ＫＤＲペプチド及びこれを含むワクチン
【課題】腫瘍組織内皮細胞に於いて強発現しているVGEF受容体２(KDR)を標的とした癌ワクチン療法の開発を目的に、ワクチンとして有効なペプチドを提供する。
【解決手段】KDRタンパク質の全アミノ酸配列を基に、HLA-A*2402に対し結合親和性の高いノナペプチド、及びデカペプチド。化学合成したこれらのペプチド及びアミノ酸の置換又は付加ペプチドより、高い細胞傷害性Ｔ細胞(CLT)誘導能を有するペプチド。更にCLT誘導能の高い抗原提示細胞を誘導する方法、これらペプチドによる腫瘍の治療、予防、及びワクチン。
【解決手段】KDRタンパク質の全アミノ酸配列を基に、HLA-A*2402に対し結合親和性の高いノナペプチド、及びデカペプチド。化学合成したこれらのペプチド及びアミノ酸の置換又は付加ペプチドより、高い細胞傷害性Ｔ細胞(CLT)誘導能を有するペプチド。更にCLT誘導能の高い抗原提示細胞を誘導する方法、これらペプチドによる腫瘍の治療、予防、及びワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌ワクチンとして非常に有効な新規ペプチド、及び該ペプチドを含む腫瘍の治療及び予防のための医薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍拒絶抗原遺伝子が悪性黒色腫を中心に同定されるに従って、それを応用した癌免疫療法が開発されている。とりわけ、抗腫瘍免疫応答におけるCD8陽性T細胞の重要性が認識されるに伴い、腫瘍特異的CD8陽性T細胞を生体内で惹起させる癌ワクチン療法が着目され、種々の臨床応用が行われている。また、10個前後のアミノ酸残基からなるペプチドが種々の共刺激分子の補助によりClassI経路を介してT細胞を活性化し、腫瘍特異的細胞傷害性T細胞(CTL)を誘導する機序が解明され、さらに個々のHLA分子に拘束性を示すペプチドの同定も精力的に進んでいる。
【０００３】
しかしながら、腫瘍を制御する事は未だ完全に出来ていないのが現状である。その原因として、腫瘍細胞の不均一性、腫瘍細胞におけるMHC-Class Iの発現低下や消失、さらに腫瘍細胞における標的分子の欠落が考えられる。また、現在同定されている腫瘍抗原ペプチドはある種の腫瘍に存在するが、全ての腫瘍を網羅できるものではない。そこで、これらの問題点を解決するため、標的細胞を腫瘍細胞ではなく、腫瘍血管における内皮細胞に着目した。すなわち、内皮細胞はMHC-Class Iの発現低下や消失、また不均一性といった問題がほとんどないので、腫瘍血管を標的にするCTLが誘導できれば、腫瘍の種類に関係なく、またClass Iの消失や標的分子の欠損といった従来の癌ワクチン療法で問題となっていた原因を凌駕でき、治療効果が大いに期待できると考えられる。癌における新生血管の研究は1970年代のFolkmanらの先駆的な仮説の提唱に始まり、様々な角度から研究がなされている。なかでも、VEGF-VEGF受容体(VEGFR)において多くの検討がなされ、腫瘍新生血管におけるその意義が評価されている。特に癌治療においては、target-oriented drugとして新生血管阻害剤の開発が精力的に進められ、すでに臨床治験も行われているが、この考え方を癌ワクチン療法に生かした治療は未だ行われていない。一つの理由としてVEGFRが正常細胞に発現しているため免疫寛容状態になっていると考えられた。しかしながら、1990年代のPlate, Millauer, Risauらの研究により腫瘍組織における内皮細胞においてVEGFRが強発現している事が確認され、また、CEA,HER/neuのように正常細胞でも発現している自己抗原に対する免疫応答が必ずしも免疫寛容状態になっていないことが明らかになった事により、VEGFR が癌ワクチン療法の標的に成り得るのではないかと考えた。
【０００４】
最近、VEGFRに対する能動免疫を行うことにより、腫瘍における血管新生及び転移を抑制できることが報告された（非特許文献１；The Journal of experimental medicine 2002年 第195巻 第12号 p.1575-1584）。しかし、この文献では可溶性のVEGFRタンパク質を用いているに過ぎず、有効なペプチドのアミノ酸配列についての検討は何らなされていない。
【非特許文献１】The Journal of experimental medicine 2002年 第195巻 第12号 p.1575-1584
【発明の開示】
【０００５】
本発明者等は、VEGFシグナルにおいて内皮細胞の増殖に関与すると考えられ、腫瘍組織内皮細胞において強発現しているVEGFR2 (KDR/flk-1、以下KDRという)を標的とした癌ワクチン療法の可能性に着目し、ワクチンとして有効に用いることができるペプチドの探索を行い、その特異性について検討を行い、本発明を完成するに到った。
【０００６】
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（２２）を提供する。
（１） 配列番号２、３、５、８、１１または１２に示すアミノ酸配列からなるペプチドから選ばれるノナペプチド。
（２） 配列番号２、３、５、８、１１または１２に示すアミノ酸配列において１個、２個または数個のアミノ酸が置換または付加されており、細胞傷害性Ｔ細胞の誘導能を有するペプチド。
（３） Ｎ末端から２番目のアミノ酸がフェニルアラニン、チロシン、メチオニンまたはトリプトファンである、上記（２）に記載のペプチド。
（４） Ｃ末端のアミノ酸がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンまたはメチオニンである、上記（２）または（３）に記載のペプチド。
（５） 配列番号２９、３０、３３、３４、４０、または４６に示すアミノ酸配列からなるペプチドから選ばれるノナペプチドまたはデカペプチド。
（６） 配列番号２９、３０、３３、３４、４０、または４６に示すアミノ酸配列において１個、２個または数個のアミノ酸が置換または付加されており、細胞傷害性Ｔ細胞の誘導能を有するペプチド。
（７） Ｎ末端から２番目のアミノ酸がロイシンまたはメチオニンである、上記（６）に記載のペプチド。
（８） Ｃ末端のアミノ酸がバリンまたはロイシンである、上記（６）または（７）に記載のペプチド。
（９） 上記（１）〜（８）のいずれかに記載のペプチドを１種以上含む、腫瘍の治療及び／または予防のための医薬。
（１０） 上記（１）〜（８）のいずれかに記載のペプチドを１種以上含む、糖尿病性網膜症、慢性関節リウマチ、乾癬、アテローム性動脈硬化症の治療のための医薬。
（１１） 上記（１）〜（８）のいずれかに記載のペプチドとＨＬＡ抗原とを含む複合体を表面に提示しているエキソソーム。
（１２） ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ０２である、上記（１１）に記載のエキソソーム。
（１３） ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２４０２またはＨＬＡ−０２０１である、上記（１２）に記載のエキソソーム。
（１４） 上記（１）〜（８）のいずれかに記載のペプチドを用いてＣＴＬ誘導能の高い抗原提示細胞を誘導する方法。
（１５） 上記（１）〜（８）のいずれかに記載のペプチドを用いてＣＴＬを誘導する方法。
（１６） 上記（１）〜（８）のいずれかに記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子を抗原提示細胞に導入することを含む、細胞傷害性Ｔ細胞誘導能の高い抗原提示細胞を誘導する方法。
（１７） 上記（１）〜（８）のいずれかに記載のペプチドを用いて誘導される、単離された細胞傷害性Ｔ細胞。
（１８） ＨＬＡ抗原と上記（１）〜（８）のいずれかに記載のペプチドとの複合体を提示してなる抗原提示細胞。
（１９） 上記（１４）または（１５）に記載の方法によって誘導される、上記（１８）に記載の抗原提示細胞。
（２０） 上記（１）〜（８）のいずれかに記載のペプチドを有効成分とする、病態部位における血管新生阻害のためのワクチン。
（２１） ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ０２である被験者に対して投与するための、上記（２０）に記載のワクチン。
（２２） 悪性腫瘍の増殖及び／または転移を抑制するために使用される、上記（２０）または（２１）に記載のワクチン。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2002-267285、2003-062003、2003-167042号の明細書および/または図面に記載される内容を包含する。
【０００７】
［発明の実施の形態］
本発明者等はまず、in vivoにおいて抗原提示細胞上に提示される場合に、種々のタンパク質が９量体のペプチド（ノナペプチド）に分解されてから提示されることを考慮し、KDRタンパク質の９量体または１０量体の部分ペプチドについて、ヒト主要組織適合抗原（ＭＨＣ抗原）であるＨＬＡ抗原との結合親和性を検討した。尚、表１の右側のペプチドにおいて、小文字は５番目のアミノ酸を示す。
ヒトKDRタンパク質のアミノ酸配列は公知であり、例えば米国特許第5,861,301号に記載されており、当業者であれば容易に入手することができる。９量体及び１０量体ペプチドは、得られたKDRタンパク質の全アミノ酸配列に基づいて、任意の位置からのペプチドを合成して得ることができる。ペプチドの合成は、通常のペプチド化学において用いられる方法に準じて行うことができる。通常用いられる合成方法は、例えば、Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966; The Proteins, Vol 2, Academic Press Inc., New York, 1976; ペプチド合成、丸善（株）、1975; ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株）、1985; 医薬品の開発 続 第１４巻・ペプチド合成、広川書店、1991等の文献や、国際公開WO99/67288号等の公報に記載されている。ＨＬＡ抗原との結合は、細胞表面にＨＬＡ抗原を有する細胞、例えば樹状細胞を単離して、細胞へのペプチドの結合を通常行われる手法を用いて測定することができる。
【０００８】
あるいはまた、最近インターネット上で利用可能となっているソフトウェア、例えばParker K. C., J. Immunol. 152, 1994に記載されているもの等を用いて、種々のペプチドとＨＬＡ抗原との結合親和性をin silicoで計算することもできる。尚、ＨＬＡ抗原との結合親和性は、例えばParker, K.C., J. Immunol., 152, 1994; Nukaya, I., Int. J. Cancer, 80, 1999等に記載のように測定することができる。
【０００９】
ＨＬＡ抗原としては、例えば日本人において多く発現しているといわれるＡ−２４型またはＡ−０２型等を用いることが有効な結果を得るために好ましく、更に好ましくはＡ−２４０２、Ａ−０２０１等のサブタイプである。しかしながら、臨床においては、治療を必要とする患者のＨＬＡ抗原の型を予め調べることにより、これとの結合親和性、あるいは抗原提示による細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）誘導能の高いペプチドを適宜選択することができる。更に、結合親和性及びＣＴＬ誘導能の高いペプチドを得るために、天然に存在するKDR部分ペプチドのアミノ酸配列に基づいて１個、２個または数個のアミノ酸の置換または付加を行うこともできる。ここで、「数個」とは、５個以下、好ましくは３個以下を意味する。更に、天然において提示されるペプチド以外にも、既にＨＬＡ抗原に結合して提示されるペプチドの配列の規則性が知られているので（J. Immunol., 152, 3913, 1994; Immunogenetics. 41:178, 1995; J. Immunol. 155:4307, 1994）、得られたペプチドに対してこれらの規則性に基づいた改変を行っても良い。例えば、ＨＬＡ−２４結合親和性の高いものはペプチドのＮ末端から２番目のアミノ酸をフェニルアラニン、チロシン、メチオニンまたはトリプトファンに置換したり、Ｃ末端のアミノ酸をフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンまたはメチオニンに置換したペプチドも好適に使用することができる。一方、ＨＬＡ−０２０１結合親和性の高いものは、ペプチドのＮ末端から２番目のアミノ酸をロイシンまたはメチオニンに置換したり、Ｃ末端のアミノ酸をバリンまたはロイシンに置換したペプチドも好適に使用することができる。更に、ペプチドのＮ末端及び／またはＣ末端に１〜２個のアミノ酸が付加していても良い。
【００１０】
しかしながら、ペプチドの配列が他の機能を有する内在性または外来性のタンパク質のアミノ酸配列の一部と同一となる場合には、自己免疫疾患等の副作用が生じたり、あるいは特定の物質に対するアレルギー症状を引き起こしたりする可能性があるため、利用可能なデータベースを用いてホモロジー検索を行い、他のタンパク質のアミノ酸配列と一致することを避けるのが好ましい。更に、ホモロジー検索において、アミノ酸が１個または２個異なるペプチドも存在しないことが明らかであれば、ＨＬＡ抗原との結合親和性及び／またはＣＴＬ誘導能を高めるための上記アミノ酸配列の改変もこのような問題を生じるおそれがない。
【００１１】
上記のようにしてＨＬＡ抗原との結合親和性の高いペプチドは、癌ワクチンとして有効である可能性が高いことが予想されるが、高い結合親和性を有することを指標として選択した候補ペプチドについて、実際にＣＴＬ誘導能を有するか否かを検討することが必要である。ＣＴＬ誘導能の確認は、ヒトＭＨＣ抗原を有する抗原提示細胞（例えばＢ−リンパ球、マクロファージ、樹状細胞）、具体的にはヒト末梢血単核球由来の樹状細胞を誘導し、ペプチドで刺激した後にＣＤ８陽性細胞と混合し、標的細胞に対する細胞傷害活性を測定する。反応系として、ヒトＨＬＡ抗原を発現するように作製されたトランスジェニック動物（例えば、Hum. Immunol. 2000 Aug.;61(8):764-79 Related Articles, Books, Linkout Induction of CTL response by a minimal epitope vaccine in HLA A*0201/DR1 transgenic mice: dependence on HLA class II restricted T(H) response., BenMohamed L., Krishnan R., Longmate J., Auge C., Low L., Primus J., Diamond DJ.に記載のもの）を用いることもできる。細胞傷害活性は、例えば標的細胞を51Ｃｒ等で放射標識し、標的細胞から遊離した放射活性から計算することができる。あるいはまた、ペプチドを拘束した抗原提示細胞の存在下でＣＴＬが産生・放出したIFN-γ及び抗IFN-γモノクローナル抗体によって培地上に可視化される阻止円を測定することによって観察することもできる。
【００１２】
上記のようにしてペプチドのＣＴＬ誘導能を検討した結果、ＨＬＡ抗原との結合親和性が高いものが必ずしも誘導能が高いわけではないことが明らかとなった。そして、VYSSEEAEL（配列番号２）、GYRIYDVVL（配列番号３）、SYMISYAGM（配列番号５）、RFVPDGNRI（配列番号８）、KWEFPRDRL（配列番号１１）、またはDFLTLEHLI（配列番号１２）に示すアミノ酸配列からなるペプチドから選ばれるノナペプチド、及びAMFFWLLLV（配列番号２９）、VIAMFFWLL（配列番号３０）、AVIAMFFWL（配列番号３３）、KLIEIGVQT（配列番号３４）、YMISYAGMV（配列番号４０）またはIQSDVWSFGV（配列番号４６）に示すアミノ酸配列からなるペプチドから選ばれるノナペプチドまたはデカペプチドが特に高いＣＴＬ誘導能を有することが明らかとなった。
【００１３】
本発明は更に、配列番号２、３、５、８、１１または１２に示すアミノ酸配列において１個、２個または数個のアミノ酸が置換または付加されており、細胞傷害性Ｔ細胞の誘導能を有するペプチドも提供する。配列番号２、３、５、８、１１または１２に示す９個のアミノ酸からなるアミノ酸配列に基づいて、１個、２個または数個のアミノ酸の置換または付加は、他のタンパク質のアミノ酸配列との一致がない限りにおいて、ＣＴＬ誘導能を有し得る。特に、アミノ酸の置換として、Ｎ末端から２番目のアミノ酸のフェニルアラニン、チロシン、メチオニンまたはトリプトファンへの置換、Ｃ末端のアミノ酸のフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンまたはメチオニンへの置換、アミノ酸の付加として、Ｎ末端及び／またはＣ末端への１〜２個のアミノ酸の付加は好適な例である。
【００１４】
本発明はまた、配列番号２９、３０、３３、３４、４０、または４６に示すアミノ酸配列において１個、２個または数個のアミノ酸が置換または付加されており、細胞傷害性Ｔ細胞の誘導能を有するペプチドも提供する。配列番号２９、３０、３３、３４、４０、または４６に示す９個または１０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列に基づいて、１個、２個または数個のアミノ酸の置換または付加は、他のタンパク質のアミノ酸配列との一致がない限りにおいて、ＣＴＬ誘導能を有し得る。特に、アミノ酸の置換として、Ｎ末端から２番目のアミノ酸のロイシンまたはメチオニンへの置換、Ｃ末端のアミノ酸のバリンまたはロイシンへの置換、アミノ酸の付加として、Ｎ末端及び／またはＣ末端への１〜２個のアミノ酸の付加は好適な例である。こうした改変ペプチドの例として、限定するものではないが、例えば配列番号３０のペプチドのＮ末端から2番目のアミノ酸をロイシンに変換したペプチド（配列番号５４）が挙げられる。これらの改変ペプチドによる刺激によって得られるCTLクローンは改変前のペプチドを認識し、傷害することができる。
【００１５】
上記の本発明のペプチドは、１種または２種以上の組み合わせとして、生体内でＣＴＬを誘導し得る癌ワクチンとして使用することができる。本発明のペプチドの投与により、抗原提示細胞のＨＬＡ抗原に該ペプチドが高密度に提示され、提示されたペプチドとＨＬＡ抗原との複合体に対して特異的に反応するＣＴＬが誘導され、標的細胞となるべき腫瘍細胞内の血管内皮細胞に対する攻撃力が高まる。あるいは、被験者から樹状細胞を取り出して本発明のペプチドで刺激することにより、細胞表面に本発明のペプチドを拘束した抗原提示細胞が得られ、これを再度被験者に投与することで被験者においてＣＴＬを誘導し、標的細胞に対する攻撃力を高めることができる。
【００１６】
すなわち、本発明は、本発明のペプチドを１種以上含む、腫瘍の治療または腫瘍の増殖・転移等の予防のための医薬を提供するものである。更に、病態部位における血管新生は、腫瘍の他、糖尿病性網膜症、慢性関節リウマチ、乾癬、アテローム性動脈硬化症のような疾患、並びに固形癌の転移と深く結びついている（Folkman, J., Nature Med. 1:27-31 (1995); Bicknell, R., Harris, A.L., Curr. Opin. Oncol. 8:60-65 (1996)）。従って、本発明のペプチドは、腫瘍、糖尿病性網膜症、慢性関節リウマチ、乾癬、アテローム性動脈硬化症のような疾患、並びに固形癌の転移の治療に用いることができる。
【００１７】
本発明のペプチドは、悪性腫瘍組織において形成され、正常な血管とは形態学的に異なる蛇行性血管の形成を阻害することが確かめられたが、ワクチン接種したマウスにおける創傷治癒及び受精能を解析した結果、正常な生理的血管新生に対しては悪影響を有さないことも確認した。更に、本発明のペプチドを認識するCTLクローンを用いて非増殖性または増殖性内皮細胞に対する細胞傷害性をin vitroで試験したところ、これらのクローンは非増殖性内皮細胞よりも増殖性内皮細胞に対して強い活性を示すことも明らかとなった。すなわち、増殖性内皮細胞が観察される疾患、特に癌において非常に特異的に作用することができる。
尚、in vivo及びin vitroにおいて、本発明のペプチドによる樹状細胞の刺激は、細胞に対して高濃度のペプチドを存在させることによって、該細胞に予め拘束されているペプチドとの交換が生じ、容易に行われる。このため、本発明において使用されるペプチドは、ＨＬＡ抗原との結合親和性がある程度以上高いことが必要とされる。
【００１８】
本発明の医薬は、本発明のペプチドを単独で直接投与しても良いが、通常用いられる製剤学的方法によって製剤化した医薬組成物として投与しても良い。その場合、本発明のペプチドの他に、通常医薬に用いられる担体、賦形剤等を適宜含むことができ、特に限定されるものではない。本発明の医薬の用途としては、胃癌、十二指腸癌、大腸癌、肺癌、乳癌、前立腺癌、脳腫瘍等の種々の腫瘍の治療及び予防に用いることができる。本発明のペプチドは、腫瘍細胞そのものではなく、腫瘍組織内に新たに形成される新生血管の内皮細胞を標的とするものであり、従って、治療対象の腫瘍は広範囲にわたり、特に用途を限定するものではない。
【００１９】
本発明のペプチドを有効成分とする腫瘍の治療及び／または予防のための医薬は、細胞性免疫が効果的に成立するようにアジュバントと共に投与したり、他の抗癌剤等の有効成分と共に投与したり、また粒子状の剤型にして投与することができる。アジュバントとしては、文献（C1in. Microbio1.Rev., 7:277-289, 1994）に記載のものなどが応用可能である。また、リポソーム製剤、直径数μｍのビーズに結合させた粒子状の製剤、リピッドを結合させた製剤なども考えられる。投与方法としては、経口投与、皮内投与、皮下投与、静脈注射などが利用でき、全身投与、あるいは目的となる腫瘍の近傍に局所投与しても良い。本発明のペプチドの投与量は、治療すべき疾患、患者の年齢、体重、投与方法等により適宜調整することができるが、通常 0.001mg〜1000mg、好ましくは 0.001mg〜1OOOmg、より好ましくはO.1mg〜1Omgであり、数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。当業者であれば、適当な投与量を適宜選択することが可能である。
【００２０】
あるいはまた、本発明は、本発明のペプチドとＨＬＡ抗原との複合体を表面に提示している、エキソソームと呼ばれる細胞内小胞を提供する。エキソソームの調製は、例えば特表平１１−５１０５０７号、及び特表２０００−５１２１６１号に詳細に記載されている方法を用いて行うことができるが、好ましくは治療及び／または予防の対象となる被験者から得た抗原提示細胞を用いて調製する。本発明のエキソソームは、上記本発明のペプチドと同様に癌ワクチンとして接種することができる。
ＨＬＡ抗原としては、治療及び／または予防を必要とする被験者のＨＬＡ抗原と同じ型のものであることが必要である。例えば、日本人の場合にはＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ０２、特にＨＬＡ−Ａ２４０２またはＨＬＡ−０２０１とすると好適であることが多い。
【００２１】
本発明はまた、本発明のペプチドを用いた抗原提示細胞の誘導方法も提供する。樹状細胞を末梢血単球から誘導した後、in vitroまたはin vivoで本発明のペプチドと接触（刺激）させ、抗原提示細胞を誘導することができる。本発明のペプチドを被験者に投与した場合、被験者の体内で本発明のペプチドを拘束した抗原提示細胞が誘導される。あるいは、抗原提示細胞に本発明のペプチドをin vitroで拘束させた後に被験者にワクチンとして投与することもできる。
【００２２】
本発明はまた、上記本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子をin vitroで抗原提示細胞に導入することを含む、細胞傷害性Ｔ細胞誘導能の高い抗原提示細胞を誘導する方法を提供する。導入する遺伝子はＤＮＡの形態であってもＲＮＡの形態であっても良い。導入の方法は当分野において通常行われるリポフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム法等の種々の方法を用いれば良く、特に限定するものではない。具体的には、例えばCancer Res., 56:5672, 1996; J. Immunol., 161:5607, 1998; J. Exp. Med., 184:465, 1996; 特表2000-509281号に記載のようにして行うことができる。遺伝子を抗原提示細胞に導入することによって、該遺伝子は細胞中で転写、翻訳等の処理の後、得られたタンパク質がＭＨＣクラスＩまたはクラスIIのプロセッシング及び提示経路を経て、部分ペプチドが提示される。
【００２３】
本発明は更に、上記本発明のペプチドを用いてＣＴＬを誘導する方法を提供する。本発明のペプチドを被験者に投与した場合、被験者の体内でＣＴＬが誘導され、腫瘍組織内の新生血管の内皮細胞を標的とした免疫力が増強される。あるいは、被験者由来の抗原提示細胞及びＣＤ８陽性細胞、または末梢血単核球をin vitroで本発明のペプチドと接触（刺激）させ、ＣＴＬを誘導してから被験者にもどすex vivoの治療方法にも用いることができる。
【００２４】
本発明は更に、本発明のペプチドを用いて誘導される、単離された細胞傷害性Ｔ細胞を提供する。本発明のペプチドを提示した抗原提示細胞による刺激に基づいて誘導された細胞傷害性Ｔ細胞は、好ましくは治療及び／または予防の対象である被験者由来のものであり、単独、または、本発明のペプチド、エキソソーム等を含む、他の医薬と共に抗腫瘍効果を目的として投与することができる。得られた細胞傷害性Ｔ細胞は、本発明のペプチド、好ましくは誘導に用いられたものと同じペプチドを提示する標的細胞に対して特異的に作用する。標的細胞は、KDRを内在的に発現する細胞であっても、強制的にKDRを発現させた細胞であっても良く、また、本発明のペプチドの刺激によって細胞表面に該ペプチドを提示する細胞であっても攻撃の対象となり得る。
【００２５】
本発明は更に、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの複合体を提示してなる抗原提示細胞を提供する。本発明のペプチド、あるいは本発明のペプチドをコードするヌクレオチドとの接触によって得られる該抗原提示細胞は、好ましくは治療及び／または予防の対象である被験者由来のものであり、単独、または、本発明のペプチド、エキソソーム、細胞傷害性Ｔ細胞等を含む、他の医薬と共にワクチンとして投与することができる。
【実施例】
【００２６】
以下、実施例を挙げて本発明を更に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
［実施例１］ VEGFR-2(KDR)由来ペプチドの予測−１（HLA-A*2402）
KDR タンパク質の全アミノ酸配列から、BioInformatics & Molecular Analysis Section (BIMAS) HLA Peptide Binding Prediction soft (http://bimas.dcrt.nih.gov/cgi-bin/molbio/ken_parker_comboform)により、HLA-A*2402に対する結合親和性の高いものから順に９量体のペプチドを１２種（配列番号１〜１２）、１０量体のペプチドを１２種（配列番号１３〜２４）予測した（表１）。表１には、９量体及び１０量体のそれぞれについて結合親和性の高い順に、そのＮ末端のKDR タンパク質のアミノ酸配列における位置と共に挙げた。尚、表中のCE652（配列番号２５）はNukaya I.によって報告されている腫瘍抗原CEA（癌胎児性抗原）のエピトープの一つである（Int. J. Cancer 80, 1999）。また、陰性対照ペプチドとしてHIVペプチド（ILKEPVHGV(配列番号５５)及びRYLRDQQLL(配列番号５６)）を用いた。
ペプチドは、標準的な固相合成法に従ってCleaved PepSet（Mimotope社、San Diego, LA）で合成し、逆相HPLCで精製した。HPLC及び質量分析によって、ペプチドの純度（>95%）及び種類をそれぞれ決定した。
【００２７】
【表１】
【００２８】
［実施例２］ 予測したペプチドを用いたCTL lineの樹立
Ebstein-Bar virus (EBV)不死化B細胞株であるTISI(HLA-A24/24)とEHM(HLA-A3/3)は宝酒造バイオ研究所より供与された。
健常人の末梢血７mlを採取し、HLAのserotypingを行った。HLA-A24陽性の末梢血から、Ficoll Paque(Pharmacia)を用いた比重遠沈法にて末梢血単核球（PBMC）を分離した。
【００２９】
得られたPBMCを培養フラスコ（Corning,43072）にて10時間静置し、浮遊細胞を除去した後にAIM-V（Invitrogen）に２％自己血清を添加した培養液にヒトGM-CSF（キリンビールより供与）1,000U/ml、ヒトIL-4(Genzyme)1,000U/mlを添加しフラスコに付着した細胞を培養した。５日後にOK-432（中外製薬より供与）10μg/mlにて48時間培養し、CTLの誘導のための抗原提示細胞として使用した。樹状細胞（Dendritic cell, DC）はFITCラベルした抗ClassII,CD80,CD86抗体及び、PEラベルした抗ClassI,CD11c,CD40（いずれもBeckton-Dickinson）、CD83(Immunotech)抗体を反応させてCell Quest softwareを使用したFACS-Calibur(Becton-Dickinson)にて表面抗原の解析を行い、DCであることを確認した。
【００３０】
あらかじめ誘導しておいたDCに、実施例１で結合親和性が高いとして予測された９量体のペプチド12種類（配列番号１〜１２）（20μg/ml）を３μg/mlのβ2-ミクログロブリンの存在下で20℃、4時間パルスし、その後DCをPBMCから磁気ビーズ（Dynabeads M-450とDetachabeds）にて選択されたCD8陽性細胞に対して1:20または1:2の比で、10ng/mlのヒトIL-7(Genzyme)存在下で48 well plate(Corning)にて混合培養を行った。3日後に最終10U/mlのIL-2（SIGMA）を加えた。7日後、14日後に同様のDCにて刺激を加えてCTL誘導を行い、20日後にペプチドをパルスしたTISI細胞を標的として各wellの細胞傷害活性を測定し、陽性wellのみをアロのPBMC、EBV不死化B細胞株(EHM)及び抗CD3抗体30ng/mlにて刺激する方法で培養し、その14日後にCTLの機能解析を行った。
【００３１】
細胞傷害活性は４時間51Cr遊離法にて測定した。ペプチドをパルスする標的細胞は20μg/mlの濃度にて一晩パルスを行った。標的細胞を100μCiのNa251CrO4にて37℃、１時間ラベルした後RPMI1640にて3回洗浄し、96穴U型マイクロプレート(Corning)に標的細胞（１×104/100μl）と種々の濃度の効果細胞を100μl加え、総量200μlとして４時間、37℃のCO2インキュベーターにて培養した。培養終了後、各wellより上清を100μl採取し、γカウンターにて測定した。自然解離は標的細胞と培地で、最大解離は標的細胞と1M HCLで得られる放射活性とした。細胞傷害活性（特異的溶解のパーセンテージ）は次式により算出した。
細胞傷害活性(% Cytotoxicity)
＝(実験解離-自然解離)/(最大解離-自然解離)×100
【００３２】
その結果、表２に示すように６種類のCTL lineが樹立でき、配列番号２（アミノ酸開始位置KDR1318）、配列番号３（KDR220）、配列番号５（KDR189）、配列番号８（KDR169）、配列番号１１（KDR826）、及び配列番号１２（KDR998）に示すノナペプチドがエピトープペプチドとして特に有効であることが示された。
【００３３】
【表２】
【００３４】
［実施例３］ 予測したペプチドから誘導されるCTL クローンの樹立
実施例２において樹立した６種類のCTL lineを96穴U型プレートに0.3、1、または3 cells/wellになるように希釈した。そこにアロ のPBMC 7×104 cells/well, EHM 1×104 cells/well, 抗CD3抗体 30ng/ml,IL-2 125U/ml となるようにして、AIM-Vに５％自己血清を添加して合計 150μl/wellになるようにした。10日後にIL-2が最終濃度125U/mlになるように調節したIL-2添加mediumを50μl/wellにて加えた。14日目にCTLの機能解析を行い、活性のあるものを大量培養した。
【００３５】
その結果、配列番号８（アミノ酸開始位置KDR169）、配列番号５（KDR189）、配列番号３（KDR220）、配列番号２（KDR1318）、及び配列番号１１（KDR826）の５種のノナペプチドよりそれぞれ8種類（C13-169、C19-169、C29-169、C53-169、C72-169、C61-169、K5-169及びK25-169）、2種類（C12-189及びC18-189）、11種類（KWC3、23、25、26、36、42、46、58、61、70及び77）、1種類（C7-1318）、1種類（C65-826）のCTL クローンを樹立した（表３）。
【表３】
【００３６】
［実施例４］ 樹立したCTLクローンの細胞傷害活性の測定
実施例３において樹立した10種類のCTL クローンの細胞傷害活性の強度を、標的細胞との比率（E:T比）を変化させて検討した（図１）。
その結果、配列番号８のノナペプチド（アミノ酸開始位置KDR169）から誘導されたC53-169が最も強力な細胞傷害活性を示した。
【００３７】
［実施例５］ 樹立したCTLクローンのHLA-テトラマー解析
HLA-A*2402と配列番号８のペプチド（アミノ酸開始位置KDR169）でHLA-テトラマーを合成した。すなわち、H鎖（約35kDa）とL鎖（約11kDa）を発現するプラスミドベクターをそれぞれ作製し、大腸菌を用いてこれらの組換えタンパク質を発現させた。 H鎖のプラスミドベクターは細胞外ドメインのみで構成され、カルボキシル末端側はビオチン化酵素認識配列に置換してある。H鎖およびL鎖は抗原ペプチドと共にリフォールディングすることにより、HLAペプチド複合体を形成する。HLAペプチド複合体をビオチン化酵素によりビオチン化し，ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーにより過剰のビオチンを除去し，ビオチン化HLAペプチド複合体を分離精製した。得られたビオチン化HLAペプチド複合体をストレプトアビジン(streptavidin; SA)と4:1のモル比で反応させて四量体化し、HLA-テトラマーを合成した。試料を解析する場合には，フィコエリスリン（phycoerythrin; PE）で蛍光標識したSA（SA-PE）を使用し四量体化した。CD8分子はHLA-A,B,Cの一部を除き，α3ドメインの245番目の一アミノ酸であるアラニンに結合することが解っており、そこでアラニンをバリンへ置換した変異導入HLA-テトラマーを作製することで，CD8分子とα3ドメインの結合に依存しないHLAペプチド複合体に対し高いavidityをもつCTLを選択的に検出することが可能である変異導入HLA-テトラマーを合成した。
【００３８】
合成した変異型HLA-A24 KDR169-テトラマーにより、樹立したCTL クローンを検出した。その結果、図２に示すように、樹立したCTLクローンはテトラマー陽性かつCD8陽性のフラクションに強く染色するCTLであり、本発明のペプチド及びＨＬＡ抗原の複合体を特異的に認識するものであることが明らかになった。尚、テトラマー陰性かつCD8陰性のフラクションのシグナルはフィーダー細胞によるものである。
【００３９】
［実施例６］ VEGFR-2(KDR)由来ペプチドの予測−２（HLA-A*0201）
実施例１と同様にして、KDR タンパク質の全アミノ酸配列から、HLA Peptide Binding Prediction soft(http://bimas.dcrt.nih.gov/cgi-bin/molbio/ken_parker_comboform)によりHLA-A*0201に対する結合親和性の高いものから順に、９量体のペプチドを15種（配列番号２６〜４０）、１０量体のペプチドを１２種（配列番号４１〜５２）予測した（表４）。表４には、９量体及び１０量体のそれぞれについて結合親和性の高い順に、そのＮ末端のKDR タンパク質のアミノ酸配列における位置と共に挙げた。尚、表中のCEA588（配列番号５３）はTanaka, H.らによって報告されている腫瘍抗原CEA（癌胎児性抗原）のエピトープの一つである（ポスター発表、AACR #3669, vol.42, p681-682, March 2001）。
【００４０】
【表４】
【００４１】
［実施例７］ HLA-A*0201拘束性エピトープペプチドの決定
実施例６において予測された９量体または１０量体のペプチド16種類（配列番号２６〜４１）を、ヒトＨＬＡ（Ａ０２０１）を発現するトランスジェニックマウス（Hum. Immunol. 2000 Aug.;61(8):764-79 Related Articles, Books, Linkout Induction of CTL response by a minimal epitope vaccine in HLA A*0201/DR1 transgenic mice: dependence on HLA class II restricted T(H) response., BenMohamed L., Krishnan R., Longmate J., Auge C., Low L., Primus J., Diamond DJ.に記載）を用い、vaccination法にてCTLの誘導を行った。
【００４２】
6-8週令BALB/C(H-2d)マウスは日本クレア株式会社から手に入れた。A2/Kb トランスジェニックマウス (TGM) はF Jim Primus Ph.D. Vanderbilt-Ingram Cancer Centerより供与された。またT2細胞（TAP欠損細胞、HLA-A*0201陽性）は三重大学第三内科珠玖洋教授より供与された。
【００４３】
マウス大腿骨、脛骨より骨髄を採取し、抗CD4,CD8,Gr-1(Beckton-Dickinson)、B220(バイオサイエンス)抗体、及びウサギ補体（PeL-Freez）にてリンパ球及び顆粒球を除去した。細胞は６well plateにて培養し、翌日浮遊細胞を回収して別の６well plateにRPMI1640（Invitrogen）に10％FBSを加えた培溶液にマウスGM-CSF（キリンビールより供与）1,000U/ml,マウスIL-4(PEPRO TECH)1,000U/mlを添加し培養した。その３日後に上記培養液にてhalf medium changeを行い、その２日後にOK-432 10μg/mlにて20時間培養し、浮遊細胞をDCとして使用した。DCはFITCラベルした抗ClassII, CD40抗体及び、PEラベルした抗ClassI,CD11c,CD80,CD86（いずれもBeckton-Dickinson）抗体を反応させてCell Quest softwareを使用したFACS-Calibur (Becton-Dickinson)にて表面抗原の解析を行い、DCであることを確認した。
【００４４】
次いで、各ペプチド100μg、HbcAg120-140 helper peptide 140μg、IFA 100μlを混和(計 200μl)し、day 0に右側腹部にday11に左側腹部に皮下摂取した。Day 21 にワクチン接種したマウスの脾臓を採取し、赤血球をred lysis buffer (sigma)にて溶血除去し、その細胞の一部をIFN-γ ELISPOT assayのresponder cellとして使用した。また、残りの細胞は24 well plate (Corning)に6×106 cells/wellにてフィーダー細胞と3:1の比率にて再刺激を加え、5日後に細胞傷害活性を測定した。フィーダー細胞は同種別マウスの赤血球を除去した脾細胞をlipopolysaccharide (LPS) 25μg/ml存在下で3日間培養したものを使用した。
【００４５】
本実施例においては、ＣＴＬの誘導能をIFN-γを産生する細胞が作るSPOTで評価するIFN-γ ELISPOT法を用いた。96穴平坦底マルチスクリーンプレートMAHA S45(ミリポア)を4℃、一晩抗マウスIFN-γ単クローン抗体(Pharmingen)にて処理し、翌日0.05% Tween 20を含んだPBSにて洗浄し、室温で２時間blocking bufferと反応させた。その後、ペプチドをパルスしたT2細胞とパルスしていないT2細胞を各wellに105 cell/100μlずつ散布した。そこに、ワクチンしたマウスの碑細胞を最大4×106 cell/100μl散布して、全200μlとして一晩37℃で培養した。翌日、各wellを洗浄後、ビオチン化したラット抗マウスIFN-γ抗体(Pharmingen)と２時間反応させ、十分に洗浄し、Extravidinを加えて２時間室温で反応させた。プレートを洗浄後、Alkaline Phosphatase Conjugate Substrate(BIO-RAD)を加えて５分間室温で放置し、IFN-γの産生による青色班をKS ELISPOT compact release(Carl Zeiss)にて計測した。そして
特異的青色班＝(TISI(+)SPOT-TISI(-)SPOT)
で決定し、
TISI(+)SPOT/TISI(-)SPOT≧2を満たしたものを有効とした。
その結果、IFN-γELISPOT アッセイにて５種類のエピトープペプチド、配列番号２９（アミノ酸開始位置KDR775）、配列番号３０（KDR773）、配列番号３３（KDR772）、配列番号３４（KDR1328）及び配列番号４０（KDR190）を得た（表５）。
【００４６】
【表５】
【００４７】
［実施例８］ in vivoにおける抗腫瘍効果の確認１
ヒトＨＬＡ−Ａ２４０２とアンカーモチーフが同じである６〜８週齢の雄BALB/cマウス（CLEA Japan Inc.）の骨髄を採取し、実施例７と同様にGM-CSF（キリンビール）（1000U/ml）及びIL-4（Genzyme）（1000U/ml）を添加して培養して、樹状細胞を調製した。この樹状細胞に配列番号５のペプチド（アミノ酸開始位置KDR189）をパルスしたもの（１×１０6／マウス）をBALB/cマウス９匹に７日間隔で２回右下腹部に投与し、その７日後に結腸癌細胞株Colon26（大鵬薬品株式会社）（５×１０5個）を右腹部に接種し、マウスの生存と腫瘍増殖を検討した。
【００４８】
まず、KDRの発現をRT-PCRで確認したところ、図３に示すように、Colon26細胞系単独ではKDRを発現していないが、Colon26を接種したマウスの腫瘍組織からKDRの発現が確認できた。すなわち、腫瘍血管が腫瘍組織に出現し、腫瘍を形成していることが確かめられた。
【００４９】
図３にColon26を接種されたマウスの生存曲線を示す。対照であるHBSS（Hank's Balanced Salt Solution）のみ（100μl）の投与の場合、腫瘍接種から３５日後において、９匹中２匹の生存、ペプチドをパルスしない樹状細胞の接種では９匹中５匹の生存であったが、配列番号５のペプチドでパルスした樹状細胞の接種の場合には全９匹が生存していた。
【００５０】
図４にマウスにおけるColon26由来の腫瘍の増殖に対する効果を示す。対照と比較して、樹状細胞を接種した場合に腫瘍増殖に対する抑制効果が認められ、配列番号５のペプチドでパルスした樹状細胞の場合に顕著な抑制効果が認められた。
【００５１】
［実施例９］ 本発明のペプチドのホモロジー検索
本発明のペプチド（配列番号２（アミノ酸開始位置KDR1318）、配列番号３（KDR220）、配列番号５（KDR189）、配列番号８（KDR169）、配列番号１１（KDR826）、配列番号３０（KDR773）、及び配列番号４０（KDR190））のホモロジー検索をBLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi）にて行った結果、いずれのペプチドにおいても配列が完全に一致したものは認められなかった(表６)。実施例４において強いCTL活性を誘導できた配列番号８の９量体ペプチド（KDR169）に関しては、2個のミスマッチ配列が1つ（77.8% homology）、3個のミスマッチ配列が２つ(66.7% homology)あるのみであった。実施例８においてin vivoにおける顕著な抗腫瘍効果が認められたペプチド配列番号５のペプチド（KDR 189）に関しては、3個のミスマッチ配列が1つ(66.7% homology)あるのみであった。
【００５２】
【表６】
【００５３】
［実施例１０］ in vivoにおける抗腫瘍効果の確認２
ヒトＨＬＡ−Ａ０２０１を発現する６〜８週齢の雄A2/Kbトランスジェニックマウス（ＴＧＭ）の骨髄を採取し、実施例８と同様にGM-CSF（キリンビール）（1000U/ml）及びIL-4（Genzyme）（1000U/ml）を添加して培養して、樹状細胞を調製した。この樹状細胞に配列番号３０（アミノ酸開始位置KDR773）のペプチドをパルスしたもの（１×１０6／マウス）をA2/Kbトランスジェニックマウス１２匹に７日間隔で２回左下腹部に投与し、その７日後にB16メラノーマ細胞（ATCC）（１×１０6個）を右腹部に接種し、マウスの生存と腫瘍増殖を検討した。
【００５４】
図５にB16を接種されたマウスの生存率を示す。対照であるHBSSのみ（100μl）の投与の場合、腫瘍接種から３５日後において、１２匹中８匹の生存、ペプチドをパルスしない樹状細胞の接種では１２匹中１１匹の生存であったが、配列番号３０のペプチドでパルスした樹状細胞の接種の場合には全１２匹が生存していた。
【００５５】
図６にマウスにおけるB16マウス由来の腫瘍の増殖に対する効果を示す。対照と比較して、樹状細胞を接種した場合に腫瘍増殖に対する抑制効果が認められ、配列番号３０のペプチドでパルスした樹状細胞の場合に顕著な抑制効果が認められた。
【００５６】
［実施例１１］ KDRを強制発現させた細胞に対する細胞障害活性
Miyake, S.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 1320-1324 (1996)に記載の方法に従い、HLA-A24陽性であるヒト大腸癌HT29株（ATCC）にアデノウイルスを用いてKDR（J. Biol. Chem. 1994 Oct 28;269(43):26988-95参照）を強制発現した。具体的には、ヒト293細胞のプラークアッセイによって決定した力価に基いて、細胞を特定の多重度で感染させた。HT29細胞を60mmのディッシュ中に１０5個の細胞密度で接種し、24時間インキュベートした。次の日、培地を捨て、新しい培地で連続希釈したウイルス200μlと交換した。37℃で１時間インキュベーションした後、増殖培地を添加し、細胞を48時間培養して標的細胞として使用した。対照としてEGFP（Leukemia 1999 Apr; 13(4):605-13参照）をアデノウイルスにて強制発現したHLA-A24陽性HT29株を用いた。KDRとEGFPを強制発現したHT29株は、細胞表面に各々その部分ペプチドを提示している可能性がある。
【００５７】
HLA-A24に結合する配列番号８のペプチド（アミノ酸開始位置KDR169）から誘導された実施例３に記載のCTLクローンC29-169を用い、KDR強制発現HLA-A24陽性HT29細胞に対する殺細胞効果をクロムリリースアッセイにて測定した。結果を図７に示す。
【００５８】
細胞障害活性は４時間51Cr遊離法にて測定した。標的細胞は6 well plate に１×106cells/wellの濃度にて２４時間培養し、KDR又はEGFPを導入したアデノウイルス（Ad-KDR又はAd-EGFP）をMOI 50にて感染させ、４８時間後に使用した。標的細胞を100μCiのNa251CrO4にて37℃、１時間ラベルした後、RPMI1640にて3回洗浄し、96穴U型マイクロプレート(Corning)に標的細胞（１×104 cells/100μl）と種々の濃度の効果細胞を100μl加え、総量200μlとして４時間、37℃のCO2インキュベーターにて培養した。培養終了後、各wellより上清を100μl採取し、γカウンターにて測定し、実施例２と同様にして細胞障害活性を算出した。
【００５９】
その結果、図７に示すように、CTLクローンC29-169は、KDRを強制発現したHLA-A24陽性HT29に対し、EGFPを強制発現した細胞と比較して顕著に高い殺細胞効果を示した。
【００６０】
［実施例１２］ 内因的にKDRを発現している細胞に対する細胞障害活性
KDRを内因的に発現しているHLA-A24陽性ヒト臍帯血管内皮細胞由来HUVEC KT5株に対する実施例３に記載のCTLクローンC29-169の殺細胞効果について、KDR陽性、HLA-A24陰性HUVEC株 P8を対照として検討した。これらの細胞はKDRの部分ペプチドを細胞表面に提示する。
【００６１】
細胞障害活性は４時間51Cr遊離法にて測定した。標的細胞を100μCiのNa251CrO4にて37℃、１時間ラベルした後RPMI1640にて3回洗浄し、96穴U型マイクロプレート(Corning)に標的細胞（１×104 cells/100μl）と種々の濃度の効果細胞を100μl加え、総量200μlとして４時間、37℃のCO2インキュベーターにて培養した。培養終了後、各wellより上清を100μl採取し、γカウンターにて測定し、実施例２と同様にして細胞障害活性を算出した。
【００６２】
図８の結果から明らかなように、CTLクローンC29-169は、内在的にKDRを発現しているHLA-A24陽性HUVECに対して殺細胞効果を示し、HLA-A24陰性HUVECに対しては低い殺細胞効果を示した。
【００６３】
［実施例１３］ HLA-A0201結合性ペプチドを用いたCTLクローンの樹立
実施例７のELISPOT解析において有効とされたHLA-A0201に結合する配列番号４０のペプチド（アミノ酸開始位置KDR190）、配列番号３０のペプチド（KDR773）のＮ末端から2番目のアミノ酸をロイシンに変換したペプチドKDR773-2L（配列番号５４）、配列番号２９のペプチド（KDR775）、配列番号３４のペプチド（KDR1328）、及び配列番号３３（KDR772）を用いて、実施例３と同様にして、それぞれ2種類（KWC14-190、KWC65-190）、4種類（KWC44-773-2L、KWC76-773-2L、KWC129-773-2L、KWC134-773-2L）、2種類（KWC81-775、KWC85-775）、12種類（KWC16、KWC21、KWC22、KWC47、KWC51、KWC108、KWC117、KWC132、KWC151、KWC153、KWC156、KWC159）、1種類（KWC72-772）のCTLクローンを得た。それぞれの細胞傷害活性を表７に示す。
【００６４】
【表７】
【００６５】
表７の結果から明らかなように、配列番号２９、３３、３４、または４０に示すペプチド、及び配列番号３０に示すペプチドのＮ末端から２番目のアミノ酸がロイシンである配列番号５４に示すペプチドのいずれも、顕著な細胞傷害活性を有するCTLを誘導することができ、エピトープペプチドとして有効であることが示された。
【００６６】
［実施例１４］
HLA-A0201陽性T2株に配列番号２９のペプチド（アミノ酸開始位置KDR775）を加えて標的細胞とし、実施例１３で配列番号２９のペプチドから得られたCTLクローン（KDR C85-775(KWC85-775)）の殺細胞効果をクロムリリースアッセイを用いて検討した。
その結果、図９に示すように、CTLクローンC85-775(KWC85-775)は、配列番号２９のペプチドを提示したHLA-A0201陽性細胞に対して明らかに殺細胞効果を示した。これに対して、配列番号２９のペプチドを提示しない対照細胞に対しては、全く殺細胞効果が見られなかった。
【００６７】
［実施例１５］
KDRをアデノウイルスで強制発現させた肝細胞癌株HLA-A0201陽性HePG2に対するCTLクローン(KDR C85-775(KWC85-775))の殺細胞効果をクロムリリースアッセイを用いて検討した。対照としてEGFPを強制発現させたHLA-A0201陽性HePG2を用いた。
その結果、図１０に示すように、CTLクローンC85-775(KWC85-775)は、KDRペプチドを表面に提示したHLA-A0201陽性細胞に対し、EGFPペプチドを提示した細胞と比較して顕著に高い殺細胞効果を示した。
【００６８】
［実施例１６］
HLA-A0201陽性T2株に配列番号３４のペプチド（アミノ酸開始位置KDR1328）を加えて標的細胞とし、実施例１３で配列番号３４のペプチドから得られたCTLクローン（KDR C51-1328(KWC51)）の殺細胞効果をクロムリリースアッセイを用いて検討した。
その結果、図１１に示すように、CTLクローンKDR C51-1328(KWC51)は、配列番号３４のペプチドを提示したHLA-A0201陽性細胞に対して明らかに殺細胞効果を示した。これに対して、配列番号３４のペプチドを提示しない対照細胞に対しては、全く殺細胞効果が見られなかった。
【００６９】
［実施例１７］
KDRをアデノウイルスで強制発現させた肝細胞癌株HLA-A0201陽性HePG2に対するCTLクローン(KDR C51-1328(KWC51))の殺細胞効果をクロムリリースアッセイを用いて検討した。対照としてEGFPを強制発現させたHLA-A0201陽性HePG2を用いた。
その結果、図１２に示すように、CTLクローンKDR C51-1328(KWC51)は、KDRペプチドを表面に提示したHLA-A0201陽性細胞に対し、EGFPペプチドを提示した細胞と比較して顕著に高い殺細胞効果を示した。
【００７０】
［実施例１８］
HLA-A0201陽性T2株に配列番号３０の2番目のペプチドをロイシンに変換した配列番号５４のペプチド（KDR773-2L）を加えて標的細胞とし、実施例１３で配列番号３４のペプチドから得られたCTLクローン（KDR C44-773-2L(KWC44-773-2L)）の殺細胞効果をクロムリリースアッセイを用いて検討した。結果を図１３に示す。
その結果、図１３に示すように、CTLクローンKDR C44-773-2L(KWC44-773-2L)は、KDR773-2Lを提示したHLA-A0201陽性細胞に対して明らかに殺細胞効果を示した。これに対して、KDR773-2Lを提示しない対照細胞に対しては、全く殺細胞効果が見られなかった。
【００７１】
［実施例１９］
HLA-A0201陽性T2株に配列番号３０の2番目のペプチドをロイシンに変換した配列番号５４に示すペプチド（KDR773-2L）より得られたCTLクローン（KDR C44-773-2L(KWC44-773-2L)）のクロムリリースアッセイでの殺細胞効果を、標的細胞としてT2に改変していない配列番号３０に示すペプチド（アミノ酸開始位置KDR773）をパルスしたもので検討した。
その結果、図１４に示すように、改変したペプチドで刺激し、得られたCTLクローンは改変前のペプチドを認識し、傷害することができた。
【００７２】
［実施例２０］
KDRをアデノウイルスで強制発現させた肝細胞癌株HLA-A0201陽性HePG2に対するCTLクローン(KDR C44-773-2L(KWC44-773-2L))の殺細胞効果をクロムリリースアッセイを用いて検討した。対照としてEGFPを強制発現させたHLA-A0201陽性HePG2を用いた。
その結果、図１５に示すように、CTLクローンKDR C44-773-2L(KWC44-773-2L)は、KDRペプチドを表面に提示したHLA-A0201陽性細胞に対し、EGFPペプチドを提示した細胞と比較して顕著に高い殺細胞効果を示した。
【００７３】
［実施例２１］
KDRをアデノウイルスで強制発現させた肝細胞癌株HLA-A0201陽性HePG2に対する配列番号３４のペプチドから得られたCTLクローン(KDR C51-1328(KWC51))の殺細胞効果が各種抗体でブロックされるかどうかについて検討した。
その結果、図１６に示すように、標的細胞が提示するHLA抗原に対する抗HLA ClassI抗体と、細胞傷害性Ｔ細胞のマーカーとなるCD8に対する抗CD8抗体がその作用を阻害した。
【００７４】
［実施例２２］ Dorsal Air Sac assay(DAS)による血管新生阻害活性の検討
ペプチドエピトープの実際の血管新生阻害活性をマウスでDASアッセイ（Clinical Cancer Research Vol.5, 2185-2191, August 1999; Cancer Research 62, 6116-6123, November 1, 2002参照）にて評価した。
【００７５】
チャンバーリングの両面にメンブレンフィルターを固定し、エチレンオキサイトガスで滅菌した。Ｂ１６メラノーマ細胞を５×105 cells/0.15mlに調整し、チャンバー内に注入した。マウス（A2/kbトランスジェニックマウス(B16由来)）を腹臥位として固定し、マウス背部皮下にシリンジにて５〜１０mlの空気を注入しair sacを作製した。Sac下部を約１cm切開し、細胞浮遊液で満たされたチャンバーリングを背部皮下に移植し、皮膚をスキンステープラで閉じた。移植日より６日目にマウス皮膚をチャンバーごと剥皮し、伸展させた状態で固定した。黒色ゴムリングでマーキングし、実態顕微鏡を用いて新生血管を計測した。悪性腫瘍細胞から放出される血管新生因子によって新たに形成される血管は、ジグザグに進行する特徴があり、本来存在するバックグラウンドの血管とは形態学的に異なっている。従って、新生血管の判定はゴムリング内の蛇行走行を示す血管で、長さが３mm以上のものとし、血管新生指数（Angiogenesis Index(AI)）としてカウントした。AIは蛇行血管数に応じて０〜５までの６段階で評価し、蛇行血管が５本以上のものはすべて５とした。
ワクチン接種はチャンバー移植の１４日前にHBSS、DC単独、DCにペプチドパルスしたものをそれぞれ５×１０4cells尾静脈に注入し、それを１週間後に再度行い、計２回接種した。結果を図１７及び以下の表８に示す。
【００７６】
【表８】
【００７７】
図１７及び表８の結果から明らかなように、DCに配列番号４０に示すペプチド（アミノ酸開始位置KDR190）、配列番号３３に示すペプチド（KDR772）、配列番号３０に示すペプチド（KDR773）、配列番号５４に示すペプチド（KDR773-2L）、配列番号２９に示すペプチド（KDR775）、及び配列番号４６に示すペプチド（KDR1084）をワクチン接種した群において、DC単独投与群と比較して、蛇行血管の形成が明らかに抑制され、統計学的有意さをもって血管新生阻害効果があった。
【００７８】
尚、これらのエピトープペプチドを用いたワクチン接種による正常な生理的血管新生に対する悪影響を観察するために、ワクチン接種したマウスにおける創傷治癒及び受精能を解析した。しかしながら、ワクチン接種したマウスにおいて有意な悪影響はなかった。更に、KDRペプチドを認識するCTLクローンを用いて非増殖性または増殖性内皮細胞に対する細胞傷害性をin vitroで試験し、ヒトにおける悪影響を検討したところ、これらのクローンは非増殖性内皮細胞よりも増殖性内皮細胞に対して強い活性を示した。
【００７９】
［実施例２３］
ヒトHLA-A0201を発現するA2/Kbトランスジェニックマウスを用いて大腸癌株MC38移植担癌マウスに対する配列番号３０(アミノ酸開始位置KDR773)と配列番号３４（KDR1084）ペプチドを不完全フロイントアジュバントと混合させてそれぞれday3,13に投与した場合の腫瘍体積の変化を示した。
【００８０】
実施例２２と同様のワクチン接種方法でHLA-A*0201拘束性エピトープペプチド(KDR773)による治療モデルにおけるin vivo抗腫瘍効果を腫瘍面積により評価した。その結果、図１８から明らかなように、配列番号３０のペプチド及び配列番号３４のペプチドのワクチン接種により、有意な腫瘍増殖抑制効果が確認できた。
【００８１】
［実施例２４］
HLA-A0201陽性T2株に配列番号４０のペプチド（アミノ酸開始位置KDR190）を加えて標的細胞とし、実施例１３で配列番号４０のペプチドから得られたCTLクローン（KWC65-190）の殺細胞効果をクロムリリースアッセイを用いて検討した。
【００８２】
その結果、図１９に示すように、CTLクローンKWC65-190は、配列番号４０のペプチドを提示したHLA-A0201陽性細胞に対して明らかに殺細胞効果を示した。これに対して、配列番号４０のペプチドを提示しない対照細胞に対しては、全く殺細胞効果が見られなかった。
【００８３】
［実施例２５］
HLA-A0201陽性T2株に配列番号３３のペプチド（アミノ酸開始位置KDR772）を加えて標的細胞とし、実施例１３で配列番号３３のペプチドから得られたCTLクローン（KWC72-772）の殺細胞効果をクロムリリースアッセイを用いて検討した。
その結果、図２０に示すように、CTLクローンKWC72-772は、配列番号３３のペプチドを提示したHLA-A0201陽性細胞に対して明らかに殺細胞効果を示した。これに対して、配列番号３３のペプチドを提示しない対照細胞に対しては、全く殺細胞効果が見られなかった。
【００８４】
［実施例２６］
KDRをアデノウイルスで強制発現させた肝細胞癌株HLA-A0201陽性HePG2に対するCTLクローン(KWC72-772)の殺細胞効果をクロムリリースアッセイを用いて検討した。対照としてEGFPを強制発現させたHLA-A0201陽性HePG2を用いた。
その結果、図２１に示すように、CTLクローンKWC72-772は、KDRペプチドを表面に提示したHLA-A0201陽性細胞に対し、EGFPペプチドを提示した細胞と比較して顕著に高い殺細胞効果を示した。
【００８５】
［実施例２７］
HLA-A24陽性であるヒトB-リンパ芽球細胞系A24-LCL（HLA-A24/24、宝酒造製）に配列番号２（アミノ酸開始位置KDR1318）、３（KDR220）、５（KDR189）、及び１１（アミノ酸開始位置KDR826）のペプチドを加えて標的細胞とし、実施例３に記載のCTLクローンC7-1318、KWC46、C18-189、及びC65-826の殺細胞効果をクロムリリースアッセイを用いて検討した。
その結果、図２２〜２５に示すように、CTLクローンC7-1318、KWC46、C18-189、及びC65-826は、それぞれ配列番号２、３、５、及び１１のペプチドを提示したHLA-A24陽性細胞に対して明らかに殺細胞効果を示した。これに対して、各ペプチドを提示しない対照細胞に対しては、全く、またはほとんど殺細胞効果が見られなかった。
【００８６】
［実施例２８］
実施例１１と同様にして、KDRをアデノウイルスで強制発現させたヒト大腸癌HT29株（ATCC）に対する実施例３に記載のCTLクローンC7-1318、KWC46、C18-189、及びC65-826の殺細胞効果をクロムリリースアッセイを用いて検討した。対照としてEGFPを強制発現させたHLA-A24陽性HT29株を用いた。
その結果、図２６〜２９に示すように、CTLクローンC7-1318、KWC46、C18-189、及びC65-826は、いずれもKDRを強制発現したHLA-A24陽性HT29に対し、EGFPを強制発現した細胞と比較して顕著に高い殺細胞効果を示した。
【００８７】
［実施例２９］
実施例２２と同様にして、BALB/cマウスにおいてcolon26細胞によって誘導される血管新生応答に対するペプチドエピトープの血管新生阻害活性をDASアッセイにて評価した。
図３０及び３１の結果から明らかなように、DCに配列番号５に示すペプチド（アミノ酸開始位置KDR189）及び配列番号１１に示すペプチド（KDR826）をワクチン接種した群において、DC単独投与群と比較して、蛇行血管の形成が明らかに抑制され、統計学的有意さをもって血管新生阻害効果があった。
【００８８】
［実施例３０］
癌患者のPBMCを用いて、各種エピトープペプチド（HLA-24結合親和性の高いペプチドとして配列番号８(アミノ酸開始位置KDR169)、配列番号５(KDR189)、配列番号３(KDR220)、配列番号１１(KDR826)、及び配列番号１７(KDR1318)、並びにHLA-A0201結合親和性の高いペプチドとして配列番号４０(KDR190)、配列番号３３(KDR772)、配列番号３０(KDR773)、配列番号２９(KDR775)、及び配列番号３４(KDR1328)）で刺激した後の各ペプチドに対するCTL応答を調べた。
【００８９】
Maeda, Y.ら、Br. J. Cancer 87, 796-804 (2002)に報告されている方法を用いてPBMC中のペプチド特異的CTLを検出した。まず、患者から採取したPBMC（１×１０5個）を200μlの培地を入れたｕ底型の９６ウェルプレートのウェルで各ペプチド１０μＭと共にインキュベートした。培地は45％のRPMI-1640培地、45％のAIM-V培地、10%のFBS、100U/mlのインターロイキン-2（IL-2）、及び0.1μM MEM非必須アミノ酸溶液から構成される。3日ごとに培地の半分を除去し、対応するペプチド（20μM）を含有する新しい培地と交換した。12日間のインキュベーション後、細胞を回収して各ペプチドに応答したIFN-γ産生能を試験した。対応するペプチドに応答してペプチドで刺激したPBMCによって産生されるIFN-γの量が対照であるHIVペプチドに応答して産生される量の２倍以上多い場合には陽性と判定した。
【００９０】
その結果、HLA-A2及び-A24の癌患者においても、健康なドナーと同様にCTL前駆体が産生されることが示された（表９）。表中、患者Ａ、Ｂ及びＣはHLA-A24型の患者であり、患者ＤはHLA-A02型の患者である。また患者Ａ及び患者Ｄは結腸癌患者、患者Ｂ及び患者Ｃはメラノーマ患者である。尚、ＣＭＶは陽性対照として用いたサイトメガロウイルス由来ペプチドであり、該ペプチドについてはＡ−２４結合親和性の高いものは、例えばKuzushima, K.ら, Blood 2001, 98(6):p1872-1881に、Ａ−２結合親和性の高いものは、例えばSolache A.ら, J. of Immunol. 1999, 163(10);p5512-5518にそれぞれ記載されている。
【００９１】
【表９】
【００９２】
更に、実施例１４等と同様にして標準的な４時間の51Cr遊離法を行い、これらのCTL前駆体からCTL系を確立した（図３２）。
【産業上の利用可能性】
【００９３】
本発明により、広範囲にわたる腫瘍組織に形成される内皮細胞を標的として細胞傷害性T細胞を誘導し、癌ワクチンとして非常に有効な新規ペプチド、及びこれを含有する腫瘍の治療及び予防のための医薬が提供される。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】図１は、標的細胞に対するCTLクローンによる細胞傷害活性を示す。
【図２】図２は、樹立したCTLクローンのHLA-テトラマー解析の結果を示す。（ａ）本発明のペプチドによって誘導されたCTLクローン及びフィーダー細胞（ｂ）フィーダー細胞（対照）
【図３】図３は、colon26を接種したBALB/cマウスの生存に対する本発明のペプチドを用いたワクチン接種の効果を示す。
【図４】図４は、colon26由来の腫瘍の増殖に対する本発明のペプチドを用いたワクチン接種の効果を示す。
【図５】図５は、B16を接種したマウスの生存に対する本発明のペプチドを用いたワクチン接種の効果を示す。
【図６】図６は、B16メラノーマ由来の腫瘍の増殖に対する本発明のペプチドを用いたワクチン接種の効果を示す。A2/Kb TGMに対してB16腫瘍細胞を皮下注射でチャレンジする前に、KDR773でパルスしたDC（●）、DC単独（△）、またはHBSS（□）で１週間の間隔をおいて２回ワクチン接種した。平均の腫瘍増殖を図示した。Ｐ<0.01。
【図７】図７は、本発明のペプチドを提示したHLA-A24陽性細胞に対するCTLクローンC29-169の殺細胞効果を示す。
【図８】図８は、本発明のペプチドを提示したHLA-A24陽性細胞に対するCTLクローンC29-169の殺細胞効果を示す。
【図９】図９は、本発明のペプチドを提示したHLA-A0201陽性細胞に対するCTLクローンKDR C85-775(KWC85-775)の殺細胞効果を示す。
【図１０】図１０は、KDRペプチドを提示したHLA-A0201陽性細胞に対するCTLクローンKDR C85-775(KWC85-775)の殺細胞効果を示す。
【図１１】図１１は、本発明のペプチドを提示したHLA-A0201陽性細胞に対するCTLクローンKDR C51-1328(KWC51)の殺細胞効果を示す。
【図１２】図１２は、KDRペプチドを提示したHLA-A0201陽性細胞に対するCTLクローンKDR C51-1328(KWC51)の殺細胞効果を示す。
【図１３】図１３は、本発明のペプチドを提示したHLA-A0201陽性細胞に対するCTLクローンKDR C44-773-2L(KWC44-773-2L)の殺細胞効果を示す。
【図１４】図１４は、本発明のペプチドを提示したHLA-A0201陽性細胞に対するCTLクローンKDR C44-773-2L(KWC44-773-2L)の殺細胞効果を示す。
【図１５】図１５は、KDRペプチドを提示したHLA-A0201陽性細胞に対するCTLクローンKDR C44-773-2L(KWC44-773-2L)の殺細胞効果を示す。
【図１６】図１６は、CTLクローンの殺細胞効果に対する各種抗体の阻害作用を示す。
【図１７】図１７は、A2/Kb TGMにおいてB16細胞によって誘導される血管新生応答に対する本発明のペプチドの阻害活性を示す。マウスをHBSS、パルスしていないDC、または本発明のエピトープペプチド（KDR190、772、773、773-2L、775、または1084）でパルスしたDCで２回ワクチン接種した。矢印は特徴的なジグザグに進む新たに形成された血管を示す。
【図１８】図１８は、本発明のペプチドのトランスジェニックマウスにおけるヒト腫瘍体積の増加に対する抑制効果を示す。
【図１９】図１９は、本発明のペプチドを提示したHLA-A0201陽性細胞に対するCTLクローンKWC65-190の殺細胞効果を示す。黒四角：ペプチド存在下、□：ペプチド不存在下
【図２０】図２０は、本発明のペプチドを提示したHLA-A0201陽性細胞に対するCTLクローンKWC72-772の殺細胞効果を示す。黒四角：ペプチド存在下、□：ペプチド不存在下
【図２１】図２１は、KDRペプチドを提示したHLA-A0201陽性細胞に対するCTLクローンKWC72-772の殺細胞効果を示す。黒四角：HePG2-VEGFR2、□：HePG2-EGFP
【図２２】図２２は、本発明のペプチドを提示したHLA-A24陽性細胞に対するCTLクローンC7-1318の殺細胞効果を示す。黒四角：ペプチド存在下、□：ペプチド不存在下
【図２３】図２３は、本発明のペプチドを提示したHLA-A24陽性細胞に対するCTLクローンKWC46の殺細胞効果を示す。黒四角：ペプチド存在下、□：ペプチド不存在下
【図２４】図２４は、本発明のペプチドを提示したHLA-A24陽性細胞に対するCTLクローンC18-189の殺細胞効果を示す。黒四角：ペプチド存在下、□：ペプチド不存在下
【図２５】図２５は、本発明のペプチドを提示したHLA-A24陽性細胞に対するCTLクローンC65-826の殺細胞効果を示す。黒四角：ペプチド存在下、□：ペプチド不存在下
【図２６】図２６は、本発明のペプチドを提示したHLA-A24陽性細胞に対するCTLクローンC7-1318の殺細胞効果を示す。黒四角：HT29-VEGFR2、□：HT29-EGFP
【図２７】図２７は、本発明のペプチドを提示したHLA-A24陽性細胞に対するCTLクローンKWC46の殺細胞効果を示す。黒四角：HT29-VEGFR2、□：HT29-EGFP
【図２８】図２８は、本発明のペプチドを提示したHLA-A24陽性細胞に対するCTLクローンC18-189の殺細胞効果を示す。黒四角：HT29-VEGFR2、□：HT29-EGFP
【図２９】図２９は、本発明のペプチドを提示したHLA-A24陽性細胞に対するCTLクローンC65-826の殺細胞効果を示す。黒四角：HT29-VEGFR2、□：HT29-EGFP
【図３０】図３０は、BALB/cにおいてcolon26細胞によって誘導される血管新生応答に対する本発明のペプチドの阻害活性を示す。マウスをHBSS、パルスしていないDC、または本発明のエピトープペプチド（KDR189または826）でパルスしたDCで２回ワクチン接種した。矢印は特徴的なジグザグに進む新たに形成された血管を示す。
【図３１】図３１は、BALB/cにおいてcolon26細胞によって誘導される血管新生応答に対する本発明のペプチドの阻害を示す。柱は平均を、縦棒は標準誤差を示す。
【図３２】図３２は、本発明のペプチドで刺激した患者由来のCTLによるHLA-A24陽性細胞に対する殺細胞効果を示す。黒ひし形：ペプチド存在下、□：ペプチド不存在下（Ａ）配列番号８（アミノ酸開始位置KDR169）で刺激して得られた結腸癌患者由来のCTLの殺細胞効果（Ｂ）配列番号５（アミノ酸開始位置KDR189）で刺激して得られた結腸癌患者由来のCTLの殺細胞効果（Ｃ）配列番号３（アミノ酸開始位置KDR220）で刺激して得られた結腸癌患者由来のCTLの殺細胞効果
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌ワクチンとして非常に有効な新規ペプチド、及び該ペプチドを含む腫瘍の治療及び予防のための医薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍拒絶抗原遺伝子が悪性黒色腫を中心に同定されるに従って、それを応用した癌免疫療法が開発されている。とりわけ、抗腫瘍免疫応答におけるCD8陽性T細胞の重要性が認識されるに伴い、腫瘍特異的CD8陽性T細胞を生体内で惹起させる癌ワクチン療法が着目され、種々の臨床応用が行われている。また、10個前後のアミノ酸残基からなるペプチドが種々の共刺激分子の補助によりClassI経路を介してT細胞を活性化し、腫瘍特異的細胞傷害性T細胞(CTL)を誘導する機序が解明され、さらに個々のHLA分子に拘束性を示すペプチドの同定も精力的に進んでいる。
【０００３】
しかしながら、腫瘍を制御する事は未だ完全に出来ていないのが現状である。その原因として、腫瘍細胞の不均一性、腫瘍細胞におけるMHC-Class Iの発現低下や消失、さらに腫瘍細胞における標的分子の欠落が考えられる。また、現在同定されている腫瘍抗原ペプチドはある種の腫瘍に存在するが、全ての腫瘍を網羅できるものではない。そこで、これらの問題点を解決するため、標的細胞を腫瘍細胞ではなく、腫瘍血管における内皮細胞に着目した。すなわち、内皮細胞はMHC-Class Iの発現低下や消失、また不均一性といった問題がほとんどないので、腫瘍血管を標的にするCTLが誘導できれば、腫瘍の種類に関係なく、またClass Iの消失や標的分子の欠損といった従来の癌ワクチン療法で問題となっていた原因を凌駕でき、治療効果が大いに期待できると考えられる。癌における新生血管の研究は1970年代のFolkmanらの先駆的な仮説の提唱に始まり、様々な角度から研究がなされている。なかでも、VEGF-VEGF受容体(VEGFR)において多くの検討がなされ、腫瘍新生血管におけるその意義が評価されている。特に癌治療においては、target-oriented drugとして新生血管阻害剤の開発が精力的に進められ、すでに臨床治験も行われているが、この考え方を癌ワクチン療法に生かした治療は未だ行われていない。一つの理由としてVEGFRが正常細胞に発現しているため免疫寛容状態になっていると考えられた。しかしながら、1990年代のPlate, Millauer, Risauらの研究により腫瘍組織における内皮細胞においてVEGFRが強発現している事が確認され、また、CEA,HER/neuのように正常細胞でも発現している自己抗原に対する免疫応答が必ずしも免疫寛容状態になっていないことが明らかになった事により、VEGFR が癌ワクチン療法の標的に成り得るのではないかと考えた。
【０００４】
最近、VEGFRに対する能動免疫を行うことにより、腫瘍における血管新生及び転移を抑制できることが報告された（非特許文献１；The Journal of experimental medicine 2002年 第195巻 第12号 p.1575-1584）。しかし、この文献では可溶性のVEGFRタンパク質を用いているに過ぎず、有効なペプチドのアミノ酸配列についての検討は何らなされていない。
【非特許文献１】The Journal of experimental medicine 2002年 第195巻 第12号 p.1575-1584
【発明の開示】
【０００５】
本発明者等は、VEGFシグナルにおいて内皮細胞の増殖に関与すると考えられ、腫瘍組織内皮細胞において強発現しているVEGFR2 (KDR/flk-1、以下KDRという)を標的とした癌ワクチン療法の可能性に着目し、ワクチンとして有効に用いることができるペプチドの探索を行い、その特異性について検討を行い、本発明を完成するに到った。
【０００６】
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（２２）を提供する。
（１） 配列番号２、３、５、８、１１または１２に示すアミノ酸配列からなるペプチドから選ばれるノナペプチド。
（２） 配列番号２、３、５、８、１１または１２に示すアミノ酸配列において１個、２個または数個のアミノ酸が置換または付加されており、細胞傷害性Ｔ細胞の誘導能を有するペプチド。
（３） Ｎ末端から２番目のアミノ酸がフェニルアラニン、チロシン、メチオニンまたはトリプトファンである、上記（２）に記載のペプチド。
（４） Ｃ末端のアミノ酸がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンまたはメチオニンである、上記（２）または（３）に記載のペプチド。
（５） 配列番号２９、３０、３３、３４、４０、または４６に示すアミノ酸配列からなるペプチドから選ばれるノナペプチドまたはデカペプチド。
（６） 配列番号２９、３０、３３、３４、４０、または４６に示すアミノ酸配列において１個、２個または数個のアミノ酸が置換または付加されており、細胞傷害性Ｔ細胞の誘導能を有するペプチド。
（７） Ｎ末端から２番目のアミノ酸がロイシンまたはメチオニンである、上記（６）に記載のペプチド。
（８） Ｃ末端のアミノ酸がバリンまたはロイシンである、上記（６）または（７）に記載のペプチド。
（９） 上記（１）〜（８）のいずれかに記載のペプチドを１種以上含む、腫瘍の治療及び／または予防のための医薬。
（１０） 上記（１）〜（８）のいずれかに記載のペプチドを１種以上含む、糖尿病性網膜症、慢性関節リウマチ、乾癬、アテローム性動脈硬化症の治療のための医薬。
（１１） 上記（１）〜（８）のいずれかに記載のペプチドとＨＬＡ抗原とを含む複合体を表面に提示しているエキソソーム。
（１２） ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ０２である、上記（１１）に記載のエキソソーム。
（１３） ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２４０２またはＨＬＡ−０２０１である、上記（１２）に記載のエキソソーム。
（１４） 上記（１）〜（８）のいずれかに記載のペプチドを用いてＣＴＬ誘導能の高い抗原提示細胞を誘導する方法。
（１５） 上記（１）〜（８）のいずれかに記載のペプチドを用いてＣＴＬを誘導する方法。
（１６） 上記（１）〜（８）のいずれかに記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子を抗原提示細胞に導入することを含む、細胞傷害性Ｔ細胞誘導能の高い抗原提示細胞を誘導する方法。
（１７） 上記（１）〜（８）のいずれかに記載のペプチドを用いて誘導される、単離された細胞傷害性Ｔ細胞。
（１８） ＨＬＡ抗原と上記（１）〜（８）のいずれかに記載のペプチドとの複合体を提示してなる抗原提示細胞。
（１９） 上記（１４）または（１５）に記載の方法によって誘導される、上記（１８）に記載の抗原提示細胞。
（２０） 上記（１）〜（８）のいずれかに記載のペプチドを有効成分とする、病態部位における血管新生阻害のためのワクチン。
（２１） ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ０２である被験者に対して投与するための、上記（２０）に記載のワクチン。
（２２） 悪性腫瘍の増殖及び／または転移を抑制するために使用される、上記（２０）または（２１）に記載のワクチン。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2002-267285、2003-062003、2003-167042号の明細書および/または図面に記載される内容を包含する。
【０００７】
［発明の実施の形態］
本発明者等はまず、in vivoにおいて抗原提示細胞上に提示される場合に、種々のタンパク質が９量体のペプチド（ノナペプチド）に分解されてから提示されることを考慮し、KDRタンパク質の９量体または１０量体の部分ペプチドについて、ヒト主要組織適合抗原（ＭＨＣ抗原）であるＨＬＡ抗原との結合親和性を検討した。尚、表１の右側のペプチドにおいて、小文字は５番目のアミノ酸を示す。
ヒトKDRタンパク質のアミノ酸配列は公知であり、例えば米国特許第5,861,301号に記載されており、当業者であれば容易に入手することができる。９量体及び１０量体ペプチドは、得られたKDRタンパク質の全アミノ酸配列に基づいて、任意の位置からのペプチドを合成して得ることができる。ペプチドの合成は、通常のペプチド化学において用いられる方法に準じて行うことができる。通常用いられる合成方法は、例えば、Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966; The Proteins, Vol 2, Academic Press Inc., New York, 1976; ペプチド合成、丸善（株）、1975; ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株）、1985; 医薬品の開発 続 第１４巻・ペプチド合成、広川書店、1991等の文献や、国際公開WO99/67288号等の公報に記載されている。ＨＬＡ抗原との結合は、細胞表面にＨＬＡ抗原を有する細胞、例えば樹状細胞を単離して、細胞へのペプチドの結合を通常行われる手法を用いて測定することができる。
【０００８】
あるいはまた、最近インターネット上で利用可能となっているソフトウェア、例えばParker K. C., J. Immunol. 152, 1994に記載されているもの等を用いて、種々のペプチドとＨＬＡ抗原との結合親和性をin silicoで計算することもできる。尚、ＨＬＡ抗原との結合親和性は、例えばParker, K.C., J. Immunol., 152, 1994; Nukaya, I., Int. J. Cancer, 80, 1999等に記載のように測定することができる。
【０００９】
ＨＬＡ抗原としては、例えば日本人において多く発現しているといわれるＡ−２４型またはＡ−０２型等を用いることが有効な結果を得るために好ましく、更に好ましくはＡ−２４０２、Ａ−０２０１等のサブタイプである。しかしながら、臨床においては、治療を必要とする患者のＨＬＡ抗原の型を予め調べることにより、これとの結合親和性、あるいは抗原提示による細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）誘導能の高いペプチドを適宜選択することができる。更に、結合親和性及びＣＴＬ誘導能の高いペプチドを得るために、天然に存在するKDR部分ペプチドのアミノ酸配列に基づいて１個、２個または数個のアミノ酸の置換または付加を行うこともできる。ここで、「数個」とは、５個以下、好ましくは３個以下を意味する。更に、天然において提示されるペプチド以外にも、既にＨＬＡ抗原に結合して提示されるペプチドの配列の規則性が知られているので（J. Immunol., 152, 3913, 1994; Immunogenetics. 41:178, 1995; J. Immunol. 155:4307, 1994）、得られたペプチドに対してこれらの規則性に基づいた改変を行っても良い。例えば、ＨＬＡ−２４結合親和性の高いものはペプチドのＮ末端から２番目のアミノ酸をフェニルアラニン、チロシン、メチオニンまたはトリプトファンに置換したり、Ｃ末端のアミノ酸をフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンまたはメチオニンに置換したペプチドも好適に使用することができる。一方、ＨＬＡ−０２０１結合親和性の高いものは、ペプチドのＮ末端から２番目のアミノ酸をロイシンまたはメチオニンに置換したり、Ｃ末端のアミノ酸をバリンまたはロイシンに置換したペプチドも好適に使用することができる。更に、ペプチドのＮ末端及び／またはＣ末端に１〜２個のアミノ酸が付加していても良い。
【００１０】
しかしながら、ペプチドの配列が他の機能を有する内在性または外来性のタンパク質のアミノ酸配列の一部と同一となる場合には、自己免疫疾患等の副作用が生じたり、あるいは特定の物質に対するアレルギー症状を引き起こしたりする可能性があるため、利用可能なデータベースを用いてホモロジー検索を行い、他のタンパク質のアミノ酸配列と一致することを避けるのが好ましい。更に、ホモロジー検索において、アミノ酸が１個または２個異なるペプチドも存在しないことが明らかであれば、ＨＬＡ抗原との結合親和性及び／またはＣＴＬ誘導能を高めるための上記アミノ酸配列の改変もこのような問題を生じるおそれがない。
【００１１】
上記のようにしてＨＬＡ抗原との結合親和性の高いペプチドは、癌ワクチンとして有効である可能性が高いことが予想されるが、高い結合親和性を有することを指標として選択した候補ペプチドについて、実際にＣＴＬ誘導能を有するか否かを検討することが必要である。ＣＴＬ誘導能の確認は、ヒトＭＨＣ抗原を有する抗原提示細胞（例えばＢ−リンパ球、マクロファージ、樹状細胞）、具体的にはヒト末梢血単核球由来の樹状細胞を誘導し、ペプチドで刺激した後にＣＤ８陽性細胞と混合し、標的細胞に対する細胞傷害活性を測定する。反応系として、ヒトＨＬＡ抗原を発現するように作製されたトランスジェニック動物（例えば、Hum. Immunol. 2000 Aug.;61(8):764-79 Related Articles, Books, Linkout Induction of CTL response by a minimal epitope vaccine in HLA A*0201/DR1 transgenic mice: dependence on HLA class II restricted T(H) response., BenMohamed L., Krishnan R., Longmate J., Auge C., Low L., Primus J., Diamond DJ.に記載のもの）を用いることもできる。細胞傷害活性は、例えば標的細胞を51Ｃｒ等で放射標識し、標的細胞から遊離した放射活性から計算することができる。あるいはまた、ペプチドを拘束した抗原提示細胞の存在下でＣＴＬが産生・放出したIFN-γ及び抗IFN-γモノクローナル抗体によって培地上に可視化される阻止円を測定することによって観察することもできる。
【００１２】
上記のようにしてペプチドのＣＴＬ誘導能を検討した結果、ＨＬＡ抗原との結合親和性が高いものが必ずしも誘導能が高いわけではないことが明らかとなった。そして、VYSSEEAEL（配列番号２）、GYRIYDVVL（配列番号３）、SYMISYAGM（配列番号５）、RFVPDGNRI（配列番号８）、KWEFPRDRL（配列番号１１）、またはDFLTLEHLI（配列番号１２）に示すアミノ酸配列からなるペプチドから選ばれるノナペプチド、及びAMFFWLLLV（配列番号２９）、VIAMFFWLL（配列番号３０）、AVIAMFFWL（配列番号３３）、KLIEIGVQT（配列番号３４）、YMISYAGMV（配列番号４０）またはIQSDVWSFGV（配列番号４６）に示すアミノ酸配列からなるペプチドから選ばれるノナペプチドまたはデカペプチドが特に高いＣＴＬ誘導能を有することが明らかとなった。
【００１３】
本発明は更に、配列番号２、３、５、８、１１または１２に示すアミノ酸配列において１個、２個または数個のアミノ酸が置換または付加されており、細胞傷害性Ｔ細胞の誘導能を有するペプチドも提供する。配列番号２、３、５、８、１１または１２に示す９個のアミノ酸からなるアミノ酸配列に基づいて、１個、２個または数個のアミノ酸の置換または付加は、他のタンパク質のアミノ酸配列との一致がない限りにおいて、ＣＴＬ誘導能を有し得る。特に、アミノ酸の置換として、Ｎ末端から２番目のアミノ酸のフェニルアラニン、チロシン、メチオニンまたはトリプトファンへの置換、Ｃ末端のアミノ酸のフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンまたはメチオニンへの置換、アミノ酸の付加として、Ｎ末端及び／またはＣ末端への１〜２個のアミノ酸の付加は好適な例である。
【００１４】
本発明はまた、配列番号２９、３０、３３、３４、４０、または４６に示すアミノ酸配列において１個、２個または数個のアミノ酸が置換または付加されており、細胞傷害性Ｔ細胞の誘導能を有するペプチドも提供する。配列番号２９、３０、３３、３４、４０、または４６に示す９個または１０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列に基づいて、１個、２個または数個のアミノ酸の置換または付加は、他のタンパク質のアミノ酸配列との一致がない限りにおいて、ＣＴＬ誘導能を有し得る。特に、アミノ酸の置換として、Ｎ末端から２番目のアミノ酸のロイシンまたはメチオニンへの置換、Ｃ末端のアミノ酸のバリンまたはロイシンへの置換、アミノ酸の付加として、Ｎ末端及び／またはＣ末端への１〜２個のアミノ酸の付加は好適な例である。こうした改変ペプチドの例として、限定するものではないが、例えば配列番号３０のペプチドのＮ末端から2番目のアミノ酸をロイシンに変換したペプチド（配列番号５４）が挙げられる。これらの改変ペプチドによる刺激によって得られるCTLクローンは改変前のペプチドを認識し、傷害することができる。
【００１５】
上記の本発明のペプチドは、１種または２種以上の組み合わせとして、生体内でＣＴＬを誘導し得る癌ワクチンとして使用することができる。本発明のペプチドの投与により、抗原提示細胞のＨＬＡ抗原に該ペプチドが高密度に提示され、提示されたペプチドとＨＬＡ抗原との複合体に対して特異的に反応するＣＴＬが誘導され、標的細胞となるべき腫瘍細胞内の血管内皮細胞に対する攻撃力が高まる。あるいは、被験者から樹状細胞を取り出して本発明のペプチドで刺激することにより、細胞表面に本発明のペプチドを拘束した抗原提示細胞が得られ、これを再度被験者に投与することで被験者においてＣＴＬを誘導し、標的細胞に対する攻撃力を高めることができる。
【００１６】
すなわち、本発明は、本発明のペプチドを１種以上含む、腫瘍の治療または腫瘍の増殖・転移等の予防のための医薬を提供するものである。更に、病態部位における血管新生は、腫瘍の他、糖尿病性網膜症、慢性関節リウマチ、乾癬、アテローム性動脈硬化症のような疾患、並びに固形癌の転移と深く結びついている（Folkman, J., Nature Med. 1:27-31 (1995); Bicknell, R., Harris, A.L., Curr. Opin. Oncol. 8:60-65 (1996)）。従って、本発明のペプチドは、腫瘍、糖尿病性網膜症、慢性関節リウマチ、乾癬、アテローム性動脈硬化症のような疾患、並びに固形癌の転移の治療に用いることができる。
【００１７】
本発明のペプチドは、悪性腫瘍組織において形成され、正常な血管とは形態学的に異なる蛇行性血管の形成を阻害することが確かめられたが、ワクチン接種したマウスにおける創傷治癒及び受精能を解析した結果、正常な生理的血管新生に対しては悪影響を有さないことも確認した。更に、本発明のペプチドを認識するCTLクローンを用いて非増殖性または増殖性内皮細胞に対する細胞傷害性をin vitroで試験したところ、これらのクローンは非増殖性内皮細胞よりも増殖性内皮細胞に対して強い活性を示すことも明らかとなった。すなわち、増殖性内皮細胞が観察される疾患、特に癌において非常に特異的に作用することができる。
尚、in vivo及びin vitroにおいて、本発明のペプチドによる樹状細胞の刺激は、細胞に対して高濃度のペプチドを存在させることによって、該細胞に予め拘束されているペプチドとの交換が生じ、容易に行われる。このため、本発明において使用されるペプチドは、ＨＬＡ抗原との結合親和性がある程度以上高いことが必要とされる。
【００１８】
本発明の医薬は、本発明のペプチドを単独で直接投与しても良いが、通常用いられる製剤学的方法によって製剤化した医薬組成物として投与しても良い。その場合、本発明のペプチドの他に、通常医薬に用いられる担体、賦形剤等を適宜含むことができ、特に限定されるものではない。本発明の医薬の用途としては、胃癌、十二指腸癌、大腸癌、肺癌、乳癌、前立腺癌、脳腫瘍等の種々の腫瘍の治療及び予防に用いることができる。本発明のペプチドは、腫瘍細胞そのものではなく、腫瘍組織内に新たに形成される新生血管の内皮細胞を標的とするものであり、従って、治療対象の腫瘍は広範囲にわたり、特に用途を限定するものではない。
【００１９】
本発明のペプチドを有効成分とする腫瘍の治療及び／または予防のための医薬は、細胞性免疫が効果的に成立するようにアジュバントと共に投与したり、他の抗癌剤等の有効成分と共に投与したり、また粒子状の剤型にして投与することができる。アジュバントとしては、文献（C1in. Microbio1.Rev., 7:277-289, 1994）に記載のものなどが応用可能である。また、リポソーム製剤、直径数μｍのビーズに結合させた粒子状の製剤、リピッドを結合させた製剤なども考えられる。投与方法としては、経口投与、皮内投与、皮下投与、静脈注射などが利用でき、全身投与、あるいは目的となる腫瘍の近傍に局所投与しても良い。本発明のペプチドの投与量は、治療すべき疾患、患者の年齢、体重、投与方法等により適宜調整することができるが、通常 0.001mg〜1000mg、好ましくは 0.001mg〜1OOOmg、より好ましくはO.1mg〜1Omgであり、数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。当業者であれば、適当な投与量を適宜選択することが可能である。
【００２０】
あるいはまた、本発明は、本発明のペプチドとＨＬＡ抗原との複合体を表面に提示している、エキソソームと呼ばれる細胞内小胞を提供する。エキソソームの調製は、例えば特表平１１−５１０５０７号、及び特表２０００−５１２１６１号に詳細に記載されている方法を用いて行うことができるが、好ましくは治療及び／または予防の対象となる被験者から得た抗原提示細胞を用いて調製する。本発明のエキソソームは、上記本発明のペプチドと同様に癌ワクチンとして接種することができる。
ＨＬＡ抗原としては、治療及び／または予防を必要とする被験者のＨＬＡ抗原と同じ型のものであることが必要である。例えば、日本人の場合にはＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ０２、特にＨＬＡ−Ａ２４０２またはＨＬＡ−０２０１とすると好適であることが多い。
【００２１】
本発明はまた、本発明のペプチドを用いた抗原提示細胞の誘導方法も提供する。樹状細胞を末梢血単球から誘導した後、in vitroまたはin vivoで本発明のペプチドと接触（刺激）させ、抗原提示細胞を誘導することができる。本発明のペプチドを被験者に投与した場合、被験者の体内で本発明のペプチドを拘束した抗原提示細胞が誘導される。あるいは、抗原提示細胞に本発明のペプチドをin vitroで拘束させた後に被験者にワクチンとして投与することもできる。
【００２２】
本発明はまた、上記本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子をin vitroで抗原提示細胞に導入することを含む、細胞傷害性Ｔ細胞誘導能の高い抗原提示細胞を誘導する方法を提供する。導入する遺伝子はＤＮＡの形態であってもＲＮＡの形態であっても良い。導入の方法は当分野において通常行われるリポフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム法等の種々の方法を用いれば良く、特に限定するものではない。具体的には、例えばCancer Res., 56:5672, 1996; J. Immunol., 161:5607, 1998; J. Exp. Med., 184:465, 1996; 特表2000-509281号に記載のようにして行うことができる。遺伝子を抗原提示細胞に導入することによって、該遺伝子は細胞中で転写、翻訳等の処理の後、得られたタンパク質がＭＨＣクラスＩまたはクラスIIのプロセッシング及び提示経路を経て、部分ペプチドが提示される。
【００２３】
本発明は更に、上記本発明のペプチドを用いてＣＴＬを誘導する方法を提供する。本発明のペプチドを被験者に投与した場合、被験者の体内でＣＴＬが誘導され、腫瘍組織内の新生血管の内皮細胞を標的とした免疫力が増強される。あるいは、被験者由来の抗原提示細胞及びＣＤ８陽性細胞、または末梢血単核球をin vitroで本発明のペプチドと接触（刺激）させ、ＣＴＬを誘導してから被験者にもどすex vivoの治療方法にも用いることができる。
【００２４】
本発明は更に、本発明のペプチドを用いて誘導される、単離された細胞傷害性Ｔ細胞を提供する。本発明のペプチドを提示した抗原提示細胞による刺激に基づいて誘導された細胞傷害性Ｔ細胞は、好ましくは治療及び／または予防の対象である被験者由来のものであり、単独、または、本発明のペプチド、エキソソーム等を含む、他の医薬と共に抗腫瘍効果を目的として投与することができる。得られた細胞傷害性Ｔ細胞は、本発明のペプチド、好ましくは誘導に用いられたものと同じペプチドを提示する標的細胞に対して特異的に作用する。標的細胞は、KDRを内在的に発現する細胞であっても、強制的にKDRを発現させた細胞であっても良く、また、本発明のペプチドの刺激によって細胞表面に該ペプチドを提示する細胞であっても攻撃の対象となり得る。
【００２５】
本発明は更に、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの複合体を提示してなる抗原提示細胞を提供する。本発明のペプチド、あるいは本発明のペプチドをコードするヌクレオチドとの接触によって得られる該抗原提示細胞は、好ましくは治療及び／または予防の対象である被験者由来のものであり、単独、または、本発明のペプチド、エキソソーム、細胞傷害性Ｔ細胞等を含む、他の医薬と共にワクチンとして投与することができる。
【実施例】
【００２６】
以下、実施例を挙げて本発明を更に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
［実施例１］ VEGFR-2(KDR)由来ペプチドの予測−１（HLA-A*2402）
KDR タンパク質の全アミノ酸配列から、BioInformatics & Molecular Analysis Section (BIMAS) HLA Peptide Binding Prediction soft (http://bimas.dcrt.nih.gov/cgi-bin/molbio/ken_parker_comboform)により、HLA-A*2402に対する結合親和性の高いものから順に９量体のペプチドを１２種（配列番号１〜１２）、１０量体のペプチドを１２種（配列番号１３〜２４）予測した（表１）。表１には、９量体及び１０量体のそれぞれについて結合親和性の高い順に、そのＮ末端のKDR タンパク質のアミノ酸配列における位置と共に挙げた。尚、表中のCE652（配列番号２５）はNukaya I.によって報告されている腫瘍抗原CEA（癌胎児性抗原）のエピトープの一つである（Int. J. Cancer 80, 1999）。また、陰性対照ペプチドとしてHIVペプチド（ILKEPVHGV(配列番号５５)及びRYLRDQQLL(配列番号５６)）を用いた。
ペプチドは、標準的な固相合成法に従ってCleaved PepSet（Mimotope社、San Diego, LA）で合成し、逆相HPLCで精製した。HPLC及び質量分析によって、ペプチドの純度（>95%）及び種類をそれぞれ決定した。
【００２７】
【表１】
【００２８】
［実施例２］ 予測したペプチドを用いたCTL lineの樹立
Ebstein-Bar virus (EBV)不死化B細胞株であるTISI(HLA-A24/24)とEHM(HLA-A3/3)は宝酒造バイオ研究所より供与された。
健常人の末梢血７mlを採取し、HLAのserotypingを行った。HLA-A24陽性の末梢血から、Ficoll Paque(Pharmacia)を用いた比重遠沈法にて末梢血単核球（PBMC）を分離した。
【００２９】
得られたPBMCを培養フラスコ（Corning,43072）にて10時間静置し、浮遊細胞を除去した後にAIM-V（Invitrogen）に２％自己血清を添加した培養液にヒトGM-CSF（キリンビールより供与）1,000U/ml、ヒトIL-4(Genzyme)1,000U/mlを添加しフラスコに付着した細胞を培養した。５日後にOK-432（中外製薬より供与）10μg/mlにて48時間培養し、CTLの誘導のための抗原提示細胞として使用した。樹状細胞（Dendritic cell, DC）はFITCラベルした抗ClassII,CD80,CD86抗体及び、PEラベルした抗ClassI,CD11c,CD40（いずれもBeckton-Dickinson）、CD83(Immunotech)抗体を反応させてCell Quest softwareを使用したFACS-Calibur(Becton-Dickinson)にて表面抗原の解析を行い、DCであることを確認した。
【００３０】
あらかじめ誘導しておいたDCに、実施例１で結合親和性が高いとして予測された９量体のペプチド12種類（配列番号１〜１２）（20μg/ml）を３μg/mlのβ2-ミクログロブリンの存在下で20℃、4時間パルスし、その後DCをPBMCから磁気ビーズ（Dynabeads M-450とDetachabeds）にて選択されたCD8陽性細胞に対して1:20または1:2の比で、10ng/mlのヒトIL-7(Genzyme)存在下で48 well plate(Corning)にて混合培養を行った。3日後に最終10U/mlのIL-2（SIGMA）を加えた。7日後、14日後に同様のDCにて刺激を加えてCTL誘導を行い、20日後にペプチドをパルスしたTISI細胞を標的として各wellの細胞傷害活性を測定し、陽性wellのみをアロのPBMC、EBV不死化B細胞株(EHM)及び抗CD3抗体30ng/mlにて刺激する方法で培養し、その14日後にCTLの機能解析を行った。
【００３１】
細胞傷害活性は４時間51Cr遊離法にて測定した。ペプチドをパルスする標的細胞は20μg/mlの濃度にて一晩パルスを行った。標的細胞を100μCiのNa251CrO4にて37℃、１時間ラベルした後RPMI1640にて3回洗浄し、96穴U型マイクロプレート(Corning)に標的細胞（１×104/100μl）と種々の濃度の効果細胞を100μl加え、総量200μlとして４時間、37℃のCO2インキュベーターにて培養した。培養終了後、各wellより上清を100μl採取し、γカウンターにて測定した。自然解離は標的細胞と培地で、最大解離は標的細胞と1M HCLで得られる放射活性とした。細胞傷害活性（特異的溶解のパーセンテージ）は次式により算出した。
細胞傷害活性(% Cytotoxicity)
＝(実験解離-自然解離)/(最大解離-自然解離)×100
【００３２】
その結果、表２に示すように６種類のCTL lineが樹立でき、配列番号２（アミノ酸開始位置KDR1318）、配列番号３（KDR220）、配列番号５（KDR189）、配列番号８（KDR169）、配列番号１１（KDR826）、及び配列番号１２（KDR998）に示すノナペプチドがエピトープペプチドとして特に有効であることが示された。
【００３３】
【表２】
【００３４】
［実施例３］ 予測したペプチドから誘導されるCTL クローンの樹立
実施例２において樹立した６種類のCTL lineを96穴U型プレートに0.3、1、または3 cells/wellになるように希釈した。そこにアロ のPBMC 7×104 cells/well, EHM 1×104 cells/well, 抗CD3抗体 30ng/ml,IL-2 125U/ml となるようにして、AIM-Vに５％自己血清を添加して合計 150μl/wellになるようにした。10日後にIL-2が最終濃度125U/mlになるように調節したIL-2添加mediumを50μl/wellにて加えた。14日目にCTLの機能解析を行い、活性のあるものを大量培養した。
【００３５】
その結果、配列番号８（アミノ酸開始位置KDR169）、配列番号５（KDR189）、配列番号３（KDR220）、配列番号２（KDR1318）、及び配列番号１１（KDR826）の５種のノナペプチドよりそれぞれ8種類（C13-169、C19-169、C29-169、C53-169、C72-169、C61-169、K5-169及びK25-169）、2種類（C12-189及びC18-189）、11種類（KWC3、23、25、26、36、42、46、58、61、70及び77）、1種類（C7-1318）、1種類（C65-826）のCTL クローンを樹立した（表３）。
【表３】
【００３６】
［実施例４］ 樹立したCTLクローンの細胞傷害活性の測定
実施例３において樹立した10種類のCTL クローンの細胞傷害活性の強度を、標的細胞との比率（E:T比）を変化させて検討した（図１）。
その結果、配列番号８のノナペプチド（アミノ酸開始位置KDR169）から誘導されたC53-169が最も強力な細胞傷害活性を示した。
【００３７】
［実施例５］ 樹立したCTLクローンのHLA-テトラマー解析
HLA-A*2402と配列番号８のペプチド（アミノ酸開始位置KDR169）でHLA-テトラマーを合成した。すなわち、H鎖（約35kDa）とL鎖（約11kDa）を発現するプラスミドベクターをそれぞれ作製し、大腸菌を用いてこれらの組換えタンパク質を発現させた。 H鎖のプラスミドベクターは細胞外ドメインのみで構成され、カルボキシル末端側はビオチン化酵素認識配列に置換してある。H鎖およびL鎖は抗原ペプチドと共にリフォールディングすることにより、HLAペプチド複合体を形成する。HLAペプチド複合体をビオチン化酵素によりビオチン化し，ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーにより過剰のビオチンを除去し，ビオチン化HLAペプチド複合体を分離精製した。得られたビオチン化HLAペプチド複合体をストレプトアビジン(streptavidin; SA)と4:1のモル比で反応させて四量体化し、HLA-テトラマーを合成した。試料を解析する場合には，フィコエリスリン（phycoerythrin; PE）で蛍光標識したSA（SA-PE）を使用し四量体化した。CD8分子はHLA-A,B,Cの一部を除き，α3ドメインの245番目の一アミノ酸であるアラニンに結合することが解っており、そこでアラニンをバリンへ置換した変異導入HLA-テトラマーを作製することで，CD8分子とα3ドメインの結合に依存しないHLAペプチド複合体に対し高いavidityをもつCTLを選択的に検出することが可能である変異導入HLA-テトラマーを合成した。
【００３８】
合成した変異型HLA-A24 KDR169-テトラマーにより、樹立したCTL クローンを検出した。その結果、図２に示すように、樹立したCTLクローンはテトラマー陽性かつCD8陽性のフラクションに強く染色するCTLであり、本発明のペプチド及びＨＬＡ抗原の複合体を特異的に認識するものであることが明らかになった。尚、テトラマー陰性かつCD8陰性のフラクションのシグナルはフィーダー細胞によるものである。
【００３９】
［実施例６］ VEGFR-2(KDR)由来ペプチドの予測−２（HLA-A*0201）
実施例１と同様にして、KDR タンパク質の全アミノ酸配列から、HLA Peptide Binding Prediction soft(http://bimas.dcrt.nih.gov/cgi-bin/molbio/ken_parker_comboform)によりHLA-A*0201に対する結合親和性の高いものから順に、９量体のペプチドを15種（配列番号２６〜４０）、１０量体のペプチドを１２種（配列番号４１〜５２）予測した（表４）。表４には、９量体及び１０量体のそれぞれについて結合親和性の高い順に、そのＮ末端のKDR タンパク質のアミノ酸配列における位置と共に挙げた。尚、表中のCEA588（配列番号５３）はTanaka, H.らによって報告されている腫瘍抗原CEA（癌胎児性抗原）のエピトープの一つである（ポスター発表、AACR #3669, vol.42, p681-682, March 2001）。
【００４０】
【表４】
【００４１】
［実施例７］ HLA-A*0201拘束性エピトープペプチドの決定
実施例６において予測された９量体または１０量体のペプチド16種類（配列番号２６〜４１）を、ヒトＨＬＡ（Ａ０２０１）を発現するトランスジェニックマウス（Hum. Immunol. 2000 Aug.;61(8):764-79 Related Articles, Books, Linkout Induction of CTL response by a minimal epitope vaccine in HLA A*0201/DR1 transgenic mice: dependence on HLA class II restricted T(H) response., BenMohamed L., Krishnan R., Longmate J., Auge C., Low L., Primus J., Diamond DJ.に記載）を用い、vaccination法にてCTLの誘導を行った。
【００４２】
6-8週令BALB/C(H-2d)マウスは日本クレア株式会社から手に入れた。A2/Kb トランスジェニックマウス (TGM) はF Jim Primus Ph.D. Vanderbilt-Ingram Cancer Centerより供与された。またT2細胞（TAP欠損細胞、HLA-A*0201陽性）は三重大学第三内科珠玖洋教授より供与された。
【００４３】
マウス大腿骨、脛骨より骨髄を採取し、抗CD4,CD8,Gr-1(Beckton-Dickinson)、B220(バイオサイエンス)抗体、及びウサギ補体（PeL-Freez）にてリンパ球及び顆粒球を除去した。細胞は６well plateにて培養し、翌日浮遊細胞を回収して別の６well plateにRPMI1640（Invitrogen）に10％FBSを加えた培溶液にマウスGM-CSF（キリンビールより供与）1,000U/ml,マウスIL-4(PEPRO TECH)1,000U/mlを添加し培養した。その３日後に上記培養液にてhalf medium changeを行い、その２日後にOK-432 10μg/mlにて20時間培養し、浮遊細胞をDCとして使用した。DCはFITCラベルした抗ClassII, CD40抗体及び、PEラベルした抗ClassI,CD11c,CD80,CD86（いずれもBeckton-Dickinson）抗体を反応させてCell Quest softwareを使用したFACS-Calibur (Becton-Dickinson)にて表面抗原の解析を行い、DCであることを確認した。
【００４４】
次いで、各ペプチド100μg、HbcAg120-140 helper peptide 140μg、IFA 100μlを混和(計 200μl)し、day 0に右側腹部にday11に左側腹部に皮下摂取した。Day 21 にワクチン接種したマウスの脾臓を採取し、赤血球をred lysis buffer (sigma)にて溶血除去し、その細胞の一部をIFN-γ ELISPOT assayのresponder cellとして使用した。また、残りの細胞は24 well plate (Corning)に6×106 cells/wellにてフィーダー細胞と3:1の比率にて再刺激を加え、5日後に細胞傷害活性を測定した。フィーダー細胞は同種別マウスの赤血球を除去した脾細胞をlipopolysaccharide (LPS) 25μg/ml存在下で3日間培養したものを使用した。
【００４５】
本実施例においては、ＣＴＬの誘導能をIFN-γを産生する細胞が作るSPOTで評価するIFN-γ ELISPOT法を用いた。96穴平坦底マルチスクリーンプレートMAHA S45(ミリポア)を4℃、一晩抗マウスIFN-γ単クローン抗体(Pharmingen)にて処理し、翌日0.05% Tween 20を含んだPBSにて洗浄し、室温で２時間blocking bufferと反応させた。その後、ペプチドをパルスしたT2細胞とパルスしていないT2細胞を各wellに105 cell/100μlずつ散布した。そこに、ワクチンしたマウスの碑細胞を最大4×106 cell/100μl散布して、全200μlとして一晩37℃で培養した。翌日、各wellを洗浄後、ビオチン化したラット抗マウスIFN-γ抗体(Pharmingen)と２時間反応させ、十分に洗浄し、Extravidinを加えて２時間室温で反応させた。プレートを洗浄後、Alkaline Phosphatase Conjugate Substrate(BIO-RAD)を加えて５分間室温で放置し、IFN-γの産生による青色班をKS ELISPOT compact release(Carl Zeiss)にて計測した。そして
特異的青色班＝(TISI(+)SPOT-TISI(-)SPOT)
で決定し、
TISI(+)SPOT/TISI(-)SPOT≧2を満たしたものを有効とした。
その結果、IFN-γELISPOT アッセイにて５種類のエピトープペプチド、配列番号２９（アミノ酸開始位置KDR775）、配列番号３０（KDR773）、配列番号３３（KDR772）、配列番号３４（KDR1328）及び配列番号４０（KDR190）を得た（表５）。
【００４６】
【表５】
【００４７】
［実施例８］ in vivoにおける抗腫瘍効果の確認１
ヒトＨＬＡ−Ａ２４０２とアンカーモチーフが同じである６〜８週齢の雄BALB/cマウス（CLEA Japan Inc.）の骨髄を採取し、実施例７と同様にGM-CSF（キリンビール）（1000U/ml）及びIL-4（Genzyme）（1000U/ml）を添加して培養して、樹状細胞を調製した。この樹状細胞に配列番号５のペプチド（アミノ酸開始位置KDR189）をパルスしたもの（１×１０6／マウス）をBALB/cマウス９匹に７日間隔で２回右下腹部に投与し、その７日後に結腸癌細胞株Colon26（大鵬薬品株式会社）（５×１０5個）を右腹部に接種し、マウスの生存と腫瘍増殖を検討した。
【００４８】
まず、KDRの発現をRT-PCRで確認したところ、図３に示すように、Colon26細胞系単独ではKDRを発現していないが、Colon26を接種したマウスの腫瘍組織からKDRの発現が確認できた。すなわち、腫瘍血管が腫瘍組織に出現し、腫瘍を形成していることが確かめられた。
【００４９】
図３にColon26を接種されたマウスの生存曲線を示す。対照であるHBSS（Hank's Balanced Salt Solution）のみ（100μl）の投与の場合、腫瘍接種から３５日後において、９匹中２匹の生存、ペプチドをパルスしない樹状細胞の接種では９匹中５匹の生存であったが、配列番号５のペプチドでパルスした樹状細胞の接種の場合には全９匹が生存していた。
【００５０】
図４にマウスにおけるColon26由来の腫瘍の増殖に対する効果を示す。対照と比較して、樹状細胞を接種した場合に腫瘍増殖に対する抑制効果が認められ、配列番号５のペプチドでパルスした樹状細胞の場合に顕著な抑制効果が認められた。
【００５１】
［実施例９］ 本発明のペプチドのホモロジー検索
本発明のペプチド（配列番号２（アミノ酸開始位置KDR1318）、配列番号３（KDR220）、配列番号５（KDR189）、配列番号８（KDR169）、配列番号１１（KDR826）、配列番号３０（KDR773）、及び配列番号４０（KDR190））のホモロジー検索をBLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi）にて行った結果、いずれのペプチドにおいても配列が完全に一致したものは認められなかった(表６)。実施例４において強いCTL活性を誘導できた配列番号８の９量体ペプチド（KDR169）に関しては、2個のミスマッチ配列が1つ（77.8% homology）、3個のミスマッチ配列が２つ(66.7% homology)あるのみであった。実施例８においてin vivoにおける顕著な抗腫瘍効果が認められたペプチド配列番号５のペプチド（KDR 189）に関しては、3個のミスマッチ配列が1つ(66.7% homology)あるのみであった。
【００５２】
【表６】
【００５３】
［実施例１０］ in vivoにおける抗腫瘍効果の確認２
ヒトＨＬＡ−Ａ０２０１を発現する６〜８週齢の雄A2/Kbトランスジェニックマウス（ＴＧＭ）の骨髄を採取し、実施例８と同様にGM-CSF（キリンビール）（1000U/ml）及びIL-4（Genzyme）（1000U/ml）を添加して培養して、樹状細胞を調製した。この樹状細胞に配列番号３０（アミノ酸開始位置KDR773）のペプチドをパルスしたもの（１×１０6／マウス）をA2/Kbトランスジェニックマウス１２匹に７日間隔で２回左下腹部に投与し、その７日後にB16メラノーマ細胞（ATCC）（１×１０6個）を右腹部に接種し、マウスの生存と腫瘍増殖を検討した。
【００５４】
図５にB16を接種されたマウスの生存率を示す。対照であるHBSSのみ（100μl）の投与の場合、腫瘍接種から３５日後において、１２匹中８匹の生存、ペプチドをパルスしない樹状細胞の接種では１２匹中１１匹の生存であったが、配列番号３０のペプチドでパルスした樹状細胞の接種の場合には全１２匹が生存していた。
【００５５】
図６にマウスにおけるB16マウス由来の腫瘍の増殖に対する効果を示す。対照と比較して、樹状細胞を接種した場合に腫瘍増殖に対する抑制効果が認められ、配列番号３０のペプチドでパルスした樹状細胞の場合に顕著な抑制効果が認められた。
【００５６】
［実施例１１］ KDRを強制発現させた細胞に対する細胞障害活性
Miyake, S.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 1320-1324 (1996)に記載の方法に従い、HLA-A24陽性であるヒト大腸癌HT29株（ATCC）にアデノウイルスを用いてKDR（J. Biol. Chem. 1994 Oct 28;269(43):26988-95参照）を強制発現した。具体的には、ヒト293細胞のプラークアッセイによって決定した力価に基いて、細胞を特定の多重度で感染させた。HT29細胞を60mmのディッシュ中に１０5個の細胞密度で接種し、24時間インキュベートした。次の日、培地を捨て、新しい培地で連続希釈したウイルス200μlと交換した。37℃で１時間インキュベーションした後、増殖培地を添加し、細胞を48時間培養して標的細胞として使用した。対照としてEGFP（Leukemia 1999 Apr; 13(4):605-13参照）をアデノウイルスにて強制発現したHLA-A24陽性HT29株を用いた。KDRとEGFPを強制発現したHT29株は、細胞表面に各々その部分ペプチドを提示している可能性がある。
【００５７】
HLA-A24に結合する配列番号８のペプチド（アミノ酸開始位置KDR169）から誘導された実施例３に記載のCTLクローンC29-169を用い、KDR強制発現HLA-A24陽性HT29細胞に対する殺細胞効果をクロムリリースアッセイにて測定した。結果を図７に示す。
【００５８】
細胞障害活性は４時間51Cr遊離法にて測定した。標的細胞は6 well plate に１×106cells/wellの濃度にて２４時間培養し、KDR又はEGFPを導入したアデノウイルス（Ad-KDR又はAd-EGFP）をMOI 50にて感染させ、４８時間後に使用した。標的細胞を100μCiのNa251CrO4にて37℃、１時間ラベルした後、RPMI1640にて3回洗浄し、96穴U型マイクロプレート(Corning)に標的細胞（１×104 cells/100μl）と種々の濃度の効果細胞を100μl加え、総量200μlとして４時間、37℃のCO2インキュベーターにて培養した。培養終了後、各wellより上清を100μl採取し、γカウンターにて測定し、実施例２と同様にして細胞障害活性を算出した。
【００５９】
その結果、図７に示すように、CTLクローンC29-169は、KDRを強制発現したHLA-A24陽性HT29に対し、EGFPを強制発現した細胞と比較して顕著に高い殺細胞効果を示した。
【００６０】
［実施例１２］ 内因的にKDRを発現している細胞に対する細胞障害活性
KDRを内因的に発現しているHLA-A24陽性ヒト臍帯血管内皮細胞由来HUVEC KT5株に対する実施例３に記載のCTLクローンC29-169の殺細胞効果について、KDR陽性、HLA-A24陰性HUVEC株 P8を対照として検討した。これらの細胞はKDRの部分ペプチドを細胞表面に提示する。
【００６１】
細胞障害活性は４時間51Cr遊離法にて測定した。標的細胞を100μCiのNa251CrO4にて37℃、１時間ラベルした後RPMI1640にて3回洗浄し、96穴U型マイクロプレート(Corning)に標的細胞（１×104 cells/100μl）と種々の濃度の効果細胞を100μl加え、総量200μlとして４時間、37℃のCO2インキュベーターにて培養した。培養終了後、各wellより上清を100μl採取し、γカウンターにて測定し、実施例２と同様にして細胞障害活性を算出した。
【００６２】
図８の結果から明らかなように、CTLクローンC29-169は、内在的にKDRを発現しているHLA-A24陽性HUVECに対して殺細胞効果を示し、HLA-A24陰性HUVECに対しては低い殺細胞効果を示した。
【００６３】
［実施例１３］ HLA-A0201結合性ペプチドを用いたCTLクローンの樹立
実施例７のELISPOT解析において有効とされたHLA-A0201に結合する配列番号４０のペプチド（アミノ酸開始位置KDR190）、配列番号３０のペプチド（KDR773）のＮ末端から2番目のアミノ酸をロイシンに変換したペプチドKDR773-2L（配列番号５４）、配列番号２９のペプチド（KDR775）、配列番号３４のペプチド（KDR1328）、及び配列番号３３（KDR772）を用いて、実施例３と同様にして、それぞれ2種類（KWC14-190、KWC65-190）、4種類（KWC44-773-2L、KWC76-773-2L、KWC129-773-2L、KWC134-773-2L）、2種類（KWC81-775、KWC85-775）、12種類（KWC16、KWC21、KWC22、KWC47、KWC51、KWC108、KWC117、KWC132、KWC151、KWC153、KWC156、KWC159）、1種類（KWC72-772）のCTLクローンを得た。それぞれの細胞傷害活性を表７に示す。
【００６４】
【表７】
【００６５】
表７の結果から明らかなように、配列番号２９、３３、３４、または４０に示すペプチド、及び配列番号３０に示すペプチドのＮ末端から２番目のアミノ酸がロイシンである配列番号５４に示すペプチドのいずれも、顕著な細胞傷害活性を有するCTLを誘導することができ、エピトープペプチドとして有効であることが示された。
【００６６】
［実施例１４］
HLA-A0201陽性T2株に配列番号２９のペプチド（アミノ酸開始位置KDR775）を加えて標的細胞とし、実施例１３で配列番号２９のペプチドから得られたCTLクローン（KDR C85-775(KWC85-775)）の殺細胞効果をクロムリリースアッセイを用いて検討した。
その結果、図９に示すように、CTLクローンC85-775(KWC85-775)は、配列番号２９のペプチドを提示したHLA-A0201陽性細胞に対して明らかに殺細胞効果を示した。これに対して、配列番号２９のペプチドを提示しない対照細胞に対しては、全く殺細胞効果が見られなかった。
【００６７】
［実施例１５］
KDRをアデノウイルスで強制発現させた肝細胞癌株HLA-A0201陽性HePG2に対するCTLクローン(KDR C85-775(KWC85-775))の殺細胞効果をクロムリリースアッセイを用いて検討した。対照としてEGFPを強制発現させたHLA-A0201陽性HePG2を用いた。
その結果、図１０に示すように、CTLクローンC85-775(KWC85-775)は、KDRペプチドを表面に提示したHLA-A0201陽性細胞に対し、EGFPペプチドを提示した細胞と比較して顕著に高い殺細胞効果を示した。
【００６８】
［実施例１６］
HLA-A0201陽性T2株に配列番号３４のペプチド（アミノ酸開始位置KDR1328）を加えて標的細胞とし、実施例１３で配列番号３４のペプチドから得られたCTLクローン（KDR C51-1328(KWC51)）の殺細胞効果をクロムリリースアッセイを用いて検討した。
その結果、図１１に示すように、CTLクローンKDR C51-1328(KWC51)は、配列番号３４のペプチドを提示したHLA-A0201陽性細胞に対して明らかに殺細胞効果を示した。これに対して、配列番号３４のペプチドを提示しない対照細胞に対しては、全く殺細胞効果が見られなかった。
【００６９】
［実施例１７］
KDRをアデノウイルスで強制発現させた肝細胞癌株HLA-A0201陽性HePG2に対するCTLクローン(KDR C51-1328(KWC51))の殺細胞効果をクロムリリースアッセイを用いて検討した。対照としてEGFPを強制発現させたHLA-A0201陽性HePG2を用いた。
その結果、図１２に示すように、CTLクローンKDR C51-1328(KWC51)は、KDRペプチドを表面に提示したHLA-A0201陽性細胞に対し、EGFPペプチドを提示した細胞と比較して顕著に高い殺細胞効果を示した。
【００７０】
［実施例１８］
HLA-A0201陽性T2株に配列番号３０の2番目のペプチドをロイシンに変換した配列番号５４のペプチド（KDR773-2L）を加えて標的細胞とし、実施例１３で配列番号３４のペプチドから得られたCTLクローン（KDR C44-773-2L(KWC44-773-2L)）の殺細胞効果をクロムリリースアッセイを用いて検討した。結果を図１３に示す。
その結果、図１３に示すように、CTLクローンKDR C44-773-2L(KWC44-773-2L)は、KDR773-2Lを提示したHLA-A0201陽性細胞に対して明らかに殺細胞効果を示した。これに対して、KDR773-2Lを提示しない対照細胞に対しては、全く殺細胞効果が見られなかった。
【００７１】
［実施例１９］
HLA-A0201陽性T2株に配列番号３０の2番目のペプチドをロイシンに変換した配列番号５４に示すペプチド（KDR773-2L）より得られたCTLクローン（KDR C44-773-2L(KWC44-773-2L)）のクロムリリースアッセイでの殺細胞効果を、標的細胞としてT2に改変していない配列番号３０に示すペプチド（アミノ酸開始位置KDR773）をパルスしたもので検討した。
その結果、図１４に示すように、改変したペプチドで刺激し、得られたCTLクローンは改変前のペプチドを認識し、傷害することができた。
【００７２】
［実施例２０］
KDRをアデノウイルスで強制発現させた肝細胞癌株HLA-A0201陽性HePG2に対するCTLクローン(KDR C44-773-2L(KWC44-773-2L))の殺細胞効果をクロムリリースアッセイを用いて検討した。対照としてEGFPを強制発現させたHLA-A0201陽性HePG2を用いた。
その結果、図１５に示すように、CTLクローンKDR C44-773-2L(KWC44-773-2L)は、KDRペプチドを表面に提示したHLA-A0201陽性細胞に対し、EGFPペプチドを提示した細胞と比較して顕著に高い殺細胞効果を示した。
【００７３】
［実施例２１］
KDRをアデノウイルスで強制発現させた肝細胞癌株HLA-A0201陽性HePG2に対する配列番号３４のペプチドから得られたCTLクローン(KDR C51-1328(KWC51))の殺細胞効果が各種抗体でブロックされるかどうかについて検討した。
その結果、図１６に示すように、標的細胞が提示するHLA抗原に対する抗HLA ClassI抗体と、細胞傷害性Ｔ細胞のマーカーとなるCD8に対する抗CD8抗体がその作用を阻害した。
【００７４】
［実施例２２］ Dorsal Air Sac assay(DAS)による血管新生阻害活性の検討
ペプチドエピトープの実際の血管新生阻害活性をマウスでDASアッセイ（Clinical Cancer Research Vol.5, 2185-2191, August 1999; Cancer Research 62, 6116-6123, November 1, 2002参照）にて評価した。
【００７５】
チャンバーリングの両面にメンブレンフィルターを固定し、エチレンオキサイトガスで滅菌した。Ｂ１６メラノーマ細胞を５×105 cells/0.15mlに調整し、チャンバー内に注入した。マウス（A2/kbトランスジェニックマウス(B16由来)）を腹臥位として固定し、マウス背部皮下にシリンジにて５〜１０mlの空気を注入しair sacを作製した。Sac下部を約１cm切開し、細胞浮遊液で満たされたチャンバーリングを背部皮下に移植し、皮膚をスキンステープラで閉じた。移植日より６日目にマウス皮膚をチャンバーごと剥皮し、伸展させた状態で固定した。黒色ゴムリングでマーキングし、実態顕微鏡を用いて新生血管を計測した。悪性腫瘍細胞から放出される血管新生因子によって新たに形成される血管は、ジグザグに進行する特徴があり、本来存在するバックグラウンドの血管とは形態学的に異なっている。従って、新生血管の判定はゴムリング内の蛇行走行を示す血管で、長さが３mm以上のものとし、血管新生指数（Angiogenesis Index(AI)）としてカウントした。AIは蛇行血管数に応じて０〜５までの６段階で評価し、蛇行血管が５本以上のものはすべて５とした。
ワクチン接種はチャンバー移植の１４日前にHBSS、DC単独、DCにペプチドパルスしたものをそれぞれ５×１０4cells尾静脈に注入し、それを１週間後に再度行い、計２回接種した。結果を図１７及び以下の表８に示す。
【００７６】
【表８】
【００７７】
図１７及び表８の結果から明らかなように、DCに配列番号４０に示すペプチド（アミノ酸開始位置KDR190）、配列番号３３に示すペプチド（KDR772）、配列番号３０に示すペプチド（KDR773）、配列番号５４に示すペプチド（KDR773-2L）、配列番号２９に示すペプチド（KDR775）、及び配列番号４６に示すペプチド（KDR1084）をワクチン接種した群において、DC単独投与群と比較して、蛇行血管の形成が明らかに抑制され、統計学的有意さをもって血管新生阻害効果があった。
【００７８】
尚、これらのエピトープペプチドを用いたワクチン接種による正常な生理的血管新生に対する悪影響を観察するために、ワクチン接種したマウスにおける創傷治癒及び受精能を解析した。しかしながら、ワクチン接種したマウスにおいて有意な悪影響はなかった。更に、KDRペプチドを認識するCTLクローンを用いて非増殖性または増殖性内皮細胞に対する細胞傷害性をin vitroで試験し、ヒトにおける悪影響を検討したところ、これらのクローンは非増殖性内皮細胞よりも増殖性内皮細胞に対して強い活性を示した。
【００７９】
［実施例２３］
ヒトHLA-A0201を発現するA2/Kbトランスジェニックマウスを用いて大腸癌株MC38移植担癌マウスに対する配列番号３０(アミノ酸開始位置KDR773)と配列番号３４（KDR1084）ペプチドを不完全フロイントアジュバントと混合させてそれぞれday3,13に投与した場合の腫瘍体積の変化を示した。
【００８０】
実施例２２と同様のワクチン接種方法でHLA-A*0201拘束性エピトープペプチド(KDR773)による治療モデルにおけるin vivo抗腫瘍効果を腫瘍面積により評価した。その結果、図１８から明らかなように、配列番号３０のペプチド及び配列番号３４のペプチドのワクチン接種により、有意な腫瘍増殖抑制効果が確認できた。
【００８１】
［実施例２４］
HLA-A0201陽性T2株に配列番号４０のペプチド（アミノ酸開始位置KDR190）を加えて標的細胞とし、実施例１３で配列番号４０のペプチドから得られたCTLクローン（KWC65-190）の殺細胞効果をクロムリリースアッセイを用いて検討した。
【００８２】
その結果、図１９に示すように、CTLクローンKWC65-190は、配列番号４０のペプチドを提示したHLA-A0201陽性細胞に対して明らかに殺細胞効果を示した。これに対して、配列番号４０のペプチドを提示しない対照細胞に対しては、全く殺細胞効果が見られなかった。
【００８３】
［実施例２５］
HLA-A0201陽性T2株に配列番号３３のペプチド（アミノ酸開始位置KDR772）を加えて標的細胞とし、実施例１３で配列番号３３のペプチドから得られたCTLクローン（KWC72-772）の殺細胞効果をクロムリリースアッセイを用いて検討した。
その結果、図２０に示すように、CTLクローンKWC72-772は、配列番号３３のペプチドを提示したHLA-A0201陽性細胞に対して明らかに殺細胞効果を示した。これに対して、配列番号３３のペプチドを提示しない対照細胞に対しては、全く殺細胞効果が見られなかった。
【００８４】
［実施例２６］
KDRをアデノウイルスで強制発現させた肝細胞癌株HLA-A0201陽性HePG2に対するCTLクローン(KWC72-772)の殺細胞効果をクロムリリースアッセイを用いて検討した。対照としてEGFPを強制発現させたHLA-A0201陽性HePG2を用いた。
その結果、図２１に示すように、CTLクローンKWC72-772は、KDRペプチドを表面に提示したHLA-A0201陽性細胞に対し、EGFPペプチドを提示した細胞と比較して顕著に高い殺細胞効果を示した。
【００８５】
［実施例２７］
HLA-A24陽性であるヒトB-リンパ芽球細胞系A24-LCL（HLA-A24/24、宝酒造製）に配列番号２（アミノ酸開始位置KDR1318）、３（KDR220）、５（KDR189）、及び１１（アミノ酸開始位置KDR826）のペプチドを加えて標的細胞とし、実施例３に記載のCTLクローンC7-1318、KWC46、C18-189、及びC65-826の殺細胞効果をクロムリリースアッセイを用いて検討した。
その結果、図２２〜２５に示すように、CTLクローンC7-1318、KWC46、C18-189、及びC65-826は、それぞれ配列番号２、３、５、及び１１のペプチドを提示したHLA-A24陽性細胞に対して明らかに殺細胞効果を示した。これに対して、各ペプチドを提示しない対照細胞に対しては、全く、またはほとんど殺細胞効果が見られなかった。
【００８６】
［実施例２８］
実施例１１と同様にして、KDRをアデノウイルスで強制発現させたヒト大腸癌HT29株（ATCC）に対する実施例３に記載のCTLクローンC7-1318、KWC46、C18-189、及びC65-826の殺細胞効果をクロムリリースアッセイを用いて検討した。対照としてEGFPを強制発現させたHLA-A24陽性HT29株を用いた。
その結果、図２６〜２９に示すように、CTLクローンC7-1318、KWC46、C18-189、及びC65-826は、いずれもKDRを強制発現したHLA-A24陽性HT29に対し、EGFPを強制発現した細胞と比較して顕著に高い殺細胞効果を示した。
【００８７】
［実施例２９］
実施例２２と同様にして、BALB/cマウスにおいてcolon26細胞によって誘導される血管新生応答に対するペプチドエピトープの血管新生阻害活性をDASアッセイにて評価した。
図３０及び３１の結果から明らかなように、DCに配列番号５に示すペプチド（アミノ酸開始位置KDR189）及び配列番号１１に示すペプチド（KDR826）をワクチン接種した群において、DC単独投与群と比較して、蛇行血管の形成が明らかに抑制され、統計学的有意さをもって血管新生阻害効果があった。
【００８８】
［実施例３０］
癌患者のPBMCを用いて、各種エピトープペプチド（HLA-24結合親和性の高いペプチドとして配列番号８(アミノ酸開始位置KDR169)、配列番号５(KDR189)、配列番号３(KDR220)、配列番号１１(KDR826)、及び配列番号１７(KDR1318)、並びにHLA-A0201結合親和性の高いペプチドとして配列番号４０(KDR190)、配列番号３３(KDR772)、配列番号３０(KDR773)、配列番号２９(KDR775)、及び配列番号３４(KDR1328)）で刺激した後の各ペプチドに対するCTL応答を調べた。
【００８９】
Maeda, Y.ら、Br. J. Cancer 87, 796-804 (2002)に報告されている方法を用いてPBMC中のペプチド特異的CTLを検出した。まず、患者から採取したPBMC（１×１０5個）を200μlの培地を入れたｕ底型の９６ウェルプレートのウェルで各ペプチド１０μＭと共にインキュベートした。培地は45％のRPMI-1640培地、45％のAIM-V培地、10%のFBS、100U/mlのインターロイキン-2（IL-2）、及び0.1μM MEM非必須アミノ酸溶液から構成される。3日ごとに培地の半分を除去し、対応するペプチド（20μM）を含有する新しい培地と交換した。12日間のインキュベーション後、細胞を回収して各ペプチドに応答したIFN-γ産生能を試験した。対応するペプチドに応答してペプチドで刺激したPBMCによって産生されるIFN-γの量が対照であるHIVペプチドに応答して産生される量の２倍以上多い場合には陽性と判定した。
【００９０】
その結果、HLA-A2及び-A24の癌患者においても、健康なドナーと同様にCTL前駆体が産生されることが示された（表９）。表中、患者Ａ、Ｂ及びＣはHLA-A24型の患者であり、患者ＤはHLA-A02型の患者である。また患者Ａ及び患者Ｄは結腸癌患者、患者Ｂ及び患者Ｃはメラノーマ患者である。尚、ＣＭＶは陽性対照として用いたサイトメガロウイルス由来ペプチドであり、該ペプチドについてはＡ−２４結合親和性の高いものは、例えばKuzushima, K.ら, Blood 2001, 98(6):p1872-1881に、Ａ−２結合親和性の高いものは、例えばSolache A.ら, J. of Immunol. 1999, 163(10);p5512-5518にそれぞれ記載されている。
【００９１】
【表９】
【００９２】
更に、実施例１４等と同様にして標準的な４時間の51Cr遊離法を行い、これらのCTL前駆体からCTL系を確立した（図３２）。
【産業上の利用可能性】
【００９３】
本発明により、広範囲にわたる腫瘍組織に形成される内皮細胞を標的として細胞傷害性T細胞を誘導し、癌ワクチンとして非常に有効な新規ペプチド、及びこれを含有する腫瘍の治療及び予防のための医薬が提供される。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】図１は、標的細胞に対するCTLクローンによる細胞傷害活性を示す。
【図２】図２は、樹立したCTLクローンのHLA-テトラマー解析の結果を示す。（ａ）本発明のペプチドによって誘導されたCTLクローン及びフィーダー細胞（ｂ）フィーダー細胞（対照）
【図３】図３は、colon26を接種したBALB/cマウスの生存に対する本発明のペプチドを用いたワクチン接種の効果を示す。
【図４】図４は、colon26由来の腫瘍の増殖に対する本発明のペプチドを用いたワクチン接種の効果を示す。
【図５】図５は、B16を接種したマウスの生存に対する本発明のペプチドを用いたワクチン接種の効果を示す。
【図６】図６は、B16メラノーマ由来の腫瘍の増殖に対する本発明のペプチドを用いたワクチン接種の効果を示す。A2/Kb TGMに対してB16腫瘍細胞を皮下注射でチャレンジする前に、KDR773でパルスしたDC（●）、DC単独（△）、またはHBSS（□）で１週間の間隔をおいて２回ワクチン接種した。平均の腫瘍増殖を図示した。Ｐ<0.01。
【図７】図７は、本発明のペプチドを提示したHLA-A24陽性細胞に対するCTLクローンC29-169の殺細胞効果を示す。
【図８】図８は、本発明のペプチドを提示したHLA-A24陽性細胞に対するCTLクローンC29-169の殺細胞効果を示す。
【図９】図９は、本発明のペプチドを提示したHLA-A0201陽性細胞に対するCTLクローンKDR C85-775(KWC85-775)の殺細胞効果を示す。
【図１０】図１０は、KDRペプチドを提示したHLA-A0201陽性細胞に対するCTLクローンKDR C85-775(KWC85-775)の殺細胞効果を示す。
【図１１】図１１は、本発明のペプチドを提示したHLA-A0201陽性細胞に対するCTLクローンKDR C51-1328(KWC51)の殺細胞効果を示す。
【図１２】図１２は、KDRペプチドを提示したHLA-A0201陽性細胞に対するCTLクローンKDR C51-1328(KWC51)の殺細胞効果を示す。
【図１３】図１３は、本発明のペプチドを提示したHLA-A0201陽性細胞に対するCTLクローンKDR C44-773-2L(KWC44-773-2L)の殺細胞効果を示す。
【図１４】図１４は、本発明のペプチドを提示したHLA-A0201陽性細胞に対するCTLクローンKDR C44-773-2L(KWC44-773-2L)の殺細胞効果を示す。
【図１５】図１５は、KDRペプチドを提示したHLA-A0201陽性細胞に対するCTLクローンKDR C44-773-2L(KWC44-773-2L)の殺細胞効果を示す。
【図１６】図１６は、CTLクローンの殺細胞効果に対する各種抗体の阻害作用を示す。
【図１７】図１７は、A2/Kb TGMにおいてB16細胞によって誘導される血管新生応答に対する本発明のペプチドの阻害活性を示す。マウスをHBSS、パルスしていないDC、または本発明のエピトープペプチド（KDR190、772、773、773-2L、775、または1084）でパルスしたDCで２回ワクチン接種した。矢印は特徴的なジグザグに進む新たに形成された血管を示す。
【図１８】図１８は、本発明のペプチドのトランスジェニックマウスにおけるヒト腫瘍体積の増加に対する抑制効果を示す。
【図１９】図１９は、本発明のペプチドを提示したHLA-A0201陽性細胞に対するCTLクローンKWC65-190の殺細胞効果を示す。黒四角：ペプチド存在下、□：ペプチド不存在下
【図２０】図２０は、本発明のペプチドを提示したHLA-A0201陽性細胞に対するCTLクローンKWC72-772の殺細胞効果を示す。黒四角：ペプチド存在下、□：ペプチド不存在下
【図２１】図２１は、KDRペプチドを提示したHLA-A0201陽性細胞に対するCTLクローンKWC72-772の殺細胞効果を示す。黒四角：HePG2-VEGFR2、□：HePG2-EGFP
【図２２】図２２は、本発明のペプチドを提示したHLA-A24陽性細胞に対するCTLクローンC7-1318の殺細胞効果を示す。黒四角：ペプチド存在下、□：ペプチド不存在下
【図２３】図２３は、本発明のペプチドを提示したHLA-A24陽性細胞に対するCTLクローンKWC46の殺細胞効果を示す。黒四角：ペプチド存在下、□：ペプチド不存在下
【図２４】図２４は、本発明のペプチドを提示したHLA-A24陽性細胞に対するCTLクローンC18-189の殺細胞効果を示す。黒四角：ペプチド存在下、□：ペプチド不存在下
【図２５】図２５は、本発明のペプチドを提示したHLA-A24陽性細胞に対するCTLクローンC65-826の殺細胞効果を示す。黒四角：ペプチド存在下、□：ペプチド不存在下
【図２６】図２６は、本発明のペプチドを提示したHLA-A24陽性細胞に対するCTLクローンC7-1318の殺細胞効果を示す。黒四角：HT29-VEGFR2、□：HT29-EGFP
【図２７】図２７は、本発明のペプチドを提示したHLA-A24陽性細胞に対するCTLクローンKWC46の殺細胞効果を示す。黒四角：HT29-VEGFR2、□：HT29-EGFP
【図２８】図２８は、本発明のペプチドを提示したHLA-A24陽性細胞に対するCTLクローンC18-189の殺細胞効果を示す。黒四角：HT29-VEGFR2、□：HT29-EGFP
【図２９】図２９は、本発明のペプチドを提示したHLA-A24陽性細胞に対するCTLクローンC65-826の殺細胞効果を示す。黒四角：HT29-VEGFR2、□：HT29-EGFP
【図３０】図３０は、BALB/cにおいてcolon26細胞によって誘導される血管新生応答に対する本発明のペプチドの阻害活性を示す。マウスをHBSS、パルスしていないDC、または本発明のエピトープペプチド（KDR189または826）でパルスしたDCで２回ワクチン接種した。矢印は特徴的なジグザグに進む新たに形成された血管を示す。
【図３１】図３１は、BALB/cにおいてcolon26細胞によって誘導される血管新生応答に対する本発明のペプチドの阻害を示す。柱は平均を、縦棒は標準誤差を示す。
【図３２】図３２は、本発明のペプチドで刺激した患者由来のCTLによるHLA-A24陽性細胞に対する殺細胞効果を示す。黒ひし形：ペプチド存在下、□：ペプチド不存在下（Ａ）配列番号８（アミノ酸開始位置KDR169）で刺激して得られた結腸癌患者由来のCTLの殺細胞効果（Ｂ）配列番号５（アミノ酸開始位置KDR189）で刺激して得られた結腸癌患者由来のCTLの殺細胞効果（Ｃ）配列番号３（アミノ酸開始位置KDR220）で刺激して得られた結腸癌患者由来のCTLの殺細胞効果
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２、３、５、８、１１または１２に示すアミノ酸配列からなるペプチドから選ばれるノナペプチド。
【請求項２】
配列番号２、３、５、８、１１または１２に示すアミノ酸配列において１個、２個または数個のアミノ酸が置換または付加されており、細胞傷害性Ｔ細胞の誘導能を有するペプチド。
【請求項３】
Ｎ末端から２番目のアミノ酸がフェニルアラニン、チロシン、メチオニンまたはトリプトファンである、請求項２に記載のペプチド。
【請求項４】
Ｃ末端のアミノ酸がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンまたはメチオニンである、請求項２または３に記載のペプチド。
【請求項５】
配列番号２９、３０、３３、３４、４０、または４６に示すアミノ酸配列からなるペプチドから選ばれるノナペプチドまたはデカペプチド。
【請求項６】
配列番号２９、３０、３３、３４、４０、または４６に示すアミノ酸配列において１個、２個または数個のアミノ酸が置換または付加されており、細胞傷害性Ｔ細胞の誘導能を有するペプチド。
【請求項７】
Ｎ末端から２番目のアミノ酸がロイシンまたはメチオニンである、請求項６に記載のペプチド。
【請求項８】
Ｃ末端のアミノ酸がバリンまたはロイシンである、請求項６または７に記載のペプチド。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のペプチドを１種以上含む、腫瘍の治療及び／または予防のための医薬。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のペプチドを１種以上含む、糖尿病性網膜症、慢性関節リウマチ、乾癬、アテローム性動脈硬化症の治療のための医薬。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれか1項に記載のペプチドとＨＬＡ抗原とを含む複合体を表面に提示しているエキソソーム。
【請求項１２】
ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ０２である、請求項１１に記載のエキソソーム。
【請求項１３】
ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２４０２またはＨＬＡ−０２０１である、請求項１２に記載のエキソソーム。
【請求項１４】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のペプチドを用いて細胞傷害性Ｔ細胞誘導能の高い抗原提示細胞を誘導する方法。
【請求項１５】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のペプチドを用いて細胞傷害性Ｔ細胞を誘導する方法。
【請求項１６】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子を抗原提示細胞に導入することを含む、細胞傷害性Ｔ細胞誘導能の高い抗原提示細胞を誘導する方法。
【請求項１７】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のペプチドを用いて誘導される、単離された細胞傷害性Ｔ細胞。
【請求項１８】
ＨＬＡ抗原と請求項１〜８のいずれか１項に記載のペプチドとの複合体を提示してなる抗原提示細胞。
【請求項１９】
請求項１４または１５に記載の方法によって誘導される、請求項１８に記載の抗原提示細胞。
【請求項２０】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のペプチドを有効成分とする、病態部位における血管新生阻害のためのワクチン。
【請求項２１】
ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ０２である被験者に対して投与するための、請求項２０に記載のワクチン。
【請求項２２】
悪性腫瘍の増殖及び／または転移を抑制するために使用される、請求項２０または２１に記載のワクチン。
【請求項１】
配列番号２、３、５、８、１１または１２に示すアミノ酸配列からなるペプチドから選ばれるノナペプチド。
【請求項２】
配列番号２、３、５、８、１１または１２に示すアミノ酸配列において１個、２個または数個のアミノ酸が置換または付加されており、細胞傷害性Ｔ細胞の誘導能を有するペプチド。
【請求項３】
Ｎ末端から２番目のアミノ酸がフェニルアラニン、チロシン、メチオニンまたはトリプトファンである、請求項２に記載のペプチド。
【請求項４】
Ｃ末端のアミノ酸がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンまたはメチオニンである、請求項２または３に記載のペプチド。
【請求項５】
配列番号２９、３０、３３、３４、４０、または４６に示すアミノ酸配列からなるペプチドから選ばれるノナペプチドまたはデカペプチド。
【請求項６】
配列番号２９、３０、３３、３４、４０、または４６に示すアミノ酸配列において１個、２個または数個のアミノ酸が置換または付加されており、細胞傷害性Ｔ細胞の誘導能を有するペプチド。
【請求項７】
Ｎ末端から２番目のアミノ酸がロイシンまたはメチオニンである、請求項６に記載のペプチド。
【請求項８】
Ｃ末端のアミノ酸がバリンまたはロイシンである、請求項６または７に記載のペプチド。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のペプチドを１種以上含む、腫瘍の治療及び／または予防のための医薬。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のペプチドを１種以上含む、糖尿病性網膜症、慢性関節リウマチ、乾癬、アテローム性動脈硬化症の治療のための医薬。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれか1項に記載のペプチドとＨＬＡ抗原とを含む複合体を表面に提示しているエキソソーム。
【請求項１２】
ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ０２である、請求項１１に記載のエキソソーム。
【請求項１３】
ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２４０２またはＨＬＡ−０２０１である、請求項１２に記載のエキソソーム。
【請求項１４】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のペプチドを用いて細胞傷害性Ｔ細胞誘導能の高い抗原提示細胞を誘導する方法。
【請求項１５】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のペプチドを用いて細胞傷害性Ｔ細胞を誘導する方法。
【請求項１６】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子を抗原提示細胞に導入することを含む、細胞傷害性Ｔ細胞誘導能の高い抗原提示細胞を誘導する方法。
【請求項１７】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のペプチドを用いて誘導される、単離された細胞傷害性Ｔ細胞。
【請求項１８】
ＨＬＡ抗原と請求項１〜８のいずれか１項に記載のペプチドとの複合体を提示してなる抗原提示細胞。
【請求項１９】
請求項１４または１５に記載の方法によって誘導される、請求項１８に記載の抗原提示細胞。
【請求項２０】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のペプチドを有効成分とする、病態部位における血管新生阻害のためのワクチン。
【請求項２１】
ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ０２である被験者に対して投与するための、請求項２０に記載のワクチン。
【請求項２２】
悪性腫瘍の増殖及び／または転移を抑制するために使用される、請求項２０または２１に記載のワクチン。
【図１】
【図２】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３１】
【図３２】
【図３】
【図１７】
【図３０】
【図２】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３１】
【図３２】
【図３】
【図１７】
【図３０】
【公開番号】特開２００７−２７７２５１（Ｐ２００７−２７７２５１Ａ）
【公開日】平成１９年１０月２５日（２００７．１０．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１２３８５０（Ｐ２００７−１２３８５０）
【出願日】平成１９年５月８日（２００７．５．８）
【分割の表示】特願２００４−５７１９３８（Ｐ２００４−５７１９３８）の分割
【原出願日】平成１５年９月１２日（２００３．９．１２）
【出願人】（５０２２４０１１３）オンコセラピー・サイエンス株式会社 (142)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１０月２５日（２００７．１０．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年５月８日（２００７．５．８）
【分割の表示】特願２００４−５７１９３８（Ｐ２００４−５７１９３８）の分割
【原出願日】平成１５年９月１２日（２００３．９．１２）
【出願人】（５０２２４０１１３）オンコセラピー・サイエンス株式会社 (142)
【Ｆターム（参考）】
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