ＭＲＩ造影剤
【課題】化学的・物理的安定性に加えて、優れた血中滞留性及び臓器・組織特異性を発現可能なＭＲＩ造影剤を提供する。
【解決手段】ナノダイヤモンド粒子に磁性元素をイオン注入してなる磁性ナノダイヤモンド粒子に、貴金属ナノ粒子が担持されてなる複合磁性粒子を含有するようにした。
【解決手段】ナノダイヤモンド粒子に磁性元素をイオン注入してなる磁性ナノダイヤモンド粒子に、貴金属ナノ粒子が担持されてなる複合磁性粒子を含有するようにした。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、化学的・物理的安定性に加えて、分子・細胞ラベリングが可能であり、また、優れた血中滞留性及び臓器・組織特異性を発現可能なＭＲＩ造影剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、がん病変の診断及び治療方針の決定に必要な情報を視覚的に読み取ることが可能な画像診断技術として、磁気共鳴現象を利用したＭＲＩ（磁気共鳴画像）法が知られている。ＭＲＩ法においては、がんを始めとする特定の組織をより鮮明に造影するために、ガドリニウム製剤や鉄製剤等の造影剤が使用されることが多い。ガドリニウム造影剤の多くは、主に血流造影剤として利用され、脳血流造影による脳腫瘍の診断等の特殊なケースを除いては、がん診断には利用されない。また、がん診断用造影剤として販売されている唯一のガドリニウム造影剤であるＥＯＢ・プリモビスト（登録商標）や、がん診断用酸化鉄ナノ粒子製剤は、肝臓に積極的に取り込まれることにより腫瘍を発見しようとするものであるため、肝がん以外には適用できないという問題点を有している。
【０００３】
近時、化学的に安定なナノダイヤモンド粒子に磁性元素をイオン注入してなる磁性ナノダイヤモンド粒子をＭＲＩ造影剤に活用する試みがなされている（特許文献１）。ナノダイヤモンドは、化学的に安定で生体内での分解が起こりにくいうえ、物理的にも非常に安定であるので、従来では毒性が高いとして用いることのできなかった元素を含むほとんどの磁性元素を内部に保持して、極めて安全性の高いＭＲＩ造影剤を構成することができる。
【０００４】
しかしながら、当該ＭＲＩ造影剤は、生理的塩濃度での分散性が充分でなく、生体に適用しようとした場合、血液中で凝集して１μｍ以上の粒子径の二次粒子を形成するので、肝臓を始め、脾臓、マクロファージに貪食されやすく、血中滞留性が充分でない。このため、肝臓以外の臓器・組織に取り込ませて、これを造影することは難しい。
【０００５】
したがって、ＭＲＩ法による腫瘍造影法をより汎用性の高いがん診断技術として発展させるために、血中滞留性に優れ、かつ、肝腫瘍のみならず種々の臓器・組織に対して適用できるＭＲＩ造影剤の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００８−７９８２４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで本発明は、化学的・物理的安定性に加えて、血中滞留性及び臓器・組織特異性を発現可能なＭＲＩ造影剤を提供すべく図ったものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、鋭意検討の結果、磁性ナノダイヤモンド粒子の磁気緩和性を損なうことなしに、磁性ナノダイヤモンド粒子に貴金属ナノ粒子を担持させることに成功した。更に、本発明者は、当該貴金属ナノ粒子を、磁性ナノダイヤモンド粒子に機能性物質を結合するための「足場」として利用して、貴金属ナノ粒子を介して磁性ナノダイヤモンド粒子に、種々の高分子化合物や生体由来の標的物質に特異的に結合する物質を固定することに成功し、これにより、磁性ナノダイヤモンド粒子を含有するＭＲＩ造影剤に、血中滞留性や臓器・組織特異性を付与することに成功した。本発明はこれらの知見に基づき完成に至ったものである。
【０００９】
すなわち本発明に係るＭＲＩ造影剤は、ナノダイヤモンド粒子に磁性元素をイオン注入してなる磁性ナノダイヤモンド粒子に、貴金属ナノ粒子が担持されてなる複合磁性粒子を含有することを特徴とする。
【００１０】
前記貴金属ナノ粒子は、金ナノ粒子であることが好ましい。
【００１１】
前記貴金属ナノ粒子には、高分子化合物が結合していてもよい。
【００１２】
前記高分子化合物は、ポリエチレングリコールであることが好ましい。
【００１３】
前記高分子化合物は、メルカプト基を介して前記貴金属ナノ粒子に結合してなることが好ましい。
【００１４】
前記高分子化合物は、水溶液中で酸性、塩基性又は中性を呈する官能基を有していてもよい。
【００１５】
前記貴金属ナノ粒子には、標的物質に対して特異的結合能を有する特異的結合物質が担持されていてもよい。なお、本発明において特異的結合物質とは、標的物質に対して特異的結合能を有するものであれば特に限定されないが、例えば、抗体とそれに対する抗原、リガンドとそれに対するレセプター、糖とそれに対するレクチン等が挙げられる。
【発明の効果】
【００１６】
このような本発明によれば、磁性粒子として化学的・物理的に安定なナノダイヤモンド粒子を用い、これに機能性物質を結合するための「足場」として利用できる貴金属ナノ粒子を担持して、当該貴金属ナノ粒子を介して磁性ナノダイヤモンド粒子に、種々の高分子化合物や生体由来の標的物質に特異的に結合する物質を固定することにより、化学的・物理的安定性に加えて、血中滞留性や臓器・組織特異性を付与したＭＲＩ造影剤を提供することができる。また、貴金属ナノ粒子の担持や高分子化合物等の結合によっても、磁性ナノダイヤモンド粒子の磁気緩和能は損なわれず、Ｔ１短縮能を発現することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】水中におけるＡｕ／Ｍｎ−ＮＤ及び未修飾Ｍｎ−ＮＤのＴ１−強調画像を示すＭＲ画像である。
【図２】ＰＥＧ−Ａｕ／ＮＤの電子顕微鏡写真である。
【図３】ＰＥＧ−Ａｕ／ＮＤ及び未修飾ＮＤを各種分散媒に分散させた状態を示す写真である。
【図４】各種分散媒中におけるＰＥＧ−Ａｕ／ＮＤ及び未修飾ＮＤの粒子サイズを動的光散乱法により測定した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下に本発明を詳述する。
【００１９】
本発明に係るＭＲＩ造影剤は、磁性ナノダイヤモンド粒子に、貴金属ナノ粒子が担持されてなる複合磁性粒子を含有するものである。
【００２０】
＜磁性ナノダイヤモンド粒子＞
前記磁性ナノダイヤモンド粒子は、ナノダイヤモンド粒子に磁性元素をイオン注入することにより得られるものである。
【００２１】
前記ナノダイヤモンド粒子は、爆発法や高温高圧法を用いて製造することができる。当該ナノダイヤモンド粒子の平均粒子径（体積平均径）は、２〜１００ｎｍであることが好ましく、３〜３０ｎｍがより好ましく、４〜１０ｎｍが更に好ましい。なお、イオン注入後の磁性ナノダイヤモンド粒子の平均粒子径も、イオン注入前のものと同様である。１００ｎｍ以上であると、長期間の分散安定性が低下し、２ｎｍ未満であると、製造が困難である。前記ナノダイヤモンド粒子の形状としては特に限定されず、例えば、真球状、板状、針状、紡錘状等が挙げられる。
【００２２】
前記磁性元素としては、例えば、Ｃｒ、Ｍｏ、Ｗ等の６族の元素；Ｍｎ、Ｔｃ、Ｒｅ等の７族の元素；Ｆｅ、Ｒｕ、Ｏｓ等の８族の元素；Ｃｏ、Ｒｈ、Ｉｒ等の９族の元素；Ｎｉ、Ｐｄ、Ｐｔ等の１０族の元素；Ｃｕ、Ａｇ、Ａｕ等の１１族の元素；Ｓｃ、ランタノイド等の３族の元素等が挙げられる。これらの元素は単独で用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。
【００２３】
前記ナノダイヤモンド粒子に磁性元素をイオン注入する方法としては特に限定されず、公知の方法を適宜選択して使用することができるが、例えば、Ｓｉ基板等の平面に塗布したナノダイヤモンド粒子にイオン注入する方法や、粉体のままで撹拌しながら注入を行う粉体注入用の治具を用いて注入する方法等を用いることができる。
【００２４】
イオン注入深度は浅いほうが、磁気反応性が高まるため、例えば１〜２ｎｍ程度が好ましいが、イオン注入エネルギをそれにあわせると通常のイオン注入のエネルギ（数１０〜数１００ｋｅＶ）よりもはるかに低く（数１００〜２０００ｅＶ程度）しなければならないために、イオンビームの発生と輸送が困難となる。したがって、例えば、中間物質をナノダイヤモンド粒子の前段に配置しておき、この中間物質を貫通してエネルギの小さくなったイオンをナノダイヤモンド粒子に照射することが好ましい。
【００２５】
このように磁性元素をイオン注入したナノダイヤモンド粒子を、引き続いて、約７００〜９００℃でアニールする。アニールすることにより、イオン注入によるダイヤモンドの表面欠陥を是正することができ、これにより、注入した磁性元素の固定の確実性を向上することができる。
【００２６】
なお、磁性ナノダイヤモンド粒子に蛍光性を与えれば、ＭＲＩと同時に他の測定装置による検出が可能となるので、診断の精度や質、時間を大幅に改善することができるようになる。そのためには、例えば、前記ナノダイヤモンド粒子に更にプロトンやユーロピウムをイオン注入したり、更に蛍光物質を結合させたり、前記磁性元素そのものに所定の電磁波に対する蛍光性を有するものを用いたりすればよい。このようにプロトンや蛍光物質等をイオン注入する場合は、アニール工程前に行うことが好ましい。
【００２７】
＜貴金属ナノ粒子＞
前記貴金属ナノ粒子としては、例えば、金（Ａｕ）、銀（Ａｇ）、白金（Ｐｔ）、パラジウム（Ｐｄ）、ルテニウム（Ｒｕ）、ロジウム（Ｒｈ）、イリジウム（Ｉｒ）、レニウム（Ｒｅ）等からなるナノ粒子が挙げられる。なかでも、生体内での化学的安定性や、後述する高分子化合物との結合の安定性等の観点から、金ナノ粒子が好ましい。
【００２８】
前記貴金属ナノ粒子の平均粒子径は、例えば１〜２０ｎｍ程度であり、好ましくは１〜１０ｎｍ程度、より好ましくは１〜５ｎｍ程度である。このような粒子径であれば、磁性ナノダイヤモンド粒子に良好に担持でき、かつ、磁性ナノダイヤモンド粒子に機能性物質を結合するための「足場」として充分な表面積が確保できる。なお、当該平均粒子径は電子顕微鏡観察により測定した値である。
【００２９】
＜貴金属ナノ粒子の磁性ナノダイヤモンド粒子への担持＞
前記貴金属ナノ粒子の前記磁性ナノダイヤモンド粒子への担持は、貴金属イオン含有液又は貴金属錯体含有液に、前記磁性ナノダイヤモンド粒子を分散して、放射線、電子線又は超音波を照射することによりなし得る。なお、これらの放射線等の射出によっても、磁性ナノダイヤモンド粒子の磁気緩和能は損なわれない。
【００３０】
前記貴金属イオン含有液は、貴金属イオンを含む水溶液又はアルコール溶液であり、溶媒中で貴金属イオンを遊離する化合物を、例えば、水；メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、ｔ−ブタノール等のアルコール；含水アルコール；塩酸、硫酸、硝酸等の酸等に溶解させることにより調製することができる。なお、前記酸はアルコール等の有機物を含んでいてもよい。前記溶媒中で貴金属イオンを遊離する化合物としては、貴金属の硝酸塩、塩化物、酢酸塩、クエン酸塩、硫酸塩、炭酸塩、酸化物、水酸化物等が挙げられる。前記貴金属が金である場合は、なかでもＨＡｕＣｌ4が好ましい。
【００３１】
前記貴金属錯体含有液としては、前記貴金属イオンに適当な配位子が配位した化合物が、水、前記各種アルコール、含水アルコール等に溶解した溶液が挙げられる。前記配位子は、非共有電子対又は負電荷を持っているものであれば特に限定されず、公知のものから適宜選択することができ、例えば、Ｆ−、Ｃｌ−、Ｂｒ−、Ｉ−等のハロゲン化物イオン、シアン化物イオン、アンモニア、ピリジン等の単座配位子；エチレンジアミン、アセチルアセトンイオン等の二座配位子；エチレンジアミンテトラ酢酸イオン等の六座配位子等が挙げられる。
【００３２】
前記貴金属イオン含有液又は前記貴金属錯体含有液中の貴金属濃度としては特に限定されないが、１μＭ〜１Ｍ程度であるのが好ましく、より好ましくは０．１〜１０ｍＭ程度である。貴金属濃度が高すぎると、得られる貴金属ナノ粒子のサイズが大きくなりすぎたり、貴金属単独の粒子が多量に生成したりすることがある。逆に、貴金属濃度が低すぎると、所望の複合磁性粒子が得られにくくなる。
【００３３】
前記貴金属イオン含有液又は前記貴金属錯体含有液には、更に必要に応じて適宜添加剤を添加してもよい。当該添加剤としては、例えば、ポリビニルアルコール等の水溶性高分子化合物；界面活性剤；アルコール類；テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル等のエーテル類；アルキレングリコール、ポリアルキレングリコール、これらのモノアルキルエーテル又はジアルキルエーテル、グリセリン等のポリオール類；ギ酸、酢酸、プロピオン酸、乳酸、グリコール酸等のカルボン酸類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類等の各種の水混和性有機溶媒等が挙げられる。これらの添加剤は、貴金属イオンの還元反応速度を促進し、生成する貴金属ナノ粒子の大きさを調整するのに有効な場合がある。
【００３４】
前記貴金属イオン含有液又は貴金属錯体含有液中への前記磁性ナノダイヤモンド粒子の添加量は、例えば０．００１〜１重量％程度である。
【００３５】
前記磁性ナノダイヤモンド粒子を分散させた前記貴金属イオン含有液又は貴金属錯体含有液に、超音波を照射するには、例えば、周波数１０ｋＨｚ〜１０ＭＨｚ、出力１Ｗ以上の条件下で照射を行う。当該照射は、例えばアルゴン（Ａｒ）等の不活性ガス置換雰囲気中で行うことが好ましい。前記貴金属が金である場合、好ましい照射条件は、例えば、周波数２００ｋＨｚ、出力２００Ｗ、照射時間３０分間程度である。
【００３６】
前記磁性ナノダイヤモンド粒子を分散させた前記貴金属イオン含有液又は貴金属錯体含有液に照射する電離放射線としては、直接（一次）電離放射線と間接（二次）電離放射線とが挙げられ、直接電離放射線とは電子、陽子、α粒子等の荷電粒子線であり、間接電離放射線とはγ線（電磁波）、Ｘ線、中性子線等の非荷電粒子線である。これらの電離放射線の波長は、例えば１ｎｍ未満であり、好ましくは０．１ｎｍ以下、より好ましくは０．０１ｎｍ以下である。波長が短いほど、大きさが均一で微細な貴金属ナノ粒子が短時間で生成する傾向がある。
【００３７】
前記磁性ナノダイヤモンド粒子を分散させた前記貴金属イオン含有液又は貴金属錯体含有液に、電離放射線を照射する際の吸収線量は、例えば１Ｊ／ｋｇ以上であり、好ましくは１〜１，０００，０００Ｊ／ｋｇである。特に、電離放射線としてγ線を利用する場合、γ線照射は、線量１Ｇｙ以上の条件で実施するのが好ましい。前記貴金属が金である場合、好ましいγ線照射条件は、例えば、放射線源としてコバルト６０γ線源（γ線光量子のエネルギー：１．２５ＭｅＶ）を用いて、線量率約３ｋＧｙ／ｈ、照射時間３時間程度である。
【００３８】
前記磁性ナノダイヤモンド粒子を分散させた前記貴金属イオン含有液又は貴金属錯体含有液に、電子線を照射するには、直線加速器によることが好ましい。前記貴金属が金である場合、好ましい電子線照射条件は、例えば、電子線加速器による電子線（エネルギー１０ＭｅＶ）を、１ＭＧｙ／ｈで２０秒程度の照射とすればよい。
【００３９】
なお、電離放射線や電子線の照射は、磁性ナノダイヤモンド粒子の分散状態を維持するために、溶液を攪拌しながら行うのが好ましいが、超音波照射の場合には、超音波の照射自体が攪拌効果を有するので、攪拌操作は不要である。本発明では電離放射線や電子線の照射と超音波照射とを併用してもよく、併用により、超音波照射の攪拌効果によって良好な分散状態を有する複合磁性粒子を得やすくなる。
【００４０】
前記磁性ナノダイヤモンド粒子への前記貴金属ナノ粒子の担持量は、例えば、磁性ナノダイヤモンド粒子の粒子径が１００ｎｍ以下である場合は、磁性ナノダイヤモンド粒子に対する貴金属ナノ粒子の重量比（貴金属ナノ粒子：磁性ナノダイヤモンド粒子）で、１：１〜１０：１程度であることが好ましい。このような担持量であれば、貴金属ナノ粒子を磁性ナノダイヤモンド粒子に機能性物質を結合するための「足場」として用いて、複合磁性粒子に血中滞留性や臓器・組織特異性を付与することができる。
【００４１】
＜高分子化合物＞
本発明で用いられる複合磁性粒子は、前記貴金属ナノ粒子を介して高分子化合物を結合させることができる。前記高分子化合物として疎水性ポリマーを用いることにより、前記複合磁性粒子に、脂肪組織等への親和性を付与することができ、一方、前記高分子化合物として親水性ポリマーを用いることにより、前記複合磁性粒子に、水溶液や血液中における良好な分散性を付与することができる。また、前記高分子化合物として、親水性セグメントと疎水性セグメントとからなるブロック共重合体を用いてもよい。
【００４２】
前記親水性ポリマーとしては特に限定されないが、例えば、ポリメチレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等のポリアルキレングリコール；ポリビニルアルコール；ポリビニルピロリドン；ポリメタクリル酸等が挙げられる。なかでも、生体適合性が良好である点から、ポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧともいう。）が好適に用いられる。これらポリアルキレングリコールが結合した複合磁性粒子は、高イオン濃度や高濃度タンパク質の水溶液中でも塩析・凝集しない優れた分散性を発現することができる。
【００４３】
前記ポリアルキレングリコールの分子量は、例えば２０００〜３０万程度であり、好ましくは２０００〜２０万程度、より好ましくは５０００〜１５万程度である。このような分子量であれば、前記複合磁性粒子の二次粒子径を、肝臓、脾臓、腎臓、マクロファージ等に取り込まれにくい５０〜１００ｎｍにすることができるので、優れた血中滞留性を付与することができる。このため、所期の臓器・組織への取り込み効率を向上することもできる。
【００４４】
前記高分子化合物は、水溶液中で酸性、塩基性又は中性を呈する官能基を有していてもよい。このようなものであれば、血液中で正若しくは負に帯電する又は帯電しないことにより、前記複合磁性粒子に臓器・組織ごとに異なる親和性を付与することができ、所望の臓器・組織に選択的に取り込ませることが可能となる。
【００４５】
前記酸性を呈する官能基としては、例えば、カルボキシル基、ヒドロキシル基、スルホン酸基等が挙げられる。
【００４６】
前記塩基性を呈する官能基としては、例えば、アミノ基等が挙げられる。
【００４７】
前記中性を呈する官能基としては、例えば、ＮＨＳ基（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基）、チオール基、アセチル基、シアノメチル基、シアノ基等が挙げられる。
【００４８】
前記貴金属ナノ粒子に高分子化合物を結合させる方法としては特に限定されないが、例えば、高分子化合物に貴金属に配位可能な官能基を導入し、当該官能基を有する前記高分子化合物を、貴金属ナノ粒子が担持された前記磁性ナノダイヤモンド粒子を含有する溶液に対して過剰量添加し、これらを室温でインキュベーションすることにより、前記貴金属ナノ粒子に高分子化合物を結合させることができる。なお、前記貴金属ナノ粒子が担持された前記磁性ナノダイヤモンド粒子を含有する溶液としては、放射線等を照射した溶液をそのまま使用してもよいし、得られた複合磁性粒子を分離してから、蒸留水等に再懸濁させた溶液であってもよい。
【００４９】
前記貴金属ナノ粒子が金ナノ粒子である場合、前記インキュベーションの条件は、１６〜２５℃程度で１時間程度が好ましい。このような条件下であれば反応が充分に進行し目的の複合磁性粒子の収量も充分となる。
【００５０】
前記貴金属に配位可能な官能基としては、例えば、メルカプト基、アミノ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、イミノ基、エーテル結合（エーテル基）、カルボン酸残基（カルボキシラート）、リン酸残基、スルフィド残基等が挙げられる。これらのなかでも、金と強い結合を形成することができることより、メルカプト基が好適である。
【００５１】
前記貴金属に配位可能な官能基は、前記高分子化合物の末端又は内部にあれば、その部位や数は特に限定されないが、末端に結合していることが好ましい。一方、前記貴金属に配位可能な官能基が前記高分子化合物の内部に１個以上存在している場合は、前記高分子化合物は分子が折れ曲がった状態で前記複合磁性粒子に結合するため、前記複合磁性粒子から伸びる前記高分子化合物の鎖の本数が多くなる。そしてこの場合、前記高分子化合物を、後述する特異的結合物質のリンカーとして用いれば、より多くの特異的結合物質を前記複合磁性粒子に担持させることができる。
【００５２】
前記高分子化合物として親水性ポリマーが結合している前記複合磁性粒子の一次粒子の平均粒子径は、１０〜１５０ｎｍ程度が好ましい。更に分子・細胞ラベリング剤として用いる場合は、１０〜２０ｎｍ程度がより好ましい。一方、血中造影剤として用いる場合は、３０〜１５０ｎｍ程度がより好ましく、３０〜８０ｎｍ程度が更に好ましい。また、前記高分子化合物が結合した前記複合磁性粒子は凝集している場合もあるが、その二次粒子の平均粒子径は、分子・細胞ラベリング剤として用いる場合は、１０〜１００ｎｍ程度が好ましく、１０〜５０ｎｍ程度がより好ましく、１０〜３０ｎｍ程度が更に好ましい。一方、血中造影剤として用いる場合は、５０〜１５０ｎｍ程度が好ましく、５０〜１００ｎｍ程度がより好ましく、５０〜８０ｎｍ程度が更に好ましい。ここで、一次粒子とは１粒の磁性ナノダイヤモンド粒子に１粒の貴金属ナノ粒子が担持されてなる粒子のことを意味し、二次粒子とは当該一次粒子が複数個、凝集したものを意味する。このような粒子径であれば、分子・細胞ラベリング剤としては、内在性の生物学的現象を阻害する可能性が低くなる。一方、血中造影剤としては、肝臓、脾臓、マクロファージ等に取り込まれにくい、優れた血中滞留性を発現することができ、このため、所期の臓器・組織への取り込み効率を向上することもできる。なお、これら粒子径は動的光散乱法又は電子顕微鏡観察により測定した値である。
【００５３】
＜特異的結合物質＞
本発明で用いられる複合磁性粒子は、前記貴金属ナノ粒子を介して、所定の標的物質に対する特異的結合物質を担持させることも可能である。前記特異的結合物質としては特に限定されず、例えば、所定の抗原と特異的に結合する抗体、所定の糖に特異的に結合するレクチン、所定のレセプターに特異的に結合するリガンド等が挙げられる。このような特異的結合物質が貴金属ナノ粒子に担持されていることにより、前記複合磁性粒子に、臓器・組織特異性を付与することができる。
【００５４】
前記特異的結合物質としてより具体的には、例えば、観察対象の臓器が肝臓であれば、ＬＤＬ受容体等が挙げられ、観察対象の組織ががん組織であれば、ＲＧＤペプチド、各種がん特異的抗体、アプタマー分子等が挙げられる。
【００５５】
前記貴金属ナノ粒子に前記特異的結合物質を担持するには、前記貴金属ナノ粒子と前記特異的結合物質との物理的吸着力、化学的吸着力、化学結合力等を利用して直接的に結合させてもよいが、リンカーを介して間接的に結合させてもよい。リンカーを介して間接的に結合させる場合、前記リンカーとしては上記の各種高分子化合物を用いることができる。なお、分散性の観点からは、ＰＥＧ等の親水性ポリマーからなるリンカーを介して結合していることが好ましい。また、この際、リンカーと特異的結合物質との結合は、上記の水溶液中で酸性、塩基性又は中性を呈する官能基を介して行われてもよい。
【００５６】
＜ＭＲＩ造影剤＞
本発明に係るＭＲＩ造影剤は、前記複合磁性粒子を、例えば、生理食塩水のような溶液に懸濁させることにより得られる。この際の溶液中の複合磁性粒子の濃度は、例えば１〜５０重量％程度である。本発明で用いられる複合磁性粒子に親水性ポリマーが結合している場合、本発明に係るＭＲＩ造影剤に分散剤を配合しなくてもよく、安全性の高い製剤とすることができる。
【００５７】
本発明に係るＭＲＩ造影剤を人体へ投与する場合は、従来のＭＲＩ造影剤の投与方法と同様に、そのまま、又はブドウ糖注射液等に用時混合して静脈注射可能な塩濃度に調整した上で、静脈注射や点滴等により投与すればよい。また投与量も市販鉄製ＭＲＩ用造影剤と同程度とすればよい。
【実施例】
【００５８】
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
【００５９】
＜磁性ナノダイヤモンド粒子の作製＞
爆発法を用いて製造した平均粒子径４ｎｍのナノダイヤモンド粒子に、イオン注入装置を用いてマンガンのイオン注入を行った。ここでは、ナノダイヤモンド粒子にエネルギ１００ｋｅＶのＭｎイオンを１．０×１０１６／ｃｍ２注入した。イオン注入後、窒素雰囲気下で、ナノダイヤモンド粒子を約７００℃で所定時間加熱してアニーリングを行った後、４２５℃で所定時間空気酸化を行い、磁性ナノダイヤモンド粒子を作製した。
【００６０】
＜Ａｕ／Ｍｎ−ＮＤの作製＞
得られた磁性ナノダイヤモンド粒子（以下、Ｍｎ−ＮＤという。）を、反応バッファー（０．５ｍＭ ＨＡｕＣｌ４、４．１２５ｍＭ ２−プロパノール、１０ｇ／Ｌ ポリビニルアルコール（ＰＶＡ））中に０．１ｇ／Ｌになるように懸濁し、ガラスバイアルへ移した。その後、バイアルに対し、加速器電子線からの電子線（加速電圧４．８ＭｅＶ）を表面線量６ｋＧｙとなるよう照射し、Ｍｎ−ＮＤ表面に金ナノ粒子を析出させて、Ａｕ／Ｍｎ−ＮＤを作製した。
【００６１】
＜Ａｕ／Ｍｎ−ＮＤの造影剤としての適性評価＞
作製したＡｕ／Ｍｎ−ＮＤ及び未修飾Ｍｎ−ＮＤを、各々超純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ ｗａｔｅｒ）中に１００μｇ／ｍＬの濃度で懸濁し、下記の条件下において、ＮＲＩ測定装置を用いてＴ１−強調画像を計測し、ＭＲ画像における造影効果を評価した。得られた画像を図１に示す。
【００６２】
ＭＲＩ測定装置：ＤＳファーマバイオメディカル社製、ＭＲｍｉｎｉＳＡ
繰返時間：５００ｍｓ
エコー時間：９ｍｓ
積算回数：３回
データサイズ：１２８×３３６
【００６３】
図１に示すように、Ａｕ／Ｍｎ−ＮＤは未修飾Ｍｎ−ＮＤと同じ濃度で同等のＴ１短縮能を示した。このことから、Ａｕの担持によっても、Ｍｎ−ＮＤの磁気緩和能は損なわれず、得られたＡｕ／Ｍｎ−ＮＤはＭＲＩ造影剤として有効に機能しうることが示された。
【００６４】
以下の試験においては、Ｍｎ−ＮＤに代えて、Ｍｎがイオン注入されていないＮＤを使用したが、Ｍｎ−ＮＤもＮＤと同様な物性を示すことが予想される。
【００６５】
＜ＰＥＧ−Ａｕ／ＮＤの作製＞
金ナノ粒子担持ＮＤ（以下、Ａｕ／ＮＤという。）を遠心操作により沈殿させ、上清を除去した。沈殿に対し、モル比でＡｕ／ＮＤ：ＰＥＧ＝１：１０４となるようにＳＨ修飾ＰＥＧ（ＰＥＧ−ＳＨ，分子量５ｋＤａ，日本油脂社製）を添加した後、水浴型超音波照射装置（ブランソン社製）にて超音波を５分照射することにより粒子を分散させて、Ａｕ／ＮＤの金ナノ粒子にＰＥＧを結合させた。
【００６６】
作製したＰＥＧ−Ａｕ／ＮＤ溶液を、１，０００倍量の超純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ ｗａｔｅｒ）に対し、Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標）透析膜（分画分子量１，０００ｋＤａ，スペクトラム・ラボラトリーズ社製）で２回透析を行うことにより、未反応のＰＥＧ−ＳＨを除去した。精製後のサンプルに対しては、室温でＨＩＴＡＣＨＩ Ｈ−８１００（日立製作所社製）による電子顕微鏡観察を行った。得られた電子顕微鏡写真を図２に示す。図２より、ＮＤとＡｕが複合化していることが確認された。
【００６７】
＜ＰＥＧ−Ａｕ／ＮＤの分散性評価＞
作製したＰＥＧ−Ａｕ／ＮＤ及び未修飾ＮＤを、各々超純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ ｗａｔｅｒ）、ＰＢＳ、牛胎児血清（ＦＣＳ）中に懸濁し、２時間室温で静置した。その後の外観を図３に示す。また、これらの粒子サイズを、Ｚ−ｓｉｚｅｒ ３０００−ＨＳ（マルバーン社製）を用いた動的光散乱法により評価した。評価結果を図４に示す。なお、図４中、「ｎｍ」はピークトップの二次粒子径を示す。
【００６８】
図３に示すように、ＰＥＧ−Ａｕ／ＮＤ群は、どのような溶液中でも高い透明度を維持していた。これに対してＮＤ群は、ＰＢＳ中では沈澱し、ＦＣＳ中に懸濁した場合は濁った溶液となった。また、図４に示すように、ＰＥＧ−Ａｕ／ＮＤ群はどのような溶液中でも約１００ｎｍの二次粒子径を維持していた。一方、ＮＤ群はＰＢＳ及びＦＣＳ中では凝集している可能性が示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明に係るＭＲＩ造影剤は、化学的・物理的安定性に加えて、優れた血中滞留性や臓器・組織特異性を有するので、肝腫瘍以外の組織にも適用可能である。
【技術分野】
【０００１】
この発明は、化学的・物理的安定性に加えて、分子・細胞ラベリングが可能であり、また、優れた血中滞留性及び臓器・組織特異性を発現可能なＭＲＩ造影剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、がん病変の診断及び治療方針の決定に必要な情報を視覚的に読み取ることが可能な画像診断技術として、磁気共鳴現象を利用したＭＲＩ（磁気共鳴画像）法が知られている。ＭＲＩ法においては、がんを始めとする特定の組織をより鮮明に造影するために、ガドリニウム製剤や鉄製剤等の造影剤が使用されることが多い。ガドリニウム造影剤の多くは、主に血流造影剤として利用され、脳血流造影による脳腫瘍の診断等の特殊なケースを除いては、がん診断には利用されない。また、がん診断用造影剤として販売されている唯一のガドリニウム造影剤であるＥＯＢ・プリモビスト（登録商標）や、がん診断用酸化鉄ナノ粒子製剤は、肝臓に積極的に取り込まれることにより腫瘍を発見しようとするものであるため、肝がん以外には適用できないという問題点を有している。
【０００３】
近時、化学的に安定なナノダイヤモンド粒子に磁性元素をイオン注入してなる磁性ナノダイヤモンド粒子をＭＲＩ造影剤に活用する試みがなされている（特許文献１）。ナノダイヤモンドは、化学的に安定で生体内での分解が起こりにくいうえ、物理的にも非常に安定であるので、従来では毒性が高いとして用いることのできなかった元素を含むほとんどの磁性元素を内部に保持して、極めて安全性の高いＭＲＩ造影剤を構成することができる。
【０００４】
しかしながら、当該ＭＲＩ造影剤は、生理的塩濃度での分散性が充分でなく、生体に適用しようとした場合、血液中で凝集して１μｍ以上の粒子径の二次粒子を形成するので、肝臓を始め、脾臓、マクロファージに貪食されやすく、血中滞留性が充分でない。このため、肝臓以外の臓器・組織に取り込ませて、これを造影することは難しい。
【０００５】
したがって、ＭＲＩ法による腫瘍造影法をより汎用性の高いがん診断技術として発展させるために、血中滞留性に優れ、かつ、肝腫瘍のみならず種々の臓器・組織に対して適用できるＭＲＩ造影剤の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００８−７９８２４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで本発明は、化学的・物理的安定性に加えて、血中滞留性及び臓器・組織特異性を発現可能なＭＲＩ造影剤を提供すべく図ったものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、鋭意検討の結果、磁性ナノダイヤモンド粒子の磁気緩和性を損なうことなしに、磁性ナノダイヤモンド粒子に貴金属ナノ粒子を担持させることに成功した。更に、本発明者は、当該貴金属ナノ粒子を、磁性ナノダイヤモンド粒子に機能性物質を結合するための「足場」として利用して、貴金属ナノ粒子を介して磁性ナノダイヤモンド粒子に、種々の高分子化合物や生体由来の標的物質に特異的に結合する物質を固定することに成功し、これにより、磁性ナノダイヤモンド粒子を含有するＭＲＩ造影剤に、血中滞留性や臓器・組織特異性を付与することに成功した。本発明はこれらの知見に基づき完成に至ったものである。
【０００９】
すなわち本発明に係るＭＲＩ造影剤は、ナノダイヤモンド粒子に磁性元素をイオン注入してなる磁性ナノダイヤモンド粒子に、貴金属ナノ粒子が担持されてなる複合磁性粒子を含有することを特徴とする。
【００１０】
前記貴金属ナノ粒子は、金ナノ粒子であることが好ましい。
【００１１】
前記貴金属ナノ粒子には、高分子化合物が結合していてもよい。
【００１２】
前記高分子化合物は、ポリエチレングリコールであることが好ましい。
【００１３】
前記高分子化合物は、メルカプト基を介して前記貴金属ナノ粒子に結合してなることが好ましい。
【００１４】
前記高分子化合物は、水溶液中で酸性、塩基性又は中性を呈する官能基を有していてもよい。
【００１５】
前記貴金属ナノ粒子には、標的物質に対して特異的結合能を有する特異的結合物質が担持されていてもよい。なお、本発明において特異的結合物質とは、標的物質に対して特異的結合能を有するものであれば特に限定されないが、例えば、抗体とそれに対する抗原、リガンドとそれに対するレセプター、糖とそれに対するレクチン等が挙げられる。
【発明の効果】
【００１６】
このような本発明によれば、磁性粒子として化学的・物理的に安定なナノダイヤモンド粒子を用い、これに機能性物質を結合するための「足場」として利用できる貴金属ナノ粒子を担持して、当該貴金属ナノ粒子を介して磁性ナノダイヤモンド粒子に、種々の高分子化合物や生体由来の標的物質に特異的に結合する物質を固定することにより、化学的・物理的安定性に加えて、血中滞留性や臓器・組織特異性を付与したＭＲＩ造影剤を提供することができる。また、貴金属ナノ粒子の担持や高分子化合物等の結合によっても、磁性ナノダイヤモンド粒子の磁気緩和能は損なわれず、Ｔ１短縮能を発現することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】水中におけるＡｕ／Ｍｎ−ＮＤ及び未修飾Ｍｎ−ＮＤのＴ１−強調画像を示すＭＲ画像である。
【図２】ＰＥＧ−Ａｕ／ＮＤの電子顕微鏡写真である。
【図３】ＰＥＧ−Ａｕ／ＮＤ及び未修飾ＮＤを各種分散媒に分散させた状態を示す写真である。
【図４】各種分散媒中におけるＰＥＧ−Ａｕ／ＮＤ及び未修飾ＮＤの粒子サイズを動的光散乱法により測定した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下に本発明を詳述する。
【００１９】
本発明に係るＭＲＩ造影剤は、磁性ナノダイヤモンド粒子に、貴金属ナノ粒子が担持されてなる複合磁性粒子を含有するものである。
【００２０】
＜磁性ナノダイヤモンド粒子＞
前記磁性ナノダイヤモンド粒子は、ナノダイヤモンド粒子に磁性元素をイオン注入することにより得られるものである。
【００２１】
前記ナノダイヤモンド粒子は、爆発法や高温高圧法を用いて製造することができる。当該ナノダイヤモンド粒子の平均粒子径（体積平均径）は、２〜１００ｎｍであることが好ましく、３〜３０ｎｍがより好ましく、４〜１０ｎｍが更に好ましい。なお、イオン注入後の磁性ナノダイヤモンド粒子の平均粒子径も、イオン注入前のものと同様である。１００ｎｍ以上であると、長期間の分散安定性が低下し、２ｎｍ未満であると、製造が困難である。前記ナノダイヤモンド粒子の形状としては特に限定されず、例えば、真球状、板状、針状、紡錘状等が挙げられる。
【００２２】
前記磁性元素としては、例えば、Ｃｒ、Ｍｏ、Ｗ等の６族の元素；Ｍｎ、Ｔｃ、Ｒｅ等の７族の元素；Ｆｅ、Ｒｕ、Ｏｓ等の８族の元素；Ｃｏ、Ｒｈ、Ｉｒ等の９族の元素；Ｎｉ、Ｐｄ、Ｐｔ等の１０族の元素；Ｃｕ、Ａｇ、Ａｕ等の１１族の元素；Ｓｃ、ランタノイド等の３族の元素等が挙げられる。これらの元素は単独で用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。
【００２３】
前記ナノダイヤモンド粒子に磁性元素をイオン注入する方法としては特に限定されず、公知の方法を適宜選択して使用することができるが、例えば、Ｓｉ基板等の平面に塗布したナノダイヤモンド粒子にイオン注入する方法や、粉体のままで撹拌しながら注入を行う粉体注入用の治具を用いて注入する方法等を用いることができる。
【００２４】
イオン注入深度は浅いほうが、磁気反応性が高まるため、例えば１〜２ｎｍ程度が好ましいが、イオン注入エネルギをそれにあわせると通常のイオン注入のエネルギ（数１０〜数１００ｋｅＶ）よりもはるかに低く（数１００〜２０００ｅＶ程度）しなければならないために、イオンビームの発生と輸送が困難となる。したがって、例えば、中間物質をナノダイヤモンド粒子の前段に配置しておき、この中間物質を貫通してエネルギの小さくなったイオンをナノダイヤモンド粒子に照射することが好ましい。
【００２５】
このように磁性元素をイオン注入したナノダイヤモンド粒子を、引き続いて、約７００〜９００℃でアニールする。アニールすることにより、イオン注入によるダイヤモンドの表面欠陥を是正することができ、これにより、注入した磁性元素の固定の確実性を向上することができる。
【００２６】
なお、磁性ナノダイヤモンド粒子に蛍光性を与えれば、ＭＲＩと同時に他の測定装置による検出が可能となるので、診断の精度や質、時間を大幅に改善することができるようになる。そのためには、例えば、前記ナノダイヤモンド粒子に更にプロトンやユーロピウムをイオン注入したり、更に蛍光物質を結合させたり、前記磁性元素そのものに所定の電磁波に対する蛍光性を有するものを用いたりすればよい。このようにプロトンや蛍光物質等をイオン注入する場合は、アニール工程前に行うことが好ましい。
【００２７】
＜貴金属ナノ粒子＞
前記貴金属ナノ粒子としては、例えば、金（Ａｕ）、銀（Ａｇ）、白金（Ｐｔ）、パラジウム（Ｐｄ）、ルテニウム（Ｒｕ）、ロジウム（Ｒｈ）、イリジウム（Ｉｒ）、レニウム（Ｒｅ）等からなるナノ粒子が挙げられる。なかでも、生体内での化学的安定性や、後述する高分子化合物との結合の安定性等の観点から、金ナノ粒子が好ましい。
【００２８】
前記貴金属ナノ粒子の平均粒子径は、例えば１〜２０ｎｍ程度であり、好ましくは１〜１０ｎｍ程度、より好ましくは１〜５ｎｍ程度である。このような粒子径であれば、磁性ナノダイヤモンド粒子に良好に担持でき、かつ、磁性ナノダイヤモンド粒子に機能性物質を結合するための「足場」として充分な表面積が確保できる。なお、当該平均粒子径は電子顕微鏡観察により測定した値である。
【００２９】
＜貴金属ナノ粒子の磁性ナノダイヤモンド粒子への担持＞
前記貴金属ナノ粒子の前記磁性ナノダイヤモンド粒子への担持は、貴金属イオン含有液又は貴金属錯体含有液に、前記磁性ナノダイヤモンド粒子を分散して、放射線、電子線又は超音波を照射することによりなし得る。なお、これらの放射線等の射出によっても、磁性ナノダイヤモンド粒子の磁気緩和能は損なわれない。
【００３０】
前記貴金属イオン含有液は、貴金属イオンを含む水溶液又はアルコール溶液であり、溶媒中で貴金属イオンを遊離する化合物を、例えば、水；メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、ｔ−ブタノール等のアルコール；含水アルコール；塩酸、硫酸、硝酸等の酸等に溶解させることにより調製することができる。なお、前記酸はアルコール等の有機物を含んでいてもよい。前記溶媒中で貴金属イオンを遊離する化合物としては、貴金属の硝酸塩、塩化物、酢酸塩、クエン酸塩、硫酸塩、炭酸塩、酸化物、水酸化物等が挙げられる。前記貴金属が金である場合は、なかでもＨＡｕＣｌ4が好ましい。
【００３１】
前記貴金属錯体含有液としては、前記貴金属イオンに適当な配位子が配位した化合物が、水、前記各種アルコール、含水アルコール等に溶解した溶液が挙げられる。前記配位子は、非共有電子対又は負電荷を持っているものであれば特に限定されず、公知のものから適宜選択することができ、例えば、Ｆ−、Ｃｌ−、Ｂｒ−、Ｉ−等のハロゲン化物イオン、シアン化物イオン、アンモニア、ピリジン等の単座配位子；エチレンジアミン、アセチルアセトンイオン等の二座配位子；エチレンジアミンテトラ酢酸イオン等の六座配位子等が挙げられる。
【００３２】
前記貴金属イオン含有液又は前記貴金属錯体含有液中の貴金属濃度としては特に限定されないが、１μＭ〜１Ｍ程度であるのが好ましく、より好ましくは０．１〜１０ｍＭ程度である。貴金属濃度が高すぎると、得られる貴金属ナノ粒子のサイズが大きくなりすぎたり、貴金属単独の粒子が多量に生成したりすることがある。逆に、貴金属濃度が低すぎると、所望の複合磁性粒子が得られにくくなる。
【００３３】
前記貴金属イオン含有液又は前記貴金属錯体含有液には、更に必要に応じて適宜添加剤を添加してもよい。当該添加剤としては、例えば、ポリビニルアルコール等の水溶性高分子化合物；界面活性剤；アルコール類；テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル等のエーテル類；アルキレングリコール、ポリアルキレングリコール、これらのモノアルキルエーテル又はジアルキルエーテル、グリセリン等のポリオール類；ギ酸、酢酸、プロピオン酸、乳酸、グリコール酸等のカルボン酸類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類等の各種の水混和性有機溶媒等が挙げられる。これらの添加剤は、貴金属イオンの還元反応速度を促進し、生成する貴金属ナノ粒子の大きさを調整するのに有効な場合がある。
【００３４】
前記貴金属イオン含有液又は貴金属錯体含有液中への前記磁性ナノダイヤモンド粒子の添加量は、例えば０．００１〜１重量％程度である。
【００３５】
前記磁性ナノダイヤモンド粒子を分散させた前記貴金属イオン含有液又は貴金属錯体含有液に、超音波を照射するには、例えば、周波数１０ｋＨｚ〜１０ＭＨｚ、出力１Ｗ以上の条件下で照射を行う。当該照射は、例えばアルゴン（Ａｒ）等の不活性ガス置換雰囲気中で行うことが好ましい。前記貴金属が金である場合、好ましい照射条件は、例えば、周波数２００ｋＨｚ、出力２００Ｗ、照射時間３０分間程度である。
【００３６】
前記磁性ナノダイヤモンド粒子を分散させた前記貴金属イオン含有液又は貴金属錯体含有液に照射する電離放射線としては、直接（一次）電離放射線と間接（二次）電離放射線とが挙げられ、直接電離放射線とは電子、陽子、α粒子等の荷電粒子線であり、間接電離放射線とはγ線（電磁波）、Ｘ線、中性子線等の非荷電粒子線である。これらの電離放射線の波長は、例えば１ｎｍ未満であり、好ましくは０．１ｎｍ以下、より好ましくは０．０１ｎｍ以下である。波長が短いほど、大きさが均一で微細な貴金属ナノ粒子が短時間で生成する傾向がある。
【００３７】
前記磁性ナノダイヤモンド粒子を分散させた前記貴金属イオン含有液又は貴金属錯体含有液に、電離放射線を照射する際の吸収線量は、例えば１Ｊ／ｋｇ以上であり、好ましくは１〜１，０００，０００Ｊ／ｋｇである。特に、電離放射線としてγ線を利用する場合、γ線照射は、線量１Ｇｙ以上の条件で実施するのが好ましい。前記貴金属が金である場合、好ましいγ線照射条件は、例えば、放射線源としてコバルト６０γ線源（γ線光量子のエネルギー：１．２５ＭｅＶ）を用いて、線量率約３ｋＧｙ／ｈ、照射時間３時間程度である。
【００３８】
前記磁性ナノダイヤモンド粒子を分散させた前記貴金属イオン含有液又は貴金属錯体含有液に、電子線を照射するには、直線加速器によることが好ましい。前記貴金属が金である場合、好ましい電子線照射条件は、例えば、電子線加速器による電子線（エネルギー１０ＭｅＶ）を、１ＭＧｙ／ｈで２０秒程度の照射とすればよい。
【００３９】
なお、電離放射線や電子線の照射は、磁性ナノダイヤモンド粒子の分散状態を維持するために、溶液を攪拌しながら行うのが好ましいが、超音波照射の場合には、超音波の照射自体が攪拌効果を有するので、攪拌操作は不要である。本発明では電離放射線や電子線の照射と超音波照射とを併用してもよく、併用により、超音波照射の攪拌効果によって良好な分散状態を有する複合磁性粒子を得やすくなる。
【００４０】
前記磁性ナノダイヤモンド粒子への前記貴金属ナノ粒子の担持量は、例えば、磁性ナノダイヤモンド粒子の粒子径が１００ｎｍ以下である場合は、磁性ナノダイヤモンド粒子に対する貴金属ナノ粒子の重量比（貴金属ナノ粒子：磁性ナノダイヤモンド粒子）で、１：１〜１０：１程度であることが好ましい。このような担持量であれば、貴金属ナノ粒子を磁性ナノダイヤモンド粒子に機能性物質を結合するための「足場」として用いて、複合磁性粒子に血中滞留性や臓器・組織特異性を付与することができる。
【００４１】
＜高分子化合物＞
本発明で用いられる複合磁性粒子は、前記貴金属ナノ粒子を介して高分子化合物を結合させることができる。前記高分子化合物として疎水性ポリマーを用いることにより、前記複合磁性粒子に、脂肪組織等への親和性を付与することができ、一方、前記高分子化合物として親水性ポリマーを用いることにより、前記複合磁性粒子に、水溶液や血液中における良好な分散性を付与することができる。また、前記高分子化合物として、親水性セグメントと疎水性セグメントとからなるブロック共重合体を用いてもよい。
【００４２】
前記親水性ポリマーとしては特に限定されないが、例えば、ポリメチレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等のポリアルキレングリコール；ポリビニルアルコール；ポリビニルピロリドン；ポリメタクリル酸等が挙げられる。なかでも、生体適合性が良好である点から、ポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧともいう。）が好適に用いられる。これらポリアルキレングリコールが結合した複合磁性粒子は、高イオン濃度や高濃度タンパク質の水溶液中でも塩析・凝集しない優れた分散性を発現することができる。
【００４３】
前記ポリアルキレングリコールの分子量は、例えば２０００〜３０万程度であり、好ましくは２０００〜２０万程度、より好ましくは５０００〜１５万程度である。このような分子量であれば、前記複合磁性粒子の二次粒子径を、肝臓、脾臓、腎臓、マクロファージ等に取り込まれにくい５０〜１００ｎｍにすることができるので、優れた血中滞留性を付与することができる。このため、所期の臓器・組織への取り込み効率を向上することもできる。
【００４４】
前記高分子化合物は、水溶液中で酸性、塩基性又は中性を呈する官能基を有していてもよい。このようなものであれば、血液中で正若しくは負に帯電する又は帯電しないことにより、前記複合磁性粒子に臓器・組織ごとに異なる親和性を付与することができ、所望の臓器・組織に選択的に取り込ませることが可能となる。
【００４５】
前記酸性を呈する官能基としては、例えば、カルボキシル基、ヒドロキシル基、スルホン酸基等が挙げられる。
【００４６】
前記塩基性を呈する官能基としては、例えば、アミノ基等が挙げられる。
【００４７】
前記中性を呈する官能基としては、例えば、ＮＨＳ基（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基）、チオール基、アセチル基、シアノメチル基、シアノ基等が挙げられる。
【００４８】
前記貴金属ナノ粒子に高分子化合物を結合させる方法としては特に限定されないが、例えば、高分子化合物に貴金属に配位可能な官能基を導入し、当該官能基を有する前記高分子化合物を、貴金属ナノ粒子が担持された前記磁性ナノダイヤモンド粒子を含有する溶液に対して過剰量添加し、これらを室温でインキュベーションすることにより、前記貴金属ナノ粒子に高分子化合物を結合させることができる。なお、前記貴金属ナノ粒子が担持された前記磁性ナノダイヤモンド粒子を含有する溶液としては、放射線等を照射した溶液をそのまま使用してもよいし、得られた複合磁性粒子を分離してから、蒸留水等に再懸濁させた溶液であってもよい。
【００４９】
前記貴金属ナノ粒子が金ナノ粒子である場合、前記インキュベーションの条件は、１６〜２５℃程度で１時間程度が好ましい。このような条件下であれば反応が充分に進行し目的の複合磁性粒子の収量も充分となる。
【００５０】
前記貴金属に配位可能な官能基としては、例えば、メルカプト基、アミノ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、イミノ基、エーテル結合（エーテル基）、カルボン酸残基（カルボキシラート）、リン酸残基、スルフィド残基等が挙げられる。これらのなかでも、金と強い結合を形成することができることより、メルカプト基が好適である。
【００５１】
前記貴金属に配位可能な官能基は、前記高分子化合物の末端又は内部にあれば、その部位や数は特に限定されないが、末端に結合していることが好ましい。一方、前記貴金属に配位可能な官能基が前記高分子化合物の内部に１個以上存在している場合は、前記高分子化合物は分子が折れ曲がった状態で前記複合磁性粒子に結合するため、前記複合磁性粒子から伸びる前記高分子化合物の鎖の本数が多くなる。そしてこの場合、前記高分子化合物を、後述する特異的結合物質のリンカーとして用いれば、より多くの特異的結合物質を前記複合磁性粒子に担持させることができる。
【００５２】
前記高分子化合物として親水性ポリマーが結合している前記複合磁性粒子の一次粒子の平均粒子径は、１０〜１５０ｎｍ程度が好ましい。更に分子・細胞ラベリング剤として用いる場合は、１０〜２０ｎｍ程度がより好ましい。一方、血中造影剤として用いる場合は、３０〜１５０ｎｍ程度がより好ましく、３０〜８０ｎｍ程度が更に好ましい。また、前記高分子化合物が結合した前記複合磁性粒子は凝集している場合もあるが、その二次粒子の平均粒子径は、分子・細胞ラベリング剤として用いる場合は、１０〜１００ｎｍ程度が好ましく、１０〜５０ｎｍ程度がより好ましく、１０〜３０ｎｍ程度が更に好ましい。一方、血中造影剤として用いる場合は、５０〜１５０ｎｍ程度が好ましく、５０〜１００ｎｍ程度がより好ましく、５０〜８０ｎｍ程度が更に好ましい。ここで、一次粒子とは１粒の磁性ナノダイヤモンド粒子に１粒の貴金属ナノ粒子が担持されてなる粒子のことを意味し、二次粒子とは当該一次粒子が複数個、凝集したものを意味する。このような粒子径であれば、分子・細胞ラベリング剤としては、内在性の生物学的現象を阻害する可能性が低くなる。一方、血中造影剤としては、肝臓、脾臓、マクロファージ等に取り込まれにくい、優れた血中滞留性を発現することができ、このため、所期の臓器・組織への取り込み効率を向上することもできる。なお、これら粒子径は動的光散乱法又は電子顕微鏡観察により測定した値である。
【００５３】
＜特異的結合物質＞
本発明で用いられる複合磁性粒子は、前記貴金属ナノ粒子を介して、所定の標的物質に対する特異的結合物質を担持させることも可能である。前記特異的結合物質としては特に限定されず、例えば、所定の抗原と特異的に結合する抗体、所定の糖に特異的に結合するレクチン、所定のレセプターに特異的に結合するリガンド等が挙げられる。このような特異的結合物質が貴金属ナノ粒子に担持されていることにより、前記複合磁性粒子に、臓器・組織特異性を付与することができる。
【００５４】
前記特異的結合物質としてより具体的には、例えば、観察対象の臓器が肝臓であれば、ＬＤＬ受容体等が挙げられ、観察対象の組織ががん組織であれば、ＲＧＤペプチド、各種がん特異的抗体、アプタマー分子等が挙げられる。
【００５５】
前記貴金属ナノ粒子に前記特異的結合物質を担持するには、前記貴金属ナノ粒子と前記特異的結合物質との物理的吸着力、化学的吸着力、化学結合力等を利用して直接的に結合させてもよいが、リンカーを介して間接的に結合させてもよい。リンカーを介して間接的に結合させる場合、前記リンカーとしては上記の各種高分子化合物を用いることができる。なお、分散性の観点からは、ＰＥＧ等の親水性ポリマーからなるリンカーを介して結合していることが好ましい。また、この際、リンカーと特異的結合物質との結合は、上記の水溶液中で酸性、塩基性又は中性を呈する官能基を介して行われてもよい。
【００５６】
＜ＭＲＩ造影剤＞
本発明に係るＭＲＩ造影剤は、前記複合磁性粒子を、例えば、生理食塩水のような溶液に懸濁させることにより得られる。この際の溶液中の複合磁性粒子の濃度は、例えば１〜５０重量％程度である。本発明で用いられる複合磁性粒子に親水性ポリマーが結合している場合、本発明に係るＭＲＩ造影剤に分散剤を配合しなくてもよく、安全性の高い製剤とすることができる。
【００５７】
本発明に係るＭＲＩ造影剤を人体へ投与する場合は、従来のＭＲＩ造影剤の投与方法と同様に、そのまま、又はブドウ糖注射液等に用時混合して静脈注射可能な塩濃度に調整した上で、静脈注射や点滴等により投与すればよい。また投与量も市販鉄製ＭＲＩ用造影剤と同程度とすればよい。
【実施例】
【００５８】
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
【００５９】
＜磁性ナノダイヤモンド粒子の作製＞
爆発法を用いて製造した平均粒子径４ｎｍのナノダイヤモンド粒子に、イオン注入装置を用いてマンガンのイオン注入を行った。ここでは、ナノダイヤモンド粒子にエネルギ１００ｋｅＶのＭｎイオンを１．０×１０１６／ｃｍ２注入した。イオン注入後、窒素雰囲気下で、ナノダイヤモンド粒子を約７００℃で所定時間加熱してアニーリングを行った後、４２５℃で所定時間空気酸化を行い、磁性ナノダイヤモンド粒子を作製した。
【００６０】
＜Ａｕ／Ｍｎ−ＮＤの作製＞
得られた磁性ナノダイヤモンド粒子（以下、Ｍｎ−ＮＤという。）を、反応バッファー（０．５ｍＭ ＨＡｕＣｌ４、４．１２５ｍＭ ２−プロパノール、１０ｇ／Ｌ ポリビニルアルコール（ＰＶＡ））中に０．１ｇ／Ｌになるように懸濁し、ガラスバイアルへ移した。その後、バイアルに対し、加速器電子線からの電子線（加速電圧４．８ＭｅＶ）を表面線量６ｋＧｙとなるよう照射し、Ｍｎ−ＮＤ表面に金ナノ粒子を析出させて、Ａｕ／Ｍｎ−ＮＤを作製した。
【００６１】
＜Ａｕ／Ｍｎ−ＮＤの造影剤としての適性評価＞
作製したＡｕ／Ｍｎ−ＮＤ及び未修飾Ｍｎ−ＮＤを、各々超純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ ｗａｔｅｒ）中に１００μｇ／ｍＬの濃度で懸濁し、下記の条件下において、ＮＲＩ測定装置を用いてＴ１−強調画像を計測し、ＭＲ画像における造影効果を評価した。得られた画像を図１に示す。
【００６２】
ＭＲＩ測定装置：ＤＳファーマバイオメディカル社製、ＭＲｍｉｎｉＳＡ
繰返時間：５００ｍｓ
エコー時間：９ｍｓ
積算回数：３回
データサイズ：１２８×３３６
【００６３】
図１に示すように、Ａｕ／Ｍｎ−ＮＤは未修飾Ｍｎ−ＮＤと同じ濃度で同等のＴ１短縮能を示した。このことから、Ａｕの担持によっても、Ｍｎ−ＮＤの磁気緩和能は損なわれず、得られたＡｕ／Ｍｎ−ＮＤはＭＲＩ造影剤として有効に機能しうることが示された。
【００６４】
以下の試験においては、Ｍｎ−ＮＤに代えて、Ｍｎがイオン注入されていないＮＤを使用したが、Ｍｎ−ＮＤもＮＤと同様な物性を示すことが予想される。
【００６５】
＜ＰＥＧ−Ａｕ／ＮＤの作製＞
金ナノ粒子担持ＮＤ（以下、Ａｕ／ＮＤという。）を遠心操作により沈殿させ、上清を除去した。沈殿に対し、モル比でＡｕ／ＮＤ：ＰＥＧ＝１：１０４となるようにＳＨ修飾ＰＥＧ（ＰＥＧ−ＳＨ，分子量５ｋＤａ，日本油脂社製）を添加した後、水浴型超音波照射装置（ブランソン社製）にて超音波を５分照射することにより粒子を分散させて、Ａｕ／ＮＤの金ナノ粒子にＰＥＧを結合させた。
【００６６】
作製したＰＥＧ−Ａｕ／ＮＤ溶液を、１，０００倍量の超純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ ｗａｔｅｒ）に対し、Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標）透析膜（分画分子量１，０００ｋＤａ，スペクトラム・ラボラトリーズ社製）で２回透析を行うことにより、未反応のＰＥＧ−ＳＨを除去した。精製後のサンプルに対しては、室温でＨＩＴＡＣＨＩ Ｈ−８１００（日立製作所社製）による電子顕微鏡観察を行った。得られた電子顕微鏡写真を図２に示す。図２より、ＮＤとＡｕが複合化していることが確認された。
【００６７】
＜ＰＥＧ−Ａｕ／ＮＤの分散性評価＞
作製したＰＥＧ−Ａｕ／ＮＤ及び未修飾ＮＤを、各々超純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ ｗａｔｅｒ）、ＰＢＳ、牛胎児血清（ＦＣＳ）中に懸濁し、２時間室温で静置した。その後の外観を図３に示す。また、これらの粒子サイズを、Ｚ−ｓｉｚｅｒ ３０００−ＨＳ（マルバーン社製）を用いた動的光散乱法により評価した。評価結果を図４に示す。なお、図４中、「ｎｍ」はピークトップの二次粒子径を示す。
【００６８】
図３に示すように、ＰＥＧ−Ａｕ／ＮＤ群は、どのような溶液中でも高い透明度を維持していた。これに対してＮＤ群は、ＰＢＳ中では沈澱し、ＦＣＳ中に懸濁した場合は濁った溶液となった。また、図４に示すように、ＰＥＧ−Ａｕ／ＮＤ群はどのような溶液中でも約１００ｎｍの二次粒子径を維持していた。一方、ＮＤ群はＰＢＳ及びＦＣＳ中では凝集している可能性が示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明に係るＭＲＩ造影剤は、化学的・物理的安定性に加えて、優れた血中滞留性や臓器・組織特異性を有するので、肝腫瘍以外の組織にも適用可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナノダイヤモンド粒子に磁性元素をイオン注入してなる磁性ナノダイヤモンド粒子に、貴金属ナノ粒子が担持されてなる複合磁性粒子を含有することを特徴とするＭＲＩ造影剤。
【請求項２】
前記貴金属ナノ粒子が、金ナノ粒子である請求項１記載のＭＲＩ造影剤。
【請求項３】
前記貴金属ナノ粒子に、高分子化合物が結合している請求項１又は２記載のＭＲＩ造影剤。
【請求項４】
前記高分子化合物が、ポリエチレングリコールである請求項３記載のＭＲＩ造影剤。
【請求項５】
前記高分子化合物が、メルカプト基を介して前記貴金属ナノ粒子に結合してなる請求項３又は４記載のＭＲＩ造影剤。
【請求項６】
前記高分子化合物が、水溶液中で酸性、塩基性又は中性を呈する官能基を有している請求項３、４又は５記載のＭＲＩ造影剤。
【請求項７】
前記貴金属ナノ粒子に、標的物質に対して特異的結合能を有する特異的結合物質が担持されている請求項１、２、３、４、５又は６記載のＭＲＩ造影剤。
【請求項１】
ナノダイヤモンド粒子に磁性元素をイオン注入してなる磁性ナノダイヤモンド粒子に、貴金属ナノ粒子が担持されてなる複合磁性粒子を含有することを特徴とするＭＲＩ造影剤。
【請求項２】
前記貴金属ナノ粒子が、金ナノ粒子である請求項１記載のＭＲＩ造影剤。
【請求項３】
前記貴金属ナノ粒子に、高分子化合物が結合している請求項１又は２記載のＭＲＩ造影剤。
【請求項４】
前記高分子化合物が、ポリエチレングリコールである請求項３記載のＭＲＩ造影剤。
【請求項５】
前記高分子化合物が、メルカプト基を介して前記貴金属ナノ粒子に結合してなる請求項３又は４記載のＭＲＩ造影剤。
【請求項６】
前記高分子化合物が、水溶液中で酸性、塩基性又は中性を呈する官能基を有している請求項３、４又は５記載のＭＲＩ造影剤。
【請求項７】
前記貴金属ナノ粒子に、標的物質に対して特異的結合能を有する特異的結合物質が担持されている請求項１、２、３、４、５又は６記載のＭＲＩ造影剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１１−１７８６６８（Ｐ２０１１−１７８６６８Ａ）
【公開日】平成２３年９月１５日（２０１１．９．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−４１４６０（Ｐ２０１０−４１４６０）
【出願日】平成２２年２月２６日（２０１０．２．２６）
【出願人】（５０４１７６９１１）国立大学法人大阪大学 (1,536)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年９月１５日（２０１１．９．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年２月２６日（２０１０．２．２６）
【出願人】（５０４１７６９１１）国立大学法人大阪大学 (1,536)
【Ｆターム（参考）】
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