ＭＬＬ−ＡＦ４のＲＮＡｉ調節およびその使用方法
【課題】本研究において出願人は、ｔ（４；１１）細胞内におけるＭＬＬ−ＡＦ４遺伝子発現を特異的に阻害するためにＲＮＡｉを用いた。出願人は、融合転写ＭＬＬ−ＡＦ４の枯渇がクローン形成能力および増殖を抑制し、ｔ（４；１１）陽性白血病細胞内においてアポトーシスを誘導し、ＳＣＩＤマウス異種移植モデル内においてかかる細胞の生着を危うくすることを明らかにする。
【解決手段】本発明は、ＭＬＬ−ＡＦ４融合遺伝子の発現を調節するための組成物及び方法に関し、より詳細には、化学的に修飾されたオリゴヌクレオチドによりＭＬＬ−ＡＦ４の下方制御を調節する方法に関する。
【解決手段】本発明は、ＭＬＬ−ＡＦ４融合遺伝子の発現を調節するための組成物及び方法に関し、より詳細には、化学的に修飾されたオリゴヌクレオチドによりＭＬＬ−ＡＦ４の下方制御を調節する方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＭＬＬ−ＡＦ４の発現を調節するための組成物および方法に関するものであ
り、より詳細には、化学的に修飾されたオリゴヌクレオチドによるＭＬＬ−ＡＦ４の下方
制御に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
本願は、２００４年１２月１４日出願の米国仮特許出願第６０／６３５，９３６号、２
００５年４月５日出願の米国仮特許出願第６０／６６８，３９２号および２００５年７月
１２日出願の米国仮特許出願第６０／６９８，４１４号の利益を主張する。３つすべての
仮特許出願は、参照により全体として本明細書に援用される。
【０００３】
種々の異なる白血病に関して、融合遺伝子を発生させる染色体異常が観察されている（
非特許文献１）。仮に、これらの発癌遺伝子が白血病の表現型を維持するために重要であ
れば、かかる腫瘍特異性の発癌遺伝子は、強い特異性を有する新たな治療アプローチのた
めの有望な標的となるはずである。しかしながら、白血病の進行とは対照的に、白血病の
持続に関する中心的役割は、少数の白血病融合遺伝子について確立されているのみである
。
【０００４】
染色体１１ｑ２３に位置する混合系統白血病（ＭＬＬ）遺伝子は、ヒト白血病に関連す
る多数の染色体転座に関与している（非特許文献２）。それらの中で最も一般的なものは
、転座ｔ（４；１１）（ｑ２１；ｑ２３）であり、かかる転座はＭＬＬ遺伝子を、染色体
４ｑ２１に位置するＡＦ４遺伝子と融合させる（非特許文献３、非特許文献４、非特許文
献５）。この転座は、高リスクの急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）の顕著な特徴であり
、特に乳児では予後不良をもたらす（非特許文献６）。
【０００５】
野生型ＭＬＬ遺伝子は、トリソラックス遺伝子群（ｆａｍｉｌｙ）の一員であり、４３
１ｋＤのタンパク質をコード化する。かかるタンパク質はタンパク質分解処理され、互い
にヘテロ二量化した２つの断片−３００ｋＤおよび１８０ｋＤになる（非特許文献７、非
特許文献８、非特許文献９、非特許文献１０）。ＭＬＬタンパク質は、ＤＮＡ結合のため
のＡＴフック・ドメイン、ＤＮＡメチル転移酵素（ＤＭＴ）およびメチル結合ドメインタ
ンパク質１（ＭＢＤ１）との相同性を示すＭＴドメイン、ジンク・フィンガーを含む植物
ホメオドメイン（ＰＨＤ）、並びにＳＥＴヒストン・メチル転移酵素ドメインを含む複雑
な構造を有する（非特許文献２）。ＭＬＬは、ホックス遺伝子の転写を制御するメカニズ
ムに関与している（非特許文献１１）。興味深いことに、ホックス遺伝子Ｈｏｘａ７およ
びＨｏｘａ９とホメオティック遺伝子Ｍｅｉｓ−１との組み合わせは、異なる幾つかのＭ
ＬＬ融合遺伝子によって誘導される形質転換のために必要である。このような決定的な役
割は、ＭＬＬ−ＡＦ４に関してはまだ報告されていない。にもかかわらず、３つすべての
ホメオティック遺伝子の発現レベルは、初代ｔ（４；１１）ＡＬＬにおいて上昇する。
【０００６】
ＡＦ４遺伝子は、核局在化シグナルおよびＧＴＰ結合ドメインを含むセリン／プロリン
・リッチタンパク質をコード化する。かかるタンパク質は細胞核に局在し（非特許文献１
２）、おそらく、転写活性化機能に関与するのであろうと思われる。ＭＬＬノックアウト
・マウスが胚致死であるのに対し（非特許文献１３）、ＡＦ４欠乏マウスは、不完全なＴ
細胞発生、およびＢ細胞発生の適度の改変を示す（非特許文献１４）。
【０００７】
特に、ｔ（４；１１）転座は２つの融合遺伝子、ＡＦ４−ＭＬＬおよびＭＬＬ−ＡＦ４
を生み出す。白血病誘発に関するいずれの融合遺伝子の重要性も、まだ完全には理解され
ていない。ＡＦ４−ＭＬＬは、ユビキチン媒介ＡＦ４分解に干渉してマウス胚由来線維芽
細胞を形質転換することが最近になって示された（非特許文献１５）。しかしながら、ｔ
（４；１１）陰性白血病細胞系でのＭＬＬ−ＡＦ４の異所性発現は、細胞周期進行を阻害
し、アポトーシスを引き起こす（非特許文献１６）。皮肉なことに、すべての（４；１１
）ＡＬＬ患者の２０％は、転写レベルまたはゲノム・レベルでＡＦ４−ＭＬＬを欠くのに
対して、ＭＬＬ−ＡＦ４は、異所性発現時の前アポトーシス活性にもかかわらず、常に検
出可能である（非特許文献１７、非特許文献１８）。興味深いことに、いくつかの研究は
、ＭＬＬ−ＡＦ４融合発癌遺伝子がｔ（４；１１）の状況において細胞生存を支援するこ
とを示唆する。ｔ（４；１１）転座のある細胞は、長期間にわたる血清枯渇を生き延び（
非特許文献１９）、ＣＤ９５媒介アポトーシスに対して耐性である（非特許文献２０）。
【０００８】
白血病誘発に関するこの融合発癌遺伝子の役割をより正確に定義するべく、出願人は、
白血病細胞内におけるＭＬＬ−ＡＦ４発現を阻害するためにＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を適
用した。ＲＮＡｉは、ｍＲＮＡの酵素開裂および破壊を生じる細胞プロセスであって、配
列特異性を有する２本鎖の小さな干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）によって導かれる（非特許
文献２１）。細胞にｓｉＲＮＡをトランスフェクトすると、ＲＮＡ誘導型サイレンシング
複合体と称される細胞質に位置付けられた（ｃｙｔｏｐｌａｓｍａｔｉｃａｌｌｙ ｌｏ
ｃａｔｅｄ）リボ核タンパク質複合体が発生する。ｓｉＲＮＡ鎖の一方を捨てることによ
りこの複合体が活性化され（非特許文献２２、非特許文献２３）、残鎖はＲＩＳＣを、相
補性を有するＲＮＡ配列に向かわせ、ＲＩＳＣ成分Ａｇｏ−２により、標的ＲＮＡのエン
ドヌクレアーゼ分解による開裂をきたす（非特許文献２４、非特許文献２５、非特許文献
２６）。外来的に追加された合成ｓｉＲＮＡは、遺伝子発現をサイレンシングさせるため
の非常に有力な、配列特異性の薬剤として働くことが示されており（非特許文献２７）、
遺伝子機能の分析ののみならず、遺伝子特異性の治療アプローチにとっても大きな可能性
を秘めていることが明らかとなった（非特許文献２８、非特許文献２９）。
【非特許文献１】ラビッツ（Ｒａｂｂｉｔｔｓ），Ｔ．Ｈ．、「Ｎａｔｕｒｅ」第３７２巻、１４３−１４９頁（１９９４年）
【非特許文献２】エルンスト（Ｅｒｎｓｔ），Ｐ．ら、「Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌ」、第９巻、２８２〜２８７頁（２００２年）
【非特許文献３】グゥ（Ｇｕ），Ｙ．ら、「Ｃｅｌｌ」第７１巻、７０１〜７０８頁（１９９２年）
【非特許文献４】マッカーブ（ＭｃＣａｂｅ），Ｎ．Ｒ．ら、「Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ」第８９巻、１１７９４〜１１７９８頁（１９９２年）
【非特許文献５】ドーマー（Ｄｏｍｅｒ），Ｐ．Ｈ．ら、「Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ」第９０巻、７８８４〜７８８８頁（１９９３年）
【非特許文献６】プイ（Ｐｕｉ），Ｃ．Ｈ．ら、「Ｌａｎｃｅｔ」第３５９巻、１９０９〜１９１５頁（２００２年）
【非特許文献７】ナカムラ（Ｎａｋａｍｕｒａ），Ｔ．ら、「Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ」第１０巻、１１１９〜１１２８頁（２００２年）
【非特許文献８】ヨコヤマ（Ｙｏｋｏｙａｍａ），Ａ．ら、「Ｂｌｏｏｄ」第１００巻、３７１０〜３７１８頁（２００２年）
【非特許文献９】シー（Ｈｓｉｅｈ），Ｊ．Ｊ．ら、「Ｃｅｌｌ」第１１５巻、２９３〜３０３頁（２００３年）
【非特許文献１０】シー（Ｈｓｉｅｈ），Ｊ．Ｊ．ら、「Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ」第２３巻、１８６〜１９４頁（２００３年）
【非特許文献１１】エートン（Ａｙｔｏｎ），Ｐ．Ｍ．およびクリアリー（Ｃｌｅａｒｙ），Ｍ．Ｌ．「Ｏｎｃｏｇｅｎｅ」第２０巻、５６９５〜５７０７頁（２００１年）
【非特許文献１２】リー（Ｌｉ），Ｑ．ら、「Ｂｌｏｏｄ」第９２巻、３８４１〜３８４７頁（１９９８年）
【非特許文献１３】ユー（Ｙｕ），Ｂ．Ｄ．ら、「Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ」第９５巻、１０６３２〜１０６３６頁（１９９８年）
【非特許文献１４】イスナール（Ｉｓｎａｒｄ），Ｐ．ら、「Ｂｌｏｏｄ」第９６巻、７０５〜７１０頁（２０００年）
【非特許文献１５】バーセン（Ｂｕｒｓｅｎ），Ａ．ら、「Ｏｎｃｏｇｅｎｅ」第２３巻、６２３７〜６２４９頁（２００４年）
【非特許文献１６】カスリーニ（Ｃａｓｌｉｎｉ），Ｃ．ら、「Ｌｅｕｋｅｍｉａ」第１８巻、１０６４〜１０７１頁（２００４年）
【非特許文献１７】ダウニング（Ｄｏｗｎｉｎｇ），Ｊ．Ｒ．ら、「Ｂｌｏｏｄ」第８３巻；３３０〜３３５頁（１９９４年）
【非特許文献１８】ライヘル（Ｒｅｉｃｈｅｌ），Ｍ．ら、「Ｏｎｃｏｇｅｎｅ」第２０巻、２９００〜２９０７頁（２００１年）
【非特許文献１９】カージー（Ｋｅｒｓｅｙ），Ｊ．Ｈ．ら、「Ｌｅｕｋｅｍｉａ」第１２巻、１５６１〜１５６４頁（１９９８年）
【非特許文献２０】デリエ（Ｄｏｒｒｉｅ），Ｊ．ら、「Ｌｅｕｋｅｍｉａ」第１３巻、１５３９〜１５４７頁（１９９９年）
【非特許文献２１】ダイクスフーム（Ｄｙｋｘｈｏｏｍ），Ｄ．Ｍ．ら、「Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ」第４巻、４５７〜４６７頁（２００３年）
【非特許文献２２】コヴォロヴァ（Ｋｈｖｏｒｏｖａ），Ａ．ら、「Ｃｅｌｌ」第１１５巻、２０９〜２１６頁（２００３年）
【非特許文献２３】シュバルツ（Ｓｃｈｗａｒｚ），Ｄ．Ｓ．ら、「Ｃｅｌｌ」第１１５巻、１９９〜２０８頁（２００３年）
【非特許文献２４】マイスター（Ｍｅｉｓｔｅｒ），Ｇ．ら、「Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ」第１５巻、１８５〜１９７頁（２００４年）
【非特許文献２５】ランド（Ｒａｎｄ），Ｔ．Ａ．ら、「Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ」第１０１巻、１４３８５〜１４３８９頁（２００４年）
【非特許文献２６】ソング（Ｓｏｎｇ），Ｊ．Ｊ．ら、「Ｓｃｉｅｎｃｅ」第３０５巻、１４３４〜１４３７頁（２００４年）
【非特許文献２７】エルバシール（Ｅｌｂａｓｈｉｒ），Ｓ．Ｍ．ら、「Ｎａｔｕｒｅ」第４１１巻、４９４〜４９８頁（２００１年）
【非特許文献２８】チェン（Ｃｈｅｎｇ），Ｊ．Ｃ．、ムーア（Ｍｏｏｒｅ），Ｔ．Ｂ．およびサカモト（Ｓａｋａｍｏｔｏ），Ｋ．Ｍ．「Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ」第８０巻、１２１〜１２８頁（２００３年）
【非特許文献２９】ハイデンライヒ（Ｈｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈ），Ｏ．「Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ」第５巻、３４９〜３５４頁（２００４年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本研究において出願人は、ｔ（４；１１）細胞内におけるＭＬＬ−ＡＦ４遺伝子発現を
特異的に阻害するためにＲＮＡｉを用いた。出願人は、融合転写ＭＬＬ−ＡＦ４の枯渇が
クローン形成能力および増殖を抑制し、ｔ（４；１１）陽性白血病細胞内においてアポト
ーシスを誘導し、ＳＣＩＤマウス異種移植モデル内においてかかる細胞の生着を危うくす
ることを明らかにする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、対象の、例えばヒトのような哺乳動物の、ＭＬＬ−ＡＦ４レベルを低減する
ための組成物および方法を提供する。この方法は、ＭＬＬ−ＡＦ４融合遺伝子の発現を（
例えば、少なくとも２％、４％、６％、１０％、１５％、２０％またはそれ以上）低下さ
せる、またはｔ（４；１１）陽性細胞の増殖率を抑制する、あるいはその両方を行うｉＲ
ＮＡ剤を、対象に投与することを含む。かかるｉＲＮＡ剤は、本明細書に記載されている
ものであり得るか、または、活性配列の１つに基づくｄｓＲＮＡであってＭＬＬ−ＡＦ４
融合遺伝子の、例えばヒトのＭＬＬ−ＡＦ４融合遺伝子のような哺乳動物ＭＬＬ−ＡＦ４
融合遺伝子の、同一の領域を標的とするｄｓＲＮＡであり得る。ｉＲＮＡ剤は、鎖当たり
３０個未満のヌクレオチドを、例えば２１〜２３個のヌクレオチドを含み、表１の薬剤番
号１乃至１２で提供される薬剤の１つから構成されるか、１つを含むか、または１つから
誘導され得る。２本鎖ｉＲＮＡ剤は平滑末端を有するか、または、より好ましくは、同薬
剤の３’末端の一方または両方からヌクレオチド１〜４個の突出部分を有することができ
る。これらの好ましいｉＲＮＡ剤は、対象内のすべての非ＭＬＬ−ＡＦ４遺伝子配列に対
して４個以上のヌクレオチド・ミスマッチを含むことが好ましい。
【００１１】
第１の態様において、本発明は特に、センス鎖であってかかるセンス鎖が、表１で提供
される薬剤番号１乃至１２のセンス鎖配列（配列番号５、１０、１２、１４、１８、２０
、２２、２４、２６、３０および３２）からの少なくとも１５個の連続したヌクレオチド
であるヌクレオチド配列を含むセンス鎖と、アンチセンス鎖であってかかるアンチセンス
鎖が、表１で提供される薬剤番号１乃至１２のアンチセンス配列（配列番号６、７、１１
、１３、１５、１９、２１、２３、２５、２７、３１および３３）からの少なくとも１５
個の連続したヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖と、を含むｉＲＮＡ剤、例えば、薬
剤番号５、センス鎖配列５’−ＡＡＧＡＡＡＡＧＣＡＧＡＣＣＵＡＣＵＣＣＡ−３’（配
列番号１４）、アンチセンス鎖配列５’−ＵＧＧＡＧＵＡＧＧＵＣＵＧＣＵＵＵＵＣＵＵ
ＵＵ−３’（配列番号１５）、を提供する。表１の薬剤番号１乃至１２のｉＲＮＡ剤は、
培養ヒトＳＥＭ細胞（白血病細胞系）内に存在するＭＬＬ−ＡＦ４ｍＲＮＡの量を、これ
らの薬剤とのインキュベーション後、かかる薬剤と共にインキュベーションされなかった
細胞に比べて４０％超低減するという有利なかつ驚くべき能力を有する（図１参照）。
【００１２】
第２の態様において本発明は、センス鎖内のヌクレオチド配列とアンチセンス鎖内のヌ
クレオチド配列とを含むｉＲＮＡ剤であって、各鎖が少なくとも１６、１７または１８個
のヌクレオチドの配列を含み、かかる配列が、培養ヒトＳＥＭ細胞内においてＭＬＬ−Ａ
Ｆ４発現を阻害するための能力を本質的に保持しながら鎖当たり１、２または３個以下の
ヌクレオチドがそれぞれ他のヌクレオチドと置換されている（例えばアデノシンがウラシ
ルに置き換えられている）点を除いて、表１の薬剤１乃至１２の配列（センス鎖：配列番
号５、１０、１２、１４、１８、２０、２２、２４、２６、３０および３２、アンチセン
ス鎖：配列番号６、７、１１、１３、１５、１９、２１、２３、２５、２７、３１および
３３）の１つと本質的に同一である、ｉＲＮＡ剤を提供する。
【００１３】
本発明のｉＲＮＡ剤は、表１で提供される薬剤１、２、５および９のセンス鎖配列（配
列番号５、１４および２４）から得られた少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含
むセンス鎖と、表１で提供される薬剤１、２、５および９のアンチセンス鎖配列（配列番
号６、７、１５および２５）の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含むアンチセ
ンス鎖とを含むことができ、かかるｉＲＮＡ剤は、これらの薬剤とのインキュベーション
後に培養ヒトＳＥＭ細胞内に存在するＭＬＬ−ＡＦ４ｍＲＮＡの量を、かかる薬剤と共に
インキュベーションされなかった細胞に比べて６０％超低減する。本発明のｉＲＮＡ剤の
アンチセンス鎖は、３０個以下のヌクレオチド長であり得、かかるｉＲＮＡ剤の２本鎖領
域は、１５〜３０対のヌクレオチド対長であり得る。ｉＲＮＡ剤は、少なくとも１つのヌ
クレオチド突出部分（ｏｖｅｒｈａｎｇ）を含むことができ、かかる突出部分は、１〜４
個の不対ヌクレオチドを、好ましくは２または３個の不対ヌクレオチドを有する。ヌクレ
オチド突出部分は、ｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖の３’末端に位置することができる。
【００１４】
さらに、本発明のｉＲＮＡ剤は、（ａ）センス鎖配列の配列番号５、１０、１２、１４
、１８、２０、２２、２４、２６、３０および３２の（５’から３’へ向かって）１位〜
１９位または１位〜２１位のヌクレオチド配列の群から選択されるヌクレオチド配列を有
するセンス鎖と、センス鎖が前記センス鎖配列の１位〜２１位のヌクレオチド配列を有す
ることが選択された場合にはアンチセンス鎖配列の配列番号６、１１、１３、１５、１９
、２１、２３、２５、２７、３１および３３の（５’から３’へ向かって）１位〜２１位
または３位〜２１位のヌクレオチド配列、並びに、センス鎖が前記センス鎖配列の１位〜
１９位のヌクレオチド配列を有することが選択された場合にはアンチセンス鎖配列の配列
番号６、１１、１３、１５、１９、２１、２３、２５、２７、３１および３３の３位〜２
１位のヌクレオチド配列、の群から選択されるヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖
と、により形成される２本鎖構造と、（ｂ）かかるセンス鎖及び／またはアンチセンス鎖
の３’末端に１〜４個の不対ヌクレオチドからなる少なくとも１つの１本鎖突出部分であ
って、同１本鎖突出部分は、センス鎖の３’末端にある場合には、前記センス鎖配列２０
位および２１位のヌクレオチドを各位置に選択的に含み、および／または、アンチセンス
鎖の３’末端にある場合には、前記アンチセンス鎖配列の２２位および２３位のヌクレオ
チドを各位置に選択的に含む、１本鎖突出部分と、から構成されており、かかる２本鎖構
造が、前記センス鎖配列の１位〜２１位のヌクレオチド配列を有するセンス鎖、および前
記アンチセンス鎖配列の１位〜２１位のヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖により
形成される場合には、かかるｉＲＮＡ剤はセンス鎖の３’末端に１〜４個の不対オリゴヌ
クレオチドの１本鎖突出部分を含んでいない。特に、センス鎖のヌクレオチド配列は、配
列番号１４のヌクレオチド配列から構成され得、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、
配列番号１４のヌクレオチド配列から構成され得る。
【００１５】
本発明のｉＲＮＡ剤は、培養ヒトＳＥＭ細胞内に存在するＭＬＬ−ＡＦ４ｍＲＮＡの量
を、このｉＲＮＡ剤とのインキュベーション後、かかる薬剤と共にインキュベーションさ
れなかった細胞に比べて４０％より多く低減するように意図されている。それらのｉＲＮ
Ａ剤は、生体試料内において同ｉＲＮＡ剤の安定性を増大させる修飾をさらに含むことが
でき、かかる修飾は、ホスホロチオエートまたは２’修飾ヌクレオチドであり得る。例え
ば、ｉＲＮＡ剤は、ウリジンが２’−修飾ヌクレオチドである少なくとも一つの５’−ウ
リジン−アデニン−３’（５’−ＵＡ−３’）ジヌクレオチド；５’−ウリジンが２’−
修飾ヌクレオチドである少なくとも一つの５’−ウリジン−グアニン−３’（５’−ＵＧ
−３’）ジヌクレオチド；５’−シチジンが２’−修飾ヌクレオチドである少なくとも一
つの５’−シチジン−アデニン−３’（５’−ＣＡ−３’）ジヌクレオチド；又は５’−
ウリジンが２’−修飾ヌクレオチドである少なくとも一つの５’−ウリジン−ウリジン−
３’（５’−ＵＵ−３’）ジヌクレオチドを更に含むことができる。２’修飾は、２’−
デオキシ、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエ
チル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−
ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（
２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭ
ＡＥＯＥ）および２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）の群から選択
できる。
【００１６】
ｉＲＮＡ剤はさらに、コレステロール部分を含むことができ、かかるコレステロール部
分は、ｉＲＮＡ剤のセンス鎖の３’末端に結合することが好ましい。ｉＲＮＡ剤は、肝臓
の細胞または消化管の細胞による取り込みに対して標的化され得る。
【００１７】
第３の態様において本発明は、医薬組成物であって、（ａ）本発明のｉＲＮＡ剤と、（
ｂ）薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物を提供する。
この医薬組成物は、ヒト血清またはマウス血清、あるいはヒト血清およびマウス血清内
においてｉＲＮＡ剤の半減期を延長させるかまたは細胞内へのｉＲＮＡ剤の取り込みを促
進する処方化剤を更に含むことができる。処方化剤はポリカチオンを含むことができる。
かかる医薬組成物は、増殖性疾患の、例えば癌腫、好ましくは白血病、より好ましくは急
性リンパ芽球性白血病の、治療に役立つものであることが好ましい。医薬組成物は、対象
、例えばヒトに、医薬組成物が投与されると、対象の細胞または組織内におけるＭＬＬ−
ＡＦ４融合遺伝子発現を（例えば、少なくとも２％、４％、６％、１０％、１５％、２０
％またはそれ以上）低下させる、またはｔ（４；１１）陽性細胞の増殖率を抑制する、あ
るいはその両方を行う能力を備えることが好ましい。
【００１８】
第４の態様において本発明は、増殖性疾患に罹患しているか、または同疾患を発症する
危険性のあるヒト対象を治療する方法であって、かかるヒト対象に本発明のｉＲＮＡ剤を
投与する工程を含む方法を提供する。かかる増殖性疾患は好ましくは癌腫であり、より好
ましくは急性リンパ芽球性白血病である。その場合、ｉＲＮＡ剤は、対象の細胞または組
織内におけるＭＬＬ−ＡＦ４の発現を（例えば、少なくとも２％、４％、６％、１０％、
１５％、２０％またはそれ以上）低下させるために、またはｔ（４；１１）陽性細胞の増
殖率を抑制するために、あるいはその両方を行うために十分な量にて投与できる。
【００１９】
第５の態様において本発明は、医薬組成物を作成する方法であって、本発明のｉＲＮＡ
剤の１つを医薬担体と共に処方する工程を含む方法を提供し、選択的に、ヒト血清または
マウス血清、あるいはヒト血清およびマウス血清内においてｉＲＮＡ剤の半減期を延長さ
せるかまたは細胞内へのｉＲＮＡ剤の取り込みを促進する処方化剤とともにｉＲＮＡ剤を
処方する工程をさらに含む。処方化剤はポリカチオンを含むことができる。本発明の方法
の医薬組成物は、増殖性疾患の治療に役立つものであることが好ましく、増殖性疾患は、
好ましくは癌腫であり、より好ましくは白血病であり、最も好ましくは急性リンパ芽球性
白血病である。ある好ましい実施形態では、本発明の方法の医薬組成物は、対象、例えば
ヒトに、同医薬組成物が投与されると、対象の細胞または組織内におけるＭＬＬ−ＡＦ４
融合遺伝子発現を（例えば、少なくとも２％、４％、６％、１０％、１５％、２０％また
はそれ以上）低下させること、またはｔ（４；１１）陽性細胞の増殖率を抑制すること、
あるいはその両方を行うことができる。
【００２０】
第６の態様において本発明は、細胞内におけるＭＬＬ−ＡＦ４ＲＮＡの量を（例えば、
少なくとも２％、４％、６％、１０％、１５％、２０％またはそれ以上）低減する、また
はｔ（４；１１）陽性細胞の増殖率を抑制する、あるいはその両方を行う方法であって、
かかる細胞を本発明のｉＲＮＡ剤に接触させる工程を含む方法を提供する。一実施形態で
は、この方法はインビトロにて行われる。代替的に、細胞は対象の細胞であって、対象は
増殖性疾患を、好ましくは癌腫を、より好ましくは急性リンパ芽球性白血病を、罹患して
いると診断されている。細胞は、腫瘍内に位置することができるか、またはマイクロクロ
ーン細胞であり得る。
【００２１】
第７の態様において本発明は、本発明のｉＲＮＡ剤を作成する方法であって、かかる方
法が、ｉＲＮＡ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖を合成する工程を含み、かかるセンス
鎖及び／またはアンチセンス鎖が少なくとも１つのヌクレオチド修飾を含み、好ましくは
前記ヌクレオチド修飾が生体試料内においてｉＲＮＡ剤の安定性を増大させる修飾である
方法を提供する。前記の方法は、対象にｉＲＮＡ剤を投与する工程をさらに含む。一実施
形態では、対象は増殖性疾患を、好ましくは癌腫、より好ましくは急性リンパ芽球性白血
病を罹患していると診察される。その場合、対象はヒトであり得る。
【００２２】
【表１】
第８の態様において本発明は、ＭＬＬ−ＡＦ４遺伝子の発現を阻害すると考えられるｉ
ＲＮＡ剤を評価する方法であって、かかる方法が、（ａ）ｉＲＮＡ剤を提供する工程と、
同工程において、第１の鎖が、ＭＬＬ−ＡＦ４ｍＲＮＡのヌクレオチド配列に対して十分
な相補性を有し、第２の鎖が、第１の鎖とハイブリダイズするために同第１の鎖に対して
十分な相補性を有することと、（ｂ）ＭＬＬ−ＡＦ４遺伝子を含む細胞にｉＲＮＡ剤を接
触させる工程と、（ｃ）ｉＲＮＡ剤を細胞に接触させる前のＭＬＬ−ＡＦ４遺伝子発現ま
たは接触していない対照細胞のＭＬＬ−ＡＦ４遺伝子発現と、ｉＲＮＡ剤を細胞に接触さ
せた後のＭＬＬ−ＡＦ４遺伝子発現と、を比較する工程と、（ｄ）ｉＲＮＡ剤が、ＭＬＬ
−ＡＦ４遺伝子発現を阻害するために有用であるかどうかを判定する工程であって、細胞
中に存在するＭＬＬ−ＡＦ４ＲＮＡの量、または細胞により分泌されるタンパク質の量が
、ｉＲＮＡ剤を細胞に接触させる前の存在量もしくは分泌量よりも少ないか、またはその
ように接触していない細胞による存在量もしくは分泌量よりも少ない場合に、同ｉＲＮＡ
剤が有用であると判定する工程とを含む方法、を提供する。
【００２３】
本方法の一実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、上記の通りの本発明のｉＲＮＡ剤である。
ｉＲＮＡ剤は、天然型のリボヌクレオチド・サブユニットのみを含み得るか、または、
ｉＲＮＡ剤に含まれる１つ以上のかかるリボヌクレオチド・サブユニットの糖もしくは塩
基に対する修飾を１つ以上含むように合成され得る。ｉＲＮＡ剤は、かかる薬剤の安定性
、分布または細胞への取り込みを改善するために選択されるリガンド、例えばコレステロ
ールに付着するようにさらに修飾され得る。かかる薬剤はさらに、単離形態であり得るか
、または、本明細書に記載されている方法に用いられる医薬組成物の一部であり得る。
【００２４】
別の実施形態では、本明細書に記載されているように、コレステロール部分（例えばセ
ンス鎖の３’末端に）、２’修飾（例えば２’−Ｏ−メチルまたは２’−デオキシ−２’
−フルオロ−修飾）およびホスホロチオエート（例えば、センス鎖およびアンチセンス鎖
の３’−端の１個または２個のヌクレオチド上に）が、同一ｉＲＮＡ剤内に存在する。
【００２５】
ｉＲＮＡ剤、例えば本明細書に記載されているｉＲＮＡ剤は、ＭＬＬ−ＡＦ４融合遺伝
子発現がある種の役割を演じる対象内に存在する疾病または疾患の治療のためのものであ
ることが好ましい。ｉＲＮＡ剤の投与は、ＭＬＬ−ＡＦ４融合により媒介される疾患の予
防的治療のためにも実施できる。
【００２６】
本発明は、ＭＬＬ−ＡＦ４の調節例えば阻害を行うｉＲＮＡ剤の調製物であって、かな
り純粋な調製物または薬学的に許容可能な調製物を含む調整物を特徴とする。ＭＬＬ−Ａ
Ｆ４を標的とするｉＲＮＡ剤が対象に投与でき、その対象は、ＭＬＬ−ＡＦ４融合遺伝子
またはその他のｔ（４；１１）染色体転座の存在を特徴とする疾患を、発症する危険性が
あるかまたは罹患している（例えば、罹患していると診断されている）。ｉＲＮＡ剤は、
かかる疾患またはその症状の開始を遅らせるために、かかる疾患と診断されたかもしくは
かかる疾患を罹患しているかまたはかかる疾患の危険性のある個人に投与できる。これら
の疾患は、急性リンパ芽球性白血病を含む、ｔ（４；１１）関連の白血病のような増殖性
疾患を含む。例えば、ＭＬＬ−ＡＦ４を標的とするｉＲＮＡ剤は、１つ以上の器官（骨髄
外での血液細胞の形成）、例えば脾臓、肝臓またはリンパ節において乳児急性リンパ芽球
性白血病、白血球増加症または髄外疾患を罹患している（例えば、罹患していると診断さ
れた）対象に投与できる。
【００２７】
また、ｉＲＮＡ剤は、骨髄のような特定の組織を標的とすることもでき、組織（例えば
組織の腫瘍）内のＭＬＬ−ＡＦ４発現レベルは、ＭＬＬ−ＡＦ４ｉＲＮＡ剤の投与後、低
下する。ｉＲＮＡ剤は、ｉＲＮＡ剤が血流内に広がっている時間を最大にするために修飾
されることが好ましい。例えばｉＲＮＡ剤は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）と結合する
ことができる。
【００２８】
本発明の方法および組成物では、ｉＲＮＡ剤は、送達剤、例えば、本明細書に記載され
ている送達剤で、例えばリポソームで修飾されるか、またはかかる送達剤と結合され得る
。かかる修飾は、かかる薬剤の循環時間を増大させるために、血清アルブミン（ＳＡ）、
例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、またはその断片との結合を媒介し得る。
【００２９】
本薬剤、本方法および本組成物は、細胞内においてＭＬＬ−ＡＦ４融合ｍＲＮＡを選択
的に分解するために、ＲＮＡ干渉に関与する細胞メカニズムを利用する。従って、本発明
の方法は通例、本発明のｉＲＮＡ剤の１つに細胞を接触させる工程を含む。かかる方法は
、細胞に対して直接実施できるか、または、本発明のｉＲＮＡ剤の１つを対象に投与する
ことにより、哺乳動物対象に対して実施できる。好ましい実施形態では、細胞は少なくと
も２回、好ましくは４８時間間隔で、ｉＲＮＡ剤に接触させられる。細胞内においてＭＬ
Ｌ−ＡＦ４融合ｍＲＮＡが減少すると、生成されるＭＬＬ−ＡＦ４融合タンパク質の量が
低減し、生物ではＭＬＬ−ＡＦ４融合物媒介型疾病の効果を減らすことができる。
【００３０】
本発明の特徴である方法および組成物、例えば、本明細書に記載されている増殖性疾患
を治療するための方法および組成物は、記載されたｉＲＮＡ剤のいずれかと共に利用でき
る。加えて、本発明の特徴である方法および組成物は、本明細書に記載されている疾病ま
たは疾患の治療、および対象、例えば動物、ヒトのような哺乳動物の治療に利用できる。
【００３１】
本発明の特徴である方法および組成物、例えば、本明細書に記載されている増殖性疾患
を治療するための方法およびｉＲＮＡ組成物は、本明細書に記載されている用量及び／ま
たは処方で、そして、本明細書に記載されている投与経路でも利用できる。
【００３２】
本発明の特徴である１つ以上の実施形態の詳細は、添付の図面および以下の詳細な説明
に記される。本発明のその他の特徴、目的および利点は、この詳細な説明、図面および請
求項から明らかになるであろう。本願はすべての目的のために、引用された全ての参照、
特許および特許出願を参照により全体として組み込む。
例えば、本願は以下の項目を提供する。
（項目１）
表１（配列番号５、１０、１２、１４、１８、２０、２２、２４、２６、３０及び３２）
に提供された薬剤番号１乃至１２のセンス鎖配列からの少なくとも１５個の連続したヌク
レオチドであるヌクレオチド配列を含むセンス鎖と、表１（配列番号６、７、１１、１３
、１５、１９、２１、２３、２５、２７、３１及び３３）に提供された薬剤番号１乃至１
２のアンチセンス鎖配列からの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含むアンチセ
ンス鎖と、とからなるｉＲＮＡ剤。
（項目２）
各々が、表１（センス鎖：配列番号５、１０、１２、１４、１８、２０、２２、２４、２
６、３０及び３２並びにアンチセンス鎖：配列番号６、７、１１、１３、１５、１９、２
１、２３、２５、２７、３１及び３３）の薬剤番号１乃至１２の配列のうちの一つと本質
的に同一である少なくとも１６、１７又は１８個のヌクレオチドの配列を含むセンス鎖中
のヌクレオチド配列とアンチセンス鎖中のヌクレオチド配列とを含むｉＲＮＡ剤であって
、鎖あたり１、２又は３個以下のヌクレオチドがそれぞれ他のヌクレオチドによって置換
されている（例えば、アデノシンがウラシルによって置換されている）が、培養ヒトＳＥ
Ｍ細胞中におけるＭＬＬ−ＡＦ４の発現を阻害する能力をほぼ維持している、ｉＲＮＡ剤
。
（項目３）
前記センス鎖は、表１に提供された薬剤番号１、２、５及び９のセンス鎖配列（配列番号
５、１４及び２４）からの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含み、前記アンチ
センス鎖は表１に提供された薬剤番号１、２、５及び９のアンチセンス鎖配列（配列番号
６、７、１５及び２５）からの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含み、前記ｉ
ＲＮＡ剤は、同剤とのインキュベーション後に、培養ヒトＳＥＭ細胞中のＭＬＬ−ＡＦ４
ｍＲＮＡの量を、同剤とともにインキュベーションしなかった細胞と比較して６０％超減
少させる、項目１に記載のｉＲＮＡ剤。
（項目４）
前記アンチセンスＲＮＡ鎖は長さが３０ヌクレオチド以下であり、前記ｉＲＮＡ剤の二重
鎖領域の長さが１５乃至３０ヌクレオチド対である、項目１乃至３のいずれか一項に記載のｉＲＮＡ剤。
（項目５）
１乃至４個の不対ヌクレオチドを有する少なくとも一つのヌクレオチド突出部分を含む、項目１乃至３のいずれか一項に記載のｉＲＮＡ剤。
（項目６）
前記ヌクレオチド突出部分が２又は３の不対ヌクレオチドを有する、項目５に記載のｉＲＮＡ剤。
（項目７）
前記ヌクレオチド突出部分ｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖の３’末端に存在する、項目５又は６に記載のｉＲＮＡ剤。
（項目８）
項目１に記載のｉＲＮＡ剤であって、
前記ｉＲＮＡ剤は、
（ａ）センス鎖配列の配列番号５、１０、１２、１４、１８、２０、２２、２４、２６、
３０及び３２の（５’から３’へ向かって）１位〜１９位又は１位〜２１位のヌクレオチ
ド配列の群から選択されるヌクレオチド配列から構成されたセンス鎖と、前記センス鎖が
同センス鎖配列の１位〜２１位のヌクレオチドの配列を有することが選択された場合には
アンチセンス鎖配列の配列番号６、７、１１、１３、１５、１９、２１、２３、２５、２
７、３１及び３３の（５’から３’へ向かって）１位〜２１位又は３位〜２１位のヌクレ
オチドの配列、並びに前記センス鎖が同センス鎖配列の１位〜１９位のヌクレオチド配列
を有することが選択された場合にはアンチセンス鎖配列の配列番号６、７、１１、１３、
１５、１９、２１、２３、２５、２７、３１及び３３の３位〜２１位のヌクレオチドの配
列、の群から選択されるヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖と、により形成される
２本鎖構造と、
（ｂ）前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖の少なくとも一方の３’−末端に１乃至４個
の不対ヌクレオチドからなる少なくとも１つの１本鎖の突出部分であって、前記１本鎖突
出部分は、前記センス鎖の３’−末端にある場合には同センス鎖配列の２０位及び２１位
のヌクレオチドを各位置に選択的に含むことと、前記アンチセンス鎖の３’−末端にある
場合には同アンチセンス鎖配列の２２位及び２３位のヌクレオチドを各位置に選択的に含
むここと、のうちの少なくとも一方である、１本鎖の突出部分と、
から構成されており、
前記２本鎖構造が前記センス鎖配列の１位〜２１位のヌクレオチド配列を有するセンス
鎖と、前記アンチセンス鎖配列の１位〜２１位のヌクレオチド配列を有するアンチセンス
鎖と、により形成されている場合には、前記ｉＲＮＡ剤は、同センス鎖の３’−末端に１
乃至４個の不対オリゴヌクレオチドの１本鎖突出部分を含んでいない、ｉＲＮＡ剤。
（項目９）
前記センス鎖のヌクレオチド配列は配列番号１４のヌクレオチド配列から構成され、かつ
前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は配列番号１５のヌクレオチド配列から構成され
る、項目８に記載のｉＲＮＡ剤。
（項目１０）
前記ｉＲＮＡ剤は同剤とのインキュベーション後に、培養ヒトＳＥＭ細胞中のＭＬＬ−Ａ
Ｆ４ｍＲＮＡの量を、同剤とともにインキュベーションしなかった細胞と比較して４０％
超減少させる、項目１乃至９のいずれか一項に記載のｉＲＮＡ剤。
（項目１１）
前記ｉＲＮＡ剤に生物試料中での高い安定性を与える修飾を更に含む、項目１乃至１０のいずれか一項に記載のｉＲＮＡ剤。
（項目１２）
ホスホロチオエート又は２’−修飾ヌクレオチドを含む、項目１乃至１１のいずれか一項に記載のｉＲＮＡ剤。
（項目１３）
ウリジンが２’−修飾ヌクレオチドである少なくとも一つの５’−ウリジン−アデニン−
３’（５’−ＵＡ−３’）ジヌクレオチド；５’−ウリジンが２’−修飾ヌクレオチドで
ある少なくとも一つの５’−ウリジン−グアニン−３’（５’−ＵＧ−３’）ジヌクレオ
チド；５’−シチジンが２’−修飾ヌクレオチドである少なくとも一つの５’−シチジン
−アデニン−３’（５’−ＣＡ−３’）ジヌクレオチド；又は５’−ウリジンが２’−修
飾ヌクレオチドである少なくとも一つの５’−ウリジン−ウリジン−３’（５’−ＵＵ−
３’）ジヌクレオチド、を含む、項目１乃至１２のいずれか一項に記載のｉＲＮＡ剤。
（項目１４）
前記２’−修飾が、２−デオキシ、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル
、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−
Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジ
メチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシ
エチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、及び２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ
−ＮＭＡ）からなる群より選択される、項目１２又は１３に記載のｉＲＮＡ剤。
（項目１５）
コレステロール部分を含む、項目１乃至１４のいずれか一項に記載のｉＲＮＡ剤。
（項目１６）
前記コレステロール部分が前記ｉＲＮＡ剤のセンス鎖の３’−末端に結合している、項目１５に記載のｉＲＮＡ剤。
（項目１７）
前記ｉＲＮＡ剤は肝臓の細胞により取り込まれるように標的化されている、項目１乃至１６のいずれか一項に記載のｉＲＮＡ剤。
（項目１８）
前記ｉＲＮＡ剤は消化管の細胞により取り込まれるように標的化されている、項目１乃至１６のいずれか一項に記載のｉＲＮＡ剤。
（項目１９）
（ａ）項目１乃至１８のいずれか一項に記載のｉＲＮＡ剤と、
（ｂ）製薬的に許容可能な担体と、
からなる製薬組成物。
（項目２０）
前記ｉＲＮＡ剤のヒト及びマウスの少なくとも一方における血漿中での半減期を延長させ
るか、又は細胞中における同ｉＲＮＡ剤の取り込みを容易にするための処方化剤を更に含
む、項目１９に記載の製薬組成物。
（項目２１）
前記処方化剤はポリカチオンを含む、項目２０に記載の製薬組成物。
（項目２２）
前記製薬組成物は増殖性疾患の治療に有用である、項目１９乃至２１のいずれか一項に記載の製薬組成物。
（項目２３）
前記増殖性疾患は、癌、好ましくは白血病、より好ましくは急性リンパ芽球性白血病である、項目２２に記載の製薬組成物。
（項目２４）
前記製薬組成物は、例えばヒトのような対象に同製薬組成物を投与することにより、同対
象の細胞又は組織中でのＭＬＬ−ＡＦ４融合遺伝子の発現を低減すること及びｔ（４；１
１）−陽性細胞の増殖率を抑制することのうちの少なくとも一方を可能にする、項目１９乃至２３のいずれか一項に記載の製薬組成物。
（項目２５）
増殖性疾患を有するヒト対象または同増殖性疾患の発生する危険性のあるヒト対象を治療
するための方法であって、項目１乃至１８のいずれか一項に記載のｉＲＮＡ剤を同ヒト対象に投与する工程を含む、方法。
（項目２６）
前記増殖性疾患は、癌、好ましくは急性リンパ芽球性白血病である、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記ｉＲＮＡ剤は対象の細胞又は組織中でのＭＬＬ−ＡＦ４の発現を低減すること及びｔ
（４；１１）−陽性細胞の増殖率を抑制することのうちの少なくとも一方を可能にするの
に十分な量にて投与される、項目２５又は２６に記載の方法。
（項目２８）
項目１乃至１８のいずれか一項に記載のｉＲＮＡ剤の一つを製薬的に許容可能な担体と
処方化させる工程を含む、製薬組成物を製造するための方法。
（項目２９）
前記ｉＲＮＡ剤のヒト及びマウスの少なくとも一方における血漿中での半減期を延長させ
るか、又は細胞中における同ｉＲＮＡ剤の取り込みを容易にするための処方化剤とともに
同ｉＲＮＡ剤を処方化する工程を更に含む、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記処方化剤はポリカチオンである、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記製薬組成物は増殖性疾患の治療に有用である、項目２８乃至３０のいずれか一項に記載の方法。
（項目３２）
前記増殖性疾患は、癌、好ましくは白血病、より好ましくは急性リンパ芽球性白血病であ
る、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記製薬組成物は、例えばヒトのような対象に同製薬組成物を投与することにより、同対
象の細胞又は組織中でのＭＬＬ−ＡＦ４融合遺伝子の発現を低減すること及びｔ（４；１
１）−陽性細胞の増殖率を抑制することのうちの少なくとも一方を可能にする、項目２
８乃至３２のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４）
細胞中のＭＬＬ−ＡＦ４ＲＮＡの量を低減すること及びｔ（４；１１）−陽性細胞の増殖
率を抑制することのうちの少なくとも一方を実施するための方法であって、前記単数又は
複数の細胞を項目１乃至１８のいずれか一項に記載のｉＲＮＡ剤と接触させる工程を含む、方法。
（項目３５）
前記方法はインビトロにて実施される、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記細胞が対象の細胞であり、かつ前記対象が増殖性疾患、好ましくは癌、より好ましく
は急性リンパ芽球性白血病に罹患していると診断されている、項目３４に記載の方法。
（項目３７）
項目１乃至１８のいずれか一項に記載のｉＲＮＡ剤を製造する方法であって、前記方法
は、同ｉＲＮＡ剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖を合成する工程を含み、前記センス鎖及
び前記アンチセンス鎖のうちの少なくとも一つは少なくとも一つのヌクレオチド修飾を含
む、方法。
（項目３８）
前記ヌクレオチド修飾は、前記ｉＲＮＡ剤に生物試料中での高い安定性を与える修飾であ
る、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記ｉＲＮＡ剤を対象に投与する工程を更に含む、項目３７に記載の方法。
（項目４０）
前記対象は増殖性疾患、好ましくは癌に罹患しているものとして診断されている、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
前記対象は急性リンパ芽球性白血病に罹患しているものとして診断されている、項目３９に記載の方法。
（項目４２）
前記対象がヒトである、項目３９に記載の方法。
（項目４３）
ＭＬＬ−ＡＦ４遺伝子の発現を阻害すると考えられているｉＲＮＡ剤を評価するための方
法であって、前記方法は、
（ａ）ｉＲＮＡ剤を提供する工程であって、第一の鎖がＭＬＬ−ＡＦ４ｍＲＮＡのヌクレ
オチド配列と十分に相補的であり、かつ第二の鎖が第一の鎖とハイブリダイズするべく同
第一の鎖と十分に相補的である、工程と、
（ｂ）前記ｉＲＮＡ剤をＭＬＬ−ＡＦ４遺伝子を含む細胞と接触させる工程と、
（ｃ）細胞と前記ｉＲＮＡ剤を接触させる前のＭＬＬ−ＡＦ４遺伝子の発現又は接触させ
ていない対照細胞のＭＬＬ−ＡＦ４遺伝子の発現と、細胞と前記ｉＲＮＡ剤を接触させた
後のＭＬＬ−ＡＦ４遺伝子の発現と、を比較する工程と、
（ｄ）前記ｉＲＮＡ剤がＭＬＬ−ＡＦ４遺伝子の発現を阻害するのに有用であるかどうか
を判定する工程であって、細胞中に存在するＭＬＬ−ＡＦ４ＲＮＡの量又は同細胞によっ
て分泌されるタンパク質の量が、細胞とｉＲＮＡ剤とを接触させる前の存在量若しくは分
泌量よりも少ない場合、又はそのような接触を受けていない細胞による存在量若しくは分
泌量よりも少ない場合、同ｉＲＮＡ剤は有用であると判定する工程と、
からなる方法。
（項目４４）
前記ｉＲＮＡ剤は項目１乃至１８のいずれか一項に記載のｉＲＮＡ剤である、項目４３に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１Ａ】ＭＬＬ−ＡＦ４ｓｉＲＮＡの活性および特異性を示す。ＭＬＬ−ＡＦｍＲＮＡ融合部位のｓｉＲＮＡスキャンを示す。ＧＡＰＤＨｍＲＮＡレベルにより正規化されたＭＬＬ−ＡＦ４ｍＲＮＡレベルが示される。表示したｓｉＲＮＡの標的部位は、１個の単一ヌクレオチドだけ融合部位のＡＦ４部分からＭＬＬ部分に移された。総ＲＮＡは、５００ｎＭのｓｉＲＮＡを用いたエレクトロポレーションの２４時間後に単離され、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより分析された。Ｘ軸の数字は、表２のｓｉＲＮＡの付番に対応する（ｓｉＭＡｎ、ｎ＝１〜１４）。エラー・バーは標準偏差を示す。
【図１Ｂ】ＭＬＬ−ＡＦ４ｓｉＲＮＡの活性および特異性を示す。ＭＬＬ−ＡＦ４枯渇の経時変化を示す。総ＲＮＡは、モックエレクトロポレーションまたは７５０ｎＭのｓｉＲＮＡであるｓｉＭＡ６もしくはミスマッチ対照ｓｉＭＡｍｍを用いたエレクトロポレーションの後、表示した時点で単離された。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、図１Ａの通りに行われた。
【図１Ｃ】ＭＬＬ−ＡＦ４ｓｉＲＮＡの活性および特異性を示す。ＳＥＭ細胞内のＭＬＬ−ＡＦ４、ＡＦ４およびＭＬＬのｍＲＮＡレベルに対するＭＬＬ−ＡＦ４ｓｉＲＮＡｓｉＭＡ６およびミスマッチ対照ｓｉＭＭの効果を示す。分析は図１Ａの通りに行われた。
【図１Ｄ】ＭＬＬ−ＡＦ４ｓｉＲＮＡの活性および特異性を示す。ｓｉＲＮＡトランスフェクションによるＭＬＬ−ＡＦ４タンパク質の枯渇を示す。総細胞溶解物は、モックエレクトロポレーションまたは５００ｎＭのｓｉＲＮＡｓｉＭＡ６もしくはミスマッチ対照ｓｉＭＡｍｍを用いたエレクトロポレーションの４８時間後に単離された。ＭＬＬ−ＡＦ４は、ＡＦ４のＣ末端を標的とする抗体を用いて検出された。ＧＡＰＤＨはローディングコントロールとして、また、正規化のために提供された。正規化ＭＬＬ−ＡＦ４タンパク質レベルは下部に表示されている。
【図１Ｅ】ＭＬＬ−ＡＦ４ｓｉＲＮＡの活性および特異性を示す。ＲＳ４；１１細胞内のＭＬＬ−ＡＦ４、ＡＦ４およびＭＬＬのｍＲＮＡレベルに対するＭＬＬ−ＡＦ４ｓｉＲＮＡであるｓｉＭＡ６およびｓｉＭＡＲＳ並びにミスマッチ対照ｓｉＭＭの効果を示す。分析は図１Ａの通りに行われた。ｓｉＭＡ６は、ＳＥＭ細胞内で発現したＭＬＬ−ＡＦ４変種と相同であり、ｓｉＭＡＲＳは、ＲＳ４；１１細胞内に存在する変種を標的とする。
【図１Ｆ】ＭＬＬ−ＡＦ４ｓｉＲＮＡの活性および特異性を示す。ＭＬＬ−ＡＦ４ｓｉＲＮＡは、インターフェロン応答を誘導しない。ＳＥＭ細胞は、表示したＲＮＡでトランスフェクションされた。ポリＩＣ（７．５μｇ／ｍｇ）は、インターフェロン応答遺伝子ＯＡＳ１およびＳＴＡＴ１の誘導に対する陽性対照として提供されている。分析は図１Ａの通りに行われた。
【図２Ａ】ＭＬＬ−ＡＦ４枯渇が、ｔ（４；１１）陽性白血病細胞のコロニー形成および増殖を阻害することを示す。ＭＬＬ−ＡＦ４およびＡＭＬ１／ＭＴＧ８ ｓｉＲＮＡの特異性を示す。ＳＥＭ細胞はＭＬＬ−ＡＦ４を発現するのに対して、Ｋａｓｕｍｉ−１細胞はＡＭＬ１／ＭＴＧ８を発現する。ｓｉＭＡ６処理済みＳＥＭ細胞またはｓｉＡＧＦ１処理済みＫａｓｕｍｉ−１細胞により形成されたコロニーの数は、各々のミスマッチ対照で処理された細胞による数よりも顕著に少ない（ｐ＜０．００１）。
【図２Ｂ】ＭＬＬ−ＡＦ４枯渇が、ｔ（４；１１）陽性白血病細胞のコロニー形成および増殖を阻害することを示す。ＲＳ４；１１クローン形成能力の阻害は、ＭＬＬ−ＡＦ４融合部位に対する完全な相同性に依存する。ｓｉＭＡＲＳ処理済みＲＳ４；１１細胞により形成されたコロニーの数は、モック処理済みＲＳ４；１１細胞、ｅ９−ｅ４変種特異的なｓｉＭＡ６で処理されたＲＳ４；１１細胞、またはｅ９−ｅ４ミスマッチ対照ｓｉＭＡｍｍによる数よりも顕著に少ない（ｐ＜０．０００１）。
【図２Ｃ】ＭＬＬ−ＡＦ４枯渇が、ｔ（４；１１）陽性白血病細胞のコロニー形成および増殖を阻害することを示す。ＭＬＬ−ＡＦ４を標的とするｓｉＲＮＡは、初代ヒトＣＤ３４＋造血細胞のコロニー形成に影響を与えない。初代ヒトＣＤ３４＋造血細胞は、７５０ｎＭのｓｉＭＡ６（ＳＥＭ細胞内で発現したＭＬＬ−ＡＦ４ｅ９−ｅ４変種を標的とするｓｉＲＮＡ）、ｓｉＭＡＲＳ（ＲＳ４；１１細胞内で発現したＭＬＬ−ＡＦ４ｅ１０−ｅ４変種を標的とするｓｉＲＮＡ）、またはｅ９−ｅ４ミスマッチ対照ｓｉＭＭを用いてエレクトロポレーションされた。エラー・バーは標準偏差を示す。
【図２Ｄ】ＭＬＬ−ＡＦ４枯渇が、ｔ（４；１１）陽性白血病細胞のコロニー形成および増殖を阻害することを示す。ｓｉＲＮＡ処理済みのＳＥＭ細胞およびＲＳ４；１１細胞の成長曲線を示す。細胞は１日おきに、モックエレクトロポレーションされたか、または７５０ｎＭのｓｉＭＡ６、ｓｉＭＡＲＳもしくはミスマッチ対照ｓｉＭＡｍｍを用いてエレクトロポレーションされた。細胞数は、ＭＴＴ試験を用いて割り出された。各々の細胞系に存在する融合部位変種に対して相補性を有するｓｉＲＮＡのみが、成長を抑制した。エラー・バーは標準偏差を示す。
【図２Ｅ】ＭＬＬ−ＡＦ４枯渇が、ｔ（４；１１）陽性白血病細胞のコロニー形成および増殖を阻害することを示す。ＳＥＭ細胞およびＲＳ４；１１細胞の細胞周期分布に対するＭＬＬ−ＡＦ４ｓｉＲＮＡの効果を示す。グラフは、表示した周期相（ｃｙｃｌｅ ｐｈａｓｅ）における細胞の割合を示す。細胞周期分布は、図２Ｄに示された経時変化実験から得られた細胞を用いて、表示された日にフロー・サイトメトリーにより割り出された。
【図３Ａ】ＭＬＬ−ＡＦ４枯渇が、ｔ（４；１１）陽性ＳＥＭ細胞およびＲＳ４；１１細胞のアポトーシスを誘導することを示す。サブＧ１細胞の画分に対するＭＬＬ−ＡＦ４抑制の効果を示す。図２Ｄおよび２Ｅに示された経時変化から得られた細胞が、フロー・サイトメトリーによりＤＮＡ量について分析された。
【図３Ｂ】ＭＬＬ−ＡＦ４枯渇が、ｔ（４；１１）陽性ＳＥＭ細胞およびＲＳ４；１１細胞のアポトーシスを誘導することを示す。ＳＥＭ細胞のアネキシンＶ染色を示す。アネキシンＶ陽性ＳＥＭ細胞は、表示したｓｉＲＮＡの７５０ｎＭを用いた２回目のエレクトロポレーションの４日後にフロー・サイトメトリーにより定量化された。アネキシンＶおよびアネキシンＶ／ヨウ化プロピジウム陽性細胞の割合が、対応する象限に示されている。
【図３Ｃ】ＭＬＬ−ＡＦ４枯渇が、ｔ（４；１１）陽性ＳＥＭ細胞およびＲＳ４；１１細胞のアポトーシスを誘導することを示す。ＭＬＬ−ＡＦ４抑制は、カスパーゼ３の活性化を引き起こし、Ｂｃｌ−ＸＬタンパク質レベルを低下させる。免疫ブロットは、タンパク質分解により活性化されたカスパーゼ３およびＢｃｌ−ＸＬタンパク質を示す。チューブリンおよびＧＡＰＤＨは、ローディングコントロールとして提供されている。
【図４】ＭＬＬ−ＡＦ４抑制が、Ｈｏｘａ７およびＨｏｘａ９の遺伝子発現に影響を与えることを示す。総ＲＮＡは、表示されたｓｉＲＮＡの５００ｎＭを用いた２回目のエレクトロポレーションの４８時間後に単離され、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより分析された。エラー・バーは標準偏差を示す。
【図５Ａ】ＭＬＬ−ＡＦ４抑制が、白血病性細胞の生着を減少させることを示す。ＳＥＭ細胞を移植されたＳＣＩＤマウスの生存曲線を示す。ＳＥＭ細胞は移植前に、２回モックエレクトロポレーションされたか、またはｓｉＲＮＡｓｉＭＡ６またはそのミスマッチ対照ｓｉＭＡｍｍを用いて２回エレクトロポレーションされた。ＭＬＬ−ＡＦ４ｅ９−ｅ４特異的ｓｉＲＮＡｓｉＭＡ６での事前処理は、モック事前処理または対照ｓｉＲＮＡ事前処理に比べて顕著に、生存時間の中央値を延長し、生存率全体を増大させた（ログランク検定によればｐ＜０．０１）。
【図５Ｂ】ＭＬＬ−ＡＦ４抑制が、白血病性細胞の生着を減少させることを示す。骨髄のＦＡＣＳ分析を示す。動物の骨髄細胞が、非ヒトＣＤ４５抗体で染色され、フロー・サイトメトリーにより分析された。ｓｉＭＡ６で処理された動物は、ＣＤ４５陽性細胞の数がかなり少なかった。
【図５Ｃ】ＭＬＬ−ＡＦ４抑制が、白血病性細胞の生着を減少させることを示す。肝臓および脾臓の組織構造を示す。原倍率：２００倍、縮尺バー：５０μｍ。モック細胞またはｓｉＭＭ事前処理済み細胞を移植されたマウスは、分析の時点で瀕死状態であった。ｓｉＭＡ６事前処理済み細胞を移植された動物は、白血病関連の病的状態の徴候を示すことなく、移植から２２８日後に死亡した。
【図５Ｄ】ＭＬＬ−ＡＦ４抑制が、白血病性細胞の生着を減少させることを示す。脾臓サイズの比較を示す。左側の脾臓は、モック処理済み動物に由来し、中央の脾臓は、ミスマッチ対照ｓｉＲＮＡｓｉＭＭで処理された動物に由来し、右の脾臓は、ＭＬＬ−ＡＦ４に特異的なｓｉＲＮＡｓｉＭＡ６で処理された動物に由来する。
【図５Ｅ】ＭＬＬ−ＡＦ４抑制が、白血病性細胞の生着を減少させることを示す。器官重量のグラフを表示する。器官重量は全体重に対して正規化された。生存ｓｉＭＡ６群動物の肝臓および脾臓の正規化重量は、モック群またはｓｉＭＭミスマッチ対照群の重量よりも顕著に小さかった（各々、ｐ＜０．０５およびｐ＜０．００１）。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
解説を容易にするために、本明細書では時として、「ヌクレオチド」または「リボヌク
レオチド」という用語を、ＲＮＡ剤の１つまたは複数の単量体サブユニットに関して使用
する。本明細書では、「リボヌクレオチド」または「ヌクレオチド」という用語の使用は
、修飾ＲＮＡまたはヌクレオチド代替物に関する場合、以下でさらに記載するように、１
つまたは複数の位置における、修飾ヌクレオチドまたは代替置換部分も指すことがあると
理解されよう。
【００３５】
本明細書で使用される場合、「ＲＮＡ剤」は、無修飾ＲＮＡ、修飾ＲＮＡ、またはヌク
レオシド代替物であり、これらはすべて本明細書に記載されている。多数の修飾ＲＮＡお
よびヌクレオチド代替物が記載されているが、好ましいものの例には、ヌクレアーゼ分解
に対して、無修飾ＲＮＡが有するものより大きな抵抗性を有するものが含まれる。好まし
いものの例には、２’糖修飾、単一鎖突出部分内、好ましくは３’単一鎖突出部分内の修
飾、あるいは、特に１本鎖の場合、１つもしくは複数のリン酸基または１つもしくは複数
のリン酸基類似体を含有する５’修飾を有するものが含まれる。
【００３６】
本明細書で使用される場合、「ｉＲＮＡ剤」（「干渉ＲＮＡ剤」の略）は、標的遺伝子
、例えば標的融合遺伝子ＭＬＬ−ＡＦ４の発現を下方制御できるＲＮＡ剤である。理論に
拘泥するものではないが、ｉＲＮＡ剤は、当技術分野では時にＲＮＡｉと呼ばれる標的ｍ
ＲＮＡの転写後の切断、または転写前もしくは翻訳前の機構を含めた多数の機構のうちの
１つまたは複数によって作用し得る。ｉＲＮＡ剤は、２本鎖ｉＲＮＡ剤であり得る。
【００３７】
「ｄｓ ｉＲＮＡ剤」（「２本鎖ｉＲＮＡ剤」の略）は、本明細書で使用される場合、
複数、好ましくは２本の鎖を含み、その中で鎖間ハイブリダイゼーションが２本鎖構造領
域を形成できるｉＲＮＡ剤である。本明細書では、「鎖」は、連続したヌクレオチド（天
然には存在しないヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチドも含まれる）の配列を指す。２本
以上の鎖が別々の分子であっても、それらの各鎖が別々の分子の一部を形成してもよく、
また、それらが、例えばリンカー、例えばポリエチレングリコールリンカーによって共有
結合で相互連結され、１分子のみを形成していてもよい。少なくとも１本の鎖は、標的Ｒ
ＮＡに十分に相補的な領域を含むものであり得る。そのような鎖は「アンチセンス鎖」と
称される。アンチセンス鎖に相補的な領域を含むｄｓＲＮＡ剤中に含まれている第２の鎖
は「センス鎖」と称されている。しかしながら、ｄｓ ｉＲＮＡ剤は、少なくとも一部が
自己相補的であり、２本鎖領域を含む、例えばヘアピンまたはフライパンハンドル構造を
形成する単一のＲＮＡ分子から形成されていてもよい。そのような場合、「鎖」という用
語は、同一ＲＮＡ分子の別の領域に相補的なＲＮＡ分子の領域の１つを指す。
【００３８】
哺乳動物細胞では、長いｄｓ ｉＲＮＡ剤によってインターフェロン応答が誘導される
ことがあり、それがしばしば有害であるが、短いｄｓ ｉＲＮＡ剤は、インターフェロン
応答を、少なくとも細胞および／または宿主に有害となる程度までには誘導しない（マン
シュ エル（Ｍａｎｃｈｅ，Ｌ．）ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９２年、第１
２巻、５２３８頁；リー エスビー（Ｌｅｅ，ＳＢ）、エステバン エム（Ｅｓｔｅｂａ
ｎ，Ｍ）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９９４年、第１９９巻、４９１頁；キャステリ ジェー
シー（Ｃａｓｔｅｌｌｉ，ＪＣ）ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９７年、第１８６巻、９
６７頁；チェン エックス（Ｚｈｅｎｇ、Ｘ．）、ベビラクア ピーシー（Ｂｅｖｉｌａ
ｃｑｕａ，ＰＣ）、ＲＮＡ、２００４年、第１０巻、１９３４頁；ハイデル（Ｈｅｉｄｅ
ｌ）ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎ．、２００４年、第２２巻、１５７９頁）。本
発明のｉＲＮＡ剤は、十分に短い分子を含有しており、それらは正常な哺乳動物細胞で有
害な非特異的インターフェロン応答を誘発しない。したがって、対象へのｉＲＮＡ剤組成
物（例えば本明細書に記載の通り製剤化されたもの）の投与を用いて、インターフェロン
応答を回避しながら、上記対象に含まれているＭＬＬ−ＡＦ４融合発現細胞におけるＭＬ
Ｌ−ＡＦ４融合遺伝子の発現をサイレンシングすることができる。十分に短くて、有害な
インターフェロン応答を誘発しない分子を、本明細書では、ｓｉＲＮＡ剤またはｓｉＲＮ
Ａと称する。「ｓｉＲＮＡ剤」または「ｓｉＲＮＡ」は、本明細書で使用される場合、十
分に短くて、ヒト細胞で有害なインターフェロン応答を誘導しないｉＲＮＡ剤、例えばｄ
ｓ ｉＲＮＡ剤を指し、それは例えば６０ヌクレオチド対未満、好ましくは５０、４０、
または３０ヌクレオチド対未満の２本鎖領域を有する。
【００３９】
ｄｓ ｉＲＮＡ剤およびｓｉＲＮＡ剤を含めた、本明細書に記載の単離されたｉＲＮＡ
剤は、例えばＲＮＡ分解によるＭＬＬ−ＡＦ４融合遺伝子のサイレンシングを媒介するこ
とができる。便宜のために、そのようなＲＮＡは、本明細書では、サイレンシングされる
ＲＮＡとも称される。そのような遺伝子は、標的遺伝子とも称される。サイレンシングさ
れるＲＮＡは、例えば白血病細胞のような細胞に対して内因性であるＭＬＬ−ＡＦ４融合
遺伝子の遺伝子産物であることが好ましい。
【００４０】
本明細書で使用される場合、「ＲＮＡｉを媒介する」という用語は、薬剤が標的遺伝子
を配列特異的な様式でサイレンシングする能力を指す。「標的遺伝子をサイレンシングす
る」とは、それによって、上記薬剤に接触していないときに標的遺伝子の特定の産物を含
有および／または分泌する細胞が、上記薬剤に接触しているときに、上記薬剤に接触して
いない同様な細胞と比較して、そのような遺伝子産物を少なくとも１０％、２０％、３０
％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％少なく含有および／または
分泌するであろう過程を意味する。標的遺伝子のそのような産物は、例えば、メッセンジ
ャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、タンパク質、または調節エレメントであり得る。
【００４１】
本明細書で使用される場合、「相補的」という用語は、本発明の化合物と標的ＲＮＡ分
子、例えばＭＬＬ−ＡＦ４ｍＲＮＡ分子との間で安定かつ特異的な結合が生じるのに十分
な程度の相補性を示すのに使用される。特異的な結合は、特異的な結合が望ましい条件下
で、すなわちインビボ試験または治療処置の場合には生理条件下で、あるいはインビトロ
試験の場合では同試験が実施される条件下で、非標的配列へのオリゴマー化合物の非特異
的結合を回避するのに十分な程度の相補性を必要とする。非標的配列は、通常、少なくと
も４ヌクレオチドの相違を有する。
【００４２】
本明細書で使用される場合、ｉＲＮＡ剤が標的ＲＮＡ、例えば標的ｍＲＮＡ（例えば標
的ＭＬＬ−ＡＦ４ｍＲＮＡ）に「十分に相補的である」のは、上記ｉＲＮＡ剤によって、
細胞内での、上記標的ＲＮＡによってコードされたタンパク質の産生が減少する場合であ
る。上記ｉＲＮＡ剤は、標的ＲＮＡに「正確に相補的」（サブユニットを含むＳＲＭＳを
除く）であってもよく、例えば上記標的ＲＮＡと上記ｉＲＮＡ剤とがアニールするもので
もよい。正確に相補的な領域では、ワトソンクリック塩基対のみでハイブリット形成され
ていることが好ましい。「十分に相補的な」ｉＲＮＡ剤は、標的ＭＬＬ−ＡＦ４ＲＮＡに
正確に相補的な内部領域（例えば少なくとも１０ヌクレオチド）を含み得る。さらに、一
部の実施形態では、上記ｉＲＮＡ剤が単一ヌクレオチドの相違を特異的に識別する。この
場合、上記ｉＲＮＡ剤は、単一ヌクレオチド相違の（例えば７ヌクレオチド以内の）領域
で正確な相補性が存在する場合にのみＲＮＡｉを媒介する。好ましいｉＲＮＡ剤は、表１
に示すセンス配列およびアンチセンス配列に基づいているか、もしくはそれからなるか、
もしくはそれを含むであろう。
【００４３】
本明細書での使用において、「本質的には同一」は、第２のヌクレオチド配列と比較し
て第１のヌクレオチド配列に関して使用される場合、最大１、２、または３ヌクレオチド
までの置換（例えばアデノシンがウラシルで置換されている）を除いて、第１のヌクレオ
チド配列が第２のヌクレオチド配列に同一であることを意味する。「培養ヒトＳＥＭ細胞
でＭＬＬ−ＡＦ４発現を阻害する能力を本質的に保持している」ということは、ヌクレオ
チドの欠失、添加または置換によって、表１のｉＲＮＡ剤のうちの１つに同一ではないが
、それに由来するｉＲＮＡ剤に関して本明細書で使用される場合、それが由来した表１の
ｉＲＮＡ剤との比較における、得られたｉＲＮＡ剤の阻害活性の低下が２０％阻害以下で
あることを意味する。例えば、培養ヒトＳＥＭ細胞中に存在するＭＬＬ−ＡＦ４ｍＲＮＡ
の量を４０％低下させる、表１のｉＲＮＡ剤に由来するｉＲＮＡ剤は、培養ヒトＳＥＭ細
胞中でＭＬＬ−ＡＦ４発現を阻害する能力を本質的に保持しているものとみなされるため
には、それ自体が、培養ヒトＳＥＭ細胞中に存在するＭＬＬ−ＡＦ４ｍＲＮＡの量を少な
くとも４０％低下させなければならない。選択的に、本発明に特徴的なｉＲＮＡ剤は、培
養ヒトＳＥＭ細胞中に存在するＭＬＬ−ＡＦ４ｍＲＮＡの量を少なくとも４０％低下させ
るものでもよい。
【００４４】
本明細書で使用される場合、「対象」は、ＭＬＬ−ＡＦ４融合タンパク質発現によって
媒介された障害の治療を受けている哺乳類生物を指す。対象は、ウシ、ウマ、マウス、ラ
ット、イヌ、ブタ、ヤギ、または霊長類など、いかなる哺乳動物でもよい。好ましい実施
形態では、対象はヒトである。
【００４５】
本明細書で使用される場合、ＭＬＬ−ＡＦ４融合発現に関連した障害は、１）、ＭＬＬ
−ＡＦ４融合タンパク質の存在によって一部媒介され、かつ２）存在している、ＭＬＬ−
ＡＦ４融合タンパク質のレベルを低減することによって結果に影響を与えることができる
いかなる生物学的または病理学的状態も指す。ＭＬＬ−ＡＦ４融合発現に関連した特定の
障害について以下に述べる。
【００４６】
（ＭＬＬ−ＡＦ４誤発現に関連した障害）
ＭＬＬ−ＡＦ４融合産物は、乳児急性リンパ芽球性白血病のような急性リンパ芽球性白
血病（ＡＬＬ）に関連していた。ＡＬＬに罹患した患者は典型的には顕著な白血球の増加
と複数の器官における髄外疾患とを呈し、化学療法に対する応答不良であり、予後不良で
ある。
【００４７】
（ｉＲＮＡ剤の設計および選択）
本発明は、ｉＲＮＡ剤でインキュベートした後の培養細胞における、インビトロでのＭ
ＬＬ−ＡＦ４融合遺伝子サイレンシングの実証、およびその結果である増殖抑制効果に基
づいている。
【００４８】
配列情報と望ましい特徴とに基づいて、ｉＲＮＡ剤を合理的に設計することができる。
例えば、候補となる２本鎖の相対的融解温度に従ってｉＲＮＡ剤を設計することができる
。通常、２本鎖は、アンチセンス鎖の３’末端より、アンチセンス鎖の５’末端で、より
低い融解温度を有するはずである。
【００４９】
また、例えば、標的遺伝子として働くであろう遺伝子の遺伝子歩行分析を行うことによ
っても、候補となるｉＲＮＡ剤を設計することができる。転写領域のすべてまたは一部に
相当する、オーバーラップ、隣接、または近接した候補薬剤を生成させ、試験することが
できる。各ｉＲＮＡ剤を、標的遺伝子発現を下方制御する能力に関して試験および評価す
ることができる（下記、「候補となるｉＲＮＡ剤の評価」を参照）。
【００５０】
以下に示す実施例１は、遺伝子歩行のアプローチをヒトＭＬＬ−ＡＦ４ｍＲＮＡの融合
部位を標的とする潜在的なｉＲＮＡ剤を評価するために使用したことを示す。与えられた
結果に基づいて、表１はＭＬＬ−ＡＦ４を標的とする活性ｉＲＮＡ剤を提供している。以
下の実施例に示されるように、表１の薬剤番号１乃至１２のｉＲＮＡ剤は、これらの薬剤
と共にインキュベーションした後の培養ＭＬＬ−ＡＦ４融合遺伝子発現細胞中に存在する
ＭＬＬ−ＡＦ４融合ｍＲＮＡの量が、上記薬剤と共にインキュベートされていない細胞と
比較して４０％超低減するという長所および驚くべき能力を有する。
【００５１】
これらの結果に基づいて、本発明は、表１に示されている薬剤のセンス鎖配列における
少なくとも１５の連続したヌクレオチドを有するセンス鎖と、表１に薬剤番号１−１２に
て示されている薬剤のアンチセンス鎖配列における少なくとも１５の連続したヌクレオチ
ドを有するアンチセンス鎖とを含有するｉＲＮＡ剤を特に提供する。
【００５２】
以下の実施例１に示したｉＲＮＡ剤は、薬剤番号２のものを除いて、長さ２１ヌクレオ
チドのセンス鎖と、長さ２３ヌクレオチドのアンチセンス鎖とで構成されている。しかし
ながら、これらの長さは潜在的に最適であり得るが、上記ｉＲＮＡ剤はこれらの長さに限
定されない。長さが特定の範囲内である場合には、有効性は鎖の長さより、むしろヌクレ
オチド配列の関数であるので、当業者は、より短いｉＲＮＡ剤またはより長いｉＲＮＡ剤
も同様に有効であり得ることを十分に認識している。例えば、ヤン ディ（Ｙａｎｇ，Ｄ
．）ら（ＰＮＡＳ、２００２年、第９９巻、９９４２〜９９４７頁）は、長さが２１塩基
対と３０塩基対との間にあるｉＲＮＡ剤が同様な効力を有することを実証した。他では、
長さ約１５塩基対にまで短くしたｉＲＮＡ剤による効果的な遺伝子サイレンシングが示さ
れている（バイロム ダブリュ．エム．（Ｂｙｒｏｍ，Ｗ．Ｍ．）ら、「Ｉｎｄｕｃｉｎ
ｇ ＲＮＡｉ ｗｉｔｈ ｓｉＲＮＡ Ｃｏｃｋｔａｉｌｓ Ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｂｙ
ＲＮａｓｅ ＩＩＩ」、Ｔｅｃｈ Ｎｏｔｅｓ、第１０（１）巻、アンビオン社（Ａｍ
ｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．）、米国テキサス州オースティン（Ａｕｓｔｉｎ）所在）。
【００５３】
したがって、表１に提示した配列の１つに由来するｉＲＮＡ剤を産生するために、表１
に提示した配列から、１５〜２２ヌクレオチドの間の部分配列を選択することが可能であ
り、かつ本発明で企図されている。代替的に、表１に提示した配列のうちの１つに１個ま
たは数個のヌクレオチドを添加してもよい。この場合、必須ではないが、添加されたヌク
レオチドが標的遺伝子、例えばＭＬＬ−ＡＦ４融合遺伝子のそれぞれの配列に相補的とな
るような様式が好ましい。このようにして派生するすべてのｉＲＮＡ剤もそれらが培養ヒ
トＳＥＭ細胞におけるＭＬＬ−ＡＦ４発現を阻害する能力を本質的に保持するという場合
には、本発明のｉＲＮＡ剤に含まれる。
【００５４】
ｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖は、長さが１４、１５、１６、１７、１８、１９、２５、
２９、４０または５０ヌクレオチド以上であるべきである。上記アンチセンス鎖は、長さ
が６０、５０、４０、または３０ヌクレオチド以下であるべきである。好ましい長さの範
囲は、１５〜３０、１７〜２５、１９〜２３、および１９〜２１ヌクレオチドである。
【００５５】
ｉＲＮＡ剤のセンス鎖は、長さが１４、１５、１６、１７、１８、１９、２５、２９、
４０または５０ヌクレオチド以上であるべきである。上記センス鎖は、長さが６０、５０
、４０または３０ヌクレオチド以下であるべきである。好ましい長さの範囲は、１５〜３
０、１７〜２５、１９〜２３、および１９〜２１ヌクレオチドである。
【００５６】
ｉＲＮＡ剤の２本鎖部分は、長さが１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２
、２３、２４、２５、２９、４０または５０ヌクレオチド対以上であるべきである。上記
２本鎖部分は、長さが６０、５０、４０または３０ヌクレオチド対以下であるべきである
。好ましい長さの範囲は、１５〜３０、１７〜２５、１９〜２３、および１９〜２１ヌク
レオチド対である。
【００５７】
通常、本発明のｉＲＮＡ剤は、ＭＬＬ−ＡＦ４融合遺伝子と十分な相補性を有する領域
を含み、上記ｉＲＮＡ剤またはその断片がＭＬＬ−ＡＦ４融合遺伝子の下方制御を媒介で
きる十分なヌクレオチドの長さを有する。表１のｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖は、ヒトＭ
ＬＬ−ＡＦ４融合遺伝子のｍＲＮＡ配列に完全に相補的であり、それらのセンス鎖は、上
記アンチセンス鎖上の２つの３’末端ヌクレオチドを除いて、上記アンチセンス鎖に完全
に相補的である。しかしながら、上記ｉＲＮＡ剤と上記標的との間に完全な相補性が存在
している必要はなく、但し、それらの対応性は、上記ｉＲＮＡ剤またはそれの切断産物が
、例えばＭＬＬ−ＡＦ４ｍＲＮＡのＲＮＡｉ切断による配列特異的なサイレンシングを誘
導するのを可能にするのに十分でなければならない。
【００５８】
したがって、本発明のｉＲＮＡ剤には、培養ヒトＳＥＭ細胞におけるＭＬＬ−ＡＦ４発
現を阻害する能力を本質的に保持しながら、それぞれ、鎖当たり１、２、または３つ以下
のヌクレオチドが他のヌクレオチドで置換されている（例えばアデノシンがウラシルで置
換されている）ことを除いて、下記に定義する通り、それぞれが、表１の配列の１つに本
質的に同一である少なくとも１６、１７または１８ヌクレオチドの配列からなるセンス鎖
およびアンチセンス鎖からなる薬剤が含まれる。したがって、これらの薬剤は、表１の配
列の１つに同一であるが、標的ＭＬＬ−ＡＦ４ｍＲＮＡ配列に関して、もしくはセンス鎖
とアンチセンス鎖との間に、１、２または３塩基のミスマッチが導入されている少なくと
も１５ヌクレオチドを有するものであろう。標的ＭＬＬ−ＡＦ４ｍＲＮＡ配列とのミスマ
ッチ、特にアンチセンス鎖におけるミスマッチは、末端領域で最もよく許容され、存在す
る場合には、１箇所または複数の端末領域内、例えば５’および／または３’末端の６、
５、４、または３ヌクレオチド以内にあることが好ましく、センス鎖の５’末端またはア
ンチセンス鎖の３’末端の６、５、４、または３ヌクレオチド以内にあることが最も好ま
しい。上記センス鎖は、分子の全体的な２本鎖特性を維持するのに十分なだけアンチセン
ス鎖に相補的であればよい。
【００５９】
上記センス鎖およびアンチセンス鎖は、上記ｉＲＮＡ剤が、その分子の一端または両端
に単一鎖または不対領域を含有するように選択されることが好ましい。したがって、ｉＲ
ＮＡ剤は、好ましくは突出部分、例えば１または２つの５’または３’突出部分、但し好
ましくは２〜３ヌクレオチドの３’突出部分１つを含有するように対合したセンス鎖およ
びアンチセンス鎖を含有する。ほとんどの実施形態は、３’突出部分を有するであろう。
好ましいｓｉＲＮＡ剤は、上記ｉＲＮＡ剤の各末端に長さが１〜４ヌクレオチド、好まし
くは２または３ヌクレオチドの１本鎖の突出部分、好ましくは３’突出部分を有するであ
ろう。上記突出部分は、一方の鎖がもう一方より長い結果、または同じ長さの２本の鎖が
ずれている結果であり得る。５’末端はリン酸化されていることが好ましい。
【００６０】
２本鎖領域の好ましい長さは、１５から３０ヌクレオチドの間、最も好ましくは１８、
１９、２０、２１、２２および２３ヌクレオチドの長さ、例えば上記に論じたｓｉＲＮＡ
剤の範囲である。ｓｉＲＮＡ剤は、長いｄｓＲＮＡからの天然Ｄｉｃｅｒ調製物に長さお
よび構造が類似したものでよい。ｓｉＲＮＡ剤の２本の鎖が、例えば共有結合によって、
連結されている実施形態も含まれる。ヘアピン構造、または必要な２本鎖領域と、好まし
くは３’突出部分とを提供する他の１本鎖構造も本発明に包含される。
【００６１】
（候補となるｉＲＮＡ剤の評価）
候補となるｉＲＮＡ剤を、それが標的遺伝子発現を下方制御する能力に関して評価する
ことができる。例えば、候補となるｉＲＮＡ剤を用意し、標的遺伝子、例えばＭＬＬ−Ａ
Ｆ４融合遺伝子を内因的に発現するか、あるいはＭＬＬ−ＡＦ４融合遺伝子をそれから発
現することができるコンストラクトでトランスフェクションされていることによって発現
する細胞、例えばＳＥＭ細胞に接触させることができる。上記候補となるｉＲＮＡ剤との
接触の前および後の標的遺伝子発現のレベルを、例えばｍＲＮＡまたはタンパク質レベル
で比較することができる。標的遺伝子から発現されたＲＮＡまたはタンパク質の量が、上
記ｉＲＮＡ剤と接触した後に低下していると判定された場合、上記ｉＲＮＡ剤が標的遺伝
子発現を下方制御すると結論付けることができる。細胞中の標的ＭＬＬ−ＡＦ４ＲＮＡま
たはＭＬＬ−ＡＦ４タンパク質のレベルは、いかなる望ましい方法でも測定できる。例え
ば、標的ＲＮＡのレベルは、ノーザンブロット解析、逆転写連結ポリメラーゼ連鎖反応（
ＲＴ−ＰＣＲ）、またはＲＮアーゼプロテクションアッセイで測定することができる。タ
ンパク質のレベルは、例えば、ウェスタンブロット解析または免疫蛍光によって測定する
ことができる。
【００６２】
（ｉＲＮＡ剤の安定性試験、修飾、および再試験）
候補となるｉＲＮＡ剤を、そのｉＲＮＡ剤が対象の体内に導入された際などの安定性、
例えばエンドヌクレアーゼまたはエクソヌクレアーゼによる切断に対する感受性に関して
評価することができる。同方法は、修飾、特に切断、例えば対象の体内に存在する成分に
よる切断の影響を受けやすい部位を同定する方法を利用することができる。
【００６３】
切断の影響を受けやすい部位が同定された場合、例えば切断部位への２’修飾、例えば
２’−Ｏ−メチル基の導入によって、上記潜在的切断部位が切断に抵抗性を有するように
作製された、さらなるｉＲＮＡ剤を設計および／または合成することができる。このさら
なるｉＲＮＡ剤を、安定性に関して再試験することができ、あるｉＲＮＡ剤が望ましい安
定性を示すことが見出されるまで、この工程を繰り返すことができる。
【００６４】
（インビボ試験）
ＭＬＬ−ＡＦ４遺伝子発現を阻害できるものとして同定されたｉＲＮＡ剤を、動物モデ
ル（例えばマウスまたはラットなどの哺乳動物）中でのインビボでの機能に関して試験す
ることができる。例えば、上記ｉＲＮＡ剤を動物、例えばＭＬＬ−ＡＦ４融合遺伝子を発
現するように作製された動物に投与して、その生体内分布、安定性、およびそれがＭＬＬ
−ＡＦ４遺伝子発現を阻害する能力に関して評価することができる。
【００６５】
上記ｉＲＮＡ剤は、注射などによって標的組織に直接投与することができ、あるいは上
記ｉＲＮＡ剤を、それがヒトに投与されるのと同じ様に動物モデルに投与することもでき
る。
【００６６】
上記ｉＲＮＡ剤を細胞内分布に関して評価することもできる。この評価には、上記ｉＲ
ＮＡ剤が細胞内に摂取されたかどうかの判定も含めることができる。この評価には、上記
ｉＲＮＡ剤の安定性（例えば半減期）の測定も含めることができる。ｉＲＮＡ剤のインビ
ボ評価は、追跡可能なマーカー（例えば、フルオレセインなどの蛍光マーカー：３５Ｓ、
３２Ｐ、３３Ｐ、もしくは３Ｈなどの放射性標識；金粒子；または免疫組織化学用抗原粒
子）に結合したｉＲＮＡ剤の使用によって容易に行うことができる。
【００６７】
上記ｉＲＮＡ剤を、それがＭＬＬ−ＡＦ４遺伝子発現を下方制御する能力に関して評価
することができる。インビボでのＭＬＬ−ＡＦ４遺伝子発現のレベルは、例えば、ｉｎ
ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、または上記ｉＲＮＡ剤への組織の曝露の前および後に
おける同組織からのＲＮＡの単離によって測定することができる。組織を採取するために
動物を屠殺する必要がある場合、未処置のコントロール動物が比較対象となろう。標的Ｍ
ＬＬ−ＡＦ４ｍＲＮＡは、限定されるものではないが、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット
、分岐ＤＮＡアッセイ、またはＲＮアーゼプロテクションアッセイを含めたいかなる望ま
しい方法でも検出することができる。代替的又は付随的に、上記ｉＲＮＡ剤で処理された
組織抽出物のウェスタンブロット解析を行うことによって、ＭＬＬ−ＡＦ４遺伝子発現を
モニタリングすることもできる。
【００６８】
（ｉＲＮＡ化学）
ここでは、ＲＮＡｉを媒介して、ＭＬＬ−ＡＦ４の発現を阻害する単離されたｉＲＮＡ
剤、例えばｄｓＲＮＡ剤について述べる。
ここで論じるＲＮＡ剤には、他には無修飾のＲＮＡに加えて、例えば効力を向上させる
ために修飾されたＲＮＡ、およびヌクレオチド代替物のポリマーも含まれる。無修飾のＲ
ＮＡは、その中で、核酸成分、すなわち、糖、塩基、およびリン酸部分が天然に存在して
いるもの、好ましくはヒト体内に生来的に存在しているものと同じであるか、もしくは本
質的に同じである分子を指す。当技術分野は、まれであるか、もしくは一般的でないが、
天然に存在するＲＮＡを修飾ＲＮＡと称することがある。例えば、リンバッハ（Ｌｉｍｂ
ａｃｈ）ら（１９９４年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．第２２巻、２１８３
〜２１９６頁を参照されたい。しばしば修飾ＲＮＡと称される（明らかに、それらが通常
は転写後修飾の結果であるため）、そのようなまれであるか、もしくは一般的でないＲＮ
Ａは、本明細書で使用される場合、無修飾ＲＮＡという用語の範囲内にある。本明細書で
使用される場合、修飾ＲＮＡは、その中で、１つまたは複数の核酸成分、すなわち、糖、
塩基、およびリン酸部分が、天然に存在しているもの、好ましくはヒト体内に生来的に存
在しているものと異なる分子を指す。それらは修飾「ＲＮＡ」と称されるが、それらには
修飾によりＲＮＡではない分子も当然ながら含まれる。ヌクレオチド代替物は、その中で
、ハイブリダイゼーションが実質的にリボリン酸骨格で見られるものと類似するように、
それらの塩基の正しい空間的関係での提示が可能となっている非リボリン酸骨格構造物、
例えばリボリン酸骨格の非荷電模倣体で、リボリン酸骨格が置換されている分子である。
上記のすべての例が本明細書に論じられている。
【００６９】
本明細書に記載の修飾は、本明細書に記載のいかなる２本鎖ＲＮＡおよびＲＮＡ様分子
、例えばｉＲＮＡ剤にも組み入れら得る。上記修飾は、ｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖およ
びセンス鎖の一方または両方を修飾することが望ましい。核酸が重合体のサブユニットま
たは単量体である場合には、下記の修飾の多くは核酸中で反復される位置で起こり、例え
ば、塩基もしくはリン酸部分、またはリン酸部分の非結合性Ｏの修飾である。一部の場合
には、上記修飾が核酸中の対象となる位置のすべてで起こるであろうが、多くの場合、そ
して実際にはほとんどの場合には、そうならないであろう。一例として、修飾は、３’ま
たは５’末端位置でのみ起こることもあり、あるいは末端領域、例えば鎖の末端ヌクレオ
チドの位置または最終２、３、４、５、または１０ヌクレオチドでのみ起こることもある
。修飾は、２本領域に起こっても、１本鎖領域に起こっても、あるいはそれら両方に起こ
ってもよい。例えば、非結合性Ｏの位置でのホスホロチオエート修飾は、一方または両方
の末端で起こることも、あるいは末端領域、例えば鎖の末端ヌクレオチドの位置または最
終２、３、４、５、または１０ヌクレオチドでのみ起こることも、あるいは２本鎖および
１本鎖領域、特に末端で起こることもある。同様に、修飾は、センス鎖で起こることも、
アンチセンス鎖で起こることも、それら両方で起こることもある。一部の場合には、セン
ス鎖およびアンチセンス鎖が同じ修飾または同じクラスの修飾を有するであろう。しかし
ながら、他の場合には、センス鎖およびアンチセンス鎖は異なった修飾を有するであろう
。例えば、一部の場合には、一方の鎖、例えばセンス鎖のみを修飾することが望ましい場
合がある。
【００７０】
ｉＲＮＡ剤に修飾を導入する２つの主要な目的は、生物学的環境における分解に対する
それらの安定化、および下記に詳細に論じる薬理学的特性、例えば薬動力学的特性の改良
である。ｉＲＮＡ剤の糖、塩基、または骨格への他の適当な修飾は、共有されている２０
０４年１月１６日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１１９３号パンフレットに
記載されている。ｉＲＮＡ剤は、共有されている２００４年４月１６日出願の国際出願第
ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１１８２２号パンフレットに記載の塩基のような天然に存在し
ない塩基を含有することもできる。ｉＲＮＡ剤は、非糖質環状担体分子のような天然に存
在しない糖を含むこともできる。ｉＲＮＡ剤で使用する天然に存在しない糖の例示的特性
は、共有されている２００３年４月１６日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／１１
８２９号パンフレットに記載されている。
【００７１】
ｉＲＮＡ剤は、ヌクレアーゼ抵抗性の増強に有用なヌクレオチド間結合（例えばキラル
ホスホロチオエート結合）を含有できる。付随的に、又は代替的に、ヌクレアーゼ抵抗性
を増強させるために、ｉＲＮＡ剤にリボース摸倣体を含有させることができる。ヌクレア
ーゼ抵抗性を増強させるための例示的ヌクレオチド間結合およびリボース模倣体は、共有
されている２００４年３月８日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０７０７０号パ
ンフレットに記載されている。
【００７２】
ｉＲＮＡ剤は、リガンド結合単量体サブユニットおよびオリゴヌクレオチド合成用の単
量体を含有できる。例示的な単量体は、共有されている２００４年８月１０日出願の米国
特許出願第１０／９１６１８５号明細書に記載されている。
【００７３】
ｉＲＮＡ剤は、共有されている２００４年３月８日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０
０４／０７０７０号パンフレットに記載されているようなＺＸＹ構造を有することができ
る。
【００７４】
ｉＲＮＡ剤は、両親媒性部分と複合体形成され得る。ｉＲＮＡ剤と共に使用するための
例示的な両親媒性部分は、共有されている２００４年３月８日出願の国際出願第ＰＣＴ／
ＵＳ２００４／０７０７０号パンフレットに記載されている。
【００７５】
ｉＲＮＡ剤のセンス配列及びアンチセンス配列はパリンドロームであり得る。パリンド
ロームｉＲＮＡ剤の例示的な特徴は、共有されている２００４年３月８日出願の国際出願
第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０７０７０号パンフレットに記載されている。
【００７６】
別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、モジュール複合体の特性を有する送達薬剤と複合体
形成され得る。この複合体は、（ａ）濃縮剤（例えば、核酸を、例えばイオンまたは静電
気相互作用を介して、誘引、例えば結合できる薬剤）；（ｂ）融合誘導剤（例えば、細胞
膜に融合し、かつ／またはそれを通って輸送される性能を有する薬剤）：および、（ｃ）
標的化化学基、例えば細胞または組織標的化剤、例えば特定の細胞型に結合するレクチン
、糖タンパク、脂質、またはタンパク質（例えば抗体）、のうちの１つまたは複数（好ま
しくは２つ以上、より好ましくは３つすべて）に結合される担体物質を含み得る。送達物
質と複合体形成されるｉＲＮＡ剤は、共有されている２００４年３月８日出願の国際出願
第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０７０７０号パンフレットに記載されている。
【００７７】
ｉＲＮＡ剤は、ｉＲＮＡ２本鎖のセンス配列とアンチセンス配列との間などに、非標準
的な対合を備え得る。非標準的なｉＲＮＡ剤の例示的特徴は、共有されている２００４年
３月８日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０７０７０号パンフレットに記載され
ている。
【００７８】
（ヌクレアーゼ抵抗性の強化）
ｉＲＮＡ剤、例えばＭＬＬ−ＡＦ４融合体を標的とするｉＲＮＡ剤は、同薬剤が有する
ヌクレアーゼ抵抗性を強化することができる。
抵抗性を強化する方法の１つは、共有されている２００４年５月４日に出願の米国特許
仮出願第６０／５５９９１７号明細書に記載の通り、切断部位を同定し、そのような部位
を修飾して、切断を阻害することである。例えば、ジヌクレオチド５’−ＵＡ−３’、５
’−ＵＧ−３’、５’−ＣＡ−３’、５’−ＵＵ−３’、又は５’−ＣＣ−３’を切断部
位として利用できる。特定の実施形態では、ｉＲＮＡ剤のすべてのピリミジンが、２’修
飾を有し、そのため、そのｉＲＮＡ剤は、エンドヌクレアーゼに対する抵抗性が強化され
る。ヌクレアーゼ抵抗性の強化は、例えば、共有されている２００４年５月２７日出願の
米国特許仮出願第６０／５７４７４４号明細書に記載の通り、ウリジンが２’修飾ヌクレ
オチドである、少なくとも１つの５’−ウリジン−アデニン−３’（５’−ＵＡ−３’）
ジヌクレオチド；５’−ウリジンが２’修飾ヌクレオチドである、少なくとも１つの５’
−ウリジン−グアニン−３’（５’−ＵＧ−３’）ジヌクレオチド；５’−シチジンが２
’修飾ヌクレオチドである、少なくとも１つの５’−シチジン−アデニン−３’（５’−
ＣＡ−３’）ジヌクレオチド；５’−ウリジンが２’修飾ヌクレオチドである、少なくと
も１つの５’−ウリジン−ウリジン−３’（５’−ＵＵ−３’）ジヌクレオチド；または
５’−シチジンが２’修飾ヌクレオチドである、少なくとも１つの５’−シチジン−シチ
ジン−３’（５’−ＣＣ−３’）ジヌクレオチドをもたらす５’ヌクレオチド修飾を行う
ことによって実現できる。上記ｉＲＮＡ剤は、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なく
とも４つ、または少なくとも５つのそのようなジヌクレオチドを含み得る。
【００７９】
２’修飾ヌクレオチドは、例えば２’修飾されたリボース単位を含み、例えば２’ヒド
ロキシ基（ＯＨ）は、種々の異なった「オキシ」または「デオキシ」置換基で修飾または
置換され得る。
【００８０】
「オキシ」−２’ヒドロキシ基修飾の例には、アルコキシもしくはアリールオキシ（Ｏ
Ｒ、例えばＲ＝Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール
、または糖）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、すなわちＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣ
Ｈ２ＣＨ２ＯＲ；例えばメチレン架橋によって２’ヒドロキシ基が同じリボース糖の４’
炭素に連結されている「ロックト」核酸（ＬＮＡ）、Ｏ−ＡＭＩＮＥ、およびアミノアル
コキシ、すなわちＯ（ＣＨ２）ｎＡＭＩＮＥ（例えば、ＡＭＩＮＥ＝ＮＨ２；アルキルア
ミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、
ヘテロアリールアミノ、またはジへテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ
）が含まれる。メトキシエチル基（ＭＯＥ）（ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、ＰＥＧ誘導体）
のみを含有するオリゴヌクレオチドは、強固なホスホロチオエート修飾で修飾されたもの
に匹敵するヌクレアーゼ安定性を示すことは、注目に値する。
【００８１】
「デオキシ」修飾には、水素（すなわち、デオキシリボース糖、これらは部分的ｄｓＲ
ＮＡの突出部分に特に重要である）；ハロ（例えばフルオロ）；アミノ（例えば、ＮＨ２
；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールア
ミノ、ヘテロアリールアミノ、ジへテロアリールアミノ、またはアミノ酸）；ＮＨ（ＣＨ
２ＣＨ２ＮＨ）ｎＣＨ２ＣＨ２−ＡＭＩＮＥ（ＡＭＩＮＥ＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジ
アルキルアミノ、ヘテロシクリルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロア
リールアミノ、またはジへテロアリールアミノ）、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ（Ｒ＝アルキル、シ
クロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖）、シアノ；メルカプト
；アルキル−チオ−アルキル：チオアルコキシ；及びアルキル、シクロアルキル、アリー
ル、アルケニル、およびアルキニルが含まれ、これらは、選択的に、例えばアミノ官能基
で置換することができる。
【００８２】
好ましい置換基は、２’−メトキシエチル、２’−ＯＣＨ３、２’−Ｏ−アリル、２’
−Ｃ−アリル、および２’−フルオロである。
オリゴヌクレオチド骨格におけるフラノース糖の包含も、エンドヌクレオチド鎖切断を
低減できる。ｉＲＮＡ剤は、さらに３’陽イオン基を包含させることによって、あるいは
３’−３’連結を伴う３’末端でのヌクレオシドの反転によって修飾され得る。別の代替
法では、アミノアルキル基、例えば、３’Ｃ５−アミノアルキルｄＴで３’末端をブロッ
クすることができる。他の３’結合体も、３’−５’エキソヌクレオチド分解性の切断を
阻害できる。理論に拘泥するものではないが、ナプロキセンまたはイブプロフェンなどの
３’結合体は、エクソヌクレアーゼがオリゴヌクレオチドの３’末端に結合するのを立体
的にブロックすることによって、エキソヌレオチド分解性の切断を阻害し得る。小さなア
ルキル鎖、アリール基、または複素環式結合もしくは修飾糖（Ｄ−リボース、デオキシリ
ボース、グルコースなど）でさえも、３’−５’エクソヌクレアーゼをブロックすること
ができる。
【００８３】
ヌクレオチド分解性の切断はまた、リン酸リンカーの修飾、例えばフォスフォロチオエ
ート結合を導入することにより阻害され得る。従って、好ましいｉＲＮＡ剤は、通常は酸
素が占めている架橋部以外の位置にヘテロ原子を含有する修飾リン酸基の特定のキラル形
に関して豊富または純粋であるヌクレオチド２量体を含有する。ヘテロ原子は、Ｓ、Ｓｅ
、Ｎｒ２又はＢｒ３であり得る。へテロ原子がＳである場合、Ｓｐ連結に関して豊富であ
るか、純粋なキラルであることが好ましい。豊富であるとは、少なくとも７０、８０、９
０、９５、または９９％が好ましい形態であることを意味する。修飾リン酸結合は、５’
−又は３’−末端、好ましくは、ｉＲＮＡ剤の５’−末端の位置付近に導入された場合エ
キソヌクレオチド分解性の切断を阻害する上においては特に効果的である。
【００８４】
５’−結合は、５’−３’−エキソヌクレオレチド分解性の切断も阻害する。理論に拘
泥するものではないが、ナプロキセンまたはイブプロフェンなどの５’結合体は、エクソ
ヌクレアーゼがオリゴヌクレオチドの５’末端に結合するのを立体的にブロックすること
によって、エキソヌクレオレチド分解性の切断を阻害し得る。小さなアルキル鎖、アリー
ル基、または複素環式結合もしくは修飾糖（Ｄ−リボース、デオキシリボース、グルコー
スなど）でさえも、３’−５’−エクソヌクレアーゼをブロックすることができる。
【００８５】
ｉＲＮＡ剤は、２本鎖ｉＲＮＡ剤が少なくとも一方の末端に１本鎖ヌクレオチド突出部
分を含有している場合に、ヌクレアーゼに対する抵抗性を増大させることができる。好ま
しい実施形態では、上記ヌクレオチド突出部分は、１乃至４個の、好ましくは２乃至３個
の不対ヌクレオチドを含有する。好ましい実施形態では、末端ヌクレオチド対に直接隣接
している上記１本鎖の突出部分の不対ヌクレオチドがプリン塩基を含有し、上記末端ヌク
レオチド対がＧ−Ｃ対であるか、もしくは相補的な最終４ヌクレオチド対のうち少なくと
も２対がＧ−Ｃ対である。さらに別の実施形態では、上記ヌクレオチド突出部分は、１ま
たは２つの不対ヌクレオチドを有することがあり、例示的実施形態では、上記ヌクレオチ
ド突出部分が５’−ＧＣ−３’である。好ましい実施形態では、上記ヌクレオチド突出部
分が、上記アンチセンス鎖の３’端にある。一実施形態では、上記ｉＲＮＡ剤は、２ｎｔ
の突出部分５’−ＧＣ−３’が形成されるように、上記アンチセンス鎖の３’末端に５’
−ＣＧＣ−３’というモチーフを含有する。
【００８６】
したがって、ｉＲＮＡ剤は、例えば対象の体内に存在するヌクレアーゼ、例えば、エン
ドヌクレアーゼまたはエクソヌクレアーゼによる分解を阻害するように修飾された単量体
を含有できる。これらの単量体は、本明細書ではＮＲＭすなわちヌクレアーゼ抵抗性促進
単量体と称され、対応する修飾は、ＮＲＭ修飾と称される。多くの場合、これらの修飾は
、ｉＲＮＡ剤の他の特性、例えばタンパク質、例えば運搬体タンパク質、例えば血清アル
ブミンまたはＲＩＳＣのメンバー、と相互作用する能力、または第１の配列および第２の
配列の、お互いと２本鎖を形成する能力、もしくは別の配列、例えば標的分子と２本鎖を
形成する能力、も調節するであろう。
【００８７】
１つまたは複数の異なったＮＲＭ修飾を、ｉＲＮＡ剤の中、または、ｉＲＮＡ剤の配列
の中に導入することができる。１つの配列中またはｉＲＮＡ剤中で１つのＮＲＭ修飾を複
数回用いることができる。
【００８８】
ＮＲＭ修飾には、末端にのみ配置できる一部のものも、いかなる位置にも配置できる他
のものも含めることができる。一部のＮＲＭ修飾は、ハイブリダイゼーションを抑制する
可能性があり、したがって、それらは末端領域のみで使用するのが好ましく、それらを切
断部位、または対象の配列もしくは遺伝子を標的とする配列、特にアンチセンス鎖上の切
断領域にて用いないことが好ましい。それらは、上記ｄｓ ｉＲＮＡ剤の２つの鎖の間で
十分なハイブリダイゼーションが維持される場合に、センス鎖の任意の場所にて使用でき
る。一部の実施形態では、ＮＲＭが標的外のサイレンシングを最小にし得るので、ＮＲＭ
を切断部位またはセンス鎖の切断領域に配置するのが望ましい。
【００８９】
ほとんどの場合、ＮＲＭ修飾は、それらがセンス鎖に含まれるか、もしくはアンチセン
ス鎖に含まれるかに応じて異なって分配されるであろう。アンチセンス鎖に含まれる場合
には、エンドヌクレアーゼ切断を妨害または阻害する修飾は、ＲＩＳＣ媒介の切断を受け
る領域、例えば切断部位または切断領域に挿入されるべきでない（本願明細書に援用する
、エルバシル（Ｅｌｂａｓｈｉｒ）ら、２００１年、Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖ．第１
５巻、１８８頁に記載されている）。標的の切断は、２０または２１ｎｔのアンチセンス
鎖のほぼ中央、すなわち上記アンチセンス鎖に相補的な標的ｍＲＮＡの最初のヌクレオチ
ドの上流のほぼ１０または１１ヌクレオチドで起こる。本明細書で使用される場合、切断
部位は、標的またはそれにハイブリダイズするｉＲＮＡ剤の鎖における、切断部位のいず
れかの側のヌクレオチドを指す。切断領域は、いずれかの方向における、上記切断部位の
１、２、または３ヌクレオチド以内にあるヌクレオチドを意味する。
【００９０】
そのような修飾は、末端領域、例えばセンス鎖またはアンチセンス鎖の末端位置、また
は上記末端の２、３、４、もしくは５番目の位置を含めた位置に導入することができる。
（テザーリガンド）
薬理学的特性を含めたｉＲＮＡ剤の特性は、リガンド、例えば、テザーリガンドを導入
することによって、影響を受け、調整され得る。
【００９１】
多種多様な構成要素、例えば、リガンドを、ｉＲＮＡ剤、例えば、リガンド結合単量体
サブユニットの担体に連結することができる。リガンド結合単量体サブユニットの場合に
ついて以下にその例を説明するが、これは単に好適な例に過ぎず、同構成要素はｉＲＮＡ
剤のその他の点にも結合することができる。
【００９２】
好ましい部分は、干渉テザー（ｔｅｔｈｅｒ）を介して直接的または間接的に担体に、
好ましくは共有結合するリガンドである。好ましい実施形態では、このリガンドは干渉テ
ザーを介して担体に結合される。リガンド結合単量体が伸長する鎖に取り込まれるとき、
リガンドまたはテザーリガンドは、リガンド結合単量体上に存在し得る。いくつかの実施
形態では、このリガンドは、「前駆体」リガンド結合単量体サブユニットが伸長する鎖に
取り込まれた後で、同「前駆体」リガンド結合単量体サブユニットに取り込まれる。例え
ば、ＴＡＰ−（ＣＨ２）ｎＮＨ２などのアミノ末端テザーなどを有する単量体は、伸長す
るセンスまたはアンチセンス鎖に取り込まれてよい。その後の操作において、すなわち、
前駆体単量体サブユニットが鎖に取り込まれた後で、求電子基、例えば、ペンタフルオロ
フェニルエステルまたはアルデヒド基を有するリガンドは、リガンドの求電子基と前駆体
リガンド結合単量体サブユニットテザーの末端求核基との結合によって、その後前駆体リ
ガンド結合単量体に結合され得る。
【００９３】
好ましい実施形態では、リガンドは、取り込まれたｉＲＮＡ剤の分布、標的化または寿
命を改変する。好ましい実施形態では、リガンドは、例えば、このようなリガンドを備え
ていない種と比較して、選択した標的、例えば、分子、細胞または細胞種、細胞区画もし
くは器官区画などの区画、組織、器官または身体の領域に対する親和性を増強する。
【００９４】
好ましいリガンドは、輸送、ハイブリダイゼーションおよび特異性の特性を改善するこ
とができ、得られた天然もしくは修飾オリゴリボヌクレオチド、または本明細書で説明し
た単量体および／または天然もしくは修飾リボヌクレオチドの任意の組合せを含むポリマ
ー分子のヌクレアーゼ抵抗性も改善することができる。
【００９５】
一般的に、リガンドは、例えば、取り込みを高めるための治療調節剤、例えば、分布を
モニタリングするための診断用化合物もしくはレポーター群、架橋剤、ヌクレアーゼ抵抗
性を付与する部分および天然もしくは通常にはない核塩基を含むことができる。一般的な
例には、脂溶性分子、脂質、レクチン、ステロイド（例えば、ウバオール、ヘシゲニン（
ｈｅｃｉｇｅｎｉｎ）、ジオスゲニン）、テルペン（例えば、トリテルペン、例えば、サ
ルササポゲニン、フリーデリン、エピフリーデラノール誘導体化リトコール酸）、ビタミ
ン、炭水化物（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロ
デキストリンまたはヒアルロン酸）、タンパク質、タンパク質結合剤、インテグリン標的
化分子、ポリカチオン、ペプチド、ポリアミンおよびペプチド模倣体が含まれる。
【００９６】
リガンドは、天然物質または組換えもしくは合成分子、例えば、合成ポリアミノ酸など
の合成ポリマーであり得る。ポリアミノ酸の例には、ポリリジン（ＰＬＬ）、ポリＬ−ア
スパラギン酸、ポリＬ−グルタミン酸、スチレン−無水マレイン酸コポリマー、ポリ（Ｌ
−ラクチド−コ−グリコリド）コポリマー、ジビニルエーテル−無水マレイン酸コポリマ
ー、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリエ
チレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（
２−エチルアクリル酸）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマーまたはポリホスファ
ジンが含まれる。ポリアミンの例には、ポリエチレンイミン、ポリリジン（ＰＬＬ）、ス
ペルミン、スペルミジン、ポリアミン、シュードペプチドポリアミン、ペプチド様ポリア
ミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、陽イオン部分、例
えば、陽イオン性脂質、陽イオン性ポルフィリン、ポリアミンの４級塩またはアルファヘ
リックスペプチドが含まれる。
【００９７】
リガンドにはまた、標的化化学基、例えば、細胞または組織標的化剤、例えば、甲状腺
刺激ホルモン、メラニン細胞刺激ホルモン、サーファクタントタンパク質Ａ、ムチン炭水
化物、グリコシル化ポリアミノ酸、トランスフェリン、ビスホスホン酸、ポリグルタミン
酸、ポリアスパラギン酸、またはＲＧＤペプチドもしくはＲＧＤペプチド模倣体が含まれ
る。
【００９８】
リガンドは、例えば糖タンパク質、例えば低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）のようなリ
ポタンパク質、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）のようなアルブミン、又はペプチドのよう
なタンパク質、コ−リガンドに対して特異的な親和性を有する分子、或いは癌細胞、内皮
細胞又は骨細胞のような特定のタイプの細胞に結合する抗体のような抗体であり得る。リ
ガンドはまた、ホルモン及びホルモン受容体を含み得る。それらはまた、補因子、多価ラ
クトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサ
ミン、多価マンノース又は多価フコースのような非ペプチド種を含み得る。リガンドは、
例えばリポ多糖体、ｐ３８ＭＡＰキナーゼのアクチベータ又はＮＦ−κＢのアクチベータ
であり得る。
【００９９】
リガンドは、例えば、細胞骨格を破壊することによって、例えば、細胞の微小管、微小
繊維および／または中間径繊維を破壊することによって、細胞へのｉＲＮＡ剤の取り込み
を増加させることができる物質、例えば、薬剤であり得る。この薬剤は、例えば、タキソ
ン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャプラキノリ
ド（ｊａｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅ）、ラトランクリンＡ、ファロイジン、スウィンホライ
ドＡ、インダノシンまたはミオセルビン（ｍｙｏｓｅｒｖｉｎ）であり得る。
【０１００】
一態様では、リガンドは脂質または脂質をベースにした分子である。このような脂質ま
たは脂質をベースにした分子は、血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ
）に結合することが好ましい。ＨＳＡ結合リガンドは、標的組織、例えば、肝臓の実質細
胞を含めた肝組織との結合体の分布を可能にする。ＨＳＡに結合できるその他の分子もリ
ガンドとして使用できる。例えば、ネプロキシン（ｎｅｐｒｏｘｉｎ）またはアスピリン
を使用できる。脂質または脂質をベースにしたリガンドは、（ａ）結合体の分解に対する
抵抗性を増強し、（ｂ）標的細胞または細胞膜への標的化または輸送を増強し、および／
または（ｃ）血清タンパク質、例えば、ＨＳＡへの結合を調節するために使用することが
できる。
【０１０１】
脂質をベースにしたリガンドは、標的組織に対する結合体の結合を調節するために、例
えば、制御するために使用され得る。例えば、ＨＳＡに一層強力に結合する脂質または脂
質をベースにしたリガンドは、腎臓を標的とする傾向が少なく、したがって、身体から排
出される傾向が低い。ＨＳＡにあまり強く結合しない脂質または脂質をベースにしたリガ
ンドは、結合体を腎臓に対する標的とするために使用することができる。
【０１０２】
好ましい実施形態では、脂質をベースにしたリガンドはＨＳＡに結合する。これは、結
合体が好ましくは腎臓以外の組織に分布するような十分な親和性で同ＨＳＡに結合するこ
とが好ましい。しかしながら、この親和性はＨＳＡリガンドの結合が離れることできない
ほど強力ではないことが好ましい。
【０１０３】
別の態様では、リガンドは、標的細胞によって、例えば増殖細胞によって取り込まれる
部分、例えば、ビタミンまたは栄養素である。これらは、例えば、悪性型または非悪性型
の、例えば、癌細胞の、望ましくない細胞増殖を特徴とする障害を治療するために特に有
用である。ビタミンの例には、ビタミンＡ、ＥおよびＫが含まれる。その他のビタミンの
例は、ビタミンＢ群、例えば、葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサール
または癌細胞によって取り込まれるその他のビタミンもしくは栄養素である。
【０１０４】
別の態様では、リガンドは、細胞透過性薬剤、好ましくはヘリックス細胞透過性薬剤で
ある。この薬剤は両親媒性であることが好ましい。薬剤の例は、ｔａｔまたはアンテナペ
ディアなどのペプチドである。この薬剤がペプチドの場合、修飾可能であり、ペプチジル
模倣体、反転異性体（ｉｎｖｅｒｔｏｍｅｒ）、非ペプチドまたは偽ペプチド結合が含ま
れ、Ｄアミノ酸も使用できる。ヘリックス剤は、好ましくは親油性相および疎油性相を有
するアルファヘリックス剤であることが好ましい。
【０１０５】
（５’−リン酸修飾）
好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、５’がリン酸化されているか、または５’プラ
イム末端にホスホリル類似体を含む。アンチセンス鎖の５’−リン酸修飾には、ＲＩＳＣ
媒介遺伝子サイレンシングに適合したものが含まれる。適切な修飾には、５’−モノホス
ファート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）；５’−ジホスファート（（ＨＯ）２（Ｏ）
Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−トリホスファート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ
−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−グアノシンキャッ
プ（７−メチル化または非メチル化）（７ｍ−Ｇ−Ｏ−５’−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（
ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−アデノシンキャップ（Ａｐ
ｐｐ）、および任意の修飾または非修飾ヌクレオチドキャップ構造（Ｎ−Ｏ−５’−（Ｈ
Ｏ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−モノ
チオホスファート（ホスホロチオエート；（ＨＯ）２（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５’）；５’−モノ
ジチオホスファート（ホスホロジチオエート；（ＨＯ）（ＨＳ）（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５’）、
５’−ホスホロチオラート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｓ−５’）；酸素／硫黄で置換された
モノホスファート、ジホスファートおよびトリホスファート（例えば、５’−アルファ−
チオトリホスファート、５’−ガンマ−チオトリホスファートなど）の任意の更なる組み
合わせ、５’−ホスホロアミデート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−ＮＨ−５’、（ＨＯ）（ＮＨ
２）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’−アルキルホスホネート（Ｒ＝アルキル＝メチル、エチ
ル、イソプロピル、プロピルなど、例えば、ＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）−Ｏ−５’−、（ＯＨ）
２（Ｏ）Ｐ−５’−ＣＨ２−）、５’−アルキルエーテルホスホネート（Ｒ＝アルキルエ
ーテル＝メトキシメチル（ＭｅＯＣＨ２−）、エトキシメチル、など、例えば、ＲＰ（Ｏ
Ｈ）（Ｏ）−Ｏ−５’−）が含まれる。
【０１０６】
センス鎖は、同センス鎖を不活性化し、活性型ＲＩＳＣの形成を阻止し、それによって
標的外効果を潜在的に減少させるために修飾され得る。これは、センス鎖の５’−リン酸
化を阻止する修飾によって、例えば、５’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドで修飾すること
によって実現することができる（ニカネン（Ｎｙｋａｅｎｅｎ）ら、２００１年、「ＡＴ
Ｐ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ａｎｄ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ
ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｉｎ ｔｈｅ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｐａｔｈｗ
ａｙ．」Ｃｅｌｌ、第１０７巻、３０９〜３２１頁を参照のこと）。リン酸化を阻止する
その他の修飾、例えば、Ｏ−ＭｅよりもＨによる５’−ＯＨの簡単な置換も使用され得る
。代替的に、大きな嵩高い基を５’−リン酸塩に添加して、ホスホジエステル結合に変更
してもよい。
【０１０７】
（ｉＲＮＡ剤の細胞への輸送）
理論に結びつけることは望まないが、コレステロール結合ｉＲＮＡ剤とリポタンパク質
のある種の成分（例えば、コレステロール、コレステリルエステル、リン脂質）との間の
化学的類似性は、ｉＲＮＡ剤と血液中のリポタンパク質（例えば、ＬＤＬ、ＨＤＬ）との
結合および／またはｉＲＮＡ剤とコレステロールに親和性を有する細胞成分、例えば、コ
レステロール輸送経路の成分との相互作用を引き起こす可能性がある。リポタンパク質な
らびにその成分は、細胞によって、様々な能動的および受動的輸送機構によって、例えば
、限定はしないが、ＬＤＬ受容体結合ＬＤＬのエンドサイトーシス、酸化された、もしく
はその他の修飾をされたＬＤＬのスカベンジャー受容体Ａとの相互作用によるエンドサイ
トーシス、肝臓におけるＨＤＬコレステロールのスカベンジャー受容体Ｂ１の媒介による
取り込み、ピノサイトーシスまたはＡＢＣ（ＡＴＰ結合カセット）輸送タンパク質、例え
ば、ＡＢＣ−Ａ１、ＡＢＣ−Ｇ１もしくはＡＢＣ−Ｇ４によるコレステロールの膜通過輸
送によって取り込まれ、処理される。したがって、コレステロール結合ｉＲＮＡ剤は、こ
のような輸送機構を有する細胞、例えば、肝臓の細胞による取り込みの促進を受けること
ができた。このように、本発明は、このような成分（例えば、コレステロール）の天然リ
ガンドをｉＲＮＡ剤に結合させるか、またはこの成分（例えば、ＬＤＬ、ＨＤＬ）の天然
リガンドと関連する、もしくは結合するｉＲＮＡ剤に化学的部分（例えば、コレステロー
ル）を結合させることによって、ある種の細胞表面成分、例えば、受容体を発現する細胞
にｉＲＮＡ剤を標的化させる証拠および一般的方法を提供する。
【０１０８】
（その他の実施形態）
ＲＮＡ、例えば、ｉＲＮＡ剤は、インビボにおいて、例えば、細胞に送達された外来Ｄ
ＮＡ鋳型から細胞内で産生され得る。例えば、このＤＮＡ鋳型は、ベクターに挿入され、
遺伝子治療ベクターとして使用され得る。遺伝子治療ベクターは、例えば、静脈注射、局
所投与によって（米国特許第５３２８４７０号）、または定位注射によって（例えば、チ
ェン（Ｃｈｅｎ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、ＵＳＡ、第９１巻、３０
５４〜３０５７頁、１９９４年）対象に送達され得る。遺伝子治療ベクターの医薬調製物
は、許容できる希釈剤中に遺伝子治療ベクターを含むことができ、または遺伝子送達担体
が包埋された徐放性マトリックスを含み得る。ＤＮＡ鋳型は、例えば、２個の転写単位を
含むことができ、一方はｉＲＮＡ剤の上鎖を含む転写物を生成し、他方はｉＲＮＡ剤の下
鎖を含む転写物を生成する。この鋳型が転写されたとき、ｉＲＮＡ剤が生成され、遺伝子
サイレンシングを媒介するｓｉＲＮＡ剤断片に処理される。
【０１０９】
（製剤）
本明細書で説明したｉＲＮＡは、対象に投与するために製剤化することができる。
説明を容易にするために、この項における製剤、組成物および方法は、ほとんどは無修
飾ｉＲＮＡ剤に関して論じる。しかしながら、これらの製剤、組成物および方法は、その
他のｉＲＮＡ剤、例えば、修飾ｉＲＮＡ剤で実施することができ、このような実施は本発
明の範囲内であることを理解されたい。
【０１１０】
製剤化されたｉＲＮＡ剤組成物は、様々な状態をとることができる。いくつかの例では
、この組成物は少なくとも部分的な結晶、均一な結晶、および／または無水物（例えば、
水分が８０、５０、３０、２０または１０％未満）である。他の例では、ｉＲＮＡ剤は水
相、例えば、水を含む溶液に含まれている。
【０１１１】
水相または結晶組成物を、例えば、送達媒体、例えば、リポソーム（特に水相用）また
は粒子（例えば、結晶組成物に適し得る微粒子）に取り込むことができる。一般的に、ｉ
ＲＮＡ剤組成物は、企図した投与方法に適合する方法で製剤化される。
【０１１２】
ｉＲＮＡ剤調製物は、他の薬剤、例えば、他の治療剤またはｉＲＮＡ剤を安定化する薬
剤、例えば、ｉＲＮＰを形成するためにｉＲＮＡ剤と複合体化するタンパク質と、組み合
わせて、製剤化することができる。さらに他の薬剤には、キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ
（例えば、Ｍｇ２＋などの２価陽イオンを除去するため）、塩、ＲＮアーゼ阻害剤（例え
ば、ＲＮＡｓｉｎなどの特異性の広いＲＮアーゼ阻害剤）などが含まれる。
【０１１３】
一実施形態では、ｉＲＮＡ剤調製物には、２個以上のｉＲＮＡ剤（類）、例えば、第２
の遺伝子に関して、又は同一遺伝子に関してＲＮＡｉを媒介する第２のｉＲＮＡ剤を含む
。更に他の調製物には、少なくとも３個、５個、１０個、２０個、５０個または１００個
以上の異なるｉＲＮＡ剤種を含めることができる。このようなｉＲＮＡ剤は、同数の異な
る遺伝子に関してＲＮＡｉを媒介することができる。
【０１１４】
このような調製物中の２個以上のｉＲＮＡが同一遺伝子を標的とする場合、それらは重
複も隣接もしていない標的配列を有すること可能で、あるいはこの標的配列は重複してい
ても隣接していてもよい。
【０１１５】
選択的に、本発明のｉＲＮＡ剤は、リポソームを用いて製剤化され得る。種々の組成の
リポソームが種々の製薬的に活性な成分を部位特異的に送達するために使用され得る（ヴ
ィッチ，シー．（Ｗｉｔｓｃｈｉ Ｃ）ら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．、１９９９年、第１６
巻、３８２−３９０頁、イェ，エム．ケイ．（Ｙｅｈ，Ｍ．Ｋ．）ら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅ
ｓ．、１９９６年、１６９３−１６９８頁）。リポソームとカーゴ（ｃａｒｇｏ）との間
の相互作用は通常、特にカチオン性脂質送達系では疎水性の相互作用又は電荷の引力に依
存する（ゼルファティ，オー．（Ｚｅｌｐｈａｔｉ，Ｏ．）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．、２００１年、第２７６巻、３５１０３−３５１１０頁）。ＨＩＶ ｔａｔペプチド保
持リポソームはまた、エンドサイトーシス経路を迂回して、カーゴを直接細胞質に送達す
るために構築され、かつ使用されてきた（トルチリン，ブイ．ピー．（Ｔｏｒｃｈｉｌｉ
ｎ、Ｖ．Ｐ．）ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｏｉｐｈｙｓ．Ａｃｔａ−Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎ
ｅｓ、２００１年、第１５１１巻、３９７−４１１頁、トルチリン，ブイ．ピー．ら、Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、２００１年、第９８巻、８７８６−８７
９１頁）。糖グラフトリポソームに封入されると、イセチオン酸ペンタミジン及び誘導体
は、通常のリポソームに封入された薬物或いはフリーの薬物と比較してより効果的である
ことが発見された（バネリー，ジー．（Ｂａｎｅｒｊｅｅ，Ｇ．）ら、Ｊ．Ａｎｔｉｍｉ
ｃｒｏｂ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、１９９６年、第３８（１）巻、１４５−１５０頁）。
温度感受性のタキソールのリポソーム製剤（熱媒介型標的化薬物送達）は、局所的な高温
療法と組み合わせて腫瘍を有するマウスにインビボで投与したところ、高温療法を組み合
わせた、又は組み合わせていない、同用量のフリーのタキソールと比較して、腫瘍体積が
有意に低減し、生存時間の増加が観察された（シェルマ，ディー．（Ｓｈｅｒｍａ，Ｄ．
）ら、Ｍｅｌａｎｏｍａ Ｒｅｓ．、１９９８年、第８（３）巻、２４０−２４４頁）。
インシュリン、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、及びプロスタグランジンＥ１の送達のためにリ
ポソーム製剤を局所に適用することは、ある程度の成功を収めている（セビッチ ジー．
（Ｃｅｖｃ Ｇ．）ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙ，Ａｃｔａ、１９９８年、第１３
６８巻、２０１−２１５頁、フォルドバリ エム．（Ｆｏｌｄｖａｒｉ Ｍ．）ら、Ｊ．
Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｒｅｓ．、１９９７年、第７巻、１１５−１２６頁、ショート エス
．エム．（Ｓｈｏｒｔ Ｓ．Ｍ．）ら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．、１９９６年、第１３巻、
１０２０−１０２７頁、フォルドバリ エム．ら、Ｕｒｏｌｏｇｙ、１９９８年、第５２
（５）巻、８３８−８４３頁、米国特許第５８５３７５５号明細書）。
【０１１６】
抗体は、リポソームを組織特異的又は細胞特異的に取り込む別の標的装置の代表である
（マストロバティスタ，イ−．（Ｍａｓｔｒｏｂａｔｔｉｓｔａ，Ｅ．）ら、Ｂｉｏｃｈ
ｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙ，Ａｃｔａ、１９９９年、第１４１９（２）巻、３５３−３６３頁、
マストロバティスタ，イ−．ら、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．、１９９９年
、第４０（１−２）巻、１０３−１２７頁）。リポソームのアプローチは、封入された活
性成分が徐々に放出されるという能力、免疫系及びタンパク質分解酵素を回避できるとい
う能力、腫瘍を標的化して腫瘍組織への優先的な蓄積及びその漏出しやすい新生血管から
の管外遊出による転移を引き起こす能力を含む種々の利点を提供する。例えばポリビニル
ピロリドンナノ粒子及びマレイレート化ウシ血清アルブミンのようなその他の担体も抗癌
剤を新生物細胞に送達するために使用され得る（シャルマ，ディ．（Ｓｈａｒｍａ、Ｄ．
）ら、Ｏｎｃｌ．Ｒｅｓ．、１９９６年、第８（７−８）巻、２８１−２８６頁、ムクホ
パディアイ，エイ．（Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ，Ａ．）ら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、１
９９５年、第３７６（１−２）巻、９５−９８頁）。従って、非常に多様性かつ合理的な
設計及び修飾が容易である標的化及び封入技術を使用して、本発明のｉＲＮＡ剤の所望と
する細胞への送達が容易になる。
【０１１７】
上記したように、本発明の製薬組成物はリポソーム成分を含み得る。本発明に従って、
リポソームは細胞の原形質膜と融合可能な脂質成分からなり、それにより、同リポソーム
がカーゴ、即ち核酸分子組成物を細胞に送達可能となる。幾らかの好ましいリポソームは
、当業者に周知である遺伝子送達法において一般的に使用されるリポソームを含む。幾ら
かの好ましいリポソーム送達ビヒクルは、多重膜リポソーム（ＭＬＶ）、脂質及び押出脂
質（Ｅｘｔｒｕｄｅｄ ｌｉｐｉｄ）を含むが、本発明はそのようなリポソームに限定さ
れるものではない。ＭＬＶを調製する方法は当業者には周知である。押出脂質もまた意図
される。押出脂質は、ＭＬＶ脂質と同様に調製される脂質であるが、その全体の内容が本
明細書において援用されているテンプレトン（Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ）らの文献（Ｎａｔｕ
ｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１９９７年、第１５巻、６４７−６５２頁）に記載されている
ように、調製後にサイズの小さいフィルタから押し出されるものである。小さな単層リポ
ソーム（ＳＵＶ）もまた、本発明の組成物及び方法において使用され得る。その他好まし
いリポソーム送達ビヒクルはポリカチオン脂質組成物を有するリポソーム（即ち、カチオ
ン性リポソーム）を含む。例えば、カチオン性リポソーム組成物は、コレステロールと複
合体化される任意のカチオン性リポソームを含むが、限定されることなく、ＤＯＴＭＡ及
びコレステロール、ＤＯＴＡＰ及びコレステロール、ＤＯＴＩＭ及びコレステロール、及
びＤＤＡＢ及びコレステロールを含む。本発明で使用されるリポソームは、約１０乃至１
０００ナノメートル（ｎｍ）の範囲を含む任意のサイズ又はその間の任意のサイズであり
得る。
【０１１８】
リポソーム送達ビヒクルは、哺乳動物の特定の部位を標的化するために修飾され得、そ
れによりその部位において本発明のｉＲＮＡ剤を標的化し、かつ使用する。適切な修飾は
、送達ビヒクルの脂質部分の化学式を操作することを含む。送達ビヒクルの脂質部分の化
学式の操作は、同送達ビヒクルの細胞外及び細胞内標的化を誘導する。例えば、リポソー
ムの脂質二重層の電荷を変える化学物質をリポソームの脂質の化学式に加え、それにより
同リポソームは特定の電荷特性を有する特定の細胞と融合する。一実施形態において、外
因性の標的分子をリポソームに添加することによる標的化（即ち、抗体）のようなその他
の標的化機構は本発明のリポソームの必要な成分とはならない。その理由は、免疫学的に
活性な器官における効果的な免疫活性は、送達経路が静脈内又は腹腔内である場合には、
更なる標的化機構の援助がなくても組成物により既に提供され得るからである。しかしな
がら、幾らかの実施形態において、リポソームは、標的分子が結合し得る特定の細胞又は
組織を標的化するために、同リポソームに組み込まれ得る抗体、可溶性レセプター又はリ
ガンドのような標的化剤を使用して、特定の標的細胞又は組織に指向され得る。リポソー
ムの標的化は、例えば、ホ（Ｈｏ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８６年、第２５
巻、５５００−６頁、ホら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、１９８７年ａ、第２６２巻、１３
９７９−８４頁、ホら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、１９８７年ｂ、第２６２巻、１３９７
３−８頁及びハン（Ｈｕａｎｇ）らの米国特許第４９５７７３５号明細書に記載されてお
り、それらの各文献は、本明細書においてその全体が参照により援用される。一実施形態
において、血漿タンパク質又はその他の要因によるリポソームのオプソニン化に起因する
細網内皮系細胞による注入リポソームの効果的な取り込みを回避することが望ましい場合
には、ガングリオシド（アレン（Ａｌｌｅｎ）ら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ、１９８７年、第
２２３巻、４２−６頁）又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）由来の脂質（クリバノフ
（Ｋｌｉｂａｎｏｖ）ら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ、１９９０年、第２６８巻、２３５−７頁
）のような親水性の脂質が従来のリポソームの二重層内に組み込まれ、いわゆる立体的に
安定化した、即ち「ステルス」リポソームが形成される（ウッドル（Ｗｏｏｄｌｅ）ら、
Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙ Ａｃｔａ、１９９２年、第１１１３巻、１７１−９９頁
）。そのようなリポソームの変更例は、例えば、ウンガー（Ｕｎｇｅｒ）らに付与された
米国特許第５７０５１８７号明細書、チョイ（Ｃｈｏｉ）らに付与された米国特許第５８
２０８７３号明細書、チロシュ（Ｔｉｒｏｓｈ）らに付与された米国特許第５８１７８５
６号明細書、タガワ（Ｔａｇａｗａ）らに付与された米国特許第５６８６１０１号明細書
、ハンらに付与された米国特許第５０４３１６４号明細書及びウッドルらに付与された米
国特許第５０１３５５６号明細書に記載されており、それらの全ては本明細書においてそ
の全体が参照により援用される。
【０１１９】
（治療方法および送達経路）
ｉＲＮＡ剤、例えば、ＭＬＬ−ＡＦ４を標的とするｉＲＮＡ剤を含む組成物は、様々な
経路によって対象に送達することができる。例示的な経路には、クモ膜下、実質、静脈内
、経鼻、経口および眼内送達が含まれる。本発明のｉＲＮＡ剤を投与する好ましい手段は
、非経口投与によるものである。
【０１２０】
ｉＲＮＡ剤は、投与に適した医薬組成物に取り込むことができる。例えば、組成物は、
１種または複数種のｉＲＮＡ剤および薬学的に許容される担体を含むことができる。本明
細書では、「薬学的に許容される担体」という用語は、医薬品投与に適合した任意の、お
よびすべての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張化剤及び吸収
遅延剤などを含むものとする。薬学的に活性のある物質のためにこのような媒体および作
用物質を使用することは、当該技術分野では周知である。従来の媒体または作用物質が活
性化合物に不適合である場合を除いて、それらは組成物に使用されるものとする。補充的
な活性化合物もこの組成物に組み入れることができる。
【０１２１】
本発明の医薬品組成物は、局所治療または全身治療が望ましいかどうかに応じて、およ
び治療する部位に応じていくつかの方法で投与することが可能である。投与は、局所投与
（眼内、経鼻、経皮を含む）、経口投与又は非経口投与であり得る。非経口投与には、静
脈点滴、皮下、腹腔内もしくは筋肉内注射、またはクモ膜下腔内もしくは心室内投与が含
まれる。
【０１２２】
送達の経路は、患者の障害に応じて変更され得る。一般的に、本発明のｉＲＮＡの送達
は、対象への全身送達を実現するために実施される。これを実現する好ましい手段は、非
経口投与による。
【０１２３】
非経口投与用製剤には、緩衝剤、希釈剤およびその他の適切な添加物も含有できる滅菌
水性溶液が含まれる。静脈内注射は、例えばリザーバに取り付けられた心室内カテーテル
により促進され得る。静脈内での使用では、溶質の総濃度は、調製物を等張にするために
制御されるべきである。
【０１２４】
投与は、対象によって提供され得るか、または例えば治療奉仕者のような別の人によっ
て提供され得る。治療奉仕者は、人に治療を提供することに関与する任意の存在、例えば
、病院、ホスピス、診療所、外来患者向け診療所で医療に従事する人、例えば、医者、看
護師もしくはその他の専門家などの医療従事者、または配偶者または親などの保護者であ
り得る。投薬は、測定された用量で、または計測された用量を送達する分配器で提供され
得る。
【０１２５】
「治療有効量」という用語は、望ましい生理学的応答をもたらすために、治療する対象
において所望するレベルの薬剤を提供するのに必要な、組成物中に存在する量のことであ
る。
【０１２６】
「生理学的有効量」という用語は、所望とする緩和または治療的効果を与えるために対
象に送達される量である。
「薬学的に許容される担体」という用語は、その担体が肺に著しく有害な毒性効果を与
えず肺に取り込まれることが可能であることを意味する。
【０１２７】
「共投与」という用語は、２種以上の薬剤、特に２種以上のｉＲＮＡ剤を対象に投与す
ることである。薬剤は、単一の医薬組成物に含有され、同時に投与され得るか、または薬
剤は別々の製剤に含有され、順番に対象に投与され得る。２種の薬剤が同時に対象にて検
出されることができる限り、２種の薬剤は共投与されたと言える。
【０１２８】
担体として有用な医薬賦形剤の種類には、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などの安定化
剤、炭水化物、アミノ酸およびポリペプチドなどの賦形剤、ｐＨ調整剤または緩衝剤；塩
化ナトリウムなどの塩などがある。これらの担体は、結晶形であっても、アモルファス形
であってもよく、２つの混合物であってもよい。
【０１２９】
特に有用である賦形剤には、適合性のある炭水化物、ポリペプチド、アミノ酸またはそ
れらの組合せが含まれる。適切な炭水化物には、ガラクトース、Ｄ−マンノース、ソルボ
ースなどの単糖類、ラクトース、トレハロースなどの二糖類、２−ヒドロキシプロピル−
β−シクロデキストリンなどのシクロデキストリン、およびラフィノース、マルトデキス
トリン、デキストランなどの多糖類、マンニトール、キシリトールなどのアルジトール類
が含まれる。好ましい炭水化物群には、ラクトース、トレハロース、ラフィノース、マル
トデキストリンおよびマンニトールが含まれる。適切なポリペプチドには、アスパルテー
ムが含まれる。アミノ酸には、アラニンおよびグリシンが含まれ、グリシンが好ましい。
【０１３０】
適切なｐＨ調整剤または緩衝剤には、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウム
などの有機酸および塩基から調製された有機塩が含まれ、クエン酸ナトリウムが好ましい
。
【０１３１】
投与量。ｉＲＮＡ剤は、体重１ｋｇ当たり約７５ｍｇ未満、または体重１ｋｇ当たり約
７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、５、２、１、０．５、０．１、０．０５、
０．０１、０．００５、０．００１または０．０００５ｍｇ未満の単位用量で、および体
重１ｋｇ当たりｉＲＮＡ剤２００ｎｍｏｌ未満（例えば、約４．４×１０１６コピー）の
単位用量で、または体重１ｋｇ当たりｉＲＮＡ剤１５００、７５０、３００、１５０、７
５、１５、７．５、１．５、０．７５、０．１５、０．０７５、０．０１５、０．００７
５、０．００１５、０．０００７５、０．０００１５ｎｍｏｌ未満の単位用量で投与され
得る。例えば、この単位用量は、注射（例えば、静脈内もしくは筋肉内注射、クモ膜下注
射、または器官への直接注射）によって、吸入投与、または局所塗布によって投与され得
る。
【０１３２】
器官へ直接（例えば、肝臓に直接）ｉＲＮＡ剤を送達することは、器官当たり約０．０
０００１ｍｇ〜約３ｍｇ、または好ましくは器官当たり約０．０００１〜約０．００１ｍ
ｇ、器官当たり約０．０３〜３．０ｍｇ、眼当たり約０．１〜３．０ｍｇまたは器官当た
り約０．３〜３．０ｍｇの程度の投与量であり得る。
【０１３３】
投与量は、疾患または障害を治療または予防するのに有効な量であり得る。
一実施形態では、単位用量を１日１回より少ない頻度で、例えば、２日、４日、８日ま
たは３０日毎に１回より少ない頻度で投与する。他の実施形態では、単位用量は一定頻度
（例えば、規則正しい頻度）では投与されない。例えば、単位用量を１回で投与すること
が可能である。ｉＲＮＡ剤が媒介するサイレンシングは、ｉＲＮＡ剤組成物を投与した後
、数日間維持され得るので、多くの場合、１日１回より少ない頻度で、場合によっては全
治量期間中１回のみ組成物を投与することが可能である。
【０１３４】
一実施形態では、例えば、２本鎖ｉＲＮＡ剤、またはｓｉＲＮＡ剤（例えば、前駆体、
例えば、ｓｉＲＮＡ剤中に処理されることができるより大きなｉＲＮＡ剤、またはｉＲＮ
Ａ剤、例えば、２本鎖ｉＲＮＡ剤、もしくはｓｉＲＮＡ剤、もしくはそれらの前駆体をコ
ードするＤＮＡ）の初回量および１回または複数の維持用量が対象に投与される。一回又
は複数回の維持用量は、一般的に初回量よりも少なく、例えば、初回量の２分の１少ない
。維持治療計画は、１日当たり体重１ｋｇに対して０．０１〜７５ｍｇの範囲、例えば、
１日当たり体重１ｋｇに対して７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、５、２、１
、０．５、０．１、０．０５、０．０１、０．００５、０．００１または０．０００５ｍ
ｇの一回又は複数回の用量で対象を治療することを含み得る。維持用量は、５、１０また
は３０日毎に１回以下投与することが好ましい。さらに、治療計画は、特定の疾患の性質
、重症度および患者の全体的状態に応じて変化し得る期間の間、維持され得る。好ましい
実施形態では、投与量は１日１回以下、例えば、２４、３６、４８時間以上に１回以下、
例えば、５日または８日毎に１回以下にて送達され得る。処置後、患者の状態の変化およ
び疾患状態の徴候の軽減をモニタリングすることができる。化合物の投与量は、患者が現
在の用量レベルに有意に応答しない場合増加させることができ、あるいは疾患状態の徴候
の軽減が認められた場合、疾患状態が消失した場合、または望ましくない副作用が認めら
れた場合、用量を減少させることができる。
【０１３５】
効果的な用量は、特定の環境下で所望するように、または適切だと考えられるように、
単回投与で、または２回以上の投与で投与することができる。反復注入又は頻繁な注入を
促進することが望ましい場合、送達装置、例えば、ポンプ、半永久的ステント（例えば、
静脈内、腹腔内、嚢内または関節包内）またはリザーバを埋め込むことが適切であり得る
。
【０１３６】
処理が成功した後、疾患状態の再発を防ぐために、本発明の化合物を体重１ｋｇ当たり
０．００１ｇ〜１００ｇの範囲の維持用量で投与する維持治療を患者に受けさせることが
望ましい（米国特許第６１０７０９４号）。
【０１３７】
ｉＲＮＡ剤組成物の濃度は、障害を治療もしくは予防するのに有効であるか、またはヒ
トの生理学的状態を調節するために十分な量である。投与するｉＲＮＡの薬剤の濃度また
は量は、薬剤について測定されたパラメータ、および経鼻、頬側または肺投与などの投与
方法に依存される。例えば、経鼻用製剤は、鼻孔の刺激または灼熱感を回避するために、
いくつかの成分をはるかに低い濃度にしなければならない傾向がある。適切な経鼻用製剤
を提供するために、経口用製剤を１０〜１００倍希釈することが時として望ましい。
【０１３８】
非限定的ではあるが、疾患もしくは障害の重症度、以前の治療法、対象の一般的健康状
態および／または年齢、その他の既存の疾患を含めたある種の因子が、対象を効果的に治
療するために必要な投与量に影響を及ぼし得る。治療に使用するｓｉＲＮＡなどのｉＲＮ
Ａ剤の効果的投与量は、特定の治療の期間中、増加または減少し得ることも理解されたい
。投与量の変化は、本明細書に記載されているように、診断試験法の結果から得られ、明
らかとなり得る。例えば、ｉＲＮＡ剤組成物投与後に対象をモニタリングすることができ
る。モニタリングからの情報に基づいて、ｉＲＮＡ剤組成物の追加量を投与することがで
きる。
【０１３９】
投薬は、数日から数ヶ月続く治療期間中、または全治するまで、もしくは疾患状態の消
失が実現するまで、治療する疾患状態の重症度および応答性に左右される。最適な投薬計
画は、患者の身体における薬剤蓄積の測定によって計算することができる。当業者であれ
ば、最適な投与量、投薬方法および反復率を容易に決定することができるだろう。最適な
投与量は、個々の化合物の相対的能力に応じて変更可能であり、前述したようにインビト
ロおよびインビボ動物モデルにおいて効果的であることが発見されたＥＣ５０に基づいて
一般的に判断することができる。
【０１４０】
本発明は、以下の実施例によってさらに例示されるが、それらはさらに限定するもので
はない。
【実施例】
【０１４１】
試薬の入手先
試薬の入手先が本明細書に具体的に挙げられていない場合、このような試薬は、分子生
物学用試薬の任意の供給元から、分子生物学での適用に標準的な量／純度で入手すること
ができる。
【０１４２】
実施例１：ｓｉＲＮＡ合成
１本鎖ＲＮＡは、Ｅｘｐｅｄｉｔｅ ８９０９合成機（アプライドバイオシステムズ、
アプレラドイチュランド社（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ａｐｐｌｅｒａ
Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ）、［ドイツ国、ダルムシュタット（Ｄａｒｍｓｔａ
ｄｔ）所在］および固相担体として微細孔性ガラス（ＣＰＧ、５００Å、グレンリサーチ
社（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅｒａｃｈ）、［米国バージニア州スターリング（Ｓｔａｒｌｉｎ
ｇ）所在］）を使用して、１μｍｏｌｅのスケールで固相合成によって作製された。ＲＮ
Ａおよび２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを含有するＲＮＡは、それぞれ対応するホスホラ
ミダイトおよび２’−Ｏ−メチルホスホラミダイトを使用して固相合成によって作製され
た（プロリゴバイオケミ社（Ｐｒｏｌｉｇｏ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ）、［ドイ
ツ国、ハンブルク（Ｈａｍｂｕｒｇ）所在］）。これらの構成単位を、「Ｃｕｒｒｅｎｔ
ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、ボカ
ージュ エス．エル．（Ｂｅａｕｃａｇｅ、Ｓ．Ｌ．）ら（編）、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ
＆ Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．［アメリカ合衆国ニューヨーク］に記載されたような標準的ヌ
クレオシドホスホラミダイト化学物質を使用してオリゴリボヌクレオチド鎖の配列内の選
択部位に取り込ませた。ホスホロチオエート結合は、ヨウ素酸化剤溶液をアセトニトリル
（１％）に溶解したボカージュ試薬（クルアケム社（Ｃｈｒｕａｃｈｅｍ Ｌｔｄ）［英
国グラスゴー（Ｇｌａｓｇｏｗ）所在］）の溶液と置換することによって導入された。他
の付随する試薬は、マリンクロットベーカー社（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ Ｂａｋｅｒ
）［ドイツ国、グリサイム（Ｇｒｉｅｓｈｅｉｍ）所在］から入手した。
【０１４３】
粗オリゴリボヌクレオチドの陰イオン交換ＨＰＬＣによる脱保護および精製は、確立さ
れた方法に従って実施された。収率および濃度は、分光光度計（ＤＵ ６４０Ｂ、ベック
マンコールター社（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＧｍｂＨ）、［ドイツ国、アンタ
ーシュリースハイム（Ｕｎｔｅｒｓｃｈｌｉｅβｈｅｉｍ）所在］）を使用して、波長２
６０ｎｍでそれぞれのＲＮＡの溶液のＵＶ吸収によって測定した。２本鎖ＲＮＡは、アニ
ーリング緩衝液（２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８、１００ｍＭの塩化ナトリウ
ム）中において相補鎖の等モル溶液を混合し、８５〜９０℃の水浴中で３分間加熱し、３
〜４時間かけて室温まで冷却することによって作製した。精製したＲＮＡ溶液を使用する
まで−２０℃で保存した。
【０１４４】
実施例２：ｓｉＲＮＡのデザイン
効率的なＭＬＬ−ＡＦ４ｓｉＲＮＡを同定するために、ＭＬＬ−ＡＦ４融合部位のいず
れかの側を含み、かつ側面に位置する配列のｓｉＲＮＡのスキャンを実施した（非特許文
献５、非特許文献３、マシャレク（Ｍａｒｓｈａｌｅｋ）ら、Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏ
ｌｏｇｙ、第９０巻、３０８−３２０頁（１９９５年））。スキャンを実施するために、
本願の発明者らは、ＭＬＬ−ＡＦ４融合部位を含む配列と重複し、かつ同配列から１つの
ヌクレオチドずつ段階的に下流側に移動させた標的部位を有する１４個の異なるｓｉＲＮ
Ａを合成した。ｓｉＲＮＡ配列及びそれらの融合ｍＲＮＡの標的部位を表２に示した。表
２に示されるｓｉＲＮＡの２本鎖は、以下においてはｓｉＭＡＸと参照され、Ｘは表２に
おいて示されるそれぞれの対応する２本鎖を構成するセンス及びアンチセンス鎖の単位に
おける整数を意味する。例えば、ｓｉＭＡ５は、ＭＡ５ｓ及びＭＡ５ａｓから形成された
２本鎖を意味する。しかしながら、ｓｉＭＡｘはＭＡ３ｓ及びＭＡｘａｓ（表１における
薬剤番号２）により形成される２本鎖を意味し、ｓｉＭＡｍｍは、ＭＡｍｍｓ及びＭＡｍ
ｍａｓにより形成されるミスマッチ２本鎖を意味する。
【０１４５】
加えて、一つのｓｉＲＮＡがＲＳ４；１１細胞における融合部位変種と相同して合成さ
れた（本明細書においてはｓｉＭＡＲＳ）。ｓｉＭＡＲＳのセンス鎖の位置１乃至２１は
、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｌ２２１７９の位置４３３８−４３５８に対応する（バージョ
ン番号．Ｌ２２１７９．１ ＧＩ：３４７３７６、非特許文献５）。
【０１４６】
【表２】
対照として、ミスマッチｓｉＲＮＡ ｓｉＭＡｍｍ、ｓｉＲＮＡ ｓｉＡＧＦ１及びそ
のミスマッチ対照ｓｉＡＦ６（ＡＭＬ／ＭＴＧ８を標的とするもの）並びにｓｉＲＮＡ
ｓｉＫ４及びｓｉＧＬ２（ネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼｍＲＮＡを標的と
するもの）（ハイデンライヒ（Ｈｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈ）ら、Ｂｌｏｏｄ、第１０１巻、
３１５７−３１６３頁（２００３年））を使用した。ｓｉＡＧＦ１のセンス鎖の１乃至２
１位は、ＡＭＬ１／ＭＴＧ８（Ｇｅｎｂａｎｋ取得番号Ｄ１３９７９）の２１０２乃至２
１２２位に対応する。ｓｉＡＧＦ６はｓｉＡＧＦ１とは、センス鎖配列の８及び１３位に
おけるＡからＵへの変更及びアンチセンス配列に対する対応する変化を除いては、同一で
ある。ｓｉＧＬ２のセンス鎖の１乃至２１位は、Ｐ．ｐｙｒａｌｉｓ ｌｕｃｉｆｅｒａ
ｓｅ（Ｇｅｎｂａｎｋ取得番号Ｍ１５０７７）の５１４乃至５３３位に対応する。ｓｉＫ
４のセンス鎖の１乃至２１位は、ネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼＩＩ（Ｇｅ
ｎｂａｎｋ取得番号Ｌ１１０１７）の４１８４乃至４２０２位に対応する。
【０１４７】
ｓｉＭＡｘ、ｓｉＡＧＦ１、ｓｉＡＧＦ６及びｓｉＧＬ２を除くｓｉＲＮＡは、２１の
ヌクレオチド長のセンス鎖と２３のヌクレオチド長のアンチセンス鎖から構成されており
、ｓｉＲＮＡはアンチセンス鎖により２個のヌクレオチドが一つの３’−突出部分を形成
する。ｓｉＭＡｘ、ｓｉＡＧＦ１、ｓｉＡＧＦ６及びｓｉＧＬ２は、２１のヌクレオチド
長のセンス鎖及びアンチセンス鎖から構成されており、両端に２個のヌクレオチドの３’
−突出部分を形成する。
【０１４８】
実施例３：細胞培養
研究された複数の遺伝子から発現されたｍＲＮＡのレベルを低減する種々のｓｉＲＮＡ
の効果を細胞株ＳＥＭ（グレイル（Ｇｒｅｉｌ）ら、Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ．、第
８６巻、２７５−２８３頁、１９９４年）、ＲＳ４；１１（ストング，アール．シー．（
Ｓｔｏｎｇ，Ｒ．Ｃ．）ら、Ｂｌｏｏｄ、第６５巻、２１−３１頁、１９８５年）（ドイ
ツ国、ブラウンシュワイクに所在のＤＳＭＺから入手した）及びＭＶ４；１１（ランゲ，
ピー．エイチ．（Ｌａｎｇｅ，Ｂ．Ｈ．）及びウィンフィールド，エイチ．エヌ．（Ｗｉ
ｎｆｉｅｌｄ，Ｈ．Ｎ．）、Ｃａｎｃｅｒ、第６０巻、４６４−４７２頁、１９８７年）
（ドイツ国ハノーバー医学校のジェイ．クラウター（Ｋｒａｕｔｅｒ）から入手した）で
試験した。これらは染色体転座ｔ（４；１１）（ｑ２１；ｑ２３）を保持するが、異なる
切断点により異なるＭＬＬ−ＡＦ４変種を発現する。更に、本研究にて使用された白血病
細胞株はＨＬ６０（コリンズ，エス．ジェイ．（Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｓ．Ｊ．）ら、Ｎａｔ
ｕｒｅ、第２７０巻、３４７−３４９頁、１９７７年）、Ｋ５６２（ロツィオ，シー．ビ
ー．（Ｌｏｚｚｉｏ，Ｃ．Ｂ．）及びロツィオ ビー．ビー．（Ｌｏｚｚｉｏ，Ｂ．Ｂ．
）、Ｊ．Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ、第５０巻、５３５−５３８頁、１９７３年
）、Ｋａｓｕｍｉ−１（アソウ，エイチ．（Ａｓｏｕ，Ｈ．）ら、Ｂｌｏｏｄ、第７７巻
、２０３１−２０３６頁、１９９１年）、ＳＫＮＯ−１（マトザキ，エス．（Ｍａｔｏｚ
ａｋｉ，Ｓ．）ら、Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ、第８９巻、８０５−８１１頁、１９９
５年）及びＵ９３７（サンドストローム，シー．（Ｓｕｎｄｓｔｒｏｍ，Ｃ．）及びニル
ソン，ケイ．（Ｎｉｌｓｓｏｎ，Ｋ．）、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ、第１７巻、５６５
−５７７頁、１９７６年）であった。ＳＫＮＯ−１細胞は２０％ＦＣＳ（ＳｅｒａＰｌｕ
ｓ、パンバイオテック社（ＰＡＮＢｏｉｔｅｃｈ ＧｍｂＨ））及び７ｎｇ／ｍｌのＧＭ
−ＣＳＦを補充したＲＩＭＩ１６４０Ｇｌｕｔａｍａｘ培地（インビトローゲン（Ｉｎｖ
ｉｔｒｏｇｅｎ），ドイツ国カールスルーエ所在）で維持され、その他の細胞株の全ては
、３７℃及び５％ＣＯ２にて１０％のＦＣＳを補充したＲＩＭＩ１６４０Ｇｌｕｔａｍａ
ｘ培地で維持された。健全な患者の骨髄からの初代ヒトＣＤ３４＋細胞は、チュービンゲ
ン（Ｔｕｅｂｉｎｇｅｎ）に所在の大学小児病院から凍結したストックとして入手した。
【０１４９】
実施例４：ｓｉＲＮＡ処理
ＳＥＭのｓｉＲＮＡエレクトロポレーションを既に述べたように実施した（ドゥネ（Ｄ
ｕｎｎｅ）ら、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、第１３巻、３７５−８０頁、２００
３年及びハイデンライヒら、Ｂｌｏｏｄ、第１０１巻、３１５７−３１６３頁、２００３
年）。エレクトロポレーションは、１０ｍｓで３５０Ｖの矩形パルスを使用したＦｉｓｃ
ｈｅｒのエレクトロポレータ（フィッシャー（Ｆｉｓｃｈｅｒ）、ドイツ国、バイデルベ
ルグ所在）にて実施した。室温にて１５分間インキュベートした後に、細胞を培地で２０
倍に希釈して、３７℃の５％ＣＯ２下にてインキュベートした。
【０１５０】
実施例５：ＲＴ−ＰＣＲ
内因性ＭＬＬ−ＡＦ４、ＭＬＬ、ＡＦ４、ＨＯＸＡ７、ＨＯＸＡ９、ＯＡＳ１及びＳＴ
ＡＴ１のレベルをリアルタイムのＰＣＲにて試験した。ＲＮＡの全抽出をＲＮイージー（
Ｒｎｅａｓｙ）キット（キアーゲン（Ｑｕｉａｇｅｎ）、ドイツ国、ヒルデン所在）を使
用して、製造者により提案されたように実施した。次に、全ＲＮＡの１ｍｇを、ポリメー
ラーゼ連鎖反応と組み合わせられたリアルタイムの逆転写（ＲＴ−ＰＣＲ）に使用した。
逆転写反応は、２５ｍＭのランダム６量体、５ｘＲＴ緩衝液、１ｍＭのｄＮＴＰＭｉｘ、
２０ＵのＲＮａｓｅ阻害剤（ＭＢＩ）及び１００ＵのＭＭＬＶ−ＲＴ、ＲＮａｓｅＨ（プ
ロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ドイツ国、ハイデルベルグ所在）を使用して実施した。混合
物を室温にて１０分間、４２℃にて４５分間、そして９９℃にて３分間インキュベートし
た。それぞれの遺伝子のｍＲＮＡレベルはＧＡＰＤＨｍＲＮＡレベルに正規化した。
【０１５１】
リアルタイムのＰＣＲ反応は、ＭＬＬ−ＡＦ４、ＭＬＬ、ＡＦ４、ＨＯＸＡ７、ＨＯＸ
Ａ９、ＯＡＳ１及びＳＴＡＴ１に対するプライマーを使用して実施した。ＧＡＰＤＨとハ
イブリダイズするプライマーを対照として使用した。ＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲ反
応に対するマスターミックス（ＭＬＬ−ＡＦ４）は、６２．５ｎＭのフォワードプライマ
ー及びリバースプライマー、６２．５％（ｖ／ｖ）のＳｙｂｒ−ＧｒｅｅｎＭｉｘを含ん
でいた。ＧＡＰＤＨ反応に対するマスターミックスは、３７５ｎＭのフォワードプライマ
ー及びリバースプライマー及び６２．５％（ｖ／ｖ）のＳｙｂｒ−ＧｒｅｅｎＭｉｘを含
んでいた。そうでない場合には、ＲＴ−ＰＣＲは、マルチネス（Ｍａｒｔｉｎｅｚ）らの
ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ、第４巻、４４頁（２００４年）の記載に従って実施した。使用し
たプライマーの配列を表３に列挙した。
【０１５２】
【表３】
プライマーはＰＲＩＭＥＲ−ＥＸＰＲＥＳＳソフトウェア（アプライドバイオシステム
ズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、アメリカ合衆国カリフォルニア州フォス
ターシティ所在）を使用して設計した。
【０１５３】
実施例６：コロニー形成試験
ｓｉＲＮＡを用いた細胞エレクトロポレーションの２４時間後に１００００個の細胞を
、２４ウェルプレート中にて、２０％ＦＣＳ及び０．５６％メチルセルロースを含む０．
５ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地中に接種した。ＲＳ４；１１の場合、細胞数はウェル当り
２００００個に増加した。接種してから１４日後に、２０個以上の細胞を含むコロニーを
計数した。これらの条件で、モック−トランスフェクト細胞（ｓｉＲＮＡを使用しないで
エレクトロポレーションした場合）は、試験した細胞株に応じてウェル当り５０乃至１０
０のコロニーを形成した。ヒトコロニー形成細胞試験はＭｅｔｈｏＣｕｌｔ（登録商標）
メチルセルロースベースの培地（セルシステムズ（ＣｅｌｌＳｙｓｔｅｍｓ）、ドイツ国
、セントカタリーネン所在）を使用して実施した。エレクトロポレーションの後、５００
０個のヒト初代ＣＤ３４＋細胞を、１ｍｌのメチルセルロース培地を含む３５ｍｍの培養
皿中に二つずつ接種した。ＣＦＵ−ＧＥＭＭｓ及びＣＦＵ−ＧＭｓの数は接種してから１
０日後に計数した。
【０１５４】
実施例７：ＭＴＴ試験
細胞は４８時間以内に２回エレクトロポレーションして、９６ウェルのプレートに、ウ
ェル当り１００μｌにて０．５×１０５個の細胞密度にて接種した。各２４時間後に１０
μｌのＭＴＴ溶液（ロッシュ（Ｒｏｃｈｅ）、ドイツ国、マンハイム所在）を加えた。３
７℃にて４時間インキュベーション後、細胞を製造業者の指示に従って可溶化溶液で溶解
した。対照波長として、５６０ｎｍ及び６５０ｎｍにて、ＥＬＩＳＡリーダ（ダイネック
ス（Ｄｙｎｅｘ）、ドイツ国、フランクフルト／Ｍ所在）を用いてＯＤ測定を実施した。
細胞数は細胞希釈系列により計数した。ヒトコロニー形成細胞試験は、ＭｅｔｈｏＣｕｌ
ｔ（登録商標）メチルセルロースベースの培地（セルシステムズ、ドイツ国、セントカタ
リーネン所在）を使用して実施した。ヒト初代細胞をエレクトロポレーションし、続いて
、５０００個の細胞を、１ｍｌのメチルセルロース培地を含む３５ｍｍの培養皿中に接種
した。各サンプルは２つずつ接種し、ＣＦＵ−ＧＥＭＭｓ及びＣＦＵ−ＧＭｓの数は接種
してから１０日後に計数した。
【０１５５】
実施例８：細胞周期分析及びアポトーシス試験
細胞周期分析は、既に記載したように（３２）実施した。次に、得られたデータを分析
し、ＭｏｄＦｉｔプログラム（ベリティ（Ｖｅｒｉｔｙ）、アメリカ合衆国、トップシャ
ム所在）を使用して評価した。アポトーシスは、供給者の指示に従って、ヒトアネキシン
（Ａｎｎｅｘｉｎ）Ｖ／ＦＩＴＣキット（ベンダーメドシステムズ（Ｂｅｎｄｅｒ Ｍｅ
ｄＳｙｓｔｅｍｓ）、オーストリア国ウィーン所在）を使用して試験した。要約すると、
２−５×１０５個の細胞をエレクトロポレーション後、指示された時点にてＰＢＳで洗浄
し、室温にて１０分間、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ溶液の存在下にてインキュベーションし
た。細胞をＰＢＳで再び洗浄し、ヨウ化プロピジウムで染色した。次にサンプルを、ＦＡ
ＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ベクトンディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、
ドイツ国、バイデルベルク所在）を使用したフローサイトメトリーにて直ちに分析した。
【０１５６】
実施例９：ウェスタンブロッティング
細胞の全タンパク質量を得るために、ＲＮイージー（ＲＮｅａｓｙ）カラムのフロース
ルー部分に存在するタンパク質を２容量のアセトンで沈殿させ、尿素緩衝液（９Ｍの尿素
、４（ｗ／ｗ）％の３−［（３−クロラミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］−プロパ
ンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、１（ｗ／ｗ）％ジチオスレイトール）中に溶解した。全
溶解物（ＭＬＬ−ＡＦ４検出に対しては５０μｇ、その他の全てのイムノブロットに対し
ては１０μｇ）を（３２）に記載したように分析した。イムノブロットの検出に以下の抗
体を使用した：切断したカスパーゼ−３（Ａｓｐ１７５）（１：１０００、Ｃｅｌｌ Ｓ
ｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｎｏｌｏｇｙ、＃９６６１）；チューブリンＡｂ−４（１ｍｇ
／ｌ、ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ ＭＳ−７１９−Ｐ０、アメリカ合衆国フレモント所在）Ｂ
ｃｌ−ＸＬ（１：５００、ＢＤＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、＃５５６４９９）；ＭＬＬＴ２（
１：６００、Ｏｒｂｉｇｅｎ、＃１０８５２）；ＧＡＰＤＨ（１：２０，０００、ＨｙＴ
ｅｓｔ、＃５Ｇ４）。
【０１５７】
実施例１０：ＳＣＩＤマウスの異種移植術
４−５週齢の雌のＣＢ−１７／ｌｃｒＣｒｊ−ＳＣＩＤ／ＳＣＩＤマウスをチャールズ
リバージャーマニー（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。Ｓ
ＥＭ細胞（２０×１０７）を１日目にエレクトロポレーションし、３日目に指定されたｓ
ｉＲＮＡの５００ｎＭを使用しない（モック）か、又は使用した。４日目に細胞をマウス
の腹腔内に注射した。動物は、チュービンゲン（Ｔｕｅｂｉｎｇｅｎ）の地方審議会によ
り承認されたプロトコルに従って維持及び処理した。
【０１５８】
実施例１１：組織学
器官を除去し、室温にて中性に緩衝化された４％のホルマリンにて４−５日固定し、脱
水し、パラフィン中に埋め込み、切断した。組織はヘマトキシリン（Ｍｅｙｅｒのヘマル
ム溶液、メルク（Ｍｅｒｃｋ）、ドイツ国ダルムスタッド所在）及びエオシン（Ｅｏｓｉ
ｎ Ｙ、メルク、ドイツ国ダルムスタッド所在）を使用して、光学顕微鏡法のために染色
した。光学顕微鏡法は、２０×Ｐｌａｎ−Ｎｅｏｆｌｕａｒ又は４０×Ｐｌａｎ−Ｎｅｏ
ｆｌｕａｒ １．３オイルレンズを使用して、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｐｌａｎ顕微鏡（ツ
ァイス（Ｚｅｉｓｓ）、ドイツ国、グッティンゲン所在）を使用して実施した。画像は、
顕微鏡に備えられたＡｘｉｏ Ｖｉｓｉｏｎ ４ Ｓｏｆｔｗａｒｅ及びＡｄｏｂｅ Ｐ
ｈｏｔｏｓｈｏｐ（アドーベシステムズ（Ａｄｏｂｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、アメリカ合衆
国、カリフォルニア州、サンホセ所在）を使用して捕捉した。
【０１５９】
実施例１２：統計学的分析
コロニー形成試験は、対応のないスチューデントｔ検定により分析した。生存曲線は、
ログランク試験により分析した。
実施例１３：ＭＬＬ−ＡＦ４発現の阻害に対する活性を備えたｓｉＲＮＡの同定
高効率ＭＬＬ−ＡＦ４ｓｉＲＮＡを同定するために、ＭＬＬ−ＡＦ４融合部位のｓｉＲ
ＮＡスキャンを実施した。そのために、本願の発明者らは、各々が一つのヌクレオチドず
つ移動している標的部位を備えた１４個の異なるｓｉＲＮＡを合成した。異なるｓｉＲＮ
Ａの効果は、５歳のＡＬＬ再発患者から得られたｔ（４；１１）−陽性白血病細胞株ＳＥ
Ｍにて試験した（グレイル（Ｇｒａｉｌ）、ジェイ．ら、Ｂｒ Ｊ Ｊａｅｍａｔｏｌ、
第８６巻、２７５−２８３頁、１９９４年）。試験した１４の全てのｓｉＲＮＡのうち、
二つのｓｉＲＮＡ、即ち、ｓｉＭＡ３及びｓｉＭＡ６は、ＭＬＬ−ＡＦ４ｍＲＮＡレベル
が６０％超減少した（図１Ａ）。ＭＬＬ−ＡＦ４転写レベルの低減は用量依存性であり、
７５０ｎＭのｓｉＲＮＡで７０％の最大値に達した（データは図示せず）。経時変化の実
験では、ｓｉＲＮＡトランスフェクション後２４乃至４８時間の間にＭＬＬ−ＡＦ４ ｍ
ＲＮＡの量がその最小値に達し、４日にて通常にレベルに回復することが示された（図１
Ｂ）。更に、ｓｉＭＡ６は野生型のＡＦ４にもＭＬＬ ｍＲＮＡレベルにも影響を与えな
かった（図１Ｃ）一方で、ｓｉＭＡ３はＡＦ４レベルを実質的に低減した（データは図示
せず）。ミスマッチ対照ｓｉＲＮＡであるｓｉＭＭはＭＬＬ−ＡＦ４にも対応する野生型
の対立遺伝子転写産物にも影響を与えなかった。ＭＬＬ−ＡＦ４ ｍＲＮＡのレベルの低
減は、ＭＬＬ−ＡＦ４タンパク質中の付随物の６７％の減少により反映されている（図１
Ｄ）。
【０１６０】
ＭＬＬ−ＡＦ４融合部位は、異なるｔ（４；１１）陽性細胞株の間にて変化する。ＳＥ
Ｍ細胞はＭＬＬエクソン９ＡＦ４エクソン４（ｅ９−ｅ４）融合を含む転写物を発現し、
ＲＳ４；１１はエクソン１０−エクソン４（ｅ１０−ｅ４）変種を発現する。６７％の相
同性にも関わらず、ｓｉＭＡ６はＲＳ４；１１細胞中におけるｅ１０−ｅ４イソ型のレベ
ルを低減しなかった（非特許文献５）のに対し、完全に相同性であるｓｉＲＮＡ、ｓｉＭ
ＡＲＳは、ＡＦ４又はＭＬＬの発現に影響を与えることなく、ＲＳ４；１１におけるＭＬ
Ｌ−ＡＦ４ ｅ１０−ｅ４を６０％低減した。
【０１６１】
ｓｉＭＡ６もｓｉＭＭもＳＴＡＴ１又は２’−５’−オリゴアデニレートシンターゼ１
の発現を誘導せず（図１Ｆ）、それは、これらのｓｉＲＮＡがインターフェロンの応答を
誘発しないことを示している（スレッツ、シー．エー．（Ｓｌｅｄｚ，Ｃ．Ａ．）ら、Ｎ
ａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、第５巻、８３４−８３９頁、２００３年）。ｐｏｌｙＩＣで
のトランスフェクションはＯＡＳ１の転写レベルを５０倍以上も増大し、ＳＴＡＴ１ ｍ
ＲＮＡのレベルを１０倍以上も増大し（図１Ｆ）、これらの白血球細胞においてインター
フェロン応答経路を誘導することを示す。それらの高い特異性により、ＭＬＬ−ＡＦ４
ｓｉＲＮＡであるｓｉＭＡ６及びミスマッチ対照ｓｉＲＮＡであるｓｉＭＭは、白血病性
表現型のためのＭＬＬ−ＡＦ４発現の重要性を証明するために選択されている。
【０１６２】
実施例１４：ＭＬＬ−ＡＦ４は白血病性クローン形成能力に影響を与える
白血病性クローン形成能力（ｃｌｏｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）に対するＭＬＬ−ＡＦ４の
適合性を研究するために、本願の発明者らはｔ（４；１１）−陽性ＳＥＭ細胞をｓｉＲＮ
Ａでトランスフェクトし、半固体の培地にてインキュベートした。ＳｉＭＡ６−媒介型の
ＭＬＬ−ＡＦ４の枯渇は、コロニーの数を５倍低減した（図２Ａ）。この影響は特異的で
ある。その理由はｔ（８；２１）−陽性白血球細胞株Ｋａｓｕｍｉ−１のコロニー形成は
ｓｉＭＡ６により影響されなかったからである。逆に、ＡＭＬ１／ＭＴＧ８特異的ｓｉＲ
ＮＡであるｓｉＡＧＦ１でのトランスフェクションは、ＳＥＭコロニー形成を干渉するこ
となくＫａｓｕｍｉ−１のコロニー形成を損ねた（マルチネス エヌ．（Ｍａｒｔｉｎｅ
ｚ，Ｎ．）ら、ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ、第４巻、４４頁、２００４年）。ミスマッチ対照
（ｓｉＭＭ及びｓｉＡＧＦ６）はいずれも白血病性クローン形成能力に影響を与えなかっ
た。さらに、ｔ（４；１１）−陰性白血病性細胞株ＨＬ６０、Ｋ５６２、ＳＫＮＯ−１及
びＵ９３７も、ｓｉＭＡ６により影響を受けないＭＬＬ−ＡＦ４変種を発現するｔ（４；
１１）−陽性白血病性細胞株ＲＳ４；１１及びＭＶ４；１１も、ｓｉＲＮＡトランスフェ
クションによりコロニー形成が損なうことのなかったことが示された（データ図示しない
）。特に、ＭＬＬ−ＡＦ４ｅ１０−ｅ４変種のｓｉＭＡＲＳ媒介型抑制はＲＳ４；１１の
コロニー形成を２倍も低減し、別のｔ（４；１１）細胞株に対するＭＬＬ−ＡＦ４のコロ
ニー形成効率の依存性を示す（図２Ｂ）。初代ヒト造血性ＣＤ３４＋細胞のＭＬＬ−ＡＦ
４ｓｉＲＮＡのエレクトロポレーションは、ＧＥＭＭコロニー数にもＧＭコロニー数にも
影響を与えなかった（図２Ｃ）。このように影響を与えないことは、非効率的なｓｉＲＮ
Ａのトランスフェクションに寄与していない。その理由は、本明細書で使用される細胞株
もヒト造血性ＣＤ３４＋細胞も機能的なｓｉＲＮＡで効率的にトランスフェクトされたか
らである（シェア エム．（Ｓｈｅｒｒ，Ｍ．）ら、Ｂｌｏｏｄ、第１０１巻、１５６６
−１５６９頁、２００３年、ハイデンライヒ オー．ら、Ｂｌｏｏｄ、第１０１巻、３１
５７−３１６３頁、２００３年、ドゥネ ジェイ（Ｄｕｎｎｅ，Ｊ．）ら、Ｏｌｉｇｏｎ
ｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、第１３巻、３７５−３８０頁、２００３年）。
【０１６３】
実施例１５：ＭＬＬ−ＡＦ４の抑制が、白血病性の増殖及び細胞周期の進行を阻害する
次に、懸濁した培地での白血病性の増殖の制御におけるＭＬＬ−ＡＦ４の役割を調べた
。ｓｉＭＡ６の単回のエレクトロポレーションはｔ（４；１１）−陽性ＳＥＭ細胞の倍加
時間に影響を与えなかった（データ図示しない）が、２日おきにｓｉＲＮＡのエレクトロ
ポレーションを繰り返すと、ｓｉＭＡ６によるＳＥＭ細胞の増殖及びｓｉＭＡＲＳによる
ＲＳ４；１１細胞の増殖の阻害が維持された（図２Ｄ）。従って、増殖は、対応するＭＬ
Ｌ−ＡＦ４融合部位に相同性を有するｓｉＲＮＡにより阻害されるのみであり、これらＭ
ＬＬ−ＡＦ４ｓｉＲＮＡの特異性を示す。モック又はｓｉＲＮＡでエレクトロポレーショ
ンされたＳＥＭ又はＲＳ４；１１細胞は１．４日の倍加時間で増殖し、エレクトロポレー
ションの繰り返しがその増殖に重大な影響を与えないことを示す。
【０１６４】
ＭＬＬ−ＡＦ４の枯渇によるｔ（４；１１）−陽性細胞の増殖の低減は、細胞周期の分
配における変化に匹敵していなかった。ＭＬＬ−ＡＦ４ｓｉＲＮＡの反復的なエレクトロ
ポレーションを伴う１０日間の経時変化の間、Ｓ相細胞のフラクションは、ＳＥＭ及びＲ
Ｓ４；１１細胞のいずれにおいても、それぞれ５０乃至３０％及び２０％減少し、Ｇ０／
Ｇ１相のフラクション細胞における増大を伴っていた（図２Ｅ）。特に、ｓｉＭＡ６は、
ＳＥＭ細胞においてのみ細胞周期の分配に影響を与えた一方、ｓｉＭＡＲＳはＲＳ４；１
１細胞においてのみそれらの変化を引き起こした。従って、ＭＬＬ−ＡＦ４の枯渇は、Ｇ
１相からＳ相までｔ（４；１１）−陽性細胞の進行に否定的に干渉する。Ｇ１／Ｓの遷移
を損なうことは、細胞の老化には関係していない。それは、β−ガラクトシダーゼ活性に
関連した老化は、ＭＬＬ−ＡＦ４の枯渇により増大しないからである（データ図示しない
）。
【０１６５】
実施例１６：ＭＬＬ−ＡＦ４の枯渇は、ｔ（４；１１）−陽性ＳＥＭ細胞のアポトーシ
スを誘導する
ＳＥＭ及びＲＳ４；１１細胞の細胞周期の分析は、１０日間にわたるＭＬＬ−ＡＦ４の
連続的な枯渇が対照と比較してサブ（ｓｕｂ）Ｇ１細胞の数を１０倍も増大し、アポトー
シス細胞の数を増大したことを示した（図３Ａ）。アネキシンＶ及びヨウ化プロピジウム
での染色は、ＭＬＬ−ＡＦ４細胞の４日間の抑制がアポトーシス細胞における３倍の増大
をＳＥＭ細胞にて示し、それにより、同時点にて見られるｓｕｂＧ１細胞の増大と一致し
た（図３Ｂ）。特に、ほとんど不活性なｓｉＲＮＡであるｓｉＭＡ１３（図１Ａを参照）
は、アポトーシス細胞の数に僅かに影響を与えるのみであり、ＭＬＬ−ＡＦ４の枯渇の程
度とアポトーシスの速度との間には直接相関関係のあることを示唆している。この結果は
、カスパーゼ−３のタンパク質分解活性及びｓｉＭＡ６でのトランスフェクションによる
抗アポトーシスタンパク質Ｂｃｌ−ＸＬの量の低減により確証された（図３Ｃ）。
【０１６６】
実施例１７：ＭＬＬ−ＡＦ４の抑制はＨｏｘ遺伝子の発現を増大する
ＭＬＬ−ＡＦ４を含むＭＬＬ癌タンパク質の発現はＨｏｘａ７及びＨｏｘａ９を含む数
種類のＨｏｘ遺伝子並びに別のホメオティック遺伝子であるＭｅｉｓ１の発現の増大と関
連している。従って、本願の発明者らは、ＭＬＬ−ＡＦ４レベルに依存するこれら３種類
の遺伝子の発現を分析した。ＭＬＬ−ＡＦ４ｓｉＲＮＡであるｓｉＭＡ６でＳＥＭ細胞を
２回連続してトランスフェクションすると、Ｈｏｘａ７ｍＲＮＡのレベルが二倍減少した
（図４）。Ｈｏｘａ９の僅かの低減も観察された。ＲＳ４；１１細胞において、Ｈｏｘａ
９はｓｉＭＲＡＳのトランスフェクションにより低減したが、Ｈｏｘａ９は低減しなかっ
た。ＲＳ４；１１細胞中にてＨｏｘａ９が低減しないことは、ＳＥＭ細胞中と比較して、
ＭＬＬ−ＡＦ４の抑制の効果が低いことによるものであろう（図１Ｄ，Ｅ）。
【０１６７】
実施例１８：ＭＬＬ−ＡＦ４はｔ（４；１１）−陽性細胞の白血病性細胞の生着に対し
て重要である
ＳＣＩＤマウスにおける白血病性細胞の成長は、高リスクのＢ−ＡＬＬと関係している
ことが示されてきた（ウックン，エフ．エム．（Ｕｃｋｕｎ，Ｆ．Ｍ．）ら、Ｂｌｏｏｄ
、第８５巻、８７３−８７８頁、１９９５年）。従って、本願の発明者らはｓｉＲＮＡの
媒介するＭＬＬ−ＡＦ４の枯渇が細胞の生着（ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ）及びインビボに
おける白血病の進行に影響を与えるかどうかを調べるためにｔ（４；１１）−ＳＣＩＤマ
ウスのモデルを使用した（ポークック，シー．エフ．（Ｐｏｃｏｃｋ，Ｃ．Ｆ．）ら、Ｂ
ｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ、第９０巻、８５５−８６７頁、１９９５年）。モック、或い
は対照のｓｉＲＮＡで処理されたＳＥＭ細胞のＳＣＩＤマウスへの腹腔内移植は移植後７
０日以内において白血病に関連して１００％死亡し、生存日数の中央値はそれぞれ５２及
び５２日であった（図５Ａ）。ＭＬＬ−ＡＦ４が枯渇したＳＥＭ細胞の異種移植術は、生
存日数の中央値が８２日であり、１２５日での全体に対する生存率が３８％（ｐは０．０
１未満）で、あまり深刻でない表現型を引き起こした。疾病にて死亡した動物は、卵巣腫
瘍と、脾腫と、骨髄、脾臓及び肝臓における重篤な白血病性芽球浸透と、を示す一方、ｓ
ｉＭＡ６群の生存動物の器官は移植後２２８日において白血病性浸透の兆候を全く示さな
かった（図５Ｂ，Ｃ）。結論として、ｓｉＲＮＡ媒介型ＭＬＬ−ＡＦ４の抑制は、異種移
植型ＳＣＩＤマウスにおけるｔ（４；１１）陽性細胞の白血病性細胞の生着を低減した。
【０１６８】
実施例１９：結論
ＭＬＬ−ＡＦ発現の阻害は、培養懸濁液中における白血病性の増殖並びにｔ（４；１１
）細胞株のコロニー形成を減少した。このコロニー形成能力及び増殖の低減は、アポトー
シスの増大に付随して起こった。更に、ＭＬＬ−ＡＦ４の枯渇は、Ｈｏｘａ７、Ｈｏｘａ
９及びＭｅｉｓ−１の発現の低減に付随して起こり、それが同様にアポトーシスに寄与し
ていると思われる。最後に、ｓｉＲＮＡ媒介型ＭＬＬ−ＡＦ４の抑制は、異種移植ＳＣＩ
Ｄマウスにおける白血病性細胞の生着を重大に損ねるものであった。ＳＣＩＤマウスにお
ける効果的な細胞の生着はＡＬＬ患者における再発の可能性が予測されているので（ウッ
クン，エフ．エム．ら、Ｂｌｏｏｄ、第８５巻、８７３−８７８頁、１９９５年）、これ
らのデータはＭＬＬ−ＡＦ４機能の干渉が患者の転帰を改善し得ることを示唆している。
【０１６９】
ｔ（４；１１）白血病細胞においてのみ発現することと、白血病の維持におけるその中
心的な役割とにより、ＭＬＬ−ＡＦ４はこの非常に進行性の白血病の治療に対する優れた
標的である。しかしながら、この融合タンパク質に特異的な小さな分子の阻害剤は現在の
ところ利用可能ではない。本願の発明者らは、この融合部位と相同であるｓｉＲＮＡがＭ
ＬＬ−ＡＦ４を効果的に抑制することを示している。更に、本願の発明者らは、この融合
遺伝子の二つの異なる変種が高効率かつ排他的な特異性にて標的化され得ることを示して
いる。この排他的な特異性はまた、これらのｓｉＲＮＡの観察された抗白血病性特性が直
接的にＭＬＬ−ＡＦ４の抑制によるものであり、他の遺伝子の意図していない阻害又はイ
ンターフェロンの応答の誘導のような標的以外の効果によるものでないことを証明した。
本願の発明者らの結果は、ＭＬＬ−ＡＦ４ｓｉＲＮＡが特異的ではあるが、柔軟性であり
、よってｔ（４；１１）ＡＬＬの治療に対する優れた治療のツールを提供することを示唆
している。
【０１７０】
その他の実施形態
本発明の種々の実施形態を記載してきた。しかしながら、本発明の精神及び範囲を逸脱
することなく種々の変更がなされることは理解されよう。
【数１】
【数２】
【数３】
【数４】
【数５】
【数６】
【数７】
【数８】
【数９】
【数１０】
【数１１】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＭＬＬ−ＡＦ４の発現を調節するための組成物および方法に関するものであ
り、より詳細には、化学的に修飾されたオリゴヌクレオチドによるＭＬＬ−ＡＦ４の下方
制御に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
本願は、２００４年１２月１４日出願の米国仮特許出願第６０／６３５，９３６号、２
００５年４月５日出願の米国仮特許出願第６０／６６８，３９２号および２００５年７月
１２日出願の米国仮特許出願第６０／６９８，４１４号の利益を主張する。３つすべての
仮特許出願は、参照により全体として本明細書に援用される。
【０００３】
種々の異なる白血病に関して、融合遺伝子を発生させる染色体異常が観察されている（
非特許文献１）。仮に、これらの発癌遺伝子が白血病の表現型を維持するために重要であ
れば、かかる腫瘍特異性の発癌遺伝子は、強い特異性を有する新たな治療アプローチのた
めの有望な標的となるはずである。しかしながら、白血病の進行とは対照的に、白血病の
持続に関する中心的役割は、少数の白血病融合遺伝子について確立されているのみである
。
【０００４】
染色体１１ｑ２３に位置する混合系統白血病（ＭＬＬ）遺伝子は、ヒト白血病に関連す
る多数の染色体転座に関与している（非特許文献２）。それらの中で最も一般的なものは
、転座ｔ（４；１１）（ｑ２１；ｑ２３）であり、かかる転座はＭＬＬ遺伝子を、染色体
４ｑ２１に位置するＡＦ４遺伝子と融合させる（非特許文献３、非特許文献４、非特許文
献５）。この転座は、高リスクの急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）の顕著な特徴であり
、特に乳児では予後不良をもたらす（非特許文献６）。
【０００５】
野生型ＭＬＬ遺伝子は、トリソラックス遺伝子群（ｆａｍｉｌｙ）の一員であり、４３
１ｋＤのタンパク質をコード化する。かかるタンパク質はタンパク質分解処理され、互い
にヘテロ二量化した２つの断片−３００ｋＤおよび１８０ｋＤになる（非特許文献７、非
特許文献８、非特許文献９、非特許文献１０）。ＭＬＬタンパク質は、ＤＮＡ結合のため
のＡＴフック・ドメイン、ＤＮＡメチル転移酵素（ＤＭＴ）およびメチル結合ドメインタ
ンパク質１（ＭＢＤ１）との相同性を示すＭＴドメイン、ジンク・フィンガーを含む植物
ホメオドメイン（ＰＨＤ）、並びにＳＥＴヒストン・メチル転移酵素ドメインを含む複雑
な構造を有する（非特許文献２）。ＭＬＬは、ホックス遺伝子の転写を制御するメカニズ
ムに関与している（非特許文献１１）。興味深いことに、ホックス遺伝子Ｈｏｘａ７およ
びＨｏｘａ９とホメオティック遺伝子Ｍｅｉｓ−１との組み合わせは、異なる幾つかのＭ
ＬＬ融合遺伝子によって誘導される形質転換のために必要である。このような決定的な役
割は、ＭＬＬ−ＡＦ４に関してはまだ報告されていない。にもかかわらず、３つすべての
ホメオティック遺伝子の発現レベルは、初代ｔ（４；１１）ＡＬＬにおいて上昇する。
【０００６】
ＡＦ４遺伝子は、核局在化シグナルおよびＧＴＰ結合ドメインを含むセリン／プロリン
・リッチタンパク質をコード化する。かかるタンパク質は細胞核に局在し（非特許文献１
２）、おそらく、転写活性化機能に関与するのであろうと思われる。ＭＬＬノックアウト
・マウスが胚致死であるのに対し（非特許文献１３）、ＡＦ４欠乏マウスは、不完全なＴ
細胞発生、およびＢ細胞発生の適度の改変を示す（非特許文献１４）。
【０００７】
特に、ｔ（４；１１）転座は２つの融合遺伝子、ＡＦ４−ＭＬＬおよびＭＬＬ−ＡＦ４
を生み出す。白血病誘発に関するいずれの融合遺伝子の重要性も、まだ完全には理解され
ていない。ＡＦ４−ＭＬＬは、ユビキチン媒介ＡＦ４分解に干渉してマウス胚由来線維芽
細胞を形質転換することが最近になって示された（非特許文献１５）。しかしながら、ｔ
（４；１１）陰性白血病細胞系でのＭＬＬ−ＡＦ４の異所性発現は、細胞周期進行を阻害
し、アポトーシスを引き起こす（非特許文献１６）。皮肉なことに、すべての（４；１１
）ＡＬＬ患者の２０％は、転写レベルまたはゲノム・レベルでＡＦ４−ＭＬＬを欠くのに
対して、ＭＬＬ−ＡＦ４は、異所性発現時の前アポトーシス活性にもかかわらず、常に検
出可能である（非特許文献１７、非特許文献１８）。興味深いことに、いくつかの研究は
、ＭＬＬ−ＡＦ４融合発癌遺伝子がｔ（４；１１）の状況において細胞生存を支援するこ
とを示唆する。ｔ（４；１１）転座のある細胞は、長期間にわたる血清枯渇を生き延び（
非特許文献１９）、ＣＤ９５媒介アポトーシスに対して耐性である（非特許文献２０）。
【０００８】
白血病誘発に関するこの融合発癌遺伝子の役割をより正確に定義するべく、出願人は、
白血病細胞内におけるＭＬＬ−ＡＦ４発現を阻害するためにＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を適
用した。ＲＮＡｉは、ｍＲＮＡの酵素開裂および破壊を生じる細胞プロセスであって、配
列特異性を有する２本鎖の小さな干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）によって導かれる（非特許
文献２１）。細胞にｓｉＲＮＡをトランスフェクトすると、ＲＮＡ誘導型サイレンシング
複合体と称される細胞質に位置付けられた（ｃｙｔｏｐｌａｓｍａｔｉｃａｌｌｙ ｌｏ
ｃａｔｅｄ）リボ核タンパク質複合体が発生する。ｓｉＲＮＡ鎖の一方を捨てることによ
りこの複合体が活性化され（非特許文献２２、非特許文献２３）、残鎖はＲＩＳＣを、相
補性を有するＲＮＡ配列に向かわせ、ＲＩＳＣ成分Ａｇｏ−２により、標的ＲＮＡのエン
ドヌクレアーゼ分解による開裂をきたす（非特許文献２４、非特許文献２５、非特許文献
２６）。外来的に追加された合成ｓｉＲＮＡは、遺伝子発現をサイレンシングさせるため
の非常に有力な、配列特異性の薬剤として働くことが示されており（非特許文献２７）、
遺伝子機能の分析ののみならず、遺伝子特異性の治療アプローチにとっても大きな可能性
を秘めていることが明らかとなった（非特許文献２８、非特許文献２９）。
【非特許文献１】ラビッツ（Ｒａｂｂｉｔｔｓ），Ｔ．Ｈ．、「Ｎａｔｕｒｅ」第３７２巻、１４３−１４９頁（１９９４年）
【非特許文献２】エルンスト（Ｅｒｎｓｔ），Ｐ．ら、「Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌ」、第９巻、２８２〜２８７頁（２００２年）
【非特許文献３】グゥ（Ｇｕ），Ｙ．ら、「Ｃｅｌｌ」第７１巻、７０１〜７０８頁（１９９２年）
【非特許文献４】マッカーブ（ＭｃＣａｂｅ），Ｎ．Ｒ．ら、「Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ」第８９巻、１１７９４〜１１７９８頁（１９９２年）
【非特許文献５】ドーマー（Ｄｏｍｅｒ），Ｐ．Ｈ．ら、「Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ」第９０巻、７８８４〜７８８８頁（１９９３年）
【非特許文献６】プイ（Ｐｕｉ），Ｃ．Ｈ．ら、「Ｌａｎｃｅｔ」第３５９巻、１９０９〜１９１５頁（２００２年）
【非特許文献７】ナカムラ（Ｎａｋａｍｕｒａ），Ｔ．ら、「Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ」第１０巻、１１１９〜１１２８頁（２００２年）
【非特許文献８】ヨコヤマ（Ｙｏｋｏｙａｍａ），Ａ．ら、「Ｂｌｏｏｄ」第１００巻、３７１０〜３７１８頁（２００２年）
【非特許文献９】シー（Ｈｓｉｅｈ），Ｊ．Ｊ．ら、「Ｃｅｌｌ」第１１５巻、２９３〜３０３頁（２００３年）
【非特許文献１０】シー（Ｈｓｉｅｈ），Ｊ．Ｊ．ら、「Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ」第２３巻、１８６〜１９４頁（２００３年）
【非特許文献１１】エートン（Ａｙｔｏｎ），Ｐ．Ｍ．およびクリアリー（Ｃｌｅａｒｙ），Ｍ．Ｌ．「Ｏｎｃｏｇｅｎｅ」第２０巻、５６９５〜５７０７頁（２００１年）
【非特許文献１２】リー（Ｌｉ），Ｑ．ら、「Ｂｌｏｏｄ」第９２巻、３８４１〜３８４７頁（１９９８年）
【非特許文献１３】ユー（Ｙｕ），Ｂ．Ｄ．ら、「Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ」第９５巻、１０６３２〜１０６３６頁（１９９８年）
【非特許文献１４】イスナール（Ｉｓｎａｒｄ），Ｐ．ら、「Ｂｌｏｏｄ」第９６巻、７０５〜７１０頁（２０００年）
【非特許文献１５】バーセン（Ｂｕｒｓｅｎ），Ａ．ら、「Ｏｎｃｏｇｅｎｅ」第２３巻、６２３７〜６２４９頁（２００４年）
【非特許文献１６】カスリーニ（Ｃａｓｌｉｎｉ），Ｃ．ら、「Ｌｅｕｋｅｍｉａ」第１８巻、１０６４〜１０７１頁（２００４年）
【非特許文献１７】ダウニング（Ｄｏｗｎｉｎｇ），Ｊ．Ｒ．ら、「Ｂｌｏｏｄ」第８３巻；３３０〜３３５頁（１９９４年）
【非特許文献１８】ライヘル（Ｒｅｉｃｈｅｌ），Ｍ．ら、「Ｏｎｃｏｇｅｎｅ」第２０巻、２９００〜２９０７頁（２００１年）
【非特許文献１９】カージー（Ｋｅｒｓｅｙ），Ｊ．Ｈ．ら、「Ｌｅｕｋｅｍｉａ」第１２巻、１５６１〜１５６４頁（１９９８年）
【非特許文献２０】デリエ（Ｄｏｒｒｉｅ），Ｊ．ら、「Ｌｅｕｋｅｍｉａ」第１３巻、１５３９〜１５４７頁（１９９９年）
【非特許文献２１】ダイクスフーム（Ｄｙｋｘｈｏｏｍ），Ｄ．Ｍ．ら、「Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ」第４巻、４５７〜４６７頁（２００３年）
【非特許文献２２】コヴォロヴァ（Ｋｈｖｏｒｏｖａ），Ａ．ら、「Ｃｅｌｌ」第１１５巻、２０９〜２１６頁（２００３年）
【非特許文献２３】シュバルツ（Ｓｃｈｗａｒｚ），Ｄ．Ｓ．ら、「Ｃｅｌｌ」第１１５巻、１９９〜２０８頁（２００３年）
【非特許文献２４】マイスター（Ｍｅｉｓｔｅｒ），Ｇ．ら、「Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ」第１５巻、１８５〜１９７頁（２００４年）
【非特許文献２５】ランド（Ｒａｎｄ），Ｔ．Ａ．ら、「Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ」第１０１巻、１４３８５〜１４３８９頁（２００４年）
【非特許文献２６】ソング（Ｓｏｎｇ），Ｊ．Ｊ．ら、「Ｓｃｉｅｎｃｅ」第３０５巻、１４３４〜１４３７頁（２００４年）
【非特許文献２７】エルバシール（Ｅｌｂａｓｈｉｒ），Ｓ．Ｍ．ら、「Ｎａｔｕｒｅ」第４１１巻、４９４〜４９８頁（２００１年）
【非特許文献２８】チェン（Ｃｈｅｎｇ），Ｊ．Ｃ．、ムーア（Ｍｏｏｒｅ），Ｔ．Ｂ．およびサカモト（Ｓａｋａｍｏｔｏ），Ｋ．Ｍ．「Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ」第８０巻、１２１〜１２８頁（２００３年）
【非特許文献２９】ハイデンライヒ（Ｈｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈ），Ｏ．「Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ」第５巻、３４９〜３５４頁（２００４年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本研究において出願人は、ｔ（４；１１）細胞内におけるＭＬＬ−ＡＦ４遺伝子発現を
特異的に阻害するためにＲＮＡｉを用いた。出願人は、融合転写ＭＬＬ−ＡＦ４の枯渇が
クローン形成能力および増殖を抑制し、ｔ（４；１１）陽性白血病細胞内においてアポト
ーシスを誘導し、ＳＣＩＤマウス異種移植モデル内においてかかる細胞の生着を危うくす
ることを明らかにする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、対象の、例えばヒトのような哺乳動物の、ＭＬＬ−ＡＦ４レベルを低減する
ための組成物および方法を提供する。この方法は、ＭＬＬ−ＡＦ４融合遺伝子の発現を（
例えば、少なくとも２％、４％、６％、１０％、１５％、２０％またはそれ以上）低下さ
せる、またはｔ（４；１１）陽性細胞の増殖率を抑制する、あるいはその両方を行うｉＲ
ＮＡ剤を、対象に投与することを含む。かかるｉＲＮＡ剤は、本明細書に記載されている
ものであり得るか、または、活性配列の１つに基づくｄｓＲＮＡであってＭＬＬ−ＡＦ４
融合遺伝子の、例えばヒトのＭＬＬ−ＡＦ４融合遺伝子のような哺乳動物ＭＬＬ−ＡＦ４
融合遺伝子の、同一の領域を標的とするｄｓＲＮＡであり得る。ｉＲＮＡ剤は、鎖当たり
３０個未満のヌクレオチドを、例えば２１〜２３個のヌクレオチドを含み、表１の薬剤番
号１乃至１２で提供される薬剤の１つから構成されるか、１つを含むか、または１つから
誘導され得る。２本鎖ｉＲＮＡ剤は平滑末端を有するか、または、より好ましくは、同薬
剤の３’末端の一方または両方からヌクレオチド１〜４個の突出部分を有することができ
る。これらの好ましいｉＲＮＡ剤は、対象内のすべての非ＭＬＬ−ＡＦ４遺伝子配列に対
して４個以上のヌクレオチド・ミスマッチを含むことが好ましい。
【００１１】
第１の態様において、本発明は特に、センス鎖であってかかるセンス鎖が、表１で提供
される薬剤番号１乃至１２のセンス鎖配列（配列番号５、１０、１２、１４、１８、２０
、２２、２４、２６、３０および３２）からの少なくとも１５個の連続したヌクレオチド
であるヌクレオチド配列を含むセンス鎖と、アンチセンス鎖であってかかるアンチセンス
鎖が、表１で提供される薬剤番号１乃至１２のアンチセンス配列（配列番号６、７、１１
、１３、１５、１９、２１、２３、２５、２７、３１および３３）からの少なくとも１５
個の連続したヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖と、を含むｉＲＮＡ剤、例えば、薬
剤番号５、センス鎖配列５’−ＡＡＧＡＡＡＡＧＣＡＧＡＣＣＵＡＣＵＣＣＡ−３’（配
列番号１４）、アンチセンス鎖配列５’−ＵＧＧＡＧＵＡＧＧＵＣＵＧＣＵＵＵＵＣＵＵ
ＵＵ−３’（配列番号１５）、を提供する。表１の薬剤番号１乃至１２のｉＲＮＡ剤は、
培養ヒトＳＥＭ細胞（白血病細胞系）内に存在するＭＬＬ−ＡＦ４ｍＲＮＡの量を、これ
らの薬剤とのインキュベーション後、かかる薬剤と共にインキュベーションされなかった
細胞に比べて４０％超低減するという有利なかつ驚くべき能力を有する（図１参照）。
【００１２】
第２の態様において本発明は、センス鎖内のヌクレオチド配列とアンチセンス鎖内のヌ
クレオチド配列とを含むｉＲＮＡ剤であって、各鎖が少なくとも１６、１７または１８個
のヌクレオチドの配列を含み、かかる配列が、培養ヒトＳＥＭ細胞内においてＭＬＬ−Ａ
Ｆ４発現を阻害するための能力を本質的に保持しながら鎖当たり１、２または３個以下の
ヌクレオチドがそれぞれ他のヌクレオチドと置換されている（例えばアデノシンがウラシ
ルに置き換えられている）点を除いて、表１の薬剤１乃至１２の配列（センス鎖：配列番
号５、１０、１２、１４、１８、２０、２２、２４、２６、３０および３２、アンチセン
ス鎖：配列番号６、７、１１、１３、１５、１９、２１、２３、２５、２７、３１および
３３）の１つと本質的に同一である、ｉＲＮＡ剤を提供する。
【００１３】
本発明のｉＲＮＡ剤は、表１で提供される薬剤１、２、５および９のセンス鎖配列（配
列番号５、１４および２４）から得られた少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含
むセンス鎖と、表１で提供される薬剤１、２、５および９のアンチセンス鎖配列（配列番
号６、７、１５および２５）の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含むアンチセ
ンス鎖とを含むことができ、かかるｉＲＮＡ剤は、これらの薬剤とのインキュベーション
後に培養ヒトＳＥＭ細胞内に存在するＭＬＬ−ＡＦ４ｍＲＮＡの量を、かかる薬剤と共に
インキュベーションされなかった細胞に比べて６０％超低減する。本発明のｉＲＮＡ剤の
アンチセンス鎖は、３０個以下のヌクレオチド長であり得、かかるｉＲＮＡ剤の２本鎖領
域は、１５〜３０対のヌクレオチド対長であり得る。ｉＲＮＡ剤は、少なくとも１つのヌ
クレオチド突出部分（ｏｖｅｒｈａｎｇ）を含むことができ、かかる突出部分は、１〜４
個の不対ヌクレオチドを、好ましくは２または３個の不対ヌクレオチドを有する。ヌクレ
オチド突出部分は、ｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖の３’末端に位置することができる。
【００１４】
さらに、本発明のｉＲＮＡ剤は、（ａ）センス鎖配列の配列番号５、１０、１２、１４
、１８、２０、２２、２４、２６、３０および３２の（５’から３’へ向かって）１位〜
１９位または１位〜２１位のヌクレオチド配列の群から選択されるヌクレオチド配列を有
するセンス鎖と、センス鎖が前記センス鎖配列の１位〜２１位のヌクレオチド配列を有す
ることが選択された場合にはアンチセンス鎖配列の配列番号６、１１、１３、１５、１９
、２１、２３、２５、２７、３１および３３の（５’から３’へ向かって）１位〜２１位
または３位〜２１位のヌクレオチド配列、並びに、センス鎖が前記センス鎖配列の１位〜
１９位のヌクレオチド配列を有することが選択された場合にはアンチセンス鎖配列の配列
番号６、１１、１３、１５、１９、２１、２３、２５、２７、３１および３３の３位〜２
１位のヌクレオチド配列、の群から選択されるヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖
と、により形成される２本鎖構造と、（ｂ）かかるセンス鎖及び／またはアンチセンス鎖
の３’末端に１〜４個の不対ヌクレオチドからなる少なくとも１つの１本鎖突出部分であ
って、同１本鎖突出部分は、センス鎖の３’末端にある場合には、前記センス鎖配列２０
位および２１位のヌクレオチドを各位置に選択的に含み、および／または、アンチセンス
鎖の３’末端にある場合には、前記アンチセンス鎖配列の２２位および２３位のヌクレオ
チドを各位置に選択的に含む、１本鎖突出部分と、から構成されており、かかる２本鎖構
造が、前記センス鎖配列の１位〜２１位のヌクレオチド配列を有するセンス鎖、および前
記アンチセンス鎖配列の１位〜２１位のヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖により
形成される場合には、かかるｉＲＮＡ剤はセンス鎖の３’末端に１〜４個の不対オリゴヌ
クレオチドの１本鎖突出部分を含んでいない。特に、センス鎖のヌクレオチド配列は、配
列番号１４のヌクレオチド配列から構成され得、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、
配列番号１４のヌクレオチド配列から構成され得る。
【００１５】
本発明のｉＲＮＡ剤は、培養ヒトＳＥＭ細胞内に存在するＭＬＬ−ＡＦ４ｍＲＮＡの量
を、このｉＲＮＡ剤とのインキュベーション後、かかる薬剤と共にインキュベーションさ
れなかった細胞に比べて４０％より多く低減するように意図されている。それらのｉＲＮ
Ａ剤は、生体試料内において同ｉＲＮＡ剤の安定性を増大させる修飾をさらに含むことが
でき、かかる修飾は、ホスホロチオエートまたは２’修飾ヌクレオチドであり得る。例え
ば、ｉＲＮＡ剤は、ウリジンが２’−修飾ヌクレオチドである少なくとも一つの５’−ウ
リジン−アデニン−３’（５’−ＵＡ−３’）ジヌクレオチド；５’−ウリジンが２’−
修飾ヌクレオチドである少なくとも一つの５’−ウリジン−グアニン−３’（５’−ＵＧ
−３’）ジヌクレオチド；５’−シチジンが２’−修飾ヌクレオチドである少なくとも一
つの５’−シチジン−アデニン−３’（５’−ＣＡ−３’）ジヌクレオチド；又は５’−
ウリジンが２’−修飾ヌクレオチドである少なくとも一つの５’−ウリジン−ウリジン−
３’（５’−ＵＵ−３’）ジヌクレオチドを更に含むことができる。２’修飾は、２’−
デオキシ、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエ
チル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−
ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（
２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭ
ＡＥＯＥ）および２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）の群から選択
できる。
【００１６】
ｉＲＮＡ剤はさらに、コレステロール部分を含むことができ、かかるコレステロール部
分は、ｉＲＮＡ剤のセンス鎖の３’末端に結合することが好ましい。ｉＲＮＡ剤は、肝臓
の細胞または消化管の細胞による取り込みに対して標的化され得る。
【００１７】
第３の態様において本発明は、医薬組成物であって、（ａ）本発明のｉＲＮＡ剤と、（
ｂ）薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物を提供する。
この医薬組成物は、ヒト血清またはマウス血清、あるいはヒト血清およびマウス血清内
においてｉＲＮＡ剤の半減期を延長させるかまたは細胞内へのｉＲＮＡ剤の取り込みを促
進する処方化剤を更に含むことができる。処方化剤はポリカチオンを含むことができる。
かかる医薬組成物は、増殖性疾患の、例えば癌腫、好ましくは白血病、より好ましくは急
性リンパ芽球性白血病の、治療に役立つものであることが好ましい。医薬組成物は、対象
、例えばヒトに、医薬組成物が投与されると、対象の細胞または組織内におけるＭＬＬ−
ＡＦ４融合遺伝子発現を（例えば、少なくとも２％、４％、６％、１０％、１５％、２０
％またはそれ以上）低下させる、またはｔ（４；１１）陽性細胞の増殖率を抑制する、あ
るいはその両方を行う能力を備えることが好ましい。
【００１８】
第４の態様において本発明は、増殖性疾患に罹患しているか、または同疾患を発症する
危険性のあるヒト対象を治療する方法であって、かかるヒト対象に本発明のｉＲＮＡ剤を
投与する工程を含む方法を提供する。かかる増殖性疾患は好ましくは癌腫であり、より好
ましくは急性リンパ芽球性白血病である。その場合、ｉＲＮＡ剤は、対象の細胞または組
織内におけるＭＬＬ−ＡＦ４の発現を（例えば、少なくとも２％、４％、６％、１０％、
１５％、２０％またはそれ以上）低下させるために、またはｔ（４；１１）陽性細胞の増
殖率を抑制するために、あるいはその両方を行うために十分な量にて投与できる。
【００１９】
第５の態様において本発明は、医薬組成物を作成する方法であって、本発明のｉＲＮＡ
剤の１つを医薬担体と共に処方する工程を含む方法を提供し、選択的に、ヒト血清または
マウス血清、あるいはヒト血清およびマウス血清内においてｉＲＮＡ剤の半減期を延長さ
せるかまたは細胞内へのｉＲＮＡ剤の取り込みを促進する処方化剤とともにｉＲＮＡ剤を
処方する工程をさらに含む。処方化剤はポリカチオンを含むことができる。本発明の方法
の医薬組成物は、増殖性疾患の治療に役立つものであることが好ましく、増殖性疾患は、
好ましくは癌腫であり、より好ましくは白血病であり、最も好ましくは急性リンパ芽球性
白血病である。ある好ましい実施形態では、本発明の方法の医薬組成物は、対象、例えば
ヒトに、同医薬組成物が投与されると、対象の細胞または組織内におけるＭＬＬ−ＡＦ４
融合遺伝子発現を（例えば、少なくとも２％、４％、６％、１０％、１５％、２０％また
はそれ以上）低下させること、またはｔ（４；１１）陽性細胞の増殖率を抑制すること、
あるいはその両方を行うことができる。
【００２０】
第６の態様において本発明は、細胞内におけるＭＬＬ−ＡＦ４ＲＮＡの量を（例えば、
少なくとも２％、４％、６％、１０％、１５％、２０％またはそれ以上）低減する、また
はｔ（４；１１）陽性細胞の増殖率を抑制する、あるいはその両方を行う方法であって、
かかる細胞を本発明のｉＲＮＡ剤に接触させる工程を含む方法を提供する。一実施形態で
は、この方法はインビトロにて行われる。代替的に、細胞は対象の細胞であって、対象は
増殖性疾患を、好ましくは癌腫を、より好ましくは急性リンパ芽球性白血病を、罹患して
いると診断されている。細胞は、腫瘍内に位置することができるか、またはマイクロクロ
ーン細胞であり得る。
【００２１】
第７の態様において本発明は、本発明のｉＲＮＡ剤を作成する方法であって、かかる方
法が、ｉＲＮＡ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖を合成する工程を含み、かかるセンス
鎖及び／またはアンチセンス鎖が少なくとも１つのヌクレオチド修飾を含み、好ましくは
前記ヌクレオチド修飾が生体試料内においてｉＲＮＡ剤の安定性を増大させる修飾である
方法を提供する。前記の方法は、対象にｉＲＮＡ剤を投与する工程をさらに含む。一実施
形態では、対象は増殖性疾患を、好ましくは癌腫、より好ましくは急性リンパ芽球性白血
病を罹患していると診察される。その場合、対象はヒトであり得る。
【００２２】
【表１】
第８の態様において本発明は、ＭＬＬ−ＡＦ４遺伝子の発現を阻害すると考えられるｉ
ＲＮＡ剤を評価する方法であって、かかる方法が、（ａ）ｉＲＮＡ剤を提供する工程と、
同工程において、第１の鎖が、ＭＬＬ−ＡＦ４ｍＲＮＡのヌクレオチド配列に対して十分
な相補性を有し、第２の鎖が、第１の鎖とハイブリダイズするために同第１の鎖に対して
十分な相補性を有することと、（ｂ）ＭＬＬ−ＡＦ４遺伝子を含む細胞にｉＲＮＡ剤を接
触させる工程と、（ｃ）ｉＲＮＡ剤を細胞に接触させる前のＭＬＬ−ＡＦ４遺伝子発現ま
たは接触していない対照細胞のＭＬＬ−ＡＦ４遺伝子発現と、ｉＲＮＡ剤を細胞に接触さ
せた後のＭＬＬ−ＡＦ４遺伝子発現と、を比較する工程と、（ｄ）ｉＲＮＡ剤が、ＭＬＬ
−ＡＦ４遺伝子発現を阻害するために有用であるかどうかを判定する工程であって、細胞
中に存在するＭＬＬ−ＡＦ４ＲＮＡの量、または細胞により分泌されるタンパク質の量が
、ｉＲＮＡ剤を細胞に接触させる前の存在量もしくは分泌量よりも少ないか、またはその
ように接触していない細胞による存在量もしくは分泌量よりも少ない場合に、同ｉＲＮＡ
剤が有用であると判定する工程とを含む方法、を提供する。
【００２３】
本方法の一実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、上記の通りの本発明のｉＲＮＡ剤である。
ｉＲＮＡ剤は、天然型のリボヌクレオチド・サブユニットのみを含み得るか、または、
ｉＲＮＡ剤に含まれる１つ以上のかかるリボヌクレオチド・サブユニットの糖もしくは塩
基に対する修飾を１つ以上含むように合成され得る。ｉＲＮＡ剤は、かかる薬剤の安定性
、分布または細胞への取り込みを改善するために選択されるリガンド、例えばコレステロ
ールに付着するようにさらに修飾され得る。かかる薬剤はさらに、単離形態であり得るか
、または、本明細書に記載されている方法に用いられる医薬組成物の一部であり得る。
【００２４】
別の実施形態では、本明細書に記載されているように、コレステロール部分（例えばセ
ンス鎖の３’末端に）、２’修飾（例えば２’−Ｏ−メチルまたは２’−デオキシ−２’
−フルオロ−修飾）およびホスホロチオエート（例えば、センス鎖およびアンチセンス鎖
の３’−端の１個または２個のヌクレオチド上に）が、同一ｉＲＮＡ剤内に存在する。
【００２５】
ｉＲＮＡ剤、例えば本明細書に記載されているｉＲＮＡ剤は、ＭＬＬ−ＡＦ４融合遺伝
子発現がある種の役割を演じる対象内に存在する疾病または疾患の治療のためのものであ
ることが好ましい。ｉＲＮＡ剤の投与は、ＭＬＬ−ＡＦ４融合により媒介される疾患の予
防的治療のためにも実施できる。
【００２６】
本発明は、ＭＬＬ−ＡＦ４の調節例えば阻害を行うｉＲＮＡ剤の調製物であって、かな
り純粋な調製物または薬学的に許容可能な調製物を含む調整物を特徴とする。ＭＬＬ−Ａ
Ｆ４を標的とするｉＲＮＡ剤が対象に投与でき、その対象は、ＭＬＬ−ＡＦ４融合遺伝子
またはその他のｔ（４；１１）染色体転座の存在を特徴とする疾患を、発症する危険性が
あるかまたは罹患している（例えば、罹患していると診断されている）。ｉＲＮＡ剤は、
かかる疾患またはその症状の開始を遅らせるために、かかる疾患と診断されたかもしくは
かかる疾患を罹患しているかまたはかかる疾患の危険性のある個人に投与できる。これら
の疾患は、急性リンパ芽球性白血病を含む、ｔ（４；１１）関連の白血病のような増殖性
疾患を含む。例えば、ＭＬＬ−ＡＦ４を標的とするｉＲＮＡ剤は、１つ以上の器官（骨髄
外での血液細胞の形成）、例えば脾臓、肝臓またはリンパ節において乳児急性リンパ芽球
性白血病、白血球増加症または髄外疾患を罹患している（例えば、罹患していると診断さ
れた）対象に投与できる。
【００２７】
また、ｉＲＮＡ剤は、骨髄のような特定の組織を標的とすることもでき、組織（例えば
組織の腫瘍）内のＭＬＬ−ＡＦ４発現レベルは、ＭＬＬ−ＡＦ４ｉＲＮＡ剤の投与後、低
下する。ｉＲＮＡ剤は、ｉＲＮＡ剤が血流内に広がっている時間を最大にするために修飾
されることが好ましい。例えばｉＲＮＡ剤は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）と結合する
ことができる。
【００２８】
本発明の方法および組成物では、ｉＲＮＡ剤は、送達剤、例えば、本明細書に記載され
ている送達剤で、例えばリポソームで修飾されるか、またはかかる送達剤と結合され得る
。かかる修飾は、かかる薬剤の循環時間を増大させるために、血清アルブミン（ＳＡ）、
例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、またはその断片との結合を媒介し得る。
【００２９】
本薬剤、本方法および本組成物は、細胞内においてＭＬＬ−ＡＦ４融合ｍＲＮＡを選択
的に分解するために、ＲＮＡ干渉に関与する細胞メカニズムを利用する。従って、本発明
の方法は通例、本発明のｉＲＮＡ剤の１つに細胞を接触させる工程を含む。かかる方法は
、細胞に対して直接実施できるか、または、本発明のｉＲＮＡ剤の１つを対象に投与する
ことにより、哺乳動物対象に対して実施できる。好ましい実施形態では、細胞は少なくと
も２回、好ましくは４８時間間隔で、ｉＲＮＡ剤に接触させられる。細胞内においてＭＬ
Ｌ−ＡＦ４融合ｍＲＮＡが減少すると、生成されるＭＬＬ−ＡＦ４融合タンパク質の量が
低減し、生物ではＭＬＬ−ＡＦ４融合物媒介型疾病の効果を減らすことができる。
【００３０】
本発明の特徴である方法および組成物、例えば、本明細書に記載されている増殖性疾患
を治療するための方法および組成物は、記載されたｉＲＮＡ剤のいずれかと共に利用でき
る。加えて、本発明の特徴である方法および組成物は、本明細書に記載されている疾病ま
たは疾患の治療、および対象、例えば動物、ヒトのような哺乳動物の治療に利用できる。
【００３１】
本発明の特徴である方法および組成物、例えば、本明細書に記載されている増殖性疾患
を治療するための方法およびｉＲＮＡ組成物は、本明細書に記載されている用量及び／ま
たは処方で、そして、本明細書に記載されている投与経路でも利用できる。
【００３２】
本発明の特徴である１つ以上の実施形態の詳細は、添付の図面および以下の詳細な説明
に記される。本発明のその他の特徴、目的および利点は、この詳細な説明、図面および請
求項から明らかになるであろう。本願はすべての目的のために、引用された全ての参照、
特許および特許出願を参照により全体として組み込む。
例えば、本願は以下の項目を提供する。
（項目１）
表１（配列番号５、１０、１２、１４、１８、２０、２２、２４、２６、３０及び３２）
に提供された薬剤番号１乃至１２のセンス鎖配列からの少なくとも１５個の連続したヌク
レオチドであるヌクレオチド配列を含むセンス鎖と、表１（配列番号６、７、１１、１３
、１５、１９、２１、２３、２５、２７、３１及び３３）に提供された薬剤番号１乃至１
２のアンチセンス鎖配列からの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含むアンチセ
ンス鎖と、とからなるｉＲＮＡ剤。
（項目２）
各々が、表１（センス鎖：配列番号５、１０、１２、１４、１８、２０、２２、２４、２
６、３０及び３２並びにアンチセンス鎖：配列番号６、７、１１、１３、１５、１９、２
１、２３、２５、２７、３１及び３３）の薬剤番号１乃至１２の配列のうちの一つと本質
的に同一である少なくとも１６、１７又は１８個のヌクレオチドの配列を含むセンス鎖中
のヌクレオチド配列とアンチセンス鎖中のヌクレオチド配列とを含むｉＲＮＡ剤であって
、鎖あたり１、２又は３個以下のヌクレオチドがそれぞれ他のヌクレオチドによって置換
されている（例えば、アデノシンがウラシルによって置換されている）が、培養ヒトＳＥ
Ｍ細胞中におけるＭＬＬ−ＡＦ４の発現を阻害する能力をほぼ維持している、ｉＲＮＡ剤
。
（項目３）
前記センス鎖は、表１に提供された薬剤番号１、２、５及び９のセンス鎖配列（配列番号
５、１４及び２４）からの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含み、前記アンチ
センス鎖は表１に提供された薬剤番号１、２、５及び９のアンチセンス鎖配列（配列番号
６、７、１５及び２５）からの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含み、前記ｉ
ＲＮＡ剤は、同剤とのインキュベーション後に、培養ヒトＳＥＭ細胞中のＭＬＬ−ＡＦ４
ｍＲＮＡの量を、同剤とともにインキュベーションしなかった細胞と比較して６０％超減
少させる、項目１に記載のｉＲＮＡ剤。
（項目４）
前記アンチセンスＲＮＡ鎖は長さが３０ヌクレオチド以下であり、前記ｉＲＮＡ剤の二重
鎖領域の長さが１５乃至３０ヌクレオチド対である、項目１乃至３のいずれか一項に記載のｉＲＮＡ剤。
（項目５）
１乃至４個の不対ヌクレオチドを有する少なくとも一つのヌクレオチド突出部分を含む、項目１乃至３のいずれか一項に記載のｉＲＮＡ剤。
（項目６）
前記ヌクレオチド突出部分が２又は３の不対ヌクレオチドを有する、項目５に記載のｉＲＮＡ剤。
（項目７）
前記ヌクレオチド突出部分ｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖の３’末端に存在する、項目５又は６に記載のｉＲＮＡ剤。
（項目８）
項目１に記載のｉＲＮＡ剤であって、
前記ｉＲＮＡ剤は、
（ａ）センス鎖配列の配列番号５、１０、１２、１４、１８、２０、２２、２４、２６、
３０及び３２の（５’から３’へ向かって）１位〜１９位又は１位〜２１位のヌクレオチ
ド配列の群から選択されるヌクレオチド配列から構成されたセンス鎖と、前記センス鎖が
同センス鎖配列の１位〜２１位のヌクレオチドの配列を有することが選択された場合には
アンチセンス鎖配列の配列番号６、７、１１、１３、１５、１９、２１、２３、２５、２
７、３１及び３３の（５’から３’へ向かって）１位〜２１位又は３位〜２１位のヌクレ
オチドの配列、並びに前記センス鎖が同センス鎖配列の１位〜１９位のヌクレオチド配列
を有することが選択された場合にはアンチセンス鎖配列の配列番号６、７、１１、１３、
１５、１９、２１、２３、２５、２７、３１及び３３の３位〜２１位のヌクレオチドの配
列、の群から選択されるヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖と、により形成される
２本鎖構造と、
（ｂ）前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖の少なくとも一方の３’−末端に１乃至４個
の不対ヌクレオチドからなる少なくとも１つの１本鎖の突出部分であって、前記１本鎖突
出部分は、前記センス鎖の３’−末端にある場合には同センス鎖配列の２０位及び２１位
のヌクレオチドを各位置に選択的に含むことと、前記アンチセンス鎖の３’−末端にある
場合には同アンチセンス鎖配列の２２位及び２３位のヌクレオチドを各位置に選択的に含
むここと、のうちの少なくとも一方である、１本鎖の突出部分と、
から構成されており、
前記２本鎖構造が前記センス鎖配列の１位〜２１位のヌクレオチド配列を有するセンス
鎖と、前記アンチセンス鎖配列の１位〜２１位のヌクレオチド配列を有するアンチセンス
鎖と、により形成されている場合には、前記ｉＲＮＡ剤は、同センス鎖の３’−末端に１
乃至４個の不対オリゴヌクレオチドの１本鎖突出部分を含んでいない、ｉＲＮＡ剤。
（項目９）
前記センス鎖のヌクレオチド配列は配列番号１４のヌクレオチド配列から構成され、かつ
前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は配列番号１５のヌクレオチド配列から構成され
る、項目８に記載のｉＲＮＡ剤。
（項目１０）
前記ｉＲＮＡ剤は同剤とのインキュベーション後に、培養ヒトＳＥＭ細胞中のＭＬＬ−Ａ
Ｆ４ｍＲＮＡの量を、同剤とともにインキュベーションしなかった細胞と比較して４０％
超減少させる、項目１乃至９のいずれか一項に記載のｉＲＮＡ剤。
（項目１１）
前記ｉＲＮＡ剤に生物試料中での高い安定性を与える修飾を更に含む、項目１乃至１０のいずれか一項に記載のｉＲＮＡ剤。
（項目１２）
ホスホロチオエート又は２’−修飾ヌクレオチドを含む、項目１乃至１１のいずれか一項に記載のｉＲＮＡ剤。
（項目１３）
ウリジンが２’−修飾ヌクレオチドである少なくとも一つの５’−ウリジン−アデニン−
３’（５’−ＵＡ−３’）ジヌクレオチド；５’−ウリジンが２’−修飾ヌクレオチドで
ある少なくとも一つの５’−ウリジン−グアニン−３’（５’−ＵＧ−３’）ジヌクレオ
チド；５’−シチジンが２’−修飾ヌクレオチドである少なくとも一つの５’−シチジン
−アデニン−３’（５’−ＣＡ−３’）ジヌクレオチド；又は５’−ウリジンが２’−修
飾ヌクレオチドである少なくとも一つの５’−ウリジン−ウリジン−３’（５’−ＵＵ−
３’）ジヌクレオチド、を含む、項目１乃至１２のいずれか一項に記載のｉＲＮＡ剤。
（項目１４）
前記２’−修飾が、２−デオキシ、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル
、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−
Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジ
メチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシ
エチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、及び２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ
−ＮＭＡ）からなる群より選択される、項目１２又は１３に記載のｉＲＮＡ剤。
（項目１５）
コレステロール部分を含む、項目１乃至１４のいずれか一項に記載のｉＲＮＡ剤。
（項目１６）
前記コレステロール部分が前記ｉＲＮＡ剤のセンス鎖の３’−末端に結合している、項目１５に記載のｉＲＮＡ剤。
（項目１７）
前記ｉＲＮＡ剤は肝臓の細胞により取り込まれるように標的化されている、項目１乃至１６のいずれか一項に記載のｉＲＮＡ剤。
（項目１８）
前記ｉＲＮＡ剤は消化管の細胞により取り込まれるように標的化されている、項目１乃至１６のいずれか一項に記載のｉＲＮＡ剤。
（項目１９）
（ａ）項目１乃至１８のいずれか一項に記載のｉＲＮＡ剤と、
（ｂ）製薬的に許容可能な担体と、
からなる製薬組成物。
（項目２０）
前記ｉＲＮＡ剤のヒト及びマウスの少なくとも一方における血漿中での半減期を延長させ
るか、又は細胞中における同ｉＲＮＡ剤の取り込みを容易にするための処方化剤を更に含
む、項目１９に記載の製薬組成物。
（項目２１）
前記処方化剤はポリカチオンを含む、項目２０に記載の製薬組成物。
（項目２２）
前記製薬組成物は増殖性疾患の治療に有用である、項目１９乃至２１のいずれか一項に記載の製薬組成物。
（項目２３）
前記増殖性疾患は、癌、好ましくは白血病、より好ましくは急性リンパ芽球性白血病である、項目２２に記載の製薬組成物。
（項目２４）
前記製薬組成物は、例えばヒトのような対象に同製薬組成物を投与することにより、同対
象の細胞又は組織中でのＭＬＬ−ＡＦ４融合遺伝子の発現を低減すること及びｔ（４；１
１）−陽性細胞の増殖率を抑制することのうちの少なくとも一方を可能にする、項目１９乃至２３のいずれか一項に記載の製薬組成物。
（項目２５）
増殖性疾患を有するヒト対象または同増殖性疾患の発生する危険性のあるヒト対象を治療
するための方法であって、項目１乃至１８のいずれか一項に記載のｉＲＮＡ剤を同ヒト対象に投与する工程を含む、方法。
（項目２６）
前記増殖性疾患は、癌、好ましくは急性リンパ芽球性白血病である、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記ｉＲＮＡ剤は対象の細胞又は組織中でのＭＬＬ−ＡＦ４の発現を低減すること及びｔ
（４；１１）−陽性細胞の増殖率を抑制することのうちの少なくとも一方を可能にするの
に十分な量にて投与される、項目２５又は２６に記載の方法。
（項目２８）
項目１乃至１８のいずれか一項に記載のｉＲＮＡ剤の一つを製薬的に許容可能な担体と
処方化させる工程を含む、製薬組成物を製造するための方法。
（項目２９）
前記ｉＲＮＡ剤のヒト及びマウスの少なくとも一方における血漿中での半減期を延長させ
るか、又は細胞中における同ｉＲＮＡ剤の取り込みを容易にするための処方化剤とともに
同ｉＲＮＡ剤を処方化する工程を更に含む、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記処方化剤はポリカチオンである、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記製薬組成物は増殖性疾患の治療に有用である、項目２８乃至３０のいずれか一項に記載の方法。
（項目３２）
前記増殖性疾患は、癌、好ましくは白血病、より好ましくは急性リンパ芽球性白血病であ
る、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記製薬組成物は、例えばヒトのような対象に同製薬組成物を投与することにより、同対
象の細胞又は組織中でのＭＬＬ−ＡＦ４融合遺伝子の発現を低減すること及びｔ（４；１
１）−陽性細胞の増殖率を抑制することのうちの少なくとも一方を可能にする、項目２
８乃至３２のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４）
細胞中のＭＬＬ−ＡＦ４ＲＮＡの量を低減すること及びｔ（４；１１）−陽性細胞の増殖
率を抑制することのうちの少なくとも一方を実施するための方法であって、前記単数又は
複数の細胞を項目１乃至１８のいずれか一項に記載のｉＲＮＡ剤と接触させる工程を含む、方法。
（項目３５）
前記方法はインビトロにて実施される、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記細胞が対象の細胞であり、かつ前記対象が増殖性疾患、好ましくは癌、より好ましく
は急性リンパ芽球性白血病に罹患していると診断されている、項目３４に記載の方法。
（項目３７）
項目１乃至１８のいずれか一項に記載のｉＲＮＡ剤を製造する方法であって、前記方法
は、同ｉＲＮＡ剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖を合成する工程を含み、前記センス鎖及
び前記アンチセンス鎖のうちの少なくとも一つは少なくとも一つのヌクレオチド修飾を含
む、方法。
（項目３８）
前記ヌクレオチド修飾は、前記ｉＲＮＡ剤に生物試料中での高い安定性を与える修飾であ
る、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記ｉＲＮＡ剤を対象に投与する工程を更に含む、項目３７に記載の方法。
（項目４０）
前記対象は増殖性疾患、好ましくは癌に罹患しているものとして診断されている、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
前記対象は急性リンパ芽球性白血病に罹患しているものとして診断されている、項目３９に記載の方法。
（項目４２）
前記対象がヒトである、項目３９に記載の方法。
（項目４３）
ＭＬＬ−ＡＦ４遺伝子の発現を阻害すると考えられているｉＲＮＡ剤を評価するための方
法であって、前記方法は、
（ａ）ｉＲＮＡ剤を提供する工程であって、第一の鎖がＭＬＬ−ＡＦ４ｍＲＮＡのヌクレ
オチド配列と十分に相補的であり、かつ第二の鎖が第一の鎖とハイブリダイズするべく同
第一の鎖と十分に相補的である、工程と、
（ｂ）前記ｉＲＮＡ剤をＭＬＬ−ＡＦ４遺伝子を含む細胞と接触させる工程と、
（ｃ）細胞と前記ｉＲＮＡ剤を接触させる前のＭＬＬ−ＡＦ４遺伝子の発現又は接触させ
ていない対照細胞のＭＬＬ−ＡＦ４遺伝子の発現と、細胞と前記ｉＲＮＡ剤を接触させた
後のＭＬＬ−ＡＦ４遺伝子の発現と、を比較する工程と、
（ｄ）前記ｉＲＮＡ剤がＭＬＬ−ＡＦ４遺伝子の発現を阻害するのに有用であるかどうか
を判定する工程であって、細胞中に存在するＭＬＬ−ＡＦ４ＲＮＡの量又は同細胞によっ
て分泌されるタンパク質の量が、細胞とｉＲＮＡ剤とを接触させる前の存在量若しくは分
泌量よりも少ない場合、又はそのような接触を受けていない細胞による存在量若しくは分
泌量よりも少ない場合、同ｉＲＮＡ剤は有用であると判定する工程と、
からなる方法。
（項目４４）
前記ｉＲＮＡ剤は項目１乃至１８のいずれか一項に記載のｉＲＮＡ剤である、項目４３に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１Ａ】ＭＬＬ−ＡＦ４ｓｉＲＮＡの活性および特異性を示す。ＭＬＬ−ＡＦｍＲＮＡ融合部位のｓｉＲＮＡスキャンを示す。ＧＡＰＤＨｍＲＮＡレベルにより正規化されたＭＬＬ−ＡＦ４ｍＲＮＡレベルが示される。表示したｓｉＲＮＡの標的部位は、１個の単一ヌクレオチドだけ融合部位のＡＦ４部分からＭＬＬ部分に移された。総ＲＮＡは、５００ｎＭのｓｉＲＮＡを用いたエレクトロポレーションの２４時間後に単離され、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより分析された。Ｘ軸の数字は、表２のｓｉＲＮＡの付番に対応する（ｓｉＭＡｎ、ｎ＝１〜１４）。エラー・バーは標準偏差を示す。
【図１Ｂ】ＭＬＬ−ＡＦ４ｓｉＲＮＡの活性および特異性を示す。ＭＬＬ−ＡＦ４枯渇の経時変化を示す。総ＲＮＡは、モックエレクトロポレーションまたは７５０ｎＭのｓｉＲＮＡであるｓｉＭＡ６もしくはミスマッチ対照ｓｉＭＡｍｍを用いたエレクトロポレーションの後、表示した時点で単離された。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、図１Ａの通りに行われた。
【図１Ｃ】ＭＬＬ−ＡＦ４ｓｉＲＮＡの活性および特異性を示す。ＳＥＭ細胞内のＭＬＬ−ＡＦ４、ＡＦ４およびＭＬＬのｍＲＮＡレベルに対するＭＬＬ−ＡＦ４ｓｉＲＮＡｓｉＭＡ６およびミスマッチ対照ｓｉＭＭの効果を示す。分析は図１Ａの通りに行われた。
【図１Ｄ】ＭＬＬ−ＡＦ４ｓｉＲＮＡの活性および特異性を示す。ｓｉＲＮＡトランスフェクションによるＭＬＬ−ＡＦ４タンパク質の枯渇を示す。総細胞溶解物は、モックエレクトロポレーションまたは５００ｎＭのｓｉＲＮＡｓｉＭＡ６もしくはミスマッチ対照ｓｉＭＡｍｍを用いたエレクトロポレーションの４８時間後に単離された。ＭＬＬ−ＡＦ４は、ＡＦ４のＣ末端を標的とする抗体を用いて検出された。ＧＡＰＤＨはローディングコントロールとして、また、正規化のために提供された。正規化ＭＬＬ−ＡＦ４タンパク質レベルは下部に表示されている。
【図１Ｅ】ＭＬＬ−ＡＦ４ｓｉＲＮＡの活性および特異性を示す。ＲＳ４；１１細胞内のＭＬＬ−ＡＦ４、ＡＦ４およびＭＬＬのｍＲＮＡレベルに対するＭＬＬ−ＡＦ４ｓｉＲＮＡであるｓｉＭＡ６およびｓｉＭＡＲＳ並びにミスマッチ対照ｓｉＭＭの効果を示す。分析は図１Ａの通りに行われた。ｓｉＭＡ６は、ＳＥＭ細胞内で発現したＭＬＬ−ＡＦ４変種と相同であり、ｓｉＭＡＲＳは、ＲＳ４；１１細胞内に存在する変種を標的とする。
【図１Ｆ】ＭＬＬ−ＡＦ４ｓｉＲＮＡの活性および特異性を示す。ＭＬＬ−ＡＦ４ｓｉＲＮＡは、インターフェロン応答を誘導しない。ＳＥＭ細胞は、表示したＲＮＡでトランスフェクションされた。ポリＩＣ（７．５μｇ／ｍｇ）は、インターフェロン応答遺伝子ＯＡＳ１およびＳＴＡＴ１の誘導に対する陽性対照として提供されている。分析は図１Ａの通りに行われた。
【図２Ａ】ＭＬＬ−ＡＦ４枯渇が、ｔ（４；１１）陽性白血病細胞のコロニー形成および増殖を阻害することを示す。ＭＬＬ−ＡＦ４およびＡＭＬ１／ＭＴＧ８ ｓｉＲＮＡの特異性を示す。ＳＥＭ細胞はＭＬＬ−ＡＦ４を発現するのに対して、Ｋａｓｕｍｉ−１細胞はＡＭＬ１／ＭＴＧ８を発現する。ｓｉＭＡ６処理済みＳＥＭ細胞またはｓｉＡＧＦ１処理済みＫａｓｕｍｉ−１細胞により形成されたコロニーの数は、各々のミスマッチ対照で処理された細胞による数よりも顕著に少ない（ｐ＜０．００１）。
【図２Ｂ】ＭＬＬ−ＡＦ４枯渇が、ｔ（４；１１）陽性白血病細胞のコロニー形成および増殖を阻害することを示す。ＲＳ４；１１クローン形成能力の阻害は、ＭＬＬ−ＡＦ４融合部位に対する完全な相同性に依存する。ｓｉＭＡＲＳ処理済みＲＳ４；１１細胞により形成されたコロニーの数は、モック処理済みＲＳ４；１１細胞、ｅ９−ｅ４変種特異的なｓｉＭＡ６で処理されたＲＳ４；１１細胞、またはｅ９−ｅ４ミスマッチ対照ｓｉＭＡｍｍによる数よりも顕著に少ない（ｐ＜０．０００１）。
【図２Ｃ】ＭＬＬ−ＡＦ４枯渇が、ｔ（４；１１）陽性白血病細胞のコロニー形成および増殖を阻害することを示す。ＭＬＬ−ＡＦ４を標的とするｓｉＲＮＡは、初代ヒトＣＤ３４＋造血細胞のコロニー形成に影響を与えない。初代ヒトＣＤ３４＋造血細胞は、７５０ｎＭのｓｉＭＡ６（ＳＥＭ細胞内で発現したＭＬＬ−ＡＦ４ｅ９−ｅ４変種を標的とするｓｉＲＮＡ）、ｓｉＭＡＲＳ（ＲＳ４；１１細胞内で発現したＭＬＬ−ＡＦ４ｅ１０−ｅ４変種を標的とするｓｉＲＮＡ）、またはｅ９−ｅ４ミスマッチ対照ｓｉＭＭを用いてエレクトロポレーションされた。エラー・バーは標準偏差を示す。
【図２Ｄ】ＭＬＬ−ＡＦ４枯渇が、ｔ（４；１１）陽性白血病細胞のコロニー形成および増殖を阻害することを示す。ｓｉＲＮＡ処理済みのＳＥＭ細胞およびＲＳ４；１１細胞の成長曲線を示す。細胞は１日おきに、モックエレクトロポレーションされたか、または７５０ｎＭのｓｉＭＡ６、ｓｉＭＡＲＳもしくはミスマッチ対照ｓｉＭＡｍｍを用いてエレクトロポレーションされた。細胞数は、ＭＴＴ試験を用いて割り出された。各々の細胞系に存在する融合部位変種に対して相補性を有するｓｉＲＮＡのみが、成長を抑制した。エラー・バーは標準偏差を示す。
【図２Ｅ】ＭＬＬ−ＡＦ４枯渇が、ｔ（４；１１）陽性白血病細胞のコロニー形成および増殖を阻害することを示す。ＳＥＭ細胞およびＲＳ４；１１細胞の細胞周期分布に対するＭＬＬ−ＡＦ４ｓｉＲＮＡの効果を示す。グラフは、表示した周期相（ｃｙｃｌｅ ｐｈａｓｅ）における細胞の割合を示す。細胞周期分布は、図２Ｄに示された経時変化実験から得られた細胞を用いて、表示された日にフロー・サイトメトリーにより割り出された。
【図３Ａ】ＭＬＬ−ＡＦ４枯渇が、ｔ（４；１１）陽性ＳＥＭ細胞およびＲＳ４；１１細胞のアポトーシスを誘導することを示す。サブＧ１細胞の画分に対するＭＬＬ−ＡＦ４抑制の効果を示す。図２Ｄおよび２Ｅに示された経時変化から得られた細胞が、フロー・サイトメトリーによりＤＮＡ量について分析された。
【図３Ｂ】ＭＬＬ−ＡＦ４枯渇が、ｔ（４；１１）陽性ＳＥＭ細胞およびＲＳ４；１１細胞のアポトーシスを誘導することを示す。ＳＥＭ細胞のアネキシンＶ染色を示す。アネキシンＶ陽性ＳＥＭ細胞は、表示したｓｉＲＮＡの７５０ｎＭを用いた２回目のエレクトロポレーションの４日後にフロー・サイトメトリーにより定量化された。アネキシンＶおよびアネキシンＶ／ヨウ化プロピジウム陽性細胞の割合が、対応する象限に示されている。
【図３Ｃ】ＭＬＬ−ＡＦ４枯渇が、ｔ（４；１１）陽性ＳＥＭ細胞およびＲＳ４；１１細胞のアポトーシスを誘導することを示す。ＭＬＬ−ＡＦ４抑制は、カスパーゼ３の活性化を引き起こし、Ｂｃｌ−ＸＬタンパク質レベルを低下させる。免疫ブロットは、タンパク質分解により活性化されたカスパーゼ３およびＢｃｌ−ＸＬタンパク質を示す。チューブリンおよびＧＡＰＤＨは、ローディングコントロールとして提供されている。
【図４】ＭＬＬ−ＡＦ４抑制が、Ｈｏｘａ７およびＨｏｘａ９の遺伝子発現に影響を与えることを示す。総ＲＮＡは、表示されたｓｉＲＮＡの５００ｎＭを用いた２回目のエレクトロポレーションの４８時間後に単離され、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより分析された。エラー・バーは標準偏差を示す。
【図５Ａ】ＭＬＬ−ＡＦ４抑制が、白血病性細胞の生着を減少させることを示す。ＳＥＭ細胞を移植されたＳＣＩＤマウスの生存曲線を示す。ＳＥＭ細胞は移植前に、２回モックエレクトロポレーションされたか、またはｓｉＲＮＡｓｉＭＡ６またはそのミスマッチ対照ｓｉＭＡｍｍを用いて２回エレクトロポレーションされた。ＭＬＬ−ＡＦ４ｅ９−ｅ４特異的ｓｉＲＮＡｓｉＭＡ６での事前処理は、モック事前処理または対照ｓｉＲＮＡ事前処理に比べて顕著に、生存時間の中央値を延長し、生存率全体を増大させた（ログランク検定によればｐ＜０．０１）。
【図５Ｂ】ＭＬＬ−ＡＦ４抑制が、白血病性細胞の生着を減少させることを示す。骨髄のＦＡＣＳ分析を示す。動物の骨髄細胞が、非ヒトＣＤ４５抗体で染色され、フロー・サイトメトリーにより分析された。ｓｉＭＡ６で処理された動物は、ＣＤ４５陽性細胞の数がかなり少なかった。
【図５Ｃ】ＭＬＬ−ＡＦ４抑制が、白血病性細胞の生着を減少させることを示す。肝臓および脾臓の組織構造を示す。原倍率：２００倍、縮尺バー：５０μｍ。モック細胞またはｓｉＭＭ事前処理済み細胞を移植されたマウスは、分析の時点で瀕死状態であった。ｓｉＭＡ６事前処理済み細胞を移植された動物は、白血病関連の病的状態の徴候を示すことなく、移植から２２８日後に死亡した。
【図５Ｄ】ＭＬＬ−ＡＦ４抑制が、白血病性細胞の生着を減少させることを示す。脾臓サイズの比較を示す。左側の脾臓は、モック処理済み動物に由来し、中央の脾臓は、ミスマッチ対照ｓｉＲＮＡｓｉＭＭで処理された動物に由来し、右の脾臓は、ＭＬＬ−ＡＦ４に特異的なｓｉＲＮＡｓｉＭＡ６で処理された動物に由来する。
【図５Ｅ】ＭＬＬ−ＡＦ４抑制が、白血病性細胞の生着を減少させることを示す。器官重量のグラフを表示する。器官重量は全体重に対して正規化された。生存ｓｉＭＡ６群動物の肝臓および脾臓の正規化重量は、モック群またはｓｉＭＭミスマッチ対照群の重量よりも顕著に小さかった（各々、ｐ＜０．０５およびｐ＜０．００１）。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
解説を容易にするために、本明細書では時として、「ヌクレオチド」または「リボヌク
レオチド」という用語を、ＲＮＡ剤の１つまたは複数の単量体サブユニットに関して使用
する。本明細書では、「リボヌクレオチド」または「ヌクレオチド」という用語の使用は
、修飾ＲＮＡまたはヌクレオチド代替物に関する場合、以下でさらに記載するように、１
つまたは複数の位置における、修飾ヌクレオチドまたは代替置換部分も指すことがあると
理解されよう。
【００３５】
本明細書で使用される場合、「ＲＮＡ剤」は、無修飾ＲＮＡ、修飾ＲＮＡ、またはヌク
レオシド代替物であり、これらはすべて本明細書に記載されている。多数の修飾ＲＮＡお
よびヌクレオチド代替物が記載されているが、好ましいものの例には、ヌクレアーゼ分解
に対して、無修飾ＲＮＡが有するものより大きな抵抗性を有するものが含まれる。好まし
いものの例には、２’糖修飾、単一鎖突出部分内、好ましくは３’単一鎖突出部分内の修
飾、あるいは、特に１本鎖の場合、１つもしくは複数のリン酸基または１つもしくは複数
のリン酸基類似体を含有する５’修飾を有するものが含まれる。
【００３６】
本明細書で使用される場合、「ｉＲＮＡ剤」（「干渉ＲＮＡ剤」の略）は、標的遺伝子
、例えば標的融合遺伝子ＭＬＬ−ＡＦ４の発現を下方制御できるＲＮＡ剤である。理論に
拘泥するものではないが、ｉＲＮＡ剤は、当技術分野では時にＲＮＡｉと呼ばれる標的ｍ
ＲＮＡの転写後の切断、または転写前もしくは翻訳前の機構を含めた多数の機構のうちの
１つまたは複数によって作用し得る。ｉＲＮＡ剤は、２本鎖ｉＲＮＡ剤であり得る。
【００３７】
「ｄｓ ｉＲＮＡ剤」（「２本鎖ｉＲＮＡ剤」の略）は、本明細書で使用される場合、
複数、好ましくは２本の鎖を含み、その中で鎖間ハイブリダイゼーションが２本鎖構造領
域を形成できるｉＲＮＡ剤である。本明細書では、「鎖」は、連続したヌクレオチド（天
然には存在しないヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチドも含まれる）の配列を指す。２本
以上の鎖が別々の分子であっても、それらの各鎖が別々の分子の一部を形成してもよく、
また、それらが、例えばリンカー、例えばポリエチレングリコールリンカーによって共有
結合で相互連結され、１分子のみを形成していてもよい。少なくとも１本の鎖は、標的Ｒ
ＮＡに十分に相補的な領域を含むものであり得る。そのような鎖は「アンチセンス鎖」と
称される。アンチセンス鎖に相補的な領域を含むｄｓＲＮＡ剤中に含まれている第２の鎖
は「センス鎖」と称されている。しかしながら、ｄｓ ｉＲＮＡ剤は、少なくとも一部が
自己相補的であり、２本鎖領域を含む、例えばヘアピンまたはフライパンハンドル構造を
形成する単一のＲＮＡ分子から形成されていてもよい。そのような場合、「鎖」という用
語は、同一ＲＮＡ分子の別の領域に相補的なＲＮＡ分子の領域の１つを指す。
【００３８】
哺乳動物細胞では、長いｄｓ ｉＲＮＡ剤によってインターフェロン応答が誘導される
ことがあり、それがしばしば有害であるが、短いｄｓ ｉＲＮＡ剤は、インターフェロン
応答を、少なくとも細胞および／または宿主に有害となる程度までには誘導しない（マン
シュ エル（Ｍａｎｃｈｅ，Ｌ．）ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９２年、第１
２巻、５２３８頁；リー エスビー（Ｌｅｅ，ＳＢ）、エステバン エム（Ｅｓｔｅｂａ
ｎ，Ｍ）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９９４年、第１９９巻、４９１頁；キャステリ ジェー
シー（Ｃａｓｔｅｌｌｉ，ＪＣ）ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９７年、第１８６巻、９
６７頁；チェン エックス（Ｚｈｅｎｇ、Ｘ．）、ベビラクア ピーシー（Ｂｅｖｉｌａ
ｃｑｕａ，ＰＣ）、ＲＮＡ、２００４年、第１０巻、１９３４頁；ハイデル（Ｈｅｉｄｅ
ｌ）ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎ．、２００４年、第２２巻、１５７９頁）。本
発明のｉＲＮＡ剤は、十分に短い分子を含有しており、それらは正常な哺乳動物細胞で有
害な非特異的インターフェロン応答を誘発しない。したがって、対象へのｉＲＮＡ剤組成
物（例えば本明細書に記載の通り製剤化されたもの）の投与を用いて、インターフェロン
応答を回避しながら、上記対象に含まれているＭＬＬ−ＡＦ４融合発現細胞におけるＭＬ
Ｌ−ＡＦ４融合遺伝子の発現をサイレンシングすることができる。十分に短くて、有害な
インターフェロン応答を誘発しない分子を、本明細書では、ｓｉＲＮＡ剤またはｓｉＲＮ
Ａと称する。「ｓｉＲＮＡ剤」または「ｓｉＲＮＡ」は、本明細書で使用される場合、十
分に短くて、ヒト細胞で有害なインターフェロン応答を誘導しないｉＲＮＡ剤、例えばｄ
ｓ ｉＲＮＡ剤を指し、それは例えば６０ヌクレオチド対未満、好ましくは５０、４０、
または３０ヌクレオチド対未満の２本鎖領域を有する。
【００３９】
ｄｓ ｉＲＮＡ剤およびｓｉＲＮＡ剤を含めた、本明細書に記載の単離されたｉＲＮＡ
剤は、例えばＲＮＡ分解によるＭＬＬ−ＡＦ４融合遺伝子のサイレンシングを媒介するこ
とができる。便宜のために、そのようなＲＮＡは、本明細書では、サイレンシングされる
ＲＮＡとも称される。そのような遺伝子は、標的遺伝子とも称される。サイレンシングさ
れるＲＮＡは、例えば白血病細胞のような細胞に対して内因性であるＭＬＬ−ＡＦ４融合
遺伝子の遺伝子産物であることが好ましい。
【００４０】
本明細書で使用される場合、「ＲＮＡｉを媒介する」という用語は、薬剤が標的遺伝子
を配列特異的な様式でサイレンシングする能力を指す。「標的遺伝子をサイレンシングす
る」とは、それによって、上記薬剤に接触していないときに標的遺伝子の特定の産物を含
有および／または分泌する細胞が、上記薬剤に接触しているときに、上記薬剤に接触して
いない同様な細胞と比較して、そのような遺伝子産物を少なくとも１０％、２０％、３０
％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％少なく含有および／または
分泌するであろう過程を意味する。標的遺伝子のそのような産物は、例えば、メッセンジ
ャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、タンパク質、または調節エレメントであり得る。
【００４１】
本明細書で使用される場合、「相補的」という用語は、本発明の化合物と標的ＲＮＡ分
子、例えばＭＬＬ−ＡＦ４ｍＲＮＡ分子との間で安定かつ特異的な結合が生じるのに十分
な程度の相補性を示すのに使用される。特異的な結合は、特異的な結合が望ましい条件下
で、すなわちインビボ試験または治療処置の場合には生理条件下で、あるいはインビトロ
試験の場合では同試験が実施される条件下で、非標的配列へのオリゴマー化合物の非特異
的結合を回避するのに十分な程度の相補性を必要とする。非標的配列は、通常、少なくと
も４ヌクレオチドの相違を有する。
【００４２】
本明細書で使用される場合、ｉＲＮＡ剤が標的ＲＮＡ、例えば標的ｍＲＮＡ（例えば標
的ＭＬＬ−ＡＦ４ｍＲＮＡ）に「十分に相補的である」のは、上記ｉＲＮＡ剤によって、
細胞内での、上記標的ＲＮＡによってコードされたタンパク質の産生が減少する場合であ
る。上記ｉＲＮＡ剤は、標的ＲＮＡに「正確に相補的」（サブユニットを含むＳＲＭＳを
除く）であってもよく、例えば上記標的ＲＮＡと上記ｉＲＮＡ剤とがアニールするもので
もよい。正確に相補的な領域では、ワトソンクリック塩基対のみでハイブリット形成され
ていることが好ましい。「十分に相補的な」ｉＲＮＡ剤は、標的ＭＬＬ−ＡＦ４ＲＮＡに
正確に相補的な内部領域（例えば少なくとも１０ヌクレオチド）を含み得る。さらに、一
部の実施形態では、上記ｉＲＮＡ剤が単一ヌクレオチドの相違を特異的に識別する。この
場合、上記ｉＲＮＡ剤は、単一ヌクレオチド相違の（例えば７ヌクレオチド以内の）領域
で正確な相補性が存在する場合にのみＲＮＡｉを媒介する。好ましいｉＲＮＡ剤は、表１
に示すセンス配列およびアンチセンス配列に基づいているか、もしくはそれからなるか、
もしくはそれを含むであろう。
【００４３】
本明細書での使用において、「本質的には同一」は、第２のヌクレオチド配列と比較し
て第１のヌクレオチド配列に関して使用される場合、最大１、２、または３ヌクレオチド
までの置換（例えばアデノシンがウラシルで置換されている）を除いて、第１のヌクレオ
チド配列が第２のヌクレオチド配列に同一であることを意味する。「培養ヒトＳＥＭ細胞
でＭＬＬ−ＡＦ４発現を阻害する能力を本質的に保持している」ということは、ヌクレオ
チドの欠失、添加または置換によって、表１のｉＲＮＡ剤のうちの１つに同一ではないが
、それに由来するｉＲＮＡ剤に関して本明細書で使用される場合、それが由来した表１の
ｉＲＮＡ剤との比較における、得られたｉＲＮＡ剤の阻害活性の低下が２０％阻害以下で
あることを意味する。例えば、培養ヒトＳＥＭ細胞中に存在するＭＬＬ−ＡＦ４ｍＲＮＡ
の量を４０％低下させる、表１のｉＲＮＡ剤に由来するｉＲＮＡ剤は、培養ヒトＳＥＭ細
胞中でＭＬＬ−ＡＦ４発現を阻害する能力を本質的に保持しているものとみなされるため
には、それ自体が、培養ヒトＳＥＭ細胞中に存在するＭＬＬ−ＡＦ４ｍＲＮＡの量を少な
くとも４０％低下させなければならない。選択的に、本発明に特徴的なｉＲＮＡ剤は、培
養ヒトＳＥＭ細胞中に存在するＭＬＬ−ＡＦ４ｍＲＮＡの量を少なくとも４０％低下させ
るものでもよい。
【００４４】
本明細書で使用される場合、「対象」は、ＭＬＬ−ＡＦ４融合タンパク質発現によって
媒介された障害の治療を受けている哺乳類生物を指す。対象は、ウシ、ウマ、マウス、ラ
ット、イヌ、ブタ、ヤギ、または霊長類など、いかなる哺乳動物でもよい。好ましい実施
形態では、対象はヒトである。
【００４５】
本明細書で使用される場合、ＭＬＬ−ＡＦ４融合発現に関連した障害は、１）、ＭＬＬ
−ＡＦ４融合タンパク質の存在によって一部媒介され、かつ２）存在している、ＭＬＬ−
ＡＦ４融合タンパク質のレベルを低減することによって結果に影響を与えることができる
いかなる生物学的または病理学的状態も指す。ＭＬＬ−ＡＦ４融合発現に関連した特定の
障害について以下に述べる。
【００４６】
（ＭＬＬ−ＡＦ４誤発現に関連した障害）
ＭＬＬ−ＡＦ４融合産物は、乳児急性リンパ芽球性白血病のような急性リンパ芽球性白
血病（ＡＬＬ）に関連していた。ＡＬＬに罹患した患者は典型的には顕著な白血球の増加
と複数の器官における髄外疾患とを呈し、化学療法に対する応答不良であり、予後不良で
ある。
【００４７】
（ｉＲＮＡ剤の設計および選択）
本発明は、ｉＲＮＡ剤でインキュベートした後の培養細胞における、インビトロでのＭ
ＬＬ−ＡＦ４融合遺伝子サイレンシングの実証、およびその結果である増殖抑制効果に基
づいている。
【００４８】
配列情報と望ましい特徴とに基づいて、ｉＲＮＡ剤を合理的に設計することができる。
例えば、候補となる２本鎖の相対的融解温度に従ってｉＲＮＡ剤を設計することができる
。通常、２本鎖は、アンチセンス鎖の３’末端より、アンチセンス鎖の５’末端で、より
低い融解温度を有するはずである。
【００４９】
また、例えば、標的遺伝子として働くであろう遺伝子の遺伝子歩行分析を行うことによ
っても、候補となるｉＲＮＡ剤を設計することができる。転写領域のすべてまたは一部に
相当する、オーバーラップ、隣接、または近接した候補薬剤を生成させ、試験することが
できる。各ｉＲＮＡ剤を、標的遺伝子発現を下方制御する能力に関して試験および評価す
ることができる（下記、「候補となるｉＲＮＡ剤の評価」を参照）。
【００５０】
以下に示す実施例１は、遺伝子歩行のアプローチをヒトＭＬＬ−ＡＦ４ｍＲＮＡの融合
部位を標的とする潜在的なｉＲＮＡ剤を評価するために使用したことを示す。与えられた
結果に基づいて、表１はＭＬＬ−ＡＦ４を標的とする活性ｉＲＮＡ剤を提供している。以
下の実施例に示されるように、表１の薬剤番号１乃至１２のｉＲＮＡ剤は、これらの薬剤
と共にインキュベーションした後の培養ＭＬＬ−ＡＦ４融合遺伝子発現細胞中に存在する
ＭＬＬ−ＡＦ４融合ｍＲＮＡの量が、上記薬剤と共にインキュベートされていない細胞と
比較して４０％超低減するという長所および驚くべき能力を有する。
【００５１】
これらの結果に基づいて、本発明は、表１に示されている薬剤のセンス鎖配列における
少なくとも１５の連続したヌクレオチドを有するセンス鎖と、表１に薬剤番号１−１２に
て示されている薬剤のアンチセンス鎖配列における少なくとも１５の連続したヌクレオチ
ドを有するアンチセンス鎖とを含有するｉＲＮＡ剤を特に提供する。
【００５２】
以下の実施例１に示したｉＲＮＡ剤は、薬剤番号２のものを除いて、長さ２１ヌクレオ
チドのセンス鎖と、長さ２３ヌクレオチドのアンチセンス鎖とで構成されている。しかし
ながら、これらの長さは潜在的に最適であり得るが、上記ｉＲＮＡ剤はこれらの長さに限
定されない。長さが特定の範囲内である場合には、有効性は鎖の長さより、むしろヌクレ
オチド配列の関数であるので、当業者は、より短いｉＲＮＡ剤またはより長いｉＲＮＡ剤
も同様に有効であり得ることを十分に認識している。例えば、ヤン ディ（Ｙａｎｇ，Ｄ
．）ら（ＰＮＡＳ、２００２年、第９９巻、９９４２〜９９４７頁）は、長さが２１塩基
対と３０塩基対との間にあるｉＲＮＡ剤が同様な効力を有することを実証した。他では、
長さ約１５塩基対にまで短くしたｉＲＮＡ剤による効果的な遺伝子サイレンシングが示さ
れている（バイロム ダブリュ．エム．（Ｂｙｒｏｍ，Ｗ．Ｍ．）ら、「Ｉｎｄｕｃｉｎ
ｇ ＲＮＡｉ ｗｉｔｈ ｓｉＲＮＡ Ｃｏｃｋｔａｉｌｓ Ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｂｙ
ＲＮａｓｅ ＩＩＩ」、Ｔｅｃｈ Ｎｏｔｅｓ、第１０（１）巻、アンビオン社（Ａｍ
ｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．）、米国テキサス州オースティン（Ａｕｓｔｉｎ）所在）。
【００５３】
したがって、表１に提示した配列の１つに由来するｉＲＮＡ剤を産生するために、表１
に提示した配列から、１５〜２２ヌクレオチドの間の部分配列を選択することが可能であ
り、かつ本発明で企図されている。代替的に、表１に提示した配列のうちの１つに１個ま
たは数個のヌクレオチドを添加してもよい。この場合、必須ではないが、添加されたヌク
レオチドが標的遺伝子、例えばＭＬＬ−ＡＦ４融合遺伝子のそれぞれの配列に相補的とな
るような様式が好ましい。このようにして派生するすべてのｉＲＮＡ剤もそれらが培養ヒ
トＳＥＭ細胞におけるＭＬＬ−ＡＦ４発現を阻害する能力を本質的に保持するという場合
には、本発明のｉＲＮＡ剤に含まれる。
【００５４】
ｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖は、長さが１４、１５、１６、１７、１８、１９、２５、
２９、４０または５０ヌクレオチド以上であるべきである。上記アンチセンス鎖は、長さ
が６０、５０、４０、または３０ヌクレオチド以下であるべきである。好ましい長さの範
囲は、１５〜３０、１７〜２５、１９〜２３、および１９〜２１ヌクレオチドである。
【００５５】
ｉＲＮＡ剤のセンス鎖は、長さが１４、１５、１６、１７、１８、１９、２５、２９、
４０または５０ヌクレオチド以上であるべきである。上記センス鎖は、長さが６０、５０
、４０または３０ヌクレオチド以下であるべきである。好ましい長さの範囲は、１５〜３
０、１７〜２５、１９〜２３、および１９〜２１ヌクレオチドである。
【００５６】
ｉＲＮＡ剤の２本鎖部分は、長さが１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２
、２３、２４、２５、２９、４０または５０ヌクレオチド対以上であるべきである。上記
２本鎖部分は、長さが６０、５０、４０または３０ヌクレオチド対以下であるべきである
。好ましい長さの範囲は、１５〜３０、１７〜２５、１９〜２３、および１９〜２１ヌク
レオチド対である。
【００５７】
通常、本発明のｉＲＮＡ剤は、ＭＬＬ−ＡＦ４融合遺伝子と十分な相補性を有する領域
を含み、上記ｉＲＮＡ剤またはその断片がＭＬＬ−ＡＦ４融合遺伝子の下方制御を媒介で
きる十分なヌクレオチドの長さを有する。表１のｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖は、ヒトＭ
ＬＬ−ＡＦ４融合遺伝子のｍＲＮＡ配列に完全に相補的であり、それらのセンス鎖は、上
記アンチセンス鎖上の２つの３’末端ヌクレオチドを除いて、上記アンチセンス鎖に完全
に相補的である。しかしながら、上記ｉＲＮＡ剤と上記標的との間に完全な相補性が存在
している必要はなく、但し、それらの対応性は、上記ｉＲＮＡ剤またはそれの切断産物が
、例えばＭＬＬ−ＡＦ４ｍＲＮＡのＲＮＡｉ切断による配列特異的なサイレンシングを誘
導するのを可能にするのに十分でなければならない。
【００５８】
したがって、本発明のｉＲＮＡ剤には、培養ヒトＳＥＭ細胞におけるＭＬＬ−ＡＦ４発
現を阻害する能力を本質的に保持しながら、それぞれ、鎖当たり１、２、または３つ以下
のヌクレオチドが他のヌクレオチドで置換されている（例えばアデノシンがウラシルで置
換されている）ことを除いて、下記に定義する通り、それぞれが、表１の配列の１つに本
質的に同一である少なくとも１６、１７または１８ヌクレオチドの配列からなるセンス鎖
およびアンチセンス鎖からなる薬剤が含まれる。したがって、これらの薬剤は、表１の配
列の１つに同一であるが、標的ＭＬＬ−ＡＦ４ｍＲＮＡ配列に関して、もしくはセンス鎖
とアンチセンス鎖との間に、１、２または３塩基のミスマッチが導入されている少なくと
も１５ヌクレオチドを有するものであろう。標的ＭＬＬ−ＡＦ４ｍＲＮＡ配列とのミスマ
ッチ、特にアンチセンス鎖におけるミスマッチは、末端領域で最もよく許容され、存在す
る場合には、１箇所または複数の端末領域内、例えば５’および／または３’末端の６、
５、４、または３ヌクレオチド以内にあることが好ましく、センス鎖の５’末端またはア
ンチセンス鎖の３’末端の６、５、４、または３ヌクレオチド以内にあることが最も好ま
しい。上記センス鎖は、分子の全体的な２本鎖特性を維持するのに十分なだけアンチセン
ス鎖に相補的であればよい。
【００５９】
上記センス鎖およびアンチセンス鎖は、上記ｉＲＮＡ剤が、その分子の一端または両端
に単一鎖または不対領域を含有するように選択されることが好ましい。したがって、ｉＲ
ＮＡ剤は、好ましくは突出部分、例えば１または２つの５’または３’突出部分、但し好
ましくは２〜３ヌクレオチドの３’突出部分１つを含有するように対合したセンス鎖およ
びアンチセンス鎖を含有する。ほとんどの実施形態は、３’突出部分を有するであろう。
好ましいｓｉＲＮＡ剤は、上記ｉＲＮＡ剤の各末端に長さが１〜４ヌクレオチド、好まし
くは２または３ヌクレオチドの１本鎖の突出部分、好ましくは３’突出部分を有するであ
ろう。上記突出部分は、一方の鎖がもう一方より長い結果、または同じ長さの２本の鎖が
ずれている結果であり得る。５’末端はリン酸化されていることが好ましい。
【００６０】
２本鎖領域の好ましい長さは、１５から３０ヌクレオチドの間、最も好ましくは１８、
１９、２０、２１、２２および２３ヌクレオチドの長さ、例えば上記に論じたｓｉＲＮＡ
剤の範囲である。ｓｉＲＮＡ剤は、長いｄｓＲＮＡからの天然Ｄｉｃｅｒ調製物に長さお
よび構造が類似したものでよい。ｓｉＲＮＡ剤の２本の鎖が、例えば共有結合によって、
連結されている実施形態も含まれる。ヘアピン構造、または必要な２本鎖領域と、好まし
くは３’突出部分とを提供する他の１本鎖構造も本発明に包含される。
【００６１】
（候補となるｉＲＮＡ剤の評価）
候補となるｉＲＮＡ剤を、それが標的遺伝子発現を下方制御する能力に関して評価する
ことができる。例えば、候補となるｉＲＮＡ剤を用意し、標的遺伝子、例えばＭＬＬ−Ａ
Ｆ４融合遺伝子を内因的に発現するか、あるいはＭＬＬ−ＡＦ４融合遺伝子をそれから発
現することができるコンストラクトでトランスフェクションされていることによって発現
する細胞、例えばＳＥＭ細胞に接触させることができる。上記候補となるｉＲＮＡ剤との
接触の前および後の標的遺伝子発現のレベルを、例えばｍＲＮＡまたはタンパク質レベル
で比較することができる。標的遺伝子から発現されたＲＮＡまたはタンパク質の量が、上
記ｉＲＮＡ剤と接触した後に低下していると判定された場合、上記ｉＲＮＡ剤が標的遺伝
子発現を下方制御すると結論付けることができる。細胞中の標的ＭＬＬ−ＡＦ４ＲＮＡま
たはＭＬＬ−ＡＦ４タンパク質のレベルは、いかなる望ましい方法でも測定できる。例え
ば、標的ＲＮＡのレベルは、ノーザンブロット解析、逆転写連結ポリメラーゼ連鎖反応（
ＲＴ−ＰＣＲ）、またはＲＮアーゼプロテクションアッセイで測定することができる。タ
ンパク質のレベルは、例えば、ウェスタンブロット解析または免疫蛍光によって測定する
ことができる。
【００６２】
（ｉＲＮＡ剤の安定性試験、修飾、および再試験）
候補となるｉＲＮＡ剤を、そのｉＲＮＡ剤が対象の体内に導入された際などの安定性、
例えばエンドヌクレアーゼまたはエクソヌクレアーゼによる切断に対する感受性に関して
評価することができる。同方法は、修飾、特に切断、例えば対象の体内に存在する成分に
よる切断の影響を受けやすい部位を同定する方法を利用することができる。
【００６３】
切断の影響を受けやすい部位が同定された場合、例えば切断部位への２’修飾、例えば
２’−Ｏ−メチル基の導入によって、上記潜在的切断部位が切断に抵抗性を有するように
作製された、さらなるｉＲＮＡ剤を設計および／または合成することができる。このさら
なるｉＲＮＡ剤を、安定性に関して再試験することができ、あるｉＲＮＡ剤が望ましい安
定性を示すことが見出されるまで、この工程を繰り返すことができる。
【００６４】
（インビボ試験）
ＭＬＬ−ＡＦ４遺伝子発現を阻害できるものとして同定されたｉＲＮＡ剤を、動物モデ
ル（例えばマウスまたはラットなどの哺乳動物）中でのインビボでの機能に関して試験す
ることができる。例えば、上記ｉＲＮＡ剤を動物、例えばＭＬＬ−ＡＦ４融合遺伝子を発
現するように作製された動物に投与して、その生体内分布、安定性、およびそれがＭＬＬ
−ＡＦ４遺伝子発現を阻害する能力に関して評価することができる。
【００６５】
上記ｉＲＮＡ剤は、注射などによって標的組織に直接投与することができ、あるいは上
記ｉＲＮＡ剤を、それがヒトに投与されるのと同じ様に動物モデルに投与することもでき
る。
【００６６】
上記ｉＲＮＡ剤を細胞内分布に関して評価することもできる。この評価には、上記ｉＲ
ＮＡ剤が細胞内に摂取されたかどうかの判定も含めることができる。この評価には、上記
ｉＲＮＡ剤の安定性（例えば半減期）の測定も含めることができる。ｉＲＮＡ剤のインビ
ボ評価は、追跡可能なマーカー（例えば、フルオレセインなどの蛍光マーカー：３５Ｓ、
３２Ｐ、３３Ｐ、もしくは３Ｈなどの放射性標識；金粒子；または免疫組織化学用抗原粒
子）に結合したｉＲＮＡ剤の使用によって容易に行うことができる。
【００６７】
上記ｉＲＮＡ剤を、それがＭＬＬ−ＡＦ４遺伝子発現を下方制御する能力に関して評価
することができる。インビボでのＭＬＬ−ＡＦ４遺伝子発現のレベルは、例えば、ｉｎ
ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、または上記ｉＲＮＡ剤への組織の曝露の前および後に
おける同組織からのＲＮＡの単離によって測定することができる。組織を採取するために
動物を屠殺する必要がある場合、未処置のコントロール動物が比較対象となろう。標的Ｍ
ＬＬ−ＡＦ４ｍＲＮＡは、限定されるものではないが、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット
、分岐ＤＮＡアッセイ、またはＲＮアーゼプロテクションアッセイを含めたいかなる望ま
しい方法でも検出することができる。代替的又は付随的に、上記ｉＲＮＡ剤で処理された
組織抽出物のウェスタンブロット解析を行うことによって、ＭＬＬ−ＡＦ４遺伝子発現を
モニタリングすることもできる。
【００６８】
（ｉＲＮＡ化学）
ここでは、ＲＮＡｉを媒介して、ＭＬＬ−ＡＦ４の発現を阻害する単離されたｉＲＮＡ
剤、例えばｄｓＲＮＡ剤について述べる。
ここで論じるＲＮＡ剤には、他には無修飾のＲＮＡに加えて、例えば効力を向上させる
ために修飾されたＲＮＡ、およびヌクレオチド代替物のポリマーも含まれる。無修飾のＲ
ＮＡは、その中で、核酸成分、すなわち、糖、塩基、およびリン酸部分が天然に存在して
いるもの、好ましくはヒト体内に生来的に存在しているものと同じであるか、もしくは本
質的に同じである分子を指す。当技術分野は、まれであるか、もしくは一般的でないが、
天然に存在するＲＮＡを修飾ＲＮＡと称することがある。例えば、リンバッハ（Ｌｉｍｂ
ａｃｈ）ら（１９９４年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．第２２巻、２１８３
〜２１９６頁を参照されたい。しばしば修飾ＲＮＡと称される（明らかに、それらが通常
は転写後修飾の結果であるため）、そのようなまれであるか、もしくは一般的でないＲＮ
Ａは、本明細書で使用される場合、無修飾ＲＮＡという用語の範囲内にある。本明細書で
使用される場合、修飾ＲＮＡは、その中で、１つまたは複数の核酸成分、すなわち、糖、
塩基、およびリン酸部分が、天然に存在しているもの、好ましくはヒト体内に生来的に存
在しているものと異なる分子を指す。それらは修飾「ＲＮＡ」と称されるが、それらには
修飾によりＲＮＡではない分子も当然ながら含まれる。ヌクレオチド代替物は、その中で
、ハイブリダイゼーションが実質的にリボリン酸骨格で見られるものと類似するように、
それらの塩基の正しい空間的関係での提示が可能となっている非リボリン酸骨格構造物、
例えばリボリン酸骨格の非荷電模倣体で、リボリン酸骨格が置換されている分子である。
上記のすべての例が本明細書に論じられている。
【００６９】
本明細書に記載の修飾は、本明細書に記載のいかなる２本鎖ＲＮＡおよびＲＮＡ様分子
、例えばｉＲＮＡ剤にも組み入れら得る。上記修飾は、ｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖およ
びセンス鎖の一方または両方を修飾することが望ましい。核酸が重合体のサブユニットま
たは単量体である場合には、下記の修飾の多くは核酸中で反復される位置で起こり、例え
ば、塩基もしくはリン酸部分、またはリン酸部分の非結合性Ｏの修飾である。一部の場合
には、上記修飾が核酸中の対象となる位置のすべてで起こるであろうが、多くの場合、そ
して実際にはほとんどの場合には、そうならないであろう。一例として、修飾は、３’ま
たは５’末端位置でのみ起こることもあり、あるいは末端領域、例えば鎖の末端ヌクレオ
チドの位置または最終２、３、４、５、または１０ヌクレオチドでのみ起こることもある
。修飾は、２本領域に起こっても、１本鎖領域に起こっても、あるいはそれら両方に起こ
ってもよい。例えば、非結合性Ｏの位置でのホスホロチオエート修飾は、一方または両方
の末端で起こることも、あるいは末端領域、例えば鎖の末端ヌクレオチドの位置または最
終２、３、４、５、または１０ヌクレオチドでのみ起こることも、あるいは２本鎖および
１本鎖領域、特に末端で起こることもある。同様に、修飾は、センス鎖で起こることも、
アンチセンス鎖で起こることも、それら両方で起こることもある。一部の場合には、セン
ス鎖およびアンチセンス鎖が同じ修飾または同じクラスの修飾を有するであろう。しかし
ながら、他の場合には、センス鎖およびアンチセンス鎖は異なった修飾を有するであろう
。例えば、一部の場合には、一方の鎖、例えばセンス鎖のみを修飾することが望ましい場
合がある。
【００７０】
ｉＲＮＡ剤に修飾を導入する２つの主要な目的は、生物学的環境における分解に対する
それらの安定化、および下記に詳細に論じる薬理学的特性、例えば薬動力学的特性の改良
である。ｉＲＮＡ剤の糖、塩基、または骨格への他の適当な修飾は、共有されている２０
０４年１月１６日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１１９３号パンフレットに
記載されている。ｉＲＮＡ剤は、共有されている２００４年４月１６日出願の国際出願第
ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１１８２２号パンフレットに記載の塩基のような天然に存在し
ない塩基を含有することもできる。ｉＲＮＡ剤は、非糖質環状担体分子のような天然に存
在しない糖を含むこともできる。ｉＲＮＡ剤で使用する天然に存在しない糖の例示的特性
は、共有されている２００３年４月１６日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／１１
８２９号パンフレットに記載されている。
【００７１】
ｉＲＮＡ剤は、ヌクレアーゼ抵抗性の増強に有用なヌクレオチド間結合（例えばキラル
ホスホロチオエート結合）を含有できる。付随的に、又は代替的に、ヌクレアーゼ抵抗性
を増強させるために、ｉＲＮＡ剤にリボース摸倣体を含有させることができる。ヌクレア
ーゼ抵抗性を増強させるための例示的ヌクレオチド間結合およびリボース模倣体は、共有
されている２００４年３月８日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０７０７０号パ
ンフレットに記載されている。
【００７２】
ｉＲＮＡ剤は、リガンド結合単量体サブユニットおよびオリゴヌクレオチド合成用の単
量体を含有できる。例示的な単量体は、共有されている２００４年８月１０日出願の米国
特許出願第１０／９１６１８５号明細書に記載されている。
【００７３】
ｉＲＮＡ剤は、共有されている２００４年３月８日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０
０４／０７０７０号パンフレットに記載されているようなＺＸＹ構造を有することができ
る。
【００７４】
ｉＲＮＡ剤は、両親媒性部分と複合体形成され得る。ｉＲＮＡ剤と共に使用するための
例示的な両親媒性部分は、共有されている２００４年３月８日出願の国際出願第ＰＣＴ／
ＵＳ２００４／０７０７０号パンフレットに記載されている。
【００７５】
ｉＲＮＡ剤のセンス配列及びアンチセンス配列はパリンドロームであり得る。パリンド
ロームｉＲＮＡ剤の例示的な特徴は、共有されている２００４年３月８日出願の国際出願
第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０７０７０号パンフレットに記載されている。
【００７６】
別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、モジュール複合体の特性を有する送達薬剤と複合体
形成され得る。この複合体は、（ａ）濃縮剤（例えば、核酸を、例えばイオンまたは静電
気相互作用を介して、誘引、例えば結合できる薬剤）；（ｂ）融合誘導剤（例えば、細胞
膜に融合し、かつ／またはそれを通って輸送される性能を有する薬剤）：および、（ｃ）
標的化化学基、例えば細胞または組織標的化剤、例えば特定の細胞型に結合するレクチン
、糖タンパク、脂質、またはタンパク質（例えば抗体）、のうちの１つまたは複数（好ま
しくは２つ以上、より好ましくは３つすべて）に結合される担体物質を含み得る。送達物
質と複合体形成されるｉＲＮＡ剤は、共有されている２００４年３月８日出願の国際出願
第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０７０７０号パンフレットに記載されている。
【００７７】
ｉＲＮＡ剤は、ｉＲＮＡ２本鎖のセンス配列とアンチセンス配列との間などに、非標準
的な対合を備え得る。非標準的なｉＲＮＡ剤の例示的特徴は、共有されている２００４年
３月８日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０７０７０号パンフレットに記載され
ている。
【００７８】
（ヌクレアーゼ抵抗性の強化）
ｉＲＮＡ剤、例えばＭＬＬ−ＡＦ４融合体を標的とするｉＲＮＡ剤は、同薬剤が有する
ヌクレアーゼ抵抗性を強化することができる。
抵抗性を強化する方法の１つは、共有されている２００４年５月４日に出願の米国特許
仮出願第６０／５５９９１７号明細書に記載の通り、切断部位を同定し、そのような部位
を修飾して、切断を阻害することである。例えば、ジヌクレオチド５’−ＵＡ−３’、５
’−ＵＧ−３’、５’−ＣＡ−３’、５’−ＵＵ−３’、又は５’−ＣＣ−３’を切断部
位として利用できる。特定の実施形態では、ｉＲＮＡ剤のすべてのピリミジンが、２’修
飾を有し、そのため、そのｉＲＮＡ剤は、エンドヌクレアーゼに対する抵抗性が強化され
る。ヌクレアーゼ抵抗性の強化は、例えば、共有されている２００４年５月２７日出願の
米国特許仮出願第６０／５７４７４４号明細書に記載の通り、ウリジンが２’修飾ヌクレ
オチドである、少なくとも１つの５’−ウリジン−アデニン−３’（５’−ＵＡ−３’）
ジヌクレオチド；５’−ウリジンが２’修飾ヌクレオチドである、少なくとも１つの５’
−ウリジン−グアニン−３’（５’−ＵＧ−３’）ジヌクレオチド；５’−シチジンが２
’修飾ヌクレオチドである、少なくとも１つの５’−シチジン−アデニン−３’（５’−
ＣＡ−３’）ジヌクレオチド；５’−ウリジンが２’修飾ヌクレオチドである、少なくと
も１つの５’−ウリジン−ウリジン−３’（５’−ＵＵ−３’）ジヌクレオチド；または
５’−シチジンが２’修飾ヌクレオチドである、少なくとも１つの５’−シチジン−シチ
ジン−３’（５’−ＣＣ−３’）ジヌクレオチドをもたらす５’ヌクレオチド修飾を行う
ことによって実現できる。上記ｉＲＮＡ剤は、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なく
とも４つ、または少なくとも５つのそのようなジヌクレオチドを含み得る。
【００７９】
２’修飾ヌクレオチドは、例えば２’修飾されたリボース単位を含み、例えば２’ヒド
ロキシ基（ＯＨ）は、種々の異なった「オキシ」または「デオキシ」置換基で修飾または
置換され得る。
【００８０】
「オキシ」−２’ヒドロキシ基修飾の例には、アルコキシもしくはアリールオキシ（Ｏ
Ｒ、例えばＲ＝Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール
、または糖）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、すなわちＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣ
Ｈ２ＣＨ２ＯＲ；例えばメチレン架橋によって２’ヒドロキシ基が同じリボース糖の４’
炭素に連結されている「ロックト」核酸（ＬＮＡ）、Ｏ−ＡＭＩＮＥ、およびアミノアル
コキシ、すなわちＯ（ＣＨ２）ｎＡＭＩＮＥ（例えば、ＡＭＩＮＥ＝ＮＨ２；アルキルア
ミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、
ヘテロアリールアミノ、またはジへテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ
）が含まれる。メトキシエチル基（ＭＯＥ）（ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、ＰＥＧ誘導体）
のみを含有するオリゴヌクレオチドは、強固なホスホロチオエート修飾で修飾されたもの
に匹敵するヌクレアーゼ安定性を示すことは、注目に値する。
【００８１】
「デオキシ」修飾には、水素（すなわち、デオキシリボース糖、これらは部分的ｄｓＲ
ＮＡの突出部分に特に重要である）；ハロ（例えばフルオロ）；アミノ（例えば、ＮＨ２
；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールア
ミノ、ヘテロアリールアミノ、ジへテロアリールアミノ、またはアミノ酸）；ＮＨ（ＣＨ
２ＣＨ２ＮＨ）ｎＣＨ２ＣＨ２−ＡＭＩＮＥ（ＡＭＩＮＥ＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジ
アルキルアミノ、ヘテロシクリルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロア
リールアミノ、またはジへテロアリールアミノ）、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ（Ｒ＝アルキル、シ
クロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖）、シアノ；メルカプト
；アルキル−チオ−アルキル：チオアルコキシ；及びアルキル、シクロアルキル、アリー
ル、アルケニル、およびアルキニルが含まれ、これらは、選択的に、例えばアミノ官能基
で置換することができる。
【００８２】
好ましい置換基は、２’−メトキシエチル、２’−ＯＣＨ３、２’−Ｏ−アリル、２’
−Ｃ−アリル、および２’−フルオロである。
オリゴヌクレオチド骨格におけるフラノース糖の包含も、エンドヌクレオチド鎖切断を
低減できる。ｉＲＮＡ剤は、さらに３’陽イオン基を包含させることによって、あるいは
３’−３’連結を伴う３’末端でのヌクレオシドの反転によって修飾され得る。別の代替
法では、アミノアルキル基、例えば、３’Ｃ５−アミノアルキルｄＴで３’末端をブロッ
クすることができる。他の３’結合体も、３’−５’エキソヌクレオチド分解性の切断を
阻害できる。理論に拘泥するものではないが、ナプロキセンまたはイブプロフェンなどの
３’結合体は、エクソヌクレアーゼがオリゴヌクレオチドの３’末端に結合するのを立体
的にブロックすることによって、エキソヌレオチド分解性の切断を阻害し得る。小さなア
ルキル鎖、アリール基、または複素環式結合もしくは修飾糖（Ｄ−リボース、デオキシリ
ボース、グルコースなど）でさえも、３’−５’エクソヌクレアーゼをブロックすること
ができる。
【００８３】
ヌクレオチド分解性の切断はまた、リン酸リンカーの修飾、例えばフォスフォロチオエ
ート結合を導入することにより阻害され得る。従って、好ましいｉＲＮＡ剤は、通常は酸
素が占めている架橋部以外の位置にヘテロ原子を含有する修飾リン酸基の特定のキラル形
に関して豊富または純粋であるヌクレオチド２量体を含有する。ヘテロ原子は、Ｓ、Ｓｅ
、Ｎｒ２又はＢｒ３であり得る。へテロ原子がＳである場合、Ｓｐ連結に関して豊富であ
るか、純粋なキラルであることが好ましい。豊富であるとは、少なくとも７０、８０、９
０、９５、または９９％が好ましい形態であることを意味する。修飾リン酸結合は、５’
−又は３’−末端、好ましくは、ｉＲＮＡ剤の５’−末端の位置付近に導入された場合エ
キソヌクレオチド分解性の切断を阻害する上においては特に効果的である。
【００８４】
５’−結合は、５’−３’−エキソヌクレオレチド分解性の切断も阻害する。理論に拘
泥するものではないが、ナプロキセンまたはイブプロフェンなどの５’結合体は、エクソ
ヌクレアーゼがオリゴヌクレオチドの５’末端に結合するのを立体的にブロックすること
によって、エキソヌクレオレチド分解性の切断を阻害し得る。小さなアルキル鎖、アリー
ル基、または複素環式結合もしくは修飾糖（Ｄ−リボース、デオキシリボース、グルコー
スなど）でさえも、３’−５’−エクソヌクレアーゼをブロックすることができる。
【００８５】
ｉＲＮＡ剤は、２本鎖ｉＲＮＡ剤が少なくとも一方の末端に１本鎖ヌクレオチド突出部
分を含有している場合に、ヌクレアーゼに対する抵抗性を増大させることができる。好ま
しい実施形態では、上記ヌクレオチド突出部分は、１乃至４個の、好ましくは２乃至３個
の不対ヌクレオチドを含有する。好ましい実施形態では、末端ヌクレオチド対に直接隣接
している上記１本鎖の突出部分の不対ヌクレオチドがプリン塩基を含有し、上記末端ヌク
レオチド対がＧ−Ｃ対であるか、もしくは相補的な最終４ヌクレオチド対のうち少なくと
も２対がＧ−Ｃ対である。さらに別の実施形態では、上記ヌクレオチド突出部分は、１ま
たは２つの不対ヌクレオチドを有することがあり、例示的実施形態では、上記ヌクレオチ
ド突出部分が５’−ＧＣ−３’である。好ましい実施形態では、上記ヌクレオチド突出部
分が、上記アンチセンス鎖の３’端にある。一実施形態では、上記ｉＲＮＡ剤は、２ｎｔ
の突出部分５’−ＧＣ−３’が形成されるように、上記アンチセンス鎖の３’末端に５’
−ＣＧＣ−３’というモチーフを含有する。
【００８６】
したがって、ｉＲＮＡ剤は、例えば対象の体内に存在するヌクレアーゼ、例えば、エン
ドヌクレアーゼまたはエクソヌクレアーゼによる分解を阻害するように修飾された単量体
を含有できる。これらの単量体は、本明細書ではＮＲＭすなわちヌクレアーゼ抵抗性促進
単量体と称され、対応する修飾は、ＮＲＭ修飾と称される。多くの場合、これらの修飾は
、ｉＲＮＡ剤の他の特性、例えばタンパク質、例えば運搬体タンパク質、例えば血清アル
ブミンまたはＲＩＳＣのメンバー、と相互作用する能力、または第１の配列および第２の
配列の、お互いと２本鎖を形成する能力、もしくは別の配列、例えば標的分子と２本鎖を
形成する能力、も調節するであろう。
【００８７】
１つまたは複数の異なったＮＲＭ修飾を、ｉＲＮＡ剤の中、または、ｉＲＮＡ剤の配列
の中に導入することができる。１つの配列中またはｉＲＮＡ剤中で１つのＮＲＭ修飾を複
数回用いることができる。
【００８８】
ＮＲＭ修飾には、末端にのみ配置できる一部のものも、いかなる位置にも配置できる他
のものも含めることができる。一部のＮＲＭ修飾は、ハイブリダイゼーションを抑制する
可能性があり、したがって、それらは末端領域のみで使用するのが好ましく、それらを切
断部位、または対象の配列もしくは遺伝子を標的とする配列、特にアンチセンス鎖上の切
断領域にて用いないことが好ましい。それらは、上記ｄｓ ｉＲＮＡ剤の２つの鎖の間で
十分なハイブリダイゼーションが維持される場合に、センス鎖の任意の場所にて使用でき
る。一部の実施形態では、ＮＲＭが標的外のサイレンシングを最小にし得るので、ＮＲＭ
を切断部位またはセンス鎖の切断領域に配置するのが望ましい。
【００８９】
ほとんどの場合、ＮＲＭ修飾は、それらがセンス鎖に含まれるか、もしくはアンチセン
ス鎖に含まれるかに応じて異なって分配されるであろう。アンチセンス鎖に含まれる場合
には、エンドヌクレアーゼ切断を妨害または阻害する修飾は、ＲＩＳＣ媒介の切断を受け
る領域、例えば切断部位または切断領域に挿入されるべきでない（本願明細書に援用する
、エルバシル（Ｅｌｂａｓｈｉｒ）ら、２００１年、Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖ．第１
５巻、１８８頁に記載されている）。標的の切断は、２０または２１ｎｔのアンチセンス
鎖のほぼ中央、すなわち上記アンチセンス鎖に相補的な標的ｍＲＮＡの最初のヌクレオチ
ドの上流のほぼ１０または１１ヌクレオチドで起こる。本明細書で使用される場合、切断
部位は、標的またはそれにハイブリダイズするｉＲＮＡ剤の鎖における、切断部位のいず
れかの側のヌクレオチドを指す。切断領域は、いずれかの方向における、上記切断部位の
１、２、または３ヌクレオチド以内にあるヌクレオチドを意味する。
【００９０】
そのような修飾は、末端領域、例えばセンス鎖またはアンチセンス鎖の末端位置、また
は上記末端の２、３、４、もしくは５番目の位置を含めた位置に導入することができる。
（テザーリガンド）
薬理学的特性を含めたｉＲＮＡ剤の特性は、リガンド、例えば、テザーリガンドを導入
することによって、影響を受け、調整され得る。
【００９１】
多種多様な構成要素、例えば、リガンドを、ｉＲＮＡ剤、例えば、リガンド結合単量体
サブユニットの担体に連結することができる。リガンド結合単量体サブユニットの場合に
ついて以下にその例を説明するが、これは単に好適な例に過ぎず、同構成要素はｉＲＮＡ
剤のその他の点にも結合することができる。
【００９２】
好ましい部分は、干渉テザー（ｔｅｔｈｅｒ）を介して直接的または間接的に担体に、
好ましくは共有結合するリガンドである。好ましい実施形態では、このリガンドは干渉テ
ザーを介して担体に結合される。リガンド結合単量体が伸長する鎖に取り込まれるとき、
リガンドまたはテザーリガンドは、リガンド結合単量体上に存在し得る。いくつかの実施
形態では、このリガンドは、「前駆体」リガンド結合単量体サブユニットが伸長する鎖に
取り込まれた後で、同「前駆体」リガンド結合単量体サブユニットに取り込まれる。例え
ば、ＴＡＰ−（ＣＨ２）ｎＮＨ２などのアミノ末端テザーなどを有する単量体は、伸長す
るセンスまたはアンチセンス鎖に取り込まれてよい。その後の操作において、すなわち、
前駆体単量体サブユニットが鎖に取り込まれた後で、求電子基、例えば、ペンタフルオロ
フェニルエステルまたはアルデヒド基を有するリガンドは、リガンドの求電子基と前駆体
リガンド結合単量体サブユニットテザーの末端求核基との結合によって、その後前駆体リ
ガンド結合単量体に結合され得る。
【００９３】
好ましい実施形態では、リガンドは、取り込まれたｉＲＮＡ剤の分布、標的化または寿
命を改変する。好ましい実施形態では、リガンドは、例えば、このようなリガンドを備え
ていない種と比較して、選択した標的、例えば、分子、細胞または細胞種、細胞区画もし
くは器官区画などの区画、組織、器官または身体の領域に対する親和性を増強する。
【００９４】
好ましいリガンドは、輸送、ハイブリダイゼーションおよび特異性の特性を改善するこ
とができ、得られた天然もしくは修飾オリゴリボヌクレオチド、または本明細書で説明し
た単量体および／または天然もしくは修飾リボヌクレオチドの任意の組合せを含むポリマ
ー分子のヌクレアーゼ抵抗性も改善することができる。
【００９５】
一般的に、リガンドは、例えば、取り込みを高めるための治療調節剤、例えば、分布を
モニタリングするための診断用化合物もしくはレポーター群、架橋剤、ヌクレアーゼ抵抗
性を付与する部分および天然もしくは通常にはない核塩基を含むことができる。一般的な
例には、脂溶性分子、脂質、レクチン、ステロイド（例えば、ウバオール、ヘシゲニン（
ｈｅｃｉｇｅｎｉｎ）、ジオスゲニン）、テルペン（例えば、トリテルペン、例えば、サ
ルササポゲニン、フリーデリン、エピフリーデラノール誘導体化リトコール酸）、ビタミ
ン、炭水化物（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロ
デキストリンまたはヒアルロン酸）、タンパク質、タンパク質結合剤、インテグリン標的
化分子、ポリカチオン、ペプチド、ポリアミンおよびペプチド模倣体が含まれる。
【００９６】
リガンドは、天然物質または組換えもしくは合成分子、例えば、合成ポリアミノ酸など
の合成ポリマーであり得る。ポリアミノ酸の例には、ポリリジン（ＰＬＬ）、ポリＬ−ア
スパラギン酸、ポリＬ−グルタミン酸、スチレン−無水マレイン酸コポリマー、ポリ（Ｌ
−ラクチド−コ−グリコリド）コポリマー、ジビニルエーテル−無水マレイン酸コポリマ
ー、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリエ
チレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（
２−エチルアクリル酸）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマーまたはポリホスファ
ジンが含まれる。ポリアミンの例には、ポリエチレンイミン、ポリリジン（ＰＬＬ）、ス
ペルミン、スペルミジン、ポリアミン、シュードペプチドポリアミン、ペプチド様ポリア
ミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、陽イオン部分、例
えば、陽イオン性脂質、陽イオン性ポルフィリン、ポリアミンの４級塩またはアルファヘ
リックスペプチドが含まれる。
【００９７】
リガンドにはまた、標的化化学基、例えば、細胞または組織標的化剤、例えば、甲状腺
刺激ホルモン、メラニン細胞刺激ホルモン、サーファクタントタンパク質Ａ、ムチン炭水
化物、グリコシル化ポリアミノ酸、トランスフェリン、ビスホスホン酸、ポリグルタミン
酸、ポリアスパラギン酸、またはＲＧＤペプチドもしくはＲＧＤペプチド模倣体が含まれ
る。
【００９８】
リガンドは、例えば糖タンパク質、例えば低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）のようなリ
ポタンパク質、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）のようなアルブミン、又はペプチドのよう
なタンパク質、コ−リガンドに対して特異的な親和性を有する分子、或いは癌細胞、内皮
細胞又は骨細胞のような特定のタイプの細胞に結合する抗体のような抗体であり得る。リ
ガンドはまた、ホルモン及びホルモン受容体を含み得る。それらはまた、補因子、多価ラ
クトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサ
ミン、多価マンノース又は多価フコースのような非ペプチド種を含み得る。リガンドは、
例えばリポ多糖体、ｐ３８ＭＡＰキナーゼのアクチベータ又はＮＦ−κＢのアクチベータ
であり得る。
【００９９】
リガンドは、例えば、細胞骨格を破壊することによって、例えば、細胞の微小管、微小
繊維および／または中間径繊維を破壊することによって、細胞へのｉＲＮＡ剤の取り込み
を増加させることができる物質、例えば、薬剤であり得る。この薬剤は、例えば、タキソ
ン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャプラキノリ
ド（ｊａｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅ）、ラトランクリンＡ、ファロイジン、スウィンホライ
ドＡ、インダノシンまたはミオセルビン（ｍｙｏｓｅｒｖｉｎ）であり得る。
【０１００】
一態様では、リガンドは脂質または脂質をベースにした分子である。このような脂質ま
たは脂質をベースにした分子は、血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ
）に結合することが好ましい。ＨＳＡ結合リガンドは、標的組織、例えば、肝臓の実質細
胞を含めた肝組織との結合体の分布を可能にする。ＨＳＡに結合できるその他の分子もリ
ガンドとして使用できる。例えば、ネプロキシン（ｎｅｐｒｏｘｉｎ）またはアスピリン
を使用できる。脂質または脂質をベースにしたリガンドは、（ａ）結合体の分解に対する
抵抗性を増強し、（ｂ）標的細胞または細胞膜への標的化または輸送を増強し、および／
または（ｃ）血清タンパク質、例えば、ＨＳＡへの結合を調節するために使用することが
できる。
【０１０１】
脂質をベースにしたリガンドは、標的組織に対する結合体の結合を調節するために、例
えば、制御するために使用され得る。例えば、ＨＳＡに一層強力に結合する脂質または脂
質をベースにしたリガンドは、腎臓を標的とする傾向が少なく、したがって、身体から排
出される傾向が低い。ＨＳＡにあまり強く結合しない脂質または脂質をベースにしたリガ
ンドは、結合体を腎臓に対する標的とするために使用することができる。
【０１０２】
好ましい実施形態では、脂質をベースにしたリガンドはＨＳＡに結合する。これは、結
合体が好ましくは腎臓以外の組織に分布するような十分な親和性で同ＨＳＡに結合するこ
とが好ましい。しかしながら、この親和性はＨＳＡリガンドの結合が離れることできない
ほど強力ではないことが好ましい。
【０１０３】
別の態様では、リガンドは、標的細胞によって、例えば増殖細胞によって取り込まれる
部分、例えば、ビタミンまたは栄養素である。これらは、例えば、悪性型または非悪性型
の、例えば、癌細胞の、望ましくない細胞増殖を特徴とする障害を治療するために特に有
用である。ビタミンの例には、ビタミンＡ、ＥおよびＫが含まれる。その他のビタミンの
例は、ビタミンＢ群、例えば、葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサール
または癌細胞によって取り込まれるその他のビタミンもしくは栄養素である。
【０１０４】
別の態様では、リガンドは、細胞透過性薬剤、好ましくはヘリックス細胞透過性薬剤で
ある。この薬剤は両親媒性であることが好ましい。薬剤の例は、ｔａｔまたはアンテナペ
ディアなどのペプチドである。この薬剤がペプチドの場合、修飾可能であり、ペプチジル
模倣体、反転異性体（ｉｎｖｅｒｔｏｍｅｒ）、非ペプチドまたは偽ペプチド結合が含ま
れ、Ｄアミノ酸も使用できる。ヘリックス剤は、好ましくは親油性相および疎油性相を有
するアルファヘリックス剤であることが好ましい。
【０１０５】
（５’−リン酸修飾）
好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、５’がリン酸化されているか、または５’プラ
イム末端にホスホリル類似体を含む。アンチセンス鎖の５’−リン酸修飾には、ＲＩＳＣ
媒介遺伝子サイレンシングに適合したものが含まれる。適切な修飾には、５’−モノホス
ファート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）；５’−ジホスファート（（ＨＯ）２（Ｏ）
Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−トリホスファート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ
−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−グアノシンキャッ
プ（７−メチル化または非メチル化）（７ｍ−Ｇ−Ｏ−５’−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（
ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−アデノシンキャップ（Ａｐ
ｐｐ）、および任意の修飾または非修飾ヌクレオチドキャップ構造（Ｎ−Ｏ−５’−（Ｈ
Ｏ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−モノ
チオホスファート（ホスホロチオエート；（ＨＯ）２（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５’）；５’−モノ
ジチオホスファート（ホスホロジチオエート；（ＨＯ）（ＨＳ）（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５’）、
５’−ホスホロチオラート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｓ−５’）；酸素／硫黄で置換された
モノホスファート、ジホスファートおよびトリホスファート（例えば、５’−アルファ−
チオトリホスファート、５’−ガンマ−チオトリホスファートなど）の任意の更なる組み
合わせ、５’−ホスホロアミデート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−ＮＨ−５’、（ＨＯ）（ＮＨ
２）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’−アルキルホスホネート（Ｒ＝アルキル＝メチル、エチ
ル、イソプロピル、プロピルなど、例えば、ＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）−Ｏ−５’−、（ＯＨ）
２（Ｏ）Ｐ−５’−ＣＨ２−）、５’−アルキルエーテルホスホネート（Ｒ＝アルキルエ
ーテル＝メトキシメチル（ＭｅＯＣＨ２−）、エトキシメチル、など、例えば、ＲＰ（Ｏ
Ｈ）（Ｏ）−Ｏ−５’−）が含まれる。
【０１０６】
センス鎖は、同センス鎖を不活性化し、活性型ＲＩＳＣの形成を阻止し、それによって
標的外効果を潜在的に減少させるために修飾され得る。これは、センス鎖の５’−リン酸
化を阻止する修飾によって、例えば、５’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドで修飾すること
によって実現することができる（ニカネン（Ｎｙｋａｅｎｅｎ）ら、２００１年、「ＡＴ
Ｐ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ａｎｄ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ
ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｉｎ ｔｈｅ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｐａｔｈｗ
ａｙ．」Ｃｅｌｌ、第１０７巻、３０９〜３２１頁を参照のこと）。リン酸化を阻止する
その他の修飾、例えば、Ｏ−ＭｅよりもＨによる５’−ＯＨの簡単な置換も使用され得る
。代替的に、大きな嵩高い基を５’−リン酸塩に添加して、ホスホジエステル結合に変更
してもよい。
【０１０７】
（ｉＲＮＡ剤の細胞への輸送）
理論に結びつけることは望まないが、コレステロール結合ｉＲＮＡ剤とリポタンパク質
のある種の成分（例えば、コレステロール、コレステリルエステル、リン脂質）との間の
化学的類似性は、ｉＲＮＡ剤と血液中のリポタンパク質（例えば、ＬＤＬ、ＨＤＬ）との
結合および／またはｉＲＮＡ剤とコレステロールに親和性を有する細胞成分、例えば、コ
レステロール輸送経路の成分との相互作用を引き起こす可能性がある。リポタンパク質な
らびにその成分は、細胞によって、様々な能動的および受動的輸送機構によって、例えば
、限定はしないが、ＬＤＬ受容体結合ＬＤＬのエンドサイトーシス、酸化された、もしく
はその他の修飾をされたＬＤＬのスカベンジャー受容体Ａとの相互作用によるエンドサイ
トーシス、肝臓におけるＨＤＬコレステロールのスカベンジャー受容体Ｂ１の媒介による
取り込み、ピノサイトーシスまたはＡＢＣ（ＡＴＰ結合カセット）輸送タンパク質、例え
ば、ＡＢＣ−Ａ１、ＡＢＣ−Ｇ１もしくはＡＢＣ−Ｇ４によるコレステロールの膜通過輸
送によって取り込まれ、処理される。したがって、コレステロール結合ｉＲＮＡ剤は、こ
のような輸送機構を有する細胞、例えば、肝臓の細胞による取り込みの促進を受けること
ができた。このように、本発明は、このような成分（例えば、コレステロール）の天然リ
ガンドをｉＲＮＡ剤に結合させるか、またはこの成分（例えば、ＬＤＬ、ＨＤＬ）の天然
リガンドと関連する、もしくは結合するｉＲＮＡ剤に化学的部分（例えば、コレステロー
ル）を結合させることによって、ある種の細胞表面成分、例えば、受容体を発現する細胞
にｉＲＮＡ剤を標的化させる証拠および一般的方法を提供する。
【０１０８】
（その他の実施形態）
ＲＮＡ、例えば、ｉＲＮＡ剤は、インビボにおいて、例えば、細胞に送達された外来Ｄ
ＮＡ鋳型から細胞内で産生され得る。例えば、このＤＮＡ鋳型は、ベクターに挿入され、
遺伝子治療ベクターとして使用され得る。遺伝子治療ベクターは、例えば、静脈注射、局
所投与によって（米国特許第５３２８４７０号）、または定位注射によって（例えば、チ
ェン（Ｃｈｅｎ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、ＵＳＡ、第９１巻、３０
５４〜３０５７頁、１９９４年）対象に送達され得る。遺伝子治療ベクターの医薬調製物
は、許容できる希釈剤中に遺伝子治療ベクターを含むことができ、または遺伝子送達担体
が包埋された徐放性マトリックスを含み得る。ＤＮＡ鋳型は、例えば、２個の転写単位を
含むことができ、一方はｉＲＮＡ剤の上鎖を含む転写物を生成し、他方はｉＲＮＡ剤の下
鎖を含む転写物を生成する。この鋳型が転写されたとき、ｉＲＮＡ剤が生成され、遺伝子
サイレンシングを媒介するｓｉＲＮＡ剤断片に処理される。
【０１０９】
（製剤）
本明細書で説明したｉＲＮＡは、対象に投与するために製剤化することができる。
説明を容易にするために、この項における製剤、組成物および方法は、ほとんどは無修
飾ｉＲＮＡ剤に関して論じる。しかしながら、これらの製剤、組成物および方法は、その
他のｉＲＮＡ剤、例えば、修飾ｉＲＮＡ剤で実施することができ、このような実施は本発
明の範囲内であることを理解されたい。
【０１１０】
製剤化されたｉＲＮＡ剤組成物は、様々な状態をとることができる。いくつかの例では
、この組成物は少なくとも部分的な結晶、均一な結晶、および／または無水物（例えば、
水分が８０、５０、３０、２０または１０％未満）である。他の例では、ｉＲＮＡ剤は水
相、例えば、水を含む溶液に含まれている。
【０１１１】
水相または結晶組成物を、例えば、送達媒体、例えば、リポソーム（特に水相用）また
は粒子（例えば、結晶組成物に適し得る微粒子）に取り込むことができる。一般的に、ｉ
ＲＮＡ剤組成物は、企図した投与方法に適合する方法で製剤化される。
【０１１２】
ｉＲＮＡ剤調製物は、他の薬剤、例えば、他の治療剤またはｉＲＮＡ剤を安定化する薬
剤、例えば、ｉＲＮＰを形成するためにｉＲＮＡ剤と複合体化するタンパク質と、組み合
わせて、製剤化することができる。さらに他の薬剤には、キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ
（例えば、Ｍｇ２＋などの２価陽イオンを除去するため）、塩、ＲＮアーゼ阻害剤（例え
ば、ＲＮＡｓｉｎなどの特異性の広いＲＮアーゼ阻害剤）などが含まれる。
【０１１３】
一実施形態では、ｉＲＮＡ剤調製物には、２個以上のｉＲＮＡ剤（類）、例えば、第２
の遺伝子に関して、又は同一遺伝子に関してＲＮＡｉを媒介する第２のｉＲＮＡ剤を含む
。更に他の調製物には、少なくとも３個、５個、１０個、２０個、５０個または１００個
以上の異なるｉＲＮＡ剤種を含めることができる。このようなｉＲＮＡ剤は、同数の異な
る遺伝子に関してＲＮＡｉを媒介することができる。
【０１１４】
このような調製物中の２個以上のｉＲＮＡが同一遺伝子を標的とする場合、それらは重
複も隣接もしていない標的配列を有すること可能で、あるいはこの標的配列は重複してい
ても隣接していてもよい。
【０１１５】
選択的に、本発明のｉＲＮＡ剤は、リポソームを用いて製剤化され得る。種々の組成の
リポソームが種々の製薬的に活性な成分を部位特異的に送達するために使用され得る（ヴ
ィッチ，シー．（Ｗｉｔｓｃｈｉ Ｃ）ら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．、１９９９年、第１６
巻、３８２−３９０頁、イェ，エム．ケイ．（Ｙｅｈ，Ｍ．Ｋ．）ら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅ
ｓ．、１９９６年、１６９３−１６９８頁）。リポソームとカーゴ（ｃａｒｇｏ）との間
の相互作用は通常、特にカチオン性脂質送達系では疎水性の相互作用又は電荷の引力に依
存する（ゼルファティ，オー．（Ｚｅｌｐｈａｔｉ，Ｏ．）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．、２００１年、第２７６巻、３５１０３−３５１１０頁）。ＨＩＶ ｔａｔペプチド保
持リポソームはまた、エンドサイトーシス経路を迂回して、カーゴを直接細胞質に送達す
るために構築され、かつ使用されてきた（トルチリン，ブイ．ピー．（Ｔｏｒｃｈｉｌｉ
ｎ、Ｖ．Ｐ．）ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｏｉｐｈｙｓ．Ａｃｔａ−Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎ
ｅｓ、２００１年、第１５１１巻、３９７−４１１頁、トルチリン，ブイ．ピー．ら、Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、２００１年、第９８巻、８７８６−８７
９１頁）。糖グラフトリポソームに封入されると、イセチオン酸ペンタミジン及び誘導体
は、通常のリポソームに封入された薬物或いはフリーの薬物と比較してより効果的である
ことが発見された（バネリー，ジー．（Ｂａｎｅｒｊｅｅ，Ｇ．）ら、Ｊ．Ａｎｔｉｍｉ
ｃｒｏｂ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、１９９６年、第３８（１）巻、１４５−１５０頁）。
温度感受性のタキソールのリポソーム製剤（熱媒介型標的化薬物送達）は、局所的な高温
療法と組み合わせて腫瘍を有するマウスにインビボで投与したところ、高温療法を組み合
わせた、又は組み合わせていない、同用量のフリーのタキソールと比較して、腫瘍体積が
有意に低減し、生存時間の増加が観察された（シェルマ，ディー．（Ｓｈｅｒｍａ，Ｄ．
）ら、Ｍｅｌａｎｏｍａ Ｒｅｓ．、１９９８年、第８（３）巻、２４０−２４４頁）。
インシュリン、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、及びプロスタグランジンＥ１の送達のためにリ
ポソーム製剤を局所に適用することは、ある程度の成功を収めている（セビッチ ジー．
（Ｃｅｖｃ Ｇ．）ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙ，Ａｃｔａ、１９９８年、第１３
６８巻、２０１−２１５頁、フォルドバリ エム．（Ｆｏｌｄｖａｒｉ Ｍ．）ら、Ｊ．
Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｒｅｓ．、１９９７年、第７巻、１１５−１２６頁、ショート エス
．エム．（Ｓｈｏｒｔ Ｓ．Ｍ．）ら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．、１９９６年、第１３巻、
１０２０−１０２７頁、フォルドバリ エム．ら、Ｕｒｏｌｏｇｙ、１９９８年、第５２
（５）巻、８３８−８４３頁、米国特許第５８５３７５５号明細書）。
【０１１６】
抗体は、リポソームを組織特異的又は細胞特異的に取り込む別の標的装置の代表である
（マストロバティスタ，イ−．（Ｍａｓｔｒｏｂａｔｔｉｓｔａ，Ｅ．）ら、Ｂｉｏｃｈ
ｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙ，Ａｃｔａ、１９９９年、第１４１９（２）巻、３５３−３６３頁、
マストロバティスタ，イ−．ら、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．、１９９９年
、第４０（１−２）巻、１０３−１２７頁）。リポソームのアプローチは、封入された活
性成分が徐々に放出されるという能力、免疫系及びタンパク質分解酵素を回避できるとい
う能力、腫瘍を標的化して腫瘍組織への優先的な蓄積及びその漏出しやすい新生血管から
の管外遊出による転移を引き起こす能力を含む種々の利点を提供する。例えばポリビニル
ピロリドンナノ粒子及びマレイレート化ウシ血清アルブミンのようなその他の担体も抗癌
剤を新生物細胞に送達するために使用され得る（シャルマ，ディ．（Ｓｈａｒｍａ、Ｄ．
）ら、Ｏｎｃｌ．Ｒｅｓ．、１９９６年、第８（７−８）巻、２８１−２８６頁、ムクホ
パディアイ，エイ．（Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ，Ａ．）ら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、１
９９５年、第３７６（１−２）巻、９５−９８頁）。従って、非常に多様性かつ合理的な
設計及び修飾が容易である標的化及び封入技術を使用して、本発明のｉＲＮＡ剤の所望と
する細胞への送達が容易になる。
【０１１７】
上記したように、本発明の製薬組成物はリポソーム成分を含み得る。本発明に従って、
リポソームは細胞の原形質膜と融合可能な脂質成分からなり、それにより、同リポソーム
がカーゴ、即ち核酸分子組成物を細胞に送達可能となる。幾らかの好ましいリポソームは
、当業者に周知である遺伝子送達法において一般的に使用されるリポソームを含む。幾ら
かの好ましいリポソーム送達ビヒクルは、多重膜リポソーム（ＭＬＶ）、脂質及び押出脂
質（Ｅｘｔｒｕｄｅｄ ｌｉｐｉｄ）を含むが、本発明はそのようなリポソームに限定さ
れるものではない。ＭＬＶを調製する方法は当業者には周知である。押出脂質もまた意図
される。押出脂質は、ＭＬＶ脂質と同様に調製される脂質であるが、その全体の内容が本
明細書において援用されているテンプレトン（Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ）らの文献（Ｎａｔｕ
ｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１９９７年、第１５巻、６４７−６５２頁）に記載されている
ように、調製後にサイズの小さいフィルタから押し出されるものである。小さな単層リポ
ソーム（ＳＵＶ）もまた、本発明の組成物及び方法において使用され得る。その他好まし
いリポソーム送達ビヒクルはポリカチオン脂質組成物を有するリポソーム（即ち、カチオ
ン性リポソーム）を含む。例えば、カチオン性リポソーム組成物は、コレステロールと複
合体化される任意のカチオン性リポソームを含むが、限定されることなく、ＤＯＴＭＡ及
びコレステロール、ＤＯＴＡＰ及びコレステロール、ＤＯＴＩＭ及びコレステロール、及
びＤＤＡＢ及びコレステロールを含む。本発明で使用されるリポソームは、約１０乃至１
０００ナノメートル（ｎｍ）の範囲を含む任意のサイズ又はその間の任意のサイズであり
得る。
【０１１８】
リポソーム送達ビヒクルは、哺乳動物の特定の部位を標的化するために修飾され得、そ
れによりその部位において本発明のｉＲＮＡ剤を標的化し、かつ使用する。適切な修飾は
、送達ビヒクルの脂質部分の化学式を操作することを含む。送達ビヒクルの脂質部分の化
学式の操作は、同送達ビヒクルの細胞外及び細胞内標的化を誘導する。例えば、リポソー
ムの脂質二重層の電荷を変える化学物質をリポソームの脂質の化学式に加え、それにより
同リポソームは特定の電荷特性を有する特定の細胞と融合する。一実施形態において、外
因性の標的分子をリポソームに添加することによる標的化（即ち、抗体）のようなその他
の標的化機構は本発明のリポソームの必要な成分とはならない。その理由は、免疫学的に
活性な器官における効果的な免疫活性は、送達経路が静脈内又は腹腔内である場合には、
更なる標的化機構の援助がなくても組成物により既に提供され得るからである。しかしな
がら、幾らかの実施形態において、リポソームは、標的分子が結合し得る特定の細胞又は
組織を標的化するために、同リポソームに組み込まれ得る抗体、可溶性レセプター又はリ
ガンドのような標的化剤を使用して、特定の標的細胞又は組織に指向され得る。リポソー
ムの標的化は、例えば、ホ（Ｈｏ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８６年、第２５
巻、５５００−６頁、ホら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、１９８７年ａ、第２６２巻、１３
９７９−８４頁、ホら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、１９８７年ｂ、第２６２巻、１３９７
３−８頁及びハン（Ｈｕａｎｇ）らの米国特許第４９５７７３５号明細書に記載されてお
り、それらの各文献は、本明細書においてその全体が参照により援用される。一実施形態
において、血漿タンパク質又はその他の要因によるリポソームのオプソニン化に起因する
細網内皮系細胞による注入リポソームの効果的な取り込みを回避することが望ましい場合
には、ガングリオシド（アレン（Ａｌｌｅｎ）ら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ、１９８７年、第
２２３巻、４２−６頁）又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）由来の脂質（クリバノフ
（Ｋｌｉｂａｎｏｖ）ら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ、１９９０年、第２６８巻、２３５−７頁
）のような親水性の脂質が従来のリポソームの二重層内に組み込まれ、いわゆる立体的に
安定化した、即ち「ステルス」リポソームが形成される（ウッドル（Ｗｏｏｄｌｅ）ら、
Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙ Ａｃｔａ、１９９２年、第１１１３巻、１７１−９９頁
）。そのようなリポソームの変更例は、例えば、ウンガー（Ｕｎｇｅｒ）らに付与された
米国特許第５７０５１８７号明細書、チョイ（Ｃｈｏｉ）らに付与された米国特許第５８
２０８７３号明細書、チロシュ（Ｔｉｒｏｓｈ）らに付与された米国特許第５８１７８５
６号明細書、タガワ（Ｔａｇａｗａ）らに付与された米国特許第５６８６１０１号明細書
、ハンらに付与された米国特許第５０４３１６４号明細書及びウッドルらに付与された米
国特許第５０１３５５６号明細書に記載されており、それらの全ては本明細書においてそ
の全体が参照により援用される。
【０１１９】
（治療方法および送達経路）
ｉＲＮＡ剤、例えば、ＭＬＬ−ＡＦ４を標的とするｉＲＮＡ剤を含む組成物は、様々な
経路によって対象に送達することができる。例示的な経路には、クモ膜下、実質、静脈内
、経鼻、経口および眼内送達が含まれる。本発明のｉＲＮＡ剤を投与する好ましい手段は
、非経口投与によるものである。
【０１２０】
ｉＲＮＡ剤は、投与に適した医薬組成物に取り込むことができる。例えば、組成物は、
１種または複数種のｉＲＮＡ剤および薬学的に許容される担体を含むことができる。本明
細書では、「薬学的に許容される担体」という用語は、医薬品投与に適合した任意の、お
よびすべての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張化剤及び吸収
遅延剤などを含むものとする。薬学的に活性のある物質のためにこのような媒体および作
用物質を使用することは、当該技術分野では周知である。従来の媒体または作用物質が活
性化合物に不適合である場合を除いて、それらは組成物に使用されるものとする。補充的
な活性化合物もこの組成物に組み入れることができる。
【０１２１】
本発明の医薬品組成物は、局所治療または全身治療が望ましいかどうかに応じて、およ
び治療する部位に応じていくつかの方法で投与することが可能である。投与は、局所投与
（眼内、経鼻、経皮を含む）、経口投与又は非経口投与であり得る。非経口投与には、静
脈点滴、皮下、腹腔内もしくは筋肉内注射、またはクモ膜下腔内もしくは心室内投与が含
まれる。
【０１２２】
送達の経路は、患者の障害に応じて変更され得る。一般的に、本発明のｉＲＮＡの送達
は、対象への全身送達を実現するために実施される。これを実現する好ましい手段は、非
経口投与による。
【０１２３】
非経口投与用製剤には、緩衝剤、希釈剤およびその他の適切な添加物も含有できる滅菌
水性溶液が含まれる。静脈内注射は、例えばリザーバに取り付けられた心室内カテーテル
により促進され得る。静脈内での使用では、溶質の総濃度は、調製物を等張にするために
制御されるべきである。
【０１２４】
投与は、対象によって提供され得るか、または例えば治療奉仕者のような別の人によっ
て提供され得る。治療奉仕者は、人に治療を提供することに関与する任意の存在、例えば
、病院、ホスピス、診療所、外来患者向け診療所で医療に従事する人、例えば、医者、看
護師もしくはその他の専門家などの医療従事者、または配偶者または親などの保護者であ
り得る。投薬は、測定された用量で、または計測された用量を送達する分配器で提供され
得る。
【０１２５】
「治療有効量」という用語は、望ましい生理学的応答をもたらすために、治療する対象
において所望するレベルの薬剤を提供するのに必要な、組成物中に存在する量のことであ
る。
【０１２６】
「生理学的有効量」という用語は、所望とする緩和または治療的効果を与えるために対
象に送達される量である。
「薬学的に許容される担体」という用語は、その担体が肺に著しく有害な毒性効果を与
えず肺に取り込まれることが可能であることを意味する。
【０１２７】
「共投与」という用語は、２種以上の薬剤、特に２種以上のｉＲＮＡ剤を対象に投与す
ることである。薬剤は、単一の医薬組成物に含有され、同時に投与され得るか、または薬
剤は別々の製剤に含有され、順番に対象に投与され得る。２種の薬剤が同時に対象にて検
出されることができる限り、２種の薬剤は共投与されたと言える。
【０１２８】
担体として有用な医薬賦形剤の種類には、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などの安定化
剤、炭水化物、アミノ酸およびポリペプチドなどの賦形剤、ｐＨ調整剤または緩衝剤；塩
化ナトリウムなどの塩などがある。これらの担体は、結晶形であっても、アモルファス形
であってもよく、２つの混合物であってもよい。
【０１２９】
特に有用である賦形剤には、適合性のある炭水化物、ポリペプチド、アミノ酸またはそ
れらの組合せが含まれる。適切な炭水化物には、ガラクトース、Ｄ−マンノース、ソルボ
ースなどの単糖類、ラクトース、トレハロースなどの二糖類、２−ヒドロキシプロピル−
β−シクロデキストリンなどのシクロデキストリン、およびラフィノース、マルトデキス
トリン、デキストランなどの多糖類、マンニトール、キシリトールなどのアルジトール類
が含まれる。好ましい炭水化物群には、ラクトース、トレハロース、ラフィノース、マル
トデキストリンおよびマンニトールが含まれる。適切なポリペプチドには、アスパルテー
ムが含まれる。アミノ酸には、アラニンおよびグリシンが含まれ、グリシンが好ましい。
【０１３０】
適切なｐＨ調整剤または緩衝剤には、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウム
などの有機酸および塩基から調製された有機塩が含まれ、クエン酸ナトリウムが好ましい
。
【０１３１】
投与量。ｉＲＮＡ剤は、体重１ｋｇ当たり約７５ｍｇ未満、または体重１ｋｇ当たり約
７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、５、２、１、０．５、０．１、０．０５、
０．０１、０．００５、０．００１または０．０００５ｍｇ未満の単位用量で、および体
重１ｋｇ当たりｉＲＮＡ剤２００ｎｍｏｌ未満（例えば、約４．４×１０１６コピー）の
単位用量で、または体重１ｋｇ当たりｉＲＮＡ剤１５００、７５０、３００、１５０、７
５、１５、７．５、１．５、０．７５、０．１５、０．０７５、０．０１５、０．００７
５、０．００１５、０．０００７５、０．０００１５ｎｍｏｌ未満の単位用量で投与され
得る。例えば、この単位用量は、注射（例えば、静脈内もしくは筋肉内注射、クモ膜下注
射、または器官への直接注射）によって、吸入投与、または局所塗布によって投与され得
る。
【０１３２】
器官へ直接（例えば、肝臓に直接）ｉＲＮＡ剤を送達することは、器官当たり約０．０
０００１ｍｇ〜約３ｍｇ、または好ましくは器官当たり約０．０００１〜約０．００１ｍ
ｇ、器官当たり約０．０３〜３．０ｍｇ、眼当たり約０．１〜３．０ｍｇまたは器官当た
り約０．３〜３．０ｍｇの程度の投与量であり得る。
【０１３３】
投与量は、疾患または障害を治療または予防するのに有効な量であり得る。
一実施形態では、単位用量を１日１回より少ない頻度で、例えば、２日、４日、８日ま
たは３０日毎に１回より少ない頻度で投与する。他の実施形態では、単位用量は一定頻度
（例えば、規則正しい頻度）では投与されない。例えば、単位用量を１回で投与すること
が可能である。ｉＲＮＡ剤が媒介するサイレンシングは、ｉＲＮＡ剤組成物を投与した後
、数日間維持され得るので、多くの場合、１日１回より少ない頻度で、場合によっては全
治量期間中１回のみ組成物を投与することが可能である。
【０１３４】
一実施形態では、例えば、２本鎖ｉＲＮＡ剤、またはｓｉＲＮＡ剤（例えば、前駆体、
例えば、ｓｉＲＮＡ剤中に処理されることができるより大きなｉＲＮＡ剤、またはｉＲＮ
Ａ剤、例えば、２本鎖ｉＲＮＡ剤、もしくはｓｉＲＮＡ剤、もしくはそれらの前駆体をコ
ードするＤＮＡ）の初回量および１回または複数の維持用量が対象に投与される。一回又
は複数回の維持用量は、一般的に初回量よりも少なく、例えば、初回量の２分の１少ない
。維持治療計画は、１日当たり体重１ｋｇに対して０．０１〜７５ｍｇの範囲、例えば、
１日当たり体重１ｋｇに対して７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、５、２、１
、０．５、０．１、０．０５、０．０１、０．００５、０．００１または０．０００５ｍ
ｇの一回又は複数回の用量で対象を治療することを含み得る。維持用量は、５、１０また
は３０日毎に１回以下投与することが好ましい。さらに、治療計画は、特定の疾患の性質
、重症度および患者の全体的状態に応じて変化し得る期間の間、維持され得る。好ましい
実施形態では、投与量は１日１回以下、例えば、２４、３６、４８時間以上に１回以下、
例えば、５日または８日毎に１回以下にて送達され得る。処置後、患者の状態の変化およ
び疾患状態の徴候の軽減をモニタリングすることができる。化合物の投与量は、患者が現
在の用量レベルに有意に応答しない場合増加させることができ、あるいは疾患状態の徴候
の軽減が認められた場合、疾患状態が消失した場合、または望ましくない副作用が認めら
れた場合、用量を減少させることができる。
【０１３５】
効果的な用量は、特定の環境下で所望するように、または適切だと考えられるように、
単回投与で、または２回以上の投与で投与することができる。反復注入又は頻繁な注入を
促進することが望ましい場合、送達装置、例えば、ポンプ、半永久的ステント（例えば、
静脈内、腹腔内、嚢内または関節包内）またはリザーバを埋め込むことが適切であり得る
。
【０１３６】
処理が成功した後、疾患状態の再発を防ぐために、本発明の化合物を体重１ｋｇ当たり
０．００１ｇ〜１００ｇの範囲の維持用量で投与する維持治療を患者に受けさせることが
望ましい（米国特許第６１０７０９４号）。
【０１３７】
ｉＲＮＡ剤組成物の濃度は、障害を治療もしくは予防するのに有効であるか、またはヒ
トの生理学的状態を調節するために十分な量である。投与するｉＲＮＡの薬剤の濃度また
は量は、薬剤について測定されたパラメータ、および経鼻、頬側または肺投与などの投与
方法に依存される。例えば、経鼻用製剤は、鼻孔の刺激または灼熱感を回避するために、
いくつかの成分をはるかに低い濃度にしなければならない傾向がある。適切な経鼻用製剤
を提供するために、経口用製剤を１０〜１００倍希釈することが時として望ましい。
【０１３８】
非限定的ではあるが、疾患もしくは障害の重症度、以前の治療法、対象の一般的健康状
態および／または年齢、その他の既存の疾患を含めたある種の因子が、対象を効果的に治
療するために必要な投与量に影響を及ぼし得る。治療に使用するｓｉＲＮＡなどのｉＲＮ
Ａ剤の効果的投与量は、特定の治療の期間中、増加または減少し得ることも理解されたい
。投与量の変化は、本明細書に記載されているように、診断試験法の結果から得られ、明
らかとなり得る。例えば、ｉＲＮＡ剤組成物投与後に対象をモニタリングすることができ
る。モニタリングからの情報に基づいて、ｉＲＮＡ剤組成物の追加量を投与することがで
きる。
【０１３９】
投薬は、数日から数ヶ月続く治療期間中、または全治するまで、もしくは疾患状態の消
失が実現するまで、治療する疾患状態の重症度および応答性に左右される。最適な投薬計
画は、患者の身体における薬剤蓄積の測定によって計算することができる。当業者であれ
ば、最適な投与量、投薬方法および反復率を容易に決定することができるだろう。最適な
投与量は、個々の化合物の相対的能力に応じて変更可能であり、前述したようにインビト
ロおよびインビボ動物モデルにおいて効果的であることが発見されたＥＣ５０に基づいて
一般的に判断することができる。
【０１４０】
本発明は、以下の実施例によってさらに例示されるが、それらはさらに限定するもので
はない。
【実施例】
【０１４１】
試薬の入手先
試薬の入手先が本明細書に具体的に挙げられていない場合、このような試薬は、分子生
物学用試薬の任意の供給元から、分子生物学での適用に標準的な量／純度で入手すること
ができる。
【０１４２】
実施例１：ｓｉＲＮＡ合成
１本鎖ＲＮＡは、Ｅｘｐｅｄｉｔｅ ８９０９合成機（アプライドバイオシステムズ、
アプレラドイチュランド社（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ａｐｐｌｅｒａ
Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ）、［ドイツ国、ダルムシュタット（Ｄａｒｍｓｔａ
ｄｔ）所在］および固相担体として微細孔性ガラス（ＣＰＧ、５００Å、グレンリサーチ
社（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅｒａｃｈ）、［米国バージニア州スターリング（Ｓｔａｒｌｉｎ
ｇ）所在］）を使用して、１μｍｏｌｅのスケールで固相合成によって作製された。ＲＮ
Ａおよび２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを含有するＲＮＡは、それぞれ対応するホスホラ
ミダイトおよび２’−Ｏ−メチルホスホラミダイトを使用して固相合成によって作製され
た（プロリゴバイオケミ社（Ｐｒｏｌｉｇｏ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ）、［ドイ
ツ国、ハンブルク（Ｈａｍｂｕｒｇ）所在］）。これらの構成単位を、「Ｃｕｒｒｅｎｔ
ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、ボカ
ージュ エス．エル．（Ｂｅａｕｃａｇｅ、Ｓ．Ｌ．）ら（編）、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ
＆ Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．［アメリカ合衆国ニューヨーク］に記載されたような標準的ヌ
クレオシドホスホラミダイト化学物質を使用してオリゴリボヌクレオチド鎖の配列内の選
択部位に取り込ませた。ホスホロチオエート結合は、ヨウ素酸化剤溶液をアセトニトリル
（１％）に溶解したボカージュ試薬（クルアケム社（Ｃｈｒｕａｃｈｅｍ Ｌｔｄ）［英
国グラスゴー（Ｇｌａｓｇｏｗ）所在］）の溶液と置換することによって導入された。他
の付随する試薬は、マリンクロットベーカー社（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ Ｂａｋｅｒ
）［ドイツ国、グリサイム（Ｇｒｉｅｓｈｅｉｍ）所在］から入手した。
【０１４３】
粗オリゴリボヌクレオチドの陰イオン交換ＨＰＬＣによる脱保護および精製は、確立さ
れた方法に従って実施された。収率および濃度は、分光光度計（ＤＵ ６４０Ｂ、ベック
マンコールター社（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＧｍｂＨ）、［ドイツ国、アンタ
ーシュリースハイム（Ｕｎｔｅｒｓｃｈｌｉｅβｈｅｉｍ）所在］）を使用して、波長２
６０ｎｍでそれぞれのＲＮＡの溶液のＵＶ吸収によって測定した。２本鎖ＲＮＡは、アニ
ーリング緩衝液（２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８、１００ｍＭの塩化ナトリウ
ム）中において相補鎖の等モル溶液を混合し、８５〜９０℃の水浴中で３分間加熱し、３
〜４時間かけて室温まで冷却することによって作製した。精製したＲＮＡ溶液を使用する
まで−２０℃で保存した。
【０１４４】
実施例２：ｓｉＲＮＡのデザイン
効率的なＭＬＬ−ＡＦ４ｓｉＲＮＡを同定するために、ＭＬＬ−ＡＦ４融合部位のいず
れかの側を含み、かつ側面に位置する配列のｓｉＲＮＡのスキャンを実施した（非特許文
献５、非特許文献３、マシャレク（Ｍａｒｓｈａｌｅｋ）ら、Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏ
ｌｏｇｙ、第９０巻、３０８−３２０頁（１９９５年））。スキャンを実施するために、
本願の発明者らは、ＭＬＬ−ＡＦ４融合部位を含む配列と重複し、かつ同配列から１つの
ヌクレオチドずつ段階的に下流側に移動させた標的部位を有する１４個の異なるｓｉＲＮ
Ａを合成した。ｓｉＲＮＡ配列及びそれらの融合ｍＲＮＡの標的部位を表２に示した。表
２に示されるｓｉＲＮＡの２本鎖は、以下においてはｓｉＭＡＸと参照され、Ｘは表２に
おいて示されるそれぞれの対応する２本鎖を構成するセンス及びアンチセンス鎖の単位に
おける整数を意味する。例えば、ｓｉＭＡ５は、ＭＡ５ｓ及びＭＡ５ａｓから形成された
２本鎖を意味する。しかしながら、ｓｉＭＡｘはＭＡ３ｓ及びＭＡｘａｓ（表１における
薬剤番号２）により形成される２本鎖を意味し、ｓｉＭＡｍｍは、ＭＡｍｍｓ及びＭＡｍ
ｍａｓにより形成されるミスマッチ２本鎖を意味する。
【０１４５】
加えて、一つのｓｉＲＮＡがＲＳ４；１１細胞における融合部位変種と相同して合成さ
れた（本明細書においてはｓｉＭＡＲＳ）。ｓｉＭＡＲＳのセンス鎖の位置１乃至２１は
、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｌ２２１７９の位置４３３８−４３５８に対応する（バージョ
ン番号．Ｌ２２１７９．１ ＧＩ：３４７３７６、非特許文献５）。
【０１４６】
【表２】
対照として、ミスマッチｓｉＲＮＡ ｓｉＭＡｍｍ、ｓｉＲＮＡ ｓｉＡＧＦ１及びそ
のミスマッチ対照ｓｉＡＦ６（ＡＭＬ／ＭＴＧ８を標的とするもの）並びにｓｉＲＮＡ
ｓｉＫ４及びｓｉＧＬ２（ネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼｍＲＮＡを標的と
するもの）（ハイデンライヒ（Ｈｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈ）ら、Ｂｌｏｏｄ、第１０１巻、
３１５７−３１６３頁（２００３年））を使用した。ｓｉＡＧＦ１のセンス鎖の１乃至２
１位は、ＡＭＬ１／ＭＴＧ８（Ｇｅｎｂａｎｋ取得番号Ｄ１３９７９）の２１０２乃至２
１２２位に対応する。ｓｉＡＧＦ６はｓｉＡＧＦ１とは、センス鎖配列の８及び１３位に
おけるＡからＵへの変更及びアンチセンス配列に対する対応する変化を除いては、同一で
ある。ｓｉＧＬ２のセンス鎖の１乃至２１位は、Ｐ．ｐｙｒａｌｉｓ ｌｕｃｉｆｅｒａ
ｓｅ（Ｇｅｎｂａｎｋ取得番号Ｍ１５０７７）の５１４乃至５３３位に対応する。ｓｉＫ
４のセンス鎖の１乃至２１位は、ネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼＩＩ（Ｇｅ
ｎｂａｎｋ取得番号Ｌ１１０１７）の４１８４乃至４２０２位に対応する。
【０１４７】
ｓｉＭＡｘ、ｓｉＡＧＦ１、ｓｉＡＧＦ６及びｓｉＧＬ２を除くｓｉＲＮＡは、２１の
ヌクレオチド長のセンス鎖と２３のヌクレオチド長のアンチセンス鎖から構成されており
、ｓｉＲＮＡはアンチセンス鎖により２個のヌクレオチドが一つの３’−突出部分を形成
する。ｓｉＭＡｘ、ｓｉＡＧＦ１、ｓｉＡＧＦ６及びｓｉＧＬ２は、２１のヌクレオチド
長のセンス鎖及びアンチセンス鎖から構成されており、両端に２個のヌクレオチドの３’
−突出部分を形成する。
【０１４８】
実施例３：細胞培養
研究された複数の遺伝子から発現されたｍＲＮＡのレベルを低減する種々のｓｉＲＮＡ
の効果を細胞株ＳＥＭ（グレイル（Ｇｒｅｉｌ）ら、Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ．、第
８６巻、２７５−２８３頁、１９９４年）、ＲＳ４；１１（ストング，アール．シー．（
Ｓｔｏｎｇ，Ｒ．Ｃ．）ら、Ｂｌｏｏｄ、第６５巻、２１−３１頁、１９８５年）（ドイ
ツ国、ブラウンシュワイクに所在のＤＳＭＺから入手した）及びＭＶ４；１１（ランゲ，
ピー．エイチ．（Ｌａｎｇｅ，Ｂ．Ｈ．）及びウィンフィールド，エイチ．エヌ．（Ｗｉ
ｎｆｉｅｌｄ，Ｈ．Ｎ．）、Ｃａｎｃｅｒ、第６０巻、４６４−４７２頁、１９８７年）
（ドイツ国ハノーバー医学校のジェイ．クラウター（Ｋｒａｕｔｅｒ）から入手した）で
試験した。これらは染色体転座ｔ（４；１１）（ｑ２１；ｑ２３）を保持するが、異なる
切断点により異なるＭＬＬ−ＡＦ４変種を発現する。更に、本研究にて使用された白血病
細胞株はＨＬ６０（コリンズ，エス．ジェイ．（Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｓ．Ｊ．）ら、Ｎａｔ
ｕｒｅ、第２７０巻、３４７−３４９頁、１９７７年）、Ｋ５６２（ロツィオ，シー．ビ
ー．（Ｌｏｚｚｉｏ，Ｃ．Ｂ．）及びロツィオ ビー．ビー．（Ｌｏｚｚｉｏ，Ｂ．Ｂ．
）、Ｊ．Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ、第５０巻、５３５−５３８頁、１９７３年
）、Ｋａｓｕｍｉ−１（アソウ，エイチ．（Ａｓｏｕ，Ｈ．）ら、Ｂｌｏｏｄ、第７７巻
、２０３１−２０３６頁、１９９１年）、ＳＫＮＯ−１（マトザキ，エス．（Ｍａｔｏｚ
ａｋｉ，Ｓ．）ら、Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ、第８９巻、８０５−８１１頁、１９９
５年）及びＵ９３７（サンドストローム，シー．（Ｓｕｎｄｓｔｒｏｍ，Ｃ．）及びニル
ソン，ケイ．（Ｎｉｌｓｓｏｎ，Ｋ．）、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ、第１７巻、５６５
−５７７頁、１９７６年）であった。ＳＫＮＯ−１細胞は２０％ＦＣＳ（ＳｅｒａＰｌｕ
ｓ、パンバイオテック社（ＰＡＮＢｏｉｔｅｃｈ ＧｍｂＨ））及び７ｎｇ／ｍｌのＧＭ
−ＣＳＦを補充したＲＩＭＩ１６４０Ｇｌｕｔａｍａｘ培地（インビトローゲン（Ｉｎｖ
ｉｔｒｏｇｅｎ），ドイツ国カールスルーエ所在）で維持され、その他の細胞株の全ては
、３７℃及び５％ＣＯ２にて１０％のＦＣＳを補充したＲＩＭＩ１６４０Ｇｌｕｔａｍａ
ｘ培地で維持された。健全な患者の骨髄からの初代ヒトＣＤ３４＋細胞は、チュービンゲ
ン（Ｔｕｅｂｉｎｇｅｎ）に所在の大学小児病院から凍結したストックとして入手した。
【０１４９】
実施例４：ｓｉＲＮＡ処理
ＳＥＭのｓｉＲＮＡエレクトロポレーションを既に述べたように実施した（ドゥネ（Ｄ
ｕｎｎｅ）ら、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、第１３巻、３７５−８０頁、２００
３年及びハイデンライヒら、Ｂｌｏｏｄ、第１０１巻、３１５７−３１６３頁、２００３
年）。エレクトロポレーションは、１０ｍｓで３５０Ｖの矩形パルスを使用したＦｉｓｃ
ｈｅｒのエレクトロポレータ（フィッシャー（Ｆｉｓｃｈｅｒ）、ドイツ国、バイデルベ
ルグ所在）にて実施した。室温にて１５分間インキュベートした後に、細胞を培地で２０
倍に希釈して、３７℃の５％ＣＯ２下にてインキュベートした。
【０１５０】
実施例５：ＲＴ−ＰＣＲ
内因性ＭＬＬ−ＡＦ４、ＭＬＬ、ＡＦ４、ＨＯＸＡ７、ＨＯＸＡ９、ＯＡＳ１及びＳＴ
ＡＴ１のレベルをリアルタイムのＰＣＲにて試験した。ＲＮＡの全抽出をＲＮイージー（
Ｒｎｅａｓｙ）キット（キアーゲン（Ｑｕｉａｇｅｎ）、ドイツ国、ヒルデン所在）を使
用して、製造者により提案されたように実施した。次に、全ＲＮＡの１ｍｇを、ポリメー
ラーゼ連鎖反応と組み合わせられたリアルタイムの逆転写（ＲＴ−ＰＣＲ）に使用した。
逆転写反応は、２５ｍＭのランダム６量体、５ｘＲＴ緩衝液、１ｍＭのｄＮＴＰＭｉｘ、
２０ＵのＲＮａｓｅ阻害剤（ＭＢＩ）及び１００ＵのＭＭＬＶ−ＲＴ、ＲＮａｓｅＨ（プ
ロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ドイツ国、ハイデルベルグ所在）を使用して実施した。混合
物を室温にて１０分間、４２℃にて４５分間、そして９９℃にて３分間インキュベートし
た。それぞれの遺伝子のｍＲＮＡレベルはＧＡＰＤＨｍＲＮＡレベルに正規化した。
【０１５１】
リアルタイムのＰＣＲ反応は、ＭＬＬ−ＡＦ４、ＭＬＬ、ＡＦ４、ＨＯＸＡ７、ＨＯＸ
Ａ９、ＯＡＳ１及びＳＴＡＴ１に対するプライマーを使用して実施した。ＧＡＰＤＨとハ
イブリダイズするプライマーを対照として使用した。ＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲ反
応に対するマスターミックス（ＭＬＬ−ＡＦ４）は、６２．５ｎＭのフォワードプライマ
ー及びリバースプライマー、６２．５％（ｖ／ｖ）のＳｙｂｒ−ＧｒｅｅｎＭｉｘを含ん
でいた。ＧＡＰＤＨ反応に対するマスターミックスは、３７５ｎＭのフォワードプライマ
ー及びリバースプライマー及び６２．５％（ｖ／ｖ）のＳｙｂｒ−ＧｒｅｅｎＭｉｘを含
んでいた。そうでない場合には、ＲＴ−ＰＣＲは、マルチネス（Ｍａｒｔｉｎｅｚ）らの
ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ、第４巻、４４頁（２００４年）の記載に従って実施した。使用し
たプライマーの配列を表３に列挙した。
【０１５２】
【表３】
プライマーはＰＲＩＭＥＲ−ＥＸＰＲＥＳＳソフトウェア（アプライドバイオシステム
ズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、アメリカ合衆国カリフォルニア州フォス
ターシティ所在）を使用して設計した。
【０１５３】
実施例６：コロニー形成試験
ｓｉＲＮＡを用いた細胞エレクトロポレーションの２４時間後に１００００個の細胞を
、２４ウェルプレート中にて、２０％ＦＣＳ及び０．５６％メチルセルロースを含む０．
５ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地中に接種した。ＲＳ４；１１の場合、細胞数はウェル当り
２００００個に増加した。接種してから１４日後に、２０個以上の細胞を含むコロニーを
計数した。これらの条件で、モック−トランスフェクト細胞（ｓｉＲＮＡを使用しないで
エレクトロポレーションした場合）は、試験した細胞株に応じてウェル当り５０乃至１０
０のコロニーを形成した。ヒトコロニー形成細胞試験はＭｅｔｈｏＣｕｌｔ（登録商標）
メチルセルロースベースの培地（セルシステムズ（ＣｅｌｌＳｙｓｔｅｍｓ）、ドイツ国
、セントカタリーネン所在）を使用して実施した。エレクトロポレーションの後、５００
０個のヒト初代ＣＤ３４＋細胞を、１ｍｌのメチルセルロース培地を含む３５ｍｍの培養
皿中に二つずつ接種した。ＣＦＵ−ＧＥＭＭｓ及びＣＦＵ−ＧＭｓの数は接種してから１
０日後に計数した。
【０１５４】
実施例７：ＭＴＴ試験
細胞は４８時間以内に２回エレクトロポレーションして、９６ウェルのプレートに、ウ
ェル当り１００μｌにて０．５×１０５個の細胞密度にて接種した。各２４時間後に１０
μｌのＭＴＴ溶液（ロッシュ（Ｒｏｃｈｅ）、ドイツ国、マンハイム所在）を加えた。３
７℃にて４時間インキュベーション後、細胞を製造業者の指示に従って可溶化溶液で溶解
した。対照波長として、５６０ｎｍ及び６５０ｎｍにて、ＥＬＩＳＡリーダ（ダイネック
ス（Ｄｙｎｅｘ）、ドイツ国、フランクフルト／Ｍ所在）を用いてＯＤ測定を実施した。
細胞数は細胞希釈系列により計数した。ヒトコロニー形成細胞試験は、ＭｅｔｈｏＣｕｌ
ｔ（登録商標）メチルセルロースベースの培地（セルシステムズ、ドイツ国、セントカタ
リーネン所在）を使用して実施した。ヒト初代細胞をエレクトロポレーションし、続いて
、５０００個の細胞を、１ｍｌのメチルセルロース培地を含む３５ｍｍの培養皿中に接種
した。各サンプルは２つずつ接種し、ＣＦＵ−ＧＥＭＭｓ及びＣＦＵ−ＧＭｓの数は接種
してから１０日後に計数した。
【０１５５】
実施例８：細胞周期分析及びアポトーシス試験
細胞周期分析は、既に記載したように（３２）実施した。次に、得られたデータを分析
し、ＭｏｄＦｉｔプログラム（ベリティ（Ｖｅｒｉｔｙ）、アメリカ合衆国、トップシャ
ム所在）を使用して評価した。アポトーシスは、供給者の指示に従って、ヒトアネキシン
（Ａｎｎｅｘｉｎ）Ｖ／ＦＩＴＣキット（ベンダーメドシステムズ（Ｂｅｎｄｅｒ Ｍｅ
ｄＳｙｓｔｅｍｓ）、オーストリア国ウィーン所在）を使用して試験した。要約すると、
２−５×１０５個の細胞をエレクトロポレーション後、指示された時点にてＰＢＳで洗浄
し、室温にて１０分間、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ溶液の存在下にてインキュベーションし
た。細胞をＰＢＳで再び洗浄し、ヨウ化プロピジウムで染色した。次にサンプルを、ＦＡ
ＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ベクトンディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、
ドイツ国、バイデルベルク所在）を使用したフローサイトメトリーにて直ちに分析した。
【０１５６】
実施例９：ウェスタンブロッティング
細胞の全タンパク質量を得るために、ＲＮイージー（ＲＮｅａｓｙ）カラムのフロース
ルー部分に存在するタンパク質を２容量のアセトンで沈殿させ、尿素緩衝液（９Ｍの尿素
、４（ｗ／ｗ）％の３−［（３−クロラミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］−プロパ
ンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、１（ｗ／ｗ）％ジチオスレイトール）中に溶解した。全
溶解物（ＭＬＬ−ＡＦ４検出に対しては５０μｇ、その他の全てのイムノブロットに対し
ては１０μｇ）を（３２）に記載したように分析した。イムノブロットの検出に以下の抗
体を使用した：切断したカスパーゼ−３（Ａｓｐ１７５）（１：１０００、Ｃｅｌｌ Ｓ
ｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｎｏｌｏｇｙ、＃９６６１）；チューブリンＡｂ−４（１ｍｇ
／ｌ、ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ ＭＳ−７１９−Ｐ０、アメリカ合衆国フレモント所在）Ｂ
ｃｌ−ＸＬ（１：５００、ＢＤＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、＃５５６４９９）；ＭＬＬＴ２（
１：６００、Ｏｒｂｉｇｅｎ、＃１０８５２）；ＧＡＰＤＨ（１：２０，０００、ＨｙＴ
ｅｓｔ、＃５Ｇ４）。
【０１５７】
実施例１０：ＳＣＩＤマウスの異種移植術
４−５週齢の雌のＣＢ−１７／ｌｃｒＣｒｊ−ＳＣＩＤ／ＳＣＩＤマウスをチャールズ
リバージャーマニー（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。Ｓ
ＥＭ細胞（２０×１０７）を１日目にエレクトロポレーションし、３日目に指定されたｓ
ｉＲＮＡの５００ｎＭを使用しない（モック）か、又は使用した。４日目に細胞をマウス
の腹腔内に注射した。動物は、チュービンゲン（Ｔｕｅｂｉｎｇｅｎ）の地方審議会によ
り承認されたプロトコルに従って維持及び処理した。
【０１５８】
実施例１１：組織学
器官を除去し、室温にて中性に緩衝化された４％のホルマリンにて４−５日固定し、脱
水し、パラフィン中に埋め込み、切断した。組織はヘマトキシリン（Ｍｅｙｅｒのヘマル
ム溶液、メルク（Ｍｅｒｃｋ）、ドイツ国ダルムスタッド所在）及びエオシン（Ｅｏｓｉ
ｎ Ｙ、メルク、ドイツ国ダルムスタッド所在）を使用して、光学顕微鏡法のために染色
した。光学顕微鏡法は、２０×Ｐｌａｎ−Ｎｅｏｆｌｕａｒ又は４０×Ｐｌａｎ−Ｎｅｏ
ｆｌｕａｒ １．３オイルレンズを使用して、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｐｌａｎ顕微鏡（ツ
ァイス（Ｚｅｉｓｓ）、ドイツ国、グッティンゲン所在）を使用して実施した。画像は、
顕微鏡に備えられたＡｘｉｏ Ｖｉｓｉｏｎ ４ Ｓｏｆｔｗａｒｅ及びＡｄｏｂｅ Ｐ
ｈｏｔｏｓｈｏｐ（アドーベシステムズ（Ａｄｏｂｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、アメリカ合衆
国、カリフォルニア州、サンホセ所在）を使用して捕捉した。
【０１５９】
実施例１２：統計学的分析
コロニー形成試験は、対応のないスチューデントｔ検定により分析した。生存曲線は、
ログランク試験により分析した。
実施例１３：ＭＬＬ−ＡＦ４発現の阻害に対する活性を備えたｓｉＲＮＡの同定
高効率ＭＬＬ−ＡＦ４ｓｉＲＮＡを同定するために、ＭＬＬ−ＡＦ４融合部位のｓｉＲ
ＮＡスキャンを実施した。そのために、本願の発明者らは、各々が一つのヌクレオチドず
つ移動している標的部位を備えた１４個の異なるｓｉＲＮＡを合成した。異なるｓｉＲＮ
Ａの効果は、５歳のＡＬＬ再発患者から得られたｔ（４；１１）−陽性白血病細胞株ＳＥ
Ｍにて試験した（グレイル（Ｇｒａｉｌ）、ジェイ．ら、Ｂｒ Ｊ Ｊａｅｍａｔｏｌ、
第８６巻、２７５−２８３頁、１９９４年）。試験した１４の全てのｓｉＲＮＡのうち、
二つのｓｉＲＮＡ、即ち、ｓｉＭＡ３及びｓｉＭＡ６は、ＭＬＬ−ＡＦ４ｍＲＮＡレベル
が６０％超減少した（図１Ａ）。ＭＬＬ−ＡＦ４転写レベルの低減は用量依存性であり、
７５０ｎＭのｓｉＲＮＡで７０％の最大値に達した（データは図示せず）。経時変化の実
験では、ｓｉＲＮＡトランスフェクション後２４乃至４８時間の間にＭＬＬ−ＡＦ４ ｍ
ＲＮＡの量がその最小値に達し、４日にて通常にレベルに回復することが示された（図１
Ｂ）。更に、ｓｉＭＡ６は野生型のＡＦ４にもＭＬＬ ｍＲＮＡレベルにも影響を与えな
かった（図１Ｃ）一方で、ｓｉＭＡ３はＡＦ４レベルを実質的に低減した（データは図示
せず）。ミスマッチ対照ｓｉＲＮＡであるｓｉＭＭはＭＬＬ−ＡＦ４にも対応する野生型
の対立遺伝子転写産物にも影響を与えなかった。ＭＬＬ−ＡＦ４ ｍＲＮＡのレベルの低
減は、ＭＬＬ−ＡＦ４タンパク質中の付随物の６７％の減少により反映されている（図１
Ｄ）。
【０１６０】
ＭＬＬ−ＡＦ４融合部位は、異なるｔ（４；１１）陽性細胞株の間にて変化する。ＳＥ
Ｍ細胞はＭＬＬエクソン９ＡＦ４エクソン４（ｅ９−ｅ４）融合を含む転写物を発現し、
ＲＳ４；１１はエクソン１０−エクソン４（ｅ１０−ｅ４）変種を発現する。６７％の相
同性にも関わらず、ｓｉＭＡ６はＲＳ４；１１細胞中におけるｅ１０−ｅ４イソ型のレベ
ルを低減しなかった（非特許文献５）のに対し、完全に相同性であるｓｉＲＮＡ、ｓｉＭ
ＡＲＳは、ＡＦ４又はＭＬＬの発現に影響を与えることなく、ＲＳ４；１１におけるＭＬ
Ｌ−ＡＦ４ ｅ１０−ｅ４を６０％低減した。
【０１６１】
ｓｉＭＡ６もｓｉＭＭもＳＴＡＴ１又は２’−５’−オリゴアデニレートシンターゼ１
の発現を誘導せず（図１Ｆ）、それは、これらのｓｉＲＮＡがインターフェロンの応答を
誘発しないことを示している（スレッツ、シー．エー．（Ｓｌｅｄｚ，Ｃ．Ａ．）ら、Ｎ
ａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、第５巻、８３４−８３９頁、２００３年）。ｐｏｌｙＩＣで
のトランスフェクションはＯＡＳ１の転写レベルを５０倍以上も増大し、ＳＴＡＴ１ ｍ
ＲＮＡのレベルを１０倍以上も増大し（図１Ｆ）、これらの白血球細胞においてインター
フェロン応答経路を誘導することを示す。それらの高い特異性により、ＭＬＬ−ＡＦ４
ｓｉＲＮＡであるｓｉＭＡ６及びミスマッチ対照ｓｉＲＮＡであるｓｉＭＭは、白血病性
表現型のためのＭＬＬ−ＡＦ４発現の重要性を証明するために選択されている。
【０１６２】
実施例１４：ＭＬＬ−ＡＦ４は白血病性クローン形成能力に影響を与える
白血病性クローン形成能力（ｃｌｏｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）に対するＭＬＬ−ＡＦ４の
適合性を研究するために、本願の発明者らはｔ（４；１１）−陽性ＳＥＭ細胞をｓｉＲＮ
Ａでトランスフェクトし、半固体の培地にてインキュベートした。ＳｉＭＡ６−媒介型の
ＭＬＬ−ＡＦ４の枯渇は、コロニーの数を５倍低減した（図２Ａ）。この影響は特異的で
ある。その理由はｔ（８；２１）−陽性白血球細胞株Ｋａｓｕｍｉ−１のコロニー形成は
ｓｉＭＡ６により影響されなかったからである。逆に、ＡＭＬ１／ＭＴＧ８特異的ｓｉＲ
ＮＡであるｓｉＡＧＦ１でのトランスフェクションは、ＳＥＭコロニー形成を干渉するこ
となくＫａｓｕｍｉ−１のコロニー形成を損ねた（マルチネス エヌ．（Ｍａｒｔｉｎｅ
ｚ，Ｎ．）ら、ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ、第４巻、４４頁、２００４年）。ミスマッチ対照
（ｓｉＭＭ及びｓｉＡＧＦ６）はいずれも白血病性クローン形成能力に影響を与えなかっ
た。さらに、ｔ（４；１１）−陰性白血病性細胞株ＨＬ６０、Ｋ５６２、ＳＫＮＯ−１及
びＵ９３７も、ｓｉＭＡ６により影響を受けないＭＬＬ−ＡＦ４変種を発現するｔ（４；
１１）−陽性白血病性細胞株ＲＳ４；１１及びＭＶ４；１１も、ｓｉＲＮＡトランスフェ
クションによりコロニー形成が損なうことのなかったことが示された（データ図示しない
）。特に、ＭＬＬ−ＡＦ４ｅ１０−ｅ４変種のｓｉＭＡＲＳ媒介型抑制はＲＳ４；１１の
コロニー形成を２倍も低減し、別のｔ（４；１１）細胞株に対するＭＬＬ−ＡＦ４のコロ
ニー形成効率の依存性を示す（図２Ｂ）。初代ヒト造血性ＣＤ３４＋細胞のＭＬＬ−ＡＦ
４ｓｉＲＮＡのエレクトロポレーションは、ＧＥＭＭコロニー数にもＧＭコロニー数にも
影響を与えなかった（図２Ｃ）。このように影響を与えないことは、非効率的なｓｉＲＮ
Ａのトランスフェクションに寄与していない。その理由は、本明細書で使用される細胞株
もヒト造血性ＣＤ３４＋細胞も機能的なｓｉＲＮＡで効率的にトランスフェクトされたか
らである（シェア エム．（Ｓｈｅｒｒ，Ｍ．）ら、Ｂｌｏｏｄ、第１０１巻、１５６６
−１５６９頁、２００３年、ハイデンライヒ オー．ら、Ｂｌｏｏｄ、第１０１巻、３１
５７−３１６３頁、２００３年、ドゥネ ジェイ（Ｄｕｎｎｅ，Ｊ．）ら、Ｏｌｉｇｏｎ
ｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、第１３巻、３７５−３８０頁、２００３年）。
【０１６３】
実施例１５：ＭＬＬ−ＡＦ４の抑制が、白血病性の増殖及び細胞周期の進行を阻害する
次に、懸濁した培地での白血病性の増殖の制御におけるＭＬＬ−ＡＦ４の役割を調べた
。ｓｉＭＡ６の単回のエレクトロポレーションはｔ（４；１１）−陽性ＳＥＭ細胞の倍加
時間に影響を与えなかった（データ図示しない）が、２日おきにｓｉＲＮＡのエレクトロ
ポレーションを繰り返すと、ｓｉＭＡ６によるＳＥＭ細胞の増殖及びｓｉＭＡＲＳによる
ＲＳ４；１１細胞の増殖の阻害が維持された（図２Ｄ）。従って、増殖は、対応するＭＬ
Ｌ−ＡＦ４融合部位に相同性を有するｓｉＲＮＡにより阻害されるのみであり、これらＭ
ＬＬ−ＡＦ４ｓｉＲＮＡの特異性を示す。モック又はｓｉＲＮＡでエレクトロポレーショ
ンされたＳＥＭ又はＲＳ４；１１細胞は１．４日の倍加時間で増殖し、エレクトロポレー
ションの繰り返しがその増殖に重大な影響を与えないことを示す。
【０１６４】
ＭＬＬ−ＡＦ４の枯渇によるｔ（４；１１）−陽性細胞の増殖の低減は、細胞周期の分
配における変化に匹敵していなかった。ＭＬＬ−ＡＦ４ｓｉＲＮＡの反復的なエレクトロ
ポレーションを伴う１０日間の経時変化の間、Ｓ相細胞のフラクションは、ＳＥＭ及びＲ
Ｓ４；１１細胞のいずれにおいても、それぞれ５０乃至３０％及び２０％減少し、Ｇ０／
Ｇ１相のフラクション細胞における増大を伴っていた（図２Ｅ）。特に、ｓｉＭＡ６は、
ＳＥＭ細胞においてのみ細胞周期の分配に影響を与えた一方、ｓｉＭＡＲＳはＲＳ４；１
１細胞においてのみそれらの変化を引き起こした。従って、ＭＬＬ−ＡＦ４の枯渇は、Ｇ
１相からＳ相までｔ（４；１１）−陽性細胞の進行に否定的に干渉する。Ｇ１／Ｓの遷移
を損なうことは、細胞の老化には関係していない。それは、β−ガラクトシダーゼ活性に
関連した老化は、ＭＬＬ−ＡＦ４の枯渇により増大しないからである（データ図示しない
）。
【０１６５】
実施例１６：ＭＬＬ−ＡＦ４の枯渇は、ｔ（４；１１）−陽性ＳＥＭ細胞のアポトーシ
スを誘導する
ＳＥＭ及びＲＳ４；１１細胞の細胞周期の分析は、１０日間にわたるＭＬＬ−ＡＦ４の
連続的な枯渇が対照と比較してサブ（ｓｕｂ）Ｇ１細胞の数を１０倍も増大し、アポトー
シス細胞の数を増大したことを示した（図３Ａ）。アネキシンＶ及びヨウ化プロピジウム
での染色は、ＭＬＬ−ＡＦ４細胞の４日間の抑制がアポトーシス細胞における３倍の増大
をＳＥＭ細胞にて示し、それにより、同時点にて見られるｓｕｂＧ１細胞の増大と一致し
た（図３Ｂ）。特に、ほとんど不活性なｓｉＲＮＡであるｓｉＭＡ１３（図１Ａを参照）
は、アポトーシス細胞の数に僅かに影響を与えるのみであり、ＭＬＬ−ＡＦ４の枯渇の程
度とアポトーシスの速度との間には直接相関関係のあることを示唆している。この結果は
、カスパーゼ−３のタンパク質分解活性及びｓｉＭＡ６でのトランスフェクションによる
抗アポトーシスタンパク質Ｂｃｌ−ＸＬの量の低減により確証された（図３Ｃ）。
【０１６６】
実施例１７：ＭＬＬ−ＡＦ４の抑制はＨｏｘ遺伝子の発現を増大する
ＭＬＬ−ＡＦ４を含むＭＬＬ癌タンパク質の発現はＨｏｘａ７及びＨｏｘａ９を含む数
種類のＨｏｘ遺伝子並びに別のホメオティック遺伝子であるＭｅｉｓ１の発現の増大と関
連している。従って、本願の発明者らは、ＭＬＬ−ＡＦ４レベルに依存するこれら３種類
の遺伝子の発現を分析した。ＭＬＬ−ＡＦ４ｓｉＲＮＡであるｓｉＭＡ６でＳＥＭ細胞を
２回連続してトランスフェクションすると、Ｈｏｘａ７ｍＲＮＡのレベルが二倍減少した
（図４）。Ｈｏｘａ９の僅かの低減も観察された。ＲＳ４；１１細胞において、Ｈｏｘａ
９はｓｉＭＲＡＳのトランスフェクションにより低減したが、Ｈｏｘａ９は低減しなかっ
た。ＲＳ４；１１細胞中にてＨｏｘａ９が低減しないことは、ＳＥＭ細胞中と比較して、
ＭＬＬ−ＡＦ４の抑制の効果が低いことによるものであろう（図１Ｄ，Ｅ）。
【０１６７】
実施例１８：ＭＬＬ−ＡＦ４はｔ（４；１１）−陽性細胞の白血病性細胞の生着に対し
て重要である
ＳＣＩＤマウスにおける白血病性細胞の成長は、高リスクのＢ−ＡＬＬと関係している
ことが示されてきた（ウックン，エフ．エム．（Ｕｃｋｕｎ，Ｆ．Ｍ．）ら、Ｂｌｏｏｄ
、第８５巻、８７３−８７８頁、１９９５年）。従って、本願の発明者らはｓｉＲＮＡの
媒介するＭＬＬ−ＡＦ４の枯渇が細胞の生着（ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ）及びインビボに
おける白血病の進行に影響を与えるかどうかを調べるためにｔ（４；１１）−ＳＣＩＤマ
ウスのモデルを使用した（ポークック，シー．エフ．（Ｐｏｃｏｃｋ，Ｃ．Ｆ．）ら、Ｂ
ｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ、第９０巻、８５５−８６７頁、１９９５年）。モック、或い
は対照のｓｉＲＮＡで処理されたＳＥＭ細胞のＳＣＩＤマウスへの腹腔内移植は移植後７
０日以内において白血病に関連して１００％死亡し、生存日数の中央値はそれぞれ５２及
び５２日であった（図５Ａ）。ＭＬＬ−ＡＦ４が枯渇したＳＥＭ細胞の異種移植術は、生
存日数の中央値が８２日であり、１２５日での全体に対する生存率が３８％（ｐは０．０
１未満）で、あまり深刻でない表現型を引き起こした。疾病にて死亡した動物は、卵巣腫
瘍と、脾腫と、骨髄、脾臓及び肝臓における重篤な白血病性芽球浸透と、を示す一方、ｓ
ｉＭＡ６群の生存動物の器官は移植後２２８日において白血病性浸透の兆候を全く示さな
かった（図５Ｂ，Ｃ）。結論として、ｓｉＲＮＡ媒介型ＭＬＬ−ＡＦ４の抑制は、異種移
植型ＳＣＩＤマウスにおけるｔ（４；１１）陽性細胞の白血病性細胞の生着を低減した。
【０１６８】
実施例１９：結論
ＭＬＬ−ＡＦ発現の阻害は、培養懸濁液中における白血病性の増殖並びにｔ（４；１１
）細胞株のコロニー形成を減少した。このコロニー形成能力及び増殖の低減は、アポトー
シスの増大に付随して起こった。更に、ＭＬＬ−ＡＦ４の枯渇は、Ｈｏｘａ７、Ｈｏｘａ
９及びＭｅｉｓ−１の発現の低減に付随して起こり、それが同様にアポトーシスに寄与し
ていると思われる。最後に、ｓｉＲＮＡ媒介型ＭＬＬ−ＡＦ４の抑制は、異種移植ＳＣＩ
Ｄマウスにおける白血病性細胞の生着を重大に損ねるものであった。ＳＣＩＤマウスにお
ける効果的な細胞の生着はＡＬＬ患者における再発の可能性が予測されているので（ウッ
クン，エフ．エム．ら、Ｂｌｏｏｄ、第８５巻、８７３−８７８頁、１９９５年）、これ
らのデータはＭＬＬ−ＡＦ４機能の干渉が患者の転帰を改善し得ることを示唆している。
【０１６９】
ｔ（４；１１）白血病細胞においてのみ発現することと、白血病の維持におけるその中
心的な役割とにより、ＭＬＬ−ＡＦ４はこの非常に進行性の白血病の治療に対する優れた
標的である。しかしながら、この融合タンパク質に特異的な小さな分子の阻害剤は現在の
ところ利用可能ではない。本願の発明者らは、この融合部位と相同であるｓｉＲＮＡがＭ
ＬＬ−ＡＦ４を効果的に抑制することを示している。更に、本願の発明者らは、この融合
遺伝子の二つの異なる変種が高効率かつ排他的な特異性にて標的化され得ることを示して
いる。この排他的な特異性はまた、これらのｓｉＲＮＡの観察された抗白血病性特性が直
接的にＭＬＬ−ＡＦ４の抑制によるものであり、他の遺伝子の意図していない阻害又はイ
ンターフェロンの応答の誘導のような標的以外の効果によるものでないことを証明した。
本願の発明者らの結果は、ＭＬＬ−ＡＦ４ｓｉＲＮＡが特異的ではあるが、柔軟性であり
、よってｔ（４；１１）ＡＬＬの治療に対する優れた治療のツールを提供することを示唆
している。
【０１７０】
その他の実施形態
本発明の種々の実施形態を記載してきた。しかしながら、本発明の精神及び範囲を逸脱
することなく種々の変更がなされることは理解されよう。
【数１】
【数２】
【数３】
【数４】
【数５】
【数６】
【数７】
【数８】
【数９】
【数１０】
【数１１】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載された発明。
【請求項１】
本願明細書に記載された発明。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図１Ｅ】
【図１Ｆ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図２Ｅ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図５Ｅ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図１Ｅ】
【図１Ｆ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図２Ｅ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図５Ｅ】
【公開番号】特開２０１１−２５４８４０（Ｐ２０１１−２５４８４０Ａ）
【公開日】平成２３年１２月２２日（２０１１．１２．２２）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１１−２０８１６７（Ｐ２０１１−２０８１６７）
【出願日】平成２３年９月２２日（２０１１．９．２２）
【分割の表示】特願２００７−５４６９７９（Ｐ２００７−５４６９７９）の分割
【原出願日】平成１７年１２月１４日（２００５．１２．１４）
【出願人】（５０５３６９１５８）アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド (51)
【氏名又は名称原語表記】ＡＬＮＹＬＡＭ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ， ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１２月２２日（２０１１．１２．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２０８１６７（Ｐ２０１１−２０８１６７）
【出願日】平成２３年９月２２日（２０１１．９．２２）
【分割の表示】特願２００７−５４６９７９（Ｐ２００７−５４６９７９）の分割
【原出願日】平成１７年１２月１４日（２００５．１２．１４）
【出願人】（５０５３６９１５８）アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド (51)
【氏名又は名称原語表記】ＡＬＮＹＬＡＭ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ， ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
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