ＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制するＲＮＡ
クルッペル様因子５（ＫＬＦ５）ｃＤＮＡの塩基配列から設計した、ＫＬＦ５ｍＲＮＡの連続する１５〜３０塩基の配列および該配列を含みＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制するＲＮＡ。特に、配列番号２〜１６のいずれか１つの配列の鎖および該配列と相補的な配列の鎖からなる二本鎖ＲＮＡのそれぞれの鎖の３’端に２個のウリジル酸を付加した二本鎖ＲＮＡ。該ＲＮＡまたは該ＲＮＡを発現するベクターを細胞に導入することにより、該細胞中のＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制することができる。該ＲＮＡまたは該ＲＮＡを発現するベクターは、心血管系疾患または癌の治療薬に用いることができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、ＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制するＲＮＡに関する。
【背景技術】
クルッペル様因子（Ｋｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ ｆａｃｔｏｒ、以下ＫＬＦと略す）ファミリーは、Ｃ末端のジンク・フィンガー（ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ）モチーフを特徴とする、転写因子のファミリーであり、ＫＬＦ１、ＫＬＦ２、ＫＬＦ３、ＫＬＦ４、ＫＬＦ５、ＫＬＦ６、ＫＬＦ７、ＫＬＦ８、ＫＬＦ９、ＫＬＦ１０、ＫＬＦ１１、ＫＬＦ１２、ＫＬＦ１３、ＫＬＦ１４、ＫＬＦ１５、ＫＬＦ１６等が知られている。哺乳類において、ＫＬＦファミリーは、様々な組織や細胞、例えば赤血球、血管内皮細胞、平滑筋、皮膚、リンパ球等の分化に重要であること、また癌、心血管疾患、肝硬変、腎疾患、免疫疾患等の各種疾患の病態形成に重要な役割を果たしていることが報告されている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６，３４３５５−３４３５８，２００１；Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．，４，２０６，２００３）。
ＫＬＦファミリーのうちのＫＬＦ５は、ＢＴＥＢ２（ｂａｓｉｃ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｅｌｅｍｅｎｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）あるいはＩＫＬＦ（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ−ｅｎｒｉｃｈｅｄ Ｋｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ ｆａｃｔｏｒ）ともよばれる。血管平滑筋におけるＫＬＦ５の発現は、発生段階で制御を受けており、胎児の血管平滑筋では、高い発現を示すのに対し、正常な成人の血管平滑筋では発現が見られなくなる。また、バルーンカテーテルによる削剥後に新生した血管内膜の平滑筋では、ＫＬＦ５の高い発現がみられ、動脈硬化や再狭窄の病変部の平滑筋でもＫＬＦ５の発現がみられる（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１０２，２５２８−２５３４，２０００）。
動脈硬化巣や経皮的冠動脈形成術後の再狭窄部位などの病変部位の血管平滑筋は、活性化しており、筋フィラメントの消失、蛋白合成の亢進、増殖能や遊走能を示し、胎児の血管平滑筋と同様の形質（胎児型）へ形質転換している。平滑筋細胞にはＳＭ１、ＳＭ２、ＳＭｅｍｂという３種類のミオシン重鎖のアイソフォームが存在するが、胎児型への形質転換に伴い、ＳＭ２が消失し、ＳＭｅｍｂの発現誘導が認められる。ＫＬＦ５は、ＳＭｅｍｂ遺伝子の転写制御配列と結合し、その転写を活性化する（非特許文献４参照）。さらに、血小板由来増殖因子Ａ鎖（以下ＰＤＧＦ−Ａとよぶ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−β、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）リセプター、誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター（ＰＡＩ）−１および転写因子Ｅｇｒ（ｅａｒｌｙ ｇｒｏｗｔｈ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）−１など、血管の形質や血管新生に関与する遺伝子の転写を活性化することが報告されている（Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，８，８５６−８６３，２００２；Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９４７，５６−６６，２００１）。
また、ＫＬＦ５遺伝子のヘテロノックアウトマウスにおいて、心血管系への物理的負荷やアンジオテンシンＩＩにより引き起こされる血管平滑筋増殖と血管内膜肥厚、血管新生、血管外膜の肉芽形成、心肥大および心筋線維化等が著明に抑制されていることが報告されている（Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，８，８５６−８６３，２００２）。
このように、ＫＬＦ５遺伝子は平滑筋形質変換に関わるだけでなく、広く心血管系の病態形成に関わる転写因子であり、その機能発現には遺伝子発現量がきわめて重要である。ＫＬＦ５は、動脈硬化や、心肥大等の心血管系の疾患あるいは癌等の血管新生が関与する疾患の病態形成に関与するので、ＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制することでこれらの疾患の治療または予防に有用な薬剤となりうることが予想される。しかし、現在のところＫＬＦファミリー遺伝子の発現を効果的に抑制する薬剤は知られていない。
一方、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ、以下、ＲＮＡｉとよぶ）は、線虫において標的とする遺伝子と同一の配列を有する二本鎖ＲＮＡを導入することにより、標的遺伝子の発現が特異的に抑制される現象として報告された（Ｎａｔｕｒｅ，３９１，８０６−８１１，１９９８）。
ＲＮＡｉは、導入した二本鎖ＲＮＡが、２１〜２３塩基の長さの二本鎖ＲＮＡに分解された後、蛋白質複合体がこの短い二本鎖ＲＮＡと結合し、同じ配列を有するｍＲＮＡを認識し切断することによって起こると考えられている。Ｔｕｓｃｈｌらは、ショウジョウバエにおいて長い二本鎖ＲＮＡの代わりに、２１〜２３塩基の長さの二本鎖ＲＮＡを導入することによっても、標的遺伝子の発現が抑制されることを見いだし、これをｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と名づけた（ＷＯ ０１／７５１６４）。ｓｉＲＮＡの配列と標的遺伝子とのミスマッチがあると非常に発現抑制の効果が弱まること、長さは２１塩基が最も効果が高く、平滑末端よりも、両方の鎖の３’末端にヌクレオチドが付加して、末端が突出した構造の方が効果が高いことが示された（ＷＯ ０２／４４３２１）。
哺乳類細胞では、長い二本鎖ＲＮＡを導入した場合、ウイルス防御機構により遺伝子全体の発現抑制とアポトーシスが起こり、特定の遺伝子の抑制をすることができなかったが、２０〜２９塩基のｓｉＲＮＡであれば、このような反応がおこらず、特定の遺伝子の発現を抑制をすることができることが見いだされた。なかでも２１〜２５塩基のものが発現抑制効果が高い（Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４９４−４９８，２００１；Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，３，７３７−７４７，２００２；Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，１０，５４９−５６１，２００２；Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０，４９７−５００，２００２）。
ＲＮＡｉでは、二本鎖ＲＮＡは一本鎖アンチセンスＲＮＡに比べ、標的遺伝子に対する発現抑制効果が飛躍的に高いことが報告されている（Ｎａｔｕｒｅ，３９１，８０６−８１１，１９９８；Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，１０，５４９−５６１，２００２）。また、二本鎖ＲＮＡでなく、分子内ハイブリダイズにより、ヘアピン構造を形成する一本鎖ＲＮＡも、ｓｉＲＮＡと同様にＲＮＡｉを示すことが報告されている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９，６０４７−６０５２，２００２）。
ＲＮＡｉはｉｎ ｖｉｔｒｏのみならず、ｉｎ ｖｉｖｏ試験においても多く検証されており、５０ｂｐ以下のｓｉＲＮＡを用いた胎児の動物での効果（ＷＯ ０２／１３２７８８）、成体マウスでの効果（ＷＯ ０３／１０１８０）が報告されている。また、ｓｉＲＮＡをマウス胎児に静脈内投与した場合に、腎臓、脾臓、肺、膵臓、肝臓の各臓器で発現抑制効果が確認されている（Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３２，１０７−１０８，２００２）。さらに、脳細胞においてもｓｉＲＮＡを直接投与することで作用することが報告されている。（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０，１００６−１０１０，２００２）しかし、これまでのところＫＬＦ５あるいは他のＫＬＦファミリー遺伝子に対するｓｉＲＮＡを用いたＲＮＡｉに関しては報告例がない。
【発明の開示】
本発明の目的はＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制するＲＮＡを見出すことである。このようなＲＮＡは、ＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制することにより、ＫＬＦ５の転写因子としての機能を阻害し、心血管性疾患や癌等のＫＬＦ５が病態の形成に関与する疾患に対する、副作用の少ない治療薬または予防薬に用いることができる。
本発明者らは、鋭意検討を行った結果、以下に記載する発明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下の（１）〜（１３）に関する。
（１）ＫＬＦ５ ｍＲＮＡの連続する１５〜３０塩基の配列および該配列と相補的な配列を含み、ＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制するＲＮＡ。
（２）ＫＬＦ５ ｍＲＮＡがヒトまたはマウスのＫＬＦ５ ｍＲＮＡである、（１）に記載のＲＮＡ。
（３）ＲＮＡが、ＫＬＦ５ ｍＲＮＡの連続する１５〜３０塩基の配列の鎖および該配列と相補的な配列の鎖からなる二本鎖ＲＮＡのそれぞれの鎖の３’端に１〜６個のヌクレオチドを付加した二本鎖ＲＮＡである、（１）または（２）に記載のＲＮＡ。
（４）ＲＮＡが、ＫＬＦ５ ｍＲＮＡの連続する１５〜３０塩基の配列からなるＲＮＡおよび該配列と相補的な配列からなるＲＮＡを、スペーサーオリゴヌクレオチドでつなぎ、３’端に１〜６個のヌクレオチドを付加した、ヘアピン構造を形成するＲＮＡである、（１）または（２）に記載のＲＮＡ。
（５）以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選ばれるＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制するＲＮＡ。
（ａ）配列番号２〜１６のいずれか１つの配列の鎖および該配列と相補的な配列の鎖からなる二本鎖ＲＮＡのそれぞれの鎖の３’端に２〜４個のウリジル酸またはデオキシチミジル酸を付加した二本鎖ＲＮＡ。
（ｂ）配列番号２〜１６のいずれか１つの配列からなるＲＮＡおよび該配列と相補的な配列からなるＲＮＡを２個のウリジル酸を５’端に有するスペーサーＲＮＡでつなぎ、３’端に２〜４個のウリジル酸を付加した、ヘアピン構造を形成するＲＮＡ。
（ｃ）配列番号２〜１１のいずれか１つの配列の鎖および該配列と相補的な配列の鎖からなる二本鎖ＲＮＡのそれぞれの鎖の３’端に２個のウリジル酸を付加した二本鎖ＲＮＡ。
（６）（１）〜（５）のいずれか１項に記載のＲＮＡを発現するベクター。
（７）（１）〜（５）のいずれか１項に記載のＲＮＡまたは（６）に記載のベクターを細胞に導入することにより、該細胞中のＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制する方法。
（８）（１）〜（５）のいずれか１項に記載のＲＮＡまたは（６）に記載のベクターを細胞に導入することにより、該細胞中のＫＬＦ５により転写が活性化される遺伝子の発現を抑制する方法。
（９）ＫＬＦ５により転写が活性化される遺伝子が血小板由来増殖因子Ａ鎖遺伝子または平滑筋ミオシン重鎖ＳＭｅｍｂ遺伝子である（８）に記載の方法。
（１０）（１）〜（５）のいずれか１項に記載のＲＮＡまたは（６）に記載のベクターを有効成分として含有する医薬組成物。
（１１）（１）〜（５）のいずれか１項に記載のＲＮＡまたは（６）に記載のベクターを有効成分として含有する、血管新生を阻害するための医薬組成物。
（１２）（１）〜（５）のいずれか１項に記載のＲＮＡまたは（６）に記載のベクターを有効成分として含有する、心血管系疾患もしくは癌の治療薬または予防薬。
（１３）心血管系疾患が動脈硬化、冠動脈インターベンション後の再狭窄または心肥大である（１２）に記載の治療薬または予防薬。
本発明のＲＮＡにより、ＫＬＦ５遺伝子およびＫＬＦ５により転写が活性化される遺伝子の発現を抑制することができる。本発明のＲＮＡまたは該ＲＮＡを発現するベクターの投与により、ＫＬＦ５遺伝子およびＫＬＦ５により転写が活性化される遺伝子の発現が抑制され、平滑筋の増殖や血管新生を抑制できるので、本発明のＲＮＡまたは該ＲＮＡを発現するベクターは、動脈硬化、冠動脈インターベンション後の再狭窄、心肥大等の心血管系疾患、あるいは癌の治療剤または予防剤の有効成分として使用することができる。
１．ＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制するＲＮＡ
本発明のＲＮＡは、ＫＬＦ５ ｍＲＮＡの連続する１５〜３０塩基、好ましくは１７〜２５塩基、より好ましくは１９〜２３塩基の配列（以下配列Ｘとする）および該配列と相補的な配列（以下、相補配列Ｘ’とする）を含み、ＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制するＲＮＡである。該ＲＮＡとしては、（ａ）配列Ｘの鎖（センス鎖）および相補配列Ｘ’の鎖（アンチセンス鎖）からなる二本鎖ＲＮＡのそれぞれの鎖の３’端に１〜６個、好ましくは２〜４個のヌクレオチドを付加した二本鎖ＲＮＡ（以下、このような構造のＲＮＡをｓｉＲＮＡとよぶ）であってＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制するＲＮＡ、（ｂ）配列ＸからなるＲＮＡおよび相補配列Ｘ’からなるＲＮＡを、スペーサーオリゴヌクレオチドでつなぎ、３’端に１〜６個、好ましくは２〜４個のヌクレオチドを付加した、ヘアピン構造を形成するＲＮＡ（以下、このようなＲＮＡをｓｈＲＮＡとよぶ）であって、ＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制するＲＮＡがあげられる。これらのＲＮＡにおいて付加するヌクレオチドの塩基はグアニン、アデニン、シトシン、チミン、ウラシルのいずれでもよく、またＲＮＡでもＤＮＡでもよいが、ウリジル酸（Ｕ）またはデオキシチミジル酸（ｄＴ）が好ましい。またスペーサーオリゴヌクレオチドは６〜１２塩基のＲＮＡが好ましく、その５’端の配列は２個のＵが好ましい。スペーサーオリゴヌクレオチドの例として、ＵＵＣＡＡＧＡＧＡの配列からなるＲＮＡをあげることができる。スペーサーオリゴヌクレオチドによってつながれる２つのＲＮＡの順番はどちらが５’側になってもよい。
配列Ｘは、ＫＬＦ５ ｍＲＮＡの連続する１５〜３０塩基の配列、好ましくは１７〜２５塩基、より好ましくは１９〜２３塩基の配列であれば、いずれの配列でもよいが、以下の（１）に記載の方法で設計した１９塩基の配列が最も好ましい。以上の構造を有するＲＮＡであって、ＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制するものであれば、本発明のＲＮＡに含まれる。
本発明のＲＮＡは、上記の構造のＲＮＡをＫＬＦ５遺伝子が発現している細胞に導入してＫＬＦ５遺伝子の発現を測定し、ＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制するＲＮＡを選択することより取得できる。
（１）配列Ｘの設計
遺伝子の発現を抑制したい動物のＫＬＦ５ ｃＤＮＡの塩基配列から、ＡＡではじまる２１塩基の部分配列を取り出す。取り出した配列のＧＣ含量を計算し、ＧＣ含量が２０〜８０％、好ましくは３０％〜７０％、より好ましくは４０〜６０％の配列を複数個選択する。
配列は、好ましくは、コード領域内の配列で、開始コドンから７５塩基以上下流の配列を選択する。ＫＬＦ５ ｃＤＮＡの塩基配列の情報は、ＧｅｎＢａｎｋ等の塩基配列データベースから得ることができる。例えば、マウスＫＬＦ５ ｃＤＮＡの配列はＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００９７６９（配列番号４９）、ヒトＫＬＦ５ ｃＤＮＡの配列はＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ２８７２７２（配列番号５０）で、配列情報が得られる。
選択した配列の５’末端のＡＡを除き、配列中のＴをＵに変えた１９塩基の配列を配列Ｘとする。
（２）本発明のＲＮＡの調製
（１）で選択した配列Ｘを元に、以下のようにしてＲＮＡを調製することができる。以下には付加するオリゴヌクレオチドとして２個のＵまたはｄＴの場合を記載するが、他のヌクレオチドの場合も同様にして調製することができる。
（ａ）ｓｉＲＮＡの場合
配列Ｘの３’端に２個のＵまたはｄＴを付加した配列からなるＲＮＡ、および相補配列Ｘ’の３’端に２個のＵまたはｄＴを付加した配列からなるＲＮＡの２本のＲＮＡを調製する。この２本のＲＮＡは、化学合成あるいはインビトロ転写により調製できる。化学合成は、ＤＮＡ合成機を用いて行うことができる。またアンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）社、日本バイオサービス株式会社、キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）社等のメーカーに化学合成を依頼することもできる。化学合成した互いに相補的な配列を含む２本のＲＮＡをアニーリングすることにより、配列Ｘの鎖および相補配列Ｘ’の鎖からなる二本鎖ＲＮＡのそれぞれの鎖の３’端に２個のＵまたはｄＴを付加した二本鎖ＲＮＡを調製することができる。アニーリングは、２本のＲＮＡを適当なバッファー中で９０〜９５℃で１〜５分加熱後、４５〜６０分間かけて室温にまで冷却することにより行うことができる。
インビトロ転写によるＲＮＡの調製は、以下のようにして行うことができる。まず、（ｉ）Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を有するＤＮＡ（Ｔ７プライマー）、（ｉｉ）相補配列Ｘ’のＵをＴに変え、その５’端には２個のＡを付加し、３’端にはＴ７プライマーの３’端８塩基と相補的な配列を付加した配列を有するＤＮＡ、（ｉｉｉ）配列ＸのＵをＴに変え、その５’端には２個のＡを付加し、３’端にはＴ７プライマーの３’端８塩基と相補的な配列を付加した配列を有するＤＮＡ、をそれぞれ調製する。
Ｔ７プライマーと（ｉｉ）のＤＮＡとをアニールさせた後、ＤＮＡポリメラーゼ反応により、二本鎖ＤＮＡにする。得られた二本鎖ＤＮＡを鋳型として、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いたインビトロ転写反応を行うことにより、配列Ｘの３’端に２個のＵが付加し、５’端にはリーダー配列が付加した配列を有するＲＮＡを合成することができる。同様にＴ７プライマーと（ｉｉｉ）のＤＮＡとを用いて同様の反応を行うことにより、相補配列Ｘ’の３’端に２個のＵが付加し、５’端にはリーダー配列が付加した配列を有するＲＮＡを合成することができる。
２つの反応液を混ぜて、さらにインビトロ転写反応を続けることにより、互いに相補的な配列を含む２本のＲＮＡをアニールさせる。その後、デオキシリボヌクレアーゼおよび一本鎖ＲＮＡ特異的なリボヌクレアーゼにより、鋳型の二本鎖ＤＮＡおよび各ＲＮＡ鎖の５’側のリーダー配列を分解して除去する。各ＲＮＡ鎖の３’端の２個のＵは分解を受けずに付加したまま残る。
以上の反応は、サイレンサーｓｉＲＮＡ作製キット（Ｓｉｌｅｎｃｅｒ・ｓｉＲＮＡ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、アンビオン社製）等のキットを用いて行うことができる。Ｔ７プライマーとアニールさせるＤＮＡは、ＤＮＡ合成機により化学合成することができる。またアンビオン社、日本バイオサービス株式会社、北海道システムサイエンス株式会社、キアゲン社等のメーカーに化学合成を依頼することもできる。
（ｂ）ｓｈＲＮＡの場合
配列ＸからなるＲＮＡおよび相補配列Ｘ’からなるＲＮＡを、スペーサーオリゴヌクレオチドでつなぎ、３’端に１〜６個、好ましくは２〜４個のヌクレオチドを付加した、ヘアピン構造を形成するＲＮＡは、ＤＮＡ合成機を用いた化学合成によって調製できる。また、２．に後述するｓｉＲＮＡ発現ベクターを細胞に導入することにより、細胞内にｓｈＲＮＡが合成される。このｓｈＲＮＡは、細胞内でｓｉＲＮＡに変換される。ベクターを導入して細胞内で合成させた場合は、ｓｈＲＮＡの単離と（３）に記載した細胞への導入の操作は不要であり、ベクターを導入した細胞についてＫＬＦ５遺伝子の発現を解析すればよい。
（３）ＫＬＦ５遺伝子の発現抑制
ＫＬＦ５遺伝子を発現する細胞株に（２）で調製したｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを導入する。細胞株は、（１）の配列Ｘの設計のもとにしたＫＬＦ５ ｃＤＮＡと同じ動物種の細胞を用いる。ＫＬＦ５遺伝子を発現する細胞株としては、平滑筋、繊維芽細胞または血管内皮細胞に由来する細胞株、例えばマウス胎児繊維芽細胞株Ｃ３Ｈ／１０Ｔ１／２（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−２２６）、ヒト臍帯血管内皮細胞等をあげることができる。ＲＮＡの導入は、動物細胞へのトランスフェクション用試薬、例えばポリフェクト（Ｐｏｌｙｆｅｃｔ）トランスフェクション試薬（キアゲン社製）、トランスメッセンジャー（ＴｒａｎｓＭｅｓｓｅｎｇｅｒ）トランスフェクション試薬、オリゴフェクトアミン（Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）試薬（インビトロジェン社製）、リポフェクトアミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）２０００（インビトロジェン社製）等を利用して、これらの試薬とＲＮＡを混合して複合体を形成させた後、細胞に添加することにより行うことができる。
本発明のＲＮＡまたは２．で後述するｓｉＲＮＡ発現ベクターを導入した細胞のＫＬＦ５遺伝子の発現は、ＲＴ−ＰＣＲにより解析することができる。ＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ発現ベクターを導入した細胞および導入しなかった細胞から総ＲＮＡを調製し、このＲＮＡからｃＤＮＡを合成する。合成したｃＤＮＡを鋳型にして、ＫＬＦ５遺伝子に特異的なプライマーを用いたＰＣＲを行い、ＫＬＦ５ ｃＤＮＡに由来する増幅産物の量を、アガロースゲル電気泳動によって定量することにより、ＫＬＦ５遺伝子の発現量を測定することができる。ＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ発現ベクターを導入しなかった細胞のＫＬＦ５遺伝子の発現量と比較して、ＫＬＦ５遺伝子の発現量が減少した細胞に導入したＲＮＡを、ＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制するＲＮＡとして選択する。
このようにして選択された、ＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制するＲＮＡとしては、配列番号２〜１１のいずれか１つの配列の鎖および該配列と相補的な配列の鎖からなる二本鎖ＲＮＡのそれぞれの鎖の３’端に２個のウリジル酸を付加した二本鎖ＲＮＡをあげることができる。該ＲＮＡはマウスｃＤＮＡの配列に基づいて設計されたものであり、マウスＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制する。このうち、配列番号４、８および１０の配列はそれぞれマウスとヒトのぞれぞれのＫＬＦ５ ｍＲＮＡで共通する配列であるので、配列番号４、８および１０のいずれか１つの配列の鎖および該配列と相補的な配列の鎖からなる二本鎖ＲＮＡのそれぞれの鎖の３’端に２個のウリジル酸を付加した二本鎖ＲＮＡは、マウスＫＬＦ５遺伝子だけでなくヒトＫＬＦ５遺伝子の発現も抑制する。
（１）の配列Ｘの設計のもとにしたある動物種ＡのＫＬＦ５ ｃＤＮＡと、異なる動物種ＢのＫＬＦ５ ｃＤＮＡを配列の相同性に基づいてアライメントすることにより、動物種Ａで選択された配列Ｘと対応する動物種Ｂの配列Ｙを得ることができる。上記の方法で、動物種ＡのＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制するＲＮＡが得られた場合、該ＲＮＡの配列Ｘおよびその相補配列Ｘ’の領域をそれぞれ配列Ｙとその相補配列Ｙ’に置換したＲＮＡは、動物種ＢのＫＬＦ５遺伝子を抑制すると考えられる。
例えば、マウスＫＬＦ５ ｃＤＮＡの配列に基づく配列番号２、３、７、９および１１のいずれか１つの配列の鎖および該配列と相補的な配列の鎖からなる二本鎖ＲＮＡのそれぞれの鎖の３’端に２個のウリジル酸を付加した二本鎖ＲＮＡは、マウスＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制するので、ヒトＫＬＦ５ ｃＤＮＡにおいて対応する配列である配列番号１２〜１６のいずれか１つの配列の鎖および該配列と相補的な配列の鎖からなる二本鎖ＲＮＡのそれぞれの鎖の３’端に２個のウリジル酸を付加した二本鎖ＲＮＡは、ヒトＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制すると考えられる。
２．ＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制するＲＮＡを発現するベクター
（１）プラスミドベクター
ＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制するＲＮＡを発現するプラスミドベクターを、培養細胞または生体内の細胞に導入することにより、細胞内で該ＲＮＡが産生され、導入した細胞でのＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制することができる。該ベクターは、Ｕ６プロモーターあるいはＨ１プロモーター等ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩのプロモーターを含む動物細胞用プラスミドベクター等のｓｉＲＮＡ発現用ベクターのプロモーターの下流に、１．で選択された配列Ｘおよびその相補配列Ｘ’（それぞれＵはＴに変換する）を、２個のＴを５’端に有するスペーサー配列でつなぎ、３’端にＲＮＡポリメラーゼＩＩＩターミネーターとなる４〜６個のＴからなる配列を含むＤＮＡ（以下、ＫＬＦ５ ｓｉＲＮＡ用ＤＮＡとよぶ）を挿入して作製することができる。スペーサー配列としては、２個のＴを５’端に有する６〜１２塩基の配列が好ましく、例えば、ＴＴＣＡＡＧＡＧＡをあげることができる。配列Ｘと相補配列Ｘ’の順序は、どちらが５’側でもよい。ｓｉＲＮＡ発現用ベクターとしては、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ１．０−Ｕ６（アンビオン社製）、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ３．０（アンビオン社製）、ｐＳＵＰＥＲ〔オリゴエンジン（ＯｌｉｇｏＥｎｇｉｎｅ）社製〕、ｐＳＩＲＥＮ−ＤＮＲ〔ＢＤバイオサイエンシズ・クロンテック（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）社製〕等をあげることができる。
上記のＫＬＦ５ ｓｉＲＮＡ用ＤＮＡを挿入して作製した組換えベクターを導入した細胞では、Ｕ６プロモーターからのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ反応により、１．（１）に記載したｓｈＲＮＡが合成され、このｓｈＲＮＡが細胞内で切断を受けてｓｉＲＮＡに変換される。組換えベクターの細胞への導入は、通常の動物細胞へのベクターの導入と同様に、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３−７４１７，１９８７）等により行うことができる。
（２）ウイルスベクター
ｓｉＲＮＡ発現ベクターとして、レトロウイルスベクターやレンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター等のウイルスベクターを利用したｓｉＲＮＡ発現用ベクターを用いることもできる。このようなウイルスベクターを利用したｓｉＲＮＡ発現用ベクターとして、ｐＳＵＰＥＲ．ｒｅｔｒｏ（オリゴエンジン社製）、ｐＳＩＲＥＮ−ＲｅｔｒｏＱ（ＢＤバイオサイエンシズ・クロンテック社製）、文献（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ，１００，１８４４−１８４８，２００３；Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，３３，４０１−４０６，２００３）に記載のベクターなどをあげることができる。
ウイルスベクターを利用したｓｉＲＮＡ発現用ベクターに上記と同様のＫＬＦ５ ｓｉＲＮＡ用ＤＮＡを挿入して作製した組換えベクターを、用いたウイルスベクターに応じたパッケージング細胞に導入することにより、該組換えベクターを含む組換えウイルスを生産させる。組換えベクターのパッケージング細胞への導入は、上記と同様に、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等により行うことができる。得られた組換えウイルスを細胞に接触させて感染させることにより、組換えベクターが細胞に導入され、１．（１）に記載したｓｈＲＮＡが合成され、このｓｈＲＮＡが細胞内で切断を受けてＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡに変換される。
３．ＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制するＲＮＡの利用法
（１）ＫＬＦ５により転写が活性化される遺伝子の発現の抑制
ＫＬＦ５は転写因子として、種々の遺伝子の発現を活性化している。ＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制するＲＮＡにより、ＫＬＦ５遺伝子の発現が抑制される結果、ＫＬＦ５により転写が活性化される遺伝子の発現も抑制することができる。ＫＬＦ５により転写が活性化される遺伝子としては、ＳＭｅｍｂ、ＰＤＧＦ−Ａ、ＴＧＦ−β、ＶＥＧＦリセプター、ＰＡＩ−１、Ｅｇｒ−１等の遺伝子をあげることができる。
（２）ＫＬＦ５の機能の解析
ＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制するＲＮＡを、種々の細胞に作用させ、その細胞の形質の変化や、各種遺伝子の発現量の変動を調べることにより、それぞれの細胞におけるＫＬＦ５の機能を解析することができる。また、該ＲＮＡは、胎児から成体まで、さまざまな発育段階の動物でＫＬＦ５遺伝子の発現抑制をすることができるので、ヘテロノックアウトマウスの解析だけではわからないＫＬＦ５の機能の解明をすることが可能となる。
４．本発明のＲＮＡまたはベクターを有効成分として含有する医薬組成物
本発明のＫＬＦ５遺伝子の発現を特異的に抑制するＲＮＡ、または該ＲＮＡを発現するベクターを投与することにより、ＫＬＦ５および、ＫＬＦ５が転写を活性化する遺伝子の発現が抑制され、平滑筋の増殖や血管新生が阻害されるので、動脈硬化、冠動脈インターベンション後の再狭窄や心肥大等の心血管系の疾患あるいは癌の治療または予防をすることができる。
本発明のＲＮＡまたは該ＲＮＡを発現するベクターは、医薬品として使用する場合、単独で投与することも可能ではあるが、通常は薬理学的に許容される添加剤（例えば担体、賦形剤、希釈剤等）、安定化剤または製薬上必要な成分と混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。また、ウイルスベクターの場合は、組換えウイルスの形態でウイルスベクターを投与することが望ましい。
投与経路は、治療に際し最も効果的なものを使用するのが望ましく、口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内などの非経口投与または経口投与をあげることができ、望ましくは静脈内投与、筋肉内投与をあげることができる。静脈内投与、筋肉内投与に適当な製剤としては、注射剤があげられる。
本発明のＲＮＡまたは該ＲＮＡを発現するベクターを、注射剤の形態に成形するに際しては、担体として、たとえば、水、エチルアルコール、マクロゴール、プロピレングリコール、クエン酸、酢酸、リン酸、乳酸、乳酸ナトリウム、硫酸および水酸化ナトリウム等の希釈剤、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウムおよびリン酸ナトリウム等のｐＨ調整剤および緩衝剤、ピロ亜硫酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸、チオグリコール酸およびチオ乳酸等の安定化剤等が使用できる。なお、この場合等張性の溶液を調製するに十分な量の食塩、ブドウ糖、マンニトールまたはグリセリンを医薬製剤中に含有せしめてもよい。安定化剤としては、グルコース等の単糖類、サッカロース、マルトース等の二糖類、マンニトール、ソルビトール等の糖アルコール、塩化ナトリウム等の中性塩、グリシン等のアミノ酸、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体（プルロニック）、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（トゥイーン）等の非イオン系界面活性剤、ヒトアルブミン等が例示される。また、細胞内への取り込みを促進するため、本発明のＲＮＡまたは該ＲＮＡを発現するベクターを、該ＲＮＡまたはベクターを含むリポソームとして調製して用いてもよい。
【図面の簡単な説明】
第１図 ＫＬＦ５遺伝子特異的なｓｉＲＮＡによるＫＬＦ５遺伝子の発現抑制を示す。左から、１００ｂｐマーカー、ｓｉＲＮＡを導入しなかった細胞、ＳＥＡＰ−ｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．２、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．３、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．４、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．５、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．６をそれぞれ導入した細胞でのＰＣＲによる測定で、ＫＬＦ５は、ＫＬＦ５ ｍＲＮＡ由来の増幅産物、１８Ｓは、１８Ｓ ｒＲＮＡ由来の増幅産物の位置を示す。
第２図 ＫＬＦ５遺伝子特異的なｓｉＲＮＡによるＫＬＦ５遺伝子の発現抑制を示す。左から、１００ｂｐマーカー、ｓｉＲＮＡを導入しなかった細胞、ＳＥＡＰ−ｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．７、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．８、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．９、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．１０、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．１１、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．４、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．１をそれぞれ導入した細胞でのＰＣＲによる測定で、ＫＬＦ５は、ＫＬＦ５ ｍＲＮＡ由来の増幅産物、１８Ｓは、１８Ｓ ｒＲＮＡ由来の増幅産物の位置を示す。
第３図 ＫＬＦ５遺伝子特異的なｓｉＲＮＡによるＰＤＧＦ−Ａ遺伝子の発現抑制を示す。左から、１００ｂｐマーカー、ｓｉＲＮＡを導入しなかった細胞、ＳＥＡＰ−ｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．７、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．８、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．９、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．１０、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．１１、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．４、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．１をそれぞれ導入した細胞でのＰＣＲによる測定で、ＰＤＧＦ−Ａは、ＰＤＧＦ−Ａ ｍＲＮＡ由来の増幅産物、１８Ｓは、１８Ｓ ｒＲＮＡ由来の増幅産物の位置を示す。
第４図 ＫＬＦ５遺伝子特異的なｓｉＲＮＡによるＳＭｅｍｂ遺伝子の発現抑制を示す。左から、１００ｂｐマーカー、ｓｉＲＮＡを導入しなかった細胞、ＳＥＡＰ−ｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．７、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．８、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．９、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．１０、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．１１、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．４、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．１をそれぞれ導入した細胞でのＰＣＲによる測定で、ＳＭｅｍｂは、ＳＭｅｍｂ ｍＲＮＡ由来の増幅産物、１８Ｓは、１８Ｓ ｒＲＮＡ由来の増幅産物の位置を示す。
第５図 ＫＬＦ５遺伝子特異的なｓｉＲＮＡはＳＲＦ遺伝子の発現は抑制しないことを示す。左から、ｓｉＲＮＡを導入しなかった細胞、ＳＥＡＰ−ｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．１、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．４、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．７、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．９、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．１０をそれぞれ導入した細胞でのＰＣＲによる測定で、ＳＲＦは、ＳＲＦｍＲＮＡ由来の増幅産物、１８Ｓは、１８Ｓ ｒＲＮＡ由来の増幅産物の位置を示す。
第６図 ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．４によるヒトＫＬＦ５遺伝子の発現抑制を示す。左から、１００ｂｐマーカー、ｓｉＲＮＡを導入しなかった細胞、ＳＥＡＰ−ｓｉＲＮＡ、およびｓｉＲＮＡ Ｎｏ．４をそれぞれ導入した細胞でのＰＣＲによる測定で、ＫＬＦは、ＫＬＦ５ ｍＲＮＡ由来の増幅産物、１８Ｓは、１８Ｓ ｒＲＮＡ由来の増幅産物の位置を示す。
第７図 ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．４による血管内皮細胞の遊走の阻害を示す。横軸は時間（時間）、縦軸は遊走した細胞数で、●はｓｉＲＮＡ Ｎｏ．４を導入した細胞、■はＳＥＡＰ−ｓｉＲＮＡを導入した細胞の結果を示す。エラーバーは例数４の標準偏差である。
第８図 ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．４による抗腫瘍効果を示す。横軸は時間（日数）、縦軸は腫瘍体積（ｍｍ３）で、●はＫＬＦ５ ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．４を投与したマウスの腫瘍体積、■はＳＥＡＰ−ｓｉＲＮＡを投与したマウスの腫瘍体積を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
実施例１ ｓｉＲＮＡによるＫＬＦ５遺伝子の発現抑制
（１）ｓｉＲＮＡの調製
ＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制できるｓｉＲＮＡの配列として、マウスＫＬＦ５ ｃＤＮＡの配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＭ＿００９７６９、配列番号４９）から、（ａ）ＡＡではじまる２１塩基の配列、（ｂ）ＧＣ含量が２０〜８０％の２つの条件に当てはまる、１１個の部分配列を選択した。ただし、開始コドン（配列番号４９の１６７〜１６９番目の配列）より７５塩基以上下流の、コード領域（配列番号１６７〜１５０７番目の配列）内の配列で、ＧＣ含量が４０〜６０％のものをなるべく選択するようにした。選択した配列の配列番号４９における配列の位置、ＧＣ含量を第１表に示した。選択した配列の５’端のＡＡを除いた１９塩基の配列のＴをＵに変えた配列をそれぞれ配列番号１〜１１に示した。
配列番号１〜１１のいずれかの配列および該配列と相補的な配列の３’端にそれぞれ２個のＵまたはｄＴを付加した配列からなる１１種類の二本鎖ＲＮＡ（以下、それぞれｓｉＲＮＡ Ｎｏ．１〜Ｎｏ．１１とよぶ）を以下のようにして調製した。ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．１〜Ｎｏ．１１それぞれのセンス鎖およびアンチセンス鎖の配列を第１表に示した（配列番号１７〜３８）。ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．１は、配列番号１７および１８の配列からなる２本のＲＮＡを、株式会社日本バイオサービスに依頼して化学合成し、アニーリングさせることにより調製した。ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．２〜Ｎｏ．１１はサイレンサーｓｉＲＮＡ作製キット（ＳｉｌｅｎｃｅｒＴＭ ｓｉＲＮＡ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、アンビオン社製）を利用したインビトロ転写により調製した。インビトロ転写の鋳型作製に用いるＤＮＡは、北海道システム・サイエンス株式会社に化学合成を依頼した。また、文献（Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，３２，１０７−１０８，２００２；米国特許出願公開 第２００２／０１３２７８８号明細書）に基づき、配列番号３９および４０の配列からなる、分泌型アルカリフォスファターゼ（ＳＥＡＰ）遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡ（以下、ＳＥＡＰ−ｓｉＲＮＡとよぶ）を、サイレンサーｓｉＲＮＡ作製キットを利用したインビトロ転写により調製し、コントロールのｓｉＲＮＡとして用いた。
（２）ｓｉＲＮＡによるＫＬＦ５遺伝子の発現抑制
マウス胎児線維芽細胞株Ｃ３Ｈ／１０Ｔ１／２（入手先：アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）、ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−２２６）をウェルあたり４×１０５個になるよう６ウェル・プレート（コーニング社製）に播種した。１．５μｇのｓｉＲＮＡ Ｎｏ．２、Ｎｏ．３、Ｎｏ．４、Ｎｏ．５、Ｎｏ．６およびＳＥＡＰ−ｓｉＲＮＡそれぞれに、細胞内導入試薬ポリフェクト（ｐｏｌｙｆｅｃｔＲ、キアゲン社製）１０μＬを添加して混合し、室温下５〜１０分保持した後、各ウェルに添加した。５％ＣＯ２存在下３７℃で４８時間から７２時間インキュベーションし、細胞にそれぞれのｓｉＲＮＡを導入した。
ｓｉＲＮＡによるＫＬＦ５遺伝子の発現抑制は、以下に示すＲＴ−ＰＣＲにより確認した。インキュベーション終了後、回収した細胞から、細胞溶解液ホモジェナイズ用キットのＱＩＡシュレッダー（ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒ、キアゲン社製）および総ＲＮＡ精製用キットのＲＮイージー（ＲＮｅａｓｙ、キアゲン社製）を用いてＲＮＡを単離した。単離したＲＮＡを、３０〜５０μＬの注射用水（大塚蒸留水、大塚製薬株式会社製）で溶解し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成した。逆転写反応は、上記のＲＮＡ溶液（ＲＮＡ１．０μｇ分）と、５×緩衝液２．５μＬ、０．１ｍｏｌ／Ｌジチオスレイトール（ＤＴＴ）２．０μＬ、２０ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰ（ロッシュ社製）１．０μＬ、５０μｍｏｌ／Ｌランダムプライマー（宝酒造株式会社製）２．０μＬ、ヌクレアーゼ阻害剤スーパーアーゼ・イン（ＳＵＰＥＲａｓｅ・Ｉｎ、アンビオン社製）１．０μＬおよびパワースクリプト（ＰｏｗｅｒＳｃｒｉｐｔ）逆転写酵素（クロンテック社製）１．０μＬを含む溶液１．０μｇを混合し、合計１８μＬになるよう注射用水を加えた反応溶液で、４２℃で１．５時間実施した。５×緩衝液およびＤＴＴはパワースクリプト逆転写酵素に付属のものを用いた。
配列番号４１および４２の配列それぞれからなる２本のＤＮＡを化学合成し、それぞれマウスＫＬＦ５遺伝子特異的なフォワードプライマー、リバースプライマーとした。これらのプライマーを用いたＰＣＲにより、ＫＬＦ５ ｃＤＮＡから配列番号４９の１２６８〜１４２８番目の配列に相当する１６１ｂｐの断片が増幅される。
１０×ＰＣＲ緩衝液２．５μＬ、２．５ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰ（ロッシュ製）２．０μＬ、５μｍｏｌ／Ｌフォワードプライマー２．０μＬ、５μｍｏｌ／Ｌリバースプライマー２．０μＬ、ホットスタータック（ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ（キアゲン社製、５単位／μＬ）０．１２５μＬ、１８Ｓ ｒＲＮＡ特異的プライマー〔クォンタｍＲＮＡ（ＱｕａｎｔｕｍＲＮＡ）クラシック１８Ｓ内部標準、アンビオン社製〕２μＬ、注射用水１３．３７５μＬ、ｃＤＮＡ１．０μＬからなる２５μＬのＰＣＲ反応溶液を調製し、９５℃で１５分保持後、熱変性９４℃で３０秒間、アニーリング５３℃で３０秒間、伸長反応７２℃で４０秒間の反応を１サイクルとして、２８サイクルのＰＣＲを実施し、その後７２℃で１０分間保持した。１０×ＰＣＲ緩衝液はホットスタータックＤＮＡポリメラーゼに付属のものを使用した。反応後の溶液の０．８％アガロースゲル電気泳動により、ＫＬＦ５ ｍＲＮＡに由来する増幅産物（１６１ｂｐ）を検出し、ｓｉＲＮＡを導入しなかった細胞での増幅産物の量と比較した。内部標準として、１８Ｓ ｒＲＮＡに由来する増幅産物（４８８ｂｐ）を用いた。第１図に示すように、コントロールのＳＥＡＰ−ｓｉＲＮＡではＫＬＦ５遺伝子の発現の抑制が見られないのに対し、ＫＬＦ５遺伝子に特異的な、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．２、Ｎｏ．３、Ｎｏ．４、Ｎｏ．５およびＮｏ．６は、ＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制することが確認できた。中でも、ｓｉＲＮＡＮｏ．３およびｓｉＲＮＡ Ｎｏ．４は強くＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制した。
ＫＬＦ５遺伝子に特異的なｓｉＲＮＡとして、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．１、Ｎｏ．４、Ｎｏ．７、Ｎｏ．８、Ｎｏ．９、Ｎｏ．１０およびＮｏ．１１を用いて、上記と同様にして、Ｃ３Ｈ／１０Ｔ１／２細胞へのｓｉＲＮＡの導入と、ＲＴ−ＰＣＲによるＫＬＦ５遺伝子の発現の解析を行った。第２図に示すように、コントロールのＳＥＡＰ−ｓｉＲＮＡではＫＬＦ５遺伝子の発現の抑制が見られないのに対し、ＫＬＦ５遺伝子に特異的な、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．４、Ｎｏ．７、Ｎｏ．８、Ｎｏ．９、Ｎｏ．１０およびＮｏ．１１は、ＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制することが確認できた。中でも、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．４、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．７、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．９およびｓｉＲＮＡ Ｎｏ．１０は強くＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制した。ＫＬＦ５遺伝子に特異的であるにもかかわらず、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．１では抑制がみられなかった。
実施例２ ＫＬＦ５遺伝子特異的なｓｉＲＮＡによる、ＫＬＦ５により転写が活性化される遺伝子の発現の抑制
（１）ＰＤＧＦ−Ａ遺伝子の発現の抑制
ＫＬＦ５遺伝子に特異的なｓｉＲＮＡとして、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．１、Ｎｏ．４、Ｎｏ．７、Ｎｏ．８、Ｎｏ．９、Ｎｏ．１０およびＮｏ．１１をＣ３Ｈ／１０Ｔ１／２細胞へ導入し、ＲＴ−ＰＣＲにより、ＫＬＦ５により転写が活性化される遺伝子であるＰＤＧＦ−Ａ遺伝子の発現の解析を行った。
実施例１（２）と同様にして、ｓｉＲＮＡのＣ３Ｈ／１０Ｔ１／２細胞への導入、ｃＤＮＡの調製を行った。配列番号４３および４４の配列からなる２本のＤＮＡを化学合成し、それぞれＰＤＧＦ−Ａ遺伝子特異的なフォワードプライマーおよびリバースプライマーとした。これらのプライマーを用いたＰＣＲにより、ＰＤＧＦ−Ａ ｃＤＮＡから４０３ｂｐの断片が増幅される。ＰＤＧＦ−Ａ遺伝子特異的なフォワードプライマーおよびリバースプライマーを、ＫＬＦ５遺伝子特異的なフォワードプライマーおよびリバースプライマーの代わりに用いて、実施例１（２）のＫＬＦ５遺伝子の発現解析と同様にして、ＰＤＧＦ−Ａ遺伝子の発現を解析した。ただしＰＣＲは、ＰＣＲ反応溶液を９５℃で１５分間保持後、熱変性９４℃で３０秒間、アニーリング５３℃で３０秒間、伸長反応７２℃で４０秒間からなる反応を１サイクルとし、２６サイクル実施し、その後７２℃で１０分間保持する条件で行い、電気泳動は１％アガロースゲルで行った。
第３図に示すように、コントロールのＳＥＡＰ−ｓｉＲＮＡではＰＤＧＦ−Ａ遺伝子の発現の抑制が見られないのに対し、ＫＬＦ５遺伝子に特異的な、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．４、Ｎｏ．７、Ｎｏ．８、Ｎｏ．９、Ｎｏ．１０およびＮｏ．１１は、ＫＬＦ５により転写が活性化される遺伝子であるＰＤＧＦ−Ａ遺伝子の発現をも抑制することが確認できた。中でも、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．４、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．７、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．９およびｓｉＲＮＡ Ｎｏ．１０は強くＰＤＧＦ−Ａ遺伝子の発現を抑制した。ＫＬＦ５遺伝子に特異的であるにもかかわらず、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．１では抑制がみられなかった。
（２）ＳＭｅｍｂ遺伝子の発現の抑制
ＫＬＦ５遺伝子に特異的なｓｉＲＮＡとして、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．１、Ｎｏ．４、Ｎｏ．７、Ｎｏ．８、Ｎｏ．９、Ｎｏ．１０およびＮｏ．１１をＣ３Ｈ／１０Ｔ１／２細胞へ導入し、ＲＴ−ＰＣＲにより、ＫＬＦ５により転写が活性化される遺伝子であるＳＭｅｍｂ遺伝子の発現の解析を行った。
実施例１（２）と同様にして、ｓｉＲＮＡのＣ３Ｈ／１０Ｔ１／２細胞への導入、ｃＤＮＡの調製を行った。配列番号４５および４６の配列からなる２本のＤＮＡを化学合成し、それぞれＳＭｅｍｂ遺伝子特異的なフォワードプライマーおよびリバースプライマーとした。これらのプライマーを用いたＰＣＲにより、ＳＭｅｍｂ ｃＤＮＡから２３５ｂｐの断片が増幅される。ＳＭｅｍｂ遺伝子特異的なフォワードプライマーおよびリバースプライマーを、ＫＬＦ５遺伝子特異的なフォワードプライマーおよびリバースプライマーの代わりに用いて、実施例１（２）のＫＬＦ５遺伝子の発現解析と同様にして、ＳＭｅｍｂ遺伝子の発現を解析した。ただしＰＣＲは、ＰＣＲ反応溶液を９５℃で１５分間保持後、熱変性９４℃で３０秒間、アニーリング５３℃で３０秒間、伸長反応７２℃で４０秒間からなる反応を１サイクルとし、２６サイクル実施し、その後７２℃で１０分間保持する条件で行い、電気泳動は１％アガロースゲルで行った。
第４図に示すように、コントロールのＳＥＡＰ−ｓｉＲＮＡではＳＭｅｍｂ遺伝子の発現の抑制が見られないのに対し、ＫＬＦ５遺伝子に特異的な、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．４、Ｎｏ．７、Ｎｏ．８、Ｎｏ．９、Ｎｏ．１０およびＮｏ．１１は、ＫＬＦ５により転写が活性化される遺伝子であるＳＭｅｍｂ遺伝子の発現をも抑制することが確認できた。中でも、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．４、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．７、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．９およびｓｉＲＮＡ Ｎｏ．１０は強くＳＭｅｍｂ遺伝子の発現を抑制した。ＫＬＦ５遺伝子に特異的であるにもかかわらず、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．１では抑制がみられなかった。
（３）ＫＬＦ５遺伝子特異的なｓｉＲＮＡによる遺伝子発現の抑制の特異性
ＫＬＦ５遺伝子に特異的なｓｉＲＮＡによる遺伝子の発現の抑制が、ＫＬＦ５遺伝子およびＫＬＦ５により転写が活性化される遺伝子に特異的であることを、ＫＬＦ５遺伝子に特異的なｓｉＲＮＡをＣ３Ｈ／１０Ｔ１／２細胞へ導入し、ＲＴ−ＰＣＲにより血清応答因子（ＳＲＦ）遺伝子の発現を解析することにより、検証した。ＳＲＦ遺伝子は平滑筋細胞で多く発現する転写因子の遺伝子であり、ＫＬＦ５により転写が活性化される遺伝子ではない。
ＫＬＦ５遺伝子に特異的なｓｉＲＮＡとして、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．１、Ｎｏ．４、Ｎｏ．７、Ｎｏ．９およびＮｏ．１０を用いて、実施例１（２）と同様にして、ｓｉＲＮＡをＣ３Ｈ／１０Ｔ１／２細胞へ導入した後、ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現の解析を行った。配列番号４７および４８の配列からなる２本のＤＮＡを化学合成し、それぞれＳＲＦ遺伝子特異的なフォワードプライマーおよびリバースプライマーとした。これらのプライマーを用いたＰＣＲにより、ＳＲＦ ｃＤＮＡから５１９ｂｐの断片が増幅される。ＳＲＦ遺伝子特異的なフォワードプライマーおよびリバースプライマーを、ＫＬＦ５遺伝子特異的なフォワードプライマーおよびリバースプライマーの代わりに用いて、実施例１（２）のＫＬＦ５遺伝子の発現解析と同様にして、ＳＲＦ遺伝子の発現を解析した。ただしＰＣＲは、ＰＣＲ反応溶液を９５℃で１５分間保持後、熱変性９４℃で３０秒間、アニーリング５３℃で３０秒間、伸長反応７２℃で４０秒間からなる反応を１サイクルとし、２６サイクル実施し、その後７２℃で１０分間保持する条件で行い、電気泳動は１．２％アガロースゲルで行った。
第５図に示すように、ＫＬＦ５遺伝子に特異的な、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．１、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．４、Ｎｏ．７、Ｎｏ．９およびＮｏ．１０全てにおいて、コントロールのＳＥＡＰ−ｓｉＲＮＡと同様に、ＳＲＦ遺伝子の発現の抑制がみられなかった。したがって、ＫＬＦ５遺伝子に特異的なｓｉＲＮＡは、非特異的に、遺伝子全体の発現を抑制するのでなく、ＫＬＦ５遺伝子およびＫＬＦにより転写の活性化をうける遺伝子の発現を特異的に抑制することが明らかとなった。
実施例３ ｓｉＲＮＡによるヒトＫＬＦ５遺伝子の発現抑制
実施例１で作製したｓｉＲＮＡ Ｎｏ．４は、マウスＫＬＦ５ ｃＤＮＡの塩基配列（配列番号４９）の１３０３〜１３２３番目の配列（ＡＡＡＡＧＣＴＣＡＣＣＴＧＡＧＧＡＣＴＣＡ）をもとにしたｓｉＲＮＡであり、Ｃ３Ｈ／１０Ｔ１／２細胞においてマウスのＫＬＦ５遺伝子の発現を強く抑制した。しかし、このＡＡＡＡＧＣＴＣＡＣＣＴＧＡＧＧＡＣＴＣＡの配列は、ヒトＫＬＦ５ ｃＤＮＡの塩基配列（配列番号５０）の１４８１〜１５０１番目にも存在するため、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．４はマウスだけでなくヒトのＫＬＦ５遺伝子の発現も抑制することが期待される。以下のようにして、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．４がヒトＫＬＦ５遺伝子の発現も強く抑制をすることを確認した。
ヒトさい帯静脈血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ、入手先：三光純薬、製品番号：ＣＣ−２５１７）を約３×１０５個となるように６ｃｍディッシュ（コーニング社）に播種した。２００ｐｍｏｌのｓｉＲＮＡ Ｎｏ．４およびＳＥＡＰ−ｓｉＲＮＡそれぞれに、細胞内導入試薬（リポフェクトアミン２０００、インビトロジェン社製）１０μＬを添加して混合し、室温下２０分保持した後、全量を各ディッシュに添加した。５％ＣＯ２存在下３７℃で２４時間インキュベーションし、細胞にそれぞれのｓｉＲＮＡを導入した。
実施例１（２）に記載した方法と同じ方法で、細胞からＲＮＡを単離し、ＲＴ−ＰＣＲによるヒトＫＬＦ５遺伝子の発現抑制を調べた。なお、ＫＬＦ遺伝子特異的なフォワードプライマー、リバースプライマーとしては、実施例１で用いた配列番号４１および４２それぞれの配列からなるＤＮＡを用いた。これらのプライマーを用いたＰＣＲにより、ヒトＫＬＦ５ ｃＤＮＡから配列番号５０の１４４６〜１６０６番目の配列に相当する１６１ｂｐの断片が増幅される。反応後の溶液の０．８％アガロースゲル電気泳動により、ＫＬＦ５ ｍＲＮＡに由来する増幅産物（１６１ｂｐ）を検出し、ｓｉＲＮＡを導入しなかった細胞での増幅産物の量と比較した。内部標準として、１８Ｓ ｒＲＮＡに由来する増幅産物（４８８ｂｐ）を用いた。第６図に示すように、コントロールのＳＥＡＰ−ｓｉＲＮＡではＫＬＦ５遺伝子の発現の抑制が見られないのに対し、ＫＬＦ５遺伝子に特異的な、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．４は、ヒトさい帯血管内皮細胞のＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制していた。したがって、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．４はマウスのＫＬＦ５遺伝子たけでなく、ヒトのＫＬＦ５遺伝子の発現も強く抑制できることが確認された。
第２表に、実施例１でマウスＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制したｓｉＲＮＡ Ｎｏ．２〜４および７〜１１において、設計のもとにしたマウスＫＬＦ５ ｃＤＮＡ上の２１塩基の配列および配列番号４９におけるその位置と、該マウス配列に対応するヒトｃＤＮＡ上の２１塩基の配列、配列番号５０におけるその位置、該ヒト配列から５’端のＡＡを除いたＲＮＡの配列を表す配列番号を示した。なお、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．５および６は、非コード領域の配列をもとにしているため、対応するヒト配列は示さなかった。これらのヒト配列をもとにした二本鎖ＲＮＡもヒトＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制すると考えられる。なお、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．４、８および１０は、対応するヒト配列がマウス配列と全く同じであり、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．８および１０は、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．４と同様に、マウスＫＬＦ５遺伝子だけでなくヒトＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制すると考えられた。
実施例４ ＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡによる血管内皮細胞の遊走の阻害
ＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡ Ｎｏ．４の、血管内皮細胞の遊走に対する阻害を、以下に示すような微小孔フィルターを用いた血管内皮細胞のインビトロ細胞遊走試験（Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１４７，１０７３−１０８４，１９９９；Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ，４２９，１９９８）により調べた。
ヒトさい帯静脈血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ、入手先：三光純薬、製品番号：ＣＣ−２５１７）を約３×１０５個となるように６ｃｍディッシュ（コーニング社）に播種した。ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．４およびコントロールのＳＥＡＰ−ｓｉＲＮＡそれぞれ２００ｐｍｏｌに１０μＬの細胞内導入試薬（リポフェクタミン２０００，インビトロジェン社製）を添加、混合し、室温下２０分インキュベーションした後、全量をディッシュに添加した。５％ＣＯ２存在下３７℃で１８時間インキュベーションし、ｓｉＲＮＡを導入した。
ｓｉＲＮＡ導入細胞を洗浄後、５μｇ／ｍＬの生細胞染色用蛍光色素（カルセインＡＭ、同仁化学社製）で細胞を蛍光標識した。得られた蛍光標識細胞は、トリプシンで細胞を剥離、洗浄後、細胞濃度５×１０５個／ｍＬになるように血管内皮細胞用基礎培地（ＥＢＭ−２、三光純薬社製）で再懸濁した。ＨＴＳフルオロブロック個別型インサート（２４ウェルプレート用ポアサイズ３μｍインサート、ＢＤファルコン）を２４ウェルセルカルチャーインサート用プレート（ＢＤファルコン）に取り付けた後、インサート側には蛍光標識細胞の懸濁液１００μＬを、２４ウェルプレート側には１０ｎｇ／ｍＬのヒトＶＥＧＦ（ＲアンドＤシステムズ社製）を含有する血管内皮細胞用増殖培地（ブレットキットＥＧＭ−２、三光純薬製）６００μＬをそれぞれ添加した。
添加後４時間まで、経時的にフィルターの微小孔を遊走してきた細胞をプレート底から蛍光顕微鏡で観察および撮影した。得られた画像から、画像解析ソフトウェア（Ｓｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅ、Ｓｃｉｏｎ社製）を用いて、遊走細胞数を計測した。第７図に示すように、コントロールのＳＥＡＰ−ｓｉＲＮＡと比較して、ＫＬＦ５遺伝子特異的なｓｉＲＮＡ Ｎｏ．４を導入した血管内皮細胞では、遊走細胞数が低下した。したがって、ＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡにより、血管内皮細胞の遊走を阻害できることが確認された。
実施例５ ＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡのインビボでの血管新生阻害効果
ＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡ Ｎｏ．４のインビボでの血管新生阻害効果を、以下に示すようなマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）を用いたアッセイ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４，１３６１２−１３６１７，１９９７；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７，６６６７−６６７５，２００２〕により調べた。
マトリゲル混合物は、マトリゲルマトリックス（ＢＤ バイオサイエンス製）０．５ｍＬ（５ｍｇ量）にマウスＶＥＧＦ〔ＲアンドＤシステムズ社（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）製、カタログ番号４９３−ＭＶ〕０．６μｇ、ウシ塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ、ＲアンドＤシステムズ社製、カタログ番号１３３−ＦＢ）０．６μｇおよびｓｉＲＮＡ Ｎｏ．４ １０μｇを加え、氷上でピペッティングにより混合して調製した。コントロールとして、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．４の代わりにＳＥＡＰ−ｓｉＲＮＡを用いたマトリゲル混合物も調製した。調製したマトリゲル混合物を６週齢のオスのＣ５７ＢＬ／６マウスの背中の皮下に注射した。注射１４日後にゲル化したマトリゲルを取り出した。取り出したマトリゲルをＰＢＳで１回洗浄し、１０％ホルムアルデヒド−ＰＢＳ溶液で固定した。固定したマトリゲルを５ｍｍ厚にカットしてパラフィンに包埋し、通常の組織学的手法を使用して切片化し、ヘマトキシリン−エオジンで染色した。染色したマトリゲル切片を顕微鏡で観察した。
その結果、コントロールのＳＥＡＰ−ｓｉＲＮＡを加えたマトリゲルでは、マトリゲルに添加したＶＥＧＦおよびｂＦＧＦに反応して、多数の血管内皮細胞が遊走して、マトリゲル内に浸潤しているのに対し、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．４を加えたマトリゲルではマトリゲル内への血管内皮細胞の浸潤が抑制されていた。したがってＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡにより、血管新生が阻害できることが確認された。
実施例６ ＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡのインビボでの抗腫瘍効果
ＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡ Ｎｏ．４のインビボでの抗腫瘍効果を、以下のように腫瘍の増殖抑制を指標にして調べた。
オス５週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスの背中の皮下に、マウスルイス肺ガン細胞株ＬＬ／２（入手先：大日本製薬株式会社、カタログ番号：０９−１６４２）を１×１０６個注射した。注射２日後、ルイス肺ガンが固定されているのを確認し、ガン周辺皮下にｓｉＲＮＡ Ｎｏ．４を注射した。コントロールとしてＳＥＡＰ−ｓｉＲＮＡを同様にガン周辺に皮下投与した。ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．４およびＳＥＡＰ−ｓｉＲＮＡの投与量はマウス１匹あたり１μｇを５０μＬの注射用水（大塚蒸留水、大塚製薬株式会社製）で溶解したものを用い、投与期間は連続８日間、投与回数は１日１回で行った。投与開始後の腫瘍の体積を下記式（１）を用いて算出し、腫瘍体積の増加をコントロールと比較した。
式（１）：腫瘍体積（ｍｍ３）＝｛腫瘍長さ（ｍｍ）×腫瘍幅（ｍｍ）２｝／２
その結果、第８図に示すように、コントロールのＳＥＡＰ−ｓｉＲＮＡを投与したマウスでの腫瘍体積は、投与開始より増加していくのに対し、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．４を投与したマウスの腫瘍体積の増加は投与後１日目より抑制された。したがってＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡはインビボでの抗腫瘍効果を有し、投与により腫瘍の増殖を抑制できることが確認された。
【配列表フリーテキスト】
配列番号１ −発明者：永井良三；眞鍋一郎；石原淳
発明者：鳥取恒彰
配列番号１７−ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．１ センス鎖
配列番号１８−ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．１ アンチセンス鎖
配列番号１９−ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．２ センス鎖
配列番号２０−ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．２ アンチセンス鎖
配列番号２１−ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．３ センス鎖
配列番号２２−ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．３ アンチセンス鎖
配列番号２３−ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．４ センス鎖
配列番号２４−ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．４ アンチセンス鎖
配列番号２５−ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．５ センス鎖
配列番号２６−ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．５ アンチセンス鎖
配列番号２７−ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．６ センス鎖
配列番号２８−ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．６ アンチセンス鎖
配列番号２９−ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．７ センス鎖
配列番号３０−ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．７ アンチセンス鎖
配列番号３１−ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．８ センス鎖
配列番号３２−ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．８ アンチセンス鎖
配列番号３３−ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．９ センス鎖
配列番号３４−ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．９ アンチセンス鎖
配列番号３５−ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．１０ センス鎖
配列番号３６−ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．１０ アンチセンス鎖
配列番号３７−ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．１１ センス鎖
配列番号３８−ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．１２ アンチセンス鎖
配列番号３９−ｓｉＲＮＡ−ＳＥＡＰ センス鎖
配列番号４０−ｓｉＲＮＡ−ＳＥＡＰ アンチセンス鎖
配列番号４１−ＫＬＦ５遺伝子特異的フォワードプライマー
配列番号４２−ＫＬＦ５遺伝子特異的リバースプライマー
配列番号４３−ＰＤＧＦ−Ａ遺伝子特異的フォワードプライマー
配列番号４４−ＰＤＧＦ−Ａ遺伝子特異的リバースプライマー
配列番号４５−ＳＭｅｍｂ遺伝子特異的フォワードプライマー
配列番号４６−ＳＭｅｍｂ遺伝子特異的リバースプライマー
配列番号４７−ＳＲＦ遺伝子特異的フォワードプライマー
配列番号４８−ＳＲＦ遺伝子特異的リバースプライマー
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【技術分野】
本発明は、ＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制するＲＮＡに関する。
【背景技術】
クルッペル様因子（Ｋｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ ｆａｃｔｏｒ、以下ＫＬＦと略す）ファミリーは、Ｃ末端のジンク・フィンガー（ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ）モチーフを特徴とする、転写因子のファミリーであり、ＫＬＦ１、ＫＬＦ２、ＫＬＦ３、ＫＬＦ４、ＫＬＦ５、ＫＬＦ６、ＫＬＦ７、ＫＬＦ８、ＫＬＦ９、ＫＬＦ１０、ＫＬＦ１１、ＫＬＦ１２、ＫＬＦ１３、ＫＬＦ１４、ＫＬＦ１５、ＫＬＦ１６等が知られている。哺乳類において、ＫＬＦファミリーは、様々な組織や細胞、例えば赤血球、血管内皮細胞、平滑筋、皮膚、リンパ球等の分化に重要であること、また癌、心血管疾患、肝硬変、腎疾患、免疫疾患等の各種疾患の病態形成に重要な役割を果たしていることが報告されている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６，３４３５５−３４３５８，２００１；Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．，４，２０６，２００３）。
ＫＬＦファミリーのうちのＫＬＦ５は、ＢＴＥＢ２（ｂａｓｉｃ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｅｌｅｍｅｎｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）あるいはＩＫＬＦ（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ−ｅｎｒｉｃｈｅｄ Ｋｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ ｆａｃｔｏｒ）ともよばれる。血管平滑筋におけるＫＬＦ５の発現は、発生段階で制御を受けており、胎児の血管平滑筋では、高い発現を示すのに対し、正常な成人の血管平滑筋では発現が見られなくなる。また、バルーンカテーテルによる削剥後に新生した血管内膜の平滑筋では、ＫＬＦ５の高い発現がみられ、動脈硬化や再狭窄の病変部の平滑筋でもＫＬＦ５の発現がみられる（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１０２，２５２８−２５３４，２０００）。
動脈硬化巣や経皮的冠動脈形成術後の再狭窄部位などの病変部位の血管平滑筋は、活性化しており、筋フィラメントの消失、蛋白合成の亢進、増殖能や遊走能を示し、胎児の血管平滑筋と同様の形質（胎児型）へ形質転換している。平滑筋細胞にはＳＭ１、ＳＭ２、ＳＭｅｍｂという３種類のミオシン重鎖のアイソフォームが存在するが、胎児型への形質転換に伴い、ＳＭ２が消失し、ＳＭｅｍｂの発現誘導が認められる。ＫＬＦ５は、ＳＭｅｍｂ遺伝子の転写制御配列と結合し、その転写を活性化する（非特許文献４参照）。さらに、血小板由来増殖因子Ａ鎖（以下ＰＤＧＦ−Ａとよぶ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−β、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）リセプター、誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター（ＰＡＩ）−１および転写因子Ｅｇｒ（ｅａｒｌｙ ｇｒｏｗｔｈ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）−１など、血管の形質や血管新生に関与する遺伝子の転写を活性化することが報告されている（Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，８，８５６−８６３，２００２；Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９４７，５６−６６，２００１）。
また、ＫＬＦ５遺伝子のヘテロノックアウトマウスにおいて、心血管系への物理的負荷やアンジオテンシンＩＩにより引き起こされる血管平滑筋増殖と血管内膜肥厚、血管新生、血管外膜の肉芽形成、心肥大および心筋線維化等が著明に抑制されていることが報告されている（Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，８，８５６−８６３，２００２）。
このように、ＫＬＦ５遺伝子は平滑筋形質変換に関わるだけでなく、広く心血管系の病態形成に関わる転写因子であり、その機能発現には遺伝子発現量がきわめて重要である。ＫＬＦ５は、動脈硬化や、心肥大等の心血管系の疾患あるいは癌等の血管新生が関与する疾患の病態形成に関与するので、ＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制することでこれらの疾患の治療または予防に有用な薬剤となりうることが予想される。しかし、現在のところＫＬＦファミリー遺伝子の発現を効果的に抑制する薬剤は知られていない。
一方、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ、以下、ＲＮＡｉとよぶ）は、線虫において標的とする遺伝子と同一の配列を有する二本鎖ＲＮＡを導入することにより、標的遺伝子の発現が特異的に抑制される現象として報告された（Ｎａｔｕｒｅ，３９１，８０６−８１１，１９９８）。
ＲＮＡｉは、導入した二本鎖ＲＮＡが、２１〜２３塩基の長さの二本鎖ＲＮＡに分解された後、蛋白質複合体がこの短い二本鎖ＲＮＡと結合し、同じ配列を有するｍＲＮＡを認識し切断することによって起こると考えられている。Ｔｕｓｃｈｌらは、ショウジョウバエにおいて長い二本鎖ＲＮＡの代わりに、２１〜２３塩基の長さの二本鎖ＲＮＡを導入することによっても、標的遺伝子の発現が抑制されることを見いだし、これをｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と名づけた（ＷＯ ０１／７５１６４）。ｓｉＲＮＡの配列と標的遺伝子とのミスマッチがあると非常に発現抑制の効果が弱まること、長さは２１塩基が最も効果が高く、平滑末端よりも、両方の鎖の３’末端にヌクレオチドが付加して、末端が突出した構造の方が効果が高いことが示された（ＷＯ ０２／４４３２１）。
哺乳類細胞では、長い二本鎖ＲＮＡを導入した場合、ウイルス防御機構により遺伝子全体の発現抑制とアポトーシスが起こり、特定の遺伝子の抑制をすることができなかったが、２０〜２９塩基のｓｉＲＮＡであれば、このような反応がおこらず、特定の遺伝子の発現を抑制をすることができることが見いだされた。なかでも２１〜２５塩基のものが発現抑制効果が高い（Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４９４−４９８，２００１；Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，３，７３７−７４７，２００２；Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，１０，５４９−５６１，２００２；Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０，４９７−５００，２００２）。
ＲＮＡｉでは、二本鎖ＲＮＡは一本鎖アンチセンスＲＮＡに比べ、標的遺伝子に対する発現抑制効果が飛躍的に高いことが報告されている（Ｎａｔｕｒｅ，３９１，８０６−８１１，１９９８；Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，１０，５４９−５６１，２００２）。また、二本鎖ＲＮＡでなく、分子内ハイブリダイズにより、ヘアピン構造を形成する一本鎖ＲＮＡも、ｓｉＲＮＡと同様にＲＮＡｉを示すことが報告されている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９，６０４７−６０５２，２００２）。
ＲＮＡｉはｉｎ ｖｉｔｒｏのみならず、ｉｎ ｖｉｖｏ試験においても多く検証されており、５０ｂｐ以下のｓｉＲＮＡを用いた胎児の動物での効果（ＷＯ ０２／１３２７８８）、成体マウスでの効果（ＷＯ ０３／１０１８０）が報告されている。また、ｓｉＲＮＡをマウス胎児に静脈内投与した場合に、腎臓、脾臓、肺、膵臓、肝臓の各臓器で発現抑制効果が確認されている（Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３２，１０７−１０８，２００２）。さらに、脳細胞においてもｓｉＲＮＡを直接投与することで作用することが報告されている。（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０，１００６−１０１０，２００２）しかし、これまでのところＫＬＦ５あるいは他のＫＬＦファミリー遺伝子に対するｓｉＲＮＡを用いたＲＮＡｉに関しては報告例がない。
【発明の開示】
本発明の目的はＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制するＲＮＡを見出すことである。このようなＲＮＡは、ＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制することにより、ＫＬＦ５の転写因子としての機能を阻害し、心血管性疾患や癌等のＫＬＦ５が病態の形成に関与する疾患に対する、副作用の少ない治療薬または予防薬に用いることができる。
本発明者らは、鋭意検討を行った結果、以下に記載する発明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下の（１）〜（１３）に関する。
（１）ＫＬＦ５ ｍＲＮＡの連続する１５〜３０塩基の配列および該配列と相補的な配列を含み、ＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制するＲＮＡ。
（２）ＫＬＦ５ ｍＲＮＡがヒトまたはマウスのＫＬＦ５ ｍＲＮＡである、（１）に記載のＲＮＡ。
（３）ＲＮＡが、ＫＬＦ５ ｍＲＮＡの連続する１５〜３０塩基の配列の鎖および該配列と相補的な配列の鎖からなる二本鎖ＲＮＡのそれぞれの鎖の３’端に１〜６個のヌクレオチドを付加した二本鎖ＲＮＡである、（１）または（２）に記載のＲＮＡ。
（４）ＲＮＡが、ＫＬＦ５ ｍＲＮＡの連続する１５〜３０塩基の配列からなるＲＮＡおよび該配列と相補的な配列からなるＲＮＡを、スペーサーオリゴヌクレオチドでつなぎ、３’端に１〜６個のヌクレオチドを付加した、ヘアピン構造を形成するＲＮＡである、（１）または（２）に記載のＲＮＡ。
（５）以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選ばれるＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制するＲＮＡ。
（ａ）配列番号２〜１６のいずれか１つの配列の鎖および該配列と相補的な配列の鎖からなる二本鎖ＲＮＡのそれぞれの鎖の３’端に２〜４個のウリジル酸またはデオキシチミジル酸を付加した二本鎖ＲＮＡ。
（ｂ）配列番号２〜１６のいずれか１つの配列からなるＲＮＡおよび該配列と相補的な配列からなるＲＮＡを２個のウリジル酸を５’端に有するスペーサーＲＮＡでつなぎ、３’端に２〜４個のウリジル酸を付加した、ヘアピン構造を形成するＲＮＡ。
（ｃ）配列番号２〜１１のいずれか１つの配列の鎖および該配列と相補的な配列の鎖からなる二本鎖ＲＮＡのそれぞれの鎖の３’端に２個のウリジル酸を付加した二本鎖ＲＮＡ。
（６）（１）〜（５）のいずれか１項に記載のＲＮＡを発現するベクター。
（７）（１）〜（５）のいずれか１項に記載のＲＮＡまたは（６）に記載のベクターを細胞に導入することにより、該細胞中のＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制する方法。
（８）（１）〜（５）のいずれか１項に記載のＲＮＡまたは（６）に記載のベクターを細胞に導入することにより、該細胞中のＫＬＦ５により転写が活性化される遺伝子の発現を抑制する方法。
（９）ＫＬＦ５により転写が活性化される遺伝子が血小板由来増殖因子Ａ鎖遺伝子または平滑筋ミオシン重鎖ＳＭｅｍｂ遺伝子である（８）に記載の方法。
（１０）（１）〜（５）のいずれか１項に記載のＲＮＡまたは（６）に記載のベクターを有効成分として含有する医薬組成物。
（１１）（１）〜（５）のいずれか１項に記載のＲＮＡまたは（６）に記載のベクターを有効成分として含有する、血管新生を阻害するための医薬組成物。
（１２）（１）〜（５）のいずれか１項に記載のＲＮＡまたは（６）に記載のベクターを有効成分として含有する、心血管系疾患もしくは癌の治療薬または予防薬。
（１３）心血管系疾患が動脈硬化、冠動脈インターベンション後の再狭窄または心肥大である（１２）に記載の治療薬または予防薬。
本発明のＲＮＡにより、ＫＬＦ５遺伝子およびＫＬＦ５により転写が活性化される遺伝子の発現を抑制することができる。本発明のＲＮＡまたは該ＲＮＡを発現するベクターの投与により、ＫＬＦ５遺伝子およびＫＬＦ５により転写が活性化される遺伝子の発現が抑制され、平滑筋の増殖や血管新生を抑制できるので、本発明のＲＮＡまたは該ＲＮＡを発現するベクターは、動脈硬化、冠動脈インターベンション後の再狭窄、心肥大等の心血管系疾患、あるいは癌の治療剤または予防剤の有効成分として使用することができる。
１．ＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制するＲＮＡ
本発明のＲＮＡは、ＫＬＦ５ ｍＲＮＡの連続する１５〜３０塩基、好ましくは１７〜２５塩基、より好ましくは１９〜２３塩基の配列（以下配列Ｘとする）および該配列と相補的な配列（以下、相補配列Ｘ’とする）を含み、ＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制するＲＮＡである。該ＲＮＡとしては、（ａ）配列Ｘの鎖（センス鎖）および相補配列Ｘ’の鎖（アンチセンス鎖）からなる二本鎖ＲＮＡのそれぞれの鎖の３’端に１〜６個、好ましくは２〜４個のヌクレオチドを付加した二本鎖ＲＮＡ（以下、このような構造のＲＮＡをｓｉＲＮＡとよぶ）であってＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制するＲＮＡ、（ｂ）配列ＸからなるＲＮＡおよび相補配列Ｘ’からなるＲＮＡを、スペーサーオリゴヌクレオチドでつなぎ、３’端に１〜６個、好ましくは２〜４個のヌクレオチドを付加した、ヘアピン構造を形成するＲＮＡ（以下、このようなＲＮＡをｓｈＲＮＡとよぶ）であって、ＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制するＲＮＡがあげられる。これらのＲＮＡにおいて付加するヌクレオチドの塩基はグアニン、アデニン、シトシン、チミン、ウラシルのいずれでもよく、またＲＮＡでもＤＮＡでもよいが、ウリジル酸（Ｕ）またはデオキシチミジル酸（ｄＴ）が好ましい。またスペーサーオリゴヌクレオチドは６〜１２塩基のＲＮＡが好ましく、その５’端の配列は２個のＵが好ましい。スペーサーオリゴヌクレオチドの例として、ＵＵＣＡＡＧＡＧＡの配列からなるＲＮＡをあげることができる。スペーサーオリゴヌクレオチドによってつながれる２つのＲＮＡの順番はどちらが５’側になってもよい。
配列Ｘは、ＫＬＦ５ ｍＲＮＡの連続する１５〜３０塩基の配列、好ましくは１７〜２５塩基、より好ましくは１９〜２３塩基の配列であれば、いずれの配列でもよいが、以下の（１）に記載の方法で設計した１９塩基の配列が最も好ましい。以上の構造を有するＲＮＡであって、ＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制するものであれば、本発明のＲＮＡに含まれる。
本発明のＲＮＡは、上記の構造のＲＮＡをＫＬＦ５遺伝子が発現している細胞に導入してＫＬＦ５遺伝子の発現を測定し、ＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制するＲＮＡを選択することより取得できる。
（１）配列Ｘの設計
遺伝子の発現を抑制したい動物のＫＬＦ５ ｃＤＮＡの塩基配列から、ＡＡではじまる２１塩基の部分配列を取り出す。取り出した配列のＧＣ含量を計算し、ＧＣ含量が２０〜８０％、好ましくは３０％〜７０％、より好ましくは４０〜６０％の配列を複数個選択する。
配列は、好ましくは、コード領域内の配列で、開始コドンから７５塩基以上下流の配列を選択する。ＫＬＦ５ ｃＤＮＡの塩基配列の情報は、ＧｅｎＢａｎｋ等の塩基配列データベースから得ることができる。例えば、マウスＫＬＦ５ ｃＤＮＡの配列はＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００９７６９（配列番号４９）、ヒトＫＬＦ５ ｃＤＮＡの配列はＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ２８７２７２（配列番号５０）で、配列情報が得られる。
選択した配列の５’末端のＡＡを除き、配列中のＴをＵに変えた１９塩基の配列を配列Ｘとする。
（２）本発明のＲＮＡの調製
（１）で選択した配列Ｘを元に、以下のようにしてＲＮＡを調製することができる。以下には付加するオリゴヌクレオチドとして２個のＵまたはｄＴの場合を記載するが、他のヌクレオチドの場合も同様にして調製することができる。
（ａ）ｓｉＲＮＡの場合
配列Ｘの３’端に２個のＵまたはｄＴを付加した配列からなるＲＮＡ、および相補配列Ｘ’の３’端に２個のＵまたはｄＴを付加した配列からなるＲＮＡの２本のＲＮＡを調製する。この２本のＲＮＡは、化学合成あるいはインビトロ転写により調製できる。化学合成は、ＤＮＡ合成機を用いて行うことができる。またアンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）社、日本バイオサービス株式会社、キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）社等のメーカーに化学合成を依頼することもできる。化学合成した互いに相補的な配列を含む２本のＲＮＡをアニーリングすることにより、配列Ｘの鎖および相補配列Ｘ’の鎖からなる二本鎖ＲＮＡのそれぞれの鎖の３’端に２個のＵまたはｄＴを付加した二本鎖ＲＮＡを調製することができる。アニーリングは、２本のＲＮＡを適当なバッファー中で９０〜９５℃で１〜５分加熱後、４５〜６０分間かけて室温にまで冷却することにより行うことができる。
インビトロ転写によるＲＮＡの調製は、以下のようにして行うことができる。まず、（ｉ）Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を有するＤＮＡ（Ｔ７プライマー）、（ｉｉ）相補配列Ｘ’のＵをＴに変え、その５’端には２個のＡを付加し、３’端にはＴ７プライマーの３’端８塩基と相補的な配列を付加した配列を有するＤＮＡ、（ｉｉｉ）配列ＸのＵをＴに変え、その５’端には２個のＡを付加し、３’端にはＴ７プライマーの３’端８塩基と相補的な配列を付加した配列を有するＤＮＡ、をそれぞれ調製する。
Ｔ７プライマーと（ｉｉ）のＤＮＡとをアニールさせた後、ＤＮＡポリメラーゼ反応により、二本鎖ＤＮＡにする。得られた二本鎖ＤＮＡを鋳型として、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いたインビトロ転写反応を行うことにより、配列Ｘの３’端に２個のＵが付加し、５’端にはリーダー配列が付加した配列を有するＲＮＡを合成することができる。同様にＴ７プライマーと（ｉｉｉ）のＤＮＡとを用いて同様の反応を行うことにより、相補配列Ｘ’の３’端に２個のＵが付加し、５’端にはリーダー配列が付加した配列を有するＲＮＡを合成することができる。
２つの反応液を混ぜて、さらにインビトロ転写反応を続けることにより、互いに相補的な配列を含む２本のＲＮＡをアニールさせる。その後、デオキシリボヌクレアーゼおよび一本鎖ＲＮＡ特異的なリボヌクレアーゼにより、鋳型の二本鎖ＤＮＡおよび各ＲＮＡ鎖の５’側のリーダー配列を分解して除去する。各ＲＮＡ鎖の３’端の２個のＵは分解を受けずに付加したまま残る。
以上の反応は、サイレンサーｓｉＲＮＡ作製キット（Ｓｉｌｅｎｃｅｒ・ｓｉＲＮＡ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、アンビオン社製）等のキットを用いて行うことができる。Ｔ７プライマーとアニールさせるＤＮＡは、ＤＮＡ合成機により化学合成することができる。またアンビオン社、日本バイオサービス株式会社、北海道システムサイエンス株式会社、キアゲン社等のメーカーに化学合成を依頼することもできる。
（ｂ）ｓｈＲＮＡの場合
配列ＸからなるＲＮＡおよび相補配列Ｘ’からなるＲＮＡを、スペーサーオリゴヌクレオチドでつなぎ、３’端に１〜６個、好ましくは２〜４個のヌクレオチドを付加した、ヘアピン構造を形成するＲＮＡは、ＤＮＡ合成機を用いた化学合成によって調製できる。また、２．に後述するｓｉＲＮＡ発現ベクターを細胞に導入することにより、細胞内にｓｈＲＮＡが合成される。このｓｈＲＮＡは、細胞内でｓｉＲＮＡに変換される。ベクターを導入して細胞内で合成させた場合は、ｓｈＲＮＡの単離と（３）に記載した細胞への導入の操作は不要であり、ベクターを導入した細胞についてＫＬＦ５遺伝子の発現を解析すればよい。
（３）ＫＬＦ５遺伝子の発現抑制
ＫＬＦ５遺伝子を発現する細胞株に（２）で調製したｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを導入する。細胞株は、（１）の配列Ｘの設計のもとにしたＫＬＦ５ ｃＤＮＡと同じ動物種の細胞を用いる。ＫＬＦ５遺伝子を発現する細胞株としては、平滑筋、繊維芽細胞または血管内皮細胞に由来する細胞株、例えばマウス胎児繊維芽細胞株Ｃ３Ｈ／１０Ｔ１／２（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−２２６）、ヒト臍帯血管内皮細胞等をあげることができる。ＲＮＡの導入は、動物細胞へのトランスフェクション用試薬、例えばポリフェクト（Ｐｏｌｙｆｅｃｔ）トランスフェクション試薬（キアゲン社製）、トランスメッセンジャー（ＴｒａｎｓＭｅｓｓｅｎｇｅｒ）トランスフェクション試薬、オリゴフェクトアミン（Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）試薬（インビトロジェン社製）、リポフェクトアミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）２０００（インビトロジェン社製）等を利用して、これらの試薬とＲＮＡを混合して複合体を形成させた後、細胞に添加することにより行うことができる。
本発明のＲＮＡまたは２．で後述するｓｉＲＮＡ発現ベクターを導入した細胞のＫＬＦ５遺伝子の発現は、ＲＴ−ＰＣＲにより解析することができる。ＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ発現ベクターを導入した細胞および導入しなかった細胞から総ＲＮＡを調製し、このＲＮＡからｃＤＮＡを合成する。合成したｃＤＮＡを鋳型にして、ＫＬＦ５遺伝子に特異的なプライマーを用いたＰＣＲを行い、ＫＬＦ５ ｃＤＮＡに由来する増幅産物の量を、アガロースゲル電気泳動によって定量することにより、ＫＬＦ５遺伝子の発現量を測定することができる。ＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ発現ベクターを導入しなかった細胞のＫＬＦ５遺伝子の発現量と比較して、ＫＬＦ５遺伝子の発現量が減少した細胞に導入したＲＮＡを、ＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制するＲＮＡとして選択する。
このようにして選択された、ＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制するＲＮＡとしては、配列番号２〜１１のいずれか１つの配列の鎖および該配列と相補的な配列の鎖からなる二本鎖ＲＮＡのそれぞれの鎖の３’端に２個のウリジル酸を付加した二本鎖ＲＮＡをあげることができる。該ＲＮＡはマウスｃＤＮＡの配列に基づいて設計されたものであり、マウスＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制する。このうち、配列番号４、８および１０の配列はそれぞれマウスとヒトのぞれぞれのＫＬＦ５ ｍＲＮＡで共通する配列であるので、配列番号４、８および１０のいずれか１つの配列の鎖および該配列と相補的な配列の鎖からなる二本鎖ＲＮＡのそれぞれの鎖の３’端に２個のウリジル酸を付加した二本鎖ＲＮＡは、マウスＫＬＦ５遺伝子だけでなくヒトＫＬＦ５遺伝子の発現も抑制する。
（１）の配列Ｘの設計のもとにしたある動物種ＡのＫＬＦ５ ｃＤＮＡと、異なる動物種ＢのＫＬＦ５ ｃＤＮＡを配列の相同性に基づいてアライメントすることにより、動物種Ａで選択された配列Ｘと対応する動物種Ｂの配列Ｙを得ることができる。上記の方法で、動物種ＡのＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制するＲＮＡが得られた場合、該ＲＮＡの配列Ｘおよびその相補配列Ｘ’の領域をそれぞれ配列Ｙとその相補配列Ｙ’に置換したＲＮＡは、動物種ＢのＫＬＦ５遺伝子を抑制すると考えられる。
例えば、マウスＫＬＦ５ ｃＤＮＡの配列に基づく配列番号２、３、７、９および１１のいずれか１つの配列の鎖および該配列と相補的な配列の鎖からなる二本鎖ＲＮＡのそれぞれの鎖の３’端に２個のウリジル酸を付加した二本鎖ＲＮＡは、マウスＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制するので、ヒトＫＬＦ５ ｃＤＮＡにおいて対応する配列である配列番号１２〜１６のいずれか１つの配列の鎖および該配列と相補的な配列の鎖からなる二本鎖ＲＮＡのそれぞれの鎖の３’端に２個のウリジル酸を付加した二本鎖ＲＮＡは、ヒトＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制すると考えられる。
２．ＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制するＲＮＡを発現するベクター
（１）プラスミドベクター
ＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制するＲＮＡを発現するプラスミドベクターを、培養細胞または生体内の細胞に導入することにより、細胞内で該ＲＮＡが産生され、導入した細胞でのＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制することができる。該ベクターは、Ｕ６プロモーターあるいはＨ１プロモーター等ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩのプロモーターを含む動物細胞用プラスミドベクター等のｓｉＲＮＡ発現用ベクターのプロモーターの下流に、１．で選択された配列Ｘおよびその相補配列Ｘ’（それぞれＵはＴに変換する）を、２個のＴを５’端に有するスペーサー配列でつなぎ、３’端にＲＮＡポリメラーゼＩＩＩターミネーターとなる４〜６個のＴからなる配列を含むＤＮＡ（以下、ＫＬＦ５ ｓｉＲＮＡ用ＤＮＡとよぶ）を挿入して作製することができる。スペーサー配列としては、２個のＴを５’端に有する６〜１２塩基の配列が好ましく、例えば、ＴＴＣＡＡＧＡＧＡをあげることができる。配列Ｘと相補配列Ｘ’の順序は、どちらが５’側でもよい。ｓｉＲＮＡ発現用ベクターとしては、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ１．０−Ｕ６（アンビオン社製）、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ３．０（アンビオン社製）、ｐＳＵＰＥＲ〔オリゴエンジン（ＯｌｉｇｏＥｎｇｉｎｅ）社製〕、ｐＳＩＲＥＮ−ＤＮＲ〔ＢＤバイオサイエンシズ・クロンテック（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）社製〕等をあげることができる。
上記のＫＬＦ５ ｓｉＲＮＡ用ＤＮＡを挿入して作製した組換えベクターを導入した細胞では、Ｕ６プロモーターからのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ反応により、１．（１）に記載したｓｈＲＮＡが合成され、このｓｈＲＮＡが細胞内で切断を受けてｓｉＲＮＡに変換される。組換えベクターの細胞への導入は、通常の動物細胞へのベクターの導入と同様に、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３−７４１７，１９８７）等により行うことができる。
（２）ウイルスベクター
ｓｉＲＮＡ発現ベクターとして、レトロウイルスベクターやレンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター等のウイルスベクターを利用したｓｉＲＮＡ発現用ベクターを用いることもできる。このようなウイルスベクターを利用したｓｉＲＮＡ発現用ベクターとして、ｐＳＵＰＥＲ．ｒｅｔｒｏ（オリゴエンジン社製）、ｐＳＩＲＥＮ−ＲｅｔｒｏＱ（ＢＤバイオサイエンシズ・クロンテック社製）、文献（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ，１００，１８４４−１８４８，２００３；Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，３３，４０１−４０６，２００３）に記載のベクターなどをあげることができる。
ウイルスベクターを利用したｓｉＲＮＡ発現用ベクターに上記と同様のＫＬＦ５ ｓｉＲＮＡ用ＤＮＡを挿入して作製した組換えベクターを、用いたウイルスベクターに応じたパッケージング細胞に導入することにより、該組換えベクターを含む組換えウイルスを生産させる。組換えベクターのパッケージング細胞への導入は、上記と同様に、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等により行うことができる。得られた組換えウイルスを細胞に接触させて感染させることにより、組換えベクターが細胞に導入され、１．（１）に記載したｓｈＲＮＡが合成され、このｓｈＲＮＡが細胞内で切断を受けてＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡに変換される。
３．ＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制するＲＮＡの利用法
（１）ＫＬＦ５により転写が活性化される遺伝子の発現の抑制
ＫＬＦ５は転写因子として、種々の遺伝子の発現を活性化している。ＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制するＲＮＡにより、ＫＬＦ５遺伝子の発現が抑制される結果、ＫＬＦ５により転写が活性化される遺伝子の発現も抑制することができる。ＫＬＦ５により転写が活性化される遺伝子としては、ＳＭｅｍｂ、ＰＤＧＦ−Ａ、ＴＧＦ−β、ＶＥＧＦリセプター、ＰＡＩ−１、Ｅｇｒ−１等の遺伝子をあげることができる。
（２）ＫＬＦ５の機能の解析
ＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制するＲＮＡを、種々の細胞に作用させ、その細胞の形質の変化や、各種遺伝子の発現量の変動を調べることにより、それぞれの細胞におけるＫＬＦ５の機能を解析することができる。また、該ＲＮＡは、胎児から成体まで、さまざまな発育段階の動物でＫＬＦ５遺伝子の発現抑制をすることができるので、ヘテロノックアウトマウスの解析だけではわからないＫＬＦ５の機能の解明をすることが可能となる。
４．本発明のＲＮＡまたはベクターを有効成分として含有する医薬組成物
本発明のＫＬＦ５遺伝子の発現を特異的に抑制するＲＮＡ、または該ＲＮＡを発現するベクターを投与することにより、ＫＬＦ５および、ＫＬＦ５が転写を活性化する遺伝子の発現が抑制され、平滑筋の増殖や血管新生が阻害されるので、動脈硬化、冠動脈インターベンション後の再狭窄や心肥大等の心血管系の疾患あるいは癌の治療または予防をすることができる。
本発明のＲＮＡまたは該ＲＮＡを発現するベクターは、医薬品として使用する場合、単独で投与することも可能ではあるが、通常は薬理学的に許容される添加剤（例えば担体、賦形剤、希釈剤等）、安定化剤または製薬上必要な成分と混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。また、ウイルスベクターの場合は、組換えウイルスの形態でウイルスベクターを投与することが望ましい。
投与経路は、治療に際し最も効果的なものを使用するのが望ましく、口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内などの非経口投与または経口投与をあげることができ、望ましくは静脈内投与、筋肉内投与をあげることができる。静脈内投与、筋肉内投与に適当な製剤としては、注射剤があげられる。
本発明のＲＮＡまたは該ＲＮＡを発現するベクターを、注射剤の形態に成形するに際しては、担体として、たとえば、水、エチルアルコール、マクロゴール、プロピレングリコール、クエン酸、酢酸、リン酸、乳酸、乳酸ナトリウム、硫酸および水酸化ナトリウム等の希釈剤、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウムおよびリン酸ナトリウム等のｐＨ調整剤および緩衝剤、ピロ亜硫酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸、チオグリコール酸およびチオ乳酸等の安定化剤等が使用できる。なお、この場合等張性の溶液を調製するに十分な量の食塩、ブドウ糖、マンニトールまたはグリセリンを医薬製剤中に含有せしめてもよい。安定化剤としては、グルコース等の単糖類、サッカロース、マルトース等の二糖類、マンニトール、ソルビトール等の糖アルコール、塩化ナトリウム等の中性塩、グリシン等のアミノ酸、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体（プルロニック）、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（トゥイーン）等の非イオン系界面活性剤、ヒトアルブミン等が例示される。また、細胞内への取り込みを促進するため、本発明のＲＮＡまたは該ＲＮＡを発現するベクターを、該ＲＮＡまたはベクターを含むリポソームとして調製して用いてもよい。
【図面の簡単な説明】
第１図 ＫＬＦ５遺伝子特異的なｓｉＲＮＡによるＫＬＦ５遺伝子の発現抑制を示す。左から、１００ｂｐマーカー、ｓｉＲＮＡを導入しなかった細胞、ＳＥＡＰ−ｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．２、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．３、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．４、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．５、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．６をそれぞれ導入した細胞でのＰＣＲによる測定で、ＫＬＦ５は、ＫＬＦ５ ｍＲＮＡ由来の増幅産物、１８Ｓは、１８Ｓ ｒＲＮＡ由来の増幅産物の位置を示す。
第２図 ＫＬＦ５遺伝子特異的なｓｉＲＮＡによるＫＬＦ５遺伝子の発現抑制を示す。左から、１００ｂｐマーカー、ｓｉＲＮＡを導入しなかった細胞、ＳＥＡＰ−ｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．７、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．８、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．９、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．１０、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．１１、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．４、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．１をそれぞれ導入した細胞でのＰＣＲによる測定で、ＫＬＦ５は、ＫＬＦ５ ｍＲＮＡ由来の増幅産物、１８Ｓは、１８Ｓ ｒＲＮＡ由来の増幅産物の位置を示す。
第３図 ＫＬＦ５遺伝子特異的なｓｉＲＮＡによるＰＤＧＦ−Ａ遺伝子の発現抑制を示す。左から、１００ｂｐマーカー、ｓｉＲＮＡを導入しなかった細胞、ＳＥＡＰ−ｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．７、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．８、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．９、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．１０、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．１１、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．４、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．１をそれぞれ導入した細胞でのＰＣＲによる測定で、ＰＤＧＦ−Ａは、ＰＤＧＦ−Ａ ｍＲＮＡ由来の増幅産物、１８Ｓは、１８Ｓ ｒＲＮＡ由来の増幅産物の位置を示す。
第４図 ＫＬＦ５遺伝子特異的なｓｉＲＮＡによるＳＭｅｍｂ遺伝子の発現抑制を示す。左から、１００ｂｐマーカー、ｓｉＲＮＡを導入しなかった細胞、ＳＥＡＰ−ｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．７、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．８、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．９、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．１０、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．１１、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．４、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．１をそれぞれ導入した細胞でのＰＣＲによる測定で、ＳＭｅｍｂは、ＳＭｅｍｂ ｍＲＮＡ由来の増幅産物、１８Ｓは、１８Ｓ ｒＲＮＡ由来の増幅産物の位置を示す。
第５図 ＫＬＦ５遺伝子特異的なｓｉＲＮＡはＳＲＦ遺伝子の発現は抑制しないことを示す。左から、ｓｉＲＮＡを導入しなかった細胞、ＳＥＡＰ−ｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．１、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．４、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．７、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．９、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．１０をそれぞれ導入した細胞でのＰＣＲによる測定で、ＳＲＦは、ＳＲＦｍＲＮＡ由来の増幅産物、１８Ｓは、１８Ｓ ｒＲＮＡ由来の増幅産物の位置を示す。
第６図 ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．４によるヒトＫＬＦ５遺伝子の発現抑制を示す。左から、１００ｂｐマーカー、ｓｉＲＮＡを導入しなかった細胞、ＳＥＡＰ−ｓｉＲＮＡ、およびｓｉＲＮＡ Ｎｏ．４をそれぞれ導入した細胞でのＰＣＲによる測定で、ＫＬＦは、ＫＬＦ５ ｍＲＮＡ由来の増幅産物、１８Ｓは、１８Ｓ ｒＲＮＡ由来の増幅産物の位置を示す。
第７図 ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．４による血管内皮細胞の遊走の阻害を示す。横軸は時間（時間）、縦軸は遊走した細胞数で、●はｓｉＲＮＡ Ｎｏ．４を導入した細胞、■はＳＥＡＰ−ｓｉＲＮＡを導入した細胞の結果を示す。エラーバーは例数４の標準偏差である。
第８図 ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．４による抗腫瘍効果を示す。横軸は時間（日数）、縦軸は腫瘍体積（ｍｍ３）で、●はＫＬＦ５ ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．４を投与したマウスの腫瘍体積、■はＳＥＡＰ−ｓｉＲＮＡを投与したマウスの腫瘍体積を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
実施例１ ｓｉＲＮＡによるＫＬＦ５遺伝子の発現抑制
（１）ｓｉＲＮＡの調製
ＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制できるｓｉＲＮＡの配列として、マウスＫＬＦ５ ｃＤＮＡの配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＭ＿００９７６９、配列番号４９）から、（ａ）ＡＡではじまる２１塩基の配列、（ｂ）ＧＣ含量が２０〜８０％の２つの条件に当てはまる、１１個の部分配列を選択した。ただし、開始コドン（配列番号４９の１６７〜１６９番目の配列）より７５塩基以上下流の、コード領域（配列番号１６７〜１５０７番目の配列）内の配列で、ＧＣ含量が４０〜６０％のものをなるべく選択するようにした。選択した配列の配列番号４９における配列の位置、ＧＣ含量を第１表に示した。選択した配列の５’端のＡＡを除いた１９塩基の配列のＴをＵに変えた配列をそれぞれ配列番号１〜１１に示した。
配列番号１〜１１のいずれかの配列および該配列と相補的な配列の３’端にそれぞれ２個のＵまたはｄＴを付加した配列からなる１１種類の二本鎖ＲＮＡ（以下、それぞれｓｉＲＮＡ Ｎｏ．１〜Ｎｏ．１１とよぶ）を以下のようにして調製した。ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．１〜Ｎｏ．１１それぞれのセンス鎖およびアンチセンス鎖の配列を第１表に示した（配列番号１７〜３８）。ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．１は、配列番号１７および１８の配列からなる２本のＲＮＡを、株式会社日本バイオサービスに依頼して化学合成し、アニーリングさせることにより調製した。ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．２〜Ｎｏ．１１はサイレンサーｓｉＲＮＡ作製キット（ＳｉｌｅｎｃｅｒＴＭ ｓｉＲＮＡ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、アンビオン社製）を利用したインビトロ転写により調製した。インビトロ転写の鋳型作製に用いるＤＮＡは、北海道システム・サイエンス株式会社に化学合成を依頼した。また、文献（Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，３２，１０７−１０８，２００２；米国特許出願公開 第２００２／０１３２７８８号明細書）に基づき、配列番号３９および４０の配列からなる、分泌型アルカリフォスファターゼ（ＳＥＡＰ）遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡ（以下、ＳＥＡＰ−ｓｉＲＮＡとよぶ）を、サイレンサーｓｉＲＮＡ作製キットを利用したインビトロ転写により調製し、コントロールのｓｉＲＮＡとして用いた。
（２）ｓｉＲＮＡによるＫＬＦ５遺伝子の発現抑制
マウス胎児線維芽細胞株Ｃ３Ｈ／１０Ｔ１／２（入手先：アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）、ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−２２６）をウェルあたり４×１０５個になるよう６ウェル・プレート（コーニング社製）に播種した。１．５μｇのｓｉＲＮＡ Ｎｏ．２、Ｎｏ．３、Ｎｏ．４、Ｎｏ．５、Ｎｏ．６およびＳＥＡＰ−ｓｉＲＮＡそれぞれに、細胞内導入試薬ポリフェクト（ｐｏｌｙｆｅｃｔＲ、キアゲン社製）１０μＬを添加して混合し、室温下５〜１０分保持した後、各ウェルに添加した。５％ＣＯ２存在下３７℃で４８時間から７２時間インキュベーションし、細胞にそれぞれのｓｉＲＮＡを導入した。
ｓｉＲＮＡによるＫＬＦ５遺伝子の発現抑制は、以下に示すＲＴ−ＰＣＲにより確認した。インキュベーション終了後、回収した細胞から、細胞溶解液ホモジェナイズ用キットのＱＩＡシュレッダー（ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒ、キアゲン社製）および総ＲＮＡ精製用キットのＲＮイージー（ＲＮｅａｓｙ、キアゲン社製）を用いてＲＮＡを単離した。単離したＲＮＡを、３０〜５０μＬの注射用水（大塚蒸留水、大塚製薬株式会社製）で溶解し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成した。逆転写反応は、上記のＲＮＡ溶液（ＲＮＡ１．０μｇ分）と、５×緩衝液２．５μＬ、０．１ｍｏｌ／Ｌジチオスレイトール（ＤＴＴ）２．０μＬ、２０ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰ（ロッシュ社製）１．０μＬ、５０μｍｏｌ／Ｌランダムプライマー（宝酒造株式会社製）２．０μＬ、ヌクレアーゼ阻害剤スーパーアーゼ・イン（ＳＵＰＥＲａｓｅ・Ｉｎ、アンビオン社製）１．０μＬおよびパワースクリプト（ＰｏｗｅｒＳｃｒｉｐｔ）逆転写酵素（クロンテック社製）１．０μＬを含む溶液１．０μｇを混合し、合計１８μＬになるよう注射用水を加えた反応溶液で、４２℃で１．５時間実施した。５×緩衝液およびＤＴＴはパワースクリプト逆転写酵素に付属のものを用いた。
配列番号４１および４２の配列それぞれからなる２本のＤＮＡを化学合成し、それぞれマウスＫＬＦ５遺伝子特異的なフォワードプライマー、リバースプライマーとした。これらのプライマーを用いたＰＣＲにより、ＫＬＦ５ ｃＤＮＡから配列番号４９の１２６８〜１４２８番目の配列に相当する１６１ｂｐの断片が増幅される。
１０×ＰＣＲ緩衝液２．５μＬ、２．５ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰ（ロッシュ製）２．０μＬ、５μｍｏｌ／Ｌフォワードプライマー２．０μＬ、５μｍｏｌ／Ｌリバースプライマー２．０μＬ、ホットスタータック（ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ（キアゲン社製、５単位／μＬ）０．１２５μＬ、１８Ｓ ｒＲＮＡ特異的プライマー〔クォンタｍＲＮＡ（ＱｕａｎｔｕｍＲＮＡ）クラシック１８Ｓ内部標準、アンビオン社製〕２μＬ、注射用水１３．３７５μＬ、ｃＤＮＡ１．０μＬからなる２５μＬのＰＣＲ反応溶液を調製し、９５℃で１５分保持後、熱変性９４℃で３０秒間、アニーリング５３℃で３０秒間、伸長反応７２℃で４０秒間の反応を１サイクルとして、２８サイクルのＰＣＲを実施し、その後７２℃で１０分間保持した。１０×ＰＣＲ緩衝液はホットスタータックＤＮＡポリメラーゼに付属のものを使用した。反応後の溶液の０．８％アガロースゲル電気泳動により、ＫＬＦ５ ｍＲＮＡに由来する増幅産物（１６１ｂｐ）を検出し、ｓｉＲＮＡを導入しなかった細胞での増幅産物の量と比較した。内部標準として、１８Ｓ ｒＲＮＡに由来する増幅産物（４８８ｂｐ）を用いた。第１図に示すように、コントロールのＳＥＡＰ−ｓｉＲＮＡではＫＬＦ５遺伝子の発現の抑制が見られないのに対し、ＫＬＦ５遺伝子に特異的な、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．２、Ｎｏ．３、Ｎｏ．４、Ｎｏ．５およびＮｏ．６は、ＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制することが確認できた。中でも、ｓｉＲＮＡＮｏ．３およびｓｉＲＮＡ Ｎｏ．４は強くＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制した。
ＫＬＦ５遺伝子に特異的なｓｉＲＮＡとして、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．１、Ｎｏ．４、Ｎｏ．７、Ｎｏ．８、Ｎｏ．９、Ｎｏ．１０およびＮｏ．１１を用いて、上記と同様にして、Ｃ３Ｈ／１０Ｔ１／２細胞へのｓｉＲＮＡの導入と、ＲＴ−ＰＣＲによるＫＬＦ５遺伝子の発現の解析を行った。第２図に示すように、コントロールのＳＥＡＰ−ｓｉＲＮＡではＫＬＦ５遺伝子の発現の抑制が見られないのに対し、ＫＬＦ５遺伝子に特異的な、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．４、Ｎｏ．７、Ｎｏ．８、Ｎｏ．９、Ｎｏ．１０およびＮｏ．１１は、ＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制することが確認できた。中でも、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．４、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．７、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．９およびｓｉＲＮＡ Ｎｏ．１０は強くＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制した。ＫＬＦ５遺伝子に特異的であるにもかかわらず、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．１では抑制がみられなかった。
実施例２ ＫＬＦ５遺伝子特異的なｓｉＲＮＡによる、ＫＬＦ５により転写が活性化される遺伝子の発現の抑制
（１）ＰＤＧＦ−Ａ遺伝子の発現の抑制
ＫＬＦ５遺伝子に特異的なｓｉＲＮＡとして、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．１、Ｎｏ．４、Ｎｏ．７、Ｎｏ．８、Ｎｏ．９、Ｎｏ．１０およびＮｏ．１１をＣ３Ｈ／１０Ｔ１／２細胞へ導入し、ＲＴ−ＰＣＲにより、ＫＬＦ５により転写が活性化される遺伝子であるＰＤＧＦ−Ａ遺伝子の発現の解析を行った。
実施例１（２）と同様にして、ｓｉＲＮＡのＣ３Ｈ／１０Ｔ１／２細胞への導入、ｃＤＮＡの調製を行った。配列番号４３および４４の配列からなる２本のＤＮＡを化学合成し、それぞれＰＤＧＦ−Ａ遺伝子特異的なフォワードプライマーおよびリバースプライマーとした。これらのプライマーを用いたＰＣＲにより、ＰＤＧＦ−Ａ ｃＤＮＡから４０３ｂｐの断片が増幅される。ＰＤＧＦ−Ａ遺伝子特異的なフォワードプライマーおよびリバースプライマーを、ＫＬＦ５遺伝子特異的なフォワードプライマーおよびリバースプライマーの代わりに用いて、実施例１（２）のＫＬＦ５遺伝子の発現解析と同様にして、ＰＤＧＦ−Ａ遺伝子の発現を解析した。ただしＰＣＲは、ＰＣＲ反応溶液を９５℃で１５分間保持後、熱変性９４℃で３０秒間、アニーリング５３℃で３０秒間、伸長反応７２℃で４０秒間からなる反応を１サイクルとし、２６サイクル実施し、その後７２℃で１０分間保持する条件で行い、電気泳動は１％アガロースゲルで行った。
第３図に示すように、コントロールのＳＥＡＰ−ｓｉＲＮＡではＰＤＧＦ−Ａ遺伝子の発現の抑制が見られないのに対し、ＫＬＦ５遺伝子に特異的な、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．４、Ｎｏ．７、Ｎｏ．８、Ｎｏ．９、Ｎｏ．１０およびＮｏ．１１は、ＫＬＦ５により転写が活性化される遺伝子であるＰＤＧＦ−Ａ遺伝子の発現をも抑制することが確認できた。中でも、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．４、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．７、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．９およびｓｉＲＮＡ Ｎｏ．１０は強くＰＤＧＦ−Ａ遺伝子の発現を抑制した。ＫＬＦ５遺伝子に特異的であるにもかかわらず、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．１では抑制がみられなかった。
（２）ＳＭｅｍｂ遺伝子の発現の抑制
ＫＬＦ５遺伝子に特異的なｓｉＲＮＡとして、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．１、Ｎｏ．４、Ｎｏ．７、Ｎｏ．８、Ｎｏ．９、Ｎｏ．１０およびＮｏ．１１をＣ３Ｈ／１０Ｔ１／２細胞へ導入し、ＲＴ−ＰＣＲにより、ＫＬＦ５により転写が活性化される遺伝子であるＳＭｅｍｂ遺伝子の発現の解析を行った。
実施例１（２）と同様にして、ｓｉＲＮＡのＣ３Ｈ／１０Ｔ１／２細胞への導入、ｃＤＮＡの調製を行った。配列番号４５および４６の配列からなる２本のＤＮＡを化学合成し、それぞれＳＭｅｍｂ遺伝子特異的なフォワードプライマーおよびリバースプライマーとした。これらのプライマーを用いたＰＣＲにより、ＳＭｅｍｂ ｃＤＮＡから２３５ｂｐの断片が増幅される。ＳＭｅｍｂ遺伝子特異的なフォワードプライマーおよびリバースプライマーを、ＫＬＦ５遺伝子特異的なフォワードプライマーおよびリバースプライマーの代わりに用いて、実施例１（２）のＫＬＦ５遺伝子の発現解析と同様にして、ＳＭｅｍｂ遺伝子の発現を解析した。ただしＰＣＲは、ＰＣＲ反応溶液を９５℃で１５分間保持後、熱変性９４℃で３０秒間、アニーリング５３℃で３０秒間、伸長反応７２℃で４０秒間からなる反応を１サイクルとし、２６サイクル実施し、その後７２℃で１０分間保持する条件で行い、電気泳動は１％アガロースゲルで行った。
第４図に示すように、コントロールのＳＥＡＰ−ｓｉＲＮＡではＳＭｅｍｂ遺伝子の発現の抑制が見られないのに対し、ＫＬＦ５遺伝子に特異的な、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．４、Ｎｏ．７、Ｎｏ．８、Ｎｏ．９、Ｎｏ．１０およびＮｏ．１１は、ＫＬＦ５により転写が活性化される遺伝子であるＳＭｅｍｂ遺伝子の発現をも抑制することが確認できた。中でも、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．４、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．７、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．９およびｓｉＲＮＡ Ｎｏ．１０は強くＳＭｅｍｂ遺伝子の発現を抑制した。ＫＬＦ５遺伝子に特異的であるにもかかわらず、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．１では抑制がみられなかった。
（３）ＫＬＦ５遺伝子特異的なｓｉＲＮＡによる遺伝子発現の抑制の特異性
ＫＬＦ５遺伝子に特異的なｓｉＲＮＡによる遺伝子の発現の抑制が、ＫＬＦ５遺伝子およびＫＬＦ５により転写が活性化される遺伝子に特異的であることを、ＫＬＦ５遺伝子に特異的なｓｉＲＮＡをＣ３Ｈ／１０Ｔ１／２細胞へ導入し、ＲＴ−ＰＣＲにより血清応答因子（ＳＲＦ）遺伝子の発現を解析することにより、検証した。ＳＲＦ遺伝子は平滑筋細胞で多く発現する転写因子の遺伝子であり、ＫＬＦ５により転写が活性化される遺伝子ではない。
ＫＬＦ５遺伝子に特異的なｓｉＲＮＡとして、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．１、Ｎｏ．４、Ｎｏ．７、Ｎｏ．９およびＮｏ．１０を用いて、実施例１（２）と同様にして、ｓｉＲＮＡをＣ３Ｈ／１０Ｔ１／２細胞へ導入した後、ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現の解析を行った。配列番号４７および４８の配列からなる２本のＤＮＡを化学合成し、それぞれＳＲＦ遺伝子特異的なフォワードプライマーおよびリバースプライマーとした。これらのプライマーを用いたＰＣＲにより、ＳＲＦ ｃＤＮＡから５１９ｂｐの断片が増幅される。ＳＲＦ遺伝子特異的なフォワードプライマーおよびリバースプライマーを、ＫＬＦ５遺伝子特異的なフォワードプライマーおよびリバースプライマーの代わりに用いて、実施例１（２）のＫＬＦ５遺伝子の発現解析と同様にして、ＳＲＦ遺伝子の発現を解析した。ただしＰＣＲは、ＰＣＲ反応溶液を９５℃で１５分間保持後、熱変性９４℃で３０秒間、アニーリング５３℃で３０秒間、伸長反応７２℃で４０秒間からなる反応を１サイクルとし、２６サイクル実施し、その後７２℃で１０分間保持する条件で行い、電気泳動は１．２％アガロースゲルで行った。
第５図に示すように、ＫＬＦ５遺伝子に特異的な、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．１、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．４、Ｎｏ．７、Ｎｏ．９およびＮｏ．１０全てにおいて、コントロールのＳＥＡＰ−ｓｉＲＮＡと同様に、ＳＲＦ遺伝子の発現の抑制がみられなかった。したがって、ＫＬＦ５遺伝子に特異的なｓｉＲＮＡは、非特異的に、遺伝子全体の発現を抑制するのでなく、ＫＬＦ５遺伝子およびＫＬＦにより転写の活性化をうける遺伝子の発現を特異的に抑制することが明らかとなった。
実施例３ ｓｉＲＮＡによるヒトＫＬＦ５遺伝子の発現抑制
実施例１で作製したｓｉＲＮＡ Ｎｏ．４は、マウスＫＬＦ５ ｃＤＮＡの塩基配列（配列番号４９）の１３０３〜１３２３番目の配列（ＡＡＡＡＧＣＴＣＡＣＣＴＧＡＧＧＡＣＴＣＡ）をもとにしたｓｉＲＮＡであり、Ｃ３Ｈ／１０Ｔ１／２細胞においてマウスのＫＬＦ５遺伝子の発現を強く抑制した。しかし、このＡＡＡＡＧＣＴＣＡＣＣＴＧＡＧＧＡＣＴＣＡの配列は、ヒトＫＬＦ５ ｃＤＮＡの塩基配列（配列番号５０）の１４８１〜１５０１番目にも存在するため、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．４はマウスだけでなくヒトのＫＬＦ５遺伝子の発現も抑制することが期待される。以下のようにして、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．４がヒトＫＬＦ５遺伝子の発現も強く抑制をすることを確認した。
ヒトさい帯静脈血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ、入手先：三光純薬、製品番号：ＣＣ−２５１７）を約３×１０５個となるように６ｃｍディッシュ（コーニング社）に播種した。２００ｐｍｏｌのｓｉＲＮＡ Ｎｏ．４およびＳＥＡＰ−ｓｉＲＮＡそれぞれに、細胞内導入試薬（リポフェクトアミン２０００、インビトロジェン社製）１０μＬを添加して混合し、室温下２０分保持した後、全量を各ディッシュに添加した。５％ＣＯ２存在下３７℃で２４時間インキュベーションし、細胞にそれぞれのｓｉＲＮＡを導入した。
実施例１（２）に記載した方法と同じ方法で、細胞からＲＮＡを単離し、ＲＴ−ＰＣＲによるヒトＫＬＦ５遺伝子の発現抑制を調べた。なお、ＫＬＦ遺伝子特異的なフォワードプライマー、リバースプライマーとしては、実施例１で用いた配列番号４１および４２それぞれの配列からなるＤＮＡを用いた。これらのプライマーを用いたＰＣＲにより、ヒトＫＬＦ５ ｃＤＮＡから配列番号５０の１４４６〜１６０６番目の配列に相当する１６１ｂｐの断片が増幅される。反応後の溶液の０．８％アガロースゲル電気泳動により、ＫＬＦ５ ｍＲＮＡに由来する増幅産物（１６１ｂｐ）を検出し、ｓｉＲＮＡを導入しなかった細胞での増幅産物の量と比較した。内部標準として、１８Ｓ ｒＲＮＡに由来する増幅産物（４８８ｂｐ）を用いた。第６図に示すように、コントロールのＳＥＡＰ−ｓｉＲＮＡではＫＬＦ５遺伝子の発現の抑制が見られないのに対し、ＫＬＦ５遺伝子に特異的な、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．４は、ヒトさい帯血管内皮細胞のＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制していた。したがって、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．４はマウスのＫＬＦ５遺伝子たけでなく、ヒトのＫＬＦ５遺伝子の発現も強く抑制できることが確認された。
第２表に、実施例１でマウスＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制したｓｉＲＮＡ Ｎｏ．２〜４および７〜１１において、設計のもとにしたマウスＫＬＦ５ ｃＤＮＡ上の２１塩基の配列および配列番号４９におけるその位置と、該マウス配列に対応するヒトｃＤＮＡ上の２１塩基の配列、配列番号５０におけるその位置、該ヒト配列から５’端のＡＡを除いたＲＮＡの配列を表す配列番号を示した。なお、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．５および６は、非コード領域の配列をもとにしているため、対応するヒト配列は示さなかった。これらのヒト配列をもとにした二本鎖ＲＮＡもヒトＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制すると考えられる。なお、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．４、８および１０は、対応するヒト配列がマウス配列と全く同じであり、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．８および１０は、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．４と同様に、マウスＫＬＦ５遺伝子だけでなくヒトＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制すると考えられた。
実施例４ ＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡによる血管内皮細胞の遊走の阻害
ＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡ Ｎｏ．４の、血管内皮細胞の遊走に対する阻害を、以下に示すような微小孔フィルターを用いた血管内皮細胞のインビトロ細胞遊走試験（Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１４７，１０７３−１０８４，１９９９；Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ，４２９，１９９８）により調べた。
ヒトさい帯静脈血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ、入手先：三光純薬、製品番号：ＣＣ−２５１７）を約３×１０５個となるように６ｃｍディッシュ（コーニング社）に播種した。ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．４およびコントロールのＳＥＡＰ−ｓｉＲＮＡそれぞれ２００ｐｍｏｌに１０μＬの細胞内導入試薬（リポフェクタミン２０００，インビトロジェン社製）を添加、混合し、室温下２０分インキュベーションした後、全量をディッシュに添加した。５％ＣＯ２存在下３７℃で１８時間インキュベーションし、ｓｉＲＮＡを導入した。
ｓｉＲＮＡ導入細胞を洗浄後、５μｇ／ｍＬの生細胞染色用蛍光色素（カルセインＡＭ、同仁化学社製）で細胞を蛍光標識した。得られた蛍光標識細胞は、トリプシンで細胞を剥離、洗浄後、細胞濃度５×１０５個／ｍＬになるように血管内皮細胞用基礎培地（ＥＢＭ−２、三光純薬社製）で再懸濁した。ＨＴＳフルオロブロック個別型インサート（２４ウェルプレート用ポアサイズ３μｍインサート、ＢＤファルコン）を２４ウェルセルカルチャーインサート用プレート（ＢＤファルコン）に取り付けた後、インサート側には蛍光標識細胞の懸濁液１００μＬを、２４ウェルプレート側には１０ｎｇ／ｍＬのヒトＶＥＧＦ（ＲアンドＤシステムズ社製）を含有する血管内皮細胞用増殖培地（ブレットキットＥＧＭ−２、三光純薬製）６００μＬをそれぞれ添加した。
添加後４時間まで、経時的にフィルターの微小孔を遊走してきた細胞をプレート底から蛍光顕微鏡で観察および撮影した。得られた画像から、画像解析ソフトウェア（Ｓｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅ、Ｓｃｉｏｎ社製）を用いて、遊走細胞数を計測した。第７図に示すように、コントロールのＳＥＡＰ−ｓｉＲＮＡと比較して、ＫＬＦ５遺伝子特異的なｓｉＲＮＡ Ｎｏ．４を導入した血管内皮細胞では、遊走細胞数が低下した。したがって、ＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡにより、血管内皮細胞の遊走を阻害できることが確認された。
実施例５ ＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡのインビボでの血管新生阻害効果
ＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡ Ｎｏ．４のインビボでの血管新生阻害効果を、以下に示すようなマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）を用いたアッセイ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４，１３６１２−１３６１７，１９９７；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７，６６６７−６６７５，２００２〕により調べた。
マトリゲル混合物は、マトリゲルマトリックス（ＢＤ バイオサイエンス製）０．５ｍＬ（５ｍｇ量）にマウスＶＥＧＦ〔ＲアンドＤシステムズ社（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）製、カタログ番号４９３−ＭＶ〕０．６μｇ、ウシ塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ、ＲアンドＤシステムズ社製、カタログ番号１３３−ＦＢ）０．６μｇおよびｓｉＲＮＡ Ｎｏ．４ １０μｇを加え、氷上でピペッティングにより混合して調製した。コントロールとして、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．４の代わりにＳＥＡＰ−ｓｉＲＮＡを用いたマトリゲル混合物も調製した。調製したマトリゲル混合物を６週齢のオスのＣ５７ＢＬ／６マウスの背中の皮下に注射した。注射１４日後にゲル化したマトリゲルを取り出した。取り出したマトリゲルをＰＢＳで１回洗浄し、１０％ホルムアルデヒド−ＰＢＳ溶液で固定した。固定したマトリゲルを５ｍｍ厚にカットしてパラフィンに包埋し、通常の組織学的手法を使用して切片化し、ヘマトキシリン−エオジンで染色した。染色したマトリゲル切片を顕微鏡で観察した。
その結果、コントロールのＳＥＡＰ−ｓｉＲＮＡを加えたマトリゲルでは、マトリゲルに添加したＶＥＧＦおよびｂＦＧＦに反応して、多数の血管内皮細胞が遊走して、マトリゲル内に浸潤しているのに対し、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．４を加えたマトリゲルではマトリゲル内への血管内皮細胞の浸潤が抑制されていた。したがってＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡにより、血管新生が阻害できることが確認された。
実施例６ ＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡのインビボでの抗腫瘍効果
ＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡ Ｎｏ．４のインビボでの抗腫瘍効果を、以下のように腫瘍の増殖抑制を指標にして調べた。
オス５週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスの背中の皮下に、マウスルイス肺ガン細胞株ＬＬ／２（入手先：大日本製薬株式会社、カタログ番号：０９−１６４２）を１×１０６個注射した。注射２日後、ルイス肺ガンが固定されているのを確認し、ガン周辺皮下にｓｉＲＮＡ Ｎｏ．４を注射した。コントロールとしてＳＥＡＰ−ｓｉＲＮＡを同様にガン周辺に皮下投与した。ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．４およびＳＥＡＰ−ｓｉＲＮＡの投与量はマウス１匹あたり１μｇを５０μＬの注射用水（大塚蒸留水、大塚製薬株式会社製）で溶解したものを用い、投与期間は連続８日間、投与回数は１日１回で行った。投与開始後の腫瘍の体積を下記式（１）を用いて算出し、腫瘍体積の増加をコントロールと比較した。
式（１）：腫瘍体積（ｍｍ３）＝｛腫瘍長さ（ｍｍ）×腫瘍幅（ｍｍ）２｝／２
その結果、第８図に示すように、コントロールのＳＥＡＰ−ｓｉＲＮＡを投与したマウスでの腫瘍体積は、投与開始より増加していくのに対し、ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．４を投与したマウスの腫瘍体積の増加は投与後１日目より抑制された。したがってＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡはインビボでの抗腫瘍効果を有し、投与により腫瘍の増殖を抑制できることが確認された。
【配列表フリーテキスト】
配列番号１ −発明者：永井良三；眞鍋一郎；石原淳
発明者：鳥取恒彰
配列番号１７−ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．１ センス鎖
配列番号１８−ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．１ アンチセンス鎖
配列番号１９−ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．２ センス鎖
配列番号２０−ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．２ アンチセンス鎖
配列番号２１−ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．３ センス鎖
配列番号２２−ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．３ アンチセンス鎖
配列番号２３−ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．４ センス鎖
配列番号２４−ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．４ アンチセンス鎖
配列番号２５−ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．５ センス鎖
配列番号２６−ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．５ アンチセンス鎖
配列番号２７−ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．６ センス鎖
配列番号２８−ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．６ アンチセンス鎖
配列番号２９−ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．７ センス鎖
配列番号３０−ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．７ アンチセンス鎖
配列番号３１−ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．８ センス鎖
配列番号３２−ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．８ アンチセンス鎖
配列番号３３−ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．９ センス鎖
配列番号３４−ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．９ アンチセンス鎖
配列番号３５−ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．１０ センス鎖
配列番号３６−ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．１０ アンチセンス鎖
配列番号３７−ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．１１ センス鎖
配列番号３８−ｓｉＲＮＡ Ｎｏ．１２ アンチセンス鎖
配列番号３９−ｓｉＲＮＡ−ＳＥＡＰ センス鎖
配列番号４０−ｓｉＲＮＡ−ＳＥＡＰ アンチセンス鎖
配列番号４１−ＫＬＦ５遺伝子特異的フォワードプライマー
配列番号４２−ＫＬＦ５遺伝子特異的リバースプライマー
配列番号４３−ＰＤＧＦ−Ａ遺伝子特異的フォワードプライマー
配列番号４４−ＰＤＧＦ−Ａ遺伝子特異的リバースプライマー
配列番号４５−ＳＭｅｍｂ遺伝子特異的フォワードプライマー
配列番号４６−ＳＭｅｍｂ遺伝子特異的リバースプライマー
配列番号４７−ＳＲＦ遺伝子特異的フォワードプライマー
配列番号４８−ＳＲＦ遺伝子特異的リバースプライマー
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＫＬＦ５ ｍＲＮＡの連続する１５〜３０塩基の配列および該配列と相補的な配列を含み、ＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制するＲＮＡ。
【請求項２】
ＫＬＦ５ ｍＲＮＡがヒトまたはマウスのＫＬＦ５ ｍＲＮＡである、請求項１に記載のＲＮＡ。
【請求項３】
ＲＮＡが、ＫＬＦ５ ｍＲＮＡの連続する１５〜３０塩基の配列の鎖および該配列と相補的な配列の鎖からなる二本鎖ＲＮＡのそれぞれの鎖の３’端に１〜６個のヌクレオチドを付加した二本鎖ＲＮＡである、請求項１または２に記載のＲＮＡ。
【請求項４】
ＲＮＡが、ＫＬＦ５ ｍＲＮＡの連続する１５〜３０塩基の配列からなるＲＮＡおよび該配列と相補的な配列からなるＲＮＡを、スペーサーオリゴヌクレオチドでつなぎ、３’端に１〜６個のヌクレオチドを付加した、ヘアピン構造を形成するＲＮＡである、請求項１または２に記載のＲＮＡ。
【請求項５】
以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選ばれるＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制するＲＮＡ。
（ａ）配列番号２〜１６のいずれか１つの配列の鎖および該配列と相補的な配列の鎖からなる二本鎖ＲＮＡのそれぞれの鎖の３’端に２〜４個のウリジル酸またはデオキシチミジル酸を付加した二本鎖ＲＮＡ。
（ｂ）配列番号２〜１６のいずれか１つの配列からなるＲＮＡおよび該配列と相補的な配列からなるＲＮＡを２個のウリジル酸またはデオキシチミジル酸を５’端に有するスペーサーオリゴヌクレオチドでつなぎ、３’端に２〜４個のウリジル酸またはデオキシ体チミジル酸を付加した、ヘアピン構造を形成するＲＮＡ。
（ｃ）配列番号２〜１１のいずれか１つの配列の鎖および該配列と相補的な配列の鎖からなる二本鎖ＲＮＡのそれぞれの鎖の３’端に２個のウリジル酸を付加した二本鎖ＲＮＡ。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のＲＮＡを発現するベクター。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のＲＮＡまたは請求項６に記載のベクターを細胞に導入
することにより、該細胞中のＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制する方法。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のＲＮＡまたは請求項６に記載のベクターを細胞に導入することにより、該細胞中のＫＬＦ５により転写が活性化される遺伝子の発現を抑制する方法。
【請求項９】
ＫＬＦ５により転写が活性化される遺伝子が血小板由来増殖因子Ａ鎖遺伝子またば平滑筋ミオシン重鎖ＳＭｅｍｂ遺伝子である請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のＲＮＡまたは請求項６に記載のベクターを有効成分として含有する医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のＲＮＡまたは請求項６に記載のベクターを有効成分として含有する、血管新生を阻害するための医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のＲＮＡまたは請求項６に記載のベクターを有効成分として含有する、心血管系疾患もしくは癌の治療薬または予防薬。
【請求項１３】
心血管系疾患が動脈硬化、冠動脈インターベンション後の再狭窄または心肥大である請求項１２に記載の治療薬または予防薬。
【請求項１】
ＫＬＦ５ ｍＲＮＡの連続する１５〜３０塩基の配列および該配列と相補的な配列を含み、ＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制するＲＮＡ。
【請求項２】
ＫＬＦ５ ｍＲＮＡがヒトまたはマウスのＫＬＦ５ ｍＲＮＡである、請求項１に記載のＲＮＡ。
【請求項３】
ＲＮＡが、ＫＬＦ５ ｍＲＮＡの連続する１５〜３０塩基の配列の鎖および該配列と相補的な配列の鎖からなる二本鎖ＲＮＡのそれぞれの鎖の３’端に１〜６個のヌクレオチドを付加した二本鎖ＲＮＡである、請求項１または２に記載のＲＮＡ。
【請求項４】
ＲＮＡが、ＫＬＦ５ ｍＲＮＡの連続する１５〜３０塩基の配列からなるＲＮＡおよび該配列と相補的な配列からなるＲＮＡを、スペーサーオリゴヌクレオチドでつなぎ、３’端に１〜６個のヌクレオチドを付加した、ヘアピン構造を形成するＲＮＡである、請求項１または２に記載のＲＮＡ。
【請求項５】
以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選ばれるＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制するＲＮＡ。
（ａ）配列番号２〜１６のいずれか１つの配列の鎖および該配列と相補的な配列の鎖からなる二本鎖ＲＮＡのそれぞれの鎖の３’端に２〜４個のウリジル酸またはデオキシチミジル酸を付加した二本鎖ＲＮＡ。
（ｂ）配列番号２〜１６のいずれか１つの配列からなるＲＮＡおよび該配列と相補的な配列からなるＲＮＡを２個のウリジル酸またはデオキシチミジル酸を５’端に有するスペーサーオリゴヌクレオチドでつなぎ、３’端に２〜４個のウリジル酸またはデオキシ体チミジル酸を付加した、ヘアピン構造を形成するＲＮＡ。
（ｃ）配列番号２〜１１のいずれか１つの配列の鎖および該配列と相補的な配列の鎖からなる二本鎖ＲＮＡのそれぞれの鎖の３’端に２個のウリジル酸を付加した二本鎖ＲＮＡ。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のＲＮＡを発現するベクター。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のＲＮＡまたは請求項６に記載のベクターを細胞に導入
することにより、該細胞中のＫＬＦ５遺伝子の発現を抑制する方法。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のＲＮＡまたは請求項６に記載のベクターを細胞に導入することにより、該細胞中のＫＬＦ５により転写が活性化される遺伝子の発現を抑制する方法。
【請求項９】
ＫＬＦ５により転写が活性化される遺伝子が血小板由来増殖因子Ａ鎖遺伝子またば平滑筋ミオシン重鎖ＳＭｅｍｂ遺伝子である請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のＲＮＡまたは請求項６に記載のベクターを有効成分として含有する医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のＲＮＡまたは請求項６に記載のベクターを有効成分として含有する、血管新生を阻害するための医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のＲＮＡまたは請求項６に記載のベクターを有効成分として含有する、心血管系疾患もしくは癌の治療薬または予防薬。
【請求項１３】
心血管系疾患が動脈硬化、冠動脈インターベンション後の再狭窄または心肥大である請求項１２に記載の治療薬または予防薬。
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０１０１８５
【国際公開日】平成１７年２月３日（２００５．２．３）
【発行日】平成１８年１１月３０日（２００６．１１．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１２１２８（Ｐ２００５−５１２１２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１１２２３
【国際出願日】平成１６年７月２９日（２００４．７．２９）
【出願人】（０００００１０２９）協和醗酵工業株式会社 (276)
【出願人】（５９４０５３４１９）
【出願人】（５０３２７１８９９）
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年２月３日（２００５．２．３）
【発行日】平成１８年１１月３０日（２００６．１１．３０）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１１２２３
【国際出願日】平成１６年７月２９日（２００４．７．２９）
【出願人】（０００００１０２９）協和醗酵工業株式会社 (276)
【出願人】（５９４０５３４１９）
【出願人】（５０３２７１８９９）
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]