ＬＴＰ阻害の抑制方法
長期増強（ＬＴＰ）のアミロイド媒介性阻害を抑制するための方法および組成物が提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
アミロイド形成タンパク質は複数の疾患状態の病理学に関与している。アミロイド形成タンパク質の異常沈着から生じる疾患は、限定されるものでないがアルツハイマー病、ＩＩ型糖尿病、パーキンソン病、びまん性レビー小体病、プリオンにより全部若しくは部分的に引き起こされる疾患（クロイツフェルト・ヤコブ病、スクレイピーおよびウシ海綿状脳症のような）、ならびに遺伝性アミロイドーシスおよび全身性アミロイドーシス双方を包含するアミロイドーシスを挙げることができる。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、米国単独で４００万人を苦しめている老人性認知症をもたらす進行性神経変性疾患である（全般として、非特許文献１；特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４を参照されたい）。大まかに言って、該疾患は２種類、すなわち高齢（６５歳超）で発生する晩発性；および老年期の十分に前すなわち３５と６０歳の間で発症する早発性に分類される。双方の型の疾患で病状は同一であるが、しかしより若年齢で開始する症例で異常がより重篤かつ広まる傾向がある。該疾患は、脳中の少なくとも２型の病変、すなわち老人斑および神経原線維変化を特徴とする。神経原線維変化は、対で相互の周囲で捻られた２本のフィラメントよりなる微小管結合τタンパク質の細胞内沈着物である。老人斑は直径１５０ミクロンまでの混乱した神経線維網の領域であり（脳組織の切片の顕微鏡分析により見える）、そして中央に細胞外アミロイド沈着物を有する。こうした斑の主成分はＡβペプチドである（非特許文献５を参照されたい）。斑中で見出される付加的なタンパク質は、非特許文献６により記述されるところのラミニン、アポＥ、アセチルコリンエステラーゼ、および非特許文献７により記述されるところのヘパリン硫酸プロテオグリカンを包含する。Ａβペプチドは、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）と命名される前駆体タンパク質の３９〜４３アミノ酸の内部フラグメントである。ＡＰＰタンパク質内の数種の突然変異がアルツハイマー病の存在と相互に関連付けられている（非特許文献８（バリン７１７からイソロイシン）；非特許文献９（バリン７１７からグリシン）；非特許文献１０（バリン７１７からフェニルアラニン）；非特許文献１１（リシン５９５メチオニン５９６をアスパラギン５９５ロイシン５９６に変える二重突然変異））。こうした突然変異は、ＡβへのＡＰＰの増大された若しくは変えられたプロセシング、とりわけ、増大された量の長い形態のＡβ（すなわちＡ１−４２およびＡ１−４３）へのＡＰＰのプロセシングによりアルツハイマー病を引き起こすと考えられている。プレセニリン遺伝子ＰＳ１およびＰＳ２のような他の遺伝子中の突然変異は、ＡＰＰのプロセシングに間接的に影響して増大された量の長い形態のＡβを生成すると考えられている（非特許文献１２）。これらの観察結果は、Ａβおよびとりわけその長い形態がアルツハイマー病における原因要素であることを示す（非特許文献１３）。
【０００３】
研究者は、シナプス不全がＡＤの発症の基礎にあると仮定している。シナプス減少がＡＤの早期事象でありかつ認知障害と構造的相関関係にあるためである。研究者は、ＡＤにおける臨床的認知症の潜行性発症に先立つ軽度認知障害が、大スケールの神経変性に先立つシナプス不全から生じるとさらに仮定している。長期増強（ＬＴＰ）は、学習および記憶の細胞モデルであると広く仮定されているシナプスの可塑性の一形態である。
【０００４】
ＬＴＰはシナプス伝達の効率の持続的な使用依存性の増大である。大部分の研究でＬＴＰは高頻度シナプス刺激（ＨＦＳ）の送達により実験的に誘導する。しかしながら他の馴化プロトコルが存在し、それらのいくつかは性質が薬理学的でありかつシナプス刺激を伴わない。さらに、複数の形態のＬＴＰが同定されている。げっ歯類脳薄片での研究は、とりわけ海馬のＣＡ３−ＣＡ１シナプスでＬＴＰの多くの局面を解明した。ＬＴＰの４つの
特徴は、共同性、連合性、持続性および入力特異性である。
【０００５】
シナプス効率の増大を開始する早期事象を構成するＬＴＰ誘導の過程は、ＬＴＰのその後の持続的発現と機構的に異なる。ＬＴＰ誘導の間、領域ＣＡ３から領域ＣＡ１に突出する線維へのＨＦＳの送達がシナプス中にグルタミン酸を放出し、そしてシナプス後ニューロンを脱分極する。高頻度の刺激（例えば１００Ｈｚ）により、連続的興奮性シナプス後電位（ＥＰＳＰ）により誘発される脱分極が重なり、そして一連のＨＦＳの間の累積的脱分極が実質的になり得る。樹状突起に後方伝播するシナプス後活動電位の発生が付加的な脱分極に寄与する。グルタミン酸放出および脱分極は原因として関係するとは言え、実験的に、それらを分離しかつＬＴＰの誘導が双方の事象を必要とする（「共同性」と命名されている関係）ことを示すことが可能である。従って、シナプス後膜が馴化の間に直接過分極される場合、ＨＦＳはＬＴＰを誘導することに失敗する。逆に、電流注入でシナプス後膜を直接脱分極することは、低頻度シナプス刺激でさえＬＴＰを誘導することを可能にする。
【０００６】
第２１染色体の余分の１コピーを有するダウン症候群のほとんど全部の個体は、彼らが彼らの４０歳代まで生き延びる場合に、アルツハイマー病で見られるものに類似の神経病理学的変化を示す。これは、第２１染色体上のＡＰＰ遺伝子によりコードされるβアミロイドタンパク質の過剰産生に帰されている。
【０００７】
数種のタンパク質がＡβとの可能な相互作用について検討されている。これらは、高度な糖化最終生成物、ＲＡＧＥ（非特許文献１４を参照されたい）、スカベンジャー受容体（非特許文献１５；および非特許文献１６）、小胞体関連アミロイドβ結合タンパク質（ＥＲＡＢ）（非特許文献１７）、α４若しくはα７ニコチン性アセチルコリン受容体（非特許文献１８および非特許文献１９）、ならびに低親和性ｐ７５ ＮＧＦ受容体（非特許文献２０を参照されたい）を包含する。加えて、Ａβは、非特許文献２１および非特許文献２２により、プレート上に被覆される場合にβ１インテグリンサブユニット依存性の様式で細胞の接着を媒介することが報告されている。
【０００８】
Ａβと相互作用しうる多様な機能の多様な分子の数を考慮すると、Ａβが神経変性を媒介しうる機序は不明なままである。該過程で役割を有しうる他の細胞タンパク質の存在および性質もまた不明である。
【０００９】
島アミロイドは、世紀の始まり以来ＩＩ型糖尿病における病理学的実体として認識されている。それは、その独特の成分として、インスリンと共分泌される島β細胞ペプチド、島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰ）すなわちアミリンを有する。この独特の成分に加え、島アミロイドは、アポリポタンパク質Ｅ、およびヘパリン硫酸プロテオグリカン、パールカンのような他のタンパク質を含有し、それらは典型的に他の形態の全身性および局在性アミロイドで観察される。島アミロイドは、ＩＩ型糖尿病を伴う個体の大多数において病理学的検査で観察されるが、しかし糖代謝の混乱を伴わないヒトで稀に観察される。げっ歯類からのＩＡＰＰと対照的にヒトＩＡＰＰはｉｎ ｖｉｔｒｏでアミロイド原線維を形成することが示されている。全ヒト被験体がアミロイド形成性の形態のＩＡＰＰを産生かつ分泌し、それでもなお全部が島アミロイドを発生するわけではないため、いくつかの他の因子が島アミロイド形成に関与していることがありそうである。１仮説は、ＩＡＰＰの産生、プロセシングおよび／若しくは分泌の変化をもたらすβ細胞機能の変化が、ヒト糖尿病における島アミロイド原線維の初期形成に関与することである。アミロイド原線維のこの形成がその後ＩＡＰＰ含有原線維の進行的蓄積を可能にする。β細胞塊のアミロイドによる最終的な置換が高血糖症の発症に寄与している。
【００１０】
アミロイド形成の開始をもたらすβ細胞の変化を生じることに関与しうる１因子は、食
物脂肪の増大された消費である。食物脂肪は島β細胞ペプチドの産生、プロセシングおよび分泌を変えることが知られており、また、ヒトＩＡＰＰを発現するトランスジェニックマウスでの研究はこの機序の作動を裏付ける。これおよび他のモデルを使用するさらなる検討が、島アミロイド形成に関与する機序への洞察を提供しそしてアミロイド原線維形成を阻害若しくは復帰する治療薬の開発を可能にするはずであり、その目標はＩＩ型糖尿病でβ細胞の機能を保存しかつグルコース制御を改善することである。非特許文献２３。
【００１１】
伝染性海綿状脳症すなわちプリオン病は、後天的、遺伝性若しくは特発性（「散発性」）疾患として症状発現し得る伝染性の迅速に進行する必ず致死的な神経変性疾患の一群を構成する。それらは、ヒトにおけるクロイツフェルト・ヤコブ病ならびに動物におけるスクレイピーおよびウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）を包含し、そして、実験的若しくは偶発的伝播後に数十年まで持続しうる長い潜伏期を特徴とする。プリオン病の古典的病理学的特徴は海綿状変化、神経膠症およびニューロン減少を包含する。ウイルスによる引き起こされる感染性疾患で典型的に見られるものと対照的に、プリオン病は有意の炎症応答を欠く（非特許文献２４、非特許文献２５）。
【００１２】
プリオン病は伝染性病原体「プリオン」の独特の特性によりかなりの科学的注目を集めている（非特許文献２６）。該感染性病原体は非常に小さく、そして核酸を破壊しかつ慣習的ウイルスを不活性化する処置に対し極めて抵抗性である（非特許文献２６）が、しかしタンパク質を変性させる処置に感受性である。該感染性病原体を精製する試みは、プリオンタンパク質（ＰｒＰ）と命名された、これまで未知のタンパク質について高度に濃縮された画分を生じた（非特許文献２７：非特許文献２８：非特許文献２９）。病原体特異的核酸はこれらの調製物中で見出されておらず（非特許文献３０；非特許文献３１）；むしろ、プリオンタンパク質は宿主ゲノム中でコードされる（非特許文献２９；非特許文献３２；非特許文献３３）。冒された個体の脳中には、ＰｒＰＳｃと命名されたプリオンタンパク質の特異的な疾患関連アイソフォームの特徴的な蓄積が見出される（図１）。ＰｒＰＳｃは、コンホメーション変化を伴う明確に定義されていない翻訳後過程によりプリオンタンパク質の正常な細胞アイソフォーム（ＰｒＰｃ）から派生する（非特許文献２５）。ＰｒＰｃおよびＰｒＰＳｃは同一アミノ酸配列を有する（非特許文献３４）が、しかしながらそれらはコンホメーションが異なる。ＰｒＰＳｃは、βシート構造のその高含量（非特許文献３５）、大型凝集物を形成するその傾向、およびプロテイナーゼＫでの消化に対するその部分的抵抗性によりＰｒＰｃと識別し得る。
【００１３】
遺伝性アミロイドーシスは、細胞外マトリックス中の不溶性タンパク質原線維の沈着物を特徴とする常染色体優性の遺伝性疾患の臨床上および遺伝的に不均一な一群を含んでなる。これらの疾患は、硝子体混濁および腎不全によりときに付随される、多発神経炎、手根幹症候群、自律神経障害、心筋症の症状および胃腸の特徴を典型的に提示する。他の表現型は、ニューロパシー、胃潰瘍、脳神経障害および格子状角膜ジストロフィーを特徴とする。稀に軟髄膜若しくは脳の構造もまた臨床像に関与している。発症時年齢は１７歳くらい早くかつ７８歳くらい遅い。アミロイド原線維の基礎構成要素は、遺伝子で決定されるコンホメーション変化によりアミロイド形成性となる生理学的タンパク質である。以前はプレアルブミンと命名されていた変異トランスサイレチン（ＴＴＲ）が遺伝性アミロイドーシスの最も頻繁な攻撃者（ｏｆｆｅｎｄｅｒ）である。同所性肝移植（ＯＬＴ）は、アミロイド形成タンパク質の主産生部位を除去することにより、そうでなければ一般的に致死性である該疾患の進行を停止する。ＯＬＴの適応症およびその成功は、手術時点での心血管系および自律神経障害の進行度、齢、併存症ならびに突然変異の型に依存する。ＴＴＲの天然の四量体コンホメーションを安定化しかつ原線維形成を阻害する薬物を用いる代替処置モダリティーが現在集中的に研究されている。
【００１４】
全身性アミロイドーシスは、実質器官；血管；皮下、粘膜下および腱周囲の脂肪；心；
眼；ならびに髄膜の原線維タンパク質凝集の細胞外沈着物を特徴とする。加えて、神経幹、神経叢、ならびに知覚および自律神経節を包含する末梢神経系のいずれの部分も関与しうる。抹消神経では、アミロイド沈着物は、通常は斑状および限局性の分布で神経上膜、神経周膜若しくは神経内膜に存在する。慣習的染色を用いる光学顕微鏡検査で、アミロイド沈着物は均一なエオシン好性の外見を有する。コンゴーレッド染色で、それらは偏光下に特徴的な黄緑色の複屈折を示す。
【００１５】
多様なタンパク質がアミロイド形成の原因であり；事実、合計１８種のアミロイド形成タンパク質がヒトアミロイドーシスで同定されている。非遺伝性の全身性アミロイドーシスは、免疫グロブリンＬ鎖（ＡＬ型、形質細胞悪液質における）、血清アミロイドＡのフラグメント、急性期タンパク質（ＡＡ型、慢性炎症性疾患における）、トランスサイレチン（ＴＴＲ；老人性全身性アミロイドーシスにおける）およびβ２−ミクログロブリン（尿毒症および透析を伴う患者における）により引き起こされ得る。遺伝性アミロイドーシスは、ＴＴＲ、およびはるかにより稀にはアポリポタンパク質Ａ１、リゾチーム、フィブリノーゲン、ゲルゾリン、アミロイドβおよびシスタチンＣを包含する生理学的タンパク質の遺伝子バリアントによる。以前はプレアルブミンと呼ばれたＴＴＲは、血清チロキシンおよび網膜結合タンパク質の輸送に関与する正常の四量体血清タンパク質である。それは第１８染色体上の単一遺伝子によりコードされ、それの５１個の異なる部位に存在する７０以上の常染色体優性遺伝性点突然変異が記述されている。これらのなかで、位置３０のメチオニン（Ｍｅｔ３０）によるバリンの置換はこれまで最も頻繁でありかつ地理的に最も広く散在している。
【００１６】
パーキンソン病は、振戦、筋固縮、ならびに平衡および協調障害により特徴付けられる進行性神経障害である。化学物質ドーパミンを産生する脳細胞の破壊がこれらの症状の基礎にある。これらの病的な細胞はレビー小体と呼ばれるタンパク質沈着物によってもまた特徴付けられる。細胞がなぜ死ぬか、若しくはレビー小体がそれらを死滅させるのを助けるかどうかは誰も知らない。パーキンおよびα−シヌクレインと呼ばれる２種のタンパク質の遺伝子中の突然変異が、稀な形態の遺伝性パーキンソン病を分離するために結び付けられている。しかし、パーキンおよびα−シヌクレインの双方が、全パーキンソン病患者の脳中に蓄積するレビー小体中で見出される。
【００１７】
最近の知見は、パーキンが、α−シヌクレインおよびシンフィリンを包含する脳中のレビー小体と関連するタンパク質の調節において重要な役割を演じていることを示唆している。正常には、パーキンは破壊のため他のタンパク質を「標識する」のにユビキチンと呼ばれるなお別のタンパク質を使用する。しかし、これらのタンパク質のあいだの関係で何かがうまくいかない場合、これはパーキンソン病で見られる細胞死の基礎作りをし得る。パーキンおよびα−シヌクレインの双方が、レビー小体関連タンパク質のユビキチン化を伴う共通の発病機序でシンフィリン−１と結合される。非特許文献３６。従って、パーキンとのその相互作用を考えれば、α−シヌクレインでの問題は、遺伝性および一般的形態の双方のパーキンソン病の中心にありうる。非特許文献３６。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】Ｈａｒｄｙら、第ＷＯ ９２／１３０６９号明細書
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】Ｓｌｏｅ、ＴＩＮＳ、１６：４０３−４０９（１９９３）
【非特許文献２】Ｓｌｏｅ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．、５３：４３８−４４７（１９９４）
【非特許文献３】Ｄｕｆｆら、Ｎａｔｕｒｅ、３７３：４７６−４７７（１９９５）
【非特許文献４】Ｇａｍｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３７３：５２３（１９９５）
【非特許文献５】Ｆｏｒｓｙｔｈ Ｐｈｙｓ．Ｔｈｅｒ．、７８：１３２５−１３３１（１９９８）
【非特許文献６】Ｍｕｒｔｏｍａｋｉら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．、３２：２６１−２７３（１９９２）
【非特許文献７】Ｙａｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１５０２：１４５−５７（２０００）
【非特許文献８】Ｇｏａｔｅら、Ｎａｔｕｒｅ、３４９：７０４−０６（１９９１）
【非特許文献９】Ｈａｒｌｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５３：８４４−４６（１９９１）
【非特許文献１０】Ｍｕｒｒｅｌｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５４：９７−９９（１９９１）
【非特許文献１１】Ｍｕｌｌａｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．、１：３４５−４７（１９９２）
【非特許文献１２】Ｈａｒｄｙ、ＴＩＮＳ、２０：１５４（１９９７）
【非特許文献１３】Ｖｅｌｅｚ−Ｐａｒｄｏら、Ｇｅｎ．Ｐｈａｒｍ．、３１（５）：６７５−８１（１９９８）
【非特許文献１４】Ｙａｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３８２：６８５−９１（１９９６）
【非特許文献１５】Ｋｈｏｕｒｙら、Ｎａｔｕｒｅ、３８２：７１６−７１９（１９９６）
【非特許文献１６】Ｐａｒｅｓｃｅら、Ｎｅｕｒｏｎ １７：５５３−６５（１９９６）
【非特許文献１７】Ｙａｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３８９：６８９−６９５（１９９７）
【非特許文献１８】Ｗａｎｇら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．、７５：１１５５−１１６１（２０００）
【非特許文献１９】Ｗａｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７５：５６２６−５６３２（２０００）
【非特許文献２０】Ｙａａｒら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１００：２３３３−２３４０（１９９７）
【非特許文献２１】Ｇｈｉｓｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、２８８：１０５３−５９（１９９２）
【非特許文献２２】Ｍａｔｔｅｒら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．、１４１：１０１９−１０３０（１９９８）
【非特許文献２３】Ｄｉａｂｅｔｅｓ、４８：２４１−２５３（１９９９）
【非特許文献２４】Ｐｒｕｓｉｎｅｒ、Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．、５０：１１２９−１１５３（１９５３）
【非特許文献２５】Ｐｒｕｓｉｎｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９５：１３３６３−１３３８３（１９９８）
【非特許文献２６】Ｐｒｕｓｉｎｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２１６：１３６−１４４（１９８２）
【非特許文献２７】Ｂｏｌｔｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２１８：１３０９−１３１１（１９８２）
【非特許文献２８】Ｐｒｕｓｉｎｅｒら、Ｃｅｌｌ、３８：１２７−１３４（１９８３）
【非特許文献２９】Ｏｅｓｃｈら、Ｃｅｌｌ、４０：７３５−７４６（１９８５）
【非特許文献３０】Ｋｅｌｌｉｎｇｓら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、７３：１０２５−１０２９（１９９２）
【非特許文献３１】Ｒｉｅｓｎｅｒら、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．、８０：１７３−１８１（１９９３）
【非特許文献３２】Ｃｈｅｓｅｂｒｏら、Ｎａｔｕｒｅ、３１５：３３１−３３３（１９８５）
【非特許文献３３】Ｂａｓｌｅｒら、Ｃｅｌｌ、４６：４１７−４２８（１９８６）
【非特許文献３４】Ｓｔａｈｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３２：１９９１−２００２（１９９３）
【非特許文献３５】Ｐａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９０：１０９６２−１０９６６（１９９３）
【非特許文献３６】Ｄａｗｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、７：１１４４−１１５０（２００１）
【発明の概要】
【００２０】
［発明の要約］
１種若しくはそれ以上の剤が長期増強（ＬＴＰ）のアミロイド媒介性阻害を抑制するような条件下でインテグリンサブユニットαｖに結合する該１種若しくはそれ以上の剤の有効投薬量を投与することを含んでなる、ＬＴＰのアミロイド媒介性阻害の抑制方法が提供される。該方法の一態様において、インテグリンサブユニットαｖに結合する最低２剤の有効投薬量が投与される。該方法の一態様において、該剤は、Ａβ産生の阻害剤、Ａβ沈着の阻害剤、Ａβ消失のメディエーター、アミロイド斑消失のメディエーター、Ａβ神経毒性の阻害剤、Ａβ凝集の阻害剤およびＡβ解離のメディエーターよりなる群から選ばれる第二の剤とともに投与される。一態様において、Ａβ産生の阻害剤はγ分泌酵素阻害剤である。一態様において、Ａβ産生の阻害剤はβ分泌酵素阻害剤である。該方法の一態様において、該剤はＡβに対する抗体とともに投与される。該方法の一態様において、該剤はＲＧＤ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）モチーフを含んでなるペプチドである。該方法の一態様において、該剤はαｖβ１インテグリンのリガンドである。該方法の一態様において、該剤はフィブロネクチン若しくはスーパーフィブロネクチンである。該方法の一態様において、該剤はαｖインテグリンサブユニット発現細胞のビトロネクチン若しくはフィブロネクチンへの接着を阻害する。該方法の一態様において、該剤はαｖインテグリンサブユニット発現細胞のオステオポンチンへの接着を阻害する。該方法の一態様において、該剤はモノクローナル若しくはポリクローナル抗体である。該方法の一態様において、該剤は、１８Ｃ７、２０Ａ９および１７Ｅ６から選択される抗体と同一のエピトープを認識する抗体である。一態様において、該抗体はヒト化抗体、キメラ抗体およびナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）から選択される。該方法の一態様において、該剤は１８Ｃ７、２０Ａ９および１７Ｅ６から選択される抗体である。該方法の一態様において、該剤は、インテグリンサブユニットαｖへの結合について１８Ｃ７、２０Ａ９および１７Ｅ６から選ばれる抗体と競合する。
【００２１】
該方法のさらなる一態様において、該剤は、それらの立体異性体、若しくはそれらの立体異性体の混合物、またはそれらの製薬学的に許容できる塩の形態を包含する、式ＩａおよびＩｂ
【００２２】
【化１】
【００２３】
の化合物から選択される化合物であり、ここで
Ｘ１およびＸ３は窒素若しくは炭素から独立に選択され；
Ｒ１は
【００２４】
【化２】
【００２５】
から選択され；
ここで、上の複素環は、ＮＨ２、ハロゲン、ＮＯ２、ＣＮ、ＣＦ３、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６アルキルおよびＣ３−Ｃ７シクロアルキルよりなる群から選択される０〜２置換基で場合によっては置換されており；
Ｕは−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｔＱ（ＣＨ２）ｍ−および−Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）
ｎ−１−から選択され、ここでメチレン基の１個は場合によってはＲ７で置換されており；
Ｑは、１，２−フェニレン、１，３−フェニレン、２，３−ピリジニレン、３，４−ピリジニレンおよび２，４−ピリジニレンから選択され；
Ｒ６はＨ、Ｃ１−Ｃ４アルキルおよびベンジルから選択され；
Ｒ７はＣ１−Ｃ６アルキル、Ｃ３−Ｃ７シクロアルキル、Ｃ４−Ｃ１１シクロアルキルアルキル、アリール、アリール（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、ヘテロアリールおよびヘテロアリール（Ｃ１−Ｃ６アルキル）から選択され；
Ｒ１０は、Ｈ、ハロゲン、ＣＯ２Ｒ１７、ＣＯＮＲ１７Ｒ２０、０〜１個のＲ１５若しくは０〜１個のＲ２１で置換されているＣ１−Ｃ６アルキル、０〜１個のＲ２１で置換されているＣ１−Ｃ４アルコキシ、０〜１個のＲ１５若しくは０〜１個のＲ２１で置換されているＣ３−Ｃ７シクロアルキル、０〜１個のＲ１５若しくは０〜１個のＲ２１で置換されているＣ４−Ｃ１１シクロアルキルアルキル、および０〜１個のＲ１５若しくは０〜２個のＲ１１若しくは０〜１個のＲ２１で置換されているアリール（Ｃ１−Ｃ６アルキル）−から選択され；
Ｒ１１は、Ｈ、ハロゲン、ＣＦ３、ＣＮ、ＮＯ２、ヒドロキシ、ＮＲ２Ｒ３、０〜１個のＲ２１で置換されているＣ１−Ｃ４アルキル、０〜１個のＲ２１で置換されているＣ１−Ｃ４アルコキシ、０〜１個のＲ２１で置換されているアリール、０〜１個のＲ２１で置換されているアリール（Ｃ１−Ｃ６アルキル）−、０〜１個のＲ２１で置換されている（Ｃ１−Ｃ４アルコキシ）カルボニル、０〜１個のＲ２１で置換されている（Ｃ１−Ｃ４アルキル）カルボニル、０〜１個のＲ２１で置換されているＣ１−Ｃ４アルキルスルホニル、および０〜１個のＲ２１で置換されているＣ１−Ｃ４アルキルアミノスルホニルから選択され；
Ｗは−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒ１３）−であり；
Ｘは−ＣＨ（Ｒ１４）−ＣＨ（Ｒ１５）−であり；
Ｒ１３はＨおよびＣＨ３から選択され；
Ｒ１４は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アリールおよびヘテロアリールから選択され、前記アリール若しくはヘテロアリール基は、Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、アリール、ハロ、シアノ、アミノ、ＣＦ３およびＮＯ２から選択される０〜３置換基で場合によっては置換されており；
Ｒ１５はＨおよびＲ１６から選択され；
Ｙは−ＣＯＲ１９であり；
Ｒ１６は
−ＮＨ（Ｒ２０）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ１７、
−Ｎ（Ｒ２０）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ１７、
−Ｎ（Ｒ２０）−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ｒ１７、
―Ｎ（Ｒ２０）ＳＯ２−Ｒ１７、および
−Ｎ（Ｒ２０）ＳＯ２−Ｎ（Ｒ２０）Ｒ１７
から選択され、
Ｒ１７は、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ３−Ｃ１１シクロアルキル、アリール（Ｃ１−Ｃ６アルキル）−、（Ｃ１−Ｃ６アルキル）アリール、ヘテロアリール（Ｃ１−Ｃ６アルキル）−、（Ｃ１−Ｃ６アルキル）ヘテロアリール、ビアリール（Ｃ１−Ｃ６アルキル）−、ヘテロアリール若しくはアリールから選択され、前記アリール若しくはヘテロアリール基は、Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、ハロ、シアノ、アミノ、ＣＦ３およびＮＯ２よりなる群から選択される０〜３置換基で場合によっては置換されており；
Ｒ１９は−Ｏ−（ＣＨ２）ｋＮ＋（Ｒ２２）（Ｒ２３）（Ｒ２４）Ｚ−であり；
Ｚ−は、ハロゲン化イオン、重硫酸イオン、硫酸イオン、リン酸水素イオン、リン酸イオン、トルエンスルホン酸イオン、メタンスルホン酸イオン、エタンスルホン酸イオン、酢酸イオン、トリフルオロ酢酸イオン、クエン酸イオン、シュウ酸イオン、コハク酸イオン
およびマロン酸イオンから選択される製薬学的に許容できる陰イオンであり；
Ｒ２２、Ｒ２３およびＲ２４はＨ、Ｃ１−Ｃ４アルキルおよびＣ４−Ｃ１１シクロアルキルアルキルから独立に選択されるか；
あるいは、Ｒ２２およびＲ２３は、一緒になって、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１〜２個のヘテロ原子を含有する５〜７員の複素環系を形成し得、ならびにＲ２４は上のとおり定義されるか、または、Ｒ２２、Ｒ２３およびＲ２４は、一緒になって、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１〜２個のヘテロ原子を含有する複素二環系を形成し得；
Ｒ２０はＨおよびＣＨ３から選択され；
Ｒ２１はＣＯＯＨおよびＮＲ６２から選択され；
ｋは２であり；
ｍは０および１から選択され；
ｎは１〜４であり；ならびに
ｔは０および１から選択される。
【００２６】
該方法の一態様において、該剤は式ＩＩ：
【００２７】
【化３】
【００２８】
の化合物であり、
ここでＲ１９は−Ｈ、−ＣＨ３および−ＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋（ＣＨ３）３から選ばれる。一態様において、Ｒ１９は−Ｈである。別の態様において、Ｒ１９は−ＣＨ３である。別の態様において、Ｒ１９は−ＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋（ＣＨ３）３である。
【００２９】
該方法の別の態様において、該剤はディスインテグリンである。該方法の別の態様において、該剤はエキスタチンである。該方法の別の態様において、該剤はヒト抗体である。該方法の別の態様において、該剤はヒト化抗体である。該方法の別の態様において、該剤はキメラ抗体である。該方法の別の態様において、該剤はナノボディである。該方法の別の態様において、該剤は抗体フラグメントである。該方法の別の態様において、該剤は、抗体の１個若しくはそれ以上のＨ鎖、Ｌ鎖、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ）ｃ若しくはＦ（ｖ）、またはそれらのいずれかの組合せを含んでなる。該方法の別の態様において、該剤は抗体でありかつ該抗体のアイソタイプはＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４である。該方法の別の態様において、該剤は抗体でありかつ該抗体のアイソタイプはＩｇＧ２若しくはＩｇＧ３である。該方法の別の態様において、該剤は１抗体鎖である。該方法の別の態様において、該剤は抗体でありかつ該抗体は２対のＬおよびＨ鎖を含んでなる。
【００３０】
該方法の別の態様において、該剤は患者に投与される。一態様において、該剤は抗体でありかつ該抗体の投薬量は患者体重１ｋｇあたり約０．０１から約１０ｍｇまでの範囲に
わたる。一態様において、該剤は製薬学的組成物として担体とともに投与される。一態様において、該剤は、腹腔内、経口、鼻内、皮下、くも膜下腔内、筋肉内、局所若しくは静脈内で投与される。一態様において、患者はアミロイド形成疾患に罹っている。一態様において、該疾患は、アルツハイマー病、ＩＩ型糖尿病、パーキンソン病、びまん性レビー小体病、アミロイドーシス、ダウン症候群、およびプリオン感染により全部若しくは部分的に引き起こされる疾患よりなる群から選ばれる。
【００３１】
該方法の別の態様において、該剤をコードする核酸が投与される。該方法の別の態様において、該剤は、アンチセンスＲＮＡ分子、アンチセンスＤＮＡ分子、リボザイム、ＲＮＡｉおよびジンクフィンガータンパク質よりなる群から選ばれる。別の態様において、該方法はアミロイド沈着物の形成を阻害することをさらに含んでなる。別の態様において、該方法はアミロイド毒性を阻害することをさらに含んでなる。該方法の別の態様において、該剤はＬＴＰの維持期を阻害しない。該方法の別の態様において、該剤は培養中の薄片調製物でのＬＴＰのアミロイド媒介性阻害を抑制する。該方法の別の態様において、該剤は可溶性ＡβによるＬＴＰの阻害を抑制する。
【００３２】
ある剤をインテグリンサブユニットαｖ結合剤と同定すること；および該同定されたαｖ結合剤がＬＴＰのアミロイド媒介性阻害を抑制することを決定することを含んでなる、ＬＴＰのアミロイド媒介性阻害を抑制する剤の同定方法もまた提供される。該方法の一態様において、剤を同定する段階は、直接結合アッセイ、競合結合アッセイおよび細胞接着アッセイの１種若しくはそれ以上を含んでなり；また、該同定されたαｖ結合剤がＬＴＰのアミロイド媒介性阻害を抑制することを決定する段階は、第一の神経回路に高頻度刺激を導入することおよびＬＴＰの誘導を測定すること、Ａβの存在下の第二の神経回路に高頻度刺激を導入することおよびＬＴＰ誘導の阻害を測定すること、ならびにＡβおよび該剤の存在下の第三の神経回路に高頻度刺激を導入することおよびＬＴＰ誘導の阻害の抑制を測定することを含んでなる。
【００３３】
該方法により同定されるＬＴＰのアミロイド媒介性阻害を抑制する剤もまた提供される。一態様において、該剤は抗体である。
【００３４】
該剤および製薬学的に許容できる担体を含んでなる組成物がさらに提供される。
【００３５】
該方法により同定される剤の有効投薬量を投与することを含んでなる、長期増強（ＬＴＰ）のアミロイド媒介性阻害の抑制方法がさらに提供される。
【００３６】
該方法により同定される、ＬＴＰのアミロイド媒介性阻害を抑制する剤もまた提供される。一態様において、該剤は抗体である。
【００３７】
該剤および製薬学的に許容できる担体を含んでなる組成物もまた提供される。
【００３８】
該方法により同定される剤の有効投薬量を投与することを含んでなる、長期増強（ＬＴＰ）のアミロイド媒介性阻害の抑制方法もまた提供される。
【００３９】
αｖ拮抗剤若しくはαｖ媒介性細胞接着の阻害剤を長期増強（ＬＴＰ）のアミロイド媒介性阻害を抑制するのに有効な量で投与することを含んでなる、Ａβ沈着を特徴とするアミロイド形成疾患の処置方法もまた提供される。一態様において、アミロイド形成疾患はアルツハイマー病である。別の態様において、アミロイド形成疾患は軽度認知障害である。
【００４０】
１種若しくはそれ以上の剤がＬＴＰのアミロイド媒介性阻害を抑制するような条件下で
インテグリンサブユニットαｖに結合する１種若しくはそれ以上の剤の有効投薬量を投与することを含んでなる、Ａβ沈着を特徴とするアミロイド形成疾患の処置若しくは予防方法もまた提供される。一態様において、アミロイド形成疾患はアルツハイマー病若しくは軽度認知障害である。一態様において、アミロイド形成疾患はパーキンソン病若しくはびまん性レビー小体病である。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
［発明の詳細な記述］
定義
本発明の治療薬は、典型的には望ましくない汚染物質から実質的に精製されている。これは、ある剤が典型的には最低約５０ｗ／ｗ（重量）％純度であり、ならびに妨害するタンパク質および汚染物質を実質的に含まないことを意味している。ときに、該剤は最低約６０％、７０％、８０％、９０％若しくは９５ｗ／ｗ％純度である。慣習的タンパク質精製技術を使用して、最低９９ｗ／ｗ％の均質なペプチドもまた得ることができる。
【００４２】
２実体間の特異的結合は最低１０６、１０７、１０８、１０９若しくは１０１０Ｍ−１の親和性を意味している。一態様において、親和性は約１０８Ｍ−１以上である。
【００４３】
「抗体」若しくは「免疫グロブリン」という用語は、無傷の抗体およびそれらの結合フラグメントを包含するのに使用する。典型的に、フラグメントは、抗原フラグメントへの特異的結合について、それらが由来した無傷の抗体と競合し、個別のＨ鎖、Ｌ鎖Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）ｃおよびＦｖを包含する。フラグメントは組換えＤＮＡ技術、または無傷の免疫グロブリンの酵素的若しくは化学的分離により製造しうる。「抗体」という用語は、他のタンパク質に化学的に複合されるか若しくは他のタンパク質との融合タンパク質として発現される１種若しくはそれ以上の免疫グロブリン鎖もまた包含する。「抗体」という用語は二特異性抗体もまた包含する。二特異性若しくは二機能性抗体は、２種の異なるＨ／Ｌ鎖対および２種の異なる結合部位を有する人工的ハイブリッド抗体である。二特異性抗体は、ハイブリドーマの融合若しくはＦａｂ’フラグメントの連結を包含する多様な方法により製造し得る（例えばＳｏｎｇｓｉｖｉｌａｉとＬａｃｈｍａｎｎ、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、７９：３１５−３２１（１９９０）；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４８：１５４７−５３（１９９２）を参照されたい）。
【００４４】
ＡＰＰ６９５、ＡＰＰ７５１およびＡＰＰ７７０は、ヒトＡＰＰ遺伝子によりコードされるそれぞれ６９５、７５１および７７０アミノ酸残基長のポリペプチドを指す。Ｋａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ、３２５：７３３−３６（１９８７）；Ｐｏｎｔｅら、Ｎａｔｕｒｅ、３３１：５２５−２７（１９８８）；およびＫｉｔａｇｕｃｈｉら、Ｎａｔｕｒｅ、３３１：５３０−３２（１９８８）を参照されたい。ヒトアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）内のアミノ酸は、ＡＰＰ７７０アイソフォームの配列に従って番号を割り当てられている。Ａβ３９、Ａβ４０、Ａβ４１、Ａβ４２およびＡβ４３のような用語は、アミノ酸残基１−３９、１−４０、１−４１、１−４２および１−４３を含有するＡβペプチドを指す。Ａβ４２は配列（配列番号１）：
Ｈ２Ｎ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−ＯＨを有する。Ａβ４１（配列番号３）、Ａβ４０（配列番号４）およびＡβ３９（配列番号５）は、Ｃ末端からのそれぞれＡｌａ、Ａｌａ−ＩｌｅおよびＡｌａ−Ｉｌｅ−Ｖａｌの脱落によりＡβ４２（配列番号１）と異なる。Ａβ４３（配列番号２）はＣ末端のトレオニン残基の存在によりＡβ４２（配列番号１）と異なる。
【００４５】
「アミリン」は、当該技術分野で公知のタンパク質、またはそのペプチド若しくはポリペプチド若しくはフラグメント、あるいは該タンパク質、ペプチド若しくはポリペプチドの前駆体タンパク質若しくはポリマーを指す。該用語は島アミロイドポリペプチドを包含する。アミリンの記述は、当該技術分野でＣｏｏｐｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８５：７７６３（１９８８）およびＬｅｉｇｈｔｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３５：６３２（１９８８）のような場所で見出しうる。
【００４６】
「アミロイドペプチド若しくはタンパク質」という用語は、アミリンおよびＡβを包含するアミロイド様沈着物を形成するペプチドおよびタンパク質のファミリーを指す。
【００４７】
「アミロイド若しくはアミロイド様沈着物」という句は、アミロイド原線維、ならびに、老人性アミロイドーシス（例えばＡβ）、プリオン関連脳症（例えばＰｒＰ）および糖尿病患者の腎若しくは膵（例えばアミリン）での沈着物などのような、アミロイド若しくはアミロイド様であると当該技術分野で認識されている構造が原線維若しくは非原線維の他のアミロイド若しくはアミロイド様沈着物を包含する。慣習的染色を用いる光学顕微鏡検査でこうした沈着物は均一なエオシン好性の外見を有する。コンゴーレッド染色でそれらは偏光下で特徴的な黄緑色の複屈折を示す。該用語は、アミロイド沈着物と異なりコンゴーレッドで染色しないプレアミロイド沈着物もまた包含する。
【００４８】
「アミロイド形成疾患」という用語は、タンパク質若しくはペプチドの不要な沈着を特徴とする疾患を包含することを意図している。該用語は、Ｋａｈｎら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、４８：２４１−２５３（１９９９）；およびＪｏｈｎｓｏｎら、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、６６（５）：５２２−５３５（１９９２）により記述されるところのＩＩ型糖尿病（例えばアミリン）、アルツハイマー病（例えばＡβ）、多発性骨髄腫および関節リウマチのような、アミロイドペプチドの不要な沈着を特徴とする疾患をとりわけ包含する。該用語は、トランスサイレチン（ＴＴＲ）沈着により媒介されるものを包含する、Ｈｕｎｄら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、５６：４３１−４３５（２００１）により記述されるところのパーキンソン病または遺伝性若しくは全身性アミロイドーシスのようなアミロイド形成タンパク質の不要な沈着を特徴とする疾患もまたとりわけ包含する。該用語はびまん性レビー小体病もまた包含する。さらに、該用語は、クロイツフェルト・ヤコブ病のようなプリオンへの感染により全部若しくは部分的に引き起こされる疾患を包含する。こうしたプリオン媒介性疾患は、Ｇｉｅｓｅら、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２５３：２０３−２１７（２００１）により記述されるところのプリオンタンパク質の蓄積を特徴とする。約言すれば、該用語は、周囲の細胞の健康および満足のいく状態に悪影響を及ぼす不要なタンパク質若しくはペプチド沈着物により病状が媒介される全疾患を包含することを意味している。
【００４９】
「抗原」は抗体が特異的に結合する実体である。
【００５０】
「エピトープ」若しくは「抗原決定基」という用語は、Ｂおよび／若しくはＴ細胞が応答する抗原上の１部位を指す。Ｂ細胞エピトープは、連続するアミノ酸、若しくはタンパク質の三次フォールディングにより並置される連続しないアミノ酸の双方から形成され得る。連続するアミノ酸から形成されるエピトープは変性溶媒への曝露に際して典型的に保持される一方、三次フォールディングにより形成されるエピトープは変性溶媒での処理に際して典型的に喪失される。エピトープは、典型的に、独特の空間的コンホメーション中に最低３、およびより通常は最低５若しくは８〜１０アミノ酸を包含する。エピトープの空間的コンホメーションの決定方法は、例えばｘ線結晶学および二次元核磁気共鳴を包含する。例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．
６６、Ｇｌｅｎｎ Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ編（１９９６）中Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓを参照されたい。同一の若しくは重なるエピトープを認識する抗体は、標的抗原への別の抗体の結合を阻止する１抗体の能力を示す単純なイムノアッセイで同定し得る。
【００５１】
「裸のポリヌクレオチド」若しくは「裸のＤＮＡ」という用語は、コロイド状物質例えばタンパク質と複合体形成されていないポリヌクレオチドを指す。裸のポリヌクレオチドはときにプラスミドベクターにクローン化される。
【００５２】
「患者」という用語は予防的若しくは治療的処置のいずれかを受領するヒトおよび他の哺乳動物被験体を包含する。
【００５３】
「予防する」、「予防すること」および「予防」という用語は、疾患若しくは状態の最低１症状（例えば長期増強の抑制および／若しくは神経変性）を究極的に明示しうるがしかし未だそうしていない個体への予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）若しくは予防的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）な治療の投与を指す。こうした個体は、該疾患のその後の発生と相関することが既知である危険因子に基づき同定しうる。あるいは、予防治療は予防対策として危険因子の事前の同定を伴わず投与しうる。疾患若しくは状態の最低１症状の発生を遅らせることもまた予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）若しくは予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）とみなしうる。
【００５４】
本明細書で使用されるところの「処置する」、「処置すること」若しくは「処置」という用語は、疾患若しくは状態の最低１症状（例えば長期増強の抑制および／若しくは神経変性）を既に明示している個体への治療の投与を指す。
【００５５】
剤および第二の剤の「共投与」は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ系、若しくは患者でのようなｉｎ
ｖｉｖｏで時間が重なる剤および第二の剤の治療濃度を達成するためのいかなる投薬計画による投与も包含する。従って、例えば、共投与は、剤および第二の剤双方を含んでなる製剤の投与、ならびに一方が該剤を含んでなりかつ別のものが第二の剤を含んでなる別個の製剤の投与を包含する。別個の製剤を投与する場合、投与は同時であっても連続してもよい。連続する場合、該剤は次々に投与しうるか、あるいは、該剤の投与と第二の剤の投与の間の時間は、例えば１時間まで、２時間まで、４時間まで、６時間まで、１２時間まで、または１日若しくは数日まででありうる。
【００５６】
神経細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで起こるＡＰＰのＡβへの天然のプロセシングの結果として、若しくは、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイでのＡβの調製物と神経細胞の接触の結果として、Ａβペプチドに曝露し得る。Ａβペプチドへの曝露は薬物への曝露前、後若しくはそれと同時に発生し得る。
【００５７】
Ａβペプチドのアミロイド沈着物は、図１Ａに示されるようなｉｎ ｖｉｔｒｏ若しくはｉｎ ｖｉｖｏで皮質細胞上および周囲に生じる原線維をおそらく包含するＡβペプチドの凝集物を指す。
【００５８】
文脈から別の方法で明らかでない限り、フィブロネクチンへの言及はスーパーフィブロネクチンを包含する。
【００５９】
抗体間の競合は、試験中の免疫グロブリンが共通抗原への参照抗体の特異的結合を阻害するアッセイにより測定する。多数の型の競合結合アッセイ、例えば固相直接若しくは間接ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、固相直接若しくは間接エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ（Ｓｔａｈｌｉら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ、９：２４２−５３（１９８３）を参照されたい）；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（Ｋｉｒｋｌａｎｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３７：３６１４−１９（１９８６）を参照されたい）；固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイ（ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ、”Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８８）を参照されたい）；Ｉ−１２５標識を使用する固相直接標識ＲＩＡ（Ｍｏｒｅｌら、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２５（１）：７−１５（１９８８）を参照されたい）；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（Ｃｈｅｕｎｇら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１７６：５４６−５２（１９９０））；および直接標識ＲＩＡ（Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒら、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３２：７７−８２（１９９０））が既知である。典型的に、こうしたアッセイは、未標識の試験免疫グロブリン若しくは標識参照免疫グロブリンいずれかを持つ固体表面若しくは細胞に結合した精製抗原の使用を必要とする。競合阻害は、試験免疫グロブリンの存在下で固体表面若しくは細胞に結合される標識の量を測定することにより測定する。通常、試験免疫グロブリンは過剰に存在する。競合アッセイにより同定される抗体（競合抗体）は、参照抗体と同一エピトープに結合する抗体、および参照抗体により結合されるエピトープの十分に近位の隣接するエピトープに結合して立体障害を起こす抗体を包含する。通常、競合抗体が過剰に存在する場合、それは参照抗体の共通抗原への特異的結合を最低５０若しくは７５％阻害することができる。
【００６０】
１種若しくはそれ以上の列挙される要素を「含んでなる」組成物若しくは方法は、具体的に列挙されない他の要素を包含しうる。例えば、抗体を含んでなる組成物は、単独若しくは他の成分と組合せの該抗体を含有しうる。
【００６１】
Ｉ．方法
本発明は、アミリンおよびＡβペプチドのようなアミロイドタンパク質の細胞外網目構造の形成の阻害若しくは予防方法、こうしたタンパク質の毒性効果の媒介方法、ならびに該方法での使用のための剤を提供する。該方法は、アルツハイマー病、ＩＩ型糖尿病、パーキンソン病、びまん性レビー小体病、全身性および遺伝性アミロイドーシス、ならびにプリオン感染により全部若しくは部分的に引き起こされる疾患を処置若しくは予防するのに使用し得る。これらの方法での使用に有効な剤は、β１、α２、α６若しくはαｖのようなインテグリンサブユニットに結合する抗体および他の剤を包含する。これらのサブユニットはヘテロ二量体受容体として会合してインテグリン、例えばα２β１、α６β１およびαｖβ１を形成する。上の剤は、インテグリンとＡβペプチドの間の相互作用を阻害するために個別で若しくは組合せで使用し得る。αｖβ１およびα２β１双方のインテグリンとＡβの間の相互作用を阻害する剤（１種若しくは複数）の使用が好ましい。フィブロネクチン（インテグリンαｖβ１のリガンド）もまた、上の方法でラミニン（αｖβ１のリガンド）に対する抗体がし得るように剤として使用し得る。本発明は、部分的に、α２、αｖ、α６およびβ１インテグリンサブユニットに対する抗体がアミリンおよびＡβペプチドのようなアミロイドタンパク質の細胞外網目構造の形成を阻害するという観察結果を前提とする。それにより、こうした抗体はアミロイドタンパク質の毒性を阻害する。αｖβ１リガンド、フィブロネクチンもまた網目構造形成を阻害する。α２β１リガンド、ラミニンは網目構造形成を阻害しないが、しかしラミニンに対する抗体は網目構造形成および毒性を阻害する。
【００６２】
本発明は、部分的に、αｖインテグリンサブユニットに対する選択的抗体がｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ双方でＡβによるＬＴＰの阻害を抑制するという観察結果を前提とする。αｖ含有インテグリンの小分子非ペプチド拮抗剤、ならびにインテグリンの２種の他の拮抗的リガンド、スーパーフィブロネクチンおよびディスインテグリン、エキスタチンもまたＬＴＰのＡβ阻害を抑制する。従って、αｖインテグリンサブユニットに結合する剤はＬＴＰのＡβ阻害を抑制し、ならびに、アミリンおよびＡβペプチドのよう
なアミロイドタンパク質の細胞外網目構造の形成を阻害若しくは予防する。
【００６３】
従って、本発明は、長期増強（ＬＴＰ）のアミロイド媒介性阻害を抑制するのに有効な量のαｖ拮抗剤若しくはαｖ媒介性細胞接着の阻害剤を投与することを含んでなる、長期増強（ＬＴＰ）のアミロイド媒介性阻害の抑制方法、およびＡβ沈着を特徴とするアミロイド形成疾患の処置若しくは予防方法、ならびに、Ａβの沈着を特徴とするアミロイド形成疾患の処置方法もまた提供する。該方法は、限定されるものでないがアルツハイマー病、ＩＩ型糖尿病、パーキンソン病、びまん性レビー小体病、全身性および遺伝性アミロイドーシスを挙げることができる疾患若しくは状態、ならびにプリオン感染により全部若しくは部分的に引き起こされる疾患を処置若しくは予防するのに有用である。これらの方法での使用に有効な剤は、限定されるものでないが、抗体、および例えばインテグリンサブユニットαｖに結合するＳＭ２５６のような他の剤を挙げることができる。上の剤は、インテグリンとＡβペプチドの間の相互作用を阻害するのに個別で若しくは組合せで使用し得る。
【００６４】
ＩＩ．インテグリン
インテグリンは、細胞外マトリックスおよび他細胞の双方への細胞の接着を制御する、細胞表面接着ヘテロ二量体膜貫通受容体のスーパーファミリーである。接着は成長、移動および分化のための固定およびシグナルを提供する。インテグリンは、約１５種の既知のα鎖の１種の約８種の既知のβ鎖の１種との会合により形成される。赤血球を除く全部のヒト細胞が１種若しくはそれ以上のインテグリンを発現する。
【００６５】
インテグリンサブユニットα２、αｖ、α６およびβ１は全部公知である。例示的ヒト配列はそれぞれＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０６２０３９、Ｍ１４６４８、Ｘ５９５１２およびＸ０７９７９から取出し可能である。別の方法で示されない限り、α２、αｖ、α６、β１への言及は、これらの例示的配列、それらのアレルバリアントおよび他の種からの同族バリアントを包含する。天然の配列のリガンドへの特異的結合について天然の配列と競合するのに十分な天然の配列に対する配列同一性を有するこれらの配列の誘導されるバリアントもまた、いくつかの方法で使用し得る。αｖ、およびβサブユニットβ１、β３、β５、β６若しくはβ８の１種を含有するインテグリンはＲＧＤモチーフを持つリガンドを認識するが、しかし結合特異性はどのβサブユニットが存在するかに依存して変動する。αｖβ１は、ビトロネクチン（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ０３１６８）、フィブロネクチン（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ２６１７９）およびオステオポンチン（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｊ０４７６５）を認識することが既知である。フィブロネクチンは、結合組織中、細胞表面上、ならびに血漿および他の体液中で見出される大型多ドメイン糖タンパク質である。フィブロネクチンは、細胞骨格および細胞外マトリックスの成分、血液凝固応答、線維素溶解の急性期および補体系に関与する循環成分を包含する多様な巨大分子、ならびに線維芽細胞、ニューロン、食細胞および細菌を包含する多様な細胞上の細胞表面受容体と作用する。
【００６６】
α２およびβ１サブユニットを含有するインテグリンは、ＶＬＡ−２（最晩期抗原（ｖｅｒｙ ｌａｔｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ）２）、ＧＰＩａ−ＩＩａ（血小板上糖タンパク質Ｉａ−ＩＩａ）およびＥＣＭＲＩＩ（細胞外マトリックス受容体ＩＩ）として知られる。α２β１インテグリンはコラーゲンＩないしＶＩ、ラミニンおよびおそらくフィブロネクチンを結合する。該受容体は、ＢおよびＴリンパ球、血小板、線維芽細胞、内皮細胞ならびに黒色腫細胞上で発現され、そしてコラーゲンおよびラミニンをリガンドとして特異的に認識する。ラミニンは共通の構造的構成をもつ大型多ドメインタンパク質である。ラミニン分子は、コイルドコイルドメインにより一緒に結合されたα、βおよびγ鎖サブユニットを有する。最低５種のα鎖、２種のβ鎖および３種のγ鎖が既知であり、そしてこれらの鎖の異なる組合せを有する最低１２種のラミニンが報告されて
いる（第ＷＯ ００／６６７３０号明細書）。ラミニンはアルツハイマー病において斑を包含する細胞外マトリックス中で見出される（Ｍｕｒｔｏｍａｋｉら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏ．Ｒｅｓ．、３２：２６１−７３（１９９２）；Ｂｒｏｎｆｉｎａｎら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、５：１６−２３（１９９７）；およびＣａｓｔｉｌｌｏら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏ．Ｒｅｓ．、６２：４５１−６２（２０００））。コラーゲンは哺乳動物で最も豊富なタンパク質であり、そして皮膚、骨、腱、軟骨および歯の主要線維成分である。２３種以上の既知のコラーゲン遺伝子が存在する（Ａｄａｍｓら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．、１：１６１−１６８（１９８９））。
【００６７】
α６／β１インテグリンは、血小板、リンパ球、単球、胸腺細胞および内皮細胞上で発現され、それら上でそれはｉｎ ｖｉｖｏでラミニン−１、ラミニン−２およびラミニン−４のラミニン受容体として機能する。それはまたラミニン−５の受容体でもあるが、しかしｉｎ ｖｉｖｏででない。ラミニン−１について、結合部位はこの細胞外マトリックス分子のＥ８ドメイン中に突き止められている。この受容体は最晩期抗原６（ＶＬＡ−６）および糖タンパク質Ｉｃ−ＩＩａ（血小板上ＧＰＩｃ−ＩＩａ）としてもまた知られている。
【００６８】
インテグリンは、セレクチンおよび免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーメンバーもまた包含する接着タンパク質として知られるタンパク質の大きな一分類の一例である（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ、３４６：４２５（１９９０）；Ｏｓｂｏｒｎ、Ｃｅｌｌ、６２：３（１９９０）；Ｈｙｎｅｓ、Ｃｅｌｌ、６９：１１（１９９２）（全部の目的上そっくりそのまま引用することにより組み込まれる）を参照されたい）。抗体、および接着タンパク質若しくはそれらのリガンドに結合しかつ／または該２者間の相互作用を阻止する他の剤を、下述されるスクリーニング方法でＡβ沈着物の蓄積の予防若しくは阻害における活性についてスクリーニングし得る。下述される方法によるスクリーニングに適する他のセレクチンおよびそれらのリガンドの例は、インテグリンα２β５、αｖβ５、α６β５、α２β６、αｖβ６およびα６β６を包含する。コラーゲンに結合するα２β１を除く他のリガンドもまたスクリーニングしうる。
【００６９】
ＩＩＩ．剤
本発明の治療薬は、α２、αｖ、α６およびβ１インテグリンサブユニットに特異的に結合する抗体を包含する。結合は、場合によっては固相に固定された単離されたインテグリンサブユニット若しくはそれらのフラグメント、または細胞の表面上で発現されたインテグリンサブユニットのいずれを用いても評価し得る。しばしば、結合はヘテロ二量体インテグリンを発現する細胞を使用して分析される。例えば、ある剤が唯一のインテグリンとしてα２β１を発現する細胞に結合する場合には、該剤がα２若しくはβ１またはいずれのサブユニット単独にも結合することなくα２β１に結合すると結論付け得る。これらの可能性は、異なるヘテロ二量体インテグリンを持つ細胞への同一の剤の結合を試験することにより識別し得る。例えば、同一の剤が、存在する唯一のインテグリンとしてαｖβ１を持つ細胞に特異的に結合する場合には、該剤がβ１サブユニットに結合していることがありそうである。インテグリンおよびインテグリンサブユニットに対する多様な抗体が商業的に入手可能であり、それらのいくつかを実施例に記述する。
【００７０】
モノクローナル若しくはポリクローナル抗体を本発明の方法で使用し得る。好ましい抗体は、それらの天然のリガンドの１種若しくはそれ以上とのこれらのインテグリンサブユニットの相互作用を阻止する。すなわち、αｖβ１に対する阻止抗体は、フィブロネクチン、オステオポンチンおよび／若しくはビトロネクチンとのこのインテグリンの相互作用を阻止する。例えば、第ＷＯ ９９／３７６８３号明細書により記述される１４Ｄ９．Ｆ８抗体はαｖのフィブロネクチンへの結合を阻止する。α２β１に対する阻止抗体はこのインテグリンのコラーゲン若しくはラミニンとの相互作用を阻止する。抗体若しくは他の
剤の阻止する能力は、抗体（若しくは他の剤）の存在若しくは非存在下で、リガンドで被覆したプレートへの接着についてインテグリンを発現する細胞を試験する単純なアッセイにより認識し得る。プレートへの細胞結合の量の最低約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％若しくは１００％の減少は、該抗体がインテグリンに関してモル濃度過剰で存在する場合に阻止抗体（若しくは他の剤）を同定する。インテグリンサブユニットの他の組合せに対する剤の阻止能力のさらなる分析は、ヘテロ二量体インテグリンのどのサブユニットが阻止されているかを特定し得る。抗体若しくは他の剤の結合特異性もまた、インテグリンサブユニット若しくはそれを持つ細胞への結合について所望のエピトープ特異性を有することが既知の参照抗体と試験抗体が競合する競合アッセイにより決定し得る。試験および参照抗体が競合する場合には、それらは、一方の抗体の結合が他方の結合を妨害する十分に近位の同一のエピトープ（１個若しくは複数）に結合する。いくつかの態様において、トランスフェクトした細胞は単一の型のインテグリンを発現する。
【００７１】
本発明での使用のための数種の抗体はただ１つの型のインテグリンサブユニットに結合する。数種の抗体は２種若しくはそれ以上のインテグリンサブユニットに特異的に結合する。数種の抗体は、インテグリンのサブユニットがヘテロ二量体インテグリンとして会合している場合にのみ結合する。例えば、数種の抗体はα２若しくはβ１いずれか単独に結合することなくα２β１に結合する。数種の抗体はαｖ若しくはβ１いずれか単独に結合することなくαｖβ１に結合する。数種の抗体はαｖインテグリンサブユニットに結合する。数種の抗体は、遊離の形態で、および該サブユニットがヘテロ二量体インテグリンの一成分である場合の双方でサブユニットに結合する。上の抗体の同一の結合特異性を有するペプチドおよび小分子もまた使用し得る。
【００７２】
本発明での使用のための他の治療薬は、フィブリノーゲン、オステオポンチン、ビトロネクチン、それらのフラグメント、およびαｖβ１への結合についてフィブリノーゲン若しくはビトロネクチンと競合するＲＧＤペプチドモチーフを含有する他の天然の若しくは合成ペプチドを包含する。αｖβ１への結合についてフィブリノーゲン、ビトロネクチン若しくはオステオポンチンと競合する小分子模倣物もまた使用し得る。他の治療薬は、ラミニンに対する抗体、ならびに同一の結合特異性をもつペプチドおよび小分子を包含する。
【００７３】
候補治療薬は以下のスクリーニングの１種若しくはそれ以上を実施することにより評価し得る。典型的には、インテグリンサブユニットα２、αｖ、α６若しくはβ１、および／またはヘテロ二量体インテグリンα２β１、αｖβ１ α６β１、あるいはラミニンへの特異的結合について剤を最初に評価する。適する剤は、典型的に最低１０７、１０８、１０９若しくは１０１０Ｍ−１の特異的親和性で結合する。
【００７４】
その後、候補は場合によっては特定のエピトープ特異性について評価する。これは、参照剤を用いる競合アッセイ、上述されたところの機能的プレートブロッキングアッセイ、または、抗原の一連の欠失変異体を結合するその能力についウエスタンブロッティング若しくはＥＬＩＳＡにより抗体若しくは他の剤を評価するエピトープマッピング実験により決定し得る。抗体若しくは他の剤への特異的結合を示すための最小フラグメントが該抗体若しくは他の剤のエピトープを規定する。あるいは、若しくは加えて、候補剤をアミロイドペプチドの細胞外網目構造の形成を阻害する能力について評価する。適する剤は、典型的に、剤の存在下でアミリン若しくはＡβのようなアミロイドペプチドでの処理から生じる毒性を対照に関して最低約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％若しくは１００％またはそれ以上低下させる。
【００７５】
候補化合物は、アミロイド形成疾患になりやすいトランスジェニック動物で予防的およ
び治療的有効性についてもまた試験し得る。こうした動物は、例えば、Ｇａｍｅｓら、上記により記述されるＡＰＰの７１７突然変異を持つマウス、ならびにＭｃＣｏｎｌｏｇｕｅら、米国特許第ＵＳ ５，６１２，４８６号明細書；Ｈｓｉａｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７４：９９（１９９６）；Ｓｔｕｒｃｈｌｅｒ−Ｐｌｅｒｒａｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９４：１３２８７−９２（１９９７）；およびＢｏｒｃｈｅｌｔら、Ｎｅｕｒｏｎ、１９：９３９−４５（１９９７）により記述されるようなＡＰＰの６７０／６７１スウェーデン型突然変異を持つマウスを包含する。トランスジェニックマウスで活性を示す剤をその後ヒト臨床試験で評価し得る。アルツハイマー病患者でヒト臨床試験を実施するための例示的形式が第ＷＯ ９８／２４６７８号明細書（引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述されている。
【００７６】
長期増強（ＬＴＰ）のアミロイド媒介性阻害の抑制方法での使用のための候補化合物の場合、該化合物をＬＴＰのｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／若しくはｉｎ ｖｉｖｏモデルで試験しうる。例えば、候補化合物をｉｎ ｖｉｔｒｏモデルで最初に試験することができ、そしてその後、該化合物がそのモデルで長期増強（ＬＴＰ）のアミロイド媒介性阻害を抑制する場合は、ｉｎ ｖｉｖｏモデルでその後試験しうる。
【００７７】
Ａ．抗体
１．免疫グロブリンの一般的特徴
基本的抗体構造ユニットはサブユニットの四量体を含んでなることが知られている。各四量体はポリペプチド鎖の２個の同一の対から構成され、各対は１本の「Ｌ」（約２５ｋＤａ）および１本の「Ｈ」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は主に抗原認識を司る約１００ないし１１０若しくはそれ以上のアミノ酸の可変領域を包含する。各鎖のカルボキシ末端部分は主にエフェクター機能を司る定常領域を規定する。
【００７８】
Ｌ鎖はκ若しくはλいずれかに分類される。Ｈ鎖はγ、μ、α、δ若しくはεに分類され、そしてそれぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥのような抗体のアイソタイプを規定する。ＬおよびＨ鎖内で、可変および定常領域は約１２若しくはそれ以上のアミノ酸の「Ｊ」領域により結合され、Ｈ鎖は約１０より多いアミノ酸の「Ｄ」領域もまた包含する。（全般として、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｐａｕｌ，Ｗ．編、第２版、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９８９）、第７章（全部の目的上そっくりそのまま引用することにより組み込まれる）を参照されたい）。
【００７９】
各Ｌ／Ｈ鎖対の可変領域は抗体の結合部位を形成する。従って無傷の抗体は２個の結合部位を有する。二機能性若しくは二特異性抗体でを除き該２結合部位は同一である。該鎖は全部、相補性決定領域若しくはＣＤＲともまた呼ばれる３個の超可変領域により結合される比較的保存された枠組み領域（ＦＲ）の同一の一般的構造を表す。各対の２本の鎖からのＣＤＲは枠組み領域により整列されて、特異的エピトープへの結合を可能にする。Ｎ末端からＣ末端へ、ＬおよびＨ鎖双方はドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含んでなる。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、Ｋａｂａｔ、Ｓｅｑｅｕｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（国立保健研究所、メリーランド州ベセスダ、１９８７および１９９１）、若しくはＣｈｏｔｈｉａとＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６：９０１−１７（１９８７）；Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｎａｔｕｒｅ、３４２：８７８−８３（１９８９）の定義に従う。
【００８０】
２．ヒト以外の抗体の製造
ヒト以外のモノクローナル抗体（例えばマウス、モルモット、霊長類、ウサギ若しくはラット）の製造は、例えば、インテグリン、そのサブユニット若しくはそれらのフラグメント、またはインテグリン若しくはそのサブユニットを持つ細胞で動物を免疫することに
より達成し得る。ラミニンに対する抗体を生成するための免疫原としてラミニンもまた使用し得る。ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９８８（全部の目的上引用することにより本明細書に組み込まれる））を参照されたい。こうした免疫原は、天然の供給源から、ペプチド合成により、若しくは組換え発現により得ることができる。場合によっては、免疫原は下述されるところの担体タンパク質と融合若しくは別の方法で複合体形成して投与し得る。場合によっては、免疫原はアジュバントとともに投与し得る。いくつかの型のアジュバントを下述されるとおり使用し得る。フロイントの完全アジュバント、次いで不完全アジュバントが実験動物の免疫化に好ましい。ウサギ、ヤギ、ヒツジ若しくはモルモットを、ポリクローナル抗体を作成するのに典型的に使用する。マウスはモノクローナル抗体を作成するのに典型的に使用する。抗体を、意図しているインテグリン若しくはそのサブユニット、またはラミニンのような他の抗原への特異的結合についてスクリーニングする。抗体は上述されたところのそのリガンドへのインテグリンの結合を阻止する能力についてもまたスクリーニングし得る。上述された他のスクリーニング手順もまた実施し得る。
【００８１】
３．キメラおよびヒト化抗体
キメラおよびヒト化抗体は、キメラ若しくはヒト化抗体の構築のための出発原料を提供するマウス若しくは他のヒト以外の抗体と同一の若しくは類似の結合特異性および親和性を有しうる。数種のキメラ若しくはヒト化抗体はマウスのものの２倍、５倍若しくは１０倍の係数内の親和性を有する。キメラ抗体は、そのＬおよびＨ鎖遺伝子が、異なる種に属する免疫グロブリン遺伝子セグメントから典型的には遺伝子工学により構築された抗体である。例えば、マウスモノクローナル抗体からの遺伝子の可変（Ｖ）セグメントをＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３若しくはＩｇＧ４のようなヒト定常（Ｃ）セグメントに結合しうる。典型的なキメラ抗体は、従って、マウス抗体からのＶすなわち抗原結合ドメインおよびヒト抗体からのＣすなわちエフェクタードメインよりなるハイブリッドタンパク質である。
【００８２】
ヒト化抗体は、実質的にヒト抗体（アクセプター抗体と命名される）からの可変領域枠組み残基、および実質的にマウス抗体のようなヒト以外の抗体（ドナー免疫グロブリンと称される）からの相補性決定領域を有する。Ｑｕｅｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８６：１００２９−３３（１９８９）および第ＷＯ ９０／０７８６１号、米国特許第ＵＳ ５，６９３，７６２号、同第ＵＳ ５，６９３，７６１号、同第ＵＳ ５，５８５，０８９号、同第ＵＳ ５，５３０，１０１号、およびＷｉｎｔｅｒ、米国特許第ＵＳ ５，２２５，５３９号明細書（それらのそれぞれは全部の目的上そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）を参照されたい。定常領域（存在する場合）もまた実質的に若しくは完全にヒト免疫グロブリンからである。ヒト可変ドメインは通常、ＣＤＲが由来したマウス可変領域ドメインとの高程度の配列同一性をその枠組み配列が表すヒト抗体から選ばれる。ＨおよびＬ鎖可変領域枠組み残基は同一若しくは異なるヒト抗体配列に由来し得る。ヒト抗体配列は天然に存在するヒト抗体の配列であり得るか、若しくは数種のヒト抗体のコンセンサス配列であり得る。Ｃａｒｔｅｒら、第ＷＯ ９２／２２６５３号明細書を参照されたい。ヒト可変領域枠組み残基からのあるアミノ酸を、ＣＤＲコンホメーションおよび／若しくは抗原への結合に対するそれらの可能な影響に基づき置換のため選択する。こうした可能な影響の検討は、モデル化、特定の場所のアミノ酸の特徴の検査、または特定のアミノ酸の置換若しくは突然変異誘発の影響の経験的観察による。
【００８３】
例えば、あるアミノ酸がマウス可変領域枠組み残基と選択したヒト可変領域枠組み残基の間で異なる場合、該ヒト枠組みアミノ酸は通常、該アミノ酸が：
（１）抗原を直接非共有結合する、
（２）ＣＤＲ領域に隣接する、
（３）ＣＤＲ領域と別の方法で相互作用する（例えばＣＤＲ領域の約６Å以内にある）、若しくは
（４）ＶＬ−ＶＨ界面に参画する
ことが合理的に期待される場合は、マウス抗体からの同等の枠組みアミノ酸により置換すべきである。
【００８４】
置換の他の候補は、その位置でヒト免疫グロブリンにとって異常であるアクセプターヒト枠組みアミノ酸である。これらのアミノ酸を、ドナー抗体の同等の位置若しくはより典型的なヒト免疫グロブリンの同等の位置からのアミノ酸で置換し得る。ヒト化免疫グロブリンの可変領域枠組みは通常、ヒト可変領域枠組み配列若しくはこうした配列のコンセンサスに対し最低８５％の配列同一性を示す。
【００８５】
４．ヒト抗体
上のインテグリン若しくはラミニンに対するヒト抗体は下述される多様な技術により提供される。数種のヒト抗体は、競合結合実験により、若しくは、そうでなければ、実施例に記述されるマウスモノクローナル抗体の１種のような特定の１マウス抗体と同一のエピトープ特異性を有するように選択する。ヒト抗体は、免疫原としてインテグリン若しくはラミニンの１フラグメントのみを使用することにより、および／またはインテグリンの欠失変異体の集合物に対し抗体をスクリーニングすることにより、特定の１エピトープ特異性についてもまたスクリーニングし得る。
【００８６】
ａ．トリオーマの方法論
基本的アプローチ、および本アプローチでの使用のための例示的１細胞融合パートナーＳＰＡＺ−４が、Ｏｅｓｔｂｅｒｇら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、２：３６１−６７（１９８３）；Ｏｅｓｔｂｅｒｇ、米国特許第４，６３４，６６４号明細書；およびＥｎｇｌｅｍａｎら、米国特許第４，６３４，６６６号明細書（それらのそれぞれは全部の目的上そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）により記述されている。この方法により得られる抗体産生細胞株は、それらが３種の細胞（２種のヒトおよび１種のマウス）を祖先とするためトリオーマと呼ばれる。最初に、マウス骨髄腫株をヒトＢリンパ球と融合して、Ｏｅｓｔｂｅｒｇ、上記により記述されるＳＰＡＺ−４細胞株のような抗体を産生しない異種ハイブリッド細胞を得る。該異種細胞をその後、免疫ヒトＢリンパ球と融合して抗体産生トリオーマ細胞株を得る。トリオーマはヒト細胞から作成される通常のハイブリドーマより安定に抗体を産生することが見出されている。
【００８７】
免疫Ｂリンパ球はヒトドナーの血液、脾、リンパ節若しくは骨髄から得る。特定の１抗原若しくはエピトープに対する抗体が望ましい場合は、免疫化にその抗原若しくはその１エピトープを使用することが好ましい。免疫化はｉｎ ｖｉｖｏ若しくはｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれでもあり得る。ｉｎ ｖｉｖｏ免疫化のため、Ｂ細胞を、典型的に、Ａβ、そのフラグメント、Ａβ若しくはフラグメントを含有するより大きいペプチド、またはＡに対する抗体に対する抗イディオタイプ抗体で免疫したヒトから単離する。いくつかの方法において、Ｂ細胞は抗体療法を最終的に投与されるはずである同一患者から単離する。ｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫化のためには、Ｂリンパ球は、典型的に、１０％ヒト血漿を補充したＲＰＭＩ−１６４０（Ｅｎｇｌｅｍａｎ、上記を参照されたい）のような培地中で７〜１４日間抗原に曝露する。
【００８８】
免疫Ｂリンパ球を公知の方法によりＳＰＡＺ−４のような異種ハイブリッド細胞に融合する。例えば、細胞をＭＷ１０００〜４０００の４０〜５０％ポリエチレングリコールで約３７℃で約５〜１０分間処理する。細胞を融合混合物から分離し、そして所望のハイブリッドについて選択的な培地（例えばヒポキサンチン＋アメトプテリン＋チミジン（ＨＡ
Ｔ培地）若しくはアメトプテリン＋ヒポキサンチン（ＡＨ培地）を含有する）中で増殖させる。必要とされる結合特異性を有する抗体を分泌するクローンは、Ａβ若しくはそのフラグメントに結合する能力についてトリオーマ培地をアッセイすることにより同定する。所望の特異性を有するヒト抗体を産生するトリオーマを限界希釈技術によりサブクローニングし、そして培地中ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させる。得られるトリオーマ細胞株をその後Ａβ若しくはそのフラグメントを結合する能力について試験する。
【００８９】
トリオーマは遺伝子的に安定であるとは言え、それらは非常に高レベルで抗体を産生しない。発現レベルは、抗体遺伝子をトリオーマから１種若しくはそれ以上の発現ベクターにクローン化すること、および該ベクターを標準的哺乳動物、細菌若しくは酵母細胞株に形質転換することにより増大させ得る。
【００９０】
ｂ．トランスジェニックのヒト以外の哺乳動物
インテグリン若しくはラミニンに対するヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の最低１セグメントをコードする導入遺伝子を有するヒト以外のトランスジェニック哺乳動物からもまた製造し得る。通常、こうしたトランスジェニック哺乳動物の内因性免疫グロブリン遺伝子座は機能的に不活性化されている。好ましくは、ヒト免疫グロブリン遺伝子座のセグメントは、ＨおよびＬ鎖コンポーネントの再配列されない配列を包含する。内因性免疫グロブリン遺伝子の不活性化および外因性免疫グロブリン遺伝子の導入の双方を、標的を定めた相同的組換え、若しくは酵母人工染色体（ＹＡＣ）の導入により達成し得る。この方法から生じるトランスジェニック哺乳動物は、免疫グロブリンコンポーネントの配列を機能的に再配列すること、および内因性免疫グロブリン遺伝子を発現することなくヒト免疫グロブリン遺伝子によりコードされる多様なアイソタイプの抗体のレパートリーを発現することが可能である。これらの特性を有する哺乳動物の製造および特性は、例えばＬｏｎｂｅｒｇら、第Ｗ０９３／１２２２７号（１９９３）；第ＵＳ ５，８７７，３９７号、同第ＵＳ ５，８７４，２９９号、同第ＵＳ ５，８１４，３１８号、同第ＵＳ５，７８９，６５０号、同第ＵＳ ５，７７０，４２９号、同第ＵＳ ５，６６１，０１６号、同第ＵＳ ５，６３３，４２５号、同第ＵＳ ５，６２５，１２６号、同第ＵＳ ５，５６９，８２５号、同第ＵＳ ５，５４５，８０６号明細書、Ｎａｔｕｒｅ １４８、１５４７−５３（１９９４）、Ｆｉｓｈｗｉｌｄら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４、８４５−５１（１９９６）、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ、第ＷＯ ９１／１０７４１号明細書（１９９１）（それらのそれぞれは全部の目的上そっくりそのまま引用することにより組み込まれる）により詳細に記述されている。トランスジェニックマウスはとりわけ適する。抗インテグリン若しくは抗ラミニン抗体は、Ｌｏｎｂｅｒｇ若しくはＫｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ、上記により記述されたようなトランスジェニックのヒト以外の哺乳動物をインテグリンまたはそのサブユニット若しくはフラグメントで免疫することにより得られる。モノクローナル抗体は、例えば、慣習的なＫｏｈｌｅｒ−Ｍｉｌｓｔｅｉｎの技術を使用してこうした哺乳動物からのＢ細胞を適する骨髄腫細胞株に融合することにより製造する。ヒトポリクローナル抗体は、免疫原性剤で免疫したヒトからの血清の形態でもまた提供し得る。場合によっては、こうしたポリクローナル抗体は、インテグリン若しくはラミニンをアフィニティー試薬として使用するアフィニティー精製により濃縮し得る。
【００９１】
ｃ．ファージディスプレイ法
ヒト抗インテグリン若しくは抗ラミニン抗体を得るためのさらなる１アプローチは、Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６：１２７５−８１（１９８９）により概説される一般的プロトコルに従ってヒトＢ細胞からのＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることである。トリオーマの方法論について記述されたとおり、こうしたＢ細胞は、インテグリン、サブユニット若しくはそれらのフラグメント、またはラミニンおよびそのフラグメントで免疫したヒトから得ることができる。場合によっては、こうしたＢ細胞は抗体処置を最
終的に受領するはずである患者から得る。目的の抗原若しくはそのフラグメントに結合する抗体を選択する。こうした抗体（若しくは結合フラグメント）をコードする配列をその後クローン化しかつ増幅する。Ｈｕｓｅにより記述されるプロトコルはファージディスプレイ技術と組合せでより効率的にされる。例えば、Ｄｏｗｅｒら、第ＷＯ ９１／１７２７１号、およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、同第ＷＯ ９２／０１０４７号、米国特許第ＵＳ ５，８７７，２１８号、同第ＵＳ ５，８７１，９０７号、同第ＵＳ ５，８５８，６５７号、同第ＵＳ ５，８３７，２４２号、同第ＵＳ ５，７３３，７４３号、同第ＵＳ ５，５６５，３３２号、同第ＵＳ ５，９６９，１０８号、同第ＵＳ ６，１７２，１９７号明細書（それらのそれぞれは全部の目的上そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）を参照されたい。抗体、若しくは特定の１リガンドに結合する他のタンパク質の付加的な選択および標識方法は、第ＵＳ ５，９９４，５１９号および同第ＵＳ ６，１８０，３３６号明細書により記述されている。
【００９２】
ファージディスプレイ法において、メンバーがそれらの外表面に多様な抗体を表示するファージのライブラリーを製造する。抗体は通常Ｆｖ若しくはＦａｂフラグメントとして表示される。所望の特異性をもつ抗体を表示するファージを、インテグリン、サブユニット若しくはそれらのフラグメントに対するアフィニティー濃縮により選択する。
【００９３】
ファージディスプレイ法の１変形において、選択したマウス抗体の結合特異性を有するヒト抗体を製造し得る。Ｗｉｎｔｅｒ、第ＷＯ ９２／２０７９１号明細書を参照されたい。この方法では、選択したマウス抗体のＨ若しくはＬ鎖可変領域のいずれかを出発原料として使用する。例えばＬ鎖可変領域を出発原料として選択する場合、メンバーが同一Ｌ鎖の可変領域（すなわちマウス出発原料）および異なるＨ鎖可変領域を表示するファージライブラリーが構築される。Ｈ鎖可変領域は再配列されたヒトＨ鎖可変領域のライブラリーから得る。Ａβに対する強い特異的結合（例えば最低約１０８若しくは最低約１０９Ｍ−１）を示すファージを選択する。このファージからのヒトＨ鎖可変領域がその後、さらなるファージライブラリーを構築するための出発原料としてはたらく。このライブラリー中で、各ファージは同一のＨ鎖可変領域（すなわち最初のディスプレイライブラリーから同定される領域）および異なるＬ鎖可変領域を表示する。Ｌ鎖可変領域は、再配列されたヒト可変Ｌ鎖領域のライブラリーから得られる。再度、所望のインテグリンに対する強い特異的結合を示すファージを選択する。これらのファージは完全にヒトの抗インテグリン抗体の可変領域を表示する。これらの抗体は通常、マウス出発原料と同一若しくは類似のエピトープ特異性を有する。
【００９４】
５．定常領域の選択
キメラ、ヒト化若しくはヒト抗体のＨおよびＬ鎖可変領域をヒト定常領域の少なくとも一部分に連結し得る。定常領域の選択は、部分的に、抗体依存性補体および／若しくは細胞媒介性毒性が望ましいかどうかに依存する。例えば、アイソタイプＩｇＧ１およびＩｇＧ３は補体活性を有し、また、アイソタイプＩｇＧ２およびＩｇＧ４は有しない。アイソタイプの選択はまた抗体の脳への通過に影響を及ぼし得る。Ｌ鎖定常領域はλ若しくはκであり得る。抗体は、２本のＬおよび２本のＨ鎖を含有する四量体として、個別のＨ鎖、Ｌ鎖として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ、若しくはＨおよびＬ鎖可変ドメインがスペーサーにより連結されている一本鎖抗体として、発現され得る。
【００９５】
６．組換え抗体の発現
キメラ、ヒト化およびヒト抗体は組換え発現により典型的に製造される。組換えポリヌクレオチド構築物は典型的に、天然に関連した若しくは異種のプロモーター領域を包含する抗体鎖のコーディング配列に作動可能に連結された発現制御配列を包含する。好ましくは、発現制御配列は、真核生物宿主細胞を形質転換若しくはトランスフェクトすることが可能なベクター中の真核生物プロモーター系である。ベクターを適切な宿主に一旦組み込
めば、該ヌクレオチド配列の高レベル発現ならびに交差反応抗体の収集および精製に適する条件下で該宿主を維持する。
【００９６】
これらの発現ベクターは、典型的に、エピソームとして、若しくは宿主染色体ＤＮＡの一体部分としてのいずれかで宿主生物体中で複製する。一般に、発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列で形質転換された細胞の検出を可能にするための選択マーカー、例えばアンピシリン耐性若しくはハイグロマイシン耐性を含有する。
【００９７】
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）は本発明のＤＮＡ配列をクローン化するのにとりわけ有用な１種の原核生物宿主である。酵母のような微生物もまた発現に有用である。サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）は好ましい酵母宿主であり、適するベクターは発現制御配列、複製起点、終止配列などを所望のとおり有する。典型的なプロモーターは、３−ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター、および他の解糖酵素からのプロモーターを包含する。誘導可能な酵母プロモーターは、とりわけ、アルコール脱水素酵素、イソチトクロームＣ、ならびに麦芽糖およびガラクトース利用を司る酵素からのプロモーターを包含する。
【００９８】
哺乳動物細胞は、免疫グロブリン若しくはそれらのフラグメントをコードするヌクレオチドセグメントを発現するのに好ましい宿主である。Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ、Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｌｏｎｅｓ、（ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、ニューヨーク、１９８７）を参照されたい。無傷の異種タンパク質を分泌することが可能な多数の適する宿主細胞株が当該技術分野で開発されており、そしてＣＨＯ細胞株、多様なＣＯＳ細胞株、ＨｅＬａ細胞、Ｌ細胞および骨髄腫細胞株を包含する。好ましくは細胞はヒト以外である。これらの細胞の発現ベクターは、複製起点、プロモーター、エンハンサー（Ｑｕｅｅｎら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．、８９：４９−６８（１９８６））のような発現制御配列、ならびにリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位のような必要なプロセシング情報部位、および転写終止配列を包含し得る。好ましい発現制御配列は、内因性遺伝子、サイトメガロウイルス、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシパピローマウイルスなど由来のプロモーターである。Ｃｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４８：１１４９−５４（１９９２）を参照されたい。
【００９９】
あるいは、抗体コーディング配列は、トランスジェニック動物のゲノムへの導入および該トランスジェニック動物の乳中でのその後の発現のため導入遺伝子に組み込み得る（例えば、米国特許第ＵＳ ５，７４１，９５７号、同第ＵＳ ５，３０４，４８９号、同第ＵＳ ５，８４９，９９２号明細書を参照されたい）。適する導入遺伝子は、カゼイン若しくはβラクトグロブリンのような乳腺特異的遺伝子からのプロモーターおよびエンハンサーと作動可能な連結にあるＬおよび／若しくはＨ鎖のコーディング配列を包含する。
【０１００】
目的のＤＮＡセグメントを含有するベクターを、細胞宿主の型に依存して公知の方法により宿主細胞に移入し得る。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションは原核生物細胞に一般に利用される一方、リン酸カルシウム処理、電気穿孔法、リポフェクション、遺伝子銃若しくはウイルスに基づくトランスフェクションを他の細胞宿主に使用し得る。哺乳動物細胞を形質転換するのに使用される他の方法は、ポリブレン、プロトプラスト融合、リポソームおよび微小注入法の使用を包含する。トランスジェニック動物の製造のため、導入遺伝子を受精卵母細胞に微小注入し得るか若しくは胚性幹細胞のゲノム中に組み込み得、そしてこうした細胞の核を除核卵母細胞に移入し得る。
【０１０１】
一旦発現されれば、抗体は、ＨＰＬＣ精製、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などを包含する当該技術分野で既知の標準的手順に従って精製し得る（全般として、Ｓｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａ
ｇ、ニューヨーク、１９８２）を参照されたい）。
【０１０２】
７．ナノボディ
ナノボディは単一可変ドメイン（ＶＨＨ）および２個の定常ドメイン（ＣＨ２およびＣＨ３）を含有するＨ鎖抗体である。クローン化かつ単離されたＶＨＨドメインは、元のＨ鎖抗体の完全な抗原結合能力を持つ安定なポリペプチドである。
【０１０３】
８．他の抗体
抗体は、米国特許出願公開第２００４００３８３０４号、同第２００７００２０６８５号、同第２００６０２５７３９６号、同第２００６０１６０１８４号、同第２００６０１３４０９８号、同第２００５０２５５５５２号、同第２００５０００８６２５号、同第２００４０１３２０６６号、同第２００４００３８３１７号、同第２００３０１９８９７１号、および同第２００３０１５７５７９号明細書に記述されるもののような方法によってもまた同定かつ／若しくは製造しうる。
【０１０４】
Ｂ．他の剤
剤は天然に存在する若しくは合成の分子であり得る。スクリーニングされるべき剤は、例えば海洋微生物、藻類、植物および真菌のような天然の供給源からもまた得ることができる。例えば、米国特許第ＵＳ ６，０９６，７０７号明細書は、クサリヘビ、ジャララカ（Ｂｏｔｈｒｏｐｓ ｊａｒａｒａｃａ）からのメタロプロテイナーゼ、ジャララギン由来のペプチドを提供する。これらのペプチドはアミノ酸モチーフＡｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（ＲＫＫ）を含有し、そしてヒトα２β１インテグリンのコラーゲンとの相互作用を低下させる。あるいは、スクリーニングされるべき剤は、ペプチド若しくは小分子を包含する剤のコンビナトリアルライブラリーから、または産業で、例えば化学、製薬、環境、農業、海洋、化粧品、薬物およびバイオテクノロジー産業により合成される化合物の既存のレパートリーからであり得る。剤は、例えば、医薬品、治療薬、環境、農業、若しくは工業的剤、汚染物質、薬用化粧品、薬物、有機化合物、脂質、グルココルチコイド、抗生物質、ペプチド、タンパク質、糖、炭水化物およびキメラ分子を包含し得る。
【０１０５】
多様な方法がペプチドライブラリーを製造するのに利用可能である（例えば、Ｌａｍら、Ｎａｔｕｒｅ、３５４：９２、１９９１および第ＷＯ ９２／０００９１号明細書；Ｇｅｙｓｅｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．、１０２：２５９（１９８７）；Ｈｏｕｇｈｔｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５４：８４（１９９１）；第ＷＯ ９２／０９３００号明細書；ならびにＬｅｂｌら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．、４１：２０１（１９９３）を参照されたい）。ペプチドライブラリーはファージディスプレイ法によってもまた生成し得る。例えばＤｅｖｌｉｎ、第Ｗ０ ９１／１８９８０号明細書を参照されたい。
【０１０６】
段階的様式で合成し得る多くの型の化合物についてコンビナトリアルライブラリーを製造し得る（例えば、ＥｌｌｍａｎとＢｕｎｉｎ、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１１４：１０９９７、１９９２（ベンゾジアゼピン鋳型）、第ＷＯ ９５／３２１８４号明細書（オキサゾロンおよびアミニジン鋳型）、第ＷＯ ９５／３０６４２号明細書（ジヒドロベンゾピラン鋳型）ならびに第ＷＯ ９５／３５２７８号明細書（ピロリジン鋳型）を参照されたい）。化合物のライブラリーは通常固相化学により合成する。しかしながら溶液相ライブラリー合成もまた有用である。コンビナトリアル合成の戦略はＤｏｌｌｅとＮｅｌｓｏｎ、Ｊ．Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１：２３５−２８２（１９９９）（全部の目的上そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）により記述されている。合成は、典型的には、異なる単量体若しくは他の成分を合成の各回に添加する周期的様式で実施する。いくつかの方法は初期プールを連続的に分画することにより実施する。例えば、第１回の合成は全部の支持体上で実施する。支持体
をその後２プールに分割し、そして別個の合成反応を各プールで実施する。該２プールをその後それぞれさらなる２プールにさらに分割し、などである。他の方法は分割および再プールの双方を使用する。例えば、初回の合成後に、化合物のプールを第２回の別個の合成のため２個に分割する。その後、別個のプールからのアリコートを第３回の合成のため再組合せする。分割およびプール法は混合化合物のプールをもたらす。これらの方法は下により詳細に記述されるとおり標識にとりわけ従いやすい。こうした方法により生成されるライブラリーの大きさは、２種の異なる化合物から１０６若しくは１０１０またはその間のいずれかの範囲まで変動し得る。
【０１０７】
コードされるライブラリーの製造法は、Ｎｅｅｄｅｌｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９０：１０７００（１９９３）；Ｎｉら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、３９：１６０１（１９９６）、第ＷＯ ９５／１２６０８号、第ＷＯ ９３／０６１２１号、第ＷＯ ９４／０８０５１号、第ＷＯ ９５／３５５０５号、および第ＷＯ ９５／３０６４２号明細書（それらのそれぞれは全部の目的上そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）を包含する多様な刊行物に記述されている。コードされるライブラリーの合成方法は、典型的に、ランダムコンビナトリアルアプローチならびに単量体単位の化学的および／若しくは酵素的集成を必要とする。例えば、該方法は、典型的に、（ａ）複数の反応容器のあいだで複数の固体支持体を割り当てる段階；（ｂ）各異なる反応容器中の異なる第一の単量体および標識の組合せを使用して第一の単量体および第一の標識を各反応容器中の支持体に結合する段階；（ｃ）支持体をプールする段階；（ｄ）複数の反応容器のあいだで該支持体を割り当てる段階；（ｅ）各異なる反応容器中で、異なる第二の単量体および第二の標識の組合せを使用して、第一の単量体に第二の単量体を結合する段階、および固体支持体若しくは第一の標識のいずれかに第二の標識を結合する段階；ならびに、場合によっては、異なる標識および異なる単量体を用いて結合および割り当て段階を１ないし２０回若しくはそれ以上反復する段階を包含する。単量体の組は段階ごとに拡張若しくは縮小し得るか；または、単量体の組は次の段階について完全に変更し得る（例えば、一段階でアミノ酸、別の段階でヌクレオシド、別の段階で炭水化物）。例えばペプチド合成のための単量体単位は単一アミノ酸若しくはより大きいペプチド単位または双方を包含し得る。
【０１０８】
こうした方法により合成可能な化合物は、ポリペプチド、βターン模倣物、多糖、リン脂質、ホルモン、プロスタグランジン、ステロイド、芳香族化合物、複素環化合物、ベンゾジアゼピン、オリゴマーＮ−置換グリシンおよびオリゴカルバメートを包含する。製造されるコンビナトリアルライブラリーは商業的供給源（例えばＣｈｅｍＲｘ、カリフォルニア州サウスサンフランシスコ）からもまた入手可能である。
【０１０９】
コンビナトリアルライブラリーおよび他の化合物は、α２β１、α６β１若しくはαｖβ１インテグリンまたはラミニンに結合するそれらの能力を測定することにより適合性について最初にスクリーニングする。上述された付加的なスクリーニング手順もまた使用し得る。
【０１１０】
それらの立体異性体、若しくはそれらの立体異性体の混合物、またはそれらの製薬学的に許容できる塩の形態を包含する、式ＩａおよびＩｂの化合物は、ＬＴＰのＡβ誘導性阻害の抑制方法で有用であり
【０１１１】
【化４】
【０１１２】
ここで
Ｘ１およびＸ３は窒素若しくは炭素から独立に選択され；
Ｒ１は
【０１１３】
【化５】
【０１１４】
から選択され；
ここで、上の複素環は、ＮＨ２、ハロゲン、ＮＯ２、ＣＮ、ＣＦ３、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６アルキルおよびＣ３−Ｃ７シクロアルキルよりなる群から選択される０〜２置換基で場合によっては置換されており；
Ｕは−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｔＱ（ＣＨ２）ｍ−および−Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−１−から選択され、ここでメチレン基の１個は場合によってはＲ７で置換されており；
Ｑは、１，２−フェニレン、１，３−フェニレン、２，３−ピリジニレン、３，４−ピリジニレンおよび２，４−ピリジニレンから選択され；
Ｒ６はＨ、Ｃ１−Ｃ４アルキルおよびベンジルから選択され；
Ｒ７はＣ１−Ｃ６アルキル、Ｃ３−Ｃ７シクロアルキル、Ｃ４−Ｃ１１シクロアルキルアルキル、アリール、アリール（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、ヘテロアリールおよびヘテロアリール（Ｃ１−Ｃ６アルキル）から選択され；
Ｒ１０は、Ｈ、ハロゲン、ＣＯ２Ｒ１７、ＣＯＮＲ１７Ｒ２０、０〜１個のＲ１５若しくは０〜１個のＲ２１で置換されているＣ１−Ｃ６アルキル、０〜１個のＲ２１で置換されているＣ１−Ｃ４アルコキシ、０〜１個のＲ１５若しくは０〜１個のＲ２１で置換されているＣ３−Ｃ７シクロアルキル、０〜１個のＲ１５若しくは０〜１個のＲ２１で置換されているＣ４−Ｃ１１シクロアルキルアルキル、および０〜１個のＲ１５若しくは０〜２個のＲ１１若しくは０〜１個のＲ２１で置換されているアリール（Ｃ１−Ｃ６アルキル）−から選択され；
Ｒ１１は、Ｈ、ハロゲン、ＣＦ３、ＣＮ、ＮＯ２、ヒドロキシ、ＮＲ２Ｒ３、０〜１個のＲ２１で置換されているＣ１−Ｃ４アルキル、０〜１個のＲ２１で置換されているＣ１−Ｃ４アルコキシ、０〜１個のＲ２１で置換されているアリール、０〜１個のＲ２１で置換されているアリール（Ｃ１−Ｃ６アルキル）−、０〜１個のＲ２１で置換されている（Ｃ１−Ｃ４アルコキシ）カルボニル、０〜１個のＲ２１で置換されている（Ｃ１−Ｃ４アルキル）カルボニル、０〜１個のＲ２１で置換されているＣ１−Ｃ４アルキルスルホニル、および０〜１個のＲ２１で置換されているＣ１−Ｃ４アルキルアミノスルホニルから選択され；
Ｗは−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒ１３）−であり；
Ｘは−ＣＨ（Ｒ１４）−ＣＨ（Ｒ１５）−であり；
Ｒ１３はＨおよびＣＨ３から選択され；
Ｒ１４は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アリールおよびヘテロアリールから選択され、前記アリール若しくはヘテロアリール基は、Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、アリール、ハロ、シアノ、アミノ、ＣＦ３およびＮＯ２から選択される０〜３置換基で場合によっては置換されており；
Ｒ１５はＨおよびＲ１６から選択され；
Ｙは−ＣＯＲ１９であり；
Ｒ１６は
−ＮＨ（Ｒ２０）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ１７、
−Ｎ（Ｒ２０）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ１７、
−Ｎ（Ｒ２０）−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ｒ１７、
―Ｎ（Ｒ２０）ＳＯ２−Ｒ１７、および
−Ｎ（Ｒ２０）ＳＯ２−Ｎ（Ｒ２０）Ｒ１７
から選択され、
Ｒ１７は、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ３−Ｃ１１シクロアルキル、アリール（Ｃ１−Ｃ６アルキル）−、（Ｃ１−Ｃ６アルキル）アリール、ヘテロアリール（Ｃ１−Ｃ６アルキル）−、（Ｃ１−Ｃ６アルキル）ヘテロアリール、ビアリール（Ｃ１−Ｃ６アルキル）−、ヘテロアリール若しくはアリールから選択され、前記アリール若しくはヘテロアリール基は、Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、ハロ、シアノ、アミノ、ＣＦ３およびＮＯ２よりなる群から選択される０〜３置換基で場合によっては置換されており；
Ｒ１９は−Ｏ−（ＣＨ２）ｋＮ＋（Ｒ２２）（Ｒ２３）（Ｒ２４）Ｚ−であり；
Ｚ−は、ハロゲン化イオン、重硫酸イオン、硫酸イオン、リン酸水素イオン、リン酸イオン、トルエンスルホン酸イオン、メタンスルホン酸イオン、エタンスルホン酸イオン、酢
酸イオン、トリフルオロ酢酸イオン、クエン酸イオン、シュウ酸イオン、コハク酸イオンおよびマロン酸イオンから選択される製薬学的に許容できる陰イオンであり；
Ｒ２２、Ｒ２３およびＲ２４はＨ、Ｃ１−Ｃ４アルキルおよびＣ４−Ｃ１１シクロアルキルアルキルから独立に選択されるか；
あるいは、Ｒ２２およびＲ２３は、一緒になって、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１〜２個のヘテロ原子を含有する５〜７員の複素環系を形成し得、ならびにＲ２４は上のとおり定義されるか、または、Ｒ２２、Ｒ２３およびＲ２４は、一緒になって、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１〜２個のヘテロ原子を含有する複素二環系を形成し得；
Ｒ２０はＨおよびＣＨ３から選択され；
Ｒ２１はＣＯＯＨおよびＮＲ６２から選択され；
ｋは２であり；
ｍは０および１から選択され；
ｎは１〜４であり；ならびに
ｔは０および１から選択される。
【０１１５】
式Ｉａの化合物の例は、限定されるものでないが式ＩＩ：
【０１１６】
【化６】
【０１１７】
の化合物を挙げることができ；ここでＲ１９は−Ｈ、−ＣＨ３および−ＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋（ＣＨ３）３から選ばれる。一態様において、Ｈ１９は−Ｈである（式ＩＩの化合物はＳＭ２５６である）。
【０１１８】
ＬＴＰのＡβ誘導性阻害の抑制方法で有用な付加的な化合物は、米国特許第６，２１４，８３４号明細書に開示される化合物を包含する。その特許は、αｖβ３に拮抗するためのＳＭ２５６（式ＩＩ）および他の化合物の使用を開示する。従って、１種若しくはそれ以上の剤がＬＴＰのアミロイド媒介性阻害を抑制するような条件下でインテグリンサブユニットαｖに結合する化合物を同定するためにαｖβ３拮抗剤をスクリーニングしうる。そのようにスクリーニングされうる例示的αｖβ３拮抗剤は、限定されるものでないが米国特許第６，２１４，８３４号明細書に開示されるαｖβ３拮抗剤を挙げることができる。
【０１１９】
Ｃ．遺伝子抑制剤
遺伝子発現を抑制する剤を使用して、インテグリンサブユニットβ１、α２、α６若しくはαｖをコードする遺伝子の発現を抑制し得る。アンチセンス剤もまた、ラミニンのようなそれに対するある種のリガンドの発現を抑制するのに使用し得る。ラミニン発現の抑制は、ラミニンに対する抗体での処置に類似の効果を達成し得る。標的細胞若しくは患者への本発明のアンチセンス試薬の投与は、上のインテグリン遺伝子若しくはそのリガンド
の１種の低下された活性をもたらす。アンチセンスポリヌクレオチドに関する一般的方法については、例えばＡｎｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮＡ ａｎｄ ＤＮＡ、（１９８８）、Ｄ．Ａ．Ｍｅｌｔｏｎ編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー）；Ｄａｇｌｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９：１８０５（１９９１）；Ｕｈｌｍａｎｎら、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖｉｅｗｓ、９０：５４３−５８４（１９９０）を参照されたい。リボザイムは遺伝子発現を抑制し得る別のアンチセンス剤である。
【０１２０】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、センスｍＲＮＡに結合しかつその翻訳を妨害すること、ｍＲＮＡをヌクレアーゼ消化に対し感受性にすること、転写を妨害すること、ＲＮＡ前駆体のプロセシング若しくは局在化を妨害すること、ｍＲＮＡの転写を抑制すること、若しくはいくつかの他の機序により作用することにより抑制を引き起こし得る。アンチセンス分子が発現を低下させる特定の機序は重要でない。
【０１２１】
典型的に、アンチセンスポリヌクレオチドは、遺伝子のｍＲＮＡからの配列に特異的にハイブリダイズする最低７ないし１０ないし典型的に２０若しくはそれ以上のヌクレオチドのアンチセンス配列を含んでなる。数種のアンチセンスポリヌクレオチドは、長さが約１０から約５０ヌクレオチドまで、若しくは長さが約１４から約３５ヌクレオチドまでである。数種のアンチセンスポリヌクレオチドは約１００ヌクレオチド未満若しくは約２００ヌクレオチド未満のポリヌクレオチドである。一般に、アンチセンスポリヌクレオチドは安定な二重鎖を形成するのに十分長くあるべきであるが、しかし、所望の場合はｉｎ ｖｉｖｏで投与するために送達様式に依存して十分に短くあるべきである。標的配列への特異的ハイブリダイゼーションに必要とされるポリヌクレオチドの最小長さは、とりわけ、Ｇ／Ｃ含量、不適正塩基（あれば）の配置、標的ポリヌクレオチドの集団に関しての該配列の全体的差違、およびポリヌクレオチドの化学的性質（例えばメチルホスホネートバックボーン、ペプチド核酸、ホスホロチオエート）のようないくつかの因子に依存する。
【０１２２】
相補核酸分子をハイブリダイズするのに適する条件は当業者に公知である。例えば、典型的な高緊縮性条件下のハイブリダイゼーションは、５×ＳＳＰＥ、５×Ｄｅｎｈａｒｔ溶液、０．５％ＳＤＳ（ｗ／ｖ）および１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含有する混合物中で実施しうる。ＤＮＡは、約６８℃で指定される時間ハイブリダイズさせる。典型的には膜若しくはフィルターに結合されているハイブリダイズされたＤＮＡをその後、２×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ（ｗ／ｖ）中室温で１０分間２回洗浄する。膜（若しくはフィルター）をその後、１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ（ｗ／ｖ）の溶液に６８℃で１５分間、そして最後に１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ（ｗ／ｖ）の溶液に６８℃で１５分間浸漬する。
【０１２３】
特異的ハイブリダイゼーションを確実にするため、アンチセンス配列は標的ｍＲＮＡ若しくはそれをコードする遺伝子に少なくとも実質的に相補的である。数種のアンチセンス配列はそれらの意図している標的配列に正確に相補的である。アンチセンスポリヌクレオチドは、しかしながら、ＲＮＡ若しくはその遺伝子に対応する適切な標的配列への特異的結合が該ポリヌクレオチドの機能的特性として保持される限りは、ヌクレオチドの置換、付加、欠失、トランジション、転位若しくは修飾、または他の核酸配列若しくは核酸以外の部分もまた包含し得る。
【０１２４】
数種のアンチセンス配列はｍＲＮＡの相対的に接近可能な配列に相補的である（例えば二次構造を相対的に欠く）。これは、予測されるＲＮＡ二次構造を例えばＭＦＯＬＤプログラム（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、ウィスコンシン州マディソン）を使用して解析すること、および当該技術分野で既知であるとおりｉｎ ｖｉｔｒｏ若しくはｉｎ ｖｉｖｏで試験することにより決定し得る。効果的なアンチセンス組成物
の別の有用な同定方法はオリゴヌクレオチドのコンビナトリアルアレイを使用する（例えば、Ｍｉｌｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１５：５３７（１９９７）を参照されたい）。
【０１２５】
遺伝子発現を阻害するための一技術は、阻害的ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）ともまた称される二本鎖ＲＮＡの細胞中への導入を必要とする。ＲＮＡｉは、二本鎖ＲＮＡ分子を形成するよう相互にアニーリングされたＲＮＡの２本の相補鎖（センス鎖およびアンチセンス鎖）を含んでなる。ＲＮＡｉは、典型的には阻害の標的とされている遺伝子のエキソンすなわちコーディング配列に由来する。ＲＮＡｉは該ＲＮＡｉ分子の配列に相補的なｍＲＮＡの破壊をもたらす。ＲＮＡｉおよび生存生物体でのそれらの使用の例は、例えばＦｉｒｅら、Ｎａｔｕｒｅ、３９１：８０６−８１１（１９９８）；Ｎｙｋａｅｎｅｎら、Ｃｅｌｌ、１０７：３０９−３２１（２００１）；および第ＷＯ ０１／２９０５８号、第ＷＯ ０１／７５１６４号および第ＷＯ ９９／３２６１９号明細書により記述される。いくつかの方法において、ＲＮＡｉは約１００ｂｐと１０００ｂｐの間、例えば約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００若しくはそれ以上の塩基対である。いくつかの方法においてＲＮＡｉはエキソン由来である。他の方法において、ＲＮＡｉはイントロン若しくはシグナル伝達配列由来である。
【０１２６】
いくつかの方法において、アンチセンスポリヌクレオチドは、アンチセンス配列に加え、アンチセンス配列の発現をもたらすプロモーターおよび他の制御配列を包含する配列を有する。プロモーターならびに好ましくは終止およびポリアデニル化シグナルが適正に配置されていることを条件に、非コーディング鎖に対応する挿入された配列の鎖が転写され、そしてアンチセンスオリゴヌクレオチドとして作用する。いくつかの方法において、該ポリヌクレオチドはアンチセンス配列より本質的になるか若しくはアンチセンス配列である。アンチセンス核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾、アナログなど）は、本明細書に開示される化学合成および組換え法のような核酸のいずれかの適する製造方法を使用して作成し得る。例えば、アンチセンスＲＮＡ分子はデノボ化学合成若しくはクローニングにより製造し得る。
【０１２７】
β１、α２、α６若しくはαｖインテグリンサブユニットをコードする遺伝子の発現を抑制するため、ジンクフィンガータンパク質を、アンチセンスポリヌクレオチドの代替として若しくはそれに加えて使用し得る。ジンクフィンガータンパク質は、ラミニンのようなこれらのインテグリンサブユニットのある種のリガンドの発現を抑制するのにもまた使用し得る。ジンクフィンガータンパク質は、本方法で剤としてそれら自身を使用し得るフィブロネクチンのような他のリガンドの発現を活性化する若しくは高めるのにもまた使用し得る。ジンクフィンガータンパク質は標的遺伝子内のいずれかの所望の標的部位に結合するよう工作若しくは選択し得る。いくつかの方法において標的部位はプロモーター若しくはエンハンサー内にある。他の方法において標的部位は構造遺伝子内にある。いくつかの方法において、ジンクフィンガータンパク質はヒトＫＯＸ−１タンパク質からのＫＲＡＢ抑制領域のような転写リプレッサーに連結される（Ｔｈｉｅｓｅｎら、Ｎｅｗ Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ、２、３６３−３７４（１９９０）；Ｍａｒｇｏｌｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９１、４５０９−４５１３（１９９４））；Ｐｅｎｇｕｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２２：２９０８−２９１４（１９９４）；Ｗｉｔｚｇａｌｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９１、４５１４−４５１８（１９９４）。活性化を達成するために好ましいドメインは、ＨＳＶ ＶＰ１６活性化ドメイン（例えばＨａｇｍａｎｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７１：５９５２−５９６２（１９９７）を参照されたい）核ホルモン受容体（例えばＴｏｒｃｈｉａら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１０：３７３−３８３（１９９８）を参照されたい）；核因子κＢのｐ６５サブユニット（ＢｉｔｋｏとＢａｒｉｋ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７２：５６１０−５６１８（１９９８）およびＤｏｙｌｅとＨｕｎｔ、Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ、８：２９３７−２９４２（１９９７））；Ｌｉｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、５：３−２８（１９９８））、若しくはＶＰ６４のような人工的キメラ機能ドメイン（Ｓｅｉｆｐａｌら、ＥＭＢＯ Ｊ．、１１：４９６１−４９６８（１９９２））を包含する。ジンクフィンガータンパク質により標的を定めるのに適する標的部位の選択方法、および選択された標的部位に結合するためのジンクフィンガータンパク質の設計方法は、第ＷＯ ００／００３８８号明細書に記述されている。標的に結合するジンクフィンガータンパク質のファージディスプレイを使用する選択方法は、第ＥＰ ９５９０８６１４Ａ号明細書により記述されている。内因性遺伝子を調節するためのジンクフィンガータンパク質の使用方法は第ＷＯ ００／００４０９号明細書に記述されている。ジンクフィンガータンパク質は、タンパク質として、若しくはジンクフィンガーをコードしかつ適切な制御配列を有する核酸の形態でのいずれでも投与し得る。
【０１２８】
Ｄ．治療薬をコードする核酸
抗体若しくは他のペプチド試薬は、抗体鎖若しくはペプチドをコードする核酸の形態で投与し得る。こうした核酸は、典型的には、患者の意図している標的細胞中での該ＤＮＡセグメントの発現を可能にするプロモーターおよびエンハンサーのような調節エレメントに連結されている。Ｌ若しくはＨ鎖免疫グロブリン遺伝子からのプロモーターおよびエンハンサーエレメント、またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）主要中初期プロモーター（ｍａｊｏｒ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）およびエンハンサーが直接発現に適する。いくつかの方法において、脳中で発現を引き起こすプロモーターを使用する。血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、プリオン若しくは神経エノラーゼのプロモーターのようなプロモーターが適する。
【０１２９】
連結された調節エレメントおよびコーディング配列はしばしば１ベクターにクローン化される。二本鎖抗体の投与のため、該２鎖を同一若しくは別個のベクターにクローン化し得る。
【０１３０】
レトロウイルス系（例えばＬａｗｒｉｅとＴｕｍｉｎ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．、２：１０２−１０９（１９９３）を参照されたい）；アデノウイルスベクター（例えばＢｅｔｔら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６７：５９１１（１９９３）を参照されたい）；アデノ随伴ウイルスベクター（例えばＺｈｏｕら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７９：１８６７−７５（１９９４）を参照されたい）、ワクシニアウイルスおよびトリポックスウイルスを包含するポックス科からのウイルスベクター、シンドビスおよびセムリキ森林ウイルス（例えばＤｕｂｅｎｓｋｙら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７０：５０８−１９（１９９６）を参照されたい）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（米国特許第ＵＳ ５，６４３，５７６号明細書を参照されたい）由来のもののようなアルファウイルス属、水疱性口内炎ウイルス（第ＷＯ ９６／３４６２５号明細書を参照されたい）のようなラブドウイルス、ならびにパピローマウイルス（Ｏｈｅら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、６：３２５−３３（１９９５）；Ｗｏｏら、第ＷＯ ９４／１２６２９号明細書；およびＸｉａｏとＢｒａｎｄｓｍａ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．、２４：２６３０−２２（１９９６））からのウイルスベクターを包含する多数のウイルスベクター系が利用可能である。
【０１３１】
ＤＮＡはリポソーム中にパッケージングし得る。適する脂質および関連アナログは、米国特許第ＵＳ ５，２０８，０３６号、同第５，２６４，６１８号、同第５，２７９，８３３号および同第５，２８３，１８５号明細書により記述されている。免疫原をコードするベクターおよびＤＮＡはまた微粒子担体に吸着若しくはそれらと会合もし得、それらの例はポリメチルメタクリレートポリマー、ポリラクチドおよびポリ（ラクチドコグリコリド）を包含する。
【０１３２】
遺伝子治療ベクター若しくは裸のＤＮＡは、典型的に全身投与（例えば静脈内、腹腔内、鼻、胃、皮内、筋肉内、くも膜下腔内、皮下若しくは頭蓋内注入）または局所適用（例えば米国特許第ＵＳ ５，３９９，３４６号明細書を参照されたい）による個々の患者への投与によりｉｎ ｖｉｖｏで送達し得る。こうしたベクターはブピバカインのような促進剤をさらに包含し得る（米国特許第ＵＳ ５，５９３，９７０号明細書）。ＤＮＡは遺伝子銃を使用してもまた投与し得る。ＸｉａｏとＢｒａｎｄｓｍａ、上記を参照されたい。ＤＮＡを微細な金属ビーズの表面上に沈殿させる。微小発射体をショック波若しくは膨張するヘリウムガスで加速し、そして数細胞層の深さまで組織を貫通させる。例えば、Ａｇａｃｅｔｕｓ，Ｉｎｃ．、ウィスコンシン州ミドルトンにより製造されるＡｃｃｅｌＴＭ遺伝子送達装置が適する。あるいは、裸のＤＮＡは、単純に化学若しくは機械的刺激で皮膚上にＤＮＡをスポットすることにより、皮膚を通り血流に移行し得る（第ＷＯ ９５／０５８５３号明細書を参照されたい）。
【０１３３】
さらなる一変形において、核酸を、個々の患者から外植した細胞（例えばリンパ球、骨髄吸引物、組織生検）若しくは普遍的ドナーの造血幹細胞のような細胞にｅｘ ｖｉｖｏで送達し得、次いで、通常はベクターを組み込んだ細胞についての選択後に細胞を患者に再移植し得る。
【０１３４】
Ｅ．ＬＴＰのＡβ媒介性阻害を抑制する剤の同定
インテグリンサブユニットαｖに結合する小分子剤は、１種若しくはそれ以上の剤がＬＴＰのアミロイド媒介性阻害を抑制するような条件下で投与しうる。適する小分子剤は、例えば、インテグリンサブユニットαｖ結合アッセイおよびＬＴＰのアミロイド媒介性阻害抑制アッセイを含んでなる方法、若しくはＬＴＰのアミロイド媒介性阻害抑制アッセイを含んでなるがしかしインテグリンサブユニットαｖ結合アッセイを含まない方法により同定する。
【０１３５】
インテグリンサブユニットαｖ結合アッセイは、例えば、単量体若しくは二量体いずれかとしてのインテグリンサブユニットαｖへの剤の特異的結合を同定するいずれかのアッセイである。例示的アッセイは、支持体への直接若しくは間接結合によるように固定されうるインテグリンサブユニットαｖに結合されている標識した剤の使用によるように結合を直接検出する。さらなる例示的アッセイは結合を間接的に検出する。一態様において競合結合アッセイを使用する。競合結合は、例えば、本明細書に開示されるか若しくは当該技術分野で既知のもののような別のインテグリンサブユニットαｖ結合剤、または本明細書に開示されるアッセイにより事前に同定された結合剤を使用して実施しうる。インテグリンサブユニットαｖ結合アッセイでの使用に適する結合剤は、限定されるものでないが、フィブロネクチン若しくはスーパーフィブロネクチン、モノクローナル若しくはポリクローナル抗体、１８Ｃ７、２０Ａ９および１７Ｅ６から選ばれる抗体と同一のエピトープを認識する抗体、ならびに１８Ｃ７、２０Ａ９および１７Ｅ６から選ばれる抗体、インテグリンサブユニットαｖへの結合について１８Ｃ７、２０Ａ９および１７Ｅ６から選ばれる抗体と競合する剤、ならびにＳＭ２５６のような式１の化合物を挙げることができる。
【０１３６】
ＬＴＰのアミロイド媒介性阻害抑制アッセイは、限定されるものでないがＬＴＰを実験的に誘導する系を使用するアッセイを挙げることができる。適する系は、ｉｎ ｖｉｖｏ、または海馬領域若しくは海馬の小領域を含んでなる脳薄片のようなｉｎ ｖｉｔｒｏでありうる。例示的アッセイを実施例１０〜１３に記述する。
【０１３７】
それらの実施例で、ＬＴＰをＨＦＳ若しくは薬理学的刺激により誘導する。ＬＴＰは、ＨＦＳ若しくは薬理学的刺激の投与の前、それらと同時に若しくは後に該系に添加されるＡβペプチドにより阻害される。候補剤によるＬＴＰのアミロイド媒介性阻害の抑制をその後、該候補剤の存在および非存在下のＡβペプチドによるＬＴＰの阻害を比較すること
によりアッセイする。抑制の程度は、対照系（Ａβペプチドの非存在下のＬＴＰの誘導後の系および／若しくはＡβペプチドによるＬＴＰの阻害後の系のいずれでもあり得る）のＨＦＳ若しくは薬理学的刺激後に観察される興奮性シナプス後場電位（ＥＰＳＰ）の振幅に関して測定する。
【０１３８】
ＩＶ．第二の剤
本発明は１種若しくはそれ以上の剤および１種若しくはそれ以上の第二の剤の共投与にさらに向けられる。例えば、適する第二の剤は、限定されるものでないが、Ａβ産生の阻害剤、Ａβ沈着の阻害剤、Ａβ消失のメディエーター、アミロイド斑消失のメディエーター、Ａβ神経毒性の阻害剤、Ａβ凝集の阻害剤、Ａβ解離のメディエーター、およびＡβに対する抗体、ならびにそれらのいずれかの組合せから選択される第二の剤を挙げることができる。Ａβ産生の適する阻害剤は、限定されるものでないがγ分泌酵素阻害剤およびβ分泌酵素阻害剤を挙げることができる。
【０１３９】
例示的γ分泌酵素阻害剤は、限定されるものでないが、米国特許第６，９９２，０８１号、同第６，９８２，２６４号、同第６，９６２，９３４号および同第６，６１０，４９３号明細書、ならびに米国特許出願公開第２００６０２８７３０６号、同第２００６０１５４９２６号、同第２００５０１５９４６０号、同第２００２００１６３２０号および同第２００３０１４８３９２号明細書に開示されるもののようなγ分泌酵素阻害剤を挙げることができる。
【０１４０】
例示的β分泌酵素阻害剤は、限定されるものでないが、米国特許第７，１１５，４１０号、同第７，１０９，０１７号、同第７，０６７，２７１号、同第６，８６４，２４０号、同第６，８５２，４８２号、同第６，６２７，７３９号、同第６，３２１，１６３号、同第６，２２１，６４５号、同第５，９４２，４００号および同第５，７４４，３４６号明細書、ならびに米国特許出願公開第２００５０１９６８３９号、同第２００５０１８２１３８号、同第２００５０１７７８８８号、同第２００５０１７０４８９号、同第２００５０１６４３２７号、同第２００５０１６４２９４号、および同第２００４０２６５５９６５号明細書に開示されるもののようなβ分泌酵素阻害剤を挙げることができる。
【０１４１】
Ａβに対する例示的抗体は、限定されるものでないが、米国特許第７，０１４，８５５号、同第６，９８２，０８４号、同第６，９７２，１２７号、同第６，９６２，７０７号、同第６，９４６，１３５号、同第６，９１３，７４５号、同第６，９０５，６８６号、同第６，８９０，５３５号、同第６，８７５，４３４号、同第６，８６６，８５０号、同第６，８６６，８４９号、同第６，８１８，２１８号、同第６，８０８，７１２号、同第６，７８７，６３７号、同第６，７８７，５２３号、同第６，７８７，１４４号、同第６，７８７，１４３号、同第６，７８７，１４０号、同第６，７８７，１３９号、同第６，７８７，１３８号、同第６，７６１，８８８号、同第６，７５０，３２４号、同第６，７４３，４２７号および同第６，７１０，２２６号明細書に開示されるもののようなＡβに対する抗体を挙げることができる。
【０１４２】
Ｖ．長期増強
長期増強はｉｎ ｖｉｖｏ若しくはｉｎ ｖｉｔｒｏで自然に発生し、およびｉｎ ｖｉｔｒｏ若しくはｉｎ ｖｉｖｏモデル系で実験的に誘導しうる。本明細書に開示されるある種の方法は、該実験系のＡβペプチドへの投与若しくは曝露により阻害し得るＬＴＰの実験的誘導を企図している。それらの方法では剤を使用してＡβペプチドによるＬＴＰのその阻害を実験的に抑制する。天然に存在するＬＴＰは多様なアミロイド形成疾患状態の発症の経過でＡβペプチドにより阻害される。本明細書に開示される剤は、例えば、ＡβペプチドによるＬＴＰの阻害をｉｎ ｖｉｖｏで処置かつ／若しくは阻害するため、ならびに／または該疾患状態を処置かつ／若しくは予防するための製薬学的製剤として患者
に投与しうる。
【０１４３】
ＬＴＰはＨＦＳの送達若しくは薬理学的方法により実験的に誘導しうる。ＬＴＰ阻害の実験モデルに、実験操作に応答してＬＴＰを表す神経回路が提供される。それはマウス若しくはラットのようなげっ歯類若しくは霊長類のような哺乳動物のような動物から選ばれた生物体で行い得る。ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養した霊長類若しくはげっ歯類脳薄片のような哺乳動物脳薄片、またはｉｎ ｖｉｖｏで哺乳動物の脳中でＬＴＰを実験的に誘導するための技術が当該技術分野で既知である。
【０１４４】
ＬＴＰの強さは、誘導後の指定される時点で基礎（誘導の非存在下）に関して観察されるＥＰＳＰ上昇の大きさにより定量化し得る。その大きさは１５０％のような基礎に関するパーセンテージとして表しうる。Ａβペプチドの投与後に観察されるＬＴＰ阻害は、基礎に関するＥＰＳＰ上昇の大きさの低下をもたらす。
【０１４５】
例えば、Ａβペプチドは、ＨＦＳ後に観察されるＥＰＳＰが基礎と統計学的に異ならない点までＬＴＰを完全に阻害する。その阻害が抑制される場合、ＬＴＰはＡβの存在下であってさえ観察し得る。その抑制は、Ａβの非存在下でＬＴＰの誘導後に観察されるＥＰＳＰの大きさに関して定量化し得る。例えば、抑制は完全であることができ、その結果、Ａβおよびαｖ結合剤の存在下でＬＴＰの誘導後のデータ組全体で観察されるＥＰＳＰの大きさは、Ａβの非存在下でＬＴＰの誘導後に観察されるＥＰＳＰの大きさと統計学的に識別可能である。他の態様において、Ａβおよびαｖ結合剤の存在下でＬＴＰの誘導後のデータ組全体で観察されるＥＰＳＰの大きさは、例えば、Ａβの非存在下でＬＴＰの誘導後に観察されるＥＰＳＰの大きさの２５％以上、５０％以上、７５％以上、８５％以上、９０％以上若しくは９５％以上である。
【０１４６】
ＶＩ．処置可能な患者
本方法は、進行性記憶障害を特徴とする疾患若しくは障害を包含する記憶障害若しくは記憶障害の可能性を特徴とする疾患若しくは障害の予防的若しくは治療的処置に有用である。例示的疾患若しくは障害は、限定されるものでないが、アミリン若しくはＡβペプチドのようなアミロイドタンパク質の沈着物の存在を特徴とするアミロイド形成疾患および状態を挙げることができる。こうした疾患は、アルツハイマー病、ダウン症候群および認知障害、ＩＩ型糖尿病、パーキンソン病、びまん性レビー小体病、遺伝性若しくは全身性アミロイドーシスのようなアミロイドーシス、ならびにプリオン感染により全部若しくは部分的に引き起こされる疾患を包含する。
【０１４７】
処置可能な患者は、疾患の危険にさらされているがしかし症状を示さない個体、ならびに現在症状を示している患者を包含する。アルツハイマー病の場合、事実上誰でも彼若しくは彼女が十分に長く生きる場合にアルツハイマー病に罹る危険にさらされている。本方法は、アルツハイマー病の既知の遺伝的危険性を有する個体にとりわけ有用である。こうした個体は、この疾患を経験した親族を有する者、および遺伝子若しくは生化学的マーカーの分析によりその危険性が決定される者を包含する。アルツハイマー病に対する危険性の遺伝子マーカーは、ＡＰＰ遺伝子中の突然変異、例えばそれぞれハーディ型およびスウェーデン型突然変異と称される位置７１７ならびに位置６７０および６７１の突然変異を包含する（Ｈａｒｄｙ、ＴＩＮＳ、上記を参照されたい）。危険性の他のマーカーは、プレセニリン遺伝子ＰＳ１およびＰＳ２ならびにＡｐｏＥ４中の突然変異、ＡＤの家族歴、高コレステロール血症若しくは動脈硬化症である。現在アルツハイマー病に罹っている個体は、特徴的な認知症ならびに上述された危険因子の存在から認識し得る。加えて、ＡＤを有する個体を同定するための多数の診断試験が利用可能である。これらは脳脊髄液（ＣＳＦ）のτおよびＡβ４２濃度の測定を包含する。上昇されたτおよび低下されたＡβ４２濃度はＡＤの存在を示す。アルツハイマー病に罹っている個体はＡＤＲＤＡ基準によっ
てもまた診断し得る。無症候性患者で処置はいかなる齢（例えば約１０、約２０、約３０歳）でも開始し得る。通常、しかしながら患者が約４０、約５０、約６０、約７０、約８０若しくは約９０歳に達するまで処置を開始することは必要でない。処置は、典型的にはある期間にわたる複数投薬量を必要とする。ダウン症候群患者の場合には、母親に治療薬を投与することにより出産前に処置を開始し得るか、若しくは処置を出生直後に開始しうる。
【０１４８】
ＶＩＩ．処置計画
予防的応用において、製薬学的組成物若しくは医薬品は、疾患、その合併症および該疾患の発症の間に見つかる中間的病理学的表現型の生化学的、組織学的および／若しくは行動的症状を包含する該疾患の危険性を排除若しくは低下、その重症度を低下、またはその発症を遅延させるのに十分な量で、アミロイド形成疾患に感受性の若しくはそうでなければそれを発症する危険にさらされている患者に投与する。
【０１４９】
治療的応用において、組成物若しくは医薬品は、その合併症および中間的病理学的表現型を包含する該疾患の症状（生化学的、組織学的および／若しくは行動的）を治癒若しくは少なくとも部分的に停止するのに十分な量で、こうした疾患が疑われる若しくは既に罹っている患者に投与する。治療的若しくは予防的処置を達成するのに十分な量を治療的若しくは予防的有効用量と定義する。治療計画において、該剤は通常、該疾患の症状が消失若しくは有意に低下するまで間隔を置いて投与する。場合によっては、再発を予防するために投与を継続し得る。予防計画において、剤は通常間隔を置いて、いくつかの例では患者の生涯の残りの間もまた投与する。処置は、投与した剤の濃度をアッセイすること若しくは患者の応答をモニターすることによりモニターし得る。応答は、ＡＤＲＤＡ基準、および患者の脳中の斑の画像化によりモニターし得る（第ＷＯ ００／１４８１０号明細書を参照されたい）。
【０１５０】
上述された状態の処置のための本発明の組成物の有効用量は、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトであるか動物であるか、投与されている他の医薬品、および処置が予防的であるか治療的であるかを包含する多くの異なる因子に依存して変動する。通常、患者はヒトであり；トランスジェニック哺乳動物を包含するヒト以外の哺乳動物もまた処置し得る。処置投薬量は、典型的には安全性および有効性を最適化するよう用量設定する。
【０１５１】
抗体、ペプチドおよび小分子の投薬量は、約０．０００１から約１００ｍｇ／ｋｇまで、およびより通常は約０．０１ないし約２０ｍｇ／ｋｇ宿主体重の範囲にわたる。例えば、投薬量は約１ｍｇ／ｋｇ体重若しくは約２０ｍｇ／ｋｇ体重または約１ないし約１０ｍｇ／ｋｇの範囲内にあり得る。例示的処置レジメンは、２週ごとあたり１回若しくは１か月に１回または３ないし６か月ごとに１回の投与を必要とする。いくつかの方法において、異なる結合特異性をもつ２、３、４種若しくはそれ以上のモノクローナル抗体を同時に投与し、この場合投与される各抗体の投薬量は示される範囲内にある。例えば、いくつかの方法において、β１インテグリン、α２インテグリンおよびαｖインテグリンサブユニットの２種若しくは全３種に対する抗体を同時に投与する。いくつかの方法において、α６インテグリンサブユニットに対する抗体もまた投与する。抗体は通常複数の機会に投与する。単一投薬量の間の間隔は週、月若しくは年であり得る。間隔は、患者中のインテグリンに対する抗体の血中濃度を測定することにより示されるように不規則でもまたあり得る。いくつかの方法において、抗体の投薬量は、約１ないし約１０００μｇ／ｍｌ、およびいくつかの方法においては約２５ないし約３００μｇ／ｍｌの血漿抗体濃度を達成するように調節する。あるいは、抗体は徐放製剤として投与し得、この場合はより少なく頻繁な投与を必要とする。投薬量および頻度は患者中の抗体の半減期に依存して変動する。一般に、ヒト抗体は最長半減期を示し、次いでヒト化抗体、キメラ抗体およびヒト以外の抗
体である。投薬量および投与頻度は、処置が予防的であるか治療的であるかに依存して変動し得る。予防的応用において、比較的低用量を長期間にわたり比較的頻繁でない間隔で投与する。若干の患者は彼らの生涯の残りの間処置を受領することを継続する。治療的応用においては、疾患の進行が低下若しくは終了するまで、および好ましくは患者が該疾患の症状の部分的若しくは完全な軽減を示すまで、比較的短い間隔での比較的高投薬量をときに必要とする。その後、該患者に予防的レジメンを投与し得る。
【０１５２】
剤をコードする核酸の用量は、患者あたり約１０ｎｇから１ｇまで、約１００ｎｇないし約１００ｍｇ、約１μｇないし約１０ｍｇ、若しくは約３０ないし約３００μｇのＤＮＡの範囲にわたる。感染性ウイルスベクターの用量は、用量あたり約１０から約１００、若しくは約１０３、約１０４、約１０５、約１０６、約１０７、約１０８、約１０９、約１０１０若しくはそれ以上のビリオンまで変動しうる。
【０１５３】
本発明の剤は、予防的および／若しくは治療的処置のため非経口、局所、静脈内、経口、皮下、くも膜下腔内、動脈内、頭蓋内、腹腔内、鼻内若しくは筋肉内手段により投与し得る。いくつかの方法において、剤は沈着物が蓄積した特定の組織に直接注入する（例えば頭蓋内注入）。いくつかの方法において、筋肉内注入若しくは静脈内注入を抗体の投与に使用する。いくつかの方法において、特定の治療抗体を頭蓋中に直接注入する。いくつかの方法において、抗体を徐放組成物、若しくはＭｅｄｉｐａｄＴＭ装置のような装置として投与する。
【０１５４】
本発明の剤は、場合によっては、アミロイド形成疾患の処置で少なくとも部分的に有効である他の剤とともに投与し得る。アミロイド沈着物が脳中に存在するアルツハイマー病およびダウン症候群の症例においては、本発明の剤は、血液脳関門を横断する本発明の剤の通過を増大させる他の剤とともにもまた投与し得る。
【０１５５】
本発明の剤は、しばしば、有効治療薬および多様な他の製薬学的に許容できる成分を含んでなる組成物として投与する。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（第１５版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、ペンシルバニア州イーストン、１９８０）を参照されたい。使用される特定の製剤は意図している投与様式および治療的応用に依存する。該組成物は、所望の製剤に依存して、動物若しくはヒト投与のための製薬学的組成物を処方するのに通例使用されるベヒクルと定義される、製薬学的に許容できる非毒性の担体若しくは希釈剤もまた包含し得る。希釈剤は該組合せの生物学的活性に悪影響を及ぼさないように選択する。こうした希釈剤の例は、限定されるものでないが、蒸留水、生理学的リン酸緩衝生理的食塩水、リンゲル液、ブドウ糖溶液およびハンクス液を挙げることができる。加えて、製薬学的組成物若しくは製剤は、他の担体、補助物質、若しくは非毒性の非治療的非免疫原性安定剤などもまた包含しうる。
【０１５６】
製薬学的組成物は、タンパク質、キトサンのような多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、コポリマー（ラテックス官能性化ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭビーズ、アガロース、セルロースなどのような）、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、および脂質凝集物（油滴若しくはリポソームのような）のような、大型のゆっくりと代謝される巨大分子もまた包含し得る。
【０１５７】
非経口投与のため、本発明の剤は、水、油、生理的食塩水、グリセロール若しくはエタノールのような無菌の液体であり得る製薬学的担体を含む生理学的に許容できる希釈剤中の物質の溶液若しくは懸濁液の注入可能な投薬量として投与し得る。ヒト投与のための非経口組成物は無菌、実質的に等張であり、そしてＧＭＰ条件下で作成される。加えて、湿潤若しくは乳化剤、界面活性剤、ｐＨ緩衝物質などのような補助物質が組成物中に存在し
得る。製薬学的組成物の他成分は、石油、動物、植物若しくは合成起源のもの、例えばラッカセイ油、ダイズ油および鉱物油である。一般に、プロピレングリコール若しくはポリエチレングリコールのようなグリコールは、とりわけ注入可能な溶液に好ましい液体担体である。抗体は、有効成分の徐放を可能にするような様式で処方し得るデポー注射剤若しくは植込み製剤の形態で投与し得る。例示的一組成物は、ＨＣｌで適するｐＨに調節された、５０ｍＭ Ｌ−ヒスチジン（任意）、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含有する水性緩衝液中で処方された５ｍｇ／ｍＬのモノクローナル抗体を含んでなる。
【０１５８】
典型的に、組成物は液体の溶液若しくは懸濁液いずれかのような注射液として製造し；注入前の液体ベヒクル中の溶液若しくは懸濁液に適する固体の形態もまた製造し得る。該製剤は、上で論考されたとおり、高められたアジュバント効果のため、乳化、あるいはリポソーム、またはポリラクチド、ポリグリコリド若しくはコポリマーのような微小粒子中に被包化もまたし得る（Ｌａｎｇｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９：１５２７−３３（１９９０）およびＨａｎｅｓら、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ、２８：９７−１１９（１９９７）を参照されたい）。本発明の剤は、有効成分の徐放若しくはパルス型放出を可能にするような様式で処方し得るデポー注射剤若しくは植込み製剤の形態で投与し得る。
【０１５９】
他の投与様式に適する付加的な製剤は、経口、鼻内および肺製剤、坐剤ならびに経皮適用を包含する。坐剤について、結合剤および担体は例えばポリアルキレングリコール若しくはトリグリセリドを包含し；こうした坐剤は、約０．５％ないし約１０％、若しくは約１％ないし約２％の範囲の有効成分を含有する混合物から形成し得る。経口製剤は、製薬学的等級のマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロースおよび炭酸マグネシウムのような賦形剤を包含するがしかしこれらに限定されない。これらの組成物は、典型的に、溶液、懸濁剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放製剤若しくは散剤の形態をとり、そして約１０％ないし約９５％、若しくは約２５％ないし約７０％の有効成分を含有する。
【０１６０】
局所適用は経皮若しくは皮内送達をもたらし得る。局所投与は、コレラ毒素若しくは解毒誘導体またはそれらのサブユニット、あるいは他の類似の細菌毒素との剤の共投与により助長し得る（Ｇｌｅｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３９１：８５１（１９８８）を参照されたい）。共投与は、成分を混合物として、または化学的架橋若しくは発現により融合タンパク質として得られた結合分子として使用することにより達成し得る。あるいは、経皮送達は皮膚貼付剤を使用して若しくはトランスフェロソーム（ｔｒａｎｓｆｅｒｏｓｏｍｅ）を使用して達成し得る（Ｐａｕｌら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２５：３５２１−２４（１９９５）；Ｃｅｖｃら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１３６８：２０１−１５（１９９８））。
【０１６１】
本明細書で引用される全部の文書はそっくりそのまま引用することによりここに本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１６２】
【図１】ヒト皮質培養物（ＨＣＣ）（上）若しくはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（下）被覆プレートでのＡβ網目構造を具体的に説明する。
【図２】ＨＣＣでのＡβ網目構造形成および神経毒性双方に対するβ１インテグリンサブユニットの効果を具体的に説明する。図２ＡはＨＣＣでのβ１インテグリンサブユニット発現を具体的に説明する。図２Ｂは抗β１抗体１９６５の非存在（上）若しくは存在（下）下のＨＣＣでの７２時間Ａβ網目構造形成を具体的に説明する。図２Ｃは、β１インテグリンサブユニット阻止抗体とプレインキュベートしたＨＣＣでの神経毒性の阻害を具体的に説明する。エラーバーは（ｎ＝３）ウェルからの標準偏差を表す。
【図３Ａ】ＨＣＣでのＡβ網目構造形成および神経毒性に対するα２およびαｖインテグリンサブユニットの効果を具体的に説明する。
【図３Ｂ】抗α２（中）若しくは抗αｖ（下）抗体の非存在（上）若しくは存在下でプレインキュベートしたＨＣＣでの７２時間Ａβ網目構造形成を具体的に説明する。
【図３Ｃ】β１インテグリンサブユニット阻止抗体とプレインキュベートしたＨＣＣでの神経毒性を具体的に説明する。
【図４】ＨＣＣでのα２およびαｖ発現を具体的に説明する。
【図５】Ａβ網目構造形成および神経毒性の阻害における抗ラミニン抗体の効果を具体的に説明する。図５Ａは抗ラミニン抗体の非存在（上）若しくは存在（下）下でプレインキュベートしたＨＣＣでの７２時間Ａβ網目構造形成を具体的に説明する。図５Ｂは抗ラミニン抗体とプレインキュベートしたＨＣＣでの神経毒性を具体的に説明する。エラーバーは（ｎ＝３）ウェルからの標準偏差を表す。図５Ｃは抗コラーゲン抗体とプレインキュベートしたＨＣＣでの神経毒性を具体的に説明する。エラーバーは（ｎ＝３）ウェルからの標準偏差を表す。
【図６】ＨＣＣでのＡβシグナル伝達経路の活性化を具体的に説明する。図６Ａは、Ａβ処理したＨＣＣでの接着斑キナーゼ（Ｆａｋ）と会合したパキシリンのチロシンリン酸化を具体的に説明する。図６Ｂは、Ａβ処理したＨＣＣでのプロリンリッチチロシンキナーゼ（Ｐｙｋ２）と会合したパキシリンのチロシンリン酸化を具体的に説明する。
【図７】ヒト皮質ニューロンを１時間播種し、次いで吸引かつ可溶性アミリンで処理する場合の１日後の毒性を具体的に説明する。インテグリン若しくはインテグリンサブユニット抗体を種（ｓｅｅｄ）および可溶性アミリンの存在下で細胞に添加して毒性を阻害し得る。種および可溶性アミリン単独は毒性でない。しかしながら、細胞を１時間播種し次いで吸引かつ可溶性アミリンで処理する場合、該アミリンは毒性である。
【図８】インテグリンおよびインテグリンサブユニット抗体、とりわけ抗ラミニン、抗β１、抗αｖおよび抗α２抗体がアミリン毒性に対し保護することを具体的に説明する。
【図９Ａ−９Ｂ】細胞を種アミリンに１時間曝露した後のアミリン２成分毒性の阻害パーセントにより示されるところの、アミリン毒性に対する保護におけるインテグリン、若しくは抗αｖβ３抗αｖを包含するインテグリンサブユニット抗体；およびサイトカラシンＤの効果を具体的に説明する。
【図１０Ａ】抗αｖインテグリン抗体１８Ｃ７がｉｎ ｖｉｔｒｏで歯状回中の合成ＡβによるＬＴＰの阻害を抑制することを具体的に説明する。
【図１０Ｂ】抗αｖインテグリン抗体２０Ａ９がｉｎ ｖｉｔｒｏで歯状回中の合成ＡβによるＬＴＰの阻害を抑制することを具体的に説明する。
【図１０Ｃ】抗αｖインテグリン抗体１７Ｅ６がｉｎ ｖｉｔｒｏで歯状回中の合成ＡβによるＬＴＰの阻害を抑制することを具体的に説明する。
【図１１Ａ】対照抗αｖ抗体２７／１がＡβによるＬＴＰの抑制を予防しなかったことを具体的に説明する。
【図１１Ｂ】対照抗αｖ抗体７Ｈ１０がＡβによるＬＴＰの抑制を予防しなかったことを具体的に説明する。
【図１２Ａ】可溶性Ａβがｉｎ ｖｉｖｏでＣＡ１領域でＬＴＰを阻害することを具体的に説明する。
【図１２Ｂ】抗αｖインテグリン抗体１７Ｅ６がｉｎ ｖｉｖｏでＣＡ１領域での可溶性ＡβによるＬＴＰの阻害を抑制することを具体的に説明する。
【図１２Ｃ】ＳＭ２５６がｉｎ ｖｉｖｏでＣＡ１領域での可溶性ＡβによるＬＴＰの阻害を抑制することを具体的に説明する。
【図１３Ａ】αｖ含有インテグリンリガンドＳＭ２５６がＡβによるＬＴＰの阻害を抑制することを具体的に説明する。
【図１３Ｂ】αｖ含有インテグリンリガンド、スーパーフィブロネクチンがＡβによるＬＴＰの阻害を抑制することを具体的に説明する。
【図１３Ｃ】αｖ含有インテグリンリガンド、エキスタチンがＡβによるＬＴＰの阻害を抑制することを具体的に説明する。
【実施例】
【０１６３】
実施例１〜５の材料および方法
抗体の供給源
【０１６４】
【表１】
【０１６５】
組織培養
組織培養プレートを１５０ｍＭホウ酸ナトリウム、ｐＨ８．５中ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）で被覆し、そして室温で一夜インキュベートした。細胞を添加する前にウェルをＰＢＳで洗浄し、そして細胞がプレーティングの準備ができるまで最小必須培地（１０％ＦＢＳを含むＭＥＭ）を添加した。ヒト胎児大脳皮質（Ｅ１３−Ｅ１６）をハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）ですすいだ。組織をＨＢＳＳ中１ｍｇのＤＮアーゼ中で摩砕した。この懸濁液を１００ミクロンのナイロン細胞濾過器で濾過し、そして２５０×ｇで５分間遠心した。細胞をトリプシンに再懸濁しかつ３７℃で２０分間インキュベートした。改変最小必須培地（１０％ＦＢＳおよび１ｍｇのＤＮアーゼを含むＭＭＥＭ）を添加しそして細胞を再懸濁し；その後遠心分離により再度収集した。Ｂ２７を含有するＭＭＥＭに細胞を再懸濁し、そして、洗浄したＰＥＩ被覆プレート中、９６ウェルプレートに１２５，０００細胞／ウェルで、若しくは６ウェルプレートに２５０万細胞／ウェルで蒔いた。ヒト皮質培養物（ＨＣＣ）は処理前に２週ごとの培地交換を伴い３週間インキュベートした。
【０１６６】
Ａβ生成
Ａβは、二重蒸留水（ｄｄＨ２Ｏ）をＡβに添加して１ｍＭストックを構成することにより生成した。これを３７℃で３日間エイジングし、アリコートに分割しそして−２０℃で凍結保存した。可溶性Ａβは、ＤＭＳＯをＡβに添加して７．５ｍＭストックを作成すること、３０分間超音波処理すること、アリコート分割することおよび−２０℃で凍結す
ることにより作成した。神経毒性Ａβは、ｄｄＨ２ＯをＡβに添加すること、アリコート分割することおよび−２０℃で凍結することにより生成した。
【０１６７】
ＨＣＣライセートからのインテグリン免疫沈降
６ウェルプレート中のＨＣＣを、メチオニンを含まない培地中１００μＣｉ／ｍｌの３５Ｓ−メチオニンで一夜標識した。細胞を洗浄し、２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．１％ＳＤＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ ＥＧＴＡで溶解し、そして２６ゲージ針を３回通過させた。不溶性物質を１５，０００ｒｐｍで４℃で１５分間の遠心分離により除去した。ライセートを、プロテインＡビーズに結合したウサギ抗マウス（ＲＡＭ）抗体で前浄化し、そしてインテグリンサブユニット特異的抗体（β１についてＬｉａ１／２、α１についてＴＳ２／７、α２についてＧｉ９、α３についてＰ１Ｂ５、α４についてＡＮ１００２２６ｍ、α５についてＡｂ０７７１、α６についてＧｏＨ３、α９についてＹ９Ａ２およびαｖについてＶＮＲ１４７）で免疫沈降した。免疫沈降物を１ｍｌの２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ １５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．５ｍＭ ＥＧＴＡで３回洗浄した。免疫沈降したサンプルを８％トリス−グリシンゲル（Ｎｏｖｅｘ）で分離しかつ固定し；ゲルを乾燥し、そしてゲル中の３５Ｓ標識タンパク質をオートラジオグラフィーにより可視化した。
【０１６８】
Ａβ免疫蛍光
Ａβで７２時間処理したＨＣＣを４％パラホルムアルデヒドで固定し、５μｇ／ｍｌの抗Ａβ−３Ｄ６−ビオチンで染色し、そして１０μｇ／ｍｌのストレプトアビジン−ＦＩＴＣ（Ｊａｃｋｓｏｎ）で可視化した。
【０１６９】
ヒト皮質ニューロン中のＡβ神経毒性
ＨＣＣを、グルタミンおよびペニシリン／ストレプトマイシンを補充した神経培地（ＭＥＭ）（基礎培地）中で抗体若しくはリガンドで３０分間処理した。基礎培地中１μモル濃度のＡβを１時間添加した。培地を除去し、そしてＨＣＣを抗体若しくはリガンドおよび基礎培地中２０μＭ可溶性Ａβで３日間処理した。３日目に、基礎培地中１０％アラマーブルー中で２時間インキュベートすることにより毒性を測定した。蛍光レベルを三重で対照およびＡβ処理したウェルに関して測定した。
【０１７０】
インテグリンヘテロ二量体会合
Ｎ−２（ＢｏｔｔｅｎｓｔｅｉｎのＮ−２処方、例えばカタログ番号１７５０２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．、カリフォルニア州カールズバッド）を補充したＭＭＥＭ培地中の６ウェルプレート中のＨＣＣを湿潤氷上に置き、ＰＢＳで洗浄し、２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．１％ＳＤＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．５ｍＭ ＥＧＴＡで溶解し、そして２６ゲージ針を３回通過させた。不溶性物質を１５，０００ｒｐｍで４℃で１５分間の遠心分離により除去した。ライセートをプロテインＡビーズで前浄化し、そして抗β１インテグリンＬｉａ１／２（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ）およびＲＡＭ／プロテインＧビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用してβ１インテグリンを免疫沈降した。免疫沈降物を１ｍｌの２５ｍＭ
Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ １５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．５ｍＭ ＥＧＴＡで３回洗浄した。免疫沈降したサンプルを４〜１２％トリス−グリシンゲル（Ｎｏｖｅｘ）で分離し、そして抗α２インテグリン（ＣｈｅｍｉｃｏｎからのＡＢ １９３６）若しくは抗αｖインテグリンＭＡＢ １９６０（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）でウエスタンブロットした。
【０１７１】
パキシリンリン酸化のＡβ誘導
神経毒性Ａβを、Ｎ−２を補充した基礎培地中の６ウェルプレート中ＨＣＣに０分ない
し２４時間添加した。ＨＣＣを湿潤氷上に置き、ＰＢＳで洗浄し、２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．１％ＳＤＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．５ｍＭ ＥＧＴＡで溶解し、そして２６ゲージ針を３回通過させた。不溶性物質を１５，０００ｒｐｍで４℃で１５分間の遠心分離により除去した。ライセートをプロテインＡビーズで前浄化し、そして抗Ｆａｋ（ＵＢＩ）若しくは抗Ｐｙｋ２抗体（ＵＢＩ）およびプロテインＡビーズを使用してそれぞれＦａｋ若しくはＰｙｋを免疫沈降した。免疫沈降物を１ｍｌの２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．５ｍＭ ＥＧＴＡで３回洗浄した。免疫沈降したサンプルを８％トリス−グリシンゲル（Ｎｏｖｅｘ）で分離し、そして抗ホスホチロシン（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｌａｂｓからのＲＣ２０）および抗パキシリン（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｌａｂｓ）でウエスタンブロットした。
【実施例１】
【０１７２】
ヒト皮質ニューロンでの免疫蛍光パターン
本実施例は、アルツハイマー病（ＡＤ）の海馬および皮質ニューロンで生じかつ関連した神経毒性を表すＡβ斑のｉｎ ｖｉｔｒｏ組織培養物モデルを生じる。該モデルは、ＡＤで遂げられるニューロンを可能な限り緊密に表す初代ヒト皮質ニューロン培養物を使用する。これらの培養物へのＡβの添加は、ニューロンで１〜３日にわたり生じかつその後ニューロンで毒性を引き起こす、再現可能なＡβ網目構造をもたらす。ＨＣＣを伴わないプレート上でインキュベートしたＡβもまた網目構造として染色したが、しかしＨＣＣで見られるものより短く薄くかつより直線状であった伸長を伴うより均一なパターンを一貫して示した。図１Ａおよび１ＢはＨＣＣの存在および非存在下の網目構造を比較する。
【実施例２】
【０１７３】
β１インテグリンはＡβ網目構造および神経毒性を媒介する
網目構造がインテグリンにより形成されるもののような細胞外マトリックスに似ていたため、インテグリンがＨＣＣ中に存在するかどうか；およびその場合、インテグリンがＨＣＣでのＡβ網目構造形成を助長したかどうかを検討した。ゲル電気泳動はβ１インテグリンがＨＣＣで発現されていることを示した。ＭＡＢ１９６５を包含するβ１インテグリン阻止抗体が、Ａβ網目構造パターンがＨＣＣで形成されることを阻止し得たこともまた見出された（図２Ａ（抗体なし）を図２Ｂ（抗体を伴う）と比較されたい）。これらの培養物でＡβにより生成される毒性に該網目構造パターンが必要であったかどうかもまた検討した。これを行うため、Ａβ網目構造を阻止することが示されたβ１インテグリン阻止抗体（ＡＩＩＢ２およびＭＡＢ１９６５）とＨＣＣをインキュベートした。これらの抗体はＡβ誘発性の毒性もまた用量依存性の様式で阻害した（図２Ｃ）。抗体ＡＩＩＢ２はＡβ毒性の非常に強力な阻害剤であり、１７０ｎｇ／ｍｌすなわち１ｎＭのＩＣ５０を表した。対照的に、対照抗体は毒性に対する影響を有しなかった。
【実施例３】
【０１７４】
α２およびαｖインテグリンに結合する剤は網目構造およびＡＢ媒介性神経毒性を阻害する
β１インテグリンは数種のαサブユニットと対形成して多様なヘテロ二量体を形成し得る。従って、どのαインテグリンサブユニットがＨＣＣ中に存在したかを試験した。α２、α３、α４、α５、α６およびαｖインテグリンがＨＣＣ中で発現された。α１およびα９インテグリンはＨＣＣ中で発現されなかった。全部のこれらのαインテグリンサブユニットに対する阻害抗体を、Ａβ網目構造形成を阻害しかつその神経毒性を阻害するそれらの能力について試験した。α２およびαｖに対する阻害抗体はＡβ網目構造形成を阻害した（図３Ａ）。これらの抗体はＨＣＣでのＡβの神経毒性効果も阻害した（図３Ｂ）。これらの特定のインテグリンに対する特異性を示すため、２〜３種の阻害抗体をこれらの
インテグリンのそれぞれおよび同様に他のインテグリンサブユニットに対し試験した。網目構造形成および神経毒性の双方を媒介するα１、α２およびαｖインテグリンに対する非常に明瞭な特異性が見出された（表１）。
【０１７５】
【表２】
【０１７６】
毒性に対する抗α６抗体の弱いがしかし再現可能な効果が観察された。最後に、これらの影響がインテグリンに向けられかつＡβ重合を非特異的に妨害しなかったことを確認するため、Ａβ毒性をヒトおよびマウス皮質培養物で並べて分析した。これらのアッセイで使用した抗体はマウスインテグリンと交差反応しない。抗ヒトインテグリン抗体はヒト培養物でＡβ毒性を阻害し得たがしかしマウス培養物ではし得ず、該抗体が毒性を阻害するためにＡβと非特異的に相互作用しなかったことを示唆した。ＨＣＣライセートをβ１抗体で免疫沈降すること、ならびにその後沈降した物質をα２およびαｖに対する抗体でブロッティングすることにより、α２およびαｖがＨＣＣ細胞中でβ１インテグリンと会合したことが確認された。これらの結果は、α２β１およびαｖβ１のヘテロ二量体が、Ａ
β網目構造形成および神経毒性の機能的メディエーターであることを示す。
【実施例４】
【０１７７】
フィブロネクチンおよび抗ラミニン抗体はＡＢ網目構造形成および神経毒性を阻害する
インテグリン／細胞外網目構造の他成分をＡβ網目構造形成および神経毒性の媒介への関与について検討した。これらの他成分は、αｖβ１インテグリンリガンド、フィブロネクチン、およびスーパーフィブロネクチン（網目構造を形成するフィブロネクチンドメインの多量体）、ならびにα２β１リガンド、コラーゲンおよびラミニンを包含した。ラミニンは２鎖β１およびγ１を有し、それらの双方はアルツハイマー病斑中で上昇している（Ｍｕｒｔｏｍａｋｉら、Ｊ．Ｎｅｕｒ．Ｒｅｓ．、３２：２６１−７３（１９９２））。フィブロネクチンおよびスーパーフィブロネクチンはＡβ網目構造形成および神経毒性を阻害することが可能であった（表１）。この結果はαｖβ１機能に対する影響についてＡβと競合するフィブロネクチンにより説明し得る。対照的に、αｖβ１リガンド、ラミニンは、Ａβ網目構造若しくは神経毒性を阻害することが可能でなかった（表１）。あるαｖβ１リガンドがそうでなかった場合にあるαｖβ１リガンドがなぜ保護的であったかを確定するため、抗ラミニン抗体を網目構造形成および神経毒性アッセイで試験した。２種のラミニン抗体はＡβ網目構造形成（図５Ａ）およびＡβ媒介性神経毒性（図５Ｂ）双方で高度に保護的であった。抗ラミニン抗体番号ＡＢ１９０１２は１ｎＭ未満のＩＣ５０を示した。対照的に、抗コラーゲン抗体はＡβ網目構造形成および神経毒性に対する影響を有しなかった（図５Ｃ）。
【実施例５】
【０１７８】
Ａβはパキシリンのチロシンリン酸化（インテグリンシグナル伝達経路の早期事象）を活性化する
細胞外マトリックスリガンドによるインテグリン活性化はＦａｋのような接着斑キナーゼの活性化およびその基質パキシリンのチロシンリン酸化に至る。Ａβがインテグリンシグナル伝達経路を同様に刺激していたかどうかを確定するため、ＨＣＣへのＡβ添加に際してのＦａｋ会合パキシリンのチロシンリン酸化パターン（図６Ａ）を分析した。Ｆａｋ会合パキシリンのチロシンリン酸化の一貫した活性化は見出されなかった。しかしながら、Ａβ刺激後のＰｙｋ２会合パキシリンのチロシンリン酸化の一貫した増大が観察された。Ｐｙｋ２もまた接着斑キナーゼであり、そして神経毒性につながる異常なＡβ／インテグリンシグナル伝達経路を媒介しているかもしれない（図６Ｂ）。ＦａｋよりむしろＰｙｋ２会合パキシリンのチロシンリン酸化の活性化は、これらの状態で毒性応答を引き起こすものでありうる。いずれの場合も、Ａβはインテグリンシグナル伝達経路の早期事象であるパキシリンのチロシンリン酸化を活性化し、Ａβ神経毒性シグナルがα２β１およびαｖβ１インテグリンシグナル伝達経路の直接の関与により媒介されうることを示す。
【実施例６】
【０１７９】
アミリン２成分毒性
ＣＰＲ，Ｉｎｃ．からの種（ｓｅｅｄ）若しくは凝集アミリン（１ｍＭ）（６４１−８０、ロットＮＧ−０２１３）を、２００μｌ水／ｍｇ粉末を添加することおよびその後該溶液を３７℃で３日間エイジングすることにより作成した。可溶性アミリン（５ｍＭ）は、４０μｌ ＤＭＳＯ／ｍｇ粉末を添加すること、および該混合物を水浴中で３０分間超音波処理することにより調製した。双方のストック溶液をアリコート分割しかつ使用の準備ができるまで凍結した。可溶性アミリンストックは、使用直前に培地で２０μＭに希釈し、そして水で前洗浄したＡｍｉｃｏｎ ３０フィルターで濾過した。濾過した物質をその後その適切な濃度に希釈した。
【０１８０】
ヒト皮質ニューロン（１２５，０００細胞／９６ウェル）を５μＭの種アミリン（１００μｌ／ウェル）で１時間処理した。細胞を吸引し、そして可溶性アミリンを１００μｌ
／ウェルあたり５μＭで戻した。化合物研究のため、可溶性アミリンを添加する前に５０μｌの２×化合物を添加した。
【０１８１】
図６はヒト皮質ニューロンを１時間播種し次いで吸引しかつ可溶性アミリンで処理した１日後の毒性を示す。インテグリン抗体を種および可溶性アミリンの存在下で細胞に添加して毒性を阻害した。図７は、数種のインテグリン抗体すなわち２０３４抗ラミニン、１９６５抗β１インテグリン、１９５８抗αｖ（ＶＮＲ）および１９５０抗α２が、アミリン２成分の毒性に対し細胞を保護したことを示す。図８は、アミリン２成分の毒性が、抗αｖβ３および抗αｖを包含する付加的なインテグリン抗体；ならびにサイトカラシンＤによりさらに阻害されることを示す。
【０１８２】
実施例７〜１１の材料および方法
薄片の調製
全実験はラット海馬（雄性、３〜４週齢、重量４０〜８０ｇ）若しくはマウス（雄性、３〜４月齢）の横断薄片で実施した。断頭後迅速に脳を取り出しかつ冷酸素添加（９５％Ｏ２／５％ＣＯ２）培地に入れた。Ｉｎｔｒａｃｅｌｌ Ｐｌｕｓ １０００を使用して３５０μｍの厚さで薄片を切断し、そして室温（２０〜２２℃）の酸素添加培地を含有する貯蔵容器に１時間入れた。薄片をその後浸積薄片のための記録チャンバーに移し、そして３０〜３２℃で５〜６ｍｌ／分の速度で連続灌流した。対照培地は（ｍＭで）ＮａＣｌ、１２０；ＫＣｌ ２．５、ＮａＨ２ＰＯ４、１．２５；ＮａＨＣＯ３ ２６；ＭｇＳＯ４、２．０；ＣａＣｌ２、２．０；Ｄ−グルコース １０を含有した。全溶液はＧＡＢＡＡ媒介性活性を阻害するため１００μＭピクロトキシン（Ｓｉｇｍａ）を含有した。
【０１８３】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ電気生理学的技術
標準的電気生理学的技術を使用して電場電位を記録した。双極絶縁タングステンワイヤ電極を使用して歯状回の内側貫通路にシナプス前刺激を適用し、また、ガラス電極を用い、歯状回の分子層の中１／３から０．０３３Ｈｚの対照試験周波数で興奮性シナプス後場電位（ＥＰＳＰ）を記録した。歯状回の内刃（ｉｎｎｅｒ ｂｌａｄｅ）を全研究で使用した。各実験で、入力−出力曲線（求心性刺激強度対ＥＰＳＰ振幅）を試験周波数でプロットした。全実験について、試験ＥＰＳＰの振幅を最大の１／３（約１．２ｍＶ）に調節した。ＬＴＰを８連の高頻度刺激（ＨＦＳ）により惹起し（８刺激のそれぞれは２００Ｈｚ、連続間間隔２ｓ）、正常の試験ＥＰＳＰ振幅の２倍の連続の初期ＥＰＳＰを惹起するようにＨＦＳの間に刺激電圧を増大した。ＬＴＰの対照（ベヒクル単独）および実験レベルを同一海馬から調製した薄片で測定した。ｐ−ＣＬＡＭＰ（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、米国カリフォルニア州）を使用して記録を解析した。本明細書に報告する値はｎ薄片の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．であった。Ｓｔｕｄｅｎｔの両側ｔ検定を統計学的比較に使用した。
【０１８４】
ｉｎ ｖｉｖｏ電気生理学
実験はウレタン（エチルカルバメート、１．５ｇｍ／ｋｇ ｉ．ｐ．）麻酔した雄性Ｗｉｓｔａｒラット（２５０〜３００ｇ）で実施した。体温は３７〜３７．３℃に維持した。動物の世話および実験プロトコルはアイルランド共和国保健省（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ
ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｉｒｅｌａｎｄ）により承認された。
【０１８５】
電極は以前に記述された（Ｋｌｙｕｂｉｎら、２００４、２００５）とおり作成しかつ植込んだ。簡潔には、捻りワイヤ双極電極をＴｅｆｌｏｎ被覆タングステンワイヤ（６２．５μｍ内核径、７５μｍ外径）から構築した。興奮性シナプス後場電位（ＥＰＳＰ）の単一経路記録を、同側のＳｃｈａｆｆｅｒ側枝−交連経路の刺激に応答する右海馬半球のＣＡ１領域中の放線状層から行った。電極植込み部位は十字縫合に関する定位座標を使用して同定し、記録部位は十字縫合の後方約３．４ｍｍかつ正中線の右約２．５ｍｍに位置
し、また、刺激電極は十字縫合の後方約４．２ｍｍかつ正中線の右約３．８に位置した。背側海馬のＣＡ１領域の放線状層中のワイヤ電極の最適深度は電気生理学的基準を使用して決定し、かつ、死後確認した。試験ＥＰＳＰは、０．０３３Ｈｚの周波数および最大の５０％のＥＰＳＰ振幅を与えるように調節した刺激強度で惹起した。ＬＴＰを誘導するためのＨＦＳプロトコルは、１０連続の２０刺激、刺激間間隔５ｍｓ（２００Ｈｚ）、連続間間隔２秒よりなった。強度は最大振幅の約７５％のＥＰＳＰを与えるようにＨＦＳの間に増大させた。
【０１８６】
サンプルを注入するため、ステンレス鋼製ガイドカニューレ（２２ゲージ、０．７ｍｍ外径、１３ｍｍ長さ）を、電極植込み直前に右側脳室の上（正中線の側方約１ｍｍおよび硬膜の表面の下約４ｍｍ）に植込んだ。内部カニューレ（２８ゲージ、０．３６ｍｍ外径）を介して脳室内（ｉ．ｃ．ｖ．）注入を行った。カニューレの配置の確認はｉ．ｃ．ｖ．注入後のインク色素の広がりを確認することにより死後に実施した。本明細書に報告する値はｎ薄片の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．であった。Ｓｔｕｄｅｎｔの両側ｔ検定を統計学的比較に使用した。
【０１８７】
剤
合成Ａβ（１−４２）をＢａｃｈｅｍから得た。ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験のため、合成Ａβ１−４２を水酸化アンモニウム（０．１％）中５０μＭのストック溶液として調製し、−２０℃で保存し、そしてその後各実験の直前に生理学的媒体に添加した。ｉｎ ｖｉｖｏ実験のため、合成Ａβ（１−４２）（Ｂａｃｈｅｍ）を氷冷ｍｉｌｌｉＱ水若しくはＴｅｐｌｏｗに再懸濁した。アリコートを取り出し、そして１００，０００ｇで３時間（原線維およびプロトフィブリル（ｐｒｏｔｏｆｉｂｒｉｌ）をペレットにすることが既知の条件）（Ｋｌｙｕｂｉｎら、２００４）遠心分離した。遠心分離後、アミノ酸分析により測定されるところの３０若しくは６４μＭの可溶性Ａβの最終濃度を有した上清を、小アリコートで−８０℃で保存した。
【０１８８】
以下のインテグリンαｖ抗体（全部ＩｇＧ１アイソタイプ）すなわち１８Ｃ７、１７Ｅ６および２０Ａ９（全部Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍから）を研究で使用した。使用した対照抗体は、ヒトＩＣＡＭ−１に対するＩｇＧ２ａマウス抗体７Ｈ１０およびＩｇＧ１アイソタイプ２７／１であった。使用した他の成分は、エキスタチン（Ｓｏｕｒｃｅ）、Ｖａｎ Ｍａｅｓら、１９９４の方法に従ってＥｌａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓにより製造されたＳＭ２５６（３−［１−［３−（Ｎ−イミダゾル−２−イルアミノ）プロピル］インダゾル−５−イルカルボニルアミノ］−２（Ｓ）−（２，４，６−トリメチルベンゼンスルホニルアミノ）プロピオン酸トリフルオロ酢酸塩）（ＥＬＮ １５１９９３として記録される）、スーパーフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ）およびファロイジン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）であった。ｉｎ ｖｉｖｏ実験において、ＳＭ２５６は生理的食塩水中Ｔｗｅｅｎ ８０（Ｓｉｇｍａ）の懸濁液中でｉ．ｐ投与のため調製した（１５ｖ／ｖ％）。
【実施例７】
【０１８９】
抗インテグリンαｖ抗体はｉｎ ｖｉｔｒｏで歯状回でのＬＴＰのＡβ媒介性阻害を予防する
ｉｎ ｖｉｔｒｏの歯状回での短いＨＦＳによるＬＴＰの誘導は、ＨＦＳ前３０分間のＡβの前灌流により予防され、以前の研究（Ｗａｎｇら、２００４ａ、ｂ、２００５）を確認した。従って、Ａβ（５００ｎＭ、ＬＴＰの最大阻害を引き起こすことが以前に見出された濃度（Ｗａｎｇら、２００４ａ））の存在下でのＬＴＰは、ＨＦＳの１時間後に基礎の１０５±３％であり（図１０Ａ）（ｎ＝５、Ｐ＜０．００１）、１５２±５％であった（図１０Ａ）対照ＬＴＰと比較して有意に低下された。
【０１９０】
αｖインテグリンサブユニットに対する選択的抗体を灌流することの効果をＬＴＰのＡβ媒介性阻害に対し検討した。１８Ｃ７、２０Ａ９および１７Ｅ６と命名される、αＶ含有インテグリンに対する３種の異なる抗体を検討した。該抗体のいずれも基礎のＥＰＳＰ若しくはＬＴＰ誘導に対するいかなる影響も有しなかった。しかしながら、ＬＴＰのＡβ媒介性阻害はαｖ抗体のそれぞれの灌流により予防された。図１０Ａ〜１０Ｃは、全３種のαｖ抗体が、介在対照実験と比較してＬＴＰに対するＡβの阻害効果の予防において有効であったことを示す。従って、ＬＴＰは、Ａβならびに抗インテグリン抗体１８Ｃ７、２０Ａ９および１７Ｅ６の存在下で１４４±６％、１３７±７％および１５３±１１％であった。該値は対照ＬＴＰと比較して有意に異ならなかった（各実験についてｎ＝５、Ｐ＞０．０１）。各抗体実験と平行して実施した介在薄片において、ＬＴＰはＡβ単独の存在下で１０５±３％、１０５±６％および１０３±３％であり、値はＬＴＰに対するＡβ単独のものと有意に異ならなかった（各実験についてｎ＝５、Ｐ＞０．０１）。
【０１９１】
対照的に、２種の対照抗体はＬＴＰのＡβ媒介性阻害を有意に予防しなかった。ＬＴＰは、Ａβおよび対照抗体２７／１の存在下で１０５±６％（図１１Ａ）、ならびに、Ａβおよび対照抗体７Ｈ１０（アイソタイプ対照）の存在下で１０７±８％であった（図１１Ｂ）（ｎ＝５、Ｐ＞０．０５）。
【実施例８】
【０１９２】
抗αｖインテグリン抗体はｉｎ ｖｉｖｏでＣＡ１でのＬＴＰのＡβ媒介性阻害を予防する
ウレタン麻酔したラットのＣＡ１でのＬＴＰの誘導は、ＨＦＳ１０分前の可溶性の原線維を含まないＡβのｉ．ｃ．ｖ．注入により予防され、以前の研究（Ｋｌｙｕｂｉｎら、２００４）を確認した。対照ベヒクル注入動物で、ＬＴＰはＨＦＳの３時間後に基礎の１４０±５％であった（ｎ＝６）。可溶性の原線維を含まないＡβ（５μｌ中５０ｐｍｏｌ、ｎ＝５）の存在下でＬＴＰは強く阻害され、１０５±５％であり（図１２Ａ）、対照ＬＴＰと比較して有意に低下された（Ｐ＜０．００１）。αｖインテグリンサブユニットに対する選択的抗体１７Ｅ６（１０μｌ中２７．９μｇ）はＬＴＰのＡβ媒介性阻害を予防し、１３５±８％であった（ｎ＝５、ベヒクルおよびＡβに比較してＰ＜０．０１；ベヒクルおよびベヒクルに比較してＰ＞０．０５）。アイソタイプ（ＩｇＧ１マウス）対照抗体２７／１（１０μｌ中２７．９μｇ）はＬＴＰのＡβ媒介性阻害に影響を及ぼすことに失敗した（１０３±６％、ｎ＝６、ベヒクルおよびＡβに比較してＰ＞０．０５；ベヒクルおよびベヒクルに比較してＰ＜０．０１）（図１２Ｂ）。
【実施例９】
【０１９３】
αｖ含有インテグリンの小分子非ペプチド拮抗剤はｉｎ ｖｉｔｒｏで歯状回およびｉｎ
ｖｉｖｏでＣＡ１でのＬＴＰのＡβ媒介性阻害を予防する
ＳＭ２５６は強力なαｖ拮抗剤でありかつαｖ媒介性の細胞接着を阻害する非ペプチド剤である（Ｖａｎ Ｗａｅｓら、２０００）。ＳＭ２５６（１０μＭ）単独はＬＴＰを阻害せず、１４８±７％であった。しかしながら、ＳＭ２５６はＬＴＰのＡβ媒介性阻害を予防し、１２９±５％であった（図１３Ａ）（ｎ＝５、Ｐ＜０．０１）。
【０１９４】
同様に、ＳＭ２５６の全身前投与は、可溶性の原線維を含まないＡβのｉ．ｃ．ｖ．注入により引き起こされるｉｎ ｖｉｖｏのＣＡ１でのＬＴＰの阻害を無効にした。選ばれたＳＭ２５６の用量（１．２ｍｌベヒクル中４０ｍｇ、ｉ．ｐ．）は基礎のシナプス伝達若しくは対照ＬＴＰに対する認識可能な影響を有しなかった（図１２Ｃおよびデータは示されない）。ＳＭ２５６の４０分後かつＨＦＳの１０分前に注入した可溶性Ａβ（５０ｐｍｏｌ、ｉ．ｃ．ｖ．）はＬＴＰを阻害することに失敗し、１３３±５％であり（図１２Ｃ、ｎ＝４；ＨＦＳ前基礎に比較してＰ＜０．０１；末梢ベヒクルおよび中枢ベヒクル（１４４±９％、ｎ＝３）に比較してＰ＞０．０５）、また、ベヒクルの末梢注入次いでＡ
βの中枢注入を与えた動物のＬＴＰの大きさと有意に異ならなかった（１０３±１０％、ｎ＝４、Ｐ＜０．０５）。
【実施例１０】
【０１９５】
スーパーフィブロネクチンはｉｎ ｖｉｔｒｏで歯状回でのＬＴＰのＡβ媒介性阻害を予防する
スーパーフィブロネクチンはαｖβ１のリガンドである（Ｍｏｒｌａら、１９９４）。スーパーフィブロネクチン（１μＭ）単独はＬＴＰを阻害せず、１５５±２％であった。しかしながら、スーパーフィブロネクチンはＬＴＰのＡβ媒介性阻止を予防し、１４７±６％であった（図１３Ｂ）（ｎ＝５、Ｐ＜０．０１）。
【実施例１１】
【０１９６】
ディスインテグリンはｉｎ ｖｉｔｒｏで歯状回でのＬＴＰのＡβ媒介性阻害を予防する
ディスインテグリン、エキスタチンの効果もまたＬＴＰのＡβ惹起性の阻害に対して検討した。ディスインテグリンは、非常に高い親和性でかつＲＧＤペプチドより強くインテグリンに結合する、インテグリンのアンタゴニストである蛇毒から単離された小型の４〜１０ｋＤａのＲＧＤを含有するシステイン豊富なペプチドである（Ｇａｎら、１９８８）。エキスタチンはαｖ／β３およびα５／β１を包含するＲＧＤ依存性インテグリンを阻害することが示された（Ｋｕｍａｒら、１９９７）１種のこうしたディスインテグリンである。エキスタチン（５０ｎＭ）単独はＬＴＰを阻害せず、１５８±５％であった。しかしながら、エキスタチンはＬＴＰのＡβ媒介性阻止を予防し、１４３±６％、ｎ＝５、Ｐ＜０．０１であった（図１３Ｃ）。
【０１９７】
上で引用された全部の刊行物、特許および特許出願は、各個々の刊行物若しくは特許出願が引用することによりそのように組み込まれることをとりわけかつ個々に示された場合と同一の程度まで全部の目的上そっくりそのまま引用することにより組み込まれる。本発明は明瞭さおよび理解の目的上具体的説明および実施例として若干詳細に記述されたとは言え、付随する請求の範囲の範囲内である種の変更および改変を実施しうることが明らかであろう。
【技術分野】
【０００１】
アミロイド形成タンパク質は複数の疾患状態の病理学に関与している。アミロイド形成タンパク質の異常沈着から生じる疾患は、限定されるものでないがアルツハイマー病、ＩＩ型糖尿病、パーキンソン病、びまん性レビー小体病、プリオンにより全部若しくは部分的に引き起こされる疾患（クロイツフェルト・ヤコブ病、スクレイピーおよびウシ海綿状脳症のような）、ならびに遺伝性アミロイドーシスおよび全身性アミロイドーシス双方を包含するアミロイドーシスを挙げることができる。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、米国単独で４００万人を苦しめている老人性認知症をもたらす進行性神経変性疾患である（全般として、非特許文献１；特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４を参照されたい）。大まかに言って、該疾患は２種類、すなわち高齢（６５歳超）で発生する晩発性；および老年期の十分に前すなわち３５と６０歳の間で発症する早発性に分類される。双方の型の疾患で病状は同一であるが、しかしより若年齢で開始する症例で異常がより重篤かつ広まる傾向がある。該疾患は、脳中の少なくとも２型の病変、すなわち老人斑および神経原線維変化を特徴とする。神経原線維変化は、対で相互の周囲で捻られた２本のフィラメントよりなる微小管結合τタンパク質の細胞内沈着物である。老人斑は直径１５０ミクロンまでの混乱した神経線維網の領域であり（脳組織の切片の顕微鏡分析により見える）、そして中央に細胞外アミロイド沈着物を有する。こうした斑の主成分はＡβペプチドである（非特許文献５を参照されたい）。斑中で見出される付加的なタンパク質は、非特許文献６により記述されるところのラミニン、アポＥ、アセチルコリンエステラーゼ、および非特許文献７により記述されるところのヘパリン硫酸プロテオグリカンを包含する。Ａβペプチドは、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）と命名される前駆体タンパク質の３９〜４３アミノ酸の内部フラグメントである。ＡＰＰタンパク質内の数種の突然変異がアルツハイマー病の存在と相互に関連付けられている（非特許文献８（バリン７１７からイソロイシン）；非特許文献９（バリン７１７からグリシン）；非特許文献１０（バリン７１７からフェニルアラニン）；非特許文献１１（リシン５９５メチオニン５９６をアスパラギン５９５ロイシン５９６に変える二重突然変異））。こうした突然変異は、ＡβへのＡＰＰの増大された若しくは変えられたプロセシング、とりわけ、増大された量の長い形態のＡβ（すなわちＡ１−４２およびＡ１−４３）へのＡＰＰのプロセシングによりアルツハイマー病を引き起こすと考えられている。プレセニリン遺伝子ＰＳ１およびＰＳ２のような他の遺伝子中の突然変異は、ＡＰＰのプロセシングに間接的に影響して増大された量の長い形態のＡβを生成すると考えられている（非特許文献１２）。これらの観察結果は、Ａβおよびとりわけその長い形態がアルツハイマー病における原因要素であることを示す（非特許文献１３）。
【０００３】
研究者は、シナプス不全がＡＤの発症の基礎にあると仮定している。シナプス減少がＡＤの早期事象でありかつ認知障害と構造的相関関係にあるためである。研究者は、ＡＤにおける臨床的認知症の潜行性発症に先立つ軽度認知障害が、大スケールの神経変性に先立つシナプス不全から生じるとさらに仮定している。長期増強（ＬＴＰ）は、学習および記憶の細胞モデルであると広く仮定されているシナプスの可塑性の一形態である。
【０００４】
ＬＴＰはシナプス伝達の効率の持続的な使用依存性の増大である。大部分の研究でＬＴＰは高頻度シナプス刺激（ＨＦＳ）の送達により実験的に誘導する。しかしながら他の馴化プロトコルが存在し、それらのいくつかは性質が薬理学的でありかつシナプス刺激を伴わない。さらに、複数の形態のＬＴＰが同定されている。げっ歯類脳薄片での研究は、とりわけ海馬のＣＡ３−ＣＡ１シナプスでＬＴＰの多くの局面を解明した。ＬＴＰの４つの
特徴は、共同性、連合性、持続性および入力特異性である。
【０００５】
シナプス効率の増大を開始する早期事象を構成するＬＴＰ誘導の過程は、ＬＴＰのその後の持続的発現と機構的に異なる。ＬＴＰ誘導の間、領域ＣＡ３から領域ＣＡ１に突出する線維へのＨＦＳの送達がシナプス中にグルタミン酸を放出し、そしてシナプス後ニューロンを脱分極する。高頻度の刺激（例えば１００Ｈｚ）により、連続的興奮性シナプス後電位（ＥＰＳＰ）により誘発される脱分極が重なり、そして一連のＨＦＳの間の累積的脱分極が実質的になり得る。樹状突起に後方伝播するシナプス後活動電位の発生が付加的な脱分極に寄与する。グルタミン酸放出および脱分極は原因として関係するとは言え、実験的に、それらを分離しかつＬＴＰの誘導が双方の事象を必要とする（「共同性」と命名されている関係）ことを示すことが可能である。従って、シナプス後膜が馴化の間に直接過分極される場合、ＨＦＳはＬＴＰを誘導することに失敗する。逆に、電流注入でシナプス後膜を直接脱分極することは、低頻度シナプス刺激でさえＬＴＰを誘導することを可能にする。
【０００６】
第２１染色体の余分の１コピーを有するダウン症候群のほとんど全部の個体は、彼らが彼らの４０歳代まで生き延びる場合に、アルツハイマー病で見られるものに類似の神経病理学的変化を示す。これは、第２１染色体上のＡＰＰ遺伝子によりコードされるβアミロイドタンパク質の過剰産生に帰されている。
【０００７】
数種のタンパク質がＡβとの可能な相互作用について検討されている。これらは、高度な糖化最終生成物、ＲＡＧＥ（非特許文献１４を参照されたい）、スカベンジャー受容体（非特許文献１５；および非特許文献１６）、小胞体関連アミロイドβ結合タンパク質（ＥＲＡＢ）（非特許文献１７）、α４若しくはα７ニコチン性アセチルコリン受容体（非特許文献１８および非特許文献１９）、ならびに低親和性ｐ７５ ＮＧＦ受容体（非特許文献２０を参照されたい）を包含する。加えて、Ａβは、非特許文献２１および非特許文献２２により、プレート上に被覆される場合にβ１インテグリンサブユニット依存性の様式で細胞の接着を媒介することが報告されている。
【０００８】
Ａβと相互作用しうる多様な機能の多様な分子の数を考慮すると、Ａβが神経変性を媒介しうる機序は不明なままである。該過程で役割を有しうる他の細胞タンパク質の存在および性質もまた不明である。
【０００９】
島アミロイドは、世紀の始まり以来ＩＩ型糖尿病における病理学的実体として認識されている。それは、その独特の成分として、インスリンと共分泌される島β細胞ペプチド、島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰ）すなわちアミリンを有する。この独特の成分に加え、島アミロイドは、アポリポタンパク質Ｅ、およびヘパリン硫酸プロテオグリカン、パールカンのような他のタンパク質を含有し、それらは典型的に他の形態の全身性および局在性アミロイドで観察される。島アミロイドは、ＩＩ型糖尿病を伴う個体の大多数において病理学的検査で観察されるが、しかし糖代謝の混乱を伴わないヒトで稀に観察される。げっ歯類からのＩＡＰＰと対照的にヒトＩＡＰＰはｉｎ ｖｉｔｒｏでアミロイド原線維を形成することが示されている。全ヒト被験体がアミロイド形成性の形態のＩＡＰＰを産生かつ分泌し、それでもなお全部が島アミロイドを発生するわけではないため、いくつかの他の因子が島アミロイド形成に関与していることがありそうである。１仮説は、ＩＡＰＰの産生、プロセシングおよび／若しくは分泌の変化をもたらすβ細胞機能の変化が、ヒト糖尿病における島アミロイド原線維の初期形成に関与することである。アミロイド原線維のこの形成がその後ＩＡＰＰ含有原線維の進行的蓄積を可能にする。β細胞塊のアミロイドによる最終的な置換が高血糖症の発症に寄与している。
【００１０】
アミロイド形成の開始をもたらすβ細胞の変化を生じることに関与しうる１因子は、食
物脂肪の増大された消費である。食物脂肪は島β細胞ペプチドの産生、プロセシングおよび分泌を変えることが知られており、また、ヒトＩＡＰＰを発現するトランスジェニックマウスでの研究はこの機序の作動を裏付ける。これおよび他のモデルを使用するさらなる検討が、島アミロイド形成に関与する機序への洞察を提供しそしてアミロイド原線維形成を阻害若しくは復帰する治療薬の開発を可能にするはずであり、その目標はＩＩ型糖尿病でβ細胞の機能を保存しかつグルコース制御を改善することである。非特許文献２３。
【００１１】
伝染性海綿状脳症すなわちプリオン病は、後天的、遺伝性若しくは特発性（「散発性」）疾患として症状発現し得る伝染性の迅速に進行する必ず致死的な神経変性疾患の一群を構成する。それらは、ヒトにおけるクロイツフェルト・ヤコブ病ならびに動物におけるスクレイピーおよびウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）を包含し、そして、実験的若しくは偶発的伝播後に数十年まで持続しうる長い潜伏期を特徴とする。プリオン病の古典的病理学的特徴は海綿状変化、神経膠症およびニューロン減少を包含する。ウイルスによる引き起こされる感染性疾患で典型的に見られるものと対照的に、プリオン病は有意の炎症応答を欠く（非特許文献２４、非特許文献２５）。
【００１２】
プリオン病は伝染性病原体「プリオン」の独特の特性によりかなりの科学的注目を集めている（非特許文献２６）。該感染性病原体は非常に小さく、そして核酸を破壊しかつ慣習的ウイルスを不活性化する処置に対し極めて抵抗性である（非特許文献２６）が、しかしタンパク質を変性させる処置に感受性である。該感染性病原体を精製する試みは、プリオンタンパク質（ＰｒＰ）と命名された、これまで未知のタンパク質について高度に濃縮された画分を生じた（非特許文献２７：非特許文献２８：非特許文献２９）。病原体特異的核酸はこれらの調製物中で見出されておらず（非特許文献３０；非特許文献３１）；むしろ、プリオンタンパク質は宿主ゲノム中でコードされる（非特許文献２９；非特許文献３２；非特許文献３３）。冒された個体の脳中には、ＰｒＰＳｃと命名されたプリオンタンパク質の特異的な疾患関連アイソフォームの特徴的な蓄積が見出される（図１）。ＰｒＰＳｃは、コンホメーション変化を伴う明確に定義されていない翻訳後過程によりプリオンタンパク質の正常な細胞アイソフォーム（ＰｒＰｃ）から派生する（非特許文献２５）。ＰｒＰｃおよびＰｒＰＳｃは同一アミノ酸配列を有する（非特許文献３４）が、しかしながらそれらはコンホメーションが異なる。ＰｒＰＳｃは、βシート構造のその高含量（非特許文献３５）、大型凝集物を形成するその傾向、およびプロテイナーゼＫでの消化に対するその部分的抵抗性によりＰｒＰｃと識別し得る。
【００１３】
遺伝性アミロイドーシスは、細胞外マトリックス中の不溶性タンパク質原線維の沈着物を特徴とする常染色体優性の遺伝性疾患の臨床上および遺伝的に不均一な一群を含んでなる。これらの疾患は、硝子体混濁および腎不全によりときに付随される、多発神経炎、手根幹症候群、自律神経障害、心筋症の症状および胃腸の特徴を典型的に提示する。他の表現型は、ニューロパシー、胃潰瘍、脳神経障害および格子状角膜ジストロフィーを特徴とする。稀に軟髄膜若しくは脳の構造もまた臨床像に関与している。発症時年齢は１７歳くらい早くかつ７８歳くらい遅い。アミロイド原線維の基礎構成要素は、遺伝子で決定されるコンホメーション変化によりアミロイド形成性となる生理学的タンパク質である。以前はプレアルブミンと命名されていた変異トランスサイレチン（ＴＴＲ）が遺伝性アミロイドーシスの最も頻繁な攻撃者（ｏｆｆｅｎｄｅｒ）である。同所性肝移植（ＯＬＴ）は、アミロイド形成タンパク質の主産生部位を除去することにより、そうでなければ一般的に致死性である該疾患の進行を停止する。ＯＬＴの適応症およびその成功は、手術時点での心血管系および自律神経障害の進行度、齢、併存症ならびに突然変異の型に依存する。ＴＴＲの天然の四量体コンホメーションを安定化しかつ原線維形成を阻害する薬物を用いる代替処置モダリティーが現在集中的に研究されている。
【００１４】
全身性アミロイドーシスは、実質器官；血管；皮下、粘膜下および腱周囲の脂肪；心；
眼；ならびに髄膜の原線維タンパク質凝集の細胞外沈着物を特徴とする。加えて、神経幹、神経叢、ならびに知覚および自律神経節を包含する末梢神経系のいずれの部分も関与しうる。抹消神経では、アミロイド沈着物は、通常は斑状および限局性の分布で神経上膜、神経周膜若しくは神経内膜に存在する。慣習的染色を用いる光学顕微鏡検査で、アミロイド沈着物は均一なエオシン好性の外見を有する。コンゴーレッド染色で、それらは偏光下に特徴的な黄緑色の複屈折を示す。
【００１５】
多様なタンパク質がアミロイド形成の原因であり；事実、合計１８種のアミロイド形成タンパク質がヒトアミロイドーシスで同定されている。非遺伝性の全身性アミロイドーシスは、免疫グロブリンＬ鎖（ＡＬ型、形質細胞悪液質における）、血清アミロイドＡのフラグメント、急性期タンパク質（ＡＡ型、慢性炎症性疾患における）、トランスサイレチン（ＴＴＲ；老人性全身性アミロイドーシスにおける）およびβ２−ミクログロブリン（尿毒症および透析を伴う患者における）により引き起こされ得る。遺伝性アミロイドーシスは、ＴＴＲ、およびはるかにより稀にはアポリポタンパク質Ａ１、リゾチーム、フィブリノーゲン、ゲルゾリン、アミロイドβおよびシスタチンＣを包含する生理学的タンパク質の遺伝子バリアントによる。以前はプレアルブミンと呼ばれたＴＴＲは、血清チロキシンおよび網膜結合タンパク質の輸送に関与する正常の四量体血清タンパク質である。それは第１８染色体上の単一遺伝子によりコードされ、それの５１個の異なる部位に存在する７０以上の常染色体優性遺伝性点突然変異が記述されている。これらのなかで、位置３０のメチオニン（Ｍｅｔ３０）によるバリンの置換はこれまで最も頻繁でありかつ地理的に最も広く散在している。
【００１６】
パーキンソン病は、振戦、筋固縮、ならびに平衡および協調障害により特徴付けられる進行性神経障害である。化学物質ドーパミンを産生する脳細胞の破壊がこれらの症状の基礎にある。これらの病的な細胞はレビー小体と呼ばれるタンパク質沈着物によってもまた特徴付けられる。細胞がなぜ死ぬか、若しくはレビー小体がそれらを死滅させるのを助けるかどうかは誰も知らない。パーキンおよびα−シヌクレインと呼ばれる２種のタンパク質の遺伝子中の突然変異が、稀な形態の遺伝性パーキンソン病を分離するために結び付けられている。しかし、パーキンおよびα−シヌクレインの双方が、全パーキンソン病患者の脳中に蓄積するレビー小体中で見出される。
【００１７】
最近の知見は、パーキンが、α−シヌクレインおよびシンフィリンを包含する脳中のレビー小体と関連するタンパク質の調節において重要な役割を演じていることを示唆している。正常には、パーキンは破壊のため他のタンパク質を「標識する」のにユビキチンと呼ばれるなお別のタンパク質を使用する。しかし、これらのタンパク質のあいだの関係で何かがうまくいかない場合、これはパーキンソン病で見られる細胞死の基礎作りをし得る。パーキンおよびα−シヌクレインの双方が、レビー小体関連タンパク質のユビキチン化を伴う共通の発病機序でシンフィリン−１と結合される。非特許文献３６。従って、パーキンとのその相互作用を考えれば、α−シヌクレインでの問題は、遺伝性および一般的形態の双方のパーキンソン病の中心にありうる。非特許文献３６。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】Ｈａｒｄｙら、第ＷＯ ９２／１３０６９号明細書
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】Ｓｌｏｅ、ＴＩＮＳ、１６：４０３−４０９（１９９３）
【非特許文献２】Ｓｌｏｅ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．、５３：４３８−４４７（１９９４）
【非特許文献３】Ｄｕｆｆら、Ｎａｔｕｒｅ、３７３：４７６−４７７（１９９５）
【非特許文献４】Ｇａｍｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３７３：５２３（１９９５）
【非特許文献５】Ｆｏｒｓｙｔｈ Ｐｈｙｓ．Ｔｈｅｒ．、７８：１３２５−１３３１（１９９８）
【非特許文献６】Ｍｕｒｔｏｍａｋｉら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．、３２：２６１−２７３（１９９２）
【非特許文献７】Ｙａｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１５０２：１４５−５７（２０００）
【非特許文献８】Ｇｏａｔｅら、Ｎａｔｕｒｅ、３４９：７０４−０６（１９９１）
【非特許文献９】Ｈａｒｌｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５３：８４４−４６（１９９１）
【非特許文献１０】Ｍｕｒｒｅｌｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５４：９７−９９（１９９１）
【非特許文献１１】Ｍｕｌｌａｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．、１：３４５−４７（１９９２）
【非特許文献１２】Ｈａｒｄｙ、ＴＩＮＳ、２０：１５４（１９９７）
【非特許文献１３】Ｖｅｌｅｚ−Ｐａｒｄｏら、Ｇｅｎ．Ｐｈａｒｍ．、３１（５）：６７５−８１（１９９８）
【非特許文献１４】Ｙａｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３８２：６８５−９１（１９９６）
【非特許文献１５】Ｋｈｏｕｒｙら、Ｎａｔｕｒｅ、３８２：７１６−７１９（１９９６）
【非特許文献１６】Ｐａｒｅｓｃｅら、Ｎｅｕｒｏｎ １７：５５３−６５（１９９６）
【非特許文献１７】Ｙａｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３８９：６８９−６９５（１９９７）
【非特許文献１８】Ｗａｎｇら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．、７５：１１５５−１１６１（２０００）
【非特許文献１９】Ｗａｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７５：５６２６−５６３２（２０００）
【非特許文献２０】Ｙａａｒら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１００：２３３３−２３４０（１９９７）
【非特許文献２１】Ｇｈｉｓｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、２８８：１０５３−５９（１９９２）
【非特許文献２２】Ｍａｔｔｅｒら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．、１４１：１０１９−１０３０（１９９８）
【非特許文献２３】Ｄｉａｂｅｔｅｓ、４８：２４１−２５３（１９９９）
【非特許文献２４】Ｐｒｕｓｉｎｅｒ、Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．、５０：１１２９−１１５３（１９５３）
【非特許文献２５】Ｐｒｕｓｉｎｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９５：１３３６３−１３３８３（１９９８）
【非特許文献２６】Ｐｒｕｓｉｎｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２１６：１３６−１４４（１９８２）
【非特許文献２７】Ｂｏｌｔｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２１８：１３０９−１３１１（１９８２）
【非特許文献２８】Ｐｒｕｓｉｎｅｒら、Ｃｅｌｌ、３８：１２７−１３４（１９８３）
【非特許文献２９】Ｏｅｓｃｈら、Ｃｅｌｌ、４０：７３５−７４６（１９８５）
【非特許文献３０】Ｋｅｌｌｉｎｇｓら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、７３：１０２５−１０２９（１９９２）
【非特許文献３１】Ｒｉｅｓｎｅｒら、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．、８０：１７３−１８１（１９９３）
【非特許文献３２】Ｃｈｅｓｅｂｒｏら、Ｎａｔｕｒｅ、３１５：３３１−３３３（１９８５）
【非特許文献３３】Ｂａｓｌｅｒら、Ｃｅｌｌ、４６：４１７−４２８（１９８６）
【非特許文献３４】Ｓｔａｈｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３２：１９９１−２００２（１９９３）
【非特許文献３５】Ｐａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９０：１０９６２−１０９６６（１９９３）
【非特許文献３６】Ｄａｗｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、７：１１４４−１１５０（２００１）
【発明の概要】
【００２０】
［発明の要約］
１種若しくはそれ以上の剤が長期増強（ＬＴＰ）のアミロイド媒介性阻害を抑制するような条件下でインテグリンサブユニットαｖに結合する該１種若しくはそれ以上の剤の有効投薬量を投与することを含んでなる、ＬＴＰのアミロイド媒介性阻害の抑制方法が提供される。該方法の一態様において、インテグリンサブユニットαｖに結合する最低２剤の有効投薬量が投与される。該方法の一態様において、該剤は、Ａβ産生の阻害剤、Ａβ沈着の阻害剤、Ａβ消失のメディエーター、アミロイド斑消失のメディエーター、Ａβ神経毒性の阻害剤、Ａβ凝集の阻害剤およびＡβ解離のメディエーターよりなる群から選ばれる第二の剤とともに投与される。一態様において、Ａβ産生の阻害剤はγ分泌酵素阻害剤である。一態様において、Ａβ産生の阻害剤はβ分泌酵素阻害剤である。該方法の一態様において、該剤はＡβに対する抗体とともに投与される。該方法の一態様において、該剤はＲＧＤ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）モチーフを含んでなるペプチドである。該方法の一態様において、該剤はαｖβ１インテグリンのリガンドである。該方法の一態様において、該剤はフィブロネクチン若しくはスーパーフィブロネクチンである。該方法の一態様において、該剤はαｖインテグリンサブユニット発現細胞のビトロネクチン若しくはフィブロネクチンへの接着を阻害する。該方法の一態様において、該剤はαｖインテグリンサブユニット発現細胞のオステオポンチンへの接着を阻害する。該方法の一態様において、該剤はモノクローナル若しくはポリクローナル抗体である。該方法の一態様において、該剤は、１８Ｃ７、２０Ａ９および１７Ｅ６から選択される抗体と同一のエピトープを認識する抗体である。一態様において、該抗体はヒト化抗体、キメラ抗体およびナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）から選択される。該方法の一態様において、該剤は１８Ｃ７、２０Ａ９および１７Ｅ６から選択される抗体である。該方法の一態様において、該剤は、インテグリンサブユニットαｖへの結合について１８Ｃ７、２０Ａ９および１７Ｅ６から選ばれる抗体と競合する。
【００２１】
該方法のさらなる一態様において、該剤は、それらの立体異性体、若しくはそれらの立体異性体の混合物、またはそれらの製薬学的に許容できる塩の形態を包含する、式ＩａおよびＩｂ
【００２２】
【化１】
【００２３】
の化合物から選択される化合物であり、ここで
Ｘ１およびＸ３は窒素若しくは炭素から独立に選択され；
Ｒ１は
【００２４】
【化２】
【００２５】
から選択され；
ここで、上の複素環は、ＮＨ２、ハロゲン、ＮＯ２、ＣＮ、ＣＦ３、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６アルキルおよびＣ３−Ｃ７シクロアルキルよりなる群から選択される０〜２置換基で場合によっては置換されており；
Ｕは−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｔＱ（ＣＨ２）ｍ−および−Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）
ｎ−１−から選択され、ここでメチレン基の１個は場合によってはＲ７で置換されており；
Ｑは、１，２−フェニレン、１，３−フェニレン、２，３−ピリジニレン、３，４−ピリジニレンおよび２，４−ピリジニレンから選択され；
Ｒ６はＨ、Ｃ１−Ｃ４アルキルおよびベンジルから選択され；
Ｒ７はＣ１−Ｃ６アルキル、Ｃ３−Ｃ７シクロアルキル、Ｃ４−Ｃ１１シクロアルキルアルキル、アリール、アリール（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、ヘテロアリールおよびヘテロアリール（Ｃ１−Ｃ６アルキル）から選択され；
Ｒ１０は、Ｈ、ハロゲン、ＣＯ２Ｒ１７、ＣＯＮＲ１７Ｒ２０、０〜１個のＲ１５若しくは０〜１個のＲ２１で置換されているＣ１−Ｃ６アルキル、０〜１個のＲ２１で置換されているＣ１−Ｃ４アルコキシ、０〜１個のＲ１５若しくは０〜１個のＲ２１で置換されているＣ３−Ｃ７シクロアルキル、０〜１個のＲ１５若しくは０〜１個のＲ２１で置換されているＣ４−Ｃ１１シクロアルキルアルキル、および０〜１個のＲ１５若しくは０〜２個のＲ１１若しくは０〜１個のＲ２１で置換されているアリール（Ｃ１−Ｃ６アルキル）−から選択され；
Ｒ１１は、Ｈ、ハロゲン、ＣＦ３、ＣＮ、ＮＯ２、ヒドロキシ、ＮＲ２Ｒ３、０〜１個のＲ２１で置換されているＣ１−Ｃ４アルキル、０〜１個のＲ２１で置換されているＣ１−Ｃ４アルコキシ、０〜１個のＲ２１で置換されているアリール、０〜１個のＲ２１で置換されているアリール（Ｃ１−Ｃ６アルキル）−、０〜１個のＲ２１で置換されている（Ｃ１−Ｃ４アルコキシ）カルボニル、０〜１個のＲ２１で置換されている（Ｃ１−Ｃ４アルキル）カルボニル、０〜１個のＲ２１で置換されているＣ１−Ｃ４アルキルスルホニル、および０〜１個のＲ２１で置換されているＣ１−Ｃ４アルキルアミノスルホニルから選択され；
Ｗは−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒ１３）−であり；
Ｘは−ＣＨ（Ｒ１４）−ＣＨ（Ｒ１５）−であり；
Ｒ１３はＨおよびＣＨ３から選択され；
Ｒ１４は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アリールおよびヘテロアリールから選択され、前記アリール若しくはヘテロアリール基は、Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、アリール、ハロ、シアノ、アミノ、ＣＦ３およびＮＯ２から選択される０〜３置換基で場合によっては置換されており；
Ｒ１５はＨおよびＲ１６から選択され；
Ｙは−ＣＯＲ１９であり；
Ｒ１６は
−ＮＨ（Ｒ２０）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ１７、
−Ｎ（Ｒ２０）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ１７、
−Ｎ（Ｒ２０）−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ｒ１７、
―Ｎ（Ｒ２０）ＳＯ２−Ｒ１７、および
−Ｎ（Ｒ２０）ＳＯ２−Ｎ（Ｒ２０）Ｒ１７
から選択され、
Ｒ１７は、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ３−Ｃ１１シクロアルキル、アリール（Ｃ１−Ｃ６アルキル）−、（Ｃ１−Ｃ６アルキル）アリール、ヘテロアリール（Ｃ１−Ｃ６アルキル）−、（Ｃ１−Ｃ６アルキル）ヘテロアリール、ビアリール（Ｃ１−Ｃ６アルキル）−、ヘテロアリール若しくはアリールから選択され、前記アリール若しくはヘテロアリール基は、Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、ハロ、シアノ、アミノ、ＣＦ３およびＮＯ２よりなる群から選択される０〜３置換基で場合によっては置換されており；
Ｒ１９は−Ｏ−（ＣＨ２）ｋＮ＋（Ｒ２２）（Ｒ２３）（Ｒ２４）Ｚ−であり；
Ｚ−は、ハロゲン化イオン、重硫酸イオン、硫酸イオン、リン酸水素イオン、リン酸イオン、トルエンスルホン酸イオン、メタンスルホン酸イオン、エタンスルホン酸イオン、酢酸イオン、トリフルオロ酢酸イオン、クエン酸イオン、シュウ酸イオン、コハク酸イオン
およびマロン酸イオンから選択される製薬学的に許容できる陰イオンであり；
Ｒ２２、Ｒ２３およびＲ２４はＨ、Ｃ１−Ｃ４アルキルおよびＣ４−Ｃ１１シクロアルキルアルキルから独立に選択されるか；
あるいは、Ｒ２２およびＲ２３は、一緒になって、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１〜２個のヘテロ原子を含有する５〜７員の複素環系を形成し得、ならびにＲ２４は上のとおり定義されるか、または、Ｒ２２、Ｒ２３およびＲ２４は、一緒になって、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１〜２個のヘテロ原子を含有する複素二環系を形成し得；
Ｒ２０はＨおよびＣＨ３から選択され；
Ｒ２１はＣＯＯＨおよびＮＲ６２から選択され；
ｋは２であり；
ｍは０および１から選択され；
ｎは１〜４であり；ならびに
ｔは０および１から選択される。
【００２６】
該方法の一態様において、該剤は式ＩＩ：
【００２７】
【化３】
【００２８】
の化合物であり、
ここでＲ１９は−Ｈ、−ＣＨ３および−ＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋（ＣＨ３）３から選ばれる。一態様において、Ｒ１９は−Ｈである。別の態様において、Ｒ１９は−ＣＨ３である。別の態様において、Ｒ１９は−ＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋（ＣＨ３）３である。
【００２９】
該方法の別の態様において、該剤はディスインテグリンである。該方法の別の態様において、該剤はエキスタチンである。該方法の別の態様において、該剤はヒト抗体である。該方法の別の態様において、該剤はヒト化抗体である。該方法の別の態様において、該剤はキメラ抗体である。該方法の別の態様において、該剤はナノボディである。該方法の別の態様において、該剤は抗体フラグメントである。該方法の別の態様において、該剤は、抗体の１個若しくはそれ以上のＨ鎖、Ｌ鎖、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ）ｃ若しくはＦ（ｖ）、またはそれらのいずれかの組合せを含んでなる。該方法の別の態様において、該剤は抗体でありかつ該抗体のアイソタイプはＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４である。該方法の別の態様において、該剤は抗体でありかつ該抗体のアイソタイプはＩｇＧ２若しくはＩｇＧ３である。該方法の別の態様において、該剤は１抗体鎖である。該方法の別の態様において、該剤は抗体でありかつ該抗体は２対のＬおよびＨ鎖を含んでなる。
【００３０】
該方法の別の態様において、該剤は患者に投与される。一態様において、該剤は抗体でありかつ該抗体の投薬量は患者体重１ｋｇあたり約０．０１から約１０ｍｇまでの範囲に
わたる。一態様において、該剤は製薬学的組成物として担体とともに投与される。一態様において、該剤は、腹腔内、経口、鼻内、皮下、くも膜下腔内、筋肉内、局所若しくは静脈内で投与される。一態様において、患者はアミロイド形成疾患に罹っている。一態様において、該疾患は、アルツハイマー病、ＩＩ型糖尿病、パーキンソン病、びまん性レビー小体病、アミロイドーシス、ダウン症候群、およびプリオン感染により全部若しくは部分的に引き起こされる疾患よりなる群から選ばれる。
【００３１】
該方法の別の態様において、該剤をコードする核酸が投与される。該方法の別の態様において、該剤は、アンチセンスＲＮＡ分子、アンチセンスＤＮＡ分子、リボザイム、ＲＮＡｉおよびジンクフィンガータンパク質よりなる群から選ばれる。別の態様において、該方法はアミロイド沈着物の形成を阻害することをさらに含んでなる。別の態様において、該方法はアミロイド毒性を阻害することをさらに含んでなる。該方法の別の態様において、該剤はＬＴＰの維持期を阻害しない。該方法の別の態様において、該剤は培養中の薄片調製物でのＬＴＰのアミロイド媒介性阻害を抑制する。該方法の別の態様において、該剤は可溶性ＡβによるＬＴＰの阻害を抑制する。
【００３２】
ある剤をインテグリンサブユニットαｖ結合剤と同定すること；および該同定されたαｖ結合剤がＬＴＰのアミロイド媒介性阻害を抑制することを決定することを含んでなる、ＬＴＰのアミロイド媒介性阻害を抑制する剤の同定方法もまた提供される。該方法の一態様において、剤を同定する段階は、直接結合アッセイ、競合結合アッセイおよび細胞接着アッセイの１種若しくはそれ以上を含んでなり；また、該同定されたαｖ結合剤がＬＴＰのアミロイド媒介性阻害を抑制することを決定する段階は、第一の神経回路に高頻度刺激を導入することおよびＬＴＰの誘導を測定すること、Ａβの存在下の第二の神経回路に高頻度刺激を導入することおよびＬＴＰ誘導の阻害を測定すること、ならびにＡβおよび該剤の存在下の第三の神経回路に高頻度刺激を導入することおよびＬＴＰ誘導の阻害の抑制を測定することを含んでなる。
【００３３】
該方法により同定されるＬＴＰのアミロイド媒介性阻害を抑制する剤もまた提供される。一態様において、該剤は抗体である。
【００３４】
該剤および製薬学的に許容できる担体を含んでなる組成物がさらに提供される。
【００３５】
該方法により同定される剤の有効投薬量を投与することを含んでなる、長期増強（ＬＴＰ）のアミロイド媒介性阻害の抑制方法がさらに提供される。
【００３６】
該方法により同定される、ＬＴＰのアミロイド媒介性阻害を抑制する剤もまた提供される。一態様において、該剤は抗体である。
【００３７】
該剤および製薬学的に許容できる担体を含んでなる組成物もまた提供される。
【００３８】
該方法により同定される剤の有効投薬量を投与することを含んでなる、長期増強（ＬＴＰ）のアミロイド媒介性阻害の抑制方法もまた提供される。
【００３９】
αｖ拮抗剤若しくはαｖ媒介性細胞接着の阻害剤を長期増強（ＬＴＰ）のアミロイド媒介性阻害を抑制するのに有効な量で投与することを含んでなる、Ａβ沈着を特徴とするアミロイド形成疾患の処置方法もまた提供される。一態様において、アミロイド形成疾患はアルツハイマー病である。別の態様において、アミロイド形成疾患は軽度認知障害である。
【００４０】
１種若しくはそれ以上の剤がＬＴＰのアミロイド媒介性阻害を抑制するような条件下で
インテグリンサブユニットαｖに結合する１種若しくはそれ以上の剤の有効投薬量を投与することを含んでなる、Ａβ沈着を特徴とするアミロイド形成疾患の処置若しくは予防方法もまた提供される。一態様において、アミロイド形成疾患はアルツハイマー病若しくは軽度認知障害である。一態様において、アミロイド形成疾患はパーキンソン病若しくはびまん性レビー小体病である。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
［発明の詳細な記述］
定義
本発明の治療薬は、典型的には望ましくない汚染物質から実質的に精製されている。これは、ある剤が典型的には最低約５０ｗ／ｗ（重量）％純度であり、ならびに妨害するタンパク質および汚染物質を実質的に含まないことを意味している。ときに、該剤は最低約６０％、７０％、８０％、９０％若しくは９５ｗ／ｗ％純度である。慣習的タンパク質精製技術を使用して、最低９９ｗ／ｗ％の均質なペプチドもまた得ることができる。
【００４２】
２実体間の特異的結合は最低１０６、１０７、１０８、１０９若しくは１０１０Ｍ−１の親和性を意味している。一態様において、親和性は約１０８Ｍ−１以上である。
【００４３】
「抗体」若しくは「免疫グロブリン」という用語は、無傷の抗体およびそれらの結合フラグメントを包含するのに使用する。典型的に、フラグメントは、抗原フラグメントへの特異的結合について、それらが由来した無傷の抗体と競合し、個別のＨ鎖、Ｌ鎖Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）ｃおよびＦｖを包含する。フラグメントは組換えＤＮＡ技術、または無傷の免疫グロブリンの酵素的若しくは化学的分離により製造しうる。「抗体」という用語は、他のタンパク質に化学的に複合されるか若しくは他のタンパク質との融合タンパク質として発現される１種若しくはそれ以上の免疫グロブリン鎖もまた包含する。「抗体」という用語は二特異性抗体もまた包含する。二特異性若しくは二機能性抗体は、２種の異なるＨ／Ｌ鎖対および２種の異なる結合部位を有する人工的ハイブリッド抗体である。二特異性抗体は、ハイブリドーマの融合若しくはＦａｂ’フラグメントの連結を包含する多様な方法により製造し得る（例えばＳｏｎｇｓｉｖｉｌａｉとＬａｃｈｍａｎｎ、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、７９：３１５−３２１（１９９０）；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４８：１５４７−５３（１９９２）を参照されたい）。
【００４４】
ＡＰＰ６９５、ＡＰＰ７５１およびＡＰＰ７７０は、ヒトＡＰＰ遺伝子によりコードされるそれぞれ６９５、７５１および７７０アミノ酸残基長のポリペプチドを指す。Ｋａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ、３２５：７３３−３６（１９８７）；Ｐｏｎｔｅら、Ｎａｔｕｒｅ、３３１：５２５−２７（１９８８）；およびＫｉｔａｇｕｃｈｉら、Ｎａｔｕｒｅ、３３１：５３０−３２（１９８８）を参照されたい。ヒトアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）内のアミノ酸は、ＡＰＰ７７０アイソフォームの配列に従って番号を割り当てられている。Ａβ３９、Ａβ４０、Ａβ４１、Ａβ４２およびＡβ４３のような用語は、アミノ酸残基１−３９、１−４０、１−４１、１−４２および１−４３を含有するＡβペプチドを指す。Ａβ４２は配列（配列番号１）：
Ｈ２Ｎ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−ＯＨを有する。Ａβ４１（配列番号３）、Ａβ４０（配列番号４）およびＡβ３９（配列番号５）は、Ｃ末端からのそれぞれＡｌａ、Ａｌａ−ＩｌｅおよびＡｌａ−Ｉｌｅ−Ｖａｌの脱落によりＡβ４２（配列番号１）と異なる。Ａβ４３（配列番号２）はＣ末端のトレオニン残基の存在によりＡβ４２（配列番号１）と異なる。
【００４５】
「アミリン」は、当該技術分野で公知のタンパク質、またはそのペプチド若しくはポリペプチド若しくはフラグメント、あるいは該タンパク質、ペプチド若しくはポリペプチドの前駆体タンパク質若しくはポリマーを指す。該用語は島アミロイドポリペプチドを包含する。アミリンの記述は、当該技術分野でＣｏｏｐｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８５：７７６３（１９８８）およびＬｅｉｇｈｔｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３５：６３２（１９８８）のような場所で見出しうる。
【００４６】
「アミロイドペプチド若しくはタンパク質」という用語は、アミリンおよびＡβを包含するアミロイド様沈着物を形成するペプチドおよびタンパク質のファミリーを指す。
【００４７】
「アミロイド若しくはアミロイド様沈着物」という句は、アミロイド原線維、ならびに、老人性アミロイドーシス（例えばＡβ）、プリオン関連脳症（例えばＰｒＰ）および糖尿病患者の腎若しくは膵（例えばアミリン）での沈着物などのような、アミロイド若しくはアミロイド様であると当該技術分野で認識されている構造が原線維若しくは非原線維の他のアミロイド若しくはアミロイド様沈着物を包含する。慣習的染色を用いる光学顕微鏡検査でこうした沈着物は均一なエオシン好性の外見を有する。コンゴーレッド染色でそれらは偏光下で特徴的な黄緑色の複屈折を示す。該用語は、アミロイド沈着物と異なりコンゴーレッドで染色しないプレアミロイド沈着物もまた包含する。
【００４８】
「アミロイド形成疾患」という用語は、タンパク質若しくはペプチドの不要な沈着を特徴とする疾患を包含することを意図している。該用語は、Ｋａｈｎら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、４８：２４１−２５３（１９９９）；およびＪｏｈｎｓｏｎら、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、６６（５）：５２２−５３５（１９９２）により記述されるところのＩＩ型糖尿病（例えばアミリン）、アルツハイマー病（例えばＡβ）、多発性骨髄腫および関節リウマチのような、アミロイドペプチドの不要な沈着を特徴とする疾患をとりわけ包含する。該用語は、トランスサイレチン（ＴＴＲ）沈着により媒介されるものを包含する、Ｈｕｎｄら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、５６：４３１−４３５（２００１）により記述されるところのパーキンソン病または遺伝性若しくは全身性アミロイドーシスのようなアミロイド形成タンパク質の不要な沈着を特徴とする疾患もまたとりわけ包含する。該用語はびまん性レビー小体病もまた包含する。さらに、該用語は、クロイツフェルト・ヤコブ病のようなプリオンへの感染により全部若しくは部分的に引き起こされる疾患を包含する。こうしたプリオン媒介性疾患は、Ｇｉｅｓｅら、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２５３：２０３−２１７（２００１）により記述されるところのプリオンタンパク質の蓄積を特徴とする。約言すれば、該用語は、周囲の細胞の健康および満足のいく状態に悪影響を及ぼす不要なタンパク質若しくはペプチド沈着物により病状が媒介される全疾患を包含することを意味している。
【００４９】
「抗原」は抗体が特異的に結合する実体である。
【００５０】
「エピトープ」若しくは「抗原決定基」という用語は、Ｂおよび／若しくはＴ細胞が応答する抗原上の１部位を指す。Ｂ細胞エピトープは、連続するアミノ酸、若しくはタンパク質の三次フォールディングにより並置される連続しないアミノ酸の双方から形成され得る。連続するアミノ酸から形成されるエピトープは変性溶媒への曝露に際して典型的に保持される一方、三次フォールディングにより形成されるエピトープは変性溶媒での処理に際して典型的に喪失される。エピトープは、典型的に、独特の空間的コンホメーション中に最低３、およびより通常は最低５若しくは８〜１０アミノ酸を包含する。エピトープの空間的コンホメーションの決定方法は、例えばｘ線結晶学および二次元核磁気共鳴を包含する。例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．
６６、Ｇｌｅｎｎ Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ編（１９９６）中Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓを参照されたい。同一の若しくは重なるエピトープを認識する抗体は、標的抗原への別の抗体の結合を阻止する１抗体の能力を示す単純なイムノアッセイで同定し得る。
【００５１】
「裸のポリヌクレオチド」若しくは「裸のＤＮＡ」という用語は、コロイド状物質例えばタンパク質と複合体形成されていないポリヌクレオチドを指す。裸のポリヌクレオチドはときにプラスミドベクターにクローン化される。
【００５２】
「患者」という用語は予防的若しくは治療的処置のいずれかを受領するヒトおよび他の哺乳動物被験体を包含する。
【００５３】
「予防する」、「予防すること」および「予防」という用語は、疾患若しくは状態の最低１症状（例えば長期増強の抑制および／若しくは神経変性）を究極的に明示しうるがしかし未だそうしていない個体への予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）若しくは予防的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）な治療の投与を指す。こうした個体は、該疾患のその後の発生と相関することが既知である危険因子に基づき同定しうる。あるいは、予防治療は予防対策として危険因子の事前の同定を伴わず投与しうる。疾患若しくは状態の最低１症状の発生を遅らせることもまた予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）若しくは予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）とみなしうる。
【００５４】
本明細書で使用されるところの「処置する」、「処置すること」若しくは「処置」という用語は、疾患若しくは状態の最低１症状（例えば長期増強の抑制および／若しくは神経変性）を既に明示している個体への治療の投与を指す。
【００５５】
剤および第二の剤の「共投与」は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ系、若しくは患者でのようなｉｎ
ｖｉｖｏで時間が重なる剤および第二の剤の治療濃度を達成するためのいかなる投薬計画による投与も包含する。従って、例えば、共投与は、剤および第二の剤双方を含んでなる製剤の投与、ならびに一方が該剤を含んでなりかつ別のものが第二の剤を含んでなる別個の製剤の投与を包含する。別個の製剤を投与する場合、投与は同時であっても連続してもよい。連続する場合、該剤は次々に投与しうるか、あるいは、該剤の投与と第二の剤の投与の間の時間は、例えば１時間まで、２時間まで、４時間まで、６時間まで、１２時間まで、または１日若しくは数日まででありうる。
【００５６】
神経細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで起こるＡＰＰのＡβへの天然のプロセシングの結果として、若しくは、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイでのＡβの調製物と神経細胞の接触の結果として、Ａβペプチドに曝露し得る。Ａβペプチドへの曝露は薬物への曝露前、後若しくはそれと同時に発生し得る。
【００５７】
Ａβペプチドのアミロイド沈着物は、図１Ａに示されるようなｉｎ ｖｉｔｒｏ若しくはｉｎ ｖｉｖｏで皮質細胞上および周囲に生じる原線維をおそらく包含するＡβペプチドの凝集物を指す。
【００５８】
文脈から別の方法で明らかでない限り、フィブロネクチンへの言及はスーパーフィブロネクチンを包含する。
【００５９】
抗体間の競合は、試験中の免疫グロブリンが共通抗原への参照抗体の特異的結合を阻害するアッセイにより測定する。多数の型の競合結合アッセイ、例えば固相直接若しくは間接ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、固相直接若しくは間接エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ（Ｓｔａｈｌｉら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ、９：２４２−５３（１９８３）を参照されたい）；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（Ｋｉｒｋｌａｎｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３７：３６１４−１９（１９８６）を参照されたい）；固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイ（ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ、”Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８８）を参照されたい）；Ｉ−１２５標識を使用する固相直接標識ＲＩＡ（Ｍｏｒｅｌら、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２５（１）：７−１５（１９８８）を参照されたい）；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（Ｃｈｅｕｎｇら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１７６：５４６−５２（１９９０））；および直接標識ＲＩＡ（Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒら、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３２：７７−８２（１９９０））が既知である。典型的に、こうしたアッセイは、未標識の試験免疫グロブリン若しくは標識参照免疫グロブリンいずれかを持つ固体表面若しくは細胞に結合した精製抗原の使用を必要とする。競合阻害は、試験免疫グロブリンの存在下で固体表面若しくは細胞に結合される標識の量を測定することにより測定する。通常、試験免疫グロブリンは過剰に存在する。競合アッセイにより同定される抗体（競合抗体）は、参照抗体と同一エピトープに結合する抗体、および参照抗体により結合されるエピトープの十分に近位の隣接するエピトープに結合して立体障害を起こす抗体を包含する。通常、競合抗体が過剰に存在する場合、それは参照抗体の共通抗原への特異的結合を最低５０若しくは７５％阻害することができる。
【００６０】
１種若しくはそれ以上の列挙される要素を「含んでなる」組成物若しくは方法は、具体的に列挙されない他の要素を包含しうる。例えば、抗体を含んでなる組成物は、単独若しくは他の成分と組合せの該抗体を含有しうる。
【００６１】
Ｉ．方法
本発明は、アミリンおよびＡβペプチドのようなアミロイドタンパク質の細胞外網目構造の形成の阻害若しくは予防方法、こうしたタンパク質の毒性効果の媒介方法、ならびに該方法での使用のための剤を提供する。該方法は、アルツハイマー病、ＩＩ型糖尿病、パーキンソン病、びまん性レビー小体病、全身性および遺伝性アミロイドーシス、ならびにプリオン感染により全部若しくは部分的に引き起こされる疾患を処置若しくは予防するのに使用し得る。これらの方法での使用に有効な剤は、β１、α２、α６若しくはαｖのようなインテグリンサブユニットに結合する抗体および他の剤を包含する。これらのサブユニットはヘテロ二量体受容体として会合してインテグリン、例えばα２β１、α６β１およびαｖβ１を形成する。上の剤は、インテグリンとＡβペプチドの間の相互作用を阻害するために個別で若しくは組合せで使用し得る。αｖβ１およびα２β１双方のインテグリンとＡβの間の相互作用を阻害する剤（１種若しくは複数）の使用が好ましい。フィブロネクチン（インテグリンαｖβ１のリガンド）もまた、上の方法でラミニン（αｖβ１のリガンド）に対する抗体がし得るように剤として使用し得る。本発明は、部分的に、α２、αｖ、α６およびβ１インテグリンサブユニットに対する抗体がアミリンおよびＡβペプチドのようなアミロイドタンパク質の細胞外網目構造の形成を阻害するという観察結果を前提とする。それにより、こうした抗体はアミロイドタンパク質の毒性を阻害する。αｖβ１リガンド、フィブロネクチンもまた網目構造形成を阻害する。α２β１リガンド、ラミニンは網目構造形成を阻害しないが、しかしラミニンに対する抗体は網目構造形成および毒性を阻害する。
【００６２】
本発明は、部分的に、αｖインテグリンサブユニットに対する選択的抗体がｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ双方でＡβによるＬＴＰの阻害を抑制するという観察結果を前提とする。αｖ含有インテグリンの小分子非ペプチド拮抗剤、ならびにインテグリンの２種の他の拮抗的リガンド、スーパーフィブロネクチンおよびディスインテグリン、エキスタチンもまたＬＴＰのＡβ阻害を抑制する。従って、αｖインテグリンサブユニットに結合する剤はＬＴＰのＡβ阻害を抑制し、ならびに、アミリンおよびＡβペプチドのよう
なアミロイドタンパク質の細胞外網目構造の形成を阻害若しくは予防する。
【００６３】
従って、本発明は、長期増強（ＬＴＰ）のアミロイド媒介性阻害を抑制するのに有効な量のαｖ拮抗剤若しくはαｖ媒介性細胞接着の阻害剤を投与することを含んでなる、長期増強（ＬＴＰ）のアミロイド媒介性阻害の抑制方法、およびＡβ沈着を特徴とするアミロイド形成疾患の処置若しくは予防方法、ならびに、Ａβの沈着を特徴とするアミロイド形成疾患の処置方法もまた提供する。該方法は、限定されるものでないがアルツハイマー病、ＩＩ型糖尿病、パーキンソン病、びまん性レビー小体病、全身性および遺伝性アミロイドーシスを挙げることができる疾患若しくは状態、ならびにプリオン感染により全部若しくは部分的に引き起こされる疾患を処置若しくは予防するのに有用である。これらの方法での使用に有効な剤は、限定されるものでないが、抗体、および例えばインテグリンサブユニットαｖに結合するＳＭ２５６のような他の剤を挙げることができる。上の剤は、インテグリンとＡβペプチドの間の相互作用を阻害するのに個別で若しくは組合せで使用し得る。
【００６４】
ＩＩ．インテグリン
インテグリンは、細胞外マトリックスおよび他細胞の双方への細胞の接着を制御する、細胞表面接着ヘテロ二量体膜貫通受容体のスーパーファミリーである。接着は成長、移動および分化のための固定およびシグナルを提供する。インテグリンは、約１５種の既知のα鎖の１種の約８種の既知のβ鎖の１種との会合により形成される。赤血球を除く全部のヒト細胞が１種若しくはそれ以上のインテグリンを発現する。
【００６５】
インテグリンサブユニットα２、αｖ、α６およびβ１は全部公知である。例示的ヒト配列はそれぞれＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０６２０３９、Ｍ１４６４８、Ｘ５９５１２およびＸ０７９７９から取出し可能である。別の方法で示されない限り、α２、αｖ、α６、β１への言及は、これらの例示的配列、それらのアレルバリアントおよび他の種からの同族バリアントを包含する。天然の配列のリガンドへの特異的結合について天然の配列と競合するのに十分な天然の配列に対する配列同一性を有するこれらの配列の誘導されるバリアントもまた、いくつかの方法で使用し得る。αｖ、およびβサブユニットβ１、β３、β５、β６若しくはβ８の１種を含有するインテグリンはＲＧＤモチーフを持つリガンドを認識するが、しかし結合特異性はどのβサブユニットが存在するかに依存して変動する。αｖβ１は、ビトロネクチン（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ０３１６８）、フィブロネクチン（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ２６１７９）およびオステオポンチン（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｊ０４７６５）を認識することが既知である。フィブロネクチンは、結合組織中、細胞表面上、ならびに血漿および他の体液中で見出される大型多ドメイン糖タンパク質である。フィブロネクチンは、細胞骨格および細胞外マトリックスの成分、血液凝固応答、線維素溶解の急性期および補体系に関与する循環成分を包含する多様な巨大分子、ならびに線維芽細胞、ニューロン、食細胞および細菌を包含する多様な細胞上の細胞表面受容体と作用する。
【００６６】
α２およびβ１サブユニットを含有するインテグリンは、ＶＬＡ−２（最晩期抗原（ｖｅｒｙ ｌａｔｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ）２）、ＧＰＩａ−ＩＩａ（血小板上糖タンパク質Ｉａ−ＩＩａ）およびＥＣＭＲＩＩ（細胞外マトリックス受容体ＩＩ）として知られる。α２β１インテグリンはコラーゲンＩないしＶＩ、ラミニンおよびおそらくフィブロネクチンを結合する。該受容体は、ＢおよびＴリンパ球、血小板、線維芽細胞、内皮細胞ならびに黒色腫細胞上で発現され、そしてコラーゲンおよびラミニンをリガンドとして特異的に認識する。ラミニンは共通の構造的構成をもつ大型多ドメインタンパク質である。ラミニン分子は、コイルドコイルドメインにより一緒に結合されたα、βおよびγ鎖サブユニットを有する。最低５種のα鎖、２種のβ鎖および３種のγ鎖が既知であり、そしてこれらの鎖の異なる組合せを有する最低１２種のラミニンが報告されて
いる（第ＷＯ ００／６６７３０号明細書）。ラミニンはアルツハイマー病において斑を包含する細胞外マトリックス中で見出される（Ｍｕｒｔｏｍａｋｉら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏ．Ｒｅｓ．、３２：２６１−７３（１９９２）；Ｂｒｏｎｆｉｎａｎら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、５：１６−２３（１９９７）；およびＣａｓｔｉｌｌｏら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏ．Ｒｅｓ．、６２：４５１−６２（２０００））。コラーゲンは哺乳動物で最も豊富なタンパク質であり、そして皮膚、骨、腱、軟骨および歯の主要線維成分である。２３種以上の既知のコラーゲン遺伝子が存在する（Ａｄａｍｓら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．、１：１６１−１６８（１９８９））。
【００６７】
α６／β１インテグリンは、血小板、リンパ球、単球、胸腺細胞および内皮細胞上で発現され、それら上でそれはｉｎ ｖｉｖｏでラミニン−１、ラミニン−２およびラミニン−４のラミニン受容体として機能する。それはまたラミニン−５の受容体でもあるが、しかしｉｎ ｖｉｖｏででない。ラミニン−１について、結合部位はこの細胞外マトリックス分子のＥ８ドメイン中に突き止められている。この受容体は最晩期抗原６（ＶＬＡ−６）および糖タンパク質Ｉｃ−ＩＩａ（血小板上ＧＰＩｃ−ＩＩａ）としてもまた知られている。
【００６８】
インテグリンは、セレクチンおよび免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーメンバーもまた包含する接着タンパク質として知られるタンパク質の大きな一分類の一例である（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ、３４６：４２５（１９９０）；Ｏｓｂｏｒｎ、Ｃｅｌｌ、６２：３（１９９０）；Ｈｙｎｅｓ、Ｃｅｌｌ、６９：１１（１９９２）（全部の目的上そっくりそのまま引用することにより組み込まれる）を参照されたい）。抗体、および接着タンパク質若しくはそれらのリガンドに結合しかつ／または該２者間の相互作用を阻止する他の剤を、下述されるスクリーニング方法でＡβ沈着物の蓄積の予防若しくは阻害における活性についてスクリーニングし得る。下述される方法によるスクリーニングに適する他のセレクチンおよびそれらのリガンドの例は、インテグリンα２β５、αｖβ５、α６β５、α２β６、αｖβ６およびα６β６を包含する。コラーゲンに結合するα２β１を除く他のリガンドもまたスクリーニングしうる。
【００６９】
ＩＩＩ．剤
本発明の治療薬は、α２、αｖ、α６およびβ１インテグリンサブユニットに特異的に結合する抗体を包含する。結合は、場合によっては固相に固定された単離されたインテグリンサブユニット若しくはそれらのフラグメント、または細胞の表面上で発現されたインテグリンサブユニットのいずれを用いても評価し得る。しばしば、結合はヘテロ二量体インテグリンを発現する細胞を使用して分析される。例えば、ある剤が唯一のインテグリンとしてα２β１を発現する細胞に結合する場合には、該剤がα２若しくはβ１またはいずれのサブユニット単独にも結合することなくα２β１に結合すると結論付け得る。これらの可能性は、異なるヘテロ二量体インテグリンを持つ細胞への同一の剤の結合を試験することにより識別し得る。例えば、同一の剤が、存在する唯一のインテグリンとしてαｖβ１を持つ細胞に特異的に結合する場合には、該剤がβ１サブユニットに結合していることがありそうである。インテグリンおよびインテグリンサブユニットに対する多様な抗体が商業的に入手可能であり、それらのいくつかを実施例に記述する。
【００７０】
モノクローナル若しくはポリクローナル抗体を本発明の方法で使用し得る。好ましい抗体は、それらの天然のリガンドの１種若しくはそれ以上とのこれらのインテグリンサブユニットの相互作用を阻止する。すなわち、αｖβ１に対する阻止抗体は、フィブロネクチン、オステオポンチンおよび／若しくはビトロネクチンとのこのインテグリンの相互作用を阻止する。例えば、第ＷＯ ９９／３７６８３号明細書により記述される１４Ｄ９．Ｆ８抗体はαｖのフィブロネクチンへの結合を阻止する。α２β１に対する阻止抗体はこのインテグリンのコラーゲン若しくはラミニンとの相互作用を阻止する。抗体若しくは他の
剤の阻止する能力は、抗体（若しくは他の剤）の存在若しくは非存在下で、リガンドで被覆したプレートへの接着についてインテグリンを発現する細胞を試験する単純なアッセイにより認識し得る。プレートへの細胞結合の量の最低約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％若しくは１００％の減少は、該抗体がインテグリンに関してモル濃度過剰で存在する場合に阻止抗体（若しくは他の剤）を同定する。インテグリンサブユニットの他の組合せに対する剤の阻止能力のさらなる分析は、ヘテロ二量体インテグリンのどのサブユニットが阻止されているかを特定し得る。抗体若しくは他の剤の結合特異性もまた、インテグリンサブユニット若しくはそれを持つ細胞への結合について所望のエピトープ特異性を有することが既知の参照抗体と試験抗体が競合する競合アッセイにより決定し得る。試験および参照抗体が競合する場合には、それらは、一方の抗体の結合が他方の結合を妨害する十分に近位の同一のエピトープ（１個若しくは複数）に結合する。いくつかの態様において、トランスフェクトした細胞は単一の型のインテグリンを発現する。
【００７１】
本発明での使用のための数種の抗体はただ１つの型のインテグリンサブユニットに結合する。数種の抗体は２種若しくはそれ以上のインテグリンサブユニットに特異的に結合する。数種の抗体は、インテグリンのサブユニットがヘテロ二量体インテグリンとして会合している場合にのみ結合する。例えば、数種の抗体はα２若しくはβ１いずれか単独に結合することなくα２β１に結合する。数種の抗体はαｖ若しくはβ１いずれか単独に結合することなくαｖβ１に結合する。数種の抗体はαｖインテグリンサブユニットに結合する。数種の抗体は、遊離の形態で、および該サブユニットがヘテロ二量体インテグリンの一成分である場合の双方でサブユニットに結合する。上の抗体の同一の結合特異性を有するペプチドおよび小分子もまた使用し得る。
【００７２】
本発明での使用のための他の治療薬は、フィブリノーゲン、オステオポンチン、ビトロネクチン、それらのフラグメント、およびαｖβ１への結合についてフィブリノーゲン若しくはビトロネクチンと競合するＲＧＤペプチドモチーフを含有する他の天然の若しくは合成ペプチドを包含する。αｖβ１への結合についてフィブリノーゲン、ビトロネクチン若しくはオステオポンチンと競合する小分子模倣物もまた使用し得る。他の治療薬は、ラミニンに対する抗体、ならびに同一の結合特異性をもつペプチドおよび小分子を包含する。
【００７３】
候補治療薬は以下のスクリーニングの１種若しくはそれ以上を実施することにより評価し得る。典型的には、インテグリンサブユニットα２、αｖ、α６若しくはβ１、および／またはヘテロ二量体インテグリンα２β１、αｖβ１ α６β１、あるいはラミニンへの特異的結合について剤を最初に評価する。適する剤は、典型的に最低１０７、１０８、１０９若しくは１０１０Ｍ−１の特異的親和性で結合する。
【００７４】
その後、候補は場合によっては特定のエピトープ特異性について評価する。これは、参照剤を用いる競合アッセイ、上述されたところの機能的プレートブロッキングアッセイ、または、抗原の一連の欠失変異体を結合するその能力についウエスタンブロッティング若しくはＥＬＩＳＡにより抗体若しくは他の剤を評価するエピトープマッピング実験により決定し得る。抗体若しくは他の剤への特異的結合を示すための最小フラグメントが該抗体若しくは他の剤のエピトープを規定する。あるいは、若しくは加えて、候補剤をアミロイドペプチドの細胞外網目構造の形成を阻害する能力について評価する。適する剤は、典型的に、剤の存在下でアミリン若しくはＡβのようなアミロイドペプチドでの処理から生じる毒性を対照に関して最低約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％若しくは１００％またはそれ以上低下させる。
【００７５】
候補化合物は、アミロイド形成疾患になりやすいトランスジェニック動物で予防的およ
び治療的有効性についてもまた試験し得る。こうした動物は、例えば、Ｇａｍｅｓら、上記により記述されるＡＰＰの７１７突然変異を持つマウス、ならびにＭｃＣｏｎｌｏｇｕｅら、米国特許第ＵＳ ５，６１２，４８６号明細書；Ｈｓｉａｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７４：９９（１９９６）；Ｓｔｕｒｃｈｌｅｒ−Ｐｌｅｒｒａｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９４：１３２８７−９２（１９９７）；およびＢｏｒｃｈｅｌｔら、Ｎｅｕｒｏｎ、１９：９３９−４５（１９９７）により記述されるようなＡＰＰの６７０／６７１スウェーデン型突然変異を持つマウスを包含する。トランスジェニックマウスで活性を示す剤をその後ヒト臨床試験で評価し得る。アルツハイマー病患者でヒト臨床試験を実施するための例示的形式が第ＷＯ ９８／２４６７８号明細書（引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述されている。
【００７６】
長期増強（ＬＴＰ）のアミロイド媒介性阻害の抑制方法での使用のための候補化合物の場合、該化合物をＬＴＰのｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／若しくはｉｎ ｖｉｖｏモデルで試験しうる。例えば、候補化合物をｉｎ ｖｉｔｒｏモデルで最初に試験することができ、そしてその後、該化合物がそのモデルで長期増強（ＬＴＰ）のアミロイド媒介性阻害を抑制する場合は、ｉｎ ｖｉｖｏモデルでその後試験しうる。
【００７７】
Ａ．抗体
１．免疫グロブリンの一般的特徴
基本的抗体構造ユニットはサブユニットの四量体を含んでなることが知られている。各四量体はポリペプチド鎖の２個の同一の対から構成され、各対は１本の「Ｌ」（約２５ｋＤａ）および１本の「Ｈ」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は主に抗原認識を司る約１００ないし１１０若しくはそれ以上のアミノ酸の可変領域を包含する。各鎖のカルボキシ末端部分は主にエフェクター機能を司る定常領域を規定する。
【００７８】
Ｌ鎖はκ若しくはλいずれかに分類される。Ｈ鎖はγ、μ、α、δ若しくはεに分類され、そしてそれぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥのような抗体のアイソタイプを規定する。ＬおよびＨ鎖内で、可変および定常領域は約１２若しくはそれ以上のアミノ酸の「Ｊ」領域により結合され、Ｈ鎖は約１０より多いアミノ酸の「Ｄ」領域もまた包含する。（全般として、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｐａｕｌ，Ｗ．編、第２版、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９８９）、第７章（全部の目的上そっくりそのまま引用することにより組み込まれる）を参照されたい）。
【００７９】
各Ｌ／Ｈ鎖対の可変領域は抗体の結合部位を形成する。従って無傷の抗体は２個の結合部位を有する。二機能性若しくは二特異性抗体でを除き該２結合部位は同一である。該鎖は全部、相補性決定領域若しくはＣＤＲともまた呼ばれる３個の超可変領域により結合される比較的保存された枠組み領域（ＦＲ）の同一の一般的構造を表す。各対の２本の鎖からのＣＤＲは枠組み領域により整列されて、特異的エピトープへの結合を可能にする。Ｎ末端からＣ末端へ、ＬおよびＨ鎖双方はドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含んでなる。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、Ｋａｂａｔ、Ｓｅｑｅｕｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（国立保健研究所、メリーランド州ベセスダ、１９８７および１９９１）、若しくはＣｈｏｔｈｉａとＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６：９０１−１７（１９８７）；Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｎａｔｕｒｅ、３４２：８７８−８３（１９８９）の定義に従う。
【００８０】
２．ヒト以外の抗体の製造
ヒト以外のモノクローナル抗体（例えばマウス、モルモット、霊長類、ウサギ若しくはラット）の製造は、例えば、インテグリン、そのサブユニット若しくはそれらのフラグメント、またはインテグリン若しくはそのサブユニットを持つ細胞で動物を免疫することに
より達成し得る。ラミニンに対する抗体を生成するための免疫原としてラミニンもまた使用し得る。ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９８８（全部の目的上引用することにより本明細書に組み込まれる））を参照されたい。こうした免疫原は、天然の供給源から、ペプチド合成により、若しくは組換え発現により得ることができる。場合によっては、免疫原は下述されるところの担体タンパク質と融合若しくは別の方法で複合体形成して投与し得る。場合によっては、免疫原はアジュバントとともに投与し得る。いくつかの型のアジュバントを下述されるとおり使用し得る。フロイントの完全アジュバント、次いで不完全アジュバントが実験動物の免疫化に好ましい。ウサギ、ヤギ、ヒツジ若しくはモルモットを、ポリクローナル抗体を作成するのに典型的に使用する。マウスはモノクローナル抗体を作成するのに典型的に使用する。抗体を、意図しているインテグリン若しくはそのサブユニット、またはラミニンのような他の抗原への特異的結合についてスクリーニングする。抗体は上述されたところのそのリガンドへのインテグリンの結合を阻止する能力についてもまたスクリーニングし得る。上述された他のスクリーニング手順もまた実施し得る。
【００８１】
３．キメラおよびヒト化抗体
キメラおよびヒト化抗体は、キメラ若しくはヒト化抗体の構築のための出発原料を提供するマウス若しくは他のヒト以外の抗体と同一の若しくは類似の結合特異性および親和性を有しうる。数種のキメラ若しくはヒト化抗体はマウスのものの２倍、５倍若しくは１０倍の係数内の親和性を有する。キメラ抗体は、そのＬおよびＨ鎖遺伝子が、異なる種に属する免疫グロブリン遺伝子セグメントから典型的には遺伝子工学により構築された抗体である。例えば、マウスモノクローナル抗体からの遺伝子の可変（Ｖ）セグメントをＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３若しくはＩｇＧ４のようなヒト定常（Ｃ）セグメントに結合しうる。典型的なキメラ抗体は、従って、マウス抗体からのＶすなわち抗原結合ドメインおよびヒト抗体からのＣすなわちエフェクタードメインよりなるハイブリッドタンパク質である。
【００８２】
ヒト化抗体は、実質的にヒト抗体（アクセプター抗体と命名される）からの可変領域枠組み残基、および実質的にマウス抗体のようなヒト以外の抗体（ドナー免疫グロブリンと称される）からの相補性決定領域を有する。Ｑｕｅｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８６：１００２９−３３（１９８９）および第ＷＯ ９０／０７８６１号、米国特許第ＵＳ ５，６９３，７６２号、同第ＵＳ ５，６９３，７６１号、同第ＵＳ ５，５８５，０８９号、同第ＵＳ ５，５３０，１０１号、およびＷｉｎｔｅｒ、米国特許第ＵＳ ５，２２５，５３９号明細書（それらのそれぞれは全部の目的上そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）を参照されたい。定常領域（存在する場合）もまた実質的に若しくは完全にヒト免疫グロブリンからである。ヒト可変ドメインは通常、ＣＤＲが由来したマウス可変領域ドメインとの高程度の配列同一性をその枠組み配列が表すヒト抗体から選ばれる。ＨおよびＬ鎖可変領域枠組み残基は同一若しくは異なるヒト抗体配列に由来し得る。ヒト抗体配列は天然に存在するヒト抗体の配列であり得るか、若しくは数種のヒト抗体のコンセンサス配列であり得る。Ｃａｒｔｅｒら、第ＷＯ ９２／２２６５３号明細書を参照されたい。ヒト可変領域枠組み残基からのあるアミノ酸を、ＣＤＲコンホメーションおよび／若しくは抗原への結合に対するそれらの可能な影響に基づき置換のため選択する。こうした可能な影響の検討は、モデル化、特定の場所のアミノ酸の特徴の検査、または特定のアミノ酸の置換若しくは突然変異誘発の影響の経験的観察による。
【００８３】
例えば、あるアミノ酸がマウス可変領域枠組み残基と選択したヒト可変領域枠組み残基の間で異なる場合、該ヒト枠組みアミノ酸は通常、該アミノ酸が：
（１）抗原を直接非共有結合する、
（２）ＣＤＲ領域に隣接する、
（３）ＣＤＲ領域と別の方法で相互作用する（例えばＣＤＲ領域の約６Å以内にある）、若しくは
（４）ＶＬ−ＶＨ界面に参画する
ことが合理的に期待される場合は、マウス抗体からの同等の枠組みアミノ酸により置換すべきである。
【００８４】
置換の他の候補は、その位置でヒト免疫グロブリンにとって異常であるアクセプターヒト枠組みアミノ酸である。これらのアミノ酸を、ドナー抗体の同等の位置若しくはより典型的なヒト免疫グロブリンの同等の位置からのアミノ酸で置換し得る。ヒト化免疫グロブリンの可変領域枠組みは通常、ヒト可変領域枠組み配列若しくはこうした配列のコンセンサスに対し最低８５％の配列同一性を示す。
【００８５】
４．ヒト抗体
上のインテグリン若しくはラミニンに対するヒト抗体は下述される多様な技術により提供される。数種のヒト抗体は、競合結合実験により、若しくは、そうでなければ、実施例に記述されるマウスモノクローナル抗体の１種のような特定の１マウス抗体と同一のエピトープ特異性を有するように選択する。ヒト抗体は、免疫原としてインテグリン若しくはラミニンの１フラグメントのみを使用することにより、および／またはインテグリンの欠失変異体の集合物に対し抗体をスクリーニングすることにより、特定の１エピトープ特異性についてもまたスクリーニングし得る。
【００８６】
ａ．トリオーマの方法論
基本的アプローチ、および本アプローチでの使用のための例示的１細胞融合パートナーＳＰＡＺ−４が、Ｏｅｓｔｂｅｒｇら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、２：３６１−６７（１９８３）；Ｏｅｓｔｂｅｒｇ、米国特許第４，６３４，６６４号明細書；およびＥｎｇｌｅｍａｎら、米国特許第４，６３４，６６６号明細書（それらのそれぞれは全部の目的上そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）により記述されている。この方法により得られる抗体産生細胞株は、それらが３種の細胞（２種のヒトおよび１種のマウス）を祖先とするためトリオーマと呼ばれる。最初に、マウス骨髄腫株をヒトＢリンパ球と融合して、Ｏｅｓｔｂｅｒｇ、上記により記述されるＳＰＡＺ−４細胞株のような抗体を産生しない異種ハイブリッド細胞を得る。該異種細胞をその後、免疫ヒトＢリンパ球と融合して抗体産生トリオーマ細胞株を得る。トリオーマはヒト細胞から作成される通常のハイブリドーマより安定に抗体を産生することが見出されている。
【００８７】
免疫Ｂリンパ球はヒトドナーの血液、脾、リンパ節若しくは骨髄から得る。特定の１抗原若しくはエピトープに対する抗体が望ましい場合は、免疫化にその抗原若しくはその１エピトープを使用することが好ましい。免疫化はｉｎ ｖｉｖｏ若しくはｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれでもあり得る。ｉｎ ｖｉｖｏ免疫化のため、Ｂ細胞を、典型的に、Ａβ、そのフラグメント、Ａβ若しくはフラグメントを含有するより大きいペプチド、またはＡに対する抗体に対する抗イディオタイプ抗体で免疫したヒトから単離する。いくつかの方法において、Ｂ細胞は抗体療法を最終的に投与されるはずである同一患者から単離する。ｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫化のためには、Ｂリンパ球は、典型的に、１０％ヒト血漿を補充したＲＰＭＩ−１６４０（Ｅｎｇｌｅｍａｎ、上記を参照されたい）のような培地中で７〜１４日間抗原に曝露する。
【００８８】
免疫Ｂリンパ球を公知の方法によりＳＰＡＺ−４のような異種ハイブリッド細胞に融合する。例えば、細胞をＭＷ１０００〜４０００の４０〜５０％ポリエチレングリコールで約３７℃で約５〜１０分間処理する。細胞を融合混合物から分離し、そして所望のハイブリッドについて選択的な培地（例えばヒポキサンチン＋アメトプテリン＋チミジン（ＨＡ
Ｔ培地）若しくはアメトプテリン＋ヒポキサンチン（ＡＨ培地）を含有する）中で増殖させる。必要とされる結合特異性を有する抗体を分泌するクローンは、Ａβ若しくはそのフラグメントに結合する能力についてトリオーマ培地をアッセイすることにより同定する。所望の特異性を有するヒト抗体を産生するトリオーマを限界希釈技術によりサブクローニングし、そして培地中ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させる。得られるトリオーマ細胞株をその後Ａβ若しくはそのフラグメントを結合する能力について試験する。
【００８９】
トリオーマは遺伝子的に安定であるとは言え、それらは非常に高レベルで抗体を産生しない。発現レベルは、抗体遺伝子をトリオーマから１種若しくはそれ以上の発現ベクターにクローン化すること、および該ベクターを標準的哺乳動物、細菌若しくは酵母細胞株に形質転換することにより増大させ得る。
【００９０】
ｂ．トランスジェニックのヒト以外の哺乳動物
インテグリン若しくはラミニンに対するヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の最低１セグメントをコードする導入遺伝子を有するヒト以外のトランスジェニック哺乳動物からもまた製造し得る。通常、こうしたトランスジェニック哺乳動物の内因性免疫グロブリン遺伝子座は機能的に不活性化されている。好ましくは、ヒト免疫グロブリン遺伝子座のセグメントは、ＨおよびＬ鎖コンポーネントの再配列されない配列を包含する。内因性免疫グロブリン遺伝子の不活性化および外因性免疫グロブリン遺伝子の導入の双方を、標的を定めた相同的組換え、若しくは酵母人工染色体（ＹＡＣ）の導入により達成し得る。この方法から生じるトランスジェニック哺乳動物は、免疫グロブリンコンポーネントの配列を機能的に再配列すること、および内因性免疫グロブリン遺伝子を発現することなくヒト免疫グロブリン遺伝子によりコードされる多様なアイソタイプの抗体のレパートリーを発現することが可能である。これらの特性を有する哺乳動物の製造および特性は、例えばＬｏｎｂｅｒｇら、第Ｗ０９３／１２２２７号（１９９３）；第ＵＳ ５，８７７，３９７号、同第ＵＳ ５，８７４，２９９号、同第ＵＳ ５，８１４，３１８号、同第ＵＳ５，７８９，６５０号、同第ＵＳ ５，７７０，４２９号、同第ＵＳ ５，６６１，０１６号、同第ＵＳ ５，６３３，４２５号、同第ＵＳ ５，６２５，１２６号、同第ＵＳ ５，５６９，８２５号、同第ＵＳ ５，５４５，８０６号明細書、Ｎａｔｕｒｅ １４８、１５４７−５３（１９９４）、Ｆｉｓｈｗｉｌｄら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４、８４５−５１（１９９６）、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ、第ＷＯ ９１／１０７４１号明細書（１９９１）（それらのそれぞれは全部の目的上そっくりそのまま引用することにより組み込まれる）により詳細に記述されている。トランスジェニックマウスはとりわけ適する。抗インテグリン若しくは抗ラミニン抗体は、Ｌｏｎｂｅｒｇ若しくはＫｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ、上記により記述されたようなトランスジェニックのヒト以外の哺乳動物をインテグリンまたはそのサブユニット若しくはフラグメントで免疫することにより得られる。モノクローナル抗体は、例えば、慣習的なＫｏｈｌｅｒ−Ｍｉｌｓｔｅｉｎの技術を使用してこうした哺乳動物からのＢ細胞を適する骨髄腫細胞株に融合することにより製造する。ヒトポリクローナル抗体は、免疫原性剤で免疫したヒトからの血清の形態でもまた提供し得る。場合によっては、こうしたポリクローナル抗体は、インテグリン若しくはラミニンをアフィニティー試薬として使用するアフィニティー精製により濃縮し得る。
【００９１】
ｃ．ファージディスプレイ法
ヒト抗インテグリン若しくは抗ラミニン抗体を得るためのさらなる１アプローチは、Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６：１２７５−８１（１９８９）により概説される一般的プロトコルに従ってヒトＢ細胞からのＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることである。トリオーマの方法論について記述されたとおり、こうしたＢ細胞は、インテグリン、サブユニット若しくはそれらのフラグメント、またはラミニンおよびそのフラグメントで免疫したヒトから得ることができる。場合によっては、こうしたＢ細胞は抗体処置を最
終的に受領するはずである患者から得る。目的の抗原若しくはそのフラグメントに結合する抗体を選択する。こうした抗体（若しくは結合フラグメント）をコードする配列をその後クローン化しかつ増幅する。Ｈｕｓｅにより記述されるプロトコルはファージディスプレイ技術と組合せでより効率的にされる。例えば、Ｄｏｗｅｒら、第ＷＯ ９１／１７２７１号、およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、同第ＷＯ ９２／０１０４７号、米国特許第ＵＳ ５，８７７，２１８号、同第ＵＳ ５，８７１，９０７号、同第ＵＳ ５，８５８，６５７号、同第ＵＳ ５，８３７，２４２号、同第ＵＳ ５，７３３，７４３号、同第ＵＳ ５，５６５，３３２号、同第ＵＳ ５，９６９，１０８号、同第ＵＳ ６，１７２，１９７号明細書（それらのそれぞれは全部の目的上そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）を参照されたい。抗体、若しくは特定の１リガンドに結合する他のタンパク質の付加的な選択および標識方法は、第ＵＳ ５，９９４，５１９号および同第ＵＳ ６，１８０，３３６号明細書により記述されている。
【００９２】
ファージディスプレイ法において、メンバーがそれらの外表面に多様な抗体を表示するファージのライブラリーを製造する。抗体は通常Ｆｖ若しくはＦａｂフラグメントとして表示される。所望の特異性をもつ抗体を表示するファージを、インテグリン、サブユニット若しくはそれらのフラグメントに対するアフィニティー濃縮により選択する。
【００９３】
ファージディスプレイ法の１変形において、選択したマウス抗体の結合特異性を有するヒト抗体を製造し得る。Ｗｉｎｔｅｒ、第ＷＯ ９２／２０７９１号明細書を参照されたい。この方法では、選択したマウス抗体のＨ若しくはＬ鎖可変領域のいずれかを出発原料として使用する。例えばＬ鎖可変領域を出発原料として選択する場合、メンバーが同一Ｌ鎖の可変領域（すなわちマウス出発原料）および異なるＨ鎖可変領域を表示するファージライブラリーが構築される。Ｈ鎖可変領域は再配列されたヒトＨ鎖可変領域のライブラリーから得る。Ａβに対する強い特異的結合（例えば最低約１０８若しくは最低約１０９Ｍ−１）を示すファージを選択する。このファージからのヒトＨ鎖可変領域がその後、さらなるファージライブラリーを構築するための出発原料としてはたらく。このライブラリー中で、各ファージは同一のＨ鎖可変領域（すなわち最初のディスプレイライブラリーから同定される領域）および異なるＬ鎖可変領域を表示する。Ｌ鎖可変領域は、再配列されたヒト可変Ｌ鎖領域のライブラリーから得られる。再度、所望のインテグリンに対する強い特異的結合を示すファージを選択する。これらのファージは完全にヒトの抗インテグリン抗体の可変領域を表示する。これらの抗体は通常、マウス出発原料と同一若しくは類似のエピトープ特異性を有する。
【００９４】
５．定常領域の選択
キメラ、ヒト化若しくはヒト抗体のＨおよびＬ鎖可変領域をヒト定常領域の少なくとも一部分に連結し得る。定常領域の選択は、部分的に、抗体依存性補体および／若しくは細胞媒介性毒性が望ましいかどうかに依存する。例えば、アイソタイプＩｇＧ１およびＩｇＧ３は補体活性を有し、また、アイソタイプＩｇＧ２およびＩｇＧ４は有しない。アイソタイプの選択はまた抗体の脳への通過に影響を及ぼし得る。Ｌ鎖定常領域はλ若しくはκであり得る。抗体は、２本のＬおよび２本のＨ鎖を含有する四量体として、個別のＨ鎖、Ｌ鎖として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ、若しくはＨおよびＬ鎖可変ドメインがスペーサーにより連結されている一本鎖抗体として、発現され得る。
【００９５】
６．組換え抗体の発現
キメラ、ヒト化およびヒト抗体は組換え発現により典型的に製造される。組換えポリヌクレオチド構築物は典型的に、天然に関連した若しくは異種のプロモーター領域を包含する抗体鎖のコーディング配列に作動可能に連結された発現制御配列を包含する。好ましくは、発現制御配列は、真核生物宿主細胞を形質転換若しくはトランスフェクトすることが可能なベクター中の真核生物プロモーター系である。ベクターを適切な宿主に一旦組み込
めば、該ヌクレオチド配列の高レベル発現ならびに交差反応抗体の収集および精製に適する条件下で該宿主を維持する。
【００９６】
これらの発現ベクターは、典型的に、エピソームとして、若しくは宿主染色体ＤＮＡの一体部分としてのいずれかで宿主生物体中で複製する。一般に、発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列で形質転換された細胞の検出を可能にするための選択マーカー、例えばアンピシリン耐性若しくはハイグロマイシン耐性を含有する。
【００９７】
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）は本発明のＤＮＡ配列をクローン化するのにとりわけ有用な１種の原核生物宿主である。酵母のような微生物もまた発現に有用である。サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）は好ましい酵母宿主であり、適するベクターは発現制御配列、複製起点、終止配列などを所望のとおり有する。典型的なプロモーターは、３−ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター、および他の解糖酵素からのプロモーターを包含する。誘導可能な酵母プロモーターは、とりわけ、アルコール脱水素酵素、イソチトクロームＣ、ならびに麦芽糖およびガラクトース利用を司る酵素からのプロモーターを包含する。
【００９８】
哺乳動物細胞は、免疫グロブリン若しくはそれらのフラグメントをコードするヌクレオチドセグメントを発現するのに好ましい宿主である。Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ、Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｌｏｎｅｓ、（ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、ニューヨーク、１９８７）を参照されたい。無傷の異種タンパク質を分泌することが可能な多数の適する宿主細胞株が当該技術分野で開発されており、そしてＣＨＯ細胞株、多様なＣＯＳ細胞株、ＨｅＬａ細胞、Ｌ細胞および骨髄腫細胞株を包含する。好ましくは細胞はヒト以外である。これらの細胞の発現ベクターは、複製起点、プロモーター、エンハンサー（Ｑｕｅｅｎら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．、８９：４９−６８（１９８６））のような発現制御配列、ならびにリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位のような必要なプロセシング情報部位、および転写終止配列を包含し得る。好ましい発現制御配列は、内因性遺伝子、サイトメガロウイルス、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシパピローマウイルスなど由来のプロモーターである。Ｃｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４８：１１４９−５４（１９９２）を参照されたい。
【００９９】
あるいは、抗体コーディング配列は、トランスジェニック動物のゲノムへの導入および該トランスジェニック動物の乳中でのその後の発現のため導入遺伝子に組み込み得る（例えば、米国特許第ＵＳ ５，７４１，９５７号、同第ＵＳ ５，３０４，４８９号、同第ＵＳ ５，８４９，９９２号明細書を参照されたい）。適する導入遺伝子は、カゼイン若しくはβラクトグロブリンのような乳腺特異的遺伝子からのプロモーターおよびエンハンサーと作動可能な連結にあるＬおよび／若しくはＨ鎖のコーディング配列を包含する。
【０１００】
目的のＤＮＡセグメントを含有するベクターを、細胞宿主の型に依存して公知の方法により宿主細胞に移入し得る。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションは原核生物細胞に一般に利用される一方、リン酸カルシウム処理、電気穿孔法、リポフェクション、遺伝子銃若しくはウイルスに基づくトランスフェクションを他の細胞宿主に使用し得る。哺乳動物細胞を形質転換するのに使用される他の方法は、ポリブレン、プロトプラスト融合、リポソームおよび微小注入法の使用を包含する。トランスジェニック動物の製造のため、導入遺伝子を受精卵母細胞に微小注入し得るか若しくは胚性幹細胞のゲノム中に組み込み得、そしてこうした細胞の核を除核卵母細胞に移入し得る。
【０１０１】
一旦発現されれば、抗体は、ＨＰＬＣ精製、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などを包含する当該技術分野で既知の標準的手順に従って精製し得る（全般として、Ｓｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａ
ｇ、ニューヨーク、１９８２）を参照されたい）。
【０１０２】
７．ナノボディ
ナノボディは単一可変ドメイン（ＶＨＨ）および２個の定常ドメイン（ＣＨ２およびＣＨ３）を含有するＨ鎖抗体である。クローン化かつ単離されたＶＨＨドメインは、元のＨ鎖抗体の完全な抗原結合能力を持つ安定なポリペプチドである。
【０１０３】
８．他の抗体
抗体は、米国特許出願公開第２００４００３８３０４号、同第２００７００２０６８５号、同第２００６０２５７３９６号、同第２００６０１６０１８４号、同第２００６０１３４０９８号、同第２００５０２５５５５２号、同第２００５０００８６２５号、同第２００４０１３２０６６号、同第２００４００３８３１７号、同第２００３０１９８９７１号、および同第２００３０１５７５７９号明細書に記述されるもののような方法によってもまた同定かつ／若しくは製造しうる。
【０１０４】
Ｂ．他の剤
剤は天然に存在する若しくは合成の分子であり得る。スクリーニングされるべき剤は、例えば海洋微生物、藻類、植物および真菌のような天然の供給源からもまた得ることができる。例えば、米国特許第ＵＳ ６，０９６，７０７号明細書は、クサリヘビ、ジャララカ（Ｂｏｔｈｒｏｐｓ ｊａｒａｒａｃａ）からのメタロプロテイナーゼ、ジャララギン由来のペプチドを提供する。これらのペプチドはアミノ酸モチーフＡｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（ＲＫＫ）を含有し、そしてヒトα２β１インテグリンのコラーゲンとの相互作用を低下させる。あるいは、スクリーニングされるべき剤は、ペプチド若しくは小分子を包含する剤のコンビナトリアルライブラリーから、または産業で、例えば化学、製薬、環境、農業、海洋、化粧品、薬物およびバイオテクノロジー産業により合成される化合物の既存のレパートリーからであり得る。剤は、例えば、医薬品、治療薬、環境、農業、若しくは工業的剤、汚染物質、薬用化粧品、薬物、有機化合物、脂質、グルココルチコイド、抗生物質、ペプチド、タンパク質、糖、炭水化物およびキメラ分子を包含し得る。
【０１０５】
多様な方法がペプチドライブラリーを製造するのに利用可能である（例えば、Ｌａｍら、Ｎａｔｕｒｅ、３５４：９２、１９９１および第ＷＯ ９２／０００９１号明細書；Ｇｅｙｓｅｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．、１０２：２５９（１９８７）；Ｈｏｕｇｈｔｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５４：８４（１９９１）；第ＷＯ ９２／０９３００号明細書；ならびにＬｅｂｌら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．、４１：２０１（１９９３）を参照されたい）。ペプチドライブラリーはファージディスプレイ法によってもまた生成し得る。例えばＤｅｖｌｉｎ、第Ｗ０ ９１／１８９８０号明細書を参照されたい。
【０１０６】
段階的様式で合成し得る多くの型の化合物についてコンビナトリアルライブラリーを製造し得る（例えば、ＥｌｌｍａｎとＢｕｎｉｎ、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１１４：１０９９７、１９９２（ベンゾジアゼピン鋳型）、第ＷＯ ９５／３２１８４号明細書（オキサゾロンおよびアミニジン鋳型）、第ＷＯ ９５／３０６４２号明細書（ジヒドロベンゾピラン鋳型）ならびに第ＷＯ ９５／３５２７８号明細書（ピロリジン鋳型）を参照されたい）。化合物のライブラリーは通常固相化学により合成する。しかしながら溶液相ライブラリー合成もまた有用である。コンビナトリアル合成の戦略はＤｏｌｌｅとＮｅｌｓｏｎ、Ｊ．Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１：２３５−２８２（１９９９）（全部の目的上そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）により記述されている。合成は、典型的には、異なる単量体若しくは他の成分を合成の各回に添加する周期的様式で実施する。いくつかの方法は初期プールを連続的に分画することにより実施する。例えば、第１回の合成は全部の支持体上で実施する。支持体
をその後２プールに分割し、そして別個の合成反応を各プールで実施する。該２プールをその後それぞれさらなる２プールにさらに分割し、などである。他の方法は分割および再プールの双方を使用する。例えば、初回の合成後に、化合物のプールを第２回の別個の合成のため２個に分割する。その後、別個のプールからのアリコートを第３回の合成のため再組合せする。分割およびプール法は混合化合物のプールをもたらす。これらの方法は下により詳細に記述されるとおり標識にとりわけ従いやすい。こうした方法により生成されるライブラリーの大きさは、２種の異なる化合物から１０６若しくは１０１０またはその間のいずれかの範囲まで変動し得る。
【０１０７】
コードされるライブラリーの製造法は、Ｎｅｅｄｅｌｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９０：１０７００（１９９３）；Ｎｉら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、３９：１６０１（１９９６）、第ＷＯ ９５／１２６０８号、第ＷＯ ９３／０６１２１号、第ＷＯ ９４／０８０５１号、第ＷＯ ９５／３５５０５号、および第ＷＯ ９５／３０６４２号明細書（それらのそれぞれは全部の目的上そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）を包含する多様な刊行物に記述されている。コードされるライブラリーの合成方法は、典型的に、ランダムコンビナトリアルアプローチならびに単量体単位の化学的および／若しくは酵素的集成を必要とする。例えば、該方法は、典型的に、（ａ）複数の反応容器のあいだで複数の固体支持体を割り当てる段階；（ｂ）各異なる反応容器中の異なる第一の単量体および標識の組合せを使用して第一の単量体および第一の標識を各反応容器中の支持体に結合する段階；（ｃ）支持体をプールする段階；（ｄ）複数の反応容器のあいだで該支持体を割り当てる段階；（ｅ）各異なる反応容器中で、異なる第二の単量体および第二の標識の組合せを使用して、第一の単量体に第二の単量体を結合する段階、および固体支持体若しくは第一の標識のいずれかに第二の標識を結合する段階；ならびに、場合によっては、異なる標識および異なる単量体を用いて結合および割り当て段階を１ないし２０回若しくはそれ以上反復する段階を包含する。単量体の組は段階ごとに拡張若しくは縮小し得るか；または、単量体の組は次の段階について完全に変更し得る（例えば、一段階でアミノ酸、別の段階でヌクレオシド、別の段階で炭水化物）。例えばペプチド合成のための単量体単位は単一アミノ酸若しくはより大きいペプチド単位または双方を包含し得る。
【０１０８】
こうした方法により合成可能な化合物は、ポリペプチド、βターン模倣物、多糖、リン脂質、ホルモン、プロスタグランジン、ステロイド、芳香族化合物、複素環化合物、ベンゾジアゼピン、オリゴマーＮ−置換グリシンおよびオリゴカルバメートを包含する。製造されるコンビナトリアルライブラリーは商業的供給源（例えばＣｈｅｍＲｘ、カリフォルニア州サウスサンフランシスコ）からもまた入手可能である。
【０１０９】
コンビナトリアルライブラリーおよび他の化合物は、α２β１、α６β１若しくはαｖβ１インテグリンまたはラミニンに結合するそれらの能力を測定することにより適合性について最初にスクリーニングする。上述された付加的なスクリーニング手順もまた使用し得る。
【０１１０】
それらの立体異性体、若しくはそれらの立体異性体の混合物、またはそれらの製薬学的に許容できる塩の形態を包含する、式ＩａおよびＩｂの化合物は、ＬＴＰのＡβ誘導性阻害の抑制方法で有用であり
【０１１１】
【化４】
【０１１２】
ここで
Ｘ１およびＸ３は窒素若しくは炭素から独立に選択され；
Ｒ１は
【０１１３】
【化５】
【０１１４】
から選択され；
ここで、上の複素環は、ＮＨ２、ハロゲン、ＮＯ２、ＣＮ、ＣＦ３、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６アルキルおよびＣ３−Ｃ７シクロアルキルよりなる群から選択される０〜２置換基で場合によっては置換されており；
Ｕは−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｔＱ（ＣＨ２）ｍ−および−Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−１−から選択され、ここでメチレン基の１個は場合によってはＲ７で置換されており；
Ｑは、１，２−フェニレン、１，３−フェニレン、２，３−ピリジニレン、３，４−ピリジニレンおよび２，４−ピリジニレンから選択され；
Ｒ６はＨ、Ｃ１−Ｃ４アルキルおよびベンジルから選択され；
Ｒ７はＣ１−Ｃ６アルキル、Ｃ３−Ｃ７シクロアルキル、Ｃ４−Ｃ１１シクロアルキルアルキル、アリール、アリール（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、ヘテロアリールおよびヘテロアリール（Ｃ１−Ｃ６アルキル）から選択され；
Ｒ１０は、Ｈ、ハロゲン、ＣＯ２Ｒ１７、ＣＯＮＲ１７Ｒ２０、０〜１個のＲ１５若しくは０〜１個のＲ２１で置換されているＣ１−Ｃ６アルキル、０〜１個のＲ２１で置換されているＣ１−Ｃ４アルコキシ、０〜１個のＲ１５若しくは０〜１個のＲ２１で置換されているＣ３−Ｃ７シクロアルキル、０〜１個のＲ１５若しくは０〜１個のＲ２１で置換されているＣ４−Ｃ１１シクロアルキルアルキル、および０〜１個のＲ１５若しくは０〜２個のＲ１１若しくは０〜１個のＲ２１で置換されているアリール（Ｃ１−Ｃ６アルキル）−から選択され；
Ｒ１１は、Ｈ、ハロゲン、ＣＦ３、ＣＮ、ＮＯ２、ヒドロキシ、ＮＲ２Ｒ３、０〜１個のＲ２１で置換されているＣ１−Ｃ４アルキル、０〜１個のＲ２１で置換されているＣ１−Ｃ４アルコキシ、０〜１個のＲ２１で置換されているアリール、０〜１個のＲ２１で置換されているアリール（Ｃ１−Ｃ６アルキル）−、０〜１個のＲ２１で置換されている（Ｃ１−Ｃ４アルコキシ）カルボニル、０〜１個のＲ２１で置換されている（Ｃ１−Ｃ４アルキル）カルボニル、０〜１個のＲ２１で置換されているＣ１−Ｃ４アルキルスルホニル、および０〜１個のＲ２１で置換されているＣ１−Ｃ４アルキルアミノスルホニルから選択され；
Ｗは−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒ１３）−であり；
Ｘは−ＣＨ（Ｒ１４）−ＣＨ（Ｒ１５）−であり；
Ｒ１３はＨおよびＣＨ３から選択され；
Ｒ１４は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アリールおよびヘテロアリールから選択され、前記アリール若しくはヘテロアリール基は、Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、アリール、ハロ、シアノ、アミノ、ＣＦ３およびＮＯ２から選択される０〜３置換基で場合によっては置換されており；
Ｒ１５はＨおよびＲ１６から選択され；
Ｙは−ＣＯＲ１９であり；
Ｒ１６は
−ＮＨ（Ｒ２０）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ１７、
−Ｎ（Ｒ２０）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ１７、
−Ｎ（Ｒ２０）−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ｒ１７、
―Ｎ（Ｒ２０）ＳＯ２−Ｒ１７、および
−Ｎ（Ｒ２０）ＳＯ２−Ｎ（Ｒ２０）Ｒ１７
から選択され、
Ｒ１７は、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ３−Ｃ１１シクロアルキル、アリール（Ｃ１−Ｃ６アルキル）−、（Ｃ１−Ｃ６アルキル）アリール、ヘテロアリール（Ｃ１−Ｃ６アルキル）−、（Ｃ１−Ｃ６アルキル）ヘテロアリール、ビアリール（Ｃ１−Ｃ６アルキル）−、ヘテロアリール若しくはアリールから選択され、前記アリール若しくはヘテロアリール基は、Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、ハロ、シアノ、アミノ、ＣＦ３およびＮＯ２よりなる群から選択される０〜３置換基で場合によっては置換されており；
Ｒ１９は−Ｏ−（ＣＨ２）ｋＮ＋（Ｒ２２）（Ｒ２３）（Ｒ２４）Ｚ−であり；
Ｚ−は、ハロゲン化イオン、重硫酸イオン、硫酸イオン、リン酸水素イオン、リン酸イオン、トルエンスルホン酸イオン、メタンスルホン酸イオン、エタンスルホン酸イオン、酢
酸イオン、トリフルオロ酢酸イオン、クエン酸イオン、シュウ酸イオン、コハク酸イオンおよびマロン酸イオンから選択される製薬学的に許容できる陰イオンであり；
Ｒ２２、Ｒ２３およびＲ２４はＨ、Ｃ１−Ｃ４アルキルおよびＣ４−Ｃ１１シクロアルキルアルキルから独立に選択されるか；
あるいは、Ｒ２２およびＲ２３は、一緒になって、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１〜２個のヘテロ原子を含有する５〜７員の複素環系を形成し得、ならびにＲ２４は上のとおり定義されるか、または、Ｒ２２、Ｒ２３およびＲ２４は、一緒になって、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１〜２個のヘテロ原子を含有する複素二環系を形成し得；
Ｒ２０はＨおよびＣＨ３から選択され；
Ｒ２１はＣＯＯＨおよびＮＲ６２から選択され；
ｋは２であり；
ｍは０および１から選択され；
ｎは１〜４であり；ならびに
ｔは０および１から選択される。
【０１１５】
式Ｉａの化合物の例は、限定されるものでないが式ＩＩ：
【０１１６】
【化６】
【０１１７】
の化合物を挙げることができ；ここでＲ１９は−Ｈ、−ＣＨ３および−ＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋（ＣＨ３）３から選ばれる。一態様において、Ｈ１９は−Ｈである（式ＩＩの化合物はＳＭ２５６である）。
【０１１８】
ＬＴＰのＡβ誘導性阻害の抑制方法で有用な付加的な化合物は、米国特許第６，２１４，８３４号明細書に開示される化合物を包含する。その特許は、αｖβ３に拮抗するためのＳＭ２５６（式ＩＩ）および他の化合物の使用を開示する。従って、１種若しくはそれ以上の剤がＬＴＰのアミロイド媒介性阻害を抑制するような条件下でインテグリンサブユニットαｖに結合する化合物を同定するためにαｖβ３拮抗剤をスクリーニングしうる。そのようにスクリーニングされうる例示的αｖβ３拮抗剤は、限定されるものでないが米国特許第６，２１４，８３４号明細書に開示されるαｖβ３拮抗剤を挙げることができる。
【０１１９】
Ｃ．遺伝子抑制剤
遺伝子発現を抑制する剤を使用して、インテグリンサブユニットβ１、α２、α６若しくはαｖをコードする遺伝子の発現を抑制し得る。アンチセンス剤もまた、ラミニンのようなそれに対するある種のリガンドの発現を抑制するのに使用し得る。ラミニン発現の抑制は、ラミニンに対する抗体での処置に類似の効果を達成し得る。標的細胞若しくは患者への本発明のアンチセンス試薬の投与は、上のインテグリン遺伝子若しくはそのリガンド
の１種の低下された活性をもたらす。アンチセンスポリヌクレオチドに関する一般的方法については、例えばＡｎｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮＡ ａｎｄ ＤＮＡ、（１９８８）、Ｄ．Ａ．Ｍｅｌｔｏｎ編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー）；Ｄａｇｌｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９：１８０５（１９９１）；Ｕｈｌｍａｎｎら、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖｉｅｗｓ、９０：５４３−５８４（１９９０）を参照されたい。リボザイムは遺伝子発現を抑制し得る別のアンチセンス剤である。
【０１２０】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、センスｍＲＮＡに結合しかつその翻訳を妨害すること、ｍＲＮＡをヌクレアーゼ消化に対し感受性にすること、転写を妨害すること、ＲＮＡ前駆体のプロセシング若しくは局在化を妨害すること、ｍＲＮＡの転写を抑制すること、若しくはいくつかの他の機序により作用することにより抑制を引き起こし得る。アンチセンス分子が発現を低下させる特定の機序は重要でない。
【０１２１】
典型的に、アンチセンスポリヌクレオチドは、遺伝子のｍＲＮＡからの配列に特異的にハイブリダイズする最低７ないし１０ないし典型的に２０若しくはそれ以上のヌクレオチドのアンチセンス配列を含んでなる。数種のアンチセンスポリヌクレオチドは、長さが約１０から約５０ヌクレオチドまで、若しくは長さが約１４から約３５ヌクレオチドまでである。数種のアンチセンスポリヌクレオチドは約１００ヌクレオチド未満若しくは約２００ヌクレオチド未満のポリヌクレオチドである。一般に、アンチセンスポリヌクレオチドは安定な二重鎖を形成するのに十分長くあるべきであるが、しかし、所望の場合はｉｎ ｖｉｖｏで投与するために送達様式に依存して十分に短くあるべきである。標的配列への特異的ハイブリダイゼーションに必要とされるポリヌクレオチドの最小長さは、とりわけ、Ｇ／Ｃ含量、不適正塩基（あれば）の配置、標的ポリヌクレオチドの集団に関しての該配列の全体的差違、およびポリヌクレオチドの化学的性質（例えばメチルホスホネートバックボーン、ペプチド核酸、ホスホロチオエート）のようないくつかの因子に依存する。
【０１２２】
相補核酸分子をハイブリダイズするのに適する条件は当業者に公知である。例えば、典型的な高緊縮性条件下のハイブリダイゼーションは、５×ＳＳＰＥ、５×Ｄｅｎｈａｒｔ溶液、０．５％ＳＤＳ（ｗ／ｖ）および１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含有する混合物中で実施しうる。ＤＮＡは、約６８℃で指定される時間ハイブリダイズさせる。典型的には膜若しくはフィルターに結合されているハイブリダイズされたＤＮＡをその後、２×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ（ｗ／ｖ）中室温で１０分間２回洗浄する。膜（若しくはフィルター）をその後、１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ（ｗ／ｖ）の溶液に６８℃で１５分間、そして最後に１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ（ｗ／ｖ）の溶液に６８℃で１５分間浸漬する。
【０１２３】
特異的ハイブリダイゼーションを確実にするため、アンチセンス配列は標的ｍＲＮＡ若しくはそれをコードする遺伝子に少なくとも実質的に相補的である。数種のアンチセンス配列はそれらの意図している標的配列に正確に相補的である。アンチセンスポリヌクレオチドは、しかしながら、ＲＮＡ若しくはその遺伝子に対応する適切な標的配列への特異的結合が該ポリヌクレオチドの機能的特性として保持される限りは、ヌクレオチドの置換、付加、欠失、トランジション、転位若しくは修飾、または他の核酸配列若しくは核酸以外の部分もまた包含し得る。
【０１２４】
数種のアンチセンス配列はｍＲＮＡの相対的に接近可能な配列に相補的である（例えば二次構造を相対的に欠く）。これは、予測されるＲＮＡ二次構造を例えばＭＦＯＬＤプログラム（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、ウィスコンシン州マディソン）を使用して解析すること、および当該技術分野で既知であるとおりｉｎ ｖｉｔｒｏ若しくはｉｎ ｖｉｖｏで試験することにより決定し得る。効果的なアンチセンス組成物
の別の有用な同定方法はオリゴヌクレオチドのコンビナトリアルアレイを使用する（例えば、Ｍｉｌｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１５：５３７（１９９７）を参照されたい）。
【０１２５】
遺伝子発現を阻害するための一技術は、阻害的ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）ともまた称される二本鎖ＲＮＡの細胞中への導入を必要とする。ＲＮＡｉは、二本鎖ＲＮＡ分子を形成するよう相互にアニーリングされたＲＮＡの２本の相補鎖（センス鎖およびアンチセンス鎖）を含んでなる。ＲＮＡｉは、典型的には阻害の標的とされている遺伝子のエキソンすなわちコーディング配列に由来する。ＲＮＡｉは該ＲＮＡｉ分子の配列に相補的なｍＲＮＡの破壊をもたらす。ＲＮＡｉおよび生存生物体でのそれらの使用の例は、例えばＦｉｒｅら、Ｎａｔｕｒｅ、３９１：８０６−８１１（１９９８）；Ｎｙｋａｅｎｅｎら、Ｃｅｌｌ、１０７：３０９−３２１（２００１）；および第ＷＯ ０１／２９０５８号、第ＷＯ ０１／７５１６４号および第ＷＯ ９９／３２６１９号明細書により記述される。いくつかの方法において、ＲＮＡｉは約１００ｂｐと１０００ｂｐの間、例えば約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００若しくはそれ以上の塩基対である。いくつかの方法においてＲＮＡｉはエキソン由来である。他の方法において、ＲＮＡｉはイントロン若しくはシグナル伝達配列由来である。
【０１２６】
いくつかの方法において、アンチセンスポリヌクレオチドは、アンチセンス配列に加え、アンチセンス配列の発現をもたらすプロモーターおよび他の制御配列を包含する配列を有する。プロモーターならびに好ましくは終止およびポリアデニル化シグナルが適正に配置されていることを条件に、非コーディング鎖に対応する挿入された配列の鎖が転写され、そしてアンチセンスオリゴヌクレオチドとして作用する。いくつかの方法において、該ポリヌクレオチドはアンチセンス配列より本質的になるか若しくはアンチセンス配列である。アンチセンス核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾、アナログなど）は、本明細書に開示される化学合成および組換え法のような核酸のいずれかの適する製造方法を使用して作成し得る。例えば、アンチセンスＲＮＡ分子はデノボ化学合成若しくはクローニングにより製造し得る。
【０１２７】
β１、α２、α６若しくはαｖインテグリンサブユニットをコードする遺伝子の発現を抑制するため、ジンクフィンガータンパク質を、アンチセンスポリヌクレオチドの代替として若しくはそれに加えて使用し得る。ジンクフィンガータンパク質は、ラミニンのようなこれらのインテグリンサブユニットのある種のリガンドの発現を抑制するのにもまた使用し得る。ジンクフィンガータンパク質は、本方法で剤としてそれら自身を使用し得るフィブロネクチンのような他のリガンドの発現を活性化する若しくは高めるのにもまた使用し得る。ジンクフィンガータンパク質は標的遺伝子内のいずれかの所望の標的部位に結合するよう工作若しくは選択し得る。いくつかの方法において標的部位はプロモーター若しくはエンハンサー内にある。他の方法において標的部位は構造遺伝子内にある。いくつかの方法において、ジンクフィンガータンパク質はヒトＫＯＸ−１タンパク質からのＫＲＡＢ抑制領域のような転写リプレッサーに連結される（Ｔｈｉｅｓｅｎら、Ｎｅｗ Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ、２、３６３−３７４（１９９０）；Ｍａｒｇｏｌｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９１、４５０９−４５１３（１９９４））；Ｐｅｎｇｕｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２２：２９０８−２９１４（１９９４）；Ｗｉｔｚｇａｌｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９１、４５１４−４５１８（１９９４）。活性化を達成するために好ましいドメインは、ＨＳＶ ＶＰ１６活性化ドメイン（例えばＨａｇｍａｎｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７１：５９５２−５９６２（１９９７）を参照されたい）核ホルモン受容体（例えばＴｏｒｃｈｉａら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１０：３７３−３８３（１９９８）を参照されたい）；核因子κＢのｐ６５サブユニット（ＢｉｔｋｏとＢａｒｉｋ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７２：５６１０−５６１８（１９９８）およびＤｏｙｌｅとＨｕｎｔ、Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ、８：２９３７−２９４２（１９９７））；Ｌｉｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、５：３−２８（１９９８））、若しくはＶＰ６４のような人工的キメラ機能ドメイン（Ｓｅｉｆｐａｌら、ＥＭＢＯ Ｊ．、１１：４９６１−４９６８（１９９２））を包含する。ジンクフィンガータンパク質により標的を定めるのに適する標的部位の選択方法、および選択された標的部位に結合するためのジンクフィンガータンパク質の設計方法は、第ＷＯ ００／００３８８号明細書に記述されている。標的に結合するジンクフィンガータンパク質のファージディスプレイを使用する選択方法は、第ＥＰ ９５９０８６１４Ａ号明細書により記述されている。内因性遺伝子を調節するためのジンクフィンガータンパク質の使用方法は第ＷＯ ００／００４０９号明細書に記述されている。ジンクフィンガータンパク質は、タンパク質として、若しくはジンクフィンガーをコードしかつ適切な制御配列を有する核酸の形態でのいずれでも投与し得る。
【０１２８】
Ｄ．治療薬をコードする核酸
抗体若しくは他のペプチド試薬は、抗体鎖若しくはペプチドをコードする核酸の形態で投与し得る。こうした核酸は、典型的には、患者の意図している標的細胞中での該ＤＮＡセグメントの発現を可能にするプロモーターおよびエンハンサーのような調節エレメントに連結されている。Ｌ若しくはＨ鎖免疫グロブリン遺伝子からのプロモーターおよびエンハンサーエレメント、またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）主要中初期プロモーター（ｍａｊｏｒ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）およびエンハンサーが直接発現に適する。いくつかの方法において、脳中で発現を引き起こすプロモーターを使用する。血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、プリオン若しくは神経エノラーゼのプロモーターのようなプロモーターが適する。
【０１２９】
連結された調節エレメントおよびコーディング配列はしばしば１ベクターにクローン化される。二本鎖抗体の投与のため、該２鎖を同一若しくは別個のベクターにクローン化し得る。
【０１３０】
レトロウイルス系（例えばＬａｗｒｉｅとＴｕｍｉｎ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．、２：１０２−１０９（１９９３）を参照されたい）；アデノウイルスベクター（例えばＢｅｔｔら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６７：５９１１（１９９３）を参照されたい）；アデノ随伴ウイルスベクター（例えばＺｈｏｕら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７９：１８６７−７５（１９９４）を参照されたい）、ワクシニアウイルスおよびトリポックスウイルスを包含するポックス科からのウイルスベクター、シンドビスおよびセムリキ森林ウイルス（例えばＤｕｂｅｎｓｋｙら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７０：５０８−１９（１９９６）を参照されたい）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（米国特許第ＵＳ ５，６４３，５７６号明細書を参照されたい）由来のもののようなアルファウイルス属、水疱性口内炎ウイルス（第ＷＯ ９６／３４６２５号明細書を参照されたい）のようなラブドウイルス、ならびにパピローマウイルス（Ｏｈｅら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、６：３２５−３３（１９９５）；Ｗｏｏら、第ＷＯ ９４／１２６２９号明細書；およびＸｉａｏとＢｒａｎｄｓｍａ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．、２４：２６３０−２２（１９９６））からのウイルスベクターを包含する多数のウイルスベクター系が利用可能である。
【０１３１】
ＤＮＡはリポソーム中にパッケージングし得る。適する脂質および関連アナログは、米国特許第ＵＳ ５，２０８，０３６号、同第５，２６４，６１８号、同第５，２７９，８３３号および同第５，２８３，１８５号明細書により記述されている。免疫原をコードするベクターおよびＤＮＡはまた微粒子担体に吸着若しくはそれらと会合もし得、それらの例はポリメチルメタクリレートポリマー、ポリラクチドおよびポリ（ラクチドコグリコリド）を包含する。
【０１３２】
遺伝子治療ベクター若しくは裸のＤＮＡは、典型的に全身投与（例えば静脈内、腹腔内、鼻、胃、皮内、筋肉内、くも膜下腔内、皮下若しくは頭蓋内注入）または局所適用（例えば米国特許第ＵＳ ５，３９９，３４６号明細書を参照されたい）による個々の患者への投与によりｉｎ ｖｉｖｏで送達し得る。こうしたベクターはブピバカインのような促進剤をさらに包含し得る（米国特許第ＵＳ ５，５９３，９７０号明細書）。ＤＮＡは遺伝子銃を使用してもまた投与し得る。ＸｉａｏとＢｒａｎｄｓｍａ、上記を参照されたい。ＤＮＡを微細な金属ビーズの表面上に沈殿させる。微小発射体をショック波若しくは膨張するヘリウムガスで加速し、そして数細胞層の深さまで組織を貫通させる。例えば、Ａｇａｃｅｔｕｓ，Ｉｎｃ．、ウィスコンシン州ミドルトンにより製造されるＡｃｃｅｌＴＭ遺伝子送達装置が適する。あるいは、裸のＤＮＡは、単純に化学若しくは機械的刺激で皮膚上にＤＮＡをスポットすることにより、皮膚を通り血流に移行し得る（第ＷＯ ９５／０５８５３号明細書を参照されたい）。
【０１３３】
さらなる一変形において、核酸を、個々の患者から外植した細胞（例えばリンパ球、骨髄吸引物、組織生検）若しくは普遍的ドナーの造血幹細胞のような細胞にｅｘ ｖｉｖｏで送達し得、次いで、通常はベクターを組み込んだ細胞についての選択後に細胞を患者に再移植し得る。
【０１３４】
Ｅ．ＬＴＰのＡβ媒介性阻害を抑制する剤の同定
インテグリンサブユニットαｖに結合する小分子剤は、１種若しくはそれ以上の剤がＬＴＰのアミロイド媒介性阻害を抑制するような条件下で投与しうる。適する小分子剤は、例えば、インテグリンサブユニットαｖ結合アッセイおよびＬＴＰのアミロイド媒介性阻害抑制アッセイを含んでなる方法、若しくはＬＴＰのアミロイド媒介性阻害抑制アッセイを含んでなるがしかしインテグリンサブユニットαｖ結合アッセイを含まない方法により同定する。
【０１３５】
インテグリンサブユニットαｖ結合アッセイは、例えば、単量体若しくは二量体いずれかとしてのインテグリンサブユニットαｖへの剤の特異的結合を同定するいずれかのアッセイである。例示的アッセイは、支持体への直接若しくは間接結合によるように固定されうるインテグリンサブユニットαｖに結合されている標識した剤の使用によるように結合を直接検出する。さらなる例示的アッセイは結合を間接的に検出する。一態様において競合結合アッセイを使用する。競合結合は、例えば、本明細書に開示されるか若しくは当該技術分野で既知のもののような別のインテグリンサブユニットαｖ結合剤、または本明細書に開示されるアッセイにより事前に同定された結合剤を使用して実施しうる。インテグリンサブユニットαｖ結合アッセイでの使用に適する結合剤は、限定されるものでないが、フィブロネクチン若しくはスーパーフィブロネクチン、モノクローナル若しくはポリクローナル抗体、１８Ｃ７、２０Ａ９および１７Ｅ６から選ばれる抗体と同一のエピトープを認識する抗体、ならびに１８Ｃ７、２０Ａ９および１７Ｅ６から選ばれる抗体、インテグリンサブユニットαｖへの結合について１８Ｃ７、２０Ａ９および１７Ｅ６から選ばれる抗体と競合する剤、ならびにＳＭ２５６のような式１の化合物を挙げることができる。
【０１３６】
ＬＴＰのアミロイド媒介性阻害抑制アッセイは、限定されるものでないがＬＴＰを実験的に誘導する系を使用するアッセイを挙げることができる。適する系は、ｉｎ ｖｉｖｏ、または海馬領域若しくは海馬の小領域を含んでなる脳薄片のようなｉｎ ｖｉｔｒｏでありうる。例示的アッセイを実施例１０〜１３に記述する。
【０１３７】
それらの実施例で、ＬＴＰをＨＦＳ若しくは薬理学的刺激により誘導する。ＬＴＰは、ＨＦＳ若しくは薬理学的刺激の投与の前、それらと同時に若しくは後に該系に添加されるＡβペプチドにより阻害される。候補剤によるＬＴＰのアミロイド媒介性阻害の抑制をその後、該候補剤の存在および非存在下のＡβペプチドによるＬＴＰの阻害を比較すること
によりアッセイする。抑制の程度は、対照系（Ａβペプチドの非存在下のＬＴＰの誘導後の系および／若しくはＡβペプチドによるＬＴＰの阻害後の系のいずれでもあり得る）のＨＦＳ若しくは薬理学的刺激後に観察される興奮性シナプス後場電位（ＥＰＳＰ）の振幅に関して測定する。
【０１３８】
ＩＶ．第二の剤
本発明は１種若しくはそれ以上の剤および１種若しくはそれ以上の第二の剤の共投与にさらに向けられる。例えば、適する第二の剤は、限定されるものでないが、Ａβ産生の阻害剤、Ａβ沈着の阻害剤、Ａβ消失のメディエーター、アミロイド斑消失のメディエーター、Ａβ神経毒性の阻害剤、Ａβ凝集の阻害剤、Ａβ解離のメディエーター、およびＡβに対する抗体、ならびにそれらのいずれかの組合せから選択される第二の剤を挙げることができる。Ａβ産生の適する阻害剤は、限定されるものでないがγ分泌酵素阻害剤およびβ分泌酵素阻害剤を挙げることができる。
【０１３９】
例示的γ分泌酵素阻害剤は、限定されるものでないが、米国特許第６，９９２，０８１号、同第６，９８２，２６４号、同第６，９６２，９３４号および同第６，６１０，４９３号明細書、ならびに米国特許出願公開第２００６０２８７３０６号、同第２００６０１５４９２６号、同第２００５０１５９４６０号、同第２００２００１６３２０号および同第２００３０１４８３９２号明細書に開示されるもののようなγ分泌酵素阻害剤を挙げることができる。
【０１４０】
例示的β分泌酵素阻害剤は、限定されるものでないが、米国特許第７，１１５，４１０号、同第７，１０９，０１７号、同第７，０６７，２７１号、同第６，８６４，２４０号、同第６，８５２，４８２号、同第６，６２７，７３９号、同第６，３２１，１６３号、同第６，２２１，６４５号、同第５，９４２，４００号および同第５，７４４，３４６号明細書、ならびに米国特許出願公開第２００５０１９６８３９号、同第２００５０１８２１３８号、同第２００５０１７７８８８号、同第２００５０１７０４８９号、同第２００５０１６４３２７号、同第２００５０１６４２９４号、および同第２００４０２６５５９６５号明細書に開示されるもののようなβ分泌酵素阻害剤を挙げることができる。
【０１４１】
Ａβに対する例示的抗体は、限定されるものでないが、米国特許第７，０１４，８５５号、同第６，９８２，０８４号、同第６，９７２，１２７号、同第６，９６２，７０７号、同第６，９４６，１３５号、同第６，９１３，７４５号、同第６，９０５，６８６号、同第６，８９０，５３５号、同第６，８７５，４３４号、同第６，８６６，８５０号、同第６，８６６，８４９号、同第６，８１８，２１８号、同第６，８０８，７１２号、同第６，７８７，６３７号、同第６，７８７，５２３号、同第６，７８７，１４４号、同第６，７８７，１４３号、同第６，７８７，１４０号、同第６，７８７，１３９号、同第６，７８７，１３８号、同第６，７６１，８８８号、同第６，７５０，３２４号、同第６，７４３，４２７号および同第６，７１０，２２６号明細書に開示されるもののようなＡβに対する抗体を挙げることができる。
【０１４２】
Ｖ．長期増強
長期増強はｉｎ ｖｉｖｏ若しくはｉｎ ｖｉｔｒｏで自然に発生し、およびｉｎ ｖｉｔｒｏ若しくはｉｎ ｖｉｖｏモデル系で実験的に誘導しうる。本明細書に開示されるある種の方法は、該実験系のＡβペプチドへの投与若しくは曝露により阻害し得るＬＴＰの実験的誘導を企図している。それらの方法では剤を使用してＡβペプチドによるＬＴＰのその阻害を実験的に抑制する。天然に存在するＬＴＰは多様なアミロイド形成疾患状態の発症の経過でＡβペプチドにより阻害される。本明細書に開示される剤は、例えば、ＡβペプチドによるＬＴＰの阻害をｉｎ ｖｉｖｏで処置かつ／若しくは阻害するため、ならびに／または該疾患状態を処置かつ／若しくは予防するための製薬学的製剤として患者
に投与しうる。
【０１４３】
ＬＴＰはＨＦＳの送達若しくは薬理学的方法により実験的に誘導しうる。ＬＴＰ阻害の実験モデルに、実験操作に応答してＬＴＰを表す神経回路が提供される。それはマウス若しくはラットのようなげっ歯類若しくは霊長類のような哺乳動物のような動物から選ばれた生物体で行い得る。ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養した霊長類若しくはげっ歯類脳薄片のような哺乳動物脳薄片、またはｉｎ ｖｉｖｏで哺乳動物の脳中でＬＴＰを実験的に誘導するための技術が当該技術分野で既知である。
【０１４４】
ＬＴＰの強さは、誘導後の指定される時点で基礎（誘導の非存在下）に関して観察されるＥＰＳＰ上昇の大きさにより定量化し得る。その大きさは１５０％のような基礎に関するパーセンテージとして表しうる。Ａβペプチドの投与後に観察されるＬＴＰ阻害は、基礎に関するＥＰＳＰ上昇の大きさの低下をもたらす。
【０１４５】
例えば、Ａβペプチドは、ＨＦＳ後に観察されるＥＰＳＰが基礎と統計学的に異ならない点までＬＴＰを完全に阻害する。その阻害が抑制される場合、ＬＴＰはＡβの存在下であってさえ観察し得る。その抑制は、Ａβの非存在下でＬＴＰの誘導後に観察されるＥＰＳＰの大きさに関して定量化し得る。例えば、抑制は完全であることができ、その結果、Ａβおよびαｖ結合剤の存在下でＬＴＰの誘導後のデータ組全体で観察されるＥＰＳＰの大きさは、Ａβの非存在下でＬＴＰの誘導後に観察されるＥＰＳＰの大きさと統計学的に識別可能である。他の態様において、Ａβおよびαｖ結合剤の存在下でＬＴＰの誘導後のデータ組全体で観察されるＥＰＳＰの大きさは、例えば、Ａβの非存在下でＬＴＰの誘導後に観察されるＥＰＳＰの大きさの２５％以上、５０％以上、７５％以上、８５％以上、９０％以上若しくは９５％以上である。
【０１４６】
ＶＩ．処置可能な患者
本方法は、進行性記憶障害を特徴とする疾患若しくは障害を包含する記憶障害若しくは記憶障害の可能性を特徴とする疾患若しくは障害の予防的若しくは治療的処置に有用である。例示的疾患若しくは障害は、限定されるものでないが、アミリン若しくはＡβペプチドのようなアミロイドタンパク質の沈着物の存在を特徴とするアミロイド形成疾患および状態を挙げることができる。こうした疾患は、アルツハイマー病、ダウン症候群および認知障害、ＩＩ型糖尿病、パーキンソン病、びまん性レビー小体病、遺伝性若しくは全身性アミロイドーシスのようなアミロイドーシス、ならびにプリオン感染により全部若しくは部分的に引き起こされる疾患を包含する。
【０１４７】
処置可能な患者は、疾患の危険にさらされているがしかし症状を示さない個体、ならびに現在症状を示している患者を包含する。アルツハイマー病の場合、事実上誰でも彼若しくは彼女が十分に長く生きる場合にアルツハイマー病に罹る危険にさらされている。本方法は、アルツハイマー病の既知の遺伝的危険性を有する個体にとりわけ有用である。こうした個体は、この疾患を経験した親族を有する者、および遺伝子若しくは生化学的マーカーの分析によりその危険性が決定される者を包含する。アルツハイマー病に対する危険性の遺伝子マーカーは、ＡＰＰ遺伝子中の突然変異、例えばそれぞれハーディ型およびスウェーデン型突然変異と称される位置７１７ならびに位置６７０および６７１の突然変異を包含する（Ｈａｒｄｙ、ＴＩＮＳ、上記を参照されたい）。危険性の他のマーカーは、プレセニリン遺伝子ＰＳ１およびＰＳ２ならびにＡｐｏＥ４中の突然変異、ＡＤの家族歴、高コレステロール血症若しくは動脈硬化症である。現在アルツハイマー病に罹っている個体は、特徴的な認知症ならびに上述された危険因子の存在から認識し得る。加えて、ＡＤを有する個体を同定するための多数の診断試験が利用可能である。これらは脳脊髄液（ＣＳＦ）のτおよびＡβ４２濃度の測定を包含する。上昇されたτおよび低下されたＡβ４２濃度はＡＤの存在を示す。アルツハイマー病に罹っている個体はＡＤＲＤＡ基準によっ
てもまた診断し得る。無症候性患者で処置はいかなる齢（例えば約１０、約２０、約３０歳）でも開始し得る。通常、しかしながら患者が約４０、約５０、約６０、約７０、約８０若しくは約９０歳に達するまで処置を開始することは必要でない。処置は、典型的にはある期間にわたる複数投薬量を必要とする。ダウン症候群患者の場合には、母親に治療薬を投与することにより出産前に処置を開始し得るか、若しくは処置を出生直後に開始しうる。
【０１４８】
ＶＩＩ．処置計画
予防的応用において、製薬学的組成物若しくは医薬品は、疾患、その合併症および該疾患の発症の間に見つかる中間的病理学的表現型の生化学的、組織学的および／若しくは行動的症状を包含する該疾患の危険性を排除若しくは低下、その重症度を低下、またはその発症を遅延させるのに十分な量で、アミロイド形成疾患に感受性の若しくはそうでなければそれを発症する危険にさらされている患者に投与する。
【０１４９】
治療的応用において、組成物若しくは医薬品は、その合併症および中間的病理学的表現型を包含する該疾患の症状（生化学的、組織学的および／若しくは行動的）を治癒若しくは少なくとも部分的に停止するのに十分な量で、こうした疾患が疑われる若しくは既に罹っている患者に投与する。治療的若しくは予防的処置を達成するのに十分な量を治療的若しくは予防的有効用量と定義する。治療計画において、該剤は通常、該疾患の症状が消失若しくは有意に低下するまで間隔を置いて投与する。場合によっては、再発を予防するために投与を継続し得る。予防計画において、剤は通常間隔を置いて、いくつかの例では患者の生涯の残りの間もまた投与する。処置は、投与した剤の濃度をアッセイすること若しくは患者の応答をモニターすることによりモニターし得る。応答は、ＡＤＲＤＡ基準、および患者の脳中の斑の画像化によりモニターし得る（第ＷＯ ００／１４８１０号明細書を参照されたい）。
【０１５０】
上述された状態の処置のための本発明の組成物の有効用量は、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトであるか動物であるか、投与されている他の医薬品、および処置が予防的であるか治療的であるかを包含する多くの異なる因子に依存して変動する。通常、患者はヒトであり；トランスジェニック哺乳動物を包含するヒト以外の哺乳動物もまた処置し得る。処置投薬量は、典型的には安全性および有効性を最適化するよう用量設定する。
【０１５１】
抗体、ペプチドおよび小分子の投薬量は、約０．０００１から約１００ｍｇ／ｋｇまで、およびより通常は約０．０１ないし約２０ｍｇ／ｋｇ宿主体重の範囲にわたる。例えば、投薬量は約１ｍｇ／ｋｇ体重若しくは約２０ｍｇ／ｋｇ体重または約１ないし約１０ｍｇ／ｋｇの範囲内にあり得る。例示的処置レジメンは、２週ごとあたり１回若しくは１か月に１回または３ないし６か月ごとに１回の投与を必要とする。いくつかの方法において、異なる結合特異性をもつ２、３、４種若しくはそれ以上のモノクローナル抗体を同時に投与し、この場合投与される各抗体の投薬量は示される範囲内にある。例えば、いくつかの方法において、β１インテグリン、α２インテグリンおよびαｖインテグリンサブユニットの２種若しくは全３種に対する抗体を同時に投与する。いくつかの方法において、α６インテグリンサブユニットに対する抗体もまた投与する。抗体は通常複数の機会に投与する。単一投薬量の間の間隔は週、月若しくは年であり得る。間隔は、患者中のインテグリンに対する抗体の血中濃度を測定することにより示されるように不規則でもまたあり得る。いくつかの方法において、抗体の投薬量は、約１ないし約１０００μｇ／ｍｌ、およびいくつかの方法においては約２５ないし約３００μｇ／ｍｌの血漿抗体濃度を達成するように調節する。あるいは、抗体は徐放製剤として投与し得、この場合はより少なく頻繁な投与を必要とする。投薬量および頻度は患者中の抗体の半減期に依存して変動する。一般に、ヒト抗体は最長半減期を示し、次いでヒト化抗体、キメラ抗体およびヒト以外の抗
体である。投薬量および投与頻度は、処置が予防的であるか治療的であるかに依存して変動し得る。予防的応用において、比較的低用量を長期間にわたり比較的頻繁でない間隔で投与する。若干の患者は彼らの生涯の残りの間処置を受領することを継続する。治療的応用においては、疾患の進行が低下若しくは終了するまで、および好ましくは患者が該疾患の症状の部分的若しくは完全な軽減を示すまで、比較的短い間隔での比較的高投薬量をときに必要とする。その後、該患者に予防的レジメンを投与し得る。
【０１５２】
剤をコードする核酸の用量は、患者あたり約１０ｎｇから１ｇまで、約１００ｎｇないし約１００ｍｇ、約１μｇないし約１０ｍｇ、若しくは約３０ないし約３００μｇのＤＮＡの範囲にわたる。感染性ウイルスベクターの用量は、用量あたり約１０から約１００、若しくは約１０３、約１０４、約１０５、約１０６、約１０７、約１０８、約１０９、約１０１０若しくはそれ以上のビリオンまで変動しうる。
【０１５３】
本発明の剤は、予防的および／若しくは治療的処置のため非経口、局所、静脈内、経口、皮下、くも膜下腔内、動脈内、頭蓋内、腹腔内、鼻内若しくは筋肉内手段により投与し得る。いくつかの方法において、剤は沈着物が蓄積した特定の組織に直接注入する（例えば頭蓋内注入）。いくつかの方法において、筋肉内注入若しくは静脈内注入を抗体の投与に使用する。いくつかの方法において、特定の治療抗体を頭蓋中に直接注入する。いくつかの方法において、抗体を徐放組成物、若しくはＭｅｄｉｐａｄＴＭ装置のような装置として投与する。
【０１５４】
本発明の剤は、場合によっては、アミロイド形成疾患の処置で少なくとも部分的に有効である他の剤とともに投与し得る。アミロイド沈着物が脳中に存在するアルツハイマー病およびダウン症候群の症例においては、本発明の剤は、血液脳関門を横断する本発明の剤の通過を増大させる他の剤とともにもまた投与し得る。
【０１５５】
本発明の剤は、しばしば、有効治療薬および多様な他の製薬学的に許容できる成分を含んでなる組成物として投与する。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（第１５版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、ペンシルバニア州イーストン、１９８０）を参照されたい。使用される特定の製剤は意図している投与様式および治療的応用に依存する。該組成物は、所望の製剤に依存して、動物若しくはヒト投与のための製薬学的組成物を処方するのに通例使用されるベヒクルと定義される、製薬学的に許容できる非毒性の担体若しくは希釈剤もまた包含し得る。希釈剤は該組合せの生物学的活性に悪影響を及ぼさないように選択する。こうした希釈剤の例は、限定されるものでないが、蒸留水、生理学的リン酸緩衝生理的食塩水、リンゲル液、ブドウ糖溶液およびハンクス液を挙げることができる。加えて、製薬学的組成物若しくは製剤は、他の担体、補助物質、若しくは非毒性の非治療的非免疫原性安定剤などもまた包含しうる。
【０１５６】
製薬学的組成物は、タンパク質、キトサンのような多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、コポリマー（ラテックス官能性化ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭビーズ、アガロース、セルロースなどのような）、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、および脂質凝集物（油滴若しくはリポソームのような）のような、大型のゆっくりと代謝される巨大分子もまた包含し得る。
【０１５７】
非経口投与のため、本発明の剤は、水、油、生理的食塩水、グリセロール若しくはエタノールのような無菌の液体であり得る製薬学的担体を含む生理学的に許容できる希釈剤中の物質の溶液若しくは懸濁液の注入可能な投薬量として投与し得る。ヒト投与のための非経口組成物は無菌、実質的に等張であり、そしてＧＭＰ条件下で作成される。加えて、湿潤若しくは乳化剤、界面活性剤、ｐＨ緩衝物質などのような補助物質が組成物中に存在し
得る。製薬学的組成物の他成分は、石油、動物、植物若しくは合成起源のもの、例えばラッカセイ油、ダイズ油および鉱物油である。一般に、プロピレングリコール若しくはポリエチレングリコールのようなグリコールは、とりわけ注入可能な溶液に好ましい液体担体である。抗体は、有効成分の徐放を可能にするような様式で処方し得るデポー注射剤若しくは植込み製剤の形態で投与し得る。例示的一組成物は、ＨＣｌで適するｐＨに調節された、５０ｍＭ Ｌ−ヒスチジン（任意）、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含有する水性緩衝液中で処方された５ｍｇ／ｍＬのモノクローナル抗体を含んでなる。
【０１５８】
典型的に、組成物は液体の溶液若しくは懸濁液いずれかのような注射液として製造し；注入前の液体ベヒクル中の溶液若しくは懸濁液に適する固体の形態もまた製造し得る。該製剤は、上で論考されたとおり、高められたアジュバント効果のため、乳化、あるいはリポソーム、またはポリラクチド、ポリグリコリド若しくはコポリマーのような微小粒子中に被包化もまたし得る（Ｌａｎｇｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９：１５２７−３３（１９９０）およびＨａｎｅｓら、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ、２８：９７−１１９（１９９７）を参照されたい）。本発明の剤は、有効成分の徐放若しくはパルス型放出を可能にするような様式で処方し得るデポー注射剤若しくは植込み製剤の形態で投与し得る。
【０１５９】
他の投与様式に適する付加的な製剤は、経口、鼻内および肺製剤、坐剤ならびに経皮適用を包含する。坐剤について、結合剤および担体は例えばポリアルキレングリコール若しくはトリグリセリドを包含し；こうした坐剤は、約０．５％ないし約１０％、若しくは約１％ないし約２％の範囲の有効成分を含有する混合物から形成し得る。経口製剤は、製薬学的等級のマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロースおよび炭酸マグネシウムのような賦形剤を包含するがしかしこれらに限定されない。これらの組成物は、典型的に、溶液、懸濁剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放製剤若しくは散剤の形態をとり、そして約１０％ないし約９５％、若しくは約２５％ないし約７０％の有効成分を含有する。
【０１６０】
局所適用は経皮若しくは皮内送達をもたらし得る。局所投与は、コレラ毒素若しくは解毒誘導体またはそれらのサブユニット、あるいは他の類似の細菌毒素との剤の共投与により助長し得る（Ｇｌｅｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３９１：８５１（１９８８）を参照されたい）。共投与は、成分を混合物として、または化学的架橋若しくは発現により融合タンパク質として得られた結合分子として使用することにより達成し得る。あるいは、経皮送達は皮膚貼付剤を使用して若しくはトランスフェロソーム（ｔｒａｎｓｆｅｒｏｓｏｍｅ）を使用して達成し得る（Ｐａｕｌら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２５：３５２１−２４（１９９５）；Ｃｅｖｃら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１３６８：２０１−１５（１９９８））。
【０１６１】
本明細書で引用される全部の文書はそっくりそのまま引用することによりここに本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１６２】
【図１】ヒト皮質培養物（ＨＣＣ）（上）若しくはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（下）被覆プレートでのＡβ網目構造を具体的に説明する。
【図２】ＨＣＣでのＡβ網目構造形成および神経毒性双方に対するβ１インテグリンサブユニットの効果を具体的に説明する。図２ＡはＨＣＣでのβ１インテグリンサブユニット発現を具体的に説明する。図２Ｂは抗β１抗体１９６５の非存在（上）若しくは存在（下）下のＨＣＣでの７２時間Ａβ網目構造形成を具体的に説明する。図２Ｃは、β１インテグリンサブユニット阻止抗体とプレインキュベートしたＨＣＣでの神経毒性の阻害を具体的に説明する。エラーバーは（ｎ＝３）ウェルからの標準偏差を表す。
【図３Ａ】ＨＣＣでのＡβ網目構造形成および神経毒性に対するα２およびαｖインテグリンサブユニットの効果を具体的に説明する。
【図３Ｂ】抗α２（中）若しくは抗αｖ（下）抗体の非存在（上）若しくは存在下でプレインキュベートしたＨＣＣでの７２時間Ａβ網目構造形成を具体的に説明する。
【図３Ｃ】β１インテグリンサブユニット阻止抗体とプレインキュベートしたＨＣＣでの神経毒性を具体的に説明する。
【図４】ＨＣＣでのα２およびαｖ発現を具体的に説明する。
【図５】Ａβ網目構造形成および神経毒性の阻害における抗ラミニン抗体の効果を具体的に説明する。図５Ａは抗ラミニン抗体の非存在（上）若しくは存在（下）下でプレインキュベートしたＨＣＣでの７２時間Ａβ網目構造形成を具体的に説明する。図５Ｂは抗ラミニン抗体とプレインキュベートしたＨＣＣでの神経毒性を具体的に説明する。エラーバーは（ｎ＝３）ウェルからの標準偏差を表す。図５Ｃは抗コラーゲン抗体とプレインキュベートしたＨＣＣでの神経毒性を具体的に説明する。エラーバーは（ｎ＝３）ウェルからの標準偏差を表す。
【図６】ＨＣＣでのＡβシグナル伝達経路の活性化を具体的に説明する。図６Ａは、Ａβ処理したＨＣＣでの接着斑キナーゼ（Ｆａｋ）と会合したパキシリンのチロシンリン酸化を具体的に説明する。図６Ｂは、Ａβ処理したＨＣＣでのプロリンリッチチロシンキナーゼ（Ｐｙｋ２）と会合したパキシリンのチロシンリン酸化を具体的に説明する。
【図７】ヒト皮質ニューロンを１時間播種し、次いで吸引かつ可溶性アミリンで処理する場合の１日後の毒性を具体的に説明する。インテグリン若しくはインテグリンサブユニット抗体を種（ｓｅｅｄ）および可溶性アミリンの存在下で細胞に添加して毒性を阻害し得る。種および可溶性アミリン単独は毒性でない。しかしながら、細胞を１時間播種し次いで吸引かつ可溶性アミリンで処理する場合、該アミリンは毒性である。
【図８】インテグリンおよびインテグリンサブユニット抗体、とりわけ抗ラミニン、抗β１、抗αｖおよび抗α２抗体がアミリン毒性に対し保護することを具体的に説明する。
【図９Ａ−９Ｂ】細胞を種アミリンに１時間曝露した後のアミリン２成分毒性の阻害パーセントにより示されるところの、アミリン毒性に対する保護におけるインテグリン、若しくは抗αｖβ３抗αｖを包含するインテグリンサブユニット抗体；およびサイトカラシンＤの効果を具体的に説明する。
【図１０Ａ】抗αｖインテグリン抗体１８Ｃ７がｉｎ ｖｉｔｒｏで歯状回中の合成ＡβによるＬＴＰの阻害を抑制することを具体的に説明する。
【図１０Ｂ】抗αｖインテグリン抗体２０Ａ９がｉｎ ｖｉｔｒｏで歯状回中の合成ＡβによるＬＴＰの阻害を抑制することを具体的に説明する。
【図１０Ｃ】抗αｖインテグリン抗体１７Ｅ６がｉｎ ｖｉｔｒｏで歯状回中の合成ＡβによるＬＴＰの阻害を抑制することを具体的に説明する。
【図１１Ａ】対照抗αｖ抗体２７／１がＡβによるＬＴＰの抑制を予防しなかったことを具体的に説明する。
【図１１Ｂ】対照抗αｖ抗体７Ｈ１０がＡβによるＬＴＰの抑制を予防しなかったことを具体的に説明する。
【図１２Ａ】可溶性Ａβがｉｎ ｖｉｖｏでＣＡ１領域でＬＴＰを阻害することを具体的に説明する。
【図１２Ｂ】抗αｖインテグリン抗体１７Ｅ６がｉｎ ｖｉｖｏでＣＡ１領域での可溶性ＡβによるＬＴＰの阻害を抑制することを具体的に説明する。
【図１２Ｃ】ＳＭ２５６がｉｎ ｖｉｖｏでＣＡ１領域での可溶性ＡβによるＬＴＰの阻害を抑制することを具体的に説明する。
【図１３Ａ】αｖ含有インテグリンリガンドＳＭ２５６がＡβによるＬＴＰの阻害を抑制することを具体的に説明する。
【図１３Ｂ】αｖ含有インテグリンリガンド、スーパーフィブロネクチンがＡβによるＬＴＰの阻害を抑制することを具体的に説明する。
【図１３Ｃ】αｖ含有インテグリンリガンド、エキスタチンがＡβによるＬＴＰの阻害を抑制することを具体的に説明する。
【実施例】
【０１６３】
実施例１〜５の材料および方法
抗体の供給源
【０１６４】
【表１】
【０１６５】
組織培養
組織培養プレートを１５０ｍＭホウ酸ナトリウム、ｐＨ８．５中ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）で被覆し、そして室温で一夜インキュベートした。細胞を添加する前にウェルをＰＢＳで洗浄し、そして細胞がプレーティングの準備ができるまで最小必須培地（１０％ＦＢＳを含むＭＥＭ）を添加した。ヒト胎児大脳皮質（Ｅ１３−Ｅ１６）をハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）ですすいだ。組織をＨＢＳＳ中１ｍｇのＤＮアーゼ中で摩砕した。この懸濁液を１００ミクロンのナイロン細胞濾過器で濾過し、そして２５０×ｇで５分間遠心した。細胞をトリプシンに再懸濁しかつ３７℃で２０分間インキュベートした。改変最小必須培地（１０％ＦＢＳおよび１ｍｇのＤＮアーゼを含むＭＭＥＭ）を添加しそして細胞を再懸濁し；その後遠心分離により再度収集した。Ｂ２７を含有するＭＭＥＭに細胞を再懸濁し、そして、洗浄したＰＥＩ被覆プレート中、９６ウェルプレートに１２５，０００細胞／ウェルで、若しくは６ウェルプレートに２５０万細胞／ウェルで蒔いた。ヒト皮質培養物（ＨＣＣ）は処理前に２週ごとの培地交換を伴い３週間インキュベートした。
【０１６６】
Ａβ生成
Ａβは、二重蒸留水（ｄｄＨ２Ｏ）をＡβに添加して１ｍＭストックを構成することにより生成した。これを３７℃で３日間エイジングし、アリコートに分割しそして−２０℃で凍結保存した。可溶性Ａβは、ＤＭＳＯをＡβに添加して７．５ｍＭストックを作成すること、３０分間超音波処理すること、アリコート分割することおよび−２０℃で凍結す
ることにより作成した。神経毒性Ａβは、ｄｄＨ２ＯをＡβに添加すること、アリコート分割することおよび−２０℃で凍結することにより生成した。
【０１６７】
ＨＣＣライセートからのインテグリン免疫沈降
６ウェルプレート中のＨＣＣを、メチオニンを含まない培地中１００μＣｉ／ｍｌの３５Ｓ−メチオニンで一夜標識した。細胞を洗浄し、２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．１％ＳＤＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ ＥＧＴＡで溶解し、そして２６ゲージ針を３回通過させた。不溶性物質を１５，０００ｒｐｍで４℃で１５分間の遠心分離により除去した。ライセートを、プロテインＡビーズに結合したウサギ抗マウス（ＲＡＭ）抗体で前浄化し、そしてインテグリンサブユニット特異的抗体（β１についてＬｉａ１／２、α１についてＴＳ２／７、α２についてＧｉ９、α３についてＰ１Ｂ５、α４についてＡＮ１００２２６ｍ、α５についてＡｂ０７７１、α６についてＧｏＨ３、α９についてＹ９Ａ２およびαｖについてＶＮＲ１４７）で免疫沈降した。免疫沈降物を１ｍｌの２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ １５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．５ｍＭ ＥＧＴＡで３回洗浄した。免疫沈降したサンプルを８％トリス−グリシンゲル（Ｎｏｖｅｘ）で分離しかつ固定し；ゲルを乾燥し、そしてゲル中の３５Ｓ標識タンパク質をオートラジオグラフィーにより可視化した。
【０１６８】
Ａβ免疫蛍光
Ａβで７２時間処理したＨＣＣを４％パラホルムアルデヒドで固定し、５μｇ／ｍｌの抗Ａβ−３Ｄ６−ビオチンで染色し、そして１０μｇ／ｍｌのストレプトアビジン−ＦＩＴＣ（Ｊａｃｋｓｏｎ）で可視化した。
【０１６９】
ヒト皮質ニューロン中のＡβ神経毒性
ＨＣＣを、グルタミンおよびペニシリン／ストレプトマイシンを補充した神経培地（ＭＥＭ）（基礎培地）中で抗体若しくはリガンドで３０分間処理した。基礎培地中１μモル濃度のＡβを１時間添加した。培地を除去し、そしてＨＣＣを抗体若しくはリガンドおよび基礎培地中２０μＭ可溶性Ａβで３日間処理した。３日目に、基礎培地中１０％アラマーブルー中で２時間インキュベートすることにより毒性を測定した。蛍光レベルを三重で対照およびＡβ処理したウェルに関して測定した。
【０１７０】
インテグリンヘテロ二量体会合
Ｎ−２（ＢｏｔｔｅｎｓｔｅｉｎのＮ−２処方、例えばカタログ番号１７５０２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．、カリフォルニア州カールズバッド）を補充したＭＭＥＭ培地中の６ウェルプレート中のＨＣＣを湿潤氷上に置き、ＰＢＳで洗浄し、２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．１％ＳＤＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．５ｍＭ ＥＧＴＡで溶解し、そして２６ゲージ針を３回通過させた。不溶性物質を１５，０００ｒｐｍで４℃で１５分間の遠心分離により除去した。ライセートをプロテインＡビーズで前浄化し、そして抗β１インテグリンＬｉａ１／２（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ）およびＲＡＭ／プロテインＧビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用してβ１インテグリンを免疫沈降した。免疫沈降物を１ｍｌの２５ｍＭ
Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ １５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．５ｍＭ ＥＧＴＡで３回洗浄した。免疫沈降したサンプルを４〜１２％トリス−グリシンゲル（Ｎｏｖｅｘ）で分離し、そして抗α２インテグリン（ＣｈｅｍｉｃｏｎからのＡＢ １９３６）若しくは抗αｖインテグリンＭＡＢ １９６０（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）でウエスタンブロットした。
【０１７１】
パキシリンリン酸化のＡβ誘導
神経毒性Ａβを、Ｎ−２を補充した基礎培地中の６ウェルプレート中ＨＣＣに０分ない
し２４時間添加した。ＨＣＣを湿潤氷上に置き、ＰＢＳで洗浄し、２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．１％ＳＤＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．５ｍＭ ＥＧＴＡで溶解し、そして２６ゲージ針を３回通過させた。不溶性物質を１５，０００ｒｐｍで４℃で１５分間の遠心分離により除去した。ライセートをプロテインＡビーズで前浄化し、そして抗Ｆａｋ（ＵＢＩ）若しくは抗Ｐｙｋ２抗体（ＵＢＩ）およびプロテインＡビーズを使用してそれぞれＦａｋ若しくはＰｙｋを免疫沈降した。免疫沈降物を１ｍｌの２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．５ｍＭ ＥＧＴＡで３回洗浄した。免疫沈降したサンプルを８％トリス−グリシンゲル（Ｎｏｖｅｘ）で分離し、そして抗ホスホチロシン（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｌａｂｓからのＲＣ２０）および抗パキシリン（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｌａｂｓ）でウエスタンブロットした。
【実施例１】
【０１７２】
ヒト皮質ニューロンでの免疫蛍光パターン
本実施例は、アルツハイマー病（ＡＤ）の海馬および皮質ニューロンで生じかつ関連した神経毒性を表すＡβ斑のｉｎ ｖｉｔｒｏ組織培養物モデルを生じる。該モデルは、ＡＤで遂げられるニューロンを可能な限り緊密に表す初代ヒト皮質ニューロン培養物を使用する。これらの培養物へのＡβの添加は、ニューロンで１〜３日にわたり生じかつその後ニューロンで毒性を引き起こす、再現可能なＡβ網目構造をもたらす。ＨＣＣを伴わないプレート上でインキュベートしたＡβもまた網目構造として染色したが、しかしＨＣＣで見られるものより短く薄くかつより直線状であった伸長を伴うより均一なパターンを一貫して示した。図１Ａおよび１ＢはＨＣＣの存在および非存在下の網目構造を比較する。
【実施例２】
【０１７３】
β１インテグリンはＡβ網目構造および神経毒性を媒介する
網目構造がインテグリンにより形成されるもののような細胞外マトリックスに似ていたため、インテグリンがＨＣＣ中に存在するかどうか；およびその場合、インテグリンがＨＣＣでのＡβ網目構造形成を助長したかどうかを検討した。ゲル電気泳動はβ１インテグリンがＨＣＣで発現されていることを示した。ＭＡＢ１９６５を包含するβ１インテグリン阻止抗体が、Ａβ網目構造パターンがＨＣＣで形成されることを阻止し得たこともまた見出された（図２Ａ（抗体なし）を図２Ｂ（抗体を伴う）と比較されたい）。これらの培養物でＡβにより生成される毒性に該網目構造パターンが必要であったかどうかもまた検討した。これを行うため、Ａβ網目構造を阻止することが示されたβ１インテグリン阻止抗体（ＡＩＩＢ２およびＭＡＢ１９６５）とＨＣＣをインキュベートした。これらの抗体はＡβ誘発性の毒性もまた用量依存性の様式で阻害した（図２Ｃ）。抗体ＡＩＩＢ２はＡβ毒性の非常に強力な阻害剤であり、１７０ｎｇ／ｍｌすなわち１ｎＭのＩＣ５０を表した。対照的に、対照抗体は毒性に対する影響を有しなかった。
【実施例３】
【０１７４】
α２およびαｖインテグリンに結合する剤は網目構造およびＡＢ媒介性神経毒性を阻害する
β１インテグリンは数種のαサブユニットと対形成して多様なヘテロ二量体を形成し得る。従って、どのαインテグリンサブユニットがＨＣＣ中に存在したかを試験した。α２、α３、α４、α５、α６およびαｖインテグリンがＨＣＣ中で発現された。α１およびα９インテグリンはＨＣＣ中で発現されなかった。全部のこれらのαインテグリンサブユニットに対する阻害抗体を、Ａβ網目構造形成を阻害しかつその神経毒性を阻害するそれらの能力について試験した。α２およびαｖに対する阻害抗体はＡβ網目構造形成を阻害した（図３Ａ）。これらの抗体はＨＣＣでのＡβの神経毒性効果も阻害した（図３Ｂ）。これらの特定のインテグリンに対する特異性を示すため、２〜３種の阻害抗体をこれらの
インテグリンのそれぞれおよび同様に他のインテグリンサブユニットに対し試験した。網目構造形成および神経毒性の双方を媒介するα１、α２およびαｖインテグリンに対する非常に明瞭な特異性が見出された（表１）。
【０１７５】
【表２】
【０１７６】
毒性に対する抗α６抗体の弱いがしかし再現可能な効果が観察された。最後に、これらの影響がインテグリンに向けられかつＡβ重合を非特異的に妨害しなかったことを確認するため、Ａβ毒性をヒトおよびマウス皮質培養物で並べて分析した。これらのアッセイで使用した抗体はマウスインテグリンと交差反応しない。抗ヒトインテグリン抗体はヒト培養物でＡβ毒性を阻害し得たがしかしマウス培養物ではし得ず、該抗体が毒性を阻害するためにＡβと非特異的に相互作用しなかったことを示唆した。ＨＣＣライセートをβ１抗体で免疫沈降すること、ならびにその後沈降した物質をα２およびαｖに対する抗体でブロッティングすることにより、α２およびαｖがＨＣＣ細胞中でβ１インテグリンと会合したことが確認された。これらの結果は、α２β１およびαｖβ１のヘテロ二量体が、Ａ
β網目構造形成および神経毒性の機能的メディエーターであることを示す。
【実施例４】
【０１７７】
フィブロネクチンおよび抗ラミニン抗体はＡＢ網目構造形成および神経毒性を阻害する
インテグリン／細胞外網目構造の他成分をＡβ網目構造形成および神経毒性の媒介への関与について検討した。これらの他成分は、αｖβ１インテグリンリガンド、フィブロネクチン、およびスーパーフィブロネクチン（網目構造を形成するフィブロネクチンドメインの多量体）、ならびにα２β１リガンド、コラーゲンおよびラミニンを包含した。ラミニンは２鎖β１およびγ１を有し、それらの双方はアルツハイマー病斑中で上昇している（Ｍｕｒｔｏｍａｋｉら、Ｊ．Ｎｅｕｒ．Ｒｅｓ．、３２：２６１−７３（１９９２））。フィブロネクチンおよびスーパーフィブロネクチンはＡβ網目構造形成および神経毒性を阻害することが可能であった（表１）。この結果はαｖβ１機能に対する影響についてＡβと競合するフィブロネクチンにより説明し得る。対照的に、αｖβ１リガンド、ラミニンは、Ａβ網目構造若しくは神経毒性を阻害することが可能でなかった（表１）。あるαｖβ１リガンドがそうでなかった場合にあるαｖβ１リガンドがなぜ保護的であったかを確定するため、抗ラミニン抗体を網目構造形成および神経毒性アッセイで試験した。２種のラミニン抗体はＡβ網目構造形成（図５Ａ）およびＡβ媒介性神経毒性（図５Ｂ）双方で高度に保護的であった。抗ラミニン抗体番号ＡＢ１９０１２は１ｎＭ未満のＩＣ５０を示した。対照的に、抗コラーゲン抗体はＡβ網目構造形成および神経毒性に対する影響を有しなかった（図５Ｃ）。
【実施例５】
【０１７８】
Ａβはパキシリンのチロシンリン酸化（インテグリンシグナル伝達経路の早期事象）を活性化する
細胞外マトリックスリガンドによるインテグリン活性化はＦａｋのような接着斑キナーゼの活性化およびその基質パキシリンのチロシンリン酸化に至る。Ａβがインテグリンシグナル伝達経路を同様に刺激していたかどうかを確定するため、ＨＣＣへのＡβ添加に際してのＦａｋ会合パキシリンのチロシンリン酸化パターン（図６Ａ）を分析した。Ｆａｋ会合パキシリンのチロシンリン酸化の一貫した活性化は見出されなかった。しかしながら、Ａβ刺激後のＰｙｋ２会合パキシリンのチロシンリン酸化の一貫した増大が観察された。Ｐｙｋ２もまた接着斑キナーゼであり、そして神経毒性につながる異常なＡβ／インテグリンシグナル伝達経路を媒介しているかもしれない（図６Ｂ）。ＦａｋよりむしろＰｙｋ２会合パキシリンのチロシンリン酸化の活性化は、これらの状態で毒性応答を引き起こすものでありうる。いずれの場合も、Ａβはインテグリンシグナル伝達経路の早期事象であるパキシリンのチロシンリン酸化を活性化し、Ａβ神経毒性シグナルがα２β１およびαｖβ１インテグリンシグナル伝達経路の直接の関与により媒介されうることを示す。
【実施例６】
【０１７９】
アミリン２成分毒性
ＣＰＲ，Ｉｎｃ．からの種（ｓｅｅｄ）若しくは凝集アミリン（１ｍＭ）（６４１−８０、ロットＮＧ−０２１３）を、２００μｌ水／ｍｇ粉末を添加することおよびその後該溶液を３７℃で３日間エイジングすることにより作成した。可溶性アミリン（５ｍＭ）は、４０μｌ ＤＭＳＯ／ｍｇ粉末を添加すること、および該混合物を水浴中で３０分間超音波処理することにより調製した。双方のストック溶液をアリコート分割しかつ使用の準備ができるまで凍結した。可溶性アミリンストックは、使用直前に培地で２０μＭに希釈し、そして水で前洗浄したＡｍｉｃｏｎ ３０フィルターで濾過した。濾過した物質をその後その適切な濃度に希釈した。
【０１８０】
ヒト皮質ニューロン（１２５，０００細胞／９６ウェル）を５μＭの種アミリン（１００μｌ／ウェル）で１時間処理した。細胞を吸引し、そして可溶性アミリンを１００μｌ
／ウェルあたり５μＭで戻した。化合物研究のため、可溶性アミリンを添加する前に５０μｌの２×化合物を添加した。
【０１８１】
図６はヒト皮質ニューロンを１時間播種し次いで吸引しかつ可溶性アミリンで処理した１日後の毒性を示す。インテグリン抗体を種および可溶性アミリンの存在下で細胞に添加して毒性を阻害した。図７は、数種のインテグリン抗体すなわち２０３４抗ラミニン、１９６５抗β１インテグリン、１９５８抗αｖ（ＶＮＲ）および１９５０抗α２が、アミリン２成分の毒性に対し細胞を保護したことを示す。図８は、アミリン２成分の毒性が、抗αｖβ３および抗αｖを包含する付加的なインテグリン抗体；ならびにサイトカラシンＤによりさらに阻害されることを示す。
【０１８２】
実施例７〜１１の材料および方法
薄片の調製
全実験はラット海馬（雄性、３〜４週齢、重量４０〜８０ｇ）若しくはマウス（雄性、３〜４月齢）の横断薄片で実施した。断頭後迅速に脳を取り出しかつ冷酸素添加（９５％Ｏ２／５％ＣＯ２）培地に入れた。Ｉｎｔｒａｃｅｌｌ Ｐｌｕｓ １０００を使用して３５０μｍの厚さで薄片を切断し、そして室温（２０〜２２℃）の酸素添加培地を含有する貯蔵容器に１時間入れた。薄片をその後浸積薄片のための記録チャンバーに移し、そして３０〜３２℃で５〜６ｍｌ／分の速度で連続灌流した。対照培地は（ｍＭで）ＮａＣｌ、１２０；ＫＣｌ ２．５、ＮａＨ２ＰＯ４、１．２５；ＮａＨＣＯ３ ２６；ＭｇＳＯ４、２．０；ＣａＣｌ２、２．０；Ｄ−グルコース １０を含有した。全溶液はＧＡＢＡＡ媒介性活性を阻害するため１００μＭピクロトキシン（Ｓｉｇｍａ）を含有した。
【０１８３】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ電気生理学的技術
標準的電気生理学的技術を使用して電場電位を記録した。双極絶縁タングステンワイヤ電極を使用して歯状回の内側貫通路にシナプス前刺激を適用し、また、ガラス電極を用い、歯状回の分子層の中１／３から０．０３３Ｈｚの対照試験周波数で興奮性シナプス後場電位（ＥＰＳＰ）を記録した。歯状回の内刃（ｉｎｎｅｒ ｂｌａｄｅ）を全研究で使用した。各実験で、入力−出力曲線（求心性刺激強度対ＥＰＳＰ振幅）を試験周波数でプロットした。全実験について、試験ＥＰＳＰの振幅を最大の１／３（約１．２ｍＶ）に調節した。ＬＴＰを８連の高頻度刺激（ＨＦＳ）により惹起し（８刺激のそれぞれは２００Ｈｚ、連続間間隔２ｓ）、正常の試験ＥＰＳＰ振幅の２倍の連続の初期ＥＰＳＰを惹起するようにＨＦＳの間に刺激電圧を増大した。ＬＴＰの対照（ベヒクル単独）および実験レベルを同一海馬から調製した薄片で測定した。ｐ−ＣＬＡＭＰ（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、米国カリフォルニア州）を使用して記録を解析した。本明細書に報告する値はｎ薄片の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．であった。Ｓｔｕｄｅｎｔの両側ｔ検定を統計学的比較に使用した。
【０１８４】
ｉｎ ｖｉｖｏ電気生理学
実験はウレタン（エチルカルバメート、１．５ｇｍ／ｋｇ ｉ．ｐ．）麻酔した雄性Ｗｉｓｔａｒラット（２５０〜３００ｇ）で実施した。体温は３７〜３７．３℃に維持した。動物の世話および実験プロトコルはアイルランド共和国保健省（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ
ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｉｒｅｌａｎｄ）により承認された。
【０１８５】
電極は以前に記述された（Ｋｌｙｕｂｉｎら、２００４、２００５）とおり作成しかつ植込んだ。簡潔には、捻りワイヤ双極電極をＴｅｆｌｏｎ被覆タングステンワイヤ（６２．５μｍ内核径、７５μｍ外径）から構築した。興奮性シナプス後場電位（ＥＰＳＰ）の単一経路記録を、同側のＳｃｈａｆｆｅｒ側枝−交連経路の刺激に応答する右海馬半球のＣＡ１領域中の放線状層から行った。電極植込み部位は十字縫合に関する定位座標を使用して同定し、記録部位は十字縫合の後方約３．４ｍｍかつ正中線の右約２．５ｍｍに位置
し、また、刺激電極は十字縫合の後方約４．２ｍｍかつ正中線の右約３．８に位置した。背側海馬のＣＡ１領域の放線状層中のワイヤ電極の最適深度は電気生理学的基準を使用して決定し、かつ、死後確認した。試験ＥＰＳＰは、０．０３３Ｈｚの周波数および最大の５０％のＥＰＳＰ振幅を与えるように調節した刺激強度で惹起した。ＬＴＰを誘導するためのＨＦＳプロトコルは、１０連続の２０刺激、刺激間間隔５ｍｓ（２００Ｈｚ）、連続間間隔２秒よりなった。強度は最大振幅の約７５％のＥＰＳＰを与えるようにＨＦＳの間に増大させた。
【０１８６】
サンプルを注入するため、ステンレス鋼製ガイドカニューレ（２２ゲージ、０．７ｍｍ外径、１３ｍｍ長さ）を、電極植込み直前に右側脳室の上（正中線の側方約１ｍｍおよび硬膜の表面の下約４ｍｍ）に植込んだ。内部カニューレ（２８ゲージ、０．３６ｍｍ外径）を介して脳室内（ｉ．ｃ．ｖ．）注入を行った。カニューレの配置の確認はｉ．ｃ．ｖ．注入後のインク色素の広がりを確認することにより死後に実施した。本明細書に報告する値はｎ薄片の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．であった。Ｓｔｕｄｅｎｔの両側ｔ検定を統計学的比較に使用した。
【０１８７】
剤
合成Ａβ（１−４２）をＢａｃｈｅｍから得た。ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験のため、合成Ａβ１−４２を水酸化アンモニウム（０．１％）中５０μＭのストック溶液として調製し、−２０℃で保存し、そしてその後各実験の直前に生理学的媒体に添加した。ｉｎ ｖｉｖｏ実験のため、合成Ａβ（１−４２）（Ｂａｃｈｅｍ）を氷冷ｍｉｌｌｉＱ水若しくはＴｅｐｌｏｗに再懸濁した。アリコートを取り出し、そして１００，０００ｇで３時間（原線維およびプロトフィブリル（ｐｒｏｔｏｆｉｂｒｉｌ）をペレットにすることが既知の条件）（Ｋｌｙｕｂｉｎら、２００４）遠心分離した。遠心分離後、アミノ酸分析により測定されるところの３０若しくは６４μＭの可溶性Ａβの最終濃度を有した上清を、小アリコートで−８０℃で保存した。
【０１８８】
以下のインテグリンαｖ抗体（全部ＩｇＧ１アイソタイプ）すなわち１８Ｃ７、１７Ｅ６および２０Ａ９（全部Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍから）を研究で使用した。使用した対照抗体は、ヒトＩＣＡＭ−１に対するＩｇＧ２ａマウス抗体７Ｈ１０およびＩｇＧ１アイソタイプ２７／１であった。使用した他の成分は、エキスタチン（Ｓｏｕｒｃｅ）、Ｖａｎ Ｍａｅｓら、１９９４の方法に従ってＥｌａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓにより製造されたＳＭ２５６（３−［１−［３−（Ｎ−イミダゾル−２−イルアミノ）プロピル］インダゾル−５−イルカルボニルアミノ］−２（Ｓ）−（２，４，６−トリメチルベンゼンスルホニルアミノ）プロピオン酸トリフルオロ酢酸塩）（ＥＬＮ １５１９９３として記録される）、スーパーフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ）およびファロイジン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）であった。ｉｎ ｖｉｖｏ実験において、ＳＭ２５６は生理的食塩水中Ｔｗｅｅｎ ８０（Ｓｉｇｍａ）の懸濁液中でｉ．ｐ投与のため調製した（１５ｖ／ｖ％）。
【実施例７】
【０１８９】
抗インテグリンαｖ抗体はｉｎ ｖｉｔｒｏで歯状回でのＬＴＰのＡβ媒介性阻害を予防する
ｉｎ ｖｉｔｒｏの歯状回での短いＨＦＳによるＬＴＰの誘導は、ＨＦＳ前３０分間のＡβの前灌流により予防され、以前の研究（Ｗａｎｇら、２００４ａ、ｂ、２００５）を確認した。従って、Ａβ（５００ｎＭ、ＬＴＰの最大阻害を引き起こすことが以前に見出された濃度（Ｗａｎｇら、２００４ａ））の存在下でのＬＴＰは、ＨＦＳの１時間後に基礎の１０５±３％であり（図１０Ａ）（ｎ＝５、Ｐ＜０．００１）、１５２±５％であった（図１０Ａ）対照ＬＴＰと比較して有意に低下された。
【０１９０】
αｖインテグリンサブユニットに対する選択的抗体を灌流することの効果をＬＴＰのＡβ媒介性阻害に対し検討した。１８Ｃ７、２０Ａ９および１７Ｅ６と命名される、αＶ含有インテグリンに対する３種の異なる抗体を検討した。該抗体のいずれも基礎のＥＰＳＰ若しくはＬＴＰ誘導に対するいかなる影響も有しなかった。しかしながら、ＬＴＰのＡβ媒介性阻害はαｖ抗体のそれぞれの灌流により予防された。図１０Ａ〜１０Ｃは、全３種のαｖ抗体が、介在対照実験と比較してＬＴＰに対するＡβの阻害効果の予防において有効であったことを示す。従って、ＬＴＰは、Ａβならびに抗インテグリン抗体１８Ｃ７、２０Ａ９および１７Ｅ６の存在下で１４４±６％、１３７±７％および１５３±１１％であった。該値は対照ＬＴＰと比較して有意に異ならなかった（各実験についてｎ＝５、Ｐ＞０．０１）。各抗体実験と平行して実施した介在薄片において、ＬＴＰはＡβ単独の存在下で１０５±３％、１０５±６％および１０３±３％であり、値はＬＴＰに対するＡβ単独のものと有意に異ならなかった（各実験についてｎ＝５、Ｐ＞０．０１）。
【０１９１】
対照的に、２種の対照抗体はＬＴＰのＡβ媒介性阻害を有意に予防しなかった。ＬＴＰは、Ａβおよび対照抗体２７／１の存在下で１０５±６％（図１１Ａ）、ならびに、Ａβおよび対照抗体７Ｈ１０（アイソタイプ対照）の存在下で１０７±８％であった（図１１Ｂ）（ｎ＝５、Ｐ＞０．０５）。
【実施例８】
【０１９２】
抗αｖインテグリン抗体はｉｎ ｖｉｖｏでＣＡ１でのＬＴＰのＡβ媒介性阻害を予防する
ウレタン麻酔したラットのＣＡ１でのＬＴＰの誘導は、ＨＦＳ１０分前の可溶性の原線維を含まないＡβのｉ．ｃ．ｖ．注入により予防され、以前の研究（Ｋｌｙｕｂｉｎら、２００４）を確認した。対照ベヒクル注入動物で、ＬＴＰはＨＦＳの３時間後に基礎の１４０±５％であった（ｎ＝６）。可溶性の原線維を含まないＡβ（５μｌ中５０ｐｍｏｌ、ｎ＝５）の存在下でＬＴＰは強く阻害され、１０５±５％であり（図１２Ａ）、対照ＬＴＰと比較して有意に低下された（Ｐ＜０．００１）。αｖインテグリンサブユニットに対する選択的抗体１７Ｅ６（１０μｌ中２７．９μｇ）はＬＴＰのＡβ媒介性阻害を予防し、１３５±８％であった（ｎ＝５、ベヒクルおよびＡβに比較してＰ＜０．０１；ベヒクルおよびベヒクルに比較してＰ＞０．０５）。アイソタイプ（ＩｇＧ１マウス）対照抗体２７／１（１０μｌ中２７．９μｇ）はＬＴＰのＡβ媒介性阻害に影響を及ぼすことに失敗した（１０３±６％、ｎ＝６、ベヒクルおよびＡβに比較してＰ＞０．０５；ベヒクルおよびベヒクルに比較してＰ＜０．０１）（図１２Ｂ）。
【実施例９】
【０１９３】
αｖ含有インテグリンの小分子非ペプチド拮抗剤はｉｎ ｖｉｔｒｏで歯状回およびｉｎ
ｖｉｖｏでＣＡ１でのＬＴＰのＡβ媒介性阻害を予防する
ＳＭ２５６は強力なαｖ拮抗剤でありかつαｖ媒介性の細胞接着を阻害する非ペプチド剤である（Ｖａｎ Ｗａｅｓら、２０００）。ＳＭ２５６（１０μＭ）単独はＬＴＰを阻害せず、１４８±７％であった。しかしながら、ＳＭ２５６はＬＴＰのＡβ媒介性阻害を予防し、１２９±５％であった（図１３Ａ）（ｎ＝５、Ｐ＜０．０１）。
【０１９４】
同様に、ＳＭ２５６の全身前投与は、可溶性の原線維を含まないＡβのｉ．ｃ．ｖ．注入により引き起こされるｉｎ ｖｉｖｏのＣＡ１でのＬＴＰの阻害を無効にした。選ばれたＳＭ２５６の用量（１．２ｍｌベヒクル中４０ｍｇ、ｉ．ｐ．）は基礎のシナプス伝達若しくは対照ＬＴＰに対する認識可能な影響を有しなかった（図１２Ｃおよびデータは示されない）。ＳＭ２５６の４０分後かつＨＦＳの１０分前に注入した可溶性Ａβ（５０ｐｍｏｌ、ｉ．ｃ．ｖ．）はＬＴＰを阻害することに失敗し、１３３±５％であり（図１２Ｃ、ｎ＝４；ＨＦＳ前基礎に比較してＰ＜０．０１；末梢ベヒクルおよび中枢ベヒクル（１４４±９％、ｎ＝３）に比較してＰ＞０．０５）、また、ベヒクルの末梢注入次いでＡ
βの中枢注入を与えた動物のＬＴＰの大きさと有意に異ならなかった（１０３±１０％、ｎ＝４、Ｐ＜０．０５）。
【実施例１０】
【０１９５】
スーパーフィブロネクチンはｉｎ ｖｉｔｒｏで歯状回でのＬＴＰのＡβ媒介性阻害を予防する
スーパーフィブロネクチンはαｖβ１のリガンドである（Ｍｏｒｌａら、１９９４）。スーパーフィブロネクチン（１μＭ）単独はＬＴＰを阻害せず、１５５±２％であった。しかしながら、スーパーフィブロネクチンはＬＴＰのＡβ媒介性阻止を予防し、１４７±６％であった（図１３Ｂ）（ｎ＝５、Ｐ＜０．０１）。
【実施例１１】
【０１９６】
ディスインテグリンはｉｎ ｖｉｔｒｏで歯状回でのＬＴＰのＡβ媒介性阻害を予防する
ディスインテグリン、エキスタチンの効果もまたＬＴＰのＡβ惹起性の阻害に対して検討した。ディスインテグリンは、非常に高い親和性でかつＲＧＤペプチドより強くインテグリンに結合する、インテグリンのアンタゴニストである蛇毒から単離された小型の４〜１０ｋＤａのＲＧＤを含有するシステイン豊富なペプチドである（Ｇａｎら、１９８８）。エキスタチンはαｖ／β３およびα５／β１を包含するＲＧＤ依存性インテグリンを阻害することが示された（Ｋｕｍａｒら、１９９７）１種のこうしたディスインテグリンである。エキスタチン（５０ｎＭ）単独はＬＴＰを阻害せず、１５８±５％であった。しかしながら、エキスタチンはＬＴＰのＡβ媒介性阻止を予防し、１４３±６％、ｎ＝５、Ｐ＜０．０１であった（図１３Ｃ）。
【０１９７】
上で引用された全部の刊行物、特許および特許出願は、各個々の刊行物若しくは特許出願が引用することによりそのように組み込まれることをとりわけかつ個々に示された場合と同一の程度まで全部の目的上そっくりそのまま引用することにより組み込まれる。本発明は明瞭さおよび理解の目的上具体的説明および実施例として若干詳細に記述されたとは言え、付随する請求の範囲の範囲内である種の変更および改変を実施しうることが明らかであろう。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１種若しくはそれ以上の剤がＬＴＰのアミロイド媒介性阻害を抑制するような条件下でインテグリンサブユニットαｖに結合する１種若しくはそれ以上の剤の有効投薬量を投与することを含んでなる、長期増強（ＬＴＰ）のアミロイド媒介性阻害の抑制方法。
【請求項２】
１種若しくはそれ以上の剤がＬＴＰのアミロイド媒介性阻害を抑制するような条件下でインテグリンサブユニットαｖに結合する１種若しくはそれ以上の剤の有効投薬量を投与することを含んでなる、Ａβ沈着を特徴とするアミロイド形成疾患の処置若しくは予防方法。
【請求項３】
アミロイド形成疾患がアルツハイマー病若しくは軽度認知障害である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
アミロイド形成疾患がびまん性レビー小体病若しくはパーキンソン病である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
インテグリンサブユニットαｖに結合する最低２剤の有効投薬量が投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
剤が、Ａβ産生の阻害剤、Ａβ沈着の阻害剤、Ａβ消失のメディエーター、アミロイド斑消失のメディエーター、Ａβ神経毒性の阻害剤、Ａβ凝集の阻害剤およびＡβ解離のメディエーターよりなる群から選ばれる第二の剤とともに投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
Ａβ産生の阻害剤がγ分泌酵素阻害剤である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
Ａβ産生の阻害剤がβ分泌酵素阻害剤である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
剤がＡβに対する抗体とともに投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
剤がＲＧＤ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）モチーフを含んでなるペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
剤がαｖβ１インテグリンのリガンドである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
剤がフィブロネクチン若しくはスーパーフィブロネクチンである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
剤が、αｖインテグリンサブユニット発現細胞のビトロネクチン若しくはフィブロネクチンへの接着を阻害する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
剤が、αｖインテグリンサブユニット発現細胞のオステオポンチンへの接着を阻害する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
剤がモノクローナル若しくはポリクローナル抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
剤が１８Ｃ７、２０Ａ９および１７Ｅ６から選択される抗体と同一のエピトープを認識する抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
抗体がヒト化抗体、キメラ抗体およびナノボディから選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
剤が１８Ｃ７、２０Ａ９および１７Ｅ６から選択される抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
剤がインテグリンサブユニットαｖへの結合について１８Ｃ７、２０Ａ９および１７Ｅ６から選ばれる抗体と競合する、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
剤が、それらの立体異性体、若しくはそれらの立体異性体の混合物、またはそれらの製薬学的に許容できる塩の形態を包含する、式ＩａおよびＩｂの化合物
【化１】
ここで
Ｘ１およびＸ３は窒素若しくは炭素から独立に選択され；
Ｒ１は
【化２】
から選択され；
ここで、上の複素環は、ＮＨ２、ハロゲン、ＮＯ２、ＣＮ、ＣＦ３、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６アルキルおよびＣ３−Ｃ７シクロアルキルよりなる群から選択される０〜２置換基で場合によっては置換されており；
Ｕは−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｔＱ（ＣＨ２）ｍ−および−Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−１−から選択され、ここでメチレン基の１個は場合によってはＲ７で置換されており
；
Ｑは、１，２−フェニレン、１，３−フェニレン、２，３−ピリジニレン、３，４−ピリジニレンおよび２，４−ピリジニレンから選択され；
Ｒ６はＨ、Ｃ１−Ｃ４アルキルおよびベンジルから選択され；
Ｒ７はＣ１−Ｃ６アルキル、Ｃ３−Ｃ７シクロアルキル、Ｃ４−Ｃ１１シクロアルキルアルキル、アリール、アリール（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、ヘテロアリールおよびヘテロアリール（Ｃ１−Ｃ６アルキル）から選択され；
Ｒ１０は、Ｈ、ハロゲン、ＣＯ２Ｒ１７、ＣＯＮＲ１７Ｒ２０、０〜１個のＲ１５若しくは０〜１個のＲ２１で置換されているＣ１−Ｃ６アルキル、０〜１個のＲ２１で置換されているＣ１−Ｃ４アルコキシ、０〜１個のＲ１５若しくは０〜１個のＲ２１で置換されているＣ３−Ｃ７シクロアルキル、０〜１個のＲ１５若しくは０〜１個のＲ２１で置換されているＣ４−Ｃ１１シクロアルキルアルキル、および０〜１個のＲ１５若しくは０〜２個のＲ１１若しくは０〜１個のＲ２１で置換されているアリール（Ｃ１−Ｃ６アルキル）−から選択され；
Ｒ１１は、Ｈ、ハロゲン、ＣＦ３、ＣＮ、ＮＯ２、ヒドロキシ、ＮＲ２Ｒ３、０〜１個のＲ２１で置換されているＣ１−Ｃ４アルキル、０〜１個のＲ２１で置換されているＣ１−Ｃ４アルコキシ、０〜１個のＲ２１で置換されているアリール、０〜１個のＲ２１で置換されているアリール（Ｃ１−Ｃ６アルキル）−、０〜１個のＲ２１で置換されている（Ｃ１−Ｃ４アルコキシ）カルボニル、０〜１個のＲ２１で置換されている（Ｃ１−Ｃ４アルキル）カルボニル、０〜１個のＲ２１で置換されているＣ１−Ｃ４アルキルスルホニル、および０〜１個のＲ２１で置換されているＣ１−Ｃ４アルキルアミノスルホニルから選択され；
Ｗは−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒ１３）−であり；
Ｘは−ＣＨ（Ｒ１４）−ＣＨ（Ｒ１５）−であり；
Ｒ１３はＨおよびＣＨ３から選択され；
Ｒ１４は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アリールおよびヘテロアリールから選択され、前記アリール若しくはヘテロアリール基は、Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、アリール、ハロ、シアノ、アミノ、ＣＦ３およびＮＯ２から選択される０〜３個の置換基で場合によっては置換されており；
Ｒ１５はＨおよびＲ１６から選択され；
Ｙは−ＣＯＲ１９であり；
Ｒ１６は
−ＮＨ（Ｒ２０）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ１７、
−Ｎ（Ｒ２０）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ１７、
−Ｎ（Ｒ２０）−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ｒ１７、
―Ｎ（Ｒ２０）ＳＯ２−Ｒ１７、および
−Ｎ（Ｒ２０）ＳＯ２−Ｎ（Ｒ２０）Ｒ１７
から選択され、
Ｒ１７は、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ３−Ｃ１１シクロアルキル、アリール（Ｃ１−Ｃ６アルキル）−、（Ｃ１−Ｃ６アルキル）アリール、ヘテロアリール（Ｃ１−Ｃ６アルキル）−、（Ｃ１−Ｃ６アルキル）ヘテロアリール、ビアリール（Ｃ１−Ｃ６アルキル）−、ヘテロアリール若しくはアリールから選択され、前記アリール若しくはヘテロアリール基は、Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、ハロ、シアノ、アミノ、ＣＦ３およびＮＯ２よりなる群から選択される０〜３置換基で場合によっては置換されており；
Ｒ１９は−Ｏ−（ＣＨ２）ｋＮ＋（Ｒ２２）（Ｒ２３）（Ｒ２４）Ｚ−であり；
Ｚ−は、ハロゲン化イオン、重硫酸イオン、硫酸イオン、リン酸水素イオン、リン酸イオン、トルエンスルホン酸イオン、メタンスルホン酸イオン、エタンスルホン酸イオン、酢酸イオン、トリフルオロ酢酸イオン、クエン酸イオン、シュウ酸イオン、コハク酸イオンおよびマロン酸イオンから選択される製薬学的に許容できる陰イオンであり；
Ｒ２２、Ｒ２３およびＲ２４はＨ、Ｃ１−Ｃ４アルキルおよびＣ４−Ｃ１１シクロアルキルアルキルから独立に選択されるか；
あるいは、Ｒ２２およびＲ２３は、一緒になって、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１〜２個のヘテロ原子を含有する５〜７員の複素環系を形成し得、ならびにＲ２４は上のとおり定義されるか、または、Ｒ２２、Ｒ２３およびＲ２４は、一緒になって、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１〜２個のヘテロ原子を含有する複素二環系を形成し得；
Ｒ２０はＨおよびＣＨ３から選択され；
Ｒ２１はＣＯＯＨおよびＮＲ６２から選択され；
ｋは２であり；
ｍは０および１から選択され；
ｎは１〜４であり；ならびに
ｔは０および１から選択される、
から選択される化合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
剤が、式ＩＩ：
【化３】
ここでＲ１９は−Ｈ、−ＣＨ３および−ＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋（ＣＨ３）３から選ばれる
の化合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
Ｈ１９が−Ｈである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
Ｈ１９が−ＣＨ３である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
Ｒ１９が−ＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋（ＣＨ３）３である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
剤がディスインテグリンである、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
剤がエキスタチンである、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
剤がヒト抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
剤がヒト化抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
剤がキメラ抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
剤がナノボディである、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
剤が抗体フラグメントである、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
剤が、抗体の１種若しくはそれ以上のＨ鎖、Ｌ鎖、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ）ｃ若しくはＦ（ｖ）、またはそれらのいずれかの組合せを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
剤が抗体でありかつ該抗体のアイソタイプがＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４である、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
剤が抗体でありかつ該抗体のアイソタイプがＩｇＧ２若しくはＩｇＧ３である、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
剤が抗体鎖である、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
剤が抗体でありかつ該抗体が２対のＬおよびＨ鎖を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
剤が患者に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項３８】
剤が抗体でありかつ該抗体の投薬量が患者体重１ｋｇあたり約０．０１から約１０ｍｇまでの範囲にわたる、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
剤が製薬学的組成物として担体とともに投与される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
剤が、腹腔内、経口、鼻内、皮下、くも膜下腔内、筋肉内、局所若しくは静脈内に投与される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
患者がアミロイド形成疾患に罹っている、請求項３７に記載の方法。
【請求項４２】
疾患が、アルツハイマー病、ＩＩ型糖尿病、パーキンソン病、びまん性レビー小体病、アミロイドーシス、ダウン症候群、およびプリオン感染により全部若しくは部分的に引き起こされる疾患よりなる群から選ばれる、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
剤をコードする核酸が投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項４４】
剤が、アンチセンスＲＮＡ分子、アンチセンスＤＮＡ分子、リボザイム、ＲＮＡｉおよびジンクフィンガータンパク質よりなる群から選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項４５】
アミロイド沈着物の形成を阻害することをさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項４６】
アミロイド毒性を阻害することをさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項４７】
剤がＬＴＰの維持期を阻止しない、請求項１に記載の方法。
【請求項４８】
剤が培養中の薄片調製物中のＬＴＰのアミロイド媒介性阻害を抑制する、請求項１に記載の方法。
【請求項４９】
剤が可溶性ＡβによるＬＴＰの阻害を抑制する、請求項１に記載の方法。
【請求項５０】
ａ）剤をインテグリンサブユニットαｖ結合剤と同定すること；および
ｂ）該同定されたαｖ結合剤がＬＴＰのアミロイド媒介性阻害を抑制することを確定すること
を含んでなる、ＬＴＰのアミロイド媒介性阻害を抑制する剤の同定方法。
【請求項５１】
剤を同定する段階が、直接結合アッセイ、競合結合アッセイおよび細胞接着アッセイの１種若しくはそれ以上を含んでなり；ならびに
同定されたαｖ結合剤がＬＴＰのアミロイド媒介性阻害を抑制することの決定段階が、高頻度刺激を第一の神経回路に導入することおよびＬＴＰの誘導を測定すること、高頻度刺激をＡβの存在下の第二の神経回路に導入することおよびＬＴＰ誘導の阻害を測定すること、ならびにＡβおよび剤の存在下の第三の神経回路に高頻度刺激を導入することならびにＬＴＰ誘導の阻害の抑制を測定することを含んでなる、
請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
請求項５０に記載の方法により同定される、ＬＴＰのアミロイド媒介性阻害を抑制する剤。
【請求項５３】
剤が抗体である、請求項５２に記載の剤。
【請求項５４】
請求項５２に記載の剤および製薬学的に許容できる担体を含んでなる組成物。
【請求項５５】
請求項５０に記載の方法により同定される剤の有効投薬量を投与することを含んでなる、長期増強（ＬＴＰ）のアミロイド媒介性阻害の抑制方法。
【請求項５６】
請求項５１に記載の方法により同定される、ＬＴＰのアミロイド媒介性阻害を抑制する剤。
【請求項５７】
剤が抗体である、請求項５６に記載の剤。
【請求項５８】
請求項５６に記載の剤および製薬学的に許容できる担体を含んでなる組成物。
【請求項５９】
請求項５１に記載の方法により同定される剤の有効投薬量を投与することを含んでなる、長期増強（ＬＴＰ）のアミロイド媒介性阻害の抑制方法。
【請求項６０】
長期増強（ＬＴＰ）のアミロイド媒介性阻害を抑制するのに有効な量のαｖ拮抗剤若しくはαｖ媒介性の細胞接着の阻害剤を投与することを含んでなる、Ａβ沈着を特徴とするアミロイド形成疾患の処置方法。
【請求項６１】
アミロイド形成疾患がアルツハイマー病である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
アミロイド形成疾患が軽度認知障害である、請求項６０に記載の方法。
【請求項１】
１種若しくはそれ以上の剤がＬＴＰのアミロイド媒介性阻害を抑制するような条件下でインテグリンサブユニットαｖに結合する１種若しくはそれ以上の剤の有効投薬量を投与することを含んでなる、長期増強（ＬＴＰ）のアミロイド媒介性阻害の抑制方法。
【請求項２】
１種若しくはそれ以上の剤がＬＴＰのアミロイド媒介性阻害を抑制するような条件下でインテグリンサブユニットαｖに結合する１種若しくはそれ以上の剤の有効投薬量を投与することを含んでなる、Ａβ沈着を特徴とするアミロイド形成疾患の処置若しくは予防方法。
【請求項３】
アミロイド形成疾患がアルツハイマー病若しくは軽度認知障害である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
アミロイド形成疾患がびまん性レビー小体病若しくはパーキンソン病である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
インテグリンサブユニットαｖに結合する最低２剤の有効投薬量が投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
剤が、Ａβ産生の阻害剤、Ａβ沈着の阻害剤、Ａβ消失のメディエーター、アミロイド斑消失のメディエーター、Ａβ神経毒性の阻害剤、Ａβ凝集の阻害剤およびＡβ解離のメディエーターよりなる群から選ばれる第二の剤とともに投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
Ａβ産生の阻害剤がγ分泌酵素阻害剤である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
Ａβ産生の阻害剤がβ分泌酵素阻害剤である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
剤がＡβに対する抗体とともに投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
剤がＲＧＤ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）モチーフを含んでなるペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
剤がαｖβ１インテグリンのリガンドである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
剤がフィブロネクチン若しくはスーパーフィブロネクチンである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
剤が、αｖインテグリンサブユニット発現細胞のビトロネクチン若しくはフィブロネクチンへの接着を阻害する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
剤が、αｖインテグリンサブユニット発現細胞のオステオポンチンへの接着を阻害する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
剤がモノクローナル若しくはポリクローナル抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
剤が１８Ｃ７、２０Ａ９および１７Ｅ６から選択される抗体と同一のエピトープを認識する抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
抗体がヒト化抗体、キメラ抗体およびナノボディから選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
剤が１８Ｃ７、２０Ａ９および１７Ｅ６から選択される抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
剤がインテグリンサブユニットαｖへの結合について１８Ｃ７、２０Ａ９および１７Ｅ６から選ばれる抗体と競合する、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
剤が、それらの立体異性体、若しくはそれらの立体異性体の混合物、またはそれらの製薬学的に許容できる塩の形態を包含する、式ＩａおよびＩｂの化合物
【化１】
ここで
Ｘ１およびＸ３は窒素若しくは炭素から独立に選択され；
Ｒ１は
【化２】
から選択され；
ここで、上の複素環は、ＮＨ２、ハロゲン、ＮＯ２、ＣＮ、ＣＦ３、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６アルキルおよびＣ３−Ｃ７シクロアルキルよりなる群から選択される０〜２置換基で場合によっては置換されており；
Ｕは−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｔＱ（ＣＨ２）ｍ−および−Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−１−から選択され、ここでメチレン基の１個は場合によってはＲ７で置換されており
；
Ｑは、１，２−フェニレン、１，３−フェニレン、２，３−ピリジニレン、３，４−ピリジニレンおよび２，４−ピリジニレンから選択され；
Ｒ６はＨ、Ｃ１−Ｃ４アルキルおよびベンジルから選択され；
Ｒ７はＣ１−Ｃ６アルキル、Ｃ３−Ｃ７シクロアルキル、Ｃ４−Ｃ１１シクロアルキルアルキル、アリール、アリール（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、ヘテロアリールおよびヘテロアリール（Ｃ１−Ｃ６アルキル）から選択され；
Ｒ１０は、Ｈ、ハロゲン、ＣＯ２Ｒ１７、ＣＯＮＲ１７Ｒ２０、０〜１個のＲ１５若しくは０〜１個のＲ２１で置換されているＣ１−Ｃ６アルキル、０〜１個のＲ２１で置換されているＣ１−Ｃ４アルコキシ、０〜１個のＲ１５若しくは０〜１個のＲ２１で置換されているＣ３−Ｃ７シクロアルキル、０〜１個のＲ１５若しくは０〜１個のＲ２１で置換されているＣ４−Ｃ１１シクロアルキルアルキル、および０〜１個のＲ１５若しくは０〜２個のＲ１１若しくは０〜１個のＲ２１で置換されているアリール（Ｃ１−Ｃ６アルキル）−から選択され；
Ｒ１１は、Ｈ、ハロゲン、ＣＦ３、ＣＮ、ＮＯ２、ヒドロキシ、ＮＲ２Ｒ３、０〜１個のＲ２１で置換されているＣ１−Ｃ４アルキル、０〜１個のＲ２１で置換されているＣ１−Ｃ４アルコキシ、０〜１個のＲ２１で置換されているアリール、０〜１個のＲ２１で置換されているアリール（Ｃ１−Ｃ６アルキル）−、０〜１個のＲ２１で置換されている（Ｃ１−Ｃ４アルコキシ）カルボニル、０〜１個のＲ２１で置換されている（Ｃ１−Ｃ４アルキル）カルボニル、０〜１個のＲ２１で置換されているＣ１−Ｃ４アルキルスルホニル、および０〜１個のＲ２１で置換されているＣ１−Ｃ４アルキルアミノスルホニルから選択され；
Ｗは−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒ１３）−であり；
Ｘは−ＣＨ（Ｒ１４）−ＣＨ（Ｒ１５）−であり；
Ｒ１３はＨおよびＣＨ３から選択され；
Ｒ１４は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アリールおよびヘテロアリールから選択され、前記アリール若しくはヘテロアリール基は、Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、アリール、ハロ、シアノ、アミノ、ＣＦ３およびＮＯ２から選択される０〜３個の置換基で場合によっては置換されており；
Ｒ１５はＨおよびＲ１６から選択され；
Ｙは−ＣＯＲ１９であり；
Ｒ１６は
−ＮＨ（Ｒ２０）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ１７、
−Ｎ（Ｒ２０）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ１７、
−Ｎ（Ｒ２０）−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ｒ１７、
―Ｎ（Ｒ２０）ＳＯ２−Ｒ１７、および
−Ｎ（Ｒ２０）ＳＯ２−Ｎ（Ｒ２０）Ｒ１７
から選択され、
Ｒ１７は、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ３−Ｃ１１シクロアルキル、アリール（Ｃ１−Ｃ６アルキル）−、（Ｃ１−Ｃ６アルキル）アリール、ヘテロアリール（Ｃ１−Ｃ６アルキル）−、（Ｃ１−Ｃ６アルキル）ヘテロアリール、ビアリール（Ｃ１−Ｃ６アルキル）−、ヘテロアリール若しくはアリールから選択され、前記アリール若しくはヘテロアリール基は、Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、ハロ、シアノ、アミノ、ＣＦ３およびＮＯ２よりなる群から選択される０〜３置換基で場合によっては置換されており；
Ｒ１９は−Ｏ−（ＣＨ２）ｋＮ＋（Ｒ２２）（Ｒ２３）（Ｒ２４）Ｚ−であり；
Ｚ−は、ハロゲン化イオン、重硫酸イオン、硫酸イオン、リン酸水素イオン、リン酸イオン、トルエンスルホン酸イオン、メタンスルホン酸イオン、エタンスルホン酸イオン、酢酸イオン、トリフルオロ酢酸イオン、クエン酸イオン、シュウ酸イオン、コハク酸イオンおよびマロン酸イオンから選択される製薬学的に許容できる陰イオンであり；
Ｒ２２、Ｒ２３およびＲ２４はＨ、Ｃ１−Ｃ４アルキルおよびＣ４−Ｃ１１シクロアルキルアルキルから独立に選択されるか；
あるいは、Ｒ２２およびＲ２３は、一緒になって、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１〜２個のヘテロ原子を含有する５〜７員の複素環系を形成し得、ならびにＲ２４は上のとおり定義されるか、または、Ｒ２２、Ｒ２３およびＲ２４は、一緒になって、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１〜２個のヘテロ原子を含有する複素二環系を形成し得；
Ｒ２０はＨおよびＣＨ３から選択され；
Ｒ２１はＣＯＯＨおよびＮＲ６２から選択され；
ｋは２であり；
ｍは０および１から選択され；
ｎは１〜４であり；ならびに
ｔは０および１から選択される、
から選択される化合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
剤が、式ＩＩ：
【化３】
ここでＲ１９は−Ｈ、−ＣＨ３および−ＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋（ＣＨ３）３から選ばれる
の化合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
Ｈ１９が−Ｈである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
Ｈ１９が−ＣＨ３である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
Ｒ１９が−ＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋（ＣＨ３）３である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
剤がディスインテグリンである、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
剤がエキスタチンである、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
剤がヒト抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
剤がヒト化抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
剤がキメラ抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
剤がナノボディである、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
剤が抗体フラグメントである、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
剤が、抗体の１種若しくはそれ以上のＨ鎖、Ｌ鎖、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ）ｃ若しくはＦ（ｖ）、またはそれらのいずれかの組合せを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
剤が抗体でありかつ該抗体のアイソタイプがＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４である、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
剤が抗体でありかつ該抗体のアイソタイプがＩｇＧ２若しくはＩｇＧ３である、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
剤が抗体鎖である、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
剤が抗体でありかつ該抗体が２対のＬおよびＨ鎖を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
剤が患者に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項３８】
剤が抗体でありかつ該抗体の投薬量が患者体重１ｋｇあたり約０．０１から約１０ｍｇまでの範囲にわたる、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
剤が製薬学的組成物として担体とともに投与される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
剤が、腹腔内、経口、鼻内、皮下、くも膜下腔内、筋肉内、局所若しくは静脈内に投与される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
患者がアミロイド形成疾患に罹っている、請求項３７に記載の方法。
【請求項４２】
疾患が、アルツハイマー病、ＩＩ型糖尿病、パーキンソン病、びまん性レビー小体病、アミロイドーシス、ダウン症候群、およびプリオン感染により全部若しくは部分的に引き起こされる疾患よりなる群から選ばれる、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
剤をコードする核酸が投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項４４】
剤が、アンチセンスＲＮＡ分子、アンチセンスＤＮＡ分子、リボザイム、ＲＮＡｉおよびジンクフィンガータンパク質よりなる群から選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項４５】
アミロイド沈着物の形成を阻害することをさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項４６】
アミロイド毒性を阻害することをさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項４７】
剤がＬＴＰの維持期を阻止しない、請求項１に記載の方法。
【請求項４８】
剤が培養中の薄片調製物中のＬＴＰのアミロイド媒介性阻害を抑制する、請求項１に記載の方法。
【請求項４９】
剤が可溶性ＡβによるＬＴＰの阻害を抑制する、請求項１に記載の方法。
【請求項５０】
ａ）剤をインテグリンサブユニットαｖ結合剤と同定すること；および
ｂ）該同定されたαｖ結合剤がＬＴＰのアミロイド媒介性阻害を抑制することを確定すること
を含んでなる、ＬＴＰのアミロイド媒介性阻害を抑制する剤の同定方法。
【請求項５１】
剤を同定する段階が、直接結合アッセイ、競合結合アッセイおよび細胞接着アッセイの１種若しくはそれ以上を含んでなり；ならびに
同定されたαｖ結合剤がＬＴＰのアミロイド媒介性阻害を抑制することの決定段階が、高頻度刺激を第一の神経回路に導入することおよびＬＴＰの誘導を測定すること、高頻度刺激をＡβの存在下の第二の神経回路に導入することおよびＬＴＰ誘導の阻害を測定すること、ならびにＡβおよび剤の存在下の第三の神経回路に高頻度刺激を導入することならびにＬＴＰ誘導の阻害の抑制を測定することを含んでなる、
請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
請求項５０に記載の方法により同定される、ＬＴＰのアミロイド媒介性阻害を抑制する剤。
【請求項５３】
剤が抗体である、請求項５２に記載の剤。
【請求項５４】
請求項５２に記載の剤および製薬学的に許容できる担体を含んでなる組成物。
【請求項５５】
請求項５０に記載の方法により同定される剤の有効投薬量を投与することを含んでなる、長期増強（ＬＴＰ）のアミロイド媒介性阻害の抑制方法。
【請求項５６】
請求項５１に記載の方法により同定される、ＬＴＰのアミロイド媒介性阻害を抑制する剤。
【請求項５７】
剤が抗体である、請求項５６に記載の剤。
【請求項５８】
請求項５６に記載の剤および製薬学的に許容できる担体を含んでなる組成物。
【請求項５９】
請求項５１に記載の方法により同定される剤の有効投薬量を投与することを含んでなる、長期増強（ＬＴＰ）のアミロイド媒介性阻害の抑制方法。
【請求項６０】
長期増強（ＬＴＰ）のアミロイド媒介性阻害を抑制するのに有効な量のαｖ拮抗剤若しくはαｖ媒介性の細胞接着の阻害剤を投与することを含んでなる、Ａβ沈着を特徴とするアミロイド形成疾患の処置方法。
【請求項６１】
アミロイド形成疾患がアルツハイマー病である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
アミロイド形成疾患が軽度認知障害である、請求項６０に記載の方法。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１２Ｃ】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１３Ｃ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１２Ｃ】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１３Ｃ】
【公表番号】特表２０１０−５２４８４７（Ｐ２０１０−５２４８４７Ａ）
【公表日】平成２２年７月２２日（２０１０．７．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５５４７５２（Ｐ２００９−５５４７５２）
【出願日】平成２０年３月２０日（２００８．３．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０５７７１３
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１１６１００
【国際公開日】平成２０年９月２５日（２００８．９．２５）
【出願人】（５０６２０９８４６）エラン・フアーマシユーチカルズ・インコーポレーテツド (4)
【出願人】（５０９２６２６７７）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年７月２２日（２０１０．７．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年３月２０日（２００８．３．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０５７７１３
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１１６１００
【国際公開日】平成２０年９月２５日（２００８．９．２５）
【出願人】（５０６２０９８４６）エラン・フアーマシユーチカルズ・インコーポレーテツド (4)
【出願人】（５０９２６２６７７）
【Ｆターム（参考）】
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