Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属の変異体酵母及びこれを用いたエタノールの製造方法
【課題】Kluyveromyces属に属する酵母を、キシロースからのエタノール収率を向上するように改変する。
【解決手段】Kluyveromyces属に属する酵母における、少なくとも１以上のトリオースホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子、TDH1遺伝子及びTDH2遺伝子を減弱化した変異体酵母。変異体酵母は、グルコースからのエタノール収率は殆ど変わらず、キシロースからのエタノール収率が大幅に向上しているので、例えば、木質系バイオマス等のリグノセルロースを含むバイオマスに由来するキシロースを含む培地において、高収率にエタノールを製造することができる。
【解決手段】Kluyveromyces属に属する酵母における、少なくとも１以上のトリオースホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子、TDH1遺伝子及びTDH2遺伝子を減弱化した変異体酵母。変異体酵母は、グルコースからのエタノール収率は殆ど変わらず、キシロースからのエタノール収率が大幅に向上しているので、例えば、木質系バイオマス等のリグノセルロースを含むバイオマスに由来するキシロースを含む培地において、高収率にエタノールを製造することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Kluyveromyces属酵母を利用した変異体酵母及びこれを用いたエタノールの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リグノセルロースを含むバイオマスは、エタノール等の有用なアルコールや有機酸の原料として有効に利用されている。リグノセルロースを含むバイオマスには、木質系バイオマス及び草本系バイオマスが含まれる。木質系バイオマスなどのリグノセルロースを含むバイオマスは、主としてセルロース、ヘミセルロース及びリグニンから構成されている。リグノセルロースを含むバイオマスからエタノール等液体燃料を製造するためには、セルロースやヘミセルロースを構成単糖にまで加水分解（糖化）し、発酵によって単糖をエタノールに変換する。セルロースはグルコースから構成され、ヘミセルロースは主としてアラビノースとキシロースから構成されている。したがって、リグノセルロースを含むバイオマスを利用してエタノールを製造する際には、グルコースのみではなくキシロースも発酵の基質として有効に利用されることが望ましい。
【０００３】
また、リグノセルロースを含むバイオマスからエタノールを製造する場合、上述した糖化反応と発酵反応とを同時に（各反応工程を区別することなく）行うことができれば製造コストの低減に繋がる。これを同時糖化発酵方法と称する。同時糖化発酵には、糖化酵素の反応温度領域（約40℃以上）で発酵が可能な耐熱性を有し、基質としてグルコースのみでなく５単糖のキシロースを利用できる微生物が必要となる。
【０００４】
耐熱性を有する酵母としては、Kluyveromyces marxianus等のKluyveromyces属酵母が知られている。このKluyveromyces属酵母は、キシロースを利用してエタノール発酵を行うことができるが、その収率は不十分であった。
【０００５】
特許文献１には、外因性のキシロースイソメラーゼ遺伝子を有する遺伝子組換え酵母が開示されており、キシロースを資化できる遺伝子組換え酵母が開示されている。特許文献１には、宿主酵母の一例としてKluyveromyces、Candida、Pichia、Hansenula、Trichosporon、Brettanomyces、Pachysolen及びYamadazyma属の酵母が開示されている。また、Kluyveromyces属酵母としては、K. marxianus、K. lactis及びK. thermotoleransが開示されている。
【０００６】
さらに、特許文献２には、F177S、Y195HおよびK218Rといった変異が導入されたTATA結合タンパク質（変異SPT15）をコードする遺伝子を導入した遺伝子組換え酵母が開示されており、グルコースからのエタノール収率を向上させる技術が開示されている。特許文献２には、キシロースを資化できる酵母の一例としてK. marxianus、K. lactis及びK. thermotolerans等のKluyveromyces属酵母が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表2006-525029号公報
【特許文献２】特表2010-512147号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述したように、Kluyveromyces属酵母は、キシロース資化性を有し、且つ耐熱性を有するため、上述した同時糖化発酵法等に有用な微生物として大きく期待されている。しかしながら、Kluyveromyces属酵母についてはキシロースからのエタノール収率が非常に悪く、またこれを改善する手段も知られていない。そこで、本発明は、このような実情に鑑み、キシロースからのエタノール収率を向上するように改変されたKluyveromyces属に属する変異体酵母、及び当該変異体酵母を用いたエタノールの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上述した目的を達成するため、本発明者らが鋭意検討した結果、Kluyveromyces属酵母におけるトリオースホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子（別称：グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、略称：TDH遺伝子又はGAPDH遺伝子）を減弱化することで当該酵母におけるキシロースからのエタノール収率が大幅に向上することを見いだし、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下を包含する。
【００１０】
（１）Kluyveromyces属に属する酵母における、少なくとも１以上のトリオースホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子を減弱化した変異体酵母。
（２）上記Kluyveromyces属に属する酵母は、Kluyveromyces marxianusであることを特徴とする（１）記載の変異体酵母。
（３）上記トリオースホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子は、TDH1遺伝子及びTDH2遺伝子であることを特徴とする（１）記載の変異体酵母。
（４）上記TDH1遺伝子は、以下(a)〜(c)いずれかのタンパク質をコードすることを特徴とする（３）記載の変異体酵母。
(a) 配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号２のアミノ酸配列に対して90％以上の配列類似性を有するアミノ酸配列を含み、グリセルアルデヒド-3-リン酸を1,3-ビスホスホグリセリン酸へと変換する活性を有するタンパク質
(c) 配列番号２のアミノ酸配列に対して１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入したアミノ酸配列を含み、グリセルアルデヒド-3-リン酸を1,3-ビスホスホグリセリン酸へと変換する活性を有するタンパク質
（５）上記TDH2遺伝子は、以下(a)〜(c)いずれかのタンパク質をコードすることを特徴とする（３）記載の変異体酵母。
(a) 配列番号４のアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号４のアミノ酸配列に対して90％以上の配列類似性を有するアミノ酸配列を含み、グリセルアルデヒド-3-リン酸を1,3-ビスホスホグリセリン酸へと変換する活性を有するタンパク質
(c) 配列番号４のアミノ酸配列に対して１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入したアミノ酸配列を含み、グリセルアルデヒド-3-リン酸を1,3-ビスホスホグリセリン酸へと変換する活性を有するタンパク質
（６）（１）乃至（５）いずれか記載の変異体酵母をキシロース含有培地にて培養する工程と、その後、培地よりエタノールを回収する工程とを含む、エタノールの製造方法。
（７）上記培養する工程は、上記変異体酵母とリグノセルロースを含むバイオマスと糖化酵素とを含む反応系で実施されることを特徴とする（６）記載のエタノールの製造方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明に係る変異体酵母は、グルコースからのエタノール収率は殆ど変わらず、キシロースからのエタノール収率が大幅に向上している。したがって、本発明に係る変異体酵母は、例えば、木質系バイオマス等のリグノセルロースを含むバイオマスに由来するキシロースを含む培地において、高収率にエタノールを製造することができる。
【００１２】
本発明に係るエタノールの製造方法は、キシロースからのエタノール収率が大幅に向上した変異体酵母を利用することで、エタノール製造効率を大幅に向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】糖成分としてキシロースを含有する培地にてTDH1破壊株、TDH2破壊株及び野生株を培養したときのエタノール濃度を測定した結果を示す特性図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明に係る変異体酵母は、Kluyveromyces属酵母における特定のトリオースホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子を減弱化したものであり、キシロースからのエタノール収率が向上した特徴を有している。
【００１５】
ここで、Kluyveromyces属酵母とは、K. aestuarii、K. africanus、K. bacillisporus、K. blattae、K. dobzhanskii、K. hubeiensis、K. lactis、K. lodderae、K. marxianus、K. nonfermentans、K. piceae、K. sinensis、K. thermotolerans、K. waltii、K. wickerhamii及びK. yarrowii等の酵母を含む意味である。すなわち、本発明に係る変異体酵母は、これらの具体的なKluyveromyces属酵母及びその変異体に対して、特定のトリオースホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子を減弱化することで作製することができる。Kluyveromyces属酵母としては、特に、耐熱性酵母として知られているKluyveromyces marxianusを使用することが好ましい。Kluyveromyces marxianusとしては、特に限定されず、寄託機関に分譲可能に保存された公知の株を使用することができるし、また公知の株から派生した変異株を使用することもできる。Kluyveromyces marxianusの公知株としては、Kluyveromyces marxianus DMKU3-1042株を挙げることができる。公知の株から派生した変異株とは、例えば、Kluyveromyces marxianus DMKU3-1042株に対して栄養要求性を付与するためにura3遺伝子やleu2遺伝子を破壊した株を例示することができる。
【００１６】
本発明に係る変異体酵母は、特定のトリオースホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子を減弱化したものである。ここで「遺伝子の減弱化」とは、当該遺伝子の発現量を低減すること、当該遺伝子がコードする酵素の活性を低減することの両者を含む意味である。例えば、特定のトリオースホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子を破壊又は欠失させる方法、当該遺伝子の発現制御領域（プロモーター等）を破壊又は欠失させる方法、当該遺伝子に対するアンチセンスRNAを発現する方法等により、当該遺伝子の発現量を低減することができる。また、所謂、トランスポゾン法、トランスジーン法、転写後遺伝子サイレンシング法、RNAi法、ナンセンス仲介減衰（Nonsense mediated decay, NMD）法、リボザイム法、アンチセンス法、miRNA（micro-RNA）法、siRNA（small interfering RNA）法等を適用し、当該遺伝子の発現量を低減することができる。さらに、トリオースホスフェートデヒドロゲナーゼの阻害剤を作用させる手法等により、当該遺伝子がコードする酵素の活性を低減することができる。なお、これらの方法を組み合わせて、特定のトリオースホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子を減弱化しても良い。
【００１７】
また、本発明に係る変異体酵母は、キシロースからのエタノール収率が向上した特徴を有している。言い換えると、本発明に係る変異体酵母は、キシロース代謝能が向上した特徴を有している。ここで、キシロース代謝能とは、培地に含まれるキシロースを代謝してアルコールとする発酵反応における効率を意味する。したがって、キシロース代謝能の向上とは、当該発酵反応における反応効率を向上させることと同義となる。酵母におけるキシロース代謝能は、キシロース含有培地にて培養し、産生されたアルコールを定量することによって評価できる。また、酵母におけるキシロース代謝能は、例えば、培地に含まれるキシロースの取り込み速度（消費速度）を指標にして評価することもできる。キシロースの取り込み速度は、培養開始時における既知濃度のキシロースの減少量を経時的に測定することで算出することができる。
【００１８】
ここで、トリオースホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子とは、グリセルアルデヒド-3-リン酸を1,3-ビスホスホグリセリン酸へと変換する活性を有する酵素をコードする遺伝子を意味する。トリオースホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子は、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子とも称され、TDH遺伝子又はGAPDH遺伝子として略記される。以下の説明においてトリオースホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子を、TDH遺伝子と略称する場合もある。
【００１９】
Kluyveromyces属酵母に内在するTDH遺伝子としては、当該酵母のゲノム配列が明らかとなっている場合には、公知のTDH遺伝子の塩基配列やTDH遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を元にした相同性検索により、TDH遺伝子を特定することができる。例えば、TDH遺伝子がコードするタンパク質の公知のアミノ酸配列に対して８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の配列類似性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子を、TDH遺伝子として特定することができる。ここで、配列類似性の値は、BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）プログラムを実装したコンピュータを用いてデフォルトの設定で求められる値を意味する。
【００２０】
また、Kluyveromyces属酵母に内在するTDH遺伝子としては、当該酵母のゲノム配列が明らかとなっていない場合には、公知の手法によりTDH遺伝子を特定することができる。例えば、公知のTDH遺伝子の塩基配列に基づいてプローブを設計し、当該プローブにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするゲノム領域を同定し、その後、核酸増幅法やシーケンス法を適用してTDH遺伝子を特定することができる。ここで、ストリンジェントな条件とは、９０％程度、好ましくは９５％、更に好ましくは９８％の同一性を有する一対のポリヌクレオチドが特異的なハイブリダイズを形成する条件（温度条件、塩濃度条件）を意味する。
【００２１】
特に、Kluyveromyces属酵母に内在するTDH遺伝子のうち、特定のTDH遺伝子を減弱化することが好ましい。具体的に、TDH遺伝子は、Kluyveromyces marxianusにおいて３種類（KmTDH1〜KmTDH3）が知られている。Kluyveromyces marxianusにおいて減弱化するTDH遺伝子は、これらのうちKmTDH1遺伝子及び/又はKmTDH2遺伝子とすることが好ましい。KmTDH1遺伝子及びKmTDH2遺伝子のうちいずれか一方のTDH遺伝子を減弱化してもよいが、両方のTDH遺伝子を減弱化してもよい。
【００２２】
一方、Kluyveromyces marxianus以外のKluyveromyces属酵母において減弱化するTDH遺伝子としては、KmTDH1遺伝子に機能的に等価なTDH遺伝子及び/又はKmTDH2遺伝子に機能的に等価なTDH遺伝子とすることが好ましい。Kluyveromyces marxianus以外のKluyveromyces属酵母において、KmTDH1遺伝子に機能的に等価なTDH遺伝子及びKmTDH2遺伝子に機能的に等価なTDH遺伝子は、従来公知の方法により同定することができる。例えば、先ず、Kluyveromyces marxianus以外のKluyveromyces属酵母において複数のTDH遺伝子を特定する。そして、これら遺伝子がコードするトリオースホスフェートデヒドロゲナーゼのなかから、KmTDH1遺伝子がコードするトリオースホスフェートデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列に対して最も配列類似性が高いアミノ酸配列を有するものを特定する。このように特定したトリオースホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子は、Kluyveromyces marxianusにおけるKmTDH1遺伝子と機能的に等価な遺伝子であると特定できる。なお、KmTDH2遺伝子と機能的に等価な遺伝子を特定する場合も同様である。ここで、配列類似性の値は、BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）プログラムを実装したコンピュータを用いてデフォルトの設定で求められる値を意味する。
【００２３】
ここで、KmTDH1遺伝子のコーディング領域の塩基配列及びKmTDH1遺伝子がコードするトリオースホスフェートデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１及び２に示す。また、KmTDH2遺伝子のコーディング領域の塩基配列及びKmTDH2遺伝子がコードするトリオースホスフェートデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号３及び４に示す。
【００２４】
なお、Kluyveromyces marxianusに存在する、これらKmTDH1遺伝子及びKmTDH2遺伝子は、以上の具体的な塩基配列及びアミノ酸配列に限定されるものではない。すなわち、KmTDH1遺伝子及びKmTDH2遺伝子は、トリオースホスフェートデヒドロゲナーゼ活性（すなわち、グリセルアルデヒド-3-リン酸を1,3-ビスホスホグリセリン酸へと変換する活性）を有するタンパク質をコードする限り、それぞれ配列番号２及び４に示すアミノ酸配列に対して８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の配列類似性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするものも含まれる。ここで、配列類似性の値は、BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）プログラムを実装したコンピュータを用いてデフォルトの設定で求められる値を意味する。
【００２５】
また、KmTDH1遺伝子及びKmTDH2遺伝子は、トリオースホスフェートデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする限り、それぞれ配列番号２及び４に示すアミノ酸配列に対して１又は複数個（例えば２〜３５個、好ましくは２〜３０個、より好ましくは２〜２０個、更に好ましくは２〜１０個）のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするものも含まれる。
【００２６】
さらに、KmTDH1遺伝子及びKmTDH2遺伝子は、トリオースホスフェートデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする限り、それぞれ配列番号１及び３に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドの一部又は全部に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドも含まれる。ここで、ストリンジェントな条件とは、９０％程度、好ましくは９５％、更に好ましくは９８％の同一性を有する一対のポリヌクレオチドが特異的なハイブリダイズを形成する条件（温度条件、塩濃度条件）を意味する。
【００２７】
＜エタノール製造＞
以上で説明した変異体酵母を利用することで、キシロース等の糖を基質としたエタノール発酵を行うことができる。特に、上述した本発明に係る変異体酵母は、優れたキシロース代謝能、すなわちキシロースからのエタノール収率が優れているため、キシロース含有培地を利用したエタノール発酵に好適である。キシロース含有培地とは、Kluyveromyces属酵母が生育しうる培地であってエタノール合成の基質となる糖成分として少なくともキシロースを含有する培地を意味する。なお、キシロース含有培地は、キシロース以外の糖成分、例えばグルコースを含有していても良い。
【００２８】
キシロース含有培地は、特に限定されないが、SD培地、YPD培地、YPAD培地、YM培地及びYeast Nitrogen Baseを含む各種合成培地にキシロースを添加するか、これら公知の培地に含まれる糖成分をキシロースに代替することで調整することができる。
【００２９】
また、木質系バイオマスや草本系バイオマスといったリグノセルロースを含むバイオマスからキシロース含有培地を調整しても良い。すなわち、リグノセルロースを含むバイオマスに含まれるセルロースやヘミセルロースを糖化処理し、得られた処理物をキシロース含有培地として使用することもできる。糖化処理としては、特に限定されず従来公知の手法をなんら限定されることなく利用することができる。糖化方法としては、例えば、希硫酸又は濃硫酸を利用する硫酸法、セルラーゼやヘミセルラーゼを利用する酵素法等を挙げることができる。また、糖化処理に先立って、木質系バイオマスや草本系バイオマスに対して従来公知の前処理を施しても良い。前処理としては、特に限定されないが、例えば、リグニンを微生物によって分解する処理や、木質系バイオマスや草本系バイオマスの粉砕処理、イオン液体やアルカリ溶液に浸漬して構造を緩和する処理、高温の水で蒸煮する水熱処理、アンモニアによる処理等を挙げることができる。
【００３０】
特に、Kluyveromyces marxianusから作製した変異体酵母では、特に耐熱性に優れるため、例えば40℃以上、好ましくは35〜48℃、より好ましくは40〜42℃といった比較的に高温度でエタノール発酵を行うことができる。このような温度領域は、セルラーゼやヘミセルラーゼといった糖化酵素も活性を示す温度領域である。したがって、当該変異体酵母は、糖化酵素を利用した所謂、同時糖化発酵に好適である。ここで同時糖化発酵とは、糖化酵素による木質系バイオマスの糖化処理と、キシロースからのエタノール発酵処理とを同一反応系で実施する処理を意味する。より具体的には、木質系バイオマスと糖化酵素と変異体酵母とを含む溶液を例えば40℃といった温度条件にてインキュベートする。これにより、木質系バイオマスの糖化と、糖化によって得られたキシロースやグルコースからのエタノール発酵が進行し、エタノールを製造することができる。また、このとき溶液を攪拌しても良いし、振とうしてもよい。
【００３１】
また、培地に含まれるキシロース等の炭素源から発酵生産されたエタノールを回収する際には、特に限定されず、従来公知のいかなる方法も適用することができる。例えば、上述したエタノール発酵が終了した後、固液分離操作によってエタノールを含む液層と、変異体酵母や固形成分を含有する固層とを分離する。その後、液層に含まれるエタノールを蒸留法によって分離・精製することで、純度の高いエタノールを回収することができる。なお、エタノールの精製度は、エタノールの使用目的にあわせて適宜調整することができる。
【実施例】
【００３２】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３３】
〔実施例１〕
本実施例では、Kluyveromyces属酵母としてKluyveromyces marxianusを使用し、トリオースホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子の破壊株を作製し、キシロースからのエタノール収率を比較検討した。
【００３４】
＜株の作製＞
接合、胞子形成によるura3- leu2-変異株の作製
Kluyveromyces marxianus DMKU3-1042株のura3-株であるRAK3605株(Nonklang, S. et al., Appl. Environ. Microbiol. 74, p. 7514-7521 (2008))を基準株として使用した。K. marxianus DMKU3-1042株由来の栄養要求性変異株は、低頻度で２倍体になることを明らかにしている。紫外線変異により、多重栄養要求性変異株を取得することは可能であるが、その結果、染色体ＤＮＡに変異が入る確率が上昇する。より安定な株を作製するために、接合と胞子形成により、２倍体から簡単に多重栄養要求性株を作製するために以下の株を作製した。
【００３５】
先ず、RAK3605株に紫外線照射し、lys-株(RAK3896株:ura3- lys2-)、ade-株(RAK3919株:ura3- ade2-)及びleu-株(RAK3966株:ura3- leu2-)を取得した。これらの株にSaccharomyces cerevisiaeのURA3をランダムに染色体へ形質転換した株、RAK4153株(ura3- lys2- ScURA3)、RAK4152株(ura3- ade2- ScURA3)及びRAK4088株（ura3- leu2- ScURA3）をそれぞれ作製した。RAK4152とRAK4153株をYPD培地(1% w/v Yeast extract, 2% w/v peptone, 2% glucose, 2% w/v agar)上で混ざるようにストリークし、MM培地（0.17% w/v yeast nitrogen base w/o amino acids and ammonium sulfate, 0.5% w/v ammonium sulfate, 2% w/v glucose, 2% w/v agar）へレプリカした。MM培地で生えた株、RAK4154株(ura3-/ura3- ade2-/ADE2, lys2-/LYS2 ScURA3/ScURA3)をS. cerevisiaeで使用されるSPO培地(1% w/v potassium acetate, 0.1% w/v yeast extract, 0.05% w/v glucose)に植菌し、胞子形成させた。
【００３６】
作製した胞子を分離し、ura- lys- ade-の3重栄養要求性株を取得するために、-A培地(MM+uracil, tryptophan, histidine HCl, methionine, leucine, lysine HCl), -K培地(MM+ uracil, tryptophan, histidine HCl, methionine, leucine, adenine hemisulfate), -U培地(MM+ tryptophan, histidine HCl, methionine, leucine, lysine HCl, adenine hemisulfate)へレプリカし、3つの培地で増殖できない株をRAK4154株の胞子から3株取得することに成功した。その株をRAK4155株(ura3- lys2- ade2-)と命名した。同様の方法でRAK4088株とRAK4155株を接合させ、RAK4156株(ura3-/ura3- lys2-/LYS2 ade2-/ADE2 leu2-/LEU2 ScURA3/ScURA3)を作製した。この株を胞子形成させ、RAK4174株(leu2- ura3-)株を作製した。
【００３７】
Ku70破壊株の作製
K. marxianusは非相同末端結合修復が高頻度で起こることから、S. cerevisiaeのように相同組換え修復を利用して遺伝子破壊を容易に行うことができない(Nonklang, S. et al., Appl. Environ. Microbiol. 74, p. 7514-7521 (2008))。そこで、非相同末端結合修復に必須のKU70遺伝子を破壊することで相同組換えを高頻度に起こさせる株の作製を行った。RAK4174株からKU70を破壊したRAK4736株(leu2- ura3- Kmku70Δ::ScLEU2)を作製した(Abdel-Banat, B.M. et al., Yeast 27, 29-39(2010))。
【００３８】
TDH1破壊株の作製
K. marxianus DMKU3-1042株のTDH1遺伝子における推定open reading frameはGenetyx ver.10 (株式会社ゼネティクス)で予測した。DMKU3-1042株のTDH1遺伝子は、331アミノ酸からなるタンパク質をコードしていた。この塩基配列情報を利用して以下の一対のプライマーを設計した。
KmTDH1-60-ASC：5’-CCCTCCCAAACCAAGTCTTTTAGATTTAACAACAGTACACACACACTTTTACACATCACAggcgcgcccggg-3’（配列番号５）
KmTDH1+1056c-TDHu：5’-ACATAGGAATGGATAATAAGTACCTCCAGCCCCAAAGCAAACTAACTTAACTAACTACATtggcagtattgataatgag-3’（配列番号６）
なお、上記プライマーの塩基配列において大文字はTDH1遺伝子との相同領域を示す。このプライマーでpST106 vectorからScURA3を合成し、RAK4736株へ形質転換した。その結果、RAK6152株(ura3- leu2- ku70Δ::ScLEU2 tdh1Δ::ScURA3)を作製した。
【００３９】
また、本実施例では、上記手順によりRAK6153株(ura3- leu2- ku70Δ::ScLEU2 tdh1Δ::ScURA3)も作製した。
【００４０】
TDH2破壊株の作製
K. marxianus DMKU3-1042株のTDH2の推定open reading frameはGenetyx ver.10 (株式会社 ゼネティクス)で予測した。DMKU3-1042株のTDH2遺伝子は329アミノ酸からなるタンパク質をコードしていた。この塩基配列情報を利用して以下の一対のプライマーを設計した。
KmTDH2-60-ASC：5’-CACGAATTTAATTGCGTACGTTCTCCCCCACACACAACTCAACTCAGATAATTTTAAAAGggcgcgcccggg -3’（配列番号７）
KmTDH2+1002c-TDHu：5’-TCAGGAAATAACCTAAGCAACGTGTTCGACCAAGTCGACGACTCTGGTGGAGTAACCGTAtggcagtattgataatgag-3’ （配列番号８）
なお、上記プライマーの塩基配列において大文字はTDH2遺伝子との相同領域を示す。このプライマーでpST106 vectorからScURA3を合成し、RAK4736株へ形質転換した。その結果、RAK6154株(ura3- leu2- ku70Δ::ScLEU2 tdh2Δ::ScURA3)を作製した。
【００４１】
また、本実施例では、上記手順によりRAK6155株(ura3- leu2- ku70Δ::ScLEU2 tdh2Δ::ScURA3)も作製した。
【００４２】
＜エタノール発酵試験＞
以上のように作製されたTDH1破壊株（RAK6152株及びRAK6153株）及びTDH2破壊株（RAK6154株及びRAK6155株）についてグルコースを利用したエタノール発酵試験、及びキシロースを利用したエタノール発酵試験を行った。なお、比較のため野生株（DMKU3-1042株）についても同様に発酵試験を行った。
【００４３】
前培養
YPX（キシロース20g/L）培地20mlを加えた50mlアシストチューブに上記破壊株を一白金耳植菌し、30℃、140rpmで6〜8時間振とう培養した。次に、その菌液2.5%を、YPX培地（キシロース:20g/L）200mlが入った500ml三角フラスコで、30℃、140rpm、一晩振とう培養した。培養後の酵母を遠心回収、滅菌水で3回洗浄し、OD600=30の酵母懸濁液を調製した。
【００４４】
本培養
表１に示す条件で培養し、培地中に産生するエタノール濃度を測定した。なお、本培養では、YPXを使用した場合、糖成分としてキシロースに代えてグルコースを含むYPDを使用した場合の２通りを行った。初発の糖濃度は、グルコース培養（YPD）は50g/L、キシロース培養（YPX）は20g/Lとした。
【００４５】
【表１】
【００４６】
また、培地中のエタノール濃度は島津製作所社製のHPLC（検出器:RI）を用いて測定した。
【００４７】
＜結果＞
糖成分としてキシロースを含有する培地にて上記破壊株及び野生株を培養した際の「培地中のエタノール濃度変化」を図１に示す。図１に示すように、TDH1破壊株及びTDH2破壊株は、野生株と比較してキシロースからのエタノール収率が大幅に向上していた。
【００４８】
また、YPD培地を使用したときのエタノール収率及びYPX培地を使用したときのエタノール収率を、上記破壊株及び野生株について下記表にまとめた。
【００４９】
【表２】
【００５０】
上記表２から判るように、TDH1破壊株及びTDH2破壊株は、野生株と比較してグルコースからのエタノール収率が同程度であった。すなわち、TDH1遺伝子やTDH2遺伝子を減弱化しても、グルコースからのエタノール合成には何ら影響がないことが明らかとなった。これに対して、TDH1破壊株及びTDH2破壊株は、野生株と比較してキシロースからのエタノール収率が大幅に向上していた。すなわち、TDH1遺伝子やTDH2遺伝子を減弱化した場合、キシロースからのエタノール合成を特異的に改善することが明らかとなった。
【００５１】
TDHの活性、すなわちグリセルアルデヒド-3-リン酸を1,3-ビスホスホグリセリン酸へと変換する活性からすると、当該活性が低下することでグルコースやキシロースからのエタノール収率が低下することが予測される。しかしながら、この予測に反して、TDH遺伝子を減弱化した変異Kluyveromyces 属酵母では、キシロースからのエタノール合成が特異的に向上するといった効果を確認できた。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Kluyveromyces属酵母を利用した変異体酵母及びこれを用いたエタノールの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リグノセルロースを含むバイオマスは、エタノール等の有用なアルコールや有機酸の原料として有効に利用されている。リグノセルロースを含むバイオマスには、木質系バイオマス及び草本系バイオマスが含まれる。木質系バイオマスなどのリグノセルロースを含むバイオマスは、主としてセルロース、ヘミセルロース及びリグニンから構成されている。リグノセルロースを含むバイオマスからエタノール等液体燃料を製造するためには、セルロースやヘミセルロースを構成単糖にまで加水分解（糖化）し、発酵によって単糖をエタノールに変換する。セルロースはグルコースから構成され、ヘミセルロースは主としてアラビノースとキシロースから構成されている。したがって、リグノセルロースを含むバイオマスを利用してエタノールを製造する際には、グルコースのみではなくキシロースも発酵の基質として有効に利用されることが望ましい。
【０００３】
また、リグノセルロースを含むバイオマスからエタノールを製造する場合、上述した糖化反応と発酵反応とを同時に（各反応工程を区別することなく）行うことができれば製造コストの低減に繋がる。これを同時糖化発酵方法と称する。同時糖化発酵には、糖化酵素の反応温度領域（約40℃以上）で発酵が可能な耐熱性を有し、基質としてグルコースのみでなく５単糖のキシロースを利用できる微生物が必要となる。
【０００４】
耐熱性を有する酵母としては、Kluyveromyces marxianus等のKluyveromyces属酵母が知られている。このKluyveromyces属酵母は、キシロースを利用してエタノール発酵を行うことができるが、その収率は不十分であった。
【０００５】
特許文献１には、外因性のキシロースイソメラーゼ遺伝子を有する遺伝子組換え酵母が開示されており、キシロースを資化できる遺伝子組換え酵母が開示されている。特許文献１には、宿主酵母の一例としてKluyveromyces、Candida、Pichia、Hansenula、Trichosporon、Brettanomyces、Pachysolen及びYamadazyma属の酵母が開示されている。また、Kluyveromyces属酵母としては、K. marxianus、K. lactis及びK. thermotoleransが開示されている。
【０００６】
さらに、特許文献２には、F177S、Y195HおよびK218Rといった変異が導入されたTATA結合タンパク質（変異SPT15）をコードする遺伝子を導入した遺伝子組換え酵母が開示されており、グルコースからのエタノール収率を向上させる技術が開示されている。特許文献２には、キシロースを資化できる酵母の一例としてK. marxianus、K. lactis及びK. thermotolerans等のKluyveromyces属酵母が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表2006-525029号公報
【特許文献２】特表2010-512147号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述したように、Kluyveromyces属酵母は、キシロース資化性を有し、且つ耐熱性を有するため、上述した同時糖化発酵法等に有用な微生物として大きく期待されている。しかしながら、Kluyveromyces属酵母についてはキシロースからのエタノール収率が非常に悪く、またこれを改善する手段も知られていない。そこで、本発明は、このような実情に鑑み、キシロースからのエタノール収率を向上するように改変されたKluyveromyces属に属する変異体酵母、及び当該変異体酵母を用いたエタノールの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上述した目的を達成するため、本発明者らが鋭意検討した結果、Kluyveromyces属酵母におけるトリオースホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子（別称：グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、略称：TDH遺伝子又はGAPDH遺伝子）を減弱化することで当該酵母におけるキシロースからのエタノール収率が大幅に向上することを見いだし、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下を包含する。
【００１０】
（１）Kluyveromyces属に属する酵母における、少なくとも１以上のトリオースホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子を減弱化した変異体酵母。
（２）上記Kluyveromyces属に属する酵母は、Kluyveromyces marxianusであることを特徴とする（１）記載の変異体酵母。
（３）上記トリオースホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子は、TDH1遺伝子及びTDH2遺伝子であることを特徴とする（１）記載の変異体酵母。
（４）上記TDH1遺伝子は、以下(a)〜(c)いずれかのタンパク質をコードすることを特徴とする（３）記載の変異体酵母。
(a) 配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号２のアミノ酸配列に対して90％以上の配列類似性を有するアミノ酸配列を含み、グリセルアルデヒド-3-リン酸を1,3-ビスホスホグリセリン酸へと変換する活性を有するタンパク質
(c) 配列番号２のアミノ酸配列に対して１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入したアミノ酸配列を含み、グリセルアルデヒド-3-リン酸を1,3-ビスホスホグリセリン酸へと変換する活性を有するタンパク質
（５）上記TDH2遺伝子は、以下(a)〜(c)いずれかのタンパク質をコードすることを特徴とする（３）記載の変異体酵母。
(a) 配列番号４のアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号４のアミノ酸配列に対して90％以上の配列類似性を有するアミノ酸配列を含み、グリセルアルデヒド-3-リン酸を1,3-ビスホスホグリセリン酸へと変換する活性を有するタンパク質
(c) 配列番号４のアミノ酸配列に対して１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入したアミノ酸配列を含み、グリセルアルデヒド-3-リン酸を1,3-ビスホスホグリセリン酸へと変換する活性を有するタンパク質
（６）（１）乃至（５）いずれか記載の変異体酵母をキシロース含有培地にて培養する工程と、その後、培地よりエタノールを回収する工程とを含む、エタノールの製造方法。
（７）上記培養する工程は、上記変異体酵母とリグノセルロースを含むバイオマスと糖化酵素とを含む反応系で実施されることを特徴とする（６）記載のエタノールの製造方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明に係る変異体酵母は、グルコースからのエタノール収率は殆ど変わらず、キシロースからのエタノール収率が大幅に向上している。したがって、本発明に係る変異体酵母は、例えば、木質系バイオマス等のリグノセルロースを含むバイオマスに由来するキシロースを含む培地において、高収率にエタノールを製造することができる。
【００１２】
本発明に係るエタノールの製造方法は、キシロースからのエタノール収率が大幅に向上した変異体酵母を利用することで、エタノール製造効率を大幅に向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】糖成分としてキシロースを含有する培地にてTDH1破壊株、TDH2破壊株及び野生株を培養したときのエタノール濃度を測定した結果を示す特性図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明に係る変異体酵母は、Kluyveromyces属酵母における特定のトリオースホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子を減弱化したものであり、キシロースからのエタノール収率が向上した特徴を有している。
【００１５】
ここで、Kluyveromyces属酵母とは、K. aestuarii、K. africanus、K. bacillisporus、K. blattae、K. dobzhanskii、K. hubeiensis、K. lactis、K. lodderae、K. marxianus、K. nonfermentans、K. piceae、K. sinensis、K. thermotolerans、K. waltii、K. wickerhamii及びK. yarrowii等の酵母を含む意味である。すなわち、本発明に係る変異体酵母は、これらの具体的なKluyveromyces属酵母及びその変異体に対して、特定のトリオースホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子を減弱化することで作製することができる。Kluyveromyces属酵母としては、特に、耐熱性酵母として知られているKluyveromyces marxianusを使用することが好ましい。Kluyveromyces marxianusとしては、特に限定されず、寄託機関に分譲可能に保存された公知の株を使用することができるし、また公知の株から派生した変異株を使用することもできる。Kluyveromyces marxianusの公知株としては、Kluyveromyces marxianus DMKU3-1042株を挙げることができる。公知の株から派生した変異株とは、例えば、Kluyveromyces marxianus DMKU3-1042株に対して栄養要求性を付与するためにura3遺伝子やleu2遺伝子を破壊した株を例示することができる。
【００１６】
本発明に係る変異体酵母は、特定のトリオースホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子を減弱化したものである。ここで「遺伝子の減弱化」とは、当該遺伝子の発現量を低減すること、当該遺伝子がコードする酵素の活性を低減することの両者を含む意味である。例えば、特定のトリオースホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子を破壊又は欠失させる方法、当該遺伝子の発現制御領域（プロモーター等）を破壊又は欠失させる方法、当該遺伝子に対するアンチセンスRNAを発現する方法等により、当該遺伝子の発現量を低減することができる。また、所謂、トランスポゾン法、トランスジーン法、転写後遺伝子サイレンシング法、RNAi法、ナンセンス仲介減衰（Nonsense mediated decay, NMD）法、リボザイム法、アンチセンス法、miRNA（micro-RNA）法、siRNA（small interfering RNA）法等を適用し、当該遺伝子の発現量を低減することができる。さらに、トリオースホスフェートデヒドロゲナーゼの阻害剤を作用させる手法等により、当該遺伝子がコードする酵素の活性を低減することができる。なお、これらの方法を組み合わせて、特定のトリオースホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子を減弱化しても良い。
【００１７】
また、本発明に係る変異体酵母は、キシロースからのエタノール収率が向上した特徴を有している。言い換えると、本発明に係る変異体酵母は、キシロース代謝能が向上した特徴を有している。ここで、キシロース代謝能とは、培地に含まれるキシロースを代謝してアルコールとする発酵反応における効率を意味する。したがって、キシロース代謝能の向上とは、当該発酵反応における反応効率を向上させることと同義となる。酵母におけるキシロース代謝能は、キシロース含有培地にて培養し、産生されたアルコールを定量することによって評価できる。また、酵母におけるキシロース代謝能は、例えば、培地に含まれるキシロースの取り込み速度（消費速度）を指標にして評価することもできる。キシロースの取り込み速度は、培養開始時における既知濃度のキシロースの減少量を経時的に測定することで算出することができる。
【００１８】
ここで、トリオースホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子とは、グリセルアルデヒド-3-リン酸を1,3-ビスホスホグリセリン酸へと変換する活性を有する酵素をコードする遺伝子を意味する。トリオースホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子は、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子とも称され、TDH遺伝子又はGAPDH遺伝子として略記される。以下の説明においてトリオースホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子を、TDH遺伝子と略称する場合もある。
【００１９】
Kluyveromyces属酵母に内在するTDH遺伝子としては、当該酵母のゲノム配列が明らかとなっている場合には、公知のTDH遺伝子の塩基配列やTDH遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を元にした相同性検索により、TDH遺伝子を特定することができる。例えば、TDH遺伝子がコードするタンパク質の公知のアミノ酸配列に対して８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の配列類似性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子を、TDH遺伝子として特定することができる。ここで、配列類似性の値は、BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）プログラムを実装したコンピュータを用いてデフォルトの設定で求められる値を意味する。
【００２０】
また、Kluyveromyces属酵母に内在するTDH遺伝子としては、当該酵母のゲノム配列が明らかとなっていない場合には、公知の手法によりTDH遺伝子を特定することができる。例えば、公知のTDH遺伝子の塩基配列に基づいてプローブを設計し、当該プローブにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするゲノム領域を同定し、その後、核酸増幅法やシーケンス法を適用してTDH遺伝子を特定することができる。ここで、ストリンジェントな条件とは、９０％程度、好ましくは９５％、更に好ましくは９８％の同一性を有する一対のポリヌクレオチドが特異的なハイブリダイズを形成する条件（温度条件、塩濃度条件）を意味する。
【００２１】
特に、Kluyveromyces属酵母に内在するTDH遺伝子のうち、特定のTDH遺伝子を減弱化することが好ましい。具体的に、TDH遺伝子は、Kluyveromyces marxianusにおいて３種類（KmTDH1〜KmTDH3）が知られている。Kluyveromyces marxianusにおいて減弱化するTDH遺伝子は、これらのうちKmTDH1遺伝子及び/又はKmTDH2遺伝子とすることが好ましい。KmTDH1遺伝子及びKmTDH2遺伝子のうちいずれか一方のTDH遺伝子を減弱化してもよいが、両方のTDH遺伝子を減弱化してもよい。
【００２２】
一方、Kluyveromyces marxianus以外のKluyveromyces属酵母において減弱化するTDH遺伝子としては、KmTDH1遺伝子に機能的に等価なTDH遺伝子及び/又はKmTDH2遺伝子に機能的に等価なTDH遺伝子とすることが好ましい。Kluyveromyces marxianus以外のKluyveromyces属酵母において、KmTDH1遺伝子に機能的に等価なTDH遺伝子及びKmTDH2遺伝子に機能的に等価なTDH遺伝子は、従来公知の方法により同定することができる。例えば、先ず、Kluyveromyces marxianus以外のKluyveromyces属酵母において複数のTDH遺伝子を特定する。そして、これら遺伝子がコードするトリオースホスフェートデヒドロゲナーゼのなかから、KmTDH1遺伝子がコードするトリオースホスフェートデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列に対して最も配列類似性が高いアミノ酸配列を有するものを特定する。このように特定したトリオースホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子は、Kluyveromyces marxianusにおけるKmTDH1遺伝子と機能的に等価な遺伝子であると特定できる。なお、KmTDH2遺伝子と機能的に等価な遺伝子を特定する場合も同様である。ここで、配列類似性の値は、BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）プログラムを実装したコンピュータを用いてデフォルトの設定で求められる値を意味する。
【００２３】
ここで、KmTDH1遺伝子のコーディング領域の塩基配列及びKmTDH1遺伝子がコードするトリオースホスフェートデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１及び２に示す。また、KmTDH2遺伝子のコーディング領域の塩基配列及びKmTDH2遺伝子がコードするトリオースホスフェートデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号３及び４に示す。
【００２４】
なお、Kluyveromyces marxianusに存在する、これらKmTDH1遺伝子及びKmTDH2遺伝子は、以上の具体的な塩基配列及びアミノ酸配列に限定されるものではない。すなわち、KmTDH1遺伝子及びKmTDH2遺伝子は、トリオースホスフェートデヒドロゲナーゼ活性（すなわち、グリセルアルデヒド-3-リン酸を1,3-ビスホスホグリセリン酸へと変換する活性）を有するタンパク質をコードする限り、それぞれ配列番号２及び４に示すアミノ酸配列に対して８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の配列類似性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするものも含まれる。ここで、配列類似性の値は、BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）プログラムを実装したコンピュータを用いてデフォルトの設定で求められる値を意味する。
【００２５】
また、KmTDH1遺伝子及びKmTDH2遺伝子は、トリオースホスフェートデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする限り、それぞれ配列番号２及び４に示すアミノ酸配列に対して１又は複数個（例えば２〜３５個、好ましくは２〜３０個、より好ましくは２〜２０個、更に好ましくは２〜１０個）のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするものも含まれる。
【００２６】
さらに、KmTDH1遺伝子及びKmTDH2遺伝子は、トリオースホスフェートデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする限り、それぞれ配列番号１及び３に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドの一部又は全部に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドも含まれる。ここで、ストリンジェントな条件とは、９０％程度、好ましくは９５％、更に好ましくは９８％の同一性を有する一対のポリヌクレオチドが特異的なハイブリダイズを形成する条件（温度条件、塩濃度条件）を意味する。
【００２７】
＜エタノール製造＞
以上で説明した変異体酵母を利用することで、キシロース等の糖を基質としたエタノール発酵を行うことができる。特に、上述した本発明に係る変異体酵母は、優れたキシロース代謝能、すなわちキシロースからのエタノール収率が優れているため、キシロース含有培地を利用したエタノール発酵に好適である。キシロース含有培地とは、Kluyveromyces属酵母が生育しうる培地であってエタノール合成の基質となる糖成分として少なくともキシロースを含有する培地を意味する。なお、キシロース含有培地は、キシロース以外の糖成分、例えばグルコースを含有していても良い。
【００２８】
キシロース含有培地は、特に限定されないが、SD培地、YPD培地、YPAD培地、YM培地及びYeast Nitrogen Baseを含む各種合成培地にキシロースを添加するか、これら公知の培地に含まれる糖成分をキシロースに代替することで調整することができる。
【００２９】
また、木質系バイオマスや草本系バイオマスといったリグノセルロースを含むバイオマスからキシロース含有培地を調整しても良い。すなわち、リグノセルロースを含むバイオマスに含まれるセルロースやヘミセルロースを糖化処理し、得られた処理物をキシロース含有培地として使用することもできる。糖化処理としては、特に限定されず従来公知の手法をなんら限定されることなく利用することができる。糖化方法としては、例えば、希硫酸又は濃硫酸を利用する硫酸法、セルラーゼやヘミセルラーゼを利用する酵素法等を挙げることができる。また、糖化処理に先立って、木質系バイオマスや草本系バイオマスに対して従来公知の前処理を施しても良い。前処理としては、特に限定されないが、例えば、リグニンを微生物によって分解する処理や、木質系バイオマスや草本系バイオマスの粉砕処理、イオン液体やアルカリ溶液に浸漬して構造を緩和する処理、高温の水で蒸煮する水熱処理、アンモニアによる処理等を挙げることができる。
【００３０】
特に、Kluyveromyces marxianusから作製した変異体酵母では、特に耐熱性に優れるため、例えば40℃以上、好ましくは35〜48℃、より好ましくは40〜42℃といった比較的に高温度でエタノール発酵を行うことができる。このような温度領域は、セルラーゼやヘミセルラーゼといった糖化酵素も活性を示す温度領域である。したがって、当該変異体酵母は、糖化酵素を利用した所謂、同時糖化発酵に好適である。ここで同時糖化発酵とは、糖化酵素による木質系バイオマスの糖化処理と、キシロースからのエタノール発酵処理とを同一反応系で実施する処理を意味する。より具体的には、木質系バイオマスと糖化酵素と変異体酵母とを含む溶液を例えば40℃といった温度条件にてインキュベートする。これにより、木質系バイオマスの糖化と、糖化によって得られたキシロースやグルコースからのエタノール発酵が進行し、エタノールを製造することができる。また、このとき溶液を攪拌しても良いし、振とうしてもよい。
【００３１】
また、培地に含まれるキシロース等の炭素源から発酵生産されたエタノールを回収する際には、特に限定されず、従来公知のいかなる方法も適用することができる。例えば、上述したエタノール発酵が終了した後、固液分離操作によってエタノールを含む液層と、変異体酵母や固形成分を含有する固層とを分離する。その後、液層に含まれるエタノールを蒸留法によって分離・精製することで、純度の高いエタノールを回収することができる。なお、エタノールの精製度は、エタノールの使用目的にあわせて適宜調整することができる。
【実施例】
【００３２】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３３】
〔実施例１〕
本実施例では、Kluyveromyces属酵母としてKluyveromyces marxianusを使用し、トリオースホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子の破壊株を作製し、キシロースからのエタノール収率を比較検討した。
【００３４】
＜株の作製＞
接合、胞子形成によるura3- leu2-変異株の作製
Kluyveromyces marxianus DMKU3-1042株のura3-株であるRAK3605株(Nonklang, S. et al., Appl. Environ. Microbiol. 74, p. 7514-7521 (2008))を基準株として使用した。K. marxianus DMKU3-1042株由来の栄養要求性変異株は、低頻度で２倍体になることを明らかにしている。紫外線変異により、多重栄養要求性変異株を取得することは可能であるが、その結果、染色体ＤＮＡに変異が入る確率が上昇する。より安定な株を作製するために、接合と胞子形成により、２倍体から簡単に多重栄養要求性株を作製するために以下の株を作製した。
【００３５】
先ず、RAK3605株に紫外線照射し、lys-株(RAK3896株:ura3- lys2-)、ade-株(RAK3919株:ura3- ade2-)及びleu-株(RAK3966株:ura3- leu2-)を取得した。これらの株にSaccharomyces cerevisiaeのURA3をランダムに染色体へ形質転換した株、RAK4153株(ura3- lys2- ScURA3)、RAK4152株(ura3- ade2- ScURA3)及びRAK4088株（ura3- leu2- ScURA3）をそれぞれ作製した。RAK4152とRAK4153株をYPD培地(1% w/v Yeast extract, 2% w/v peptone, 2% glucose, 2% w/v agar)上で混ざるようにストリークし、MM培地（0.17% w/v yeast nitrogen base w/o amino acids and ammonium sulfate, 0.5% w/v ammonium sulfate, 2% w/v glucose, 2% w/v agar）へレプリカした。MM培地で生えた株、RAK4154株(ura3-/ura3- ade2-/ADE2, lys2-/LYS2 ScURA3/ScURA3)をS. cerevisiaeで使用されるSPO培地(1% w/v potassium acetate, 0.1% w/v yeast extract, 0.05% w/v glucose)に植菌し、胞子形成させた。
【００３６】
作製した胞子を分離し、ura- lys- ade-の3重栄養要求性株を取得するために、-A培地(MM+uracil, tryptophan, histidine HCl, methionine, leucine, lysine HCl), -K培地(MM+ uracil, tryptophan, histidine HCl, methionine, leucine, adenine hemisulfate), -U培地(MM+ tryptophan, histidine HCl, methionine, leucine, lysine HCl, adenine hemisulfate)へレプリカし、3つの培地で増殖できない株をRAK4154株の胞子から3株取得することに成功した。その株をRAK4155株(ura3- lys2- ade2-)と命名した。同様の方法でRAK4088株とRAK4155株を接合させ、RAK4156株(ura3-/ura3- lys2-/LYS2 ade2-/ADE2 leu2-/LEU2 ScURA3/ScURA3)を作製した。この株を胞子形成させ、RAK4174株(leu2- ura3-)株を作製した。
【００３７】
Ku70破壊株の作製
K. marxianusは非相同末端結合修復が高頻度で起こることから、S. cerevisiaeのように相同組換え修復を利用して遺伝子破壊を容易に行うことができない(Nonklang, S. et al., Appl. Environ. Microbiol. 74, p. 7514-7521 (2008))。そこで、非相同末端結合修復に必須のKU70遺伝子を破壊することで相同組換えを高頻度に起こさせる株の作製を行った。RAK4174株からKU70を破壊したRAK4736株(leu2- ura3- Kmku70Δ::ScLEU2)を作製した(Abdel-Banat, B.M. et al., Yeast 27, 29-39(2010))。
【００３８】
TDH1破壊株の作製
K. marxianus DMKU3-1042株のTDH1遺伝子における推定open reading frameはGenetyx ver.10 (株式会社ゼネティクス)で予測した。DMKU3-1042株のTDH1遺伝子は、331アミノ酸からなるタンパク質をコードしていた。この塩基配列情報を利用して以下の一対のプライマーを設計した。
KmTDH1-60-ASC：5’-CCCTCCCAAACCAAGTCTTTTAGATTTAACAACAGTACACACACACTTTTACACATCACAggcgcgcccggg-3’（配列番号５）
KmTDH1+1056c-TDHu：5’-ACATAGGAATGGATAATAAGTACCTCCAGCCCCAAAGCAAACTAACTTAACTAACTACATtggcagtattgataatgag-3’（配列番号６）
なお、上記プライマーの塩基配列において大文字はTDH1遺伝子との相同領域を示す。このプライマーでpST106 vectorからScURA3を合成し、RAK4736株へ形質転換した。その結果、RAK6152株(ura3- leu2- ku70Δ::ScLEU2 tdh1Δ::ScURA3)を作製した。
【００３９】
また、本実施例では、上記手順によりRAK6153株(ura3- leu2- ku70Δ::ScLEU2 tdh1Δ::ScURA3)も作製した。
【００４０】
TDH2破壊株の作製
K. marxianus DMKU3-1042株のTDH2の推定open reading frameはGenetyx ver.10 (株式会社 ゼネティクス)で予測した。DMKU3-1042株のTDH2遺伝子は329アミノ酸からなるタンパク質をコードしていた。この塩基配列情報を利用して以下の一対のプライマーを設計した。
KmTDH2-60-ASC：5’-CACGAATTTAATTGCGTACGTTCTCCCCCACACACAACTCAACTCAGATAATTTTAAAAGggcgcgcccggg -3’（配列番号７）
KmTDH2+1002c-TDHu：5’-TCAGGAAATAACCTAAGCAACGTGTTCGACCAAGTCGACGACTCTGGTGGAGTAACCGTAtggcagtattgataatgag-3’ （配列番号８）
なお、上記プライマーの塩基配列において大文字はTDH2遺伝子との相同領域を示す。このプライマーでpST106 vectorからScURA3を合成し、RAK4736株へ形質転換した。その結果、RAK6154株(ura3- leu2- ku70Δ::ScLEU2 tdh2Δ::ScURA3)を作製した。
【００４１】
また、本実施例では、上記手順によりRAK6155株(ura3- leu2- ku70Δ::ScLEU2 tdh2Δ::ScURA3)も作製した。
【００４２】
＜エタノール発酵試験＞
以上のように作製されたTDH1破壊株（RAK6152株及びRAK6153株）及びTDH2破壊株（RAK6154株及びRAK6155株）についてグルコースを利用したエタノール発酵試験、及びキシロースを利用したエタノール発酵試験を行った。なお、比較のため野生株（DMKU3-1042株）についても同様に発酵試験を行った。
【００４３】
前培養
YPX（キシロース20g/L）培地20mlを加えた50mlアシストチューブに上記破壊株を一白金耳植菌し、30℃、140rpmで6〜8時間振とう培養した。次に、その菌液2.5%を、YPX培地（キシロース:20g/L）200mlが入った500ml三角フラスコで、30℃、140rpm、一晩振とう培養した。培養後の酵母を遠心回収、滅菌水で3回洗浄し、OD600=30の酵母懸濁液を調製した。
【００４４】
本培養
表１に示す条件で培養し、培地中に産生するエタノール濃度を測定した。なお、本培養では、YPXを使用した場合、糖成分としてキシロースに代えてグルコースを含むYPDを使用した場合の２通りを行った。初発の糖濃度は、グルコース培養（YPD）は50g/L、キシロース培養（YPX）は20g/Lとした。
【００４５】
【表１】
【００４６】
また、培地中のエタノール濃度は島津製作所社製のHPLC（検出器:RI）を用いて測定した。
【００４７】
＜結果＞
糖成分としてキシロースを含有する培地にて上記破壊株及び野生株を培養した際の「培地中のエタノール濃度変化」を図１に示す。図１に示すように、TDH1破壊株及びTDH2破壊株は、野生株と比較してキシロースからのエタノール収率が大幅に向上していた。
【００４８】
また、YPD培地を使用したときのエタノール収率及びYPX培地を使用したときのエタノール収率を、上記破壊株及び野生株について下記表にまとめた。
【００４９】
【表２】
【００５０】
上記表２から判るように、TDH1破壊株及びTDH2破壊株は、野生株と比較してグルコースからのエタノール収率が同程度であった。すなわち、TDH1遺伝子やTDH2遺伝子を減弱化しても、グルコースからのエタノール合成には何ら影響がないことが明らかとなった。これに対して、TDH1破壊株及びTDH2破壊株は、野生株と比較してキシロースからのエタノール収率が大幅に向上していた。すなわち、TDH1遺伝子やTDH2遺伝子を減弱化した場合、キシロースからのエタノール合成を特異的に改善することが明らかとなった。
【００５１】
TDHの活性、すなわちグリセルアルデヒド-3-リン酸を1,3-ビスホスホグリセリン酸へと変換する活性からすると、当該活性が低下することでグルコースやキシロースからのエタノール収率が低下することが予測される。しかしながら、この予測に反して、TDH遺伝子を減弱化した変異Kluyveromyces 属酵母では、キシロースからのエタノール合成が特異的に向上するといった効果を確認できた。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Kluyveromyces属に属する酵母における、少なくとも１以上のトリオースホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子を減弱化した変異体酵母。
【請求項２】
上記Kluyveromyces属に属する酵母は、Kluyveromyces marxianusであることを特徴とする請求項１記載の変異体酵母。
【請求項３】
上記トリオースホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子は、TDH1遺伝子又はTDH2遺伝子であることを特徴とする請求項１記載の変異体酵母。
【請求項４】
上記TDH1遺伝子は、以下(a)〜(c)いずれかのタンパク質をコードすることを特徴とする請求項３記載の変異体酵母。
(a) 配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号２のアミノ酸配列に対して90％以上の配列類似性を有するアミノ酸配列を含み、グリセルアルデヒド-3-リン酸を1,3-ビスホスホグリセリン酸へと変換する活性を有するタンパク質
(c) 配列番号２のアミノ酸配列に対して１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入したアミノ酸配列を含み、グリセルアルデヒド-3-リン酸を1,3-ビスホスホグリセリン酸へと変換する活性を有するタンパク質
【請求項５】
上記TDH2遺伝子は、以下(a)〜(c)いずれかのタンパク質をコードすることを特徴とする請求項３記載の変異体酵母。
(a) 配列番号４のアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号４のアミノ酸配列に対して90％以上の配列類似性を有するアミノ酸配列を含み、グリセルアルデヒド-3-リン酸を1,3-ビスホスホグリセリン酸へと変換する活性を有するタンパク質
(c) 配列番号４のアミノ酸配列に対して１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入したアミノ酸配列を含み、グリセルアルデヒド-3-リン酸を1,3-ビスホスホグリセリン酸へと変換する活性を有するタンパク質
【請求項６】
請求項１乃至５いずれか一項記載の変異体酵母をキシロース含有培地にて培養する工程と、その後、培地よりエタノールを回収する工程とを含む、エタノールの製造方法。
【請求項７】
上記培養する工程は、上記変異体酵母とリグノセルロースを含むバイオマスと糖化酵素とを含む反応系で実施されることを特徴とする請求項６記載のエタノールの製造方法。
【請求項１】
Kluyveromyces属に属する酵母における、少なくとも１以上のトリオースホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子を減弱化した変異体酵母。
【請求項２】
上記Kluyveromyces属に属する酵母は、Kluyveromyces marxianusであることを特徴とする請求項１記載の変異体酵母。
【請求項３】
上記トリオースホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子は、TDH1遺伝子又はTDH2遺伝子であることを特徴とする請求項１記載の変異体酵母。
【請求項４】
上記TDH1遺伝子は、以下(a)〜(c)いずれかのタンパク質をコードすることを特徴とする請求項３記載の変異体酵母。
(a) 配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号２のアミノ酸配列に対して90％以上の配列類似性を有するアミノ酸配列を含み、グリセルアルデヒド-3-リン酸を1,3-ビスホスホグリセリン酸へと変換する活性を有するタンパク質
(c) 配列番号２のアミノ酸配列に対して１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入したアミノ酸配列を含み、グリセルアルデヒド-3-リン酸を1,3-ビスホスホグリセリン酸へと変換する活性を有するタンパク質
【請求項５】
上記TDH2遺伝子は、以下(a)〜(c)いずれかのタンパク質をコードすることを特徴とする請求項３記載の変異体酵母。
(a) 配列番号４のアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号４のアミノ酸配列に対して90％以上の配列類似性を有するアミノ酸配列を含み、グリセルアルデヒド-3-リン酸を1,3-ビスホスホグリセリン酸へと変換する活性を有するタンパク質
(c) 配列番号４のアミノ酸配列に対して１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入したアミノ酸配列を含み、グリセルアルデヒド-3-リン酸を1,3-ビスホスホグリセリン酸へと変換する活性を有するタンパク質
【請求項６】
請求項１乃至５いずれか一項記載の変異体酵母をキシロース含有培地にて培養する工程と、その後、培地よりエタノールを回収する工程とを含む、エタノールの製造方法。
【請求項７】
上記培養する工程は、上記変異体酵母とリグノセルロースを含むバイオマスと糖化酵素とを含む反応系で実施されることを特徴とする請求項６記載のエタノールの製造方法。
【図１】
【公開番号】特開２０１３−２１９４７（Ｐ２０１３−２１９４７Ａ）
【公開日】平成２５年２月４日（２０１３．２．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１５８１８６（Ｐ２０１１−１５８１８６）
【出願日】平成２３年７月１９日（２０１１．７．１９）
【出願人】（０００００３２０７）トヨタ自動車株式会社 (59,920)
【出願人】（０００００３６０９）株式会社豊田中央研究所 (4,200)
【出願人】（３０４０２０１７７）国立大学法人山口大学 (579)
【出願人】（０００００４４４４）ＪＸ日鉱日石エネルギー株式会社 (1,898)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年２月４日（２０１３．２．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年７月１９日（２０１１．７．１９）
【出願人】（０００００３２０７）トヨタ自動車株式会社 (59,920)
【出願人】（０００００３６０９）株式会社豊田中央研究所 (4,200)
【出願人】（３０４０２０１７７）国立大学法人山口大学 (579)
【出願人】（０００００４４４４）ＪＸ日鉱日石エネルギー株式会社 (1,898)
【Ｆターム（参考）】
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