ＬＤＬ亜画分を用いた冠動脈疾患の判定方法
【課題】高価な測定装置が必要なく、簡便で性能の高い冠動脈疾患の判定方法の提供。
【解決手段】本発明は、陰イオン交換樹脂を用いて、ＬＤＬを吸着させた後、ＬＤＬ亜画分のうち、結合力の弱い画分である、ＬＤＬｆを溶出させ、続いて、ＬＤＬ亜画分のうち、結合力の強い画分である、ＬＤＬｓを溶出させる測定法において、ＬＤＬｓが高値を示した場合に冠動脈疾患である可能性が高いと判別する方法を提供する。
【解決手段】本発明は、陰イオン交換樹脂を用いて、ＬＤＬを吸着させた後、ＬＤＬ亜画分のうち、結合力の弱い画分である、ＬＤＬｆを溶出させ、続いて、ＬＤＬ亜画分のうち、結合力の強い画分である、ＬＤＬｓを溶出させる測定法において、ＬＤＬｓが高値を示した場合に冠動脈疾患である可能性が高いと判別する方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
イオン交換樹脂を用いて分離、測定されるＬＤＬ亜画分を用いて、冠動脈疾患を判定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血清中のリポ蛋白には、大きく分類して、比重の軽い順にカイロマイクロン（ＣＭ）、超低比重リポ蛋白（ＶＬＤＬ）、中間型リポ蛋白（ＩＤＬ）、低比重リポ蛋白（ＬＤＬ）、高比重リポ蛋白（ＨＤＬ）の５種類が知られている。ＶＬＤＬは肝臓で産生され、血液中で代謝されることによりＩＤＬを経由し、ＬＤＬとなる。ＬＤＬは抹消組織細胞に脂質を供給する。ＬＤＬには比重の異なるものが存在していることが知られており、近年、血液中に比重の高いＬＤＬが多いことは、動脈硬化を進展させる主要なリスクファクターになると考えられている（非特許文献１）。また、近年、ＬＤＬの中でも、粒子系の小さなＳｍａｌｌ， ｄｅｎｓｅ ＬＤＬや、酸化を受けたＯｘｉｄｉｚｅｄ ＬＤＬ（以下、酸化ＬＤＬと呼ぶ）が特に動脈硬化性疾患のリスクファクターとして指摘され注目されている（非特許文献２、３）。
【０００３】
このように、ＬＤＬを更に詳細に分離し測定することにより、ＬＤＬのどのような分子が高い動脈硬化性疾患のリスクファクターであるかを理解することは、動脈硬化性疾患の治療及び予防を進めるうえで重要である。
【０００４】
Ｓｍａｌｌ， ｄｅｎｓｅ ＬＤＬを分離測定する方法としては、超遠心分離装置（非特許文献１、４）、ＮＭＲ分析装置（非特許文献５、６）、ゲルろ過クロマトグラフィー（非特許文献７）、電気泳動（非特許文献８）、沈殿法（非特許文献９）による方法があるが、超遠心分離装置やＮＭＲ分析装置は高価な装置であり、汎用性に乏しい。また、ＮＭＲ分析装置、ゲルろ過カラム、電気泳動、沈殿法による方法は各リポ蛋白の亜画分を分離する能力が十分でないという問題点がある。酸化ＬＤＬの測定法は、モノクローナル抗体を用いたイムノアッセイによる方法で簡便ではあるが、用いるモノクローナル抗体の種類が異なる場合や、分離したＬＤＬ試料を用いる方法と希釈した血清を試料として用いる方法など種々の方法があり、方法により値が異なるという問題がある（非特許文献３）。
【０００５】
【非特許文献１】Ｇｒｉｆｆｉｎ Ｂら、Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ １０６、ｐ２４１（１９９４）
【非特許文献２】Ｃａｒｍｅｎａ Ｒら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、１０９．ｐＩＩＩ−２（２００４）
【非特許文献３】Ｉｔａｂｅ Ｈら、Ｊ Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ、１４、ｐ１（２００７）
【非特許文献４】Ｇｕｅｒｉｎ Ｍら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０、ｐ１８９（２０００）
【非特許文献５】Ｉｋｅｗａｋｉ Ｋら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ １１、ｐ２７８（２００４）
【非特許文献６】Ｏｔｖｏｓ Ｊ Ｄ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｓｔｉｎｇ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、ｐ６０９（２０００）
【非特許文献７】Ｏｋａｚａｋｉ Ｍら、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｓｔｉｎｇ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、ｐ６４７（２０００）
【非特許文献８】Ｈｏｅｆｎｅｒ Ｄ Ｍら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４７、ｐ２６６（２００１）
【非特許文献９】Ｈｉｒａｎｏら、Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、４４、ｐ２１９３（２００３）
【非特許文献１０】Ｙａｍａｇｕｃｈｉ Ｙら、Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ｂ、７３１、ｐ２２３（１９９９）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記のように、Ｓｍａｌｌ， ｄｅｎｓｅ ＬＤＬや酸化ＬＤＬの測定法が構築され冠動脈疾患との関連が検討されているが、冠動脈疾患との関連を検討する方法として性能が満足できるものではなく、その評価結果も一定の成績が得られていない。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、陰イオン交換樹脂を用いたリポ蛋白の分離分析法を考案し、更にＬＤＬの中の結合力が強い画分を測定する方法を確立した。この測定法はＬＤＬ亜画分を分離する能力が高く、再現性も良好な方法であった。この測定法を用いて、冠動脈疾患患者の血清を測定することにより、本発明に到達した。
【０００８】
すなわち、陰イオン交換樹脂を用いて、ＬＤＬを吸着させた後、ＬＤＬ亜画分のうち、結合力の弱い画分である、ＬＤＬｆを溶出させ、続いて、ＬＤＬ亜画分のうち、結合力の強い画分である、ＬＤＬｓを溶出させる測定法において、ＬＤＬｓが高値を示した場合に冠動脈疾患である可能性が高いと判別する方法である。ここで、陰イオン交換樹脂に対する結合力の強弱は、当該ＬＤＬ亜画分を陰イオン交換樹脂から溶出させる際に使用する溶出液の塩濃度で判断する。すなわち、溶出液の塩濃度が相対的に高い場合に溶出する亜画分を結合力の強い画分（ＬＤＬｓ）といい、溶出液の塩濃度が相対的に低い場合に溶出する亜画分を結合力の弱い画分（ＬＤＬｆ）という。
【０００９】
従って、本願は以下の発明を包含する。
１．ＬＤＬ亜画分のうち、陰イオン交換樹脂に対して、結合力が強いＬＤＬ亜画分（以下、ＬＤＬｓ）を指標として用いる、冠動脈疾患の判定方法。
２．ＬＤＬｓのコレステロール濃度を比較することにより、冠動脈疾患を判定する、１に記載の方法。
３．被験者から得られるＬＤＬｓのコレステロール濃度が、健常者から得られるＬＤＬｓのコレステロール濃度の平均値よりも高い場合に、冠動脈疾患であると判定する、２に記載の方法。
４．溶離液の塩濃度勾配を利用して、ＬＤＬからＬＤＬｓを分離し、測定したものを指標として用いる、１〜３のいずれか一つに記載の方法。
５．ＬＤＬを吸着させるための溶離液（溶離液１）、ＬＤＬ亜画分のうち、結合力の弱い画分を溶出させるための溶離液（溶離液２）、ＬＤＬ亜画分のうち、結合力が強い画分を溶出させるための溶離液（溶離液３）の塩濃度の異なる溶離液を、溶離液１、２、３の順に陰イオン交換樹脂に流すことにより、ＬＤＬからＬＤＬｓを分離し、測定したものを指標として用いる、１〜４のいずれか一つに記載の方法。
６．溶離液１の塩濃度が１３０ｍｍｏｌ／Ｌから１８０ｍｍｏｌ／Ｌであり、溶離液３の塩濃度が溶離液１の塩濃度より２０ｍｍｏｌ／Ｌから５０ｍｍｏｌ／Ｌ高く、溶離液２の塩濃度が、溶離液１の塩濃度よりも高く、溶離液３の塩濃度よりも低い、１〜５のいずれか一つに記載の方法。
７．溶離液２の塩濃度が、溶離液１と溶離液３の塩濃度の差に対して３５％から６０％分溶離液３より低い、１〜６のいずれか一つに記載の方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明は、イオン交換樹脂を用いて分離、測定されるＬＤＬ亜画分を用いて、簡便で性能の高い冠動脈疾患を判定する方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下に本発明について、詳細に説明する。
ＬＤＬの亜画分の分離測定方法としては、超遠心分離装置を用いた方法が一般に用いられており、分離する能力も高いが、一方で、手技が難しく、また、超遠心分離装置は高価なため、多くの研究者が利用することは出来ない。ＮＭＲやゲルろ過クロマトグラフィーによる測定方法の手技は難しくないが、どちらもＬＤＬの亜画分を分離する能力は十分とは言えない。電気泳動による測定方法も、手技は難しくないが、分離する能力は十分とは言えないし、一般的に定量性という面で性能の低い測定方法である。
【００１２】
陰イオン交換クロマトグラフィーによるリポ蛋白の分離は、一般的な液体クロマトグラフィーの装置を用いて実施することが可能である。分離後は、コレステロールと反応する市販の酵素液（例えば総コレステロールＥテストワコー、和光純薬株式会社製）と混合して反応させ、可視光検出器で測定することができ、簡便で定量性も良いことが知られている（Ｈｉｒｏｗａｔａｒｉ Ｙら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４４、ｐ１４０４（２００３））。我々は、この陰イオン交換クロマトグラフィーによるリポ蛋白分析の手法を用いて、ＬＤＬの亜画分を分離することを試みた。具体的には、ＬＤＬ２の含まれる量の多い画分（ＬＤＬｆ）とＬＤＬ３の含まれる量の多い画分（ＬＤＬｓ）の２つに、各々３つの溶離液を用いたステップ溶出により、ＬＤＬの亜画分を分離することを試みた。
【００１３】
使用出来る陰イオン交換カラムに充填されるゲルとしては、シリカ系やポリマー系のゲルにジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基や第４級アミノエチル（ＱＡＥ）基が結合されたもの、また、そのゲルの表面に１０００オングストローム程度の孔があるもの（多孔質）と孔がないもの（非多孔質）があるが、好ましくは、リポ蛋白に対して分離性能の高い非多孔質のタイプ、例えばポリマー系の非多孔質タイプの表面にＤＥＡＥ基を持つゲルをカラムに充填したＴＳＫ−ＧＥＬ ＤＥＡＥ−ＮＰＲ（東ソー（株）製）が挙げられる。溶離液は、リポ蛋白の分離能力の高い過塩素酸ナトリウムなどのカオトロピックイオンを含んだ溶離液が望ましい。
【００１４】
ＬＤＬの分離は、イオン交換樹脂、例えばイオン交換カラムを使用し、溶離液の塩濃度勾配を利用して行うことができる。好ましくは、分離に使用する塩濃度の異なる溶離液１、２、３を、塩濃度の低い順にカラムに流す。この３種類の溶離液の役割としては、溶離液１はＬＤＬ画分を吸着させるとともにＨＤＬ画分を溶出させ、溶離液２はＬＤＬ２（密度１．０３５〜１．０４５ｇ／ｍｌ）の含まれる量が多い画分（ＬＤＬｆ）を溶出させ、溶離液３はＬＤＬ３（密度１．０４５〜１．０６３ｇ／ｍｌ）の含まれる量が多い画分（ＬＤＬｓ）を溶出させことにある。かつ、溶離液３は、陰イオン交換カラムにおいて、ＬＤＬよりも溶出の遅いＩＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭがＬＤＬｓから溶出しない塩濃度とする。それらが同時に溶出すると、ＬＤＬｓの精度が低下する。ＩＤＬは３型高脂血症という遺伝性の病態以外ではその量は少なくＬＤＬｓの精度に大きな支障をもたらさないが、ＶＬＤＬやＣＭは病状の軽い高脂血症においても、ある程度存在するので、ＬＤＬｓの測定精度を著しく低下させ、問題となる。また、溶離液１と２や溶離液２と３の間にＬＤＬ亜画分の分離を高めるために更に新たな塩濃度の溶離液を加えたり、分離溶出する条件として、段階的に溶離液の塩濃度を高める条件を加えたりしても良い。
【００１５】
使用するカラムや溶離液に入れる塩の種類により若干異なるが、本分離における最も好ましい条件においては、ＤＥＡＥ基を持つ非多孔質のポリマー系のゲルを充填したカラムを用い、そのカラムに用いる溶離液に過塩素酸ナトリウムを含み、溶離液１の塩濃度が１３０ｍｍｏｌ／Ｌから１８０ｍｍｏｌ／Ｌであり、溶離液３は溶離液１より２０ｍｍｏｌ／Ｌから５０ｍｍｏｌ／Ｌ高く、溶離液２は溶離液３に比べ溶離液１と溶離液３の塩濃度の差に対して３５％から６０％分塩濃度が低い溶離液とする。
【００１６】
好ましい塩として、上述のとおり過塩素酸ナトリウムが使用されるが、その他、チオシアン酸ナトリウム、ヨウ化カリウムなどが挙げられる。また、溶離液の塩濃度とは、加えた試薬の解離しているイオンの濃度であり、過塩素酸ナトリウムの場合には、ほぼ１００％が解離しているので、過塩素酸ナトリウムを１００ｍｍｏｌ／Ｌ入れた場合には、その塩濃度は１００ｍｍｏｌ／Ｌとなる。緩衝液に依存する塩濃度はその試薬の解離定数から算出するが、実施例で使用した５０ｍｍｏｌ／Ｌのトリス緩衝液については、ｐＨ８のときの解離した分子の濃度（塩濃度）は、トリスのｐＫａ＝８．１から算出すると、約２８ｍｍｏｌ／Ｌとなる。
【００１７】
使用する溶離液には、緩衝液を加えて、ｐＨを６から９に調整することが好ましい。加える緩衝液の種類としては、例えばＴｒｉｓ−ＨＣｌ、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液など、当業界において慣用のあらゆるものを使用することができる。
【００１８】
また、実施例４において、高脂血症患者の血清を用いて、溶離液１及び３に適した塩濃度を検討し、さらに、ＬＤＬｓ濃度が異なる高脂血症患者において、溶離液１及び３中の塩濃度を固定した条件で溶離液２の塩濃度を変動させたとき、ＬＤＬｓの測定値は変動するものの、溶離液２の濃度が、溶離液１と溶離液３の塩濃度の差に対して３４％分以上溶離液３より低い条件では、各患者間の測定値の順序には変動がないことを確認している。これらのことから、前述した分離条件の範囲内であれば、ＬＤＬｓの値が変動するものの、同じ分離条件で得られた複数の個人の測定値と比較して、その値の高さから冠動脈疾患である可能性を判別することは可能である。
【００１９】
本分析法を用いて実施例に示したように、冠動脈疾患患者と健常人を測定して比較したところ、ＬＤＬｓは冠動脈疾患患者において、有意に高値を示した（表４、図１４）。このことから、ＬＤＬｓを測定することにより冠動脈疾患を判定することが出来ることが分かる。例えば、ＬＤＬｓ中のコレステロール濃度について、健常人の測定値と、冠動脈疾患患者との測定値とを比較して判定を行う。具体的には、ＬＤＬｓ中のコレステロール濃度について、健常人の平均測定値と被験者から得られる測定値を比較し、被験者の測定値が高い場合に、好ましくは５％以上高い場合に、より好ましくは１０％以上高い場合に、なおより好ましくは２０％以上高い場合に、更により好ましくは３０％以上高い場合に、特に好ましくは４０％以上高い場合に、最も好ましくは５０％以上高い場合に、その被験者は冠動脈疾患である可能性が高いと判断することができる。
【００２０】
次に、本発明について、実施例を用いて説明する。ただし、本発明は実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００２１】
（実施例１）
図１に装置の形態を示す。実施例に用いた装置構成を下記に示す。
溶離液Ａ（１）は５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ＋１ｍＭ ＥＤＴＡ２Ｎａ ｐＨ７．５、溶離液Ｂ（２）は５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ＋１ｍＭ ＥＤＴＡ２Ｎａ＋５００ｍＭ 過塩素酸ナトリウム ｐＨ７．５である。溶離液ＡとＢを流すポンプ（４）はＣＣＰＭ２（東ソー（株）製）を用いた。ＣＣＰＭ２は、ポンプヘッドを２つもち、溶離液２液のグラディエントを行えるポンプである。溶離液ＡとＢを混合するミキサー（５）はスタティックミキサーＣ（東ソー（株）製）を用いた。オートサンプラー（６）はＡＳ−８０２０（東ソー（株）製）を、カラムオーブン（９）はＣＯ−８０２１（東ソー（株）製）を用いた。カラム（８）はＤＥＡＥ−ＮＰＲカラムサイズ４．６ｍｍＩ．Ｄ．ｘ３５ｍｍ（東ソー（株）製）を、フィルター（７）はＨＬＣ−７２３ＧＨｂ３型用のカラムフィルターＳタイプ（東ソー（株）製）を用いた。コレステロール反応液（１０）はＴＣＨＯ−ＣＬ（セロテック社製）を、ポンプ直前にエアートラップ（１１）を設置した。コレステロール反応液のためのポンプ（１２）はＤＰ−８０２０（東ソー（株）製）を用いた。溶離液ＡとＢおよびコレステロール反応液については、脱気装置（３）を設置した。コレステロール反応液のラインに、抵抗管（１３）０．１ｍｍＩ．Ｄ．ｘ２ｍを２つ直列につないで設置した。反応コイル（１４）は、０．２５ｍｍＩ．Ｄ．ｘ３０ｍとした。検出器はＵＶ−８０２０（東ソー（株）製）（１５）を用いた。溶離液はＡとＢをあわせて０．５ｍＬ／ｍｉｎの流速とし、コレステロール反応液の流速は０．２５ｍＬ／ｍｉｎとした。カラムオーブンの温度は２５℃とし、反応コイルは３７℃に保温した。検出器は６００ｎｍで検出した。
【００２２】
溶離液による溶出パターンを、０．０分から２０．０分はＢの組成を１０．０％（その他の組成は全てＡ、以下同じ）から３７．０％へのリニアグラディエントとし、２０．０分から２１．８分はＢの組成を３７．０％に固定し、２１．８分から２２．３分はＢの組成を３７．０％から１００．０％へのリニアグラディエントとし、２２．３分から２３．８分はＢの組成を１００．０％に固定し、２３．８分から２４．３分はＢの組成を１００．０％から１０．０％へのリニアグラディエントとし、２４．３分から４０．０分はＢの組成を１０．０％に固定し、ＨＤＬ亜画分の検討を行った。なお、本分析において、１検体の測定時間は４０分とした。なお、本測定機器のこの溶出パターンの時間の設定と実際にカラムに流れる溶離液の組成には、ポンプからカラムまでの配管容量とカラムから溶出してから反応して検出するまでに要する時間により４分のタイムラグが生じる。
【００２３】
健常人の血清検体と、健常人から超遠心分離装置を用いた方法で得られたＨＤＬ２（密度１．０６３〜１．１２５ｇ／ｍｌ）とＨＤＬ３（密度１．１２５ｇ／ｍｌ以上）を測定した。健常人検体では、溶出時間９．２７分にＨＤＬ３を主体としたピークが、溶出時間１２．６０分にＨＤＬ２を主体としたピークが、溶出時間１６．０８分にＬＤＬが、溶出時間１９．２０分にＶＬＤＬが確認された（図２）。ＨＤＬ２試料を分析した際には、主要なピークが溶出時間１２．２９分に確認され、小さなピークが溶出時間１７．００分に確認された（図３）。なお、このマイナーピークと主要なピークとの性質の差は現時点では不明である。ＨＤＬ３試料を分析した際には、溶出時間として１１．４２分のピークが確認された（図４）。これらの結果から、イオン交換クロマトグラフィーにおいてＨＤＬ３はＨＤＬ２より早く溶出する性質を有することがわかった。
【００２４】
また、図２の溶出パターンを見ると、ＨＤＬ３の溶出はグラディエント条件１５％ぐらいから始まっている。図３の超遠心で分離したＨＤＬ３の試料を測定した結果では、グラディエント条件１８％ぐらいから溶出が始まっているが、この差は超遠心で分離したＨＤＬ３の試料には血清由来の蛋白が含まれないためだと考えられる。これらの結果からＨＤＬ亜画分を測定する場合のＨＤＬ全体を吸着させる溶離液（溶離液１’）は確実に吸着が起こる８％以下が好ましい。８％の時の過塩素酸ナトリウム濃度は４０ｍｍｏｌ／Ｌであり、５０ｍｍｏｌ／Ｌ トリス緩衝液 ｐＨ７．５の塩濃度は４０ｍｍｏｌ／Ｌであるので、全体で８０ｍｍｏｌ／Ｌ以下が望ましいと言える。また、ＨＤＬ２は図３からわかるように、１８％の時から溶出が開始され２８％には完全に溶出が終了する。このことから、ＨＤＬ画分をすべて溶出する溶離液（溶離液３’）は１８％の組成の溶離液（塩濃度１３０ｍｍｏｌ／Ｌ）を流し長い時間をかけて溶出するか、２８％の組成の溶離液（塩濃度１８０ｍｍｏｌ／Ｌ）を短時間流せば良い。溶離液３’の塩濃度は１３０〜１８０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲が好ましいと言える。
【００２５】
次に、ｐＨ８．０の溶離液を用いて、溶離液による溶出パターンを、０．０分から２０．０分はＢの組成を１０．０％（その他の組成は全てＡ、以下同じ）から３７．０％へのリニアグラディエントとし、２０．０分から２２．０分はＢの組成を３７．０％に固定し、２２．０分から２６．０分はＢの組成を１００．０％に固定し、２６．０分から４０．０分はＢの組成を１０．０％に固定し、ＬＤＬ亜画分の検討を行った。なお、１検体の測定時間は４０分とした。
【００２６】
健常人の血清検体と、高脂血症患者から超遠心分離装置を用いた方法で得られたＬＤＬ１（密度１．０１９〜１．０３５ｇ／ｍｌ）とＬＤＬ２（密度１．０３５〜１．０４５ｇ／ｍｌ）とＬＤＬ３（密度１．０４５〜１．０６３ｇ／ｍｌ）を測定した。健常人検体では、溶出時間１２．８１分と１３．９１分に２つに分かれてＨＤＬ３を主体としたピークが、溶出時間１５．８９分にＨＤＬ２を主体としたピークが、溶出時間１９．２０分にＬＤＬが確認され、ＬＤＬと分離したピークとして確認はされていないが２２分ぐらいに溶出されている画分はＶＬＤＬと推定される（図５）。ＬＤＬ１試料を分析した際には、溶出時間として１９．８５分のピークが確認された（図６）。ＬＤＬ２試料を分析した際には、主要なピークが溶出時間１９．４９分に確認され、小さなピークが溶出時間２１．７０分に確認された（図７）。なお、このマイナーピークと主要なピークとの性質の差は現時点では不明である。ＬＤＬ３試料を分析した際には、溶出時間として１９．９２分のピークが確認された（図８）。これらの結果から、イオン交換クロマトグラフィーにおいて、ＬＤＬ亜画分の溶出する順序は、ＬＤＬ２、ＬＤＬ１、ＬＤＬ３となることがわかる。
前述したように、ＨＤＬ画分をすべて溶出する溶離液（溶離液３’）の塩濃度は１３０〜１８０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲が好ましいとわかった。このことから、ＨＤＬ画分を吸着、もしくは、溶出させて、なおかつ、ＬＤＬ画分を吸着させるための溶離液（溶離液１）も同様に１３０〜１８０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲が好ましいと言える。実際に図５から８を見ると、ＬＤＬの溶出は約３０％（塩濃度は、過塩素酸濃度が１５０ｍｍｏｌ／Ｌ、５０ｍｍｏｌ／Ｌ トリス緩衝液 ｐＨ８．０の塩濃度は２８ｍｍｏｌ／Ｌであるので、全体で約１８０ｍｍｏｌ／Ｌとなる。）から始まっている。また、ＬＤＬ画分をすべて溶出するための溶離液（溶離液３）は、ＬＤＬ画分の溶出する溶離液の塩濃度が図６〜８から３０〜３４％程度（塩濃度で１７８〜１９８ｍｍｍｏｌ／Ｌ）となり、３０％程度の溶離液を長時間流すか、あるいは、３４％程度の溶離液を短時間流すかのどちらかを選択する。このことから、溶離液３の濃度は、３０〜３４％程度（塩濃度で１７８〜１９８ｍｍｍｏｌ／Ｌ）が好ましい濃度となり、溶離液１との差はおおむね２０〜５０ｍｍｏｌ／Ｌである。
【００２７】
（実施例２）
実施例１と同じ装置を用い、溶離液のｐＨは８．０として、検討を行った。溶離液の溶出パターンは、０．０分から０．０１分はＢの組成を８．０％（その他の組成は全てＡ、以下同じ）に固定、０．０１分から３．０分はＢの組成を１９．０％に固定、３．０分から６．０分はＢの組成を２４．５％に固定、６．０分から９．５分はＢの組成を２７．８％に固定、９．５分から１３．０分はＢの組成を２９．５％に固定、１３．０分から１６．５分はＢの組成を３３．０％に固定、１６．５分から２０．０分はＢの組成を４３．０％に固定、２０．０分から２５．０分はＢの組成を６３．０％に固定、２５．０分から３５．０分はＢの組成を８．０％に固定した。なお、１検体の測定時間は３５分とした。
【００２８】
健常人の血清検体と、健常人から超遠心分離装置を用いた方法で得られたＨＤＬ２（密度１．０６３〜１．１２５ｇ／ｍｌ）、ＨＤＬ３（密度１．１２５ｇ／ｍｌ以上）、ＬＤＬ１（密度１．０１９〜１．０３５ｇ／ｍｌ）、ＬＤＬ２（密度１．０３５〜１．０４５ｇ／ｍｌ）、ＬＤＬ３（密度１．０４５〜１．０６３ｇ／ｍｌ）、ＩＤＬ（密度１．００６〜１．０１９ｇ／ｍｌ）、ＶＬＤＬ（密度０．９３０〜１．００６ｇ／ｍｌ）、ＣＭ（密度０．９３０ｇ／ｍｌ以下）を測定した。
【００２９】
ＨＤＬ３試料については、溶出時間５．９分に主たるピークが見られ、溶出時間８．４分にマイナーなピークが確認され、ＨＤＬ２試料については、溶出時間８．５分にピークが確認された（図９）。ＬＤＬ３試料は、溶出時間１２．９分に主たるピークが見られ、溶出時間１５．１分にマイナーなピークが確認され、ＬＤＬ２試料は、溶出時間１２．１分に主たるピークが見られ、溶出時間１５．０分と１８．８分にマイナーなピークが確認され、ＬＤＬ１試料は、溶出時間１２．３分に主たるピークが見られ、溶出時間１５．１分にマイナーなピークが確認された（図９）。ＩＤＬ試料は、溶出時間１８．６分に主たるピークが見られ、溶出時間１５．９分にマイナーなピークが確認され、ＶＬＤＬ試料は、溶出時間２２．０分に主たるピークが見られ、溶出時間２５．２分にマイナーなピークが確認され、ＣＭ試料では、ピークは確認されなかった（図９）。これらの結果から、健常人の血清検体において見られる溶出時間６．７分、８．６分、１２．１分、１５．２分、１８．８分、２１．９分、２５．２分のピークは、それぞれ、ＨＤＬ３が主要な成分であるＨＤＬ３＋、ＨＤＬ２が主要な成分であるＨＤＬ２＋、ＬＤＬ１とＬＤＬ２が主要な成分であるＬＤＬｆ、ＬＤＬｆに比べＬＤＬ３の含量が多いＬＤＬｓ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭのピークであると言える（図９）。
【００３０】
次に、高脂血症患者検体においても、同様の検討を行った。各画分の分析結果から、高脂血症患者の血清検体において見られる溶出時間６．５分、８．５分、１１．８分、１５．１分、１８．８分、２２．０分、２５．１分のピークは、それぞれ、健常人血清と同様に、ＨＤＬ３が主要な成分であるＨＤＬ３＋、ＨＤＬ２が主要な成分であるＨＤＬ２＋、ＬＤＬ１とＬＤＬ２が主要な成分であるＬＤＬｆ、ＬＤＬｆに比べＬＤＬ３の含量が多いＬＤＬｓ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭのピークであると言える（図１０）。
【００３１】
このように、溶離液Ｂ８％（過塩素酸ナトリウム４０ｍｍｏｌ／ｌ）において、リポ蛋白画分を吸着させ、溶離液Ｂ１９％（過塩素酸ナトリウム９５ｍｍｏｌ／ｌ）において、ＨＤＬ３を多く含むＨＤＬ画分を溶出させ、溶離液Ｂ２４．５％（過塩素酸ナトリウム１２２．５ｍｍｏｌ／ｌ）において、ＨＤＬ２を多く含むＨＤＬ画分を溶出させることが出来る。そして、溶離液Ｂ２４．５％（過塩素酸ナトリウム１２２．５ｍｍｏｌ／ｌ）において、ＨＤＬ画分がすべて溶出した後に、溶離液Ｂ２７．８％（過塩素酸ナトリウム１３９ｍｍｏｌ／ｌ）において、ＬＤＬ２を多く含むＬＤＬｆ画分を溶出させ、溶離液Ｂ２９．５％（過塩素酸ナトリウム１４７．５ｍｍｏｌ／ｌ）において、ＬＤＬ３を多く含むＬＤＬｓ画分を溶出させることが出来る。その後、溶離液Ｂ３３．０％（過塩素酸ナトリウム１６５ｍｍｏｌ／ｌ）においてＩＤＬ画分を、溶離液Ｂ４３．０％（過塩素酸ナトリウム２１５ｍｍｏｌ／ｌ）においてＶＬＤＬ画分を、溶離液Ｂ６３．０％（過塩素酸ナトリウム３１５ｍｍｏｌ／ｌ）においてＣＭ画分を溶出する。以上のように、ステップ溶出を用いることにより、ＨＤＬ３＋、ＨＤＬ２＋、ＬＤＬｆ、ＬＤＬｓ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭの７つのリポ蛋白画分を良好に分離し測定することが出来る。
【００３２】
以上の結果から、ステップ溶出によるＬＤＬ亜画分の最も好ましい溶出条件においては、溶離液１は塩濃度１４３〜１６３ｍｍｏｌ／ｌ（溶離液Ｂ２３〜２７％）であり、溶離液２は溶離液１と３の塩濃度の差の３４％分溶離液３より低く（溶離液３が溶離液Ｂ２９．５％であり、溶離液２が溶離液Ｂ２７．８％である。）、溶離液３は１７５．５〜１８８ｍｍｏｌ／ｌ（溶離液Ｂ２９．５〜３２％）である。
【００３３】
（実施例３）
実施例２と同じ条件で、ＬＤＬｆとＬＤＬｓの溶出条件を検討することを目的として、ＬＤＬｆを溶出する溶離液をＢ２５．０〜２９．０%（過塩素酸ナトリウム１２５〜１４５ｍｍｏｌ／ｌ）に変動させて、測定を実施した。高脂血症患者２名の血清試料を用いた。結果を表１と２に示す。また、そのＬＤＬｓ/ＬＤＬｆの比率（％）の変動を図１１に示した。図１１から、溶離液Ｂ２６．３％（過塩素酸ナトリウム１３１．５ｍｍｏｌ／ｌ）以下になると急激に高くなることがわかる。溶離液Ｂ２６．３％でＬＤＬｆ画分を溶出する前の溶離液はＢ２４．５％であり、ＬＤＬｓ画分を溶出する溶離液はＢ２９．５％であるので、ＬＤＬ亜画分を溶出する条件として、２番目に流す溶離液と３番目に流す溶離液の塩濃度の差はＢ％として３．２％であり、１番目に流す溶離液と３番目に流す溶離液の塩濃度の差はＢ％として５％であるので、その割合（低下率）は６４％である。このことから、安定して測定するには、２番目に流す溶離液の塩濃度の低下率としては６４％以下である必要がある。
【００３４】
【表１】
【００３５】
【表２】
【００３６】
また、ＬＤＬ３の含量はＬＤＬ全体の５〜３０％程度とわかっており、ＬＤＬｓのＬＤＬ３の含量が適当となるＬＤＬｓ/ＬＤＬｆの比率（％）は、５．３〜４３％となる。このことを考慮すると、ＬＤＬｆを溶出する塩濃度はＢ２８．７％以下であり、これは、上記のように算出すると２番目に流す溶離液の塩濃度の低下率１６％である。これらのことから、適切な２番目に流す溶離液の塩濃度の低下率は概ね２０〜６０％といえ、さらに安定的に値を得るための好ましい塩濃度はＢ２６．９〜２８．４％であるので、低下率としては２２〜５２％である。
【００３７】
（実施例４）
実施例３で記述したＬＤＬｓについて、ＬＤＬ亜画分への溶出条件の影響を確認するために、ＬＤＬｆを溶出する溶離液をＢ２５．５〜２９．０%（過塩素酸ナトリウム１２７．５〜１４５ｍｍｏｌ／ｌ）に変動させて、測定を実施した（表３）。３つの高脂血症患者の血清試料を用いた。２番目に流す溶離液の塩濃度の低下率が約３５％〜６０％の場合、ＬＤＬｓの測定値は変動するものの、各患者間の測定値の順序には変動がないことが分かる。
【００３８】
【表３】
【００３９】
（実施例５）
測定方法は、実施例１と同じとした。ただし、カラムは同じ種類であるが充填を別に行なったものであり、そのため分離条件を一部変更した。
【００４０】
実施例５で用いた装置の形態を図１２に示す。溶離液A（１）；５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、溶離液Ｂ（２）；５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ+５００ｍＭ 過塩素酸ナトリウム ｐＨ８．０、溶離液ＡとＢを流すポンプ（４）；ＤＰ−８０２０を２台（東ソー（株）製）、溶離液ＡとＢを混合するミキサー（５）；スタティックミキサーＣ（東ソー（株）製）、オートサンプラー（６）；ＡＳ−８０２０（東ソー（株）製）、カラムオーブン（９）；ＣＯ−８０２１（東ソー（株）製）、カラム（８）；ＤＥＡＥ−ＮＰＲ カラムサイズ４．６ｍｍＩ．Ｄ．×３５ｍｍ（東ソー（株）製）、フィルター（７）；ＨＬＣ−７２３ＧＨｂ３型用のカラムフィルターＳタイプ（東ソー（株）製）、コレステロール反応液（１０）；ＴＣＨＯ−ＣＬ（セロテック社製）、ポンプ直前のエアートラップ（１１）；エアートラップＧ（東ソー（株）製）、コレステロール反応液のためのポンプ（１２）；ＤＰ−８０２０（東ソー（株）製）、反応コイル（１４）；０．２５ｍｍＩ．Ｄ．×３０ｍ。検出器（１５）；ＵＶ−８０２０（東ソー（株）製）。溶離液ＡとＢ及びコレステロール反応液については、脱気装置（３）を設置し、コレステロール反応液のラインに、抵抗管（１３）０．１ｍｍＩ．Ｄ．×２ｍを２つ直列につないで設置した。溶離液はＡとＢをあわせて０．５ｍＬ／ｍｉｎの流速とし、コレステロール反応液の流速は０．２５ｍＬ／ｍｉｎとした。カラムオーブンの温度は２５℃とし、反応コイルは３７℃に保温した。検出器は６００ｎｍで検出した。溶離液の溶出パターンは、０．０分から０．０１分はＢの組成を８．０％（その他の組成は全てＡ、以下同じ）に固定、０．０１分から３．０分はＢの組成を１９．０％に固定、３．０分から６．０分はＢの組成を２４．５％に固定、６．０分から９．５分はＢの組成を２８．０％に固定、９．５分から１３．０分はＢの組成を３０．０％に固定、１３．０分から１６．５分はＢの組成を３２．０％に固定、１６．５分から２０．０分はＢの組成を６０．０％に固定、２０．０分から２５．０分はＢの組成を１００．０％に固定、２５．０分から３５．０分はＢの組成を８．０％に固定した。なお、１検体の測定時間は３５分とした。なお、この条件における各溶離液中におけるＢの組成はそれぞれ、溶離液１が２４．５％（塩濃度で１５０．５ｍｍｏｌ／Ｌ）、溶離液２が２８％（塩濃度で１６８ｍｍｏｌ／Ｌ）、溶離液３が３０％（塩濃度で１７８ｍｍｏｌ／Ｌ）である。
【００４１】
この測定条件により、測定検体はＨＤＬ３（結合力が弱いＨＤＬ亜画分）、ＨＤＬ２（結合力が強いＨＤＬ亜画分）、ＬＤＬｆ（結合力が弱いＬＤＬ亜画分）、ＬＤＬｓ（結合力が強いＬＤＬ亜画分）、ＩＤＬ、ＶＬＤＬ、カイロミクロン（ＣＭ）の順に溶出され、その後のポストカラム検出により、各リポ蛋白のコレステロール濃度を測定できる。
【００４２】
健常者（Ｈｅａｌｔｈｙ）１４例と冠動脈疾患（ＣＡＤ）患者１７例を本測定法に供し、各リポ蛋白中のコレステロール濃度を測定した。測定結果を表４に示す。また、測定結果のうち、ＬＤＬｆコレステロール、ＬＤＬｓコレステロール、総ＬＤＬコレステロールについては、健常者及び冠動脈疾患患者個々の測定値をプロットしたものを図１３から１５に示した。なお、図中のバーはノンパラメトリック統計による中心値（５０％パーセンタイル値）を、四角は２５から７５パーセンタイル値の範囲（ＩＱＲ）をそれぞれ示す。
【００４３】
各リポ蛋白中のコレステロール濃度について、健常人の測定値と、冠動脈疾患患者との測定値とで、ウェルチのｔ検定（非等分散の２標本を対象とするｔ検定）を行ない、有意差判定（ｐ＜０．０５）を行なったところ、ＬＤＬｆコレステロール（図１３、表４）、ＬＤＬｓコレステロール（図１４、表４）、総ＬＤＬコレステロール（図１５、表４）、カイロマイクロンコレステロール（表４）、総コレステロール（表４）について、冠動脈疾患患者が有意な高値を示した。総ＬＤＬコレステロール、総コレステロールについては、以前から冠動脈疾患のリスクファクターとして知られていたものであり、本測定法で得られた値の結果と一致した。また、カイロマイクロンコレステロールについては、特に詳細な評価結果はないが、レムナント様リポ蛋白が多く含まれていることが知られているリポ蛋白画分であり、このことからも推測される結果と言える。なお、ＬＤＬｆコレステロール、ＬＤＬｓコレステロールについては、我々が今回得た新しい知見である。
【００４４】
【表４】
【００４５】
次に、ＬＤＬｆコレステロール、ＬＤＬｓコレステロール、総ＬＤＬコレステロールの３つの値について、それぞれの相関関係を見た（図１６から１８）。図１６を見ると明らかなように、ＬＤＬｆはＬＤＬ全体の主たる画分であることから、ＬＤＬｆコレステロールと総ＬＤＬコレステロールは相関性が高く、総ＬＤＬコレステロールと同様の病態を判断するための数値であると言える。しかしながら、ＬＤＬの中で陰イオン交換カラムへの吸着力が強い画分であるＬＤＬｓについて解析すると、ＬＤＬｓコレステロールと総ＬＤＬコレステロール（図１７）、及びＬＤＬｓコレステロールとＬＤＬｆコレステロール（図１８）の相関性は極めて低く、病態において総ＬＤＬコレステロールと異なる動きを示すことがわかる。このことから、ＬＤＬｓは、総ＬＤＬコレステロールとは独立した冠動脈疾患の判定因子であることが明らかとなった。
【００４６】
Ｙａｍａｇｕｃｈｉ Ｙら（非特許文献１０）は、ＤＥＡＥグルコマンナンゲルを充填したカラムを用いて、ウサギの血液から超遠心分離法で得たＬＤＬに塩化銅を５μｍｏｌ／Ｌ濃度になるように加え保存することにより酸化させ、その挙動を検討している。その結果は、ＬＤＬを酸化させると溶出時間が遅くなることというものである。我々も、ＬＤＬｓと酸化ＬＤＬとの関連を調べるために、同様の実験を試みた。すなわち、健常人血清より超遠心分離法によりＬＤＬ（密度１．０１９〜１．０６３ｇ／ｍｌ）試料を採取し、ＥＤＴＡを含まないリン酸緩衝生理食塩水にて１晩透析後、３μｍｏｌ／Ｌの硫酸銅を加え、３５℃で４時間加温したところ、ＬＤＬｆ画分が主であったＬＤＬ試料は、ＬＤＬｓ画分が主へと変化した（図１９）。この結果から、冠動脈疾患で高値となる酸化ＬＤＬがＬＤＬｓの中には多く含まれていることが推測され、これは、ＬＤＬｓの有用性の高さを示唆するものである。
【００４７】
また、高脂血症患者４０例を用いて、酸化ＬＤＬのキット（協和メデックス株式会社製）と、本測定法によるＬＤＬｆコレステロール、ＬＤＬｓコレステロール、総ＬＤＬコレステロールとの比較を行なった（図２０から２２）。ＬＤＬｆコレステロール（図２０）と総ＬＤＬコレステロール（図２２）については、有意な相関関係は認められなかった（ｐ＞０．０５）が、ＬＤＬｓコレステロール（図２１）では有意な相関関係（ｐ＝０．０００２）が認められた。このことからも、ＬＤＬｓと酸化ＬＤＬとの関係は強く、間接的ではあるが、ＬＤＬｓの有用性の高さを示すデータである。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】実施例１〜４で用いた装置。
【図２】実施例１の結果（健常人血清）。
【図３】実施例１の結果（ＨＤＬ２試料）。
【図４】実施例１の結果（ＨＤＬ３試料）。
【図５】実施例１の結果（健常人血清）。
【図６】実施例１の結果（ＬＤＬ１試料）。
【図７】実施例１の結果（ＬＤＬ２試料）。
【図８】実施例１の結果（ＬＤＬ３試料）。
【図９】実施例２の結果（健常人血清と超遠心分離法によるリポ蛋白試料）。
【図１０】実施例２の結果（高脂血症患者血清と超遠心分離法によるリポ蛋白試料）。
【図１１】実施例３の結果（高脂血症患者検体を用いたＬＤＬｆの溶出条件の検討）。
【図１２】実施例５で用いた装置。
【図１３】実施例５の結果（健常人と冠動脈疾患患者におけるＬＤＬｆコレステロールの比較）。
【図１４】実施例５の結果（健常人と冠動脈疾患患者におけるＬＤＬｓコレステロールの比較）。
【図１５】実施例５の結果（健常人と冠動脈疾患患者における総ＬＤＬコレステロールの比較）。
【図１６】実施例５の結果（総ＬＤＬコレステロールとＬＤＬｆコレステロールの相関関係）。
【図１７】実施例５の結果（総ＬＤＬコレステロールとＬＤＬｓコレステロールの相関関係）。
【図１８】実施例５の結果（ＬＤＬｆコレステロールとＬＤＬｓコレステロールの相関関係）。
【図１９】実施例５の結果（ＬＤＬｓと酸化ＬＤＬとの関係）。
【図２０】実施例５の結果（酸化ＬＤＬとＬＤＬｆコレステロールの相関関係）。
【図２１】実施例５の結果（酸化ＬＤＬとＬＤＬｓコレステロールの相関関係）。
【図２２】実施例５の結果（酸化ＬＤＬと総ＬＤＬコレステロールの相関関係）。
【符号の説明】
【００４９】
１ 溶離液A
２ 溶離液Ｂ
３ 脱気装置
４ ポンプ
５ ミキサー
６ オートサンプラー
７ フィルター
８ カラム
９ カラムオーブン
１０ コレステロール反応液
１１ エアートラップ
１２ コレステロール反応液のためのポンプ
１３ 抵抗管
１４ 反応コイル
１５ 検出器
【技術分野】
【０００１】
イオン交換樹脂を用いて分離、測定されるＬＤＬ亜画分を用いて、冠動脈疾患を判定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血清中のリポ蛋白には、大きく分類して、比重の軽い順にカイロマイクロン（ＣＭ）、超低比重リポ蛋白（ＶＬＤＬ）、中間型リポ蛋白（ＩＤＬ）、低比重リポ蛋白（ＬＤＬ）、高比重リポ蛋白（ＨＤＬ）の５種類が知られている。ＶＬＤＬは肝臓で産生され、血液中で代謝されることによりＩＤＬを経由し、ＬＤＬとなる。ＬＤＬは抹消組織細胞に脂質を供給する。ＬＤＬには比重の異なるものが存在していることが知られており、近年、血液中に比重の高いＬＤＬが多いことは、動脈硬化を進展させる主要なリスクファクターになると考えられている（非特許文献１）。また、近年、ＬＤＬの中でも、粒子系の小さなＳｍａｌｌ， ｄｅｎｓｅ ＬＤＬや、酸化を受けたＯｘｉｄｉｚｅｄ ＬＤＬ（以下、酸化ＬＤＬと呼ぶ）が特に動脈硬化性疾患のリスクファクターとして指摘され注目されている（非特許文献２、３）。
【０００３】
このように、ＬＤＬを更に詳細に分離し測定することにより、ＬＤＬのどのような分子が高い動脈硬化性疾患のリスクファクターであるかを理解することは、動脈硬化性疾患の治療及び予防を進めるうえで重要である。
【０００４】
Ｓｍａｌｌ， ｄｅｎｓｅ ＬＤＬを分離測定する方法としては、超遠心分離装置（非特許文献１、４）、ＮＭＲ分析装置（非特許文献５、６）、ゲルろ過クロマトグラフィー（非特許文献７）、電気泳動（非特許文献８）、沈殿法（非特許文献９）による方法があるが、超遠心分離装置やＮＭＲ分析装置は高価な装置であり、汎用性に乏しい。また、ＮＭＲ分析装置、ゲルろ過カラム、電気泳動、沈殿法による方法は各リポ蛋白の亜画分を分離する能力が十分でないという問題点がある。酸化ＬＤＬの測定法は、モノクローナル抗体を用いたイムノアッセイによる方法で簡便ではあるが、用いるモノクローナル抗体の種類が異なる場合や、分離したＬＤＬ試料を用いる方法と希釈した血清を試料として用いる方法など種々の方法があり、方法により値が異なるという問題がある（非特許文献３）。
【０００５】
【非特許文献１】Ｇｒｉｆｆｉｎ Ｂら、Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ １０６、ｐ２４１（１９９４）
【非特許文献２】Ｃａｒｍｅｎａ Ｒら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、１０９．ｐＩＩＩ−２（２００４）
【非特許文献３】Ｉｔａｂｅ Ｈら、Ｊ Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ、１４、ｐ１（２００７）
【非特許文献４】Ｇｕｅｒｉｎ Ｍら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０、ｐ１８９（２０００）
【非特許文献５】Ｉｋｅｗａｋｉ Ｋら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ １１、ｐ２７８（２００４）
【非特許文献６】Ｏｔｖｏｓ Ｊ Ｄ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｓｔｉｎｇ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、ｐ６０９（２０００）
【非特許文献７】Ｏｋａｚａｋｉ Ｍら、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｓｔｉｎｇ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、ｐ６４７（２０００）
【非特許文献８】Ｈｏｅｆｎｅｒ Ｄ Ｍら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４７、ｐ２６６（２００１）
【非特許文献９】Ｈｉｒａｎｏら、Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、４４、ｐ２１９３（２００３）
【非特許文献１０】Ｙａｍａｇｕｃｈｉ Ｙら、Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ｂ、７３１、ｐ２２３（１９９９）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記のように、Ｓｍａｌｌ， ｄｅｎｓｅ ＬＤＬや酸化ＬＤＬの測定法が構築され冠動脈疾患との関連が検討されているが、冠動脈疾患との関連を検討する方法として性能が満足できるものではなく、その評価結果も一定の成績が得られていない。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、陰イオン交換樹脂を用いたリポ蛋白の分離分析法を考案し、更にＬＤＬの中の結合力が強い画分を測定する方法を確立した。この測定法はＬＤＬ亜画分を分離する能力が高く、再現性も良好な方法であった。この測定法を用いて、冠動脈疾患患者の血清を測定することにより、本発明に到達した。
【０００８】
すなわち、陰イオン交換樹脂を用いて、ＬＤＬを吸着させた後、ＬＤＬ亜画分のうち、結合力の弱い画分である、ＬＤＬｆを溶出させ、続いて、ＬＤＬ亜画分のうち、結合力の強い画分である、ＬＤＬｓを溶出させる測定法において、ＬＤＬｓが高値を示した場合に冠動脈疾患である可能性が高いと判別する方法である。ここで、陰イオン交換樹脂に対する結合力の強弱は、当該ＬＤＬ亜画分を陰イオン交換樹脂から溶出させる際に使用する溶出液の塩濃度で判断する。すなわち、溶出液の塩濃度が相対的に高い場合に溶出する亜画分を結合力の強い画分（ＬＤＬｓ）といい、溶出液の塩濃度が相対的に低い場合に溶出する亜画分を結合力の弱い画分（ＬＤＬｆ）という。
【０００９】
従って、本願は以下の発明を包含する。
１．ＬＤＬ亜画分のうち、陰イオン交換樹脂に対して、結合力が強いＬＤＬ亜画分（以下、ＬＤＬｓ）を指標として用いる、冠動脈疾患の判定方法。
２．ＬＤＬｓのコレステロール濃度を比較することにより、冠動脈疾患を判定する、１に記載の方法。
３．被験者から得られるＬＤＬｓのコレステロール濃度が、健常者から得られるＬＤＬｓのコレステロール濃度の平均値よりも高い場合に、冠動脈疾患であると判定する、２に記載の方法。
４．溶離液の塩濃度勾配を利用して、ＬＤＬからＬＤＬｓを分離し、測定したものを指標として用いる、１〜３のいずれか一つに記載の方法。
５．ＬＤＬを吸着させるための溶離液（溶離液１）、ＬＤＬ亜画分のうち、結合力の弱い画分を溶出させるための溶離液（溶離液２）、ＬＤＬ亜画分のうち、結合力が強い画分を溶出させるための溶離液（溶離液３）の塩濃度の異なる溶離液を、溶離液１、２、３の順に陰イオン交換樹脂に流すことにより、ＬＤＬからＬＤＬｓを分離し、測定したものを指標として用いる、１〜４のいずれか一つに記載の方法。
６．溶離液１の塩濃度が１３０ｍｍｏｌ／Ｌから１８０ｍｍｏｌ／Ｌであり、溶離液３の塩濃度が溶離液１の塩濃度より２０ｍｍｏｌ／Ｌから５０ｍｍｏｌ／Ｌ高く、溶離液２の塩濃度が、溶離液１の塩濃度よりも高く、溶離液３の塩濃度よりも低い、１〜５のいずれか一つに記載の方法。
７．溶離液２の塩濃度が、溶離液１と溶離液３の塩濃度の差に対して３５％から６０％分溶離液３より低い、１〜６のいずれか一つに記載の方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明は、イオン交換樹脂を用いて分離、測定されるＬＤＬ亜画分を用いて、簡便で性能の高い冠動脈疾患を判定する方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下に本発明について、詳細に説明する。
ＬＤＬの亜画分の分離測定方法としては、超遠心分離装置を用いた方法が一般に用いられており、分離する能力も高いが、一方で、手技が難しく、また、超遠心分離装置は高価なため、多くの研究者が利用することは出来ない。ＮＭＲやゲルろ過クロマトグラフィーによる測定方法の手技は難しくないが、どちらもＬＤＬの亜画分を分離する能力は十分とは言えない。電気泳動による測定方法も、手技は難しくないが、分離する能力は十分とは言えないし、一般的に定量性という面で性能の低い測定方法である。
【００１２】
陰イオン交換クロマトグラフィーによるリポ蛋白の分離は、一般的な液体クロマトグラフィーの装置を用いて実施することが可能である。分離後は、コレステロールと反応する市販の酵素液（例えば総コレステロールＥテストワコー、和光純薬株式会社製）と混合して反応させ、可視光検出器で測定することができ、簡便で定量性も良いことが知られている（Ｈｉｒｏｗａｔａｒｉ Ｙら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４４、ｐ１４０４（２００３））。我々は、この陰イオン交換クロマトグラフィーによるリポ蛋白分析の手法を用いて、ＬＤＬの亜画分を分離することを試みた。具体的には、ＬＤＬ２の含まれる量の多い画分（ＬＤＬｆ）とＬＤＬ３の含まれる量の多い画分（ＬＤＬｓ）の２つに、各々３つの溶離液を用いたステップ溶出により、ＬＤＬの亜画分を分離することを試みた。
【００１３】
使用出来る陰イオン交換カラムに充填されるゲルとしては、シリカ系やポリマー系のゲルにジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基や第４級アミノエチル（ＱＡＥ）基が結合されたもの、また、そのゲルの表面に１０００オングストローム程度の孔があるもの（多孔質）と孔がないもの（非多孔質）があるが、好ましくは、リポ蛋白に対して分離性能の高い非多孔質のタイプ、例えばポリマー系の非多孔質タイプの表面にＤＥＡＥ基を持つゲルをカラムに充填したＴＳＫ−ＧＥＬ ＤＥＡＥ−ＮＰＲ（東ソー（株）製）が挙げられる。溶離液は、リポ蛋白の分離能力の高い過塩素酸ナトリウムなどのカオトロピックイオンを含んだ溶離液が望ましい。
【００１４】
ＬＤＬの分離は、イオン交換樹脂、例えばイオン交換カラムを使用し、溶離液の塩濃度勾配を利用して行うことができる。好ましくは、分離に使用する塩濃度の異なる溶離液１、２、３を、塩濃度の低い順にカラムに流す。この３種類の溶離液の役割としては、溶離液１はＬＤＬ画分を吸着させるとともにＨＤＬ画分を溶出させ、溶離液２はＬＤＬ２（密度１．０３５〜１．０４５ｇ／ｍｌ）の含まれる量が多い画分（ＬＤＬｆ）を溶出させ、溶離液３はＬＤＬ３（密度１．０４５〜１．０６３ｇ／ｍｌ）の含まれる量が多い画分（ＬＤＬｓ）を溶出させことにある。かつ、溶離液３は、陰イオン交換カラムにおいて、ＬＤＬよりも溶出の遅いＩＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭがＬＤＬｓから溶出しない塩濃度とする。それらが同時に溶出すると、ＬＤＬｓの精度が低下する。ＩＤＬは３型高脂血症という遺伝性の病態以外ではその量は少なくＬＤＬｓの精度に大きな支障をもたらさないが、ＶＬＤＬやＣＭは病状の軽い高脂血症においても、ある程度存在するので、ＬＤＬｓの測定精度を著しく低下させ、問題となる。また、溶離液１と２や溶離液２と３の間にＬＤＬ亜画分の分離を高めるために更に新たな塩濃度の溶離液を加えたり、分離溶出する条件として、段階的に溶離液の塩濃度を高める条件を加えたりしても良い。
【００１５】
使用するカラムや溶離液に入れる塩の種類により若干異なるが、本分離における最も好ましい条件においては、ＤＥＡＥ基を持つ非多孔質のポリマー系のゲルを充填したカラムを用い、そのカラムに用いる溶離液に過塩素酸ナトリウムを含み、溶離液１の塩濃度が１３０ｍｍｏｌ／Ｌから１８０ｍｍｏｌ／Ｌであり、溶離液３は溶離液１より２０ｍｍｏｌ／Ｌから５０ｍｍｏｌ／Ｌ高く、溶離液２は溶離液３に比べ溶離液１と溶離液３の塩濃度の差に対して３５％から６０％分塩濃度が低い溶離液とする。
【００１６】
好ましい塩として、上述のとおり過塩素酸ナトリウムが使用されるが、その他、チオシアン酸ナトリウム、ヨウ化カリウムなどが挙げられる。また、溶離液の塩濃度とは、加えた試薬の解離しているイオンの濃度であり、過塩素酸ナトリウムの場合には、ほぼ１００％が解離しているので、過塩素酸ナトリウムを１００ｍｍｏｌ／Ｌ入れた場合には、その塩濃度は１００ｍｍｏｌ／Ｌとなる。緩衝液に依存する塩濃度はその試薬の解離定数から算出するが、実施例で使用した５０ｍｍｏｌ／Ｌのトリス緩衝液については、ｐＨ８のときの解離した分子の濃度（塩濃度）は、トリスのｐＫａ＝８．１から算出すると、約２８ｍｍｏｌ／Ｌとなる。
【００１７】
使用する溶離液には、緩衝液を加えて、ｐＨを６から９に調整することが好ましい。加える緩衝液の種類としては、例えばＴｒｉｓ−ＨＣｌ、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液など、当業界において慣用のあらゆるものを使用することができる。
【００１８】
また、実施例４において、高脂血症患者の血清を用いて、溶離液１及び３に適した塩濃度を検討し、さらに、ＬＤＬｓ濃度が異なる高脂血症患者において、溶離液１及び３中の塩濃度を固定した条件で溶離液２の塩濃度を変動させたとき、ＬＤＬｓの測定値は変動するものの、溶離液２の濃度が、溶離液１と溶離液３の塩濃度の差に対して３４％分以上溶離液３より低い条件では、各患者間の測定値の順序には変動がないことを確認している。これらのことから、前述した分離条件の範囲内であれば、ＬＤＬｓの値が変動するものの、同じ分離条件で得られた複数の個人の測定値と比較して、その値の高さから冠動脈疾患である可能性を判別することは可能である。
【００１９】
本分析法を用いて実施例に示したように、冠動脈疾患患者と健常人を測定して比較したところ、ＬＤＬｓは冠動脈疾患患者において、有意に高値を示した（表４、図１４）。このことから、ＬＤＬｓを測定することにより冠動脈疾患を判定することが出来ることが分かる。例えば、ＬＤＬｓ中のコレステロール濃度について、健常人の測定値と、冠動脈疾患患者との測定値とを比較して判定を行う。具体的には、ＬＤＬｓ中のコレステロール濃度について、健常人の平均測定値と被験者から得られる測定値を比較し、被験者の測定値が高い場合に、好ましくは５％以上高い場合に、より好ましくは１０％以上高い場合に、なおより好ましくは２０％以上高い場合に、更により好ましくは３０％以上高い場合に、特に好ましくは４０％以上高い場合に、最も好ましくは５０％以上高い場合に、その被験者は冠動脈疾患である可能性が高いと判断することができる。
【００２０】
次に、本発明について、実施例を用いて説明する。ただし、本発明は実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００２１】
（実施例１）
図１に装置の形態を示す。実施例に用いた装置構成を下記に示す。
溶離液Ａ（１）は５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ＋１ｍＭ ＥＤＴＡ２Ｎａ ｐＨ７．５、溶離液Ｂ（２）は５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ＋１ｍＭ ＥＤＴＡ２Ｎａ＋５００ｍＭ 過塩素酸ナトリウム ｐＨ７．５である。溶離液ＡとＢを流すポンプ（４）はＣＣＰＭ２（東ソー（株）製）を用いた。ＣＣＰＭ２は、ポンプヘッドを２つもち、溶離液２液のグラディエントを行えるポンプである。溶離液ＡとＢを混合するミキサー（５）はスタティックミキサーＣ（東ソー（株）製）を用いた。オートサンプラー（６）はＡＳ−８０２０（東ソー（株）製）を、カラムオーブン（９）はＣＯ−８０２１（東ソー（株）製）を用いた。カラム（８）はＤＥＡＥ−ＮＰＲカラムサイズ４．６ｍｍＩ．Ｄ．ｘ３５ｍｍ（東ソー（株）製）を、フィルター（７）はＨＬＣ−７２３ＧＨｂ３型用のカラムフィルターＳタイプ（東ソー（株）製）を用いた。コレステロール反応液（１０）はＴＣＨＯ−ＣＬ（セロテック社製）を、ポンプ直前にエアートラップ（１１）を設置した。コレステロール反応液のためのポンプ（１２）はＤＰ−８０２０（東ソー（株）製）を用いた。溶離液ＡとＢおよびコレステロール反応液については、脱気装置（３）を設置した。コレステロール反応液のラインに、抵抗管（１３）０．１ｍｍＩ．Ｄ．ｘ２ｍを２つ直列につないで設置した。反応コイル（１４）は、０．２５ｍｍＩ．Ｄ．ｘ３０ｍとした。検出器はＵＶ−８０２０（東ソー（株）製）（１５）を用いた。溶離液はＡとＢをあわせて０．５ｍＬ／ｍｉｎの流速とし、コレステロール反応液の流速は０．２５ｍＬ／ｍｉｎとした。カラムオーブンの温度は２５℃とし、反応コイルは３７℃に保温した。検出器は６００ｎｍで検出した。
【００２２】
溶離液による溶出パターンを、０．０分から２０．０分はＢの組成を１０．０％（その他の組成は全てＡ、以下同じ）から３７．０％へのリニアグラディエントとし、２０．０分から２１．８分はＢの組成を３７．０％に固定し、２１．８分から２２．３分はＢの組成を３７．０％から１００．０％へのリニアグラディエントとし、２２．３分から２３．８分はＢの組成を１００．０％に固定し、２３．８分から２４．３分はＢの組成を１００．０％から１０．０％へのリニアグラディエントとし、２４．３分から４０．０分はＢの組成を１０．０％に固定し、ＨＤＬ亜画分の検討を行った。なお、本分析において、１検体の測定時間は４０分とした。なお、本測定機器のこの溶出パターンの時間の設定と実際にカラムに流れる溶離液の組成には、ポンプからカラムまでの配管容量とカラムから溶出してから反応して検出するまでに要する時間により４分のタイムラグが生じる。
【００２３】
健常人の血清検体と、健常人から超遠心分離装置を用いた方法で得られたＨＤＬ２（密度１．０６３〜１．１２５ｇ／ｍｌ）とＨＤＬ３（密度１．１２５ｇ／ｍｌ以上）を測定した。健常人検体では、溶出時間９．２７分にＨＤＬ３を主体としたピークが、溶出時間１２．６０分にＨＤＬ２を主体としたピークが、溶出時間１６．０８分にＬＤＬが、溶出時間１９．２０分にＶＬＤＬが確認された（図２）。ＨＤＬ２試料を分析した際には、主要なピークが溶出時間１２．２９分に確認され、小さなピークが溶出時間１７．００分に確認された（図３）。なお、このマイナーピークと主要なピークとの性質の差は現時点では不明である。ＨＤＬ３試料を分析した際には、溶出時間として１１．４２分のピークが確認された（図４）。これらの結果から、イオン交換クロマトグラフィーにおいてＨＤＬ３はＨＤＬ２より早く溶出する性質を有することがわかった。
【００２４】
また、図２の溶出パターンを見ると、ＨＤＬ３の溶出はグラディエント条件１５％ぐらいから始まっている。図３の超遠心で分離したＨＤＬ３の試料を測定した結果では、グラディエント条件１８％ぐらいから溶出が始まっているが、この差は超遠心で分離したＨＤＬ３の試料には血清由来の蛋白が含まれないためだと考えられる。これらの結果からＨＤＬ亜画分を測定する場合のＨＤＬ全体を吸着させる溶離液（溶離液１’）は確実に吸着が起こる８％以下が好ましい。８％の時の過塩素酸ナトリウム濃度は４０ｍｍｏｌ／Ｌであり、５０ｍｍｏｌ／Ｌ トリス緩衝液 ｐＨ７．５の塩濃度は４０ｍｍｏｌ／Ｌであるので、全体で８０ｍｍｏｌ／Ｌ以下が望ましいと言える。また、ＨＤＬ２は図３からわかるように、１８％の時から溶出が開始され２８％には完全に溶出が終了する。このことから、ＨＤＬ画分をすべて溶出する溶離液（溶離液３’）は１８％の組成の溶離液（塩濃度１３０ｍｍｏｌ／Ｌ）を流し長い時間をかけて溶出するか、２８％の組成の溶離液（塩濃度１８０ｍｍｏｌ／Ｌ）を短時間流せば良い。溶離液３’の塩濃度は１３０〜１８０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲が好ましいと言える。
【００２５】
次に、ｐＨ８．０の溶離液を用いて、溶離液による溶出パターンを、０．０分から２０．０分はＢの組成を１０．０％（その他の組成は全てＡ、以下同じ）から３７．０％へのリニアグラディエントとし、２０．０分から２２．０分はＢの組成を３７．０％に固定し、２２．０分から２６．０分はＢの組成を１００．０％に固定し、２６．０分から４０．０分はＢの組成を１０．０％に固定し、ＬＤＬ亜画分の検討を行った。なお、１検体の測定時間は４０分とした。
【００２６】
健常人の血清検体と、高脂血症患者から超遠心分離装置を用いた方法で得られたＬＤＬ１（密度１．０１９〜１．０３５ｇ／ｍｌ）とＬＤＬ２（密度１．０３５〜１．０４５ｇ／ｍｌ）とＬＤＬ３（密度１．０４５〜１．０６３ｇ／ｍｌ）を測定した。健常人検体では、溶出時間１２．８１分と１３．９１分に２つに分かれてＨＤＬ３を主体としたピークが、溶出時間１５．８９分にＨＤＬ２を主体としたピークが、溶出時間１９．２０分にＬＤＬが確認され、ＬＤＬと分離したピークとして確認はされていないが２２分ぐらいに溶出されている画分はＶＬＤＬと推定される（図５）。ＬＤＬ１試料を分析した際には、溶出時間として１９．８５分のピークが確認された（図６）。ＬＤＬ２試料を分析した際には、主要なピークが溶出時間１９．４９分に確認され、小さなピークが溶出時間２１．７０分に確認された（図７）。なお、このマイナーピークと主要なピークとの性質の差は現時点では不明である。ＬＤＬ３試料を分析した際には、溶出時間として１９．９２分のピークが確認された（図８）。これらの結果から、イオン交換クロマトグラフィーにおいて、ＬＤＬ亜画分の溶出する順序は、ＬＤＬ２、ＬＤＬ１、ＬＤＬ３となることがわかる。
前述したように、ＨＤＬ画分をすべて溶出する溶離液（溶離液３’）の塩濃度は１３０〜１８０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲が好ましいとわかった。このことから、ＨＤＬ画分を吸着、もしくは、溶出させて、なおかつ、ＬＤＬ画分を吸着させるための溶離液（溶離液１）も同様に１３０〜１８０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲が好ましいと言える。実際に図５から８を見ると、ＬＤＬの溶出は約３０％（塩濃度は、過塩素酸濃度が１５０ｍｍｏｌ／Ｌ、５０ｍｍｏｌ／Ｌ トリス緩衝液 ｐＨ８．０の塩濃度は２８ｍｍｏｌ／Ｌであるので、全体で約１８０ｍｍｏｌ／Ｌとなる。）から始まっている。また、ＬＤＬ画分をすべて溶出するための溶離液（溶離液３）は、ＬＤＬ画分の溶出する溶離液の塩濃度が図６〜８から３０〜３４％程度（塩濃度で１７８〜１９８ｍｍｍｏｌ／Ｌ）となり、３０％程度の溶離液を長時間流すか、あるいは、３４％程度の溶離液を短時間流すかのどちらかを選択する。このことから、溶離液３の濃度は、３０〜３４％程度（塩濃度で１７８〜１９８ｍｍｍｏｌ／Ｌ）が好ましい濃度となり、溶離液１との差はおおむね２０〜５０ｍｍｏｌ／Ｌである。
【００２７】
（実施例２）
実施例１と同じ装置を用い、溶離液のｐＨは８．０として、検討を行った。溶離液の溶出パターンは、０．０分から０．０１分はＢの組成を８．０％（その他の組成は全てＡ、以下同じ）に固定、０．０１分から３．０分はＢの組成を１９．０％に固定、３．０分から６．０分はＢの組成を２４．５％に固定、６．０分から９．５分はＢの組成を２７．８％に固定、９．５分から１３．０分はＢの組成を２９．５％に固定、１３．０分から１６．５分はＢの組成を３３．０％に固定、１６．５分から２０．０分はＢの組成を４３．０％に固定、２０．０分から２５．０分はＢの組成を６３．０％に固定、２５．０分から３５．０分はＢの組成を８．０％に固定した。なお、１検体の測定時間は３５分とした。
【００２８】
健常人の血清検体と、健常人から超遠心分離装置を用いた方法で得られたＨＤＬ２（密度１．０６３〜１．１２５ｇ／ｍｌ）、ＨＤＬ３（密度１．１２５ｇ／ｍｌ以上）、ＬＤＬ１（密度１．０１９〜１．０３５ｇ／ｍｌ）、ＬＤＬ２（密度１．０３５〜１．０４５ｇ／ｍｌ）、ＬＤＬ３（密度１．０４５〜１．０６３ｇ／ｍｌ）、ＩＤＬ（密度１．００６〜１．０１９ｇ／ｍｌ）、ＶＬＤＬ（密度０．９３０〜１．００６ｇ／ｍｌ）、ＣＭ（密度０．９３０ｇ／ｍｌ以下）を測定した。
【００２９】
ＨＤＬ３試料については、溶出時間５．９分に主たるピークが見られ、溶出時間８．４分にマイナーなピークが確認され、ＨＤＬ２試料については、溶出時間８．５分にピークが確認された（図９）。ＬＤＬ３試料は、溶出時間１２．９分に主たるピークが見られ、溶出時間１５．１分にマイナーなピークが確認され、ＬＤＬ２試料は、溶出時間１２．１分に主たるピークが見られ、溶出時間１５．０分と１８．８分にマイナーなピークが確認され、ＬＤＬ１試料は、溶出時間１２．３分に主たるピークが見られ、溶出時間１５．１分にマイナーなピークが確認された（図９）。ＩＤＬ試料は、溶出時間１８．６分に主たるピークが見られ、溶出時間１５．９分にマイナーなピークが確認され、ＶＬＤＬ試料は、溶出時間２２．０分に主たるピークが見られ、溶出時間２５．２分にマイナーなピークが確認され、ＣＭ試料では、ピークは確認されなかった（図９）。これらの結果から、健常人の血清検体において見られる溶出時間６．７分、８．６分、１２．１分、１５．２分、１８．８分、２１．９分、２５．２分のピークは、それぞれ、ＨＤＬ３が主要な成分であるＨＤＬ３＋、ＨＤＬ２が主要な成分であるＨＤＬ２＋、ＬＤＬ１とＬＤＬ２が主要な成分であるＬＤＬｆ、ＬＤＬｆに比べＬＤＬ３の含量が多いＬＤＬｓ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭのピークであると言える（図９）。
【００３０】
次に、高脂血症患者検体においても、同様の検討を行った。各画分の分析結果から、高脂血症患者の血清検体において見られる溶出時間６．５分、８．５分、１１．８分、１５．１分、１８．８分、２２．０分、２５．１分のピークは、それぞれ、健常人血清と同様に、ＨＤＬ３が主要な成分であるＨＤＬ３＋、ＨＤＬ２が主要な成分であるＨＤＬ２＋、ＬＤＬ１とＬＤＬ２が主要な成分であるＬＤＬｆ、ＬＤＬｆに比べＬＤＬ３の含量が多いＬＤＬｓ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭのピークであると言える（図１０）。
【００３１】
このように、溶離液Ｂ８％（過塩素酸ナトリウム４０ｍｍｏｌ／ｌ）において、リポ蛋白画分を吸着させ、溶離液Ｂ１９％（過塩素酸ナトリウム９５ｍｍｏｌ／ｌ）において、ＨＤＬ３を多く含むＨＤＬ画分を溶出させ、溶離液Ｂ２４．５％（過塩素酸ナトリウム１２２．５ｍｍｏｌ／ｌ）において、ＨＤＬ２を多く含むＨＤＬ画分を溶出させることが出来る。そして、溶離液Ｂ２４．５％（過塩素酸ナトリウム１２２．５ｍｍｏｌ／ｌ）において、ＨＤＬ画分がすべて溶出した後に、溶離液Ｂ２７．８％（過塩素酸ナトリウム１３９ｍｍｏｌ／ｌ）において、ＬＤＬ２を多く含むＬＤＬｆ画分を溶出させ、溶離液Ｂ２９．５％（過塩素酸ナトリウム１４７．５ｍｍｏｌ／ｌ）において、ＬＤＬ３を多く含むＬＤＬｓ画分を溶出させることが出来る。その後、溶離液Ｂ３３．０％（過塩素酸ナトリウム１６５ｍｍｏｌ／ｌ）においてＩＤＬ画分を、溶離液Ｂ４３．０％（過塩素酸ナトリウム２１５ｍｍｏｌ／ｌ）においてＶＬＤＬ画分を、溶離液Ｂ６３．０％（過塩素酸ナトリウム３１５ｍｍｏｌ／ｌ）においてＣＭ画分を溶出する。以上のように、ステップ溶出を用いることにより、ＨＤＬ３＋、ＨＤＬ２＋、ＬＤＬｆ、ＬＤＬｓ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭの７つのリポ蛋白画分を良好に分離し測定することが出来る。
【００３２】
以上の結果から、ステップ溶出によるＬＤＬ亜画分の最も好ましい溶出条件においては、溶離液１は塩濃度１４３〜１６３ｍｍｏｌ／ｌ（溶離液Ｂ２３〜２７％）であり、溶離液２は溶離液１と３の塩濃度の差の３４％分溶離液３より低く（溶離液３が溶離液Ｂ２９．５％であり、溶離液２が溶離液Ｂ２７．８％である。）、溶離液３は１７５．５〜１８８ｍｍｏｌ／ｌ（溶離液Ｂ２９．５〜３２％）である。
【００３３】
（実施例３）
実施例２と同じ条件で、ＬＤＬｆとＬＤＬｓの溶出条件を検討することを目的として、ＬＤＬｆを溶出する溶離液をＢ２５．０〜２９．０%（過塩素酸ナトリウム１２５〜１４５ｍｍｏｌ／ｌ）に変動させて、測定を実施した。高脂血症患者２名の血清試料を用いた。結果を表１と２に示す。また、そのＬＤＬｓ/ＬＤＬｆの比率（％）の変動を図１１に示した。図１１から、溶離液Ｂ２６．３％（過塩素酸ナトリウム１３１．５ｍｍｏｌ／ｌ）以下になると急激に高くなることがわかる。溶離液Ｂ２６．３％でＬＤＬｆ画分を溶出する前の溶離液はＢ２４．５％であり、ＬＤＬｓ画分を溶出する溶離液はＢ２９．５％であるので、ＬＤＬ亜画分を溶出する条件として、２番目に流す溶離液と３番目に流す溶離液の塩濃度の差はＢ％として３．２％であり、１番目に流す溶離液と３番目に流す溶離液の塩濃度の差はＢ％として５％であるので、その割合（低下率）は６４％である。このことから、安定して測定するには、２番目に流す溶離液の塩濃度の低下率としては６４％以下である必要がある。
【００３４】
【表１】
【００３５】
【表２】
【００３６】
また、ＬＤＬ３の含量はＬＤＬ全体の５〜３０％程度とわかっており、ＬＤＬｓのＬＤＬ３の含量が適当となるＬＤＬｓ/ＬＤＬｆの比率（％）は、５．３〜４３％となる。このことを考慮すると、ＬＤＬｆを溶出する塩濃度はＢ２８．７％以下であり、これは、上記のように算出すると２番目に流す溶離液の塩濃度の低下率１６％である。これらのことから、適切な２番目に流す溶離液の塩濃度の低下率は概ね２０〜６０％といえ、さらに安定的に値を得るための好ましい塩濃度はＢ２６．９〜２８．４％であるので、低下率としては２２〜５２％である。
【００３７】
（実施例４）
実施例３で記述したＬＤＬｓについて、ＬＤＬ亜画分への溶出条件の影響を確認するために、ＬＤＬｆを溶出する溶離液をＢ２５．５〜２９．０%（過塩素酸ナトリウム１２７．５〜１４５ｍｍｏｌ／ｌ）に変動させて、測定を実施した（表３）。３つの高脂血症患者の血清試料を用いた。２番目に流す溶離液の塩濃度の低下率が約３５％〜６０％の場合、ＬＤＬｓの測定値は変動するものの、各患者間の測定値の順序には変動がないことが分かる。
【００３８】
【表３】
【００３９】
（実施例５）
測定方法は、実施例１と同じとした。ただし、カラムは同じ種類であるが充填を別に行なったものであり、そのため分離条件を一部変更した。
【００４０】
実施例５で用いた装置の形態を図１２に示す。溶離液A（１）；５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、溶離液Ｂ（２）；５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ+５００ｍＭ 過塩素酸ナトリウム ｐＨ８．０、溶離液ＡとＢを流すポンプ（４）；ＤＰ−８０２０を２台（東ソー（株）製）、溶離液ＡとＢを混合するミキサー（５）；スタティックミキサーＣ（東ソー（株）製）、オートサンプラー（６）；ＡＳ−８０２０（東ソー（株）製）、カラムオーブン（９）；ＣＯ−８０２１（東ソー（株）製）、カラム（８）；ＤＥＡＥ−ＮＰＲ カラムサイズ４．６ｍｍＩ．Ｄ．×３５ｍｍ（東ソー（株）製）、フィルター（７）；ＨＬＣ−７２３ＧＨｂ３型用のカラムフィルターＳタイプ（東ソー（株）製）、コレステロール反応液（１０）；ＴＣＨＯ−ＣＬ（セロテック社製）、ポンプ直前のエアートラップ（１１）；エアートラップＧ（東ソー（株）製）、コレステロール反応液のためのポンプ（１２）；ＤＰ−８０２０（東ソー（株）製）、反応コイル（１４）；０．２５ｍｍＩ．Ｄ．×３０ｍ。検出器（１５）；ＵＶ−８０２０（東ソー（株）製）。溶離液ＡとＢ及びコレステロール反応液については、脱気装置（３）を設置し、コレステロール反応液のラインに、抵抗管（１３）０．１ｍｍＩ．Ｄ．×２ｍを２つ直列につないで設置した。溶離液はＡとＢをあわせて０．５ｍＬ／ｍｉｎの流速とし、コレステロール反応液の流速は０．２５ｍＬ／ｍｉｎとした。カラムオーブンの温度は２５℃とし、反応コイルは３７℃に保温した。検出器は６００ｎｍで検出した。溶離液の溶出パターンは、０．０分から０．０１分はＢの組成を８．０％（その他の組成は全てＡ、以下同じ）に固定、０．０１分から３．０分はＢの組成を１９．０％に固定、３．０分から６．０分はＢの組成を２４．５％に固定、６．０分から９．５分はＢの組成を２８．０％に固定、９．５分から１３．０分はＢの組成を３０．０％に固定、１３．０分から１６．５分はＢの組成を３２．０％に固定、１６．５分から２０．０分はＢの組成を６０．０％に固定、２０．０分から２５．０分はＢの組成を１００．０％に固定、２５．０分から３５．０分はＢの組成を８．０％に固定した。なお、１検体の測定時間は３５分とした。なお、この条件における各溶離液中におけるＢの組成はそれぞれ、溶離液１が２４．５％（塩濃度で１５０．５ｍｍｏｌ／Ｌ）、溶離液２が２８％（塩濃度で１６８ｍｍｏｌ／Ｌ）、溶離液３が３０％（塩濃度で１７８ｍｍｏｌ／Ｌ）である。
【００４１】
この測定条件により、測定検体はＨＤＬ３（結合力が弱いＨＤＬ亜画分）、ＨＤＬ２（結合力が強いＨＤＬ亜画分）、ＬＤＬｆ（結合力が弱いＬＤＬ亜画分）、ＬＤＬｓ（結合力が強いＬＤＬ亜画分）、ＩＤＬ、ＶＬＤＬ、カイロミクロン（ＣＭ）の順に溶出され、その後のポストカラム検出により、各リポ蛋白のコレステロール濃度を測定できる。
【００４２】
健常者（Ｈｅａｌｔｈｙ）１４例と冠動脈疾患（ＣＡＤ）患者１７例を本測定法に供し、各リポ蛋白中のコレステロール濃度を測定した。測定結果を表４に示す。また、測定結果のうち、ＬＤＬｆコレステロール、ＬＤＬｓコレステロール、総ＬＤＬコレステロールについては、健常者及び冠動脈疾患患者個々の測定値をプロットしたものを図１３から１５に示した。なお、図中のバーはノンパラメトリック統計による中心値（５０％パーセンタイル値）を、四角は２５から７５パーセンタイル値の範囲（ＩＱＲ）をそれぞれ示す。
【００４３】
各リポ蛋白中のコレステロール濃度について、健常人の測定値と、冠動脈疾患患者との測定値とで、ウェルチのｔ検定（非等分散の２標本を対象とするｔ検定）を行ない、有意差判定（ｐ＜０．０５）を行なったところ、ＬＤＬｆコレステロール（図１３、表４）、ＬＤＬｓコレステロール（図１４、表４）、総ＬＤＬコレステロール（図１５、表４）、カイロマイクロンコレステロール（表４）、総コレステロール（表４）について、冠動脈疾患患者が有意な高値を示した。総ＬＤＬコレステロール、総コレステロールについては、以前から冠動脈疾患のリスクファクターとして知られていたものであり、本測定法で得られた値の結果と一致した。また、カイロマイクロンコレステロールについては、特に詳細な評価結果はないが、レムナント様リポ蛋白が多く含まれていることが知られているリポ蛋白画分であり、このことからも推測される結果と言える。なお、ＬＤＬｆコレステロール、ＬＤＬｓコレステロールについては、我々が今回得た新しい知見である。
【００４４】
【表４】
【００４５】
次に、ＬＤＬｆコレステロール、ＬＤＬｓコレステロール、総ＬＤＬコレステロールの３つの値について、それぞれの相関関係を見た（図１６から１８）。図１６を見ると明らかなように、ＬＤＬｆはＬＤＬ全体の主たる画分であることから、ＬＤＬｆコレステロールと総ＬＤＬコレステロールは相関性が高く、総ＬＤＬコレステロールと同様の病態を判断するための数値であると言える。しかしながら、ＬＤＬの中で陰イオン交換カラムへの吸着力が強い画分であるＬＤＬｓについて解析すると、ＬＤＬｓコレステロールと総ＬＤＬコレステロール（図１７）、及びＬＤＬｓコレステロールとＬＤＬｆコレステロール（図１８）の相関性は極めて低く、病態において総ＬＤＬコレステロールと異なる動きを示すことがわかる。このことから、ＬＤＬｓは、総ＬＤＬコレステロールとは独立した冠動脈疾患の判定因子であることが明らかとなった。
【００４６】
Ｙａｍａｇｕｃｈｉ Ｙら（非特許文献１０）は、ＤＥＡＥグルコマンナンゲルを充填したカラムを用いて、ウサギの血液から超遠心分離法で得たＬＤＬに塩化銅を５μｍｏｌ／Ｌ濃度になるように加え保存することにより酸化させ、その挙動を検討している。その結果は、ＬＤＬを酸化させると溶出時間が遅くなることというものである。我々も、ＬＤＬｓと酸化ＬＤＬとの関連を調べるために、同様の実験を試みた。すなわち、健常人血清より超遠心分離法によりＬＤＬ（密度１．０１９〜１．０６３ｇ／ｍｌ）試料を採取し、ＥＤＴＡを含まないリン酸緩衝生理食塩水にて１晩透析後、３μｍｏｌ／Ｌの硫酸銅を加え、３５℃で４時間加温したところ、ＬＤＬｆ画分が主であったＬＤＬ試料は、ＬＤＬｓ画分が主へと変化した（図１９）。この結果から、冠動脈疾患で高値となる酸化ＬＤＬがＬＤＬｓの中には多く含まれていることが推測され、これは、ＬＤＬｓの有用性の高さを示唆するものである。
【００４７】
また、高脂血症患者４０例を用いて、酸化ＬＤＬのキット（協和メデックス株式会社製）と、本測定法によるＬＤＬｆコレステロール、ＬＤＬｓコレステロール、総ＬＤＬコレステロールとの比較を行なった（図２０から２２）。ＬＤＬｆコレステロール（図２０）と総ＬＤＬコレステロール（図２２）については、有意な相関関係は認められなかった（ｐ＞０．０５）が、ＬＤＬｓコレステロール（図２１）では有意な相関関係（ｐ＝０．０００２）が認められた。このことからも、ＬＤＬｓと酸化ＬＤＬとの関係は強く、間接的ではあるが、ＬＤＬｓの有用性の高さを示すデータである。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】実施例１〜４で用いた装置。
【図２】実施例１の結果（健常人血清）。
【図３】実施例１の結果（ＨＤＬ２試料）。
【図４】実施例１の結果（ＨＤＬ３試料）。
【図５】実施例１の結果（健常人血清）。
【図６】実施例１の結果（ＬＤＬ１試料）。
【図７】実施例１の結果（ＬＤＬ２試料）。
【図８】実施例１の結果（ＬＤＬ３試料）。
【図９】実施例２の結果（健常人血清と超遠心分離法によるリポ蛋白試料）。
【図１０】実施例２の結果（高脂血症患者血清と超遠心分離法によるリポ蛋白試料）。
【図１１】実施例３の結果（高脂血症患者検体を用いたＬＤＬｆの溶出条件の検討）。
【図１２】実施例５で用いた装置。
【図１３】実施例５の結果（健常人と冠動脈疾患患者におけるＬＤＬｆコレステロールの比較）。
【図１４】実施例５の結果（健常人と冠動脈疾患患者におけるＬＤＬｓコレステロールの比較）。
【図１５】実施例５の結果（健常人と冠動脈疾患患者における総ＬＤＬコレステロールの比較）。
【図１６】実施例５の結果（総ＬＤＬコレステロールとＬＤＬｆコレステロールの相関関係）。
【図１７】実施例５の結果（総ＬＤＬコレステロールとＬＤＬｓコレステロールの相関関係）。
【図１８】実施例５の結果（ＬＤＬｆコレステロールとＬＤＬｓコレステロールの相関関係）。
【図１９】実施例５の結果（ＬＤＬｓと酸化ＬＤＬとの関係）。
【図２０】実施例５の結果（酸化ＬＤＬとＬＤＬｆコレステロールの相関関係）。
【図２１】実施例５の結果（酸化ＬＤＬとＬＤＬｓコレステロールの相関関係）。
【図２２】実施例５の結果（酸化ＬＤＬと総ＬＤＬコレステロールの相関関係）。
【符号の説明】
【００４９】
１ 溶離液A
２ 溶離液Ｂ
３ 脱気装置
４ ポンプ
５ ミキサー
６ オートサンプラー
７ フィルター
８ カラム
９ カラムオーブン
１０ コレステロール反応液
１１ エアートラップ
１２ コレステロール反応液のためのポンプ
１３ 抵抗管
１４ 反応コイル
１５ 検出器
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＬＤＬ亜画分のうち、陰イオン交換樹脂に対して、結合力が強いＬＤＬ亜画分（以下、ＬＤＬｓ）を指標として用いる、冠動脈疾患の判定方法。
【請求項２】
ＬＤＬｓのコレステロール濃度を比較することにより、冠動脈疾患を判定する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
被験者から得られるＬＤＬｓのコレステロール濃度が、健常者から得られるＬＤＬｓのコレステロール濃度の平均値よりも高い場合に、冠動脈疾患であると判定する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
溶離液の塩濃度勾配を利用して、ＬＤＬからＬＤＬｓを分離し、測定したものを指標として用いる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ＬＤＬを吸着させるための溶離液（溶離液１）、ＬＤＬ亜画分のうち、結合力の弱い画分を溶出させるための溶離液（溶離液２）、ＬＤＬ亜画分のうち、結合力が強い画分を溶出させるための溶離液（溶離液３）の塩濃度の異なる溶離液を、溶離液１、２、３の順に陰イオン交換樹脂に流すことにより、ＬＤＬからＬＤＬｓを分離し、測定したものを指標として用いる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
溶離液１の塩濃度が１３０ｍｍｏｌ／Ｌから１８０ｍｍｏｌ／Ｌであり、溶離液３の塩濃度が溶離液１の塩濃度より２０ｍｍｏｌ／Ｌから５０ｍｍｏｌ／Ｌ高く、溶離液２の塩濃度が、溶離液１の塩濃度よりも高く、溶離液３の塩濃度よりも低い、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
溶離液２の塩濃度が、溶離液１と溶離液３の塩濃度の差に対して３５％から６０％分溶離液３より低い、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１】
ＬＤＬ亜画分のうち、陰イオン交換樹脂に対して、結合力が強いＬＤＬ亜画分（以下、ＬＤＬｓ）を指標として用いる、冠動脈疾患の判定方法。
【請求項２】
ＬＤＬｓのコレステロール濃度を比較することにより、冠動脈疾患を判定する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
被験者から得られるＬＤＬｓのコレステロール濃度が、健常者から得られるＬＤＬｓのコレステロール濃度の平均値よりも高い場合に、冠動脈疾患であると判定する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
溶離液の塩濃度勾配を利用して、ＬＤＬからＬＤＬｓを分離し、測定したものを指標として用いる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ＬＤＬを吸着させるための溶離液（溶離液１）、ＬＤＬ亜画分のうち、結合力の弱い画分を溶出させるための溶離液（溶離液２）、ＬＤＬ亜画分のうち、結合力が強い画分を溶出させるための溶離液（溶離液３）の塩濃度の異なる溶離液を、溶離液１、２、３の順に陰イオン交換樹脂に流すことにより、ＬＤＬからＬＤＬｓを分離し、測定したものを指標として用いる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
溶離液１の塩濃度が１３０ｍｍｏｌ／Ｌから１８０ｍｍｏｌ／Ｌであり、溶離液３の塩濃度が溶離液１の塩濃度より２０ｍｍｏｌ／Ｌから５０ｍｍｏｌ／Ｌ高く、溶離液２の塩濃度が、溶離液１の塩濃度よりも高く、溶離液３の塩濃度よりも低い、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
溶離液２の塩濃度が、溶離液１と溶離液３の塩濃度の差に対して３５％から６０％分溶離液３より低い、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【公開番号】特開２００８−２９８６１６（Ｐ２００８−２９８６１６Ａ）
【公開日】平成２０年１２月１１日（２００８．１２．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１４５６１６（Ｐ２００７−１４５６１６）
【出願日】平成１９年５月３１日（２００７．５．３１）
【出願人】（０００００３３００）東ソー株式会社 (1,901)
【出願人】（０００１２５３６９）学校法人東海大学 (352)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１２月１１日（２００８．１２．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年５月３１日（２００７．５．３１）
【出願人】（０００００３３００）東ソー株式会社 (1,901)
【出願人】（０００１２５３６９）学校法人東海大学 (352)
【Ｆターム（参考）】
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