説明

L−メチオニン前駆体生産菌株およびこれを用いたL−メチオニン前駆体の生産方法

【課題】L−メチオニン前駆体であるO−アセチルホモセリンを生産する菌株、およびL−メチオニン前駆体を生産する方法の提供。
【解決手段】a)コリネバクテリウム属(corynebacterium sp.)、レプトスピラ属(Leptospira sp.)、デイノコッカス属(Deinococcus sp.)、シュードモナス属(Pseudomonas sp.)、またはマイコバクテリウム属(Mycobacterium sp.)から選ばれた菌株に由来するホモセリンO−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の挿入によってホモセリンO−アセチルトランスフェラーゼ活性が増進され、あるいはb)アスパルトキナーゼまたはホモセリンデヒドロゲナーゼ活性が増進され、あるいはc)前記a)およびb)の特性を全て有する、O−アセチルホモセリンを生産することが可能なエシェリキア属(Escherichia sp.)由来菌株。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、L−メチオニン前駆体(Methionine Precursor)であるO−アセチルホモセリン(O-acetylhomoserine)を生産する菌株、およびこの菌株を用いてL−メチオニン前駆体を生産する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
メチオニンは、ヒトに必要な必須アミノ酸の一つであって、飼料および飲食物添加剤だけでなく、医学溶剤および医学補充剤の合成原料としても広く使われる。メチオニンは、コリン(レシチン)およびクレアチンのような合成物の前駆体としての役割を果たすと同時に、システインおよびタウリンの合成原料としても使われる。また、メチオニンは硫黄(sulfur)を提供する役割を果たす。S−アデノシル−メチオニン(S-adenosyl-methionine)は、L−メチオニンに由来し、生体内メチル基を提供する役割を果たし、脳における様々な神経伝達物質の合成に関与する。メチオニンおよび/またはS−アデノシル−メチオニン(SAM)は、生体内で肝と動脈の脂肪蓄積を抑制し、うつ病、炎症、肝疾患および筋肉痛を緩和させるなどの様々な役割を果たす。
今まで知られているメチオニンおよび/またはS−アデノシル−メチオニンの生体内(in vivo)機能は、次のとおりである。
1)脂肪代謝を促進する肝と動脈における脂肪蓄積を抑制し、脳、心臓および腎臓の血液循環を向上させる(非特許文献1)。
2)消化作用、毒性物質の解毒または排出、および鉛(Pb)などの重金属の排出を増進させる。
3)1日当たり800〜1600mgの投与量で抗うつ剤として投与できる(非特許文献2)。
4)肝機能を増進させ(非特許文献3)、特に、アルコールによって引き起こされる肝疾患に効果的である(非特許文献4)。
5)骨関節疾患に対する抗炎症効果を示し、関節回復を促進する(非特許文献5)。
6)毛髪の必須栄養素である。毛髪に栄養を供給することにより、脱毛を防ぐ(非特許文献6)。
【0003】
メチオニンは、動物飼料や食品、医薬品などに適用するために、化学的または生物学的に合成できる。
化学的な合成は、主に、5−(β−メチルメルカプトエチル)−ヒダントイン(5-(β-methylmercaptoethyl)-hydantoin)の加水分解反応によってメチオニンを生産する。ところが、このように化学的に合成されたメチオニンは、L型とD型の混合形態で生産されるという欠点を持っている。
生物学的な合成は、メチオニンの合成に関与するタンパク質を使用する方法である。L−メチオニンは、大腸菌(E.coli)においてmetA、metB、metC、metEおよびmetHなどの遺伝子から発現する酵素の作用によってホモセリンから生合成される。特に、metAは、メチオニン生合成の一番目の酵素であるホモセリンO−スクシニルトランスフェラーゼ(succinyltransferase)をコードする遺伝子であって、ホモセリンをO−スクシニル−L−ホモセリン(O-succinylhomoserine)に転換する機能を行う。metB遺伝子によってコードされるO−スクシニルホモセリンリアーゼ(O-succinylhomoserine lyase)またはシスタチオニンガンマシンターゼ(cystathionine gamma synthase)は、O−スクシニル−L−ホモセリンをシスタチオニンに転換する。metCによってコードされるシスタチオニンベータリアーゼは、シスタチオニンをL−ホモシステインに転換する機能を行う。metEによってコードされるコバラミン非依存性メチオニンシンターゼ(cobalamine-independent methionine synthase)と、metHによってコードされるコバラミン依存性メチオニンシンターゼ(cobalamine-dependent methionine synthase)は、L−ホモシステインをL−メチオニンに転換する。ここに加えて、metFによってコードされる5,10−メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素(5,10-methylenetetrahydrofolate reductase)と、glyAによってコードされるセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼとは一緒に作用し、L−メチオニンの合成に必須的なメチル基を提供するN(5)−メチルテトラヒドロ葉酸(N(5)-methyltetrahydrofolate)を合成する機能を行う。
【0004】
L−メチオニンは、前記酵素による連鎖的な有機反応によって合成され、前記タンパク質、または前記タンパク質に影響するタンパク質に遺伝的な操作を加える場合、L−メチオニンの合成を増加させることができる。例えば、特許文献1は、エシェリキア属(Escherichia sp.)に属するゲノム上に、thrBCとmetJを除去してmetBLを過発現させ、metKをリーキー型に製作してL−メチオニンを生産する方法を開示している。また、特許文献2は、コリネバクテリウム属(Corynebacterium sp.)に属し、metD(L−メチオニン合成阻害剤)遺伝子をノックアウト(Knock-out)した菌株を使用する方法を開示している。特許文献3は、5,10−メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素(metF)の発現を増加させてL−メチオニンの生産を増加させる方法を開示している。
また、生物学的方法によって生産されるメチオニンは、L型であるという利点があるが、その量は極めて微量である。これはメチオニン生合成経路が非常によく調節されるフィードバック体系を持っているためである。メチオニンが一定の水準以上に合成されると、最終産物としてのメチオニンがメチオニン生合成を開始する初期タンパク質をコードするmetA遺伝子の転写をフィードバックで抑制する。metA遺伝子は、転写段階ではメチオニンによって阻害され、翻訳段階では細胞内プロテアーゼによって分解されるメカニズムでメチオニンの量を調節するので、metA遺伝子の高発現のみではメチオニンの量を一定の水準以上に増加させることができない(非特許文献7)。したがって、以前の多くの特許らは、フィードバック調節体系からmetA遺伝子のフィードバックを解除する研究に集中している(特許文献4および特許文献5)。
【0005】
特許文献6は、硫黄の源泉としてシステインを使用せず、直接メチルメルカプタン(CHSH)または硫化水素(HS)を使用するように変形されたシスタチオニンシンターゼ(O−スクシニルホモセリンリアーゼ)によってホモシステインまたはメチオニンを合成する方法について開示している。ところが、シスタチオニンシンターゼは、細胞で様々なメチオニン前駆体と結合することができ、それにより高い水準の副産物を生産することができると知られている。例えば、シスタチオニンシンターゼは、O−スクシニルホモセリンとホモシステインの付随反応によって高い水準のホモランチオニン(homolanthionin)を蓄積すると報告された(非特許文献8)。したがって、シスタチオニンシンターゼの過発現は、付随反応の増加に起因した細胞内反応の効率性を減少させることができる。また、この方法では、細胞内のメチオニン代謝経路を用いるため、酵素の反応過程が非効率的であり、細胞に激しい毒性を持つH-SまたはCHSHを使用するという点で実効性が低下し、メチオニン合成経路のフィードバック調節によって十分な量のメチオニンを合成することができないという問題がある。
【0006】
このような問題を解決するために、本発明者らは、2段階、(1)大腸菌(E.coli)の発酵によってL−メチオニン前駆体を生産する段階と、(2)酵素反応によってL−メチオニン前駆体をL−メチオニンに転換する段階とを含む過程を開発したことがある(特許文献7)。前記2段階の過程による場合、硫化物特有の基質毒性問題、メチオニンとSAMeによる菌株のフィードバック調節問題、細胞内酵素(例えば、シスタチオニンガンマシンターゼ、O−スクシニルホモセリンスルフヒドリルリアーゼ、およびO−アセチルホモセリンスルフヒドリルリアーゼ)による中間産物の分解活性問題を全て解決することができる。しかも、D−メチオニンとL−メチオニンとの混合形態を生産する化学的な合成方法に比べ、前記2段階の過程はL−メチオニンのみを選択的に生産するのに非常に効果的である。
前記2段階の過程で、メチオニン前駆体の生産量はメチオニン生産量増加の核心要素の一つである。メチオニン前駆体であるO−アセチルホモセリンの合成量を増加させるために、強力なアスパルトキナーゼ、ホモセリントランスフェラーゼおよびO−アセチルホモセリントランスフェラーゼの組み合わせが非常に重要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【特許文献1】日本特開2000−139471号公報
【特許文献2】米国特許公開第2003/0092026号明細書
【特許文献3】米国特許公開第2002/0049305号明細書
【特許文献4】国際特許公開第2005/108561号パンフレット
【特許文献5】国際特許公開第2005/1403813号パンフレット
【特許文献6】米国特許公開第2005/0054060号明細書
【特許文献7】PCT/KR2007/003650明細書
【非特許文献】
【0008】
【非特許文献1】J Hepatol. Jeon BR et al., 2001 Mar; 34(3): 395-401
【非特許文献2】Am J Clin Nutr. Mischoulon D. et al., 2002 Nov; 76(5): 1158S-61S
【非特許文献3】FASEB J. Mato JM., 2002 Jan; 16(1): 15-26
【非特許文献4】Cochrane Database Syst Rev., Rambal A., 2001; (4): CD002235
【非特許文献5】ACP J Club. Sander O., 2003 Jan-Feb; 138(1): 21, J Fam Pract., Soeken KL et al., 2002 May; 51(5): 425-30
【非特許文献6】Audiol Neurootol., Lockwood DS et al., 2000 Sep-Oct; 5(5): 263-266
【非特許文献7】Dvora Biran, Eyal Gur, Leora Gollan and Eliora Z. Ron: Control of methionine biosynthesis in Escherichia coli by proteolysis: Molecular Microbiology (2000) 37(6), 1436-1443
【非特許文献8】J.Bacteriol (2006) vol 188:p609-618
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
このような背景の下に、本発明者らは、a)コリネバクテリウム属(corynebacterium sp.)、レプトスピラ属(Leptospira sp.)、デイノコッカス属(Deinococcus sp.)、シュードモナス属(Pseudomonas sp.)、またはマイコバクテリウム属(Mycobacterium sp.)から選ばれた菌株に由来するホモセリンO−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の挿入によってホモセリンO−アセチルトランスフェラーゼ活性(EC2.3.1.31)が導入および増進され、あるいはb)アスパルトキナーゼまたはホモセリンデヒドロゲナーゼ活性(EC2.7.2.4または1.1.1.3)が増進され、あるいはc)前記a)およびb)の特性を全て有する、L−メチオニン前駆体生産菌株を開発した。
本発明の目的は、a)コリネバクテリウム属(corynebacterium sp.)、レプトスピラ属(Leptospira sp.)、デイノコッカス属(Deinococcus sp.)、シュードモナス属(Pseudomonas sp.)、またはマイコバクテリウム属(Mycobacterium sp.)から選ばれた菌株に由来するホモセリンO−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の挿入によってホモセリンO−アセチルトランスフェラーゼ活性(EC2.3.1.31)が導入および増進され、あるいはb)アスパルトキナーゼまたはホモセリンデヒドロゲナーゼ活性(EC2.7.2.4または1.1.1.3)が増進され、あるいはc)前記a)およびb)の特性を全て有する、O−アセチルホモセリンを生産することが可能なエシェリキア属(Escherichia sp.)由来菌株を提供することにある。
本発明の他の目的は、前記菌株を用いてL−メチオニン前駆体を生産する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0010】
一つの様態において、本発明は、a)コリネバクテリウム属(corynebacterium sp.)、レプトスピラ属(Leptospira sp.)、デイノコッカス属(Deinococcus sp.)、シュードモナス属(Pseudomonas sp.)、またはマイコバクテリウム属(Mycobacterium sp.)から選ばれた菌株に由来するホモセリンO−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の挿入によってホモセリンO−アセチルトランスフェラーゼ活性(EC2.3.1.31)が導入および増進され、あるいはb)アスパルトキナーゼまたはホモセリンデヒドロゲナーゼ活性(EC2.7.2.4または1.1.1.3)が増進され、あるいはc)前記a)およびb)の特性を全て有する、O−アセチルホモセリンを生産することが可能なエシェリキア属(Escherichia sp.)由来菌株を提供する。
本願で使用される用語「L−メチオニン前駆体」とは、メチオニン特化代謝経路の一部分である代謝物質、またはこの代謝物質から派生した物質をいう。特に、本願におけるL−メチオニン前駆体とはO−アセチルホモセリンを意味する。
本願で使用される用語「L−メチオニン前駆体生産菌株」とは、L−メチオニン前駆体を生物体内で生産することが可能な原核または眞核微生物菌株であって、本発明に係る操作によってL−メチオニン前駆体を蓄積することが可能な菌株をいう。例えば、菌株はエシェリキア属(Escherichia sp.)、エルウィニア属(Erwinia sp.)、セラシア属(Serratia sp.)、プロビデンシア属(Providencia sp.)、コリネバクテリウム属(Corynebacteria sp.)、シュードモナス属(Pseudomonas sp.)、レプトスピラ属 (Leptospira)、サルモネラ属(Salmonellar sp.)、ブレビバクテリウム属(Brevibacteria sp.)、ヒポモナス属(Hypomonas sp.)、クロモバクテリウム属(Chromobacteria sp.)、およびノカルジア属(Nocardia)、またはカビ類(fungi)または酵母類(yeast)に属する微生物菌株を含むことができる。好ましくは、エシェリキア属、コリネバクテリウム属およびレプトスピラ属の微生物菌株と酵母である。さらに好ましくはエシェリキア属の微生物菌株であり、最も好ましくは大腸菌(E.coli)である。
【0011】
様々な具体例として、本発明は、前記菌株から完全なO−スクシニルホモセリンまたはO−アセチルホモセリンの分解に関与する遺伝子を欠損または弱化させ、O−アセチルホモセリンの合成に関与する遺伝子を導入または増強させた菌株をL−メチオニン前駆体の生産菌株として提供する。また、本発明は、O−アセチルホモセリンの生産を増強させるために、トレオニン生合成経路を遮断または弱化させた菌株を提供する。また、本発明は、フィードバック調節体系から自由なO−アセチルホモセリントランスフェラーゼを導入、過発現または活性増強させた菌株を提供する。また、本発明は、アスパルトキナーゼまたはホモセリンデヒドロゲナーゼが過発現し或いは活性増強された菌株を提供する。また、本発明は、フィードバック調節体系から自由なホモセリンO−アセチルトランスフェラーゼの導入、過発現または活性増強されると同時に、アスパルトキナーゼまたはホモセリンデヒドロゲナーゼが過発現または活性増強された菌株を提供する。
さらに詳しくは、本発明は、L−メチオニン前駆体の分解に関与するmetB遺伝子、トレオニン生合成経路に関与するthrB遺伝子、およびL−メチオニン前駆体生産遺伝子の転写を調節するmetJ遺伝子を欠損させたL−メチオニン前駆体生産菌株を提供する。また、本発明は、メチオニン前駆体の合成に関与する本来のmetAまたはmetX遺伝子をノックアウトし、フィードバックが解除された外部のmetX遺伝子を導入したL−メチオニン前駆体生産菌株を提供する。また、本発明は、thrA遺伝子によってコードされる活性を増強させたL−メチオニン前駆体生産菌株を提供する。
より望ましくは, 本発明はまた L-メチオニン前駆体合成に関与する本来の metA または metX 遺伝子をノックアウッさせて, フィードバックが解除された外部 metX 遺伝子を取り入れて, thrA 遺伝子によってコーディングされる活性を増強させた L-メチオニン前駆体生産菌株を提供する.
【0012】
本願で使用される用語「非活性」とは、遺伝子の減衰または欠失をいう。遺伝子の欠失は、遺伝子を切断しあるいは染色体上に特定の遺伝子配列を挿入してタンパク質の配列を変形させることにより行われる。ここで、「減衰(attenuation)」または「弱化(weakening)」という用語は、微生物菌株において相応するDNAによってコードされる少なくとも一つの酵素に対する細胞内活性を除去または減少させることを意味する。例えば、遺伝子のプロモーター部位および5’−UTR部位の塩基配列を変形させることによりタンパク質の発現を弱化させるか、あるいは当該遺伝子のORF部位に突然変異を導入することによりタンパク質の活性を弱化させることができる。減衰の測定によれば、相応するタンパク質の濃度または活性は一般に野生型(wild-type)または初期微生物菌株の濃度または活性に比べて0〜75%、0〜50%、0〜25%、0〜10%または0〜5%に減少する。
減衰を成すために、例えば、遺伝子の発現または酵素タンパク質の触媒活性を減少または除去することができ、前記2つの方法を選択的に組み合わせることができる。
適切な培養によって、あるいは遺伝子発現の信号構造の変形によって、あるいはアンチセンス−RNA技術によって遺伝子発現を減少させることができる。例えば、遺伝子発現の信号構造は、例えばリプレッサー(repressor)、アクチベータ(activator)、オペレーター(operator)、プロモーター、アテニュエーター(attenuator)、リボソーム結合部位、開始コドン(codon)およびターミネーター(terminator)である。これに関連し、JensenおよびHammer(Biotechnology and Bioengineering 58: 191 195 (1998)) 、CarrierおよびKeasling(Biotechnology Progress 15: 58 64 (1999)) 、FranchおよびGerdes(Current Opinion in Microbiology 3: 159 164 (2000)) 、並びに遺伝学科分子生物学の公知の教科書であるKnippers("Molecular Genetics", 6th edition, 1995)またはWinnacker("Genes and Clones", 1990)などを参考することができる。
【0013】
酵素タンパク質の触媒活性の変化または減少を誘導する突然変異は、当業界によく知られている。例えば、QiuおよびGoodman(Journal of Biological Chemistry 272: 8611 8617 (1997))、Yano等(Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 95: 5511 5515 (1998))、並びにWenteおよびSchachamann(Journal of Biological Chemistry 266: 20833 20839 (1991)の論文、またはHagemann("General Genetics", 1986)などを参考することができる。
できる限り、突然変異は転移(transitions)、転換(transversions)、挿入(insertions)および欠失(deletions)による突然変異である。酵素活性に関わるアミノ酸配列の変化有無に応じてミスセンス(missense)突然変異またはノンセンス(nonsense)突然変異に区分することができる。遺伝子の少なくとも一つの塩基対において、この突然変異は間違ったアミノ酸を導入し、翻訳が速やかな中断を誘導する。もし停止コドンが突然変異の結果としてコーディング地域に形成されると、これも翻訳の未成熟終了(termination)を誘導する。典型的に多数のコドンが欠失されると、酵素活性が完全に損失してしまう。このような突然変異の発生に関する具体的な内容は、Knippers("Molecular Genetics", 6th edition, 1995)、Winnacker ("Genes and Clones", , 1990)またはHagemann("General Genetics", 1986)などの著名な遺伝学および分子生物学教科書を参考することができる。
【0014】
本願で使用される用語「増進(enhancement)」とは、相応するDNAによってコードされる酵素の細胞内活性の増加をいう。酵素の細胞内活性の増進は遺伝子の過発現によってなされ得る。目的遺伝子の過発現は、前記遺伝子のプロモーター地域または5’−UTR地域の塩基配列を変形させることによりタンパク質の発現を増進させることができ、目的の遺伝子を染色体上に追加導入することにより発現を強化させることができ、目的の遺伝子をベクター上に自己プロモーターまたは強化された別個のプロモーターと共に導入して菌株に形質転換させることによりタンパク質の発現量を強化させることができる。また、酵素の細胞内活性の増進は、目的遺伝子のORF(open reading frame)地域に突然変異を導入することによりなされ得る。増進の測定によれば、相応するタンパク質の活性または濃度が野生型タンパク質または初期の微生物菌株における活性または濃度を基準として、一般に最少10%、25%、50%、75%、100%、150%、200%、300%、400%または500%、最大1000%または2000%まで増加することが分かる。
本発明の具体的な実施様態において、L−メチオニン前駆体生産菌株を準備する方法は次のとおりである。
第1段階として、O−スクシニルホモセリンまたはO−アセチルホモセリンなどのL−メチオニン前駆体を蓄積するために、シスタチオニンガンマシンターゼ、O−スクシニルホモセリンスルフヒドリルリアーゼまたはO−アセチルホモセリンスルフヒドリルリアーゼなどのタンパク質をコードする遺伝子を菌株において欠損または弱化させる。
【0015】
シスタチオニンガンマシンターゼをコードする遺伝子を通称「metB」と表示し、O−スクシニルホモセリンスルフヒドリルリアーゼをコードする遺伝子を通称「metZ」と表示し、O−アセチルホモセリンスルフヒドリルリアーゼをコードする遺伝子を通称「metY」と表示する。前述した活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、例えば、大腸菌(Escherichai coli.)における公知のmetBである。この遺伝子のゲノム塩基配列は以前の文献「Blattner et. al., Science 277: 1453-1462 (1997)」によって公開されたE.coliのゲノム塩基配列( Accession No.AAC75876)から得ることができる。また、前記遺伝子配列は、米国生物工学情報センター(NCBI、National Center for Biotechnology Information)および日本DNAデータバンク(DDBJ、DNA Data Bank Japan)から得ることができる。この他にも、同じ活性を持つ遺伝子として、コリネバクテリウムのmetBとmetY、シュードモナス(Pseudomonas.)由来のmetZなどを例示することができる。
シスタチオニンガンマシンターゼまたはO−スクシニルホモセリンスルフヒドリルリアーゼまたはO−アセチルホモセリンスルフヒドリルリアーゼは、次の反応式に示すように、O−スクシニルホモセリンまたはO−アセチルホモセリンをシスタチオニンまたはホモシステインに転換する能力を持っている。よって、この活性を持つ遺伝子を弱化させる場合、O−スクシニルホモセリンまたはO−アセチルホモセリンが培養液に過量蓄積される。
L−システイン+O−スクシニル−L−ホモセリン⇔スクシネート+シスタチオニン
L−システイン+O−アセチル−L−ホモセリン⇔アセテート+シスタチオニン
HS+O−スクシニル−L−ホモセリン⇔スクシネート+ホモシステイン
HS+O−アセチル−L−ホモセリン⇔アセテート+ホモシステイン
【0016】
第2段階として、第1段階で準備された菌株にホモセリンキナーゼをコードするthrB遺伝子を除去または弱化させる。ThrB遺伝子はホモセリンからO−ホスホホモセリン(phosphohomoserine)の合成を随伴し、次いでthrC遺伝子によってトレオニンに転換される。合成されたホモセリンが全量メチオニンの前駆体合成に利用できるようにするために、thrB遺伝子を欠損または弱化させる。
第3段階として、メチオニン合成経路の転写調節因子を欠損または弱化させる。メチオニン合成を随伴するmetA、metB、metC、metEおよびmetF遺伝子は、フィードバック調節体系によって抑制される。metJ遺伝子はE.coliにおける典型的な転写調節因子である。メチオニン前駆体を合成するためにmetAまたはmetX遺伝子を過発現させなければならず、このためにmetJの除去が必要である。よって、E.coliからmetJを除去すると、metAまたはmetX遺伝子の発現が常に促進された状態となり、L−メチオニン前駆体を大量生産することができる。
前記第2段階と前記第3段階は、前駆体生産菌株によって異なり、前駆体生産菌株を製作するために必須的ではない。より好ましくは、エシェリキア属の微生物における前駆体生産経路を強化するために行うことができる。
【0017】
第4段階として、L−メチオニン前駆体であるO−アセチルホモセリンの合成を増加させるために、メチオニン生合成経路の第1過程を媒介する酵素としてのホモセリンO−アセチルトランスフェラーゼをコードするmetX遺伝子の発現を増進させる。metXは
ホモセリンO−アセチルトランスフェラーゼの活性を持つタンパク質をコードする遺伝子の通称であり、新規の外部のホモセリンO−アセチルトランスフェラーゼは様々な微生物種から得られる。例えば、ホモセリンO−アセチルトランスフェラーゼは、コリネバクテリウム属(corynebacterium sp.)、レプトスピラ属(Leptospira sp.)、デイノコッカス属(Deinococcus sp.)、シュードモナス属(Pseudomonas sp.)、またはマイコバクテリウム属(Mycobacterium sp.)から選ばれた菌株に由来する遺伝子によってコードされる。好ましくは、前記ホモセリO−アセチルトランスフェラーゼはコリネバクテリウムグルタミカム(corynebacterium glutamicum)、レプトスピラメイエリ(Leptospira meyeri)、デイノコッカスラジオデュランス(Deinococcus radiodurans)、シュードモナスエレギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、またはマイコバクテリウムスメグマチス(Mycobacterium smegmatis)から選ばれた菌株に由来する遺伝子によってコードされる。さらに好ましくは、前記ホモセリンO−アセチルトランスフェラーゼはUniproデータベース登録番号Q9RVZ8(配列番号32)、NP_249081(配列番号33)またはYP_886028(配列番号34)のアミノ酸配列を有する。レプトスピラメイエリ(Leptospira meyeri)に由来したmetX遺伝子は、フィードバック抵抗性(J Bacteriol. 1998 Jan;180(2):250-5. Belfaiza J et al.)があるものと知られている。様々なホモセリンO−アセチルトランスフェラーゼは、以前、本発明者らの研究からフィードバック抵抗性が確認された。
【0018】
metX遺伝子の導入および増進は、遺伝子の導入によって、または5’−UTRのヌクレオチド配列と遺伝子のプロモーター地域の変形によって、または目的遺伝子のORF地域への突然変異導入によってなされ得る。metX遺伝子発現の増進によって結局メチオニン前駆体合成が増加する。
第5段階として、O−スクシニルホモセリンまたはO−アセチルホモセリンの前駆体であるホモセリンの合成を増加させるために、アスパルトキナーゼまたはホモセリンデヒドロゲナーゼの活性を増進させる。thrAは、アスパルトキナーゼおよびホモセリンデヒドロゲナーゼの活性を持つペプチドをコードする遺伝子の通称である。好ましくは、アスパルトキナーゼおよびホモセリンデヒドロゲナーゼは、Uniproデータベース登録番号AP_000666の遺伝子によってコードされる。さらに好ましくは、thrA遺伝子によってコードされるアミノ酸配列は、配列番号27に示されたが、アミノ酸位置345に突然変異を持っている。ThrA活性の増進は、thrA遺伝子への突然変異導入によって染色体上に目標の遺伝子をさらに導入し、過程処理されたプラスミドをさらに導入することによりなされ得る。
L−メチオニン前駆体であるO−アセチルホモセリンは、前記第1段階〜第5段階の全体過程または一部分を用いることにより菌株に蓄積できる。
【0019】
L−メチオニン前駆体生産菌株は、L−リシン(lysine)、L−トレオニン、L−イソロイシン(isoleusine)を生産する菌株を用いて製造することができる。好ましくは、L−トレオニンを生産する菌株を使用することにより製造する。この場合には、既にホモセリンまでの合成が円滑に行われた菌株であって、さらに多くのメチオニン前駆体を合成することができる。したがって、トレオニン生産菌株を用いて、トレオニン生合成経路に関与する遺伝子、およびmetA、metY、metZを欠損または弱化させることにより、メチオニン前駆体を蓄積することができる。また、metX遺伝子発現を増進させてより多量のメチオニン前駆体を合成することができる。
本願で使用される用語「L−トレオニン生産菌株」とは、生体内でL−トレオニンを生産することが可能な原核または眞核微生物菌株をいう。例えば、エシェリキア属(Escherichia sp.)、エルウィニア属(Erwinia sp.)、セラシア属(Serratia sp.)、プロビデンシア属(Providencia sp.)、コリネバクテリウム属(Corynebacteria sp.)、またはブレビバクテリウム属(Brevibacteria sp.)に属するL−トレオニン生産微生物菌株が含まれ得る。これらの中でも、エシェリキア属(Escherichia sp.)が好ましく、大腸菌(Escherichia coli)がさらに好ましい。
【0020】
本発明の好適な具体例において、L−トレオニンを生産するE.coli突然変異菌株であるTF4076(KFCC10718、韓国特許公告第92−8365号)から形質転換されたL−トレオニン生産および独立菌株としてのCJM002を使用した。TF4076は、メチオニン要求性、メチオニン類似体(例えば、α−アミノ−β−ヒドロキシバレリアン酸、AHV)、リシン類似体(例えば、S−(2−アミノエチル)−L−システイン、AEC)に対する耐性、イソロイシン類似体(例えば、α−アミノ酪酸)に対する耐性などの特徴を持つ。TF4076はメチオニン要求性菌株であって、細胞内でメチオニンは合成できない。本発明者らはこのようなメチオニン要求性を解除してメチオニン生産菌株として用いるために、NTGを使用した人工的な突然変異法を用いて、メチオニン要求性が解除されたトレオニン生産菌株E.coli CJM002を製造した。前記E.coli CJM002は、Escherichia coli MF001と命名し、2004年4月9日にKCCM(Korean Culture Center of Microorganism、韓国ソウル市西大門区弘済1洞ユリムビル361−221)に寄託番号KCCM−10568で寄託した。
本発明において、E.coli CJM002菌株のmetB、thrB、metJおよびmetA遺伝子を欠損させた後、metA位置にmetXを導入した。このように製造された最終的なL−メチオニン前駆体生産菌株はCJM−Xと命名した。CJM−X菌株のmetX遺伝子はD.radioduransに由来した。CJM−X菌株をthrA発現ベクターで形質転換させ、これをCJM−X(pthrA(M)_CL)と命名した。前記方法によって製造されたO−アセチルホモセリン生産菌株Escherchia coli CJM−X(pthrA(M)−CL)は2008年1月23日に寄託番号KCCM10921Pで寄託した。
【0021】
本発明の好適な具体例において、PCT/KR2005/00344で開示されたL−トレオニン生産菌株FTR2533を使用することができる。FTR2533は、Escherichia coli寄託番号KCCM10236から派生したEscherichia coli TFR7624に由来した。Escherichia coli寄託番号KCCM10236は、Escherichia coli TF4076に由来した。 Escherichia coli寄託番号KCCM10236は、PEPからオキサロ酢酸(oxaloacetate)形成の触媒として作用するppc遺伝子とアスパラギン酸塩からトレオニンを生合成するために必要な酵素、例えばthrA:アスパルトキナーゼ1−ホモセリンデヒドロゲナーゼ、thrB:ホモセリンキナーゼ、thrC:トレオニンシンターゼを高水準で発現するので、L−トレオニンの生産を増加させることができる。また、Escherichia coli FTR7624(KCCM10538)はL−トレオニン生合成のために必要なtyrB遺伝子の発現を抑制する非活性tryR遺伝子を持っている。また、Escherichia coli FTR2533(KCCM10541)は、非活性化されたgalR遺伝子を持つL−トレオニン生産菌株であると同時に、L−トレオニン生産E.coli突然変異菌株である。
本発明の具体的な実施例において、E.coli FTR2533菌株のmetB、thrB、metJおよびmetA遺伝子を欠損させた後、metAの位置にmetX遺伝子を導入した。このように製造された最終的なL−メチオニン前駆体はCJM2−Xと命名した。CJM2−X菌株のmetX遺伝子はD.radioduransに由来した。CJM2−X菌株をthrA発現ベクターで形質転換させ、これをCJM2−X(pthrA(M)−CL)と命名した。前記方法によって製造したEscherichia coli CJM2−X(pthrA(M)−CL)は、2008年2月12日に寄託番号KCCM10925Pで寄託した。
【0022】
別の様態において、本発明は、L−メチオニン前駆体を生産する方法に関するものである。具体的には、本発明は、a)前記微生物菌株を発酵させる段階と、b)培地または菌株内でO−アセチルホモセリンを培養する段階、およびc)O−アセチルホモセリンを分離する段階を含んでなる、O−アセチルホモセリンの生産方法に関する。
前記で製造されたL−メチオニン前駆体生産菌株の培養は、当業界における公知の適切な培地と培養条件によって行われ得る。このような培養過程は、当業者であれば選択される菌株に応じて容易に調整して使用することができる。前記培養方法は、例えば回分式、連続式および流加式培養を含むが、これに限定されない。このような様々な培養方法は、例えば、文献「"Biochemical Engineering"by James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, pp 138-176.」に開示されている。
培養に使用される培地は、特定菌株の要求条件を適切に満足させなければならない。様々な微生物培養培地は、例えば、文献「"Manual of Methods for General Bacteriology" by the American Society for Bacteriology, Washington D.C., USA, 1981.」に開示されている。これらの培地は多様な炭素源、窒素源および微量元素成分を含む。炭素源は、例えば、グルコース(glucose)、ラクトース(lactose)、スクロース(sucrose)、フルクトース(fructose)、マルトース(maltose)、スターチ(starch)およびセルロース(cellulose)などの炭水化物;大豆油(soybean oil)、ヒマワリ油(sunflower oil)、ヒマシ油(castor oil)またはココナツオイル(coconut oil)などの脂肪;パルミチン酸(palmitic acid)、ステアリン酸(stearic acid)およびリノール酸(linoleic acid)などの脂肪酸;グリセロール(glycerol)およびエタノール(ethanol)などのアルコールと酢酸(acetic acid)などの有機酸(organic acid)を含む。これらの炭素源は単独でまたは組み合わせて使用できる。窒素源としては、ペプトン(peptone)、酵母抽出液(yeast extract)、肉汁(gravy)、麦牙抽出液(malt extract)、コーンスティープリカー(corn steep liquor(CSL))およびベスン粉(bean flour)などの有機窒素源および尿素(urea)、硫酸アンモニウム(ammonium sulfate)、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムおよび硝酸アンモニウムなどの無機窒素源を含む。これらの窒素源は単独でまたは組み合わせて使用できる。前記培地には、リン酸源としてさらにリン酸二水素カリウム(potassium dihydrogen phosphate)、リン酸水素二カリウム(dipotassium hydrogen phosphate)および相応するナトリウム含有塩(sodium-containing salts)を含むことができる。また、培地は硫酸マグネシウム(magnesium sulfate)または硫酸鉄(iron sulfate)などの金属を含むことができる。また、アミノ酸、ビタミンおよび適切な前駆体などが添加できる。これらの培地または前駆体は培養物に回分式または連続式で添加できる。
【0023】
また、培養中に水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸および硫酸などの化合物を適切な方式で添加することにより、培養物のpHを調整することができる。また、培養中に脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を使用することにより培養する間に気泡の生成を抑えることができる。また、培養液の好気性条件を保つために、培養液内に酸素または酸素含有ガス(例えば、空気)が注入できる。培養物の温度は一般に20〜45℃、好ましくは25〜40℃である。培養の期間はL−メチオニン前駆体の生産が所望の水準に到達するまで続くことができ、好ましい培養時間は10〜160時間である。
【発明の効果】
【0024】
本発明のメチオニン前駆体生産菌株を使用する場合、メチオニンは、典型的な化学的メチオニン合成方法より環境親和的に生産することができる。また、本発明に係る菌株から生産されたO−アセチルホモセリンから転換されたL−メチオニンは、動物飼料または動物飼料添加剤だけでなく、ヒトの食品または食品添加剤の生産に広く使用できる。
本発明のメチオニン前駆体生産菌株を使用する場合、メチオニンは、典型的な化学的メチオニン合成方法より環境親和的に生産することができる。また、本発明に係る菌株から生産されたO−アセチルホモセリンから転換されたL−メチオニンは、動物飼料または動物飼料添加剤だけでなく、ヒトの食品または食品添加剤の生産に広く使用できる。
【図面の簡単な説明】
【0025】
【図1】メチオニン前駆体生産菌株の遺伝的操作を説明する図である。
【図2】メチオニン生産のための2段階過程の化学的な構造を説明した図である。
【図3】metX遺伝子発現のためのpCJ−MetX−CLの開裂地図を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0026】
以下、本発明を実施例によってさらに詳しく説明する。但し、これらの実施例は本発明を例示するものに過ぎず、本発明を限定するものではない。
実施例1:メチオニン前駆体生産菌株の製造
<1−1>metB遺伝子の欠損
E.coli菌株においてシスタチオニンシンターゼをコードするmetB遺伝子を欠損させるために、FRT−one−step PCR deletion方法を行った(PNAS(2000)vol97:P6640〜6645)。配列番号1および配列番号2のプライマーを用いてpKD3ベクター(PNAS(2000)vol97:P6640〜6645)を鋳型としてPCR反応によって欠損カセットを構成した。PCRは、94℃で30秒の変性過程(denaturation)、55℃で30秒のアニーリング過程(annealing)および72℃で1分の伸長過程を1サイクルとして、これを30サイクル繰り返すことにより行った。
【0027】
その結果として得られたPCR産物を1.0%アガロースゲルで電気泳動した後、1.2kbpサイズのバンドからDNAを精製した。回収されたDNA断片はpKD46ベクター(PNAS(2000)vol97:P6640〜6645)を予め形質転換させたE.coli(K12)W3110菌株にエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションのために、pKD46で形質転換されたW3110菌株は、100μg/Lアンピシリンと5mM L−アラビノースが含まれたLB培地を用いて、OD600が0.6に到達するまで30℃で培養した。滅菌蒸留水で2回、10%グリセロールで1回洗浄して使用した。エレクトロポレーションは2500Vで加えた。回収された菌株を25μg/Lのクロラムフェニコール(chloramphenicol)を含んだLB平板培地に塗抹して37℃で一晩培養した後、耐性を示す菌株を選別した。
【0028】
選別された菌株は、菌株を鋳型として同一のプライマーを用いて同一の条件でPCRした後、1.0%アガロースゲル上で遺伝子のサイズが1.2Kbと観察されることを確認することにより、metB遺伝子の欠損を確認した。確認された菌株はさらにpCP20ベクター(PNAS(2000)vol97:P6640〜6645)で形質転換させてLB培地で培養した。その後、再び同一条件のPCRによって1.0%アガロースゲル上で遺伝子のサイズが150bpに小さくなった最終metB遺伝子欠損菌株を製作し、クロラムフェニコールマーカーが除去されたことを確認した。製作された菌株をW3−Bと命名した。
【0029】
<1−2>thrB遺伝子の欠損
ホモセリンキナーゼをコードする遺伝子としてのthrB遺伝子を欠損させることにより、ホモセリンからO−スクシニルホモセリンの合成量を増加させようとした。特にトレオニン生産菌株を用いる場合、ホモセリンの利用活性が非常に大きいため、この遺伝子の欠損が必ず必要である。前記製作されたW3−B菌株からthrB遺伝子を欠損させるために、metB遺伝子欠損時と同一のFRT one step PCR deletion方法を使用した。
thrB欠損カセットを製作するために、pKD4ベクター(PNAS(2000)vol197:P6640〜6645)を鋳型として、配列番号3、4のプライマーを用いて、94℃で30秒の変性段階、55℃で30秒のアニーリング段階および72℃で1分の延長段階を1サイクルとして、これを30サイクル繰り返すPCR反応を行った。
その結果として得られたPCR産物を1.0%アガロースゲルで電気泳動した後、1.6kbpサイズのバンドからDNAを精製した。回収されたDNA断片をpKD46ベクターで予め形質転換させたW3−B菌株にエレクトロポレーションした。回収された菌株を、50μg/Lのカナマイシンを含んだLB平板培地に塗抹し、37℃で一晩培養した後、耐性を示す菌株を選別した。
【0030】
選別された菌株は菌株を直接鋳型として配列番号3、4のプライマーを用いて同一の条件でPCRした後、1.0%アガロースゲル上で遺伝子のサイズが1.6Kbと確認される菌株を選別することにより、thrB遺伝子の欠損を確認した。確認された菌株はさらにpCP20ベクターで形質転換させてLB培地で培養し、さらに同一条件のPCRによって1.0%アガロースゲル上で遺伝子のサイズが150bpに小さくなった最終thrB遺伝子欠損菌株を製作し、カナマイシンマーカーが除去されたことを確認した。製作された菌株はW3−BT菌株と命名した。
【0031】
<1−3>metJ遺伝子の欠損
メチオニン前駆体の合成に関与するmetA遺伝子の調節遺伝子であるmetJ遺伝子を欠損させるために、metB遺伝子欠損時と同一のFRT one step PCR deletion方法を使用した。metJ遺伝子欠損カセットを製作するために、配列番号5、6のプライマーを用いて、94℃で30秒の変性(denaturation)段階、55℃で30秒のアニーリング(annealing)段階および72℃で1分の延長(extension)段階を1サイクルとして、これを30サイクル繰り返し行った。
その結果として得られたPCR産物を1.0%アガロースゲルで電気泳動した後、1.2kbpサイズのバンドからDNAを精製した。回収されたDNA断片をpKD46ベクターで予め形質転換させたW3−BT菌株にエレクトロポレーションした。回収された菌株を、クロラムフェニコールを含んだLB平板培地に塗抹して37℃で一晩培養した後、耐性を示す菌株を選別した。
【0032】
選別された菌株を直接鋳型として配列番号7、8のプライマーを用いて同一の条件でPCRした後、1.0%アガロースゲル上で遺伝子のサイズが1.6Kbに変化することを確認することにより、metJ遺伝子の欠損を確認した。確認された菌株はさらにpCP20ベクターで形質転換してLB培地で培養し、さらに同一条件のPCRによって1.0%アガロースゲル上で遺伝子のサイズが600bpに小さくなった最終metJ遺伝子欠損菌株を製作し、クロラムフェニコールマーカーが除去されたことを確認した。製作された菌株をW3−BTJと命名した。
【0033】
<1−4>metA遺伝子の欠損
O−アセチルホモセリンの生産を増加させるために、ホモセリンO−スクシニルトランスフェラーゼをコードするmetA遺伝子をW3−BTJ菌株から除去した。metX遺伝子挿入がO−スクシニルホモセリンおよびO−アセチルホモセリンの蓄積をもたらすという発見に基づき、metA遺伝子欠損がO−アセチルホモセリンの蓄積を誘導するものと期待された(表3)。metA遺伝子を除去するために、FRT one step PCR deletion方法を行った。
metA遺伝子欠損カセットを製作するために、配列番号9、10のプライマーを用いて、94℃で30秒の変性段階、55℃で30秒のアニーリング段階および72℃で1分の延長段階を1サイクルとして、これを30サイクル繰り返し行った。
その結果として得られたPCR産物は、1.0%アガロースゲルで電気泳動した後、1.2kbpサイズのバンドからDNAを精製した。回収されたDNA断片をpKD46ベクターで予め形質転換させたW3−BT菌株にエレクトロポレーションした。回収された菌株を、クロラムフェニコールを含んだLB平板培地に塗抹して37℃で一晩培養した後、耐性を示す菌株を選別した。
【0034】
選別された菌株を直接鋳型として配列番号9、10のプライマーを用いて同一の条件でPCRした後、1.0%アガロースゲル上で遺伝子のサイズが1.1Kbpに変化することを確認することにより、metA遺伝子の欠損を確認した。確認された菌株はさらにpCP20ベクターで形質転換してLB培地で培養し、さらに同一条件のPCRによって1.0%アガロースゲル上で遺伝子のサイズが100bpに小さくなった最終metA遺伝子欠損菌株を製作し、クロラムフェニコールマーカーが除去されたことを確認した。製作された菌株をW3−BTJAと命名した。
【0035】
<1−5>metX遺伝子の過発現
O−アセチルホモセリンの合成のために、メチオニン前駆体であるO−アセチルホモセリン合成遺伝子、すなわちホモセリンO−アセチルトランスフェラーゼ(homoserine O-acetyl transferase)をコードするmetX遺伝子を過発現させようとした。
このために、レプトスピラメイエリ(Leptospira meyeri)のクロモソーム(chromosome)を鋳型として配列番号28、29番のプライマーを用いて、94℃で30秒の変性段階、55℃で30秒のアニーリング段階および72℃で2分の延長段階を1サイクルとして、これを25サイクル繰り返すPCR反応を行った。
その結果として得られたPCR産物を1%アガロースゲルで電気泳動した後、1.1kbpサイズのバンドからDNAを精製した。回収されたDNA断片をpCL1920ベクターにCJ1プロモーターとEcoRV制限酵素を用いて連結した。連結されたベクターでE.coliを形質転換させ、50μg/Lのスペクチノマイシンが含まれたLB培地で培養した後、選別した。このように製造されたベクターをpCJ1−MetXlme−CLと命名した。前記ベクターでW3−BTJ菌株を形質転換させて製作された菌株をW3−BTJ/pCJ−MetXlme−CLと命名し、O−アセチルホモセリンの増加を観察した。
【0036】
metX遺伝子を過発現させるための他の方法として、コリネバクテリウムグルタミカム(corynebacterium glutamicum)のクロモソーム(chromosome)を鋳型として配列番号30、31番のプライマーを用いて、94℃で30秒の変性段階、55℃で30秒のアニーリング段階および72℃で2分の延長段階を1サイクルとして、これを25サイクル繰り返すPCR反応を行った。
その結果として得られたPCR産物を1%アガロースゲルで電気泳動した後、DNAを精製した。回収されたDNA断片をpCL1920ベクターにCJ1プロモーターとEcoRV制限酵素を用いて連結した。連結されたベクターでE.coliを形質転換させ、50μg/Lのスペクチノマイシンが含まれたLB培地で培養した後、選別した。このように製造されたベクターをpCJ1−MetXcgl−CLと命名した。前記ベクターでW3−BTJ菌株を形質転換させて製作された菌株をW3−BTJ/pCJ−MetXcgl−CLと命名し、O−アセチルホモセリンの増加を観察した。
【0037】
metX遺伝子を過発現させるための別の方法として、デイノコッカスラジオデュランス(Deinococcus radiodurans)を鋳型として配列番号11、12番のプライマーを用いて、94℃で30秒の変性段階、55℃で30秒のアニーリング段階および72℃で2分の延長段階を1サイクルとして、これを25サイクル繰り返すPCR反応を行った。
その結果として得られたPCR産物を1%アガロースゲルで電気泳動した後、DNAを精製した。回収されたDNA断片をpCL1920ベクターにCJ1プロモーターとEcoRV制限酵素を用いて連結した。連結されたベクターでE.coliを形質転換させ、50μg/Lのスペクチノマイシンが含まれたLB培地で培養した後、選別した。このように製造されたベクターをpCJ1−MetXdra−CLと命名した。前記ベクターでW3−BTJ菌株を形質転換させて製作された菌株をW3−BTJ/pCJ−MetXdra−CLと命名し、O−アセチルホモセリンの増加を観察した。
metX遺伝子を過発現させるための別の方法として、マイコバクテリウムスメグマチス(Mycobacterium smegmatis)を鋳型として配列番号13、14番のプライマーを用いて、94℃で30秒の変性段階、55℃で30秒のアニーリング段階および72℃で2分の延長段階を1サイクルとして、これを25サイクル繰り返すPCR反応を行った。
【0038】
その結果として得られたPCR産物を1%アガロースゲルで電気泳動した後、DNAを精製した。回収されたDNA断片をpCL1920ベクターにCJ1プロモーターとEcoRV制限酵素を用いて連結した。連結されたベクターでE.coliを形質転換させ、50μg/Lのスペクチノマイシンが含まれたLB培地で培養した後、選別した。このように製造されたベクターをpCJ1−MetXmsm−CLと命名した。前記ベクターでW3−BTJ菌株を形質転換させて製作された菌株をW3−BTJ/pCJ−MetXmsm−CLと命名し、O−アセチルホモセリンの増加を観察した。
metX遺伝子を過発現させるための別の方法として、シュードモナスエレギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)を鋳型として配列番号15、16番のプライマーを用いて、94℃で30秒の変性段階、55℃で30秒のアニーリング段階および72℃で2分の延長段階を1サイクルとして、これを25サイクル繰り返すPCR反応を行った。
【0039】
その結果として得られたPCR産物を1%アガロースゲルで電気泳動した後、DNAを精製した。回収されたDNA断片をpCL1920ベクターにCJ1プロモーターとEcoRV制限酵素を用いて連結した。連結されたベクターでE.coliを形質転換させ、50μg/Lのスペクチノマイシンが含まれたLB培地で培養した後、選別した。このように製造されたベクターをpCJ1−MetXpae−CLと命名した。前記ベクターでW3−BTJ菌株を形質転換させて製作された菌株をW3−BTJ/pCJ−MetXpae−CLと命名し、O−アセチルホモセリンの増加を観察した。
このように製造されたベクターをW3−BTJA菌株にそれぞれエレクトロポレーションし、菌株の生産能力を実施例2−1で説明されたようにフラスコ培養を用いて検定した。各菌株のO−アセチルホモセリン生産能力は、コリネバクテリウムグルタミカムに由来したmetXベクターを導入した菌株のO−アセチルホモセリン生産能力(PCT/KR2007/003650)を100%としてそれぞれ測定した。その結果、O−アセチルホモセリン生産能力はベクターpCJ−MetXdra−CL、pCJ−MetXmsm−CLおよびpCJ−MetXlme−CLでそれぞれ形質転換された菌株において著しく増加した。
【0040】
【表1】

【0041】
前述した3つの中でも最も効果的な生産を示すデイノコッカスラジオデュランス(Deinococcus radiodurans)(metX(dra)由来のmetX遺伝子の安定的な発現のために、前記metX(dra)遺伝子をE.coliの染色体に挿入した。metX(dra)挿入菌株を構成するために、pSGベクター体系を使用した(Appl. Environ. Microbiol. 1993 V59. p.3485-3487, villaverde. A et. al)。
まず、配列番号17、18のプライマーを用いてゲノムDNAからmetAの上流(upstream)地域の600bpを増幅し、配列番号19、20のプライマーを用いてゲノムDNAからmetAの下流(downstream)地域の600bpを増幅した。次に、配列番号21、22のプライマーを用いてmetX(dra)を増幅した。その結果として得られたPCR産物はゲル抽出によって分離し、断片の混合物は配列番号23、24をプライマーとしてPCR増幅した。増幅されたDNAは、制限酵素BamHI/EcoRIで切断し、pSG76Cベクターにクローニング(cloning)した。前記で構成されたベクターでW3−BTJA菌株を形質転換させ、クロラムフェニルコール抵抗性菌株を選別し、metX dra遺伝子が成功的にクローニングされたことを確認した。選別された菌株のマーカーを除去するために、plscelベクターで形質転換させ、再び選別した。前記菌株のO−アセチルホモセリン生産能力を確認した結果、metX(dra)遺伝子が導入された菌株の生産はpCL−metXdraプラスミドを含有した菌株の生産と類似の生産能を示した。
【0042】
<1−6>thrA遺伝子の過発現
O−アセチルホモセリンの生産をさらに効果的に増加させるために、thrA遺伝子を過発現させた。
このために、L−トレオニン生産菌株であるE.coli CJM002(KCCM10568)の染色体を鋳型として配列番号25、26のプライマーを用いてPCR増幅した。増幅されたDNA断片は、ゲル−抽出によって分離し、制限酵素EcoRVを用いてpCL1920ベクターのCJ1プロモーターに連結した。連結されたベクターはpCJ−thrA(M)−CLと命名した。このベクターで、実施例1−1〜1−5の方法により製造された菌株を形質転換させた。thrA遺伝子によってコードされるアミノ酸配列は、配列番号27に示され、アミノ酸位置345に突然変異を持っている。
【0043】
<1−7>L−トレオニン生産菌株の転換
メチオニン要求性が解除されたL−トレオニン生産菌株である大腸菌CJM002(KCCM−10568号)を用いて、前記1−1〜1−5と同様の方法でO−アセチルホモセリン生産菌株を製作してCJM−Xと命名した。CJM−X菌株の染色体は、デイノコッカスラジオデュランス(Deinococcus radiodurans)由来のmetX遺伝子を持っている。また、PCT/KR2005/00344に記載されたL−トレオニン生産菌株である大腸菌FTR2533(KCCM10541)を用いて、前記1−1〜1−5と同様の方法でメチオニン前駆体生産菌株を製作し、これをCJM−2Xと命名した。CJM−2X菌株の染色体は、デイノコッカスラジオデュランス由来のmetX遺伝子を持っている。また、それぞれの菌株は実施例1−6に説明されたようにthrA発現ベクターで形質転換させ、メチオニン前駆体生産量を測定した。
【0044】
実施例2:L−メチオニン前駆体の生産のための発酵
<2−1>フラスコ培養実験
実施例1で製作された菌株のメチオニン前駆体生産量を実験するために、三角フラスコ培養を行った。平板LB培地にmetX発現ベクターおよびCJM−X、CJM2−X、CJM2−X/pthrA(M)−CLで形質転換させたCJM2−BTJA菌株を接種して31℃で一晩培養した。O−アセチルホモセリン前駆体生産菌株である大腸菌CJM−BTJA(pCJ−MetX−CL)はPCT/KR2007/003650に記載されており、2007年7月5日に寄託番号KCCM−10873で寄託した。
単一コロニーをスペクチノマイシンの含まれた3mLのLB培地に接種した後、31℃で5時間培養し、さらに25mLのメチオニン前駆体生産培地を含んだ250mLの三角フラスコに200倍希釈して31℃の200rpmで64時間培養し、HPLC分析によってメチオニン前駆体生産量を比較した(表2および表3)。その結果、メチオニン要求性が解除されたトレオニン生産菌株を用いて製作されたメチオニン前駆体生産菌株の場合において、メチオニン前駆体生産量が著しい増加したことが分かった。
【0045】
【表2】

【0046】
【表3】

【0047】
<2−2>大容量発酵
O−アセチルホモセリンを大量生産するために、O−アセチルホモセリン生産能力を示す幾つかの菌株を選択して5Lの発酵槽で培養した。それぞれの菌株を、抗生剤スペクチノマイシンの含有された平板LB培地に接種して31℃で一晩培養した。その後、単一コロニーを、スペクチノマイシンを含有するLB培地10mLに接種した後、31℃で5時間培養した。培養液は、200mLのメチオニン前駆体シード培地を含有する1000mLの三角フラスコに100倍希釈して31℃、200rpmで3〜10時間培養した後、5Lの発酵槽に接種して流加式(Fed batch)培養発酵法で20〜100時間培養した。このように培養した発酵液でメチオニン前駆体の濃度をHPLCで分析した結果は、表5のとおりであった。
【0048】
【表4】

【0049】
【表5】


【特許請求の範囲】
【請求項1】
a)コリネバクテリウム属(corynebacterium sp.)、レプトスピラ属(Leptospira sp.)、デイノコッカス属(Deinococcus sp.)、シュードモナス属(Pseudomonas sp.)、またはマイコバクテリウム属(Mycobacterium sp.)から選ばれた菌株に由来するホモセリンO−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の挿入によってホモセリンO−アセチルトランスフェラーゼ活性(EC2.3.1.31)が導入および増進され、あるいは
b)アスパルトキナーゼまたはホモセリンデヒドロゲナーゼ活性(EC2.7.2.4または1.1.1.3)が増進され、あるいは
c)前記a)およびb)の特性を全て有する、O−アセチルホモセリンを生産することが可能なエシェリキア属(Escherichia sp.)由来菌株。
【請求項2】
前記ホモセリンO−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、コリネバクテリウムグルタミカム(corynebacterium glutamicum)、レプトスピラメイエリ(Leptospira meyeri)、デイノコッカスラジオデュランス(Deinococcus radiodurans)、シュードモナスエレギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、またはマイコバクテリウムスメグマチス(Mycobacterium smegmatis)から選択された菌株。
【請求項3】
前記ホモセリンO−アセチルトランスフェラーゼは、Unipro database No. Q9RVZ8, NP_249081またはYP_886028から選択された遺伝子でエンコーディングされた、請求項1に記載の菌株。
【請求項4】
前記アスパルトキナーゼまたはホモセリンデヒドロゲナーゼペプチドは、アミノ酸345番の位置に突然変異を持っている、請求項1に記載の菌株。
【請求項5】
前記アスパルトキナーゼまたはホモセリンデヒドロゲナーゼペプチドは、配列番号27のアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の菌株。
【請求項6】
前記菌株は、L−トレオニン、L−イソロイシンまたはL−リシンを生産する菌株に由来する、請求項1に記載の菌株。
【請求項7】
前記菌株は大腸菌(Escherichia coli.)である、請求項1に記載の菌株。
【請求項8】
前記菌株は、シスタチオニンガンマシンターゼ、O−スクシニルホモセリンスルフヒドリルリアーゼまたはO−アセチルホモセリンスルフヒドリルリアーゼが弱化または非活性化されている、請求項1に記載の菌株。
【請求項9】
前記菌株はホモセリンキナーゼが弱化または非活性されている、請求項1に記載の菌株。
【請求項10】
前記菌株は、メチオニン合成経路の転写調節因子が弱化または非活性化されている、請求項1に記載の菌株。
【請求項11】
前記菌株は、L−メチオニン−依存性から自由なトレオニン生産菌株である大腸菌MF001(Escherichia coli MF001、寄託番号KCCM10568)に由来する、請求項1に記載の菌株。
【請求項12】
前記菌株は、トレオニン生産菌株である大腸菌FTR2533(Escherichia coli FTR2533、寄託番号KCCM10541)に由来する、請求項1に記載の菌株。
【請求項13】
前記菌株は O−アセチルホモセリン(O-acetylhomoserine) 生産菌株であるEscherichia coli CJM-X(pthrA(M)-CL) (KCCM10921P)である、請求項1に記載の菌株。
【請求項14】
前記菌株は O−アセチルホモセリン(O-acetylhomoserine) 生産菌株であるEscherichia coli CJM2-X(pthrA(M)-CL) (KCCM10925P) である、請求項1に記載の菌株。
【請求項15】
1)請求項1〜14のいずれか1項による菌株を発酵させる段階と、2)培地または菌株内でO−アセチルホモセリンを培養する段階と、3)O−アセチルホモセリンを分離する段階とを含む、O−アセチルホモセリンの生産方法。


【図1】
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【図2】
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【図3】
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【公開番号】特開2010−75(P2010−75A)
【公開日】平成22年1月7日(2010.1.7)
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願2009−90021(P2009−90021)
【出願日】平成21年4月2日(2009.4.2)
【出願人】(508081075)シージェイチェイルジェダンコーポレーション (6)
【Fターム(参考)】