【課題】新規なカリウムチャネルタンパク質、ＫＣＮＢについての核酸およびタンパク質配列を提供すること。
【解決手段】本発明は、新規なカリウムチャネルタンパク質、ＫＣＮＢについての核酸およびタンパク質配列を提供する。本明細書中で開示される配列は、任意の多くの目的のために使用され得る。これらの目的としては、ＫＣＮＢの特異的検出、ＫＣＮＢの活性と関連する分子および／またはＫＣＮＢの活性を調節する分子の同定が挙げられ、ＫＣＮＢまたはＫＣＮＢ活性に関連する任意の多くの状態を診断するか、または哺乳動物におけるＫＣＮＢ分子の数またはＫＣＮＢ活性を調節する。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願との相互参照）
本出願は、米国仮出願番号６０／１８６，９５１（２０００年３月３日出願）による優先権の利益を主張する。この仮出願は、本明細書中で参考として援用される。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
カリウムイオンチャネル（Ｋ^＋チャネル）は、遍在する膜タンパク質である。この膜タンパク質は、殆ど全ての動物細胞の膜電位（すなわち、原形質膜を隔てて存在する電位差）の主要な決定因子である。興奮細胞において、Ｋ^＋はチャネルは、活動電位の頻度と持続時間を規定し、そして神経統合、筋肉収縮、およびホルモン分泌において基礎的な役割を果たす。非興奮細胞において、Ｋ^＋チャネルは、膜電位の維持および細胞体積の調節の中枢である。これらのチャネルは、従って、基礎的な細胞電気生理の調節（特に治療用途）に使用し得るモジュレーターの開発のための重要な標的である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
（発明の要旨）
本発明は、新規Ｋ^＋チャネルタンパク質であるＫＣＮＢ（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ Ｃｈａｎｎｅｌ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｂｒｅａｓｔ：乳房で発現するカリウムチャネル）をコードする単離された核酸を提供する。本明細書で開示される配列を、以下の任意の多数の目的に使用し得る：ＫＣＮＢを発現する細胞の特異的検出、ＫＣＮＢの活性に関連するかそして／またはＫＣＮＢの活性を調節する分子の同定、Ｋ^＋チャネルの活性またＫ^＋チャネルの発現に関連する多くの条件（例えば、癌）のいずれかの診断をする。この核酸およびこれがコードする新規のレセプターを、本明細書中で、特にＫＣＮＢと称する。
【０００４】
一局面において、本発明は、配列番号１に対して、少なくとも７０％のアミノ酸同一性、しばしば９０％または９５％より高い配列同一性を含む、ポリペプチドをコードする単離された核酸を提供する。一実施形態において、この核酸は、配列番号１のアミノ酸配列に対して産生されたポリクローナル抗体に特異的に結合するポリペプチドをコードする。別の実施形態において、この核酸は、カリウムチャネル活性を有するポリペプチドをコードする。別の実施形態において、この核酸は、アミノ酸配列を含むタンパク質をコードする。
【０００５】
さらなる実施形態において、この核酸は、配列番号２または配列番号５のヌクレオチド配列を含むか、または配列番号２または配列番号５のヌクレオチド配列を有する核酸にストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするプライマーによって増幅され得る。
【０００６】
別の局面において、本発明は、配列番号１のヌクレオチド配列を有する核酸にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で特異的にハイブリダイズする単離された核酸を提供する。
【０００７】
別の局面において、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して、少なくとも７０％のアミノ酸同一性、しばしば９０％または９５％より高い配列同一性を含む、ポリペプチドをコードする単離された核酸を提供し、ここで、この核酸が、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１のヌクレオチド配列と選択的にハイブリダイズする。
【０００８】
別の実施形態において、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％のアミノ酸同一性、しばしば９０％または９５％より高い配列同一性を含む、ポリペプチドをコードする単離された核酸を提供する。ある実施形態において、このポリペプチドは、配列番号１に対して産生されたポリクローナル抗体に特異的に結合する。別の実施形態において、このポリペプチドはカルシウムチャネル活性を有する。さらなる実施形態において、このポリペプチドは配列番号１のアミノ酸配列を有する。
【０００９】
別の局面において、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性、しばしば９０％または９５％より高い配列同一性を含むポリペプチドに選択的に結合する抗体を提供する。
【００１０】
別の局面において、本発明は、配列番号１に対して少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性、しばしば９０％または９５％より高い配列同一性を含むポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターを提供する。別の局面において、本発明はこのベクターでトランスフェクトした宿主細胞を提供する。
【００１１】
本発明はまた、カリウムチャネルを調節する化合物を同定する方法を提供する。この方法は、以下：（ｉ）この化合物と、配列番号１に対して少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性、しばしば９０％または９５％より高い配列同一性を含むポリペプチドとを接触させる工程；および（ｉｉ）このポリペプチドに対するこの化合物の機能的効果を決定する工程、を包含する。一実施形態において、このポリペプチドは、固体相に連結している（例えば、固体相に共有結合的に連結する）。
【００１２】
一つの実施形態において、この機能的効果は、イオン流量の変化を測定することにより決定される。別の実施形態において、この機能的効果はこのポリペプチドに対する化合物の結合を測定することによって測定される。さらなる実施形態において、このポリペプチドは組換え体である。いくつかの実施形態において、このポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含むか、または細胞もしくは細胞膜で発現される。この細胞は真核細胞（例えばニューロン）であり得る。
【００１３】
別の局面において、本発明はＫＣＮＢ活性のモジュレーターを同定する方法を提供する。この方法は、以下：（ｉ）ＫＣＮＢと候補モジュレーターとを接触させる工程；および（ｉｉ）この候補モジュレーターがＫＣＮＢに対して機能的効果をを有するか否かを決定する工程、を包含する。一実施形態において、ＫＣＮＢは、配列番号１のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％のアミノ酸同一性、しばしば９０％または９５％より高い配列同一性を含む、ポリペプチドを含む。別の実施形態において、ＫＣＮＢは、配列番号１のアミノ酸配列のうち少なくとも３０個の連続したアミノ酸を有するポリペプチドを含む。さらなる実施形態において、ＫＣＮＢは配列番号１のアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態において、ＫＣＮＢは、カリウムチャネル活性を有するか、または固体相に（例えば共有結合的な連結で）結合する。
【００１４】
いくつかの実施形態では、機能的効果は、イオン流量の変化を測定することよってか、またはＫＣＮＢへのこの化合物の結合を測定することによって決定される。
【００１５】
別の実施形態において、このポリペプチドは細胞または細胞膜で発現される。この細胞は神経細胞または腫瘍細胞のような真核生物細胞であり得る。一実施形態において、真核生物細胞はＫＣＮＢが細胞または細胞膜で正常なものに対して増幅する腫瘍細胞である。
【００１６】
別の局面において、本発明は哺乳類（しばしば、ヒト）からの生物学的サンプルにおける癌細胞を検出する方法を提供する。この方法は、以下の工程を含む：（ｉ）哺乳類由来の生物学的サンプルを提供する工程；および（ｉｉ）この哺乳類由来のサンプルでＫＣＮＢ核酸分子を検出する工程であって、通常と比較したときのサンプルの中のＫＣＮＢ核酸の増加は、癌細胞の存在を示す。一実施形態において、ＫＣＮＢ核酸分子は配列番号２の核酸配列と７０％より高い核酸配列同一性を含む。別の実施形態において、ＫＣＮＢ核酸分子は配列番号２または配列番号５の核酸配列の少なくとも５０個の連続したヌクレオチドを含む。代替的な実施形態において、核酸配列配列は、配列番号２または配列番号５の配列を含む。
【００１７】
さらなる実施形態において、検出工程はさらに以下の工程を含む：（ａ）このプローブが選択的にこの遺伝子とハイブリダイズして安定なハイブリダイゼーション複合体を形成する条件下で、この遺伝子と、ＫＣＮＢ核酸分子に選択的にハイブリダイズするプローブとを接触させる工程；および（ｂ）このハイブリダイゼーション複合体を検出する工程。一実施形態において、この接触させる工程は、増幅反応でＫＣＮＢ核酸分子を増幅する工程をさらに包含する。いくつかの実施形態において、この増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応である。
【００１８】
別の実施形態において、癌細胞は、以下からなる群より選択される：乳癌細胞、肺癌細胞、結腸癌細胞、または前立腺癌細胞。しばしば、これらの細胞は、乳癌細胞または肺癌細胞である。
【００１９】
別の局面において、本発明は哺乳類（しばしば、ヒト）からの生物学的サンプルにおける癌細胞の検出方法を提供し、この方法は以下の工程を含む：（ｉ）哺乳類からの生物学的サンプルを提供する工程；および（ｉｉ）ＫＣＮＢポリペプチドの過剰発現を検出して、それによって生物学的サンプル中の癌細胞の存在を検する工程。一実施形態において、ＫＣＮＢポリペプチドは、配列番号１の核酸配列に対して、７０％より高いアミノ酸配列同一性、しばしば９０％または９５％より高い配列同一性を含む。別の実施形態において、ＫＣＮＢポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列の少なくとも５０個連続したヌクレオチドを含む。さらなる実施形態において、このポリペプチドは配列番号１の配列を含む。
【００２０】
一実施形態において、このポリペプチドはこのポリペプチドに選択的に結合する抗体を使用して検出される。しばしば、このポリペプチドはイムノアッセイによって定量される。
【００２１】
いくつかの実施形態において、癌細胞は以下からなる群より選択される：乳癌細胞、肺癌細胞、結腸癌細胞、および前立腺癌細胞。しばしば、これらの癌細胞は、乳癌細胞または肺癌細胞である。
【００２２】
別の局面において、本発明は、配列番号１に対して、少なくとも７０％アミノ酸配列同一性、しばしば９０％または９５％より高い配列同一性を含む、ＫＣＮＢポリペプチドを過剰発現する癌細胞の増殖を阻害する方法を提供し、この方法は、癌細胞とＫＣＮＢポリペプチドのインヒビターの治療有効量とを接触させる工程を包含する。いくつかの実施形態において、癌細胞は以下からなる群より選択される：乳癌細胞、肺癌細胞、結腸癌細胞、または前立腺癌細胞。しばしば、この癌細胞は乳癌細胞または肺癌細胞である。一実施形態において、ＫＣＮＢポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を有する。他の実施形態において、インヒビターは抗体またはアンチセンスポリヌクレオチドである。
【００２３】
別の局面において、本発明はＫＣＮＢ関連障害の処置方法、ＫＣＮＢのモジュレーターの治療有効量を投与する工程を包含する方法を提供する。
局面において、本発明はカリウムチャネルタンパク質に関連する疾患または状態を処置する方法、配列番号１に対して７０％より高いアミノ酸同一性、しばしば９０％または９５％より高い配列同一性を含む、単離されたカリウムチャネルポリペプチドに選択的結合する抗体を、患者に投与する工程を含む方法を提供する。一実施局面において、本発明は、ポリペプチドをコードする単離された核酸を提供し、ここでこの核酸はストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号２または配列番号５のヌクレオチド配列に含む核酸にハイブリダイズする。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）カリウムチャネルポリペプチドをコードする単離された核酸であって、該核酸は、配列番号１のアミノ酸配列に対して７０％より高いアミノ酸配列同一性を含む、単離された核酸。
（項目２）前記ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列に対して９０％より高いアミノ酸配列同一性を含む、項目１に記載の単離された核酸。
（項目３）前記ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列に対して９５％より高いアミノ酸配列同一性を含む、項目１に記載の単離された核酸。
（項目４）前記核酸が、配列番号１のアミノ酸配列に対して産生されたポリクローナル抗体に特異的に結合するポリペプチドをコードする、項目１に記載の単離された核酸。
（項目５）前記核酸が、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする、項目１に記載の単離された核酸。
（項目６）前記核酸が、配列番号２または配列番号５のヌクレオチド配列を含む、項目１に記載の単離された核酸。
（項目７）前記核酸が、配列番号２または配列番号５のヌクレオチド配列を含む核酸に、ストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするプライマーによって増幅される、項目１に記載の単離された核酸。
（項目８）配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドに対して７０％より高いアミノ酸配列同一性を含むポリペプチドをコードする単離された核酸であって、該核酸が、配列番号２または配列番号５のヌクレオチド配列に、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で選択的にハイブリダイズする、単離された核酸。
（項目９）配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドに対して７０％より高いアミノ酸配列同一性を含むカリウムチャネルポリペプチドをコードする単離された核酸であって、該核酸が、配列番号２または配列番号５のヌクレオチド配列に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で選択的にハイブリダイズする、単離された核酸。
（項目１０）カリウムチャネルポリペプチドをコードする単離された核酸であって、該ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列のうち少なくとも３０個連続したアミノ酸を含む、単離された核酸。
（項目１１）配列番号１のアミノ酸配列のサブフラグメントをコードする単離された核酸であって、ここで、該サブフラグメントが、Ｃ末端ドメイン、Ｍ３ドメイン、およびアミノ酸３０〜アミノ酸７０のサブフラグメントからなる群から選択される、単離された核酸。
（項目１２）配列番号１のアミノ酸配列に対して、７０％より高いアミノ酸配列同一性を含む、単離されたカリウムチャネルポリペプチド。
（項目１３）前記ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列に対して、９０％より高いアミノ酸配列同一性を含む、項目１２に記載のポリペプチド。
（項目１４）前記ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列に対して、９５％より高いアミノ酸配列同一性を含む、項目１２に記載のポリペプチド。
（項目１５）前記ポリペプチドが、配列番号１に対して産生されたポリクローナル抗体に特異的に結合する、項目１２に記載のポリペプチド。
（項目１６）前記ポリペプチドが配列番号１のアミノ酸配列を含む、項目１２に記載のポリペプチド。
（項目１７）単離されたカリウムチャネルポリペプチドであって、該ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列のうち少なくとも３０個連続したアミノ酸を含む、ポリペプチド。
（項目１８）配列番号１のアミノ酸配列のサブフラグメントを含む単離されたポリペプチドであって、ここで、該サブフラグメントが、Ｃ末端ドメイン、Ｍ３ドメイン、およびアミノ酸３０〜アミノ酸７０のサブフラグメントからなる群から選択される、ポリペプチド。
（項目１９）項目１２または項目１７に記載のポリペプチドに選択的に結合する、抗体。
（項目２０）項目１に記載の核酸を含む、発現ベクター。
（項目２１）項目２０に記載のベクターを用いてトランスフェクトされた、宿主細胞。
（項目２２）カリウムチャネルポリペプチドの活性を調節する化合物を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ｉ）該化合物を、配列番号１に対して７０％より高いアミノ酸配列同一性を含むポリペプチドと接触させる工程；および
（ｉｉ）該ポリペプチドに対する該化合物の機能的影響を決定する工程、
を包含する、方法。
（項目２３）前記ポリペプチドが配列番号１に対して９０％より高いアミノ酸配列同一性を含む、項目２２に記載の方法。
（項目２４）前記ポリペプチドが配列番号１に対して９５％より高いアミノ酸配列同一性を含む、項目２２に記載の方法。
（項目２５）前記化合物が、低有機化合物である、項目２２に記載の方法。
（項目２６）前記ポリペプチドが固相に連結されている、項目２２に記載の方法。
（項目２７）前記ポリペプチドが前記固相に共有結合している、項目２６に記載の方法。
（項目２８）前記機能的影響が、イオン流量の変化を測定することによって決定される、項目２２に記載の方法。
（項目２９）前記機能的影響が、前記ポリペプチドへの前記化合物の結合を測定することによって決定される、項目２２に記載の方法。
（項目３０）前記ポリペプチドが組換えである、項目２２に記載の方法。
（項目３１）前記ポリペプチドが配列番号１のアミノ酸配列を含む、項目２２に記載の方法。
（項目３２）前記ポリペプチドが細胞または細胞膜において発現される、項目２２に記載の方法。
（項目３３）前記細胞が、真核生物細胞である、項目３２に記載の方法。
（項目３４）前記真核生物細胞がニューロンである、項目３３に記載の方法。
（項目３５）哺乳動物由来の生物学的サンプル中の癌細胞を検出する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ｉ）該哺乳動物由来の生物学的サンプルを提供する工程；および
（ｉｉ）該哺乳動物由来の生物学的サンプル中の、配列番号１に対して７０％より高いアミノ酸同一性を含むカリウムチャネルポリペプチドをコードする核酸分子を検出する工程、を包含し、ここで、該サンプル中の該核酸分子のレベルにおける正常と比較した増加が、癌細胞の存在を示す、方法。
（項目３６）前記ポリペプチドが配列番号１に対して９０％より高いアミノ酸配列同一性を含む、項目３５に記載の方法。
（項目３７）前記ポリペプチドが配列番号１に対して９５％より高いアミノ酸配列同一性を含む、項目３５に記載の方法。
（項目３８）前記核酸分子が、配列番号２または配列番号５の配列を含む、項目３５に記載の方法。
（項目３９）項目３５に記載の方法であって、ここで、前記検出する工程が、以下：
（ａ）前記核酸分子に選択的にハイブリダイズするプローブを、該プローブが該核酸分子に選択的にハイブリダイズして安定なハイブリダイゼーション複合体を形成する条件下で、該核酸分子と接触させる工程；および
（ｂ）該ハイブリダイゼーション複合体を検出する工程、
をさらに包含する、方法。
（項目４０）前記接触させる工程が、増幅反応において前記核酸分子を増幅する工程をさらに包含する、項目３９に記載の方法。
（項目４１）前記増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応である、項目４０に記載の方法。
（項目４２）項目３５に記載の方法であって、ここで、前記癌細胞が、乳癌細胞、肺癌細胞、結腸癌細胞、および前立腺癌細胞からなる群から選択される細胞である、方法。
（項目４３）前記癌細胞が乳癌細胞である、項目４２に記載の方法。
（項目４４）前記癌細胞が肺癌細胞である、項目４２に記載の方法。
（項目４５）前記哺乳動物がヒトである、項目３５に記載の方法。
（項目４６）哺乳動物由来の生物学的サンプル中の癌細胞を検出する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ｉ）該哺乳動物由来の生物学的サンプルを提供する工程；および
（ｉｉ）該哺乳動物由来のサンプル中の、配列番号１に対して７０％より高いアミノ酸同一性を含むカリウムチャネルポリペプチドを検出する工程、を包含し、ここで、該サンプル中の該ポリペプチドのレベルにおける正常と比較した増加が、癌細胞の存在を示す、方法。
（項目４７）前記ポリペプチドが配列番号１に対して９０％より高いアミノ酸配列同一性を含む、項目４６に記載の方法。
（項目４８）前記ポリペプチドが配列番号１に対して９５％より高いアミノ酸配列同一性を含む、項目４６に記載の方法。
（項目４９）前記ポリペプチドが、配列番号１の配列を含む、項目４６に記載の方法。
（項目５０）前記ポリペプチドが、該ポリペプチドに選択的に結合する抗体を使用して検出される、項目４６に記載の方法。
（項目５１）前記ポリペプチドがイムノアッセイによって定量される、項目５０に記載の方法。
（項目５２）前記癌細胞が、乳癌細胞、肺癌細胞、結腸癌細胞、および前立腺癌細胞からなる群から選択される細胞である、項目４６に記載の方法。
（項目５３）前記癌細胞が乳癌細胞である、項目５２に記載の方法。
（項目５４）前記癌細胞が肺癌細胞である、項目５２に記載の方法。
（項目５５）前記哺乳動物がヒトである、項目４６に記載の方法。
（項目５６）配列番号１に対して７０％より高いアミノ酸同一性を含むカリウムチャネルポリペプチドを過剰発現する癌細胞の増殖を阻害する方法であって、該方法は、該癌細胞を、治療有効量の該カリウムチャネルポリペプチドのインヒビターと接触させる工程を包含する、方法。
（項目５７）前記癌細胞を治療有効量の前記インヒビターと接触させる工程が、該癌細胞のアポトーシスを生じる、項目５６に記載の方法。
（項目５８）前記癌細胞が、乳癌細胞、肺癌細胞、結腸癌細胞または前立腺癌細胞からなる群から選択される、項目５６に記載の方法。
（項目５９）前記癌細胞が乳癌細胞である、項目５８に記載の方法。
（項目６０）前記癌細胞が肺癌細胞である、項目５８に記載の方法。
（項目６１）前記カリウムチャネルポリペプチドが配列番号１のアミノ酸配列を含む、項目５６に記載の方法。
（項目６２）前記インヒビターが抗体である、項目５６に記載の方法。
（項目６３）前記インヒビターがアンチセンスポリヌクレオチドである、項目５６に記載の方法。
（項目６４）カリウムチャネル関連障害を処置する方法であって、該方法は、配列番号１に対して７０％より高いアミノ酸同一性を含むカリウムチャネルポリペプチドの治療有効量の調節因子を投与する工程を包含する、方法。
（項目６５）カリウムチャネルタンパク質に関連する疾患または状態を処置する方法であって、該方法は、項目１９に記載の抗体を患者に投与する工程を包含する、方法。
（項目６６）カリウムチャネルポリペプチドを作製する方法であって、該方法は、該ポリペプチドをコードする核酸を含む組換え発現ベクターから該ポリペプチドを発現する工程を包含し、ここで、該ポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号１に対して７０％より高いアミノ酸同一性を含む、方法。
（項目６７）カリウムチャネルポリペプチドを含む組換え細胞を作製する方法であって、該方法は、該細胞を、該ポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターを用いて形質導入する工程を包含し、ここで、該ポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号１に対して７０％より高いアミノ酸同一性を含む、方法。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、ＫＣＮＢのドメインに対応するアミノ酸配列を図示する。
【図２】図２は、ＫＣＮＢ遺伝子座におけるゲノムＤＮＡ増幅中心点および物理的地図の概略図である。ｘ軸はヒト染色体８ｑ２４．３の領域における１０個のマーカーを示す。ｙ軸は、ｘ軸において規定された各マーカーについてのＤＮＡコピー数を表す。ＫＣＮＢ遺伝子を矢印で示す。ヒトゲノムＤＮＡクローンは実際のクローンサイズのスケールではない。この１０個のマーカーは、概観目的で同じ間隔で配置されており、実際の距離のスケールに対して配置していない。
【図３】図３は、ＣＯＳ−７細胞における機能的なＫＣＮＢの発現を図示する。四角はＫＣＮＢでトランスフェクトした細胞のＩ−Ｖ曲線を示す。黒丸はＫＣＮＢ挿入物を欠いたプラスミドコントロールでトランスフェクトした細胞から生じたシグナルを示す。
【図４】図４は、ＴＮＦ−α誘導細胞死に対する、ＫＣＮＢトランスフェクト体、ＢＣＬ２トランスフェクト体およびＫＣＮＢ／ＢＣＬ２トランスフェクト体の感受性を図示する。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
（本発明の詳細な説明および好ましい実施形態）
（Ｉ．導入）
本発明は、ＫＣＮＢをコードする単離された核酸配列およびアミノ酸配列ならびにＫＣＮＢを産生する方法を提供する。ＫＣＮＢを発現する組織型または細胞型としては、脳、膵臓、腎臓、乳房、肺、結腸、脾臓、肝臓、胎盤、胃、卵巣、前立腺、膀胱および末梢血単球細胞が挙げられるが、これらに限定されない。構造的に、ＫＣＮＢ（配列番号２および配列番号５）の全長ヌクレオチド配列は、３７４アミノ酸長のポリペプチド（配列番号１）をコードする。このアミノ酸配列は、カリウムチャネルタンパク質のＫＣＮＫ３またはＴＡＳＫのアミノ酸配列と６２％の配列同一性で整列され得る。ＫＣＮＫ３またはＴＡＳＫは、２つのポア（Ｐ）ドメインおよび４つの膜貫通領域の存在によって定義づけられるカリウムチャネルのＴＷＩＫ−１ファミリー（例えば、Ｄｕｐｒａｔら、ＥＭＢＯ Ｊ．１６：５４６４−５４７１，１９９７；米国特許第６，０１３，４７０号；およびＷＯ９９／３７７６２を参照のこと）のメンバーである。Ｋ^＋チャネルのＴＷＩＫファミリーの２つのポアドメインおよび４つの膜貫通領域の保存は、機能的な特性の保存と必ずしも関連するわけではない：弱い内向きの整流であるＫ^＋電流を生じるＴＷＩＫファミリーメンバーが同定された；別のものは外向きの整流であるＫ^＋電流を生じる。両方のチャネルは、静止電位で開口しており、そしてＫ^＋平衡電位近くで静止膜電位を駆動し得る。ＫＣＮＫ３（またはＴＡＳＫ）は、バックグラウンドコンダクタンス（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ）の特徴を保有するＫ^＋電流を生じ、そして狭い生理学的範囲の細胞外ｐＨの変化に非常に感受性である（Ｄｕｐｒａｔら、前出を参照）。ＫＣＮＢとは違って、ＴＡＳＫは癌細胞において過剰発現することを観察されていない。
【００２６】
本発明はまた、ＫＣＮＢ核酸またはタンパク質のモジュレーター（例えば、活性薬、阻害剤、興奮薬、エンハンサーなど）をスクリーニングする方法を提供する。このようなモジュレーターがＫＣＮＢ活性に以下により影響を与える；例えば、ＫＣＮＢの転写、翻訳、ｍＲＮＡまたはタンパク質の安定性の調節；ＫＣＮＢと原形質膜もしくは他の分子との相互作用の変化；またはＫＣＮＢタンパク質の活性への影響。一実施形態において、化合物が、例えば、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）を使用して、スクリーニングされ、そして単離されたＫＣＮＢポリペプチドまたはこれらのフラグメントに結合し、そして／またはこれらの活性を調節し得る化合物を同定する。別の実施形態において、ＫＣＮＢタンパク質は細胞内で組換え的に発現され、そしてＫＣＮＢの調節は膜電位の測定のようなカリウムチャネル機能の任意の測定を使用してアッセイされる。膜電位を測定する方法としては、例えばパッチクランプ技術、細胞電流全体の測定、放射性標識ルビジウムフラックスアッセイ、および電圧感受性色素を用いた蛍光アッセイが挙げられる。
【００２７】
多くの実施形態において、ＫＣＮＢポリヌクレオチドまたはポリペプチドは細胞内へ、インビボまたはエキソビボで導入され、そして細胞内のＫＣＮＢ活性は、これによって調節される。例えば、全長ＫＣＮＢポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、細胞集団に導入され、これによってこれらの細胞の電気生理学的特徴を調節し得る。
【００２８】
特定の実施形態において、ＫＣＮＢ、好ましくは、ＫＣＮＢのＮ末端ドメイン、Ｃ末端ドメイン、膜貫通ドメイン、または細胞外ループを指向したモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体が、哺乳動物に投与され、細胞内ＫＣＮＢの活性を阻害する。この実施形態は、有用である（例えば、ＫＣＮＢ活性に関する疾患または障害（例えば、癌）の処置において）。
【００２９】
本発明はまた、ＫＣＮＢ核酸およびタンパク質発現の検出の方法を提供する。ＫＣＮＢポリペプチドはまた、ＫＣＮＢ発現細胞の検出またはＫＣＮＢ活性の改善のために有用なモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を産生するのに利用され得る。ＫＣＮＢを発現する細胞はまた、ｍＲＮＡの逆転写および増幅、総ＲＮＡまたはポリＡ^＋ＲＮＡの単離、ノーザンブロット、ドットブロット、インサイチュハイブリダイゼーション、ＲＮａｓｅプロテクション、Ｓ１消化、プローブ化ＤＮＡマイクロチップアレイ、ウエスタンブロットなどのような技術を用いて同定され得る。
【００３０】
機能的に、ＫＣＮＢ核酸は、カリウムイオンチャネルタンパク質をコードする。ＫＣＮＢヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の特定の領域を用いて、多型改変体、種間のホモログ、およびＫＣＮＢ遺伝子の対立遺伝子の同定をし得る。インビトロ技術を用いることによって（例えば、ストリンジェントまたは中程度なハイブリダイゼーション条件下でＰＣＲを用いてか、または他のヌクレオチド配列との比較のためにコンピューターシステム中の配列情報を用いることによって）同定を実施され得る。本明細書の以下で議論されるようないずれかの配列比較アルゴリズムを用いて、配列比較を実施し得る。ＫＣＮＢポリペプチドまたはこれらの保存領域（例えば、ＫＣＮＢのＣ末端領域）に特異的に結合する抗体はまた、対立遺伝子、種間のホモログ、多形改変体の同定に利用され得る。
【００３１】
多型改変体、種間のホモログ、およびＫＣＮＢの対立遺伝子は典型的に、配列番号１のアミノ酸配列を有するＫＣＮＢポリペプチドを推定ＫＣＮＢタンパク質に対して比較することによって確認されて、ＫＣＮＢ遺伝子またはタンパク質の多型改変体または対立遺伝子の同定を実証する。このような改変体を発現させ、そして活性を分析することによって（例えば、本明細書に記載されるように、電気生理学的特性を決定することによって）この改変体またはホモログは、同じ機能特性を有することが確認され得る。
【００３２】
ＫＣＮＢについてのヌクレオチド配列情報およびアミノ酸配列情報はまた、ＫＣＮＢタンパク質のモデルを構築するのに利用され得る。これらのモデルは実質的に、ＫＣＮＢタンパク質を活性または阻害し得る化合物を同定するのに利用される。ＫＣＮＢ遺伝子またはタンパク質の活性を調節するこのような化合物を用いて、ＫＣＮＢ遺伝子の生理学的役割を調査し得る。
【００３３】
本発明はまた、アッセイ（好ましくは、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）アッセイ）を提供し、ＫＣＮＢと相互作用および／またはＫＣＮＢを調節する化合物または他の分子を同定する。特定のアッセイにおいて、ＫＣＮＢの特定のドメインが用いられ得る（例えば、Ｎ末端ドメイン、膜貫通ドメイン、ポア（ｐｏｒｅ）ドメインまたはＣ末端ドメインが利用され得る）。
【００３４】
本発明はまた、ＫＣＮＢ活性に関する疾患または状態を処置するための方法を提供する。例えば、本発明の方法は、多くの型の癌のいずれかを診断、予後判断、または処置するために使用され得る。好ましい実施形態において、癌は、上皮癌（例えば、乳癌、肺癌、前立腺癌、腎臓癌、胃癌、膀胱癌、または卵巣癌）または胃腸管の任意の癌）である。
【００３５】
本発明の診断方法は、動物（例えば、霊長類、イヌ、ネコ、マウス、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ウサギ等を含む）ならびにヒトにおいて使用され得る。
【００３６】
キットはまた、本明細書で開示される診断および治療方法を実施するために提供され得る。
【００３７】
（ＩＩ．定義）
本明細書で使用される場合、以下の用語は、特に他に記載のない限りこれらに帰する意味を有する。
【００３８】
従って、用語「ＫＣＮＢ」は、ＫＣＮＢ核酸およびポリペプチド多型性変異体、対立遺伝子、変異体、および種間のホモログをいい：これらは、（１）好ましくは、少なくとも約５０、１００、２００、５００、１０００またはこれより多くのアミノ酸の領域にわたって配列番号１のＫＣＮＢ配列に対し、約６５％よりも大きいアミノ酸配列同一性、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、好ましくは９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％、またはより大きいアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する；（２）配列番号１のアミノ酸配列を含む免疫原に対し惹起した抗体（例えば、ポリクローナル抗体）およびその保存的に改変された改変体に結合する；（３）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号２または配列番号５のＫＣＮＢ核酸配列およびその保存的に改変された改変体に特異的にハイブリダイズする；（４）好ましくは、少なくとも約５０、１００、２００、５００、１０００またはこれより多くのヌクレオチドの領域にわたって配列番号２または配列番号５に対し、約９５％、好ましくは約９６％、９７％、９８％、９９％、またはこれより高いヌクレオチド配列同一性を有する核酸配列を有する；または（５）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号３および４、配列番号６および７、配列番号９および１０からなる群から選択されるプライマーセットと同じ配列に特異的にハイブリダイズするプライマーにより増幅される。ＫＣＮＢポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列は、典型的には哺乳動物（ヒト、ラット、マウス、ハムスター、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、または任意の哺乳動物をふくむが、これらに限定されない）に由来する。「ＫＣＮＢポリヌクレオチド」および「ＫＣＮＢポリペプチド」は、両方とも天然に生じるかまたは組換え体かのいずれかである。ヒトＫＣＮＢ遺伝子は、染色体８ｑ２４．３に位置する。
【００３９】
「全長」ＫＣＮＢタンパク質または核酸は、通常１つ以上の天然に生じる野生型ＫＣＮＢポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に含まれる全てのエレメントを含む、ＫＣＮＢポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列またはこれらの変異体をいう。しかし、ＫＣＮＢの誘導体、ホモログ、およびフラグメントは本発明において容易に利用可能であることが理解される。このようなＫＣＮＢ改変体は、配列番号１に示されるポリペプチドドメインのいずれか１つ以上を含み得るか、または、いずれか１つ以上のドメインの複数のコピー、または互いにもしくは他のタンパク質もしくはタンパク質ドメインとの新規な組み合せにおいての任意の数のドメインを含み得る。
【００４０】
トポロジー的に、本明細書で規定されるような全長ＫＣＮＢポリペプチドは、アミノ末端ドメイン、２つのポアドメイン、４つの膜貫通ドメイン、およびＣ末端ドメインを有すると考えられる（図１）。これらのドメインは、当該分野で公知の方法（例えば、疎水性ドメインおよび親水性ドメインを同定する配列分析プログラム）を用いて、構造的に同定され得る（例えば、Ｓｔｒｙｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第３版、１９８８）を参照；インターネットをベースにした多くの配列分析プログラム（例えば、ｄｏｔ．ｉｍｇｅｎ．ｂｃｍ．ｔｍｃ．ｅｄｕで見出されるもの）のいずれかもまた参照）。
【００４１】
例えば、配列番号１の約２５０〜約３７４のアミノ酸に対応する「Ｃ末端ドメイン」は、このタンパク質の４番目の膜貫通ドメイン付近からＣ末端まで伸展するタンパク質の領域をいう。このドメインは、ＫＣＮＢおよびそのホモログの印であり、ＫＣＮＫ３と約３０％未満、必要に応じて約５０％、４０％、または３５％未満の配列同一性を有する。
【００４２】
「Ｐドメイン」は、ポアドメインをコードするタンパク質の構造領域をいい、カリウムイオンチャネルの特徴的な特性がある（例えば、Ｈｅｇｉｎｂｏｔｈａｍら、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．６６：１０６１〜１０６７、１９９４を参照）。ＫＣＮＢは、２つのポアドメイン（すなわち、２つのＰドメイン）を有する。
【００４３】
「膜貫通ドメイン」は、形質膜内にありかつ貫通する疎水性タンパク質ドメインをいい、対応する細胞質（細胞内）および細胞外ループもまた含み得る。ＫＣＮＢの膜貫通ドメインは、ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５〜１３２（１９８２）またはＳｔｒｙｅｒ（前出）に記載されるような標準的方法を用いて同定され得る。ＫＣＮＢは、４つの膜貫通ドメインを有する。
【００４４】
「保存的に改変された改変体」は、アミノ酸および核酸配列の両方に適用する。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された改変体は、同一または本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸をいうか、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合本質的に同一の配列をいう。遺伝子コードの縮重に起因して、多くの機能的に同一の核酸は、任意の所定のポリペプチドをコードする。例えば、コドンＣＧＵ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡ、およびＡＧＧの全てはアミノ酸アルギニンをコードする。したがって、アルギニンがコドンによって特定される全ての位置において、コドンは、コードするポリペプチドを変えることなく記載される対応するコドンのいずれかに変り得る。このような核酸改変体は、「サイレント置換」または「サイレントなバリエーション」であり、「保存的に改変された改変体」の１種である。ポリペプチドをコードする本明細書中に記載されるの全てのヌクレオチド配列はまた、他に記載される場合を除いて、全ての潜在的なサイレントなバリエーション変異体を記載する。したがって、サイレント置換は、アミノ酸をコードする全ての核酸配列の特性を含む。当業者は、標準技術を用いて核酸中の各コドン（通常、メチオニンにのみに対するコドンであるＡＵＧを除く）を改変して、機能的に同一である分子を生じ得ることを認識する。一部の実施形態において、酵素をコードするヌクレオチド配列は、好ましくは、酵素を産生するのに使用される特定の宿主細胞（例えば、酵母、哺乳動物、植物、真菌など）においての発現に最適化される。
【００４５】
アミノ酸配列について、当業者は、核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列への、コードされる配列中の単一アミノ酸または少ない割合のアミノ酸を変換、添加、または欠損する個々の置換、欠損、または添加が、「保存的に改変された改変体」であることを認識する。ここで、この変換は、化学的に同じアミノ酸でのアミノ酸置換を生じる。機能的に同様のアミノ酸を提供する保存的置換の表は、当該分野で周知である。このような保存的に改変された改変体が追加され、本発明の多型改変体、種間のホモログおよび対立遺伝子を除外しない。
【００４６】
以下の８つの群は、それぞれ互いに保存的に置換されるアミノ酸を含む：
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；および
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）
（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８４）を参照）。
【００４７】
高分子構造（例えば、ポリペプチド構造）は、種々のレベルの構成に関して記載され得る。この構成の一般的な議論について、例えば、Ａｌｂｅｒｔｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ（第３版、１９９４）およびＣａｎｔｏｒおよびＳｃｈｉｍｍｅｌ、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＰａｒｔＩ：Ｔｈｅ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（１９８０）を参照。「１次構造」は、特定のペプチドのアミノ酸配列をいう。「２次構造」は、局所的に配置されるポリペプチドの３次元構造をいう。これらの構造は、一般的にドメインとして公知である。ドメインは、ポリペプチドの小型の単位を形成するポリペプチドの一部であり、典型的には、５０〜３５０アミノ酸長である。典型的ドメインは、例えばβシートおよびαへリックスのストレッチのようなより少ない構成の区分から作られる。「３次構造」は、ポリペプチドのモノマーの完全な３次元構造をいう。「４次構造」は、独立した３次元のユニットの非共有会合によって形成される３次元構造をいう。異方性の用語はまたエネルギー用語として公知である。
【００４８】
動物における「癌」は、癌を引き起こす細胞の典型的特性（例えば、調節されない増殖、不死化、転移可能性、急迅速な増殖および増殖速度、特定の特徴的な形態学的特徴ならびに細胞マーカー）を有する細胞の存在をいう。いくつかの状況で、癌細胞は、腫瘍を形成するが、このような細胞は、動物において単独で存在するか、または独立した細胞として血流中に循環し得る（例えば、白血病細胞）。
【００４９】
本明細書で用いられる「生物学的サンプル」は、１つ以上のＫＣＮＢタンパク質をコードする１つ以上のＫＣＮＢ核酸を含む生物学的組織または体液のサンプルをいう。このようなサンプルは、以下を含むが、これらに限定されない：ヒト、マウス、およびラットから単離された組織、特に胸および肺組織、ならびに血液、リンパ組織、肝、脳、心臓、脾臓、精巣、卵巣、甲状腺、腎、および胚組織。生物学的サンプルはまた、組織切片（例えば、組織学的目的のため採取された凍結切片）を含み得る。生物学的サンプルは、典型的に真核生物組織（例えば、昆虫、原生動物、鳥、魚、爬虫類、および好ましくは、哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウシ、イヌ、モルモット、またはウサギ）および最も好ましくは霊長類（例えば、チンパンジーまたはヒト）から得られる。
【００５０】
「機能的影響を決定する」とは、ＫＣＮＢポリペプチドの影響下で直接的にまたは間接的にパラメーターを増大または減少する化合物の影響（例えば、機能的、物理的、および化学的影響）をアッセイすることを意味する。このような機能的影響は、以下を含むがこれらに限定されない：イオンフラックスの変化、膜電位、電流振幅、電圧ゲーティング、およびｐＨ感度ならびに他の生物学的影響（例えば、ＫＣＮＢまたは任意のマーカー遺伝子の遺伝子発現の変化）など。イオンフラックスの変化は、チャネルを通して通過する任意のイオンを含み得る（例えば、カリウム、または、ルビジウム、およびこれらのアナログ（例えば、放射性同位体））。このような機能的影響は、当該分野で公知の任意の方法（例えば、電圧感受性の色素を用いたパッチクランプ）によって測定され得るか、あるいは分光学的特徴（例えば、蛍光、吸光度、屈折率）、流体力学的特徴（例えば、形）、クロマトグラフィー的特徴または溶解特性のようなパラメーターにおける変化によって測定され得る。
【００５１】
ＫＣＮＢ遺伝子またはタンパク質の「阻害因子」、「活性化因子」および「修飾因子」を交換可能に用いて、ＫＣＮＢ活性または数についてインビトロおよびインビボアッセイを用いて同定される阻害分子、活性化分子および修飾分子を言及する。このような修飾分子はまた、本明細書において化合物（ポリペプチド、抗体、アミノ酸、ヌクレオチド、脂質、炭水化物、または任意の有機分子または無機分子を含む）として言及される。阻害因子は、例えば、ＫＣＮＢ活性を遅延するか、あるいは部分的または全体的にＫＣＮＢ活性をブロックするか、ＫＣＮＢを非感受性にするか、あるいはＫＣＮＢ発現または安定性の下方制御する化合物である。活性化因子は、例えば、ＫＣＮＢチャネルを開くか、ＫＣＮＢを感受性にするか、またはＫＣＮＢ活性を刺激するか、あるいはＫＣＮＢ発現または安定性を増大する化合物である。阻害因子および活性化因子についてのアッセイは、以下に記載され、そして例えば、細胞また細胞膜でＫＣＮＢタンパク質を発現させる工程、推定される修飾因子を適用する工程、次いで細胞の電気生理的特性に対する機能的影響を決定する工程を含む。機能的影響の測定は、例えば、膜電位の変化を決定する工程を含む。膜電位を測定する方法は、パッチクランプ技術、細胞全体の電流の決定、放射性同位元素標識されたルビジウムフラックスアッセイおよび電位感受性色素を用いた蛍光アッセイを含むが、これらに限定されない。
【００５２】
潜在的な活性化因子、阻害因子または修飾因子を用いて処理されるＫＣＮＢポリペプチドを含むサンプルおよびアッセイを、活性化因子、阻害因子または修飾因子を伴わないコントロールサンプルと比較して、その候補化合物の有効性を試験する。（化合物処理されていない）コントロールサンプルは、１００％の相対的なＫＣＮＢ活性値を設定される。ＫＣＮＢポリペプチドの阻害は、コントロールについての活性値が、約８０％、必要に応じて約５０％または２５〜０％である場合に、達成される。ＫＣＮＢポリペプチドの活性化は、コントロールについての活性値が、約１１０％、必要に応じて約１５０％、必要に応じて２００〜５００％または約１０００〜３０００％より高い場合に、達成される。
【００５３】
用語「単離された」、「精製された」または「生物学的に純粋な」は、実質的にまたは本質的に、そのネイティブな状態において見出されるような物質を通常に伴う構成要素を有さない物質をいう。純度および均一性は、代表的には、分析化学技術（例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィー）を使用して決定される。調製において優位な種を示すタンパク質が、実質的に精製される。詳細には、単離したＫＣＮＢ核酸は、ＫＣＮＢ遺伝子に隣接しかつＫＣＮＢ以外のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームから分離される。用語「精製された」は、核酸またはタンパク質が、電気泳動ゲルにおいて実質的に１つのバンドを生じることを意味する。特に、核酸またはタンパク質が、少なくとも８５％の純度、必要に応じて少なくとも９５％の純度、および必要に応じて少なくとも９９％の純度であることを意味する。
【００５４】
「核酸」は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよび単鎖形態もしくは二重鎖形態のいずれかのそれらのポリマーをいう。この用語は、公知のヌクレオチドアナログまたは改変したバックボーン残基または連鎖を含有する核酸を表し、これらは、合成物質であり、天然に存在し、そして天然に存在せず、これらは参照ヌクレオチドと類似の結合特性を有し、そしてこれらは参照ヌクレオチドと類似の様式において代謝される。このようなアナログの例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ホスホロチオネート、ホスホラミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）、ホスホン酸メチル、ホスホン酸キラルメチル、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）。
【００５５】
他に規定がない限り、特定の核酸配列はまた、それらの保存的に改変された変異体（例えば、縮重コドン置換）および相補的な配列、ならびに明確に示される配列を暗に示す。特に、縮重コドン置換は、選択された１つ以上（または、全部）のコドンの第３の位置が、混合した塩基残基および／またはデオキシノシンで置換される配列を生成することによって達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５〜２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１〜９８（１９９４）。用語、核酸は、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドと互換可能に使用される。
【００５６】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを言及するために、本明細書中で互換可能に使用される。この用語は、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび天然に存在しないアミノ酸ポリマーの人工的な化学模倣物である、アミノ酸ポリマーに適用する。
【００５７】
用語「アミノ酸」は、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸と類似の様式で機能するアミノ酸アナログおよびアミノ酸模倣物をいう。天然に存在するアミノ酸は、遺伝子コードによってコードされるアミノ酸および後に改変されるアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸およびＯ−ホスホセリン）である。アミノ酸アナログは、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造（すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基およびＲ基（例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム）に結合するα炭素）を有する化合物をいう。このようなアナログは、改変したＲ基（例えば、ノルロイシン）または改変したペプチドバックボーンを有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造を維持する。アミノ酸模倣物は、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と類似の様式で機能する化学的化合物をいう。
【００５８】
アミノ酸は、本明細書中で、それらの一般的に既知の３文字記号、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨される１文字記号のいずれかによって参照され得る。同様に、ヌクレオチドは、それらの一般的に受容される１文字コードによって参照され得る。
【００５９】
「標識」または「検出可能な一部分」は、分光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段または化学的手段によって検出可能な組成物である。例えば、有用な標識としては、^３２Ｐ、蛍光染料、高電子密度の試薬、酵素（例えば、一般に、ＥＬＩＳＡに使用されるような）、ビオチン、ジゴキシゲニンまたはハプテンおよび、例えば、ペプチドに放射標識を取り込むことによって検出可能にされ得るタンパク質またはペプチドと特異的に反応する抗体を検出するために使用されるタンパク質が挙げられる。
【００６０】
「標識核酸プローブまたはオリゴヌクレオチド」は、リンカー結合もしくは化学結合を介して共有結合されるか、またはイオン結合、ファンデルワールス結合、静電気的結合もしくは水素結合を介して非共有結合されるかのいずれかで標識に結合されるものであり、その結果、プローブの存在は、このプローブに結合された標識の存在を検出することによって検出され得る。
【００６１】
本明細書中で使用される場合、「核酸プローブまたはオリゴヌクレオチド」は、１つ以上の型の化学結合を介してか、一般には相補的な塩基対形成を介してか、一般には水素結合形成を介して、相補的な配列の標的核酸に結合し得る核酸として定義される。本明細書中で使用される場合、プローブは、天然の（すなわち、Ａ、Ｇ，ＣまたはＴ）または改変した塩基（７−デアザグアノシン（ｄｅａｚａｇｕａｎｏｓｉｎｅ）、イノシンなど）を含有し得る。さらに、プローブにおける塩基は、ハイブリダイゼーションを阻害しない限りは、ホスホジエステル結合以外の結合によって連結され得る。従って、例えば、プローブは、ホスホジエステル結合よりもむしろペプチド結合によって構成塩基が連結される、ペプチド核酸であり得る。プローブが、ストリンジェンシーなハイブリダイゼーション条件に依存するプローブ配列との完全な相補性を欠失している標的配列を結合し得ることが、当業者によって理解される。このプローブは、必要に応じて、同位体、発色団、発光体（ｌｕｍｉｐｈｏｒｅ）、色原体で直接標識されるか、または例えばストレプトアビジン複合体が後に結合し得るビオチンを用いて非直接的に標識される。このプローブの存在または非存在についてアッセイすることによって、選択配列または部分列の存在または非存在を検出し得る。
【００６２】
参考として使用される場合（例えば、細胞または核酸、タンパク質もしくはベクターに対して）、用語「組換え」は、細胞、核酸、タンパク質またはベクターが、異種核酸もしくはタンパク質の導入、またはネイティブの核酸もしくはタンパク質の変更によって改変されるか、あるいは細胞が、そのように改変された細胞に由来することを示す。従って、例えば、組換え細胞は、この細胞のネイティブ形態（非組換え）内に見出されない遺伝子を発現するか、またはそうでなければ発現下で異常に発現されるか、もしくは少しも発現されないネイティブの遺伝子を発現する。
【００６３】
核酸の一部分について使用される場合、用語「異種」は、核酸が、天然で互いに同じ関係を見出されない２以上の部分列を含むことを示す。例えば、核酸は、代表的には、組換え的に産生され、新規の機能的核酸（例えば、１つの供給源由来のプロモータおよび別の供給源由来のコード領域）を作製するために配置される無関係の遺伝子からの２以上の配列を有する。同様に、異種タンパク質は、タンパク質が天然で互いに同じ関係を見出されない２以上の部分列を含む（例えば、融合タンパク質）ことを示す。
【００６４】
「プロモータ」は、核酸の転写を指向する核酸コントロール配列のアレイとして定義される。本明細書中で使用される場合、プロモータは、転写の開始部位近くの必要な核酸配列（例えば、ポリメラーゼＩＩ型プロモータの場合、ＴＡＴＡエレメント）を含む。プロモータはまた、必要に応じて、遠位エンハンサまたはレプレッサエレメントを含み、これらは、転写の開始部位からの数千ほどの塩基対に位置付けられ得る。「構成的」プロモータは、最も環境的かつ発生的な条件下で活性なプロモータである。「誘導性」プロモータは、環境的かつ発生的な制御下で活性なプロモータである。用語「作動可能に連結される」は、核酸発現コントロール配列（例えば、プロモータまたは転写因子結合部位のアレイ）と第二核酸配列との間の機能的結合をいい、ここで、発現コントロール配列は、第二核酸配列に対応する核酸の転写を指向する。
【００６５】
「発現ベクター」は、組換え的にまたは合成的に産生された核酸構築物であり、宿主細胞において特定の核酸の転写を可能にする一連の特異的核酸エレメントを有する。この発現ベクターは、プラスミド、ウイルスまたは核酸フラグメントの一部であり得る。代表的に、この発現ベクターは、プロモータに作動可能に連結されるように転写された核酸を含む。
【００６６】
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列に関連して、用語、「同一な」またはパーセント「同一性」は、同じであるかまたはアミノ酸残基もしくはヌクレオチドの特定の割合を有する２つ以上の配列または部分列をいい、下記のデフォルトパラメータを有するＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ２．０配列比較アルゴリズムを用いて、または手動アライメントおよび目視検査によって測定されるように、この割合は、同じである（すなわち、比較ウィンドウまたは指定領域にわたる最大一致について比較されかつ整列される場合、特定の領域（例えば、配列番号１、２または５）にわたる、約７０％の同一性、好ましくは７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはより高い同一性）。それによって、このような配列は、「実質的に同一」と言われる。この定義はまた、試験配列の相補体にも言及する。この定義はまた、欠失および／または付加を有する配列ならびに部分列を有する配列を含む。下記のように、好ましいアルゴリズムは、ギャップなどを考慮し得る。好ましくは、同一性は、少なくとも約２５のアミノ酸長もしくはヌクレオチド長の領域、またはより好ましくは、５０、６０、７０、８０、９０もしくは１００のアミノ酸長またはヌクレオチド長の領域にわたって存在する。
【００６７】
配列比較について、代表的には、１つの配列は参照配列として作用し、試験配列と比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列は、コンピュータに入力され、必要な場合、部分列座標が示され、そして配列アルゴリズムプログラムパラメータが示される。デフォルトプログラムパラメータが使用され得るか、または代替のパラメータが示され得る。次いで、この配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて参照配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を算出する。
【００６８】
本明細書中で使用される場合、「比較ウィンドウ」は、２０〜６００、一般には約５０〜約２００、さらに一般には約１００〜約１５０（この中で、配列は、２つの配列が最適に整列された後、近接位置の同じ数の参照配列と比較され得る）からなる群から選択される多数の近接位置のいずれか１つのセグメントの参照を含む。比較についての配列のアライメントの方法は、当該分野で周知である。比較についての配列の最適なアライメントは、例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所的な相同性アルゴリズムによってか、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アルゴリズムによってか、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似方法の検索によってか、これらのアルゴリズム（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のコンピュータ化インプリメンテーションによってか、または手動アライメントおよび目視検査（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら、編．１９９５ 付録）を参照のこと）によって行われ得る。
【００６９】
パーセント配列同一性および配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの別の例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズム（これらは、それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２（１９９７）およびＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０（１９９０）に記載される）である。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウエアは、国際生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて、公然に利用可能である。このアルゴリズムは、照会配列における長さＷの短いワードを同定することによって高いスコアの配列対（ＨＰＳ）を最初に同定する工程を包含し、データベース配列において同じ長さのワードと整列される場合、いずれかの陽性値の閾値スコアＴと一致するか、またはそれを満たす。Ｔは、近接ワードスコア閾値と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、前出）。これらの頭文字近接ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見出すために検索を開始するためのシードとして働く。このワードヒットは、累積アライメントスコアが増加され得る限り、各配列に沿って両方向に広げられる。累積スコアは、ヌクレオチド配列について、パラメータＭ（一致する残基対の報酬スコア；常に０より大きい）およびＮ（一致しない残基の損失スコア；常に０より小さい）を用いて算出される。アミノ酸配列について、スコアマトリックスを使用して、累積スコアを算出し得る。各方向のワードヒットの拡張は、以下の場合に停止される；累積アライアメントスコアが、その最大到達値から量Ｘだけ減少する場合；１つ以上の陰性スコア残基アライメントの集積に起因して、累積スコアが０またはそれより小さい場合；または、配列のいずれかの末端が到達される場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、ＴおよびＸは、感度およびアライメントの速度を決定する。（ヌクレオチド配列についての）ＢＬＡＳＴプログラムは、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝４および両鎖の比較のデフォルトとして使用する。アミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、３のワード長（Ｗ）、および１０の期待値（Ｅ）、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアマトリックス（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５（１９８９）を参照のこと）、５０のアライメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝４および両鎖の比較を、デフォルトとして使用する。
【００７０】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計的分析を行う（例えば、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３〜５７８７（１９９３）を参照のこと）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの測定は、最も小さい総和確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間の一致が変化によって起こることによる確率の指標を提供する。例えば、核酸は、参照配列と試験核酸の比較における最小総和確率が約０．２未満、より好ましくは約０．０１未満、そして最も好ましくは約０．００１である場合、参照配列と類似していると考えられる。
【００７１】
２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一である指標は、第一核酸によってコードされるポリペプチドが、免疫学的に、下記のように第二核酸によってコードされるポリペプチドに対して惹起された抗体と交差反応することである。従って、ポリペプチドは、例えば、２つのペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合、代表的には、第二ポリペプチドと実質的に同一である。２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一である別の指標は、２つの分子またはこれらの相補体が、下記のようにストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。２つの核酸配列が実質的に同一であるなお別の指標は、同じプライマーが配列を増幅するために使用され得ることである。
【００７２】
句「選択的に（または特異的に）ハイブリダイズする」は、配列が複合体マトリックス（例えば、全細胞またはライブラリーのＤＮＡまたはＲＮＡ）に存在する場合、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、特定のヌクレオチド配列のみに対する分子の結合、複製またはハイブリダイズをいう。
【００７３】
用語「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、プローブが、代表的に核酸の複合混合物中におけるその標識配列にハイブリダイズするが、他の配列にはハイブリダイズしない条件をいう。ストリンジェントな条件は、配列依存的であり、そして異なる状況において異なる。より配列が長くなるほど、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに対するより広範な指示は、Ｔｉｊｓｓｅｎ、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ｐｒｏｂｅｓ、「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｓｓａｙｓ」（１９９３）において見出される。一般に、ストリンジェントな条件は、規定されるイオン強度ｐＨでの特異的な配列についての熱融解点（Ｔ_ｍ）よりも約５〜１０℃低く選択される。このＴ_ｍは（５０％のプローブが、平衡点で占有されるＴｍにおいて、標的配列が過剰に存在する場合）、標的に対して相補的なプローブの５０％が、平衡点で標的配列にハイブリダイズする（規定されるイオン強度、ｐＨ、および核濃度下での）温度である。ストリンジェントな条件は、ｐＨ７．０〜８．３で、塩濃度が約１．０Ｍナトリウムイオン濃度未満、代表的には約０．０１〜１．０Ｍナトリウムイオン濃度（または他の塩）条件であり、そして温度は、短いプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）について、少なくとも約３０℃であり、長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチド以上）について、少なくとも約６０℃以上の条件である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような不安定化剤の添加によって達成され得る。選択的ハイブリダイゼーションまたは特異的ハイブリダイゼーションについて、陽性シグナルは、少なくとも２回のバックグラウンドハイブリダイゼーション、必要に応じて１０回のバックグラウンドハイブリダイゼーションである。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は以下のようである：５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣおよび１％のＳＤＳで、４２℃でインキュベートするか、あるいは、５×ＳＳＣ、１％のＳＤＳで、６５℃でインキュベートをし、０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳで６５℃で洗浄する。このような洗浄は、５分、１５分、３０分、６０分、１２０分またはそれ以上行い得る。ＰＣＲについて、約３６℃の温度は、代表的な低いストリンジェンシーな増幅であるが、アニーリング温度は、約３２℃と４８℃との間で、プライマーの長さに依存して変化し得る。高いストリンジェンシーなＰＣＲ増幅について、約６２℃の温度が代表的であるが、高いストリンジェンシーなアニーリング温度は、プライマーの長さおよび特異性に依存して、約５０℃〜約６５℃の範囲であり得る。高いおよび低いストリンジェンシーな増幅の両方についての代表的なサイクル条件は、９０℃〜９５℃で３０秒〜２分の変性期、３０秒〜２分間続くアニーリング期、および約７２℃で１〜２分の伸長期を含む。
【００７４】
ストリンジェントな条件下でお互いにハイブリダイズしない核酸は、コードするポリペプチドが実質的に同一の場合、なお実質的に同一である。これは、例えば、核酸のコピーが、遺伝的コードによって可能になった最大のコドン変性を使用して作製される場合、生じる。このような場合において、この核酸は、代表的に、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ハイブリダイズする。例示的な「中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、４０％のホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳの緩衝液において３７℃でハイブリダイズし、そして１×ＳＳＣ中で４５℃で洗浄する工程を包含する。このような洗浄は、５分、１５分、３０分、６０分、１２０分またはそれ以上行い得る。陽性ハイブリダイゼーションは、少なくとも２回のバックグラウンドハイブリダイゼーションである。当業者は、代替的なハイブリダイゼーション条件および洗浄条件が、同様のストリンジェンシーな条件を利用して提供され得ることを容易に理解する。
【００７５】
「抗体」は、抗原に特異的に結合しそして認識する、免疫グロブリン遺伝子またはそららのフラグメント由来のフレームワーク領域を含むポリペプチドである。この認識された免疫グロブリン遺伝子は、κ定常領域遺伝子、λ定常領域遺伝子、α定常領域遺伝子、γ定常領域遺伝子、δ定常領域遺伝子、ε定常領域遺伝子、μ定常領域遺伝子、ならびに種々の免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。軽鎖は、κまたはλのいずれかにクラス分けされる。重鎖は、γ、μ、α、δまたはεにクラス分けされ、これは次いで免疫グロブリンのクラス、すなわちそれぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥを規定する。
【００７６】
例示的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は、４量体を構成する。それぞれの４量体は、ポリペプチド鎖の２つの同一の対（それぞれの対は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する）からなる。それぞれの鎖のＮ末端は、抗原認識について主に応答的である約１００〜１１０もしくはそれ以上のアミノ酸可変領域を規定する。用語可変軽鎖（Ｖ_Ｌ）および可変重鎖（Ｖ_Ｈ）は、それぞれこれらの軽鎖および重鎖をいう。
【００７７】
抗体は、例えば、インタクトな免疫グロブリンとして、または種々のペプチダーゼによって消化されることによって生じる、十分に特徴化された多くのフラグメントとして存在する。従って、例えば、ペプシンは抗体を、ヒンジ領域における以下のジスルフィド結合以下で消化して、Ｆ（ａｂ）’_２、すなわち、それ自体がジスルフィド結合によってＶ_Ｈ−Ｖ_Ｌ１と連結した軽鎖であるＦａｂの２量体を産生する。このＦ（ａｂ）’_２は、おだやかな条件下で減少して、ヒンジ領域におけるジスルフィド結合を破壊し、それによってＦ（ａｂ）’_２２量体をＦａｂ’単量体に変換する。このＦａｂ’単量体は、実質的にヒンジ領域の部分を有するＦａｂである（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｐａｕｌ編、第３版、１９９３）を参照のこと）。種々の抗体フラグメントが、インタクトな抗体の消化によって規定される一方、当業者は、このようなフラグメントは、化学的にまたは組換えＤＮＡ方法論のいずれかによってデノボ合成され得ることが理解される。従って、本明細書中で使用される場合、用語抗体はまた、全体の抗体の改変によって産生されるか、あるいは組換えＤＮＡ方法論（例えば、単鎖Ｆｖ）を使用してデノボ合成されるかまたはファージディスプレーライブラリーを使用して同定されるかのいずれかによって産生される抗体フラグメントを含む（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２〜５５４（１９９０）を参照のこと）。
【００７８】
モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の調製について、当該分野で公知である任意の技術が使用され得る（例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５〜４９７（１９７５）；Ｋｏｚｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７２（１９８３）；Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９８５）の７７〜９６頁を参照のこと）。単鎖抗体の産生についての技術（米国特許第４，９４６，７７８号）を適用して、本発明のポリペプチドに対する抗体を産生し得る。また、トランスジェニックマウスまたは、他の哺乳動物のような他の生物を使用して、ヒト化抗体を発現し得る。あるいは、ファージディスプレー技術を使用して、選択された抗原に特異的に結合する抗体およびヘテロマーＦａｂフラグメントを同定し得る（例えば、ＭａｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２〜５５４（１９９０）；Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７７９〜７８３（１９９２）を参照のこと）。
【００７９】
「キメラ抗体」は、（ａ）抗原結合部位（可変領域）が、異なるクラスもしくは改変されたクラス、エフェクター機能および／または種の定常領域、あるいは、このキメラ抗体に新しい特徴を与える完全に別の分子（例えば、酵素、毒素、ホルモン、成長因子、薬物など）に結合されるように、定常領域またはそれらの部分が改変、置換または交換される抗体分子であるか；または（ｂ）可変領域またはそれらの部分が、異なるもしくは改変された抗原特異性を有する可変領域と共に改変、置換または交換される抗体分子である。
【００８０】
「抗ＫＣＮＢ」抗体は、ＫＣＮＢ遺伝子、ｃＤＮＡまたはそのサブ配列（例えば、Ｃ末端ドメイン）によってコードされるポリペプチドに特異的に結合する、抗体または抗体フラグメントである。
【００８１】
用語「免疫アッセイ」は、抗原に特異的に結合する抗体を使用するアッセイである。この免疫アッセイは、抗原の単離、標的化および／または定量するための特定の抗体の特異的な結合の特徴の使用によって特徴化される。
【００８２】
タンパク質もしくはペプチドについていう場合、句 抗体に「特異的に（または選択的に）結合する」あるいは「特異的（または選択的に）免疫応答性」とは、タンパク質および他の生物製剤の異質な集団における、タンパク質の存在の決定因子（ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ）である結合反応をいう。従って、指定された免疫アッセイ条件下で、この特定化された抗体は、少なくとも２回バックグラウンドで特定のタンパク質と結合し、そして、このサンプル中に存在する他のタンパク質と、有為な量で実質的に結合しない。このような条件下での抗体への特異的な結合は、特定のタンパク質に対するその特異性について選択される抗体を必要とし得る。例えば、ラット、マウスまたはヒトのような特定の種由来のＫＣＮＢポリペプチドに惹起されるポリクローナル抗体は、特異的にＫＣＮＢタンパク質と免疫反応し、そしてＫＣＮＢタンパク質の多型変異体および対立遺伝子を除く他のタンパク質と免疫反応をしない、ＫＣＮＢのポリクローナル抗体のみを得るために選択され得る。この選択は、他の種から、ＫＣＮＢ分子と交差反応する抗体を引き算することによって達成され得る。種々の免疫アッセイ形式を使用して、特定のタンパク質と特異的に免疫反応する抗体を選択し得る。例えば、固相ＥＬＩＳＡ免疫アッセイを慣習的に使用して、特異的にタンパク質と免疫反応する抗体を選択する（例えば、特異的免疫反応性を決定するために使用され得る免疫アッセイ形式および条件について記載する、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８８）を参照のこと）。代表的に、特異的または選択的な反応は、少なくとも２回のバックグラウンドシグナルまたはノイズ、より代表的には１０回よりも多くから１００回までのバックグラウンドシグナルである。
【００８３】
句「選択的に関連する」は、核酸が上記のように別の核酸に「選択的にハイブリダイズする」能力、あるいは、抗体が上記のようにタンパク質に「選択的に（または特異的に）結合する」能力についていう。
【００８４】
「宿主細胞」は、発現ベクターを含み、そして発現ベクターの複製または発現を支持する細胞が意味される。宿主細胞は、例えばＥ．ｃｏｌｉのような原核生物細胞、または酵母細胞、昆虫細胞、両生類細胞、もしくはＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞などの哺乳動物細胞のような真核生物細胞、培養細胞、移植片およびインビボの細胞であり得る。句「癌を検出する」または「癌を診断する」は、動物において、癌または前癌状態の存在または非存在を決定することをいう。「癌を検出する」はまた、その動物において、癌性細胞の存在の尤度に関する間接的な証拠を得ることについて言及し得る。癌を検出することは、本発明の方法を単独で使用して、他の方法と組み合わせて、または動物の健康状態に関連する他の情報を考慮して、達成し得る。
【００８５】
（ＩＩＩ．ＫＣＮＢ核酸の操作および検出）
本発明の多くの実施例において、ＫＣＮＢポリペプチド（全長ＫＣＮＢタンパク質を含む）、またはその誘導体、改変体、ホモログもしくはフラグメントをコードする核酸が使用され得る。このような核酸は、多くの応用（ＫＣＮＢタンパク質の産生のため、診断アッセイのため、治療的応用のため、ＫＣＮＢ特異的プローブのため、ＫＣＮＢ結合および／または調節化合物についてのアッセイのため、他の種またはマウスからＫＣＮＢホモログを同定および／または単離するための応用、ならびに他の応用を含む）のいずれにも有用である。
【００８６】
（Ａ．一般的な組換えＤＮＡ方法）
本発明の多くの応用には、クローニング、合成、維持、変異誘発、および組換え遺伝学の分野における慣習的な技術を使用して実行され得る核酸配列の他の操作が挙げられる。本発明における一般的な使用方法を開示する基礎テキストには、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｔａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９９０）；およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９４）が挙げられる。
【００８７】
核酸について、サイズは、キロベース（ｋｂ）または塩基対（ｂｐ）のいずれかで示される。これらは、アガロースゲル電気泳動もしくはアクリルアミドゲル電気泳動、配列決定された核酸、または公開されたＤＮＡ配列に由来して推定される。タンパク質について、サイズは、キロダルトン（ｋＤａ）またはアミノ酸残基数で示される。タンパク質のサイズは、ゲル電気泳動、配列決定されたタンパク質、誘導されるアミノ酸配列、または公開されたタンパク質配列から推定される。
【００８８】
市販されていないオリゴヌクレオチドは、固相ホスホラミダイトトリエステル方法（ＢｅａｕｃａｇｅおよびＣａｒｕｔｈｅｒｓ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｓ．２２：１８５９〜１８６２（１９８１）によって最初に記載される）に従って、自動合成装置（Ｖａｎ Ｄｅｖａｎｔｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：６１５９〜６１６８（１９８４）に記載されるような）を使用して、化学的に合成される。オリゴヌクレオチドの精製は、ネイティブのアクリルアミドゲル電気泳動によるか、またはＰｅａｓｏｎおよびＲｅａｎｉｅｒ、Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．２５５：１３７〜１４９（１９８３）に記載されるような陰イオン交換ＨＰＬＣによるかのいずれかである。
【００８９】
クローン化された遺伝子の配列および合成されたオリゴヌクレオチドは、例えば、Ｗａｌｌａｃｅら、Ｇｅｎｅ １６：２１〜２６（１９８１）の２重鎖テンプレートの配列決定のための鎖末端方法を使用して、クローニングの後に改変され得る。
【００９０】
（Ｂ．ＫＣＮＢヌクレオチド配列の単離および検出）
本発明の多くの実施形態において、ＫＣＮＢ核酸は、組換え方法を使用して単離およびクローン化される。このような実施形態は、例えば、タンパク質発現、または改変体、誘導体、発現カセット、もしくはＫＣＮＢに由来する他の配列の産生の間にＫＣＮＢポリヌクレオチドを単離するため、ＫＣＮＢ遺伝子発現をモニターするため、種々の種におけるＫＣＮＢ配列の決定のため、患者における診断目的のため、すなわち、ＫＣＮＢにおける変異の検出のため、または遺伝子型決定および／もしくは法医学的応用のために使用される。
【００９１】
しばしば、ＫＣＮＢタンパク質をコードする核酸配列および関連する核酸配列ホモログは、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡライブラリーから、プローブとのハイブリダイゼーションによってクローン化されるか、またはオリゴヌクレオチドプライマーを用いた増幅技術を使用して単離される。例えば、ＫＣＮＢ配列は、代表的に哺乳動物核酸（ゲノムもしくはｃＤＮＡ）ライブラリーから、核酸プローブ（すなわち、配列番号２に由来し得る配列、または例えば配列番号３および配列番号４、もしくは配列番号６および配列番号７、もしくは配列番号９および配列番号１０を含むプライマーを使用して増幅された配列）とのハイブリダイゼーションによって単離される。ＫＣＮＢについてＲＮＡおよびｃＤＮＡが単離され得る適切な生物学的材料としては、胸および肺、ならびに血液、リンパ、脳、肝臓、心臓、脾臓、精巣、卵巣、甲状腺、腎臓、胚または他の組織のような組織が挙げられる。
【００９２】
プライマーを使用する増幅技術を使用して、ＤＮＡまたはＲＮＡからＫＣＮＢ配列を増幅および単離し得る（例えば、ＤｉｅｆｆｅｎｆａｃｈおよびＤｖｅｋｓｌｅｒ、ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９９５）を参照のこと）。プライマーを使用して、（例えば、配列番号３および配列番号４に示されるようなプライマーを使用して）例えば、全長配列または１から数百ヌクレオチドからのプローブのいずれかを増幅し得、次いでこれを使用して、全長ＫＣＮＢクローンについて哺乳動物ライブラリーをスクリーニングする。
【００９３】
ＫＣＮＢポリペプチドをコードする核酸はまた、発現ライブラリーから、抗体をプローブとして使用して単離され得る。このようなポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、配列番号１またはそれらの誘導体もしくはフラグメントの配列を使用して惹起され得る。
【００９４】
実質的にＫＣＮＢ遺伝子と同一の多型改変体、対立遺伝子および種間ホモログは、ＫＣＮＢ核酸プローブ、およびオリゴヌクレオチドを使用して、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でライブラリーをスクリーニングすることによって、単離され得る。あるいは、発現ライブラリーを使用して、ＫＣＮＢ多型改変体、対立遺伝子、および種間ホモログを、発現されるホモログを検出することによって、免疫学的に、ＫＣＮＢポリペプチドに対して生成された抗血清または精製された抗体を用いてクローン化し得、これはまた、ＫＣＮＢホモログを認識および選択的に結合する。
【００９５】
より隔たった関係のＫＣＮＢホモログは、任意の多くの周知の技術（中程度にストリンジェントな条件を使用する、または低いストリンジェンシーな条件下でＫＣＮＢについて選択的な領域に由来するプローブ（例えば、Ｃ末端ドメインを生成する特異的なプローブ）を使用する、ゲノムライブラリーもしくはｃＤＮＡライブラリーを用いるＫＣＮＢプローブのハイブリダイゼーションを含む）を使用して単離され得る。また、遠隔なホモログは、変性プライマーセット、すなわち所定のアミノ酸配列（特に高度に変換されたアミノ酸伸長に基づく）をコードする全ての可能なコドンを組み込むプライマーを使用して、核酸ライブラリーから増幅され得る。このようなプライマーは当業者に周知であり、そして多くのプログラムが、例えばインターネット上で、プライマー設計を変形するために利用可能である。
【００９６】
ｃＤＮＡライブラリーを生成するために、ＫＣＮＢ ｍＲＮＡが豊富な供給源、例えば脳、または乳癌細胞もしくは肺癌細胞から単離された細胞を選択すべきである。次いでこのｍＲＮＡは、逆転写酵素を使用してｃＤＮＡに生成され、組換えベクターに連結され、そして増殖のために組換え宿主中にトランスフェクトされ、スクリーニングおよびクローニングされる。ｃＤＮＡライブラリーを生成およびスクリーニングするための方法は周知である（例えば、ＧｕｂｌｅｒおよびＨｏｆｆｍａｎ、Ｇｅｎｅ ２５：２６３〜２６９（１９８３）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出；Ａｕｓｕｂｅｌら、前出を参照のこと）。
【００９７】
ゲノムライブラリーに関して、ＤＮＡは、組織または細胞から抽出され、そして機械的な剪断かまたは酵素学的な消化をして約１２−２０ｋｂのフラグメントを得る。次いで、このフラグメントを、グラジエント遠心分離によって所望のサイズに分離され、そしてバクテリオファージλベクター中に構築される。これらのベクターおよびファージは、インビトロでパッケージ化する。組換えファージを、Ｂｅｎｔｏｎ ＆ Ｄａｖｉｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９６：１８０−１８２（１９７７）に記載されるようにプラークファージによって分析する。コロニーハイブリダイゼージョンを、一般にＧｒｕｎｓｔｅｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，７２：３９６１−３９６５（１９７５）に示されるように実行する。
【００９８】
ＫＣＮＢ核酸およびそのホモログを単離する代替の方法は、合成オリゴヌクレオチドプライマーの使用とＲＮＡまたはＤＮＡテンプレートの増幅とを組み合わせる（米国特許第４，６８３，１９５号および同４，６８３，２０２号；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓら，編，１９９０）を参照のこと）。ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）およびリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）のような方法は、ｍＲＮＡから、ＤＮＡから、ゲノムライブラリーからまたはｃＤＮＡライブラリーから直接的にＫＣＮＢ遺伝子の核酸配列を増幅するのに使用され得る。オリゴヌクレオチドを変性することは、本明細書中で提供される配列を使用してＫＣＮＢホモログを増幅するように設計され得る。制限エンドヌクレアーゼ部位は、プレイマーに取り込まれ得る。ポリメラーゼ連鎖反応法または他のインビトロ増幅方法はまた、例えば、発現されるべきタンパク質をコードする核酸配列をクローニングにするのに、生理学的なサンプルにおいてＫＣＮＢをコードするｍＲＮＡの存在を検出するためにか、核酸の配列決定のためにか、または他の目的のためにプローブとして使用する核酸を作製するのに有用であり得る。ＰＣＲ反応によって増幅された遺伝子は、アガロースゲルから精製され得、そして適切なベクターにクローニングし得る。
【００９９】
合成オリゴヌクレオチドを、プローブとして使用するためかまたはタンパク質の発現のために組換えＫＣＮＢ遺伝子を構築するために使用し得る。この方法は、一連の重複するオリゴヌクレオチドの通常４０−１２０ｂｐ長（遺伝子のセンス鎖および非センス鎖の両方を示す）を使用して実施される。次いで、これらのＤＮＡフラグメントをアニールし、結合しそしてクローニングする。あるいは、増幅技術を、ＫＣＮＢ核酸の特異的な核酸を増幅するために正確なプライマーと共に使用し得る。次いで、この特異的な配列を、発現ベクターに連結し得る。
【０１００】
ＫＣＮＢポリペプチドをコードする核酸を、典型的に複製および／または発現のために原核細胞または真核細胞に形質導入の前に中間ベクターにクローニングする。これらの中間ベクターは、典型的には原核生物ベクター（例えば、プラスミド、またはシャトルベクター）である。ベクター、細胞およびトランスフェクション方法は、当業者に周知であり、そしてＡｕｓｕｂｅｌにおいてかまたはＳａｍｂｒｏｏｋにおいて記載される（両方とも前述）。
【０１０１】
ＫＣＮＢ核酸によってコードされるポリペプチドのカリウムチャネル活性は、当業者に公知の種々のアッセイ（例えば、パッチクランプ法）を使用してか、電位感受性色素を使用してかまたは分光学的な特性（例えば、蛍光、吸収、屈折率）、水力学（例えば、形）、クロマトグラフィー的にまたは可溶性性質のようなパラメーターの変化を測定することによって評価し得る。しばしば、ＫＣＮＢ活性は、ＫＣＮＢをコードする発現ベクターが、細胞にトランスフェクションされる発現アッセイ系を使用して評価される。次いで、細胞の電気生理学的な性質は、コントロール細胞と比較して評価され得る。例えば、ＫＣＮＢ発現ベクターは、トランスフェクションされた細胞の同定を可能にするプラスミド（例えば、緑色蛍光タンパク質発現プラスミド）と共に同時トランスフェクションされ得る。次いで、細胞電気生理学は、ＫＣＮＢ挿入および識別子プラスミドを欠いた発現ベクターと同時トランスフェクションされたトランスフェクト体とＫＣＮＢを発現するトランスフェクト体を比較して測定され得る。発現されたＫＣＮＢタンパク質の活性は、パッチクランプ技術を含むイオン束、細胞全体の測定、放射ラベル化ルビジウム流動アッセイおよび電位感受性色素を使用する蛍光の変化を測定する種々のアッセイを使用してアッセイし得る（例えば、Ｖｅｓｔｅｒｇａｒｒｄ−Ｂｏｇｉｎｄら，Ｊ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｂｉｏｌ．８８：６７−７５（１９８８）；Ｄａｎｉｅｌら，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｍｅｔｈ．２５：１８５−１９３（１９９１）；Ｈｏｅｖｉｎｓｋｙら，Ｊ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｂｉｏｌ．１３７：５９−７０（１９９４）を参照のこと）。
【０１０２】
必要に応じて、異種ポリペプチドまたはポリペプチドと組み合わせにおいてＫＣＮＢポリペプチドまたはそのドメインを含むキメラタンパク質をコードする核酸が使用される。例えば、ドメイン（例えば、ＫＣＮＢのＮ末端ドメインまたはＣ末端ドメイン、細胞外ループあるいは膜貫通ドメイン）は、異種膜貫通ドメインまたは異種細胞外ドメインのような異種タンパク質に共有的に結合し得る。他の異種タンパク質の選択としては、例えば、ルシフェラーゼ、ＧＦＰおよびβ−ｇａｌが挙げられる。
【０１０３】
特定の実施形態において、ＫＣＮＢポリヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションに基づく方法（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ ｍｅｔｈｏｄｓ）を使用して検出されて、例えば、診断適用または予後適用のために、例えば、ＫＣＮＢ ＲＮＡレベルを決定されるかまたは特定のＤＮＡ配列を検出する。ＫＣＮＢポリヌクレオチドレベルは、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡを含む、任意のＫＣＮＢ ＤＮＡまたはＲＮＡを検出することによって検出され得る。検出は、ポリヌクレオチド（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡ）のレベルの定量化を含むかまたは、あるいは、特にコントロールレベルと比較して、ＫＣＮＢの、レベルあるいは存在または非存在の定性的な評価であり得る。上記のいずれかを検出するための多数の方法のいずれかは、以下に記載される。このような方法としては、例えば、ハイブリダイゼーション、増幅および他のアッセイが挙げられる。
【０１０４】
特定の実施形態において、細胞において増大したレベルまたは診断的な存在を検出する能力は、癌細胞に対するマーカーとして使用される（すなわち、インビトロまたはインビボにおいて検出されるような患者における癌細胞の数または局在をモニタするために）。
【０１０５】
ＫＣＮＢの遺伝子発現が、当該分野における公知の技術（例えば、ノザンブロット、リアルタイムＰＣＲ手順を使用したｍＲＮＡレベルの定量的ＰＣＲ分析（例えば、逆転写酵素−ＴＡＱＭＡＮ^ＴＭ増幅）を含むｍＲＮＡの逆転写およびＰＣＲ増幅、ドットブロッティング、インサイチューハイブリダイゼーション、ＲＮａｓｅ保護、プローブＤＮＡマイクロチップアレイなど）によって分析され得る。１つの実施形態において、高密度オリゴヌクレオチド分析技術（例えば、ＧｅｎｅＣｈｉｐ^ＴＭ）は、ＫＣＮＢのホモログおよび多型変異体を同定するためかまたはＫＣＮＢ ｍＲＮＡのレベルをモニタするために使用される。ＫＣＮＢが、公知の疾患（例えば、癌、）に結合する場合、これらは生物学サンプルにおける疾患を検出する診断ツールとしてＧｅｎｅＣｈｉｐ^ＴＭと共に使用され得る（例えば、Ｇｕｎｔｈａｎｄら，ＡＩＤＳ Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ １４：８６９−８７６（１９９８）；Ｋｏｚａｌら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．」２：７５３−７５９（１９９６）；Ｍａｔｓｏｎら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２４：１１０−１０６（１９９５）；Ｌｏｃｋｈａｒｔら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：１６７５−１６８０（１９９６）；Ｇｉｎｇｅｒａｓら，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．８：４３５−４４８（１９９８）；Ｈａｃｉａら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６：３８６５−３８６６（１９９８）を参照のこと）。
【０１０６】
１つの実施形態において（例えば、癌の診断において）、コピー数（すなわち、細胞中のＫＣＮＢ遺伝子の数）が、評価される。一般に、特定の常染色体遺伝子に関して、動物は、それぞれの遺伝子の２つのコピーを有する。しかし、コピー数は、（例えば、癌細胞における）遺伝子増幅および複製によって増大し、または欠失によって減少し得る。特定の遺伝子のコピー数を評価する方法は、当業者にとって周知であり、特にハイブリダイゼーションおよび増幅に基づくアッセイ（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂａｓｅｄ ａｓｓａｙｓ）を含む。
【０１０７】
任意の多数のハイブリダイゼーションに基づくアッセイは、生物学的なサンプルの細胞おけるＫＣＮＢ遺伝子またはコピー数を検出するために使用され得る。１つのこのような方法は、サザンブロッティングによってである。サザンブロッティングにおいて、ゲノムＤＮＡは、典型的にフラグメント化され、分離され、電気泳動され、メンブレンに写されそして、次にＫＣＮＢ特異的プローブとハイブリダイゼーションされる。コピー数決定に関して、正常ゲノムＤＮＡ（例えば、同じかまたは関連する細胞、組織、器官などの非増幅部分）の領域に対するコントロールプローブからのシグナルと、標的領域に対するプローブからのハイブリダイゼーションシグナルの強度の比較は、相対的なＫＣＮＢコピー数の推定値を提供する。サザンブロット方法論は、当該分野で周知であり、そしてＡｕｓｕｂｅｌらおよびＳａｍｂｒｏｏｋら（前述）に記載される。
【０１０８】
サンプルにおけるＫＣＮＢ遺伝子のコピー数を決定する代替の方法は、インサイチューハイブリダイゼーションによってである（例えば、蛍光インサイチューハイブリダイゼーションまたはＦＩＳＨ）。インサイチューハイブリダイゼーションアッセイは周知である（例えば、Ａｎｇｅｒｅｒ（１９８７）Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ １５２：６４９）。一般に、インサイチューハイブリダイゼーションは、以下の主要な工程を含む：（１）分析するべき組織および生物学的構造物の固定；（２）標的ＤＮＡのアクセス可能性を増大するため、そして非特異的な結合を減少させるための生物学的構造物のプレハイブリダイゼーション処置；（３）生物学的構造物または組織において核酸と核酸の混合物とのハイブリダイゼーション；（４）ハイブリダイゼーションで結合しなかった核酸フラグメントを除去するためのハイブリダイゼーション後の洗浄、および（５）ハイブリダイズした核酸フラグメントの検出。
【０１０９】
このような適用に使用されるプローブは、典型的には標識化される（例えば、放射性同位体または蛍光レポーターを用いて）。ストリンジェント条件下で標的核酸と特異的にハイブリダイゼーションするために、好ましいプローブは、十分に長い（例えば、約５０、１００または２００ヌクレオチドから約１０００以上のヌクレオチド）。
【０１１０】
多数の実施形態において、「比較プローブ」方法（例えば、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ））は、遺伝子増幅を検出するために使用される。比較ゲノムハイブリダイゼーション方法において、核酸の「試験」回収物は、最初に標識化されるが、第２の回収物（例えば、健康な細胞または組織由来）は、第２の標識で標識される。核酸のハイブリダイゼーションの比は、アレイにおいて各線維体に結合する第１の標識および第２の標識の比によって決定される。２つの標識からのシグナルの比における差異（例えば、試験回収物における遺伝子増幅物による）が、検出されそしてこの比は、ＫＣＮＢ遺伝子コピー数の測定を提供する。
【０１１１】
本発明の方法に用いる使用に適するハイブリダイゼーションプロトコルは、例えば、Ａｌｂｅｒｔｓｏｎ（１９８４）ＥＭＢＯ Ｊ．３：１２２７−１２３４；Ｐｉｎｋｅｌ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：９１３８−９１４２；ＥＰＯ Ｐｕｂ．Ｎｏ．４３０，４０２；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３３巻：Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｃｈｏｏら編，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ（１９９４）などに記載される。
【０１１２】
別の実施形態において、増幅に基づくアッセイ（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ ａｓｓａｙｓ）は、ＫＣＮＢ発現を検出するためかまたはＫＣＮＢ遺伝子のコピー数を測定するために使用される。このようなアッセイにおいて、ＫＣＮＢヌクレオチド配列が、増幅反応（例えば、ＰＣＲ）においてテンプレートとして役立つサンプルに存在する。定量的増幅において、増幅生成物の量は、元のサンプルにおけるテンプレートの量に比例する。適切なコントロールとの比較は、サンプルにおけるＫＣＮＢポリヌクレオチドのレベルの測定を提供する。定量的増幅の方法は、当業者に周知である。定量的ＰＣＲに関して詳細なプロトコルは、例えば、Ｉｎｎｉｓら，（１９９０）ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．において提供される。ＫＣＮＢに関する核酸配列（例えば、配列番号２または配列番号５を参照のこと）は、慣用的にプライマーを選択して、遺伝子の任意の部分を増幅することを当業者にとって十分に可能にする。
【０１１３】
いくつかの実施形態において、ＴａｑＭａｎに基づくアッセイは、ＫＣＮＢポリヌクレオチドを数量化するために使用される。ＴａｑＭａｎに基づくアッセイは、５’蛍光色素および３’クエンチング薬剤を含む蛍光発生的オリゴヌクレオチドプローブを使用する。プローブは、ＰＣＲ産物とハイブリダイゼーションするが、３’末端におけるブロッキング薬剤のせいでそれ自身は伸長できない。ＰＣＲ産物が、続くサイクルにおいて増幅される場合、ポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性（例えば、ＡｍｐｌｉＴａｑ）は、ＴａｑＭａｎプローブの開裂を生じる。この開裂は、５’蛍光色素および３’クエンチング薬剤を分離し、それによって増幅の機能における蛍光の増大を生じる（例えば、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、例えば、ｗｗｗ２．ｐｅｒｋｉｎ−ｅｌｍｅｒ．ｃｏｍを参照のこと）。
【０１１４】
他の適切な増幅方法として以下が挙げられるがこれらに限定されない：リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（ＷｕおよびＷａｌｌａｃｅ（１９８９） Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４：５６０，Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０７７，およびＢａｒｒｉｎｇｅｒら，（１９９０）Ｇｅｎｅ ８９：１１７を参照のこと），転写物増幅（Ｋｗｏｈら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１１７３），自己持続性配列複製（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）（Ｇｕａｔｅｌｌｉら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１８７４）、ドットＰＣＲおよびリンカーアダプターＰＣＲなど。
【０１１５】
（Ｃ．原核生物および真核生物における発現）
クローンされた遺伝子または核酸（例えば、ＫＣＮＢポリペプチドをコードするｃＤＮＡ）の高発現レベルを得るために、ＫＣＮＢ配列は、典型的に強力なプロモーターを含む発現ベクターにサブクローニングして、転写物、転写物／翻訳ターミネーターおよびタンパク質をコードする核酸である場合、翻訳開始のためのリボソーム結合部位を指向する。適切な細菌性プロモーターは当該分野で周知であり、そしてＳａｍｂｒｏｏｋらおよびＡｕｓｕｂｅｌらに記載される。ＫＣＮＢタンパク質を発現するための細菌性発現系は、利用可能である（例えば、Ｅ． ｃｏｌｉ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．，およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ（Ｐａｌｖａら，Ｇｅｎｅ ２２：２２９−２３５（１９８３）；Ｍｏｓｂａｃｈら，Ｎａｔｕｒｅ ３０２：５４３−５４５（１９８３））。このような発現系のためのキットは、市販されている。哺乳動物細胞、酵母および昆虫細胞のための真核生物発現系は、当該分野で周知であり、そしてまた市販されている。１つの実施形態において、真核生物発現ベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ベクターまたはレトロウイルスベクターである。
【０１１６】
治療学的適応に関して、ＫＣＮＢ核酸は、ウイルスベクターを用いた感染、リソソームに基づく方法、微粒銃加速（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ ｐａｒｔｉｃｌｅ ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｏｎ）（遺伝子銃）および裸のＤＮＡインジェクションが挙げられるがこれらに限定されない多くの方法のいずれかを使用して、インビトロ、インビボまたはエキソビボにおいて細胞に導入される。このような治療的に有用な核酸としては、全長ＫＣＮＢに対するコード配列、ＫＣＮＢフラグメント、ドメイン、誘導体または改変体に対するコード配列、ＫＣＮＢアンチセンス配列およびＫＣＮＢリボザイムが挙げられるがこれらに限定されない。典型的に、このような配列は、プロモーターに作動可能に結合されるが、多くの適用において、核酸は、それ自身直接的に治療学的に効果がある細胞に投与される（例えば、特定のアンチセンスまたはリボザイム分子）。
【０１１７】
異種核酸の発現を指向するために使用されるプロモーターは、特定の適用に依存する。このプロモーターは、必要に応じて、異種転写開始部位は、天然に位置する転写開始部位からなので異種転写開始部位からおよそ同じ距離に位置付けられる。しかし、当該分野で公知のように、この距離におけるいくつかの改変体は、プロモーターの機能の欠損をせずに適応され得る。
【０１１８】
プロモーターに加えて、典型的に、発現ベクターは、宿主細胞においてＫＣＮＢ−コード核酸の発現のために必要なすべてのさらなるエレメントを含む転写ユニットまたは発現カセットを含む。従って、典型的な発現カセットは、ＫＣＮＢポリペプチドをコードする核酸配列に作動可能に結合したプロモーター、および転写物の有効なポリアデニル化、リボソーム結合部位および転写終結に必要なシグナルを含む。ＫＣＮＢポリペプチドをコードする核酸配列は、開裂可能なシグナルペプチド配列に結合されて、トランスフェクトされた細胞によってコードされるタンパク質の分泌を促進し得る。このようなシグナルペプチドとしては、特に、組織プラスミノゲンアクチベーター由来のシグナルペプチド、インスリンおよび神経増殖因子およびＨｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓの若年性ホルモンエステラーゼを含む。カセットのさらなるエレメントとしては、エンハンサーおよびゲノムＤＮＡが、構造遺伝子として使用される場合、機能性スプライスドナーおよび受容体部位を有するイントロンが挙げられる。
【０１１９】
プロモーター配列に加えて、発現カセットはまた、構造遺伝子の下流の転写終結領域を含み、十分な終結を提供する。この終結領域は、プロモーター配列として同じ遺伝子から入手され得るか、または異なる遺伝子から入手され得る。
【０１２０】
細胞に遺伝的情報を輸送するために使用される特定の発現ベクターは、特に重要ではない。真核生物細胞または原核生物細胞における発現に使用される従来のベクターのいずれかが使用され得る。標準的な細菌性発現ベクターとしては、プラスミド（例えば、ｐＢＲ３２２に基づくプラスミド、ｐＳＫＦ、ｐＥＴ２３Ｄ）および融合発現系（例えば、ＧＳＴおよびＬａｃＺ）が挙げられる。エピトープタグはまた、組換えタンパク質に加えられて、単離物の簡便な方法（例えば、多くが当業者に周知である、ｃ−ｍｙｃ、ＨＡ−タグ、６−Ｈｉｓ タグ、マルトース結合タンパク質、ＶＳＶ−Ｇタグ、抗ＤＹＫＤＤＤＤＫタグまたは任意のこのようなタグ）を提供し得る。
【０１２１】
真核生物ウイルス由来の調節エレメントを含む発現ベクターは、代表的に、真核生物発現ベクター（例えば、ＳＶ４０ベクター、パピローマウイルスベクター、およびエプスタイン−バーウイルス由来のベクター）において使用される。他の例示的な真核生物ベクターとしては、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ^＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ^＋、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥ、およびＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳腺癌ウイルスプロモーター、ラウス肉腫プロモーター、ポリへドリンプロモーター、または真核生物細胞中の発現のために効果的であると示される他のプロモーターの指向下で、タンパク質の発現を可能にする他の任意のベクターが挙げられる。
【０１２２】
いくつかの発現系は、遺伝子増幅を提供するマーカー（例えば、ネオマイシン、チミジンキナーゼ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、およびジヒドロ葉酸レダクターゼ）を有する。あるいは、ポリヘドリンプロモーターまたは他の強力なバキュロウイルスプロモーターの指向下で、ＫＣＮＢポリペプチドをコードする配列を用いる、遺伝子増幅に関与しない高収量発現系（例えば、昆虫細胞中のバキュロウイルスを使用する）がまた、適切である。
【０１２３】
発現ベクターに代表的に含まれるエレメントはまた、Ｅ．ｃｏｌｉ中で機能するレプリコン、組換えプラスミドを保有する細菌の選択を可能にする抗生物質の耐性をコードする遺伝子、および真核生物配列の挿入を可能にするプラスミドの非必須領域中の独特の制限部位を含む。選択された特定の抗生物質耐性遺伝子は、重要ではなく、当該分野で公知の任意の多数の耐性遺伝子が適切である。原核生物配列は、必要な場合、それらが真核生物細胞中のＤＮＡの複製と干渉しないように、必要に応じて、選択される。
【０１２４】
標準的なトランスフェクション方法を使用して、大量のＫＣＮＢタンパク質（次いで、標準的な技術を使用して精製される）を発現する細菌細胞株、哺乳動物細胞株または昆虫細胞株を生成する（例えば、Ｃｏｌｌｅｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１７６１９−１７６２２（１９８９）；Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｋｏｇｙ、第１８２巻（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ編、１９９０年）を参照のこと）。真核生物細胞および原核生物細胞の形質転換は、標準的な技術に従って行なわれる（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｊ．Ｂａｃｔ．１３２：３４９−３５１（１９７７）；Ｃｌａｒｋ−Ｃｕｒｔｉｓｓ＆Ｃｕｒｔｉｓｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １０１：３４７−３６２（Ｗｕら編、１９８３））。
【０１２５】
宿主細胞中に外来ヌクレオチド配列を導入するための周知の手順のいずれかを使用し得る。これらとしては、以下を含む：Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ）のような試薬の使用、リポソーム、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、微小注入、プラスミドベクター、ウイルスベクター、微粒子銃粒子高速化（遺伝子銃）、または、宿主細胞中にクローニングされたゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡまたは他の外来遺伝的物質を導入するための他の周知の方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出）のいずれか。使用される特定の遺伝子操作手順は、ＫＣＮＢ遺伝子を発現し得る宿主細胞中に少なくとも１つの遺伝子を首尾良く導入し得ることのみが必要である。
【０１２６】
発現ベクターが細胞に導入された後、トランスフェクトされた細胞は、ＫＣＮＢポリペプチドの発現を助ける条件下で培養され、このＫＣＮＢポリペプチドは、以下に同定された標準技術を使用して培養から回収される。原核生物または真核生物を培養する方法は周知であり、そして、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｓａｍｂｒｏｏｋらにおいて、およびＦｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ，第３版、（１９９３），Ａ Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎにおいて、教示される。
【０１２７】
（ＩＶ．ＫＣＮＢポリペプチドの精製）
天然に存在するＫＣＮＢポリペプチドまたは組換えＫＣＮＢポリペプチドのいずれかは、機能的アッセイ、結合アッセイ、診断アッセイ、および他の適用における使用のために精製され得る。天然に存在するＫＣＮＢポリペプチドは、例えば、血液、リンパ性組織、またはＫＣＮＢホモログの任意の他の供給源のような哺乳動物組織から、精製される。組換えＫＣＮＢポリペプチドは、任意の適切な細菌発現系または真核生物発現系（例えば、ＣＨＯ細胞または昆虫細胞）から精製される。
【０１２８】
ＫＣＮＢタンパク質は、硫酸アンモニウムのような物質を用いる選択的な精製；カラムクロマトグラフィー、免疫精製方法、およびその他を含むがこれらに限定されない、標準的な技術によって、実質的に純粋まで精製され得る（例えば、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（１９８２）；米国特許第４，６７３，７４１号；Ａｕｓｕｂｅｌら、前出；およびＳａｍｂｒｏｏｋら、前出を参照のこと）。
【０１２９】
組換えＫＣＮＢポリペプチドが精製される場合に、多数の手順が利用され得る。例えば、確立された分子性吸着特性を有するタンパク質は、ＫＣＮＢポリペプチドに可逆的に融合され得る。適切なリガンドを使用して、ＫＣＮＢポリペプチドは、精製カラムに選択的に吸着され得、次いで比較的純粋な形態で、カラムから遊離され得る。次いで、融合されたタンパク質は、酵素学的活性によって、取り出される。ＫＣＮＢタンパク質はまた、免疫親和性カラムを使用して精製され得る。
【０１３０】
（Ａ．組換えＫＣＮＢタンパク質の精製）
組換えタンパク質は、代表的にプロモーター誘導後（しかし発現は構成的であり得る）、形質転換した細菌細胞またはＣＨＯ細胞のような真核生物細胞または昆虫細胞によって大量に発現される。ＩＰＴＧを用いるプロモーター誘導は、誘導的プロモーター系の１つの例である。細胞は、当該分野で標準的な手順に従って増殖される。新鮮な細胞または凍結した細胞が、タンパク質の単離に使用される。
【０１３１】
細菌において発現されるタンパク質は、不溶性凝集物（「封入体」）由来であり得る。いくつかのプロトコルが、ＫＣＮＢ封入体の精製のために適切である。例えば、封入体の精製は、代表的に、細菌細胞の破壊（例えば、５０ｍＭ ＴＲＩＳ／ＨＣＬ ｐＨ７．５、５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ
ＤＴＴ、０．１ｍＭ ＡＴＰ、および１ｍＭ ＰＭＳＦの緩衝液中でのインキュベーション）による封入体の抽出、分離および／または精製を含む。細胞懸濁液は、Ｐｏｌｙｔｒｏｎ（Ｂｒｉｎｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用してホモジナイズしたか、または氷上で超音波処理した、Ｆｒｅｎｃｈ Ｐｒｅｓｓを通して、２〜３回の通過を使用することによって溶解され得る。細菌を溶解させる代替的な方法は、当業者に明らかである（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出；Ａｕｓｕｂｅｌら、前出を参照のこと）。
【０１３２】
必要であれば、封入体は、可溶化され、そして溶解した細胞懸濁液は、代表的に遠心分離して、不必要な不溶性物質を除去する。封入体を形成するタンパク質は、適合性の緩衝液を用いる希釈または透析によって再生され得る。適切な溶媒としては、尿素（約４Ｍ〜約８Ｍ）、ホルムアミド（少なくとも約８０％、容量／容量基準）、およびグアニジンハイドロクロライド（約４Ｍ〜約８Ｍ）を含むがこれらに限定されない。凝集体形成タンパク質を可溶化し得るいくつかの溶媒（例えば、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）および７０％ギ酸）は、免疫原性および／または活性の欠如が伴う、タンパク質の不可逆的変性の可能性に起因して、この手順における使用のために不適切である。グアニジンハイドロクロライドおよび同様の薬剤が、変性剤であるが、この変性は不可逆的なものではなく、再生は、変性剤の除去（例えば、透析による）または変性剤の希釈の際に発生し、免疫学的および／または生物学的活性タンパク質の再形成を可能にし得る。他の適切な緩衝液は、当業者に公知である。ＫＣＮＢポリペプチドは、標準的な分離技術（例えば、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース樹脂を用いる）によって他の細菌タンパク質から分離される。
【０１３３】
あるいは、細菌ペリプラズムからＫＣＮＢポリペプチドを精製することが可能である。細菌の溶解後、ＫＣＮＢタンパク質が細菌のペリプラズムに輸送される場合、細菌のペリプラズム画分は、当業者に公知の他の方法に加えて、冷浸透圧ショックによって単離され得る。ペリプラズムから組換えタンパク質を単離するために、細菌細胞を遠心分離して、ペレットを形成する。このペレットを、２０％スクロースを含む緩衝液中に再懸濁する。細胞を溶解するために、細菌を遠心分離し、そして、ペレットを、氷冷５ｍＭ ＭｇＳＯ_４中で再懸濁し、そして、約１０分間、氷浴中に維持する。細胞懸濁液を遠心分離し、そして上清をデカントし、取っておく。上清中に存在する組換えタンパク質は、当業者に周知の標準的な分離技術によって、宿主細胞から分離され得る。
【０１３４】
（Ｂ．ＫＣＮＢポリペプチドを精製するための標準的なタンパク質分離技術）
しばしば最初の工程として、特にタンパク質混合物が複合体である場合、最初の塩画分は、目的の組換えタンパク質から、多数の不必要な宿主細胞タンパク質（または細胞培養培地に由来するタンパク質）を分離し得る。好ましい塩は、硫酸アンモニウムである。硫酸アンモニウムは、タンパク質混合物中の水の量を効果的に減少させることによって、タンパク質を沈殿させる。次いで、タンパク質は、それらの可溶性に基づいて、沈殿する。タンパク質が、より疎水性であればあるほど、タンパク質は、より低い硫酸アンモニウム濃度で、沈殿するようである。代表的なプロトコルは、得られた硫酸アンモニウム濃度が、２０〜３０％の間の濃度であるように、飽和硫酸アンモニウムをタンパク質溶液に添加する工程を包含する。この濃度は、最も疎水性のタンパク質を沈殿させる。次いで、この沈殿を捨て（目的のタンパク質が、疎水性でない場合）、そして、硫酸アンモニウムを、目的のタンパク質を沈殿させることが公知の濃度まで上清に添加する。次いで、この沈殿を緩衝液中で可溶化し、そして必要に応じて、過剰の塩を、透析またはダイアフィルトレーションのいずれかを通して除去する。タンパク質の可溶性に依存する他の方法（例えば、冷エタノール沈殿）は、当業者に周知であり、そして、これらを使用して、複合体タンパク質混合物を分画する。
【０１３５】
ＫＣＮＢタンパク質の分子量を使用して、異なる孔の大きさの膜（例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ膜）を通る限外ろ過を使用して、より大きい大きさおよびより小さい大きさのタンパク質からそれを単離する。第１の工程として、タンパク質混合物を、目的のタンパク質の分子量よりも小さい分子量のカットオフを有する孔の大きさを有する膜を介して、限外ろ過する。次いで、限外ろ過の保持液（ｒｅｔｅｎａｔｅ）を、目的のタンパク質の分子量よりも大きい分子カットオフを用いて膜に対して限外ろ過する。組換えタンパク質は、膜をろ液へと通過する。次いで、ろ液を以下に記載されるように、色層分析し得る。
【０１３６】
ＢＣＮＢタンパク質はまた、それらの大きさ、正味の表面電荷、疎水性、および異種分子についての親和性に基づいて、他のタンパク質から分離され得る。さらに、タンパク質に対して惹起される抗体は、カラムマトリクスに結合体化され得、そして、タンパク質は免疫精製される。これらの方法の全ては当該分野で周知である。クロマトグラフィー技術が、任意の規模で、そして多数の異なる製造業者（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｈｅｃｈ）からの機器を使用して、行なわれ得ることが当業者に明らかである。
【０１３７】
（Ｖ．ＫＣＮＢファミリーメンバーに対する抗体）
本発明の多数の実施形態において、ＫＣＮＢポリペプチドに特異的に結合する抗体が使用される。このような抗体は、ＫＣＮＢ活性の調節について、ならびにＫＣＮＢ、およびＫＣＮＢの改変体、誘導体、フラグメントなどを検出するための免疫アッセイについて、を含む多数の適用を有する。免疫アッセイを使用して、ＫＣＮＢポリペプチドを定性的または定量的に分析し得る。適用可能な技術の一般的な概要は、Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ，Ａｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８８）において見出され得る。いくつかの実施形態において、抗体を使用して、診断および／または予後適用について、ＫｃＮＢを検出する。
【０１３８】
ＫＣＮＢに対する抗体はまた、抗体またはそのサブフラグメントが分子に連結されているキメラ抗体を含み得、この分子において、（ａ）定常領域またはその部分が、変更され、置換され、または交換され、その結果、抗原結合部位（可変領域）が、異なるかまたは変更されたクラス、エフェクター機能および／もしくは種、の定常領域、あるいはキメラ抗体に新しい特性を与える全体的に異なる分子（例えば、酵素、毒素、ホルモン、増殖因子、薬物など）に連結されている；または（ｂ）可変領域またはその一部が、異なるかまたは変更された抗原特異性を有する可変領域と変更され、置換されたかまたは交換されている。このような抗原は、例えば、ＫＣＮＢ発現細胞に対する毒素のような部位を標的化するための標的化試薬として、有用であり得る。
【０１３９】
ＫＣＮＢポリペプチドと特異的に反応するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を産生する方法は、当該分野で公知である（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９１）；Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ、前出；Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（第２版、１９８６）；Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７（１９７５）を参照のこと）。このような技術としては、ファージまたは類似のベクター中の組換え抗体のライブラリーからの抗体の単離による抗体調製、ならびにウサギまたはマウスを免疫することによるポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の調製を含む（例えば、Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１（１９８９）；Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６（１９８９）を参照のこと）。
【０１４０】
多数のＫＣＮＢ含有免疫源を使用して、ＫＣＮＢポリペプチドと特異的に反応する抗体を産生し得る。例えば、組換えＫＣＮＢタンパク質またはその抗原性フラグメントは、本明細書中に記載されるように単離される。組換えタンパク質は、上記のように真核生物細胞または原核生物細胞中で発現され得、そして、一般に上記のように精製される。組換えタンパク質は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の産生のための好ましい免疫源である。あるいは、本明細書中に開示された配列由来でありかつキャリアタンパク質に結合体化された合成ペプチドが、免疫源として使用され得る。天然に存在するタンパク質はまた、純粋または不純な形態のいずれかで使用され得る。次いで、産物を、抗体を産生し得る動物に注射する。モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のいずれかが、タンパク質を測定するための免疫アッセイにおける引き続く使用のために、産生され得る。
【０１４１】
ポリクローナル抗体を産生するための方法は、当業者に公知である。マウス（例えば、ＢＡＬＢ／Ｃマウス）またはウサギの近交系系統は、標準的なアジュバント（例えば、フロイトアジュバント）および標準免疫プロトコルを使用して、タンパク質を用いて免疫する。免疫原調製物に対する動物の免疫応答は、試験出血を行なうことおよびＫＣＮＢポリペプチドに対する応答性の力価を決定することによって、モニターされる。免疫原に対する抗体の適切に高い力価が得られる場合、血液は、動物から回収され、そして、抗血清が調製される。タンパク質に反応性の抗体を濃縮するための抗血清のさらなる画分は、所望の場合に行なわれ得る（Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ、前出を参照のこと）。
【０１４２】
モノクローナル抗体は、当業者に知られた種々の技術によって得られ得る。手短にいうと、所望の抗原を用いて免疫した動物由来の脾臓細胞を、一般に骨髄腫細胞を用いる融合によって、不死化する（Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９（１９７６）を参照のこと）。不死化のための代替的な方法は、エプスタイン−バーウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ Ｖｉｒｕｓ）、オンコジーン、もしくはレトロウイルスを用いるトランスフェクション、または当該分野で周知の他の方法を含む。単一の不死化細胞から生じるコロニーを、抗原について所望の特異性および親和性の抗体の産生についてスクリーニングされ、そしてこのような細胞によって産生されるモノクローナル抗体の収量は、種々の技術（脊椎動物宿主の腹膜管腔への注射を含む）によって強化され得る。あるいは、Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１（１９８９）によって概略される一般的なプロトコルに従って、ヒトＢ細胞由来のＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって、モノクローナル抗体またはその結合フラグメントをコードするＤＮＡ配列を単離し得る。
【０１４３】
モノクローナル抗体およびポリクローナル血清は、イムノアッセイ（例えば、固体支持体に固定された免疫原を用いた固相イムノアッセイ）において、免疫原タンパク質に対して収集され、滴定される。代表的には、１０^４以上の力価を有するポリクローナル抗血清は、競合結合イムノアッセイを用いて、非ＫＣＮＢタンパク質に対してまたはさらに他の生物由来の関連するタンパク質に対してその交差反応性に関して選択され、試験される。特異的なポリクローナル抗血清およびモノクローナル抗体は、通常、少なくとも約０．１ｍＭのＫ_ｄ、より通常では少なくとも約１μＭのＫ_ｄ、必要に応じて少なくとも約０．１μＭまたはそれより良好なＫ_ｄ、そして必要に応じて０．０１μＭまたはそれより良好なＫ_ｄで結合する。
【０１４４】
（Ａ．免疫学的結合アッセイ）
一旦ＫＣＮＢ特異的抗体が利用可能になると、個々のＫＣＮＢタンパク質は、種々のイムノアッセイ方法によって検出され得る。一般的なイムノアッセイの概説に関しては、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌｕｍｅ ３７（Ａｓａｉ編、１９９３）；Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｓｔｉｔｅｓ ＆ Ｔｅｒｒ編、第７版、１９９１）もまた参照のこと。さらに、本発明のイムノアッセイは、任意のいくつかの形態で実行され得、これらの形態は、Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（Ｍａｇｇｉｏ編、１９８０）；およびＨａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ（前出）に広範に概説される。免疫学的結合アッセイ（すなわちイムノアッセイ）は、代表的に、選り抜きのタンパク質または抗原（この場合、ＫＣＮＢタンパク質またはその抗原性部分配列）に特異的に結合する抗体を使用する。抗体（例えば、抗ＫＣＮＢ）は、当業者に周知の多数の手段および上記のような多数の手段のうちのいずれかによって作製され得る。
【０１４５】
イムノアッセイはまた、抗体および抗原によって形成された複合体に特異的に結合して標識するための標識因子をしばしば使用する。この標識因子は、これ自体、抗体／抗原複合体を含む部分のうちの１つであり得る。従って、標識因子は、標識ＫＣＮＢポリペプチドまたは標識抗ＫＣＮＢ抗体であり得る。あるいは、標識因子は、抗体／ＫＣＮＢ複合体に特異的に結合する第３の部分（例えば、二次抗体）であり得る（二次抗体は、代表的に、一次抗体が由来する種の抗体に特異的である）。免疫グロブリン定常領域に特異的に結合し得る他のタンパク質（例えば、プロテインＡまたはプロテインＧ）はまた、標識因子として使用され得る。これらのタンパク質は、種々の種由来の免疫グロブリン定常領域と強い非免疫原性反応性を示す（例えば、Ｋｒｏｎｖａｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１１：１４０１−１４０６（１９７３）；Ａｋｅｒｓｔｒｏｍら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３５：２５８９−２５４２（１９８５）を参照のこと）。標識因子は、別の分子（例えば、ストレプトアビジン）が特異的に結合し得る検出部分（例えば、ビオチン）を用いて改変され得る。種々の検出可能な部分が、当業者に周知である。
【０１４６】
このアッセイを通じて、インキュベーション工程および／または洗浄工程は、試薬の各組み合わせ後に必要とされ得る。インキュベーション工程は、約５秒間〜数時間で変化し、必要に応じて約５分間〜約２４時間で変化し得る。しかし、インキュベーション時間は、アッセイ形式、抗原、溶液の容積、濃度などに依存する。通常、アッセイは、１０℃〜４０℃のような温度範囲にわたって実行されるが、周囲温度で実行され得る。
【０１４７】
（１．非競合アッセイ形式）
サンプル中のＫＣＮＢタンパク質を検出するためのイムノアッセイは、競合または非競合のいずれかであり得る。非競合イムノアッセイは、抗原量が直接測定されるアッセイである。例えば、１つの好ましい「サンドイッチ」アッセイにおいて、抗ＫＣＮＢ抗体は、この抗体が固定される固体基材に直接結合され得る。次いで、これらの固定された抗体は、試験サンプル中に存在するＫＣＮＢタンパク質を捕獲する。従って、固定されたＫＣＮＢタンパク質は次いで、標識因子（例えば、標識を保有する二次ＫＣＮＢ抗体）によって結合される。あるいは、二次抗体は、標識を欠き得るが、二次抗体は順に、この二次抗体が由来する種の抗体に特異的な標識三次抗体によって結合され得る。二次抗体または三次抗体は、代表的に、別の分子（例えば、ストレプトアビジン）が特異的に結合する検出可能な部分（例えば、ビオチン）によって改変されて、検出可能な部分を提供する。
【０１４８】
（２．競合アッセイ形式）
競合アッセイにおいて、サンプル中に存在するＫＣＮＢタンパク質の量は、サンプル中に存在する未知のＫＣＮＢタンパク質によって抗ＫＣＮＢ抗体から置換された（競合された）、既知の添加された（外因性）ＫＣＮＢタンパク質の量を測定することによって間接的に測定される。１つの競合アッセイにおいて、既知量のＫＣＮＢタンパク質は、サンプルに添加され、次いでこのサンプルは、ＫＣＮＢタンパク質に特異的に結合する抗体と接触される。抗体に結合した外因性ＫＣＮＢタンパク質の量は、サンプル中に存在するＫＣＮＢタンパク質濃度に逆比例する。特に好ましい実施形態において、抗体は固体基材に固定される。抗体に結合したＫＣＮＢタンパク質の量は、ＫＣＮＢ／抗体複合体に存在するＫＣＮＢタンパク質の量を測定することによってか、あるいは残存する複合体化していないタンパク質の量を測定することによってかのいずれかで決定され得る。ＫＣＮＢタンパク質量は、標識ＫＣＮＢ分子を提供することによって検出され得る。
【０１４９】
ハプテン阻害アッセイは、別の好ましい競合アッセイである。このアッセイにおいて、既知のＫＣＮＢタンパク質が、固体基材に固定される。既知量の抗ＫＣＮＢ抗体がサンプルに添加され、次いでこのサンプルが固定されたＫＣＮＢと接触される。既知の固定ＫＣＮＢタンパク質に結合した抗ＫＣＮＢ抗体の量は、サンプル中に存在するＫＣＮＢタンパク質量に逆比例する。また、固定された抗体の量は、固定された抗体の分画または溶液中に残存する抗体の分画のいずれかを検出することによって検出され得る。検出は、直接的（抗体が標識される場合）であってもよく、または間接的（上記のように抗体に特異的に結合する標識部分の引続く添加による）であってもよい。
【０１５０】
（３．交差反応性の決定）
競合結合形式におけるイムノアッセイはまた、交差反応性の決定に関して使用され得る。例えば、配列番号２によって少なくとも部分的にコードされるタンパク質は、固体支持体に固定され得る。タンパク質（例えば、ＫＣＮＢタンパク質およびホモログ）は、固定された抗原に対する抗血清の結合を競合するアッセイに添加される。固定されたタンパク質に対する抗血清の結合に競合する添加されたタンパク質の能力は、配列番号２によってコードされるＫＣＮＢポリペプチドがそれ自体を競合する能力に対して比較される。上記タンパク質に関する交差反応性の割合は、標準的な計算を用いて計算される。上記の添加されたタンパク質の各々と１０％未満の交差反応性を有する抗血清が選択され、プールされる。交差反応抗体は、必要に応じて、添加された考慮されるタンパク質（例えば、離れている関連ホモログ）との免疫吸収によってプールされた抗血清から取り除かれる。
【０１５１】
免疫吸収されプールされた抗血清は次いで、免疫原タンパク質（すなわち、配列番号２によってコードされるＫＣＮＢタンパク質）に対して二次タンパク質（おそらく、ＫＣＮＢタンパク質の対立遺伝子改変体または多型改変体であると考えられる）を競合するために上記のような競合結合イムノアッセイに使用される。この比較をするために、２つのタンパク質を、広範な濃度で各々アッセイし、そして抗血清が固定されたタンパク質に結合することを５０％阻害するのに必要とされる各タンパク質の量が、決定される。結合を５０％阻害するのに必要とされる二次タンパク質の量が、結合を５０％阻害するのに必要とされる配列番号２によってコードされるタンパク質の量の１０倍未満である場合、この二次タンパク質は、ＫＣＮＢ免疫原に対して作製されたポリクローナル抗体に特異的に結合するといわれる。
【０１５２】
特定の種由来のＫＣＮＢタンパク質に特異的に結合するポリクローナル抗体は、ＫＣＮＢホモログを用いて交差反応性抗体を差し引きすることによって作製され得る。例えば、ヒトＫＣＮＢに特異的な抗体は、マウスＫＣＮＢと交差反応性である抗体を差し引きすることによって作製され得る。類似の様式において、特定のＫＣＮＢタンパク質に特異的な抗体は、複数のＫＣＮＢ遺伝子を用いて生物中で作製され得る。
【０１５３】
（４．他のアッセイ形式）
ウエスタンブロット（イムノブロット）分析を使用して、サンプル中のＫＣＮＢタンパク質の存在を検出および定量する。この技術は、一般的に、分子量に基づくゲル電気泳動によってサンプルタンパク質を分離する工程、分離したタンパク質を適切な固体支持体（例えば、ニトロセルロースフィルター、ナイロンフィルター、または誘導体化されたナイロンフィルター）に移す工程、ならびにこのサンプルをＫＣＮＢタンパク質に特異的に結合する抗体とインキュベートする工程を含む。抗ＫＣＮＢポリクローナル抗体は、固体支持体上のＫＣＮＢポリペプチドに特異的に結合する。これらの抗体は、直接標識され得るか、あるいは抗ＫＣＮＢ抗体に特異的に結合する標識抗体（例えば、標識ヒツジ抗マウス抗体）を用いて引き続いて検出され得る。
【０１５４】
他のアッセイ形式は、リポソームイムノアッセイ（ＬＩＡ）を含み、このアッセイは、特定の分子（例えば、抗体）に結合し、カプセル化された試薬またはマーカーを放出するように設計されたリポソームを使用する。この放出された化学物質は次いで、標準的な技術に従って検出される（Ｍｏｎｒｏｅら、Ａｍｅｒ．Ｃｌｉｎ．Ｐｒｏｄ．Ｒｅｖ．５：３４−４１（１９８６）を参照のこと）。
【０１５５】
当業者は、イムノアッセイにおいて非特異的結合を最小化することがしばしば望ましいことを認識する。詳細には、このアッセイが固体基材上に固定された抗原または抗体を含む場合、この基材に対する非特異的結合の量を最小化することが望ましい。このような非特異的結合を減少する手段は、当業者に周知である。代表的には、この技術は、この基材を蛋白様の組成物でコーティングすることを含む。詳細には、タンパク質組成物（例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、脱脂粉乳、およびゼラチン）が、広範に使用され、粉乳が最も好ましい。
【０１５６】
（５．標識）
このアッセイに使用される特定の標識または検出可能な基は、これらがこのアッセイに使用する抗体の特異的結合を有意に妨げない限り、本発明の重要な局面ではない。検出可能な基は、検出可能な物理特性または化学特性を有する任意の物質であり得る。このような検出可能な標識は、イムノアッセイの分野で非常に開発されており、一般的に、このような方法に有用な任意の標識のほとんどが本発明に適用され得る。従って、標識は、分光学的手段、光化学手段、生化学手段、免疫化学手段、電気的手段、光学手段または化学手段によって検出可能な任意の組成物である。本発明において有用な標識としては、磁気ビーズ（例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ^ＴＭ）、蛍光色素（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、Ｔｅｘａｓレッド、ローダミンなど）、放射性標識（例えば、^３Ｈ、^１２５Ｉ、^３５Ｓ、^１４Ｃ、または^３２Ｐ）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼおよびＥＬＩＳＡに一般的に使用される他のもの）、ならびに比色標識（例えば、コロイド金または有色ガラスまたはプラスチックビーズ（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）が挙げられる。
【０１５７】
標識は、当該分野で周知の方法に従うアッセイの所望の成分に直接または間接的に結合され得る。上記のように、広範な種々の標識が使用され得、標識の選択は必要とされる感度、化合物との結合体化の容易さ、必要物の安定性、利用可能な装置、および廃棄規定に依存する。
【０１５８】
非放射性標識が、しばしば間接的な手段によって付着される。一般的に、リガンド分子（例えば、ビオチン）は、分子に共有結合される。次いでリガンドは、別の分子（例えば、ストレプトアビジン）分子（これは、本来検出可能であるか、またはシグナルシステム（例えば、検出可能な酵素、蛍光化合物、または化学発光化合物）に共有結合するかのいずれかである）に結合する。リガンドおよびその標的は、ＫＣＮＢタンパク質を認識する抗体、または抗ＫＣＮＢを認識する二次抗体との任意の適切な組み合わせで使用され得る。
【０１５９】
分子または、例えば、酵素またはフルオロホア（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）との結合体化によってシグナル生成化合物に直接結合体化され得る。標識として興味のある酵素は、主に、ヒドロラーゼ（特にホスファターゼ、エステラーゼおよびグリコシダーゼ）、またはオキシダーゼ（特にペルオキシダーゼ）である。蛍光化合物としては、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロンなどが挙げられる。化学発光化合物としては、ルシフェリン、および２，３−ジヒドロフタラジンジオン（例えば、ルミノール）が挙げられる。使用され得る種々の標識またはシグナル生成システムの概説に関しては、米国特許第４，３９１，９０４号を参照のこと。
【０１６０】
標識を検出する手段は、当業者に周知である。従って、例えば、標識が放射性標識である場合、検出のための手段としては、シンチレーションカウンターまたはオートラジオグラフィーのような写真フィルムが挙げられる。標識が蛍光標識である場合、この標識は、蛍光色素を適切な波長の光で励起し、生じる蛍光を検出することによって検出され得る。蛍光は、写真フィルムによって、電子検出器（例えば、電荷結合素子（ＣＣＤ）または光電子増倍器など）の使用によって、視覚的に検出され得る。同様に、酵素標識が、酵素に対する適切な基質を提供し、生じる反応生成物を検出することによって検出され得る。最後に、簡単な比色標識が、この標識と関連する色を観察することによって簡単に検出され得る。従って、種々のディップスティックアッセイにおいて、結合体化された金はしばしばピンクのようであり、一方、種々の結合体化されたビーズはビーズの色のようである。
【０１６１】
いくつかのアッセイ形式は標識化合物の使用を必要としない。例えば、凝集アッセイが使用されて標的抗体の存在を検出し得る。この場合、抗原コーティングされた粒子は、標的抗体を含むサンプルによって凝集される。この形式において、これらの成分は、標識される必要はなく、そして標的抗体の存在は、簡単な視覚検査によって検出される。
【０１６２】
（ＶＩ．変更されたＫＣＮＢ活性および発現と関連する疾患の診断）
ＫＣＮＢ核酸、タンパク質、および／または抗体は、診断的または予後的に使用されて、正常なものに対して変更されたＫＣＮＢ活性または発現と関連する疾患または状態を検出し得る。このような疾患は、減少したまたは増加したＫＣＮＢ活性または発現のいずれかと関連し得る。ＫＣＮＢ活性または発現は、例えば、ＫＣＮＢタンパク質、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＫＣＮＢに対する抗体を含む種々の試薬のうちのいずれかを用いて検出され得る。活性における変化は、例えば、ＫＣＮＢ遺伝子のコピー数、ＫＣＮＢ遺伝子配列中の変異、転写の変更、翻訳、ＲＮＡ、タンパク質レベル、タンパク質安定性、またはタンパク質活性における変更を示し得る。従って、多数のアッセイのうちのいずれか（この例は、本明細書中に提供される）を使用して、ＫＣＮＢ核酸またはポリペプチドを検出し得る。
【０１６３】
従って、本配列は、患者において本明細書中に記載される疾患または状態のいずれかを処置するために使用され得、ここで、ＫＣＮＢ発現レベルまたはＫＣＮＢ活性レベルにおける変更、またはＫＣＮＢポリヌクレオチドまたはポリペプチドにおける有害な変異の検出は、これらの疾患または状態の存在またはその可能性を示す。従って、本発明は、増加または低下したＫＣＮＢ活性と関連する疾患またはこの疾患の可能性を検出または診断方法を提供する。これらとしては、癌（以下にさらに議論する）、癲癇、アルツハイマー病、パーキンソン病、発作、多発性硬化症、片頭痛、および精神医学的障害（鬱病、精神分裂病、双極性疾患などを含む）のような脳と関連する障害が挙げられる（例えば、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，第１２版、Ｗｉｌｓｏｎら、編、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｉｎｃ．を参照のこと）。他の疾患としては、心臓に関連する疾患（例えば、不整脈、心不全、および種々の血管疾患（例えば、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１２版、Ｗｉｌｓｏｎら、編、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｉｎｃ．を参照のこと））、および膵臓に関連する疾患（例えば、膵炎、糖尿病、膵臓中のホルモン（例えば、グルカゴン）分泌の他の異常、ソマトスタチン分泌（例えば、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１２版、Ｗｉｌｓｏｎら、編、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｉｎｃ．を参照のこと））が挙げられる。
【０１６４】
特定の実施形態において、癌の診断、ＫＣＮＢポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはタンパク質レベルの活性が定量される。このような実施形態において、ＫＣＮＢ関連障害を有するかその障害を有する疑いのある患者由来の生物学的サンプルにおけるＫＣＮＢレベルと、正常なコントロールレベルとの間の差異が、好ましくは、統計的に重要である。代表的に、診断的プレゼンスは、コントロールサンプル（例えば、健康な被験体または正常な組織を代表する生物学的サンプル）の期待されるレベルと比較して、生物学的サンプルにおけるＫＣＮＢポリペプチドまたはポリヌクレオチドのレベルの少なくとも約１．５、２、５、１０またはそれより大きい倍数の変化を示す。ＫＣＮＢの検出は、インビトロで（すなわち、哺乳動物から取られた生物学的サンプル内の細胞において）、またはインビボで実施され得る。「診断的プレゼンス」は、正常なコントロールサンプルにおいて期待されるレベルから変更されたＫＣＮＢの任意のレベルを示す。
【０１６５】
１つの実施形態において、ＫＣＮＢ核酸またはタンパク質は、それ自体または他の診断方法と共に、診断ツールまたは予後ツールとして使用されて、例えば、以下のような癌と関連するＫＣＮＢコピー数または発現の増加を検出し得る：乳癌または肺癌、ならびに他の癌（例えば、上皮癌（例えば、結腸直腸癌、前立腺癌、腎臓癌、胃癌、膀胱癌、卵巣癌、または胃腸管の癌））。ＫＣＮＢ核酸またはタンパク質の検出はまた、癌処置の効力をモニタするために使用され得る。例えば、抗癌処置後のＫＣＮＢタンパク質または核酸のレベルは、処置の前のレベルと比較され得、ここで、ＫＣＮＢタンパク質または核酸はまた、哺乳動物における抗癌処置の選択に影響を与えるために使用され得、ここで、例えば、ＫＣＮＢの大きな増加は、より積極的な抗癌治療の使用を示し、そして小さな増加または増加しないことは、あまり積極的でない抗癌治療の使用を示す。さらに、変化したＫＣＮＢ活性または発現を示す癌細胞を検出する能力は、例えば、インビボまたはインビトロで、経時的な疾患の進行を評価するために、患者の癌細胞の数および／または位置をモニタする際に有用であり得る。
【０１６６】
（ＶＩＩ．ＫＣＮＢ活性を調節すること）
（Ａ．ＫＣＮＢタンパク質の調節因子についてのアッセイ）
本発明の種々の実施形態において、ＫＣＮＢ活性のレベルは、インビボまたはインビトロで、多数のＫＣＮＢ調節分子（例えば、ポリペプチド、抗体、アミノ酸、ヌクレオチド、脂質、炭水化物、または任意の有機分子または無機分子）のいずれかを、細胞に投与することによって、細胞において調節され得る。
【０１６７】
ＫＣＮＢを調節し得る分子を同定するために、アッセイが実施されて、細胞におけるＫＣＮＢ活性に対する種々の候補調節因子の効果を検出する。ＫＣＮＢポリペプチドの活性は、種々のインビトロまたはインビアッセイを使用して評価されて、機能的、化学的、および物理的効果（例えば、ＫＣＮＢの他の分子への結合を測定して（例えば、放射活性結合）、ＫＣＮＢタンパク質および／またはＲＮＡレベルを測定して、またはＫＣＮＢポリペプチドの他の局面（例えば、リン酸化レベル、転写レベル、アポトーシス（プログラムされた細胞死）から細胞を保護する能力、レセプター活性またはチャネル活性など）を測定して）を決定し得る。このようなアッセイは、ＫＣＮＢタンパク質のアクチベーターおよびインヒビターの両方について試験するために使用され得る。従って、同定されたインヒビターは、例えば、多くの診断適用および治療適用のために有用である。
【０１６８】
ＫＣＮＢタンパク質のカリウムチャネル活性が、イオンフラックスの変化を測定するための種々のアッセイ（パッチクランプ技術、全細胞電流の測定、放射標識ルビジウムフラックスアッセイ、電圧感受性染料を使用する蛍光アッセイ）を使用してアッセイされ得る（例えば、Ｖｅｓｔｅｒｇａｒｒｄ−Ｂｏｇｉｎｄら，Ｊ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｂｉｏｌ．８８：６７−７５（１９８８）；Ｄａｎｉｅｌら，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｍｅｔｈ．２５：１８５−１９３（１９９１）；Ｈｏｅｖｉｎｓｋｙら． Ｊ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｂｉｏｌ．１３７：５９−７０（１９９４）を参照のこと）。例えば、ＫＣＮＢタンパク質またはそのホモログをコードする核酸は、Ｘｅｎｏｐｕｓ卵母細胞に注入され得る。次いで、ＫＣＮＢ活性が、膜極性の変化（すなわち、膜ポテンシャルの変化）を測定することによって、アッセイされ得る。電気生理学的測定を得るための好ましい手段は、パッチクランプ技術（例えば、「細胞−付着」モデル、「インサイドアウト（ｉｎｓｉｄｅ−ｏｕｔ）」モデル、および「全細胞」モデル）を使用して電流を測定することによる（例えば、Ａｃｋｅｒｍａｎら，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３６：１５７５−１５９５，１９９７を参照のこと）。全細胞電流は、標準的な方法論（例えば、Ｈａｍｉｌら，ＰＦｌｕｇｅｒｓ．Ａｒｃｈｉｖ．３９１：１８５（１９８１）に記載されるようなもの）を使用して、決定され得る。
【０１６９】
ＫＣＮＢ活性（例えば、アポトーシスからの保護）もまた、アッセイされ得る。例えば、プログラムされたＴＮＦ−α誘導細胞死から細胞を保護するＫＣＮＢの能力が、実施例４に記載される方法論を使用して測定され得る。
【０１７０】
このアッセイのＫＣＮＢタンパク質は、代表的に、組換え体であるかまたは配列番号１を有する天然に存在するポリペプチドであるか、あるいはそれらの保存的に改変された変異体である。あるいは、このアッセイのＫＣＮＢタンパク質は、真核生物由来であるかまたは配列１に対するアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一般に、アミノ酸配列同一性は、少なくとも７０％、必要に応じて、少なくとも７５％、８５％または９０％；あるいは必要に応じて、少なくとも９５％〜９８％である。必要に応じて、これらのアッセイのポリペプチドは、ＫＣＮＢタンパク質のドメイン（例えば、Ｎ末端ドメイン、Ｃ末端ドメイン、細胞外ループ、１つ以上の膜貫通ドメインなど）を含む。特定の実施形態において、ＫＣＮＢタンパク質のドメイン（例えば、Ｎ末端ドメイン、Ｃ末端ドメイン、細胞外ループ、または１つ以上の膜貫通ドメイン）が固体基材に結合し、そして例えば、結合し得る任意の分子を単離し、そして／またはそれらの活性を調節するために使用される。特定の実施形態において、ＫＣＮＢポリペプチドのドメイン（例えば、Ｎ末端ドメイン、Ｃ末端ドメイン、細胞外ループ、または１つ以上の膜貫通ドメイン）は、異種タンパク質に融合され、それによってキメラポリペプチドを形成する。このようなキメラポリペプチドは、例えば、ＫＣＮＢのモジュレーターを同定するためのアッセイにおいて有用である。
【０１７１】
潜在的なＫＣＮＢタンパク質インヒビターまたはアクチベーターで処理されるサンプルまたはアッセイは、調節の程度を試験するために、試験化合物を含まないコントロールサンプルと比較される。コントロールサンプル（アクチベーターまたはインヒビターで処理されていない）は、１００の相対ＫＣＮＢ活性値を割り当てられる。ＫＣＮＢタンパク質の阻害は、コントロールに対するＫＣＮＢ活性値が約９０％、必要に応じて約５０％、必要に応じて２５〜０％である場合に達成される。ＫＣＮＢタンパク質の活性化は、コントロールに対するＫＣＮＢ活性値が、約１１０％、必要に応じて約１５０％、２００〜５００％、または約１０００〜２０００％である場合に、達成される。
【０１７２】
これらのポリペプチドの機能に対する試験化合物の効果は、上記にパラメータのいずれかを試験することによって測定され得る。ＫＣＮＢ活性に影響する任意の適切な生理学的変化は、本発明のポリペプチドに対する試験化合物の影響をｊ評価するために使用され得る。機能的な重要性が、インタクトな細胞または動物を使用して決定される場合、細胞増殖またはｐＨ変化、細胞内の第二のメッセンジャー（例えば、Ｃａ^２＋、ＩＰ３、ｃＧＭＰ、またはｃＡＭＰ）の変化、あるいは細胞の膜ポテンシャルの変化のような種々の効果がまた測定され得る。
【０１７３】
目的のＫＣＮＢタンパク質を含む宿主細胞は、任意の相互作用をもたらすに十分な時間試験化合物と接触され、次いで遺伝子発現のレベルが測定される。このような相互作用をもたらす時間は、例えば、時間経過を行い、そして時間の関数として転写レベルを測定することによって、経験的に決定される。転写の量は、当業者に公知の、適切である任意の方法を使用して測定され得る。例えば、目的のタンパク質のｍＲＮＡ発現は、ノーザンブロットを使用してまたは免疫アッセイを使用してそれらのポリペプチド産物を検出することによって検出され得る。
【０１７４】
（Ｂ．ＫＣＮＢ相互作用化合物についてのアッセイ）
特定の実施形態において、ＫＣＮＢタンパク質と物理的に相互作用する分子を同定するために、アッセイが実施される。このような分子は、任の型の分子（ポリペプチド、ポリヌクレオチド、アミノ酸、ヌクレオチド、炭水化物、脂質、あるいは任意の他の有機分子または無機分子を含む）であり得る。このような分子は、通常ＫＣＮＢと相互作用する分子を代表し得るか、またはＫＣＮＢと相互作用し得そしてＫＣＮＢと相互作用し得そして／または調節し得る分子のクラスを同定するための先導化合物として潜在的に使用され得る、合成または他の分子であり得る。このようなアッセイは、物理的な結合アッセイ（例えば、アフィニティクロマトグラフィー、免疫沈降、２ハイブリッドスクリーン、または他の結合アッセイ）を表し得るか、または遺伝学的アッセイを表し得る。
【０１７５】
本明細書に記載される結合または機能的アッセイのいずれかにおいて、インビボまたはインビトロで、任意のＫＣＮＢタンパク質またはＫＣＮＢタンパク質の任意の誘導体、変異、ホモログまたはフラグメントが使用され得る。好ましくは、ＫＣＮＢタンパク質は、配列番号１の少なくとも約７０％同一である。多くの実施形態において、ＫＣＮＢタンパク質のフラグメントが使用される。例えば、Ｎ末端またはＣ末端、あるいは細胞外ループまたは膜貫通ドメインのみを含むフラグメントが使用され得る。このようなフラグメントは、それ自体で、他のＫＣＮＢと組合せて、あるいは異種タンパク質由来の配列（例えば、フラグメント）と組合せて、異種ポリペプチドに融合され得、それによってキメラポリペプチドを形成する。
【０１７６】
ＫＣＮＢタンパク質と相互作用する化合物は、ＫＣＮＢタンパク質またはそのフラグメントに特異的に結合する能力に基づいて単離され得る。多くの実施形態において、ＫＣＮＢタンパク質またはタンパク質フラグメントは、固体支持体に付着される。１つの実施形態において、アフィニティカラムが、ＫＣＮＢポリペプチドを使用して作製され、そして物理的に相互作用する分子が同定される。クロマトグラフィー技術は、任意の規模でそして多くの（ｍａｙ）異なる製造業者（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）からの装置を使用して実施され得る。さらに、インビボでＫＣＮＢタンパク質と相互作用する分子は、共免疫沈または他の方法（すなわち、抗ＫＣＮＢ抗体を使用してＫＣＮＢタンパク質を細胞または細胞抽出物から免疫沈降すること、およびＫＣＮＢタンパク質とともに沈降する化合物（例えば、タンパク質）を同定すること）によって同定され得る。このような方法は、当業者に周知であり、そして例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、およびＨａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ（全て、前出）に教示される。
【０１７７】
（Ｃ．モジュレータおよび結合化合物）
ＫＣＮＢタンパク質のモジュレータとして試験される化合物は、任意の小さな有機化学化合物もしくは無機化学化合物、または生物学的実体（例えば、タンパク質、糖、核酸または脂質）であり得る。代表的に、試験化合物は、小さな化学化合物およびペプチドである。本質的に任意の化学化合物は、本発明のアッセイにおいて潜在的なモジュレータまたは結合化合物として使用され得るが、最もしばしば、化合物は、使用される水溶液または有機（特に、ＤＭＳＯベースの）溶液に溶解され得る。これらのアッセイは、アッセイ工程を自動化しそして任意の好都合な供給源から化合物をアッセイに提供することによって、大きな化学ライブラリをスクリーニングするように設計され、これらの工程は、代表的に、並行して実施される（例えば、ロボットアッセイにおけるマイクロタイタープレート上のマイクロタイター形式で）。化学化合物の多くの供給業者が存在することが理解され、この業者としては、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ），Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｋａ−Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ Ａｎａｌｙｔｉｋａ（Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）などが挙げられる。
【０１７８】
１つの好ましい実施形態において、ハイスループットスクリーニング方法は、多数の潜在的な治療化合物（潜在的なモジュレーターまたは結合化合物）を含むコンビナトリアル化学ライブラリーまたはペプチドライブラリーを提供する工程を包含する。次いで、このような「コンビナトリアル化学ライブラリー」は、所望の特徴的な活性を示すこれらのライブラリーメンバー（特に化学種またはサブクラス）を同定するために、本明細書中に記載される１つ以上のアッセイにおいて、スクリーニングされ得る。このように同定された化合物は、従来の「先導化合物」として機能し得るかまたはそれ自体潜在的な治療剤もしくは実質の治療剤として使用され得る。
【０１７９】
コンビナトリアル化学ライブラリーは、多くの化学的「ビルディングブロック」（例えば、試薬）を組合せることによる、化学合成または生物学的合成のいずれかによって生成された多様な化学化合物の収集である。例えば、リニアコンビナトリアル化学ライブラリー（例えば、ポリペプチドライブラリー）は、所定の化合物長（すなわち、ポリペプチド化合物のアミノ酸の数）についての全ての可能な方法で、化学ビルディングブロックのセット（アミノ酸）を組み合せることによって、形成される。数百万の化学化合物が、このような化学ビルディングブロックの組合せ混合を介して合成され得る。
【０１８０】
コンビナトリアル化学ライブラリーの調製およびスクリーニングは、当該分野で周知である。このようなコンビナトリアル化学ライブラリーは、以下を含むが、これに限定されない：ペプチドライブラリー（例えば、米国特許第５，０１０，１７５号、Ｆｕｒｋａ、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．３７：４８７−４９３（１９９１）およびＨｏｕｇｈｔｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８４−８８（１９９１）を参照のこと）。多様な化学ライブラリーを形成するための他の化学もまた、使用され得る。このような化学としては、以下が含まれるが、これらに限定されない：ペプトイド（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ ９１／１９７３５）、コードされたペプチド（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ ９３／２０２４２）、ランダムなバイオオリゴマー（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ ９２／０００９１）、ベンゾジアゼピン（例えば、米国特許第５，２８８，５１４号）、ヒダントインのような多様体（ｄｉｖｅｒｓｏｍｅｒ）、ベンゾジアゼピンおよびジペプチド（Ｈｏｂｂｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６９０９−６９１３（１９９３））、ビニル様ポリペプチド（Ｈａｇｉｈａｒａら、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：６５６８（１９９２））、グルコース足場を有する非ペプチド様ペプチド模倣物（Ｈｉｒｓｃｈｍａｎｎら、Ｊ Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：９２１７−９２１８（１９９２））、小化合物ライブラリーの類似の有機合成（Ｃｈｅｎら、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：２６６１（１９９４））。オリゴカルバメート（Ｃｈｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１３０３（１９９３））、および／またはペプチジルホスホネート（Ｃａｍｐｂｅｌｌら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５９：６５８（１９９４））、核酸ライブラリー（Ａｕｓｕｂｅｌ、ＢｅｒｇｅｒおよびＳａｍｂｒｏｏｋ（全て、前出）を参照のこと）、ペプチド核酸ライブラリー（例えば、米国特許第５，５３９，０８３を参照のこと）、抗体ライブラリー（例えば、Ｖａｕｇｈｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４（３）：３０９−３１４（１９９６）およびＰＣＴ／ＵＳ９６／１０２８７を参照のこと）、炭水化物ライブラリー（例えば、Ｌｉａｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７４：１５２０−１５２２（１９９６）および米国特許第５，５９３，８５３号を参照のこと）、有機低分子ライブラリー（例えば、ベンゾジアゼピン、Ｂａｕｍ Ｃ ＆ ＥＮ， Ｊａｎ １８，３３頁（１９９３）；イソプレノイド、米国特許第５，５６９，５８８号；チアゾリジノン（ｔｈｉａｚｏｌｉｄｉｎｏｎｅ）およびメタチアザノン、米国特許第５，５４９，９７４号；ピロリジン、米国特許第５，５２５，７３５号および同第５，５１９，１３４号；モルフォリノ化合物、米国特許第５，５０６，３３７号；ベンゾジアゼピン、米国特許第５，２８８，５１４号などを参照のこと）。
【０１８１】
コンビナトリアルライブラリーの調製のためのデバイスは、市販されている（例えば、３５７ ＭＰＳ、３９０ ＭＰＳ、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍ Ｔｅｃｈ，Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ ＫＹ，Ｓｙｍｐｈｏｎｙ，Ｒａｉｎｉｎ，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ、４３３Ａ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ、９０５０ Ｐｌｕｓ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）。さらに、多くのコンビナトリアルライブラリー自体が、市販されている（例えば、ＣｏｍＧｅｎｅｘ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．，Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ、３Ｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｅｘｔｏｎ，ＰＡ、Ｍａｒｔｅｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤなど）。
【０１８２】
（１．固体状態および可溶性ハイスループットアッセイ）
１つの実施形態において、本発明は、単独かまたは異種タンパク質に共有結合したかのいずれかのＮ末端ドメインまたはＣ末端ドメインのような分子を使用して、キメラ分子を作製する可溶性アッセイを提供する。別の実施形態において、本発明は、ハイスループット様式の固相ベースのインビトロアッセイを提供し、ここで、ドメイン、キメラ分子、ＫＣＮＢタンパク質、またはＫＣＮＢタンパク質を発現する細胞もしくは組織は、固相基板に結合される。
【０１８３】
本発明のハイスループットアッセイにおいて、一日で数千個の異なるモジュレーターをスクリーニングすることが可能である。特に、マイクロタイタープレートの各ウェルは、選択した強力なモジュレーターに対する別々のアッセイを行うために使用され得るか、または濃縮時間またはインキュベーション時間の効果が観察される場合、全ての５〜１０のウェルが単一の分子を試験し得る。従って、単一の標準マイクロタイタープレートは、約１００（例えば、９６）のモジュレーターをアッセイし得る。１５３６ウェルプレートが使用される場合、１つのプレートは、約１００〜約１５００の異なる化合物を容易にアッセイし得る。一日でいくつかの異なるプレートをアッセイすることが可能であり；約６，０００〜２０，０００までの異なる化合物をスクリーニングするアッセイは、本発明の一体型システムを使用して可能となる。より最近では、試薬操作に対する微小流体アプローチが開発されている。
【０１８４】
目的の分子は、固体状態の成分に、共有結合または非共有結合を介して（例えば、タグを介して）直接または間接的に結合され得る。このタグは、任意の様々な成分であり得る。一般に、このタグに結合する分子（タグバインダー）は、固体支持体に固定され、そして目的のタグ化分子は、このタグとタグバインダーとの相互作用によって固体支持体に結合される。
【０１８５】
多数のタグおよびタグバインダーが、文献に十分に記載される公知の分子相互作用に基づいて使用され得る。例えば、タグが天然のバインダー（例えば、ビオチン、プロテインＡ、またはプロテインＧ）を有する場合、これは、適切なタグバインダー（例えば、アビジン、ストレプトアビジン、中性アビジン、免疫グロブリンのＦｃ領域など）と共に使用され得る。中性バインダー（ビオチン）を有する分子に対する抗体はまた、広範に入手可能であり、そして適切なタグバインダーである；ＳＩＧＭＡ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ １９９８、カタログＳＩＧＭＡ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ ＭＯを参照のこと）。
【０１８６】
同様に、任意のハプテン化合物または抗原性化合物は、タグ／タグバインダー対を形成するために、適切な抗体と組み合わせて使用され得る。数千の特異的抗体が市販されており、そして多くのさらなる抗体が、文献に記載されている。例えば、１つの一般的な構成において、タグは、第１の抗体であり、そしてタグバインダーは、この第１の抗体を認識する第２の抗体である。
【０１８７】
合成ポリマー（例えば、ポリウレタン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリウレア、ポリアミド、ポリエチレンイミン、ポリアリーレンスルフィド、ポリシロキサン、ポリイミド、およびポリアセテート）はまた、適切なタグまたはタグバインダーを形成し得る。本開示を見ると当業者に明らかなように、多くの他のタグ／タグバインダー対もまた、本明細書中に記載されるアッセイ系において有用である。
【０１８８】
一般的なリンカー（例えば、ペプチド、ポリエーテルなど）はまた、タグとして働き得、そしてポリペプチド配列（例えば、約５アミノ酸と２００アミノ酸との間のポリ−ｇｌｙ配列）を含む。このような可撓性リンカーは、当業者に公知である。例えば、ポリ（エチレングリコール）リンカーは、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，Ａｌａｂａｍａから入手可能である。これらのリンカーは、必要に応じて、アミド結合、スルフヒドリル結合、またはヘテロ官能性結合を有する。
【０１８９】
タグバインダーは、現在利用可能な様々な方法のいずれかを使用して固体基板に固定される。固体基板は、一般的に、この基板の全てまたは一部を、化学基をタグバインダーの一部と反応性の表面に固定する化学試薬に曝すことによって、誘導体化または官能化される。例えば、長鎖部分を結合するために適切な基としては、アミン基、ヒドロキシル基、チオール基、およびカルボキシル基が挙げられる。アミノアルキルシランおよびヒドロキシアルキルシランは、様々な表面（例えば、ガラス表面）を官能化するために使用され得る。このような固相生体高分子アレイの構築は、文献に十分に記載されている。例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９〜２１５４（１９６３）（これは、例えば、ペプチドの固相合成を記載している）；Ｇｅｙｓｅｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．Ｍｅｔｈ．１０２：２５９〜２７４（１９８７）（これは、ピン上の固相成分の合成を記載している）；ＦｒａｎｋおよびＤｏｒｉｎｇ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４４：６０３１６０４０（１９８８）（これは、セルロースディスク上の様々なペプチド配列の合成を記載している）；Ｆｏｄｏｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：７６７〜７７７（１９９１）；Ｓｈｅｌｄｏｎら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９（４）：７１８〜７１９（１９９３）；およびＫｏｚａｌら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２（７）：７５３７５９（１９９６）（全て固体基板に固定された生体高分子のアレイを記載している）を参照のこと。タグバインダーを基板に固定するための非化学的アプローチは、他の一般の方法（例えば、加熱、ＵＶ照射による架橋など）を含む。
【０１９０】
（２．コンピューターベースのアッセイ）
ＫＣＮＢタンパク質活性を調節する化合物についてのさらに別のアッセイは、コンピューター支援薬物設計を含み、ここでコンピューターシステムは、そのアミノ酸配列によりコードされる構造の情報に基づいて、ＫＣＮＢタンパク質の三次元構造を生成するために使用される。入力アミノ酸配列は、コンピュータープログラムの予め確立されたアルゴリズムと直接かつアクティブに相互作用して、タンパク質の二次構造モデル、三次構造モデルおよび四次構造モデルを生成する。次いで、このタンパク質構造のモデルは、結合する能力を有する構造の領域を同定するために試験される。次いで、これらの領域は、このタンパク質に結合する化合物を同定するために使用される。
【０１９１】
このタンパク質の三次元構造モデルは、少なくとも１０アミノ酸残基のタンパク質アミノ酸配列、またはＫＣＮＢポリペプチドをコードする対応する核酸配列をコンピューターシステムに入力することによって生成される。このポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、またはそのアミノ酸配列は、好ましくは配列番号２または配列番号１、およびそれらの保存的に改変された変形である。このアミノ酸配列は、タンパク質の一次配列またはサブ配列を表し、これはタンパク質の構造情報をコードする。少なくとも１０残基のアミノ酸配列（または１０アミノ酸をコードするヌクレオチド配列）は、コンピューターキーボードからコンピューターシステムに入力され、コンピューター読み取り可能基板としては、電子保存媒体（例えば、磁気ディスケット、テープ、カートリッジ、およびチップ）、光学媒体（例えば、ＣＤ ＲＯＭ）、インターネットサイトおよびＲＡＭにより分配される情報が挙げられるが、これら限定されない。次いで、このタンパク質の三次元構造モデルは、当業者に公知のソフトウェアを使用して、アミノ酸配列とコンピューターシステムとの相互作用によって生成される。
【０１９２】
アミノ酸配列は、目的のタンパク質の二次構造、三次構造および四次構造を形成するのに必要な情報をコードする一次構造を表す。このソフトウェアは、この一次配列によりコードされる特定のパラメーターを見て、構造モデルを生成する。これらのパラメーターは、「エネルギー項（ｔｅｒｍ）」と称され、そして主に、静電ポテンシャル、疎水性ポテンシャル、溶媒接触可能表面、および水素結合を含む。二次エネルギー項は、ファンデルワールスポテンシャルを含む。生物学的分子は、累積様式でエネルギー項を最小化する構造を形成する。従って、このコンピューターアルゴリズムは、二次構造モデルを作製するために、一次構造によりコードされるそれらの項およびアミノ酸配列を使用する。
【０１９３】
二次構造によりコードされるタンパク質の三次構造は、次いで、二次構造のエネルギー項を基礎にして形成される。この時点で使用者は、さらなる変数（例えば、このタンパク質が膜結合性であるかまたは可溶性であるか、身体におけるその位置、およびその細胞位置（例えば、細胞質内、表面または核））を入力し得る。これらの変数は、二次構造のエネルギー項と共に、三次構造のモデルを形成するために使用される。三次構造のモデリングにおいて、コンピュータープログラムは、同じ二次構造の疎水性表面を同じ二次構造の親水性表面と一致させる。
【０１９４】
一旦、この構造が生成されると、可能なモジュレーター結合領域が、このコンピューターシステムによって同定される。強力なモジュレーターの三次元構造は、上記のように、アミノ酸配列もしくはヌクレオチド配列、または化合物の化学式を入力することによって生成される。強力なモジュレーターの三次元構造は、次いで、ＫＣＮＢタンパク質の三次元構造と比較されて、このタンパク質に結合する化合物が同定される。タンパク質と化合物との間の結合親和性は、どの化合物がタンパク質に結合する増大した可能性を有するかを決定するために、エネルギー項を使用して決定される。
【０１９５】
コンピューターシステムはまた、変異、多型改変体、対立遺伝子、およびＫＣＮＢ遺伝子の種間ホモログについてスクリーニングするために使用される。このような変異は、疾患状態または遺伝形質に関連し得る。上記のように、ＧｅｎｅＣｈｉｐ^ＴＭおよび関連の技術はまた、変異、多型改変体、対立遺伝子および種間ホモログについてスクリーニングするために使用され得る。一旦、改変体が同定されると、このような変位遺伝子を有する患者を同定するために、診断アッセイが使用され得る。変異ＫＣＮＢ遺伝子の同定は、それぞれ配列番号２または配列番号１の第１の核酸配列またはアミノ酸配列、およびそれらの保存的に改変された改変体の入力を受信する工程を包含する。この配列は、上記のように、コンピューターシステムに入力される。この第１の核酸配列またはアミノ酸配列は、次いで、この第１の配列に対する実質的な同一性を有する第２の核酸配列またはアミノ酸配列と比較される。この第２の配列は、上記の様式で、コンピューターシステムに入力される。一旦、第１および第２の配列が比較されると、これらの配列間のヌクレオチドまたはアミノ酸の差違が同定される。このような配列は、様々なＫＣＮＢ遺伝子における対立遺伝子の差違、および疾患状態および遺伝形質に関連する変異を表し得る。
【０１９６】
（ＶＩＩＩ．疾患または状態を処置するためのｎＫＣＮ活性／発現の調節）
本発明の多数の実施形態において、化合物（例えば、核酸、ポリペプチドまたは他の分子）は、患者におけるＫＣＮＢ活性または発現を変化させるために、患者にインビボまたはエキソビボで投与される。所望の変化は、ＫＣＮＢの活性または発現の増加または減少のいずれかであり得る。例えば、正常な乳房細胞と比較して増加したレベルのＫＣＮＢを示す腫瘍を有する乳癌患者において、ＫＣＮＢの活性または発現を現象することが所望され得る。ＫＣＮＢの減少した活性または発現に関連する疾患を有する他の患者において、ＫＣＮＢの活性または発現を増加することが所望され得る。
【０１９７】
従って、本発明は、ＫＣＮＢの増加または減少した活性に関連する疾患を処置する方法を提供する。特定の実施形態において、ＫＣＮＢは、疾患または状態の診断および処置において使用され得る。例えば、特定の細胞型において発現するＫＣＮＢの活性は、細胞機能（例えば、細胞外シグナルに対する応答性）を調節し、それにより、患者におけるこのタイプの細胞の機能を特異的に調節するために使用され得る。さらに、細胞特異的ＫＣＮＢの変異は、特定の細胞型の機能の欠失に関連する疾患、状態または症状を生じるようである。これには、癌（乳癌、肺癌、結腸癌および前立腺癌を含む）、脳関連障害（例えば、癲癇、アルツハイマー病、パーキンソン病、発作、多発性硬化症、偏頭痛）、および神経学的障害（うつ病、精神分裂病、双極性障害を含む）などが挙げられる（例えば、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第１２版、Ｗｉｌｓｏｎら編、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｉｎｃ．を参照のこと）。他の疾患としては、心臓に関連する疾患（例えば、不整脈、心不全）、および様々な血管疾患（例えば、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第１２版、Ｗｉｌｓｏｎら編、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｉｎｃ．を参照のこと）、および膵臓に関連する疾患（例えば、膵炎、糖尿病、膵臓におけるホルモン分泌（例えば、グルカゴン、サマトスタチン分泌）の他の異常）（例えば、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第１２版、Ｗｉｌｓｏｎら編、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｉｎｃ．を参照のこと）が挙げられる。従って、ＫＣＮＢの調節（例えば、ＫＣＮＢのモジュレーターを投与することによる）は、この状態または疾患のいずれかを処置または予防するために使用され得る。
【０１９８】
患者に投与され得る化合物としては、プロモーターに作動可能に連結された、全長ＫＣＮＢポリペプチドをコードする核酸（例えば、配列番号１で示されるような）、またはそれらの任意の誘導体、フラグメントまたは改変体が挙げられる。適切な核酸はまた、阻害配列（例えば、アンチセンス配列またはリボザイム配列）を含み、これは例えば、プロモーターに作動可能に連結された発現ベクターで送達され得るか、または直接送達され得る。また、ＫＣＮＢの発現を調節するポリペプチドをコードする任意の核酸が使用され得る。
【０１９９】
一般に、核酸は、多数のベクターまたは方法（例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはアデノ随伴ウイルスベクター、リポゾーム処方物、裸のＤＮＡ注射、促進された（ブピバカイン、ポリマー、ペプチド媒介性）送達、カチオン脂質複合体、および粒子媒介（「遺伝子銃」）送達または圧力媒介送達）のいずれかを使用して細胞に送達され得る。
【０２００】
タンパク質はまた、ＫＣＮＢ活性を調節するために患者に送達され得る。好ましい実施形態において、ＫＣＮＢに特異的に結合するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体が送達される。さらに、ＫＣＮＢと相互作用しそして／またはＫＣＮＢ活性を調節する任意のポリペプチド（例えば、現在記載されるアッセイを使用して同定されるポリペプチド）が使用され得る。さらに、ＫＣＮＢ発現に影響を与えるポリペプチドが使用される。
【０２０１】
さらに、ＫＣＮＢと相互作用しそして／またはＫＣＮＢの活性を調節することが見出されたかまたはそのように設計された任意の化合物が使用され得る。例えば、本明細書中に記載される方法を使用して、ＫＣＮＢに結合するかまたはＫＣＮＢの活性を調節することが見出された任意の化合物が使用され得る。
【０２０２】
上記の方法のいずれかを使用して、ＫＣＮＢの発現または活性を増加または減少し得るか、そうでなければ、ＫＣＮＢポリペプチドまたはポリヌクレオチドの特徴および／または挙動（例えば、安定性、細胞内位置、他の細胞内部分または細胞外部分との相互作用など）に影響を与え得る。
【０２０３】
（Ａ．投与および薬学的組成物）
任意の本発明の分子の投与は、モジュレーター化合物を導入するかまたはモジュレーター化合物を処置される組織と接触させるために一般的に使用される経路のいずれかによって達成され得る。モジュレーターは、任意の適切な様式で、必要に応じて、薬学的に受容可能なキャリアと共に投与される。このようなモジュレーターを投与する適切な方法は利用可能であり、かつ当業者に周知であり、そして１つ以上の経路が特定の組成物を投与するために使用され得るが、特定の経路は、しばしば、別の経路より即効性で効果的な反応を与え得る。
【０２０４】
薬学的に受容可能なキャリアは、一部は、投与される特定の組成物によって、ならびに組成物を投与するために使用される特定の方法によって決定される。従って、本発明の薬学的組成物の広範な適切な処方物が存在する（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１７版、１９８５を参照のこと）。
【０２０５】
ＫＣＮＢモジュレータは、単独または適切な他の成分と組み合わせて、吸入を介して投与されるように、エアロゾル処方物（すなわち、この処方物は、「噴霧」され得る）になされ得る。エアロゾル処方物は、加圧された受容可能な噴霧剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素など）中に配置され得る。
【０２０６】
投与に適切な処方物としては、以下が挙げられる：水性溶液および非水性溶液、等張性滅菌溶液（この滅菌溶液は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および処方物に等張性を与える溶液を含む）、ならびに水性滅菌懸濁液および非水性滅菌懸濁液（この懸濁液としては、懸濁剤、溶解剤、濃厚剤、安定剤、および保存剤が挙げられる）。本発明の実施において、組成物が、例えば、経口、経鼻、局所、静脈内、腹腔内、膀胱内またはくも膜下腔内に投与され得る。この化合物の処方物は、アンプルおよびバイアルのような、一回用量または複数用量の密封容器内に提供され得る。溶液および懸濁物は、上記の種類の滅菌粉末、顆粒、および錠剤から調製され得る。このモジュレータはまた、調製された食物または薬物の一部分として投与され得る。
【０２０７】
本発明の文脈中において、患者に投与される用量は、経時的に被験体において、有効な応答をもたらすに十分であるべきである。この用量は、使用される特定のモジュレータの有効性および患者の症状、ならびに体重および処置される領域の表面積によって決定される。用量のサイズはまた、存在、性質、および任意の有害な副作用によって決定され、この副作用は、特定の被験体の特定の化合物またはベクターの投与に付随して生じる。
【０２０８】
投与される有効量のモジュレータを決定するために、内科医は、モジュレータ、モジュレータの毒性、および抗モジュレータ抗体の産物の血漿レベルを計算して、評価し得る。一般に、モジュレータの用量等価物は、典型的な被験体において約１ｎｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇである。
【０２０９】
投与のために、本発明のモジュレータは、被験体の体重および全健康状態に対して適用される場合、モジュレータのＬＤ−５０および種々の濃度の化合物の副作用によって決定される割合で投与され得る。投与は、単一用量または分割用量を介して達成され得る。
【０２１０】
（ＩＸ．キット）
ＫＣＮＢ核酸に特異的にハイブリダイズする薬剤（例えば、ＫＣＮＢプローブおよびＫＣＮＢプライマー）およびＫＣＮＢタンパク質に特異的に結合するか、またはＫＣＮＢタンパク質の活性を調製するＫＣＮＢ特異的薬剤（例えば、ＫＣＮＢ抗体または他の化合物）を使用して、ＫＣＮＢ関連疾患または状態を処置し得る。
【０２１１】
サンプル中のＫＣＮＢポリヌクレオチドに対するＤＮＡおよびＲＮＡの存在を決定するための核酸アッセイとしては、以下の当該分野で公知の多くの技術が挙げられる：サザン分析、ノーザン分析、ドットブロット、ＲＮａｓｅ防御、Ｓ１分析、ＰＣＲおよびＬＣＲのような増幅技術、およびインサイチュハイブリダイゼーション。インサイチュハイブリダイゼーションにおいて、例えば、標的核酸は、細胞の周りから遊離され、細胞内でのハイブリダイゼーションを利用可能にする一方で、引き続く読解および分析のための細胞形態学を保存する。以下の文献は、インサイチュハイブリダイゼーションの分野の総説を提供する：Ｓｉｎｇｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ４：２３０−２５０（１９８６）；Ｈａａｓｅら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，第ＶＩＩ巻、第１８９〜２２６頁（１９８４）；およびＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｈａｍｅｓら編、１９８７）。さらに、ＫＣＮＢタンパク質は、上記の種々の免疫アッセイ技術を使用して検出され得る。代表的に、この試験サンプルは、ポジティブコントロール（例えば、組換えＫＣＮＢタンパク質を発現するサンプル）およびネガティブコントロールの両方と比較される。
【０２１２】
本発明はまた、ＫＣＮＢタンパク質または核酸のモジュレータをスクリーニングするためのキットを提供する。このようなキットは、容易に利用可能な材料および薬剤から調製され得る。例えば、このようなキットは、任意の１以上の以下の材料を含み得る：ＫＣＮＢ核酸またはタンパク質、反応チューブ、およびＫＣＮＢ活性を試験するための指示書。必要に応じて、このキットは生物学的に活性なＫＣＮＢタンパク質を含む。広範な種々のキットおよび成分は、意図されたキットの使用者および使用者の具体的な必要性に依存して、本発明に従って調製され得る。
【実施例】
【０２１３】
（実施例）
（実施例１．癌におけるＫＣＮＢの増幅）
以下の実施例は、ＫＣＮＢが癌内で増幅されることを示す。
【０２１４】
ＫＣＮＢはまた、癌において増幅されるヒトの染色体領域８ｑ２４．３での増幅の基点として同定した。この実施例は、８ｑ２４．３アンプリコンのＤＮＡコピーの数の決定を例示する（図２）。
【０２１５】
ＤＮＡコピーの数を、アンプリコンの境界を規定するための一次腫瘍と腫瘍細胞系との両方から調製されたゲノムＤＮＡサンプル中の１０個のマーカーから決定した。以下のマーカーを使用した：Ｗｉ−１１６２３、ヒトＳＴＳ；ＦＡＫ、病巣付着キナーゼ（寄託番号Ｌ１３６１６）；３４Ｄ１０−５’、ＣＩＴＢヒトＢＡＣ Ｂ＆ＣライブラリリリースＩＶのクローン３４Ｄ１０のＴ７部位ＢＡＣ配列；３８１Ｋ１２−Ｔ７、ＣＩＴＢヒトＢＡＣ Ｂ＆ＣライブラリリリースＩＶのクローン３８１Ｋ１２のＴ７部位ＢＡＣ配列；４３１Ｃ１８Ｔ７、ゲノムクローンＡＣ００７８６９のＴ７部位ＢＡＣ末端配列；ｄ８ｓ１７４１、ヒトＳＴＳ；５６４Ｌ１７−５’、ゲノムクローンＡＣ００７８７１のＴ７末端ＢＡＣ配列；４Ｐ６−３’、ＣＩＴＢヒトＢＡＣ Ｂ＆ＣライブラリリリースＩＶのゲノムクローン４ｐ６のＳＰ６末端ＢＡＣ配列；ＷＩ−１８６３２、ヒトＳＴＳ；Ｔ１−５’、ヒトｃＤＮＡクローンＡＫ０２６３９４．１の５’末端。ＣＴＨＮ１５９および８７−６３４は、一次乳癌およびＺＲ７５３０およびＭＤＡＭＢ４３６は、乳癌細胞株である。
【０２１６】
各マーカーに対するプローブを、ＰｒｉｍｅｒＥｘｐｒｅｓｓ １．０（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して設計し、そしてＯｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって合成した。標的プローブ、ゲノムの正常の単一コピー領域を表す参照プローブおよび腫瘍遺伝子ＤＮＡ（１０ｎｇ）を、製造業者のプロトコールに従って、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７７００ Ｔａｑｍａｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒに供した。この結果を、図２に示す。これらのデータは、８ｑ２４．３領域の増幅の境界を規定する。
【０２１７】
約２００の乳癌のさらなる分析により、約１０〜１４％が、この領域において増幅されることが示された。一次乳癌は、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙのＬｉｎｄａ ＲｏｄｇｅｒｓおよびＭｉｋｅ ＷｉｇｌｅｒおよびＤｕｋｅ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＪｅｆｆ Ｍａｒｋｓにより提供された。
【０２１８】
（ＫＣＮＢの同定）
ＰＣＲベースの物理学的マッピング（上述）は、ヒトＢＡＣライブラリＣＩＴＢリリースＩＶ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）のＢＡＣクローン４３１ｃ１８（登録番号 ＡＣ００７８６９）が、基点であった。続いて、ＢＡＣクローンに含まれる、約２００ｋＢ長のヒト遺伝子配列を、ＢＬＡＳＴＸを介してＧｅｎｂａｎｋおよびＳＷＩＳＳＰＲＯＴデータベースで調査するために使用した。
【０２１９】
この配列の領域を、上記のＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ Ｋ^＋チャネルタンパク質ＴＷＫ−８（登録番号Ｐ３４４１０）との相同的な配列を示すために見出した。ＴＷＫ−８は、クローン化ヒトカリウムチャネル、ＫＣＮＫ３（寄託番号ＡＡＣ５１７７７／ＰＩＤ ｇ２４６５５４２）に対して相同性であり、これは、ヒト染色体２ｐ２３に対して局在化される。ＫＣＮＫ３に対する相同性に基づいて、配列番号２として出発するオープンリーディングフレームは、ゲノム配列から決定された。ＫＣＮＢの推定オープンリーディングフレームは、ＫＣＮＫ３と６２％のアミノ酸同一性を共有する。遺伝子ＤＮＡによってコードされたＫＣＮＢタンパク質の推定アミノ酸配列は、配列番号１として示される。
【０２２０】
（乳癌細胞株由来のＫＣＮＢ ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅）
次いで、配列番号３および４で出発するヌクレオチド配列を有するプライマーを使用する高度の忠実度のＰＣＲを、乳癌細胞株ＺＲ７５３０由来のｃＤＮＡ調製物由来のＫＣＮＢをコードするｃＤＮＡを得るために実施した。ｃＤＮＡを、以下のように単離した。
【０２２１】
（１）第１鎖ｃＤＮＡ調製物：
ヒト乳癌細胞株（ＺＲ７５３０）から調製した１μｇの総ＲＮＡを、１μＭｇのオリゴ（ｄＴ）_１８および２００ユニットのＭＭＬＶ逆転写酵素（ＣＩＯＮＴＥＣＨ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）と共に、以下の成分を含む２０μＬの総容積中でインキュベートした：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．３、７５ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ_２および５０μＭ ｄＮＴＰ。４２℃で６０分のインキュベーション後に、この反応物を、５分間、９５℃に維持して、逆転写酵素を不活化した。続いて、８μｌのヌクレアーゼを含まない水を添加して、最後に、第１鎖のｃＤＮＡ調製物を得た。
【０２２２】
（２）ＫＣＮ ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅：
ＺＲ７５３０の４μｌの第１鎖ｃＤＮＡ調製物を、以下の成分を含む５０μＬの総容量中で混合した：２０μＭ ｄＮＴＰ、各々０．５μＭのオリゴヌクレオチドＲ５およびＲ１０（それぞれ、配列番号３および４）、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．８５、５ｍＭ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、２５ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭｇＳＯ_４、および３単位のＰＷＯ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）。次いで、この反応物を、鉱油（３０μＬ）で覆い、そしてＰＣＲ熱サイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ、ＭＡ）を使用して４０分間増幅し、各々のサイクルは、以下の３工程であった：９５℃（２０秒）、６４℃（４０秒）、および７２℃（１分）。続いて、この混合物を、製造業者の推薦書に従って、Ｈｉｇｈ−Ｐｕｒｅ ＰＣＲ精製カラム（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を使用して精製した。２％のアガロースゲル電気泳動を使用する分析により、約１．２ｋｂ長の産物を、ＫＣＮＢの全長オープンリーディングフレームを示すことで、検出した。
【０２２３】
ｃＤＮＡの配列は、６５３位置のシトシンを除いて、ゲノム配列（配列番号５）のオープンリーディングフレームと同一であり、この６５３位のシトシンを、ゲノム配列中に示されるＴで置換した。この位置のＣをＴに置換することは、ヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸を変えない。乳癌細胞株ＺＲ７５３０中のＫＣＮＢメッセンジャーＲＮＡの５’および３’の未翻訳領域（ＵＴＲ）のヌクレオチド配列を、ＲＡＣＥ（迅速なｃＤＮＡ末端の増幅）を使用して決定した。３’および５’ＵＴＲに含まれるｃＤＮＡ配列は、配列番号５で記載される。
【０２２４】
５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲを含む配列は、約２．３ｋｂ長である。この開始メチオニンコドンおよび終止コドンを、太字で示した。この配列の５’末端からの３２３位のＧヌクレオチドは、エキソン１の末端を標識し、そしてＧヌクレオチドの３２４位置は、エキソン２の第１塩基を表す。ＫＣＮＢ ｃＤＮＡと対応するゲノム配列（登録番号ＡＣ００７８６９）との比較から、約８３．６ｋｂのイントロンは、エキソン１および２によってフランクされると推定される。この推定ポリアデニル化シグナル配列に、下線を引いている。
【０２２５】
（実施例２．ＫＣＮＢの発現）
以下の実施例は、ＫＣＮＢが、脳中で高いレベルで正常に発現され、そして癌中で過剰に発現する。
【０２２６】
（ＫＣＮＢは、正常な乳細胞と比較して、乳癌細胞株中で過剰発現する）
ＫＣＮＢ ｍＲＮＡの発現レベルをまた、正常の乳組織と比較して、乳癌組織中で決定した（表１）。定量的なＰＣＲを、以下の示されるように実施した。
【０２２７】
総ＲＮＡを、腫瘍細胞株から単離し、そしてＴｒｉｚｏｌ試薬（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｇａｉｔｈｅｒｂｕｒｇ，ＭＤ）を使用して一次腫瘍組織を凍結し、そして約１μｇ／μＬの濃度でＲＮＡｓｅｃｕｒｅ（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）中に保存した。総ＲＮＡを、ＤＮＡａｓｅＩ（Ｇｉｂｃｏ）を用いて処理し、ゲノムＤＮＡを排除し、次いで、製造業者に従って１本のチューブのフォーマットでＰＣＲ増幅と連結させた逆転写反応（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ／ＡＢＩ）に供した。予め設定した閾値を通過するに必要とされるＰＣＲサイクルの数は、サンプル腫瘍ＲＮＡ調製において、Ｃｔ値としても知られており、そして一連の正常の乳腺のＲＮＡ調製物（種々の濃度）を、ＰＥ／ＡＢＩ ７７００ Ｔａｑｍａｎマシンを使用することによって、標的プローブおよびβアクチンプローブの両方について、測定した。次いで、各サンプル中のβアクチンに対する標的配列の相対的な存在比を、未知のサンプルのＣｔ値の統計学的分析および種々の濃度の乳腺のＲＮＡプレップから得られる標準的な曲線によって計算した。
【０２２８】
３種類のオリゴヌクレオチドを、各々定量的なＰＣＲ；順方向プライマー；逆方向プライマー、およびプローブに関して使用した。表１に示された結果を得るための分析を実施する際に、配列番号６〜８および９〜１１で示される２種の異なるオリゴヌクレオチドのセットを使用した。比較可能な結果が、各々のセットで得られた。表１に示される結果により、ＫＣＮＢが、正常と比較して乳癌細胞中で過剰発現することが示される。
【０２２９】
試験した３８個の一次乳癌の中で、１９個が、正常の乳組織よりも５倍以上大きなレベルのＫＣＮＢ ｍＲＮＡを発現する（１９／３８＝５０％の過剰発現頻度）（表１ｂ）。ＫＣＮＢの遺伝子のコピー数の増加を示す１１個の腫瘍がまた、ｍＲＮＡの過剰発現を示した（２．５未満のＫＣＮＢ遺伝子のコピー数の腫瘍に、「−」を標識し、そして２．５より大きいコピー数を有する腫瘍を、「＋」で標識する。ＮＤは、「未検出」を示す）。
【０２３０】
ＫＣＮＢの増幅を示さない１２個の腫瘍の中で、７個がＫＣＮＢ（しばしば、癌遺伝子の特徴）を発現した。
【０２３１】
（表１）
（乳癌細胞株中の相対的なＫＣＮＢｍＲＮＡレベル）
【０２３２】
【表１】

^１表中の７個の細胞株の中で、ＺＲ７５３０は、８ｑ２４．３で増幅した唯一の細胞株である。
^２ＫＣＮＢｍＲＮＡの相対的なレベルが、ＨＢＬ−１００細胞株または正常の乳腺上皮細胞。βアクチンｍＲＮＡを、試験サンプル中で内部参照として使用した。
ＮＤ＝未検出。
【０２３３】
【表１ｂ】

（ＫＣＮＢは、他の上皮腫瘍において発現される）
ＫＣＮＢ発現はまた、乳房腫瘍以外の腫瘍型において試験された（表２）。この結果は、ＫＣＮＢがまた肺腫瘍および前立腺腫瘍において過剰発現されることを示す。試験されるそれぞれの腫瘍型の数が示される。４つの転移性前立腺腫瘍は、試験された２６サンプルのうち５倍以上でＫＣＮＢを過剰発現することが見出された。試験された２０の肺腫瘍のうち、３５％が５倍より多い発現を示した。
【０２３４】
【表２】

（ヒトＴＡＳＫ１（ＫＣＮＢの近い配列ホモログ）が癌において過剰発現されない）
ＴＡＳＫ１（ＫＣＮＫ３としても公知、Ｄｕｐｒａｔら、ＥＭＢＯ Ｊ．（１９９７）１６、５４６４−５４７１）は、ＫＣＮＢと６２％のタンパク質配列同一性を共有する。サブセットの一次乳房腫瘍を、ＴＡＳＫが癌において過剰発現されるか否かを決定するために試験した。ＴＡＳＫ１ ｍＲＮＡのレベルを、ＫＣＮＢ ｍＲＮＡレベルの決定のための方法論と同じ方法論を使用して決定した。ＴＡＳＫ１ ｍＲＮＡ発現およびコピー数のＴａｑｍａｎ分析に使用されるＴＡＳＫプライマーおよびプローブは、以下であった：
【０２３５】
【数１】

ＴＡＳＫ１は、癌において過剰発現されず、増加したＴＡＳＫ１遺伝子コピー数を示す乳房腫瘍も同定されなかった（表３）。従って、癌と関連する遺伝子コピー数の増加および過剰発現は、ＴＡＳＫ型ＫチャネルのうちＫＣＮＢに対して独特である。
【０２３６】
【表３】

（ＫＣＮＢは、正常なヒト脳組織において高度に発現される）
１５の正常なヒト組織合計ＲＮＡを、Ｂｉｏｃｈａｉｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから購入し、そしてＲＴ−Ｔａｑｍａｎを使用してＫＣＮＢ発現について分析した（表４）。大部分の組織は、脳を除いて比較できるレベルでＫＣＮＢを発現し、脳は、相対的に高いレベルのＫＣＮＢを発現する。レベルを、組織におけるβ−アクチンのレベルに対して決定した。結果は、任意の単位で表現される。
【０２３７】
【表４】

（実施例３．ＣＯＳ−７細胞における機能性ＫＣＮＢの発現）
以下の実施例は、全細胞の流れに対するＫＣＮＢの発現の効果を示す。
【０２３８】
トランスフェクション分析は、ＫＣＮＢをコードする発現プラスミドを使用して、ＣＯＳ−７細胞においてＫＣＮＢの活性を試験するために使用した。コントロール培養物は、ＫＣＮＢ挿入物を欠く同じ発現ベクターを受容した。全細胞の流れをピペットおよび１４０ｍＭ ＫＣｌを含む浴溶液で記録した。保持電位は、０ｍＶであり、そして電圧ステップは、１４ｍＶの増分で−１５０ｍＶ〜１１６ｍＶであった。結果は、図３に示される。データは、流れがＫＣＮＢを発現する細胞において生成され、さらに、ＫＣＮＢがカリウムチャネルタンパク質に特徴的な活性を示すことを示す。
【０２３９】
（実施例４．ＫＣＮＢは、ＴＮＦ−α誘導細胞死から細胞を保護する）
レトロウイルスに基づく遺伝子移入方法を使用して、ＫＣＮＢ、ＢＣＬ２またはＫＣＮＢとＢＣＬ２との両方のいずれかを発現するＭＥＦ（マウス胚性繊維芽細胞）細胞株Ａ９のトランスフェクト体を確立した。次いで、ＴＮＦ−αに対するこれらの細胞株の感受性を試験した。トランスフェクト体を、０ｎｇ／ｍｌ、２．５ｎｇ／ｍｌまたは５ｎｇ／ｍｌのマウスＴＮＦ−α（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）の存在下でＤＭＥＭ／Ｆ−１２（Ｇｉｂｃｏ）および１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。ＴＮＦ−αの添加の４８時間後、全ての細胞（生きていると死んでいるとの両方）を収集し、そしてトリパンブルーで染色した。結果（表４）は、ＫＣＮＢまたはＫＣＮＢとＢＣＬ２との両方を発現する多くの細胞が、ベクターコントロールまたはＢＣＬ２単独を使用して生成されるトランスフェクト体と比較して２．５ｎｇ／ｍｌまたは５ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αでの処置に続いて生存したことを示した。従って、ＫＣＮＢの発現は、ＴＮＦ−α誘導殺傷から細胞を保護することが観察された。
【０２４０】
本明細書中に引用される全ての刊行物および特許出願は、それぞれ個々の刊行物または特許出願が具体的にかつ個々に参考として組み込まれたように示されたかのように、本明細書中で参考として援用される。
【０２４１】
前述の本発明が理解を明瞭にするために例示および実施例によっていくぶん詳細に記載したが、特定の変化および改変が添付の特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなくそれらに対してなされ得ることが、本発明の教示を考慮して当業者に容易に明かである。
【０２４２】
［配列表］
【表５】

【特許請求の範囲】
【請求項１】
カリウムチャネルポリペプチドをコードする単離された核酸であって、該核酸は、配列番号１のアミノ酸配列に対して７５％より高いアミノ酸配列同一性を含む、単離された核酸。
【請求項２】
配列番号１のアミノ酸配列に対して９０％より高いアミノ酸配列同一性を含むポリペプチドをコードする、単離された核酸。
【請求項３】
前記ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列に対して９５％より高いアミノ酸配列同一性を含む、請求項２に記載の単離された核酸。
【請求項４】
前記ポリペプチドが、カリウムチャネル活性を有する、請求項２に記載の単離された核酸。
【請求項５】
前記核酸が、配列番号１のアミノ酸配列に対して産生されたポリクローナル抗体に特異的に結合するポリペプチドをコードする、請求項１または請求項２に記載の単離された核酸。
【請求項６】
前記核酸が、配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、請求項２に記載の単離された核酸。
【請求項７】
前記核酸が、配列番号２または配列番号５のヌクレオチド配列を含む、請求項２に記載の単離された核酸。
【請求項８】
前記核酸が、配列番号２または配列番号５のヌクレオチド配列を含む核酸に、ストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするプライマーによって増幅される、請求項１または請求項２に記載の単離された核酸。
【請求項９】
前記核酸が、配列番号２または配列番号５のヌクレオチド配列に、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で選択的にハイブリダイズする、請求項１または請求項２に記載の単離された核酸。
【請求項１０】
前記核酸が、配列番号２または配列番号５のヌクレオチド配列に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で選択的にハイブリダイズする、請求項１または請求項２に記載の単離された核酸。
【請求項１１】
前記核酸が、配列番号１のアミノ酸配列のうち少なくとも３０個連続したアミノ酸を含むポリペプチドをコードする、請求項１または請求項２に記載の単離された核酸。
【請求項１２】
前記核酸が、配列番号１のアミノ酸配列のサブフラグメントをコードする、請求項１または請求項２に記載の単離された核酸であって、ここで、該サブフラグメントが、Ｃ末端ドメイン、Ｍ３ドメイン、およびアミノ酸３０〜アミノ酸７０のサブフラグメントからなる群から選択される、単離された核酸。
【請求項１３】
配列番号１のアミノ酸配列に対して、７５％より高いアミノ酸配列同一性を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項１４】
前記ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列に対して、９０％より高いアミノ酸配列同一性を含む、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
前記ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列に対して、９５％より高いアミノ酸配列同一性を含む、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
前記ポリペプチドが、配列番号１に対して産生されたポリクローナル抗体に特異的に結合する、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
前記ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
前記ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列のうち少なくとも３０個連続したアミノ酸を含む、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
請求項１３に記載のポリペプチドであって、ここで、該ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列のサブフラグメントを含み、ここで、該サブフラグメントが、Ｃ末端ドメイン、Ｍ３ドメイン、およびアミノ酸３０〜アミノ酸７０のサブフラグメントからなる群から選択される、ポリペプチド。
【請求項２０】
請求項１３に記載のポリペプチドに選択的に結合する、抗体。
【請求項２１】
請求項１９に記載のサブフラグメントに選択的に結合する、抗体。
【請求項２２】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項２０または請求項２１に記載の抗体。
【請求項２３】
請求項１または請求項２に記載の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項２４】
請求項２３に記載のベクターを用いてトランスフェクトされた、宿主細胞。
【請求項２５】
ポリペプチドの活性を調節する化合物を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ｉ）該化合物を、請求項１３に記載のポリペプチドと接触させる工程；および
（ｉｉ）該ポリペプチドに対する該化合物の機能的影響を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２６】
前記化合物が、低有機化合物である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ポリペプチドが固相に連結されている、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記ポリペプチドが前記固相に共有結合している、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記機能的影響が、イオン流量の変化を測定することによって決定される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記機能的影響が、前記ポリペプチドへの前記化合物の結合を測定することによって決定される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
前記ポリペプチドが、真核生物細胞において発現される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記真核生物細胞がニューロンである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
カリウムチャネル関連障害を処置する組成物であって、請求項１３に記載のポリペプチドの治療有効量の調節因子を含有する、組成物。
【請求項３４】
前記調節因子が抗体である、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
前記調節因子が有機低分子である、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３６】
ポリペプチドを作製する方法であって、該方法は、請求項２３に記載の組換え発現ベクターから該ポリペプチドを発現する工程を包含する、方法。
【請求項３７】
ポリペプチドを含む組換え細胞を作製する方法であって、該方法は、該細胞を、請求項２３に記載の発現ベクターを用いて形質導入する工程を包含する、方法。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【公開番号】特開２０１１−１１５１６９（Ｐ２０１１−１１５１６９Ａ）
【公開日】平成２３年６月１６日（２０１１．６．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５３４２（Ｐ２０１１−５３４２）
【出願日】平成２３年１月１３日（２０１１．１．１３）
【分割の表示】特願２００１−５６５８９５（Ｐ２００１−５６５８９５）の分割
【原出願日】平成１３年３月２日（２００１．３．２）
【出願人】（５００２０３７０９）アムジェン　インコーポレイテッド (76)
【Ｆターム（参考）】