ＭＩＦ分泌抑制剤
【課題】MIF分泌抑制剤の提供
【解決手段】ヒメジョオン又はその抽出物を含むマクロファージ遊走阻止因子分泌抑制剤
【解決手段】ヒメジョオン又はその抽出物を含むマクロファージ遊走阻止因子分泌抑制剤
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マクロファージ遊走阻止因子（MIF）分泌抑制剤、炎症性疾患の改善剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
マクロファージ遊走阻止因子（以下、MIFと記載する）は、炎症・免疫のメディエーターの１つであり、マクロファージの遊走を制御し、炎症部位にマクロファージを集め、貪食能を高める液性因子である。MIFは慢性関節リウマチ(非特許文献１：Expert Opin Ther Targets, 7, 2, 153-164, 2003)、腎炎(非特許文献２：Expert Opin Ther Targets, 7, 2, 153-164, 2003)、アトピー性皮膚炎(非特許文献３：Biochem Biophys res Commun, 240, 11, 173-8, 1997)、乾癬（非特許文献４：B J Dermatol, 141, 1061-66, 1999）、潰瘍性大腸炎、敗血症、接触性皮膚炎(非特許文献５：Eur J Immunol, 33, 1478-87, 2003)、紫外線による炎症(非特許文献６：J Invest Dermatol, 112, 2, 210-15, 1999)、遅延性アレルギー(非特許文献７：Pro Natl Acad Sci USA, 93, 7849-54, 1996)などの急性・慢性炎症疾患(J End, 179, 15-23, 2003)、関節炎、移植片拒絶反応、腫瘍成長、血管新生、貧血、脳脊髄炎等の炎症性疾患の病理過程に関与しており、MIFを阻害することにより、これら炎症性疾患を軽減させることが期待される。
MIFの活性阻害剤は種々開発されているが（特許文献１：特表２００３−５１３０６５号公報、特許文献２：特表２００５−５００２６６号公報、特許文献３：特表２００６−５１７９７７号公報）、MIFの分泌抑制剤は知られていない。
ヒメジョオンは伝承的に消化促進、急性伝染性肝炎の治療、利尿、結石の治療に用いられてきた。また、タンパクの糖化抑制と抗酸化作用が認められている（非特許文献８：J. Agric. Food Chem. 2003 Mar 12;51(6):1586-91）。しかし、ヒメジョオン抽出物による
MIFの分泌抑制効果は知られていない。
【０００３】
【特許文献１】特表２００３−５１３０６５号公報
【特許文献２】特表２００５−５００２６６号公報
【特許文献３】特表２００６−５１７９７７号公報
【非特許文献１】Expert Opin Ther Targets, 7, 2, 153-164, 2003
【非特許文献２】Expert Opin Ther Targets, 7, 2, 153-164, 2003
【非特許文献３】Biochem Biophys res Commun, 240, 11, 173-8, 1997
【非特許文献４】B J Dermatol, 141, 1061-66, 1999
【非特許文献５】Eur J Immunol, 33, 1478-87, 2003
【非特許文献６】J Invest Dermatol, 112, 2, 210-15, 1999
【非特許文献７】Pro Natl Acad Sci USA, 93, 7849-54, 1996
【非特許文献８】J. Agric. Food Chem. 2003 Mar 12;51(6):1586-91
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明はMIF分泌抑制剤の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
ヒメジョオン（Erigeron annuus）抽出物が、マクロファージ遊走阻止因子分泌抑制作用を有することを見出し、本発明を完成させた。
本発明の主な構成は、次のとおりである。
１．ヒメジョオン又はその抽出物を含むマクロファージ遊走阻止因子分泌抑制剤。
２．ヒメジョオン抽出物が、エタノール抽出物又は水抽出物であることを特徴とする１．記載のマクロファージ遊走阻止因子分泌抑制剤。
３．１．又は２．記載のマクロファージ遊走阻止因子分泌抑制剤を含む皮膚外用剤。
４．ヒメジョオン又はその抽出物を含む炎症性疾患の改善剤。
５．ヒメジョオン又はその抽出物を含む皮膚の炎症性疾患の改善剤。
【発明の効果】
【０００６】
本発明により、MIF異常分泌が認められるアトピー性皮膚炎への新たな治療剤または予防剤の提供が可能となった。
アトピー性皮膚炎以外にMIFの異常分泌や関与が示唆されている、乾癬や紫外線による皮膚炎症、血管腫、蕁麻疹、敗血症、呼吸器炎症、潰瘍性大腸炎、慢性関節リウマチ、腎炎、接触性皮膚炎、遅延性アレルギーなどの急性・慢性炎症疾患、関節炎、移植片拒絶反応、腫瘍成長、血管新生、貧血、脳脊髄炎、その他菌感染による炎症への治療や予防にも効果を期待できる。MIF分泌抑制剤を皮膚外用剤として局所に処方することにより、マクロファージ遊走阻止因子の働きを抑えて、炎症部位におけるマクロファージの機能を抑制することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明で使用されるヒメジョオン（姫女苑）（学名 Erigeron annuus、別名 ヤナギバヒメギク）は、キク科 ムカシヨモギ属の１〜２年草で、北アメリカ原産の帰化植物である。通常、秋に発芽し、そのまま越冬して翌年の初夏から夏に開花する。
【０００８】
ヒメジョオン抽出物としては、ヒメジョオンの全草、あるいは花、茎、葉、根をそのまま搾汁、粉砕し、あるいは乾燥させた後に粉砕して、水あるいはエタノール等のアルコール、エーテル、アセトン、1,3−ブチレングリコール、1,2−ペンタンジオール、プロピレングリコール、酢酸エチルなどの有機溶媒により抽出した粗抽出物、および粗抽出物を分配抽出やカラムクロマトなどの各種クロマトグラフィーなどで段階的に精製して得られた抽出物画分を含む。これらは単独で用いても良く、また２種以上混合して用いても良い。
ヒメジョオンの全草、あるいは花、茎、葉、根を生のまま抽出操作に供しても良いが、細切、乾燥、粉砕等の処理を行なった後、抽出を行なう方が効率がよい。抽出は抽出溶媒に浸漬して行なうことができる。抽出効率を上げる為に、抽出溶媒を攪拌したり、抽出溶媒中で破砕均一化したり、抽出溶媒中で圧力をかけることもできる。抽出温度は５〜100℃程度が適切であり、抽出時間は５分〜１ヶ月程度である。これらの条件は適宜設定することができる。
上記ヒメジョオン抽出物はそのまま、また、水、エタノール等の有機溶媒に懸濁させた状態で、MIF分泌抑制剤、炎症性疾患の改善剤、特に皮膚の炎症性疾患の改善剤として使用できる。また、必要に応じて抽出溶媒を留去し、その乾燥物を用いてもよい。
【０００９】
ヒメジョオン抽出物は、乾燥物として、0.0001〜1000mg／日の範囲で適用することができ、さらに、この範囲に限らず、対象、適用形態、症状に応じてその量を適宜設定することができる。
本発明のヒメジョオン抽出物の配合量としては、0.0001〜10重量％程度が好ましいが、用いる剤型、使用対象等の様々の条件に応じて、100重量％までの広範囲でその配合量を適宜設定できる。
【００１０】
本発明の製剤は、経口で又は非経口で投与することができる。
本発明の製剤は、例えば水溶液、油剤、乳液、懸濁液等の液剤、ゲル、クリーム等の半固形剤、粉末、顆粒、カプセル、マイクロカプセル、固形等の固形剤の形態で適用可能である。従来から公知の方法でこれらの形態に調製し、ローション剤、乳剤、ゲル剤、クリーム剤、軟膏、硬膏、ハップ剤、エアゾル剤、坐剤、注射剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤、丸剤、シロップ剤、トローチ剤等の種々の剤型とすることができる。これらを身体に塗布、貼付、噴霧、飲用等により適用することができる。特にこれら剤型の中で、皮膚外用剤であるローション剤、乳剤、クリーム剤、軟膏剤、硬膏剤、ハップ剤、エアゾル剤等が適している。
通常、医薬において使用される製剤化方法にしたがって、これらの剤型、組成物として製造することができる。
以下、本発明を詳細に説明する。
【実施例１】
【００１１】
ヒメジョオンエタノール抽出物の調製
ヒメジョオン全草乾燥物100ｇを６Ｌの99.5％エタノールに１週間浸漬し、得られたエタノール抽出液の溶媒を留去して、２ｇのヒメジョオン抽出物を得た。
【００１２】
ヒメジョオンエタノール抽出物のMIF分泌抑制試験
１．ケラチノサイトを用いたUVB誘導性MIF分泌抑制試験
MIFは皮膚の構成細胞の一つであるケラチノサイトで強く発現することが知られている。そして、ケラチノサイトにUVBを照射することにより、MIFの分泌が促進されることが知られている(J Invest Dermatol, 112, 2, 210-15, 1999)。そこで、ケラチノサイトにUVBを照射したときのMIFの分泌を、ヒメジョオンエタノール抽出物が抑制するか調べた。 ヒトケラチノサイトを7.0×104cells/cm2でφ35mm dishに播種し、KBM・KGM培地（LONZA社製）で５日間培養した。ヒメジョオンエタノール抽出物の入ったKBM・KGM培地（BPE(-)）に交換し、１晩培養後、HANKS(-)存在下で、UVBを1.0 W/m2、20 mJ/m2照射し、ヒメジョオンエタノール抽出物の入ったKBM・KGM培地（BPE(-)）に交換し、６時間培養した。培養上清を回収し、hMIF ELISA kitを用いて、定法に従い上清中MIF量を測定し、MIF分泌量を算出した。さらに、細胞をCell Lysis Bufferで溶解し、溶解液中の蛋白質をプロテインアッセイキットで測定し、dishあたりの蛋白量を算出した。ヒメジョオンエタノール抽出物無添加、UVB(-)処理を100％とし、ヒメジョオンエタノール抽出物添加時の単位蛋白質当たりのMIF分泌率の比較を行った。結果を表１、図１に示す。なお、本試験におけるコントロールとヒメジョオンエタノール抽出物添加との細胞のタンパク質量を比較した結果、両者におけるタンパク質量に差は認められず、本試験系においてヒメジョオンの細胞毒性がないことを確認した。
【００１３】
【表１】
【００１４】
ケラチノサイトにヒメジョオンエタノール抽出物を添加することにより、MIFの分泌が顕著に抑制された。MIFの発現が増加し、症状が悪化することが知られている紫外線による皮膚障害・炎症、アトピー性皮膚炎、乾癬、接触性皮膚炎等の皮膚の炎症性疾患に対して改善効果が期待できる。
【００１５】
２．THP-1細胞を用いたLPS誘導性MIF分泌抑制試験
菌感染や異物などの刺激によりマクロファージからのMIF分泌が促進されることが知られている。マクロファージのモデル細胞であるヒト単球性白血病細胞であるTHP-1細胞は、菌感染モデルのLPSの刺激により、MIFを分泌する (FEBS Let 551, 78-88, 2003)。そこで、LPSで刺激したTHP-1細胞のMIF分泌をヒメジョオンエタノール抽出物が抑制するか調べた。
【００１６】
THP-1細胞を１％血清・RPMI培地中で３時間培養後、同培地で1×106cells/well(12well plate)で播種し、ヒメジョオンエタノール抽出物を添加した。ヒメジョオンエタノール抽出物添加45分後に、LPSを終濃度10μg/mlで添加し、４時間培養した。培養後に400×gで遠心し、細胞上清を回収し、hMIF ELISA kitを用いて、定法に従い上清中MIF量を測定し、MIF分泌量を算出した。ヒメジョオンエタノール抽出物無添加、LPS(-)処理を100％とし、ヒメジョオンエタノール抽出物添加時のMIF分泌率の比較を行った。結果を表２、図２に示す。
【００１７】
【表２】
【実施例２】
【００１８】
ヒメジョオン熱水抽出物の調製
ヒメジョオン全草乾燥物100ｇを100℃の精製水6Lに10分浸漬し、得られた熱水抽出液の溶媒を留去して、２ｇのヒメジョオン熱水抽出物を得た。
【００１９】
ヒメジョオン抽出物のMIF分泌抑制試験
１．ケラチノサイトを用いたUVB誘導性MIF分泌抑制試験
ヒトケラチノサイトを7.0×104cells/cm2でφ35mm dishに播種し、KBM・KGM培地（LONZA社製）で５日間培養した。ヒメジョオン熱水抽出物の入ったKBM・KGM培地（BPE(-)）に交換し、１晩培養後、HANKS(-)存在下で、UVBを1.0 W/m2、20 mJ/m2照射し、ヒメジョオン熱水抽出物の入ったKBM・KGM培地（BPE(-)）に交換し、６時間培養した。培養上清を回収し、hMIF ELISA kitを用いて、定法に従い上清中MIF量を測定し、MIF分泌量を算出した。さらに、細胞をCell Lysis Bufferで溶解し、溶解液中の蛋白質をプロテインアッセイキットで測定し、dishあたりの蛋白量を算出した。ヒメジョオン熱水抽出物無添加、UVB(-)処理を100％とし、ヒメジョオン熱水抽出物添加時の単位蛋白質当たりのMIF分泌率の比較を行った。結果を表３に示し、それをグラフ化して図３とした。なお、本試験におけるコントロールとヒメジョオン熱水抽出物添加との細胞のタンパク質量を比較した結果、両者におけるタンパク質量に差は認められず、本試験系においてヒメジョオンの細胞毒性がないことを確認した。
【００２０】
【表３】
【００２１】
ケラチノサイトにヒメジョオン熱水抽出物を添加することにより、MIFの分泌が顕著に抑制された。MIFの発現が増加し、症状が悪化することが知られている紫外線による皮膚障害・炎症、アトピー性皮膚炎、乾癬、接触性皮膚炎等の皮膚の炎症性疾患に対して改善効果が期待できる。
【００２２】
２．THP-1細胞を用いたLPS誘導性MIF分泌抑制試験
THP-1細胞を１％血清・RPMI培地中で３時間培養後、同培地で1×106cells/well(12well plate)で播種し、ヒメジョオン熱水抽出物を添加した。ヒメジョオン熱水抽出物添加45分後に、LPSを終濃度10μg/mlで添加し、４時間培養した。培養後に400×gで遠心し、細胞上清を回収し、hMIF ELISA kitを用いて、定法に従い上清中MIF量を測定し、MIF分泌量を算出した。ヒメジョオン熱水抽出物無添加、LPS(-)処理を100％とし、ヒメジョオン熱水抽出物添加時のMIF分泌率の比較を行った。結果を表４に示し、それをグラフ化して図４とした。
【００２３】
【表４】
【００２４】
THP-1細胞にヒメジョオン抽出物を添加することにより、MIFの分泌が抑制された。ニキビ、敗血症、などの菌感染による炎症や、浸潤性炎症、アレルギー、慢性関節リウマチなどの慢性炎症疾患の予防や改善が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ケラチノサイトを用いたヒメジョオンエタノール抽出物のUVB誘導性MIF分泌抑制試験結果を示すグラフ。
【図２】THP-1細胞を用いたヒメジョオンエタノール抽出物のLPS誘導性MIF分泌抑制試験結果を示すグラフ。
【図３】ケラチノサイトを用いたヒメジョオン熱水抽出物のUVB誘導性MIF分泌抑制試験結果を示すグラフ。
【図４】THP-1細胞を用いたヒメジョオン熱水抽出物のLPS誘導性MIF分泌抑制試験結果を示すグラフ。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マクロファージ遊走阻止因子（MIF）分泌抑制剤、炎症性疾患の改善剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
マクロファージ遊走阻止因子（以下、MIFと記載する）は、炎症・免疫のメディエーターの１つであり、マクロファージの遊走を制御し、炎症部位にマクロファージを集め、貪食能を高める液性因子である。MIFは慢性関節リウマチ(非特許文献１：Expert Opin Ther Targets, 7, 2, 153-164, 2003)、腎炎(非特許文献２：Expert Opin Ther Targets, 7, 2, 153-164, 2003)、アトピー性皮膚炎(非特許文献３：Biochem Biophys res Commun, 240, 11, 173-8, 1997)、乾癬（非特許文献４：B J Dermatol, 141, 1061-66, 1999）、潰瘍性大腸炎、敗血症、接触性皮膚炎(非特許文献５：Eur J Immunol, 33, 1478-87, 2003)、紫外線による炎症(非特許文献６：J Invest Dermatol, 112, 2, 210-15, 1999)、遅延性アレルギー(非特許文献７：Pro Natl Acad Sci USA, 93, 7849-54, 1996)などの急性・慢性炎症疾患(J End, 179, 15-23, 2003)、関節炎、移植片拒絶反応、腫瘍成長、血管新生、貧血、脳脊髄炎等の炎症性疾患の病理過程に関与しており、MIFを阻害することにより、これら炎症性疾患を軽減させることが期待される。
MIFの活性阻害剤は種々開発されているが（特許文献１：特表２００３−５１３０６５号公報、特許文献２：特表２００５−５００２６６号公報、特許文献３：特表２００６−５１７９７７号公報）、MIFの分泌抑制剤は知られていない。
ヒメジョオンは伝承的に消化促進、急性伝染性肝炎の治療、利尿、結石の治療に用いられてきた。また、タンパクの糖化抑制と抗酸化作用が認められている（非特許文献８：J. Agric. Food Chem. 2003 Mar 12;51(6):1586-91）。しかし、ヒメジョオン抽出物による
MIFの分泌抑制効果は知られていない。
【０００３】
【特許文献１】特表２００３−５１３０６５号公報
【特許文献２】特表２００５−５００２６６号公報
【特許文献３】特表２００６−５１７９７７号公報
【非特許文献１】Expert Opin Ther Targets, 7, 2, 153-164, 2003
【非特許文献２】Expert Opin Ther Targets, 7, 2, 153-164, 2003
【非特許文献３】Biochem Biophys res Commun, 240, 11, 173-8, 1997
【非特許文献４】B J Dermatol, 141, 1061-66, 1999
【非特許文献５】Eur J Immunol, 33, 1478-87, 2003
【非特許文献６】J Invest Dermatol, 112, 2, 210-15, 1999
【非特許文献７】Pro Natl Acad Sci USA, 93, 7849-54, 1996
【非特許文献８】J. Agric. Food Chem. 2003 Mar 12;51(6):1586-91
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明はMIF分泌抑制剤の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
ヒメジョオン（Erigeron annuus）抽出物が、マクロファージ遊走阻止因子分泌抑制作用を有することを見出し、本発明を完成させた。
本発明の主な構成は、次のとおりである。
１．ヒメジョオン又はその抽出物を含むマクロファージ遊走阻止因子分泌抑制剤。
２．ヒメジョオン抽出物が、エタノール抽出物又は水抽出物であることを特徴とする１．記載のマクロファージ遊走阻止因子分泌抑制剤。
３．１．又は２．記載のマクロファージ遊走阻止因子分泌抑制剤を含む皮膚外用剤。
４．ヒメジョオン又はその抽出物を含む炎症性疾患の改善剤。
５．ヒメジョオン又はその抽出物を含む皮膚の炎症性疾患の改善剤。
【発明の効果】
【０００６】
本発明により、MIF異常分泌が認められるアトピー性皮膚炎への新たな治療剤または予防剤の提供が可能となった。
アトピー性皮膚炎以外にMIFの異常分泌や関与が示唆されている、乾癬や紫外線による皮膚炎症、血管腫、蕁麻疹、敗血症、呼吸器炎症、潰瘍性大腸炎、慢性関節リウマチ、腎炎、接触性皮膚炎、遅延性アレルギーなどの急性・慢性炎症疾患、関節炎、移植片拒絶反応、腫瘍成長、血管新生、貧血、脳脊髄炎、その他菌感染による炎症への治療や予防にも効果を期待できる。MIF分泌抑制剤を皮膚外用剤として局所に処方することにより、マクロファージ遊走阻止因子の働きを抑えて、炎症部位におけるマクロファージの機能を抑制することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明で使用されるヒメジョオン（姫女苑）（学名 Erigeron annuus、別名 ヤナギバヒメギク）は、キク科 ムカシヨモギ属の１〜２年草で、北アメリカ原産の帰化植物である。通常、秋に発芽し、そのまま越冬して翌年の初夏から夏に開花する。
【０００８】
ヒメジョオン抽出物としては、ヒメジョオンの全草、あるいは花、茎、葉、根をそのまま搾汁、粉砕し、あるいは乾燥させた後に粉砕して、水あるいはエタノール等のアルコール、エーテル、アセトン、1,3−ブチレングリコール、1,2−ペンタンジオール、プロピレングリコール、酢酸エチルなどの有機溶媒により抽出した粗抽出物、および粗抽出物を分配抽出やカラムクロマトなどの各種クロマトグラフィーなどで段階的に精製して得られた抽出物画分を含む。これらは単独で用いても良く、また２種以上混合して用いても良い。
ヒメジョオンの全草、あるいは花、茎、葉、根を生のまま抽出操作に供しても良いが、細切、乾燥、粉砕等の処理を行なった後、抽出を行なう方が効率がよい。抽出は抽出溶媒に浸漬して行なうことができる。抽出効率を上げる為に、抽出溶媒を攪拌したり、抽出溶媒中で破砕均一化したり、抽出溶媒中で圧力をかけることもできる。抽出温度は５〜100℃程度が適切であり、抽出時間は５分〜１ヶ月程度である。これらの条件は適宜設定することができる。
上記ヒメジョオン抽出物はそのまま、また、水、エタノール等の有機溶媒に懸濁させた状態で、MIF分泌抑制剤、炎症性疾患の改善剤、特に皮膚の炎症性疾患の改善剤として使用できる。また、必要に応じて抽出溶媒を留去し、その乾燥物を用いてもよい。
【０００９】
ヒメジョオン抽出物は、乾燥物として、0.0001〜1000mg／日の範囲で適用することができ、さらに、この範囲に限らず、対象、適用形態、症状に応じてその量を適宜設定することができる。
本発明のヒメジョオン抽出物の配合量としては、0.0001〜10重量％程度が好ましいが、用いる剤型、使用対象等の様々の条件に応じて、100重量％までの広範囲でその配合量を適宜設定できる。
【００１０】
本発明の製剤は、経口で又は非経口で投与することができる。
本発明の製剤は、例えば水溶液、油剤、乳液、懸濁液等の液剤、ゲル、クリーム等の半固形剤、粉末、顆粒、カプセル、マイクロカプセル、固形等の固形剤の形態で適用可能である。従来から公知の方法でこれらの形態に調製し、ローション剤、乳剤、ゲル剤、クリーム剤、軟膏、硬膏、ハップ剤、エアゾル剤、坐剤、注射剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤、丸剤、シロップ剤、トローチ剤等の種々の剤型とすることができる。これらを身体に塗布、貼付、噴霧、飲用等により適用することができる。特にこれら剤型の中で、皮膚外用剤であるローション剤、乳剤、クリーム剤、軟膏剤、硬膏剤、ハップ剤、エアゾル剤等が適している。
通常、医薬において使用される製剤化方法にしたがって、これらの剤型、組成物として製造することができる。
以下、本発明を詳細に説明する。
【実施例１】
【００１１】
ヒメジョオンエタノール抽出物の調製
ヒメジョオン全草乾燥物100ｇを６Ｌの99.5％エタノールに１週間浸漬し、得られたエタノール抽出液の溶媒を留去して、２ｇのヒメジョオン抽出物を得た。
【００１２】
ヒメジョオンエタノール抽出物のMIF分泌抑制試験
１．ケラチノサイトを用いたUVB誘導性MIF分泌抑制試験
MIFは皮膚の構成細胞の一つであるケラチノサイトで強く発現することが知られている。そして、ケラチノサイトにUVBを照射することにより、MIFの分泌が促進されることが知られている(J Invest Dermatol, 112, 2, 210-15, 1999)。そこで、ケラチノサイトにUVBを照射したときのMIFの分泌を、ヒメジョオンエタノール抽出物が抑制するか調べた。 ヒトケラチノサイトを7.0×104cells/cm2でφ35mm dishに播種し、KBM・KGM培地（LONZA社製）で５日間培養した。ヒメジョオンエタノール抽出物の入ったKBM・KGM培地（BPE(-)）に交換し、１晩培養後、HANKS(-)存在下で、UVBを1.0 W/m2、20 mJ/m2照射し、ヒメジョオンエタノール抽出物の入ったKBM・KGM培地（BPE(-)）に交換し、６時間培養した。培養上清を回収し、hMIF ELISA kitを用いて、定法に従い上清中MIF量を測定し、MIF分泌量を算出した。さらに、細胞をCell Lysis Bufferで溶解し、溶解液中の蛋白質をプロテインアッセイキットで測定し、dishあたりの蛋白量を算出した。ヒメジョオンエタノール抽出物無添加、UVB(-)処理を100％とし、ヒメジョオンエタノール抽出物添加時の単位蛋白質当たりのMIF分泌率の比較を行った。結果を表１、図１に示す。なお、本試験におけるコントロールとヒメジョオンエタノール抽出物添加との細胞のタンパク質量を比較した結果、両者におけるタンパク質量に差は認められず、本試験系においてヒメジョオンの細胞毒性がないことを確認した。
【００１３】
【表１】
【００１４】
ケラチノサイトにヒメジョオンエタノール抽出物を添加することにより、MIFの分泌が顕著に抑制された。MIFの発現が増加し、症状が悪化することが知られている紫外線による皮膚障害・炎症、アトピー性皮膚炎、乾癬、接触性皮膚炎等の皮膚の炎症性疾患に対して改善効果が期待できる。
【００１５】
２．THP-1細胞を用いたLPS誘導性MIF分泌抑制試験
菌感染や異物などの刺激によりマクロファージからのMIF分泌が促進されることが知られている。マクロファージのモデル細胞であるヒト単球性白血病細胞であるTHP-1細胞は、菌感染モデルのLPSの刺激により、MIFを分泌する (FEBS Let 551, 78-88, 2003)。そこで、LPSで刺激したTHP-1細胞のMIF分泌をヒメジョオンエタノール抽出物が抑制するか調べた。
【００１６】
THP-1細胞を１％血清・RPMI培地中で３時間培養後、同培地で1×106cells/well(12well plate)で播種し、ヒメジョオンエタノール抽出物を添加した。ヒメジョオンエタノール抽出物添加45分後に、LPSを終濃度10μg/mlで添加し、４時間培養した。培養後に400×gで遠心し、細胞上清を回収し、hMIF ELISA kitを用いて、定法に従い上清中MIF量を測定し、MIF分泌量を算出した。ヒメジョオンエタノール抽出物無添加、LPS(-)処理を100％とし、ヒメジョオンエタノール抽出物添加時のMIF分泌率の比較を行った。結果を表２、図２に示す。
【００１７】
【表２】
【実施例２】
【００１８】
ヒメジョオン熱水抽出物の調製
ヒメジョオン全草乾燥物100ｇを100℃の精製水6Lに10分浸漬し、得られた熱水抽出液の溶媒を留去して、２ｇのヒメジョオン熱水抽出物を得た。
【００１９】
ヒメジョオン抽出物のMIF分泌抑制試験
１．ケラチノサイトを用いたUVB誘導性MIF分泌抑制試験
ヒトケラチノサイトを7.0×104cells/cm2でφ35mm dishに播種し、KBM・KGM培地（LONZA社製）で５日間培養した。ヒメジョオン熱水抽出物の入ったKBM・KGM培地（BPE(-)）に交換し、１晩培養後、HANKS(-)存在下で、UVBを1.0 W/m2、20 mJ/m2照射し、ヒメジョオン熱水抽出物の入ったKBM・KGM培地（BPE(-)）に交換し、６時間培養した。培養上清を回収し、hMIF ELISA kitを用いて、定法に従い上清中MIF量を測定し、MIF分泌量を算出した。さらに、細胞をCell Lysis Bufferで溶解し、溶解液中の蛋白質をプロテインアッセイキットで測定し、dishあたりの蛋白量を算出した。ヒメジョオン熱水抽出物無添加、UVB(-)処理を100％とし、ヒメジョオン熱水抽出物添加時の単位蛋白質当たりのMIF分泌率の比較を行った。結果を表３に示し、それをグラフ化して図３とした。なお、本試験におけるコントロールとヒメジョオン熱水抽出物添加との細胞のタンパク質量を比較した結果、両者におけるタンパク質量に差は認められず、本試験系においてヒメジョオンの細胞毒性がないことを確認した。
【００２０】
【表３】
【００２１】
ケラチノサイトにヒメジョオン熱水抽出物を添加することにより、MIFの分泌が顕著に抑制された。MIFの発現が増加し、症状が悪化することが知られている紫外線による皮膚障害・炎症、アトピー性皮膚炎、乾癬、接触性皮膚炎等の皮膚の炎症性疾患に対して改善効果が期待できる。
【００２２】
２．THP-1細胞を用いたLPS誘導性MIF分泌抑制試験
THP-1細胞を１％血清・RPMI培地中で３時間培養後、同培地で1×106cells/well(12well plate)で播種し、ヒメジョオン熱水抽出物を添加した。ヒメジョオン熱水抽出物添加45分後に、LPSを終濃度10μg/mlで添加し、４時間培養した。培養後に400×gで遠心し、細胞上清を回収し、hMIF ELISA kitを用いて、定法に従い上清中MIF量を測定し、MIF分泌量を算出した。ヒメジョオン熱水抽出物無添加、LPS(-)処理を100％とし、ヒメジョオン熱水抽出物添加時のMIF分泌率の比較を行った。結果を表４に示し、それをグラフ化して図４とした。
【００２３】
【表４】
【００２４】
THP-1細胞にヒメジョオン抽出物を添加することにより、MIFの分泌が抑制された。ニキビ、敗血症、などの菌感染による炎症や、浸潤性炎症、アレルギー、慢性関節リウマチなどの慢性炎症疾患の予防や改善が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ケラチノサイトを用いたヒメジョオンエタノール抽出物のUVB誘導性MIF分泌抑制試験結果を示すグラフ。
【図２】THP-1細胞を用いたヒメジョオンエタノール抽出物のLPS誘導性MIF分泌抑制試験結果を示すグラフ。
【図３】ケラチノサイトを用いたヒメジョオン熱水抽出物のUVB誘導性MIF分泌抑制試験結果を示すグラフ。
【図４】THP-1細胞を用いたヒメジョオン熱水抽出物のLPS誘導性MIF分泌抑制試験結果を示すグラフ。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒメジョオン又はその抽出物を含むマクロファージ遊走阻止因子分泌抑制剤。
【請求項２】
ヒメジョオン抽出物が、エタノール抽出物又は水抽出物であることを特徴とする請求項１記載のマクロファージ遊走阻止因子分泌抑制剤。
【請求項３】
請求項１又は２記載のマクロファージ遊走阻止因子分泌抑制剤を含む皮膚外用剤。
【請求項４】
ヒメジョオン又はその抽出物を含む炎症性疾患の改善剤。
【請求項５】
ヒメジョオン又はその抽出物を含む皮膚の炎症性疾患の改善剤。
【請求項１】
ヒメジョオン又はその抽出物を含むマクロファージ遊走阻止因子分泌抑制剤。
【請求項２】
ヒメジョオン抽出物が、エタノール抽出物又は水抽出物であることを特徴とする請求項１記載のマクロファージ遊走阻止因子分泌抑制剤。
【請求項３】
請求項１又は２記載のマクロファージ遊走阻止因子分泌抑制剤を含む皮膚外用剤。
【請求項４】
ヒメジョオン又はその抽出物を含む炎症性疾患の改善剤。
【請求項５】
ヒメジョオン又はその抽出物を含む皮膚の炎症性疾患の改善剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００９−２０３２２１（Ｐ２００９−２０３２２１Ａ）
【公開日】平成２１年９月１０日（２００９．９．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２８７９９１（Ｐ２００８−２８７９９１）
【出願日】平成２０年１１月１０日（２００８．１１．１０）
【出願人】（５９３１０６９１８）株式会社ファンケル (310)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年９月１０日（２００９．９．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１１月１０日（２００８．１１．１０）
【出願人】（５９３１０６９１８）株式会社ファンケル (310)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]