ＭＭＳＥＴを阻害するための組成物および方法
本発明は、癌の治療、管理、および／または研究において用途を見出す薬剤に関する。具体的には、本発明は、ＭＭＳＥＴの発現または活性に影響を与える薬剤（例えば、小分子、核酸）に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１０年２月１９日に出願された特許出願第６１／３０６，２５１号に対する優先権を主張するものであり、当該出願は、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与されたＣＡ６９５６８に基づいて、連邦政府の支援のもとに実施された。連邦政府は、本発明において特定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、癌の治療、管理、および／または研究において用途を見出す治療剤に関する。具体的には、本発明は、癌（例えば、前立腺癌、乳癌、他の固形腫瘍、多発性骨髄腫）におけるＭＭＳＥＴの発現を標的とする小分子および核酸に関する。
【背景技術】
【０００４】
６５歳を超える男性の９人に１人が罹患する前立腺癌（ＰＣＡ）は、肺癌の次に多い男性の癌による死亡原因である（Ａｂａｔｅ−Ｓｈｅｎ ａｎｄ Ｓｈｅｎ，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １４：２４１０［２０００］、Ｒｕｉｊｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｖ，２０：２２［１９９９］）。米国癌協会は、２００１年には約１８４，５００人の米国人男性が前立腺癌であると診断され、３９，２００人が死亡すると推定している。
【０００５】
前立腺癌は、典型的には、直腸指診および／または前立腺特異抗原（ＰＳＡ）スクリーニングによって診断される。血清ＰＳＡレベルの上昇は、ＰＣＡの存在を示唆する場合がある。ＰＳＡは、前立腺細胞によってのみ分泌されるため、前立腺癌のマーカーとして用いられる。正常な前立腺は、一定量、典型的には１ミリリットル当たり４ナノグラム未満、すなわち「４」以下のＰＳＡ読み取り値を生成するのに対し、癌細胞は、癌の重症度に応じて上昇する量を生成する。４〜１０のレベルは、医師に患者が前立腺癌に罹患していることを疑わせ、５０を超える量では、身体の他の箇所に広がっていることを示す可能性がある。
【０００６】
ＰＳＡまたは指診によって癌が存在する高い可能性が示された場合、経直腸超音波法（ＴＲＵＳ）を用いて前立腺のマッピングを行い、あらゆる疑わしい領域を示す。前立腺の種々の箇所の生検を用いて前立腺癌が存在するかどうかを判定する。治療の選択肢は、癌の段階に依存する。余命１０年以下で、グリーソン値が低く、腫瘍が前立腺以外には転移していない男性には、慎重な経過観察で対応することが多い（治療は行わない）。より悪性度の高い癌に対する治療の選択肢として、（神経温存術を用いるかまたは用いずに）前立腺を完全に除去する根治的前立腺摘除（ＲＰ）等の外科的治療、および体外から前立腺に線量を導く外部ビームによって、または癌細胞を局所的に死滅させるために前立腺内に移植される低線量の放射線シードを介して適用される、放射線が挙げられる。また、抗アンドロゲンホルモン療法も、単独で、または手術もしくは放射線と組み合わせて用いられる。ホルモン療法は、下垂体がテストロン生成を刺激するホルモンを生成するのを阻止する黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨ−ＲＨ）類似体を用いる。患者は、一生、ＬＨ−ＲＨ類似体の注射を受けなければならない。
【０００７】
手術およびホルモンによる治療は局在性ＰＣＡには有効であることが多いが、進行した疾患は、本質的に治癒不能のままである。アンドロゲン除去は、進行したＰＣＡに対する最も一般的な治療法であり、アンドロゲン依存性悪性細胞の大規模なアポトーシスを引き起こし、腫瘍の一時的な退縮をもたらす。しかしながら、ほとんどの場合、腫瘍はすさまじい勢いで再発し、アンドロゲンシグナルとは関係なく増殖する可能性がある。
【０００８】
前立腺特異抗原（ＰＳＡ）スクリーニングの出現は、ＰＣＡの早期発見をもたらし、ＰＣＡに関連する死亡率が大幅に減少した。しかしながら、ＰＳＡスクリーニングが癌特異的な死亡率に与える影響は、前向き無作為化スクリーニング試験の結果が出るまでは未知のままである（Ｅｔｚｉｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．，９１：１０３３［１９９９］、Ｍａａｔｔａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ７９：１２１０［１９９９］、Ｓｃｈｒｏｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．，９０：１８１７［１９９８］）。血清ＰＳＡ検査の主な限界は、特にＰＳＡ検出における中程度の範囲（４〜１０ｎｇ／ｍｌ）で、前立腺癌に対する感受性および特異性が不足していることである。血清ＰＳＡレベルの上昇は、良性前立腺過形成（ＢＰＨ）および前立腺炎等の非悪性の病態を有する患者においても検出されることがあり、検出された癌の悪性度に関する情報がほとんど得られない。血清ＰＳＡ検査の増加と同じ時期に、前立腺針生検が行われる数が劇的に増加した（Ｊａｃｏｂｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＪＡＭＡ ２７４：１４４５［１９９５］）。これにより、不確かな前立腺針生検が急増する結果となった（Ｅｐｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｐｏｔｔｅｒ Ｊ．Ｕｒｏｌ．，１６６：４０２［２００１］）。そのため、新しい治療標的および薬剤の開発が必要とされている。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、癌の治療、管理、および／または研究において用途を見出す治療剤に関する。具体的には、本発明は、癌（例えば、前立腺癌、乳癌、他の固形腫瘍、多発性骨髄腫）における多発性骨髄腫ＳＥＴドメイン保有タンパク質（ＭＭＳＥＴ）の発現を標的とする小分子および核酸に関する。
【００１０】
ＭＭＳＥＴ（ウォルフ・ヒルシュホーン症候群候補１（ＷＨＳＣ１）または核内ＳＥＴドメイン保有タンパク質２（ＮＳＤ２）としても知られる）は、リシン３６のヒストンＨ３をジメチル化することで知られるヒストンメチルトランスフェラーゼ（Ｈ３−Ｋ３６−ジメチルまたはＨ３−Ｋ３６−Ｍｅ２と称される修飾）である。ＭＭＳＥＴは、染色体完全性を促進し、複数の癌において異常に発現される。多発性骨髄腫において、ＭＭＳＥＴがｔ（４；１４）（ｐ１６ｑ３２）染色体転座に関与する患者は、そのような転座のない多発性骨髄腫患者と比較して１５％の再発率および予後の悪化を経験する（Ｉｎｔｉｎｉ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．１２６：４３７、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）。転座陽性多発性骨髄腫細胞におけるＭＭＳＥＴノックダウンは、そのような細胞の増殖および腫瘍形成能に強い影響を与える（Ｂｒｉｔｏ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ ９４：７８、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）。本発明のいくつかの実施形態を開発する過程で実施した実験により、転移性前立腺癌および乳癌におけるＭＭＳＥＴの過剰発現が示された（図８）。別のヒストンメチルトランスフェラーゼＥＺＨ２の発現と相関する発現（図８）。さらに、ＭＭＳＥＴノックダウンは、高悪性度の前立腺癌細胞株の細胞増殖および浸潤の低下をもたらし（図５）、癌細胞の増殖におけるＭＭＳＥＴの重要な役割を裏付けた。したがって、この酵素を阻害することは、治療的な影響を有する。いくつかの実施形態において、ＭＭＳＥＴの阻害剤（例えば、低分子阻害剤、ｓｉＲＮＡ阻害剤、抗体阻害剤）は、これらに限定されないが、前立腺癌、乳癌、および多発性骨髄腫を含むＭＭＳＥＴに関連する状態および疾患の治療において用途を見出す。
【００１１】
本発明の方法および組成物は、対象における種々の癌の種類において用途を見出す。いくつかの実施形態において、本発明の方法および組成物は、前立腺癌の治療または予防において用途を見出す。いくつかの実施形態において、本発明の方法および組成物は、乳癌の治療または予防において用途を見出す。いくつかの実施形態において、本発明の方法および組成物は、多発性骨髄腫の治療はまたは予防において用途を見出す。対象は、本明細書に記載される化合物の投与から恩恵を受けることができるあらゆる動物である。いくつかの実施形態において、対象は哺乳動物であり、例えば、ヒト、霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、例えばラットまたはマウス等のげっ歯類である。典型的には、対象はヒトである。
【００１２】
本発明の方法は、ＭＭＳＥＴ活性（例えば、ＭＭＳＥＴを阻害する）薬剤に関する投薬、製剤、投与経路、または時間的な投与計画に限定されない。いくつかの実施形態において、ＭＭＳＥＴ活性薬剤の投与量は、１日あたり約２ｍｇ〜約２，０００ｍｇであり、疾患の標的、患者、および投与経路に依存して必然的に変動が生じる。いくつかの実施形態において、投与量は、１日体重１ｋｇ当たり約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇの範囲、より好ましくは約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約２ｍｇ／ｋｇの範囲、最も好ましくは約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約０．２ｍｇの範囲で経口投与される。投与経路は、これらに限定されないが、経口、局所、および非経口（例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、くも膜下腔内、動脈内、経鼻、または肺内投与）を含む。本発明は、ＭＭＳＥＴ活性薬剤（例えば、ＭＭＳＥＴ阻害剤）の投与の時間的態様によって制限されない。ＭＭＳＥＴ活性薬剤は、単独で、または１つ以上の他の薬剤（複数可）、例えば、１つ以上の他の化学療法剤（複数可）と組み合わせて投与されてもよい。別の薬剤（複数可）と組み合わせて投与される場合、投与の順序に関係なく、そのような投与は同時にまたは逐次的に起こってもよい。ＭＭＳＥＴ活性薬剤療法は、１日当たり１〜５０回、またはそれよりも少ない回数で（例えば、隔日、３日毎、４日毎、５日毎、６日毎、週１回、月１回、３ヵ月毎）投与されてもよい。ＭＭＳＥＴ活性薬剤療法は、１日、１週間、１ヶ月間、１年間、１０年間、または１０年以上継続されてもよい。
【００１３】
本発明の文脈内で「治療する」とは、疾患もしくは障害と関連する症状の全体的または部分的な軽減、あるいはそれらの症状のさらなる進行もしくは悪化を遅延、阻害、または停止すること、あるいはその疾患もしくは障害を発症するリスクのある対象における疾患または障害の防止または予防を意味する。したがって、例えば、転移性前立腺癌の治療は、癌の転移を阻害または防止すること、転移の速度および／または数の減少、転移した前立腺癌の腫瘍量の減少、転移した前立腺癌の全体的または部分的な寛解、あるいは任意の他の治療効果を含み得る。本明細書において使用される場合、「治療的に有効な量」の本発明の化合物とは、疾患もしくは障害と関連する症状を全体的にまたは部分的に軽減する、あるいはそれらの症状のさらなる進行もしくは悪化を遅延、阻害、または停止させる、あるいはその疾患もしくは障害を発症するリスクのある対象において疾患または障害を防止または予防する化合物の量を指す。
【００１４】
本発明の実施形態の方法および組成物は、それらがＭＭＳＥＴに影響を与える機構によって限定されない。いくつかの実施形態において、ＭＭＳＥＴのｍＲＮＡ発現（例えば、癌細胞における発現）（例えば、前立腺癌細胞またはそれらの前駆体における発現、乳癌細胞またはそれらの前駆体における発現、形質細胞または形質細胞前駆体における発現）が影響を受ける。いくつかの実施形態において、ＭＭＳＥＴのｍＲＮＡ転写率が変化する（例えば、低下する）。いくつかの実施形態において、ＭＭＳＥＴのｍＲＮＡ転写安定性が変化する（例えば、ＭＭＳＥＴのｍＲＮＡ転写物が不安定になるか、または分解しやすくなる）。いくつかの実施形態において、ＭＭＳＥＴのタンパク質レベルが影響を受ける（例えば、低下する）（例えば、前立腺癌細胞またはそれらの前駆体において低下する、乳癌細胞またはそれらの前駆体において低下する、形質細胞またはそれらの前駆体において低下する）。いくつかの実施形態において、ＭＭＳＥＴのタンパク質分子の安定性が変化する（例えば、低下する）。いくつかの実施形態において、ＭＭＳＥＴのタンパク質の１つ以上の活性が変化する。いくつかの実施形態において、ＭＳＥＴのメチル化活性が阻害される。いくつかの実施形態において、ＭＭＳＥＴと基質との相互作用が影響を受ける（例えば、阻害される、促進する、不可逆性になる、弱まる、非特異性になる、特異性がより高くなる）。いくつかの実施形態において、ＭＭＳＥＴ制御因子の活性（例えば、正の制御因子、負の制御因子）が影響を受ける。
【００１５】
特定の実施形態において、本発明は、細胞の増殖を阻害する方法であって、ＭＭＳＥＴを発現する細胞を細胞中のＭＭＳＥＴの少なくとも１つの活性を阻害する薬剤に接触させることを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、ＭＭＳＥＴ薬剤は、小分子、ｓｉＲＮＡ、または抗体等の種類であるが、他も企図される。いくつかの実施形態において、小分子は、３−ヒドラジニルキノキサリン−２−チオールである。いくつかの実施形態において、細胞は、癌細胞である。いくつかの実施形態において、癌細胞は、前立腺癌細胞、前立腺癌細胞前駆体、乳癌細胞、乳癌細胞前駆体、形質細胞、または形質細胞前駆体等の種類のものである。いくつかの実施形態において、癌細胞は、前立腺癌細胞である。
【００１６】
特定の実施形態において、本発明は、ヒストンＨ３のリシン３６のメチル化を阻害することを含む、細胞の増殖を阻害する方法を提供する。いくつかの実施形態において、ヒストンＨ３のリシン３６のメチル化は、ジメチル化からなる。いくつかの実施形態において、ヒストンＨ３のリシン３６のメチル化は、トリメチル化からなる。いくつかの実施形態において、阻害は、ＭＭＳＥＴの少なくとも１つの活性を変化させることによって起こる。例えば、いくつかの実施形態において、ＭＭＳＥＴの活性は、ＭＭＳＥＴの酵素活性、ＭＭＳＥＴの転写レベル、またはＭＭＳＥＴのタンパク質レベルである。いくつかの実施形態において、ＭＭＳＥＴ酵素活性は、メチル化を含む。
【００１７】
特定の実施形態において、本発明は、細胞中のＭＭＳＥＴの少なくとも１つの活性を阻害する薬剤を含む、薬学的組成物を提供する。いくつかの実施形態において、薬剤は、核酸である。いくつかの実施形態において、薬剤は、小分子である。いくつかの実施形態において、薬剤は、小分子である。いくつかの実施形態において、薬剤は、３−ヒドラジニルキノキサリン−２−チオールである。
【００１８】
本明細書に含まれる教示を踏まえると、関連技術分野の当業者にはさらなる実施形態が明白であろう。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】前立腺癌におけるＷｈｓｃ１（ＭＭＳＥＴ）の過剰発現を示す。発現レベルは、公的に利用可能なデータ（Ｏｎｃｏｍｉｎｅ）（Ｖａｒａｍｂａｌｌｙ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２２：１６９５−１６９９、Ｙｕ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎｅｏｐｌａｓｉａ ９：２９２−３０３、Ｌａｐｏｉｎｔｅ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６７：８５０４−８５１０、Ｌａｐｏｉｎｔｅ ｅｔ ａｌ．（２００４）ＰＮＡＳ １０１：８１１−８１６、各々は、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）を用いて調査した。
【図２】前立腺試料全体にわたるＭＭＳＥＴ発現を示す。
【図３】前立腺細胞株のパネルにおけるＭＭＳＥＴ発現を示す。
【図４】ＭＭＳＥＴノックダウンが、Ｈ３Ｋ３６のジメチル化を特異的に減少させることを示す。
【図５】ＭＭＳＥＴノックダウンが、ＤＵ１４５細胞の増殖を減少させることを示す。
【図６】ＭＭＳＥＴノックダウンがＰＣ３細胞に与える影響を示す。
【図７】ＭＣＴＰ３９がＤＵ１４５細胞の増殖および浸潤に与える影響を示す。
【図８】切除した前立腺の転移性組織におけるＷＨＳＣ１（ＭＭＳＥＴ）およびＥｚｈ２の過剰発現を示す。ＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲを行って、ＭＭＳＥＴ１およびＥｚｈ２ ｍＲＮＡの発現を判定した。
【図９】ＭＣＴＰ３９（３−ヒドラジニルキノキサリン−２−チオール）で処理したＤＵ１４５細胞に示された位置におけるヒストンＨ３のメチル化修飾のレベルを示す。
【図１０】ＭＣＴＰ３９（３−ヒドラジニルキノキサリン−２−チオール）の化学構造を示す。
【図１１】ＥＺＨ２の標的としてのＨ３Ｋ３６ｍｅ２マーカーの同定を示す。
【図１２】ＥＺＨ２が、ＭＭＳＥＴを制御することによってＨ３Ｋ３６ｍｅ２に間接的に影響を与えることを示す。
【図１３】ＥＺＨ２が、正常細胞においてＭＭＳＥＴの発現を誘導することを示す。
【図１４】ＥＺＨ２が、ｍｉＲＮＡのＭＭＳＥＴ標的化を抑制したことを示す。
【図１５】ＭＭＳＥＴノックダウンが、前立腺癌の増殖、浸潤、および遊走に影響を与えることを示す。
【図１６】ＭＭＳＥＴの減少が、ＣＡＭモデルにおける基底膜の浸潤および転移を減衰させることを示す。
【図１７】ＭＭＳＥＴの過剰発現が、Ｈ３Ｋ３６ｍｅ２マーク、ならびにより高い細胞増殖および浸潤を誘導することを示す。
【図１８】ＭＭＥＳＴノックダウンが、ＥＺＨ２媒介性細胞浸潤を減衰させることを示す。
【図１９】複数の癌におけるＭＭＳＥＴの高い発現を示す。
【図２０】前立腺癌試料におけるＥＺＨ２とＭＭＳＥＴの発現との相関を示す。
【図２１】前立腺癌におけるＥＺＨ２およびＭＭＳＥＴの発現のｑＰＣＲバリデーションを示す。
【図２２】複数の癌細胞株および前立腺組織におけるＥＺＨ２およびＭＭＳＥＴの発現を示す。
【図２３】ＭＣＴＰ３９がＭＭＳＥＴの活性に与える影響を示す。
【図２４】ＭＣＴＰ３９が、Ｈ３Ｋのメチル化、ならびに癌細胞の増殖および浸潤に与える影響を示す。
【図２５】ＭＣＴＰ３９が転座陽性ＭＭ細胞株に対して特異性を示すことを示す。
【図２６】ＭＣＴＰ３９が、異種移植腫瘍の腫瘍量を減少させることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
定義
本発明を理解しやすくするために、いくつかの用語および表現を以下の通り定義する。
【００２１】
本明細書において使用される場合、「ＭＭＳＥＴの少なくとも１つの生物学的活性を阻害する」という用語は、ＭＭＳＥＴタンパク質に直接接触するか、ＭＭＳＥＴのｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡに接触するか、ＭＭＳＥＴのポリペプチドの立体構造的変化を引き起こすか、ＭＭＳＥＴのタンパク質レベルを低下させるか、またはシグナルパートナーとのＭＭＳＥＴの相互作用に干渉して、ＭＭＳＥＴ標的遺伝子の発現に影響を与えることにより、ＭＭＳＥＴのあらゆる活性（例えば、これに限定されないが、本明細書に記載される活性を含む）を低下させる任意の薬剤を指す。また、阻害剤は、上流または下流のシグナル分子を妨害することによってＭＭＳＥＴの生物学的活性を間接的に制御する分子も含む。
【００２２】
本明細書において使用される場合、「対象」とは、これらに限定されないが、特定の治療のレシピエントとなる、ヒト、ヒト以外の霊長類、げっ歯類等を含むあらゆる動物（例えば、哺乳動物）を指す。典型的には、「対象」および「患者」という用語は、本明細書においてヒト対象を指して交換可能に用いられる。
【００２３】
本明細書において使用される場合、「癌マーカー遺伝子」という用語は、その発現レベルが、単独でまたは他の遺伝子と合わさって、癌または癌の予後と相関する遺伝子を指す。相関性は、遺伝子発現の低下または増加のいずれかに関する可能性がある。例えば、遺伝子の発現は、癌の予兆であり得るか、または遺伝子の発現不足は、癌患者の予後不良と相関する可能性がある。いくつかの実施形態において、癌マーカー遺伝子は、抗癌剤の標的としての役割を果たす。いくつかの実施形態において、癌マーカー遺伝子は、癌の悪性度（例えば、侵襲性）の指標としての役割を果たす。
【００２４】
本明細書において使用される場合、「癌と診断された対象」という用語は、検査を受け、癌性細胞を有することが発見された対象を指す。癌は、これらに限定されないが、生検、Ｘ線、血液検査、および本発明の診断法を含むいずれの好適な方法を用いて診断されてもよい。
【００２５】
本明細書において使用される場合、「ヒト以外の動物」という用語は、これらに限定されないが、げっ歯類、ヒト以外の霊長類、ヒツジ、ウシ、反芻動物、ウサギ、ブタ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、鳥類等の、脊椎動物を含む全てのヒト以外の動物を指す。
【００２６】
本明細書において使用される場合、「遺伝子導入システム」という用語は、核酸配列を含む組成物を細胞または組織に送達する任意の手段を指す。例えば、遺伝子導入システムは、これらに限定されないが、ベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、および他の核酸ベースの送達システム）、裸の核酸の微量注入、ポリマーベースの送達システム（例えば、リポソームベースおよび金属粒子ベースのシステム）、バイオリスティック注入等を含む。本明細書において使用される場合、「ウイルス遺伝子導入システム」という用語は、所望の細胞または組織への試料の送達を促進するためのウイルス要素（例えば、無傷のウイルス、変化したウイルス、および核酸またはタンパク質等のウイルス成分）を含む遺伝子導入システムを指す。本明細書において使用される場合、「アデノウイルス遺伝子導入システム」という用語は、アデノウイルス科に属する無傷のウイルスまたは変化したウイルスを含む遺伝子導入システムを指す。
【００２７】
本明細書において使用される場合、「核酸分子」という用語は、これに限定されないが、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む、任意の核酸含有分子を指す。この用語は、これらに限定されないが、４−アセチルシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、シュードイソシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルシュードウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５´−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、オキシブトキソシン、シュードウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、シュードウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、および２，６−ジアミノプリンを含む、ＤＮＡおよびＲＮＡの既知の塩基類似体のうちのいずれかを含む配列を包含する。
【００２８】
「遺伝子」という用語は、ポリペプチド、前駆体、またはＲＮＡ（例えば、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ）の生成に必要なコード配列を含む核酸（例えば、ＤＮＡ）配列を指す。全長または断片の所望の活性または機能特性（例えば、酵素活性、リガンド結合、シグナル伝達、免疫原性等）が保持される限り、ポリペプチドは、全長コード配列、またはコード配列の任意の部分によってコード化することができる。また、この用語は、構造遺伝子のコード領域、ならびに、遺伝子が全長ｍＲＮＡの長さに対応するように、いずれかの末端に約１ｋｂ以上の距離で５´および３´末端の両方のコード領域に隣接して位置する配列も包含する。コード領域の５´に位置し、かつｍＲＮＡ上に存在する配列は、５´非翻訳配列と称される。コード領域の３´または下流に位置し、かつｍＲＮＡ上に存在する配列は、３´非翻訳配列と称される。「遺伝子」という用語は、遺伝子のｃＤＮＡおよびゲノム形態の両方を包含する。遺伝子のゲノム形態またはクローンは、「イントロン」または「介在領域」または「介在配列」と称される非コード配列によって分断されるコード領域を含む。イントロンは、核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）に転写される遺伝子のセグメントであり、イントロンは、エンハンサー等の制御要素を含み得る。イントロンは、核転写物または一次転写物から除去されるか、または「スプライシングで切り出され」、したがって、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写物には含まれない。ｍＲＮＡは、翻訳の間に、新生ポリペプチドにおけるアミノ酸の配列または順序を特定するよう機能する。
【００２９】
本明細書において使用される場合、「遺伝子発現」という用語は、遺伝子内でコードされた遺伝子情報を、遺伝子の「転写」により（すなわち、ＲＮＡポリメラーゼの酵素作用を介して）ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ）に変換するプロセス、またタンパク質コード遺伝子の場合には、ｍＲＮＡの「翻訳」によってタンパク質に変換するプロセスを指す。遺伝子発現は、プロセスにおける多くの段階で制御することができる。「上方制御」または「活性化」は、遺伝子発現産物（すなわち、ＲＮＡまたはタンパク質）の生成を増加させる制御を指し、「下方制御」または「抑制」とは、生成を低下させる制御を指す。上方制御または下方制御に関与する分子（例えば、転写因子）は、それぞれ「活性化因子」および「抑制因子」と称されることが多い。
【００３０】
イントロンを含むことの他に、遺伝子のゲノム形態は、ＲＮＡ転写物上に存在する配列の５’末端および３’末端の両方に位置する配列も含み得る。これらの配列は、「フランキング」配列または領域と称される（これらのフランキング配列は、ｍＲＮＡ転写物上に存在する非翻訳配列の５’または３’に位置する）。５’フランキング領域は、遺伝子の転写を制御するかまたはそれに影響を与えるプロモーターおよびエンハンサー等の制御配列を含み得る。３’フランキング領域は、転写の終了、転写後切断、およびポリアデニル化を指示する配列を含み得る。
【００３１】
「野生型」という用語は、天然の発生源から単離された遺伝子または遺伝子産物を指す。野生型遺伝子は、集団において最も頻繁に観察される遺伝子であり、したがって、任意に設計される「正常な」または「野生型」の遺伝子の形態である。反対に、「修飾された」または「変異体」という用語は、野生型遺伝子または遺伝子産物と比較した場合に、配列または機能特性における修飾（すなわち、変化した特徴）を示す遺伝子または遺伝子産物を指す。天然に発生する変異体を単離することができることに留意されたい；これらは、野生型遺伝子または遺伝子産物と比較した場合に、変化した特徴（核酸配列の変化）を有するという事実によって同定される。
【００３２】
本明細書において使用される場合、「〜をコードする核酸分子」、「〜をコードするＤＮＡ配列」、および「〜をコードするＤＮＡ」という用語は、デオキシリボ核酸の鎖に沿ったデオキシリボヌクレオチドの順序または配列を指す。これらのデオキシリボヌクレオチドの順序は、ポリペプチド（タンパク質）鎖に沿ったアミノ酸の順序を決定する。したがって、ＤＮＡ配列は、アミノ酸配列をコードする。
【００３３】
本明細書において使用される場合、「オリゴヌクレオチド」という用語は、１本鎖ポリヌクレオチド鎖の長さの短いものを指す。オリゴヌクレオチドは、典型的には２００残基長未満（例えば、１５〜１００）であるが、本明細書において使用される場合、この用語は、より長いポリヌクレオチド鎖を包含することも意図する。オリゴヌクレオチドは、その長さで称されることが多い。例えば、２４残基のオリゴヌクレオチドは、「２４塩基長」と称される。オリゴヌクレオチドは、自己ハイブリダイズすることによって、または他のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることによって、２次および３次構造を形成することができる。そのような構造は、これらに限定されないが、２本鎖、ヘアピン、十字型、屈曲型、および３本鎖を含むことができる。
【００３４】
本明細書において使用される場合、「相補的」または「相補性」という用語は、塩基対合規則によって関連付けられるポリヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチドの配列）に関連して使用される。例えば、配列「５’−Ａ−Ｇ−Ｔ−３’」は、配列「３’−Ｔ−Ｃ−Ａ−５’」に相補的である。相補性は「部分的」であってもよく、その場合、核酸の塩基の一部のみが塩基対合規則に従ってマッチする。または、核酸間には「完全」または「全」相補性が存在してもよい。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率および強度に著しい影響を有する。このことは、増幅反応、および核酸間の結合に依存する検出方法において、特に重要である。
【００３５】
「相同性」という用語は、相補性の程度を指す。部分相同性および完全相同性（すなわち同一性）が存在し得る。部分的に相補的な配列は、完全に相補的な核酸分子が「実質的に相同」である標的核酸にハイブリダイズするのを少なくとも一部阻害する核酸分子である。完全に相補的な配列の標的配列へのハイブリダイゼーションを阻害することは、低ストリンジェンシー条件下でのハイブリダイゼーションアッセイ（サザンまたはノーザンブロット法、溶液ハイブリダイゼーション等）を用いて調べることができる。実質的に相同である配列またはプローブは、低ストリンジェンシー条件下における完全に相同な核酸分子の標的への結合（すなわち、ハイブリダイゼーション）と競合しかつそれを阻害する。これは、低ストリンジェンシー条件が非特異的結合を可能にするような条件であることを意味するものではない：低ストリンジェンシー条件は、２つの配列の互いへの結合が特定の（すなわち選択的な）相互作用であることを必要とする。非特異的結合が存在しないことは、実質的に非相補的（例えば、同一性が約３０％未満）である第２の標的の使用によって検査することができ、非特異的結合が存在しない場合、プローブは、第２の非相補的な標的にハイブリダイズしない。
【００３６】
ｃＤＮＡまたはゲノムクローン等の２本鎖核酸配列に関連して使用される場合、「実質的に相同である」という用語は、上述のような低ストリンジェンシー条件下で２本鎖核酸配列の一方または両方の鎖にハイブリダイズできる任意のプローブを指す。
【００３７】
遺伝子は、一次ＲＮＡ転写物の差次的スプライシングによって生成される複数のＲＮＡ種を生成し得る。同じ遺伝子のスプライス変異体であるｃＤＮＡは、配列同一性または完全相同性の領域（同じエクソンまたは両ｃＤＮＡ上の同一エクソンの一部の存在を表す）および完全非同一性の領域（例えば、ｃＤＮＡ１上にエクソン「Ａ」の存在を示し、代わりにｃＤＮＡ２はエクソン「Ｂ」を含む）を有する。２つのｃＤＮＡが配列同一性の領域を含むため、これらはどちらも、遺伝子全体または両方のｃＤＮＡに見られる配列を含む遺伝子の一部に由来するプローブにハイブリダイズする：２つのスプライス変異体は、このようなプローブに対しておよび互いに実質的に相同である。
【００３８】
本明細書において使用される場合、「ハイブリダイゼーション」という用語は、相補的な核酸の対合に関連して用いられる。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの強度（すなわち核酸間の会合の強度）は、核酸間の相補性の程度、関連条件のストリンジェンシー、形成されるハイブリッドのＴｍ、および核酸内のＧ：Ｃ比等の要因によって影響を受ける。その構造内に相補的な核酸の対を含む単一分子は、「自己ハイブリダイズ」していると言われる。
【００３９】
本明細書において使用される場合、「Ｔｍ」という用語は、「融解温度」に関連して用いられる。融解温度は、２本鎖核酸分子の集団が半分融解して一本鎖になる温度である。核酸のＴｍを算出するための方程式は、当該技術分野において周知である。標準的な参考文献によって示されるように、核酸が１Ｍ ＮａＣｌの水溶液中にある場合、Ｔｍ値の単純推定値は、方程式Ｔｍ＝８１．５＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）によって算出することができる（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ，Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｆｉｌｔｅｒ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ， ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ［１９８５］を参照のこと）。他の参考文献は、Ｔｍの算出のために構造的および配列的特性を考慮に入れたより複雑な計算を含む。
【００４０】
本明細書において使用される場合、「ストリンジェンシー」という用語は、核酸ハイブリダイゼーションが行われる温度、イオン強度、および有機溶媒等の他の化合物の存在といった条件に関連して使用される。「低ストリンジェンシー条件」下において、対象とする核酸配列は、その完全な補体、単一の塩基ミスマッチを有する配列、密接に関連する配列（例えば、９０％以上の相同性を有する配列）、および部分的な相同性のみを有する配列（例えば、５０〜９０％の相同性を有する配列）とハイブリダイズする。「中程度のストリンジェンシー条件」下において、対象とする核酸配列は、その完全な補体、単一の塩基ミスマッチを有する配列、および密接に関連する配列（例えば、９０％以上の相同性）とのみハイブリダイズする。「高ストリンジェンシー条件」下において、対象とする核酸配列は、その完全な補体、および（温度等の条件に依存して）単一の塩基ミスマッチを有する配列とのみハイブリダイズする。換言すると、高ストリンジェンシーの条件下では、単一の塩基ミスマッチを有する配列とのハイブリダイゼーションを排除するために温度を上昇させることができる。
【００４１】
ヌクレオチド配列に関連して本明細書において使用される「一部」という用語（「所与のヌクレオチド配列の一部」のように）は、その配列の断片を指す。断片は、４ヌクレオチド〜全ヌクレオチド配列から１ヌクレオチドを差し引いた範囲のサイズであり得る（１０ヌクレオチド、２０、３０、４０、５０、１００、２００等）。
【００４２】
本明細書において使用される場合、「ベクター」という用語は、１つの細胞から別の細胞にＤＮＡセグメント（複数可）を移す核酸分子に関連して用いられる。「ビヒクル」という用語が、「ベクター」と交換可能に用いられることがある。ベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、または植物性もしくは動物性ウイルスに由来することが多い。
【００４３】
本明細書において使用される「発現ベクター」という用語は、所望のコード配列および特定の宿主生物において操作可能に連結されたコード配列の発現に必要な、適切な核酸配列を含む組換えＤＮＡ分子を指す。通常、原核生物における発現に必要な核酸配列は、多くの場合は他の配列に沿って、プロモーター、オペレーター（任意選択的）、およびリボソーム結合部位を含む。真核生物細胞は、プロモーター、エンハンサー、ならびに終止およびポリアデニル化シグナルを利用することが分かっている。
【００４４】
「過剰発現」および「過剰発現する」という用語ならび文法上の均等物は、対照または非トランスジェニック動物における所与の組織に観察されるよりも約３倍高い（またはそれを上回る）発現のレベルを意味するためにｍＲＮＡのレベルに関連して用いられる。ｍＲＮＡのレベルは、これに限定されないがノーザンブロット分析を含む当業者に既知の多くの技術のうちのいずれかを用いて測定される。分析される各組織からローディングされたＲＮＡの量の違いと照合するために、ノーザンブロットに適切な対照が含まれる（例えば、各試料中に存在する、全ての組織中に本質的に同じ量で存在する豊富なＲＮＡ転写物である２８ＳのｒＲＮＡの量を、ノーザンブロット上で観察されるｍＲＮＡ特異的シグナルを正規化または標準化するための手段として用いることができる）。正しくスプライスされた導入遺伝子のＲＮＡに大きさが対応するバンドに存在するｍＲＮＡの量を定量化する：導入遺伝子のプローブとハイブリダイズする他の微量なＲＮＡ種は、導入遺伝子のｍＲＮＡの発現の定量化においては考慮されない。
【００４５】
本明細書で使用される「トランスフェクション」という用語は、真核生物細胞への外来性ＤＮＡの導入を指す。トランスフェクションは、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈降、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、ポリブレン媒介性トランスフェクション、電気穿孔、マイクロインジェクション、リポソーム融合、リポフェクション、プロトプラスト融合、レトロウイルス感染、および微粒子銃を含む、当該技術分野で既知の様々な手段によって達成することができる。
【００４６】
「安定したトランスフェクション」または「安定にトランスフェクトされた」という用語は、トランスフェクトされた細胞のゲノムへの外来性ＤＮＡの導入および組込みを指す。「安定したトランスフェクタント」という用語は、外来性ＤＮＡがゲノムＤＮＡに安定に組み込まれた細胞を指す。
【００４７】
「一過性のトランスフェクション」または「一過性にトランスフェクトされた」という用語は、トランスフェクトされた細胞のゲノムに外来性ＤＮＡが組み込むことができない場合の、外来性ＤＮＡの細胞への導入を指す。外来性ＤＮＡは、トランスフェクトされた細胞の核に数日間留まる。この間、外来性ＤＮＡは、染色体において内因性遺伝子の発現を司る調節制御を受ける。「一過性のトランスフェクタント」という用語は、外来性ＤＮＡを取り込んだが、このＤＮＡを組み込むことができなかった細胞を指す。
【００４８】
本明細書において使用される場合、「細胞培養物」という用語は、任意のインビトロ細胞の培養物を指す。この用語には、連続細胞系（例えば、不死化表現型を有する）、初代細胞培養物、形質転換細胞系、有限細胞系（例えば、非形質転換細胞）、およびインビトロで維持される任意の他の細胞集団が含まれる。
【００４９】
使用される場合、「真核生物」という用語は、「原核生物」と区別可能な生物を指す。この用語は、通常の真核生物の特徴、例えば、その中に染色体が存在する、核膜によって仕切られた真核の存在、膜結合細胞小器官の存在、および真核生物において一般的に観察される他の特徴を示す細胞を有する全ての生物を包含することが意図される。したがって、この用語は、これらに限定されないが、真菌、原生動物、および動物（例えば、ヒト）等の生物を含む。
【００５０】
本明細書において使用される場合、「インビトロ」という用語は、人工的な環境、および人工的な環境内で起こるプロセスまたは反応を指す。インビトロ環境は、これらに限定されないが、試験管および細胞培養物から構成され得る。「インビボ」という用語は、天然の環境（例えば、動物または細胞）、および天然の環境内で起こるプロセスまたは反応を指す。
【００５１】
「試験化合物」および「候補化合物」という用語は、疾患、疾病、病気もしくは身体機能の障害（例えば、癌）を治療または予防するために用いられる任意の化学物質、医薬品、薬物等を指す。試験化合物は、既知の治療化合物および潜在的な治療化合物の両方を含む。試験化合物は、本発明のスクリーニング法を用いたスクリーニングによって治療効果があるかどうかを判定することができる。本発明のいくつかの実施形態において、試験化合物は、アンチセンス化合物を含む。
【００５２】
本明細書において使用される場合、「試料」という用語は、その最も広義において用いられる。１つの意味において、それは、任意の源から得られた検体または培養物、ならびに生物学的試料および環境試料を含むことを意味する。生物学的試料は、動物（ヒトを含む）から得られてもよく、流体、固体、組織、および気体を包含する。生物学的試料は、血漿、血清等の血液製剤を含む。しかしながら、このような例は、本発明に適用可能な試料の種類を限定するものであると解釈されるべきではない。
【００５３】
「化学部分」という用語は、少なくとも１つの炭素原子を含有む任意の化学化合物を指す。化学部分の例として、これらに限定されないが、芳香族化学部分、硫黄を含む化学部分、窒素を含む化学部分、親水性化学部分、および疎水性化学部分が挙げられる。
【００５４】
本明細書において使用される場合、「脂肪族」という用語は、これらに限定されないが、アルキル、アルケニル、アルキニル、脂環を含む基を意味する。
【００５５】
本明細書において使用される場合、「アリール」という用語は、フェニル環等の単一芳香族環、または２つ以上の芳香族環（例えば、ビスフェニル、ナフタレン、アントラセン）、または芳香族環および１つ以上の非芳香族環を意味する。アリール基は、任意選択的に低級脂肪族基（例えば、アルキル、アルケニル、アルキニル、または脂環）で置換されてもよい。また、脂肪族およびアリール基は、これらに限定されないが、−ＮＨ２、−ＮＨＣＯＣＨ３、−ＯＨ、低級アルコキシ（Ｃ１−Ｃ４）、ハロ（−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、または−Ｉ）を含む１つ以上の官能基でさらに置換されてもよい。
【００５６】
本明細書において使用される場合、「置換脂肪族」という用語は、脂肪族水素原子のうちの少なくとも１つが、例えば、ハロゲン、アミノ、ヒドロキシ、ニトロ、チオ、ケトン、アルデヒド、エステル、アミド、低級脂肪族、置換低級脂肪族、または環（アリール、置換アリール、環状脂肪族、もしくは置換環状脂肪族等）で置換されたアルカン、アルケン、アルキン、または脂環族部分を示す。そのような例として、１−クロロエチル等が挙げられるが、これに限定されない。
【００５７】
本明細書において使用される場合、「置換アリール」という用語は、環炭素上の水素原子のうちの少なくとも１つが、例えば、ハロゲン、アミノ、ヒドロキシ、ニトロ、チオ、ケトン、アルデヒド、エステル、アミド、低級脂肪族、置換低級脂肪族、または環（アリール、置換アリール、環状脂肪族、もしくは置換環状脂肪族）で置換された、芳香族環または少なくとも１つの芳香族環からなる縮合芳香族環系を指す。そのような例として、ヒドロキシフェニル等が挙げられるが、これに限定されない。
【００５８】
本明細書において使用される場合、「環状脂肪族」という用語は、縮合環系を含む脂肪族構造を指す。そのような例として、デカリン等が挙げられるが、これに限定されない。
【００５９】
本明細書において使用される場合、「置換環状脂肪族」という用語は、脂肪族水素原子のうちの少なくとも１つが、ハロゲン、ニトロ、チオ、アミノ、ヒドロキシ、ケトン、アルデヒド、エステル、アミド、低級脂肪族、置換低級脂肪族、または環（アリール、置換アリール、環状脂肪族、もしくは置換環状脂肪族）で置換された環状脂肪族構造を指す。そのような例として、１−クロロデカリル、ビシクロ−ヘプタン、オクタン、およびノナン（例えば、ノルボルニル）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６０】
本明細書において使用される場合、「複素環」という用語は、例えば、１つ以上のヘテロ原子を含む芳香族または非芳香族環を意味する。ヘテロ原子は、互いに同じかまたは異なり得る。ヘテロ原子の例として、これらに限定されないが、窒素、酸素、および硫黄が挙げられる。芳香族および非芳香族複素環は、当該技術分野において周知である。芳香族複素環のいくつかの非限定的な例として、ピリジン、ピリミジン、インドール、プリン、キノリン、およびイソキノリンが挙げられる。非芳香族複素環化合物の非限定的な例として、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン、ピロリジン、およびピラゾリジンが挙げられる。酸素含有複素環の例として、これらに限定されないが、フラン、オキシラン、２Ｈ−ピラン、４Ｈ−ピラン、２Ｈ−クロメン、およびベンゾフランが挙げられる。硫黄含有複素環の例として、これらに限定されないが、チオフェン、ベンゾチオフェン、およびパラチアジンが挙げられる。窒素含有複素環の例としての例として、これらに限定されないが、ピロール、ピロリジン、ピラゾール、ピラゾリジン、イミダゾール、イミダゾリン、イミダゾリジン、ピリジン、ピペリジン、ピラジン、ピペラジン、ピリミジン、インドール、プリン、ベンゾイミダゾール、キノリン、イソキノリン、トリアゾール、およびトリアジンが挙げられる。２つの異なるヘテロ原子を含む複素環の例として、これらに限定されないが、フェノチアジン、モルホリン、パラチアジン、オキサジン、オキサゾール、チアジン、およびチアゾールが挙げられる。複素環は、任意選択的に、脂肪族、ニトロ、アセチル（すなわち、−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ３）、またはアリール基から選択される１つ以上の基でさらに置換されてもよい。
【００６１】
本明細書において使用される場合、「置換複素環」という用語は、環炭素原子のうちの少なくとも１つが、酸素、窒素、または硫黄で置換され、脂肪族水素原子のうちの少なくとも１つが、ハロゲン、ヒドロキシ、チオ、ニトロ、アミノ、ケトン、アルデヒド、エステル、アミド、低級脂肪族、置換低級脂肪族、または環（アリール、置換アリール、環状脂肪族、もしくは置換環状脂肪族）で置換された複素環構造を指す。そのような例として、２−クロロピラニルが挙げられるが、これに限定されない。
【００６２】
本明細書において使用される場合、「リンカー」という用語は、２つの異なる構造部分を接続する最大８個の近接する原子を含む鎖を指し、この場合、そのような原子は、例えば、炭素、窒素、酸素、または硫黄である。エチレングリコールは、１つの非限定的な例である。
【００６３】
本明細書において使用される場合、「低級アルキル置換アミノ」という用語は、最大８個の炭素原子を含み、脂肪族水素原子のうちの１つがアミノ基で置換された、任意のアルキル単位を指す。そのような例として、エチルアミノ等が挙げられるが、これに限定されない。
【００６４】
本明細書において使用される場合「低級アルキル置換ハロゲン」という用語は、最大８個の炭素原子を含み、脂肪族水素原子のうちの１つがハロゲンで置換された、任意のアルキル単位を指す。そのような例として、クロロエチル等が挙げられるが、これに限定されない。
【００６５】
本明細書において使用される場合、「アセチルアミノ」という用語は、アセチル化された任意の一級または二級アミノを意味する。そのような例として、アセトアミド等が挙げられるが、これに限定されない。
【００６６】
本明細書において使用される場合、「水素結合に関与する部分」または「水素結合に関与する化学部分」という用語は、プロトンを受容するかまたは供与し、それによって水素結合を形成する基を意味する。水素結合に関与する部分のいくつかの具体的な非限定的な例として、当技術分野で周知のフルオロ、酸素含有基および窒素含有基が挙げられる。水素結合に関与する酸素含有基のいくつかの例として、以下が挙げられる：ヒドロキシ、低級アルコキシ、低級カルボニル、低級カルボキシル、低級エーテル、およびフェノール基。本明細書で使用される「低級」という修飾語は、それぞれの酸素含有官能基が結合した低級脂肪族基（Ｃ１〜Ｃ４）を指す。このように、例えば、「低級カルボニル」という用語は、とりわけ、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒドを指す。水素結合形成に関与する窒素含有基のいくつかの非限定的な例として、アミノおよびアミド基が挙げられる。さらに、酸素原子および窒素原子の両方を含む基も、水素結合の形成に関与することができる。そのような基の例として、ニトロ、Ｎ−ヒドロキシ、および亜硝酸基が挙げられる。また、本発明における水素結合受容体は、芳香族環のπ電子である可能性もある。
【００６７】
化合物の「誘導体」という用語は、本明細書において使用される場合、化学修飾された化合物を指し、該化学修飾は、化合物の官能基または骨格のいずれかで起こる。そのような誘導体として、これらに限定されないが、アルコール含有化合物のエステル、カルボキシ含有化合物のエステル、アミン含有化合物のアミド、カルボキシ含有化合物のアミド、アミノ含有化合物のイミン、アルデヒド含有化合物のアセタール、カルボニル含有化合物のケタール等が挙げられる。
【００６８】
本明細書において使用される場合、「薬学的に許容される塩」という用語は、対象に投与されると、本発明の化合物またはその活性代謝産物もしくは残渣を提供することができる、本発明の化合物の任意の薬学的に許容される塩（例えば、酸または塩基）を指す。当業者には既知であるように、本発明の化合物の「塩」は、無機または有機の酸および塩基に由来してもよい。酸の例として、これらに限定されないが、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、過塩素酸、フマル酸、マレイン酸、リン酸、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、コハク酸、トルエン−ｐ−スルホン酸、酒石酸、酢酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ギ酸、安息香酸、マロン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、ベンゼンスルホン酸等が挙げられる。シュウ酸等の他の酸は、それら自体は薬学的に許容されないが、本発明の化合物およびそれらの薬学的に許容される酸付加塩を得る際の中間体として有用な塩の調製において用いられてもよい。
【００６９】
塩基の例として、これらに限定されないが、アルカリ金属（例えば、ナトリウム）水酸化物、アルカリ土類金属（例えば、マグネシウム）水酸化物、アンモニア、および式ＮＷ４＋（式中、ＷはＣ１−４アルキル等である）の化合物等が挙げられる。
【００７０】
塩の例として、これらに限定されないが、以下が挙げられる：アセテート、アジペート、アルギネート、アスパルテート、ベンゾエート、ベンゼンスルホネート、ビスルフェート、ブチラート、シトレート、カンフォレート、カンフォスルホネート、シクロペンタンプロピオネート、ジグルコネート、ドデシルスルフェート、エタンスルホネート、フマレート、フルコヘプタノエート、グリセロホスフェート、ヘミスルフェート、ヘプタノエート、ヘキサノエート、ヒドロクロリド、ヒドロブロミド、ヒドロイオダイド、２−ヒドロキシエタンスルホネート、ラクテート、マレアート、メタンスルホネート、２−ナフタレンスルホネート、ニコチネート、オキサレート、パルモアート、ペクチネート、ペルスルフェート、フェニルプロピオネート、ピクレート、ピバレート、プロピオネート、スクシネート、タルトレート、チオシアネート、トシレート、ウンデカノアート等。塩の他の例として、Ｎａ＋、ＮＨ４＋、およびＮＷ４＋（式中、ＷはＣ１−４アルキル基である）等の好適なカチオンと配合した本発明の化合物のアニオン等が挙げられる。
【００７１】
治療上の用途のために、本発明の化合物の塩は、薬学的に許容されることが意図される。しかしながら、薬学的に許容されない酸および塩基の塩も、例えば、薬学的に許容される化合物の調製または精製において用途を見出すことができる。
【００７２】
本明細書において使用される場合、「ｓｉＲＮＡ」という用語は、低分子干渉ＲＮＡを指す。いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡは、約１８〜２５ヌクレオチド長の２本鎖または２本鎖領域を含む：ｓｉＲＮＡは、各鎖の３´末端に約２〜４個の不対ヌクレオチドを含むことが多い。ｓｉＲＮＡの２本鎖または２本鎖領域のうちの少なくとも１つの鎖は、標的ＲＮＡ分子に実質的に相同であるか、または実質的に相補的である。標的ＲＮＡ分子に相補的な鎖は「アンチセンス」鎖であり、標的ＲＮＡ分子に相同的な鎖は「センス」鎖であり、それはｓｉＲＮＡアンチセンス鎖に相補的でもある。また、ｓｉＲＮＡは、付加的な配列を含み得る：そのような配列の非限定的な例として、連結配列またはループ、ならびにステムおよび他の折り畳み構造が挙げられる。ｓｉＲＮＡは、無脊椎動物および脊椎動物においてＲＮＡ干渉を引き起こす際、ならびに植物において転写後遺伝子サイレンシングの間に配列特異的ＲＮＡ分解を引き起こす際に、重要な中間体として機能すると考えられる。
【００７３】
「ＲＮＡ干渉」または「ＲＮＡｉ」という用語は、ｓｉＲＮＡによる遺伝子発現のサイレンシングまたは減少を指す。これは、その２本鎖領域内で、サイレンシングされる遺伝子の配列に相同なｓｉＲＮＡによって開始される、動物および植物における配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングのプロセスである。遺伝子は、その生物に内因性または外来性であり得、染色体に組み込まれて存在するか、またはゲノムに組み込まれていないトランスフェクションベクター中に存在してもよい。遺伝子の発現は、完全にまたは一部阻害される。また、ＲＮＡｉは、標的ＲＮＡの機能を阻害するとも考えられ得、標的ＲＮＡの機能は、完全または部分的であり得る。
【００７４】
本発明は、癌の治療、管理、および／または研究において用途を見出す治療剤に関する。具体的には、本発明は、癌（例えば、前立腺癌、乳癌、他の固形腫瘍、多発性骨髄腫）におけるＭＭＳＥＴの発現を標的とする小分子および核酸に関する。
【００７５】
多発性骨髄腫ＳＥＴドメイン（ＭＭＳＥＴ）（ＦＬＪ２３２８６、ＫＩＡＡ１０９０、ＭＧＣ１７６６３８、ＮＳＤ２、核内ＳＥＴドメイン保有タンパク質２、タンパク質トライソラクス−５、ＲＥＩＩＢＰ、ＴＲＸ５、ＷＨＳ、ウォルフ・ヒルシュホーン症候群候補１タンパク質、ＮＳＤ２、およびＷＨＳＣ１としても知られる）は、ｔ（４；１４）に関連する多発性骨髄腫（ＭＭ）におけるＩｇＨ遺伝子座への融合によって同定され、染色体制御因子内に見られるドメイン（ＳＥＴドメインを含む）を保有する。ＭＭＳＥＴは、ウォルフ・ヒルシュホーン症候群において欠失した、ヒストンメチルトランスフェラーゼである。その基質特異性は異なる。Ｈ３Ｋ３６のジメチル化活性およびＨ３Ｋ３６のトリメチル化活性の両方が報告されている。ＭＭＳＥＴは、そのＨＭＧドメインを介してアンドロゲン受容体（ＡＲ）と相互作用し、受容体媒介性の転写を増強する。ＭＭＳＥＴは、ＨＤＡＣ１およびＨＤＡＣ２、ｍＳｉｎ３ａ、ならびにＬＳＤ１と複合体を形成し、ＭＭ細胞における機能の研究に基づいた細胞周期の正の制御因子である。
【００７６】
本発明の実施形態を開発する過程で実施した実験により、前立腺組織試料（転移性組織を含む）および細胞株中に著しく高いＭＭＳＥＴの発現が同定された（図１、図２、図３、図８）。ＭＭＳＥＴのノックダウンは、転移性前立腺癌細胞株ＤＵ１４５およびＰＣ３の増殖および浸潤の低下をもたらした。ＭＭＳＥＴのノックダウンは、Ｈ３Ｋ３６のジメチル化を特異的に低下させ、Ｅｚｈ２（ｚｅｓｔｅ２のエンハンサー）のノックダウンでも同じ効果を観察することができた（図４）。また、ＭＭＳＥＴノックダウンは、ＤＵ１４５細胞の増殖能および侵襲性（図５）ならびにＰＣ３細胞の侵襲性（図６）も減少させた。ＭＣＴＰ３９とも称されるＮ３９（ＭＭＳＥＴ阻害剤）は、非常に低い濃度でＤＵ１４５細胞事象の増殖および浸潤に影響を与えた（図７）。Ｎ３９は、ＤＵ１４５細胞においてＨ３Ｋ２７のトリメチル化、Ｈ３Ｋ３６のトリメチル化、およびＨ３Ｋ３６のジメチル化を低下させた（図９）。
【００７７】
Ｉ．ＭＭＳＥＴを標的とする癌治療
いくつかの実施形態において、本発明は、癌（例えば、前立腺癌、乳癌、他の固形腫瘍、多発性骨髄腫）の治療を提供する。いくつかの実施形態において、治療は、ＭＭＳＥＴ、ＭＭＳＥＴの制御因子、ＭＭＳＥＴと相互作用するタンパク質、および／またはＭＭＳＥＴの標的（複数可）を標的とする。
【００７８】
Ａ．低分子療法
いくつかの実施形態において、本発明は、ＭＭＳＥＴの発現または活性の低分子阻害剤を提供する。例示的な低分子化合物として、本明細書に記載されるものが挙げられるが（例えば、ＭＣＴＰ３９（３−ヒドラジニルキノキサリン−２−チオール）およびその誘導体）、これに限定されない。
【００７９】
いくつかの実施形態において、これらの化合物は、単独で、または本明細書に記載される追加の治療剤と組み合わせて、ＭＭＳＥＴの阻害に（例えば、癌治療薬として）おいて用途を見出す。
【００８０】
Ｂ．ＲＮＡ干渉およびアンチセンス療法
いくつかの実施形態において、本発明は、ＭＭＳＥＴの発現を標的とする。例えば、いくつかの実施形態において、本発明は、ＭＭＳＥＴをコードする核酸分子の機能を調節し、最終的には発現されるＭＭＳＥＴの量を調節する際に使用するための、オリゴマーアンチセンスまたはＲＮＡｉ化合物、特に、オリゴヌクレオチド（例えば、本明細書に記載されるもの）を含む組成物を用いる。
【００８１】
１． ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）
いくつかの実施形態において、ＭＭＳＥＴタンパク質の機能を阻害するためにＲＮＡｉが用いられる。ＲＮＡｉは、ヒトを含むほとんどの真核生物における外来遺伝子の発現をコントロールするための進化する上で保存された細胞防御を表す。ＲＮＡｉは、典型的には２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって誘導され、ｄｓＲＮＡに応じて相同な１本鎖標的ＲＮＡの配列特異的なｍＲＮＡ分解を引き起こす。ｍＲＮＡ分解の介在物質は、通常、細胞中の酵素切断によって長鎖ｄｓＲＮＡから生成される低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）２本鎖である。ｓｉＲＮＡは、一般に、約２１ヌクレオチド長（例えば２１〜２３ヌクレオチド長）であり、２つのヌクレオチド３’−オーバーハングによって特徴付けられる塩基対構造を有する。低分子ＲＮＡまたはＲＮＡｉの細胞内への導入後、この配列は、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体）と称される酵素複合体に送達されると考えられる。ＲＩＳＣは、標的を認識し、エンドヌクレアーゼで切断する。より大きなＲＮＡ配列が細胞に送達される場合、ＲＮａｓｅＩＩＩ酵素（Ｄｉｃｅｒ）は、より長いｄｓＲＮＡを２１〜２３ｎｔのｄｓ−ｓｉＲＮＡ断片に変換することに留意されたい。
【００８２】
化学的に合成されたｓｉＲＮＡは、培養体細胞における哺乳類の遺伝子機能の全ゲノム的解析のための強力な試薬となっている。遺伝子機能を検証するためのそれらの価値以外にも、ｓｉＲＮＡは、遺伝子特異的治療薬としての大きな可能性も有する（Ｔｕｓｃｈｌ ａｎｄ Ｂｏｒｋｈａｒｄｔ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔ．２００２；２（３）：１５８−６７、参照により本明細書に組み込まれる）。
【００８３】
動物細胞へのｓｉＲＮＡのトランスフェクションは、特定の遺伝子の強力で長期的な転写後サイレンシングをもたらす（Ｃａｐｌｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．２００１；９８：９７４２−７、Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ．２００１；４１１：４９４−８、Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２００１；１５： １８８−２００、およびＥｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．２００１；２０：６８７７−８８、これらは全て、参照により本明細書に組み込まれる）。ｓｉＲＮＡを用いてＲＮＡｉを行うための方法および組成物は、例えば米国特許第６，５０６，５５９号に記載され、参照により本明細書に組み込まれる。
【００８４】
ｓｉＲＮＡは、伸長タンパク質によって、多くの場合は検出不能なレベルまで、標的となるＲＮＡの量を減少させる際に極めて効果的である。サイレンシング効果は、数ヶ月間持続し得、標的ＲＮＡとｓｉＲＮＡの中心領域との間の１つのヌクレオチドミスマッチがサイレンシングを防ぐのに十分であることが多いため、極めて特異的である（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００２；２９６：５５０−３、およびＨｏｌｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００２；３０：１７５７−６６、これらは両方とも、参照により本明細書に組み込まれる）。
【００８５】
ｓｉＲＮＡの設計における重要な要因は、ｓｉＲＮＡ結合のための到達可能な部位の存在である。Ｂａｈｏｉａ ｅｔ ａｌ．，（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００３；２７８：１５９９１−１５９９７、参照により本明細書に組み込まれる）は、効果的なｓｉＲＮＡを設計するためにｍＲＮＡ内の到達可能な部位を見つけるための、走査アレイと称される一種のＤＮＡアレイの使用について記載している。これらのアレイは、物理的バリア（マスク）を使用して、配列に各塩基を段階的に加えることによって合成される、モノマーから特定の最大サイズにまで及ぶオリゴヌクレオチド、通常はコマー（ｃｏｍｅｒ）を含む。したがって、これらのアレイは、標的遺伝子の領域の完全なオリゴヌクレオチド補体を表す。これらのアレイとの標的ｍＲＮＡのハイブリダイゼーションは、標的ｍＲＮＡのこの領域に関する徹底した到達性プロファイルを提供する。そのようなデータは、有効性および標的特異性を保持するためにオリゴヌクレオチド長と結合親和性との間の妥協点に達することが重要であるアンチセンスオリゴヌクレオチド（７塩基長〜２５塩基長の範囲）の設計に有用である（Ｓｏｈａｉｌ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２００１；２９（１０）：２０４１− ２０４５）。ｓｉＲＮＡｓを選択するためのさらなる方法および検討事項は、例えば、国際公開第ＷＯ０５０５４２７０号、第ＷＯ０５０３８０５４Ａ１号、第ＷＯ０３０７０９６６Ａ２号、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００５ Ｍａｙ １３；３４８（４）：８８３−９３，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００５ Ｍａｙ １３；３４８（４）：８７１−８１、およびＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００３ Ａｕｇ １；３１（１５）：４４１７−２４に記載され、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。また、ｓｉＲＮＡを選択する際に使用するためのソフトウェア（例えば、ＭＷＧオンラインｓｉＭＡＸ ｓｉＲＮＡデザインツール）が市販されているかまたは一般に入手可能である。
【００８６】
いくつかの実施形態において、本発明は、平滑末端（例えば、米国特許第２００８０２００４２０号を参照のこと（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる））、オーバーハング（例えば、米国特許第２００８０２６９１４７Ａ１号を参照のこと（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる））、固定核酸（例えば、国際公開第ＷＯ２００８／００６３６９号、第ＷＯ２００８／０４３７５３号、および第ＷＯ２００８／０５１３０６号を参照のこと（それらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））を含むｓｉＲＮＡを用いる。いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡは、遺伝子発現を介して、または細菌を使用して送達される（例えば、Ｘｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２４：６（２００６）および国際公開第ＷＯ０６０６６０４８号を参照、それらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【００８７】
他の実施形態において、ｓｈＲＮＡ法（例えば、第２００８００２５９５８号を参照、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）が用いられる。低分子ヘアピンＲＮＡまたはショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉を介して遺伝子発現をサイレンシングするために使用することができる急なヘアピンカーブを形成するＲＮＡの配列である。ｓｈＲＮＡは、細胞に導入されたベクターを使用し、ｓｈＲＮＡが常に発現されていることを確実にするためにＵ６プロモーターを用いる。このベクターは、通常、娘細胞に継承され、遺伝子サイレンシングが受け継がれることを可能にする。ｓｈＲＮＡヘアピン構造は、細胞機構によってｓｉＲＮＡへと切断され、次いで、ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と結合する。この複合体は、それに結合するｓｉＲＮＡにマッチするｍＲＮＡに結合して切断する。ｓｈＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによって転写される。
【００８８】
好ましい実施形態において、ｓｉＲＮＡベースの治療薬は、後に記載するように薬学的組成物として調剤される。好ましい実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡ組成物の投与は、癌において測定可能な減少（例えば、腫瘍の減少または排除、形質細胞の過剰増殖の減少）をもたらす。
【００８９】
２． アンチセンス
他の実施形態において、ＭＭＳＥＴタンパク質の発現は、ＭＭＳＥＴをコードする１つ以上の核酸と特異的にハイブリダイズするアンチセンス化合物を使用して調節される。オリゴマー化合物のその標的核酸との特異的ハイブリダイゼーションは、核酸の正常な機能を妨げる。特異的にハイブリダイズする化合物によるこの標的核酸の機能の調節は、一般的に「アンチセンス」と称される。妨げられるＤＮＡの機能は、複製および転写を含む。妨げられるＲＮＡの機能は、例えば、タンパク質翻訳部位へのＲＮＡの転座、ＲＮＡからのタンパク質の翻訳、１つ以上のｍＲＮＡ種を生じるようなＲＮＡのスプライシング、およびＲＮＡに関与し得るまたはＲＮＡによって促進され得る触媒活性等の全ての重要な機能を含む。標的核酸の機能に対するこのような干渉の全体的な影響は、ＭＭＳＥＴの発現の調節である。本発明の文脈において、「調節」とは、遺伝子の発現における増大（刺激）または減少（阻害）のいずれかを意味する。例えば、発現は、腫瘍増殖を防ぐために阻害され得る。
【００９０】
アンチセンスに特異的な核酸を標的とすることが好ましい。本発明の文脈において、特定の核酸に対するアンチセンス化合物を「標的化する」ことは、多段階にわたるプロセスである。通常、このプロセスは、機能が調節される核酸配列の同定から始まる。これは、例えば、特定の疾患または病態に関連する細胞遺伝子（もしくは遺伝子から転写されたｍＲＮＡ）、または感染病原体由来の核酸分子であってもよい。本発明において、標的は、ＭＭＳＥＴをコードする核酸分子である。また、標的化プロセスは、所望の効果、例えば、タンパク質の発現の検出または調節がもたらされるようにアンチセンスの相互作用を生じさせるための遺伝子内の１つの部位または複数の部位の特定も含む。本発明の文脈において、好ましい遺伝子内の部位は、遺伝子の翻訳領域（ＯＲＦ）の翻訳開始コドンまたは終止コドンを包含する領域である。翻訳開始コドンは、典型的には５´−ＡＵＧ（転写されたｍＲＮＡ分子において、対応するＤＮＡ分子においては５´−ＡＴＧ）であるため、翻訳開始コドンは「ＡＵＧコドン」、「開始コドン」、または「ＡＵＧ開始コドン」とも称される。少数の遺伝子は、ＲＮＡ配列５´−ＧＵＧ、５´−ＵＵＧまたは５´−ＣＵＧ、および５´−ＡＵＡを有する翻訳開始コドンを有し、５´−ＡＣＧおよび５´−ＣＵＧは、インビボで機能することが分かっている。したがって、各場合において、開始アミノ酸が典型的にはメチオニン（真核生物において）またはホルミルメチオニン（原核生物において）であっても、「翻訳開始コドン」および「開始コドン」という用語は、多くのコドン配列を包含することができる。真核生物および原核生物の遺伝子は、２つ以上の代替の開始コドンを有し得、これらのうちのいずれか１つが、特定の細胞型もしくは組織において、または特定の条件下で、翻訳開始に優先的に用いることができる。本発明の文脈において、「開始コドン」および「翻訳開始コドン」とは、そのようなコドンの配列に関係なく、本発明の腫瘍抗原をコードする遺伝子から転写されたｍＲＮＡの翻訳を開始するためにインビボで使用される１つまたは複数のコドンを指す。
【００９１】
遺伝子の翻訳終止コドン（または「停止コドン」）は、３つの配列（すなわち、５´−ＵＡＡ、５´−ＵＡＧ、および５´−ＵＧＡ、対応するＤＮＡ配列は、それぞれ５´−ＴＡＡ、５´−ＴＡＧ、および５´−ＴＧＡ）のうちの１つを有し得る。「開始コドン領域」および「翻訳開始コドン領域」という用語は、翻訳開始コドンからいずれかの方向（すなわち、５´または３´）に約２５〜約５０個の近接するヌクレオチドを包含するそのようなｍＲＮＡまたは遺伝子の一部分を指す。同様に、「停止コドン領域」および「翻訳終止コドン領域」という用語は、翻訳終止コドンからいずれかの方向（すなわち、５´または３´）に約２５〜約５０個の近接するヌクレオチドを包含するそのようなｍＲＮＡまたは遺伝子の一部分を指す。
【００９２】
翻訳開始コドンと翻訳終止コドンとの間の領域を指す翻訳領域（ＯＲＦ）または「コード領域」とは、効果的に標的とされ得る領域でもある。他の標的領域は、翻訳開始コドンから５´方向にあるｍＲＮＡの部分を意味し、したがって、５´キャップ部位とｍＲＮＡの翻訳開始コドンとの間のヌクレオチドまたは遺伝子上の対応するヌクレオチドを含む５´非翻訳領域（５´ＵＴＲ）と、翻訳終止コドンから３´方向にあるｍＲＮＡの部分を意味し、したがって翻訳終止コドンとｍＲＮＡの３´末端との間のヌクレオチドまたはその遺伝子上の対応するヌクレオチドを含む３´非翻訳領域（３´ＵＴＲ）とを含む。ｍＲＮＡの５´キャップは、ｍＲＮＡの最も５´側の残基に５´−５´トリホスフェート結合を介して結合するＮ７−メチル化グアノシン残基を含む。ｍＲＮＡの５´キャップ領域は、５´キャップ構造自体、およびそのキャップに隣接する第１の５０ヌクレオチドを含むと考えられる。キャップ領域も、好ましい標的領域であり得る。
【００９３】
真核生物のｍＲＮＡ転写物の中には直接的に翻訳されるものもあるが、その多くは、翻訳される前に転写物から切除される「イントロン」として知られる１つ以上の領域を含む。残りの（したがって翻訳された）領域は、「エクソン」として知られ、ともにスプライスされて連続的なｍＲＮＡ配列を形成する。ｍＲＮＡスプライス部位（すなわち、イントロン−エクソン接合部）も、好ましい標的領域であり得、異常なスプライシングが疾患と関連する状況、または特定のｍＲＮＡスプライス産物の過剰生成が疾患と関連している状況において、特に有用である。再配列または欠失による異常な融合接合部も、好ましい標的である。イントロンは、例えば、ＤＮＡまたはプレｍＲＮＡを標的とするアンチセンス化合物の、効果的な、したがって好ましい標的領域であり得ることも分かっている。
【００９４】
いくつかの実施形態において、アンチセンス阻害のための標的部位は、市販のソフトウェアプログラム（例えば、Ｂｉｏｇｎｏｓｔｉｋ、Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ（Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＳｙｓＡｒｒｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｂａｎｇａｌｏｒｅ（Ｉｎｄｉａ）、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｖｅｒｐｏｏｌ（Ｌｉｖｅｒｐｏｏｌ，Ｅｎｇｌａｎｄ）、ＧｅｎｅＴｒｏｖｅ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））を使用して同定される。他の実施形態において、アンチセンス阻害のための標的部位は、国際公開第ＷＯ０１９８５３７Ａ２号に記載される到達可能部位法を用いて同定され、参照により、本明細書に組み込まれる。
【００９５】
一旦、１つ以上の標的部位が同定されると、所望の効果を付与するように、標的に十分相補的な（すなわち、十分に、かつ十分な特異性を持って、ハイブリダイズする）オリゴヌクレオチドが選択される。例えば、本発明の好ましい実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、開始コドンまたその近くを標的とする。
【００９６】
この発明の文脈において、アンチセンス組成物および方法に関する「ハイブリダイゼーション」とは、相補的なヌクレオシドまたはヌクレオチド塩基間でのワトソン−クリック、フーグスティーン、または逆フーグスティーン水素結合等の水素結合を意味する。例えば、アデニンおよびチミンは、水素結合の形成によって対合する相補的な核酸塩基である。標的核酸が特異的にハイブリダイズ可能な核酸であるために、アンチセンス化合物の配列がその標的核酸の配列に１００％相補的である必要はないことを理解されたい。アンチセンス化合物は、標的ＤＮＡまたはＲＮＡ分子への化合物の結合が、標的ＤＮＡまたはＲＮＡの正常な機能を妨げて有用性の損失を引き起こし、アンチセンス化合物の非標的配列への非特異的結合を回避するのに十分な程度の相補性がある場合に、特異的な結合が所望される条件下で（すなわち、インビボアッセイまたは治療処置の場合は生理学的条件下で、またインビトロアッセイの場合は、アッセイが実施される条件下で）、特異的にハイブリダイズ可能である。
【００９７】
アンチセンス化合物は、研究試薬および診断薬として一般的に使用される。例えば、特異性を持って遺伝子発現を阻害することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、特定の遺伝子の機能を解明するために使用することができる。また、アンチセンス化合物は、例えば、種々の生物学的経路の機能を識別するためにも使用される。
【００９８】
アンチセンスの特異性および感度は、治療上の用途にも適用される。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、動物およびヒトにおける病態の治療における治療部分として用いられてきた。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、安全かつ効果的にヒトに投与されてきており、現在、数多くの臨床試験が行われている。したがって、オリゴヌクレオチドは、細胞、組織、および動物、特にヒトの治療のための治療計画において有用であるように構成することができる、有用な治療様式であることが確立されている。
【００９９】
アンチセンスオリゴヌクレオチドがアンチセンス化合物の好ましい形態である一方で、本発明は、これに限定されないが、後に記載するようなオリゴヌクレオチド模倣体を含む他のオリゴマーのアンチセンス化合物を包含する。より長い配列およびより短い配列のどちらも本発明とともに使用され得るが、この発明によるアンチセンス化合物は、好ましくは約８〜約３０個の核酸塩基（すなわち、約８〜約３０個の結合塩基）を含む。特に好ましいアンチセンス化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、さらにより好ましくは、約１２〜約２５の核酸塩基を含む化合物である。
【０１００】
本発明を用いると有用である好ましいアンチセンス化合物の具体例として、修飾された主鎖または非天然ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドが挙げられる。本明細書において定義されるように、修飾された主鎖を有するオリゴヌクレオチドは、主鎖中にリン原子を保持するものおよび主鎖中にリン原子を有さないものを含む。本明細書の目的のために、それらのヌクレオシド主鎖中にリン原子を有さない修飾されたオリゴヌクレオチドも、オリゴヌクレオシドと見なすことができる。
【０１０１】
好ましい修飾されたオリゴヌクレオチド主鎖は、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルおよび他のアルキルホスホネート（３´−アルキレンホスホネートおよびキラルのホスホネートを含む）、ホスフィネート、ホスホロアミデート（３´−アミノホスホロアミデートおよびアミノアルキルホスホロアミデート、チオノホスホロアミデートを含む）、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、および正常な３´−５´結合を有するボラノホスフェート、これらの２´−５´結合類似体、ならびにヌクレオシド単位の隣接する対が結合５´−３´に対しては３´−５´または５´−２´に対しては２´−５´である反転極性を有するものを含む。種々の塩、混合塩類、および遊離酸型も含まれる。
【０１０２】
その中にリン原子を含まない好ましい修飾されたオリゴヌクレオチド主鎖は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間の結合、または１つ以上の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環ヌクレオシド間結合によって形成される主鎖を有する。これらは、モルホリノ結合（ヌクレオシドの糖部分から一部形成される）、シロキサン主鎖、硫化物、スルホキシドおよびスルホン主鎖、ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖、メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖、アルケン含有主鎖、スルファメート主鎖、メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ主鎖、スルホネートおよびスルホンアミド主鎖、アミド主鎖、ならびにＮ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２成分の部分を混合して有する他のものを有するものを含む。
【０１０３】
他の好ましいオリゴヌクレオチド模倣体において、ヌクレオチド単位の糖およびヌクレオシド間結合（すなわち、主鎖）の両方が、新規の基で置換される。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。このようなオリゴマー化合物の１つである、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが分かっているオリゴヌクレオチド模倣体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と称される。ＰＮＡ化合物において、オリゴヌクレオチドの糖−主鎖は、アミドを含む主鎖、特にアミノエチルグリシン主鎖で置換される。核酸塩基は、保持されて、主鎖のアミド部分のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合する。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許として、これらに限定されないが、米国特許第５，５３９，０８２号、第５，７１４，３３１号、および第５，７１９，２６２号が挙げられ、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。ＰＮＡ化合物のさらなる教示は、Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１４９７（１９９１）に見出すことができる。
【０１０４】
本発明の最も好ましい実施形態は、ホスホロチオエート主鎖を有するオリゴヌクレオチドおよびヘテロ原子主鎖を有するオリゴヌクレオシドであり、特に、−−ＣＨ２、−−ＮＨ−−Ｏ−−ＣＨ２−−、−−ＣＨ２−−Ｎ（ＣＨ３）−−Ｏ−−ＣＨ２−−［メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ主鎖として知られる］、−−ＣＨ２−−Ｏ−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２−−、−−ＣＨ２−−Ｎ（ＣＨ３）−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２−−、上述の米国特許第５，４８９，６７７号記載の−−Ｏ−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２−−ＣＨ２−−［式中、未変性のホスホジエステル主鎖は−−Ｏ−−Ｐ−−Ｏ−−ＣＨ２−−で表される］、および上述の米国特許第５，６０２，２４０号記載のアミド主鎖を有するものである。また、上述の米国特許第５，０３４，５０６号記載のモルホリノ主鎖構造を有するオリゴヌクレオチドも好ましい。
【０１０５】
修飾されたオリゴヌクレオチドは、１つ以上の置換された糖部分を有してもよい。好ましいオリゴヌクレオチドは、以下のうちの１つを２´位に有する：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキル（アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、置換または未置換のＣ１―１０アルキルまたはＣ２−Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルであってもよい）。特に好ましいものは、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２であり、式中、ｎおよびｍは１〜約１０である。他の好ましいオリゴヌクレオチドは、以下のうちの１つを２´位に有する：Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリルもしくはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を向上させるための基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を向上させるための基、および同様の特性を有する他の置換基。好ましい修飾は、２´−メトキシエトキシ（２´−Ｏ−−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３であり、２´−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２´−ＭＯＥとしても知られている）（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ７８：４８６［１９９５］）、すなわち、アルコキシアルコキシ基を含む。さらに好ましい修飾は、２´−ＤＭＡＯＥとしても知られる２´−ジメチルアミノオキシエトキシ（すなわち、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基）、および２´−ジメチルアミノエトキシエトキシ（当該技術分野において２´−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチルまたは２´−ＤＭＡＥＯＥとしても知られる）、すなわち、２´−Ｏ−−ＣＨ２−−Ｏ−−ＣＨ２−−Ｎ（ＣＨ２）２を含む。
【０１０６】
他の好ましい修飾は、２´−メトキシ（２´−Ｏ−−ＣＨ３）、２´−アミノプロポキシ（２´−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、および２´−フルオロ（２´−Ｆ）を含む。同様の修飾が、オリゴヌクレオチド上の他の位置、特に３´末端ヌクレオチドまたは２´−５´結合オリゴヌクレオチド上の糖の３´位、および５´末端ヌクレオチドの５´位にも形成され得る。また、オリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分等の糖模倣体を有していてもよい。
【０１０７】
また、オリゴヌクレオチドは、核酸塩基（当該技術分野において、単純に「塩基」と称されることが多い）の修飾または置換を含んでもよい。本明細書において使用される場合、「未修飾の」または「天然の」核酸塩基は、プリン塩基アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）を含む。修飾された核酸塩基は、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシン、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ（特に５−ブロモ）、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニン、ならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニン等の、他の合成および天然の核酸塩基を含む。さらなる核酸塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されるものを含む。これらの核酸塩基のうちのいくつかは、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を高めるために特に有用である。それらは、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、および５−プロピニルシトシンを含む、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびにＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリンを含む。５−メチルシトシン置換は、０．６〜１．２℃で核酸２本鎖の安定性を増加させることが分かっており、現在のところ好ましい塩基置換であり、特に、２´−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わせた場合により一層好ましい。
【０１０８】
本発明のオリゴヌクレオチドの別の修飾は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞内分布、または細胞内取り込みを増強する１つ以上の部分またはコンジュゲートのオリゴヌクレオチドへの化学的結合に関与する。そのような部分は、これらに限定されないが、脂質部分、例えば、コレステロール部分、コール酸、チオエーテル、（例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール）、チオコレステロール、脂肪族鎖、（例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基）、リン脂質、（例えば、ジヘキサデシル−ｒａｃ‐グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ‐グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート）、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖、またはアダマンタン酢酸、パルミチル部分、あるいはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分を含む。
【０１０９】
関連技術分野の当業者は、上記修飾を含むオリゴヌクレオチドの生成の仕方を十分に分かっている。本発明は、上述のアンチセンスオリゴヌクレオチドに限定されるものではない。任意の好適な修飾または置換が用いられ得る。
【０１１０】
所与の化合物におけるすべての位置が均一に修飾される必要はなく、実際、上記修飾のうちの１つ以上が、オリゴヌクレオチド内の単一化合物または単一ヌクレオシドにさえも組み込まれ得る。本発明は、キメラ化合物であるアンチセンス化合物も包含する。本発明の文脈において「キメラ」アンチセンス化合物または「キメラ」は、アンチセンス化合物であり、特に、各々が少なくとも１つのモノマー単位（すなわち、オリゴヌクレオチド化合物の場合はヌクレオチド）からなる、化学的に異なる２つ以上の領域を含むオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは、典型的には、ヌクレアーゼ分解に対する耐性の増加、細胞内取り込みの増加、および／または標的核酸に対する結合親和性の増大をヌクレオチドに付与するようにオリゴヌクレオチドが修飾された、少なくとも１つの領域を含む。オリゴヌクレオチドのさらなる領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断することができる酵素の基質としての役割を果たし得る。例として、ＲＮａｓｅＨは、ＲＮＡ：ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞内エンドヌクレアーゼである。したがって、ＲＮａｓｅＨの活性化は、ＲＮＡ標的の切断を生じ、それによって遺伝子発現のオリゴヌクレオチド阻害の効率を大幅に高める。その結果、同じ標的領域にハイブリッド形成するホスホロチオエートデオキシオリゴヌクレオチドと比べて、キメラオリゴヌクレオチドを用いた場合、より短い鎖のオリゴヌクレオチドで同程度の結果が得られることが多い。ＲＮＡ標的の切断は、ゲル電気泳動によって、また必要に応じて、当該技術分野において既知である関連する核酸ハイブリダイゼーション技法によって、ルーチン的に検出することができる。
【０１１１】
本発明のキメラアンチセンス化合物は、２つ以上のオリゴヌクレオチド、修飾されたオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシドおよび／または上述のようなオリゴヌクレオチド模倣体の複合構造として形成され得る。
【０１１２】
本発明は、以下に記載する本発明のアンチセンス化合物を含む薬学的組成物および製剤も含む。
【０１１３】
Ｃ．遺伝子療法
本発明は、ＭＭＳＥＴの発現を操作する際に使用するための任意の遺伝子操作の使用を企図する。遺伝子操作の例として、これらに限定されないが、遺伝子ノックアウト（例として、例えば組換えを用いて、染色体からＭＭＳＥＴ遺伝子を除去する）、誘導性プロモーターを含む／含まないアンチセンスコンストラクトの発現等が挙げられる。インビトロまたはインビボでの核酸コンストラクトの細胞への送達は、任意の好適な方法を用いて実施され得る。好適な方法とは、所望の事象（例えば、アンチセンスコンストラクトの発現）が起こるように核酸コンストラクトを細胞に導入する方法である。また、遺伝子療法は、（例えば、誘導性プロモーター（例えば、アンドロゲン応答性プロモーター）による刺激の際に）インビボで発現されるｓｉＲＮＡまたは他の干渉する分子を送達するためにも用いられ得る。
【０１１４】
遺伝子情報を保有する分子の細胞内への導入は、これらに限定されないが、裸のＤＮＡコンストラクトの直接注入、該コンストラクトを添加した金粒子を用いた打ち込み、および例えば、リポソーム、生体高分子等を用いた、巨大分子の介在による遺伝子導入等を含む種々の方法のうちのいずれかによって達成される。好ましい方法は、これらに限定されないが、アデノウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、およびアデノ随伴ウイルス等の、ウイルス由来の遺伝子送達ビヒクルを用いる。レトロウイルスと比較すると効率がより高いため、アデノウイルス由来のベクターは、核酸分子をインビボで宿主細胞に導入するための好ましい遺伝子送達ビヒクルである。アデノウイルスベクターは、動物モデルにおける様々な固形腫瘍および免疫欠乏マウスにおけるヒト固形腫瘍異種移植片に、非常に効率的なインビボ遺伝子導入を提供することが分かっている。遺伝子導入のためのアデノウイルスベクターおよび方法の例は、国際公開第ＷＯ００／１２７３８号および第ＷＯ００／０９６７５号、ならびに米国特許出願第６，０３３，９０８号、第６，０１９，９７８号、第６，００１，５５７号、第５，９９４，１３２号、第５，９９４，１２８号、第５，９９４，１０６号、第５，９８１，２２５号、第５，８８５，８０８号、第５，８７２，１５４号、第５，８３０，７３０号、および第５，８２４，５４４号に記載され、それらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１１５】
ベクターは、様々な方法において対象に投与され得る。例えば、本発明のいくつかの実施形態において、ベクターは、直接注射を用いて、腫瘍または腫瘍を伴う組織に投与される。他の実施形態において、投与は、血液またはリンパ循環を介する（例えば、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる国際公開第９９／０２６８５号を参照）。アデノウイルスベクターの例示的な投与レベルは、好ましくは灌流液に添加された１０８〜１０１１のベクター粒子である。
【０１１６】
Ｄ．抗体療法
いくつかの実施形態において、本発明は、ＭＭＳＥＴを発現する腫瘍または細胞（例えば、前立腺腫瘍、乳癌腫瘍、形質細胞）を標的とする抗体を提供する。任意の好適な抗体（例えば、モノクローナル、ポリクローナル、または合成）が、本明細書に開示される治療法に用いられ得る。好ましい実施形態において、癌治療に使用される抗体は、ヒト化抗体である。抗体をヒト化するための方法は、当該技術分野において周知である（例えば、米国特許第６，１８０，３７０号、第５，５８５，０８９号、第６，０５４，２９７号、および第５，５６５，３３２号を参照のこと、それらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、治療抗体は、ＭＭＳＥＴに対して産生される抗体を含み、該抗体は、細胞毒性薬物とコンジュゲートされる。そのような実施形態において、正常細胞を標的としない腫瘍特異的治療剤が生成され、したがって、従来の化学療法の有害な副作用の多くを軽減する。特定の用途の場合、治療剤は、抗体への付加に有用な薬剤としての役割を果たす薬理学的薬剤であり、特に、内皮細胞を死滅させるか増殖または細胞分割を抑制する能力を有する細胞毒性またはさもなければ抗細胞剤（ａｎｔｉｃｅｌｌｕｌａｒ ａｇｅｎｔ）であることが構想される。本発明は、抗体にコンジュゲートし、活性型で送達される、任意の薬理学的薬剤の使用を企図する。例示的な抗細胞剤として、化学療法剤、放射性同位元素、および細胞毒が挙げられる。本発明の治療抗体は、これらに限定されないが、例えば放射性同位元素（例えば、ヨウ素−１３１、ヨウ素−１２３、テクニシウム−９９ｍ、インジウム−１１１、レニウム−１８８、レニウム−１８６、ガリウム−６７、銅−６７、イットリウム−９０、ヨウ素−１２５、またはアスタチン−２１１）、ステロイド等のホルモン、シトシン等の代謝拮抗剤（例えば、アラビノシド、フルオロウラシル、メトトレキサート、またはアミノプテリン；アントラサイクリン；マイトマイシンＣ）、ビンカアルカロイド（例えば、デモコルチン、エトポシド、ミトラマイシン）、およびクロラムブシルまたはメルファラン等の抗腫瘍アルキル化剤を含む、様々な細胞毒性部分を含んでもよい。他の実施形態は、血液凝固剤、サイトカイン、増殖因子、細菌性内毒素、または細菌性内毒素の脂質Ａ部分等の薬剤を含む。例えば、いくつかの実施形態において、数個の例を挙げると、治療薬剤として、Ａ鎖毒素、リボソーム失活性タンパク質、αサルシン、アスペルギリン、レストリクトシン、リボヌクレアーゼ、ジフテリア毒素、またはシュードモナス外毒素等の、植物、真菌、または細菌由来の毒素が挙げられる。いくつかの好ましい実施形態において、脱グリコシル化リシンＡ鎖が用いられる。
【０１１８】
いずれの場合においても、それらのような薬剤は、所望の場合、既知のコンジュゲーション技術を用いて、必要に応じて、標的とされる腫瘍細胞の部位での標的化、内部移行、血液成分に対する遊離または提示を可能にする様式で、抗体と良好にコンジュゲートさせることができることが提唱されている（例えば、Ｇｈｏｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，９３：２８０［１９８３］を参照）。
【０１１９】
例えば、いくつかの実施形態において、本発明は、ＭＭＳＥＴを標的とする免疫毒素を提供する。免疫毒素は、典型的には腫瘍指向性の抗体または断片である特異的標的薬剤の毒素部分等の細胞毒性薬とのコンジュゲートである。標的化薬剤は、標的とされる抗原を保持する細胞に毒素を誘導し、それによって選択的に該細胞を死滅させる。いくつかの実施形態において、治療抗体は、高いインビボ安定性を提供する架橋剤を用いる（Ｔｈｏｒｐｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，４８：６３９６［１９８８］）。
【０１２０】
特に固形腫瘍の治療に関与する他の実施形態において、抗体は、血管内皮細胞の増殖または細胞分裂を抑制することによって、腫瘍脈管構造に対して細胞毒性またはさもなければ抗細胞効果を有するように設計される。この攻撃は、腫瘍細胞、特に脈管構造の遠位の腫瘍細胞から、酸素および栄養分を奪い、最終的には細胞死および腫瘍壊死をもたらす、腫瘍に局在化する血管崩壊を引き起こすことを意図する。
【０１２１】
好ましい実施形態において、抗体ベースの治療薬は、後に記載するように薬学的組成物として調剤される。好ましい実施形態において、本発明の抗体組成物の投与は、癌において測定可能な減少（例えば、腫瘍の減少または排除、形質細胞の過剰増殖の減少）をもたらす。
【０１２２】
Ｅ．薬学的組成物
化合物は、好ましくは好適な薬学的担体と組み合わせて治療用途に用いられる。そのような組成物は、有効量の化合物、および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む。製剤は、投与の様式に適合するように作製される。薬学的に許容される担体は、投与される特定の組成物によってある程度決定され、また該組成物を投与するために用いられる特定の様式によっても決定される。したがって、核酸を含む薬学的組成物の多種多様な好適な製剤があり、そのうちのいくつかは本明細書に記載される。
【０１２３】
ｍｉＲＮＡ治療薬の使用に関して、当業者は、インビボで投与された核酸が取り込まれ、細胞および組織に分配されることを理解する（Ｈｕａｎｇ， ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳＬｅｔｔ．５５８（ｌ−３）：６９−７３（２００４））。例えば、Ｎｙｃｅらは、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）が吸入されると、内因性界面活性剤（肺細胞によって生成される脂質）に結合し、さらなる担体脂質を必要とせずに肺細胞によって取り込まれることを示した（Ｎｙｃｅ ａｎｄ Ｍｅｔｚｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ，３８５：７２１−７２５（１９９７）。小さな核酸は、Ｔ２４膀胱癌組織の培養細胞に容易に取り込まれる（Ｍａ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．８：４１５−４２６（１９９８）。ｓｉＲＮＡは、全身投与による内因性遺伝子の治療的サイレンシングに用いられてきた（Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４３２，１７３−１７８（２００４））。
【０１２４】
化合物は、好適な薬学的担体中の、局所的、局部的、または全身的な投与のための製剤中に存在してもよい。Ｅ．Ｗ．ＭａｒｔｉｎによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ´ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｍａｒｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９７５）は、典型的な担体および調製方法を開示している。また、化合物は、細胞を標的化するための生分解性もしくは非生分解性のポリマーまたはタンパク質またはリポソームで形成される好適な生体適合性マイクロカプセル、微粒子、またはマイクロスフェア中に封入されてもよい。そのようなシステムは、当業者には周知であり、適切な核酸とともに使用するために最適化することができる。
【０１２５】
核酸送達のための種々の方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ ＹｏｒｋおよびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されている。そのような核酸送達システムは、限定ではなく例として、「裸の核酸」として「裸」の形態で、または陽イオン性分子もしくはリポソームを形成する脂質との複合体中等の送達に好適なビヒクルに配合されて、またはベクターの成分として、または薬学的組成物の成分としてのいずれかで、所望の核酸を含む。核酸送達系は、それを細胞と接触させることによって等、直接的に、またはいずれかの生物学的プロセスの作用を通して等、間接的に細胞に提供することができる。限定ではなく例として、エンドサイトーシス、受容体標的化、天然または合成の細胞膜断片との結合、エレクトロポーレーション等の物理的手段、核酸送達システムのポリマー担体（例えば、制御放出フィルムまたはナノ粒子もしくは微粒子等）との組み合わせ、ベクターの使用、細胞を取り囲む組織または流体への核酸送達システムの注入、細胞膜を横切る核酸送達システムの単純拡散、あるいは細胞膜を横切る任意の能動的または受動的な輸送機構によって、核酸送達システムを細胞に提供することができる。さらに、核酸送達システムは、ウイルスベクターの抗体に関連する標的化および抗体媒介性固定化等の技術を用いて細胞に提供することもできる。
【０１２６】
局所投与のための製剤は、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、坐薬、スプレー、液剤および散剤を含み得る。従来の薬学的担体、水性、粉末状または油状基剤、増粘剤等が、必要に応じて用いられてもよい。
【０１２７】
例えば、関節内（関節の中）、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、および皮下経路等の非経口投与に好適な製剤は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および製剤を対象となるレシピエントの血液と等張にする溶質を含み得る水性および非水性の等張無菌注射液、ならびに、懸濁剤、溶解剤、増粘剤、分散剤、安定剤、および保存剤を含み得る水性および非水性の無菌懸濁液、溶液、または乳濁液を含む。注射用製剤は、添加される保存剤とともに、例えばアンプル中または多回投与用容器内に、単位剤形で提供され得る。組成物は、このような形態をとり得る。
【０１２８】
調製物は、無菌の水溶液または非水溶液、懸濁液および乳濁液を含み、それらは特定の実施形態において対象の血液と等調性であり得る。非水性溶媒の例として、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（オリーブ油、ゴマ油、ヤシ油、ラッカセイ油、ピーナッツ油等）、鉱油、オレイン酸エチル等の注射用有機エステル、または合成モノグリセリドもしくはジグリセリドを含む不揮発性油が挙げられる。水性担体は、水、アルコール性／水性の溶液、乳濁液または懸濁液が挙げられる（生理食塩水および緩衝液を含む）。非経口ビヒクルは、塩化ナトリウム溶液、１，３−ブタンジオール、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液、または不揮発性油を含む。静脈内ビヒクルは、流体および栄養補充液、電解質補充液（リンガーデキストロースに基づくもの等）を含む。保存剤および他の添加剤、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガス等も存在し得る。また、無菌の不揮発性油は、溶媒または懸濁媒として従来通り用いられる。この目的のために、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む任意の無刺激性の不揮発性油が用いられてもよい。さらに、オレイン酸等の脂肪酸が、注射剤の調製に使用されてもよい。担体製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ´ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ）に見出すことができる。当業者は、過度の実験を行うことなく、組成物の調製および配合のための種々のパラメーターを容易に決定することができる。
【０１２９】
単独のまたは他の好適な成分と組み合わされた化合物は、吸入によって投与されるエアロゾル製剤にすることもできる（すなわち、それらは「噴霧」され得る）。エアロゾル製剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素等の、加圧された許容される噴霧剤中に入れることができる。吸入による投与では、化合物は、好適な噴霧剤を使用して、加圧パックまたは噴霧器からのエアロゾルスプレー提示の形態で都合よく送達される。
【０１３０】
いくつかの実施形態において、上記化合物は、塩、担体、緩衝剤、乳化剤、希釈剤、賦形剤、キレート化剤、増量剤、乾燥剤、抗酸化剤、抗菌剤、保存剤、結合剤、膨張剤、シリカ、溶解剤、または安定剤等の配合成分とともに薬学的に許容される担体を含んでもよい。一実施形態において、化合物は、細胞への取り込みを向上させるために、コレステロール、ならびにＣ３２官能基を有するラウリン酸導体等およびリトコール酸誘導体等の親油基にコンジュゲートされる。例えば、コレステロールは、ｓｉＲＮＡの取り込みおよび血清安定性を、インビトロ（Ｌｏｒｅｎｚ， ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｎｉ．Ｌｅｔｔ．１４（１９）：４９７５−４９７７（２００４））およびインビボ（Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４３２（７０１４）：１７３−１７８（２００４））で促進することが示されている。また、ステロイドとコンジュゲートしたオリゴヌクレオチドがＬＤＬ等の血流中の異なるリポタンパク質に結合することで、完全性を保護し、生体内分布を促進することも示されている（Ｒｕｍｐ， ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５９（１１）：１４０７−１４１６（２０００））。上記化合物に結合またはコンジュゲートし、細胞への取り込みを増加させることができる他の群は、アクリジン誘導体、架橋剤（ソラレン誘導体、アジドフェナシル、プロフラビン、およびアジドプロフラビン等）、人工エンドヌクレアーゼ、金属錯体（ＥＤＴＡ−Ｆｅ（ＩＩ）およびポルフィリン−Ｆｅ（ＩＩ）等）、アルキル化部分、ヌクレアーゼ（アルカリホスファターゼ等）、末端トランスフェラーゼ、アブザイム、コレステリル部分、親油性担体、ペプチドコンジュゲート、長鎖アルコール、リン酸エステル、放射性マーカー、非放射性マーカー、炭水化物、およびポリリジンまたは他のポリアミンを含む。
【０１３１】
Ｌｅｖｙらに対する米国特許第６，９１９，２０８号（参照により、本明細書に組み込まれる）も、送達の増強のための方法を記載している。これらの薬学的製剤は、従来の混合、溶解、造粒、研和、乳化、カプセル化、封入、または凍結乾燥のプロセスを用いる等、それ自体が既知である様式で製造されてもよい。
【０１３２】
本明細書に記載される核酸の製剤は、核酸の融合または核酸の修飾を包含し、核酸は、別の部分もしくは部分、例えば、標的化部分、または別の治療剤に融合される。そのような類似体は、活性および／または安定性等の特性の改善を示し得る。核酸と結合してもまたは結合しなくてもよい部分の例として、例えば、特定の細胞への核酸の送達を提供する標的化部分、例えば、膵臓細胞、免疫細胞、肺細胞、または任意の他の好ましい細胞型に対する抗体、ならびに好ましい細胞型に発現する受容体およびリガンドが挙げられる。好ましくは、部分は、癌または腫瘍細胞を標的とする。例えば、癌細胞はグルコースの消費が高いため、核酸はグルコース分子に結合することができる。癌または腫瘍細胞を標的とするヒト化モノクローナル抗体は、好ましい部分であり、核酸と結合してもまたはしなくてもよい。癌治療の場合、標的抗原は、典型的には、腫瘍細胞に特有および／または必須のタンパク質（例えば、受容体タンパク質ＨＥＲ−２／ｎｅｕ）である。
【０１３３】
一般に、核酸を含む化合物を投与する方法は、当該技術分野において周知である。特に、現在使用されている製剤とともに核酸治療のために既に使用されている投与経路は、上記核酸のための好ましい投与経路および製剤を提供する。
【０１３４】
組成物は、これらに限定されないが、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、経皮、皮下、局所、舌下、または直腸手段を含む多数の経路によって投与することができる。また化合物は、リポソームを介して投与されてもよい。そのような投与経路および適切な製剤は、当業者に一般的に知られている。
【０１３５】
本明細書に記載される製剤の投与は、化合物（例えば、ｍｉＲＮＡもしくは分子（例えば、小分子）をコードするｍｉＲＮＡまたは核酸）が、その標的に到達できるようにする任意の許容される方法によって達成されてもよい。
【０１３６】
選択される特定の様式は、当然のことながら、特定の製剤、治療を受ける対象の状態の重症度、および治療有効性のために必要な投与量等の要因に依存する。本明細書において一般的に使用される場合、「有効量」とは、製剤が投与される対象において、化合物を投与されていない対応する対象と比較して、ＭＭＳＥＴ関連疾患の１つ以上の症状を治療することができるか、ＭＭＳＥＴ関連疾患の１つ以上の症状を逆転させることができるか、ＭＭＳＥＴ関連疾患の１つ以上の症状の進行を停止させることができるか、またはＭＭＳＥＴ関連疾患の１つ以上の症状の発生を防止することができる量である。
【０１３７】
化合物の実際の有効量は、用いられる特定の化合物またはそれらの組み合わせ、配合される特定の組成物、投与の様式、個体の年齢、体重、状態、および治療される症状または状態の重症度に応じて異なり得る。
【０１３８】
当業者に既知の任意の許容される方法が、対象に製剤を投与するために用いられてもよい。治療される状態に応じて、投与は、局所的（すなわち、特定の領域、生理系、組織、器官、もしくは細胞型）、または全身的であり得る。
【０１３９】
注射は、例えば、静脈内、皮内、皮下、筋肉内、または腹腔内であり得る。組成物は、例えば、加齢関連疾患の治療または防止のために皮内注射することができる。いくつかの実施形態において、注射は複数箇所に打たれてもよい。移植は、移植可能な薬物送達システム（例えば、マイクロスフェア、ヒドロゲル、高分子リザーバー、コレステロールマトリックス）、ポリマー系（例えば、マトリックス侵食および／または拡散系）、ならびに非ポリマー系（例えば、圧縮された、融合された、または部分的に融合されたペレット）を挿入することを含む。吸入は、組成物を単独でまたは吸収され得る担体に結合させて、吸入器内のエアロゾルとともに投与することを含む。全身投与では、組成物がリポソーム中に封入されることが好ましいかもしれない。
【０１４０】
化合物は、薬剤の組織特異的な取り込みを可能にする様式で送達されてもよい。化合物が核酸であるいくつかの実施形態において、核酸送達システムが用いられ得る。技術は、創傷包帯法もしくは経皮送達システム等の組織または器官を局在化するデバイスの使用、血管カテーテルまたは尿路カテーテル等の侵襲性デバイスの使用、薬物送達能を有し、拡張可能なデバイスまたはステントグラフトとして構成されるステント等の介入的デバイスの使用を含む。
【０１４１】
製剤は、生侵食性インプラントを使用して拡散によって、またはポリマーマトリックスの分解によって送達されてもよい。特定の実施形態において、製剤の投与は、特定の期間、例えば、数時間、数日間、数週間、数ヶ月、または数年にわたって化合物への逐次的暴露をもたらすように設計されてもよい。これは、例えば、製剤の反復投与によって、または化合物が反復投与なしで長期にわたって送達される持続放出送達システムもしくは制御放出送達システムによって達成され得る。そのような送達システムを使用した製剤の投与は、例えば、経口剤形、ボーラス注入、経皮パッチまたは皮下インプラントによるものであり得る。実質的に一定である組成物の濃度を維持することは、いくつかの場合において好ましいかもしれない。
【０１４２】
他の好適な送達システムは、徐放、遅延放出、持続放出、または制御放出の送達システムを含む。そのようなシステムは、多くの場合において反復投与を回避することができ、対象および医師にとっての利便性を高める。多くの種類の放出送達システムが利用可能であり、当業者に既知である。それらは、例えば、ポリ乳酸および／もしくはポリグリコール酸、ポリ酸無水物、ポリカプロラクトン、コポリオキサレート、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリヒドロキシ酪酸、ならびに／またはこれらの組み合わせ等の、ポリマーベースのシステムを含む。
【０１４３】
核酸を含む前述のポリマーのマイクロカプセルは、例えば、米国特許第５，０７５，１０９号に記載されており、参照により、本明細書に組み込まれる。他の例として、ステロール（例えばコレステロール、コレステロールエステル等）、ならびに脂肪酸または中性脂肪（例えば、モノグリセリド、ジグリセリドおよびトリグリセリド等）を含む脂質ベースの非ポリマーシステム、ヒドロゲル放出システム、リポソームベースのシステム、リン脂質ベースのシステム、シラスティックシステム、ペプチドベースのシステム、ワックスコーティング、従来の結合剤および賦形剤を用いた圧縮錠、または部分的に融合したインプラントが挙げられる。特定の例として、化合物がマトリックス内で製剤中に含まれる侵食システム（例えば、米国特許第４，４５２，７７５号、第４，６７５、１８９号、第５，７３６，１５２号、第４，６６７，０１３号、第４，７４８，０３４号、および第５，２３９，６６０号（参照により、本明細書に組み込まれる）に記載されるような）、または活性成分が放出速度を制御する拡散システム（例えば、米国特許第３，８３２，２５３号、第３，８５４，４８０号、第５，１３３，９７４号、および第５，４０７，６８６号に記載されるような）が挙げられる。製剤は、例えば、マイクロスフェア、ヒドロゲル、高分子リザーバー、コレステロールマトリックス、またはポリマーシステムであってもよい。いくつかの実施形態において、システムは、例えば、化合物を含む製剤の拡散または浸食／分解速度の制御を介して、組成物の持続放出または制御放出を可能にすることができる。また、ポンプベースのハードウェア送達システムは、１つ以上の実施形態を送達するために使用され得る。
【０１４４】
一気に放出が起こるシステムの例として、例えば、ポリマーマトリックスに封入されたリポソームに中に組成物が封入される、該リポソームが特定の刺激（例えば、温度、ｐＨ、光、または分解酵素）に感受性であるシステム、およびマイクロカプセルのコア分解酵素でイオン的に被覆されたマイクロカプセルによって組成物が封入されるシステムが挙げられる。インヒビターの放出が段階的かつ継続的なシステムの例として、例えば、組成物がマトリックス内にある形態で含まれる侵食システム、および組成物が、例えば、ポリマーを通って、制御された速度で浸透する浸出システムが挙げられる。このような持続放出システムは、例えば、ペレットまたはカプセルの形態であり得る。
【０１４５】
長期放出インプラントの使用は、いくつかの実施形態において特に好適であるかもしれない。本明細書において使用される場合、「長期放出」とは、組成物を含むインプラントが、少なくとも３０日間もしくは４５日間、好ましくは少なくとも６０日間もしくは９０日間、またはいくつかの場合においてはさらにそれよりも長く、治療的に有効なレベルの組成物を送達するように構築および配置されることを意味する。長期放出インプラントは、当業者に周知であり、上記放出システムのいくつかを含む。
【０１４６】
特定の個体のための投与量は、従来の検討事項を用いて（例えば、適切な従来の薬理学的プロトコルにより）、当業者によって決定され得る。医師は、例えば、最初に比較的低用量を処方し、その後、適切な応答が得られるまで用量を増加させてもよい。個体に投与される用量は、用途に応じて、個体において経時的に有益な治療反応をもたらすか（もしくは、例えば、症状を軽減する）、または他の適切な活性をもたらすのに十分である。用量は、特定の製剤の有効性、ならびに用いられる化合物の活性、安定性、または血清半減期および個体の状態、そして治療を受ける個体の体重または体表面積によって決定される。また、用量の大きさは、特定の個体における特定のベクター、製剤等の投与に伴う任意の有害な副作用の存在、性質および程度によっても決定される。
【０１４７】
１つ以上の核酸を含む治療組成物は、当該技術分野において周知の方法に従って有効性、組織代謝を確認するためおよび投与量を推定するために、１つ以上の適切なインビトロおよび／またはインビボの疾患動物モデルにおいて任意選択的に調査される。具体的には、関連するアッセイにおいて、治療対無治療の活性、安定性、または他の好適な尺度（例えば、治療された細胞または動物モデル対治療されていない細胞または動物モデルの比較）によって、最初に投与量が決定され得る。製剤は、例えば、個体の質量および相対的な健康に適用されるように、関連する製剤のＬＤ５０によって、および／または、種々の濃度における核酸の任意の副作用の観察によって決定される速度で投与される。投与は、単一用量または分割用量によって達成され得る。
【０１４８】
実施例に記載されるように、潜在的な加齢関連疾患の治療としての核酸の有効量を決定するためにインビトロモデルを使用することができる。疾患の治療または予防において投与されるべき化合物の有効量を決定する際に、医師は、循環血漿レベル、製剤の毒性、および疾患の進行を評価する。非限定的な例において、核酸の場合、７０キログラムの個体に投与される用量は、典型的には、現在使用されている治療的アンチセンスオリゴヌクレオチド、例えば、サイトメガロウイルスＲＮＡの治療についてＦＤＡによって認可され、関連する組成物の活性または血清半減期の改変のために調節されたＶｉｔｒａｖｅｎｅ（登録商標）（ホミビルセンナトリウム注射）等の投与量と等しい範囲内である。
【０１４９】
本明細書に記載される製剤は、これらに限定されないが、抗体投与、ワクチン投与、細胞傷害性薬剤、天然アミノ酸ポリペプチド、核酸、ヌクレオチド類似体、および生物学的応答修飾物質の投与を含む、任意の既知の従来の治療による治療条件を補うことができる。組み合わされた２つ以上の化合物は、一緒にまたは経時的に使用され得る。例えば、抗加齢関連疾患カクテルの一部として治療的に有効な量の核酸を投与することもできる。
【０１５０】
本発明の特定の実施形態は、（ａ）１つ以上のＭＭＳＥＴを標的とする核酸または低分子化合物および（ｂ）１つ以上の他の化学療法剤を含む薬学的組成物を提供する。そのような化学療法剤の例として、これらに限定されないが、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、マイトマイシン、ナイトロジェンマスタード、クロラムブシル、メルファラン、シクロホスファミド、６−メルカプトプリン，６−チオグアニン、シタラビン（ＣＡ）、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フロクスウリジン（５−ＦＵｄＲ）、メトトレキサート（ＭＴＸ）、コルヒチン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド、テニポシド、シスプラチン、およびジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）等の抗癌剤が挙げられる。これらに限定されないが、非ステロイド系抗炎症剤および副腎皮質ステロイドを含む抗炎症剤、およびこれらに限定されないが、リビビリン、ビダラビン、アシクロビル、およびガンシクロビルを含む抗ウイルス剤も、本発明の組成物と組み合わされてもよい。他の非アンチセンス化学療法剤も、本発明の範囲内である。組み合わされた２つ以上の化合物は、一緒にまたは経時的に使用され得る。
【０１５１】
Ｆ．併用療法
いくつかの実施形態において、本発明は、追加の薬剤（例えば、化学療法剤）と組み合わせて、本明細書に記載される１つ以上の組成物を含む治療法を提供する。本発明は、特定の化学療法剤に限定されるものではない。
【０１５２】
種々のクラスの抗腫瘍性（例えば、抗癌性）薬剤が、特定の本発明の実施形態において使用するために企図される。本発明の実施形態とともに使用するのに好適な抗癌剤は、これらに限定されないが、アポトーシスを誘導する薬剤、アデノシンデアミナーゼの機能を阻害する薬剤、ピリミジン生合成を阻害する、プリン環生合成を阻害する、ヌクレオチド相互変換を阻害する、リボヌクレオチドレダクターゼを阻害する、チミジンモノホスフェート（ＴＭＰ）合成を阻害する、ジヒドロフォレート還元を阻害する、ＤＮＡ合成を阻害する、ＤＮＡとの付加体を形成する、ＤＮＡを損傷する、ＤＮＡ修復を阻害する、ＤＮＡとインターカレートする、アスパラギン類を脱アミノ化する、ＲＮＡ合成を阻害する、タンパク質の合成または安定性を阻害する、微小管の合成または機能を阻害するもの等を含む。
【０１５３】
いくつかの実施形態において、本発明の実施形態の組成物および方法において使用するのに好適な例示的な抗癌剤として、これらに限定されないが、１）アルカロイド、例えば、微小管阻害剤（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、およびビンデシン等）、微小管安定剤（例えば、パクリタキセル（タキソール）、およびドセタキセル、等）、およびクロマチン機能阻害剤、例えば、トポイソメラーゼ阻害剤、例えば、エピポドフィロトキシン（例えば、エトポシド（ＶＰ−１６）、およびテニポシド（ＶＭ−２６）等）、ならびにトポイソメラーゼＩを標的とする薬剤（例えば、カンプトテシンおよびイリノテカン（ＣＰＴ−１１）等）、２）共有結合性ＤＮＡ結合剤（アルキル化剤）、例えば、ナイトロジェンマスタード（例えば、メクロレタミン、クロラムブシル、シクロホスファミド、イホスファミド、およびブスルファン（マイレラン）等）、ニトロソ尿素（例えば、カルムスチン、ロムスチン、およびセムスチン等）、ならびに他のアルキル化剤（例えば、ダカルバジン、ヒドロキシメチルメラミン、チオテパ、およびマイトシシン等）、３）非共有結合性ＤＮＡ結合剤（抗腫瘍抗生物質）、例えば、核酸阻害剤（例えば、ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ等）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（ダウノマイシン、およびセルビジン）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、およびイダルビシン（イダマイシン）等）、アントラセンジオン（例えば、アントラサイクリン類似体、例えば、ミトキサントロン等）、ブレオマイシン（ブレノキサン）等、ならびにプリカマイシン（ミトラマイシン）等、４）代謝拮抗物質、例えば、葉酸代謝拮抗薬（例えば、メトトレキサート、フォレックスおよびメキサート等）、プリン代謝拮抗薬（例えば、６−メルカプトプリン（６−ＭＰ、プリントール）、６−チオグアニン（６−ＴＧ）、アザチオプリン、アシクロビル、ガンシクロビル、クロロデオキシアデノシン、２−クロロデオキシアデノシン（ＣｄＡ）、および２´−デオキシコホルマイシン（ペントスタチン）等）、ピリミジン拮抗薬（例えば、フルオロピリミジン（例えば、５−フルオロウラシル（アドルシル）、５−フルオロデオキシウリジン（ＦｄＵｒｄ）（フロクスウリジン）等）、ならびにシトシンアラビノシド（例えば、シトサール（ａｒａ−Ｃ）およびフルダラビン等）、５）酵素、例えば、Ｌ−アスパラギナーゼ、およびヒドロキシ尿素等、６）ホルモン、例えば、グルココルチコイド、抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン等）、非ステロイド性抗アンドロゲン（例えば、フルタミド等）、およびアロマターゼ阻害剤（例えば、アナストロゾール（アリミデックス）等）、７）白金化合物（例えば、シスプラチンおよびカルボプラチン等）、８）抗癌剤、毒素、および／または放射性核種等とコンジュゲートしたモノクローナル抗体、９）生物学的応答調節因子（例えば、インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−α）等］およびインターロイキン（例えば、ＩＬ−２等）等）、１０）養子免疫療法、１１）造血成長因子、１２）腫瘍細胞分化を誘導する薬剤（例えば、オールトランスレチノイン酸等）、１３）遺伝子療法の技法、１４）アンチセンス療法の技法、１５）腫瘍ワクチン、１６）腫瘍転移に対する薬剤（例えば、バチマスタット等）、１７）血管新生阻害剤、１８）プロテオソーム阻害剤（例えば、ＶＥＬＣＡＤＥ）、１９）アセチル化および／またはメチル化の阻害剤（例えば、ＨＤＡＣ阻害剤）、２０）ＮＦ−κＢの調節因子、２１）細胞周期制御の阻害剤（例えば、ＣＤＫ阻害剤）、２２）ｐ５３タンパク質機能の調節因子、そして２３）放射線が挙げられる。
【０１５４】
癌治療の状況においてルーチン的に使用される任意の腫瘍退縮剤を、本発明の実施形態の組成物および方法において使用することができる。例えば、米国食品医薬品局は、米国内での使用が認可された腫瘍退縮剤の処方集を維持する。米国Ｆ．Ｄ．Ａと同等の国際機関が、同様の処方集を維持する。下の表は、米国内での使用が認可された例示的な抗腫瘍剤のリストを提供する。当業者は、米国で認可された全ての化学療法剤に必要とされる「製品ラベル」が、例示的な薬剤について認可された適応症、投与情報、毒性データ等を記載していることを認識するであろう。
【０１５５】
【表１】
【０１５６】
【表２】
【０１５７】
【表３】
【０１５８】
【表４】
【０１５９】
【表５】
【０１６０】
【表６】
【０１６１】
【表７】
【０１６２】
【表８】
【０１６３】
【表９】
【０１６４】
本発明の方法および組成物が前立腺癌の治療または防止のために使用される場合、前立腺癌の治療のための既存の治療が本発明の方法と組み合わせて用いられてもよい。したがって、転移性前立腺癌を治療または阻害する方法は、前立腺癌の治療のための第２の治療とともにＭＭＳＥＴ阻害剤を投与することをさらに含み得る。第２の治療は、別のＭＭＳＥＴ阻害剤であってもよいが、典型的には異なる治療である。好適な異なる治療は、放射線治療および前立腺摘除からなる群から選択される１つ以上の治療を含む。使用され得る別の第２の治療は、抗アンドロゲン療法である。抗アンドロゲン療法は、ロイプロリドおよびゴセレリンからなる群から選択される１つ以上の薬剤を対象に投与することを含み得る。使用され得る別の第２の治療は、ケトコナゾール、ビカルタミド（カソデックス）、ミトキサントロン（ノバントロン）、リン酸エストラムスチン（エムサイト）、エトポシド（ベプシド）、パクリタキセル（タキソール）、ドセタキセル（タキソテール）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、またはビンブラスチン（ベルバン）を含むがこれに限定されない１つ以上のホルモン剤または化学療法剤を投与する等の化学療法である。
【０１６５】
ＩＩ．抗体
本発明は、単離された抗体を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、ＭＭＳＥＴの少なくとも５つのアミノ酸残基で構成される単離されたポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を提供する。このような抗体は、本明細書に記載される治療および薬物スクリーニングの方法において用途を見出す。
【０１６６】
本発明のタンパク質に対する抗体は、該タンパク質を認識できる限り、いずれのモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であってもよい。抗体は、本発明のタンパク質を抗原として用いて、従来の抗体または抗血清の調製プロセスに従って製造することができる。
【０１６７】
本発明は、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の両方の使用を企図する。本発明の方法および組成物において使用される抗体を産生するために、これに限定されないが、本発明に開示されるものを含む任意の好適な方法が用いられてもよい。例えば、モノクローナル抗体の産生のためには、抗体の産生が可能な条件下で、タンパク質を単独で、または好適な担体もしくは希釈剤とともに、動物（例えば、哺乳動物）に投与する。抗体産生能を高めるために、完全または不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。通常、２週間〜６週間毎に１回、全部で約２回〜約１０回タンパク質を投与する。そのような方法に好適な動物は、これらに限定されないが、霊長類、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ等を含む。
【０１６８】
モノクローナル抗体を産生する細胞を調製するためには、最終免疫の２日〜５日後に、抗体価が確認された個々の動物（例えば、マウス）を選択し、脾臓またはリンパ節を採取し、その中に含まれる抗体を産生する細胞を骨髄腫細胞と融合させて、所望のモノクローナル抗体産生株であるハイブリドーマを調製する。例えば、本明細書に後述されるように標識されたタンパク質と抗血清を反応させ、次いで、抗体に結合した標識剤の活性を測定することによって、抗血清中の抗体価の測定を行うことができる。細胞融合は、例えば、ＫｏｅｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５［１９７５］）によって記載される方法等の既知の方法に従って実施することができる。融合プロモーターとして、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはセンダイウイルス（ＨＶＪ）、好ましくはＰＥＧが使用される。
【０１６９】
骨髄腫細胞の例として、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１等が挙げられる。用いられる抗体産生株細胞（脾臓細胞）の数と骨髄腫細胞の数との比率は、好ましくは約１：１〜約２０：１である。ＰＥＧ（好ましくは、ＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）は、好ましくは約１０％〜約８０％の濃度で添加される。細胞融合は、両方の細胞の混合物を約２０℃〜約４０℃、好ましくは約３０℃〜約３７℃で約１分〜１０分インキュベートすることによって効率的に行うことができる。
【０１７０】
抗体（例えば、腫瘍抗原または本発明の自己抗体に対する）を産生するハイブリドーマをスクリーニングするために種々の方法が用いられてもよい。例えば、抗体を直接または担体とともに吸着させた固相（例えば、マイクロプレート）にハイブリドーマの上清を添加し、次いで、放射性物質または酵素で標識した抗免疫グロブリン抗体（マウス細胞を細胞融合に用いる場合は、抗マウス免疫グロブリン抗体を使用）またはプロテインＡを添加して、固相に結合したタンパク質に対するモノクローナル抗体を検出する。代替として、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマの上清を添加し、放射性物質または酵素で標識したタンパク質を添加して、固相に結合したタンパク質に対するモノクローナル抗体を検出する。
【０１７１】
モノクローナル抗体の選択は、任意の既知の方法またはその変形例に従って行うことができる。通常、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞のための培地が用いられる。ハイブリドーマが増殖できる限り、いずれの選択および成長培地が用いられてもよい。例えば、１％〜２０％、好ましくは１０％〜２０％のウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地、１％〜１０％のウシ胎仔血清を含むＧＩＴ培地、ハイブリドーマ培養のための無血清培地、（ＳＦＭ−１０１、Ｎｉｓｓｕｉ Ｓｅｉｙａｋｕ）等を用いることができる。通常、培養は、約５％のＣＯ２ガス下で、２０℃〜４０℃、好ましくは３７℃で、約５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間行われる。ハイブリドーマ培養物の上清の抗体価は、抗血清中の抗タンパク質の抗体価に関して上述したのと同じ様式に従って測定することができる。
【０１７２】
モノクローナル抗体（例えば、ＭＭＳＥＴ、ＭＭＳＥＴと相互作用するタンパク質、またはＭＭＳＥＴの標的に対する）の分離および精製は、免疫グロブリンの分離および精製等の従来のポリクローナル抗体と同じ様式に従って行うことができ、例えば、塩析法、アルコール沈殿法，等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例えば、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲル濾過法、または、抗原と結合する固相、プロテインＡまたはプロテインＧ等の活性吸着剤で抗体のみを収集し、結合を溶解して抗体を得る特異的精製法を含む。
【０１７３】
ポリクローナル抗体は、患者から抗体を得ることを含む、いずれの既知の方法またはこれらの方法の変更例によって調製されてもよい。例えば、免疫原（タンパク質に対する抗原）と担体タンパク質との複合体を調製し、上記モノクローナル抗体の調製に関して上述したのと同じ様式に従って、該複合体により動物を免疫化する。免疫化した動物から抗体含有物質を回収し、抗体を分離および精製する。
【０１７４】
動物の免疫化に使用される免疫原と担体タンパク質との複合体に関して、ハプテン（担体上にクロスリンクされ、免疫化に用いられる）に対する抗体が効率的に産生される限り、任意の担体タンパク質、および担体とハプテンとの任意の混合比を用いることができる。例えば、ウシ血清アルブミン、ウシシクログロブリン、キーホールリンペットヘモシアニン等が、ハプテン１部当たり約０．１部〜約２０部、好ましくは約１部〜約５部の重量比でハプテンとカップリングさせてもよい。
【０１７５】
また、ハプテンと担体をカップリングさせるために種々の縮合剤を使用することができる。例えば、グルタルアルデヒド、カルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基またはジチオピリジル基を含む活性エステル試薬等が本発明とともに用途を見出す。縮合物は、単独で、または好適な担体もしくは希釈剤とともに、抗体の産生が可能な動物の部位に投与される。抗体産生能を高めるために、完全または不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。通常、２週間〜６週間毎に１回、全部で約３回〜約１０回タンパク質を投与する。
【０１７６】
ポリクローナル抗体は、上記方法で免疫化した動物の血液、腹水等から回収される。抗血清中の抗体価は、ハイブリドーマ培養物の上清に関して上述したのと同じ様式に従って測定することができる。抗体の分離および精製は、モノクローナル抗体に関して上述したのと同じ免疫グロブリンの分離および精製に従って行うことができる。
【０１７７】
本明細書において免疫原として用いられるタンパク質は、いずれか特定の種類の免疫原に限定されない。例えば、本発明の癌マーカー（部分的に変更されたヌクレオチド配列を有する遺伝子をさらに含む）が免疫原として用いられてもよい。さらに、タンパク質の断片が使用されてもよい。断片は、これらに限定されないが、遺伝子断片の発現、タンパク質の酵素処理、化学合成を含むいずれの方法によって得られてもよい。
【０１７８】
ＩＩＩ．薬物スクリーニング用途
いくつかの実施形態において、本発明は、薬物スクリーニングアッセイ（例えば、抗癌剤のスクリーニング）を提供する。本発明のスクリーニング法は、ＭＭＳＥＴを用いる。例えば、いくつかの実施形態において、本発明は、ＭＭＳＥＴの発現を変化させる（例えば減少させる）化合物のスクリーニング法を提供する。化合物または薬剤は、例えば、プロモーター領域との相互作用によって、転写を妨げることができる。化合物または薬剤は、ＭＭＳＥＴから生成されるｍＲＮＡを妨げることができる（例えば、ＲＮＡ干渉、アンチセンス技術等により）。化合物または薬剤は、ＭＭＳＥＴの生物学的活性の上流または下流である経路を妨げることができる。いくつかの実施形態において、候補化合物は、ＭＭＳＥＴに対するアンチセンスまたは干渉ＲＮＡ剤（例えば、オリゴヌクレオチド）である。他の実施形態において、候補化合物は、ＭＭＳＥＴ制御因子、ＭＭＳＥＴの標的（複数可）、またはそれらの異なる発現産物に特異的に結合し、それによって生物学的機能を変化させる（例えば、阻害する）抗体または小分子である。
【０１７９】
あるスクリーニング法において、候補化合物は、ＭＭＳＥＴを発現する細胞に化合物を接触させ、次いで、候補化合物が発現に与える影響を評価することによって、ＭＭＳＥＴの発現を変化させる能力について評価される。いくつかの実施形態において、候補化合物がＭＭＳＥＴ遺伝子の発現に与える影響は、細胞によって発現されるＭＭＳＥＴのｍＲＮＡのレベルを検出することによって評価される。ｍＲＮＡの発現は、任意の好適な方法によって検出することができる。ｍＲＮＡの発現を分析するための方法は、当該技術分野において周知であり、これらに限定されないが、ＲＴ−ＰＣＲ、定量（例えば、ＴａｑＭａｎ）ＲＴ−ＰＣＲアッセイ、ＳＡＧＥ、アレイ法、トランスクリプトームシーケンシング、ノーザンブロット等を含む。
【０１８０】
他の実施形態において、候補化合物がＭＭＳＥＴ遺伝子の発現に与える影響は、ＭＭＳＥＴによってコードされるポリペプチドのレベルを測定することによって評価される。発現されるポリペプチドのレベルは、本明細書に開示されるものを含むが、これらに限定されない任意の好適な方法によって測定することができる。ポリペプチドレベルを分析する方法は、当該技術分野において周知であり、これらに限定されないが、免疫ブロット法、ＥＬＩＳＡ、ドットブロット、タンパク質アッセイ、免疫沈降、ビーズベースアッセイ等を含む。
【０１８１】
具体的には、本発明は、修飾物質、すなわち、ＭＭＳＥＴに結合し、例えば、ＭＭＳＥＴの発現またはＭＭＳＥＴの活性に対する阻害（または促進）効果を有するか、あるいは、例えば、ＭＭＳＥＴ基質またはＭＭＳＥＴの制御因子の発現または活性に対して促進または阻害効果を有する候補化合物もしくは試験化合物または薬剤（例えば、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣体、ペプトイド、小分子、または他の薬剤）を同定するためのスクリーニング法を提供する。したがって、同定された化合物は、標的遺伝子産物の生物学的機能を生成するため、または正常な標的遺伝子の相互作用を妨げる化合物を同定するために、治療プロトコルにおいて標的遺伝子産物（例えば、ＭＭＳＥＴ遺伝子）の活性を直接的または間接的に調節するために使用することができる。ＭＭＳＥＴの活性または発現を阻害する化合物は、増殖性疾患、例えば、癌（例えば、前立腺癌、乳癌、他の固形腫瘍癌、多発性骨髄腫）の治療において有用である。
【０１８２】
一実施形態において、本発明は、癌マーカータンパク質もしくはポリペプチドまたはその生物学的活性部分の基質である候補化合物または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。別の実施形態において、本発明は、癌マーカータンパク質もしくはポリペプチドまたはその生物学的活性部分に結合するかまたはそれらの活性を調節する候補化合物または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。
【０１８３】
本発明の試験化合物は、生物学的ライブラリー、ペプトイドライブラリー（ペプチドの機能性を有する分子のライブラリーであるが、酵素分解に耐性を示すにもかかわらず生物活性を保持する、新規の非ペプチド主鎖を有する、例えば、Ｚｕｃｋｅｎｎａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８−８５［１９９４］）を参照）、空間的に位置指定可能な平行固相または溶液相ライブラリー、逆重畳を必要とする合成ライブラリー法、「１ビーズ１化合物」ライブラリー法、およびアフィニティクロマトグラフィ選別を用いた合成ライブラリー法を含む、当該技術分野で既知のコンビナトリアルライブラリー法における数多くのアプローチのうちのいずれかを用いることによって得ることができる。生物学的ライブラリーおよびペプトイドライブラリーのアプローチは、ペプチドライブラリーとともに用いるのが好ましく、他の４つのアプローチは、化合物のペプチド、非ペプチドオリゴマー、または低分子化合物ライブラリーに適用される（Ｌａｍ（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ． １２：１４５）。
【０１８４】
分子ライブラリーの合成のための方法の例は、当該技術分野において、例えば、 ＤｅＷｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６９０９［１９９３］、Ｅｒｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｄ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１１４２２［１９９４］、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８［１９９４］、Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１３０３［１９９３］、Ｃａｒｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３．２０５９［１９９４］、Ｃａｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１［１９９４］、およびＧａｌｌｏｐ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３［１９９４］に見ることができる。
【０１８５】
化合物のライブラリーは、例えば、溶液中（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１３：４１２−４２１［１９９２］）、またはビーズ上（Ｌａｍ，Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２−８４［１９９１］）、チップ（Ｆｏｄｏｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３６４：５５５−５５６［１９９３］）、細菌または胞子（米国特許第５，２２３，４０９号、参照により、本明細書に組み込まれる）、プラスミド（Ｃｕｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｄ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１８６５１８６９［１９９２］）、またはファージ上（Ｓｃｏｔｔ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６−３９０［１９９０］、Ｄｅｖｌｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４−４０６［１９９０］、Ｃｗｉｒｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．ＮａｔＩ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：６３７８−６３８２［１９９０］、Ｆｅｌｉｃｉ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１［１９９１］）に存在し得る。
【実施例】
【０１８６】
実験
以下の実施例は、本発明の特定の好ましい実施形態および態様を示し、またさらに例示するために提供されるものであって、本発明の範囲を限定するものであると見なされるべきではない。
【０１８７】
実験１
前立腺癌組織および細胞株におけるＭＭＳＥＴ発現の分析
方法
ＭＭＳＥＴおよびＥｚｈ２のｍＲＮＡ検出のためのＴａｑＭａｎ定量ＰＣＲ
組織検体由来の全ＲＮＡをｍｉＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出し、得られたｃＤＮＡ試料をＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて調製した。Ａｓｓａｙ−ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄプライマー／プローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて定量ＲＴ−ＰＣＲを行った。ＭＭＳＥＴおよびＥｚｈ２のｍＲＮＡレベルを定量化し、２−ΔΔＣＴ法を用いてＧＡＰＤＨに正規化した。
【０１８８】
結果
ＴａｑＭａｎ定量リアルタイムＰＣＲにより、切除した前立腺の転移性組織試料において、良性またはＰＣＡ組織試料と比較してＭＭＳＥＴおよびＥｚｈ２の相対的な発現の増加が示された（図８）。
【０１８９】
実験２
細胞浸潤に影響を与えるＭＭＳＥＴノックダウン
方法
基底膜マトリックス浸潤アッセイ
浸潤アッセイにはＤＵ１４５細胞を用いた。いくつかの実験において、２つの異なるＭＭＳＥＴ特異的ｓｉＲＮＡで細胞をトランスフェクトすることにより、ＭＭＳＥＴノックダウンを行った。トランスフェクションから４８時間後、２４ウェル培養プレートのインサート中に存在する基底膜マトリックス（ＥＣ ｍａｔｒｉｘ、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）上に細胞を播種した。いくつかの実験において、低分子阻害剤（ＭＣＴＰ３９）を用いてＭＭＳＥＴを阻害した。２用量の低分子阻害剤を含むかまたは含まない化学誘引物質として、ウシ胎仔血清を下のチャンバに加えた。４８時間後、非浸潤細胞およびＥＣマトリックスを綿棒で穏やかに除去した。チャンバの下側に位置する浸潤細胞を１５０μｌの１０％酢酸で処理することにより比色測定で測定し、分光光度計を使用して５６０ｎｍで吸光度を測定した。
【０１９０】
結果
ｓｉＲＮＡ媒介性のＭＭＳＥＴノックダウンは、ＤＵ１４５細胞の浸潤の低下をもたらした（図５）。同様に、基底膜マトリックス浸潤アッセイにおいて、ＤＵ１４５細胞をＭＭＳＥＴの低分子阻害剤で処理することにより浸潤の低下がもたらされた（図７）。
【０１９１】
実験３
細胞生存率アッセイ
方法
ＭＭＳＥＴ阻害剤が細胞の生存率に与える作用を調べるために、ＷＳＴ−１細胞生存率アッセイ（Ｒｏｃｈｅ）を行った。製造者のプロトコルに従ってＷＳＴ−１アッセイを行う９６時間前に、ＤＭＳＯ中に溶解した異なる用量の小分子で高悪性度の前立腺細胞株ＤＵ１４５を処理した。各実験を８回行い、４５０ｎｍで吸光度を測定した。
【０１９２】
結果
ＭＭＳＥＴの低分子阻害剤であるＭＣＴＰ３９に関する生存率アッセイの結果を図７に示す。ＭＣＴＰ３９のＩＣ５０値は＜３μＭであった。
【０１９３】
実験４
ＭＭＳＥＴ阻害剤で処理したまたは未処理の細胞におけるヒストンのメチル化修飾
方法
免疫ブロット解析
ＤＵ１４５細胞を複数用量の小分子阻害剤で９６時間インキュベートするか、または本明細書に記載されるようなｓｉＲＮＡ媒介性ＭＭＳＥＴノックダウンに供した（例えば、ｓｈ１ ＧＧＵＣＣＡＡＡＧＵＧＵＣＧＧＧＵＵＡまたはｓｈ２ ＧＵＣＡＧＵＧＧＡＧＧＡＧＣＧＧＡＡを使用）。Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ混合物（Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を含むＮＰ４０溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１％ ＮＰ４０、ｐＨ７．４、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中で細胞を均質化した。１０マイクログラムの各タンパク質抽出物を試料用緩衝液中で沸騰させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ポリフッ化ビニリデン膜（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に移した。ブロッキング溶液中で膜を１時間インキュベートし、以下の抗体を用いて４℃で一晩インキュベートした：抗モノメチル化、ジメチル化、およびトリメチル化Ｈ３−２７、抗ジメチル化およびトリメチル化Ｈ３−ｋ３６、ならびに抗トリメチル化Ｈ３−Ｋ９。ＴＢＳ−Ｔで洗浄後、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体でブロットをインキュベートした。製造者（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって記載されるように、化学発光の増強によりシグナルを可視化した。抗Ｈ３およびβアクチンを用いてブロットを再度プローブし、ローディングが等しいことを確認した。
【０１９４】
結果
ＭＭＳＥＴのノックダウンは、Ｈ３Ｋ３６のジメチル化の低下をもたらした（図４）。ＭＭＳＥＴ阻害剤ＭＣＴＰ３９を用いたインキュベーションにより、Ｈ３Ｋ３６のジメチル化の用量依存性低下とともに、Ｈ３Ｋ２７のジメチル化、Ｈ３Ｋ２７のトリメチル化、およびＨ３Ｋ３６のトリメチル化の用量依存性の低下がもたらされた（図９）。
【０１９５】
図１１〜２６は、複数の癌におけるＭＭＳＥＴ発現のさらなる特徴付けおよびＭＣＴＰ３９による阻害を示す。ＭＣＴＰ３９は、異種移植腫瘍において細胞生存率および腫瘍サイズを減少させた。
【０１９６】
上記明細書で述べた全ての刊行物および特許は、参照により本明細書に組み込まれる。記載される本発明の方法およびシステムの種々の変更例および変形例が、本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく当業者には明白であろう。特定の好ましい実施形態と関連させて本発明を記載してきたが、請求されるような本発明は、そのような特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことを理解されたい。実際、関連技術分野の当業者には明白である記載される本発明を実行するための様式の種々の変更例は、以下の特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１０年２月１９日に出願された特許出願第６１／３０６，２５１号に対する優先権を主張するものであり、当該出願は、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与されたＣＡ６９５６８に基づいて、連邦政府の支援のもとに実施された。連邦政府は、本発明において特定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、癌の治療、管理、および／または研究において用途を見出す治療剤に関する。具体的には、本発明は、癌（例えば、前立腺癌、乳癌、他の固形腫瘍、多発性骨髄腫）におけるＭＭＳＥＴの発現を標的とする小分子および核酸に関する。
【背景技術】
【０００４】
６５歳を超える男性の９人に１人が罹患する前立腺癌（ＰＣＡ）は、肺癌の次に多い男性の癌による死亡原因である（Ａｂａｔｅ−Ｓｈｅｎ ａｎｄ Ｓｈｅｎ，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １４：２４１０［２０００］、Ｒｕｉｊｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｖ，２０：２２［１９９９］）。米国癌協会は、２００１年には約１８４，５００人の米国人男性が前立腺癌であると診断され、３９，２００人が死亡すると推定している。
【０００５】
前立腺癌は、典型的には、直腸指診および／または前立腺特異抗原（ＰＳＡ）スクリーニングによって診断される。血清ＰＳＡレベルの上昇は、ＰＣＡの存在を示唆する場合がある。ＰＳＡは、前立腺細胞によってのみ分泌されるため、前立腺癌のマーカーとして用いられる。正常な前立腺は、一定量、典型的には１ミリリットル当たり４ナノグラム未満、すなわち「４」以下のＰＳＡ読み取り値を生成するのに対し、癌細胞は、癌の重症度に応じて上昇する量を生成する。４〜１０のレベルは、医師に患者が前立腺癌に罹患していることを疑わせ、５０を超える量では、身体の他の箇所に広がっていることを示す可能性がある。
【０００６】
ＰＳＡまたは指診によって癌が存在する高い可能性が示された場合、経直腸超音波法（ＴＲＵＳ）を用いて前立腺のマッピングを行い、あらゆる疑わしい領域を示す。前立腺の種々の箇所の生検を用いて前立腺癌が存在するかどうかを判定する。治療の選択肢は、癌の段階に依存する。余命１０年以下で、グリーソン値が低く、腫瘍が前立腺以外には転移していない男性には、慎重な経過観察で対応することが多い（治療は行わない）。より悪性度の高い癌に対する治療の選択肢として、（神経温存術を用いるかまたは用いずに）前立腺を完全に除去する根治的前立腺摘除（ＲＰ）等の外科的治療、および体外から前立腺に線量を導く外部ビームによって、または癌細胞を局所的に死滅させるために前立腺内に移植される低線量の放射線シードを介して適用される、放射線が挙げられる。また、抗アンドロゲンホルモン療法も、単独で、または手術もしくは放射線と組み合わせて用いられる。ホルモン療法は、下垂体がテストロン生成を刺激するホルモンを生成するのを阻止する黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨ−ＲＨ）類似体を用いる。患者は、一生、ＬＨ−ＲＨ類似体の注射を受けなければならない。
【０００７】
手術およびホルモンによる治療は局在性ＰＣＡには有効であることが多いが、進行した疾患は、本質的に治癒不能のままである。アンドロゲン除去は、進行したＰＣＡに対する最も一般的な治療法であり、アンドロゲン依存性悪性細胞の大規模なアポトーシスを引き起こし、腫瘍の一時的な退縮をもたらす。しかしながら、ほとんどの場合、腫瘍はすさまじい勢いで再発し、アンドロゲンシグナルとは関係なく増殖する可能性がある。
【０００８】
前立腺特異抗原（ＰＳＡ）スクリーニングの出現は、ＰＣＡの早期発見をもたらし、ＰＣＡに関連する死亡率が大幅に減少した。しかしながら、ＰＳＡスクリーニングが癌特異的な死亡率に与える影響は、前向き無作為化スクリーニング試験の結果が出るまでは未知のままである（Ｅｔｚｉｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．，９１：１０３３［１９９９］、Ｍａａｔｔａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ７９：１２１０［１９９９］、Ｓｃｈｒｏｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．，９０：１８１７［１９９８］）。血清ＰＳＡ検査の主な限界は、特にＰＳＡ検出における中程度の範囲（４〜１０ｎｇ／ｍｌ）で、前立腺癌に対する感受性および特異性が不足していることである。血清ＰＳＡレベルの上昇は、良性前立腺過形成（ＢＰＨ）および前立腺炎等の非悪性の病態を有する患者においても検出されることがあり、検出された癌の悪性度に関する情報がほとんど得られない。血清ＰＳＡ検査の増加と同じ時期に、前立腺針生検が行われる数が劇的に増加した（Ｊａｃｏｂｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＪＡＭＡ ２７４：１４４５［１９９５］）。これにより、不確かな前立腺針生検が急増する結果となった（Ｅｐｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｐｏｔｔｅｒ Ｊ．Ｕｒｏｌ．，１６６：４０２［２００１］）。そのため、新しい治療標的および薬剤の開発が必要とされている。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、癌の治療、管理、および／または研究において用途を見出す治療剤に関する。具体的には、本発明は、癌（例えば、前立腺癌、乳癌、他の固形腫瘍、多発性骨髄腫）における多発性骨髄腫ＳＥＴドメイン保有タンパク質（ＭＭＳＥＴ）の発現を標的とする小分子および核酸に関する。
【００１０】
ＭＭＳＥＴ（ウォルフ・ヒルシュホーン症候群候補１（ＷＨＳＣ１）または核内ＳＥＴドメイン保有タンパク質２（ＮＳＤ２）としても知られる）は、リシン３６のヒストンＨ３をジメチル化することで知られるヒストンメチルトランスフェラーゼ（Ｈ３−Ｋ３６−ジメチルまたはＨ３−Ｋ３６−Ｍｅ２と称される修飾）である。ＭＭＳＥＴは、染色体完全性を促進し、複数の癌において異常に発現される。多発性骨髄腫において、ＭＭＳＥＴがｔ（４；１４）（ｐ１６ｑ３２）染色体転座に関与する患者は、そのような転座のない多発性骨髄腫患者と比較して１５％の再発率および予後の悪化を経験する（Ｉｎｔｉｎｉ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．１２６：４３７、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）。転座陽性多発性骨髄腫細胞におけるＭＭＳＥＴノックダウンは、そのような細胞の増殖および腫瘍形成能に強い影響を与える（Ｂｒｉｔｏ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ ９４：７８、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）。本発明のいくつかの実施形態を開発する過程で実施した実験により、転移性前立腺癌および乳癌におけるＭＭＳＥＴの過剰発現が示された（図８）。別のヒストンメチルトランスフェラーゼＥＺＨ２の発現と相関する発現（図８）。さらに、ＭＭＳＥＴノックダウンは、高悪性度の前立腺癌細胞株の細胞増殖および浸潤の低下をもたらし（図５）、癌細胞の増殖におけるＭＭＳＥＴの重要な役割を裏付けた。したがって、この酵素を阻害することは、治療的な影響を有する。いくつかの実施形態において、ＭＭＳＥＴの阻害剤（例えば、低分子阻害剤、ｓｉＲＮＡ阻害剤、抗体阻害剤）は、これらに限定されないが、前立腺癌、乳癌、および多発性骨髄腫を含むＭＭＳＥＴに関連する状態および疾患の治療において用途を見出す。
【００１１】
本発明の方法および組成物は、対象における種々の癌の種類において用途を見出す。いくつかの実施形態において、本発明の方法および組成物は、前立腺癌の治療または予防において用途を見出す。いくつかの実施形態において、本発明の方法および組成物は、乳癌の治療または予防において用途を見出す。いくつかの実施形態において、本発明の方法および組成物は、多発性骨髄腫の治療はまたは予防において用途を見出す。対象は、本明細書に記載される化合物の投与から恩恵を受けることができるあらゆる動物である。いくつかの実施形態において、対象は哺乳動物であり、例えば、ヒト、霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、例えばラットまたはマウス等のげっ歯類である。典型的には、対象はヒトである。
【００１２】
本発明の方法は、ＭＭＳＥＴ活性（例えば、ＭＭＳＥＴを阻害する）薬剤に関する投薬、製剤、投与経路、または時間的な投与計画に限定されない。いくつかの実施形態において、ＭＭＳＥＴ活性薬剤の投与量は、１日あたり約２ｍｇ〜約２，０００ｍｇであり、疾患の標的、患者、および投与経路に依存して必然的に変動が生じる。いくつかの実施形態において、投与量は、１日体重１ｋｇ当たり約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇの範囲、より好ましくは約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約２ｍｇ／ｋｇの範囲、最も好ましくは約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約０．２ｍｇの範囲で経口投与される。投与経路は、これらに限定されないが、経口、局所、および非経口（例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、くも膜下腔内、動脈内、経鼻、または肺内投与）を含む。本発明は、ＭＭＳＥＴ活性薬剤（例えば、ＭＭＳＥＴ阻害剤）の投与の時間的態様によって制限されない。ＭＭＳＥＴ活性薬剤は、単独で、または１つ以上の他の薬剤（複数可）、例えば、１つ以上の他の化学療法剤（複数可）と組み合わせて投与されてもよい。別の薬剤（複数可）と組み合わせて投与される場合、投与の順序に関係なく、そのような投与は同時にまたは逐次的に起こってもよい。ＭＭＳＥＴ活性薬剤療法は、１日当たり１〜５０回、またはそれよりも少ない回数で（例えば、隔日、３日毎、４日毎、５日毎、６日毎、週１回、月１回、３ヵ月毎）投与されてもよい。ＭＭＳＥＴ活性薬剤療法は、１日、１週間、１ヶ月間、１年間、１０年間、または１０年以上継続されてもよい。
【００１３】
本発明の文脈内で「治療する」とは、疾患もしくは障害と関連する症状の全体的または部分的な軽減、あるいはそれらの症状のさらなる進行もしくは悪化を遅延、阻害、または停止すること、あるいはその疾患もしくは障害を発症するリスクのある対象における疾患または障害の防止または予防を意味する。したがって、例えば、転移性前立腺癌の治療は、癌の転移を阻害または防止すること、転移の速度および／または数の減少、転移した前立腺癌の腫瘍量の減少、転移した前立腺癌の全体的または部分的な寛解、あるいは任意の他の治療効果を含み得る。本明細書において使用される場合、「治療的に有効な量」の本発明の化合物とは、疾患もしくは障害と関連する症状を全体的にまたは部分的に軽減する、あるいはそれらの症状のさらなる進行もしくは悪化を遅延、阻害、または停止させる、あるいはその疾患もしくは障害を発症するリスクのある対象において疾患または障害を防止または予防する化合物の量を指す。
【００１４】
本発明の実施形態の方法および組成物は、それらがＭＭＳＥＴに影響を与える機構によって限定されない。いくつかの実施形態において、ＭＭＳＥＴのｍＲＮＡ発現（例えば、癌細胞における発現）（例えば、前立腺癌細胞またはそれらの前駆体における発現、乳癌細胞またはそれらの前駆体における発現、形質細胞または形質細胞前駆体における発現）が影響を受ける。いくつかの実施形態において、ＭＭＳＥＴのｍＲＮＡ転写率が変化する（例えば、低下する）。いくつかの実施形態において、ＭＭＳＥＴのｍＲＮＡ転写安定性が変化する（例えば、ＭＭＳＥＴのｍＲＮＡ転写物が不安定になるか、または分解しやすくなる）。いくつかの実施形態において、ＭＭＳＥＴのタンパク質レベルが影響を受ける（例えば、低下する）（例えば、前立腺癌細胞またはそれらの前駆体において低下する、乳癌細胞またはそれらの前駆体において低下する、形質細胞またはそれらの前駆体において低下する）。いくつかの実施形態において、ＭＭＳＥＴのタンパク質分子の安定性が変化する（例えば、低下する）。いくつかの実施形態において、ＭＭＳＥＴのタンパク質の１つ以上の活性が変化する。いくつかの実施形態において、ＭＳＥＴのメチル化活性が阻害される。いくつかの実施形態において、ＭＭＳＥＴと基質との相互作用が影響を受ける（例えば、阻害される、促進する、不可逆性になる、弱まる、非特異性になる、特異性がより高くなる）。いくつかの実施形態において、ＭＭＳＥＴ制御因子の活性（例えば、正の制御因子、負の制御因子）が影響を受ける。
【００１５】
特定の実施形態において、本発明は、細胞の増殖を阻害する方法であって、ＭＭＳＥＴを発現する細胞を細胞中のＭＭＳＥＴの少なくとも１つの活性を阻害する薬剤に接触させることを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、ＭＭＳＥＴ薬剤は、小分子、ｓｉＲＮＡ、または抗体等の種類であるが、他も企図される。いくつかの実施形態において、小分子は、３−ヒドラジニルキノキサリン−２−チオールである。いくつかの実施形態において、細胞は、癌細胞である。いくつかの実施形態において、癌細胞は、前立腺癌細胞、前立腺癌細胞前駆体、乳癌細胞、乳癌細胞前駆体、形質細胞、または形質細胞前駆体等の種類のものである。いくつかの実施形態において、癌細胞は、前立腺癌細胞である。
【００１６】
特定の実施形態において、本発明は、ヒストンＨ３のリシン３６のメチル化を阻害することを含む、細胞の増殖を阻害する方法を提供する。いくつかの実施形態において、ヒストンＨ３のリシン３６のメチル化は、ジメチル化からなる。いくつかの実施形態において、ヒストンＨ３のリシン３６のメチル化は、トリメチル化からなる。いくつかの実施形態において、阻害は、ＭＭＳＥＴの少なくとも１つの活性を変化させることによって起こる。例えば、いくつかの実施形態において、ＭＭＳＥＴの活性は、ＭＭＳＥＴの酵素活性、ＭＭＳＥＴの転写レベル、またはＭＭＳＥＴのタンパク質レベルである。いくつかの実施形態において、ＭＭＳＥＴ酵素活性は、メチル化を含む。
【００１７】
特定の実施形態において、本発明は、細胞中のＭＭＳＥＴの少なくとも１つの活性を阻害する薬剤を含む、薬学的組成物を提供する。いくつかの実施形態において、薬剤は、核酸である。いくつかの実施形態において、薬剤は、小分子である。いくつかの実施形態において、薬剤は、小分子である。いくつかの実施形態において、薬剤は、３−ヒドラジニルキノキサリン−２−チオールである。
【００１８】
本明細書に含まれる教示を踏まえると、関連技術分野の当業者にはさらなる実施形態が明白であろう。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】前立腺癌におけるＷｈｓｃ１（ＭＭＳＥＴ）の過剰発現を示す。発現レベルは、公的に利用可能なデータ（Ｏｎｃｏｍｉｎｅ）（Ｖａｒａｍｂａｌｌｙ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２２：１６９５−１６９９、Ｙｕ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎｅｏｐｌａｓｉａ ９：２９２−３０３、Ｌａｐｏｉｎｔｅ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６７：８５０４−８５１０、Ｌａｐｏｉｎｔｅ ｅｔ ａｌ．（２００４）ＰＮＡＳ １０１：８１１−８１６、各々は、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）を用いて調査した。
【図２】前立腺試料全体にわたるＭＭＳＥＴ発現を示す。
【図３】前立腺細胞株のパネルにおけるＭＭＳＥＴ発現を示す。
【図４】ＭＭＳＥＴノックダウンが、Ｈ３Ｋ３６のジメチル化を特異的に減少させることを示す。
【図５】ＭＭＳＥＴノックダウンが、ＤＵ１４５細胞の増殖を減少させることを示す。
【図６】ＭＭＳＥＴノックダウンがＰＣ３細胞に与える影響を示す。
【図７】ＭＣＴＰ３９がＤＵ１４５細胞の増殖および浸潤に与える影響を示す。
【図８】切除した前立腺の転移性組織におけるＷＨＳＣ１（ＭＭＳＥＴ）およびＥｚｈ２の過剰発現を示す。ＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲを行って、ＭＭＳＥＴ１およびＥｚｈ２ ｍＲＮＡの発現を判定した。
【図９】ＭＣＴＰ３９（３−ヒドラジニルキノキサリン−２−チオール）で処理したＤＵ１４５細胞に示された位置におけるヒストンＨ３のメチル化修飾のレベルを示す。
【図１０】ＭＣＴＰ３９（３−ヒドラジニルキノキサリン−２−チオール）の化学構造を示す。
【図１１】ＥＺＨ２の標的としてのＨ３Ｋ３６ｍｅ２マーカーの同定を示す。
【図１２】ＥＺＨ２が、ＭＭＳＥＴを制御することによってＨ３Ｋ３６ｍｅ２に間接的に影響を与えることを示す。
【図１３】ＥＺＨ２が、正常細胞においてＭＭＳＥＴの発現を誘導することを示す。
【図１４】ＥＺＨ２が、ｍｉＲＮＡのＭＭＳＥＴ標的化を抑制したことを示す。
【図１５】ＭＭＳＥＴノックダウンが、前立腺癌の増殖、浸潤、および遊走に影響を与えることを示す。
【図１６】ＭＭＳＥＴの減少が、ＣＡＭモデルにおける基底膜の浸潤および転移を減衰させることを示す。
【図１７】ＭＭＳＥＴの過剰発現が、Ｈ３Ｋ３６ｍｅ２マーク、ならびにより高い細胞増殖および浸潤を誘導することを示す。
【図１８】ＭＭＥＳＴノックダウンが、ＥＺＨ２媒介性細胞浸潤を減衰させることを示す。
【図１９】複数の癌におけるＭＭＳＥＴの高い発現を示す。
【図２０】前立腺癌試料におけるＥＺＨ２とＭＭＳＥＴの発現との相関を示す。
【図２１】前立腺癌におけるＥＺＨ２およびＭＭＳＥＴの発現のｑＰＣＲバリデーションを示す。
【図２２】複数の癌細胞株および前立腺組織におけるＥＺＨ２およびＭＭＳＥＴの発現を示す。
【図２３】ＭＣＴＰ３９がＭＭＳＥＴの活性に与える影響を示す。
【図２４】ＭＣＴＰ３９が、Ｈ３Ｋのメチル化、ならびに癌細胞の増殖および浸潤に与える影響を示す。
【図２５】ＭＣＴＰ３９が転座陽性ＭＭ細胞株に対して特異性を示すことを示す。
【図２６】ＭＣＴＰ３９が、異種移植腫瘍の腫瘍量を減少させることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
定義
本発明を理解しやすくするために、いくつかの用語および表現を以下の通り定義する。
【００２１】
本明細書において使用される場合、「ＭＭＳＥＴの少なくとも１つの生物学的活性を阻害する」という用語は、ＭＭＳＥＴタンパク質に直接接触するか、ＭＭＳＥＴのｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡに接触するか、ＭＭＳＥＴのポリペプチドの立体構造的変化を引き起こすか、ＭＭＳＥＴのタンパク質レベルを低下させるか、またはシグナルパートナーとのＭＭＳＥＴの相互作用に干渉して、ＭＭＳＥＴ標的遺伝子の発現に影響を与えることにより、ＭＭＳＥＴのあらゆる活性（例えば、これに限定されないが、本明細書に記載される活性を含む）を低下させる任意の薬剤を指す。また、阻害剤は、上流または下流のシグナル分子を妨害することによってＭＭＳＥＴの生物学的活性を間接的に制御する分子も含む。
【００２２】
本明細書において使用される場合、「対象」とは、これらに限定されないが、特定の治療のレシピエントとなる、ヒト、ヒト以外の霊長類、げっ歯類等を含むあらゆる動物（例えば、哺乳動物）を指す。典型的には、「対象」および「患者」という用語は、本明細書においてヒト対象を指して交換可能に用いられる。
【００２３】
本明細書において使用される場合、「癌マーカー遺伝子」という用語は、その発現レベルが、単独でまたは他の遺伝子と合わさって、癌または癌の予後と相関する遺伝子を指す。相関性は、遺伝子発現の低下または増加のいずれかに関する可能性がある。例えば、遺伝子の発現は、癌の予兆であり得るか、または遺伝子の発現不足は、癌患者の予後不良と相関する可能性がある。いくつかの実施形態において、癌マーカー遺伝子は、抗癌剤の標的としての役割を果たす。いくつかの実施形態において、癌マーカー遺伝子は、癌の悪性度（例えば、侵襲性）の指標としての役割を果たす。
【００２４】
本明細書において使用される場合、「癌と診断された対象」という用語は、検査を受け、癌性細胞を有することが発見された対象を指す。癌は、これらに限定されないが、生検、Ｘ線、血液検査、および本発明の診断法を含むいずれの好適な方法を用いて診断されてもよい。
【００２５】
本明細書において使用される場合、「ヒト以外の動物」という用語は、これらに限定されないが、げっ歯類、ヒト以外の霊長類、ヒツジ、ウシ、反芻動物、ウサギ、ブタ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、鳥類等の、脊椎動物を含む全てのヒト以外の動物を指す。
【００２６】
本明細書において使用される場合、「遺伝子導入システム」という用語は、核酸配列を含む組成物を細胞または組織に送達する任意の手段を指す。例えば、遺伝子導入システムは、これらに限定されないが、ベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、および他の核酸ベースの送達システム）、裸の核酸の微量注入、ポリマーベースの送達システム（例えば、リポソームベースおよび金属粒子ベースのシステム）、バイオリスティック注入等を含む。本明細書において使用される場合、「ウイルス遺伝子導入システム」という用語は、所望の細胞または組織への試料の送達を促進するためのウイルス要素（例えば、無傷のウイルス、変化したウイルス、および核酸またはタンパク質等のウイルス成分）を含む遺伝子導入システムを指す。本明細書において使用される場合、「アデノウイルス遺伝子導入システム」という用語は、アデノウイルス科に属する無傷のウイルスまたは変化したウイルスを含む遺伝子導入システムを指す。
【００２７】
本明細書において使用される場合、「核酸分子」という用語は、これに限定されないが、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む、任意の核酸含有分子を指す。この用語は、これらに限定されないが、４−アセチルシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、シュードイソシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルシュードウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５´−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、オキシブトキソシン、シュードウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、シュードウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、および２，６−ジアミノプリンを含む、ＤＮＡおよびＲＮＡの既知の塩基類似体のうちのいずれかを含む配列を包含する。
【００２８】
「遺伝子」という用語は、ポリペプチド、前駆体、またはＲＮＡ（例えば、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ）の生成に必要なコード配列を含む核酸（例えば、ＤＮＡ）配列を指す。全長または断片の所望の活性または機能特性（例えば、酵素活性、リガンド結合、シグナル伝達、免疫原性等）が保持される限り、ポリペプチドは、全長コード配列、またはコード配列の任意の部分によってコード化することができる。また、この用語は、構造遺伝子のコード領域、ならびに、遺伝子が全長ｍＲＮＡの長さに対応するように、いずれかの末端に約１ｋｂ以上の距離で５´および３´末端の両方のコード領域に隣接して位置する配列も包含する。コード領域の５´に位置し、かつｍＲＮＡ上に存在する配列は、５´非翻訳配列と称される。コード領域の３´または下流に位置し、かつｍＲＮＡ上に存在する配列は、３´非翻訳配列と称される。「遺伝子」という用語は、遺伝子のｃＤＮＡおよびゲノム形態の両方を包含する。遺伝子のゲノム形態またはクローンは、「イントロン」または「介在領域」または「介在配列」と称される非コード配列によって分断されるコード領域を含む。イントロンは、核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）に転写される遺伝子のセグメントであり、イントロンは、エンハンサー等の制御要素を含み得る。イントロンは、核転写物または一次転写物から除去されるか、または「スプライシングで切り出され」、したがって、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写物には含まれない。ｍＲＮＡは、翻訳の間に、新生ポリペプチドにおけるアミノ酸の配列または順序を特定するよう機能する。
【００２９】
本明細書において使用される場合、「遺伝子発現」という用語は、遺伝子内でコードされた遺伝子情報を、遺伝子の「転写」により（すなわち、ＲＮＡポリメラーゼの酵素作用を介して）ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ）に変換するプロセス、またタンパク質コード遺伝子の場合には、ｍＲＮＡの「翻訳」によってタンパク質に変換するプロセスを指す。遺伝子発現は、プロセスにおける多くの段階で制御することができる。「上方制御」または「活性化」は、遺伝子発現産物（すなわち、ＲＮＡまたはタンパク質）の生成を増加させる制御を指し、「下方制御」または「抑制」とは、生成を低下させる制御を指す。上方制御または下方制御に関与する分子（例えば、転写因子）は、それぞれ「活性化因子」および「抑制因子」と称されることが多い。
【００３０】
イントロンを含むことの他に、遺伝子のゲノム形態は、ＲＮＡ転写物上に存在する配列の５’末端および３’末端の両方に位置する配列も含み得る。これらの配列は、「フランキング」配列または領域と称される（これらのフランキング配列は、ｍＲＮＡ転写物上に存在する非翻訳配列の５’または３’に位置する）。５’フランキング領域は、遺伝子の転写を制御するかまたはそれに影響を与えるプロモーターおよびエンハンサー等の制御配列を含み得る。３’フランキング領域は、転写の終了、転写後切断、およびポリアデニル化を指示する配列を含み得る。
【００３１】
「野生型」という用語は、天然の発生源から単離された遺伝子または遺伝子産物を指す。野生型遺伝子は、集団において最も頻繁に観察される遺伝子であり、したがって、任意に設計される「正常な」または「野生型」の遺伝子の形態である。反対に、「修飾された」または「変異体」という用語は、野生型遺伝子または遺伝子産物と比較した場合に、配列または機能特性における修飾（すなわち、変化した特徴）を示す遺伝子または遺伝子産物を指す。天然に発生する変異体を単離することができることに留意されたい；これらは、野生型遺伝子または遺伝子産物と比較した場合に、変化した特徴（核酸配列の変化）を有するという事実によって同定される。
【００３２】
本明細書において使用される場合、「〜をコードする核酸分子」、「〜をコードするＤＮＡ配列」、および「〜をコードするＤＮＡ」という用語は、デオキシリボ核酸の鎖に沿ったデオキシリボヌクレオチドの順序または配列を指す。これらのデオキシリボヌクレオチドの順序は、ポリペプチド（タンパク質）鎖に沿ったアミノ酸の順序を決定する。したがって、ＤＮＡ配列は、アミノ酸配列をコードする。
【００３３】
本明細書において使用される場合、「オリゴヌクレオチド」という用語は、１本鎖ポリヌクレオチド鎖の長さの短いものを指す。オリゴヌクレオチドは、典型的には２００残基長未満（例えば、１５〜１００）であるが、本明細書において使用される場合、この用語は、より長いポリヌクレオチド鎖を包含することも意図する。オリゴヌクレオチドは、その長さで称されることが多い。例えば、２４残基のオリゴヌクレオチドは、「２４塩基長」と称される。オリゴヌクレオチドは、自己ハイブリダイズすることによって、または他のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることによって、２次および３次構造を形成することができる。そのような構造は、これらに限定されないが、２本鎖、ヘアピン、十字型、屈曲型、および３本鎖を含むことができる。
【００３４】
本明細書において使用される場合、「相補的」または「相補性」という用語は、塩基対合規則によって関連付けられるポリヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチドの配列）に関連して使用される。例えば、配列「５’−Ａ−Ｇ−Ｔ−３’」は、配列「３’−Ｔ−Ｃ−Ａ−５’」に相補的である。相補性は「部分的」であってもよく、その場合、核酸の塩基の一部のみが塩基対合規則に従ってマッチする。または、核酸間には「完全」または「全」相補性が存在してもよい。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率および強度に著しい影響を有する。このことは、増幅反応、および核酸間の結合に依存する検出方法において、特に重要である。
【００３５】
「相同性」という用語は、相補性の程度を指す。部分相同性および完全相同性（すなわち同一性）が存在し得る。部分的に相補的な配列は、完全に相補的な核酸分子が「実質的に相同」である標的核酸にハイブリダイズするのを少なくとも一部阻害する核酸分子である。完全に相補的な配列の標的配列へのハイブリダイゼーションを阻害することは、低ストリンジェンシー条件下でのハイブリダイゼーションアッセイ（サザンまたはノーザンブロット法、溶液ハイブリダイゼーション等）を用いて調べることができる。実質的に相同である配列またはプローブは、低ストリンジェンシー条件下における完全に相同な核酸分子の標的への結合（すなわち、ハイブリダイゼーション）と競合しかつそれを阻害する。これは、低ストリンジェンシー条件が非特異的結合を可能にするような条件であることを意味するものではない：低ストリンジェンシー条件は、２つの配列の互いへの結合が特定の（すなわち選択的な）相互作用であることを必要とする。非特異的結合が存在しないことは、実質的に非相補的（例えば、同一性が約３０％未満）である第２の標的の使用によって検査することができ、非特異的結合が存在しない場合、プローブは、第２の非相補的な標的にハイブリダイズしない。
【００３６】
ｃＤＮＡまたはゲノムクローン等の２本鎖核酸配列に関連して使用される場合、「実質的に相同である」という用語は、上述のような低ストリンジェンシー条件下で２本鎖核酸配列の一方または両方の鎖にハイブリダイズできる任意のプローブを指す。
【００３７】
遺伝子は、一次ＲＮＡ転写物の差次的スプライシングによって生成される複数のＲＮＡ種を生成し得る。同じ遺伝子のスプライス変異体であるｃＤＮＡは、配列同一性または完全相同性の領域（同じエクソンまたは両ｃＤＮＡ上の同一エクソンの一部の存在を表す）および完全非同一性の領域（例えば、ｃＤＮＡ１上にエクソン「Ａ」の存在を示し、代わりにｃＤＮＡ２はエクソン「Ｂ」を含む）を有する。２つのｃＤＮＡが配列同一性の領域を含むため、これらはどちらも、遺伝子全体または両方のｃＤＮＡに見られる配列を含む遺伝子の一部に由来するプローブにハイブリダイズする：２つのスプライス変異体は、このようなプローブに対しておよび互いに実質的に相同である。
【００３８】
本明細書において使用される場合、「ハイブリダイゼーション」という用語は、相補的な核酸の対合に関連して用いられる。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの強度（すなわち核酸間の会合の強度）は、核酸間の相補性の程度、関連条件のストリンジェンシー、形成されるハイブリッドのＴｍ、および核酸内のＧ：Ｃ比等の要因によって影響を受ける。その構造内に相補的な核酸の対を含む単一分子は、「自己ハイブリダイズ」していると言われる。
【００３９】
本明細書において使用される場合、「Ｔｍ」という用語は、「融解温度」に関連して用いられる。融解温度は、２本鎖核酸分子の集団が半分融解して一本鎖になる温度である。核酸のＴｍを算出するための方程式は、当該技術分野において周知である。標準的な参考文献によって示されるように、核酸が１Ｍ ＮａＣｌの水溶液中にある場合、Ｔｍ値の単純推定値は、方程式Ｔｍ＝８１．５＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）によって算出することができる（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ，Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｆｉｌｔｅｒ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ， ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ［１９８５］を参照のこと）。他の参考文献は、Ｔｍの算出のために構造的および配列的特性を考慮に入れたより複雑な計算を含む。
【００４０】
本明細書において使用される場合、「ストリンジェンシー」という用語は、核酸ハイブリダイゼーションが行われる温度、イオン強度、および有機溶媒等の他の化合物の存在といった条件に関連して使用される。「低ストリンジェンシー条件」下において、対象とする核酸配列は、その完全な補体、単一の塩基ミスマッチを有する配列、密接に関連する配列（例えば、９０％以上の相同性を有する配列）、および部分的な相同性のみを有する配列（例えば、５０〜９０％の相同性を有する配列）とハイブリダイズする。「中程度のストリンジェンシー条件」下において、対象とする核酸配列は、その完全な補体、単一の塩基ミスマッチを有する配列、および密接に関連する配列（例えば、９０％以上の相同性）とのみハイブリダイズする。「高ストリンジェンシー条件」下において、対象とする核酸配列は、その完全な補体、および（温度等の条件に依存して）単一の塩基ミスマッチを有する配列とのみハイブリダイズする。換言すると、高ストリンジェンシーの条件下では、単一の塩基ミスマッチを有する配列とのハイブリダイゼーションを排除するために温度を上昇させることができる。
【００４１】
ヌクレオチド配列に関連して本明細書において使用される「一部」という用語（「所与のヌクレオチド配列の一部」のように）は、その配列の断片を指す。断片は、４ヌクレオチド〜全ヌクレオチド配列から１ヌクレオチドを差し引いた範囲のサイズであり得る（１０ヌクレオチド、２０、３０、４０、５０、１００、２００等）。
【００４２】
本明細書において使用される場合、「ベクター」という用語は、１つの細胞から別の細胞にＤＮＡセグメント（複数可）を移す核酸分子に関連して用いられる。「ビヒクル」という用語が、「ベクター」と交換可能に用いられることがある。ベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、または植物性もしくは動物性ウイルスに由来することが多い。
【００４３】
本明細書において使用される「発現ベクター」という用語は、所望のコード配列および特定の宿主生物において操作可能に連結されたコード配列の発現に必要な、適切な核酸配列を含む組換えＤＮＡ分子を指す。通常、原核生物における発現に必要な核酸配列は、多くの場合は他の配列に沿って、プロモーター、オペレーター（任意選択的）、およびリボソーム結合部位を含む。真核生物細胞は、プロモーター、エンハンサー、ならびに終止およびポリアデニル化シグナルを利用することが分かっている。
【００４４】
「過剰発現」および「過剰発現する」という用語ならび文法上の均等物は、対照または非トランスジェニック動物における所与の組織に観察されるよりも約３倍高い（またはそれを上回る）発現のレベルを意味するためにｍＲＮＡのレベルに関連して用いられる。ｍＲＮＡのレベルは、これに限定されないがノーザンブロット分析を含む当業者に既知の多くの技術のうちのいずれかを用いて測定される。分析される各組織からローディングされたＲＮＡの量の違いと照合するために、ノーザンブロットに適切な対照が含まれる（例えば、各試料中に存在する、全ての組織中に本質的に同じ量で存在する豊富なＲＮＡ転写物である２８ＳのｒＲＮＡの量を、ノーザンブロット上で観察されるｍＲＮＡ特異的シグナルを正規化または標準化するための手段として用いることができる）。正しくスプライスされた導入遺伝子のＲＮＡに大きさが対応するバンドに存在するｍＲＮＡの量を定量化する：導入遺伝子のプローブとハイブリダイズする他の微量なＲＮＡ種は、導入遺伝子のｍＲＮＡの発現の定量化においては考慮されない。
【００４５】
本明細書で使用される「トランスフェクション」という用語は、真核生物細胞への外来性ＤＮＡの導入を指す。トランスフェクションは、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈降、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、ポリブレン媒介性トランスフェクション、電気穿孔、マイクロインジェクション、リポソーム融合、リポフェクション、プロトプラスト融合、レトロウイルス感染、および微粒子銃を含む、当該技術分野で既知の様々な手段によって達成することができる。
【００４６】
「安定したトランスフェクション」または「安定にトランスフェクトされた」という用語は、トランスフェクトされた細胞のゲノムへの外来性ＤＮＡの導入および組込みを指す。「安定したトランスフェクタント」という用語は、外来性ＤＮＡがゲノムＤＮＡに安定に組み込まれた細胞を指す。
【００４７】
「一過性のトランスフェクション」または「一過性にトランスフェクトされた」という用語は、トランスフェクトされた細胞のゲノムに外来性ＤＮＡが組み込むことができない場合の、外来性ＤＮＡの細胞への導入を指す。外来性ＤＮＡは、トランスフェクトされた細胞の核に数日間留まる。この間、外来性ＤＮＡは、染色体において内因性遺伝子の発現を司る調節制御を受ける。「一過性のトランスフェクタント」という用語は、外来性ＤＮＡを取り込んだが、このＤＮＡを組み込むことができなかった細胞を指す。
【００４８】
本明細書において使用される場合、「細胞培養物」という用語は、任意のインビトロ細胞の培養物を指す。この用語には、連続細胞系（例えば、不死化表現型を有する）、初代細胞培養物、形質転換細胞系、有限細胞系（例えば、非形質転換細胞）、およびインビトロで維持される任意の他の細胞集団が含まれる。
【００４９】
使用される場合、「真核生物」という用語は、「原核生物」と区別可能な生物を指す。この用語は、通常の真核生物の特徴、例えば、その中に染色体が存在する、核膜によって仕切られた真核の存在、膜結合細胞小器官の存在、および真核生物において一般的に観察される他の特徴を示す細胞を有する全ての生物を包含することが意図される。したがって、この用語は、これらに限定されないが、真菌、原生動物、および動物（例えば、ヒト）等の生物を含む。
【００５０】
本明細書において使用される場合、「インビトロ」という用語は、人工的な環境、および人工的な環境内で起こるプロセスまたは反応を指す。インビトロ環境は、これらに限定されないが、試験管および細胞培養物から構成され得る。「インビボ」という用語は、天然の環境（例えば、動物または細胞）、および天然の環境内で起こるプロセスまたは反応を指す。
【００５１】
「試験化合物」および「候補化合物」という用語は、疾患、疾病、病気もしくは身体機能の障害（例えば、癌）を治療または予防するために用いられる任意の化学物質、医薬品、薬物等を指す。試験化合物は、既知の治療化合物および潜在的な治療化合物の両方を含む。試験化合物は、本発明のスクリーニング法を用いたスクリーニングによって治療効果があるかどうかを判定することができる。本発明のいくつかの実施形態において、試験化合物は、アンチセンス化合物を含む。
【００５２】
本明細書において使用される場合、「試料」という用語は、その最も広義において用いられる。１つの意味において、それは、任意の源から得られた検体または培養物、ならびに生物学的試料および環境試料を含むことを意味する。生物学的試料は、動物（ヒトを含む）から得られてもよく、流体、固体、組織、および気体を包含する。生物学的試料は、血漿、血清等の血液製剤を含む。しかしながら、このような例は、本発明に適用可能な試料の種類を限定するものであると解釈されるべきではない。
【００５３】
「化学部分」という用語は、少なくとも１つの炭素原子を含有む任意の化学化合物を指す。化学部分の例として、これらに限定されないが、芳香族化学部分、硫黄を含む化学部分、窒素を含む化学部分、親水性化学部分、および疎水性化学部分が挙げられる。
【００５４】
本明細書において使用される場合、「脂肪族」という用語は、これらに限定されないが、アルキル、アルケニル、アルキニル、脂環を含む基を意味する。
【００５５】
本明細書において使用される場合、「アリール」という用語は、フェニル環等の単一芳香族環、または２つ以上の芳香族環（例えば、ビスフェニル、ナフタレン、アントラセン）、または芳香族環および１つ以上の非芳香族環を意味する。アリール基は、任意選択的に低級脂肪族基（例えば、アルキル、アルケニル、アルキニル、または脂環）で置換されてもよい。また、脂肪族およびアリール基は、これらに限定されないが、−ＮＨ２、−ＮＨＣＯＣＨ３、−ＯＨ、低級アルコキシ（Ｃ１−Ｃ４）、ハロ（−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、または−Ｉ）を含む１つ以上の官能基でさらに置換されてもよい。
【００５６】
本明細書において使用される場合、「置換脂肪族」という用語は、脂肪族水素原子のうちの少なくとも１つが、例えば、ハロゲン、アミノ、ヒドロキシ、ニトロ、チオ、ケトン、アルデヒド、エステル、アミド、低級脂肪族、置換低級脂肪族、または環（アリール、置換アリール、環状脂肪族、もしくは置換環状脂肪族等）で置換されたアルカン、アルケン、アルキン、または脂環族部分を示す。そのような例として、１−クロロエチル等が挙げられるが、これに限定されない。
【００５７】
本明細書において使用される場合、「置換アリール」という用語は、環炭素上の水素原子のうちの少なくとも１つが、例えば、ハロゲン、アミノ、ヒドロキシ、ニトロ、チオ、ケトン、アルデヒド、エステル、アミド、低級脂肪族、置換低級脂肪族、または環（アリール、置換アリール、環状脂肪族、もしくは置換環状脂肪族）で置換された、芳香族環または少なくとも１つの芳香族環からなる縮合芳香族環系を指す。そのような例として、ヒドロキシフェニル等が挙げられるが、これに限定されない。
【００５８】
本明細書において使用される場合、「環状脂肪族」という用語は、縮合環系を含む脂肪族構造を指す。そのような例として、デカリン等が挙げられるが、これに限定されない。
【００５９】
本明細書において使用される場合、「置換環状脂肪族」という用語は、脂肪族水素原子のうちの少なくとも１つが、ハロゲン、ニトロ、チオ、アミノ、ヒドロキシ、ケトン、アルデヒド、エステル、アミド、低級脂肪族、置換低級脂肪族、または環（アリール、置換アリール、環状脂肪族、もしくは置換環状脂肪族）で置換された環状脂肪族構造を指す。そのような例として、１−クロロデカリル、ビシクロ−ヘプタン、オクタン、およびノナン（例えば、ノルボルニル）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６０】
本明細書において使用される場合、「複素環」という用語は、例えば、１つ以上のヘテロ原子を含む芳香族または非芳香族環を意味する。ヘテロ原子は、互いに同じかまたは異なり得る。ヘテロ原子の例として、これらに限定されないが、窒素、酸素、および硫黄が挙げられる。芳香族および非芳香族複素環は、当該技術分野において周知である。芳香族複素環のいくつかの非限定的な例として、ピリジン、ピリミジン、インドール、プリン、キノリン、およびイソキノリンが挙げられる。非芳香族複素環化合物の非限定的な例として、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン、ピロリジン、およびピラゾリジンが挙げられる。酸素含有複素環の例として、これらに限定されないが、フラン、オキシラン、２Ｈ−ピラン、４Ｈ−ピラン、２Ｈ−クロメン、およびベンゾフランが挙げられる。硫黄含有複素環の例として、これらに限定されないが、チオフェン、ベンゾチオフェン、およびパラチアジンが挙げられる。窒素含有複素環の例としての例として、これらに限定されないが、ピロール、ピロリジン、ピラゾール、ピラゾリジン、イミダゾール、イミダゾリン、イミダゾリジン、ピリジン、ピペリジン、ピラジン、ピペラジン、ピリミジン、インドール、プリン、ベンゾイミダゾール、キノリン、イソキノリン、トリアゾール、およびトリアジンが挙げられる。２つの異なるヘテロ原子を含む複素環の例として、これらに限定されないが、フェノチアジン、モルホリン、パラチアジン、オキサジン、オキサゾール、チアジン、およびチアゾールが挙げられる。複素環は、任意選択的に、脂肪族、ニトロ、アセチル（すなわち、−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ３）、またはアリール基から選択される１つ以上の基でさらに置換されてもよい。
【００６１】
本明細書において使用される場合、「置換複素環」という用語は、環炭素原子のうちの少なくとも１つが、酸素、窒素、または硫黄で置換され、脂肪族水素原子のうちの少なくとも１つが、ハロゲン、ヒドロキシ、チオ、ニトロ、アミノ、ケトン、アルデヒド、エステル、アミド、低級脂肪族、置換低級脂肪族、または環（アリール、置換アリール、環状脂肪族、もしくは置換環状脂肪族）で置換された複素環構造を指す。そのような例として、２−クロロピラニルが挙げられるが、これに限定されない。
【００６２】
本明細書において使用される場合、「リンカー」という用語は、２つの異なる構造部分を接続する最大８個の近接する原子を含む鎖を指し、この場合、そのような原子は、例えば、炭素、窒素、酸素、または硫黄である。エチレングリコールは、１つの非限定的な例である。
【００６３】
本明細書において使用される場合、「低級アルキル置換アミノ」という用語は、最大８個の炭素原子を含み、脂肪族水素原子のうちの１つがアミノ基で置換された、任意のアルキル単位を指す。そのような例として、エチルアミノ等が挙げられるが、これに限定されない。
【００６４】
本明細書において使用される場合「低級アルキル置換ハロゲン」という用語は、最大８個の炭素原子を含み、脂肪族水素原子のうちの１つがハロゲンで置換された、任意のアルキル単位を指す。そのような例として、クロロエチル等が挙げられるが、これに限定されない。
【００６５】
本明細書において使用される場合、「アセチルアミノ」という用語は、アセチル化された任意の一級または二級アミノを意味する。そのような例として、アセトアミド等が挙げられるが、これに限定されない。
【００６６】
本明細書において使用される場合、「水素結合に関与する部分」または「水素結合に関与する化学部分」という用語は、プロトンを受容するかまたは供与し、それによって水素結合を形成する基を意味する。水素結合に関与する部分のいくつかの具体的な非限定的な例として、当技術分野で周知のフルオロ、酸素含有基および窒素含有基が挙げられる。水素結合に関与する酸素含有基のいくつかの例として、以下が挙げられる：ヒドロキシ、低級アルコキシ、低級カルボニル、低級カルボキシル、低級エーテル、およびフェノール基。本明細書で使用される「低級」という修飾語は、それぞれの酸素含有官能基が結合した低級脂肪族基（Ｃ１〜Ｃ４）を指す。このように、例えば、「低級カルボニル」という用語は、とりわけ、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒドを指す。水素結合形成に関与する窒素含有基のいくつかの非限定的な例として、アミノおよびアミド基が挙げられる。さらに、酸素原子および窒素原子の両方を含む基も、水素結合の形成に関与することができる。そのような基の例として、ニトロ、Ｎ−ヒドロキシ、および亜硝酸基が挙げられる。また、本発明における水素結合受容体は、芳香族環のπ電子である可能性もある。
【００６７】
化合物の「誘導体」という用語は、本明細書において使用される場合、化学修飾された化合物を指し、該化学修飾は、化合物の官能基または骨格のいずれかで起こる。そのような誘導体として、これらに限定されないが、アルコール含有化合物のエステル、カルボキシ含有化合物のエステル、アミン含有化合物のアミド、カルボキシ含有化合物のアミド、アミノ含有化合物のイミン、アルデヒド含有化合物のアセタール、カルボニル含有化合物のケタール等が挙げられる。
【００６８】
本明細書において使用される場合、「薬学的に許容される塩」という用語は、対象に投与されると、本発明の化合物またはその活性代謝産物もしくは残渣を提供することができる、本発明の化合物の任意の薬学的に許容される塩（例えば、酸または塩基）を指す。当業者には既知であるように、本発明の化合物の「塩」は、無機または有機の酸および塩基に由来してもよい。酸の例として、これらに限定されないが、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、過塩素酸、フマル酸、マレイン酸、リン酸、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、コハク酸、トルエン−ｐ−スルホン酸、酒石酸、酢酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ギ酸、安息香酸、マロン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、ベンゼンスルホン酸等が挙げられる。シュウ酸等の他の酸は、それら自体は薬学的に許容されないが、本発明の化合物およびそれらの薬学的に許容される酸付加塩を得る際の中間体として有用な塩の調製において用いられてもよい。
【００６９】
塩基の例として、これらに限定されないが、アルカリ金属（例えば、ナトリウム）水酸化物、アルカリ土類金属（例えば、マグネシウム）水酸化物、アンモニア、および式ＮＷ４＋（式中、ＷはＣ１−４アルキル等である）の化合物等が挙げられる。
【００７０】
塩の例として、これらに限定されないが、以下が挙げられる：アセテート、アジペート、アルギネート、アスパルテート、ベンゾエート、ベンゼンスルホネート、ビスルフェート、ブチラート、シトレート、カンフォレート、カンフォスルホネート、シクロペンタンプロピオネート、ジグルコネート、ドデシルスルフェート、エタンスルホネート、フマレート、フルコヘプタノエート、グリセロホスフェート、ヘミスルフェート、ヘプタノエート、ヘキサノエート、ヒドロクロリド、ヒドロブロミド、ヒドロイオダイド、２−ヒドロキシエタンスルホネート、ラクテート、マレアート、メタンスルホネート、２−ナフタレンスルホネート、ニコチネート、オキサレート、パルモアート、ペクチネート、ペルスルフェート、フェニルプロピオネート、ピクレート、ピバレート、プロピオネート、スクシネート、タルトレート、チオシアネート、トシレート、ウンデカノアート等。塩の他の例として、Ｎａ＋、ＮＨ４＋、およびＮＷ４＋（式中、ＷはＣ１−４アルキル基である）等の好適なカチオンと配合した本発明の化合物のアニオン等が挙げられる。
【００７１】
治療上の用途のために、本発明の化合物の塩は、薬学的に許容されることが意図される。しかしながら、薬学的に許容されない酸および塩基の塩も、例えば、薬学的に許容される化合物の調製または精製において用途を見出すことができる。
【００７２】
本明細書において使用される場合、「ｓｉＲＮＡ」という用語は、低分子干渉ＲＮＡを指す。いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡは、約１８〜２５ヌクレオチド長の２本鎖または２本鎖領域を含む：ｓｉＲＮＡは、各鎖の３´末端に約２〜４個の不対ヌクレオチドを含むことが多い。ｓｉＲＮＡの２本鎖または２本鎖領域のうちの少なくとも１つの鎖は、標的ＲＮＡ分子に実質的に相同であるか、または実質的に相補的である。標的ＲＮＡ分子に相補的な鎖は「アンチセンス」鎖であり、標的ＲＮＡ分子に相同的な鎖は「センス」鎖であり、それはｓｉＲＮＡアンチセンス鎖に相補的でもある。また、ｓｉＲＮＡは、付加的な配列を含み得る：そのような配列の非限定的な例として、連結配列またはループ、ならびにステムおよび他の折り畳み構造が挙げられる。ｓｉＲＮＡは、無脊椎動物および脊椎動物においてＲＮＡ干渉を引き起こす際、ならびに植物において転写後遺伝子サイレンシングの間に配列特異的ＲＮＡ分解を引き起こす際に、重要な中間体として機能すると考えられる。
【００７３】
「ＲＮＡ干渉」または「ＲＮＡｉ」という用語は、ｓｉＲＮＡによる遺伝子発現のサイレンシングまたは減少を指す。これは、その２本鎖領域内で、サイレンシングされる遺伝子の配列に相同なｓｉＲＮＡによって開始される、動物および植物における配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングのプロセスである。遺伝子は、その生物に内因性または外来性であり得、染色体に組み込まれて存在するか、またはゲノムに組み込まれていないトランスフェクションベクター中に存在してもよい。遺伝子の発現は、完全にまたは一部阻害される。また、ＲＮＡｉは、標的ＲＮＡの機能を阻害するとも考えられ得、標的ＲＮＡの機能は、完全または部分的であり得る。
【００７４】
本発明は、癌の治療、管理、および／または研究において用途を見出す治療剤に関する。具体的には、本発明は、癌（例えば、前立腺癌、乳癌、他の固形腫瘍、多発性骨髄腫）におけるＭＭＳＥＴの発現を標的とする小分子および核酸に関する。
【００７５】
多発性骨髄腫ＳＥＴドメイン（ＭＭＳＥＴ）（ＦＬＪ２３２８６、ＫＩＡＡ１０９０、ＭＧＣ１７６６３８、ＮＳＤ２、核内ＳＥＴドメイン保有タンパク質２、タンパク質トライソラクス−５、ＲＥＩＩＢＰ、ＴＲＸ５、ＷＨＳ、ウォルフ・ヒルシュホーン症候群候補１タンパク質、ＮＳＤ２、およびＷＨＳＣ１としても知られる）は、ｔ（４；１４）に関連する多発性骨髄腫（ＭＭ）におけるＩｇＨ遺伝子座への融合によって同定され、染色体制御因子内に見られるドメイン（ＳＥＴドメインを含む）を保有する。ＭＭＳＥＴは、ウォルフ・ヒルシュホーン症候群において欠失した、ヒストンメチルトランスフェラーゼである。その基質特異性は異なる。Ｈ３Ｋ３６のジメチル化活性およびＨ３Ｋ３６のトリメチル化活性の両方が報告されている。ＭＭＳＥＴは、そのＨＭＧドメインを介してアンドロゲン受容体（ＡＲ）と相互作用し、受容体媒介性の転写を増強する。ＭＭＳＥＴは、ＨＤＡＣ１およびＨＤＡＣ２、ｍＳｉｎ３ａ、ならびにＬＳＤ１と複合体を形成し、ＭＭ細胞における機能の研究に基づいた細胞周期の正の制御因子である。
【００７６】
本発明の実施形態を開発する過程で実施した実験により、前立腺組織試料（転移性組織を含む）および細胞株中に著しく高いＭＭＳＥＴの発現が同定された（図１、図２、図３、図８）。ＭＭＳＥＴのノックダウンは、転移性前立腺癌細胞株ＤＵ１４５およびＰＣ３の増殖および浸潤の低下をもたらした。ＭＭＳＥＴのノックダウンは、Ｈ３Ｋ３６のジメチル化を特異的に低下させ、Ｅｚｈ２（ｚｅｓｔｅ２のエンハンサー）のノックダウンでも同じ効果を観察することができた（図４）。また、ＭＭＳＥＴノックダウンは、ＤＵ１４５細胞の増殖能および侵襲性（図５）ならびにＰＣ３細胞の侵襲性（図６）も減少させた。ＭＣＴＰ３９とも称されるＮ３９（ＭＭＳＥＴ阻害剤）は、非常に低い濃度でＤＵ１４５細胞事象の増殖および浸潤に影響を与えた（図７）。Ｎ３９は、ＤＵ１４５細胞においてＨ３Ｋ２７のトリメチル化、Ｈ３Ｋ３６のトリメチル化、およびＨ３Ｋ３６のジメチル化を低下させた（図９）。
【００７７】
Ｉ．ＭＭＳＥＴを標的とする癌治療
いくつかの実施形態において、本発明は、癌（例えば、前立腺癌、乳癌、他の固形腫瘍、多発性骨髄腫）の治療を提供する。いくつかの実施形態において、治療は、ＭＭＳＥＴ、ＭＭＳＥＴの制御因子、ＭＭＳＥＴと相互作用するタンパク質、および／またはＭＭＳＥＴの標的（複数可）を標的とする。
【００７８】
Ａ．低分子療法
いくつかの実施形態において、本発明は、ＭＭＳＥＴの発現または活性の低分子阻害剤を提供する。例示的な低分子化合物として、本明細書に記載されるものが挙げられるが（例えば、ＭＣＴＰ３９（３−ヒドラジニルキノキサリン−２−チオール）およびその誘導体）、これに限定されない。
【００７９】
いくつかの実施形態において、これらの化合物は、単独で、または本明細書に記載される追加の治療剤と組み合わせて、ＭＭＳＥＴの阻害に（例えば、癌治療薬として）おいて用途を見出す。
【００８０】
Ｂ．ＲＮＡ干渉およびアンチセンス療法
いくつかの実施形態において、本発明は、ＭＭＳＥＴの発現を標的とする。例えば、いくつかの実施形態において、本発明は、ＭＭＳＥＴをコードする核酸分子の機能を調節し、最終的には発現されるＭＭＳＥＴの量を調節する際に使用するための、オリゴマーアンチセンスまたはＲＮＡｉ化合物、特に、オリゴヌクレオチド（例えば、本明細書に記載されるもの）を含む組成物を用いる。
【００８１】
１． ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）
いくつかの実施形態において、ＭＭＳＥＴタンパク質の機能を阻害するためにＲＮＡｉが用いられる。ＲＮＡｉは、ヒトを含むほとんどの真核生物における外来遺伝子の発現をコントロールするための進化する上で保存された細胞防御を表す。ＲＮＡｉは、典型的には２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって誘導され、ｄｓＲＮＡに応じて相同な１本鎖標的ＲＮＡの配列特異的なｍＲＮＡ分解を引き起こす。ｍＲＮＡ分解の介在物質は、通常、細胞中の酵素切断によって長鎖ｄｓＲＮＡから生成される低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）２本鎖である。ｓｉＲＮＡは、一般に、約２１ヌクレオチド長（例えば２１〜２３ヌクレオチド長）であり、２つのヌクレオチド３’−オーバーハングによって特徴付けられる塩基対構造を有する。低分子ＲＮＡまたはＲＮＡｉの細胞内への導入後、この配列は、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体）と称される酵素複合体に送達されると考えられる。ＲＩＳＣは、標的を認識し、エンドヌクレアーゼで切断する。より大きなＲＮＡ配列が細胞に送達される場合、ＲＮａｓｅＩＩＩ酵素（Ｄｉｃｅｒ）は、より長いｄｓＲＮＡを２１〜２３ｎｔのｄｓ−ｓｉＲＮＡ断片に変換することに留意されたい。
【００８２】
化学的に合成されたｓｉＲＮＡは、培養体細胞における哺乳類の遺伝子機能の全ゲノム的解析のための強力な試薬となっている。遺伝子機能を検証するためのそれらの価値以外にも、ｓｉＲＮＡは、遺伝子特異的治療薬としての大きな可能性も有する（Ｔｕｓｃｈｌ ａｎｄ Ｂｏｒｋｈａｒｄｔ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔ．２００２；２（３）：１５８−６７、参照により本明細書に組み込まれる）。
【００８３】
動物細胞へのｓｉＲＮＡのトランスフェクションは、特定の遺伝子の強力で長期的な転写後サイレンシングをもたらす（Ｃａｐｌｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．２００１；９８：９７４２−７、Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ．２００１；４１１：４９４−８、Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２００１；１５： １８８−２００、およびＥｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．２００１；２０：６８７７−８８、これらは全て、参照により本明細書に組み込まれる）。ｓｉＲＮＡを用いてＲＮＡｉを行うための方法および組成物は、例えば米国特許第６，５０６，５５９号に記載され、参照により本明細書に組み込まれる。
【００８４】
ｓｉＲＮＡは、伸長タンパク質によって、多くの場合は検出不能なレベルまで、標的となるＲＮＡの量を減少させる際に極めて効果的である。サイレンシング効果は、数ヶ月間持続し得、標的ＲＮＡとｓｉＲＮＡの中心領域との間の１つのヌクレオチドミスマッチがサイレンシングを防ぐのに十分であることが多いため、極めて特異的である（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００２；２９６：５５０−３、およびＨｏｌｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００２；３０：１７５７−６６、これらは両方とも、参照により本明細書に組み込まれる）。
【００８５】
ｓｉＲＮＡの設計における重要な要因は、ｓｉＲＮＡ結合のための到達可能な部位の存在である。Ｂａｈｏｉａ ｅｔ ａｌ．，（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００３；２７８：１５９９１−１５９９７、参照により本明細書に組み込まれる）は、効果的なｓｉＲＮＡを設計するためにｍＲＮＡ内の到達可能な部位を見つけるための、走査アレイと称される一種のＤＮＡアレイの使用について記載している。これらのアレイは、物理的バリア（マスク）を使用して、配列に各塩基を段階的に加えることによって合成される、モノマーから特定の最大サイズにまで及ぶオリゴヌクレオチド、通常はコマー（ｃｏｍｅｒ）を含む。したがって、これらのアレイは、標的遺伝子の領域の完全なオリゴヌクレオチド補体を表す。これらのアレイとの標的ｍＲＮＡのハイブリダイゼーションは、標的ｍＲＮＡのこの領域に関する徹底した到達性プロファイルを提供する。そのようなデータは、有効性および標的特異性を保持するためにオリゴヌクレオチド長と結合親和性との間の妥協点に達することが重要であるアンチセンスオリゴヌクレオチド（７塩基長〜２５塩基長の範囲）の設計に有用である（Ｓｏｈａｉｌ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２００１；２９（１０）：２０４１− ２０４５）。ｓｉＲＮＡｓを選択するためのさらなる方法および検討事項は、例えば、国際公開第ＷＯ０５０５４２７０号、第ＷＯ０５０３８０５４Ａ１号、第ＷＯ０３０７０９６６Ａ２号、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００５ Ｍａｙ １３；３４８（４）：８８３−９３，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００５ Ｍａｙ １３；３４８（４）：８７１−８１、およびＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００３ Ａｕｇ １；３１（１５）：４４１７−２４に記載され、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。また、ｓｉＲＮＡを選択する際に使用するためのソフトウェア（例えば、ＭＷＧオンラインｓｉＭＡＸ ｓｉＲＮＡデザインツール）が市販されているかまたは一般に入手可能である。
【００８６】
いくつかの実施形態において、本発明は、平滑末端（例えば、米国特許第２００８０２００４２０号を参照のこと（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる））、オーバーハング（例えば、米国特許第２００８０２６９１４７Ａ１号を参照のこと（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる））、固定核酸（例えば、国際公開第ＷＯ２００８／００６３６９号、第ＷＯ２００８／０４３７５３号、および第ＷＯ２００８／０５１３０６号を参照のこと（それらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））を含むｓｉＲＮＡを用いる。いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡは、遺伝子発現を介して、または細菌を使用して送達される（例えば、Ｘｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２４：６（２００６）および国際公開第ＷＯ０６０６６０４８号を参照、それらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【００８７】
他の実施形態において、ｓｈＲＮＡ法（例えば、第２００８００２５９５８号を参照、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）が用いられる。低分子ヘアピンＲＮＡまたはショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉を介して遺伝子発現をサイレンシングするために使用することができる急なヘアピンカーブを形成するＲＮＡの配列である。ｓｈＲＮＡは、細胞に導入されたベクターを使用し、ｓｈＲＮＡが常に発現されていることを確実にするためにＵ６プロモーターを用いる。このベクターは、通常、娘細胞に継承され、遺伝子サイレンシングが受け継がれることを可能にする。ｓｈＲＮＡヘアピン構造は、細胞機構によってｓｉＲＮＡへと切断され、次いで、ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と結合する。この複合体は、それに結合するｓｉＲＮＡにマッチするｍＲＮＡに結合して切断する。ｓｈＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによって転写される。
【００８８】
好ましい実施形態において、ｓｉＲＮＡベースの治療薬は、後に記載するように薬学的組成物として調剤される。好ましい実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡ組成物の投与は、癌において測定可能な減少（例えば、腫瘍の減少または排除、形質細胞の過剰増殖の減少）をもたらす。
【００８９】
２． アンチセンス
他の実施形態において、ＭＭＳＥＴタンパク質の発現は、ＭＭＳＥＴをコードする１つ以上の核酸と特異的にハイブリダイズするアンチセンス化合物を使用して調節される。オリゴマー化合物のその標的核酸との特異的ハイブリダイゼーションは、核酸の正常な機能を妨げる。特異的にハイブリダイズする化合物によるこの標的核酸の機能の調節は、一般的に「アンチセンス」と称される。妨げられるＤＮＡの機能は、複製および転写を含む。妨げられるＲＮＡの機能は、例えば、タンパク質翻訳部位へのＲＮＡの転座、ＲＮＡからのタンパク質の翻訳、１つ以上のｍＲＮＡ種を生じるようなＲＮＡのスプライシング、およびＲＮＡに関与し得るまたはＲＮＡによって促進され得る触媒活性等の全ての重要な機能を含む。標的核酸の機能に対するこのような干渉の全体的な影響は、ＭＭＳＥＴの発現の調節である。本発明の文脈において、「調節」とは、遺伝子の発現における増大（刺激）または減少（阻害）のいずれかを意味する。例えば、発現は、腫瘍増殖を防ぐために阻害され得る。
【００９０】
アンチセンスに特異的な核酸を標的とすることが好ましい。本発明の文脈において、特定の核酸に対するアンチセンス化合物を「標的化する」ことは、多段階にわたるプロセスである。通常、このプロセスは、機能が調節される核酸配列の同定から始まる。これは、例えば、特定の疾患または病態に関連する細胞遺伝子（もしくは遺伝子から転写されたｍＲＮＡ）、または感染病原体由来の核酸分子であってもよい。本発明において、標的は、ＭＭＳＥＴをコードする核酸分子である。また、標的化プロセスは、所望の効果、例えば、タンパク質の発現の検出または調節がもたらされるようにアンチセンスの相互作用を生じさせるための遺伝子内の１つの部位または複数の部位の特定も含む。本発明の文脈において、好ましい遺伝子内の部位は、遺伝子の翻訳領域（ＯＲＦ）の翻訳開始コドンまたは終止コドンを包含する領域である。翻訳開始コドンは、典型的には５´−ＡＵＧ（転写されたｍＲＮＡ分子において、対応するＤＮＡ分子においては５´−ＡＴＧ）であるため、翻訳開始コドンは「ＡＵＧコドン」、「開始コドン」、または「ＡＵＧ開始コドン」とも称される。少数の遺伝子は、ＲＮＡ配列５´−ＧＵＧ、５´−ＵＵＧまたは５´−ＣＵＧ、および５´−ＡＵＡを有する翻訳開始コドンを有し、５´−ＡＣＧおよび５´−ＣＵＧは、インビボで機能することが分かっている。したがって、各場合において、開始アミノ酸が典型的にはメチオニン（真核生物において）またはホルミルメチオニン（原核生物において）であっても、「翻訳開始コドン」および「開始コドン」という用語は、多くのコドン配列を包含することができる。真核生物および原核生物の遺伝子は、２つ以上の代替の開始コドンを有し得、これらのうちのいずれか１つが、特定の細胞型もしくは組織において、または特定の条件下で、翻訳開始に優先的に用いることができる。本発明の文脈において、「開始コドン」および「翻訳開始コドン」とは、そのようなコドンの配列に関係なく、本発明の腫瘍抗原をコードする遺伝子から転写されたｍＲＮＡの翻訳を開始するためにインビボで使用される１つまたは複数のコドンを指す。
【００９１】
遺伝子の翻訳終止コドン（または「停止コドン」）は、３つの配列（すなわち、５´−ＵＡＡ、５´−ＵＡＧ、および５´−ＵＧＡ、対応するＤＮＡ配列は、それぞれ５´−ＴＡＡ、５´−ＴＡＧ、および５´−ＴＧＡ）のうちの１つを有し得る。「開始コドン領域」および「翻訳開始コドン領域」という用語は、翻訳開始コドンからいずれかの方向（すなわち、５´または３´）に約２５〜約５０個の近接するヌクレオチドを包含するそのようなｍＲＮＡまたは遺伝子の一部分を指す。同様に、「停止コドン領域」および「翻訳終止コドン領域」という用語は、翻訳終止コドンからいずれかの方向（すなわち、５´または３´）に約２５〜約５０個の近接するヌクレオチドを包含するそのようなｍＲＮＡまたは遺伝子の一部分を指す。
【００９２】
翻訳開始コドンと翻訳終止コドンとの間の領域を指す翻訳領域（ＯＲＦ）または「コード領域」とは、効果的に標的とされ得る領域でもある。他の標的領域は、翻訳開始コドンから５´方向にあるｍＲＮＡの部分を意味し、したがって、５´キャップ部位とｍＲＮＡの翻訳開始コドンとの間のヌクレオチドまたは遺伝子上の対応するヌクレオチドを含む５´非翻訳領域（５´ＵＴＲ）と、翻訳終止コドンから３´方向にあるｍＲＮＡの部分を意味し、したがって翻訳終止コドンとｍＲＮＡの３´末端との間のヌクレオチドまたはその遺伝子上の対応するヌクレオチドを含む３´非翻訳領域（３´ＵＴＲ）とを含む。ｍＲＮＡの５´キャップは、ｍＲＮＡの最も５´側の残基に５´−５´トリホスフェート結合を介して結合するＮ７−メチル化グアノシン残基を含む。ｍＲＮＡの５´キャップ領域は、５´キャップ構造自体、およびそのキャップに隣接する第１の５０ヌクレオチドを含むと考えられる。キャップ領域も、好ましい標的領域であり得る。
【００９３】
真核生物のｍＲＮＡ転写物の中には直接的に翻訳されるものもあるが、その多くは、翻訳される前に転写物から切除される「イントロン」として知られる１つ以上の領域を含む。残りの（したがって翻訳された）領域は、「エクソン」として知られ、ともにスプライスされて連続的なｍＲＮＡ配列を形成する。ｍＲＮＡスプライス部位（すなわち、イントロン−エクソン接合部）も、好ましい標的領域であり得、異常なスプライシングが疾患と関連する状況、または特定のｍＲＮＡスプライス産物の過剰生成が疾患と関連している状況において、特に有用である。再配列または欠失による異常な融合接合部も、好ましい標的である。イントロンは、例えば、ＤＮＡまたはプレｍＲＮＡを標的とするアンチセンス化合物の、効果的な、したがって好ましい標的領域であり得ることも分かっている。
【００９４】
いくつかの実施形態において、アンチセンス阻害のための標的部位は、市販のソフトウェアプログラム（例えば、Ｂｉｏｇｎｏｓｔｉｋ、Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ（Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＳｙｓＡｒｒｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｂａｎｇａｌｏｒｅ（Ｉｎｄｉａ）、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｖｅｒｐｏｏｌ（Ｌｉｖｅｒｐｏｏｌ，Ｅｎｇｌａｎｄ）、ＧｅｎｅＴｒｏｖｅ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））を使用して同定される。他の実施形態において、アンチセンス阻害のための標的部位は、国際公開第ＷＯ０１９８５３７Ａ２号に記載される到達可能部位法を用いて同定され、参照により、本明細書に組み込まれる。
【００９５】
一旦、１つ以上の標的部位が同定されると、所望の効果を付与するように、標的に十分相補的な（すなわち、十分に、かつ十分な特異性を持って、ハイブリダイズする）オリゴヌクレオチドが選択される。例えば、本発明の好ましい実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、開始コドンまたその近くを標的とする。
【００９６】
この発明の文脈において、アンチセンス組成物および方法に関する「ハイブリダイゼーション」とは、相補的なヌクレオシドまたはヌクレオチド塩基間でのワトソン−クリック、フーグスティーン、または逆フーグスティーン水素結合等の水素結合を意味する。例えば、アデニンおよびチミンは、水素結合の形成によって対合する相補的な核酸塩基である。標的核酸が特異的にハイブリダイズ可能な核酸であるために、アンチセンス化合物の配列がその標的核酸の配列に１００％相補的である必要はないことを理解されたい。アンチセンス化合物は、標的ＤＮＡまたはＲＮＡ分子への化合物の結合が、標的ＤＮＡまたはＲＮＡの正常な機能を妨げて有用性の損失を引き起こし、アンチセンス化合物の非標的配列への非特異的結合を回避するのに十分な程度の相補性がある場合に、特異的な結合が所望される条件下で（すなわち、インビボアッセイまたは治療処置の場合は生理学的条件下で、またインビトロアッセイの場合は、アッセイが実施される条件下で）、特異的にハイブリダイズ可能である。
【００９７】
アンチセンス化合物は、研究試薬および診断薬として一般的に使用される。例えば、特異性を持って遺伝子発現を阻害することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、特定の遺伝子の機能を解明するために使用することができる。また、アンチセンス化合物は、例えば、種々の生物学的経路の機能を識別するためにも使用される。
【００９８】
アンチセンスの特異性および感度は、治療上の用途にも適用される。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、動物およびヒトにおける病態の治療における治療部分として用いられてきた。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、安全かつ効果的にヒトに投与されてきており、現在、数多くの臨床試験が行われている。したがって、オリゴヌクレオチドは、細胞、組織、および動物、特にヒトの治療のための治療計画において有用であるように構成することができる、有用な治療様式であることが確立されている。
【００９９】
アンチセンスオリゴヌクレオチドがアンチセンス化合物の好ましい形態である一方で、本発明は、これに限定されないが、後に記載するようなオリゴヌクレオチド模倣体を含む他のオリゴマーのアンチセンス化合物を包含する。より長い配列およびより短い配列のどちらも本発明とともに使用され得るが、この発明によるアンチセンス化合物は、好ましくは約８〜約３０個の核酸塩基（すなわち、約８〜約３０個の結合塩基）を含む。特に好ましいアンチセンス化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、さらにより好ましくは、約１２〜約２５の核酸塩基を含む化合物である。
【０１００】
本発明を用いると有用である好ましいアンチセンス化合物の具体例として、修飾された主鎖または非天然ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドが挙げられる。本明細書において定義されるように、修飾された主鎖を有するオリゴヌクレオチドは、主鎖中にリン原子を保持するものおよび主鎖中にリン原子を有さないものを含む。本明細書の目的のために、それらのヌクレオシド主鎖中にリン原子を有さない修飾されたオリゴヌクレオチドも、オリゴヌクレオシドと見なすことができる。
【０１０１】
好ましい修飾されたオリゴヌクレオチド主鎖は、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルおよび他のアルキルホスホネート（３´−アルキレンホスホネートおよびキラルのホスホネートを含む）、ホスフィネート、ホスホロアミデート（３´−アミノホスホロアミデートおよびアミノアルキルホスホロアミデート、チオノホスホロアミデートを含む）、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、および正常な３´−５´結合を有するボラノホスフェート、これらの２´−５´結合類似体、ならびにヌクレオシド単位の隣接する対が結合５´−３´に対しては３´−５´または５´−２´に対しては２´−５´である反転極性を有するものを含む。種々の塩、混合塩類、および遊離酸型も含まれる。
【０１０２】
その中にリン原子を含まない好ましい修飾されたオリゴヌクレオチド主鎖は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間の結合、または１つ以上の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環ヌクレオシド間結合によって形成される主鎖を有する。これらは、モルホリノ結合（ヌクレオシドの糖部分から一部形成される）、シロキサン主鎖、硫化物、スルホキシドおよびスルホン主鎖、ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖、メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖、アルケン含有主鎖、スルファメート主鎖、メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ主鎖、スルホネートおよびスルホンアミド主鎖、アミド主鎖、ならびにＮ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２成分の部分を混合して有する他のものを有するものを含む。
【０１０３】
他の好ましいオリゴヌクレオチド模倣体において、ヌクレオチド単位の糖およびヌクレオシド間結合（すなわち、主鎖）の両方が、新規の基で置換される。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。このようなオリゴマー化合物の１つである、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが分かっているオリゴヌクレオチド模倣体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と称される。ＰＮＡ化合物において、オリゴヌクレオチドの糖−主鎖は、アミドを含む主鎖、特にアミノエチルグリシン主鎖で置換される。核酸塩基は、保持されて、主鎖のアミド部分のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合する。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許として、これらに限定されないが、米国特許第５，５３９，０８２号、第５，７１４，３３１号、および第５，７１９，２６２号が挙げられ、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。ＰＮＡ化合物のさらなる教示は、Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１４９７（１９９１）に見出すことができる。
【０１０４】
本発明の最も好ましい実施形態は、ホスホロチオエート主鎖を有するオリゴヌクレオチドおよびヘテロ原子主鎖を有するオリゴヌクレオシドであり、特に、−−ＣＨ２、−−ＮＨ−−Ｏ−−ＣＨ２−−、−−ＣＨ２−−Ｎ（ＣＨ３）−−Ｏ−−ＣＨ２−−［メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ主鎖として知られる］、−−ＣＨ２−−Ｏ−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２−−、−−ＣＨ２−−Ｎ（ＣＨ３）−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２−−、上述の米国特許第５，４８９，６７７号記載の−−Ｏ−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２−−ＣＨ２−−［式中、未変性のホスホジエステル主鎖は−−Ｏ−−Ｐ−−Ｏ−−ＣＨ２−−で表される］、および上述の米国特許第５，６０２，２４０号記載のアミド主鎖を有するものである。また、上述の米国特許第５，０３４，５０６号記載のモルホリノ主鎖構造を有するオリゴヌクレオチドも好ましい。
【０１０５】
修飾されたオリゴヌクレオチドは、１つ以上の置換された糖部分を有してもよい。好ましいオリゴヌクレオチドは、以下のうちの１つを２´位に有する：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキル（アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、置換または未置換のＣ１―１０アルキルまたはＣ２−Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルであってもよい）。特に好ましいものは、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２であり、式中、ｎおよびｍは１〜約１０である。他の好ましいオリゴヌクレオチドは、以下のうちの１つを２´位に有する：Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリルもしくはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を向上させるための基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を向上させるための基、および同様の特性を有する他の置換基。好ましい修飾は、２´−メトキシエトキシ（２´−Ｏ−−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３であり、２´−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２´−ＭＯＥとしても知られている）（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ７８：４８６［１９９５］）、すなわち、アルコキシアルコキシ基を含む。さらに好ましい修飾は、２´−ＤＭＡＯＥとしても知られる２´−ジメチルアミノオキシエトキシ（すなわち、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基）、および２´−ジメチルアミノエトキシエトキシ（当該技術分野において２´−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチルまたは２´−ＤＭＡＥＯＥとしても知られる）、すなわち、２´−Ｏ−−ＣＨ２−−Ｏ−−ＣＨ２−−Ｎ（ＣＨ２）２を含む。
【０１０６】
他の好ましい修飾は、２´−メトキシ（２´−Ｏ−−ＣＨ３）、２´−アミノプロポキシ（２´−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、および２´−フルオロ（２´−Ｆ）を含む。同様の修飾が、オリゴヌクレオチド上の他の位置、特に３´末端ヌクレオチドまたは２´−５´結合オリゴヌクレオチド上の糖の３´位、および５´末端ヌクレオチドの５´位にも形成され得る。また、オリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分等の糖模倣体を有していてもよい。
【０１０７】
また、オリゴヌクレオチドは、核酸塩基（当該技術分野において、単純に「塩基」と称されることが多い）の修飾または置換を含んでもよい。本明細書において使用される場合、「未修飾の」または「天然の」核酸塩基は、プリン塩基アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）を含む。修飾された核酸塩基は、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシン、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ（特に５−ブロモ）、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニン、ならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニン等の、他の合成および天然の核酸塩基を含む。さらなる核酸塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されるものを含む。これらの核酸塩基のうちのいくつかは、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を高めるために特に有用である。それらは、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、および５−プロピニルシトシンを含む、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびにＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリンを含む。５−メチルシトシン置換は、０．６〜１．２℃で核酸２本鎖の安定性を増加させることが分かっており、現在のところ好ましい塩基置換であり、特に、２´−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わせた場合により一層好ましい。
【０１０８】
本発明のオリゴヌクレオチドの別の修飾は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞内分布、または細胞内取り込みを増強する１つ以上の部分またはコンジュゲートのオリゴヌクレオチドへの化学的結合に関与する。そのような部分は、これらに限定されないが、脂質部分、例えば、コレステロール部分、コール酸、チオエーテル、（例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール）、チオコレステロール、脂肪族鎖、（例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基）、リン脂質、（例えば、ジヘキサデシル−ｒａｃ‐グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ‐グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート）、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖、またはアダマンタン酢酸、パルミチル部分、あるいはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分を含む。
【０１０９】
関連技術分野の当業者は、上記修飾を含むオリゴヌクレオチドの生成の仕方を十分に分かっている。本発明は、上述のアンチセンスオリゴヌクレオチドに限定されるものではない。任意の好適な修飾または置換が用いられ得る。
【０１１０】
所与の化合物におけるすべての位置が均一に修飾される必要はなく、実際、上記修飾のうちの１つ以上が、オリゴヌクレオチド内の単一化合物または単一ヌクレオシドにさえも組み込まれ得る。本発明は、キメラ化合物であるアンチセンス化合物も包含する。本発明の文脈において「キメラ」アンチセンス化合物または「キメラ」は、アンチセンス化合物であり、特に、各々が少なくとも１つのモノマー単位（すなわち、オリゴヌクレオチド化合物の場合はヌクレオチド）からなる、化学的に異なる２つ以上の領域を含むオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは、典型的には、ヌクレアーゼ分解に対する耐性の増加、細胞内取り込みの増加、および／または標的核酸に対する結合親和性の増大をヌクレオチドに付与するようにオリゴヌクレオチドが修飾された、少なくとも１つの領域を含む。オリゴヌクレオチドのさらなる領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断することができる酵素の基質としての役割を果たし得る。例として、ＲＮａｓｅＨは、ＲＮＡ：ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞内エンドヌクレアーゼである。したがって、ＲＮａｓｅＨの活性化は、ＲＮＡ標的の切断を生じ、それによって遺伝子発現のオリゴヌクレオチド阻害の効率を大幅に高める。その結果、同じ標的領域にハイブリッド形成するホスホロチオエートデオキシオリゴヌクレオチドと比べて、キメラオリゴヌクレオチドを用いた場合、より短い鎖のオリゴヌクレオチドで同程度の結果が得られることが多い。ＲＮＡ標的の切断は、ゲル電気泳動によって、また必要に応じて、当該技術分野において既知である関連する核酸ハイブリダイゼーション技法によって、ルーチン的に検出することができる。
【０１１１】
本発明のキメラアンチセンス化合物は、２つ以上のオリゴヌクレオチド、修飾されたオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシドおよび／または上述のようなオリゴヌクレオチド模倣体の複合構造として形成され得る。
【０１１２】
本発明は、以下に記載する本発明のアンチセンス化合物を含む薬学的組成物および製剤も含む。
【０１１３】
Ｃ．遺伝子療法
本発明は、ＭＭＳＥＴの発現を操作する際に使用するための任意の遺伝子操作の使用を企図する。遺伝子操作の例として、これらに限定されないが、遺伝子ノックアウト（例として、例えば組換えを用いて、染色体からＭＭＳＥＴ遺伝子を除去する）、誘導性プロモーターを含む／含まないアンチセンスコンストラクトの発現等が挙げられる。インビトロまたはインビボでの核酸コンストラクトの細胞への送達は、任意の好適な方法を用いて実施され得る。好適な方法とは、所望の事象（例えば、アンチセンスコンストラクトの発現）が起こるように核酸コンストラクトを細胞に導入する方法である。また、遺伝子療法は、（例えば、誘導性プロモーター（例えば、アンドロゲン応答性プロモーター）による刺激の際に）インビボで発現されるｓｉＲＮＡまたは他の干渉する分子を送達するためにも用いられ得る。
【０１１４】
遺伝子情報を保有する分子の細胞内への導入は、これらに限定されないが、裸のＤＮＡコンストラクトの直接注入、該コンストラクトを添加した金粒子を用いた打ち込み、および例えば、リポソーム、生体高分子等を用いた、巨大分子の介在による遺伝子導入等を含む種々の方法のうちのいずれかによって達成される。好ましい方法は、これらに限定されないが、アデノウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、およびアデノ随伴ウイルス等の、ウイルス由来の遺伝子送達ビヒクルを用いる。レトロウイルスと比較すると効率がより高いため、アデノウイルス由来のベクターは、核酸分子をインビボで宿主細胞に導入するための好ましい遺伝子送達ビヒクルである。アデノウイルスベクターは、動物モデルにおける様々な固形腫瘍および免疫欠乏マウスにおけるヒト固形腫瘍異種移植片に、非常に効率的なインビボ遺伝子導入を提供することが分かっている。遺伝子導入のためのアデノウイルスベクターおよび方法の例は、国際公開第ＷＯ００／１２７３８号および第ＷＯ００／０９６７５号、ならびに米国特許出願第６，０３３，９０８号、第６，０１９，９７８号、第６，００１，５５７号、第５，９９４，１３２号、第５，９９４，１２８号、第５，９９４，１０６号、第５，９８１，２２５号、第５，８８５，８０８号、第５，８７２，１５４号、第５，８３０，７３０号、および第５，８２４，５４４号に記載され、それらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１１５】
ベクターは、様々な方法において対象に投与され得る。例えば、本発明のいくつかの実施形態において、ベクターは、直接注射を用いて、腫瘍または腫瘍を伴う組織に投与される。他の実施形態において、投与は、血液またはリンパ循環を介する（例えば、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる国際公開第９９／０２６８５号を参照）。アデノウイルスベクターの例示的な投与レベルは、好ましくは灌流液に添加された１０８〜１０１１のベクター粒子である。
【０１１６】
Ｄ．抗体療法
いくつかの実施形態において、本発明は、ＭＭＳＥＴを発現する腫瘍または細胞（例えば、前立腺腫瘍、乳癌腫瘍、形質細胞）を標的とする抗体を提供する。任意の好適な抗体（例えば、モノクローナル、ポリクローナル、または合成）が、本明細書に開示される治療法に用いられ得る。好ましい実施形態において、癌治療に使用される抗体は、ヒト化抗体である。抗体をヒト化するための方法は、当該技術分野において周知である（例えば、米国特許第６，１８０，３７０号、第５，５８５，０８９号、第６，０５４，２９７号、および第５，５６５，３３２号を参照のこと、それらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、治療抗体は、ＭＭＳＥＴに対して産生される抗体を含み、該抗体は、細胞毒性薬物とコンジュゲートされる。そのような実施形態において、正常細胞を標的としない腫瘍特異的治療剤が生成され、したがって、従来の化学療法の有害な副作用の多くを軽減する。特定の用途の場合、治療剤は、抗体への付加に有用な薬剤としての役割を果たす薬理学的薬剤であり、特に、内皮細胞を死滅させるか増殖または細胞分割を抑制する能力を有する細胞毒性またはさもなければ抗細胞剤（ａｎｔｉｃｅｌｌｕｌａｒ ａｇｅｎｔ）であることが構想される。本発明は、抗体にコンジュゲートし、活性型で送達される、任意の薬理学的薬剤の使用を企図する。例示的な抗細胞剤として、化学療法剤、放射性同位元素、および細胞毒が挙げられる。本発明の治療抗体は、これらに限定されないが、例えば放射性同位元素（例えば、ヨウ素−１３１、ヨウ素−１２３、テクニシウム−９９ｍ、インジウム−１１１、レニウム−１８８、レニウム−１８６、ガリウム−６７、銅−６７、イットリウム−９０、ヨウ素−１２５、またはアスタチン−２１１）、ステロイド等のホルモン、シトシン等の代謝拮抗剤（例えば、アラビノシド、フルオロウラシル、メトトレキサート、またはアミノプテリン；アントラサイクリン；マイトマイシンＣ）、ビンカアルカロイド（例えば、デモコルチン、エトポシド、ミトラマイシン）、およびクロラムブシルまたはメルファラン等の抗腫瘍アルキル化剤を含む、様々な細胞毒性部分を含んでもよい。他の実施形態は、血液凝固剤、サイトカイン、増殖因子、細菌性内毒素、または細菌性内毒素の脂質Ａ部分等の薬剤を含む。例えば、いくつかの実施形態において、数個の例を挙げると、治療薬剤として、Ａ鎖毒素、リボソーム失活性タンパク質、αサルシン、アスペルギリン、レストリクトシン、リボヌクレアーゼ、ジフテリア毒素、またはシュードモナス外毒素等の、植物、真菌、または細菌由来の毒素が挙げられる。いくつかの好ましい実施形態において、脱グリコシル化リシンＡ鎖が用いられる。
【０１１８】
いずれの場合においても、それらのような薬剤は、所望の場合、既知のコンジュゲーション技術を用いて、必要に応じて、標的とされる腫瘍細胞の部位での標的化、内部移行、血液成分に対する遊離または提示を可能にする様式で、抗体と良好にコンジュゲートさせることができることが提唱されている（例えば、Ｇｈｏｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，９３：２８０［１９８３］を参照）。
【０１１９】
例えば、いくつかの実施形態において、本発明は、ＭＭＳＥＴを標的とする免疫毒素を提供する。免疫毒素は、典型的には腫瘍指向性の抗体または断片である特異的標的薬剤の毒素部分等の細胞毒性薬とのコンジュゲートである。標的化薬剤は、標的とされる抗原を保持する細胞に毒素を誘導し、それによって選択的に該細胞を死滅させる。いくつかの実施形態において、治療抗体は、高いインビボ安定性を提供する架橋剤を用いる（Ｔｈｏｒｐｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，４８：６３９６［１９８８］）。
【０１２０】
特に固形腫瘍の治療に関与する他の実施形態において、抗体は、血管内皮細胞の増殖または細胞分裂を抑制することによって、腫瘍脈管構造に対して細胞毒性またはさもなければ抗細胞効果を有するように設計される。この攻撃は、腫瘍細胞、特に脈管構造の遠位の腫瘍細胞から、酸素および栄養分を奪い、最終的には細胞死および腫瘍壊死をもたらす、腫瘍に局在化する血管崩壊を引き起こすことを意図する。
【０１２１】
好ましい実施形態において、抗体ベースの治療薬は、後に記載するように薬学的組成物として調剤される。好ましい実施形態において、本発明の抗体組成物の投与は、癌において測定可能な減少（例えば、腫瘍の減少または排除、形質細胞の過剰増殖の減少）をもたらす。
【０１２２】
Ｅ．薬学的組成物
化合物は、好ましくは好適な薬学的担体と組み合わせて治療用途に用いられる。そのような組成物は、有効量の化合物、および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む。製剤は、投与の様式に適合するように作製される。薬学的に許容される担体は、投与される特定の組成物によってある程度決定され、また該組成物を投与するために用いられる特定の様式によっても決定される。したがって、核酸を含む薬学的組成物の多種多様な好適な製剤があり、そのうちのいくつかは本明細書に記載される。
【０１２３】
ｍｉＲＮＡ治療薬の使用に関して、当業者は、インビボで投与された核酸が取り込まれ、細胞および組織に分配されることを理解する（Ｈｕａｎｇ， ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳＬｅｔｔ．５５８（ｌ−３）：６９−７３（２００４））。例えば、Ｎｙｃｅらは、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）が吸入されると、内因性界面活性剤（肺細胞によって生成される脂質）に結合し、さらなる担体脂質を必要とせずに肺細胞によって取り込まれることを示した（Ｎｙｃｅ ａｎｄ Ｍｅｔｚｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ，３８５：７２１−７２５（１９９７）。小さな核酸は、Ｔ２４膀胱癌組織の培養細胞に容易に取り込まれる（Ｍａ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．８：４１５−４２６（１９９８）。ｓｉＲＮＡは、全身投与による内因性遺伝子の治療的サイレンシングに用いられてきた（Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４３２，１７３−１７８（２００４））。
【０１２４】
化合物は、好適な薬学的担体中の、局所的、局部的、または全身的な投与のための製剤中に存在してもよい。Ｅ．Ｗ．ＭａｒｔｉｎによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ´ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｍａｒｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９７５）は、典型的な担体および調製方法を開示している。また、化合物は、細胞を標的化するための生分解性もしくは非生分解性のポリマーまたはタンパク質またはリポソームで形成される好適な生体適合性マイクロカプセル、微粒子、またはマイクロスフェア中に封入されてもよい。そのようなシステムは、当業者には周知であり、適切な核酸とともに使用するために最適化することができる。
【０１２５】
核酸送達のための種々の方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ ＹｏｒｋおよびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されている。そのような核酸送達システムは、限定ではなく例として、「裸の核酸」として「裸」の形態で、または陽イオン性分子もしくはリポソームを形成する脂質との複合体中等の送達に好適なビヒクルに配合されて、またはベクターの成分として、または薬学的組成物の成分としてのいずれかで、所望の核酸を含む。核酸送達系は、それを細胞と接触させることによって等、直接的に、またはいずれかの生物学的プロセスの作用を通して等、間接的に細胞に提供することができる。限定ではなく例として、エンドサイトーシス、受容体標的化、天然または合成の細胞膜断片との結合、エレクトロポーレーション等の物理的手段、核酸送達システムのポリマー担体（例えば、制御放出フィルムまたはナノ粒子もしくは微粒子等）との組み合わせ、ベクターの使用、細胞を取り囲む組織または流体への核酸送達システムの注入、細胞膜を横切る核酸送達システムの単純拡散、あるいは細胞膜を横切る任意の能動的または受動的な輸送機構によって、核酸送達システムを細胞に提供することができる。さらに、核酸送達システムは、ウイルスベクターの抗体に関連する標的化および抗体媒介性固定化等の技術を用いて細胞に提供することもできる。
【０１２６】
局所投与のための製剤は、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、坐薬、スプレー、液剤および散剤を含み得る。従来の薬学的担体、水性、粉末状または油状基剤、増粘剤等が、必要に応じて用いられてもよい。
【０１２７】
例えば、関節内（関節の中）、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、および皮下経路等の非経口投与に好適な製剤は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および製剤を対象となるレシピエントの血液と等張にする溶質を含み得る水性および非水性の等張無菌注射液、ならびに、懸濁剤、溶解剤、増粘剤、分散剤、安定剤、および保存剤を含み得る水性および非水性の無菌懸濁液、溶液、または乳濁液を含む。注射用製剤は、添加される保存剤とともに、例えばアンプル中または多回投与用容器内に、単位剤形で提供され得る。組成物は、このような形態をとり得る。
【０１２８】
調製物は、無菌の水溶液または非水溶液、懸濁液および乳濁液を含み、それらは特定の実施形態において対象の血液と等調性であり得る。非水性溶媒の例として、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（オリーブ油、ゴマ油、ヤシ油、ラッカセイ油、ピーナッツ油等）、鉱油、オレイン酸エチル等の注射用有機エステル、または合成モノグリセリドもしくはジグリセリドを含む不揮発性油が挙げられる。水性担体は、水、アルコール性／水性の溶液、乳濁液または懸濁液が挙げられる（生理食塩水および緩衝液を含む）。非経口ビヒクルは、塩化ナトリウム溶液、１，３−ブタンジオール、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液、または不揮発性油を含む。静脈内ビヒクルは、流体および栄養補充液、電解質補充液（リンガーデキストロースに基づくもの等）を含む。保存剤および他の添加剤、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガス等も存在し得る。また、無菌の不揮発性油は、溶媒または懸濁媒として従来通り用いられる。この目的のために、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む任意の無刺激性の不揮発性油が用いられてもよい。さらに、オレイン酸等の脂肪酸が、注射剤の調製に使用されてもよい。担体製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ´ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ）に見出すことができる。当業者は、過度の実験を行うことなく、組成物の調製および配合のための種々のパラメーターを容易に決定することができる。
【０１２９】
単独のまたは他の好適な成分と組み合わされた化合物は、吸入によって投与されるエアロゾル製剤にすることもできる（すなわち、それらは「噴霧」され得る）。エアロゾル製剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素等の、加圧された許容される噴霧剤中に入れることができる。吸入による投与では、化合物は、好適な噴霧剤を使用して、加圧パックまたは噴霧器からのエアロゾルスプレー提示の形態で都合よく送達される。
【０１３０】
いくつかの実施形態において、上記化合物は、塩、担体、緩衝剤、乳化剤、希釈剤、賦形剤、キレート化剤、増量剤、乾燥剤、抗酸化剤、抗菌剤、保存剤、結合剤、膨張剤、シリカ、溶解剤、または安定剤等の配合成分とともに薬学的に許容される担体を含んでもよい。一実施形態において、化合物は、細胞への取り込みを向上させるために、コレステロール、ならびにＣ３２官能基を有するラウリン酸導体等およびリトコール酸誘導体等の親油基にコンジュゲートされる。例えば、コレステロールは、ｓｉＲＮＡの取り込みおよび血清安定性を、インビトロ（Ｌｏｒｅｎｚ， ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｎｉ．Ｌｅｔｔ．１４（１９）：４９７５−４９７７（２００４））およびインビボ（Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４３２（７０１４）：１７３−１７８（２００４））で促進することが示されている。また、ステロイドとコンジュゲートしたオリゴヌクレオチドがＬＤＬ等の血流中の異なるリポタンパク質に結合することで、完全性を保護し、生体内分布を促進することも示されている（Ｒｕｍｐ， ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５９（１１）：１４０７−１４１６（２０００））。上記化合物に結合またはコンジュゲートし、細胞への取り込みを増加させることができる他の群は、アクリジン誘導体、架橋剤（ソラレン誘導体、アジドフェナシル、プロフラビン、およびアジドプロフラビン等）、人工エンドヌクレアーゼ、金属錯体（ＥＤＴＡ−Ｆｅ（ＩＩ）およびポルフィリン−Ｆｅ（ＩＩ）等）、アルキル化部分、ヌクレアーゼ（アルカリホスファターゼ等）、末端トランスフェラーゼ、アブザイム、コレステリル部分、親油性担体、ペプチドコンジュゲート、長鎖アルコール、リン酸エステル、放射性マーカー、非放射性マーカー、炭水化物、およびポリリジンまたは他のポリアミンを含む。
【０１３１】
Ｌｅｖｙらに対する米国特許第６，９１９，２０８号（参照により、本明細書に組み込まれる）も、送達の増強のための方法を記載している。これらの薬学的製剤は、従来の混合、溶解、造粒、研和、乳化、カプセル化、封入、または凍結乾燥のプロセスを用いる等、それ自体が既知である様式で製造されてもよい。
【０１３２】
本明細書に記載される核酸の製剤は、核酸の融合または核酸の修飾を包含し、核酸は、別の部分もしくは部分、例えば、標的化部分、または別の治療剤に融合される。そのような類似体は、活性および／または安定性等の特性の改善を示し得る。核酸と結合してもまたは結合しなくてもよい部分の例として、例えば、特定の細胞への核酸の送達を提供する標的化部分、例えば、膵臓細胞、免疫細胞、肺細胞、または任意の他の好ましい細胞型に対する抗体、ならびに好ましい細胞型に発現する受容体およびリガンドが挙げられる。好ましくは、部分は、癌または腫瘍細胞を標的とする。例えば、癌細胞はグルコースの消費が高いため、核酸はグルコース分子に結合することができる。癌または腫瘍細胞を標的とするヒト化モノクローナル抗体は、好ましい部分であり、核酸と結合してもまたはしなくてもよい。癌治療の場合、標的抗原は、典型的には、腫瘍細胞に特有および／または必須のタンパク質（例えば、受容体タンパク質ＨＥＲ−２／ｎｅｕ）である。
【０１３３】
一般に、核酸を含む化合物を投与する方法は、当該技術分野において周知である。特に、現在使用されている製剤とともに核酸治療のために既に使用されている投与経路は、上記核酸のための好ましい投与経路および製剤を提供する。
【０１３４】
組成物は、これらに限定されないが、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、経皮、皮下、局所、舌下、または直腸手段を含む多数の経路によって投与することができる。また化合物は、リポソームを介して投与されてもよい。そのような投与経路および適切な製剤は、当業者に一般的に知られている。
【０１３５】
本明細書に記載される製剤の投与は、化合物（例えば、ｍｉＲＮＡもしくは分子（例えば、小分子）をコードするｍｉＲＮＡまたは核酸）が、その標的に到達できるようにする任意の許容される方法によって達成されてもよい。
【０１３６】
選択される特定の様式は、当然のことながら、特定の製剤、治療を受ける対象の状態の重症度、および治療有効性のために必要な投与量等の要因に依存する。本明細書において一般的に使用される場合、「有効量」とは、製剤が投与される対象において、化合物を投与されていない対応する対象と比較して、ＭＭＳＥＴ関連疾患の１つ以上の症状を治療することができるか、ＭＭＳＥＴ関連疾患の１つ以上の症状を逆転させることができるか、ＭＭＳＥＴ関連疾患の１つ以上の症状の進行を停止させることができるか、またはＭＭＳＥＴ関連疾患の１つ以上の症状の発生を防止することができる量である。
【０１３７】
化合物の実際の有効量は、用いられる特定の化合物またはそれらの組み合わせ、配合される特定の組成物、投与の様式、個体の年齢、体重、状態、および治療される症状または状態の重症度に応じて異なり得る。
【０１３８】
当業者に既知の任意の許容される方法が、対象に製剤を投与するために用いられてもよい。治療される状態に応じて、投与は、局所的（すなわち、特定の領域、生理系、組織、器官、もしくは細胞型）、または全身的であり得る。
【０１３９】
注射は、例えば、静脈内、皮内、皮下、筋肉内、または腹腔内であり得る。組成物は、例えば、加齢関連疾患の治療または防止のために皮内注射することができる。いくつかの実施形態において、注射は複数箇所に打たれてもよい。移植は、移植可能な薬物送達システム（例えば、マイクロスフェア、ヒドロゲル、高分子リザーバー、コレステロールマトリックス）、ポリマー系（例えば、マトリックス侵食および／または拡散系）、ならびに非ポリマー系（例えば、圧縮された、融合された、または部分的に融合されたペレット）を挿入することを含む。吸入は、組成物を単独でまたは吸収され得る担体に結合させて、吸入器内のエアロゾルとともに投与することを含む。全身投与では、組成物がリポソーム中に封入されることが好ましいかもしれない。
【０１４０】
化合物は、薬剤の組織特異的な取り込みを可能にする様式で送達されてもよい。化合物が核酸であるいくつかの実施形態において、核酸送達システムが用いられ得る。技術は、創傷包帯法もしくは経皮送達システム等の組織または器官を局在化するデバイスの使用、血管カテーテルまたは尿路カテーテル等の侵襲性デバイスの使用、薬物送達能を有し、拡張可能なデバイスまたはステントグラフトとして構成されるステント等の介入的デバイスの使用を含む。
【０１４１】
製剤は、生侵食性インプラントを使用して拡散によって、またはポリマーマトリックスの分解によって送達されてもよい。特定の実施形態において、製剤の投与は、特定の期間、例えば、数時間、数日間、数週間、数ヶ月、または数年にわたって化合物への逐次的暴露をもたらすように設計されてもよい。これは、例えば、製剤の反復投与によって、または化合物が反復投与なしで長期にわたって送達される持続放出送達システムもしくは制御放出送達システムによって達成され得る。そのような送達システムを使用した製剤の投与は、例えば、経口剤形、ボーラス注入、経皮パッチまたは皮下インプラントによるものであり得る。実質的に一定である組成物の濃度を維持することは、いくつかの場合において好ましいかもしれない。
【０１４２】
他の好適な送達システムは、徐放、遅延放出、持続放出、または制御放出の送達システムを含む。そのようなシステムは、多くの場合において反復投与を回避することができ、対象および医師にとっての利便性を高める。多くの種類の放出送達システムが利用可能であり、当業者に既知である。それらは、例えば、ポリ乳酸および／もしくはポリグリコール酸、ポリ酸無水物、ポリカプロラクトン、コポリオキサレート、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリヒドロキシ酪酸、ならびに／またはこれらの組み合わせ等の、ポリマーベースのシステムを含む。
【０１４３】
核酸を含む前述のポリマーのマイクロカプセルは、例えば、米国特許第５，０７５，１０９号に記載されており、参照により、本明細書に組み込まれる。他の例として、ステロール（例えばコレステロール、コレステロールエステル等）、ならびに脂肪酸または中性脂肪（例えば、モノグリセリド、ジグリセリドおよびトリグリセリド等）を含む脂質ベースの非ポリマーシステム、ヒドロゲル放出システム、リポソームベースのシステム、リン脂質ベースのシステム、シラスティックシステム、ペプチドベースのシステム、ワックスコーティング、従来の結合剤および賦形剤を用いた圧縮錠、または部分的に融合したインプラントが挙げられる。特定の例として、化合物がマトリックス内で製剤中に含まれる侵食システム（例えば、米国特許第４，４５２，７７５号、第４，６７５、１８９号、第５，７３６，１５２号、第４，６６７，０１３号、第４，７４８，０３４号、および第５，２３９，６６０号（参照により、本明細書に組み込まれる）に記載されるような）、または活性成分が放出速度を制御する拡散システム（例えば、米国特許第３，８３２，２５３号、第３，８５４，４８０号、第５，１３３，９７４号、および第５，４０７，６８６号に記載されるような）が挙げられる。製剤は、例えば、マイクロスフェア、ヒドロゲル、高分子リザーバー、コレステロールマトリックス、またはポリマーシステムであってもよい。いくつかの実施形態において、システムは、例えば、化合物を含む製剤の拡散または浸食／分解速度の制御を介して、組成物の持続放出または制御放出を可能にすることができる。また、ポンプベースのハードウェア送達システムは、１つ以上の実施形態を送達するために使用され得る。
【０１４４】
一気に放出が起こるシステムの例として、例えば、ポリマーマトリックスに封入されたリポソームに中に組成物が封入される、該リポソームが特定の刺激（例えば、温度、ｐＨ、光、または分解酵素）に感受性であるシステム、およびマイクロカプセルのコア分解酵素でイオン的に被覆されたマイクロカプセルによって組成物が封入されるシステムが挙げられる。インヒビターの放出が段階的かつ継続的なシステムの例として、例えば、組成物がマトリックス内にある形態で含まれる侵食システム、および組成物が、例えば、ポリマーを通って、制御された速度で浸透する浸出システムが挙げられる。このような持続放出システムは、例えば、ペレットまたはカプセルの形態であり得る。
【０１４５】
長期放出インプラントの使用は、いくつかの実施形態において特に好適であるかもしれない。本明細書において使用される場合、「長期放出」とは、組成物を含むインプラントが、少なくとも３０日間もしくは４５日間、好ましくは少なくとも６０日間もしくは９０日間、またはいくつかの場合においてはさらにそれよりも長く、治療的に有効なレベルの組成物を送達するように構築および配置されることを意味する。長期放出インプラントは、当業者に周知であり、上記放出システムのいくつかを含む。
【０１４６】
特定の個体のための投与量は、従来の検討事項を用いて（例えば、適切な従来の薬理学的プロトコルにより）、当業者によって決定され得る。医師は、例えば、最初に比較的低用量を処方し、その後、適切な応答が得られるまで用量を増加させてもよい。個体に投与される用量は、用途に応じて、個体において経時的に有益な治療反応をもたらすか（もしくは、例えば、症状を軽減する）、または他の適切な活性をもたらすのに十分である。用量は、特定の製剤の有効性、ならびに用いられる化合物の活性、安定性、または血清半減期および個体の状態、そして治療を受ける個体の体重または体表面積によって決定される。また、用量の大きさは、特定の個体における特定のベクター、製剤等の投与に伴う任意の有害な副作用の存在、性質および程度によっても決定される。
【０１４７】
１つ以上の核酸を含む治療組成物は、当該技術分野において周知の方法に従って有効性、組織代謝を確認するためおよび投与量を推定するために、１つ以上の適切なインビトロおよび／またはインビボの疾患動物モデルにおいて任意選択的に調査される。具体的には、関連するアッセイにおいて、治療対無治療の活性、安定性、または他の好適な尺度（例えば、治療された細胞または動物モデル対治療されていない細胞または動物モデルの比較）によって、最初に投与量が決定され得る。製剤は、例えば、個体の質量および相対的な健康に適用されるように、関連する製剤のＬＤ５０によって、および／または、種々の濃度における核酸の任意の副作用の観察によって決定される速度で投与される。投与は、単一用量または分割用量によって達成され得る。
【０１４８】
実施例に記載されるように、潜在的な加齢関連疾患の治療としての核酸の有効量を決定するためにインビトロモデルを使用することができる。疾患の治療または予防において投与されるべき化合物の有効量を決定する際に、医師は、循環血漿レベル、製剤の毒性、および疾患の進行を評価する。非限定的な例において、核酸の場合、７０キログラムの個体に投与される用量は、典型的には、現在使用されている治療的アンチセンスオリゴヌクレオチド、例えば、サイトメガロウイルスＲＮＡの治療についてＦＤＡによって認可され、関連する組成物の活性または血清半減期の改変のために調節されたＶｉｔｒａｖｅｎｅ（登録商標）（ホミビルセンナトリウム注射）等の投与量と等しい範囲内である。
【０１４９】
本明細書に記載される製剤は、これらに限定されないが、抗体投与、ワクチン投与、細胞傷害性薬剤、天然アミノ酸ポリペプチド、核酸、ヌクレオチド類似体、および生物学的応答修飾物質の投与を含む、任意の既知の従来の治療による治療条件を補うことができる。組み合わされた２つ以上の化合物は、一緒にまたは経時的に使用され得る。例えば、抗加齢関連疾患カクテルの一部として治療的に有効な量の核酸を投与することもできる。
【０１５０】
本発明の特定の実施形態は、（ａ）１つ以上のＭＭＳＥＴを標的とする核酸または低分子化合物および（ｂ）１つ以上の他の化学療法剤を含む薬学的組成物を提供する。そのような化学療法剤の例として、これらに限定されないが、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、マイトマイシン、ナイトロジェンマスタード、クロラムブシル、メルファラン、シクロホスファミド、６−メルカプトプリン，６−チオグアニン、シタラビン（ＣＡ）、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フロクスウリジン（５−ＦＵｄＲ）、メトトレキサート（ＭＴＸ）、コルヒチン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド、テニポシド、シスプラチン、およびジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）等の抗癌剤が挙げられる。これらに限定されないが、非ステロイド系抗炎症剤および副腎皮質ステロイドを含む抗炎症剤、およびこれらに限定されないが、リビビリン、ビダラビン、アシクロビル、およびガンシクロビルを含む抗ウイルス剤も、本発明の組成物と組み合わされてもよい。他の非アンチセンス化学療法剤も、本発明の範囲内である。組み合わされた２つ以上の化合物は、一緒にまたは経時的に使用され得る。
【０１５１】
Ｆ．併用療法
いくつかの実施形態において、本発明は、追加の薬剤（例えば、化学療法剤）と組み合わせて、本明細書に記載される１つ以上の組成物を含む治療法を提供する。本発明は、特定の化学療法剤に限定されるものではない。
【０１５２】
種々のクラスの抗腫瘍性（例えば、抗癌性）薬剤が、特定の本発明の実施形態において使用するために企図される。本発明の実施形態とともに使用するのに好適な抗癌剤は、これらに限定されないが、アポトーシスを誘導する薬剤、アデノシンデアミナーゼの機能を阻害する薬剤、ピリミジン生合成を阻害する、プリン環生合成を阻害する、ヌクレオチド相互変換を阻害する、リボヌクレオチドレダクターゼを阻害する、チミジンモノホスフェート（ＴＭＰ）合成を阻害する、ジヒドロフォレート還元を阻害する、ＤＮＡ合成を阻害する、ＤＮＡとの付加体を形成する、ＤＮＡを損傷する、ＤＮＡ修復を阻害する、ＤＮＡとインターカレートする、アスパラギン類を脱アミノ化する、ＲＮＡ合成を阻害する、タンパク質の合成または安定性を阻害する、微小管の合成または機能を阻害するもの等を含む。
【０１５３】
いくつかの実施形態において、本発明の実施形態の組成物および方法において使用するのに好適な例示的な抗癌剤として、これらに限定されないが、１）アルカロイド、例えば、微小管阻害剤（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、およびビンデシン等）、微小管安定剤（例えば、パクリタキセル（タキソール）、およびドセタキセル、等）、およびクロマチン機能阻害剤、例えば、トポイソメラーゼ阻害剤、例えば、エピポドフィロトキシン（例えば、エトポシド（ＶＰ−１６）、およびテニポシド（ＶＭ−２６）等）、ならびにトポイソメラーゼＩを標的とする薬剤（例えば、カンプトテシンおよびイリノテカン（ＣＰＴ−１１）等）、２）共有結合性ＤＮＡ結合剤（アルキル化剤）、例えば、ナイトロジェンマスタード（例えば、メクロレタミン、クロラムブシル、シクロホスファミド、イホスファミド、およびブスルファン（マイレラン）等）、ニトロソ尿素（例えば、カルムスチン、ロムスチン、およびセムスチン等）、ならびに他のアルキル化剤（例えば、ダカルバジン、ヒドロキシメチルメラミン、チオテパ、およびマイトシシン等）、３）非共有結合性ＤＮＡ結合剤（抗腫瘍抗生物質）、例えば、核酸阻害剤（例えば、ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ等）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（ダウノマイシン、およびセルビジン）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、およびイダルビシン（イダマイシン）等）、アントラセンジオン（例えば、アントラサイクリン類似体、例えば、ミトキサントロン等）、ブレオマイシン（ブレノキサン）等、ならびにプリカマイシン（ミトラマイシン）等、４）代謝拮抗物質、例えば、葉酸代謝拮抗薬（例えば、メトトレキサート、フォレックスおよびメキサート等）、プリン代謝拮抗薬（例えば、６−メルカプトプリン（６−ＭＰ、プリントール）、６−チオグアニン（６−ＴＧ）、アザチオプリン、アシクロビル、ガンシクロビル、クロロデオキシアデノシン、２−クロロデオキシアデノシン（ＣｄＡ）、および２´−デオキシコホルマイシン（ペントスタチン）等）、ピリミジン拮抗薬（例えば、フルオロピリミジン（例えば、５−フルオロウラシル（アドルシル）、５−フルオロデオキシウリジン（ＦｄＵｒｄ）（フロクスウリジン）等）、ならびにシトシンアラビノシド（例えば、シトサール（ａｒａ−Ｃ）およびフルダラビン等）、５）酵素、例えば、Ｌ−アスパラギナーゼ、およびヒドロキシ尿素等、６）ホルモン、例えば、グルココルチコイド、抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン等）、非ステロイド性抗アンドロゲン（例えば、フルタミド等）、およびアロマターゼ阻害剤（例えば、アナストロゾール（アリミデックス）等）、７）白金化合物（例えば、シスプラチンおよびカルボプラチン等）、８）抗癌剤、毒素、および／または放射性核種等とコンジュゲートしたモノクローナル抗体、９）生物学的応答調節因子（例えば、インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−α）等］およびインターロイキン（例えば、ＩＬ−２等）等）、１０）養子免疫療法、１１）造血成長因子、１２）腫瘍細胞分化を誘導する薬剤（例えば、オールトランスレチノイン酸等）、１３）遺伝子療法の技法、１４）アンチセンス療法の技法、１５）腫瘍ワクチン、１６）腫瘍転移に対する薬剤（例えば、バチマスタット等）、１７）血管新生阻害剤、１８）プロテオソーム阻害剤（例えば、ＶＥＬＣＡＤＥ）、１９）アセチル化および／またはメチル化の阻害剤（例えば、ＨＤＡＣ阻害剤）、２０）ＮＦ−κＢの調節因子、２１）細胞周期制御の阻害剤（例えば、ＣＤＫ阻害剤）、２２）ｐ５３タンパク質機能の調節因子、そして２３）放射線が挙げられる。
【０１５４】
癌治療の状況においてルーチン的に使用される任意の腫瘍退縮剤を、本発明の実施形態の組成物および方法において使用することができる。例えば、米国食品医薬品局は、米国内での使用が認可された腫瘍退縮剤の処方集を維持する。米国Ｆ．Ｄ．Ａと同等の国際機関が、同様の処方集を維持する。下の表は、米国内での使用が認可された例示的な抗腫瘍剤のリストを提供する。当業者は、米国で認可された全ての化学療法剤に必要とされる「製品ラベル」が、例示的な薬剤について認可された適応症、投与情報、毒性データ等を記載していることを認識するであろう。
【０１５５】
【表１】
【０１５６】
【表２】
【０１５７】
【表３】
【０１５８】
【表４】
【０１５９】
【表５】
【０１６０】
【表６】
【０１６１】
【表７】
【０１６２】
【表８】
【０１６３】
【表９】
【０１６４】
本発明の方法および組成物が前立腺癌の治療または防止のために使用される場合、前立腺癌の治療のための既存の治療が本発明の方法と組み合わせて用いられてもよい。したがって、転移性前立腺癌を治療または阻害する方法は、前立腺癌の治療のための第２の治療とともにＭＭＳＥＴ阻害剤を投与することをさらに含み得る。第２の治療は、別のＭＭＳＥＴ阻害剤であってもよいが、典型的には異なる治療である。好適な異なる治療は、放射線治療および前立腺摘除からなる群から選択される１つ以上の治療を含む。使用され得る別の第２の治療は、抗アンドロゲン療法である。抗アンドロゲン療法は、ロイプロリドおよびゴセレリンからなる群から選択される１つ以上の薬剤を対象に投与することを含み得る。使用され得る別の第２の治療は、ケトコナゾール、ビカルタミド（カソデックス）、ミトキサントロン（ノバントロン）、リン酸エストラムスチン（エムサイト）、エトポシド（ベプシド）、パクリタキセル（タキソール）、ドセタキセル（タキソテール）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、またはビンブラスチン（ベルバン）を含むがこれに限定されない１つ以上のホルモン剤または化学療法剤を投与する等の化学療法である。
【０１６５】
ＩＩ．抗体
本発明は、単離された抗体を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、ＭＭＳＥＴの少なくとも５つのアミノ酸残基で構成される単離されたポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を提供する。このような抗体は、本明細書に記載される治療および薬物スクリーニングの方法において用途を見出す。
【０１６６】
本発明のタンパク質に対する抗体は、該タンパク質を認識できる限り、いずれのモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であってもよい。抗体は、本発明のタンパク質を抗原として用いて、従来の抗体または抗血清の調製プロセスに従って製造することができる。
【０１６７】
本発明は、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の両方の使用を企図する。本発明の方法および組成物において使用される抗体を産生するために、これに限定されないが、本発明に開示されるものを含む任意の好適な方法が用いられてもよい。例えば、モノクローナル抗体の産生のためには、抗体の産生が可能な条件下で、タンパク質を単独で、または好適な担体もしくは希釈剤とともに、動物（例えば、哺乳動物）に投与する。抗体産生能を高めるために、完全または不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。通常、２週間〜６週間毎に１回、全部で約２回〜約１０回タンパク質を投与する。そのような方法に好適な動物は、これらに限定されないが、霊長類、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ等を含む。
【０１６８】
モノクローナル抗体を産生する細胞を調製するためには、最終免疫の２日〜５日後に、抗体価が確認された個々の動物（例えば、マウス）を選択し、脾臓またはリンパ節を採取し、その中に含まれる抗体を産生する細胞を骨髄腫細胞と融合させて、所望のモノクローナル抗体産生株であるハイブリドーマを調製する。例えば、本明細書に後述されるように標識されたタンパク質と抗血清を反応させ、次いで、抗体に結合した標識剤の活性を測定することによって、抗血清中の抗体価の測定を行うことができる。細胞融合は、例えば、ＫｏｅｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５［１９７５］）によって記載される方法等の既知の方法に従って実施することができる。融合プロモーターとして、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはセンダイウイルス（ＨＶＪ）、好ましくはＰＥＧが使用される。
【０１６９】
骨髄腫細胞の例として、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１等が挙げられる。用いられる抗体産生株細胞（脾臓細胞）の数と骨髄腫細胞の数との比率は、好ましくは約１：１〜約２０：１である。ＰＥＧ（好ましくは、ＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）は、好ましくは約１０％〜約８０％の濃度で添加される。細胞融合は、両方の細胞の混合物を約２０℃〜約４０℃、好ましくは約３０℃〜約３７℃で約１分〜１０分インキュベートすることによって効率的に行うことができる。
【０１７０】
抗体（例えば、腫瘍抗原または本発明の自己抗体に対する）を産生するハイブリドーマをスクリーニングするために種々の方法が用いられてもよい。例えば、抗体を直接または担体とともに吸着させた固相（例えば、マイクロプレート）にハイブリドーマの上清を添加し、次いで、放射性物質または酵素で標識した抗免疫グロブリン抗体（マウス細胞を細胞融合に用いる場合は、抗マウス免疫グロブリン抗体を使用）またはプロテインＡを添加して、固相に結合したタンパク質に対するモノクローナル抗体を検出する。代替として、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマの上清を添加し、放射性物質または酵素で標識したタンパク質を添加して、固相に結合したタンパク質に対するモノクローナル抗体を検出する。
【０１７１】
モノクローナル抗体の選択は、任意の既知の方法またはその変形例に従って行うことができる。通常、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞のための培地が用いられる。ハイブリドーマが増殖できる限り、いずれの選択および成長培地が用いられてもよい。例えば、１％〜２０％、好ましくは１０％〜２０％のウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地、１％〜１０％のウシ胎仔血清を含むＧＩＴ培地、ハイブリドーマ培養のための無血清培地、（ＳＦＭ−１０１、Ｎｉｓｓｕｉ Ｓｅｉｙａｋｕ）等を用いることができる。通常、培養は、約５％のＣＯ２ガス下で、２０℃〜４０℃、好ましくは３７℃で、約５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間行われる。ハイブリドーマ培養物の上清の抗体価は、抗血清中の抗タンパク質の抗体価に関して上述したのと同じ様式に従って測定することができる。
【０１７２】
モノクローナル抗体（例えば、ＭＭＳＥＴ、ＭＭＳＥＴと相互作用するタンパク質、またはＭＭＳＥＴの標的に対する）の分離および精製は、免疫グロブリンの分離および精製等の従来のポリクローナル抗体と同じ様式に従って行うことができ、例えば、塩析法、アルコール沈殿法，等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例えば、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲル濾過法、または、抗原と結合する固相、プロテインＡまたはプロテインＧ等の活性吸着剤で抗体のみを収集し、結合を溶解して抗体を得る特異的精製法を含む。
【０１７３】
ポリクローナル抗体は、患者から抗体を得ることを含む、いずれの既知の方法またはこれらの方法の変更例によって調製されてもよい。例えば、免疫原（タンパク質に対する抗原）と担体タンパク質との複合体を調製し、上記モノクローナル抗体の調製に関して上述したのと同じ様式に従って、該複合体により動物を免疫化する。免疫化した動物から抗体含有物質を回収し、抗体を分離および精製する。
【０１７４】
動物の免疫化に使用される免疫原と担体タンパク質との複合体に関して、ハプテン（担体上にクロスリンクされ、免疫化に用いられる）に対する抗体が効率的に産生される限り、任意の担体タンパク質、および担体とハプテンとの任意の混合比を用いることができる。例えば、ウシ血清アルブミン、ウシシクログロブリン、キーホールリンペットヘモシアニン等が、ハプテン１部当たり約０．１部〜約２０部、好ましくは約１部〜約５部の重量比でハプテンとカップリングさせてもよい。
【０１７５】
また、ハプテンと担体をカップリングさせるために種々の縮合剤を使用することができる。例えば、グルタルアルデヒド、カルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基またはジチオピリジル基を含む活性エステル試薬等が本発明とともに用途を見出す。縮合物は、単独で、または好適な担体もしくは希釈剤とともに、抗体の産生が可能な動物の部位に投与される。抗体産生能を高めるために、完全または不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。通常、２週間〜６週間毎に１回、全部で約３回〜約１０回タンパク質を投与する。
【０１７６】
ポリクローナル抗体は、上記方法で免疫化した動物の血液、腹水等から回収される。抗血清中の抗体価は、ハイブリドーマ培養物の上清に関して上述したのと同じ様式に従って測定することができる。抗体の分離および精製は、モノクローナル抗体に関して上述したのと同じ免疫グロブリンの分離および精製に従って行うことができる。
【０１７７】
本明細書において免疫原として用いられるタンパク質は、いずれか特定の種類の免疫原に限定されない。例えば、本発明の癌マーカー（部分的に変更されたヌクレオチド配列を有する遺伝子をさらに含む）が免疫原として用いられてもよい。さらに、タンパク質の断片が使用されてもよい。断片は、これらに限定されないが、遺伝子断片の発現、タンパク質の酵素処理、化学合成を含むいずれの方法によって得られてもよい。
【０１７８】
ＩＩＩ．薬物スクリーニング用途
いくつかの実施形態において、本発明は、薬物スクリーニングアッセイ（例えば、抗癌剤のスクリーニング）を提供する。本発明のスクリーニング法は、ＭＭＳＥＴを用いる。例えば、いくつかの実施形態において、本発明は、ＭＭＳＥＴの発現を変化させる（例えば減少させる）化合物のスクリーニング法を提供する。化合物または薬剤は、例えば、プロモーター領域との相互作用によって、転写を妨げることができる。化合物または薬剤は、ＭＭＳＥＴから生成されるｍＲＮＡを妨げることができる（例えば、ＲＮＡ干渉、アンチセンス技術等により）。化合物または薬剤は、ＭＭＳＥＴの生物学的活性の上流または下流である経路を妨げることができる。いくつかの実施形態において、候補化合物は、ＭＭＳＥＴに対するアンチセンスまたは干渉ＲＮＡ剤（例えば、オリゴヌクレオチド）である。他の実施形態において、候補化合物は、ＭＭＳＥＴ制御因子、ＭＭＳＥＴの標的（複数可）、またはそれらの異なる発現産物に特異的に結合し、それによって生物学的機能を変化させる（例えば、阻害する）抗体または小分子である。
【０１７９】
あるスクリーニング法において、候補化合物は、ＭＭＳＥＴを発現する細胞に化合物を接触させ、次いで、候補化合物が発現に与える影響を評価することによって、ＭＭＳＥＴの発現を変化させる能力について評価される。いくつかの実施形態において、候補化合物がＭＭＳＥＴ遺伝子の発現に与える影響は、細胞によって発現されるＭＭＳＥＴのｍＲＮＡのレベルを検出することによって評価される。ｍＲＮＡの発現は、任意の好適な方法によって検出することができる。ｍＲＮＡの発現を分析するための方法は、当該技術分野において周知であり、これらに限定されないが、ＲＴ−ＰＣＲ、定量（例えば、ＴａｑＭａｎ）ＲＴ−ＰＣＲアッセイ、ＳＡＧＥ、アレイ法、トランスクリプトームシーケンシング、ノーザンブロット等を含む。
【０１８０】
他の実施形態において、候補化合物がＭＭＳＥＴ遺伝子の発現に与える影響は、ＭＭＳＥＴによってコードされるポリペプチドのレベルを測定することによって評価される。発現されるポリペプチドのレベルは、本明細書に開示されるものを含むが、これらに限定されない任意の好適な方法によって測定することができる。ポリペプチドレベルを分析する方法は、当該技術分野において周知であり、これらに限定されないが、免疫ブロット法、ＥＬＩＳＡ、ドットブロット、タンパク質アッセイ、免疫沈降、ビーズベースアッセイ等を含む。
【０１８１】
具体的には、本発明は、修飾物質、すなわち、ＭＭＳＥＴに結合し、例えば、ＭＭＳＥＴの発現またはＭＭＳＥＴの活性に対する阻害（または促進）効果を有するか、あるいは、例えば、ＭＭＳＥＴ基質またはＭＭＳＥＴの制御因子の発現または活性に対して促進または阻害効果を有する候補化合物もしくは試験化合物または薬剤（例えば、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣体、ペプトイド、小分子、または他の薬剤）を同定するためのスクリーニング法を提供する。したがって、同定された化合物は、標的遺伝子産物の生物学的機能を生成するため、または正常な標的遺伝子の相互作用を妨げる化合物を同定するために、治療プロトコルにおいて標的遺伝子産物（例えば、ＭＭＳＥＴ遺伝子）の活性を直接的または間接的に調節するために使用することができる。ＭＭＳＥＴの活性または発現を阻害する化合物は、増殖性疾患、例えば、癌（例えば、前立腺癌、乳癌、他の固形腫瘍癌、多発性骨髄腫）の治療において有用である。
【０１８２】
一実施形態において、本発明は、癌マーカータンパク質もしくはポリペプチドまたはその生物学的活性部分の基質である候補化合物または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。別の実施形態において、本発明は、癌マーカータンパク質もしくはポリペプチドまたはその生物学的活性部分に結合するかまたはそれらの活性を調節する候補化合物または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。
【０１８３】
本発明の試験化合物は、生物学的ライブラリー、ペプトイドライブラリー（ペプチドの機能性を有する分子のライブラリーであるが、酵素分解に耐性を示すにもかかわらず生物活性を保持する、新規の非ペプチド主鎖を有する、例えば、Ｚｕｃｋｅｎｎａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８−８５［１９９４］）を参照）、空間的に位置指定可能な平行固相または溶液相ライブラリー、逆重畳を必要とする合成ライブラリー法、「１ビーズ１化合物」ライブラリー法、およびアフィニティクロマトグラフィ選別を用いた合成ライブラリー法を含む、当該技術分野で既知のコンビナトリアルライブラリー法における数多くのアプローチのうちのいずれかを用いることによって得ることができる。生物学的ライブラリーおよびペプトイドライブラリーのアプローチは、ペプチドライブラリーとともに用いるのが好ましく、他の４つのアプローチは、化合物のペプチド、非ペプチドオリゴマー、または低分子化合物ライブラリーに適用される（Ｌａｍ（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ． １２：１４５）。
【０１８４】
分子ライブラリーの合成のための方法の例は、当該技術分野において、例えば、 ＤｅＷｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６９０９［１９９３］、Ｅｒｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｄ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１１４２２［１９９４］、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８［１９９４］、Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１３０３［１９９３］、Ｃａｒｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３．２０５９［１９９４］、Ｃａｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１［１９９４］、およびＧａｌｌｏｐ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３［１９９４］に見ることができる。
【０１８５】
化合物のライブラリーは、例えば、溶液中（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１３：４１２−４２１［１９９２］）、またはビーズ上（Ｌａｍ，Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２−８４［１９９１］）、チップ（Ｆｏｄｏｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３６４：５５５−５５６［１９９３］）、細菌または胞子（米国特許第５，２２３，４０９号、参照により、本明細書に組み込まれる）、プラスミド（Ｃｕｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｄ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１８６５１８６９［１９９２］）、またはファージ上（Ｓｃｏｔｔ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６−３９０［１９９０］、Ｄｅｖｌｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４−４０６［１９９０］、Ｃｗｉｒｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．ＮａｔＩ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：６３７８−６３８２［１９９０］、Ｆｅｌｉｃｉ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１［１９９１］）に存在し得る。
【実施例】
【０１８６】
実験
以下の実施例は、本発明の特定の好ましい実施形態および態様を示し、またさらに例示するために提供されるものであって、本発明の範囲を限定するものであると見なされるべきではない。
【０１８７】
実験１
前立腺癌組織および細胞株におけるＭＭＳＥＴ発現の分析
方法
ＭＭＳＥＴおよびＥｚｈ２のｍＲＮＡ検出のためのＴａｑＭａｎ定量ＰＣＲ
組織検体由来の全ＲＮＡをｍｉＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出し、得られたｃＤＮＡ試料をＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて調製した。Ａｓｓａｙ−ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄプライマー／プローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて定量ＲＴ−ＰＣＲを行った。ＭＭＳＥＴおよびＥｚｈ２のｍＲＮＡレベルを定量化し、２−ΔΔＣＴ法を用いてＧＡＰＤＨに正規化した。
【０１８８】
結果
ＴａｑＭａｎ定量リアルタイムＰＣＲにより、切除した前立腺の転移性組織試料において、良性またはＰＣＡ組織試料と比較してＭＭＳＥＴおよびＥｚｈ２の相対的な発現の増加が示された（図８）。
【０１８９】
実験２
細胞浸潤に影響を与えるＭＭＳＥＴノックダウン
方法
基底膜マトリックス浸潤アッセイ
浸潤アッセイにはＤＵ１４５細胞を用いた。いくつかの実験において、２つの異なるＭＭＳＥＴ特異的ｓｉＲＮＡで細胞をトランスフェクトすることにより、ＭＭＳＥＴノックダウンを行った。トランスフェクションから４８時間後、２４ウェル培養プレートのインサート中に存在する基底膜マトリックス（ＥＣ ｍａｔｒｉｘ、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）上に細胞を播種した。いくつかの実験において、低分子阻害剤（ＭＣＴＰ３９）を用いてＭＭＳＥＴを阻害した。２用量の低分子阻害剤を含むかまたは含まない化学誘引物質として、ウシ胎仔血清を下のチャンバに加えた。４８時間後、非浸潤細胞およびＥＣマトリックスを綿棒で穏やかに除去した。チャンバの下側に位置する浸潤細胞を１５０μｌの１０％酢酸で処理することにより比色測定で測定し、分光光度計を使用して５６０ｎｍで吸光度を測定した。
【０１９０】
結果
ｓｉＲＮＡ媒介性のＭＭＳＥＴノックダウンは、ＤＵ１４５細胞の浸潤の低下をもたらした（図５）。同様に、基底膜マトリックス浸潤アッセイにおいて、ＤＵ１４５細胞をＭＭＳＥＴの低分子阻害剤で処理することにより浸潤の低下がもたらされた（図７）。
【０１９１】
実験３
細胞生存率アッセイ
方法
ＭＭＳＥＴ阻害剤が細胞の生存率に与える作用を調べるために、ＷＳＴ−１細胞生存率アッセイ（Ｒｏｃｈｅ）を行った。製造者のプロトコルに従ってＷＳＴ−１アッセイを行う９６時間前に、ＤＭＳＯ中に溶解した異なる用量の小分子で高悪性度の前立腺細胞株ＤＵ１４５を処理した。各実験を８回行い、４５０ｎｍで吸光度を測定した。
【０１９２】
結果
ＭＭＳＥＴの低分子阻害剤であるＭＣＴＰ３９に関する生存率アッセイの結果を図７に示す。ＭＣＴＰ３９のＩＣ５０値は＜３μＭであった。
【０１９３】
実験４
ＭＭＳＥＴ阻害剤で処理したまたは未処理の細胞におけるヒストンのメチル化修飾
方法
免疫ブロット解析
ＤＵ１４５細胞を複数用量の小分子阻害剤で９６時間インキュベートするか、または本明細書に記載されるようなｓｉＲＮＡ媒介性ＭＭＳＥＴノックダウンに供した（例えば、ｓｈ１ ＧＧＵＣＣＡＡＡＧＵＧＵＣＧＧＧＵＵＡまたはｓｈ２ ＧＵＣＡＧＵＧＧＡＧＧＡＧＣＧＧＡＡを使用）。Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ混合物（Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を含むＮＰ４０溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１％ ＮＰ４０、ｐＨ７．４、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中で細胞を均質化した。１０マイクログラムの各タンパク質抽出物を試料用緩衝液中で沸騰させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ポリフッ化ビニリデン膜（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に移した。ブロッキング溶液中で膜を１時間インキュベートし、以下の抗体を用いて４℃で一晩インキュベートした：抗モノメチル化、ジメチル化、およびトリメチル化Ｈ３−２７、抗ジメチル化およびトリメチル化Ｈ３−ｋ３６、ならびに抗トリメチル化Ｈ３−Ｋ９。ＴＢＳ−Ｔで洗浄後、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体でブロットをインキュベートした。製造者（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって記載されるように、化学発光の増強によりシグナルを可視化した。抗Ｈ３およびβアクチンを用いてブロットを再度プローブし、ローディングが等しいことを確認した。
【０１９４】
結果
ＭＭＳＥＴのノックダウンは、Ｈ３Ｋ３６のジメチル化の低下をもたらした（図４）。ＭＭＳＥＴ阻害剤ＭＣＴＰ３９を用いたインキュベーションにより、Ｈ３Ｋ３６のジメチル化の用量依存性低下とともに、Ｈ３Ｋ２７のジメチル化、Ｈ３Ｋ２７のトリメチル化、およびＨ３Ｋ３６のトリメチル化の用量依存性の低下がもたらされた（図９）。
【０１９５】
図１１〜２６は、複数の癌におけるＭＭＳＥＴ発現のさらなる特徴付けおよびＭＣＴＰ３９による阻害を示す。ＭＣＴＰ３９は、異種移植腫瘍において細胞生存率および腫瘍サイズを減少させた。
【０１９６】
上記明細書で述べた全ての刊行物および特許は、参照により本明細書に組み込まれる。記載される本発明の方法およびシステムの種々の変更例および変形例が、本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく当業者には明白であろう。特定の好ましい実施形態と関連させて本発明を記載してきたが、請求されるような本発明は、そのような特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことを理解されたい。実際、関連技術分野の当業者には明白である記載される本発明を実行するための様式の種々の変更例は、以下の特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の増殖を阻害する方法であって、ＭＭＳＥＴを発現する細胞を、前記細胞中のＭＭＳＥＴの少なくとも１つの活性を阻害する薬剤に接触させることを含む、方法。
【請求項２】
前記薬剤は、小分子、ｓｉＲＮＡ、および抗体からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記小分子は、３−ヒドラジニルキノキサリン−２−チオールである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞は、癌細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記癌細胞は、前立腺癌細胞、前立腺癌細胞前駆体、乳癌細胞、乳癌細胞前駆体、形質細胞、および形質細胞前駆体からなる群から選択される種類のものである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記癌細胞は、前立腺癌細胞である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ヒストンＨ３のリシン３６のメチル化を阻害することを含む、細胞の増殖を阻害する方法。
【請求項８】
前記ヒストンＨ３のリシン３６のメチル化は、ジメチル化からなる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ヒストンＨ３のリシン３６のメチル化は、トリメチル化からなる、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記阻害は、ＭＭＳＥＴの少なくとも１つの活性を変化させることによって起こる、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＭＭＳＥＴの活性は、ＭＭＳＥＴの酵素活性、ＭＭＳＥＴの転写レベル、およびＭＭＳＥＴのタンパク質レベルからなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＭＭＳＥＴの酵素活性は、メチル化を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
細胞中のＭＭＳＥＴの少なくとも１つの活性を阻害する薬剤を含む、薬学的組成物。
【請求項１４】
前記薬剤は、核酸である、請求項１３に記載の薬学的化合物。
【請求項１５】
前記薬剤は、抗体である、請求項１３に記載の薬学的化合物。
【請求項１６】
前記薬剤は、小分子である、請求項１３に記載の薬学的化合物。
【請求項１７】
前記薬剤は、３−ヒドラジニルキノキサリン−２−チオールである、請求項１３に記載の薬学的化合物。
【請求項１】
細胞の増殖を阻害する方法であって、ＭＭＳＥＴを発現する細胞を、前記細胞中のＭＭＳＥＴの少なくとも１つの活性を阻害する薬剤に接触させることを含む、方法。
【請求項２】
前記薬剤は、小分子、ｓｉＲＮＡ、および抗体からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記小分子は、３−ヒドラジニルキノキサリン−２−チオールである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞は、癌細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記癌細胞は、前立腺癌細胞、前立腺癌細胞前駆体、乳癌細胞、乳癌細胞前駆体、形質細胞、および形質細胞前駆体からなる群から選択される種類のものである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記癌細胞は、前立腺癌細胞である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ヒストンＨ３のリシン３６のメチル化を阻害することを含む、細胞の増殖を阻害する方法。
【請求項８】
前記ヒストンＨ３のリシン３６のメチル化は、ジメチル化からなる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ヒストンＨ３のリシン３６のメチル化は、トリメチル化からなる、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記阻害は、ＭＭＳＥＴの少なくとも１つの活性を変化させることによって起こる、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＭＭＳＥＴの活性は、ＭＭＳＥＴの酵素活性、ＭＭＳＥＴの転写レベル、およびＭＭＳＥＴのタンパク質レベルからなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＭＭＳＥＴの酵素活性は、メチル化を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
細胞中のＭＭＳＥＴの少なくとも１つの活性を阻害する薬剤を含む、薬学的組成物。
【請求項１４】
前記薬剤は、核酸である、請求項１３に記載の薬学的化合物。
【請求項１５】
前記薬剤は、抗体である、請求項１３に記載の薬学的化合物。
【請求項１６】
前記薬剤は、小分子である、請求項１３に記載の薬学的化合物。
【請求項１７】
前記薬剤は、３−ヒドラジニルキノキサリン−２−チオールである、請求項１３に記載の薬学的化合物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【公表番号】特表２０１３−５２０１６９（Ｐ２０１３−５２０１６９Ａ）
【公表日】平成２５年６月６日（２０１３．６．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５５３９４３（Ｐ２０１２−５５３９４３）
【出願日】平成２３年２月１１日（２０１１．２．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２４４３６
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／１０３０２８
【国際公開日】平成２３年８月２５日（２０１１．８．２５）
【出願人】（５０６２７７４１０）ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミシガン (19)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年６月６日（２０１３．６．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年２月１１日（２０１１．２．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２４４３６
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／１０３０２８
【国際公開日】平成２３年８月２５日（２０１１．８．２５）
【出願人】（５０６２７７４１０）ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミシガン (19)
【Ｆターム（参考）】
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