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IL−29の生産および精製の方法
説明

IL−29の生産および精製の方法

【課題】IL-29の大規模生産のための、発現ベクター、および大腸菌発現系を用いる方法を提供する。
【解決手段】大腸菌における翻訳用にコドンおよびmRNA二次構造を最適化するためにヌクレオチド中に特定の変化を有するIL-29コード配列。IL-29ポリペプチドの生産、精製およびペグ化の方法。


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【特許請求の範囲】
【請求項1】
IL-29ポリペプチドを生産する方法であって、
以下の段階を含む方法:
(a)誘導性プロモーターと機能的に連結されたIL-29ポリペプチドをコードする核酸分子を含む原核宿主細胞を、第1の増殖培地中にて、コードされるIL-29ポリペプチドを振盪フラスコ内でOD600が5〜20となるまで発現させる条件下で培養する段階;
(b)宿主細胞を含む1〜5% v/vの振盪フラスコ培地を発酵容器に接種する段階;
(c)宿主細胞をpH 6.2〜7.2の第2の増殖培地中で培養する段階であり、6〜8時間の発酵経過時間の時点で発酵容器に炭水化物供給溶液を供給する段階;
(d)20〜30時間の発酵経過時間の時点で誘導物質を発酵容器に添加する段階;および
(e)48〜56時間の発酵経過時間の時点で原核宿主細胞を収集する段階。
【請求項2】
炭水化物供給溶液がグリセロールまたはグルコースを10〜30g/L増殖培地の濃度で含み、供給速度が1時間につき1リットル当たりグリセロールまたはグルコースが5〜15グラムである、請求項1記載の方法。
【請求項3】
原核宿主細胞が大腸菌(Escherichia coli)である、請求項1記載の方法。
【請求項4】
大腸菌細胞がW3110である、請求項3記載の方法。
【請求項5】
大腸菌細胞がZGOLD1である、請求項3記載の方法。
【請求項6】
大腸菌細胞がOmpT欠損性である、請求項3記載の方法。
【請求項7】
大腸菌細胞がZGOLD5である、請求項3記載の方法。
【請求項8】
大腸菌細胞がfhuA欠損性である、請求項3記載の方法。
【請求項9】
大腸菌細胞がOmpTおよびfhuA欠損性である、請求項3記載の方法。
【請求項10】
コードされるIL-29ポリペプチドが、SEQ ID NO:2、4、6、8、10および12からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項11】
段階(d)の誘導物質がイソプロピルチオガラクトピラノシドである、請求項1記載の方法。
【請求項12】
イソプロピルチオガラクトピラノシドが0.5mM〜2mMの濃度で培養物に添加される、請求項11記載の方法。
【請求項13】
IL-29ポリペプチドを原核宿主細胞から回収するための方法であって、
以下の段階を含む方法:
(a)誘導性プロモーターと機能的に連結されたIL-29ポリペプチドをコードする核酸分子を含む原核宿主細胞を、増殖培地中にて、コードされるIL-29ポリペプチドを発現させる条件下で培養する段階;
(b)IL-29ポリペプチドの発現を誘導するために誘導物質を添加する段階;
(c)原核宿主細胞を収集する段階;
(d)原核宿主細胞を溶解させる段階;
(e)溶解された原核宿主細胞を遠心分離する段階;
(f)封入体ペレットを回収する段階;
(g)封入体ペレットを4〜6Mの塩酸グアニジンおよび10〜50mMのジチオトレイトール中にて15〜25℃で1〜2時間にわたり可溶化する段階;および
(h)可溶化されたIL-29ポリペプチドを、0.05〜0.5%のポリエチレングリコール、塩、0.5M〜1.25Mのアルギニンおよび還元された分子と酸化された分子との混合物を含むリフォールディング緩衝液に温度4〜30℃およびpH 7.3〜8.5にて1〜26時間にわたり添加する段階であり、可溶化されたIL-29ポリペプチドがリフォールディングされる段階;
(i)pHを5.5〜6.5に調整することによってリフォールディング反応を停止させる段階;
(j)反応停止したリフォールディング溶液を水またはpH 5〜7の低イオン強度緩衝液で1.5〜10倍に希釈する段階;および
(k)反応停止し希釈したリフォールディング溶液を、沈殿物または粒子状物質を除去するためにフィルターで濾過する段階。
【請求項14】
段階(d)の原核宿主細胞がホモジナイゼーションによって溶解される、請求項13記載の方法。
【請求項15】
段階(e)の溶解された原核宿主細胞が、バッチ遠心法または連続遠心法のいずれかによって遠心分離される、請求項13記載の方法。
【請求項16】
段階(h)のIL-29ポリペプチドが、リフォールディング緩衝液に0.05〜3.0mg/mlの最終濃度まで添加される、請求項13記載の方法。
【請求項17】
リフォールディング緩衝液の還元された分子と酸化された分子との混合物が、システインとシスチン、ジチオトレイトールとシスチン、還元グルタチオンと酸化グルタチオン、およびジチオトレイトールと酸化グルタチオンからなる群より選択される、請求項13記載の方法。
【請求項18】
IL-29ポリペプチドを精製する方法であって、
以下の段階を含む方法:
(a)請求項13の段階(k)に従ってIL-29ポリペプチドを提供する段階;
(b)段階(a)のリフォールディングしたIL-29ポリペプチドを含む濾過溶液を、pH 5.5の酢酸ナトリウムによって平衡化された陽イオン交換クロマトグラフィーカラムにローディングする段階;
(c)結合したIL-29ポリペプチドを、酢酸ナトリウム中の塩化ナトリウム、pH 5.5によって溶出させる段階;および
(d)溶出液を硫酸アンモニウムによって1Mの濃度に調整して、調整されたIL-29ポリペプチド溶出液を0.45μmフィルターに通す段階。
【請求項19】
IL-29ポリペプチドが、0〜2Mの塩化ナトリウムの直線勾配溶出を用いた後に約0.7M〜0.8Mの塩化ナトリウムのプールを形成するように、陽イオン交換カラムから溶出する、請求項18記載の方法。
【請求項20】
以下の段階をさらに含む、請求項18記載の方法:
(e)段階(d)のIL-29ポリペプチドを、50mM酢酸ナトリウム、1.5M硫酸アンモニウム、pH 5.5によって平衡化された疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムにローディングする段階;
(f)直線性50mM酢酸ナトリウム、1.5M硫酸アンモニウムから硫酸アンモニウムを含まない50mM酢酸ナトリウムまでを、pH 5.5でIL-29ポリペプチドを溶出させる段階;
(g)溶出液を水または低イオン強度緩衝液によって約6倍に希釈して、希釈したIL-29ポリペプチド溶出液を0.2μmまたは0.45μmのフィルターに通す段階。
【請求項21】
IL-29ポリペプチドが、疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムから約0.75M硫酸アンモニウム〜0M硫酸アンモニウムで溶出する、請求項20記載の方法。
【請求項22】
以下の段階をさらに含む、請求項20記載の方法:
(h)段階(g)のIL-29ポリペプチドを、0〜300mMの塩化ナトリウム、pH 5.5を含む50mM酢酸ナトリウムによって平衡化された高性能陽イオン交換クロマトグラフィーカラムにローディングする段階;および
(i)IL-29ポリペプチドを、50mM酢酸ナトリウム中のより高濃度の塩化ナトリウム、pH 5.5によって段階溶出または勾配溶出の方式で溶出させる段階。
【請求項23】
IL-29ポリペプチドが、300〜800mMの塩化ナトリウムの勾配溶出を用いた後に約0.4Mの塩化ナトリウム〜0.6M塩化ナトリウムで高性能陽イオン交換クロマトグラフィーカラムから溶出する、請求項22記載の方法。
【請求項24】
IL-29ポリペプチドを濃縮する方法であって、
以下の段階を含む方法:
(a)請求項22の段階(i)に従ってIL-29ポリペプチドを提供する段階;
(b)IL-29ポリペプチドを、1つまたは複数の3〜10kDa分子量カットオフ膜を含むタンジェンシャルフロー濾過プレート・フレームシステムに添加する段階;
(c)溶液をより高濃度に限外濾過するために15〜25psiの膜間圧をシステムに印加する段階;および
(c)濃縮されたIL-29ポリペプチドを0.2μm膜に通して濾過する段階。
【請求項25】
IL-29ポリペプチドをモノペグ化する方法であって、
以下の段階を含む方法:
(a)酢酸ナトリウム緩衝液中にある3〜5g/LのIL-29ポリペプチドを提供する段階;
(b)10〜20mMのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを段階(a)の溶液に添加する段階;
(c)2倍モル過剰の誘導体化ポリエチレングリコールを段階(b)の溶液に添加する段階;および
(d)段階(c)の溶液を16〜20℃で10〜18時間にわたり混合する段階。
【請求項26】
モノペグ化IL-29ポリペプチドを精製する方法であって、
以下の段階を含む方法:
(e)請求項25の段階(d)に従ってモノペグ化IL-29ポリペプチドを提供する段階;
(f)段階(e)の溶液を50mM酢酸ナトリウム、pH 5.5によって2倍に希釈する段階;
(g)段階(f)の溶液を0.2μm膜に通して濾過する段階;
(h)段階(g)の溶液を、50mM酢酸ナトリウム、200mM塩化ナトリウム、pH 5.5によって平衡化された高性能陽イオン交換クロマトグラフィーカラムにローディングする段階;
(i)モノペグ化IL-29ポリペプチドを、50mM酢酸ナトリウム、500mM塩化ナトリウム、pH 5.5の直線勾配によって高性能陽イオン交換クロマトグラフィーカラムから溶出させる段階;
(j)モノペグ化IL-29ポリペプチドを、1つまたは複数の3〜10kDa分子量カットオフ膜を含むタンジェンシャルフロー濾過プレート・フレームシステムに添加する段階;
(k)溶液をより高濃度に限外濾過するために15〜25psiの膜間圧をシステムに印加する段階;
(l)ダイアフィルトレーションによる、濃縮されたIL-29ポリペプチドの適切な調合緩衝液への緩衝液交換のためにシステムを用いる段階;および
(m)濃縮されたモノペグ化IL-29ポリペプチドを0.2μm膜に通して濾過する段階。
【請求項27】
ポリエチレングリコールが、20kDaまたは30kDaのモノ-メトキシPEG-プロピオンアルデヒドを含む、請求項26記載の方法。
【請求項28】
ポリエチレングリコールがIL-29ポリペプチドとN末端で結合している、請求項26記載の方法。
【請求項29】
IL-29ポリペプチドがドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル分析によって少なくとも98%の純度であり、凝集物がサイズ排除HPLCによって0.2%未満である、請求項22記載の方法。
【請求項30】
IL-29ペプチドがドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル分析によって少なくとも98%の純度であり、凝集物がサイズ排除HPLCによって0.2%未満である、請求項24記載の方法。
【請求項31】
IL-29ポリペプチドのエンドトキシンレベルが、USP <85>に基づくリムルス・アメーバ様細胞(Limulus amoebocyte)溶解物アッセイ法においてIL-29ポリペプチド1mg当たり10エンドトキシン単位未満である、請求項24記載の方法。
【請求項32】
モノペグ化IL-29ポリペプチドが、逆相HPLCによる測定で少なくとも99%のモノペグ化される、請求項25記載の方法。
【請求項33】
請求項1記載の方法によって生産されたIL-29ポリペプチド。
【請求項34】
請求項22記載の方法によって生産されたIL-29ポリペプチド。
【請求項35】
請求項24記載の方法によって生産されたIL-29ポリペプチド。
【請求項36】
請求項25記載の方法によって生産されたモノペグ化IL-29ポリペプチド。
【請求項37】
請求項26記載の方法によって生産された、精製されたモノペグ化IL-29ポリペプチド。

【公開番号】特開2013−99337(P2013−99337A)
【公開日】平成25年5月23日(2013.5.23)
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願2012−284581(P2012−284581)
【出願日】平成24年12月27日(2012.12.27)
【分割の表示】特願2008−534712(P2008−534712)の分割
【原出願日】平成18年10月4日(2006.10.4)
【出願人】(509354341)ザイモジェネティクス リミテッド ライアビリティ カンパニー (4)
【出願人】(509054371)ブリストル−マイヤーズ スクウィブ カンパニー (10)
【Fターム(参考)】