ＭＨＣ分子を結合する腫瘍関連ペプチド
【課題】ヒト主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）クラスＩの分子に結合する能力を示す腫瘍関連ペプチドを提供する。
【解決手段】ペプチドがヒト主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）クラスＩの分子に結合する能力を示す、特定のアミノ酸配列をもつ腫瘍関連ペプチド。さらに、腫瘍疾患および／若しくは腺腫性疾患の医薬品の製造および処置のための該ペプチドの使用。また、最低１種の該ペプチドを有する製薬学的組成物。
【解決手段】ペプチドがヒト主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）クラスＩの分子に結合する能力を示す、特定のアミノ酸配列をもつ腫瘍関連ペプチド。さらに、腫瘍疾患および／若しくは腺腫性疾患の医薬品の製造および処置のための該ペプチドの使用。また、最低１種の該ペプチドを有する製薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）クラスＩの分子に結合する能力を示す腫瘍関連ペプチドに関する。
こうしたペプチドは、例えば腫瘍疾患の免疫療法で使用される。
【背景技術】
【０００２】
免疫系による腫瘍細胞の排除に際し、免疫系の成分による腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の検出は顕著な役割を演じている。この機構は、腫瘍細胞と正常細胞の間に質的若しくは量的な差違が存在するという仮定に基づく。抗腫瘍応答を遂げるために、腫瘍細胞は抗原を発現せねばならず、それらに対し腫瘍の排除に十分である免疫学的応答が起こる。
腫瘍の拒絶にはとりわけＣＤ８を発現する細胞傷害性Ｔリンパ球（以下ＣＴＬ）が参画している。細胞傷害性Ｔ細胞によるこうした免疫応答の誘発のためには、外来タンパク質／ペプチドがそのためにＴ細胞に提示されなければならない。Ｔ細胞は、これらがＭＨＣ分子から細胞表面上に提示される場合にのみペプチドフラグメントとして抗原を認識する。これらのＭＨＣ分子（「主要組織適合抗原複合体」）はペプチド受容体であり、通常はそれらが細胞表面に輸送されるためにペプチドが細胞の内側に結合している。ペプチドおよびＭＨＣ分子からのこの複合体はＴ細胞により認識され得る。ヒトのＭＨＣ分子はヒト白血球抗原（ＨＬＡ）ともまた称される。
ＭＨＣ分子の２つのクラスが存在する。すなわち、核をもつ大部分の細胞で見出されるＭＨＣクラスＩ分子は、内因性のタンパク質のタンパク質分解性の分解により生じるペプチドを提示する。ＭＨＣクラスＩＩ分子は、専門的な抗原提示細胞（ＡＰＣ）上にのみ見出され、そしてＡＰＣのエンドサイトーシスの経過中に取り込まれかつプロセシングされる外因性タンパク質のペプチドを提示する。ペプチドおよびＭＨＣクラスＩからの複合体はＣＤ８陽性の細胞傷害性Ｔ細胞に認識され、ペプチドおよびＭＨＣクラスＩＩからの複合体はＣＤ４ヘルパーＴ細胞に認識される。
ペプチドが細胞性免疫応答を誘発し得るために、それはＭＨＣ分子に結合しなければならない。この作用は、ＭＨＣ分子の対立遺伝子および該ペプチドのアミノ酸配列に依存する。ＭＨＣクラスＩに結合するペプチドは、概して８〜１０残基長であり、そしてそれらの配列中に、ＭＨＣ分子の相応した結合溝と相互作用する２個の保存された残基（「アンカー」）を含有する。
免疫系が腫瘍由来のペプチドに対する効果的なＣＴＬ応答を開始し得るために、これらのペプチドは、腫瘍細胞から発現される特定のＭＨＣクラスＩ分子に結合する状況にあるのみならず、しかしそれらはまたＴ細胞から特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ、「Ｔ−ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ」）で認識されなければならない。
腫瘍ワクチンの開発のための主目的は、ＣＤ８＋ ＣＴＬにより認識される腫瘍関連抗原の同定および特徴付けである。
腫瘍特異的細胞傷害性Ｔリンパ球で認識される抗原、あるいはそれらのエピトープは、例えば酵素、受容体、転写因子などのような、すべてのタンパク質分類からの分子であり得る。腫瘍関連抗原の別の重要な分類は、例えば、多様な腫瘍形態および健康な精巣組織中で発現される例えばＣＴ（「癌精巣」）抗原のような組織特異的構造である。
タンパク質が細胞傷害性Ｔリンパ球により腫瘍特異的抗原として認識されるため、および従って治療で使用されることができるために、特定の仮定、すなわち、該抗原は主として腫瘍細胞から発現され、かつ、正常組織からは全く若しくは腫瘍中でよりも少ない量でのみ発現される、が、存在しなければならない。さらに、挙げられた抗原が腫瘍形態中のみならず、しかしまた引き続きより高濃度で存在する場合が望ましい。このような腫瘍関連抗原由来のペプチド（「免疫原ペプチド」）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏであろうとｉｎ ｖｉｖｏであろうとＴ細胞応答に至るために、抗原のアミノ酸配列中のエピトープの存在もまた絶対に不可欠である。
ＴＡＡは、従って腫瘍ワクチンの開発のための出発点である。ＴＡＡの同定および特徴付け方法は、一方で、患者で既に誘導されたＣＴＬの使用に基づくか、若しくは、腫瘍と正常組織の間の示差的な転写プロファイルの生成に基づく。
腫瘍組織若しくはヒト腫瘍細胞株中で過剰発現されているか、またはこうした組織若しくは細胞株中で選択的に発現されている遺伝子の位置決めは、しかしながら、免疫療法におけるこれらの遺伝子から転写された抗原の使用についての正確な情報を生じない。これは、いつもこれらの抗原のわずか２、３のエピトープがこうした使用に適することに理由を有する。完全な抗原でなく、抗原のエピトープのみがＭＨＣ提示によりＴ細胞応答を惹起するからである。従って、ＭＨＣ分子と共に提示される、過剰発現された若しくは選択的に発現されたタンパク質のペプチドを選択することが重要であり、それにより初代細胞若しくは初代腫瘍組織細胞から樹立された腫瘍細胞株の特異的認識のための攻撃点が細胞傷害性Ｔリンパ球により獲得され得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
この背景の前に、ヒト主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）クラスＩの分子に結合する能力を示す、こうしたペプチドの最低１種の新規アミノ酸配列を提供することが本発明の課題である。
この課題は、本発明により、付随する配列表からの配列番号１から配列番号５７７よりなる群から示されるアミノ酸配列をもつ腫瘍関連ペプチドの提供により解決され、その際に、該ペプチドは、ヒト主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）クラスＩの分子に結合する能力を示す。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の根底にある課題は該方法で完全に解決される。
従って、腫瘍から同定されるペプチドが、より多量の獲得のため、および下で挙げられる目的のための使用のために、合成されるか若しくは細胞中で発現にもたらされることが自明である。
発明者は、上述されたペプチドをＭＨＣクラスＩ分子の特異的リガンドとして腫瘍組織から単離かつ同定し得た。その際、本明細書で、「腫瘍関連」ペプチドという用語で、腫瘍物質から単離かつ同定されたものを指す。真正の（初代）腫瘍に提示されるこれらのペプチドは、従って腫瘍細胞中での抗原プロセシングを受ける。
特異的リガンドは、例えば相応する抗原（それからペプチドが発する）が発現される腫瘍細胞に対する免疫応答を誘導するために、癌治療において使用し得る。
ＣＴＬの誘導の形態の１つのこうした免疫応答は一方でｉｎ ｖｉｖｏで達成され得る。加えて、ＴＡＡと関連する腫瘍疾患に苦しめられている患者は、該ペプチドを例えば製薬学的組成物の形態で投与される。
対照的に、該ペプチドが発する抗原を発現する腫瘍に対するＣＴＬ応答はｅｘ ｖｉｖｏでもまた惹起され得る。そのためには、ＣＴＬ前駆細胞を抗原提示細胞およびペプチドと一緒にインキュベートする。次いで、それにより刺激されたＣＴＬを培養し、そしてこの活性化されたＣＴＬを患者に投与する。
さらに、ｅｘ ｖｉｖｏでＡＰＣにペプチドを負荷する可能性、および、該ペプチドが発する抗原を腫瘍組織中で発現している患者にこの負荷されたＡＰＣを投与する可能性が存在する。ＡＰＣはその後、順に、ｉｎ ｖｉｖｏでＣＴＬにペプチドを提示し得そしてそれらを活性化し得る。
本発明のペプチドはしかし診断試薬としてもまた使用し得る。
【発明の効果】
【０００５】
であるから、該ペプチドを用いて、１つのＣＴＬ集団中に該ペプチドに特異的に向けられたＣＴＬが存在するかどうか、若しくは治療により誘導されるかどうかを確認し得る。
また、定義されたペプチドに対する反応性を示すＴ細胞の前駆体の増加を、該ペプチドを用いて試験し得る。
また、該ペプチドを、該ペプチドが発する抗原を発現する腫瘍の疾患経過を追跡するために、それに対するマーカーとして利用し得る。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】ａは、ＫＭ２２目的細胞のＣＴＬ特異的溶解に関する陰性対照（ペプチドなし）。ｂは、ペプチドでパルスしかつインターフェロンγで処理したＫＭ２２目的細胞のＣＴＬ特異的溶解。
【図２】ペプチドを負荷したＫＭ２２若しくはＪＹ細胞による刺激後の特異的Ｔリンパ球によるインターフェロンγ形成。
【図３】ヒトＣＤ８陽性Ｔ細胞のペプチド特異的刺激、および
【図４】腎細胞癌患者の血液からのペプチド特異的Ｔ細胞の検出。
【図５】末梢血からのＢ*０７０２／ＩＡＲＮＬＴＱＱＬ特異的ＣＤ８＋リンパ球のマイクロスフェアに駆動される増殖の四量体分析。６名の試験した健康な被験体のうち４名（ＨＤ１５５、−１５９、−１６１、−１７７）が、四量体染色による、ペプチド／ＫＬＡ−Ｂ*０７０２複合体特異的Ｔ細胞受容体についての結果により示されるとおり、配列番号２３３をもつ試験したペプチド抗原に特異的に向けられた有意の（赤線より上にある）Ｔ細胞応答を有した。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
付随する表１に、同定されたペプチドを示す。該表中ではまた、「ＨＵＧＯ遺伝子命名法委員会（ＨＵＧＯ Ｇｅｎｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）」に従った受容された遺伝子記号（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅ．ｕｃｌ．ａｃ．ｕｋ／ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ／あるいはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ／ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＬｏｃｕｓＬｉｎｋ／）により命名あるいは略記される、該ペプチドが発するタンパク質、および挙げられたタンパク質中のペプチドの特定の位置も示す。ここでは、誤りやすい翻訳を回避するためにタンパク質の英語名称が保持されている。再度、それぞれに、国立保健研究所（Ｎａｔｉｎａｏｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）の「国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＧｅｎｂａｎｋに登録されているＡｃｃ番号を示す（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい）。
発明者は、合計１０例の患者の８個の腎細胞腫瘍および２個の膠芽腫、すなわちＲＣＣ７５、ＲＣＣ９８、ＲＣＣ１００、ＲＣＣ１０３、ＲＣＣ１１２、ＲＣＣ１１５、ＲＣＣ１１６、ＲＣＣ１３０およびＮＣＨ３５９、ならびにＮＣＨ３６１、ならびに１個の腫瘍細胞株（Ｊ−Ｙ）からペプチド（若しくはリガンド）を単離し得た。
患者の腫瘍および細胞株Ｊ−Ｙから５７７のリガンドを同定し得、それらはＨＬＡサブタイプＡ*０３、Ｂ*０７、Ｂ*４０（ＲＣＣ７５）、Ａ*０１、Ａ*０３、Ｂ*０７、Ｂ*１８（ＲＣＣ９８）、Ａ*０２、Ａ*０３、Ｂ*０７、Ｂ*１８（ＲＣＣ１００）、Ａ*１１、Ａ*２５、Ｂ*１５、Ｂ*４４（ＲＣＣ１０３）、Ａ*０１、Ａ*３１、Ｂ*０８、Ｂ*２７（ＲＣＣ１１２）、Ａ*０２、Ａ*０３、Ｂ*１５、Ｂ*１８（ＲＣＣ１１５）、Ａ*０１、Ａ*０２、Ｂ*２７、Ｂ*３７（ＲＣＣ１１６）、Ａ*０２、Ａ*２４、Ｂ*０７、Ｂ*４４（ＲＣＣ１３０）、Ａ*０３、Ａ*３２、Ｂ*０７、Ｂ*３５（ＮＣＨ３５９）、Ａ*２６、Ｂ*３８（ＮＣＨ３６１）およびＡ*０２、Ｂ*０７（Ｊ−Ｙ）に結合した。
該リガンドのいくつかは、強く発現するいわゆる「ハウスキーピング」遺伝子から発し、それらは大部分の組織中で顕著に発現され、多くは際だっていたが、しかし組織特異的および腫瘍特異的発現により顕著であった。
そのように、とりわけ腫瘍組織中で過剰発現されるタンパク質から発するいくつかのペプチドを同定し得た。従って、例えばテナシン−Ｃのフラグメント（ＧＬＡＰＳＩＲＴＫ、配列番号２）を同定し得た。（Ｈｅｒｏｌｄ−Ｍｅｎｄｅら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｐａｃｔ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ Ｔｅｎａｓｃｉｎ−Ｃ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ Ｇｌｉｏｍａ Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ、２００２、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、９８：３６２−３６９）
発明者はまた、とりわけ、ＳＯＸ９（ＹＰＨＬＨＮＡＥＬ、配列番号７）およびＲＧＳ５（ＬＡＡＬＰＨＳＣＬ、配列番号４４８）から発するリガンドを同定し得た。
【０００８】
初代腫瘍細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏの培養に適しないため、発明者は、本発明により、この細胞株から同定されたペプチドが細胞傷害性Ｔリンパ球をｉｎ ｖｉｔｒｏで活性化するのに適することを付加的に立証するために、例示的一ヒト腫瘍細胞株を選択した。とりわけ、発明者は、樹立腫瘍細胞株ＪＹの例示的な選択されたペプチドの使用下で、配列ＦＰＳＬＲＥＡＡＬ（ＭＡＧＥＡ１、位置２９４−３０２）および配列番号１１４をもつ選択されたペプチド、ならびにＨＬＡ対立遺伝子Ｂ*０７０２に対し特異的であった細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）をｉｎ ｖｉｔｒｏで発生させることが可能であることを示し得た。このＣＴＬを用いて、配列番号１１４をもつペプチドを負荷された標的とされるＫＭ２２目的細胞を殺し得た。それに対して、対照に使用された、配列番号１１４を持つペプチドを負荷されないＫＭ２２目的細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞から認識されなかった。従って、エピトープとして本発明のペプチドを用いて、ヒトＴ細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで活性化し得たことを例示的に示し得た。また、配列番号１１４をもつペプチドを負荷されたＴ２細胞を溶解した細胞傷害性Ｔリンパ球が、Ｔ細胞の活性化の真正のマーカーとして記述されたインターフェロンγも発現することを示し得た。
【０００９】
好ましい一態様において、配列番号１から５７７を示しかつ最低１個のアミノ酸が類似の化学的特徴をもつ別のアミノ酸により置換されているペプチドもまた、免疫応答の刺激に使用し得る。
これらは、特定のＭＨＣサブタイプ、例えば類似の化学的特徴をもつアミノ酸により使用され得るアンカーアミノ酸に関する。従って、例えば、ＭＨＣサブタイプＨＬＡ−Ａ*０２と関連するペプチドでは、位置２でロイシンをイソロイシン、バリン、若しくはメチオニンで、および逆に、ならびに、Ｃ末端のロイシンでバリン、ロイシン、イソロイシンおよびアラニン（全部非極性の側鎖を示す）で交換し得る。
さらに、そのＮ若しくは／およびＣ末端が最低１個のさらなるアミノ酸を示すか若しくは最低１個のアミノ酸が欠失されている、配列番号１から５７７をもつペプチドを使用することが可能である。
さらに、最低１個のアミノ酸が化学修飾されている、配列番号１から５７７をもつペプチドを使用し得る。
従って、ペプチドの免疫原性が変動により影響を及ぼされない、すなわちＭＨＣ分子に対する類似の結合親和性およびＴ細胞刺激の能力を示すように、変動するアミノ酸（１個若しくは複数）を選択する。
【００１０】
本発明により、該ペプチドは腫瘍疾患および／若しくは腺腫性疾患の処置に使用し得る。
処置されるべき腫瘍疾患は、従って、例えば腎、脳、乳房、膵、胃、精巣および／若しくは皮膚癌ならびに神経系の腫瘍疾患を包含する。腫瘍疾患の一覧はこれにより単に例示的であり、そして応用の範囲を狭めない。発明者は、自身の研究において、本発明のペプチドがこうした使用に適することを示し得た。ここで、あるペプチドに特異的であったこの目的のため生成されたＣＴＬが、効果的かつ選択的にＴ細胞を殺し得たことが証明された。
【００１１】
腫瘍ワクチンでの腫瘍関連抗原の使用のため、基本的ないくつかの適用形式が可能である。従って、Ｔｉｇｈｅら、１９９８、Ｇｅｎｅ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ：ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ ｉｓ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ｊｕｓｔ ａ ｂｌｕｅｐｒｉｎｔ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １９（２）：８９−９７は、適するアジュバントあるいは担体系を伴う組換えタンパク質若しくはプラスミドベクター中の抗原をコードするｃＤＮＡのいずれかとして、抗原を投与し得ることを記述している。これらの例において、免疫応答が惹起されるように、患者の体内の該抗原が抗原提示細胞（ＡＰＣ）によりプロセシングかつ提示されなければならない。
Ｍｅｌｉｅｆら、１９９６、Ｐｅｐｔｉｄｅ−ｂａｓｅｄ ｃａｎｃｅｒ ｖａｃｃｉｎｅｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：６５１−６５７は、さらなる可能性、すなわち合成ペプチドのワクチンとしての使用を示す。
該ペプチドは、従って、好ましい一態様において、アジュバントの添加を伴い、若しくはしかし単独でも使用し得る。
アジュバントとして、例えば、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）が適し得る。こうしたアジュバントのさらなる例は、水酸化アルミニウム、例えばフロイントのアジュバント、サポニン若しくはケイ素化合物のような鉱物油の乳液である。
アジュバントを伴う使用は、ペプチドにより惹起される免疫応答が強められ得る場合、および／若しくはペプチドが安定化されるという利点を提供する。
【００１２】
別の好ましい一態様において、抗原提示細胞に結合されたペプチドを使用する。
こうした処置は、ペプチドが免疫系、とりわけ細胞傷害性Ｔリンパ球（ＴＣＬ）に提示され得るという利点を有する。それによりＣＴＬは腫瘍細胞を認識し得かつ特異的に殺し得る。抗原提示細胞として、例えば樹状細胞、単球若しくはＢリンパ球がこうした一使用に適する。
この場合、細胞は例えばｅｘ ｖｉｖｏでペプチドを負荷される。他方、その後該ペプチドを細胞上で発現にもたらすために、該ペプチドをコードするＤＮＡ若しくは相応するＲＮＡで細胞をトランスフェクトする可能性もまた存在する。
発明者は、樹状細胞（ＤＣ）に特定のペプチドを負荷すること、およびこれらの負荷された樹状細胞がペプチド特異的ＣＴＬを活性化することが可能であることを適切な研究で示し得た。これは、相応するペプチドを発現するＣＴＬを腫瘍に対し発生させるように免疫系を刺激し得ることを意味している。
該ペプチドを運搬する抗原提示細胞は、従って、直接使用し得るか、若しくは使用の前に例えば熱ショックタンパク質ｇｐ９６で活性化し得るかのいずれかである。これらの熱ショックタンパク質は、ＭＨＣクラスＩＩ分子およびＢ７のような共刺激分子の発現を誘導し、そしてさらにサイトカインの産生を刺激する。これにより、全体として免疫応答の惹起が促進される。
【００１３】
別の好ましい一態様において、白血球、とりわけＴリンパ球の標示にペプチドを使用する。
これらの使用は、あるペプチドに特異的なＣＴＬ集団中に指向されたＣＴＬが存在するかどうかを該ペプチドで確認しなければならない場合に有利である。
また、腫瘍疾患での治療経過の評価のためのマーカーとして該ペプチドを使用し得る。
また、他の免疫化若しくは治療に際して、該ペプチドを治療のモニタリングに使用し得る。従って、該ペプチドは治療的のみならずしかしまた診断的にも使用可能である。
【００１４】
さらなる一態様において、該ペプチドを抗体の製造に使用し得る。
ポリクローナル抗体は、慣習的方法で、ペプチドの注入による動物の免疫化、およびその後の免疫グロブリンの精製により獲得し得る。
モノクローナル抗体は、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８６），１２１，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓに記述されるような標準的プロトコルに従って製造し得る。
【００１５】
本発明はまた、さらなる一局面において、該ペプチドの１種若しくはそれ以上を含有する製薬学的組成物に関する。
これらの組成物は、例えば非経口投与、例えば皮下、皮内若しくは筋肉内、または経口投与に役立つ。その場合、該ペプチドは製薬学的に許容できる、とりわけ水性の担体に溶解若しくは懸濁される。さらに、該組成物は、例えば緩衝剤、結合剤、希釈剤などのような賦形剤を含有し得る。
該ペプチドはまた、免疫刺激物質、例えばサイトカインと一緒になって投与され得る。それらのこのような組成物とともに使用され得るような賦形剤の包括的な記述は、例えばＡ．Ｋｉｂｂｅ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，第３版、２０００、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｐｒｅｓｓに記述されている。
該剤は、従って、腫瘍疾患および／若しくは腺腫性疾患の防止（Ｐｒａｅｖｅｎｔｉｏｎ）、予防措置（Ｐｒｏｐｈｙｌａｘｅ）および／若しくは治療に使用し得る。
配列番号１から５７７をもつペプチドの最低１種を含有する製薬学的剤は、挙げられたペプチド、例えば抗原が関連する腫瘍疾患を担持する患者に投与される。従って、腫瘍特異的ＣＴＬに基づく腫瘍特異的免疫応答が惹起され得る。
該製薬学的組成物中に存在するペプチド（１種若しくは複数）の量は、従って治療上有効な量で存在する。従って、該組成物中に含有されるペプチドは、最低２種の異なるＨＬＡタイプにも結合し得る。
【００１６】
本発明は、さらなる一局面において、配列番号１から５７７をもつペプチドをコードする核酸分子に関する。
該核酸分子は、この場合ＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子であり得、そしてまた癌疾患の免疫療法に使用される。従って、該核酸分子から発現されるペプチドは、該ペプチドが発現する腫瘍細胞に対する免疫応答を誘導する。
本発明により、該核酸分子はベクター中にも存在し得る。
さらに、本発明は、該ペプチドをコードする核酸分子の助けを借りて、配列番号１から５７７をもつペプチドをそれらが産生するように遺伝子的に変えられた細胞に関する。
該細胞は、このため、該ペプチドをコードするＤＮＡ若しくは相応するＲＮＡでトランスフェクトされ、それにより該ペプチドは該細胞上で発現にもたらされる。こうした使用のため、抗原提示細胞として、例えば樹状細胞、単球若しくはＢリンパ球が適する。
前に挙げられかつなお下の例示的特徴が、常に述べられる組合せでのみならず、しかしまた単独で使用可能であることが、本発明の範囲を離れることなく、認識される。
本発明の実施例は後に続く実施例および付随する図面に記述かつ例示される。
【実施例１】
【００１７】
１．１ 患者サンプル
チュービンゲン大学泌尿器科から、組織学的に確認された腎細胞癌を表す患者由来の８検体のサンプルを得た。ＲＣＣ７５で示される患者は以下のＨＬＡタイピングすなわちＡ*０３、Ｂ*０７、Ｂ*４０を有した。ＲＣＣ９８で示される患者は以下のＨＬＡタイピングすなわちＡ*０１、Ａ*０３、Ｂ*０７、Ｂ*１８を有した。ＲＣＣ１００で示される患者はＨＬＡタイピングＡ*０２、Ａ*０３、Ｂ*０７、Ｂ*１８を有した。ＲＣＣ１０３で示される患者は以下のＨＬＡタイピングすなわちＡ*１１、Ａ*２５、Ｂ*１５、Ｂ*４４を有した。ＲＣＣ１１２で示される患者は以下のＨＬＡタイピングすなわちＡ*０１、Ａ*３１、Ｂ*０８、Ｂ*２７を有した。ＲＣＣ１１５で示される患者は以下のＨＬＡタイピングすなわちＡ*０２、Ａ*０３、Ｂ*１５、Ｂ*１８を有し、ＲＣＣ１１６で示される患者はＨＬＡタイピングＡ*０１、Ａ*０２、Ｂ*２７、Ｂ*３７を有し、そしてＲＣＣ１３０で示される患者はＨＬＡタイピングＡ*０２、Ａ*２４、Ｂ*０７、Ｂ*４４を有した。
ハイデルベルク大学神経外科から、組織学的に確認された膠芽腫を表す患者由来の２検体のサンプルを得た。ＮＣＨ３５９で表される患者は以下のＨＬＡタイピングすなわちＡ*０３、Ａ*３２、Ｂ*０７、Ｂ*３５を有した。ＮＣＨ３６１で表される患者は以下のＨＬＡタイピングすなわちＡ*２６およびＢ*３８を有した。
１．２ ＭＨＣクラスＩに結合されるペプチドの単離
ショック凍結させた腫瘍サンプルを、Ｓｃｈｕｒｌｅ，Ｍ．ら、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ａ ｎｏｖｅｌ Ｔ ｃｅｌｌ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｐｐｒｏａｃｈ，２０００，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３０：２２１６−２２２５に既に記述されたように処理した。ペプチドを標準的プロトコルに従って、すなわち、ＨＬＡクラスＩ分子に特異的であるモノクローナル抗体Ｗ６／３２、若しくはＨＬＡ−Ａ２に特異的であるモノクローナル抗体ＢＢ７．２の使用下で単離した。Ｂａｒｎｓｔａｂｌｅ，Ｃ．Ｊ．ら、Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｇｒｏｕｐ Ａ ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ，ＨＬＡ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎｓ−ｎｅｗ ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ，１９７８，Ｃｅｌｌ，１４：９−２０、およびＰａｒｈａｍ，Ｐ．＆Ｂｒｏｄｓｋｙ，Ｆ．Ｍ．，Ｐａｒｔｉａｌ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｏｍｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ＢＢ７．２．Ａ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｗｉｔｈ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｆｏｒ ＨＬＡ−Ａ２ ａｎｄ ａ ｖａｒｉａｎｔ ｏｆ ＨＬＡ−Ａ２８，１９８１，Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３：２７７−２９９は、これらの抗体の製造および応用を記述している。
１．３ 質量分析
ペプチドは「逆相ＨＰＬＣ」により分離し（ＳＭＡＲＴシステム、μＲＰＣ Ｃ２／Ｃ１８ ＳＣ ２．１／１９、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、そして得られた画分をナノＥＳＩ ＭＳにより分析した。その際、Ｓｃｈｉｒｌｅ，Ｍ．ら、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ａ ｎｏｖｅｌ Ｔ ｃｅｌｌ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｐｐｒｏａｃｈ，２０００，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３０：２２１６−２２２５に記述されるとおり進行した。
腫瘍組織から得られたペプチドは、たった今記述されたとおり、しかしながらわずかな変更を伴い、キャピラリーＬＣ−ＭＳにより同定した。すなわち、１００μｌのサンプルを常に負荷し、脱塩し、そして３００μｍ×５ｍｍ Ｃ１８ μ−Ｖｏｒｓａｅｕｌｅ（ＬＣ充填剤）で前濃縮した。溶媒およびサンプルを、封止した１００μｌシリンジ（１７１０ ＲＮＲ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ）を伴うシリンジポンプ（ＰＨＤ ２０００、Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｒ，Ｉｎｃ．）を用い、２μｌ／分の速度で供給した。ペプチドの分離のため、前濃縮カラムを、７５μｍ×２５０ｍｍ Ｃ−１８カラムの前に接続した。次いで、１２μｌ／分の流速から約３００ｎｌ／分に低下させ、すなわち実際にＴＥＥ接続（ＺＴＩＣ、Ｖａｌｃｏ）および３００μｍ×１５０ｍｍ Ｃ−１８カラムの使用下で、７０分間の２５〜６０％Ｂを伴う二相勾配を行った。
該装置が残余のペプチドを含まなかったことを保証するために、サンプルブランクを常に測定した。オンラインの断片化を記述されたとおり実施し、そしてフラグメントのスペクトルを人的に分析した。データバンク調査（ＮＣＢＩ番号、ＥＳＴ）はＭＡＳＣＯＴの使用下で実施した（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍａｔｒｉｘｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ）。
１．４ ＭＨＣクラスＩリガンドの同定
開示される配列表および開示される表１に、患者ＲＣＣ７５、ＲＣＣ９８、ＲＣＣ１００、ＲＣＣ１０３、ＲＣＣ１１２、ＲＣＣ１１５、ＲＣＣ１１６、ＲＣＣ１３０、ＮＣＨ３５９およびＮＣＨ３６１のＨＬＡ分子に結合したリガンドを列挙する。ＨＬＡ−Ａ*０２と関連するペプチドは対立遺伝子特異的なペプチドモチーフを示した。従って、位置２にロイシン、バリン、イソロイシン、アラニン若しくはメチオニン、およびＣ末端にロイシン、バリン、イソロイシン若しくはアラニンが見出された。該リガンドの大部分はいわゆる「ハウスキーピング」タンパク質から発したとは言え、腫瘍と関連するタンパク質のリガンドも同定され得た。かように、例えばテナシン−Ｃのフラグメントを同定し得た（ＧＬＡＰＳＩＲＴＫ、配列番号２；ＧＶＬＫＫＶＩＲＨ、配列番号２０）。Ｈｅｒｏｌｄ−Ｍｅｎｄｅら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｐａｃｔ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ Ｔｅｎａｓｃｉｎ−Ｃ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ Ｇｌｉｏｍａ Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ，２００２，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，９８：３６２−３６９は、一般に細胞外マトリックスタンパク質テナシン−Ｃの発現の高さが、疾患の重症度および健康な組織への腫瘍細胞の移動と相関することを示している。
１．５ 正常ＣＤ８＋ Ｔ細胞レパートリー中のペプチド特異的Ｔ細胞の証明
例えば配列ＦＰＳＬＲＥＡＡＬ（配列番号１１４）をもつペプチドについてのペプチド特異的Ｔ細胞の証明のため、健康被験体の末梢血からの単核細胞を、関係のあるペプチドで構成された、関係のあるＨＬＡ−Ａ*サブタイプの四量体で染色した。すなわち、四量体の製造のため、Ｗａｌｔｅｒ Ｓら、２００３，Ｃｕｔｔｉｎｇ Ｅｄｇｅ：Ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ Ａｖｉｄｉｔｙ ｏｆ Ｈｕｍａｎ ＣＤ８ Ｔ Ｃｅｌｌｓ Ｅｘｐａｎｄｅｄ ｏｎ Ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ ＭＨＣ／Ａｎｔｉ−ＣＤ２８−Ｃｏａｔｅｄ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７１：４９７４−４９７８のように、組換えＨＬＡ−Ｂ*サブタイプの分子を、該ペプチドを伴いｉｎ ｖｉｔｒｏで構成し、ゲル濾過により精製し、ビオチニル化し、そして単量体の結合のためストレプトアビジンと混合した。
原則的に、ＦＡＣＳを用いる分析による二重染色の結果を検討し、そしてペプチド−四量体の特異的結合が証明される（Ｗａｌｔｅｒ Ｓら、２００３，Ｃｕｔｔｉｎｇ Ｅｄｇｅ：Ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ Ａｖｉｄｉｔｙ ｏｆ Ｈｕｍａｎ ＣＤ８ Ｔ Ｃｅｌｌｓ Ｅｘｐａｎｄｅｄ ｏｎ Ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ ＭＨＣ／Ａｎｔｉ−ＣＤ２８−Ｃｏａｔｅｄ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７１：４９７４−４９７８）。
【実施例２】
【００１８】
腫瘍細胞による選択されたペプチドの提示およびＣＴＬによるペプチドの認識を分析するため、選択されたペプチドに特異的であったＣＴＬをｉｎ ｖｉｔｒｏで誘導した。それのため、ＫＭ２２およびＪＹ目的細胞株を使用した。
２．１ 特異的Ｔリンパ球の獲得
特異的Ｔリンパ球は、１．５で記述されるとおり健康被験体の血液から単離し、そしてＦＡＣＳ分取により濃縮した。
２．２ ペプチドの合成
例示的な選択されたペプチドは、Ｆ−ｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）保護基の使用によりペプチド合成機（４３２Ａ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ドイツ・ヴァイターシュタット）で合成し、そして「逆相」ＨＰＬＣおよび質量分析により分析した。これらの方法で、同定されたペプチドについて十分な量を製造し得る。
２．３ 制限された合成ペプチドの使用下での抗原特異的ＣＴＬ応答の誘導
ＣＴＬの誘導のため、段階２．１で得られたＴリンパ球（ウェルあたり５×１０６個のＴリンパ球）を、１０％熱不活性化ヒトＡＢ血清（ＣＣ Ｐｒｏ、ドイツ・ノイシュタット／ヴァインシュトラッセ）、２ｍＬ Ｌ−グルタミン、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび２０μｇ／ｍｌゲンタマイシン（全部ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ／Ｃａｍｂｒｅｘ、ベルギー・ヴェルヴィエから）を含む１．５ｍｌのＴ細胞培地［ＲＰＭＩ １６４０、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ドイツ・カールスルーエ）から構成される］中ウェルあたり１×１０６の照射した目的細胞とともに、２４ウェルプレート中でのｉｎ ｖｉｔｒｏ再刺激により共インキュベートした。加えて、５ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ−１２ ｐ７０（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を添加した。３７℃で約４日の共インキュベーション後に、２０Ｕ／ｍｌのヒトＩＬ−２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含む新鮮培地を添加し、そして細胞をさらなる３から４日間インキュベートした。この刺激周囲を２回反復した。
２．４ ＣＴＬアッセイ
ＣＴＬアッセイのため、標的細胞としてＫＭ２２およびＪＹ腫瘍細胞株を使用した。ペプチドでパルスされる細胞は、５０μｇ／ｍｌのペプチドで２時間パルスした。全標的細胞は、ＲＰ１０培地（１０％熱不活性化ウシ胎児血清および抗生物質を補充したＲＰＭＩ １６４０）中、３７℃で［５１Ｃｒ］クロムナトリウム（５１Ｃｒ）で１時間標識した。次いで、丸底をもつ９６ウェルプレートの１ウェルあたり常に１０４細胞を与えた。２００μｌの最終容量を達成するためにさまざまな量をＣＴＬに添加し、次いで３７℃で４時間インキュベートした。その後、上清（５０μｌ／ウェル）を収集し、そしてベータプレート計数器で正確に計数した。特異的溶解を、後に続くとおり、すなわち、１００×（実験的放出−自発的放出／最大放出−自発的放出）パーセントで評価した。自発的および最大放出は、常に、培地若しくは２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００いずれかの存在下で測定した。
２．５．ＣＴＬ誘導の結果
ａ）ペプチドでパルスした目的細胞に対するＣＴＬ細胞傷害性活性
５１Ｃｒ放出アッセイ（２．４．でを参照されたい）において、ＫＭ２２若しくはＪＹ細胞に対する誘導されたＣＴＬの細胞傷害性活性（２．３．でを参照されたい）を試験した。細胞株ＫＭ２２およびＪ−ＹはＨＬＡ−Ｂ*０７陽性である。
この放出アッセイの結果を図１ａおよび１ｂに具体的に説明する。図１ａおよび１ｂにおいて、「ＩＦＮ」でインターフェロン−γを、「Ｅ：Ｔ」でエフェクター−目的細胞の比を、「Ｔｅｔ＋」でＨＬＡ−Ｂ*０７０２／ＦＰＳＬＲＥＡＡＬ四量体に結合するＴリンパ球を、および「Ｔｅｔ−」でＨＬＡ−Ｂ*０７０２／ＦＰＳＬＲＥＡＡＬ四量体に結合しないＴリンパ球を略記する。
該結果は、２週の再刺激後に得られるＣＴＬ細胞株で、抗原特異的細胞死（Ａｂｔｏｅｔｕｎｇ）が達成され得たことを示す。すなわち、図１ａにおいて、インターフェロン−γで処理した、ペプチドを伴わないＨＬＡ対立遺伝子Ｂ*０７０２について陽性のＫＭ２２目的細胞が、特異的細胞傷害性Ｔリンパ球により認識されなかったことを示す。図１ｂは、腫瘍抗原ＭＡＧＥ−１からの配列ＦＰＳＬＲＥＡＡＬを伴うペプチドを提示する、インターフェロン−γで処理した、ＨＬＡ対立遺伝子Ｂ*０７０２について陽性のＫＭ２２目的細胞が、特異的細胞傷害性Ｔリンパ球により認識かつ溶解されたことを示す。結果として、その細胞のみが、従って、増大する量により、選択されたペプチドを常に提示したＣＴＬを殺し；無関係のペプチドを負荷した対照細胞は殺されなかった。従って、細胞溶解活性の特異性が示され得た。
ｂ）ペプチドで刺激したＴリンパ球によるインターフェロン−γの形成
次の試みにおいて、ペプチドＦＰＳＬＲＥＡＡＬ（配列番号１１４）を負荷したＴ２細胞を溶解した細胞傷害性Ｔリンパ球が、Ｔ細胞の活性化の確実なマーカーとして記述されているインターフェロン−γも発現したことを示した。
図２において、ここでＫＭ２２およびＪＹ細胞を試験した測定の結果を示す。図１でと等しい略語が使用され、ここで再度、「ＣＤ８＋」で、細胞表面上に受容体分子ＣＤ８を発現するＴリンパ球を示す。
ＩＦＮ−γの証明のため、ペプチドでパルスした１×１０５個のエフェクター細胞および刺激体細胞を９６ウェルプレート上でＴ細胞培地中で培養した（Ｔ細胞培地：１０％熱不活性化ヒトＡＢ血清（ＣＣ ｐｒｏ、ノイシュタット／Ｗ．、ドイツ；２ｍＭ Ｌ−グルタミン、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび２０μｇ／ｍｌゲンタマイシン（全部ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）を補充した２５ｍＭ ＨＥＰＥＳを含むＲＰＭＩ １６４０（Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ドイツ・カールスルーエ）。ペプチド負荷は、３７℃でＸ−Ｖｉｖｏ １５培地中、それぞれのペプチドで約２時間実施した。
１から２時間後にＧｏｌｇｉＳｔｏｐ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を添加し、そしてさらなる４から５時間インキュベートした。次いで細胞を浸透化し、そしてＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ Ｐｌｕｓキットの使用下、ならびに抗ＣＤ４−ＦＩＴＣ、抗ＩＦＮ−γ−ＰＥおよび抗ＣＤ８−ＰｅｒＣＰを用い、製造元（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）の説明書に従って染色した。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｅｅｒ細胞計数器の使用下でサイトメトリー分析を実施した。
図２に見られるように、ＨＬＡ−Ｂ*０７０２／ＦＰＳＬＲＥＡＡＬ四量体に結合したＴリンパ球（＝特異的Ｔリンパ球、「Ｔｅｔ＋」）で、常に異なる量のインターフェロン−γで前処理しかつ配列番号１１４をもつペプチドを負荷したＫＭ２２若しくはＪＹ細胞によりそれらを刺激した場合に、インターフェロン−γが形成した（図２を参照されたい、「ＫＭ２２＋ＦＰＳＬＲＥＡＡＬ」および「ＪＹ＋ＦＰＳＬＲＥＡＡＬ」、常に５若しくは２５μＭ ＩＮＦで前処理した）。非特異的Ｔリンパ球（従ってＨＬＡ−Ｂ*０７０２／ＦＰＳＬＲＥＡＡＬ四量体に結合したＴリンパ球でない）は、しかしながらインターフェロン−γを形成しなかった（＝「Ｔｅｔ−」）。
図２において、再度、特異的（＝「Ｔｅｔ＋」）Ｔリンパ球も非特異的（「Ｔｅｔ−」）リンパ球も、それらを非特異的対照ペプチド（図２中で例示的に：ＡＰＲＴＶＡＬＴＡ、配列番号５８５）で刺激した場合に、インターフェロン−γを形成しなかった（常に「Ｔｅｔ＋」および「Ｔｅｔ−」（すなわち「ＫＭ２２＋ＡＰＲＴＶＡＬＴＡ」および「ＪＹ＋ＡＰＲＴＶＡＬＴＡ」、２５μＭ ＩＮＦで前処理した）について常に図２を参照されたい）ことが示された。
ｃ）ＣＤ８陽性Ｔ細胞のペプチド特異的刺激
ＣＤ８陽性Ｔ細胞のペプチド特異的刺激のさらなる証明のため、それに際して対照ペプチドもＨＬＡ対立遺伝子Ａ*０２に結合する、タンパク質ＲＧＳ−５の配列ＬＡＡＬＰＨＳＣＬ（配列番号４４８）をもつペプチドおよび黒色腫抗原ＭＥＬＡＮ−Ａの配列ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号５７８）をもつ対照ペプチド（位置２６−３５、ロイシンによる位置２７にあるアラニンのアミノ酸変化により改変した）を、Ｆｍｏｃ化学の標準的方法の使用下で合成した。ビオチニル化組換えＡ*０２分子および蛍光ＭＨＣ四量体を、Ａｌｔｍａｎら（「Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：９４，１９９６）に記述されるように製造した。人工的抗原提示細胞（ＡＰＣ）の製造のため、マイクロスフェア１ｍｇあたり０．０６４μｇビオチン−０．０６４μｇビオチン−ＦＩＴＣの結合容量をもつストレプトアビジン被覆したポリスチロール粒子（直径５．６μｍ）（Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国イリノイ州フィッシャー）を、ビオチニル化ＭＣＨおよび抗体を含有する緩衝液中に２×１０６粒子／ｍｌで懸濁し、そして室温で３０分間インキュベートした。
ヒトＣＤ８ Ｔ細胞の抗原特異的ｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激のため、新鮮なＢｕｆｆｙ−Ｃｏａｔから標準的な勾配分離によりＰＢＭＣを単離した。未処理のＣＤ８ Ｔ細胞を、ＭＡＣＳを用いる陰性枯渇により濃縮した（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、ドイツ・ベルギッシュ・グラードバッハ）。ｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激は、２４ウェルプレート上、１．５ｍｌのＴ細胞培地（ｓ．ｏ．）中ウェルあたり５×１０６の応答体細胞および１×１０６個のビーズ若しくは１×１０６の照射したＡＰＣを用いて実施した。５ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ−１２ ｐ７０（Ｒ％Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、米国）にマイクロスフェアを添加した。３７℃での３から４日の共インキュベーション後に新鮮な培地および２０Ｕ／ｍｌのヒトＩＬ−２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、米国）を添加し、そして細胞をさらなる３から４日インキュベートした。この刺激周期を２回反復した。
細胞表面および細胞内のサイトメトリー分析のため、蛍光ＭＨＣ四量体および抗ＣＤ８抗体（ハイブリドーマＵＫＴ８）を用いる四量体分析を、四色ＦＡＣＳＣａｌｉｂｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で実施した。
この分析の結果を図３に示す。ここで、配列番号４４８を伴うＲＧＳ−５ペプチドＬＡＡＬＰＨＳＣＬがヒトＣＤ８陽性Ｔ細胞を特異的に刺激することが見られる。図３で、左の列に、上述されたとおりＭｅｌａｎ−Ａからの配列ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号５７８）をもつ対照ペプチドで前の２倍刺激した、ＰＢＭＣからのＴ細胞の分析を示す。右の列は、配列ＬＡＡＬＰＨＳＣＬ（配列番号４４８）を伴うＲＧＳ−５ペプチドで刺激したＴ細胞の分析を示す。
図３で、上左は、Ｍｅｌａｎ−Ａペプチド／ＭＨＣ−Ａ*０２四量体複合体で刺激したＣＤ８陽性（Ｘ軸）Ｔ細胞が、配列ＬＡＡＬＰＨＳＣＬ（配列番号４４８）をもつペプチドと複合体形成したＭＨＣ−Ａ*０２四量体に結合しない（Ｙ軸）ことを示す。
図３の上右は、配列ＬＡＡＬＰＨＳＣＬ（配列番号４４８）をもつＲＧＳ−５ペプチド／ＭＨＣ−Ａ*０２四量体複合体で刺激したＣＤ８陽性Ｔ細胞が、配列ＬＡＡＬＰＨＳＣＬ（配列番号４４８）をもつペプチドと複合体形成したＭＨＣ−Ａ*０２四量体（Ｙ軸）に結合することを示す。二重に染色された（二重陽性）細胞は右上四分円に見られる。
図３の中央の左は、Ｍｅｌａｎ−Ａペプチド／ＭＨＣ−Ａ*０２四量体複合体で刺激したＣＤ８陽性Ｔ細胞（Ｘ軸）が、Ｍｅｌａｎ−Ａからの配列ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号５７８）をもつペプチドと複合体形成したＭＨＣ−Ａ*０２四量体（Ｙ軸）に結合することが見られる。二重に染色された（二重陽性）細胞は右上四分円に見出される。中央右には、配列ＬＡＡＬＰＨＳＣＬをもつＲＧＳ−５ペプチド／ＭＨＣ−Ａ*０２四量体複合体で刺激したＣＤ８陽性Ｔ細胞が、Ｍｅｌａｎ−Ａからの配列ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号５７８）をもつペプチドと複合体形成したＭＨＣ−Ａ*０２四量体（Ｙ軸）に結合しないことが示される。
図３の下行には、左に２種の使用したＭＨＣ四量体−ペプチド複合体（Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＨＣ−Ａ*０２およびＲＧＳ−５／ＭＨＣ−Ａ*０２）での二重染色によるＭｅｌａｎ−Ａ／ＭＨＣ−Ａ*０２特異的Ｔ細胞の定量的部分を示す。人工的抗原提示細胞に結合されたＭｅｌａｎ−Ａペプチド／ＭＨＣ−Ａ*０２四量体複合体での前述の刺激後に、刺激された細胞の１９．３％が、Ｍｅｌａｎ−ＡペプチドおよびＭＨＣ−Ａ*０２からのＭＨＣ四量体複合体に特異的に結合する。右で、２種の使用したＭＨＣ四量体複合体（Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＨＣ−Ａ*０２およびＲＧＳ−５／ＭＨＣ−Ａ*０２）での二重染色によるＲＧＳ−５／ＭＨＣ−Ａ*０２特異的Ｔ細胞の定量的部分を示す。人工的抗原提示細胞に結合されたＲＧＳ−５ペプチド／ＭＨＣ−Ａ*０２四量体複合体での前述の刺激後に、刺激された細胞の８．０％が、配列ＬＡＡＬＰＨＳＣＬ（配列番号４４８）をもつＲＧＳ−５ペプチドおよびＨＬＡ−Ａ*０２からのＭＨＣ四量体複合体に特異的に結合する。
ｄ）腎細胞癌患者の血液からのペプチド特異的Ｔ細胞の証明
さらなる研究において、前にペプチドを負荷した自己樹状細胞で免疫した腎細胞癌患者の血液からのペプチド特異的Ｔ細胞を証明し得た。
この証明のため、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を実施した。このＲＴ−ＰＣＲは、Ｋａｍｍｕｌａらの記述する（Ｋａｍｍｕｌｒａら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６３：６８６７，２０００）とおり実施した。このため、ＰＢＭＣをＴ細胞培地中で融解し、５００μｌの培地中に１×１０６細胞を接種し、そして３７℃および５％ ＣＯ２で一夜インキュベートした。次いで合成ペプチドを５μｇ／ｍｌで３時間添加し、そしてその後、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ドイツ・カールスルーエ）を用いるＲＮＡ抽出を実施した。ｃＤＮＡをランダムへキサマープライマー（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ドイツ・フライブルク）およびＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ ＧｍｂＨ、ドイツ・マンハイム）の使用下に転写した。
定量的ＲＴ−ＰＣＲは、ＩＦＮ−γ ｍＲＮＡおよびＣＤ８ ｍＲＮＡに関して「ＡＢＩＰｒｉｓｍ ７０００配列検出装置」（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ドイツ・ダルムシュタット）を用いて二重で実施し、その際にＴａｑｍａｎ ＰＣＲマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、特異的プライマーおよび蛍光プローブを使用した。
該結果はＩＦＮ−γのｍＲＮＡのコピー数を反映し、ここでは各プローブを（参照遺伝子産物としての）ＣＤ８ ｍＲＮＡのコピー数に関して正規化した（刺激指数）。試験したペプチドの存在下での遺伝子発現は、対照（配列ＩＬＫＥＰＶＨＧＶ、配列番号５７９をもつＨＩＶ１ ｐｏｌから発するＨＬＡ−Ａ*０２エピトープ）の存在下に得られた遺伝子発現に関して表される（対照のコピー数を１と設定した）。
図４にこの実験の結果を示す。図４の具体的説明は、９種のＨＬＡに結合するペプチドでの、チュービンゲン大学臨床センターの患者ＲＣＣ９８の免疫化後のｅｘ ｖｉｖｏのＴ細胞活性化を示す。１１の棒群（Ｓａｅｕｌｅｎｂｌｏｃｋ）はＴ細胞の実験の陰性および陽性対照を示す。エラーバーは標準偏差を示す。上で示されたとおり、陰性対照として、配列ＩＬＫＥＰＶＨＧＶ（ウイルス抗原ＨＩＶ１ ｐｏｌから、位置８９６−９０４；配列番号５７９）をもつＨＩＶペプチドを使用した。陰性対照は、患者がＨＩＶ血清陰性であった場合はＴ細胞応答に至らなかった。陽性対照として、インフルエンザマトリックス５８−６６（ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ；配列番号５８０）、ＨＣＭＶＡ ｐｐ６５ ４９５−５０３（ＮＬＰＶＭＶＡＴＶ；配列番号５８１）、ＥＢＮＡ６−ＥＢＶ ２８４−２９３（ＬＬＤＦＶＲＦＭＧＶ；配列番号５８２）、ＩＥ６３−ＥＢＶ ２５９−２６７（ＧＬＣＴＬＶＡＭＬ；配列番号５８３）およびＬＭＰ２−ＥＢＶ ２９４−３０２（ＣＬＧＧＬＬＴＭＶ；配列番号５８４）のペプチドからの混合物を使用し、それにより非常に強いＴ細胞応答が期待された（「ポズミックス（ｐｏｓｍｉｘ）」；刺激指数の最大４３．６）。全部のＰＢＭＣの刺激に使用した対照ペプチドは５μｇ／ｍｌの濃度で使用した。バックグラウンドは陰性対照の標準偏差（刺激指数１．３５、水平の破線として表される）と定義した。
図４中の具体的説明の次の９つの棒群は、９種の免疫化ペプチドに対し測定されたＴ細胞活性化を示す。これら９種のペプチドは、全部で７回、必ず１４日の間隔で、自己樹状細胞によって一緒に皮下に負荷されて投与された。従って、各棒群は８本の棒から構成される（１回目の免疫化前、２回目の免疫化後、２回目の免疫化後、など）。各棒群は従って、免疫化の経過におけるＴ細胞の特徴を示す。
既に、３回目の免疫化に際して、ＧＫＡＳＦＫＳＦＬＫ（ＲＧＳ５ ７４−８３、配列番号１５３）およびＳＬＬＴＳＳＫＧＱＬＱＫ（ＡＤＦＰ ３６９−３８０、配列番号２８９）に対する強いＴ細胞応答が見られ、その際、後者のペプチドにより４回目の免疫化後のＴ細胞応答が上昇した。免疫療法の経過中のＴ細胞応答のこうした変動は他の患者でも示されている。
Ｔ細胞応答は、ＩＡＲＮＬＴＱＱＬ（ＡＤＦＰ ３１３−３２１；配列番号２３３）、ＧＰＡＬＧＲＳＦＬ（ＴＮＦＳＦ７ ７８−８６、配列番号５７７）についてバックグラウンドで明瞭に、および汎ＨＬＡ−ＤＲに結合する（ＰＡＤＲＥ）公知のペプチドについてより弱く見られた。これらとともに、３種のペプチドも免疫療法の経過中にＴ細胞応答の上昇が見出された（点線）。これは、これら３種の最後に挙げられたペプチドが陽性のＴ細胞応答を惹起したことを確認した。
該患者は、チュービンゲン大学臨床センターでの申告された臨床試験の枠内で免疫した。該臨床試験は、チュービンゲン大学の倫理委員会に申告され、そして文書で承認された。該試験はドイツ医薬品法（ＡＭＧ）の規則およびガイドライン、ならびに「医薬品の臨床試験の実施基準」（ＧＣＰ）に従って実施した。
一緒にすれば、発明者は従って、同定されたペプチドが、（腫瘍）疾患の多数に際しての免疫療法の枠内で有利な物質を生じることを示し得た。
【実施例３】
【００１９】
末梢血からのＢ*０７０２／ＩＡＲＮＬＴＱＱＬ（配列番号２３３）特異的ＣＤ８＋リンパ球のミクロスフェアに駆動される増殖の四量体分析（図５を参照されたい）。
６例の健康なＨＡＬ−Ａ*０２０１＋被験体ＨＤ１５５、ＨＤ１５９、ＨＤ１６１、ＨＤ１６７、ＨＤ１６８およびＨＤ１７７のウェルあたり１×１０６のＣＤ８＋濃縮したＰＢＭＣを、抗ＣＤ８および無関係な抗原（「無関係刺激」）、腫瘍抗原Ｂ*０７０２／ＩＡＲＮＬＴＱＱＬ高密度（「ＨＤ」）若しくは腫瘍抗原Ｂ*０７０２／ＩＡＲＮＬＴＱＱＬ低密度（「ＬＤ」）に結合させたマイクロスフェアで、小さな改変を伴い前に示された［Ｗａｌｔｅｒ，Ｓら Ｃｕｔｔｉｎｇ Ｅｄｇｅ：Ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ａｖｉｄｉｔｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＣＤ８ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｅｘｐａｎｄｅｄ ｏｎ ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ ＭＨＣ／ａｎｔｉ−ＣＤ２８−ｃｏａｔｅｄ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７１：４９７４−８，２００３］とおりに毎週刺激した。ｉｎ ｖｉｔｒｏで３回の刺激後に、いくつかのウェルをＣＤ８および四量体Ｂ*０７０２／ＩＡＲＮＬＴＱＱＬの抗体で染色した。全部の点は、１個のウェルからのＣＤ８＋リンパ球の内側の四量体＋のパーセントを表す。
個々の被験体での無関係刺激後の見出される応答の分布に基づき、有意の閾値、および以下の式：
閾値＝剤についての９５％信頼区間の上限＋３×標準偏差の９５％信頼区間の上限
の使用下で水平の赤線によりを評価した。図中の数字は、得られた条件についてのウェル全体での有意に陽性のウェルの数を表す。
【００２０】
以下に配列、位置、遺伝子記号、受託番号、配列番号を示す。
（表１）
【００２１】
ＮＣＨ３５９の配列
1.VPDSSGPERIL78-88
HNRPKNP_002131.2配列番号1
2.GLAPSIRTK1510-1518
TNCNP_002151.1配列番号2
3.RLFEHPLYR149-157
FAM20CNP_064608.1配列番号3
4.TPSEPHPVL381-389
HGRG8NP_057342.1配列番号4
5.QIFVKTLTGK2-11
RPS27AAAH01392.1配列番号5
6.SLMHSFILK44-52
DNCL2ANP_054902.1配列番号6
7.YPHLHNAEL127-135
SOX9NP_000337.1配列番号7
8.RLFVGSIPK244-252
SYNCRIPNP_006363 配列番号8
9.RVFPDKGYSF233-242
TIA1NP_071320.1配列番号9
10.SLYKKLEIK554-562
SLC9A2NP_003039.2配列番号10
11.HPVSDHEATL216-225
HLA-CNP_002108配列番号11
12.LPTRVDFSL46-54
記号は存在しない。遺伝子の種類：命名されていないタンパク質産物
BAC87610配列番号12
13.KSFGSAQEFAW386-396
COPB2NP_004757 配列番号13
14.SPSTSRTPLL1026-1035
EGFRNP_005219.2配列番号14
15.STFDSPAHW1149-1157
EGFRNP_005219.2配列番号15
16.APEEHPVLL97-105
ACTBNP_001092.1配列番号16
17.RQITQVYGF117-125
PPP6CNP_002712.1配列番号17
18.KVSDYILQH1046-1054
ASTN2NP_054729.3配列番号18
19.KLLPSVVLK2-10
DTRNP_001936.1配列番号19
20.GVLKKVIRH23-31
TNCNP_002151.1配列番号20
21.KLFDHAVSKF40-49
ACSL4NP_004449.1配列番号21
22.ITVLTKPLPV112-121
PTPRONP_002839.1配列番号22
23.HPVHPDIKL130-138
PIAS1NP_057250.1配列番号23
24.IPRAALLPLL3-12
PRSS11NP_002766.1配列番号24
25.ATNRITVTW254-262
PIASYNP_056981.2配列番号25
26.KIADRFLLY29-37
LMO4NP_006760.1配列番号26
【００２２】
ＮＣＨ３６１の配列
27.DHDPVDKIVL150-159
HNRPA2B1NP_002128.1配列番号27
28.DHHQEVIGF165-173
C9ORF10NP_055427.2配列番号28
29.IHDLDNISF188-196
PSMB2NP_002785.1配列番号29
30.DHINDIIKI834-842
IQGAP1NP_003861.1配列番号30
31.DHMRFISEL355-363
CYFIP1NP_055423.1配列番号31
32.THSLPVVVI456-464
STAT3NP_003141.2配列番号32
33.MPVGPDAILRY929-939
BAT3NP_004630.2配列番号33
34.RLDDAIHVL406-414
TCF12NP_003196.1配列番号34
35.QHEGTVNIF1953-1961
PTPRZ1NP_002842.1配列番号35
36.ETVNIWTHF48-56
PAQR6NP_940798配列番号36
37.VHILDTETF195-203
KLHDC2NP_055130.1配列番号37
38.QTPDFTPTKY607-616
ZHX3NP_055850.1配列番号38
39.RHVEVFELL133-141
MPDZNP_003820.1配列番号39
40.TTIDIGVKY136-144
CNN3NP_001830.1配列番号40
41.DLIEHFSQF113-121
HNRPA0NP_006796.1配列番号41
42.ETVWRLEEF65-73
HLA-DRANP_061984配列番号42
43.DVLESVNLL176-184
AP2M1NP_004059.2配列番号43
44.IHDDFVTTF466-474
AEBP1NP_001120.2配列番号44
45.IHIPINNII57-65
Sec61GNP_055117.1配列番号45
46.IHLIDPNTL281-289
CGI-07NP_057022.2配列番号46
47.IHVIGGNDV1016-1024
KIAA1268XP_291055.1配列番号47
48.KAFQKIVVL291-299
BZW1NP_055485.2配列番号48
49.YQDLLNVKL349-357
GFAPNP_002046.1配列番号49
50.GHYEVAELL728-736
TNKSNP_003738.1配列番号50
51.LVVYPWTQRF33-42
HBBNP_000509.1配列番号51
52.MHLRQYELL386-393
GNASNP_000507.1配列番号52
53.EAIEQILKY149-157
FLJ10539NP_060600.1配列番号53
54.DVAEGDLIEHF108-118
HNRPA0NP_006796.1配列番号54
55.DVLQKIKY191-198
EPS8L1NP_060199.2配列番号55
56.DSFPMEIRQY24-33
STAT1NP_009330.1配列番号56
57.DVISNIETF281-289
SOX9NP_000337.1配列番号57
58.DVIRLIMQY9-17
SMU-1NP_060695.1配列番号58
59.DVIERVIQY792-800
IDN3NP_056199.1配列番号59
60.DVIAQGIGKL53-62
RPLP2NP_000995.1配列番号60
61.DVFNEKGWNY94-103
PBEF1NP_005737.1配列番号61
62.THLDSVTKI254-262
C6.1ANP_077308.1配列番号62
63.DVAGIIADY294-302
KIAA1238XP_048675.4配列番号63
64.TAAPFPFHL536-544
TBX2NP_005985.2配列番号64
65.DTLDKVFTY86-94
ACSL3NP_004448.2配列番号65
66.DTISPTLGF42-50
ARL2NP_001658.1配列番号66
67.DTGILDSIGRF35-45
MBPNP_002376.1配列番号67
68.VVYPWTQRF34-42
HBBNP_000509.1配列番号68
69.EVVAGIKEYF128-137
MORF4NP_006783.2配列番号69
70.SSVPGVRLL72-80
VIMNP_003371.1配列番号70
71.SVVDAIGISRF364-374
FLJ45273BAC86883.1配列番号71
72.EVIPPMKEF115-123
NDUFB6NP_002484.1配列番号72
73.EVIPPYYSY152-160
TTRAPNP_057698.2配列番号73
74.EVNGLISMY284-292
U5-116KDNP_004238.2配列番号74
75.EVIDLMIKEY57-66
PHF10NP_060758.1配列番号75
76.EVVAGIKEY128-136
MORF4NP_006783.2配列番号76
77.EVFPLAMNY76-84
CCND1NP_444284.1配列番号77
78.EVVERVLTF28-36
FBXO22NP_036302.1配列番号78
79.SHSPFGLDSF1251-1260
JMJD1BNP_057688.2配列番号79
80.FGVDRAILY457-465
ITGAVNP_002201.1配列番号80
81.SHSDYLLTI76-84
SOCS2NP_003868.1配列番号81
82.SHLDYDITL511-519
KIAA0794XP_087353.5配列番号82
83.SHFVSDVVI63-71
GNB2L1NP_006089.1配列番号83
84.EVTELLARY155-163
POLR2ENP_002686.2配列番号84
85.ETADTLMGLRY425-435
GFPT1NP_002047.1配列番号85
86.EHAHLIVVL662-670
ABCB9NP_062570.1配列番号86
87.EHSLVIDTL53-61
PFDN2NP_036526.2配列番号87
88.EIAEAYLGY129-137
HSPA1ANP_005336.2配列番号88
89.EIYGGSDSRF42-51
SF3B1NP_036565.1配列番号89
90.ELIAKIPNF73-81
SETNP_003002.1配列番号90
91.EVIKNFIQY50-58
EIF3S6IPNP_057175.1配列番号91
92.ETADTLLALRY426-436
GFPT2NP_005101.1配列番号92
93.EVVSEPFRSF581-590
PSMD2NP_002799.3配列番号93
94.ETFDAGLQAF2019-2028
SPTAN1NP_003118.1配列番号94
95.SHSQLMQLI164-172
ADRM1NP_008933.2配列番号95
96.ETVRELTEF255-263
PPARDNP_006229.1配列番号96
97.EVAATEIKM10-18
HNRPMNP_005959.2配列番号97
98.EVAAVLLHF214-222
SEC10L1NP_006535.1配列番号98
99.EVFDKTYQF132-140
C6orf153NP_149103.1配列番号99
100.ELVKRILNF174-182
DEKNP_003463.1配列番号100
101.AHDDGRWSL95-103
FSCN1NP_003079.1配列番号101
102.SVVSVISRF4-12
DAD1NP_001335.1配列番号102
103.SVVELINHY132-140
PIK3R3NP_003620.2配列番号103
104.SVVDLINHY397-405
PIK3R2NP_005018.1配列番号104
105.AHVDLIEKL51-59
POLR2LNP_066951.1配列番号105
106.FHNELLTQL97-105
BAIAP2NP_006331.1配列番号106
107.SVIEAVAHF812-820
C6orf133NP_056070.1配列番号107
108.GHFEKPLFL149-157
NTENP_006693.2配列番号108
109.GHDASQITL273-281
TH1LNP_057481.2配列番号109
110.SAVDFIRTL293-301
STK17ANP_004751.1配列番号110
111.ISTPVIRTF989-997
C9orf10NP_055427.2配列番号111
112.GVIEKLLTSY28-37
D1S155EAAH32446配列番号112
113.SHDLTLVNL395-403
KIAA1706NP_085139.1配列番号113
【００２３】
ＪＹの配列
114.FPSLREAAL294-302
MAGEA1NP_004979.2配列番号114
【００２４】
ＲＣＣ０７５の配列
115.SIFKQPVTK250-258
MBD2NP_003918.1配列番号115
116.KPNANRIAL139-147
LGALS3NP_002297.1配列番号116
117.KLYEMILKR174-182
ARL7NP_005728.2配列番号117
118.SLFSRLFGK7-15
ARF4NP_001651.1配列番号118
119.KLFDKLLEY309-317
API5NP_006586.1配列番号119
120.SLFPNSPKWTSK96-107
MMP7NP_002414.1配列番号120
121.LESLDQLEL29-37
BAG2NP_004273.1配列番号121
122.VVNKVPLTGK101-110
MGC17943NP_689474.1配列番号122
123.SVYDSVLQK4470-4478
SYNE1NP_149062.1配列番号123
124.SVYVLVRQK39-47
MLSTD2NP_115604.1配列番号124
125.ILENIQRNK557-565
ERCC2NP_000391.1配列番号125
126.GSYNKVFLAK146-155
PSMD8NP_002803.1配列番号126
127.TESGLNVTL6-14
PCBP1NP_006187.1配列番号127
128.TEHGVEVVL612-620
SH2D3CNP_005480.1配列番号128
129.TEARFGAQL327-335
KRT19NP_002267.2配列番号129
130.TLADILLYY114-122
EEF1E1NP_004271.1配列番号130
131.LVFPSEIVGK133-142
RPS7NP_001002.1配列番号131
132.VLFGKALNPK709-718
ABCC3NP_003777.2配列番号132
133.RPELVRPAL91-99
AKR1C3NP_003730.4配列番号133
134.VPNQKRLTLL576-585
ACSL4NP_004449.1配列番号134
135.QLYWSHPRK5-13
RPS29NP_001023.1配列番号135
136.SVYVYKVLK39-47
H2BFSNP_059141.1配列番号136
137.REKLQEEML186-194
VIMNP_003371.1配列番号137
138.RVFSGLVSTGLK415-426
EEF2NP_001952.1配列番号138
139.KPRDVSSVEL1939-1948
SPTBN1NP_003119.1配列番号139
140.NEFPEPIKL184-192
RAB7NP_004628.4配列番号140
141.KTYGEIFEK106-114
NDUFC2NP_004540.1配列番号141
142.RILFFNTPK196-204
PSMD8NP_002803.1配列番号142
143.RVFPWFSVK1764-1772
MLLNP_005924.1配列番号143
144.SEVQDRVML54-62
CGI-127NP_057145.1配列番号144
145.SLWDRLIFH410-418
ACSL1NP_001986.2配列番号145
146.KVYNIQIRY468-476
LCP2NP_005556.1配列番号146
147.RLLEMILNK171-179
AKR1C2NP_001345.1配列番号147
148.SEDKKNIIL41-49
CFL1NP_005498.1配列番号148
149.YEELVRMVL106-114
MYL6NP_524147.1配列番号149
150.GEITGEVHM1758-1766
FLNBNP_001448.1配列番号150
151.IVAGSLITK183-191
FNBP3AAH11788配列番号151
152.APRIITGPAPVL225-236
QKINP_006766.1配列番号152
153.GLASFKSFLK74-83
RGS5NP_003608.1配列番号153
154.FPNSPKWTSK98-107
MMP7NP_002414.1配列番号154
155.FVIETARQL49-57
C14orf4NP_078772.1配列番号155
156.IEVDGKQVEL46-55
RHOANP_001655.1配列番号156
157.GELTGEVRM1776-1786
FLNCNP_001449.1配列番号157
158.GESDDSILRL63-72
RPS21NP_001015.1配列番号158
159.GEGDFLAEGGGV23-34
FGANP_000499.1配列番号159
160.DNFPQSL690-696
CACNA1CNP_000710.3配列番号160
161.GLTDVILYH269-277
SYNCRIPNP_006363.3配列番号161
162.AALVASGVALY247-257
P2RY11NP_002557.2配列番号162
163.AEIRHVLVTL107-116
MYL6NP_066299.2配列番号163
164.AEPEEVEVL10-18
PGR1NP_150638.1配列番号164
165.AIIDHIFASK256-265
KISNP_787062配列番号165
166.ALLDGSNVVFK48-58
HKE2NP_055075.1配列番号166
167.AMLDTVVFK302-310
PSMD14NP_005796.1配列番号167
168.APARLFALL2-10
SDC4NP_002990.2配列番号168
169.AVNAHSNILK248-257
IMMTNP_006830配列番号169
170.APRPGVLLL8-16
ELNNP_000492配列番号170
171.EAFPLRVID749-757
MAN2A2NP_006113.1配列番号171
172.GVADKILKK211-219
NMINP_004679.1配列番号172
173.AVFPKPFVEK189-198
KIAA0377NP_055474.2配列番号173
174.VVYVGGILTK258-267
UGT8NP_003351.2配列番号174
175.HLEDIVRQK1751-1759
TRIP12XP_376178.1配列番号175
176.VTLTLVILSY207-216
LOC390323XP_372460.1配列番号176
177.SLLSLVTGLK読み枠＋3１
記号は存在しない。遺伝子の種類：発現遺伝子配列断片CD105815配列番号177
178.QTYVGITEK687-695
U5-200KDNP_054733.2配列番号178
179.HEDKIRVVL210-218
EHD2NP_055416.2配列番号179
180.QISIPFLLK208-216
C9orf88AAH01979配列番号180
181.GLMGFIVYK29-37
C14orf2NP_004885.1配列番号181
182.FADQEVRSL950-958
PIK3C2ANP_002636.1配列番号182
183.IVALILSTK147-155
ATP6V0CNP_001685.1配列番号183
184.GTYAPAEVPK22-31
AKR1C1NP_001344.2配列番号184
185.GTMTGMLYK161-169
TIMM23NP_006318.1配列番号185
186.SLAEILLKK439-447
IPO8NP_006381.1配列番号186
187.KLTYIYIQK読み枠＋１
記号は存在しない。遺伝子の種類：発現遺伝子配列断片AA295205配列番号187
188.KLLNYAPLEK58-67
POLR2LNP_055427 配列番号188
189.GTLPHPLQR182-190
SCNN1ANP_001029.1配列番号189
190.GLYEFFRAK680-688
CHERPNP_006378.2配列番号190
191.KEPEINTTL226-234
FLJ34588NP_689939.1配列番号191
192.HASDRIIAL330-338
TKTNP_001055.1配列番号192
【００２５】
ＲＣＣ０９８の配列
193.RPTLWAAAL5-13
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295.VALISPKDI読み枠−１
記号は存在しない。遺伝子の種類：発現遺伝子配列断片AC079587.4配列番号295
296.STDKAEYTFY332-341
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【００２６】
ＲＣＣ１００の配列
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【００２７】
ＲＣＣ１０３の配列
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LOC345778XP_293971.3配列番号366
【００２８】
ＲＣＣ１１２の配列
367.GRVDFAYKF111-119
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368.GRDLTDYLM182-190
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ＨＬＡ−Ａ、−Ｂ若しくは−ＣAAC17722配列番号373
374.GRMVQVHEL170-178
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375.FLDASGAKLDY53-63
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377.ARLPWAGQL624-632
PBXIP1NP_065385.2配列番号377
378.YGMPRQIL192-199
TAGLN2NP_003555.1配列番号378
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PPP2R1ANP_055040.2配列番号380
381.GRAPISNPGM179-188
RPA2NP_002937配列番号381
382.GRMENLASYR308-317
PPP1R3CNP_005389配列番号382
383.VLPKSRVEL89-97
HLA-DOABAA81787配列番号383
384.DAKIRIFDL28-36
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385.GRAMVARLGL2-11
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386.FIDASRLVY612-620
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387.DPMKARVVL21-29
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388.FRFDPQFAL77-85
HLA-DQA1XP_371812配列番号388
389.DTDHYFLRY165-173
PIGTNP_057021.2配列番号389
390.ELLIRKLPF60-68
HIST3H3NP_003484.1配列番号390
391.EAFVRHIL142-149
MYL6NP_066299.2配列番号391
392.RYFDTAMSR5-13
ＨＬＡ−Ａ、−Ｂ若しくは−ＣAAB48498.1配列番号392
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FLJ31657NP_689971配列番号393
394.TFRPAAMLVER154-164
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【００２９】
ＲＣＣ１１５の配列
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【００３０】
ＲＣＣ１１６の配列
490.HDFPRALIF64-72
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491.GSHSMRYF25-32
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PTGISNP_000952.1配列番号514
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RPS2NP_002943.2配列番号523
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MHC2TANP_000237.1配列番号525
526.AEMLRSISF217-225
CSTF1NP_001315.1配列番号526
527.RLQEDPPVGV15-24
UBE2BNP_003328.1配列番号527
528.AELERAAAL465-473
FLJ35453NP_689813.1配列番号528
529.YTDKIDRY107-114
TM4SF7NP_003262.1配列番号529
530.FLLPDVIRI329-337
TBC1D13NP_060671.2配列番号530
531.VELPHINLL169-177
FLJ10349NP_060536.2配列番号531
532.VMLDVPIRL725-733
RASAL2NP_004832.1配列番号532
533.SLLENLEKI209-216
HNRPCNP_112604.1配列番号533
534.YADPVNAHY226-234
ROD1NP_005147.3配列番号534
535.AELLRGLSL165-173
FBXL5NP_036293.1配列番号535
536.TTEVHPELY51-59
SDBCAG84NP_057050.1配列番号536
537.RETNLDSLP424-432
VIMNP_003371.1配列番号537
538.ELEDSTLRY543-551
PLEC1NP_000436.1配列番号538
【００３１】
ＲＣＣ１３０の配列
539.FLDIYIFL84-91
LOC390875XP_372703.1配列番号539
540.TYTDRVFFL1282-1290
PLXNB2BAA21571.1配列番号540
541.SPHLANYFYF147-156
記号は存在しない。遺伝子の種類：命名されていないタンパク質産物BAC87422配列番号541
542.SPRLPVGGF1921-1929
TRIP12XP_376178.1配列番号542
543.KLLDKVQAYS9-18
GJA1NP_000156.1配列番号543
544.AYQHLFYLL955-963
IQGAP3NP_839943.2配列番号544
545.KYILLMDIIA148-157
TBX3NP_005987.2配列番号545
546.RYSSMAASF82-90
MAP17NP_005755.1配列番号546
547.SPRAAEPVQL397-406
CA9NP_001207.1配列番号547
548.IYTSSVNRL535-543
COPB2NP_004757.1配列番号548
549.LYPQFMFHL576-584
SEC23ANP_006355.2配列番号549
550.RYIPTAAAF415-423
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EIF2S3NP_001406.1配列番号551
552.SRVEAVYVL13-21
PADI2NP_031391.1配列番号552
553.MPRGVVVTL851-859
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565.FLDILNTLI1729-1737
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ELOVL5NP_068586.1配列番号566
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573.KYPSPFFVF2-10
DHX9NP_085077.1配列番号573
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KIAA1363NP_065843.2配列番号576
【００３２】
ＪＹの配列
577.GPALGRSFL78-86
TNFSF7NP_001243.1配列番号577
対照ペプチドの配列
578.ELAGIGILTV26-35
ＭＬＡＮＡ（改変Ａ２７−＞Ｌ）NP_005502.1配列番号578
579.ILKEPVHGV896-904
polNP_057849.4配列番号579
580.GILGFVFTL58-66
記号は存在しない。遺伝子の種類：マトリックスタンパク質Ｍ１S14616配列番号580
581.NLVPMVATV495-503
記号は存在しない。遺伝子の種類：ｐｐ６５P06725配列番号581
582.LLDFVRFMGV284-293
記号は存在しない。遺伝子の種類：ＥＢＮＡ−６核タンパク質P03204配列番号582
583.GLCTLVAML259-267
記号は存在しない。遺伝子の種類：前初期トランス活性化因子NP_039857.1配列番号583
584.CLGGLLTMV294-302
記号は存在しない。遺伝子の種類：潜在性膜タンパク質２ AAB59844.1配列番号584
585.APRTVALTA9-17
HLA-DPB1NP_002112配列番号585
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）クラスＩの分子に結合する能力を示す腫瘍関連ペプチドに関する。
こうしたペプチドは、例えば腫瘍疾患の免疫療法で使用される。
【背景技術】
【０００２】
免疫系による腫瘍細胞の排除に際し、免疫系の成分による腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の検出は顕著な役割を演じている。この機構は、腫瘍細胞と正常細胞の間に質的若しくは量的な差違が存在するという仮定に基づく。抗腫瘍応答を遂げるために、腫瘍細胞は抗原を発現せねばならず、それらに対し腫瘍の排除に十分である免疫学的応答が起こる。
腫瘍の拒絶にはとりわけＣＤ８を発現する細胞傷害性Ｔリンパ球（以下ＣＴＬ）が参画している。細胞傷害性Ｔ細胞によるこうした免疫応答の誘発のためには、外来タンパク質／ペプチドがそのためにＴ細胞に提示されなければならない。Ｔ細胞は、これらがＭＨＣ分子から細胞表面上に提示される場合にのみペプチドフラグメントとして抗原を認識する。これらのＭＨＣ分子（「主要組織適合抗原複合体」）はペプチド受容体であり、通常はそれらが細胞表面に輸送されるためにペプチドが細胞の内側に結合している。ペプチドおよびＭＨＣ分子からのこの複合体はＴ細胞により認識され得る。ヒトのＭＨＣ分子はヒト白血球抗原（ＨＬＡ）ともまた称される。
ＭＨＣ分子の２つのクラスが存在する。すなわち、核をもつ大部分の細胞で見出されるＭＨＣクラスＩ分子は、内因性のタンパク質のタンパク質分解性の分解により生じるペプチドを提示する。ＭＨＣクラスＩＩ分子は、専門的な抗原提示細胞（ＡＰＣ）上にのみ見出され、そしてＡＰＣのエンドサイトーシスの経過中に取り込まれかつプロセシングされる外因性タンパク質のペプチドを提示する。ペプチドおよびＭＨＣクラスＩからの複合体はＣＤ８陽性の細胞傷害性Ｔ細胞に認識され、ペプチドおよびＭＨＣクラスＩＩからの複合体はＣＤ４ヘルパーＴ細胞に認識される。
ペプチドが細胞性免疫応答を誘発し得るために、それはＭＨＣ分子に結合しなければならない。この作用は、ＭＨＣ分子の対立遺伝子および該ペプチドのアミノ酸配列に依存する。ＭＨＣクラスＩに結合するペプチドは、概して８〜１０残基長であり、そしてそれらの配列中に、ＭＨＣ分子の相応した結合溝と相互作用する２個の保存された残基（「アンカー」）を含有する。
免疫系が腫瘍由来のペプチドに対する効果的なＣＴＬ応答を開始し得るために、これらのペプチドは、腫瘍細胞から発現される特定のＭＨＣクラスＩ分子に結合する状況にあるのみならず、しかしそれらはまたＴ細胞から特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ、「Ｔ−ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ」）で認識されなければならない。
腫瘍ワクチンの開発のための主目的は、ＣＤ８＋ ＣＴＬにより認識される腫瘍関連抗原の同定および特徴付けである。
腫瘍特異的細胞傷害性Ｔリンパ球で認識される抗原、あるいはそれらのエピトープは、例えば酵素、受容体、転写因子などのような、すべてのタンパク質分類からの分子であり得る。腫瘍関連抗原の別の重要な分類は、例えば、多様な腫瘍形態および健康な精巣組織中で発現される例えばＣＴ（「癌精巣」）抗原のような組織特異的構造である。
タンパク質が細胞傷害性Ｔリンパ球により腫瘍特異的抗原として認識されるため、および従って治療で使用されることができるために、特定の仮定、すなわち、該抗原は主として腫瘍細胞から発現され、かつ、正常組織からは全く若しくは腫瘍中でよりも少ない量でのみ発現される、が、存在しなければならない。さらに、挙げられた抗原が腫瘍形態中のみならず、しかしまた引き続きより高濃度で存在する場合が望ましい。このような腫瘍関連抗原由来のペプチド（「免疫原ペプチド」）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏであろうとｉｎ ｖｉｖｏであろうとＴ細胞応答に至るために、抗原のアミノ酸配列中のエピトープの存在もまた絶対に不可欠である。
ＴＡＡは、従って腫瘍ワクチンの開発のための出発点である。ＴＡＡの同定および特徴付け方法は、一方で、患者で既に誘導されたＣＴＬの使用に基づくか、若しくは、腫瘍と正常組織の間の示差的な転写プロファイルの生成に基づく。
腫瘍組織若しくはヒト腫瘍細胞株中で過剰発現されているか、またはこうした組織若しくは細胞株中で選択的に発現されている遺伝子の位置決めは、しかしながら、免疫療法におけるこれらの遺伝子から転写された抗原の使用についての正確な情報を生じない。これは、いつもこれらの抗原のわずか２、３のエピトープがこうした使用に適することに理由を有する。完全な抗原でなく、抗原のエピトープのみがＭＨＣ提示によりＴ細胞応答を惹起するからである。従って、ＭＨＣ分子と共に提示される、過剰発現された若しくは選択的に発現されたタンパク質のペプチドを選択することが重要であり、それにより初代細胞若しくは初代腫瘍組織細胞から樹立された腫瘍細胞株の特異的認識のための攻撃点が細胞傷害性Ｔリンパ球により獲得され得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
この背景の前に、ヒト主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）クラスＩの分子に結合する能力を示す、こうしたペプチドの最低１種の新規アミノ酸配列を提供することが本発明の課題である。
この課題は、本発明により、付随する配列表からの配列番号１から配列番号５７７よりなる群から示されるアミノ酸配列をもつ腫瘍関連ペプチドの提供により解決され、その際に、該ペプチドは、ヒト主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）クラスＩの分子に結合する能力を示す。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の根底にある課題は該方法で完全に解決される。
従って、腫瘍から同定されるペプチドが、より多量の獲得のため、および下で挙げられる目的のための使用のために、合成されるか若しくは細胞中で発現にもたらされることが自明である。
発明者は、上述されたペプチドをＭＨＣクラスＩ分子の特異的リガンドとして腫瘍組織から単離かつ同定し得た。その際、本明細書で、「腫瘍関連」ペプチドという用語で、腫瘍物質から単離かつ同定されたものを指す。真正の（初代）腫瘍に提示されるこれらのペプチドは、従って腫瘍細胞中での抗原プロセシングを受ける。
特異的リガンドは、例えば相応する抗原（それからペプチドが発する）が発現される腫瘍細胞に対する免疫応答を誘導するために、癌治療において使用し得る。
ＣＴＬの誘導の形態の１つのこうした免疫応答は一方でｉｎ ｖｉｖｏで達成され得る。加えて、ＴＡＡと関連する腫瘍疾患に苦しめられている患者は、該ペプチドを例えば製薬学的組成物の形態で投与される。
対照的に、該ペプチドが発する抗原を発現する腫瘍に対するＣＴＬ応答はｅｘ ｖｉｖｏでもまた惹起され得る。そのためには、ＣＴＬ前駆細胞を抗原提示細胞およびペプチドと一緒にインキュベートする。次いで、それにより刺激されたＣＴＬを培養し、そしてこの活性化されたＣＴＬを患者に投与する。
さらに、ｅｘ ｖｉｖｏでＡＰＣにペプチドを負荷する可能性、および、該ペプチドが発する抗原を腫瘍組織中で発現している患者にこの負荷されたＡＰＣを投与する可能性が存在する。ＡＰＣはその後、順に、ｉｎ ｖｉｖｏでＣＴＬにペプチドを提示し得そしてそれらを活性化し得る。
本発明のペプチドはしかし診断試薬としてもまた使用し得る。
【発明の効果】
【０００５】
であるから、該ペプチドを用いて、１つのＣＴＬ集団中に該ペプチドに特異的に向けられたＣＴＬが存在するかどうか、若しくは治療により誘導されるかどうかを確認し得る。
また、定義されたペプチドに対する反応性を示すＴ細胞の前駆体の増加を、該ペプチドを用いて試験し得る。
また、該ペプチドを、該ペプチドが発する抗原を発現する腫瘍の疾患経過を追跡するために、それに対するマーカーとして利用し得る。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】ａは、ＫＭ２２目的細胞のＣＴＬ特異的溶解に関する陰性対照（ペプチドなし）。ｂは、ペプチドでパルスしかつインターフェロンγで処理したＫＭ２２目的細胞のＣＴＬ特異的溶解。
【図２】ペプチドを負荷したＫＭ２２若しくはＪＹ細胞による刺激後の特異的Ｔリンパ球によるインターフェロンγ形成。
【図３】ヒトＣＤ８陽性Ｔ細胞のペプチド特異的刺激、および
【図４】腎細胞癌患者の血液からのペプチド特異的Ｔ細胞の検出。
【図５】末梢血からのＢ*０７０２／ＩＡＲＮＬＴＱＱＬ特異的ＣＤ８＋リンパ球のマイクロスフェアに駆動される増殖の四量体分析。６名の試験した健康な被験体のうち４名（ＨＤ１５５、−１５９、−１６１、−１７７）が、四量体染色による、ペプチド／ＫＬＡ−Ｂ*０７０２複合体特異的Ｔ細胞受容体についての結果により示されるとおり、配列番号２３３をもつ試験したペプチド抗原に特異的に向けられた有意の（赤線より上にある）Ｔ細胞応答を有した。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
付随する表１に、同定されたペプチドを示す。該表中ではまた、「ＨＵＧＯ遺伝子命名法委員会（ＨＵＧＯ Ｇｅｎｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）」に従った受容された遺伝子記号（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅ．ｕｃｌ．ａｃ．ｕｋ／ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ／あるいはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ／ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＬｏｃｕｓＬｉｎｋ／）により命名あるいは略記される、該ペプチドが発するタンパク質、および挙げられたタンパク質中のペプチドの特定の位置も示す。ここでは、誤りやすい翻訳を回避するためにタンパク質の英語名称が保持されている。再度、それぞれに、国立保健研究所（Ｎａｔｉｎａｏｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）の「国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＧｅｎｂａｎｋに登録されているＡｃｃ番号を示す（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい）。
発明者は、合計１０例の患者の８個の腎細胞腫瘍および２個の膠芽腫、すなわちＲＣＣ７５、ＲＣＣ９８、ＲＣＣ１００、ＲＣＣ１０３、ＲＣＣ１１２、ＲＣＣ１１５、ＲＣＣ１１６、ＲＣＣ１３０およびＮＣＨ３５９、ならびにＮＣＨ３６１、ならびに１個の腫瘍細胞株（Ｊ−Ｙ）からペプチド（若しくはリガンド）を単離し得た。
患者の腫瘍および細胞株Ｊ−Ｙから５７７のリガンドを同定し得、それらはＨＬＡサブタイプＡ*０３、Ｂ*０７、Ｂ*４０（ＲＣＣ７５）、Ａ*０１、Ａ*０３、Ｂ*０７、Ｂ*１８（ＲＣＣ９８）、Ａ*０２、Ａ*０３、Ｂ*０７、Ｂ*１８（ＲＣＣ１００）、Ａ*１１、Ａ*２５、Ｂ*１５、Ｂ*４４（ＲＣＣ１０３）、Ａ*０１、Ａ*３１、Ｂ*０８、Ｂ*２７（ＲＣＣ１１２）、Ａ*０２、Ａ*０３、Ｂ*１５、Ｂ*１８（ＲＣＣ１１５）、Ａ*０１、Ａ*０２、Ｂ*２７、Ｂ*３７（ＲＣＣ１１６）、Ａ*０２、Ａ*２４、Ｂ*０７、Ｂ*４４（ＲＣＣ１３０）、Ａ*０３、Ａ*３２、Ｂ*０７、Ｂ*３５（ＮＣＨ３５９）、Ａ*２６、Ｂ*３８（ＮＣＨ３６１）およびＡ*０２、Ｂ*０７（Ｊ−Ｙ）に結合した。
該リガンドのいくつかは、強く発現するいわゆる「ハウスキーピング」遺伝子から発し、それらは大部分の組織中で顕著に発現され、多くは際だっていたが、しかし組織特異的および腫瘍特異的発現により顕著であった。
そのように、とりわけ腫瘍組織中で過剰発現されるタンパク質から発するいくつかのペプチドを同定し得た。従って、例えばテナシン−Ｃのフラグメント（ＧＬＡＰＳＩＲＴＫ、配列番号２）を同定し得た。（Ｈｅｒｏｌｄ−Ｍｅｎｄｅら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｐａｃｔ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ Ｔｅｎａｓｃｉｎ−Ｃ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ Ｇｌｉｏｍａ Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ、２００２、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、９８：３６２−３６９）
発明者はまた、とりわけ、ＳＯＸ９（ＹＰＨＬＨＮＡＥＬ、配列番号７）およびＲＧＳ５（ＬＡＡＬＰＨＳＣＬ、配列番号４４８）から発するリガンドを同定し得た。
【０００８】
初代腫瘍細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏの培養に適しないため、発明者は、本発明により、この細胞株から同定されたペプチドが細胞傷害性Ｔリンパ球をｉｎ ｖｉｔｒｏで活性化するのに適することを付加的に立証するために、例示的一ヒト腫瘍細胞株を選択した。とりわけ、発明者は、樹立腫瘍細胞株ＪＹの例示的な選択されたペプチドの使用下で、配列ＦＰＳＬＲＥＡＡＬ（ＭＡＧＥＡ１、位置２９４−３０２）および配列番号１１４をもつ選択されたペプチド、ならびにＨＬＡ対立遺伝子Ｂ*０７０２に対し特異的であった細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）をｉｎ ｖｉｔｒｏで発生させることが可能であることを示し得た。このＣＴＬを用いて、配列番号１１４をもつペプチドを負荷された標的とされるＫＭ２２目的細胞を殺し得た。それに対して、対照に使用された、配列番号１１４を持つペプチドを負荷されないＫＭ２２目的細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞から認識されなかった。従って、エピトープとして本発明のペプチドを用いて、ヒトＴ細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで活性化し得たことを例示的に示し得た。また、配列番号１１４をもつペプチドを負荷されたＴ２細胞を溶解した細胞傷害性Ｔリンパ球が、Ｔ細胞の活性化の真正のマーカーとして記述されたインターフェロンγも発現することを示し得た。
【０００９】
好ましい一態様において、配列番号１から５７７を示しかつ最低１個のアミノ酸が類似の化学的特徴をもつ別のアミノ酸により置換されているペプチドもまた、免疫応答の刺激に使用し得る。
これらは、特定のＭＨＣサブタイプ、例えば類似の化学的特徴をもつアミノ酸により使用され得るアンカーアミノ酸に関する。従って、例えば、ＭＨＣサブタイプＨＬＡ−Ａ*０２と関連するペプチドでは、位置２でロイシンをイソロイシン、バリン、若しくはメチオニンで、および逆に、ならびに、Ｃ末端のロイシンでバリン、ロイシン、イソロイシンおよびアラニン（全部非極性の側鎖を示す）で交換し得る。
さらに、そのＮ若しくは／およびＣ末端が最低１個のさらなるアミノ酸を示すか若しくは最低１個のアミノ酸が欠失されている、配列番号１から５７７をもつペプチドを使用することが可能である。
さらに、最低１個のアミノ酸が化学修飾されている、配列番号１から５７７をもつペプチドを使用し得る。
従って、ペプチドの免疫原性が変動により影響を及ぼされない、すなわちＭＨＣ分子に対する類似の結合親和性およびＴ細胞刺激の能力を示すように、変動するアミノ酸（１個若しくは複数）を選択する。
【００１０】
本発明により、該ペプチドは腫瘍疾患および／若しくは腺腫性疾患の処置に使用し得る。
処置されるべき腫瘍疾患は、従って、例えば腎、脳、乳房、膵、胃、精巣および／若しくは皮膚癌ならびに神経系の腫瘍疾患を包含する。腫瘍疾患の一覧はこれにより単に例示的であり、そして応用の範囲を狭めない。発明者は、自身の研究において、本発明のペプチドがこうした使用に適することを示し得た。ここで、あるペプチドに特異的であったこの目的のため生成されたＣＴＬが、効果的かつ選択的にＴ細胞を殺し得たことが証明された。
【００１１】
腫瘍ワクチンでの腫瘍関連抗原の使用のため、基本的ないくつかの適用形式が可能である。従って、Ｔｉｇｈｅら、１９９８、Ｇｅｎｅ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ：ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ ｉｓ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ｊｕｓｔ ａ ｂｌｕｅｐｒｉｎｔ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １９（２）：８９−９７は、適するアジュバントあるいは担体系を伴う組換えタンパク質若しくはプラスミドベクター中の抗原をコードするｃＤＮＡのいずれかとして、抗原を投与し得ることを記述している。これらの例において、免疫応答が惹起されるように、患者の体内の該抗原が抗原提示細胞（ＡＰＣ）によりプロセシングかつ提示されなければならない。
Ｍｅｌｉｅｆら、１９９６、Ｐｅｐｔｉｄｅ−ｂａｓｅｄ ｃａｎｃｅｒ ｖａｃｃｉｎｅｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：６５１−６５７は、さらなる可能性、すなわち合成ペプチドのワクチンとしての使用を示す。
該ペプチドは、従って、好ましい一態様において、アジュバントの添加を伴い、若しくはしかし単独でも使用し得る。
アジュバントとして、例えば、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）が適し得る。こうしたアジュバントのさらなる例は、水酸化アルミニウム、例えばフロイントのアジュバント、サポニン若しくはケイ素化合物のような鉱物油の乳液である。
アジュバントを伴う使用は、ペプチドにより惹起される免疫応答が強められ得る場合、および／若しくはペプチドが安定化されるという利点を提供する。
【００１２】
別の好ましい一態様において、抗原提示細胞に結合されたペプチドを使用する。
こうした処置は、ペプチドが免疫系、とりわけ細胞傷害性Ｔリンパ球（ＴＣＬ）に提示され得るという利点を有する。それによりＣＴＬは腫瘍細胞を認識し得かつ特異的に殺し得る。抗原提示細胞として、例えば樹状細胞、単球若しくはＢリンパ球がこうした一使用に適する。
この場合、細胞は例えばｅｘ ｖｉｖｏでペプチドを負荷される。他方、その後該ペプチドを細胞上で発現にもたらすために、該ペプチドをコードするＤＮＡ若しくは相応するＲＮＡで細胞をトランスフェクトする可能性もまた存在する。
発明者は、樹状細胞（ＤＣ）に特定のペプチドを負荷すること、およびこれらの負荷された樹状細胞がペプチド特異的ＣＴＬを活性化することが可能であることを適切な研究で示し得た。これは、相応するペプチドを発現するＣＴＬを腫瘍に対し発生させるように免疫系を刺激し得ることを意味している。
該ペプチドを運搬する抗原提示細胞は、従って、直接使用し得るか、若しくは使用の前に例えば熱ショックタンパク質ｇｐ９６で活性化し得るかのいずれかである。これらの熱ショックタンパク質は、ＭＨＣクラスＩＩ分子およびＢ７のような共刺激分子の発現を誘導し、そしてさらにサイトカインの産生を刺激する。これにより、全体として免疫応答の惹起が促進される。
【００１３】
別の好ましい一態様において、白血球、とりわけＴリンパ球の標示にペプチドを使用する。
これらの使用は、あるペプチドに特異的なＣＴＬ集団中に指向されたＣＴＬが存在するかどうかを該ペプチドで確認しなければならない場合に有利である。
また、腫瘍疾患での治療経過の評価のためのマーカーとして該ペプチドを使用し得る。
また、他の免疫化若しくは治療に際して、該ペプチドを治療のモニタリングに使用し得る。従って、該ペプチドは治療的のみならずしかしまた診断的にも使用可能である。
【００１４】
さらなる一態様において、該ペプチドを抗体の製造に使用し得る。
ポリクローナル抗体は、慣習的方法で、ペプチドの注入による動物の免疫化、およびその後の免疫グロブリンの精製により獲得し得る。
モノクローナル抗体は、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８６），１２１，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓに記述されるような標準的プロトコルに従って製造し得る。
【００１５】
本発明はまた、さらなる一局面において、該ペプチドの１種若しくはそれ以上を含有する製薬学的組成物に関する。
これらの組成物は、例えば非経口投与、例えば皮下、皮内若しくは筋肉内、または経口投与に役立つ。その場合、該ペプチドは製薬学的に許容できる、とりわけ水性の担体に溶解若しくは懸濁される。さらに、該組成物は、例えば緩衝剤、結合剤、希釈剤などのような賦形剤を含有し得る。
該ペプチドはまた、免疫刺激物質、例えばサイトカインと一緒になって投与され得る。それらのこのような組成物とともに使用され得るような賦形剤の包括的な記述は、例えばＡ．Ｋｉｂｂｅ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，第３版、２０００、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｐｒｅｓｓに記述されている。
該剤は、従って、腫瘍疾患および／若しくは腺腫性疾患の防止（Ｐｒａｅｖｅｎｔｉｏｎ）、予防措置（Ｐｒｏｐｈｙｌａｘｅ）および／若しくは治療に使用し得る。
配列番号１から５７７をもつペプチドの最低１種を含有する製薬学的剤は、挙げられたペプチド、例えば抗原が関連する腫瘍疾患を担持する患者に投与される。従って、腫瘍特異的ＣＴＬに基づく腫瘍特異的免疫応答が惹起され得る。
該製薬学的組成物中に存在するペプチド（１種若しくは複数）の量は、従って治療上有効な量で存在する。従って、該組成物中に含有されるペプチドは、最低２種の異なるＨＬＡタイプにも結合し得る。
【００１６】
本発明は、さらなる一局面において、配列番号１から５７７をもつペプチドをコードする核酸分子に関する。
該核酸分子は、この場合ＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子であり得、そしてまた癌疾患の免疫療法に使用される。従って、該核酸分子から発現されるペプチドは、該ペプチドが発現する腫瘍細胞に対する免疫応答を誘導する。
本発明により、該核酸分子はベクター中にも存在し得る。
さらに、本発明は、該ペプチドをコードする核酸分子の助けを借りて、配列番号１から５７７をもつペプチドをそれらが産生するように遺伝子的に変えられた細胞に関する。
該細胞は、このため、該ペプチドをコードするＤＮＡ若しくは相応するＲＮＡでトランスフェクトされ、それにより該ペプチドは該細胞上で発現にもたらされる。こうした使用のため、抗原提示細胞として、例えば樹状細胞、単球若しくはＢリンパ球が適する。
前に挙げられかつなお下の例示的特徴が、常に述べられる組合せでのみならず、しかしまた単独で使用可能であることが、本発明の範囲を離れることなく、認識される。
本発明の実施例は後に続く実施例および付随する図面に記述かつ例示される。
【実施例１】
【００１７】
１．１ 患者サンプル
チュービンゲン大学泌尿器科から、組織学的に確認された腎細胞癌を表す患者由来の８検体のサンプルを得た。ＲＣＣ７５で示される患者は以下のＨＬＡタイピングすなわちＡ*０３、Ｂ*０７、Ｂ*４０を有した。ＲＣＣ９８で示される患者は以下のＨＬＡタイピングすなわちＡ*０１、Ａ*０３、Ｂ*０７、Ｂ*１８を有した。ＲＣＣ１００で示される患者はＨＬＡタイピングＡ*０２、Ａ*０３、Ｂ*０７、Ｂ*１８を有した。ＲＣＣ１０３で示される患者は以下のＨＬＡタイピングすなわちＡ*１１、Ａ*２５、Ｂ*１５、Ｂ*４４を有した。ＲＣＣ１１２で示される患者は以下のＨＬＡタイピングすなわちＡ*０１、Ａ*３１、Ｂ*０８、Ｂ*２７を有した。ＲＣＣ１１５で示される患者は以下のＨＬＡタイピングすなわちＡ*０２、Ａ*０３、Ｂ*１５、Ｂ*１８を有し、ＲＣＣ１１６で示される患者はＨＬＡタイピングＡ*０１、Ａ*０２、Ｂ*２７、Ｂ*３７を有し、そしてＲＣＣ１３０で示される患者はＨＬＡタイピングＡ*０２、Ａ*２４、Ｂ*０７、Ｂ*４４を有した。
ハイデルベルク大学神経外科から、組織学的に確認された膠芽腫を表す患者由来の２検体のサンプルを得た。ＮＣＨ３５９で表される患者は以下のＨＬＡタイピングすなわちＡ*０３、Ａ*３２、Ｂ*０７、Ｂ*３５を有した。ＮＣＨ３６１で表される患者は以下のＨＬＡタイピングすなわちＡ*２６およびＢ*３８を有した。
１．２ ＭＨＣクラスＩに結合されるペプチドの単離
ショック凍結させた腫瘍サンプルを、Ｓｃｈｕｒｌｅ，Ｍ．ら、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ａ ｎｏｖｅｌ Ｔ ｃｅｌｌ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｐｐｒｏａｃｈ，２０００，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３０：２２１６−２２２５に既に記述されたように処理した。ペプチドを標準的プロトコルに従って、すなわち、ＨＬＡクラスＩ分子に特異的であるモノクローナル抗体Ｗ６／３２、若しくはＨＬＡ−Ａ２に特異的であるモノクローナル抗体ＢＢ７．２の使用下で単離した。Ｂａｒｎｓｔａｂｌｅ，Ｃ．Ｊ．ら、Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｇｒｏｕｐ Ａ ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ，ＨＬＡ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎｓ−ｎｅｗ ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ，１９７８，Ｃｅｌｌ，１４：９−２０、およびＰａｒｈａｍ，Ｐ．＆Ｂｒｏｄｓｋｙ，Ｆ．Ｍ．，Ｐａｒｔｉａｌ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｏｍｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ＢＢ７．２．Ａ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｗｉｔｈ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｆｏｒ ＨＬＡ−Ａ２ ａｎｄ ａ ｖａｒｉａｎｔ ｏｆ ＨＬＡ−Ａ２８，１９８１，Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３：２７７−２９９は、これらの抗体の製造および応用を記述している。
１．３ 質量分析
ペプチドは「逆相ＨＰＬＣ」により分離し（ＳＭＡＲＴシステム、μＲＰＣ Ｃ２／Ｃ１８ ＳＣ ２．１／１９、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、そして得られた画分をナノＥＳＩ ＭＳにより分析した。その際、Ｓｃｈｉｒｌｅ，Ｍ．ら、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ａ ｎｏｖｅｌ Ｔ ｃｅｌｌ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｐｐｒｏａｃｈ，２０００，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３０：２２１６−２２２５に記述されるとおり進行した。
腫瘍組織から得られたペプチドは、たった今記述されたとおり、しかしながらわずかな変更を伴い、キャピラリーＬＣ−ＭＳにより同定した。すなわち、１００μｌのサンプルを常に負荷し、脱塩し、そして３００μｍ×５ｍｍ Ｃ１８ μ−Ｖｏｒｓａｅｕｌｅ（ＬＣ充填剤）で前濃縮した。溶媒およびサンプルを、封止した１００μｌシリンジ（１７１０ ＲＮＲ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ）を伴うシリンジポンプ（ＰＨＤ ２０００、Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｒ，Ｉｎｃ．）を用い、２μｌ／分の速度で供給した。ペプチドの分離のため、前濃縮カラムを、７５μｍ×２５０ｍｍ Ｃ−１８カラムの前に接続した。次いで、１２μｌ／分の流速から約３００ｎｌ／分に低下させ、すなわち実際にＴＥＥ接続（ＺＴＩＣ、Ｖａｌｃｏ）および３００μｍ×１５０ｍｍ Ｃ−１８カラムの使用下で、７０分間の２５〜６０％Ｂを伴う二相勾配を行った。
該装置が残余のペプチドを含まなかったことを保証するために、サンプルブランクを常に測定した。オンラインの断片化を記述されたとおり実施し、そしてフラグメントのスペクトルを人的に分析した。データバンク調査（ＮＣＢＩ番号、ＥＳＴ）はＭＡＳＣＯＴの使用下で実施した（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍａｔｒｉｘｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ）。
１．４ ＭＨＣクラスＩリガンドの同定
開示される配列表および開示される表１に、患者ＲＣＣ７５、ＲＣＣ９８、ＲＣＣ１００、ＲＣＣ１０３、ＲＣＣ１１２、ＲＣＣ１１５、ＲＣＣ１１６、ＲＣＣ１３０、ＮＣＨ３５９およびＮＣＨ３６１のＨＬＡ分子に結合したリガンドを列挙する。ＨＬＡ−Ａ*０２と関連するペプチドは対立遺伝子特異的なペプチドモチーフを示した。従って、位置２にロイシン、バリン、イソロイシン、アラニン若しくはメチオニン、およびＣ末端にロイシン、バリン、イソロイシン若しくはアラニンが見出された。該リガンドの大部分はいわゆる「ハウスキーピング」タンパク質から発したとは言え、腫瘍と関連するタンパク質のリガンドも同定され得た。かように、例えばテナシン−Ｃのフラグメントを同定し得た（ＧＬＡＰＳＩＲＴＫ、配列番号２；ＧＶＬＫＫＶＩＲＨ、配列番号２０）。Ｈｅｒｏｌｄ−Ｍｅｎｄｅら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｐａｃｔ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ Ｔｅｎａｓｃｉｎ−Ｃ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ Ｇｌｉｏｍａ Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ，２００２，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，９８：３６２−３６９は、一般に細胞外マトリックスタンパク質テナシン−Ｃの発現の高さが、疾患の重症度および健康な組織への腫瘍細胞の移動と相関することを示している。
１．５ 正常ＣＤ８＋ Ｔ細胞レパートリー中のペプチド特異的Ｔ細胞の証明
例えば配列ＦＰＳＬＲＥＡＡＬ（配列番号１１４）をもつペプチドについてのペプチド特異的Ｔ細胞の証明のため、健康被験体の末梢血からの単核細胞を、関係のあるペプチドで構成された、関係のあるＨＬＡ−Ａ*サブタイプの四量体で染色した。すなわち、四量体の製造のため、Ｗａｌｔｅｒ Ｓら、２００３，Ｃｕｔｔｉｎｇ Ｅｄｇｅ：Ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ Ａｖｉｄｉｔｙ ｏｆ Ｈｕｍａｎ ＣＤ８ Ｔ Ｃｅｌｌｓ Ｅｘｐａｎｄｅｄ ｏｎ Ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ ＭＨＣ／Ａｎｔｉ−ＣＤ２８−Ｃｏａｔｅｄ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７１：４９７４−４９７８のように、組換えＨＬＡ−Ｂ*サブタイプの分子を、該ペプチドを伴いｉｎ ｖｉｔｒｏで構成し、ゲル濾過により精製し、ビオチニル化し、そして単量体の結合のためストレプトアビジンと混合した。
原則的に、ＦＡＣＳを用いる分析による二重染色の結果を検討し、そしてペプチド−四量体の特異的結合が証明される（Ｗａｌｔｅｒ Ｓら、２００３，Ｃｕｔｔｉｎｇ Ｅｄｇｅ：Ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ Ａｖｉｄｉｔｙ ｏｆ Ｈｕｍａｎ ＣＤ８ Ｔ Ｃｅｌｌｓ Ｅｘｐａｎｄｅｄ ｏｎ Ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ ＭＨＣ／Ａｎｔｉ−ＣＤ２８−Ｃｏａｔｅｄ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７１：４９７４−４９７８）。
【実施例２】
【００１８】
腫瘍細胞による選択されたペプチドの提示およびＣＴＬによるペプチドの認識を分析するため、選択されたペプチドに特異的であったＣＴＬをｉｎ ｖｉｔｒｏで誘導した。それのため、ＫＭ２２およびＪＹ目的細胞株を使用した。
２．１ 特異的Ｔリンパ球の獲得
特異的Ｔリンパ球は、１．５で記述されるとおり健康被験体の血液から単離し、そしてＦＡＣＳ分取により濃縮した。
２．２ ペプチドの合成
例示的な選択されたペプチドは、Ｆ−ｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）保護基の使用によりペプチド合成機（４３２Ａ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ドイツ・ヴァイターシュタット）で合成し、そして「逆相」ＨＰＬＣおよび質量分析により分析した。これらの方法で、同定されたペプチドについて十分な量を製造し得る。
２．３ 制限された合成ペプチドの使用下での抗原特異的ＣＴＬ応答の誘導
ＣＴＬの誘導のため、段階２．１で得られたＴリンパ球（ウェルあたり５×１０６個のＴリンパ球）を、１０％熱不活性化ヒトＡＢ血清（ＣＣ Ｐｒｏ、ドイツ・ノイシュタット／ヴァインシュトラッセ）、２ｍＬ Ｌ−グルタミン、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび２０μｇ／ｍｌゲンタマイシン（全部ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ／Ｃａｍｂｒｅｘ、ベルギー・ヴェルヴィエから）を含む１．５ｍｌのＴ細胞培地［ＲＰＭＩ １６４０、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ドイツ・カールスルーエ）から構成される］中ウェルあたり１×１０６の照射した目的細胞とともに、２４ウェルプレート中でのｉｎ ｖｉｔｒｏ再刺激により共インキュベートした。加えて、５ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ−１２ ｐ７０（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を添加した。３７℃で約４日の共インキュベーション後に、２０Ｕ／ｍｌのヒトＩＬ−２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含む新鮮培地を添加し、そして細胞をさらなる３から４日間インキュベートした。この刺激周囲を２回反復した。
２．４ ＣＴＬアッセイ
ＣＴＬアッセイのため、標的細胞としてＫＭ２２およびＪＹ腫瘍細胞株を使用した。ペプチドでパルスされる細胞は、５０μｇ／ｍｌのペプチドで２時間パルスした。全標的細胞は、ＲＰ１０培地（１０％熱不活性化ウシ胎児血清および抗生物質を補充したＲＰＭＩ １６４０）中、３７℃で［５１Ｃｒ］クロムナトリウム（５１Ｃｒ）で１時間標識した。次いで、丸底をもつ９６ウェルプレートの１ウェルあたり常に１０４細胞を与えた。２００μｌの最終容量を達成するためにさまざまな量をＣＴＬに添加し、次いで３７℃で４時間インキュベートした。その後、上清（５０μｌ／ウェル）を収集し、そしてベータプレート計数器で正確に計数した。特異的溶解を、後に続くとおり、すなわち、１００×（実験的放出−自発的放出／最大放出−自発的放出）パーセントで評価した。自発的および最大放出は、常に、培地若しくは２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００いずれかの存在下で測定した。
２．５．ＣＴＬ誘導の結果
ａ）ペプチドでパルスした目的細胞に対するＣＴＬ細胞傷害性活性
５１Ｃｒ放出アッセイ（２．４．でを参照されたい）において、ＫＭ２２若しくはＪＹ細胞に対する誘導されたＣＴＬの細胞傷害性活性（２．３．でを参照されたい）を試験した。細胞株ＫＭ２２およびＪ−ＹはＨＬＡ−Ｂ*０７陽性である。
この放出アッセイの結果を図１ａおよび１ｂに具体的に説明する。図１ａおよび１ｂにおいて、「ＩＦＮ」でインターフェロン−γを、「Ｅ：Ｔ」でエフェクター−目的細胞の比を、「Ｔｅｔ＋」でＨＬＡ−Ｂ*０７０２／ＦＰＳＬＲＥＡＡＬ四量体に結合するＴリンパ球を、および「Ｔｅｔ−」でＨＬＡ−Ｂ*０７０２／ＦＰＳＬＲＥＡＡＬ四量体に結合しないＴリンパ球を略記する。
該結果は、２週の再刺激後に得られるＣＴＬ細胞株で、抗原特異的細胞死（Ａｂｔｏｅｔｕｎｇ）が達成され得たことを示す。すなわち、図１ａにおいて、インターフェロン−γで処理した、ペプチドを伴わないＨＬＡ対立遺伝子Ｂ*０７０２について陽性のＫＭ２２目的細胞が、特異的細胞傷害性Ｔリンパ球により認識されなかったことを示す。図１ｂは、腫瘍抗原ＭＡＧＥ−１からの配列ＦＰＳＬＲＥＡＡＬを伴うペプチドを提示する、インターフェロン−γで処理した、ＨＬＡ対立遺伝子Ｂ*０７０２について陽性のＫＭ２２目的細胞が、特異的細胞傷害性Ｔリンパ球により認識かつ溶解されたことを示す。結果として、その細胞のみが、従って、増大する量により、選択されたペプチドを常に提示したＣＴＬを殺し；無関係のペプチドを負荷した対照細胞は殺されなかった。従って、細胞溶解活性の特異性が示され得た。
ｂ）ペプチドで刺激したＴリンパ球によるインターフェロン−γの形成
次の試みにおいて、ペプチドＦＰＳＬＲＥＡＡＬ（配列番号１１４）を負荷したＴ２細胞を溶解した細胞傷害性Ｔリンパ球が、Ｔ細胞の活性化の確実なマーカーとして記述されているインターフェロン−γも発現したことを示した。
図２において、ここでＫＭ２２およびＪＹ細胞を試験した測定の結果を示す。図１でと等しい略語が使用され、ここで再度、「ＣＤ８＋」で、細胞表面上に受容体分子ＣＤ８を発現するＴリンパ球を示す。
ＩＦＮ−γの証明のため、ペプチドでパルスした１×１０５個のエフェクター細胞および刺激体細胞を９６ウェルプレート上でＴ細胞培地中で培養した（Ｔ細胞培地：１０％熱不活性化ヒトＡＢ血清（ＣＣ ｐｒｏ、ノイシュタット／Ｗ．、ドイツ；２ｍＭ Ｌ−グルタミン、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび２０μｇ／ｍｌゲンタマイシン（全部ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）を補充した２５ｍＭ ＨＥＰＥＳを含むＲＰＭＩ １６４０（Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ドイツ・カールスルーエ）。ペプチド負荷は、３７℃でＸ−Ｖｉｖｏ １５培地中、それぞれのペプチドで約２時間実施した。
１から２時間後にＧｏｌｇｉＳｔｏｐ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を添加し、そしてさらなる４から５時間インキュベートした。次いで細胞を浸透化し、そしてＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ Ｐｌｕｓキットの使用下、ならびに抗ＣＤ４−ＦＩＴＣ、抗ＩＦＮ−γ−ＰＥおよび抗ＣＤ８−ＰｅｒＣＰを用い、製造元（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）の説明書に従って染色した。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｅｅｒ細胞計数器の使用下でサイトメトリー分析を実施した。
図２に見られるように、ＨＬＡ−Ｂ*０７０２／ＦＰＳＬＲＥＡＡＬ四量体に結合したＴリンパ球（＝特異的Ｔリンパ球、「Ｔｅｔ＋」）で、常に異なる量のインターフェロン−γで前処理しかつ配列番号１１４をもつペプチドを負荷したＫＭ２２若しくはＪＹ細胞によりそれらを刺激した場合に、インターフェロン−γが形成した（図２を参照されたい、「ＫＭ２２＋ＦＰＳＬＲＥＡＡＬ」および「ＪＹ＋ＦＰＳＬＲＥＡＡＬ」、常に５若しくは２５μＭ ＩＮＦで前処理した）。非特異的Ｔリンパ球（従ってＨＬＡ−Ｂ*０７０２／ＦＰＳＬＲＥＡＡＬ四量体に結合したＴリンパ球でない）は、しかしながらインターフェロン−γを形成しなかった（＝「Ｔｅｔ−」）。
図２において、再度、特異的（＝「Ｔｅｔ＋」）Ｔリンパ球も非特異的（「Ｔｅｔ−」）リンパ球も、それらを非特異的対照ペプチド（図２中で例示的に：ＡＰＲＴＶＡＬＴＡ、配列番号５８５）で刺激した場合に、インターフェロン−γを形成しなかった（常に「Ｔｅｔ＋」および「Ｔｅｔ−」（すなわち「ＫＭ２２＋ＡＰＲＴＶＡＬＴＡ」および「ＪＹ＋ＡＰＲＴＶＡＬＴＡ」、２５μＭ ＩＮＦで前処理した）について常に図２を参照されたい）ことが示された。
ｃ）ＣＤ８陽性Ｔ細胞のペプチド特異的刺激
ＣＤ８陽性Ｔ細胞のペプチド特異的刺激のさらなる証明のため、それに際して対照ペプチドもＨＬＡ対立遺伝子Ａ*０２に結合する、タンパク質ＲＧＳ−５の配列ＬＡＡＬＰＨＳＣＬ（配列番号４４８）をもつペプチドおよび黒色腫抗原ＭＥＬＡＮ−Ａの配列ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号５７８）をもつ対照ペプチド（位置２６−３５、ロイシンによる位置２７にあるアラニンのアミノ酸変化により改変した）を、Ｆｍｏｃ化学の標準的方法の使用下で合成した。ビオチニル化組換えＡ*０２分子および蛍光ＭＨＣ四量体を、Ａｌｔｍａｎら（「Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：９４，１９９６）に記述されるように製造した。人工的抗原提示細胞（ＡＰＣ）の製造のため、マイクロスフェア１ｍｇあたり０．０６４μｇビオチン−０．０６４μｇビオチン−ＦＩＴＣの結合容量をもつストレプトアビジン被覆したポリスチロール粒子（直径５．６μｍ）（Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国イリノイ州フィッシャー）を、ビオチニル化ＭＣＨおよび抗体を含有する緩衝液中に２×１０６粒子／ｍｌで懸濁し、そして室温で３０分間インキュベートした。
ヒトＣＤ８ Ｔ細胞の抗原特異的ｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激のため、新鮮なＢｕｆｆｙ−Ｃｏａｔから標準的な勾配分離によりＰＢＭＣを単離した。未処理のＣＤ８ Ｔ細胞を、ＭＡＣＳを用いる陰性枯渇により濃縮した（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、ドイツ・ベルギッシュ・グラードバッハ）。ｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激は、２４ウェルプレート上、１．５ｍｌのＴ細胞培地（ｓ．ｏ．）中ウェルあたり５×１０６の応答体細胞および１×１０６個のビーズ若しくは１×１０６の照射したＡＰＣを用いて実施した。５ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ−１２ ｐ７０（Ｒ％Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、米国）にマイクロスフェアを添加した。３７℃での３から４日の共インキュベーション後に新鮮な培地および２０Ｕ／ｍｌのヒトＩＬ−２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、米国）を添加し、そして細胞をさらなる３から４日インキュベートした。この刺激周期を２回反復した。
細胞表面および細胞内のサイトメトリー分析のため、蛍光ＭＨＣ四量体および抗ＣＤ８抗体（ハイブリドーマＵＫＴ８）を用いる四量体分析を、四色ＦＡＣＳＣａｌｉｂｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で実施した。
この分析の結果を図３に示す。ここで、配列番号４４８を伴うＲＧＳ−５ペプチドＬＡＡＬＰＨＳＣＬがヒトＣＤ８陽性Ｔ細胞を特異的に刺激することが見られる。図３で、左の列に、上述されたとおりＭｅｌａｎ−Ａからの配列ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号５７８）をもつ対照ペプチドで前の２倍刺激した、ＰＢＭＣからのＴ細胞の分析を示す。右の列は、配列ＬＡＡＬＰＨＳＣＬ（配列番号４４８）を伴うＲＧＳ−５ペプチドで刺激したＴ細胞の分析を示す。
図３で、上左は、Ｍｅｌａｎ−Ａペプチド／ＭＨＣ−Ａ*０２四量体複合体で刺激したＣＤ８陽性（Ｘ軸）Ｔ細胞が、配列ＬＡＡＬＰＨＳＣＬ（配列番号４４８）をもつペプチドと複合体形成したＭＨＣ−Ａ*０２四量体に結合しない（Ｙ軸）ことを示す。
図３の上右は、配列ＬＡＡＬＰＨＳＣＬ（配列番号４４８）をもつＲＧＳ−５ペプチド／ＭＨＣ−Ａ*０２四量体複合体で刺激したＣＤ８陽性Ｔ細胞が、配列ＬＡＡＬＰＨＳＣＬ（配列番号４４８）をもつペプチドと複合体形成したＭＨＣ−Ａ*０２四量体（Ｙ軸）に結合することを示す。二重に染色された（二重陽性）細胞は右上四分円に見られる。
図３の中央の左は、Ｍｅｌａｎ−Ａペプチド／ＭＨＣ−Ａ*０２四量体複合体で刺激したＣＤ８陽性Ｔ細胞（Ｘ軸）が、Ｍｅｌａｎ−Ａからの配列ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号５７８）をもつペプチドと複合体形成したＭＨＣ−Ａ*０２四量体（Ｙ軸）に結合することが見られる。二重に染色された（二重陽性）細胞は右上四分円に見出される。中央右には、配列ＬＡＡＬＰＨＳＣＬをもつＲＧＳ−５ペプチド／ＭＨＣ−Ａ*０２四量体複合体で刺激したＣＤ８陽性Ｔ細胞が、Ｍｅｌａｎ−Ａからの配列ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号５７８）をもつペプチドと複合体形成したＭＨＣ−Ａ*０２四量体（Ｙ軸）に結合しないことが示される。
図３の下行には、左に２種の使用したＭＨＣ四量体−ペプチド複合体（Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＨＣ−Ａ*０２およびＲＧＳ−５／ＭＨＣ−Ａ*０２）での二重染色によるＭｅｌａｎ−Ａ／ＭＨＣ−Ａ*０２特異的Ｔ細胞の定量的部分を示す。人工的抗原提示細胞に結合されたＭｅｌａｎ−Ａペプチド／ＭＨＣ−Ａ*０２四量体複合体での前述の刺激後に、刺激された細胞の１９．３％が、Ｍｅｌａｎ−ＡペプチドおよびＭＨＣ−Ａ*０２からのＭＨＣ四量体複合体に特異的に結合する。右で、２種の使用したＭＨＣ四量体複合体（Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＨＣ−Ａ*０２およびＲＧＳ−５／ＭＨＣ−Ａ*０２）での二重染色によるＲＧＳ−５／ＭＨＣ−Ａ*０２特異的Ｔ細胞の定量的部分を示す。人工的抗原提示細胞に結合されたＲＧＳ−５ペプチド／ＭＨＣ−Ａ*０２四量体複合体での前述の刺激後に、刺激された細胞の８．０％が、配列ＬＡＡＬＰＨＳＣＬ（配列番号４４８）をもつＲＧＳ−５ペプチドおよびＨＬＡ−Ａ*０２からのＭＨＣ四量体複合体に特異的に結合する。
ｄ）腎細胞癌患者の血液からのペプチド特異的Ｔ細胞の証明
さらなる研究において、前にペプチドを負荷した自己樹状細胞で免疫した腎細胞癌患者の血液からのペプチド特異的Ｔ細胞を証明し得た。
この証明のため、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を実施した。このＲＴ−ＰＣＲは、Ｋａｍｍｕｌａらの記述する（Ｋａｍｍｕｌｒａら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６３：６８６７，２０００）とおり実施した。このため、ＰＢＭＣをＴ細胞培地中で融解し、５００μｌの培地中に１×１０６細胞を接種し、そして３７℃および５％ ＣＯ２で一夜インキュベートした。次いで合成ペプチドを５μｇ／ｍｌで３時間添加し、そしてその後、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ドイツ・カールスルーエ）を用いるＲＮＡ抽出を実施した。ｃＤＮＡをランダムへキサマープライマー（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ドイツ・フライブルク）およびＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ ＧｍｂＨ、ドイツ・マンハイム）の使用下に転写した。
定量的ＲＴ−ＰＣＲは、ＩＦＮ−γ ｍＲＮＡおよびＣＤ８ ｍＲＮＡに関して「ＡＢＩＰｒｉｓｍ ７０００配列検出装置」（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ドイツ・ダルムシュタット）を用いて二重で実施し、その際にＴａｑｍａｎ ＰＣＲマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、特異的プライマーおよび蛍光プローブを使用した。
該結果はＩＦＮ−γのｍＲＮＡのコピー数を反映し、ここでは各プローブを（参照遺伝子産物としての）ＣＤ８ ｍＲＮＡのコピー数に関して正規化した（刺激指数）。試験したペプチドの存在下での遺伝子発現は、対照（配列ＩＬＫＥＰＶＨＧＶ、配列番号５７９をもつＨＩＶ１ ｐｏｌから発するＨＬＡ−Ａ*０２エピトープ）の存在下に得られた遺伝子発現に関して表される（対照のコピー数を１と設定した）。
図４にこの実験の結果を示す。図４の具体的説明は、９種のＨＬＡに結合するペプチドでの、チュービンゲン大学臨床センターの患者ＲＣＣ９８の免疫化後のｅｘ ｖｉｖｏのＴ細胞活性化を示す。１１の棒群（Ｓａｅｕｌｅｎｂｌｏｃｋ）はＴ細胞の実験の陰性および陽性対照を示す。エラーバーは標準偏差を示す。上で示されたとおり、陰性対照として、配列ＩＬＫＥＰＶＨＧＶ（ウイルス抗原ＨＩＶ１ ｐｏｌから、位置８９６−９０４；配列番号５７９）をもつＨＩＶペプチドを使用した。陰性対照は、患者がＨＩＶ血清陰性であった場合はＴ細胞応答に至らなかった。陽性対照として、インフルエンザマトリックス５８−６６（ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ；配列番号５８０）、ＨＣＭＶＡ ｐｐ６５ ４９５−５０３（ＮＬＰＶＭＶＡＴＶ；配列番号５８１）、ＥＢＮＡ６−ＥＢＶ ２８４−２９３（ＬＬＤＦＶＲＦＭＧＶ；配列番号５８２）、ＩＥ６３−ＥＢＶ ２５９−２６７（ＧＬＣＴＬＶＡＭＬ；配列番号５８３）およびＬＭＰ２−ＥＢＶ ２９４−３０２（ＣＬＧＧＬＬＴＭＶ；配列番号５８４）のペプチドからの混合物を使用し、それにより非常に強いＴ細胞応答が期待された（「ポズミックス（ｐｏｓｍｉｘ）」；刺激指数の最大４３．６）。全部のＰＢＭＣの刺激に使用した対照ペプチドは５μｇ／ｍｌの濃度で使用した。バックグラウンドは陰性対照の標準偏差（刺激指数１．３５、水平の破線として表される）と定義した。
図４中の具体的説明の次の９つの棒群は、９種の免疫化ペプチドに対し測定されたＴ細胞活性化を示す。これら９種のペプチドは、全部で７回、必ず１４日の間隔で、自己樹状細胞によって一緒に皮下に負荷されて投与された。従って、各棒群は８本の棒から構成される（１回目の免疫化前、２回目の免疫化後、２回目の免疫化後、など）。各棒群は従って、免疫化の経過におけるＴ細胞の特徴を示す。
既に、３回目の免疫化に際して、ＧＫＡＳＦＫＳＦＬＫ（ＲＧＳ５ ７４−８３、配列番号１５３）およびＳＬＬＴＳＳＫＧＱＬＱＫ（ＡＤＦＰ ３６９−３８０、配列番号２８９）に対する強いＴ細胞応答が見られ、その際、後者のペプチドにより４回目の免疫化後のＴ細胞応答が上昇した。免疫療法の経過中のＴ細胞応答のこうした変動は他の患者でも示されている。
Ｔ細胞応答は、ＩＡＲＮＬＴＱＱＬ（ＡＤＦＰ ３１３−３２１；配列番号２３３）、ＧＰＡＬＧＲＳＦＬ（ＴＮＦＳＦ７ ７８−８６、配列番号５７７）についてバックグラウンドで明瞭に、および汎ＨＬＡ−ＤＲに結合する（ＰＡＤＲＥ）公知のペプチドについてより弱く見られた。これらとともに、３種のペプチドも免疫療法の経過中にＴ細胞応答の上昇が見出された（点線）。これは、これら３種の最後に挙げられたペプチドが陽性のＴ細胞応答を惹起したことを確認した。
該患者は、チュービンゲン大学臨床センターでの申告された臨床試験の枠内で免疫した。該臨床試験は、チュービンゲン大学の倫理委員会に申告され、そして文書で承認された。該試験はドイツ医薬品法（ＡＭＧ）の規則およびガイドライン、ならびに「医薬品の臨床試験の実施基準」（ＧＣＰ）に従って実施した。
一緒にすれば、発明者は従って、同定されたペプチドが、（腫瘍）疾患の多数に際しての免疫療法の枠内で有利な物質を生じることを示し得た。
【実施例３】
【００１９】
末梢血からのＢ*０７０２／ＩＡＲＮＬＴＱＱＬ（配列番号２３３）特異的ＣＤ８＋リンパ球のミクロスフェアに駆動される増殖の四量体分析（図５を参照されたい）。
６例の健康なＨＡＬ−Ａ*０２０１＋被験体ＨＤ１５５、ＨＤ１５９、ＨＤ１６１、ＨＤ１６７、ＨＤ１６８およびＨＤ１７７のウェルあたり１×１０６のＣＤ８＋濃縮したＰＢＭＣを、抗ＣＤ８および無関係な抗原（「無関係刺激」）、腫瘍抗原Ｂ*０７０２／ＩＡＲＮＬＴＱＱＬ高密度（「ＨＤ」）若しくは腫瘍抗原Ｂ*０７０２／ＩＡＲＮＬＴＱＱＬ低密度（「ＬＤ」）に結合させたマイクロスフェアで、小さな改変を伴い前に示された［Ｗａｌｔｅｒ，Ｓら Ｃｕｔｔｉｎｇ Ｅｄｇｅ：Ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ａｖｉｄｉｔｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＣＤ８ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｅｘｐａｎｄｅｄ ｏｎ ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ ＭＨＣ／ａｎｔｉ−ＣＤ２８−ｃｏａｔｅｄ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７１：４９７４−８，２００３］とおりに毎週刺激した。ｉｎ ｖｉｔｒｏで３回の刺激後に、いくつかのウェルをＣＤ８および四量体Ｂ*０７０２／ＩＡＲＮＬＴＱＱＬの抗体で染色した。全部の点は、１個のウェルからのＣＤ８＋リンパ球の内側の四量体＋のパーセントを表す。
個々の被験体での無関係刺激後の見出される応答の分布に基づき、有意の閾値、および以下の式：
閾値＝剤についての９５％信頼区間の上限＋３×標準偏差の９５％信頼区間の上限
の使用下で水平の赤線によりを評価した。図中の数字は、得られた条件についてのウェル全体での有意に陽性のウェルの数を表す。
【００２０】
以下に配列、位置、遺伝子記号、受託番号、配列番号を示す。
（表１）
【００２１】
ＮＣＨ３５９の配列
1.VPDSSGPERIL78-88
HNRPKNP_002131.2配列番号1
2.GLAPSIRTK1510-1518
TNCNP_002151.1配列番号2
3.RLFEHPLYR149-157
FAM20CNP_064608.1配列番号3
4.TPSEPHPVL381-389
HGRG8NP_057342.1配列番号4
5.QIFVKTLTGK2-11
RPS27AAAH01392.1配列番号5
6.SLMHSFILK44-52
DNCL2ANP_054902.1配列番号6
7.YPHLHNAEL127-135
SOX9NP_000337.1配列番号7
8.RLFVGSIPK244-252
SYNCRIPNP_006363 配列番号8
9.RVFPDKGYSF233-242
TIA1NP_071320.1配列番号9
10.SLYKKLEIK554-562
SLC9A2NP_003039.2配列番号10
11.HPVSDHEATL216-225
HLA-CNP_002108配列番号11
12.LPTRVDFSL46-54
記号は存在しない。遺伝子の種類：命名されていないタンパク質産物
BAC87610配列番号12
13.KSFGSAQEFAW386-396
COPB2NP_004757 配列番号13
14.SPSTSRTPLL1026-1035
EGFRNP_005219.2配列番号14
15.STFDSPAHW1149-1157
EGFRNP_005219.2配列番号15
16.APEEHPVLL97-105
ACTBNP_001092.1配列番号16
17.RQITQVYGF117-125
PPP6CNP_002712.1配列番号17
18.KVSDYILQH1046-1054
ASTN2NP_054729.3配列番号18
19.KLLPSVVLK2-10
DTRNP_001936.1配列番号19
20.GVLKKVIRH23-31
TNCNP_002151.1配列番号20
21.KLFDHAVSKF40-49
ACSL4NP_004449.1配列番号21
22.ITVLTKPLPV112-121
PTPRONP_002839.1配列番号22
23.HPVHPDIKL130-138
PIAS1NP_057250.1配列番号23
24.IPRAALLPLL3-12
PRSS11NP_002766.1配列番号24
25.ATNRITVTW254-262
PIASYNP_056981.2配列番号25
26.KIADRFLLY29-37
LMO4NP_006760.1配列番号26
【００２２】
ＮＣＨ３６１の配列
27.DHDPVDKIVL150-159
HNRPA2B1NP_002128.1配列番号27
28.DHHQEVIGF165-173
C9ORF10NP_055427.2配列番号28
29.IHDLDNISF188-196
PSMB2NP_002785.1配列番号29
30.DHINDIIKI834-842
IQGAP1NP_003861.1配列番号30
31.DHMRFISEL355-363
CYFIP1NP_055423.1配列番号31
32.THSLPVVVI456-464
STAT3NP_003141.2配列番号32
33.MPVGPDAILRY929-939
BAT3NP_004630.2配列番号33
34.RLDDAIHVL406-414
TCF12NP_003196.1配列番号34
35.QHEGTVNIF1953-1961
PTPRZ1NP_002842.1配列番号35
36.ETVNIWTHF48-56
PAQR6NP_940798配列番号36
37.VHILDTETF195-203
KLHDC2NP_055130.1配列番号37
38.QTPDFTPTKY607-616
ZHX3NP_055850.1配列番号38
39.RHVEVFELL133-141
MPDZNP_003820.1配列番号39
40.TTIDIGVKY136-144
CNN3NP_001830.1配列番号40
41.DLIEHFSQF113-121
HNRPA0NP_006796.1配列番号41
42.ETVWRLEEF65-73
HLA-DRANP_061984配列番号42
43.DVLESVNLL176-184
AP2M1NP_004059.2配列番号43
44.IHDDFVTTF466-474
AEBP1NP_001120.2配列番号44
45.IHIPINNII57-65
Sec61GNP_055117.1配列番号45
46.IHLIDPNTL281-289
CGI-07NP_057022.2配列番号46
47.IHVIGGNDV1016-1024
KIAA1268XP_291055.1配列番号47
48.KAFQKIVVL291-299
BZW1NP_055485.2配列番号48
49.YQDLLNVKL349-357
GFAPNP_002046.1配列番号49
50.GHYEVAELL728-736
TNKSNP_003738.1配列番号50
51.LVVYPWTQRF33-42
HBBNP_000509.1配列番号51
52.MHLRQYELL386-393
GNASNP_000507.1配列番号52
53.EAIEQILKY149-157
FLJ10539NP_060600.1配列番号53
54.DVAEGDLIEHF108-118
HNRPA0NP_006796.1配列番号54
55.DVLQKIKY191-198
EPS8L1NP_060199.2配列番号55
56.DSFPMEIRQY24-33
STAT1NP_009330.1配列番号56
57.DVISNIETF281-289
SOX9NP_000337.1配列番号57
58.DVIRLIMQY9-17
SMU-1NP_060695.1配列番号58
59.DVIERVIQY792-800
IDN3NP_056199.1配列番号59
60.DVIAQGIGKL53-62
RPLP2NP_000995.1配列番号60
61.DVFNEKGWNY94-103
PBEF1NP_005737.1配列番号61
62.THLDSVTKI254-262
C6.1ANP_077308.1配列番号62
63.DVAGIIADY294-302
KIAA1238XP_048675.4配列番号63
64.TAAPFPFHL536-544
TBX2NP_005985.2配列番号64
65.DTLDKVFTY86-94
ACSL3NP_004448.2配列番号65
66.DTISPTLGF42-50
ARL2NP_001658.1配列番号66
67.DTGILDSIGRF35-45
MBPNP_002376.1配列番号67
68.VVYPWTQRF34-42
HBBNP_000509.1配列番号68
69.EVVAGIKEYF128-137
MORF4NP_006783.2配列番号69
70.SSVPGVRLL72-80
VIMNP_003371.1配列番号70
71.SVVDAIGISRF364-374
FLJ45273BAC86883.1配列番号71
72.EVIPPMKEF115-123
NDUFB6NP_002484.1配列番号72
73.EVIPPYYSY152-160
TTRAPNP_057698.2配列番号73
74.EVNGLISMY284-292
U5-116KDNP_004238.2配列番号74
75.EVIDLMIKEY57-66
PHF10NP_060758.1配列番号75
76.EVVAGIKEY128-136
MORF4NP_006783.2配列番号76
77.EVFPLAMNY76-84
CCND1NP_444284.1配列番号77
78.EVVERVLTF28-36
FBXO22NP_036302.1配列番号78
79.SHSPFGLDSF1251-1260
JMJD1BNP_057688.2配列番号79
80.FGVDRAILY457-465
ITGAVNP_002201.1配列番号80
81.SHSDYLLTI76-84
SOCS2NP_003868.1配列番号81
82.SHLDYDITL511-519
KIAA0794XP_087353.5配列番号82
83.SHFVSDVVI63-71
GNB2L1NP_006089.1配列番号83
84.EVTELLARY155-163
POLR2ENP_002686.2配列番号84
85.ETADTLMGLRY425-435
GFPT1NP_002047.1配列番号85
86.EHAHLIVVL662-670
ABCB9NP_062570.1配列番号86
87.EHSLVIDTL53-61
PFDN2NP_036526.2配列番号87
88.EIAEAYLGY129-137
HSPA1ANP_005336.2配列番号88
89.EIYGGSDSRF42-51
SF3B1NP_036565.1配列番号89
90.ELIAKIPNF73-81
SETNP_003002.1配列番号90
91.EVIKNFIQY50-58
EIF3S6IPNP_057175.1配列番号91
92.ETADTLLALRY426-436
GFPT2NP_005101.1配列番号92
93.EVVSEPFRSF581-590
PSMD2NP_002799.3配列番号93
94.ETFDAGLQAF2019-2028
SPTAN1NP_003118.1配列番号94
95.SHSQLMQLI164-172
ADRM1NP_008933.2配列番号95
96.ETVRELTEF255-263
PPARDNP_006229.1配列番号96
97.EVAATEIKM10-18
HNRPMNP_005959.2配列番号97
98.EVAAVLLHF214-222
SEC10L1NP_006535.1配列番号98
99.EVFDKTYQF132-140
C6orf153NP_149103.1配列番号99
100.ELVKRILNF174-182
DEKNP_003463.1配列番号100
101.AHDDGRWSL95-103
FSCN1NP_003079.1配列番号101
102.SVVSVISRF4-12
DAD1NP_001335.1配列番号102
103.SVVELINHY132-140
PIK3R3NP_003620.2配列番号103
104.SVVDLINHY397-405
PIK3R2NP_005018.1配列番号104
105.AHVDLIEKL51-59
POLR2LNP_066951.1配列番号105
106.FHNELLTQL97-105
BAIAP2NP_006331.1配列番号106
107.SVIEAVAHF812-820
C6orf133NP_056070.1配列番号107
108.GHFEKPLFL149-157
NTENP_006693.2配列番号108
109.GHDASQITL273-281
TH1LNP_057481.2配列番号109
110.SAVDFIRTL293-301
STK17ANP_004751.1配列番号110
111.ISTPVIRTF989-997
C9orf10NP_055427.2配列番号111
112.GVIEKLLTSY28-37
D1S155EAAH32446配列番号112
113.SHDLTLVNL395-403
KIAA1706NP_085139.1配列番号113
【００２３】
ＪＹの配列
114.FPSLREAAL294-302
MAGEA1NP_004979.2配列番号114
【００２４】
ＲＣＣ０７５の配列
115.SIFKQPVTK250-258
MBD2NP_003918.1配列番号115
116.KPNANRIAL139-147
LGALS3NP_002297.1配列番号116
117.KLYEMILKR174-182
ARL7NP_005728.2配列番号117
118.SLFSRLFGK7-15
ARF4NP_001651.1配列番号118
119.KLFDKLLEY309-317
API5NP_006586.1配列番号119
120.SLFPNSPKWTSK96-107
MMP7NP_002414.1配列番号120
121.LESLDQLEL29-37
BAG2NP_004273.1配列番号121
122.VVNKVPLTGK101-110
MGC17943NP_689474.1配列番号122
123.SVYDSVLQK4470-4478
SYNE1NP_149062.1配列番号123
124.SVYVLVRQK39-47
MLSTD2NP_115604.1配列番号124
125.ILENIQRNK557-565
ERCC2NP_000391.1配列番号125
126.GSYNKVFLAK146-155
PSMD8NP_002803.1配列番号126
127.TESGLNVTL6-14
PCBP1NP_006187.1配列番号127
128.TEHGVEVVL612-620
SH2D3CNP_005480.1配列番号128
129.TEARFGAQL327-335
KRT19NP_002267.2配列番号129
130.TLADILLYY114-122
EEF1E1NP_004271.1配列番号130
131.LVFPSEIVGK133-142
RPS7NP_001002.1配列番号131
132.VLFGKALNPK709-718
ABCC3NP_003777.2配列番号132
133.RPELVRPAL91-99
AKR1C3NP_003730.4配列番号133
134.VPNQKRLTLL576-585
ACSL4NP_004449.1配列番号134
135.QLYWSHPRK5-13
RPS29NP_001023.1配列番号135
136.SVYVYKVLK39-47
H2BFSNP_059141.1配列番号136
137.REKLQEEML186-194
VIMNP_003371.1配列番号137
138.RVFSGLVSTGLK415-426
EEF2NP_001952.1配列番号138
139.KPRDVSSVEL1939-1948
SPTBN1NP_003119.1配列番号139
140.NEFPEPIKL184-192
RAB7NP_004628.4配列番号140
141.KTYGEIFEK106-114
NDUFC2NP_004540.1配列番号141
142.RILFFNTPK196-204
PSMD8NP_002803.1配列番号142
143.RVFPWFSVK1764-1772
MLLNP_005924.1配列番号143
144.SEVQDRVML54-62
CGI-127NP_057145.1配列番号144
145.SLWDRLIFH410-418
ACSL1NP_001986.2配列番号145
146.KVYNIQIRY468-476
LCP2NP_005556.1配列番号146
147.RLLEMILNK171-179
AKR1C2NP_001345.1配列番号147
148.SEDKKNIIL41-49
CFL1NP_005498.1配列番号148
149.YEELVRMVL106-114
MYL6NP_524147.1配列番号149
150.GEITGEVHM1758-1766
FLNBNP_001448.1配列番号150
151.IVAGSLITK183-191
FNBP3AAH11788配列番号151
152.APRIITGPAPVL225-236
QKINP_006766.1配列番号152
153.GLASFKSFLK74-83
RGS5NP_003608.1配列番号153
154.FPNSPKWTSK98-107
MMP7NP_002414.1配列番号154
155.FVIETARQL49-57
C14orf4NP_078772.1配列番号155
156.IEVDGKQVEL46-55
RHOANP_001655.1配列番号156
157.GELTGEVRM1776-1786
FLNCNP_001449.1配列番号157
158.GESDDSILRL63-72
RPS21NP_001015.1配列番号158
159.GEGDFLAEGGGV23-34
FGANP_000499.1配列番号159
160.DNFPQSL690-696
CACNA1CNP_000710.3配列番号160
161.GLTDVILYH269-277
SYNCRIPNP_006363.3配列番号161
162.AALVASGVALY247-257
P2RY11NP_002557.2配列番号162
163.AEIRHVLVTL107-116
MYL6NP_066299.2配列番号163
164.AEPEEVEVL10-18
PGR1NP_150638.1配列番号164
165.AIIDHIFASK256-265
KISNP_787062配列番号165
166.ALLDGSNVVFK48-58
HKE2NP_055075.1配列番号166
167.AMLDTVVFK302-310
PSMD14NP_005796.1配列番号167
168.APARLFALL2-10
SDC4NP_002990.2配列番号168
169.AVNAHSNILK248-257
IMMTNP_006830配列番号169
170.APRPGVLLL8-16
ELNNP_000492配列番号170
171.EAFPLRVID749-757
MAN2A2NP_006113.1配列番号171
172.GVADKILKK211-219
NMINP_004679.1配列番号172
173.AVFPKPFVEK189-198
KIAA0377NP_055474.2配列番号173
174.VVYVGGILTK258-267
UGT8NP_003351.2配列番号174
175.HLEDIVRQK1751-1759
TRIP12XP_376178.1配列番号175
176.VTLTLVILSY207-216
LOC390323XP_372460.1配列番号176
177.SLLSLVTGLK読み枠＋3１
記号は存在しない。遺伝子の種類：発現遺伝子配列断片CD105815配列番号177
178.QTYVGITEK687-695
U5-200KDNP_054733.2配列番号178
179.HEDKIRVVL210-218
EHD2NP_055416.2配列番号179
180.QISIPFLLK208-216
C9orf88AAH01979配列番号180
181.GLMGFIVYK29-37
C14orf2NP_004885.1配列番号181
182.FADQEVRSL950-958
PIK3C2ANP_002636.1配列番号182
183.IVALILSTK147-155
ATP6V0CNP_001685.1配列番号183
184.GTYAPAEVPK22-31
AKR1C1NP_001344.2配列番号184
185.GTMTGMLYK161-169
TIMM23NP_006318.1配列番号185
186.SLAEILLKK439-447
IPO8NP_006381.1配列番号186
187.KLTYIYIQK読み枠＋１
記号は存在しない。遺伝子の種類：発現遺伝子配列断片AA295205配列番号187
188.KLLNYAPLEK58-67
POLR2LNP_055427 配列番号188
189.GTLPHPLQR182-190
SCNN1ANP_001029.1配列番号189
190.GLYEFFRAK680-688
CHERPNP_006378.2配列番号190
191.KEPEINTTL226-234
FLJ34588NP_689939.1配列番号191
192.HASDRIIAL330-338
TKTNP_001055.1配列番号192
【００２５】
ＲＣＣ０９８の配列
193.RPTLWAAAL5-13
IGFBP3 NP_000589.1配列番号193
194.APSPRPLSL11-19
C19orf28NP_778148.1配列番号194
195.ASDFITKMDY362-371
GSNNP_000168.1配列番号195
196.EERVINEEY13-21
RBBP4NP_005601.1配列番号196
197.ATGSWDSFLK328-337
GNB1NP_002065.1配列番号197
198.RMFDMGFEY411-419
DDX42NP_031398.2配列番号198
199.APLLRWVL265-272
HMOX1NP_002124.1配列番号199
200.ALRPSTSRSLY43-53
VIMNP_003371.1配列番号200
201.RQIPYTMMK225-233
SLC25A3NP_002626.1配列番号201
202.AETHIVLLF267-275
DKFZp564K142NP_115497.3配列番号202
203.RVHAYIISY305-313
EHD2NP_055416.2配列番号203
204.AVIVLVENFYK11-21
S100A16NP_525127.1配列番号204
205.SEELLREHY61-69
NME3NP_002504.2配列番号205
206.RADGNFLLY368-376
KIAA0930XP_047214.6配列番号206
207.SEFTGVWKY83-91
PDCD6NP_037364.1配列番号207
208.SIDRTVMYY389-397
SLC3A1NP_000332.1配列番号208
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295.VALISPKDI読み枠−１
記号は存在しない。遺伝子の種類：発現遺伝子配列断片AC079587.4配列番号295
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【００２６】
ＲＣＣ１００の配列
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【００２７】
ＲＣＣ１０３の配列
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【００２８】
ＲＣＣ１１２の配列
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412.VGLIRNLAL511-519
CTNNB1NP_001895.1配列番号412
413.GRLDAVLQR317-325
PMLNP_002666.1配列番号413
414.LLDQGQLNKY421-430
CLTCNP_004850.1配列番号414
415.NRFAGFGIGL98-107
LOC91137NP_620128.1配列番号415
416.KRLGTLVVTY305-314
GBP4NP_443173.2配列番号416
417.KRGDVIYIL319-327
SCAP2NP_003921.2配列番号417
418.SRFDIPLGL1103-1111
PCF11NP_056969.2配列番号418
419.STDPSVLGKY101-110
HES1NP_005515.1配列番号419
420.SRFLKSDLF130-138
RGS10NP_002916.1配列番号420
421.VQKPSYYVR211-219
ADFPNP_001113.2配列番号421
422.SRISLPLPNF409-418
VIMNP_003371.1配列番号422
423.LRSGLPLLL231-239
MADHIPNP_004790.1配列番号423
424.SFKDYIQER330-338
ETS2NP_005230.1配列番号424
425.HTQGPVDGSLY104-114
TENS1NP_073585.6配列番号425
426.STDKFKTDFY271-280
COPS6NP_006824.2配列番号426
【００２９】
ＲＣＣ１１５の配列
427.GSHSMRYFF25-33
HLA-ANP_002107配列番号427
428.GSHSMRYFFT25-34
HLA-ANP_002107配列番号428
429.GSHSMRYFH25-33
HLA-BI37515配列番号429
430.AAILGMHNL135-143
TMOD3NP_055362.1配列番号430
431.KLDPTKTTL275-283
NDRG1NP_006087.2配列番号431
432.FVHDLVLYL783-791
CLTCL1NP_001826.1配列番号432
433.FVHDLVL783-789
CLTCL1NP_001826.1配列番号433
434.VLIPKLPQL134-142
ORMDL3NP_644809.1配列番号434
435.NEITIPVTF177-185
HSPB1NP_001531.1配列番号435
436.YLADFLLTK255-263
SLC17A3NP_006623.1配列番号436
437.YLIPLLERL139-147
DDX6NP_004388.1配列番号437
438.NEVVTREY18-25
RPL31NP_000984.1配列番号438
439.DEFKIGELF145-153
PRKDCNP_008835 配列番号439
440.IQRTPKIQVYS21-31
B2MNP_004039.1配列番号440
441.LTGPVMPVR150-158
RPL13NP_000968.2配列番号441
442.AVAIKAMAK146-154
EIF5ANP_001961.1配列番号442
443.FVQMMTAK142-149
CALM1NP_008819.1配列番号443
444.ATDPNILGR4111-4119
PRKDCNP_008835.5配列番号444
445.LLLLSIVIL212-220
EDG1NP_001391.2配列番号445
446.KLPNFGFVVF376-385
G3BPNP_005745.1配列番号446
447.KLSEIDVAL174-182
EFHD1NP_079478.1配列番号447
448.LAALPHSCL5-13
RGS5NP_003608.1配列番号448
449.YSIITPNILRL26-36
C3NP_000055.1配列番号449
450.ALPSRILLWK2-11
MGC3047NP_115724.1配列番号450
451.VKGFYPSDIAVE247-258
IGHG2AAB59393.1配列番号451
452.FLLDLSRSV92-100
GPR31NP_005290.1配列番号452
453.IIYKGGTSR545-553
GSNNP_000168.1配列番号453
454.IVADHVASY3-11
ＭＨＣクラスＩＩAAC41957配列番号454
455.EVGGEALGRLL23-33
HBBNP_000509.1配列番号455
456.RTGPPMGSRF175-184
WBSCR1NP_071496.1配列番号456
457.RQIQESVTF1305-1313
ANK2NP_001139.2配列番号457
458.RVAPEEHPV95-103
ACTBNP_001092.1配列番号458
459.TLADLLALR1433-1441
DNAH11NP_003768.1配列番号459
460.RVAPEEHPVLLT95-106
ACTBNP_001092.1配列番号460
461.TLADIIARL1487-1495
KIAA1305XP_370756.2配列番号461
462.RWEDGSPLNF142-151
KLRG1NP_005801.2配列番号462
463.YEVSQLKD468-475
CNDP2NP_060705.1配列番号463
464.YRDIPELQGF663-672
AACSNP_076417配列番号464
465.YVDGTQFVRF51-60
ＨＬＡ−Ａ、−Ｂ若しくは−ＣBAA04965配列番号465
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M11S1NP_005889.3配列番号466
467.HGIDPTGTY28-36
TUBB5NP_006078.2配列番号467
468.SLDKFLASVSTVL125-137
HBA1NP_000549.1配列番号468
469.SIGERDLIFH289-298
TIMELESSNP_003911.1配列番号469
470.SITSVFITK1788-1796
TRRAPNP_003487.1配列番号470
471.FGEHLLESDLF28-38
CRYABNP_001876.1配列番号471
472.FLDPIKAYL76-84
GPR116NP_056049.3配列番号472
473.FLADPSAFVAA268-278
RPLP0NP_000993.1配列番号473
474.ITAPPSRVL20-28
SCDNP_005054.2配列番号474
475.VLDELKNMKC170-179
CYFIP2NP_055191.1配列番号475
476.LLGPRLVLA23-31
TMP21NP_006818.2配列番号476
477.IIMPHNIYL251-259
SLC11A1NP_000569.2配列番号477
478.LVRMVLNG144-151
MYL6NP_034990 配列番号478
479.RLYGPSSVSF133-142
SERPINH1NP_001226.2配列番号479
480.FEAPIKLVF236-244
HM13NP_110416.1配列番号480
481.IQPGAVKVY1472-1480
C3NP_000055.1配列番号481
482.VLAEVPTQL501-509
CPNE1NP_003906.1配列番号482
483.IMRAGMSSL521-529
CCT6ANP_001753.1配列番号483
484.VEFSSGLKGMSL96-107
ATP5A1NP_004037.1配列番号484
485.ILNPDNSFEIL241-251
CANXNP_001737.1配列番号485
486.VALEFALHL344-352
CABLES1NP_612384.1配列番号486
487.TVAVPLVGK22-30
MGC3067NP_077271.1配列番号487
488.TLSDLRVYL121-129
C20Orf139NP_542763.1配列番号488
489.TLIDIMTRF35-43
HK1NP_000179.1配列番号489
【００３０】
ＲＣＣ１１６の配列
490.HDFPRALIF64-72
CG018AAH22188配列番号490
491.GSHSMRYF25-32
HLA-A,-B or -CBAA04965配列番号491
492.SLMDHTIPEV289-298
SDCBPNP_005616.1配列番号492
493.SGVHTFPAVLQ155-165
Ｉｇ Ｈ鎖AAO22172配列番号493
494.FLVTVIHTL1065-1073
PLXNC1NP_005752.1配列番号494
495.TDGKVFQF24-31
RPL24NP_000977.1配列番号495
496.YDLLRNTNF246-254
DYRK1ANP_001387.2配列番号496
497.ILYPKTLFL138-146
PPP3CANP_000935.1配列番号497
498.MRYVASYL1-8
RPLP2NP_000995.1配列番号498
499.FIWENIHTL3725-3733
BPAG1NP_056363.2配列番号499
500.RELPAWVSF125-133
MBC2NP_056107.1配列番号500
501.QDLNRIFPL81-89
PRG1NP_002718.2配列番号501
502.RDSIVAEL97-104
COPENP_009194.2配列番号502
503.ADVLKVEVF130-138
ITGB4BPNP_002203.1配列番号503
504.YDSIIYRM335-342
ATP6AP2NP_005756.2配列番号504
505.AMNPVEHPF203-211
RPL8NP_000964.1配列番号505
506.SELIRNVTL126-134
U5-116KDNP_004238.2配列番号506
507.QDVARVLGF117-125
PNMA1NP_006020.3配列番号507
508.SDHIHIIAL215-223
OTUB1NP_060140.1配列番号508
509.ADSLRLQQL781-789
SPTAN1NP_003118.1配列番号509
510.LLDIRSEY466-473
ANXA11NP_001148.1配列番号510
511.VLFGLLREV663-671
DHX38NP_054722.2配列番号511
512.VAVGRALYY510-518
DDB1NP_001914.2配列番号512
513.MRFLAATFL1-9
NPC2NP_006423.1配列番号513
514.YTDPEVFKY398-406
PTGISNP_000952.1配列番号514
515.HDFLKYDFF232-240
SURF4NP_149351.1配列番号515
516.AIDQLHLEY525-533
ACTN4NP_004915.2配列番号516
517.SDLERVTSL316-324
FLJ21616NP_078843.2配列番号517
518.TLLPLRVFL128-136
FLJ90013NP_699196.1配列番号518
519.YSIITPNILR26-35
C3NP_000055.1配列番号519
520.FELQRNFQL19-27
ING4NP_057246.2配列番号520
521.LDLQRNYIF186-194
UNQ3030NP_940967.1配列番号521
522.RRLDPIPQL56-64
MGC8721NP_057211.4配列番号522
523.SLPIKESEIIDF85-96
RPS2NP_002943.2配列番号523
524.TELLRYYML292-300
SNX5NP_055241.1配列番号524
525.FIYHGEVPQA254-263
MHC2TANP_000237.1配列番号525
526.AEMLRSISF217-225
CSTF1NP_001315.1配列番号526
527.RLQEDPPVGV15-24
UBE2BNP_003328.1配列番号527
528.AELERAAAL465-473
FLJ35453NP_689813.1配列番号528
529.YTDKIDRY107-114
TM4SF7NP_003262.1配列番号529
530.FLLPDVIRI329-337
TBC1D13NP_060671.2配列番号530
531.VELPHINLL169-177
FLJ10349NP_060536.2配列番号531
532.VMLDVPIRL725-733
RASAL2NP_004832.1配列番号532
533.SLLENLEKI209-216
HNRPCNP_112604.1配列番号533
534.YADPVNAHY226-234
ROD1NP_005147.3配列番号534
535.AELLRGLSL165-173
FBXL5NP_036293.1配列番号535
536.TTEVHPELY51-59
SDBCAG84NP_057050.1配列番号536
537.RETNLDSLP424-432
VIMNP_003371.1配列番号537
538.ELEDSTLRY543-551
PLEC1NP_000436.1配列番号538
【００３１】
ＲＣＣ１３０の配列
539.FLDIYIFL84-91
LOC390875XP_372703.1配列番号539
540.TYTDRVFFL1282-1290
PLXNB2BAA21571.1配列番号540
541.SPHLANYFYF147-156
記号は存在しない。遺伝子の種類：命名されていないタンパク質産物BAC87422配列番号541
542.SPRLPVGGF1921-1929
TRIP12XP_376178.1配列番号542
543.KLLDKVQAYS9-18
GJA1NP_000156.1配列番号543
544.AYQHLFYLL955-963
IQGAP3NP_839943.2配列番号544
545.KYILLMDIIA148-157
TBX3NP_005987.2配列番号545
546.RYSSMAASF82-90
MAP17NP_005755.1配列番号546
547.SPRAAEPVQL397-406
CA9NP_001207.1配列番号547
548.IYTSSVNRL535-543
COPB2NP_004757.1配列番号548
549.LYPQFMFHL576-584
SEC23ANP_006355.2配列番号549
550.RYIPTAAAF415-423
SEC61A1NP_037468.1配列番号550
551.EYIVKKIPV237-245
EIF2S3NP_001406.1配列番号551
552.SRVEAVYVL13-21
PADI2NP_031391.1配列番号552
553.MPRGVVVTL851-859
HECTD1NP_056197.1配列番号553
554.LPKPPGRGV341-349
FBXL6NP_036294.1配列番号554
555.RLWGEPVNL1665-1673
USP9XNP_004643.2配列番号555
556.RLLDVLAPL14-22
COL18A1NP_569712.1配列番号556
557.LYILSSHDI474-482
FBXO24NP_277041.1配列番号557
558.TPMGPGRTV235-243
LGALS8NP_006490.3配列番号558
559.GPPGTGKTDVAVQI823-836
AQRNP_055506.1配列番号559
560.NEIEDTFRQF46-55
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561.EEIDLRSVGW315-324
UNC93B1NP_112192.2配列番号561
562.KYQKGFSLW245-253
TRAM1NP_055109.1配列番号562
563.VYPDGIRHI519-527
SF3B3NP_036558.2配列番号563
564.KFIDTTSKF366-374
RPL3LNP_005052.1配列番号564
565.FLDILNTLI1729-1737
DNAH8NP_001362.1配列番号565
566.KYITQGQLLQF200-210
ELOVL5NP_068586.1配列番号566
567.KYLSVQGQLF344-353
MTCH1NP_055156.1配列番号567
568.RYFDEPVEL355-363
ARFGAP3NP_055385.2配列番号568
569.KYDEIFYNL452-460
EHD2NP_055416.2配列番号569
570.SYIEHIFEI61-69
PEA15NP_003759.1配列番号570
571.KFIDPIYQVW572-581
RRN3NP_060897.2配列番号571
572.LGYTEGALLAL1370-1380
PCDH15NP_149045.2配列番号572
573.KYPSPFFVF2-10
DHX9NP_085077.1配列番号573
574.EYPDRIMNTF158-167
TUBB4NP_006077.1配列番号574
575.VYISEHEHF107-115
CLPTM1NP_001285.1配列番号575
576.KYFLKPEVL167-175
KIAA1363NP_065843.2配列番号576
【００３２】
ＪＹの配列
577.GPALGRSFL78-86
TNFSF7NP_001243.1配列番号577
対照ペプチドの配列
578.ELAGIGILTV26-35
ＭＬＡＮＡ（改変Ａ２７−＞Ｌ）NP_005502.1配列番号578
579.ILKEPVHGV896-904
polNP_057849.4配列番号579
580.GILGFVFTL58-66
記号は存在しない。遺伝子の種類：マトリックスタンパク質Ｍ１S14616配列番号580
581.NLVPMVATV495-503
記号は存在しない。遺伝子の種類：ｐｐ６５P06725配列番号581
582.LLDFVRFMGV284-293
記号は存在しない。遺伝子の種類：ＥＢＮＡ−６核タンパク質P03204配列番号582
583.GLCTLVAML259-267
記号は存在しない。遺伝子の種類：前初期トランス活性化因子NP_039857.1配列番号583
584.CLGGLLTMV294-302
記号は存在しない。遺伝子の種類：潜在性膜タンパク質２ AAB59844.1配列番号584
585.APRTVALTA9-17
HLA-DPB1NP_002112配列番号585
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号３０３に記載のアミノ酸配列からなる腫瘍関連ペプチドであって、該ペプチドが、ヒト主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）クラスＩの分子に結合する能力を示す、ペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のペプチドにおいて、１個のアミノ酸が、類似の化学的特徴をもつ別の１個のアミノ酸で置換されることを特徴とする、ＭＨＣクラスＩの分子に結合する能力を示すペプチド。
【請求項３】
請求項１または２に記載のペプチドにおいて、付加的な１個のアミノ酸がＮ末端および／またはＣ末端に存在することを特徴とする、ＭＨＣクラスＩの分子に結合する能力を示すペプチド。
【請求項４】
腫瘍疾患および／または腺腫性疾患の処置のための医薬品の製造のための、請求項１〜３のいずれか１つに記載の１種若しくはそれ以上のペプチドの使用。
【請求項５】
腫瘍疾患および／または腺腫性疾患が、腎臓、乳房、膵臓、胃、脳、膀胱、精巣の癌および／または神経系の腫瘍疾患であることを特徴とする、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
ペプチドがアジュバントと共に使用されることを特徴とする、請求項４または５に記載の使用。
【請求項７】
抗原提示細胞に結合されたペプチドが使用されることを特徴とする、請求項４または５に記載の使用。
【請求項８】
ｉｎ ｖｉｔｒｏで白血球またはＴリンパ球を同定するための、請求項１〜３のいずれか１つに記載のペプチドの使用。
【請求項９】
患者から得られた試料を用いて、腫瘍疾患の治療経過を評価するための、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
ｉｎ ｖｉｔｒｏで抗体を製造するための、請求項１〜３のいずれか１つに記載のペプチドの使用。
【請求項１１】
請求項１〜３のいずれか１つに記載の１種若しくはそれ以上のペプチドを含有する製薬学的組成物。
【請求項１２】
請求項１〜３のいずれか１つに記載の単独のペプチドをコードする核酸分子。
【請求項１３】
請求項１２に記載の核酸分子を包含するベクター。
【請求項１４】
請求項１２に記載の核酸分子を使用して、または請求項１３に記載のベクターを使用して、請求項１〜３のいずれか１つに記載のペプチドを産生するように遺伝的に組換えられた細胞。
【請求項１】
配列表の配列番号３０３に記載のアミノ酸配列からなる腫瘍関連ペプチドであって、該ペプチドが、ヒト主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）クラスＩの分子に結合する能力を示す、ペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のペプチドにおいて、１個のアミノ酸が、類似の化学的特徴をもつ別の１個のアミノ酸で置換されることを特徴とする、ＭＨＣクラスＩの分子に結合する能力を示すペプチド。
【請求項３】
請求項１または２に記載のペプチドにおいて、付加的な１個のアミノ酸がＮ末端および／またはＣ末端に存在することを特徴とする、ＭＨＣクラスＩの分子に結合する能力を示すペプチド。
【請求項４】
腫瘍疾患および／または腺腫性疾患の処置のための医薬品の製造のための、請求項１〜３のいずれか１つに記載の１種若しくはそれ以上のペプチドの使用。
【請求項５】
腫瘍疾患および／または腺腫性疾患が、腎臓、乳房、膵臓、胃、脳、膀胱、精巣の癌および／または神経系の腫瘍疾患であることを特徴とする、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
ペプチドがアジュバントと共に使用されることを特徴とする、請求項４または５に記載の使用。
【請求項７】
抗原提示細胞に結合されたペプチドが使用されることを特徴とする、請求項４または５に記載の使用。
【請求項８】
ｉｎ ｖｉｔｒｏで白血球またはＴリンパ球を同定するための、請求項１〜３のいずれか１つに記載のペプチドの使用。
【請求項９】
患者から得られた試料を用いて、腫瘍疾患の治療経過を評価するための、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
ｉｎ ｖｉｔｒｏで抗体を製造するための、請求項１〜３のいずれか１つに記載のペプチドの使用。
【請求項１１】
請求項１〜３のいずれか１つに記載の１種若しくはそれ以上のペプチドを含有する製薬学的組成物。
【請求項１２】
請求項１〜３のいずれか１つに記載の単独のペプチドをコードする核酸分子。
【請求項１３】
請求項１２に記載の核酸分子を包含するベクター。
【請求項１４】
請求項１２に記載の核酸分子を使用して、または請求項１３に記載のベクターを使用して、請求項１〜３のいずれか１つに記載のペプチドを産生するように遺伝的に組換えられた細胞。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１１−２２４００７（Ｐ２０１１−２２４００７Ａ）
【公開日】平成２３年１１月１０日（２０１１．１１．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１０４０３８（Ｐ２０１１−１０４０３８）
【出願日】平成２３年５月９日（２０１１．５．９）
【分割の表示】特願２００７−５１３７９０（Ｐ２００７−５１３７９０）の分割
【原出願日】平成１７年５月２４日（２００５．５．２４）
【出願人】（５０６２５８０７３）イマティクス バイオテクノロジーズ ゲーエムベーハー (24)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１１月１０日（２０１１．１１．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年５月９日（２０１１．５．９）
【分割の表示】特願２００７−５１３７９０（Ｐ２００７−５１３７９０）の分割
【原出願日】平成１７年５月２４日（２００５．５．２４）
【出願人】（５０６２５８０７３）イマティクス バイオテクノロジーズ ゲーエムベーハー (24)
【Ｆターム（参考）】
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