IL−29の生産および精製の方法

【課題】IL-29の大規模生産のための、発現ベクター、および大腸菌発現系を用いる方法を提供する。
【解決手段】大腸菌における翻訳用にコドンおよびmRNA二次構造を最適化するためにヌクレオチド中に特定の変化を有するIL-29コード配列。IL-29ポリペプチドの生産、精製およびペグ化の方法。

【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【0001】
発明の背景
ヒトゲノムおよび他のゲノムからの遺伝子の入手可能性および同定の増大は、組換えタンパク質の効率的な発現および精製の必要性の増大をもたらしている。細菌におけるタンパク質の発現は、クローニングされた遺伝子の生産のために際立って最も広く用いられているアプローチである。多くの理由から、細菌における発現は真核細胞における発現よりも好まれている。例えば、細菌は真核細胞よりもはるかに増殖させることが容易である。より具体的には、多岐にわたる精巧な分子遺伝学的ツールおよび数千種もの突然変異株が利用可能であることが、大腸菌(E. coli)をタンパク質生産のための発現宿主として極めて有用なものにしている。しかし、大腸菌における機能性タンパク質、特に真核生物由来のものの高レベル生産はしばしば困難である。
【0002】
IL-28A、IL-28BおよびIL-29は、I型インターフェロンに対する配列相同性およびIL-10に対するゲノム相同性を有する、最近発見された新たなタンパク質ファミリーである。この新たなファミリーは、共有PCT出願WO 02/086087(特許文献1)およびSheppard et al., Nature Immunol. 4:63-68, 2003(非特許文献1)に詳細に記載されている。機能的には、IL-28A、IL-28BおよびIL-29は、細胞における抗ウイルス状態を誘導する能力の点でI型INFと類似しているが、I型IFNとは異なり、それらはある種のB細胞株に対する抗増殖活性を示さない。
【0003】
組換えIL-29は、原核細胞において、特に大腸菌において生産されている。結果として生じる、細菌により生産されるタンパク質はグリコシル化されておらず、凝集状態で生産される。大腸菌からのIL-29の生産は、凝集したタンパク質が不溶性の封入体から可溶化されて、再生またはリフォールディングすることが必要である。再生(renaturation)が行われなければ、組換えタンパク質の比活性は著しく低下すると考えられる。
【0004】
細菌宿主における組換えタンパク質の進歩にもかかわらず、タンパク質の生産に関してより多くの収量が結果としてもたらされる、生物活性のある精製された組換えIL-29タンパク質を原核系において生産するための改良された方法が必要である。本発明のこれらのおよび他の局面は、以下の詳細な説明を参照することによって明白になると考えられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】WO 02/086087
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】Sheppard et al., Nature Immunol. 4:63-68, 2003
【発明の概要】
【0007】
発明の説明
以下の説明においては数多くの用語が広範囲にわたって用いられる。以下の定義は、本発明の理解を促すために提供される。
【0008】
別に特定する場合を除き、「1つの(a)」、「1つの(an)、「その(the)」および「少なくとも1つの」は互換的に用いられ、1つまたは複数を意味する。
【0009】
本明細書で用いる場合、「核酸」または「核酸分子」とは、デオキシリボ核酸(DNA)またはリボ核酸(RNA)などのポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって生じた断片、ならびに連結、切断、エンドヌクレアーゼ作用およびエキソヌクレアーゼ作用のいずれかによって生じた断片のことを指す。核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド(DNAおよびRNAなど)または天然に存在するヌクレオチド(例えば、天然に存在するヌクレオチドのα-鏡像異性形態)またはその両者の組み合わせである単量体から構成されうる。修飾ヌクレオチドは、糖部分および/またはピリミジンもしくはプリン塩基部分に変化を有しうる。糖修飾には、例えば、1つまたは複数のヒドロキシル基のハロゲン、アルキル基、アミンおよびアジド基による置換が含まれ、または糖をエーテルもしくはエステルとして官能化することもできる。さらに、糖部分全体を、アザ糖および炭素環式糖類似体といった立体的および電子的に類似した構造によって置換することもできる。塩基部分における修飾の例には、アルキル化プリンおよびピリミジン、アシル化プリンもしくはピリミジン、または他の周知の複素環式置換物が含まれる。核酸モノマーは、ホスホジエステル結合またはそのような結合の類似物によって連結することができる。ホスホジエステル結合の類似物には、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホロアニリデート、ホスホロアミデートなどが含まれる。「核酸分子」という用語には、また、天然に存在するまたは修飾された核酸塩基がポリアミド骨格と結合した、いわゆる「ペプチド核酸」も含まれる。核酸は一本鎖でも二本鎖でもよい。
【0010】
「核酸分子の相補物」という用語は、参照ヌクレオチド配列と比べて、相補的ヌクレオチド配列および逆の向きを有する核酸分子のことを指す。
【0011】
「エンハンサー」は、転写の開始部位に対するエンハンサーの距離または向きとは関係なく、転写の効率を高めることができる、一種の調節エレメントのことである。
【0012】
「異種DNA」とは、所定の宿主細胞内に自然下では存在しない、1つのDNA分子またはDNA分子の集団のことを指す。特定の宿主細胞に対して異種であるDNA分子は、宿主DNAが非宿主DNA(すなわち、外因性DNA)と組み合わされている限り、宿主細胞種に由来するDNA(すなわち、内因性DNA)を含んでもよい。例えば、転写プロモーターを含む宿主DNAセグメントと機能的に連結された非宿主DNAセグメントを含むDNA分子は、異種DNA分子であるとみなされる。その反対に、異種DNA分子が、外因性プロモーターと機能的に連結された内因性遺伝子を含むこともできる。もう1つの例示として、野生型細胞に由来する遺伝子を含むDNA分子は、そのDNA分子が野生型遺伝子を欠失する突然変異細胞に導入されている場合には、異種DNAであるとみなされる。
【0013】
「コンティグ」という用語は、別の核酸分子に対して同一または相補的な配列の連続した連鎖を有する核酸分子を表す。連続した配列は、その全体が、または核酸分子の部分的連鎖に沿って、核酸分子の所定の連鎖と「一部重複する」と言われる。
【0014】
「相補的DNA(cDNA)」とは、逆転写酵素という酵素によってmRNAテンプレートから形成される一本鎖DNA分子のことである。典型的には、逆転写の開始のためにはmRNAの部分に対して相補的なプライマーが用いられる。当業者はまた、「cDNA」という用語を、そのような一本鎖DNA分子およびその相補的DNA鎖からなる二本鎖DNA分子を指すためにも用いる。「cDNA」という用語はまた、RNAテンプレートから合成されたcDNA分子のクローンのことも指す。
【0015】
「単離された核酸分子」とは、生物体のゲノムDNAに組み込まれていない核酸分子のことである。例えば、細胞のゲノムDNAから分離されている、増殖因子をコードするDNA分子は、単離されたDNA分子である。単離された核酸分子のもう1つの例は、生物体のゲノムに組み込まれていない、化学合成された核酸分子である。特定の種から単離された核酸分子は、その種からの染色体の完全なDNA分子よりも小さい。
【0016】
「線状DNA」は、遊離した5'末端および3'末端を有する非環状DNA分子のことを表す。線状DNAは、プラスミドなどの閉環状DNA分子から、酵素消化または物理的破壊によって調製することができる。
【0017】
「プロモーター」とは、構造遺伝子の転写を導くヌクレオチド配列のことである。典型的には、プロモーターは、遺伝子の5'非コード領域に位置しており、構造遺伝子の転写開始部位の近位にある。プロモーターの内部にあって転写の開始に機能する配列エレメントは、多くの場合、コンセンサスヌクレオチド配列によって特徴づけられる。これらのプロモーターには「誘導性プロモーター」が含まれ、それには例えば、IPTG-誘導性プロモーター(tacプロモーター;trcプロモーター;lacプロモーター;バクテリオファージT7、T3、T5プロモーター;およびnprM-lacプロモーターなど)、trpプロモーター、phoAプロモーター、recAプロモーター、cspAプロモーター、tetAプロモーターおよびバクテリオファージλPLがあるが、それらに限定されない。Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001を参照のこと。「誘導物質(inducing agent)」、例えば、IPTG誘導性プロモーターに対してのイソプロピルチオガラクトピラノシド(IPTG)の添加は、IPTG誘導性プロモーターの制御下にある1つまたは複数の遺伝子の発現を誘導すると考えられる。典型的なプロモーターは、-35および-10にあるコンセンサス配列とそれらの間の16〜19ヌクレオチドの配列という3つの構成要素を有すると考えられる(Lisset, S. and Margalit, H., Nucleic Acids Res. 21: 1512, 1993)。この種のプロモーターには、lac、trp、trp-lac(tac)およびtrp-lac(trc)プロモーターが含まれる。プロモーターが誘導性プロモーターである場合には、転写の速度は誘導物質に応答して上昇する。これに対して、プロモーターが構成性プロモーターである場合には、転写の速度は誘導物質によって調節されない。抑制性プロモーターも公知である。
【0018】
「コアプロモーター」は、転写の開始を含むプロモーター機能のための必須ヌクレオチド配列を含む。この定義によれば、コアプロモーターは、活性を高めること、または組織特異性活性を付与することのできる特定の配列の非存在下で検出可能な活性を有してもよく、または有しなくてもよい。
【0019】
「調節エレメント」とは、コアプロモーターの活性を調節するヌクレオチド配列のことである。例えば、真核生物調節エレメントは、特定の細胞、組織またはオルガネラにおける転写を排他的または優先的に可能にする細胞因子と結合するヌクレオチド配列を含みうる。これらの種類の調節エレメントは通常、「細胞特異的」、「組織特異的」または「オルガネラ特異的」な様式で発現させる遺伝子と結合される。細菌プロモーターは、アクチベーター分子またはリプレッサー分子と結合するオペレーター配列などのように、コアプロモーターと結合してその活性を調節する調節エレメントを有する。
【0020】
「クローニングベクター」とは、宿主細胞内で自律的に複製する能力を有する、プラスミド、コスミドまたはバクテリオファージなどの核酸分子のことである。クローニングベクターは、典型的には、ベクターの必須な生物的機能の喪失を伴わない決定可能な様式において、核酸分子の挿入を可能にする1つまたは少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位、ならびにクローニングベクターによって形質転換された細胞の同定および選択に用いるのに適したマーカー遺伝子を含む。マーカー遺伝子は、典型的には、抗生物質に対する耐性を提供する遺伝子を含む。
【0021】
「発現ベクター」とは、宿主細胞において発現させる遺伝子をコードする核酸分子のことである。典型的には、発現ベクターは、転写プロモーター、遺伝子、複製起点、選択マーカーおよび転写ターミネーターを含む。遺伝子発現は通常、プロモーターの制御下におかれ、そのような遺伝子はそのプロモーターと「機能的に連結している」と言われる。同様に、調節エレメントおよびコアプロモーターは、調節エレメントがコアプロモーターの活性を調節する場合には、機能的に連結している。発現ベクターが発現構築物として公知である場合もある。
【0022】
「組換え宿主」とは、クローニングベクターまたは発現ベクターなどの異種核酸分子を含む細胞のことである。
【0023】
「発現」という用語は、遺伝子産物の生合成のことを指す。例えば、構造遺伝子の場合には、発現は、構造遺伝子のmRNAへの転写、およびmRNAの1つまたは複数のポリペプチドへの翻訳を含む。
【0024】
「分泌シグナル配列」という用語は、より大きなポリペプチドの構成要素として、そのより大きなポリペプチドをそれが合成される細胞の分泌経路を通って導くペプチド(「分泌ペプチド」)をコードするDNA配列のことを表す。より大きなポリペプチドは、分泌経路を通過する間に一般に切断され、分泌ペプチドが除去される。
【0025】
「ポリペプチド」とは、天然性または合成性のいずれによって生成されたかにかかわらず、ペプチド結合によって連結したアミノ酸残基の重合体のことである。アミノ酸残基が約10個未満のポリペプチドは一般に「ペプチド」と呼ばれる。
【0026】
「タンパク質」とは、1つまたは複数のポリペプチド鎖を含む高分子のことである。タンパク質が、炭水化物基などの非ペプチド性構成要素を含んでもよい。炭水化物および他の非ペプチド性置換基がタンパク質に付加されてもよい。タンパク質は、本明細書において、それらのアミノ酸骨格構造に関して定義され;炭水化物基および非ペプチド基などの置換基は一般に特定されないが、それにもかかわらず存在してよい。
【0027】
非宿主DNA分子によってコードされるペプチドまたはポリペプチドは、「異種の」ペプチドまたはポリペプチドである。
【0028】
「単離されたポリペプチド」とは、自然下でポリペプチドに付随する炭水化物、脂質または他のタンパク質性不純物などの混入性細胞成分を本質的に含まないポリペプチドのことである。典型的には、単離されたポリペプチドの調製物は、ポリペプチドを高精製された形態で、すなわち、少なくとも約80%の純度で、少なくとも約90%の純度で、少なくとも約95%の純度で、95%を上回る純度で、または99%を上回る純度で含む。特定のタンパク質調製物が、単離されたポリペプチドを含むことを示すための1つの方法は、タンパク質調製物のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)-ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびゲルのクーマシーブリリアントブルー染色の後の単一バンドの出現による。しかし、「単離された」という用語は、二量体、または代替的にはグリコシル化もしくは誘導体化された形態などの代替的な物理的形態にある同じポリペプチドの存在を除外するものではない。
【0029】
「アミノ末端」または「N末端」および「カルボキシル末端」または「C末端」という用語は、本明細書において、ポリペプチド内部の位置を表すために用いられる。文脈が許容する場合、これらの用語は、近接性または相対的位置を表すために、特定の配列、またはポリペプチドの部分に関して用いられる。例えば、ポリペプチド内部の参照配列に対してカルボキシル末端側に位置するある種の配列は、参照配列のカルボキシル末端の近位に位置するが、必ずしも全ポリペプチドのカルボキシル末端にあるわけではない。
【0030】
「融合タンパク質」とは、少なくとも2つの遺伝子のヌクレオチド配列を含む核酸分子によって発現されるハイブリッドタンパク質のことである。
【0031】
「アフィニティータグ」は、本明細書において、第2のポリペプチドの精製もしくは検出を提供するために、または第2のポリペプチドの基質に対する付着のための部位を提供するために、第2のポリペプチドに付着されるポリペプチドセグメントを表すために用いられる。原理的には、抗体または他の特異的な結合物質が入手可能な任意のペプチドまたはタンパク質をアフィニティータグとして用いることができる。アフィニティータグには、ポリヒスチジントラクト(poly-histidine tract)、プロテインA(Nilsson et al., EMBO J. 4:1075(1985);Nilsson et al., Methods Enzymol. 198:3(1991))、グルタチオンSトランスフェラーゼ(Smith and Johnson, Gene 67:31(1988))、Glu-Gluアフィニティータグ(Grussenmeyer et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA 82:7952(1985))、サブスタンスP、FLAGペプチド(Hopp et al., Biotechnology 6:1204(1988))、ストレプトアビジン結合ペプチドまたは他の抗原性エピトープもしくは結合ドメインが含まれる。概論については、Ford et al., Protein Expression and Purification 2:95(1991)を参照のこと。アフィニティータグをコードするDNA分子は、販売供給元(例えば、Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)から入手可能である。
【0032】
「等張性」という用語は、本明細書において、NaClの0.9%溶液と同等な、血液のそれと等しい張度であるという、その従来の意味に関して用いられる。塩の「等張量」とは、等張な溶液を作るため、または凍結乾燥調製物の再構成によって等張溶液を作製するために必要な量のことである。
【0033】
濃度は、本明細書において、液体組成物のモル濃度または% w/vの単位によって特定される。組成物が凍結乾燥粉末の形態にある場合、各々の成分の濃度は、粉末の再構成後に指定濃度が得られるようなものであると考えられる。
【0034】
標準的な分析方法の不正確さのため、重合体の分子量および長さは概略値であると解釈される。そのような値が「約」Xまたは「およそ」Xであると表現される場合には、Xの述べられた値は±10%の精度であると解釈されると考えられる。
【0035】
本発明は、原核生物複製起点、転写開始DNAエレメント、ならびにSEQ ID NO:1、3、5、7、9および11からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列、ならびに転写ターミネーターという機能的に連結したエレメントを含む、IL-29ポリペプチドを生産するための発現ベクターを提供する。もう1つの局面において、発現ベクターは、ベクターpTAP440またはpTAP395である。任意で、発現ベクターが、カナマイシンなどの選択マーカーをさらに含んでもよい。
【0036】
もう1つの局面において、本発明は、IL-29ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列(例えば、SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12および生物活性のある突然変異体)を含む発現ベクター、ベクターpTAP440またはベクターpTAP395によって形質転換された原核宿主細胞を提供する。他の態様において、宿主株は大腸菌株W3110、zGOLD1またはzGOLD5である。
【0037】
もう1つの局面において、本発明は、IL-29ポリペプチドを発現させる条件下でIL-29ポリペプチドを生産するための方法を提供する。1つの態様において、本方法は、pTAP440またはpTAP395によって形質転換された後の、IL-29ポリペプチドを発現する宿主細胞を培養する段階を含む。もう1つの態様において、本方法は、SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12および生物活性のある突然変異体からなる群より選択されるポリペプチドを含む発現ベクターによって形質転換された宿主細胞を培養する段階を含む。本方法はまた、宿主細胞を増殖培地から回収し、続いてIL-29ポリペプチドを宿主細胞から単離する段階も含む。
【0038】
他の局面において、本発明は、流加発酵工程またはバッチ発酵工程における、上記の段階を含む、IL-29ポリペプチドを生産する方法を提供する。
【0039】
本発明はまた、IL-29ポリペプチドを生産する方法であって、宿主細胞を振盪フラスコ内で適した増殖培地中にて600nmで5〜20の光学密度(OD)となるまで培養する段階、宿主細胞を含む1〜5% v/v(例えば、1% v/vおよび2% v/v)の振盪フラスコ培地を発酵容器に接種する段階、宿主細胞を増殖培地中にてpH 6.2〜7.2(例えば、pH 6.8)で培養する段階であり、10〜20時間(例えば、15時間)の発酵経過時間(EFT)の前に供給溶液が発酵容器に供給される段階、20〜30時間(例えば、24時間)のEFTの時点で誘導物質を発酵容器に添加する段階、および48〜56時間のEFTの時点で宿主細胞を収集する段階を含む方法も提供する。1つの態様において、誘導物質は、0.5〜2mM(例えば、1mM)のイソプロピルチオガラクトピラノシド(IPTG)である。もう1つの態様において、供給溶液は、炭水化物、例えばグリセロールおよびグルコースを含み、供給量は1時間当たり10〜30グラム/リットル(g/L)(例えば、10〜20g/L)の炭水化物である。もう1つの態様において、供給溶液中のグリセロールは40〜70% v/vのグリセロール(例えば、50% w/v)である、またはグルコースは40〜70% w/vのグルコース(例えば、50% w/v)である。さらなる態様において、グリセロールは約70% v/vである、またはグルコースは約60% w/vである。
【0040】
本発明はまた、IL-29ポリペプチドを生産する方法であって、SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12および生物活性のある突然変異体からなる群より選択されるIL-29ポリペプチドを発現する大腸菌W3110、ZGold1もしくはZGold5宿主細胞、またはIL-29ポリペプチドを発現させるpTAP440もしくはpTAP395ベクターを含む大腸菌W3110、ZGold1もしくはZGold5宿主細胞を含む接種物、および約5〜7g/Lのグリセロールまたはグルコースを含む増殖培地をフラスコに播種する段階、接種物を増殖培地中にて約30℃〜約37℃で16〜20時間培養する段階、増殖培地中の培養した接種物を1〜5% v/v接種物(例えば、1〜2% v/v)の濃度でバッチ発酵槽に移す段階、バッチ発酵物を約10〜30g/L(例えば、10〜20g/L)のグリセロールまたはグルコースとともに約37℃および約pH 6.8で発酵させる段階、約6〜8時間のEFTの時点で1時間につき1リットル当たり約5〜15グラムのグルコースまたはグリセロールのグルコース供給を投入して発酵操作の終了まで継続する段階、約24時間のEFTの時点でIPTGを0.5〜2mM(例えば、1mM)の最終濃度まで添加する段階、さらに20〜30時間(例えば、24時間)にわたり発酵させる段階、発酵ブロスを発酵槽から収集する段階、等容積の水を発酵ブロスに添加する段階、ならびにIL-29タンパク質材料を含む細胞ペレットまたは細胞スラリーを採取するためにホモジネート化および遠心処理を行う段階を含む方法も提供する。
【0041】
もう1つの局面において、本発明は、SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12および生物活性のある突然変異体からなる群より選択されるアミノ酸残基の配列を含む不溶性IL-29ポリペプチドを単離する方法であって、不溶性IL-29ポリペプチドを細胞ペレットまたはスラリーから分離する段階、不溶性IL-29材料をカオトロピック溶媒に溶解する段階、カオトロピック溶媒を希釈してIL-29ポリペプチドをリフォールディングさせる段階;およびIL-29ポリペプチドを単離する段階を含み、単離されたIL-29ポリペプチドが生物活性を有しうる方法を提供する。本発明の1つの態様において、単離されたIL-29ポリペプチドは、少なくとも90%の純度である。もう1つの態様において、単離されたIL-29ポリペプチドは少なくとも90%の純度であり、エンドトキシンレベルは、USP <85>に基づくリムルスアメーバ様細胞(Limulus Amoebocyte)溶解物アッセイ法においてIL-29ポリペプチド1mg当たり10エンドトキシン単位未満である。
【0042】
本発明はまた、SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12および生物活性のある突然変異体からなる群より選択されるアミノ酸残基の配列を含む不溶性IL-29ポリペプチドを単離する方法であって、不溶性IL-29ポリペプチド材料を含む細胞ペレットまたは細胞スラリーを発酵ブロスから分離する段階、封入体を採取するために細胞ペレットまたは細胞スラリーをホモジネート化する段階、不溶性IL-29ポリペプチド材料をグアニジン塩を含むカオトロピック溶媒に溶解する段階、アルギニン塩および還元成分と酸化成分との混合物を含むリフォールディング緩衝液の添加によってカオトロピック溶媒を希釈する段階、非フォールディングタンパク質および凝集タンパク質を濾過により除去することによってIL-29ポリペプチドを単離する段階、およびリフォールディングしたIL-29ポリペプチドを陽イオン交換カラムで精製する段階を含み、単離および精製されたIL-29が生物活性を有しうる方法も提供する。
【0043】
もう1つの局面において、本発明は、SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12および生物活性のある突然変異体からなる群より選択されるアミノ酸残基の配列を含む不溶性IL-29ポリペプチドを単離する方法であって、不溶性IL-29材料を含む細胞ペレットまたは細胞スラリーを発酵ブロスから分離する段階、封入体を採取するために細胞ペレットまたは細胞スラリーをホモジネート化する段階、不溶性IL-29タンパク質材料をグアニジン塩を含むカオトロピック溶媒に溶解する段階、アルギニン塩および還元成分と酸化成分との混合物を含むリフォールディング緩衝液の添加によってカオトロピック溶媒を希釈する段階、非フォールディングタンパク質および凝集タンパク質を濾過により除去することによってIL-29ポリペプチドを単離する段階、リフォールディングしたIL-29ポリペプチドを陽イオン交換カラムで精製する段階、ならびにIL-29溶出液を疎水性相互作用カラムで精製する段階を含み、単離および精製されたIL-29ポリペプチドが生物活性を有しうる方法を提供する。
【0044】
もう1つの局面において、本発明は、SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12および生物活性のある突然変異体からなる群より選択されるアミノ酸残基の配列を含む不溶性IL-29ポリペプチドを単離するための方法であって、不溶性IL-29ポリペプチド材料を含む細胞ペレットまたは細胞スラリーを発酵ブロスから分離する段階、封入体を採取するために細胞ペレットまたは細胞スラリーをホモジネート化する段階、不溶性IL-29ポリペプチド材料を約6Mの塩酸グアニジン、40mMジチオトレイトール(DTT)を含むカオトロピック溶媒に室温で約1時間にわたり溶解する段階、溶液中に溶けた封入体を約2mMのDTT、4mMのシスチン酸化-還元対を含むリフォールディング緩衝液中に少なくとも20倍に希釈することによってリフォールディングさせる段階、約20%酢酸によってpHを約5.5に調整する段階、および溶液を少なくとも5時間にわたり反応させる段階、約1+1.4倍容積の25mMアセテート、pH 5.5によって溶液を希釈する段階、溶液を濾過する段階、酢酸ナトリウム緩衝液を用いてpH 5.5に平衡化されたTosohaas SP-550C樹脂カラムに溶液をローディングする段階、約2Mの塩化ナトリウムによって樹脂カラムを洗浄する段階、結合したIL-29ポリペプチドを溶出させるために約0.6Mの塩化ナトリウムによって樹脂カラムを洗浄する段階、硫酸アンモニウムを約1.5Mの濃度で溶出液に添加して溶出溶液を濾過する段階、1.5M硫酸アンモニウム、酢酸ナトリウム緩衝液中の0.05塩化ナトリウムに対して平衡化されたTosohaasブチル650-Mカラムに溶出溶液をローディングする段階、溶出液を酢酸ナトリウム緩衝液によって平衡化されたSP Sepharose HPカラムに対して希釈する段階、20倍カラム容積の0.3〜0.7Mの塩化ナトリウムの直線勾配によってカラムを洗浄する段階、IL-29タンパク質を濃縮する段階、およびタンジェンシャルフロー限外濾過を用いて緩衝液を製剤化緩衝液(formulation buffer)に交換する段階を含む方法を提供する。
【0045】
本発明はまた、精製されたIL-29ポリペプチドにポリエチレングリコール(PEG)を共有結合させることも提供する。PEGを、IL-29ポリペプチドのN末端またはC末端に結合させることができる。PEGは20kDaのメトキシPEG-プロピオンアルデヒドであってよい。本発明はまた、モノPEG化IL-29の精製も提供する。
【0046】
本発明はまた、IL-29ポリペプチドを生産する方法であって、(a)誘導性プロモーターと機能的に連結されたIL-29ポリペプチドをコードする核酸分子を含む原核宿主細胞を、第1の増殖培地中にて、コードされるIL-29ポリペプチドを振盪フラスコ内でOD600が5〜20となるまで発現させる条件下で培養する段階;(b)宿主細胞を含む1〜5% v/vの振盪フラスコ培地を発酵容器に接種する段階;(c)宿主細胞をpH 6.2〜7.2の第2の増殖培地中で培養する段階であり、6〜8時間の発酵経過時間の時点で発酵容器に炭水化物供給溶液を供給する段階;(d)20〜30時間の発酵経過時間の時点で誘導物質を発酵容器に添加する段階;および(e)48〜56時間の発酵経過時間の時点で原核宿主細胞を収集する段階を含む方法も提供する。任意で、炭水化物供給溶液はグリセロールまたはグルコースを10〜30g/L増殖培地の濃度で含んでよく、供給速度は1時間につき1リットル当たりグリセロールまたはグルコースが5〜15グラムであってよい。原核宿主細胞は、大腸菌、例えばW3110、ZGOLD1およびZGOLD5などであってよい。加えて、原核宿主細胞、例えば大腸菌が、OmpT欠損性および/またはfhuA欠損性であってもよい。コードされるIL-29ポリペプチドには、SEQ ID NO:2、4、6、8、10および12からなる群より選択されるアミノ酸配列が含まれうる。段階(d)の誘導物質はイソプロピルチオガラクトピラノシドであってよく、これを培養物に0.5mM〜2mMの濃度で添加することができる。
【0047】
本発明はまた、IL-29ポリペプチドを原核宿主細胞から回収するための方法であって、(a)誘導性プロモーターと機能的に連結されたIL-29ポリペプチドをコードする核酸分子を含む原核宿主細胞を、増殖培地中にて、コードされるIL-29ポリペプチドを発現させる条件下で培養する段階;(b)IL-29ポリペプチドの発現を誘導するために誘導物質を添加する段階;(c)原核宿主細胞を収集する段階;(d)原核宿主細胞を溶解させる段階;(e)溶解された原核宿主細胞を遠心分離する段階;(f)封入体ペレットを回収する段階;(g)封入体ペレットを4〜6Mの塩酸グアニジンおよび10〜50mMのジチオトレイトール中にて15〜25℃で1〜2時間にわたり可溶化する段階;および(h)可溶化されたIL-29ポリペプチドを、0.05〜0.5%のポリエチレングリコール、塩、0.5M〜1.25Mのアルギニンおよび還元された分子と酸化された分子との混合物を含むリフォールディング緩衝液に温度4〜30℃およびpH 7.3〜8.5にて1〜26時間にわたり添加する段階であり、可溶化されたIL-29ポリペプチドがリフォールディングされる段階;(i)pHを5.5〜6.5に調整することによってリフォールディング反応を停止させる段階;(j)反応停止したリフォールディング溶液を水またはpH 5〜7の低イオン強度緩衝液で1.5〜10倍に希釈する段階;および(k)反応停止し希釈したリフォールディング溶液を、沈殿物または粒子状物質を除去するためにフィルターで濾過する段階を含む方法も提供する。段階(d)の原核宿主細胞は、ホモジナイゼーションによって溶解させることができる。段階(e)の溶解された原核宿主細胞は、バッチ遠心法または連続遠心法のいずれかによって遠心分離することができる。段階(h)のIL-29ポリペプチドは、リフォールディング緩衝液に0.05〜3.0mg/mlの最終濃度まで添加することができる。段階(h)のリフォールディング緩衝液の還元された分子と酸化された分子との混合物は、システインとシスチン、ジチオトレイトールとシスチン、還元グルタチオンと酸化グルタチオン、およびジチオトレイトールと酸化グルタチオンの群より選択される分子であってよい。本発明はまた、本明細書に記載した方法によって生産および/または回収されたIL-29ポリペプチドも提供する。
【0048】
本発明はまた、IL-29ポリペプチドを精製する方法であって、(a)請求項13の段階(k)に従ってIL-29ポリペプチドを提供する段階;(b)段階(a)のリフォールディングしたIL-29ポリペプチドを含む濾過溶液を、pH 5.5の酢酸ナトリウムによって平衡化された陽イオン交換クロマトグラフィーカラムにローディングする段階;(c)結合したIL-29ポリペプチドを、酢酸ナトリウム中の塩化ナトリウム、pH 5.5によって溶出させる段階;および(d)溶出液を硫酸アンモニウムによって1Mの濃度に調整して、調整されたIL-29ポリペプチド溶出液を0.45μmフィルターに通す段階を含む方法も提供する。任意で、IL-29ポリペプチドを、0〜2Mの塩化ナトリウムの直線勾配溶出を用いた後に約0.7M〜0.8Mの塩化ナトリウムのプールを形成するように、陽イオン交換カラムから溶出させてもよい。IL-29ポリペプチドの精製におけるもう1つの局面において、本方法はさらに、(e)段階(d)のIL-29ポリペプチドを、50mM酢酸ナトリウム、1.5M硫酸アンモニウム、pH 5.5によって平衡化された疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムにローディングする段階;(f)直線性50mM酢酸ナトリウム、1.5M硫酸アンモニウムから硫酸アンモニウムを含まない50mM酢酸ナトリウムまでを、pH 5.5でIL-29ポリペプチドを溶出させる段階;(g)溶出液を水または低イオン強度緩衝液によって約6倍に希釈して、希釈したIL-29ポリペプチド溶出液を0.2μmまたは0.45μmのフィルターに通す段階を含んでもよい。任意で、IL-29ポリペプチドを、疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムから約0.75M硫酸アンモニウム〜0M硫酸アンモニウムで溶出させてもよい。IL-29ポリペプチドの精製におけるもう1つの局面において、本方法はさらに、(h)段階(g)のIL-29ポリペプチドを、0〜300mM塩化ナトリウム、pH 5.5を含む50mM酢酸ナトリウムによって平衡化された高性能陽イオン交換クロマトグラフィーカラムにローディングする段階;および(i)IL-29ポリペプチドを、50mM酢酸ナトリウム中のより高濃度の塩化ナトリウム、pH 5.5によって段階溶出または勾配溶出の方式で溶出させる段階を含んでもよい。任意で、IL-29ポリペプチドを、300〜800mMの塩化ナトリウムの勾配溶出を用いた後に約0.4Mの塩化ナトリウム〜0.6M塩化ナトリウムで高性能陽イオン交換クロマトグラフィーカラムから溶出させてもよい。IL-29ポリペプチドはドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル分析によって少なくとも98%の純度であってよく、凝集物はサイズ排除HPLCによって0.2%未満であってよい。本発明はまた、本明細書に記載した方法によって生産および/または回収および/または精製されたIL-29ポリペプチドも提供する。
【0049】
本発明はまた、精製されたIL-29ポリペプチドを濃縮する方法であって、(a)本明細書に記載した通りに精製IL-29ポリペプチドを提供する段階;(b)IL-29ポリペプチドを、1つまたは複数の3〜10kDa分子量カットオフ膜を含むタンジェンシャルフロー濾過プレート・フレームシステムに添加する段階;(c)溶液をより高濃度に限外濾過するために15〜25psiの膜間圧をシステムに印加する段階;および(c)濃縮されたIL-29ポリペプチドを0.2μm膜に通して濾過する段階を含む方法も提供する。IL-29ポリペプチドはドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル分析によって少なくとも98%の純度であってよく、凝集物はサイズ排除HPLCによって0.2%未満であってよい。IL-29ポリペプチドのエンドトキシンレベルは、USP <85>に基づくリムルス・アメーバ様細胞溶解物アッセイ法においてIL-29ポリペプチド1mg当たり10エンドトキシン単位未満であってよい。本発明はまた、本明細書に記載した方法によって生産および/または回収および/または精製および/または濃縮されたIL-29ポリペプチドも提供する。
【0050】
本発明はまた、IL-29ポリペプチドをモノペグ化する方法であって、(a)酢酸ナトリウム緩衝液中にある3〜5g/LのIL-29ポリペプチドを提供する段階;(b)10〜20mMのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを段階(a)の溶液に添加する段階;(c)2倍モル過剰の誘導体化ポリエチレングリコールを段階(b)の溶液に添加する段階;および(d)段階(c)の溶液を16〜20℃で10〜18時間混合する段階を含む方法も提供する。任意で、モノペグ化IL-29ポリペプチドは、逆相HPLCによる測定で少なくとも99%のモノペグ化を有してもよい。本発明はまた、本明細書に記載した方法によって生産されたモノペグ化IL-29ポリペプチドも提供する。
【0051】
本発明はまた、モノペグ化IL-29ポリペプチドを精製する方法であって、(e)本明細書に記載した通りにモノペグ化IL-29ポリペプチドを提供する段階;(f)段階(e)の溶液を50mM酢酸ナトリウム、pH 5.5によって2倍に希釈する段階;(g)段階(f)の溶液を0.2μm膜に通して濾過する段階;(h)段階(g)の溶液を、50mM酢酸ナトリウム、200mM塩化ナトリウム、pH 5.5によって平衡化された高性能陽イオン交換クロマトグラフィーカラムにローディングする段階;(i)モノペグ化IL-29ポリペプチドを、直線性50mM酢酸ナトリウム、500mM塩化ナトリウムまでを、pH 5.5で高性能陽イオン交換クロマトグラフィーカラムから溶出させる段階;(j)モノペグ化IL-29ポリペプチドを、1つまたは複数の3〜10kDa分子量カットオフ膜を含むタンジェンシャルフロー濾過プレート・フレームシステムに添加する段階;(k)溶液をより高濃度に限外濾過するために15〜25psiの膜間圧をシステムに印加する段階;(l)ダイアフィルトレーションによる、濃縮されたIL-29ポリペプチドの適切な調合緩衝液への緩衝液交換のためにシステムを用いる段階;および(m)濃縮されたモノペグ化IL-29ポリペプチドを0.2μm膜に通して濾過する段階を含む方法も提供する。ポリエチレングリコールは、20kDaまたは30kDaのモノ-メトキシPEG-プロピオンアルデヒドを含んでもよい。ポリエチレングリコールは、IL-29ポリペプチドとN末端またはC末端で結合してもよい。任意で、モノペグ化IL-29ポリペプチドは、逆相HPLCによる測定で少なくとも99%のモノペグ化を有してもよい。本発明はまた、本明細書に記載した方法によって生産および精製されたモノペグ化IL-29ポリペプチドも提供する。
【発明を実施するための形態】
【0052】
IL-29ポリヌクレオチドおよびポリペプチド
ヒトIL-29遺伝子は、シグナル配列を含まない、182アミノ酸の成熟ポリペプチドをコードする。原核発現系を用いて発現させるIL-29配列はN末端メチオニンを有し、そのヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列はそれぞれSEQ ID NO:11および12(本明細書ではIL-29野生型配列と称する)に示されている。SEQ ID NO:11のヌクレオチド配列はコドン最適化された配列を示しており、これは本発明の範囲に含まれる。「IL-29」、「組換えIL-29」、「組換えヒトIL-29」は、本明細書において互換的に用いられ、IL-29分子全般を指し、これにはIL-29野生型(SEQ ID NO:12)、IL-29 C172S(SEQ ID NO:2)、IL-29 C172Sロイシンインサート(SEQ ID NO:4)、IL-29 C172S d2-7(SEQ ID NO:6)、IL-29 C1突然変異体(SEQ ID NO:8)、IL-29 C5突然変異体(SEQ ID NO:10)、それらの断片(N末端、C末端ならびにNおよびC末端の断片)、変異体および融合物が含まれる。
【0053】
本発明のZcyto21またはIL-29ポリペプチドは、成熟ポリペプチドの第5のシステイン、C5にも突然変異を含む。例えば、SEQ ID NO:12のポリペプチドのN末端からのC5は、172位にあるシステインである。IL-29のこの第5システインまたはC5を、例えば、別のシステインとジスルフィド結合を形成しないと考えられる任意のアミノ酸(例えば、セリン、アラニン、トレオニン、バリンまたはアスパラギン)へと突然変異させることができる。これらのIL-29 C5突然変異ポリペプチドは、C1(SEQ ID NO:10のCys16)/C3(SEQ ID NO:10のCys113)およびC2(SEQ ID NO:10のCys50)/C4(SEQ ID NO:10のCys146)というジスルフィド結合パターンを有する。本発明のIL-29 C5突然変異分子には、SEQ ID NO:10に示されたIL-29 C5突然変異ポリペプチドをコードする、DNAおよびRNA分子を含む、SEQ ID NO:9に示されたポリヌクレオチド分子が含まれる(米国特許出願第60/700,905号および第60/700,951号、PCT公報WO 03/066002(Kotenko et al.)およびPCT公報WO 02/092762(Baum et al.)を参照)。
【0054】
例えば、本発明のIL-29分子に関する種々の用途には、抗ウイルス薬(例えば、C型肝炎、B型肝炎、ヒト免疫不全ウイルスの治療のための)、ならびに種々の自己免疫疾患(例えば、多発性硬化症)および種々の癌(例えば、肝細胞癌、腎細胞癌、膵癌、結腸癌、種々のB細胞悪性腫瘍)に対する治療薬としての使用が含まれ、これらは同一出願人による米国特許第6,927,040号、米国特許第7,038,032号、WO 04/037995、WO 05/023862、米国特許出願公開第2005-0244423号、米国特許出願公開第2006-012644号、米国特許出願第11/458,945号および米国特許出願第11/489,894号により詳細に開示されており、それらはすべてその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【0055】
本発明はまた、少なくとも部分的な抗ウイルス活性を提供する、または自己免疫疾患および/もしくは種々の癌に対する治療活性を有する、IL-29 C5システイン突然変異体の生物活性のある突然変異体も含む。本発明のIL-29 C5システイン突然変異体の生物活性のある突然変異体には、IL-29のN末端、C末端ならびにNおよびC末端の欠失体、例えば、SEQ ID NO:9のポリヌクレオチドによってコードされるSEQ ID NO:10のポリペプチドが含まれる。
【0056】
IL-29 C5突然変異体の、N末端が修飾された生物活性のある突然変異体には、例えば、SEQ ID NO:9のヌクレオチド4〜546によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基2〜182;SEQ ID NO:9のヌクレオチド7〜546によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基3〜182;SEQ ID NO:9のヌクレオチド10〜546によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基4〜182;SEQ ID NO:9のヌクレオチド13〜546によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基5〜182;SEQ ID NO:9のヌクレオチド16〜546によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基6〜182;SEQ ID NO:9のヌクレオチド19〜546によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基7〜182;SEQ ID NO:9のヌクレオチド22〜546によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基8〜182;SEQ ID NO:9のヌクレオチド25〜546によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基9〜182;SEQ ID NO:9のヌクレオチド28〜546によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基10〜182;SEQ ID NO:9のヌクレオチド31〜546によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基11〜182;SEQ ID NO:9のヌクレオチド34〜546によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基12〜182;SEQ ID NO:9のヌクレオチド37〜546によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基13〜182;SEQ ID NO:9のヌクレオチド40〜546によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基14〜182;SEQ ID NO:9のヌクレオチド43〜546によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基15〜182が含まれる。本発明のIL-29 C5突然変異体の、N末端が修飾された生物活性のある突然変異体は、例えば、大腸菌において発現させた場合に、N末端メチオニンを含んでもよい。
【0057】
IL-29 C5突然変異体の、C末端が修飾された生物活性のある突然変異体には、例えば、SEQ ID NO:9のヌクレオチド1〜543によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基1〜181;SEQ ID NO:9のヌクレオチド1〜540によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基1〜180;SEQ ID NO:9のヌクレオチド1〜537によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基1〜179;SEQ ID NO:9のヌクレオチド1〜534によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基1〜178;SEQ ID NO:9のヌクレオチド1〜531によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基1〜177;SEQ ID NO:9のヌクレオチド1〜528によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基1〜176;SEQ ID NO:9のヌクレオチド1〜525によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基1〜175;SEQ ID NO:9のヌクレオチド1〜522によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基1〜174;SEQ ID NO:9のヌクレオチド1〜519によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基1〜173;SEQ ID NO:9のヌクレオチド1〜516によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基1〜172が含まれる。本発明のIL-29 C5突然変異体の、C末端が修飾された生物活性のある突然変異体は、例えば、大腸菌において発現させた場合に、N末端メチオニンを含んでもよい。
【0058】
IL-29 C5突然変異体の、N末端およびC末端が修飾された生物活性のある突然変異体には、例えば、SEQ ID NO:9のヌクレオチド4〜546によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基2〜182;SEQ ID NO:9のヌクレオチド4〜543によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基2〜181;SEQ ID NO:9のヌクレオチド4〜540によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基2〜180;SEQ ID NO:9のヌクレオチド4〜537によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基2〜179;SEQ ID NO:9のヌクレオチド4〜534によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基2〜178;SEQ ID NO:9のヌクレオチド4〜531によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基2〜177;SEQ ID NO:9のヌクレオチド4〜528によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基2〜176;SEQ ID NO:9のヌクレオチド4〜525によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基2〜175;SEQ ID NO:9のヌクレオチド4〜522によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基2〜174;SEQ ID NO:9のヌクレオチド4〜519によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基2〜173;SEQ ID NO:9のヌクレオチド4〜516によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基2〜172;SEQ ID NO:9のヌクレオチド7〜546によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基3〜182;SEQ ID NO:9のヌクレオチド7〜543によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基3〜181;SEQ ID NO:9のヌクレオチド7〜540によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基3〜180;SEQ ID NO:9のヌクレオチド7〜537によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基3〜179;SEQ ID NO:9のヌクレオチド7〜534によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基3〜178;SEQ ID 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34〜531によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基12〜177;SEQ ID NO:9のヌクレオチド34〜528によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基12〜176;SEQ ID NO:9のヌクレオチド34〜525によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基12〜175;SEQ ID NO:9のヌクレオチド34〜522によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基12〜174;SEQ ID NO:9のヌクレオチド34〜519によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基12〜173;SEQ ID NO:9のヌクレオチド34〜516によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基12〜172;SEQ ID NO:9のヌクレオチド37〜546によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基13〜182;SEQ ID NO:9のヌクレオチド37〜543によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基13〜181;SEQ ID NO:9のヌクレオチド37〜540によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基13〜180;SEQ ID NO:9のヌクレオチド37〜537によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基13〜179;SEQ ID NO:9のヌクレオチド37〜534によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基13〜178;SEQ ID NO:9のヌクレオチド37〜531によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基13〜177;SEQ ID NO:9のヌクレオチド37〜528によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基13〜176;SEQ ID NO:9のヌクレオチド37〜525によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基13〜175;SEQ ID NO:9のヌクレオチド37〜522によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基13〜174;SEQ ID NO:9のヌクレオチド37〜519によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基13〜173;SEQ ID NO:9のヌクレオチド37〜516によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基13〜172;SEQ ID NO:9のヌクレオチド40〜546によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基14〜182;SEQ ID NO:9のヌクレオチド40〜543によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基14〜181;SEQ ID NO:9のヌクレオチド40〜540によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基14〜180;SEQ ID NO:9のヌクレオチド40〜537によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基14〜179;SEQ ID NO:9のヌクレオチド40〜534によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基14〜178;SEQ ID NO:9のヌクレオチド40〜531によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基14〜177;SEQ ID NO:9のヌクレオチド40〜528によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基14〜176;SEQ ID NO:9のヌクレオチド40〜525によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基14〜175;SEQ ID NO:9のヌクレオチド40〜522によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基14〜174;SEQ ID NO:9のヌクレオチド40〜519によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基40〜173;SEQ ID NO:9のヌクレオチド40〜516によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基14〜172;SEQ ID NO:9のヌクレオチド43〜546によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基15〜182;SEQ ID NO:9のヌクレオチド43〜543によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基15〜181;SEQ ID NO:9のヌクレオチド43〜540によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基15〜180;SEQ ID NO:9のヌクレオチド43〜537によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基15〜179;SEQ ID NO:9のヌクレオチド43〜534によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基15〜178;SEQ ID NO:9のヌクレオチド43〜531によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基15〜177;SEQ ID NO:9のヌクレオチド43〜528によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基15〜176;SEQ ID NO:9のヌクレオチド43〜525によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基15〜175;SEQ ID NO:9のヌクレオチド43〜522によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基15〜174;SEQ ID NO:9のヌクレオチド43〜519によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基15〜173;SEQ ID NO:9のヌクレオチド43〜516によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基15〜172;SEQ ID NO:9のヌクレオチド46〜546によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基16〜182;SEQ ID NO:9のヌクレオチド46〜543によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基16〜181;SEQ ID NO:9のヌクレオチド46〜540によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基16〜180;SEQ ID NO:9のヌクレオチド46〜537によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基16〜179;SEQ ID NO:9のヌクレオチド46〜534によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基16〜178;SEQ ID NO:9のヌクレオチド46〜531によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基16〜177;SEQ ID NO:9のヌクレオチド46〜528によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基16〜176;SEQ ID NO:9のヌクレオチド46〜525によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基16〜175;SEQ ID NO:9のヌクレオチド46〜522によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基16〜174;SEQ ID NO:9のヌクレオチド46〜519によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基16〜173;および、SEQ ID NO:9のヌクレオチド46〜516によってコードされるSEQ ID NO:10のアミノ酸残基16〜172が含まれる。本発明のIL-29 C5突然変異体の、N末端およびC末端が修飾された生物活性のある突然変異体は、例えば、大腸菌において発現させた場合に、N末端メチオニンを含んでもよい。
【0059】
IL-29 C5突然変異体に加えて、本発明はまた、成熟ポリペプチドの第1のシステイン位置、C1に突然変異を含むIL-29ポリペプチドも含む。例えば、SEQ ID NO:12のポリペプチドのN末端からのC1は、16位にあるシステインである。これらのIL-29 C1突然変異ポリペプチドは、C2(SEQ ID NO:8のCys50)/C4(SEQ ID NO:8のCys146)およびC3(SEQ ID NO:8のCys113)/C5(SEQ ID NO:8のCys172)と予想されるジスルフィド結合パターンを有する。本発明のIL-29 C1突然変異分子には、SEQ ID NO:8に示されたIL-29 C1突然変異ポリペプチドをコードする、DNAおよびRNA分子を含む、SEQ ID NO:7に示されたポリヌクレオチド分子が含まれる。
【0060】
本発明はまた、少なくとも部分的な抗ウイルス活性を提供する、または自己免疫疾患および/もしくは種々の癌に対する治療活性を有する、IL-29 C1システイン突然変異体の生物活性のある突然変異体も含む。本発明のIL-29 C1システイン突然変異体の生物活性のある突然変異体には、IL-29のN末端、C末端ならびにNおよびC末端の欠失体、例えば、SEQ ID NO:7のポリヌクレオチドによってコードされるSEQ ID NO:8のポリペプチドが含まれる。
【0061】
IL-29 C1突然変異体の、N末端が修飾された生物活性のある突然変異体には、例えば、SEQ ID NO:7のヌクレオチド4〜546によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基2〜182;SEQ ID NO:7のヌクレオチド7〜546によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基3〜182;SEQ ID NO:7のヌクレオチド10〜546によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基4〜182;SEQ ID NO:7のヌクレオチド13〜546によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基5〜182;SEQ ID NO:7のヌクレオチド16〜546によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基6〜182;SEQ ID NO:7のヌクレオチド19〜546によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基7〜182;SEQ ID NO:7のヌクレオチド22〜546によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基8〜182;SEQ ID NO:7のヌクレオチド25〜546によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基9〜182;SEQ ID NO:7のヌクレオチド28〜546によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基10〜182;SEQ ID NO:7のヌクレオチド31〜546によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基11〜182;SEQ ID NO:7のヌクレオチド34〜182によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基12〜182;SEQ ID NO:7のヌクレオチド37〜546によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基13〜182;SEQ ID NO:7のヌクレオチド40〜546によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基14〜182;SEQ ID NO:7のヌクレオチド43〜546によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基15〜182;および、SEQ ID NO:7のヌクレオチド46〜546によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基16〜182が含まれる。本発明のIL-29 C1突然変異体の、N末端が修飾された生物活性のある突然変異体は、例えば、大腸菌において発現させた場合に、N末端メチオニンを含んでもよい。
【0062】
IL-29 C1突然変異体の、C末端が修飾された生物活性のある突然変異体には、例えば、SEQ ID NO:7のヌクレオチド1〜543によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基1〜181;SEQ ID NO:7のヌクレオチド1〜540によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基1〜180;SEQ ID NO:7のヌクレオチド1〜537によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基1〜179;SEQ ID NO:7のヌクレオチド1〜534によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基1〜178;SEQ ID NO:7のヌクレオチド1〜531によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基1〜177;SEQ ID NO:7のヌクレオチド1〜528によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基1〜176;SEQ ID NO:7のヌクレオチド1〜525によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基1〜175;SEQ ID NO:7のヌクレオチド1〜522によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基1〜174;SEQ ID NO:7のヌクレオチド1〜519によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基1〜173;および、SEQ ID NO:7のヌクレオチド1〜516によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基1〜172が含まれる。本発明のIL-29 C1突然変異体の、C末端が修飾された生物活性のある突然変異体は、例えば、大腸菌において発現させた場合に、N末端メチオニンを含んでもよい。
【0063】
IL-29 C1突然変異体の、N末端およびC末端が修飾された生物活性のある突然変異体には、例えば、SEQ ID NO:7のヌクレオチド4〜543によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基2〜181;SEQ ID NO:7のヌクレオチド4〜540によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基2〜180;SEQ ID NO:7のヌクレオチド4〜537によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基2〜179;SEQ ID NO:7のヌクレオチド4〜534によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基2〜178;SEQ ID NO:7のヌクレオチド4〜531によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基2〜177;SEQ ID NO:7のヌクレオチド4〜528によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基2〜176;SEQ ID NO:7のヌクレオチド4〜525によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基2〜175;SEQ ID NO:7のヌクレオチド4〜522によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基2〜174;SEQ ID NO:7のヌクレオチド4〜519によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基2〜173;SEQ ID NO:7のヌクレオチド4〜516によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基2〜172;SEQ ID NO:7のヌクレオチド7〜543によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基3〜181;SEQ ID NO:7のヌクレオチド7〜540によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基3〜180;SEQ ID NO:7のヌクレオチド7〜537によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基3〜179;SEQ ID NO:7のヌクレオチド7〜534によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基3〜178;SEQ ID NO:7のヌクレオチド7〜531によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基3〜177;SEQ ID NO:7のヌクレオチド7〜528によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基3〜176;SEQ ID NO:7のヌクレオチド7〜525によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基3〜175;SEQ ID NO:7のヌクレオチド7〜522によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基3〜174;SEQ ID NO:7のヌクレオチド7〜519によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基3〜173;SEQ ID NO:7のヌクレオチド7〜516によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基3〜172;SEQ ID NO:7のヌクレオチド10〜543によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基4〜181;SEQ ID NO:7のヌクレオチド10〜540によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基4〜180;SEQ ID NO:7のヌクレオチド10〜537によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基4〜179;SEQ ID NO:7のヌクレオチド10〜534によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基4〜178;SEQ ID NO:7のヌクレオチド10〜531によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基4〜177;SEQ ID NO:7のヌクレオチド10〜528によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基4〜176;SEQ ID NO:7のヌクレオチド10〜525によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基4〜175;SEQ ID NO:7のヌクレオチド10〜522によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基4〜174;SEQ ID NO:7のヌクレオチド10〜519によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基4〜173;SEQ ID NO:7のヌクレオチド10〜516によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基4〜172;SEQ ID NO:7のヌクレオチド13〜543によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基5〜181;SEQ ID NO:7のヌクレオチド13〜540によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基5〜180;SEQ ID NO:7のヌクレオチド13〜537によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基5〜179;SEQ ID NO:7のヌクレオチド13〜534によってコードされるSEQ ID 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ードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基13〜175;SEQ ID NO:7のヌクレオチド37〜522によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基13〜174;SEQ ID NO:7のヌクレオチド37〜519によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基13〜173;SEQ ID NO:7のヌクレオチド37〜516によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基13〜172;SEQ ID NO:7のヌクレオチド40〜543によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基14〜181;SEQ ID NO:7のヌクレオチド40〜540によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基14〜180;SEQ ID NO:7のヌクレオチド40〜537によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基14〜179;SEQ ID NO:7のヌクレオチド40〜534によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基14〜178;SEQ ID NO:7のヌクレオチド40〜531によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基14〜177;SEQ ID NO:7のヌクレオチド40〜528によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基14〜176;SEQ ID NO:7のヌクレオチド40〜525によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基14〜175;SEQ ID NO:7のヌクレオチド40〜522によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基14〜174;SEQ ID NO:7のヌクレオチド40〜519によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基14〜173;SEQ ID NO:7のヌクレオチド40〜516によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基14〜172;SEQ ID NO:7のヌクレオチド43〜543によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基15〜181;SEQ ID NO:7のヌクレオチド43〜540によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基15〜180;SEQ ID NO:7のヌクレオチド43〜537によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基15〜179;SEQ ID NO:7のヌクレオチド43〜534によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基15〜178;SEQ ID NO:7のヌクレオチド43〜531によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基15〜177;SEQ ID NO:7のヌクレオチド43〜528によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基15〜176;SEQ ID NO:7のヌクレオチド43〜525によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基15〜175;SEQ ID NO:7のヌクレオチド43〜522によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基15〜174;SEQ ID NO:7のヌクレオチド43〜519によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基15〜173;SEQ ID NO:7のヌクレオチド43〜516によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基15〜172;SEQ ID NO:7のヌクレオチド46〜543によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基16〜181;SEQ ID NO:7のヌクレオチド46〜540によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基16〜180;SEQ ID NO:7のヌクレオチド46〜537によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基16〜179;SEQ ID NO:7のヌクレオチド46〜534によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基16〜178;SEQ ID NO:7のヌクレオチド46〜531によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基16〜177;SEQ ID NO:7のヌクレオチド46〜528によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基16〜176;SEQ ID NO:7のヌクレオチド46〜525によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基16〜175;SEQ ID NO:7のヌクレオチド46〜522によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基16〜174;SEQ ID NO:7のヌクレオチド46〜519によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基16〜173;および、SEQ ID NO:7のヌクレオチド46〜516によってコードされるSEQ ID NO:8のアミノ酸残基16〜172が含まれる。本発明のIL-29 C1突然変異体の、N末端およびC末端が修飾された生物活性のある突然変異体は、例えば、大腸菌において発現させた場合に、N末端メチオニンを含んでもよい。
【0064】
本発明のIL-29ポリペプチドには、例えば、それぞれSEQ ID NO:1、3、5、7、9および11に示されたIL-29ポリヌクレオチド分子によってコードされるSEQ ID NO:2、4、6、8、10および12、それらの断片、突然変異体(生物活性のあるN末端、C末端ならびにNおよびC末端の突然変異体を含む)、変異体および融合物が含まれる。
【0065】
組換えIL-29の発現
本発明は、原核宿主から組換えIL-29タンパク質を生産および精製するための発現ベクターおよび方法を提供する。IL-29は以前にはzcyto21と呼ばれており(IL-29およびzcyto21は本明細書で互換的に用いられる)、同一出願人による米国特許第6,927,040号、米国特許第7,038,032号、WO 04/037995、WO 05/023862、米国特許出願公開第2005-0244423号、米国特許出願公開第2006-012644号、米国特許出願第11/458,945号および米国特許出願第11/489,894に詳細に記載されており、これらはすべてその全体が参照により本明細書に組み入れられる。特に、本発明の発現ベクターおよび方法は、大腸菌における翻訳用にコドンおよびmRNA二次構造を最適化するためにヌクレオチド中に特定の変化を有するIL-29コード配列を用いる、IL-29の大規模生産のための大腸菌発現系を含む。本明細書に記載した発現ベクターおよび増殖条件を用いると、細菌から回収される組換えタンパク質の収量が有意に増進された。もう1つの態様においては、高細胞密度流加発酵の開発を容易にするために、別の大腸菌株であるW3110をIL-29の大規模生産のための宿主として選択した。この宿主株は非病原性であり、最小限に規定された発酵培地中で高い細胞密度となるまで増殖することができる。
【0066】
本発明はまた、IL-29タンパク質を宿主によって発現させて、非グリコシル化不溶性封入体として宿主細胞内に見いだされた場合に、原核宿主から組換えIL-29タンパク質を回収するための方法も提供する。封入体(光屈折小体とも呼ばれる)を単離するために原核細胞を溶解させる場合には、封入体はIL-29の凝集物である。このため、IL-29タンパク質を単離するためには封入体を解離させて溶かさなければならず、一般にこれは変性作用のあるカオトロピック溶媒を必要とし、それは結果として、明らかな生物活性を有するためにはリフォールディングしなければならないポリペプチドの回収をもたらす。ひとたびIL-29タンパク質がリフォールディングしたところで、そのタンパク質を捕捉して精製しなければならない。したがって、本発明は、不溶性IL-29タンパク質を原核細胞から単離して、不溶性IL-29タンパク質材料をカオトロピック溶媒に溶かして、IL-29タンパク質がリフォールディングして単離されるような様式でカオトロピック溶媒を希釈するための方法を提供する。本発明はまた、再生したIL-29タンパク質を、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて希釈リフォールディング緩衝液から捕捉して、リフォールディングしたIL-29タンパク質を疎水性相互作用クロマトグラフィー(「HIC」)を用いて精製するための方法も含む。さらなる精製は、荷電した変異体を組換えIL-29溶液から除去するための高性能陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて達成される。
【0067】
本明細書で用いるIL-29 DNAコード配列には、成熟ヒト遺伝子、すなわち、シグナル配列を持たないものが含まれる。大腸菌コドンバイアスを反映させるためにそのDNA配列を合成したところ、1つのメチオニンが成熟タンパク質のN末端に翻訳開始のために付加された。
【0068】
最適な大腸菌生産宿主は、1)非病原性であり;2)標的タンパク質を十分に発現し;3)発現ベクターの安定性を維持し;かつ4)規定された最小限の発酵培地中で十分に増殖するべきである。例えば、大腸菌株W3110を組換えタンパク質の生産のための宿主として用いることができるが、このことはそれがこれらの要求条件を満たすためである。W3110はK-12の原栄養性派生株である。この菌株は1950年代初期に、University of WisconsinのDr Joshua Lederbergと彼の研究チームによって分離された。他のK-12派生株と同じように、大腸菌株W3110は非滅菌水、土壌および下水の中では生存しない(Smith HW, Infect Dis. 1978 May;137(5):655-660;Bogosian G. et al., Adv Appl Microbiol. 1991;36:87-131;Bogosian G. et al., Appl Environ Microbiol. 1996 Nov;62(11):4114-20;Heitkamp M.A. et al,, J Ind Microbiol. 1993 Jul;11(4):243-52;Bogosian G. et al., J Ind Microbiol. 1993 Jul;11(4):235-41;Bogosian G. et al., J Ind Microbiol. 1992 Jan;9(1):27-36)。さらに、この菌株は哺乳動物腸細胞に付着することができず、哺乳動物の腸管にコロニーを形成しない。これらの知見に基づき、W3110は非病原性であって、哺乳動物組織中に生存して疾患の原因になる可能性が低いと判断された。その上、W3110はタンパク質生産のための宿主として広範囲に用いられており(Kane J.F. et al., Trends Biotechnol., 6:95-101;およびKane J.F. et al, In:Surface reactive peptides and polymers: discovery and commercialization (CS Sikes and AP Wheeler,eds.) Amercian Chemical Society Books,Washington, DC.)、流加発酵工程において極めて高密度となるまで増殖する。
【0069】
OmpTは、2つの連続した塩基性残基の間を特異的に切断するペリプラズムエンドペプチダーゼであり、8M尿素および6Mグアニジン-HClなどの変性条件下で活性がある(White C.B. et al., J Biol Chem., 1995 Jun 2;270(22):12990-4;およびDekker N. et al., Biochemistry. 2001 Feb 13;40(6):1694-701)。OmpTは、大腸菌内で封入体として発現された組換えタンパク質の分解と関連づけられている。W3110はタンパク質の発酵および発現のための頑強な宿主であるものの、IL-29の下流プロセシングのためには理想的でない。ひとたび細胞が溶解されると、OmpTプロテアーゼは組換え生産されたタンパク質を分解する可能性がある。
【0070】
大腸菌は、緩徐な増殖または発酵の失敗を引き起こす可能性のあるT-oddバクテリオファージによる感染に対する感受性がある(Ogata S. et al., Uirusu. 2000 Jun;50(1):17-26)。これは経済的に深刻な結果をもたらす恐れがある。大腸菌K-12のfhuA遺伝子によってコードされるフェリクロム鉄受容体は、フェリクロムの結合および取込みのために必要な多機能性の外膜受容体であり、T-oddバクテリオファージの結合部位としての役割を果たす。fhuA遺伝子産物のカルボキシル末端に対する抗体は、バクテリオファージT5による感染を防止する(Moeck G.S. et al., J Bacteriol. 1995 Nov;177(21):6118-25)。
【0071】
IL-29の生産のための工程を合理化するために、ompT遺伝子およびfhuA遺伝子が相同組換えによって宿主株W3110から除去されている(Datsenko KA, Wanner BL. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci U S A. 2000 Jun 6;97(12):6640-5;Murphy KC, Campellone KG, Poteete AR. PCR-mediated gene replacement in Escherichia coli. Gene. 2000 Apr 4;246(1-2):321-30;およびYu D, Ellis IM,Lee EC, Jenkins NA, Copeland NG, Court DL. An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 2000 May 23;97(11):5978-83.)。この新たに開発された宿主株は、ZGOLD5として公知である(以下により詳細に述べる)。
【0072】
本発明の例示的な生産株は、種々の発現ベクターを保有するさまざまな大腸菌宿主株からなる。例えば、大腸菌W3110はIL-29発現用のカナマイシン選択性プラスミド安定的に維持する。W3110は遺伝子型F- IN(rrnD- rrnE)1 lambda-を有する。ZGOLD1[F- IN(rrnD- rrnE)1 lambda- ΔompT::tet]は、W3110に由来するΔompT突然変異体である。ZGOLD5[F- IN(rrnD- rrnE)1 lambda- ΔompT::tet ΔfhuA::Cm]は、ZGOLD1(W3110)に由来するΔfhuA突然変異体である。F-は内因性大腸菌Fプラスミドの欠失を表す(New England Biolabs 2005-6 Catalog, page 270)。IN(rrnD- rrnE)1は、rrnDおよびrrnEオペロンを含む染色体座位での逆位を表す(Hill CW and Gray JW, Genetics., 1988 Aug;119(4):771-778)。数字の1は、これがこの逆位の最初に報告されたアレルであることを示している。この染色体再配列はIL-29の生産に何ら影響を及ぼさないと予想されている。rph1は1bp欠失体であり、tRNA前駆体の3'末端からヌクレオチドを除去するタンパク質であるRNアーゼPHの最後の15コドンにわたるフレームシフトを引き起こす。この損傷は、オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼをコードする隣接するpyrE遺伝子に対して極性効果を及ぼす。これは最小培地上でのピリミジンの欠乏を招く。しかし、この部分的栄養要求性は、培地への補給によって容易に代償される。ilvGは、アセト乳酸シンターゼIIおよびアセトヒドロキシ酪酸シンターゼIIのサブユニットをコードする遺伝子である。これらの酵素は、それぞれバリン/ロイシンおよびイソロイシン生合成経路に関与している。W3110およびZGOLD5を含むK12派生株のilvG遺伝子は、ポリペプチド鎖未熟終結の原因となる極性フレームシフトを遺伝子の中央部に含む(Parekh BS and Hatfield GW, J Bacteriol., 1997 Mar;179(6):2086-2088)。この短縮型タンパク質はバリンに対する感受性があり、バリンが存在するとフィードバック阻害を受ける。イソロイシンおよびバリンの合成につながる経路は、細胞がイソロイシンに関する欠乏状態にあっても、バリンの存在下では遮断される。酵母エキスを含む混合供給物は、菌株がバリンの存在下でイソロイシンを産生する能力を持たないことを代償する。λ-は、溶原状態または溶解状態においてバクテリオファージλ配列が存在しないことを示す。ompTは、2つの連続した塩基性残基の間を切断するペリプラズムエンドペプチダーゼである(White et al., J Biol Chem., 1995 Jun 2;270(22):12990-4;およびDekker et al., Biochemistry. 2001 Feb 13;40(6):1694-701)。ompT遺伝子は、OmpTによって起こりうる分解をなくすためにこの菌株から除去された(RES-10544)。fhuAは、フェリクロムの結合および取込みならびにT-oddファージの付着に関与する多機能性の外膜タンパク質をコードする(Ogata et al., Uirusu. 2000 Jun;50(1):17-26;およびMoeck et al., J Bacteriol., 1995 Nov;177(21):6118-25)。この遺伝子は、特に発酵タンク内でのT-oddファージによる菌株の感染を防止するために除去された。
【0073】
原核細胞における所望のタンパク質の生産のために適した発現ベクターは、典型的には、(1)細菌宿主内での発現ベクターの維持のための細菌由来物をコードする原核生物DNAエレメント;(2)転写の開始を制御するDNAエレメント、例えばプロモーターなど;(3)転写物のプロセシングを制御するDNAエレメント、例えば転写ターミネーターなど、および(4)選択マーカーをコードする遺伝子、例えば抗生物質耐性など、を含む。原核宿主細胞は、発現ベクターの導入および適切な誘導因子の添加がなされるとIL-29を産生する。したがって、本発明は、プロモーター、最適化されたIL-29ポリヌクレオチド配列、およびターミネーター配列を含む発現ベクターを想定している。例示的な最適化IL-29ポリヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:1、3、5、7、9および11に示されている。もう1つの態様において、発現ベクターはさらに選択マーカーを含む。1つの態様において、選択マーカーはカナマイシン耐性である。
【0074】
発現ベクターはまた、所望のタンパク質の精製の助けとなるペプチドタグをコードするポリヌクレオチド配列も含む。組換えポリペプチドを単離するために有用なペプチドタグには、例えば、ポリヒスチジンタグ(ニッケルキレート化樹脂に対する親和性を有する)、c-mycタグ、カルモジュリン結合タンパク質(カルモジュリンアフィニティークロマトグラフィーによって単離される)、サブスタンスP、RYIRSタグ(抗RYIRS抗体と結合する)、Glu-GluタグおよびFLAGタグ(抗FLAG抗体と結合する)。例えば、Luo et al., Arch. Biochem. Biophys. 329:215(1996), Morganti et al., Biotechnol. Appl. Biochem. 23:67(1996)、およびZheng et al., Gene 186:55(1997)を参照のこと。このようなペプチドタグをコードする核酸分子は、例えば、Sigma-Aldrich Corporation(St. Louis, MO)から販売されている。
【0075】
当業者は、発現ベクターの調製のための多数の分子的手法に精通しているであろう。例えば、IL-29ポリヌクレオチドは、相互プライミング性の長いオリゴヌクレオチドおよび本明細書に記載のヌクレオチド配列を用いて核酸分子を合成することによって調製することができる(例えば、Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition, John Wiley & Sons, 8-8から8-9の4頁(1995)を参照)。ポリメラーゼ連鎖反応を用いる確立された手法は、長さが少なくとも2キロ塩基であるDNA分子を合成する能力を提供する(Adang et al., Plant Molec. Biol. 21:1131 (1993), Bambot et al., PCR Methods and Applications 2:266 (1993), Dillon et al., "Use of Polymerase Chain Reaction for the Rapid Construction of synthetic Genes," Methods in Molecular Biology, Vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications, White (ed.), pages 263-268, (Humana Press, Inc. 1993), and Holowachuk et al., PCR Methods Appl. 4:299 (1995))。
【0076】
発現系を構築するためのもう1つの方法は、酵母系を用いる相同組換えを用いる。米国特許第6,207,442号、Plasmid Construction by Homologous Recombinationを参照されたく、これは参照により本明細書に組み入れられる。この系は、ポリペプチド融合物を含む、関心対象の任意のポリペプチドをコードするDNAをクローニングするための汎用アクセプタープラスミドを提供する。この系は、関心対象のタンパク質をコードする領域を含む二本鎖の環状DNA分子を調製するための方法を提供する。関心対象のタンパク質、すなわちIL-29をコードする1つまたは複数のドナーDNA断片を、サッカロミセス-セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)宿主細胞においてアクセプタープラスミド、第1のDNAリンカーおよび第2のDNAリンカーと組み合わせ、ドナーDNA、アクセプタープラスミドおよびリンカーの相同組換えによってドナーDNA断片がアクセプタープラスミドと連結して閉環状プラスミドを形成するようにする。
【0077】
また、本発明の核酸分子を、ホスホラアミダイト法などのプロトコールを用いて「遺伝子装置(gene machine)」によって合成することもできる。化学合成する場合には、遺伝子または遺伝子断片の合成などの用途のために二本鎖DNAが必要であり、続いて各々の相補鎖を別々にする。短い遺伝子(60〜80塩基対)の作製は技術的に簡単であり、相補鎖を合成して、続いてそれらをアニーリングさせることによって達成しうる。しかし、より長い遺伝子(>300塩基対)の作製のためには、DNA化学合成の各サイクルのカップリング効率が100%となることはほとんどないため、特別な方策が必要となる可能性がある。この問題を克服するためには、長さ20〜100ヌクレオチドずつの一本鎖断片から、合成遺伝子(二本鎖)をモジュール型式で集合させる。ポリヌクレオチド合成に関する総説については、例えば、Glick and Pasternak, Molecular Biotechnology, Principles and Applications of Recombinant DNA (ASM Press 1994), Itakura et al., Annu. Rev. Biochem 53:323 (1984)およびClimie et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 87:633 (1990)を参照されたい。
【0078】
IL-29遺伝子および発現ベクターを調製するための代替的な手法の例には、例えば、制限エンドヌクレアーゼ消化および連結、ならびにポリメラーゼ連鎖反応が含まれ、それらはすべて当技術分野で周知である。
【0079】
種々さまざまな選択マーカー遺伝子が入手可能である(例えば、Kaufman, Meth. Enzymol. 185:487 (1990); Kaufman, Meth. Enzymol. 185:537 (1990)を参照)。発現ベクターは、テトラサイクリン耐性、アンピシリン耐性、カナマイシン耐性、ネオマイシン耐性またはクロラムフェニコール耐性などの選択マーカーを含むことが一般的である。選択マーカーは、発現ベクターによって形質転換された細胞の、形質転換されていない細胞からの選択および/または検出を可能にすると考えられる。発現ベクターは、複数のそのような抗生物質耐性遺伝子を保有することができる。抗生物質耐性を伴わない選択マーカーの一例は、プラスミドR1由来のhok/sok系を用いる。hok遺伝子は52アミノ酸の毒性Hokタンパク質をコードし、sok遺伝子はhok mRNAリーダー配列に対して相補的なアンチセンスRNAをコードする。この選択マーカーは当業者に公知であり、Gerdes, K. et al., Genetic Engineering, 19:49-61, 1997にさらに詳細に記載されている。
【0080】
種々さまざまな適した組換え宿主細胞が本発明に包含され、これには、グラム陰性原核宿主生物が非限定的に含まれる。大腸菌の適した菌株には、W3110、K12派生株であるMM294、TG-1、JM-107、BL21およびUT5600が含まれる。他の適した菌株には以下のものが含まれる:BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、BL21(DE3)pLysE、DH1、DH4I、DH5、DH5I、DH5IF'、DH5IMCR、DH10B、DH10B/p3、DH11S、C600、HB101、JM101、JM105、JM109、JM110、K38、RR1、Y1088、Y1089、CSH18、ER1451、ER1647、大腸菌K12、大腸菌K12 RV308、大腸菌K12 C600、大腸菌HB101、大腸菌K12 C600 R.sub.k-M.sub.k-、大腸菌K12 RR1が含まれる(例えば、Brown(ed.), Molecular Biology Labfax(Academic Press 1991)を参照)。他のグラム陰性原核宿主には、セラチア属(Serratia)、シュードモナス属(Pseudomonas)、コーロバクター属(Caulobacter)が含まれる。原核宿主には、バシラス属(Bacillus)、例えば枯草菌(B. subtilis)およびB.チューリンゲンシス(B. thuringienesis)およびB.チューリンゲンシス亜種イスラエレンシス(B. thuringienesis var. israelensis)など、ならびにストレプトミセス属(Streptomyces)、例えばS.リビダンス(S. lividans)、S.アンボファシエンス(S. ambofaciens)、S.フラジアエ(S. fradiae)およびS.グリセオフスカス(S. griseofuscus)などのグラム陽性菌が含まれうる。枯草菌の適した菌株には、BR151、YB886、MI119、MI120およびB170が含まれる(例えば、Hardy, "Bacillus Cloning Methods," DNA Cloning: A Practical Approach, Glover (ed.) (IRL Press 1985)を参照)。原核宿主においてベクターを増殖させるための標準的な手法は当業者に周知である(例えば、Ausubel et al.(eds.), Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition (John Wiley & Sons 1995);Wu et al., Methods in Gene Biotechnology (CRC Press, Inc. 1997)を参照)。原核生物におけるプロテアーゼ欠損株の概要については、Meerman et al., Biotechnology 12:1107-1110, 1994を参照されたい。
【0081】
クローニングされたDNA分子を操作するため、および外因性DNAを種々の宿主細胞に導入するための手法は、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989およびAusubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987に開示されている。形質転換またはトランスフェクションを受けた宿主細胞は、選択された宿主細胞の増殖のために必要な栄養素および他の構成成分を含む培地中で従来の手順に従って培養する。規定培地および複合培地を含む種々の適した培地は当技術分野で公知であり、炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミンおよびミネラルが一般に含まれる。培地が、必要に応じて増殖因子または血清などの構成成分を含んでもよい。増殖培地は一般に、外因性に添加されたDNAを含む細胞を、例えば、発現ベクター上に保有されるか宿主細胞に同時にトランスフェクトされた選択マーカーによって補完される、薬剤選択、または必須栄養素の欠乏によって選別すると考えられる。液体培養物には、小型フラスコの振盪または発酵槽のスパージングなどの従来の手段によって十分な通気を与える。形質転換細胞を選択して増殖させることで、関心対象の遺伝子を発現する組換え宿主細胞を得ることができる。IL-29は、MBP(マルトース結合タンパク質)融合系(New England Biolabs(NEB;Beverly, MA))を用いて大腸菌において発現させることができる。この系では、IL-29 cDNAをmalE遺伝子の3'末端と結合させて、MBP-IL-29融合タンパク質を形成させる。融合タンパク質の発現はtacプロモーターによって作動し、1mM IPTG(イソプロピルb-チオガラクトピラノシド)の添加によってプロモーターが誘導されるまでは「オフ」である。これらの構築物は、製造元の仕様書に従って、pMAL-c2ベクター(NEB)のマルチクローニングサイト(MCS)に合わせてMBPとのインフレーム融合物として構成することができる。
【0082】
ヒトIL-29をコードするコドン最適化がなされた遺伝子を含む大腸菌発現ベクターが、構築されている。このベクター(pSDH175)は、以下の機能性エレメントを含む:lacIリプレッサー、tacプロモーター、G10翻訳エンハンサー、SmaIクローニングサイト、転写ターミネーター、カナマイシン選択マーカーおよびpMB1複製起点およびROB遺伝子。以下の表1に示されたプラスミド番号(ベクター)はすべて、翻訳エンハンサーの表示された置換を除き、pSDH175ベクターと同じ機能性エレメントを含む。表1の種々のプラスミドまたはベクターによって発現される個々のIL-29分子は、IL-29構築物の列にも表示されている。発現を向上させるため、またはリフォールディングを増進するために、IL-29のタンパク質構造に対して数多くの変化が加えられた。野生型IL-29タンパク質(SEQ ID NO:12)の172位のシステインは、セリン(SEQ ID NO:2またはC172S)に変更され、結果として生じた発現ベクターはpSDH177と名付けられた。pSDH177のG10翻訳エンハンサーはZymo2ベクターに置換され(SEQ ID NO:13)、このベクターはpCHAN15と名付けられた。SEQ ID NO:2の2〜7位にあるアミノ酸がpCHAN15ベクターから除去されて、SEQ ID NO:6に示された代替的形態のIL-29をコードするpTAP440ベクターが形成された。SEQ ID NO:6のポリペプチドを本明細書ではIL-29 C172S d2-7またはC172S d2-7とも称する。ベクターpTAP438では、SEQ ID NO:2のN末端メチオニンの後ろの2位に1つのロイシンが挿入され、それはSEQ ID NO:4として示されている。SEQ ID NO:4のポリペプチドを本明細書ではIL-29 C172S LeuインサートまたはC172S Leuインサートとも称する。これらのベクターを数多くの宿主株に形質転換導入して、以下の表1に列記した発現株を形成させた。組換えヒトIL-29が、数多くの大腸菌生産宿主およびベクターを用いて流加発酵で生産されている。IL-29は、用いた種々の大腸菌宿主株において不溶性で光屈折性の封入体として生産される。
【0083】
(表1)

【0084】
高いIL-29発現レベルが、発現ベクターpTAP440を含む、下記の、大腸菌ZGOLD5(EE867)細胞を用いて得られている。数多くの流加発酵法が、この菌株を用いたIL-29の生産のために開発されている。発酵を開始させるには、一段階または二段階の播種方法のいずれを用いることもできる。播種培地は、2%グルコースを含む、以下の表2に記載された規定配合物(ZSM)であり、ワーキングセルバンク(working cell bank)(WCB)からのバイアルを用いて接種される。発酵は、ZSM中で一晩(16〜18時間)培養した物からの接種物を用いて開始させる。生産培地(PCOL18)は、1〜2%グルコース、1%ダイズ加水分解物および0.5%酵母エキスを含む規定塩類培地である。初期バッチ相を7〜8時間実施し、続いて次の12時間はグルコースのみの供給を行う。供給速度は発酵期間全体を通じて一定に維持する。IL-29発現は、24時間の発酵経過時間(EFT)の時点での、イソプロピルチオガラクトピラノシド(IPTG)の最終濃度1mMまでの添加によって誘導する。総発酵時間は約48時間である。
【0085】
(表2)培地1リットル当たりのZSM播種培地の配合表

【0086】
発酵
本発明の1つの態様においては、特に本発明の発現系を用いたIL-29の大規模生産が求められる場合に、バッチ発酵を用いることができる。一般に、バッチ発酵は、IL-29を発現する大腸菌株を、振盪フラスコ培養下で適した増殖培地中にて、光学密度(OD)が600nmで5〜20になるまでの増殖が可能となるように増殖させることによって、第一段階の播種フラスコを調製することを含む。適した培地は、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酵母エキス、加水分解された動物タンパク質、加水分解された植物タンパク質または加水分解されたカゼインなどの供給源からの窒素を含む。ホスフェートは、リン酸カリウム、リン酸アンモニウム、リン酸またはリン酸ナトリウムから供給することが考えられる。培地の他の構成成分には、塩化マグネシウムまたは硫酸マグネシウム、硫酸第二鉄または塩化第二鉄および他の微量元素が含まれる。増殖培地には、増殖を増進するために、フルクトース、グルコース、ガラクトース、ラクトースおよびグリセロールなどの炭水化物を補給することができる。
【0087】
第一段階の播種フラスコは以下のように調製される:IL-29を生産する大腸菌株(例えば、W3110、ZGold1およびZGold5)を、振盪フラスコ培養下で適した培地中にて、光学密度(OD)が600nmで5〜20となるまでの増殖が可能となるように増殖させる。適した培地は、例えば、以下であることができる:Super Broth II、APS-Super BrothまたはZSM。増殖培地には増殖を増進するための炭水化物を補給することができる。好ましい炭水化物添加物は、例えば、1〜20g/L培地で、好ましくは10〜20g/Lで添加されるグリセロールまたはグルコースでありうる。増殖は、好ましい増殖培地を含む振盪フラスコ(500ml〜3000mlのバッフルフラスコ)に、凍結保存培養物からのカナマイシン(10〜50ug/ml)を含む大腸菌を接種することによって開始される。振盪フラスコにおける増殖は28〜40℃の温度で行われ、30〜37℃での増殖が好ましい。フラスコを200〜300rpmの撹拌設定下でインキュベートする。
【0088】
A.流加培養‐グルコースのみの供給(PCOL001またはPCOL0013)
発酵容器に適した増殖培地(例えば、以下の表3を参照)を調製して滅菌する。培地のpHはpH 6.2〜7.2に、好ましくはpH約6.8に調整する。増殖培地には増殖を増進するために炭水化物を補給することができる。好ましい炭水化物添加物は、10〜30g/L培地で、好ましくは10〜20g/Lで添加される、グリセロールまたはグルコースである。容器は適切な通気および撹拌レベルに設定し、10〜20時間にわたって増殖させた、ODが600nmで5〜20である第一段階播種フラスコ培養物または第二段階播種容器からの接種を行う。接種レベルは1〜5%(容積/容積基準で)であり、好ましくは1〜2% v/vである。溶存酸素レベルは、撹拌速度を高めること、通気量(aeration rate)を増やすこと、酸素中でスパージングを行うこと、またはそれらの種々の組み合わせによって、20%を越える飽和度で維持する。
【0089】
炭水化物溶液を、6〜8時間の発酵経過時間(EFT)以後に、所定の速度で発酵槽に供給する。供給は、10時間のEFTよりも後に開始すべきではない。供給は発酵の終了時まで継続する。供給溶液(グリセロールまたはグルコース)は40〜70% w/vで調製し、50%グルコース(w/v)が好ましい。供給速度は、1時間につき1リットル当たりグルコースまたはグリセロールが5〜15グラムの間でさまざまであってよく、8〜10g/l/hr(開始容積)が好ましい。20〜30時間のEFT、好ましくは24時間の時点で、IPTGを培養物に濃度1mMで添加する。48〜56時間のEFTの時点で発酵物を収集する。
【0090】
(表3)培地1リットル当たりのPCOL13培地の配合表

【0091】
B.流加培養‐グルコースのみの供給(PCOL0013+添加物)
発酵容器に適した増殖培地(例えば、以下の表3を参照)を調製して滅菌する。培地のpHはpH 6.2〜7.2に、好ましくはpH約6.8に調整する。増殖培地には増殖を増進するために炭水化物を補給することができる。好ましい炭水化物添加物は、10〜30g/L培地で、好ましくは10〜20g/Lで添加される、グリセロールまたはグルコースである。増殖培地には増殖を増進するためにタンパク質を補給することができる。好ましいタンパク質添加物は、5〜30g/L培地で、好ましくは5〜10g/Lで添加される、ダイズペプトンおよび/または酵母エキスである。容器は適切な通気および撹拌レベルに設定し、10〜20時間にわたって増殖させた、ODが600nmで5〜20である第一段階播種フラスコ培養物または第二段階播種容器からの接種を行う。接種レベルは1〜5%(v/v)であり、好ましくは1〜2% v/vである。溶存酸素レベルは、撹拌速度を高めること、通気量を増やすこと、酸素中でスパージングを行うこと、またはそれらの種々の組み合わせによって、20%を越える飽和度で維持する。
【0092】
炭水化物溶液を、6〜8時間の発酵経過時間(EFT)以後に、所定の速度で発酵槽に供給する。供給は、10時間のEFTを過ぎないうちに開始する必要がある。供給は発酵の終了時まで継続する。供給溶液(グリセロールまたはグルコース)は40〜70% w/vで調製し、50%グルコース(w/v)が好ましい。供給速度は、1時間につき1リットル当たりグルコースまたはグリセロールが5〜15グラムの間でさまざまであってよく、8〜10g/l/hr(開始容積)が好ましい。20〜30時間のEFT、好ましくは24時間の時点で、IPTGを培養物に濃度1mMで添加する。48〜56時間のEFTの時点で、発酵物を収集する。
【0093】
C.流加培養‐混合供給(PCOL18)
発酵容器に適した増殖培地を調製して滅菌する。培地のpHはpH 6.2〜7.2に、好ましくはpH約6.8に調整する。増殖培地には増殖を増進するために炭水化物を補給することができる。好ましい炭水化物添加物は、10〜30g/L培地で、好ましくは10〜20g/Lで添加される、グリセロールまたはグルコースである。容器は適切な通気および撹拌レベルに設定し、10〜20時間にわたって増殖させた、ODが600nmで5〜20である第一段階播種フラスコ培養物または第二段階播種容器からの接種を行う。接種レベルは1〜5%(v/v)であり、好ましくは1〜2% v/vである。溶存酸素レベルは、撹拌速度を高めること、通気量を増やすこと、酸素中でスパージングを行うこと、またはそれらの種々の組み合わせによって、20%を越える飽和度で維持する。
【0094】
炭水化物溶液を、6〜8時間の発酵経過時間(EFT)以後に、所定の速度で発酵槽に供給する。供給は10時間のEFTを過ぎないうちに開始する必要がある。供給は発酵の終了時まで継続する。供給溶液(グリセロールまたはグルコース)は40〜70% w/vで調製し、50%グルコース(w/v)が好ましい。供給速度は、1時間につき1リットル当たりグルコースまたはグリセロールが5〜15グラムの間でさまざまであってよく、8〜10g/l/hrが好ましい。20〜30時間のEFT、好ましくは24時間の時点で、IPTGを培養物に濃度1mMで添加する。20〜30時間のEFT、好ましくは24時間の時点で、グルコース供給速度を2〜6g/L/hrの供給に低下させる。酵母エキス(20〜30%w/w)、好ましくは25%w/wを含む第2の供給を、2〜6g/L/hrの間の、好ましくは2g/L/hrの速度で開始する。48〜56時間のEFTの時点で発酵物を収集する。
【0095】
IL-29の回収
発酵の後に細胞を遠心分離によって収集し、脱イオン水中に再懸濁させて、APV-Gaulinホモジナイザーまたは他の種類の細胞破壊装置でホモジネート化する。または、細胞を発酵槽から直接採取し、脱イオン水を添加した後に、APV-Gaulinホモジナイザーでホモジネート化する。続いてホモジネートを遠心分離し(連続モードまたはまたはバッチモードで)、上清をデカントした後に、封入体を含むペレットを入手する。続いて封入体ペレットを、種々のレベルの以下の化合物の存在下または非存在下において、水またはTris緩衝液中で洗浄する:塩化ナトリウム、尿素、Triton X-100、ラウリル硫酸ナトリウム。
【0096】
A.ホモジナイゼーションおよびペレット洗浄(直接ホモジナイゼーション)
発酵操作の終了時に温度を4〜20℃に下方調整する。発酵ブロスを容器から収集し、ブロスの採取は試料採取ポートを通して行う。または、ブロスを試料採取ポートの1つを通して排出させる。発酵ブロスは10〜30%の固体を含みうる。
【0097】
大腸菌細胞を破壊するためにはホモジナイザーを用いるが、ビーズミルおよび超音波処理器を用いることもできる。ホモジナイザー(APV-Gaulin 1000、APV 2000またはNiro Soavi)は、使用前に4〜15℃に冷却しておくべきである。等量の冷却脱イオン水を発酵ブロスに添加する。発酵ブロスをホモジナイザーに通し、細胞懸濁液を冷却容器に集める。ホモジナイザー圧は、最大の細胞破壊のためには8700〜11,600ポンド/平方インチ圧力(「psi」)(600-800バール)に設定すべきである。懸濁液をホモジナイザーに1〜5回、好ましくは3回通す。
【0098】
B.バッチ収集および封入体洗浄
ホモジナイゼーション工程の終了時に、破壊された細胞を1L遠心ボトルに移し、それぞれに0.75〜1.0Lを入れる。ペレットを収集するためには、KompSpin KAJ7.100ローターを備えたBeckman J6MI遠心機を7,500〜16,000×Gで用いることができる。Beckman JLA-8.1固定角ローターを備えたBeckman Avanti JHC遠心機(7,500〜16,000×G)または2.25Lボトルを備えたAries JS 5.0 Swinging Bucketローターを7,500〜16,000×Gで用いることもできる。
【0099】
ボトルを4℃で30分間遠心処理する。7500〜16,000×Gの遠心力を用いる。培養ブロスまたは上清を注ぎ移す。種々の添加物を含む脱イオン水または緩衝液をペレットに添加する。添加物は、Triton X 100(0.1〜5%)、塩化ナトリウム(10〜500mM)、塩化亜鉛(1〜10mM)、EDTA(1〜10mM)、スクロース(10〜500mM)、ラウリル硫酸ナトリウム(0.1〜2.0%)または尿素(1〜8M)であってよい。洗浄溶液は、デカントした上清と等しい容積を添加する。ペレットは、スパーテルを用いて混合し、続いてOmni EZホモジナイザーなどの電動式混合装置を用いて混合することにより、液体中に再懸濁させる。混合はIBペレットが十分に懸濁化されるまで行う。溶液を7500〜16,000×G、4℃で30分間遠心処理する。細胞ペレットからのブロスを注ぎ移して、ペレットに水または緩衝液を添加する。ペレットが再懸濁された後に、遠心分離の段階を繰り返し、上清を注ぎ移す。この工程を必要に応じて多くの回数繰り返すことができる。
【0100】
C.連続細胞収集および封入体の洗浄
ホモジナイゼーション工程の終了時に、破壊された細胞を冷却保持タンクに移す。溶液を、CarrまたはWestfaliaディスクスタック遠心機などの適切な連続遠心機に通す。溶液は、用いる遠心機に応じて、1時間につき1〜200Lの供給速度で通させることができる。遠心機の遠心力は7,500〜15,000×Gであるべきである。Carr BiopilotまたはSharples清澄機などの非排出式遠心機の場合は、溶液を遠心機に通し、ペレットがボウルに集められる。封入体ペーストをボウルからかき出す。ペレットはそのまま用いることもでき、または再び希釈して遠心機に通させることもできる。上清は廃棄する。
【0101】
Westfalia C6ディスクスタック遠心機などの連続排出式遠心機の場合には、溶液を遠心機に通し、固形物をボウルに留めさせる。上清の流れを連続的に廃棄する。所定の設定点で、ボウル内の固形物をスラリーとして適切な採取容器に排出させる。または、水または緩衝液を固形物の上に通過させ、それらがボウル内にある場合に固形物に対する洗浄段階が提供されるようにする。続いて固形物を所定の点で排出させることができる。
【0102】
封入体の可溶化
洗浄した封入体ペレットを、ジチオトレイトール(DTT)10〜50mMを含む塩酸グアニジン(4〜6M)中で可溶化する。可溶化は15〜25℃で1〜2時間かけて行う。続いて、可溶化された材料を遠心分離によって清澄化するか、または清澄化処理を行わずに用いる。可溶性画分中のIL-29の量を決定するためにHPLC分析を行う。この濃度に基づき、GuHCl/IL-29溶質をリフォールディング緩衝液混合物中に最終濃度1.25〜2.0mg/mLとして希釈する。
【0103】
A.洗浄した封入体の可溶化
洗浄した封入体調製物は、βメルカプトエタノール(10〜100mM)またはジチオトレイトール(5〜50mM)などの還元剤を含む、塩酸グアニジン(5〜8M)または尿素(7〜8M)を用いて可溶化することができる。溶液はTris、リン酸、HEPESまたは他の適切な緩衝液中に調製することができる。封入体を、尿素(1〜2M)を伴う、または伴わない、pH 10〜11.5のTris緩衝液中に可溶化することもできる。1リットルの発酵ブロスからの細胞を、50〜200mlの記載した溶液を用いて可溶化することができる。好ましい方法は、1リットルの発酵ブロスからの洗浄した封入体ペレットを、40mM DTTを含む100mM Tris pH 8.0中に調製した150mlの6M GuHCl中に可溶化することである。スラリーは、スパーテルを用いた混合に続いて、Omni EZホモジナイザーによるホモジナイゼーションまたは機械的装置を用いた混合を行うことにより、再懸濁化される。可溶化工程を完了させるために、混合物を4〜30℃で混合しながら30〜90分間インキュベートする。適切な遠心機を用いて、試料を7500〜16,000×G、4℃で10〜30分間遠心分離することができる。上清試料をデカントして保管する。清澄化していない試料をリフォールディングのために用いることもできる。
【0104】
B.洗浄した封入体スラリーの可溶化
洗浄した封入体調製物を、水による封入体のスラリーとして生成させることができる。これは遠心分離および連続遠心機を用いた洗浄の後には典型的である。塩酸グアニジン(4〜6M)または尿素(4〜7M)などの可溶化剤を、乾燥粉末形態で封入体スラリーに添加することができる。緩衝液(Tris、リン酸、HEPES)、塩類(塩化マグネシウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム)および他の化合物、例えばPEG 3500などを、スラリー化した混合物に粉末形態で添加することもできる。βメルカプトエタノール(10〜100mM)またはジチオトレイトール(5〜50mM)などの還元剤を粉末または液体の形態で添加することができる。スラリーは、高出力の混合機およびインペラーであるOmni EZホモジナイザーを用いて混合することによって、または機械的装置を用いて混合することによって再懸濁させる。可溶化工程を完了させるために、混合物を4〜30℃で混合しながら30〜90分間インキュベートする。適切な遠心機を用いて、試料を7500〜16,000×G、4℃で10〜30分間遠心分離することができる。上清試料をデカントして保管する。または、清澄化を行わずに溶液を用いる。
【0105】
リフォールディング
リフォールディングは、アルギニン、シスチン、システイン、DTTおよび塩類を含むリフォールディング混合物に溶質溶液をゆっくりと添加することによって行う。IL-29溶質はバッチまたは流加によって添加することができる。組換えヒトIL-29のリフォールディング反応は、pHを5.8〜6.1、好ましくは約5.9に調整することによって停止する。酸性化されたリフォールディング物を、ミスフォールディングしたタンパク質および非フォールディングタンパク質を沈殿させるため、ならびに捕捉カラムへのローディング用にリフォールディング物の状態を調節するために、25mM酢酸ナトリウム、pH 5.6で4.25倍に希釈する。沈殿物を一晩おいて沈降させ、その後に上清を、粗いフィルター(定格0.8μm)および微細(定格0.2μm)フィルターが連続したもので構成される一連のデプスフィルターを通して清澄化する。
【0106】
可溶化された画分中のIL-29の濃度は逆相HPLCによって決定する。リフォールディング緩衝液の容積の決定は、溶質の量および溶質中に存在するIL-29の濃度に基づく。リフォールディング緩衝液は種々の塩およびポリエチレングリコール(0.05〜0.5%)を含みうる。凝集を防止するためにアルギニン(0.5〜1.25M)を用いる。アルギニンの好ましいレベルは、IL-29の濃度が2.0mg/mlの場合に1.0Mである。IL-29分子のジスルフィド結合を開始させるためにはオキシドシャッフリング系(oxido shuffling system)を用いる。
【0107】
オキシドシャッフリング系は、システインとシスチン、DTTとシスチン、還元グルタチオンと酸化グルタチオン、またはDTTと酸化グルタチオンといった還元分子と酸化分子との混合物を基にしている。還元グルタチオンと酸化グルタチオンまたはシスチンとの比は1:1〜6:1の範囲でさまざまであってよく、濃度範囲は0.5〜8mMである。IL-29のリフォールディングのための至適濃度はほぼシステイン4mM:シスチン2mMである。
【0108】
IL-29を含む溶質は、混合しながらリフォールディング緩衝液に急速(1〜30分)または緩徐(0.5〜5時間)に添加する。IL-29は、1回の添加で、複数回の添加で添加すること、またはある期間にわたって供給することができる。IL-29はリフォールディング混合物に対して最終濃度0.5mg/ml〜3.0mg/mlで、好ましくは1.5mg/ml〜2.0mg/mlで添加される。温度範囲は4〜30℃である。pHは7.3〜8.5である。リフォールディング混合物を含む容器は大気に対して露出したままにするか、または再生期間中に空気もしくは窒素を注入することができる。リフォールディングは、溶質添加の終了後1〜26時間にわたって行わせる。その後に、溶液のpHを5.5〜6.5に、好ましくはpH 5.9に調整することによって、リフォールディング反応を停止させる。
【0109】
リフォールディングしたIL-29の捕捉
清澄化し、希釈したIL-29を、陽イオン交換カラム、例えば、ToyoPearl SP 550C(Tosoh Bioscience)によりpH 5.5で捕捉する。平衡化緩衝液は50mM酢酸ナトリウム、pH 5.5であり、結合したIL-29は、直線勾配を2M塩化ナトリウム、50mM酢酸ナトリウム中、pH 5.5まで上昇させることによって溶出させる。捕捉カラム溶出液プールを1.0M (NH4)2SO4に調整し、続いて不溶性材料を除去するために0.45μmフィルターに通す。
【0110】
この段階は、正しくフォールディングしたIL-29を、希釈および清澄化したリフォールディング溶液から捕捉するために、陽イオン交換カラムを用いる。IL-29をカラムと結合させるために、リフォールディングした溶液の希釈を最初に行う。一般に、リフォールディングしたIL-29を、水またはpH 5〜7の低イオン強度緩衝液で1.5〜10倍に希釈する。好ましくは、25mM酢酸ナトリウム、pH 5.6を用いて1:4.25の希釈を行う。希釈後の溶液の導電率は30mS/cmを上回るべきではない。沈殿物が形成し、それを10〜25℃で0.5〜18時間かけて溶液から沈降させる。沈降は16〜22℃で10〜16時間にわたり行わせることが好ましい。続いて、溶液中に残存する沈殿物を除去するために沈降上清を濾過する。定格0.8μmのフィルターおよび定格0.2μmフィルターが連続したもので構成される一連のデプスフィルターが、沈殿物を除去するために用いられている。また、単一のデプスフィルターまたは他の種類のフィルター、例えばバッグフィルターもしくは段階的密度のフィルター、またはフィルターの組み合わせを、希釈したリフォールディング上清を清澄化するために用いることもできる。また、連続モードまたはバッチモードのいずれかの遠心分離を、沈殿物を除去するために用いることもできる。
【0111】
リフォールディング溶液中の組換えIL-29は、pH 5.5の陽イオン交換カラムにより捕捉される。典型的には、カラムはTosoh Bioscience製のToyoPearl SP 550C樹脂を含む。カラムを50mM酢酸ナトリウム、pH 5.5で平衡化し、続いて、清澄化し希釈したリフォールディング物を、樹脂1リットル当たりIL-29が1.0〜17.5gのロード率でローディングする。好ましくは、樹脂1リットリ当たり5〜15gのIL-29をカラムにローディングする。ローディングの後に、非結合材料を除去するためにカラムを2〜5CVの平衡化緩衝液で洗浄し、続いて、結合したIL-29を、50mM酢酸ナトリウム、pH 5.5中の0〜2Mの塩化ナトリウムの直線勾配によって溶出させる。IL-29は、溶出液プールが約0.7〜0.8Mの塩化ナトリウムとなるようにSP550Cから溶出する。
【0112】
この段階のためには、GE Healthcare製のSP Sepharose XLなどの他のスルホプロピル樹脂、またはカルボキシメチルなどの弱陽イオン交換体を含む、多くのさまざまな陽イオン交換樹脂、ならびにアガロースまたはセルロースなどのさまざまな種類の固体支持体および種々の樹脂ビーズ粒径を用いることができる。また、このカラムを、5.0〜7.0の範囲の種々のpHで、ならびに種々の緩衝液および塩を用いて、動作させることもできると考えられる。改変された勾配または段階溶出のストラテジーまたは方式を、組換えヒトIL-29をカラムから溶出させるために用いてもよい。また、この精製を行うために膨張層(expanded bed)クロマトグラフィーを用いることもできる。
【0113】
IL-29の精製
濾過され、調整された溶液を、50mM酢酸ナトリウム、1.5M (NH4)2SO4、pH 5.5によってあらかじめ平衡化した、疎水性相互作用クロマトグラフィー(「HIC」」)カラム、例えば、ToyoPearl Super Butyl 550C(Tosoh Bioscience)にローディングする。HICカラムを、非結合材料を除去するために平衡化緩衝液によって洗浄し、続いて、IL-29を50mM酢酸ナトリウム、pH 5.5への直線勾配によって溶出させる。HIC溶出液プールを水で6倍に希釈した上で濾過し、50mM酢酸ナトリウム、300mM塩化ナトリウム、pH 5.5で平衡化した陽イオン交換カラム、SP Sepharose HP(GE Healthcare)に適用する。この高性能陽イオン交換カラムを平衡化緩衝液で洗浄し、続いて50mM酢酸ナトリウム、800mM塩化ナトリウム、pH 5.5への直線勾配によって溶出させる。続いて、溶出液プールを、5kDa分子量カットオフのポリエーテルスルホン膜を備えたタンジェンシャルフロー濾過システムにおける限外濾過によって濃縮する。濃縮された生成物であるIL-29バルク中間体を濾過し、分取して≦60℃以下で保存する。
【0114】
A.組換えヒトIL-29の中間体精製
この段階は、宿主細胞タンパク質およびIL-29疎水性変異体を除去するために疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)を用いて、IL-29のさらなる精製を実現するために設計されている。典型的には、ToyoPearl Super Butyl 550C樹脂(Tosoh Bioscience)をこの段階のために用いる。樹脂を50mM酢酸ナトリウム、1.5M (NH4)2SO4、pH 5.5によって平衡化する。捕捉カラムから溶出したIL-29のプールを、50mM酢酸ナトリウム、2.0M (NH4)2SO4、pH 5.5による2倍希釈によって1.0M (NH4)2SO4に調整し、続いて定格0.2μmまたは0.45μmのフィルターに通す。続いて、調整され、濾過されたIL-29を、平衡化された樹脂に、樹脂1リットル当たりIL-29が1.0〜20g、好ましくは樹脂1リットル当たりIL-29が≦18gというロード率でローディングする。非結合材料を除去するためにカラムを平衡化緩衝液で洗浄し、続いてIL-29を、50mM酢酸ナトリウム、1.0M (NH4)2SO4から、硫酸アンモニウムを含まない50mM酢酸ナトリウム、pH 5.5への直線勾配によって溶出させる。IL-29はカラムから、約0.75M (NH4)2SO4から0M (NH4)2SO4で溶出する。前述のすべての段階は16〜24℃で行う。
【0115】
当業者は、他のブチル置換樹脂、例えばToyoPearl Butyl 650M(Tosoh Bioscience)など、またはフェニルにより置換されたもの、例えばToyoPearl Phenyl 650M(Tosoh Bioscience)またはPhenyl Sepharose Fast Flow(GE Healthcare)などを非限定的に含む、他の疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂をこの段階のために用いることができる。加えて、アガロースまたはセルロースなどのさまざまな種類の固体支持体および種々の樹脂ビーズ粒径を用いることもできる。また、このカラムを、5.0〜9.0の範囲の種々のpHで、ならびに種々の緩衝液および塩(例えば、硫酸ナトリウム)を用いて、動作させることもできる。HICローディング物中の他の濃度の塩(例えば、1.5M硫酸アンモニウム)を、疎水性効果を高めることによってIL-29をHIC樹脂に結合させるために用いることもでき、他の勾配または段階溶出のストラテジーまたは方式を、IL-29をカラムから溶出させるために用いてもよい。また、カラムと結合した疎水性の高い変異体は残したままでIL-29を精製するために、HIC樹脂による置換クロマトグラフィーを用いることもできる。
【0116】
B.組換えヒトIL-29の仕上げ精製(Polish Purification)
この段階は、荷電変異体をIL-29溶液から除去するために高性能陽イオン交換クロマトグラフィーを使用する。「高性能」とは、主として樹脂ビーズサイズの低下により、異なる荷電構成成分を互いにより良く分離する能力のことを指す。本明細書に記載する工程では、高性能陽イオン交換樹脂ビーズは、より分解能の低い捕捉(SP550C)段階のために用いられる陽イオン交換樹脂ビーズよりも約9分の1の小ささである。この精製段階のためには、SP Sepharose HP樹脂(GE Healthcare)を用いる。樹脂を50mM酢酸ナトリウム、300mM塩化ナトリウム、pH 5.5によって平衡化する。HICカラムからのプールを水または低イオン強度緩衝液で6倍に希釈し、続いてカラムへのローディング用の準備として0.2μmで濾過する。続いて、調整され、濾過されたIL-29溶液を、樹脂1リットル当たりIL-29が1.0〜50g、好ましくは樹脂1リットル当たりIL-29が15〜30gというロード率でローディングする。非結合材料を除去するためにカラムを平衡化緩衝液で洗浄し、続いてIL-29を、50mM酢酸ナトリウム、800mM塩化ナトリウム、pH 5.5への直線勾配を用いて溶出させる。IL-29は約0.4M〜0.6Mの塩化ナトリウムでカラムから溶出する。
【0117】
この段階のためには、他のスルホプロピル樹脂、またはカルボキシメチルなどの弱陽イオン交換体を含む、多くのさまざまな陽イオン交換樹脂のいずれか、ならびにアガロースまたはセルロースなどのさまざまな種類の固体支持体および種々の樹脂ビーズ粒径を用いることができる。また、このカラムを、5.0〜7.0の範囲の種々のpHで、ならびに種々の緩衝液および塩を用いて、動作させることもできる。カラムの分解能および選択性を変化させるために、平衡化および溶出緩衝液に対する有機調節剤(10%イソプロパノールまたは10%エタノール)の添加を用いてもよい。改変された勾配または段階溶出ストラテジーを、IL-29をカラムから溶出させるために用いることもできる。
【0118】
C.IL-29の濃縮
この段階は、SP HPカラムの溶出液を濃縮し、IL-29バルク中間体を生成させるために設計されている。5kDa分子量カットオフのポリエーテルスルホン製タンジェンシャルフロー濾過(TFF)プレート・フレーム膜を15〜25psiの膜間圧で用いて、SPHPプールを約2〜4倍に濃縮する。濃縮された保持物質をTFFシステムを用いて取り出し、システムを緩衝液(例えば50mM酢酸ナトリウム、pH 5.5)ですすぎ洗いし、すすぎ洗い液を濃縮された保持物質と合わせる。続いてこの溶液を0.2μm膜を通して濾過した上で適切な容器に充填し、その後のPEG化反応のために準備して保存した。この限外濾過段階を達成するために、再生セルロースで、および/またはさまざまな多孔度、例えば3kDa分子量カットオフのプレート・フレーム膜または10kDa分子量カットオフのホローファイバーシステムで構成されるもののような異なる組成の膜を用いることができる。または、SPHPプールが以下のPEG化反応を実施するのに十分なIL-29濃度を有する場合には、この濃縮段階を省いてもよい。
【0119】
D.精製された組換えヒトIL-29バルク中間体の特性
IL-29バルク中間体の純度は、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル分析によって、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%である。凝集物は、サイズ排除HPLCによって、1.0%未満、0.9%未満、0.8%未満、0.7%未満、0.6%未満、0.5%未満、0.4未満、0.3%未満、0.2%未満、0.1%未満または0.005%未満である。陽イオン交換HPLCによる荷電の不均一性は、約10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%または1%であり、逆相HPLCによって測定される純度は少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%である。
【0120】
IL-29の力価(PEG-IL-29に対しても同じアッセイ法)は、細胞利用活性アッセイ法を用いて測定した。このバイオアッセイ法は、ヒトIL-29受容体を過剰発現するように操作されていて、ISREおよびSTAT結合エレメントをルシフェラーゼ遺伝子のすぐ上流に含むホタルルシフェラーゼレポーター構築物(KZ157)を含む、293ヒト胎児腎臓(293HEK)レポーター細胞株を用いる。IL-29受容体は、IL-10受容体β(IL-10Rβ)およびIL-28受容体α(IL-28Rα)サブユニットからなるヘテロ二量体である。IL-29受容体の過剰発現は、内因性に発現されたIL-10Rβとともにヘテロ二量体IL-29受容体を形成するIL-28Rα cDNAによる293HEK細胞の安定的トランスフェクションによって達成させた。IL-29(またはPEG-IL-29)のIL-29受容体に対する結合は、JAK/STATシグナル伝達経路を活性化し、その結果として細胞内転写転写因子ISGF3の形成をもたらす。その後のISGF3のISRE/STAT DNA配列エレメントとの結合により、結果として、ホタルルシフェラーゼ遺伝子産物の発現がもたらされた。組換えヒトIL-29は、IL-29細胞利用力価バイオアッセイ法において活性を有していた。
【0121】
このバイオアッセイ法では、アッセイ細胞をIL-29(またはPEG-IL-29)で4時間刺激し、続いて溶解させた。ルシフェラーゼ基質であるルシフェリンを溶解細胞に添加した後に、ルシフェラーゼ発現を照度計を用いて相対光単位(RLU)として間接的に測定した。較正曲線をIL-29(またはPEG-IL-29)標準品を用いて作成し、発光シグナルをIL-29標準品の濃度と関連づけて、それから対照試料および被験試料の力価を計算した。結果は、標準品を基準として計算した1ミリグラム当たりの相対力価単位(RPU/mg)として報告した。IL-29およびPEG-IL-29の開発参照ロットに、タンパク質1ミリグラム当たりの相対力価単位1(1 RPU/mg)を指定した。
【0122】
IL-29のペグ化
本発明のIL-29ポリペプチド、融合物、断片、突然変異体および変異体は、ポリエチレングリコール(「PEG」)によって修飾することがででき、この工程は「PEG化」として公知である。IL-29ポリペプチドのPEG化は、当技術分野で公知のPEG化反応のいずれかによって行うことができる(例えば、EP 0154316号、Delgado et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9:249(1992)、Duncan and Spreafico, Clin. Pharmacokinet. 27:290 (1994)およびFrancis et al., Int J Hematol 68:1(1998)を参照)。例えば、PEG化は、反応性ポリエチレングリコール分子とのアシル化反応によって、またはアルキル化反応によって実施することができる。代替的なアプローチにおいて、IL-29ポリペプチド結合物は、PEGの末端ヒドロキシ基またはアミノ基が活性化リンカーによって置換された活性化PEGを縮合させることによって形成される(例えば、Karasiewicz et al., 米国特許第5,382,657号を参照)。
【0123】
アシル化によるPEG化は、典型的には、PEGの活性エステル誘導体をIL-29ポリペプチドと反応させることを必要とする。活性化PEGエステルの一例は、N-ヒドロキシスクシンイミドへとエステル化されたPEGである。本明細書で用いる場合、「アシル化」という用語は、IL-29ポリペプチドと水溶性ポリマーとの間の以下の種類の連結を含む:アミド、カルバメート、ウレタンなど。アシル化によってPEG化IL-29を調製するための方法は、典型的には、以下の段階を含む:(a)IL-29ポリペプチドをPEG(PEGのアルデヒド誘導体の反応性エステル)と、1つまたは複数のPEG基がIL-29と結合する条件下で反応させる段階、および(b)反応生成物を入手する段階。一般に、アシル化反応に関する至適反応条件は、公知のパラメーターおよび所望の結果に基づいて決定されると考えられる。例えば、PEG:IL-29比が大きいほど、ポリPEG化IL-29生成物のパーセンテージは大きい。
【0124】
アルキル化によるPEG化は一般に、PEGの末端アルデヒド、例えば、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、アセトアルデヒド誘導体などを、還元剤の存在下でIL-29ポリペプチドと反応させることを含む。PEG基は-CH2-NH2基を介してポリペプチドと結合することが好ましい。
【0125】
モノペグ化生成物を生成するための還元性アルキル化を介した誘導体化は、誘導体化のために用いうる、さまざまな種類の第一級アミノ基のさまざまな反応性を利用する。典型的には、反応は、タンパク質のリジン残基のε-アミノ基とN末端残基のα-アミノ基との間のpKaの違いを利用することを可能にするpHで行われる。このような選択的誘導体化により、アルデヒドなどの反応基を含む水溶性ポリマーの、タンパク質に対する結合が制御される。ポリマーの結合は主としてタンパク質のN末端で起こり、リジン側鎖アミノ基のような他の反応基には著しい修重要な飾は伴わない。
【0126】
モノペグ化IL-29結合物分子の実質的に均一な集団を生成するための還元性アルキル化は、以下の段階を含みうる:(a)IL-28またはIL-29ポリペプチドを、反応性PEGと、IL-29ポリペプチドのアミノ末端でのα-アミノ基の選択的修飾を可能にするのに適したpHでの還元性アルキル化条件下で反応させる段階;および(b)反応生成物を入手する段階。還元性アルキル化のために用いられる還元剤は水溶液中で安定であって、好ましくは、還元性アルキル化の初期過程で形成されたシッフ塩基のみを還元させうるべきである。好ましい還元剤には、水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、ジメチルアミンボラン、トリメチルアミンボランおよびビリジンボランが含まれる。
【0127】
モノペグ化IL-29結合物の実質的に均一な集団に対する、還元性アルキル化反応条件とは、IL-29ポリペプチドのN末端に対する水溶性ポリマー部分の選択的結合を可能にするものである。そのような反応条件は一般に、リジンアミノ基とN末端のα-アミノ基との間にpKaの違いをもたらす。pHはまた、用いようとするポリマーとタンパク質との比にも影響を及ぼす。一般に、pHが低いほど、タンパク質に対してより大過剰なポリマーが望まれるが、これはN末端α-基の反応性が低いほど、至適条件を達成するためにより多くのポリマーが必要になるためである。pHが高い場合には、より多くの反応基が利用可能なため、ポリマー:L-29はそれほど大きい必要はない。典型的には、pHは3〜9または3〜6の範囲に収まると考えられる。考慮すべきもう1つの要因は、水溶性ポリマーの分子量である。一般に、ポリマーの分子量が高いほど、タンパク質と結合しうるポリマー分子の数は少なくなる。PEG化反応に関して、典型的な分子量は約2kDa〜約100kDa、約5kDa〜約50kDaまたは約12kDa〜約40kDaである。水溶性ポリマーとIL-29とのモル比は一般に1:1〜100:1の範囲にあると考えられる。典型的には、水溶性ポリマーとIL-29とのモル比は、ポリPEG化に関しては1:1〜20:1であり、モノPEG化に関しては1:1〜5:1であると考えられる。
【0128】
PEG化反応のための調製においては、組換えIL-29バルク中間体を解凍させて、反応容器に移す。希釈のための緩衝液である、シアノ水素化ホウ素ナトリウム還元剤保存溶液、および誘導体化ポリエチレングリコール(「PEG」)(例えば、20kDa直鎖状メトキシPEGプロピオンアルデヒド)保存溶液を反応物に添加して、50mM酢酸ナトリウム緩衝液中にある5g/L IL-29、10g/L誘導体化PEGおよび20mMシアノ水素化ホウ素ナトリウム、pH 5.5との混合物を作製する。反応は混合しながら16〜20℃でほぼ18時間進行させる。
【0129】
この段階は、ポリエチレングリコール(PEG)分子をIL-29と、好ましくはタンパク質のアミノ末端に優先的に単一のPEGを、共有結合させるために用いられる。例えば、50mM酢酸ナトリウム、pH 4.5〜6.5中の濃度20〜200mg/mLの20kDa直鎖状メトキシPEG-プロピオンアルデヒド(例えば、Nippon Oil & Fat製)で、好ましくは濃度100mg/ml、pH 5.5で構成されるPEG保存溶液を調製する。pHが4.5〜6.5の範囲(好ましくはpH 5.5)にある50mM酢酸ナトリウム緩衝液中にある5〜500mMシアノ水素化ホウ素ナトリウム(好ましくは100〜200mM)で構成される還元剤保存溶液も調製する。IL-29バルク中間体溶液を適切なサイズの反応容器に移す。緩衝液(例えば50mM酢酸ナトリウム、pH 5.5)、還元剤保存溶液およびPEG保存溶液を、最終的な混合物が濃度2〜6g/LのIL-29、IL-29に対して1〜4倍モル過剰のPEG、および濃度5〜40mMのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを、4.5〜6.5の範囲のpHで含むように、この順序で逐次的に添加する。続いて反応溶液を16〜24℃で2〜24時間混合する。1つの好ましい場合には、最終的な反応混合物は、濃度3〜5g/LのIL-29を、IL-29ポリペプチド濃度に対して2倍モル過剰であるPEG、10〜20mMのシアノ水素化ホウ素ナトリウムとともに、pH 5.5で含む。この反応物を16〜20℃で14〜18時間混合する。
【0130】
当業者は、鎖の長さがより長いまたはより短い他のPEG分子を、タンパク質をPEG化するためにいかにして用いるかを把握しているであろう。例えば、上記の条件下でIL-29をPEG化するために、30kDa直鎖状メトキシPEGプロピオンアルデヒドも用いられている。直鎖状ではなく分枝鎖PEG分子を反応に用いることができる。また、活性化PEGをブチルアルデヒドなどの他のアルデヒドを用いて誘導体化してもよく、または他のアミン反応性化合物によって誘導体化してもよい。他の部位特異的PEG化学反応を、IL-29上の他の特定部位を誘導体化のための標的とするために用いることもできると考えられる。反応性アルデヒドの例として、イミンをアミンに選択的に還元すると考えられる他の還元剤を、シアノ水素化ホウ素ナトリウムの代わりに用いてもよい。所望のN末端モノペグ化種の収量を高めるために、温度、pH、塩の組成および濃度を変更する他の反応条件を試みてもよい。
【0131】
PEG-IL-29の精製
IL-29のペグ化の後に、反応物を50mM酢酸ナトリウム、pH 5.5で2倍に希釈し、続いて0.2μm濾過して、50mM酢酸ナトリウム, 200mM塩化ナトリウム、pH 5.5で平衡化された第2の陽イオン交換カラム(例えば、SP Sepharose HP(GE Healthcare))にローディングする。この高性能陽イオン交換カラムを平衡化緩衝液で洗浄し、続いて50mM酢酸ナトリウム、500mM塩化ナトリウム、pH 5.5への直線勾配を用いて溶出させる。続いて、モノペグ化IL-29を含む溶出液プールを、5kDa分子量カットオフポリエーテルスルホン膜を備えたタンジェンシャルフロー濾過システムにおける限外濾過によって濃縮する。濃縮後に、保持物質を7倍透析容積の調合緩衝液に対してダイアフィルトレーションし、モノペグ化IL-29(「PEG-IL-29」)バルク原薬を生じさせる。続いて、調合されたバルク原薬を0.2μm濾過し、充填して、将来用いるために≦60℃で保存する。
【0132】
A.PEG-IL-29の高性能陽イオン交換精製
この段階は、多PEG化(タンパク質1つ当たり2つまたはそれ以上のPEG基を含む)および非PEG化IL-29タンパク質を所望のモノペグ化種から分離するために、高性能陽イオン交換クロマトグラフィーを用いる。ここでは、SP Sepharose HP樹脂(GE Healthcare)を用いる。樹脂を50mM酢酸ナトリウム, 200mM塩化ナトリウム、pH 5.5で平衡化する。反応混合物を水または低イオン強度緩衝液(好ましくは50mM酢酸ナトリウム、pH 5.5)で2倍に希釈し、続いてカラムへのローディング用の準備として0.2μmで濾過する。続いて、調整され、濾過された溶液を、平衡化された樹脂にローディングし、続いて非結合材料を除去するためにそれを平衡化緩衝液で洗浄する。PEG化IL-29タンパク質を、50mM酢酸ナトリウム、500mM塩化ナトリウム、pH 5.5への直線勾配によって溶出させる。モノペグ化IL-29は約0.3M〜0.5M塩化ナトリウムでカラムから溶出する。続いて、50mM酢酸ナトリウム、1M塩化ナトリウム、pH 5.5への段階を用いて、非PEG化IL-29をカラムから溶出させる。
【0133】
当業者は、この段階のために、他のスルホプロピル樹脂、またはカルボキシメチルなどの弱陽イオン交換体を含む、多くのさまざまな陽イオン交換樹脂、ならびにアガロースまたはセルロースなどのさまざまな種類の固体支持体および種々の樹脂ビーズ粒径を用いることができることを把握しているであろう。また、当業者は、このカラムを5.0〜7.0の範囲の種々のpHで、ならびに種々の緩衝液および塩を用いて、動作させることも把握しているであろう。改変された勾配または段階溶出のストラテジーまたは方式を、PEG化IL-29をカラムから溶出させるために用いてもよい。
【0134】
B.PEG-IL-29の濃縮およびダイアフィルトレーション
この段階は、PEG-IL-29を含むSP HPカラム溶出液を濃縮し、溶液を調合緩衝液に交換して、PEG-IL-29バルク中間体を生成させるために設計されている。5kDa分子量カットオフのポリエーテルスルホン製タンジェンシャルフロー濾過(TFF)プレート・フレーム膜を用いて、SPHPプールを約10〜15倍に濃縮する。濃縮後に、保持物質を5〜10倍透析容積の調合緩衝液に対してダイアフィルトレーションする。濃縮および緩衝液交換はいずれも、15〜25psiの範囲の膜間圧で行う。続いて、緩衝液が交換された濃縮物をTFFシステムから取り出し、システムを緩衝液ですすぎ洗いし、すすぎ洗い液を濃縮された保持物質と合わせる。続いて、溶液を0.2μm膜で濾過した上で、適切な容器に充填して、バルク原薬として保存する。
【0135】
また、この限外濾過/ダイアフィルトレーション段階を達成するために、再生セルロースで、および/またはさまざまな多孔度、例えば3kDa分子量カットオフのプレート・フレーム膜または10kDa分子量カットオフのホローファイバーシステムで構成されるもののような異なる組成の膜を用いることもできる。
【0136】
IL-29およびPEG-IL-29の追加精製
IL-29またはPEG-IL-29のいずれかを、不純物または混入物を除去するためにさらに精製することが必要な場合もある。陰エンドトキシンレベルを低下させるためにイオン交換カラムを用いてもよい。IL-29を<10mS/cm未満の導電率レベルになるまで希釈し、pHを8.0に調整する。それを、20mM Tris、pH 8.0に対して平衡化されたQ Sepharose FFカラムに適用する。IL-29はこのカラムを通過して、ローディング物と比較してエンドトキシンが約80%減少するはずである。IL-29ポリペプチドまたはPEG-IL29ポリペプチドのエンドトキシンレベルは、USP <85>に基づくリムルス・アメーバ様細胞溶解物アッセイ法において、IL-29ポリペプチドまたはPEG-IL29ポリペプチド1mg当たり10エンドトキシン単位未満であると考えられる(例えば、R. Nachum and R. N. Berzofsky, J. Clinical Microbiology, 21(5):759-763 (May 1985)を参照)。また、Mustang QまたはMustang E荷電膜(Pall)を、pH 5.0〜9.0の溶液中のエンドトキシンレベルを低下させるために用いることもできる。
【0137】
IL-29をさらに精製するために用いうるその他の精製段階には、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィーまたは疎水性荷電誘導クロマトグラフィーが含まれる。IL-29またはPEG-IL-29を精製するために、カラムへの高度のタンパク質ローディングが、より強固に結合した不純物によって置換されるために関心対象のタンパク質の溶出を引き起こす、置換クロマトグラフィーを用いることもできる。または、不純物が樹脂に結合し、一方、IL-29またはPEG-IL-29はローディング段階で通過する(上記のQ Sepharose上でのエンドトキシン除去の例のように)という、フロースルーモードのクロマトグラフィーを使用することも可能と思われる。
【0138】
精製されたPEG-IL-29の特性
PEG-IL-29バルク原薬の純度は、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル分析によって、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%である、または99%を上回る。凝集物は、サイズ排除HPLCによって、1.0%未満、0.9%未満、0.8%未満、0.7%未満、0.6%未満、0.5%未満、0.4未満、0.3%未満、0.2%未満、0.1%未満または0.005%未満である。陽イオン交換HPLCによる荷電の不均一性は、約10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%または1%であり、逆相HPLCによって測定されるモノPEG純度は少なくとも少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%である、または99%を上回る。PEG-IL-29の力価は上記の細胞利用活性アッセイ法を用いて測定した。PEG-IL-29はIL-29細胞利用力価バイオアッセイ法において活性を有した。
【0139】
本発明を、以下の非限定的な実施例によってさらに例示する。
【実施例】
【0140】
実施例
実施例1
発現ベクターpTAP395の構築
IL-29 C172S d2-7(SEQ ID NO:5)のための大腸菌発現ベクターを構築するために用いた骨格はpTAP395とした。pTAP395は、srpプロモーター、2つの転写ターミネーターrrnB T1およびrrnB T2、カナマイシン耐性遺伝子、複製起点、URA3選択マーカーおよび酵母におけるプラスミド複製のためのARS-CENS6座位を含んでいた。pTAP395はpTAP238から作製されたが、pTAP238とは異なる翻訳エンハンサーを有する。pTAP395は、chan2またはzymo2として公知である翻訳エンハンサーを有していた(SEQ ID NO:13)。pTAP395は、オリゴ体zc42188(SEQ ID NO:14)、zc42187(SEQ ID NO:15)、zc42194(SEQ ID NO:16)およびzc29741(SEQ ID NO:17)を用いて、オーバーラップPCRストラテジーを実施することによって構築した。PCR断片の末端はpTAP395と相同であった。XbaI部位とSmaI部位との間の中央領域にはzymo2((SEQ ID NO:13))翻訳エンハンサーが含まれた。PCR試薬濃度は以下の通りとした:1μMのzc42188(SEQ ID NO:14)およびzc29741(SEQ ID NO:17);50nMのzc42187(SEQ ID NO:15)およびzc42194(SEQ ID NO:16);0.2mMの各dNTP;1×反応緩衝液;ならびに0.05U/μLのPwo(Roche)。反応は以下の10サイクルからなった:94℃を30秒間、55℃を30秒間および72℃を30秒間。4つの反応をすべてに関して行った。DNAを2倍容積の100%エタノールを用いて沈殿させ、微量遠心機で遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットを10μLの水に再懸濁させた。結果として生じたDNA断片を、2% 1×TBEアガロースゲルでの2μLの電気泳動によってサイズに関して検査した。PCR断片のサイズは予想された通り、約150bpであった。残りのDNAを、SmaIで消化した100ngのpTAP238と混合した。続いてDNA混合物を100μLのエレクトロコンピテント(electrocompetent)SF838-9Dα酵母細胞(S. cerevisiae)と混合し、以下の条件下で電気穿孔法を行った:25μF、0.75kVおよび∞オーム。600マイクロリットルの1.2Mソルビトールを細胞に添加し、続いてそれを-Ura Dプレートに広げて、30℃で約72時間インキュベートした。単一のプレートからのUra+酵母形質転換体を2〜3mLのH2Oで再懸濁させ、細胞をペレット化するために短時間の遠心分離を行った。細胞ペレットを1mLの溶解緩衝液(2%Triton X-100、1% SDS、100mM NaCl、10mM Tris、pH 8.0、1mM EDTA)中に再懸濁させた。500マイクロリットルの溶解混合物を、300μLの酸洗浄したガラスビーズおよび500μLのフェノール-クロロホルムを含むEppendorfチューブに添加した。試料を1分間間隔で2回または3回ボルテックス処理し、続いてEppendorf遠心機にて最大速度で5分間遠心分離した。300マイクロリットルの水相を新たなチューブに移した。DNAを600μLの100%エタノールを用いて沈殿させ、4℃で10分間遠心分離した。DNAペレットを100μL H2O中に再懸濁させた。40マイクロリットルのエレクトロコンピテントMC1061細胞を、1μLのプラスミドDNA調製物によって形質転換させた。細胞には2.0kV、25μFおよび400オームのパルス処理を与えた。電気穿孔法の後に、600μLのSOCを細胞に添加し、37℃で1時間かけて回復させた。続いて細胞を1つのアリコートとして、25μg/mLカナマイシンを含むLBプレート(LBブロス(Lennox)、1.8% Bacto(商標)Agar(Difco))上にプレーティングし、37℃で一晩増殖させた。プライマーzc42188(SEQ ID NO:14)およびzc29741(SEQ ID NO:17)を用いたコロニーPCRによるスクリーニングによって、改変された翻訳エンハンサーに関するDNA配列を含む正しい構築物を保有する細胞が同定された。PCR条件は以下の通りとした:0.2μMの各オリゴ体;0.2mMの各dNTP;1×反応緩衝液;および0.05U/μLのTaq(Roche)。各反応に関するテンプレートは、形質転換プレートから選び取り10μLのLB中に懸濁させた単一のコロニーとした。PCRは以下の25サイクルからなった:94℃を30秒間、55℃を30秒間、および72℃を1分間。8つのクローンがすべて、2%アガロースゲル上での分析による判断で陽性であり、その3つを配列解析に供した。この正しいクローンはpTAP395として公知となった。
【0141】
実施例2
コドン最適化がなされたIL-29遺伝子の構築
大腸菌における翻訳のためにコドン最適化がなされたIL-29コード配列を、10種の一部重複するオリゴヌクレオチドから構築した(オリゴ体番号:zc44,559(SEQ ID NO:18)、zc44,566(SEQ ID NO:19)、zc44,565(SEQ ID NO:20)、zc44,562(SEQ ID NO:21)、zc44,563(SEQ ID NO:22)、zc44,560(SEQ ID NO:23)、zc44,561(SEQ ID NO:24)、zc44,564(SEQ ID NO:25)、zc44,557(SEQ ID NO:26)およびzc44,558(SEQ ID NO:27)。プライマー伸長後にPCR増幅を行うことにより、完全長の最適化されたIL-29遺伝子が作製された。最終的なPCR産物をクローニングベクター、pCR-Blunt II TOPO中に連結によって挿入した。この連結混合物をコンピテント大腸菌TOP10に形質転換導入した。カナマイシン耐性クローンをコロニーPCRによってスクリーニングした。陽性クローンをDNAシークエンシングによって確認した。
【0142】
実施例3
発現ベクターpCHAN15の構築
IL-29 C172S(SEQ ID NO:1)突然変異体を作製するために用いたストラテジーは、QuikChange(登録商標)Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene, La Jolla, CA)を基にしている。製造元の提案に従ってC172S変異を導入するためにプライマーを設計した。プライマーはzc44,340(SEQ ID)NO:28)およびzc44,341(SEQ ID NO:29)と命名した。QuikChange Mutagenesis Kitに備わった説明書に従ってIL-29 C172S突然変異体を作製するためにPCRを行った。5つの同一な50μL反応物を用意した。各反応物は、2.5μLのpSDH175(最適化されたIL-29遺伝子配列を有する発現構築物)をテンプレートとして含んだ。PCR混合液は、以下の試薬を含んだ:30μLの10×PCR緩衝液、125ng(27.42μL)のzc44,340(SEQ ID NO:28)。125ng(9.18μL)のzc44,341(SEQ ID NO:29)、6μLのdNTP、6μLのPfu Turboポリメラーゼ(Strategene)および206.4μLの水。各反応物には47.5μLの混合液を加えた。PCR条件は以下の通りとした:95℃で30秒間を1サイクル、その後に95℃を30秒間、55℃を1分間、68℃を7分間を16サイクル、さらに68℃で7分間を1サイクル。最終サイクルの後には、反応物を4℃に保った。5つのPCR反応物のすべてを1つのチューブにまとめた。製造元の指示に従って、5μLの制限酵素DpnIをPCR反応物に添加し、混合物を37℃で2時間インキュベートした。10%の3M酢酸ナトリウムおよび2倍容積の100%エタノールを添加することによってDNAを沈殿させた。DNAペレットを20μLの水に再懸濁させ、大腸菌株DH10Bに形質転換導入した。続いて、電気穿孔を行った細胞を37℃で1時間おいて回復させた。細胞を、25μg/mLカナマイシンを含むLB寒天培地にプレーティングし、37℃で一晩インキュベートした。10種のクローンを、IL-29 C172Sを含むインサートの存在に関してスクリーニングした。QIAprepTM Spin Miniprep Kit(Qiagen)を用いて、DNAを10個のクローンすべてから単離し、XbaI(Roche)およびPstI(New England Biolabs)による消化によってインサートの存在に関して分析した。9種のクローンがインサートを含んでおり、シークエンシングによってIL-29 C172S変異が導入されたことが確かめられた。配列が確認された1種のクローンを保存し、pSDH188と表記した。引き続いて、IL-29 C172Sインサートを発現ベクターpTAP395中にサブクローニングした。その結果得られた構築物はpCHAN15として公知となった。
【0143】
実施例4
発現ベクターpTAP440の構築
pTAP440の構築のために用いたオリゴ体は、zc49249(順方向プライマー)(SEQ ID NO:30)およびzc45403(逆方向プライマー)(SEQ ID NO:31)であった。zc49249の5'末端の最初の38塩基はベクター骨格pTAP395と相同である。残りの26塩基は、最初のメチオニンコドン(ATG)の後に、IL-29遺伝子と相同なDNA配列が第8コドン以後続く。逆方向プライマーzc45403(SEQ ID NO:31)の5'末端は、ベクター骨格と相同な39塩基からなる。オリゴ体の第2の半分である25塩基は、C172S変異をコードする塩基対変化を含む、最適化されたIL-29遺伝子と相同である。IL-29の遺伝子を増幅するために、以下の最終濃度の試薬を、総反応容積100μL中に用いた:0.2μMの各オリゴ体;0.2mMの各dNTP;1×反応緩衝液;10% DMSO;および0.05U/μLのPwo(Roche)。増幅のために用いたテンプレートはpCHAN15とした。反応は、以下の25サイクルからなった:94℃を30秒間、55℃を30秒間、および72℃を1分間。DNAを2倍容積の100%エタノールを用いて沈殿させ、微量遠心機でペレット化した。上清を廃棄し、ペレットを10μLの水に再懸濁させた。その結果生じたDNA断片を、1% 1×TBEアガロースゲルでの2μLの電気泳動によってサイズに関して検査した。PCR断片のサイズは予想された通り、約500bpであった。8マイクロリットルのDNAを、SmaIで消化した2μLのpTAP395と混合した。
【0144】
このDNA混合物を100μLのエレクトロコンピテントSF838-9Dα酵母細胞(S. cerevisiae)と混合し、電気穿孔法を以下の条件下で行った:25μF、0.75kVおよび∞オーム。600マイクロリットルの1.2Mソルビトールを細胞に添加した。細胞を-Ura Dプレートに広げて、30℃で約72時間インキュベートした。単一のプレートからのUra+酵母形質転換体を2〜3mLのH2Oで再懸濁させ、細胞をペレット化するために短時間の遠心分離を行った。細胞ペレットを1mLの溶解緩衝液(2%Triton X-100、1% SDS、100mM NaCl、10mM Tris、pH 8.0、1mM EDTA)中に再懸濁させた。500マイクロリットルの溶解混合物を、300μLの酸洗浄したガラスビーズおよび500μLのフェノール-クロロホルムを含むEppendorfチューブに添加した。試料を1分間間隔で2回または3回ボルテックス処理し、続いてEppendorf遠心機にて最大速度で5分間遠心分離した。300マイクロリットルの水相を新たなチューブに移した。DNAを600μLの100%エタノールを用いて沈殿させ、4℃で10分間遠心分離した。DNAペレットを50μLのH2O中に再懸濁させた。
【0145】
エレクトロコンピテント大腸菌細胞の形質転換は、1μLのプラスミドDNA調製物および40μLのMC1061細胞を用いて行った。細胞には2.0kV、25μFおよび400オームのパルス処理を与えた。電気穿孔法の後に、600μLのTerrificブロスを細胞に添加し、それを37℃で1時間かけて回復させた。細胞を25μg/mLカナマイシンを含むLBプレート上にプレーティングし、37℃で一晩増殖させた。プライマーzc49249(SEQ ID N0:30)およびzc45403(SEQ ID N0:31)を用いたコロニーPCRによるスクリーニングによって、IL-29 C172S d2-7(SEQ ID NO:5)のDNA配列を含む正しい構築物を保有する細胞が同定された。PCR条件は以下の通りとした:0.2μMの各オリゴ体;0.2mMの各dNTP;1×反応緩衝液;10% DMSO;および0.05U/μLのPwo(Roche)。
【0146】
各反応に関するテンプレートは、形質転換プレートから選び取り10μLのLB中に懸濁させた単一のコロニーとした。PCRは以下の25サイクルからなった:94℃を30秒間、55℃を30秒間、および72℃を1分間。8種のクローンがすべて、1%アガロースゲル上での分析による判断で陽性であり、その4つを配列解析に供した。これらのクローンの1つ、現在はpTAP440として公知であるものを、シークエンシングに供した4つの中から選択した。10マイクロリットルのDNAを、2μLのNotI、3μLのNEB緩衝液3、および15μLの水を含む反応物中にて37℃で1時間消化した。続いて7μLのこの反応物を2μLの5×緩衝液および1μLのT4 DNAリガーゼと混合した。この反応物を室温で1時間インキュベートした。1マイクロリットルの連結反応物を、電気穿孔法による菌株W3110[F- IN(rrnD- rrnE)1 lambda-](例えば、ATCCから入手)の形質転換に用いた。
【0147】
細胞には2.0kV、25μFおよび400オームのパルス処理を与えた。電気穿孔法の後に、600μLのSOC(2% Bacto(商標)Tryptone(Difco, Detroit, MI)、0.5%酵母エキス(Difco)、10mM NaCl、2.5mM KCl、10mM MgCl2、10mM MgSO4、20mMグルコース)を細胞に添加した。細胞を37℃で1時間増殖させ、1つのアリコートとして、25μg/mLカナマイシンを含むLB寒天培地上にプレーティングした。プレートを室温で48時間インキュベートした。4つのコロニーを選び取り、25μg/mLカナマイシンを含むLB中にて37℃で一晩増殖させた。プラスミドDNAを、QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen)を用いて単離した。酵母URA3およびCEN/ARSエレメントの喪失を確かめるためにDNAをPvuIIで消化した:12.5μLのDNA、1μLのPvuII、15μLの緩衝液2 NEB、37℃で1時間。酵母エレメントを欠失する正しいクローンの1つを、40μLのエレクトロコンピテントZGOLD5[F- IN(rrnD-rrnE)1 lambda- ΔompT::tet ΔfhuA::Cm]の形質転換に用いた。細胞に2.0kV、25μFおよび400オームのパルス処理を与えた。電気穿孔法の後に、600μLのSOCを細胞に添加した。細胞を37℃で1時間増殖させた後、25μg/mLカナマイシンを含むLB寒天培地上にプレーティングした。プレートを37℃で24時間インキュベートした。この細菌は純粋なプラスミドにより形質転換されたため、カナマイシン耐性細菌はこのプラスミドを有すると推定された。pTAP440によって形質転換されたZGOLD5を保管し、凍結保存した。
【0148】
実施例5
グルコース流加発酵‐ECD686(IL-29:C172S)
振盪フラスコ(100ml培地の入った500mlバッフルフラスコ)にZSM培地を調製した。増殖は、研究用ワーキングセルバンクのバイアルからの、発現ベクターpSDH177を含む0.10mLの大腸菌W3110(EE675)を、振盪フラスコに接種することによって開始させた。このベクターはC172S型のIL-29分子をコードする。振盪フラスコ内での増殖は温度32℃で行い、撹拌設定は250rpmとした。培養物を、OD600が8〜20単位となるまで一晩(16時間)増殖させた。
【0149】
6L発酵容器に3.0LのPCOL-01培地を調製して滅菌した。滅菌の後に、培地にグルコース20g/L、1M MgSO4(10ml/L)およびカナマイシン25ug/mlを補給した。培地のpHはpH 6.8に調整した。容器の通気は1vvm、撹拌は350rpmに設定し、温度は37℃に設定した。発酵槽に、16時間にわたって増殖させた、ODが600nmで10.9である振盪フラスコ培養物からの接種を行った。接種レベルは5%容積/容積であった。溶存酸素レベルは、撹拌速度を高めることによって飽和度30%よりも高く維持した。
【0150】
炭水化物溶液を、9時間のEFTの時点から発酵槽に供給した。供給は発酵の終了時まで継続した。供給溶液は、50% w/wで調製したグルコースとした。供給速度は、初期開始容積を基にして1時間につき1リットル当たりグルコース10.8グラムとした。24時間のEFTの時点で、IPTGを培養物に濃度1mMで添加した。48時間のEFTの時点で、発酵物を収集した。バイオマスは、収集時点で乾燥細胞重量(DCW)58.8g/Lに達し、発酵力価はIL-29 4.6g/L発酵槽ブロスであった。
【0151】
実施例6
グルコース流加発酵‐ECD712(IL-29 C172S)
振盪フラスコ(100ml培地の入った500mlバッフルフラスコ)にZSM培地を調製した。増殖は、研究用ワーキングセルバンクのバイアルからの、発現ベクターpCHAN15を含む0.10mLの大腸菌ZGOLD1[F-IN(rrnD-rrnE)1 lambda-ΔompT::tet](EE733)を、振盪フラスコに接種することによって開始させた。このベクターはC172S型のIL-29分子をコードする。振盪フラスコ内での増殖は温度32℃で行い、撹拌設定は250rpmとした。培養物を、OD600が8〜20単位となるまで一晩(16時間)増殖させた。
【0152】
6L発酵容器に3.0LのPCOL-01培地を調製して滅菌した。滅菌の後に、培地にグルコース20g/L、1M MgSO4(10ml/L)およびカナマイシン25ug/mlを補給した。培地のpHはpH 6.8に調整した。容器の通気は1vvm、撹拌は350rpmに設定し、温度は37℃に設定した。発酵槽に、16時間にわたって増殖させた、ODが600nmで13.1である振盪フラスコ培養物からの接種を行った。接種レベルは5% v/vとした。溶存酸素レベルは、撹拌速度を高めることによって飽和度30%よりも高く維持した。
【0153】
炭水化物溶液を、9.5時間のEFTの時点から発酵槽に供給した。供給は発酵の終了時まで継続した。供給溶液は、50% w/wで調製したグルコースとした。供給速度は、初期開始容積を基にして1時間につき1リットル当たりグルコース9.5グラムとした。24時間のEFTの時点で、IPTGを培養物に濃度1mMで添加した。48時間のEFTの時点で、発酵物を収集した。バイオマスは、収集時点で乾燥細胞重量(DCW)67.4g/Lに達し、発酵力価はIL-29 3.6g/L発酵槽ブロスであった。
【0154】
実施例7
グルコース流加発酵‐ECD856(IL-29:C172S+ロイシン)
振盪フラスコ(100ml培地の入った500mlバッフルフラスコ)にZSM培地を調製した。増殖は、研究用ワーキングセルバンクのバイアルからの、発現ベクターpTAP438を含む0.10mLの大腸菌ZGOLD1(EE831)を、振盪フラスコに接種することによって開始させた。このベクターは、N末端のメチオニンの後に付加されたロイシンを含む、C172S型のIL-29分子をコードする。振盪フラスコ内での増殖は温度32℃で行い、撹拌設定は250rpmとした。培養物を、OD600が8〜20単位となるまで一晩(16時間)増殖させた。
【0155】
6L発酵容器に3.0LのPCOL-13培地を調製して滅菌した。滅菌の後に、培地にグルコース20g/L、1M MgSO4(10ml/L)およびカナマイシン25ug/mlを補給した。培地のpHはpH 6.8に調整した。容器の通気は1vvm、撹拌は350rpmに設定し、温度は37℃に設定した。発酵槽に、16時間にわたって増殖させた、ODが600nmで13.8である振盪フラスコ培養物からの接種を行った。接種レベルは5%容積/容積であった。溶存酸素レベルは、撹拌速度を高めることによって飽和度30%よりも高く維持した。
【0156】
炭水化物溶液を、8時間のEFTの時点から発酵槽に供給した。供給は発酵の終了時まで継続した。供給溶液は、50% w/wで調製したグルコースとした。供給速度は、初期開始容積を基にして1時間につき1リットル当たりグルコース9.5グラムとした。24時間のEFTの時点で、IPTGを培養物に濃度1mMで添加した。50時間のEFTの時点で、発酵物を収集した。バイオマスは、収集時点でDCW 70.0g/Lに達し、発酵力価はIL-29 7.3g/L発酵槽ブロスであった。
【0157】
実施例8
グルコース流加発酵‐ECD859(IL-29 C172S d2-7)
振盪フラスコ(100ml培地の入った500mlバッフルフラスコ)にZSM培地を調製した。増殖は、研究用ワーキングセルバンクのバイアルからの、発現ベクターpTAP440を含む0.10mLの大腸菌ZGOLD1(EE833)を、振盪フラスコに接種することによって開始させた。このベクターは、第2アミノ酸から第7アミノ酸までの欠失を含む形態のIL-29分子をコードする。振盪フラスコ内での増殖は温度32℃で行い、撹拌設定は250rpmとした。培養物を、OD600が8〜20単位となるまで一晩(16時間)増殖させた。
【0158】
6L発酵容器に3.0LのPCOL-13培地を調製して滅菌した。滅菌の後に、培地にグルコース20g/L、1M MgSO4(10ml/L)およびカナマイシン25ug/mlを補給した。培地のpHはpH 6.8に調整した。容器の通気は1vvm、撹拌は350rpmに設定し、温度は37℃に設定した。発酵槽に、16時間にわたって増殖させた、ODが600nmで12.5である振盪フラスコ培養物からの接種を行った。接種レベルは5% v/vとした。溶存酸素レベルは、撹拌速度を高めることによって飽和度30%よりも高く維持した。
【0159】
炭水化物溶液を、8時間のEFTの時点から発酵槽に供給した。供給は発酵の終了時まで継続した。供給溶液は、50% w/wで調製したグルコースとした。供給速度は、初期開始容積を基にして1時間につき1リットル当たりグルコース9.5グラムとした。24時間のEFTの時点で、IPTGを培養物に濃度1mMで添加した。50時間のEFTの時点で、発酵物を収集した。バイオマスは、収集時点で乾燥細胞重量(DCW)82.8g/Lに達し、発酵力価はIL-29 11.3g/L発酵槽ブロスであった。
【0160】
実施例9
グルコース流加発酵+ダイズペプトン‐ECD892(IL-29 C172S d2-7)
振盪フラスコ(100ml培地の入った500mlバッフルフラスコ)にZSM培地を調製した。増殖は、研究用ワーキングセルバンクのバイアルからの、発現ベクターpTAP440を含む0.10mLの大腸菌W3110(EE826)を、振盪フラスコに接種することによって開始させた。このベクターは、第2アミノ酸から第7アミノ酸までの欠失を含む形態のIL-29分子をコードする。振盪フラスコ内での増殖は温度32℃で行い、撹拌設定は250rpmとした。培養物を、OD600が8〜20単位となるまで一晩(16時間)増殖させた。
【0161】
6L発酵容器に、10.0g/Lのダイズ加水分解物を含む3.0LのPCOL-13培地を調製して滅菌した。滅菌の後に、培地にグルコース20g/L、1M MgSO4(10ml/L)およびカナマイシン25ug/mlを補給した。培地のpHはpH 6.8に調整した。容器の通気は1vvm、撹拌は350rpmに設定し、温度は37℃に設定した。発酵槽に、16時間にわたって増殖させた、ODが600nmで11.5である振盪フラスコ培養物からの接種を行った。接種レベルは5%容積/容積であった。溶存酸素レベルは、撹拌速度を高めることによって飽和度30%よりも高く維持した。
【0162】
炭水化物溶液を、8時間のEFTの時点から発酵槽に供給した。供給は発酵の終了時まで継続した。供給溶液は、50% w/wで調製したグルコースとした。供給速度は、初期開始容積を基にして1時間につき1リットル当たりグルコース9.5グラムとした。24時間のEFTの時点で、IPTGを培養物に濃度1mMで添加した。50時間のEFTの時点で、発酵物を収集した。バイオマスは、収集時点で乾燥細胞重量(DCW)73.3g/Lに達し、発酵力価はIL-29 12.5g/L発酵槽ブロスであった。
【0163】
実施例10
グルコース流加発酵+酵母エキス‐ECD880(IL-29 C172S d2-7)
振盪フラスコ(100ml培地の入った500mlバッフルフラスコ)にZSM培地を調製した。増殖は、研究用ワーキングセルバンクのバイアルからの、発現ベクターpTAP440を含む0.10mLの大腸菌ZGOLD1(EE833)を、振盪フラスコに接種することによって開始させた。このベクターは、第2アミノ酸から第7アミノ酸までの欠失を含む形態のIL-29分子をコードする。振盪フラスコ内での増殖は温度32℃で行い、撹拌設定は250rpmとした。培養物を、OD600が8〜20単位となるまで一晩(16時間)増殖させた。
【0164】
6L発酵容器に、20.0g/Lの酵母エキスを含む3.0LのPCOL-13培地を調製して滅菌した。滅菌の後に、培地にグルコース20g/L、1M MgSO4(10ml/L)およびカナマイシン25ug/mlを補給した。培地のpHはpH 6.8に調整した。容器の通気は1vvm、撹拌は350rpmに設定し、温度は37℃に設定した。発酵槽に、16時間にわたって増殖させた、ODが600nmで8.9である振盪フラスコ培養物からの接種を行った。接種レベルは1%容積/容積であった。溶存酸素レベルは、撹拌速度を高めることによって飽和度30%よりも高く維持した。
【0165】
炭水化物溶液を、8時間のEFTの時点から発酵槽に供給した。供給は発酵の終了時まで継続した。供給溶液は、50% w/wで調製したグルコースとした。供給速度は、初期開始容積を基にして1時間につき1リットル当たりグルコース9.5グラムとした。24時間のEFTの時点で、IPTGを培養物に濃度1mMで添加した。49時間のEFTの時点で、発酵物を収集した。バイオマスは、収集時点で乾燥細胞重量(DCW)66.7g/Lに達し、発酵力価はIL-29 10.4g/L発酵槽ブロスであった。
【0166】
実施例11
グルコース流加発酵+酵母エキス供給‐EGD920(IL-29 C172S d2-7)
振盪フラスコ(100ml培地の入った500mlバッフルフラスコ)にZSM培地を調製した。増殖は、研究用ワーキングセルバンクのバイアルからの、発現ベクターpTAP440を含む0.10mLの大腸菌ZGOLD1(EE833)を、振盪フラスコに接種することによって開始させた。このベクターは、第2アミノ酸から第7アミノ酸までの欠失を含む形態のIL-29分子をコードする。振盪フラスコ内での増殖は温度32℃で行い、撹拌設定は250rpmとした。培養物を、OD600が8〜20単位となるまで一晩(16時間)増殖させた。
【0167】
6L発酵容器に、3.0LのPCOL-18培地(10.0g/Lのダイズペプトンを含むPCOL-13)を調製して滅菌した。滅菌の後に、培地にグルコース20g/L、1M MgSO4(10ml/L)およびカナマイシン25ug/mlを補給した。培地のpHはpH 6.8に調整した。容器の通気は1vvm、撹拌は350rpmに設定し、温度は37℃に設定した。発酵槽に、16時間にわたって増殖させた、ODが600nmで9.6である振盪フラスコ培養物からの接種を行った。接種レベルは1%容積/容積であった。溶存酸素レベルは、撹拌速度を高めることによって飽和度30%よりも高く維持した。
【0168】
グルコース溶液(50% w/w)を、8時間のEFTの時点から発酵槽に供給した。供給速度は、初期開始容積を基にして1時間につき1リットル当たりグルコース9.5グラムとした。供給速度を24時間のEFTの時点で4.75gグルコース/L/hr(開始時容積)に低下させ、25% w/w酵母エキス溶液の供給物も、4.75g酵母エキス/L/hr(開始時容積)で発酵槽に供給した。24時間のEFTの時点で、IPTGを培養物に濃度1mMで添加した。48時間のEFTの時点で、発酵物を収集した。バイオマスは、収集時点で乾燥細胞重量(DCW)74.8g/Lに達し、発酵力価はIL-29 10.1g/L発酵槽ブロスであった。
【0169】
実施例12
グルコース流加発酵+酵母エキス供給‐ECD 964(IL-29:d2-7)
振盪フラスコ(100ml培地の入った500mlバッフルフラスコ)にZSM培地を調製した。増殖は、研究用ワーキングセルバンクのバイアルからの、発現ベクターpTAP440を含む0.10mLの大腸菌ZGOLD5(EE867)を、振盪フラスコに接種することによって開始させた。このベクターは、第2アミノ酸から第7アミノ酸までの欠失を含む形態のIL-29分子をコードする。振盪フラスコ内での増殖は温度32℃で行い、撹拌設定は250rpmとした。培養物を、OD600が8〜20単位となるまで一晩(16時間)増殖させた。
【0170】
6L発酵容器に、3.0LのPCOL-18培地(10.0g/Lのダイズペプトンを含むPCOL-13)を調製して滅菌した。滅菌の後に、培地にグルコース20g/L、1M MgSO4(10ml/L)およびカナマイシン25ug/mlを補給した。培地のpHはpH 6.8に調整した。容器の通気は1vvm、撹拌は350rpmに設定し、温度は37℃に設定した。発酵槽に、16時間にわたって増殖させた、振盪フラスコ培養物からの接種を行った。接種レベルは1%容積/容積であった。溶存酸素レベルは、撹拌速度を高めることによって飽和度30%よりも高く維持した。
【0171】
グルコース溶液(50% w/w)を、8時間のEFTの時点から発酵槽に供給した。供給速度は、初期開始容積を基にして1時間につき1リットル当たりグルコース9.5グラムとした。供給速度を24時間のEFTの時点で4.75gグルコース/L/hr(開始時容積)に低下させ、25% w/w酵母エキス溶液の供給物も、4.75g酵母エキス/L/hr(開始時容積)で発酵槽に供給した。24時間のEFTの時点で、IPTGを培養物に濃度1mMで添加した。48時間のEFTの時点で、発酵物を収集した。バイオマスは、収集時点で乾燥細胞重量(DCW)71.1g/Lに達し、発酵力価はIL-29 9.8g/L発酵槽ブロスであった。
【0172】
実施例13
グルコース流加発酵+酵母エキス供給‐ECD 1065(IL-29 C172S d2-7)
振盪フラスコ(100ml培地の入った500mlバッフルフラスコ)にZSM培地を調製した。増殖は、研究用ワーキングセルバンクのバイアルからの、発現ベクターpTAP440を含む0.10mLの大腸菌ZGOLD5(EE867)を、振盪フラスコに接種することによって開始させた。このベクターは、第2アミノ酸から第7アミノ酸までの欠失を含む形態のIL-29分子をコードする。振盪フラスコ内での増殖は温度32℃で行い、撹拌設定は250rpmとした。培養物を、OD600が8〜20単位となるまで一晩(16時間)増殖させた。
【0173】
6L発酵容器に、3.0LのPCOL-18A培地(10.0g/Lのグルコースのみを含むPCOL 18)を調製して滅菌した。滅菌の後に、培地にグルコース20g/L、1M MgSO4(10ml/L)およびカナマイシン25ug/mlを補給した。培地のpHはpH 6.8に調整した。容器の通気は1vvm、撹拌は350rpmに設定し、温度は37℃に設定した。発酵槽に、16時間にわたって増殖させた、ODが600nmで11.8である振盪フラスコ培養物からの接種を行った。接種レベルは1%容積/容積であった。溶存酸素レベルは、撹拌速度を高めることによって飽和度30%よりも高く維持した。
【0174】
グルコース溶液(50% w/w)を、8時間のEFTの時点から発酵槽に供給した。供給速度は、8〜9時間のEFTでは初期開始容積を基にして1時間につき1リットル当たりグルコース4.0グラムとした。9時間のEFTの時点で、供給速度を、初期開始容積を基にして1時間につき1リットル当たりグルコース8.0グラムに増やした。24時間のEFTの時点で供給速度を4.0gグルコース/L/hr(開始時容積)に低下させ、25% w/w酵母エキス溶液の供給物も、4.0g酵母エキス/L/hr(開始時容積)で発酵槽に供給した。24時間のEFTの時点で、IPTGを培養物に濃度1mMで添加した。47時間のEFTの時点で、発酵物を収集した。バイオマスは、収集時点で乾燥細胞重量(DCW)66.9g/Lに達し、発酵力価はIL-29 9.3g/L発酵槽ブロスであった。
【0175】
実施例14
発酵ブロスの直接ホモジナイゼーションおよびバッチ遠心分離
ECD892(上記)からの発酵ブロス(0.90L)を0.90Lの脱イオン水と混合した。希釈したブロス混合物を、APV-Gaulin 2000ホモジナイザーに10,000psiで通した。ホモジナイザーの流出口を、2〜8℃に設定された再循環式水浴につながれた熱交換器と接続した。ホモジナイザーを通した後に混合物を採取し、10,00psiで2回目の通過を行わせた。この工程を3回目の最後の回も繰り返した。ホモジネート中のIL-29の収量は10.9g/L発酵槽ブロスであり、工程収率は87%であった。
【0176】
ホモジネートを1.0L Beckman遠心ボトルに移し、ボトル1つ当たり0.90Lのホモジネートを添加した。続いて混合物を、Beckman JLA-8.1固定角ローターを用いて、Beckman Avanti JHC遠心機にて15,000×gおよび4℃で30分間遠心分離した。
【0177】
遠心分離の後に、デカントした上清と等しい容積の水を添加した。ペレットを、スパーテルを用いて混合し、続いてOmni EZ手持ち式ホモジナイザーを用いて混合することによって再懸濁させた。適切なサイズの金属プローブを半分の力でほぼ15秒間にわたり、または細胞ペレットが十分に懸濁化するまで用いて、混合物をホモジネート化した。続いて、Beckman Avanti JHC遠心機をBeckman JLA8.1固定角ローターとともに15,000×G、4℃で30分間用いて、混合物を再び遠心分離した。この工程をもう1回繰り返し、その結果得られた洗浄された封入体(WIB)ペレットをリフォールディング用に準備した。WIBの収量は発酵槽ブロス1リットル当たりIL-29 9.6gに等しかった。ホモジネートからの段階収率は88%であり、発酵槽ブロスからの総収率は76.8%であった。
【0178】
実施例15
発酵ブロスの直接ホモジナイゼーションおよび連続遠心分離
ECD967(Il-29=8.0g/L)からの発酵ブロス(80.0Kg)を80.0Kgの脱イオン水と混合した。希釈したブロス混合物を、Niro-Sovaiホモジナイザーに800バールで通した。ホモジナイザーの流出口を、2〜8℃に設定された再循環式水浴につながれた熱交換器と接続した。ホモジナイザーを通した後に混合物を採取し、同じ圧力で2回目の通過を行わせた。この工程を3回目の最後の回も繰り返した。ホモジネート中のIL-29の収量は7.24g/L発酵槽ブロスであり、工程収率は90%であった。
【0179】
続いて、3%の固形物(wt/wt)を含むホモジネートを、Westfalia C6ディスクスタック遠心機で遠心分離して洗浄した。溶液は遠心機に1.5L/分で通させ、G力は15,000×gに設定した。固形物はボウル内に留まり、一方、上清の流れは連続的に廃棄された。所定の設定点で、ホモジネートの供給を停止し、固体の上に精製水を1.5L/分で通過させた。この水洗浄により、上清をボウル内に移動させた。続いて、遠心機のボウル内の固形物および水を排出させた。排出された固形物(19.81Kg)は17.6%の固形物(wt/wt)を含み、一方、上清は約1%の固形物を含んでいた。排出された固形物を、それぞれ2.4Kgの材料を含む8個の容器に分けた。
【0180】
実施例16
グアニジン溶液を用いたWIBペレットの可溶化
実施例14に記載した通りに、発酵物ECD917からWIBペレットを作製した。2リットルの発酵ブロスからのWIBペレットの湿重量は約400gであった。40mMジチオトレイトールを含む6MグアニジンHCl溶液を、以下の表4に記載した通りに調製した。300ミリリットルのこの溶液をWIBペレットに添加し、小型の手持ち式ホモジナイザーを用いてペレットを溶液中に分散させた。この溶液を室温で1時間かけて可溶化させた。可溶化の後に、700mlの溶体が得られた。この材料のIL-29含有量は19.5mg/mlであり、溶体は13.65gのIL-29を含んでいた。これは発酵ブロス1リットル当たりIL-29 6.82gに等しく、工程収率は70%であった。
【0181】
(表4)グアニジンHCl/DTT溶液

【0182】
実施例17
グアニジン粉末を用いた排出固形物の可溶化
Tris塩基(11.0g)およびTris HCl(23.4g)の粉末を、実施例15に記載された2.4KgのECD967排出固形物に添加した。粉末を混合して溶液にし、pHを8.0に調整した。ジチオトレイトール(14.8g)およびグアニジンHCl(1.37Kg)を混合物に添加した。温度調整を行わずに溶液を1時間かけて混合させた。可溶化の後の混合物の重量は3.78Kgであり、55.72グラムのIL-29を含んでいた。
【0183】
実施例18
システインおよびシスチンを用いた、可溶化されたWIBペレットのリフォールディング
5.0Lのガラス製リフォールディング容器に、3.0Lの1.1MアルギニンHCl緩衝液および0.167Lの20×塩を満たした(以下の表5を参照)。撹拌バーを容器内に加え、容器を撹拌プレート上に置いた。続いてこの全体を、低速での混合設定にした8℃の冷却インキュベーターに入れた。この溶液に対して0.77gのDTTおよび0.167Lの120mMシスチン溶液(以下の表6を参照)を添加した。この混合物を用いて、比6:1のシステインおよびシスチン酸化還元対を作製した。pHはNaOHによって8.0に調整した。調製後に、0.3Lの緩衝液を容器から除去し、実施例16に上述した通りのECD917からの溶質溶液300mlと置き換えた。この300mlの溶体は5.85gのIL-29を含み、非フォールディングIL-29の開始時濃度は1.95mg/mLであった。この溶液を6時間かけてリフォールディングさせ、20%酢酸でpHを5.5に調整することによって停止させた。リフォールディング物の最終濃度は1.12mg/mLであった。リフォールディング収率は57%であり、3.4gのリフォールディングしたIL-29が生成された。
【0184】
(表5)1.1Mアルギニン緩衝液

【0185】
(表6)0.25M NaOH溶液中に調製された120mMシスチン溶液

【0186】
実施例19
システインおよびシスチンを用いた排出固形物のリフォールディング
1.1MアルギニンHClを含むリフォールディング緩衝液を上記の表5の通りに調製した。塩類溶液(20倍)および120mMシスチン溶液も下記の表7の通りに調製した。アルギニン緩衝液(30.0L)を、50Lジャケット付きタンクに、撹拌(100rpm)しながら8℃の冷却設定で分注した。このアルギニン緩衝液に対して、1.67Lの20倍塩類および1.67Lの120mMシスチン溶液を添加した。ジチオトレイトール(7.7g)を添加し、10N NaOHによってpHをpH 8.0に調整した。実施例17で調製した溶体(3.35L)を、この混合物に4時間かけて添加した。非フォールディングIL-29のリフォールディング開始時濃度は1.72mg/mlであった。リフォールディングをさらに2時間進行させた後に、pHが5.5に低下するまで20%酢酸を添加することによって反応を停止させた。120Lの25mM酢酸緩衝液、pH 5.5を添加することによって溶液を希釈した。溶液を室温で一晩おいて沈降させた。この混合物をCuno BioPlusフィルターを用いて濾過した。リフォールディング後のIL-29濃度は0.90mg/mLであった。希釈し清澄化した溶液中のIL-29濃度は0.19mg/mLであった。清澄化したブロス中のリフォールディングしたIL-29の総量は29.85gであり、リフォールディング収率は54%であった。
【0187】
(表7)20倍塩類溶液

【0188】
実施例20
再生IL-29の清澄化および捕捉
pHを6.0に低下させることで、IL-29リフォールディング反応は停止する。酸性化されたリフォールディング物を、ミスフォールディングしたタンパク質および非フォールディングタンパク質を沈殿させるため、ならびに捕捉カラムへのローディング用にリフォールディング物の状態を調節するために、25mM酢酸ナトリウム、pH 5.6で4.25倍に希釈する。沈殿物を一晩おいて沈降させ、その後に上清を、粗いCuno Zeta Plus Maximizer 30M03(定格0.8μm)および微細Cuno Zeta Plus Maximizer 90M05(定格0.2μm)フィルターが連続したもので構成される一連のデプスフィルターを通して清澄化する。
【0189】
清澄化し、希釈したIL-29を、ToyoPearl SP550C(Tosoh Bioscience)陽イオン交換カラムによりpH 5.5で捕捉する。この場合には、10Lの発酵ブロスから生じた再生IL-29 C172S d2-7を捕捉するために、高さ14.5cm×直径14cmのカラム(カラム容積2.23L)を180cm/hrで用いる。カラムを50mM酢酸ナトリウム、pH 5.5によって平衡化し、続いて29gのIL-29(13g/L樹脂)をローディングする。平衡化緩衝液で洗浄した後に、結合したIL-29を、カラム容積の5倍をかけて直線勾配を2M塩化ナトリウム、50mM酢酸ナトリウム中、pH 5.5まで上昇させることによって溶出させる。280nmの吸光度に基づき、溶出材料の1つのプールを、溶出ピークの前側の0.2AUから1.0AUにかけて採取する。第2のプールは、溶出ピークの前側の1.0AUから終端の0.2AUにかけて採取する。大部分が非IL-29タンパク質で構成される第1のプールは廃棄する。第2のプールを中間体精製へと進める。同様の方法が、天然型、C172SおよびC172S Leuインサート型を含む、他のIL-29変異体を捕捉するために用いられている。
【0190】
または、IL-29をカラムから移動させるために、均一濃度塩溶出を用いることもできる。この実施例では、4Lの発酵ブロスから生じた再生C172S IL-29を捕捉するために、ToyoPearl SP550C樹脂の高さ10cm×直径1.6cmのカラムを180cm/hrで用いる。カラムを50mM酢酸ナトリウム、pH 5.5によって平衡化し、続いて136mgのIL-29(6.8g/L樹脂)をローディングする。平衡化緩衝液で洗浄した後に、結合したIL-29を、600mM NaCl、50mM酢酸ナトリウム中、pH 5.5によるCVの10倍を用いる段階によって溶出させる。280nmの吸光度に基づき、ピークの上り勾配での最大シグナルのほぼ20%から下り勾配での最大シグナルのほぼ20%にかけて溶出した材料をプールし、中間体精製へと進める。実質的に同様な段階溶出法が、IL-29 C172 d2-7変異体の捕捉および溶出のためにも用いられている。
【0191】
実施例21
Super Butyl 550C樹脂を用いた疎水性相互作用クロマトグラフィー
IL-29 C172S d2-7タンパク質を含む捕捉プールを、50mM酢酸ナトリウム、2.0M (NH4)2SO4、pH 5.5による2倍希釈を行うことによって、1.0M (NH4)2SO4に調整した。不溶性材料を除去するために、この溶液を0.45μmフィルターに通した。濾過され、調整されたHICローディング溶液を、50mM酢酸ナトリウム、1.5M (NH4)2SO4、pH 5.5によってあらかじめ平衡化したToyoPearl Super Butyl 550C(Tosoh Bioscience)カラムに対して適用した。この場合には、10Lの発酵ブロスから生じたIL-29を精製するために、高さ14cm×直径14cmのカラム(CV 2.16L)を室温にて150cm/hrで動作させた(樹脂1リットル当たり12.4gのIL-29をローディングした)。このHICカラムを、非結合材料を除去するために平衡化緩衝液によって洗浄し、続いてIL-29を、カラム容積(CV)の10倍を用いる50mM酢酸ナトリウム、pH 5.5への直線勾配によって溶出させた。280nmの吸光度に基づき、CV画分の1/3を溶出ピークの前端の0.1AUから後端の0.1AUにかけて採取した。280nmの吸光度の測定を各画分について行い、A280が最大である画分を同定した。プール化のためには、上り勾配での最大OD280の少なくとも20%を含む画分から、下り勾配での最大OD280の少なくとも45%を含むものまでをまとめた。
【0192】
実施例22
Butyl 650M樹脂を用いた疎水性相互作用クロマトグラフィー
IL-29 C172S d2-7タンパク質を含む捕捉プールを、50mM酢酸ナトリウム、2.0M (NH4)2SO4、pH 5.5による2倍希釈を行うことによって、1.0M (NH4)2SO4に調整した。不溶性材料を除去するために、この溶液を0.45μmフィルターに通した。濾過され、調整されたHICローディング溶液を、50mM酢酸ナトリウム、1.5M (NH4)2SO4、pH 5.5によってあらかじめ平衡化したToyoPearl Butyl 650M(Tosoh Bioscience)カラムに対して適用した。この場合には、4Lの発酵ブロスから生じたIL-29を精製するために、高さ11cm×直径10cmのカラム(CV 0.86L)を室温にて150cm/hrで動作させた(樹脂1リットル当たり8.6gのIL-29をローディングした)。このHICカラムを、非結合材料を除去するために平衡化緩衝液によって洗浄し、続いてIL-29を、カラム容積(CV)の10倍を用いる50mM酢酸ナトリウム、pH 5.5への直線勾配によって溶出させた。実質的に同様な段階溶出法が、IL-29のC172 Leuインサート変異体をButyl 650M樹脂で精製するために用いられている。
【0193】
実施例23
Phenyl 650M樹脂を用いた疎水性相互作用クロマトグラフィー
IL-29 C172Sタンパク質を含む捕捉プールを、50mM酢酸ナトリウム、2.0M (NH4)2SO4、pH 5.5による2倍希釈を行うことによって、1.0M (NH4)2SO4に調整した。不溶性材料を除去するために、この溶液を0.45μmフィルターに通した。濾過され、調整されたHICローディング溶液を、50mM酢酸ナトリウム、1.5M (NH4)2SO4、pH 5.5によってあらかじめ平衡化したToyoPearl Phenyl 650M(Tosoh Bioscience)カラムに対して適用した。この場合には、5Lの発酵ブロスから生じたIL-29を精製するために、高さ10cm×直径10cmのカラム(CV 0.785L)を室温にて150cm/hrで動作させた(樹脂1リットル当たり7.0gのIL-29をローディングした)。このHICカラムを、非結合材料を除去するために平衡化緩衝液によって洗浄し、続いてIL-29を、カラム容積(CV)の10倍を用いる50mM酢酸ナトリウム、pH 5.5への直線勾配によって溶出させた。実質的に同様な段階溶出法が、天然型IL-29をPhenyl 650M樹脂で精製するために用いられている。
【0194】
実施例24
他のHIC樹脂を用いた疎水性相互作用クロマトグラフィー
IL-29 C172Sタンパク質を含む捕捉プールを、50mM酢酸ナトリウム、3.0M (NH4)2SO4、pH 5.5による2倍希釈を行うことによって、1.5M (NH4)2SO4に調整した。不溶性材料を除去するために、この溶液を0.45μmフィルターに通した。濾過され、調整されたHICローディング溶液を分け、50mM酢酸ナトリウム、1.5M (NH4)2SO4、pH 5.5によってそれぞれあらかじめ平衡化した6種の別々のカラムにローディングした。検討した樹脂には以下が含まれる:Ether 650M(Tosoh Bioscience)、PPG 600M(Tosoh Bioscience)、Octyl Sepharose(GE Healthcare)、Phenyl Sepharose 6 Fast Flow(低置換バージョン、GE Healthcare)、Butyl Sepharose 4 Fast Flow(GE Healthcare)およびPhenyl Sepharose 6 Fast Flow(高置換バージョン、GE Healthcare)。この場合には、樹脂1リットル当たりIL-29 5gのロード率のIL-29を精製するために、それぞれ高さ8cm×直径1.6cmのカラム(CV 16mL)を室温にて150cm/hrで動作させた。それぞれのHICカラムを、非結合材料を除去するために平衡化緩衝液によって洗浄し、続いてIL-29を、カラム容積(CV)の10倍を用いる50mM酢酸ナトリウム、pH 5.5への直線勾配によって溶出させた。
【0195】
実施例25
高性能陽イオン交換クロマトグラフィーによるIL-29の精製
IL-29 C172S d2-7を含むHIC溶出液プールを水で6倍に希釈した後に0.2μmで濾過し、50mM酢酸ナトリウム、300mM塩化ナトリウム、pH 5.5によって平衡化したSP Sepharose HP(GE Healthcare)カラムに適用した。この場合には、樹脂1リットル当たりIL-29 15.6gのロード率でローディングした後にIL-29を精製するために、高さ16cm×直径10cmのカラム(CV 1.26L)を125cm/hrで動作させた。この高性能陽イオン交換カラムを平衡化緩衝液によって洗浄し、続いてCVの20倍を用いた50mM酢酸ナトリウム、800mM塩化ナトリウム、pH 5.5への直線勾配によって溶出させた。280nmの吸光度に基づき、CV画分の1/3を溶出ピークの前端の0.1AUから後端の0.1AUにかけて採取した。280nmの吸光度の測定を各画分について行い、A280が最大である画分を同定した。プール化のためには、上り勾配での最大OD280の少なくとも20%を含む画分から、下り勾配での最大OD280の少なくとも80%を含むものまでをまとめた。同様の方法が、C172SおよびC172Sロイシンインサート型のIL-29を精製するために用いられている。
【0196】
または、IL-29をカラムから移動させるために、均一濃度塩溶出を用いることもできる。この実施例では、希釈し濾過したHICプールからIL-29を精製するために、SP Sepharose HP(GE Healthcare)の高さ15.8cm×直径1.6cmのカラム(CV 31.6mL)を、150cm/hrで用いる。カラムを50mM酢酸ナトリウム、300mM塩化ナトリウム、pH 5.5によって平衡化し、続いて304mgのIL-29(樹脂1L当たりIL-29 9.6g)をローディングする。平衡化緩衝液で洗浄した後に、結合したIL-29を、CVの10倍の450mM NaCl、50mM酢酸ナトリウム中、pH 5.5を用いる段階によって溶出させる。
【0197】
実施例26
他の陽イオン交換樹脂を用いたIL-29の精製
天然型IL-29を含む捕捉プールを、50mM酢酸ナトリウム、pH 5.5によって導電率が40mS/cm未満となるまで希釈し、続いてカラムローディング物を作製するために濾過した。濾過され、調整された溶液を分け、塩化ナトリウムを含む50mM酢酸ナトリウム、pH 5.5によってそれぞれあらかじめ平衡化した2種の別々のカラムにローディングした。検討した樹脂には以下が含まれる:CM Sepharose Fast Flow(GE Healthcare)およびFractogel SO3-(EMD Biosciences)。この場合には、樹脂1リットル当たりIL-29 5gのロード率でカラムにローディングした後のIL-29を精製するために、それぞれ高さ8cm×直径1.6cmのカラム(CV 16.1ml)を室温にて150cm/hrで動作させた。それぞれの陽イオン交換カラムを、非結合材料を除去するために平衡化緩衝液によって洗浄し、続いてIL-29を、カラム容積(CV)の20倍をかけて50mM酢酸ナトリウム、pH 5.5中の塩濃度を上昇させる直線勾配によって溶出させた。CM Sepharoseカラムの場合は勾配は100〜800mMの塩化ナトリウムにわたり、一方、Fractogel樹脂の場合は勾配は400mM〜2Mの塩化ナトリウムであった。
【0198】
実施例27
疎水性荷電誘導クロマトグラフィーによるIL-29の精製
IL-29 C172Sを含むHIC溶出液プールを濃縮し、緩衝液を50mM Tris、100mM NaCl、pH 8に交換した。この材料を、50mM Tris、100mM NaCl、pH 8によってあらかじめ平衡化したメルカプトエチルピリジン(MEP)HyperCel(BioSepra)カラムに適用した。この場合には、樹脂1リットル当たりIL-29 10gのロード率のIL-29を精製するために、高さ6cm×直径1.1cmのカラム(CV 5.7mL)を90cm/hrで動作させた。MEP HyperCel樹脂を平衡化緩衝液、pH 8によって洗浄し、続いてクエン酸-リン酸緩衝液、pH 6.5によって洗浄した。続いて、組換えIL-29を、CVの10倍を用いるクエン酸-リン酸緩衝液、pH 4.5への直線勾配によってHClC樹脂から溶出させた。
【0199】
実施例28
固定化金属アフィニティークロマトグラフィーによるIL-29の精製
天然型のIL-29を含む捕捉プールを、あらかじめ(硫酸銅からの)銅によって荷電させ、50mM酢酸ナトリウム、800mM塩化ナトリウム、pH 5.5によって平衡化したChelating Sepharose(GE Healthcare)カラムに適用した。樹脂1リットル当たりのIL-29がほぼ5gのロード率のIL-29を精製するために、高さ8cm×直径1.6cmのカラム(CV 16.1mL)を150cm/hrで動作させた。銅キレート化された樹脂を平衡化緩衝液によって洗浄し、CVの10倍を用いる25mM酢酸ナトリウム、800mM塩化ナトリウム、500mMイミダゾール、pH 5.5を含む緩衝液への直線勾配によってIL-29を溶出させた。同様の結果が、(硫酸ニッケルからの)ニッケルまたは(塩化亜鉛からの)亜鉛のいずれかをキレート化される二価陽イオンとして用いた場合に得られている。
【0200】
実施例29
精製されたIL-29バルク中間体の濃縮
SPHPプールを、5kDa分子量カットオフのポリエーテルスルホン製タンジェンシャルフロー濾過(TFF)プレート・フレーム膜をほぼ20psiの膜間圧で用いて約2〜3倍に濃縮した。ここで述べる10L規模の工程のためには、0.1m2の膜面積および15L/hrの投入流量を用いた。保持物質を15mg/mLに濃縮した後に、それをTFFシステムから取り出し、システムを50mM酢酸ナトリウム、pH 5.5ですすぎ洗いした。すすぎ洗い液を濃縮された保持物質と合わせて、ほぼ12.5mg/mLの最終濃度が得られた。続いてこの溶液を0.2μm膜に通して濾過した後に、適切な容器に充填して、その後のPEG化反応のためにほぼ-60℃以下に準備して保存する。
【0201】
実施例30
20kDa直鎖状mPEG-プロピオンアルデヒドによるIL-29のPEG化
PEG化反応の準備として、IL-29バルク中間体を解凍させて反応容器に移した。希釈用の緩衝液である、100mMのシアノ水素化ホウ素ナトリウム還元剤保存溶液および100g/Lの誘導体化PEG(20kDa直鎖状メトキシPEGプロピオンアルデヒド)保存溶液を反応物に添加して、50mM酢酸ナトリウム緩衝液中に5g/LのIL-29、10g/Lの誘導体化PEG(モル比でIL-29が1に対してPEGが2)および20mMシアノ水素化ホウ素ナトリウム、pH 5.5を含む混合物を作製した。この実施例では、13.54g/LのIL-29バルク中間体16g(容積1.18L)を1.06Lの50mM酢酸ナトリウム、pH 5.5、0.64Lの100mM還元剤保存液および0.32Lの100g/L PEG保存液と混合して、上記の反応パラメーターを有する容積3.2Lを作製した。反応を、弱い照明下にて20℃でほぼ18時間混合しながら進行させた。これらの反応条件は、C172Sロイシンインサート型またはC172S d2-7型の組換えIL-29を出発材料として用いた場合に、65〜75%のモノペグ化IL-29と、それぞれ10〜20%の非PEG化種および多PEG化種との混合物を生じさせた。同様の結果は、IL-29を3g/Lの濃度で、50mM酢酸ナトリウム緩衝液中の6g/Lの誘導体化PEG(モル比でIL-29が1に対してPEGが2)および20mMシアノ水素化ホウ素ナトリウム、pH 5.5と反応させた場合にも得られている。
【0202】
実施例31
30kDa直鎖状mPEG-プロピオンアルデヒドによるIL-29のPEG化
PEG化反応の準備として、IL-29バルク中間体を解凍させて反応容器に移した。希釈用の緩衝液である、100mMのシアノ水素化ホウ素ナトリウム還元剤保存溶液および150g/Lの誘導体化PEG(30kDa直鎖状メトキシPEGプロピオンアルデヒド)保存溶液を反応物に添加して、50mM酢酸ナトリウム緩衝液中に5g/LのIL-29、15g/Lの誘導体化PEG(モル比でIL-29が1に対してPEGが2)および20mMシアノ水素化ホウ素ナトリウム、pH 5.5を含む混合物を作製した。この実施例では、12.8g/LのIL-29 C172S バルク中間体2.5mg(容積195μL)を155μLの50mM酢酸ナトリウム、pH 5.5、100μLの100mM還元剤保存液および50μLの150g/L PEG保存液と混合して、上記の反応パラメーターを有する容積0.5mLを作製した。反応を、弱い照明下にて20℃でほぼ18時間混合しながら進行させた。これらの反応条件は、モノペグ化IL-29が、5g/L IL-29と20kDaバージョンのmPEG-プロピオンアルデヒドとの2:1のPEG:タンパク質反応と対比して同等なレベルにある混合物を生じさせた。
【0203】
実施例32
高性能陽イオン交換クロマトグラフィーによるPEG-IL-29の精製
PEG反応が完了した後に、反応混合物を50mM酢酸ナトリウム、pH 5.5によって2倍に希釈した上で0.2μmで濾過し、50mM酢酸ナトリウム、200mM塩化ナトリウム、pH 5.5によって平衡化したSP Sepharose HP(GE Healthcare)カラムにローディングした。この実施例では、8gのIL-29を用いるPEG反応によって生じたPEG-IL-29を精製するために、高さ16cm×直径10cmのカラム(CV 1.26L)を125cm/hrで動作させた。この高性能陽イオン交換カラムを平衡化緩衝液によって洗浄し、続いてCVの10倍をかけた50mM酢酸ナトリウム、500mM塩化ナトリウム、pH 5.5への直線勾配によって溶出させた。280nmの吸光度に基づき、CV画分の1/3を溶出ピークの前端の0.1AUから後端の0.1AUにかけて採取した。逆相HPLCによって画分をモノPEG-IL-29の含有量に関して分析し、少なくとも99%のモノPEG化IL-29を含む画分をプールした。PEG-IL-29がC172Sロイシンインサート型またはC172S d2-7型の分子のいずれに由来するかにかかわらず、同様の結果が得られている。
【0204】
また、PEG-IL-29を、均一濃度法を用いてSP HPカラムから溶出させることもできる。この実施例では、IL-29 C172S d2-7を用いた反応混合物を50mM酢酸ナトリウム、pH 5.5によって2倍に希釈した上で2μmで濾過し、50mM酢酸ナトリウム、200mM塩化ナトリウム、pH 5.5によって平衡化したSP Sepharose HP(GE Healthcare)カラムにローディングした。この場合には、樹脂1リットル当たりIL-29 9gのロード率でカラムにローディングした後にPEG-IL-29を精製するために、高さ15.5cm×直径1.6cmのカラム(CV 31mL)を125cm/hrで動作させた。この高性能陽イオン交換カラムを、CVの5倍の平衡化緩衝液により、およびCVの3倍の50mM酢酸ナトリウム、240mM塩化ナトリウム、pH 5.5を用いる段階により洗浄した。続いてPEG-IL-29を、CVの4倍の400mM塩化ナトリウム、50mM酢酸ナトリウム中、pH 5.5を用いる段階によって溶出させた。
【0205】
実施例33
PEG-IL-29の限外濾過/ダイアフィルトレーション
モノペグ化IL-29を含むSP HP溶出液プールを、膜間圧がほぼ20psiである5kDa分子量カットオフのポリエーテルスルホン製プレート・フレーム膜を備えたタンジェンシャルフロー濾過システムにおける限外濾過によって濃縮した。ここで述べる7.7g規模の工程のためには、0.1m2の膜面積および15L/hrの投入流量を用いた。保持物質をほぼ15〜20mg/mLに濃縮した後に、それを透析容積の7倍の調合緩衝液に対してダイアフィルトレーションさせた。調合されたバルク体をTFFシステムから取り出し、システムを調合緩衝液ですすぎ洗いした。すすぎ洗い液を濃縮された保持物質と合わせて、ほぼ12〜14mg/mLの最終濃度が得られた。続いてこの溶液を0.2μm膜に通して濾過した後に、適切な容器に充填して、PEG-IL-29バルク原薬を作製するために≦-60℃以下で保存した。
【0206】
本明細書で引用した、すべての特許、特許出願および刊行物、ならびに電子的に入手可能な材料(例えば、GenBankアミノ酸およびヌクレオチド配列寄託物)の全開示内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。前述した詳細な説明および実施例は、理解をしやすくするためにのみ提示されている。不必要な限定をそれらから解釈すべきではない。本発明は提示および記載がなされた厳密な詳細に限定されるのではなく、当業者にとって明白な変更は特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲に含まれるものと考えられる。

【特許請求の範囲】
【請求項1】
IL-29ポリペプチドを生産する方法であって、
以下の段階を含む方法:
(a)誘導性プロモーターと機能的に連結されたIL-29ポリペプチドをコードする核酸分子を含む原核宿主細胞を、第1の増殖培地中にて、コードされるIL-29ポリペプチドを振盪フラスコ内でOD600が5〜20となるまで発現させる条件下で培養する段階;
(b)宿主細胞を含む1〜5% v/vの振盪フラスコ培地を発酵容器に接種する段階;
(c)宿主細胞をpH 6.2〜7.2の第2の増殖培地中で培養する段階であり、6〜8時間の発酵経過時間の時点で発酵容器に炭水化物供給溶液を供給する段階;
(d)20〜30時間の発酵経過時間の時点で誘導物質を発酵容器に添加する段階;および
(e)48〜56時間の発酵経過時間の時点で原核宿主細胞を収集する段階。
【請求項2】
炭水化物供給溶液がグリセロールまたはグルコースを10〜30g/L増殖培地の濃度で含み、供給速度が1時間につき1リットル当たりグリセロールまたはグルコースが5〜15グラムである、請求項1記載の方法。
【請求項3】
原核宿主細胞が大腸菌(Escherichia coli)である、請求項1記載の方法。
【請求項4】
大腸菌細胞がW3110である、請求項3記載の方法。
【請求項5】
大腸菌細胞がZGOLD1である、請求項3記載の方法。
【請求項6】
大腸菌細胞がOmpT欠損性である、請求項3記載の方法。
【請求項7】
大腸菌細胞がZGOLD5である、請求項3記載の方法。
【請求項8】
大腸菌細胞がfhuA欠損性である、請求項3記載の方法。
【請求項9】
大腸菌細胞がOmpTおよびfhuA欠損性である、請求項3記載の方法。
【請求項10】
コードされるIL-29ポリペプチドが、SEQ ID NO:2、4、6、8、10および12からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項11】
段階(d)の誘導物質がイソプロピルチオガラクトピラノシドである、請求項1記載の方法。
【請求項12】
イソプロピルチオガラクトピラノシドが0.5mM〜2mMの濃度で培養物に添加される、請求項11記載の方法。
【請求項13】
IL-29ポリペプチドを原核宿主細胞から回収するための方法であって、
以下の段階を含む方法:
(a)誘導性プロモーターと機能的に連結されたIL-29ポリペプチドをコードする核酸分子を含む原核宿主細胞を、増殖培地中にて、コードされるIL-29ポリペプチドを発現させる条件下で培養する段階;
(b)IL-29ポリペプチドの発現を誘導するために誘導物質を添加する段階;
(c)原核宿主細胞を収集する段階;
(d)原核宿主細胞を溶解させる段階;
(e)溶解された原核宿主細胞を遠心分離する段階;
(f)封入体ペレットを回収する段階;
(g)封入体ペレットを4〜6Mの塩酸グアニジンおよび10〜50mMのジチオトレイトール中にて15〜25℃で1〜2時間にわたり可溶化する段階;および
(h)可溶化されたIL-29ポリペプチドを、0.05〜0.5%のポリエチレングリコール、塩、0.5M〜1.25Mのアルギニンおよび還元された分子と酸化された分子との混合物を含むリフォールディング緩衝液に温度4〜30℃およびpH 7.3〜8.5にて1〜26時間にわたり添加する段階であり、可溶化されたIL-29ポリペプチドがリフォールディングされる段階;
(i)pHを5.5〜6.5に調整することによってリフォールディング反応を停止させる段階;
(j)反応停止したリフォールディング溶液を水またはpH 5〜7の低イオン強度緩衝液で1.5〜10倍に希釈する段階;および
(k)反応停止し希釈したリフォールディング溶液を、沈殿物または粒子状物質を除去するためにフィルターで濾過する段階。
【請求項14】
段階(d)の原核宿主細胞がホモジナイゼーションによって溶解される、請求項13記載の方法。
【請求項15】
段階(e)の溶解された原核宿主細胞が、バッチ遠心法または連続遠心法のいずれかによって遠心分離される、請求項13記載の方法。
【請求項16】
段階(h)のIL-29ポリペプチドが、リフォールディング緩衝液に0.05〜3.0mg/mlの最終濃度まで添加される、請求項13記載の方法。
【請求項17】
リフォールディング緩衝液の還元された分子と酸化された分子との混合物が、システインとシスチン、ジチオトレイトールとシスチン、還元グルタチオンと酸化グルタチオン、およびジチオトレイトールと酸化グルタチオンからなる群より選択される、請求項13記載の方法。
【請求項18】
IL-29ポリペプチドを精製する方法であって、
以下の段階を含む方法:
(a)請求項13の段階(k)に従ってIL-29ポリペプチドを提供する段階;
(b)段階(a)のリフォールディングしたIL-29ポリペプチドを含む濾過溶液を、pH 5.5の酢酸ナトリウムによって平衡化された陽イオン交換クロマトグラフィーカラムにローディングする段階;
(c)結合したIL-29ポリペプチドを、酢酸ナトリウム中の塩化ナトリウム、pH 5.5によって溶出させる段階;および
(d)溶出液を硫酸アンモニウムによって1Mの濃度に調整して、調整されたIL-29ポリペプチド溶出液を0.45μmフィルターに通す段階。
【請求項19】
IL-29ポリペプチドが、0〜2Mの塩化ナトリウムの直線勾配溶出を用いた後に約0.7M〜0.8Mの塩化ナトリウムのプールを形成するように、陽イオン交換カラムから溶出する、請求項18記載の方法。
【請求項20】
以下の段階をさらに含む、請求項18記載の方法:
(e)段階(d)のIL-29ポリペプチドを、50mM酢酸ナトリウム、1.5M硫酸アンモニウム、pH 5.5によって平衡化された疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムにローディングする段階;
(f)直線性50mM酢酸ナトリウム、1.5M硫酸アンモニウムから硫酸アンモニウムを含まない50mM酢酸ナトリウムまでを、pH 5.5でIL-29ポリペプチドを溶出させる段階;
(g)溶出液を水または低イオン強度緩衝液によって約6倍に希釈して、希釈したIL-29ポリペプチド溶出液を0.2μmまたは0.45μmのフィルターに通す段階。
【請求項21】
IL-29ポリペプチドが、疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムから約0.75M硫酸アンモニウム〜0M硫酸アンモニウムで溶出する、請求項20記載の方法。
【請求項22】
以下の段階をさらに含む、請求項20記載の方法:
(h)段階(g)のIL-29ポリペプチドを、0〜300mMの塩化ナトリウム、pH 5.5を含む50mM酢酸ナトリウムによって平衡化された高性能陽イオン交換クロマトグラフィーカラムにローディングする段階;および
(i)IL-29ポリペプチドを、50mM酢酸ナトリウム中のより高濃度の塩化ナトリウム、pH 5.5によって段階溶出または勾配溶出の方式で溶出させる段階。
【請求項23】
IL-29ポリペプチドが、300〜800mMの塩化ナトリウムの勾配溶出を用いた後に約0.4Mの塩化ナトリウム〜0.6M塩化ナトリウムで高性能陽イオン交換クロマトグラフィーカラムから溶出する、請求項22記載の方法。
【請求項24】
IL-29ポリペプチドを濃縮する方法であって、
以下の段階を含む方法:
(a)請求項22の段階(i)に従ってIL-29ポリペプチドを提供する段階;
(b)IL-29ポリペプチドを、1つまたは複数の3〜10kDa分子量カットオフ膜を含むタンジェンシャルフロー濾過プレート・フレームシステムに添加する段階;
(c)溶液をより高濃度に限外濾過するために15〜25psiの膜間圧をシステムに印加する段階;および
(c)濃縮されたIL-29ポリペプチドを0.2μm膜に通して濾過する段階。
【請求項25】
IL-29ポリペプチドをモノペグ化する方法であって、
以下の段階を含む方法:
(a)酢酸ナトリウム緩衝液中にある3〜5g/LのIL-29ポリペプチドを提供する段階;
(b)10〜20mMのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを段階(a)の溶液に添加する段階;
(c)2倍モル過剰の誘導体化ポリエチレングリコールを段階(b)の溶液に添加する段階;および
(d)段階(c)の溶液を16〜20℃で10〜18時間にわたり混合する段階。
【請求項26】
モノペグ化IL-29ポリペプチドを精製する方法であって、
以下の段階を含む方法:
(e)請求項25の段階(d)に従ってモノペグ化IL-29ポリペプチドを提供する段階;
(f)段階(e)の溶液を50mM酢酸ナトリウム、pH 5.5によって2倍に希釈する段階;
(g)段階(f)の溶液を0.2μm膜に通して濾過する段階;
(h)段階(g)の溶液を、50mM酢酸ナトリウム、200mM塩化ナトリウム、pH 5.5によって平衡化された高性能陽イオン交換クロマトグラフィーカラムにローディングする段階;
(i)モノペグ化IL-29ポリペプチドを、50mM酢酸ナトリウム、500mM塩化ナトリウム、pH 5.5の直線勾配によって高性能陽イオン交換クロマトグラフィーカラムから溶出させる段階;
(j)モノペグ化IL-29ポリペプチドを、1つまたは複数の3〜10kDa分子量カットオフ膜を含むタンジェンシャルフロー濾過プレート・フレームシステムに添加する段階;
(k)溶液をより高濃度に限外濾過するために15〜25psiの膜間圧をシステムに印加する段階;
(l)ダイアフィルトレーションによる、濃縮されたIL-29ポリペプチドの適切な調合緩衝液への緩衝液交換のためにシステムを用いる段階;および
(m)濃縮されたモノペグ化IL-29ポリペプチドを0.2μm膜に通して濾過する段階。
【請求項27】
ポリエチレングリコールが、20kDaまたは30kDaのモノ-メトキシPEG-プロピオンアルデヒドを含む、請求項26記載の方法。
【請求項28】
ポリエチレングリコールがIL-29ポリペプチドとN末端で結合している、請求項26記載の方法。
【請求項29】
IL-29ポリペプチドがドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル分析によって少なくとも98%の純度であり、凝集物がサイズ排除HPLCによって0.2%未満である、請求項22記載の方法。
【請求項30】
IL-29ペプチドがドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル分析によって少なくとも98%の純度であり、凝集物がサイズ排除HPLCによって0.2%未満である、請求項24記載の方法。
【請求項31】
IL-29ポリペプチドのエンドトキシンレベルが、USP <85>に基づくリムルス・アメーバ様細胞(Limulus amoebocyte)溶解物アッセイ法においてIL-29ポリペプチド1mg当たり10エンドトキシン単位未満である、請求項24記載の方法。
【請求項32】
モノペグ化IL-29ポリペプチドが、逆相HPLCによる測定で少なくとも99%のモノペグ化される、請求項25記載の方法。
【請求項33】
請求項1記載の方法によって生産されたIL-29ポリペプチド。
【請求項34】
請求項22記載の方法によって生産されたIL-29ポリペプチド。
【請求項35】
請求項24記載の方法によって生産されたIL-29ポリペプチド。
【請求項36】
請求項25記載の方法によって生産されたモノペグ化IL-29ポリペプチド。
【請求項37】
請求項26記載の方法によって生産された、精製されたモノペグ化IL-29ポリペプチド。

【公開番号】特開2013−99337(P2013−99337A)
【公開日】平成25年5月23日(2013.5.23)
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願2012−284581(P2012−284581)
【出願日】平成24年12月27日(2012.12.27)
【分割の表示】特願2008−534712(P2008−534712)の分割
【原出願日】平成18年10月4日(2006.10.4)
【出願人】(509354341)ザイモジェネティクス リミテッド ライアビリティ カンパニー (4)
【出願人】(509054371)ブリストル−マイヤーズ スクウィブ カンパニー (10)
【Fターム(参考)】