ＬＣＥによる肥満治療に有効な化合物の評価方法
肥満又は痩せの検査において、ＬＣＥ遺伝子又はタンパク質の被検組織又は被検細胞における発現レベルや、当該遺伝子における多型等に基づいた検査をする。また、肥満又は痩せの治療薬のスクリーニング等をはじめとする化合物の評価において、ＬＣＥ遺伝子又はタンパク質の性質を利用して当該評価をする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＬＣＥ（ｌｏｎｇ ｃｈａｉｎ ｆａｔｔｙ ａｃｙｌ ｅｌｏｎｇａｓｅ）遺伝子又はタンパク質を用いた肥満の治療又は予防に有効な化合物の評価方法に関する。また、本発明は、前記遺伝子又はタンパク質を用いた肥満の検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肥満は、高血圧症、糖尿病、高脂血症、虚血性心疾患等に代表される種々の成人病の危険因子である。また、これらの多くは慢性疾患であることから、将来的には医療費の高騰の原因になると考えられ、社会的にも大きな問題となっている。
【０００３】
このような肥満を防止するために抗肥満薬の開発が進められており、現在では、食欲抑制剤や脂質吸収阻害剤が臨床的に利用されている。ここで、抗肥満薬研究の標的分子としては、これまでにレプチン、ＰＰＡＲγ、ニューロペプチドＹ等が知られているが、肥満の原因は非常に多様であるため、創薬標的として作用機序の異なった標的分子が待望されている。
【０００４】
また、このような肥満状態あるいはその原因を適切に診断することは、その後の適切な治療にとって不可欠であるため、簡便で精度の高い肥満マーカーの出現が望まれている。また、近年、投与した薬剤の効果が被投与者の遺伝子多型等の遺伝子型に影響を受ける現象が見出されており、薬剤の開発段階における臨床試験やいわゆるオーダーメイド医療において、分子レベルでの検査や診断のマーカーが待望されている。
【０００５】
一方、脂肪酸の生合成はアセチルＣｏＡカルボキシラーゼと脂肪酸合成酵素によって行われる。ＬＣＥ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿０２４０９０（ヒト：配列番号１）；ＮＭ＿１３０４５０（マウス：配列番号２））は、脂肪酸合成酵素の一種であり、アセチルＣｏＡを基質として合成が始まる脂肪酸合成経路において、ラウリン酸からミリスチン酸、ミリスチン酸からパルミチン酸、パルミチン酸からステアリン酸、パルミトレイン酸からワクセン酸等、主に炭素数が１２以上の脂肪酸の炭素鎖の伸長を司ることが知られている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６（４８），４５３５８−４５３６６（２００１）；非特許文献１）。
【０００６】
例えば、ＷＯ０２／４４３２０号公報（特許文献１）には、ＥＬＧ５（ＬＣＥ）が多不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）を基質としてエロンゲース（ｅｌｏｎｇａｓｅ）としての活性を有することが記載されている。また、糖尿病モデルラットであるＳＴＺ ｉｎｄｕｃｅｄ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｒａｔの肝臓においてエロンゲースの活性が亢進する旨の報告（Ｓｕｎｅｊａ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１０４２：８１−８５；非特許文献２）を引用して、エロンゲースが糖尿病等の疾患に関与するとの記載がある。
【０００７】
また、摂餌によりマウスＦＡＣＥ（ＬＣＥ）の発現量が変化する旨の報告もある（Ｍａｔｓｕｚａｋａ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．，４３（６）：９１１−２０（２００２）；非特許文献３）。
【０００８】
【特許文献１】ＷＯ０２／４４３２０号
【非特許文献１】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６（４８），４５３５８−４５３６６，（２００１）
【非特許文献２】Ｓｕｎｅｊａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１０４２：８１−８５（１９９０）
【非特許文献３】Ｍａｔｓｕｚａｋａ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．，４３（６）：９１１−２０（２００２）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、前記文献には、ＬＣＥと肥満とについて直接的に示したデータは開示されておらず、また、その際、ＬＣＥの飽和脂肪酸に対するエロンゲース活性が重要な役割を果たすことについては何ら示されていなかった。
【００１０】
本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、ＬＣＥと肥満との直接的な関係を示すことにより、分子レベルで判断可能な肥満又は痩せの検査方法及び当該分子を用いた肥満及び痩せの検査薬等を提供することを目的とする。また、肥満又は痩せの治療薬や診断薬をスクリーニングする等、化合物の評価方法を提供することを目的とする。さらに、脂肪合成の抑制や肥満の抑制をする方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、体重変化とＬＣＥの発現量との間に一定の相関関係があることを見出し、本発明を完成した。
【００１２】
すなわち、本発明は、以下の肥満の治療又は予防に有効な化合物の評価方法（１）〜（４）を提供する。
（１）被検化合物を、被検動物又は被検細胞に、投与又は接触させる工程と、該被検化合物が、該被検動物又は該被検細胞中でＬＣＥ遺伝子あるいは該遺伝子と機能的に等価な遺伝子の発現レベルを調節するか否かを確認する工程と、を含むことを特徴とする肥満の治療又は予防に有効な化合物の評価方法。
（２）被験化合物を、ＬＣＥ遺伝子の発現調節領域とレポーター遺伝子との融合遺伝子を有する被検動物又は被検細胞に接触させる工程と、該レポーター遺伝子の被検動物又は被検細胞中での発現レベルを測定する工程と、を含むことを特徴とする肥満の治療又は予防に有効な化合物の評価方法。
（３）被検化合物を、ＬＣＥタンパク質に接触させる工程と、該被検化合物が、該タンパク質の活性に影響を与えるか否かを確認する工程と、を含むことを特徴とする肥満の治療又は予防に有効な化合物の評価方法。
（４）被検化合物を、ＬＣＥを含む複数種のエロンゲースタンパク質に接触させる工程と、該複数種のエロンゲースタンパク質の活性を測定する工程と、該複数種のエロンゲースタンパク質においてＬＣＥの活性を阻害する被検化合物を選択する工程と、を含むことを特徴とする肥満の治療又は予防に有効な化合物の評価方法。
【００１３】
ここで、前述した本発明の肥満の治療又は予防に有効な化合物の評価方法によって得られた化合物を有効成分として含有する肥満の治療又は予防剤も本発明に含まれる。
【００１４】
本発明は、また、ＬＣＥの脂肪酸合成活性を抑制することを特徴とする脂肪合成抑制方法を提供する。ここで、ＬＣＥの脂肪酸合成活性を抑制する手段は特に制限されないが、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）により抑制することが好ましい。ＲＮＡｉは、配列番号１３及び１４に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号１５及び１６に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）、配列番号１７及び１８に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号１９及び２０に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号２１及び２２に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号２３及び２４に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号２５及び２６に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号２７及び２８に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号２９及び３０に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号３１及び３２に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号３３及び３４に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号３５及び３６に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号３７及び３８に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号４９及び５０に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号５１及び５１に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ及び配列番号５３及び５４に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡからなる群から選択される一以上のｓｉＲＮＡを使用することにより達成されるが、特に、配列番号２３及び２４に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡを使用することが好ましい。
【００１５】
本発明は、また、ＬＣＥの脂肪酸合成活性をＲＮＡｉにより抑制することを特徴とする肥満の治療又は予防方法を提供する。ここで、ＬＣＥの脂肪酸合成活性を抑制する手段は特に制限されないが、ＲＮＡｉにより抑制することが好ましい。ＲＮＡｉは、上述のｓｉＲＮＡを使用することにより達成されるが、特に配列番号２３及び２４に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡを使用することが好ましい。
【００１６】
本発明は、また、以下の肥満の検査方法（１）〜（４）を提供する。
（１）被検組織又は被検細胞におけるＬＣＥ遺伝子の発現レベル又は発現レベルの変化を測定することを特徴とする肥満の検査方法。
（２）被検組織又は被検細胞におけるＬＣＥタンパク質の発現レベル又は発現レベルの変化を測定することを特徴とする肥満の検査方法。
（３）被検組織又は被検細胞におけるＬＣＥ遺伝子に存在する多型を検出することを特徴とする肥満の検査方法。
（４）ＬＣＥタンパク質と相互作用することによりＬＣＥ遺伝子の発現量に影響を及ぼすタンパク質の発現量又は活性を検出することを特徴とする肥満の検査方法。
【００１７】
本発明は、さらに、配列番号２３及び２４に記載の核酸からなることを特徴とするｓｉＲＮＡを提供し、当該ｓｉＲＮＡを含むことを特徴とするＬＣＥ発現抑制剤、脂肪合成抑制剤及び肥満の治療又は予防剤を提供する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の化合物の評価方法等によれば、ＬＣＥと肥満との直接的な関係が明らかとなり、分子レベルで判断可能な肥満又は痩せの検査方法及び当該分子を用いた肥満及び痩せの検査薬等を提供することが可能となる。また、肥満又は痩せの治療薬や診断薬のスクリーニング等、化合物の評価方法を提供することが可能となる。さらに、脂肪合成の抑制や肥満の抑制をする方法を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、ＬＣＥを強制発現させた細胞における、（ａ）ＬＣＥ ｍＲＮＡの発現量、及び（ｂ）ＬＣＥ活性を表すグラフである。ＨＥＫ２９３は非処理の細胞を、Ａ５はＬＣＥが中程度発現している細胞を、Ｄ８はＬＣＥが高発現している細胞を、それぞれ表す。
【図２】図２は、ＬＣＥを強制発現させた細胞における脂肪酸組成を表すグラフである。黒色部分は炭素鎖の炭素数が１８以上の脂肪酸を、白色部分は炭素鎖の炭素数が１６以下の脂肪酸を表す。（ａ）〜（ｃ）はトリグリセリドを構成する脂肪酸の組成を表し、（ｄ）〜（ｆ）はコレステロールエステルを構成する脂肪酸の組成を表し、（ｇ）〜（ｉ）はリン脂質を構成する脂肪酸の組成を表す。ｗｔは非処理のＨＥＫ２９３細胞を表す。
【図３】図３は、ＬＣＥを強制発現させた細胞における詳細な脂肪酸組成を表すグラフである。（ａ）はトリグリセリドを構成する脂肪酸の組成を表し、（ｂ）はコレステロールエステルを構成する脂肪酸の組成を表し、（ｃ）はリン脂質を構成する脂肪酸の組成を表す。
【図４】図４は、ＲＮＡｉによるＬＣＥの発現抑制の結果を表す図である。（ａ）はＬＣＥ遺伝子における各ｓｉＲＮＡの対応部分を表し、（ｂ）は各ｓｉＲＮＡを導入した場合のＬＣＥｍＲＮＡの発現量を表している。
【図５】図５は、ＲＮＡｉによるＬＣＥの活性抑制の結果を表すグラフである。（ａ）はＬＣＥ ｍＲＮＡの発現量を表し、（ｂ）はＦａｔｔｙ Ａｃｙｌ ＣｏＡの伸長活性を表している。ＬＣＥＲＮＡｉは、ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−６を用いてＬＣＥのＲＮＡｉを行ったことを表す（以下、特に断らない限り同様である）。
【図６】図６は、ｓｉＲＮＡを導入したＨｅｐＧ２細胞におけるＬＣＥｍＲＮＡの発現量を表すグラフである。（ａ）：２４時間後、（ｂ）：４８時間後。
【図７】図７は、ｓｉＲＮＡを導入したＨｅｐＧ２細胞における（ａ）ＬＣＥ、（ｂ）ＦＡＳ及び（ｃ）ＳＣＤのｍＲＮＡの発現量を表すグラフである。
【図８】図８は、ＲＮＡｉによるマウスＬＣＥの発現抑制の結果を表す図である。（ａ）はマウスＬＣＥ遺伝子における各ｓｉＲＮＡの対応部分を表し、（ｂ）は各ｓｉＲＮＡを導入した場合のマウスＬＣＥｍＲＮＡの発現量を表し、（ｃ）は各ｓｉＲＮＡを導入した場合のマウスＦＡＳ ｍＲＮＡの発現量を表している。
【図９】図９は、ＲＮＡｉによる（ａ）ＬＣＥ及び（ｂ）ＦＡＳの発現抑制並びに（ｃ）脂肪酸合成抑制の結果を表す図である。
【図１０】図１０は、ＲＮＡｉによる（ａ）ＬＣＥの発現抑制及び（ｂ）アポリポタンパク質Ｂの分泌抑制の結果を表す図である。
【図１１】図１１は、ｓｉＲＮＡ投与による（ａ）体重、（ｂ）血糖値及び（ｃ）血漿インスリンの変化を表す図である。ｓｃｒａｍｂｌｅ ＲＮＡｉは、哺乳類では効果を示さないｓｃｒａｍｂｌｅｓｉＲＮＡを用いてＲＮＡｉを行ったコントロールを表す。
【図１２】ｓｉＲＮＡを導入したＨｅｐＧ２細胞におけるＳＲＥＢＰ−１及びＳＲＥＢＰ−２のｍＲＮＡの発現量を表すグラフである。
【図１３】図１３は、ｓｉＲＮＡを導入したＨｅｐＧ２細胞における（ａ）脂肪酸合成能及び（ｂ）中性脂肪合成能を表す図である。
【図１４】図１４は、ｓｉＲＮＡを導入したＨｅｐＧ２細胞中の中性脂肪量を表すグラフである。
【図１５】図１５は、ｓｉＲＮＡを導入したＨｅｐＧ２細胞における（ａ）ＣＯ２産生量、（ｂ）ケトン体産生量及び（ｃ）パルミチン酸の中性脂肪への取り込み量を表すグラフである。
【図１６】図１６は、ｓｉＲＮＡを導入したＨｅｐＧ２細胞におけるＣＰＴ−１ ｍＲＮＡの発現量を表すグラフである。
【図１７】図１７は、高スクロース食を負荷したマウスにおける（ａ）体重、（ｂ）精巣上体の脂肪重量及び（ｃ）肝臓におけるＬＣＥ ｍＲＮＡの発現量を表すグラフである。ＣＡ−１は通常食を与えたマウスを表し、ＨＳＤ（３ｄａｙｓ）及びＨＳＤ（１０ｄａｙｓ）は、それぞれ、高スクロース食を３日間及び１０日間与えたマウスを表す。
【図１８】図１８は、ｓｉＲＮＡを投与したマウスの（ａ）体脂肪量、（ｂ）脂肪重量／体重比及び（ｃ）血漿レプチン濃度を表すグラフである。ＨＳＤ ＳＣＲ−ＲＮＡｉは、高スクロース食を負荷したマウスに哺乳類では効果を示さないｓｃｒａｍｂｌｅｓｉＲＮＡを投与したことを表す。ＨＳＤ ＬＣＥ−ＲＮＡｉは高スクロース食を負荷したマウスにｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−６を投与したことを表す。
【図１９】図１９は、ｓｉＲＮＡを投与したマウスの（ａ）ＬＣＥ ｍＲＮＡの発現量、（ｂ）ＦＡＳ ｍＲＮＡの発現量及び（ｃ）肝臓における中性脂肪含量を表すグラフである。
【図２０】図２０は、ｓｉＲＮＡを投与したマウスの肝臓におけるＬＣＥタンパク質量の変化を表す図である。
【図２１】図２１は、ｓｉＲＮＡを投与したマウスの肝臓における（ａ）ＡＣＣ、ＦＡＳ、ＳＣＤ１、ＳＲＥＢＰ−１ｃ、ＩＲＳ−２及び（ｂ）ＬＣＥのｍＲＮＡの発現量を表すグラフである。
【図２２】図２２は、ＬＣＥ変異体のＬＣＥ活性を表すグラフである。（ａ）はシステインをアラニンに置換した変異体のＬＣＥ活性を表し、（ｂ）はヒスチジンをアラニンに置換した変異体のＬＣＥ活性を表している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
【００２１】
本発明における「発現レベル」とはＬＣＥ遺伝子の転写産物の絶対量又は相対量をいう。この場合、当該遺伝子は、ＤＮＡ又はｍＲＮＡのいずれをも含む。また、発現の検出対象がタンパク質の場合、その「発現レベル」とは、ＬＣＥ遺伝子の翻訳産物の絶対量又は相対量をいう。
【００２２】
また、本発明における「被検動物」とは、化合物の評価に使用できる動物であれば、その種は特に限定されないが、具体的には、例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、サルが挙げられる。
【００２３】
また、本発明における「被検組織」とは、肥満又は痩せの検査を行う際に生体から抽出可能な組織であれば、その種類は特に限定されないが、肥満又は痩せの影響が反映されやすいとの観点から、例えば、肝臓組織、脂肪組織、筋肉組織、血液組織であることが好ましい。また、組織の単離が容易であるとの観点から、前記組織の中でも血液組織であることが好ましい。ここで、これらの組織の由来となる動物種については特に制限されないが、本発明の主たる用途がヒトの臨床的使用であることから、ヒトであることが好ましい。
【００２４】
また、本発明における「被検細胞」についても、肥満又は痩せの検査を行う際に生体から抽出可能な細胞であれば、その種類は特に限定されないが、肥満又は痩せの影響が反映されやすいとの観点から、例えば、肝細胞、脂肪細胞（白色脂肪細胞、褐色脂肪細胞等）、筋肉細胞（筋芽細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞等）、膵細胞（膵島細胞等）、血球細胞であることが好ましい。ここで、かかる組織の由来となる動物種については特に限定されないが、本発明の主たる用途がヒトの臨床的使用であることから、ヒトであることが好ましい。
【００２５】
さらに、本発明における「肥満」とは、脂肪組織が過剰に蓄積した状態と定義される一般的な肥満に加え、これに糖尿病や高血圧等の合併症又は内臓脂肪が伴う、いわゆる「肥満症」も含む。また、本発明における「肥満」は、薬物投与等による体重のコントロールを受けた場合に、もとの体重と比較して相対的に体重が増加した状態をも意味する。
【００２６】
また、本発明における「検査」とは、肥満又は痩せであることを単に判断するのみならず、将来的な肥満又は痩せを「予測」する場合をも含む。
【００２７】
また、本発明における「エロンゲース活性」とは、脂肪酸又はＦａｔｔｙ ａｃｙｌ−ＣｏＡの炭素鎖を伸長させる活性を意味する。
【００２８】
（１）肥満の治療又は予防に有効な化合物の評価方法
本発明の肥満の治療又は予防に有効な化合物の評価方法について説明する。被検化合物を被検動物や被検細胞に投与、接触させることにより変動するＬＣＥ遺伝子の発現量を測定したり、被検化合物をＬＣＥタンパク質に接触させて当該タンパク質の活性に及ぼす影響を検討したりすることにより、当該被検化合物の評価を行うことが可能となる。
【００２９】
すなわち、このような被検化合物の中には、細胞や組織に作用することにより、ＬＣＥ遺伝子の発現レベルやＬＣＥタンパク質の活性を正常化あるいはコントロールし、脂肪の蓄積や食欲のコントロール等、肥満の原因となるメカニズムの正常化を図ることができるものがあると考えられる。従って、以下に説明するような評価方法により、肥満の治療薬又は予防に有効な化合物を評価することが可能となる。
【００３０】
（Ａ）ＬＣＥ遺伝子の発現レベル調節能を指標とする評価方法
被検化合物を被検動物又は被検細胞に投与又は接触させ、当該被検化合物が被検動物又は被検細胞中でＬＣＥ遺伝子あるいは当該遺伝子と機能的に等価な遺伝子の発現レベルを調節するか否かを確認することにより、肥満の治療又は予防に有効な化合物を評価することが可能となる。
【００３１】
具体的には、以下の手順で被検化合物の評価を行う。
先ず、被検化合物を被検動物又は被検細胞に投与又は接触させる。ここで、被検化合物としては、肥満の治療又は予防薬の候補化合物であれば、その構造や性質は問わず、化合物種も限定されない。被検化合物を被検動物に投与する方法としては特に制限はなく、具体的には、例えば、経口投与、非経口投与（例えば、経皮投与、筋肉内注射、静脈内注射、皮下注射）が挙げられる。また、被検化合物を被検細胞に接触させる方法としても特に制限はなく、具体的には、例えば、培養液や緩衝液（リン酸緩衝液等）等の溶液中で混合し両者を接触させる方法が挙げられる。
【００３２】
次に、被検化合物が被検動物又は被検細胞中でＬＣＥ遺伝子あるいは当該遺伝子と機能的に等価な遺伝子の発現レベルを調節するか否かを確認する。
【００３３】
前記遺伝子の発現レベルの調節の有無の確認法としては、特に制限はなく、前述の投与又は接触の前を対照とし、当該遺伝子の発現量の変化をＲＴ−ＰＣＲのような遺伝子増幅法、ＤＮＡマイクロアレイを用いる方法又はノーザンハイブリダイゼーション法等によって検出することにより実施することができる。また、前記遺伝子の発現調節領域とレポーター遺伝子との融合遺伝子を人為的に導入した動物又は細胞を用いてもよい。この場合、レポーター遺伝子としては、具体的には、例えば、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子又はグリーンフルオレッセンスプロテイン遺伝子が挙げられる。
【００３４】
ここで、「ＬＣＥ遺伝子と機能的に等価な遺伝子」とは、ＬＣＥ遺伝子と塩基配列は異なるものの、比較的高い同性を示し、ＬＣＥと同じ又は類似の活性を有する遺伝子を示す。ここで、前記相同性は、遺伝子の機能が等価であれば特に制限はないが、塩基配列の相同性が７０〜１００％であることが好ましく、８０〜１００％であることがより好ましく、９０〜１００％であることがさらに好ましく、９５〜１００％であることが特に好ましい。相同性が前記下限より低い場合には、ＬＣＥと同じ又は類似の機能を示さない可能性が高い傾向にある。しかしながら、塩基配列の相同性が前記下限未満であっても、ＬＣＥに特有の機能を有するドメインと、当該ドメインに対応する塩基配列との相同性が高い場合にはＬＣＥ遺伝子と同様又は類似の機能を有する場合がある。このような遺伝子は、塩基配列の相同性が前記範囲外であっても好適に使用可能である。また、比較的相同性の高い遺伝子としては、ＬＣＥ遺伝子における１又は２以上の塩基が自然若しくは人工的に置換、欠失、不可及び／又は挿入したものであってもよい。
【００３５】
被検化合物を投与又は接触させない場合に比べて、被検化合物を投与又は接触させた場合のＬＣＥ遺伝子又はＬＣＥ遺伝子と機能的に等価な遺伝子の発現レベルが２０％以上、好ましくは５０％以上低下した場合、当該被検化合物は肥満の治療又は予防に有効な化合物と評価できる。
【００３６】
（Ｂ）ＬＣＥタンパク質の活性を指標とする評価方法
被検化合物をＬＣＥタンパク質に接触させ、被検化合物が当該タンパク質の活性に影響を与えるか否かを確認することにより、肥満の治療又は予防に有効な化合物を評価することが可能となる。
【００３７】
具体的には、以下の手順で被検化合物の評価を行う。
先ず、被検化合物をＬＣＥタンパク質に接触させる。このようなタンパク質と被検化合物を接触させる方法としては、特に制限はなく、具体的には、例えば、緩衝液（リン酸緩衝液等）等の溶液中で混合し接触させる方法が挙げられる。
【００３８】
次に、被検化合物が当該タンパク質の活性に影響を与えるか否かを確認する。タンパク質の活性測定における条件は、使用するタンパク質の性質により適宜設定すればよい。このような条件としては、具体的には、例えば、ＬＣＥタンパク質の場合には、エロンゲース活性を指標とすることができ、具体的には、例えば、細胞から抽出したミクロソーム画分を、ＮＡＤＰＨ、パルミトイルＣｏＡ、１４Ｃ標識マロニルＣｏＡ等を含む溶液中で混合してインキュベートし、脂肪酸を抽出した後、脂肪酸に含まれる放射性比活性を測定することによりエロンゲース活性を測定することができる。また、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６（４８），４５３５８−４５３６６，（２００１）を参照して行うこともできる。
【００３９】
被検化合物を投与又は接触させない場合に比べて、被検化合物を投与又は接触させた場合のＬＣＥタンパク質の活性が２０％以上、好ましくは５０％以上低下した場合、当該被検化合物は肥満の治療又は予防に有効な化合物と評価できる。
【００４０】
以上説明したような本発明の肥満の治療又は予防に有効な化合物の評価方法により、肥満の治療薬や診断薬のスクリーニングや、これらの薬剤の有効性又は安全性の評価、さらには、オーダーメイド治療における適切な薬剤の選択が可能となる。
【００４１】
（Ｃ）ＬＣＥタンパク質を阻害する化合物の評価方法
被検化合物を、ＬＣＥを含む複数種のエロンゲースタンパク質に接触させ、当該複数種のエロンゲースタンパク質の活性を測定した後、ＬＣＥの活性を阻害する被検化合物を選択することにより、エロンゲースの中でもＬＣＥのエロンゲース活性を阻害する化合物を評価・選択することが可能となる。
【００４２】
具体的には、以下の手順で評価を行う。
先ず、被検化合物を、ＬＣＥを含む複数種のエロンゲースタンパク質にそれぞれ接触させる。このようなタンパク質と被検化合物を接触させる方法としては、特に制限はなく、具体的には、例えば、緩衝液（リン酸緩衝液等）等の溶液中で混合し接触させる方法が挙げられる。ここで、複数種のエロンゲースとは、エロンゲース活性を有するものであればその種類は特に制限されないが、具体的には、例えば、ＦＡＳ（Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄ Ｓｙｎｔｈａｓｅ）、ＥＬＯ−１が挙げられる。
【００４３】
次に、被検化合物がそれぞれのタンパク質の活性に影響を与えるか否かを確認する。タンパク質の活性測定における条件は、使用するタンパク質の性質により適宜設定すればよい。このような条件としては、例えば、ＬＣＥタンパク質の場合には、エロンゲース活性を指標とすることができ、具体的には、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６（４８），４５３５８−４５３６６，（２００１）を参照して行うことができる。また、他のエロンゲースにおいては、ＬＣＥと同様にエロンゲース活性を指標にすればよく、公知の方法に従って活性測定を行えばよいが、例えば、前記のＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６（４８），４５３５８−４５３６６，（２００１）を参照して実施することができる。
【００４４】
以上説明したような本発明の肥満の治療又は予防に有効な化合物の評価方法により、肥満の治療薬又は診断薬のスクリーニングや、これらの薬剤の有効性又は安全性の評価、さらには、オーダーメイド治療における適切な薬剤の選択が可能となる。
【００４５】
（２）脂肪合成抑制方法及び肥満の治療又は予防方法
次に、本発明の脂肪合成抑制方法及び肥満の治療又は予防方法について説明する。ＬＣＥは脂肪の構成成分である脂肪酸の合成酵素であることから、かかる酵素活性を阻害することにより脂肪酸の合成を阻害することが可能となり、ひいては、脂肪の合成を阻害することが可能となる。
【００４６】
具体的には、以下の手順で脂肪合成抑制を行う。
先ず、ＬＣＥの活性を阻害する物質を選択する。かかる物質としては、例えば、ＬＣＥ阻害剤として機能する化合物、ＬＣＥの抗体、アンチセンスヌクレオチド及びＲＮＡｉに使用するｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ；センスＲＮＡ・アンチセンスＲＮＡの二本鎖ＲＮＡ）が挙げられる。
【００４７】
次に、ＬＣＥが存在する個体、組織、細胞に対して前記の物質を導入する。具体的には、対象が個体であれば、導入方法としては特に制限はないが、前記化合物等を、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射等の他、鼻腔内的、経気管支的、筋肉的又は経口的に導入する方法が挙げられる。また、対象が組織であれば、導入方法としては特に制限はないが、組織中への注入、緩衝液中での混合により導入する方法が挙げられる。さらに、対象が細胞であれば、導入方法としては特に制限はないが、緩衝液中での混合、エレクトロポレーション等が挙げられる。
【００４８】
より具体的には、ＲＮＡｉの場合、例えば、リポソームに封入したｓｉＲＮＡを細胞培養液に添加し細胞に接触させることで細胞内にｓｉＲＮＡを導入でき、ＲＮＡｉを起こすことができる（Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４９４−４９８，（２００１）、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．，１１４（Ｐｔ ２４），４５５７−４５６５，（２００１）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３０１（３），８０４−８０９，２００３）。ＬＣＥのＲＮＡｉには、以下のｓｉＲＮＡを用いることができる。ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−１（配列番号１３及び１４）、ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−２（配列番号１５及び１６）、ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−３（配列番号１７及び１８）、ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−４（配列番号１９及び２０）、ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−５（配列番号２１及び２２）、ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−６（配列番号２３及び２４）、ＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−２（配列番号２５及び２６）、ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−７（配列番号２７及び２８）、ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−８（配列番号２９及び３０）、ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−９（配列番号３１及び３２）、ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−１０（配列番号３３及び３４）、ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−１１（配列番号３５及び３６）、ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−１２（配列番号３７及び３８）、ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−６（配列番号４９及び５０）、ｍＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−７（配列番号５１及び５２）及びｍＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−１１（配列番号５３及び５４）。これらのｓｉＲＮＡを複数組み合わせて使用することによりＲＮＡｉを生じさせてもよい。これらの中でも、ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−６（配列番号２３及び２４）はＬＣＥの発現抑制作用が特に強いため、ＬＣＥのＲＮＡｉに適している。
【００４９】
このようにＬＣＥの活性を阻害することにより、脂肪酸の炭素鎖の伸張反応が抑制され、脂肪酸の生合成が抑制される。
【００５０】
また、かかる脂肪合成抑制方法を肥満の治療又は予防に応用することができる。すなわち、生体内でＬＣＥの活性を阻害することにより脂肪酸の合成を抑制し、結果的に脂質の合成を抑制することにより肥満の治療又は予防が可能となる。
【００５１】
具体的には、以下の手順で肥満の治療又は予防を行う。
先ず、ＬＣＥの活性を阻害する物質を選択する。かかる物質としては、例えば、ＬＣＥ阻害剤として機能する化合物、ＬＣＥの抗体、アンチセンスヌクレオチド及びＲＮＡｉに使用するｓｉＲＮＡが挙げられる。
【００５２】
次に、このような物質を生体内に投与する。投与方法としては、特に制限はないが、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射等の他、鼻腔内的、経気管支的、筋肉的又は経口的な投与方法が挙げられる。ＲＮＡｉを用いた具体的な方法については、脂肪合成抑制方法で説明した通りである。
【００５３】
（３）肥満又は痩せの検査方法
次に、本発明の肥満又は痩せの検査方法について説明する。
【００５４】
（Ａ）ＬＣＥ遺伝子の発現レベルを測定することによる肥満または痩せの検査方法被検組織又は被検細胞におけるＬＣＥ遺伝子の発現レベルの変化を検出することにより、又は、発現レベルを測定することにより、当該被検組織又は被検細胞を抽出した生体（例えばヒト）が肥満であるか否かを検査・診断することが可能である。また、単に検査時の肥満の状態を検査するのみならず、将来的に肥満又は痩せになりうるかを予測することも可能である。
【００５５】
以下に、このような検査の具体的な方法について説明する。
先ず、検査対象となる生体より被検組織又は被検細胞を抽出する。このような抽出の方法としては特に制限はなく、公知の方法により抽出することができる。
【００５６】
次に、抽出された被検組織又は被検細胞から発現レベルの測定の対象となる遺伝子を調製する。ＬＣＥ遺伝子の発現レベルを測定するには、先ず、被検組織又は被検細胞からＬＣＥのＲＮＡ（ｔｏｔａｌ ＲＮＡ又はｍＲＮＡ）を調製する必要がある。このようなＲＮＡの調製は、公知の方法によって行うことができるが、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ ２ｎｄ ＥＤＩＴＩＯＮ（１９８９）（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ著：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）７．３−７．３６を参照して行うことができる。こうして調製したＲＮＡを用いて、例えば、ＲＴ−ＰＣＲのような遺伝子増幅法、ＤＮＡマイクロアレイ（例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製ＤＮＡチップ）を用いる方法、ノーザンハイブリダイゼーション法により、その発現量を測定することができる。また、被検組織又は被検細胞を用いたイン サイチュ ハイブリダイゼーション（ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）等により、その発現量を測定することもできる。
【００５７】
また、ＬＣＥ遺伝子の発現レベルの変化を検出するには、前記の発現量の測定を当該発現量が変化すると予測される期間の前後（例えば、肥満治療薬の投与の前後）について行い、発現量の差を測定すればよい。具体的には、被検組織又は被検細胞において、前述したＬＣＥ遺伝子の発現量が変化すると予測される期間の前後で、その発現レベルが有意に上昇した場合に、体重の増加があった又は将来的に増加する可能性があると診断できる。
【００５８】
（Ｂ）ＬＣＥタンパク質の発現レベルを測定することによる肥満又は痩せの検査方法被検組織又は被検細胞におけるＬＣＥタンパク質の発現レベルの変化を検出することにより、又は、発現レベルを測定することにより、当該被検組織又は被検細胞を抽出した生体（例えばヒト）が肥満であるか否かを検査・診断することが可能である。また、単に検査時の肥満状態を検査するのみならず、将来的に肥満又は痩せになりうるかを予測することも可能である。
【００５９】
以下、このような検査の具体的な方法について説明する。
タンパク質の発現レベルを測定する方法としては、生体から単離したタンパク質を定量する方法やタンパク質の血中濃度を測定する方法があり、具体的な方法としては特に限定されない。生体から単離したタンパク質を定量する方法の具体例としては、以下のとおりである。先ず、被検組織又は被検細胞からＬＣＥタンパク質を調製する。このようなタンパク質の調製は、公知の方法によって行うことができる。こうして調製したタンパク質から、例えば、プロテインチップ（例えば、ＣＩＰＨＥＲＧＥＮ社製プロテインチップシステム）を用いる方法、免疫学的方法（例えば、ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ法、ウェスタンブロッティング法）により、その発現量を測定することができる。また、被検組織又は被検細胞を用いた免疫染色等によって、その発現量を測定することもできる。一方、タンパク質の血中濃度を測定する方法の具体例としては、生体から採取した血液を用いて、上記免疫学的方法等により、ＬＣＥタンパク質を定量する方法が挙げられる。
【００６０】
以上のようにして、ＬＣＥの遺伝子又はタンパク質の発現レベルを測定した後、その結果を解析することにより、被検体の肥満を検査できる。すなわち、本発明より、ＬＣＥタンパク質の発現レベルと体重は一定の相関関係を有することが明らかになったため、上記検査結果と対照群（健常人等）におけるＬＣＥタンパク質の発現量とを比較することにより、肥満の程度を判断することが可能となる。また、本発明の検査方法によれば、単に検査時の肥満の状態を検査するのみならず、将来的な肥満又は痩せの可能性の予測も可能となる。
【００６１】
また、ＬＣＥタンパク質の発現レベルの変化を検出するには、前記の発現量の測定を当該発現量が変化すると予測される期間の前後（例えば、肥満治療薬の投与の前後）について行い、発現量の差を測定すればよい。具体的には、被検組織又は被検細胞において、前述したＬＣＥタンパク質の発現量が変化すると予測される期間の前後でその発現レベルが有意に上昇した場合に、体重の増加があった又は将来的に増加する可能性があると診断できる。
【００６２】
（Ｃ）ＬＣＥ遺伝子の遺伝的多型を検出する肥満又は痩せの検査方法
ＬＣＥ遺伝子に遺伝的多型が存在する場合、その多型の有無や種類によりＬＣＥ遺伝子又はタンパク質の発現レベルが変化したり、当該タンパク質の活性に異常が生じたりする場合がある。従って、このような遺伝的多型を検出することによりＬＣＥの発現や活性に関する知見を得、さらに、被検組織や被検細胞の由来となった被検体の肥満の検査を行うことができる。このような遺伝的多型としては、具体的には、例えば、ミニサテライト、マイクロサテライト、ＳＮＰ（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：一塩基多型）が挙げられる。
【００６３】
ＬＣＥ遺伝子における多型の検出は以下のようにして行うことができる。すなわち、ＬＣＥ遺伝子において、その発現量を制御する領域を検査対象となる肥満の被検体を対象として塩基配列を決定し、多型部位を検出する。検出された多型部位の対立遺伝子頻度を算出し、被検体集団において有意に増加又は減少している対立遺伝子を見出すことにより肥満と相関する多型を同定する。このようにして検出された遺伝的多型は、例えば、被検体由来のゲノムＤＮＡについて、多型部位の塩基配列の解析、多型部位に存在する塩基の種類に依存して変化するＤＮＡの物理化学的性質の差や制限酵素部位の相違を利用する方法、当該多型部位の検出に適当な検出用プローブを利用する方法及び質量分析法を利用した方法等によって臨床的に検出可能である。
【００６４】
（Ｄ）ＬＣＥタンパク質と相互作用することによりＬＣＥ遺伝子の発現量に影響を及ぼすタンパク質の発現量又は活性を検出することによる肥満の検査方法
生体内において、多くのタンパク質は他のタンパク質と相互作用することにより、所定の生理機能を発揮する。ＬＣＥについても同様に、例えば、その発現を制御する転写因子等の作用を受けることにより発現量が制御され、所定の機能を発揮している。ＬＣＥタンパク質と、当該ＬＣＥタンパク質と相互作用することによりＬＣＥ遺伝子の発現量に影響を及ぼすタンパク質の発現量やその活性とは、一定の相関関係を有し、いずれか一方の挙動を検出することにより、他方の挙動を推測できる関係にある。
【００６５】
ここで、「相互作用」とは、ＬＣＥタンパク質と別のタンパク質が直接的又は間接的に作用することをいい、例えば、ＬＣＥタンパク質が別のタンパク質と物理的に接触することによりアミノ酸の修飾等を生じるような作用や、第３のタンパク質を介して相互作用し、間接的にＬＣＥタンパク質の発現に影響を及ぼすような作用が挙げられる。このようなタンパク質としては、例えば、ＬＣＥタンパク質を介するシグナル伝達において、ＬＣＥタンパク質の上流又は下流で生理的機能を発揮するタンパク質が挙げられる。このようなタンパク質の発現量又は活性を検出する方法としては、対象となるタンパク質の種類に応じて好適な手段を適宜選択すればよく、具体的な手段としては特に限定されない。
【００６６】
以上の（Ａ）〜（Ｄ）で説明したような本発明の肥満の検査方法によって、分子レベルで肥満の診断が可能となるばかりか、将来的に肥満になる可能性についても予測できることとなり、従来の診断方法と比較して、より的確な診断が可能となる。
【００６７】
（４）肥満の治療、予防剤
ＬＣＥ遺伝子は、その発現量と体重とが相関関係を示す。従って、当該遺伝子の発現レベルを正常レベルへと調節する化合物は肥満の治療又は予防に有用であるのみならず、例えば、痩せ、糖尿病、高血圧症、高脂血症、虚血性心疾患にも応用可能である。このような化合物としては、上述したような本発明の化合物の評価方法によって選択された化合物が挙げられる。これらの化合物を薬剤として使用するには、当該化合物を直接患者へ投与する以外に、公知の製剤学的方法により製剤化した医薬組成物として投与することもできる。製剤化するに際し、薬理学上許容される担体若しくは媒体としては、具体的には、例えば、滅菌水、生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定化剤、結合剤、滑沢剤、甘味料、香料又は着色剤が挙げられる。また、このような医薬組成物を患者に投与する方法としては、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射等の他、鼻腔内的、経気管支的、筋肉的又は経口的な投与が挙げられる。医薬組成物の投与量は、患者の体重、年齢又は投与方法等により変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。
【００６８】
（５）肥満の検査薬、検査キット
ＬＣＥタンパク質の発現量は、肥満に基づく体重変化と相関関係を有する。従って、当該タンパク質に対する抗体を使用して被検細胞や被検組織中のタンパク質量を検出、測定することにより、肥満の検査を簡便に行うことができる。ここで、「抗体」とは、抗原であるＬＣＥ遺伝子産物に結合しうる抗体分子全体又はその断片をいう。このような抗体は、公知の方法によって製造することができ、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体のいずれであってもよい。また、当該抗体を用いた免疫学的測定法としては、公知の方法を使用すればよく、具体的には、例えば、蛍光抗体法、酵素抗体法が挙げられる。
【００６９】
また、このような抗体を含んだキットを製造し、本発明を実施することも可能である。キットの構成としては、当該抗体に加え、例えば、抗体を検出するために蛍光標識やラジオアイソトープで標識された２次抗体や抗原抗体反応を行う際に使用する緩衝液を備えていてもよい。
【００７０】
このような肥満の検査薬を使用することにより、分子レベルで肥満の診断が可能となるばかりか、将来的に肥満になる可能性についても予測できることとなり、従来の診断方法と比較して、より的確な診断が可能となる。また、本発明の肥満の検査キットを使用することにより、前述したような的確な診断を非常に簡便に実施することが可能となる。
【００７１】
（６）ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−６（配列番号２３及び２４の核酸からなるｓｉＲＮＡ）及びそれを含むＬＣＥ発現抑制剤、脂肪合成抑制剤、肥満の治療又は予防剤
既に述べたように、配列番号２３及び２４の核酸からなるｓｉＲＮＡであるｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−６は、ＬＣＥの発現を強く抑制する。したがって、ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−６はＬＣＥ発現抑制剤として用いることができ、また、脂肪合成抑制剤として用いることもでき、さらに、肥満の治療又は予防剤として用いることも可能である。
【実施例】
【００７２】
（肥満モデル動物の作製）
製造例１：ニューロペプチドＹ（Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ Ｙ：ＮＰＹ）Ｙ５アゴニスト脳質内（ｉ．ｃ．ｖ．）投与マウス）
【００７３】
ＮＰＹ Ｙ５アゴニストを投与することにより肥満を呈するモデルマウスを以下の要領で作製した。９〜１２週齢の雄マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ：クレア社製）を、室温２３±２℃、湿度５５±１５％の条件下、１プラスチックゲージに１匹ずつ飼育した。また、飼育時の明暗のサイクルは１２時間とし、午前７時に点灯し、午後７時に消灯した。また、マウスには、飼料（ＣＥ−２（タンパク質：２５．４重量％、炭水化物：５０．３重量％、脂質：４．４重量％）：クレア社製）と水を自由に摂取させた。
【００７４】
マウスを８０ｍｇ／ｋｇペントバルビタールナトリウム（ダイナボット社製）で麻酔し、滅菌された２８ゲージの脳注入カニューレ（アルゼ（Ａｌｚｅｔ）社製）を右側脳質へ定位的に移植した。カニューレを、ブレグマより後方へ０．４ｍｍ、側方へ０．８ｍｍ、深さ２ｍｍの位置に、頭蓋骨に対し垂直に歯科用セメントで固定した。カニューレを、０．０５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む１０ｍＭのリン酸緩衝液で満たした浸透圧ポンプ（モデルナンバー２００２：アルゼ社製）にポリビニルクロライドチューブで接続した。１０ｍＭ ＰＢＳ（０．０５％ＢＳＡ含む）にＤ−Ｔｒｙ３４ＮＰＹ（５マイクログラム／日になるように調製）を溶解した溶液をポンプに満たした後、マウスの背中の皮下に埋め込み、抗生物質（５０ｍｇ／ｋｇのセファメジン（Ｃｅｆａｍｅｄｉｎｅ）：藤沢薬品製）を皮下注射した。
【００７５】
これらのマウスを、平均体重を一致させた３つのグループ（溶媒のみを注入したグループ（ｖｅｈｉｃｌｅ ｇｒｏｕｐ）、Ｄ−Ｔｒｙ３４ＮＰＹ（ＮＰＹ Ｙ５アゴニスト）を注入したグループ（ａｄ ｌｉｂ ｆｅｄ ｇｒｏｕｐ）、Ｄ−Ｔｒｙ３４ＮＰＹを注入しペアフィードとしたグループ（ｐａｉｒ−ｆｅｄ ｇｒｏｕｐ））に分けた。
【００７６】
製造例２：ＭＣＨ投与マウス
ＭＣＨ（ｍｅｌａｎｉｎ−ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ）を投与することにより肥満を呈するモデルマウスを以下の要領で作製した。
【００７７】
１３週齢の雄マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ：クレア社製）を、室温２３±２℃、湿度５５±１５％の条件下、１プラスチックゲージに１匹ずつ飼育した。また、飼育時の明暗のサイクルは１２時間とし、午前７時に点灯し、午後７時に消灯した。また、マウスには、飼料（ＣＥ−２（タンパク質：２５．４重量％、炭水化物：５０．３重量％、脂質：４．４重量％）：クレア社製）と水は自由に摂取させた。マウスが環境に適応した頃、飼料としてＭＨＦ（タンパク質：１５．０重量％、炭水化物：５２．４重量％、脂質：３２．６重量％、オリエンタルバイオサービス社製）を与えた。
【００７８】
マウスを８０ｍｇ／ｋｇペントバルビタールナトリウム（ダイナボット社製）で麻酔し、滅菌された２８ゲージの脳注入カニューレ（アルゼ（Ａｌｚｅｔ）社製）を右側脳質へ定位的に移植した。カニューレはブレグマより後方へ０．４ｍｍ、側方へ０．８ｍｍ、深さ２ｍｍの位置に、頭蓋骨に対し垂直に歯科用セメントで固定した。カニューレを、３０％プロピレングリコールで満たした浸透圧ポンプ（モデルナンバー２００２：アルゼ社製）にポリビニルクロライドチューブで接続した。ポンプをマウスの背中の皮下に埋め込み、抗生物質を皮下注射した。
【００７９】
これらのマウスを、平均体重を一致させた３つのグループ（溶媒のみを注入したグループ（ｖｅｈｉｃｌｅ ｇｒｏｕｐ）、ＭＣＨを注入したグループ（ａｄ ｌｉｂ ｆｅｄ ｇｒｏｕｐ）、ＭＣＨを注入しペアフィードとしたグループ（ｐａｉｒ−ｆｅｄ ｇｒｏｕｐ））に分けた。続いて、エーテル麻酔下で、ポンプをＭＣＨ（３マイクログラム／日）又は溶媒（３０％プロピレングリコール）に置き換えた。
【００８０】
製造例３：ＤＩＯ（Ｄｉｅｔ ｉｎｄｕｃｅｄ ｏｂｅｓｉｔｙ）マウス
１８週齢のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ：クレア社製）を、室温２３±２℃、湿度５５±１５％の条件下、１プラスチックゲージに１匹ずつ飼育した。このマウスに高カロリー食であるＭＨＦ（タンパク質：１８．２重量％、炭水化物：５５．６重量％、脂質：１５．５重量％）を６ヶ月間に渡って与え、肥満を呈するモデルマウス（ＤＩＯマウス）を作製した。なお、実施例中、「ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ＭＦＤ」は、これ以上体重が増えないようになるまでＭＨＰを与えて飼育したマウスを指す。
【００８１】
また、前記のマウスにＭＨＦよりさらに高い脂肪を含有する高カロリー食であるＨＦＤ（タンパク質：２０．８重量％、炭水化物：３８．５９重量％、脂質：３２．８８重量％）を与えたＤＩＯマウス（ＨＰＤ）も作製した。
【００８２】
製造例４：食事制限をしたマウス
マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ、１７週齢）を１ケージに１匹ずつ個別に飼育した。また、エサは普通食（ＣＡ−１、ＣＬＥＡ）を与えた。摂食制限は、以下のようなスケジュールで行った。すなわち、エサ（ＣＡ−１）を１日につき３時間（１０：００〜１３：００）だけ与え、水は自由に摂取できるようにした。摂食時間の前後で餌の重量を測定し、その差を摂食量とした。また、摂食制限をしている期間は、体重、外見の観察等をモニターした。なお、条件付けに失敗したと思われるマウス（短期間に極度な体重減少（例えば２０％程度の減少）が見られるマウス）は実験には使用しなかった。かかる条件下でマウスを７日間飼育した後、白色脂肪細胞を摘出した。
【００８３】
実施例１〜５及び比較例１：白色脂肪細胞におけるＬＣＥの発現
製造例１〜４において製造したモデルマウスを用いて、肝臓及び白色脂肪細胞（ＷＡＴ）におけるＬＣＥ遺伝子の発現量を測定した。発現量の測定は、各モデルマウスの白色脂肪細胞から抽出したＲＮＡを、ｍｏｕｓｅ Ｕ７４Ａチップ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）を用いて処理することにより行った。
【００８４】
非処理のＣ５７ＢＬ／６Ｎの肝臓又はＷＡＴそれぞれにおけるＬＣＥの発現量を１．００とした場合の、ＤＩＯマウス（ＤＩＯ）、Ｄ−Ｔｒｙ３４ＮＰＹ投与マウス（ＮＰＹ（ＦＦ））、Ｄ−Ｔｒｙ３４ＮＰＹ ｐａｉｒ ｆｅｅｄｉｎｇ投与群マウス（ＮＰＹ（ＰＦ））、ＭＣＨ投与マウス（ＭＣＨ（ＦＦ））、ＭＣＨ ｐａｉｒ ｆｅｅｄｉｎｇ投与群マウス（ＭＣＨ（ＰＦ））、食事制限をしたマウス（Ｆａｓｔｉｎｇ）及びＮＰＹ Ｙ５ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ投与マウス（Ｙ５ａｎｔ）におけるＬＣＥ遺伝子の発現量を表１に示す。
【００８５】
表１より明らかなように、肥満モデルマウスではＬＣＥ遺伝子の発現量が増加する傾向にあり、食事制限をしたマウスではその発現量が低下していた。したがって、ＬＣＥの発現量と体重とが相関関係を有していることが明らかとなった。
【００８６】
【表１】
【００８７】
実施例６：ＨＥＫ２９３細胞におけるマウスＬＣＥｍＲＮＡの発現量測定
１．ＬＣＥ発現亢進細胞の作製
マウス肝臓より抽出したＲＮＡを用いて、ＲＴ−ＰＣＲ法によりマウスＬＣＥのｃＤＮＡを増幅した。得られたＰＣＲ産物を発現ベクターｐＣＤＮＡ３．１にサブクローニングした後、その塩基配列を確認した。次に、マウスＬＣＥがサブクローニングされた発現ベクターを制限酵素ＳｃａＩで直線化し、ＨＥＫ２９３細胞に導入した。この細胞を１ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８を含む選択培地で培養することにより、マウスＬＣＥ遺伝子の安定高発現細胞株を得た。
【００８８】
以下に、ＲＴ−ＰＣＲに用いたプライマーの塩基配列を示す。
ｍＬＣＥ−ｅｘＦ：５’−
ＧＣＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＧＧＣ ＡＡＣ ＡＴＧ ＴＣＡ ＧＴＧ ＴＴＧ ＡＣＴ ＴＴＡ Ｃ−３’（配列番号３）
ｍＬＣＥ−ｅｘＲ：５’−
ＣＴＡ ＣＴＣ ＡＧＣ ＣＴＴ ＣＧＴ ＧＧＣ ＴＴＴ ＣＴＴ−３’（配列番号４）
【００８９】
２．ＨＥＫ２９３細胞におけるマウスＬＣＥ ｍＲＮＡの発現量測定
ＨＥＫ２９３細胞からｔｏｔａｌ ＲＮＡを精製し、逆転写反応によりｃＤＮＡを得た。ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ ＳｙｓｔｅｍによるＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法を用いてマウスＬＣＥ ｍＲＮＡ及びヒトＬＣＥ ｍＲＮＡの発現量を測定した。マウスＬＣＥの標準曲線は、前記のマウスＬＣＥがサブクローニングされた発現ベクターを制限酵素ＳｃａＩにより直鎖化したＤＮＡを用いた発現解析により作成した。また、ヒトＬＣＥの標準曲線は、ＰＣＲにより調製したヒトＬＣＥのｃＤＮＡ断片をｐｃＤＮＡ３．１にサブクローニングし、ＳｃａＩにより直鎖化したＤＮＡ断片を用いた発現解析により作成した。次に、マウスＬＣＥの発現量をヒトＬＣＥの発現量にて除し、導入されたマウスＬＣＥ遺伝子の発現量と内在性ヒトＬＣＥ遺伝子の発現量の比を求めた。
【００９０】
以下に使用したプライマー及びプローブの塩基配列を記す。
マウスＬＣＥ用ＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅ
ｍＬＣＥ−Ｐ：５’−
ＣＴＴ ＴＣＣ ＴＧＴ ＴＴＴ ＣＴＧ ＣＧＣ ＴＧＴ ＡＣＧ ＣＴＧ−３’（配列番号５）
マウスＬＣＥ用ＴａｑＭａｎ ｐｒｉｍｅｒ
ｍＬＣＥ−Ｆ：５’−
ＧＧＡ ＴＧＣ ＡＧＧ ＡＡＡ ＡＣＴ ＧＧＡ ＡＧＡ Ａ−３’（配列番号６）
ｍＬＣＥ−Ｒ：５’−
ＴＧＣ ＣＧＡ ＣＣＡ ＣＣＡ ＡＡＧ ＡＴＡ ＡＡＧ−３’（配列番号７）
ヒトＬＣＥ用ＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅ
ｈＬＣＥ−Ｐ２：５’−
ＡＴＣ ＡＣＴ ＧＴＧ ＣＴＣ ＣＴＧ ＴＡＣ Ｔ−３’（配列番号８）
ヒトＬＣＥ用ＴａｑＭａｎ ｐｒｉｍｅｒ
ｈＬＣＥ−Ｆ２：５’−
ＡＧＣ ＴＧＡ ＴＣＴ ＴＣＣ ＴＧＣ ＡＣＴ ＧＧＴ ＡＴ−３’（配列番号９）
ｈＬＣＥ−Ｒ２：５’−
ＧＧＣ ＡＡＣ ＣＡＴ ＧＴＣ ＴＴＴ ＧＴＡ ＧＧＡ ＧＴＡ−３’（配列番号１０）
ヒトＬＣＥ用ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ
ｍＬＣＥ−ｅｘＦ：５’−
ＧＣＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＧＧＣ ＡＡＣ ＡＴＧ ＴＣＡ ＧＴＧ ＴＴＧ ＡＣＴ ＴＴＡ Ｃ−３’（配列番号１１）
ｈＬＣＥ−ｅｘＲ：５’−
ＣＴＡ ＴＴＣ ＡＧＣ ＴＴＴ ＣＧＴ ＴＧＴ ＴＴＴ ＣＣＴ Ｃ−３’（配列番号１２）。
【００９１】
３．ＨＥＫ２９３細胞におけるＬＣＥ活性の測定
ＨＥＫ２９３細胞を超音波破砕した後に、超遠心操作によりミクロソーム画分を調製した。得られたミクロソーム画分を用いて以下の方法によりＬＣＥ活性を測定した。反応に必要とされるＮＡＤＰＨ、パルミトイルＣｏＡ、１４Ｃ標識マロニルＣｏＡを含むリン酸緩衝液中にミクロソーム画分を加えて、３７℃で５分間インキュベートした。次に、１５％水酸化カリウム−メタノール溶液を加え、７５℃で４５分間加熱してけん化処理を行なった。これに５Ｎ塩酸を加えた後、ヘキサンを用いて脂肪酸を抽出した。得られた脂肪酸に含まれる放射性比活性を測定し、脂肪酸延伸反応により脂肪酸に取り込まれたマロニルＣｏＡの量を求めた。
【００９２】
図１は、ＬＣＥを強制発現させた細胞における、（ａ）ＬＣＥ ｍＲＮＡの発現量、及び（ｂ）ＬＣＥ活性を表すグラフである。図１に示すように、ＬＣＥの発現が亢進した細胞株を取得できたことが確認されるとともに、これらの細胞株ではＬＣＥの活性も亢進していることが確認できた。
【００９３】
実施例７：ＨＥＫ２９３細胞中に含まれる脂肪酸組成の測定
ＨＥＫ２９３細胞をリン酸緩衝液中にて超音波破砕し、内部標準物質としてＣ１７：０の中性脂肪（ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅｓ）、コレステリルエステル（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ ｅｓｔｅｒｓ）及びリン脂質（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ）を加えた後に、クロロホルム−メタノール（２：１）により脂質成分を抽出した。得られた脂質を窒素気流下にて乾固した後、ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ Ｇを用いた薄層クロマトグラフによる分画（ヘキサン：ジエチルエーテル：酢酸＝８０：２０：１）を行い、中性脂肪、コレステリルエステル及びリン脂質を分離した。これら３画分それぞれを５％塩酸−メタノールにより脂肪酸残基をメチル化し、ガスクロマトグラフ（ＧＣ−ＦＩＤ）を用いて脂肪酸組成の分析を行なった。
【００９４】
炭素鎖長１８以上の脂肪酸と１６以下の脂肪酸を比較した結果を図２に示す。図２から明らかなように、ＬＣＥの発現が亢進した細胞株ではＣ１８以上の脂肪酸の構成比率が増加する傾向にあり、炭素鎖の伸長反応はＬＣＥの活性の増強に比例して進行することが確認できた。また、細胞内では、脂肪酸のほとんどがトリグリセリド、コレステリルエステル、リン脂質といったエステル体として存在する。これら全てのエステル体においてＬＣＥの発現亢進によりＣ１８以上の脂肪酸の構成比率が増加する傾向が認められることから、ＬＣＥの活性変化は細胞全体の脂肪酸構成比率を変更すると考えられ、ＬＣＥは細胞の脂肪酸組成を決定する重要因子であると、本発明者らは考えている。
【００９５】
また、各脂肪酸の組成を比較した結果を図３に示す。図３から明らかなように、ＬＣＥの発現が亢進した細胞株ではＣ１８以上の脂肪酸の構成比率が増加する傾向にあることが確認できた。
【００９６】
実施例８：ＲＮＡｉによるヒトＬＣＥの発現抑制
１．発現抑制実験に使用するｓｉＲＮＡの検討
ヒトＬＣＥ ｃＤＮＡの塩基配列情報に基づいて、下記配列からなるｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）を合成した。合成したｓｉＲＮＡそれぞれをＨｅｐＧ２細胞に導入し、２４時間後に細胞からｔｏｔａｌ ＲＮＡを調製した。次に、逆転写反応によりｃＤＮＡを作製し、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ ＳｙｓｔｅｍによるＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法によりヒトＬＣＥ ｍＲＮＡの発現量を測定した。図４（ａ）に、ＬＣＥ遺伝子における各ｓｉＲＮＡの対応部分を示した。図４（ｂ）は、各ｓｉＲＮＡを導入した場合のＬＣＥ ｍＲＮＡの発現量を表すグラフである。図４（ｂ）に示すように、ｓｉＲＮＡ（ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−６）を用いた場合にＬＣＥの発現抑制の効果が高いことが確認できた。
【００９７】
使用したｓｉＲＮＡの配列を以下に示す。
ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−１
（図４における１のｓｉＲＮＡ）
５’−ＧＡＣＣＧＣＡＡＧＧＣＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵ−３’（配列番号１３）
３’−ＵＵＣＵＧＧＣＧＵＵＣＣＧＵＡＡＧＵＡＡＡ−５’（配列番号１４）
ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−２
（図４における２のｓｉＲＮＡ）
５’−ＣＡＣＵＣＧＡＡＡＵＣＡＡＧＣＧＣＵＵＵＵ−３’（配列番号１５）
３’−ＵＵＧＵＧＡＧＣＵＵＵＡＧＵＵＣＧＣＧＡＡ−５’（配列番号１６）
ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−３
（図４における３のｓｉＲＮＡ）
５’−ＣＡＣＧＵＡＧＣＧＡＣＵＣＣＧＡＡＧＡＵＵ−３’（配列番号１７）
３’−ＵＵＧＵＧＣＡＵＣＧＣＵＧＡＧＧＣＵＵＣＵ−５’（配列番号１８）
ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−４
（図４における４のｓｉＲＮＡ）
５’−ＵＧＡＡＧＣＣＡＵＣＣＡＡＵＧＧＡＵＧＵＵ−３’（配列番号１９）
３’−ＵＵＡＣＵＵＣＧＧＵＡＧＧＵＵＡＣＣＵＡＣ−５’（配列番号２０）
ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−５
（図４における５のｓｉＲＮＡ）
５’−ＧＣＣＡＵＵＡＧＵＧＣＵＣＵＧＧＵＣＵＵＵ−３’（配列番号２１）
３’−ＵＵＣＧＧＵＡＡＵＣＡＣＧＡＧＡＣＣＡＧＡ−５’（配列番号２２）
ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−６
（図４における６のｓｉＲＮＡ）
５’−ＡＧＧＣＣＵＧＡＡＧＣＡＧＵＣＡＧＵＵＵＵ−３’（配列番号２３）
３’−ＵＵＵＣＣＧＧＡＣＵＵＣＧＵＣＡＧＵＣＡＡ−５’（配列番号２４）
ＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−２
（図４における７のｓｉＲＮＡ）
５’−ＵＧＧＡＣＣＵＧＵＣＡＧＣＡＡＡＵＵＣＵＵ−３’（配列番号２５）
３’−ＵＵＡＣＣＵＧＧＡＣＡＧＵＣＧＵＵＵＡＡＧ−５’（配列番号２６）
ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−７
（図４における８のｓｉＲＮＡ）
５’−ＡＧＣＡＣＣＣＧＡＡＣＵＡＧＧＡＧＡＵＵＵ−３’（配列番号２７）
３’−ＵＵＵＣＧＵＧＧＧＣＵＵＧＡＵＣＣＵＣＵＡ−５’（配列番号２８）
ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−８
（図４における９のｓｉＲＮＡ）
５’−ＣＡＵＣＵＵＣＵＧＧＵＣＣＵＣＡＣＵＣＵＵ−３’（配列番号２９）
３’−ＵＵＧＵＡＧＡＡＧＡＣＣＡＧＧＡＧＵＧＡＧ−５’（配列番号３０）
ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−９
（図４における１０のｓｉＲＮＡ）
５’−ＵＣＡＣＡＣＧＵＧＧＵＧＣＡＧＣＵＡＡＵＵ−３’（配列番号３１）
３’−ＵＵＡＧＵＧＵＧＣＡＣＣＡＣＧＵＣＧＡＵＵ−５’（配列番号３２）
ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−１０
（図４における１１のｓｉＲＮＡ）
５’−ＧＣＡＣＵＧＣＵＧＣＵＧＧＡＡＧＡＣＣＵＵ−３’（配列番号３３）
３’−ＵＵＣＧＵＧＡＣＧＡＣＧＡＣＣＵＵＣＵＧＧ−５’（配列番号３４）
ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−１１
（図４における１２のｓｉＲＮＡ）
５’−ＡＣＵＧＵＧＣＧＡＧＣＡＣＡＡＣＡＣＡＵＵ−３’（配列番号３５）
３’−ＵＵＵＧＡＣＡＣＧＣＵＣＧＵＧＵＵＧＵＧＵ−５’（配列番号３６）
ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−１２
（図４における１３のｓｉＲＮＡ）
５’−ＡＧＧＧＧＧＵＧＡＡＵＡＣＵＵＣＣＣＣＵＵ−３’（配列番号３７）
３’−ＵＵＵＣＣＣＣＣＡＣＵＵＡＵＧＡＡＧＧＧＧ−５’（配列番号３８）。
【００９８】
２．ＨｅｐＧ２細胞におけるｓｉＲＮＡのＬＣＥ活性低下作用
ｓｉＲＮＡ（ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−６）を導入したＨｅｐＧ２細胞を超音波破砕した後に、超遠心操作によりミクロソーム画分を調製した。次に、得られたミクロソーム画分のＬＣＥ活性（Ｆａｔｔｙ Ａｃｙｌ ＣｏＡの伸長活性）を測定した。対照には哺乳類遺伝子に相同性を持たない配列であるｓｉＲＮＡ（ｓｃｒａｍｂｌｅ ｓｉＲＮＡ Ｄｕｐｌｅｘ：Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｉｎｃ．）を導入したＨｅｐＧ２細胞を用いた。図５（ａ）は、ＬＣＥ ｍＲＮＡの発現量を表すグラフであり、図５（ｂ）は、伸長活性を表すグラフである。図５（ａ），（ｂ）に示すように、ＬＣＥの発現が特異的に抑制されるとともに、ＬＣＥの活性が抑制されることが確認できた。
【００９９】
また、ＨｅｐＧ２細胞に２種類のｓｉＲＮＡ（発現抑制効果が強いもの：ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−６、発現抑制効果が中程度のもの：ＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−２）をそれぞれ導入した。ｓｉＲＮＡの導入後２４時間及び４８時間の時点で、細胞からｔｏｔａｌ ＲＮＡを調製し、ＤＮＡチップ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）を用いて遺伝子発現解析を行ない、ｓｉＲＮＡの導入により発現が低下している遺伝子を選択した。図６は、ｓｉＲＮＡ導入後のＬＣＥ ｍＲＮＡの発現量を表すグラフである（（ａ）：２４時間後、（ｂ）：４８時間後）。ｓｉＲＮＡの導入によりＬＣＥの発現が抑制されていることが確認された。
【０１００】
ｓｉＲＮＡの導入により発現が低下した遺伝子は、２４時間で５遺伝子、４８時間で６４遺伝子であった。発現が低下した遺伝子の中で、ＬＣＥと同じ脂肪酸合成に関与するＦＡＳ（Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄ Ｓｙｎｔｈａｓｅ）及びＳＣＤ（ｓｔｅａｒｏｙｌ ＣｏＡ ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ）に注目し、その発現量を検討した。具体的には、ｓｉＲＮＡ（ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−６）を導入したＨｅｐＧ２細胞からｔｏｔａｌ ＲＮＡを精製し、逆転写反応によりｃＤＮＡを得た。次に、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍを用いたＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法により、ヒトＦＡＳ ｍＲＮＡ及びヒトＳＣＤ ｍＲＮＡの発現を測定した。標準曲線は、ＰＣＲにより調製したヒトＦＡＳ ｃＤＮＡ断片及びヒトＳＣＤ ｃＤＮＡ断片をそれぞれ用いて作成した。ＦＡＳ及びＳＣＤの発現量はβ−アクチンの発現量で規格化した。図７は、ｓｉＲＮＡを導入したＨｅｐＧ２細胞における（ａ）ＬＣＥ、（ｂ）ＦＡＳ及び（ｃ）ＳＣＤのｍＲＮＡの発現量を表すグラフである。図７に示すとおり、ｓｉＲＮＡの導入により、ＬＣＥの発現は顕著に低下する一方、ＦＡＳ及びＳＣＤはＬＣＥほどの発現の低下は見られないものの、４０〜６０％程度の発現低下が見られることが確認された。
【０１０１】
以下に、測定に用いたプライマー及びプローブの塩基配列を示す。
ヒトＦＡＳ用ＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅ
ｈＦＡＳ−Ｐ：５’−
ＡＣＣ ＣＧＣ ＴＣＧ ＧＣＡ ＴＧＧ ＣＴＡ ＴＣＴＴ−３’（配列番号３９）
ヒトＦＡＳ用ＴａｑＭａｎ ｐｒｉｍｅｒ
ｈＦＡＳ−Ｆ：５’−
ＧＣＡ ＡＡＴ ＴＣＧ ＡＣＣ ＴＴＴ ＣＴＣ ＡＧＡ ＡＣ−３’（配列番号４０）
ｈＦＡＳ−Ｒ：５’−
ＧＧＡ ＣＣＣ ＣＧＴ ＧＧＡ ＡＴＧ ＴＣＡ−３’（配列番号４１）
ヒトＦＡＳ ｃＤＮＡ作成用ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ
ｈＦＡＳ−４８２３Ｓ：５’−
ＴＡＣ ＧＣＣ ＴＣＣ ＣＴＣ ＡＡＣ ＴＴＣ ＣＧ−３’（配列番号４２）
ｈＦＡＳ−５６０４Ａ：５’−
ＣＡＣ ＴＴＧ ＡＧＧ ＧＧＣ ＣＧＴ ＡＣＣ ＡＣ−３’（配列番号４３）
ヒトＳＣＤ用ＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅ
ｈＳＣＤ−Ｐ：５’−
ＣＡＣ ＡＴＧ ＣＴＧ ＡＴＣ ＣＴＣ ＡＴＡ ＡＴＴ ＣＣＣ ＧＡＣ Ｇ−３’（配列番号４４）
ヒトＳＣＤ用ＴａｑＭａｎ ｐｒｉｍｅｒ
ｈＳＣＤ−Ｆ：５’−
ＧＣＣ ＣＡＣ ＣＡＣ ＡＡＧ ＴＴＴ ＴＣＡ ＧＡＡ−３’（配列番号４５）
ｈＳＣＤ−Ｒ：５’−
ＣＣＡ ＣＧＴ ＧＡＧ ＡＧＡ ＡＧＡ ＡＡＡ ＡＧＣ Ｃ−３’（配列番号４６）
ヒトＳＣＤ ｃＤＮＡ作成用ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ
ｈＳＣＤ−６００Ｓ：５’−
ＴＧＴ ＧＧＡ ＧＣＣ ＡＣＣ ＧＣＴ ＣＴＴ ＡＣ−３’（配列番号４７）
ｈＳＣＤ−９３１Ａ：５’−
ＡＡＧ ＣＧＴ ＧＧＧ ＣＡＧ ＧＡＴ ＧＡＡ ＧＣ−３’（配列番号４８）。
【０１０２】
実施例９：ＲＮＡｉによるマウスＬＣＥの発現抑制
実施例８と同様の実験をマウスＬＣＥについても行った。マウスＬＣＥ ｃＤＮＡの塩基配列情報に基づいて、下記配列からなるｓｉＲＮＡを合成した。合成したｓｉＲＮＡそれぞれを３Ｔ３−Ｌ１細胞に導入し、２４時間後に細胞からｔｏｔａｌ ＲＮＡを調製した。次に、逆転写反応によりｃＤＮＡを作製し、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ ＳｙｓｔｅｍによるＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法によりマウスＬＣＥ ｍＲＮＡの発現量を測定した。
【０１０３】
図８は、ＲＮＡｉによるマウスＬＣＥの発現抑制の結果を表す図である。（ａ）はマウスＬＣＥ遺伝子における各ｓｉＲＮＡの対応部分を示す図であり、（ｂ）は各ｓｉＲＮＡを導入した場合のマウスＬＣＥ ｍＲＮＡの発現量を表すグラフであり、（ｃ）は各ｓｉＲＮＡを導入した場合のマウスＦＡＳ ｍＲＮＡの発現量を表すグラフである。図８に示すように、各ｓｉＲＮＡによりＬＣＥ及びＦＡＳの発現が抑制されることが確認された。
【０１０４】
実験に用いたｓｉＲＮＡを以下に示す。
ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−６（先述したヒトＬＣＥに対するｓｉＲＮＡであるｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−６と同一）
（図８における６のｓｉＲＮＡ）
５’−ＡＧＧＣＣＵＧＡＡＧＣＡＧＵＣＡＧＵＵＵＵ−３’（配列番号４９）
３’−ＵＵＵＣＣＧＧＡＣＵＵＣＧＵＣＡＧＵＣＡＡ−５’（配列番号５０）
ｍＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−７（図８におけるｍ７のｓｉＲＮＡ）
５’−ＵＣＣＣＡＵＡＵＧＧＵＧＣＡＧＣＵＡＡＵＵ−３’（配列番号５１）
３’−ＵＵＡＧＧＧＵＡＵＡＣＣＡＣＧＵＣＧＡＵＵ−５’（配列番号５２）
ｍＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−１１（図８におけるｍ１１のｓｉＲＮＡ）
５’−ＧＣＡＵＣＣＧＵＵＧＵＵＣＡＧＵＵＧＣＵＵ−３’（配列番号５３）
３’−ＵＵＣＧＵＡＧＧＣＡＡＣＡＡＧＵＣＡＡＣＧ−５’（配列番号５４）。
【０１０５】
実施例１０：３Ｔ３−Ｌ１細胞においてＬＣＥ ＲＮＡｉがＦＡＳ ｍＲＮＡの発現に与える影響
脂肪細胞に分化した３Ｔ３−Ｌ１細胞にｓｉＲＮＡ（ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−６）を導入し、２４時間後に細胞からｔｏｔａｌ ＲＮＡを精製した。得られたｔｏｔａｌ ＲＮＡより逆転写反応によりｃＤＮＡを調製し、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍを用いたＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法によりマウスＦＡＳ ｍＲＮＡの発現量を測定した。標準曲線は、ＰＣＲにより調製したマウスＦＡＳ ｃＤＮＡ断片を用いて作成した。ＦＡＳの発現量はβ−アクチンの発現量で規格化した。
【０１０６】
測定に用いたプライマーおよびプローブは下記の通りである。
マウスＦＡＳ用ＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅ
ｍＦＡＳ−Ｐ２：５’−
ＡＴＧ ＣＴＧ ＧＣＣ ＡＡＡ ＣＴＡ ＡＣＴ ＡＣＧ ＧＣＴ ＴＣＧ−３’（配列番号５５）
マウスＦＡＳ用ＴａｑＭａｎ ｐｒｉｍｅｒ
ｍＦＡＳ−Ｆ２：５’−
ＴＧＧ ＣＣＴ ＴＣＴ ＣＣＴ ＣＴＧ ＴＡＡ ＧＣＴ Ｇ−３’（配列番号５６）
ｍＦＡＳ−Ｒ２：５’−
ＣＴＧ ＴＴＣ ＡＣＡ ＴＡＴ ＡＣＧ ＣＴＣ ＣＡＴ ＧＧ−３’（配列番号５７）
マウスＦＡＳ ｃＤＮＡ作成用ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ
ｍＦＡＳ−５５４１Ｓ：５’−
ＴＴＣ ＣＧＣ ＴＡＣ ＡＴＧ ＧＣＴ ＣＡＧ ＧＧ−３’（配列番号５８）
ｍＦＡＳ−７５５１Ａ：５’−
ＣＣＣ ＧＴＡ ＣＡＣ ＴＣＡ ＣＴＣ ＧＴＧ ＧＣ−３’（配列番号５９）
【０１０７】
また、脂肪細胞に分化した３Ｔ３−Ｌ１細胞に、ｓｉＲＮＡ（ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−６）を導入し、２４時間後に培地に１４Ｃ標識酢酸ナトリウムを添加した。添加してから４時間後に細胞を０．１％ＳＤＳにて溶解し、１５％水酸化カリウム−メタノール溶液を加え７５℃４５分間加熱によるけん化処理を行った。これに５Ｎ塩酸を加えた後、クロロホルム−メタノール（２：１）にて脂質成分を抽出した。抽出した脂質成分をＳｉｌｉｃａ ｇｅｌ Ｇを用いた薄層クロマトグラフにより分画（ヘキサン：ジエチルエーテル：酢酸＝８０：２０：１）し、脂肪酸画分に取り込まれた１４Ｃ酢酸を測定することで脂肪酸合成能を測定した。対照には哺乳類遺伝子に相同性がない配列のｓｉＲＮＡ（ｓｃｒａｍｂｌｅ ｓｉＲＮＡ Ｄｕｐｌｅｘ：Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｉｎｃ．）を導入した３Ｔ３−Ｌ１細胞を用いた。
【０１０８】
図９は、ＲＮＡｉによる（ａ）ＬＣＥ及び（ｂ）ＦＡＳの発現抑制並びに（ｃ）脂肪酸合成抑制の結果を表す図である。図９に示すように、ＬＣＥの発現を抑制することにより、脂肪酸の合成が抑制されることが確認できた。
【０１０９】
実施例１１：ＨｅｐＧ２細胞においてＬＣＥ ＲＮＡｉがアポリポタンパク質Ｂの分泌に与える影響
ＨｅｐＧ２細胞にｓｉＲＮＡ（ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−６）を導入し４８時間後に培地を交換した。培地交換後４８時間インキュベートし、培養上清を回収し、培地中に分泌されたアポリポタンパク質Ｂを定量した。アポリポタンパク質Ｂの定量には、マイクロプレートのＥＩＡ法（Ｅｘｏｃｅｌｌ，Ｉｎｃ社製：ＡＰＯ Ｂ ＴＥＳＴ）を用いた。アポリポタンパク質Ｂ標準液を用いて標準曲線を作成し、培養上清中のアポリポタンパク質Ｂの濃度を求めた。対照には哺乳類遺伝子に相同性がない配列のｓｉＲＮＡ（ｓｃｒａｍｂｌｅ ｓｉＲＮＡ Ｄｕｐｌｅｘ：Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｉｎｃ．社製）を導入したＨｅｐＧ２細胞を用いた。
【０１１０】
図１０は、ＲＮＡｉによる（ａ）ＬＣＥの発現抑制及び（ｂ）アポリポタンパク質Ｂの分泌抑制の結果を表す図である。図１０に示すように、ＬＣＥの発現を抑制することによりアポリポタンパク質Ｂの分泌が抑制されることが確認できた。
【０１１１】
以上より、ＬＣＥの活性を抑制することにより、抗肥満効果を示すことが示唆された。
【０１１２】
実施例１２：ＤＩＯマウスにおけるＬＣＥ ＲＮＡｉが与える影響
７週齢のマウス（ＩＣＲ、雌）を高カロリー食であるＭＨＦｄｉｅｔにて２３週間飼育し、肥満を形成させた。先ず、ｓｉＲＮＡの投与開始前にマウスの体重を測定した。ｓｉＲＮＡ（ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡｉ−６）を、ＨＶＪ−リポソームをキャリアとして用いマウスの尾静脈から投与した（４０μｇ／ｍｏｕｓｅ／ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）。投与は１日おきに５回行い、最終投与２日後にマウスの体重を測定し、ｓｉＲＮＡ投与の前後での体重変化を求めた。眼窩静脈叢より採血し血糖値を測定した。腹部大静脈より採血し血漿インスリン濃度を測定した。対照には、哺乳類細胞では効果を示さないｓｃｒａｍｂｌｅ ｓｉＲＮＡを投与したマウスを用いた。
【０１１３】
図１１は、ｓｉＲＮＡ投与による（ａ）体重、（ｂ）血糖値及び（ｃ）血漿インシュリンレベルの変化を表す図である。図１１に示すように、ＬＣＥに対するｓｉＲＮＡをマウスに投与することにより体重が減少した。また、血糖値および血漿インシュリンレベルのいずれもが減少し、ＬＣＥに対するｓｉＲＮＡがＬＣＥの活性を抑制し、肥満改善効果を示すことが個体レベルでも確認できた。
【０１１４】
また、これらマウスの肝臓からｔｏｔａｌ ＲＮＡを精製し、逆転写反応によりｃＤＮＡを得た。
ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ ＳｙｓｔｅｍによるＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法を用いてマウスＬＣＥ ｍＲＮＡ、マウスａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ（ＡＣＣ）ｍＲＮＡ、マウスＦＡＳ ｍＲＮＡ、マウスＳＣＤ−１ ｍＲＮＡ、マウスＳＲＥＢＰ−１ｃ ｍＲＮＡ、マウスｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＩＲＳ）−２ ｍＲＮＡの発現量を測定した。標準曲線はＰＣＲにより調製した各遺伝子のｃＤＮＡ断片をそれぞれ用いて作製した。各遺伝子の発現量はβ−アクチンの発現量で規格化した。
【０１１５】
測定に用いたプライマーおよびプローブの塩基配列を示す。
マウスＡＣＣ１用ＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅ
５’−
ＡＧＣＴＧＣＡＡＧＣＣＴＧＴＣＡＴＣＣＴＣＡＡＴＡＴＣＧ−３’（配列番号７３）
マウスＡＣＣ１ ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ
ｆｏｒｗａｒｄ：
５’−ＴＴＣＴＧＡＡＴＧＴＧＧＣＴＡＴＣＡＡＧＡＣＴＧＡ−３’（配列番号７４）
ｒｅｖｅｒｓｅ：
５’−ＴＧＣＴＧＧＧＴＧＡＡＣＴＣＴＣＴＧＡＡＣＡ−３’（配列番号７５）
マウスＡＣＣ１用ｃＤＮＡ作製用ｐｒｉｍｅｒ
ｆｏｒｗａｒｄ：
５’−ＴＡＧＴＧＴＣＡＧＣＧＡＴＧＴＴＣＴＧＴ−３’（配列番号７６）
ｒｅｖｅｒｓｅ：
５’−ＡＡＡＴＣＴＣＴＧＡＴＣＣＡＣＣＴＣＡＣ−３’（配列番号７７）
マウスＳＣＤ−１用ＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅ
ＡＣＴＣＧＣＣＴＡＣＡＣＣＡＡＣＧＧＧＣＴＣＣ（配列番号７８）
マウスＳＣＤ−１用ＴａｑＭａｎ ｐｒｉｍｅｒ
ｆｏｒｗａｒｄ：
５’−ＴＴＴＣＣＡＡＧＣＧＣＡＧＴＴＣＣＧ−３’（配列番号７９）
ｒｅｖｅｒｓｅ：
５’−ＡＴＣＧＡＧＣＧＴＧＧＡＣＴＴＣＧＧＴ−３’（配列番号８０）
マウスＳＣＤ−１ ｃＤＮＡ作製用ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ
ｆｏｒｗａｒｄ：
５’−ＣＡＣＣＣＡＴＣＣＣＧＡＧＡＧＴＣＡＧＧ−３’（配列番号８１）
ｒｅｖｅｒｓｅ：
５’−ＧＴＧＧＧＣＣＧＧＣＡＴＧＡＴＧＡＴＡＧ−３’（配列番号８２）
マウスＳＲＥＢＰ−１ｃ用ＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅ
５’−
ＣＴＴＣＡＡＡＴＧＴＧＣＡＡＴＣＣＡＴＧＧＣＴＣＣＧＴ−３’（配列番号８３）
マウスＳＲＥＢＰ−１ｃ用ＴａｑＭａｎ ｐｒｉｍｅｒ
ｆｏｒｗａｒｄ：
５’−ＧＴＡＧＣＧＴＣＴＧＣＡＣＧＣＣＣＴＡ−３’（配列番号８４）
ｒｅｖｅｒｓｅ：
５’−ＣＴＴＧＧＴＴＧＴＴＧＡＴＧＡＧＣＴＧＧＡＧ−３’（配列番号８５）
マウスＳＲＥＢＰ−１ｃ ｃＤＮＡ作製用ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ
ｆｏｒｗａｒｄ：
５’−ＡＡＧＣＴＧＴＣＧＧＧＧＴＡＧＣＧＴＣＴ−３’（配列番号８６）
ｒｅｖｅｒｓｅ：
５’−ＡＧＧＣＴＣＧＡＧＴＡＡＣＣＣＡＧＣＡＣ−３’（配列番号８７）
マウスＩＲＳ−２用ＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅ
５’−
ＡＣＴＴＡＧＣＣＧＣＴＴＣＡＡＧＣＣＣＧＡＴＧＴＧ−３’（配列番号８８）
マウスＩＲＳ−２ ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ用ｐｒｉｍｅｒ
ｆｏｒｗａｒｄ：
５’−ＡＧＡＡＧＧＴＧＣＣＣＧＡＧＴＧＧＣ−３’（配列番号８９）
ｒｅｖｅｒｓｅ：
５’−ＣＣＣＣＡＧＡＴＡＣＣＴＧＡＴＣＣＡＴＧＡ−３’（配列番号９０）
マウスＩＲＳ−２ ｃＤＮＡ作製用ｐｒｉｍｅｒ
ｆｏｒｗａｒｄ：
５’−ＣＡＧＴＡＧＧＣＴＣＣＡＴＧＧＡＴＧＧＣ−３’（配列番号９１）
ｒｅｖｅｒｓｅ：
５’−ＡＴＧＡＣＣＴＴＡＧＣＡＣＣＣＣＧＧＴＧ−３’（配列番号９２）
【０１１６】
図２１は、ｓｉＲＮＡを投与したマウスの肝臓における（ａ）ＡＣＣ、ＦＡＳ、ＳＣＤ１、ＳＲＥＢＰ−１ｃ、ＩＲＳ−２及び（ｂ）ＬＣＥのｍＲＮＡの発現量を表すグラフである。ＬＣＥの発現を抑制することにより、脂肪酸合成に関わる酵素であるＡＣＣ、ＦＡＳ、ＳＣＤ１の発現が低下しており、また脂肪酸合成を調節する転写因子であるＳＲＥＢＰ−１ｃの発現量も低下していることが確認された。すなわち、ＤＩＯマウスの肝臓におけるＬＣＥの発現抑制により、肝臓での脂肪合成が抑制されることが示唆された。
【０１１７】
また、ＩＲＳ−２（ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−２）の発現がＬＣＥ ＲＮＡｉ投与マウスの肝臓で亢進しているのは、肝臓のＬＣＥの発現抑制が肝臓のインスリン感受性を亢進させることを示唆する。これは、実施例１２で示したＬＣＥの発現抑制による血糖値及び血漿インスリン濃度の低下を引き起こす原因になっていると発明者らは考えている。
【０１１８】
実施例１３：ＨｅｐＧ２細胞においてＬＣＥ ＲＮＡｉが細胞の脂肪酸組成に与える影響
ＨｅｐＧ２細胞にｓｉＲＮＡ（ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−６）を導入し７２時間後に細胞を回収した。その細胞をリン酸緩衝液中にて超音波破砕し、内部標準としてＣ１７：０の中性脂肪、コレステリルエステル、リン脂質を加えた後にＢｌｉｇｈ−Ｄｙｅｒ法により脂質成分を抽出した。得られた脂質を窒素気流下にて乾固した後、ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ Ｇを用いた薄層クロマトグラフによる分画（ヘキサン：ジエチルエーテル：酢酸＝８０：２０：１）を行い、中性脂肪、コレステリルエステル、リン脂質を分離した。これら３画分それぞれを５％塩酸−メタノールにより脂肪酸残基をメチル化し、ガスクロマトグラフ（ＧＣ−ＦＩＤ）を用いて脂肪酸組成の分析を行った。対照には哺乳類遺伝子に相同性がない配列のｓｉＲＮＡ（ｓｃｒａｍｂｌｅ ｓｉＲＮＡ Ｄｕｐｌｅｘ：Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｉｎｃ）を導入したＨｅｐＧ２細胞を用いた。
【０１１９】
脂肪酸組成の分析結果を表２に示す。表２に示した結果から分かるように、ＲＮＡｉによりＬＣＥの発現を抑制すると、トリグリセリド、コレステリルエステル及びリン脂質のいずれにおいてもＣ１８以上の脂肪酸の構成比率が減少することが確認できた。
【０１２０】
【表２】
【０１２１】
実施例１４：ＨｅｐＧ２細胞においてＬＣＥ ＲＮＡｉが他遺伝子の発現に与える影響
脂肪酸合成に関与するＳＲＥＢＰ−１（ｓｔｅｒｏｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ−１）及びコレステロール合成に関与するＳＲＥＢＰ−２（ｓｔｅｒｏｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ−２）に対して、ＬＣＥ発現抑制が与える影響について調べた。ｓｉＲＮＡ（ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−６）を導入したＨｅｐＧ２細胞からｔｏｔａｌ ＲＮＡを精製し、逆転写反応によりｃＤＮＡを得た。ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍを用いたＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法によりヒトＳＲＥＢＰ−１ ｍＲＮＡ、ヒトＳＲＥＢＰ−２ ｍＲＮＡの発現を測定した。対照には哺乳類遺伝子に相同性がない配列のｓｉＲＮＡ（ｓｃｒａｍｂｌｅ ｓｉＲＮＡ Ｄｕｐｌｅｘ：Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｉｎｃ）を導入したＨｅｐＧ２細胞を用いた。標準曲線はＰＣＲにより調製したヒトＳＲＥＢＰ−１ ｃＤＮＡ断片、ヒトＳＲＥＢＰ−２ ｃＤＮＡ断片をそれぞれ用いて作製した。各遺伝子の発現量はβ−アクチンの発現量で規格化した。
【０１２２】
測定に用いたプライマーの塩基配列を示す。
ヒトＳＲＥＢＰ−１用ＴａｑＭａｎ ｐｒｉｍｅｒ
ｆｏｒｗａｒｄ：
５’−ＣＡＡＣＡＣＡＧＣＡＡＣＣＡＧＡＡＡＣＴＣＡＡＧ−３’（配列番号６０）
ｒｅｖｅｒｓｅ：
５’−ＴＴＧＣＴＴＴＴＧＴＧＧＡＣＡＧＣＡＧＴＧ−３’（配列番号６１）
ヒトＳＲＥＢＰ−１ ｃＤＮＡ作製用ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ
ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＣＧＧＡＧＡＡＧＣＴＧＣＣＴＡＴＣＡＡＣ−３’（配列番号６２）
ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＧＧＴＣＡＧＴＧＴＧＴＣＣＴＣＣＡＣＣＴ−３’（配列番号６３）
ヒトＳＲＥＢＰ−２用ＴａｑＭａｎ ｐｒｉｍｅｒ
ｆｏｒｗａｒｄ：
５’−ＧＡＴＡＴＣＧＣＴＣＣＴＣＣＡＴＣＡＡＴＧＡＣ−３’（配列番号６４）
ｒｅｖｅｒｓｅ：
５’−ＡＣＴＴＧＴＧＣＡＴＣＴＴＧＧＣＧＴＣＴＧ−３’（配列番号６５）
ヒトＳＲＥＢＰ−２ ｃＤＮＡ作製用ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ
ｆｏｒｗａｒｄ：
５’−ＣＡＴＴＣＴＧＡＣＣＡＣＡＡＴＧＣＣＴＧ−３’（配列番号６６）
ｒｅｖｅｒｓｅ：
５’−ＡＧＴＡＧＧＧＡＧＡＧＡＡＧＣＣＡＧＣＣ−３’（配列番号６７）
【０１２３】
図１２は、ｓｉＲＮＡを導入したＨｅｐＧ２細胞におけるＳＲＥＢＰ−１及びＳＲＥＢＰ−２のｍＲＮＡの発現量を表すグラフである。図１２に示すとおり、ｓｉＲＮＡの導入により、ＳＲＥＢＰ−１の発現は顕著に低下する一方、ＳＲＥＢＰ−２の発現は変化しないことが確認された。
【０１２４】
実施例１５：ＨｅｐＧ２細胞においてＬＣＥ ＲＮＡｉが細胞の脂質合成に与える影響
ＨｅｐＧ２細胞にｓｉＲＮＡ（ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−６）を導入し、７２時間後に培地に１４Ｃ標識酢酸ナトリウムを添加した。添加４時間後に細胞を０．１％ＳＤＳにて溶解した。細胞溶解液の一部に１５％水酸化カリウム−メタノール溶液を加え７５℃４５分間加熱によるけん化処理行った。５Ｎ塩酸を加えた後に、クロロホルム−メタノール（２：１）にて脂質成分を抽出した。抽出した脂質成分をｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ Ｇを用いた薄層クロマトグラフにより分画（ヘキサン：ジエチルエーテル：酢酸＝８０：２０：１）し、脂肪酸画分に取り込まれた１４Ｃ酢酸を測定することで脂肪酸合成能を測定した。
【０１２５】
また、上記細胞溶解液の一部から直接、クロロホルム−メタノール（２：１）にて脂質成分を抽出した。得られた脂質成分を薄層クロマトグラフにより分画し、中性脂肪画分に取り込まれた１４Ｃ酢酸を測定することで中性脂肪合成能を測定した。得られた脂肪酸合成能および中性脂肪合成能の値は、細胞溶解液中のタンパク質量により規格化した。対照には哺乳類遺伝子に相同性がない配列のｓｉＲＮＡ（ｓｃｒａｍｂｌｅ ｓｉＲＮＡ Ｄｕｐｌｅｘ：Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｉｎｃ）を導入したＨｅｐＧ２細胞を用いた。
【０１２６】
図１３は、ｓｉＲＮＡを導入したＨｅｐＧ２細胞における（ａ）脂肪酸合成能及び（ｂ）中性脂肪合成能を表す図である。図１３に示したように、ｓｉＲＮＡを導入してＬＣＥの発現を抑制することで、脂肪酸合成能及び中性脂肪合成能が低下することが確認された。
【０１２７】
実施例１６：ＨｅｐＧ２細胞においてＬＣＥ ＲＮＡｉが細胞の中性脂肪含量に与える影響
ＨｅｐＧ２細胞にｓｉＲＮＡ（ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−６）を導入し７２時間後に細胞を回収した。その細胞をリン酸緩衝液中にて超音波破砕し、その一部からＢｌｉｇｈ−Ｄｙｅｒ法により脂質成分を抽出した。得られた脂質を窒素気流下にて乾固した後、２−プロパノールに溶解し、酵素法により中性脂肪量を測定した。得られた中性脂肪量の値は、細胞の超音波破砕液中のタンパク質量にて規格化した。対照には哺乳類遺伝子に相同性がない配列のｓｉＲＮＡ（ｓｃｒａｍｂｌｅ ｓｉＲＮＡ Ｄｕｐｌｅｘ：Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｉｎｃ）を導入したＨｅｐＧ２細胞を用いた。
【０１２８】
図１４は、ｓｉＲＮＡを導入したＨｅｐＧ２細胞中の中性脂肪量を表すグラフである。図１４に示したように、ｓｉＲＮＡを導入してＬＣＥの発現を抑制することで、細胞内の中性脂肪含量が低下することが確認された。
【０１２９】
実施例１７：ＨｅｐＧ２細胞においてＬＣＥ ＲＮＡｉが細胞の脂肪酸酸化に与える影響
ＨｅｐＧ２細胞にｓｉＲＮＡ（ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−６）を導入し、７２時間後に培地に１４Ｃパルミチン酸を添加した。３０分間インキュベーションした後に、培地を別チューブに移し１０％トリクロロ酢酸を加えた。培地から遊離したＣＯ２を１０％水酸化ナトリウム水溶液によりトラップした。トラップされたＣＯ２の放射比活性を測定し、培地に加えたパルミチン酸からβ酸化により作られたＣＯ２量を求めた。またＣＯ２を遊離させた後の培地を遠心して、その上清中の酸可溶性画分の放射比活性を測定し、培地に加えたパルミチン酸からβ酸化により作られたケトン体量を求めた。インキュベーション後のＨｅｐＧ２細胞は培地を取り除いた後に０．１％ＳＤＳにて溶解した。細胞溶解液の一部からクロロホルム−メタノール（２：１）にて脂質成分を抽出し、薄層クロマトグラフにより分画した。そして中性脂肪画分の放射比活性を測定し、培地に加えたパルミチン酸が細胞中の中性脂肪に取り込まれた量を求めた。得られたＣＯ２量、ケトン体量、中性脂肪への取り込み量の値は、細胞溶解液中のタンパク質量にて規格化した。対照には、哺乳類遺伝子に相同性がない配列のｓｉＲＮＡ（ｓｃｒａｍｂｌｅ ｓｉＲＮＡ Ｄｕｐｌｅｘ：Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｉｎｃ）を導入したＨｅｐＧ２細胞を用いた。
【０１３０】
図１５は、ｓｉＲＮＡを導入したＨｅｐＧ２細胞における（ａ）ＣＯ２産生量、（ｂ）ケトン体産生量及び（ｃ）パルミチン酸の中性脂肪への取り込み量を表すグラフである。図１５に示したように、ｓｉＲＮＡを導入してＬＣＥの発現を抑制すると、ＣＯ２産生量及びケトン体産生量が増加し、パルミチン酸の中性脂肪への取り込みが低下することが確認された。脂肪酸の燃焼にともなってＣＯ２及びケトン体が産生するため、この結果は、ＬＣＥの発現抑制は、脂肪酸の燃焼を促進することを示唆している。
【０１３１】
実施例１８：ＨｅｐＧ２細胞においてＬＣＥ ＲＮＡｉが細胞のＣＰＴ−１の発現に与える影響
脂肪酸をミトコンドリアに取り込むトランスポーターであるＣＰＴ−１（ｃａｒｎｉｔｉｎｅ ｐａｌｍｉｔｏｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−１）に対して、ＬＣＥ発現抑制が与える影響について調べた。ＨｅｐＧ２細胞にｓｉＲＮＡ（ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−６）を導入し７２時間後に細胞を回収した。この細胞からｔｏｔａｌ ＲＮＡを精製し、逆転写反応によりｃＤＮＡを得た。ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍを用いたＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法によりヒトＣＰＴ−１ ｍＲＮＡの発現を測定した。対照には、哺乳類遺伝子に相同性がない配列のｓｉＲＮＡ（ｓｃｒａｍｂｌｅ ｓｉＲＮＡ Ｄｕｐｌｅｘ：Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｉｎｃ）を導入したＨｅｐＧ２細胞を用いた。標準曲線はＰＣＲにより調製したヒトＣＰＴ−１ ｃＤＮＡ断片を用いて作製した。得られた値はβ−アクチンの発現量で規格化した。
【０１３２】
測定に用いたプライマーおよびプローブの塩基配列を示す。
ヒトＣＰＴ−１ ＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅ
５’−
ＣＣＧＧＧＡＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡＣＣＡＡＴＴＣＧＴＣ−３’（配列番号６８）
ヒトＣＰＴ−１用ＴａｑＭａｎ ｐｒｉｍｅｒ
ｆｏｒｗａｒｄ：
５’−ＴＧＣＴＴＴＡＣＡＧＧＣＧＣＡＡＡＣＴＧ−３’（配列番号６９）
ｒｅｖｅｒｓｅ：
５’−ＴＧＧＡＡＴＣＧＴＧＧＡＴＣＣＣＡＡＡ−３’（配列番号７０）
ヒトＣＰＴ−１ ｃＤＮＡ作製用ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ
ｆｏｒｗａｒｄ：
５’−ＡＴＴＴＧＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＣＣＴＧＧＴＧＧＧＣ−３’（配列番号７１）
ｒｅｖｅｒｓｅ：
５’−ＴＴＣＣＣＡＣＧＴＣＣＡＡＡＡＴＡＧＧＣ−３’（配列番号７２）
【０１３３】
図１６は、ｓｉＲＮＡを導入したＨｅｐＧ２細胞におけるＣＰＴ−１ ｍＲＮＡの発現量を表すグラフである。図１６に示したように、ｓｉＲＮＡを導入してＬＣＥの発現を抑制すると、ＣＰＴ−１の発現量が増加することが確認された。
【０１３４】
実施例１９：高スクロース食負荷マウスにおける肝臓でのＬＣＥ発現の変化８週齢のマウス（ＩＣＲ、雄）を高スクロース食（６７％スクロース）にて３日間、および７週齢のマウス（ＩＣＲ、雄）を高スクロース食にて１０日間飼育した。体重測定後にマウスを安楽死させ、精巣上体脂肪を摘出し重量を測定した。また、マウスから肝臓を摘出しｔｏｔａｌ ＲＮＡを精製し、Ｔａｑ Ｍａｎ ＰＣＲ法を用いて肝臓でのＬＣＥ ｍＲＮＡの発現量を測定した。ＬＣＥ ｍＲＮＡの発現量はβ−アクチンの発現量で規格化した。対照には通常食（ＣＡ−１）で飼育したマウスを用いた。
【０１３５】
図１７は、高スクロース食を負荷したマウスにおける（ａ）体重、（ｂ）精巣上体の脂肪重量及び（ｃ）肝臓におけるＬＣＥ ｍＲＮＡの発現量を表すグラフである。図１７に示したように、高スクロース負荷することにより、マウスの体重及び脂肪重量は増加し、肝臓におけるＬＣＥ ｍＲＮＡの発現量が増加することが確認された。
【０１３６】
実施例２０：高スクロース食負荷マウスにおけるＬＣＥ ＲＮＡｉ投与の作用
ＨＶＪ−リポソームをキャリアとして用い、ｓｉＲＮＡ（ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡｉ−６）を、マウス（７週齢、ＩＣＲ、雄）に尾静脈から投与した（４０μｇ／ｍｏｕｓｅ／ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）。投与開始直後から、マウスを高スクロース食にて飼育した。対照には、哺乳類細胞では効果を示さないｓｃｒａｍｂｌｅ ｓｉＲＮＡを投与したマウスを用いた。ｓｉＲＮＡの投与は１日おきに５回行い、最終投与の翌日にマウスの体重を測定し、体脂肪量をＮＭＲ ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｍｉｎｉｓｐｅｃ；ｍｑ７．５）にて測定し、脂肪重量／体重比を求めた。腹部大静脈より採血し、血漿レプチン濃度を測定した。
【０１３７】
図１８は、ｓｉＲＮＡを投与したマウスの（ａ）体脂肪量、（ｂ）脂肪重量／体重比及び（ｃ）血漿レプチン濃度を表すグラフである。ＬＣＥ ＲＮＡｉの投与によるＬＣＥ発現抑制は、高スクロース負荷による体脂肪量の増加を抑制した。同様に脂肪重量／体重比の増加を抑制した。これはＬＣＥの発現抑制が、高スクロース摂食による肥満形成を阻害すること（抗肥満効果）を示す。また、レプチンは脂肪組織から分泌されるので、脂肪重量が増加すると分泌されるレプチン濃度が増加する。この実験において、高スクロース食負荷によりレプチンが増加しているのは、脂肪量が増加したことを意味し、ＬＣＥ ＲＮＡｉの投与群でレプチン濃度上昇が抑えられているのは、ＬＣＥ ＲＮＡｉ投与で脂肪重量の増加が抑制されたことを意味する。
【０１３８】
また、マウスを安楽死させた後に肝臓を摘出し、その一部からｔｏｔａｌ ＲＮＡを精製し、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法を用いて肝臓でのＬＣＥ ｍＲＮＡ、ＦＡＳ ｍＲＮＡの発現量を測定した。ＬＣＥ ｍＲＮＡ、ＦＡＳ ｍＲＮＡの発現量はβ−アクチンの発現量で規格化した。また、肝臓の一部をリン酸緩衝液中においてホモジナイズし、Ｂｌｉｇｈ−Ｄｙｅｒ法により脂質成分を抽出した。得られた脂質を窒素気流下にて乾固し、２−プロパノールに溶解し、酵素法により中性脂肪量を測定した。得られた中性脂肪量の値は肝臓ホモジナイズ液中に含まれるタンパク質量で規格化した。さらに、肝臓組織からミクロソーム画分を調製し、ウェスタンブロッティング法によりＬＣＥのタンパク質量の変化を測定した。ウェスタンブロッティングには、マウスＬＣＥタンパク質の一次構造に含まれるアミノ酸配列”ＦＥＡＹＩＧＫＶＫＫＡＴＫＡＥ”に基づいて合成した合成ペプチド”ＣＦＥＡＹＩＧＫＶＫＫＡＴＫＡＥ”をウサギ（ＳＰＦ，Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｗｈｉｔｅ Ｒａｂｂｉｔ）に免疫して得た抗ＬＣＥポリクローナル抗体を用いた。
【０１３９】
図１９は、ｓｉＲＮＡを投与したマウスの（ａ）ＬＣＥ ｍＲＮＡの発現量、（ｂ）ＦＡＳ ｍＲＮＡの発現量及び（ｃ）肝臓における中性脂肪含量を表すグラフである。図１９（ａ）より、高スクロース食負荷により肝臓のＬＣＥの発現が亢進すること、すなわち肥満形成の過程で肝臓のＬＣＥ発現が亢進していることが確認された。また、ＬＣＥ ＲＮＡｉの投与がマウスの肝臓でのＬＣＥの発現亢進を抑制していることが確認された。
【０１４０】
図１９（ｂ）より、高スクロース食負荷により肝臓のＦＡＳの発現が亢進すること、すなわち肝臓での脂肪酸合成が亢進していることが示唆された。また、ＬＣＥ ＲＮＡｉ投与によるＬＣＥ発現抑制によりＦＡＳの発現亢進が抑制され、脂肪酸合成亢進が抑制されることが示唆された。
【０１４１】
図１９（ｃ）より、高スクロース食負荷により肝臓への脂肪の蓄積が亢進していることが確認された。また、ＬＣＥ ＲＮＡｉ投与によるＬＣＥ発現抑制が肥満形成の過程での肝臓での脂肪蓄積を抑制することが確認された。
【０１４２】
以上より、高スクロース食負荷により肝臓での脂肪合成が亢進すること（肥満形成の促進過程）と、ＬＣＥの発現抑制がこの脂肪合成亢進を阻害（肥満形成過程を抑制）することが確認された。
【０１４３】
図２０は、ｓｉＲＮＡを投与したマウスの肝臓におけるＬＣＥタンパク質量の変化を表す図である。図１９に示した脂肪酸合成とＬＣＥの発現量との関係をＬＣＥタンパク質レベルでも確認することができた。
【０１４４】
実施例２１：ヒトＬＣＥのアミノ酸置換及びそれによるＬＣＥ活性の変化
ヒトＬＣＥ ｃＤＮＡを、ＢａｍＨＩサイトを付加したｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ（ｈＬＣＥ−５ＢａｍＨＩ）およびＸｈｏＩサイトを付加したｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ（ｈＬＣＥ−３ＸｈｏＩ）を用いたＰＣＲにより作製した。得られたｃＤＮＡ断片を、付加したＢａｍＨＩサイトとＸｈｏＩサイトを用いて、プラスミドｐＣＭＶ−Ｔａｇ２Ｂ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローニングした（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ ＬＣＥ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）。
【０１４５】
用いたプライマーの配列は以下の通りである。
ｈＬＣＥ−５ＢＢａｍＨＩ：
ＧＧＡＴＣＣＡＡＣＡＴＧＴＣＡＧＴＧＴＴＧＡＣＴＴ（配列番号９３）
ｈＬＣＥ−３ＸｈｏＩ：
ＣＴＣＧＡＧＣＴＡＴＴＣＡＧＣＴＴＴＣＧＴＴＧＴＴ（配列番号９４）
【０１４６】
このプラスミドを鋳型として、ＰＣＲ法を用いた点突然変異導入により変異ＬＣＥをコードするｃＤＮＡを作成した。点突然変異の導入方法を以下に記す。最初にＦｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒとしてｈＬＣＥ−Ｆ４を、ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒとして各変異導入用のｍｕｔａｇｅｎｉｃ ｐｒｉｍｅｒを用いたＰＣＲにより変異導入ＬＣＥ ｃＤＮＡの５’側部分を作製した。またＦｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒとしてｈＬＣＥ−５１０Ｓを、ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒとしてＴ７を用いたＰＣＲによりＬＣＥ ｃＤＮＡの３’側部分を作製した。得られた各変異導入ＬＣＥ ｃＤＮＡ ５’側断片とＬＣＥ ｃＤＮＡ３’側断片を混合したものを鋳型として、ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒにｈＬＣＥ−Ｆ４を、ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒにＴ７を用いたＰＣＲにより、変異を導入したＬＣＥのコーディング領域全長を含むｃＤＮＡ断片を得た。
【０１４７】
用いたプライマーの配列は以下の通りである。
ｈＬＣＥ−Ｆ４：
ＡＡＣＡＴＧＴＣＡＧＴＧＴＴＧＡＣＴＴＴＡＣ（配列番号９５）
ｈＬＣＥ−５１０Ｓ：
ＧＴＧＣＴＣＴＴＣＧＡＡＣＴＧＧＴＧＣＴ（配列番号９６）
Ｔ７：
ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ（配列番号９７）
【０１４８】
作製した突然変異導入ＬＣＥは下記の通りである。ヒトＬＣＥに導入した突然変異は、９９番目のシステインをアラニンに置換したもの（Ｃ９９Ａ）、２２５番目のシステインをアラニンに置換したもの（Ｃ２２５Ａ）、１４１番目のヒスチジンをアラニンにしたもの（Ｈ１４１Ａ）、１４４番目のヒスチジンをアラニンにしたもの（Ｈ１４４Ａ）、１４５番目のヒスチジンをアラニンにしたもの（Ｈ１４５Ａ）、及び１７４番目のヒスチジンをアラニンにしたもの（Ｈ１４７Ａ）である。
【０１４９】
これら変異導入に使用したプライマーの配列は以下の通りである。
Ｃ９９Ａ：
ＣＣＣＴＧＧＴＣＧＧＣＡＡＣＴＧＡＣＴＧＣＴＴＣ（配列番号９８）
Ｃ２２５Ａ：
ＧＴＧＡＧＡＧＴＧＧＧＣＣＴＧＧＴＣＡＴＧＣＴＧ（配列番号９９）
Ｈ１４１Ａ：
ＧＴＧＡＴＡＣＣＡＧＧＣＣＡＧＧＡＡＧＡＴＣ（配列番号１００）
Ｈ１４４Ａ：
ＧＴＧＡＴＧＴＧＧＧＣＡＴＡＣＣＡＧＴＧＣ（配列番号１０１）
Ｈ１４５Ａ：
ＣＡＣＡＧＴＧＡＴＧＧＣＧＴＧＡＴＡＣＣＡＧ（配列番号１０２）
Ｈ１７４Ａ：
ＣＡＴＣＡＣＧＧＣＧＧＣＣＡＣＧＣＣＡＴＡＧ（配列番号１０３）
【０１５０】
得られた変異ＬＣＥ ｃＤＮＡ断片は、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩを利用してプラスミドｐＣＭＶ−Ｔａｇ２Ｂにサブクローニングし、変異ＬＣＥ発現コンストラクトを作製した。これらのコンストラクトをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトし、変異ＬＣＥを発現させた。トランスフェクトから２日後に細胞を回収し、ミクロソーム画分を調製し、ミクロソーム中のＬＣＥ活性を測定した。なお、ＬＣＥの活性測定は、実施例６に記載の方法と同様の方法により行った。
【０１５１】
図２２は、ＬＣＥ変異体のＬＣＥ活性を表すグラフである。（ａ）はシステインをアラニンに置換した変異体のＬＣＥ活性を表し、（ｂ）はヒスチジンをアラニンに置換した変異体のＬＣＥ活性を表している。いずれの変異体も野生型と比較して半分以下にＬＣＥ活性が低下している。
【産業上の利用可能性】
【０１５２】
本発明によれば、長鎖脂肪鎖伸長酵素活性を抑制する活性を有する物質（例えば、ｓｉＲＮＡ、低分子化合物、タンパク質、抗体など）を用いた代謝系疾患、循環器系疾患、中枢神経系疾患などの治療・予防方法を提供することが可能となり、また、かかる物質を含有する治療・予防剤を提供することが可能となる。代謝系疾患としては、例えば、肥満症、糖尿病、ホルモン分泌異常、高脂血症、通風、脂肪肝などが挙げられる。循環器疾患としては、例えば、狭心症、急性・うっ血性心不全、心筋梗塞、冠状動脈硬化症、高血圧、腎臓病、電解質異常などが挙げられる。中枢神経系疾患としては、過食症などが挙げられる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＬＣＥ（ｌｏｎｇ ｃｈａｉｎ ｆａｔｔｙ ａｃｙｌ ｅｌｏｎｇａｓｅ）遺伝子又はタンパク質を用いた肥満の治療又は予防に有効な化合物の評価方法に関する。また、本発明は、前記遺伝子又はタンパク質を用いた肥満の検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肥満は、高血圧症、糖尿病、高脂血症、虚血性心疾患等に代表される種々の成人病の危険因子である。また、これらの多くは慢性疾患であることから、将来的には医療費の高騰の原因になると考えられ、社会的にも大きな問題となっている。
【０００３】
このような肥満を防止するために抗肥満薬の開発が進められており、現在では、食欲抑制剤や脂質吸収阻害剤が臨床的に利用されている。ここで、抗肥満薬研究の標的分子としては、これまでにレプチン、ＰＰＡＲγ、ニューロペプチドＹ等が知られているが、肥満の原因は非常に多様であるため、創薬標的として作用機序の異なった標的分子が待望されている。
【０００４】
また、このような肥満状態あるいはその原因を適切に診断することは、その後の適切な治療にとって不可欠であるため、簡便で精度の高い肥満マーカーの出現が望まれている。また、近年、投与した薬剤の効果が被投与者の遺伝子多型等の遺伝子型に影響を受ける現象が見出されており、薬剤の開発段階における臨床試験やいわゆるオーダーメイド医療において、分子レベルでの検査や診断のマーカーが待望されている。
【０００５】
一方、脂肪酸の生合成はアセチルＣｏＡカルボキシラーゼと脂肪酸合成酵素によって行われる。ＬＣＥ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿０２４０９０（ヒト：配列番号１）；ＮＭ＿１３０４５０（マウス：配列番号２））は、脂肪酸合成酵素の一種であり、アセチルＣｏＡを基質として合成が始まる脂肪酸合成経路において、ラウリン酸からミリスチン酸、ミリスチン酸からパルミチン酸、パルミチン酸からステアリン酸、パルミトレイン酸からワクセン酸等、主に炭素数が１２以上の脂肪酸の炭素鎖の伸長を司ることが知られている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６（４８），４５３５８−４５３６６（２００１）；非特許文献１）。
【０００６】
例えば、ＷＯ０２／４４３２０号公報（特許文献１）には、ＥＬＧ５（ＬＣＥ）が多不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）を基質としてエロンゲース（ｅｌｏｎｇａｓｅ）としての活性を有することが記載されている。また、糖尿病モデルラットであるＳＴＺ ｉｎｄｕｃｅｄ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｒａｔの肝臓においてエロンゲースの活性が亢進する旨の報告（Ｓｕｎｅｊａ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１０４２：８１−８５；非特許文献２）を引用して、エロンゲースが糖尿病等の疾患に関与するとの記載がある。
【０００７】
また、摂餌によりマウスＦＡＣＥ（ＬＣＥ）の発現量が変化する旨の報告もある（Ｍａｔｓｕｚａｋａ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．，４３（６）：９１１−２０（２００２）；非特許文献３）。
【０００８】
【特許文献１】ＷＯ０２／４４３２０号
【非特許文献１】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６（４８），４５３５８−４５３６６，（２００１）
【非特許文献２】Ｓｕｎｅｊａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１０４２：８１−８５（１９９０）
【非特許文献３】Ｍａｔｓｕｚａｋａ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．，４３（６）：９１１−２０（２００２）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、前記文献には、ＬＣＥと肥満とについて直接的に示したデータは開示されておらず、また、その際、ＬＣＥの飽和脂肪酸に対するエロンゲース活性が重要な役割を果たすことについては何ら示されていなかった。
【００１０】
本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、ＬＣＥと肥満との直接的な関係を示すことにより、分子レベルで判断可能な肥満又は痩せの検査方法及び当該分子を用いた肥満及び痩せの検査薬等を提供することを目的とする。また、肥満又は痩せの治療薬や診断薬をスクリーニングする等、化合物の評価方法を提供することを目的とする。さらに、脂肪合成の抑制や肥満の抑制をする方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、体重変化とＬＣＥの発現量との間に一定の相関関係があることを見出し、本発明を完成した。
【００１２】
すなわち、本発明は、以下の肥満の治療又は予防に有効な化合物の評価方法（１）〜（４）を提供する。
（１）被検化合物を、被検動物又は被検細胞に、投与又は接触させる工程と、該被検化合物が、該被検動物又は該被検細胞中でＬＣＥ遺伝子あるいは該遺伝子と機能的に等価な遺伝子の発現レベルを調節するか否かを確認する工程と、を含むことを特徴とする肥満の治療又は予防に有効な化合物の評価方法。
（２）被験化合物を、ＬＣＥ遺伝子の発現調節領域とレポーター遺伝子との融合遺伝子を有する被検動物又は被検細胞に接触させる工程と、該レポーター遺伝子の被検動物又は被検細胞中での発現レベルを測定する工程と、を含むことを特徴とする肥満の治療又は予防に有効な化合物の評価方法。
（３）被検化合物を、ＬＣＥタンパク質に接触させる工程と、該被検化合物が、該タンパク質の活性に影響を与えるか否かを確認する工程と、を含むことを特徴とする肥満の治療又は予防に有効な化合物の評価方法。
（４）被検化合物を、ＬＣＥを含む複数種のエロンゲースタンパク質に接触させる工程と、該複数種のエロンゲースタンパク質の活性を測定する工程と、該複数種のエロンゲースタンパク質においてＬＣＥの活性を阻害する被検化合物を選択する工程と、を含むことを特徴とする肥満の治療又は予防に有効な化合物の評価方法。
【００１３】
ここで、前述した本発明の肥満の治療又は予防に有効な化合物の評価方法によって得られた化合物を有効成分として含有する肥満の治療又は予防剤も本発明に含まれる。
【００１４】
本発明は、また、ＬＣＥの脂肪酸合成活性を抑制することを特徴とする脂肪合成抑制方法を提供する。ここで、ＬＣＥの脂肪酸合成活性を抑制する手段は特に制限されないが、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）により抑制することが好ましい。ＲＮＡｉは、配列番号１３及び１４に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号１５及び１６に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）、配列番号１７及び１８に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号１９及び２０に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号２１及び２２に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号２３及び２４に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号２５及び２６に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号２７及び２８に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号２９及び３０に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号３１及び３２に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号３３及び３４に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号３５及び３６に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号３７及び３８に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号４９及び５０に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号５１及び５１に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ及び配列番号５３及び５４に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡからなる群から選択される一以上のｓｉＲＮＡを使用することにより達成されるが、特に、配列番号２３及び２４に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡを使用することが好ましい。
【００１５】
本発明は、また、ＬＣＥの脂肪酸合成活性をＲＮＡｉにより抑制することを特徴とする肥満の治療又は予防方法を提供する。ここで、ＬＣＥの脂肪酸合成活性を抑制する手段は特に制限されないが、ＲＮＡｉにより抑制することが好ましい。ＲＮＡｉは、上述のｓｉＲＮＡを使用することにより達成されるが、特に配列番号２３及び２４に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡを使用することが好ましい。
【００１６】
本発明は、また、以下の肥満の検査方法（１）〜（４）を提供する。
（１）被検組織又は被検細胞におけるＬＣＥ遺伝子の発現レベル又は発現レベルの変化を測定することを特徴とする肥満の検査方法。
（２）被検組織又は被検細胞におけるＬＣＥタンパク質の発現レベル又は発現レベルの変化を測定することを特徴とする肥満の検査方法。
（３）被検組織又は被検細胞におけるＬＣＥ遺伝子に存在する多型を検出することを特徴とする肥満の検査方法。
（４）ＬＣＥタンパク質と相互作用することによりＬＣＥ遺伝子の発現量に影響を及ぼすタンパク質の発現量又は活性を検出することを特徴とする肥満の検査方法。
【００１７】
本発明は、さらに、配列番号２３及び２４に記載の核酸からなることを特徴とするｓｉＲＮＡを提供し、当該ｓｉＲＮＡを含むことを特徴とするＬＣＥ発現抑制剤、脂肪合成抑制剤及び肥満の治療又は予防剤を提供する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の化合物の評価方法等によれば、ＬＣＥと肥満との直接的な関係が明らかとなり、分子レベルで判断可能な肥満又は痩せの検査方法及び当該分子を用いた肥満及び痩せの検査薬等を提供することが可能となる。また、肥満又は痩せの治療薬や診断薬のスクリーニング等、化合物の評価方法を提供することが可能となる。さらに、脂肪合成の抑制や肥満の抑制をする方法を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、ＬＣＥを強制発現させた細胞における、（ａ）ＬＣＥ ｍＲＮＡの発現量、及び（ｂ）ＬＣＥ活性を表すグラフである。ＨＥＫ２９３は非処理の細胞を、Ａ５はＬＣＥが中程度発現している細胞を、Ｄ８はＬＣＥが高発現している細胞を、それぞれ表す。
【図２】図２は、ＬＣＥを強制発現させた細胞における脂肪酸組成を表すグラフである。黒色部分は炭素鎖の炭素数が１８以上の脂肪酸を、白色部分は炭素鎖の炭素数が１６以下の脂肪酸を表す。（ａ）〜（ｃ）はトリグリセリドを構成する脂肪酸の組成を表し、（ｄ）〜（ｆ）はコレステロールエステルを構成する脂肪酸の組成を表し、（ｇ）〜（ｉ）はリン脂質を構成する脂肪酸の組成を表す。ｗｔは非処理のＨＥＫ２９３細胞を表す。
【図３】図３は、ＬＣＥを強制発現させた細胞における詳細な脂肪酸組成を表すグラフである。（ａ）はトリグリセリドを構成する脂肪酸の組成を表し、（ｂ）はコレステロールエステルを構成する脂肪酸の組成を表し、（ｃ）はリン脂質を構成する脂肪酸の組成を表す。
【図４】図４は、ＲＮＡｉによるＬＣＥの発現抑制の結果を表す図である。（ａ）はＬＣＥ遺伝子における各ｓｉＲＮＡの対応部分を表し、（ｂ）は各ｓｉＲＮＡを導入した場合のＬＣＥｍＲＮＡの発現量を表している。
【図５】図５は、ＲＮＡｉによるＬＣＥの活性抑制の結果を表すグラフである。（ａ）はＬＣＥ ｍＲＮＡの発現量を表し、（ｂ）はＦａｔｔｙ Ａｃｙｌ ＣｏＡの伸長活性を表している。ＬＣＥＲＮＡｉは、ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−６を用いてＬＣＥのＲＮＡｉを行ったことを表す（以下、特に断らない限り同様である）。
【図６】図６は、ｓｉＲＮＡを導入したＨｅｐＧ２細胞におけるＬＣＥｍＲＮＡの発現量を表すグラフである。（ａ）：２４時間後、（ｂ）：４８時間後。
【図７】図７は、ｓｉＲＮＡを導入したＨｅｐＧ２細胞における（ａ）ＬＣＥ、（ｂ）ＦＡＳ及び（ｃ）ＳＣＤのｍＲＮＡの発現量を表すグラフである。
【図８】図８は、ＲＮＡｉによるマウスＬＣＥの発現抑制の結果を表す図である。（ａ）はマウスＬＣＥ遺伝子における各ｓｉＲＮＡの対応部分を表し、（ｂ）は各ｓｉＲＮＡを導入した場合のマウスＬＣＥｍＲＮＡの発現量を表し、（ｃ）は各ｓｉＲＮＡを導入した場合のマウスＦＡＳ ｍＲＮＡの発現量を表している。
【図９】図９は、ＲＮＡｉによる（ａ）ＬＣＥ及び（ｂ）ＦＡＳの発現抑制並びに（ｃ）脂肪酸合成抑制の結果を表す図である。
【図１０】図１０は、ＲＮＡｉによる（ａ）ＬＣＥの発現抑制及び（ｂ）アポリポタンパク質Ｂの分泌抑制の結果を表す図である。
【図１１】図１１は、ｓｉＲＮＡ投与による（ａ）体重、（ｂ）血糖値及び（ｃ）血漿インスリンの変化を表す図である。ｓｃｒａｍｂｌｅ ＲＮＡｉは、哺乳類では効果を示さないｓｃｒａｍｂｌｅｓｉＲＮＡを用いてＲＮＡｉを行ったコントロールを表す。
【図１２】ｓｉＲＮＡを導入したＨｅｐＧ２細胞におけるＳＲＥＢＰ−１及びＳＲＥＢＰ−２のｍＲＮＡの発現量を表すグラフである。
【図１３】図１３は、ｓｉＲＮＡを導入したＨｅｐＧ２細胞における（ａ）脂肪酸合成能及び（ｂ）中性脂肪合成能を表す図である。
【図１４】図１４は、ｓｉＲＮＡを導入したＨｅｐＧ２細胞中の中性脂肪量を表すグラフである。
【図１５】図１５は、ｓｉＲＮＡを導入したＨｅｐＧ２細胞における（ａ）ＣＯ２産生量、（ｂ）ケトン体産生量及び（ｃ）パルミチン酸の中性脂肪への取り込み量を表すグラフである。
【図１６】図１６は、ｓｉＲＮＡを導入したＨｅｐＧ２細胞におけるＣＰＴ−１ ｍＲＮＡの発現量を表すグラフである。
【図１７】図１７は、高スクロース食を負荷したマウスにおける（ａ）体重、（ｂ）精巣上体の脂肪重量及び（ｃ）肝臓におけるＬＣＥ ｍＲＮＡの発現量を表すグラフである。ＣＡ−１は通常食を与えたマウスを表し、ＨＳＤ（３ｄａｙｓ）及びＨＳＤ（１０ｄａｙｓ）は、それぞれ、高スクロース食を３日間及び１０日間与えたマウスを表す。
【図１８】図１８は、ｓｉＲＮＡを投与したマウスの（ａ）体脂肪量、（ｂ）脂肪重量／体重比及び（ｃ）血漿レプチン濃度を表すグラフである。ＨＳＤ ＳＣＲ−ＲＮＡｉは、高スクロース食を負荷したマウスに哺乳類では効果を示さないｓｃｒａｍｂｌｅｓｉＲＮＡを投与したことを表す。ＨＳＤ ＬＣＥ−ＲＮＡｉは高スクロース食を負荷したマウスにｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−６を投与したことを表す。
【図１９】図１９は、ｓｉＲＮＡを投与したマウスの（ａ）ＬＣＥ ｍＲＮＡの発現量、（ｂ）ＦＡＳ ｍＲＮＡの発現量及び（ｃ）肝臓における中性脂肪含量を表すグラフである。
【図２０】図２０は、ｓｉＲＮＡを投与したマウスの肝臓におけるＬＣＥタンパク質量の変化を表す図である。
【図２１】図２１は、ｓｉＲＮＡを投与したマウスの肝臓における（ａ）ＡＣＣ、ＦＡＳ、ＳＣＤ１、ＳＲＥＢＰ−１ｃ、ＩＲＳ−２及び（ｂ）ＬＣＥのｍＲＮＡの発現量を表すグラフである。
【図２２】図２２は、ＬＣＥ変異体のＬＣＥ活性を表すグラフである。（ａ）はシステインをアラニンに置換した変異体のＬＣＥ活性を表し、（ｂ）はヒスチジンをアラニンに置換した変異体のＬＣＥ活性を表している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
【００２１】
本発明における「発現レベル」とはＬＣＥ遺伝子の転写産物の絶対量又は相対量をいう。この場合、当該遺伝子は、ＤＮＡ又はｍＲＮＡのいずれをも含む。また、発現の検出対象がタンパク質の場合、その「発現レベル」とは、ＬＣＥ遺伝子の翻訳産物の絶対量又は相対量をいう。
【００２２】
また、本発明における「被検動物」とは、化合物の評価に使用できる動物であれば、その種は特に限定されないが、具体的には、例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、サルが挙げられる。
【００２３】
また、本発明における「被検組織」とは、肥満又は痩せの検査を行う際に生体から抽出可能な組織であれば、その種類は特に限定されないが、肥満又は痩せの影響が反映されやすいとの観点から、例えば、肝臓組織、脂肪組織、筋肉組織、血液組織であることが好ましい。また、組織の単離が容易であるとの観点から、前記組織の中でも血液組織であることが好ましい。ここで、これらの組織の由来となる動物種については特に制限されないが、本発明の主たる用途がヒトの臨床的使用であることから、ヒトであることが好ましい。
【００２４】
また、本発明における「被検細胞」についても、肥満又は痩せの検査を行う際に生体から抽出可能な細胞であれば、その種類は特に限定されないが、肥満又は痩せの影響が反映されやすいとの観点から、例えば、肝細胞、脂肪細胞（白色脂肪細胞、褐色脂肪細胞等）、筋肉細胞（筋芽細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞等）、膵細胞（膵島細胞等）、血球細胞であることが好ましい。ここで、かかる組織の由来となる動物種については特に限定されないが、本発明の主たる用途がヒトの臨床的使用であることから、ヒトであることが好ましい。
【００２５】
さらに、本発明における「肥満」とは、脂肪組織が過剰に蓄積した状態と定義される一般的な肥満に加え、これに糖尿病や高血圧等の合併症又は内臓脂肪が伴う、いわゆる「肥満症」も含む。また、本発明における「肥満」は、薬物投与等による体重のコントロールを受けた場合に、もとの体重と比較して相対的に体重が増加した状態をも意味する。
【００２６】
また、本発明における「検査」とは、肥満又は痩せであることを単に判断するのみならず、将来的な肥満又は痩せを「予測」する場合をも含む。
【００２７】
また、本発明における「エロンゲース活性」とは、脂肪酸又はＦａｔｔｙ ａｃｙｌ−ＣｏＡの炭素鎖を伸長させる活性を意味する。
【００２８】
（１）肥満の治療又は予防に有効な化合物の評価方法
本発明の肥満の治療又は予防に有効な化合物の評価方法について説明する。被検化合物を被検動物や被検細胞に投与、接触させることにより変動するＬＣＥ遺伝子の発現量を測定したり、被検化合物をＬＣＥタンパク質に接触させて当該タンパク質の活性に及ぼす影響を検討したりすることにより、当該被検化合物の評価を行うことが可能となる。
【００２９】
すなわち、このような被検化合物の中には、細胞や組織に作用することにより、ＬＣＥ遺伝子の発現レベルやＬＣＥタンパク質の活性を正常化あるいはコントロールし、脂肪の蓄積や食欲のコントロール等、肥満の原因となるメカニズムの正常化を図ることができるものがあると考えられる。従って、以下に説明するような評価方法により、肥満の治療薬又は予防に有効な化合物を評価することが可能となる。
【００３０】
（Ａ）ＬＣＥ遺伝子の発現レベル調節能を指標とする評価方法
被検化合物を被検動物又は被検細胞に投与又は接触させ、当該被検化合物が被検動物又は被検細胞中でＬＣＥ遺伝子あるいは当該遺伝子と機能的に等価な遺伝子の発現レベルを調節するか否かを確認することにより、肥満の治療又は予防に有効な化合物を評価することが可能となる。
【００３１】
具体的には、以下の手順で被検化合物の評価を行う。
先ず、被検化合物を被検動物又は被検細胞に投与又は接触させる。ここで、被検化合物としては、肥満の治療又は予防薬の候補化合物であれば、その構造や性質は問わず、化合物種も限定されない。被検化合物を被検動物に投与する方法としては特に制限はなく、具体的には、例えば、経口投与、非経口投与（例えば、経皮投与、筋肉内注射、静脈内注射、皮下注射）が挙げられる。また、被検化合物を被検細胞に接触させる方法としても特に制限はなく、具体的には、例えば、培養液や緩衝液（リン酸緩衝液等）等の溶液中で混合し両者を接触させる方法が挙げられる。
【００３２】
次に、被検化合物が被検動物又は被検細胞中でＬＣＥ遺伝子あるいは当該遺伝子と機能的に等価な遺伝子の発現レベルを調節するか否かを確認する。
【００３３】
前記遺伝子の発現レベルの調節の有無の確認法としては、特に制限はなく、前述の投与又は接触の前を対照とし、当該遺伝子の発現量の変化をＲＴ−ＰＣＲのような遺伝子増幅法、ＤＮＡマイクロアレイを用いる方法又はノーザンハイブリダイゼーション法等によって検出することにより実施することができる。また、前記遺伝子の発現調節領域とレポーター遺伝子との融合遺伝子を人為的に導入した動物又は細胞を用いてもよい。この場合、レポーター遺伝子としては、具体的には、例えば、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子又はグリーンフルオレッセンスプロテイン遺伝子が挙げられる。
【００３４】
ここで、「ＬＣＥ遺伝子と機能的に等価な遺伝子」とは、ＬＣＥ遺伝子と塩基配列は異なるものの、比較的高い同性を示し、ＬＣＥと同じ又は類似の活性を有する遺伝子を示す。ここで、前記相同性は、遺伝子の機能が等価であれば特に制限はないが、塩基配列の相同性が７０〜１００％であることが好ましく、８０〜１００％であることがより好ましく、９０〜１００％であることがさらに好ましく、９５〜１００％であることが特に好ましい。相同性が前記下限より低い場合には、ＬＣＥと同じ又は類似の機能を示さない可能性が高い傾向にある。しかしながら、塩基配列の相同性が前記下限未満であっても、ＬＣＥに特有の機能を有するドメインと、当該ドメインに対応する塩基配列との相同性が高い場合にはＬＣＥ遺伝子と同様又は類似の機能を有する場合がある。このような遺伝子は、塩基配列の相同性が前記範囲外であっても好適に使用可能である。また、比較的相同性の高い遺伝子としては、ＬＣＥ遺伝子における１又は２以上の塩基が自然若しくは人工的に置換、欠失、不可及び／又は挿入したものであってもよい。
【００３５】
被検化合物を投与又は接触させない場合に比べて、被検化合物を投与又は接触させた場合のＬＣＥ遺伝子又はＬＣＥ遺伝子と機能的に等価な遺伝子の発現レベルが２０％以上、好ましくは５０％以上低下した場合、当該被検化合物は肥満の治療又は予防に有効な化合物と評価できる。
【００３６】
（Ｂ）ＬＣＥタンパク質の活性を指標とする評価方法
被検化合物をＬＣＥタンパク質に接触させ、被検化合物が当該タンパク質の活性に影響を与えるか否かを確認することにより、肥満の治療又は予防に有効な化合物を評価することが可能となる。
【００３７】
具体的には、以下の手順で被検化合物の評価を行う。
先ず、被検化合物をＬＣＥタンパク質に接触させる。このようなタンパク質と被検化合物を接触させる方法としては、特に制限はなく、具体的には、例えば、緩衝液（リン酸緩衝液等）等の溶液中で混合し接触させる方法が挙げられる。
【００３８】
次に、被検化合物が当該タンパク質の活性に影響を与えるか否かを確認する。タンパク質の活性測定における条件は、使用するタンパク質の性質により適宜設定すればよい。このような条件としては、具体的には、例えば、ＬＣＥタンパク質の場合には、エロンゲース活性を指標とすることができ、具体的には、例えば、細胞から抽出したミクロソーム画分を、ＮＡＤＰＨ、パルミトイルＣｏＡ、１４Ｃ標識マロニルＣｏＡ等を含む溶液中で混合してインキュベートし、脂肪酸を抽出した後、脂肪酸に含まれる放射性比活性を測定することによりエロンゲース活性を測定することができる。また、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６（４８），４５３５８−４５３６６，（２００１）を参照して行うこともできる。
【００３９】
被検化合物を投与又は接触させない場合に比べて、被検化合物を投与又は接触させた場合のＬＣＥタンパク質の活性が２０％以上、好ましくは５０％以上低下した場合、当該被検化合物は肥満の治療又は予防に有効な化合物と評価できる。
【００４０】
以上説明したような本発明の肥満の治療又は予防に有効な化合物の評価方法により、肥満の治療薬や診断薬のスクリーニングや、これらの薬剤の有効性又は安全性の評価、さらには、オーダーメイド治療における適切な薬剤の選択が可能となる。
【００４１】
（Ｃ）ＬＣＥタンパク質を阻害する化合物の評価方法
被検化合物を、ＬＣＥを含む複数種のエロンゲースタンパク質に接触させ、当該複数種のエロンゲースタンパク質の活性を測定した後、ＬＣＥの活性を阻害する被検化合物を選択することにより、エロンゲースの中でもＬＣＥのエロンゲース活性を阻害する化合物を評価・選択することが可能となる。
【００４２】
具体的には、以下の手順で評価を行う。
先ず、被検化合物を、ＬＣＥを含む複数種のエロンゲースタンパク質にそれぞれ接触させる。このようなタンパク質と被検化合物を接触させる方法としては、特に制限はなく、具体的には、例えば、緩衝液（リン酸緩衝液等）等の溶液中で混合し接触させる方法が挙げられる。ここで、複数種のエロンゲースとは、エロンゲース活性を有するものであればその種類は特に制限されないが、具体的には、例えば、ＦＡＳ（Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄ Ｓｙｎｔｈａｓｅ）、ＥＬＯ−１が挙げられる。
【００４３】
次に、被検化合物がそれぞれのタンパク質の活性に影響を与えるか否かを確認する。タンパク質の活性測定における条件は、使用するタンパク質の性質により適宜設定すればよい。このような条件としては、例えば、ＬＣＥタンパク質の場合には、エロンゲース活性を指標とすることができ、具体的には、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６（４８），４５３５８−４５３６６，（２００１）を参照して行うことができる。また、他のエロンゲースにおいては、ＬＣＥと同様にエロンゲース活性を指標にすればよく、公知の方法に従って活性測定を行えばよいが、例えば、前記のＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６（４８），４５３５８−４５３６６，（２００１）を参照して実施することができる。
【００４４】
以上説明したような本発明の肥満の治療又は予防に有効な化合物の評価方法により、肥満の治療薬又は診断薬のスクリーニングや、これらの薬剤の有効性又は安全性の評価、さらには、オーダーメイド治療における適切な薬剤の選択が可能となる。
【００４５】
（２）脂肪合成抑制方法及び肥満の治療又は予防方法
次に、本発明の脂肪合成抑制方法及び肥満の治療又は予防方法について説明する。ＬＣＥは脂肪の構成成分である脂肪酸の合成酵素であることから、かかる酵素活性を阻害することにより脂肪酸の合成を阻害することが可能となり、ひいては、脂肪の合成を阻害することが可能となる。
【００４６】
具体的には、以下の手順で脂肪合成抑制を行う。
先ず、ＬＣＥの活性を阻害する物質を選択する。かかる物質としては、例えば、ＬＣＥ阻害剤として機能する化合物、ＬＣＥの抗体、アンチセンスヌクレオチド及びＲＮＡｉに使用するｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ；センスＲＮＡ・アンチセンスＲＮＡの二本鎖ＲＮＡ）が挙げられる。
【００４７】
次に、ＬＣＥが存在する個体、組織、細胞に対して前記の物質を導入する。具体的には、対象が個体であれば、導入方法としては特に制限はないが、前記化合物等を、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射等の他、鼻腔内的、経気管支的、筋肉的又は経口的に導入する方法が挙げられる。また、対象が組織であれば、導入方法としては特に制限はないが、組織中への注入、緩衝液中での混合により導入する方法が挙げられる。さらに、対象が細胞であれば、導入方法としては特に制限はないが、緩衝液中での混合、エレクトロポレーション等が挙げられる。
【００４８】
より具体的には、ＲＮＡｉの場合、例えば、リポソームに封入したｓｉＲＮＡを細胞培養液に添加し細胞に接触させることで細胞内にｓｉＲＮＡを導入でき、ＲＮＡｉを起こすことができる（Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４９４−４９８，（２００１）、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．，１１４（Ｐｔ ２４），４５５７−４５６５，（２００１）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３０１（３），８０４−８０９，２００３）。ＬＣＥのＲＮＡｉには、以下のｓｉＲＮＡを用いることができる。ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−１（配列番号１３及び１４）、ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−２（配列番号１５及び１６）、ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−３（配列番号１７及び１８）、ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−４（配列番号１９及び２０）、ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−５（配列番号２１及び２２）、ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−６（配列番号２３及び２４）、ＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−２（配列番号２５及び２６）、ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−７（配列番号２７及び２８）、ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−８（配列番号２９及び３０）、ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−９（配列番号３１及び３２）、ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−１０（配列番号３３及び３４）、ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−１１（配列番号３５及び３６）、ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−１２（配列番号３７及び３８）、ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−６（配列番号４９及び５０）、ｍＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−７（配列番号５１及び５２）及びｍＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−１１（配列番号５３及び５４）。これらのｓｉＲＮＡを複数組み合わせて使用することによりＲＮＡｉを生じさせてもよい。これらの中でも、ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−６（配列番号２３及び２４）はＬＣＥの発現抑制作用が特に強いため、ＬＣＥのＲＮＡｉに適している。
【００４９】
このようにＬＣＥの活性を阻害することにより、脂肪酸の炭素鎖の伸張反応が抑制され、脂肪酸の生合成が抑制される。
【００５０】
また、かかる脂肪合成抑制方法を肥満の治療又は予防に応用することができる。すなわち、生体内でＬＣＥの活性を阻害することにより脂肪酸の合成を抑制し、結果的に脂質の合成を抑制することにより肥満の治療又は予防が可能となる。
【００５１】
具体的には、以下の手順で肥満の治療又は予防を行う。
先ず、ＬＣＥの活性を阻害する物質を選択する。かかる物質としては、例えば、ＬＣＥ阻害剤として機能する化合物、ＬＣＥの抗体、アンチセンスヌクレオチド及びＲＮＡｉに使用するｓｉＲＮＡが挙げられる。
【００５２】
次に、このような物質を生体内に投与する。投与方法としては、特に制限はないが、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射等の他、鼻腔内的、経気管支的、筋肉的又は経口的な投与方法が挙げられる。ＲＮＡｉを用いた具体的な方法については、脂肪合成抑制方法で説明した通りである。
【００５３】
（３）肥満又は痩せの検査方法
次に、本発明の肥満又は痩せの検査方法について説明する。
【００５４】
（Ａ）ＬＣＥ遺伝子の発現レベルを測定することによる肥満または痩せの検査方法被検組織又は被検細胞におけるＬＣＥ遺伝子の発現レベルの変化を検出することにより、又は、発現レベルを測定することにより、当該被検組織又は被検細胞を抽出した生体（例えばヒト）が肥満であるか否かを検査・診断することが可能である。また、単に検査時の肥満の状態を検査するのみならず、将来的に肥満又は痩せになりうるかを予測することも可能である。
【００５５】
以下に、このような検査の具体的な方法について説明する。
先ず、検査対象となる生体より被検組織又は被検細胞を抽出する。このような抽出の方法としては特に制限はなく、公知の方法により抽出することができる。
【００５６】
次に、抽出された被検組織又は被検細胞から発現レベルの測定の対象となる遺伝子を調製する。ＬＣＥ遺伝子の発現レベルを測定するには、先ず、被検組織又は被検細胞からＬＣＥのＲＮＡ（ｔｏｔａｌ ＲＮＡ又はｍＲＮＡ）を調製する必要がある。このようなＲＮＡの調製は、公知の方法によって行うことができるが、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ ２ｎｄ ＥＤＩＴＩＯＮ（１９８９）（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ著：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）７．３−７．３６を参照して行うことができる。こうして調製したＲＮＡを用いて、例えば、ＲＴ−ＰＣＲのような遺伝子増幅法、ＤＮＡマイクロアレイ（例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製ＤＮＡチップ）を用いる方法、ノーザンハイブリダイゼーション法により、その発現量を測定することができる。また、被検組織又は被検細胞を用いたイン サイチュ ハイブリダイゼーション（ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）等により、その発現量を測定することもできる。
【００５７】
また、ＬＣＥ遺伝子の発現レベルの変化を検出するには、前記の発現量の測定を当該発現量が変化すると予測される期間の前後（例えば、肥満治療薬の投与の前後）について行い、発現量の差を測定すればよい。具体的には、被検組織又は被検細胞において、前述したＬＣＥ遺伝子の発現量が変化すると予測される期間の前後で、その発現レベルが有意に上昇した場合に、体重の増加があった又は将来的に増加する可能性があると診断できる。
【００５８】
（Ｂ）ＬＣＥタンパク質の発現レベルを測定することによる肥満又は痩せの検査方法被検組織又は被検細胞におけるＬＣＥタンパク質の発現レベルの変化を検出することにより、又は、発現レベルを測定することにより、当該被検組織又は被検細胞を抽出した生体（例えばヒト）が肥満であるか否かを検査・診断することが可能である。また、単に検査時の肥満状態を検査するのみならず、将来的に肥満又は痩せになりうるかを予測することも可能である。
【００５９】
以下、このような検査の具体的な方法について説明する。
タンパク質の発現レベルを測定する方法としては、生体から単離したタンパク質を定量する方法やタンパク質の血中濃度を測定する方法があり、具体的な方法としては特に限定されない。生体から単離したタンパク質を定量する方法の具体例としては、以下のとおりである。先ず、被検組織又は被検細胞からＬＣＥタンパク質を調製する。このようなタンパク質の調製は、公知の方法によって行うことができる。こうして調製したタンパク質から、例えば、プロテインチップ（例えば、ＣＩＰＨＥＲＧＥＮ社製プロテインチップシステム）を用いる方法、免疫学的方法（例えば、ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ法、ウェスタンブロッティング法）により、その発現量を測定することができる。また、被検組織又は被検細胞を用いた免疫染色等によって、その発現量を測定することもできる。一方、タンパク質の血中濃度を測定する方法の具体例としては、生体から採取した血液を用いて、上記免疫学的方法等により、ＬＣＥタンパク質を定量する方法が挙げられる。
【００６０】
以上のようにして、ＬＣＥの遺伝子又はタンパク質の発現レベルを測定した後、その結果を解析することにより、被検体の肥満を検査できる。すなわち、本発明より、ＬＣＥタンパク質の発現レベルと体重は一定の相関関係を有することが明らかになったため、上記検査結果と対照群（健常人等）におけるＬＣＥタンパク質の発現量とを比較することにより、肥満の程度を判断することが可能となる。また、本発明の検査方法によれば、単に検査時の肥満の状態を検査するのみならず、将来的な肥満又は痩せの可能性の予測も可能となる。
【００６１】
また、ＬＣＥタンパク質の発現レベルの変化を検出するには、前記の発現量の測定を当該発現量が変化すると予測される期間の前後（例えば、肥満治療薬の投与の前後）について行い、発現量の差を測定すればよい。具体的には、被検組織又は被検細胞において、前述したＬＣＥタンパク質の発現量が変化すると予測される期間の前後でその発現レベルが有意に上昇した場合に、体重の増加があった又は将来的に増加する可能性があると診断できる。
【００６２】
（Ｃ）ＬＣＥ遺伝子の遺伝的多型を検出する肥満又は痩せの検査方法
ＬＣＥ遺伝子に遺伝的多型が存在する場合、その多型の有無や種類によりＬＣＥ遺伝子又はタンパク質の発現レベルが変化したり、当該タンパク質の活性に異常が生じたりする場合がある。従って、このような遺伝的多型を検出することによりＬＣＥの発現や活性に関する知見を得、さらに、被検組織や被検細胞の由来となった被検体の肥満の検査を行うことができる。このような遺伝的多型としては、具体的には、例えば、ミニサテライト、マイクロサテライト、ＳＮＰ（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：一塩基多型）が挙げられる。
【００６３】
ＬＣＥ遺伝子における多型の検出は以下のようにして行うことができる。すなわち、ＬＣＥ遺伝子において、その発現量を制御する領域を検査対象となる肥満の被検体を対象として塩基配列を決定し、多型部位を検出する。検出された多型部位の対立遺伝子頻度を算出し、被検体集団において有意に増加又は減少している対立遺伝子を見出すことにより肥満と相関する多型を同定する。このようにして検出された遺伝的多型は、例えば、被検体由来のゲノムＤＮＡについて、多型部位の塩基配列の解析、多型部位に存在する塩基の種類に依存して変化するＤＮＡの物理化学的性質の差や制限酵素部位の相違を利用する方法、当該多型部位の検出に適当な検出用プローブを利用する方法及び質量分析法を利用した方法等によって臨床的に検出可能である。
【００６４】
（Ｄ）ＬＣＥタンパク質と相互作用することによりＬＣＥ遺伝子の発現量に影響を及ぼすタンパク質の発現量又は活性を検出することによる肥満の検査方法
生体内において、多くのタンパク質は他のタンパク質と相互作用することにより、所定の生理機能を発揮する。ＬＣＥについても同様に、例えば、その発現を制御する転写因子等の作用を受けることにより発現量が制御され、所定の機能を発揮している。ＬＣＥタンパク質と、当該ＬＣＥタンパク質と相互作用することによりＬＣＥ遺伝子の発現量に影響を及ぼすタンパク質の発現量やその活性とは、一定の相関関係を有し、いずれか一方の挙動を検出することにより、他方の挙動を推測できる関係にある。
【００６５】
ここで、「相互作用」とは、ＬＣＥタンパク質と別のタンパク質が直接的又は間接的に作用することをいい、例えば、ＬＣＥタンパク質が別のタンパク質と物理的に接触することによりアミノ酸の修飾等を生じるような作用や、第３のタンパク質を介して相互作用し、間接的にＬＣＥタンパク質の発現に影響を及ぼすような作用が挙げられる。このようなタンパク質としては、例えば、ＬＣＥタンパク質を介するシグナル伝達において、ＬＣＥタンパク質の上流又は下流で生理的機能を発揮するタンパク質が挙げられる。このようなタンパク質の発現量又は活性を検出する方法としては、対象となるタンパク質の種類に応じて好適な手段を適宜選択すればよく、具体的な手段としては特に限定されない。
【００６６】
以上の（Ａ）〜（Ｄ）で説明したような本発明の肥満の検査方法によって、分子レベルで肥満の診断が可能となるばかりか、将来的に肥満になる可能性についても予測できることとなり、従来の診断方法と比較して、より的確な診断が可能となる。
【００６７】
（４）肥満の治療、予防剤
ＬＣＥ遺伝子は、その発現量と体重とが相関関係を示す。従って、当該遺伝子の発現レベルを正常レベルへと調節する化合物は肥満の治療又は予防に有用であるのみならず、例えば、痩せ、糖尿病、高血圧症、高脂血症、虚血性心疾患にも応用可能である。このような化合物としては、上述したような本発明の化合物の評価方法によって選択された化合物が挙げられる。これらの化合物を薬剤として使用するには、当該化合物を直接患者へ投与する以外に、公知の製剤学的方法により製剤化した医薬組成物として投与することもできる。製剤化するに際し、薬理学上許容される担体若しくは媒体としては、具体的には、例えば、滅菌水、生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定化剤、結合剤、滑沢剤、甘味料、香料又は着色剤が挙げられる。また、このような医薬組成物を患者に投与する方法としては、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射等の他、鼻腔内的、経気管支的、筋肉的又は経口的な投与が挙げられる。医薬組成物の投与量は、患者の体重、年齢又は投与方法等により変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。
【００６８】
（５）肥満の検査薬、検査キット
ＬＣＥタンパク質の発現量は、肥満に基づく体重変化と相関関係を有する。従って、当該タンパク質に対する抗体を使用して被検細胞や被検組織中のタンパク質量を検出、測定することにより、肥満の検査を簡便に行うことができる。ここで、「抗体」とは、抗原であるＬＣＥ遺伝子産物に結合しうる抗体分子全体又はその断片をいう。このような抗体は、公知の方法によって製造することができ、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体のいずれであってもよい。また、当該抗体を用いた免疫学的測定法としては、公知の方法を使用すればよく、具体的には、例えば、蛍光抗体法、酵素抗体法が挙げられる。
【００６９】
また、このような抗体を含んだキットを製造し、本発明を実施することも可能である。キットの構成としては、当該抗体に加え、例えば、抗体を検出するために蛍光標識やラジオアイソトープで標識された２次抗体や抗原抗体反応を行う際に使用する緩衝液を備えていてもよい。
【００７０】
このような肥満の検査薬を使用することにより、分子レベルで肥満の診断が可能となるばかりか、将来的に肥満になる可能性についても予測できることとなり、従来の診断方法と比較して、より的確な診断が可能となる。また、本発明の肥満の検査キットを使用することにより、前述したような的確な診断を非常に簡便に実施することが可能となる。
【００７１】
（６）ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−６（配列番号２３及び２４の核酸からなるｓｉＲＮＡ）及びそれを含むＬＣＥ発現抑制剤、脂肪合成抑制剤、肥満の治療又は予防剤
既に述べたように、配列番号２３及び２４の核酸からなるｓｉＲＮＡであるｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−６は、ＬＣＥの発現を強く抑制する。したがって、ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−６はＬＣＥ発現抑制剤として用いることができ、また、脂肪合成抑制剤として用いることもでき、さらに、肥満の治療又は予防剤として用いることも可能である。
【実施例】
【００７２】
（肥満モデル動物の作製）
製造例１：ニューロペプチドＹ（Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ Ｙ：ＮＰＹ）Ｙ５アゴニスト脳質内（ｉ．ｃ．ｖ．）投与マウス）
【００７３】
ＮＰＹ Ｙ５アゴニストを投与することにより肥満を呈するモデルマウスを以下の要領で作製した。９〜１２週齢の雄マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ：クレア社製）を、室温２３±２℃、湿度５５±１５％の条件下、１プラスチックゲージに１匹ずつ飼育した。また、飼育時の明暗のサイクルは１２時間とし、午前７時に点灯し、午後７時に消灯した。また、マウスには、飼料（ＣＥ−２（タンパク質：２５．４重量％、炭水化物：５０．３重量％、脂質：４．４重量％）：クレア社製）と水を自由に摂取させた。
【００７４】
マウスを８０ｍｇ／ｋｇペントバルビタールナトリウム（ダイナボット社製）で麻酔し、滅菌された２８ゲージの脳注入カニューレ（アルゼ（Ａｌｚｅｔ）社製）を右側脳質へ定位的に移植した。カニューレを、ブレグマより後方へ０．４ｍｍ、側方へ０．８ｍｍ、深さ２ｍｍの位置に、頭蓋骨に対し垂直に歯科用セメントで固定した。カニューレを、０．０５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む１０ｍＭのリン酸緩衝液で満たした浸透圧ポンプ（モデルナンバー２００２：アルゼ社製）にポリビニルクロライドチューブで接続した。１０ｍＭ ＰＢＳ（０．０５％ＢＳＡ含む）にＤ−Ｔｒｙ３４ＮＰＹ（５マイクログラム／日になるように調製）を溶解した溶液をポンプに満たした後、マウスの背中の皮下に埋め込み、抗生物質（５０ｍｇ／ｋｇのセファメジン（Ｃｅｆａｍｅｄｉｎｅ）：藤沢薬品製）を皮下注射した。
【００７５】
これらのマウスを、平均体重を一致させた３つのグループ（溶媒のみを注入したグループ（ｖｅｈｉｃｌｅ ｇｒｏｕｐ）、Ｄ−Ｔｒｙ３４ＮＰＹ（ＮＰＹ Ｙ５アゴニスト）を注入したグループ（ａｄ ｌｉｂ ｆｅｄ ｇｒｏｕｐ）、Ｄ−Ｔｒｙ３４ＮＰＹを注入しペアフィードとしたグループ（ｐａｉｒ−ｆｅｄ ｇｒｏｕｐ））に分けた。
【００７６】
製造例２：ＭＣＨ投与マウス
ＭＣＨ（ｍｅｌａｎｉｎ−ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ）を投与することにより肥満を呈するモデルマウスを以下の要領で作製した。
【００７７】
１３週齢の雄マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ：クレア社製）を、室温２３±２℃、湿度５５±１５％の条件下、１プラスチックゲージに１匹ずつ飼育した。また、飼育時の明暗のサイクルは１２時間とし、午前７時に点灯し、午後７時に消灯した。また、マウスには、飼料（ＣＥ−２（タンパク質：２５．４重量％、炭水化物：５０．３重量％、脂質：４．４重量％）：クレア社製）と水は自由に摂取させた。マウスが環境に適応した頃、飼料としてＭＨＦ（タンパク質：１５．０重量％、炭水化物：５２．４重量％、脂質：３２．６重量％、オリエンタルバイオサービス社製）を与えた。
【００７８】
マウスを８０ｍｇ／ｋｇペントバルビタールナトリウム（ダイナボット社製）で麻酔し、滅菌された２８ゲージの脳注入カニューレ（アルゼ（Ａｌｚｅｔ）社製）を右側脳質へ定位的に移植した。カニューレはブレグマより後方へ０．４ｍｍ、側方へ０．８ｍｍ、深さ２ｍｍの位置に、頭蓋骨に対し垂直に歯科用セメントで固定した。カニューレを、３０％プロピレングリコールで満たした浸透圧ポンプ（モデルナンバー２００２：アルゼ社製）にポリビニルクロライドチューブで接続した。ポンプをマウスの背中の皮下に埋め込み、抗生物質を皮下注射した。
【００７９】
これらのマウスを、平均体重を一致させた３つのグループ（溶媒のみを注入したグループ（ｖｅｈｉｃｌｅ ｇｒｏｕｐ）、ＭＣＨを注入したグループ（ａｄ ｌｉｂ ｆｅｄ ｇｒｏｕｐ）、ＭＣＨを注入しペアフィードとしたグループ（ｐａｉｒ−ｆｅｄ ｇｒｏｕｐ））に分けた。続いて、エーテル麻酔下で、ポンプをＭＣＨ（３マイクログラム／日）又は溶媒（３０％プロピレングリコール）に置き換えた。
【００８０】
製造例３：ＤＩＯ（Ｄｉｅｔ ｉｎｄｕｃｅｄ ｏｂｅｓｉｔｙ）マウス
１８週齢のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ：クレア社製）を、室温２３±２℃、湿度５５±１５％の条件下、１プラスチックゲージに１匹ずつ飼育した。このマウスに高カロリー食であるＭＨＦ（タンパク質：１８．２重量％、炭水化物：５５．６重量％、脂質：１５．５重量％）を６ヶ月間に渡って与え、肥満を呈するモデルマウス（ＤＩＯマウス）を作製した。なお、実施例中、「ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ＭＦＤ」は、これ以上体重が増えないようになるまでＭＨＰを与えて飼育したマウスを指す。
【００８１】
また、前記のマウスにＭＨＦよりさらに高い脂肪を含有する高カロリー食であるＨＦＤ（タンパク質：２０．８重量％、炭水化物：３８．５９重量％、脂質：３２．８８重量％）を与えたＤＩＯマウス（ＨＰＤ）も作製した。
【００８２】
製造例４：食事制限をしたマウス
マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ、１７週齢）を１ケージに１匹ずつ個別に飼育した。また、エサは普通食（ＣＡ−１、ＣＬＥＡ）を与えた。摂食制限は、以下のようなスケジュールで行った。すなわち、エサ（ＣＡ−１）を１日につき３時間（１０：００〜１３：００）だけ与え、水は自由に摂取できるようにした。摂食時間の前後で餌の重量を測定し、その差を摂食量とした。また、摂食制限をしている期間は、体重、外見の観察等をモニターした。なお、条件付けに失敗したと思われるマウス（短期間に極度な体重減少（例えば２０％程度の減少）が見られるマウス）は実験には使用しなかった。かかる条件下でマウスを７日間飼育した後、白色脂肪細胞を摘出した。
【００８３】
実施例１〜５及び比較例１：白色脂肪細胞におけるＬＣＥの発現
製造例１〜４において製造したモデルマウスを用いて、肝臓及び白色脂肪細胞（ＷＡＴ）におけるＬＣＥ遺伝子の発現量を測定した。発現量の測定は、各モデルマウスの白色脂肪細胞から抽出したＲＮＡを、ｍｏｕｓｅ Ｕ７４Ａチップ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）を用いて処理することにより行った。
【００８４】
非処理のＣ５７ＢＬ／６Ｎの肝臓又はＷＡＴそれぞれにおけるＬＣＥの発現量を１．００とした場合の、ＤＩＯマウス（ＤＩＯ）、Ｄ−Ｔｒｙ３４ＮＰＹ投与マウス（ＮＰＹ（ＦＦ））、Ｄ−Ｔｒｙ３４ＮＰＹ ｐａｉｒ ｆｅｅｄｉｎｇ投与群マウス（ＮＰＹ（ＰＦ））、ＭＣＨ投与マウス（ＭＣＨ（ＦＦ））、ＭＣＨ ｐａｉｒ ｆｅｅｄｉｎｇ投与群マウス（ＭＣＨ（ＰＦ））、食事制限をしたマウス（Ｆａｓｔｉｎｇ）及びＮＰＹ Ｙ５ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ投与マウス（Ｙ５ａｎｔ）におけるＬＣＥ遺伝子の発現量を表１に示す。
【００８５】
表１より明らかなように、肥満モデルマウスではＬＣＥ遺伝子の発現量が増加する傾向にあり、食事制限をしたマウスではその発現量が低下していた。したがって、ＬＣＥの発現量と体重とが相関関係を有していることが明らかとなった。
【００８６】
【表１】
【００８７】
実施例６：ＨＥＫ２９３細胞におけるマウスＬＣＥｍＲＮＡの発現量測定
１．ＬＣＥ発現亢進細胞の作製
マウス肝臓より抽出したＲＮＡを用いて、ＲＴ−ＰＣＲ法によりマウスＬＣＥのｃＤＮＡを増幅した。得られたＰＣＲ産物を発現ベクターｐＣＤＮＡ３．１にサブクローニングした後、その塩基配列を確認した。次に、マウスＬＣＥがサブクローニングされた発現ベクターを制限酵素ＳｃａＩで直線化し、ＨＥＫ２９３細胞に導入した。この細胞を１ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８を含む選択培地で培養することにより、マウスＬＣＥ遺伝子の安定高発現細胞株を得た。
【００８８】
以下に、ＲＴ−ＰＣＲに用いたプライマーの塩基配列を示す。
ｍＬＣＥ−ｅｘＦ：５’−
ＧＣＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＧＧＣ ＡＡＣ ＡＴＧ ＴＣＡ ＧＴＧ ＴＴＧ ＡＣＴ ＴＴＡ Ｃ−３’（配列番号３）
ｍＬＣＥ−ｅｘＲ：５’−
ＣＴＡ ＣＴＣ ＡＧＣ ＣＴＴ ＣＧＴ ＧＧＣ ＴＴＴ ＣＴＴ−３’（配列番号４）
【００８９】
２．ＨＥＫ２９３細胞におけるマウスＬＣＥ ｍＲＮＡの発現量測定
ＨＥＫ２９３細胞からｔｏｔａｌ ＲＮＡを精製し、逆転写反応によりｃＤＮＡを得た。ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ ＳｙｓｔｅｍによるＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法を用いてマウスＬＣＥ ｍＲＮＡ及びヒトＬＣＥ ｍＲＮＡの発現量を測定した。マウスＬＣＥの標準曲線は、前記のマウスＬＣＥがサブクローニングされた発現ベクターを制限酵素ＳｃａＩにより直鎖化したＤＮＡを用いた発現解析により作成した。また、ヒトＬＣＥの標準曲線は、ＰＣＲにより調製したヒトＬＣＥのｃＤＮＡ断片をｐｃＤＮＡ３．１にサブクローニングし、ＳｃａＩにより直鎖化したＤＮＡ断片を用いた発現解析により作成した。次に、マウスＬＣＥの発現量をヒトＬＣＥの発現量にて除し、導入されたマウスＬＣＥ遺伝子の発現量と内在性ヒトＬＣＥ遺伝子の発現量の比を求めた。
【００９０】
以下に使用したプライマー及びプローブの塩基配列を記す。
マウスＬＣＥ用ＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅ
ｍＬＣＥ−Ｐ：５’−
ＣＴＴ ＴＣＣ ＴＧＴ ＴＴＴ ＣＴＧ ＣＧＣ ＴＧＴ ＡＣＧ ＣＴＧ−３’（配列番号５）
マウスＬＣＥ用ＴａｑＭａｎ ｐｒｉｍｅｒ
ｍＬＣＥ−Ｆ：５’−
ＧＧＡ ＴＧＣ ＡＧＧ ＡＡＡ ＡＣＴ ＧＧＡ ＡＧＡ Ａ−３’（配列番号６）
ｍＬＣＥ−Ｒ：５’−
ＴＧＣ ＣＧＡ ＣＣＡ ＣＣＡ ＡＡＧ ＡＴＡ ＡＡＧ−３’（配列番号７）
ヒトＬＣＥ用ＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅ
ｈＬＣＥ−Ｐ２：５’−
ＡＴＣ ＡＣＴ ＧＴＧ ＣＴＣ ＣＴＧ ＴＡＣ Ｔ−３’（配列番号８）
ヒトＬＣＥ用ＴａｑＭａｎ ｐｒｉｍｅｒ
ｈＬＣＥ−Ｆ２：５’−
ＡＧＣ ＴＧＡ ＴＣＴ ＴＣＣ ＴＧＣ ＡＣＴ ＧＧＴ ＡＴ−３’（配列番号９）
ｈＬＣＥ−Ｒ２：５’−
ＧＧＣ ＡＡＣ ＣＡＴ ＧＴＣ ＴＴＴ ＧＴＡ ＧＧＡ ＧＴＡ−３’（配列番号１０）
ヒトＬＣＥ用ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ
ｍＬＣＥ−ｅｘＦ：５’−
ＧＣＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＧＧＣ ＡＡＣ ＡＴＧ ＴＣＡ ＧＴＧ ＴＴＧ ＡＣＴ ＴＴＡ Ｃ−３’（配列番号１１）
ｈＬＣＥ−ｅｘＲ：５’−
ＣＴＡ ＴＴＣ ＡＧＣ ＴＴＴ ＣＧＴ ＴＧＴ ＴＴＴ ＣＣＴ Ｃ−３’（配列番号１２）。
【００９１】
３．ＨＥＫ２９３細胞におけるＬＣＥ活性の測定
ＨＥＫ２９３細胞を超音波破砕した後に、超遠心操作によりミクロソーム画分を調製した。得られたミクロソーム画分を用いて以下の方法によりＬＣＥ活性を測定した。反応に必要とされるＮＡＤＰＨ、パルミトイルＣｏＡ、１４Ｃ標識マロニルＣｏＡを含むリン酸緩衝液中にミクロソーム画分を加えて、３７℃で５分間インキュベートした。次に、１５％水酸化カリウム−メタノール溶液を加え、７５℃で４５分間加熱してけん化処理を行なった。これに５Ｎ塩酸を加えた後、ヘキサンを用いて脂肪酸を抽出した。得られた脂肪酸に含まれる放射性比活性を測定し、脂肪酸延伸反応により脂肪酸に取り込まれたマロニルＣｏＡの量を求めた。
【００９２】
図１は、ＬＣＥを強制発現させた細胞における、（ａ）ＬＣＥ ｍＲＮＡの発現量、及び（ｂ）ＬＣＥ活性を表すグラフである。図１に示すように、ＬＣＥの発現が亢進した細胞株を取得できたことが確認されるとともに、これらの細胞株ではＬＣＥの活性も亢進していることが確認できた。
【００９３】
実施例７：ＨＥＫ２９３細胞中に含まれる脂肪酸組成の測定
ＨＥＫ２９３細胞をリン酸緩衝液中にて超音波破砕し、内部標準物質としてＣ１７：０の中性脂肪（ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅｓ）、コレステリルエステル（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ ｅｓｔｅｒｓ）及びリン脂質（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ）を加えた後に、クロロホルム−メタノール（２：１）により脂質成分を抽出した。得られた脂質を窒素気流下にて乾固した後、ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ Ｇを用いた薄層クロマトグラフによる分画（ヘキサン：ジエチルエーテル：酢酸＝８０：２０：１）を行い、中性脂肪、コレステリルエステル及びリン脂質を分離した。これら３画分それぞれを５％塩酸−メタノールにより脂肪酸残基をメチル化し、ガスクロマトグラフ（ＧＣ−ＦＩＤ）を用いて脂肪酸組成の分析を行なった。
【００９４】
炭素鎖長１８以上の脂肪酸と１６以下の脂肪酸を比較した結果を図２に示す。図２から明らかなように、ＬＣＥの発現が亢進した細胞株ではＣ１８以上の脂肪酸の構成比率が増加する傾向にあり、炭素鎖の伸長反応はＬＣＥの活性の増強に比例して進行することが確認できた。また、細胞内では、脂肪酸のほとんどがトリグリセリド、コレステリルエステル、リン脂質といったエステル体として存在する。これら全てのエステル体においてＬＣＥの発現亢進によりＣ１８以上の脂肪酸の構成比率が増加する傾向が認められることから、ＬＣＥの活性変化は細胞全体の脂肪酸構成比率を変更すると考えられ、ＬＣＥは細胞の脂肪酸組成を決定する重要因子であると、本発明者らは考えている。
【００９５】
また、各脂肪酸の組成を比較した結果を図３に示す。図３から明らかなように、ＬＣＥの発現が亢進した細胞株ではＣ１８以上の脂肪酸の構成比率が増加する傾向にあることが確認できた。
【００９６】
実施例８：ＲＮＡｉによるヒトＬＣＥの発現抑制
１．発現抑制実験に使用するｓｉＲＮＡの検討
ヒトＬＣＥ ｃＤＮＡの塩基配列情報に基づいて、下記配列からなるｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）を合成した。合成したｓｉＲＮＡそれぞれをＨｅｐＧ２細胞に導入し、２４時間後に細胞からｔｏｔａｌ ＲＮＡを調製した。次に、逆転写反応によりｃＤＮＡを作製し、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ ＳｙｓｔｅｍによるＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法によりヒトＬＣＥ ｍＲＮＡの発現量を測定した。図４（ａ）に、ＬＣＥ遺伝子における各ｓｉＲＮＡの対応部分を示した。図４（ｂ）は、各ｓｉＲＮＡを導入した場合のＬＣＥ ｍＲＮＡの発現量を表すグラフである。図４（ｂ）に示すように、ｓｉＲＮＡ（ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−６）を用いた場合にＬＣＥの発現抑制の効果が高いことが確認できた。
【００９７】
使用したｓｉＲＮＡの配列を以下に示す。
ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−１
（図４における１のｓｉＲＮＡ）
５’−ＧＡＣＣＧＣＡＡＧＧＣＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵ−３’（配列番号１３）
３’−ＵＵＣＵＧＧＣＧＵＵＣＣＧＵＡＡＧＵＡＡＡ−５’（配列番号１４）
ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−２
（図４における２のｓｉＲＮＡ）
５’−ＣＡＣＵＣＧＡＡＡＵＣＡＡＧＣＧＣＵＵＵＵ−３’（配列番号１５）
３’−ＵＵＧＵＧＡＧＣＵＵＵＡＧＵＵＣＧＣＧＡＡ−５’（配列番号１６）
ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−３
（図４における３のｓｉＲＮＡ）
５’−ＣＡＣＧＵＡＧＣＧＡＣＵＣＣＧＡＡＧＡＵＵ−３’（配列番号１７）
３’−ＵＵＧＵＧＣＡＵＣＧＣＵＧＡＧＧＣＵＵＣＵ−５’（配列番号１８）
ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−４
（図４における４のｓｉＲＮＡ）
５’−ＵＧＡＡＧＣＣＡＵＣＣＡＡＵＧＧＡＵＧＵＵ−３’（配列番号１９）
３’−ＵＵＡＣＵＵＣＧＧＵＡＧＧＵＵＡＣＣＵＡＣ−５’（配列番号２０）
ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−５
（図４における５のｓｉＲＮＡ）
５’−ＧＣＣＡＵＵＡＧＵＧＣＵＣＵＧＧＵＣＵＵＵ−３’（配列番号２１）
３’−ＵＵＣＧＧＵＡＡＵＣＡＣＧＡＧＡＣＣＡＧＡ−５’（配列番号２２）
ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−６
（図４における６のｓｉＲＮＡ）
５’−ＡＧＧＣＣＵＧＡＡＧＣＡＧＵＣＡＧＵＵＵＵ−３’（配列番号２３）
３’−ＵＵＵＣＣＧＧＡＣＵＵＣＧＵＣＡＧＵＣＡＡ−５’（配列番号２４）
ＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−２
（図４における７のｓｉＲＮＡ）
５’−ＵＧＧＡＣＣＵＧＵＣＡＧＣＡＡＡＵＵＣＵＵ−３’（配列番号２５）
３’−ＵＵＡＣＣＵＧＧＡＣＡＧＵＣＧＵＵＵＡＡＧ−５’（配列番号２６）
ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−７
（図４における８のｓｉＲＮＡ）
５’−ＡＧＣＡＣＣＣＧＡＡＣＵＡＧＧＡＧＡＵＵＵ−３’（配列番号２７）
３’−ＵＵＵＣＧＵＧＧＧＣＵＵＧＡＵＣＣＵＣＵＡ−５’（配列番号２８）
ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−８
（図４における９のｓｉＲＮＡ）
５’−ＣＡＵＣＵＵＣＵＧＧＵＣＣＵＣＡＣＵＣＵＵ−３’（配列番号２９）
３’−ＵＵＧＵＡＧＡＡＧＡＣＣＡＧＧＡＧＵＧＡＧ−５’（配列番号３０）
ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−９
（図４における１０のｓｉＲＮＡ）
５’−ＵＣＡＣＡＣＧＵＧＧＵＧＣＡＧＣＵＡＡＵＵ−３’（配列番号３１）
３’−ＵＵＡＧＵＧＵＧＣＡＣＣＡＣＧＵＣＧＡＵＵ−５’（配列番号３２）
ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−１０
（図４における１１のｓｉＲＮＡ）
５’−ＧＣＡＣＵＧＣＵＧＣＵＧＧＡＡＧＡＣＣＵＵ−３’（配列番号３３）
３’−ＵＵＣＧＵＧＡＣＧＡＣＧＡＣＣＵＵＣＵＧＧ−５’（配列番号３４）
ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−１１
（図４における１２のｓｉＲＮＡ）
５’−ＡＣＵＧＵＧＣＧＡＧＣＡＣＡＡＣＡＣＡＵＵ−３’（配列番号３５）
３’−ＵＵＵＧＡＣＡＣＧＣＵＣＧＵＧＵＵＧＵＧＵ−５’（配列番号３６）
ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−１２
（図４における１３のｓｉＲＮＡ）
５’−ＡＧＧＧＧＧＵＧＡＡＵＡＣＵＵＣＣＣＣＵＵ−３’（配列番号３７）
３’−ＵＵＵＣＣＣＣＣＡＣＵＵＡＵＧＡＡＧＧＧＧ−５’（配列番号３８）。
【００９８】
２．ＨｅｐＧ２細胞におけるｓｉＲＮＡのＬＣＥ活性低下作用
ｓｉＲＮＡ（ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−６）を導入したＨｅｐＧ２細胞を超音波破砕した後に、超遠心操作によりミクロソーム画分を調製した。次に、得られたミクロソーム画分のＬＣＥ活性（Ｆａｔｔｙ Ａｃｙｌ ＣｏＡの伸長活性）を測定した。対照には哺乳類遺伝子に相同性を持たない配列であるｓｉＲＮＡ（ｓｃｒａｍｂｌｅ ｓｉＲＮＡ Ｄｕｐｌｅｘ：Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｉｎｃ．）を導入したＨｅｐＧ２細胞を用いた。図５（ａ）は、ＬＣＥ ｍＲＮＡの発現量を表すグラフであり、図５（ｂ）は、伸長活性を表すグラフである。図５（ａ），（ｂ）に示すように、ＬＣＥの発現が特異的に抑制されるとともに、ＬＣＥの活性が抑制されることが確認できた。
【００９９】
また、ＨｅｐＧ２細胞に２種類のｓｉＲＮＡ（発現抑制効果が強いもの：ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−６、発現抑制効果が中程度のもの：ＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−２）をそれぞれ導入した。ｓｉＲＮＡの導入後２４時間及び４８時間の時点で、細胞からｔｏｔａｌ ＲＮＡを調製し、ＤＮＡチップ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）を用いて遺伝子発現解析を行ない、ｓｉＲＮＡの導入により発現が低下している遺伝子を選択した。図６は、ｓｉＲＮＡ導入後のＬＣＥ ｍＲＮＡの発現量を表すグラフである（（ａ）：２４時間後、（ｂ）：４８時間後）。ｓｉＲＮＡの導入によりＬＣＥの発現が抑制されていることが確認された。
【０１００】
ｓｉＲＮＡの導入により発現が低下した遺伝子は、２４時間で５遺伝子、４８時間で６４遺伝子であった。発現が低下した遺伝子の中で、ＬＣＥと同じ脂肪酸合成に関与するＦＡＳ（Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄ Ｓｙｎｔｈａｓｅ）及びＳＣＤ（ｓｔｅａｒｏｙｌ ＣｏＡ ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ）に注目し、その発現量を検討した。具体的には、ｓｉＲＮＡ（ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−６）を導入したＨｅｐＧ２細胞からｔｏｔａｌ ＲＮＡを精製し、逆転写反応によりｃＤＮＡを得た。次に、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍを用いたＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法により、ヒトＦＡＳ ｍＲＮＡ及びヒトＳＣＤ ｍＲＮＡの発現を測定した。標準曲線は、ＰＣＲにより調製したヒトＦＡＳ ｃＤＮＡ断片及びヒトＳＣＤ ｃＤＮＡ断片をそれぞれ用いて作成した。ＦＡＳ及びＳＣＤの発現量はβ−アクチンの発現量で規格化した。図７は、ｓｉＲＮＡを導入したＨｅｐＧ２細胞における（ａ）ＬＣＥ、（ｂ）ＦＡＳ及び（ｃ）ＳＣＤのｍＲＮＡの発現量を表すグラフである。図７に示すとおり、ｓｉＲＮＡの導入により、ＬＣＥの発現は顕著に低下する一方、ＦＡＳ及びＳＣＤはＬＣＥほどの発現の低下は見られないものの、４０〜６０％程度の発現低下が見られることが確認された。
【０１０１】
以下に、測定に用いたプライマー及びプローブの塩基配列を示す。
ヒトＦＡＳ用ＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅ
ｈＦＡＳ−Ｐ：５’−
ＡＣＣ ＣＧＣ ＴＣＧ ＧＣＡ ＴＧＧ ＣＴＡ ＴＣＴＴ−３’（配列番号３９）
ヒトＦＡＳ用ＴａｑＭａｎ ｐｒｉｍｅｒ
ｈＦＡＳ−Ｆ：５’−
ＧＣＡ ＡＡＴ ＴＣＧ ＡＣＣ ＴＴＴ ＣＴＣ ＡＧＡ ＡＣ−３’（配列番号４０）
ｈＦＡＳ−Ｒ：５’−
ＧＧＡ ＣＣＣ ＣＧＴ ＧＧＡ ＡＴＧ ＴＣＡ−３’（配列番号４１）
ヒトＦＡＳ ｃＤＮＡ作成用ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ
ｈＦＡＳ−４８２３Ｓ：５’−
ＴＡＣ ＧＣＣ ＴＣＣ ＣＴＣ ＡＡＣ ＴＴＣ ＣＧ−３’（配列番号４２）
ｈＦＡＳ−５６０４Ａ：５’−
ＣＡＣ ＴＴＧ ＡＧＧ ＧＧＣ ＣＧＴ ＡＣＣ ＡＣ−３’（配列番号４３）
ヒトＳＣＤ用ＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅ
ｈＳＣＤ−Ｐ：５’−
ＣＡＣ ＡＴＧ ＣＴＧ ＡＴＣ ＣＴＣ ＡＴＡ ＡＴＴ ＣＣＣ ＧＡＣ Ｇ−３’（配列番号４４）
ヒトＳＣＤ用ＴａｑＭａｎ ｐｒｉｍｅｒ
ｈＳＣＤ−Ｆ：５’−
ＧＣＣ ＣＡＣ ＣＡＣ ＡＡＧ ＴＴＴ ＴＣＡ ＧＡＡ−３’（配列番号４５）
ｈＳＣＤ−Ｒ：５’−
ＣＣＡ ＣＧＴ ＧＡＧ ＡＧＡ ＡＧＡ ＡＡＡ ＡＧＣ Ｃ−３’（配列番号４６）
ヒトＳＣＤ ｃＤＮＡ作成用ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ
ｈＳＣＤ−６００Ｓ：５’−
ＴＧＴ ＧＧＡ ＧＣＣ ＡＣＣ ＧＣＴ ＣＴＴ ＡＣ−３’（配列番号４７）
ｈＳＣＤ−９３１Ａ：５’−
ＡＡＧ ＣＧＴ ＧＧＧ ＣＡＧ ＧＡＴ ＧＡＡ ＧＣ−３’（配列番号４８）。
【０１０２】
実施例９：ＲＮＡｉによるマウスＬＣＥの発現抑制
実施例８と同様の実験をマウスＬＣＥについても行った。マウスＬＣＥ ｃＤＮＡの塩基配列情報に基づいて、下記配列からなるｓｉＲＮＡを合成した。合成したｓｉＲＮＡそれぞれを３Ｔ３−Ｌ１細胞に導入し、２４時間後に細胞からｔｏｔａｌ ＲＮＡを調製した。次に、逆転写反応によりｃＤＮＡを作製し、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ ＳｙｓｔｅｍによるＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法によりマウスＬＣＥ ｍＲＮＡの発現量を測定した。
【０１０３】
図８は、ＲＮＡｉによるマウスＬＣＥの発現抑制の結果を表す図である。（ａ）はマウスＬＣＥ遺伝子における各ｓｉＲＮＡの対応部分を示す図であり、（ｂ）は各ｓｉＲＮＡを導入した場合のマウスＬＣＥ ｍＲＮＡの発現量を表すグラフであり、（ｃ）は各ｓｉＲＮＡを導入した場合のマウスＦＡＳ ｍＲＮＡの発現量を表すグラフである。図８に示すように、各ｓｉＲＮＡによりＬＣＥ及びＦＡＳの発現が抑制されることが確認された。
【０１０４】
実験に用いたｓｉＲＮＡを以下に示す。
ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−６（先述したヒトＬＣＥに対するｓｉＲＮＡであるｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−６と同一）
（図８における６のｓｉＲＮＡ）
５’−ＡＧＧＣＣＵＧＡＡＧＣＡＧＵＣＡＧＵＵＵＵ−３’（配列番号４９）
３’−ＵＵＵＣＣＧＧＡＣＵＵＣＧＵＣＡＧＵＣＡＡ−５’（配列番号５０）
ｍＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−７（図８におけるｍ７のｓｉＲＮＡ）
５’−ＵＣＣＣＡＵＡＵＧＧＵＧＣＡＧＣＵＡＡＵＵ−３’（配列番号５１）
３’−ＵＵＡＧＧＧＵＡＵＡＣＣＡＣＧＵＣＧＡＵＵ−５’（配列番号５２）
ｍＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−１１（図８におけるｍ１１のｓｉＲＮＡ）
５’−ＧＣＡＵＣＣＧＵＵＧＵＵＣＡＧＵＵＧＣＵＵ−３’（配列番号５３）
３’−ＵＵＣＧＵＡＧＧＣＡＡＣＡＡＧＵＣＡＡＣＧ−５’（配列番号５４）。
【０１０５】
実施例１０：３Ｔ３−Ｌ１細胞においてＬＣＥ ＲＮＡｉがＦＡＳ ｍＲＮＡの発現に与える影響
脂肪細胞に分化した３Ｔ３−Ｌ１細胞にｓｉＲＮＡ（ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−６）を導入し、２４時間後に細胞からｔｏｔａｌ ＲＮＡを精製した。得られたｔｏｔａｌ ＲＮＡより逆転写反応によりｃＤＮＡを調製し、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍを用いたＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法によりマウスＦＡＳ ｍＲＮＡの発現量を測定した。標準曲線は、ＰＣＲにより調製したマウスＦＡＳ ｃＤＮＡ断片を用いて作成した。ＦＡＳの発現量はβ−アクチンの発現量で規格化した。
【０１０６】
測定に用いたプライマーおよびプローブは下記の通りである。
マウスＦＡＳ用ＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅ
ｍＦＡＳ−Ｐ２：５’−
ＡＴＧ ＣＴＧ ＧＣＣ ＡＡＡ ＣＴＡ ＡＣＴ ＡＣＧ ＧＣＴ ＴＣＧ−３’（配列番号５５）
マウスＦＡＳ用ＴａｑＭａｎ ｐｒｉｍｅｒ
ｍＦＡＳ−Ｆ２：５’−
ＴＧＧ ＣＣＴ ＴＣＴ ＣＣＴ ＣＴＧ ＴＡＡ ＧＣＴ Ｇ−３’（配列番号５６）
ｍＦＡＳ−Ｒ２：５’−
ＣＴＧ ＴＴＣ ＡＣＡ ＴＡＴ ＡＣＧ ＣＴＣ ＣＡＴ ＧＧ−３’（配列番号５７）
マウスＦＡＳ ｃＤＮＡ作成用ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ
ｍＦＡＳ−５５４１Ｓ：５’−
ＴＴＣ ＣＧＣ ＴＡＣ ＡＴＧ ＧＣＴ ＣＡＧ ＧＧ−３’（配列番号５８）
ｍＦＡＳ−７５５１Ａ：５’−
ＣＣＣ ＧＴＡ ＣＡＣ ＴＣＡ ＣＴＣ ＧＴＧ ＧＣ−３’（配列番号５９）
【０１０７】
また、脂肪細胞に分化した３Ｔ３−Ｌ１細胞に、ｓｉＲＮＡ（ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−６）を導入し、２４時間後に培地に１４Ｃ標識酢酸ナトリウムを添加した。添加してから４時間後に細胞を０．１％ＳＤＳにて溶解し、１５％水酸化カリウム−メタノール溶液を加え７５℃４５分間加熱によるけん化処理を行った。これに５Ｎ塩酸を加えた後、クロロホルム−メタノール（２：１）にて脂質成分を抽出した。抽出した脂質成分をＳｉｌｉｃａ ｇｅｌ Ｇを用いた薄層クロマトグラフにより分画（ヘキサン：ジエチルエーテル：酢酸＝８０：２０：１）し、脂肪酸画分に取り込まれた１４Ｃ酢酸を測定することで脂肪酸合成能を測定した。対照には哺乳類遺伝子に相同性がない配列のｓｉＲＮＡ（ｓｃｒａｍｂｌｅ ｓｉＲＮＡ Ｄｕｐｌｅｘ：Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｉｎｃ．）を導入した３Ｔ３−Ｌ１細胞を用いた。
【０１０８】
図９は、ＲＮＡｉによる（ａ）ＬＣＥ及び（ｂ）ＦＡＳの発現抑制並びに（ｃ）脂肪酸合成抑制の結果を表す図である。図９に示すように、ＬＣＥの発現を抑制することにより、脂肪酸の合成が抑制されることが確認できた。
【０１０９】
実施例１１：ＨｅｐＧ２細胞においてＬＣＥ ＲＮＡｉがアポリポタンパク質Ｂの分泌に与える影響
ＨｅｐＧ２細胞にｓｉＲＮＡ（ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−６）を導入し４８時間後に培地を交換した。培地交換後４８時間インキュベートし、培養上清を回収し、培地中に分泌されたアポリポタンパク質Ｂを定量した。アポリポタンパク質Ｂの定量には、マイクロプレートのＥＩＡ法（Ｅｘｏｃｅｌｌ，Ｉｎｃ社製：ＡＰＯ Ｂ ＴＥＳＴ）を用いた。アポリポタンパク質Ｂ標準液を用いて標準曲線を作成し、培養上清中のアポリポタンパク質Ｂの濃度を求めた。対照には哺乳類遺伝子に相同性がない配列のｓｉＲＮＡ（ｓｃｒａｍｂｌｅ ｓｉＲＮＡ Ｄｕｐｌｅｘ：Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｉｎｃ．社製）を導入したＨｅｐＧ２細胞を用いた。
【０１１０】
図１０は、ＲＮＡｉによる（ａ）ＬＣＥの発現抑制及び（ｂ）アポリポタンパク質Ｂの分泌抑制の結果を表す図である。図１０に示すように、ＬＣＥの発現を抑制することによりアポリポタンパク質Ｂの分泌が抑制されることが確認できた。
【０１１１】
以上より、ＬＣＥの活性を抑制することにより、抗肥満効果を示すことが示唆された。
【０１１２】
実施例１２：ＤＩＯマウスにおけるＬＣＥ ＲＮＡｉが与える影響
７週齢のマウス（ＩＣＲ、雌）を高カロリー食であるＭＨＦｄｉｅｔにて２３週間飼育し、肥満を形成させた。先ず、ｓｉＲＮＡの投与開始前にマウスの体重を測定した。ｓｉＲＮＡ（ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡｉ−６）を、ＨＶＪ−リポソームをキャリアとして用いマウスの尾静脈から投与した（４０μｇ／ｍｏｕｓｅ／ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）。投与は１日おきに５回行い、最終投与２日後にマウスの体重を測定し、ｓｉＲＮＡ投与の前後での体重変化を求めた。眼窩静脈叢より採血し血糖値を測定した。腹部大静脈より採血し血漿インスリン濃度を測定した。対照には、哺乳類細胞では効果を示さないｓｃｒａｍｂｌｅ ｓｉＲＮＡを投与したマウスを用いた。
【０１１３】
図１１は、ｓｉＲＮＡ投与による（ａ）体重、（ｂ）血糖値及び（ｃ）血漿インシュリンレベルの変化を表す図である。図１１に示すように、ＬＣＥに対するｓｉＲＮＡをマウスに投与することにより体重が減少した。また、血糖値および血漿インシュリンレベルのいずれもが減少し、ＬＣＥに対するｓｉＲＮＡがＬＣＥの活性を抑制し、肥満改善効果を示すことが個体レベルでも確認できた。
【０１１４】
また、これらマウスの肝臓からｔｏｔａｌ ＲＮＡを精製し、逆転写反応によりｃＤＮＡを得た。
ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ ＳｙｓｔｅｍによるＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法を用いてマウスＬＣＥ ｍＲＮＡ、マウスａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ（ＡＣＣ）ｍＲＮＡ、マウスＦＡＳ ｍＲＮＡ、マウスＳＣＤ−１ ｍＲＮＡ、マウスＳＲＥＢＰ−１ｃ ｍＲＮＡ、マウスｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＩＲＳ）−２ ｍＲＮＡの発現量を測定した。標準曲線はＰＣＲにより調製した各遺伝子のｃＤＮＡ断片をそれぞれ用いて作製した。各遺伝子の発現量はβ−アクチンの発現量で規格化した。
【０１１５】
測定に用いたプライマーおよびプローブの塩基配列を示す。
マウスＡＣＣ１用ＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅ
５’−
ＡＧＣＴＧＣＡＡＧＣＣＴＧＴＣＡＴＣＣＴＣＡＡＴＡＴＣＧ−３’（配列番号７３）
マウスＡＣＣ１ ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ
ｆｏｒｗａｒｄ：
５’−ＴＴＣＴＧＡＡＴＧＴＧＧＣＴＡＴＣＡＡＧＡＣＴＧＡ−３’（配列番号７４）
ｒｅｖｅｒｓｅ：
５’−ＴＧＣＴＧＧＧＴＧＡＡＣＴＣＴＣＴＧＡＡＣＡ−３’（配列番号７５）
マウスＡＣＣ１用ｃＤＮＡ作製用ｐｒｉｍｅｒ
ｆｏｒｗａｒｄ：
５’−ＴＡＧＴＧＴＣＡＧＣＧＡＴＧＴＴＣＴＧＴ−３’（配列番号７６）
ｒｅｖｅｒｓｅ：
５’−ＡＡＡＴＣＴＣＴＧＡＴＣＣＡＣＣＴＣＡＣ−３’（配列番号７７）
マウスＳＣＤ−１用ＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅ
ＡＣＴＣＧＣＣＴＡＣＡＣＣＡＡＣＧＧＧＣＴＣＣ（配列番号７８）
マウスＳＣＤ−１用ＴａｑＭａｎ ｐｒｉｍｅｒ
ｆｏｒｗａｒｄ：
５’−ＴＴＴＣＣＡＡＧＣＧＣＡＧＴＴＣＣＧ−３’（配列番号７９）
ｒｅｖｅｒｓｅ：
５’−ＡＴＣＧＡＧＣＧＴＧＧＡＣＴＴＣＧＧＴ−３’（配列番号８０）
マウスＳＣＤ−１ ｃＤＮＡ作製用ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ
ｆｏｒｗａｒｄ：
５’−ＣＡＣＣＣＡＴＣＣＣＧＡＧＡＧＴＣＡＧＧ−３’（配列番号８１）
ｒｅｖｅｒｓｅ：
５’−ＧＴＧＧＧＣＣＧＧＣＡＴＧＡＴＧＡＴＡＧ−３’（配列番号８２）
マウスＳＲＥＢＰ−１ｃ用ＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅ
５’−
ＣＴＴＣＡＡＡＴＧＴＧＣＡＡＴＣＣＡＴＧＧＣＴＣＣＧＴ−３’（配列番号８３）
マウスＳＲＥＢＰ−１ｃ用ＴａｑＭａｎ ｐｒｉｍｅｒ
ｆｏｒｗａｒｄ：
５’−ＧＴＡＧＣＧＴＣＴＧＣＡＣＧＣＣＣＴＡ−３’（配列番号８４）
ｒｅｖｅｒｓｅ：
５’−ＣＴＴＧＧＴＴＧＴＴＧＡＴＧＡＧＣＴＧＧＡＧ−３’（配列番号８５）
マウスＳＲＥＢＰ−１ｃ ｃＤＮＡ作製用ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ
ｆｏｒｗａｒｄ：
５’−ＡＡＧＣＴＧＴＣＧＧＧＧＴＡＧＣＧＴＣＴ−３’（配列番号８６）
ｒｅｖｅｒｓｅ：
５’−ＡＧＧＣＴＣＧＡＧＴＡＡＣＣＣＡＧＣＡＣ−３’（配列番号８７）
マウスＩＲＳ−２用ＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅ
５’−
ＡＣＴＴＡＧＣＣＧＣＴＴＣＡＡＧＣＣＣＧＡＴＧＴＧ−３’（配列番号８８）
マウスＩＲＳ−２ ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ用ｐｒｉｍｅｒ
ｆｏｒｗａｒｄ：
５’−ＡＧＡＡＧＧＴＧＣＣＣＧＡＧＴＧＧＣ−３’（配列番号８９）
ｒｅｖｅｒｓｅ：
５’−ＣＣＣＣＡＧＡＴＡＣＣＴＧＡＴＣＣＡＴＧＡ−３’（配列番号９０）
マウスＩＲＳ−２ ｃＤＮＡ作製用ｐｒｉｍｅｒ
ｆｏｒｗａｒｄ：
５’−ＣＡＧＴＡＧＧＣＴＣＣＡＴＧＧＡＴＧＧＣ−３’（配列番号９１）
ｒｅｖｅｒｓｅ：
５’−ＡＴＧＡＣＣＴＴＡＧＣＡＣＣＣＣＧＧＴＧ−３’（配列番号９２）
【０１１６】
図２１は、ｓｉＲＮＡを投与したマウスの肝臓における（ａ）ＡＣＣ、ＦＡＳ、ＳＣＤ１、ＳＲＥＢＰ−１ｃ、ＩＲＳ−２及び（ｂ）ＬＣＥのｍＲＮＡの発現量を表すグラフである。ＬＣＥの発現を抑制することにより、脂肪酸合成に関わる酵素であるＡＣＣ、ＦＡＳ、ＳＣＤ１の発現が低下しており、また脂肪酸合成を調節する転写因子であるＳＲＥＢＰ−１ｃの発現量も低下していることが確認された。すなわち、ＤＩＯマウスの肝臓におけるＬＣＥの発現抑制により、肝臓での脂肪合成が抑制されることが示唆された。
【０１１７】
また、ＩＲＳ−２（ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−２）の発現がＬＣＥ ＲＮＡｉ投与マウスの肝臓で亢進しているのは、肝臓のＬＣＥの発現抑制が肝臓のインスリン感受性を亢進させることを示唆する。これは、実施例１２で示したＬＣＥの発現抑制による血糖値及び血漿インスリン濃度の低下を引き起こす原因になっていると発明者らは考えている。
【０１１８】
実施例１３：ＨｅｐＧ２細胞においてＬＣＥ ＲＮＡｉが細胞の脂肪酸組成に与える影響
ＨｅｐＧ２細胞にｓｉＲＮＡ（ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−６）を導入し７２時間後に細胞を回収した。その細胞をリン酸緩衝液中にて超音波破砕し、内部標準としてＣ１７：０の中性脂肪、コレステリルエステル、リン脂質を加えた後にＢｌｉｇｈ−Ｄｙｅｒ法により脂質成分を抽出した。得られた脂質を窒素気流下にて乾固した後、ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ Ｇを用いた薄層クロマトグラフによる分画（ヘキサン：ジエチルエーテル：酢酸＝８０：２０：１）を行い、中性脂肪、コレステリルエステル、リン脂質を分離した。これら３画分それぞれを５％塩酸−メタノールにより脂肪酸残基をメチル化し、ガスクロマトグラフ（ＧＣ−ＦＩＤ）を用いて脂肪酸組成の分析を行った。対照には哺乳類遺伝子に相同性がない配列のｓｉＲＮＡ（ｓｃｒａｍｂｌｅ ｓｉＲＮＡ Ｄｕｐｌｅｘ：Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｉｎｃ）を導入したＨｅｐＧ２細胞を用いた。
【０１１９】
脂肪酸組成の分析結果を表２に示す。表２に示した結果から分かるように、ＲＮＡｉによりＬＣＥの発現を抑制すると、トリグリセリド、コレステリルエステル及びリン脂質のいずれにおいてもＣ１８以上の脂肪酸の構成比率が減少することが確認できた。
【０１２０】
【表２】
【０１２１】
実施例１４：ＨｅｐＧ２細胞においてＬＣＥ ＲＮＡｉが他遺伝子の発現に与える影響
脂肪酸合成に関与するＳＲＥＢＰ−１（ｓｔｅｒｏｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ−１）及びコレステロール合成に関与するＳＲＥＢＰ−２（ｓｔｅｒｏｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ−２）に対して、ＬＣＥ発現抑制が与える影響について調べた。ｓｉＲＮＡ（ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−６）を導入したＨｅｐＧ２細胞からｔｏｔａｌ ＲＮＡを精製し、逆転写反応によりｃＤＮＡを得た。ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍを用いたＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法によりヒトＳＲＥＢＰ−１ ｍＲＮＡ、ヒトＳＲＥＢＰ−２ ｍＲＮＡの発現を測定した。対照には哺乳類遺伝子に相同性がない配列のｓｉＲＮＡ（ｓｃｒａｍｂｌｅ ｓｉＲＮＡ Ｄｕｐｌｅｘ：Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｉｎｃ）を導入したＨｅｐＧ２細胞を用いた。標準曲線はＰＣＲにより調製したヒトＳＲＥＢＰ−１ ｃＤＮＡ断片、ヒトＳＲＥＢＰ−２ ｃＤＮＡ断片をそれぞれ用いて作製した。各遺伝子の発現量はβ−アクチンの発現量で規格化した。
【０１２２】
測定に用いたプライマーの塩基配列を示す。
ヒトＳＲＥＢＰ−１用ＴａｑＭａｎ ｐｒｉｍｅｒ
ｆｏｒｗａｒｄ：
５’−ＣＡＡＣＡＣＡＧＣＡＡＣＣＡＧＡＡＡＣＴＣＡＡＧ−３’（配列番号６０）
ｒｅｖｅｒｓｅ：
５’−ＴＴＧＣＴＴＴＴＧＴＧＧＡＣＡＧＣＡＧＴＧ−３’（配列番号６１）
ヒトＳＲＥＢＰ−１ ｃＤＮＡ作製用ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ
ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＣＧＧＡＧＡＡＧＣＴＧＣＣＴＡＴＣＡＡＣ−３’（配列番号６２）
ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＧＧＴＣＡＧＴＧＴＧＴＣＣＴＣＣＡＣＣＴ−３’（配列番号６３）
ヒトＳＲＥＢＰ−２用ＴａｑＭａｎ ｐｒｉｍｅｒ
ｆｏｒｗａｒｄ：
５’−ＧＡＴＡＴＣＧＣＴＣＣＴＣＣＡＴＣＡＡＴＧＡＣ−３’（配列番号６４）
ｒｅｖｅｒｓｅ：
５’−ＡＣＴＴＧＴＧＣＡＴＣＴＴＧＧＣＧＴＣＴＧ−３’（配列番号６５）
ヒトＳＲＥＢＰ−２ ｃＤＮＡ作製用ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ
ｆｏｒｗａｒｄ：
５’−ＣＡＴＴＣＴＧＡＣＣＡＣＡＡＴＧＣＣＴＧ−３’（配列番号６６）
ｒｅｖｅｒｓｅ：
５’−ＡＧＴＡＧＧＧＡＧＡＧＡＡＧＣＣＡＧＣＣ−３’（配列番号６７）
【０１２３】
図１２は、ｓｉＲＮＡを導入したＨｅｐＧ２細胞におけるＳＲＥＢＰ−１及びＳＲＥＢＰ−２のｍＲＮＡの発現量を表すグラフである。図１２に示すとおり、ｓｉＲＮＡの導入により、ＳＲＥＢＰ−１の発現は顕著に低下する一方、ＳＲＥＢＰ−２の発現は変化しないことが確認された。
【０１２４】
実施例１５：ＨｅｐＧ２細胞においてＬＣＥ ＲＮＡｉが細胞の脂質合成に与える影響
ＨｅｐＧ２細胞にｓｉＲＮＡ（ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−６）を導入し、７２時間後に培地に１４Ｃ標識酢酸ナトリウムを添加した。添加４時間後に細胞を０．１％ＳＤＳにて溶解した。細胞溶解液の一部に１５％水酸化カリウム−メタノール溶液を加え７５℃４５分間加熱によるけん化処理行った。５Ｎ塩酸を加えた後に、クロロホルム−メタノール（２：１）にて脂質成分を抽出した。抽出した脂質成分をｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ Ｇを用いた薄層クロマトグラフにより分画（ヘキサン：ジエチルエーテル：酢酸＝８０：２０：１）し、脂肪酸画分に取り込まれた１４Ｃ酢酸を測定することで脂肪酸合成能を測定した。
【０１２５】
また、上記細胞溶解液の一部から直接、クロロホルム−メタノール（２：１）にて脂質成分を抽出した。得られた脂質成分を薄層クロマトグラフにより分画し、中性脂肪画分に取り込まれた１４Ｃ酢酸を測定することで中性脂肪合成能を測定した。得られた脂肪酸合成能および中性脂肪合成能の値は、細胞溶解液中のタンパク質量により規格化した。対照には哺乳類遺伝子に相同性がない配列のｓｉＲＮＡ（ｓｃｒａｍｂｌｅ ｓｉＲＮＡ Ｄｕｐｌｅｘ：Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｉｎｃ）を導入したＨｅｐＧ２細胞を用いた。
【０１２６】
図１３は、ｓｉＲＮＡを導入したＨｅｐＧ２細胞における（ａ）脂肪酸合成能及び（ｂ）中性脂肪合成能を表す図である。図１３に示したように、ｓｉＲＮＡを導入してＬＣＥの発現を抑制することで、脂肪酸合成能及び中性脂肪合成能が低下することが確認された。
【０１２７】
実施例１６：ＨｅｐＧ２細胞においてＬＣＥ ＲＮＡｉが細胞の中性脂肪含量に与える影響
ＨｅｐＧ２細胞にｓｉＲＮＡ（ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−６）を導入し７２時間後に細胞を回収した。その細胞をリン酸緩衝液中にて超音波破砕し、その一部からＢｌｉｇｈ−Ｄｙｅｒ法により脂質成分を抽出した。得られた脂質を窒素気流下にて乾固した後、２−プロパノールに溶解し、酵素法により中性脂肪量を測定した。得られた中性脂肪量の値は、細胞の超音波破砕液中のタンパク質量にて規格化した。対照には哺乳類遺伝子に相同性がない配列のｓｉＲＮＡ（ｓｃｒａｍｂｌｅ ｓｉＲＮＡ Ｄｕｐｌｅｘ：Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｉｎｃ）を導入したＨｅｐＧ２細胞を用いた。
【０１２８】
図１４は、ｓｉＲＮＡを導入したＨｅｐＧ２細胞中の中性脂肪量を表すグラフである。図１４に示したように、ｓｉＲＮＡを導入してＬＣＥの発現を抑制することで、細胞内の中性脂肪含量が低下することが確認された。
【０１２９】
実施例１７：ＨｅｐＧ２細胞においてＬＣＥ ＲＮＡｉが細胞の脂肪酸酸化に与える影響
ＨｅｐＧ２細胞にｓｉＲＮＡ（ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−６）を導入し、７２時間後に培地に１４Ｃパルミチン酸を添加した。３０分間インキュベーションした後に、培地を別チューブに移し１０％トリクロロ酢酸を加えた。培地から遊離したＣＯ２を１０％水酸化ナトリウム水溶液によりトラップした。トラップされたＣＯ２の放射比活性を測定し、培地に加えたパルミチン酸からβ酸化により作られたＣＯ２量を求めた。またＣＯ２を遊離させた後の培地を遠心して、その上清中の酸可溶性画分の放射比活性を測定し、培地に加えたパルミチン酸からβ酸化により作られたケトン体量を求めた。インキュベーション後のＨｅｐＧ２細胞は培地を取り除いた後に０．１％ＳＤＳにて溶解した。細胞溶解液の一部からクロロホルム−メタノール（２：１）にて脂質成分を抽出し、薄層クロマトグラフにより分画した。そして中性脂肪画分の放射比活性を測定し、培地に加えたパルミチン酸が細胞中の中性脂肪に取り込まれた量を求めた。得られたＣＯ２量、ケトン体量、中性脂肪への取り込み量の値は、細胞溶解液中のタンパク質量にて規格化した。対照には、哺乳類遺伝子に相同性がない配列のｓｉＲＮＡ（ｓｃｒａｍｂｌｅ ｓｉＲＮＡ Ｄｕｐｌｅｘ：Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｉｎｃ）を導入したＨｅｐＧ２細胞を用いた。
【０１３０】
図１５は、ｓｉＲＮＡを導入したＨｅｐＧ２細胞における（ａ）ＣＯ２産生量、（ｂ）ケトン体産生量及び（ｃ）パルミチン酸の中性脂肪への取り込み量を表すグラフである。図１５に示したように、ｓｉＲＮＡを導入してＬＣＥの発現を抑制すると、ＣＯ２産生量及びケトン体産生量が増加し、パルミチン酸の中性脂肪への取り込みが低下することが確認された。脂肪酸の燃焼にともなってＣＯ２及びケトン体が産生するため、この結果は、ＬＣＥの発現抑制は、脂肪酸の燃焼を促進することを示唆している。
【０１３１】
実施例１８：ＨｅｐＧ２細胞においてＬＣＥ ＲＮＡｉが細胞のＣＰＴ−１の発現に与える影響
脂肪酸をミトコンドリアに取り込むトランスポーターであるＣＰＴ−１（ｃａｒｎｉｔｉｎｅ ｐａｌｍｉｔｏｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−１）に対して、ＬＣＥ発現抑制が与える影響について調べた。ＨｅｐＧ２細胞にｓｉＲＮＡ（ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡ−６）を導入し７２時間後に細胞を回収した。この細胞からｔｏｔａｌ ＲＮＡを精製し、逆転写反応によりｃＤＮＡを得た。ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍを用いたＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法によりヒトＣＰＴ−１ ｍＲＮＡの発現を測定した。対照には、哺乳類遺伝子に相同性がない配列のｓｉＲＮＡ（ｓｃｒａｍｂｌｅ ｓｉＲＮＡ Ｄｕｐｌｅｘ：Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｉｎｃ）を導入したＨｅｐＧ２細胞を用いた。標準曲線はＰＣＲにより調製したヒトＣＰＴ−１ ｃＤＮＡ断片を用いて作製した。得られた値はβ−アクチンの発現量で規格化した。
【０１３２】
測定に用いたプライマーおよびプローブの塩基配列を示す。
ヒトＣＰＴ−１ ＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅ
５’−
ＣＣＧＧＧＡＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡＣＣＡＡＴＴＣＧＴＣ−３’（配列番号６８）
ヒトＣＰＴ−１用ＴａｑＭａｎ ｐｒｉｍｅｒ
ｆｏｒｗａｒｄ：
５’−ＴＧＣＴＴＴＡＣＡＧＧＣＧＣＡＡＡＣＴＧ−３’（配列番号６９）
ｒｅｖｅｒｓｅ：
５’−ＴＧＧＡＡＴＣＧＴＧＧＡＴＣＣＣＡＡＡ−３’（配列番号７０）
ヒトＣＰＴ−１ ｃＤＮＡ作製用ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ
ｆｏｒｗａｒｄ：
５’−ＡＴＴＴＧＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＣＣＴＧＧＴＧＧＧＣ−３’（配列番号７１）
ｒｅｖｅｒｓｅ：
５’−ＴＴＣＣＣＡＣＧＴＣＣＡＡＡＡＴＡＧＧＣ−３’（配列番号７２）
【０１３３】
図１６は、ｓｉＲＮＡを導入したＨｅｐＧ２細胞におけるＣＰＴ−１ ｍＲＮＡの発現量を表すグラフである。図１６に示したように、ｓｉＲＮＡを導入してＬＣＥの発現を抑制すると、ＣＰＴ−１の発現量が増加することが確認された。
【０１３４】
実施例１９：高スクロース食負荷マウスにおける肝臓でのＬＣＥ発現の変化８週齢のマウス（ＩＣＲ、雄）を高スクロース食（６７％スクロース）にて３日間、および７週齢のマウス（ＩＣＲ、雄）を高スクロース食にて１０日間飼育した。体重測定後にマウスを安楽死させ、精巣上体脂肪を摘出し重量を測定した。また、マウスから肝臓を摘出しｔｏｔａｌ ＲＮＡを精製し、Ｔａｑ Ｍａｎ ＰＣＲ法を用いて肝臓でのＬＣＥ ｍＲＮＡの発現量を測定した。ＬＣＥ ｍＲＮＡの発現量はβ−アクチンの発現量で規格化した。対照には通常食（ＣＡ−１）で飼育したマウスを用いた。
【０１３５】
図１７は、高スクロース食を負荷したマウスにおける（ａ）体重、（ｂ）精巣上体の脂肪重量及び（ｃ）肝臓におけるＬＣＥ ｍＲＮＡの発現量を表すグラフである。図１７に示したように、高スクロース負荷することにより、マウスの体重及び脂肪重量は増加し、肝臓におけるＬＣＥ ｍＲＮＡの発現量が増加することが確認された。
【０１３６】
実施例２０：高スクロース食負荷マウスにおけるＬＣＥ ＲＮＡｉ投与の作用
ＨＶＪ−リポソームをキャリアとして用い、ｓｉＲＮＡ（ｈＬＣＥ−ｓｉＲＮＡｉ−６）を、マウス（７週齢、ＩＣＲ、雄）に尾静脈から投与した（４０μｇ／ｍｏｕｓｅ／ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）。投与開始直後から、マウスを高スクロース食にて飼育した。対照には、哺乳類細胞では効果を示さないｓｃｒａｍｂｌｅ ｓｉＲＮＡを投与したマウスを用いた。ｓｉＲＮＡの投与は１日おきに５回行い、最終投与の翌日にマウスの体重を測定し、体脂肪量をＮＭＲ ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｍｉｎｉｓｐｅｃ；ｍｑ７．５）にて測定し、脂肪重量／体重比を求めた。腹部大静脈より採血し、血漿レプチン濃度を測定した。
【０１３７】
図１８は、ｓｉＲＮＡを投与したマウスの（ａ）体脂肪量、（ｂ）脂肪重量／体重比及び（ｃ）血漿レプチン濃度を表すグラフである。ＬＣＥ ＲＮＡｉの投与によるＬＣＥ発現抑制は、高スクロース負荷による体脂肪量の増加を抑制した。同様に脂肪重量／体重比の増加を抑制した。これはＬＣＥの発現抑制が、高スクロース摂食による肥満形成を阻害すること（抗肥満効果）を示す。また、レプチンは脂肪組織から分泌されるので、脂肪重量が増加すると分泌されるレプチン濃度が増加する。この実験において、高スクロース食負荷によりレプチンが増加しているのは、脂肪量が増加したことを意味し、ＬＣＥ ＲＮＡｉの投与群でレプチン濃度上昇が抑えられているのは、ＬＣＥ ＲＮＡｉ投与で脂肪重量の増加が抑制されたことを意味する。
【０１３８】
また、マウスを安楽死させた後に肝臓を摘出し、その一部からｔｏｔａｌ ＲＮＡを精製し、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法を用いて肝臓でのＬＣＥ ｍＲＮＡ、ＦＡＳ ｍＲＮＡの発現量を測定した。ＬＣＥ ｍＲＮＡ、ＦＡＳ ｍＲＮＡの発現量はβ−アクチンの発現量で規格化した。また、肝臓の一部をリン酸緩衝液中においてホモジナイズし、Ｂｌｉｇｈ−Ｄｙｅｒ法により脂質成分を抽出した。得られた脂質を窒素気流下にて乾固し、２−プロパノールに溶解し、酵素法により中性脂肪量を測定した。得られた中性脂肪量の値は肝臓ホモジナイズ液中に含まれるタンパク質量で規格化した。さらに、肝臓組織からミクロソーム画分を調製し、ウェスタンブロッティング法によりＬＣＥのタンパク質量の変化を測定した。ウェスタンブロッティングには、マウスＬＣＥタンパク質の一次構造に含まれるアミノ酸配列”ＦＥＡＹＩＧＫＶＫＫＡＴＫＡＥ”に基づいて合成した合成ペプチド”ＣＦＥＡＹＩＧＫＶＫＫＡＴＫＡＥ”をウサギ（ＳＰＦ，Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｗｈｉｔｅ Ｒａｂｂｉｔ）に免疫して得た抗ＬＣＥポリクローナル抗体を用いた。
【０１３９】
図１９は、ｓｉＲＮＡを投与したマウスの（ａ）ＬＣＥ ｍＲＮＡの発現量、（ｂ）ＦＡＳ ｍＲＮＡの発現量及び（ｃ）肝臓における中性脂肪含量を表すグラフである。図１９（ａ）より、高スクロース食負荷により肝臓のＬＣＥの発現が亢進すること、すなわち肥満形成の過程で肝臓のＬＣＥ発現が亢進していることが確認された。また、ＬＣＥ ＲＮＡｉの投与がマウスの肝臓でのＬＣＥの発現亢進を抑制していることが確認された。
【０１４０】
図１９（ｂ）より、高スクロース食負荷により肝臓のＦＡＳの発現が亢進すること、すなわち肝臓での脂肪酸合成が亢進していることが示唆された。また、ＬＣＥ ＲＮＡｉ投与によるＬＣＥ発現抑制によりＦＡＳの発現亢進が抑制され、脂肪酸合成亢進が抑制されることが示唆された。
【０１４１】
図１９（ｃ）より、高スクロース食負荷により肝臓への脂肪の蓄積が亢進していることが確認された。また、ＬＣＥ ＲＮＡｉ投与によるＬＣＥ発現抑制が肥満形成の過程での肝臓での脂肪蓄積を抑制することが確認された。
【０１４２】
以上より、高スクロース食負荷により肝臓での脂肪合成が亢進すること（肥満形成の促進過程）と、ＬＣＥの発現抑制がこの脂肪合成亢進を阻害（肥満形成過程を抑制）することが確認された。
【０１４３】
図２０は、ｓｉＲＮＡを投与したマウスの肝臓におけるＬＣＥタンパク質量の変化を表す図である。図１９に示した脂肪酸合成とＬＣＥの発現量との関係をＬＣＥタンパク質レベルでも確認することができた。
【０１４４】
実施例２１：ヒトＬＣＥのアミノ酸置換及びそれによるＬＣＥ活性の変化
ヒトＬＣＥ ｃＤＮＡを、ＢａｍＨＩサイトを付加したｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ（ｈＬＣＥ−５ＢａｍＨＩ）およびＸｈｏＩサイトを付加したｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ（ｈＬＣＥ−３ＸｈｏＩ）を用いたＰＣＲにより作製した。得られたｃＤＮＡ断片を、付加したＢａｍＨＩサイトとＸｈｏＩサイトを用いて、プラスミドｐＣＭＶ−Ｔａｇ２Ｂ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローニングした（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ ＬＣＥ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）。
【０１４５】
用いたプライマーの配列は以下の通りである。
ｈＬＣＥ−５ＢＢａｍＨＩ：
ＧＧＡＴＣＣＡＡＣＡＴＧＴＣＡＧＴＧＴＴＧＡＣＴＴ（配列番号９３）
ｈＬＣＥ−３ＸｈｏＩ：
ＣＴＣＧＡＧＣＴＡＴＴＣＡＧＣＴＴＴＣＧＴＴＧＴＴ（配列番号９４）
【０１４６】
このプラスミドを鋳型として、ＰＣＲ法を用いた点突然変異導入により変異ＬＣＥをコードするｃＤＮＡを作成した。点突然変異の導入方法を以下に記す。最初にＦｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒとしてｈＬＣＥ−Ｆ４を、ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒとして各変異導入用のｍｕｔａｇｅｎｉｃ ｐｒｉｍｅｒを用いたＰＣＲにより変異導入ＬＣＥ ｃＤＮＡの５’側部分を作製した。またＦｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒとしてｈＬＣＥ−５１０Ｓを、ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒとしてＴ７を用いたＰＣＲによりＬＣＥ ｃＤＮＡの３’側部分を作製した。得られた各変異導入ＬＣＥ ｃＤＮＡ ５’側断片とＬＣＥ ｃＤＮＡ３’側断片を混合したものを鋳型として、ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒにｈＬＣＥ−Ｆ４を、ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒにＴ７を用いたＰＣＲにより、変異を導入したＬＣＥのコーディング領域全長を含むｃＤＮＡ断片を得た。
【０１４７】
用いたプライマーの配列は以下の通りである。
ｈＬＣＥ−Ｆ４：
ＡＡＣＡＴＧＴＣＡＧＴＧＴＴＧＡＣＴＴＴＡＣ（配列番号９５）
ｈＬＣＥ−５１０Ｓ：
ＧＴＧＣＴＣＴＴＣＧＡＡＣＴＧＧＴＧＣＴ（配列番号９６）
Ｔ７：
ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ（配列番号９７）
【０１４８】
作製した突然変異導入ＬＣＥは下記の通りである。ヒトＬＣＥに導入した突然変異は、９９番目のシステインをアラニンに置換したもの（Ｃ９９Ａ）、２２５番目のシステインをアラニンに置換したもの（Ｃ２２５Ａ）、１４１番目のヒスチジンをアラニンにしたもの（Ｈ１４１Ａ）、１４４番目のヒスチジンをアラニンにしたもの（Ｈ１４４Ａ）、１４５番目のヒスチジンをアラニンにしたもの（Ｈ１４５Ａ）、及び１７４番目のヒスチジンをアラニンにしたもの（Ｈ１４７Ａ）である。
【０１４９】
これら変異導入に使用したプライマーの配列は以下の通りである。
Ｃ９９Ａ：
ＣＣＣＴＧＧＴＣＧＧＣＡＡＣＴＧＡＣＴＧＣＴＴＣ（配列番号９８）
Ｃ２２５Ａ：
ＧＴＧＡＧＡＧＴＧＧＧＣＣＴＧＧＴＣＡＴＧＣＴＧ（配列番号９９）
Ｈ１４１Ａ：
ＧＴＧＡＴＡＣＣＡＧＧＣＣＡＧＧＡＡＧＡＴＣ（配列番号１００）
Ｈ１４４Ａ：
ＧＴＧＡＴＧＴＧＧＧＣＡＴＡＣＣＡＧＴＧＣ（配列番号１０１）
Ｈ１４５Ａ：
ＣＡＣＡＧＴＧＡＴＧＧＣＧＴＧＡＴＡＣＣＡＧ（配列番号１０２）
Ｈ１７４Ａ：
ＣＡＴＣＡＣＧＧＣＧＧＣＣＡＣＧＣＣＡＴＡＧ（配列番号１０３）
【０１５０】
得られた変異ＬＣＥ ｃＤＮＡ断片は、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩを利用してプラスミドｐＣＭＶ−Ｔａｇ２Ｂにサブクローニングし、変異ＬＣＥ発現コンストラクトを作製した。これらのコンストラクトをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトし、変異ＬＣＥを発現させた。トランスフェクトから２日後に細胞を回収し、ミクロソーム画分を調製し、ミクロソーム中のＬＣＥ活性を測定した。なお、ＬＣＥの活性測定は、実施例６に記載の方法と同様の方法により行った。
【０１５１】
図２２は、ＬＣＥ変異体のＬＣＥ活性を表すグラフである。（ａ）はシステインをアラニンに置換した変異体のＬＣＥ活性を表し、（ｂ）はヒスチジンをアラニンに置換した変異体のＬＣＥ活性を表している。いずれの変異体も野生型と比較して半分以下にＬＣＥ活性が低下している。
【産業上の利用可能性】
【０１５２】
本発明によれば、長鎖脂肪鎖伸長酵素活性を抑制する活性を有する物質（例えば、ｓｉＲＮＡ、低分子化合物、タンパク質、抗体など）を用いた代謝系疾患、循環器系疾患、中枢神経系疾患などの治療・予防方法を提供することが可能となり、また、かかる物質を含有する治療・予防剤を提供することが可能となる。代謝系疾患としては、例えば、肥満症、糖尿病、ホルモン分泌異常、高脂血症、通風、脂肪肝などが挙げられる。循環器疾患としては、例えば、狭心症、急性・うっ血性心不全、心筋梗塞、冠状動脈硬化症、高血圧、腎臓病、電解質異常などが挙げられる。中枢神経系疾患としては、過食症などが挙げられる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検化合物を、被検動物又は被検細胞に、投与又は接触させる工程と、
該被検化合物が、該被検動物又は該被検細胞中でＬＣＥ遺伝子あるいは該遺伝子と機能的に等価な遺伝子の発現レベルを調節するか否かを確認する工程と、
を含むことを特徴とする肥満の治療又は予防に有効な化合物の評価方法。
【請求項２】
被験化合物を、ＬＣＥ遺伝子の発現調節領域とレポーター遺伝子との融合遺伝子を有する被検動物又は被検細胞に接触させる工程と、
該レポーター遺伝子の被検動物又は被検細胞中での発現レベルを測定する工程と、
を含むことを特徴とする肥満の治療又は予防に有効な化合物の評価方法。
【請求項３】
被検化合物を、ＬＣＥタンパク質に接触させる工程と、
該被検化合物が、該タンパク質の活性に影響を与えるか否かを確認する工程と、
を含むことを特徴とする肥満の治療又は予防に有効な化合物の評価方法。
【請求項４】
被検化合物を、ＬＣＥを含む複数種のエロンゲースタンパク質に接触させる工程と、
該複数種のエロンゲースタンパク質の活性を測定する工程と、
該複数種のエロンゲースタンパク質においてＬＣＥの活性を阻害する被検化合物を選択する工程と、
を含むことを特徴とする肥満の治療又は予防に有効な化合物の評価方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の評価方法によって得られた化合物を有効成分として含有する肥満の治療又は予防剤。
【請求項６】
ＬＣＥの脂肪酸合成活性を抑制することを特徴とする脂肪合成抑制方法。
【請求項７】
ＬＣＥの脂肪酸合成活性をＲＮＡｉにより抑制することを特徴とする脂肪合成抑制方法。
【請求項８】
前記ＲＮＡｉが、配列番号１３及び１４に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号１５及び１６に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号１７及び１８に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号１９及び２０に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号２１及び２２に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号２３及び２４に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号２５及び２６に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号２７及び２８に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号２９及び３０に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号３１及び３２に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号３３及び３４に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号３５及び３６に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号３７及び３８に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号４９及び５０に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号５１及び５１に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ及び配列番号５３及び５４に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡからなる群から選択される一以上のｓｉＲＮＡを使用したものであることを特徴とする請求項７に記載の脂肪合成抑制方法。
【請求項９】
前記ＲＮＡｉが、配列番号２３及び２４に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡを使用したものであることを特徴とする請求項７に記載の脂肪合成抑制方法。
【請求項１０】
ＬＣＥの脂肪酸合成活性を抑制する工程を含むことを特徴とする肥満の治療又は予防方法。
【請求項１１】
ＬＣＥの脂肪酸合成活性をＲＮＡｉにより抑制することを特徴とする肥満の治療又は予防方法。
【請求項１２】
前記ＲＮＡｉが、配列番号１３及び１４に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号１５及び１６に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号１７及び１８に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号１９及び２０に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号２１及び２２に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号２３及び２４に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号２５及び２６に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号２７及び２８に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号２９及び３０に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号３１及び３２に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号３３及び３４に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号３５及び３６に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号３７及び３８に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号４９及び５０に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号５１及び５１に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ及び配列番号５３及び５４に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡからなる群から選択される一以上のｓｉＲＮＡを使用したものであることを特徴とする請求項１１に記載の肥満の治療又は予防方法。
【請求項１３】
前記ＲＮＡｉが、配列番号２３及び２４に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡを使用したものであることを特徴とする請求項１１に記載の肥満の治療又は予防方法。
【請求項１４】
被検組織又は被検細胞におけるＬＣＥ遺伝子の発現レベル又は発現レベルの変化を測定することを特徴とする肥満の検査方法。
【請求項１５】
被検組織又は被検細胞におけるＬＣＥタンパク質の発現レベル又は発現レベルの変化を測定することを特徴とする肥満の検査方法。
【請求項１６】
被検組織又は被検細胞におけるＬＣＥ遺伝子に存在する多型を検出することを特徴とする肥満の検査方法。
【請求項１７】
ＬＣＥタンパク質と相互作用することによりＬＣＥ遺伝子の発現量に影響を及ぼすタンパク質の発現量又は活性を検出することを特徴とする肥満の検査方法。
【請求項１８】
配列番号２３及び２４に記載の核酸からなることを特徴とするｓｉＲＮＡ。
【請求項１９】
請求項１８に記載のｓｉＲＮＡを含むことを特徴とするＬＣＥ発現抑制剤。
【請求項２０】
請求項１８に記載のｓｉＲＮＡを含むことを特徴とする脂肪合成抑制剤。
【請求項２１】
請求項１８に記載のｓｉＲＮＡを含むことを特徴とする肥満の治療又は予防剤。
【請求項１】
被検化合物を、被検動物又は被検細胞に、投与又は接触させる工程と、
該被検化合物が、該被検動物又は該被検細胞中でＬＣＥ遺伝子あるいは該遺伝子と機能的に等価な遺伝子の発現レベルを調節するか否かを確認する工程と、
を含むことを特徴とする肥満の治療又は予防に有効な化合物の評価方法。
【請求項２】
被験化合物を、ＬＣＥ遺伝子の発現調節領域とレポーター遺伝子との融合遺伝子を有する被検動物又は被検細胞に接触させる工程と、
該レポーター遺伝子の被検動物又は被検細胞中での発現レベルを測定する工程と、
を含むことを特徴とする肥満の治療又は予防に有効な化合物の評価方法。
【請求項３】
被検化合物を、ＬＣＥタンパク質に接触させる工程と、
該被検化合物が、該タンパク質の活性に影響を与えるか否かを確認する工程と、
を含むことを特徴とする肥満の治療又は予防に有効な化合物の評価方法。
【請求項４】
被検化合物を、ＬＣＥを含む複数種のエロンゲースタンパク質に接触させる工程と、
該複数種のエロンゲースタンパク質の活性を測定する工程と、
該複数種のエロンゲースタンパク質においてＬＣＥの活性を阻害する被検化合物を選択する工程と、
を含むことを特徴とする肥満の治療又は予防に有効な化合物の評価方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の評価方法によって得られた化合物を有効成分として含有する肥満の治療又は予防剤。
【請求項６】
ＬＣＥの脂肪酸合成活性を抑制することを特徴とする脂肪合成抑制方法。
【請求項７】
ＬＣＥの脂肪酸合成活性をＲＮＡｉにより抑制することを特徴とする脂肪合成抑制方法。
【請求項８】
前記ＲＮＡｉが、配列番号１３及び１４に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号１５及び１６に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号１７及び１８に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号１９及び２０に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号２１及び２２に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号２３及び２４に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号２５及び２６に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号２７及び２８に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号２９及び３０に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号３１及び３２に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号３３及び３４に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号３５及び３６に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号３７及び３８に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号４９及び５０に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号５１及び５１に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ及び配列番号５３及び５４に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡからなる群から選択される一以上のｓｉＲＮＡを使用したものであることを特徴とする請求項７に記載の脂肪合成抑制方法。
【請求項９】
前記ＲＮＡｉが、配列番号２３及び２４に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡを使用したものであることを特徴とする請求項７に記載の脂肪合成抑制方法。
【請求項１０】
ＬＣＥの脂肪酸合成活性を抑制する工程を含むことを特徴とする肥満の治療又は予防方法。
【請求項１１】
ＬＣＥの脂肪酸合成活性をＲＮＡｉにより抑制することを特徴とする肥満の治療又は予防方法。
【請求項１２】
前記ＲＮＡｉが、配列番号１３及び１４に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号１５及び１６に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号１７及び１８に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号１９及び２０に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号２１及び２２に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号２３及び２４に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号２５及び２６に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号２７及び２８に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号２９及び３０に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号３１及び３２に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号３３及び３４に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号３５及び３６に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号３７及び３８に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号４９及び５０に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号５１及び５１に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ及び配列番号５３及び５４に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡからなる群から選択される一以上のｓｉＲＮＡを使用したものであることを特徴とする請求項１１に記載の肥満の治療又は予防方法。
【請求項１３】
前記ＲＮＡｉが、配列番号２３及び２４に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡを使用したものであることを特徴とする請求項１１に記載の肥満の治療又は予防方法。
【請求項１４】
被検組織又は被検細胞におけるＬＣＥ遺伝子の発現レベル又は発現レベルの変化を測定することを特徴とする肥満の検査方法。
【請求項１５】
被検組織又は被検細胞におけるＬＣＥタンパク質の発現レベル又は発現レベルの変化を測定することを特徴とする肥満の検査方法。
【請求項１６】
被検組織又は被検細胞におけるＬＣＥ遺伝子に存在する多型を検出することを特徴とする肥満の検査方法。
【請求項１７】
ＬＣＥタンパク質と相互作用することによりＬＣＥ遺伝子の発現量に影響を及ぼすタンパク質の発現量又は活性を検出することを特徴とする肥満の検査方法。
【請求項１８】
配列番号２３及び２４に記載の核酸からなることを特徴とするｓｉＲＮＡ。
【請求項１９】
請求項１８に記載のｓｉＲＮＡを含むことを特徴とするＬＣＥ発現抑制剤。
【請求項２０】
請求項１８に記載のｓｉＲＮＡを含むことを特徴とする脂肪合成抑制剤。
【請求項２１】
請求項１８に記載のｓｉＲＮＡを含むことを特徴とする肥満の治療又は予防剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【国際公開番号】ＷＯ２００５／００５６６５
【国際公開日】平成１７年１月２０日（２００５．１．２０）
【発行日】平成１８年１１月９日（２００６．１１．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１１５４４（Ｐ２００５−５１１５４４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００９８３４
【国際出願日】平成１６年７月９日（２００４．７．９）
【出願人】（０００００５０７２）萬有製薬株式会社 (51)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年１月２０日（２００５．１．２０）
【発行日】平成１８年１１月９日（２００６．１１．９）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００９８３４
【国際出願日】平成１６年７月９日（２００４．７．９）
【出願人】（０００００５０７２）萬有製薬株式会社 (51)
【Ｆターム（参考）】
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