ＩＬ−５により媒介される疾病の治療に有用な組み換えＩＬ−５アンタゴニスト
【課題】ヒト・インターロイキン５に対する中和モノクローナル抗体のごとき高アフィニティーＩＬ−５アンタゴニストであって、好酸球の分化および増殖（すなわち、好酸球の蓄積）を抑制し、好酸球による炎症を抑制する高アフィニティーＩＬ−５アンタゴニストを提供する。
【解決手段】重鎖および軽鎖を含んでなるヒト・インターロイキン−５に特異的なヒト化抗体。
【解決手段】重鎖および軽鎖を含んでなるヒト・インターロイキン−５に特異的なヒト化抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、１９９４年１２月２３日出願のＵ.Ｓ.第０８／３６３,１３１号の一部継続出願であるＵ.Ｓ.第０８／４７０,１１０号および０８／４６７,４２０号（ともに１９９５年６月６日出願）の一部継続出願である。
【０００２】
発明の分野
一般的には、本発明は、ＩＬ−５および過剰な好酸球産生により媒介される症状の治療および診断に有用な抗体および変化した抗体、そしてより詳細には、ｍＡｂｓ、Ｆａｂ、キメラおよびヒト化抗体の分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
好酸球は、肺組織の過敏反応に関連したアレルギー性疾患を包含する広範囲の炎症性疾病状態の発生に関与している（非特許文献１）。注目すべき例は喘息であり、喘息は、非特異的気管支過敏症を引き起こす気道の可逆的閉塞により特徴づけられる。さらに喘息は、気管支粘膜のレベルの慢性的炎症反応ならびにマクロファージ、リンパ球および好酸球による特徴的な炎症の発生と因果関係がある。好酸球は、疾病の典型的な粘膜ダメージの開始において中心的役割を果たしているようである（非特許文献２）。数が増加した活性化された好酸球は、慢性喘息の患者の循環系、気管支分泌物および肺の実質において報告されており、種々の肺機能試験により測定される疾病の重さは血中好酸球数と相関関係がある（非特許文献３）。また、しばしば、脱顆粒反応の過程における増加した好酸球が、後期喘息反応中の患者気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）中に回収され、通常には、ステロイド療法の結果としての好酸球の減少は臨床的徴候の改善に関連している（非特許文献４）。
【０００４】
インターロイキン５（ＩＬ−５）は、活性化されたＣＤ４およびＴリンパ球により産生されるホモダイマー糖蛋白である。ヒトにおいて、ＩＬ−５は好酸球の増殖および分化の調節に大いに関係している。ＩＬ−５の上昇したレベルは喘息性気管支肺胞洗浄液中に検出される（非特許文献５）。ＩＬ−５に関してトランスジェニックなマウスは、抗原刺激の不存在下の末梢血および組織における著しい好酸球増加を示し（非特許文献６）、抗−ネズミ・ＩＬ−５モノクローナル抗体は、マウスの血液および組織における好酸球増加（非特許文献７）ならびに実験動物における寄生虫感染およびアレルゲン攻撃に関連した好酸球増加（非特許文献８〜１０）の抑制における効果が示されている。
【０００５】
コルチコステロイドは、好酸球数および喘息の他の炎症性成分の減少にきわめて効果的であるが、重い喘息およびより最近になってからは軽い喘息ないしは中程度の喘息のいずれにおいても副作用の心配がある。唯一の他の主要抗−炎症薬剤療法−クロモグリケート類（クロモリンナトリウムおよびネドクロミル）−はコルチコステロイドよりもかなり効果が少なく、それらの正確な作用機構は不明のままである。
【０００６】
より最近の開発は、新たな吸入ステロイド、長時間作用する気管支拡張剤、および新規生化学的もしくは薬理学的標的（例えば、カリウムチャンネル活性化剤、ロイコトリエンアンタゴニスト、５−リポオキシゲナーゼ（５−ＬＯ）阻害剤等）に作用する薬剤に焦点を絞っている。理想的な薬剤は、ステロイドの有効性をクロモリンナトリウムの安全性と結び付けるものであり、選択性が増加していてより迅速に作用を発揮するものである。中和ＩＬ−５抗体は潜在的にヒトにおける好酸球増加関連徴候の軽減に有用でありうる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Butterfieldら,Immunopharmacology of Eosinophils（H.SmithおよびR.Cook編,）中,p151-192,Academic Press, London(1993)
【非特許文献２】Corrigan et al., Immunol.Today,13:501-507(1992)
【非特許文献３】Griffen et al.,J.Aller.Clin.Immunol.67,548-557(1991)
【非特許文献４】Bousquet et al.,N.Eng.J.Med.,323:1033-1039(1990)
【非特許文献５】Motojima et al.,Allergy,48:98(1993)
【非特許文献６】Dent et al.,J.Exp.Med.,172, 1425(1990)
【非特許文献７】Hitoshi et al.,Int.Immunol.,315(1991)
【非特許文献８】Coffman et al.,Science,245,308-310(1989)
【非特許文献９】Sher et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,83:61-65(1990)
【非特許文献１０】Chand et al.,Eur.J.Pharmacol.,211:121-123(1992)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ゆえに、ヒト・インターロイキン５に対する中和モノクローナル抗体のごとき高アフィニティーＩＬ−５アンタゴニストであって、好酸球の分化および増殖（すなわち、好酸球の蓄積）を抑制し、かくして好酸球により炎症を抑制する高アフィニティーＩＬ−５アンタゴニストに対する必要性が当該分野において存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の概要
第１の態様において、本発明は、ヒト・インターロイキン５に特異的で、詳細な説明の欄において説明するように、約３.５ｘ１０−１１Ｍに等しいかまたはそれ未満の解離定数により特徴づけられる結合アフィニティーを有する齧歯類（例えば、ラットおよびマウス）の中和モノクローナル抗体を提供する。かかるモノクローナル抗体の典型例はマウスのモノクローナル抗体２Ｂ６、２Ｅ６および２Ｆ２ならびに４Ａ６のごときラットのモノクローナル抗体である。本発明のもう１つの態様は、ＳＫ１１９−２Ｂ６.２０６.７５（１）、ＳＫ１１９−２Ｅ３.３９.４０.２、ＳＫ１１９−２Ｆ２.３７.８０.１２、４Ａ６（１）Ｇ１Ｆ７および５Ｄ３（１）Ｆ５Ｄ６のごときハイブリドーマである。
【００１０】
関連態様において、本発明は、本発明の齧歯類中和モノクローナル抗体のＦｃ領域を欠失させることにより製造される、ヒト・インターロイキン−５に特異的な中和ＦａｂフラグメントまたはそのＦ（ａｂ'）２フラグメントを提供する。
【００１１】
さらにもう１つの関連態様において、本発明は、チェイン・シャフリング（chain shuffling）法により製造される、ヒト・インターロイキン−５に特異的な中和ＦａｂフラグメントまたはそのＦ（ａｂ'）２フラグメントを提供する。該方法により、線維状ファージＦａｂディスプレイライブラリーにおいてインターロイキン５で免疫された齧歯類から単離された軽鎖（または重鎖）免疫グロブリンライブラリーとともに本発明齧歯類中和モノクローナル抗体から単離された重鎖（または軽鎖）免疫グロブリンが発現される。
【００１２】
さらにもう１つの関連態様において、本発明は、ヒト・インターロイキン５に対して約３.５ｘ１０−１１Ｍに等しいかまたはそれ未満の解離定数により特徴づけられる非ヒト・中和モノクローナル抗体（ｍＡｂ(ｓ)）由来の相補性決定領域（ＣＤＲ(ｓ)）を含んでなる、ヒト・インターロイキン５に特異的な変化した抗体ならびにそれをコードしている核酸分子を提供する。変化した抗体がヒト化抗体である場合には、非ヒト・免疫グロブリン由来の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）をコードしている配列が、少なくとも１つ、好ましくは全部の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）が非ヒト・モノクローナル抗体由来のＣＤＲｓにより置換されている第１の免疫グロブリンパートナー中に挿入される。好ましくは、第１の免疫グロブリンパートナーは、同様に免疫グロブリンの不変鎖全部またはその一部を含んでなる第２の免疫グロブリンパートナーに作動可能に連結される。
【００１３】
関連態様において、本発明は、ヒト・インターロイキン５に対して約３.５ｘ１０−１１Ｍに等しいかまたはそれ未満の解離定数を有すことにより特徴づけられる非ヒト・中和モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）由来のＣＤＲｓ、ならびにかかるＣＤＲｓをコードしている核酸分子を提供する。
【００１４】
さらにもう１つの態様において、ヒト・重鎖および軽鎖の不変領域ならびにヒト・インターロイキン５に対して約３.５ｘ１０−１１Ｍに等しいかまたはそれ未満の解離定数により特徴づけられる非ヒト・中和モノクローナル抗体由来の重鎖および軽鎖の可変領域を含むキメラ抗体を提供する。
【００１５】
さらにもう１つの態様において、本発明は、上記の変化した抗体のうちの１種（またはそれ以上）および医薬上許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【００１６】
さらなる態様において、本発明は、ヒトに有効量の本発明医薬組成物を投与することによる、過剰の好酸球産生に関連したヒトにおける症状の治療方法を提供する。
【００１７】
さらなる態様において、本発明は、ＩＬ−５に対して約３.５ｘ１０−１１Ｍに等しいかまたはそれ未満の解離定数により特徴づけられる非ヒト・中和モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）由来の変化した抗体（例えば、組み換え抗体、ＣＤＲｓ、ＦａｂまたはそのＦ（ａｂ'）２フラグメントもしくはアナログ）の組み換え製造方法および該組み換え製造において有用な成分を提供する。これらの成分は、上記のものをコードしている単離核酸配列、ならびに選択された調節配列の制御下の当該核酸配列を含む組み換えプラスミドを包含し、該調節配列は、該組み換えプラスミドでトランスフェクションされた宿主細胞（好ましくは哺乳動物細胞）における該核酸配列の発現を指令することができるものである。該製造方法は、変化した抗体、好ましくはヒト化抗体がトランスフェクションされた細胞中で発現されるような条件下で本発明のトランスフェクションされた宿主細胞系を培養し、次いで、そこから発現産物を単離することを包含する。
【００１８】
本発明のさらなる態様において、患者から生物学的液体試料を得て、ＩＬ−５／（モノクローナルまたはポリクローナル）抗体複合体が形成されるような条件下で本発明抗体および変化した抗体をかかる試料と接触させ、次いで、該ＩＬ−５／抗体複合体の存在または不存在を検出することを特徴とする、ヒトにおける過剰な好酸球産生に関連した症状の診断方法が提供される。
【００１９】
本発明の他の態様および利点を、詳細な説明および好ましい具体例の欄においてさらに説明する。
【発明の効果】
【００２０】
本発明により、高い結合アフィニティーを有するヒト・インターロイキン５に対する中和モノクローナル抗体などが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１［配列番号：１および１５］は、マウス・抗体２Ｂ６およびマウス／ヒト・２Ｂ６キメラ抗体に関する重鎖可変領域を示す。ボックス領域はＣＤＲｓを示す。
【図２】図２［配列番号：２および１６］は、マウス・抗体２Ｂ６およびマウス／ヒト・２Ｂ６キメラ抗体に関する軽鎖可変領域を示す。ボックス領域はＣＤＲｓを示す。
【図３】図３［配列番号：３］は、マウス・抗体２Ｆ２に関する重鎖可変領域を示す。ボックス領域はＣＤＲｓを示す。
【図４】図４［配列番号：４］は、マウス・抗体２Ｆ２に関する軽鎖可変領域を示す。ボックス領域はＣＤＲｓを示す。
【図５】図５［配列番号：５］は、マウス・抗体２Ｅ３に関する重鎖可変領域を示す。ボックス領域はＣＤＲｓを示す。
【図６】図６［配列番号：６］は、マウス・抗体２Ｅ３に関する軽鎖可変領域を示す。ボックス領域はＣＤＲｓを示す。
【図７】図７［配列番号：７−１４］は、マウス抗体・２Ｂ６、２Ｆ２および２Ｅ３由来の重鎖および軽鎖のＣＤＲｓを示す。
【図８】図８［配列番号：１８、１９］は、ヒト化抗体２Ｂ６に関する重鎖可変領域を示す。ボックス領域はＣＤＲｓを示す。
【図９】図９［配列番号：２０、２１］は、ヒト化抗体２Ｂ６に関する軽鎖可変領域を示す。ボックス領域はＣＤＲｓを示す。
【図１０】図１０は、哺乳動物細胞におけるヒト化重鎖遺伝子の発現に用いるプラスミドｐＣＤＩＬ５ＨＺＨＣ１.０のスキーム図である。該プラスミドはベータラクタマーゼ遺伝子（ＢＥＴＡ ＬＡＣ）、ＳＶ−４０複製開始点（ＳＶ４０）、サイトメガロウイルスプロモーター配列（ＣＭＶ）、シグナル配列、ヒト化重鎖、ウシ・成長ホルモン（ＢＧＨ）由来のポリＡシグナル、ベータグロビンプロモーター（ベータグロプロ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子（ＤＨＦＲ）、およびもう１つのＢＧＨ配列のポリＡシグナルをｐＵＣ１９骨格中に含んでいる。
【図１１】図１１は、哺乳動物細胞におけるヒト化軽鎖遺伝子の発現に用いるプラスミドｐＣＮＩＬ５ＨＺＬＣ１.０のスキーム図である。
【図１２】図１２［配列番号：６１、６２］は、ヒト化抗体２Ｂ６に関するＮｅｗＭ重鎖可変領域を示す。ボックス領域はＣＤＲｓを示す。
【図１３】図１３［配列番号：６９、７０］は、ヒト化抗体２Ｂ６に関するＲＥＩ軽鎖可変領域を示す。ボックス領域はＣＤＲｓを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
発明の詳細な説明
本発明は、マウス・モノクローナル抗体２Ｂ６のおいて例示されるヒト・ＩＬ−５特異性、中和活性、およびヒト・ＩＬ−５に対する高アフィニティーにより特徴づけられる種々の抗体、変化した抗体およびそれらのフラグメントを提供する。新規中和抗体を得るための慣用的なハイブリドーマ法、ファージディスプレイ組み合わせライブラリー、免疫グロブリンのチェイン・シャフリング、およびヒト化法により本発明抗体は製造された。これらの製造物は、例えば喘息のごときＩＬ−５により媒介される疾病の治療のための治療および医薬組成物において有用である。また、これらの製造物は、ヒトにおける内在性ＩＬ−５レベルまたは活性化細胞からex vivoで放出されるＩＬ−５レベルの測定（例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ））による、ＩＬ−５により媒介される症状の診断において有用である。
【００２３】
Ｉ.定義
「変化した抗体」は、変化した免疫グロブリンコーディング領域によりコードされている蛋白をいい、選択された宿主細胞における発現により得ることができる。かかる変化した抗体は遺伝子組み換えによる抗体（例えば、キメラ抗体またはヒト化抗体）または免疫グロブリン不変領域の全部もしくは一部を欠く抗体フラグメント、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、またはＦ（ａｂ'）２等である。
【００２４】
「変化した免疫グロブリンコーディング領域」は、本発明の変化した抗体をコードしている核酸配列をいう。変化した抗体がＣＤＲを継ぎ足した抗体またはヒト化抗体である場合、非ヒト・免疫グロブリン由来の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）をコードしている配列が、ヒト・可変枠組み配列を含んでなる第１の免疫グロブリンパートナー中に挿入される。第１の免疫グロブリンパートナーが第２の免疫グロブリンパートナーに作動可能に連結されていてもよい。
【００２５】
「第１の免疫グロブリンパートナー」は、無傷（または天然に存在する）のＣＤＲコーディング領域がドナー抗体のＣＤＲコーディング領域により置換されているヒト・枠組みまたはヒト・免疫グロブリン可変領域をコードしている核酸配列をいう。ヒト・可変領域は免疫グロブリン重鎖、軽鎖（または両方）、それらの機能的フラグメントのアナログであってよい。抗体（免疫グロブリン）の可変領域中に存在するかかるＣＤＲ領域を、当該分野で知られた方法により決定することができる。例えば、Kabatら（Sequences of Proteins of Immunological Interest,4th Ed.,U.S.Department of Health and Human Services,National Institutes of Health(1987)）は、ＣＤＲｓの存在位置に関する規則を開示している。さらに、ＣＤＲ領域／構造の同定に有用なコンピュータープログラムが知られている。
【００２６】
「中和」は、ヒト・ＩＬ−５のその特異的受容体への結合を妨げることにより、あるいはその受容体を通じてのＩＬ−５のシグナリングを阻害することによりＩＬ−５活性を阻害する抗体をいう。Ｂ１３細胞バイオアッセイ（ＩＬ−５中和アッセイ、実施例２Ｃ参照）において測定されるＩＬ−５活性の阻害において９０％有効、好ましくは９５％有効、最も好ましくは１００％有効な場合、ｍＡｂは中和抗体である。
【００２７】
用語「高アフィニティー」は、光学的バイオセンサー分析（実施例２参照）により測定されるヒト・ＩＬ−５に対する３.５ｘ１０−１１Ｍに等しいかまたはそれ未満のＫｄにより特徴づけられる結合アフィニティーを有する抗体をいう。
【００２８】
「ヒト・ＩＬ−５に対する結合特異性」は、マウスではなくヒトのＩＬ−５に対する高アフィニティーを意味する。
【００２９】
「第２の免疫グロブリンパートナー」は、イン・フレームで、あるいは所望により慣用的リンカー配列により第１の免疫グロブリンパートナーが融合（すなわち、作動可能に連結）している蛋白またはペプチドをコードしているもう１つのヌクレオチド配列をいう。好ましくは、それは免疫グロブリン遺伝子である。第２の免疫グロブリンパートナーは、その不変領域全体（すなわち、同種のもの−第１および第２の変化した抗体は同じ起源由来である）または対象とするさらなる抗体（すなわち、異種のもの）をコードしている核酸配列を包含しうる。それは免疫グロブリン重鎖または軽鎖（または１本のポリペプチドの一部としての両鎖）であってもよい。第２の免疫グロブリンパートナーは特定の免疫グロブリンクラスまたはイソタイプに限らない。さらに、第２の免疫グロブリンパートナーは、ＦａｂまたはＦ（ａｂ'）２のごとき免疫グロブリン不変領域の一部（すなわち、適当なヒト・不変領域または枠組み領域の別個の部分）を含んでなっていてもよい。また、かかる第２の免疫グロブリンパートナーは、例えばファージディスプレイライブラリーとして宿主細胞の外表面上に露出した内在性膜蛋白をコードしている配列、あるいは分析または診断的検出のための蛋白、例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ等をコードしている配列を含んでいてもよい。
【００３０】
用語Ｆｖ、Ｆｃ、Ｆｄ、Ｆａｂ、またはＦ（ａｂ'）２を、その標準的な意味で用いる（例えば、Harlow et al.,Antibodies A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory,(1988)参照）。
【００３１】
本明細書の用語「組み換え法による抗体」は、変化した抗体の１のタイプ、すなわち、選択されたアクセプター抗体の軽鎖および／または重鎖可変ドメインの一部分が、選択されたエピトープに特異性を有する１種またはそれ以上のドナー抗体由来の類似部分により置換されている全長の合成抗体（抗体フラグメントに対立するものとしてのキメラ抗体またはヒト化抗体）をいう。例えば、かかる分子は、未修飾軽鎖（またはキメラ軽鎖）に結合したヒト化重鎖（あるいはその逆）によって特徴づけられる抗体を包含しうる。組み換え法による抗体もまた、ドナー抗体の結合特異性を保持するようなアクセプター抗体の軽鎖および／または重鎖の可変ドメイン枠組み領域をコードしている核酸配列の変化によって特徴づけられる。これらの抗体は、アクセプター抗体由来の１種またはそれ以上のＣＤＲｓ（好ましくは全部のＣＤＲｓ）の本明細書記載のドナー抗体由来のＣＤＲｓでの置換を含んでいてもよい。
【００３２】
「キメラ抗体」は、アクセプター抗体由来の軽鎖および重鎖不変領域に結合したドナー抗体由来の天然に存在する可変領域（軽鎖および重鎖）を含んでいる組み換え法による抗体の１のタイプをいう。
【００３３】
「ヒト化抗体」は、非ヒト・ドナー免疫グロブリン由来のＣＤＲｓを有する組み換え法による抗体の１のタイプであって、その残りの免疫グロブリン由来の部分は１種（またはそれ以上）のヒト由来であるものをいう。さらに、結合アフィニティーを保持するように枠組み支持残基を変化させてもよい（例えば、Queen et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:10029-10032(1989)、Hodgson et al.,Bio/Technology,9:421(1991)参照）。
【００３４】
用語「ドナー抗体」は、その可変領域、ＣＤＲｓ、またはその他のフラグメントもしくはアナログの核酸配列が第１の免疫グロブリンパートナーのものになっている抗体をいい、その結果、変化した免疫グロブリンコーディング領域を提供し、発現した変化した抗体がドナー抗体の抗原特異性および中和活性を有する。本発明における使用に適した１のドナー抗体は、２Ｂ６と命名された非ヒト・中和モノクローナル抗体（すなわち、マウスの）である。抗体２Ｂ６は、イソタイプＩｇＧ１に属する高アフィニティーヒト・ＩＬ−５特異性（すなわち、マウス・ＩＬ−５を認識しない）中和抗体であると定義され、適当なマウス・ＩｇＧ不変領域上に配列番号：２および１６の可変軽鎖ＤＮＡおよびアミノ酸配列、ならびに配列番号：１および１５の可変重鎖ＤＮＡおよびアミノ酸配列を有している。
【００３５】
用語「アクセプター抗体」は、ドナー抗体とは異種の抗体（モノクローナル、または組み換え型）をいい、その重鎖および／または軽鎖枠組み領域ならびに／あるいはその重鎖および／または軽鎖不変領域のすべて（またはいずれかの部分、しかし、好ましくはすべての部分）が第１の免疫グロブリンパートナーのものとなっている。好ましくは、ヒト・抗体がアクセプター抗体である。
【００３６】
「ＣＤＲｓ」は、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の超可変領域である抗体の相補性決定領域のアミノ酸配列をいう。例えば、Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,4th Ed,U.S.Department of Health and Human Services,National Institutes of Health(1987)参照。免疫グロブリン可変領域には３本の重鎖ＣＤＲｓおよび３本の軽鎖ＣＤＲｓがある。よって、本明細書の用語「ＣＤＲｓ」は、３本の重鎖ＣＤＲｓすべて、あるいは３本の軽鎖ＣＤＲｓすべて（あるいは適当な場合には、すべての重鎖および軽鎖ＣＤＲｓの両方）をいう。
【００３７】
ＣＤＲｓは、抗原またはエピトープへの抗体結合のための接触残基の大部分を提供する。本発明の対象ＣＤＲｓはドナー抗体可変重鎖および軽鎖配列由来であり、天然に存在するＣＤＲｓのアナログを包含し、該アナログはまた、それらが由来するドナー抗体と同じ抗原結合特異性および／または中和能を共有している。
【００３８】
「抗原結合特異性または中和能を共有」とは、例えば、ｍＡｂ ２Ｂ６は一定レベルの抗原アフィニティーにより特徴づけられるが、適当な構造的環境においては２Ｂ６の核酸配列によりコードされているＣＤＲは低いまたは高いアフィニティーを有するかもしれないということを意味する。それにもかかわらず、かかる環境において、２Ｂ６のＣＤＲｓは２Ｂ６と同じエピトープを認識するであろうと予想される。典型的な２Ｂ６の重鎖ＣＤＲｓは配列番号：７、配列番号：８および配列番号：９を包含し、典型的な２Ｂ６の軽鎖ＣＤＲは配列番号：１０、配列番号：１１および配列番号：１２を包含する。
【００３９】
「機能的フラグメント」は、そのフラグメントが由来している抗体と同じ抗原結合特異性および／または中和能を保持している部分的な重鎖または軽鎖可変配列（例えば、免疫グロブリン可変領域のアミノ末端またはカルボキシ末端における小規模な欠失を有する）である。
【００４０】
「アナログ」は、少なくとも１個のアミノ酸によって修飾されているアミノ酸配列であり、該修飾は化学的なものあるいは少数（すなわち、１０個未満）のアミノ酸の置換または転移であってもよく、修飾されているとしてもアミノ酸配列が未修飾配列の生物学的特性、例えば、抗原特異性および高アフィニティーを保持しているものである。例えば、ある種のエンドヌクレアーゼ制限部位をＣＤＲコーディング配列中またはその周辺に作成する場合には、置換により（サイレント）変異を構築することができる。
【００４１】
アナログは対立遺伝子変化を生じるものであってもよい。「対立遺伝子変化または修飾」とは、本発明アミノ酸またはペプチド配列をコードしている核酸配列中の変化である。かかる変化または修飾は遺伝コードの縮重によるものであってもよく、あるいは所望特性を得るように慎重に組み換え法を用いて作成されたものであってもよい。これらの変化または修飾は、コードされているアミノ酸配列の変化を生じるものであってもよく、生じないものであってもよい。
【００４２】
用語「エフェクター剤」は、変化した抗体および／またはドナー抗体もしくはその他のフラグメントの天然または合成の軽鎖または重鎖が慣用的手段により結合されていてもよい非蛋白担体分子をいう。かかる非蛋白担体は、診断分野において用いられる慣用的担体、例えば、ポリスチレンまたは他のプラスチックビーズ、多糖類、例えば、BIAcore［Pharmacia］システムに用いるもの、または医学分野で使用され、ヒトおよび動物への投与が安全である他の非蛋白物質を包含する。他のエフェクター剤は、重金属原子またはラジオアイソトープをキレートするためのマクロサイトを包含する。かかるエフェクター剤は、変化した抗体の半減期を延長することにも有用であり、例えば、ポリエチレングリコールが挙げられる。
【００４３】
ＩＩ.高アフィニティーＩＬ−５モノクローナル抗体
本発明抗体、変化した抗体およびフラグメントの構築に使用するために、無傷のヒト・ＩＬ−５またはそれに由来するペプチドエピトープを与えることにより、非ヒト種（例えば、ウシ、ヒツジ、サル、ニワトリ、齧歯類（例えばマウスおよびラット）等）を用いて所望免疫グロブリンを得てもよい。慣用的なハイブリドーマ法を用いて、ＩＬ−５に対する非ヒト・ｍＡｂを分泌するハイブリドーマ細胞系を得る。次いで、実施例セクションに記載のごとくＩＬ−５で被覆した９６ウェルプレートを用いて、あるいは別法としてストレプトアビジンで被覆したプレートに結合したビオチン化ＩＬ−５を用いてかかるハイブリドーマを結合に関してスクリーニングする。
【００４４】
本発明の１の典型的な高アフィニティー中和ｍＡｂはマウス・抗体であるｍＡｂ ２Ｂ６であり、実施例１においてより詳細に説明されるキメラ抗体またはヒト化抗体の開発にそれを用いることができる。２Ｂ６ ｍＡｂは、ヒト・ＩＬ−５に対する抗原結合特異性により特徴づけられ、ＩＬ−５に対して３.５ｘ１０−１１Ｍ未満（約２.２ｘ１０−１１Ｍ）のＫｄを有する。光学的バイオセンサーによる測定により２Ｂ６由来のＦａｂフラグメントのＩＬ−５に対するＫｄを評価したところ（実施例３Ｈ参照）、約９ｘ１０−１１Ｍである。ｍＡｂ ２Ｂ６は、ヒト・ＩＬ−５とヒト・ＩＬ−５受容体のα−鎖との間の結合相互作用をブロックするように思われる。
【００４５】
もう１つの望ましいドナー抗体はマウス・ｍＡｂ ２Ｅ３である。このｍＡｂは、イソタイプＩｇＧ２ａであり、３.５ｘ１０−１１Ｍ未満（約２.０ｘ１０−１１Ｍ）のヒト・ＩＬ−５に対する解離定数を有することにより特徴づけられる。
【００４６】
さらにもう１つの望ましいドナー抗体はラット・ｍＡｂ ４Ａ６である。このｍＡｂは、３.５ｘ１０−１１Ｍ未満（約１.８ｘ１０−１１Ｍ）のヒト・ＩＬ−５に対する解離定数を有することにより特徴づけられる。さらに、ｍＡｂ ４Ａ６は、ヒト・ＩＬ−５とヒト・ＩＬ−５受容体のβ−鎖との間の結合相互作用をブロックするように思われる。
【００４７】
本発明は２Ｂ６ ｍＡｂ、２Ｅ３ ｍＡｂ、またはそれらの超可変（すなわち、ＣＤＲ）配列の使用に限定されない。ヒト・ＩＬ−５に対する３.５ｘ１０−１１Ｍに等しいかまたはそれ未満の解離定数により特徴づけられる他の適当な高アフィニティーＩＬ−５抗体および対応する抗−ＩＬ−５ ＣＤＲｓをそれらに代えて用いてもよい。以下の説明のいずれの箇所においても、ドナー抗体は２Ｂ６または２Ｅ３と同定されるが、この命名は例示および単なる説明のためのものである。
【００４８】
ＩＩＩ.抗体フラグメント
本発明は、ヒト・ＩＬ−５に指向されたｍＡｂ由来のＦａｂフラグメントまたはＦ（ａｂ'）２フラグメントの使用も包含する。これらのフラグメントは、in vivoにおけるＩＬ−５および好酸球により媒介される症状に対する防御剤として、あるいはin vitroでのＩＬ−５診断薬の一部として有用である。Ｆａｂフラグメントは軽鎖全体および重鎖のアミノ末端部分を含んでおり；Ｆ（ａｂ'）２フラグメントはジスルフィド結合により結合している２個のＦａｂフラグメントにより形成されるフラグメントである。ｍＡｂｓ ２Ｂ６、２Ｅ３および他の類似高アフィニティーＩＬ−５結合抗体は、ＦａｂフラグメントおよびＦ（ａｂ'）２フラグメントのソースを提供するものであり、それらのフラグメントは慣用的手段、例えば、適当な蛋白分解酵素パパインおよび／またはペプシンでのｍＡｂの開裂により、あるいは組み換え法により得ることができる。本明細書記載のごとく、これらのＦａｂおよびＦ（ａｂ'）２フラグメントはそれら自体、治療、予防または診断薬、ならびに組み換え型抗体またはヒト化抗体の形成において有用な可変領域およびＣＤＲ配列を含む配列のドナーとして有用である。
【００４９】
組み合わせファージライブラリー（例えば、Winter et al.,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)参照）または免疫グロブリンのチェイン・シャフリング（例えば、Marks et al.,Bio/Technology,10:779-783(1992)参照）によりＦａｂおよびＦ（ａｂ'）２フラグメントを構築することができ（両文献を参照により本明細書に記載されているものとみなす）、それらの方法において、選択された抗体（例えば、２Ｂ６）由来のＦｄまたはＶＨ免疫グロブリンを軽鎖免疫グロブリンＶＬ（ＶＫ）のレパートリーと結合させて新規Ｆａｂｓを得る。逆に、選択された抗体由来の軽鎖免疫グロブリンを重鎖免疫グロブリンＶＨ（またはＦｄ）のレパートリーと結合させて新規Ｆａｂを得てもよい。実施例セクションにおいてより詳細に説明するように、ｍＡｂ ２Ｂ６のＦｄを軽鎖免疫グロブリンのレパートリーと結合させた場合に中和ＩＬ−５ Ｆａｂｓが得られた。よって、チェイン・シャフリング法により、ユニークな配列（ヌクレオチドおよびアミノ酸）を有する中和Ｆａｂｓを得ることができる。
【００５０】
ＩＶ.対象とする抗−ＩＬ−５アミノ酸およびヌクレオチド配列
上記ｍＡｂ ２Ｂ６または他の抗体は、ドナー抗体の抗原結合特異性により特徴づけられる種々の変化した抗体の設計および取得に有用な配列、例えば、可変重鎖および／または軽鎖ペプチド配列、枠組み配列、ＣＤＲ配列、機能的フラグメント、およびそれらのアナログ、およびそれらをコードしている核酸配列を提供する。
【００５１】
よって、一例として、本発明は、ＩＬ−５マウス抗体２Ｂ６由来の可変軽鎖および可変重鎖配列ならびにそれら由来の配列を提供する。２Ｂ６の重鎖可変領域を図１に示す。ＣＤＲをコードしている領域はボックス領域により示され、それらは配列番号：７；配列番号：８；および配列番号：９に示される。２Ｂ６の軽鎖クローン可変領域を図２に示す。ＣＤＲをコードしている領域を配列番号：１０；配列番号：１１；および配列番号：１２に示す。
【００５２】
ヒト化重鎖可変領域を図８［配列番号：１８および１９］に示す。シグナル配列も配列番号：１７に示す。当業者に知られた他の適当なシグナル配列を、本明細書に例示したシグナル配列に代えて使用してもよい。この構築物のＣＤＲアミノ酸配列は無傷のマウスのものおよびキメラ重鎖ＣＤＲｓと同一であり、それらを配列番号：７、配列番号：８、および配列番号：９に示す。典型的な（合成）ヒト化軽鎖可変配列を図９［配列番号：２０および２１］に示す。
【００５３】
可変軽鎖および重鎖ペプチド配列をコードしている本発明核酸配列またはそのフラグメントは、ＣＤＲｓまたは枠組み領域をコードしている核酸配列中の特異的変化の突然変異による導入、ならびに生じた修飾または融合核酸配列の発現用プラスミド中への導入にも有用である。例えば、枠組みおよびＣＤＲをコードしている領域におけるサイレント置換を用いて突然変異されたＣＤＲ（および／または枠組み）領域の挿入を容易にする制限酵素部位を作成した。これらのＣＤＲをコードしている領域を、本発明ヒト化抗体の構築に使用した。
【００５４】
遺伝コードの縮重を考慮して、本発明の重鎖および軽鎖アミノ酸配列およびＣＤＲ配列ならびにドナー抗体の抗原特異性を共有しているそれらの機能的フラグメントおよびアナログをコードしている種々のコーディング配列を構築してもよい。第２の免疫グロブリンパートナーに作動可能に結合する場合には、可変鎖ペプチド配列またはＣＤＲｓをコードしている本発明の単離核酸配列またはそのフラグメントを用いて、本発明の変化した抗体、例えば、キメラまたはヒト化抗体、あるいは他の組み換え法による抗体を得ることができる。
【００５５】
本明細書記載の変化した抗体および抗体の一部をコードしている単離核酸配列のほかに、他のかかる核酸配列、例えば、無傷のＣＤＲをコードしている配列の相補的な配列またはＣＤＲをコードしている領域周辺の修飾されたヒト・枠組み領域に相補的な配列も本発明に包含されることに注意すべきである。有用なＤＮＡ配列は、厳密なハイブリダイゼーション条件下［T.Maniatis et al.,Molecular Cloning(A Laboratory Manual),Cold Spring Harbor Laboratory(1982),３８７−３８９頁参照］でＤＮＡ配列にハイブリダイゼーションする配列を包含する。１のかかる厳密なハイブリダイゼーション条件の例は、４ＸＳＳＣ、６５℃、次いで、６５℃の０.１ＸＳＳＣでの１時間の洗浄である。あるいはまた、厳密なハイブリダイゼーション条件の典型例は、５０％ホルムアミド、４ＸＳＳＣ中、４２℃である。好ましくは、これらのハイブリダイゼーションするＤＮＡ配列は少なくとも１８ヌクレオチドの長さ、すなわち、ほぼＣＤＲのサイズである。
【００５６】
Ｖ.変化した免疫グロブリン分子および変化した抗体
変化した免疫グロブリン分子は、キメラ抗体およびヒト化抗体のごとき組み換え法により抗体を包含する変化した抗体をコードしていてもよい。望ましい変化した免疫グロブリンコーディング領域はＣＤＲをコードしている領域を含み、該領域は、ＩＬ−５抗体の抗原特異性、好ましくは本発明により提供されるような高アフィニティー抗体の抗原特異性を有するペプチドをコードしており、第１の免疫グロブリンパートナー（ヒト・枠組みまたはヒト・免疫グロブリン可変領域）中に挿入されている。
【００５７】
好ましくは、第１の免疫グロブリンパートナーは第２の免疫グロブリンパートナーに作動可能に連結される。第２の免疫グロブリンパートナーは上で定義されており、興味ある第２の抗体領域、例えばＦｃ領域をコードしている配列を含んでもよい。第２の免疫グロブリンパートナーは、軽鎖または重鎖不変領域がイン・フレームまたはリンカー配列手段により融合しているもう１つの免疫グロブリンをコードしている配列を含んでもよい。機能的フラグメントまたはＩＬ−５のアナログに対して結合が促進されるように、それらに指向された組み換え法による抗体を設計してもよい。
【００５８】
第２の免疫グロブリンパートナーを非蛋白担体分子を包含する上記定義のエフェクター剤と結合させてもよく、慣用的手段により第２の免疫グロブリンパートナーを作動可能に結合させる。
【００５９】
第２の免疫グロブリンパートナー、例えば抗体配列とエフェクター剤との間の融合または結合は、例えば慣用的な共有結合またはイオン結合、蛋白融合、あるいは異種二官能基架橋（例、カルボジイミド、グルタルアルデヒド等）のような適当な手段によるものであってよい。かかる方法は当該分野において知られており、普通の化学および生化学の教科書に記載されている。
【００６０】
さらに、第２の免疫グロブリンパートナーとエフェクター剤との間に所望量のスペースを単に提供するだけの慣用的リンカー配列を、変化した免疫グロブリンコーディング領域中に構築してもよい。かかるリンカーの設計は当業者によく知られている。
【００６１】
さらに、本発明分子のシグナル配列を修飾して発現を促進してもよい。一例として、シグナル配列およびマウス・重鎖配列由来のＣＤＲｓを有する２Ｂ６ヒト化抗体はもとのシグナルペプチドを別のシグナル配列［配列番号：１７］に置き換えられている。
【００６２】
典型的な変化した抗体は、ｍＡｂ ２Ｂ６の抗原特異性を有する可変重鎖および／または軽鎖ペプチドまたは蛋白配列、例えば、ＶＨおよびＶＬ鎖を含んでいる。さらにもう１つの望ましい本発明の変化した抗体は、少なくとも１つ、マウス・抗体分子２Ｂ６の重鎖および／または軽鎖の可変領域の好ましくは全部のＣＤＲｓを含んでおり、残りの配列はヒト起源のもの、またはその機能的フラグメントもしくはアナログである。例えば、ヒト化ＶＨおよびＶＬ領域（図８および９）参照。
【００６３】
さらなる具体例において、組み換え法による本発明抗体にさらなる剤が結合していてもよい。例えば、組み換えＤＮＡ法の手順を用いて、完全な抗体分子のＦｃフラグメントまたはＣＨ２ ＣＨ３ドメインが酵素または他の検出可能な分子（すなわち、ポリペプチドエフェクターまたはレポーター分子）に置き換えられている本発明の組み換え法による抗体を得てもよい。
【００６４】
第２の免疫グロブリンパートナーを、マウス２Ｂ６の抗原特異性を有するＣＤＲ含有配列とは異種の非免疫グロブリンペプチド、蛋白またはそのフラグメントに作動可能に結合させてもよい。得られる蛋白は、発現すると、ＩＬ−５抗原特異性および非免疫グロブリン特性を示すことができる。その融合パートナーの特性は、例えば、別の結合ドメインまたは受容体ドメインのごとき機能的特性、あるいは融合パートナー自体が治療蛋白である場合には治療特性またはさらなる抗原特性であってもよい。
【００６５】
もう１つの望ましい本発明蛋白は、全長の重鎖および軽鎖を有する完全な抗体分子、あるいはＦａｂまたはＦ（ａｂ'）２フラグメントのごときそれらの別々のフラグメント、重鎖ダイマー、またはＦＶまたは１本鎖抗体（ＳＣＡ）のごときそれらの最小の組み換えフラグメント、または例えばｍＡｂ ２Ｂ６または２Ｅ３のような選択されたドナーｍＡｂと同じ特異性を有する他の分子を含んでなっていてもよい。かかる蛋白を変化した抗体の形態で用いてもよく、あるいはその未融合形態で使用してもよい。
【００６６】
第２の免疫グロブリンパートナーがドナー抗体とは異なる抗体、例えば、異なるイソタイプまたはクラスの免疫グロブリン枠組みまたは不変領域に由来する場合はいつでも、組み換え法による抗体が得られる。組み換え法による抗体は、１の起源、例えばアクセプター抗体由来の免疫グロブリン（Ｉｇ）不変領域および可変枠組み領域、ならびにドナー抗体、例えば本明細書記載の抗−ＩＬ−５抗体由来の１つまたはそれ以上（好ましくは全部）のＣＤＲｓを含んでなっていてもよい。さらに、核酸またはアミノ酸レベルでのアクセプターｍＡｂ軽鎖および／または重鎖可変ドメイン枠組み領域の変化、例えば、欠失、置換、または付加、あるいはドナーＣＤＲの変化を行ってドナー抗体の抗原結合特異性を保持するようにしてもよい。
【００６７】
ＩＬ−５ ｍＡｂの可変重鎖および／または軽鎖の一方（または両方）（所望により説明したように修飾されていてもよい）あるいは１つまたはそれ以上の下で定義する重鎖または軽鎖ＣＤＲｓ（図７も参照）を用いるようにかかる組み換え法による抗体を設計する。組み換え法による本発明抗体は中和抗体、すなわち、望ましくはＩＬ−５受容体への結合をブロックし、さらにまたＩＬ−５依存性細胞の増殖をブロックまたは防止するものである。
【００６８】
かかる組み換え法による抗体は、選択されたヒト・免疫グロブリンもしくはサブタイプの枠組み領域を含むヒト化抗体、またはＩＬ−５抗体の機能的フラグメントに融合したヒト・重鎖および軽鎖不変領域を含むキメラ抗体を包含しうる。適当なヒト（または他の動物）のアクセプター抗体は、ドナー抗体の核酸およびアミノ酸配列に対する相同性により、慣用的データベース、例えば、KABATRデータベース、Los Alamosデータベース、およびSwiss Proteinデータベースから選択されるものであってもよい。ドナー抗体の枠組み領域に対する相同性（アミノ酸による）により特徴づけられるヒト・抗体は、ドナーＣＤＲｓの挿入用の重鎖不変領域および／または重鎖可変領域枠組み領域の提供に適するかもしれない。軽鎖不変または可変枠組み領域を提供しうる適当なアクセプター抗体を同様の方法で選択してもよい。アクセプター抗体の重鎖および軽鎖は同じアクセプター抗体に由来する必要がないことに注意すべきである。
【００６９】
望ましくは、異種枠組みおよび不変領域をヒト・免疫グロブリンのクラスおよびイソタイプ、例えば、ＩｇＧ（サブタイプ１から４）、ＩｇＭ、ＩｇＡおよびＩｇＥから選択する。しかしながら、受容体抗体はヒト・免疫グロブリン蛋白配列のみを含んでなることを必要としない。例えば、ヒト・免疫グロブリン鎖の一部をコードしているＤＮＡ配列が、ポリペプチドエフェクターまたはレポーター分子のごとき非免疫グロブリンアミノ酸配列をコードしているＤＮＡ配列に融合している遺伝子を構築してもよい。
【００７０】
特に望ましいヒト化抗体の一例は、選択されたヒト・抗体配列の枠組み領域上に挿入された２Ｂ６のＣＤＲｓを含む。中和ヒト化抗体とするには、ＩＬ−５抗体の重鎖および／または軽鎖可変領域由来の１個、２個または好ましくは３個のＣＤＲｓを、選択されたヒト・抗体配列の枠組み領域中に挿入し、ヒト・抗体の無傷のＣＤＲｓと入れ替える。
【００７１】
好ましくは、ヒト化抗体において、ヒト・重鎖および軽鎖双方中の可変ドメインは組み換え法により１個またはそれ以上のＣＤＲが置換されたものである。６個すべてのＣＤＲｓまたは６個未満のＣＤＲｓの種々の組み合わせを用いることが可能である。好ましくは、６個全部のＣＤＲを置換する。ヒト・アクセプター抗体由来の未修飾軽鎖を軽鎖として用いて、ヒト・重鎖中でのみＣＤＲｓを置換することが可能である。さらに別法として、慣用的な抗体のデータベースを用いて、適合する軽鎖を別のヒト・抗体から選択してもよい。組み換え法による抗体の残りの部分はいずれかの適当なアクセプターヒト・免疫グロブリン由来であってもよい。
【００７２】
よって、好ましくは、組み換え法によるヒト化抗体は、天然のヒト・抗体またはそのフラグメントの構造を有し、効果的な治療的使用、例えば、ヒトにおけるＩＬ−５により媒介される炎症性疾患の治療、または診断用途に必要な特性の組み合わせを有する。
【００７３】
もう１つの例として、組み換え法による抗体は、２Ｅ３の可変軽鎖領域の３つのＣＤＲｓ［配列番号：１０、１１および１３］および２Ｂ６の可変重鎖領域の３つのＣＤＲｓ［配列番号：７、８および９］を含む。得られるヒト化抗体はｍＡｂ ２Ｂ６と同じ抗原結合特異性および高アフィニティーにより特徴づけられる。
【００７４】
必ずしもドナー抗体の特異性および高アフィニティーに影響することなく、可変ドメインのアミノ酸を変化させることにより組み換え法による抗体をさらに修飾（すなわち、アナログを得る）してもよいことが当業者により理解されるであろう。重鎖および軽鎖のアミノ酸を、可変ドメイン枠組みまたはＣＤＲｓまたはそれらの両方のいずれかに存在する他のアミノ酸により置換してもよいと予想される。
【００７５】
さらに、不変領域を変化させて本発明分子の選択特性を増加または減少させてもよい。例えば、ダイマー化、Ｆｃ受容体への結合、または補体結合および活性化能が挙げられる（例えば、Angal et al.,Mol.Immunol,30:105-108(1993)、Xu et al.,J.Biol.Chem,269,3469-3474(1994)、Winter et al.,EP307,434-B参照）。
【００７６】
キメラ抗体である変化した抗体は、非ヒト・ドナー抗体の重鎖および軽鎖可変領域全体を提供し、両鎖についてヒト・免疫グロブリン不変領域に結合した枠組み領域を包含するという点で上記ヒト化抗体とは異なる。本発明ヒト化抗体に関連したさらなる非ヒト配列を保有しているキメラ抗体はヒトにおいて有意な免疫応答を誘導しうると予想される。
【００７７】
かかる抗体は、上述のＩＬ−５により媒介される疾病の予防および治療に有用である。
【００７８】
ＶＩ.変化した抗体および組み換え法による抗体の製造
好ましくは、２Ｂ６または他の適当なドナーｍＡｂｓ（例えば、２Ｅ３、２Ｆ２、４Ａ６等）の可変軽鎖および／または重鎖配列およびＣＤＲｓ、およびそれらをコードしている核酸配列を、変化した抗体、好ましくはヒト化抗体の構築に用いる。同一または類似の方法を用いて本発明の他の具体例を得てもよい。 選択されたドナーｍＡｂ、例えばマウス抗体２Ｂ６を産生するハイブリドーマを慣用的にクローンし、当業者に知られた方法、例えば、Sambrook et al., molecular Cloning (A Laboratory Manual),2nd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory(1989)に記載の方法によりその重鎖および軽鎖可変領域のＤＮＡを得る。ドナーｍＡｂ結合特異性を保持するのに必要な少なくともＣＤＲをコードしている領域およびアクセプターｍＡｂ軽鎖および／または重鎖可変ドメイン枠組み領域含んでいる２Ｂ６の可変重鎖および軽鎖、ならびにヒト・免疫グロブリン由来の抗体鎖の残りの部分を、ポリヌクレオチドプライマーおよび逆転写酵素を用いて得る。既知データベースを用い、他の抗体と比較することによりＣＤＲをコードしている領域を同定する。
【００７９】
次いで、マウス／ヒト・キメラ抗体を調製し、結合能についてアッセイすることができる。かかるキメラ抗体は、ヒト・Ｉｇ不変領域に結合した非ヒト・ドナー抗体のＶＨおよびＶＬ領域全体を含んでいる。
【００８０】
コンピューターデータベース、例えばKABATRを用いてヒト抗体由来の重鎖可変領域の同種枠組み領域を同定し、２Ｂ６に対して相同性を有するヒト・抗体をアクセプター抗体として選択した。ヒト・抗体枠組み中の２Ｂ６のＣＤＲをコードしている領域を含む合成重鎖可変領域の配列を、制限部位を含むように枠組み中のヌクレオチド置換を所望により行って設計した。次いで、この設計された配列を、長い合成オリゴマーを用いて合成した。別法として、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅され、エラーを修正されたオリゴヌクレオチドを重複させることにより、設計配列を合成することもできる。
適当な軽鎖可変枠組み領域を同様の方法で設計した。
【００８１】
ヒト化抗体はキメラ抗体由来であってもよく、あるいは好ましくは、重鎖および軽鎖由来のドナーｍＡｂのＣＤＲをコードしている領域を選択された重鎖および軽鎖枠組み中に適当に挿入することにより合成的に得てもよい。別法として、本発明ヒト化抗体を標準的な突然変異法を用いて調製してもよい。かくして得られたヒト化抗体はヒト・枠組み領域およびドナーｍＡｂのＣＤＲをコードしている領域を含む。枠組み残基について引き続き操作を行ってよい。得られるヒト化抗体は組み換え宿主細胞、例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯまたはミエローマ細胞において発現されうる。他の適当なＩＬ−５特異的中和高アフィニティー非ヒト・抗体に対してこの方法を用いて他のヒト化抗体を調製してもよい。
【００８２】
宿主細胞における複製および発現および／または宿主細胞からの分泌を制御しうる慣用的な調節的制御配列に作動可能に結合した変化した抗体の配列にもとのプラスミドのコーディング配列を置き換えることにより、慣用的な発現ベクターまたは組み換えプラスミドを製造する。調節配列はプロモーター配列、例えば、ＣＭＶプロモーター、およびシグナル配列を包含し、それらは他の既知抗体由来であってもよい。同様にして、相補的な抗体の軽鎖または重鎖をコードしているＤＮＡ配列を有する第２の発現ベクターを作成することもできる。好ましくは、この第２の発現ベクターは、コーディング配列および選択可能マーカーを除き、各ポリペプチド鎖が機能的に発現されることが可能なかぎり、第１のものと同じである。
【００８３】
第１および第２の両方のベクターを用いる慣用的方法によって選択された宿主細胞を同時トランスフェクションして（あるいは単一ベクターによりトランスフェクションして）、組み換えまたは合成の軽鎖および重鎖両方を含んでなる本発明トランスフェクション宿主細胞を作成する。次いで、トランスフェクション細胞を慣用的方法により培養して本発明の組み換え法による抗体を得る。組み換え重鎖および／または軽鎖との結合を含むヒト化抗体を、ＥＬＩＳＡまたはＲＩＡのごとき適当なアッセイにより培養物からスクリーニングする。同様の慣用的方法を用いて本発明の他の変化した抗体および分子を構築してもよい。
【００８４】
本発明方法および組成物の構築に用いるクローニングおよびサブクローニング工程に適したベクターが当業者により選択される。例えば、慣用的なｐＵＣシリーズのクローニングベクターを用いてもよい。使用される１のベクターはｐＵＣ１９であり、Amersham（英国Buckinghamshire）またはPharmacia（スウェーデンUppsala）のごとき業者から市販されている。さらに、容易に複製しうるいずれかのベクターは多くのクローニング部位および選択可能遺伝子（例えば、抗生物質耐性）を有しており、クローニングのための容易に取り扱いすることができる。よって、クローニングベクターの選択は本発明における制限因子ではない。
【００８５】
同様に、本発明による組み換え法により得られた抗体の発現に用いるベクターは、いずれかの慣用的ベクターから当業者により選択されうる。またベクターは、選択された細胞において異種ＤＮＡ配列の複製および発現を指令する選択された調節配列（ＣＭＶプロモーターのごとき）を含んでいる。これらのベクターは、組み換え法による抗体または変化した免疫グロブリンのコーディング領域をコードしている上記ＤＮＡ配列を含んでいる。さらに、ベクターは、取り扱いが容易なように所望制限部位を挿入することにより修飾された選択免疫グロブリン配列を含んでいてもよい。
【００８６】
異種ＤＮＡ配列、例えば、哺乳動物ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）の発現の増幅に適した遺伝子により発現ベクターを特徴づけてもよい。他の好ましいベクター配列は、ウシ・成長ホルモン（ＢＧＨ）およびベータグロブリンプロモーター配列（betaglopro）のごときポリＡシグナル配列を包含する。当業者によく知られた方法により本発明において有用な発現ベクターを合成してもよい。
【００８７】
選択宿主における組み換えＤＮＡからの生成物の発現および／または分泌の指令に有用なかかるベクターの成分、例えば、レプリコン、選択遺伝子、エンハンサー、プロモーター、シグナル配列等を、市販または天然ソースから得てもよく、あるいは既知方法により合成してもよい。
【００８８】
また本発明は、組み換え法による抗体またはその変化した免疫グロブリン分子のコーディング配列を含む組み換えプラスミドでトランスフェクションした細胞系に関する。これらのクローニングベクターのクローニングおよび他の操作に有用な宿主細胞も慣用的である。しかしながら、最も望ましくは、種々のE.coli株の細胞をクローニングベクターの複製および本発明の変化した抗体の構築における他のステップに使用する。
【００８９】
本発明の組み換え法による抗体または変化した抗体の発現に適する宿主または細胞系は、好ましくは、ＣＨＯ、ＣＯＳ、線維芽細胞（例えば、３Ｔ３）、および骨髄細胞のごとき哺乳動物細胞、より好ましくは、骨髄細胞またはＣＨＯである。ヒト・細胞を用いてもよく、かくして、分子をヒトのグリコシレーションパターンで修飾することが可能となる。別法として、他の真核細胞系を用いてもよい。形質転換、培養、増幅、スクリーニングならびに生成物の生産および精製に適した哺乳動物宿主細胞および方法の選択は当該分野において知られている。例えば、上で引用したSambrookらの文献参照。
【００９０】
細菌細胞は本発明組み換えＦａｂの発現に適した宿主細胞であることがわかるだろう（例えば、Pluckthun,A.,Immunol.Rev.,130:151-188(1992)参照）。しかしながら、細菌細胞において発現された蛋白の、変性または正しく折り畳まれていない形態あるいはグリコシレーションされていない形態となる傾向のため、細菌細胞において生産された組み換えＦａｂを抗原結合能の保持についてスクリーニングしなければならない。細菌細胞により発現された分子が正しく折り畳まれた形態で生産された場合には、当該細菌細胞は望ましい宿主であろう。例えば、発現に使用される種々のE.coli株は、バイオテクノロジーの分野において宿主としてよく知られている。種々のB.subtilis、Streptomyces、他の枯草菌等の株も本発明方法に使用できる。
【００９１】
所望ならば、当業者に知られた酵母細胞株ならびに昆虫細胞、例えば、DrosophilaおよびLepidoptera、およびウイルス発現系も宿主細胞として用いられる。例えば、Miller et al.,Genetic Engineering,8:277-298,Plenum Press(1986)およびその中の引用文献参照。
【００９２】
本発明ベクターを構築することのできる一般的方法、本発明宿主細胞を製造するのに必要なトランスフェクション法、およびかかる宿主細胞から本発明の変化した抗体を製造するのに必要な培養法はすべて慣用的方法である。同様に、生産されたならば、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動等を包含する当該分野の標準的方法により本発明の変化した抗体を細胞培養物から精製することができる。かかる方法は当業者の範囲内であり、本発明を制限するものでない。
【００９３】
ヒト化抗体のさらなる発現方法は、米国特許第４,８７３,３１６号記載のごとく、トランスジェニック動物における発現を用いるものであってもよい。これは、動物のカゼインプロモーター（トランスジェニック的に哺乳動物に導入された場合、メスの哺乳動物はその乳中の所望組み換え蛋白を生産する）を用いる発現系に関連している。所望方法により発現されたならば、適当なアッセイを用いて、組み換え法による抗体をインビトロ活性について試験する。現在慣用的となっているＥＬＩＳＡアッセイフォーマットを用いて、組み換え法により抗体のＩＬ−５への結合を定量的かつ定性的に評価する。さらに、他のインビトロアッセイを用いて、通常のクリアランス機構存在下の体内での組み換え抗体の維持を評価するために引き続き行われるヒトの臨床研究を行う前に中和効率を確認しておいてもよい。
【００９４】
２Ｂ６から調製されたヒト化抗体について説明された方法に従って、当業者は、本明細書記載の他のドナーＩＬ−５抗体、可変領域配列およびＣＤＲペプチドからヒト化抗体を構築することができる。レシピエントにより「自己」であると潜在的に認識される可変領域枠組みを用いて組み換え法による抗体を製造することができる。可変領域枠組みに対する小さな修飾を行って、レシピエントに対する免疫原性を有意に上昇させずに抗原結合を促進することができる。かかる組み換え法による抗体は、ヒトのＩＬ−５により媒介される症状を効果的に治療する可能性がある。
【００９５】
ＶＩＩ. 治療的／予防的使用
また本発明は、有効量の本明細書記載の１種またはそれ以上の組み換え法による抗体または変化した抗体を包含する抗体、あるいはそれらのフラグメントを投与することを特徴とする、喘息のごとき好酸球増加症関連症候群にかかっているヒトの治療方法に関する。
【００９６】
ヒト・ＩＬ−５への結合、次いで、好酸球刺激のブロックにより、本発明分子の使用による治療的応答を得る。よって、本発明分子は、治療用途に適した調合品および処方に含まれた場合、アレルギー性鼻炎、喘息、慢性好酸球性肺炎、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、セリアック病、好酸球性胃腸炎、Churg-Strauss症候群（結節性動脈周囲炎およびアトピー）、好酸球性筋肉痛症候群、過好酸球増加症候群、血管皮膚炎を包含する水腫性反応、ぜん虫感染（ここで、好酸球は防御的役割をしている可能性がある）、オンコセルカ皮膚炎およびアトピー性皮膚炎のごときアレルギー性および／またはアトピー性応答、あるいは好酸球増加症に関連した応答をしているヒトに対して非常に望ましい。
【００９７】
他の抗体、詳細には本発明組み換え法による抗体が指向する症状の原因となりうる他のマーカー（エピトープ）と反応するヒト・ｍＡｂと組み合わせて本発明の変化した抗体、抗体およびそれらのフラグメントを用いてもよい。
【００９８】
本発明治療剤は、約２日ないし約３週間、あるいは必要な期間のアレルギー症状の治療に望ましいと考えられる。例えば、季節性鼻炎等を治療する場合には、より長期の治療が望ましい。このことは、ＩＬ−５により媒介される疾病に対する現用の先行技術である輸液プロトコールよりもかなり有利であることを示す。治療のための用量および期間は、ヒトの循環系における本発明分子の相対的持続時間に関係し、治療すべき症状および患者の一般的健康状態に応じて当業者により調整されうる。
【００９９】
本発明治療剤の投与モードは、宿主に対して剤を送達するいずれの適切な経路であってもよい。変化した抗体、抗体、組み換え法による抗体、およびそれらのフラグメント、ならびに本発明医薬成分は、詳細には、非経口投与、すなわち、皮下、筋肉内、静脈または鼻腔内投与において有用である。
【０１００】
本発明治療剤を、医薬上許容される担体中の有効成分としての有効量の本発明の組み換え法による（例えば、ヒト化）抗体を含有する医薬組成物として調製してもよい。本発明の予防剤において、組み換え法による抗体を含有する、好ましくは生理学的ｐＨに調節された即座に注射可能な形態の水性懸濁液または溶液が好ましい。通常には、非経口投与用組成物は本発明の組み換え法による抗体の溶液または医薬上許容される担体（好ましくは水性担体）に溶解されたそのカクテルを含んでなる。種々の水性担体を用いることができ、例えば、０.４％食塩水、０.３％グリシン等を用いることができる。これらの溶液は滅菌されており、一般的には微粒子不含である。よく知られた滅菌法（例えば、濾過）によりこれらの溶液を滅菌することができる。組成物は、ｐＨ調節および緩衝化剤等のごとき、所望により医薬上許容される添加物を含んでいてもよい。かかる医薬処方中の本発明抗体の濃度を広範囲に、すなわち、重量で約０.５％未満から、通常には約１％またはそれ未満ないし１５％または２０％まで変化させることができ、主として液体の体積、粘度等に基づいて選択され、選択された個々の投与モードに応じて選択されるであろう。
【０１０１】
よって、筋肉内注射用の本発明医薬組成物を、１ｍｌの滅菌緩衝水および約１ｎｇないし約１００ｍｇ、例えば約５０ｎｇないし約３０ｍｇ、またはより好ましくは約５ｍｇなし約２５ｍｇの本発明の組み換え法による抗体を含有するように調製することができる。同様に、静脈輸液用の本発明医薬組成物を、約２５０ｍｌの滅菌リンゲル溶液、および約１ないし約３０ｍｇ、好ましくは５ｍｇないし約２５ｍｇの本発明の組み換え法による抗体を含有するように調製することができる。非経口的投与可能組成物の調製のための実際的な方法は当業者によく知られているかまたは明らかであり、例えばRemington's Pharmaceutical Science,15th ed.,Mark Publishing Company,Easton,Pennsylvaniaにおいてより詳細に記載されている。
【０１０２】
本発明治療剤は、医薬組成物中に入れる場合、１回分の剤型として提供するのが好ましい。適当な治療上有効量は当業者により容易に決定されうる。ヒトまたは他の動物における炎症性疾患を有効に治療するためには、１回分の用量は、体重７０ｋｇにつき約０.１ｍｇはいし約２０ｍｇの本発明抗体を非経口的に、好ましくは静脈または筋肉内投与すべきである。必要ならば、炎症応答中に医師がかかる用量を適当時間間隔をおいて調製してもよい。
【０１０３】
本発明の変化した抗体および組み換え法による抗体を、ＩＬ−５により媒介される疾病の決定またはかかる疾病の治療進行の追跡のごとき診断に用いてもよい。診断には、これらの変化した抗体を、慣用的には、血清、血漿または他の適当な組織中のＩＬ−５レベルの測定あるいは培養中のヒト細胞による放出の測定のためにＥＬＩＳＡまたは他の慣用的アッセイフォーマット用に標識することができる。変化した抗体が用いられるアッセイの性質は慣用的なものであり、本開示を限定するものでない。
【０１０４】
よって、本発明の１の具体例は、患者における過剰な好酸球産生に関連したアレルギーおよび他の症状の診断を援助する方法であって、患者から得た試料（血漿または組織）中のヒト・ＩＬ−５の量を決定し、次いで、決定した量を正常集団におけるヒト・ＩＬ−５平均量と比較することを特徴とし、そのことにより患者試料中の有意に上昇したＩＬ−５量が過剰な好酸球産生に関連したアレルギーおよび他の症状を示すものとなる方法に関する。
【０１０５】
本明細書記載の抗体、変化した抗体またはそれらのフラグメントを保存のための凍結乾燥し、使用のために適当な担体中で復元することができる。この方法は、慣用的免疫グロブリンに関して効果的であることが示されており、当該分野で知られている凍結乾燥および復元方法を用いることができる。
【０１０６】
下記実施例は、典型的な組み換え法による抗体の構築および適当なベクターおよび宿主細胞中でのその発現を包含する本発明の種々の態様を説明するが、本発明の範囲を限定するものと解してはならない。すべてのアミノ酸は慣用的な３文字または１文字法により表される。特記しないかぎり、すべての必要な制限酵素、プラスミド、ならびに他の試薬および材料は市販のものである。すべての一般的クローニング、連結および他のＤＮＡ組み換え法は、T.Maniatisら（すでに引用）、または同じ出版社からのその第２版（１９８９）（Sambrookら編）（「Sambrookら」という）において行われたものである。
【実施例１】
【０１０７】
実施例１ ｈＩＬ−５（ヒト・ＩＬ−５）に対するＭａｂｓ（モノクローナル抗体）の製造
ヒト・ＩＬ−５をDrosophila Schneider 2(S２)細胞において発現させ、均一に精製した。Spodoptera frugiperda 21(Sf21)細胞を用いてマウス・ＩＬ−５をバキュロウイルス中で発現させ、均一に精製した。モノクローナル抗体ＴＲＦＫ−５（中和ラット・抗−マウスＩＬ−５抗体）をGenzyme Corp.（Cambridge,MA）から得た。
【０１０８】
Ａ.免疫手順
組み換えヒト・ＩＬ−５（ＩＬ−５）を、７匹のＣＡＦ１マウス（メス）（Charls River,Wilmington,MA）のパネルに対する免疫原として用いた。４カ月の期間にわたり、１：１の割合のTiterMAX（登録商標）（CytoRx Corp.,Norcross,GA）を用いて乳化したリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）中のＩＬ−５を動物に３回皮下注射した。最初の抗原量は５０μｇであり、追加免疫は２５μｇおよび１０μｇであった。追加免疫後、血清試料を集め、受容体結合阻害アッセイおよびＢ１３増殖アッセイ（またはＩＬ−５中和アッセイ（実施例２Ｃ））により、ＩＬ−５への結合および中和活性についてアッセイした。すべてのマウスは、ＩＬ−５に結合する血清試料を産生した。脾臓ドナーとして選択された動物を安楽死させる３日前に１０μｇの組み換えヒト・ＩＬ−５を静脈から追加免疫した。
【０１０９】
Ｂ.ハイブリドーマ取得
Kohler et al.,Nature,256:495(1975)により初めて報告された融合法を変更して用いて、細胞単層（Kennet et al.,Eds.,"Hybridomas:A new dimension in biological analysis",pp.368-377,Plenum Press,New York）を用いる方法を行った。２匹のドナーマウスからの脾臓細胞をプールし、１千万個のＳＰ２／０／Ａｇ１４骨髄腫細胞に対して５千万個の脾臓細胞の割合で融合を行った。融合が確認された細胞の上清を、ＩＬ−５に対する結合に関してＥＬＩＳＡによりアッセイした。ＩＬ−５に対する抗体を産生する細胞を含むウェルを増殖させ、上清をＩＬ−５受容体結合阻害アッセイおよびＢ１３（中和）増殖アッセイにおいてスクリーニングした（下記）。
【０１１０】
ＩＬ−５と反応するｍＡｂｓを分泌する１６個のハイブリドーマを単離した。ハイブリドーマ上清をヨウ素化ＩＬ−５と混合し、ＩＬ−５受容体（ＩＬ−５Ｒ）のα−鎖を発現するDrosophila細胞から調製した抽出物に添加し、受容体結合の阻害に関してアッセイした。１１個のハイブリドーマ上清は、ＩＬ−５受容体α−鎖へのヨウ素化ＩＬ−５の結合を６０％よりも多く阻害した。３個のｍＡｂｓ（２Ｂ６、２Ｅ３および２Ｆ２）も、ヒト・ＩＬ−５に応答してマウス・Ｂ１３細胞の増殖を７０％よいも多く阻害したが、マウス・ＩＬ−５には応答しなかった。５個のハイブリドーマ（そのうち４個（１Ｃ６、２Ｂ６、２Ｅ３および２Ｆ２）は結合および／または増殖をブロックし、１個（２４Ｇ９）は中和的でなかった）を軟寒天で繰り返しサブクローンして安定なクローン細胞系を得た。クローン細胞系からの上清を交差反応性についてＥＬＩＳＡによりスクリーニングしたが、ヒト・ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−４、ＩＬ−８、Ｍ−ＣＳＦまたはＴＧＦαには結合しなかった。ｍＡＢｓを精製し、光学的バイオセンサー（BIAcore）分析により結合アフィニティーを評価したところ、１０ないし１００ｐＭの範囲であった。マウス・イソタイプ分類試薬（PhaMingen,San Diego,CA）を用いて細胞系からの上清をイソタイプに分類した。ＭＡｂｓの中和活性に関するアフィニティーおよびＩＣ５０のまとめを表１（実施例２）に示す。
【０１１１】
同様の方法により、対応する免疫プロトコールおよびラット・骨髄腫をマウスについて上記した融合に用いてラット・ハイブリドーマを免疫ラットから得た。２つのラット・ハイブリドーマ４Ａ６および５Ｄ３は、ＩＬ−５に結合するｍＡｂｓを産生することが同定された。２Ｂ６、２Ｅ３および２Ｆ２と同様に、ｍＡｂｓ４Ａ６および５Ｄ３は、下記Ｂ１３アッセイにおいて中和的であることがわかった。
【０１１２】
Ｃ.ハイブリドーマの寄託
モノクローナル抗体２Ｂ６を産生するハイブリドーマ細胞系ＳＫ１１９−２Ｂ６.２０６.７５（１）は、特許手続上の微生物の寄託に関するブダペスト条約に従って、American Type Culture Collection(ATCC),Rockville,MD,USAに受託番号ＨＢ １１７８３として寄託され、特許寄託物として受託された。
【０１１３】
モノクローナル抗体２Ｅ３を産生するハイブリドーマ細胞系ＳＫ１１９−２Ｅ３.３９.４０.２は、特許手続上の微生物の寄託に関するブダペスト条約に従って、American Type Culture Collection(ATCC),Rockville,MD,USAに受託番号ＨＢ １１７８２として寄託され、特許寄託物として受託された。
【０１１４】
モノクローナル抗体２Ｆ２を産生するハイブリドーマ細胞系ＳＫ１１９−２Ｆ２.３７.８０.１２は、特許手続上の微生物の寄託に関するブダペスト条約に従って、American Type Culture Collection(ATCC),Rockville,MD,USAに受託番号ＨＢ １１７８１として寄託され、特許寄託物として受託された。
【０１１５】
モノクローナル抗体２４Ｇ９を産生するハイブリドーマ細胞系ＳＫ１１９−２４Ｇ９.８.２０.５は、特許手続上の微生物の寄託に関するブダペスト条約に従って、American Type Culture Collection(ATCC),Rockville,MD,USAに受託番号ＨＢ １１７８０として寄託され、特許寄託物として受託された。
【０１１６】
モノクローナル抗体４Ａ６を産生するハイブリドーマ細胞系４Ａ６（１）Ｇ１Ｆ７は、特許手続上の微生物の寄託に関するブダペスト条約に従って、American Type Culture Collection(ATCC),Rockville,MD,USAに受託番号ＨＢ １１９４３として寄託され、特許寄託物として受託された。
【０１１７】
モノクローナル抗体５Ｄ３を産生するハイブリドーマ細胞系５Ｄ３（１）Ｆ５Ｄ６は、特許手続上の微生物の寄託に関するブダペスト条約に従って、American Type Culture Collection(ATCC),Rockville,MD,USAに受託番号ＨＢ １１９４２として寄託され、特許寄託物として受託された。
【実施例２】
【０１１８】
実施例２ アッセイ
Ａ. ＥＬＩＳＡ
MaxiSorb（登録商標）イムノプレート（Nunc,Naperville,IL）の個々のウェルを、０.０５Ｍ炭酸バッファーｐＨ９.６中０.２μｇのＩＬ−５で被覆した。４℃で一晩インキュベーション後、０.０２５％ TweenR２０含有ＰＢＳでプレートをすすぎ、０.０２５％ TweenR２０含有ＰＢＳ中１％ ＢＳＡにて室温で２時間ブロックした。未希釈ハイブリッド上清をＩＬ−５被覆ウェルに添加し、室温で２時間インキュベーションした。プレートをすすいだ後、ヤギ・抗−マウスＩｇＧおよびＩｇＭ標識ペルオキシダーゼ（Boehrionger Mannheim,Indianapolis,IN）を、１％ ＢＳＡおよび０.０２５％TweenR２０含有ＰＢＳ中１／７５００希釈して添加した。１５分後、VMax（登録商標）マイクロプレートリーダー（Molecular Devices, Menlo Park,CA）により４５０ｎｍにおいてプレートを読んだ。
【０１１９】
Ｂ.受容体結合阻害アッセイ
ヒト・ＩＬ−５受容体（ＩＬ−５Ｒ）のα−鎖を発現するDrosophila S2細胞の膜抽出物を用いて受容体へのＩＬ−５の結合に対する抗体の効果を測定した。膜を調製するために、１０９個の細胞を１０００ｘｇ、４℃、１０分間ペレット化した。細胞ペレットをドライアイス／エタノール浴で１５分凍結した。ペレットを融解し、４℃の１０ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、１０００ｘｇで１０分間ペレット化した。細胞ペレットをＰＢＳで２回洗浄し、１３.５ｍｌの低張バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７.５、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ジチオスレイトール、１ｍＭ フェニルメチルスルホニルフルオリド、１μＭ ロイペプチン、１μＭ ペプスタチンＡ）に再懸濁し、氷上で５分間インキュベーションした。細胞懸濁液を１５ｍｌのDounceホモジナイザーでホモジナイズし、２.５Ｍ蔗糖溶液を用いて蔗糖最終濃度０.２５Ｍとした。１０００ｘｇで１５分の遠心分離により細胞残渣を除去した。細胞膜を１０００００ｘｇ、４℃で９０分間ペレット化し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７.５、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、２５０ｍＭ 蔗糖中に再懸濁し、−７０℃で保存した。
【０１２０】
受容体を含むDrosophila膜を用いるアッセイを、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー ｐＨ７.２および０.１％ ＢＳＡ（結合バッファー）を含有するDrosophila組織培養培地Ｍ３（Lindquist et al.,Drosophila Inf.Serv.,58:163(1982)）を用いて、MultiscreenGV（登録商標）プレート（Millipore Corp.,Bedford,MA）中で行った。０.１ｍｌの結合バッファーを用いてウェルをプレブロック（preblock）した。５０μｌの試験試料（３系とした）をウェルに添加し、次いで、２５μｌのヨウ素化（１２５Ｉ）ＩＬ−５を添加した。２０分室温でインキュベーションした後、ヒト・ＩＬ−５Ｒのα−鎖を発現しているDrosophila S2細胞の膜抽出物２５μｌをウェルに添加した。さらに１時間インキュベーションした後、減圧濾過により膜を集め、結合バッファーで３回洗浄した。フィルターを乾燥し、カウントした。
【０１２１】
Ｃ. ＩＬ−５中和アッセイ
親切にも、R.Palacios（Basel Institute of Immunology,Switzerland）からマウス・ＩＬ−５／ＩＬ−３依存性細胞系ＬｙＨ７.Ｂ１３（Ｂ１３）を得た。Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、ペニシリン−ストレプトマイシン（すべてGibcoBRL）ならびに２−メルカプトエタノール（５ｘ１０−５Ｍ,Sigma）、１０％ ウシ胎児血清（Globepharm,Surrey,UK）および１〜１０ユニットのマウス・ＩＬ−５を補足したＲＰＭＩ １６４０培地（GibcoBRL, Renfrewshire,UK）中で１週間に２回細胞をサブクローンした。アッセイのために、９６ウェル丸底プレート中、適当に希釈した試験試料の存在下、３系で４８時間培養し、次いで、０.５μＣｉの３Ｈ−チミジン（Amersham,Bucks,UK）を添加して最後の４時間のインキュベーションを行った。それらを1205 Beteplate（LKB Wallac,Beds,UK）におけるシンチレーションカウンティングのために処理した。
【０１２２】
Ｄ.光学的バイオセンサー
固定化ｈＩＬ−５と抗体に関する速度論的平衡結合特性を、BIAcore光学的バイオセンサー（Pharmacia Biosensor,Uppsala,Sweden）を用いて行った。以前に記載されているようにして（Karlsson et al.,J.Immunol.Meth.,145:229-240(1991)（その全体を参照により本明細書に記載されているものと見なす））速度論的データを評価した。
【０１２３】
３つの中和ｍＡｂｓ、すなわち、２Ｂ６、２Ｅ３および２Ｆ２は、膜受容体への１２５Ｉ−ＩＬ−５の結合に対する阻害およびＢ細胞増殖の中和について類似した能力を有しおり、またＩＬ−５に対して非常に類似したアフィニティーを有していた（表１参照）。これら３つのｍＡｂｓ、すなわち２つのＩｇＧ１および１つのＩｇＧ２ａからのＶＨおよびＶＬのヌクレオチド配列をそれぞれ決定した。得られた配列は非常に類似しており、ほんの少数の残基のみが異なっていた。
【０１２４】
【表１】
【実施例３】
【０１２５】
実施例３ 組み合わせライブラリーからのＩＬ−５ Ｆａｂｓの単離および特徴づけ
Ａ. ＰＣＲおよび組み合わせライブラリーの構築
Huse et al.Science,246:1275(1989)およびKang,S.A.Methods:Comparison Methods Enzymol.,2:111(1991)（それら全体を参照により本明細書に記載されているものと見なす）により記載されたようにして、３匹のマウスの脾臓から精製したＲＮＡを、ｃＤＮＡキット（Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN）により逆転写した（キット付属のプライマー（ｄＴ）１５または３’Ｆｄ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ３）およびカッパ軽鎖プライマーを用いる）。記載されたプライマーおよび温度サイクリング条件（上記Huseら）を用いてＰＣＲにより免疫グロブリンｃＤＮＡを増幅した。AmpliWaxTMPCR Gem 100（Perkin Elmer Cetus,Norwalk,CT）ビーズおよび製造者のプロトコールを用いるホット・スタート（Hot Start）法をすべての反応に使用した。ＰＣＲ生成物をゲル精製し、消化し、pMKFabGene3ベクター（Ames et al.,J.Immunol.,512:4572(1994)）中に連結した。Ｆｄ ｃＤＮＡを用いる連結後のライブラリー力価は５.１Ｘ１０７ＣＦＵであり、カッパｃＤＮＡを用いるライゲーション後の力価は１.５Ｘ１０６ＣＦＵであった。ファージミドライブラリーを用いて形質転換されたXL1-Blue細胞（Stratagene,La Jolla,CA）を、ヘルパーファージＶＣＳＭ１３（Stratagene）に感染させ、Barbas and Lerner,Methosa:Comparison Methods Enzymol.,2:119(1991)により記載されたようにしてファージを調製した。
【０１２６】
Ｂ.バイオパンニング（Biopanning）
４つのマイクロタイターウェル（Immulon II Removawell Strips,Dynatech Laboratories Inc.,Chantilly,VA）を、０.１Ｍ重炭酸,ｐＨ８.６中ＩＬ−５（１μｇ／ウェル）で４℃において被覆した。ウェルを水洗し、３％ ＢＳＡ含有ＰＢＳを用いて３７℃で１時間ブロックした。ブロッキング溶液を除去し、ライブラリーをマイクロタイターウェルに添加し（５０μｌ／ウェル）、３７℃で２時間インキュベーションした。ウェルをＴＢＳ／TweenR（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ,ｐＨ７.５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０.５％ TweenR２０）で１０回洗浄し、水で１回洗浄し、次いで、０.１Ｍ ＨＣｌ（１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ含有グリシンでｐＨ２.２に調節）で付着ファージを溶離した。
【０１２７】
Ｃ.コロニー釣菌
バイオパンニングの第３ラウンドおよび第４ラウンドから単離されたコロニーからのコロニー釣菌を記載されたようにして（Barbas and Lerner、上記）行った。０.５〜１.０μＣｉの１２５Ｉ−ＩＬ−５とともにフィルターを室温で１時間インキュベーションし、製造者の推奨手順に従ってBolton-Hunter試薬（NEN,Billerica,MA）を用いて１％ ＢＳＡ含有ＰＢＳ中でヨウ素化し、ＰＢＳ ０.２５％ Tweenで洗浄し、Kodak XARフィルムにさらした。ＩＬ−５反応性Ｆａｂｓを発現しているコロニーをオートラジオグラフィーにより検出した。
【０１２８】
Ｄ.可溶性ＦＡＢｓの調製
ファージミドＤＮＡをＮｈｅＩおよびＳｐｅＩで消化して遺伝子ＩＩＩを除去し、自己連結させた。ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞を形質転換し、単離されたコロニーを、１％グルコースおよび５０μｇ／ｍｌカルベニシリンを含有する５.０ｍｌのスーパーブロス（ＳＢ）培地（３０ｇトリプトン、２０ｇ酵母エキス、１０ｇの３−［Ｎ−モルホリノ］プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、ｐＨを７に調節）中で３７℃で一晩増殖させた。この培養１ｍｌからの細胞をBeckman GS-6R遠心分離機にて３５００ｒｐｍで１０分間ペレット化し、５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含有する５ｍｌのＳＢに植菌した。培養物を３７℃で１時間振盪し、イソプロピル−ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ；１ｍＭ）を添加し、培養物を２８℃に移し、一晩おいた。３０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８.０に懸濁した２０％蔗糖中、４℃で２０分間細胞を溶解し、次いで、微量遠心機で１０分間遠心分離することによりペリプラスム抽出物から可溶性Ｆａｂを調製した。ウェルタンブロットにより、既知量のマウス・Ｆａｂを含有する試料と比較することによってＦａｂ濃度を評価した。別の細菌のペリプラスム抽出物は同様の濃度のＦａｂを含んでおり、ウェスタンブロット分析による分析では１ないし２０μｇ／ｍｌの範囲であった。
【０１２９】
Ｅ. ＦＡＢｓの精製
重鎖のカルボキシ末端上にキレートするペプチドを加工作成して蛋白精製の助けとした。ＮｈｅＩおよびＳｐｅＩでの消化によるＭ１３遺伝子ＩＩＩコーディング領域の除去後、６個のヒスチジン残基をコードしている１対の重複オリゴヌクレオチド：［配列番号：４３］５’−ＣＴＡＧＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＴＡＡ−３’；［配列番号：４４］３’−ＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＡＴＴＧＡＴＣ−５’をＦａｂ発現ベクター中にサブクローンした。上記のごとくＦａｂ発現の誘導を行った。２８℃で一晩インキュベーションした後、２０％蔗糖、３０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８.０中４℃で３０分インキュベーションすることにより細胞ペレットのペリプラスム溶解物を調製した。尿素およびＢｒｉｊ−３５界面活性剤を清澄化した上清に添加して、最終濃度をそれぞれ、２Ｍおよび１％とした。室温で１時間撹拌後、処理され清澄化された上清を、５ｍｌのニッケル−ＮＴＡ金属キレーティングカラム（１.５ｘ３ｃｍ）（バッファーＡ（１００ｍＭ Ｎａ−リン酸、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０.３Ｍ ＮａＣｌ、２Ｍ尿素,ｐＨ８.０）で平衡化されている）に、流速０.５ｍｌ／分で直接負荷した。４カラム体積分（２０ｍｌ）の洗浄後、上と同じバッファー中ｐＨを８から４にする６カラム体積分（３０ｍｌ）の逆ｐＨグラジエントで結合物質を溶離した。精製されたＦａｂｓは、ｐＨ５.５において対称形の鋭いピークとなってカラムから溶出した。精製Ｆａｂｓは＞９０％の純度であり、ＤＮＡ不含であった。
【０１３０】
Ｆ. ＦＡＢ ＥＬＩＳＡ
０.１Ｍ重炭酸バッファー,ｐＨ８.６に懸濁された（１ｍｇ／ｍｌ；ウェル１個あたり５０ｍｌ）蛋白でImmulon IIプレート（Dynatech）を４℃で一晩被覆した。０.０５％ Tween（登録商標）２０含有ＰＢＳにて希釈および洗浄を行った。プレートを洗浄し、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳにて室温で１時間ブロッキングした。可溶性Ｆａｂを含有する細菌懸濁液の種々の希釈物、または精製Ｆａｂｓをプレートに添加した。１時間インキュベーション後、プレートを洗浄し、ビオチン化ヤギ・抗−マウスカッパ（Southern Biotechnology Associates,Inc.,Birmingham,AL）を添加（１：２０００希釈；５０μｌ／ウェル）して１時間おいた。プレートを洗浄し、ストレプトアビジン標識セイヨウワサビペルオキシダーゼを添加し（１：２０００希釈；５０μｌ／ウェル）１時間おいた。プレートを洗浄し、ＡＢＴＳペルオキシダーゼ基質を添加し（１００μｌ／ウェル；Kirkegaard & Perry Laboratories,Gaithersberg,MD）、４０５ｎｍにおける光学密度をUVmax（登録商標）（Molecular Devices）マイクロプレートリーダーで読んだ。
【０１３１】
Ｇ.組み合わせライブラリーからのＦａｂｓの単離および特徴付け
ＩＬ−５で被覆したマイクロタイターウェルに対する複数ラウンドのバイオパンニングにより、ＩＬ−５に対するＦａｂｓを有するファージをライブラリーから選択した。４ラウンドの選択後、１２５Ｉ−ＩＬ−５を用いるコロニー釣菌アッセイによりＩＬ−５反応性Ｆａｂｓが同定された。第３ラウンドから３４個のコロニーが、第４ラウンドから４個のコロニーが同定され、それらは標識ＩＬ−５に結合した。Ｆａｂ−遺伝子ＩＩＩ融合蛋白を発現している培養上清を用いる直接結合ＥＬＩＳＡによりＩＬ−５への結合を確認した。これらのコロニーからＤＮＡを単離し、Ｍ１３遺伝子ＩＩＩのコーディング領域を除去後、可溶性Ｆａｂの発現を誘導した。ペリプラスムフラクションを調製し、ＩＬ−５への結合についてＥＬＩＳＡによりアッセイした。Ｆａｂは、別の蛋白ｒＣ５ａへの結合を示すことなくＩＬ−５に特異的に結合した。
【０１３２】
未希釈ペリプラスム抽出物（１ないし２０μｇ／ｍｌのＦａｂを含有）を、ＩＬ−５Ｒ結合阻害アッセイ（実施例２）においてアッセイした。Ｌ−５Ｒαへのヨウ素化ＩＬ−５の結合を３５％よりも多く阻害するＦａｂはなかった。
【０１３３】
Ｈ.中和ｍＡｂのＦＡＢへの変換
ＦｄおよびｍＡｂ（２Ｂ６）のκｃＤＮＡを、上記条件を用いるＰＣＲにより単離した。ゲル精製したフラグメントをpMKFabGene3ベクター中にサブクローンし、これを修飾して遺伝子ＩＩＩのｃＤＮＡの３’末端にヘキサ−Ｈｉｓ配列を含むようにして、プラスミドpMKFabGene3Hを得た。２Ｂ６重鎖および軽鎖を有する機能的なＩＬ−５結合Ｆａｂクローンをコロニー釣菌アッセイにより同定した。ＮｈｅＩ／ＳｐｅＩ消化による遺伝子ＩＩＩの除去および自己連結を行って、重鎖をイン−フレームでヘキサ−Ｈｉｓに融合させ、上記のごとく精製を可能にした。このＦａｂは用量依存的に受容体結合を阻害し、ＩＣ５０は約７.５μｇ／ｍｌであり、親ｍＡｂであるマウス・２Ｂ６のＩＣ５０と同様であった。
【０１３４】
Ｉ.チェイン−シャッフル（chain-shuffle）されたライブラリーの構築およびスクリーニング
中和ｍＡｂ ２Ｂ６のＦｄをコードしているｃＤＮＡを、ＸｈｏＩ／ＳｐｅＩフラグメントとしてpMKFabGene3H中にサブクローンして、軽鎖ｃＤＮＡのかわりにＳｓｔＩ／ＸｂａＩフラグメントを含ませた。このファージミドをＳｓｔＩおよびＸｂａＩで消化し、ＩＬ−５免疫マウス由来（上記）のＳｓｔＩ／ＸｂａＩ消化された軽鎖のＰＣＲ生成物と連結した。連結後のライブラリー力価は４ｘ１０５ＣＦＵであった。バイオパンニングおよびコロニー釣菌アッセイを、組み合わせライブラリーに関して上で説明したように行った。
【０１３５】
中和ｍＡｂ ２Ｂ６のＦｄをコードしているｃＤＮＡを、ＩＬ−５免疫マウスから回収された同じ軽鎖レパートリーと対合させることによりライブラリーを構築した。このチェインシャッフルされたライブラリーを、固定化ＩＬ−５に対する４ラウンドのバイオパンニングに供し、得られたコロニーをコロニー釣菌アッセイを用いてＩＬ−５反応性に関してアッセイした。ヨウ素化ＩＬ−５に結合する陽性コロニーを、ＥＬＩＳＡおよびＩＬ−５Ｒα結合アッセイによりさらにアッセイした。チェインシャッフルされたライブラリーから回収されたＦａｂのうち２個（２および１５）がＩＬ−５ＲαへのＩＬ−５の結合をブロックし、Ｂ１３アッセイにおいてＩＬ−５依存的増殖を抑制した。これら２個のＶｋの配列は２Ｂ６のＶｋ（２Ｂ６のＶＨに対するもとの軽鎖パートナー）の配列と類似であった。Ｆａｂ２および１５に関する軽鎖配列は、それぞれ配列番号：４５および４６である。Ｆａｂ２については、ＣＤＲ１〜３はそれぞれ配列番号：１０、１１および４７である。Ｆａｂ１５については、ＣＤＲ１〜３はそれぞれ配列番号：１０、１１および４８である。
【０１３６】
下記実施例４および５に記載したすべての抗体のアミノ酸配列はＫＡＢＡＴナンバーリングシステムを用い、このシステムにおいてはＣＤＲおよび枠組み長が変化してもかまわない。すなわち、鍵アミノ酸は、それに先行するアミノ酸数にかかわらず常に同じ番号を与えられる。例えば、すべての軽鎖のＣＤＲ１に先行するシステインは、常にＫＡＢＡＴ位置２３であり、たとえＣＤＲ１が１７個までのアミノ酸を含む場合であってもＣＤＲ１の後に続くトリプトファン残基は常にＫＡＢＡＴ位置３５である。
【実施例４】
【０１３７】
実施例４ ヒト化抗体
マウス・ＣＤＲｓをヒト化抗体枠組み中に含むように１のヒト化抗体を設計した。下記操作を行うことにより、ＩＬ−５特異的マウス・抗体２Ｂ６のこのヒト化バージョンを調製した。
【０１３８】
Ａ.遺伝子クローニング
Boehringer Mannheim（Indianapolis,IN）から得たキットを用いて２Ｂ６、２Ｆ２および２Ｅ３ハイブリドーマ細胞系（実施例１）のそれぞれからｍＲＮＡを単離し、次いで、ｃＤＮＡキット（Boehringer Mannheim）付属のプライマー（ｄＴ）１５を用いて逆転写してｃＤＮＡを作成した。マウス・免疫グロブリンに特異的なＰＣＲプライマーを用いて、重鎖可変領域のアミノ酸９（ＫＡＢＡＴナンバーリングシステム）からヒンジ領域まで伸長しているドメインならびに軽鎖可変領域のアミノ酸９（ＫＡＢＡＴナンバーリングシステム）から不変領域の末端まで伸長しているドメインをコードしているＤＮＡを増幅した。独立別個のＰＣＲ反応により各抗体鎖の数個のクローンを得た。
【０１３９】
使用したマウス・ガンマ１ヒンジ領域プライマーは［配列番号：２２］：５’ＧＴＡＣＡＴＡＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＡＣＡＡＣＣＡＣＡＡＴＣ３’であった。
【０１４０】
使用したマウス・ガンマ２ａヒンジ領域プライマーは［配列番号：２３］：５’ＧＧＡＣＡＧＧＧＣＴＴＡＣＴＡＧＴＧＧＧＣＣＣＴＣＴＧＧＧＣＴＣ３’であった。
【０１４１】
使用したマウス・重鎖可変領域プライマーは［配列番号：２４］：５’ＡＧＧＴ（ＣまたはＧ）（ＣまたはＡ）Ａ（ＧまたはＡ）ＣＴ（ＧまたはＴ）ＴＣＴＣＧＡＧＴＣ（ＴまたはＡ）ＧＧ３’であった。
【０１４２】
使用したマウス・カッパ鎖不変領域プライマーは［配列番号：２５］：５’ＣＴＡＡＣＡＣＴＣＡＴＴＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣＴＣＴＴＧＡＣＡＡＴＧＧＧ３’であった。
マウス・軽鎖可変領域プライマーは［配列番号：２６］：５’ＣＣＡＧＡＴＧＴＧＡＧＣＴＣＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＣＴＣＣＡ３’であった。
【０１４３】
ＰＣＲフラグメントをプラスミドｐＧＥＭ７ｆ＋（Promega）中にクローンし、次いで、それをE.coli DH5a（Bethesda Reaearch Labs）中に形質転換した。
【０１４４】
Ｂ. ＤＮＡ配列決定
上記Ａで得た重鎖および軽鎖マウスｃＤＮＡクローンを配列決定した。これらのクローンの可変領域の配列決定結果を配列番号：１〜６（図１〜６）に示す。各クローンは、マウス・重鎖可変領域または軽鎖可変領域間で保存されていることが知られているアミノ酸を含んでいた。ＣＤＲアミノ酸配列を以下に記載する。 ２Ｂ６重鎖に関するＣＤＲ領域は配列番号：７、８および９である。図７参照。これらの配列は配列番号：１によりコードされている。軽鎖に関するＣＤＲ領域は配列番号：１０、１１および１２である。図７参照。これらの配列は配列番号：２によりコードされている。
【０１４５】
２Ｆ２重鎖に関するＣＤＲ領域は配列番号：７、８および９である。図７参照。これらの配列は配列番号：３によりコードされている。軽鎖に関するＣＤＲ領域は配列番号：１０、１１および１３である。図７参照。これらの配列は配列番号：４によりコードされている。
【０１４６】
２Ｅ３重鎖に関するＣＤＲ領域は配列番号：７、８および１４である。図７参照。これらの配列は配列番号：５によりコードされている。軽鎖に関するＣＤＲ領域は配列番号：１０、１１および１３である。図７参照。これらの配列は配列番号：６によりコードされている。
【０１４７】
Ｃ.ヒト・枠組みの選択
２Ｂ６のクローニング後、ＫＡＢＡＴおよびＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ（Nuc. Acids Res.,20:2019-2022(1992)）蛋白配列データベースにおいて可変領域重鎖および軽鎖のアミノ酸配列（図１および２）（それぞれ配列番号：１５および１６）を既知マウス・免疫グロブリン配列と比較してＮ末端残基に割り当てた。次いで、２Ｂ６重鎖および軽鎖可変領域の推定アミノ酸配列をヒト・免疫グロブリン蛋白配列データベースと比較して、マウス配列に最もぴったりと合致する重鎖および軽鎖両方のヒト・枠組みを同定した。さらに、ＣＤＲ表現に影響しうるアミノ酸による潜在的矛盾を評価するためにＦａｂドメインの構造的モデルから得られた位置のデータベースを用いて重鎖および軽鎖を評価した。矛盾位置における対応マウス・アミノ酸の置換により、ヒト化可変領域枠組みの合成中に矛盾は解決された。
【０１４８】
ヒト骨髄腫免疫グロブリン（ＣＯＲ）から得られた抗体の重鎖枠組み領域を用いた（E.M.Press and N.M.Hogg,Biochem.J.,117:641-660(1970)）。ヒト・重鎖枠組みアミノ酸配列は２Ｂ６枠組みに対して約６６％の相同性があることが見いだされた。
【０１４９】
適当な軽鎖可変領域枠組みについては、Bence-Jones蛋白（LEN）（Schneider et al.,Hoppe-Seyler's Z.Physiol.Chem.,356:507-557(1975)）の軽鎖可変枠組み配列を用いた。ヒト・軽鎖枠組み領域は、マウス・２Ｂ６軽鎖枠組み領域に対して、アミノ酸レベルで約８２％の相同性があった。
【０１５０】
選択されたヒト・枠組みを戻し翻訳（back translate）してＤＮＡ配列を得た。
【０１５１】
Ｄ.ヒト化ＭＡＢ遺伝子の構築
２Ｂ６重鎖ＣＤＲｓ［図７および配列番号：１〜２］およびヒト・抗体の枠組み配列を得て、合成重鎖可変領域［配列番号：１８］を作成した。結合した場合にアミノ酸２１〜１０６（ＫＡＢＡＴ番号付け）をコードすることとなる４つの合成オリゴヌクレオチド［配列番号：２７および２８］［配列番号：２９および３０］を用いてこれを作成した。次いで、ＣＯＲ枠組み（上記）に基づく別のヒト化重鎖由来の配列を含むｐＵＣ１８をベースにしたプラスミドのＨｐａＩ−ＫｐｎＩ制限部位中にオリゴヌクレオチドを連結した。このプラスミドはシグナル配列［配列番号：１７］および残りの可変領域配列を提供する。変異原性プライマーを用いるＰＣＲまたは存在する制限部位中への合成リンカーの付加により、マッピングされた配列中のエラーを修正した。
【０１５２】
シグナル配列およびヒト化重鎖可変領域をｐＵＣをベースとしたプラスミドからＥｃｏＲＩ−ＡｐａＩフラグメントとして切り出し、ＩｇＧ１ヒト・不変領域を含んでいる発現ベクターｐＣＤ中に連結した。合成重鎖可変領域ヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図８［配列番号：１８および１９］に示す。ヒト・枠組み残基は配列番号：１９のアミノ酸１〜３０、３６〜４９、６６〜９７および１０９〜１１９である。ＣＤＲｓのアミノ酸配列はマウス・２Ｂ６ ＣＤＲｓと同じである。得られた発現ベクターｐＣＤＩＬ５ＨＺＨＣ１.０を図１０に示す。
【０１５３】
２Ｂ６軽鎖ＣＤＲｓ［図７および配列番号：１０、１１および１２］およびヒト・抗体の枠組み配列を得てから、合成軽鎖可変領域［配列番号：２０］を作成した。それぞれＳａｃＩ−ＫｐｎＩおよびＰｓｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ末端を有するヒト化ＶＬのアミノ酸２７〜５８（ＫＡＢＡＴ番号付け）［配列番号：３１および３２］およびアミノ酸８０〜１０９［配列番号：３３および３４］をコードしている４つの合成オリゴヌクレオチドを、ＬＥＮ枠組みに対して高度な相同性を有する別のヒト・軽鎖枠組み（Ｂ１７）（Marsh et al,Nuc.Acids Res.,13:6531-6544(1985)）由来の配列を含むｐＵＣ１８をベースにしたプラスミド中に挿入した。このプラスミドは残りの可変領域配列を提供する。マッピングされた配列中のエラーおよびＬＥＮとＢ１７との間の１個のアミノ酸の相違を、変異原性プライマーを用いるＰＣＴまたは存在する制限部位中への合成リンカーの付加により修正した。
【０１５４】
ヒト化軽鎖領域をｐＵＣプラスミドからＥｃｏＲＶ−ＮａｒＩフラグメントとして単離し、カッパヒト不変領域ならびにシグナル配列［配列番号：１７］を含む発現ベクターｐＣＮ中に連結した。合成軽鎖可変領域ヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図９［配列番号：２０および２１］に示す。ヒト・枠組み残基は配列番号：２１のアミノ酸１〜２３、４１〜５５、６３〜９４および１０４〜１１３である。ＣＤＲｓのアミノ酸配列はマウス・２Ｂ６ ＣＤＲｓと同じである。しかしながら、これらのＣＤＲｓに関するコーディング配列はマウス・２Ｂ６コーディング配列とは異なっており、制限酵素部位の作成が可能である。得られた発現ベクターの１つであるｐＣＮＩＬ５ＨＺＬＣ１.０を１１に示す。これらの合成可変軽鎖および／または重鎖配列をヒト化抗体の構築に使用する。
【０１５５】
Ｅ.ヒト化ＭＡｂの発現
ＩｇＧ１イソタイプ由来のヒト化重鎖には配列番号：１９に示す合成重鎖可変領域を用いる。２Ｂ６重鎖ＣＤＲｓを含んでいるこの合成ＶＨを上記のごとく設計し、合成した。
【０１５６】
ヒト化軽鎖、ヒト・カッパ鎖には配列番号：２１に示す合成軽鎖可変領域を用いる。２Ｂ６軽鎖ＣＤＲｓを含んでいるこの合成ＶＬを上記のごとく設計し、合成した。ヒト化可変領域をコードしているＤＮＡフラグメントをｐＵＣ１９をベースにした哺乳動物細胞発現プラスミド中に挿入してプラスミドｐＣＤＩＬ５ＨＺＨＣ１.０（重鎖）［配列番号：４９、図１０も参照］およびｐＣＮＩＬ５ＨＬＣ１.０（軽鎖）［配列番号：５０、図１１も参照］。該発現プラスミドはシグナル配列を使用するものであり、ＣＭＶプロモーターおよび下記実施例５にて慣用的方法（すでに引用したManiatisらの文献）により製造されるキメラのヒト・重鎖またはヒト・軽鎖不変領域を含んでいる。プラスミドをＣＯＳ細胞中に同時トランスフェクションし、実施例５記載のＥＬＩＳＡにより３日後および４日後に上清をヒト・抗体の存在についてアッセイした。
【０１５７】
上記実施例は典型的な組み換え法による抗体の調製を説明する。慣用的手段により得られた他の抗−ＩＬ−５抗体（例えば、２Ｆ２、２Ｅ３、４Ａ６、５Ｄ３、２４Ｇ９等）を用いて、他の組み換え抗体の取得に関して同様の手順を用いることができる。
【０１５８】
Ｆ.精製
ＣＨＯにより発現されたキメラおよびヒト化２Ｂ６の精製を、慣用的なプロテインＡ（またはＧ）アフィニティークロマトグラフィー、次いで、イオン交換および分子ふるいクロマトグラフィーにより行うことができる。同様のプロセスをうまく用いて他のｍＡｂｓ（例えば、呼吸器合胞体ウイルス、インターロイキン−４およびマラリアサーカムスポロゾイトに対するもの）の純度９５％以上の精製が行われている。
【０１５９】
Ｇ.さらなるヒト化ｍＡｂｓおよび発現プラスミド
プラスミドｐＣＤＩＬ５ＨＺＨＣ１.０［配列番号：４９］を得てから、枠組み位置７３のスレオニンをアスパラギンに置換した発現プラスミドｐＣＤＩＬ５ＨＺＨＣ１.１を作成した。ＥｃｏＲＶおよびＸｈｏＩ末端［配列番号：５１および配列番号：５２］を有する合成リンカーを、同様にして消化されたｐＣＤＩＬ５ＨＺＨＣ１.０中に連結することにより、これを作成した。同様にして、発現プラスミドｐＣＤＩＬ５ＨＺＨ１.２は、枠組み位置３７においてバリンのかわりにイソロイシンを有する。ＨｐａＩおよびＸｂａＩ末端［配列番号：５３および配列番号：５４］を有する合成リンカーを、同様にして消化されたｐＣＤＩＬ５ＨＺＨＣ１.０中に連結することにより、これを作成した。さらに、ＨｐａＩおよびＸｂａＩ末端［配列番号：５３および配列番号：５４］を有する合成リンカーを、同様にして消化されたｐＣＤＩＬ５ＨＺＨＣ１.１中に連結することにより、ｐＣＤＩＬ５ＨＺＨＣ１.３を作成した。
【０１６０】
４つの合成オリゴヌクレオチド［配列番号：３１、３２、３３および３４］のＤＮＡ配列を含むすでに記載されているｐＵＣ１８をベースにしたプラスミドを得て、枠組み位置１５がロイシンからアラニンに変更されているヒト化軽鎖可変領域を作成した。このプラスミドをＮｈｅＩおよびＳａｃＩ制限エンドヌクレアーゼで消化し、合成リンカー［配列番号：５５および５６］を挿入した。次いで、ＥｃｏＲＶ−ＮａｒＩフラグメントを単離し、同様に消化した発現ベクターｐＣＮＩＬ５ＨＺＬＣ１.０中に連結してｐＣＮＩＬ５ＨＺＬＣ１.１を得た。
【０１６１】
免疫グロブリン（ＮＥＷ）（Saul et al,J.Biol.Chem.253:585-597(1978)）から得た重鎖枠組み領域および２Ｂ６重鎖ＣＤＲｓ［図７および配列番号：１〜２］を用いて合成可変領域を作成した。ＣＤＲ表現に影響しうる枠組みアミノ酸を同定し、ずでに記載されている方法を用いて置換を行った。４つの重複合成オリゴヌクレオチド［配列番号：５７、５８、５９および６０］を得て、それらはアニーリングされ伸長された場合に、シグナル配列［配列番号：１７］および重鎖可変領域を表わすアミノ酸をコードする。次いで、この合成遺伝子を、ＰＣＲプライマー［配列番号：６３および６４］を用いて増幅し、ＣＯＲ枠組みに基づく別のヒト化重鎖由来の配列を含むｐＵＣ１８をベースにしたプラスミド中にＢｓｔＸＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントとして連結した。合成オリゴヌクレオチドリンカー［配列番号：７５および７６］をＳａｃＩＩおよびＫｐｎＩ制限部位に挿入することにより、枠組みのフェニルアラニンからチロシンへの置換をアミノ酸位置９１（ＫＡＢＡＴ番号付けシステム）（図１２の位置９４と同じ）において行った。得られた重鎖可変領域［図１２および配列番号：６１、６２］をＮＥＷＭヒト化重鎖という。変異原性プライマーを用いるＰＣＲまたは存在する制限部位中への合成リンカーの付加により、マッピングされた配列中のエラーを修正した。シグナル配列およびヒト化重鎖可変領域をｐＵＣをベースにしたプラスミドからＥｃｏＲＩ−ＡｐａＩフラグメントとして切り出し、ヒト・ＩｇＧ１不変領域を含む発現ベクターｐＣＤ中に連結してプラスミドｐＣＤＩＬ５ＮＥＷＭを得た。ＣＤＲｓのアミノ酸配列はマウス・２Ｂ６重鎖ＣＤＲｓと同じである。
【０１６２】
免疫グロブリン（ＲＥＩ）(Palm et al,Hoppe-Seyler's Z.Physiol.Chem.356:167-191(1975)）から得た軽鎖枠組み領域および２Ｂ６軽鎖ＣＤＲｓ［図７および配列番号：１０、１１および１２］を用いて合成可変領域を作成した。ＣＤＲの表現に影響しうる枠組みアミノ酸を同定し、すでに記載された方法を用いて置換を行った。４つの重複合成オリゴヌクレオチド［配列番号：６５、６６、６７および６８］を得て、それらはアニーリンされ伸長された場合、ＲＥＩヒト化軽鎖と呼ばれる軽鎖可変領域［図１３および配列番号：６９、７０］を表すアミノ酸をコードする。次いで、この合成遺伝子をＰＣＲプライマー［配列番号：７１および７２］を用いて増幅し、ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントとしてｐＧＥＭ−７Ｚｆ（＋）（Promega Corporation,Madison,WI）中に連結した。
【０１６３】
変異原性プライマーを用いるＰＣＲまたは存在する制限部位中への合成リンカーの付加によりマッピングされた配列中のエラーを修正した。ヒト化軽鎖可変領域をｐＧＥＭ−７Ｚｆ（＋）をベースにしたプラスミドからＥｃｏＲＶ−ＮａｒＩフラグメントとして切り出し、ヒト・カッパ不変領域ならびにシグナル配列［配列番号：１７］を含む発現ベクターｐＣＮ中に連結した。ＣＤＲｓのアミノ酸配列はマウス・２Ｂ６軽鎖ＣＤＲｓと同じである。しかしながら、これらのＣＤＲｓのコーディング配列はマウス・２Ｂ６のコーディング配列とは異なり、制限酵素部位の作成を可能にする。これらの合成可変軽鎖および／または重鎖配列をヒト化抗体の構築に使用する。
【０１６４】
すでに記載されたｐＧＥＭ−７Ｚｆ（＋）をベースにしたプラスミドを得ると、枠組み位置１５がバリンからアラニンに変化しているヒト化軽鎖可変領域を作成することができる。このプラスミドをＮｈｅＩおよびＳａｃＩ制限エンドヌクレアーゼで消化することができ、合成リンカー［配列番号：７３および７４］を挿入する。次いで、ＥｃｏＲＶ−ＮａｒＩフラグメントを単離し、同様に消化された発現ベクターｐＣＮＩＬ５ＨＺＲＥＩ中に連結してプラスミドｐＣＮＩＬ５ＲＥＩＶ１５Ａを得ることができる。
【実施例５】
【０１６５】
実施例５ キメラ抗体の構築
マウス・ｍＡｂ ２Ｂ６重鎖可変領域のアミノ酸９〜１０４（ＫＡＢＡＴ番号付け）をコードしているＤＮＡを、２Ｂ６ハイブリドーマ細胞系から得たｃＤＮＡ（実施例４参照）のｐＧＥＭ７Ｚｆ（＋）をベースにしたＰＣＲクローンｐＧＥＭ７Ｚｆ（＋）からＡｖａＩＩ−ＳｔｙＩ制限フラグメントとして単離した。このフラグメントを４つの小型合成オリゴマーリンカー［配列番号：３５および３６］［配列番号：３７および３８］とともにｐＵＣ１８をベースにしたプラスミド（ＢｓｔＸＩ−ＨｉｎｄＩＩＩで消化）中で一緒にすることにより、隣接重鎖可変領域配列およびシグナル配列［配列番号：１７］を提供した。密接に関連したマウス・重鎖から推定されたＮ末端アミノ酸のコンセンサスを、最初の８個のＶＨ残基に関して帰属し、それらは配列番号：３５および３６中にコードされている。２Ｂ６重鎖の最初の１５個のＮ末端アミノ酸を配列決定することにより重鎖の推定アミノ酸配列を確かめた。
【０１６６】
シグナルおよびＶＨ領域に関する配列を含むＥｃｏＲＩ−ＡｐａＩフラグメントを単離し、すでにヒト・ＩｇＧ１不変領域をコードしているプラスミドｐＣＤ中に連結した。
【０１６７】
マウス・ｍＡｂ ２Ｂ６軽鎖可変領域のアミノ酸１２〜９９（ＫＡＢＡＴ番号付け）をコードしているＤＮＡを、２Ｂ６ハイブリドーマ細胞系から得たｃＤＮＡ（実施例４参照）のｐＧＥＭ７Ｚｆ（＋）に基づくＰＣＲクローンからＤｄｅＩＩ−ＡｖａＩ制限フラグメントとして単離した。ｐＵＣ１８をベースにしたプラスミド（ＥｃｏＲＶ−ＨｉｎｄＩＩＩで消化）中においてこのフラグメントを４つの小型合成オリゴマーリンカー［配列番号：３９および４０］［配列番号：４１および４２］と一緒にすることにより、隣接軽鎖可変領域配列を提供した。密接に関連したマウス・軽鎖から推定されたＮ末端アミノ酸のコンセンサスを、最初の８個のＶＬ残基に関して帰属し、それらは配列番号：３９および
４０中にコードされている。２Ｂ６軽鎖の最初の１５個のＮ末端アミノ酸を配列決定することにより軽鎖の推定アミノ酸配列を確かめた。次いで、この可変領域をＥｃｏＲＶ−ＮａｒＩフラグメントとして単離し、すでにヒト・カッパ領域およびシグナル配列を含んでいる発現ベクターｐＣＮ中に連結した。
【０１６８】
ｐＣＤおよびｐＣＮをベースにしたプラスミドをＣＯＳ細胞中に同時トランスフェクションすることによりキメラ抗体の発現を行った。３日後および５日後に培養上清を集め、下記のごとくＥＬＩＳＡにより免疫グロブリン発現に関してアッセイした。最終工程以外の各工程の後にＰＢＳ洗浄を行う。ヒト・抗体のＲｃ領域に特異的なヤギ・抗体１００ｎｇ／５０μｌ／ウェルを用いてマイクロタイタープレートを一晩被覆した。培養上清を添加し、１時間インキュベーションした。次いで、セイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ抱合ヤギ・抗−ヒトＩｇＧ抗体を添加し、１時間インキュベーションした。次いで、ＡＢＴＳペルオキシダーゼ基質（Kirkegaard & Perry Laboratories Inc.,Gaithersberg,MD）を添加した。１時間インキュベーションした後、マイクロタイタープレートリーダー（Molecular Devices Corporation,Menlo Park,CA）により４０５ｎｍの吸光度を読んだ。キメラ抗体の発現を検出した。同様のＥＬＩＳＡにおいて、キメラ抗体を含むＣＯＳ細胞上清は、ヒト・ＩＬ−５蛋白で被覆したマイクロタイターウェルに特異的に結合した。この結果は、ＩＬ−５に対する抗体をコードしている遺伝子が合成され、発現されたことを示すものである。
【０１６９】
上の実施例は典型的な組み換え法による抗体の調製を説明するものである。慣用的手段により得られた他の抗−ＩＬ−５抗体（例えば、２Ｆ２、２Ｅ３、４Ａ６、５Ｄ３、２４Ｇ９等）を用いて、他の組み換え抗体の取得に関して同様の手順を用いることができる。
【産業上の利用可能性】
【０１７０】
本発明により、高い結合アフィニティーを有するヒト・インターロイキン５に対する中和モノクローナル抗体などが提供されるので、ＩＬ−５により媒介されるえ疾病の治療または予防用医薬組成物などの分野において利用可能である。
【配列表フリーテキスト】
【０１７１】
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【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、１９９４年１２月２３日出願のＵ.Ｓ.第０８／３６３,１３１号の一部継続出願であるＵ.Ｓ.第０８／４７０,１１０号および０８／４６７,４２０号（ともに１９９５年６月６日出願）の一部継続出願である。
【０００２】
発明の分野
一般的には、本発明は、ＩＬ−５および過剰な好酸球産生により媒介される症状の治療および診断に有用な抗体および変化した抗体、そしてより詳細には、ｍＡｂｓ、Ｆａｂ、キメラおよびヒト化抗体の分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
好酸球は、肺組織の過敏反応に関連したアレルギー性疾患を包含する広範囲の炎症性疾病状態の発生に関与している（非特許文献１）。注目すべき例は喘息であり、喘息は、非特異的気管支過敏症を引き起こす気道の可逆的閉塞により特徴づけられる。さらに喘息は、気管支粘膜のレベルの慢性的炎症反応ならびにマクロファージ、リンパ球および好酸球による特徴的な炎症の発生と因果関係がある。好酸球は、疾病の典型的な粘膜ダメージの開始において中心的役割を果たしているようである（非特許文献２）。数が増加した活性化された好酸球は、慢性喘息の患者の循環系、気管支分泌物および肺の実質において報告されており、種々の肺機能試験により測定される疾病の重さは血中好酸球数と相関関係がある（非特許文献３）。また、しばしば、脱顆粒反応の過程における増加した好酸球が、後期喘息反応中の患者気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）中に回収され、通常には、ステロイド療法の結果としての好酸球の減少は臨床的徴候の改善に関連している（非特許文献４）。
【０００４】
インターロイキン５（ＩＬ−５）は、活性化されたＣＤ４およびＴリンパ球により産生されるホモダイマー糖蛋白である。ヒトにおいて、ＩＬ−５は好酸球の増殖および分化の調節に大いに関係している。ＩＬ−５の上昇したレベルは喘息性気管支肺胞洗浄液中に検出される（非特許文献５）。ＩＬ−５に関してトランスジェニックなマウスは、抗原刺激の不存在下の末梢血および組織における著しい好酸球増加を示し（非特許文献６）、抗−ネズミ・ＩＬ−５モノクローナル抗体は、マウスの血液および組織における好酸球増加（非特許文献７）ならびに実験動物における寄生虫感染およびアレルゲン攻撃に関連した好酸球増加（非特許文献８〜１０）の抑制における効果が示されている。
【０００５】
コルチコステロイドは、好酸球数および喘息の他の炎症性成分の減少にきわめて効果的であるが、重い喘息およびより最近になってからは軽い喘息ないしは中程度の喘息のいずれにおいても副作用の心配がある。唯一の他の主要抗−炎症薬剤療法−クロモグリケート類（クロモリンナトリウムおよびネドクロミル）−はコルチコステロイドよりもかなり効果が少なく、それらの正確な作用機構は不明のままである。
【０００６】
より最近の開発は、新たな吸入ステロイド、長時間作用する気管支拡張剤、および新規生化学的もしくは薬理学的標的（例えば、カリウムチャンネル活性化剤、ロイコトリエンアンタゴニスト、５−リポオキシゲナーゼ（５−ＬＯ）阻害剤等）に作用する薬剤に焦点を絞っている。理想的な薬剤は、ステロイドの有効性をクロモリンナトリウムの安全性と結び付けるものであり、選択性が増加していてより迅速に作用を発揮するものである。中和ＩＬ−５抗体は潜在的にヒトにおける好酸球増加関連徴候の軽減に有用でありうる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Butterfieldら,Immunopharmacology of Eosinophils（H.SmithおよびR.Cook編,）中,p151-192,Academic Press, London(1993)
【非特許文献２】Corrigan et al., Immunol.Today,13:501-507(1992)
【非特許文献３】Griffen et al.,J.Aller.Clin.Immunol.67,548-557(1991)
【非特許文献４】Bousquet et al.,N.Eng.J.Med.,323:1033-1039(1990)
【非特許文献５】Motojima et al.,Allergy,48:98(1993)
【非特許文献６】Dent et al.,J.Exp.Med.,172, 1425(1990)
【非特許文献７】Hitoshi et al.,Int.Immunol.,315(1991)
【非特許文献８】Coffman et al.,Science,245,308-310(1989)
【非特許文献９】Sher et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,83:61-65(1990)
【非特許文献１０】Chand et al.,Eur.J.Pharmacol.,211:121-123(1992)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ゆえに、ヒト・インターロイキン５に対する中和モノクローナル抗体のごとき高アフィニティーＩＬ−５アンタゴニストであって、好酸球の分化および増殖（すなわち、好酸球の蓄積）を抑制し、かくして好酸球により炎症を抑制する高アフィニティーＩＬ−５アンタゴニストに対する必要性が当該分野において存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の概要
第１の態様において、本発明は、ヒト・インターロイキン５に特異的で、詳細な説明の欄において説明するように、約３.５ｘ１０−１１Ｍに等しいかまたはそれ未満の解離定数により特徴づけられる結合アフィニティーを有する齧歯類（例えば、ラットおよびマウス）の中和モノクローナル抗体を提供する。かかるモノクローナル抗体の典型例はマウスのモノクローナル抗体２Ｂ６、２Ｅ６および２Ｆ２ならびに４Ａ６のごときラットのモノクローナル抗体である。本発明のもう１つの態様は、ＳＫ１１９−２Ｂ６.２０６.７５（１）、ＳＫ１１９−２Ｅ３.３９.４０.２、ＳＫ１１９−２Ｆ２.３７.８０.１２、４Ａ６（１）Ｇ１Ｆ７および５Ｄ３（１）Ｆ５Ｄ６のごときハイブリドーマである。
【００１０】
関連態様において、本発明は、本発明の齧歯類中和モノクローナル抗体のＦｃ領域を欠失させることにより製造される、ヒト・インターロイキン−５に特異的な中和ＦａｂフラグメントまたはそのＦ（ａｂ'）２フラグメントを提供する。
【００１１】
さらにもう１つの関連態様において、本発明は、チェイン・シャフリング（chain shuffling）法により製造される、ヒト・インターロイキン−５に特異的な中和ＦａｂフラグメントまたはそのＦ（ａｂ'）２フラグメントを提供する。該方法により、線維状ファージＦａｂディスプレイライブラリーにおいてインターロイキン５で免疫された齧歯類から単離された軽鎖（または重鎖）免疫グロブリンライブラリーとともに本発明齧歯類中和モノクローナル抗体から単離された重鎖（または軽鎖）免疫グロブリンが発現される。
【００１２】
さらにもう１つの関連態様において、本発明は、ヒト・インターロイキン５に対して約３.５ｘ１０−１１Ｍに等しいかまたはそれ未満の解離定数により特徴づけられる非ヒト・中和モノクローナル抗体（ｍＡｂ(ｓ)）由来の相補性決定領域（ＣＤＲ(ｓ)）を含んでなる、ヒト・インターロイキン５に特異的な変化した抗体ならびにそれをコードしている核酸分子を提供する。変化した抗体がヒト化抗体である場合には、非ヒト・免疫グロブリン由来の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）をコードしている配列が、少なくとも１つ、好ましくは全部の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）が非ヒト・モノクローナル抗体由来のＣＤＲｓにより置換されている第１の免疫グロブリンパートナー中に挿入される。好ましくは、第１の免疫グロブリンパートナーは、同様に免疫グロブリンの不変鎖全部またはその一部を含んでなる第２の免疫グロブリンパートナーに作動可能に連結される。
【００１３】
関連態様において、本発明は、ヒト・インターロイキン５に対して約３.５ｘ１０−１１Ｍに等しいかまたはそれ未満の解離定数を有すことにより特徴づけられる非ヒト・中和モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）由来のＣＤＲｓ、ならびにかかるＣＤＲｓをコードしている核酸分子を提供する。
【００１４】
さらにもう１つの態様において、ヒト・重鎖および軽鎖の不変領域ならびにヒト・インターロイキン５に対して約３.５ｘ１０−１１Ｍに等しいかまたはそれ未満の解離定数により特徴づけられる非ヒト・中和モノクローナル抗体由来の重鎖および軽鎖の可変領域を含むキメラ抗体を提供する。
【００１５】
さらにもう１つの態様において、本発明は、上記の変化した抗体のうちの１種（またはそれ以上）および医薬上許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【００１６】
さらなる態様において、本発明は、ヒトに有効量の本発明医薬組成物を投与することによる、過剰の好酸球産生に関連したヒトにおける症状の治療方法を提供する。
【００１７】
さらなる態様において、本発明は、ＩＬ−５に対して約３.５ｘ１０−１１Ｍに等しいかまたはそれ未満の解離定数により特徴づけられる非ヒト・中和モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）由来の変化した抗体（例えば、組み換え抗体、ＣＤＲｓ、ＦａｂまたはそのＦ（ａｂ'）２フラグメントもしくはアナログ）の組み換え製造方法および該組み換え製造において有用な成分を提供する。これらの成分は、上記のものをコードしている単離核酸配列、ならびに選択された調節配列の制御下の当該核酸配列を含む組み換えプラスミドを包含し、該調節配列は、該組み換えプラスミドでトランスフェクションされた宿主細胞（好ましくは哺乳動物細胞）における該核酸配列の発現を指令することができるものである。該製造方法は、変化した抗体、好ましくはヒト化抗体がトランスフェクションされた細胞中で発現されるような条件下で本発明のトランスフェクションされた宿主細胞系を培養し、次いで、そこから発現産物を単離することを包含する。
【００１８】
本発明のさらなる態様において、患者から生物学的液体試料を得て、ＩＬ−５／（モノクローナルまたはポリクローナル）抗体複合体が形成されるような条件下で本発明抗体および変化した抗体をかかる試料と接触させ、次いで、該ＩＬ−５／抗体複合体の存在または不存在を検出することを特徴とする、ヒトにおける過剰な好酸球産生に関連した症状の診断方法が提供される。
【００１９】
本発明の他の態様および利点を、詳細な説明および好ましい具体例の欄においてさらに説明する。
【発明の効果】
【００２０】
本発明により、高い結合アフィニティーを有するヒト・インターロイキン５に対する中和モノクローナル抗体などが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１［配列番号：１および１５］は、マウス・抗体２Ｂ６およびマウス／ヒト・２Ｂ６キメラ抗体に関する重鎖可変領域を示す。ボックス領域はＣＤＲｓを示す。
【図２】図２［配列番号：２および１６］は、マウス・抗体２Ｂ６およびマウス／ヒト・２Ｂ６キメラ抗体に関する軽鎖可変領域を示す。ボックス領域はＣＤＲｓを示す。
【図３】図３［配列番号：３］は、マウス・抗体２Ｆ２に関する重鎖可変領域を示す。ボックス領域はＣＤＲｓを示す。
【図４】図４［配列番号：４］は、マウス・抗体２Ｆ２に関する軽鎖可変領域を示す。ボックス領域はＣＤＲｓを示す。
【図５】図５［配列番号：５］は、マウス・抗体２Ｅ３に関する重鎖可変領域を示す。ボックス領域はＣＤＲｓを示す。
【図６】図６［配列番号：６］は、マウス・抗体２Ｅ３に関する軽鎖可変領域を示す。ボックス領域はＣＤＲｓを示す。
【図７】図７［配列番号：７−１４］は、マウス抗体・２Ｂ６、２Ｆ２および２Ｅ３由来の重鎖および軽鎖のＣＤＲｓを示す。
【図８】図８［配列番号：１８、１９］は、ヒト化抗体２Ｂ６に関する重鎖可変領域を示す。ボックス領域はＣＤＲｓを示す。
【図９】図９［配列番号：２０、２１］は、ヒト化抗体２Ｂ６に関する軽鎖可変領域を示す。ボックス領域はＣＤＲｓを示す。
【図１０】図１０は、哺乳動物細胞におけるヒト化重鎖遺伝子の発現に用いるプラスミドｐＣＤＩＬ５ＨＺＨＣ１.０のスキーム図である。該プラスミドはベータラクタマーゼ遺伝子（ＢＥＴＡ ＬＡＣ）、ＳＶ−４０複製開始点（ＳＶ４０）、サイトメガロウイルスプロモーター配列（ＣＭＶ）、シグナル配列、ヒト化重鎖、ウシ・成長ホルモン（ＢＧＨ）由来のポリＡシグナル、ベータグロビンプロモーター（ベータグロプロ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子（ＤＨＦＲ）、およびもう１つのＢＧＨ配列のポリＡシグナルをｐＵＣ１９骨格中に含んでいる。
【図１１】図１１は、哺乳動物細胞におけるヒト化軽鎖遺伝子の発現に用いるプラスミドｐＣＮＩＬ５ＨＺＬＣ１.０のスキーム図である。
【図１２】図１２［配列番号：６１、６２］は、ヒト化抗体２Ｂ６に関するＮｅｗＭ重鎖可変領域を示す。ボックス領域はＣＤＲｓを示す。
【図１３】図１３［配列番号：６９、７０］は、ヒト化抗体２Ｂ６に関するＲＥＩ軽鎖可変領域を示す。ボックス領域はＣＤＲｓを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
発明の詳細な説明
本発明は、マウス・モノクローナル抗体２Ｂ６のおいて例示されるヒト・ＩＬ−５特異性、中和活性、およびヒト・ＩＬ−５に対する高アフィニティーにより特徴づけられる種々の抗体、変化した抗体およびそれらのフラグメントを提供する。新規中和抗体を得るための慣用的なハイブリドーマ法、ファージディスプレイ組み合わせライブラリー、免疫グロブリンのチェイン・シャフリング、およびヒト化法により本発明抗体は製造された。これらの製造物は、例えば喘息のごときＩＬ−５により媒介される疾病の治療のための治療および医薬組成物において有用である。また、これらの製造物は、ヒトにおける内在性ＩＬ−５レベルまたは活性化細胞からex vivoで放出されるＩＬ−５レベルの測定（例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ））による、ＩＬ−５により媒介される症状の診断において有用である。
【００２３】
Ｉ.定義
「変化した抗体」は、変化した免疫グロブリンコーディング領域によりコードされている蛋白をいい、選択された宿主細胞における発現により得ることができる。かかる変化した抗体は遺伝子組み換えによる抗体（例えば、キメラ抗体またはヒト化抗体）または免疫グロブリン不変領域の全部もしくは一部を欠く抗体フラグメント、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、またはＦ（ａｂ'）２等である。
【００２４】
「変化した免疫グロブリンコーディング領域」は、本発明の変化した抗体をコードしている核酸配列をいう。変化した抗体がＣＤＲを継ぎ足した抗体またはヒト化抗体である場合、非ヒト・免疫グロブリン由来の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）をコードしている配列が、ヒト・可変枠組み配列を含んでなる第１の免疫グロブリンパートナー中に挿入される。第１の免疫グロブリンパートナーが第２の免疫グロブリンパートナーに作動可能に連結されていてもよい。
【００２５】
「第１の免疫グロブリンパートナー」は、無傷（または天然に存在する）のＣＤＲコーディング領域がドナー抗体のＣＤＲコーディング領域により置換されているヒト・枠組みまたはヒト・免疫グロブリン可変領域をコードしている核酸配列をいう。ヒト・可変領域は免疫グロブリン重鎖、軽鎖（または両方）、それらの機能的フラグメントのアナログであってよい。抗体（免疫グロブリン）の可変領域中に存在するかかるＣＤＲ領域を、当該分野で知られた方法により決定することができる。例えば、Kabatら（Sequences of Proteins of Immunological Interest,4th Ed.,U.S.Department of Health and Human Services,National Institutes of Health(1987)）は、ＣＤＲｓの存在位置に関する規則を開示している。さらに、ＣＤＲ領域／構造の同定に有用なコンピュータープログラムが知られている。
【００２６】
「中和」は、ヒト・ＩＬ−５のその特異的受容体への結合を妨げることにより、あるいはその受容体を通じてのＩＬ−５のシグナリングを阻害することによりＩＬ−５活性を阻害する抗体をいう。Ｂ１３細胞バイオアッセイ（ＩＬ−５中和アッセイ、実施例２Ｃ参照）において測定されるＩＬ−５活性の阻害において９０％有効、好ましくは９５％有効、最も好ましくは１００％有効な場合、ｍＡｂは中和抗体である。
【００２７】
用語「高アフィニティー」は、光学的バイオセンサー分析（実施例２参照）により測定されるヒト・ＩＬ−５に対する３.５ｘ１０−１１Ｍに等しいかまたはそれ未満のＫｄにより特徴づけられる結合アフィニティーを有する抗体をいう。
【００２８】
「ヒト・ＩＬ−５に対する結合特異性」は、マウスではなくヒトのＩＬ−５に対する高アフィニティーを意味する。
【００２９】
「第２の免疫グロブリンパートナー」は、イン・フレームで、あるいは所望により慣用的リンカー配列により第１の免疫グロブリンパートナーが融合（すなわち、作動可能に連結）している蛋白またはペプチドをコードしているもう１つのヌクレオチド配列をいう。好ましくは、それは免疫グロブリン遺伝子である。第２の免疫グロブリンパートナーは、その不変領域全体（すなわち、同種のもの−第１および第２の変化した抗体は同じ起源由来である）または対象とするさらなる抗体（すなわち、異種のもの）をコードしている核酸配列を包含しうる。それは免疫グロブリン重鎖または軽鎖（または１本のポリペプチドの一部としての両鎖）であってもよい。第２の免疫グロブリンパートナーは特定の免疫グロブリンクラスまたはイソタイプに限らない。さらに、第２の免疫グロブリンパートナーは、ＦａｂまたはＦ（ａｂ'）２のごとき免疫グロブリン不変領域の一部（すなわち、適当なヒト・不変領域または枠組み領域の別個の部分）を含んでなっていてもよい。また、かかる第２の免疫グロブリンパートナーは、例えばファージディスプレイライブラリーとして宿主細胞の外表面上に露出した内在性膜蛋白をコードしている配列、あるいは分析または診断的検出のための蛋白、例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ等をコードしている配列を含んでいてもよい。
【００３０】
用語Ｆｖ、Ｆｃ、Ｆｄ、Ｆａｂ、またはＦ（ａｂ'）２を、その標準的な意味で用いる（例えば、Harlow et al.,Antibodies A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory,(1988)参照）。
【００３１】
本明細書の用語「組み換え法による抗体」は、変化した抗体の１のタイプ、すなわち、選択されたアクセプター抗体の軽鎖および／または重鎖可変ドメインの一部分が、選択されたエピトープに特異性を有する１種またはそれ以上のドナー抗体由来の類似部分により置換されている全長の合成抗体（抗体フラグメントに対立するものとしてのキメラ抗体またはヒト化抗体）をいう。例えば、かかる分子は、未修飾軽鎖（またはキメラ軽鎖）に結合したヒト化重鎖（あるいはその逆）によって特徴づけられる抗体を包含しうる。組み換え法による抗体もまた、ドナー抗体の結合特異性を保持するようなアクセプター抗体の軽鎖および／または重鎖の可変ドメイン枠組み領域をコードしている核酸配列の変化によって特徴づけられる。これらの抗体は、アクセプター抗体由来の１種またはそれ以上のＣＤＲｓ（好ましくは全部のＣＤＲｓ）の本明細書記載のドナー抗体由来のＣＤＲｓでの置換を含んでいてもよい。
【００３２】
「キメラ抗体」は、アクセプター抗体由来の軽鎖および重鎖不変領域に結合したドナー抗体由来の天然に存在する可変領域（軽鎖および重鎖）を含んでいる組み換え法による抗体の１のタイプをいう。
【００３３】
「ヒト化抗体」は、非ヒト・ドナー免疫グロブリン由来のＣＤＲｓを有する組み換え法による抗体の１のタイプであって、その残りの免疫グロブリン由来の部分は１種（またはそれ以上）のヒト由来であるものをいう。さらに、結合アフィニティーを保持するように枠組み支持残基を変化させてもよい（例えば、Queen et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:10029-10032(1989)、Hodgson et al.,Bio/Technology,9:421(1991)参照）。
【００３４】
用語「ドナー抗体」は、その可変領域、ＣＤＲｓ、またはその他のフラグメントもしくはアナログの核酸配列が第１の免疫グロブリンパートナーのものになっている抗体をいい、その結果、変化した免疫グロブリンコーディング領域を提供し、発現した変化した抗体がドナー抗体の抗原特異性および中和活性を有する。本発明における使用に適した１のドナー抗体は、２Ｂ６と命名された非ヒト・中和モノクローナル抗体（すなわち、マウスの）である。抗体２Ｂ６は、イソタイプＩｇＧ１に属する高アフィニティーヒト・ＩＬ−５特異性（すなわち、マウス・ＩＬ−５を認識しない）中和抗体であると定義され、適当なマウス・ＩｇＧ不変領域上に配列番号：２および１６の可変軽鎖ＤＮＡおよびアミノ酸配列、ならびに配列番号：１および１５の可変重鎖ＤＮＡおよびアミノ酸配列を有している。
【００３５】
用語「アクセプター抗体」は、ドナー抗体とは異種の抗体（モノクローナル、または組み換え型）をいい、その重鎖および／または軽鎖枠組み領域ならびに／あるいはその重鎖および／または軽鎖不変領域のすべて（またはいずれかの部分、しかし、好ましくはすべての部分）が第１の免疫グロブリンパートナーのものとなっている。好ましくは、ヒト・抗体がアクセプター抗体である。
【００３６】
「ＣＤＲｓ」は、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の超可変領域である抗体の相補性決定領域のアミノ酸配列をいう。例えば、Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,4th Ed,U.S.Department of Health and Human Services,National Institutes of Health(1987)参照。免疫グロブリン可変領域には３本の重鎖ＣＤＲｓおよび３本の軽鎖ＣＤＲｓがある。よって、本明細書の用語「ＣＤＲｓ」は、３本の重鎖ＣＤＲｓすべて、あるいは３本の軽鎖ＣＤＲｓすべて（あるいは適当な場合には、すべての重鎖および軽鎖ＣＤＲｓの両方）をいう。
【００３７】
ＣＤＲｓは、抗原またはエピトープへの抗体結合のための接触残基の大部分を提供する。本発明の対象ＣＤＲｓはドナー抗体可変重鎖および軽鎖配列由来であり、天然に存在するＣＤＲｓのアナログを包含し、該アナログはまた、それらが由来するドナー抗体と同じ抗原結合特異性および／または中和能を共有している。
【００３８】
「抗原結合特異性または中和能を共有」とは、例えば、ｍＡｂ ２Ｂ６は一定レベルの抗原アフィニティーにより特徴づけられるが、適当な構造的環境においては２Ｂ６の核酸配列によりコードされているＣＤＲは低いまたは高いアフィニティーを有するかもしれないということを意味する。それにもかかわらず、かかる環境において、２Ｂ６のＣＤＲｓは２Ｂ６と同じエピトープを認識するであろうと予想される。典型的な２Ｂ６の重鎖ＣＤＲｓは配列番号：７、配列番号：８および配列番号：９を包含し、典型的な２Ｂ６の軽鎖ＣＤＲは配列番号：１０、配列番号：１１および配列番号：１２を包含する。
【００３９】
「機能的フラグメント」は、そのフラグメントが由来している抗体と同じ抗原結合特異性および／または中和能を保持している部分的な重鎖または軽鎖可変配列（例えば、免疫グロブリン可変領域のアミノ末端またはカルボキシ末端における小規模な欠失を有する）である。
【００４０】
「アナログ」は、少なくとも１個のアミノ酸によって修飾されているアミノ酸配列であり、該修飾は化学的なものあるいは少数（すなわち、１０個未満）のアミノ酸の置換または転移であってもよく、修飾されているとしてもアミノ酸配列が未修飾配列の生物学的特性、例えば、抗原特異性および高アフィニティーを保持しているものである。例えば、ある種のエンドヌクレアーゼ制限部位をＣＤＲコーディング配列中またはその周辺に作成する場合には、置換により（サイレント）変異を構築することができる。
【００４１】
アナログは対立遺伝子変化を生じるものであってもよい。「対立遺伝子変化または修飾」とは、本発明アミノ酸またはペプチド配列をコードしている核酸配列中の変化である。かかる変化または修飾は遺伝コードの縮重によるものであってもよく、あるいは所望特性を得るように慎重に組み換え法を用いて作成されたものであってもよい。これらの変化または修飾は、コードされているアミノ酸配列の変化を生じるものであってもよく、生じないものであってもよい。
【００４２】
用語「エフェクター剤」は、変化した抗体および／またはドナー抗体もしくはその他のフラグメントの天然または合成の軽鎖または重鎖が慣用的手段により結合されていてもよい非蛋白担体分子をいう。かかる非蛋白担体は、診断分野において用いられる慣用的担体、例えば、ポリスチレンまたは他のプラスチックビーズ、多糖類、例えば、BIAcore［Pharmacia］システムに用いるもの、または医学分野で使用され、ヒトおよび動物への投与が安全である他の非蛋白物質を包含する。他のエフェクター剤は、重金属原子またはラジオアイソトープをキレートするためのマクロサイトを包含する。かかるエフェクター剤は、変化した抗体の半減期を延長することにも有用であり、例えば、ポリエチレングリコールが挙げられる。
【００４３】
ＩＩ.高アフィニティーＩＬ−５モノクローナル抗体
本発明抗体、変化した抗体およびフラグメントの構築に使用するために、無傷のヒト・ＩＬ−５またはそれに由来するペプチドエピトープを与えることにより、非ヒト種（例えば、ウシ、ヒツジ、サル、ニワトリ、齧歯類（例えばマウスおよびラット）等）を用いて所望免疫グロブリンを得てもよい。慣用的なハイブリドーマ法を用いて、ＩＬ−５に対する非ヒト・ｍＡｂを分泌するハイブリドーマ細胞系を得る。次いで、実施例セクションに記載のごとくＩＬ−５で被覆した９６ウェルプレートを用いて、あるいは別法としてストレプトアビジンで被覆したプレートに結合したビオチン化ＩＬ−５を用いてかかるハイブリドーマを結合に関してスクリーニングする。
【００４４】
本発明の１の典型的な高アフィニティー中和ｍＡｂはマウス・抗体であるｍＡｂ ２Ｂ６であり、実施例１においてより詳細に説明されるキメラ抗体またはヒト化抗体の開発にそれを用いることができる。２Ｂ６ ｍＡｂは、ヒト・ＩＬ−５に対する抗原結合特異性により特徴づけられ、ＩＬ−５に対して３.５ｘ１０−１１Ｍ未満（約２.２ｘ１０−１１Ｍ）のＫｄを有する。光学的バイオセンサーによる測定により２Ｂ６由来のＦａｂフラグメントのＩＬ−５に対するＫｄを評価したところ（実施例３Ｈ参照）、約９ｘ１０−１１Ｍである。ｍＡｂ ２Ｂ６は、ヒト・ＩＬ−５とヒト・ＩＬ−５受容体のα−鎖との間の結合相互作用をブロックするように思われる。
【００４５】
もう１つの望ましいドナー抗体はマウス・ｍＡｂ ２Ｅ３である。このｍＡｂは、イソタイプＩｇＧ２ａであり、３.５ｘ１０−１１Ｍ未満（約２.０ｘ１０−１１Ｍ）のヒト・ＩＬ−５に対する解離定数を有することにより特徴づけられる。
【００４６】
さらにもう１つの望ましいドナー抗体はラット・ｍＡｂ ４Ａ６である。このｍＡｂは、３.５ｘ１０−１１Ｍ未満（約１.８ｘ１０−１１Ｍ）のヒト・ＩＬ−５に対する解離定数を有することにより特徴づけられる。さらに、ｍＡｂ ４Ａ６は、ヒト・ＩＬ−５とヒト・ＩＬ−５受容体のβ−鎖との間の結合相互作用をブロックするように思われる。
【００４７】
本発明は２Ｂ６ ｍＡｂ、２Ｅ３ ｍＡｂ、またはそれらの超可変（すなわち、ＣＤＲ）配列の使用に限定されない。ヒト・ＩＬ−５に対する３.５ｘ１０−１１Ｍに等しいかまたはそれ未満の解離定数により特徴づけられる他の適当な高アフィニティーＩＬ−５抗体および対応する抗−ＩＬ−５ ＣＤＲｓをそれらに代えて用いてもよい。以下の説明のいずれの箇所においても、ドナー抗体は２Ｂ６または２Ｅ３と同定されるが、この命名は例示および単なる説明のためのものである。
【００４８】
ＩＩＩ.抗体フラグメント
本発明は、ヒト・ＩＬ−５に指向されたｍＡｂ由来のＦａｂフラグメントまたはＦ（ａｂ'）２フラグメントの使用も包含する。これらのフラグメントは、in vivoにおけるＩＬ−５および好酸球により媒介される症状に対する防御剤として、あるいはin vitroでのＩＬ−５診断薬の一部として有用である。Ｆａｂフラグメントは軽鎖全体および重鎖のアミノ末端部分を含んでおり；Ｆ（ａｂ'）２フラグメントはジスルフィド結合により結合している２個のＦａｂフラグメントにより形成されるフラグメントである。ｍＡｂｓ ２Ｂ６、２Ｅ３および他の類似高アフィニティーＩＬ−５結合抗体は、ＦａｂフラグメントおよびＦ（ａｂ'）２フラグメントのソースを提供するものであり、それらのフラグメントは慣用的手段、例えば、適当な蛋白分解酵素パパインおよび／またはペプシンでのｍＡｂの開裂により、あるいは組み換え法により得ることができる。本明細書記載のごとく、これらのＦａｂおよびＦ（ａｂ'）２フラグメントはそれら自体、治療、予防または診断薬、ならびに組み換え型抗体またはヒト化抗体の形成において有用な可変領域およびＣＤＲ配列を含む配列のドナーとして有用である。
【００４９】
組み合わせファージライブラリー（例えば、Winter et al.,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)参照）または免疫グロブリンのチェイン・シャフリング（例えば、Marks et al.,Bio/Technology,10:779-783(1992)参照）によりＦａｂおよびＦ（ａｂ'）２フラグメントを構築することができ（両文献を参照により本明細書に記載されているものとみなす）、それらの方法において、選択された抗体（例えば、２Ｂ６）由来のＦｄまたはＶＨ免疫グロブリンを軽鎖免疫グロブリンＶＬ（ＶＫ）のレパートリーと結合させて新規Ｆａｂｓを得る。逆に、選択された抗体由来の軽鎖免疫グロブリンを重鎖免疫グロブリンＶＨ（またはＦｄ）のレパートリーと結合させて新規Ｆａｂを得てもよい。実施例セクションにおいてより詳細に説明するように、ｍＡｂ ２Ｂ６のＦｄを軽鎖免疫グロブリンのレパートリーと結合させた場合に中和ＩＬ−５ Ｆａｂｓが得られた。よって、チェイン・シャフリング法により、ユニークな配列（ヌクレオチドおよびアミノ酸）を有する中和Ｆａｂｓを得ることができる。
【００５０】
ＩＶ.対象とする抗−ＩＬ−５アミノ酸およびヌクレオチド配列
上記ｍＡｂ ２Ｂ６または他の抗体は、ドナー抗体の抗原結合特異性により特徴づけられる種々の変化した抗体の設計および取得に有用な配列、例えば、可変重鎖および／または軽鎖ペプチド配列、枠組み配列、ＣＤＲ配列、機能的フラグメント、およびそれらのアナログ、およびそれらをコードしている核酸配列を提供する。
【００５１】
よって、一例として、本発明は、ＩＬ−５マウス抗体２Ｂ６由来の可変軽鎖および可変重鎖配列ならびにそれら由来の配列を提供する。２Ｂ６の重鎖可変領域を図１に示す。ＣＤＲをコードしている領域はボックス領域により示され、それらは配列番号：７；配列番号：８；および配列番号：９に示される。２Ｂ６の軽鎖クローン可変領域を図２に示す。ＣＤＲをコードしている領域を配列番号：１０；配列番号：１１；および配列番号：１２に示す。
【００５２】
ヒト化重鎖可変領域を図８［配列番号：１８および１９］に示す。シグナル配列も配列番号：１７に示す。当業者に知られた他の適当なシグナル配列を、本明細書に例示したシグナル配列に代えて使用してもよい。この構築物のＣＤＲアミノ酸配列は無傷のマウスのものおよびキメラ重鎖ＣＤＲｓと同一であり、それらを配列番号：７、配列番号：８、および配列番号：９に示す。典型的な（合成）ヒト化軽鎖可変配列を図９［配列番号：２０および２１］に示す。
【００５３】
可変軽鎖および重鎖ペプチド配列をコードしている本発明核酸配列またはそのフラグメントは、ＣＤＲｓまたは枠組み領域をコードしている核酸配列中の特異的変化の突然変異による導入、ならびに生じた修飾または融合核酸配列の発現用プラスミド中への導入にも有用である。例えば、枠組みおよびＣＤＲをコードしている領域におけるサイレント置換を用いて突然変異されたＣＤＲ（および／または枠組み）領域の挿入を容易にする制限酵素部位を作成した。これらのＣＤＲをコードしている領域を、本発明ヒト化抗体の構築に使用した。
【００５４】
遺伝コードの縮重を考慮して、本発明の重鎖および軽鎖アミノ酸配列およびＣＤＲ配列ならびにドナー抗体の抗原特異性を共有しているそれらの機能的フラグメントおよびアナログをコードしている種々のコーディング配列を構築してもよい。第２の免疫グロブリンパートナーに作動可能に結合する場合には、可変鎖ペプチド配列またはＣＤＲｓをコードしている本発明の単離核酸配列またはそのフラグメントを用いて、本発明の変化した抗体、例えば、キメラまたはヒト化抗体、あるいは他の組み換え法による抗体を得ることができる。
【００５５】
本明細書記載の変化した抗体および抗体の一部をコードしている単離核酸配列のほかに、他のかかる核酸配列、例えば、無傷のＣＤＲをコードしている配列の相補的な配列またはＣＤＲをコードしている領域周辺の修飾されたヒト・枠組み領域に相補的な配列も本発明に包含されることに注意すべきである。有用なＤＮＡ配列は、厳密なハイブリダイゼーション条件下［T.Maniatis et al.,Molecular Cloning(A Laboratory Manual),Cold Spring Harbor Laboratory(1982),３８７−３８９頁参照］でＤＮＡ配列にハイブリダイゼーションする配列を包含する。１のかかる厳密なハイブリダイゼーション条件の例は、４ＸＳＳＣ、６５℃、次いで、６５℃の０.１ＸＳＳＣでの１時間の洗浄である。あるいはまた、厳密なハイブリダイゼーション条件の典型例は、５０％ホルムアミド、４ＸＳＳＣ中、４２℃である。好ましくは、これらのハイブリダイゼーションするＤＮＡ配列は少なくとも１８ヌクレオチドの長さ、すなわち、ほぼＣＤＲのサイズである。
【００５６】
Ｖ.変化した免疫グロブリン分子および変化した抗体
変化した免疫グロブリン分子は、キメラ抗体およびヒト化抗体のごとき組み換え法により抗体を包含する変化した抗体をコードしていてもよい。望ましい変化した免疫グロブリンコーディング領域はＣＤＲをコードしている領域を含み、該領域は、ＩＬ−５抗体の抗原特異性、好ましくは本発明により提供されるような高アフィニティー抗体の抗原特異性を有するペプチドをコードしており、第１の免疫グロブリンパートナー（ヒト・枠組みまたはヒト・免疫グロブリン可変領域）中に挿入されている。
【００５７】
好ましくは、第１の免疫グロブリンパートナーは第２の免疫グロブリンパートナーに作動可能に連結される。第２の免疫グロブリンパートナーは上で定義されており、興味ある第２の抗体領域、例えばＦｃ領域をコードしている配列を含んでもよい。第２の免疫グロブリンパートナーは、軽鎖または重鎖不変領域がイン・フレームまたはリンカー配列手段により融合しているもう１つの免疫グロブリンをコードしている配列を含んでもよい。機能的フラグメントまたはＩＬ−５のアナログに対して結合が促進されるように、それらに指向された組み換え法による抗体を設計してもよい。
【００５８】
第２の免疫グロブリンパートナーを非蛋白担体分子を包含する上記定義のエフェクター剤と結合させてもよく、慣用的手段により第２の免疫グロブリンパートナーを作動可能に結合させる。
【００５９】
第２の免疫グロブリンパートナー、例えば抗体配列とエフェクター剤との間の融合または結合は、例えば慣用的な共有結合またはイオン結合、蛋白融合、あるいは異種二官能基架橋（例、カルボジイミド、グルタルアルデヒド等）のような適当な手段によるものであってよい。かかる方法は当該分野において知られており、普通の化学および生化学の教科書に記載されている。
【００６０】
さらに、第２の免疫グロブリンパートナーとエフェクター剤との間に所望量のスペースを単に提供するだけの慣用的リンカー配列を、変化した免疫グロブリンコーディング領域中に構築してもよい。かかるリンカーの設計は当業者によく知られている。
【００６１】
さらに、本発明分子のシグナル配列を修飾して発現を促進してもよい。一例として、シグナル配列およびマウス・重鎖配列由来のＣＤＲｓを有する２Ｂ６ヒト化抗体はもとのシグナルペプチドを別のシグナル配列［配列番号：１７］に置き換えられている。
【００６２】
典型的な変化した抗体は、ｍＡｂ ２Ｂ６の抗原特異性を有する可変重鎖および／または軽鎖ペプチドまたは蛋白配列、例えば、ＶＨおよびＶＬ鎖を含んでいる。さらにもう１つの望ましい本発明の変化した抗体は、少なくとも１つ、マウス・抗体分子２Ｂ６の重鎖および／または軽鎖の可変領域の好ましくは全部のＣＤＲｓを含んでおり、残りの配列はヒト起源のもの、またはその機能的フラグメントもしくはアナログである。例えば、ヒト化ＶＨおよびＶＬ領域（図８および９）参照。
【００６３】
さらなる具体例において、組み換え法による本発明抗体にさらなる剤が結合していてもよい。例えば、組み換えＤＮＡ法の手順を用いて、完全な抗体分子のＦｃフラグメントまたはＣＨ２ ＣＨ３ドメインが酵素または他の検出可能な分子（すなわち、ポリペプチドエフェクターまたはレポーター分子）に置き換えられている本発明の組み換え法による抗体を得てもよい。
【００６４】
第２の免疫グロブリンパートナーを、マウス２Ｂ６の抗原特異性を有するＣＤＲ含有配列とは異種の非免疫グロブリンペプチド、蛋白またはそのフラグメントに作動可能に結合させてもよい。得られる蛋白は、発現すると、ＩＬ−５抗原特異性および非免疫グロブリン特性を示すことができる。その融合パートナーの特性は、例えば、別の結合ドメインまたは受容体ドメインのごとき機能的特性、あるいは融合パートナー自体が治療蛋白である場合には治療特性またはさらなる抗原特性であってもよい。
【００６５】
もう１つの望ましい本発明蛋白は、全長の重鎖および軽鎖を有する完全な抗体分子、あるいはＦａｂまたはＦ（ａｂ'）２フラグメントのごときそれらの別々のフラグメント、重鎖ダイマー、またはＦＶまたは１本鎖抗体（ＳＣＡ）のごときそれらの最小の組み換えフラグメント、または例えばｍＡｂ ２Ｂ６または２Ｅ３のような選択されたドナーｍＡｂと同じ特異性を有する他の分子を含んでなっていてもよい。かかる蛋白を変化した抗体の形態で用いてもよく、あるいはその未融合形態で使用してもよい。
【００６６】
第２の免疫グロブリンパートナーがドナー抗体とは異なる抗体、例えば、異なるイソタイプまたはクラスの免疫グロブリン枠組みまたは不変領域に由来する場合はいつでも、組み換え法による抗体が得られる。組み換え法による抗体は、１の起源、例えばアクセプター抗体由来の免疫グロブリン（Ｉｇ）不変領域および可変枠組み領域、ならびにドナー抗体、例えば本明細書記載の抗−ＩＬ−５抗体由来の１つまたはそれ以上（好ましくは全部）のＣＤＲｓを含んでなっていてもよい。さらに、核酸またはアミノ酸レベルでのアクセプターｍＡｂ軽鎖および／または重鎖可変ドメイン枠組み領域の変化、例えば、欠失、置換、または付加、あるいはドナーＣＤＲの変化を行ってドナー抗体の抗原結合特異性を保持するようにしてもよい。
【００６７】
ＩＬ−５ ｍＡｂの可変重鎖および／または軽鎖の一方（または両方）（所望により説明したように修飾されていてもよい）あるいは１つまたはそれ以上の下で定義する重鎖または軽鎖ＣＤＲｓ（図７も参照）を用いるようにかかる組み換え法による抗体を設計する。組み換え法による本発明抗体は中和抗体、すなわち、望ましくはＩＬ−５受容体への結合をブロックし、さらにまたＩＬ−５依存性細胞の増殖をブロックまたは防止するものである。
【００６８】
かかる組み換え法による抗体は、選択されたヒト・免疫グロブリンもしくはサブタイプの枠組み領域を含むヒト化抗体、またはＩＬ−５抗体の機能的フラグメントに融合したヒト・重鎖および軽鎖不変領域を含むキメラ抗体を包含しうる。適当なヒト（または他の動物）のアクセプター抗体は、ドナー抗体の核酸およびアミノ酸配列に対する相同性により、慣用的データベース、例えば、KABATRデータベース、Los Alamosデータベース、およびSwiss Proteinデータベースから選択されるものであってもよい。ドナー抗体の枠組み領域に対する相同性（アミノ酸による）により特徴づけられるヒト・抗体は、ドナーＣＤＲｓの挿入用の重鎖不変領域および／または重鎖可変領域枠組み領域の提供に適するかもしれない。軽鎖不変または可変枠組み領域を提供しうる適当なアクセプター抗体を同様の方法で選択してもよい。アクセプター抗体の重鎖および軽鎖は同じアクセプター抗体に由来する必要がないことに注意すべきである。
【００６９】
望ましくは、異種枠組みおよび不変領域をヒト・免疫グロブリンのクラスおよびイソタイプ、例えば、ＩｇＧ（サブタイプ１から４）、ＩｇＭ、ＩｇＡおよびＩｇＥから選択する。しかしながら、受容体抗体はヒト・免疫グロブリン蛋白配列のみを含んでなることを必要としない。例えば、ヒト・免疫グロブリン鎖の一部をコードしているＤＮＡ配列が、ポリペプチドエフェクターまたはレポーター分子のごとき非免疫グロブリンアミノ酸配列をコードしているＤＮＡ配列に融合している遺伝子を構築してもよい。
【００７０】
特に望ましいヒト化抗体の一例は、選択されたヒト・抗体配列の枠組み領域上に挿入された２Ｂ６のＣＤＲｓを含む。中和ヒト化抗体とするには、ＩＬ−５抗体の重鎖および／または軽鎖可変領域由来の１個、２個または好ましくは３個のＣＤＲｓを、選択されたヒト・抗体配列の枠組み領域中に挿入し、ヒト・抗体の無傷のＣＤＲｓと入れ替える。
【００７１】
好ましくは、ヒト化抗体において、ヒト・重鎖および軽鎖双方中の可変ドメインは組み換え法により１個またはそれ以上のＣＤＲが置換されたものである。６個すべてのＣＤＲｓまたは６個未満のＣＤＲｓの種々の組み合わせを用いることが可能である。好ましくは、６個全部のＣＤＲを置換する。ヒト・アクセプター抗体由来の未修飾軽鎖を軽鎖として用いて、ヒト・重鎖中でのみＣＤＲｓを置換することが可能である。さらに別法として、慣用的な抗体のデータベースを用いて、適合する軽鎖を別のヒト・抗体から選択してもよい。組み換え法による抗体の残りの部分はいずれかの適当なアクセプターヒト・免疫グロブリン由来であってもよい。
【００７２】
よって、好ましくは、組み換え法によるヒト化抗体は、天然のヒト・抗体またはそのフラグメントの構造を有し、効果的な治療的使用、例えば、ヒトにおけるＩＬ−５により媒介される炎症性疾患の治療、または診断用途に必要な特性の組み合わせを有する。
【００７３】
もう１つの例として、組み換え法による抗体は、２Ｅ３の可変軽鎖領域の３つのＣＤＲｓ［配列番号：１０、１１および１３］および２Ｂ６の可変重鎖領域の３つのＣＤＲｓ［配列番号：７、８および９］を含む。得られるヒト化抗体はｍＡｂ ２Ｂ６と同じ抗原結合特異性および高アフィニティーにより特徴づけられる。
【００７４】
必ずしもドナー抗体の特異性および高アフィニティーに影響することなく、可変ドメインのアミノ酸を変化させることにより組み換え法による抗体をさらに修飾（すなわち、アナログを得る）してもよいことが当業者により理解されるであろう。重鎖および軽鎖のアミノ酸を、可変ドメイン枠組みまたはＣＤＲｓまたはそれらの両方のいずれかに存在する他のアミノ酸により置換してもよいと予想される。
【００７５】
さらに、不変領域を変化させて本発明分子の選択特性を増加または減少させてもよい。例えば、ダイマー化、Ｆｃ受容体への結合、または補体結合および活性化能が挙げられる（例えば、Angal et al.,Mol.Immunol,30:105-108(1993)、Xu et al.,J.Biol.Chem,269,3469-3474(1994)、Winter et al.,EP307,434-B参照）。
【００７６】
キメラ抗体である変化した抗体は、非ヒト・ドナー抗体の重鎖および軽鎖可変領域全体を提供し、両鎖についてヒト・免疫グロブリン不変領域に結合した枠組み領域を包含するという点で上記ヒト化抗体とは異なる。本発明ヒト化抗体に関連したさらなる非ヒト配列を保有しているキメラ抗体はヒトにおいて有意な免疫応答を誘導しうると予想される。
【００７７】
かかる抗体は、上述のＩＬ−５により媒介される疾病の予防および治療に有用である。
【００７８】
ＶＩ.変化した抗体および組み換え法による抗体の製造
好ましくは、２Ｂ６または他の適当なドナーｍＡｂｓ（例えば、２Ｅ３、２Ｆ２、４Ａ６等）の可変軽鎖および／または重鎖配列およびＣＤＲｓ、およびそれらをコードしている核酸配列を、変化した抗体、好ましくはヒト化抗体の構築に用いる。同一または類似の方法を用いて本発明の他の具体例を得てもよい。 選択されたドナーｍＡｂ、例えばマウス抗体２Ｂ６を産生するハイブリドーマを慣用的にクローンし、当業者に知られた方法、例えば、Sambrook et al., molecular Cloning (A Laboratory Manual),2nd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory(1989)に記載の方法によりその重鎖および軽鎖可変領域のＤＮＡを得る。ドナーｍＡｂ結合特異性を保持するのに必要な少なくともＣＤＲをコードしている領域およびアクセプターｍＡｂ軽鎖および／または重鎖可変ドメイン枠組み領域含んでいる２Ｂ６の可変重鎖および軽鎖、ならびにヒト・免疫グロブリン由来の抗体鎖の残りの部分を、ポリヌクレオチドプライマーおよび逆転写酵素を用いて得る。既知データベースを用い、他の抗体と比較することによりＣＤＲをコードしている領域を同定する。
【００７９】
次いで、マウス／ヒト・キメラ抗体を調製し、結合能についてアッセイすることができる。かかるキメラ抗体は、ヒト・Ｉｇ不変領域に結合した非ヒト・ドナー抗体のＶＨおよびＶＬ領域全体を含んでいる。
【００８０】
コンピューターデータベース、例えばKABATRを用いてヒト抗体由来の重鎖可変領域の同種枠組み領域を同定し、２Ｂ６に対して相同性を有するヒト・抗体をアクセプター抗体として選択した。ヒト・抗体枠組み中の２Ｂ６のＣＤＲをコードしている領域を含む合成重鎖可変領域の配列を、制限部位を含むように枠組み中のヌクレオチド置換を所望により行って設計した。次いで、この設計された配列を、長い合成オリゴマーを用いて合成した。別法として、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅され、エラーを修正されたオリゴヌクレオチドを重複させることにより、設計配列を合成することもできる。
適当な軽鎖可変枠組み領域を同様の方法で設計した。
【００８１】
ヒト化抗体はキメラ抗体由来であってもよく、あるいは好ましくは、重鎖および軽鎖由来のドナーｍＡｂのＣＤＲをコードしている領域を選択された重鎖および軽鎖枠組み中に適当に挿入することにより合成的に得てもよい。別法として、本発明ヒト化抗体を標準的な突然変異法を用いて調製してもよい。かくして得られたヒト化抗体はヒト・枠組み領域およびドナーｍＡｂのＣＤＲをコードしている領域を含む。枠組み残基について引き続き操作を行ってよい。得られるヒト化抗体は組み換え宿主細胞、例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯまたはミエローマ細胞において発現されうる。他の適当なＩＬ−５特異的中和高アフィニティー非ヒト・抗体に対してこの方法を用いて他のヒト化抗体を調製してもよい。
【００８２】
宿主細胞における複製および発現および／または宿主細胞からの分泌を制御しうる慣用的な調節的制御配列に作動可能に結合した変化した抗体の配列にもとのプラスミドのコーディング配列を置き換えることにより、慣用的な発現ベクターまたは組み換えプラスミドを製造する。調節配列はプロモーター配列、例えば、ＣＭＶプロモーター、およびシグナル配列を包含し、それらは他の既知抗体由来であってもよい。同様にして、相補的な抗体の軽鎖または重鎖をコードしているＤＮＡ配列を有する第２の発現ベクターを作成することもできる。好ましくは、この第２の発現ベクターは、コーディング配列および選択可能マーカーを除き、各ポリペプチド鎖が機能的に発現されることが可能なかぎり、第１のものと同じである。
【００８３】
第１および第２の両方のベクターを用いる慣用的方法によって選択された宿主細胞を同時トランスフェクションして（あるいは単一ベクターによりトランスフェクションして）、組み換えまたは合成の軽鎖および重鎖両方を含んでなる本発明トランスフェクション宿主細胞を作成する。次いで、トランスフェクション細胞を慣用的方法により培養して本発明の組み換え法による抗体を得る。組み換え重鎖および／または軽鎖との結合を含むヒト化抗体を、ＥＬＩＳＡまたはＲＩＡのごとき適当なアッセイにより培養物からスクリーニングする。同様の慣用的方法を用いて本発明の他の変化した抗体および分子を構築してもよい。
【００８４】
本発明方法および組成物の構築に用いるクローニングおよびサブクローニング工程に適したベクターが当業者により選択される。例えば、慣用的なｐＵＣシリーズのクローニングベクターを用いてもよい。使用される１のベクターはｐＵＣ１９であり、Amersham（英国Buckinghamshire）またはPharmacia（スウェーデンUppsala）のごとき業者から市販されている。さらに、容易に複製しうるいずれかのベクターは多くのクローニング部位および選択可能遺伝子（例えば、抗生物質耐性）を有しており、クローニングのための容易に取り扱いすることができる。よって、クローニングベクターの選択は本発明における制限因子ではない。
【００８５】
同様に、本発明による組み換え法により得られた抗体の発現に用いるベクターは、いずれかの慣用的ベクターから当業者により選択されうる。またベクターは、選択された細胞において異種ＤＮＡ配列の複製および発現を指令する選択された調節配列（ＣＭＶプロモーターのごとき）を含んでいる。これらのベクターは、組み換え法による抗体または変化した免疫グロブリンのコーディング領域をコードしている上記ＤＮＡ配列を含んでいる。さらに、ベクターは、取り扱いが容易なように所望制限部位を挿入することにより修飾された選択免疫グロブリン配列を含んでいてもよい。
【００８６】
異種ＤＮＡ配列、例えば、哺乳動物ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）の発現の増幅に適した遺伝子により発現ベクターを特徴づけてもよい。他の好ましいベクター配列は、ウシ・成長ホルモン（ＢＧＨ）およびベータグロブリンプロモーター配列（betaglopro）のごときポリＡシグナル配列を包含する。当業者によく知られた方法により本発明において有用な発現ベクターを合成してもよい。
【００８７】
選択宿主における組み換えＤＮＡからの生成物の発現および／または分泌の指令に有用なかかるベクターの成分、例えば、レプリコン、選択遺伝子、エンハンサー、プロモーター、シグナル配列等を、市販または天然ソースから得てもよく、あるいは既知方法により合成してもよい。
【００８８】
また本発明は、組み換え法による抗体またはその変化した免疫グロブリン分子のコーディング配列を含む組み換えプラスミドでトランスフェクションした細胞系に関する。これらのクローニングベクターのクローニングおよび他の操作に有用な宿主細胞も慣用的である。しかしながら、最も望ましくは、種々のE.coli株の細胞をクローニングベクターの複製および本発明の変化した抗体の構築における他のステップに使用する。
【００８９】
本発明の組み換え法による抗体または変化した抗体の発現に適する宿主または細胞系は、好ましくは、ＣＨＯ、ＣＯＳ、線維芽細胞（例えば、３Ｔ３）、および骨髄細胞のごとき哺乳動物細胞、より好ましくは、骨髄細胞またはＣＨＯである。ヒト・細胞を用いてもよく、かくして、分子をヒトのグリコシレーションパターンで修飾することが可能となる。別法として、他の真核細胞系を用いてもよい。形質転換、培養、増幅、スクリーニングならびに生成物の生産および精製に適した哺乳動物宿主細胞および方法の選択は当該分野において知られている。例えば、上で引用したSambrookらの文献参照。
【００９０】
細菌細胞は本発明組み換えＦａｂの発現に適した宿主細胞であることがわかるだろう（例えば、Pluckthun,A.,Immunol.Rev.,130:151-188(1992)参照）。しかしながら、細菌細胞において発現された蛋白の、変性または正しく折り畳まれていない形態あるいはグリコシレーションされていない形態となる傾向のため、細菌細胞において生産された組み換えＦａｂを抗原結合能の保持についてスクリーニングしなければならない。細菌細胞により発現された分子が正しく折り畳まれた形態で生産された場合には、当該細菌細胞は望ましい宿主であろう。例えば、発現に使用される種々のE.coli株は、バイオテクノロジーの分野において宿主としてよく知られている。種々のB.subtilis、Streptomyces、他の枯草菌等の株も本発明方法に使用できる。
【００９１】
所望ならば、当業者に知られた酵母細胞株ならびに昆虫細胞、例えば、DrosophilaおよびLepidoptera、およびウイルス発現系も宿主細胞として用いられる。例えば、Miller et al.,Genetic Engineering,8:277-298,Plenum Press(1986)およびその中の引用文献参照。
【００９２】
本発明ベクターを構築することのできる一般的方法、本発明宿主細胞を製造するのに必要なトランスフェクション法、およびかかる宿主細胞から本発明の変化した抗体を製造するのに必要な培養法はすべて慣用的方法である。同様に、生産されたならば、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動等を包含する当該分野の標準的方法により本発明の変化した抗体を細胞培養物から精製することができる。かかる方法は当業者の範囲内であり、本発明を制限するものでない。
【００９３】
ヒト化抗体のさらなる発現方法は、米国特許第４,８７３,３１６号記載のごとく、トランスジェニック動物における発現を用いるものであってもよい。これは、動物のカゼインプロモーター（トランスジェニック的に哺乳動物に導入された場合、メスの哺乳動物はその乳中の所望組み換え蛋白を生産する）を用いる発現系に関連している。所望方法により発現されたならば、適当なアッセイを用いて、組み換え法による抗体をインビトロ活性について試験する。現在慣用的となっているＥＬＩＳＡアッセイフォーマットを用いて、組み換え法により抗体のＩＬ−５への結合を定量的かつ定性的に評価する。さらに、他のインビトロアッセイを用いて、通常のクリアランス機構存在下の体内での組み換え抗体の維持を評価するために引き続き行われるヒトの臨床研究を行う前に中和効率を確認しておいてもよい。
【００９４】
２Ｂ６から調製されたヒト化抗体について説明された方法に従って、当業者は、本明細書記載の他のドナーＩＬ−５抗体、可変領域配列およびＣＤＲペプチドからヒト化抗体を構築することができる。レシピエントにより「自己」であると潜在的に認識される可変領域枠組みを用いて組み換え法による抗体を製造することができる。可変領域枠組みに対する小さな修飾を行って、レシピエントに対する免疫原性を有意に上昇させずに抗原結合を促進することができる。かかる組み換え法による抗体は、ヒトのＩＬ−５により媒介される症状を効果的に治療する可能性がある。
【００９５】
ＶＩＩ. 治療的／予防的使用
また本発明は、有効量の本明細書記載の１種またはそれ以上の組み換え法による抗体または変化した抗体を包含する抗体、あるいはそれらのフラグメントを投与することを特徴とする、喘息のごとき好酸球増加症関連症候群にかかっているヒトの治療方法に関する。
【００９６】
ヒト・ＩＬ−５への結合、次いで、好酸球刺激のブロックにより、本発明分子の使用による治療的応答を得る。よって、本発明分子は、治療用途に適した調合品および処方に含まれた場合、アレルギー性鼻炎、喘息、慢性好酸球性肺炎、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、セリアック病、好酸球性胃腸炎、Churg-Strauss症候群（結節性動脈周囲炎およびアトピー）、好酸球性筋肉痛症候群、過好酸球増加症候群、血管皮膚炎を包含する水腫性反応、ぜん虫感染（ここで、好酸球は防御的役割をしている可能性がある）、オンコセルカ皮膚炎およびアトピー性皮膚炎のごときアレルギー性および／またはアトピー性応答、あるいは好酸球増加症に関連した応答をしているヒトに対して非常に望ましい。
【００９７】
他の抗体、詳細には本発明組み換え法による抗体が指向する症状の原因となりうる他のマーカー（エピトープ）と反応するヒト・ｍＡｂと組み合わせて本発明の変化した抗体、抗体およびそれらのフラグメントを用いてもよい。
【００９８】
本発明治療剤は、約２日ないし約３週間、あるいは必要な期間のアレルギー症状の治療に望ましいと考えられる。例えば、季節性鼻炎等を治療する場合には、より長期の治療が望ましい。このことは、ＩＬ−５により媒介される疾病に対する現用の先行技術である輸液プロトコールよりもかなり有利であることを示す。治療のための用量および期間は、ヒトの循環系における本発明分子の相対的持続時間に関係し、治療すべき症状および患者の一般的健康状態に応じて当業者により調整されうる。
【００９９】
本発明治療剤の投与モードは、宿主に対して剤を送達するいずれの適切な経路であってもよい。変化した抗体、抗体、組み換え法による抗体、およびそれらのフラグメント、ならびに本発明医薬成分は、詳細には、非経口投与、すなわち、皮下、筋肉内、静脈または鼻腔内投与において有用である。
【０１００】
本発明治療剤を、医薬上許容される担体中の有効成分としての有効量の本発明の組み換え法による（例えば、ヒト化）抗体を含有する医薬組成物として調製してもよい。本発明の予防剤において、組み換え法による抗体を含有する、好ましくは生理学的ｐＨに調節された即座に注射可能な形態の水性懸濁液または溶液が好ましい。通常には、非経口投与用組成物は本発明の組み換え法による抗体の溶液または医薬上許容される担体（好ましくは水性担体）に溶解されたそのカクテルを含んでなる。種々の水性担体を用いることができ、例えば、０.４％食塩水、０.３％グリシン等を用いることができる。これらの溶液は滅菌されており、一般的には微粒子不含である。よく知られた滅菌法（例えば、濾過）によりこれらの溶液を滅菌することができる。組成物は、ｐＨ調節および緩衝化剤等のごとき、所望により医薬上許容される添加物を含んでいてもよい。かかる医薬処方中の本発明抗体の濃度を広範囲に、すなわち、重量で約０.５％未満から、通常には約１％またはそれ未満ないし１５％または２０％まで変化させることができ、主として液体の体積、粘度等に基づいて選択され、選択された個々の投与モードに応じて選択されるであろう。
【０１０１】
よって、筋肉内注射用の本発明医薬組成物を、１ｍｌの滅菌緩衝水および約１ｎｇないし約１００ｍｇ、例えば約５０ｎｇないし約３０ｍｇ、またはより好ましくは約５ｍｇなし約２５ｍｇの本発明の組み換え法による抗体を含有するように調製することができる。同様に、静脈輸液用の本発明医薬組成物を、約２５０ｍｌの滅菌リンゲル溶液、および約１ないし約３０ｍｇ、好ましくは５ｍｇないし約２５ｍｇの本発明の組み換え法による抗体を含有するように調製することができる。非経口的投与可能組成物の調製のための実際的な方法は当業者によく知られているかまたは明らかであり、例えばRemington's Pharmaceutical Science,15th ed.,Mark Publishing Company,Easton,Pennsylvaniaにおいてより詳細に記載されている。
【０１０２】
本発明治療剤は、医薬組成物中に入れる場合、１回分の剤型として提供するのが好ましい。適当な治療上有効量は当業者により容易に決定されうる。ヒトまたは他の動物における炎症性疾患を有効に治療するためには、１回分の用量は、体重７０ｋｇにつき約０.１ｍｇはいし約２０ｍｇの本発明抗体を非経口的に、好ましくは静脈または筋肉内投与すべきである。必要ならば、炎症応答中に医師がかかる用量を適当時間間隔をおいて調製してもよい。
【０１０３】
本発明の変化した抗体および組み換え法による抗体を、ＩＬ−５により媒介される疾病の決定またはかかる疾病の治療進行の追跡のごとき診断に用いてもよい。診断には、これらの変化した抗体を、慣用的には、血清、血漿または他の適当な組織中のＩＬ−５レベルの測定あるいは培養中のヒト細胞による放出の測定のためにＥＬＩＳＡまたは他の慣用的アッセイフォーマット用に標識することができる。変化した抗体が用いられるアッセイの性質は慣用的なものであり、本開示を限定するものでない。
【０１０４】
よって、本発明の１の具体例は、患者における過剰な好酸球産生に関連したアレルギーおよび他の症状の診断を援助する方法であって、患者から得た試料（血漿または組織）中のヒト・ＩＬ−５の量を決定し、次いで、決定した量を正常集団におけるヒト・ＩＬ−５平均量と比較することを特徴とし、そのことにより患者試料中の有意に上昇したＩＬ−５量が過剰な好酸球産生に関連したアレルギーおよび他の症状を示すものとなる方法に関する。
【０１０５】
本明細書記載の抗体、変化した抗体またはそれらのフラグメントを保存のための凍結乾燥し、使用のために適当な担体中で復元することができる。この方法は、慣用的免疫グロブリンに関して効果的であることが示されており、当該分野で知られている凍結乾燥および復元方法を用いることができる。
【０１０６】
下記実施例は、典型的な組み換え法による抗体の構築および適当なベクターおよび宿主細胞中でのその発現を包含する本発明の種々の態様を説明するが、本発明の範囲を限定するものと解してはならない。すべてのアミノ酸は慣用的な３文字または１文字法により表される。特記しないかぎり、すべての必要な制限酵素、プラスミド、ならびに他の試薬および材料は市販のものである。すべての一般的クローニング、連結および他のＤＮＡ組み換え法は、T.Maniatisら（すでに引用）、または同じ出版社からのその第２版（１９８９）（Sambrookら編）（「Sambrookら」という）において行われたものである。
【実施例１】
【０１０７】
実施例１ ｈＩＬ−５（ヒト・ＩＬ−５）に対するＭａｂｓ（モノクローナル抗体）の製造
ヒト・ＩＬ−５をDrosophila Schneider 2(S２)細胞において発現させ、均一に精製した。Spodoptera frugiperda 21(Sf21)細胞を用いてマウス・ＩＬ−５をバキュロウイルス中で発現させ、均一に精製した。モノクローナル抗体ＴＲＦＫ−５（中和ラット・抗−マウスＩＬ−５抗体）をGenzyme Corp.（Cambridge,MA）から得た。
【０１０８】
Ａ.免疫手順
組み換えヒト・ＩＬ−５（ＩＬ−５）を、７匹のＣＡＦ１マウス（メス）（Charls River,Wilmington,MA）のパネルに対する免疫原として用いた。４カ月の期間にわたり、１：１の割合のTiterMAX（登録商標）（CytoRx Corp.,Norcross,GA）を用いて乳化したリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）中のＩＬ−５を動物に３回皮下注射した。最初の抗原量は５０μｇであり、追加免疫は２５μｇおよび１０μｇであった。追加免疫後、血清試料を集め、受容体結合阻害アッセイおよびＢ１３増殖アッセイ（またはＩＬ−５中和アッセイ（実施例２Ｃ））により、ＩＬ−５への結合および中和活性についてアッセイした。すべてのマウスは、ＩＬ−５に結合する血清試料を産生した。脾臓ドナーとして選択された動物を安楽死させる３日前に１０μｇの組み換えヒト・ＩＬ−５を静脈から追加免疫した。
【０１０９】
Ｂ.ハイブリドーマ取得
Kohler et al.,Nature,256:495(1975)により初めて報告された融合法を変更して用いて、細胞単層（Kennet et al.,Eds.,"Hybridomas:A new dimension in biological analysis",pp.368-377,Plenum Press,New York）を用いる方法を行った。２匹のドナーマウスからの脾臓細胞をプールし、１千万個のＳＰ２／０／Ａｇ１４骨髄腫細胞に対して５千万個の脾臓細胞の割合で融合を行った。融合が確認された細胞の上清を、ＩＬ−５に対する結合に関してＥＬＩＳＡによりアッセイした。ＩＬ−５に対する抗体を産生する細胞を含むウェルを増殖させ、上清をＩＬ−５受容体結合阻害アッセイおよびＢ１３（中和）増殖アッセイにおいてスクリーニングした（下記）。
【０１１０】
ＩＬ−５と反応するｍＡｂｓを分泌する１６個のハイブリドーマを単離した。ハイブリドーマ上清をヨウ素化ＩＬ−５と混合し、ＩＬ−５受容体（ＩＬ−５Ｒ）のα−鎖を発現するDrosophila細胞から調製した抽出物に添加し、受容体結合の阻害に関してアッセイした。１１個のハイブリドーマ上清は、ＩＬ−５受容体α−鎖へのヨウ素化ＩＬ−５の結合を６０％よりも多く阻害した。３個のｍＡｂｓ（２Ｂ６、２Ｅ３および２Ｆ２）も、ヒト・ＩＬ−５に応答してマウス・Ｂ１３細胞の増殖を７０％よいも多く阻害したが、マウス・ＩＬ−５には応答しなかった。５個のハイブリドーマ（そのうち４個（１Ｃ６、２Ｂ６、２Ｅ３および２Ｆ２）は結合および／または増殖をブロックし、１個（２４Ｇ９）は中和的でなかった）を軟寒天で繰り返しサブクローンして安定なクローン細胞系を得た。クローン細胞系からの上清を交差反応性についてＥＬＩＳＡによりスクリーニングしたが、ヒト・ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−４、ＩＬ−８、Ｍ−ＣＳＦまたはＴＧＦαには結合しなかった。ｍＡＢｓを精製し、光学的バイオセンサー（BIAcore）分析により結合アフィニティーを評価したところ、１０ないし１００ｐＭの範囲であった。マウス・イソタイプ分類試薬（PhaMingen,San Diego,CA）を用いて細胞系からの上清をイソタイプに分類した。ＭＡｂｓの中和活性に関するアフィニティーおよびＩＣ５０のまとめを表１（実施例２）に示す。
【０１１１】
同様の方法により、対応する免疫プロトコールおよびラット・骨髄腫をマウスについて上記した融合に用いてラット・ハイブリドーマを免疫ラットから得た。２つのラット・ハイブリドーマ４Ａ６および５Ｄ３は、ＩＬ−５に結合するｍＡｂｓを産生することが同定された。２Ｂ６、２Ｅ３および２Ｆ２と同様に、ｍＡｂｓ４Ａ６および５Ｄ３は、下記Ｂ１３アッセイにおいて中和的であることがわかった。
【０１１２】
Ｃ.ハイブリドーマの寄託
モノクローナル抗体２Ｂ６を産生するハイブリドーマ細胞系ＳＫ１１９−２Ｂ６.２０６.７５（１）は、特許手続上の微生物の寄託に関するブダペスト条約に従って、American Type Culture Collection(ATCC),Rockville,MD,USAに受託番号ＨＢ １１７８３として寄託され、特許寄託物として受託された。
【０１１３】
モノクローナル抗体２Ｅ３を産生するハイブリドーマ細胞系ＳＫ１１９−２Ｅ３.３９.４０.２は、特許手続上の微生物の寄託に関するブダペスト条約に従って、American Type Culture Collection(ATCC),Rockville,MD,USAに受託番号ＨＢ １１７８２として寄託され、特許寄託物として受託された。
【０１１４】
モノクローナル抗体２Ｆ２を産生するハイブリドーマ細胞系ＳＫ１１９−２Ｆ２.３７.８０.１２は、特許手続上の微生物の寄託に関するブダペスト条約に従って、American Type Culture Collection(ATCC),Rockville,MD,USAに受託番号ＨＢ １１７８１として寄託され、特許寄託物として受託された。
【０１１５】
モノクローナル抗体２４Ｇ９を産生するハイブリドーマ細胞系ＳＫ１１９−２４Ｇ９.８.２０.５は、特許手続上の微生物の寄託に関するブダペスト条約に従って、American Type Culture Collection(ATCC),Rockville,MD,USAに受託番号ＨＢ １１７８０として寄託され、特許寄託物として受託された。
【０１１６】
モノクローナル抗体４Ａ６を産生するハイブリドーマ細胞系４Ａ６（１）Ｇ１Ｆ７は、特許手続上の微生物の寄託に関するブダペスト条約に従って、American Type Culture Collection(ATCC),Rockville,MD,USAに受託番号ＨＢ １１９４３として寄託され、特許寄託物として受託された。
【０１１７】
モノクローナル抗体５Ｄ３を産生するハイブリドーマ細胞系５Ｄ３（１）Ｆ５Ｄ６は、特許手続上の微生物の寄託に関するブダペスト条約に従って、American Type Culture Collection(ATCC),Rockville,MD,USAに受託番号ＨＢ １１９４２として寄託され、特許寄託物として受託された。
【実施例２】
【０１１８】
実施例２ アッセイ
Ａ. ＥＬＩＳＡ
MaxiSorb（登録商標）イムノプレート（Nunc,Naperville,IL）の個々のウェルを、０.０５Ｍ炭酸バッファーｐＨ９.６中０.２μｇのＩＬ−５で被覆した。４℃で一晩インキュベーション後、０.０２５％ TweenR２０含有ＰＢＳでプレートをすすぎ、０.０２５％ TweenR２０含有ＰＢＳ中１％ ＢＳＡにて室温で２時間ブロックした。未希釈ハイブリッド上清をＩＬ−５被覆ウェルに添加し、室温で２時間インキュベーションした。プレートをすすいだ後、ヤギ・抗−マウスＩｇＧおよびＩｇＭ標識ペルオキシダーゼ（Boehrionger Mannheim,Indianapolis,IN）を、１％ ＢＳＡおよび０.０２５％TweenR２０含有ＰＢＳ中１／７５００希釈して添加した。１５分後、VMax（登録商標）マイクロプレートリーダー（Molecular Devices, Menlo Park,CA）により４５０ｎｍにおいてプレートを読んだ。
【０１１９】
Ｂ.受容体結合阻害アッセイ
ヒト・ＩＬ−５受容体（ＩＬ−５Ｒ）のα−鎖を発現するDrosophila S2細胞の膜抽出物を用いて受容体へのＩＬ−５の結合に対する抗体の効果を測定した。膜を調製するために、１０９個の細胞を１０００ｘｇ、４℃、１０分間ペレット化した。細胞ペレットをドライアイス／エタノール浴で１５分凍結した。ペレットを融解し、４℃の１０ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、１０００ｘｇで１０分間ペレット化した。細胞ペレットをＰＢＳで２回洗浄し、１３.５ｍｌの低張バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７.５、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ジチオスレイトール、１ｍＭ フェニルメチルスルホニルフルオリド、１μＭ ロイペプチン、１μＭ ペプスタチンＡ）に再懸濁し、氷上で５分間インキュベーションした。細胞懸濁液を１５ｍｌのDounceホモジナイザーでホモジナイズし、２.５Ｍ蔗糖溶液を用いて蔗糖最終濃度０.２５Ｍとした。１０００ｘｇで１５分の遠心分離により細胞残渣を除去した。細胞膜を１０００００ｘｇ、４℃で９０分間ペレット化し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７.５、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、２５０ｍＭ 蔗糖中に再懸濁し、−７０℃で保存した。
【０１２０】
受容体を含むDrosophila膜を用いるアッセイを、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー ｐＨ７.２および０.１％ ＢＳＡ（結合バッファー）を含有するDrosophila組織培養培地Ｍ３（Lindquist et al.,Drosophila Inf.Serv.,58:163(1982)）を用いて、MultiscreenGV（登録商標）プレート（Millipore Corp.,Bedford,MA）中で行った。０.１ｍｌの結合バッファーを用いてウェルをプレブロック（preblock）した。５０μｌの試験試料（３系とした）をウェルに添加し、次いで、２５μｌのヨウ素化（１２５Ｉ）ＩＬ−５を添加した。２０分室温でインキュベーションした後、ヒト・ＩＬ−５Ｒのα−鎖を発現しているDrosophila S2細胞の膜抽出物２５μｌをウェルに添加した。さらに１時間インキュベーションした後、減圧濾過により膜を集め、結合バッファーで３回洗浄した。フィルターを乾燥し、カウントした。
【０１２１】
Ｃ. ＩＬ−５中和アッセイ
親切にも、R.Palacios（Basel Institute of Immunology,Switzerland）からマウス・ＩＬ−５／ＩＬ−３依存性細胞系ＬｙＨ７.Ｂ１３（Ｂ１３）を得た。Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、ペニシリン−ストレプトマイシン（すべてGibcoBRL）ならびに２−メルカプトエタノール（５ｘ１０−５Ｍ,Sigma）、１０％ ウシ胎児血清（Globepharm,Surrey,UK）および１〜１０ユニットのマウス・ＩＬ−５を補足したＲＰＭＩ １６４０培地（GibcoBRL, Renfrewshire,UK）中で１週間に２回細胞をサブクローンした。アッセイのために、９６ウェル丸底プレート中、適当に希釈した試験試料の存在下、３系で４８時間培養し、次いで、０.５μＣｉの３Ｈ−チミジン（Amersham,Bucks,UK）を添加して最後の４時間のインキュベーションを行った。それらを1205 Beteplate（LKB Wallac,Beds,UK）におけるシンチレーションカウンティングのために処理した。
【０１２２】
Ｄ.光学的バイオセンサー
固定化ｈＩＬ−５と抗体に関する速度論的平衡結合特性を、BIAcore光学的バイオセンサー（Pharmacia Biosensor,Uppsala,Sweden）を用いて行った。以前に記載されているようにして（Karlsson et al.,J.Immunol.Meth.,145:229-240(1991)（その全体を参照により本明細書に記載されているものと見なす））速度論的データを評価した。
【０１２３】
３つの中和ｍＡｂｓ、すなわち、２Ｂ６、２Ｅ３および２Ｆ２は、膜受容体への１２５Ｉ−ＩＬ−５の結合に対する阻害およびＢ細胞増殖の中和について類似した能力を有しおり、またＩＬ−５に対して非常に類似したアフィニティーを有していた（表１参照）。これら３つのｍＡｂｓ、すなわち２つのＩｇＧ１および１つのＩｇＧ２ａからのＶＨおよびＶＬのヌクレオチド配列をそれぞれ決定した。得られた配列は非常に類似しており、ほんの少数の残基のみが異なっていた。
【０１２４】
【表１】
【実施例３】
【０１２５】
実施例３ 組み合わせライブラリーからのＩＬ−５ Ｆａｂｓの単離および特徴づけ
Ａ. ＰＣＲおよび組み合わせライブラリーの構築
Huse et al.Science,246:1275(1989)およびKang,S.A.Methods:Comparison Methods Enzymol.,2:111(1991)（それら全体を参照により本明細書に記載されているものと見なす）により記載されたようにして、３匹のマウスの脾臓から精製したＲＮＡを、ｃＤＮＡキット（Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN）により逆転写した（キット付属のプライマー（ｄＴ）１５または３’Ｆｄ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ３）およびカッパ軽鎖プライマーを用いる）。記載されたプライマーおよび温度サイクリング条件（上記Huseら）を用いてＰＣＲにより免疫グロブリンｃＤＮＡを増幅した。AmpliWaxTMPCR Gem 100（Perkin Elmer Cetus,Norwalk,CT）ビーズおよび製造者のプロトコールを用いるホット・スタート（Hot Start）法をすべての反応に使用した。ＰＣＲ生成物をゲル精製し、消化し、pMKFabGene3ベクター（Ames et al.,J.Immunol.,512:4572(1994)）中に連結した。Ｆｄ ｃＤＮＡを用いる連結後のライブラリー力価は５.１Ｘ１０７ＣＦＵであり、カッパｃＤＮＡを用いるライゲーション後の力価は１.５Ｘ１０６ＣＦＵであった。ファージミドライブラリーを用いて形質転換されたXL1-Blue細胞（Stratagene,La Jolla,CA）を、ヘルパーファージＶＣＳＭ１３（Stratagene）に感染させ、Barbas and Lerner,Methosa:Comparison Methods Enzymol.,2:119(1991)により記載されたようにしてファージを調製した。
【０１２６】
Ｂ.バイオパンニング（Biopanning）
４つのマイクロタイターウェル（Immulon II Removawell Strips,Dynatech Laboratories Inc.,Chantilly,VA）を、０.１Ｍ重炭酸,ｐＨ８.６中ＩＬ−５（１μｇ／ウェル）で４℃において被覆した。ウェルを水洗し、３％ ＢＳＡ含有ＰＢＳを用いて３７℃で１時間ブロックした。ブロッキング溶液を除去し、ライブラリーをマイクロタイターウェルに添加し（５０μｌ／ウェル）、３７℃で２時間インキュベーションした。ウェルをＴＢＳ／TweenR（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ,ｐＨ７.５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０.５％ TweenR２０）で１０回洗浄し、水で１回洗浄し、次いで、０.１Ｍ ＨＣｌ（１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ含有グリシンでｐＨ２.２に調節）で付着ファージを溶離した。
【０１２７】
Ｃ.コロニー釣菌
バイオパンニングの第３ラウンドおよび第４ラウンドから単離されたコロニーからのコロニー釣菌を記載されたようにして（Barbas and Lerner、上記）行った。０.５〜１.０μＣｉの１２５Ｉ−ＩＬ−５とともにフィルターを室温で１時間インキュベーションし、製造者の推奨手順に従ってBolton-Hunter試薬（NEN,Billerica,MA）を用いて１％ ＢＳＡ含有ＰＢＳ中でヨウ素化し、ＰＢＳ ０.２５％ Tweenで洗浄し、Kodak XARフィルムにさらした。ＩＬ−５反応性Ｆａｂｓを発現しているコロニーをオートラジオグラフィーにより検出した。
【０１２８】
Ｄ.可溶性ＦＡＢｓの調製
ファージミドＤＮＡをＮｈｅＩおよびＳｐｅＩで消化して遺伝子ＩＩＩを除去し、自己連結させた。ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞を形質転換し、単離されたコロニーを、１％グルコースおよび５０μｇ／ｍｌカルベニシリンを含有する５.０ｍｌのスーパーブロス（ＳＢ）培地（３０ｇトリプトン、２０ｇ酵母エキス、１０ｇの３−［Ｎ−モルホリノ］プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、ｐＨを７に調節）中で３７℃で一晩増殖させた。この培養１ｍｌからの細胞をBeckman GS-6R遠心分離機にて３５００ｒｐｍで１０分間ペレット化し、５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含有する５ｍｌのＳＢに植菌した。培養物を３７℃で１時間振盪し、イソプロピル−ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ；１ｍＭ）を添加し、培養物を２８℃に移し、一晩おいた。３０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８.０に懸濁した２０％蔗糖中、４℃で２０分間細胞を溶解し、次いで、微量遠心機で１０分間遠心分離することによりペリプラスム抽出物から可溶性Ｆａｂを調製した。ウェルタンブロットにより、既知量のマウス・Ｆａｂを含有する試料と比較することによってＦａｂ濃度を評価した。別の細菌のペリプラスム抽出物は同様の濃度のＦａｂを含んでおり、ウェスタンブロット分析による分析では１ないし２０μｇ／ｍｌの範囲であった。
【０１２９】
Ｅ. ＦＡＢｓの精製
重鎖のカルボキシ末端上にキレートするペプチドを加工作成して蛋白精製の助けとした。ＮｈｅＩおよびＳｐｅＩでの消化によるＭ１３遺伝子ＩＩＩコーディング領域の除去後、６個のヒスチジン残基をコードしている１対の重複オリゴヌクレオチド：［配列番号：４３］５’−ＣＴＡＧＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＴＡＡ−３’；［配列番号：４４］３’−ＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＡＴＴＧＡＴＣ−５’をＦａｂ発現ベクター中にサブクローンした。上記のごとくＦａｂ発現の誘導を行った。２８℃で一晩インキュベーションした後、２０％蔗糖、３０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８.０中４℃で３０分インキュベーションすることにより細胞ペレットのペリプラスム溶解物を調製した。尿素およびＢｒｉｊ−３５界面活性剤を清澄化した上清に添加して、最終濃度をそれぞれ、２Ｍおよび１％とした。室温で１時間撹拌後、処理され清澄化された上清を、５ｍｌのニッケル−ＮＴＡ金属キレーティングカラム（１.５ｘ３ｃｍ）（バッファーＡ（１００ｍＭ Ｎａ−リン酸、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０.３Ｍ ＮａＣｌ、２Ｍ尿素,ｐＨ８.０）で平衡化されている）に、流速０.５ｍｌ／分で直接負荷した。４カラム体積分（２０ｍｌ）の洗浄後、上と同じバッファー中ｐＨを８から４にする６カラム体積分（３０ｍｌ）の逆ｐＨグラジエントで結合物質を溶離した。精製されたＦａｂｓは、ｐＨ５.５において対称形の鋭いピークとなってカラムから溶出した。精製Ｆａｂｓは＞９０％の純度であり、ＤＮＡ不含であった。
【０１３０】
Ｆ. ＦＡＢ ＥＬＩＳＡ
０.１Ｍ重炭酸バッファー,ｐＨ８.６に懸濁された（１ｍｇ／ｍｌ；ウェル１個あたり５０ｍｌ）蛋白でImmulon IIプレート（Dynatech）を４℃で一晩被覆した。０.０５％ Tween（登録商標）２０含有ＰＢＳにて希釈および洗浄を行った。プレートを洗浄し、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳにて室温で１時間ブロッキングした。可溶性Ｆａｂを含有する細菌懸濁液の種々の希釈物、または精製Ｆａｂｓをプレートに添加した。１時間インキュベーション後、プレートを洗浄し、ビオチン化ヤギ・抗−マウスカッパ（Southern Biotechnology Associates,Inc.,Birmingham,AL）を添加（１：２０００希釈；５０μｌ／ウェル）して１時間おいた。プレートを洗浄し、ストレプトアビジン標識セイヨウワサビペルオキシダーゼを添加し（１：２０００希釈；５０μｌ／ウェル）１時間おいた。プレートを洗浄し、ＡＢＴＳペルオキシダーゼ基質を添加し（１００μｌ／ウェル；Kirkegaard & Perry Laboratories,Gaithersberg,MD）、４０５ｎｍにおける光学密度をUVmax（登録商標）（Molecular Devices）マイクロプレートリーダーで読んだ。
【０１３１】
Ｇ.組み合わせライブラリーからのＦａｂｓの単離および特徴付け
ＩＬ−５で被覆したマイクロタイターウェルに対する複数ラウンドのバイオパンニングにより、ＩＬ−５に対するＦａｂｓを有するファージをライブラリーから選択した。４ラウンドの選択後、１２５Ｉ−ＩＬ−５を用いるコロニー釣菌アッセイによりＩＬ−５反応性Ｆａｂｓが同定された。第３ラウンドから３４個のコロニーが、第４ラウンドから４個のコロニーが同定され、それらは標識ＩＬ−５に結合した。Ｆａｂ−遺伝子ＩＩＩ融合蛋白を発現している培養上清を用いる直接結合ＥＬＩＳＡによりＩＬ−５への結合を確認した。これらのコロニーからＤＮＡを単離し、Ｍ１３遺伝子ＩＩＩのコーディング領域を除去後、可溶性Ｆａｂの発現を誘導した。ペリプラスムフラクションを調製し、ＩＬ−５への結合についてＥＬＩＳＡによりアッセイした。Ｆａｂは、別の蛋白ｒＣ５ａへの結合を示すことなくＩＬ−５に特異的に結合した。
【０１３２】
未希釈ペリプラスム抽出物（１ないし２０μｇ／ｍｌのＦａｂを含有）を、ＩＬ−５Ｒ結合阻害アッセイ（実施例２）においてアッセイした。Ｌ−５Ｒαへのヨウ素化ＩＬ−５の結合を３５％よりも多く阻害するＦａｂはなかった。
【０１３３】
Ｈ.中和ｍＡｂのＦＡＢへの変換
ＦｄおよびｍＡｂ（２Ｂ６）のκｃＤＮＡを、上記条件を用いるＰＣＲにより単離した。ゲル精製したフラグメントをpMKFabGene3ベクター中にサブクローンし、これを修飾して遺伝子ＩＩＩのｃＤＮＡの３’末端にヘキサ−Ｈｉｓ配列を含むようにして、プラスミドpMKFabGene3Hを得た。２Ｂ６重鎖および軽鎖を有する機能的なＩＬ−５結合Ｆａｂクローンをコロニー釣菌アッセイにより同定した。ＮｈｅＩ／ＳｐｅＩ消化による遺伝子ＩＩＩの除去および自己連結を行って、重鎖をイン−フレームでヘキサ−Ｈｉｓに融合させ、上記のごとく精製を可能にした。このＦａｂは用量依存的に受容体結合を阻害し、ＩＣ５０は約７.５μｇ／ｍｌであり、親ｍＡｂであるマウス・２Ｂ６のＩＣ５０と同様であった。
【０１３４】
Ｉ.チェイン−シャッフル（chain-shuffle）されたライブラリーの構築およびスクリーニング
中和ｍＡｂ ２Ｂ６のＦｄをコードしているｃＤＮＡを、ＸｈｏＩ／ＳｐｅＩフラグメントとしてpMKFabGene3H中にサブクローンして、軽鎖ｃＤＮＡのかわりにＳｓｔＩ／ＸｂａＩフラグメントを含ませた。このファージミドをＳｓｔＩおよびＸｂａＩで消化し、ＩＬ−５免疫マウス由来（上記）のＳｓｔＩ／ＸｂａＩ消化された軽鎖のＰＣＲ生成物と連結した。連結後のライブラリー力価は４ｘ１０５ＣＦＵであった。バイオパンニングおよびコロニー釣菌アッセイを、組み合わせライブラリーに関して上で説明したように行った。
【０１３５】
中和ｍＡｂ ２Ｂ６のＦｄをコードしているｃＤＮＡを、ＩＬ−５免疫マウスから回収された同じ軽鎖レパートリーと対合させることによりライブラリーを構築した。このチェインシャッフルされたライブラリーを、固定化ＩＬ−５に対する４ラウンドのバイオパンニングに供し、得られたコロニーをコロニー釣菌アッセイを用いてＩＬ−５反応性に関してアッセイした。ヨウ素化ＩＬ−５に結合する陽性コロニーを、ＥＬＩＳＡおよびＩＬ−５Ｒα結合アッセイによりさらにアッセイした。チェインシャッフルされたライブラリーから回収されたＦａｂのうち２個（２および１５）がＩＬ−５ＲαへのＩＬ−５の結合をブロックし、Ｂ１３アッセイにおいてＩＬ−５依存的増殖を抑制した。これら２個のＶｋの配列は２Ｂ６のＶｋ（２Ｂ６のＶＨに対するもとの軽鎖パートナー）の配列と類似であった。Ｆａｂ２および１５に関する軽鎖配列は、それぞれ配列番号：４５および４６である。Ｆａｂ２については、ＣＤＲ１〜３はそれぞれ配列番号：１０、１１および４７である。Ｆａｂ１５については、ＣＤＲ１〜３はそれぞれ配列番号：１０、１１および４８である。
【０１３６】
下記実施例４および５に記載したすべての抗体のアミノ酸配列はＫＡＢＡＴナンバーリングシステムを用い、このシステムにおいてはＣＤＲおよび枠組み長が変化してもかまわない。すなわち、鍵アミノ酸は、それに先行するアミノ酸数にかかわらず常に同じ番号を与えられる。例えば、すべての軽鎖のＣＤＲ１に先行するシステインは、常にＫＡＢＡＴ位置２３であり、たとえＣＤＲ１が１７個までのアミノ酸を含む場合であってもＣＤＲ１の後に続くトリプトファン残基は常にＫＡＢＡＴ位置３５である。
【実施例４】
【０１３７】
実施例４ ヒト化抗体
マウス・ＣＤＲｓをヒト化抗体枠組み中に含むように１のヒト化抗体を設計した。下記操作を行うことにより、ＩＬ−５特異的マウス・抗体２Ｂ６のこのヒト化バージョンを調製した。
【０１３８】
Ａ.遺伝子クローニング
Boehringer Mannheim（Indianapolis,IN）から得たキットを用いて２Ｂ６、２Ｆ２および２Ｅ３ハイブリドーマ細胞系（実施例１）のそれぞれからｍＲＮＡを単離し、次いで、ｃＤＮＡキット（Boehringer Mannheim）付属のプライマー（ｄＴ）１５を用いて逆転写してｃＤＮＡを作成した。マウス・免疫グロブリンに特異的なＰＣＲプライマーを用いて、重鎖可変領域のアミノ酸９（ＫＡＢＡＴナンバーリングシステム）からヒンジ領域まで伸長しているドメインならびに軽鎖可変領域のアミノ酸９（ＫＡＢＡＴナンバーリングシステム）から不変領域の末端まで伸長しているドメインをコードしているＤＮＡを増幅した。独立別個のＰＣＲ反応により各抗体鎖の数個のクローンを得た。
【０１３９】
使用したマウス・ガンマ１ヒンジ領域プライマーは［配列番号：２２］：５’ＧＴＡＣＡＴＡＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＡＣＡＡＣＣＡＣＡＡＴＣ３’であった。
【０１４０】
使用したマウス・ガンマ２ａヒンジ領域プライマーは［配列番号：２３］：５’ＧＧＡＣＡＧＧＧＣＴＴＡＣＴＡＧＴＧＧＧＣＣＣＴＣＴＧＧＧＣＴＣ３’であった。
【０１４１】
使用したマウス・重鎖可変領域プライマーは［配列番号：２４］：５’ＡＧＧＴ（ＣまたはＧ）（ＣまたはＡ）Ａ（ＧまたはＡ）ＣＴ（ＧまたはＴ）ＴＣＴＣＧＡＧＴＣ（ＴまたはＡ）ＧＧ３’であった。
【０１４２】
使用したマウス・カッパ鎖不変領域プライマーは［配列番号：２５］：５’ＣＴＡＡＣＡＣＴＣＡＴＴＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣＴＣＴＴＧＡＣＡＡＴＧＧＧ３’であった。
マウス・軽鎖可変領域プライマーは［配列番号：２６］：５’ＣＣＡＧＡＴＧＴＧＡＧＣＴＣＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＣＴＣＣＡ３’であった。
【０１４３】
ＰＣＲフラグメントをプラスミドｐＧＥＭ７ｆ＋（Promega）中にクローンし、次いで、それをE.coli DH5a（Bethesda Reaearch Labs）中に形質転換した。
【０１４４】
Ｂ. ＤＮＡ配列決定
上記Ａで得た重鎖および軽鎖マウスｃＤＮＡクローンを配列決定した。これらのクローンの可変領域の配列決定結果を配列番号：１〜６（図１〜６）に示す。各クローンは、マウス・重鎖可変領域または軽鎖可変領域間で保存されていることが知られているアミノ酸を含んでいた。ＣＤＲアミノ酸配列を以下に記載する。 ２Ｂ６重鎖に関するＣＤＲ領域は配列番号：７、８および９である。図７参照。これらの配列は配列番号：１によりコードされている。軽鎖に関するＣＤＲ領域は配列番号：１０、１１および１２である。図７参照。これらの配列は配列番号：２によりコードされている。
【０１４５】
２Ｆ２重鎖に関するＣＤＲ領域は配列番号：７、８および９である。図７参照。これらの配列は配列番号：３によりコードされている。軽鎖に関するＣＤＲ領域は配列番号：１０、１１および１３である。図７参照。これらの配列は配列番号：４によりコードされている。
【０１４６】
２Ｅ３重鎖に関するＣＤＲ領域は配列番号：７、８および１４である。図７参照。これらの配列は配列番号：５によりコードされている。軽鎖に関するＣＤＲ領域は配列番号：１０、１１および１３である。図７参照。これらの配列は配列番号：６によりコードされている。
【０１４７】
Ｃ.ヒト・枠組みの選択
２Ｂ６のクローニング後、ＫＡＢＡＴおよびＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ（Nuc. Acids Res.,20:2019-2022(1992)）蛋白配列データベースにおいて可変領域重鎖および軽鎖のアミノ酸配列（図１および２）（それぞれ配列番号：１５および１６）を既知マウス・免疫グロブリン配列と比較してＮ末端残基に割り当てた。次いで、２Ｂ６重鎖および軽鎖可変領域の推定アミノ酸配列をヒト・免疫グロブリン蛋白配列データベースと比較して、マウス配列に最もぴったりと合致する重鎖および軽鎖両方のヒト・枠組みを同定した。さらに、ＣＤＲ表現に影響しうるアミノ酸による潜在的矛盾を評価するためにＦａｂドメインの構造的モデルから得られた位置のデータベースを用いて重鎖および軽鎖を評価した。矛盾位置における対応マウス・アミノ酸の置換により、ヒト化可変領域枠組みの合成中に矛盾は解決された。
【０１４８】
ヒト骨髄腫免疫グロブリン（ＣＯＲ）から得られた抗体の重鎖枠組み領域を用いた（E.M.Press and N.M.Hogg,Biochem.J.,117:641-660(1970)）。ヒト・重鎖枠組みアミノ酸配列は２Ｂ６枠組みに対して約６６％の相同性があることが見いだされた。
【０１４９】
適当な軽鎖可変領域枠組みについては、Bence-Jones蛋白（LEN）（Schneider et al.,Hoppe-Seyler's Z.Physiol.Chem.,356:507-557(1975)）の軽鎖可変枠組み配列を用いた。ヒト・軽鎖枠組み領域は、マウス・２Ｂ６軽鎖枠組み領域に対して、アミノ酸レベルで約８２％の相同性があった。
【０１５０】
選択されたヒト・枠組みを戻し翻訳（back translate）してＤＮＡ配列を得た。
【０１５１】
Ｄ.ヒト化ＭＡＢ遺伝子の構築
２Ｂ６重鎖ＣＤＲｓ［図７および配列番号：１〜２］およびヒト・抗体の枠組み配列を得て、合成重鎖可変領域［配列番号：１８］を作成した。結合した場合にアミノ酸２１〜１０６（ＫＡＢＡＴ番号付け）をコードすることとなる４つの合成オリゴヌクレオチド［配列番号：２７および２８］［配列番号：２９および３０］を用いてこれを作成した。次いで、ＣＯＲ枠組み（上記）に基づく別のヒト化重鎖由来の配列を含むｐＵＣ１８をベースにしたプラスミドのＨｐａＩ−ＫｐｎＩ制限部位中にオリゴヌクレオチドを連結した。このプラスミドはシグナル配列［配列番号：１７］および残りの可変領域配列を提供する。変異原性プライマーを用いるＰＣＲまたは存在する制限部位中への合成リンカーの付加により、マッピングされた配列中のエラーを修正した。
【０１５２】
シグナル配列およびヒト化重鎖可変領域をｐＵＣをベースとしたプラスミドからＥｃｏＲＩ−ＡｐａＩフラグメントとして切り出し、ＩｇＧ１ヒト・不変領域を含んでいる発現ベクターｐＣＤ中に連結した。合成重鎖可変領域ヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図８［配列番号：１８および１９］に示す。ヒト・枠組み残基は配列番号：１９のアミノ酸１〜３０、３６〜４９、６６〜９７および１０９〜１１９である。ＣＤＲｓのアミノ酸配列はマウス・２Ｂ６ ＣＤＲｓと同じである。得られた発現ベクターｐＣＤＩＬ５ＨＺＨＣ１.０を図１０に示す。
【０１５３】
２Ｂ６軽鎖ＣＤＲｓ［図７および配列番号：１０、１１および１２］およびヒト・抗体の枠組み配列を得てから、合成軽鎖可変領域［配列番号：２０］を作成した。それぞれＳａｃＩ−ＫｐｎＩおよびＰｓｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ末端を有するヒト化ＶＬのアミノ酸２７〜５８（ＫＡＢＡＴ番号付け）［配列番号：３１および３２］およびアミノ酸８０〜１０９［配列番号：３３および３４］をコードしている４つの合成オリゴヌクレオチドを、ＬＥＮ枠組みに対して高度な相同性を有する別のヒト・軽鎖枠組み（Ｂ１７）（Marsh et al,Nuc.Acids Res.,13:6531-6544(1985)）由来の配列を含むｐＵＣ１８をベースにしたプラスミド中に挿入した。このプラスミドは残りの可変領域配列を提供する。マッピングされた配列中のエラーおよびＬＥＮとＢ１７との間の１個のアミノ酸の相違を、変異原性プライマーを用いるＰＣＴまたは存在する制限部位中への合成リンカーの付加により修正した。
【０１５４】
ヒト化軽鎖領域をｐＵＣプラスミドからＥｃｏＲＶ−ＮａｒＩフラグメントとして単離し、カッパヒト不変領域ならびにシグナル配列［配列番号：１７］を含む発現ベクターｐＣＮ中に連結した。合成軽鎖可変領域ヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図９［配列番号：２０および２１］に示す。ヒト・枠組み残基は配列番号：２１のアミノ酸１〜２３、４１〜５５、６３〜９４および１０４〜１１３である。ＣＤＲｓのアミノ酸配列はマウス・２Ｂ６ ＣＤＲｓと同じである。しかしながら、これらのＣＤＲｓに関するコーディング配列はマウス・２Ｂ６コーディング配列とは異なっており、制限酵素部位の作成が可能である。得られた発現ベクターの１つであるｐＣＮＩＬ５ＨＺＬＣ１.０を１１に示す。これらの合成可変軽鎖および／または重鎖配列をヒト化抗体の構築に使用する。
【０１５５】
Ｅ.ヒト化ＭＡｂの発現
ＩｇＧ１イソタイプ由来のヒト化重鎖には配列番号：１９に示す合成重鎖可変領域を用いる。２Ｂ６重鎖ＣＤＲｓを含んでいるこの合成ＶＨを上記のごとく設計し、合成した。
【０１５６】
ヒト化軽鎖、ヒト・カッパ鎖には配列番号：２１に示す合成軽鎖可変領域を用いる。２Ｂ６軽鎖ＣＤＲｓを含んでいるこの合成ＶＬを上記のごとく設計し、合成した。ヒト化可変領域をコードしているＤＮＡフラグメントをｐＵＣ１９をベースにした哺乳動物細胞発現プラスミド中に挿入してプラスミドｐＣＤＩＬ５ＨＺＨＣ１.０（重鎖）［配列番号：４９、図１０も参照］およびｐＣＮＩＬ５ＨＬＣ１.０（軽鎖）［配列番号：５０、図１１も参照］。該発現プラスミドはシグナル配列を使用するものであり、ＣＭＶプロモーターおよび下記実施例５にて慣用的方法（すでに引用したManiatisらの文献）により製造されるキメラのヒト・重鎖またはヒト・軽鎖不変領域を含んでいる。プラスミドをＣＯＳ細胞中に同時トランスフェクションし、実施例５記載のＥＬＩＳＡにより３日後および４日後に上清をヒト・抗体の存在についてアッセイした。
【０１５７】
上記実施例は典型的な組み換え法による抗体の調製を説明する。慣用的手段により得られた他の抗−ＩＬ−５抗体（例えば、２Ｆ２、２Ｅ３、４Ａ６、５Ｄ３、２４Ｇ９等）を用いて、他の組み換え抗体の取得に関して同様の手順を用いることができる。
【０１５８】
Ｆ.精製
ＣＨＯにより発現されたキメラおよびヒト化２Ｂ６の精製を、慣用的なプロテインＡ（またはＧ）アフィニティークロマトグラフィー、次いで、イオン交換および分子ふるいクロマトグラフィーにより行うことができる。同様のプロセスをうまく用いて他のｍＡｂｓ（例えば、呼吸器合胞体ウイルス、インターロイキン−４およびマラリアサーカムスポロゾイトに対するもの）の純度９５％以上の精製が行われている。
【０１５９】
Ｇ.さらなるヒト化ｍＡｂｓおよび発現プラスミド
プラスミドｐＣＤＩＬ５ＨＺＨＣ１.０［配列番号：４９］を得てから、枠組み位置７３のスレオニンをアスパラギンに置換した発現プラスミドｐＣＤＩＬ５ＨＺＨＣ１.１を作成した。ＥｃｏＲＶおよびＸｈｏＩ末端［配列番号：５１および配列番号：５２］を有する合成リンカーを、同様にして消化されたｐＣＤＩＬ５ＨＺＨＣ１.０中に連結することにより、これを作成した。同様にして、発現プラスミドｐＣＤＩＬ５ＨＺＨ１.２は、枠組み位置３７においてバリンのかわりにイソロイシンを有する。ＨｐａＩおよびＸｂａＩ末端［配列番号：５３および配列番号：５４］を有する合成リンカーを、同様にして消化されたｐＣＤＩＬ５ＨＺＨＣ１.０中に連結することにより、これを作成した。さらに、ＨｐａＩおよびＸｂａＩ末端［配列番号：５３および配列番号：５４］を有する合成リンカーを、同様にして消化されたｐＣＤＩＬ５ＨＺＨＣ１.１中に連結することにより、ｐＣＤＩＬ５ＨＺＨＣ１.３を作成した。
【０１６０】
４つの合成オリゴヌクレオチド［配列番号：３１、３２、３３および３４］のＤＮＡ配列を含むすでに記載されているｐＵＣ１８をベースにしたプラスミドを得て、枠組み位置１５がロイシンからアラニンに変更されているヒト化軽鎖可変領域を作成した。このプラスミドをＮｈｅＩおよびＳａｃＩ制限エンドヌクレアーゼで消化し、合成リンカー［配列番号：５５および５６］を挿入した。次いで、ＥｃｏＲＶ−ＮａｒＩフラグメントを単離し、同様に消化した発現ベクターｐＣＮＩＬ５ＨＺＬＣ１.０中に連結してｐＣＮＩＬ５ＨＺＬＣ１.１を得た。
【０１６１】
免疫グロブリン（ＮＥＷ）（Saul et al,J.Biol.Chem.253:585-597(1978)）から得た重鎖枠組み領域および２Ｂ６重鎖ＣＤＲｓ［図７および配列番号：１〜２］を用いて合成可変領域を作成した。ＣＤＲ表現に影響しうる枠組みアミノ酸を同定し、ずでに記載されている方法を用いて置換を行った。４つの重複合成オリゴヌクレオチド［配列番号：５７、５８、５９および６０］を得て、それらはアニーリングされ伸長された場合に、シグナル配列［配列番号：１７］および重鎖可変領域を表わすアミノ酸をコードする。次いで、この合成遺伝子を、ＰＣＲプライマー［配列番号：６３および６４］を用いて増幅し、ＣＯＲ枠組みに基づく別のヒト化重鎖由来の配列を含むｐＵＣ１８をベースにしたプラスミド中にＢｓｔＸＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントとして連結した。合成オリゴヌクレオチドリンカー［配列番号：７５および７６］をＳａｃＩＩおよびＫｐｎＩ制限部位に挿入することにより、枠組みのフェニルアラニンからチロシンへの置換をアミノ酸位置９１（ＫＡＢＡＴ番号付けシステム）（図１２の位置９４と同じ）において行った。得られた重鎖可変領域［図１２および配列番号：６１、６２］をＮＥＷＭヒト化重鎖という。変異原性プライマーを用いるＰＣＲまたは存在する制限部位中への合成リンカーの付加により、マッピングされた配列中のエラーを修正した。シグナル配列およびヒト化重鎖可変領域をｐＵＣをベースにしたプラスミドからＥｃｏＲＩ−ＡｐａＩフラグメントとして切り出し、ヒト・ＩｇＧ１不変領域を含む発現ベクターｐＣＤ中に連結してプラスミドｐＣＤＩＬ５ＮＥＷＭを得た。ＣＤＲｓのアミノ酸配列はマウス・２Ｂ６重鎖ＣＤＲｓと同じである。
【０１６２】
免疫グロブリン（ＲＥＩ）(Palm et al,Hoppe-Seyler's Z.Physiol.Chem.356:167-191(1975)）から得た軽鎖枠組み領域および２Ｂ６軽鎖ＣＤＲｓ［図７および配列番号：１０、１１および１２］を用いて合成可変領域を作成した。ＣＤＲの表現に影響しうる枠組みアミノ酸を同定し、すでに記載された方法を用いて置換を行った。４つの重複合成オリゴヌクレオチド［配列番号：６５、６６、６７および６８］を得て、それらはアニーリンされ伸長された場合、ＲＥＩヒト化軽鎖と呼ばれる軽鎖可変領域［図１３および配列番号：６９、７０］を表すアミノ酸をコードする。次いで、この合成遺伝子をＰＣＲプライマー［配列番号：７１および７２］を用いて増幅し、ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントとしてｐＧＥＭ−７Ｚｆ（＋）（Promega Corporation,Madison,WI）中に連結した。
【０１６３】
変異原性プライマーを用いるＰＣＲまたは存在する制限部位中への合成リンカーの付加によりマッピングされた配列中のエラーを修正した。ヒト化軽鎖可変領域をｐＧＥＭ−７Ｚｆ（＋）をベースにしたプラスミドからＥｃｏＲＶ−ＮａｒＩフラグメントとして切り出し、ヒト・カッパ不変領域ならびにシグナル配列［配列番号：１７］を含む発現ベクターｐＣＮ中に連結した。ＣＤＲｓのアミノ酸配列はマウス・２Ｂ６軽鎖ＣＤＲｓと同じである。しかしながら、これらのＣＤＲｓのコーディング配列はマウス・２Ｂ６のコーディング配列とは異なり、制限酵素部位の作成を可能にする。これらの合成可変軽鎖および／または重鎖配列をヒト化抗体の構築に使用する。
【０１６４】
すでに記載されたｐＧＥＭ−７Ｚｆ（＋）をベースにしたプラスミドを得ると、枠組み位置１５がバリンからアラニンに変化しているヒト化軽鎖可変領域を作成することができる。このプラスミドをＮｈｅＩおよびＳａｃＩ制限エンドヌクレアーゼで消化することができ、合成リンカー［配列番号：７３および７４］を挿入する。次いで、ＥｃｏＲＶ−ＮａｒＩフラグメントを単離し、同様に消化された発現ベクターｐＣＮＩＬ５ＨＺＲＥＩ中に連結してプラスミドｐＣＮＩＬ５ＲＥＩＶ１５Ａを得ることができる。
【実施例５】
【０１６５】
実施例５ キメラ抗体の構築
マウス・ｍＡｂ ２Ｂ６重鎖可変領域のアミノ酸９〜１０４（ＫＡＢＡＴ番号付け）をコードしているＤＮＡを、２Ｂ６ハイブリドーマ細胞系から得たｃＤＮＡ（実施例４参照）のｐＧＥＭ７Ｚｆ（＋）をベースにしたＰＣＲクローンｐＧＥＭ７Ｚｆ（＋）からＡｖａＩＩ−ＳｔｙＩ制限フラグメントとして単離した。このフラグメントを４つの小型合成オリゴマーリンカー［配列番号：３５および３６］［配列番号：３７および３８］とともにｐＵＣ１８をベースにしたプラスミド（ＢｓｔＸＩ−ＨｉｎｄＩＩＩで消化）中で一緒にすることにより、隣接重鎖可変領域配列およびシグナル配列［配列番号：１７］を提供した。密接に関連したマウス・重鎖から推定されたＮ末端アミノ酸のコンセンサスを、最初の８個のＶＨ残基に関して帰属し、それらは配列番号：３５および３６中にコードされている。２Ｂ６重鎖の最初の１５個のＮ末端アミノ酸を配列決定することにより重鎖の推定アミノ酸配列を確かめた。
【０１６６】
シグナルおよびＶＨ領域に関する配列を含むＥｃｏＲＩ−ＡｐａＩフラグメントを単離し、すでにヒト・ＩｇＧ１不変領域をコードしているプラスミドｐＣＤ中に連結した。
【０１６７】
マウス・ｍＡｂ ２Ｂ６軽鎖可変領域のアミノ酸１２〜９９（ＫＡＢＡＴ番号付け）をコードしているＤＮＡを、２Ｂ６ハイブリドーマ細胞系から得たｃＤＮＡ（実施例４参照）のｐＧＥＭ７Ｚｆ（＋）に基づくＰＣＲクローンからＤｄｅＩＩ−ＡｖａＩ制限フラグメントとして単離した。ｐＵＣ１８をベースにしたプラスミド（ＥｃｏＲＶ−ＨｉｎｄＩＩＩで消化）中においてこのフラグメントを４つの小型合成オリゴマーリンカー［配列番号：３９および４０］［配列番号：４１および４２］と一緒にすることにより、隣接軽鎖可変領域配列を提供した。密接に関連したマウス・軽鎖から推定されたＮ末端アミノ酸のコンセンサスを、最初の８個のＶＬ残基に関して帰属し、それらは配列番号：３９および
４０中にコードされている。２Ｂ６軽鎖の最初の１５個のＮ末端アミノ酸を配列決定することにより軽鎖の推定アミノ酸配列を確かめた。次いで、この可変領域をＥｃｏＲＶ−ＮａｒＩフラグメントとして単離し、すでにヒト・カッパ領域およびシグナル配列を含んでいる発現ベクターｐＣＮ中に連結した。
【０１６８】
ｐＣＤおよびｐＣＮをベースにしたプラスミドをＣＯＳ細胞中に同時トランスフェクションすることによりキメラ抗体の発現を行った。３日後および５日後に培養上清を集め、下記のごとくＥＬＩＳＡにより免疫グロブリン発現に関してアッセイした。最終工程以外の各工程の後にＰＢＳ洗浄を行う。ヒト・抗体のＲｃ領域に特異的なヤギ・抗体１００ｎｇ／５０μｌ／ウェルを用いてマイクロタイタープレートを一晩被覆した。培養上清を添加し、１時間インキュベーションした。次いで、セイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ抱合ヤギ・抗−ヒトＩｇＧ抗体を添加し、１時間インキュベーションした。次いで、ＡＢＴＳペルオキシダーゼ基質（Kirkegaard & Perry Laboratories Inc.,Gaithersberg,MD）を添加した。１時間インキュベーションした後、マイクロタイタープレートリーダー（Molecular Devices Corporation,Menlo Park,CA）により４０５ｎｍの吸光度を読んだ。キメラ抗体の発現を検出した。同様のＥＬＩＳＡにおいて、キメラ抗体を含むＣＯＳ細胞上清は、ヒト・ＩＬ−５蛋白で被覆したマイクロタイターウェルに特異的に結合した。この結果は、ＩＬ−５に対する抗体をコードしている遺伝子が合成され、発現されたことを示すものである。
【０１６９】
上の実施例は典型的な組み換え法による抗体の調製を説明するものである。慣用的手段により得られた他の抗−ＩＬ−５抗体（例えば、２Ｆ２、２Ｅ３、４Ａ６、５Ｄ３、２４Ｇ９等）を用いて、他の組み換え抗体の取得に関して同様の手順を用いることができる。
【産業上の利用可能性】
【０１７０】
本発明により、高い結合アフィニティーを有するヒト・インターロイキン５に対する中和モノクローナル抗体などが提供されるので、ＩＬ−５により媒介されるえ疾病の治療または予防用医薬組成物などの分野において利用可能である。
【配列表フリーテキスト】
【０１７１】
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
重鎖および軽鎖を含んでなるヒト・インターロイキン−５に特異的なヒト化抗体であって、
（ａ）該重鎖の可変領域が、配列番号：７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１領域、配列番号：８のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２領域、および配列番号：９のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３領域を含み、
（ｂ）該軽鎖の可変領域が、配列番号：１０のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１領域、配列番号：１１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２領域、および配列番号：１２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３領域を含む、
ヒト化抗体。
【請求項２】
重鎖および軽鎖を含んでなるヒト・インターロイキン−５に特異的なヒト化抗体であって、
（ａ）該重鎖の可変領域が、配列番号：１５のアミノ酸残基３１〜３５からなるＣＤＲ１領域、配列番号：１５のアミノ酸残基５０〜６５からなるＣＤＲ２領域、および配列番号：１５のアミノ酸残基９８〜１０８からなるＣＤＲ３領域を含み、
（ｂ）該軽鎖の可変領域が、配列番号：１６のアミノ酸残基２４〜４０からなるＣＤＲ１領域、配列番号：１６のアミノ酸残基５６〜６２からなるＣＤＲ２領域、および配列番号：１６のアミノ酸残基９５〜１０３からなるＣＤＲ３領域を含む、
ヒト化抗体。
【請求項３】
ヒト・インターロイキン−５のその特異的受容体への結合を妨げる、あるいは、その受容体を通じてのインターロイキン−５のシグナリングを阻害する、請求項１または２に記載のヒト化抗体。
【請求項４】
３．５×１０−１１Ｍまたはそれ未満のＫｄでヒト・インターロイキン−５に結合する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のヒト化抗体。
【請求項５】
該重鎖および軽鎖の枠組み領域が少なくとも１の選択されたヒト抗体に由来する、請求項１〜４のいずれか一項に記載のヒト化抗体。
【請求項６】
少なくとも１の選択されたヒト抗体が、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ １１７８３を有するハイブリドーマ細胞系により産生されるヒト・インターロイキン−５に特異的なマウスの中和モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖可変領域の推定アミノ酸配列を、ヒト・免疫グロブリン蛋白配列データベースとそれぞれ比較することにより、該中和モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖可変領域の推定アミノ酸配列のそれぞれと最も合致すると同定された、重鎖および軽鎖可変領域のヒト枠組み領域を含む、請求項５に記載のヒト化抗体。
【請求項７】
該重鎖の枠組み領域のアミノ酸配列が、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ １１７８３を有するハイブリドーマ細胞系により産生される、ヒト・インターロイキン−５に特異的なマウスの中和モノクローナル抗体の重鎖枠組み領域のアミノ酸配列に対して６６％の相同性がある、請求項５に記載のヒト化抗体。
【請求項８】
該軽鎖の枠組み領域のアミノ酸配列が、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ １１７８３を有するハイブリドーマ細胞系により産生される、ヒト・インターロイキン−５に特異的なマウスの中和モノクローナル抗体の軽鎖枠組み領域のアミノ酸配列に対して８２％の相同性がある、請求項５に記載のヒト化抗体。
【請求項９】
配列番号：６２の重鎖可変領域および配列番号：７０の軽鎖可変領域を含む、ヒト化抗体。
【請求項１０】
少なくとも１個のアミノ酸によって修飾されているアミノ酸配列を有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載のヒト化抗体。
【請求項１１】
前記修飾が１０個未満のアミノ酸の置換または転位であり、未修飾配列の抗原特異性および高アフィニティーを保持している、請求項１０に記載のヒト化抗体。
【請求項１２】
ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ １１７８３を有するハイブリドーマ細胞系により産生される、ヒト・インターロイキン−５に特異的なマウスの中和モノクローナル抗体と同じ特異性および高アフィニティー性を有し、重鎖および軽鎖のアミノ酸が可変ドメインの枠組み領域またはＣＤＲまたはそれらの両方のいずれかに存在する他のアミノ酸により置換されている、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のヒト化抗体。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のヒト化抗体および医薬上許容される担体を含んでなる、インターロイキン−５を中和するための組成物であって、喘息および過好酸球増加症候群からなる群より選択される症状の処置のための組成物。
【請求項１４】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のヒト化抗体および医薬上許容される担体を含んでなる、インターロイキン−５により媒介される疾病の診断のための組成物。
【請求項１】
重鎖および軽鎖を含んでなるヒト・インターロイキン−５に特異的なヒト化抗体であって、
（ａ）該重鎖の可変領域が、配列番号：７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１領域、配列番号：８のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２領域、および配列番号：９のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３領域を含み、
（ｂ）該軽鎖の可変領域が、配列番号：１０のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１領域、配列番号：１１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２領域、および配列番号：１２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３領域を含む、
ヒト化抗体。
【請求項２】
重鎖および軽鎖を含んでなるヒト・インターロイキン−５に特異的なヒト化抗体であって、
（ａ）該重鎖の可変領域が、配列番号：１５のアミノ酸残基３１〜３５からなるＣＤＲ１領域、配列番号：１５のアミノ酸残基５０〜６５からなるＣＤＲ２領域、および配列番号：１５のアミノ酸残基９８〜１０８からなるＣＤＲ３領域を含み、
（ｂ）該軽鎖の可変領域が、配列番号：１６のアミノ酸残基２４〜４０からなるＣＤＲ１領域、配列番号：１６のアミノ酸残基５６〜６２からなるＣＤＲ２領域、および配列番号：１６のアミノ酸残基９５〜１０３からなるＣＤＲ３領域を含む、
ヒト化抗体。
【請求項３】
ヒト・インターロイキン−５のその特異的受容体への結合を妨げる、あるいは、その受容体を通じてのインターロイキン−５のシグナリングを阻害する、請求項１または２に記載のヒト化抗体。
【請求項４】
３．５×１０−１１Ｍまたはそれ未満のＫｄでヒト・インターロイキン−５に結合する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のヒト化抗体。
【請求項５】
該重鎖および軽鎖の枠組み領域が少なくとも１の選択されたヒト抗体に由来する、請求項１〜４のいずれか一項に記載のヒト化抗体。
【請求項６】
少なくとも１の選択されたヒト抗体が、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ １１７８３を有するハイブリドーマ細胞系により産生されるヒト・インターロイキン−５に特異的なマウスの中和モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖可変領域の推定アミノ酸配列を、ヒト・免疫グロブリン蛋白配列データベースとそれぞれ比較することにより、該中和モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖可変領域の推定アミノ酸配列のそれぞれと最も合致すると同定された、重鎖および軽鎖可変領域のヒト枠組み領域を含む、請求項５に記載のヒト化抗体。
【請求項７】
該重鎖の枠組み領域のアミノ酸配列が、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ １１７８３を有するハイブリドーマ細胞系により産生される、ヒト・インターロイキン−５に特異的なマウスの中和モノクローナル抗体の重鎖枠組み領域のアミノ酸配列に対して６６％の相同性がある、請求項５に記載のヒト化抗体。
【請求項８】
該軽鎖の枠組み領域のアミノ酸配列が、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ １１７８３を有するハイブリドーマ細胞系により産生される、ヒト・インターロイキン−５に特異的なマウスの中和モノクローナル抗体の軽鎖枠組み領域のアミノ酸配列に対して８２％の相同性がある、請求項５に記載のヒト化抗体。
【請求項９】
配列番号：６２の重鎖可変領域および配列番号：７０の軽鎖可変領域を含む、ヒト化抗体。
【請求項１０】
少なくとも１個のアミノ酸によって修飾されているアミノ酸配列を有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載のヒト化抗体。
【請求項１１】
前記修飾が１０個未満のアミノ酸の置換または転位であり、未修飾配列の抗原特異性および高アフィニティーを保持している、請求項１０に記載のヒト化抗体。
【請求項１２】
ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ １１７８３を有するハイブリドーマ細胞系により産生される、ヒト・インターロイキン−５に特異的なマウスの中和モノクローナル抗体と同じ特異性および高アフィニティー性を有し、重鎖および軽鎖のアミノ酸が可変ドメインの枠組み領域またはＣＤＲまたはそれらの両方のいずれかに存在する他のアミノ酸により置換されている、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のヒト化抗体。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のヒト化抗体および医薬上許容される担体を含んでなる、インターロイキン−５を中和するための組成物であって、喘息および過好酸球増加症候群からなる群より選択される症状の処置のための組成物。
【請求項１４】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のヒト化抗体および医薬上許容される担体を含んでなる、インターロイキン−５により媒介される疾病の診断のための組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公開番号】特開２０１３−９１６３６（Ｐ２０１３−９１６３６Ａ）
【公開日】平成２５年５月１６日（２０１３．５．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−２２０６１４（Ｐ２０１２−２２０６１４）
【出願日】平成２４年１０月２日（２０１２．１０．２）
【分割の表示】特願２００９−２４４４４８（Ｐ２００９−２４４４４８）の分割
【原出願日】平成７年１２月２２日（１９９５．１２．２２）
【出願人】（５９１００２９５７）グラクソスミスクライン・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー (341)
【氏名又は名称原語表記】ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ ＬＬＣ
【出願人】（５９５０４７１９０）スミスクライン ビーチャム リミテッド (34)
【氏名又は名称原語表記】ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ Ｌｉｍｉｔｅｄ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年５月１６日（２０１３．５．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年１０月２日（２０１２．１０．２）
【分割の表示】特願２００９−２４４４４８（Ｐ２００９−２４４４４８）の分割
【原出願日】平成７年１２月２２日（１９９５．１２．２２）
【出願人】（５９１００２９５７）グラクソスミスクライン・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー (341)
【氏名又は名称原語表記】ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ ＬＬＣ
【出願人】（５９５０４７１９０）スミスクライン ビーチャム リミテッド (34)
【氏名又は名称原語表記】ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ Ｌｉｍｉｔｅｄ
【Ｆターム（参考）】
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