ＭＡＬＤＩ−ＭＳ用試料調製方法
【課題】均一性及びイオン化持続性の高い試料／マトリックス混合物をサンプルプレート上に形成する。
【解決手段】液体マトリックスであるＣＨＣＡ＿Ｂと分析対象物質を含む試料液とをサンプルプレート１０上に滴下して混合し、その上にメタノール又はアセトニトリルを含む液滴統一用液体を滴下する。これにより、サンプルプレート１０上で複数の小液滴に分散した試料／マトリックス混合液を一つの液滴に纏めることができ分析対象物質を巨視的に均一な状態とすることができる。また、マトリックスとして液体マトリックスを用いることにより、固体マトリックスを用いた従来法に比べて高いイオン化持続性を達成することができる。以上の結果、数点のみのレーザー照射で十分な分析精度を達成することが可能となり、ＭＡＬＤＩ−ＭＳにおける分析時間を大幅に短縮することができる。
【解決手段】液体マトリックスであるＣＨＣＡ＿Ｂと分析対象物質を含む試料液とをサンプルプレート１０上に滴下して混合し、その上にメタノール又はアセトニトリルを含む液滴統一用液体を滴下する。これにより、サンプルプレート１０上で複数の小液滴に分散した試料／マトリックス混合液を一つの液滴に纏めることができ分析対象物質を巨視的に均一な状態とすることができる。また、マトリックスとして液体マトリックスを用いることにより、固体マトリックスを用いた従来法に比べて高いイオン化持続性を達成することができる。以上の結果、数点のみのレーザー照射で十分な分析精度を達成することが可能となり、ＭＡＬＤＩ−ＭＳにおける分析時間を大幅に短縮することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ＝Matrix Assisted Laser Desorption /Ionization）によるイオン源を備える質量分析装置で分析を行うための試料を調製する試料調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＭＡＬＤＩは、レーザー光を吸収しにくい試料やタンパク質などレーザー光で損傷を受け易い試料を分析するために、レーザー光を吸収し易く且つイオン化し易い物質をマトリックスとして試料に予め混合しておき、これにレーザー光を照射することで試料をイオン化するものである。ＭＡＬＤＩによれば、分子量の大きな高分子化合物をあまり開裂させることなく分析することが可能であり、しかも微量分析にも好適であることから、近年、生命科学などの分野で広範に利用されている。
【０００３】
こうしたＭＡＬＤＩによるイオン源を備えた質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ装置）は、他の質量分析装置では測定が不可能であった分子量が１万を越すような高質量領域までの分析が可能であり、分子量の分布の測定と構造解析とが同時に且つ短時間に行え、また、熱に不安定で分解し易い物質でも開裂させることなく分析ができる、といった特徴から、タンパク質、ペプチド等の生体高分子の分析に広く使用されるようになっている。
【０００４】
質量分析に用いられるマトリックスには、ＭＳ装置内部の真空中で固体状態をとる固体マトリックスと液体状態をとる液体マトリックスとがあり、ＭＡＬＤＩ−ＭＳによる分析では、一般に固体マトリックスが使用される。固体マトリックスは、所定の溶媒に溶解させたマトリックス溶液の状態で試料に添加される。
【０００５】
ここで、前記固体マトリックスを用いたＭＡＬＤＩ−ＭＳ用試料の調製方法の一例について詳しく述べる。サンプルプレートと呼ばれる金属板には、通常、複数個のウェル（液滴が載置される領域）が形成されている。分析作業者は、分析対象物質を含有する試料液と上述のマトリックス溶液とを予め混合し、サンプルプレートのウェル内に滴下する。或いは、試料液とマトリックス溶液とをそれぞれサンプルプレートのウェル内に滴下し、その中で両者を混合する。その後、サンプルプレートに乾燥風を当てるなどして、試料液やマトリックス溶液に含まれる溶媒を蒸発させると、その過程で試料液に含まれる分析対象物質がマトリックスに取り込まれ、ウェル内に試料とマトリックスの混合結晶が形成される。
【０００６】
従来、上記のような試料の調製作業は、専ら分析作業者が手作業で行うのが一般的であった。そのため、作業効率が悪いのみならず、作業に関わるミスも起こり易かった。こうした作業の手間を軽減するため、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ用試料を調製するための特殊な試料調製装置も提案されている。例えば、特許文献１には、分取液体クロマトグラフィーを利用した試料調製装置が記載されている。この装置では、液体クロマトグラフによって生体試料を時間的に分離し、該液体クロマトグラフのカラムから溶出する試料液を順次分取して予め用意したマトリックス溶液と共にサンプルプレート上に滴下する構成となっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開2005-201828号公報
【特許文献２】特表2005-536759号公報（[0082]）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、固体マトリックスは一般にイオン化持続性が低いため、質量分析を行う際には、ウェル内でレーザー照射位置を順次移動させながら分析を行ってデータを積算する必要がある。また、固体マトリックスはサンプルプレート上で不均質な試料／マトリックス混合結晶を形成するため、イオン化可能な部位（スィートスポット）がサンプルプレートの各ウェル内で偏在することとなる。そのため、質量分析を行う際には、レーザー照射部位を移動させてスィートスポットを探索する必要がある。
【０００９】
以上の理由から、従来のＭＡＬＤＩ−ＭＳ装置では、ラスター分析によって一つのウェルにつき５０−２００点を順次走査して分析を行っていた。ラスター分析は、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ装置内でサンプルプレートを載置したステージを移動させることによりウェル内でのレーザー照射位置を変えながら質量分析を行うものである。こうしたラスター分析では、ステージの移動、ステージの停止、及びレーザー照射が繰り返し実行されるが、ステージ移動には一定の時間を要するため、これが律速となって分析時間が長くなるという問題があった。
【００１０】
一方、液体マトリックスは固体マトリックスに比べて高いイオン化持続性を有するため、近年では、ＭＡＬＤＩへの液体マトリックスの適用が注目されている。例えば、特許文献２には、分取液体クロマトグラフィーとＭＡＬＤＩ−ＭＳを併用する分析システム（ＬＣ−ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）に液体マトリックスを使用することができるとの記載がある。しかしながら、同文献には、ＬＣ−ＭＡＬＤＩ−ＭＳへの液体マトリックスの具体的な適用方法については記載されていない。
【００１１】
本発明者が、液体マトリックスと試料液を、従来の固体マトリックスを用いる場合と同様にしてサンプルプレートの同一ウェル内に滴下したところ、該ウェル内で液滴が細かく分散する場合があった。このとき、レーザービーム径に対して液滴サイズが小さい場合、サンプルプレートのウェル内の試料／マトリックス混合物は巨視的には不均一となる。
【００１２】
本発明は上記のような課題に鑑みて成されたものであり、その目的とするところは、イオン化持続性が高く、サンプルプレート上で均一な試料／マトリックス混合物を形成することのできるＭＡＬＤＩ−ＭＳ用試料調製方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記課題を解決するために成された本発明に係るＭＡＬＤＩ−ＭＳ用試料調製方法は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法による質量分析用の試料を調製するための方法であって、
a)酸と塩基から生成される有機塩であって前記酸が酸性基を持つベンゼン環であり前記塩基がアミンである液体マトリックスと、分析対象物質を含む試料液とをサンプルプレート上に滴下するステップと、
b)前記サンプルプレート上に滴下された液体マトリックス及び試料液の上にメタノール又はアセトニトリルを含む液滴統一用液体を滴下するステップと、
を有することを特徴としている。
【００１４】
なお、前記液滴統一用液体としては、メタノール又はアセトニトリルを６０v/v％以上含む液体を用いることが好ましく、より好ましくは７５v/v％以上含む液体を用いる。また、メタノール又はアセトニトリルが１００v/v％未満の液体を用いる場合、該液体は水溶液とすることが望ましい。
【発明の効果】
【００１５】
上記本発明に係るＭＡＬＤＩ−ＭＳ用試料調製方法によれば、サンプルプレートの各ウェル内で複数の小液滴に分散した試料／マトリックス混合物を、前記液滴統一用液体の滴下によって一つの液滴に纏めることができる。そのため、各ウェル内において分析対象物質を巨視的に均一な状態とすることができる。更に、本発明のＭＡＬＤＩ−ＭＳ用試料調製方法によれば、試料液と混合するマトリックスとして液体マトリックスを用いることにより、従来の固体マトリックスを用いた場合に比べて高いイオン化持続性を達成することができる。
【００１６】
以上のように、本発明に係るＭＡＬＤＩ−ＭＳ用試料調製方法によれば、サンプルプレート上に均一性及びイオン化持続性に優れた試料／マトリックス混合物を形成することができるため、従来のようなラスター分析を行う必要がなく、数点のみのレーザー照射で十分な分析精度を達成することが可能となる。そのため、質量分析時におけるステージ移動を最小限に抑えることができ、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析における分析時間を大幅に短縮することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明に係るＭＡＬＤＩ−ＭＳ用試料調製方法を説明する模式図。
【図２】本発明の方法による試料調製を行う自動滴下装置の要部構成を示す模式図。
【図３】実施例１、２及び比較例１、２におけるレーザー照射位置を説明する図。
【図４】サンプルプレートのウェル内に形成された試料／マトリックス混合物を示す写真であって、（ａ）は実施例１、（ｂ）は実施例２、（ｃ）は比較例１、（ｄ）は比較例２を示す。
【図５】実施例１の各レーザー照射位置におけるマススペクトル、及びショット数と信号強度の関係を表したグラフを示す図。
【図６】実施例２の各レーザー照射位置におけるマススペクトル、及びショット数と信号強度の関係を表したグラフを示す図。
【図７】比較例１の各レーザー照射位置におけるマススペクトル、及びショット数と信号強度の関係を表したグラフを示す図。
【図８】比較例２の各レーザー照射位置におけるマススペクトル、及びショット数と信号強度の関係を表したグラフを示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明に係るＭＡＬＤＩ−ＭＳ用試料調製方法について図１を参照して説明する。以下、％で表された量の基準に関しては、特に断りのない限りv/v％とする。
【００１９】
まず、分析対象物質を含む試料液と液体マトリックスをサンプルプレート１０の同一ウェル内に滴下する。分析対象物質としては、タンパク質酵素消化物、ペプチドなどが挙げられる。加えて、糖タンパク質消化物、糖鎖なども対象となるが、これらに限定されるものではない。試料液の溶媒としては、タンパク質の酵素消化物の液体クロマトグラフ溶出液を対象とすることが好ましい。なお、試料液と液体マトリックスは予め混合した状態でサンプルプレート１０に滴下してもよく、別々に滴下してサンプルプレート１０上で混合させるようにしてもよい。
【００２０】
その後、前記のウェルにメタノール又はアセトニトリルを含む液滴統一用液体を滴下する。これにより、ウェル内で前記試料液と液体マトリックスの混合物が複数の液滴に分散している場合でも、該ウェルに上乗せした液滴統一用液体によって前記複数の液滴を一つに纏めることができる。
【００２１】
前記液体マトリックスとしては、酸と塩基から生成された有機塩であって、前記酸が酸性基を持つベンゼン環から成るもの（例えば、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）、２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）、３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシケイ皮酸等）であり、前記塩基がアミン（例えば、ブチルアミン、ジヒドロキシアミン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ−イソプロピル−Ｎ−メチル−ｔｅｒｔ−ブチルアミン、１，１，３，３−テトラメチルグアニジン等）であるものを使用する。このような液体マトリックスとしては、例えば、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸のブチルアミン塩 (ＣＨＣＡ＿Ｂ)、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸のジヒドロキシルアミン塩、２，５−ジヒドロキシ安息香酸のブチルアミン塩、２，５−ジヒドロキシ安息香酸のジヒドロキシルアミン塩などを用いることができる。更に、前記液体マトリックスは、前記酸と塩基をモル比で表して１：１の割合で混合して作成されたものを用いることが望ましい。
【００２２】
前記液滴統一用液体としては、メタノール又はアセトニトリルを６０％以上（望ましくは７５％以上）の割合で含む水溶液を用いることが望ましい。なお、１００％のメタノール又はアセトニトリルを用いてもよい。なお、サンプルプレート上に均一な試料／マトリックス混合物を形成するためには、前記メタノール又はアセトニトリルを用いるのが特に効果的であるが、これらに代えて他の有機溶媒を用いることも可能である。また、液滴統一用液体は、試料液と液体マトリックスの混合物：液滴統一用液体の体積比が１０：１〜１：１０となるように滴下することが望ましい。
【００２３】
以上により、試料調製が完了した後は、自然乾燥又はサンプルプレート１０の上面に温風を供給するなどして前記液滴統一用液体を蒸発させる。このサンプルプレート１０をＭＡＬＤＩ質量分析装置、例えばＭＡＬＤＩ飛行時間型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ装置）を用いて分析し、所定の質量範囲のマススペクトルを取得する。
【００２４】
このとき、サンプルプレートの各ウェルでは、試料／マトリックス混合物が均一な状態で存在しているため、レーザー照射位置によるマススペクトルのばらつきを抑えることができる。また、液体マトリックスは固体マトリックスに比べてイオン化持続性が高いため、同一箇所に繰り返しレーザー照射を行うことができる。従って、本発明の方法で調製された試料を分析する際には、従来の固体マトリックスを用いたＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析のようにラスター分析によって数十〜数百点のレーザー照射を行う必要がなく、１ウェルにつき１〜３点程度のレーザー照射により高感度な分析を行うことができる。
【００２５】
上記のような本発明の方法による試料調製は、分析作業者が手作業で行ってもよいが、自動滴下装置を用いて行うことが望ましい。
【００２６】
以下、本発明に係る試料調製を行うための自動試料滴下装置の構成と動作を説明する。なお、ここでは液体クロマトグラフ装置から溶出する試料液をサンプルプレート上に滴下する構成の自動試料滴下装置について説明するが、他の構成の装置、例えば、予めバイアル瓶等に収容された試料液を採取してサンプルプレート上に滴下する構成の自動試料滴下装置においても本発明に係る試料調製方法を同様に適用することができる。
【００２７】
図２は自動試料滴下装置３０を液体クロマトグラフ装置と共に示した概略構成図である。溶離液槽２１に貯留されている溶離液（移動相）は送液ポンプ２２により吸引され、一定流量で試料導入部２３を介してカラム２４に流される。試料導入部２３において移動相中に注入された試料液は移動相に乗ってカラム２４に導入され、カラム２４を通過する間に時間方向に成分分離されて溶出する。紫外可視分光光度計である検出器２５はカラム２４から溶出する成分を順次検出し、検出信号を信号処理部４１へと送る。検出器２５を通った溶出液はその全量又は一部が自動試料滴下装置３０に導入される。
【００２８】
自動試料滴下装置３０は、検出器２５の下流に接続された第一配管３１と、前記第一配管３１に液体マトリックス（例えば、ＣＨＣＡ＿Ｂ）を供給する第二配管３２と、前記第一配管３１に液滴統一用液体（例えば、７５％メタノール水溶液）を供給する第三配管３３を有している。液体容器３４に貯留された液体マトリックスは、送液ポンプ３５によって吸引され、第二配管３２を介して第一配管３１へ導かれる。また、液体容器３６に貯留された液滴統一用液体は、送液ポンプ３７によって吸引され第三配管３３を介して第一配管３１へ導かれる。
【００２９】
第一配管３１は、第二配管３２との接続点Ａから第三配管との接続点Ｂの間では二重管構造となっており、第二配管３２を流れてきた液体マトリックスは、試料液が流れる管の外側を流れるようになっている。更に、第一配管３１は、第三配管３３との接続点Ｂより下流では三重管構造となっており、第三配管３３を流れてきた液滴統一用液体は、液体マトリックスが流れる管の更に外側を流れるようになっている。第一配管３１の先端には三重管構造のニードル３８が接続されており、その先端から試料液、液体マトリックス、及び液滴統一用液体がサンプルプレート１０に向かって滴下される。
【００３０】
なお、前記ニードル３８は、図示しないニードル駆動機構によって水平方向及び上下方向に移動可能となっており、ニードル３８を移動させつつ試料液、液体マトリックス、又は液滴統一用液体を該ニードル３８へ送液することにより、サンプルプレート１０上の各ウェル１１に順次液滴を吐出させることができる。
【００３１】
自動試料滴下装置３０は、更に、信号処理部４１と制御部４２を備えている。信号処理部４１は、液体クロマトグラフ装置の検出器２５から得られる検出信号を基にクロマトグラムを作成し、そのクロマトグラムに出現するピークを利用して、試料成分の採取タイミングを指示するための制御信号を発生する。制御部４２は、該制御信号に従って送液ポンプ３５、３７、前記ニードル駆動機構、及び第一配管３１上に設けられた電磁弁３９の動作を制御する。
【００３２】
カラム２４から溶出される試料液をサンプルプレート１０に滴下する際には、電磁弁３９及び送液ポンプ３５を制御することにより、試料液と液体マトリックスとをニードル３８の先端から同時に吐出する。ニードル３８を移動させながらこうした試料液及び液体マトリックスの吐出を行い、サンプルプレート１０上の全てのウェル１１に試料液及び液体マトリックスの滴下を完了したら、次の作業に移る。すなわち、試料液及び液体マトリックスの滴下が完了したウェル上に再びニードル３８を移動させ、送液ポンプ３７を動作させることにより、液滴統一用液体を滴下して該ウェル上の液滴を一つに統一する。
【００３３】
なお、作業効率を鑑みれば、上記のように試料液と液体マトリックスをサンプルプレート上の全てウェルに滴下した後に液滴統一用液体の滴下を行うことが望ましいが、これに限らず、一つのウェルに試料液と液体マトリックスを滴下する毎に液滴統一用液体の滴下を行うようにしてもよい。
【実施例】
【００３４】
以下、本発明に係るＭＡＬＤＩ−ＭＳ用試料調製方法の実施例について、本発明者が行った従来手法との比較のための実験の内容及び結果を説明する。なお、以下の実験におけるマススペクトルの測定は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ装置「ＡＸＩＭＡ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ」（島津製作所製）を用い、ＭＡＬＤＩ用のサンプルプレートとしては「μＦｏｃｕｓ ＭＡＬＤＩ ｐｌａｔｅ」（Hudson Surface Technology社製）を使用した。
【００３５】
［１］液滴の均一性、イオン化持続性の比較実験
以下に述べる実施例１、２は、本発明の方法による試料調製を行ったものであり、比較例１、２は、液滴統一用液体の滴下を行わない従来法による試料調製を行ったものである。実施例１では液滴統一用液体として１００％メタノールを使用し、実施例２では１００％アセトニトリルを使用した。また、実施例１、２及び比較例２では試料液と混合するマトリックスとして液体マトリックスであるＣＨＣＡ＿Ｂを用い、ＣＨＣＡ＿Ｂを０．０５％トリフルオロ酢酸を含む５０％アセトニトリル水溶液に１ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解させて使用した。一方、比較例１ではマトリックスとして固体マトリックスであるＣＨＣＡを用い、ＣＨＣＡを０．０５％トリフルオロ酢酸を含む５０％アセトニトリル水溶液に３ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解させて使用した(メーカー推奨濃度)。なお、以下の実験では、分析対象物質としてペプチド（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ＿２、ＡＣＴＨ１−１８、又はＡＣＴＨ７−３８）を用い、該ペプチドを、０．０５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む２７％アセトニトリル（ＡＣＮ）水溶液（ＬＣ抽出溶媒条件の最大アセトニトリル割合）に１００ｆｍｏｌ／μＬとなるように溶解したものを試料液として使用した。
【００３６】
実施例１、２については以下の手順で実験を行った。
（１）まず、液体マトリックスと試料液をサンプルプレートの同一ウェルにそれぞれ１μＬずつ滴下した。
（２）その後、前記のウェル上に１００％メタノール又は１００％アセトニトリルを１μＬずつ滴下した。
（３）このサンプルプレートをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ装置に挿入して質量分析を行った。このとき、図３に示すように試料／マトリックス混合物表面の９点についてそれぞれ５００(又は１０００)ショットずつレーザー照射を行った。
【００３７】
一方、比較例１については前記（１）の工程で液体マトリックスの代わりに固体マトリックス溶液を使用すると共に、上記（２）の工程を省き、それ以外は上記実施例１、２と同様にして実験を行った。また、比較例２については前記（２）の工程を省き、それ以外は上記実施例１、２と同様にして実験を行った。
【００３８】
図４にＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ装置による分析の直前におけるサンプルプレートの拡大写真を示す。同図に示すように、比較例１（図４（ｃ））では試料／固体マトリックス混合物の小結晶がウェル内で散乱しており、比較例２（図４（ｄ））では試料／液体マトリックス混合物の小液滴がウェル内で不均一に散乱していた。これに対し、実施例１（図４（ａ））及び実施例２（図４（ｂ））では、いずれも試料／液体マトリックス混合物がウェル内で一つの液滴に統一されていることが確認された。
【００３９】
図５〜８に、実施例１、２及び比較例１、２の上記９点におけるマススペクトルと、該９点におけるイオン化持続性を表すグラフ（即ち、ショット数と信号強度の関係を表したグラフ）を示す。なお、各図中に示した分解能Ｒは、Ｒ＝（m/z値）/（ピーク半値全幅）である。
【００４０】
比較例１（図７）では、イオン化持続性が低く、マススペクトルのピーク形状も前記９点の間でばらつきが見られた。また、比較例２（図８）では、前記９点の内の８点で分析対象物質のピークが検出されなかった、これは、上記のように試料／液体マトリックス混合物の小液滴がサンプルプレート上に不均一に散乱しているために、前記８点では液滴にレーザーが当たらなかったためと考えられる。これに対し、実施例１（図５）及び実施例２（図６）では、いずれの点でも分析対象物質のピークが検出され、且つ比較例１に比べてイオン化持続性及び分解能が高く、前記９点間でのマススペクトルのピーク形状の差も比較例１に比べて小さいことが確認された。
【００４１】
［２］分析時間の比較実験
以下に述べる実施例３は、本発明の方法による試料調製を行ったものであり、比較例３は、従来法による試料調製を行ったものである。なお、以下の実験では、試料液と液体マトリックス（又は固体マトリックス溶液）の滴下は自動試料滴下装置（Ａｃｃｕｓｐｏｔ、島津製作所製）によって行い、液滴統一用液体（すなわち１００％メタノール）の滴下は分析作業者が手作業で行った。実施例３では試料液と混合するマトリックスとして液体マトリックスであるＣＨＣＡ＿Ｂを用い、実施例１のようにＣＨＣＡ＿Ｂを０．０５％トリフルオロ酢酸を含む５０％アセトニトリル水溶液に１ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解させたものがウェル上に滴下されるように調製し、自動試料滴下装置にセットした。一方、比較例３ではマトリックスとして固体マトリックスであるＣＨＣＡを用い、ＣＨＣＡを０．０５％トリフルオロ酢酸を含む５０％アセトニトリル水溶液に３ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解させたものがウェル上に滴下されるように調製し、自動試料滴下装置にセットした。
【００４２】
実施例３については、以下のようにして実験を行った。
（１）まず、自動滴下装置内に液体マトリックスをセットすると共に、装置内の所定の位置にサンプルプレートを載置した。
（２）前記自動滴下装置に接続されたＨＰＬＣシステムに、市販のＢＳＡトリプシン消化物（Waters社製）を０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に５ｐｍｏｌ／５μＬとなるように溶解したものを注入し、リテンションタイム（カラムに対する試料保持時間）に従い、６分間で試料分離を行った。
（３）それと同時に、順次カラムから溶出される試料液と前記液体マトリックスを、前記のサンプルプレートの６０ウェル分に滴下した。
（４）その後、各ウェルの試料／マトリックス混合物上に、１００％メタノールを１μＬずつ滴下した。
（５）このサンプルプレートをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ装置に挿入し、試料／マトリックス混合物表面の１ポイントのみレーザー照射してＭＳ分析を、続いて２ポイントのみレーザー照射してＭＳ／ＭＳ分析を行うよう設定すると共に、得られたデータを利用してプロテオーム解析用データベース検索ソフトウエア（ＭＡＳＣＯＴ、ＭＡＴＲＩＸ ＳＣＩＥＮＣＥ社）のＭＳ／ＭＳイオンサーチによる解析を実行するように設定して自動分析を行った。
（６）自動分析終了後、得られたＭＳ／ＭＳイオンサーチ結果を確認し、試料の同定を確認した。
【００４３】
一方、比較例３では、上記の液体マトリックスに代えて固体マトリックス溶液を使用し、且つ上記（４）の工程を省略した。更に、（５）の工程において試料／マトリックス混合物表面の６４ポイントにレーザー照射してＭＳ分析を、続いて１００ポイントにレーザー照射してＭＳ／ＭＳ分析を行うように設定して自動ラスター分析を行った。それ以外の点については、上記実施例３と同様である。
【００４４】
上記の実施例３及び比較例３におけるＭＳ／ＭＳイオンサーチ（表中ではMascot Search）のスコアとシーケンスカバー率、及びＭＳ分析及びＭＳＭＳ分析の分析時間を以下の表１に示す。
【００４５】
【表１】
【００４６】
表１から明らかなように、本発明の試料調製方法を用いた実施例３では、従来の試料調製方法を用いた比較例３に比べて約１／４の分析時間で十分なスコアでの試料同定が可能であることが確認された。
【符号の説明】
【００４７】
１０…サンプルプレート
１１…ウェル
２１…溶離液槽
２２…送液ポンプ
２３…試料導入部
２４…カラム
２５…検出器
３０…自動試料滴下装置
３１…第一配管
３２…第二配管
３３…第三配管
３４、３６…液体容器
３５、３７…送液ポンプ
３８…ニードル
３９…電磁弁
４１…信号処理部
４２…制御部
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ＝Matrix Assisted Laser Desorption /Ionization）によるイオン源を備える質量分析装置で分析を行うための試料を調製する試料調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＭＡＬＤＩは、レーザー光を吸収しにくい試料やタンパク質などレーザー光で損傷を受け易い試料を分析するために、レーザー光を吸収し易く且つイオン化し易い物質をマトリックスとして試料に予め混合しておき、これにレーザー光を照射することで試料をイオン化するものである。ＭＡＬＤＩによれば、分子量の大きな高分子化合物をあまり開裂させることなく分析することが可能であり、しかも微量分析にも好適であることから、近年、生命科学などの分野で広範に利用されている。
【０００３】
こうしたＭＡＬＤＩによるイオン源を備えた質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ装置）は、他の質量分析装置では測定が不可能であった分子量が１万を越すような高質量領域までの分析が可能であり、分子量の分布の測定と構造解析とが同時に且つ短時間に行え、また、熱に不安定で分解し易い物質でも開裂させることなく分析ができる、といった特徴から、タンパク質、ペプチド等の生体高分子の分析に広く使用されるようになっている。
【０００４】
質量分析に用いられるマトリックスには、ＭＳ装置内部の真空中で固体状態をとる固体マトリックスと液体状態をとる液体マトリックスとがあり、ＭＡＬＤＩ−ＭＳによる分析では、一般に固体マトリックスが使用される。固体マトリックスは、所定の溶媒に溶解させたマトリックス溶液の状態で試料に添加される。
【０００５】
ここで、前記固体マトリックスを用いたＭＡＬＤＩ−ＭＳ用試料の調製方法の一例について詳しく述べる。サンプルプレートと呼ばれる金属板には、通常、複数個のウェル（液滴が載置される領域）が形成されている。分析作業者は、分析対象物質を含有する試料液と上述のマトリックス溶液とを予め混合し、サンプルプレートのウェル内に滴下する。或いは、試料液とマトリックス溶液とをそれぞれサンプルプレートのウェル内に滴下し、その中で両者を混合する。その後、サンプルプレートに乾燥風を当てるなどして、試料液やマトリックス溶液に含まれる溶媒を蒸発させると、その過程で試料液に含まれる分析対象物質がマトリックスに取り込まれ、ウェル内に試料とマトリックスの混合結晶が形成される。
【０００６】
従来、上記のような試料の調製作業は、専ら分析作業者が手作業で行うのが一般的であった。そのため、作業効率が悪いのみならず、作業に関わるミスも起こり易かった。こうした作業の手間を軽減するため、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ用試料を調製するための特殊な試料調製装置も提案されている。例えば、特許文献１には、分取液体クロマトグラフィーを利用した試料調製装置が記載されている。この装置では、液体クロマトグラフによって生体試料を時間的に分離し、該液体クロマトグラフのカラムから溶出する試料液を順次分取して予め用意したマトリックス溶液と共にサンプルプレート上に滴下する構成となっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開2005-201828号公報
【特許文献２】特表2005-536759号公報（[0082]）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、固体マトリックスは一般にイオン化持続性が低いため、質量分析を行う際には、ウェル内でレーザー照射位置を順次移動させながら分析を行ってデータを積算する必要がある。また、固体マトリックスはサンプルプレート上で不均質な試料／マトリックス混合結晶を形成するため、イオン化可能な部位（スィートスポット）がサンプルプレートの各ウェル内で偏在することとなる。そのため、質量分析を行う際には、レーザー照射部位を移動させてスィートスポットを探索する必要がある。
【０００９】
以上の理由から、従来のＭＡＬＤＩ−ＭＳ装置では、ラスター分析によって一つのウェルにつき５０−２００点を順次走査して分析を行っていた。ラスター分析は、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ装置内でサンプルプレートを載置したステージを移動させることによりウェル内でのレーザー照射位置を変えながら質量分析を行うものである。こうしたラスター分析では、ステージの移動、ステージの停止、及びレーザー照射が繰り返し実行されるが、ステージ移動には一定の時間を要するため、これが律速となって分析時間が長くなるという問題があった。
【００１０】
一方、液体マトリックスは固体マトリックスに比べて高いイオン化持続性を有するため、近年では、ＭＡＬＤＩへの液体マトリックスの適用が注目されている。例えば、特許文献２には、分取液体クロマトグラフィーとＭＡＬＤＩ−ＭＳを併用する分析システム（ＬＣ−ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）に液体マトリックスを使用することができるとの記載がある。しかしながら、同文献には、ＬＣ−ＭＡＬＤＩ−ＭＳへの液体マトリックスの具体的な適用方法については記載されていない。
【００１１】
本発明者が、液体マトリックスと試料液を、従来の固体マトリックスを用いる場合と同様にしてサンプルプレートの同一ウェル内に滴下したところ、該ウェル内で液滴が細かく分散する場合があった。このとき、レーザービーム径に対して液滴サイズが小さい場合、サンプルプレートのウェル内の試料／マトリックス混合物は巨視的には不均一となる。
【００１２】
本発明は上記のような課題に鑑みて成されたものであり、その目的とするところは、イオン化持続性が高く、サンプルプレート上で均一な試料／マトリックス混合物を形成することのできるＭＡＬＤＩ−ＭＳ用試料調製方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記課題を解決するために成された本発明に係るＭＡＬＤＩ−ＭＳ用試料調製方法は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法による質量分析用の試料を調製するための方法であって、
a)酸と塩基から生成される有機塩であって前記酸が酸性基を持つベンゼン環であり前記塩基がアミンである液体マトリックスと、分析対象物質を含む試料液とをサンプルプレート上に滴下するステップと、
b)前記サンプルプレート上に滴下された液体マトリックス及び試料液の上にメタノール又はアセトニトリルを含む液滴統一用液体を滴下するステップと、
を有することを特徴としている。
【００１４】
なお、前記液滴統一用液体としては、メタノール又はアセトニトリルを６０v/v％以上含む液体を用いることが好ましく、より好ましくは７５v/v％以上含む液体を用いる。また、メタノール又はアセトニトリルが１００v/v％未満の液体を用いる場合、該液体は水溶液とすることが望ましい。
【発明の効果】
【００１５】
上記本発明に係るＭＡＬＤＩ−ＭＳ用試料調製方法によれば、サンプルプレートの各ウェル内で複数の小液滴に分散した試料／マトリックス混合物を、前記液滴統一用液体の滴下によって一つの液滴に纏めることができる。そのため、各ウェル内において分析対象物質を巨視的に均一な状態とすることができる。更に、本発明のＭＡＬＤＩ−ＭＳ用試料調製方法によれば、試料液と混合するマトリックスとして液体マトリックスを用いることにより、従来の固体マトリックスを用いた場合に比べて高いイオン化持続性を達成することができる。
【００１６】
以上のように、本発明に係るＭＡＬＤＩ−ＭＳ用試料調製方法によれば、サンプルプレート上に均一性及びイオン化持続性に優れた試料／マトリックス混合物を形成することができるため、従来のようなラスター分析を行う必要がなく、数点のみのレーザー照射で十分な分析精度を達成することが可能となる。そのため、質量分析時におけるステージ移動を最小限に抑えることができ、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析における分析時間を大幅に短縮することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明に係るＭＡＬＤＩ−ＭＳ用試料調製方法を説明する模式図。
【図２】本発明の方法による試料調製を行う自動滴下装置の要部構成を示す模式図。
【図３】実施例１、２及び比較例１、２におけるレーザー照射位置を説明する図。
【図４】サンプルプレートのウェル内に形成された試料／マトリックス混合物を示す写真であって、（ａ）は実施例１、（ｂ）は実施例２、（ｃ）は比較例１、（ｄ）は比較例２を示す。
【図５】実施例１の各レーザー照射位置におけるマススペクトル、及びショット数と信号強度の関係を表したグラフを示す図。
【図６】実施例２の各レーザー照射位置におけるマススペクトル、及びショット数と信号強度の関係を表したグラフを示す図。
【図７】比較例１の各レーザー照射位置におけるマススペクトル、及びショット数と信号強度の関係を表したグラフを示す図。
【図８】比較例２の各レーザー照射位置におけるマススペクトル、及びショット数と信号強度の関係を表したグラフを示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明に係るＭＡＬＤＩ−ＭＳ用試料調製方法について図１を参照して説明する。以下、％で表された量の基準に関しては、特に断りのない限りv/v％とする。
【００１９】
まず、分析対象物質を含む試料液と液体マトリックスをサンプルプレート１０の同一ウェル内に滴下する。分析対象物質としては、タンパク質酵素消化物、ペプチドなどが挙げられる。加えて、糖タンパク質消化物、糖鎖なども対象となるが、これらに限定されるものではない。試料液の溶媒としては、タンパク質の酵素消化物の液体クロマトグラフ溶出液を対象とすることが好ましい。なお、試料液と液体マトリックスは予め混合した状態でサンプルプレート１０に滴下してもよく、別々に滴下してサンプルプレート１０上で混合させるようにしてもよい。
【００２０】
その後、前記のウェルにメタノール又はアセトニトリルを含む液滴統一用液体を滴下する。これにより、ウェル内で前記試料液と液体マトリックスの混合物が複数の液滴に分散している場合でも、該ウェルに上乗せした液滴統一用液体によって前記複数の液滴を一つに纏めることができる。
【００２１】
前記液体マトリックスとしては、酸と塩基から生成された有機塩であって、前記酸が酸性基を持つベンゼン環から成るもの（例えば、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）、２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）、３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシケイ皮酸等）であり、前記塩基がアミン（例えば、ブチルアミン、ジヒドロキシアミン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ−イソプロピル−Ｎ−メチル−ｔｅｒｔ−ブチルアミン、１，１，３，３−テトラメチルグアニジン等）であるものを使用する。このような液体マトリックスとしては、例えば、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸のブチルアミン塩 (ＣＨＣＡ＿Ｂ)、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸のジヒドロキシルアミン塩、２，５−ジヒドロキシ安息香酸のブチルアミン塩、２，５−ジヒドロキシ安息香酸のジヒドロキシルアミン塩などを用いることができる。更に、前記液体マトリックスは、前記酸と塩基をモル比で表して１：１の割合で混合して作成されたものを用いることが望ましい。
【００２２】
前記液滴統一用液体としては、メタノール又はアセトニトリルを６０％以上（望ましくは７５％以上）の割合で含む水溶液を用いることが望ましい。なお、１００％のメタノール又はアセトニトリルを用いてもよい。なお、サンプルプレート上に均一な試料／マトリックス混合物を形成するためには、前記メタノール又はアセトニトリルを用いるのが特に効果的であるが、これらに代えて他の有機溶媒を用いることも可能である。また、液滴統一用液体は、試料液と液体マトリックスの混合物：液滴統一用液体の体積比が１０：１〜１：１０となるように滴下することが望ましい。
【００２３】
以上により、試料調製が完了した後は、自然乾燥又はサンプルプレート１０の上面に温風を供給するなどして前記液滴統一用液体を蒸発させる。このサンプルプレート１０をＭＡＬＤＩ質量分析装置、例えばＭＡＬＤＩ飛行時間型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ装置）を用いて分析し、所定の質量範囲のマススペクトルを取得する。
【００２４】
このとき、サンプルプレートの各ウェルでは、試料／マトリックス混合物が均一な状態で存在しているため、レーザー照射位置によるマススペクトルのばらつきを抑えることができる。また、液体マトリックスは固体マトリックスに比べてイオン化持続性が高いため、同一箇所に繰り返しレーザー照射を行うことができる。従って、本発明の方法で調製された試料を分析する際には、従来の固体マトリックスを用いたＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析のようにラスター分析によって数十〜数百点のレーザー照射を行う必要がなく、１ウェルにつき１〜３点程度のレーザー照射により高感度な分析を行うことができる。
【００２５】
上記のような本発明の方法による試料調製は、分析作業者が手作業で行ってもよいが、自動滴下装置を用いて行うことが望ましい。
【００２６】
以下、本発明に係る試料調製を行うための自動試料滴下装置の構成と動作を説明する。なお、ここでは液体クロマトグラフ装置から溶出する試料液をサンプルプレート上に滴下する構成の自動試料滴下装置について説明するが、他の構成の装置、例えば、予めバイアル瓶等に収容された試料液を採取してサンプルプレート上に滴下する構成の自動試料滴下装置においても本発明に係る試料調製方法を同様に適用することができる。
【００２７】
図２は自動試料滴下装置３０を液体クロマトグラフ装置と共に示した概略構成図である。溶離液槽２１に貯留されている溶離液（移動相）は送液ポンプ２２により吸引され、一定流量で試料導入部２３を介してカラム２４に流される。試料導入部２３において移動相中に注入された試料液は移動相に乗ってカラム２４に導入され、カラム２４を通過する間に時間方向に成分分離されて溶出する。紫外可視分光光度計である検出器２５はカラム２４から溶出する成分を順次検出し、検出信号を信号処理部４１へと送る。検出器２５を通った溶出液はその全量又は一部が自動試料滴下装置３０に導入される。
【００２８】
自動試料滴下装置３０は、検出器２５の下流に接続された第一配管３１と、前記第一配管３１に液体マトリックス（例えば、ＣＨＣＡ＿Ｂ）を供給する第二配管３２と、前記第一配管３１に液滴統一用液体（例えば、７５％メタノール水溶液）を供給する第三配管３３を有している。液体容器３４に貯留された液体マトリックスは、送液ポンプ３５によって吸引され、第二配管３２を介して第一配管３１へ導かれる。また、液体容器３６に貯留された液滴統一用液体は、送液ポンプ３７によって吸引され第三配管３３を介して第一配管３１へ導かれる。
【００２９】
第一配管３１は、第二配管３２との接続点Ａから第三配管との接続点Ｂの間では二重管構造となっており、第二配管３２を流れてきた液体マトリックスは、試料液が流れる管の外側を流れるようになっている。更に、第一配管３１は、第三配管３３との接続点Ｂより下流では三重管構造となっており、第三配管３３を流れてきた液滴統一用液体は、液体マトリックスが流れる管の更に外側を流れるようになっている。第一配管３１の先端には三重管構造のニードル３８が接続されており、その先端から試料液、液体マトリックス、及び液滴統一用液体がサンプルプレート１０に向かって滴下される。
【００３０】
なお、前記ニードル３８は、図示しないニードル駆動機構によって水平方向及び上下方向に移動可能となっており、ニードル３８を移動させつつ試料液、液体マトリックス、又は液滴統一用液体を該ニードル３８へ送液することにより、サンプルプレート１０上の各ウェル１１に順次液滴を吐出させることができる。
【００３１】
自動試料滴下装置３０は、更に、信号処理部４１と制御部４２を備えている。信号処理部４１は、液体クロマトグラフ装置の検出器２５から得られる検出信号を基にクロマトグラムを作成し、そのクロマトグラムに出現するピークを利用して、試料成分の採取タイミングを指示するための制御信号を発生する。制御部４２は、該制御信号に従って送液ポンプ３５、３７、前記ニードル駆動機構、及び第一配管３１上に設けられた電磁弁３９の動作を制御する。
【００３２】
カラム２４から溶出される試料液をサンプルプレート１０に滴下する際には、電磁弁３９及び送液ポンプ３５を制御することにより、試料液と液体マトリックスとをニードル３８の先端から同時に吐出する。ニードル３８を移動させながらこうした試料液及び液体マトリックスの吐出を行い、サンプルプレート１０上の全てのウェル１１に試料液及び液体マトリックスの滴下を完了したら、次の作業に移る。すなわち、試料液及び液体マトリックスの滴下が完了したウェル上に再びニードル３８を移動させ、送液ポンプ３７を動作させることにより、液滴統一用液体を滴下して該ウェル上の液滴を一つに統一する。
【００３３】
なお、作業効率を鑑みれば、上記のように試料液と液体マトリックスをサンプルプレート上の全てウェルに滴下した後に液滴統一用液体の滴下を行うことが望ましいが、これに限らず、一つのウェルに試料液と液体マトリックスを滴下する毎に液滴統一用液体の滴下を行うようにしてもよい。
【実施例】
【００３４】
以下、本発明に係るＭＡＬＤＩ−ＭＳ用試料調製方法の実施例について、本発明者が行った従来手法との比較のための実験の内容及び結果を説明する。なお、以下の実験におけるマススペクトルの測定は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ装置「ＡＸＩＭＡ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ」（島津製作所製）を用い、ＭＡＬＤＩ用のサンプルプレートとしては「μＦｏｃｕｓ ＭＡＬＤＩ ｐｌａｔｅ」（Hudson Surface Technology社製）を使用した。
【００３５】
［１］液滴の均一性、イオン化持続性の比較実験
以下に述べる実施例１、２は、本発明の方法による試料調製を行ったものであり、比較例１、２は、液滴統一用液体の滴下を行わない従来法による試料調製を行ったものである。実施例１では液滴統一用液体として１００％メタノールを使用し、実施例２では１００％アセトニトリルを使用した。また、実施例１、２及び比較例２では試料液と混合するマトリックスとして液体マトリックスであるＣＨＣＡ＿Ｂを用い、ＣＨＣＡ＿Ｂを０．０５％トリフルオロ酢酸を含む５０％アセトニトリル水溶液に１ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解させて使用した。一方、比較例１ではマトリックスとして固体マトリックスであるＣＨＣＡを用い、ＣＨＣＡを０．０５％トリフルオロ酢酸を含む５０％アセトニトリル水溶液に３ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解させて使用した(メーカー推奨濃度)。なお、以下の実験では、分析対象物質としてペプチド（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ＿２、ＡＣＴＨ１−１８、又はＡＣＴＨ７−３８）を用い、該ペプチドを、０．０５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む２７％アセトニトリル（ＡＣＮ）水溶液（ＬＣ抽出溶媒条件の最大アセトニトリル割合）に１００ｆｍｏｌ／μＬとなるように溶解したものを試料液として使用した。
【００３６】
実施例１、２については以下の手順で実験を行った。
（１）まず、液体マトリックスと試料液をサンプルプレートの同一ウェルにそれぞれ１μＬずつ滴下した。
（２）その後、前記のウェル上に１００％メタノール又は１００％アセトニトリルを１μＬずつ滴下した。
（３）このサンプルプレートをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ装置に挿入して質量分析を行った。このとき、図３に示すように試料／マトリックス混合物表面の９点についてそれぞれ５００(又は１０００)ショットずつレーザー照射を行った。
【００３７】
一方、比較例１については前記（１）の工程で液体マトリックスの代わりに固体マトリックス溶液を使用すると共に、上記（２）の工程を省き、それ以外は上記実施例１、２と同様にして実験を行った。また、比較例２については前記（２）の工程を省き、それ以外は上記実施例１、２と同様にして実験を行った。
【００３８】
図４にＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ装置による分析の直前におけるサンプルプレートの拡大写真を示す。同図に示すように、比較例１（図４（ｃ））では試料／固体マトリックス混合物の小結晶がウェル内で散乱しており、比較例２（図４（ｄ））では試料／液体マトリックス混合物の小液滴がウェル内で不均一に散乱していた。これに対し、実施例１（図４（ａ））及び実施例２（図４（ｂ））では、いずれも試料／液体マトリックス混合物がウェル内で一つの液滴に統一されていることが確認された。
【００３９】
図５〜８に、実施例１、２及び比較例１、２の上記９点におけるマススペクトルと、該９点におけるイオン化持続性を表すグラフ（即ち、ショット数と信号強度の関係を表したグラフ）を示す。なお、各図中に示した分解能Ｒは、Ｒ＝（m/z値）/（ピーク半値全幅）である。
【００４０】
比較例１（図７）では、イオン化持続性が低く、マススペクトルのピーク形状も前記９点の間でばらつきが見られた。また、比較例２（図８）では、前記９点の内の８点で分析対象物質のピークが検出されなかった、これは、上記のように試料／液体マトリックス混合物の小液滴がサンプルプレート上に不均一に散乱しているために、前記８点では液滴にレーザーが当たらなかったためと考えられる。これに対し、実施例１（図５）及び実施例２（図６）では、いずれの点でも分析対象物質のピークが検出され、且つ比較例１に比べてイオン化持続性及び分解能が高く、前記９点間でのマススペクトルのピーク形状の差も比較例１に比べて小さいことが確認された。
【００４１】
［２］分析時間の比較実験
以下に述べる実施例３は、本発明の方法による試料調製を行ったものであり、比較例３は、従来法による試料調製を行ったものである。なお、以下の実験では、試料液と液体マトリックス（又は固体マトリックス溶液）の滴下は自動試料滴下装置（Ａｃｃｕｓｐｏｔ、島津製作所製）によって行い、液滴統一用液体（すなわち１００％メタノール）の滴下は分析作業者が手作業で行った。実施例３では試料液と混合するマトリックスとして液体マトリックスであるＣＨＣＡ＿Ｂを用い、実施例１のようにＣＨＣＡ＿Ｂを０．０５％トリフルオロ酢酸を含む５０％アセトニトリル水溶液に１ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解させたものがウェル上に滴下されるように調製し、自動試料滴下装置にセットした。一方、比較例３ではマトリックスとして固体マトリックスであるＣＨＣＡを用い、ＣＨＣＡを０．０５％トリフルオロ酢酸を含む５０％アセトニトリル水溶液に３ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解させたものがウェル上に滴下されるように調製し、自動試料滴下装置にセットした。
【００４２】
実施例３については、以下のようにして実験を行った。
（１）まず、自動滴下装置内に液体マトリックスをセットすると共に、装置内の所定の位置にサンプルプレートを載置した。
（２）前記自動滴下装置に接続されたＨＰＬＣシステムに、市販のＢＳＡトリプシン消化物（Waters社製）を０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液に５ｐｍｏｌ／５μＬとなるように溶解したものを注入し、リテンションタイム（カラムに対する試料保持時間）に従い、６分間で試料分離を行った。
（３）それと同時に、順次カラムから溶出される試料液と前記液体マトリックスを、前記のサンプルプレートの６０ウェル分に滴下した。
（４）その後、各ウェルの試料／マトリックス混合物上に、１００％メタノールを１μＬずつ滴下した。
（５）このサンプルプレートをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ装置に挿入し、試料／マトリックス混合物表面の１ポイントのみレーザー照射してＭＳ分析を、続いて２ポイントのみレーザー照射してＭＳ／ＭＳ分析を行うよう設定すると共に、得られたデータを利用してプロテオーム解析用データベース検索ソフトウエア（ＭＡＳＣＯＴ、ＭＡＴＲＩＸ ＳＣＩＥＮＣＥ社）のＭＳ／ＭＳイオンサーチによる解析を実行するように設定して自動分析を行った。
（６）自動分析終了後、得られたＭＳ／ＭＳイオンサーチ結果を確認し、試料の同定を確認した。
【００４３】
一方、比較例３では、上記の液体マトリックスに代えて固体マトリックス溶液を使用し、且つ上記（４）の工程を省略した。更に、（５）の工程において試料／マトリックス混合物表面の６４ポイントにレーザー照射してＭＳ分析を、続いて１００ポイントにレーザー照射してＭＳ／ＭＳ分析を行うように設定して自動ラスター分析を行った。それ以外の点については、上記実施例３と同様である。
【００４４】
上記の実施例３及び比較例３におけるＭＳ／ＭＳイオンサーチ（表中ではMascot Search）のスコアとシーケンスカバー率、及びＭＳ分析及びＭＳＭＳ分析の分析時間を以下の表１に示す。
【００４５】
【表１】
【００４６】
表１から明らかなように、本発明の試料調製方法を用いた実施例３では、従来の試料調製方法を用いた比較例３に比べて約１／４の分析時間で十分なスコアでの試料同定が可能であることが確認された。
【符号の説明】
【００４７】
１０…サンプルプレート
１１…ウェル
２１…溶離液槽
２２…送液ポンプ
２３…試料導入部
２４…カラム
２５…検出器
３０…自動試料滴下装置
３１…第一配管
３２…第二配管
３３…第三配管
３４、３６…液体容器
３５、３７…送液ポンプ
３８…ニードル
３９…電磁弁
４１…信号処理部
４２…制御部
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マトリックス支援レーザー脱離イオン化法による質量分析用の試料を調製するための方法であって、
a)酸と塩基から生成される有機塩であって前記酸が酸性基を持つベンゼン環であり前記塩基がアミンである液体マトリックスと、分析対象物質を含む試料液とをサンプルプレート上に滴下するステップと、
b)前記サンプルプレート上に滴下された液体マトリックス及び試料液の上にメタノール又はアセトニトリルを含む液滴統一用液体を滴下するステップと、
を有することを特徴とするＭＡＬＤＩ−ＭＳ用試料調製方法。
【請求項２】
前記液滴統一用液体が、メタノール又はアセトニトリルを６０v/v％以上含む液体であることを特徴とする請求項１に記載のＭＡＬＤＩ−ＭＳ用試料調製方法。
【請求項３】
前記液体マトリックスが、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸のブチルアミン塩、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸のジヒドロキシルアミン塩、２，５−ジヒドロキシ安息香酸のブチルアミン塩、及び、２，５−ジヒドロキシ安息香酸のジヒドロキシルアミン塩からなる群より選ばれる少なくとも一の有機塩であることを特徴とする請求項１又は２に記載のＭＡＬＤＩ−ＭＳ用試料調製方法。
【請求項１】
マトリックス支援レーザー脱離イオン化法による質量分析用の試料を調製するための方法であって、
a)酸と塩基から生成される有機塩であって前記酸が酸性基を持つベンゼン環であり前記塩基がアミンである液体マトリックスと、分析対象物質を含む試料液とをサンプルプレート上に滴下するステップと、
b)前記サンプルプレート上に滴下された液体マトリックス及び試料液の上にメタノール又はアセトニトリルを含む液滴統一用液体を滴下するステップと、
を有することを特徴とするＭＡＬＤＩ−ＭＳ用試料調製方法。
【請求項２】
前記液滴統一用液体が、メタノール又はアセトニトリルを６０v/v％以上含む液体であることを特徴とする請求項１に記載のＭＡＬＤＩ−ＭＳ用試料調製方法。
【請求項３】
前記液体マトリックスが、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸のブチルアミン塩、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸のジヒドロキシルアミン塩、２，５−ジヒドロキシ安息香酸のブチルアミン塩、及び、２，５−ジヒドロキシ安息香酸のジヒドロキシルアミン塩からなる群より選ばれる少なくとも一の有機塩であることを特徴とする請求項１又は２に記載のＭＡＬＤＩ−ＭＳ用試料調製方法。
【図１】
【図２】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図３】
【図４】
【図２】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１１−１７４８８７（Ｐ２０１１−１７４８８７Ａ）
【公開日】平成２３年９月８日（２０１１．９．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−４０９２３（Ｐ２０１０−４０９２３）
【出願日】平成２２年２月２５日（２０１０．２．２５）
【出願人】（０００００１９９３）株式会社島津製作所 (3,708)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年９月８日（２０１１．９．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年２月２５日（２０１０．２．２５）
【出願人】（０００００１９９３）株式会社島津製作所 (3,708)
【Ｆターム（参考）】
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