ＬＥＷＩＳｙ抗原及びＬＥＷＩＳｂ抗原に対する抗癌抗体
本発明は、ＬｅｗｉｓｙとＬｅｗｉｓｂ抗原との双方に結合する抗体又は抗原結合断片を含む結合複合体であって、前記抗体又は抗原結合断片がマルチマーの形態にあり、かつ、前記抗体又は結合断片が自然にはマルチマーを形成しない、結合複合体を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の治療に有用な抗体又は抗原結合断片を含む結合複合体に関する。特に、本発明は、Ｌｅｗｉｓｙ抗原とＬｅｗｉｓｂ抗原との双方に結合する抗体又は抗原結合断片を含む結合複合体であって、前記抗体又は抗原結合断片がマルチマーの形態にある、結合複合体を提供する。前記結合複合体は、Ｌｅｗｉｓｙ及びＬｅｗｉｓｂを過剰発現している腫瘍細胞において細胞死を誘導する。
【背景技術】
【０００２】
Ｌｅｗｉｓｙ及びＬｅｗｉｓｂは、乳癌、肺癌、結腸癌、及び卵巣癌によって過剰発現されている複合糖質である。したがって、それらは、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）治療の良好な標的である。Ｌｅｗｉｓｙハプテンは、二型血液型オリゴ糖で発見されたジフコシル化四糖類（Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ）である。この抗原は、Ｌｅｗｉｓｂハプテン（Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３（Ｆｕｃα１−４）ＧｌＮＡｃ））の位置異性体及びＬｅｗｉｓｘハプテンのフコシル化誘導体である（Ａｂｅ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｃｈ ４６：２６３９；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｃｈ ４６：５９８５）。Ｌｅｗｉｓｙは胸部、気管支、脾臓、秘尿生殖器、及び胃腸管の深部にある腺内において発現する。対照的に、Ｌｅｗｉｓｂは、表面上皮によって発現する（Ｓａｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４９：７４５−５２；Ｋｉｔａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：１２９５７−６１）。
【０００３】
ＩｇＭマウスｍＡｂであるＣ１４は、標準的な融合方法を用いて原発結腸直腸腫瘍細胞に対して作製し、ＬｅｗｉｓｙとＬｅｗｉｓｂとの双方の（伸長又は非伸長（ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｏｒ ｎｏｎ−ｅｘｔｅｎｄｅｄ））抗原に結合する（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｂｉｏｓｃｉ．Ｒｅｐ．３：１６３；Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ３３：７２７；Ｄｕｒｒａｎｔ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １２：６４７−６０）。Ｃ１４抗体は、７８％の結腸直腸癌に結合したが（Ｄｕｒｒａｎｔ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８１：６８８−９５）、マウスＩｇＭなので、ｉｎ ｖｉｖｏ試験には適さなかった。その抗体のＩｇＧバリアントを生産するために、Ｃ１４ｍＡｂでラットを免疫して、生産されたラットの抗Ｃ１４を精製した。この抗血清及びＣ１４ｇｐ２００抗原でマウスに免疫した後に、それらの脾細胞をマウスのミエローマと融合させて、５種のＩｇＧ ｍＡｂ、すなわち、２種のＩｇＧ３（ＳＣ１０１／２３、ＳＣ１０１／２９ ｍＡｂ）及び３種のＩｇＧ１（ＳＣ１０１／３３、ＳＣ１０１／４２、及びＳＣ１０１／４３）（これらの５種の抗体は既に「６９２」抗体として公開している）を生産させた。全てのＩｇＧバリアントは、Ｌｅｗｉｓｙ及びＬｅｗｉｓｂ抗原を認識し、Ｃ１４と同一の特異性を示した。さらに、これらの抗体は、薄層クロマトグラフィー及びＥＬＩＳＡによって、伸長及び非伸長Ｌｅｗｉｓｙ及びＬｅｗｉｓｂハプテンに結合するが、Ｌｅｗｉｓｘ又はＨ血液型ハプテンには結合しないことが示された（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｂｉｏｓｃｉ．Ｒｅｐ．３：１６３）。
【０００４】
ＬｅｗｉｓｙとＬｅｗｉｓｂとの双方に結合する抗体は既知であるが、ＳＣ１０１ ｍＡｂは、Ｌｅｗｉｓｙ決定基とＬｅｗｉｓｂ決定基との双方を認識するという能力において特異なものである。他のｍＡｂはこれらの２つの分子の同様の面を認識せず、また、１つの珍しいレクチンのみがこれらの２つの分子の同様の面を認識する。Ｌｅｗｉｓ ｙ／ｂは、糖脂質としてセラミド骨格上で大部分が発現する。最近の結晶学的研究によって、Ｌｅｗｉｓｙに特異的な抗体は、ハプテンのＮ−アセチルグルコサミン又はフコースのいずれかに適応する（Ｒａｍｓｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０：８０９−１８）非常に異なる結合部位を有することが示された。ＳＣ１０１は、ＬｅｗｉｓｙとＬｅｗｉｓｂとが互いに立体異性体であるため非常に珍しいことに、ＬｅｗｉｓｙとＬｅｗｉｓｂとの双方の面に結合部位が適応するため異なる。更に興味深いことに、これらの抗体は、おそらくセラミド又は他の密接に関連する分子からの立体障害のため、胃腸管を含む大半の通常の組織における糖脂質を認識することができない。このことにより、ＳＣ１０１抗体は特有の組織分布を有するが、広範な上皮腫瘍に非常に強力に結合する（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｂｉｏｓｃｉ．Ｒｅｐ．３：１６３）。
【０００５】
脱凝集された原発結腸直腸腫瘍に対する抗体結合の最初の特性決定の間に、それらが細胞死を誘導することが認められた。細胞死は、アポトーシス及びオンコーシスを含む多数の機構によって生じ得る。アポトーシスはカスパーゼ依存性であり、最終的には細胞のアポトーシス小体への分割を生じさせる細胞収縮、クロマチンの凝縮及び辺縁趨向、並びに細胞膜のラッフリングを特徴とする。オンコーシスは、早期の細胞壊死であり、膜透過性の増大期の結果としての細胞膨張を特徴とする。壊死は、細胞死後に現れ、アポトーシス又はオンコーシスの後に生じる形態変化である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ａｂｅ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｃｈ ４６：２６３９
【非特許文献２】Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｃｈ ４６：５９８５
【非特許文献３】Ｓａｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４９：７４５−５２
【非特許文献４】Ｋｉｔａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：１２９５７−６１
【非特許文献５】Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｂｉｏｓｃｉ．Ｒｅｐ．３：１６３
【非特許文献６】Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ３３：７２７
【非特許文献７】Ｄｕｒｒａｎｔ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １２：６４７−６０
【非特許文献８】Ｄｕｒｒａｎｔ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８１：６８８−９５
【非特許文献９】Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｂｉｏｓｃｉ．Ｒｅｐ．３：１６３
【非特許文献１０】Ｒａｍｓｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０：８０９−１８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者は、ＳＣ１０１／２９ ｍＡｂによる腫瘍細胞の殺滅を実証し、当該抗体が、古典的なオンコーシスと多数の類似点を有する特有の機構によって、ｉｎ ｖｉｔｒｏとｉｎ ｖｉｖｏの双方においてＬｅｗｉｓｙ及びＬｅｗｉｓｂを過剰発現する腫瘍細胞を直接殺滅することを実証した。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の第一の態様では、ＬｅｗｉｓｙとＬｅｗｉｓｂとの双方に結合する抗体又は抗原結合断片を含む結合複合体であって、前記抗体又は抗原結合断片がマルチマーの形態にある、結合複合体を提供する。
【０００９】
本発明の第二の態様では、本発明の第一の態様に係る結合複合体の有効量を対象に投与する工程を含む、Ｌｅｗｉｓｙ抗原及びＬｅｗｉｓｂ抗原を過剰発現している腫瘍細胞における細胞死の誘導を提供する。
【００１０】
本発明の第三の態様では、本発明の第一の態様に係る結合複合体の治療上有効量を対象に投与する工程を含む、治療の必要がある対象の癌を治療するための方法を提供する。
【００１１】
本発明の第四の態様では、本発明の第一の態様に係る結合組成物を製薬学的に許容される担体又は希釈剤と共に含む、Ｌｅｗｉｓｙ抗原及びＬｅｗｉｓｂ抗原を過剰発現している腫瘍細胞における細胞死を誘導するための医薬組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１ａ】間接免疫蛍光によってアッセイし、フローサイトメトリーで分析した、新しく脱凝集させた結腸直腸腫瘍細胞に対するＳＣ１０１の結合を示す。各々のバーは、個々の腫瘍の平均蛍光を示す。結腸直腸腫瘍細胞株であるＣｏｌｏ２０５、Ｃ１７０、ＨＴ２９、及びＬｏＶｏに対するＳＣ１０１の結合を比較のために示している。
【図１ｂ】ＳＣ１０１／２９によるＬｏＶｏ及びＣ１７０細胞のＩＣ５０増殖阻害曲線を示す。増殖阻害の％を、ＳＣ１０１／２９ｍＡｂに曝露した細胞数／対照ｍＡｂに曝露した細胞数として表示した。増殖阻害曲線からの生細胞数を、４９０ｎｍの吸光度の読み取るＭＴＳによって決定した。
【図１ｃ】ＳＣ１０１／２９によるＣｏｌｏ２０５及びＨＴ−２９のＩＣ５０増殖阻害曲線を示す。増殖の阻害％は、ＳＣ１０１／２９ ｍＡｂに曝露された細胞数／対照ｍＡｂに曝露された細胞数として表示される。増殖阻害曲線からの生細胞数は、４９０ｎｍにおける吸光度を読取るＭＴＳによって決定した。
【図２ａ】３０μｇ／ｍｌのＩｇＧ、３００ｎｇ／ｍｌの抗ＦａｓクローンＣｈ１１、３０μｇ／ｍｌのＢＲ９６、又は３０μｇ／ｍｌのＳＣ１０１／２９ ｍＡｂのいずれかを用いて３０分、２時間、又は４時間処理した２×１０５のＣｏｌｏ２０５細胞を示す。細胞は、ＰＩを用いて１５分間に亘って室温で暗所において染色し、４８８ｎｍでＦＣ５００フローサイトメーター（発光 ６２０ｎｍ ＦＬ３）を用いて分析した。
【図２ｂ】３０μｇ／ｍｌのＩｇＧ、３００ｎｇ／ｍｌの抗ＦａｓクローンＣｈ１１、３０μｇ／ｍｌのＢＲ９６、又は３０μｇ／ｍｌのＳＣ１０１／２９ ｍＡｂのいずれかを用いて３０分、２時間、又は４時間処理した２×１０５のＣ１７０細胞を示す。細胞は、ＰＩを用いて１５分間に亘って室温で暗所において染色し、４８８ｎｍでＦＣ５００フローサイトメーター（発光 ６２０ｎｍ ＦＬ３）を用いて分析した。
【図２ｃ】３０μｇ／ｍｌのＩｇＧ、３００ｎｇ／ｍｌの抗ＦａｓクローンＣｈ１１、３０μｇ／ｍｌのＢＲ９６、又は３０μｇ／ｍｌのＳＣ１０１／２９ ｍＡｂのいずれかを用いて３０分、２時間、又は４時間処理した２×１０５のＨＴ−２９細胞を示す。細胞は、ＰＩを用いて１５分間に亘って室温で暗所において染色し、４８８ｎｍでＦＣ５００フローサイトメーター（発光 ６２０ｎｍ ＦＬ３）を用いて分析した。
【図２ｄ】３０μｇ／ｍｌのＩｇＧ、３００ｎｇ／ｍｌの抗ＦａｓクローンＣｈ１１、３０μｇ／ｍｌのＢＲ９６、又は３０μｇ／ｍｌのＳＣ１０１／２９ ｍＡｂのいずれかを用いて３０分、２時間、又は４時間処理した２×１０５のＬｏＶｏ細胞を示す。細胞は、ＰＩを用いて１５分間に亘って室温で暗所において染色し、４８８ｎｍでＦＣ５００フローサイトメーター（発光 ６２０ｎｍ ＦＬ３）を用いて分析した。
【図２ｅ】１００μｇ／ｍｌのＳＣ１０１／２９ ｍＡｂを用いて３０分に亘って０から１０μＭドクソルビシンの存在下において処理した２×１０５のＣｏｌｏ２０５、Ｃ１７０、ＨＴ−２９、又はＬｏＶｏ細胞を示す。細胞は、４８８ｎｍでＦＣ５００フローサイトメーター（発光 ５７５ｎｍ ＦＬ２）を用いて分析した。
【図２ｆ】細胞をｐ−糖タンパク質（０．３から３０μｇ／ｍｌ）を認識するｍＡｂを用いて染色し、４８８ｎｍでＦＣ５００フローサイトメーター（発光 ５２５ ＦＬ１）を用いて分析した。
【図３ａ】ＳＣ１０１／２９、ＳＣ１０１／４３、又はそれらの双方のｍＡｂのいずれかを用いて１時間に亘って処理した２×１０５のＣ１７０細胞を示す。細胞は、ＰＩを用いて１５分に亘って室温で暗所において染色し、４８８ｎｍでＦＣ５００フローサイトメーター（発光 ６２０ ＦＬ３）を用いて分析した。
【図３ｂ】１００μｇ／ｍｌのＩｇＧ、アビジンと混合した１００μｇ／ｍｌのＩｇＧ、１００μｇ／ｍｌのＳＣ１０１／２９、１００μｇ／ｍｌのＳＣ１０１／４３−ビオチン、又はアビジンと架橋した１００μｇ／ｍｌのビオチン化ＳＣ１０１／４３のいずれかを用いて１時間に亘って処理した２×１０５のＣ１７０細胞を示す。細胞は、ＰＩを用いて１５分に亘って室温で暗所において染色し、４８８ｎｍでＦＣ５００フローサイトメーター（発光 ６２０ ＦＬ３）を用いて分析した。
【図３ｃ】１００μｇ／ｍｌのマウスＳＣ１０１／２９ヒトＩｇＧ２キメラ抗体で３０分間に亘って処理し、続いて架橋抗ヒトＩｇＧ抗体（０−１００μｇ／ｍｌ）を用いて処理した１×１０５のＣｏｌｏ２０５細胞を示す。３時間室温でインキュベートした後に、細胞を７ＡＡＤを用いて２０分間に亘って暗所で染色し、４８８ｎｍでＣｅｌｌ Ｑｕａｎｔａ ＳＣ ＭＰＬを用いて分析した。２つのサンプルにおける死（７ＡＤＤ＋）細胞の平均割合を示す。
【図３ｄ】１００μｇ／ｍｌのアイソタイプネガティブｍＡｂ、１００ｎｇ／ｍｌの抗Ｆａｓ、又は１００μｇ／ｍｌのＳＣ１０１／２９ ｍＡｂを用いて、０、１、又は１０μＭのいずれかのｚ−ＦＭＫ−ｖａｄ ｐａｎ−カスパーゼインヒビターの存在下において、約１２時間に亘って処理した５×１０５のＣ１７０細胞を示す。細胞は、アネキシンＶ及びＰＩを用いて１５分に亘って室温で暗所において染色し、４８８ｎｍでＦＣ５００フローサイトメーター（発光 ５２５ｎｍ ＦＬ１、６２０ｎｍ ＦＬ３）を用いて分析した。
【図３ｅ】ＩｇＧ（３０μｇ／ｍｌ）ネガティブコントロールに４時間、ＳＣ１０１に１から４時間、又は０．５Ｍのソルビトールに３０分間（ポジティブコントロール）曝露した２×１０６のＣ１７０細胞を示す。細胞は、氷冷Ｔｒｉｓ抽出干渉液＋０．５ｍＭ ＮａＶＯ４中で抽出し、７５μｇの総タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで１レーン毎に載せた。１０％ゲルを１３０Ｖで９０分間に亘って分離させ、ＢｉｏＲａｄ ｓｅｍｉ−ｄｒｙ ｂｌｏｔｔｅｒ（１２Ｖ 定電圧）で７０分間に亘ってＰＶＤＦ膜に転写させた。膜をブロッキングして、２ｍｌあたり１μｌのＰ−ｐ３８、Ｐ−ＪＮＫ、又はＰ−ＥＲＫ（１％ ＢＳＡ ＴＢＳ−Ｔ、ＥＣＬ Ｐｌｕｓ＋を用いて洗浄及び現像した）で探索した。
【図４ａ】ヌードマウスにおけるＣ１７０異種移植片の増殖に対するＳＣ１０１／２９ ｍＡｂ、５−ＦＵ／ロイコボリン、又はＳＣ１０１／２９ｍＡｂと５−ＦＵ／ロイコボリンとの組み合わせの効果を表すグラフを示す。Ｃ１７０異種移植片の増殖は、動物をＳＣ１９１／２９ ｍＡｂ ｉｐ（０．２ｍｇ）、対照抗体 ｉｐ（０．２ｍｇ）、及び５−ＦＵ／ロイコボリン（１２．５ｍｇ／ｋｇ；ｉｖ）を用いて処理した際に、断面積（ｍｍ２）の測定によって、１２、１６、１９、及び２３日目に測定した。２３日目に得られた結果の分散分析は、ＳＣ１０１／２９ ｍＡｂを未処理の対照群と比較した際に、ｐ＜０．００４の有意な値を示し、ＳＣ１０１／２９ ｍＡＢ＋５−ＦＵ／ロイコボリンに対する対照群＋５−ＦＵ／ロイコボリンについてはｐ＜０．０２０の有意な値を示した。
【図４ｂ】ＳＣ１０１／２９ ｍＡｂのみ（第二群）、５−ＦＵ／ロイコボリンのみ（第三群）、若しくはＳＣ１０１／２９ ｍＡｂと５−ＦＵ／ロイコボリンとの組み合わせ（第四群）を用いて免疫されているか又は未処理（第一群）のマウスの最終腫瘍重量を示す。
【図４ｃ】ＳＣ１０１／２９ ｍＡｂのみ、５−ＦＵ／ロイコボリンのみ、若しくはＳＣ１０１／２９ ｍＡｂと５−ＦＵ／ロイコボリンとの組み合わせを用いて免疫されているか又は未処理のマウスの重量を示す。
【図４ｄ】ＳＣ１０１／２９ ｍＡｂ ｉｐ（０．２ｍｇ）、５−ＦＵ／ロイコボリン（１２．５ｍｇ／ｋｇ ｉｖ）、又はＳＣ１０１／２９ ｍＡｂ（０．２ｍｇ）と５−ＦＵ／ロイコボリン（１２．５ｍｇ／ｋｇ ｉｖ）との組み合わせを用いて処理したＣ１７０異種移植片を有する動物の生存データを示す。ＳＣ１０１／２９ ｍＡｂを７日目に与え、次いで１週間に３回与えた。５−ＦＵ／ロイコボリンは、１、３、５、及び７日目に与えた。ＳＣ１０１／２９ ｍＡｂは、５−ＦＵ／ロイコボリンと併用する際には、ビヒクル対照マウスを超えて生存率を有意に改善した（ｐ＝０．０１６３ Ｌｏｇ Ｒａｎｋ）。
【図５】Ｃ１７０ＨＭ２肝臓転移ヌードマウスモデルにおける最終肝臓腫瘍重量（ｇ）に対する１０μｇ若しくは１００μｇのＳＣ１０１／２９ ｍＡｂ又はビヒクル対照の効果を表すグラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明者は、Ｌｅｗｉｓｙ抗原とＬｅｗｉｓｂ抗原との双方に結合する抗体又は抗原結合断片を含む結合複合体が、Ｌｅｗｉｓｙ及びＬｅｗｉｓｂを過剰発現している腫瘍細胞における細胞死を誘導することを実証した。
【００１４】
本発明の第一の態様では、Ｌｅｗｉｓｙ抗原とＬｅｗｉｓｂ抗原との双方に結合する抗体又は抗原結合断片を含む結合複合体であって、前記抗体又は抗原結合断片がマルチマーの形態にある、結合複合体を提供する。
【００１５】
本明細書において使用する用語「抗体」は、４つのポリペプチド鎖、すなわちジスルフィド結合で相互に連結した２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ又はＶＨ）及び重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメインとしてＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ又はＶＬ）及び軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメインとしてＣＬを含む。ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存された領域が散りばめられた、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変領域に細分することが可能である。各ＶＨ及びＶＬは、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順番でアミノ末端からカルボキシ末端へと配置された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲからなる。
【００１６】
本明細書で使用する、抗体の「抗原結合断片」という用語は、抗原に結合する能力を示す免疫グロブリンの１つ又は複数の成分又は誘導体を示す。抗体の抗原結合機能は、全長の抗体の断片によって奏されるものであることが示されている。抗体の「抗原結合断片」という用語の範囲に含まれる結合断片の例は、（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、及びＣＨ１ドメインからなる一価断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって結合した２つのＦａｂ断片を含む二価断片；（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の１つの腕のＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｖ）１つのＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６）又はＶＬドメイン（ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｕｋｅｎ ｅｔ ａｌ（２００１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，３１０，５９１）；（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）；並びに（ｖｉｉ）同種のフレームワーク領域によって融合した複数の相補性決定領域、例えばＱｉｕ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２５（８）：９２１−９２９に開示されているものを含む。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶＬ及びＶＨは別々の遺伝子にコードされているが、それらは、ＶＬ領域とＶＨ領域が対になって一価分子（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦＶ）としても知られている）を形成する単鎖タンパク質とすることを可能にする合成リンカーによって、組換え法を用いて、連結させてよい（Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６；Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３）。その様な単鎖Ｆｖも、抗体の「抗原結合断片」という用語の範囲内含まれることが意図される。単鎖ＦＶ及び関連する分子、例えば、二重特異性抗体又は三重特異性抗体も含まれる。二重特異性抗体は、短いために同一の鎖上において２つのドメインの間で対を形成することを可能にするリンカーを使用するがＶＨドメインとＶＬドメインとが単独のポリペプチド鎖に発現され、そのドメインを他の鎖の相補的なドメインと対を形成させ、２つの抗原結合部位を生じさせている二価の抗体である（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８；Ｐｏｌｊａｋ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：１１２１−１１２３）。
【００１７】
抗体又は抗原結合断片がマルチマーの状態にあることは、本発明に必須の特徴である。抗体又は抗原結合断片は、Ｌｅｗｉｓｙ抗原とＬｅｗｉｓｂ抗原との双方に結合して、抗原の架橋を生じさせる。Ｌｅｗｉｓｙ抗原とＬｅｗｉｓｂ抗原との架橋は、Ｌｅｗｉｓｙ及びＬｅｗｉｓｂを過剰発現している細胞についての腫瘍細胞死の仲介において重要であり得る。
【００１８】
本明細書で使用する用語「マルチマー」は、互いに結合を形成している２つ又はそれ以上の抗体又は抗原結合断片を意味する。さらに、マルチマーは、ホモ又はヘテロマルチマーであってよい。例えば、マルチマーは、ホモ若しくはヘテロダイマー、ホモ若しくはヘテロトリマー、又はそれより高度のマルチマーであってよい。ホモマルチマーは、同一の抗体又は抗原結合断片を含むマルチマーであり、ヘテロマルチマーは、少なくとも２つの異種抗体又は抗原結合断片を含むマルチマーである。しかしながら、マルチマーの組成にかかわらず、各抗体又は抗原結合断片は、Ｌｅｗｉｓｙ抗原とＬｅｗｉｓｂ抗原との双方に結合する必要がある。
【００１９】
本発明の好ましい実施態様では、マルチマーは、ホモ又はヘテロダイマーである。
【００２０】
本発明の更に好ましい実施態様では、抗体が自然にはダイマー又はマルチマーを形成しない。
【００２１】
本明細書で使用する用語「Ｌｅｗｉｓｙ抗原とＬｅｗｉｓｂ抗原との双方に結合する」は、Ｌｅｗｉｓｙ抗原とＬｅｗｉｓｂ抗原とが架橋を形成するように、Ｌｅｗｉｓｙ抗原とＬｅｗｉｓｂ抗原との双方に結合する抗体又は抗原結合断片を意味する。
【００２２】
本明細書で使用する用語「結合する」は、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）表面プラズモン共鳴システム及びＢＩＡｃｏｒｅ（商標）動力学的評価ソフト（例えば、ｖｅｒｓｉｏｎ ２．１）を使用して表面プラズモン共鳴分析によって測定すると、１μＭ以下の解離定数（Ｋｄ）を有する、抗体の免疫グロブリン可変領域による抗原への結合を意味する。特異的な結合相互作用についての親和性又は解離定数（Ｋｄ）は、約５００ｎＭから約５０ｐＭ、より好ましくは約５００ｎＭ以下、より好ましくは約３００ｎＭ以下、好ましくは少なくとも約３００ｎＭから５０ｐＭ、約２００ｎＭから約５０ｐＭ、より好ましくは約１００ｎＭから約５０ｐＭ、約７５ｎＭから約５０ｐＭ、約１０ｎＭから約５０ｐＭである。
【００２３】
本発明のある実施態様では、抗体又は抗原結合断片が、二重特異性抗体又は多重特異性抗体である。本発明の他の実施態様では、二重特異性抗体又は多重特異性抗体が修飾されたＦｃドメインを含む。
【００２４】
本発明の他の実施態様では、抗体又は抗原結合断片を含むマルチマーがＩｇＧ抗体である。本発明の更なる実施態様では、マルチマーがダイマーのＩｇＧ１抗体である。
【００２５】
幾つかの抗体（例えば、ＩｇＧ３）はｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでダイマーを形成し、ＩｇＧ１抗体はモノマー形態で存在する。モノマーの抗体又はその抗原結合断片が、Ｌｅｗｉｓｙ抗原及びＬｅｗｉｓｂ抗原を過剰発現している腫瘍細胞において腫瘍細胞死を誘導し得るために、Ｌｅｗｉｓｙ抗原及びＬｅｗｉｓｂ抗原は、モノマーの抗体又は抗原結合断片のアビジン／ビオチンによる架橋によって架橋される。代替的には、モノマーの抗体又は抗原結合断片は、組換え工学、例えば、モノマーのカルボキシ末端における鎖間ジスルフィド結合の形成を可能にする、ＣＨ３領域の遺伝子におけるセリンからシステインへの変異によって、架橋されてよい（Ｃａｒｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１１９１−１１９５）。これが、次いで、Ｌｅｗｉｓｙ抗原とＬｅｗｉｓｂ抗原との架橋を容易にする。
【００２６】
本発明の第二の態様では、Ｌｅｗｉｓｙ抗原とＬｅｗｉｓｂ抗原との双方に結合する抗体又は抗原結合断片を含む結合複合体の有効量を対象に投与する工程を含む、Ｌｅｗｉｓｙ抗原及びＬｅｗｉｓｂ抗原を過剰発現している腫瘍細胞において細胞死を誘導するための方法であって、前記抗体又は抗原結合断片がマルチマーの形態にある、方法を提供する。
【００２７】
本発明の第三の実施態様では、Ｌｅｗｉｓｙ抗原とＬｅｗｉｓｂ抗原との双方に結合する本発明の第一の態様に係る結合複合体の治療上有効量を、対象に投与する工程を含む、治療の必要がある対象の癌を治療するための方法を提供する。
【００２８】
用語「治療上有効量」は、特定の疾患若しくは障害（本発明の場合には癌）又はその症状の１つ若しくは複数を治療又は緩和し、及び／又は疾患又は障害の発生を予防又は低減させるために十分な、抗体又はその抗原結合断片（抗体又は抗原結合断片を含む医薬組成物を含む）の量を意味する。
【００２９】
抗体又はその抗原結合断片（抗体又はその抗原結合断片を含む医薬組成物を含む）の使用及び治療方法に関して使用する際に、「治療の必要がある」個体は、癌であると診断されているか又は過去に治療されている個体であってよい。
【００３０】
本発明の好ましい実施態様では、癌は、乳癌、肺癌、結腸癌、及び卵巣癌からなる群から選択されてよい。
【００３１】
本発明の第四の態様では、本発明の第一の態様に係る結合複合体を製薬学的に許容される担体又は希釈剤と共に含む、Ｌｅｗｉｓｙ抗原及びＬｅｗｉｓｂ抗原を過剰発現している腫瘍細胞において細胞死を誘導するための医薬組成物を提供する。
【００３２】
「製薬学的に許容される担体又は希釈剤」は、任意の全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤若しくは抗真菌剤、等張剤、及び吸収遅延剤などの生理的に適合するものを含む。製薬学的に許容される担体の例は、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、及びそれらの組み合わせの１つ又は複数を含む。多くの場合において、等張剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、又は塩化ナトリウムを組成物に含むことが好ましいであろう。
【００３３】
組成物は、液体、半固体、又は固体の剤形、例えば、溶液（例えば、注射可能な溶液及び輸液可能な溶液）、分散物又は懸濁物、錠剤、丸剤、粉末剤、リポソーム、又は座剤を含む各種の形態にあってよい。好ましくは、組成物は、免疫のための注射可能な溶液の形態にある。投与は、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内、経皮、鞘内、及び動脈内であってよい。好ましくは、前記剤形は、約０．００１ｍｇから約１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲内で、毎日、毎週、二週若しくは三週に一度、又は毎月投与され、好ましくは約０．０５から約５ｍｇ／ｋｇ体重で毎週投与される。
【００３４】
前記組成物は、滅菌した注射可能な溶液の調製のための滅菌粉末として製剤化されてもよい。
【００３５】
ある実施態様では、結合複合体が、急速な放出に対して化合物を保護する担体と共に調製されてよく、例えば、インプラント、経皮パッチ、及びマイクロカプセル化送達系を含む制御放出製剤であってよい。適合性のあるポリマーが使用されてよく、例えば、エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、又はポリ乳酸が使用されてよい。
【００３６】
前記組成物は、経口投与のために製剤化されてもよい。この実施態様では、抗体は、硬質ゼラチンカプセル又は軟質ゼラチンカプセルに覆われてよく、錠剤に押し固められてよく、又は対象の食料に直接含ませてもよい。
【００３７】
前記組成物は、直腸投与のために製剤化されてもよい。
【００３８】
本発明の結合複合体は、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて特定の細胞に結合及び同定するか、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて特定の細胞に結合及び破壊するか、又はｉｎ ｖｉｖｏにおいて特定の細胞に入り込み、破壊するために投与されてよい。
【００３９】
好ましい実施態様では、前記組成物はヒトに投与される。
【００４０】
本発明の本質がより明確に理解され得るように、その好ましい態様を、以下の非限定的な実施例を参照して説明する。
【実施例】
【００４１】
（実施例１）
材料及び方法
細胞株
Ｃ１７０は、原発腫瘍由来の結腸直腸細胞である（Ｄｕｒｒａｎｔ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ５３：３７−４５）。Ｃｏｌｏ２０５、ＨＴ−２９、及びＬｏＶｏは、ＡＴＣＣから得られた結腸直腸細胞である。全ての細胞は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ Ｆ６１７８；Ｓｉｇｍａ，Ｐｏｏｌｅ，ＵＫ）ＲＰＭＩ１６４０（ＢＥ１２−７０２Ｆ；Ｃａｍｂｒｅｘ Ｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｅｒｋｓｈｉｒｅ，ＵＫ）において培養した。
【００４２】
モノクローナル抗体
ＬｅｗｉｓｙハプテンとＬｅｗｉｓｂハプテンとの双方を認識するＳＣ１０１ ｍＡｂは、過去に開示されている（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｂｉｏｓｃｉ．Ｒｅｐ．３：１６３；Ｄｒｕｕｒａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １２：６４７−６０）ように精製した。抗Ｆａｓ（ヒト活性化）クローンＣｈ１１（０５−２０１）抗体は、Ｕｐｓｔａｔｅから得られ、Ｂｒ９６およびＩｇＧネガティブコントロールはＳｉｇｍａ（Ｉ５３８１）から得られた。
【００４３】
結腸直腸細胞に結合する抗体
腫瘍検体は、結腸直腸癌の切除時に得た。検体を非常に細かく切って、０．０５％のコラゲナーゼ（タイプＩＶ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｌｅｗｅｓ，ＵＫ）を用いて２０分間に亘って３７℃で脱凝集させて、ＳＣ１０１／２９及びヤギ抗マウスＦＩＴＣ（Ｄａｋｏ Ｌｔｄ，Ｂｕｃｋｓ ＵＫ；１：１００希釈）を用いて間接免疫蛍光によって染色した。腫瘍細胞株は一定分量（１０５）に分けて、ＳＣ１０１／２９ ｍＡｂ又は抗Ｐ−糖タンパク質（多剤耐性を示す、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＵＳＡ）を各種の濃度で用いて、４℃において３０分間に亘って染色した。培地（ＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ）で二回洗浄した後に、細胞を二次抗体（ヤギ抗マウスＦＩＴＣ）を用いて４℃で３０分間に亘ってインキュベートし、その後に、最終的な洗浄を行い、４８８ｎｍでＦＣ５００フローサイトメーター（発光５２５ｎｍ ＦＬ１）において分析した。
【００４４】
結腸直腸腫瘍細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける殺滅
１×１０３の結腸直腸Ｃ１７０、Ｃｏｌｏ２０５、ＨＴ−２９、及びＬｏＶｏ細胞を、平底９６ウェルプレートの個々のウェルに一定分量に分けて、一晩３７℃で静置して接着させた。翌日、１００、３０、１０、３、１、又は０μｇ／ｍｌのＳＣ１０１／２９ ｍＡｂ（１００μｌ／ウェル）を用いて細胞を処理した。アイソタイプに適合したポジティブコントロール又はネガティブコントロールを比較のために使用した。ウェルを３つ重複させて使用した。細胞を抗体の存在下で３７℃に５日間に亘って静置した後に、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｇ３５８０；Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ，ＵＫ）を各ウェルに添加して、４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００４５】
ＰＩ取り込み
２×１０５のＣｏｌｏ２０５、Ｃ１７０、ＨＴ−２９、又はＬｏＶｏ細胞を、３０μｇ／ｍｌのＩｇＧ、３００ｎｇ／ｍｌの抗Ｆａｓ、３０μｇ／ｍｌのＢＲ９６、又はＳＣ１０１／２９ ｍＡｂのいずれかを３０分、２時間、又は４時間に亘って処理した。その後に、ＰＩ（６３０１１０；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）を用いて１５分間に亘って暗所で室温において細胞を染色し、４８８ｎｍでＦＣ５００ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒを用いて分析した（発光６２０ｎｍ ＦＬ３）。
【００４６】
７ＡＡＤ取り込み
１×１０５のＣｏｌｏ２０５を、１００μｇ／ｍｌのマウスＳＣ１０１／２９−ヒトＩｇＧ２キメラ抗体とともに室温においてリン酸干渉生理食塩水（ＰＢＳ）中でインキュベートした。３０分後に、各種の濃度の架橋抗ヒトＩｇＧ抗体（０−１００μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）を添加して、細胞を３時間に亘って室温でインキュベートし、次いで、７ＡＡＤ（Ｂｅｃｈｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて２０分間に亘って暗所で細胞を染色し、４８８ｎｍでＱｕａｎｔａ ＳＣ ＭＰＬ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ；発光フィルター６７０ ＬＰ ＦＬ３）を用いて分析した。
【００４７】
ＭＤＲ細胞株における薬剤取り込み
２×１０５のＣｏｌｏ２０５、Ｃ１７０、ＨＴ−２９、又はＬｏＶｏ細胞を、０、１、３、１０、３０、又は１００μｇ／ｍｌのＳＣ１０１／２９ ｍＡｂを用いて３０分間に亘って３７℃で処理した。次いで、０、１、又は１０μＭの終濃度でドクソルビシンを前記細胞に添加し、３７℃で１時間に亘ってインキュベートした。細胞を氷冷リン酸干渉生理食塩水（ＰＢＳ）で五回洗浄し、４８８ｎｍでＦＣ５００フローサイトメーター（発光５７５ｎｍ ＦＬ２）を用いて蛍光分析した。
【００４８】
カスパーゼ依存性細胞死の阻害アッセイ
５×１０５のＣ１７０細胞を、平底滅菌２４ウェルプレートの個々のウェルに一定分量に分けて、６時間に亘って３７℃で接着させた。前記細胞を、１００μｇ／ｍｌのアイソタイプに適合したネガティブコントロールｍＡｂ、１００ｎｇ／ｍｌの抗Ｆａｓ、又は１００μｇ／ｍｌのＳＣ１０１／２９ ｍＡｂ、及び０、１、又は１０μＭのｚ−ＦＭＫ−ｖａｄ（Ｇ７２３２；Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ，ＵＫ）を用いて処理した。細胞を３７℃で一晩静置して、その後に、アネキシンＶ及びＰＩを用いて１５分に亘って染色し、４８８ｎｍでＦＣ５００フローサイトメーター（発光５２５ｎｍ ＦＬ１、６２０ｎｍ ＦＬ３）を用いて分析した。
【００４９】
ストレス関連キナーゼを介するシグナル伝達
２×１０６のＣ１７０細胞を、ＩｇＧ（３０μｇ／ｍｌ）ネガティブコントロールに４時間に亘って、ＳＣ１０１（３０μｇ／ｍｌ）に１〜４時間に亘って、又は０．５Ｍソルビトール（ポジティブコントロール）に３０分間に亘って曝露した。細胞は、氷冷抽出干渉液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ７．４、２ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ Ｎａ４Ｐ２Ｏ７、２ｍＭ ベンズアミジン、１ｍＭ ＰＭＳＦ、０．５ｍＭ ＮａＶＯ４、０．５ｍＭ ＤＴＴ ０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００）中で抽出して、標準的なＢｉｏＲａｄタンパク質アッセイを用いてタンパク質濃度を測定し、７５μｇの総タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥのレーン毎に載せた。１０％ゲルを１３０Ｖで９０分に亘って分離させて、ＢｉｏＲａｄ ｓｅｍｉ−ｄｒｙ ｂｌｏｔｔｅｒ（１２Ｖ定電圧）で７０分間に亘ってＰＶＤＦに転写した。膜を１時間に亘って１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）Ｔｒｉｓ干渉生理食塩水０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＴＢＳ−Ｔ）中で１時間に亘ってブロッキングし、１％ ＢＳＡ ＴＢＳ−Ｔ中で２ｍｌあたり１μｌのＰ−ｐ３８、Ｐ−ＪＮＫ、又はＰ−ＥＲＫ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で探索した。その後に、膜をＴＢＳ−Ｔ中で三回洗浄して、ヤギ抗ウサギＨＲＰ（ＧαＲ ＨＲＰ；Ｄａｋｏ，Ｐ０４４８）で探索し、ＴＢＳ−Ｔで三回洗浄して、ＥＣＬ Ｐｌｕｓ＋で現像した。
【００５０】
ｉｎ ｖｉｖｏ試験
予防モデル
結腸直腸腫瘍細胞株であるＣ１７０を、ヌードマウスにおいて連続継代に維持した。治療のために、マウスを屠殺して、腫瘍を摘出した。前記腫瘍を非常に細かく切って、３ｍｍ２片を麻酔（Ｈｙｐｎｏｒｍ、Ｒｏｃｈｅ／Ｈｙｐｎｏｖｅｌ、Ｊａｎｎｓｅｎ）条件下で、無作為に４つの実験群に割り当てた４０匹のオスのマウスの皮下に移植した。１つの群のマウスは、５−ＦＵ／ロイコボリン（１２．５ｍｇ／ｋｇ）を用いて静脈内（ｉｖ）注射で１、３、５、７、２１、及び２２日目に処理した。一週間に三回、マウスに、０．２ｍｇのＳＣ１０１／２９ ｍＡｂを用いる腹腔内（ｉｐ）注射も実施した。対照マウスは、ＳＣ１０１／２９ ｍＡｂ、５−ＦＵ／ロイコボリン、又はビヒクルのみのいずれかを受けた。腫瘍の大きさはキャリパーによって測定し、腫瘍断面積を１２、１６、１９、及び２３日目に計算した。実験の終わりに、腫瘍を秤量して、抗腫瘍効果を評価した。動物を秤量して、治療の毒性を評価した。
【００５１】
治療モデル
結腸直腸腫瘍細胞株であるＣ１７０を、ヌードマウスにおいて連続継代に維持した。治療のために、マウスを屠殺して、腫瘍を摘出した。前記腫瘍を非常に細かく切って、３ｍｍ３片を麻酔条件下で、無作為に４つの実験群に割り当てた４０匹のオスのマウスの皮下に移植した。マウスは、Ｃ１７０異種移植片の３ｍｍ３片を外植した。前記群のマウスを、５−ＦＵ／ロイコボリン（２５ｍｇ／ｋｇ）を用いてｉｖ注射で１日目、３日目、５日目、７日目、適用可能な場合には２８日目から繰り返して治療した。一週間に三回、マウスに、０．２ｍｇのＳＣ１０１／２９ ｍＡｂを用いてｉｖ注射も実施し、対照マウスは、ＳＣ１０１／２９ ｍＡｂのみ又は対照マウスＩｇＧ抗体を５−ＦＵ／ロイコボリンとともに受けた。
【００５２】
転移モデル
Ｃ１７０ＨＭ２細胞を、３７℃、５％ ＣＯ２で加湿条件下において１０％熱不活化ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ １６４０培養培地中でｉｎ ｖｉｔｒｏに維持した。ほぼコンフルエントな単層から細胞を、０．０２５％ ＥＤＴＡを用いて回収し、上記の培養培地で二回洗浄し、ｉｎ ｖｉｖｏ投与のために滅菌ＰＢＳ（ｐＨ ７．４）に再懸濁した。１ｍｌの容量における１．５×１０６の細胞を、３０匹のオスのヌードマウスの腹腔に注射した。動物をそれらの治療群に割り当てて、治療を１日目に開始して、試験に間に亘って継続した。前記群のマウスを、１０μｇ若しくは１００μｇのＳＣ１０１／２９ ｍＡｂ又はビヒクル対照を用いてｉｖ注射によって、一日目及び次いで一週間に三回、治療した。マウスは４０日目に屠殺して、体重及び腫瘍の重量を評価した。
【００５３】
統計
統計分析を、ＰＣ用のＭｉｎｉｔａｂプログラムのＡｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｖａｒｉａｎｃｅ及びＬｏｇ Ｒａｎｋを用いて実施した。
【００５４】
（実施例２）
結果
結腸直腸腫瘍細胞による抗体結合
ＳＣ１０１ ｍＡｂは、ＬｅｗｉｓｙハプテンとＬｅｗｉｓｂハプテンとの双方に結合することが過去に示されている。新しく脱凝集させた結腸直腸腫瘍の強力な染色を、図１ａに示している。ｍＡｂは、脱凝集した卵巣及び胃の腫瘍にも結合する（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｂｉｏｓｃｉ．Ｒｅｐ．３：１６３）。さらに、これらの抗体は、原発腫瘍細胞の細胞死の促進を誘導した。ＳＣ１０１／２９抗体及びＳＣ１０１／３３抗体を用いた免疫組織化学及びフローサイトメトリー実験は、以下のタイプ：卵巣、胸部、肺、前立腺、及び膵臓の腫瘍細胞株及び腫瘍異種移植片に顕著に結合した（データ示さず）。
【００５５】
結腸直腸腫瘍細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける殺滅
当該殺滅を調べるために、さらに広範な細胞株を、ＳＣ１０１／２９ ｍＡｂによる結合（図１ａ）及び細胞増殖の阻害（図１ｂ及び１ｃ）についてスクリーニングした。Ｃ１７０及びＣｏｌｏ２０５細胞株の双方が、ＳＣ１０１／２９ ｍＡｂに結合したが、大半の原発性腫瘍が、より強力な結合を示した。対照的に、ＳＣ１０１／２９ ｍＡｂは、ＨＴ−２９及びＬｏＶｏには原発腫瘍の２０％に相当するレベルで弱く結合した。特に興味深いことは、ＳＣ１０１／２９が、Ｃ１７０及びＣｏｌｏ２０５細胞の増殖を阻害するが、Ｌｅｗｉｓｙ抗原及びＬｅｗｉｓｂ抗原を低レベルで発現するＨＴ−２９及びＬｏＶｏ細胞の増殖を阻害し得ないことである。
【００５６】
生存率試験
ＳＣ１０１／２９ ｍＡｂによって仲介される細胞死の機構を評価するために、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）という、等張条件下において非生細胞にのみ侵入し得る蛍光化合物をプローブとして使用して、細胞膜の完全性を失った細胞を同定した。図２ａ及び２ｂに示すように、ＳＣ１０１／２９ ｍＡｂは、Ｃｏｌｏ２０５及びＣ１７０細胞の浸透性を急速に増大させ、７５％超の細胞が、早くも抗体処理の３０分後にＰＩで強力に染色された。同一の条件下において、アポトーシス性細胞死を誘導することが既知の抗ＣＤ９５抗体又は対照マウスＩｇＧ抗体を用いて４時間に亘ってインキュベートした際には、１０％未満の細胞がＰＩを取り込んだ。同様に、Ｌｅｗｉｓｂには結合せずＬｅｗｉｓｙに結合するのみのｍＡｂであるＢＲ９６は、４時間に亘って、ＰＩの顕著な取り込みを示し得なかった。細胞増殖の阻害と一致して、ＳＣ１０１／２９ ｍＡｂは、低い抗原の発現を有するＨＴ−２９及びＬｏＶｏ細胞におけるＰＩ取り込みを誘導し得なかった。
【００５７】
ＳＣ１０１／４３も、膜透過性を変化する能力について分析したが、ＳＣ１０１／２９とは反対に、ＰＩ取り込みを誘導し得なかった（図３ａ）。しかしながら、それは、ＳＣ１０１／２９によって誘導されるＰＩ取り込みの阻害において非常に効果的であり、同一又は密接に関連するエピトープに結合することを示している。ＳＣ１０１／４３がアビジン／ビオチンを使用して架橋されている場合は、効果的に細胞死を誘導することも可能である。同様に、キメラＳＣ１０１／２９ ＩｇＧ２抗体の架橋は、結腸腫瘍細胞の直接的な殺滅を誘導する（図３ｃ）。ＳＣ１０１／２９は天然にダイマーとして存在するマウスＩｇＧ３であり、これらの結果は、Ｌｅｗｉｓｙ及びＬｅｗｉｓｂの架橋がオンコーシスには重要であり、ＳＣ１０１がそのダイマー構造により架橋するが、ＩｇＧ１であるＳＣ１０１／４３は人工的な架橋が必要であることを示す。
【００５８】
ＭＤＲ細胞株における薬剤取り込み
膜の完全性を失うことによって、低分子が細胞に接近することを可能にする。これは、蛍光薬剤であるドクソルビシンを用いて示されており、ＳＣ１０１／２９ ｍＡｂに対する広範な細胞の曝露の後に、抗原を高レベルで発現し、且つ、膜の完全性の損失している細胞株においてデュロキセチンの取り込みが向上したが（Ｃｏｌｏ２０５及びＣ１７０）、低い抗原密度を有する細胞では向上しなかった（ＨＴ−２９及びＬｏＶｏ、図２ｃ）。その効果は、ｐ−糖タンパク質を発現する細胞（Ｃ１７０）で更に強力に現れ（図２ｆ）、このことは、ＳＣ１０１／２９によって生じた膜の混乱が当該ポンプによる薬剤の排出を阻害したことを示す。
【００５９】
カスパーゼ依存性細胞死アッセイの阻害
膜の完全性の急速な損失は、膜に形成される細孔が、大きな細胞質タンパク質、例えば、ＬＤＨの放出を可能にするまで、そのサイズを大きくし続けるオンコーシスを生じさせる。ＰＩは完全性の損失を示すが、同時に起こるＣ１７０細胞からのＬＤＨの放出は認められなかった。ＬＤＨ放出が存在しないことによってＣ１７０のオンコーシスの発現に疑問を抱いたため、同定したＰＩ染色が、古典的なアポトーシスのアーチファクトによるものではないことを確認するために、全てのカスパーゼのインヒビターであるｚ−ＦＭＫ−ｖａｄを使用した。要するに、抗Ｆａｓに対する曝露は、Ｃ１７０細胞におけるアポトーシスを十分には誘導しないことが過去に認められていたが、前記インヒビターは、前記抗体の効果を完全に逆転させ得た（図３ｄ）。ｚ−ＦＭＫ−ｖａｄの存在下におけるＳＣ１０１／２９ ｍＡｂに対する腫瘍細胞の曝露は、認識可能な効果を有さず、このことは、細胞死の様式が古典的なアポトーシス経路からは独立していることを示す。
【００６０】
ストレス関連キナーゼを解するシグナル伝達
膜の透過性は、ＨＳＰ２７をリン酸化してアクチン重合を生じさせるｐ３８の活性化と強く関連している。弱いｐ３８活性化が、１時間後にＣ１７０細胞において認められ、４時間後により強力な活性化が認められた（図３ｅ）。対照的に、ＪＮＫ又はＥＲＫの活性化は存在しなかった。ストレスによって活性化されるタンパク質キナーゼであるｐ３８は、５−ＦＵを含む広範な化学療法剤によって誘導される。したがって、ＳＣ１０１／２９がｉｎ ｖｉｖｏで細胞死を誘導するかどうか及びこれが５−ＦＵと相乗効果を奏するかどうかを決定するために、ヒト異種移植片を移植したマウスにそれを投与した。
【００６１】
ｉｎ ｖｉｖｏ試験
前記抗体を、Ｃ１７０腫瘍の３ｍｍ２抽出物を移植したマウス又は抗体の投与前に５日間に亘って増殖させたＣ１７０腫瘍に一週間に三回投与した。前記動物は、ＳＣ１０１／２９ ｍＡｂのみ、５−ＦＵ／ロイコボリン、又は双方の組み合わせのいずれかを用いて３週間に亘って処理した。図４ａは、ＳＣ１０１／２９と５−ＦＵ／ロイコボリンとの双方のみが、新しく外植した腫瘍の腫瘍増殖阻害を生じさせた（ｐ＜０．００４ ＡＮＯＶＡ）。対照的に、双方の組み合わせは更なる増殖阻害を示し、２／１０のマウスのみが移植した腫瘍の０．３ｇという重量を超える任意の増殖を示した（図４ｂ ｐ＜０．０２ ＡＮＯＶＡ）。このＳＣ１０１／２９ ｍＡｂの用量は全てのマウスに良好に許容され、体重減少又は任意の他のひどい症状を示さなかった（図４ｃ）ＳＣ１０１／２９ ｍＡｂが、Ｃ１７０腫瘍を発現するマウスに、２５ｍｇ／ｋｇの５−ＦＵ／ロイコボリンと組み合わせて治療目的で投与される際は、腫瘍増殖を顕著に阻害し、且つ、生存を向上させた（図４ｄ：ｐ＜０．０１６３ Ｌｏｇ Ｒａｎｋ）。
【００６２】
細胞殺滅の機構はＳＣ１０１／２９の微小転移細胞に対する結合が非常に効果的であるはずであるため、肝臓転移の予防におけるＳＣ１０１／２９ ｍＡｂの治療効果を、Ｃ１７０ＨＭ２結腸直腸モデルを使用して評価した。マウスは、低用量である１００μｇ及び１０μｇのＳＣ１０１／２９ ｍＡｂを用いて一週間に三回、六週間に亘って治療した。試験の終わりに、摘出したＣ１７０ＨＭ２肝臓腫瘍の重量を測定した。各群について中央値を計算して、図５にデータをグラフ化した。各群についての中央値及び平均値は、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ試験によって統計学的有意性について分析した。１０μｇ及び１００μｇ ＳＣ１０１／２９ ｍＡｂ（第二群及び第三群）についての中央値は、ビヒクル対照（第一群）から有意（ｐ＜０．００１）であることが認められた。ＳＣ１０１／２９は当該モデルにおいて低用量であっても非常に効果的であったため、５−ＦＵは必要でなかった。
【００６３】
（実施例３）
考察
広範なＬｅｗｉｓｙ抗体が同定されているが、それらは一貫して、Ｌｅｗｉｓｘ及びＨ型２構造と交差反応する。このことが、正常な組織との望ましくない交差反応を生じさせ、臨床試験において後に毒性を誘導し得る。例えば、Ｈ抗原と交差反応するマウスｍＡｂ ＢＲ５５−２のフェーズＩ試験において、６／１２の患者において血尿症が存在し、２／９の患者においてｄｉａｈｏｒｅａが存在し、３人の患者において一過性の皮膚病変の減少が存在していた（Ｔｏｌｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１７：４７８−８４）。Ｌｅｗｉｓｙのみに対するＬＭＢ−１イムノトキシン（シュードモナス属のエンドトキシンに結合したＢ３抗体）は、５／３８の患者において反応を生じた（Ｐａｉ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２：３５０−３）。ＢＲ９６ ｍＡｂは、Ｂ血液型と交差反応するが、Ｌｅｗｉｓｂとは交差反応しない。胃腸に対する結合は用量制限的であり、抗体結合と関連することが示された（Ｓａｌｅｈ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１８：２２８２−９２）。最後に、Ｌｅｗｉｓｙ特異的なヒト化抗体である３Ｓ１９３は、結合試験において優れた選択性を示し（Ｓｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６０：３２５４−６１）、臨床試験に入っている。
【００６４】
ＳＣ１０１抗体は、ＬｅｗｉｓｙとＬｅｗｉｓｂとの双方の特有の面を認識する。ＳＣ１０１抗体は、Ｌｅｗｉｓｙ又はＬｅｗｉｓｂのいずれかを発現する広範な正常組織と強力な交差反応性を示すことを予測し得るが、他のＬｅｗｉｓ抗体とは対照的に、胃腸管内のムチンの弱い染色のみが認められた（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｂｉｏｓｃｉ．Ｒｅｐ．３：１６３）。このことは、ＢＲ９６ ｍＡｂを用いて認められた胃腸管の毒性はＳＣ１０１抗体を用いて回避し得ることを示す。
【００６５】
ＳＣ１０１抗体は、免疫エフェクター細胞なしでｉｎ ｖｉｔｒｏで腫瘍細胞死を誘導し、おそらく、ＩｇＧ３抗体はＣＤＣ及びＡＤＣＣといった媒介因子が非常に乏しいようなｉｎ ｖｉｖｏでも誘導する。非常に興味深いことは、腫瘍細胞が、殺滅されるためにＬｅｗｉｓｙ及びＬｅｗｉｓｂを過剰発現していることを必要としたことである。この発現レベルにおいて、８０％の胃腸管及び３０％の卵巣／胸部の腫瘍が、細胞の殺滅を受けやすいが、正常な組織は除外され、良好な治療方法を提供する。ＳＣ１０１／２９ ｍＡｂが膜の完全性の急速な損失を生じさせるように、細胞の殺滅の機構は非常に興味深い。これは、浸透圧刺激及び酸素過剰細胞において認められるオンコーシスによる細胞死と類似する（Ｇａｒｍｙｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１７：１２９０−５；Ｍｏｒｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２６９８１−８；Ｒｏｍａｎｓｈｋｏ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．３５：９７８−９３；Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：４５７７６−８４；Ｔｉｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９９６）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３９５：１３３−６）。しかしながら、伝統的なオンコーシスの進行は、次いで、ＬＤＨなどの細胞質の内容物の放出を生じさせる（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１７１：１−１１）。よく特徴付けられた抗Ｌｅｗｉｓｙ抗体であるＢＲ９６が細胞膜に対する作用を示さないので、細胞死の機構はＬｅｗｉｓｙ／Ｌｅｗｉｓｂ構造と関連しているようである。Ｌｅｗｉｓｙ及びＬｅｗｉｓｂが、天然のマウスＩｇＧ３又はＩｇＧ１バリアントのアビジン／ビオチン架橋によって架橋されて、膜の混乱を生じさせることも必要とした。腫瘍細胞死などの腫脹を誘導し得る幾つかの他の抗体が開示されている。これらは、広範に発現する糖タンパク質を認識する抗ポリミン（Ｐｏｒｉｍｉｎ）抗体（Ｍａ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９８：９７７８−８３）、腎臓関連糖タンパク質を認識するＲＥ２（Ｍａｔｓｕｏｋａ（１９９５）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１：２００７−２０１５）、及び新規の糖タンパク質を認識するＲＡＶ１２を含む。しかしながら、これらの抗体は、特にＭＤＲ細胞株において化学療法剤の取り込みを増大させることを示さないため、ＳＣ１０１は独特なものである。
【００６６】
細胞におけるＰＩ取り込みは、ｐ３８活性化を伴う。ｐ３８活性化はマイクロフィラメントダイナミクスを変化させるＨＳＰ２７のリン酸化と関連しているため（Ｄｅｓｃｈｅｓｎｅｓ（２００１）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ １２：１５６９−８２；Ｈｕｏｔ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １４３：１３６１−７３）、これによって膜の透過性が説明される。膜の完全性の損失は急速に起こるものであり、細胞死の上流にある。ｐ３８の活性化は、カスパーゼ依存性又は非依存性細胞死を誘導し得る（Ｄｅｓｃｈｅｓｎｅｓ（２００１）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ １２：１５６９−８２）。ＳＣ１０１／２９ ｍＡｂは、ＤＮＡ断片化を誘導し得ず（データは示さず）、全てのカスパーゼのインヒビターであるｚ−ＦＭＫ−ｖａｄを用いるカスパーゼの阻害は細胞死を妨げないようであり、このことは、抗体がカスパーゼ非依存性の細胞死を誘導することを示す。結腸直腸腫瘍は、アポトーシス反応に関与する遺伝子における＞７０％の変異を示し、当該反応を避ける任意の治療が非常に治療的価値がある（Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ（１９８８）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１９：５２５−３２；Ｆｕｌｄａ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｃｕｒｒ．Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ ４：５６９−７６）。１つのカスパーゼ非依存性の機構は、ミトコンドリアからのアポトーシス誘導因子（ＡＩＦ）の放出及びその核移行、そこで未知の様式において核濃縮に寄与することを伴う（Ｓｕｓｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２：５７１−８０）。
【００６７】
ストレス関連キナーゼであるｐ３８は、広範な化学療法剤によっても誘導され得るものであり、薬剤合成において極めて重要な役割を担っていると提案されている（Ｏｌｓｏｎ ＆ Ｈａｌｌａｈａｎ（２００４）Ｔｒｅｎｄ Ｍｏｌ Ｍｅｄ １０：１２５−９）。Ｌｅｗｉｓｙ及びＬｅｗｉｓｂは、腫瘍糖タンパク質及び糖脂質上で発現し、これらは、細胞ストレスに反応してアップレギュレートされる。実際、化学療法ストレス（Ｆｌｉｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２３：９−１４）、特に５−ＦＵに対するＬｅｗｉｓｙのアップレギュレートが過去に報告されている。したがって、５−ＦＵ／ロイコボリンは結腸直腸腫瘍に標準的な化学療法であるため、Ｌｅｗｉｓｙをアップレギュレートし、且つ、ｐ３８を活性化し得る（Ｆｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００２） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６２：１９２０−６）。ＳＣ１０１／２９及び５−ＦＵ／ロイコボリンの組み合わせを、ヌードマウスにおける結腸異種移植変の増殖疎外能力についてｉｎ ｖｉｖｏでスクリーニングした。ＳＣ１０１／２９ ｍＡｂのみ及び５−ＦＵ／ロイコボリンとの併用において、小さい腫瘍及び樹立腫瘍の双方の増殖を顕著に阻害した。キメラバージョンのＳＣ１０１／２９ ｍＡｂを用いたフェーズＩ試験が安全であることを示したら、その後に、手術後の結腸直腸癌患者において、薬剤のみとの比較における５−ＦＵ／ロイコボリンとＳＣ１０１／２９ ｍＡｂとの併用の試験が開始されるであろう。当該併用は、パノレックス／５−ＦＵは直接殺滅する活性を有さず、且つ、ＣＤＣ及びＡＤＣＣに依存しており、補体調節分子の過剰発現による固形癌への限定的な成功を有するため、パノレックス／５−ＦＵよりもさらに効果的であり得る（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ８４：８０−６）。
【００６８】
本発明者は、ＳＣ１０１／２９が、低分子量（＜８００Ｄ）の薬剤を取り込ませるが、ＬＤＨなどの大きな細胞内成分を放出させないように膜の透過性を誘導することを示した。ＳＣ１０１／２９は、ストレス関連キナーゼであるｐ３８のリン酸化を誘導するが、ＪＮＫのリン酸化は誘導せず、最終的にカスパーゼ非依存性細胞死を誘導する。セラミドがｐ３８の活性化及びＡＩＦを含む多数のミトコンドリアタンパク質の放出によって神経細胞死を誘導することが示されているため、このことは特に興味深い（Ｇｈａｔａｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：３３５−４７；Ｓｔｏｉｃａ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２９：３３５−７１）。Ｌｅｗｉｓｙ／Ｌｅｗｉｓｂは糖脂質上で主に発現するため、その分解は、セラミドの増加及びその後のｐ３８活性化を生じさせ得る。ＳＣ１０１／２９は古典的な経路によって細胞死を誘導しないため、古典的なアポトーシス又はオンコーシスに対する耐性機構を発達させている腫瘍細胞において特に効果的であり得る。しかしながら、その経路は、より注意深く解明し、本発明者による殺滅アッセイの更なる検証によって、潜在的な耐性機構の評価及び最適な腫瘍標的の同定をすることが必要である。
【００６９】
結論として、ＳＣ１０１／２９は、Ｌｅｗｉｓｙ及びＬｅｗｉｓｂを認識し、膜の完全性の損失を誘導することによって細胞死を直接誘導する新規ｍＡｂである。本願は、オンコーシスの様式において、腫瘍細胞を選択的に殺滅し得る血液型抗原を認識する抗体を初めて開示するものである。治療における相乗的な反応におけるｐ３８の役割は、次第に明らかになっている。ＳＣ１０１／２９は、５−ＦＵ／ロイコボリンとの組み合わせにおいて殺滅の促進を示し、これらの薬剤と組み合わせて使用して、毒性を低減し、且つ、癌治療の効果を増大させる。
【００７０】
本明細書を通じて、「含む」なる用語は、記載した要素、数字、若しくは工程、又は要素、数字、若しくは工程の群の包含を示すものであり、任意の他の要素、数字、若しくは工程、又は要素、数字、若しくは工程の群の排除を意味するものではないと解されるであろう。
【００７１】
本明細書で挙げた全ての文献は、参照によって本明細書に取り込む。本明細書に含まれる文献、行為、材料、装置、又は論文などの任意の議論は、本明細書の内容を提供するためだけのものである。これらが従来技術の基礎の一部を形成し、又は本願の各請求項の優先日前に豪州又は他の地域に存在した本発明に関連する分野の共通する一般的知識であったと認めるものとして解釈されるべきではない。
【００７２】
広範に記載したように本発明の精神又は範囲を逸脱すること無く、特定の実施態様に示したように、本発明の多数の変形例及び／又は修飾例を作製し得ることが当業者によって理解されるであろう。本実施態様は、したがって、全ての態様において説明するものであり、限定するものではないと解されるべきである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の治療に有用な抗体又は抗原結合断片を含む結合複合体に関する。特に、本発明は、Ｌｅｗｉｓｙ抗原とＬｅｗｉｓｂ抗原との双方に結合する抗体又は抗原結合断片を含む結合複合体であって、前記抗体又は抗原結合断片がマルチマーの形態にある、結合複合体を提供する。前記結合複合体は、Ｌｅｗｉｓｙ及びＬｅｗｉｓｂを過剰発現している腫瘍細胞において細胞死を誘導する。
【背景技術】
【０００２】
Ｌｅｗｉｓｙ及びＬｅｗｉｓｂは、乳癌、肺癌、結腸癌、及び卵巣癌によって過剰発現されている複合糖質である。したがって、それらは、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）治療の良好な標的である。Ｌｅｗｉｓｙハプテンは、二型血液型オリゴ糖で発見されたジフコシル化四糖類（Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ）である。この抗原は、Ｌｅｗｉｓｂハプテン（Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３（Ｆｕｃα１−４）ＧｌＮＡｃ））の位置異性体及びＬｅｗｉｓｘハプテンのフコシル化誘導体である（Ａｂｅ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｃｈ ４６：２６３９；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｃｈ ４６：５９８５）。Ｌｅｗｉｓｙは胸部、気管支、脾臓、秘尿生殖器、及び胃腸管の深部にある腺内において発現する。対照的に、Ｌｅｗｉｓｂは、表面上皮によって発現する（Ｓａｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４９：７４５−５２；Ｋｉｔａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：１２９５７−６１）。
【０００３】
ＩｇＭマウスｍＡｂであるＣ１４は、標準的な融合方法を用いて原発結腸直腸腫瘍細胞に対して作製し、ＬｅｗｉｓｙとＬｅｗｉｓｂとの双方の（伸長又は非伸長（ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｏｒ ｎｏｎ−ｅｘｔｅｎｄｅｄ））抗原に結合する（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｂｉｏｓｃｉ．Ｒｅｐ．３：１６３；Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ３３：７２７；Ｄｕｒｒａｎｔ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １２：６４７−６０）。Ｃ１４抗体は、７８％の結腸直腸癌に結合したが（Ｄｕｒｒａｎｔ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８１：６８８−９５）、マウスＩｇＭなので、ｉｎ ｖｉｖｏ試験には適さなかった。その抗体のＩｇＧバリアントを生産するために、Ｃ１４ｍＡｂでラットを免疫して、生産されたラットの抗Ｃ１４を精製した。この抗血清及びＣ１４ｇｐ２００抗原でマウスに免疫した後に、それらの脾細胞をマウスのミエローマと融合させて、５種のＩｇＧ ｍＡｂ、すなわち、２種のＩｇＧ３（ＳＣ１０１／２３、ＳＣ１０１／２９ ｍＡｂ）及び３種のＩｇＧ１（ＳＣ１０１／３３、ＳＣ１０１／４２、及びＳＣ１０１／４３）（これらの５種の抗体は既に「６９２」抗体として公開している）を生産させた。全てのＩｇＧバリアントは、Ｌｅｗｉｓｙ及びＬｅｗｉｓｂ抗原を認識し、Ｃ１４と同一の特異性を示した。さらに、これらの抗体は、薄層クロマトグラフィー及びＥＬＩＳＡによって、伸長及び非伸長Ｌｅｗｉｓｙ及びＬｅｗｉｓｂハプテンに結合するが、Ｌｅｗｉｓｘ又はＨ血液型ハプテンには結合しないことが示された（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｂｉｏｓｃｉ．Ｒｅｐ．３：１６３）。
【０００４】
ＬｅｗｉｓｙとＬｅｗｉｓｂとの双方に結合する抗体は既知であるが、ＳＣ１０１ ｍＡｂは、Ｌｅｗｉｓｙ決定基とＬｅｗｉｓｂ決定基との双方を認識するという能力において特異なものである。他のｍＡｂはこれらの２つの分子の同様の面を認識せず、また、１つの珍しいレクチンのみがこれらの２つの分子の同様の面を認識する。Ｌｅｗｉｓ ｙ／ｂは、糖脂質としてセラミド骨格上で大部分が発現する。最近の結晶学的研究によって、Ｌｅｗｉｓｙに特異的な抗体は、ハプテンのＮ−アセチルグルコサミン又はフコースのいずれかに適応する（Ｒａｍｓｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０：８０９−１８）非常に異なる結合部位を有することが示された。ＳＣ１０１は、ＬｅｗｉｓｙとＬｅｗｉｓｂとが互いに立体異性体であるため非常に珍しいことに、ＬｅｗｉｓｙとＬｅｗｉｓｂとの双方の面に結合部位が適応するため異なる。更に興味深いことに、これらの抗体は、おそらくセラミド又は他の密接に関連する分子からの立体障害のため、胃腸管を含む大半の通常の組織における糖脂質を認識することができない。このことにより、ＳＣ１０１抗体は特有の組織分布を有するが、広範な上皮腫瘍に非常に強力に結合する（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｂｉｏｓｃｉ．Ｒｅｐ．３：１６３）。
【０００５】
脱凝集された原発結腸直腸腫瘍に対する抗体結合の最初の特性決定の間に、それらが細胞死を誘導することが認められた。細胞死は、アポトーシス及びオンコーシスを含む多数の機構によって生じ得る。アポトーシスはカスパーゼ依存性であり、最終的には細胞のアポトーシス小体への分割を生じさせる細胞収縮、クロマチンの凝縮及び辺縁趨向、並びに細胞膜のラッフリングを特徴とする。オンコーシスは、早期の細胞壊死であり、膜透過性の増大期の結果としての細胞膨張を特徴とする。壊死は、細胞死後に現れ、アポトーシス又はオンコーシスの後に生じる形態変化である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ａｂｅ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｃｈ ４６：２６３９
【非特許文献２】Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｃｈ ４６：５９８５
【非特許文献３】Ｓａｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４９：７４５−５２
【非特許文献４】Ｋｉｔａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：１２９５７−６１
【非特許文献５】Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｂｉｏｓｃｉ．Ｒｅｐ．３：１６３
【非特許文献６】Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ３３：７２７
【非特許文献７】Ｄｕｒｒａｎｔ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １２：６４７−６０
【非特許文献８】Ｄｕｒｒａｎｔ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８１：６８８−９５
【非特許文献９】Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｂｉｏｓｃｉ．Ｒｅｐ．３：１６３
【非特許文献１０】Ｒａｍｓｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０：８０９−１８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者は、ＳＣ１０１／２９ ｍＡｂによる腫瘍細胞の殺滅を実証し、当該抗体が、古典的なオンコーシスと多数の類似点を有する特有の機構によって、ｉｎ ｖｉｔｒｏとｉｎ ｖｉｖｏの双方においてＬｅｗｉｓｙ及びＬｅｗｉｓｂを過剰発現する腫瘍細胞を直接殺滅することを実証した。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の第一の態様では、ＬｅｗｉｓｙとＬｅｗｉｓｂとの双方に結合する抗体又は抗原結合断片を含む結合複合体であって、前記抗体又は抗原結合断片がマルチマーの形態にある、結合複合体を提供する。
【０００９】
本発明の第二の態様では、本発明の第一の態様に係る結合複合体の有効量を対象に投与する工程を含む、Ｌｅｗｉｓｙ抗原及びＬｅｗｉｓｂ抗原を過剰発現している腫瘍細胞における細胞死の誘導を提供する。
【００１０】
本発明の第三の態様では、本発明の第一の態様に係る結合複合体の治療上有効量を対象に投与する工程を含む、治療の必要がある対象の癌を治療するための方法を提供する。
【００１１】
本発明の第四の態様では、本発明の第一の態様に係る結合組成物を製薬学的に許容される担体又は希釈剤と共に含む、Ｌｅｗｉｓｙ抗原及びＬｅｗｉｓｂ抗原を過剰発現している腫瘍細胞における細胞死を誘導するための医薬組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１ａ】間接免疫蛍光によってアッセイし、フローサイトメトリーで分析した、新しく脱凝集させた結腸直腸腫瘍細胞に対するＳＣ１０１の結合を示す。各々のバーは、個々の腫瘍の平均蛍光を示す。結腸直腸腫瘍細胞株であるＣｏｌｏ２０５、Ｃ１７０、ＨＴ２９、及びＬｏＶｏに対するＳＣ１０１の結合を比較のために示している。
【図１ｂ】ＳＣ１０１／２９によるＬｏＶｏ及びＣ１７０細胞のＩＣ５０増殖阻害曲線を示す。増殖阻害の％を、ＳＣ１０１／２９ｍＡｂに曝露した細胞数／対照ｍＡｂに曝露した細胞数として表示した。増殖阻害曲線からの生細胞数を、４９０ｎｍの吸光度の読み取るＭＴＳによって決定した。
【図１ｃ】ＳＣ１０１／２９によるＣｏｌｏ２０５及びＨＴ−２９のＩＣ５０増殖阻害曲線を示す。増殖の阻害％は、ＳＣ１０１／２９ ｍＡｂに曝露された細胞数／対照ｍＡｂに曝露された細胞数として表示される。増殖阻害曲線からの生細胞数は、４９０ｎｍにおける吸光度を読取るＭＴＳによって決定した。
【図２ａ】３０μｇ／ｍｌのＩｇＧ、３００ｎｇ／ｍｌの抗ＦａｓクローンＣｈ１１、３０μｇ／ｍｌのＢＲ９６、又は３０μｇ／ｍｌのＳＣ１０１／２９ ｍＡｂのいずれかを用いて３０分、２時間、又は４時間処理した２×１０５のＣｏｌｏ２０５細胞を示す。細胞は、ＰＩを用いて１５分間に亘って室温で暗所において染色し、４８８ｎｍでＦＣ５００フローサイトメーター（発光 ６２０ｎｍ ＦＬ３）を用いて分析した。
【図２ｂ】３０μｇ／ｍｌのＩｇＧ、３００ｎｇ／ｍｌの抗ＦａｓクローンＣｈ１１、３０μｇ／ｍｌのＢＲ９６、又は３０μｇ／ｍｌのＳＣ１０１／２９ ｍＡｂのいずれかを用いて３０分、２時間、又は４時間処理した２×１０５のＣ１７０細胞を示す。細胞は、ＰＩを用いて１５分間に亘って室温で暗所において染色し、４８８ｎｍでＦＣ５００フローサイトメーター（発光 ６２０ｎｍ ＦＬ３）を用いて分析した。
【図２ｃ】３０μｇ／ｍｌのＩｇＧ、３００ｎｇ／ｍｌの抗ＦａｓクローンＣｈ１１、３０μｇ／ｍｌのＢＲ９６、又は３０μｇ／ｍｌのＳＣ１０１／２９ ｍＡｂのいずれかを用いて３０分、２時間、又は４時間処理した２×１０５のＨＴ−２９細胞を示す。細胞は、ＰＩを用いて１５分間に亘って室温で暗所において染色し、４８８ｎｍでＦＣ５００フローサイトメーター（発光 ６２０ｎｍ ＦＬ３）を用いて分析した。
【図２ｄ】３０μｇ／ｍｌのＩｇＧ、３００ｎｇ／ｍｌの抗ＦａｓクローンＣｈ１１、３０μｇ／ｍｌのＢＲ９６、又は３０μｇ／ｍｌのＳＣ１０１／２９ ｍＡｂのいずれかを用いて３０分、２時間、又は４時間処理した２×１０５のＬｏＶｏ細胞を示す。細胞は、ＰＩを用いて１５分間に亘って室温で暗所において染色し、４８８ｎｍでＦＣ５００フローサイトメーター（発光 ６２０ｎｍ ＦＬ３）を用いて分析した。
【図２ｅ】１００μｇ／ｍｌのＳＣ１０１／２９ ｍＡｂを用いて３０分に亘って０から１０μＭドクソルビシンの存在下において処理した２×１０５のＣｏｌｏ２０５、Ｃ１７０、ＨＴ−２９、又はＬｏＶｏ細胞を示す。細胞は、４８８ｎｍでＦＣ５００フローサイトメーター（発光 ５７５ｎｍ ＦＬ２）を用いて分析した。
【図２ｆ】細胞をｐ−糖タンパク質（０．３から３０μｇ／ｍｌ）を認識するｍＡｂを用いて染色し、４８８ｎｍでＦＣ５００フローサイトメーター（発光 ５２５ ＦＬ１）を用いて分析した。
【図３ａ】ＳＣ１０１／２９、ＳＣ１０１／４３、又はそれらの双方のｍＡｂのいずれかを用いて１時間に亘って処理した２×１０５のＣ１７０細胞を示す。細胞は、ＰＩを用いて１５分に亘って室温で暗所において染色し、４８８ｎｍでＦＣ５００フローサイトメーター（発光 ６２０ ＦＬ３）を用いて分析した。
【図３ｂ】１００μｇ／ｍｌのＩｇＧ、アビジンと混合した１００μｇ／ｍｌのＩｇＧ、１００μｇ／ｍｌのＳＣ１０１／２９、１００μｇ／ｍｌのＳＣ１０１／４３−ビオチン、又はアビジンと架橋した１００μｇ／ｍｌのビオチン化ＳＣ１０１／４３のいずれかを用いて１時間に亘って処理した２×１０５のＣ１７０細胞を示す。細胞は、ＰＩを用いて１５分に亘って室温で暗所において染色し、４８８ｎｍでＦＣ５００フローサイトメーター（発光 ６２０ ＦＬ３）を用いて分析した。
【図３ｃ】１００μｇ／ｍｌのマウスＳＣ１０１／２９ヒトＩｇＧ２キメラ抗体で３０分間に亘って処理し、続いて架橋抗ヒトＩｇＧ抗体（０−１００μｇ／ｍｌ）を用いて処理した１×１０５のＣｏｌｏ２０５細胞を示す。３時間室温でインキュベートした後に、細胞を７ＡＡＤを用いて２０分間に亘って暗所で染色し、４８８ｎｍでＣｅｌｌ Ｑｕａｎｔａ ＳＣ ＭＰＬを用いて分析した。２つのサンプルにおける死（７ＡＤＤ＋）細胞の平均割合を示す。
【図３ｄ】１００μｇ／ｍｌのアイソタイプネガティブｍＡｂ、１００ｎｇ／ｍｌの抗Ｆａｓ、又は１００μｇ／ｍｌのＳＣ１０１／２９ ｍＡｂを用いて、０、１、又は１０μＭのいずれかのｚ−ＦＭＫ−ｖａｄ ｐａｎ−カスパーゼインヒビターの存在下において、約１２時間に亘って処理した５×１０５のＣ１７０細胞を示す。細胞は、アネキシンＶ及びＰＩを用いて１５分に亘って室温で暗所において染色し、４８８ｎｍでＦＣ５００フローサイトメーター（発光 ５２５ｎｍ ＦＬ１、６２０ｎｍ ＦＬ３）を用いて分析した。
【図３ｅ】ＩｇＧ（３０μｇ／ｍｌ）ネガティブコントロールに４時間、ＳＣ１０１に１から４時間、又は０．５Ｍのソルビトールに３０分間（ポジティブコントロール）曝露した２×１０６のＣ１７０細胞を示す。細胞は、氷冷Ｔｒｉｓ抽出干渉液＋０．５ｍＭ ＮａＶＯ４中で抽出し、７５μｇの総タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで１レーン毎に載せた。１０％ゲルを１３０Ｖで９０分間に亘って分離させ、ＢｉｏＲａｄ ｓｅｍｉ−ｄｒｙ ｂｌｏｔｔｅｒ（１２Ｖ 定電圧）で７０分間に亘ってＰＶＤＦ膜に転写させた。膜をブロッキングして、２ｍｌあたり１μｌのＰ−ｐ３８、Ｐ−ＪＮＫ、又はＰ−ＥＲＫ（１％ ＢＳＡ ＴＢＳ−Ｔ、ＥＣＬ Ｐｌｕｓ＋を用いて洗浄及び現像した）で探索した。
【図４ａ】ヌードマウスにおけるＣ１７０異種移植片の増殖に対するＳＣ１０１／２９ ｍＡｂ、５−ＦＵ／ロイコボリン、又はＳＣ１０１／２９ｍＡｂと５−ＦＵ／ロイコボリンとの組み合わせの効果を表すグラフを示す。Ｃ１７０異種移植片の増殖は、動物をＳＣ１９１／２９ ｍＡｂ ｉｐ（０．２ｍｇ）、対照抗体 ｉｐ（０．２ｍｇ）、及び５−ＦＵ／ロイコボリン（１２．５ｍｇ／ｋｇ；ｉｖ）を用いて処理した際に、断面積（ｍｍ２）の測定によって、１２、１６、１９、及び２３日目に測定した。２３日目に得られた結果の分散分析は、ＳＣ１０１／２９ ｍＡｂを未処理の対照群と比較した際に、ｐ＜０．００４の有意な値を示し、ＳＣ１０１／２９ ｍＡＢ＋５−ＦＵ／ロイコボリンに対する対照群＋５−ＦＵ／ロイコボリンについてはｐ＜０．０２０の有意な値を示した。
【図４ｂ】ＳＣ１０１／２９ ｍＡｂのみ（第二群）、５−ＦＵ／ロイコボリンのみ（第三群）、若しくはＳＣ１０１／２９ ｍＡｂと５−ＦＵ／ロイコボリンとの組み合わせ（第四群）を用いて免疫されているか又は未処理（第一群）のマウスの最終腫瘍重量を示す。
【図４ｃ】ＳＣ１０１／２９ ｍＡｂのみ、５−ＦＵ／ロイコボリンのみ、若しくはＳＣ１０１／２９ ｍＡｂと５−ＦＵ／ロイコボリンとの組み合わせを用いて免疫されているか又は未処理のマウスの重量を示す。
【図４ｄ】ＳＣ１０１／２９ ｍＡｂ ｉｐ（０．２ｍｇ）、５−ＦＵ／ロイコボリン（１２．５ｍｇ／ｋｇ ｉｖ）、又はＳＣ１０１／２９ ｍＡｂ（０．２ｍｇ）と５−ＦＵ／ロイコボリン（１２．５ｍｇ／ｋｇ ｉｖ）との組み合わせを用いて処理したＣ１７０異種移植片を有する動物の生存データを示す。ＳＣ１０１／２９ ｍＡｂを７日目に与え、次いで１週間に３回与えた。５−ＦＵ／ロイコボリンは、１、３、５、及び７日目に与えた。ＳＣ１０１／２９ ｍＡｂは、５−ＦＵ／ロイコボリンと併用する際には、ビヒクル対照マウスを超えて生存率を有意に改善した（ｐ＝０．０１６３ Ｌｏｇ Ｒａｎｋ）。
【図５】Ｃ１７０ＨＭ２肝臓転移ヌードマウスモデルにおける最終肝臓腫瘍重量（ｇ）に対する１０μｇ若しくは１００μｇのＳＣ１０１／２９ ｍＡｂ又はビヒクル対照の効果を表すグラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明者は、Ｌｅｗｉｓｙ抗原とＬｅｗｉｓｂ抗原との双方に結合する抗体又は抗原結合断片を含む結合複合体が、Ｌｅｗｉｓｙ及びＬｅｗｉｓｂを過剰発現している腫瘍細胞における細胞死を誘導することを実証した。
【００１４】
本発明の第一の態様では、Ｌｅｗｉｓｙ抗原とＬｅｗｉｓｂ抗原との双方に結合する抗体又は抗原結合断片を含む結合複合体であって、前記抗体又は抗原結合断片がマルチマーの形態にある、結合複合体を提供する。
【００１５】
本明細書において使用する用語「抗体」は、４つのポリペプチド鎖、すなわちジスルフィド結合で相互に連結した２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ又はＶＨ）及び重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメインとしてＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ又はＶＬ）及び軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメインとしてＣＬを含む。ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存された領域が散りばめられた、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変領域に細分することが可能である。各ＶＨ及びＶＬは、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順番でアミノ末端からカルボキシ末端へと配置された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲからなる。
【００１６】
本明細書で使用する、抗体の「抗原結合断片」という用語は、抗原に結合する能力を示す免疫グロブリンの１つ又は複数の成分又は誘導体を示す。抗体の抗原結合機能は、全長の抗体の断片によって奏されるものであることが示されている。抗体の「抗原結合断片」という用語の範囲に含まれる結合断片の例は、（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、及びＣＨ１ドメインからなる一価断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって結合した２つのＦａｂ断片を含む二価断片；（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の１つの腕のＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｖ）１つのＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６）又はＶＬドメイン（ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｕｋｅｎ ｅｔ ａｌ（２００１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，３１０，５９１）；（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）；並びに（ｖｉｉ）同種のフレームワーク領域によって融合した複数の相補性決定領域、例えばＱｉｕ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２５（８）：９２１−９２９に開示されているものを含む。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶＬ及びＶＨは別々の遺伝子にコードされているが、それらは、ＶＬ領域とＶＨ領域が対になって一価分子（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦＶ）としても知られている）を形成する単鎖タンパク質とすることを可能にする合成リンカーによって、組換え法を用いて、連結させてよい（Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６；Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３）。その様な単鎖Ｆｖも、抗体の「抗原結合断片」という用語の範囲内含まれることが意図される。単鎖ＦＶ及び関連する分子、例えば、二重特異性抗体又は三重特異性抗体も含まれる。二重特異性抗体は、短いために同一の鎖上において２つのドメインの間で対を形成することを可能にするリンカーを使用するがＶＨドメインとＶＬドメインとが単独のポリペプチド鎖に発現され、そのドメインを他の鎖の相補的なドメインと対を形成させ、２つの抗原結合部位を生じさせている二価の抗体である（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８；Ｐｏｌｊａｋ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：１１２１−１１２３）。
【００１７】
抗体又は抗原結合断片がマルチマーの状態にあることは、本発明に必須の特徴である。抗体又は抗原結合断片は、Ｌｅｗｉｓｙ抗原とＬｅｗｉｓｂ抗原との双方に結合して、抗原の架橋を生じさせる。Ｌｅｗｉｓｙ抗原とＬｅｗｉｓｂ抗原との架橋は、Ｌｅｗｉｓｙ及びＬｅｗｉｓｂを過剰発現している細胞についての腫瘍細胞死の仲介において重要であり得る。
【００１８】
本明細書で使用する用語「マルチマー」は、互いに結合を形成している２つ又はそれ以上の抗体又は抗原結合断片を意味する。さらに、マルチマーは、ホモ又はヘテロマルチマーであってよい。例えば、マルチマーは、ホモ若しくはヘテロダイマー、ホモ若しくはヘテロトリマー、又はそれより高度のマルチマーであってよい。ホモマルチマーは、同一の抗体又は抗原結合断片を含むマルチマーであり、ヘテロマルチマーは、少なくとも２つの異種抗体又は抗原結合断片を含むマルチマーである。しかしながら、マルチマーの組成にかかわらず、各抗体又は抗原結合断片は、Ｌｅｗｉｓｙ抗原とＬｅｗｉｓｂ抗原との双方に結合する必要がある。
【００１９】
本発明の好ましい実施態様では、マルチマーは、ホモ又はヘテロダイマーである。
【００２０】
本発明の更に好ましい実施態様では、抗体が自然にはダイマー又はマルチマーを形成しない。
【００２１】
本明細書で使用する用語「Ｌｅｗｉｓｙ抗原とＬｅｗｉｓｂ抗原との双方に結合する」は、Ｌｅｗｉｓｙ抗原とＬｅｗｉｓｂ抗原とが架橋を形成するように、Ｌｅｗｉｓｙ抗原とＬｅｗｉｓｂ抗原との双方に結合する抗体又は抗原結合断片を意味する。
【００２２】
本明細書で使用する用語「結合する」は、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）表面プラズモン共鳴システム及びＢＩＡｃｏｒｅ（商標）動力学的評価ソフト（例えば、ｖｅｒｓｉｏｎ ２．１）を使用して表面プラズモン共鳴分析によって測定すると、１μＭ以下の解離定数（Ｋｄ）を有する、抗体の免疫グロブリン可変領域による抗原への結合を意味する。特異的な結合相互作用についての親和性又は解離定数（Ｋｄ）は、約５００ｎＭから約５０ｐＭ、より好ましくは約５００ｎＭ以下、より好ましくは約３００ｎＭ以下、好ましくは少なくとも約３００ｎＭから５０ｐＭ、約２００ｎＭから約５０ｐＭ、より好ましくは約１００ｎＭから約５０ｐＭ、約７５ｎＭから約５０ｐＭ、約１０ｎＭから約５０ｐＭである。
【００２３】
本発明のある実施態様では、抗体又は抗原結合断片が、二重特異性抗体又は多重特異性抗体である。本発明の他の実施態様では、二重特異性抗体又は多重特異性抗体が修飾されたＦｃドメインを含む。
【００２４】
本発明の他の実施態様では、抗体又は抗原結合断片を含むマルチマーがＩｇＧ抗体である。本発明の更なる実施態様では、マルチマーがダイマーのＩｇＧ１抗体である。
【００２５】
幾つかの抗体（例えば、ＩｇＧ３）はｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでダイマーを形成し、ＩｇＧ１抗体はモノマー形態で存在する。モノマーの抗体又はその抗原結合断片が、Ｌｅｗｉｓｙ抗原及びＬｅｗｉｓｂ抗原を過剰発現している腫瘍細胞において腫瘍細胞死を誘導し得るために、Ｌｅｗｉｓｙ抗原及びＬｅｗｉｓｂ抗原は、モノマーの抗体又は抗原結合断片のアビジン／ビオチンによる架橋によって架橋される。代替的には、モノマーの抗体又は抗原結合断片は、組換え工学、例えば、モノマーのカルボキシ末端における鎖間ジスルフィド結合の形成を可能にする、ＣＨ３領域の遺伝子におけるセリンからシステインへの変異によって、架橋されてよい（Ｃａｒｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１１９１−１１９５）。これが、次いで、Ｌｅｗｉｓｙ抗原とＬｅｗｉｓｂ抗原との架橋を容易にする。
【００２６】
本発明の第二の態様では、Ｌｅｗｉｓｙ抗原とＬｅｗｉｓｂ抗原との双方に結合する抗体又は抗原結合断片を含む結合複合体の有効量を対象に投与する工程を含む、Ｌｅｗｉｓｙ抗原及びＬｅｗｉｓｂ抗原を過剰発現している腫瘍細胞において細胞死を誘導するための方法であって、前記抗体又は抗原結合断片がマルチマーの形態にある、方法を提供する。
【００２７】
本発明の第三の実施態様では、Ｌｅｗｉｓｙ抗原とＬｅｗｉｓｂ抗原との双方に結合する本発明の第一の態様に係る結合複合体の治療上有効量を、対象に投与する工程を含む、治療の必要がある対象の癌を治療するための方法を提供する。
【００２８】
用語「治療上有効量」は、特定の疾患若しくは障害（本発明の場合には癌）又はその症状の１つ若しくは複数を治療又は緩和し、及び／又は疾患又は障害の発生を予防又は低減させるために十分な、抗体又はその抗原結合断片（抗体又は抗原結合断片を含む医薬組成物を含む）の量を意味する。
【００２９】
抗体又はその抗原結合断片（抗体又はその抗原結合断片を含む医薬組成物を含む）の使用及び治療方法に関して使用する際に、「治療の必要がある」個体は、癌であると診断されているか又は過去に治療されている個体であってよい。
【００３０】
本発明の好ましい実施態様では、癌は、乳癌、肺癌、結腸癌、及び卵巣癌からなる群から選択されてよい。
【００３１】
本発明の第四の態様では、本発明の第一の態様に係る結合複合体を製薬学的に許容される担体又は希釈剤と共に含む、Ｌｅｗｉｓｙ抗原及びＬｅｗｉｓｂ抗原を過剰発現している腫瘍細胞において細胞死を誘導するための医薬組成物を提供する。
【００３２】
「製薬学的に許容される担体又は希釈剤」は、任意の全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤若しくは抗真菌剤、等張剤、及び吸収遅延剤などの生理的に適合するものを含む。製薬学的に許容される担体の例は、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、及びそれらの組み合わせの１つ又は複数を含む。多くの場合において、等張剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、又は塩化ナトリウムを組成物に含むことが好ましいであろう。
【００３３】
組成物は、液体、半固体、又は固体の剤形、例えば、溶液（例えば、注射可能な溶液及び輸液可能な溶液）、分散物又は懸濁物、錠剤、丸剤、粉末剤、リポソーム、又は座剤を含む各種の形態にあってよい。好ましくは、組成物は、免疫のための注射可能な溶液の形態にある。投与は、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内、経皮、鞘内、及び動脈内であってよい。好ましくは、前記剤形は、約０．００１ｍｇから約１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲内で、毎日、毎週、二週若しくは三週に一度、又は毎月投与され、好ましくは約０．０５から約５ｍｇ／ｋｇ体重で毎週投与される。
【００３４】
前記組成物は、滅菌した注射可能な溶液の調製のための滅菌粉末として製剤化されてもよい。
【００３５】
ある実施態様では、結合複合体が、急速な放出に対して化合物を保護する担体と共に調製されてよく、例えば、インプラント、経皮パッチ、及びマイクロカプセル化送達系を含む制御放出製剤であってよい。適合性のあるポリマーが使用されてよく、例えば、エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、又はポリ乳酸が使用されてよい。
【００３６】
前記組成物は、経口投与のために製剤化されてもよい。この実施態様では、抗体は、硬質ゼラチンカプセル又は軟質ゼラチンカプセルに覆われてよく、錠剤に押し固められてよく、又は対象の食料に直接含ませてもよい。
【００３７】
前記組成物は、直腸投与のために製剤化されてもよい。
【００３８】
本発明の結合複合体は、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて特定の細胞に結合及び同定するか、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて特定の細胞に結合及び破壊するか、又はｉｎ ｖｉｖｏにおいて特定の細胞に入り込み、破壊するために投与されてよい。
【００３９】
好ましい実施態様では、前記組成物はヒトに投与される。
【００４０】
本発明の本質がより明確に理解され得るように、その好ましい態様を、以下の非限定的な実施例を参照して説明する。
【実施例】
【００４１】
（実施例１）
材料及び方法
細胞株
Ｃ１７０は、原発腫瘍由来の結腸直腸細胞である（Ｄｕｒｒａｎｔ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ５３：３７−４５）。Ｃｏｌｏ２０５、ＨＴ−２９、及びＬｏＶｏは、ＡＴＣＣから得られた結腸直腸細胞である。全ての細胞は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ Ｆ６１７８；Ｓｉｇｍａ，Ｐｏｏｌｅ，ＵＫ）ＲＰＭＩ１６４０（ＢＥ１２−７０２Ｆ；Ｃａｍｂｒｅｘ Ｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｅｒｋｓｈｉｒｅ，ＵＫ）において培養した。
【００４２】
モノクローナル抗体
ＬｅｗｉｓｙハプテンとＬｅｗｉｓｂハプテンとの双方を認識するＳＣ１０１ ｍＡｂは、過去に開示されている（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｂｉｏｓｃｉ．Ｒｅｐ．３：１６３；Ｄｒｕｕｒａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １２：６４７−６０）ように精製した。抗Ｆａｓ（ヒト活性化）クローンＣｈ１１（０５−２０１）抗体は、Ｕｐｓｔａｔｅから得られ、Ｂｒ９６およびＩｇＧネガティブコントロールはＳｉｇｍａ（Ｉ５３８１）から得られた。
【００４３】
結腸直腸細胞に結合する抗体
腫瘍検体は、結腸直腸癌の切除時に得た。検体を非常に細かく切って、０．０５％のコラゲナーゼ（タイプＩＶ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｌｅｗｅｓ，ＵＫ）を用いて２０分間に亘って３７℃で脱凝集させて、ＳＣ１０１／２９及びヤギ抗マウスＦＩＴＣ（Ｄａｋｏ Ｌｔｄ，Ｂｕｃｋｓ ＵＫ；１：１００希釈）を用いて間接免疫蛍光によって染色した。腫瘍細胞株は一定分量（１０５）に分けて、ＳＣ１０１／２９ ｍＡｂ又は抗Ｐ−糖タンパク質（多剤耐性を示す、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＵＳＡ）を各種の濃度で用いて、４℃において３０分間に亘って染色した。培地（ＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ）で二回洗浄した後に、細胞を二次抗体（ヤギ抗マウスＦＩＴＣ）を用いて４℃で３０分間に亘ってインキュベートし、その後に、最終的な洗浄を行い、４８８ｎｍでＦＣ５００フローサイトメーター（発光５２５ｎｍ ＦＬ１）において分析した。
【００４４】
結腸直腸腫瘍細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける殺滅
１×１０３の結腸直腸Ｃ１７０、Ｃｏｌｏ２０５、ＨＴ−２９、及びＬｏＶｏ細胞を、平底９６ウェルプレートの個々のウェルに一定分量に分けて、一晩３７℃で静置して接着させた。翌日、１００、３０、１０、３、１、又は０μｇ／ｍｌのＳＣ１０１／２９ ｍＡｂ（１００μｌ／ウェル）を用いて細胞を処理した。アイソタイプに適合したポジティブコントロール又はネガティブコントロールを比較のために使用した。ウェルを３つ重複させて使用した。細胞を抗体の存在下で３７℃に５日間に亘って静置した後に、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｇ３５８０；Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ，ＵＫ）を各ウェルに添加して、４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００４５】
ＰＩ取り込み
２×１０５のＣｏｌｏ２０５、Ｃ１７０、ＨＴ−２９、又はＬｏＶｏ細胞を、３０μｇ／ｍｌのＩｇＧ、３００ｎｇ／ｍｌの抗Ｆａｓ、３０μｇ／ｍｌのＢＲ９６、又はＳＣ１０１／２９ ｍＡｂのいずれかを３０分、２時間、又は４時間に亘って処理した。その後に、ＰＩ（６３０１１０；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）を用いて１５分間に亘って暗所で室温において細胞を染色し、４８８ｎｍでＦＣ５００ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒを用いて分析した（発光６２０ｎｍ ＦＬ３）。
【００４６】
７ＡＡＤ取り込み
１×１０５のＣｏｌｏ２０５を、１００μｇ／ｍｌのマウスＳＣ１０１／２９−ヒトＩｇＧ２キメラ抗体とともに室温においてリン酸干渉生理食塩水（ＰＢＳ）中でインキュベートした。３０分後に、各種の濃度の架橋抗ヒトＩｇＧ抗体（０−１００μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）を添加して、細胞を３時間に亘って室温でインキュベートし、次いで、７ＡＡＤ（Ｂｅｃｈｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて２０分間に亘って暗所で細胞を染色し、４８８ｎｍでＱｕａｎｔａ ＳＣ ＭＰＬ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ；発光フィルター６７０ ＬＰ ＦＬ３）を用いて分析した。
【００４７】
ＭＤＲ細胞株における薬剤取り込み
２×１０５のＣｏｌｏ２０５、Ｃ１７０、ＨＴ−２９、又はＬｏＶｏ細胞を、０、１、３、１０、３０、又は１００μｇ／ｍｌのＳＣ１０１／２９ ｍＡｂを用いて３０分間に亘って３７℃で処理した。次いで、０、１、又は１０μＭの終濃度でドクソルビシンを前記細胞に添加し、３７℃で１時間に亘ってインキュベートした。細胞を氷冷リン酸干渉生理食塩水（ＰＢＳ）で五回洗浄し、４８８ｎｍでＦＣ５００フローサイトメーター（発光５７５ｎｍ ＦＬ２）を用いて蛍光分析した。
【００４８】
カスパーゼ依存性細胞死の阻害アッセイ
５×１０５のＣ１７０細胞を、平底滅菌２４ウェルプレートの個々のウェルに一定分量に分けて、６時間に亘って３７℃で接着させた。前記細胞を、１００μｇ／ｍｌのアイソタイプに適合したネガティブコントロールｍＡｂ、１００ｎｇ／ｍｌの抗Ｆａｓ、又は１００μｇ／ｍｌのＳＣ１０１／２９ ｍＡｂ、及び０、１、又は１０μＭのｚ−ＦＭＫ−ｖａｄ（Ｇ７２３２；Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ，ＵＫ）を用いて処理した。細胞を３７℃で一晩静置して、その後に、アネキシンＶ及びＰＩを用いて１５分に亘って染色し、４８８ｎｍでＦＣ５００フローサイトメーター（発光５２５ｎｍ ＦＬ１、６２０ｎｍ ＦＬ３）を用いて分析した。
【００４９】
ストレス関連キナーゼを介するシグナル伝達
２×１０６のＣ１７０細胞を、ＩｇＧ（３０μｇ／ｍｌ）ネガティブコントロールに４時間に亘って、ＳＣ１０１（３０μｇ／ｍｌ）に１〜４時間に亘って、又は０．５Ｍソルビトール（ポジティブコントロール）に３０分間に亘って曝露した。細胞は、氷冷抽出干渉液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ７．４、２ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ Ｎａ４Ｐ２Ｏ７、２ｍＭ ベンズアミジン、１ｍＭ ＰＭＳＦ、０．５ｍＭ ＮａＶＯ４、０．５ｍＭ ＤＴＴ ０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００）中で抽出して、標準的なＢｉｏＲａｄタンパク質アッセイを用いてタンパク質濃度を測定し、７５μｇの総タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥのレーン毎に載せた。１０％ゲルを１３０Ｖで９０分に亘って分離させて、ＢｉｏＲａｄ ｓｅｍｉ−ｄｒｙ ｂｌｏｔｔｅｒ（１２Ｖ定電圧）で７０分間に亘ってＰＶＤＦに転写した。膜を１時間に亘って１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）Ｔｒｉｓ干渉生理食塩水０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＴＢＳ−Ｔ）中で１時間に亘ってブロッキングし、１％ ＢＳＡ ＴＢＳ−Ｔ中で２ｍｌあたり１μｌのＰ−ｐ３８、Ｐ−ＪＮＫ、又はＰ−ＥＲＫ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で探索した。その後に、膜をＴＢＳ−Ｔ中で三回洗浄して、ヤギ抗ウサギＨＲＰ（ＧαＲ ＨＲＰ；Ｄａｋｏ，Ｐ０４４８）で探索し、ＴＢＳ−Ｔで三回洗浄して、ＥＣＬ Ｐｌｕｓ＋で現像した。
【００５０】
ｉｎ ｖｉｖｏ試験
予防モデル
結腸直腸腫瘍細胞株であるＣ１７０を、ヌードマウスにおいて連続継代に維持した。治療のために、マウスを屠殺して、腫瘍を摘出した。前記腫瘍を非常に細かく切って、３ｍｍ２片を麻酔（Ｈｙｐｎｏｒｍ、Ｒｏｃｈｅ／Ｈｙｐｎｏｖｅｌ、Ｊａｎｎｓｅｎ）条件下で、無作為に４つの実験群に割り当てた４０匹のオスのマウスの皮下に移植した。１つの群のマウスは、５−ＦＵ／ロイコボリン（１２．５ｍｇ／ｋｇ）を用いて静脈内（ｉｖ）注射で１、３、５、７、２１、及び２２日目に処理した。一週間に三回、マウスに、０．２ｍｇのＳＣ１０１／２９ ｍＡｂを用いる腹腔内（ｉｐ）注射も実施した。対照マウスは、ＳＣ１０１／２９ ｍＡｂ、５−ＦＵ／ロイコボリン、又はビヒクルのみのいずれかを受けた。腫瘍の大きさはキャリパーによって測定し、腫瘍断面積を１２、１６、１９、及び２３日目に計算した。実験の終わりに、腫瘍を秤量して、抗腫瘍効果を評価した。動物を秤量して、治療の毒性を評価した。
【００５１】
治療モデル
結腸直腸腫瘍細胞株であるＣ１７０を、ヌードマウスにおいて連続継代に維持した。治療のために、マウスを屠殺して、腫瘍を摘出した。前記腫瘍を非常に細かく切って、３ｍｍ３片を麻酔条件下で、無作為に４つの実験群に割り当てた４０匹のオスのマウスの皮下に移植した。マウスは、Ｃ１７０異種移植片の３ｍｍ３片を外植した。前記群のマウスを、５−ＦＵ／ロイコボリン（２５ｍｇ／ｋｇ）を用いてｉｖ注射で１日目、３日目、５日目、７日目、適用可能な場合には２８日目から繰り返して治療した。一週間に三回、マウスに、０．２ｍｇのＳＣ１０１／２９ ｍＡｂを用いてｉｖ注射も実施し、対照マウスは、ＳＣ１０１／２９ ｍＡｂのみ又は対照マウスＩｇＧ抗体を５−ＦＵ／ロイコボリンとともに受けた。
【００５２】
転移モデル
Ｃ１７０ＨＭ２細胞を、３７℃、５％ ＣＯ２で加湿条件下において１０％熱不活化ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ １６４０培養培地中でｉｎ ｖｉｔｒｏに維持した。ほぼコンフルエントな単層から細胞を、０．０２５％ ＥＤＴＡを用いて回収し、上記の培養培地で二回洗浄し、ｉｎ ｖｉｖｏ投与のために滅菌ＰＢＳ（ｐＨ ７．４）に再懸濁した。１ｍｌの容量における１．５×１０６の細胞を、３０匹のオスのヌードマウスの腹腔に注射した。動物をそれらの治療群に割り当てて、治療を１日目に開始して、試験に間に亘って継続した。前記群のマウスを、１０μｇ若しくは１００μｇのＳＣ１０１／２９ ｍＡｂ又はビヒクル対照を用いてｉｖ注射によって、一日目及び次いで一週間に三回、治療した。マウスは４０日目に屠殺して、体重及び腫瘍の重量を評価した。
【００５３】
統計
統計分析を、ＰＣ用のＭｉｎｉｔａｂプログラムのＡｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｖａｒｉａｎｃｅ及びＬｏｇ Ｒａｎｋを用いて実施した。
【００５４】
（実施例２）
結果
結腸直腸腫瘍細胞による抗体結合
ＳＣ１０１ ｍＡｂは、ＬｅｗｉｓｙハプテンとＬｅｗｉｓｂハプテンとの双方に結合することが過去に示されている。新しく脱凝集させた結腸直腸腫瘍の強力な染色を、図１ａに示している。ｍＡｂは、脱凝集した卵巣及び胃の腫瘍にも結合する（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｂｉｏｓｃｉ．Ｒｅｐ．３：１６３）。さらに、これらの抗体は、原発腫瘍細胞の細胞死の促進を誘導した。ＳＣ１０１／２９抗体及びＳＣ１０１／３３抗体を用いた免疫組織化学及びフローサイトメトリー実験は、以下のタイプ：卵巣、胸部、肺、前立腺、及び膵臓の腫瘍細胞株及び腫瘍異種移植片に顕著に結合した（データ示さず）。
【００５５】
結腸直腸腫瘍細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける殺滅
当該殺滅を調べるために、さらに広範な細胞株を、ＳＣ１０１／２９ ｍＡｂによる結合（図１ａ）及び細胞増殖の阻害（図１ｂ及び１ｃ）についてスクリーニングした。Ｃ１７０及びＣｏｌｏ２０５細胞株の双方が、ＳＣ１０１／２９ ｍＡｂに結合したが、大半の原発性腫瘍が、より強力な結合を示した。対照的に、ＳＣ１０１／２９ ｍＡｂは、ＨＴ−２９及びＬｏＶｏには原発腫瘍の２０％に相当するレベルで弱く結合した。特に興味深いことは、ＳＣ１０１／２９が、Ｃ１７０及びＣｏｌｏ２０５細胞の増殖を阻害するが、Ｌｅｗｉｓｙ抗原及びＬｅｗｉｓｂ抗原を低レベルで発現するＨＴ−２９及びＬｏＶｏ細胞の増殖を阻害し得ないことである。
【００５６】
生存率試験
ＳＣ１０１／２９ ｍＡｂによって仲介される細胞死の機構を評価するために、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）という、等張条件下において非生細胞にのみ侵入し得る蛍光化合物をプローブとして使用して、細胞膜の完全性を失った細胞を同定した。図２ａ及び２ｂに示すように、ＳＣ１０１／２９ ｍＡｂは、Ｃｏｌｏ２０５及びＣ１７０細胞の浸透性を急速に増大させ、７５％超の細胞が、早くも抗体処理の３０分後にＰＩで強力に染色された。同一の条件下において、アポトーシス性細胞死を誘導することが既知の抗ＣＤ９５抗体又は対照マウスＩｇＧ抗体を用いて４時間に亘ってインキュベートした際には、１０％未満の細胞がＰＩを取り込んだ。同様に、Ｌｅｗｉｓｂには結合せずＬｅｗｉｓｙに結合するのみのｍＡｂであるＢＲ９６は、４時間に亘って、ＰＩの顕著な取り込みを示し得なかった。細胞増殖の阻害と一致して、ＳＣ１０１／２９ ｍＡｂは、低い抗原の発現を有するＨＴ−２９及びＬｏＶｏ細胞におけるＰＩ取り込みを誘導し得なかった。
【００５７】
ＳＣ１０１／４３も、膜透過性を変化する能力について分析したが、ＳＣ１０１／２９とは反対に、ＰＩ取り込みを誘導し得なかった（図３ａ）。しかしながら、それは、ＳＣ１０１／２９によって誘導されるＰＩ取り込みの阻害において非常に効果的であり、同一又は密接に関連するエピトープに結合することを示している。ＳＣ１０１／４３がアビジン／ビオチンを使用して架橋されている場合は、効果的に細胞死を誘導することも可能である。同様に、キメラＳＣ１０１／２９ ＩｇＧ２抗体の架橋は、結腸腫瘍細胞の直接的な殺滅を誘導する（図３ｃ）。ＳＣ１０１／２９は天然にダイマーとして存在するマウスＩｇＧ３であり、これらの結果は、Ｌｅｗｉｓｙ及びＬｅｗｉｓｂの架橋がオンコーシスには重要であり、ＳＣ１０１がそのダイマー構造により架橋するが、ＩｇＧ１であるＳＣ１０１／４３は人工的な架橋が必要であることを示す。
【００５８】
ＭＤＲ細胞株における薬剤取り込み
膜の完全性を失うことによって、低分子が細胞に接近することを可能にする。これは、蛍光薬剤であるドクソルビシンを用いて示されており、ＳＣ１０１／２９ ｍＡｂに対する広範な細胞の曝露の後に、抗原を高レベルで発現し、且つ、膜の完全性の損失している細胞株においてデュロキセチンの取り込みが向上したが（Ｃｏｌｏ２０５及びＣ１７０）、低い抗原密度を有する細胞では向上しなかった（ＨＴ−２９及びＬｏＶｏ、図２ｃ）。その効果は、ｐ−糖タンパク質を発現する細胞（Ｃ１７０）で更に強力に現れ（図２ｆ）、このことは、ＳＣ１０１／２９によって生じた膜の混乱が当該ポンプによる薬剤の排出を阻害したことを示す。
【００５９】
カスパーゼ依存性細胞死アッセイの阻害
膜の完全性の急速な損失は、膜に形成される細孔が、大きな細胞質タンパク質、例えば、ＬＤＨの放出を可能にするまで、そのサイズを大きくし続けるオンコーシスを生じさせる。ＰＩは完全性の損失を示すが、同時に起こるＣ１７０細胞からのＬＤＨの放出は認められなかった。ＬＤＨ放出が存在しないことによってＣ１７０のオンコーシスの発現に疑問を抱いたため、同定したＰＩ染色が、古典的なアポトーシスのアーチファクトによるものではないことを確認するために、全てのカスパーゼのインヒビターであるｚ−ＦＭＫ−ｖａｄを使用した。要するに、抗Ｆａｓに対する曝露は、Ｃ１７０細胞におけるアポトーシスを十分には誘導しないことが過去に認められていたが、前記インヒビターは、前記抗体の効果を完全に逆転させ得た（図３ｄ）。ｚ−ＦＭＫ−ｖａｄの存在下におけるＳＣ１０１／２９ ｍＡｂに対する腫瘍細胞の曝露は、認識可能な効果を有さず、このことは、細胞死の様式が古典的なアポトーシス経路からは独立していることを示す。
【００６０】
ストレス関連キナーゼを解するシグナル伝達
膜の透過性は、ＨＳＰ２７をリン酸化してアクチン重合を生じさせるｐ３８の活性化と強く関連している。弱いｐ３８活性化が、１時間後にＣ１７０細胞において認められ、４時間後により強力な活性化が認められた（図３ｅ）。対照的に、ＪＮＫ又はＥＲＫの活性化は存在しなかった。ストレスによって活性化されるタンパク質キナーゼであるｐ３８は、５−ＦＵを含む広範な化学療法剤によって誘導される。したがって、ＳＣ１０１／２９がｉｎ ｖｉｖｏで細胞死を誘導するかどうか及びこれが５−ＦＵと相乗効果を奏するかどうかを決定するために、ヒト異種移植片を移植したマウスにそれを投与した。
【００６１】
ｉｎ ｖｉｖｏ試験
前記抗体を、Ｃ１７０腫瘍の３ｍｍ２抽出物を移植したマウス又は抗体の投与前に５日間に亘って増殖させたＣ１７０腫瘍に一週間に三回投与した。前記動物は、ＳＣ１０１／２９ ｍＡｂのみ、５−ＦＵ／ロイコボリン、又は双方の組み合わせのいずれかを用いて３週間に亘って処理した。図４ａは、ＳＣ１０１／２９と５−ＦＵ／ロイコボリンとの双方のみが、新しく外植した腫瘍の腫瘍増殖阻害を生じさせた（ｐ＜０．００４ ＡＮＯＶＡ）。対照的に、双方の組み合わせは更なる増殖阻害を示し、２／１０のマウスのみが移植した腫瘍の０．３ｇという重量を超える任意の増殖を示した（図４ｂ ｐ＜０．０２ ＡＮＯＶＡ）。このＳＣ１０１／２９ ｍＡｂの用量は全てのマウスに良好に許容され、体重減少又は任意の他のひどい症状を示さなかった（図４ｃ）ＳＣ１０１／２９ ｍＡｂが、Ｃ１７０腫瘍を発現するマウスに、２５ｍｇ／ｋｇの５−ＦＵ／ロイコボリンと組み合わせて治療目的で投与される際は、腫瘍増殖を顕著に阻害し、且つ、生存を向上させた（図４ｄ：ｐ＜０．０１６３ Ｌｏｇ Ｒａｎｋ）。
【００６２】
細胞殺滅の機構はＳＣ１０１／２９の微小転移細胞に対する結合が非常に効果的であるはずであるため、肝臓転移の予防におけるＳＣ１０１／２９ ｍＡｂの治療効果を、Ｃ１７０ＨＭ２結腸直腸モデルを使用して評価した。マウスは、低用量である１００μｇ及び１０μｇのＳＣ１０１／２９ ｍＡｂを用いて一週間に三回、六週間に亘って治療した。試験の終わりに、摘出したＣ１７０ＨＭ２肝臓腫瘍の重量を測定した。各群について中央値を計算して、図５にデータをグラフ化した。各群についての中央値及び平均値は、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ試験によって統計学的有意性について分析した。１０μｇ及び１００μｇ ＳＣ１０１／２９ ｍＡｂ（第二群及び第三群）についての中央値は、ビヒクル対照（第一群）から有意（ｐ＜０．００１）であることが認められた。ＳＣ１０１／２９は当該モデルにおいて低用量であっても非常に効果的であったため、５−ＦＵは必要でなかった。
【００６３】
（実施例３）
考察
広範なＬｅｗｉｓｙ抗体が同定されているが、それらは一貫して、Ｌｅｗｉｓｘ及びＨ型２構造と交差反応する。このことが、正常な組織との望ましくない交差反応を生じさせ、臨床試験において後に毒性を誘導し得る。例えば、Ｈ抗原と交差反応するマウスｍＡｂ ＢＲ５５−２のフェーズＩ試験において、６／１２の患者において血尿症が存在し、２／９の患者においてｄｉａｈｏｒｅａが存在し、３人の患者において一過性の皮膚病変の減少が存在していた（Ｔｏｌｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１７：４７８−８４）。Ｌｅｗｉｓｙのみに対するＬＭＢ−１イムノトキシン（シュードモナス属のエンドトキシンに結合したＢ３抗体）は、５／３８の患者において反応を生じた（Ｐａｉ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２：３５０−３）。ＢＲ９６ ｍＡｂは、Ｂ血液型と交差反応するが、Ｌｅｗｉｓｂとは交差反応しない。胃腸に対する結合は用量制限的であり、抗体結合と関連することが示された（Ｓａｌｅｈ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１８：２２８２−９２）。最後に、Ｌｅｗｉｓｙ特異的なヒト化抗体である３Ｓ１９３は、結合試験において優れた選択性を示し（Ｓｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６０：３２５４−６１）、臨床試験に入っている。
【００６４】
ＳＣ１０１抗体は、ＬｅｗｉｓｙとＬｅｗｉｓｂとの双方の特有の面を認識する。ＳＣ１０１抗体は、Ｌｅｗｉｓｙ又はＬｅｗｉｓｂのいずれかを発現する広範な正常組織と強力な交差反応性を示すことを予測し得るが、他のＬｅｗｉｓ抗体とは対照的に、胃腸管内のムチンの弱い染色のみが認められた（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｂｉｏｓｃｉ．Ｒｅｐ．３：１６３）。このことは、ＢＲ９６ ｍＡｂを用いて認められた胃腸管の毒性はＳＣ１０１抗体を用いて回避し得ることを示す。
【００６５】
ＳＣ１０１抗体は、免疫エフェクター細胞なしでｉｎ ｖｉｔｒｏで腫瘍細胞死を誘導し、おそらく、ＩｇＧ３抗体はＣＤＣ及びＡＤＣＣといった媒介因子が非常に乏しいようなｉｎ ｖｉｖｏでも誘導する。非常に興味深いことは、腫瘍細胞が、殺滅されるためにＬｅｗｉｓｙ及びＬｅｗｉｓｂを過剰発現していることを必要としたことである。この発現レベルにおいて、８０％の胃腸管及び３０％の卵巣／胸部の腫瘍が、細胞の殺滅を受けやすいが、正常な組織は除外され、良好な治療方法を提供する。ＳＣ１０１／２９ ｍＡｂが膜の完全性の急速な損失を生じさせるように、細胞の殺滅の機構は非常に興味深い。これは、浸透圧刺激及び酸素過剰細胞において認められるオンコーシスによる細胞死と類似する（Ｇａｒｍｙｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１７：１２９０−５；Ｍｏｒｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２６９８１−８；Ｒｏｍａｎｓｈｋｏ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．３５：９７８−９３；Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：４５７７６−８４；Ｔｉｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９９６）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３９５：１３３−６）。しかしながら、伝統的なオンコーシスの進行は、次いで、ＬＤＨなどの細胞質の内容物の放出を生じさせる（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１７１：１−１１）。よく特徴付けられた抗Ｌｅｗｉｓｙ抗体であるＢＲ９６が細胞膜に対する作用を示さないので、細胞死の機構はＬｅｗｉｓｙ／Ｌｅｗｉｓｂ構造と関連しているようである。Ｌｅｗｉｓｙ及びＬｅｗｉｓｂが、天然のマウスＩｇＧ３又はＩｇＧ１バリアントのアビジン／ビオチン架橋によって架橋されて、膜の混乱を生じさせることも必要とした。腫瘍細胞死などの腫脹を誘導し得る幾つかの他の抗体が開示されている。これらは、広範に発現する糖タンパク質を認識する抗ポリミン（Ｐｏｒｉｍｉｎ）抗体（Ｍａ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９８：９７７８−８３）、腎臓関連糖タンパク質を認識するＲＥ２（Ｍａｔｓｕｏｋａ（１９９５）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１：２００７−２０１５）、及び新規の糖タンパク質を認識するＲＡＶ１２を含む。しかしながら、これらの抗体は、特にＭＤＲ細胞株において化学療法剤の取り込みを増大させることを示さないため、ＳＣ１０１は独特なものである。
【００６６】
細胞におけるＰＩ取り込みは、ｐ３８活性化を伴う。ｐ３８活性化はマイクロフィラメントダイナミクスを変化させるＨＳＰ２７のリン酸化と関連しているため（Ｄｅｓｃｈｅｓｎｅｓ（２００１）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ １２：１５６９−８２；Ｈｕｏｔ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １４３：１３６１−７３）、これによって膜の透過性が説明される。膜の完全性の損失は急速に起こるものであり、細胞死の上流にある。ｐ３８の活性化は、カスパーゼ依存性又は非依存性細胞死を誘導し得る（Ｄｅｓｃｈｅｓｎｅｓ（２００１）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ １２：１５６９−８２）。ＳＣ１０１／２９ ｍＡｂは、ＤＮＡ断片化を誘導し得ず（データは示さず）、全てのカスパーゼのインヒビターであるｚ−ＦＭＫ−ｖａｄを用いるカスパーゼの阻害は細胞死を妨げないようであり、このことは、抗体がカスパーゼ非依存性の細胞死を誘導することを示す。結腸直腸腫瘍は、アポトーシス反応に関与する遺伝子における＞７０％の変異を示し、当該反応を避ける任意の治療が非常に治療的価値がある（Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ（１９８８）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１９：５２５−３２；Ｆｕｌｄａ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｃｕｒｒ．Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ ４：５６９−７６）。１つのカスパーゼ非依存性の機構は、ミトコンドリアからのアポトーシス誘導因子（ＡＩＦ）の放出及びその核移行、そこで未知の様式において核濃縮に寄与することを伴う（Ｓｕｓｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２：５７１−８０）。
【００６７】
ストレス関連キナーゼであるｐ３８は、広範な化学療法剤によっても誘導され得るものであり、薬剤合成において極めて重要な役割を担っていると提案されている（Ｏｌｓｏｎ ＆ Ｈａｌｌａｈａｎ（２００４）Ｔｒｅｎｄ Ｍｏｌ Ｍｅｄ １０：１２５−９）。Ｌｅｗｉｓｙ及びＬｅｗｉｓｂは、腫瘍糖タンパク質及び糖脂質上で発現し、これらは、細胞ストレスに反応してアップレギュレートされる。実際、化学療法ストレス（Ｆｌｉｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２３：９−１４）、特に５−ＦＵに対するＬｅｗｉｓｙのアップレギュレートが過去に報告されている。したがって、５−ＦＵ／ロイコボリンは結腸直腸腫瘍に標準的な化学療法であるため、Ｌｅｗｉｓｙをアップレギュレートし、且つ、ｐ３８を活性化し得る（Ｆｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００２） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６２：１９２０−６）。ＳＣ１０１／２９及び５−ＦＵ／ロイコボリンの組み合わせを、ヌードマウスにおける結腸異種移植変の増殖疎外能力についてｉｎ ｖｉｖｏでスクリーニングした。ＳＣ１０１／２９ ｍＡｂのみ及び５−ＦＵ／ロイコボリンとの併用において、小さい腫瘍及び樹立腫瘍の双方の増殖を顕著に阻害した。キメラバージョンのＳＣ１０１／２９ ｍＡｂを用いたフェーズＩ試験が安全であることを示したら、その後に、手術後の結腸直腸癌患者において、薬剤のみとの比較における５−ＦＵ／ロイコボリンとＳＣ１０１／２９ ｍＡｂとの併用の試験が開始されるであろう。当該併用は、パノレックス／５−ＦＵは直接殺滅する活性を有さず、且つ、ＣＤＣ及びＡＤＣＣに依存しており、補体調節分子の過剰発現による固形癌への限定的な成功を有するため、パノレックス／５−ＦＵよりもさらに効果的であり得る（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ８４：８０−６）。
【００６８】
本発明者は、ＳＣ１０１／２９が、低分子量（＜８００Ｄ）の薬剤を取り込ませるが、ＬＤＨなどの大きな細胞内成分を放出させないように膜の透過性を誘導することを示した。ＳＣ１０１／２９は、ストレス関連キナーゼであるｐ３８のリン酸化を誘導するが、ＪＮＫのリン酸化は誘導せず、最終的にカスパーゼ非依存性細胞死を誘導する。セラミドがｐ３８の活性化及びＡＩＦを含む多数のミトコンドリアタンパク質の放出によって神経細胞死を誘導することが示されているため、このことは特に興味深い（Ｇｈａｔａｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：３３５−４７；Ｓｔｏｉｃａ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２９：３３５−７１）。Ｌｅｗｉｓｙ／Ｌｅｗｉｓｂは糖脂質上で主に発現するため、その分解は、セラミドの増加及びその後のｐ３８活性化を生じさせ得る。ＳＣ１０１／２９は古典的な経路によって細胞死を誘導しないため、古典的なアポトーシス又はオンコーシスに対する耐性機構を発達させている腫瘍細胞において特に効果的であり得る。しかしながら、その経路は、より注意深く解明し、本発明者による殺滅アッセイの更なる検証によって、潜在的な耐性機構の評価及び最適な腫瘍標的の同定をすることが必要である。
【００６９】
結論として、ＳＣ１０１／２９は、Ｌｅｗｉｓｙ及びＬｅｗｉｓｂを認識し、膜の完全性の損失を誘導することによって細胞死を直接誘導する新規ｍＡｂである。本願は、オンコーシスの様式において、腫瘍細胞を選択的に殺滅し得る血液型抗原を認識する抗体を初めて開示するものである。治療における相乗的な反応におけるｐ３８の役割は、次第に明らかになっている。ＳＣ１０１／２９は、５−ＦＵ／ロイコボリンとの組み合わせにおいて殺滅の促進を示し、これらの薬剤と組み合わせて使用して、毒性を低減し、且つ、癌治療の効果を増大させる。
【００７０】
本明細書を通じて、「含む」なる用語は、記載した要素、数字、若しくは工程、又は要素、数字、若しくは工程の群の包含を示すものであり、任意の他の要素、数字、若しくは工程、又は要素、数字、若しくは工程の群の排除を意味するものではないと解されるであろう。
【００７１】
本明細書で挙げた全ての文献は、参照によって本明細書に取り込む。本明細書に含まれる文献、行為、材料、装置、又は論文などの任意の議論は、本明細書の内容を提供するためだけのものである。これらが従来技術の基礎の一部を形成し、又は本願の各請求項の優先日前に豪州又は他の地域に存在した本発明に関連する分野の共通する一般的知識であったと認めるものとして解釈されるべきではない。
【００７２】
広範に記載したように本発明の精神又は範囲を逸脱すること無く、特定の実施態様に示したように、本発明の多数の変形例及び／又は修飾例を作製し得ることが当業者によって理解されるであろう。本実施態様は、したがって、全ての態様において説明するものであり、限定するものではないと解されるべきである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＬｅｗｉｓｙとＬｅｗｉｓｂとの双方に結合する抗体又は抗原結合断片を含む結合複合体であって、前記抗体又は抗原結合断片がマルチマーの形態にあり、且つ、前記抗体又は抗原結合断片が自然にはマルチマーを形成しない、結合複合体。
【請求項２】
前記マルチマーがホモ又はヘテロマルチマーである、請求項１に記載の結合複合体。
【請求項３】
前記マルチマーがホモ又はヘテロダイマーである、請求項１又は２に記載の結合複合体。
【請求項４】
前記マルチマーがＩｇＧ抗体を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の結合複合体。
【請求項５】
前記マルチマーがヘテロダイマーのＩｇＧ２／ＩｇＧ３抗体である、請求項１から４のいずれか一項に記載の結合複合体。
【請求項６】
前記マルチマーが、同一の種に由来しない抗体又は抗原結合断片を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の結合複合体。
【請求項７】
前記マルチマーがダイマーのＩｇＧ抗体である、請求項１から４のいずれか一項に記載の結合複合体。
【請求項８】
前記抗原結合断片が、多重特異性抗体、ドメイン抗体、Ｆｖ断片、Ｆｄ断片、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、相補性決定領域（ＣＤＲ）、及び同種のフレームワーク領域によって融合した複数のＣＤＲからなる群から選択される、請求項１から７のいずれか一項に記載の結合複合体。
【請求項９】
前記多重特異性抗体が二重特異性抗体又は三重特異性抗体である、請求項８に記載の結合複合体。
【請求項１０】
前記多重特異性抗体が二重特異性抗体である、請求項９に記載の結合複合体。
【請求項１１】
前記多重特異性抗体が修飾Ｆｃドメインをさらに含む、請求項８から１０のいずれか一項に記載の結合複合体。
【請求項１２】
Ｌｅｗｉｓｙ抗原及びＬｅｗｉｓｂ抗原を過剰発現している腫瘍細胞において細胞死を誘導するための方法であって、Ｌｅｗｉｓｙ抗原とＬｅｗｉｓｂ抗原との双方に結合する抗体又は抗原結合断片を含む結合複合体の有効量を対象に投与する工程を含み、前記抗体又は抗原結合断片がマルチマーの形態にあり、且つ、前記抗体又は抗原結合断片が自然にはマルチマーを形成しない、方法。
【請求項１３】
Ｌｅｗｉｓｙ抗原とＬｅｗｉｓｂ抗原との双方に結合する抗体又は抗原結合断片を含む結合複合体の治療上有効量を対象に投与する工程を含む、対象における癌を治療するための方法であって、前記抗体又は抗原結合断片がマルチマーの形態にあり、且つ、前記抗体又は抗原結合断片が自然にはマルチマーを形成しない、方法。
【請求項１４】
前記癌が、乳癌、肺癌、結腸癌、卵巣癌、前立腺癌、及び膵臓癌からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記結合複合体が、対象に投与するための医薬組成物として製剤化されている、請求項１２から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記結合複合体が注射可能な溶液として投与される、請求項１２から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記結合複合体が静脈内に投与される、請求項１２から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記結合複合体がヒトに投与される、請求項１２から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
Ｌｅｗｉｓｙ抗原とＬｅｗｉｓｂ抗原との双方に結合する抗体又は抗原結合断片を含む結合複合体の治療上有効量を製薬学的に許容される担体と共に含む、Ｌｅｗｉｓｙ抗原及びＬｅｗｉｓｂ抗原を過剰発現している腫瘍細胞において細胞死を誘導するための医薬組成物であって、前記抗体又は抗原結合断片がマルチマーの形態にあり、且つ、前記抗体又は抗原結合断片が自然にはマルチマーを形成しない、医薬組成物。
【請求項２０】
Ｌｅｗｉｓｙ抗原及びＬｅｗｉｓｂ抗原を過剰発現している腫瘍細胞において細胞死を誘導するための医薬の製造における、Ｌｅｗｉｓｙ抗原とＬｅｗｉｓｂ抗原との双方に結合する抗体又は抗原結合断片を含む結合複合体の治療上有効量の使用であって、前記抗体又は抗原結合断片がマルチマーの形態にあり、且つ、前記抗体又は抗原結合断片が自然にはマルチマーを形成しない、使用。
【請求項２１】
対象において癌を治療するための医薬の製造における、Ｌｅｗｉｓｙ抗原とＬｅｗｉｓｂ抗原との双方に結合する抗体又は抗原結合断片を含む結合複合体の治療上有効量の使用であって、前記抗体又は抗原結合断片がマルチマーの形態にあり、且つ、前記抗体又は抗原結合断片が自然にはマルチマーを形成しない、使用。
【請求項１】
ＬｅｗｉｓｙとＬｅｗｉｓｂとの双方に結合する抗体又は抗原結合断片を含む結合複合体であって、前記抗体又は抗原結合断片がマルチマーの形態にあり、且つ、前記抗体又は抗原結合断片が自然にはマルチマーを形成しない、結合複合体。
【請求項２】
前記マルチマーがホモ又はヘテロマルチマーである、請求項１に記載の結合複合体。
【請求項３】
前記マルチマーがホモ又はヘテロダイマーである、請求項１又は２に記載の結合複合体。
【請求項４】
前記マルチマーがＩｇＧ抗体を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の結合複合体。
【請求項５】
前記マルチマーがヘテロダイマーのＩｇＧ２／ＩｇＧ３抗体である、請求項１から４のいずれか一項に記載の結合複合体。
【請求項６】
前記マルチマーが、同一の種に由来しない抗体又は抗原結合断片を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の結合複合体。
【請求項７】
前記マルチマーがダイマーのＩｇＧ抗体である、請求項１から４のいずれか一項に記載の結合複合体。
【請求項８】
前記抗原結合断片が、多重特異性抗体、ドメイン抗体、Ｆｖ断片、Ｆｄ断片、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、相補性決定領域（ＣＤＲ）、及び同種のフレームワーク領域によって融合した複数のＣＤＲからなる群から選択される、請求項１から７のいずれか一項に記載の結合複合体。
【請求項９】
前記多重特異性抗体が二重特異性抗体又は三重特異性抗体である、請求項８に記載の結合複合体。
【請求項１０】
前記多重特異性抗体が二重特異性抗体である、請求項９に記載の結合複合体。
【請求項１１】
前記多重特異性抗体が修飾Ｆｃドメインをさらに含む、請求項８から１０のいずれか一項に記載の結合複合体。
【請求項１２】
Ｌｅｗｉｓｙ抗原及びＬｅｗｉｓｂ抗原を過剰発現している腫瘍細胞において細胞死を誘導するための方法であって、Ｌｅｗｉｓｙ抗原とＬｅｗｉｓｂ抗原との双方に結合する抗体又は抗原結合断片を含む結合複合体の有効量を対象に投与する工程を含み、前記抗体又は抗原結合断片がマルチマーの形態にあり、且つ、前記抗体又は抗原結合断片が自然にはマルチマーを形成しない、方法。
【請求項１３】
Ｌｅｗｉｓｙ抗原とＬｅｗｉｓｂ抗原との双方に結合する抗体又は抗原結合断片を含む結合複合体の治療上有効量を対象に投与する工程を含む、対象における癌を治療するための方法であって、前記抗体又は抗原結合断片がマルチマーの形態にあり、且つ、前記抗体又は抗原結合断片が自然にはマルチマーを形成しない、方法。
【請求項１４】
前記癌が、乳癌、肺癌、結腸癌、卵巣癌、前立腺癌、及び膵臓癌からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記結合複合体が、対象に投与するための医薬組成物として製剤化されている、請求項１２から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記結合複合体が注射可能な溶液として投与される、請求項１２から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記結合複合体が静脈内に投与される、請求項１２から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記結合複合体がヒトに投与される、請求項１２から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
Ｌｅｗｉｓｙ抗原とＬｅｗｉｓｂ抗原との双方に結合する抗体又は抗原結合断片を含む結合複合体の治療上有効量を製薬学的に許容される担体と共に含む、Ｌｅｗｉｓｙ抗原及びＬｅｗｉｓｂ抗原を過剰発現している腫瘍細胞において細胞死を誘導するための医薬組成物であって、前記抗体又は抗原結合断片がマルチマーの形態にあり、且つ、前記抗体又は抗原結合断片が自然にはマルチマーを形成しない、医薬組成物。
【請求項２０】
Ｌｅｗｉｓｙ抗原及びＬｅｗｉｓｂ抗原を過剰発現している腫瘍細胞において細胞死を誘導するための医薬の製造における、Ｌｅｗｉｓｙ抗原とＬｅｗｉｓｂ抗原との双方に結合する抗体又は抗原結合断片を含む結合複合体の治療上有効量の使用であって、前記抗体又は抗原結合断片がマルチマーの形態にあり、且つ、前記抗体又は抗原結合断片が自然にはマルチマーを形成しない、使用。
【請求項２１】
対象において癌を治療するための医薬の製造における、Ｌｅｗｉｓｙ抗原とＬｅｗｉｓｂ抗原との双方に結合する抗体又は抗原結合断片を含む結合複合体の治療上有効量の使用であって、前記抗体又は抗原結合断片がマルチマーの形態にあり、且つ、前記抗体又は抗原結合断片が自然にはマルチマーを形成しない、使用。
【図１ａ】
【図１ｂ】
【図１ｃ】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図２ｃ】
【図２ｄ】
【図２ｅ】
【図２ｆ】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図４ａ】
【図４ｂ】
【図４ｃ】
【図４ｄ】
【図５】
【図３ｃ】
【図３ｄ】
【図３ｅ】
【図１ｂ】
【図１ｃ】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図２ｃ】
【図２ｄ】
【図２ｅ】
【図２ｆ】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図４ａ】
【図４ｂ】
【図４ｃ】
【図４ｄ】
【図５】
【図３ｃ】
【図３ｄ】
【図３ｅ】
【公表番号】特表２０１０−５０４２８９（Ｐ２０１０−５０４２８９Ａ）
【公表日】平成２２年２月１２日（２０１０．２．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５２８５５２（Ｐ２００９−５２８５５２）
【出願日】平成１９年９月２０日（２００７．９．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＡＵ２００７／００１３８６
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０３４１８１
【国際公開日】平成２０年３月２７日（２００８．３．２７）
【出願人】（５００４６８５３７）アラーナ・テラピューティクス・リミテッド (16)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年２月１２日（２０１０．２．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年９月２０日（２００７．９．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＡＵ２００７／００１３８６
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０３４１８１
【国際公開日】平成２０年３月２７日（２００８．３．２７）
【出願人】（５００４６８５３７）アラーナ・テラピューティクス・リミテッド (16)
【Ｆターム（参考）】
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