Ｌ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン酸の製造方法及び触媒組成物の組合せ
【課題】Ｌ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン酸を効率的に製造する方法を開発すること。
【解決手段】本発明は、（１）Ｌ−アスパラギンをＬ−アスパラギン水酸化酵素に接触させてＬ−ヒドロキシアスパラギンを生成するステップと、（２）前記Ｌ−ヒドロキシアスパラギンをＬ−アスパラギナーゼに接触させてＬ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン酸を生成するステップとを含む、Ｌ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン酸の製造方法を提供する。本発明は、Ｌ−アスパラギン水酸化酵素を含む第１の触媒組成物と、Ｌ−アスパラギナーゼを含む第２の触媒組成物とを含む触媒組成物の組合せであって、Ｌ−アスパラギンを第１の触媒組成物に接触させて生成されるＬ−ヒドロキシアスパラギンを、第２の触媒組成物に接触させてＬ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン酸を生成するための触媒組成物の組合せを提供する。
【解決手段】本発明は、（１）Ｌ−アスパラギンをＬ−アスパラギン水酸化酵素に接触させてＬ−ヒドロキシアスパラギンを生成するステップと、（２）前記Ｌ−ヒドロキシアスパラギンをＬ−アスパラギナーゼに接触させてＬ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン酸を生成するステップとを含む、Ｌ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン酸の製造方法を提供する。本発明は、Ｌ−アスパラギン水酸化酵素を含む第１の触媒組成物と、Ｌ−アスパラギナーゼを含む第２の触媒組成物とを含む触媒組成物の組合せであって、Ｌ−アスパラギンを第１の触媒組成物に接触させて生成されるＬ−ヒドロキシアスパラギンを、第２の触媒組成物に接触させてＬ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン酸を生成するための触媒組成物の組合せを提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｌ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン酸の製造方法と、触媒組成物の組合せとに関し、具体的には、Ｌ−アスパラギン水酸化酵素とＬ−アスパラギナーゼとの２段階反応を利用する、Ｌ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン酸の製造方法と、触媒組成物の組合せとに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒドロキシアスパラギン酸は、その立体異性体がシス体又はトランス体（幾何異性体）か、アスパラギン酸がＤ体又はＬ体（光学異性体）かによって４種類の立体異性体が存在する。ヒドロキシアスパラギン酸のうち、Ｌ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン酸（以下、「Ｌ−ＴＨＡ」という。）は、抗生物質、皮膚外用剤、グルタミン酸トランスポーターのブロッカー、機能性ゲル、樹脂などの原料として有用な物質である。
【０００３】
Ｌ−ＴＨＡの製造方法としては、マレイン酸又はフマル酸か、これらの塩かと、過酸化水素とをエポキシ化触媒の存在下で反応させてエポキシコハク酸を得るステップと、前記エポキシコハク酸にアンモニアを作用させることによりスレオ−３−ヒドロキシアスパラギン酸を得るステップとを含む方法が開示されている（特許文献１）。しかし、前記方法ではＬ−体及びＤ−体が等しく生成されるため、Ｌ−ＴＨＡを単離するために複雑な精製処理が必要となる。糸状菌によってＬ−ＴＨＡを発酵生産する方法も開示されているが、培養液から微量のＬ−ＴＨＡを精製するには多段階のカラムクロマトグラフィ処理が必要となる（特許文献２及び３）。
【０００４】
近年、アスパラギン水酸化酵素が遺伝子工学的に改変されて、アスパラギン酸水酸化活性が付与された改変酵素が報告された（特許文献４及び非特許文献１）。前記酵素を用いることによって、１段階反応でＬ−アスパラギン酸からＬ−ＴＨＡを位置及び立体選択的に合成可能である。しかし前記改変酵素は、安定性及び活性などに問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平１１−２２２４７１号公報
【特許文献２】特開平７−１７０９９２号公報
【特許文献３】特開平７−１０７９９０号公報
【特許文献４】国際公開第ＷＯ ２００８／１２５０８０号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｓｔｒｉｅｋｅｒ、Ｍ．ら、Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．、９：３７４−６（２００８）．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、産業上有用なＬ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン酸を効率的に製造する方法を開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明はＬ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン酸の製造方法を提供する。前記製造方法は、（１）Ｌ−アスパラギンをＬ−アスパラギン水酸化酵素に接触させてＬ−ヒドロキシアスパラギンを生成するステップと、（２）前記Ｌ−ヒドロキシアスパラギンをＬ−アスパラギナーゼに接触させてＬ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン酸を生成するステップとを含む。
【０００９】
本発明のＬ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン酸の製造方法において、前記Ｌ−アスパラギン水酸化酵素及びＬ−アスパラギナーゼは精製タンパク質の場合がある。
【００１０】
本発明のＬ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン酸の製造方法において、前記Ｌ−アスパラギン水酸化酵素及びＬ−アスパラギナーゼのうち、少なくともＬ−アスパラギン水酸化酵素は該酵素を発現する細胞の表面又は内部に存在する場合がある。
【００１１】
本発明のＬ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン酸の製造方法において、前記Ｌ−アスパラギン水酸化酵素及びＬ−アスパラギナーゼの両方が、該酵素を発現する細胞の表面又は内部に存在する場合がある。
【００１２】
本発明のＬ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン酸の製造方法において、前記Ｌ−アスパラギン水酸化酵素及びＬ−アスパラギナーゼの両方が、同一の細胞の表面又は内部に存在する場合がある。
【００１３】
本発明のＬ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン酸の製造方法において、前記Ｌ−アスパラギン水酸化酵素は、（ａ）配列番号１又は２のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにエンコードされるタンパク質と、（ｂ）配列番号１又は２のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドに１個若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換又は付加されたヌクレオチド配列にエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ−アスパラギン水酸化酵素活性を有するタンパク質と、（ｃ）配列番号１又は２のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上、８５％以上、９０％以上又は９５％以上の相同性を示すヌクレオチド配列にエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつＬ−アスパラギン水酸化酵素活性を有するタンパク質と、（ｄ）特異的結合タグペプチドが前記（ａ）ないし（ｃ）のいずれかのタンパク質に連結した融合タンパク質とからなるグループから選択される少なくとも１種類のタンパク質を含む場合がある。
【００１４】
本発明のＬ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン酸の製造方法において、前記Ｌ−アスパラギナーゼは、（ｅ）配列番号５のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにエンコードされるタンパク質と、（ｆ）配列番号５のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドに１個若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換又は付加されたヌクレオチド配列にエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ−アスパラギナーゼ活性を有するタンパク質と、（ｇ）配列番号５のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上、８５％以上、９０％以上又は９５％以上の相同性を示すヌクレオチド配列にエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ−アスパラギナーゼ活性を有するタンパク質と、（ｈ）特異的結合タグペプチドが前記（ｅ）ないし（ｇ）のいずれかのタンパク質に連結した融合タンパク質とからなるグループから選択される少なくとも１種類のタンパク質を含む場合がある。
【００１５】
本発明は、Ｌ−アスパラギン水酸化酵素を含む第１の触媒組成物と、Ｌ−アスパラギナーゼを含む第２の触媒組成物とを含む触媒組成物の組合せであって、Ｌ−アスパラギンを第１の触媒組成物に接触させて生成されるＬ−ヒドロキシアスパラギンを、第２の触媒組成物に接触させてＬ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン酸を生成するための触媒組成物の組合せを提供する。
【００１６】
本発明の触媒組成物の組合せにおいて、前記Ｌ−アスパラギン水酸化酵素及びＬ−アスパラギナーゼは精製タンパク質の場合がある。
【００１７】
本発明の触媒組成物の組合せにおいて、前記Ｌ−アスパラギン水酸化酵素及びＬ−アスパラギナーゼのうち、少なくともＬ−アスパラギン水酸化酵素は該酵素を発現する細胞の表面又は内部に存在する場合がある。
【００１８】
本発明の触媒組成物の組合せにおいて、前記Ｌ−アスパラギン水酸化酵素及びＬ−アスパラギナーゼの両方が、該酵素を発現する細胞の表面又は内部に存在する場合がある。
【００１９】
本発明の触媒組成物の組合せにおいて、前記Ｌ−アスパラギン水酸化酵素及びＬ−アスパラギナーゼの両方が同一の細胞の表面又は内部に存在する場合がある。
【００２０】
本発明の触媒組成物の組合せにおいて、前記Ｌ−アスパラギン水酸化酵素は、（ａ）配列番号１又は２のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにエンコードされるタンパク質と、（ｂ）配列番号１又は２のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドに１個若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換又は付加されたヌクレオチド配列にエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ−アスパラギン水酸化酵素活性を有するタンパク質と、（ｃ）配列番号１又は２のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上、８５％以上、９０％以上又は９５％以上の相同性を示すヌクレオチド配列にエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつＬ−アスパラギン水酸化酵素活性を有するタンパク質と、（ｄ）特異的結合タグペプチドが前記（ａ）ないし（ｃ）のいずれかのタンパク質に連結した融合タンパク質とからなるグループから選択される少なくとも１種類のタンパク質を含む場合がある。
【００２１】
本発明の触媒組成物の組合せにおいて、前記Ｌ−アスパラギナーゼは、（ｅ）配列番号５のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにエンコードされるタンパク質と、（ｆ）配列番号５のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドに１個若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換又は付加されたヌクレオチド配列にエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ−アスパラギナーゼ活性を有するタンパク質と、（ｇ）配列番号５のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上、８５％以上、９０％以上又は９５％以上の相同性を示すヌクレオチド配列にエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ−アスパラギナーゼ活性を有するタンパク質と、（ｈ）特異的結合タグペプチドが前記（ｅ）ないし（ｇ）のいずれかのタンパク質に連結した融合タンパク質とからなるグループから選択される少なくとも１種類のタンパク質を含む場合がある。
【００２２】
本明細書では、ヒドロキシアスパラギン（酸）の立体異性体は、Ｄ体又はＬ体（光学異性体）かで区別され、Ｌ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン（酸）、Ｄ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン（酸）、Ｌ−エリスロ−３−ヒドロキシアスパラギン（酸）及びＤ−エリスロ−３−ヒドロキシアスパラギン（酸）と表される。本発明の方法で製造されるＬ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン酸は、（２Ｓ，３Ｓ）−３−ヒドロキシアスパラギン酸とも表され、以下では「Ｌ−ＴＨＡ」という。本発明のヒドロキシアスパラギン（酸）の立体異性体は、以下の実施例２で説明されるＨＰＬＣ法の他、Ｘ線結晶構造解析を含むが、これに限定されない、当業者に知られたいずれかの方法によって分離分析が可能である。
【００２３】
本発明の製造方法と、触媒組成物の組合せとは、Ｌ−アスパラギンを反応基質としてＬ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギンを反応産物とする第１の化学反応と、Ｌ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギンを反応基質としてＬ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン酸（Ｌ−ＴＨＡ）を反応産物とする第２の化学反応とを共役させることを特徴とする。したがって、本発明のＬ−アスパラギン水酸化酵素及びＬ−アスパラギナーゼは、それぞれ、Ｌ−アスパラギン及びＬ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギンを反応基質とし、Ｌ−ＴＨＡを反応産物とする化学反応を触媒することを条件として、いかなる生物種に由来するものであっても、いかなるアミノ酸配列を有するものであってもかまわない。前記Ｌ−アスパラギン水酸化酵素は、（ａ）配列番号１又は２のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにエンコードされるタンパク質と、（ｂ）配列番号１又は２のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドに１個若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換又は付加されたヌクレオチド配列にエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ−アスパラギン水酸化酵素活性を有するタンパク質と、（ｃ）配列番号１又は２のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の相同性を示すヌクレオチド配列にエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつＬ−アスパラギン水酸化酵素活性を有するタンパク質と、（ｄ）特異的結合タグペプチドが前記（ａ）ないし（ｃ）のいずれかのタンパク質に連結した融合タンパク質とからなるグループから選択される少なくとも１種類のタンパク質を含む場合がある。前記Ｌ−アスパラギナーゼは、（ｅ）配列番号５のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにエンコードされるタンパク質と、（ｆ）配列番号５のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドに１個若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換又は付加されたヌクレオチド配列にエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ−アスパラギナーゼ活性を有するタンパク質と、（ｇ）配列番号５のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の相同性を示すヌクレオチド配列にエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ−アスパラギナーゼ活性を有するタンパク質と、（ｈ）特異的結合タグペプチドが前記（ｅ）ないし（ｇ）のいずれかのタンパク質に連結した融合タンパク質とからなるグループから選択される少なくとも１種類のタンパク質を含む場合がある。
【００２４】
本発明のＬ−アスパラギン水酸化酵素及びＬ−アスパラギナーゼは、そのアミノ酸配列をエンコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡを、無生物発現系か、宿主生物及び発現ベクターを使用する発現系かで発現させることにより産生される。前記宿主生物は、大腸菌、枯草菌等のような原核生物と、酵母、菌類、植物、動物等のような真核生物とを含む。本発明の宿主生物及び発現ベクターを使用する発現系は、細胞や組織のような生物の一部か、生物の個体全体かの場合がある。本発明のＬ−アスパラギン水酸化酵素又はＬ−アスパラギナーゼは、それぞれ、Ｌ−アスパラギン水酸化酵素又はＬ−アスパラギナーゼの活性を有することを条件として、無生物発現系又は宿主生物及び発現ベクターを使用する発現系の他の成分が混在する状態で本発明のＬ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン酸の製造方法に使用される場合がある。本発明のＬ−アスパラギン水酸化酵素及びＬ−アスパラギナーゼを前記宿主生物及び発現ベクターを使用する発現系で発現させる場合には、前記Ｌ−アスパラギン水酸化酵素及びＬ−アスパラギナーゼを発現する宿主生物、例えば本発明のＬ−アスパラギン水酸化酵素及びＬ−アスパラギナーゼの遺伝子を発現するベクターを含む形質転換体が生きた状態で本発明のＬ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン酸の製造に用いられる場合がある。このとき、本発明のＬ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン酸の製造は、菌体反応系や発酵法によって実行される場合がある。あるいは、前記酵素タンパク質は、精製された状態で本発明のＬ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン酸の製造方法に使用されてもよい。
【００２５】
本発明のＬ−アスパラギン水酸化酵素及びＬ−アスパラギナーゼは、形質転換体で産生された後、単離精製された状態で、本発明のＬ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン酸の製造方法に使用される場合がある。あるいは、本発明のＬ−アスパラギン水酸化酵素及びＬ−アスパラギナーゼは、該酵素を発現する細胞すなわち形質転換体の、表面又は内部に存在する場合がある。前記細胞の表面及び内部とは、細菌又は植物の細胞壁、細胞の外膜及び内膜、ペリプラズムと、細胞膜の内側とを含む。遠心分離、膜濾過その他の方法で物理的に細胞を分離するときに、イオン強度や界面活性剤の有無等の条件を適切に設定すると、ある酵素が細胞と挙動をともにすることができる場合に、該酵素は前記細胞の表面又は内部に存在するといえる。
【００２６】
本発明のＬ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン酸の製造方法と、触媒組成物の組合せとにおいては、Ｌ−アスパラギン水酸化酵素及びＬ−アスパラギナーゼのうち少なくともＬ−アスパラギン水酸化酵素が前記細胞の表面又は内部に存在することが好ましい。Ｌ−アスパラギン水酸化酵素及びＬ−アスパラギナーゼの両方が前記細胞の表面又は内部に存在する場合がある。この場合には、Ｌ−アスパラギン水酸化酵素及びＬ−アスパラギナーゼの両方が同一の細胞に共発現することがあり、あるいは、Ｌ−アスパラギン水酸化酵素とＬ−アスパラギナーゼとが別々の細胞で発現していることがある。Ｌ−アスパラギン水酸化酵素及びＬ−アスパラギナーゼの両方が同一の細胞に共発現するとき、Ｌ−アスパラギン水酸化酵素及びＬ−アスパラギナーゼの両方が強制発現させられる場合があり、あるいは、いずれか一方のみが強制発現させられ、他方は前記細胞自体がもともと保持する遺伝子が発現する場合がある。Ｌ−アスパラギン水酸化酵素及びＬ−アスパラギナーゼの発現が強制されるとき、形質転換体が増殖する間はこれらの酵素遺伝子の発現は抑制されていて、形質転換体が十分に増殖してから、人工的に遺伝子発現が誘導されることが好ましい。かかる遺伝子発現の誘導及び抑制は、大腸菌ラクトースオペロンの遺伝子発現制御システムとイソプロピルチオ−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドとを含むが、これらに限定されない、当業者に周知ないずれかの遺伝子発現制御システム及び誘導物質を用いて実現される場合がある。
【００２７】
本明細書においてヌクレオチド配列の相同性は、本発明のヌクレオチド配列と、比較対象のヌクレオチド配列との間でヌクレオチド配列が一致する部分が最も多くなるように整列させて、ヌクレオチド配列が一致する部分のヌクレオチドの数を本発明のヌクレオチド配列のヌクレオチドの総数で割った商の百分率で表される。同様に、本明細書においてアミノ酸配列の相同性は、本発明のアミノ酸配列と、比較対象のアミノ酸配列との間で配列が一致するアミノ酸残基の数が最も多くなるように整列させて、配列が一致するアミノ酸残基の数の合計を本発明のアミノ酸配列のアミノ酸残基の総数で割った商の百分率で表される。本発明のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の相同性は、当業者に周知の配列整列プログラムＣＬＵＳＴＡＬＷを使用することにより算出することができる。
【００２８】
本明細書において「ストリンジェントな条件」とは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．及びＲｕｓｓｅｌｌ、Ｄ．Ｗ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２００１）に説明されるサザンブロット法で以下の実験条件で行うことを指す。比較対象のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドをアガロース電気泳動によりバンドを形成させた上で毛管現象又は電気泳動によりニトロセルロースフィルターその他の固相に不動化する。６× ＳＳＣ及び０．２％ ＳＤＳからなる溶液で前洗浄する。本発明のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを放射性同位元素その他の標識物質で標識したプローブと前記固相に不動化された比較対象のポリヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーション反応を６× ＳＳＣ及び０．２％ ＳＤＳからなる溶液中で６５°Ｃ、終夜行う。その後前記固相を１× ＳＳＣ及び０．１％ ＳＤＳからなる溶液中で６５°Ｃ、各３０分ずつ２回洗浄し、０．２× ＳＳＣ及び０．１％ ＳＤＳからなる溶液中で６５°Ｃ、各３０分ずつ２回洗浄する。最後に前記固相に残存するプローブの量を前記標識物質の定量により決定する。本明細書において「ストリンジェントな条件」でハイブリダイゼーションをするとは、比較対象のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを不動化した固相に残存するプローブの量が、本発明のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを不動化した陽性対照実験の固相に残存するプローブの量の少なくとも２５％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％以上であることを指す。
【００２９】
本発明の融合タンパク質は、特異的結合タグペプチドが本発明のアスパラギン水酸化酵素及び／又はＬ−アスパラギナーゼのアミノ末端又はカルボキシル末端に連結したものである。
【００３０】
本発明の特異的結合タグペプチドは、本発明のＬ−アスパラギン水酸化酵素及び／又はＬ−アスパラギナーゼを調製する際に、発現したタンパク質の検出、分離又は精製をより容易に行うことを可能にするために、他のタンパク質、多糖類、糖脂質、核酸及びこれらの誘導体、樹脂等と特異的に結合するポリペプチドである。特異的結合タグと結合するリガンドは、水溶液中に溶解した遊離状態の場合も固体支持体に不動化される場合もある。そこで、本発明の融合タンパク質は固体支持体に不動化されたリガンドに特異的に結合するため、発現系の他の成分を洗浄除去することができる。その後、遊離状態のリガンドを添加したり、ｐＨ、イオン強度その他の条件を変えることにより、固体支持体から前記融合タンパク質を分離して回収することができる。本発明の特異的結合タグは、Ｈｉｓタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、インテインタグ、ＭＢＰ、ＧＳＴその他これらに類するポリペプチドが含まれるがこれらに限定されない。本発明の特異的結合タグは、融合タンパク質がＬ−アスパラギン水酸化酵素及び／又はＬ−アスパラギナーゼ活性を保持することを条件として、いかなるアミノ酸配列を有してもかまわない。
【００３１】
本発明のＬ−アスパラギン水酸化酵素及び／又はＬ−アスパラギナーゼの活性は、本発明の酵素と、反応基質であるＬ−アスパラギン及び／又はＬ−ヒドロキシアスパラギンと、２−オキソグルタル酸と、２価鉄イオンと、Ｌ−アスコルビン酸とを含む反応液中で前記タンパク質をＬ−アスパラギン又はＬ−ヒドロキシアスパラギンに対して作用させることにより生成される反応産物である、Ｌ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン、Ｌ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン酸等を定量することにより評価される場合がある。
【００３２】
Ｌ−アスパラギン及びＬ−アスパラギン酸と、Ｌ−ヒドロキシアスパラギン及び／又はＬ−ヒドロキシアスパラギン酸の立体異性体とを含むが、これらに限定されない化合物は、ＬＣ／ＭＳ等のような当業者に周知の分析機器の使用により分離分析される場合がある。これらの化合物の定量分析の感度を増強するために、発色団、蛍光色素その他の増感剤との誘導体化を行った後に、前記分析機器に適用される場合がある。
【００３３】
本発明の製造方法のステップ（１）において、Ｌ−アスパラギンは、適当な組成の反応混合液中でＬ−アスパラギン水酸化酵素に接触させられる。前記反応混合液は、前記Ｌ−アスパラギン水酸化酵素の活性を阻害しないことを条件として、いかなる組成であってもかまわないが、ｐＨ６．０ないしｐＨ８．０、好ましくは、ｐＨ６．５ないしｐＨ７．５の範囲に調整された、リン酸緩衝液、Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ緩衝液を含むが、これらに限定されない緩衝液と、適当なイオン強度の塩とを含む場合がある。また、本発明のＬ−アスパラギン水酸化酵素は２−オキソグルタル酸依存型酵素であるから、２−オキソグルタル酸及び２価鉄イオンが必要な場合がある。また、抗酸化剤としてアスコルビン酸等が添加される場合がある。これらの化合物の反応混合液中の濃度と、反応温度と、反応時間とは、当業者が適宜設定することができる。
【００３４】
本発明の製造方法のステップ（２）において、前記ステップ（１）で生成されたＬ−ヒドロキシアスパラギンは、適当な組成の反応混合液中でＬ−アスパラギナーゼと接触させられる。前記反応混合液は、前記Ｌ−アスパラギナーゼの活性を阻害しないことを条件として、いかなる組成であってもかまわないが、ｐＨ６．０ないしｐＨ８．０、好ましくは、ｐＨ６．５ないしｐＨ７．５の範囲に調整された、リン酸緩衝液、Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ緩衝液を含むが、これらに限定されない緩衝液と、適当なイオン強度の塩とを含む場合がある。これらの化合物の反応混合液中の濃度と、反応温度と、反応時間とは、当業者が適宜設定することができる。
【００３５】
本明細書において「発現ベクター」とは、所望の機能を有するタンパク質を宿主生物において発現させるために使用される、該所望の機能を有するタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドが組み込まれたベクターである。
【００３６】
本明細書において「ベクター」とは、所望の機能を有するタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドを組み込み宿主生物へ導入することにより、該所望の機能を有するタンパク質を該宿主生物において複製及び発現させるために用いられる遺伝因子であり、プラスミド、ウイルス、ファージ、コスミド等を含むがこれらに限定されない。好ましくは前記ベクターはプラスミドの場合がある。さらに好ましくは前記ベクターは、ｐＥＴ−２１ａ（＋）プラスミドの場合がある。
【００３７】
本発明の発現ベクターは、制限酵素、ＤＮＡ連結酵素等を使用する当業者に周知の遺伝子工学手法を用いて本発明のタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドといずれかのベクターとを連結することにより作製される場合がある。
【００３８】
本明細書において「形質転換体」とは、本発明のタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドが組み込まれた発現ベクターが導入され、所望の機能を有するタンパク質に関連する所望の形質を表すことができるようになった生物である。
【００３９】
本明細書において「宿主生物」とは、形質転換体の作製において、所望の機能を有するタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドが組み込まれた組換えベクターが導入される生物である。前記宿主生物は、大腸菌、枯草菌等のような原核生物と、酵母、菌類、植物、動物等のような真核生物とを含む。前記宿主生物は大腸菌の場合がある。
【００４０】
本発明の形質転換体は、本発明の発現ベクターをいずれかの適切な宿主生物に導入することにより作製される。発現ベクターの導入は、電気刺激で細胞膜に空隙を作るエレクトロポレーション法、カルシウムイオン処理と併せて行うヒートショック法等を含む当業者に周知のさまざまな手法により実施される場合がある。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】ヒドロキシアスパラギン酸の光学異性体を単独で前記ＨＰＬＣ法で分析したクロマトグラムを重ね合わせた波形図。
【図２】ＡｓｎＯ（黒丸）と、ＡｓｎＯ−Ｄ２４１Ｎ（白丸）とについて、各反応温度での酵素活性をプロットしたグラフ。
【図３】ＡｓｎＯ（黒丸）と、ＡｓｎＯ−Ｄ２４１Ｎ（白丸）とについて、各温度で３０分間温度処理を施された酵素の残存活性をプロットしたグラフ。
【図４】ＡｓｎＯ−Ｄ２４１Ｎのタンパク質を発現する大腸菌の菌体が懸濁された反応混合液での反応基質及び反応産物の濃度の経時変化をプロットしたグラフ。
【図５】Ｌ−アスパラギン水酸化酵素及びＬ−アスラパギナーゼの２段階反応の反応式。
【図６Ａ】第１のインキュベーション前に回収された反応混合液のＨＰＬＣ溶出パターンのクロマトグラム。
【図６Ｂ】第１のインキュベーション後に回収された反応混合液のＨＰＬＣ溶出パターンのクロマトグラム。
【図６Ｃ】第２のインキュベーション後に回収された反応混合液のＨＰＬＣ溶出パターンのクロマトグラム。
【図７】ＡｓｎＯのタンパク質を発現する大腸菌の菌体が懸濁された反応混合液での反応基質及び反応産物の濃度の経時変化をプロットしたグラフ。
【図８】ＣＡＢ９２２５９のタンパク質を発現する大腸菌の菌体が懸濁された反応混合液での反応基質及び反応産物の濃度の経時変化をプロットしたグラフ。
【図９】ＡｓｎＯのタンパク質を発現する大腸菌の菌体が反応混合液に懸濁された場合の反応基質及び反応産物の濃度の経時変化をプロットしたグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。
【実施例１】
【００４３】
本発明に用いられる酵素遺伝子のクローニング及び発現
放線菌ストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）株は独立行政法人製品評価技術基盤機構のＮＢＲＣ（ＮＩＴＥ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ）から購入され、ＩＳＰ Ｎｏ．２培地（イーストエクストラクト ４ｇ／Ｌ、モルトエクストラクト １０ｇ／Ｌ、グルコース ４ｇ／Ｌ）を用いて、２８°Ｃ、２００ｒｐｍで２日間培養され、菌体が遠心により回収された。
【００４４】
既知アスパラギン水酸化酵素と、本発明の新規アスパラギン水酸化酵素とをエンコードする遺伝子（以下、それぞれ「ＡｓｎＯ」及び「ＣＡＢ９２２５９」という。）は、前記菌体の染色体ＤＮＡを鋳型として、ＧＣ-ＲＩＣＨ ＰＣＲ システム（ロッシュ）により増幅された。ＡｓｎＯ及びＣＡＢ９２２５９のヌクレオチド配列は、それぞれ、配列番号１及び２に列挙される。ＡｓｎＯ増幅用の順方向及び逆方向プライマーの配列は、それぞれ、配列番号６及び７に列挙され、ＣＡＢ９２２５９増幅用の順方向及び逆方向プライマーの配列は、それぞれ、配列番号８及び９に列挙される。反応は、始めに９５°Ｃ、３分間、その後、９５°Ｃ、１０秒間、５０°Ｃ、１５秒間及び７２°Ｃ、１分間を３０回繰り返し、最後に７２°Ｃ、７分間という条件で行われた。
【００４５】
前記ＰＣＲ反応の増幅産物は、順方向プライマー中のＮｄｅＩ部位と、逆方向プライマー中のＸｈｏＩ部位とで切断され、同じ酵素で二重消化されたｐＥＴ−２１ａ（＋）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）に連結された。こうして、ＡｓｎＯ及びＣＡＢ９２２５９がエンコードするタンパク質のカルボキシル末端にヒスチジンタグペプチドが連結した融合タンパク質を大腸菌で発現するプラスミドコンストラクトｐＥＴＡｓｎＯ及びｐＥＣＡＢ９２２５９が作成された。
【００４６】
大腸菌アスパラギナーゼをエンコードする遺伝子（ａｎｓＡ）は、大腸菌Ｋ−１２株の染色体ＤＮＡを鋳型として、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡）により増幅された。ａｎｓＡのヌクレオチド配列は配列番号５に列挙される。アスパラギナーゼ遺伝子増幅用の順方向及び逆方向プライマーの配列は、それぞれ、配列番号１４及び１５に列挙される。反応は、始めに９５°Ｃ、３分間、その後、９５°Ｃ、１０秒間、５０°Ｃ、１５秒間及び７２°Ｃ、１分間を３０回繰り返し、最後に７２°Ｃ、７分間という条件で行われた。
【００４７】
前記ＰＣＲ反応の増幅産物は、順方向プライマー中のＮｄｅＩ部位と、逆方向プライマー中のＸｈｏＩ部位とで切断され、同じ酵素で二重消化されたｐＥＴ−２１ａ（＋）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）に連結された。こうして、大腸菌アスパラギナーゼ遺伝子のカルボキシル末端にヒスチジンタグペプチドが連結した融合タンパク質を大腸菌で発現するプラスミドコンストラクトｐＥＥｃＡｎｓＡが作成された。
【００４８】
アスパラギン水酸化酵素遺伝子の改変は、発現ベクターｐＥＡｓｎＯ及びｐＥＣＡＢ９２２５９を鋳型とするインバースＰＣＲ法により部位特異的な突然変異導入によって行われた。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡）が用いられた。ＡｓｎＯ改変用の順方向及び逆方向プライマーの配列は、それぞれ、配列番号１０及び１１に列挙され、ＣＡＢ９２２５９改変用の順方向及び逆方向プライマーの配列は、それぞれ、配列番号１２及び１３に列挙される。ＰＣＲ反応の温度条件は、始めに９４°Ｃ、２分間、その後、９８°Ｃ、１０秒間及び６８°Ｃ、７分間を１０回繰り返すという条件で行われた。ＡｓｎＯ及びＣＡＢ９２２５９遺伝子と、ｐＥＴ−２１ａ（＋）ベクターとには、制限酵素ＤｐｎＩの切断部位がそれぞれ１カ所ずつ存在するが、突然変異導入によりＡｓｎＯ及びＣＡＢ９２２５９遺伝子内のＤｐｎＩの切断部位はなくなる。そこで前記ＰＣＲ反応産物は制限酵素ＤｐｎＩで消化された後、ＤＮＡリガーゼ処理され、突然変異体ＤＮＡのみが自己環化された。前記ＤＮＡリガーゼ処理の反応産物は大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換され、アンピシリン選択によりプラスミドが単離された。前記プラスミドの塩基配列決定により、ＡｓｎＯ遺伝子の２４１番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基に置換した変異体と、ＣＡＢ９２２５９遺伝子の２４６番目のスパラギン酸残基がアスパラギン残基に置換した変異体とが確認された（以下、それぞれ、「ＡｓｎＯ−Ｄ２４１Ｎ」及び「ＣＡＢ９２２５９−Ｄ２４６Ｎ」という。ＡｓｎＯ−Ｄ２４１Ｎ及びＣＡＢ９２２５９−Ｄ２４６Ｎのヌクレオチド配列は、それぞれ、配列番号３及び４に列挙される。また、変異体遺伝子ＡｓｎＯ−Ｄ２４１Ｎ及びＣＡＢ９２２５９−Ｄ２４６Ｎがエンコードするタンパク質のカルボキシル末端にヒスチジンタグペプチドが連結した融合タンパク質を大腸菌で発現するプラスミドコンストラクトは、それぞれ、ｐＥＴＡｓｎＯ−Ｄ２４１Ｎ及びｐＥＣＡＢ９２２５９−Ｄ２４６Ｎという。
【００４９】
発現コンストラクトｐＥＡｓｎＯ、ｐＥＣＡＢ９２２５９、ｐＥＡｓｎＯ−Ｄ２４１Ｎ及びｐＥＣＡＢ９２２５９−Ｄ２４６Ｎは、大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）に形質転換された。形質転換体の単離コロニーは、５０μｇ／ｍＬ アンピシリン及び３４μｇ／ｍＬ クロラムフェニコールが添加されたＬＢ液体培地（以下、「ＬＢ−ＡＣ液体培地」という。）５ｍＬに接種され、３７°Ｃ、１５０ｒｐｍで１６時間振盪培養された。その後、前記液体培地１ｍＬは新鮮なＬＢ−ＡＣ液体培地１００ｍＬに接種され、３７°Ｃ、１２０ｒｐｍでＯ．Ｄ．６６０が０．５に達するまで振盪培養された。前記培地に終濃度０．１ｍＭのイソプロピル−β−ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）が添加され遺伝子発現が誘導され、２５°Ｃ、１２０ｒｐｍで６時間振盪培養された。その後、遠心分離（４°Ｃ、５０００×ｇ、１０分間）によって回収された遺伝子発現誘導菌体は、５ｍＬの酵素反応液に懸濁して菌体反応系として利用されるか、発現タンパク質の精製に供された。
【００５０】
ＡｓｎＯ、ＣＡＢ９２２５９、ＡｓｎＯ−Ｄ２４１Ｎ及びＣＡＢ９２２５９−Ｄ２４６Ｎの遺伝子産物のカルボキシル末端にＨｉｓタグが連結された融合タンパク質（以下、「タンパク質」という。）の精製は常法に従って行われた。すなわち、前記遺伝子発現誘導菌体は、２０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）５ｍＬに懸濁され、超音波破砕装置（トミー、ＵＤ−２００、出力：２００Ｗ、発振周波数：２０ｋＨｚ）で３分間超音波破砕された。遠心分離（４°Ｃ、２００００×ｇ、３０分間）によって残渣が除去された後の上清が無細胞抽出液として回収された。前記無細胞抽出液はＮｉ２＋アフィニティーカラム（Ｈｉｓ−ｔｒａｐ、ＧＥヘルスケア）に適用された。その後、溶出バッファー（２０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）及び５００ｍＭ イミダゾール）を用いて溶出された。溶出された分画は、脱塩カラムＰＤ−１０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて脱塩処理が施された後、分注された（以下、「精製標品」という。）。
【実施例２】
【００５１】
ヒドロキシアスパラギン酸の光学異性体の同定
方法
Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン酸（Ｌ−ＴＨＡ）、Ｌ−エリスロ−３−ヒドロキシアスパラギン酸（Ｌ−ＥＨＡ）、Ｄ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン酸（Ｄ−ＴＨＡ）、Ｌ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン及びＬ−グルタミン酸の０．５ｍＭ溶液１００μＬ、０．５Ｍ ホウ酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．０）５０μＬ、１０ｍＭ Ｎα−（５−フルオロ−２，４−ジニトロフェニル）−Ｌ−アラニンアミド１００μＬとを混合させ、４０°Ｃ、１時間反応させた後、１Ｎ ＨＣｌを５０μＬ添加して反応を停止させて、それぞれのアミノ酸の誘導体が得られた。前記アミノ酸誘導体のそれぞれは、ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ１８−ＡＲ−ＩＩ Ｐａｃｋｅｄ Ｃｏｌｕｍｎ （内径：４．６ｍｍ、長さ：１５０ｍｍ）（ナカライテスク）が装着されたＨＰＬＣ装置（Ｌ−７０００系、日立）により分析された。カラムオーブンは４０°Ｃに設定され、３４０ｎｍにおける吸光度によって検出された。溶離液Ａ（４５ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ２．７）、５％ メタノール及び５％ アセトニトリル）と、溶離液Ｂ（３０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ２．７）、５％ メタノール及び３５％ アセトニトリル）の直線的グラジェントにより化合物が分離された。グラジェントプログラムはＡ／Ｂ：７０／３０（０分）からＡ／Ｂ：２０／８０（１２分）に設定された。
【００５２】
結果
図１は、ヒドロキシアスパラギン酸の光学異性体を単独で前記ＨＰＬＣ法で分析したクロマトグラムを重ね合わせた波形図である。図１の波形図のピーク１はＤ−ＴＨＡ（保持時間５．４分）、ピーク２はＬ−ＴＨＡ（保持時間５．７分）、ピーク３はＬ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン（保持時間６．１分）、ピーク４はＬ−アスパラギン（保持時間８．０分）、ピーク５はＬ−ＥＨＡ（保持時間８．７分）、ピーク６はＬ−アスパラギン酸（保持時間９．５分）、ピーク７はＬ−グルタミン酸（保持時間１０．６分）であった。以上の結果から、前記ＨＰＬＣ法によってヒドロキシアスパラギン酸の光学異性体を同定することが可能となった。また、前記ヒドロキシアスパラギン酸の光学異性体の濃度と、ＨＰＬＣのクロマトグラムの信号強度との較正曲線を作成することにより、前記ヒドロキシアスパラギン酸の光学異性体を定量測定することも可能となった（データは示されない）。
【実施例３】
【００５３】
アスパラギン水酸化活性の評価
方法
アスパラギン水酸化反応混合液として、５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）中に、５ｍＭ Ｌ−アスパラギンと、１０ｍＭ ２−オキソグルタル酸と、１ｍＭ Ｌ−アスコルビン酸と、０．５ｍＭ ＦｅＳＯ４と、０．０５ｍｇ／ｍＬのＡｓｎＯ又はＣＡＢ９２２５９タンパク質精製標品とを含む反応混合液が調製された。対照実験では、前記アスパラギン水酸化反応混合液から、Ｌ−アスパラギンか、Ｌ−アスコルビン酸か、ＦｅＳＯ４か、前記タンパク質精製標品かのいずれかが欠けた反応混合液が用いられた。前記アスパラギン水酸化反応混合液又は対照実験の反応混合液は２５°Ｃで３０分間インキュベーションされた。その後、生成されたヒドロキシアスパラギンの量が実施例２で説明されたＨＰＬＣ法によって分析された。
【００５４】
結果
前記ＨＰＬＣ法による分析の結果、ＣＡＢ９２２５９タンパク質精製標品及びＡｓｎＯタンパク質精製標品の生成するヒドロキシアスパラギンは同一の保持時間であった。そこで、ＣＡＢ９２２５９タンパク質も、ＡｓｎＯタンパク質と同じく、Ｌ−アスパラギンを基質としてＬ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギンを生成する水酸化反応を触媒する活性を有することが明らかになった。表１は、前記アスパラギン水酸化反応混合液又は対照実験の反応混合液が、実施例２のＨＰＬＣ法によって分析された結果をまとめた表である。
【００５５】
【表１】
【００５６】
表１から明らかなとおり、ＣＡＢ９２２５９タンパク質精製標品は、２５°Ｃで３０分間の反応で、５ｍＭのＬ−アスパラギンから４．３ｍＭのＬ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギンを生成することができた。また、ＣＡＢ９２２５９タンパク質によるＬ−アスパラギンの水酸化反応は、２−オキソグルタル酸、Ｌ−アスコルビン酸及び２価鉄イオンに依存するので、ＣＡＢ９２２５９遺伝子産物は２−オキソグルタル酸依存型ジオキシゲナーゼ活性を有することが示された。
【実施例４】
【００５７】
アスパラギン水酸化酵素の改変
方法
Ｓｔｒｉｅｋｅｒ、Ｍ．ら（ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ、９：３７４−３７６（２００８））は、アスパラギン水酸化活性を有するＡｓｎＯ遺伝子の２４１番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基に置換されるように部位特異的突然変異を導入することによって、アスパラギン酸を水酸化できるように改変した。そこで、ＣＡＢ９２２５９遺伝子の２４６番目のスパラギン酸残基がアスパラギン残基に置換されるように部位特異的突然変異が導入された。
【００５８】
アスパラギン酸水酸化反応反応混合液として、５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）中に、５ｍＭ Ｌ−アスパラギン酸と、１０ｍＭ ２−オキソグルタル酸と、１ｍＭ Ｌ−アスコルビン酸と、０．５ｍＭ ＦｅＳＯ４と、０．０５ｍｇ／ｍＬのＡｓｎＯ−Ｄ２４１Ｎ又はＣＡＢ９２２５９−Ｄ２４６Ｎタンパク質精製標品とを含む反応混合液が調製された。対照実験では、前記アスパラギン酸水酸化反応混合液から、Ｌ−アスパラギン酸か、Ｌ−アスコルビン酸か、ＦｅＳＯ４か、前記タンパク質精製標品かのいずれかが欠けた反応混合液が用いられた。前記アスパラギン酸水酸化反応混合液又は対照実験の反応混合液は２５°Ｃで３０分間インキュベーションされた。その後、生成されたヒドロキシアスパラギン酸の量が実施例２で説明されたＨＰＬＣ法によって分析された。
【００５９】
結果
前記ＨＰＬＣ法による分析の結果、ＣＡＢ９２２５９−Ｄ２４６タンパク質精製標品の生成するヒドロキシアスパラギン酸はＬ−ＴＨＡと同一の保持時間であり、他の異性体は含まれなかった。そこで、ＣＡＢ９２２５９−Ｄ２４６Ｎ遺伝子産物も、ＡｓｎＯ−Ｄ２４１遺伝子産物と同じく、Ｌ−アスパラギン酸を基質としてＬ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン酸を生成する水酸化反応を触媒する活性を有することが明らかになった。また、対照実験の結果、ＣＡＢ９２２５９−Ｄ２４６Ｎタンパク質によるＬ−アスパラギン酸の水酸化反応は、２−オキソグルタル酸、Ｌ−アスコルビン酸及び２価鉄イオンに依存するので、ＣＡＢ９２２５９−Ｄ２４６Ｎ遺伝子産物も２−オキソグルタル酸依存型ジオキシゲナーゼ活性を有することが示された。しかし、ＣＡＢ９２２５９−Ｄ２４６Ｎタンパク質精製標品は、２５°Ｃで３０分間の反応で、５ｍＭのＬ−アスパラギン酸から０．０７ｍＭのＬ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギンしか生成することができなかった。これは、ＡｓｎＯ−Ｄ２４１Ｎタンパク質と比較して低い活性であった。
【００６０】
ここで、ＡｓｎＯ及びＣＡＢ９２２５９のアスパラギン水酸化酵素と、ＡｓｎＯ−Ｄ２４１Ｎ及びＣＡＢ９２２５９−Ｄ２４６Ｎのアスパラギン酸水酸化酵素とについて、水酸化反応による基質の転換率が比較された。水酸化反応混合液として、５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）中に、５ｍＭ Ｌ−アスパラギン又はＬ−アスパラギン酸と、１０ｍＭ ２−オキソグルタル酸と、１ｍＭ Ｌ−アスコルビン酸と、０．５ｍＭ ＦｅＳＯ４と、０．０５ｍｇ／ｍＬのＡｓｎＯ、ＡｓｎＯ−Ｄ２４１Ｎ、ＣＡＢ９２２５９、又はＣＡＢ９２２５９−Ｄ２４６Ｎタンパク質とを含む反応混合液が調製された。前記水酸化反応混合液は２５°Ｃで３０分間インキュベーションされた。その後、生成されたヒドロキシアスパラギン又はヒドロキシアスパラギン酸の量が実施例２で説明されたＨＰＬＣ法によって分析された（表２）。
【００６１】
【表２】
【００６２】
表２は、それぞれの酵素について、基質の反応開始時のモル濃度に対する、前記水酸化反応混合液中で２５°Ｃ、３０分間のインキュベーションで生成した反応産物のモル濃度の百分率（転換率）を比較した表である。表から明らかなとおり、ＡｓｎＯ−Ｄ２４１Ｎ及びＣＡＢ９２２５９−Ｄ２４６Ｎのアスパラギン酸水酸化酵素は、改変のもととなったＡｓｎＯ及びＣＡＢ９２２５９のアスパラギン水酸化酵素と比べて非常に転換率が低かった。
【００６３】
野生型酵素と改変酵素との最適反応温度の比較
表２の結果から、比較的転換率が高かったＡｓｎＯ（以下、「野生型酵素」という。）と、ＡｓｎＯ−Ｄ２４１Ｎ（以下、「改変酵素」という。）との最適反応温度が比較検討された。酵素反応混合液として、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）中に、前記タンパク質精製標品０．１ｍｇ／ｍＬと、５ｍＭ Ｌ−アスパラギン（ＡｓｎＯ又はＣＡＢ９２２５９の場合）か、Ｌ−アスパラギン酸（ＡｓｎＯ−Ｄ２４１Ｎ又はＣＡＢ９２２５９−Ｄ２４６Ｎの場合）かと、１０ｍＭ ２−オキソグルタル酸と、１ｍＭ Ｌ−アスコルビン酸と、０．５ｍＭ ＦｅＳＯ４とを含む反応混合液が調製された。反応は、１０°Ｃないし５０°Ｃの温度で１時間行われた。前記反応混合液中に生成された水酸化アミノ酸が実施例２で説明されたＨＰＬＣ法によって分析され、野生型酵素とその改変酵素とで比較された。
【００６４】
図２は、ＡｓｎＯ（黒丸（●））と、ＡｓｎＯ−Ｄ２４１Ｎ（白丸（○））とについて、各反応温度での酵素活性をプロットしたグラフである。図２から明らかなとおり、野生型酵素は１０°Ｃから４５°Ｃまでの温度範囲ではほぼ同じ活性を示したが、改変酵素は３５°Ｃ以上では活性がなくなった。また、野生型酵素に比べて改変酵素は酵素活性が著しく低く、改変酵素で活性が高い１０°Ｃないし３０°Ｃでの酵素活性でも、野生型酵素で活性が急激に低下する５０°Ｃでの酵素活性と同程度であった。
【００６５】
改変酵素の温度安定性
野生型酵素と、改変酵素とについて酵素の温度安定性が比較検討された。ＡｓｎＯ、ＡｓｎＯ−Ｄ２４１Ｎ、ＣＡＢ９２２５９又はＣＡＢ９２２５９−Ｄ２４６Ｎのタンパク質精製標品は、１０°Ｃないし５０°Ｃの温度で３０分間インキュベーションされる温度処理の後、３０°Ｃ１時間の酵素反応に供された。酵素反応混合液として、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）中に、前記温度処理が施されたタンパク質精製標品０．１ｍｇ／ｍＬと、５ｍＭ Ｌ−アスパラギン（ＡｓｎＯ又はＣＡＢ９２２５９の場合）か、Ｌ−アスパラギン酸（ＡｓｎＯ−Ｄ２４１Ｎ又はＣＡＢ９２２５９−Ｄ２４６Ｎの場合）かと、１０ｍＭ ２−オキソグルタル酸と、１ｍＭ Ｌ−アスコルビン酸と、０．５ｍＭ ＦｅＳＯ４とを含む反応混合液が調製された。前記反応混合液中に生成された水酸化アミノ酸が実施例２で説明されたＨＰＬＣ法によって分析され、それぞれの野生型酵素とその改変酵素とで比較された。
【００６６】
図３は、ＡｓｎＯ（黒丸（●））と、ＡｓｎＯ−Ｄ２４１Ｎ（白丸（○））とについて、各温度で３０分間温度処理を施された酵素の残存活性をプロットしたグラフである。図３から明らかなとおり、野生型酵素は１０°Ｃから３５°Ｃまでの温度範囲ではほぼ安定であったが、改変酵素は１０°Ｃでも活性がほとんどなかった。
【００６７】
菌体反応系を用いる１段階反応の検討
発現コンストラクトｐＥＡｓｎＯ−Ｄ２４１Ｎが形質転換された大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）株が、実施例１で説明される手順で振盪培養された。すなわち、終夜培養１ｍＬが１００ｍＬの新鮮なＬＢ液体培地に接種され、３７°Ｃ、１２０ｒｐｍでＯ．Ｄ．６６０が０．５に達するまで振盪培養された。前記培地に終濃度０．１ｍＭのイソプロピル−β−ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）が添加され遺伝子発現が誘導され、２５°Ｃ、１２０ｒｐｍで６時間振盪培養された。その後、遠心分離（４°Ｃ、５０００×ｇ、１０分間）によって回収された遺伝子発現誘導菌体は、５ｍＬの酵素反応液に懸濁された。前記反応混合液は、５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）中に、５ｍＭ Ｌ−アスパラギンと、１０ｍＭ ２−オキソグルタル酸と、１ｍＭ Ｌ−アスコルビン酸と、０．５ｍＭ ＦｅＳＯ４とが含まれた。前記反応混合液は２５°Ｃ、２８０ｒｐｍで振盪しながらインキュベーションされた。前記反応混合液の一部が経時的にサンプリングされ、実施例２に説明されるＨＰＬＣ法で分析された。
【００６８】
図４は、ＡｓｎＯ−Ｄ２４１Ｎのタンパク質を発現する大腸菌の菌体が懸濁された反応混合液での反応基質及び反応産物の濃度の経時変化をプロットしたグラフである。図４では、反応基質のＬ−アスパラギン酸の濃度の経時変化が黒い三角（▲）のグラフで表され、反応産物のＬ−ＴＨＡの濃度の経時変化が黒い丸（●）のグラフで表された。反応基質のＬ−アスパラギン酸の濃度は反応開始から８時間後にはほぼ０となり、反応産物のＬ−ＴＨＡの濃度は反応開始から６時間後にはほぼプラトーに達し、反応開始から３０時間後でも５．５ｍＭであった。なお、反応の副産物として、Ｌ−グルタミン酸が反応開始から３０時間後に７．２ｍＭも蓄積していた（データ示さず）。したがって、改変酵素による１段階反応は、菌体反応系では副産物の生成のため、効率に限界があった。
【実施例５】
【００６９】
Ｌ−アスパラギン水酸化酵素及びＬ−アスラパギナーゼの２段階反応
実施例４に詳しく説明されたとおり、Ｌ−アスパラギン水酸化酵素の改変により１段階でＬ−アスパラギン酸からＬ−ＴＨＡを生成させるアプローチでは、酵素の活性自体が非常に低く、室温でも酵素の安定性が低く、菌体反応系では反応副産物が大量に生成するため、工業的なＬ−ＴＨＡの生産には問題が多い。そこで、Ｌ−アスパラギン水酸化酵素をＬ−アスラパギナーゼと共役させる２段階反応を検討した。図５は、Ｌ−アスパラギン水酸化酵素及びＬ−アスラパギナーゼの２段階反応の反応式である。第１段階の反応は、ＡｓｎＯ及びＣＡＢ９２２５９のようなＬ−アスパラギン水酸化酵素によって触媒される。第２段階の反応は、ＡｎｓＡのようなＬ−アスパラギナーゼによって触媒される。Ｌ−アスパラギナーゼが、Ｌ−アスパラギンだけでなく、Ｌ−ヒドロキシアスパラギンも基質として加水分解反応を触媒することができることは本願で明らかにされる新知見である。
【００７０】
実施例１で説明されたＬ−アスパラギン水酸化酵素（ＡｓｎＯ及びＣＡＢ９２２５０）と、Ｌ−アスパラギナーゼ（ＡｎｓＡ）とのタンパク質精製標品を用いて、Ｌ−アスパラギンからＬ−ＴＨＡを生成させた。まず、アスパラギン水酸化反応反応混合液として、２０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）と、５ｍＭ Ｌ−アスパラギンと、１０ｍＭ ２−オキソグルタル酸と、１ｍＭ Ｌ−アスコルビン酸と、０．５ｍＭ ＦｅＳＯ４と、０．１ｍｇ／ｍＬのＡｓｎＯタンパク質精製標品とを含む反応混合液が調製された。前記反応混合液が、２５°Ｃ、１６時間の第１のインキュベーションに供された。その後、前記反応混合液にＬ−アスパラギナーゼ（ＡｎｓＡ）のタンパク質精製標品０．００５ｍｇ／ｍＬが添加され、３７°Ｃ、１時間の第２のインキュベーションに供された。第１のインキュベーションの前と、第１のインキュベーションの後と、第２のインキュベーションの後とに、反応混合液の一部が回収され、実施例２で説明されたＨＰＬＣ法により、反応基質及び反応産物が分析された。
【００７１】
図６Ａは第１のインキュベーション前に回収された反応混合液のＨＰＬＣ溶出パターンのクロマトグラムであり、図６Ｂは第１のインキュベーション後に回収された反応混合液のＨＰＬＣ溶出パターンのクロマトグラムであり、図６Ｃは第２のインキュベーション後に回収された反応混合液のＨＰＬＣ溶出パターンのクロマトグラムである。図１と対比すると明かなとおり、第１のインキュベーションの前ではＬ−アスパラギンが反応混合液に存在していたことが図６Ａからわかる。第１のインキュベーションの後ではＬ−アスパラギンは完全に消失して、かわりにＬ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギンが生成したことが図６Ｂからわかる。さらに第２のインキュベーションの後ではＬ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギンが完全に消失して、かわりにＬ−ＴＨＡが生成したことが図６Ｃからわかる。これらの結果から、精製酵素を触媒とする場合には、Ｌ−アスパラギン水酸化酵素をＬ−アスラパギナーゼと共役させる２段階反応系によって、効率的にＬ−アスパラギンからＬ−ＴＨＡを生成できることが示された。
【００７２】
発現コンストラクトｐＥＡｓｎＯ又はｐＥＣＡＢ９２２５９が形質転換された大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）株が実施例１で説明される手順で振盪培養された。すなわち、終夜培養１ｍＬが１００ｍＬの新鮮なＬＢ液体培地に接種され、３７°Ｃ、１２０ｒｐｍでＯ．Ｄ．６６０が０．５に達するまで振盪培養された。前記培地に終濃度０．１ｍＭのイソプロピル−β−ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）が添加され遺伝子発現が誘導され、２５°Ｃ、１２０ｒｐｍで６時間振盪培養された。その後、遠心分離（４°Ｃ、５０００×ｇ、１０分間）によって回収された遺伝子発現誘導菌体は、５ｍＬの酵素反応液に懸濁された。前記反応混合液は、５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）中に、４５ｍＭ Ｌ−アスパラギンと、９０ｍＭ ２−オキソグルタル酸と、１ｍＭ Ｌ−アスコルビン酸と、０．５ｍＭ ＦｅＳＯ４とが含まれた。前記反応混合液は２５°Ｃ、２８０ｒｐｍで振盪しながらインキュベーションされた。前記反応混合液の一部が経時的にサンプリングされ、実施例２に説明されるＨＰＬＣ法で分析された。
【００７３】
図７及び８は、それぞれ、ＡｓｎＯ及びＣＡＢ９２２５９のタンパク質を発現する大腸菌の菌体が懸濁された反応混合液での反応基質及び反応産物の濃度の経時変化をプロットしたグラフである。図７及び８では、反応基質のＬ−アスパラギンの濃度の経時変化が黒い四角（■）のグラフで表され、反応産物のＬ−ＴＨＡの濃度の経時変化が黒い丸（●）のグラフで表された。反応基質のＬ−アスパラギンの濃度は反応開始から２４時間後にはほぼ０となったが、反応産物のＬ−ＴＨＡの濃度は反応開始から５８時間後でもまだ少しずつ上昇中であった。なお、反応の副産物の蓄積はほとんどみられなかった（データ示さず）。ＡｓｎＯのタンパク質を発現する大腸菌では、反応開始から５８時間後の反応産物Ｌ−ＴＨＡの濃度は１８ｍＭ、ＣＡＢ９２２５９のタンパク質を発現する大腸菌では、反応開始から５８時間後の反応産物Ｌ−ＴＨＡの濃度は３．２ｍＭであった。
【００７４】
図９は、ＡｓｎＯのタンパク質を発現する大腸菌の菌体が反応混合液（Ｌ−アスパラギン濃度を２５ｍＭ、２−オキソグルタル酸濃度を５０ｍＭとした他は、図７及び８の実験と同じ組成）に懸濁された場合の反応基質及び反応産物の濃度の経時変化をプロットしたグラフである。図９では、反応基質のＬ−アスパラギンの濃度の経時変化が黒い四角（■）のグラフで表され、反応産物のＬ−ＴＨＡの濃度の経時変化が黒い丸（●）のグラフで表された。反応基質のＬ−アスパラギンの濃度は反応開始から２４時間後にはほぼ０となったが、反応産物のＬ−ＴＨＡの濃度は反応開始から５４時間後で２５ｍＭに達した。なお、この実験では、反応混合液に添加された反応基質のＬ−アスパラギンの濃度は２５ｍＭであったので、反応産物のモル収率はほぼ１００％であった。また、反応の副産物の蓄積はほとんどみられなかった（データ示さず）。
【００７５】
糸状菌によるＬ−ＴＨＡの発酵生産では、ジャーファーメンターによって１８Ｌの培養液を４８時間培養して、純度８２％の粉末が１７．４ｇしか得られなかった。改変酵素による１段階反応を菌体反応系で行う場合では、５０ｍＭのＬ−アスパラギン酸から５．５ｍＭのＬ−ＴＨＡが得られたが、副生物として７．２ｍＭものＬ−グルタミン酸が蓄積した。これに対し、本発明の２段階反応では、最適化を行うと、１００％のモル収率を達成することができた。したがって、本発明のＬ−ＴＨＡの製造方法は産業上の利用性が非常に高い。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｌ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン酸の製造方法と、触媒組成物の組合せとに関し、具体的には、Ｌ−アスパラギン水酸化酵素とＬ−アスパラギナーゼとの２段階反応を利用する、Ｌ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン酸の製造方法と、触媒組成物の組合せとに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒドロキシアスパラギン酸は、その立体異性体がシス体又はトランス体（幾何異性体）か、アスパラギン酸がＤ体又はＬ体（光学異性体）かによって４種類の立体異性体が存在する。ヒドロキシアスパラギン酸のうち、Ｌ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン酸（以下、「Ｌ−ＴＨＡ」という。）は、抗生物質、皮膚外用剤、グルタミン酸トランスポーターのブロッカー、機能性ゲル、樹脂などの原料として有用な物質である。
【０００３】
Ｌ−ＴＨＡの製造方法としては、マレイン酸又はフマル酸か、これらの塩かと、過酸化水素とをエポキシ化触媒の存在下で反応させてエポキシコハク酸を得るステップと、前記エポキシコハク酸にアンモニアを作用させることによりスレオ−３−ヒドロキシアスパラギン酸を得るステップとを含む方法が開示されている（特許文献１）。しかし、前記方法ではＬ−体及びＤ−体が等しく生成されるため、Ｌ−ＴＨＡを単離するために複雑な精製処理が必要となる。糸状菌によってＬ−ＴＨＡを発酵生産する方法も開示されているが、培養液から微量のＬ−ＴＨＡを精製するには多段階のカラムクロマトグラフィ処理が必要となる（特許文献２及び３）。
【０００４】
近年、アスパラギン水酸化酵素が遺伝子工学的に改変されて、アスパラギン酸水酸化活性が付与された改変酵素が報告された（特許文献４及び非特許文献１）。前記酵素を用いることによって、１段階反応でＬ−アスパラギン酸からＬ−ＴＨＡを位置及び立体選択的に合成可能である。しかし前記改変酵素は、安定性及び活性などに問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平１１−２２２４７１号公報
【特許文献２】特開平７−１７０９９２号公報
【特許文献３】特開平７−１０７９９０号公報
【特許文献４】国際公開第ＷＯ ２００８／１２５０８０号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｓｔｒｉｅｋｅｒ、Ｍ．ら、Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．、９：３７４−６（２００８）．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、産業上有用なＬ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン酸を効率的に製造する方法を開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明はＬ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン酸の製造方法を提供する。前記製造方法は、（１）Ｌ−アスパラギンをＬ−アスパラギン水酸化酵素に接触させてＬ−ヒドロキシアスパラギンを生成するステップと、（２）前記Ｌ−ヒドロキシアスパラギンをＬ−アスパラギナーゼに接触させてＬ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン酸を生成するステップとを含む。
【０００９】
本発明のＬ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン酸の製造方法において、前記Ｌ−アスパラギン水酸化酵素及びＬ−アスパラギナーゼは精製タンパク質の場合がある。
【００１０】
本発明のＬ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン酸の製造方法において、前記Ｌ−アスパラギン水酸化酵素及びＬ−アスパラギナーゼのうち、少なくともＬ−アスパラギン水酸化酵素は該酵素を発現する細胞の表面又は内部に存在する場合がある。
【００１１】
本発明のＬ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン酸の製造方法において、前記Ｌ−アスパラギン水酸化酵素及びＬ−アスパラギナーゼの両方が、該酵素を発現する細胞の表面又は内部に存在する場合がある。
【００１２】
本発明のＬ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン酸の製造方法において、前記Ｌ−アスパラギン水酸化酵素及びＬ−アスパラギナーゼの両方が、同一の細胞の表面又は内部に存在する場合がある。
【００１３】
本発明のＬ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン酸の製造方法において、前記Ｌ−アスパラギン水酸化酵素は、（ａ）配列番号１又は２のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにエンコードされるタンパク質と、（ｂ）配列番号１又は２のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドに１個若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換又は付加されたヌクレオチド配列にエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ−アスパラギン水酸化酵素活性を有するタンパク質と、（ｃ）配列番号１又は２のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上、８５％以上、９０％以上又は９５％以上の相同性を示すヌクレオチド配列にエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつＬ−アスパラギン水酸化酵素活性を有するタンパク質と、（ｄ）特異的結合タグペプチドが前記（ａ）ないし（ｃ）のいずれかのタンパク質に連結した融合タンパク質とからなるグループから選択される少なくとも１種類のタンパク質を含む場合がある。
【００１４】
本発明のＬ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン酸の製造方法において、前記Ｌ−アスパラギナーゼは、（ｅ）配列番号５のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにエンコードされるタンパク質と、（ｆ）配列番号５のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドに１個若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換又は付加されたヌクレオチド配列にエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ−アスパラギナーゼ活性を有するタンパク質と、（ｇ）配列番号５のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上、８５％以上、９０％以上又は９５％以上の相同性を示すヌクレオチド配列にエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ−アスパラギナーゼ活性を有するタンパク質と、（ｈ）特異的結合タグペプチドが前記（ｅ）ないし（ｇ）のいずれかのタンパク質に連結した融合タンパク質とからなるグループから選択される少なくとも１種類のタンパク質を含む場合がある。
【００１５】
本発明は、Ｌ−アスパラギン水酸化酵素を含む第１の触媒組成物と、Ｌ−アスパラギナーゼを含む第２の触媒組成物とを含む触媒組成物の組合せであって、Ｌ−アスパラギンを第１の触媒組成物に接触させて生成されるＬ−ヒドロキシアスパラギンを、第２の触媒組成物に接触させてＬ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン酸を生成するための触媒組成物の組合せを提供する。
【００１６】
本発明の触媒組成物の組合せにおいて、前記Ｌ−アスパラギン水酸化酵素及びＬ−アスパラギナーゼは精製タンパク質の場合がある。
【００１７】
本発明の触媒組成物の組合せにおいて、前記Ｌ−アスパラギン水酸化酵素及びＬ−アスパラギナーゼのうち、少なくともＬ−アスパラギン水酸化酵素は該酵素を発現する細胞の表面又は内部に存在する場合がある。
【００１８】
本発明の触媒組成物の組合せにおいて、前記Ｌ−アスパラギン水酸化酵素及びＬ−アスパラギナーゼの両方が、該酵素を発現する細胞の表面又は内部に存在する場合がある。
【００１９】
本発明の触媒組成物の組合せにおいて、前記Ｌ−アスパラギン水酸化酵素及びＬ−アスパラギナーゼの両方が同一の細胞の表面又は内部に存在する場合がある。
【００２０】
本発明の触媒組成物の組合せにおいて、前記Ｌ−アスパラギン水酸化酵素は、（ａ）配列番号１又は２のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにエンコードされるタンパク質と、（ｂ）配列番号１又は２のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドに１個若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換又は付加されたヌクレオチド配列にエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ−アスパラギン水酸化酵素活性を有するタンパク質と、（ｃ）配列番号１又は２のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上、８５％以上、９０％以上又は９５％以上の相同性を示すヌクレオチド配列にエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつＬ−アスパラギン水酸化酵素活性を有するタンパク質と、（ｄ）特異的結合タグペプチドが前記（ａ）ないし（ｃ）のいずれかのタンパク質に連結した融合タンパク質とからなるグループから選択される少なくとも１種類のタンパク質を含む場合がある。
【００２１】
本発明の触媒組成物の組合せにおいて、前記Ｌ−アスパラギナーゼは、（ｅ）配列番号５のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにエンコードされるタンパク質と、（ｆ）配列番号５のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドに１個若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換又は付加されたヌクレオチド配列にエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ−アスパラギナーゼ活性を有するタンパク質と、（ｇ）配列番号５のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上、８５％以上、９０％以上又は９５％以上の相同性を示すヌクレオチド配列にエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ−アスパラギナーゼ活性を有するタンパク質と、（ｈ）特異的結合タグペプチドが前記（ｅ）ないし（ｇ）のいずれかのタンパク質に連結した融合タンパク質とからなるグループから選択される少なくとも１種類のタンパク質を含む場合がある。
【００２２】
本明細書では、ヒドロキシアスパラギン（酸）の立体異性体は、Ｄ体又はＬ体（光学異性体）かで区別され、Ｌ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン（酸）、Ｄ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン（酸）、Ｌ−エリスロ−３−ヒドロキシアスパラギン（酸）及びＤ−エリスロ−３−ヒドロキシアスパラギン（酸）と表される。本発明の方法で製造されるＬ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン酸は、（２Ｓ，３Ｓ）−３−ヒドロキシアスパラギン酸とも表され、以下では「Ｌ−ＴＨＡ」という。本発明のヒドロキシアスパラギン（酸）の立体異性体は、以下の実施例２で説明されるＨＰＬＣ法の他、Ｘ線結晶構造解析を含むが、これに限定されない、当業者に知られたいずれかの方法によって分離分析が可能である。
【００２３】
本発明の製造方法と、触媒組成物の組合せとは、Ｌ−アスパラギンを反応基質としてＬ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギンを反応産物とする第１の化学反応と、Ｌ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギンを反応基質としてＬ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン酸（Ｌ−ＴＨＡ）を反応産物とする第２の化学反応とを共役させることを特徴とする。したがって、本発明のＬ−アスパラギン水酸化酵素及びＬ−アスパラギナーゼは、それぞれ、Ｌ−アスパラギン及びＬ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギンを反応基質とし、Ｌ−ＴＨＡを反応産物とする化学反応を触媒することを条件として、いかなる生物種に由来するものであっても、いかなるアミノ酸配列を有するものであってもかまわない。前記Ｌ−アスパラギン水酸化酵素は、（ａ）配列番号１又は２のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにエンコードされるタンパク質と、（ｂ）配列番号１又は２のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドに１個若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換又は付加されたヌクレオチド配列にエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ−アスパラギン水酸化酵素活性を有するタンパク質と、（ｃ）配列番号１又は２のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の相同性を示すヌクレオチド配列にエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつＬ−アスパラギン水酸化酵素活性を有するタンパク質と、（ｄ）特異的結合タグペプチドが前記（ａ）ないし（ｃ）のいずれかのタンパク質に連結した融合タンパク質とからなるグループから選択される少なくとも１種類のタンパク質を含む場合がある。前記Ｌ−アスパラギナーゼは、（ｅ）配列番号５のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにエンコードされるタンパク質と、（ｆ）配列番号５のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドに１個若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換又は付加されたヌクレオチド配列にエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ−アスパラギナーゼ活性を有するタンパク質と、（ｇ）配列番号５のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の相同性を示すヌクレオチド配列にエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ−アスパラギナーゼ活性を有するタンパク質と、（ｈ）特異的結合タグペプチドが前記（ｅ）ないし（ｇ）のいずれかのタンパク質に連結した融合タンパク質とからなるグループから選択される少なくとも１種類のタンパク質を含む場合がある。
【００２４】
本発明のＬ−アスパラギン水酸化酵素及びＬ−アスパラギナーゼは、そのアミノ酸配列をエンコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡを、無生物発現系か、宿主生物及び発現ベクターを使用する発現系かで発現させることにより産生される。前記宿主生物は、大腸菌、枯草菌等のような原核生物と、酵母、菌類、植物、動物等のような真核生物とを含む。本発明の宿主生物及び発現ベクターを使用する発現系は、細胞や組織のような生物の一部か、生物の個体全体かの場合がある。本発明のＬ−アスパラギン水酸化酵素又はＬ−アスパラギナーゼは、それぞれ、Ｌ−アスパラギン水酸化酵素又はＬ−アスパラギナーゼの活性を有することを条件として、無生物発現系又は宿主生物及び発現ベクターを使用する発現系の他の成分が混在する状態で本発明のＬ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン酸の製造方法に使用される場合がある。本発明のＬ−アスパラギン水酸化酵素及びＬ−アスパラギナーゼを前記宿主生物及び発現ベクターを使用する発現系で発現させる場合には、前記Ｌ−アスパラギン水酸化酵素及びＬ−アスパラギナーゼを発現する宿主生物、例えば本発明のＬ−アスパラギン水酸化酵素及びＬ−アスパラギナーゼの遺伝子を発現するベクターを含む形質転換体が生きた状態で本発明のＬ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン酸の製造に用いられる場合がある。このとき、本発明のＬ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン酸の製造は、菌体反応系や発酵法によって実行される場合がある。あるいは、前記酵素タンパク質は、精製された状態で本発明のＬ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン酸の製造方法に使用されてもよい。
【００２５】
本発明のＬ−アスパラギン水酸化酵素及びＬ−アスパラギナーゼは、形質転換体で産生された後、単離精製された状態で、本発明のＬ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン酸の製造方法に使用される場合がある。あるいは、本発明のＬ−アスパラギン水酸化酵素及びＬ−アスパラギナーゼは、該酵素を発現する細胞すなわち形質転換体の、表面又は内部に存在する場合がある。前記細胞の表面及び内部とは、細菌又は植物の細胞壁、細胞の外膜及び内膜、ペリプラズムと、細胞膜の内側とを含む。遠心分離、膜濾過その他の方法で物理的に細胞を分離するときに、イオン強度や界面活性剤の有無等の条件を適切に設定すると、ある酵素が細胞と挙動をともにすることができる場合に、該酵素は前記細胞の表面又は内部に存在するといえる。
【００２６】
本発明のＬ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン酸の製造方法と、触媒組成物の組合せとにおいては、Ｌ−アスパラギン水酸化酵素及びＬ−アスパラギナーゼのうち少なくともＬ−アスパラギン水酸化酵素が前記細胞の表面又は内部に存在することが好ましい。Ｌ−アスパラギン水酸化酵素及びＬ−アスパラギナーゼの両方が前記細胞の表面又は内部に存在する場合がある。この場合には、Ｌ−アスパラギン水酸化酵素及びＬ−アスパラギナーゼの両方が同一の細胞に共発現することがあり、あるいは、Ｌ−アスパラギン水酸化酵素とＬ−アスパラギナーゼとが別々の細胞で発現していることがある。Ｌ−アスパラギン水酸化酵素及びＬ−アスパラギナーゼの両方が同一の細胞に共発現するとき、Ｌ−アスパラギン水酸化酵素及びＬ−アスパラギナーゼの両方が強制発現させられる場合があり、あるいは、いずれか一方のみが強制発現させられ、他方は前記細胞自体がもともと保持する遺伝子が発現する場合がある。Ｌ−アスパラギン水酸化酵素及びＬ−アスパラギナーゼの発現が強制されるとき、形質転換体が増殖する間はこれらの酵素遺伝子の発現は抑制されていて、形質転換体が十分に増殖してから、人工的に遺伝子発現が誘導されることが好ましい。かかる遺伝子発現の誘導及び抑制は、大腸菌ラクトースオペロンの遺伝子発現制御システムとイソプロピルチオ−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドとを含むが、これらに限定されない、当業者に周知ないずれかの遺伝子発現制御システム及び誘導物質を用いて実現される場合がある。
【００２７】
本明細書においてヌクレオチド配列の相同性は、本発明のヌクレオチド配列と、比較対象のヌクレオチド配列との間でヌクレオチド配列が一致する部分が最も多くなるように整列させて、ヌクレオチド配列が一致する部分のヌクレオチドの数を本発明のヌクレオチド配列のヌクレオチドの総数で割った商の百分率で表される。同様に、本明細書においてアミノ酸配列の相同性は、本発明のアミノ酸配列と、比較対象のアミノ酸配列との間で配列が一致するアミノ酸残基の数が最も多くなるように整列させて、配列が一致するアミノ酸残基の数の合計を本発明のアミノ酸配列のアミノ酸残基の総数で割った商の百分率で表される。本発明のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の相同性は、当業者に周知の配列整列プログラムＣＬＵＳＴＡＬＷを使用することにより算出することができる。
【００２８】
本明細書において「ストリンジェントな条件」とは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．及びＲｕｓｓｅｌｌ、Ｄ．Ｗ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２００１）に説明されるサザンブロット法で以下の実験条件で行うことを指す。比較対象のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドをアガロース電気泳動によりバンドを形成させた上で毛管現象又は電気泳動によりニトロセルロースフィルターその他の固相に不動化する。６× ＳＳＣ及び０．２％ ＳＤＳからなる溶液で前洗浄する。本発明のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを放射性同位元素その他の標識物質で標識したプローブと前記固相に不動化された比較対象のポリヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーション反応を６× ＳＳＣ及び０．２％ ＳＤＳからなる溶液中で６５°Ｃ、終夜行う。その後前記固相を１× ＳＳＣ及び０．１％ ＳＤＳからなる溶液中で６５°Ｃ、各３０分ずつ２回洗浄し、０．２× ＳＳＣ及び０．１％ ＳＤＳからなる溶液中で６５°Ｃ、各３０分ずつ２回洗浄する。最後に前記固相に残存するプローブの量を前記標識物質の定量により決定する。本明細書において「ストリンジェントな条件」でハイブリダイゼーションをするとは、比較対象のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを不動化した固相に残存するプローブの量が、本発明のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを不動化した陽性対照実験の固相に残存するプローブの量の少なくとも２５％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％以上であることを指す。
【００２９】
本発明の融合タンパク質は、特異的結合タグペプチドが本発明のアスパラギン水酸化酵素及び／又はＬ−アスパラギナーゼのアミノ末端又はカルボキシル末端に連結したものである。
【００３０】
本発明の特異的結合タグペプチドは、本発明のＬ−アスパラギン水酸化酵素及び／又はＬ−アスパラギナーゼを調製する際に、発現したタンパク質の検出、分離又は精製をより容易に行うことを可能にするために、他のタンパク質、多糖類、糖脂質、核酸及びこれらの誘導体、樹脂等と特異的に結合するポリペプチドである。特異的結合タグと結合するリガンドは、水溶液中に溶解した遊離状態の場合も固体支持体に不動化される場合もある。そこで、本発明の融合タンパク質は固体支持体に不動化されたリガンドに特異的に結合するため、発現系の他の成分を洗浄除去することができる。その後、遊離状態のリガンドを添加したり、ｐＨ、イオン強度その他の条件を変えることにより、固体支持体から前記融合タンパク質を分離して回収することができる。本発明の特異的結合タグは、Ｈｉｓタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、インテインタグ、ＭＢＰ、ＧＳＴその他これらに類するポリペプチドが含まれるがこれらに限定されない。本発明の特異的結合タグは、融合タンパク質がＬ−アスパラギン水酸化酵素及び／又はＬ−アスパラギナーゼ活性を保持することを条件として、いかなるアミノ酸配列を有してもかまわない。
【００３１】
本発明のＬ−アスパラギン水酸化酵素及び／又はＬ−アスパラギナーゼの活性は、本発明の酵素と、反応基質であるＬ−アスパラギン及び／又はＬ−ヒドロキシアスパラギンと、２−オキソグルタル酸と、２価鉄イオンと、Ｌ−アスコルビン酸とを含む反応液中で前記タンパク質をＬ−アスパラギン又はＬ−ヒドロキシアスパラギンに対して作用させることにより生成される反応産物である、Ｌ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン、Ｌ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン酸等を定量することにより評価される場合がある。
【００３２】
Ｌ−アスパラギン及びＬ−アスパラギン酸と、Ｌ−ヒドロキシアスパラギン及び／又はＬ−ヒドロキシアスパラギン酸の立体異性体とを含むが、これらに限定されない化合物は、ＬＣ／ＭＳ等のような当業者に周知の分析機器の使用により分離分析される場合がある。これらの化合物の定量分析の感度を増強するために、発色団、蛍光色素その他の増感剤との誘導体化を行った後に、前記分析機器に適用される場合がある。
【００３３】
本発明の製造方法のステップ（１）において、Ｌ−アスパラギンは、適当な組成の反応混合液中でＬ−アスパラギン水酸化酵素に接触させられる。前記反応混合液は、前記Ｌ−アスパラギン水酸化酵素の活性を阻害しないことを条件として、いかなる組成であってもかまわないが、ｐＨ６．０ないしｐＨ８．０、好ましくは、ｐＨ６．５ないしｐＨ７．５の範囲に調整された、リン酸緩衝液、Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ緩衝液を含むが、これらに限定されない緩衝液と、適当なイオン強度の塩とを含む場合がある。また、本発明のＬ−アスパラギン水酸化酵素は２−オキソグルタル酸依存型酵素であるから、２−オキソグルタル酸及び２価鉄イオンが必要な場合がある。また、抗酸化剤としてアスコルビン酸等が添加される場合がある。これらの化合物の反応混合液中の濃度と、反応温度と、反応時間とは、当業者が適宜設定することができる。
【００３４】
本発明の製造方法のステップ（２）において、前記ステップ（１）で生成されたＬ−ヒドロキシアスパラギンは、適当な組成の反応混合液中でＬ−アスパラギナーゼと接触させられる。前記反応混合液は、前記Ｌ−アスパラギナーゼの活性を阻害しないことを条件として、いかなる組成であってもかまわないが、ｐＨ６．０ないしｐＨ８．０、好ましくは、ｐＨ６．５ないしｐＨ７．５の範囲に調整された、リン酸緩衝液、Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ緩衝液を含むが、これらに限定されない緩衝液と、適当なイオン強度の塩とを含む場合がある。これらの化合物の反応混合液中の濃度と、反応温度と、反応時間とは、当業者が適宜設定することができる。
【００３５】
本明細書において「発現ベクター」とは、所望の機能を有するタンパク質を宿主生物において発現させるために使用される、該所望の機能を有するタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドが組み込まれたベクターである。
【００３６】
本明細書において「ベクター」とは、所望の機能を有するタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドを組み込み宿主生物へ導入することにより、該所望の機能を有するタンパク質を該宿主生物において複製及び発現させるために用いられる遺伝因子であり、プラスミド、ウイルス、ファージ、コスミド等を含むがこれらに限定されない。好ましくは前記ベクターはプラスミドの場合がある。さらに好ましくは前記ベクターは、ｐＥＴ−２１ａ（＋）プラスミドの場合がある。
【００３７】
本発明の発現ベクターは、制限酵素、ＤＮＡ連結酵素等を使用する当業者に周知の遺伝子工学手法を用いて本発明のタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドといずれかのベクターとを連結することにより作製される場合がある。
【００３８】
本明細書において「形質転換体」とは、本発明のタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドが組み込まれた発現ベクターが導入され、所望の機能を有するタンパク質に関連する所望の形質を表すことができるようになった生物である。
【００３９】
本明細書において「宿主生物」とは、形質転換体の作製において、所望の機能を有するタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドが組み込まれた組換えベクターが導入される生物である。前記宿主生物は、大腸菌、枯草菌等のような原核生物と、酵母、菌類、植物、動物等のような真核生物とを含む。前記宿主生物は大腸菌の場合がある。
【００４０】
本発明の形質転換体は、本発明の発現ベクターをいずれかの適切な宿主生物に導入することにより作製される。発現ベクターの導入は、電気刺激で細胞膜に空隙を作るエレクトロポレーション法、カルシウムイオン処理と併せて行うヒートショック法等を含む当業者に周知のさまざまな手法により実施される場合がある。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】ヒドロキシアスパラギン酸の光学異性体を単独で前記ＨＰＬＣ法で分析したクロマトグラムを重ね合わせた波形図。
【図２】ＡｓｎＯ（黒丸）と、ＡｓｎＯ−Ｄ２４１Ｎ（白丸）とについて、各反応温度での酵素活性をプロットしたグラフ。
【図３】ＡｓｎＯ（黒丸）と、ＡｓｎＯ−Ｄ２４１Ｎ（白丸）とについて、各温度で３０分間温度処理を施された酵素の残存活性をプロットしたグラフ。
【図４】ＡｓｎＯ−Ｄ２４１Ｎのタンパク質を発現する大腸菌の菌体が懸濁された反応混合液での反応基質及び反応産物の濃度の経時変化をプロットしたグラフ。
【図５】Ｌ−アスパラギン水酸化酵素及びＬ−アスラパギナーゼの２段階反応の反応式。
【図６Ａ】第１のインキュベーション前に回収された反応混合液のＨＰＬＣ溶出パターンのクロマトグラム。
【図６Ｂ】第１のインキュベーション後に回収された反応混合液のＨＰＬＣ溶出パターンのクロマトグラム。
【図６Ｃ】第２のインキュベーション後に回収された反応混合液のＨＰＬＣ溶出パターンのクロマトグラム。
【図７】ＡｓｎＯのタンパク質を発現する大腸菌の菌体が懸濁された反応混合液での反応基質及び反応産物の濃度の経時変化をプロットしたグラフ。
【図８】ＣＡＢ９２２５９のタンパク質を発現する大腸菌の菌体が懸濁された反応混合液での反応基質及び反応産物の濃度の経時変化をプロットしたグラフ。
【図９】ＡｓｎＯのタンパク質を発現する大腸菌の菌体が反応混合液に懸濁された場合の反応基質及び反応産物の濃度の経時変化をプロットしたグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。
【実施例１】
【００４３】
本発明に用いられる酵素遺伝子のクローニング及び発現
放線菌ストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）株は独立行政法人製品評価技術基盤機構のＮＢＲＣ（ＮＩＴＥ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ）から購入され、ＩＳＰ Ｎｏ．２培地（イーストエクストラクト ４ｇ／Ｌ、モルトエクストラクト １０ｇ／Ｌ、グルコース ４ｇ／Ｌ）を用いて、２８°Ｃ、２００ｒｐｍで２日間培養され、菌体が遠心により回収された。
【００４４】
既知アスパラギン水酸化酵素と、本発明の新規アスパラギン水酸化酵素とをエンコードする遺伝子（以下、それぞれ「ＡｓｎＯ」及び「ＣＡＢ９２２５９」という。）は、前記菌体の染色体ＤＮＡを鋳型として、ＧＣ-ＲＩＣＨ ＰＣＲ システム（ロッシュ）により増幅された。ＡｓｎＯ及びＣＡＢ９２２５９のヌクレオチド配列は、それぞれ、配列番号１及び２に列挙される。ＡｓｎＯ増幅用の順方向及び逆方向プライマーの配列は、それぞれ、配列番号６及び７に列挙され、ＣＡＢ９２２５９増幅用の順方向及び逆方向プライマーの配列は、それぞれ、配列番号８及び９に列挙される。反応は、始めに９５°Ｃ、３分間、その後、９５°Ｃ、１０秒間、５０°Ｃ、１５秒間及び７２°Ｃ、１分間を３０回繰り返し、最後に７２°Ｃ、７分間という条件で行われた。
【００４５】
前記ＰＣＲ反応の増幅産物は、順方向プライマー中のＮｄｅＩ部位と、逆方向プライマー中のＸｈｏＩ部位とで切断され、同じ酵素で二重消化されたｐＥＴ−２１ａ（＋）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）に連結された。こうして、ＡｓｎＯ及びＣＡＢ９２２５９がエンコードするタンパク質のカルボキシル末端にヒスチジンタグペプチドが連結した融合タンパク質を大腸菌で発現するプラスミドコンストラクトｐＥＴＡｓｎＯ及びｐＥＣＡＢ９２２５９が作成された。
【００４６】
大腸菌アスパラギナーゼをエンコードする遺伝子（ａｎｓＡ）は、大腸菌Ｋ−１２株の染色体ＤＮＡを鋳型として、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡）により増幅された。ａｎｓＡのヌクレオチド配列は配列番号５に列挙される。アスパラギナーゼ遺伝子増幅用の順方向及び逆方向プライマーの配列は、それぞれ、配列番号１４及び１５に列挙される。反応は、始めに９５°Ｃ、３分間、その後、９５°Ｃ、１０秒間、５０°Ｃ、１５秒間及び７２°Ｃ、１分間を３０回繰り返し、最後に７２°Ｃ、７分間という条件で行われた。
【００４７】
前記ＰＣＲ反応の増幅産物は、順方向プライマー中のＮｄｅＩ部位と、逆方向プライマー中のＸｈｏＩ部位とで切断され、同じ酵素で二重消化されたｐＥＴ−２１ａ（＋）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）に連結された。こうして、大腸菌アスパラギナーゼ遺伝子のカルボキシル末端にヒスチジンタグペプチドが連結した融合タンパク質を大腸菌で発現するプラスミドコンストラクトｐＥＥｃＡｎｓＡが作成された。
【００４８】
アスパラギン水酸化酵素遺伝子の改変は、発現ベクターｐＥＡｓｎＯ及びｐＥＣＡＢ９２２５９を鋳型とするインバースＰＣＲ法により部位特異的な突然変異導入によって行われた。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡）が用いられた。ＡｓｎＯ改変用の順方向及び逆方向プライマーの配列は、それぞれ、配列番号１０及び１１に列挙され、ＣＡＢ９２２５９改変用の順方向及び逆方向プライマーの配列は、それぞれ、配列番号１２及び１３に列挙される。ＰＣＲ反応の温度条件は、始めに９４°Ｃ、２分間、その後、９８°Ｃ、１０秒間及び６８°Ｃ、７分間を１０回繰り返すという条件で行われた。ＡｓｎＯ及びＣＡＢ９２２５９遺伝子と、ｐＥＴ−２１ａ（＋）ベクターとには、制限酵素ＤｐｎＩの切断部位がそれぞれ１カ所ずつ存在するが、突然変異導入によりＡｓｎＯ及びＣＡＢ９２２５９遺伝子内のＤｐｎＩの切断部位はなくなる。そこで前記ＰＣＲ反応産物は制限酵素ＤｐｎＩで消化された後、ＤＮＡリガーゼ処理され、突然変異体ＤＮＡのみが自己環化された。前記ＤＮＡリガーゼ処理の反応産物は大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換され、アンピシリン選択によりプラスミドが単離された。前記プラスミドの塩基配列決定により、ＡｓｎＯ遺伝子の２４１番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基に置換した変異体と、ＣＡＢ９２２５９遺伝子の２４６番目のスパラギン酸残基がアスパラギン残基に置換した変異体とが確認された（以下、それぞれ、「ＡｓｎＯ−Ｄ２４１Ｎ」及び「ＣＡＢ９２２５９−Ｄ２４６Ｎ」という。ＡｓｎＯ−Ｄ２４１Ｎ及びＣＡＢ９２２５９−Ｄ２４６Ｎのヌクレオチド配列は、それぞれ、配列番号３及び４に列挙される。また、変異体遺伝子ＡｓｎＯ−Ｄ２４１Ｎ及びＣＡＢ９２２５９−Ｄ２４６Ｎがエンコードするタンパク質のカルボキシル末端にヒスチジンタグペプチドが連結した融合タンパク質を大腸菌で発現するプラスミドコンストラクトは、それぞれ、ｐＥＴＡｓｎＯ−Ｄ２４１Ｎ及びｐＥＣＡＢ９２２５９−Ｄ２４６Ｎという。
【００４９】
発現コンストラクトｐＥＡｓｎＯ、ｐＥＣＡＢ９２２５９、ｐＥＡｓｎＯ−Ｄ２４１Ｎ及びｐＥＣＡＢ９２２５９−Ｄ２４６Ｎは、大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）に形質転換された。形質転換体の単離コロニーは、５０μｇ／ｍＬ アンピシリン及び３４μｇ／ｍＬ クロラムフェニコールが添加されたＬＢ液体培地（以下、「ＬＢ−ＡＣ液体培地」という。）５ｍＬに接種され、３７°Ｃ、１５０ｒｐｍで１６時間振盪培養された。その後、前記液体培地１ｍＬは新鮮なＬＢ−ＡＣ液体培地１００ｍＬに接種され、３７°Ｃ、１２０ｒｐｍでＯ．Ｄ．６６０が０．５に達するまで振盪培養された。前記培地に終濃度０．１ｍＭのイソプロピル−β−ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）が添加され遺伝子発現が誘導され、２５°Ｃ、１２０ｒｐｍで６時間振盪培養された。その後、遠心分離（４°Ｃ、５０００×ｇ、１０分間）によって回収された遺伝子発現誘導菌体は、５ｍＬの酵素反応液に懸濁して菌体反応系として利用されるか、発現タンパク質の精製に供された。
【００５０】
ＡｓｎＯ、ＣＡＢ９２２５９、ＡｓｎＯ−Ｄ２４１Ｎ及びＣＡＢ９２２５９−Ｄ２４６Ｎの遺伝子産物のカルボキシル末端にＨｉｓタグが連結された融合タンパク質（以下、「タンパク質」という。）の精製は常法に従って行われた。すなわち、前記遺伝子発現誘導菌体は、２０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）５ｍＬに懸濁され、超音波破砕装置（トミー、ＵＤ−２００、出力：２００Ｗ、発振周波数：２０ｋＨｚ）で３分間超音波破砕された。遠心分離（４°Ｃ、２００００×ｇ、３０分間）によって残渣が除去された後の上清が無細胞抽出液として回収された。前記無細胞抽出液はＮｉ２＋アフィニティーカラム（Ｈｉｓ−ｔｒａｐ、ＧＥヘルスケア）に適用された。その後、溶出バッファー（２０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）及び５００ｍＭ イミダゾール）を用いて溶出された。溶出された分画は、脱塩カラムＰＤ−１０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて脱塩処理が施された後、分注された（以下、「精製標品」という。）。
【実施例２】
【００５１】
ヒドロキシアスパラギン酸の光学異性体の同定
方法
Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン酸（Ｌ−ＴＨＡ）、Ｌ−エリスロ−３−ヒドロキシアスパラギン酸（Ｌ−ＥＨＡ）、Ｄ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン酸（Ｄ−ＴＨＡ）、Ｌ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン及びＬ−グルタミン酸の０．５ｍＭ溶液１００μＬ、０．５Ｍ ホウ酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．０）５０μＬ、１０ｍＭ Ｎα−（５−フルオロ−２，４−ジニトロフェニル）−Ｌ−アラニンアミド１００μＬとを混合させ、４０°Ｃ、１時間反応させた後、１Ｎ ＨＣｌを５０μＬ添加して反応を停止させて、それぞれのアミノ酸の誘導体が得られた。前記アミノ酸誘導体のそれぞれは、ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ１８−ＡＲ−ＩＩ Ｐａｃｋｅｄ Ｃｏｌｕｍｎ （内径：４．６ｍｍ、長さ：１５０ｍｍ）（ナカライテスク）が装着されたＨＰＬＣ装置（Ｌ−７０００系、日立）により分析された。カラムオーブンは４０°Ｃに設定され、３４０ｎｍにおける吸光度によって検出された。溶離液Ａ（４５ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ２．７）、５％ メタノール及び５％ アセトニトリル）と、溶離液Ｂ（３０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ２．７）、５％ メタノール及び３５％ アセトニトリル）の直線的グラジェントにより化合物が分離された。グラジェントプログラムはＡ／Ｂ：７０／３０（０分）からＡ／Ｂ：２０／８０（１２分）に設定された。
【００５２】
結果
図１は、ヒドロキシアスパラギン酸の光学異性体を単独で前記ＨＰＬＣ法で分析したクロマトグラムを重ね合わせた波形図である。図１の波形図のピーク１はＤ−ＴＨＡ（保持時間５．４分）、ピーク２はＬ−ＴＨＡ（保持時間５．７分）、ピーク３はＬ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン（保持時間６．１分）、ピーク４はＬ−アスパラギン（保持時間８．０分）、ピーク５はＬ−ＥＨＡ（保持時間８．７分）、ピーク６はＬ−アスパラギン酸（保持時間９．５分）、ピーク７はＬ−グルタミン酸（保持時間１０．６分）であった。以上の結果から、前記ＨＰＬＣ法によってヒドロキシアスパラギン酸の光学異性体を同定することが可能となった。また、前記ヒドロキシアスパラギン酸の光学異性体の濃度と、ＨＰＬＣのクロマトグラムの信号強度との較正曲線を作成することにより、前記ヒドロキシアスパラギン酸の光学異性体を定量測定することも可能となった（データは示されない）。
【実施例３】
【００５３】
アスパラギン水酸化活性の評価
方法
アスパラギン水酸化反応混合液として、５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）中に、５ｍＭ Ｌ−アスパラギンと、１０ｍＭ ２−オキソグルタル酸と、１ｍＭ Ｌ−アスコルビン酸と、０．５ｍＭ ＦｅＳＯ４と、０．０５ｍｇ／ｍＬのＡｓｎＯ又はＣＡＢ９２２５９タンパク質精製標品とを含む反応混合液が調製された。対照実験では、前記アスパラギン水酸化反応混合液から、Ｌ−アスパラギンか、Ｌ−アスコルビン酸か、ＦｅＳＯ４か、前記タンパク質精製標品かのいずれかが欠けた反応混合液が用いられた。前記アスパラギン水酸化反応混合液又は対照実験の反応混合液は２５°Ｃで３０分間インキュベーションされた。その後、生成されたヒドロキシアスパラギンの量が実施例２で説明されたＨＰＬＣ法によって分析された。
【００５４】
結果
前記ＨＰＬＣ法による分析の結果、ＣＡＢ９２２５９タンパク質精製標品及びＡｓｎＯタンパク質精製標品の生成するヒドロキシアスパラギンは同一の保持時間であった。そこで、ＣＡＢ９２２５９タンパク質も、ＡｓｎＯタンパク質と同じく、Ｌ−アスパラギンを基質としてＬ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギンを生成する水酸化反応を触媒する活性を有することが明らかになった。表１は、前記アスパラギン水酸化反応混合液又は対照実験の反応混合液が、実施例２のＨＰＬＣ法によって分析された結果をまとめた表である。
【００５５】
【表１】
【００５６】
表１から明らかなとおり、ＣＡＢ９２２５９タンパク質精製標品は、２５°Ｃで３０分間の反応で、５ｍＭのＬ−アスパラギンから４．３ｍＭのＬ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギンを生成することができた。また、ＣＡＢ９２２５９タンパク質によるＬ−アスパラギンの水酸化反応は、２−オキソグルタル酸、Ｌ−アスコルビン酸及び２価鉄イオンに依存するので、ＣＡＢ９２２５９遺伝子産物は２−オキソグルタル酸依存型ジオキシゲナーゼ活性を有することが示された。
【実施例４】
【００５７】
アスパラギン水酸化酵素の改変
方法
Ｓｔｒｉｅｋｅｒ、Ｍ．ら（ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ、９：３７４−３７６（２００８））は、アスパラギン水酸化活性を有するＡｓｎＯ遺伝子の２４１番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基に置換されるように部位特異的突然変異を導入することによって、アスパラギン酸を水酸化できるように改変した。そこで、ＣＡＢ９２２５９遺伝子の２４６番目のスパラギン酸残基がアスパラギン残基に置換されるように部位特異的突然変異が導入された。
【００５８】
アスパラギン酸水酸化反応反応混合液として、５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）中に、５ｍＭ Ｌ−アスパラギン酸と、１０ｍＭ ２−オキソグルタル酸と、１ｍＭ Ｌ−アスコルビン酸と、０．５ｍＭ ＦｅＳＯ４と、０．０５ｍｇ／ｍＬのＡｓｎＯ−Ｄ２４１Ｎ又はＣＡＢ９２２５９−Ｄ２４６Ｎタンパク質精製標品とを含む反応混合液が調製された。対照実験では、前記アスパラギン酸水酸化反応混合液から、Ｌ−アスパラギン酸か、Ｌ−アスコルビン酸か、ＦｅＳＯ４か、前記タンパク質精製標品かのいずれかが欠けた反応混合液が用いられた。前記アスパラギン酸水酸化反応混合液又は対照実験の反応混合液は２５°Ｃで３０分間インキュベーションされた。その後、生成されたヒドロキシアスパラギン酸の量が実施例２で説明されたＨＰＬＣ法によって分析された。
【００５９】
結果
前記ＨＰＬＣ法による分析の結果、ＣＡＢ９２２５９−Ｄ２４６タンパク質精製標品の生成するヒドロキシアスパラギン酸はＬ−ＴＨＡと同一の保持時間であり、他の異性体は含まれなかった。そこで、ＣＡＢ９２２５９−Ｄ２４６Ｎ遺伝子産物も、ＡｓｎＯ−Ｄ２４１遺伝子産物と同じく、Ｌ−アスパラギン酸を基質としてＬ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン酸を生成する水酸化反応を触媒する活性を有することが明らかになった。また、対照実験の結果、ＣＡＢ９２２５９−Ｄ２４６Ｎタンパク質によるＬ−アスパラギン酸の水酸化反応は、２−オキソグルタル酸、Ｌ−アスコルビン酸及び２価鉄イオンに依存するので、ＣＡＢ９２２５９−Ｄ２４６Ｎ遺伝子産物も２−オキソグルタル酸依存型ジオキシゲナーゼ活性を有することが示された。しかし、ＣＡＢ９２２５９−Ｄ２４６Ｎタンパク質精製標品は、２５°Ｃで３０分間の反応で、５ｍＭのＬ−アスパラギン酸から０．０７ｍＭのＬ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギンしか生成することができなかった。これは、ＡｓｎＯ−Ｄ２４１Ｎタンパク質と比較して低い活性であった。
【００６０】
ここで、ＡｓｎＯ及びＣＡＢ９２２５９のアスパラギン水酸化酵素と、ＡｓｎＯ−Ｄ２４１Ｎ及びＣＡＢ９２２５９−Ｄ２４６Ｎのアスパラギン酸水酸化酵素とについて、水酸化反応による基質の転換率が比較された。水酸化反応混合液として、５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）中に、５ｍＭ Ｌ−アスパラギン又はＬ−アスパラギン酸と、１０ｍＭ ２−オキソグルタル酸と、１ｍＭ Ｌ−アスコルビン酸と、０．５ｍＭ ＦｅＳＯ４と、０．０５ｍｇ／ｍＬのＡｓｎＯ、ＡｓｎＯ−Ｄ２４１Ｎ、ＣＡＢ９２２５９、又はＣＡＢ９２２５９−Ｄ２４６Ｎタンパク質とを含む反応混合液が調製された。前記水酸化反応混合液は２５°Ｃで３０分間インキュベーションされた。その後、生成されたヒドロキシアスパラギン又はヒドロキシアスパラギン酸の量が実施例２で説明されたＨＰＬＣ法によって分析された（表２）。
【００６１】
【表２】
【００６２】
表２は、それぞれの酵素について、基質の反応開始時のモル濃度に対する、前記水酸化反応混合液中で２５°Ｃ、３０分間のインキュベーションで生成した反応産物のモル濃度の百分率（転換率）を比較した表である。表から明らかなとおり、ＡｓｎＯ−Ｄ２４１Ｎ及びＣＡＢ９２２５９−Ｄ２４６Ｎのアスパラギン酸水酸化酵素は、改変のもととなったＡｓｎＯ及びＣＡＢ９２２５９のアスパラギン水酸化酵素と比べて非常に転換率が低かった。
【００６３】
野生型酵素と改変酵素との最適反応温度の比較
表２の結果から、比較的転換率が高かったＡｓｎＯ（以下、「野生型酵素」という。）と、ＡｓｎＯ−Ｄ２４１Ｎ（以下、「改変酵素」という。）との最適反応温度が比較検討された。酵素反応混合液として、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）中に、前記タンパク質精製標品０．１ｍｇ／ｍＬと、５ｍＭ Ｌ−アスパラギン（ＡｓｎＯ又はＣＡＢ９２２５９の場合）か、Ｌ−アスパラギン酸（ＡｓｎＯ−Ｄ２４１Ｎ又はＣＡＢ９２２５９−Ｄ２４６Ｎの場合）かと、１０ｍＭ ２−オキソグルタル酸と、１ｍＭ Ｌ−アスコルビン酸と、０．５ｍＭ ＦｅＳＯ４とを含む反応混合液が調製された。反応は、１０°Ｃないし５０°Ｃの温度で１時間行われた。前記反応混合液中に生成された水酸化アミノ酸が実施例２で説明されたＨＰＬＣ法によって分析され、野生型酵素とその改変酵素とで比較された。
【００６４】
図２は、ＡｓｎＯ（黒丸（●））と、ＡｓｎＯ−Ｄ２４１Ｎ（白丸（○））とについて、各反応温度での酵素活性をプロットしたグラフである。図２から明らかなとおり、野生型酵素は１０°Ｃから４５°Ｃまでの温度範囲ではほぼ同じ活性を示したが、改変酵素は３５°Ｃ以上では活性がなくなった。また、野生型酵素に比べて改変酵素は酵素活性が著しく低く、改変酵素で活性が高い１０°Ｃないし３０°Ｃでの酵素活性でも、野生型酵素で活性が急激に低下する５０°Ｃでの酵素活性と同程度であった。
【００６５】
改変酵素の温度安定性
野生型酵素と、改変酵素とについて酵素の温度安定性が比較検討された。ＡｓｎＯ、ＡｓｎＯ−Ｄ２４１Ｎ、ＣＡＢ９２２５９又はＣＡＢ９２２５９−Ｄ２４６Ｎのタンパク質精製標品は、１０°Ｃないし５０°Ｃの温度で３０分間インキュベーションされる温度処理の後、３０°Ｃ１時間の酵素反応に供された。酵素反応混合液として、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）中に、前記温度処理が施されたタンパク質精製標品０．１ｍｇ／ｍＬと、５ｍＭ Ｌ−アスパラギン（ＡｓｎＯ又はＣＡＢ９２２５９の場合）か、Ｌ−アスパラギン酸（ＡｓｎＯ−Ｄ２４１Ｎ又はＣＡＢ９２２５９−Ｄ２４６Ｎの場合）かと、１０ｍＭ ２−オキソグルタル酸と、１ｍＭ Ｌ−アスコルビン酸と、０．５ｍＭ ＦｅＳＯ４とを含む反応混合液が調製された。前記反応混合液中に生成された水酸化アミノ酸が実施例２で説明されたＨＰＬＣ法によって分析され、それぞれの野生型酵素とその改変酵素とで比較された。
【００６６】
図３は、ＡｓｎＯ（黒丸（●））と、ＡｓｎＯ−Ｄ２４１Ｎ（白丸（○））とについて、各温度で３０分間温度処理を施された酵素の残存活性をプロットしたグラフである。図３から明らかなとおり、野生型酵素は１０°Ｃから３５°Ｃまでの温度範囲ではほぼ安定であったが、改変酵素は１０°Ｃでも活性がほとんどなかった。
【００６７】
菌体反応系を用いる１段階反応の検討
発現コンストラクトｐＥＡｓｎＯ−Ｄ２４１Ｎが形質転換された大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）株が、実施例１で説明される手順で振盪培養された。すなわち、終夜培養１ｍＬが１００ｍＬの新鮮なＬＢ液体培地に接種され、３７°Ｃ、１２０ｒｐｍでＯ．Ｄ．６６０が０．５に達するまで振盪培養された。前記培地に終濃度０．１ｍＭのイソプロピル−β−ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）が添加され遺伝子発現が誘導され、２５°Ｃ、１２０ｒｐｍで６時間振盪培養された。その後、遠心分離（４°Ｃ、５０００×ｇ、１０分間）によって回収された遺伝子発現誘導菌体は、５ｍＬの酵素反応液に懸濁された。前記反応混合液は、５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）中に、５ｍＭ Ｌ−アスパラギンと、１０ｍＭ ２−オキソグルタル酸と、１ｍＭ Ｌ−アスコルビン酸と、０．５ｍＭ ＦｅＳＯ４とが含まれた。前記反応混合液は２５°Ｃ、２８０ｒｐｍで振盪しながらインキュベーションされた。前記反応混合液の一部が経時的にサンプリングされ、実施例２に説明されるＨＰＬＣ法で分析された。
【００６８】
図４は、ＡｓｎＯ−Ｄ２４１Ｎのタンパク質を発現する大腸菌の菌体が懸濁された反応混合液での反応基質及び反応産物の濃度の経時変化をプロットしたグラフである。図４では、反応基質のＬ−アスパラギン酸の濃度の経時変化が黒い三角（▲）のグラフで表され、反応産物のＬ−ＴＨＡの濃度の経時変化が黒い丸（●）のグラフで表された。反応基質のＬ−アスパラギン酸の濃度は反応開始から８時間後にはほぼ０となり、反応産物のＬ−ＴＨＡの濃度は反応開始から６時間後にはほぼプラトーに達し、反応開始から３０時間後でも５．５ｍＭであった。なお、反応の副産物として、Ｌ−グルタミン酸が反応開始から３０時間後に７．２ｍＭも蓄積していた（データ示さず）。したがって、改変酵素による１段階反応は、菌体反応系では副産物の生成のため、効率に限界があった。
【実施例５】
【００６９】
Ｌ−アスパラギン水酸化酵素及びＬ−アスラパギナーゼの２段階反応
実施例４に詳しく説明されたとおり、Ｌ−アスパラギン水酸化酵素の改変により１段階でＬ−アスパラギン酸からＬ−ＴＨＡを生成させるアプローチでは、酵素の活性自体が非常に低く、室温でも酵素の安定性が低く、菌体反応系では反応副産物が大量に生成するため、工業的なＬ−ＴＨＡの生産には問題が多い。そこで、Ｌ−アスパラギン水酸化酵素をＬ−アスラパギナーゼと共役させる２段階反応を検討した。図５は、Ｌ−アスパラギン水酸化酵素及びＬ−アスラパギナーゼの２段階反応の反応式である。第１段階の反応は、ＡｓｎＯ及びＣＡＢ９２２５９のようなＬ−アスパラギン水酸化酵素によって触媒される。第２段階の反応は、ＡｎｓＡのようなＬ−アスパラギナーゼによって触媒される。Ｌ−アスパラギナーゼが、Ｌ−アスパラギンだけでなく、Ｌ−ヒドロキシアスパラギンも基質として加水分解反応を触媒することができることは本願で明らかにされる新知見である。
【００７０】
実施例１で説明されたＬ−アスパラギン水酸化酵素（ＡｓｎＯ及びＣＡＢ９２２５０）と、Ｌ−アスパラギナーゼ（ＡｎｓＡ）とのタンパク質精製標品を用いて、Ｌ−アスパラギンからＬ−ＴＨＡを生成させた。まず、アスパラギン水酸化反応反応混合液として、２０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）と、５ｍＭ Ｌ−アスパラギンと、１０ｍＭ ２−オキソグルタル酸と、１ｍＭ Ｌ−アスコルビン酸と、０．５ｍＭ ＦｅＳＯ４と、０．１ｍｇ／ｍＬのＡｓｎＯタンパク質精製標品とを含む反応混合液が調製された。前記反応混合液が、２５°Ｃ、１６時間の第１のインキュベーションに供された。その後、前記反応混合液にＬ−アスパラギナーゼ（ＡｎｓＡ）のタンパク質精製標品０．００５ｍｇ／ｍＬが添加され、３７°Ｃ、１時間の第２のインキュベーションに供された。第１のインキュベーションの前と、第１のインキュベーションの後と、第２のインキュベーションの後とに、反応混合液の一部が回収され、実施例２で説明されたＨＰＬＣ法により、反応基質及び反応産物が分析された。
【００７１】
図６Ａは第１のインキュベーション前に回収された反応混合液のＨＰＬＣ溶出パターンのクロマトグラムであり、図６Ｂは第１のインキュベーション後に回収された反応混合液のＨＰＬＣ溶出パターンのクロマトグラムであり、図６Ｃは第２のインキュベーション後に回収された反応混合液のＨＰＬＣ溶出パターンのクロマトグラムである。図１と対比すると明かなとおり、第１のインキュベーションの前ではＬ−アスパラギンが反応混合液に存在していたことが図６Ａからわかる。第１のインキュベーションの後ではＬ−アスパラギンは完全に消失して、かわりにＬ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギンが生成したことが図６Ｂからわかる。さらに第２のインキュベーションの後ではＬ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギンが完全に消失して、かわりにＬ−ＴＨＡが生成したことが図６Ｃからわかる。これらの結果から、精製酵素を触媒とする場合には、Ｌ−アスパラギン水酸化酵素をＬ−アスラパギナーゼと共役させる２段階反応系によって、効率的にＬ−アスパラギンからＬ−ＴＨＡを生成できることが示された。
【００７２】
発現コンストラクトｐＥＡｓｎＯ又はｐＥＣＡＢ９２２５９が形質転換された大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）株が実施例１で説明される手順で振盪培養された。すなわち、終夜培養１ｍＬが１００ｍＬの新鮮なＬＢ液体培地に接種され、３７°Ｃ、１２０ｒｐｍでＯ．Ｄ．６６０が０．５に達するまで振盪培養された。前記培地に終濃度０．１ｍＭのイソプロピル−β−ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）が添加され遺伝子発現が誘導され、２５°Ｃ、１２０ｒｐｍで６時間振盪培養された。その後、遠心分離（４°Ｃ、５０００×ｇ、１０分間）によって回収された遺伝子発現誘導菌体は、５ｍＬの酵素反応液に懸濁された。前記反応混合液は、５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）中に、４５ｍＭ Ｌ−アスパラギンと、９０ｍＭ ２−オキソグルタル酸と、１ｍＭ Ｌ−アスコルビン酸と、０．５ｍＭ ＦｅＳＯ４とが含まれた。前記反応混合液は２５°Ｃ、２８０ｒｐｍで振盪しながらインキュベーションされた。前記反応混合液の一部が経時的にサンプリングされ、実施例２に説明されるＨＰＬＣ法で分析された。
【００７３】
図７及び８は、それぞれ、ＡｓｎＯ及びＣＡＢ９２２５９のタンパク質を発現する大腸菌の菌体が懸濁された反応混合液での反応基質及び反応産物の濃度の経時変化をプロットしたグラフである。図７及び８では、反応基質のＬ−アスパラギンの濃度の経時変化が黒い四角（■）のグラフで表され、反応産物のＬ−ＴＨＡの濃度の経時変化が黒い丸（●）のグラフで表された。反応基質のＬ−アスパラギンの濃度は反応開始から２４時間後にはほぼ０となったが、反応産物のＬ−ＴＨＡの濃度は反応開始から５８時間後でもまだ少しずつ上昇中であった。なお、反応の副産物の蓄積はほとんどみられなかった（データ示さず）。ＡｓｎＯのタンパク質を発現する大腸菌では、反応開始から５８時間後の反応産物Ｌ−ＴＨＡの濃度は１８ｍＭ、ＣＡＢ９２２５９のタンパク質を発現する大腸菌では、反応開始から５８時間後の反応産物Ｌ−ＴＨＡの濃度は３．２ｍＭであった。
【００７４】
図９は、ＡｓｎＯのタンパク質を発現する大腸菌の菌体が反応混合液（Ｌ−アスパラギン濃度を２５ｍＭ、２−オキソグルタル酸濃度を５０ｍＭとした他は、図７及び８の実験と同じ組成）に懸濁された場合の反応基質及び反応産物の濃度の経時変化をプロットしたグラフである。図９では、反応基質のＬ−アスパラギンの濃度の経時変化が黒い四角（■）のグラフで表され、反応産物のＬ−ＴＨＡの濃度の経時変化が黒い丸（●）のグラフで表された。反応基質のＬ−アスパラギンの濃度は反応開始から２４時間後にはほぼ０となったが、反応産物のＬ−ＴＨＡの濃度は反応開始から５４時間後で２５ｍＭに達した。なお、この実験では、反応混合液に添加された反応基質のＬ−アスパラギンの濃度は２５ｍＭであったので、反応産物のモル収率はほぼ１００％であった。また、反応の副産物の蓄積はほとんどみられなかった（データ示さず）。
【００７５】
糸状菌によるＬ−ＴＨＡの発酵生産では、ジャーファーメンターによって１８Ｌの培養液を４８時間培養して、純度８２％の粉末が１７．４ｇしか得られなかった。改変酵素による１段階反応を菌体反応系で行う場合では、５０ｍＭのＬ−アスパラギン酸から５．５ｍＭのＬ−ＴＨＡが得られたが、副生物として７．２ｍＭものＬ−グルタミン酸が蓄積した。これに対し、本発明の２段階反応では、最適化を行うと、１００％のモル収率を達成することができた。したがって、本発明のＬ−ＴＨＡの製造方法は産業上の利用性が非常に高い。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）Ｌ−アスパラギンをＬ−アスパラギン水酸化酵素に接触させてＬ−ヒドロキシアスパラギンを生成するステップと、
（２）前記Ｌ−ヒドロキシアスパラギンをＬ−アスパラギナーゼに接触させてＬ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン酸を生成するステップとを含むことを特徴とする、Ｌ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン酸の製造方法。
【請求項２】
前記Ｌ−アスパラギン水酸化酵素及びＬ−アスパラギナーゼは精製タンパク質であることを特徴とする、請求項１に記載のＬ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン酸の製造方法。
【請求項３】
前記Ｌ−アスパラギン水酸化酵素及びＬ−アスパラギナーゼのうち、少なくともＬ−アスパラギン水酸化酵素は該酵素を発現する細胞の表面又は内部に存在することを特徴とする、請求項１に記載のＬ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン酸の製造方法。
【請求項４】
前記Ｌ−アスパラギン水酸化酵素及びＬ−アスパラギナーゼの両方が、該酵素を発現する細胞の表面又は内部に存在することを特徴とする、請求項３に記載のＬ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン酸の製造方法。
【請求項５】
前記Ｌ−アスパラギン水酸化酵素及びＬ−アスパラギナーゼの両方が同一の細胞の表面又は内部に存在することを特徴とする、請求項４に記載のＬ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン酸の製造方法。
【請求項６】
前記Ｌ−アスパラギン水酸化酵素は、
（ａ）配列番号１又は２のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにエンコードされるタンパク質と、
（ｂ）配列番号１又は２のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドに１個若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換又は付加されたヌクレオチド配列にエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ−アスパラギン水酸化酵素活性を有するタンパク質と、
（ｃ）配列番号１又は２のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の相同性を示すヌクレオチド配列にエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつＬ−アスパラギン水酸化酵素活性を有するタンパク質と、
（ｄ）特異的結合タグペプチドが前記（ａ）ないし（ｃ）のいずれかのタンパク質に連結した融合タンパク質とからなるグループから選択される少なくとも１種類のタンパク質を含むことを特徴とする、請求項１ないし５のいずれか１つに記載のＬ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン酸の製造方法。
【請求項７】
前記Ｌ−アスパラギナーゼは、
（ｅ）配列番号５のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにエンコードされるタンパク質と、
（ｆ）配列番号５のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドに１個若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換又は付加されたヌクレオチド配列にエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ−アスパラギナーゼ活性を有するタンパク質と、
（ｇ）配列番号５のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の相同性を示すヌクレオチド配列にエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ−アスパラギナーゼ活性を有するタンパク質と、
（ｈ）特異的結合タグペプチドが前記（ｅ）ないし（ｇ）のいずれかのタンパク質に連結した融合タンパク質とからなるグループから選択される少なくとも１種類のタンパク質を含むことを特徴とする、請求項１ないし６のいずれか１つに記載のＬ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン酸の製造方法。
【請求項８】
Ｌ−アスパラギン水酸化酵素を含む第１の触媒組成物と、Ｌ−アスパラギナーゼを含む第２の触媒組成物とを含む触媒組成物の組合せであって、
Ｌ−アスパラギンを第１の触媒組成物に接触させて生成されるＬ−ヒドロキシアスパラギンを、第２の触媒組成物に接触させてＬ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン酸を生成するための触媒組成物の組合せ。
【請求項９】
前記Ｌ−アスパラギン水酸化酵素及びＬ−アスパラギナーゼは精製タンパク質であることを特徴とする、請求項８に記載の触媒組成物の組合せ。
【請求項１０】
前記Ｌ−アスパラギン水酸化酵素及びＬ−アスパラギナーゼのうち、少なくともＬ−アスパラギン水酸化酵素は該酵素を発現する細胞の表面又は内部に存在することを特徴とする、請求項８に記載の触媒組成物の組合せ。
【請求項１１】
前記Ｌ−アスパラギン水酸化酵素及びＬ−アスパラギナーゼの両方が、該酵素を発現する細胞の表面又は内部に存在することを特徴とする、請求項１０に記載の触媒組成物の組合せ。
【請求項１２】
前記Ｌ−アスパラギン水酸化酵素及びＬ−アスパラギナーゼの両方が同一の細胞の表面又は内部に存在することを特徴とする、請求項１１に記載の触媒組成物の組合せ。
【請求項１３】
前記Ｌ−アスパラギン水酸化酵素は、
（ａ）配列番号１又は２のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにエンコードされるタンパク質と、
（ｂ）配列番号１又は２のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドに１個若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換又は付加されたヌクレオチド配列にエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ−アスパラギン水酸化酵素活性を有するタンパク質と、
（ｃ）配列番号１又は２のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の相同性を示すヌクレオチド配列にエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつＬ−アスパラギン水酸化酵素活性を有するタンパク質と、
（ｄ）特異的結合タグペプチドが前記（ａ）ないし（ｃ）のいずれかのタンパク質に連結した融合タンパク質とからなるグループから選択される少なくとも１種類のタンパク質を含むことを特徴とする、請求項８ないし１２のいずれか１つに記載の触媒組成物の組合せ。
【請求項１４】
前記Ｌ−アスパラギナーゼは、
（ｅ）配列番号５のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにエンコードされるタンパク質と、
（ｆ）配列番号５のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドに１個若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換又は付加されたヌクレオチド配列にエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ−アスパラギナーゼ活性を有するタンパク質と、
（ｇ）配列番号５のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の相同性を示すヌクレオチド配列にエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ−アスパラギナーゼ活性を有するタンパク質と、
（ｈ）特異的結合タグペプチドが前記（ｅ）ないし（ｇ）のいずれかのタンパク質に連結した融合タンパク質とからなるグループから選択される少なくとも１種類のタンパク質を含むことを特徴とする、請求項８ないし１３のいずれか１つに記載の触媒組成物の組合せ。
【請求項１】
（１）Ｌ−アスパラギンをＬ−アスパラギン水酸化酵素に接触させてＬ−ヒドロキシアスパラギンを生成するステップと、
（２）前記Ｌ−ヒドロキシアスパラギンをＬ−アスパラギナーゼに接触させてＬ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン酸を生成するステップとを含むことを特徴とする、Ｌ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン酸の製造方法。
【請求項２】
前記Ｌ−アスパラギン水酸化酵素及びＬ−アスパラギナーゼは精製タンパク質であることを特徴とする、請求項１に記載のＬ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン酸の製造方法。
【請求項３】
前記Ｌ−アスパラギン水酸化酵素及びＬ−アスパラギナーゼのうち、少なくともＬ−アスパラギン水酸化酵素は該酵素を発現する細胞の表面又は内部に存在することを特徴とする、請求項１に記載のＬ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン酸の製造方法。
【請求項４】
前記Ｌ−アスパラギン水酸化酵素及びＬ−アスパラギナーゼの両方が、該酵素を発現する細胞の表面又は内部に存在することを特徴とする、請求項３に記載のＬ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン酸の製造方法。
【請求項５】
前記Ｌ−アスパラギン水酸化酵素及びＬ−アスパラギナーゼの両方が同一の細胞の表面又は内部に存在することを特徴とする、請求項４に記載のＬ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン酸の製造方法。
【請求項６】
前記Ｌ−アスパラギン水酸化酵素は、
（ａ）配列番号１又は２のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにエンコードされるタンパク質と、
（ｂ）配列番号１又は２のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドに１個若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換又は付加されたヌクレオチド配列にエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ−アスパラギン水酸化酵素活性を有するタンパク質と、
（ｃ）配列番号１又は２のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の相同性を示すヌクレオチド配列にエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつＬ−アスパラギン水酸化酵素活性を有するタンパク質と、
（ｄ）特異的結合タグペプチドが前記（ａ）ないし（ｃ）のいずれかのタンパク質に連結した融合タンパク質とからなるグループから選択される少なくとも１種類のタンパク質を含むことを特徴とする、請求項１ないし５のいずれか１つに記載のＬ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン酸の製造方法。
【請求項７】
前記Ｌ−アスパラギナーゼは、
（ｅ）配列番号５のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにエンコードされるタンパク質と、
（ｆ）配列番号５のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドに１個若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換又は付加されたヌクレオチド配列にエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ−アスパラギナーゼ活性を有するタンパク質と、
（ｇ）配列番号５のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の相同性を示すヌクレオチド配列にエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ−アスパラギナーゼ活性を有するタンパク質と、
（ｈ）特異的結合タグペプチドが前記（ｅ）ないし（ｇ）のいずれかのタンパク質に連結した融合タンパク質とからなるグループから選択される少なくとも１種類のタンパク質を含むことを特徴とする、請求項１ないし６のいずれか１つに記載のＬ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン酸の製造方法。
【請求項８】
Ｌ−アスパラギン水酸化酵素を含む第１の触媒組成物と、Ｌ−アスパラギナーゼを含む第２の触媒組成物とを含む触媒組成物の組合せであって、
Ｌ−アスパラギンを第１の触媒組成物に接触させて生成されるＬ−ヒドロキシアスパラギンを、第２の触媒組成物に接触させてＬ−スレオ−３−ヒドロキシアスパラギン酸を生成するための触媒組成物の組合せ。
【請求項９】
前記Ｌ−アスパラギン水酸化酵素及びＬ−アスパラギナーゼは精製タンパク質であることを特徴とする、請求項８に記載の触媒組成物の組合せ。
【請求項１０】
前記Ｌ−アスパラギン水酸化酵素及びＬ−アスパラギナーゼのうち、少なくともＬ−アスパラギン水酸化酵素は該酵素を発現する細胞の表面又は内部に存在することを特徴とする、請求項８に記載の触媒組成物の組合せ。
【請求項１１】
前記Ｌ−アスパラギン水酸化酵素及びＬ−アスパラギナーゼの両方が、該酵素を発現する細胞の表面又は内部に存在することを特徴とする、請求項１０に記載の触媒組成物の組合せ。
【請求項１２】
前記Ｌ−アスパラギン水酸化酵素及びＬ−アスパラギナーゼの両方が同一の細胞の表面又は内部に存在することを特徴とする、請求項１１に記載の触媒組成物の組合せ。
【請求項１３】
前記Ｌ−アスパラギン水酸化酵素は、
（ａ）配列番号１又は２のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにエンコードされるタンパク質と、
（ｂ）配列番号１又は２のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドに１個若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換又は付加されたヌクレオチド配列にエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ−アスパラギン水酸化酵素活性を有するタンパク質と、
（ｃ）配列番号１又は２のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の相同性を示すヌクレオチド配列にエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつＬ−アスパラギン水酸化酵素活性を有するタンパク質と、
（ｄ）特異的結合タグペプチドが前記（ａ）ないし（ｃ）のいずれかのタンパク質に連結した融合タンパク質とからなるグループから選択される少なくとも１種類のタンパク質を含むことを特徴とする、請求項８ないし１２のいずれか１つに記載の触媒組成物の組合せ。
【請求項１４】
前記Ｌ−アスパラギナーゼは、
（ｅ）配列番号５のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにエンコードされるタンパク質と、
（ｆ）配列番号５のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドに１個若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換又は付加されたヌクレオチド配列にエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ−アスパラギナーゼ活性を有するタンパク質と、
（ｇ）配列番号５のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の相同性を示すヌクレオチド配列にエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ−アスパラギナーゼ活性を有するタンパク質と、
（ｈ）特異的結合タグペプチドが前記（ｅ）ないし（ｇ）のいずれかのタンパク質に連結した融合タンパク質とからなるグループから選択される少なくとも１種類のタンパク質を含むことを特徴とする、請求項８ないし１３のいずれか１つに記載の触媒組成物の組合せ。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２０１２−４５（Ｐ２０１２−４５Ａ）
【公開日】平成２４年１月５日（２０１２．１．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１３７１３８（Ｐ２０１０−１３７１３８）
【出願日】平成２２年６月１６日（２０１０．６．１６）
【出願人】（８９９００００６８）学校法人早稲田大学 (602)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１月５日（２０１２．１．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年６月１６日（２０１０．６．１６）
【出願人】（８９９００００６８）学校法人早稲田大学 (602)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]