ＭＰＨＯＳＰＨ１またはＤＥＰＤＣ１ポリペプチドを発現する癌に対するペプチドワクチン
本発明は、配列番号７、８、９、１０、１１、１２、１９２、１９５、１９７、２０９、２２５、２２６、２２８、２３０、２４０、２４１、２４３、２４４、２４９、２５３、２５４または２５５に記載のアミノ酸配列を有するペプチドのほか、前記のアミノ酸配列を有するペプチドの１、２またはいくつかのアミノ酸が置換、欠失、または付加されたペプチドであって、細胞障害性Ｔ細胞誘導能を有するペプチドを提供する。本発明はまた、活性成分としてこれらのペプチドを含む、ＭＰＨＯＳＰＨ１および／またはＤＥＰＤＣ１の過剰発現と関連した疾患（例えば癌）の治療または予防のための薬剤を提供する。本発明のペプチドは、ワクチンとしても用いられる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は２００６年１０月１７日に出願した米国仮出願Ｎｏ．６０／８５２，５７５の恩典を主張し、その内容は全体として参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
本発明は生物科学の分野、より具体的には癌治療の分野に関する。特に、本発明は、極めて有効な癌ワクチンとして役立つ新規なペプチド、そして当該ペプチドを含む腫瘍を治療および予防する薬剤に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＣＤ８＋細胞障害性Tリンパ球（ＣＴＬ）がＭＨＣクラスＩ分子に提示される腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）由来のエピトープペプチドを認識して、腫瘍細胞を溶解させることが証明されている。ＴＡＡの最初の例としてのＭＡＧＥファミリーの発見以来、多くの他のＴＡＡが、免疫学的方法を用いて発見された（Boon T.(1993)Int J Cancer 54:177-80.;Boon T.et al.(1996)J Exp Med 183:725-9.;van der Bruggen P et al.(1991)Science 254:1643-7.;Brichard V et al.(1993)J Exp Med 178:489-95.;Kawakami Y et al.(1994)J Exp Med 180:347-52.）。それらの一部は、現在免疫療法の標的として、臨床開発中である。今までに発見されたＴＡＡは、ＭＡＧＥ（van der Bruggen P et al.、(1991)Science 254:
1643-7.）、ｇｐ１００（Kawakami Y et al.(1994)J Exp Med 180:347-52.）、ＳＡＲＴ（Shichijo S et al.(1998)J Exp Med 187:277-88.）、そして、ＮＹ―ＥＳＯ―１（Chen Y.T.et al.(1997)Proc. Natl. Acd.Sci. USA、94:1914-8.）を含む。一方、腫瘍細胞においてある程度特異的に過剰発現することが示された遺伝子産物は、細胞免疫反応を誘導する標的として認識されることが示されている。この種の遺伝子産物には、ｐ５３（Umano Y et al.Br J Cancer(2001)、84:1052-7.）（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）（Tanaka H et al.Br J Cancer(2001)、84:94-9.）、ＣＥＡ（Ｎukaya I et al.Int. J. Cancer(1999)80、92-7.）などがある。
【０００４】
ＴＡＡの基礎および臨床研究における著しい進展にもかかわらず、癌の治療に適した現在利用可能なＴＡＡ候補は非常に限られた数しかない（Rosenberg SA et al.Nature Med(1998)、4:321-7. Mukherji B. et al.(1995)Proc Natl Acad Sci USA、 Res(1996)、56:2479-83.）。癌細胞において多量に発現され、そしてその発現が癌細胞に限定されるＴＡＡは、免疫療法の標的として有望な候補である。
【０００５】
ＨＬＡ―Ａ２４およびＨＬＡ―Ａ０２０１は、日本人および白色人種の集団の一般のＨＬＡアレルである（Date Y et al.(1996)Tissue Antigens 47:93-101.Kondo A et al.(1995)J Immunol 155:4307-12.; Kubo RT et al.(1994)J Immunol 152:3913-24.; Imanishi et al.Proceeding of the eleventh International Histocompatibility Workshop and Conference Oxford University Press, Oxford, 1065 (1992);Williams F et al.(1997)Tissue Antigen 49:129-33.）。従って、これらのＨＬＡアレルによって提示される癌の抗原ペプチドは、日本人および白色人種の患者の癌治療において特に有用性を見いだすことができる。更に、インビトロでの低親和性ＣＴＬの誘導は通常、これらのＣＴＬを効果的に活性化する抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に生じる高レベルの特定ペプチド／ＭＨＣ複合体の高濃度のペプチドに曝すことでなしうることが知られている（Alexander-Miller et al.(1996)Proc Natl Acad Sci USA 93:4102-7.）。
【０００６】
cDNAマイクロアレイ技術の近年の発達の結果、正常細胞と比較した悪性細胞の遺伝子発現の包括的なプロファイルの構築を可能にした（Okabe、H.et al.(2001)Cancer Res.61、2129-37.Lin YM.et al.Oncogene(2002)、21;4120-8.Hasegawa S.et al.(2002)Cancer Res 62:7012-7.）。この方法は、癌細胞の複雑な性質および発癌の機序の理解を可能にし、腫瘍において無秩序に発現する遺伝子の識別を容易にする（Bienz M.et al.Cell(2000)103、311-20.）。癌において上方制御さていると確認された転写産物より、ＭＰＨＯＳＰＨ１（Ｍ期リン蛋白１；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１６１９５；配列番号：１、２）、そして、ＤＥＰＤＣ１（ＤＥＰ領域含有１；ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＢＭ６８３５７８）、が近年発見された。ＷＯ２００４／０３１４１３、ＷＯ２００６／０８５６８４およびＷＯ２，００７／０１３，６６５を参照（全コンテンツが本願明細書において引用されたものとする）。ＤＥＰＤＣ１は、２つの異なるトランスクリプショナルバリアント（ＤＥＰＤＣ１ Ｖ１（配列番号：３、４）およびＤＥＰＤＣ１ Ｖ２（配列番号：５、６））として記載されている。これらの遺伝子は、解析されたさまざまな癌組織の腫瘍細胞において特異的に上方制御されることを示した（下記参照）；しかしながら、ノーザンブロット解析は、これらの遺伝子産物が正常な重要臓器では見られないことを示す（ＰＣＴ／ＪＰ２００６／３０２６８４を参照）。ＭＰＨＯＳＰＨ１およびＤＥＰＤＣ１由来の抗原性ペプチドが、それらの抗原を発現している腫瘍細胞を殺傷するという有用性を見出すことができるという点で、これらの遺伝子は本発明者らにとって特別な興味のあるものである。
【０００７】
例えばＭ―ＶＡＣのような細胞障害性の薬剤によってしばしば重篤な副作用が生じるため、よく検討した作用機構を基に新規な標的分子を注意して選択することが負の副作用のリスクを最小限にする有効な抗癌剤の開発において重要であることは明白である。この目的に向けて、発明者は、以前にさまざまな癌および正常な人体組織の発現プロファイル解析を行い、癌において特異的に過剰発現する複数の遺伝子を見出した（Lin YM、et al．Oncogene．2002 Jun 13;21:4120-8.; Kitahara O、et al.Cancer Res. 2001 May 1;61:3544-9.; Suzuki C, et al., Cancer Res. 2003 Nov 1;63:7038-41.; Ashida S, Cancer Res. 2004 Sep 1;64:5963-72.; Ochi K, et al., Int J Oncol. 2004 Mar;24（3）:647-55.; Kaneta Y, et al., Int J Oncol. 2003 Sep;23:681-91.; Obama K, Hepatology. 2005 Jun;41:1339-48.; Kato T, et al., Cancer Res. 2005 Jul 1;65:5638-46.; Kitahara O, et al., Neoplasia. 2002 Jul-Aug;4:295-303.; Saito-Hisaminato A et al., DNA Res 2002, 9: 35-45.）。これらの中で、ＭＰＨＯＳＰＨ１（In house No．Ｃ２０９３）、そして、ＤＥＰＤＣ１（In house No．Ｂ５８６０Ｎ）は、さまざまな癌において過剰発現する遺伝子と同定された。特に、ＭＰＨＯＳＰＨ１は膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、胃癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、前立腺癌、腎癌、軟組織腫瘍において過剰発現することが、確認された。
同様に、ＤＥＰＤＣ１は膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、前立腺癌、ＳＣＬＣ、軟組織腫瘍において過剰発現することが、確認された。
【０００８】
ＭＰＨＯＳＰＨ１は、以前に、特異的にＧ２／Ｍ期移行でリン酸化される、プラス方向誘導キネシン関連のタンパク質として特徴づけられるタンパク質の１つとして同定された（Abaza A et al．Ｊ Biol Chem 2003、278：27844-52.）。より詳細には、ＭＰＨＯＳＰＨ１は、以前、細胞分裂において重要な役割を果たす、プラス方向誘導分子モーターであり、HeLa細胞において後期から終期の間に、紡錘体の中心に集積すると証明された（Abaza A et al. J Biol Chem 2003、278:27844-52；Kamimoto T et al.J Biol Chem 2001、276:37520-8）。ＭＰＨＯＳＰＨ１cＤＮＡは、下記３つの領域から成る１７８０アミノ酸タンパク質をコードする：ＮＨ２―ｋｉｎａｓｉｎモータードメイン（NH2-kinasin motor domain）、中心高次コイル―軸ドメイン（central coiled coil-stalk domain）およびＣ球状尾部ドメイン（C-globular tail domain）。同時に、このデータは、ＭＰＨＯＳＰＨ１がＮＨ２タイプキネシン関連のタンパク質であることを示唆する。
【０００９】
ＤＥＰＤＣ１に関しては、その機能は、未だ不明である。このタンパク質に含まれるＤＥＰドメインは、Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ、Ｅｇｌ―１０およびＰｌｅｃｋｓｔｒｉｎにおいても見られる。ショウジョウバエのｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄのＤＥＰドメインは、平面極性欠損の救済およびＪＮＫシグナリングの誘導において欠くことのできない役割を果たしている；それにもかかわらず、ヒトにおけるその機能は、まだ明らかにされていない。
しかしながら、ＰＣＴ／ＪＰ２００６／３０２６８４の中に開示されているように、ＤＥＰＤＣ１のｓｉＲＮＡは、癌細胞の増殖を抑制することができる。これらの結果は、ＤＥＰＤＣ１が多くの癌細胞の増殖において重要な役割を果たすことを証明する。
【発明の概要】
【００１０】
上記の如く、ＭＰＨＯＳＰＨ１（Ｍ期リン蛋白１）およびＤＥＰＤＣ１（ＤＥＰドメイン含有１）はさまざまな癌において上方制御されることが確認されている。より詳細には、これらの遺伝子は、ゲノムワイドなｃＤＮＡマイクロアレイによる遺伝子発現プロファイルを使用して確認された。上記のように、ＭＰＨＯＳＰＨ１およびＤＥＰＤＣ１の発現は肺癌および膀胱癌を含むさまざまな腫瘍細胞において特異的に上方制御されることを示されている。表１に示されるように、ＭＰＨＯＳＰＨ１の発現は、３１の膀胱癌中３０、３６の乳癌中８、１８の子宮頸癌中１８、１７の胆管細胞癌中５、３１のＣＭＬ中２５、１１の結腸直腸癌中６、１４の胃癌中６、５つのＮＳＣＬＣｓ中５、７つのリンパ腫中７、１０の骨肉腫中６、２２の前立腺癌中７、１８の腎癌中１０および２１の軟組織腫瘍中１５において有意に上昇することが示された。同時に、ＤＥＰＤＣ１の発現は、表１に示されるように、２５の膀胱癌中２３、１３の乳癌中６、１２の子宮頸癌中１２、６の胆管細胞癌中６、４のＣＭＬ中３、４の結腸直腸癌中２、６のＮＳＣＬＣｓ中６、７のリンパ腫中７、１４の骨肉腫中１０、２４の前立腺癌中１１、１４のＳＣＬＣｓ中１４および３１の軟組織腫瘍中２２において有意に上昇することを示した。
【００１１】
本発明は、少なくとも一つには、対応する分子に特異的な細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を誘導する能力を備えているこれらの遺伝子（ＭＰＨＯＳＰＨ１およびＤＥＰＤＣ１）の遺伝子産物の特定のエピトープペプチドを同定したことに基づく。以下に詳細に述べられるように、健常者ドナーの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）はＭＰＨＯＳＰＨ１またはＤＥＰＤＣ１由来のＨＬＡ―Ａ＊２４０２およびＨＬＡ―Ａ＊０２０１結合性候補ペプチドを使用して刺激された。ＣＴＬクローンおよび／またはラインは、それぞれの候補ペプチドでパルスされたＨＬＡ―Ａ２４またはＨＬＡ―Ａ２陽性標的細胞に対する特異的な細胞障害性を有するものが樹立された。これらの結果は、これらのペプチドが、ＨＬＡ―Ａ２４またはＨＬＡ―Ａ２拘束性エピトープペプチドでありＭＰＨＯＳＰＨ１またはＤＥＰＤＣ１を発現する細胞に対して有効な特異性免疫応答を誘導することができるということを示す。
【００１２】
したがって、本発明は、ＭＰＨＯＳＰＨ１および／またはＤＥＰＤＣ１の過剰発現と関連した疾患（例えば癌）を治療または予防する方法を提供する。当該方法はそれを必要とする対象に本発明のＭＰＨＯＳＰＨ１および／またはＤＥＰＤＣ１ポリペプチドを投与するステップを含む。当該ペプチドの投与は、抗腫瘍免疫を誘導結果となる。このように、本発明は対象に抗腫瘍免疫を誘導する方法を提供する。当該方法は例えば対象にＭＰＨＯＳＰＨ１および／またはＤＥＰＤＣ１ポリペプチドだけでなくＭＰＨＯＳＰＨ１および／またはＤＥＰＤＣ１の過剰発現と関連した疾患（例えば癌）を治療または予防するためのＭＰＨＯＳＰＨ１および／またはＤＥＰＤＣ１ポリペプチドを含む医薬品組成物を投与するステップを含む。癌には例えば、限定するものではないが、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、胃癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣおよび軟組織腫瘍が含まれる。
【００１３】
すなわち、本出願は、以下の態様およびそれらのいかなる組み合わせも含む。
[1]
細胞障害性Ｔ細胞誘導能を有する単離ペプチドであって、配列番号：２、４または６のアミノ酸配列由来である前記ペプチド。
[2]
配列番号：７、８および１２のアミノ酸配列を含むペプチドからなるグループから選択される約１５アミノ酸未満の単離ペプチド、または細胞障害性Ｔ細胞誘導能を有するペプチドであって、以下を含む前記ペプチド：
配列番号：７、８および１２からなるグループから選択され、１、２またはいくつかのアミノ酸が、置換、欠失、または、付加されたアミノ酸配列。
[3]
細胞障害性Ｔ細胞誘導能を有する、Ｎ末端からの第２位のアミノ酸がフェニルアラニン、チロシン、メチオニンまたはトリプトファンである〔２〕に記載のペプチド。
[4]
細胞障害性Ｔ細胞誘導能を有する、Ｃ末端アミノ酸は、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンまたはメチオニンである〔２〕に記載のペプチド。
[5]
配列番号：９、１０、１１、１９２、１９５、１９７、２０９、２２５、２２６、２２８、２３０、２４０、２４１、２４３、２４４、２５３、２５４および２５５、のアミノ酸配列を含むペプチドからなるグループから選択された約１５アミノ酸未満の単離ペプチド、または細胞障害性Ｔ細胞誘導能を有するペプチドであって、以下を含む前記ペプチド：
配列番号：９、１０、１１、１９２、１９５、１９７、２０９、２２５、２２６、２２８、２３０、２４０、２４１、２４３、２４４、２５３、２５４および２５５、からなるグループから選択され、１、２またはいくつかのアミノ酸が、置換、欠失、または、付加されたアミノ酸配列。
[6]
細胞障害性Ｔ細胞誘導能を有する、Ｎ末端からの第２位のアミノ酸は、ロイシンまたはメチオニンである〔５〕に記載のペプチド。
[7]
細胞障害性Ｔ細胞誘導能を有する、Ｃ末端アミノ酸は、バリンまたはロイシンである〔５〕に記載のペプチド。
[8]
ＤＮＡが〔１〕から〔７〕のいずれかのペプチドをコードするベクター。
[9]
配列番号：１、３および／または５の遺伝子の過剰発現と関連した疾患を治療または予防するための医薬組成物であって、前記組成物が〔１〕から〔７〕のいずれか一つのペプチドを一つ以上含む医薬組成物。
[10]
疾患が癌である〔９〕に記載の医薬組成物。
[11]
癌が、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、胃癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣおよび軟組織腫瘍からなるグループから選択される〔１０〕に記載の医薬組成物。
[12]
〔１〕から〔７〕のいずれか一つのペプチドおよびＨＬＡ抗原から成る複合体を表面に提示するエキソソーム。
[13]
ＨＬＡ抗原がＨＬＡ―Ａ２４である、〔１２〕に記載のエキソソーム。
[14]
ＨＬＡ抗原がＨＬＡ―Ａ２４０２である、〔１３〕に記載のエキソソーム。
[15]
ＨＬＡ抗原がＨＬＡ―Ａ２である、〔１２〕に記載のエキソソーム。
[16]
ＨＬＡ抗原がＨＬＡ―Ａ０２０１である、〔１３〕に記載のエキソソーム。
[17]
〔１〕から〔７〕のいずれかのペプチドを抗原提示細胞と接触させる工程を含む、高い細胞障害性Ｔ細胞誘導能を有する抗原提示細胞を誘導する方法。
[18]
〔１〕から〔７〕のいずれかのペプチドとＴ細胞を接触させることにより、細胞障害性Ｔ細胞を誘導する方法。
[19]
抗原提示細胞に〔１〕から〔７〕のいずれかのペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子を導入する工程を含む、高い細胞障害性Ｔ細胞誘導能を有する抗原提示細胞を誘導する方法。
[20]
請求項１から７のいずれかのペプチドとＴ細胞を接触させることにより、または、請求項１から７のいずれかのＨＬＡ―Ａ２４またはＨＬＡ―Ａ２のペプチドと結合するＴＣＲサブユニットポリペプチドをコードする核酸を導入することにより、誘導される単離された細胞障害性Ｔ細胞
[21]
ＨＬＡ抗原と〔１〕から〔７〕のいずれかのペプチドとで形成された複合体を含む、抗原提示細胞。
[22]
〔１７〕の方法により誘導される、〔２１〕に記載の抗原提示細胞。
[23]
活性成分として〔１〕から〔７〕のいずれかのペプチドを含む、配列番号：１、３および／または５の遺伝子を発現している細胞の細胞増殖を阻害するためのワクチン。
[24]
細胞が癌細胞である、〔２３〕に記載のワクチン。
[25]
癌が、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、胃癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣおよび軟組織腫瘍からなるグループから選択される、〔２４〕に記載のワクチン。
[26]
ＨＬＡ抗原がＨＬＡ―Ａ２４またはＨＬＡ―Ａ２である対象への投与のために調製される、〔２３〕に記載のワクチン。
[27]
対象に〔１〕から〔７〕のいずれか一つ以上のペプチド、その免疫学的活性断片、または前記ペプチドまたは活性断片をコードするポリヌクレオチドを含むワクチンを投与することを含む、配列番号：１、３および／または５の遺伝子の過剰発現と関連した疾患を治療または予防する方法。
[28]
疾患が癌である、〔２７〕に記載の方法。
[29]
癌が膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、胃癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣおよび軟組織腫瘍からなるグループから選択される〔２８〕に記載の方法。
【００１４】
あるいは、本発明は、〔１９〕の方法によって作製される抗原提示細胞とＴ細胞を接触させる段階を含む細胞障害性Ｔ細胞を誘導する方法にも関する。
【００１５】
以下の詳細な説明が添付の図および実施例と連動して読まれるときに、これらの、そしてまた他の、目的および発明の特徴はより十分に明らかになる。
しかしながら、前述の本発明の開示および以下の詳細な説明は好適な態様であって、本発明の、または本発明の他の態様にも限定されものではないことを理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１Ａは、ＩＦＮ―γＥＬＩＳＰＯＴ検査法によるエピトープペプチドのスクリーニングの結果を表しており、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２４―９―２７８（配列番号：７）がＩＦＮ―γの有力な生産体であることを証明する。ＭＰＨＯＳＨＰ１由来のそれらのペプチドに対するＣＴＬは、下記の実施例の「材料および方法」部分に記載されているプロトコールに従って生成された。結果として検出可能な特異的なＣＴＬ活性を有するＣＴＬが示された。特に、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２４―９―２７８によって刺激されたウェルナンバー＃４の細胞は、コントロールと比較して、ペプチドをパルスした標的細胞を認識して強力なＩＦＮ―ガンマを産生することを示した。図１Ｂは、限界希釈後（ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２４―９―２７８ ＣＴＬクローン）、ＣＴＬクローンのスクリーニングのＩＦＮ―γＥＬＩＳＰＯＴ検査法の結果を表す。陽性ウェルの細胞は拡張され、限界希釈された。表された結果に示されるように、ペプチドパルスをしていない標的に対する活性と比較して、ペプチドパルスされた標的に対してより高い特異的なＣＴＬ活性を有するＣＴＬクローンが樹立された。
【図２】図２Ａはエピトープペプチド細胞障害性のスクリーニングのためのＩＦＮ―γＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を表し、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２４―１０―２７８（配列番号：８）がＩＦＮ―γの有力な生産体であることを証明する。ＭＰＨＯＳＨＰ１由来のそれらのペプチドに対するＣＴＬは、下記の実施例の「材料および方法」部分に記載されているプロトコールに従って生成された。結果として検出可能な特異的なＣＴＬ活性を有するＣＴＬが示される。特に、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２４―１０―２７８によって刺激されたウェルナンバー＃８の細胞は、コントロールと比較して、強力なＩＦＮ―ガンマ産生を示した。図２Ｂは、限界希釈（ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２４―１０―２７８ ＣＴＬクローン）の後、ＣＴＬクローンのスクリーニングのためのＩＦＮ―γＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を表す。陽性ウェルの細胞は拡張され、そして、限界希釈された。結果が示すように、ペプチドパルスをしない標的に対する活性と比較して、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２４―１０―２７８をパルスした標的に対するより高い特異的なＣＴＬ活性を有するＣＴＬクローンが樹立された。
【図３】図３Ａは、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２４―９―２７８によって刺激されたＣＴＬクローンの樹立を表す（配列番号：７）。このＣＴＬクローンが、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２４―９―２７８をパルスした標的細胞（Ａ２４ＬＣＬ）に対して高い特異的なＣＴＬ活性を示したが、ペプチドをパルスしない同じ標的細胞（Ａ２４ＬＣＬ）に対しては著しいＣＴＬ活性を示さないことを証明した。図３Ｂは、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２４―１０―２７８（配列番号：８）によって刺激されたＣＴＬクローンの確立を示す。このＣＴＬクローンが、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２４―１０―２７８によってパルスされた標的細胞（Ａ２４ＬＣＬ）に対して高い特異的なＣＴＬ活性を示したが、ペプチドをパルスしない同じ標的細胞（Ａ２４ＬＣＬ）に対しては著しいＣＴＬ活性を示さなかった。Ｒは、レスポンダーを意味する：ＣＴＬクローン。Ｓは、スティミュレーターを意味する：ペプチドパルスされたＡ２４―ＬＣＬ（１ｘ１０４／ウェル）。
【図４】図４は、ＨＬＡ―Ａ２４を有する標的細胞表面上におけるＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２４―９―２７８（配列番号：７）の発現を表す。全長ＭＰＨＯＳＰＨ１遺伝子とＨＬＡ―Ａ＊２４０２分子を両方トランスフェクトしたＣＯＳ７に対する特異的なＣＴＬ活性は、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２４―９―２７８によっておこされたＣＴＬクローンをエフェクター細胞として使用して評価された。全長ＭＰＨＯＳＰＨ１によってトランスフェクトするがＨＬＡ―Ａ＊２４０２はしないＣＯＳ７、およびＨＬＡ―Ａ＊２４０２によってトランスフェクトするが全長ＭＰＨＯＳＰＨ１はしないＣＯＳ７は、コントロールとして調整された。ＣＴＬクローンは、ＭＰＨＯＳＰＨ１およびＨＬＡ―Ａ２４の両方によりトランスフェクトしたＣＯＳ７に対して、高い特異的なＣＴＬ活性を示した。しかし、ＭＰＨＯＳＰＨ１もＨＬＡ―Ａ２４もトランスフェクトさせないＣＯＳ７に対しては著しい特異的なＣＴＬ活性は示さなかった。Ｒは、レスポンダーを意味する：ＣＴＬクローン。Ｓは、スティミュレーターを意味する：ＣＯＳ７トランスフェクタント（１ｘ１０４／ウェル）。
【図５】図５は、ＭＰＨＯＳＰＨ１を内因的に発現している膀胱癌細胞株に対するＣＴＬ活性を表す。ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２４―９―２７８ペプチドによって誘導されて確立されたＣＴＬクローンは、ＭＰＨＯＳＰＨ１を内因的に発現している腫瘍細胞を認識した。ＨＴ１３７６、ＲＴ―４およびＪ８２細胞は、内因的にそれぞれＭＰＨＯＳＰＨ１を発現した。ＣＴＬクローンは、ＨＬＡ―Ａ＊２４０２遺伝子型を有するＨＴ１３７６に対するＩＦＮ―ガンマの産生を示したが、ＨＬＡ―Ａ＊２４０２遺伝子型を有しないＲＴ―４およびＪ８２に対しては反応を示さなかった。
【図６】図６は、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２４―９―２７８ペプチドを用いたインビボの免疫原性解析を表す。ＩＦＡ複合ペプチドは、皮下に０日目および７日目にＢＡＬＢ／ｃマウスに注射された。ワクチン接種されたマウスの脾細胞は１４日目に収集されてレスポンダー細胞として用いられ、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２４―９―２７８ペプチドをパルスされた１ｘ１０ ４のＲＬｍａｌｅ１細胞はＩＦＮ―γＥＬＩＳＰＯＴアッセイのスティミュレーターとして用いられた。スポットフォーミングカウント（ＳＦＣ）は、それぞれのマウスのケースで示された；５匹のマウス（Ａｎｉ１〜Ａｎｉ５）はエピトープペプチドをワクチン接種され、３匹のマウス（ｎｅｇａ１〜ｎｅｇａ３）は陰性コントロールとしてモックＩＦＡエマルジョンをワクチン接種された。
【図７】図７はエピトープペプチドのスクリーニングのためのＩＦＮ―γＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を表しており、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２―９―２８２（配列番号：９）、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２―９―６３８（配列番号：１０）およびＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２―１０―１７１４（配列番号：１１）が強力なＩＦＮ―ガンマ産生能を有することを証明する。ＭＰＨＯＳＨＰ１由来のそれらのペプチドに対するＣＴＬは、以下に述べる実施例の「材料およびＭｅｔｈｏｄｓ」部分に記載されているプロトコールに従って生成された。結果として検出可能な特異的なＣＴＬ活性を有するＣＴＬが示される。特に、図７Ａは、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２―９―２８２によって刺激されたウェルナンバー＃１および＃５の細胞が、コントロールと比較すると、標的細胞にパルスしたペプチドを認識するのに十分な強力なＩＦＮ―ガンマの産生を示したことを証明する。図７Ｂは、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２―９―６３８によって刺激されたウェルナンバー＃８の細胞が、コントロールと比較して、ペプチドをパルスした標的細胞を認識するのに十分な強力なＩＦＮ―ガンマの産生を示したことを証明する。図７Ｃは、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２―１０―１７１４によって刺激されたウェルナンバー＃４の細胞が、コントロールと比較して、ペプチドをパルスした標的細胞を認識するのに十分な強力なＩＦＮ―ガンマを産生することを示したことを証明する。
【図８】図８は、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ０２―９―２８２（配列番号：９）、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ０２―９―６３８（配列番号：１０）およびＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ０２―１０―１７１４（配列番号：１１）によって刺激されたＣＴＬラインの樹立を表す。陽性ウェルの細胞は拡張され、そして、結果が示すように、ペプチドパルスをしない標的に対する活性と比較して、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ０２―９―２８２をパルスした標的（Ａ）、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ０２―９―６３８をパルスした標的（Ｂ）またはＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ０２―１０―１７１４をパルス化した標的（Ｃ）に対する高い特異的なＣＴＬ活性を有するＣＴＬのラインが樹立された。Ｒは、レスポンダーを意味する：ＣＴＬライン。Ｓは、スティミュレーターを意味する：ペプチドパルス化されたＴ２（１ｘ１０４／ウェル）。
【図９】図９Ａは、限界希釈（ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２―９―２８２ ＣＴＬクローン）後のＣＴＬクローンのスクリーニングのためのＩＦＮ―γＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を表す。陽性ウェルの細胞は拡張され、そして限界希釈された。表された結果が示すように、ペプチドパルスをしない標的に対する活性と比較して、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２―９―２８２をパルスした（配列番号：９）標的に対する高い特異的なＣＴＬ活性を有するＣＴＬクローンが樹立された。図９Ｂは、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ０２―９―２８２によって刺激されたＣＴＬクローンの樹立を表す。当該ＣＴＬクローンは、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２―９―２８２によってパルスした標的細胞（Ｔ２）に対する高い特異的なＣＴＬ活性を示したが、ペプチドがパルスされない同じ標的細胞（Ｔ２）に対しては著しいＣＴＬ活性を所有しなかったことを証明した。Ｒは、レスポンダーを意味する：ＣＴＬクローン。Ｓは、スティミュレーターを意味する：ペプチドパルス化されたＴ２（１ｘ１０４／ウェル）。
【図１０】図１０ＡはエピトープペプチドのスクリーニングのためのＩＦＮ―γＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を表しており、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２４―９―２９４（配列番号：１２）がＩＦＮ―γの強力な生産体であることを示す。ＤＥＰＤＣ１由来のそれらのペプチドに対するＣＴＬは、以下に述べる実施例の「材料および方法」部分に記載されているプロトコールに従って生成された。結果として検出可能な特異的なＣＴＬ活性を示すＣＴＬが示された。コントロールと比較して、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２４―９―２９４によって刺激されたウェルナンバー＃１０の細胞は、ペプチドをパルスした標的細胞を認識して強力なＩＦＮ―ガンマを産生することを示した。図１０Ｂは、限界希釈（ＤＥＰＤＣ１―Ａ２４―９―２９４ ＣＴＬクローン）後の、ＣＴＬクローンのスクリーニングのためのＩＦＮ―γＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を表す。陽性ウェルの細胞は拡張され、そして、限界希釈された。結果が示すように、ペプチドパルスをしない標的に対する活性と比較して、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２４―９―２９４をパルスした標的に対する高い特異的なＣＴＬ活性を有するＣＴＬクローンが樹立された。
【図１１】図１１は、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２４―９―２９４（配列番号：１２）によって刺激されたＣＴＬクローンの樹立を表す。このＣＴＬクローンはＤＥＰＤＣ１―Ａ２４―９―２９４によってパルスされた標的細胞（Ａ２４ＬＣＬ）に対して高い特異的なＣＴＬ活性を示したが、それはペプチドをパルスしない同じ標的細胞（Ａ２４ＬＣＬ）に対しては、有意なＣＴＬ活性を示さなかった。Ｒは、レスポンダーを意味する：ＤＥＰＤＣ―Ａ２４―９―２９４ ＣＴＬクローン。Ｓは、スティミュレーターを意味する：ペプチドパルスされたＡ２４―ＬＣＬ（１ｘ１０４／ウェル）。
【図１２】図１２は、ＨＬＡ―Ａ２４を有する標的細胞表面上のＤＥＰＤＣ１―Ａ２４―９―２９４（配列番号：１２）の発現を示す。全長ＤＥＰＤＣ１遺伝子およびＨＬＡ―Ａ＊２４０２分子の両者によってトランスフェクトしたＣＯＳ７に対する特異的なＣＴＬ活性は、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２４―９―２９４によって上がるＣＴＬクローンをエフェクター細胞として用いて検定した。全長ＤＥＰＤＣ１によってトランスフェクトしたが、ＨＬＡ―Ａ＊２４０２はしないＣＯＳ７、およびＨＬＡ―Ａ＊２４０２をトランスフェクトしたが全長ＤＥＰＤＣ１はしないＣＯＳ７は、コントロールとして調整された。樹立されたＣＴＬクローンは、ＤＥＰＤＣ１およびＨＬＡ―Ａ２４の両者によってトランスフェクトしたＣＯＳ７に対して、高い特異的なＣＴＬ活性を示した。しかしながら、ＤＥＰＤＣ１もＨＬＡ―Ａ２４によってもトランスフェクトしないＣＯＳ７に対しては、有意な特異的ＣＴＬ活性を示さなかった。Ｒは、レスポンダーを意味する：ＤＥＰ―Ａ２４―９―２９４ ＣＴＬクローン。Ｓは、スティミュレーターを意味する：ＣＯＳ７トランスフェクタント（１ｘ１０４／ウェル）。
【図１３】図１３は、ＤＥＰＤＣ１を内因的に発現している膀胱癌細胞に対するＣＴＬ活性を示す。ＤＥＰＤＣ１―Ａ２４―９―２９４ペプチドによって誘導された樹立したＣＴＬクローンは、ＤＥＰＤＣ１を内因的に発現している腫瘍細胞を認識した。ＨＴ１３７６、ＲＴ―４およびＪ８２細胞は、それぞれが、内因的にＤＥＰＤＣ１を発現した。ＣＴＬクローンは、ＨＬＡ―Ａ＊２４０２遺伝子型を有するＨＴ１３７６に対するＩＦＮ―ガンマ産生を示したが、ＨＬＡ―Ａ＊２４０２遺伝子型を有しないＲＴ―４およびＪ８２に対しては反応しないことを示した。
【図１４】図１４は、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２４―９―２９４ペプチドを用いたインビボの免疫原性解析を示す。ＩＦＡ複合ペプチドは、０日目および７日目にＢＡＬＢ／ｃマウスに皮下注射された。１４日目に、ワクチン接種を受けたマウスの脾細胞は集められて応答細胞として用いられ、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２４―９―２９４ペプチドをパルスした１ｘ１０４のＲＬｍａｌｅ１細胞は刺激因子細胞としてＩＦＮ―ガンマＥＬＩＳＰＯＴアッセイに用いられた。スポット形成カウント（ＳＦＣ）は、それぞれのマウスで示された；５匹のマウス（Ａｎｉ１〜Ａｎｉ５）はエピトープペプチドをワクチン接種され、そして、２匹のマウス（ｎｅｇａ１およびｎｅｇａ２）は陰性対照としてＭｏｃｋ ＩＦＡエマルジョンを注入された。
【図１５】図１５は、エピトープペプチドのスクリーニングのためのＩＦＮ―ガンマＥＬＩＳＰＯＴアッセイによる、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―６４４―１０―５７５―１０―５０６―１０―７６５―１０―３９５―１０―２２４―９―２９７―１０―２９６および―１０―３０２の強力なＩＦＮ―ガンマ生産を示す。ＤＥＰＤＣ１由来のそれらのペプチドに対するＣＴＬは、「材料および方法」に記載されている方法で生成された。ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―６４４で刺激されたウェルナンバー＃４と＃７の細胞、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―５７５で刺激されたウェルナンバー＃２の細胞、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―５０６による＃７の細胞、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―７６５による＃１の細胞およびＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―３９５による、＃１の細胞、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―２２４による＃１と＃２の細胞、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―９―２９７による＃４の細胞、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―２９６による＃３と＃４の細胞およびＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―３０２による＃２、＃３、＃５および＃７の細胞は、コントロールと比較して有力なＩＦＮ―ガンマ生産を示した。
【図１６】図１６は、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―２９６ペプチドによって生成されたＣＴＬラインのＩＦＮ―ガンマ産生を示す。ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―２９６ペプチドによって高められ樹立したＣＴＬラインは、強力なＩＦＮ―ガンマ産生活性を有する。それは、ペプチドパルスされた標的細胞に対してＩＦＮ―ガンマ産生を示したが、ペプチドをパルスしない標的に対しては、示さなかった。標的細胞は、細胞表面でＨＬＡ―Ａ２分子を発現するＴ２細胞を用いた。
【図１７】図１７は、ＤＥＰＤＣ１およびＨＬＡ―Ａ２分子を内因的に発現している標的に対する、ＣＴＬ活性を示す。ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―２９６ペプチドにより生成されて樹立したＣＴＬ株がＤＥＰＤＣ１Ｖ２およびＨＬＡ―Ａ２を内因的に発現した標的細胞に対してＩＦＮ―ガンマ産生活性を有したことは、上方パネルにおいて示された。このＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―２９６ペプチドを用いたケースは、下方パネルに示された。ＤＥＰＤＣ１Ｖ１―９―６７４またはＤＥＰ―９―４６２のペプチドパルスの処理によるＨＬＡ―Ａ２のみ発現する標的細胞およびＤＥＰＤＣ１Ｖ２だけを発現する標的細胞は、陰性対照として調整された。標的細胞は、ＨＬＡ―Ａ２またはモックを安定的に発現するＨＥＫ２９３トランスフェクタントより調整された。
【図１８】図１８は、症例２における抗原発現を示す。症例２において、ＭＰＨＯＳＰＨ１およびＤＥＰＤＣ１の両者が、強く発現された。従って、ＭＰＨＯＳＰＨ１およびＤＥＰＤＣ１由来の２種類のエピトープペプチドがワクチン接種された。
【図１９】図１９は、症例２における膀胱癌の局所再発の臨床評価を示す。症例２は、ＲＥＣＩＳＴ基準によるとＳＤ評価であった。
【図２０】図２０は、症例３の抗原発現を示す。症例３において、ＤＥＰＤＣ１が強く発現された。従って、ＤＥＰＤＣ１由来のエピトープペプチドを単独でワクチン接種した。
【図２１】図２１は、症例３の転移肺の右葉に対する臨床評価を示す。この進行率は、ワクチン接種の後低下した。とりわけ、腫瘍のサイズは、第３コース後に減少した。
【図２２】図２２は、症例３の転移肺の左葉に対する臨床評価を示す。この進行率は、ワクチン接種の後低下した。特に、腫瘍のサイズは、第３コース後に減少した。
【図２３】図２３は、症例３における抗腫瘍効果を示す。転移性腫瘍の進行率は、ワクチン接種の後低下した。
【図２４】図２４は、症例３の特異的なＣＴＬ反応を示す。特異的なＣＴＬ反応がワクチン接種の後強く示された。
【図２５】図２５は、症例４の抗原発現を示す。症例４において、ＭＰＨＯＳＰＨ１およびＤＥＰＤＣ１が発現された。従って、ＭＰＨＯＳＰＨ１およびＤＥＰＤＣ１由来の２種類のエピトープペプチドがワクチン接種された。
【図２６】図２６は、症例４の膀胱癌の局所再発のための臨床評価を示す。腫瘍サイズは、第１コースのワクチン接種後ＲＥＣＩＳＴ基準に基づくと２０％減少した。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
発明の詳細な説明
本明細書で用いられる「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」の単語は、とくに別段の明示がない限り、「少なくとも一つ」を意味する。
【００１８】
別途定められない限り、本願明細書において用いられるすべての技術的および科学的な用語は、本発明が属する当業者によって共通に理解されるのと同じ意味を有する。
【００１９】
新しいTAA、特に、強力かつ特異的な抗腫瘍免疫応答を誘導するTAAの同定により、様々な型の癌におけるペプチドワクチン接種ストラテジーの臨床での応用のさらなる進歩が保証される（Boon T et al.(1996)J Exp Med 183:725-9.van der Bruggen P et al.((1991)Science 254):1643-7.Brichard V et al.((1993)J Exp Med 178):489-95.Kawakami Y et al.（（1994）Ｊ Exp Med 180）:347-52.Shichijo S et al.((1998)J Exp Med 187):277-88.Chen YT et al.(1997)Proc.Natl.Acd.Sci.USA、94:1914-8.Harris CC((1996)J Natl Cancer Inst 88):1442-55.Butterfield LH et al.((1999)Cancer Res 59):3134-42.Vissers JL et al.((1999)Cancer Res 59):5554-9.van der Burg SH et al.((1996)J. Immunol 156):3308-14.Tanaka F et al.((1997)Cancer Res 57):4465-8.Fujie T et al.((1999)Int J Cancer 80):169-72. Kikuchi M et al.((1999)Int J Cancer 81):459-66.Oiso M et al.（（1999）Int J Cancer 81）:387-94）。
上記の如く、ＭＰＨＯＳＰＨ１（Ｍ期リン蛋白１；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１６１９５；配列番号：１、２）およびＤＥＰＤＣ１（ＤＥＰ領域含有１；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＢＭ６８３５７８）、特に、その２つのバリアント（ＤＥＰＤＣ１Ｖ１（配列番号：３、４）およびＤＥＰＤＣ１Ｖ２（配列番号：５、６）は、以前、cDNAマイクロアレイ技術を用いて、さまざまな癌において過剰発現するものとして同定された。ＭＰＨＯＳＰＨ１は、以前Ｇ２／Ｍ移行で特異的にリン酸化されるタンパク質のうちの１つとして同定され、プラス方向誘導キネシン関連のタンパク質として特徴づけられた（Abaza A et al. J Biol Chem 2003、278:27844-52．）。特に、ＭＰＨＯＳＰＨ１は、以前、細胞分裂において重要な役割を果たすプラス方向誘導分子モーターであり、HeLa細胞の終期までの後期の間に、紡錘体の中心部に集積すると実証された（Abaza A et al. J Biol Chem 2003、278:27844-52; KamimotoT et al. J Biol Chem 2001、276:37520-8.）。
ＭＰＨＯＳＰＨ１のcDNAは、３つの領域、：ＮＨ２―ｋｉｎａｓｉｎモータードメイン（NH2-kinasin motor domain）、中心高次コイル―軸ドメイン（central coiled coil-stalk domain）およびＣ球状尾部ドメイン（C-globular tail domain）、から成る１７８０アミノ酸のタンパク質をコードする。これらのデータは、ＭＰＨＯＳＰＨ１がＮＨ２タイプキネシン関連のタンパク質であることを示唆する。
【００２０】
ＤＥＰＤＣ１タンパク質の機能は、いまだ明らかでない。このタンパク質に含まれるＤＥＰ領域はＤｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ、Ｅｇｌ―１０およびＰｌｅｃｋｓｔｒｉｎにおいて見られる。特に、ショウジョウバエのｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄのＤＥＰドメインは、平面極性欠損の救済およびＪＮＫシグナリングの誘導において欠くことのできない役割を果たしている；にもかかわらず、ヒトにおけるその機能は、まだ明らかにされていない。しかしながら、ＰＣＴ／ＪＰ２００６／３０２６８４に開示されているように、ＤＥＰＤＣ１（In House No.：Ｂ５８６０Ｎ）は、ＤＥＰＤＣ１Ｖ１およびＶ２に対応するそれぞれ１２と１１のエキソンからなる２つの異なるトランスクリプショナルバリアントを有する。Ｖ１のエキソン８における変異が認められており、そして、他の残りのエキソンは両方のバリアントに共通であることが見いだされた。Ｖ２異型は、Ｖ１のエキソン８を有しないが、最後のエキソン内で同じ終止コドンを生成する。Ｂ５８６０ＮＶ１およびＢ５８６０ＮＶ２バリアントの全長cDNAシーケンスは、それぞれ５３１８のおよび４４６６のヌクレオチドから成る。これらのバリアントのＯＲＦはそれぞれのエキソン１内で始まる。最終的に、Ｖ１およびＶ２の転写産物は、それぞれ８１１および５２７のアミノ酸をコードする。ｓｉＲＮＡは癌細胞の増殖を抑制した。これらの結果はＤＥＰＤＣ１が殆どの癌細胞の増殖において重要な役割を果たしていることを示す。
【００２１】
ＰＣＴ／ＪＰ２００６／３０２６８４に開示されているように、ＭＰＨＯＳＰＨ１およびＤＥＰＤＣ１は、膀胱癌においては過剰発現するが、正常組織では軽微な発現のみ示す。加えて、これらの遺伝子は、細胞増殖に関連した重要な機能を有するとされた。
【００２２】
本発明において、ＭＰＨＯＳＰＨ１またはＤＥＰＤＣ１由来のペプチドは、日本人および白色人種の集団において共通に見いだされるＨＬＡアレルであるＨＬＡ―Ａ２４およびＨＬＡ―Ａ２によって拘束されたＴＡＡエピトープとなることを示す。とくに、ＨＬＡ―Ａ２４およびＨＬＡ―Ａ２へのそれらの結合能を用いて、ＭＰＨＯＳＰＨ１またはＤＥＰＤＣ１由来のＨＬＡ―Ａ２４およびＨＬＡ―Ａ２結合ペプチドの候補が同定された。これらのペプチドを負荷された樹状細胞（ＤＣｓ）によるＴ細胞のインビトロ刺激の後、ＣＴＬは、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２４―９―２７８（ＩＹＮＥＹＩＹＤＬ（配列番号：７）、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２４―１０―２７８（ＩＹＮＥｙＩＹＤＬＦ（配列番号：８）、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２―９―２８２（ＹＩＹＤＬＦＶＰＶ（配列番号：９）、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２―９―６３８（ＲＬＡＩＦＫＤＬＶ（配列番号：１０）、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２―１０―１７１４（ＴＭＳＳｓＫＬＳＮＶ（配列番号：１１）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２４―９―２９４（ＥＹＹＥＬＦＶＮＩ（配列番号：１２）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―６４４（ＳＬＭＩｈＴＦＳＲＣ（配列番号：２４０）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―５７５（ＳＬＬＰａＳＳＭＬＴ（配列番号：２４１）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―５０６（ＱＬＣＲｓＱＳＬＬＬ（配列番号：２４３）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―７６５（ＫＱＦＱｋＥＹＰＬＩ（配列番号：２４４）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―３９５（ＩＭＧＧＳＣＨＮＬＩ（配列番号：２４９）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―２２４（ＮＭＡＮｔＳＫＲＧＶ（配列番号：２５３）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―９―２９７（ＥＬＦＶＮＩＬＧＬ（配列番号：２２６）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―２９６（ＹＥＬＦｖＮＩＬＧＬ（配列番号：２５４）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―３０１（ＮＩＬＧｌＬＱＰＨＬ（配列番号：２５５）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２―９―５８９（ＬＬＱＰＨＬＥＲＶ（配列番号：１９２）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２―９―６１９（ＬＬＭＲＭＩＳＲＭ（配列番号：１９５）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２―９―２９０（ＬＬＴＦＥＹＹＥＬ（配列番号：１９７）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２―９―５６３（ＲＬＣＫＳＴＩＥＬ（配列番号：２０９）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２―９―６５３（ＣＶＬＣＣＡＥＥＶ（配列番号：２２５）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２―１０―６７４（ＦＬＭＤｈＨＱＥＩＬ（配列番号：２２８）およびＤＥＰＤＣ１―Ａ２―１０―３０２（ＩＬＶＶｃＧＹＩＴＶ（配列番号：２３０）を用いて、成功裡に樹立された。これらのＣＴＬは、ペプチドパルスされたＡ２４ＬＣＬおよびＴ２細胞に対して、強力な細胞障害活性を示した。さらにまた、これらの細胞由来のＣＴＬクローンも、それぞれ、ＭＰＨＯＳＰＨ１またはＤＥＰＤＣ１を発現しているＨＬＡ―Ａ２４またはＨＬＡ―Ａ２陽性細胞に対して特異的な細胞障害性を示した。しかしながら、これらのＣＴＬクローンはＨＬＡ―Ａ２４、ＨＬＡ―Ａ２、ＭＰＨＯＳＰＨ１およびＤＥＰＤＣ１のペプチドのうちの１つのみ発現する細胞に対しては、細胞障害活性を示さなかった。同時に、これらの結果は、ＭＰＨＯＳＰＨ１およびＤＥＰＤＣ１の癌細胞に対するＴＡＡとしての有用性を示唆し、そして、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２４―９―２７８（ＩＹＮＥＹＩＹＤＬ（配列番号：７））、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２４―１０―２７８（ＩＹＮＥｙＩＹＤＬＦ（配列番号：８））、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２―９―２８２（ＹＩＹＤＬＦＶＰＶ（配列番号：９））、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２―９―６３８（ＲＬＡＩＦＫＤＬＶ（配列番号：１０））、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２―１０―１７１４（ＴＭＳＳｓＫＬＳＮＶ（配列番号：１１））、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２４―９―２９４（ＥＹＹＥＬＦＶＮＩ（配列番号：１２））、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―６４４（ＳＬＭＩｈＴＦＳＲＣ（配列番号：２４０））、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―５７５（ＳＬＬＰａＳＳＭＬＴ（配列番号：２４１））、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―５０６（ＱＬＣＲｓＱＳＬＬＬ（配列番号：２４３））、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―７６５（ＱＦＱｋＥＹＰＬＩ（配列番号：２４４））、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―３９５（ＩＭＧＧＳＣＨＮＬＩ（配列番号：２４９）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―２２４（ＮＭＡＮｔＳＫＲＧＶ（配列番号：２５３））、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―９―２９７（ＥＬＦＶＮＩＬＧＬ（配列番号：２２６））、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―２９６（ＹＥＬＦｖＮＩＬＧＬ（配列番号：２５４））、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―３０１（ＮＩＬＧｌＬＱＰＨＬ（配列番号：２５５））、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２―９―５８９（ＬＬＱＰＨＬＥＲＶ（配列番号：１９２））、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２―９―６１９（ＬＬＭＲＭＩＳＲＭ（配列番号：１９５））、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２―９―２９０（ＬＬＴＦＥＹＹＥＬ（配列番号：１９７））、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２―９―５６３（ＲＬＣＫＳＴＩＥＬ（配列番号：２０９））、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２―９―６５３（ＣＶＬＣＣＡＥＥＶ（配列番号：２２５））、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２―１０―６７４（ＦＬＭＤｈＨＱＥＩＬ（配列番号：２２８））およびＤＥＰＤＣ１―Ａ２―１０―３０２（ＩＬＶＶｃＧＹＩＴＶ（配列番号：２３０））は、ＨＬＡ―Ａ２４またはＨＬＡ―Ａ２に拘束されるそれぞれのＴＡＡのエピトープペプチドである。これらの抗原が多くの癌において過剰発現して、腫瘍細胞増殖と関係しているので、それらは癌に対する免疫療法の標的として有用性を提供する。例えば癌には、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、胃癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣ、軟組織腫瘍が含まれるが限定するものではない。
【００２３】
したがって、本発明は更に、ＭＰＨＯＳＰＨ１および／またはＤＥＰＤＣ１の過剰発現と関連した対象における疾患（例えば癌）を治療または予防する方法であって約40アミノ酸未満、しばしば、約20アミノ酸未満、通常は約15アミノ酸未満であり、かつ配列番号：７、８、９、１０、１１、１２、１９２、１９５、１９７、２０９、２２５、２２６、２２８、２３０、２４０、２４１、２４３、２４４、２４９、２５３、２５４または２５５のアミノ酸配列を含む免疫原性ペプチドを、必要としている対象に投与する段階を含む方法を提供する。あるいは、免疫原性ペプチドは、結果として生じる変異体ペプチドが免疫原性活性（すなわち、肺癌細胞に特異的なCTLを誘導する能力）を保持するとの条件で、1個、2個、または数個のアミノ酸が置換、除去、または付加されている、配列番号：７、８、９、１０、１１、１２、１９２、１９５、１９７、２０９、２２５、２２６、２２８、２３０、２４０、２４１、２４３、２４４、２４９、２５３、２５４または２５５の配列を含みうる。置換、除去、または付加される残基の数は、一般的に、5アミノ酸またはそれ未満、好ましくは4アミノ酸またはそれ未満、より好ましくは3アミノ酸またはそれ未満、よりいっそう好ましくは1アミノ酸もしくは2アミノ酸である。 意図される癌としては、限定はされないが、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、胃癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣ、軟組織腫瘍が挙げられる。
【００２４】
変異体ペプチド（すなわち、本来のアミノ酸配列に対して、1個、2個、または数個のアミノ酸残基の置換、除去、または付加を行うことにより改変されたアミノ酸配列を含むペプチド）は、本来の生物活性を保持することが知られている（Mark DF et al.(1984)Proc Natl Acad Sci USA 81:5662-6.Zoller MJ and Smith M((1982)Nucleic Acids Res 10):6487-500.Dalbadie-McFarland et al.((1982)Proc Natl Acad Sci USA 79):6409-13.）。
本発明の文脈において、アミノ酸改変は、結果として、本来のアミノ酸側鎖の性質を保存することが好ましい（保存的アミノ酸置換として公知の方法）。アミノ酸側鎖の性質の例は、疎水性アミノ酸（A、I、L、M、F、P、W、Y、V）、親水性アミノ酸（R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T）、および共通して、以下の官能基または特性を有する側鎖である：脂肪族側鎖（G、A、V、L、I、P）；ヒドロキシ基含有側鎖（S、T、Y）；イオウ原子含有側鎖（C、M）；カルボン酸およびアミド含有側鎖（D、N、E、Q）；塩基含有側鎖（R、K、H）；ならびに芳香族含有側鎖（H、F、Y、W）。ただし、括弧でくくられた文字は、アミノ酸の一文字記号を示す。
【００２５】
好適な態様において、免疫原ペプチドは、ノナペプチド（９―ｍｅｒ）またはデカペプチド（１０―ｍｅｒ）である。
【００２６】
本発明はさらに、対象においてＭＰＨＯＳＰＨ１および／またはＤＥＰＤＣ１の過剰発現と関連した主題の疾患（例えば癌）対する抗腫瘍免疫を誘導する方法であって、本発明の免疫原性ペプチド、すなわち７、８、９、１０、１１、１２、１９２、１９５、１９７、２０９、２２５、２２６、２２８、２３０、２４０、２４１、２４３、２４４、２４９、２５３、２５４または２５５のアミノ酸配列またはそれらの変異体（すなわち、1個、2個、もしくは数個のアミノ酸の置換、除去、または付加を含む）を含むペプチドを、それを必要としている対象に投与する段階を含む方法を提供する。 意図される癌としては、限定はされないが、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、胃癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣ、軟組織腫瘍が挙げられる。
【００２７】
本発明の文脈において、対象は、好ましくは哺乳類である。典型的な哺乳類は、例えば、人間、人間以外の霊長類、マウス、ネズミ、イヌ、ネコ、ウマまたはウシを含むが、これに限定されるものではない。
【００２８】
本発明において、ペプチドは、インビボまたはエクスビボで対象に投与することができる。さらに、本発明はまた、ＭＰＨＯＳＰＨ１および／またはＤＥＰＤＣ１の過剰発現と関連した疾患（例えば癌）の処置または予防するための免疫原性組成物を製造するための７、８、９、１０、１１、１２、１９２、１９５、１９７、２０９、２２５、２２６、２２８、２３０、２４０、２４１、２４３、２４４、２４９、２５３、２５４および２５５のアミノ酸配列（ならびにそれらの変異体）を含むペプチドから選択されるノナペプチドまたはデカペプチドの使用を提供する。意図される癌としては、限定はされないが、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、胃癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣ、軟組織腫瘍が挙げられる。
【００２９】
ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２４―９―２７８（ＩＹＮＥＹＩＹＤＬ（配列番号：７））、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２４―１０―２７８（ＩＹＮＥｙＩＹＤＬＦ（配列番号：８））、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２―９―２８２（ＹＩＹＤＬＦＶＰＶ（配列番号：９））、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２―９―６３８（ＲＬＡＩＦＫＤＬＶ（配列番号：１０））、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２―１０―１７１４（ＴＭＳＳｓＫＬＳＮＶ（配列番号：１１））、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２４―９―２９４（ＥＹＹＥＬＦＶＮＩ（配列番号：１２））、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２―９―５８９（ＬＬＱＰＨＬＥＲＶ（配列番号：１９２））、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２―９―６１９（ＬＬＭＲＭＩＳＲＭ（配列番号：１９５））、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２―９―２９０（ＬＬＴＦＥＹＹＥＬ（配列番号：１９７））、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２―９―５６３（ＲＬＣＫＳＴＩＥＬ（配列番号：２０９））、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２―９―６５３（ＣＶＬＣＣＡＥＥＶ（配列番号：２２５））、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２―１０―６７４（ＦＬＭＤｈＨＱＥＩＬ（配列番号：２２８））、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２―１０―３０２（ＩＬＶＶｃＧＹＩＴＶ（配列番号：２３０））ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―６４４（ＳＬＭＩｈＴＦＳＲＣ（配列番号：２４０））、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―５７５（ＳＬＬＰａＳＳＭＬＴ（配列番号：２４１））、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―５０６（ＱＬＣＲｓＱＳＬＬＬ（配列番号：２４３））、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―７６５（ＫＱＦＱｋＥＹＰＬＩ（配列番号：２４４））、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―３９５（ＩＭＧＧＳＣＨＮＬＩ（配列番号：２４９）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―２２４（ＮＭＡＮｔＳＫＲＧＶ（配列番号：２５３））、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―９―２９７（ＥＬＦＶＮＩＬＧＬ（配列番号：２２６））、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―２９６（ＹＥＬＦｖＮＩＬＧＬ（配列番号：２５４））およびＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―３０１（ＮＩＬＧｌＬＱＰＨＬ（配列番号：２５５））の相同性解析は、それらにはいかなる公知のヒト遺伝子産物由来のペプチドとも有意な相同性がないことを証明する。従って、これらの分子に対する免疫療法での未知の、または望ましくない免疫応答の可能性は、著しく低減される。
【００３０】
ＨＬＡ抗原に関して、ここで提示されるデータは、Ａ―２４タイプまたはＡ―２タイプ抗原（日本人の中で多く発現しているといわれている）が有効な結果を得ることに好都合であることを証明する。Ａ―２４０２およびＡ―０２０１のようなサブタイプの使用は、さらに好ましい。一般に、臨床において、治療を必要としている患者のＨＬＡ抗原のタイプが前もって調べられ、患者抗原に対する高い結合能を有する、または、抗原提示による細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）誘導能を有する適切なペプチドの選択を可能にする。さらに、高い結合親和性およびCTL誘導能を示すペプチドを得るために、1個、2個、もしくは数個のアミノ酸の置換、除去、または付加が、天然に存在するＭＰＨＯＳＰＨ１およびＤＥＰＤＣ1の部分的ペプチドのアミノ酸配列に基づいて行われうる。本明細書において、「数個の」という用語は、5個またはそれ未満、より好ましくは3個またはそれ未満を指す。さらに、天然で示されるペプチドに加えて、HLA抗原への結合により示されるペプチドの配列の規則性は既知であるため（Kubo RT、et al. J.Immunol.(1994)、152、3913-24.Ｒammensee HG、et al.、 (1995)Immunogenetics.41:178-228.;Kondo A、et aｌ.、（1995) J. Immunol.155:4307−12.）、そのような規則性に基づいた改変を、本発明の免疫原性ペプチドに対して行うことができる。例えば、N末端から2番目のアミノ酸がフェニルアラニン、チロシン、メチオニン、またはトリプトファンで置換されている、高いHLA-24結合親和性を示すペプチドは、有利に用いられうる。同様に、Ｃ末端アミノ酸がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンまたはメチオニンによって置換されるペプチドは、有利に用いられうる。一方、N末端から2番目のアミノ酸がロイシンまたはメチオニンによって置換されたペプチド、そして、Ｃ末端アミノ酸がバリンまたはロイシンによって置換されたペプチドを有する高いＨＬＡ―Ａ２結合能を有しているペプチドは有利に用いられうる。さらに、１〜２のアミノ酸は、ペプチドのＮ末端またはＣ末端に加えられることができる。
【００３１】
しかしながら、ペプチド配列が、異なる機能をもつ内因性または外因性のタンパク質のアミノ酸配列の一部と同一である場合、特定の物質に対する自己免疫異常またはアレルギー症状のような副作用が引き起こされうる。それゆえに、免疫原性配列が公知のタンパク質のアミノ酸配列に一致する状況は避けることが好ましい。この状況は、利用可能なデータベースを用いて相同性検索を行うことにより避けられうる。相同性検索で、1個、2個、または数個のアミノ酸が異なるペプチドが存在しないことが確認される場合、例えば、HLA抗原との結合親和性を増加させる、および/またはCTL誘導能を増加させる上記のアミノ酸配列の改変による危険性が避けられうる。
【００３２】
上記のようなHLA抗原に対する高い結合親和性をもつペプチドは、癌ワクチンとして大いに効果的であることが期待されるが、高い結合親和性の存在を指標とし、それに応じて選択される候補ペプチドは、実際のCTL誘導能の存在について調べる必要がある。CTL誘導能は、ヒトMHC抗原を有する抗原提示細胞（例えば、Bリンパ球、マクロファージ、および樹状細胞）、またはより具体的には、ヒト末梢血単核白血球由来の樹状細胞を誘導し、関心の対象のペプチドによる刺激後、CD8陽性細胞と混合し、標的細胞に対する細胞傷害活性を測定することにより確認されうる。反応系として、ヒトHLA抗原を発現させるように作製されたトランスジェニック動物（例えばBenMohamed L、et al.Hum.IMMUNOL.(2000);61の(8):764-79 Related Articles、Books、Linkout.に記載）が用いられうる。例えば、標的細胞は、51Crなどで放射標識することができ、細胞傷害活性は、標的細胞から放出された放射能から計算することができる。あるいは該標的細胞は、固定化ペプチドを有する抗原提示細胞の存在下でCTLにより産生および放出されたIFN-γを測定し、抗IFN-γモノクローナル抗体を用いて培地上の阻害ゾーンを可視化することにより調べることができる。
【００３３】
上記の通りにペプチドのＣＴＬ誘導能を調べた結果として、ＨＬＡ抗原に対する高い結合能を有するそれらのペプチドが高い誘導性を必ずしも有するというわけではないということが見出された。しかしながら、ＩＹＮＥＹＩＹＤＬ（配列番号：７）、ＩＹＮＥｙＩＹＤＬＦ（配列番号：８）、ＹＩＹＤＬＦＶＰＶ（配列番号：９）、ＲＬＡＩＦＫＤＬＶ（配列番号：１０）、ＴＭＳＳｓＫＬＳＮＶ（配列番号：１１）ＥＹＹＥＬＦＶＮＩ（配列番号：１２）ＬＬＱＰＨＬＥＲＶ（配列番号：１９２）ＬＬＭＲＭＩＳＲＭ（配列番号：１９５）ＬＬＴＦＥＹＹＥＬ（配列番号：１９７）ＲＬＣＫＳＴＩＥＬ（配列番号：２０９）ＣＶＬＣＣＡＥＥＶ（配列番号：２２５）ＦＬＭＤｈＨＱＥＩＬ（配列番号：２２８）ＩＬＶＶｃＧＹＩＴＶ（配列番号：２３０）ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―６４４（ＳＬＭＩｈＴＦＳＲＣ（配列番号：２４０））、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―５７５（ＳＬＬＰａＳＳＭＬＴ（配列番号：２４１））、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―５０６（ＱＬＣＲｓＱＳＬＬＬ（配列番号：２４３））、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―７６５（ＫＱＦＱｋＥＹＰＬＩ（配列番号：２４４））、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―３９５（ＩＭＧＧＳＣＨＮＬＩ（配列番号：２４９）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―２２４（ＮＭＡＮｔＳＫＲＧＶ（配列番号：２５３））、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―９―２９７（ＥＬＦＶＮＩＬＧＬ（配列番号：２２６））、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―２９６（ＹＥＬＦｖＮＩＬＧＬ（配列番号：２５４））およびＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―３０１（ＮＩＬＧｌＬＱＰＨＬ（配列番号：２５５））により示されたアミノ酸配列を含むペプチドから選択されたノナペプチドまたはデカペプチドは、特に高いCTL誘導能を示した。
【００３４】
上記のように、本発明は、細胞傷害性T細胞誘導能をもつペプチド、すなわち、配列番号：７、８、９、１０、１１、１２、１９２、１９５、１９７、２０９、２２５、２２６、２２８、２３０、２４０、２４１、２４３、２４４、２４９、２５３、２５４もしくは２５５のアミノ酸配列またはそれらの変異体（すなわち、1個、2個、または数個のアミノ酸が置換、除去、または付加されているアミノ酸配列）を含むペプチドを提供する。配列番号：７、８、９、１０、１１、１２、１９２、１９５、１９７、２０９、２２５、２２６、２２８、２３０、２４０、２４１、２４３、２４４、２４９、２５３、２５４もしくは２５５に示される9アミノ酸もしくは10アミノ酸を含むアミノ酸配列またはそれらの変異体は、別の内因性タンパク質と関連したアミノ酸配列と一致しないことが好ましい。特に、N末端から2番目のアミノ酸におけるロイシンまたはメチオニンへのアミノ酸置換、またはC末端アミノ酸におけるバリンまたはロイシンへのアミノ酸置換、ならびにN末端および/もしくはC末端における1〜2アミノ酸のアミノ酸付加が、好ましい例である。当業者は、アミノ酸置換および付加に加え、ペプチドの免疫学的活性断片が本発明の方法においても使われうると認識する。活性断片を決定する方法は、公知技術である。これらの改変ペプチドによる刺激によって得られたＣＴＬクローンは、もとのペプチドを認識でき、本来のペプチドを発現している細胞に、傷害を与えることができる。
【００３５】
本発明のペプチドは、公知技術を用いて調整されうる。例えば、該ペプチドは、組換えDNA技術または化学合成のいずれかを用いて、合成的に調製することができる。本発明のペプチドは、個々に、または2つもしくはそれ以上のペプチドを含むより長いポリペプチドとして、合成されうる。本発明のペプチドは、好ましくは単離される、すなわち、他の天然に存在する宿主細胞タンパク質およびそれらの断片を実質的に含まない。
【００３６】
本発明のペプチドは、改変が本明細書に記載されているようなペプチドの生物活性、すなわち、ＨＬＡ抗原に結合する能力やＣＴＬを誘導する能力、を破壊しない限りにおいて、グリコシル化、側鎖酸化、またはリン酸化のような改変を含みうる。他の改変は、例えば、ペプチドの血清半減期を増加させるために用いることができるD-アミノ酸または他のアミノ酸模倣体の取り込みを含む。
【００３７】
本発明のペプチドは、インビボでＣＴＬを誘導しうるＭＰＨＯＳＰＨ１および／またはＤＥＰＤＣ１の過剰発現と関連した疾患（例えば癌）のためのワクチンとして使用するために、本発明のペプチドの２つまたはそれ以上を含む組み合わせとして調製することができる。意図される癌としては、限定はされないが、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、胃癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣ、軟組織腫瘍が挙げられる。該ペプチドは、カクテルであってもよく、または標準的な技術を用いて互いに結合させてもよい。例えば、該ペプチドは、単一のポリペプチド配列として発現しうる。組み合わせにおける該ペプチドは、同じまたは異なりうる。本発明のペプチドを投与することにより、ペプチドは、抗原提示細胞のHLA抗原上において高密度で提示され、続いて、示されたペプチドとHLA抗原の間で形成された複合体に対して特異的に反応するCTLを誘導する。あるいは、対象から樹状細胞を取り出すことにより得られた、本発明のペプチドをその細胞表面上に固定化している抗原提示細胞が、本発明のペプチドにより刺激されうる。それぞれの対象へのこれらの細胞の再投与はCTLを誘導し、その結果、標的細胞に対する攻撃性を増加させることができる。
【００３８】
より具体的には、本発明は、本発明のペプチドを1つまたは複数含む、ＭＰＨＯＳＰＨ１および／またはＤＥＰＤＣ１の過剰発現と関連した疾患（例えば癌）を処置するための、または腫瘍の増殖、転移などを予防するための薬剤を提供する。本発明のこのペプチドは、ＭＰＨＯＳＰＨ１および／またはＤＥＰＤＣ１の過剰発現と関連した疾患（例えば癌）の治療の特定の有用性を提供する。意図される癌としては、限定はされないが、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、胃癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣ、軟組織腫瘍が挙げられる。
【００３９】
本発明のペプチドは、従来の製剤方法により製剤した薬学的組成物として対象へ直接投与することができる。そのような場合、本発明のペプチドに加えて、薬物に通常用いられる担体、賦形剤などを、特別な制限なしに、必要に応じて含むことができる。本発明の免疫原組成物は、ＭＰＨＯＳＰＨ１および／またはＤＥＰＤＣ１の過剰発現と関連した疾患の処理および予防のために用いられうる。意図される癌としては、限定はされないが、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、胃癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣ、軟組織腫瘍が挙げられる。
【００４０】
活性成分として本発明のペプチドを1つまたは複数含む、ＭＰＨＯＳＰＨ１および／またはＤＥＰＤＣ１の過剰発現と関連した疾患（例えば癌）の処置および／または予防のための免疫原性組成物は、さらに、細胞性免疫を効果的に確立するためにアジュバントを含むことができる。あるいは、該組成物は抗癌剤のような他の活性成分と共に投与されうる。
意図される癌としては、限定はされないが、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、胃癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣ、軟組織腫瘍が挙げられる。適切な製剤には顆粒も含まれる。適切なアジュバントは、文献（Johnson AG.(1994)C1in.Microbio1.Rev.7:277-89．）に記載されている。例示的なアジュバントは、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、およびミョウバンを含むが、これに限定されない。さらに、リポソーム製剤、薬物が直径数μmのビーズへ結合している顆粒製剤、および脂質が前記ペプチドに結合している製剤が、便利に用いられうる。投与の方法は、経口投与、皮内注射、皮下注射、静脈内注射などであってもよく、全身投与または標的腫瘍の付近への局所的投与を含みうる。本発明のペプチドの用量は、処置すべき疾患、患者の年齢、体重、投与の方法などにより適切に調整することができる。用量は、普通、0.001mg〜1000mg、好ましくは0.01mg〜100mg、より好ましくは0.1mg〜10mgであり、好ましくは数日に1回から数ヶ月に1回投与されるが、当業者は適切な用量および投与の方法を容易に選択することができ、これらのパラメーターの選択および最適化は、十分に通常の技術の範囲内である。
【００４１】
本発明はさらに、本発明のペプチドとＨＬＡ抗原で形成された複合体をその表面上に提示するエキソソームと呼ばれる細胞内小胞を提供する。エキソソームは、例えば、国際公開され、日本語翻訳されて公開された特表平１１−５１０５０７号および特表２０００−５１２１６１号の公報に詳細に記載された方法を用いることにより調製することができ、好ましくは、処置および/または予防の標的である対象から得られた抗原提示細胞を用いて調製される。本発明のエキソソームは、本発明のペプチドと同様に、癌ワクチンとしてワクチン接種することができる。
【００４２】
用いられるHLA抗原の型は、処置および/または予防を必要とする対象のHLA抗原の型と一致しなければならない。例えば、日本人集団においては、ＨＬＡ―Ａ２４またはＨＬＡ―Ａ２、特にＨＬＡ―Ａ２４０２またはＨＬＡ―Ａ０２０１が、多くの場合適当である。
【００４３】
いくつかの態様において、本発明のワクチン組成物は、細胞傷害性Ｔリンパ球を初回抗原刺激する構成要素を含む。脂質は、ウイルス抗原に対してインビボでＣＴＬを初回抗原刺激する能力がある作用物質として同定されている。例えば、パルミチン酸残基は、リシン残基のε−アミノ基およびα−アミノ基に付着し、その後、本発明の免疫原性ペプチドに連結することができる。脂質化ペプチドは、その後、ミセルまたは粒子に入れる、リポソームに取り込ませる、またはアジュバント中に乳化するかのいずれかで、直接投与することができる。ＣＴＬ反応の脂質初回抗原刺激のもう一つの例として、適切なペプチドに共有結合的に付着している場合、トリパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイニルセリル-セリン（Ｐ３ＣＳＳ）のような大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）リポタンパク質を、ＣＴＬを初回抗原刺激するために用いることができる（例えば、Deres K、et al. (1989)Nature 342:561-4.を参照）。
【００４４】
本発明の免疫原性組成物はまた、本明細書に開示された免疫原性ペプチドの1つまたは複数をコードする核酸を含みうる。Wolff JA et al.（Science (1990) 247）1465-8；米国特許第5,580,859号；5,589,466；5,804,566； 5,739,118； 5,736,524； 5,679,647；、WO98/04720参照。
ＤＮＡに基づいた送達技術（delivery technologies）の例は、「ネイキッドＤＮＡ（naked DNA）」、促進化ブピビカイン（bupivicaine）、ポリマー、ペプチド媒介性）送達、カチオン性脂質複合体、および粒子媒介性（「ジーンガン（gene gun）」）または圧力媒介性送達を含む（例えば、米国特許第5,922,687号参照）。
【００４５】
本発明の免疫原性ペプチドはまた、ウイルスベクターまたは細菌ベクターにより発現させることができる。適切な発現ベクターの例は、ワクシニアまたは鶏痘のような弱毒性ウイルス宿主を含む。このアプローチは、例えば、ペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現させうるベクターとしてのワクシニアウイルスの使用を含む。宿主への導入により、組換えワクシニアウイルスは、免疫原性ペプチドを発現させ、それにより、免疫応答を誘発する。免疫化プロトコールにおいて有用なワクシニアベクターおよび方法は、例えば、米国特許第4,722,848号に記載されている。もう一つの適したベクターは、BCG（カルメット・ゲラン菌（Bacille Calmette Guerin））である。ＢＣＧベクターは、Stover CK、et al.、Nature(1991)351:456-60に記載されている。
治療的投与または免疫化に有用な幅広い種類の他のベクター、例えば、アデノおよびアデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、チフス菌（Salmonella typhi）ベクター、解毒化炭疽毒素ベクターなどが、当技術分野において公知である。例えばShata MT、et al. (2000)Mol. Med. Today 6:66-71; Shedlock DJ and Weiner DB. et al. (2000)J Leukoc.Biol.68:793-806；そして、Hipp JD、et al.、In Vivo 14(2000):571-85を参照。
【００４６】
本発明はまた、本発明の1つまたは複数のペプチドを用いて抗原提示細胞を誘導する方法を提供する。抗原提示細胞は、末梢血単球から樹状細胞を誘導し、その後それらを、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで本発明の1つまたは複数のペプチドと接触させる（刺激する）ことにより誘導することができる。本発明のペプチドを対象へ投与すると、自身に固定化されている本発明のペプチドを有する抗原提示細胞が、対象の体内において誘導される。
あるいは、本発明のペプチドを抗原提示細胞へ固定化した後、細胞をワクチンとして対象に投与することができる。例えば、エクスビボ投与は以下の段階を含みうる：
a：対象から抗原提示細胞を収集する段階、および
b：段階aの抗原提示細胞を本発明のペプチドと接触させる段階。
【００４７】
段階bにより得られた抗原提示細胞は、対象へワクチンとして投与することができる。
【００４８】
本発明はまた、高レベルの細胞傷害性T細胞誘導能をもつ抗原提示細胞を誘導するための方法であって、インビトロで、本発明の1つまたは複数のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子を抗原提示細胞へ移入する段階を含む方法を提供する。導入された遺伝子は、DNAまたはRNAの形をとりうる。導入の方法について、特別な制限なしに、リポフェクション、エレクトロポレーション、およびリン酸カルシウム法のような、当分野において通常行われる様々な方法が適切に用いられうる。より詳しくは、トランスフェクトは、Reeves ME et al. (1996) Cancer Res. 56:5672-7.； Butterfield LH et al. (1998) J. Immunol. 161:5607-13.； Boczｋowski D et al. (1996) J.Exp.Med. 184:465-72. ；国際公開され、日本語翻訳されて公開された特表2000-509281号公報；に開示されているように、実行されうる。遺伝子を抗原提示細胞へ移入することにより、遺伝子は、細胞において転写、翻訳などを受け、その後、得られたタンパク質は、MHCクラスIまたはクラスIIによりプロセシングされ、提示経路を通って進み、部分ペプチドを提示する。
【００４９】
本発明はさらに、本発明の1つまたは複数のペプチドを用いてCTLを誘導するための方法を提供する。本発明のペプチドが対象に投与された場合、CTLは、対象の体内において誘導され、腫瘍組織におけるＭＰＨＯＳＰＨ１および／またはＤＥＰＤＣ１を発現する細胞（例えば癌細胞）を標的とする免疫系の強さは、それにより増強される。意図される癌としては、限定はされないが、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、胃癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣ、軟組織腫瘍が挙げられる。あるいは、本発明のペプチドは、対象由来の抗原提示細胞およびＣＤ８陽性細胞または末梢血単核白血球がインビトロで本発明の１つまたは複数のペプチドと接触させられ（刺激され）、ＣＴＬを誘導した後、細胞が対象へ戻される、エクスビボ治療方法との関連において用いられうる。
例えば、本方法は以下の段階を含みうる：
a：対象から抗原提示細胞を収集する段階、
b：段階aの抗原提示細胞を本発明のペプチドと接触させる段階、
c：細胞傷害性T細胞を誘導するために、段階bの抗原提示細胞をＣＤ８陽性Ｔ細胞と混合し共培養する段階、および
d：段階cの共培養物からＣＤ８陽性Ｔ細胞を収集する段階。
段階dにより得られた細胞傷害活性をもつＣＤ８陽性Ｔ細胞は、ワクチンとして対象に投与することができる。
【００５０】
本発明は更に、本発明のペプチドを用いた活性化細胞障害性Ｔ細胞を生成する方法を提供する。例えば、前記方法は、以下の段階を含むことができる：
a:対象からＴ細胞を収集する段階、そして、
ｂ：Ｔ細胞を以下のペプチドと接触させる段階。
（1）
配列番号：７、８、９、１０、１１、１２、１９２、１９５、１９７、２０９、２２５、２２６、２２８、２３０、２４０、２４１、２４３、２４４、２４９、２５３、２５４および２５５のアミノ酸配列を有するペプチドからなるグループから選択される約１５アミノ酸未満の単離ペプチド。
（2）
細胞障害性Ｔ細胞誘導能を有するペプチドであって、配列番号：９、１０、１１、１９２、１９５、１９７、２０９、２２５、２２６、２２８、２３０、２４０、２４１、２４３、２４４、２５３、２５４および２５５、からなるグループから選択され、１、２またはいくつかのアミノ酸が、置換、欠失、または、付加された、アミノ酸配列を有する前記ペプチド。
【００５１】
本発明はまた、本発明のペプチドを用いて活性Ｔ細胞の誘導能を有するＡＰＣを生成する方法を提供する。例えば、当該方法は、表面上にペプチドおよびＨＬＡ抗原を提示する抗原提示細胞を生産するためにペプチドと抗原提示細胞を接触させる段階を含みうる。
本発明の文脈において、「活性された細胞障害性Ｔ細胞」は、ＩＦＮ―ガンマ産生、ＩＦＮ―ガンマ放出および腫瘍細胞の細胞死を誘導する。
【００５２】
本発明は、更に、本発明のペプチドを用いて誘導される単離された細胞障害性Ｔ細胞を提供する。本発明の1つまたは複数のペプチドを提示する抗原提示細胞での刺激により誘導された細胞傷害性T細胞は、好ましくは、処置および/または予防の標的である対象由来であり、単独で、または本発明の1つもしくは複数のペプチドまたは抗腫瘍活性をもつエキソソームを含む他の薬物と組み合わせて投与することができる。得られた細胞傷害性T細胞は、本発明のペプチド、または好ましくは誘導に用いられたものと同じペプチドを提示する標的細胞に対して特異的である。標的細胞は、ＭＰＨＯＳＰＨ１および／またはＤＥＰＤＣ１を内因的に発現する細胞またはＭＰＨＯＳＰＨ１および／またはＤＥＰＤＣ１遺伝子がトランスフェクトされている細胞でもよい。これらのペプチドによる刺激により本発明のペプチドを細胞表面上に提示する細胞もまた、攻撃の標的になりうる。
【００５３】
本発明はまた、HLA抗原と本発明の1つまたは複数のペプチドとの間で形成された複合体を提示する抗原提示細胞を提供する。本発明のペプチドまたはそのようなペプチドをコードするヌクレオチドとの接触を通して得られた抗原提示細胞は、好ましくは、処置および/または予防の標的である対象に由来し、単独で、または本発明のペプチド、エキソソーム、もしくは細胞傷害性T細胞を含む他の薬物と組み合わせて、ワクチンとして投与することができる。
【００５４】
本発明はまた、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のサブユニットを形成することができるポリペプチドをコードする核酸を含む組成物およびその使用方法を提供する。当該ＴＣＲサブユニットは、ＭＰＨＯＳＰＨ１またはＤＥＰＤＣ１を提示する腫瘍細胞に対してＴ細胞を特異的にするＴＣＲｓを形成する能力を有する。従来技術において公知の方法を用いることにより、本発明の一つまたは複数のペプチドによって誘導されるＣＴＬのＴＣＲサブユニットのα鎖およびβ鎖の核酸は同定されうる（WO2007/032255およびMorgan et al. J Immunol 171 3288no(2003)）。誘導体ＴＣＲは、好ましくは高い結合活性を有してＭＰＨＯＳＰＨ１またはＤＥＰＤＣ１ペプチドを提示している標的細胞と結合し、そして、任意にインビトロでＭＰＨＯＳＰＨ１またはＤＥＰＤＣ１ペプチドを提示している標的細胞の効果的な殺傷をもたらす。
【００５５】
ＴＣＲサブユニットをコードしている核酸は、適切なベクター（例えばレトロウイルスベクタ）に組み込むことができる。これらのベクターは、当該技術分野において公知である。
核酸またはそれらを含むベクターは有効にＴ細胞に導入することができる、ここで、Ｔ細胞は好ましくは患者由来である。都合のよいことに、本発明は、迅速にまた容易に強い癌細胞殺傷特性を持つ改変Ｔ細胞を供給するため患者自身のＴ細胞（または他の哺乳類のそれら）を迅速に改変することができるｏｆｆ−ｔｈｅ−ｓｈｅｌｆ組成物を提供する。
【００５６】
また、本発明は、ＭＰＨＯＳＰＨ１またはＤＥＰＤＣ１ペプチド（例えば、ＨＬＡ―Ａ２４またはＨＬＡ―Ａ２との関係において配列番号：７、８、９、１０、１１、１２、１９２、１９５、１９７、２０９、２２５、２２６、２２８、２３０、２４０、２４１、２４３、２４４、２４９、２５３、２５４または２５５である）と結合するＴＣＲサブユニットポリペプチドをコードしている核酸の形質導入によって調整されるＣＴＬを提供する。形質導入されたＣＴＬは、インビボで癌細胞にホーミングができ、よく知られた培養方法によりインビトロで拡張される（例えば、Kawakami et al. J Immunol.142 3452-3461no(1989)）。本発明のＴ細胞は、治療または保護を必要とする患者の癌の治療または予防に役立つ免疫原組成物を形成するために用いることができる（WO2006/031221）。
【００５７】
本発明の文脈において、「ワクチン」という用語（免疫原組成物とも称される）は、抗腫瘍免疫の誘導または動物へのワクチン接種に応じて癌を抑制する物質を指す。本発明により、配列番号：７、８または１２のアミノ酸配列を有するポリペプチドはＨＬＡ―Ａ２４拘束性エピトープペプチド、そして、配列番号：９、１０、１１、１９２、１９５、１９７、２０９、２２５、２２６、２２８、２３０、２４０、２４１、２４３、２４４、２４９、２５３、２５４または２５５のそれはＨＬＡ―Ａ２拘束性エピトープペプチドであり、ＭＰＨＯＳＰＨ１および／またはＤＥＰＤＣ１を発現している細胞（例えばＭＰＨＯＳＰＨ１および／またはＤＥＰＤＣ１を発現している癌細胞）に対して有力および特異的な免疫応答を誘導することができることが示唆された。意図される癌としては、限定はされないが、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、胃癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣ、軟組織腫瘍が挙げられる。したがって、本発明はまた、配列番号７、８、９、１０、１１、１２、１９２、１９５、１９７、２０９、２２５、２２６、２２８、２３０、２４０、２４１、２４３、２４４、２４９、２５３、２５４または２５５のアミノ酸配列またはその変異体（すなわち、１、２またはいくつかのアミノ酸置換、欠失または付加を含む）を有するポリペプチドを用いて抗腫瘍免疫を誘導する方法を含む。
一般に、抗腫瘍免疫は、以下のような免疫応答を含む：
ＭＰＨＯＳＰＨ１および／またはＤＥＰＤＣ１を発現している細胞を含む腫瘍に対する細胞障害性リンパ球の誘導、
ＭＰＨＯＳＰＨ１および／またはＤＥＰＤＣ１を発現している細胞を含む腫瘍を認識する抗体の誘導、そして、
抗腫瘍サイトカイン産生の誘導。
【００５８】
従って、特定のペプチドが動物へのワクチン接種によりこれらの免疫応答のいずれか1つを誘導する場合、そのペプチドは、抗腫瘍免疫誘導効果をもつと決定される。ペプチドによる抗腫瘍免疫の誘導は、インビボまたはインビトロで、ペプチドに対する宿主における免疫系の応答を観察することにより、検出することができる。
【００５９】
例えば、細胞毒性Ｔリンパ球の誘導を検出する方法は、公知である。生体に侵入する異物は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の作用により、Ｔ細胞およびＢ細胞へ提示される。抗原特異的な様式でAPCにより提示された抗原に対して応答するT細胞は、抗原による刺激により、細胞傷害性T細胞（細胞傷害性Tリンパ球またはCTLとも呼ばれる）へ分化し、その後増殖する；この過程は、本明細書では、T細胞の「活性化」と呼ばれる。従って、特定のペプチドによるＣＴＬ誘導は、以下によって評価することができる：ＡＰＣによってＴ細胞にペプチドを提示し、そして、ＣＴＬの誘導を検出する。さらに、ＡＰＣは、ＣＤ４+ Ｔ細胞、ＣＤ８+Ｔ細胞、マクロファージ、好酸球、およびＮＫ細胞を活性化する効果を有する。
ＣＤ４+ Ｔ細胞はまた抗腫瘍免疫において重要であるため、ペプチドの抗腫瘍免疫誘導作用は、これらの細胞の活性化効果を指標として用いて評価することができる。
【００６０】
樹状細胞（ＤＣ）をＡＰＣとして用いるＣＴＬの誘導作用を評価するための方法は、当技術分野において周知である。ＤＣは、ＡＰＣ中で最も強いＣＴＬ誘導作用をもつ代表的なＡＰＣである。この方法では、試験ポリペプチドを最初にＤＣに接触させ、その後、該ＤＣをＴ細胞と接触させる。ＤＣとの接触後の、対象となる細胞に対する細胞傷害性効果をもつＴ細胞の検出は、試験ポリペプチドが細胞傷害性Ｔ細胞を誘導する活性をもつことを示している。瘍に対するＣＴＬの活性は、例えば、５１Ｃｒ標識腫瘍細胞の溶解を指標として用いて検出することができる。あるいは、３Ｈ−チミジン取り込み活性またはＬＤＨ（ラクトースデヒドロゲナーゼ）放出を指標として用いて腫瘍細胞損傷の程度を評価することは周知である。 さらに、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイのような坑ＩＦＮガンマ抗体を用いた視覚化によって、固定化したペプチドを担持する抗原提示細胞の存在下で、ＣＴＬによって産生、放出されるＩＦＮ―ガンマを測定することによって、検討することができる。
【００６１】
ＤＣとは別に、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）もまた、ＡＰＣとして用いられうる。ＣＴＬの誘導は、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の存在下でＰＢＭＣを培養することにより増強されることが報告されている。同様に、ＣＴＬは、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）およびＩＬ−７の存在下で、ＰＢＭＣを培養することによって誘導されることが示されている。
【００６２】
これらの方法によりＣＴＬ誘導活性を有することが確認された試験ポリペプチドは、ＤＣ活性効果およびその後のＣＴＬ誘導活性をもつポリペプチドである。従って、腫瘍細胞に対してＣＴＬを誘導するポリペプチドは、ＭＰＨＯＳＰＨ１および／またはＤＥＰＤＣ１の過剰発現と関連した疾患（例えば癌）に対するワクチンとして有効である。さらに、ポリペプチドと接触させることによってＭＰＨＯＳＰＨ１および／またはＤＥＰＤＣ１の過剰発現と関連した疾患に対してＣＴＬを誘導する能力を得たＡＰＣは、疾患に対するワクチンとして有効である。ＡＰＣによるポリペプチド抗原の提示によって細胞傷害性を獲得したＣＴＬもまた、ＭＰＨＯＳＰＨ１および／またはＤＥＰＤＣ１の過剰発現と関連した疾患に対するワクチンとして利用できる。ＡＰＣおよびＣＴＬのため抗腫瘍免疫を用いるＭＰＨＯＳＰＨ１および／またはＤＥＰＤＣ１の過剰発現と関連した疾患のためのそのような治療法は、細胞免疫療法と呼ばれる。意図される癌としては、限定はされないが、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、胃癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣ、軟組織腫瘍が挙げられる。
【００６３】
一般的に、細胞免疫療法のためにポリペプチドを用いる場合、ＣＴＬ誘導の効率は、異なる構造をもつ複数のポリペプチドを組み合わせ、それらをＤＣと接触させることにより、増加させることができる。それゆえに、タンパク質断片でＤＣを刺激する場合、複数の型の断片の混合物を用いることが有利である。
【００６４】
ポリペプチドによる抗腫瘍免疫の誘導は、腫瘍に対する抗体産生の誘導を観察することによって、更に確認することができる。例えば、ポリペプチドに対する抗体が、ポリペプチドで免疫された実験動物において誘導される場合、ならびに、腫瘍細胞の成長、増殖、および/または転移がそれらの抗体により抑制される場合、ポリペプチドは抗腫瘍免疫を誘導すると決定される。
【００６５】
抗腫瘍免疫は、本発明のワクチンを投与することにより誘導することができ、抗腫瘍免疫の誘導は、ＭＰＨＯＳＰＨ１および／またはＤＥＰＤＣ１の過剰発現と関連した疾患（例えば癌）の治療および予防を可能にする。ＭＰＨＯＳＰＨ１および／またはＤＥＰＤＣ１の過剰発現と関連した疾患（例えば癌）に対する治療または発症の予防は、ＭＰＨＯＳＰＨ１および／またはＤＥＰＤＣ１を発現する細胞（例えば癌細胞）の成長の阻害、それらの細胞の退縮、およびそれらの細胞（例えば癌細胞）の発生の抑制を含みうる。ＭＰＨＯＳＰＨ１および／またはＤＥＰＤＣ１の過剰発現と関連した疾患を有する個人の死亡率の減少、血液中の疾患マーカーの減少、疾患に伴う検出可能な症状の軽減などもまた、疾患（例えば癌）の治療または予防に含まれる。そのような治療的または予防的効果は、ＭＰＨＯＳＰＨ１および／またはＤＥＰＤＣ１の過剰発現と関連した疾患（例えば癌）に対するワクチンの治療的または予防的効果がワクチン投与なしの対照と比較される場合に統計学的に有意であること、例えば５%またはそれ未満の有意レベルで観察されることが好ましい。例えば、スチューデントｔ検定、マン-ホイットニーＵ検定、またはＡＮＯＶＡが、統計学的有意性を決定するために用いられうる。
【００６６】
本発明がＭＰＨＯＳＰＨ１および／またはＤＥＰＤＣ１の過剰発現に関連した疾患（例えば癌）を治療または予防する方法を提供するという点で、治療的な化合物または組成物は予防的に、または、治療的に疾患の発達に苦しんでいるまたはその危険におかれている（または、受けやすい）対象に投与されうる。当該対象は、標準的臨床方法を用いて同定されうる。本発明の文脈において、予防的投与は疾患の明らかな症状が現れる前に行われ、そうすることで、疾患が予防されるかまたはその進行が遅らされる。医学の分野の文脈において、「予防する」という用語は、疾患による死亡率または罹患率の負荷を減少させるいかなる活性も含む。予防は、"ｔ第一次、第二次および第三次予防レベルを生じうる。第一次予防は疾患の発達を避けるが、第二次および第三次レベルの予防は疾患の進行や症状の発生を予防し、またすでにおきている疾患の悪影響を、修復機能や合併症を減少させることにより、減少することを意図した活性を含む。
【００６７】
癌治療の文脈において、「有効である」という用語は、対象における癌のサイズ、罹患率または転移の可能性の減少につながる処理に関連する。治療が予防的に適用される場合、「有効である」は治療が非癌の発生を遅延または防止するかまたは癌の臨床症状を軽減することを意味する。癌の評価は、標準的な臨床プロトコールを用いて行うことができる。さらにまた、治療の効用は、癌を診断または治療するいかなる公知の方法と共同しても決定されうる。例えば、癌は、組織病理学的に、または、対症異常を同定することによって診断することができる。
【００６８】
免疫学的活性を有する前記のペプチド、または当該ペプチドをコードしているポリヌクレオチドまたはベクターは、アジュバントと組み合わすことができる。アジュバントとは、免疫学的活性を有するペプチドによって同時に（または連続して）投与されるときに、ペプチドに対して免疫応答を強化する化合物を指す。適切なアジュバントの例としては、コレラ毒素、サルモネラ菌毒素、ミョウバンおよびそのようなものを含むが、それに限定されない。さらに、本発明のワクチンは、薬学的に許容される担体と適切に組み合わせられうる。そのような担体の例は、滅菌水、生理食塩水、リン酸緩衝液、培養液などである。さらに、ワクチンは、必要に応じて、安定剤、懸濁剤、保存剤、界面活性剤などを含みうる。ワクチンは、全身的にまたは局所的に投与される。ワクチン投与は、単回投与により行われるか、または複数回投与により追加免疫されうる。
【００６９】
本発明のワクチンとしてＡＰＣまたはＣＴＬを用いるときに、ＭＰＨＯＳＰＨ１および／またはＤＥＰＤＣ１の過剰発現と関連した疾患（例えば癌）は例えば、エクスビボの方法によって処置または、予防することができる。より具体的には、処置または予防を受ける対象のＰＢＭＣを収集し、エクスビボで本発明のペプチドと接触させる。ＡＰＣまたはＣＴＬの誘導後、細胞を対象に投与する。ＡＰＣはまた、ペプチドをコードするベクターをエクスビボでＰＢＭＣへ導入することにより誘導することができる。インビトロで誘導されたAPCまたはCTLは、投与の前にクローニングすることができる。標的細胞を損傷する高い活性をもつ細胞をクローニングおよび増殖させることにより、細胞免疫療法をより効果的に行うことができる。さらに、この方法で単離されたＡＰＣおよびＣＴＬは、細胞が由来している個体に対する細胞免疫療法だけでなく、他の個体における類似した型の疾患に対する細胞免疫療法にも用いられうる。
【００７０】
本発明の態様は以下の実施例において説明され、その実施例は、本発明を例証するため、および同じものの作製および使用において当業者を援助するためにのみ示される。本実施例は、いかなる形であれ本発明の範囲を限定することを意図していない。
【００７１】
本明細書に記載されたものと類似または同等の方法および材料を、本発明の実施または試験において用いることができるが、適切な方法および材料は以下に記載されている。
【００７２】
実施例
本発明は以下の実施例により例証されるが、それらに限定されない。しかしながら、本願明細書において記載されている材料、方法およびそのようなものは、本発明の態様を例示しているが、決して本発明の範囲を制限することを意図しない。よって、そのときに記載されている材料、方法およびそれらと同様または同等なものは、本発明の実施をまたは試験に用いうる。
【００７３】
実施例１
材料および方法
細胞株
Ａ２４ＬＣＬ細胞（ＨＬＡ―Ａ２４／２４）、ヒトＢ―リンパ芽球腫細胞株、Ｔ２細胞およびＣＯＳ７は、ＡＴＣＣから購入された。
【００７４】
ＭＰＨＯＳＯＨ１およびＤＥＰＤＣ１由来ペプチドの候補選択
ＨＬＡ―Ａ＊２４０２およびＨＬＡ―Ａ＊０２０１分子に結合するＭＰＨＯＳＯＨ１またはＤＥＰＤＣ１由来の９―ｍｅｒおよび１０―ｍｅｒペプチドは結合予測ソフトウェア「ＢＩＭＡＳ」（bimas.dcrt.nih.gov/cgi-bin/molbio/ken_parker_comboform）を用いて予測された（Parker KC et al. J Immunol. (1994);152no(1):163-75. Kuzushima K et al. Blood. (2001); 98 no(6):1872-81.）。これらのペプチドは、Ｓｉｇｍａ（札幌、日本）によって、標準的な固相合成方法に従って合成されて、逆相ＨＰＬＣによって精製された。
純度（>９０％）およびペプチドの同一性はそれぞれ、ＨＰＬＣ分析およびマススペクトル分析によって決定された。ペプチドは、２０ｍｇ／ｍｌでジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解されて―８０度Ｃで保存された。
【００７５】
生体外ＣＴＬ誘導
単球由来の樹状細胞（ＤＣ）は、ＨＬＡに提示されるペプチドに対するＣＴＬ反応を誘導する抗原提示細胞（ＡＰＣ）として用いられた。
ＤＣは他で報告されているように、インビトロで生成された。（Nukaya I et al.、Int. J. Cancer (1999)80、92-7.Tsai V et al. J.Immunol (1997)158:1796-802.）簡潔には、Ｆｉｃｏｌｌ―Ｐａｑｕｅ（Pharmacia）溶液によって正常なボランティア（ＨＬＡ―Ａ＊２４０２および／またはＨＬＡ―Ａ＊０２０１）から分離された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）は、それらを単球画分について濃縮するために、プラスチック組織培養フラスコ（Becton Dickinson）への粘着性により分離した。単球の濃縮集団を、２％加熱不活性化自己血清（ＡＳ）を含むＡＩＭ−Ｖ（Invitrogen）中、１０００Ｕ／ｍｌのＧＭ−ＣＦＳ（Kirin Brewery Companyより提供）および１０００Ｕ／ｍｌのＩＬ−４（Genzyme）の存在下で培養した。
培養７日後、サイトカイン産生ＤＣを、ＡＩＭ−Ｖ中、３mcｇ/ｍｌのβ２-ミクログロブリンの存在下に、20 mcg/mlの合成ペプチドを用いて２０℃、４時間パルスした。これらのペプチドパルスされたＤＣは、ＭＭＣ（３０分間の３０ｍｃｇ／ｍｌ）によって不活性化されて、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ―４５０ ＣＤ８（Ｄｙｎａｌ）およびＤＥＴＡＣＨａ ＢＥＡＤＴＭ（Ｄｙｎａｌ）による陽性選択によって得られた自己由来ＣＤ８＋Ｔ細胞と１：２０の比率で混合された。これらの培養物を48ウェルプレート（Corning）に配置した；各ウェルには、AIM-V/2%AS0.5ml中、1.5×104個のペプチドパルスしたDC、3×105個のCD8+ T細胞、および10ng/mlのIL-7（Genzyme）を含む。3日後、これらの培養物に、最終濃度20IU/mlのIL-2（CHIRON）を追加した。7日目および14日目に、T細胞を、自己ペプチドパルスしたDCでさらに再刺激した。ＤＣは、上記と同じ方法により毎回調製した。CTLは、21日目における3回目のペプチド刺激後に、ペプチドパルスしたA24LCL細胞またはT2細胞に対して試験した。
【００７６】
ＣＴＬ展開手順
ＣＴＬは、Riddell SR et al.（Walter EA et al. (1995)N Engl J Med 333:1038-44.； Riddell SR、et al. (1996)Nature Med. 2:216-23.）に記載された方法と類似の方法を用いた培養で拡張させた。合計5×104個のＣＴＬを、40ng/mlの抗CD3モノクローナル抗体（Pharmingen）の存在下で、二種のヒトＢ―リンパ芽球腫細胞株を含む25mlのAIM-V/5%AS中に再懸濁した。培養の開始から1日後、120IU/mlのIL-2を培養物に加えた。培養物に、5日目、8日目、および11日目に30IU/mlのIL-2を含む新鮮なAIM-V/5%ASを供給した。
【００７７】
ＣＴＬクローンの樹立
希釈は、96ウェルの丸底マイクロタイタープレート（Nalge Nunc International）において0.3個、1個、および3個のCTL/ウェルになるように行なわれた。CTLは、7×104細胞/ウェルの二種のヒトＢ―リンパ芽球腫細胞株、30ng/mlの抗CD3抗体、および125U/mlのIL-2と共に、5%AS含む合計150 mcl/ウェルのAIM-V中で培養された。10日後、50 mcl/ウェルのIL-2を、IL-2が最終濃度において125U/mlになるように培地へ加えた。CTLのＣＴＬ活性は14日目に試験され、CTLクローンは上記と同じ方法を用いて拡張された。
【００７８】
特異的ＣＴＬ活性
特異的なＣＴＬ活性を検討するために、ＩＦＮ―ガンマＥＬＩＳＰＯＴアッセイおよびＩＦＮ―ガンマＥＬＩＳＡが行われた。簡潔には、ペプチドパルスされたＡ２４―ＬＣＬまたはＴ２細胞（１ｘ１０４／ウェル）は、スティミュレーター細胞として調製された。
４８ウェルの培養細胞または限界希釈後のＣＴＬクローンは、レスポンダー細胞として用いられた。ＩＦＮ―ガンマＥＬＩＳＰＯＴアッセイおよびＥＬＩＳＡは、製造手順に基づき行われた。
【００７９】
細胞培養およびトランスフェクション
イプシュタインバーウイルス（Epstein Bar virus）が変換されたＨＬＡ―Ａ２４ Ｂ―ＬＣＬｓ（Ａ２４ＬＣＬ）は、樹立された。Ｊｉｙｏｙｅ、ＥＢ―３、ＣＯＳ７、ＨＴ１３７６、ＲＴ―４およびＪ８２は、アメリカンタイプカルシャーコレクション（Rockville、MD）から購入された。Ａ２４ＬＣＬ、ＪｉｙｏｙｅおよびＥＢ―３は、１０％のウシ胎児血清（ＧＥＭＩＮＩ Ｂｉｏ製）および１％の抗生剤溶液（シグマ）を含むＲＰＭＩ１６４０において維持された。ＣＯＳ７、ＨＴ１３７６、ＲＴ―４およびＪ８２は、適切な培地および抗生物質において維持された。ＣＯＳ７およびＨＥＫのトランスフェクションは、ＦＵＧＥＮＥ６（ロシュ）を用いて行われた。ＨＬＡ―Ａ＊０２０１分子を発現している安定的クローン、ＨＥＫ―Ａ２細胞は、ｐｃＤＮＡ６．２―ＨＬＡ―Ａ２プラスミドのトランスフェクションによって樹立され、５ｍｃｇ／ｍｌのＢｌａｓｔｃｉｄｉｎＳの存在下で、限界希釈法によって分離された。
【００８０】
ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるエピトープペプチドの免疫原性
ペプチド特異的なＣＴＬの誘導のために、免疫処置は、マウスごとに、５０ｍｃｌ（１００ｍｃｇ）のＨＬＡ―Ａ２４拘束性ペプチドおよび５０ｍｃｌのＩＦＡを含む、１００ｍｌのワクチンの混合物を用いてされた。ワクチンは、０日目に最初の免疫を右側腹部において、そして、二回目を７日目に左の横腹において皮下注射された。１４日目、ワクチン接種されたマウスの脾細胞は、いかなるインビトロ刺激もしないで、レスポンダー細胞に用いられ、ペプチドの有無にかかわらずパルスされたＲＬｍａｌｅ１細胞はＩＦＮ―ガンマＥＬＩＳＰＯＴアッセイのスティミュレーター細胞として用いられた。
【００８１】
結果
癌におけるＭＰＨＯＳＰＨ１およびＤＥＰＤＣ１発現上昇
cDNA―マイクロアレイを用いてさまざまな癌から得られた網羅的遺伝子発現プロプロファイルデータは、ＭＰＨＯＳＰＨ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０１６１９５；配列番号：１）、そして、２つの異型を有したＤＥＰＤＣ１（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号：ＢＭ６８３５７８）；ＤＥＰＤＣ１ Ｖ１（配列番号：３）およびＤＥＰＤＣ１ Ｖ２（配列番号：５）の発現が上昇することを示した。ＭＰＨＯＳＰＨ１発現は、３１の膀胱癌中３０、３６の乳癌中８、１８の子宮頸癌中１８、１７の胆管細胞癌中５、３１のＣＭＬ中２５、１１の結腸直腸癌中６、１４の胃癌中６、５つのＮＳＣＬＣ中５、７つのリンパ腫中７、１０の骨肉腫中６、２２の前立腺癌中７、１８の腎癌中１０および２１の軟組織腫瘍中１５において、対応する正常組織と比較して有意に上昇した。ＤＥＰＤＣ１発現は、２５の膀胱癌中２３、１３の乳癌中６、１２の子宮頸癌中１２、６つの胆管細胞癌中６、４のＣＭＬ中３、４の結腸直腸癌中２、６のＮＳＣＬＣ（非小細胞肺癌）中６、７のリンパ腫中７、１４の骨肉腫中１０、２４の前立腺癌中１１、１４のＳＣＬＣ（小細胞肺癌）中１４および３１の軟組織腫瘍中２２において、対応する正常組織と比較して有意に上昇した（表１）。
【００８２】
（表１）対応する正常組織と比較して癌組織でＭＰＨＯＳＰＨ１またはＤＥＰＤＣ１の上方制御が観察された症例の割合
【００８３】
ＭＰＨＯＳＰＨ１またはＤＥＰＤＣ１に由来するＨＬＡ―Ａ２４およびＨＬＡ―Ａ２結合ペプチドの予測
表２は、結合親和性の順にＭＰＨＯＳＰＨ１に対するＨＬＡ―Ａ＊２４０２結合ペプチドを記載する。
表２ＡはＭＰＨＯＳＰＨ１由来の９―ｍｅｒペプチド、そして、表２ＢはＭＰＨＯＳＰＨ１由来の１０―ｍｅｒペプチドを記載する。
表３は、結合親和性の順にＭＰＨＯＳＰＨ１に対するＨＬＡ―Ａ＊０２０１結合ペプチドを記載する。
表３ＡはＭＰＨＯＳＰＨ１由来の９―ｍｅｒペプチド、そして、表３ＢはＭＰＨＯＳＰＨ１由来の１０―ｍｅｒペプチドを記載する。
表４は、結合親和性の順にＤＥＰＤＣ１ Ｖ１およびＶ２に対するＨＬＡ―Ａ＊２４０２結合ペプチドを記載する。
表４ＡはＤＥＰＤＣ１ Ｖ１およびＶ２由来の９―ｍｅｒペプチド、そして、表４ＢはＤＥＰＤＣ１ Ｖ１由来の１０―ｍｅｒペプチドを記載する。
表５はＤＥＰＤＣ１Ｖ１およびＶに対するペプチド、表５ＡはＤＥＰＤＣ１ Ｖ１およびＶ２由来の９―ｍｅｒペプチド、そして、表４ＢはＤＥＰＤＣ１ Ｖ１およびＶ２由来の１０―ｍｅｒペプチドを記載する。
【００８４】
（表２Ａ）MPHOSPH1由来HLA-A*2402結合性ペプチド (9mer ペプチド)
開始位置は、ＭＰＨＯＳＰＨ１のＮ末端からのアミノ酸の数を示す。
結合スコアは、材料および方法に記載されている「ＢＩＭＡＳ」に由来する。
【００８５】
（表２Ｂ）MPHOSPH1由来HLA-A*2402結合性ペプチド (10mer ペプチド)
開始位置は、ＭＰＨＯＳＰＨ１のＮ末端からのアミノ酸の数を示す。
結合スコアは、材料および方法に記載されている「ＢＩＭＡＳ」に由来する。
【００８６】
（表３Ａ）MPHOSPH1由来HLA-A*0201結合性ペプチド (9mer ペプチド)
開始位置は、ＭＰＨＯＳＰＨ１のＮ末端からのアミノ酸の数を示す。
結合スコアは、材料および方法に記載されている「ＢＩＭＡＳ」に由来する。
【００８７】
（表３Ｂ）MPHOSPH1由来HLA-A*0201結合性ペプチド (10mer ペプチド)
開始位置は、ＭＰＨＯＳＰＨ１のＮ末端からのアミノ酸の数を示す。
結合スコアは、材料および方法に記載されている「ＢＩＭＡＳ」に由来する。
【００８８】
（表４Ａ）DEPDC1由来HLA-A*2402結合性ペプチド (9mer ペプチド)
開始位置は、ＤＥＰＤＣ１のＮ末端からのアミノ酸の数を示す。
結合スコアは、材料および方法に記載されている「ＢＩＭＡＳ」に由来する。
【００８９】
（表４Ｂ）DEPDC1由来HLA-A*2402結合性ペプチド (10mer ペプチド)
開始位置は、ＤＥＰＤＣ１のＮ末端からのアミノ酸の数を示す。
結合スコアは、材料および方法に記載されている「ＢＩＭＡＳ」に由来する。
【００９０】
（表５Ａ）DEPDC1由来HLA-A*0201結合性ペプチド (9mer ペプチド)
開始位置は、ＤＥＰＤＣ１のＮ末端からのアミノ酸の数を示す。
結合スコアは、材料および方法に記載されている「ＢＩＭＡＳ」に由来する。
【００９１】
（表５Ｂ）DEPDC1由来HLA-A*0201結合性ペプチド (10mer ペプチド)
開始位置は、ＤＥＰＤＣ１のＮ末端からのアミノ酸の数を示す。
結合スコアは、材料および方法に記載されている「ＢＩＭＡＳ」に由来する。
【００９２】
ＨＬＡ―Ａ＊２４０２拘束性ＭＰＨＯＳＰＨ１から予測されたペプチドを用いたＴ細胞の刺激
ＭＰＨＯＳＨＰ１（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２）由来のそれらのペプチドに対するＣＴＬは、上記の「材料および方法」の項に記載されるプロトコールに従って生成された。
結果として生じるＩＦＮ―ガンマＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって評価されるように、検出可能な特異的なＣＴＬ活性を有するＣＴＬは、図１Ａおよび図２Ａに示される。
図１Ａにおいて、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２４―９―２７８（配列番号：７）によって刺激されたウェルナンバー＃４の細胞は、コントロールと比較して強力なＩＦＮ―ガンマ生産を示した。
図２Ａにおいて、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２４―１０―２７８（配列番号：８）によって刺激されたウェルナンバー＃８の細胞は、コントロールと比較して強力なＩＦＮ―ガンマ生産を示した。次に、陽性ウェルのこれらの細胞は拡張され、限界希釈された。
図１Ｂ（ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２４―９―２７８（配列番号：７））および図２Ｂ（ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２４―１０―２７８（配列番号：８））に示すように、ペプチドパルスのない標的に対する活性と比較して、ペプチドパルスされた標的に対する高い特異的なＣＴＬ活性を有するＣＴＬクローンが樹立された。
【００９３】
ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２４―９―２７８（ＩＹＮＥＹＩＹＤＬ（配列番号：７））（図３Ａ）およびＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２４―１０―２７８（ＩＹＮＥＹＩＹＤＬＦ（配列番号：８））（図３Ｂ）によって刺激されたＣＴＬクローンは、いずれのペプチドにもパルスされない標的に対して少しも有意な特異的ＣＴＬ活性を示すことなく、ペプチドパルスされた標的に対して、強力な特異的なＣＴＬ活性を示した。これは、当該ＣＴＬクローンがペプチド特異的な細胞障害性を有することを示唆する。
【００９４】
ＭＰＨＯＳＰＨ１を発現している標的細胞に対する特異的なＣＴＬ活性
これらのペプチドに対して高められた樹立したＣＴＬクローンは、ＭＰＨＯＳＰＨ１およびＨＬＡ―Ａ＊２４０２を内因的に発現している標的細胞を認識する能力について検討された。
ＭＰＨＯＳＰＨ１およびＨＬＡ―Ａ＊２４０２を内因的に発現する標的細胞の特異的モデルであるところの、全長ＭＰＨＯＳＰＨ１遺伝子およびＨＬＡ―Ａ＊２４０２分子によってトランスフェクトされたCOS7に対する特異的CTL活性を、MPHOSPH1-A24-9-278 (SEQ ID NO: 7)で高められたCTLクローンをエフェクター細胞として用いて試験した。
全長ＭＰＨＯＳＰＨ１によってトランスフェクトしたがＨＬＡ―Ａ＊２４０２はしないＣＯＳ７およびＨＬＡ―Ａ＊２４０２でトランスフェクトしたが全長ＭＰＨＯＳＰＨ１はしないＣＯＳ７をコントロールとして調製した。
ＣＯＳ７に対する最も高い特異的なＣＴＬ活性を有するＣＴＬクローンは、ＭＰＨＯＳＰＨ１およびＨＬＡ―Ａ２４の両者によってトランスフェクトしたものであった。しかしながら、ＭＰＨＯＳＰＨ１もＨＬＡ―Ａ２４によってもトランスフェクトしないＣＯＳ７に対しては有意な特異的ＣＴＬ活性を示さなかった（図４）。
【００９５】
これらの結果は、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２４―９―２７８（配列番号：７）がＨＬＡ―Ａ２４分子とともに標的細胞表面に自然に発現され、ＣＴＬが認識されたことを明確に示す。
【００９６】
ＭＰＨＯＳＰＨ１を内因的に発現している膀胱癌細胞株に対するＣＴＬ活性
ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２４―９―２７８（配列番号：７）ペプチドに対して高められた樹立したＣＴＬクローンは、ＭＰＨＯＳＰＨ１を内因的に発現している腫瘍細胞を認識するための能力を検討された。ＭＰＨＯＳＰＨ１およびＨＬＡ―Ａ２４を内因的に発現するＨＴ１３７６細胞に対するＣＴＬ活性は、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２４―９―２７８（配列番号：７）により高められたＣＴＬクローンをエフェクター細胞として用いて試験された。
内因的にＭＰＨＯＳＰＨ１を発現するが、ＨＬＡ―Ａ２４を発現しないＪ８２細胞およびＲＴ―４細胞は標的細胞として用いられた。樹立したＣＴＬクローンは、ＭＰＨＯＳＰＨ１およびＨＬＡ―Ａ２４を両者とも発現するＨＴ１３７６細胞に対して、高いＩＦＮ―ガンマ産生を示した。一方、このＣＴＬは、ＭＰＨＯＳＰＨ１を発現するがＨＬＡ―Ａ２４を発現しないＪ８２およびＲＴ―４細胞に対しては有意なＣＴＬ活性を示さなかった（図５）。それは、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２４―９―２７８（配列番号：７）ペプチドがＨＬＡ―Ａ２４分子とともに腫瘍細胞表面に自然に加工され、ＣＴＬによって認識されることを明確に証明した。
【００９７】
ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２４―９―２７８ペプチドによるインビボのＣＴＬ誘導
Ｈ―２Ｋｄ分子（マウスＭＨＣクラスＩの１つ）がＨＬＡ―Ａ２４分子に対するペプチド・アンカーのモチーフに似ており、ＨＬＡ―Ａ２４拘束性ペプチドと一部交差反応することは公知である。本発明者らは、次に、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２４―９―２７８ペプチドがインビボでＣＴＬを誘導するかどうかを、このペプチドをＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｈ―２ｋｄ）にワクチン接種することによって検討した。ＩＦＡ接合ペプチドは、０および７日目にＢＡＬＢ／ｃマウスに皮下注射された。１４日目に、脾細胞は収集され、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイのためのレスポンダー細胞として用いられた。ペプチドを注入されたすべてのマウス（Ａｎｉ１〜５）の脾細胞は、ＩＦＡ単独を注入されたコントロールマウス（ｎｅｇａ１〜３）と比較して強力なＩＦＮ―ガンマの産生を示した。（図６）。このデータは、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２４―９―２７８ペプチドがインビボでもＣＴＬ反応を誘導できることを示した。
【００９８】
ＨＬＡ―Ａ＊０２０１拘束ＭＰＨＯＳＰＨ１由来予測ペプチドを用いたＴ細胞の刺激
結果として、ＩＦＮ―ガンマＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって評価された検出可能な特異的ＣＴＬ活性を有するＣＴＬは、図７に示される。図７Ａに示すように、ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ２−９−２８２（ＹＩＹＤＬＦＶＰＶ（配列番号：９））で刺激されたウェルナンバー＃１および＃５の細胞は、コントロールと比較して、強力なＩＦＮ―ガンマ生産を示した。図７Ｂに示すように、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２―９―６３８（ＲＬＡＩＦＫＤＬＶ（配列番号：１０））によって刺激されたウェルナンバー＃８の細胞は、コントロールと比較して強力なＩＦＮ―ガンマ生産を示した。図７Ｃに示すように、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２―１０―１７１４（ＴＭＳＳｓＫＬＳＮＶ（配列番号：１１））によって刺激されたウェルナンバー＃４の細胞は、コントロールと比較して強力なＩＦＮ―ガンマ生産を示した。
【００９９】
図８Ａ（ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２―９―２８２（配列番号：９））、図８Ｂ（ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２―９―６３８（配列番号：１０））および図８Ｃ（ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２―１０―１７１４（配列番号：９））に示すように、陽性ウェルのこれらの細胞は拡張され、そしてペプチドパルスしていない標的に対する活性と比較してペプチドパルスされた標的に対する高い特異的なＣＴＬ活性をもつＣＴＬ株が樹立された。
【０１００】
ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２―９―２８２（ＹＩＹＤＬＦＶＰＶ（配列番号：９））（図９Ａおよび９Ｂ）によって刺激されたＣＴＬクローンは、いかなるペプチドもパルスしない標的に対しては、いかなる有意な特異的ＣＴＬ活性を示さず、ペプチドパルスされた標的に対して強力な特異的なＣＴＬ活性を示した。
【０１０１】
ＨＬＡ―Ａ＊２４０２拘束性ＤＥＰＤＣ１由来予測ペプチドを用いたＴ細胞の刺激
ＤＥＰＤＣ１由来のそれらのペプチドのためのＣＴＬは、上記の「材料および方法」の項目に記載されているプロトコールに従って生成された。結果としてＩＦＮ―ガンマＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって評価されるように、検出可能な特異的ＣＴＬ活性を有するＣＴＬは図１０に示される。図１０Ａに示すように、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２４―９―２９４（ＥＹＹＥＬＦＶＮＩ（配列番号：１２））によって刺激されたウェルナンバー＃１０の細胞は、コントロールと比較して強力なＩＦＮ―ガンマ生産を示した。したがって、陽性ウェルのこれらの細胞は拡張され、限界希釈された。図１０Ｂ（ＤＥＰＤＣ１―Ａ２４―９―２９４（配列番号：１２））に示すように、ペプチドをパルスしない標的に対する活性と比較してペプチドパルスされた標的に対して高い特異的ＣＴＬ活性を有するＣＴＬクローンが樹立された。ＤＥＰＤＣ１―Ａ２４―９―２９４（ＥＹＹＥＬＦＶＮＩ（配列番号：１２））（図１１）によって刺激されたこのＣＴＬクローンは、いずれのペプチドもパルスしない標的に対しては、少しも有意な特異的ＣＴＬ活性を示さず、ペプチドパルスされた標的に対して強力な特異的なＣＴＬ活性を示した。この結果は、このＣＴＬクローンがペプチド特異的な細胞障害性を有することを示唆する。
【０１０２】
ＤＥＰＤＣ１およびＨＬＡ―Ａ＊２４０２を発現している標的細胞に対する特異的なＣＴＬ活性
これらのペプチドに対して高められた樹立したＣＴＬクローンは、ＤＥＰＤＣ１およびＨＬＡ―Ａ＊２４０２を内因的に発現している標的細胞を認識するための能力が検討された。標的細胞が内因的にＤＥＰＤＣ１およびＨＬＡ―Ａ＊２４０２発現する特異的なモデルである、全長ＤＥＰＤＣ１遺伝子およびＨＬＡ―Ａ＊２４０２分子によってトランスフェクトするＣＯＳ７、に対する特異的なＣＴＬ活性は、エフェクター細胞としてＤＥＰＤＣ１―Ａ２４―９―２９４（ＥＹＹＥＬＦＶＮＩ（配列番号：１２））により増えたＣＴＬクローンを用いて、試験された。全長ＤＥＰＤＣ１によってトランスフェクトするがＨＬＡ―Ａ＊２４０２はしないＣＯＳ７およびＨＬＡ―Ａ＊２４０２をトランスフェクトさせるが全長ＤＥＰＤＣ１はしないＣＯＳ７はコントロールとして調製された。ＣＴＬクローンは、ＤＥＰＤＣ１およびＨＬＡ―Ａ２４の両者をトランスフェクトさせたＣＯＳ７に対して高い特異的なＣＴＬ活性を示した。しかしながら、ＤＥＰＤＣ１もＨＬＡ―Ａ２４によってもトランスフェクトしないＣＯＳ７に対しては有意な特異的ＣＴＬ活性を示さなかった（図１２）。
【０１０３】
これらの結果は、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２４―９―２９４（ＥＹＹＥＬＦＶＮＩ（配列番号：１２））が、ＨＬＡ―Ａ２４分子とともに標的細胞表面に自然に発現されそしてＣＴＬを認識したことを明確に示す。
【０１０４】
ＤＥＰＤＣ１を内因的に発現している膀胱癌細胞株に対するＣＴＬ活性
ＤＥＰＤＣ１―Ａ２４―９―２９４ペプチドに対して高められた樹立したＣＴＬクローンは、ＤＥＰＤＣ１を内因的に発現している腫瘍細胞を認識するための能力が検討された。ＤＥＰＤＣ１およびＨＬＡ―Ａ２４を内因的に発現するＨＴ１３７６細胞に対するＣＴＬ活性は、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２４―９―２９４によって高められたＣＴＬクローンをエフェクター細胞として用いて試験された。Ｊ８２細胞およびＲＴ―４細胞は、内因的にＤＥＰＤＣ１を発現するがＨＬＡ―Ａ２４を発現しない標的細胞として用いられた。樹立したＣＴＬクローンは、ＤＥＰＤＣ１およびＨＬＡ―Ａ２４を発現するＨＴ１３７６細胞に対して、高いＩＦＮ―ガンマ産生を示した。一方、ＤＥＰＤＣ１を発現するがＨＬＡ―Ａ２４は発現しないＪ８２およびＲＴ―４細胞に対しては、有意なＣＴＬ活性を示さなかった（図１３）。それは、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２４―９―２９４がＨＬＡ―Ａ２４分子を有する腫瘍細胞表面に自然に加工され、ＣＴＬによって認識されることを明確に証明した。
【０１０５】
ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＤＥＰＤＣ１―Ａ２４―９―２９４ペプチドによるインビボのＣＴＬ誘導
Ｈ―２Ｋｄ分子（マウスＭＨＣクラスＩの１つ）がＨＬＡ―Ａ２４分子に対するペプチド・アンカーのモチーフに似ており、ＨＬＡ―Ａ２４拘束性ペプチドと一部交差反応することは公知である。本発明者らは、次に、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２４―９―２９４ペプチドがインビボでＣＴＬを誘導するかどうかを、このペプチドをＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｈ―２ｋｄ）にワクチン接種することによって検討した。ＩＦＡ接合ペプチドは、０および７日目にＢＡＬＢ／ｃマウスに、皮下注射された。１４日目に、脾細胞は収集されて、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイのためのレスポンダー細胞として用いられた。ペプチドを注入されたすべてのマウス（Ａｎｉ１〜５）の脾細胞は、ＩＦＡ単独を注入されたコントロールマウス（ｎｅｇａ１〜３）と比較して強力なＩＦＮ―ガンマの産生を示した。（図１４）。このデータは、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２４―９―２９４ペプチドがインビボでもＣＴＬ反応を誘導することができることを示した。
【０１０６】
ＨＬＡ―Ａ＊０２０１拘束性ＤＥＰＤＣ１由来予測ペプチドを用いたＴ細胞の刺激
ＩＦＮ―ガンマＥＬＩＳＰＯＴアッセイによる選択時に、検出可能な特異的ＣＴＬ活性を有しているＣＴＬは、図１５および表６に示される。ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―６４４（（ＳＬＭＩＨＴＦＳＲＣ配列番号：２４０））によって刺激されたウェルナンバー＃４および＃７の細胞は、コントロールと比較して強力なＩＦＮ―ガンマの産生を示した。ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―５７５（ＳＬＬＰＡＳＳＭＬＴ（配列番号：２４１））によって刺激されたウェルナンバー＃２の細胞は、コントロールと比較して強力なＩＦＮ―ガンマに産生を示した。ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―５０６（ＱＬＣＲＳＱＳＬＬＬ（配列番号：２４３））によって刺激されたウェルナンバー＃７の細胞は、コントロールと比較して強力なＩＦＮ―ガンマに産生を示した。ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―７６５（ＫＱＦＱＫＥＹＰＬＩ（配列番号：２４４））によって刺激されたウェルナンバー＃１の細胞は、コントロールと比較して強力なＩＦＮ―ガンマに産生を示した。ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―３９５（ＩＭＧＧＳＣＨＮＬＩ（配列番号：２４９））によって刺激されたウェルナンバー＃１の細胞は、コントロールと比較して強力なＩＦＮ―ガンマに産生を示した。
ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―２２４（ＮＭＡＮＴＳＫＲＧＶ（配列番号：２５３））によって刺激されたウェルナンバー＃１および＃２の細胞は、コントロールと比較して強力なＩＦＮ―ガンマに産生を示した。ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―９―２９７（ＥＬＦＶＮＩＬＧＬ（配列番号：２２６））によって刺激されたウェルナンバー＃４の細胞は、コントロールと比較して強力なＩＦＮ―ガンマに産生を示した。ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―２９６（ＹＥＬＦＶＮＩＬＧＬ（配列番号：２５４））によって刺激されたウェルナンバー＃３および＃４の細胞は、コントロールと比較して強力なＩＦＮ―ガンマに産生を示した。
ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―３０１（ＮＩＬＧＬＬＱＰＨＬ（配列番号：２５５））によって刺激されたウェルナンバー＃２、＃３、＃５および＃７の細胞は、コントロールと比較して強力なＩＦＮ―ガンマに産生を示した。ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―９―５９８（ＬＬＱＰＨＬＥＲＶ（配列番号：１９２））によって刺激されたウェルナンバー＃６の細胞は、コントロールと比較して強力なＩＦＮ―ガンマ産生を示した。ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―９―６１９（ＬＬＭＲＭＩＳＲＭ（配列番号：１９５））によって刺激されたウェルナンバー＃６の細胞は、コントロールと比較して強力なＩＦＮ―ガンマ産生を示した。ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―９―２９０（ＬＬＴＦＥＹＹＥＬ（配列番号：１９７））によって刺激されたウェルナンバー＃２の細胞は、コントロールと比較して強力なＩＦＮ―ガンマ産生を示した。ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―９―５６３（ＲＬＣＫＳＴＩＥＬ（配列番号：２０９））によって刺激されるウェルナンバー＃５の細胞は、コントロールと比較して強力なＩＦＮ―ガンマ産生を示した。ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―９―６５３（ＣＶＬＣＣＡＥＥＶ（配列番号：２２５））によって刺激されたウェルナンバー＃１および＃３の細胞は、コントロールと比較して強力なＩＦＮ―ガンマ産生を示した。ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―６７４（ＦＬＭＤｈＨＱＥＩＬ（配列番号：２２８））によって刺激されたウェルナンバー＃１の細胞は、コントロールと比較して強力なＩＦＮ―ガンマ産生を示した。最後に、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―３０２（ＩＬＶＶｃＧＹＩＴＶ（配列番号：２３０））によって刺激されたウェルナンバー＃２および＃６の細胞は、コントロールと比較して強力なＩＦＮ―ガンマ産生を示した。
【０１０７】
ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―２９６（ＹＥＬＦＶＮＩＬＧＬ（配列番号：２５４））およびＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―９―６５３（ＣＶＬＣＣＡＥＥＶ（配列番号：２２５））（図１６）によって刺激したＣＴＬ株は、いずれのペプチドによってもパルスされない標的に対しては有意な特異的なＣＴＬ活性を示さず、ペプチドパルスされた標的に対して、強力な特異的ＣＴＬ活性を示した。これはＣＴＬクローンがペプチド特異的な細胞障害性を有することを示す。
【０１０８】
（表６）DEPDC1由来HLA-A*0201拘束性候補ペプチド
【０１０９】
ＤＥＰＤＣ１およびＨＬＡ―Ａ＊０２０１を発現している標的細胞に対する特異的ＣＴＬ活性
ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―２９６ペプチド（ＹＥＬＦＶＮＩＬＧＬ（配列番号：２５４））およびＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―９―６５３（ＣＶＬＣＣＡＥＥＶ（配列番号：２２５））に対して高められた樹立したＣＴＬ株は、ＤＥＰＤＣ１およびＨＬＡ―Ａ２を内因的に発現している標的細胞を認識する能力について検討された。最初に、我々は、効率的に特異的なＣＴＬ反応を測定するためにＨＬＡ―Ａ＊０２０１（ＨＥＫ―Ａ２）を構成的に発現するＨＥＫ２９３細胞株を樹立した。ＤＥＰＤＣ１およびＨＬＡ―Ａ２を発現する標的細胞の特異的なモデルである、全長ＤＥＰＤＣ１遺伝子をトランスフェクトさせたＨＥＫ―Ａ２細胞に対する特異的なＣＴＬ活性は、エフェクター細胞としてＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―２９６（ＹＥＬＦＶＮＩＬＧＬ（配列番号：２５４））またはＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―９―６５３（ＣＶＬＣＣＡＥＥＶ（配列番号：２２５））によって高めれた樹立したＣＴＬ株を用いて試験された。Ｍｏｃｋ発現ベクターをトランスフェクトしたＨＥＫ―Ａ２、そして、ＤＥＰＤＣ１由来のものに対応しないペプチドでパルスしたＨＥＫ―Ａ２はネガティブコントロールとして調製された。樹立したＣＴＬ株は、ＤＥＰＤＣ１をトランスフェクトしたＨＥＫ―Ａ２に対して特異的なＣＴＬ活性を示した。一方で、当該ＣＴＬ株は、トランスフェクトしたＭｏｃｋ発現ベクターおよびＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―９―６７４ペプチドまたはＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―９―４６２ペプチドがパルスされたＨＥＫ―Ａ２に対して、有意な特異的ＣＴＬ活性を示さなかった（図１７）。それは、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―２９６ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―９―６５３ペプチドが、ＨＬＡ―Ａ２分子とともに標的細胞表面に自然に加工され、ＣＴＬによって認識されることを明確に証明した。
【０１１０】
抗原ペプチドの相同性解析
本発明のペプチドに対して樹立されるＣＴＬは、強力な特異的ＣＴＬ活性を示した。
これはＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２４―９―２７８（配列番号：７）、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２４―１０―２７８（配列番号：８）、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２―９―２８２（配列番号：９）、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２―９―６３８（配列番号：１０）、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２―１０―１７１４（配列番号：１１）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２４―９―２９４（配列番号：１２）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２―９―５８９（配列番号：１９２）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２―９―６１９（配列番号：１９５）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２―９―２９０（配列番号：１９７）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２―９―５６３（配列番号：２０９）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２―９―６５３（配列番号：２２５）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２―１０―６７４（配列番号：２２８）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２―１０―３０２（配列番号：２３０）ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―６４４（配列番号：２４０）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―５７５（配列番号：２４１）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―５０６（配列番号：２４３）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―７６５（配列番号：２４４）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―３９５（配列番号：２４９）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―２２４（配列番号：２５３）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―９―２９７（配列番号：２２６）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―２９６（配列番号：２５４）およびＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―３０１（配列番号：２５５）のシーケンスがヒト免疫系を感作することが知られている他の分子由来のペプチドに相同であることを示唆する。この可能性を排除するため、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi）を用いて、ペプチド配列をクエリーとして相同性解析が行われた。有意な配列相同性は、示されなかった。
【０１１１】
これらの結果は、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２４―９―２７８（配列番号：７）、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２４―１０―２７８（配列番号：８）、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２―９―２８２（配列番号：９）、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２―９―６３８（配列番号：１０）、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２―１０―１７１４（配列番号：１１）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２４―９―２９４（配列番号：１２）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２―９―５９８（配列番号：１９２）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２―９―６１９（配列番号：１９５）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２―９―２９０（配列番号：１９７）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２―９―５６３（配列番号：２０９）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２―９―６５３（配列番号：２２５）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２―１０―６７４（配列番号：２２８）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２―１０―３０２（配列番号：２３０）ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―６４４（配列番号：２４０）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―５７５（配列番号：２４１）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―５０６（配列番号：２４３）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―７６５（配列番号：２４４）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―３９５（配列番号：２４９）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―２２４（配列番号：２５３）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―９―２９７（配列番号：２２６）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―２９６（配列番号：２５４）およびＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―３０１（配列番号：２５５）のシーケンスがユニークで、いかなる関連のない分子にたいして予期しない免疫反応を起こすリスクが低いことを示唆する。
【０１１２】
考察
新規なＴＡＡ（特に強力および特異的な抗腫瘍免疫応答を誘導するそれら）の同定は、様々なタイプの癌におけるペプチドワクチン接種戦略の臨床応用の更なる発達を保証する（Boon T.et al.、(1996)J Exp Med 183:725-9. van der Bruggen P et al.((1991)Science 254):1643-7. Brichard V et al.((1993)J Exp Med 178):489-95. Kawakami Y et al.((1994)J Exp Med 180):347-52. Shichijo S et al.((1998)J Exp Med 187):277-88. Chen YT et al.,(1997)Proc.Natl.Acd.Sci. USA、94:1914-8. Harris Cc.((1996)J Natl Cancer Inst 88):1442-5. Butterfield LH et al.((1999)Cancer Res 59):3134-42. Vissers JL et al.((1999)Cancer Res 59):5554-9. van der Burg SH et al.((1996)J.Immunol 156):3308-14. Tanaka F et al.((1997)Cancer Res 57):4465-8. Fujie T et al.((1999)Int J Cancer 80):169-72. Kikuchi M et al.((1999)Int J Cancer 81):459-66. Oiso M et al.((1999)Int J Cancer 81):387-94.）。
【０１１３】
cDNAマイクロアレイ技術は、悪性細胞の遺伝子発現の包括的なプロファイルを開示することができる（Lin YM, et al., Oncogene.2002 Jun 13;21:4120-8. Kitahara O, et al., Cancer Res. 2001 May 1;61:3544-9. Suzuki C、et al.,Cancer Res.2003 Nov 1;63:7038-41. Ashida S(Cancer Res.2004 Sep 1);64:5963-72.Ochi K、et al.、Int J Oncol.2004 Mar;24(3):647-55. Kaneta Y、et al.、Int J Oncol.2003 Sep;23:681-91. Obama K(Hepatology.2005 Jun);41:1339-48. Kato T, et al.,Cancer Res. 2005 Jul 1;65:5638-46. Kitahara O、et al.、Neoplasia.2002 Jul-Aug;4:295-303. Saito-Hisaminato A et al.、DNA Res 2002、9:35-45.）。そして、ＴＡＡ候補の同定において有用なものを見いだす。さまざまな癌において上方制御される転写産物の中で、２つの新規ヒト遺伝子（それぞれＭＰＨＯＳＰＨ１およびＤＥＰＤＣ１と称される）は、これらの技術を用いて同定された。
【０１１４】
上記で示したように、ＭＰＨＯＳＰＨ１およびＤＥＰＤＣ１はさまざまな癌において過剰発現するが、正常組織ではごく僅かな発現のみを示す。加えて、これらの遺伝子は細胞増殖に関連した重要な機能を有することが示されている（PCT/JP2006/302684を参照）。したがって、ＭＰＨＯＳＰＨ１およびＤＥＰＤＣ１由来のペプチドはＴＡＡエピトープとして役立ち、癌細胞に対して有意および特異的な免疫応答を誘導するために用いることができる。
【０１１５】
したがって、ＭＰＨＯＳＰＨ１およびＤＥＰＤＣ１は新規ＴＡＡとして、これらのエピトープペプチドを用いるワクチンは、これらの分子を発現しているさまざまな癌腫または他の疾患に対する免疫治療法としての有用性を見出す。
【０１１６】
実施例２
材料および方法
ペプチドおよびアジュバント
合成されたＧＭＰグレードのペプチドは、ネオマルチペプタイドシステム（Neo Multi Peptide System）（MPS）（サンディエゴ、ＣＡ）より購入された。アジュバントとして、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）（ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ＊ＩＳＡ５１）が、用いられた。１ｍｇの適切なペプチドは、１ｍｇのＩＦＡによって乳化された。
【０１１７】
抗原発現
本発明者らは、免疫組織化学的解析を行った。手術または生検から得られた膀胱癌由来の腫瘍細胞または腫瘍組織は、それぞれのＭＰＨＯＳＰＨ１およびＤＥＰＤＣ１特異的ポリクローナル抗体によって染色された。染色のプロトコールは、以前に述べられたように（Kanehira M et al. Cancer Res.;67（7）:3276-3285, 2007., Kanehira M et al. Oncogene. 2007 Apr 23; [Epub ahead of print]）東京大学医科学研究所ヒトゲノムセンターにおいて確立された。ＨＬＡ―Ａ＊２４０２発現は、ＳＲＬ（立川、日本）で、行われ試験された
【０１１８】
登録される患者
登録基準は、以下の通り；
1. 標準的な化学療法によって過去に治療をうけて失敗となった手術不能の再発性膀胱癌患者。
2. 日本の判定基準において一般状態が０または１である患者。
3. ２０歳から８０歳の患者
4. ＲＥＣＩＳＴガイドラインは考慮しないが、治療前に画像検査（ＣＴ／ＭＲＩ）によって原発腫瘍または転移と認められた患者
5. 前治療（手術、化学療法、放射線療法、温熱療法、他の免疫療法その他）後４週以上経過した患者
6. ３ヵ月以上の予後が予測される患者
7. 骨髄機能（白血球数２０００以上、１５０００以下、血小板５００００以上を）、肝機能（ＧＯＴ１５０以下、ＧＰＴ１５０以下、Ｔ―ｂｉｌ３．０以下）、腎機能（Ｃｒ３．０以下）の患者
8. ＨＬＡ―Ａ＊２４０２を有する患者
9. ＭＰＨＯＳＰＨ１および／またはＤＥＰＤＣ１の発現を有する患者の腫瘍
【０１１９】
除外基準は、以下の通り；
1. 妊娠中の患者
2. 授乳中の患者
3. 妊娠の意思のある患者
4. 制御困難な感染症を有する患者
5. 臨床試験期間中に以下の薬剤を必要とする患者
ステロイドの全身投与
免疫抑制薬の全身投与
6. 医師または治験責任医師によってこの試験に登録するべきと思われない患者
【０１２０】
プロトコール
腫瘍がM phase phosphoprotein 1（ＭＰＨＯＳＰＨ１）および／またはDEP domain containing 1 （ＤＥＰＤＣ１）を発現する、 ＨＬＡ―Ａ＊２４０２を有する登録された膀胱癌患者は、ＨＬＡ―Ａ＊２４０２―拘束性エピトープペプチドＭＰＨＯＳＰＨ１―９―２７８（ＩＹＮＥＹＩＹＤＬ（配列番号：７））および／またはＤＥＰＤＣ１―９―２９４（ＥＹＹＥＬＦＶＮＩ（配列番号：１２））によって免疫された。それぞれのペプチドは、１ｍＬの不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ、ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ＊ＩＳＡ５１）と組み合わせられて、週に一度腋窩あるいは鼠径部の病変に、皮下注射された。１コース４回注射と規定され、続いて１コース後、免疫学的および臨床的評価のため、採血並びにＣＴ／ＭＲＩが行われた。
【０１２１】
安全性の評価
副作用の評価は、国立癌研究所―共通毒性判定基準第３版（ＮＣＩ―ＣＴＣ ｖｅｒ．３）に従って行われた。
【０１２２】
免疫学的評価
これはこの研究のセカンダリーエンドポイントの１つで、我々はペプチド特異的なＣＴＬ反応が発生したかどうかを確認する。特異的なＣＴＬ反応の計測は、以下の通り；
末梢血単核細胞は回収され、適切なペプチドによって再刺激された。ＣＴＬ反応は、ＩＦＮ―ガンマＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって、１４日目に試験された。
【０１２３】
抗腫瘍効果の評価
臨床反応の評価は、ＲＥＣＩＳＴ基準に従って行われた。
【０１２４】
結果
表７は、本臨床研究の概要を示す。症例３のグレード２の発疹を除き、重篤な副作用はなかった。マイナーレスポンス（症例３）およびミックスレスポンス（症例４）が得られた。ＭＰＨＯＳＰＨ１の発現は５症例中４症例であったが、ＤＥＰＤＣ１のそれは５症例中５症例であった。
【０１２５】
（表７）本臨床研究の概要
【０１２６】
症例２
症例２において、標準化学療法の失敗でかなり進行した膀胱癌をもつ７２歳の女性が本臨床試験に登録された。図１８において、彼女の腫瘍の抗原発現は、ＭＰＨＯＳＰＨ１およびＤＥＰＤＣ１が強く発現することを示した。従って、我々はＭＰＨＯＳＰＨ１およびＤＥＰＤＣ１由来のエピトープペプチド２種をワクチン接種した。症例２は、膀胱癌の局所再発を有した。それは、ＲＥＣＩＳＴ基準基づき安定（ＳＤ）と評価された（図１９）。
【０１２７】
症例３
症例３において、標準化学療法の失敗でかなり進行した膀胱癌をもつ４９歳の男性が、本臨床試験に登録された。ＤＥＰＤＣ１のみが強く発現された（図２０）。従って、我々は、ＤＥＰＤＣ１由来のエピトープペプチドを単独でワクチン接種した。症例３は、膀胱癌の複数の肺転移を有した。右（図２１）および左（図２２）の肺葉転移において、進行率がワクチン接種後に低下した。特に、腫瘍のサイズが３コース後に減少した。図２３は、ＲＥＣＩＳＴ基準に基づいた抗腫瘍効果を示す。転移性腫瘍の進行率がワクチン接種後に低下したことが明らかにされた。
それは、ＤＥＰＤＣ１由来のエピトープペプチドを用いているワクチン接種によってマイナーレスポンスが得られることを示した。症例３の免疫学的評価に関して、特異的ＣＴＬ反応は、ワクチン接種の前後で測定された。特異的ＣＴＬ反応はワクチン接種後強く示された（図２４）。それは、ＤＥＰＤＣ１由来のエピトープペプチドによって誘導されるＣＴＬが抗腫瘍効果を示しうることを明確に示した。
【０１２８】
症例４
症例４において、標準的化学療法の失敗でかなり進行した膀胱癌をもつ７４歳の男性が本臨床試験に登録された。ＭＰＨＯＳＰＨ１およびＤＥＰＤＣ１は、彼の腫瘍で発現した（図２５）。従って、我々は、ＭＰＨＯＳＰＨ１およびＤＥＰＤＣ１由来の２種類のエピトープペプチドをワクチン接種した。症例４は、膀胱癌の局所再発を有していた。１コースのワクチン接種後、腫瘍のサイズは、ＲＥＣＩＳＴ基準に基づき、２０％減少した（図２６）。しかしながら、肺の新しい転移性病変が発生した。それは、ＭＰＨＯＳＰＨ１およびＤＥＰＤＣ１由来の２種類のエピトープペプチドを用いるワクチン接種によってまちまちの反応が得られることを示した。
【０１２９】
考察
本臨床試験の理論的根拠は、以下に述べられる；
1. ＭＰＨＯＳＰＨ１およびＤＥＰＤＣ１は精巣を除く正常組織においては発現されないので、両抗原は非常に腫瘍特異的である。
2. 強力で特異的なＣＴＬはこれらのエピトープペプチドによって樹立されたことから、これらのペプチドは強い免疫原性を有すると考えられる。
3. 日本人集団の６０％がＨＬＡ―Ａ＊２４０２をもつ。
4. これらのペプチドは、臨床試験に適用するのに化学的に十分安定である。
本研究の目的は、その毒性、免疫学的応答および抗腫瘍活性の臨床的な情報を得ることである。
【０１３０】
以前に報告されたペプチドを用いた臨床試験のワクチンの副作用は、熱、頭痛および不快のようなfur-like symptomである。まれに、注射された部位に一時的な交差反応性と考えられる水疱を伴う過激な皮膚反応が報告された。この試験において、症例３のグレード２の発疹を除いて、重篤な副作用はなかった。この患者は、化学療法中、発疹を示す病歴があった。それはこの副作用がこのワクチン接種によるものでないことを示唆し、したがって、このプロトコールは安全でありうる。
【０１３１】
免疫学的解析は、ワクチン接種後、特異的ＣＴＬ誘導によって行われた。症例１において、特異的ＣＴＬ反応は、ワクチン接種後得られなかった（データ非表示）。症例３において、ＤＥＰＤＣ１由来のペプチドに対する特異的なＣＴＬ反応は、第１および第２コースのワクチン接種後、明確に示された。症例３において、抗腫瘍効果は、ワクチン接種によって得られた。それは、当該ＤＥＰＤＣ１由来のペプチドが特異的なＣＴＬの誘導によって膀胱癌に対して抗腫瘍効果を示すことを明確に証明した。
【０１３２】
症例４において、１コースのみのワクチン接種後、抗腫瘍効果は、膀胱癌の局所再発に対して明らかに得られた。この証拠は、これらのエピトープペプチドが膀胱癌に対して抗腫瘍効果を示すことを強く支持する。
【０１３３】
結論として、本エピトープ治療は安全であり、さらに、重篤な副作用のない強い抗腫瘍効果が示されることが明らかにされた。
【産業上の利用可能性】
【０１３４】
本発明は、新規なＴＡＡ、特に、強力な特異的抗腫瘍免疫応答を誘導するそれを同定する。
当該ＴＡＡは、ＭＰＨＯＳＰＨ１および／またはＤＥＰＤＣ１に関連する疾患（例えば癌）に対するペプチドワクチンとして、更なる発展を保証する。
【０１３５】
本願明細書において引用されるすべての特許、特許出願および刊行物は、参照により組み入れられる。
【０１３６】
本発明が、その特定の実施態様に関して詳細に述べられたが、上記記述は、事実上例示的および説明的なものであり、本発明およびその好適な態様を具体的に説明することを意図することが理解されるべきである。ルーチン実験によって、本発明の精神と範囲から逸脱することなく、さまざまな変更や修正がなされうることを、当業者は容易に認識するであろう。したがって、本発明は、上記記載によって限定されるのでなく、以下請求項およびそれらの同等物によって限定されることを意図する。
【技術分野】
【０００１】
本出願は２００６年１０月１７日に出願した米国仮出願Ｎｏ．６０／８５２，５７５の恩典を主張し、その内容は全体として参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
本発明は生物科学の分野、より具体的には癌治療の分野に関する。特に、本発明は、極めて有効な癌ワクチンとして役立つ新規なペプチド、そして当該ペプチドを含む腫瘍を治療および予防する薬剤に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＣＤ８＋細胞障害性Tリンパ球（ＣＴＬ）がＭＨＣクラスＩ分子に提示される腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）由来のエピトープペプチドを認識して、腫瘍細胞を溶解させることが証明されている。ＴＡＡの最初の例としてのＭＡＧＥファミリーの発見以来、多くの他のＴＡＡが、免疫学的方法を用いて発見された（Boon T.(1993)Int J Cancer 54:177-80.;Boon T.et al.(1996)J Exp Med 183:725-9.;van der Bruggen P et al.(1991)Science 254:1643-7.;Brichard V et al.(1993)J Exp Med 178:489-95.;Kawakami Y et al.(1994)J Exp Med 180:347-52.）。それらの一部は、現在免疫療法の標的として、臨床開発中である。今までに発見されたＴＡＡは、ＭＡＧＥ（van der Bruggen P et al.、(1991)Science 254:
1643-7.）、ｇｐ１００（Kawakami Y et al.(1994)J Exp Med 180:347-52.）、ＳＡＲＴ（Shichijo S et al.(1998)J Exp Med 187:277-88.）、そして、ＮＹ―ＥＳＯ―１（Chen Y.T.et al.(1997)Proc. Natl. Acd.Sci. USA、94:1914-8.）を含む。一方、腫瘍細胞においてある程度特異的に過剰発現することが示された遺伝子産物は、細胞免疫反応を誘導する標的として認識されることが示されている。この種の遺伝子産物には、ｐ５３（Umano Y et al.Br J Cancer(2001)、84:1052-7.）（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）（Tanaka H et al.Br J Cancer(2001)、84:94-9.）、ＣＥＡ（Ｎukaya I et al.Int. J. Cancer(1999)80、92-7.）などがある。
【０００４】
ＴＡＡの基礎および臨床研究における著しい進展にもかかわらず、癌の治療に適した現在利用可能なＴＡＡ候補は非常に限られた数しかない（Rosenberg SA et al.Nature Med(1998)、4:321-7. Mukherji B. et al.(1995)Proc Natl Acad Sci USA、 Res(1996)、56:2479-83.）。癌細胞において多量に発現され、そしてその発現が癌細胞に限定されるＴＡＡは、免疫療法の標的として有望な候補である。
【０００５】
ＨＬＡ―Ａ２４およびＨＬＡ―Ａ０２０１は、日本人および白色人種の集団の一般のＨＬＡアレルである（Date Y et al.(1996)Tissue Antigens 47:93-101.Kondo A et al.(1995)J Immunol 155:4307-12.; Kubo RT et al.(1994)J Immunol 152:3913-24.; Imanishi et al.Proceeding of the eleventh International Histocompatibility Workshop and Conference Oxford University Press, Oxford, 1065 (1992);Williams F et al.(1997)Tissue Antigen 49:129-33.）。従って、これらのＨＬＡアレルによって提示される癌の抗原ペプチドは、日本人および白色人種の患者の癌治療において特に有用性を見いだすことができる。更に、インビトロでの低親和性ＣＴＬの誘導は通常、これらのＣＴＬを効果的に活性化する抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に生じる高レベルの特定ペプチド／ＭＨＣ複合体の高濃度のペプチドに曝すことでなしうることが知られている（Alexander-Miller et al.(1996)Proc Natl Acad Sci USA 93:4102-7.）。
【０００６】
cDNAマイクロアレイ技術の近年の発達の結果、正常細胞と比較した悪性細胞の遺伝子発現の包括的なプロファイルの構築を可能にした（Okabe、H.et al.(2001)Cancer Res.61、2129-37.Lin YM.et al.Oncogene(2002)、21;4120-8.Hasegawa S.et al.(2002)Cancer Res 62:7012-7.）。この方法は、癌細胞の複雑な性質および発癌の機序の理解を可能にし、腫瘍において無秩序に発現する遺伝子の識別を容易にする（Bienz M.et al.Cell(2000)103、311-20.）。癌において上方制御さていると確認された転写産物より、ＭＰＨＯＳＰＨ１（Ｍ期リン蛋白１；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１６１９５；配列番号：１、２）、そして、ＤＥＰＤＣ１（ＤＥＰ領域含有１；ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＢＭ６８３５７８）、が近年発見された。ＷＯ２００４／０３１４１３、ＷＯ２００６／０８５６８４およびＷＯ２，００７／０１３，６６５を参照（全コンテンツが本願明細書において引用されたものとする）。ＤＥＰＤＣ１は、２つの異なるトランスクリプショナルバリアント（ＤＥＰＤＣ１ Ｖ１（配列番号：３、４）およびＤＥＰＤＣ１ Ｖ２（配列番号：５、６））として記載されている。これらの遺伝子は、解析されたさまざまな癌組織の腫瘍細胞において特異的に上方制御されることを示した（下記参照）；しかしながら、ノーザンブロット解析は、これらの遺伝子産物が正常な重要臓器では見られないことを示す（ＰＣＴ／ＪＰ２００６／３０２６８４を参照）。ＭＰＨＯＳＰＨ１およびＤＥＰＤＣ１由来の抗原性ペプチドが、それらの抗原を発現している腫瘍細胞を殺傷するという有用性を見出すことができるという点で、これらの遺伝子は本発明者らにとって特別な興味のあるものである。
【０００７】
例えばＭ―ＶＡＣのような細胞障害性の薬剤によってしばしば重篤な副作用が生じるため、よく検討した作用機構を基に新規な標的分子を注意して選択することが負の副作用のリスクを最小限にする有効な抗癌剤の開発において重要であることは明白である。この目的に向けて、発明者は、以前にさまざまな癌および正常な人体組織の発現プロファイル解析を行い、癌において特異的に過剰発現する複数の遺伝子を見出した（Lin YM、et al．Oncogene．2002 Jun 13;21:4120-8.; Kitahara O、et al.Cancer Res. 2001 May 1;61:3544-9.; Suzuki C, et al., Cancer Res. 2003 Nov 1;63:7038-41.; Ashida S, Cancer Res. 2004 Sep 1;64:5963-72.; Ochi K, et al., Int J Oncol. 2004 Mar;24（3）:647-55.; Kaneta Y, et al., Int J Oncol. 2003 Sep;23:681-91.; Obama K, Hepatology. 2005 Jun;41:1339-48.; Kato T, et al., Cancer Res. 2005 Jul 1;65:5638-46.; Kitahara O, et al., Neoplasia. 2002 Jul-Aug;4:295-303.; Saito-Hisaminato A et al., DNA Res 2002, 9: 35-45.）。これらの中で、ＭＰＨＯＳＰＨ１（In house No．Ｃ２０９３）、そして、ＤＥＰＤＣ１（In house No．Ｂ５８６０Ｎ）は、さまざまな癌において過剰発現する遺伝子と同定された。特に、ＭＰＨＯＳＰＨ１は膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、胃癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、前立腺癌、腎癌、軟組織腫瘍において過剰発現することが、確認された。
同様に、ＤＥＰＤＣ１は膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、前立腺癌、ＳＣＬＣ、軟組織腫瘍において過剰発現することが、確認された。
【０００８】
ＭＰＨＯＳＰＨ１は、以前に、特異的にＧ２／Ｍ期移行でリン酸化される、プラス方向誘導キネシン関連のタンパク質として特徴づけられるタンパク質の１つとして同定された（Abaza A et al．Ｊ Biol Chem 2003、278：27844-52.）。より詳細には、ＭＰＨＯＳＰＨ１は、以前、細胞分裂において重要な役割を果たす、プラス方向誘導分子モーターであり、HeLa細胞において後期から終期の間に、紡錘体の中心に集積すると証明された（Abaza A et al. J Biol Chem 2003、278:27844-52；Kamimoto T et al.J Biol Chem 2001、276:37520-8）。ＭＰＨＯＳＰＨ１cＤＮＡは、下記３つの領域から成る１７８０アミノ酸タンパク質をコードする：ＮＨ２―ｋｉｎａｓｉｎモータードメイン（NH2-kinasin motor domain）、中心高次コイル―軸ドメイン（central coiled coil-stalk domain）およびＣ球状尾部ドメイン（C-globular tail domain）。同時に、このデータは、ＭＰＨＯＳＰＨ１がＮＨ２タイプキネシン関連のタンパク質であることを示唆する。
【０００９】
ＤＥＰＤＣ１に関しては、その機能は、未だ不明である。このタンパク質に含まれるＤＥＰドメインは、Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ、Ｅｇｌ―１０およびＰｌｅｃｋｓｔｒｉｎにおいても見られる。ショウジョウバエのｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄのＤＥＰドメインは、平面極性欠損の救済およびＪＮＫシグナリングの誘導において欠くことのできない役割を果たしている；それにもかかわらず、ヒトにおけるその機能は、まだ明らかにされていない。
しかしながら、ＰＣＴ／ＪＰ２００６／３０２６８４の中に開示されているように、ＤＥＰＤＣ１のｓｉＲＮＡは、癌細胞の増殖を抑制することができる。これらの結果は、ＤＥＰＤＣ１が多くの癌細胞の増殖において重要な役割を果たすことを証明する。
【発明の概要】
【００１０】
上記の如く、ＭＰＨＯＳＰＨ１（Ｍ期リン蛋白１）およびＤＥＰＤＣ１（ＤＥＰドメイン含有１）はさまざまな癌において上方制御されることが確認されている。より詳細には、これらの遺伝子は、ゲノムワイドなｃＤＮＡマイクロアレイによる遺伝子発現プロファイルを使用して確認された。上記のように、ＭＰＨＯＳＰＨ１およびＤＥＰＤＣ１の発現は肺癌および膀胱癌を含むさまざまな腫瘍細胞において特異的に上方制御されることを示されている。表１に示されるように、ＭＰＨＯＳＰＨ１の発現は、３１の膀胱癌中３０、３６の乳癌中８、１８の子宮頸癌中１８、１７の胆管細胞癌中５、３１のＣＭＬ中２５、１１の結腸直腸癌中６、１４の胃癌中６、５つのＮＳＣＬＣｓ中５、７つのリンパ腫中７、１０の骨肉腫中６、２２の前立腺癌中７、１８の腎癌中１０および２１の軟組織腫瘍中１５において有意に上昇することが示された。同時に、ＤＥＰＤＣ１の発現は、表１に示されるように、２５の膀胱癌中２３、１３の乳癌中６、１２の子宮頸癌中１２、６の胆管細胞癌中６、４のＣＭＬ中３、４の結腸直腸癌中２、６のＮＳＣＬＣｓ中６、７のリンパ腫中７、１４の骨肉腫中１０、２４の前立腺癌中１１、１４のＳＣＬＣｓ中１４および３１の軟組織腫瘍中２２において有意に上昇することを示した。
【００１１】
本発明は、少なくとも一つには、対応する分子に特異的な細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を誘導する能力を備えているこれらの遺伝子（ＭＰＨＯＳＰＨ１およびＤＥＰＤＣ１）の遺伝子産物の特定のエピトープペプチドを同定したことに基づく。以下に詳細に述べられるように、健常者ドナーの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）はＭＰＨＯＳＰＨ１またはＤＥＰＤＣ１由来のＨＬＡ―Ａ＊２４０２およびＨＬＡ―Ａ＊０２０１結合性候補ペプチドを使用して刺激された。ＣＴＬクローンおよび／またはラインは、それぞれの候補ペプチドでパルスされたＨＬＡ―Ａ２４またはＨＬＡ―Ａ２陽性標的細胞に対する特異的な細胞障害性を有するものが樹立された。これらの結果は、これらのペプチドが、ＨＬＡ―Ａ２４またはＨＬＡ―Ａ２拘束性エピトープペプチドでありＭＰＨＯＳＰＨ１またはＤＥＰＤＣ１を発現する細胞に対して有効な特異性免疫応答を誘導することができるということを示す。
【００１２】
したがって、本発明は、ＭＰＨＯＳＰＨ１および／またはＤＥＰＤＣ１の過剰発現と関連した疾患（例えば癌）を治療または予防する方法を提供する。当該方法はそれを必要とする対象に本発明のＭＰＨＯＳＰＨ１および／またはＤＥＰＤＣ１ポリペプチドを投与するステップを含む。当該ペプチドの投与は、抗腫瘍免疫を誘導結果となる。このように、本発明は対象に抗腫瘍免疫を誘導する方法を提供する。当該方法は例えば対象にＭＰＨＯＳＰＨ１および／またはＤＥＰＤＣ１ポリペプチドだけでなくＭＰＨＯＳＰＨ１および／またはＤＥＰＤＣ１の過剰発現と関連した疾患（例えば癌）を治療または予防するためのＭＰＨＯＳＰＨ１および／またはＤＥＰＤＣ１ポリペプチドを含む医薬品組成物を投与するステップを含む。癌には例えば、限定するものではないが、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、胃癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣおよび軟組織腫瘍が含まれる。
【００１３】
すなわち、本出願は、以下の態様およびそれらのいかなる組み合わせも含む。
[1]
細胞障害性Ｔ細胞誘導能を有する単離ペプチドであって、配列番号：２、４または６のアミノ酸配列由来である前記ペプチド。
[2]
配列番号：７、８および１２のアミノ酸配列を含むペプチドからなるグループから選択される約１５アミノ酸未満の単離ペプチド、または細胞障害性Ｔ細胞誘導能を有するペプチドであって、以下を含む前記ペプチド：
配列番号：７、８および１２からなるグループから選択され、１、２またはいくつかのアミノ酸が、置換、欠失、または、付加されたアミノ酸配列。
[3]
細胞障害性Ｔ細胞誘導能を有する、Ｎ末端からの第２位のアミノ酸がフェニルアラニン、チロシン、メチオニンまたはトリプトファンである〔２〕に記載のペプチド。
[4]
細胞障害性Ｔ細胞誘導能を有する、Ｃ末端アミノ酸は、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンまたはメチオニンである〔２〕に記載のペプチド。
[5]
配列番号：９、１０、１１、１９２、１９５、１９７、２０９、２２５、２２６、２２８、２３０、２４０、２４１、２４３、２４４、２５３、２５４および２５５、のアミノ酸配列を含むペプチドからなるグループから選択された約１５アミノ酸未満の単離ペプチド、または細胞障害性Ｔ細胞誘導能を有するペプチドであって、以下を含む前記ペプチド：
配列番号：９、１０、１１、１９２、１９５、１９７、２０９、２２５、２２６、２２８、２３０、２４０、２４１、２４３、２４４、２５３、２５４および２５５、からなるグループから選択され、１、２またはいくつかのアミノ酸が、置換、欠失、または、付加されたアミノ酸配列。
[6]
細胞障害性Ｔ細胞誘導能を有する、Ｎ末端からの第２位のアミノ酸は、ロイシンまたはメチオニンである〔５〕に記載のペプチド。
[7]
細胞障害性Ｔ細胞誘導能を有する、Ｃ末端アミノ酸は、バリンまたはロイシンである〔５〕に記載のペプチド。
[8]
ＤＮＡが〔１〕から〔７〕のいずれかのペプチドをコードするベクター。
[9]
配列番号：１、３および／または５の遺伝子の過剰発現と関連した疾患を治療または予防するための医薬組成物であって、前記組成物が〔１〕から〔７〕のいずれか一つのペプチドを一つ以上含む医薬組成物。
[10]
疾患が癌である〔９〕に記載の医薬組成物。
[11]
癌が、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、胃癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣおよび軟組織腫瘍からなるグループから選択される〔１０〕に記載の医薬組成物。
[12]
〔１〕から〔７〕のいずれか一つのペプチドおよびＨＬＡ抗原から成る複合体を表面に提示するエキソソーム。
[13]
ＨＬＡ抗原がＨＬＡ―Ａ２４である、〔１２〕に記載のエキソソーム。
[14]
ＨＬＡ抗原がＨＬＡ―Ａ２４０２である、〔１３〕に記載のエキソソーム。
[15]
ＨＬＡ抗原がＨＬＡ―Ａ２である、〔１２〕に記載のエキソソーム。
[16]
ＨＬＡ抗原がＨＬＡ―Ａ０２０１である、〔１３〕に記載のエキソソーム。
[17]
〔１〕から〔７〕のいずれかのペプチドを抗原提示細胞と接触させる工程を含む、高い細胞障害性Ｔ細胞誘導能を有する抗原提示細胞を誘導する方法。
[18]
〔１〕から〔７〕のいずれかのペプチドとＴ細胞を接触させることにより、細胞障害性Ｔ細胞を誘導する方法。
[19]
抗原提示細胞に〔１〕から〔７〕のいずれかのペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子を導入する工程を含む、高い細胞障害性Ｔ細胞誘導能を有する抗原提示細胞を誘導する方法。
[20]
請求項１から７のいずれかのペプチドとＴ細胞を接触させることにより、または、請求項１から７のいずれかのＨＬＡ―Ａ２４またはＨＬＡ―Ａ２のペプチドと結合するＴＣＲサブユニットポリペプチドをコードする核酸を導入することにより、誘導される単離された細胞障害性Ｔ細胞
[21]
ＨＬＡ抗原と〔１〕から〔７〕のいずれかのペプチドとで形成された複合体を含む、抗原提示細胞。
[22]
〔１７〕の方法により誘導される、〔２１〕に記載の抗原提示細胞。
[23]
活性成分として〔１〕から〔７〕のいずれかのペプチドを含む、配列番号：１、３および／または５の遺伝子を発現している細胞の細胞増殖を阻害するためのワクチン。
[24]
細胞が癌細胞である、〔２３〕に記載のワクチン。
[25]
癌が、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、胃癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣおよび軟組織腫瘍からなるグループから選択される、〔２４〕に記載のワクチン。
[26]
ＨＬＡ抗原がＨＬＡ―Ａ２４またはＨＬＡ―Ａ２である対象への投与のために調製される、〔２３〕に記載のワクチン。
[27]
対象に〔１〕から〔７〕のいずれか一つ以上のペプチド、その免疫学的活性断片、または前記ペプチドまたは活性断片をコードするポリヌクレオチドを含むワクチンを投与することを含む、配列番号：１、３および／または５の遺伝子の過剰発現と関連した疾患を治療または予防する方法。
[28]
疾患が癌である、〔２７〕に記載の方法。
[29]
癌が膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、胃癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣおよび軟組織腫瘍からなるグループから選択される〔２８〕に記載の方法。
【００１４】
あるいは、本発明は、〔１９〕の方法によって作製される抗原提示細胞とＴ細胞を接触させる段階を含む細胞障害性Ｔ細胞を誘導する方法にも関する。
【００１５】
以下の詳細な説明が添付の図および実施例と連動して読まれるときに、これらの、そしてまた他の、目的および発明の特徴はより十分に明らかになる。
しかしながら、前述の本発明の開示および以下の詳細な説明は好適な態様であって、本発明の、または本発明の他の態様にも限定されものではないことを理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１Ａは、ＩＦＮ―γＥＬＩＳＰＯＴ検査法によるエピトープペプチドのスクリーニングの結果を表しており、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２４―９―２７８（配列番号：７）がＩＦＮ―γの有力な生産体であることを証明する。ＭＰＨＯＳＨＰ１由来のそれらのペプチドに対するＣＴＬは、下記の実施例の「材料および方法」部分に記載されているプロトコールに従って生成された。結果として検出可能な特異的なＣＴＬ活性を有するＣＴＬが示された。特に、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２４―９―２７８によって刺激されたウェルナンバー＃４の細胞は、コントロールと比較して、ペプチドをパルスした標的細胞を認識して強力なＩＦＮ―ガンマを産生することを示した。図１Ｂは、限界希釈後（ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２４―９―２７８ ＣＴＬクローン）、ＣＴＬクローンのスクリーニングのＩＦＮ―γＥＬＩＳＰＯＴ検査法の結果を表す。陽性ウェルの細胞は拡張され、限界希釈された。表された結果に示されるように、ペプチドパルスをしていない標的に対する活性と比較して、ペプチドパルスされた標的に対してより高い特異的なＣＴＬ活性を有するＣＴＬクローンが樹立された。
【図２】図２Ａはエピトープペプチド細胞障害性のスクリーニングのためのＩＦＮ―γＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を表し、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２４―１０―２７８（配列番号：８）がＩＦＮ―γの有力な生産体であることを証明する。ＭＰＨＯＳＨＰ１由来のそれらのペプチドに対するＣＴＬは、下記の実施例の「材料および方法」部分に記載されているプロトコールに従って生成された。結果として検出可能な特異的なＣＴＬ活性を有するＣＴＬが示される。特に、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２４―１０―２７８によって刺激されたウェルナンバー＃８の細胞は、コントロールと比較して、強力なＩＦＮ―ガンマ産生を示した。図２Ｂは、限界希釈（ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２４―１０―２７８ ＣＴＬクローン）の後、ＣＴＬクローンのスクリーニングのためのＩＦＮ―γＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を表す。陽性ウェルの細胞は拡張され、そして、限界希釈された。結果が示すように、ペプチドパルスをしない標的に対する活性と比較して、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２４―１０―２７８をパルスした標的に対するより高い特異的なＣＴＬ活性を有するＣＴＬクローンが樹立された。
【図３】図３Ａは、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２４―９―２７８によって刺激されたＣＴＬクローンの樹立を表す（配列番号：７）。このＣＴＬクローンが、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２４―９―２７８をパルスした標的細胞（Ａ２４ＬＣＬ）に対して高い特異的なＣＴＬ活性を示したが、ペプチドをパルスしない同じ標的細胞（Ａ２４ＬＣＬ）に対しては著しいＣＴＬ活性を示さないことを証明した。図３Ｂは、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２４―１０―２７８（配列番号：８）によって刺激されたＣＴＬクローンの確立を示す。このＣＴＬクローンが、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２４―１０―２７８によってパルスされた標的細胞（Ａ２４ＬＣＬ）に対して高い特異的なＣＴＬ活性を示したが、ペプチドをパルスしない同じ標的細胞（Ａ２４ＬＣＬ）に対しては著しいＣＴＬ活性を示さなかった。Ｒは、レスポンダーを意味する：ＣＴＬクローン。Ｓは、スティミュレーターを意味する：ペプチドパルスされたＡ２４―ＬＣＬ（１ｘ１０４／ウェル）。
【図４】図４は、ＨＬＡ―Ａ２４を有する標的細胞表面上におけるＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２４―９―２７８（配列番号：７）の発現を表す。全長ＭＰＨＯＳＰＨ１遺伝子とＨＬＡ―Ａ＊２４０２分子を両方トランスフェクトしたＣＯＳ７に対する特異的なＣＴＬ活性は、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２４―９―２７８によっておこされたＣＴＬクローンをエフェクター細胞として使用して評価された。全長ＭＰＨＯＳＰＨ１によってトランスフェクトするがＨＬＡ―Ａ＊２４０２はしないＣＯＳ７、およびＨＬＡ―Ａ＊２４０２によってトランスフェクトするが全長ＭＰＨＯＳＰＨ１はしないＣＯＳ７は、コントロールとして調整された。ＣＴＬクローンは、ＭＰＨＯＳＰＨ１およびＨＬＡ―Ａ２４の両方によりトランスフェクトしたＣＯＳ７に対して、高い特異的なＣＴＬ活性を示した。しかし、ＭＰＨＯＳＰＨ１もＨＬＡ―Ａ２４もトランスフェクトさせないＣＯＳ７に対しては著しい特異的なＣＴＬ活性は示さなかった。Ｒは、レスポンダーを意味する：ＣＴＬクローン。Ｓは、スティミュレーターを意味する：ＣＯＳ７トランスフェクタント（１ｘ１０４／ウェル）。
【図５】図５は、ＭＰＨＯＳＰＨ１を内因的に発現している膀胱癌細胞株に対するＣＴＬ活性を表す。ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２４―９―２７８ペプチドによって誘導されて確立されたＣＴＬクローンは、ＭＰＨＯＳＰＨ１を内因的に発現している腫瘍細胞を認識した。ＨＴ１３７６、ＲＴ―４およびＪ８２細胞は、内因的にそれぞれＭＰＨＯＳＰＨ１を発現した。ＣＴＬクローンは、ＨＬＡ―Ａ＊２４０２遺伝子型を有するＨＴ１３７６に対するＩＦＮ―ガンマの産生を示したが、ＨＬＡ―Ａ＊２４０２遺伝子型を有しないＲＴ―４およびＪ８２に対しては反応を示さなかった。
【図６】図６は、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２４―９―２７８ペプチドを用いたインビボの免疫原性解析を表す。ＩＦＡ複合ペプチドは、皮下に０日目および７日目にＢＡＬＢ／ｃマウスに注射された。ワクチン接種されたマウスの脾細胞は１４日目に収集されてレスポンダー細胞として用いられ、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２４―９―２７８ペプチドをパルスされた１ｘ１０ ４のＲＬｍａｌｅ１細胞はＩＦＮ―γＥＬＩＳＰＯＴアッセイのスティミュレーターとして用いられた。スポットフォーミングカウント（ＳＦＣ）は、それぞれのマウスのケースで示された；５匹のマウス（Ａｎｉ１〜Ａｎｉ５）はエピトープペプチドをワクチン接種され、３匹のマウス（ｎｅｇａ１〜ｎｅｇａ３）は陰性コントロールとしてモックＩＦＡエマルジョンをワクチン接種された。
【図７】図７はエピトープペプチドのスクリーニングのためのＩＦＮ―γＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を表しており、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２―９―２８２（配列番号：９）、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２―９―６３８（配列番号：１０）およびＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２―１０―１７１４（配列番号：１１）が強力なＩＦＮ―ガンマ産生能を有することを証明する。ＭＰＨＯＳＨＰ１由来のそれらのペプチドに対するＣＴＬは、以下に述べる実施例の「材料およびＭｅｔｈｏｄｓ」部分に記載されているプロトコールに従って生成された。結果として検出可能な特異的なＣＴＬ活性を有するＣＴＬが示される。特に、図７Ａは、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２―９―２８２によって刺激されたウェルナンバー＃１および＃５の細胞が、コントロールと比較すると、標的細胞にパルスしたペプチドを認識するのに十分な強力なＩＦＮ―ガンマの産生を示したことを証明する。図７Ｂは、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２―９―６３８によって刺激されたウェルナンバー＃８の細胞が、コントロールと比較して、ペプチドをパルスした標的細胞を認識するのに十分な強力なＩＦＮ―ガンマの産生を示したことを証明する。図７Ｃは、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２―１０―１７１４によって刺激されたウェルナンバー＃４の細胞が、コントロールと比較して、ペプチドをパルスした標的細胞を認識するのに十分な強力なＩＦＮ―ガンマを産生することを示したことを証明する。
【図８】図８は、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ０２―９―２８２（配列番号：９）、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ０２―９―６３８（配列番号：１０）およびＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ０２―１０―１７１４（配列番号：１１）によって刺激されたＣＴＬラインの樹立を表す。陽性ウェルの細胞は拡張され、そして、結果が示すように、ペプチドパルスをしない標的に対する活性と比較して、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ０２―９―２８２をパルスした標的（Ａ）、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ０２―９―６３８をパルスした標的（Ｂ）またはＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ０２―１０―１７１４をパルス化した標的（Ｃ）に対する高い特異的なＣＴＬ活性を有するＣＴＬのラインが樹立された。Ｒは、レスポンダーを意味する：ＣＴＬライン。Ｓは、スティミュレーターを意味する：ペプチドパルス化されたＴ２（１ｘ１０４／ウェル）。
【図９】図９Ａは、限界希釈（ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２―９―２８２ ＣＴＬクローン）後のＣＴＬクローンのスクリーニングのためのＩＦＮ―γＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を表す。陽性ウェルの細胞は拡張され、そして限界希釈された。表された結果が示すように、ペプチドパルスをしない標的に対する活性と比較して、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２―９―２８２をパルスした（配列番号：９）標的に対する高い特異的なＣＴＬ活性を有するＣＴＬクローンが樹立された。図９Ｂは、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ０２―９―２８２によって刺激されたＣＴＬクローンの樹立を表す。当該ＣＴＬクローンは、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２―９―２８２によってパルスした標的細胞（Ｔ２）に対する高い特異的なＣＴＬ活性を示したが、ペプチドがパルスされない同じ標的細胞（Ｔ２）に対しては著しいＣＴＬ活性を所有しなかったことを証明した。Ｒは、レスポンダーを意味する：ＣＴＬクローン。Ｓは、スティミュレーターを意味する：ペプチドパルス化されたＴ２（１ｘ１０４／ウェル）。
【図１０】図１０ＡはエピトープペプチドのスクリーニングのためのＩＦＮ―γＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を表しており、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２４―９―２９４（配列番号：１２）がＩＦＮ―γの強力な生産体であることを示す。ＤＥＰＤＣ１由来のそれらのペプチドに対するＣＴＬは、以下に述べる実施例の「材料および方法」部分に記載されているプロトコールに従って生成された。結果として検出可能な特異的なＣＴＬ活性を示すＣＴＬが示された。コントロールと比較して、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２４―９―２９４によって刺激されたウェルナンバー＃１０の細胞は、ペプチドをパルスした標的細胞を認識して強力なＩＦＮ―ガンマを産生することを示した。図１０Ｂは、限界希釈（ＤＥＰＤＣ１―Ａ２４―９―２９４ ＣＴＬクローン）後の、ＣＴＬクローンのスクリーニングのためのＩＦＮ―γＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を表す。陽性ウェルの細胞は拡張され、そして、限界希釈された。結果が示すように、ペプチドパルスをしない標的に対する活性と比較して、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２４―９―２９４をパルスした標的に対する高い特異的なＣＴＬ活性を有するＣＴＬクローンが樹立された。
【図１１】図１１は、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２４―９―２９４（配列番号：１２）によって刺激されたＣＴＬクローンの樹立を表す。このＣＴＬクローンはＤＥＰＤＣ１―Ａ２４―９―２９４によってパルスされた標的細胞（Ａ２４ＬＣＬ）に対して高い特異的なＣＴＬ活性を示したが、それはペプチドをパルスしない同じ標的細胞（Ａ２４ＬＣＬ）に対しては、有意なＣＴＬ活性を示さなかった。Ｒは、レスポンダーを意味する：ＤＥＰＤＣ―Ａ２４―９―２９４ ＣＴＬクローン。Ｓは、スティミュレーターを意味する：ペプチドパルスされたＡ２４―ＬＣＬ（１ｘ１０４／ウェル）。
【図１２】図１２は、ＨＬＡ―Ａ２４を有する標的細胞表面上のＤＥＰＤＣ１―Ａ２４―９―２９４（配列番号：１２）の発現を示す。全長ＤＥＰＤＣ１遺伝子およびＨＬＡ―Ａ＊２４０２分子の両者によってトランスフェクトしたＣＯＳ７に対する特異的なＣＴＬ活性は、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２４―９―２９４によって上がるＣＴＬクローンをエフェクター細胞として用いて検定した。全長ＤＥＰＤＣ１によってトランスフェクトしたが、ＨＬＡ―Ａ＊２４０２はしないＣＯＳ７、およびＨＬＡ―Ａ＊２４０２をトランスフェクトしたが全長ＤＥＰＤＣ１はしないＣＯＳ７は、コントロールとして調整された。樹立されたＣＴＬクローンは、ＤＥＰＤＣ１およびＨＬＡ―Ａ２４の両者によってトランスフェクトしたＣＯＳ７に対して、高い特異的なＣＴＬ活性を示した。しかしながら、ＤＥＰＤＣ１もＨＬＡ―Ａ２４によってもトランスフェクトしないＣＯＳ７に対しては、有意な特異的ＣＴＬ活性を示さなかった。Ｒは、レスポンダーを意味する：ＤＥＰ―Ａ２４―９―２９４ ＣＴＬクローン。Ｓは、スティミュレーターを意味する：ＣＯＳ７トランスフェクタント（１ｘ１０４／ウェル）。
【図１３】図１３は、ＤＥＰＤＣ１を内因的に発現している膀胱癌細胞に対するＣＴＬ活性を示す。ＤＥＰＤＣ１―Ａ２４―９―２９４ペプチドによって誘導された樹立したＣＴＬクローンは、ＤＥＰＤＣ１を内因的に発現している腫瘍細胞を認識した。ＨＴ１３７６、ＲＴ―４およびＪ８２細胞は、それぞれが、内因的にＤＥＰＤＣ１を発現した。ＣＴＬクローンは、ＨＬＡ―Ａ＊２４０２遺伝子型を有するＨＴ１３７６に対するＩＦＮ―ガンマ産生を示したが、ＨＬＡ―Ａ＊２４０２遺伝子型を有しないＲＴ―４およびＪ８２に対しては反応しないことを示した。
【図１４】図１４は、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２４―９―２９４ペプチドを用いたインビボの免疫原性解析を示す。ＩＦＡ複合ペプチドは、０日目および７日目にＢＡＬＢ／ｃマウスに皮下注射された。１４日目に、ワクチン接種を受けたマウスの脾細胞は集められて応答細胞として用いられ、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２４―９―２９４ペプチドをパルスした１ｘ１０４のＲＬｍａｌｅ１細胞は刺激因子細胞としてＩＦＮ―ガンマＥＬＩＳＰＯＴアッセイに用いられた。スポット形成カウント（ＳＦＣ）は、それぞれのマウスで示された；５匹のマウス（Ａｎｉ１〜Ａｎｉ５）はエピトープペプチドをワクチン接種され、そして、２匹のマウス（ｎｅｇａ１およびｎｅｇａ２）は陰性対照としてＭｏｃｋ ＩＦＡエマルジョンを注入された。
【図１５】図１５は、エピトープペプチドのスクリーニングのためのＩＦＮ―ガンマＥＬＩＳＰＯＴアッセイによる、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―６４４―１０―５７５―１０―５０６―１０―７６５―１０―３９５―１０―２２４―９―２９７―１０―２９６および―１０―３０２の強力なＩＦＮ―ガンマ生産を示す。ＤＥＰＤＣ１由来のそれらのペプチドに対するＣＴＬは、「材料および方法」に記載されている方法で生成された。ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―６４４で刺激されたウェルナンバー＃４と＃７の細胞、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―５７５で刺激されたウェルナンバー＃２の細胞、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―５０６による＃７の細胞、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―７６５による＃１の細胞およびＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―３９５による、＃１の細胞、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―２２４による＃１と＃２の細胞、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―９―２９７による＃４の細胞、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―２９６による＃３と＃４の細胞およびＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―３０２による＃２、＃３、＃５および＃７の細胞は、コントロールと比較して有力なＩＦＮ―ガンマ生産を示した。
【図１６】図１６は、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―２９６ペプチドによって生成されたＣＴＬラインのＩＦＮ―ガンマ産生を示す。ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―２９６ペプチドによって高められ樹立したＣＴＬラインは、強力なＩＦＮ―ガンマ産生活性を有する。それは、ペプチドパルスされた標的細胞に対してＩＦＮ―ガンマ産生を示したが、ペプチドをパルスしない標的に対しては、示さなかった。標的細胞は、細胞表面でＨＬＡ―Ａ２分子を発現するＴ２細胞を用いた。
【図１７】図１７は、ＤＥＰＤＣ１およびＨＬＡ―Ａ２分子を内因的に発現している標的に対する、ＣＴＬ活性を示す。ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―２９６ペプチドにより生成されて樹立したＣＴＬ株がＤＥＰＤＣ１Ｖ２およびＨＬＡ―Ａ２を内因的に発現した標的細胞に対してＩＦＮ―ガンマ産生活性を有したことは、上方パネルにおいて示された。このＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―２９６ペプチドを用いたケースは、下方パネルに示された。ＤＥＰＤＣ１Ｖ１―９―６７４またはＤＥＰ―９―４６２のペプチドパルスの処理によるＨＬＡ―Ａ２のみ発現する標的細胞およびＤＥＰＤＣ１Ｖ２だけを発現する標的細胞は、陰性対照として調整された。標的細胞は、ＨＬＡ―Ａ２またはモックを安定的に発現するＨＥＫ２９３トランスフェクタントより調整された。
【図１８】図１８は、症例２における抗原発現を示す。症例２において、ＭＰＨＯＳＰＨ１およびＤＥＰＤＣ１の両者が、強く発現された。従って、ＭＰＨＯＳＰＨ１およびＤＥＰＤＣ１由来の２種類のエピトープペプチドがワクチン接種された。
【図１９】図１９は、症例２における膀胱癌の局所再発の臨床評価を示す。症例２は、ＲＥＣＩＳＴ基準によるとＳＤ評価であった。
【図２０】図２０は、症例３の抗原発現を示す。症例３において、ＤＥＰＤＣ１が強く発現された。従って、ＤＥＰＤＣ１由来のエピトープペプチドを単独でワクチン接種した。
【図２１】図２１は、症例３の転移肺の右葉に対する臨床評価を示す。この進行率は、ワクチン接種の後低下した。とりわけ、腫瘍のサイズは、第３コース後に減少した。
【図２２】図２２は、症例３の転移肺の左葉に対する臨床評価を示す。この進行率は、ワクチン接種の後低下した。特に、腫瘍のサイズは、第３コース後に減少した。
【図２３】図２３は、症例３における抗腫瘍効果を示す。転移性腫瘍の進行率は、ワクチン接種の後低下した。
【図２４】図２４は、症例３の特異的なＣＴＬ反応を示す。特異的なＣＴＬ反応がワクチン接種の後強く示された。
【図２５】図２５は、症例４の抗原発現を示す。症例４において、ＭＰＨＯＳＰＨ１およびＤＥＰＤＣ１が発現された。従って、ＭＰＨＯＳＰＨ１およびＤＥＰＤＣ１由来の２種類のエピトープペプチドがワクチン接種された。
【図２６】図２６は、症例４の膀胱癌の局所再発のための臨床評価を示す。腫瘍サイズは、第１コースのワクチン接種後ＲＥＣＩＳＴ基準に基づくと２０％減少した。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
発明の詳細な説明
本明細書で用いられる「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」の単語は、とくに別段の明示がない限り、「少なくとも一つ」を意味する。
【００１８】
別途定められない限り、本願明細書において用いられるすべての技術的および科学的な用語は、本発明が属する当業者によって共通に理解されるのと同じ意味を有する。
【００１９】
新しいTAA、特に、強力かつ特異的な抗腫瘍免疫応答を誘導するTAAの同定により、様々な型の癌におけるペプチドワクチン接種ストラテジーの臨床での応用のさらなる進歩が保証される（Boon T et al.(1996)J Exp Med 183:725-9.van der Bruggen P et al.((1991)Science 254):1643-7.Brichard V et al.((1993)J Exp Med 178):489-95.Kawakami Y et al.（（1994）Ｊ Exp Med 180）:347-52.Shichijo S et al.((1998)J Exp Med 187):277-88.Chen YT et al.(1997)Proc.Natl.Acd.Sci.USA、94:1914-8.Harris CC((1996)J Natl Cancer Inst 88):1442-55.Butterfield LH et al.((1999)Cancer Res 59):3134-42.Vissers JL et al.((1999)Cancer Res 59):5554-9.van der Burg SH et al.((1996)J. Immunol 156):3308-14.Tanaka F et al.((1997)Cancer Res 57):4465-8.Fujie T et al.((1999)Int J Cancer 80):169-72. Kikuchi M et al.((1999)Int J Cancer 81):459-66.Oiso M et al.（（1999）Int J Cancer 81）:387-94）。
上記の如く、ＭＰＨＯＳＰＨ１（Ｍ期リン蛋白１；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１６１９５；配列番号：１、２）およびＤＥＰＤＣ１（ＤＥＰ領域含有１；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＢＭ６８３５７８）、特に、その２つのバリアント（ＤＥＰＤＣ１Ｖ１（配列番号：３、４）およびＤＥＰＤＣ１Ｖ２（配列番号：５、６）は、以前、cDNAマイクロアレイ技術を用いて、さまざまな癌において過剰発現するものとして同定された。ＭＰＨＯＳＰＨ１は、以前Ｇ２／Ｍ移行で特異的にリン酸化されるタンパク質のうちの１つとして同定され、プラス方向誘導キネシン関連のタンパク質として特徴づけられた（Abaza A et al. J Biol Chem 2003、278:27844-52．）。特に、ＭＰＨＯＳＰＨ１は、以前、細胞分裂において重要な役割を果たすプラス方向誘導分子モーターであり、HeLa細胞の終期までの後期の間に、紡錘体の中心部に集積すると実証された（Abaza A et al. J Biol Chem 2003、278:27844-52; KamimotoT et al. J Biol Chem 2001、276:37520-8.）。
ＭＰＨＯＳＰＨ１のcDNAは、３つの領域、：ＮＨ２―ｋｉｎａｓｉｎモータードメイン（NH2-kinasin motor domain）、中心高次コイル―軸ドメイン（central coiled coil-stalk domain）およびＣ球状尾部ドメイン（C-globular tail domain）、から成る１７８０アミノ酸のタンパク質をコードする。これらのデータは、ＭＰＨＯＳＰＨ１がＮＨ２タイプキネシン関連のタンパク質であることを示唆する。
【００２０】
ＤＥＰＤＣ１タンパク質の機能は、いまだ明らかでない。このタンパク質に含まれるＤＥＰ領域はＤｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ、Ｅｇｌ―１０およびＰｌｅｃｋｓｔｒｉｎにおいて見られる。特に、ショウジョウバエのｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄのＤＥＰドメインは、平面極性欠損の救済およびＪＮＫシグナリングの誘導において欠くことのできない役割を果たしている；にもかかわらず、ヒトにおけるその機能は、まだ明らかにされていない。しかしながら、ＰＣＴ／ＪＰ２００６／３０２６８４に開示されているように、ＤＥＰＤＣ１（In House No.：Ｂ５８６０Ｎ）は、ＤＥＰＤＣ１Ｖ１およびＶ２に対応するそれぞれ１２と１１のエキソンからなる２つの異なるトランスクリプショナルバリアントを有する。Ｖ１のエキソン８における変異が認められており、そして、他の残りのエキソンは両方のバリアントに共通であることが見いだされた。Ｖ２異型は、Ｖ１のエキソン８を有しないが、最後のエキソン内で同じ終止コドンを生成する。Ｂ５８６０ＮＶ１およびＢ５８６０ＮＶ２バリアントの全長cDNAシーケンスは、それぞれ５３１８のおよび４４６６のヌクレオチドから成る。これらのバリアントのＯＲＦはそれぞれのエキソン１内で始まる。最終的に、Ｖ１およびＶ２の転写産物は、それぞれ８１１および５２７のアミノ酸をコードする。ｓｉＲＮＡは癌細胞の増殖を抑制した。これらの結果はＤＥＰＤＣ１が殆どの癌細胞の増殖において重要な役割を果たしていることを示す。
【００２１】
ＰＣＴ／ＪＰ２００６／３０２６８４に開示されているように、ＭＰＨＯＳＰＨ１およびＤＥＰＤＣ１は、膀胱癌においては過剰発現するが、正常組織では軽微な発現のみ示す。加えて、これらの遺伝子は、細胞増殖に関連した重要な機能を有するとされた。
【００２２】
本発明において、ＭＰＨＯＳＰＨ１またはＤＥＰＤＣ１由来のペプチドは、日本人および白色人種の集団において共通に見いだされるＨＬＡアレルであるＨＬＡ―Ａ２４およびＨＬＡ―Ａ２によって拘束されたＴＡＡエピトープとなることを示す。とくに、ＨＬＡ―Ａ２４およびＨＬＡ―Ａ２へのそれらの結合能を用いて、ＭＰＨＯＳＰＨ１またはＤＥＰＤＣ１由来のＨＬＡ―Ａ２４およびＨＬＡ―Ａ２結合ペプチドの候補が同定された。これらのペプチドを負荷された樹状細胞（ＤＣｓ）によるＴ細胞のインビトロ刺激の後、ＣＴＬは、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２４―９―２７８（ＩＹＮＥＹＩＹＤＬ（配列番号：７）、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２４―１０―２７８（ＩＹＮＥｙＩＹＤＬＦ（配列番号：８）、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２―９―２８２（ＹＩＹＤＬＦＶＰＶ（配列番号：９）、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２―９―６３８（ＲＬＡＩＦＫＤＬＶ（配列番号：１０）、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２―１０―１７１４（ＴＭＳＳｓＫＬＳＮＶ（配列番号：１１）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２４―９―２９４（ＥＹＹＥＬＦＶＮＩ（配列番号：１２）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―６４４（ＳＬＭＩｈＴＦＳＲＣ（配列番号：２４０）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―５７５（ＳＬＬＰａＳＳＭＬＴ（配列番号：２４１）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―５０６（ＱＬＣＲｓＱＳＬＬＬ（配列番号：２４３）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―７６５（ＫＱＦＱｋＥＹＰＬＩ（配列番号：２４４）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―３９５（ＩＭＧＧＳＣＨＮＬＩ（配列番号：２４９）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―２２４（ＮＭＡＮｔＳＫＲＧＶ（配列番号：２５３）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―９―２９７（ＥＬＦＶＮＩＬＧＬ（配列番号：２２６）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―２９６（ＹＥＬＦｖＮＩＬＧＬ（配列番号：２５４）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―３０１（ＮＩＬＧｌＬＱＰＨＬ（配列番号：２５５）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２―９―５８９（ＬＬＱＰＨＬＥＲＶ（配列番号：１９２）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２―９―６１９（ＬＬＭＲＭＩＳＲＭ（配列番号：１９５）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２―９―２９０（ＬＬＴＦＥＹＹＥＬ（配列番号：１９７）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２―９―５６３（ＲＬＣＫＳＴＩＥＬ（配列番号：２０９）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２―９―６５３（ＣＶＬＣＣＡＥＥＶ（配列番号：２２５）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２―１０―６７４（ＦＬＭＤｈＨＱＥＩＬ（配列番号：２２８）およびＤＥＰＤＣ１―Ａ２―１０―３０２（ＩＬＶＶｃＧＹＩＴＶ（配列番号：２３０）を用いて、成功裡に樹立された。これらのＣＴＬは、ペプチドパルスされたＡ２４ＬＣＬおよびＴ２細胞に対して、強力な細胞障害活性を示した。さらにまた、これらの細胞由来のＣＴＬクローンも、それぞれ、ＭＰＨＯＳＰＨ１またはＤＥＰＤＣ１を発現しているＨＬＡ―Ａ２４またはＨＬＡ―Ａ２陽性細胞に対して特異的な細胞障害性を示した。しかしながら、これらのＣＴＬクローンはＨＬＡ―Ａ２４、ＨＬＡ―Ａ２、ＭＰＨＯＳＰＨ１およびＤＥＰＤＣ１のペプチドのうちの１つのみ発現する細胞に対しては、細胞障害活性を示さなかった。同時に、これらの結果は、ＭＰＨＯＳＰＨ１およびＤＥＰＤＣ１の癌細胞に対するＴＡＡとしての有用性を示唆し、そして、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２４―９―２７８（ＩＹＮＥＹＩＹＤＬ（配列番号：７））、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２４―１０―２７８（ＩＹＮＥｙＩＹＤＬＦ（配列番号：８））、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２―９―２８２（ＹＩＹＤＬＦＶＰＶ（配列番号：９））、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２―９―６３８（ＲＬＡＩＦＫＤＬＶ（配列番号：１０））、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２―１０―１７１４（ＴＭＳＳｓＫＬＳＮＶ（配列番号：１１））、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２４―９―２９４（ＥＹＹＥＬＦＶＮＩ（配列番号：１２））、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―６４４（ＳＬＭＩｈＴＦＳＲＣ（配列番号：２４０））、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―５７５（ＳＬＬＰａＳＳＭＬＴ（配列番号：２４１））、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―５０６（ＱＬＣＲｓＱＳＬＬＬ（配列番号：２４３））、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―７６５（ＱＦＱｋＥＹＰＬＩ（配列番号：２４４））、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―３９５（ＩＭＧＧＳＣＨＮＬＩ（配列番号：２４９）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―２２４（ＮＭＡＮｔＳＫＲＧＶ（配列番号：２５３））、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―９―２９７（ＥＬＦＶＮＩＬＧＬ（配列番号：２２６））、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―２９６（ＹＥＬＦｖＮＩＬＧＬ（配列番号：２５４））、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―３０１（ＮＩＬＧｌＬＱＰＨＬ（配列番号：２５５））、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２―９―５８９（ＬＬＱＰＨＬＥＲＶ（配列番号：１９２））、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２―９―６１９（ＬＬＭＲＭＩＳＲＭ（配列番号：１９５））、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２―９―２９０（ＬＬＴＦＥＹＹＥＬ（配列番号：１９７））、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２―９―５６３（ＲＬＣＫＳＴＩＥＬ（配列番号：２０９））、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２―９―６５３（ＣＶＬＣＣＡＥＥＶ（配列番号：２２５））、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２―１０―６７４（ＦＬＭＤｈＨＱＥＩＬ（配列番号：２２８））およびＤＥＰＤＣ１―Ａ２―１０―３０２（ＩＬＶＶｃＧＹＩＴＶ（配列番号：２３０））は、ＨＬＡ―Ａ２４またはＨＬＡ―Ａ２に拘束されるそれぞれのＴＡＡのエピトープペプチドである。これらの抗原が多くの癌において過剰発現して、腫瘍細胞増殖と関係しているので、それらは癌に対する免疫療法の標的として有用性を提供する。例えば癌には、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、胃癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣ、軟組織腫瘍が含まれるが限定するものではない。
【００２３】
したがって、本発明は更に、ＭＰＨＯＳＰＨ１および／またはＤＥＰＤＣ１の過剰発現と関連した対象における疾患（例えば癌）を治療または予防する方法であって約40アミノ酸未満、しばしば、約20アミノ酸未満、通常は約15アミノ酸未満であり、かつ配列番号：７、８、９、１０、１１、１２、１９２、１９５、１９７、２０９、２２５、２２６、２２８、２３０、２４０、２４１、２４３、２４４、２４９、２５３、２５４または２５５のアミノ酸配列を含む免疫原性ペプチドを、必要としている対象に投与する段階を含む方法を提供する。あるいは、免疫原性ペプチドは、結果として生じる変異体ペプチドが免疫原性活性（すなわち、肺癌細胞に特異的なCTLを誘導する能力）を保持するとの条件で、1個、2個、または数個のアミノ酸が置換、除去、または付加されている、配列番号：７、８、９、１０、１１、１２、１９２、１９５、１９７、２０９、２２５、２２６、２２８、２３０、２４０、２４１、２４３、２４４、２４９、２５３、２５４または２５５の配列を含みうる。置換、除去、または付加される残基の数は、一般的に、5アミノ酸またはそれ未満、好ましくは4アミノ酸またはそれ未満、より好ましくは3アミノ酸またはそれ未満、よりいっそう好ましくは1アミノ酸もしくは2アミノ酸である。 意図される癌としては、限定はされないが、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、胃癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣ、軟組織腫瘍が挙げられる。
【００２４】
変異体ペプチド（すなわち、本来のアミノ酸配列に対して、1個、2個、または数個のアミノ酸残基の置換、除去、または付加を行うことにより改変されたアミノ酸配列を含むペプチド）は、本来の生物活性を保持することが知られている（Mark DF et al.(1984)Proc Natl Acad Sci USA 81:5662-6.Zoller MJ and Smith M((1982)Nucleic Acids Res 10):6487-500.Dalbadie-McFarland et al.((1982)Proc Natl Acad Sci USA 79):6409-13.）。
本発明の文脈において、アミノ酸改変は、結果として、本来のアミノ酸側鎖の性質を保存することが好ましい（保存的アミノ酸置換として公知の方法）。アミノ酸側鎖の性質の例は、疎水性アミノ酸（A、I、L、M、F、P、W、Y、V）、親水性アミノ酸（R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T）、および共通して、以下の官能基または特性を有する側鎖である：脂肪族側鎖（G、A、V、L、I、P）；ヒドロキシ基含有側鎖（S、T、Y）；イオウ原子含有側鎖（C、M）；カルボン酸およびアミド含有側鎖（D、N、E、Q）；塩基含有側鎖（R、K、H）；ならびに芳香族含有側鎖（H、F、Y、W）。ただし、括弧でくくられた文字は、アミノ酸の一文字記号を示す。
【００２５】
好適な態様において、免疫原ペプチドは、ノナペプチド（９―ｍｅｒ）またはデカペプチド（１０―ｍｅｒ）である。
【００２６】
本発明はさらに、対象においてＭＰＨＯＳＰＨ１および／またはＤＥＰＤＣ１の過剰発現と関連した主題の疾患（例えば癌）対する抗腫瘍免疫を誘導する方法であって、本発明の免疫原性ペプチド、すなわち７、８、９、１０、１１、１２、１９２、１９５、１９７、２０９、２２５、２２６、２２８、２３０、２４０、２４１、２４３、２４４、２４９、２５３、２５４または２５５のアミノ酸配列またはそれらの変異体（すなわち、1個、2個、もしくは数個のアミノ酸の置換、除去、または付加を含む）を含むペプチドを、それを必要としている対象に投与する段階を含む方法を提供する。 意図される癌としては、限定はされないが、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、胃癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣ、軟組織腫瘍が挙げられる。
【００２７】
本発明の文脈において、対象は、好ましくは哺乳類である。典型的な哺乳類は、例えば、人間、人間以外の霊長類、マウス、ネズミ、イヌ、ネコ、ウマまたはウシを含むが、これに限定されるものではない。
【００２８】
本発明において、ペプチドは、インビボまたはエクスビボで対象に投与することができる。さらに、本発明はまた、ＭＰＨＯＳＰＨ１および／またはＤＥＰＤＣ１の過剰発現と関連した疾患（例えば癌）の処置または予防するための免疫原性組成物を製造するための７、８、９、１０、１１、１２、１９２、１９５、１９７、２０９、２２５、２２６、２２８、２３０、２４０、２４１、２４３、２４４、２４９、２５３、２５４および２５５のアミノ酸配列（ならびにそれらの変異体）を含むペプチドから選択されるノナペプチドまたはデカペプチドの使用を提供する。意図される癌としては、限定はされないが、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、胃癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣ、軟組織腫瘍が挙げられる。
【００２９】
ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２４―９―２７８（ＩＹＮＥＹＩＹＤＬ（配列番号：７））、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２４―１０―２７８（ＩＹＮＥｙＩＹＤＬＦ（配列番号：８））、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２―９―２８２（ＹＩＹＤＬＦＶＰＶ（配列番号：９））、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２―９―６３８（ＲＬＡＩＦＫＤＬＶ（配列番号：１０））、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２―１０―１７１４（ＴＭＳＳｓＫＬＳＮＶ（配列番号：１１））、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２４―９―２９４（ＥＹＹＥＬＦＶＮＩ（配列番号：１２））、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２―９―５８９（ＬＬＱＰＨＬＥＲＶ（配列番号：１９２））、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２―９―６１９（ＬＬＭＲＭＩＳＲＭ（配列番号：１９５））、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２―９―２９０（ＬＬＴＦＥＹＹＥＬ（配列番号：１９７））、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２―９―５６３（ＲＬＣＫＳＴＩＥＬ（配列番号：２０９））、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２―９―６５３（ＣＶＬＣＣＡＥＥＶ（配列番号：２２５））、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２―１０―６７４（ＦＬＭＤｈＨＱＥＩＬ（配列番号：２２８））、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２―１０―３０２（ＩＬＶＶｃＧＹＩＴＶ（配列番号：２３０））ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―６４４（ＳＬＭＩｈＴＦＳＲＣ（配列番号：２４０））、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―５７５（ＳＬＬＰａＳＳＭＬＴ（配列番号：２４１））、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―５０６（ＱＬＣＲｓＱＳＬＬＬ（配列番号：２４３））、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―７６５（ＫＱＦＱｋＥＹＰＬＩ（配列番号：２４４））、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―３９５（ＩＭＧＧＳＣＨＮＬＩ（配列番号：２４９）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―２２４（ＮＭＡＮｔＳＫＲＧＶ（配列番号：２５３））、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―９―２９７（ＥＬＦＶＮＩＬＧＬ（配列番号：２２６））、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―２９６（ＹＥＬＦｖＮＩＬＧＬ（配列番号：２５４））およびＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―３０１（ＮＩＬＧｌＬＱＰＨＬ（配列番号：２５５））の相同性解析は、それらにはいかなる公知のヒト遺伝子産物由来のペプチドとも有意な相同性がないことを証明する。従って、これらの分子に対する免疫療法での未知の、または望ましくない免疫応答の可能性は、著しく低減される。
【００３０】
ＨＬＡ抗原に関して、ここで提示されるデータは、Ａ―２４タイプまたはＡ―２タイプ抗原（日本人の中で多く発現しているといわれている）が有効な結果を得ることに好都合であることを証明する。Ａ―２４０２およびＡ―０２０１のようなサブタイプの使用は、さらに好ましい。一般に、臨床において、治療を必要としている患者のＨＬＡ抗原のタイプが前もって調べられ、患者抗原に対する高い結合能を有する、または、抗原提示による細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）誘導能を有する適切なペプチドの選択を可能にする。さらに、高い結合親和性およびCTL誘導能を示すペプチドを得るために、1個、2個、もしくは数個のアミノ酸の置換、除去、または付加が、天然に存在するＭＰＨＯＳＰＨ１およびＤＥＰＤＣ1の部分的ペプチドのアミノ酸配列に基づいて行われうる。本明細書において、「数個の」という用語は、5個またはそれ未満、より好ましくは3個またはそれ未満を指す。さらに、天然で示されるペプチドに加えて、HLA抗原への結合により示されるペプチドの配列の規則性は既知であるため（Kubo RT、et al. J.Immunol.(1994)、152、3913-24.Ｒammensee HG、et al.、 (1995)Immunogenetics.41:178-228.;Kondo A、et aｌ.、（1995) J. Immunol.155:4307−12.）、そのような規則性に基づいた改変を、本発明の免疫原性ペプチドに対して行うことができる。例えば、N末端から2番目のアミノ酸がフェニルアラニン、チロシン、メチオニン、またはトリプトファンで置換されている、高いHLA-24結合親和性を示すペプチドは、有利に用いられうる。同様に、Ｃ末端アミノ酸がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンまたはメチオニンによって置換されるペプチドは、有利に用いられうる。一方、N末端から2番目のアミノ酸がロイシンまたはメチオニンによって置換されたペプチド、そして、Ｃ末端アミノ酸がバリンまたはロイシンによって置換されたペプチドを有する高いＨＬＡ―Ａ２結合能を有しているペプチドは有利に用いられうる。さらに、１〜２のアミノ酸は、ペプチドのＮ末端またはＣ末端に加えられることができる。
【００３１】
しかしながら、ペプチド配列が、異なる機能をもつ内因性または外因性のタンパク質のアミノ酸配列の一部と同一である場合、特定の物質に対する自己免疫異常またはアレルギー症状のような副作用が引き起こされうる。それゆえに、免疫原性配列が公知のタンパク質のアミノ酸配列に一致する状況は避けることが好ましい。この状況は、利用可能なデータベースを用いて相同性検索を行うことにより避けられうる。相同性検索で、1個、2個、または数個のアミノ酸が異なるペプチドが存在しないことが確認される場合、例えば、HLA抗原との結合親和性を増加させる、および/またはCTL誘導能を増加させる上記のアミノ酸配列の改変による危険性が避けられうる。
【００３２】
上記のようなHLA抗原に対する高い結合親和性をもつペプチドは、癌ワクチンとして大いに効果的であることが期待されるが、高い結合親和性の存在を指標とし、それに応じて選択される候補ペプチドは、実際のCTL誘導能の存在について調べる必要がある。CTL誘導能は、ヒトMHC抗原を有する抗原提示細胞（例えば、Bリンパ球、マクロファージ、および樹状細胞）、またはより具体的には、ヒト末梢血単核白血球由来の樹状細胞を誘導し、関心の対象のペプチドによる刺激後、CD8陽性細胞と混合し、標的細胞に対する細胞傷害活性を測定することにより確認されうる。反応系として、ヒトHLA抗原を発現させるように作製されたトランスジェニック動物（例えばBenMohamed L、et al.Hum.IMMUNOL.(2000);61の(8):764-79 Related Articles、Books、Linkout.に記載）が用いられうる。例えば、標的細胞は、51Crなどで放射標識することができ、細胞傷害活性は、標的細胞から放出された放射能から計算することができる。あるいは該標的細胞は、固定化ペプチドを有する抗原提示細胞の存在下でCTLにより産生および放出されたIFN-γを測定し、抗IFN-γモノクローナル抗体を用いて培地上の阻害ゾーンを可視化することにより調べることができる。
【００３３】
上記の通りにペプチドのＣＴＬ誘導能を調べた結果として、ＨＬＡ抗原に対する高い結合能を有するそれらのペプチドが高い誘導性を必ずしも有するというわけではないということが見出された。しかしながら、ＩＹＮＥＹＩＹＤＬ（配列番号：７）、ＩＹＮＥｙＩＹＤＬＦ（配列番号：８）、ＹＩＹＤＬＦＶＰＶ（配列番号：９）、ＲＬＡＩＦＫＤＬＶ（配列番号：１０）、ＴＭＳＳｓＫＬＳＮＶ（配列番号：１１）ＥＹＹＥＬＦＶＮＩ（配列番号：１２）ＬＬＱＰＨＬＥＲＶ（配列番号：１９２）ＬＬＭＲＭＩＳＲＭ（配列番号：１９５）ＬＬＴＦＥＹＹＥＬ（配列番号：１９７）ＲＬＣＫＳＴＩＥＬ（配列番号：２０９）ＣＶＬＣＣＡＥＥＶ（配列番号：２２５）ＦＬＭＤｈＨＱＥＩＬ（配列番号：２２８）ＩＬＶＶｃＧＹＩＴＶ（配列番号：２３０）ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―６４４（ＳＬＭＩｈＴＦＳＲＣ（配列番号：２４０））、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―５７５（ＳＬＬＰａＳＳＭＬＴ（配列番号：２４１））、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―５０６（ＱＬＣＲｓＱＳＬＬＬ（配列番号：２４３））、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―７６５（ＫＱＦＱｋＥＹＰＬＩ（配列番号：２４４））、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―３９５（ＩＭＧＧＳＣＨＮＬＩ（配列番号：２４９）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―２２４（ＮＭＡＮｔＳＫＲＧＶ（配列番号：２５３））、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―９―２９７（ＥＬＦＶＮＩＬＧＬ（配列番号：２２６））、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―２９６（ＹＥＬＦｖＮＩＬＧＬ（配列番号：２５４））およびＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―３０１（ＮＩＬＧｌＬＱＰＨＬ（配列番号：２５５））により示されたアミノ酸配列を含むペプチドから選択されたノナペプチドまたはデカペプチドは、特に高いCTL誘導能を示した。
【００３４】
上記のように、本発明は、細胞傷害性T細胞誘導能をもつペプチド、すなわち、配列番号：７、８、９、１０、１１、１２、１９２、１９５、１９７、２０９、２２５、２２６、２２８、２３０、２４０、２４１、２４３、２４４、２４９、２５３、２５４もしくは２５５のアミノ酸配列またはそれらの変異体（すなわち、1個、2個、または数個のアミノ酸が置換、除去、または付加されているアミノ酸配列）を含むペプチドを提供する。配列番号：７、８、９、１０、１１、１２、１９２、１９５、１９７、２０９、２２５、２２６、２２８、２３０、２４０、２４１、２４３、２４４、２４９、２５３、２５４もしくは２５５に示される9アミノ酸もしくは10アミノ酸を含むアミノ酸配列またはそれらの変異体は、別の内因性タンパク質と関連したアミノ酸配列と一致しないことが好ましい。特に、N末端から2番目のアミノ酸におけるロイシンまたはメチオニンへのアミノ酸置換、またはC末端アミノ酸におけるバリンまたはロイシンへのアミノ酸置換、ならびにN末端および/もしくはC末端における1〜2アミノ酸のアミノ酸付加が、好ましい例である。当業者は、アミノ酸置換および付加に加え、ペプチドの免疫学的活性断片が本発明の方法においても使われうると認識する。活性断片を決定する方法は、公知技術である。これらの改変ペプチドによる刺激によって得られたＣＴＬクローンは、もとのペプチドを認識でき、本来のペプチドを発現している細胞に、傷害を与えることができる。
【００３５】
本発明のペプチドは、公知技術を用いて調整されうる。例えば、該ペプチドは、組換えDNA技術または化学合成のいずれかを用いて、合成的に調製することができる。本発明のペプチドは、個々に、または2つもしくはそれ以上のペプチドを含むより長いポリペプチドとして、合成されうる。本発明のペプチドは、好ましくは単離される、すなわち、他の天然に存在する宿主細胞タンパク質およびそれらの断片を実質的に含まない。
【００３６】
本発明のペプチドは、改変が本明細書に記載されているようなペプチドの生物活性、すなわち、ＨＬＡ抗原に結合する能力やＣＴＬを誘導する能力、を破壊しない限りにおいて、グリコシル化、側鎖酸化、またはリン酸化のような改変を含みうる。他の改変は、例えば、ペプチドの血清半減期を増加させるために用いることができるD-アミノ酸または他のアミノ酸模倣体の取り込みを含む。
【００３７】
本発明のペプチドは、インビボでＣＴＬを誘導しうるＭＰＨＯＳＰＨ１および／またはＤＥＰＤＣ１の過剰発現と関連した疾患（例えば癌）のためのワクチンとして使用するために、本発明のペプチドの２つまたはそれ以上を含む組み合わせとして調製することができる。意図される癌としては、限定はされないが、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、胃癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣ、軟組織腫瘍が挙げられる。該ペプチドは、カクテルであってもよく、または標準的な技術を用いて互いに結合させてもよい。例えば、該ペプチドは、単一のポリペプチド配列として発現しうる。組み合わせにおける該ペプチドは、同じまたは異なりうる。本発明のペプチドを投与することにより、ペプチドは、抗原提示細胞のHLA抗原上において高密度で提示され、続いて、示されたペプチドとHLA抗原の間で形成された複合体に対して特異的に反応するCTLを誘導する。あるいは、対象から樹状細胞を取り出すことにより得られた、本発明のペプチドをその細胞表面上に固定化している抗原提示細胞が、本発明のペプチドにより刺激されうる。それぞれの対象へのこれらの細胞の再投与はCTLを誘導し、その結果、標的細胞に対する攻撃性を増加させることができる。
【００３８】
より具体的には、本発明は、本発明のペプチドを1つまたは複数含む、ＭＰＨＯＳＰＨ１および／またはＤＥＰＤＣ１の過剰発現と関連した疾患（例えば癌）を処置するための、または腫瘍の増殖、転移などを予防するための薬剤を提供する。本発明のこのペプチドは、ＭＰＨＯＳＰＨ１および／またはＤＥＰＤＣ１の過剰発現と関連した疾患（例えば癌）の治療の特定の有用性を提供する。意図される癌としては、限定はされないが、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、胃癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣ、軟組織腫瘍が挙げられる。
【００３９】
本発明のペプチドは、従来の製剤方法により製剤した薬学的組成物として対象へ直接投与することができる。そのような場合、本発明のペプチドに加えて、薬物に通常用いられる担体、賦形剤などを、特別な制限なしに、必要に応じて含むことができる。本発明の免疫原組成物は、ＭＰＨＯＳＰＨ１および／またはＤＥＰＤＣ１の過剰発現と関連した疾患の処理および予防のために用いられうる。意図される癌としては、限定はされないが、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、胃癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣ、軟組織腫瘍が挙げられる。
【００４０】
活性成分として本発明のペプチドを1つまたは複数含む、ＭＰＨＯＳＰＨ１および／またはＤＥＰＤＣ１の過剰発現と関連した疾患（例えば癌）の処置および／または予防のための免疫原性組成物は、さらに、細胞性免疫を効果的に確立するためにアジュバントを含むことができる。あるいは、該組成物は抗癌剤のような他の活性成分と共に投与されうる。
意図される癌としては、限定はされないが、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、胃癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣ、軟組織腫瘍が挙げられる。適切な製剤には顆粒も含まれる。適切なアジュバントは、文献（Johnson AG.(1994)C1in.Microbio1.Rev.7:277-89．）に記載されている。例示的なアジュバントは、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、およびミョウバンを含むが、これに限定されない。さらに、リポソーム製剤、薬物が直径数μmのビーズへ結合している顆粒製剤、および脂質が前記ペプチドに結合している製剤が、便利に用いられうる。投与の方法は、経口投与、皮内注射、皮下注射、静脈内注射などであってもよく、全身投与または標的腫瘍の付近への局所的投与を含みうる。本発明のペプチドの用量は、処置すべき疾患、患者の年齢、体重、投与の方法などにより適切に調整することができる。用量は、普通、0.001mg〜1000mg、好ましくは0.01mg〜100mg、より好ましくは0.1mg〜10mgであり、好ましくは数日に1回から数ヶ月に1回投与されるが、当業者は適切な用量および投与の方法を容易に選択することができ、これらのパラメーターの選択および最適化は、十分に通常の技術の範囲内である。
【００４１】
本発明はさらに、本発明のペプチドとＨＬＡ抗原で形成された複合体をその表面上に提示するエキソソームと呼ばれる細胞内小胞を提供する。エキソソームは、例えば、国際公開され、日本語翻訳されて公開された特表平１１−５１０５０７号および特表２０００−５１２１６１号の公報に詳細に記載された方法を用いることにより調製することができ、好ましくは、処置および/または予防の標的である対象から得られた抗原提示細胞を用いて調製される。本発明のエキソソームは、本発明のペプチドと同様に、癌ワクチンとしてワクチン接種することができる。
【００４２】
用いられるHLA抗原の型は、処置および/または予防を必要とする対象のHLA抗原の型と一致しなければならない。例えば、日本人集団においては、ＨＬＡ―Ａ２４またはＨＬＡ―Ａ２、特にＨＬＡ―Ａ２４０２またはＨＬＡ―Ａ０２０１が、多くの場合適当である。
【００４３】
いくつかの態様において、本発明のワクチン組成物は、細胞傷害性Ｔリンパ球を初回抗原刺激する構成要素を含む。脂質は、ウイルス抗原に対してインビボでＣＴＬを初回抗原刺激する能力がある作用物質として同定されている。例えば、パルミチン酸残基は、リシン残基のε−アミノ基およびα−アミノ基に付着し、その後、本発明の免疫原性ペプチドに連結することができる。脂質化ペプチドは、その後、ミセルまたは粒子に入れる、リポソームに取り込ませる、またはアジュバント中に乳化するかのいずれかで、直接投与することができる。ＣＴＬ反応の脂質初回抗原刺激のもう一つの例として、適切なペプチドに共有結合的に付着している場合、トリパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイニルセリル-セリン（Ｐ３ＣＳＳ）のような大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）リポタンパク質を、ＣＴＬを初回抗原刺激するために用いることができる（例えば、Deres K、et al. (1989)Nature 342:561-4.を参照）。
【００４４】
本発明の免疫原性組成物はまた、本明細書に開示された免疫原性ペプチドの1つまたは複数をコードする核酸を含みうる。Wolff JA et al.（Science (1990) 247）1465-8；米国特許第5,580,859号；5,589,466；5,804,566； 5,739,118； 5,736,524； 5,679,647；、WO98/04720参照。
ＤＮＡに基づいた送達技術（delivery technologies）の例は、「ネイキッドＤＮＡ（naked DNA）」、促進化ブピビカイン（bupivicaine）、ポリマー、ペプチド媒介性）送達、カチオン性脂質複合体、および粒子媒介性（「ジーンガン（gene gun）」）または圧力媒介性送達を含む（例えば、米国特許第5,922,687号参照）。
【００４５】
本発明の免疫原性ペプチドはまた、ウイルスベクターまたは細菌ベクターにより発現させることができる。適切な発現ベクターの例は、ワクシニアまたは鶏痘のような弱毒性ウイルス宿主を含む。このアプローチは、例えば、ペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現させうるベクターとしてのワクシニアウイルスの使用を含む。宿主への導入により、組換えワクシニアウイルスは、免疫原性ペプチドを発現させ、それにより、免疫応答を誘発する。免疫化プロトコールにおいて有用なワクシニアベクターおよび方法は、例えば、米国特許第4,722,848号に記載されている。もう一つの適したベクターは、BCG（カルメット・ゲラン菌（Bacille Calmette Guerin））である。ＢＣＧベクターは、Stover CK、et al.、Nature(1991)351:456-60に記載されている。
治療的投与または免疫化に有用な幅広い種類の他のベクター、例えば、アデノおよびアデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、チフス菌（Salmonella typhi）ベクター、解毒化炭疽毒素ベクターなどが、当技術分野において公知である。例えばShata MT、et al. (2000)Mol. Med. Today 6:66-71; Shedlock DJ and Weiner DB. et al. (2000)J Leukoc.Biol.68:793-806；そして、Hipp JD、et al.、In Vivo 14(2000):571-85を参照。
【００４６】
本発明はまた、本発明の1つまたは複数のペプチドを用いて抗原提示細胞を誘導する方法を提供する。抗原提示細胞は、末梢血単球から樹状細胞を誘導し、その後それらを、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで本発明の1つまたは複数のペプチドと接触させる（刺激する）ことにより誘導することができる。本発明のペプチドを対象へ投与すると、自身に固定化されている本発明のペプチドを有する抗原提示細胞が、対象の体内において誘導される。
あるいは、本発明のペプチドを抗原提示細胞へ固定化した後、細胞をワクチンとして対象に投与することができる。例えば、エクスビボ投与は以下の段階を含みうる：
a：対象から抗原提示細胞を収集する段階、および
b：段階aの抗原提示細胞を本発明のペプチドと接触させる段階。
【００４７】
段階bにより得られた抗原提示細胞は、対象へワクチンとして投与することができる。
【００４８】
本発明はまた、高レベルの細胞傷害性T細胞誘導能をもつ抗原提示細胞を誘導するための方法であって、インビトロで、本発明の1つまたは複数のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子を抗原提示細胞へ移入する段階を含む方法を提供する。導入された遺伝子は、DNAまたはRNAの形をとりうる。導入の方法について、特別な制限なしに、リポフェクション、エレクトロポレーション、およびリン酸カルシウム法のような、当分野において通常行われる様々な方法が適切に用いられうる。より詳しくは、トランスフェクトは、Reeves ME et al. (1996) Cancer Res. 56:5672-7.； Butterfield LH et al. (1998) J. Immunol. 161:5607-13.； Boczｋowski D et al. (1996) J.Exp.Med. 184:465-72. ；国際公開され、日本語翻訳されて公開された特表2000-509281号公報；に開示されているように、実行されうる。遺伝子を抗原提示細胞へ移入することにより、遺伝子は、細胞において転写、翻訳などを受け、その後、得られたタンパク質は、MHCクラスIまたはクラスIIによりプロセシングされ、提示経路を通って進み、部分ペプチドを提示する。
【００４９】
本発明はさらに、本発明の1つまたは複数のペプチドを用いてCTLを誘導するための方法を提供する。本発明のペプチドが対象に投与された場合、CTLは、対象の体内において誘導され、腫瘍組織におけるＭＰＨＯＳＰＨ１および／またはＤＥＰＤＣ１を発現する細胞（例えば癌細胞）を標的とする免疫系の強さは、それにより増強される。意図される癌としては、限定はされないが、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、胃癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣ、軟組織腫瘍が挙げられる。あるいは、本発明のペプチドは、対象由来の抗原提示細胞およびＣＤ８陽性細胞または末梢血単核白血球がインビトロで本発明の１つまたは複数のペプチドと接触させられ（刺激され）、ＣＴＬを誘導した後、細胞が対象へ戻される、エクスビボ治療方法との関連において用いられうる。
例えば、本方法は以下の段階を含みうる：
a：対象から抗原提示細胞を収集する段階、
b：段階aの抗原提示細胞を本発明のペプチドと接触させる段階、
c：細胞傷害性T細胞を誘導するために、段階bの抗原提示細胞をＣＤ８陽性Ｔ細胞と混合し共培養する段階、および
d：段階cの共培養物からＣＤ８陽性Ｔ細胞を収集する段階。
段階dにより得られた細胞傷害活性をもつＣＤ８陽性Ｔ細胞は、ワクチンとして対象に投与することができる。
【００５０】
本発明は更に、本発明のペプチドを用いた活性化細胞障害性Ｔ細胞を生成する方法を提供する。例えば、前記方法は、以下の段階を含むことができる：
a:対象からＴ細胞を収集する段階、そして、
ｂ：Ｔ細胞を以下のペプチドと接触させる段階。
（1）
配列番号：７、８、９、１０、１１、１２、１９２、１９５、１９７、２０９、２２５、２２６、２２８、２３０、２４０、２４１、２４３、２４４、２４９、２５３、２５４および２５５のアミノ酸配列を有するペプチドからなるグループから選択される約１５アミノ酸未満の単離ペプチド。
（2）
細胞障害性Ｔ細胞誘導能を有するペプチドであって、配列番号：９、１０、１１、１９２、１９５、１９７、２０９、２２５、２２６、２２８、２３０、２４０、２４１、２４３、２４４、２５３、２５４および２５５、からなるグループから選択され、１、２またはいくつかのアミノ酸が、置換、欠失、または、付加された、アミノ酸配列を有する前記ペプチド。
【００５１】
本発明はまた、本発明のペプチドを用いて活性Ｔ細胞の誘導能を有するＡＰＣを生成する方法を提供する。例えば、当該方法は、表面上にペプチドおよびＨＬＡ抗原を提示する抗原提示細胞を生産するためにペプチドと抗原提示細胞を接触させる段階を含みうる。
本発明の文脈において、「活性された細胞障害性Ｔ細胞」は、ＩＦＮ―ガンマ産生、ＩＦＮ―ガンマ放出および腫瘍細胞の細胞死を誘導する。
【００５２】
本発明は、更に、本発明のペプチドを用いて誘導される単離された細胞障害性Ｔ細胞を提供する。本発明の1つまたは複数のペプチドを提示する抗原提示細胞での刺激により誘導された細胞傷害性T細胞は、好ましくは、処置および/または予防の標的である対象由来であり、単独で、または本発明の1つもしくは複数のペプチドまたは抗腫瘍活性をもつエキソソームを含む他の薬物と組み合わせて投与することができる。得られた細胞傷害性T細胞は、本発明のペプチド、または好ましくは誘導に用いられたものと同じペプチドを提示する標的細胞に対して特異的である。標的細胞は、ＭＰＨＯＳＰＨ１および／またはＤＥＰＤＣ１を内因的に発現する細胞またはＭＰＨＯＳＰＨ１および／またはＤＥＰＤＣ１遺伝子がトランスフェクトされている細胞でもよい。これらのペプチドによる刺激により本発明のペプチドを細胞表面上に提示する細胞もまた、攻撃の標的になりうる。
【００５３】
本発明はまた、HLA抗原と本発明の1つまたは複数のペプチドとの間で形成された複合体を提示する抗原提示細胞を提供する。本発明のペプチドまたはそのようなペプチドをコードするヌクレオチドとの接触を通して得られた抗原提示細胞は、好ましくは、処置および/または予防の標的である対象に由来し、単独で、または本発明のペプチド、エキソソーム、もしくは細胞傷害性T細胞を含む他の薬物と組み合わせて、ワクチンとして投与することができる。
【００５４】
本発明はまた、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のサブユニットを形成することができるポリペプチドをコードする核酸を含む組成物およびその使用方法を提供する。当該ＴＣＲサブユニットは、ＭＰＨＯＳＰＨ１またはＤＥＰＤＣ１を提示する腫瘍細胞に対してＴ細胞を特異的にするＴＣＲｓを形成する能力を有する。従来技術において公知の方法を用いることにより、本発明の一つまたは複数のペプチドによって誘導されるＣＴＬのＴＣＲサブユニットのα鎖およびβ鎖の核酸は同定されうる（WO2007/032255およびMorgan et al. J Immunol 171 3288no(2003)）。誘導体ＴＣＲは、好ましくは高い結合活性を有してＭＰＨＯＳＰＨ１またはＤＥＰＤＣ１ペプチドを提示している標的細胞と結合し、そして、任意にインビトロでＭＰＨＯＳＰＨ１またはＤＥＰＤＣ１ペプチドを提示している標的細胞の効果的な殺傷をもたらす。
【００５５】
ＴＣＲサブユニットをコードしている核酸は、適切なベクター（例えばレトロウイルスベクタ）に組み込むことができる。これらのベクターは、当該技術分野において公知である。
核酸またはそれらを含むベクターは有効にＴ細胞に導入することができる、ここで、Ｔ細胞は好ましくは患者由来である。都合のよいことに、本発明は、迅速にまた容易に強い癌細胞殺傷特性を持つ改変Ｔ細胞を供給するため患者自身のＴ細胞（または他の哺乳類のそれら）を迅速に改変することができるｏｆｆ−ｔｈｅ−ｓｈｅｌｆ組成物を提供する。
【００５６】
また、本発明は、ＭＰＨＯＳＰＨ１またはＤＥＰＤＣ１ペプチド（例えば、ＨＬＡ―Ａ２４またはＨＬＡ―Ａ２との関係において配列番号：７、８、９、１０、１１、１２、１９２、１９５、１９７、２０９、２２５、２２６、２２８、２３０、２４０、２４１、２４３、２４４、２４９、２５３、２５４または２５５である）と結合するＴＣＲサブユニットポリペプチドをコードしている核酸の形質導入によって調整されるＣＴＬを提供する。形質導入されたＣＴＬは、インビボで癌細胞にホーミングができ、よく知られた培養方法によりインビトロで拡張される（例えば、Kawakami et al. J Immunol.142 3452-3461no(1989)）。本発明のＴ細胞は、治療または保護を必要とする患者の癌の治療または予防に役立つ免疫原組成物を形成するために用いることができる（WO2006/031221）。
【００５７】
本発明の文脈において、「ワクチン」という用語（免疫原組成物とも称される）は、抗腫瘍免疫の誘導または動物へのワクチン接種に応じて癌を抑制する物質を指す。本発明により、配列番号：７、８または１２のアミノ酸配列を有するポリペプチドはＨＬＡ―Ａ２４拘束性エピトープペプチド、そして、配列番号：９、１０、１１、１９２、１９５、１９７、２０９、２２５、２２６、２２８、２３０、２４０、２４１、２４３、２４４、２４９、２５３、２５４または２５５のそれはＨＬＡ―Ａ２拘束性エピトープペプチドであり、ＭＰＨＯＳＰＨ１および／またはＤＥＰＤＣ１を発現している細胞（例えばＭＰＨＯＳＰＨ１および／またはＤＥＰＤＣ１を発現している癌細胞）に対して有力および特異的な免疫応答を誘導することができることが示唆された。意図される癌としては、限定はされないが、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、胃癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣ、軟組織腫瘍が挙げられる。したがって、本発明はまた、配列番号７、８、９、１０、１１、１２、１９２、１９５、１９７、２０９、２２５、２２６、２２８、２３０、２４０、２４１、２４３、２４４、２４９、２５３、２５４または２５５のアミノ酸配列またはその変異体（すなわち、１、２またはいくつかのアミノ酸置換、欠失または付加を含む）を有するポリペプチドを用いて抗腫瘍免疫を誘導する方法を含む。
一般に、抗腫瘍免疫は、以下のような免疫応答を含む：
ＭＰＨＯＳＰＨ１および／またはＤＥＰＤＣ１を発現している細胞を含む腫瘍に対する細胞障害性リンパ球の誘導、
ＭＰＨＯＳＰＨ１および／またはＤＥＰＤＣ１を発現している細胞を含む腫瘍を認識する抗体の誘導、そして、
抗腫瘍サイトカイン産生の誘導。
【００５８】
従って、特定のペプチドが動物へのワクチン接種によりこれらの免疫応答のいずれか1つを誘導する場合、そのペプチドは、抗腫瘍免疫誘導効果をもつと決定される。ペプチドによる抗腫瘍免疫の誘導は、インビボまたはインビトロで、ペプチドに対する宿主における免疫系の応答を観察することにより、検出することができる。
【００５９】
例えば、細胞毒性Ｔリンパ球の誘導を検出する方法は、公知である。生体に侵入する異物は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の作用により、Ｔ細胞およびＢ細胞へ提示される。抗原特異的な様式でAPCにより提示された抗原に対して応答するT細胞は、抗原による刺激により、細胞傷害性T細胞（細胞傷害性Tリンパ球またはCTLとも呼ばれる）へ分化し、その後増殖する；この過程は、本明細書では、T細胞の「活性化」と呼ばれる。従って、特定のペプチドによるＣＴＬ誘導は、以下によって評価することができる：ＡＰＣによってＴ細胞にペプチドを提示し、そして、ＣＴＬの誘導を検出する。さらに、ＡＰＣは、ＣＤ４+ Ｔ細胞、ＣＤ８+Ｔ細胞、マクロファージ、好酸球、およびＮＫ細胞を活性化する効果を有する。
ＣＤ４+ Ｔ細胞はまた抗腫瘍免疫において重要であるため、ペプチドの抗腫瘍免疫誘導作用は、これらの細胞の活性化効果を指標として用いて評価することができる。
【００６０】
樹状細胞（ＤＣ）をＡＰＣとして用いるＣＴＬの誘導作用を評価するための方法は、当技術分野において周知である。ＤＣは、ＡＰＣ中で最も強いＣＴＬ誘導作用をもつ代表的なＡＰＣである。この方法では、試験ポリペプチドを最初にＤＣに接触させ、その後、該ＤＣをＴ細胞と接触させる。ＤＣとの接触後の、対象となる細胞に対する細胞傷害性効果をもつＴ細胞の検出は、試験ポリペプチドが細胞傷害性Ｔ細胞を誘導する活性をもつことを示している。瘍に対するＣＴＬの活性は、例えば、５１Ｃｒ標識腫瘍細胞の溶解を指標として用いて検出することができる。あるいは、３Ｈ−チミジン取り込み活性またはＬＤＨ（ラクトースデヒドロゲナーゼ）放出を指標として用いて腫瘍細胞損傷の程度を評価することは周知である。 さらに、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイのような坑ＩＦＮガンマ抗体を用いた視覚化によって、固定化したペプチドを担持する抗原提示細胞の存在下で、ＣＴＬによって産生、放出されるＩＦＮ―ガンマを測定することによって、検討することができる。
【００６１】
ＤＣとは別に、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）もまた、ＡＰＣとして用いられうる。ＣＴＬの誘導は、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の存在下でＰＢＭＣを培養することにより増強されることが報告されている。同様に、ＣＴＬは、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）およびＩＬ−７の存在下で、ＰＢＭＣを培養することによって誘導されることが示されている。
【００６２】
これらの方法によりＣＴＬ誘導活性を有することが確認された試験ポリペプチドは、ＤＣ活性効果およびその後のＣＴＬ誘導活性をもつポリペプチドである。従って、腫瘍細胞に対してＣＴＬを誘導するポリペプチドは、ＭＰＨＯＳＰＨ１および／またはＤＥＰＤＣ１の過剰発現と関連した疾患（例えば癌）に対するワクチンとして有効である。さらに、ポリペプチドと接触させることによってＭＰＨＯＳＰＨ１および／またはＤＥＰＤＣ１の過剰発現と関連した疾患に対してＣＴＬを誘導する能力を得たＡＰＣは、疾患に対するワクチンとして有効である。ＡＰＣによるポリペプチド抗原の提示によって細胞傷害性を獲得したＣＴＬもまた、ＭＰＨＯＳＰＨ１および／またはＤＥＰＤＣ１の過剰発現と関連した疾患に対するワクチンとして利用できる。ＡＰＣおよびＣＴＬのため抗腫瘍免疫を用いるＭＰＨＯＳＰＨ１および／またはＤＥＰＤＣ１の過剰発現と関連した疾患のためのそのような治療法は、細胞免疫療法と呼ばれる。意図される癌としては、限定はされないが、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、胃癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣ、軟組織腫瘍が挙げられる。
【００６３】
一般的に、細胞免疫療法のためにポリペプチドを用いる場合、ＣＴＬ誘導の効率は、異なる構造をもつ複数のポリペプチドを組み合わせ、それらをＤＣと接触させることにより、増加させることができる。それゆえに、タンパク質断片でＤＣを刺激する場合、複数の型の断片の混合物を用いることが有利である。
【００６４】
ポリペプチドによる抗腫瘍免疫の誘導は、腫瘍に対する抗体産生の誘導を観察することによって、更に確認することができる。例えば、ポリペプチドに対する抗体が、ポリペプチドで免疫された実験動物において誘導される場合、ならびに、腫瘍細胞の成長、増殖、および/または転移がそれらの抗体により抑制される場合、ポリペプチドは抗腫瘍免疫を誘導すると決定される。
【００６５】
抗腫瘍免疫は、本発明のワクチンを投与することにより誘導することができ、抗腫瘍免疫の誘導は、ＭＰＨＯＳＰＨ１および／またはＤＥＰＤＣ１の過剰発現と関連した疾患（例えば癌）の治療および予防を可能にする。ＭＰＨＯＳＰＨ１および／またはＤＥＰＤＣ１の過剰発現と関連した疾患（例えば癌）に対する治療または発症の予防は、ＭＰＨＯＳＰＨ１および／またはＤＥＰＤＣ１を発現する細胞（例えば癌細胞）の成長の阻害、それらの細胞の退縮、およびそれらの細胞（例えば癌細胞）の発生の抑制を含みうる。ＭＰＨＯＳＰＨ１および／またはＤＥＰＤＣ１の過剰発現と関連した疾患を有する個人の死亡率の減少、血液中の疾患マーカーの減少、疾患に伴う検出可能な症状の軽減などもまた、疾患（例えば癌）の治療または予防に含まれる。そのような治療的または予防的効果は、ＭＰＨＯＳＰＨ１および／またはＤＥＰＤＣ１の過剰発現と関連した疾患（例えば癌）に対するワクチンの治療的または予防的効果がワクチン投与なしの対照と比較される場合に統計学的に有意であること、例えば５%またはそれ未満の有意レベルで観察されることが好ましい。例えば、スチューデントｔ検定、マン-ホイットニーＵ検定、またはＡＮＯＶＡが、統計学的有意性を決定するために用いられうる。
【００６６】
本発明がＭＰＨＯＳＰＨ１および／またはＤＥＰＤＣ１の過剰発現に関連した疾患（例えば癌）を治療または予防する方法を提供するという点で、治療的な化合物または組成物は予防的に、または、治療的に疾患の発達に苦しんでいるまたはその危険におかれている（または、受けやすい）対象に投与されうる。当該対象は、標準的臨床方法を用いて同定されうる。本発明の文脈において、予防的投与は疾患の明らかな症状が現れる前に行われ、そうすることで、疾患が予防されるかまたはその進行が遅らされる。医学の分野の文脈において、「予防する」という用語は、疾患による死亡率または罹患率の負荷を減少させるいかなる活性も含む。予防は、"ｔ第一次、第二次および第三次予防レベルを生じうる。第一次予防は疾患の発達を避けるが、第二次および第三次レベルの予防は疾患の進行や症状の発生を予防し、またすでにおきている疾患の悪影響を、修復機能や合併症を減少させることにより、減少することを意図した活性を含む。
【００６７】
癌治療の文脈において、「有効である」という用語は、対象における癌のサイズ、罹患率または転移の可能性の減少につながる処理に関連する。治療が予防的に適用される場合、「有効である」は治療が非癌の発生を遅延または防止するかまたは癌の臨床症状を軽減することを意味する。癌の評価は、標準的な臨床プロトコールを用いて行うことができる。さらにまた、治療の効用は、癌を診断または治療するいかなる公知の方法と共同しても決定されうる。例えば、癌は、組織病理学的に、または、対症異常を同定することによって診断することができる。
【００６８】
免疫学的活性を有する前記のペプチド、または当該ペプチドをコードしているポリヌクレオチドまたはベクターは、アジュバントと組み合わすことができる。アジュバントとは、免疫学的活性を有するペプチドによって同時に（または連続して）投与されるときに、ペプチドに対して免疫応答を強化する化合物を指す。適切なアジュバントの例としては、コレラ毒素、サルモネラ菌毒素、ミョウバンおよびそのようなものを含むが、それに限定されない。さらに、本発明のワクチンは、薬学的に許容される担体と適切に組み合わせられうる。そのような担体の例は、滅菌水、生理食塩水、リン酸緩衝液、培養液などである。さらに、ワクチンは、必要に応じて、安定剤、懸濁剤、保存剤、界面活性剤などを含みうる。ワクチンは、全身的にまたは局所的に投与される。ワクチン投与は、単回投与により行われるか、または複数回投与により追加免疫されうる。
【００６９】
本発明のワクチンとしてＡＰＣまたはＣＴＬを用いるときに、ＭＰＨＯＳＰＨ１および／またはＤＥＰＤＣ１の過剰発現と関連した疾患（例えば癌）は例えば、エクスビボの方法によって処置または、予防することができる。より具体的には、処置または予防を受ける対象のＰＢＭＣを収集し、エクスビボで本発明のペプチドと接触させる。ＡＰＣまたはＣＴＬの誘導後、細胞を対象に投与する。ＡＰＣはまた、ペプチドをコードするベクターをエクスビボでＰＢＭＣへ導入することにより誘導することができる。インビトロで誘導されたAPCまたはCTLは、投与の前にクローニングすることができる。標的細胞を損傷する高い活性をもつ細胞をクローニングおよび増殖させることにより、細胞免疫療法をより効果的に行うことができる。さらに、この方法で単離されたＡＰＣおよびＣＴＬは、細胞が由来している個体に対する細胞免疫療法だけでなく、他の個体における類似した型の疾患に対する細胞免疫療法にも用いられうる。
【００７０】
本発明の態様は以下の実施例において説明され、その実施例は、本発明を例証するため、および同じものの作製および使用において当業者を援助するためにのみ示される。本実施例は、いかなる形であれ本発明の範囲を限定することを意図していない。
【００７１】
本明細書に記載されたものと類似または同等の方法および材料を、本発明の実施または試験において用いることができるが、適切な方法および材料は以下に記載されている。
【００７２】
実施例
本発明は以下の実施例により例証されるが、それらに限定されない。しかしながら、本願明細書において記載されている材料、方法およびそのようなものは、本発明の態様を例示しているが、決して本発明の範囲を制限することを意図しない。よって、そのときに記載されている材料、方法およびそれらと同様または同等なものは、本発明の実施をまたは試験に用いうる。
【００７３】
実施例１
材料および方法
細胞株
Ａ２４ＬＣＬ細胞（ＨＬＡ―Ａ２４／２４）、ヒトＢ―リンパ芽球腫細胞株、Ｔ２細胞およびＣＯＳ７は、ＡＴＣＣから購入された。
【００７４】
ＭＰＨＯＳＯＨ１およびＤＥＰＤＣ１由来ペプチドの候補選択
ＨＬＡ―Ａ＊２４０２およびＨＬＡ―Ａ＊０２０１分子に結合するＭＰＨＯＳＯＨ１またはＤＥＰＤＣ１由来の９―ｍｅｒおよび１０―ｍｅｒペプチドは結合予測ソフトウェア「ＢＩＭＡＳ」（bimas.dcrt.nih.gov/cgi-bin/molbio/ken_parker_comboform）を用いて予測された（Parker KC et al. J Immunol. (1994);152no(1):163-75. Kuzushima K et al. Blood. (2001); 98 no(6):1872-81.）。これらのペプチドは、Ｓｉｇｍａ（札幌、日本）によって、標準的な固相合成方法に従って合成されて、逆相ＨＰＬＣによって精製された。
純度（>９０％）およびペプチドの同一性はそれぞれ、ＨＰＬＣ分析およびマススペクトル分析によって決定された。ペプチドは、２０ｍｇ／ｍｌでジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解されて―８０度Ｃで保存された。
【００７５】
生体外ＣＴＬ誘導
単球由来の樹状細胞（ＤＣ）は、ＨＬＡに提示されるペプチドに対するＣＴＬ反応を誘導する抗原提示細胞（ＡＰＣ）として用いられた。
ＤＣは他で報告されているように、インビトロで生成された。（Nukaya I et al.、Int. J. Cancer (1999)80、92-7.Tsai V et al. J.Immunol (1997)158:1796-802.）簡潔には、Ｆｉｃｏｌｌ―Ｐａｑｕｅ（Pharmacia）溶液によって正常なボランティア（ＨＬＡ―Ａ＊２４０２および／またはＨＬＡ―Ａ＊０２０１）から分離された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）は、それらを単球画分について濃縮するために、プラスチック組織培養フラスコ（Becton Dickinson）への粘着性により分離した。単球の濃縮集団を、２％加熱不活性化自己血清（ＡＳ）を含むＡＩＭ−Ｖ（Invitrogen）中、１０００Ｕ／ｍｌのＧＭ−ＣＦＳ（Kirin Brewery Companyより提供）および１０００Ｕ／ｍｌのＩＬ−４（Genzyme）の存在下で培養した。
培養７日後、サイトカイン産生ＤＣを、ＡＩＭ−Ｖ中、３mcｇ/ｍｌのβ２-ミクログロブリンの存在下に、20 mcg/mlの合成ペプチドを用いて２０℃、４時間パルスした。これらのペプチドパルスされたＤＣは、ＭＭＣ（３０分間の３０ｍｃｇ／ｍｌ）によって不活性化されて、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ―４５０ ＣＤ８（Ｄｙｎａｌ）およびＤＥＴＡＣＨａ ＢＥＡＤＴＭ（Ｄｙｎａｌ）による陽性選択によって得られた自己由来ＣＤ８＋Ｔ細胞と１：２０の比率で混合された。これらの培養物を48ウェルプレート（Corning）に配置した；各ウェルには、AIM-V/2%AS0.5ml中、1.5×104個のペプチドパルスしたDC、3×105個のCD8+ T細胞、および10ng/mlのIL-7（Genzyme）を含む。3日後、これらの培養物に、最終濃度20IU/mlのIL-2（CHIRON）を追加した。7日目および14日目に、T細胞を、自己ペプチドパルスしたDCでさらに再刺激した。ＤＣは、上記と同じ方法により毎回調製した。CTLは、21日目における3回目のペプチド刺激後に、ペプチドパルスしたA24LCL細胞またはT2細胞に対して試験した。
【００７６】
ＣＴＬ展開手順
ＣＴＬは、Riddell SR et al.（Walter EA et al. (1995)N Engl J Med 333:1038-44.； Riddell SR、et al. (1996)Nature Med. 2:216-23.）に記載された方法と類似の方法を用いた培養で拡張させた。合計5×104個のＣＴＬを、40ng/mlの抗CD3モノクローナル抗体（Pharmingen）の存在下で、二種のヒトＢ―リンパ芽球腫細胞株を含む25mlのAIM-V/5%AS中に再懸濁した。培養の開始から1日後、120IU/mlのIL-2を培養物に加えた。培養物に、5日目、8日目、および11日目に30IU/mlのIL-2を含む新鮮なAIM-V/5%ASを供給した。
【００７７】
ＣＴＬクローンの樹立
希釈は、96ウェルの丸底マイクロタイタープレート（Nalge Nunc International）において0.3個、1個、および3個のCTL/ウェルになるように行なわれた。CTLは、7×104細胞/ウェルの二種のヒトＢ―リンパ芽球腫細胞株、30ng/mlの抗CD3抗体、および125U/mlのIL-2と共に、5%AS含む合計150 mcl/ウェルのAIM-V中で培養された。10日後、50 mcl/ウェルのIL-2を、IL-2が最終濃度において125U/mlになるように培地へ加えた。CTLのＣＴＬ活性は14日目に試験され、CTLクローンは上記と同じ方法を用いて拡張された。
【００７８】
特異的ＣＴＬ活性
特異的なＣＴＬ活性を検討するために、ＩＦＮ―ガンマＥＬＩＳＰＯＴアッセイおよびＩＦＮ―ガンマＥＬＩＳＡが行われた。簡潔には、ペプチドパルスされたＡ２４―ＬＣＬまたはＴ２細胞（１ｘ１０４／ウェル）は、スティミュレーター細胞として調製された。
４８ウェルの培養細胞または限界希釈後のＣＴＬクローンは、レスポンダー細胞として用いられた。ＩＦＮ―ガンマＥＬＩＳＰＯＴアッセイおよびＥＬＩＳＡは、製造手順に基づき行われた。
【００７９】
細胞培養およびトランスフェクション
イプシュタインバーウイルス（Epstein Bar virus）が変換されたＨＬＡ―Ａ２４ Ｂ―ＬＣＬｓ（Ａ２４ＬＣＬ）は、樹立された。Ｊｉｙｏｙｅ、ＥＢ―３、ＣＯＳ７、ＨＴ１３７６、ＲＴ―４およびＪ８２は、アメリカンタイプカルシャーコレクション（Rockville、MD）から購入された。Ａ２４ＬＣＬ、ＪｉｙｏｙｅおよびＥＢ―３は、１０％のウシ胎児血清（ＧＥＭＩＮＩ Ｂｉｏ製）および１％の抗生剤溶液（シグマ）を含むＲＰＭＩ１６４０において維持された。ＣＯＳ７、ＨＴ１３７６、ＲＴ―４およびＪ８２は、適切な培地および抗生物質において維持された。ＣＯＳ７およびＨＥＫのトランスフェクションは、ＦＵＧＥＮＥ６（ロシュ）を用いて行われた。ＨＬＡ―Ａ＊０２０１分子を発現している安定的クローン、ＨＥＫ―Ａ２細胞は、ｐｃＤＮＡ６．２―ＨＬＡ―Ａ２プラスミドのトランスフェクションによって樹立され、５ｍｃｇ／ｍｌのＢｌａｓｔｃｉｄｉｎＳの存在下で、限界希釈法によって分離された。
【００８０】
ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるエピトープペプチドの免疫原性
ペプチド特異的なＣＴＬの誘導のために、免疫処置は、マウスごとに、５０ｍｃｌ（１００ｍｃｇ）のＨＬＡ―Ａ２４拘束性ペプチドおよび５０ｍｃｌのＩＦＡを含む、１００ｍｌのワクチンの混合物を用いてされた。ワクチンは、０日目に最初の免疫を右側腹部において、そして、二回目を７日目に左の横腹において皮下注射された。１４日目、ワクチン接種されたマウスの脾細胞は、いかなるインビトロ刺激もしないで、レスポンダー細胞に用いられ、ペプチドの有無にかかわらずパルスされたＲＬｍａｌｅ１細胞はＩＦＮ―ガンマＥＬＩＳＰＯＴアッセイのスティミュレーター細胞として用いられた。
【００８１】
結果
癌におけるＭＰＨＯＳＰＨ１およびＤＥＰＤＣ１発現上昇
cDNA―マイクロアレイを用いてさまざまな癌から得られた網羅的遺伝子発現プロプロファイルデータは、ＭＰＨＯＳＰＨ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０１６１９５；配列番号：１）、そして、２つの異型を有したＤＥＰＤＣ１（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号：ＢＭ６８３５７８）；ＤＥＰＤＣ１ Ｖ１（配列番号：３）およびＤＥＰＤＣ１ Ｖ２（配列番号：５）の発現が上昇することを示した。ＭＰＨＯＳＰＨ１発現は、３１の膀胱癌中３０、３６の乳癌中８、１８の子宮頸癌中１８、１７の胆管細胞癌中５、３１のＣＭＬ中２５、１１の結腸直腸癌中６、１４の胃癌中６、５つのＮＳＣＬＣ中５、７つのリンパ腫中７、１０の骨肉腫中６、２２の前立腺癌中７、１８の腎癌中１０および２１の軟組織腫瘍中１５において、対応する正常組織と比較して有意に上昇した。ＤＥＰＤＣ１発現は、２５の膀胱癌中２３、１３の乳癌中６、１２の子宮頸癌中１２、６つの胆管細胞癌中６、４のＣＭＬ中３、４の結腸直腸癌中２、６のＮＳＣＬＣ（非小細胞肺癌）中６、７のリンパ腫中７、１４の骨肉腫中１０、２４の前立腺癌中１１、１４のＳＣＬＣ（小細胞肺癌）中１４および３１の軟組織腫瘍中２２において、対応する正常組織と比較して有意に上昇した（表１）。
【００８２】
（表１）対応する正常組織と比較して癌組織でＭＰＨＯＳＰＨ１またはＤＥＰＤＣ１の上方制御が観察された症例の割合
【００８３】
ＭＰＨＯＳＰＨ１またはＤＥＰＤＣ１に由来するＨＬＡ―Ａ２４およびＨＬＡ―Ａ２結合ペプチドの予測
表２は、結合親和性の順にＭＰＨＯＳＰＨ１に対するＨＬＡ―Ａ＊２４０２結合ペプチドを記載する。
表２ＡはＭＰＨＯＳＰＨ１由来の９―ｍｅｒペプチド、そして、表２ＢはＭＰＨＯＳＰＨ１由来の１０―ｍｅｒペプチドを記載する。
表３は、結合親和性の順にＭＰＨＯＳＰＨ１に対するＨＬＡ―Ａ＊０２０１結合ペプチドを記載する。
表３ＡはＭＰＨＯＳＰＨ１由来の９―ｍｅｒペプチド、そして、表３ＢはＭＰＨＯＳＰＨ１由来の１０―ｍｅｒペプチドを記載する。
表４は、結合親和性の順にＤＥＰＤＣ１ Ｖ１およびＶ２に対するＨＬＡ―Ａ＊２４０２結合ペプチドを記載する。
表４ＡはＤＥＰＤＣ１ Ｖ１およびＶ２由来の９―ｍｅｒペプチド、そして、表４ＢはＤＥＰＤＣ１ Ｖ１由来の１０―ｍｅｒペプチドを記載する。
表５はＤＥＰＤＣ１Ｖ１およびＶに対するペプチド、表５ＡはＤＥＰＤＣ１ Ｖ１およびＶ２由来の９―ｍｅｒペプチド、そして、表４ＢはＤＥＰＤＣ１ Ｖ１およびＶ２由来の１０―ｍｅｒペプチドを記載する。
【００８４】
（表２Ａ）MPHOSPH1由来HLA-A*2402結合性ペプチド (9mer ペプチド)
開始位置は、ＭＰＨＯＳＰＨ１のＮ末端からのアミノ酸の数を示す。
結合スコアは、材料および方法に記載されている「ＢＩＭＡＳ」に由来する。
【００８５】
（表２Ｂ）MPHOSPH1由来HLA-A*2402結合性ペプチド (10mer ペプチド)
開始位置は、ＭＰＨＯＳＰＨ１のＮ末端からのアミノ酸の数を示す。
結合スコアは、材料および方法に記載されている「ＢＩＭＡＳ」に由来する。
【００８６】
（表３Ａ）MPHOSPH1由来HLA-A*0201結合性ペプチド (9mer ペプチド)
開始位置は、ＭＰＨＯＳＰＨ１のＮ末端からのアミノ酸の数を示す。
結合スコアは、材料および方法に記載されている「ＢＩＭＡＳ」に由来する。
【００８７】
（表３Ｂ）MPHOSPH1由来HLA-A*0201結合性ペプチド (10mer ペプチド)
開始位置は、ＭＰＨＯＳＰＨ１のＮ末端からのアミノ酸の数を示す。
結合スコアは、材料および方法に記載されている「ＢＩＭＡＳ」に由来する。
【００８８】
（表４Ａ）DEPDC1由来HLA-A*2402結合性ペプチド (9mer ペプチド)
開始位置は、ＤＥＰＤＣ１のＮ末端からのアミノ酸の数を示す。
結合スコアは、材料および方法に記載されている「ＢＩＭＡＳ」に由来する。
【００８９】
（表４Ｂ）DEPDC1由来HLA-A*2402結合性ペプチド (10mer ペプチド)
開始位置は、ＤＥＰＤＣ１のＮ末端からのアミノ酸の数を示す。
結合スコアは、材料および方法に記載されている「ＢＩＭＡＳ」に由来する。
【００９０】
（表５Ａ）DEPDC1由来HLA-A*0201結合性ペプチド (9mer ペプチド)
開始位置は、ＤＥＰＤＣ１のＮ末端からのアミノ酸の数を示す。
結合スコアは、材料および方法に記載されている「ＢＩＭＡＳ」に由来する。
【００９１】
（表５Ｂ）DEPDC1由来HLA-A*0201結合性ペプチド (10mer ペプチド)
開始位置は、ＤＥＰＤＣ１のＮ末端からのアミノ酸の数を示す。
結合スコアは、材料および方法に記載されている「ＢＩＭＡＳ」に由来する。
【００９２】
ＨＬＡ―Ａ＊２４０２拘束性ＭＰＨＯＳＰＨ１から予測されたペプチドを用いたＴ細胞の刺激
ＭＰＨＯＳＨＰ１（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２）由来のそれらのペプチドに対するＣＴＬは、上記の「材料および方法」の項に記載されるプロトコールに従って生成された。
結果として生じるＩＦＮ―ガンマＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって評価されるように、検出可能な特異的なＣＴＬ活性を有するＣＴＬは、図１Ａおよび図２Ａに示される。
図１Ａにおいて、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２４―９―２７８（配列番号：７）によって刺激されたウェルナンバー＃４の細胞は、コントロールと比較して強力なＩＦＮ―ガンマ生産を示した。
図２Ａにおいて、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２４―１０―２７８（配列番号：８）によって刺激されたウェルナンバー＃８の細胞は、コントロールと比較して強力なＩＦＮ―ガンマ生産を示した。次に、陽性ウェルのこれらの細胞は拡張され、限界希釈された。
図１Ｂ（ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２４―９―２７８（配列番号：７））および図２Ｂ（ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２４―１０―２７８（配列番号：８））に示すように、ペプチドパルスのない標的に対する活性と比較して、ペプチドパルスされた標的に対する高い特異的なＣＴＬ活性を有するＣＴＬクローンが樹立された。
【００９３】
ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２４―９―２７８（ＩＹＮＥＹＩＹＤＬ（配列番号：７））（図３Ａ）およびＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２４―１０―２７８（ＩＹＮＥＹＩＹＤＬＦ（配列番号：８））（図３Ｂ）によって刺激されたＣＴＬクローンは、いずれのペプチドにもパルスされない標的に対して少しも有意な特異的ＣＴＬ活性を示すことなく、ペプチドパルスされた標的に対して、強力な特異的なＣＴＬ活性を示した。これは、当該ＣＴＬクローンがペプチド特異的な細胞障害性を有することを示唆する。
【００９４】
ＭＰＨＯＳＰＨ１を発現している標的細胞に対する特異的なＣＴＬ活性
これらのペプチドに対して高められた樹立したＣＴＬクローンは、ＭＰＨＯＳＰＨ１およびＨＬＡ―Ａ＊２４０２を内因的に発現している標的細胞を認識する能力について検討された。
ＭＰＨＯＳＰＨ１およびＨＬＡ―Ａ＊２４０２を内因的に発現する標的細胞の特異的モデルであるところの、全長ＭＰＨＯＳＰＨ１遺伝子およびＨＬＡ―Ａ＊２４０２分子によってトランスフェクトされたCOS7に対する特異的CTL活性を、MPHOSPH1-A24-9-278 (SEQ ID NO: 7)で高められたCTLクローンをエフェクター細胞として用いて試験した。
全長ＭＰＨＯＳＰＨ１によってトランスフェクトしたがＨＬＡ―Ａ＊２４０２はしないＣＯＳ７およびＨＬＡ―Ａ＊２４０２でトランスフェクトしたが全長ＭＰＨＯＳＰＨ１はしないＣＯＳ７をコントロールとして調製した。
ＣＯＳ７に対する最も高い特異的なＣＴＬ活性を有するＣＴＬクローンは、ＭＰＨＯＳＰＨ１およびＨＬＡ―Ａ２４の両者によってトランスフェクトしたものであった。しかしながら、ＭＰＨＯＳＰＨ１もＨＬＡ―Ａ２４によってもトランスフェクトしないＣＯＳ７に対しては有意な特異的ＣＴＬ活性を示さなかった（図４）。
【００９５】
これらの結果は、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２４―９―２７８（配列番号：７）がＨＬＡ―Ａ２４分子とともに標的細胞表面に自然に発現され、ＣＴＬが認識されたことを明確に示す。
【００９６】
ＭＰＨＯＳＰＨ１を内因的に発現している膀胱癌細胞株に対するＣＴＬ活性
ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２４―９―２７８（配列番号：７）ペプチドに対して高められた樹立したＣＴＬクローンは、ＭＰＨＯＳＰＨ１を内因的に発現している腫瘍細胞を認識するための能力を検討された。ＭＰＨＯＳＰＨ１およびＨＬＡ―Ａ２４を内因的に発現するＨＴ１３７６細胞に対するＣＴＬ活性は、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２４―９―２７８（配列番号：７）により高められたＣＴＬクローンをエフェクター細胞として用いて試験された。
内因的にＭＰＨＯＳＰＨ１を発現するが、ＨＬＡ―Ａ２４を発現しないＪ８２細胞およびＲＴ―４細胞は標的細胞として用いられた。樹立したＣＴＬクローンは、ＭＰＨＯＳＰＨ１およびＨＬＡ―Ａ２４を両者とも発現するＨＴ１３７６細胞に対して、高いＩＦＮ―ガンマ産生を示した。一方、このＣＴＬは、ＭＰＨＯＳＰＨ１を発現するがＨＬＡ―Ａ２４を発現しないＪ８２およびＲＴ―４細胞に対しては有意なＣＴＬ活性を示さなかった（図５）。それは、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２４―９―２７８（配列番号：７）ペプチドがＨＬＡ―Ａ２４分子とともに腫瘍細胞表面に自然に加工され、ＣＴＬによって認識されることを明確に証明した。
【００９７】
ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２４―９―２７８ペプチドによるインビボのＣＴＬ誘導
Ｈ―２Ｋｄ分子（マウスＭＨＣクラスＩの１つ）がＨＬＡ―Ａ２４分子に対するペプチド・アンカーのモチーフに似ており、ＨＬＡ―Ａ２４拘束性ペプチドと一部交差反応することは公知である。本発明者らは、次に、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２４―９―２７８ペプチドがインビボでＣＴＬを誘導するかどうかを、このペプチドをＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｈ―２ｋｄ）にワクチン接種することによって検討した。ＩＦＡ接合ペプチドは、０および７日目にＢＡＬＢ／ｃマウスに皮下注射された。１４日目に、脾細胞は収集され、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイのためのレスポンダー細胞として用いられた。ペプチドを注入されたすべてのマウス（Ａｎｉ１〜５）の脾細胞は、ＩＦＡ単独を注入されたコントロールマウス（ｎｅｇａ１〜３）と比較して強力なＩＦＮ―ガンマの産生を示した。（図６）。このデータは、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２４―９―２７８ペプチドがインビボでもＣＴＬ反応を誘導できることを示した。
【００９８】
ＨＬＡ―Ａ＊０２０１拘束ＭＰＨＯＳＰＨ１由来予測ペプチドを用いたＴ細胞の刺激
結果として、ＩＦＮ―ガンマＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって評価された検出可能な特異的ＣＴＬ活性を有するＣＴＬは、図７に示される。図７Ａに示すように、ＭＰＨＯＳＰＨ１−Ａ２−９−２８２（ＹＩＹＤＬＦＶＰＶ（配列番号：９））で刺激されたウェルナンバー＃１および＃５の細胞は、コントロールと比較して、強力なＩＦＮ―ガンマ生産を示した。図７Ｂに示すように、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２―９―６３８（ＲＬＡＩＦＫＤＬＶ（配列番号：１０））によって刺激されたウェルナンバー＃８の細胞は、コントロールと比較して強力なＩＦＮ―ガンマ生産を示した。図７Ｃに示すように、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２―１０―１７１４（ＴＭＳＳｓＫＬＳＮＶ（配列番号：１１））によって刺激されたウェルナンバー＃４の細胞は、コントロールと比較して強力なＩＦＮ―ガンマ生産を示した。
【００９９】
図８Ａ（ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２―９―２８２（配列番号：９））、図８Ｂ（ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２―９―６３８（配列番号：１０））および図８Ｃ（ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２―１０―１７１４（配列番号：９））に示すように、陽性ウェルのこれらの細胞は拡張され、そしてペプチドパルスしていない標的に対する活性と比較してペプチドパルスされた標的に対する高い特異的なＣＴＬ活性をもつＣＴＬ株が樹立された。
【０１００】
ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２―９―２８２（ＹＩＹＤＬＦＶＰＶ（配列番号：９））（図９Ａおよび９Ｂ）によって刺激されたＣＴＬクローンは、いかなるペプチドもパルスしない標的に対しては、いかなる有意な特異的ＣＴＬ活性を示さず、ペプチドパルスされた標的に対して強力な特異的なＣＴＬ活性を示した。
【０１０１】
ＨＬＡ―Ａ＊２４０２拘束性ＤＥＰＤＣ１由来予測ペプチドを用いたＴ細胞の刺激
ＤＥＰＤＣ１由来のそれらのペプチドのためのＣＴＬは、上記の「材料および方法」の項目に記載されているプロトコールに従って生成された。結果としてＩＦＮ―ガンマＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって評価されるように、検出可能な特異的ＣＴＬ活性を有するＣＴＬは図１０に示される。図１０Ａに示すように、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２４―９―２９４（ＥＹＹＥＬＦＶＮＩ（配列番号：１２））によって刺激されたウェルナンバー＃１０の細胞は、コントロールと比較して強力なＩＦＮ―ガンマ生産を示した。したがって、陽性ウェルのこれらの細胞は拡張され、限界希釈された。図１０Ｂ（ＤＥＰＤＣ１―Ａ２４―９―２９４（配列番号：１２））に示すように、ペプチドをパルスしない標的に対する活性と比較してペプチドパルスされた標的に対して高い特異的ＣＴＬ活性を有するＣＴＬクローンが樹立された。ＤＥＰＤＣ１―Ａ２４―９―２９４（ＥＹＹＥＬＦＶＮＩ（配列番号：１２））（図１１）によって刺激されたこのＣＴＬクローンは、いずれのペプチドもパルスしない標的に対しては、少しも有意な特異的ＣＴＬ活性を示さず、ペプチドパルスされた標的に対して強力な特異的なＣＴＬ活性を示した。この結果は、このＣＴＬクローンがペプチド特異的な細胞障害性を有することを示唆する。
【０１０２】
ＤＥＰＤＣ１およびＨＬＡ―Ａ＊２４０２を発現している標的細胞に対する特異的なＣＴＬ活性
これらのペプチドに対して高められた樹立したＣＴＬクローンは、ＤＥＰＤＣ１およびＨＬＡ―Ａ＊２４０２を内因的に発現している標的細胞を認識するための能力が検討された。標的細胞が内因的にＤＥＰＤＣ１およびＨＬＡ―Ａ＊２４０２発現する特異的なモデルである、全長ＤＥＰＤＣ１遺伝子およびＨＬＡ―Ａ＊２４０２分子によってトランスフェクトするＣＯＳ７、に対する特異的なＣＴＬ活性は、エフェクター細胞としてＤＥＰＤＣ１―Ａ２４―９―２９４（ＥＹＹＥＬＦＶＮＩ（配列番号：１２））により増えたＣＴＬクローンを用いて、試験された。全長ＤＥＰＤＣ１によってトランスフェクトするがＨＬＡ―Ａ＊２４０２はしないＣＯＳ７およびＨＬＡ―Ａ＊２４０２をトランスフェクトさせるが全長ＤＥＰＤＣ１はしないＣＯＳ７はコントロールとして調製された。ＣＴＬクローンは、ＤＥＰＤＣ１およびＨＬＡ―Ａ２４の両者をトランスフェクトさせたＣＯＳ７に対して高い特異的なＣＴＬ活性を示した。しかしながら、ＤＥＰＤＣ１もＨＬＡ―Ａ２４によってもトランスフェクトしないＣＯＳ７に対しては有意な特異的ＣＴＬ活性を示さなかった（図１２）。
【０１０３】
これらの結果は、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２４―９―２９４（ＥＹＹＥＬＦＶＮＩ（配列番号：１２））が、ＨＬＡ―Ａ２４分子とともに標的細胞表面に自然に発現されそしてＣＴＬを認識したことを明確に示す。
【０１０４】
ＤＥＰＤＣ１を内因的に発現している膀胱癌細胞株に対するＣＴＬ活性
ＤＥＰＤＣ１―Ａ２４―９―２９４ペプチドに対して高められた樹立したＣＴＬクローンは、ＤＥＰＤＣ１を内因的に発現している腫瘍細胞を認識するための能力が検討された。ＤＥＰＤＣ１およびＨＬＡ―Ａ２４を内因的に発現するＨＴ１３７６細胞に対するＣＴＬ活性は、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２４―９―２９４によって高められたＣＴＬクローンをエフェクター細胞として用いて試験された。Ｊ８２細胞およびＲＴ―４細胞は、内因的にＤＥＰＤＣ１を発現するがＨＬＡ―Ａ２４を発現しない標的細胞として用いられた。樹立したＣＴＬクローンは、ＤＥＰＤＣ１およびＨＬＡ―Ａ２４を発現するＨＴ１３７６細胞に対して、高いＩＦＮ―ガンマ産生を示した。一方、ＤＥＰＤＣ１を発現するがＨＬＡ―Ａ２４は発現しないＪ８２およびＲＴ―４細胞に対しては、有意なＣＴＬ活性を示さなかった（図１３）。それは、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２４―９―２９４がＨＬＡ―Ａ２４分子を有する腫瘍細胞表面に自然に加工され、ＣＴＬによって認識されることを明確に証明した。
【０１０５】
ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＤＥＰＤＣ１―Ａ２４―９―２９４ペプチドによるインビボのＣＴＬ誘導
Ｈ―２Ｋｄ分子（マウスＭＨＣクラスＩの１つ）がＨＬＡ―Ａ２４分子に対するペプチド・アンカーのモチーフに似ており、ＨＬＡ―Ａ２４拘束性ペプチドと一部交差反応することは公知である。本発明者らは、次に、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２４―９―２９４ペプチドがインビボでＣＴＬを誘導するかどうかを、このペプチドをＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｈ―２ｋｄ）にワクチン接種することによって検討した。ＩＦＡ接合ペプチドは、０および７日目にＢＡＬＢ／ｃマウスに、皮下注射された。１４日目に、脾細胞は収集されて、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイのためのレスポンダー細胞として用いられた。ペプチドを注入されたすべてのマウス（Ａｎｉ１〜５）の脾細胞は、ＩＦＡ単独を注入されたコントロールマウス（ｎｅｇａ１〜３）と比較して強力なＩＦＮ―ガンマの産生を示した。（図１４）。このデータは、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２４―９―２９４ペプチドがインビボでもＣＴＬ反応を誘導することができることを示した。
【０１０６】
ＨＬＡ―Ａ＊０２０１拘束性ＤＥＰＤＣ１由来予測ペプチドを用いたＴ細胞の刺激
ＩＦＮ―ガンマＥＬＩＳＰＯＴアッセイによる選択時に、検出可能な特異的ＣＴＬ活性を有しているＣＴＬは、図１５および表６に示される。ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―６４４（（ＳＬＭＩＨＴＦＳＲＣ配列番号：２４０））によって刺激されたウェルナンバー＃４および＃７の細胞は、コントロールと比較して強力なＩＦＮ―ガンマの産生を示した。ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―５７５（ＳＬＬＰＡＳＳＭＬＴ（配列番号：２４１））によって刺激されたウェルナンバー＃２の細胞は、コントロールと比較して強力なＩＦＮ―ガンマに産生を示した。ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―５０６（ＱＬＣＲＳＱＳＬＬＬ（配列番号：２４３））によって刺激されたウェルナンバー＃７の細胞は、コントロールと比較して強力なＩＦＮ―ガンマに産生を示した。ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―７６５（ＫＱＦＱＫＥＹＰＬＩ（配列番号：２４４））によって刺激されたウェルナンバー＃１の細胞は、コントロールと比較して強力なＩＦＮ―ガンマに産生を示した。ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―３９５（ＩＭＧＧＳＣＨＮＬＩ（配列番号：２４９））によって刺激されたウェルナンバー＃１の細胞は、コントロールと比較して強力なＩＦＮ―ガンマに産生を示した。
ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―２２４（ＮＭＡＮＴＳＫＲＧＶ（配列番号：２５３））によって刺激されたウェルナンバー＃１および＃２の細胞は、コントロールと比較して強力なＩＦＮ―ガンマに産生を示した。ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―９―２９７（ＥＬＦＶＮＩＬＧＬ（配列番号：２２６））によって刺激されたウェルナンバー＃４の細胞は、コントロールと比較して強力なＩＦＮ―ガンマに産生を示した。ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―２９６（ＹＥＬＦＶＮＩＬＧＬ（配列番号：２５４））によって刺激されたウェルナンバー＃３および＃４の細胞は、コントロールと比較して強力なＩＦＮ―ガンマに産生を示した。
ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―３０１（ＮＩＬＧＬＬＱＰＨＬ（配列番号：２５５））によって刺激されたウェルナンバー＃２、＃３、＃５および＃７の細胞は、コントロールと比較して強力なＩＦＮ―ガンマに産生を示した。ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―９―５９８（ＬＬＱＰＨＬＥＲＶ（配列番号：１９２））によって刺激されたウェルナンバー＃６の細胞は、コントロールと比較して強力なＩＦＮ―ガンマ産生を示した。ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―９―６１９（ＬＬＭＲＭＩＳＲＭ（配列番号：１９５））によって刺激されたウェルナンバー＃６の細胞は、コントロールと比較して強力なＩＦＮ―ガンマ産生を示した。ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―９―２９０（ＬＬＴＦＥＹＹＥＬ（配列番号：１９７））によって刺激されたウェルナンバー＃２の細胞は、コントロールと比較して強力なＩＦＮ―ガンマ産生を示した。ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―９―５６３（ＲＬＣＫＳＴＩＥＬ（配列番号：２０９））によって刺激されるウェルナンバー＃５の細胞は、コントロールと比較して強力なＩＦＮ―ガンマ産生を示した。ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―９―６５３（ＣＶＬＣＣＡＥＥＶ（配列番号：２２５））によって刺激されたウェルナンバー＃１および＃３の細胞は、コントロールと比較して強力なＩＦＮ―ガンマ産生を示した。ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―６７４（ＦＬＭＤｈＨＱＥＩＬ（配列番号：２２８））によって刺激されたウェルナンバー＃１の細胞は、コントロールと比較して強力なＩＦＮ―ガンマ産生を示した。最後に、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―３０２（ＩＬＶＶｃＧＹＩＴＶ（配列番号：２３０））によって刺激されたウェルナンバー＃２および＃６の細胞は、コントロールと比較して強力なＩＦＮ―ガンマ産生を示した。
【０１０７】
ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―２９６（ＹＥＬＦＶＮＩＬＧＬ（配列番号：２５４））およびＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―９―６５３（ＣＶＬＣＣＡＥＥＶ（配列番号：２２５））（図１６）によって刺激したＣＴＬ株は、いずれのペプチドによってもパルスされない標的に対しては有意な特異的なＣＴＬ活性を示さず、ペプチドパルスされた標的に対して、強力な特異的ＣＴＬ活性を示した。これはＣＴＬクローンがペプチド特異的な細胞障害性を有することを示す。
【０１０８】
（表６）DEPDC1由来HLA-A*0201拘束性候補ペプチド
【０１０９】
ＤＥＰＤＣ１およびＨＬＡ―Ａ＊０２０１を発現している標的細胞に対する特異的ＣＴＬ活性
ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―２９６ペプチド（ＹＥＬＦＶＮＩＬＧＬ（配列番号：２５４））およびＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―９―６５３（ＣＶＬＣＣＡＥＥＶ（配列番号：２２５））に対して高められた樹立したＣＴＬ株は、ＤＥＰＤＣ１およびＨＬＡ―Ａ２を内因的に発現している標的細胞を認識する能力について検討された。最初に、我々は、効率的に特異的なＣＴＬ反応を測定するためにＨＬＡ―Ａ＊０２０１（ＨＥＫ―Ａ２）を構成的に発現するＨＥＫ２９３細胞株を樹立した。ＤＥＰＤＣ１およびＨＬＡ―Ａ２を発現する標的細胞の特異的なモデルである、全長ＤＥＰＤＣ１遺伝子をトランスフェクトさせたＨＥＫ―Ａ２細胞に対する特異的なＣＴＬ活性は、エフェクター細胞としてＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―２９６（ＹＥＬＦＶＮＩＬＧＬ（配列番号：２５４））またはＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―９―６５３（ＣＶＬＣＣＡＥＥＶ（配列番号：２２５））によって高めれた樹立したＣＴＬ株を用いて試験された。Ｍｏｃｋ発現ベクターをトランスフェクトしたＨＥＫ―Ａ２、そして、ＤＥＰＤＣ１由来のものに対応しないペプチドでパルスしたＨＥＫ―Ａ２はネガティブコントロールとして調製された。樹立したＣＴＬ株は、ＤＥＰＤＣ１をトランスフェクトしたＨＥＫ―Ａ２に対して特異的なＣＴＬ活性を示した。一方で、当該ＣＴＬ株は、トランスフェクトしたＭｏｃｋ発現ベクターおよびＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―９―６７４ペプチドまたはＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―９―４６２ペプチドがパルスされたＨＥＫ―Ａ２に対して、有意な特異的ＣＴＬ活性を示さなかった（図１７）。それは、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―２９６ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―９―６５３ペプチドが、ＨＬＡ―Ａ２分子とともに標的細胞表面に自然に加工され、ＣＴＬによって認識されることを明確に証明した。
【０１１０】
抗原ペプチドの相同性解析
本発明のペプチドに対して樹立されるＣＴＬは、強力な特異的ＣＴＬ活性を示した。
これはＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２４―９―２７８（配列番号：７）、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２４―１０―２７８（配列番号：８）、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２―９―２８２（配列番号：９）、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２―９―６３８（配列番号：１０）、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２―１０―１７１４（配列番号：１１）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２４―９―２９４（配列番号：１２）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２―９―５８９（配列番号：１９２）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２―９―６１９（配列番号：１９５）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２―９―２９０（配列番号：１９７）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２―９―５６３（配列番号：２０９）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２―９―６５３（配列番号：２２５）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２―１０―６７４（配列番号：２２８）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２―１０―３０２（配列番号：２３０）ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―６４４（配列番号：２４０）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―５７５（配列番号：２４１）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―５０６（配列番号：２４３）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―７６５（配列番号：２４４）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―３９５（配列番号：２４９）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―２２４（配列番号：２５３）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―９―２９７（配列番号：２２６）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―２９６（配列番号：２５４）およびＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―３０１（配列番号：２５５）のシーケンスがヒト免疫系を感作することが知られている他の分子由来のペプチドに相同であることを示唆する。この可能性を排除するため、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi）を用いて、ペプチド配列をクエリーとして相同性解析が行われた。有意な配列相同性は、示されなかった。
【０１１１】
これらの結果は、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２４―９―２７８（配列番号：７）、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２４―１０―２７８（配列番号：８）、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２―９―２８２（配列番号：９）、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２―９―６３８（配列番号：１０）、ＭＰＨＯＳＰＨ１―Ａ２―１０―１７１４（配列番号：１１）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２４―９―２９４（配列番号：１２）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２―９―５９８（配列番号：１９２）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２―９―６１９（配列番号：１９５）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２―９―２９０（配列番号：１９７）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２―９―５６３（配列番号：２０９）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２―９―６５３（配列番号：２２５）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２―１０―６７４（配列番号：２２８）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ２―１０―３０２（配列番号：２３０）ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―６４４（配列番号：２４０）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―５７５（配列番号：２４１）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―５０６（配列番号：２４３）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―７６５（配列番号：２４４）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―３９５（配列番号：２４９）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―２２４（配列番号：２５３）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―９―２９７（配列番号：２２６）、ＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―２９６（配列番号：２５４）およびＤＥＰＤＣ１―Ａ０２―１０―３０１（配列番号：２５５）のシーケンスがユニークで、いかなる関連のない分子にたいして予期しない免疫反応を起こすリスクが低いことを示唆する。
【０１１２】
考察
新規なＴＡＡ（特に強力および特異的な抗腫瘍免疫応答を誘導するそれら）の同定は、様々なタイプの癌におけるペプチドワクチン接種戦略の臨床応用の更なる発達を保証する（Boon T.et al.、(1996)J Exp Med 183:725-9. van der Bruggen P et al.((1991)Science 254):1643-7. Brichard V et al.((1993)J Exp Med 178):489-95. Kawakami Y et al.((1994)J Exp Med 180):347-52. Shichijo S et al.((1998)J Exp Med 187):277-88. Chen YT et al.,(1997)Proc.Natl.Acd.Sci. USA、94:1914-8. Harris Cc.((1996)J Natl Cancer Inst 88):1442-5. Butterfield LH et al.((1999)Cancer Res 59):3134-42. Vissers JL et al.((1999)Cancer Res 59):5554-9. van der Burg SH et al.((1996)J.Immunol 156):3308-14. Tanaka F et al.((1997)Cancer Res 57):4465-8. Fujie T et al.((1999)Int J Cancer 80):169-72. Kikuchi M et al.((1999)Int J Cancer 81):459-66. Oiso M et al.((1999)Int J Cancer 81):387-94.）。
【０１１３】
cDNAマイクロアレイ技術は、悪性細胞の遺伝子発現の包括的なプロファイルを開示することができる（Lin YM, et al., Oncogene.2002 Jun 13;21:4120-8. Kitahara O, et al., Cancer Res. 2001 May 1;61:3544-9. Suzuki C、et al.,Cancer Res.2003 Nov 1;63:7038-41. Ashida S(Cancer Res.2004 Sep 1);64:5963-72.Ochi K、et al.、Int J Oncol.2004 Mar;24(3):647-55. Kaneta Y、et al.、Int J Oncol.2003 Sep;23:681-91. Obama K(Hepatology.2005 Jun);41:1339-48. Kato T, et al.,Cancer Res. 2005 Jul 1;65:5638-46. Kitahara O、et al.、Neoplasia.2002 Jul-Aug;4:295-303. Saito-Hisaminato A et al.、DNA Res 2002、9:35-45.）。そして、ＴＡＡ候補の同定において有用なものを見いだす。さまざまな癌において上方制御される転写産物の中で、２つの新規ヒト遺伝子（それぞれＭＰＨＯＳＰＨ１およびＤＥＰＤＣ１と称される）は、これらの技術を用いて同定された。
【０１１４】
上記で示したように、ＭＰＨＯＳＰＨ１およびＤＥＰＤＣ１はさまざまな癌において過剰発現するが、正常組織ではごく僅かな発現のみを示す。加えて、これらの遺伝子は細胞増殖に関連した重要な機能を有することが示されている（PCT/JP2006/302684を参照）。したがって、ＭＰＨＯＳＰＨ１およびＤＥＰＤＣ１由来のペプチドはＴＡＡエピトープとして役立ち、癌細胞に対して有意および特異的な免疫応答を誘導するために用いることができる。
【０１１５】
したがって、ＭＰＨＯＳＰＨ１およびＤＥＰＤＣ１は新規ＴＡＡとして、これらのエピトープペプチドを用いるワクチンは、これらの分子を発現しているさまざまな癌腫または他の疾患に対する免疫治療法としての有用性を見出す。
【０１１６】
実施例２
材料および方法
ペプチドおよびアジュバント
合成されたＧＭＰグレードのペプチドは、ネオマルチペプタイドシステム（Neo Multi Peptide System）（MPS）（サンディエゴ、ＣＡ）より購入された。アジュバントとして、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）（ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ＊ＩＳＡ５１）が、用いられた。１ｍｇの適切なペプチドは、１ｍｇのＩＦＡによって乳化された。
【０１１７】
抗原発現
本発明者らは、免疫組織化学的解析を行った。手術または生検から得られた膀胱癌由来の腫瘍細胞または腫瘍組織は、それぞれのＭＰＨＯＳＰＨ１およびＤＥＰＤＣ１特異的ポリクローナル抗体によって染色された。染色のプロトコールは、以前に述べられたように（Kanehira M et al. Cancer Res.;67（7）:3276-3285, 2007., Kanehira M et al. Oncogene. 2007 Apr 23; [Epub ahead of print]）東京大学医科学研究所ヒトゲノムセンターにおいて確立された。ＨＬＡ―Ａ＊２４０２発現は、ＳＲＬ（立川、日本）で、行われ試験された
【０１１８】
登録される患者
登録基準は、以下の通り；
1. 標準的な化学療法によって過去に治療をうけて失敗となった手術不能の再発性膀胱癌患者。
2. 日本の判定基準において一般状態が０または１である患者。
3. ２０歳から８０歳の患者
4. ＲＥＣＩＳＴガイドラインは考慮しないが、治療前に画像検査（ＣＴ／ＭＲＩ）によって原発腫瘍または転移と認められた患者
5. 前治療（手術、化学療法、放射線療法、温熱療法、他の免疫療法その他）後４週以上経過した患者
6. ３ヵ月以上の予後が予測される患者
7. 骨髄機能（白血球数２０００以上、１５０００以下、血小板５００００以上を）、肝機能（ＧＯＴ１５０以下、ＧＰＴ１５０以下、Ｔ―ｂｉｌ３．０以下）、腎機能（Ｃｒ３．０以下）の患者
8. ＨＬＡ―Ａ＊２４０２を有する患者
9. ＭＰＨＯＳＰＨ１および／またはＤＥＰＤＣ１の発現を有する患者の腫瘍
【０１１９】
除外基準は、以下の通り；
1. 妊娠中の患者
2. 授乳中の患者
3. 妊娠の意思のある患者
4. 制御困難な感染症を有する患者
5. 臨床試験期間中に以下の薬剤を必要とする患者
ステロイドの全身投与
免疫抑制薬の全身投与
6. 医師または治験責任医師によってこの試験に登録するべきと思われない患者
【０１２０】
プロトコール
腫瘍がM phase phosphoprotein 1（ＭＰＨＯＳＰＨ１）および／またはDEP domain containing 1 （ＤＥＰＤＣ１）を発現する、 ＨＬＡ―Ａ＊２４０２を有する登録された膀胱癌患者は、ＨＬＡ―Ａ＊２４０２―拘束性エピトープペプチドＭＰＨＯＳＰＨ１―９―２７８（ＩＹＮＥＹＩＹＤＬ（配列番号：７））および／またはＤＥＰＤＣ１―９―２９４（ＥＹＹＥＬＦＶＮＩ（配列番号：１２））によって免疫された。それぞれのペプチドは、１ｍＬの不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ、ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ＊ＩＳＡ５１）と組み合わせられて、週に一度腋窩あるいは鼠径部の病変に、皮下注射された。１コース４回注射と規定され、続いて１コース後、免疫学的および臨床的評価のため、採血並びにＣＴ／ＭＲＩが行われた。
【０１２１】
安全性の評価
副作用の評価は、国立癌研究所―共通毒性判定基準第３版（ＮＣＩ―ＣＴＣ ｖｅｒ．３）に従って行われた。
【０１２２】
免疫学的評価
これはこの研究のセカンダリーエンドポイントの１つで、我々はペプチド特異的なＣＴＬ反応が発生したかどうかを確認する。特異的なＣＴＬ反応の計測は、以下の通り；
末梢血単核細胞は回収され、適切なペプチドによって再刺激された。ＣＴＬ反応は、ＩＦＮ―ガンマＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって、１４日目に試験された。
【０１２３】
抗腫瘍効果の評価
臨床反応の評価は、ＲＥＣＩＳＴ基準に従って行われた。
【０１２４】
結果
表７は、本臨床研究の概要を示す。症例３のグレード２の発疹を除き、重篤な副作用はなかった。マイナーレスポンス（症例３）およびミックスレスポンス（症例４）が得られた。ＭＰＨＯＳＰＨ１の発現は５症例中４症例であったが、ＤＥＰＤＣ１のそれは５症例中５症例であった。
【０１２５】
（表７）本臨床研究の概要
【０１２６】
症例２
症例２において、標準化学療法の失敗でかなり進行した膀胱癌をもつ７２歳の女性が本臨床試験に登録された。図１８において、彼女の腫瘍の抗原発現は、ＭＰＨＯＳＰＨ１およびＤＥＰＤＣ１が強く発現することを示した。従って、我々はＭＰＨＯＳＰＨ１およびＤＥＰＤＣ１由来のエピトープペプチド２種をワクチン接種した。症例２は、膀胱癌の局所再発を有した。それは、ＲＥＣＩＳＴ基準基づき安定（ＳＤ）と評価された（図１９）。
【０１２７】
症例３
症例３において、標準化学療法の失敗でかなり進行した膀胱癌をもつ４９歳の男性が、本臨床試験に登録された。ＤＥＰＤＣ１のみが強く発現された（図２０）。従って、我々は、ＤＥＰＤＣ１由来のエピトープペプチドを単独でワクチン接種した。症例３は、膀胱癌の複数の肺転移を有した。右（図２１）および左（図２２）の肺葉転移において、進行率がワクチン接種後に低下した。特に、腫瘍のサイズが３コース後に減少した。図２３は、ＲＥＣＩＳＴ基準に基づいた抗腫瘍効果を示す。転移性腫瘍の進行率がワクチン接種後に低下したことが明らかにされた。
それは、ＤＥＰＤＣ１由来のエピトープペプチドを用いているワクチン接種によってマイナーレスポンスが得られることを示した。症例３の免疫学的評価に関して、特異的ＣＴＬ反応は、ワクチン接種の前後で測定された。特異的ＣＴＬ反応はワクチン接種後強く示された（図２４）。それは、ＤＥＰＤＣ１由来のエピトープペプチドによって誘導されるＣＴＬが抗腫瘍効果を示しうることを明確に示した。
【０１２８】
症例４
症例４において、標準的化学療法の失敗でかなり進行した膀胱癌をもつ７４歳の男性が本臨床試験に登録された。ＭＰＨＯＳＰＨ１およびＤＥＰＤＣ１は、彼の腫瘍で発現した（図２５）。従って、我々は、ＭＰＨＯＳＰＨ１およびＤＥＰＤＣ１由来の２種類のエピトープペプチドをワクチン接種した。症例４は、膀胱癌の局所再発を有していた。１コースのワクチン接種後、腫瘍のサイズは、ＲＥＣＩＳＴ基準に基づき、２０％減少した（図２６）。しかしながら、肺の新しい転移性病変が発生した。それは、ＭＰＨＯＳＰＨ１およびＤＥＰＤＣ１由来の２種類のエピトープペプチドを用いるワクチン接種によってまちまちの反応が得られることを示した。
【０１２９】
考察
本臨床試験の理論的根拠は、以下に述べられる；
1. ＭＰＨＯＳＰＨ１およびＤＥＰＤＣ１は精巣を除く正常組織においては発現されないので、両抗原は非常に腫瘍特異的である。
2. 強力で特異的なＣＴＬはこれらのエピトープペプチドによって樹立されたことから、これらのペプチドは強い免疫原性を有すると考えられる。
3. 日本人集団の６０％がＨＬＡ―Ａ＊２４０２をもつ。
4. これらのペプチドは、臨床試験に適用するのに化学的に十分安定である。
本研究の目的は、その毒性、免疫学的応答および抗腫瘍活性の臨床的な情報を得ることである。
【０１３０】
以前に報告されたペプチドを用いた臨床試験のワクチンの副作用は、熱、頭痛および不快のようなfur-like symptomである。まれに、注射された部位に一時的な交差反応性と考えられる水疱を伴う過激な皮膚反応が報告された。この試験において、症例３のグレード２の発疹を除いて、重篤な副作用はなかった。この患者は、化学療法中、発疹を示す病歴があった。それはこの副作用がこのワクチン接種によるものでないことを示唆し、したがって、このプロトコールは安全でありうる。
【０１３１】
免疫学的解析は、ワクチン接種後、特異的ＣＴＬ誘導によって行われた。症例１において、特異的ＣＴＬ反応は、ワクチン接種後得られなかった（データ非表示）。症例３において、ＤＥＰＤＣ１由来のペプチドに対する特異的なＣＴＬ反応は、第１および第２コースのワクチン接種後、明確に示された。症例３において、抗腫瘍効果は、ワクチン接種によって得られた。それは、当該ＤＥＰＤＣ１由来のペプチドが特異的なＣＴＬの誘導によって膀胱癌に対して抗腫瘍効果を示すことを明確に証明した。
【０１３２】
症例４において、１コースのみのワクチン接種後、抗腫瘍効果は、膀胱癌の局所再発に対して明らかに得られた。この証拠は、これらのエピトープペプチドが膀胱癌に対して抗腫瘍効果を示すことを強く支持する。
【０１３３】
結論として、本エピトープ治療は安全であり、さらに、重篤な副作用のない強い抗腫瘍効果が示されることが明らかにされた。
【産業上の利用可能性】
【０１３４】
本発明は、新規なＴＡＡ、特に、強力な特異的抗腫瘍免疫応答を誘導するそれを同定する。
当該ＴＡＡは、ＭＰＨＯＳＰＨ１および／またはＤＥＰＤＣ１に関連する疾患（例えば癌）に対するペプチドワクチンとして、更なる発展を保証する。
【０１３５】
本願明細書において引用されるすべての特許、特許出願および刊行物は、参照により組み入れられる。
【０１３６】
本発明が、その特定の実施態様に関して詳細に述べられたが、上記記述は、事実上例示的および説明的なものであり、本発明およびその好適な態様を具体的に説明することを意図することが理解されるべきである。ルーチン実験によって、本発明の精神と範囲から逸脱することなく、さまざまな変更や修正がなされうることを、当業者は容易に認識するであろう。したがって、本発明は、上記記載によって限定されるのでなく、以下請求項およびそれらの同等物によって限定されることを意図する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞障害性Ｔ細胞誘導能を有する単離ペプチドであって、配列番号：２、４または６のアミノ酸配列から誘導される前記ペプチド。
【請求項２】
配列番号：７、８および１２のアミノ酸配列を含むペプチドからなるグループから選択される約１５アミノ酸未満の単離ペプチド、
または配列番号：７、８および１２からなるグループから選択されるアミノ酸配列であって、そのうちの１、２または数個のアミノ酸が、置換、欠失、または、付加されたアミノ酸配列を含む細胞障害性Ｔ細胞誘導能を有するペプチド。
【請求項３】
細胞障害性Ｔ細胞誘導能を有するペプチドであって、Ｎ末端からの第２位のアミノ酸がフェニルアラニン、チロシン、メチオニンまたはトリプトファンである、請求項２に記載のペプチド。
【請求項４】
細胞障害性Ｔ細胞誘導性を有するペプチドであって、Ｃ末端アミノ酸が、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンまたはメチオニンである、請求項２に記載のペプチド。
【請求項５】
配列番号：９、１０、１１、１９２、１９５、１９７、２０９、２２５、２２６、２２８、２３０、２４０、２４１、２４３、２４４、２５３、２５４および２５５のアミノ酸配列を含むペプチドからなるグループから選択された約１５アミノ酸未満の単離ペプチド、
または配列番号：９、１０、１１、１９２、１９５、１９７、２０９、２２５、２２６、２２８、２３０、２４０、２４１、２４３、２４４、２５３、２５４および２５５からなるグループから選択されるアミノ酸配列であって、そのうちの１、２または数個のアミノ酸が、置換、欠失、または、付加されたアミノ酸配列を含む細胞障害性Ｔ細胞誘導能を有するペプチド。
【請求項６】
細胞障害性Ｔ細胞誘導能を有するペプチドであって、Ｎ末端からの第２位のアミノ酸が、ロイシンまたはメチオニンである、請求項５に記載のペプチド。
【請求項７】
細胞障害性Ｔ細胞誘導能を有するペプチドであって、Ｃ末端アミノ酸が、バリンまたはロイシンである、請求項５に記載のペプチド。
【請求項８】
ＤＮＡが請求項１〜７のいずれか一項に記載のペプチドをコードするベクター。
【請求項９】
配列番号：１、３および／または５の遺伝子の過剰発現と関連した疾患を治療または予防するための医薬組成物であって、請求項２あるいは５に記載のペプチドを一つ以上含む前記医薬組成物。
【請求項１０】
疾患が癌である、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
癌が、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、胃癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣおよび軟組織腫瘍からなるグループから選択される、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
請求項２あるいは５に記載のペプチドおよびＨＬＡ抗原からなる複合体を表面に提示するエキソソーム。
【請求項１３】
ＨＬＡ抗原がＨＬＡ―Ａ２４である、請求項１２に記載のエキソソーム。
【請求項１４】
ＨＬＡ抗原がＨＬＡ―Ａ２４０２である、請求項１３に記載のエキソソーム。
【請求項１５】
ＨＬＡ抗原がＨＬＡ―Ａ２である、請求項１２に記載のエキソソーム。
【請求項１６】
ＨＬＡ抗原がＨＬＡ―Ａ０２０１である、請求項１３に記載のエキソソーム。
【請求項１７】
請求項２または５に記載のペプチドを抗原提示細胞と接触させる工程を含む、高い細胞障害性Ｔ細胞誘導能を有する抗原提示細胞を誘導する方法。
【請求項１８】
請求項２または５に記載のペプチドとＴ細胞を接触させることにより、細胞障害性Ｔ細胞を誘導する方法。
【請求項１９】
抗原提示細胞に請求項２または５に記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子を導入する工程を含む、高い細胞障害性Ｔ細胞誘導能を有する抗原提示細胞を誘導する方法。
【請求項２０】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のペプチドとＴ細胞を接触させることにより誘導された、または、ＨＬＡ―Ａ２４またはＨＬＡ―Ａ２との関連において請求項１〜８のいずれか一項に記載のペプチドと結合するＴＣＲサブユニットポリペプチドをコードする核酸が導入された、単離された細胞障害性Ｔ細胞。
【請求項２１】
ＨＬＡ抗原と請求項２または５に記載のペプチドとの間で形成された複合体を含む、抗原提示細胞。
【請求項２２】
請求項１７に記載の方法により誘導される、請求項２１に記載の抗原提示細胞。
【請求項２３】
配列番号：１、３および／または５の遺伝子を発現している細胞の細胞増殖を阻害するためのワクチンであって、活性成分として請求項２または５に記載のペプチドを含むワクチン。
【請求項２４】
細胞が癌細胞である、請求項２３に記載のワクチン。
【請求項２５】
癌が、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、胃癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣおよび軟組織腫瘍からなるグループから選択される、請求項２４に記載のワクチン。
【請求項２６】
ＨＬＡ抗原がＨＬＡ―Ａ２４またはＨＬＡ―Ａ２である対象への投与のために調製される、請求項２３に記載のワクチン。
【請求項２７】
対象に請求項２または５に記載の１つ以上のペプチド、その免疫学的活性断片、または前記ペプチドもしくは免疫学的活性断片をコードするポリヌクレオチドを含むワクチンを投与することを含む、配列番号：１、３および／または５の遺伝子の過剰発現と関連した疾患を治療または予防する方法。
【請求項２８】
疾患が癌である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
癌が膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、胃癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣおよび軟組織腫瘍からなるグループから選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項１】
細胞障害性Ｔ細胞誘導能を有する単離ペプチドであって、配列番号：２、４または６のアミノ酸配列から誘導される前記ペプチド。
【請求項２】
配列番号：７、８および１２のアミノ酸配列を含むペプチドからなるグループから選択される約１５アミノ酸未満の単離ペプチド、
または配列番号：７、８および１２からなるグループから選択されるアミノ酸配列であって、そのうちの１、２または数個のアミノ酸が、置換、欠失、または、付加されたアミノ酸配列を含む細胞障害性Ｔ細胞誘導能を有するペプチド。
【請求項３】
細胞障害性Ｔ細胞誘導能を有するペプチドであって、Ｎ末端からの第２位のアミノ酸がフェニルアラニン、チロシン、メチオニンまたはトリプトファンである、請求項２に記載のペプチド。
【請求項４】
細胞障害性Ｔ細胞誘導性を有するペプチドであって、Ｃ末端アミノ酸が、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンまたはメチオニンである、請求項２に記載のペプチド。
【請求項５】
配列番号：９、１０、１１、１９２、１９５、１９７、２０９、２２５、２２６、２２８、２３０、２４０、２４１、２４３、２４４、２５３、２５４および２５５のアミノ酸配列を含むペプチドからなるグループから選択された約１５アミノ酸未満の単離ペプチド、
または配列番号：９、１０、１１、１９２、１９５、１９７、２０９、２２５、２２６、２２８、２３０、２４０、２４１、２４３、２４４、２５３、２５４および２５５からなるグループから選択されるアミノ酸配列であって、そのうちの１、２または数個のアミノ酸が、置換、欠失、または、付加されたアミノ酸配列を含む細胞障害性Ｔ細胞誘導能を有するペプチド。
【請求項６】
細胞障害性Ｔ細胞誘導能を有するペプチドであって、Ｎ末端からの第２位のアミノ酸が、ロイシンまたはメチオニンである、請求項５に記載のペプチド。
【請求項７】
細胞障害性Ｔ細胞誘導能を有するペプチドであって、Ｃ末端アミノ酸が、バリンまたはロイシンである、請求項５に記載のペプチド。
【請求項８】
ＤＮＡが請求項１〜７のいずれか一項に記載のペプチドをコードするベクター。
【請求項９】
配列番号：１、３および／または５の遺伝子の過剰発現と関連した疾患を治療または予防するための医薬組成物であって、請求項２あるいは５に記載のペプチドを一つ以上含む前記医薬組成物。
【請求項１０】
疾患が癌である、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
癌が、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、胃癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣおよび軟組織腫瘍からなるグループから選択される、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
請求項２あるいは５に記載のペプチドおよびＨＬＡ抗原からなる複合体を表面に提示するエキソソーム。
【請求項１３】
ＨＬＡ抗原がＨＬＡ―Ａ２４である、請求項１２に記載のエキソソーム。
【請求項１４】
ＨＬＡ抗原がＨＬＡ―Ａ２４０２である、請求項１３に記載のエキソソーム。
【請求項１５】
ＨＬＡ抗原がＨＬＡ―Ａ２である、請求項１２に記載のエキソソーム。
【請求項１６】
ＨＬＡ抗原がＨＬＡ―Ａ０２０１である、請求項１３に記載のエキソソーム。
【請求項１７】
請求項２または５に記載のペプチドを抗原提示細胞と接触させる工程を含む、高い細胞障害性Ｔ細胞誘導能を有する抗原提示細胞を誘導する方法。
【請求項１８】
請求項２または５に記載のペプチドとＴ細胞を接触させることにより、細胞障害性Ｔ細胞を誘導する方法。
【請求項１９】
抗原提示細胞に請求項２または５に記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子を導入する工程を含む、高い細胞障害性Ｔ細胞誘導能を有する抗原提示細胞を誘導する方法。
【請求項２０】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のペプチドとＴ細胞を接触させることにより誘導された、または、ＨＬＡ―Ａ２４またはＨＬＡ―Ａ２との関連において請求項１〜８のいずれか一項に記載のペプチドと結合するＴＣＲサブユニットポリペプチドをコードする核酸が導入された、単離された細胞障害性Ｔ細胞。
【請求項２１】
ＨＬＡ抗原と請求項２または５に記載のペプチドとの間で形成された複合体を含む、抗原提示細胞。
【請求項２２】
請求項１７に記載の方法により誘導される、請求項２１に記載の抗原提示細胞。
【請求項２３】
配列番号：１、３および／または５の遺伝子を発現している細胞の細胞増殖を阻害するためのワクチンであって、活性成分として請求項２または５に記載のペプチドを含むワクチン。
【請求項２４】
細胞が癌細胞である、請求項２３に記載のワクチン。
【請求項２５】
癌が、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、胃癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣおよび軟組織腫瘍からなるグループから選択される、請求項２４に記載のワクチン。
【請求項２６】
ＨＬＡ抗原がＨＬＡ―Ａ２４またはＨＬＡ―Ａ２である対象への投与のために調製される、請求項２３に記載のワクチン。
【請求項２７】
対象に請求項２または５に記載の１つ以上のペプチド、その免疫学的活性断片、または前記ペプチドもしくは免疫学的活性断片をコードするポリヌクレオチドを含むワクチンを投与することを含む、配列番号：１、３および／または５の遺伝子の過剰発現と関連した疾患を治療または予防する方法。
【請求項２８】
疾患が癌である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
癌が膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、胃癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、前立腺癌、腎癌、ＳＣＬＣおよび軟組織腫瘍からなるグループから選択される、請求項２８に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【公表番号】特表２０１０−５０６８２６（Ｐ２０１０−５０６８２６Ａ）
【公表日】平成２２年３月４日（２０１０．３．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５１６７７６（Ｐ２００９−５１６７７６）
【出願日】平成１９年１０月１６日（２００７．１０．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００７／００１１２２
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０４７４７３
【国際公開日】平成２０年４月２４日（２００８．４．２４）
【出願人】（５０２２４０１１３）オンコセラピー・サイエンス株式会社 (142)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年３月４日（２０１０．３．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１０月１６日（２００７．１０．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００７／００１１２２
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０４７４７３
【国際公開日】平成２０年４月２４日（２００８．４．２４）
【出願人】（５０２２４０１１３）オンコセラピー・サイエンス株式会社 (142)
【Ｆターム（参考）】
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