
【図5A】図5Aおよび図5Bは、pIL−15Rαが、主にCD8+T細胞によるIFN−γの分泌を増加させることを示す図である。CD8+T細胞による分泌がIFN−γの分泌中のどの程度を占めるかを、Miltenyi社のビーズを用いて、免疫化されたマウスの脾細胞からのCD8+T細胞のex vivo除去処理によって測定した。図5Aは、全脾細胞に対するもの(黒色)と、CD8が欠乏した脾細胞(灰色)とに対する全抗原反応であって、IFN−γELISpotによって測定されたものを示す。図5Bでは、HIV−1gag p24抗原性タンパク質に対する抗体の力価を、[材料および方法]の項で説明する同一の構築物とスケジュールで免疫化されたBALB/cマウスの血清サンプルから決定した。犠牲時に採取されたサンプルの希釈液列を、p24でコーティングしたELISAプレート上で走らせて、抗マウスIgG−HRP抗体で検出し、抗原特異的なIgGのレベルを測定した。希釈液ウェルのみにおけるバックグラウンドの反応は、グラフに描く前にサンプルのOD値から差し引いた。
【図5B】図5Aおよび図5Bは、pIL−15Rαが、主にCD8+T細胞によるIFN−γの分泌を増加させることを示す図である。CD8+T細胞による分泌がIFN−γの分泌中のどの程度を占めるかを、Miltenyi社のビーズを用いて、免疫化されたマウスの脾細胞からのCD8+T細胞のex vivo除去処理によって測定した。図5Aは、全脾細胞に対するもの(黒色)と、CD8が欠乏した脾細胞(灰色)とに対する全抗原反応であって、IFN−γELISpotによって測定されたものを示す。図5Bでは、HIV−1gag p24抗原性タンパク質に対する抗体の力価を、[材料および方法]の項で説明する同一の構築物とスケジュールで免疫化されたBALB/cマウスの血清サンプルから決定した。犠牲時に採取されたサンプルの希釈液列を、p24でコーティングしたELISAプレート上で走らせて、抗マウスIgG−HRP抗体で検出し、抗原特異的なIgGのレベルを測定した。希釈液ウェルのみにおけるバックグラウンドの反応は、グラフに描く前にサンプルのOD値から差し引いた。
【図6A】図6A〜図6Cは、pIL−15とpIL−15Rαの組合せが、メモリ応答を増強させないことを示す図である。マウスは3回免疫化し、犠牲前に30週間おいた。図6Aは、IFN−γ ELISpotにより、免疫化されたマウスの脾細胞からIFN−γ分泌を測定したことを示す。図6Bは、免疫化されたマウスからのメモリ応答を決定するために用いた細胞内サイトカイン染色を示す。免疫化されたマウスの脾細胞を、培地において、PMA/イオノマイシンで、またはブレフェルジンAの存在下でドミナントな、およびサブドミナントなHIV−1gagおよびpol抗原ペプチドのそれぞれで5時間刺激した。図6Cでは、免疫化されたマウスから血清を採取し、HIV−1gag p24ELISAで走らせた。血清の希釈液列において抗原特異的IgGの有無を解析した。希釈液ウェルのみにおけるバックグラウンドの反応は、グラフに描く前にサンプルのOD値から差し引いた。
【図6B】図6A〜図6Cは、pIL−15とpIL−15Rαの組合せが、メモリ応答を増強させないことを示す図である。マウスは3回免疫化し、犠牲前に30週間おいた。図6Aは、IFN−γ ELISpotにより、免疫化されたマウスの脾細胞からIFN−γ分泌を測定したことを示す。図6Bは、免疫化されたマウスからのメモリ応答を決定するために用いた細胞内サイトカイン染色を示す。免疫化されたマウスの脾細胞を、培地において、PMA/イオノマイシンで、またはブレフェルジンAの存在下でドミナントな、およびサブドミナントなHIV−1gagおよびpol抗原ペプチドのそれぞれで5時間刺激した。図6Cでは、免疫化されたマウスから血清を採取し、HIV−1gag p24ELISAで走らせた。血清の希釈液列において抗原特異的IgGの有無を解析した。希釈液ウェルのみにおけるバックグラウンドの反応は、グラフに描く前にサンプルのOD値から差し引いた。
【図6C】図6A〜図6Cは、pIL−15とpIL−15Rαの組合せが、メモリ応答を増強させないことを示す図である。マウスは3回免疫化し、犠牲前に30週間おいた。図6Aは、IFN−γ ELISpotにより、免疫化されたマウスの脾細胞からIFN−γ分泌を測定したことを示す。図6Bは、免疫化されたマウスからのメモリ応答を決定するために用いた細胞内サイトカイン染色を示す。免疫化されたマウスの脾細胞を、培地において、PMA/イオノマイシンで、またはブレフェルジンAの存在下でドミナントな、およびサブドミナントなHIV−1gagおよびpol抗原ペプチドのそれぞれで5時間刺激した。図6Cでは、免疫化されたマウスから血清を採取し、HIV−1gag p24ELISAで走らせた。血清の希釈液列において抗原特異的IgGの有無を解析した。希釈液ウェルのみにおけるバックグラウンドの反応は、グラフに描く前にサンプルのOD値から差し引いた。
【図7A】図7A〜図7Cは、pIL−15Rαが、内生IL−15の不存在下でアジュバントとなり得ることを示す図である。IL−15Rαがアジュバントとして機能する機序を探るために、本発明者はヒトIL−15RαがマウスのIL−15に結合する能力を調べた。図7Aは、放射性標識したヒトIL−15RαがマウスのIL−15に結合し、抗マウスIL−15抗体と免疫共沈降したことを示す。図7Bに示すように対照のC57BL/6においても、また図7Cに示すようにIL−15ノックアウトマウスにおいても、図3Aのスケジュールに従って免疫化を反復し、脾細胞に対してはIFN−γ ELISpotを実施した。
【図7B】図7A〜図7Cは、pIL−15Rαが、内生IL−15の不存在下でアジュバントとなり得ることを示す図である。IL−15Rαがアジュバントとして機能する機序を探るために、本発明者はヒトIL−15RαがマウスのIL−15に結合する能力を調べた。図7Aは、放射性標識したヒトIL−15RαがマウスのIL−15に結合し、抗マウスIL−15抗体と免疫共沈降したことを示す。図7Bに示すように対照のC57BL/6においても、また図7Cに示すようにIL−15ノックアウトマウスにおいても、図3Aのスケジュールに従って免疫化を反復し、脾細胞に対してはIFN−γ ELISpotを実施した。
【図7C】図7A〜図7Cは、pIL−15Rαが、内生IL−15の不存在下でアジュバントとなり得ることを示す図である。IL−15Rαがアジュバントとして機能する機序を探るために、本発明者はヒトIL−15RαがマウスのIL−15に結合する能力を調べた。図7Aは、放射性標識したヒトIL−15RαがマウスのIL−15に結合し、抗マウスIL−15抗体と免疫共沈降したことを示す。図7Bに示すように対照のC57BL/6においても、また図7Cに示すようにIL−15ノックアウトマウスにおいても、図3Aのスケジュールに従って免疫化を反復し、脾細胞に対してはIFN−γ ELISpotを実施した。
【発明を実施するための形態】
【0026】
本明細書で使用される「IL−15Ra」という用語は、インターロイキン15受容体αタンパク質をさす。
【0027】
本明細書で使用される「機能性断片」とは、IL−15Raの断片であって、免疫原とともに与えられたときに誘発される免疫応答が、その断片なしに免疫原が与えられたときに誘発される免疫応答と比較して高い免疫応答となるものを意味する。断片は通常10個以上のアミノ酸からなる長さを有する。
【0028】
本明細書で使用される「標的タンパク質」という用語は、免疫応答の標的タンパク質として作用する、本発明の遺伝子構築物によってコードされるペプチドおよびタンパク質を意味する。「標的タンパク質」という用語と「免疫原」という用語は、互換的に用いられ、免疫応答が誘発される対象となるタンパク質をさす。標的タンパク質は免疫原性タンパク質であって、病原体または、免疫応答の対象となることが望ましい癌細胞または自己免疫疾患に関与する細胞などの望ましくない細胞型に由来するタンパク質と少なくとも1つのエピトープを共有する。標的タンパク質に対する免疫応答は、当該標的タンパク質が関連する特定の感染症や疾病に対して個体を防御および/または治療するものとなる。
【0029】
本明細書で使用される「遺伝子構築物」とは、標的タンパク質または免疫調節タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むDNAまたはRNA分子をさす。コード配列は、当該核酸分子が投与される個体の細胞での発現を誘導できるプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに機能可能に結合された開始シグナルおよび終止シグナルを含む。
【0030】
本明細書で使用される「発現可能な形態」という用語は、標的タンパク質または免疫調節タンパク質をコードするコード配列に機能可能に結合された、必要な調節エレメントを含み、個体の細胞に存在するとき、そのコード配列が発現されるように構成された遺伝子構築物をさす。
【0031】
本明細書で使用される「エピトープの共有」という用語は、他のタンパク質のエピトープと同一または実質的に類似なエピトープを少なくとも1つ含むタンパク質をさす。
【0032】
本明細書で使用される「実質的に類似なエピトープ」という用語は、別のあるタンパク質のエピトープと構造は同一ではないが、そのタンパク質と交差反応する細胞性免疫応答または体液性免疫応答を引き起こすエピトープを意味する。
【0033】
本明細書で使用される「細胞内病原体」という用語は、その生殖周期または生活周期の少なくとも一時期にホストの細胞内部に存在し、そこで病原体タンパク質を産生する、またはその産生を引き起こすウイルスまたは病原体を意味する。
【0034】
本明細書で使用される「過剰増殖性疾患」という用語は、細胞の過剰増殖によって特性化される疾病および障害を意味する。
【0035】
本明細書で使用される「過剰増殖関連タンパク質」という用語は、過剰増殖性疾患に関連するタンパク質を意味する。
【0036】
本発明は、IL−15Raとその機能性断片、およびそれらの組合せをコードする核酸分子が、ワクチンの成分として与えられたとき、免疫応答を調節するという発見から生まれたものである。従って、IL−15Raとその機能性断片、およびそれらの組合せをコードする核酸分子は、免疫治療薬としてワクチンと組合せて、またはワクチンの成分として投与され得る。
【0037】
さらに、本発明は、IL−15Raまたはその機能性断片、およびそれらの組合せをコードする核酸分子が、IL−15またはその機能性断片と組合せてワクチンの成分として与えられたとき免疫応答を調節するという発見から生まれたものである。従って、IL−15Raとその機能性断片、およびそれらの組合せをコードする核酸分子を、IL−15またはその機能性断片と組合せたものは、免疫治療薬としてワクチンと組合せて、またはワクチンの成分として投与され得る。
【0038】
本発明のいくつかの側面は、特にCD8+メモリT細胞応答が望ましくない場合における、治療用ワクチンでのIL−15Raの核酸コード配列の使用を提供する。そのような治療用ワクチンには、抗原標的が、疾病関連細胞のみならず正常な細胞でも発現される抗原であることにより、抗原を有する細胞が短時間で除去されると、抗原を発現する正常細胞を対象とする長期免疫応答を生じさせることなく治療効果をあげられるものが含まれる。従って、本発明のこの側面は、正常な細胞にも存在する癌細胞上の抗原を対象とする治療用ワクチン、正常な細胞にも存在する自己免疫疾患関連の細胞によって発現される抗原を対象とする治療用ワクチン、および継続的な免疫応答が生ずるのは望ましくない慢性感染症に関与する病原体抗原を対象とする治療用ワクチンにおいて特に有用である。慢性感染症とは、病原体が除去されない病原体感染症をさす。その例として、ポリオ、天然痘、流行性耳下腺炎等の急性感染症とは異なる、HCV、HSV、CMV、水疱瘡、HIV等が挙げられるが、これらに限定されない。
【0039】
本発明のいくつかの側面は、特に増強された急速な免疫応答が望ましい場合における、治療用ワクチンでのIL−15をコードする核酸コード配列と組合せたIL−15Raタンパク質をコードする核酸コード配列の使用を提供する。IL−15Raタンパク質の核酸コード配列と、IL−15をコードする核酸コード配列とを組合せると、免疫応答の初期の誘発時に付加的なアジュバント効果が得られる。付加的な免疫応答を達成するためには、IL−15Raタンパク質をコードする核酸コード配列とIL−15をコードする核酸コード配列とを同じ部位に投与しても、或いはIL−15Raタンパク質をコードする核酸コード配列と後者の核酸コード配列とを、それぞれ別の場所に与えてもよい。
【0040】
前記ヒトIL−15Raのヌクレオチド配列は、GenBank受託番号NM172200およびNM002189として開示されており、それぞれ引用により本明細書の一部とする。ヒトIL−15Raのタンパク質配列は、GenBank受託番号Q13261、NP002180およびNP751950として開示されおり、それぞれ引用により本明細書の一部とする。本発明のいくつかの実施形態では、IL−15Raタンパク質をコードする核酸コード配列は、発現レベルが高くなるように最適化される。本発明のいくつかの実施形態では、IL−15Raタンパク質をコードする核酸コード配列は、SEQ ID NO:1の配列のように最適化される。本発明のいくつかの実施形態では、IL−15Raタンパク質をコードする核酸コード配列は、SEQ ID NO:2の配列のように最適化される。
【0041】
ヒトIL−15のヌクレオチド配列は、GenBank受託番号NM172174およびNM000585として開示されており、それぞれ引用により本明細書の一部とする。ヒトIL−15のタンパク質配列は、GenBank受託番号CAA86100、CAA62616、AAI00964、CAA72044、AAH18149およびAAU21241として開示されており、それぞれ引用により本明細書の一部とする。本発明のいくつかの実施形態では、IL−15タンパク質をコードする核酸コード配列が、高い発現レベルとなるように最適化される。いくつかの実施形態では、改良型IL−15として、米国特許出願第10/560,650号明細書(米国特許出願公開第2007−0041941号)に記載されているようなものが構築される。この出願の内容は引用により本明細書の一部とする。いくつかの実施形態では、改良型IL−15として、米国特許出願第12/160,766号明細書に記載されているようなものが構築される。この出願の内容は引用により本明細書の一部とする。本発明のいくつかの実施形態では、IL−15タンパク質をコードする核酸コード配列はSEQ ID NO:3である。
【0042】
本発明のいくつかの実施形態では、IL−15Raタンパク質をコードする核酸コード配列および標的抗原をコードする核酸コード配列が、それぞれ同一のプラスミド上に組み入れられる。
【0043】
本発明のいくつかの実施形態では、2種のプラスミドを含む組成物が提供され、第1のプラスミドはIL−15Raタンパク質をコードする核酸コード配列を含み、第2のプラスミドは標的抗原をコードする核酸コード配列を含む(それぞれ同一のプラスミド上に)。
【0044】
本発明のいくつかの実施形態では、2種類の組成物が提供される。第1の組成物は、IL−15Raタンパク質をコードする核酸コード配列を含むプラスミドを含み、第2の組成物は、標的抗原をコードする核酸コード配列を含むプラスミドを含む(それぞれ同一のプラスミド上に)。前記2種類の組成物を別々の容器に入れ、キットとしてパッケージ化してもよい。
【0045】
本発明のいくつかの実施形態では、IL−15Raタンパク質をコードする核酸コード配列、IL−15をコードする核酸コード配列、および標的抗原をコードする核酸コード配列が、それぞれ同一のプラスミド上に存在する。
【0046】
本発明のいくつかの実施形態では、本発明は2種類のプラスミドを含む組成物を提供する。IL−15Raタンパク質をコードする核酸コード配列およびIL−15をコードする核酸コード配列が一方のプラスミド上に存在し、標的抗原をコードする核酸コード配列が第2のプラスミド上に存在する。
【0047】
本発明のいくつかの実施形態では、本発明は3種のプラスミドを含む組成物を提供する。IL−15Raタンパク質をコードする核酸コード配列は第1のプラスミド上に、IL−15をコードする核酸コード配列は第2のプラスミド上に、標的抗原をコードする核酸コード配列は第3のプラスミド上にある。
【0048】
本発明のいくつかの実施形態では、本発明が、1種類のプラスミドを含む第1の組成物と、1種類のプラスミドを含む第2の組成物からなる2種類の組成物を提供する。そのような実施形態のいくつかでは、第1の組成物がIL−15Raタンパク質をコードする核酸コード配列と標的抗原をコードする核酸コード配列とを含むプラスミドを含む。そして第2の組成物はIL−15をコードする核酸コード配列を含むプラスミドを含む。そのような実施形態のいくつかでは、第1の組成物がIL−15タンパク質をコードする核酸コード配列と、標的抗原をコードする核酸コード配列とを含むプラスミドを含む。そして第2の組成物はIL−15Raをコードする核酸コード配列を含むプラスミドを含む。そのような実施形態のいくつかでは、第1の組成物がIL−15タンパク質をコードする核酸コード配列と、IL−15Raをコードする核酸コード配列とを含むプラスミドを含む。そして第2の組成物は、標的抗原をコードする核酸コード配列を含むプラスミドを含む。これら複数種の組成物を別々の容器で提供し、それらがキットを構成するようにパッケージ化してもよい。
【0049】
本発明のいくつかの実施形態では、本発明は、2種類の組成物、即ち2種のプラスミドを含む第1の組成物と1種のプラスミドを含む第2の組成物とを提供する。そのような実施形態のいくつかでは、第1の組成物がIL−15Raタンパク質をコードする核酸コード配列を含む第1のプラスミドと、標的抗原をコードする核酸コード配列を含む第2のプラスミドとを含む。そして第2の組成物は、IL−15をコードする核酸コード配列を含むプラスミドを含む。そのような実施形態のいくつかでは、第1の組成物がIL−15タンパク質をコードする核酸コード配列を含む第1のプラスミドと、標的抗原をコードする核酸コード配列を含む第2のプラスミドとを含む。そして第2の組成物は、IL−15Raをコードする核酸コード配列を含むプラスミドを含む。そのような実施形態のいくつかでは、第1の組成物がIL−15タンパク質をコードする核酸コード配列を含む第1のプラスミドと、IL−15Raをコードする核酸コード配列を含む第2のプラスミドとを含む。そして第2の組成物は、標的抗原をコードする核酸コード配列を含むプラスミドを含む。これら複数種の組成物を別々の容器で提供し、それらがキットを構成するようにパッケージ化してもよい。
【0050】
本発明のいくつかの実施形態では、本発明は、1種類のプラスミドを含む第1の組成物と、1種類のプラスミドを含む第2の組成物と、1種類のプラスミドを含む第3の組成物とからなる3種類の組成物を提供する。そのような実施形態のいくつかでは、第1の組成物がIL−15Raタンパク質をコードする核酸コード配列と標的抗原をコードする核酸コード配列とを含むプラスミドを含む。そして第2の組成物は標的抗原をコードする核酸コード配列を含むプラスミドを含む。さらに第3の組成物はIL−15をコードする核酸コード配列を含むプラスミドを含む。これら複数種の組成物を別々の容器で提供し、それらがキットを構成するようにパッケージ化してもよい。
【0051】
免疫調節タンパク質をコードする単離されたcDNAは、その免疫調節タンパク質を産生し得る構築物の作製の開始材料として有用である。標準的な技術と入手容易な材料を用いて、免疫調節タンパク質をコードする核酸分子を作製し得る。
【0052】
その核酸分子は、DNA注入(DNAワクチン接種ともいう)や、組換え体ベクター(組換え体アデノウイルス、組換え体アデノウイルス関連ウイルス、および組換え体ワクシニアウイルスなど)を含むいくつかの周知技術のいずれかを用いて供給できる。
【0053】
DNAワクチンについては、米国特許第5,593,972号、同第5,739,118号、同第5,817,637号、同第5,830,876号、同第5,962,428号、同第5,981,505号、同第5,580,859号、同第5,703,055号、同第5,676,594号、ならびにこれらで引用される優先権基礎出願の各明細書中に記載され、それぞれ引用により本明細書の一部とする。上記の特許出願明細書中に記載された送達プロトコールに加えて、DNAを供給する別の方法が、米国特許第4,945,050号および同第5,036,006号の各明細書中に記載されており、ともに引用により本明細書の一部とする。
【0054】
投与経路としては、筋肉内投与、鼻腔内投与、腹腔内投与、皮内投与、皮下投与、静脈内投与、動脈内投与、眼内投与、および経口投与とともに、吸入又は座薬による、または洗浄などによる粘膜組織(膣、直腸、尿道、頬および舌下組織など)への経皮投与、局所投与が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい投与経路としては、粘膜組織への投与や、筋肉内、腹腔内、皮内、および皮下への注射等が挙げられる。遺伝子構築物は、従来型の注射器、無針注射器、または「微小遺伝子銃」などによって投与してもよいが、これらの手段に限定されない。
【0055】
別の投与経路として、遺伝子構築物を送達するために電気穿孔法を利用する手法が、米国特許第5,273,525号、同第5,439,440号、同第5,702,359号、同第5,810,762号、同第5,993,434号、同第6,014,584号、同第6,055,453号、同第6,068,650号、同第6,110,161号、同第6,120,493号、同第6,135,990号、同第6,181,964号、同第6,216,034号、同第6,233,482号、同第6,241,701号、同第6,347,247号、同第6,418,341号、同第6,451,002号、同第6,516,223号、同第6,567,694号、同第6,569,149号、同第6,610,044号、同第6,654,636号、同第6,678,556号、同第6,697,669号、同第6,763,264号、同第6,778,853号、同第6,865,416号、同第6,939,862号、および第6,958,060号の各明細書中に記載され、これらは引用により本明細書の一部とする。
【0056】
細胞に取り込まれたとき、遺伝子構築物は、機能する染色体外分子として細胞内に存在し続けることができる。DNAは細胞に導入され、そこに1つのプラスミドまたは複数のプラスミドの形で一時的に存在することもできる。あるいは、RNAを細胞に投与してもよい。セントロメア、テロメア、複製起点を含む直鎖状のミニ染色体として遺伝子構築物を提供することも意図されている。遺伝子構築物は、被験者に投与される弱毒化生微生物や組換え体微生物のベクターにおいて遺伝子材料の一部を構成し得る。遺伝子構築物は、遺伝子材料が染色体外に存在する組換え体ウイルスワクチンのゲノムの一部であり得る。遺伝子構築物は、核酸分子の遺伝子発現に必要な調節エレメントを含む。そのエレメントには、プロモーター、開始コドン、停止コドン、およびポリアデニル化シグナルが含まれる。加えて、標的タンパク質または免疫調節タンパク質をコードする配列の遺伝子発現にはエンハンサーが必要となることが多い。これらのエレメントは、必要なタンパク質をコードする配列に機能可能に結合されていること、調節エレメントが、投与対象の個体において機能できるものである必要がある。
【0057】
開始コドンおよび停止コドンは、必要なタンパク質をコードするヌクレオチド配列の一部であると一般的には考えられる。しかし、これらのエレメントは、遺伝子構築物が投与される個体において機能的である必要がある。開始コドンと終止コドンは、コード配列のフレーム内に入っていなければならない。
【0058】
使用されるプロモーターとポリアデニル化シグナルは、前記個体の細胞内で機能的でなければならない。
【0059】
本発明の実施、特にヒトの遺伝子ワクチンの製造において有用なプロモーターの例としては、シミアンウイルス40(SV40)由来のプロモーター、マウス乳癌ウイルス(MMTV)プロモーター、BIV末端反復配列(LTR)プロモーターのようなヒト免疫不全ウイルス(MV)由来のプロモーター、モロニーウイルス由来のプロモーター、ALV由来プロモーター、CMV前初期プロモーターのようなサイトメガロウイルス(CMV)由来のプロモーター、エプスタイン−バーウイルス(EBV)由来のプロモーター、ラウス肉腫ウイルス(RSV)由来のプロモーター、ならびにヒト遺伝子(ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒトの筋肉のクレアチン、およびヒトメタロチオネインなど)由来のプロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【0060】
本発明の実施、特にヒトの遺伝子ワクチンの製造において有用なポリアデニル化シグナルの例としては、SV40ポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモンポリアデニル化(bgh−PolyA)シグナル、およびLTRポリアデニル化シグナルが挙げられるが、これらに限定されない。特に、pCEP4プラスミド(Invitrogen,San Diego CA)(SV40ポリアデニル化シグナルともよばれる)に含まれているSV40ポリアデニル化シグナルが用いられる。
【0061】
DNAの発現に必要な調節エレメントに加えて、他のエレメントもDNA分子に含められ得る。そのような付加的エレメントにはエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチンのエンハンサーや、CMV、RSV、およびEBV由来のエンハンサーなどのウイルス由来エンハンサーからなる群から選択されたものであり得るが、これらに限定されない。
【0062】
遺伝子構築物は、当該構築物を染色体外に維持し、細胞内でその構築物の複数のコピーを作り出すために、哺乳類の複製起点を備える形で提供され得る。Invitrogen(San Diego,CA)から市販されているプラスミドpVAX1、pCEP4、およびpREP4は、エプスタイン−バーウイルスの複製起点、および融合なしで高コピーのエピソームの複製を作り出す核抗原EBNA−1コード領域を含む。
【0063】
免疫化の用途に関連する好ましい実施形態のいくつかでは、標的タンパク質、免疫調節タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、および、それに加えてそのような標的タンパク質に対する免疫応答をさらに増強するタンパク質の遺伝子が与えられる。そのような遺伝子の例として、例えばインターフェロンα、インターフェロンγ、血小板由来増殖因子(PDGF)、TNF、GM−CSF、上皮成長因子(EGF)、IL−1、IL−2、IL−4、IL−6、IL−10、IL−12およびIL−15(シグナル配列が除去され、選択に応じてIgE由来のシグナルペプチドを含むIL−15など)のような他のサイトカインやリンホカインをコードする遺伝子が挙げられる。
【0064】
前記方法で用いられる組成物はさらに、引用により本明細書の一部とする米国特許出願第10/139,423号明細書(米国特許出願公開第2003−0176378号に対応)に記載のような、以下に挙げるタンパク質および/またはそのようなタンパク質をコードする核酸分子の1種または2種以上を含み得る。即ち、主要組織適合性複合体抗原(主要組織適合複合体クラスI抗原、または主要組織適合遺伝子複合体クラスII抗原を含む);デスドメイン受容体(以下に限定されないが、APo−1、Fas、TNFR−1、p55、WSL−1、DR3、TRAMP、Apo−3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL−R2、TRICK2、およびDR6の各受容体を含む);デスシグナル即ちデスドメイン受容体と相互作用するタンパク質(以下に限定されないが、FADD、FAP−1、TRADD、RIP、FLICE、およびRAIDDを含む);またはデスドメイン受容体と結合し、アポトーシスを開始させるリガンドを含むデスシグナル(以下に限定されないが、FAS−LおよびTNFを含む);およびデスドメイン受容体と相互作用するメディエーター(以下に限定されないが、FADD、MORT1、およびMyD88を含む);細胞を殺すタンパク質を含む毒素(以下に限定されないが、昆虫やヘビの毒、緑膿菌の内毒素など細菌の内毒素、一本鎖毒素を含むリシンなどの二重鎖リボソーム不活性化タンパク質、およびゲロニンを含む)、および/またはそれらをコードする核酸分子の1種または2種以上を含み得る。
【0065】
前記方法で用いられる組成物はさらに、引用により本明細書の一部とする米国特許出願第10/560,650号明細書(米国特許出願公開第2007/0041941号明細書に対応)に記載のような、以下に挙げるタンパク質および/またはそのようなタンパク質をコードする核酸分子の1種または2種以上を含み得る。即ち、IL−15タンパク質配列に結合した非IL−15シグナルペプチドを含む融合タンパク質(IL15−タンパク質配列、CD40L、TRAILに結合したIgEシグナルペプチドを含む融合タンパク質など);TRAILrecDRC5、TRAIL−R2、TRAIL−R3、TRAIL−R4、RANK、RANKリガンド、Ox40、Ox40リガンド、NKG2D、F461811またはMICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、CD30、CD153(CD30L)、FOS、c−jun、Sp−1、Ap1、Ap−2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、NIK、SAP K、SAP1、JNK2、JNK1B2、JNK1B1、JNK2B2、JNK2B1、JNK1A2、JNK2A1、JNK3A1、JNK3A2、NF−κ−B2、p49スプライスフォーム、NF−κ−B2、p100スプライスアイソフォーム、NF−κ−B2、p105スプライスフォーム、NF−κ−B50K単鎖前駆体、NFkBのp50、ヒトIL−1α、ヒトIL−2、ヒトIL−4、マウスIL−4、ヒトIL−5、ヒトIL−10、ヒトIL−15、ヒトIL−18、ヒトTNF−α、ヒトTNF−β、ヒトIL−12、MAdCAM−1、NGF IL−7、VEGF、TNF−R、Fas、CD40L、IL−4、CSF、G−CSF、GM−CSF、M−CSF、LFA−3、ICAM−3、ICAM−2、ICAM−1、PECAM、P150.95、Mac−1、LFA−1、CD34、RANTES、IL−8、MIP−1α、E−セレクチン、CD2、MCP−1、L−セレクチン、P−セレクチン、FLT、Apo−1、Fas、TNFR−1、p55、WSL−1、DR3、TRAMP、Apo−3、AIR、LARD、NGRF、DR4(TRAIL)、DR5、KILLER、TRAIL−R2、TRICK2、DR6、ICE、VLA−1、およびCD86(B7.2)、および/またはそれらをコードする核酸分子の1種または2種以上を含み得る。
【0066】
前記方法で用いられる組成物はさらに、引用により本明細書の一部とする米国特許出願第10/560,653号明細書(米国特許出願公開第2007/0104686号明細書に対応)に記載のような、以下に挙げるタンパク質および/またはそのようなタンパク質をコードする核酸分子の1種または2種以上を含み得る。即ち、Fos、c−jun、Sp−1、Ap−1、Ap−2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、不活性なNIK、SAP K、SAP−1、JNK、インターフェロン応答遺伝子、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL−R3、TRAIL−R4、RANK、RANKリガンド、Ox40、Ox40リガンド、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1、およびTAP2、および/またはそれらをコードする核酸分子の1種または2種以上を含み得る。
【0067】
遺伝子構築物を受けた細胞を、なんらかの理由で除去することが望ましい場合には、細胞破壊のための標的として役立つ付加的なエレメントを加えてもよい。発現可能な形態でのヘルペスチミジンキナーゼ(tk)遺伝子を、遺伝子構築物に含めることができる。薬物のガングシクロビルが、個体に投与され得、そしてその薬が、tkを産生するあらゆる細胞を選択的に殺し、従って、その遺伝子構築物を持つ細胞の選択的な破壊の手段を提供する。
【0068】
タンパク質産生を最大にするために、その構築物が投与される細胞における遺伝子発現によく適合した調節配列が選択され得る。さらに、その細胞中で最も効果的に転写されるコドンが選択され得る。当業者は、その細胞中で機能するDNA構築物を作製できる。
【0069】
いくつかの実施形態において、遺伝子構築物が、IgEシグナルペプチドに結合された本明細書に記載の免疫調節タンパク質のコード配列を作りだすために提供され得る。
【0070】
本発明の方法の1つは、核酸分子を、筋肉内、鼻腔内、腹腔内、皮下、皮内に、または局所的にもしくは洗浄により、吸入、膣、直腸、尿道、頬および舌下からなる群から選択された粘膜組織へ投与する工程を含む。
【0071】
いくつかの実施形態では、その核酸分子は、ポリヌクレオチド機能エンハンサーまたは遺伝子ワクチン促進物質の投与と組合せて、細胞に送達される。ポリヌクレオチド機能エンハンサーは、米国特許第5,593,972号および同第5,962,428号の各明細書に記載されており、それぞれ引用により本明細書の一部とする。遺伝子ワクチン促進物質は、米国特許第5,739,118号明細書に記載されており、その内容は引用により本明細書の一部とする。核酸分子とともに投与される助剤は、その核酸分子との混合物として投与され得るか、または別々に、核酸分子の投与と同時、投与前もしくは投与後に、投与され得る。加えて、トランスフェクト剤、および/または複製剤、および/または炎症性物質として機能し得、かつポリヌクレオチド機能エンハンサーと同時投与され得る他の物質として、成長因子、サイトカインやリンホカイン(インターフェロンα、インターフェロンγ、GM−CSF、血小板由来増殖因子(PDGF)、TNF、上皮成長因子(EGF)、IL−1、IL−2、IL−4、IL−6、IL−10、IL−12、およびIL−15ならびに線維芽細胞増殖因子など)、免疫刺激複合体(ISCOMS)などの界面活性剤、モノホスホリルリピドA(WL)を含むLPSアナログ、ムラミルペプチド、キノンアナログならびにスクアレンやスクワレンなどの小胞、およびヒアルロン酸が挙げられ、これらはまた遺伝子構築物とともに用いられ投与され得る。いくつかの実施形態では、免疫調節タンパク質も、ポリヌクレオチド機能エンハンサーとして使用することができる。いくつかの実施形態において、核酸分子は、送達/取り込みを増強するためにポリ(ラクチド-co-グリコリド)(PLG)と結合した形で提供される。
【0072】
本発明による医薬組成物は、約1ng〜約2000μgのDNAを含む。いくつかの好ましい実施形態では、本発明による医薬組成物は、約5ng〜約1000μgのDNAを含む。いくつかの好ましい実施形態では、その医薬組成物は、約10ng〜約800μgのDNAを含む。いくつかの好ましい実施形態では、その医薬組成物は、約0.1μg〜約500μgのDNAを含む。いくつかの好ましい実施形態では、その医薬組成物は、約1μg〜約350μgのDNAを含む。いくつかの好ましい実施形態では、その医薬組成物は、約25μg〜約250μgのDNAを含む。いくつかの好ましい実施形態では、その医薬組成物は、約100μg〜約200μgのDNAを含む。
【0073】
本発明による医薬組成物は、用いられる投与の方式に応じて調合される。医薬組成物が、注入可能なものである場合、その医薬組成物は滅菌され、発熱物質を含まず、そして微粒子を含まない。等浸透圧性の調合物を用いるのが好ましい。一般的に、等浸透圧のための添加剤としては、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、および乳糖を挙げることができる。場合によっては、リン酸緩衝食塩水のような等浸透圧性の溶液が好ましい。安定剤としては、ゼラチンおよびアルブミンが挙げられる。いくつかの実施形態では、血管収縮剤がその調合物に加えられる。
【0074】
本発明のいくつかの実施形態によれば、免疫原に対する免疫応答を誘導する方法が、免疫原およびIL−15Rαまたはその機能性断片を個体に与えることによって提供される。ワクチンは、弱毒化生ワクチン、組換え体ワクチンまたは核酸ワクチンもしくはDNAワクチンであり得る。
【0075】
本発明は、標的たんぱく質、即ち病原体、アレルゲンまたは個体自身の「異常な」細胞に特異的に関連するタンパク質に対する増強された免疫応答を誘導するのに役立つ。本発明は、病原体タンパク質に対する免疫応答が病原体に対する防御免疫をもたらすように、病原性の物質や生物に対して個体を免疫化する上で有用である。本発明は、過剰増殖性細胞に特異的に関連する標的タンパク質に対する免疫応答を引き出すことによって癌などの過剰増殖性疾患や障害を治療するのに役立つ。本発明は、自己免疫状態に関与する細胞に特異的に関連する標的タンパク質に対する免疫応答を引き出すことによって自己免疫疾患や障害を治療するのに役立つ。
【0076】
本発明のいくつかの側面によれば、標的タンパク質および免疫調節タンパク質をコードするDNAまたはRNAが、発現される個体の組織の細胞に導入され、従って、そのコードされたタンパク質が産生される。標的タンパク質および免疫調節タンパク質をコードするDNA配列またはRNA配列が、個体の細胞中での発現に必要な調節エレメントに結合される。DNA発現のための調節エレメントには、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルが含まれる。加えて、コザック領域のような他のエレメントも、その遺伝子構築物中に含めることができる。
【0077】
いくつかの実施形態では、標的タンパク質をコードする配列の発現可能な形態、および両方の免疫調節タンパク質をコードする配列の発現可能な形態が、個体に与えられる同じ核酸分子上に存在する。
【0078】
いくつかの実施形態では、標的タンパク質をコードする配列の発現可能な形態は、免疫調節性のタンパク質をコードする配列の発現可能な形態を含むものとは別の核酸分子上に存在する。いくつかの実施形態では、標的タンパク質をコードする配列の発現可能な形態と、1種または2種以上の免疫調節性のタンパク質群をコードする配列の発現可能な形態とが、免疫調節タンパク質をコードする配列の発現可能な形態を含む核酸分子とは別の1つの核酸分子上に存在する。本発明によれば、複数の異なる核酸分子を作り出し、与えることができる。
【0079】
核酸分子は、組換え体ベクターの核酸分子であるプラスミドDNAとして、または弱毒化ワクチンで提供される遺伝子物質の一部として提供され得る。あるいは、いくつかの実施形態では、標的タンパク質および免疫調節タンパク質が、それらをコードする核酸分子に加えて、またはそれらをコードする核酸分子のかわりに、タンパク質として与えられ得る。
【0080】
遺伝子構築物は、標的タンパク質、または遺伝子発現に必要な調節エレメントに機能可能に結合された免疫調節タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み得る。本発明によれば、標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現可能な形態を含む構築物、および免疫調節タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現可能な形態を含む構築物を含む遺伝子構築物の組合せが提供される。遺伝子構築物の組合せを含む、DNA分子またはRNA分子を生細胞に導入することにより、そのDNAまたはRNAが発現し、標的タンパク質と1種または2種以上の免疫調節タンパク質が産生される。標的タンパク質に対する増強された免疫応答を結果として生じる。
【0081】
本発明は、ウイルス、原核生物と真核生物の病原性生物(例えば、単細胞病原生物や多細胞の寄生虫など)のような病原体に対して個体を免疫化するために用いられ得る。本発明は、特に、細胞に感染し、かつ被包性でない病原体(例えば、ウイルス)、および原核生物(淋菌、リステリア菌、および赤痢菌など)に対して個体を免疫化するために特に有用である。加えて、本発明は、原生動物病原体(それらが細胞内病原体である、生活周期上のステージを含む)に対して、個体を免疫化するためにも有用である。表1は、本発明によってワクチンが作られ得るウイルスの科および属のいくつかのリストを提供する。表に記載される抗原のような病原体抗原上に提示されるエピトープに同一または実質的に類似である少なくとも1つのエピトープを含むペプチドをコードするDNA配列を含むDNA構築物は、ワクチンにおいて有用である。さらに、本発明は、表2に記載されたような、原核生物および真核生物である原生動物病原体、ならびに多細胞寄生生物を含む他の病原体に対して、個体を免疫化するためにも役立つ。当業者は、慢性感染症を生じさせる病原体を容易に特定し、感染後除去されるもの(即ち急性感染症)から区別できる。
【0082】
[表]
表1−ウイルス
ピコナウイルス科
属:
ライノウイルス:(医学上)通常の感冒の50%の症例の原因となる。
エンテロウイルス:(医学上)ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルス、およびA型肝炎ウイルスなどのヒトエンテロウイルス
アフトウイルス:(獣医学上)これらは口蹄疫ウイルスである。
標的抗原: VP1、VP2、VP3、VP4、VPG
カリシウイルス科
属:
ノーフォークウイルス群:(医学上)これらのウイルスは流行性胃腸炎の重要な原因病原体である。
トガウイルス科
属:
アルファウイルス:(医学上および獣医学上)例としてシンドビスウイルス、ロスリバーウイルスならびに東部ウマ脳炎ウイルスおよび西部ウマ脳炎ウイルスが挙げられる。
レオウイルス:(医学上)風疹ウイルス
フラビウイルス科
例:
(医学上)デング熱、黄熱病、日本脳炎、セントルイス脳炎、およびダニ媒介脳炎ウイルス。
西ナイルウイルス(Genbank NC001563、AF533540、AF404757、AF404756、AF404755、AF404754、AF404753、AF481864、M12294、AF317203、AF196835、AF260969、AF260968、AF260967、AF206518およびAF202541)
代表的な標的抗原:
E
NS5
C
C型肝炎ウイルス:
(医学上)これらのウイルスは未だ科に位置づけられていないが、トガウイルスまたはフラビウイルスのいずれかであると考えられる。最も類似性が高いのはトガウイルス科である。
コロナウイルス科:(医学上および獣医学上)
伝染性気管支炎ウイルス(家禽)
ブタ伝染性胃腸炎ウイルス(ブタ)
ブタ血球凝集性脳脊髄炎ウイルス(ブタ)
ネコ伝染性腹膜炎ウイルス(ネコ)
ネコ腸コロナウイルス(ネコ)
イヌコロナウイルス(犬)
SARS関連コロナウイルス
ヒト呼吸器コロナウイルスは一般的な感冒の症例の約40%の原因となる。
EX. 224E、OC43
注−コロナウイルスは、非A型、非B型または非C型の肝炎を起こし得る。
標的抗原:
E1−Mまたはマトリックスタンパク質とも呼ばれる。
E2−Sまたはスパイクタンパク質とも呼ばれる。
E3−BEまたはヘマグルチンエルテロースとも呼ばれる。
糖タンパク質(すべてのコロナウイルスに存在するわけではない)
N−ヌクレオカプシド
ラブドウイルス科
属:
ベシクロウイルス
リッサウイルス(医学上および獣医学上)
狂犬病
標的抗原:
Gタンパク質
Nタンパク質
フィロウイルス科:(医学上)
マールブルグウイルスまたはエボラウイルスなどの出血熱ウイルス
パラミクソウイルス科:
属:
パラミクソウイルス:(医学上および獣医学上)流行性耳下腺炎ウイルス、ニューカッスル病ウイルス(ニワトリに重要な病原体)
麻疹ウイルス:(医学上および獣医学上)麻疹、イヌジステンパー
肺炎ウイルス:(医学上および獣医学上)呼吸器合胞体ウイルス
オルトミクソウイルス科:(医学上)インフルエンザウイルス
ブンヤウイルス科
属:
ブンヤウイルス:(医学上)カリフォルニア脳炎、ラクロスウイルス
フレボウイルス:(医学上)リフトバレー熱
ハンタウイルス:プレマーラ(puremala)はヘマハギン(hemahagin)熱ウイルスである。
ナイロウイルス:(獣医学上)ナイロビヒツジ病
さらに多くの未分類のブンヤウイルスが存在する。
アレナウイルス科(医学上)LCM、ラッサ熱ウイルス
レオウイルス科
属:
レオウイルス:ヒト病原体の可能性がある
ロタウイルス:小児の急性胃腸炎
オルビウイルス:(医学上および獣医学上)コロラドダニ熱、レボンボ(Lebombo)(ヒト)ウマ脳症、ブルータング
レトロウイルス科
亜科:
オンコウイルス亜科:(獣医学上)(医学上)ネコ白血病ウイルス、HTLVIおよびHTLVII
レンチウイルス亜科:(医学上および獣医学上)HIV、ネコ免疫不全ウイルス、ウマ伝染性貧血ウイルス
スプマウイルス亜科
パポーバウイルス科
亜科:
ポリオーマウイルス:(医学上)BKU及びJCUウイルス
亜科:
パピローマウイルス:(医学上)癌や乳頭腫の悪性進行に関連する多種のウイルス
アデノウイルス(医学上)
EX AD7、ARD、O.B.
−呼吸器疾患を引き起こす。
−275などいくつかのアデノウイルスは腸炎の原因となる。
パルボウイルス科(獣医学上)
ネコパルボウイルス:ネコ腸炎を引き起こす。
ネコパンロイコペニアウイルス
イヌパルボウイルス
ブタパルボウイルス
ヘルペスウイルス科
亜科:
アルファヘルペスウイルス亜科
属:
単純ヘルペスウイルス(医学上)
HSVI(Genbank X14112、NC001806)、HSVII(NC001798)
水痘帯状疱疹ウイルス(医学上および獣医学上):仮性狂犬病、水痘帯状疱疹
亜科:
ベータヘルペスウイルス亜科
属:
サイトメガロウイルス(医学上)
HCMV
ムロメガロウイルス
亜科:
ガンマヘルペスウイルス亜科
属:
リンフォクリプトウイルス(医学上)
EBV−(バーキットリンパ腫)
ポックスウイルス科
亜科:
コードポックスウイルス亜科(医学上および獣医学上)
属:
痘瘡(天然痘)
ワクシニア(牛痘)
パラポックスウイルス−獣医学上
アビポックスウイルス−獣医学上
カプリポックスウイルス
レポリポックスウイルス
スイポックスウイルス
亜科:
エントモポックスウイルス亜科
ヘパドナウイルス科
B型肝炎ウイルス
未分類
D型肝炎ウイルス
【0083】
表2
細菌性病原体
肺炎球菌、ブドウ球菌、および連鎖球菌を含む病原性グラム陽性球菌
髄膜炎菌および淋菌を含む病原性グラム陰性菌
病原性腸内グラム陰性桿菌には次のものが含まれる。
腸内細菌科;シュードモナス、アシネトバクタおよびエイケネラ、類鼻疽菌;サルモネラ属;赤痢菌;ヘモフィルス属;軟性下疳菌;ブルセラ症菌;野兎病菌;エルシニア属(パスツレラ属);ストレプトバシラスモニリフォルミスおよびスピリルム属;リステリア菌:豚丹毒菌;ジフテリア菌、コレラ菌、炭疽菌;ドノバノーシス(鼠径部肉芽腫)菌;およびバルトネラ症菌。
病原性嫌気性細菌には次のものが含まれる。
破傷風菌、ボツリヌス菌;他のクロストリジウム属;結核菌;らい菌;および他のマイコバクテリア。
病原性のスピロヘータ疾患には次のものが含まれる。
梅毒;−トレポネーマ症:フランベジア、ピンタと風土病性梅毒;およびレプトスピラ症の細菌。
高病原性細菌および病原性真菌による他の感染症には次のものが含まれる。
放線菌症;ノカルジア症;クリプトコッカス症、ブラストミセス症、ヒストプラスマ症、およびコクシジオイデス症;カンジダ症、アスペルギルス症、およびムコール症;スポロトリクム症;パラコクシジオイドミコーシス、ペトリエリジオーシス(petriellidiosis)、トルロプシス症、菌腫、およびクロモミコーシス;ならびに皮膚糸状菌症。
リケッチア感染は、リケッチア感染症およびリケッチア症を含む。
マイコプラズマおよびクラミジア感染症の例としては、マイコプラズマ肺炎;鼠径部リンパ肉芽腫;オウム病;および周産期のクラミジア感染症が挙げられる。
病原性真核生物
病原性原生動物および蠕虫による感染症には次のものが含まれる。
アメーバ症;マラリア;リーシュマニア症;トリパノソーマ症;トキソプラズマ症;ニューモシスティスカリニ;バベシア症;ジアルジア症;旋毛虫症;フィラリア症;住血吸虫症;線虫感染症;吸虫類感染症;および条虫(サナダムシ)感染症。
【0084】
病原体感染を防ぐ遺伝子ワクチンを作るため、防御免疫反応の対象となり得る免疫原タンパク質をコードする遺伝子物質が、標的のためのコード配列として、遺伝子構築物中に含められなければならない。DNAおよびRNAはともに比較的小さく、そして比較的容易に作製できるため、本発明は、多数の病原体抗原でワクチン接種することを可能にする付加的な利点を提供する。遺伝子ワクチンにおいて用いられる遺伝子構築物は、多くの病原体抗原をコードする遺伝子物質を含み得る。例えば、いくつかのウイルス遺伝子が、1つの構築物中に含まれ得、それにより複数の標的を提供する。
【0085】
表1および表2は、いくつかの病原体および病原性生物のリストを含み、それらによる感染から個体を防御するために遺伝子ワクチンを調製できる。いくつかの好ましい実施形態では、病原体に対して個体を免疫する方法が、ヒト免疫不全症ウイルス(HIV)、単純ヘルペスウイルス(HSV)、C型肝炎ウイルス(HCV)、西ナイルウイルス(WNV))、またはB型肝炎ウイルス(HBV)を対象とする。
【0086】
本発明の別の側面が、過剰増殖性の疾患に特徴的な過剰増殖細胞に対する防御免疫応答を付与する方法、および過剰増殖性疾患に罹患している個体を処置する方法を提供する。過剰増殖性疾患の例としては、全ての形態の癌および乾癬が挙げられる。
【0087】
免疫原である「過剰増殖細胞」関連タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物の、個体の細胞内への導入が、個体のワクチン接種された細胞でのこれらのタンパク質の産生をもたらすことが発見された。過剰増殖性疾患に対して免疫化するため、過剰増殖性疾患に関連するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物が、個体に投与される。
【0088】
過剰増殖関連タンパク質が有効な免疫原性標的であるためには、正常細胞と比較した場合、それが、過剰増殖細胞中で排他的に、または高レベルで産生されるタンパク質でなければならない。標的抗原はそのようなタンパク質、その断片およびペプチドを含み、それらは、そのようなタンパク質上に見出される少なくとも1つのエピトープを含む。場合によっては、過剰増殖関連タンパク質は、タンパク質をコードする遺伝子の変異の産物である。その変異した遺伝子は、正常なタンパク質では見られない異なるエピトープを生じる、わずかに異なるアミノ酸配列を持つこと以外は、正常なタンパク質とほぼ相同なタンパク質をコードする。そのような標的タンパク質としては、癌遺伝子(例えば、myb、myc、fyn、および転座遺伝子でもあるbcr/abl、ras、src、P53、neu、trk、ならびにEGRFなど)によりコードされるタンパク質が挙げられる。標的抗原としての癌遺伝子産物に加えて、抗癌処置および保護的レジメンのための標的タンパク質としては、B細胞リンパ腫により作られる抗体の可変領域およびT細胞リンパ腫のT細胞受容体の可変領域が挙げられ、それらはいくつかの実施形態では、自己免疫疾患のための標的抗原としても用いられる。他の腫瘍関連タンパク質がまた、標的タンパク質として用いられ得るが、それらは腫瘍細胞において高レベルで存在するタンパク質であり、モノクローナル抗体17−IAにより認識されるタンパク質および葉酸塩結合タンパク質またはPSAを含む。
【0089】
本発明は、1つまたはそれ以上の数のいくつかの形態の癌に対して、個体を免疫化するために用いられ得るが、本発明は特に、特定の癌を発症しやすいか、または過去に癌にかかり、従って再発しやすい個体を予防的に免疫化するために有用である。疫学とともに遺伝学および技術における発展によって、個体における癌の発症の見込みの決定およびリスクアセスメントが可能となる。遺伝子スクリーニングおよび/または家族の健康暦を用いて、特定の個体が、いくつかの型の癌のいずれかを発症する見込みを予測することができる。
【0090】
同様に、既に癌を発症した個体、および癌を除去する処置を受けたか、またはさもなければ寛解期の個体は、ぶり返しおよび再発を特に受けやすい。処置レジメンの一部として、そのような個体を、再発と戦うために、その個体が有したと診断された癌に対して免疫化し得る。従って、個体が、ある型の癌を有し再発のリスクがあると一度分かったならば、その個体を、あらゆる将来の癌の出現とも戦う免疫系を準備するべく免疫化し得る。
【0091】
本発明は、過剰増殖性疾患に罹患した個体を処置する方法を提供する。そのような方法において、遺伝子構築物の導入は、標的タンパク質を産生する過剰増殖細胞と戦うべく個体の免疫系を誘導し促進する免疫療法として役立つ。
【0092】
本発明は、自己免疫に関連する標的(細胞受容体、および「自己」に対する抗体を産生する細胞を含む)に対する広範囲にわたる防御免疫応答を与えることにより、自己免疫疾患および自己免疫障害に罹患した個体を処置する方法を提供する。
【0093】
T細胞媒介自己免疫疾患としては、慢性関節リウマチ(RA)、多発性硬化症(MS)、シェーグレン症候群、サルコイドーシス、インスリン依存性真性糖尿病(IDDM)、自己免疫性甲状腺炎、反応性関節炎、強直性脊椎炎、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、乾癬、脈管炎、ヴェーゲナー肉芽腫症、クローン病、および潰瘍性大腸炎が挙げられる。これらの疾患のそれぞれは、内生抗原に結合し、そして自己免疫疾患に関連する炎症カスケードを開始するT細胞受容体によって特性化される。T細胞の多様な領域に対するワクチンの接種は、それらのT細胞を除去するCTLを含む免疫応答を誘発する。
【0094】
RAでは、その疾患に関与するT細胞受容体(TCR)のいくつかの特異的な可変領域が特性化されている。これらのTCRとしては、Vβ−3、Vβ−14、20 Vβ−17、およびVa−17が挙げられる。従って、これらのタンパク質の少なくとも1つをコードするDNA構築物を用いたワクチン接種が、RAに関連するT細胞を標的とする免疫応答を誘発することになる。参照:Howell,M.D.,ら,1991 Proc.Nat.Acad.Sci.USA 88:10921−10925;Piliard,X.,ら,1991 Science 253:325−329;Williams,W.V.,ら,1992 J Clin.Invest.90:326−333;それぞれ引用により本明細書の一部とする。MSでは、その疾患に関与するTCRのいくつかの特異的な可変領域が特性化されている。これらのTCRには、VfPおよびVa−10が含まれる。従って、これらのタンパク質の少なくとも1つをコードするDNA構築物を用いるワクチン接種は、MSに関連するT細胞を標的とする免疫応答を誘発することになる。参照:Wucherpfennig,K.W.,ら,1990 Science 248:1016−1019;Oksenberg,J.R.,ら,1990 Nature 345:344−346;それぞれ引用により本明細書の一部とする。
【0095】
強皮症では、その疾患に関与するTCRのいくつかの特異的な可変領域が特性化されている。これらのTCRには、Vβ−6、Vβ−8、Vβ−14およびVa−16、Va−3C、Va−7、Va−14、Va−15、Va−16、Va−28およびVa−12が含まれる。従って、これらのタンパク質の少なくとも1つをコードするDNA構築物を用いるワクチン接種は、強皮症に関連するT細胞を標的とする免疫応答を誘発することになる。
【0096】
特にTCRの可変領域がまだ特性化されていないT細胞媒介自己免疫疾患に罹患している患者を処置するため、滑膜の生検を行い得る。存在するT細胞のサンプルを採取し、そしてそれらのTCRの可変領域を、標準的な技術を用いて特定し得る。遺伝子ワクチンは、この情報を用いて調製することができる。
【0097】
B細胞媒介自己免疫疾患としては、狼瘡(SLE)、グレーブズ病、重症筋無力症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少症、ぜん息、クリオグロブリン血症、原発性胆汁性硬化症、および悪性貧血が挙げられる。これらの疾患のそれぞれは、内生抗原に結合し、そして自己免疫疾患に関連する炎症カスケードを開始する抗体によって特性化される。抗体の可変領域に対するワクチン接種は、その抗体を産生するB細胞を除去するCTLを含む免疫応答を誘発する。
【0098】
B細胞媒介自己免疫疾患に罹患している患者を処置するため、自己免疫活性に関与する抗体の可変領域が同定されなければならない。生検を実行し得、そして、炎症部位に存在する抗体のサンプルを採取し得る。それらの抗体の可変領域を、標準的な技術を用いて同定し得る。遺伝子ワクチンは、この情報を用いて調製することができる。
【0099】
SLEの場合、1つの抗原はDNAであると考えられている。従って、SLEに対して免疫化される患者においては、患者の血清を抗DNA抗体についてスクリーニングし得、そして、その血清中にみとめられるそのような抗DNA抗体の可変領域をコードするDNA構築物を含むワクチンを調製し得る。
【0100】
TCRおよび抗体の両方の可変領域の中の、共通の構造的な特徴は周知である。特定のTCRまたは抗体をコードするDNA配列は、周知の方法(例えば、引用により本明細書の一部とするKabat,ら1987 Sequence of Proteins of Immunological Interest U.S. Department of Health and Human Services,Bethesda MDに記載された方法)に従って通常見出すことができる。加えて、抗体から機能性の可変領域をクローニングする一般的な方法は、引用により本明細書の一部とするChaudhary,V.K.,ら,1990 Proc.Natl.Acad Sci.USA 87:1066に見出すことができる。
【0101】
遺伝子ワクチンを改善するために免疫調節タンパク質コード配列の発現可能な形態を用いることに加えて、本発明は、改善された弱毒化生ワクチン、および抗原をコードする外来遺伝子を送達する組換えベクターを用いる改善されたワクチンに関する。弱毒化生ワクチンおよび外来抗原を送達する組換えベクターを用いるワクチンの例は、米国特許第4,722,848号;同第5,017,487号;同第5,077,044号;同第5,110,587号;同第5,112,749号;同第5,174,993号;同第5,223,424号;同第5,225,336号;同第5,240,703号;同第5,242,829号;同第5,294,441号;同第5,294,548号;同第5,310,668号;同第5,387,744号;同第5,389,368号;同第5,424,065号;同第5,451,499号;同第5,453,364号;同第5,462,734号;同第5,470,734号;および同第5,482,713号の各明細書に記載され、それぞれ引用により本明細書の一部とする。IL−R15αまたはその機能性断片をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物が提供され、そのヌクレオチド配列は、ワクチンにおいて、発現をもたらすように機能し得る調節配列に機能可能に連結される。本発明による改善されたワクチンを製造するために、遺伝子構築物は、弱毒化生ワクチンおよび組換え体ワクチン中に組み込まれる。
【0102】
本発明は、個体を免疫化する改善された方法であって、DNAワクチン、弱毒化生ワクチン、および組換え体ワクチンを含むワクチン組成物の部分として個体の細胞に遺伝子構築物を送達する工程を含む方法を提供する。その遺伝子構築物は、IL−15受容体αまたはその機能性断片をコードし、ワクチンにおいて、発現をもたらすように機能し得る調節配列に機能可能に連結されるヌクレオチド配列を含む。改善されたワクチンは、細胞性免疫応答を増強させる。
【実施例】
【0103】
マウスをpIL−15とpIL−15Rαで共免疫して、HIV−1 DNAワクチン抗原を用いて誘発された、増強された免疫応答を判定した。データによれば、IL−15とIL−15Rαの組合せは細胞全体の免疫応答を実際に増強したが、驚くべきことに、IL−15RαのプラスミドはIL−15とは無関係に免疫応答を増大させた。重要な点として、誘発されたメモリ応答は、pIL−15とpIL−15Rαとで共免疫されたマウスでのみ維持され、IL−15Rα単体では維持されなかった。初めて行われたこれらの試験から立証されるのは、IL−15Rαタンパク質が単独で、限定された免疫増殖の表現型でアジュバントとして機能し得るということである。
【0104】
[材料および方法]
(ウエスタンブロット法による解析)
標準的なプロトコールに従ってウエスタンブロット解析を行った。ウェル1つ当たり3μgの組換え体IL−15αまたはVPRタンパク質(Abgent)をSDS−PAGEゲル(Cambrex,Rockland,ME)上で走らせ、ニトロセルロースメンブランにブロットし、R&D製またはKK1.23抗ヒトIL−15Rα抗体のいずれかでプローブした。抗マウスIgG−HRP(Zymed)を用いてシグナルを増幅し、ECL(GE Healthcare,Chalfont St.Giles,United Kingdom)で検出した。
【0105】
(DNAプラスミド)
HIV−1gagおよびHIV−1polを発現するDNAワクチン構築物(Kimら、1998)とヒトIL−15(Kutzlerら,2005)を、前述したように準備した。ヒトIL−15Rαのオープンリーディングフレームを、pVAX1およびpTRACERベクター(Invitrogen,Carlsbad,CA)に移した。EcoRI/BamHIまたはNheI/EcoRI(New England Biolabs,Beverly,MA)を利用した制限酵素による消化をそれぞれ用いた。陽性のクローンをシーケンス解析により検証した。
【0106】
(In−vitro翻訳アッセイ)
TNT−T7 Quick Coupled Transcription/Translation Reticulocyte Lysate system(Promega,WI)と[35S]メチオニンを用いて、標識されたIL−15Rαタンパク質産物を作り出した。pVAXベクター単体(陰性対照)またはIL−15Rαおよび[35S]メチオニンを含むpVAXベクターを、製造元の指示に従って反応混合物に添加した。反応は30℃で1時間かけて行った。標識されたタンパク質を、5μgの精製モノクローナル抗IL−15Rα抗体(R&D Systems)またはクローンKK1.23を用いて、RIPAバッファ中で4℃で一晩、回転撹拌させて免疫沈降した。約5mgのプロテインGセファロースビーズ(GE Healthcare)(100mg/mLストックの50μL)を各免疫沈降反応物に添加し、そのサンプルを4℃で2時間、回転撹拌しながらインキュベートした。高濃度の塩とウシ血清アルブミンを含む結合バッファで3回洗浄し、最終的に2×のサンプルバッファに懸濁した。免疫沈降したタンパク質複合体を、5分間ボイルしてセファロースビーズから溶出させ、12%SDS−PAGEゲル(Cambrex)上を走らせた。ゲルを固定し、増幅溶液(GE Healthcare)で処理して、ゲル乾燥機(Bio−Rad,Hercules,CA)で2時間乾燥した。乾燥したゲルを−80度でX線フィルムに露出し、Kodak自動現像機(Kodak,Rochester,NY)を用いて現像した。
【0107】
(間接免疫蛍光アッセイ)
pIL−15Rαプラスミドの発現を確認するための間接免疫蛍光アッセイを、以前に説明された(Ramanathanら,2002)、以下のプロトコールに従って行った。スライドチャンバ(BD Biosciences,Bedford,MA)において、完全DMEM培地プラス10%FBS(Hyclone,Logan,UT)と抗生物質/抗真菌薬(GIBCO,Invitrogen,Carlsbad,CA)中で1チャンバ当たり100,000セルの密度で成長したHeLa細胞(ATCC,Rockville,MD)を、接着できるように一晩おいた。FuGENE 6 Transfection Reagent(Roche Diagnostics,Basel,Switzerland)を製造元のプロトコールに従って用いて、細胞にpIL−15Rα、pTRACER、またはpVAX−1(1μg/ウェル)をトランスフェクトした。トランスフェクトの24時間後に、細胞をPBSで洗浄し、室温で1時間かけて2%PFA/PBSを用いてスライド上に固定した。スライドを、発明者の研究室で作製した5μgのクローンKK1.23マウス抗ヒトIL−15Rα、またはIgG1アイソタイプの対照(R&D systems,Minneapolis,MN)とともに37度で90分間インキュベートした。二次抗体にコンジュゲートした抗マウスIgG−ローダミン(Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA)を1:200で添加し、そのスライドを室温で45分間インキュベートした。室温で10分間DAPI(Molecular Probes,Invitrogen)染色した後、スライドをFluoromount−G培地(Electron Microscopy Sciences,Hatfield,PA)に設置し、蛍光顕微鏡検査のためのPhase3 Image Pro Program(Media Cybernetics,Bethesda,MD)を用いて解析した。
【0108】
(プラスミド免疫化とマウス)
6乃至8週齢の雌BALB/c(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)、C57BL/6(Taconic,Germantown,NY)またはIL−15ノックアウト(Taconic)(Kennedyら、2000)マウスの前脛骨筋に、2週間の間隔をおいて3回注射し、CELLECTRA(登録商標)適応的定電流装置(VGX Pharmaceuticals,The Woodlands,TX)を用いて、以前に説明された(Khanら,2003;Laddyら,2008)電気穿孔処理を行った。全てのマウス実験のために、その動物を、35μgのpVAX1、5μgのHIV−1抗原プラスミド(gag、pol)、10μgのpIL−15、および/または7.5μgの、10μgの、または15μgのpIL−15Rα(各グループあたりn=3−7)で免疫化した。さまざまな遺伝子プラスミドの同時投与では、指定したDNAプラスミドの混合の後、等張クエン酸塩バッファ(Kimら,1998;Kutzlerら,2005)にいれた0.25%塩酸ブピバカイン(Sigma)に注入し,最終容量を40μlとした。全ての動物は、ペンシルベニア大学の温度制御、光サイクル機能付き施設に収容され、その世話は米国国立衛生研究所とペンシルベニア大学のガイドラインに従って行われた。
【0109】
(マウス犠牲処置、サンプル収集、および組織回収の方法)
免疫化スケジュールの指定された複数の時点で、動物を鎮痛剤を用いて沈静化し、血液を採取した後に、当該動物を頚部脱臼により犠牲処置した。各マウスの脾臓を採取して、R10培地(RPMI1640+10%ウシ胎仔血清、抗生物質/抗真菌薬およびB−メルカプトエタノール)を含む15mlの三角管に(実験グループごとに)プールした。滅菌組織培養フードでは、各実験グループからプールされた脾臓/培地混合物を、ストマッカー装置(Seward80、Metrohm,Riverview,FL)を用いて破砕し、単一細胞の懸濁液とした。細胞/組織間質は、40ミクロンのセルストレーナーに通し、R10で洗浄してペレット化して、ACK溶解バッファ(Lonza,Switzerland)中で5分間室温でインキュベートして、赤血球を溶解させた。その後脾細胞をカウントし、後述するように免疫アッセイにて利用した。
【0110】
(IFN−γ ELISPOTアッセイ)
IFN−γ ELISPOTアッセイを、前述したように(Kutzlerら,2005)行って、免疫化されたマウスからの抗原特異的なサイトカインの分泌を判定した。簡潔に説明すると、ELISpot96穴プレートを抗マウスIFN−γ捕捉抗体でコーティングし、4℃で24時間インキュベートする(R&D Systems)。免疫化したマウスからの2×105の脾細胞をELISpotプレートの各ウェルに加え、5%のCO2、37℃で一晩刺激した。この処置は、R10(陰性対照)、コンカナバリンA(陽性対照)、または特定のペプチド(HIV−1gagまたはpol)抗原(10μg/ml)の存在下で行った。11個のアミノ酸で重複し、それぞれのタンパク質の全体にまたがるHIV−1コンセンサスクレードBのサブタイプHIV−1gagおよびpolの15量体ペプチドを、AIDS Reagent and Reference Repository(Frederick、MD)から入手した。CD8欠失実験のために、CD8+T細胞を、抗CD8a(LY−2)抗体(Miltenyi Biotech、Germany)を製造元のプロトコールに従って用いて、ポジティブ磁気選択により全脾細胞から除去した。24時間の刺激の後、プレートを洗浄し、4℃で一晩ビオチン化抗マウスIFN−γ抗体(R&D Systems)とともにインキュベートした。次いでプレートを洗浄し、室温で2時間、ストレプトアビジンアルカリホスファターゼ(R&D Systems)とともにインキュベートした。さらにプレートを洗浄し、5−ブロモ−4−クロロ−3’−インドリルホスフェートp−トルイジン塩(BCIP)とニトロブルー塩化テトラゾリウム(NBT)(クロモゲン着色試薬、R&D Systems)を加えた。プレートを蒸留水でリンスし、室温で乾燥させた。そして、自動化されたELISpotリーダー(CTL Limited,Inc. Cleveland,OH)によってスポットをカウントした。生の値を決定しそれを5倍して、データが100万個の脾細胞あたりのセル形成スポットとして表現されるようにした。グラフに描く前に、グラフ各グループのR10ウェルでのバックグラウンド値をペプチド刺激されたウェルの値から差し引いた。
【0111】
細胞内サイトカイン染色HIV−1特異的T細胞応答も、Cytofix/Cytopermキットと標準プロトコール(BD Biosciences)を用いた細胞内サイトカイン染色により決定した。免疫化マウスからの脾細胞を、R10およびDMSO(陰性対照)、10ng/mlのPMAおよび250ng/mlのイオノマイシン(陽性対照)、またはHIV−1コンセンサスクレードBgagまたはpolの15量体のペプチドとともに、1ul/mlのGolgiPlug(BD Biosciences)の存在下で5時間刺激した。表面染色の前に、細胞を37℃で10分間 LIVE/DEAD fixable violetキット(分子プローブ、Invitrogen)で染色し、Fcブロック(BD)を加えて4度で15分間おきFc受容体をブロックした。全抗体はBD Biosciencesから購入し、試験1回あたり1μlを使用した。透過/固定化処理の前に細胞を、40℃で30分間、CD4−Alexa700およびCD8−PerCPで染色した。4度で45分間の細胞内染色では、CD3−PECy5およびIFN−γPE−Cy7を含めた。50000の生きたCD3+リンパ球作動性イベントからのデータを、LSRIIフローサイトメーター(BD Biosciences)を用いて取得し、FlowJoソフトウェア(Treestar,Inc.,Ashland、OR)を使用して解析した。グラフに描く前に、陰性対照ウェルからの応答を抗原刺激のものから差し引いた。
【0112】
(HIV−1Gag結合抗体の解析)
以前に説明されたように(Ogawaら,1989;Mesteckyら,2004)、ELISAを用いて、マウス血清中のHIV−1Gag特異的抗体IgGの有無を判定した。EIA/RIAプレート(Corning Costar,Cambridge,MA)を、ウェル当たり100μlの最終容量にPBS(Mediatech,Herndon,VA)で希釈した1μg/mlの組換え体HIV−1IIIBgag p24遺伝子(Immunodiagnostics,Woburn,MA)でコーティングした後、4℃で一晩インキュベートした。プレートをPBS−Tween(0.05%のTween20)で洗浄し、200μlのブロッキングバッファ/希釈液(PBS中3%BSA)を用いて室温で2時間かけて非特異的結合に対してブロックした。プレートを洗浄し、免疫化マウス由来のプールした血清の希釈液を、1/10から1/1600までの希釈度で3部づつ(ウェルあたり100μl)加え、室温で2時間インキュベートした。結合した抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識したヤギ抗マウスIgG(H+L)(Zymed)で検出し、基質TMB H2O2(Sigma−Aldrich)で現像検出した。呈色反応を2N H2SO4で停止し、450nmでの吸光度をEL312 Bio−Kineticsマイクロプレートリーダー(Bio−Tek Instruments Inc.、Winooski,VT)で読み取った。
【0113】
[結果]
(抗ヒトIL−15Rα抗体の生成)
市販の抗体は細胞上のIL−15Rαプラスミド(pIL−15Rα)の発現を検出する能力が不十分なので、ヒトIL−15Rαに対してモノクローナル抗体を生成した。組換え体ヒトIL−15Rαは、以下のように作製した。
【0114】
組換え体ヒトIL−15Rαタンパク質は、Abgent(San Diego,CA)に作製させた。ヒトIL−15Rαのオープンリーディングフレーム(Thomas Waldmann(NCI,NIH,Bethesda,MD)からの贈与)を、高発現細菌ベクターpET21a(EMD Biosciences,Gibbstown,NJ)にクローン化した。コンピテント細胞を、大腸菌内に形質転換して増幅し、組換え体タンパク質をNi−NTAカラムを用いて精製した。精製タンパク質の精製度は、抗ヒトIL−15Rα抗体(R&D Systems,Minneapolis,MN)を用いた直接ELISAにより確認した。
【0115】
新しく生成されたIL−15Rαタンパク質の大きさを確認するために、精製タンパク質の濃度を順次減らした希釈液を、SDS−PAGEゲル上を走らせて、クマシーブルー色素で染色した(図1A)。図1Aに示すように、生成されたタンパク質は、予想されたサイズである約30kDaに動いた。このタンパク質について、その適正な完全さの指標として、市販の抗体に結合する能力の有無を検査した。図1Bは、組換え体IL−15Rα、または陰性対照であるVPRタンパク質を結合したプレートのELISAアッセイを示す。VPRはIL−15Rαタンパク質と同様の方法によって製造されるので、これを用いた。図1Bは、市販の抗ヒトIL−15Rα抗体が、生成された組換えタンパク質を検出できることを示す。
【0116】
IL−15Rαに対する抗体を生成するため、組換え体ヒトIL−15Rαタンパク質を、以下に説明するように図1Cに示すBALB/cマウスに注射した。
【0117】
モノクローナル抗体を生成するため、組換え体ヒトIL−15Rαタンパク質をBALB/cマウス(n=4)に注射した。各注射のたびに、完全フロイントアジュバント(初回の接種のみ)や不完全フロイントアジュバント(その後の接種)に乳化した5μgの全タンパク質を与えた(Sigma,St.Louis,MO)。50μlをそれぞれの脇腹に皮下注射し、100μlを腹腔に注射した。細胞融合処理の3日前に、マウスに対して、滅菌したPBS中の35μgのタンパク質の静脈内への最終追加接種を行った。次に血清中の抗体標識を、組換え体IL−15Rαタンパク質と抗マウスIgG−HRP(Zymed,San Francisco,CA)を用いて直接ELISAにより測定した。IL−15Rαに対する抗体の力価が1:8,000のマウス1匹を、そこから切除された脾臓と骨髄腫細胞株との細胞融合を行うために犠牲処置した。1500のハイブリドーマ上清をELISAによってスクリーニングし、8個の陽性クローンを増殖し、そのうちの1つを硫酸アンモニウムのカラムと抗体KK1.23により精製した。モノクローナル抗体の作製と精製を、Wistar Institute Hybridoma FacilityのJulia Conicello(Philadelphia、PA)に依頼した。
【0118】
図1Dに示すように、ELISA法により約1500のハイブリドーマの培養上清をスクリーニングした後、1つのハイブリドーマKK1.23が抗体の力価(>1〜12,800)を示した。その後このハイブリドーマを、クローン化し増殖させて、精製した。精製した抗体KK1.23は、図1Eのウエスタンブロット解析によって示すように、ヒトIL−15Rαに特異的である。さらに、KK1.23は、市販の抗体(図1E)よりも高い親和性をもってヒトIL−15Rαに結合するとみられる。
【0119】
(pIL−15Rαによる生物活性タンパク質の発現)
ワクチン接種の試験に適するIL−15Rα発現ベクターを作製した。CMVプロモーターの制御の下、図2Aに示すようにヒトIL−15RαORFをpVAX1発現ベクターにクローン化した。IL−15Rαプラスミドが適切に発現していることを評価するため、in vitro翻訳アッセイを行った。予想通り、対照プラスミドのpVAXは一切の検出可能なタンパク質産物を作り出さなかったのに対し、S35放射性標識したタンパク質が概ね30.0kDに移行したことが図2B及び図2Cに示されている。ヒトIL−15Rαに対する市販のR&Dの抗体(図2B)またはKK1.23抗体(図2C)抗体を利用して、放射性標識タンパク質を免疫沈降した。
【0120】
プラスミドIL−15Rαの発現を確認するために、上述の実施例1のKK1.23抗体を用いて免疫蛍光アッセイを行った。ヒトIL−15RαのORFを、緑色蛍光タンパク質(GFP)レポーターもコードしているpTRACER発現ベクターにクローン化した。従って、緑色に蛍光発色する細胞(図2E−図2G)も、pIL−15Rαを発現している。KK1.23抗ヒトIL−15Rαは、抗マウスIgG−PEを用いて検出される(赤)。トランスフェクトされていない対照は図2Dに、アイソタイプ対照は図2Eに示されている。前記データは、pIL−15Rαプラスミドの発現能力、ならびに抗ヒトPIL−15Rα抗体の翻訳されたタンパク質産物を検出する能力を示している。pIL−15Rαプラスミドは、立体構造的に正確かつ表面局在したタンパク質をコードする。
【0121】
(pIL−15とアジュバントとしてのpIL−15Rαの結合)
pIL−15と比較したpIL−15Rαの免疫応答を増強する能力を調べるために、BALB/cマウスに対して、図3Aに示すスケジュールに従い、in vivoでの電気穿孔処理を伴う前脛骨筋への筋肉内免疫化処理を行った。マウスを、pVAX対照ベクター、または5μgの抗原性構築物(HIV−1gag、HIV−1pol)のいずれかとともに、10μgのpIL−15、15μgのpIL−15Rα、またはpIL−15とpIL−15Rαの両方の最終容量40μlのいずれかで免疫化した。これらの用量は、予備試験(データは示さず)において、最適な応答を与えるために予め決定された。図3Bに示すように、抗原性構築物の単体で免疫化すると、IFN−γELISpotにより測定したとき、106の脾細胞あたり2300のスポット形成細胞(SFC)が生じた。pIL−15の添加により3800SFCまで応答が増強したが、pIL−15RαとpIL−15とで共免疫すると抗原群単独に対して最も劇的な増加を示し、5900SFCとなった。これらの結果は、IL−15/IL−15Rα免疫複合体の形成が、IL−15単独よりも強力なアジュバントとして機能し得るという説を裏づけている。
【0122】
この免疫複合体が実際にin vivoで形成されたか否かを判定するため、pIL−15およびPpL−15Rαが(抗原とともに)それぞれ別々の脚に注射された、もう1つの免疫化グループを追加した。この分割供給方式では、プラスミドで供給されたIL−15およびIL−15Rαは、免疫複合体を形成できなくなる。別々の脚へのPIL−15およびIL−15Rαの共免疫化は、同じ組合せを同じ脚に供給したときに観察されたものと類似レベルのIFN−γ(それぞれ4562SFC、4072SFC)を誘発することが判明した。
【0123】
抗原性構築物とpIL−15Rαでの免疫化グループはまた、約3500SFCに抗原特異的IFN−γ分泌も増強する(図3B)ことに留意されたい。これらの結果を確認するため、本発明者は、pIL−15Rαが用量依存的に応答を誘発するか否かを確認するべく、抗原性構築物とともに漸次増加させた用量のpIL−15Rαプラスミドでマウスの新しい組を免疫化した。図4に示すように、pIL−15Rαを含めても、pGagに対する応答(パネルA)またはpPolに対する応答(パネルB)をそれぞれ測定した結果、誘導されるIFN−γ分泌は用量依存的に増加しなかった。HIV−1抗原性構築物の使用の有無にかかわらず、最高用量で使用したpIL−15Rαとの共免疫化によって細胞の免疫応答は1.5倍から2倍に増大した。注目すべき点として、IL−15Rαは、IL−15の不存在下であっても抗原特異的免疫応答を増強するとみられる。
【0124】
さらにpIL−15Rαのアジュバント特性を確認するため、ワクチン接種の後のCD4+およびCD8+T細胞のエフェクタ機能を調べた。IFN−γELISpotアッセイを実施する前に、CD8+T細胞を、前述のように各ワクチンの組合せで免疫化したマウスの脾細胞から除去した。図5Aに示すように、pIL−15、pIL−15Rα、または両方の組合せで免疫化されたマウスの脾細胞からのCD8+T細胞の除去処理により、検出されたIFN−γ分泌の量は有意に減少した。いずれの免疫化グループにおいても、全脾細胞において観察された全免疫応答(黒色)と比較したCD4+T細胞の占める程度(灰色)の間に差はみられなかった。以上を総合すると、ワクチン接種戦略におけるpIL−15RαとpIL−15の組合せは、それぞれ単独の構築物を用いた場合より大幅に免疫応答を増強する。この相加効果は、CD8+T細胞集団が除去された場合には当該効果は失われたことから、主としてCD8+T細胞に作用する。
【0125】
pIL−15Rαが体液性免疫応答にも影響を与えるか否かを判定する判断するため、各ワクチン接種戦略において誘発される免疫応答もELISAによって測定した。免疫化したマウスからの血清をアッセイして、HIV−1Gag(p24)タンパク質に対するIgG抗体のレベルを測定した(図5B)。細胞性免疫の誘発にはpIL−15とpIL−15Rαの組合せが最もよい結果が得られたが、pIL−15、pIL−15Rαのいずれか単体で免疫化したマウスでのHIV−1特異的抗体の力価(1:1600)は、pVAXで免疫化したマウスの場合(検出されず)、pGag単独でまたはpVAXとpGagの組合せで免疫化したマウスの場合(1:800)と比較して最も高くなった。
【0126】
(CD8+T細胞メモリを増強しないとみられるpIL−15Raアジュバント)
マウスは、本明明細書中で前述したように3回免疫したが、3回目の免疫の一週間後にこれらのマウスを犠牲処置する代わりに約30週間の無処置期間をおくと、観察される応答が主としてメモリ細胞の集団によるものであることが確実となる。図6Aに示すように、有意な無処置期間の後の応答は依然として非常に堅調であった。単独の抗原性構築物で免疫化したマウスは、概ね1700SFCの応答を有していた。最大の応答は、pIL−15との共免疫のグループであることは明らかであり、pIL−15と、pIL−15/pIL−15Raの組合せの両方で〜2800SFCであった。pIL−15の不存在下でのpIL−15Rαとの共免疫では、アジュバントの効果はもはや観察されなかった(〜1700SFC)。同じ傾向はまた、細胞内サイトカイン染色とフローサイトメトリー(図6B)によっても観察され、ここではCD8+T細胞によるIFN−γ産生のレベルは、pIL−15との共免疫化マウスにおいて最も顕著であった。pIL−15が大きな影響を与えることが観察されたのに対し、ワクチン接種戦略においてpIL−15Rαを追加しても、メモリ細胞の応答にはほとんど影響がないことが観察された。従って、pIL−15Rαはワクチン接種の直後には強力なアジュバントであったが、時間の経過とともに、IL−15がメモリCD8+T細胞の優れた誘発物質となるという理論が裏付けられる。
【0127】
メモリ細胞の抗体応答は、エフェクタ期で観察されたものと同様であった。図6Cに示すように、pIL−15で免疫したマウスでは、希釈列から検出可能なHIV−1Gag(P24)に対する抗体が1:1600まであったが、pIL−15とpIL−15Rαの組合せを含む他の全てのグループでは、希釈したものから検出された抗体が1:400であった。pIL−15は、細胞性のメモリ応答のみならず体液性の応答の発生においても効果的なアジュバントであることを示しているが、一方pIL−15Rαは、抗原に対する急性の免疫応答の促進に一定の役割を果たしているとみられる。
【0128】
(IL−15のないpIL−15Rαアジュバント)
ヒトIL−15Rαタンパク質は、内生のマウスIL−15と複合体を形成することにより、ワクチン接種したマウスの免疫応答を増強し得るか否かを調べるため、またはIL−15とは無関係に、IL−15ノックアウトマウスでワクチン接種を試験した。最初に、対照として、翻訳されたヒトIL−15Rαタンパク質のマウスIL−15への結合の有無について試験した。図7Aに示すように、マウスIL−15とともにインキュベートした、S35放射標識されたヒトIL−15Rαタンパク質は、抗マウスIL−15抗体とともに免疫沈降させることができ、このことは、マウスIL−15のヒトIL−15Rαに結合する能力を示唆している。
【0129】
マウスIL−15の不存在下でpIL−15Rαのアジュバントとなる能力を調べた。従って、IL−15ノックアウトマウスでの同様のワクチン接種の試験、即ち内生IL−15を欠いており、結果としてNK細胞およびメモリCD8+T細胞の欠失した条件でのワクチン接種の試験を行った(Kennedyら,2000)。図7Cは、ノックアウトマウスでの内生マウスIL−15の不存在下でpIL−15Rαは免疫応答を増強することが、IFN−γELISpotにより判明したことを示す。また、pIL−15とpIL−15Rαの組合せは、最初にBALB/cマウスで観察されたようにいずれかのアジュバントを単独で投与された場合より免疫応答を増強することはない。IL−15−/−マウスは、TaconicのC57/BL6バックグラウンド上で作製した。従って、適切なバックグラウンド対照マウスで、BALB/cで観察されたのと同様の免疫応答が得られるか否かを確認するため、同じ実験を反復した。図7Bは、同一のスケジュールで免疫化した対照マウスからの結果を示しており、BALB/c免疫化マウスと同様の傾向を示している。
【0130】
[結論]
ヒトIL−15およびHIV−1抗原性DNA構築物とIL−15Rα構築物との共免疫化は、抗原性構築物単体で免疫化した場合より、2.5倍のIFN−γ分泌レベルの増強をもたらした(図3B)。ELISpot上に置く前のCD8+T細胞の除去処理がIFN−γの分泌を10分の1に減らしたことから、IFN−γ分泌はCD8+T細胞によるものであった。pIL−15およびpIL−15Raを別々の脚に(抗原とともに)注射しても、同じ脚に供給した場合と類似の免疫応答が誘発されることから、IL−15/IL−15Rαの組合せを与えた場合に観察された効力の増加は、トランスフェクトされた細胞での安定な複合体の形成によるものではないとみられる。従って、pIL−15/pIL−15Rαの同時供給で観察された応答の増強は、2つの独立したアジュバントの相加効果である可能性が高い。これら2つのアジュバントを同時供給しても、血清中のIgG抗体によって測定される体液性免疫応答の増強もみられなかった。
【0131】
pIL−15/pIL−15Rαの組合せの免疫応答に対する長期的な影響も調べた。メモリの応答を観察するため、免疫の解析を実施する前に3回目の免疫化から30週間無処置においた。その結果から、これら2つのアジュバントの組合せは、免疫応答の初期段階で強力なCD8+T細胞応答を誘発するが、メモリT細胞への影響は主としてpIL−15と共に免疫化したマウスのみでしか観察されないことが分かった。抗原単独の場合よりメモリ応答を増強するためには、pIL−15を含めることが必要であった。同様に、IL−15Rαは、最初にIL−15と等しいかそれより大きいの免疫応答を誘発するが、それはメモリ応答を維持する助けにはならなかった。従って、IL−15Rαがバーストサイズまで増大しても、メモリに対するIL−15シグナルの不存在下でのバーストサイズは、長期的な応答を維持するために不十分であった。
【0132】
驚くべき所見としては、pIL−15Rαを含む抗原性プラスミドの供給によっても細胞性免疫応答は増強され、pIL−15によって誘発されたものに等しくなった。確認のため、複数の免疫化処理をpIL−15Rαの量を増加させながら行い、用量依存的な応答を観察した。これは、マウスIL−15はヒトIL−15と〜73%相同であるため(Andersonら,1995a)、ヒトIL−15Rαタンパク質は内生マウスIL−15に結合し、それを同様に転移させられるということであるとみられる。この仮説を調べるため、内生IL−15を欠くIL−15ノックアウトマウスを免疫化した。pIL−15Rαで免疫化されたIL−15ノックアウトマウスにおいて、抗原単独の場合のおよそ2倍の増加が観察された。6−8週齢IL−15−/−のメスのマウスを大量に得ることが困難であるため、これらの実験からpIL−15のグループは除外した。しかし、pIL−15/pIL−15Rαの組合せの増強効果はもはや観察されなかった。対照のC57/BL6マウスは、BALB/cマウスで見られたのと同じ傾向を示す(総スポット数は小さく、pVAXグループでのバックグラウンドは高いが)こと、およびIL−15ノックアウトマウスはC57/BL6マウスに比較した場合でも全体的に低い応答を示したことに留意すべきである。これらのマウスは、ワクシニアチャレンジ感染に対する防御ができないなど、多少欠陥のあるホストの防御応答を有することが以前に報告されている(Kennedyら,2000)。全体的な免疫応答が低いにもかかわらず、pIL−15Rαのアジュバント効果は、あらゆる内生IL−15の不存在下でも依然として観察された。この理論によって拘束されることを意図するものではないが、十分に結果を考慮すると、IL−15Rαは、IL−15から独立して応答を誘発することができる新規なアジュバントとして機能し得ると考えられる。この免疫応答の増幅は、ホストT細胞応答のメモリ期より急性期での免疫の増大に特に集中しているとみられる。
【0133】
(参考文献)
AMARA,R.R.,VILLINGER,F.,ALTMAN,J.D.,LYDY,S.L.,O’NEIL,S.P.,STAPRANS,S.I.,MONTEFIORI,D.C.,XU,Y.,HERNDON,J.G.,WYATT,L.S.,CANDIDO,M.A.,KOZYR,N.L.,EARL,P.L.,SMITH,J.M.,MA,H.L.,GRIMM,B.D.,HULSEY,M.L.,MILLER,J.,MCCLURE,H.M.,MCNICHOLL,J.M.,MOSS,B.,およびROBINSON,H.L.(2001).Control of a mucosal challenge and prevention of AIDS by a multiprotein DNA/MVA vaccine. Science(New York,N.Y 292,69−74.
ANDERSON,D.M.,JOHNSON,L.,GLACCUM,M.B.,COPELAND,N.G.,GILBERT,D.J.,JENKINS,N.A.,VALENTINE,V.,KIRSTEIN,M.N.,SHAPIRO,D.N.,MORRIS,S.W.,ら(1995a).Chromosomal assignment and genomic structure of Il15. Genomics 25, 701−706.
ANDERSON,D.M.,KUMAKI,S.,AHDIEH,M.,BERTLES,J.,TOMETSKO,M.,LOOMIS,A.,GIRI,J.,COPELAND,N.G.,GILBERT,D.J.,JENKINS,N.A.,ら(1995b).Functional characterization of the human interleukin−15 receptor alpha chain and close linkage of IL15RA and IL2RA genes. The Journal of biological chemistry 270, 29862−29869.
BAMFORD,R.N.,DEFILIPPIS,A.P.,AZIMI,N.,KURYS,G.,およびWALDMANN,T.A.(1998).The 5’ untranslated region, signal peptide, and the coding sequence of the carboxyl terminus of IL−15 participate in its multifaceted translational control. J Immunol 160, 4418−4426.
BAROUCH,D.H.,SANTRA,S.,SCHMITZ,J.E.,KURODA,M.J.,FU,T.M.,WAGNER,W.,BILSKA,M.,CRAIU,A.,ZHENG,X.X.,KRIVULKA,G.R.,BEAUDRY,K.,LIFTON,M.A.,NICKERSON,C.E.,TRIGONA,W.L.,PUNT,K.,FREED,D.C.,GUAN,L.,DUBEY,S.,CASIMIRO,D.,SIMON,A.,DAVIES,M.E.,CHASTAIN,M.,STROM,T.B.,GELMAN,R.S.,MONTEFIORI,D.C.,LEWIS,M.G.,EMINI,E.A.,SHIVER,J.W.,およびLETVIN,N.L.(2000).Control of viremia and prevention of clinical AIDS in rhesus monkeys by cytokine−augmented DNA vaccination. Science (New York, N.Y 290, 486−492.
BECKER,T.C.,WHERRY,E.J.,BOONE,D.,MURALI−KRISHNA,K.,ANTIA,R.,MA,A.,andAHMED,R.(2002).Interleukin 15 is required for proliferative renewal of virus−specific memory CD8 T cells. The Journal of experimental medicine 195, 1541−1548.
BERGAMASCHI,C.,ROSATI,M.,JALAH,R.,VALENTIN,A.,KULKARNI,V.,ALICEA,C.,ZHANG,G.M.,PATEL,V.,FELBER,B.K.,およびPAVLAKIS,G.N.(2008).Intracellular interaction of interleukin−15 with its receptor alpha during production leads to mutual stabilization and increased bioactivity. The Journal of biological chemistry 283, 4189−4199.
BETTS,M.R.,KROWKA,J.F.,KEPLER,T.B.,DAVIDIAN,M.,CHRISTOPHERSON,C.,KWOK,S.,LOUIE,L.,ERON,J.,SHEPPARD,H.,およびFRELINGER,J.A.(1999).Human immunodeficiency virus type 1−specific cytotoxic T lymphocyte activity is inversely correlated with HIV type 1 viral load in HIV type 1−infected long−term survivors. AIDS research and human retroviruses 15, 1219−1228.
BOYER,J.D.,ROBINSON,T.M.,KUTZLER,M.A.,VANSANT,G.,HOKEY,D.A.,KUMAR,S.,PARKINSON,R.,WU,L.,SIDHU,M.K.,PAVLAKIS,G.N.,FELBER,B.K.,BROWN,C.,SILVERA,P.,LEWIS,M.G.,MONFORTE,J.,WALDMANN,T.A.,ELDRIDGE,J.,およびWEINER,D.B.(2007).Protection against simian/human immunodeficiency virus (SHIV) 89.6P in macaques after coimmunization with SHIV antigen and IL−15 plasmid. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 104, 18648−18653.
BULANOVA,E.,BUDAGIAN,V.,POHL,T.,KRAUSE,H.,DURKOP,H.,PAUS,R.,およびBULFONE−PAUS,S.(2001).The IL−15R alpha chain signals through association with Syk in human B cells. J Immunol 167, 6292−6302.
BURKETT,P.R.,KOKA,R.,CHIEN,M.,CHAI,S.,BOONE,D.L.,およびMA,A.(2004).Coordinate expression and trans presentation of interleukin (IL)−15Ralpha and IL−15 supports natural killer cell and memory CD8+ T cell homeostasis. The Journal of experimental medicine 200, 825−834.
BURKETT,P.R.,KOKA,R.,CHIEN,M.,CHAI,S.,CHAN,F.,MA,A.,およびBOONE,D.L.(2003).IL−15R alpha expression on CD8+ T cells is dispensable for T cell memory. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 100, 4724−4729.
CALAROTA,S.A.,DAI,A.,TROCIO,J.N.,WEINER,D.B.,LORI,F.,およびLISZIEWICZ,J.(2008).IL−15 as memory T−cell adjuvant for topical HIV−1 DermaVir vaccine. Vaccine.
CAO,Y.,QIN,L.,ZHANG,L.,SAFRIT,J.,およびHO,D.D.(1995).Virologic and immunologic characterization of long−term survivors of human immunodeficiency virus type 1 infection. The New England journal of medicine 332, 201−208.
DUBOIS,S.,MARINER,J.,WALDMANN,T.A.,およびTAGAYA,Y.(2002).IL−15Ralpha recycles and presents IL−15 In trans to neighboring cells. Immunity 17, 537−547.
DUITMAN,E.H.,ORINSKA,Z.,BULANOVA,E.,PAUS,R.,およびBULFONE−PAUS,S.(2008).How a cytokine is chaperoned through the secretory pathway by complexing with its own receptor: lessons from IL−15/IL−15R{alpha}. Molecular and cellular biology.
FULLER,D.H.,LOUDON,P.,およびSCHMALJOHN,C.(2006).Preclinical and clinical progress of particle−mediated DNA vaccines for infectious diseases. Methods (San Diego, Calif 40, 86−97.
GAO,F.,LI,Y.,DECKER,J.M.,PEYERL,F.W.,BIBOLLET−RUCHE,F.,RODENBURG,C.M.,CHEN,Y.,SHAW,D.R.,ALLEN,S.,MUSONDA,R.,SHAW,G.M.,ZAJAC,A.J.,LETVIN,N.,およびHAHN,B.H.(2003).Codon usage optimization of HIV type 1 subtype C gag, pol, env, and nef genes: in vitro expression and immune responses in DNA−vaccinated mice. AIDS research and human retroviruses 19, 817−823.
GIRI,J.G.,AHDIEH,M.,EISENMAN,J.,SHANEBECK,K.,GRABSTEIN,K.,KUMAKI,S.,NAMEN,A.,PARK,L.S.,COSMAN,D.,およびANDERSON,D.(1994).Utilization of the beta and gamma chains of the IL−2 receptor by the novel cytokine IL−15. The EMBO journal 13, 2822−2830.
GIRI,J.G.,ANDERSON,D.M.,KUMAKI,S.,PARK,L.S.,GRABSTEIN,K.H.,およびCOSMAN,D.(1995).IL−15, a novel T cell growth factor that shares activities and receptor components with IL−2. Journal of leukocyte biology 57, 763−766.
HALWANI,R.,BOYER,J.D.,YASSINE−DIAB,B.,HADDAD,E.K.,ROBINSON,T.M.,KUMAR,S.,PARKINSON,R.,WU,L.,SIDHU,M.K.,PHILLIPSON−WEINER,R.,PAVLAKIS,G.N.,FELBER,B.K.,LEWIS,M.G.,SHEN,A.,SILICIANO,R.F.,WEINER,D.B.,およびSEKALY,R.P.(2008).Therapeutic vaccination with simian immunodeficiency virus (SIV)−DNA+IL−12 or IL−15 induces distinct CD8 memory subsets in SIV−infected macaques. J Immunol 180, 7969−7979.
HOKEY,D.A.,およびWEINER,D.B.(2006).DNA vaccines for HIV: challenges and opportunities. Springer seminars in immunopathology 28, 267−279.
JIN,X.,BAUER,D.E.,TUTTLETON,S.E.,LEWIN,S.,GETTIE,A.,BLANCHARD,J.,IRWIN,C.E.,SAFRIT,J.T.,MITTLER,J.,WEINBERGER,L.,KOSTRIKIS,L.G.,ZHANG,L.,PERELSON,A.S.,およびHO,D.D.(1999).Dramatic rise in plasma viremia after CD8(+) T cell depletion in simian immunodeficiency virus−infected macaques. The Journal of experimental medicine 189, 991−998.
KENNEDY,M.K.,GLACCUM,M.,BROWN,S.N.,BUTZ,E.A.,VINEY,J.L.,EMBERS,M.,MATSUKI,N.,CHARRIER,K.,SEDGER,L.,WILLIS,C.R.,BRASEL,K.,MORRISSEY,P.J.,STOCKING,K.,SCHUH,J.C.,JOYCE,S.,およびPESCHON,J.J.(2000).Reversible defects in natural killer and memory CD8 T cell lineages in interleukin 15−deficient mice. The Journal of experimental medicine 191, 771−780.
KHAN,A.S.,SMITH,L.C.,ABRUZZESE,R.V.,CUMMINGS,K.K.,POPE,M.A.,BROWN,P.A.,およびDRAGHIA−AKLI,R.(2003).Optimization of electroporation parameters for the intramuscular delivery of plasmids in pigs. DNA and cell biology 22, 807−814.
KIM,J.J.,NOTTINGHAM,L.K.,SIN,J.I.,TSAI,A.,MORRISON,L.,OH,J.,DANG,K.,HU,Y.,KAZAHAYA,K.,BENNETT,M.,DENTCHEV,T.,WILSON,D.M.,CHALIAN,A.A.,BOYER,J.D.,AGADJANYAN,M.G.,およびWEINER,D.B.(1998).CD8 positive T cells influence antigen−specific immune responses through the expression of chemokines. The Journal of clinical investigation 102, 1112−1124.
KOKA,R.,BURKETT,P.,CHIEN,M.,CHAI,S.,BOONE,D.L.,およびMA,A.(2004).Cutting edge: murine dendritic cells require IL−15R alpha to prime NK cells. J Immunol 173, 3594−3598.
KOUP,R.A.,SAFRIT,J.T.,CAO,Y.,ANDREWS,C.A.,MCLEOD,G.,BORKOWSKY,W.,FARTHING,C.,およびHO,D.D.(1994).Temporal association of cellular immune responses with the initial control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 syndrome. Journal of virology 68, 4650−4655.
KU,C.C.,MURAKAMI,M.,SAKAMOTO,A.,KAPPLER,J.,およびMARRACK,P.(2000).Control of homeostasis of CD8+ memory T cells by opposing cytokines. Science (New York, N.Y 288, 675−678.
KUTZLER,M.A.,ROBINSON,T.M.,CHATTERGOON,M.A.,CHOO,D.K.,CHOO,A.Y.,CHOE,P.Y.,RAMANATHAN,M.P.,PARKINSON,R.,KUDCHODKAR,S.,TAMURA,Y.,SIDHU,M.,ROOPCHAND,V.,KIM,J.J.,PAVLAKIS,G.N.,FELBER,B.K.,WALDMANN,T.A.,BOYER,J.D.,およびWEINER,D.B.(2005).Coimmunization with an optimized IL−15 plasmid results in enhanced function and longevity of CD8 T cells that are partially independent of CD4 T cell help. J Immunol 175, 112−123.
LADDY,D.J.,YAN,J.,KUTZLER,M.,KOBASA,D.,KOBINGER,G.P.,KHAN,A.S.,GREENHOUSE,J.,SARDESAI,N.Y.,DRAGHIA−AKLI,R.,およびWEINER,D.B.(2008).Heterosubtypic protection against pathogenic human and avian influenza viruses via in vivo electroporation of synthetic consensus DNA antigens. PLoS ONE 3, e2517.
LEIFERT,J.A.,RODRIGUEZ−CARRENO,M.P.,RODRIGUEZ,F.,およびWHITTON,J.L.(2004).Targeting plasmid−encoded proteins to the antigen presentation pathways. Immunological reviews 199, 40−53.
LI,W.,LI,S.,HU,Y.,TANG,B.,CUI,L.,およびHE,W.(2008).Efficient augmentation of a long−lasting immune responses in HIV−1 gag DNA vaccination by IL−15 plasmid boosting. Vaccine 26, 3282−3290.
LODOLCE,J.P.,BOONE,D.L.,CHAI,S.,SWAIN,R.E.,DASSOPOULOS,T.,TRETTIN,S.,およびMA,A.(1998).IL−15 receptor maintains lymphoid homeostasis by supporting lymphocyte homing and proliferation. Immunity 9, 669−676.
LODOLCE,J.P.,BURKETT,P.R.,BOONE,D.L.,CHIEN,M.,およびMA,A.(2001).T cell−independent interleukin 15Ralpha signals are required for bystander proliferation. The Journal of experimental medicine 194, 1187−1194.
LUCAS,M.,SCHACHTERLE,W.,OBERLE,K.,AICHELE,P.,およびDIEFENBACH,A.(2007).Dendritic cells prime natural killer cells by trans−presenting interleukin 15. Immunity 26, 503−517.
MESTECKY,J.,JACKSON,S.,MOLDOVEANU,Z.,NESBIT,L.R.,KULHAVY,R.,PRINCE,S.J.,SABBAJ,S.,MULLIGAN,M.J.,およびGOEPFERT,P.A.(2004).Paucity of antigen−specific IgA responses in sera and external secretions of HIV−type 1−infected individuals. AIDS Res Hum Retroviruses 20, 972−988.
MOORE,A.C.,KONG,W.P.,CHAKRABARTI,B.K.,およびNABEL,G.J.(2002).Effects of antigen and genetic adjuvants on immune responses to human immunodeficiency virus DNA vaccines in mice. Journal of virology 76, 243−250.
MORROW,M.P.,およびWEINER,D.B.(2008).Cytokines as adjuvants for improving anti−HIV responses. AIDS (London, England) 22, 333−338.
MUSEY,L.,HUGHES,J.,SCHACKER,T.,SHEA,T.,COREY,L.,およびMCELRATH,M.J.(1997).Cytotoxic−T−cell responses, viral load, and disease progression in early human immunodeficiency virus type 1 infection. The New England journal of medicine 337, 1267−1274.
OGAWA,T.,TARKOWSKI,A.,MCGHEE,M.L.,MOLDOVEANU,Z.,MESTECKY,J.,HIRSCH,H.Z.,KOOPMAN,W.J.,HAMADA,S.,MCGHEE,J.R.,およびKIYONO,H.(1989).Analysis of human IgG and IgA subclass antibody−secreting cells from localized chronic inflammatory tissue. J Immunol 142, 1150−1158.
OGG,G.S.,JIN,X.,BONHOEFFER,S.,DUNBAR,P.R.,NOWAK,M.A.,MONARD,S.,SEGAL,J.P.,CAO,Y.,ROWLAND−JONES,S.L.,CERUNDOLO,V.,HURLEY,A.,MARKOWITZ,M.,HO,D.D.,NIXON,D.F.,およびMCMICHAEL,A.J.(1998).Quantitation of HIV−1−specific cytotoxic T lymphocytes and plasma load of viral RNA. Science (New York, N.Y 279, 2103−2106.
OH,S.,BERZOFSKY,J.A.,BURKE,D.S.,WALDMANN,T.A.,およびPERERA,L.P.(2003).Coadministration of HIV vaccine vectors with vaccinia viruses expressing IL−15 but not IL−2 induces long−lasting cellular immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 100, 3392−3397.
OH,S.,PERERA,L.P.,BURKE,D.S.,WALDMANN,T.A.,およびBERZOFSKY,J.A.(2004).IL−15/IL−15Ralpha−mediated avidity maturation of memory CD8+ T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 101, 15154−15159.
OH,S.,PERERA,L.P.,TERABE,M.,NI,L.,WALDMANN,T.A.,およびBERZOFSKY,J.A.(2008).IL−15 as a mediator of CD4+ help for CD8+ T cell longevity and avoidance of TRAIL−mediated apoptosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 105, 5201−5206.
ONU,A.,POHL,T.,KRAUSE,H.,およびBULFONE−PAUS,S.(1997).Regulation of IL−15 secretion via the leader peptide of two IL−15 isoforms. J Immunol 158, 255−262.
PICKER,L.J.,REED−INDERBITZIN,E.F.,HAGEN,S.I.,EDGAR,J.B.,HANSEN,S.G.,LEGASSE,A.,PLANER,S.,PIATAK,M.,JR.,LIFSON,J.D.,MAINO,V.C.,AXTHELM,M.K.,およびVILLINGER,F.(2006).IL−15 induces CD4 effector memory T cell production and tissue emigration in nonhuman primates. The Journal of clinical investigation 116, 1514−1524.
RAMANATHAN,M.P.,CURLEY,E.,3RD,SU,M.,CHAMBERS,J.A.,およびWEINER,D.B.(2002).Carboxyl terminus of hVIP/mov34 is critical for HIV−1−Vpr interaction and glucocorticoid−mediated signaling. The Journal of biological chemistry 277, 47854−47860.
SANDAU,M.M.,SCHLUNS,K.S.,LEFRANCOIS,L.,およびJAMESON,S.C.(2004).Cutting edge: transpresentation of IL−15 by bone marrow−derived cells necessitates expression of IL−15 and IL−15R alpha by the same cells. J Immunol 173, 6537−6541.
SATO,N.,PATEL,H.J.,WALDMANN,T.A.,およびTAGAYA,Y.(2007).The IL−15/IL−15Ralpha on cell surfaces enables sustained IL−15 activity and contributes to the long survival of CD8 memory T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 104, 588−593.
SCHLUNS,K.S.,KLONOWSKI,K.D.,およびLEFRANCOIS,L.(2004a).Transregulation of memory CD8 T−cell proliferation by IL−15Ralpha+ bone marrow−derived cells. Blood 103, 988−994.
SCHLUNS,K.S.,NOWAK,E.C.,CABRERA−HERNANDEZ,A.,PUDDINGTON,L.,LEFRANCOIS,L.,およびAGUILA,H.L.(2004b).Distinct cell types control lymphoid subset development by means of IL−15 and IL−15 receptor alpha expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 101, 5616−5621.
SCHMITZ,J.E.,KURODA,M.J.,SANTRA,S.,SASSEVILLE,V.G.,SIMON,M.A.,LIFTON,M.A.,RACZ,P.,TENNER−RACZ,K.,DALESANDRO,M.,SCALLON,B.J.,GHRAYEB,J.,FORMAN,M.A.,MONTEFIORI,D.C.,RIEBER,E.P.,LETVIN,N.L.,およびREIMANN,K.A.(1999).Control of viremia in simian immunodeficiency virus infection by CD8+ lymphocytes. Science (New York, N.Y 283, 857−860.
SCHOENLY,K.A.,およびWEINER,D.B.(2008).Human immunodeficiency virus type 1 vaccine development: recent advances in the cytotoxic T−lymphocyte platform “spotty business”. Journal of virology 82, 3166−3180.
SHIVER,J.W.,FU,T.M.,CHEN,L.,CASIMIRO,D.R.,DAVIES,M.E.,EVANS,R.K.,ZHANG,Z.Q.,SIMON,A.J.,TRIGONA,W.L.,DUBEY,S.A.,HUANG,L.,HARRIS,V.A.,LONG,R.S.,LIANG,X.,HANDT,L.,SCHLEIF,W.A.,ZHU,L.,FREED,D.C.,PERSAUD,N.V.,GUAN,L.,PUNT,K.S.,TANG,A.,CHEN,M.,WILSON,K.A.,COLLINS,K.B.,HEIDECKER,G.J.,FERNANDEZ,V.R.,PERRY,H.C.,JOYCE,J.G.,GRIMM,K.M.,COOK,J.C.,KELLER,P.M.,KRESOCK,D.S.,MACH,H.,TROUTMAN,R.D.,ISOPI,L.A.,WILLIAMS,D.M.,XU,Z.,BOHANNON,K.E.,VOLKIN,D.B.,MONTEFIORI,D.C.,MIURA,A.,KRIVULKA,G.R.,LIFTON,M.A.,KURODA,M.J.,SCHMITZ,J.E.,LETVIN,N.L.,CAULFIELD,M.J.,BETT,A.J.,YOUIL,R.,KASLOW,D.C.,およびEMINI,E.A.(2002).Replication−incompetent adenoviral vaccine vector elicits effective anti−immunodeficiency−virus immunity. Nature 415, 331−335.
SPRENT,J.(2003).Turnover of memory−phenotype CD8+ T cells. Microbes and infection / Institut Pasteur 5, 227−231.
TAGAYA,Y.,BAMFORD,R.N.,DEFILIPPIS,A.P.,およびWALDMANN,T.A.(1996).IL−15: a pleiotropic cytokine with diverse receptor/signaling pathways whose expression is controlled at multiple levels. Immunity 4, 329−336.
WALDMANN,T.(2002).The contrasting roles of IL−2 and IL−15 in the life and death of lymphocytes: implications for the immunotherapy of rheumatological diseases. Arthritis research 4 Suppl 3, S161−167.
WALDMANN,T.A.,およびTAGAYA,Y.(1999).The multifaceted regulation of interleukin−15 expression and the role of this cytokine in NK cell differentiation and host response to intracellular pathogens. Annual review of immunology 17, 19−49.
YAJIMA,T.,NISHIMURA,H.,ISHIMITSU,R.,WATASE,T.,BUSCH,D.H.,PAMER,E.G.,KUWANO,H.,およびYOSHIKAI,Y.(2002).Overexpression of IL−15 in vivo increases antigen−driven memory CD8+ T cells following a microbe exposure. J Immunol 168, 1198−1203.
ZHANG,W.,DONG,S.F.,SUN,S.H.,WANG,Y.,LI,G.D.,およびQU,D.(2006).Coimmunization with IL−15 plasmid enhances the longevity of CD8 T cells induced by DNA encoding hepatitis B virus core antigen. World J Gastroenterol 12, 4727−4735.
ZHANG,X.,SUN,S.,HWANG,I.,TOUGH,D.F.,およびSPRENT,J.(1998).Potent and selective stimulation of memory−phenotype CD8+ T cells in vivo by IL−15. Immunity 8, 591−599.
【0134】
【表3−1】
【0135】
【表3−2】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
免疫原をコードする、単離された核酸分子と、
IL−15Rα又はその機能性断片をコードする、単離された核酸分子とを含む組成物。
【請求項2】
前記免疫原が、病原体抗原、癌関連抗原、又は自己免疫疾患に関与する細胞に関連する抗原のいずれかである請求項1に記載の組成物。
【請求項3】
前記免疫原が、慢性感染症を引き起こす病原体に由来する病原体抗原である請求項2に記載の組成物。
【請求項4】
IL−15Rαをコードする前記単離された核酸分子は、SEQ ID NO:1に記載の配列を有するIL−15Raをコードする核酸コード配列を含む請求項1乃至3のいずれかに記載の組成物。
【請求項5】
IL−15又はその機能性断片をコードする核酸配列をさらに含む請求項1乃至4のいずれかに記載の組成物。
【請求項6】
前記核酸分子がプラスミドである請求項1乃至5のいずれかに記載の組成物。
【請求項7】
請求項1乃至6のいずれかに記載の組成物を含む、注入可能な医薬組成物。
【請求項8】
個体において免疫原に対する免疫応答を誘発する方法であって、
請求項1乃至7のいずれかに記載の組成物を個体に対して投与する工程を含む、方法。
【請求項9】
調節エレメントに機能可能に結合された免疫原をコードするヌクレオチド配列と、
IL−15Rα又はその機能性断片をコードするヌクレオチド配列とを含む、組換え体ワクチン。
【請求項10】
前記免疫原が、病原体抗原、癌関連抗原、又は自己免疫疾患に関与する細胞に関連する抗原のいずれかである請求項9に記載の組換え体ワクチン。
【請求項11】
前記免疫原が、慢性感染症を引き起こす病原体に由来する病原体抗原である請求項10に記載の組換え体ワクチン。
【請求項12】
IL−15Rαをコードする前記単離された核酸分子は、SEQ ID NO:1に記載の配列を有するIL−15Raをコードする核酸コード配列を含む請求項9乃至11のいずれかに記載に組換え体ワクチン。
【請求項13】
IL−15又はその機能性断片をコードする核酸配列をさらに含む請求項9乃至12のいずれかに記載の組換え体ワクチン。
【請求項14】
個体において免疫原に対する免疫応答を誘発する方法であって、
請求項9乃至13のいずれかに記載の組換え体ワクチンを個体に対して投与する工程を含む、方法。
【請求項15】
IL−15Rα又はその機能性断片をコードするヌクレオチド配列を含む、弱毒化生病原体。
【請求項16】
前記病原体が、慢性感染症を引き起こす病原体の弱毒株である請求項15に記載の弱毒化生病原体。
【請求項17】
IL−15Rαをコードする核酸コード配列がSEQ ID NO:1の配列である請求項15又は16に記載の弱毒化生病原体。
【請求項18】
IL−15又はその機能性断片をコードする核酸配列をさらに含む請求項15乃至17のいずれかに記載の弱毒化生病原体。
【請求項19】
個体において免疫原に対する免疫応答を誘発する方法であって、
請求項15乃至18のいずれかに記載の弱毒化生病原体を個体に対して投与する工程を含む、方法。
【請求項20】
SEQ ID NO:1の配列、又はIL−15Rα免疫調節機能、IL−15結合機能、IL−15受容体複合体の他のサブユニットへの結合機能、もしくはそれらの組合せの機能を有するその断片を含む、核酸分子。
【請求項1】
免疫原をコードする、単離された核酸分子と、
IL−15Rα又はその機能性断片をコードする、単離された核酸分子とを含む組成物。
【請求項2】
前記免疫原が、病原体抗原、癌関連抗原、又は自己免疫疾患に関与する細胞に関連する抗原のいずれかである請求項1に記載の組成物。
【請求項3】
前記免疫原が、慢性感染症を引き起こす病原体に由来する病原体抗原である請求項2に記載の組成物。
【請求項4】
IL−15Rαをコードする前記単離された核酸分子は、SEQ ID NO:1に記載の配列を有するIL−15Raをコードする核酸コード配列を含む請求項1乃至3のいずれかに記載の組成物。
【請求項5】
IL−15又はその機能性断片をコードする核酸配列をさらに含む請求項1乃至4のいずれかに記載の組成物。
【請求項6】
前記核酸分子がプラスミドである請求項1乃至5のいずれかに記載の組成物。
【請求項7】
請求項1乃至6のいずれかに記載の組成物を含む、注入可能な医薬組成物。
【請求項8】
個体において免疫原に対する免疫応答を誘発する方法であって、
請求項1乃至7のいずれかに記載の組成物を個体に対して投与する工程を含む、方法。
【請求項9】
調節エレメントに機能可能に結合された免疫原をコードするヌクレオチド配列と、
IL−15Rα又はその機能性断片をコードするヌクレオチド配列とを含む、組換え体ワクチン。
【請求項10】
前記免疫原が、病原体抗原、癌関連抗原、又は自己免疫疾患に関与する細胞に関連する抗原のいずれかである請求項9に記載の組換え体ワクチン。
【請求項11】
前記免疫原が、慢性感染症を引き起こす病原体に由来する病原体抗原である請求項10に記載の組換え体ワクチン。
【請求項12】
IL−15Rαをコードする前記単離された核酸分子は、SEQ ID NO:1に記載の配列を有するIL−15Raをコードする核酸コード配列を含む請求項9乃至11のいずれかに記載に組換え体ワクチン。
【請求項13】
IL−15又はその機能性断片をコードする核酸配列をさらに含む請求項9乃至12のいずれかに記載の組換え体ワクチン。
【請求項14】
個体において免疫原に対する免疫応答を誘発する方法であって、
請求項9乃至13のいずれかに記載の組換え体ワクチンを個体に対して投与する工程を含む、方法。
【請求項15】
IL−15Rα又はその機能性断片をコードするヌクレオチド配列を含む、弱毒化生病原体。
【請求項16】
前記病原体が、慢性感染症を引き起こす病原体の弱毒株である請求項15に記載の弱毒化生病原体。
【請求項17】
IL−15Rαをコードする核酸コード配列がSEQ ID NO:1の配列である請求項15又は16に記載の弱毒化生病原体。
【請求項18】
IL−15又はその機能性断片をコードする核酸配列をさらに含む請求項15乃至17のいずれかに記載の弱毒化生病原体。
【請求項19】
個体において免疫原に対する免疫応答を誘発する方法であって、
請求項15乃至18のいずれかに記載の弱毒化生病原体を個体に対して投与する工程を含む、方法。
【請求項20】
SEQ ID NO:1の配列、又はIL−15Rα免疫調節機能、IL−15結合機能、IL−15受容体複合体の他のサブユニットへの結合機能、もしくはそれらの組合せの機能を有するその断片を含む、核酸分子。
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図1E】
【図3A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【図6A】
【図1A】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図2E】
【図2F】
【図2G】
【図3B】
【図3C】
【図4A】
【図6B】
【図6C】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図1C】
【図1D】
【図1E】
【図3A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【図6A】
【図1A】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図2E】
【図2F】
【図2G】
【図3B】
【図3C】
【図4A】
【図6B】
【図6C】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【公表番号】特表2013−504600(P2013−504600A)
【公表日】平成25年2月7日(2013.2.7)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2012−529004(P2012−529004)
【出願日】平成22年9月14日(2010.9.14)
【国際出願番号】PCT/US2010/048827
【国際公開番号】WO2011/032179
【国際公開日】平成23年3月17日(2011.3.17)
【出願人】(500429103)ザ・トラスティーズ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・ペンシルバニア (102)
【Fターム(参考)】
【公表日】平成25年2月7日(2013.2.7)
【国際特許分類】
【出願日】平成22年9月14日(2010.9.14)
【国際出願番号】PCT/US2010/048827
【国際公開番号】WO2011/032179
【国際公開日】平成23年3月17日(2011.3.17)
【出願人】(500429103)ザ・トラスティーズ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・ペンシルバニア (102)
【Fターム(参考)】
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