ＭＵＣ−１抗原に対する治療用抗体およびその使用方法
【課題】癌治療における新規な治療組成物の提供。
【解決手段】腫瘍関連ＭＵＣ−１に特異的に結合し、癌におけるそれらの効果を低下または阻止する結合剤を含む治療組成物。特に、このような腫瘍関連ＭＵＣ−１上のペプチドと炭水化物の両方を含むエピトープに特異的に結合することができる結合剤を含む治療組成物。さらに、このような治療組成物の有効量を哺乳動物に投与することを含む、腫瘍を保有する哺乳動物を治療的に処置する方法。
【解決手段】腫瘍関連ＭＵＣ−１に特異的に結合し、癌におけるそれらの効果を低下または阻止する結合剤を含む治療組成物。特に、このような腫瘍関連ＭＵＣ−１上のペプチドと炭水化物の両方を含むエピトープに特異的に結合することができる結合剤を含む治療組成物。さらに、このような治療組成物の有効量を哺乳動物に投与することを含む、腫瘍を保有する哺乳動物を治療的に処置する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［発明の背景］
［発明の分野］
本発明は、癌治療のための治療用組成物に関する。特に、本発明は、ＭＵＣ−１抗原を発現する癌の治療的処置に関する。
【背景技術】
【０００２】
［関連技術の概要］
腫瘍関連抗原ＭＵＣ１は、多くの腺癌で発現する高分子量糖タンパク質である。Gender, et al., Biol. Chem. 265:15286, 1990, Gender, et al., P.N.A.S. U.S.A., 84:6060, 1987, Siddiqui, et al., P.N.A.S. U.S.A. 85:2320, 1988およびLigtenberg, et al., J. Biol. Chem. 265:5573 1990は、不可欠な膜糖タンパク質の細胞外ドメインは、セリン、トレオニンおよびプロリンに富む２０個のアミノ酸コア配列、ＧＳＴＡＰＰＡＨＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰの３０〜９０タンデム型反復から主として構成されることを教示する。Burchell, et al., Cancer Surv. 18:135, 1993 は、個体によって発現される反復数は、遺伝的に決定され、サイズ多型を生じることを教示する。
【０００３】
Price, et al., Breast 2:3, 1993は、ほとんどのＭＵＣ１反応性モノクローナル抗体全ての最小配列認識は、ＡＰＤＴＲＰＡＰ内に存在し、タイプ１β-ターンであると考えられることを教示する。Burchell, et al., Cancer Surv. 18:135, 1993は、ＭＵＣ１タンデム型反復中の配列ＳＡＰＤＴＲＰは、免疫優性Ｂ細胞エピトープであり、タンデム型反復のＴ細胞エピトープは、五量体ＰＤＴＲＰに位置付けられてきたことを開示する。隣接アミノ酸および糖残基は、自然の分子の結合において重要な役割を果たし得る。１分子当たり３０〜９０の範囲で、多数のタンデム型反復は、ＭＵＣ１ムチンに存在し得る。
【０００４】
腫瘍ＭＵＣ−１は、一般には低グリコシル化されていて、グリコシル化部位はしばしば異常型糖鎖伸長を有する。Magnani, et al., Cancer Res. 43:5489, 1983は、この異常型グリコシル化が正常な潜在的(cryptic)ペプチドエピトープの露出および新規炭水化物エピトープの創出という結果を生じることを教示している。それらの高分子量（２×１０５〜５×１０７ダルトン）ならびに広範囲なグリコシル化のために、細胞膜ムチンは柔軟な杆状体として存在し、細胞表面から比較的大きな距離で突出している。したがって、ムチンは、多糖外皮の重要な成分を形成し、おそらく抗体と免疫系の細胞との細胞接触の第１のポイントである。
【０００５】
Rittenhouse, et al., Lab. Med. 16:556, 1985; Price, et al., Breast 2:3, 1993; Metzgar, et al., P.N.A.S. U.S.A. 81:5242, 1984; Magnani et al., Cancer Res, 46:5489, 1983; Burchell, et al., Int. J. Cancer 34:763, 1984; Linsley, et al., Cancer Res. 46:5444, 1986; and Neura, et al., in Physiology of the Gastrointenstinal Tract, Johnson, L.R. ed., 2 edition, Raven Press, New York, p 975-1009, 1987は、正常組織ムチンは、通常、上皮細胞の頂端表面、特に粘膜表面上でのみ露呈および分泌されることを教示する。 Ho et al., Cancer Res. 53:641, 1993は、ＭＵＣ１ムチンは、気管支、胸部、唾液腺、膵臓、前立腺および子宮の頂端膜上で多く発現され、胃表面細胞、胆嚢、小腸および結腸上皮上でわずかに発現することを教示する。細胞表面ＭＵＣ−１は、タンパク質分解性の分解に対する保護を含み、微生物毒性に対するバリアをもたらす重要な機能を果たす。Jentoff, Trends Biol. Sci. 15:29 1990; Parry, et al., Exp. Cell Res. 188:302, 1990; Wong, et al., J. Immunol. 144:1455, 1990; Devine and Mackenzie, BioEssays 14:619 1993は、それらは、病原体と競合する共生株の選択のために、膜貫通シグナル変換、細胞-細胞相互作用、細胞成長の調節、ならびに極性の維持のために、上皮表面の潤滑、それらの排泄を助ける微生物のための炭水化物受容体の提示として作用することもできることを教示する。
【０００６】
腫瘍ムチンは、体内の腫瘍生存の決定的機能を果たすと考えられる。それらは、腫瘍内での高い代謝活性によって生じる低ｐHから腫瘍細胞を保護し得る。ＭＵＣ１は、腫瘍細胞が腫瘍組織と緊密凝集体を形成して、それによって転移潜在性を増加させることを阻止すると考えられている。Regimbald et al., Cancer Res. 56:4244, 1996は、ＭＵＣ１は、正常細胞上に存在するＩＣＡＭ１との分子相互作用によって、腫瘍細胞を遠い部位へ循環するホーミングに関与していることを教示する。ムチンはまた、免疫系による認識から腫瘍細胞を保護し得る。Devine and MacKenzie, BioEssays 14:619, 1993は、ＭＵＣ−１が循環中に流れると、細胞性および体液性免疫エフェクターに対する細胞表面抗原に立体障害を提供することにより、おそらく観察される腫瘍特異的免疫抑制にてある役割を果たすことを教示する。Codington, et al., in Biomembranes, Mansoe, L.A., ed., Plenum Pub. Corp, New York, pp 207-259, 1983; Miller, et al., J. Cell Biol. 72:511, 1977; Hull, et al., Cancer Commun. 1:261, 1989は、細胞膜ＭＵＣ−１が他の細胞表面抗原を遮蔽し、免疫攻撃から癌細胞を保護することができることを教示する。
【０００７】
患者の血清中の腫瘍関連ＭＵＣ−１の濃度上昇はまた、疾病の進行を示す腫瘍負担の増加と相関してきた。Price et al., Breast 2:3, 1993 and Pihl et al., Pathol, 12:439, 1980は、ＭＵＣ−１の高い血清レベルは、癌患者の予後が不十分であることと相関していることを教示する。
【０００８】
したがって、腫瘍関連ＭＵＣ−１に選択的に結合し、癌におけるその影響を低減、逆転または予防することができる新規治療用組成物が必要とされている。米国特許第５，５０６，３４３号(Kufe, 1996)は、完全にグリコシル化されていないペプチドが抗体によって認識されるときにのみ、腫瘍関連ＭＵＣ−１抗体の特異性が達成され得ることを教示する。しかしながら、残念なことに、この抗体は、腫瘍関連ＭＵＣ−１を発現する腫瘍に対して治療的に有効であることを示してはいなかった。腫瘍関連ＭＵＣ−１はグリコシル化を低減および変化させられるが、これらはなおも癌に対して特異的な炭水化物構造を保持している。したがって、ペプチドおよび腫瘍特異的炭水化物の両方を含むＭＵＣ−１のエピトープに結合することができる結合剤を含む治療用組成物が特に必要とされている。
【発明の概要】
【０００９】
［本発明の簡単な概要］
本発明は、腫瘍関連ＭＵＣ−１に特異的に結合し、癌においてそれらの影響を低減、逆転または予防する結合剤を含む治療用組成物を提供する。特に、本発明は、このような腫瘍関連ＭＵＣ−１上のペプチドおよび炭水化物の両方を含むエピトープに特異的に結合することができる結合剤を含む治療用組成物を提供する。さらに、本発明は、癌治療におけるこのような治療用組成物の使用方法を提供する。本発明者らはおどろくべきことに、腫瘍関連ＭＵＣ−１に対する相対的特異性は、炭水化物を含むエピトープを認識する結合剤の場合に、かならずしも犠牲にされないことを見出した。本発明の組成物および方法は、腫瘍関連ＭＵＣ−１抗原を産生する腫瘍の治療的処置において新しい期待を提供する。
【００１０】
第１態様では、本発明は、腫瘍関連ＭＵＣ−１に特異的に結合し、かつ、腫瘍関連ＭＵＣ−１を発現する腫瘍を有する哺乳動物の腫瘍負担を低減するか、または生存を延ばすことにおいて有効である結合剤を含む治療用組成物を提供する。ある好ましい実施態様では、ＭＵＣ−１は、ヒトＭＵＣ−１である。好ましい結合剤は、炭水化物を含むＭＵＣ−１エピトープに対して特異的に結合する。特に好ましい結合剤としては、抗体および抗体誘導体を含むペプチドまたはペプチド擬似体が挙げられる。
【００１１】
第２態様では、本発明は、腫瘍関連ＭＵＣ−１抗原を含む腫瘍を保有する哺乳動物を治療的に処置する方法を提供する。本発明のこの態様による方法は、本発明の結合剤の有効量を哺乳動物へ投与することを含む。好ましくは、結合剤は低投与量で静脈内または皮下投与される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の結合剤を投与したマウスと対照マウスの生存研究の結果を示す。
【図２】本発明の結合剤を投与したマウスと対照マウスのＡｂ２産生研究の結果を示す。
【図３】腫瘍細胞がＡＰＣとして作用して、結合剤特異的Ｔ細胞応答を生じることを示す研究の結果を示す。
【図４】本発明の結合剤を投与したマウスと対照マウスの腫瘍低下研究の結果を示す。
【図５】本発明の結合剤を投与したｈＰＢＬ−再構築ＳＣＩＤマウスの腫瘍低下研究の結果を示す。
【図６】光力学剤を結合した本発明の結合剤を使用した腫瘍低下研究の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
［好ましい実施形態の詳しい説明］
本発明は、癌治療のための治療用組成物に関する。特に、本発明は、ＭＵＣ−１抗原を発現する癌の治療的処置に関する。本明細書中に記載する特許および刊行物は、この分野の知識を反映し、その全体を参照として本明細書に援用される。これらの参照文献のいずれかおよび本明細書の教示間に矛盾がある場合には、後者を優先させる。
【００１４】
本発明は、腫瘍関連ＭＵＣ−１のエピトープに特異的に結合し、かつ、癌におけるそれらの影響を低減、逆転または予防する結合剤を含む治療用組成物を提供する。特に、本発明は、このような腫瘍関連ＭＵＣ−１のペプチドおよび炭水化物の両方を含むエピトープに特異的に結合することができる結合剤を含む治療用組成物を提供する。さらに、本発明は、癌治療においてこのような治療用組成物を使用する方法を提供する。本発明の組成物および方法は、腫瘍関連ＭＵＣ−１を産生する腫瘍の治療的処理において新規な期待を提供する。
【００１５】
第１態様では、本発明は、腫瘍関連ＭＵＣ−１に特異的に結合し、かつ、腫瘍関連ＭＵＣ−１を発現する腫瘍を有する哺乳動物を治療的に処置するに有効である結合剤を含む治療用組成物を提供する。ある好ましい態様では、ＭＵＣ−１は、ヒトＭＵＣ−１である。本明細書中に使用する「治療的に処置する」または「治療的処置」との用語は、腫瘍容積において統計的に有意な低減を生じるか、あるいは腫瘍を保有する哺乳動物の生存を統計的に有意に延ばすことを意味する。「結合剤」とは、生理的条件下にてＭＵＣ−１に結合し、その生物活性を阻止する分子または高分子である。「特異的に結合する」および「生理的条件下にて結合する」とは、体内またはイオン強度に関して生理学的条件に近い条件で（例えば、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２）、少なくとも１０６Ｍ−１、最も好ましくは少なくとも１０９Ｍ−１の親和性を有する共有または非共有結合を形成することを意味する。実際には、腫瘍負担の低減または延命から、体内のこのような結合が推測されるであろう。好ましい実施態様では、結合剤は、炭水化物を含む免疫学的決定基を含むエピトープを特異的に結合する。腫瘍ＭＵＣ−１は、一般的には低グリコシル化されていて、グリコシル化部位は異常型糖鎖伸長で充填され、したがって、腫瘍ＭＵＣ−１と通常、区別されている。異常型グリコシル化は、通常、潜在的ペプチドエピトープの露出および新規炭水化物エピトープの創出を生じる結果となる。本発明の好ましい結合剤は、これらの新規エピトープに結合することができる。「エピトープ」とは、本発明の結合剤によって生理学的条件下にて結合される抗原の一部分である。「免疫学的決定基」とは、エピトープの全体の三次元形状に寄与する三次形状である。好ましい実施態様では、結合剤は、アミノ酸配列ＤＴＲＰＡＰを有するペプチドのアミノ酸残基からの免疫学的決定基を含むエピトープを結合する。「アミノ酸残基」とは、特定のペプチドの適所にあるアミノ酸である。本明細書中で使用する「生物活性の阻止」とは、腫瘍を保有する動物または患者において、腫瘍負担の統計的に有意な低減か、または統計的に有意な延命を意味する。このような統計的有意な阻止は、本明細書の例で説明される。本発明の結合剤のある好ましい実施態様は、非放射標識性である。本発明のある結合剤は、循環性および腫瘍結合性腫瘍関連ＭＵＣ−１の両方に結合し、ここで、「腫瘍関連」とは、腫瘍へのその近接性よりもむしろ腫瘍細胞により作製されるＭＵＣ−１の改変グリコシル化を言う。特に好ましい結合剤は、Ａｌｔ−１(ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−９７５)である。
【００１６】
治療のための好ましい腫瘍としては、乳癌、結腸癌、食道扁平上皮癌、膵臓癌、前立腺癌および多発性骨髄腫が挙げられあるが、これらに特に制限されない。
【００１７】
好ましくは、本発明の結合剤は、ペプチドまたはペプチド擬似体である。本発明の目的において、「ペプチド」とは、ペプチド結合によって直線配列で互いに連結したアミノ酸残基の一次元配列を含む分子である。本発明のかかるペプチドとしては、約３〜約５００個のアミノ酸を含んでもよく、さらに、二次、三次または四次構造、ならびに他のペプチドまたは他の非ペプチド分子との分子間結合を含んでもよい。このような分子間結合としては、共有結合（例えば、ジスルフィド結合）を介して、またはキレート化、静電気相互作用、疎水性相互作用、水素結合、イオン双極子相互作用、双極子−双極子相互作用、または上記の組合せを介してもよいが、これらに特に限定されない。
【００１８】
ある好ましい実施態様では、このような結合剤は、生理的条件下にて炭水化物を含むＭＵＣ−１エピトープに結合する抗体の相補的決定領域、またはこのような相補的決定領域のペプチド擬似体を含む。本発明の目的では、抗体の「相補的決定領域」（ＣＤＲ）は、生理条件下にてエピトープに結合する抗体の一部であり、かかる結合に必要なフレームワーク領域を含み、好ましくはヒト重鎖Ｖ、ＤおよびＪ領域、ヒト軽鎖ＶおよびＪ領域、および／またはそれらの組合せによりコードされるアミノ酸残基のサブセットからなる。ある好ましい抗体は外因性抗体であり、すなわち、それらは抗体を投与される種とは異なる種に由来する。このような抗体は、ヒト抗外因性抗体（ＨＡＸＡ）の誘発を引き起こすであろう。好ましい抗体としては、マウス抗体が挙げられ、それはヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答を誘発する。
【００１９】
当業者は、本明細書に開示する抗体から、当業者は様々な抗体誘導体を作製することが可能であると認識するであろう。例えば、Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)は、ヒト抗体のＣＤＲをマウス抗体から得られるもので置換することを開示する。Marx, Science 229:445-456 (1985)は、マウス可変領域およびヒト定常領域を有するキメラ抗体について議論している。Rodwell, Nature 342:99-100(1989)は、抗体CDR情報から得られる低分子量認識要素について議論している。Clackson, Br, J. Rheumatol. 3052:36-39 (1991)は、Ｆｖ断片誘導体、１本鎖抗体、融合タンパク質キメラ抗体およびヒト化ゲッ歯類抗体を含む、遺伝子的に操作したモノクローナル抗体について議論している。Reichman et al., Nature 332:323-327 (1988)は、ラット高頻度可変領域がグラフトされているヒト抗体について議論している。Verhoeyen, et al., Science 239:1534-1536(1988)は、ヒト抗体上へのマウス抗原結合部位のグラフトを教示する。
【００２０】
さらに、本明細書中に開示する抗体から、当業者はこのような相補的決定領域と同等または優れた結合特性を有するペプチド擬似体を設計および製造することが可能である（例えば、Horwell et al., Bioorg. Med. Chem. 4:153 (1996); Liskamp et al., Recl. Trav. Chim. Pays-Bas 1:113 (1994); Gante et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:1699 (1994); Seebach et al., Helv. Chim. Acta 79:913 (1996)を参照）。したがって、かかる抗体誘導体およびこれらのペプチド擬似体の全てが、本発明の範囲内にあると考えられる。本発明の組成物は、生理学的に許容可能な希釈剤、安定剤、局在化剤または緩衝剤をさらに含んでいてもよい。
【００２１】
いくつかの好ましい実施態様では、本発明の結合剤は、好ましくは化学的または光力学的アプローチによって活性化される。好ましい化学的アプローチは、ホルムアミジンスルホン酸などの有機還元剤、水銀（Ｉ）イオン、スズ（ＩＩ）イオン、シアニドイオン、水素化シアノホウ素ナトリウムおよび水素化ホウ素ナトリウムなどの無機還元剤、ジチオトレイトール、メルカプトエタノールおよびメルカプトエタノールアミンなどのチオール交換試薬、チオレドキシンなどのタンパク還元剤を含む。これらの試薬の使用により、結合剤内のいくつかのジスフィドの還元が生じ、いくつかのスルフヒドリル基を有する結合剤が生産される。かかる基の存在は結合剤の三次構造を変化させることができる。このような構造変化は結合剤の免疫反応性を変調することができる。このような変調は結合剤が投与される固体の抗イディオタイプ応答および／または細胞性応答を改善することにつながり得る。
【００２２】
ある実施態様では、活性化は、光力学的アプローチを利用する。例えば、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９３／０６３８８を参照。好ましくは結合剤は、好ましくは約１０〜約８２０ｎｍのスペクトル範囲にある紫外線を照射される。より好ましくは、少なくとも９０％及び最も好ましくは少なくとも９９％の照射が、２５０〜３２０ｎｍスペクトル範囲にある。このようなＵＶ照射は、水素または重水素放出ランプ、キセノンアークランプ、または水銀ランプなどの光源から便宜的に供給される。従来のフィルターは、最適スペクトル波長を得るために使用してもよい（例えば、Photochemistry, pp. 686-798 (John Wiley & Sons, N.Y., 1996を参照)。
【００２３】
ある好ましい実施態様では、本発明の好ましい結合剤は、光力学剤と任意に結合させてもよい。好ましくは、このような結合剤は、共有結合、またはリポソーム会合による。リポソーム会合は、好ましくはリポソーム形成試薬の存在下で光力剤を結合剤と混合することにより達成させる。ある好ましい実施態様では、本発明の結合剤は、リポソーム形成試薬に共有結合している。好ましい光力剤はハイポクレリン(hypocrellin)である。
【００２４】
いくつかの好ましい実施態様では、本発明の結合剤は、下記モノクローナル抗体：ＨＭＰＶ、ＶＵ−３−Ｃ６、ＭＦ０６、ＶＵ−１１−Ｄ１、ＭＦ３０、ＢＣＰ８、ＤＦ３、ＢＣ２、Ｂ２７．２９、ＶＵ−３−Ｄ１、７５４０ＭＲ、ＭＦ１１、Ｂｃ４Ｅ５４９、ＶＵ−１１−Ｅ２、Ｍ３８、Ｅ２９、ＧＰ１．４、２１４Ｄ４、ＢＣ４Ｗ１５４、ＨＭＦＧ−１、ＨＭＦＧ−２、Ｃ５９５、Ｍｃ５およびＡ７６−Ａ／Ｃ７を特に除外する。これらの各名称は、抗−ＭＵＣ−１抗体に関する文献で使用されている。
【００２５】
理論により拘束されることを望むものではないが、本発明のある結合剤は、一般的に抗イディオタイプネットワークを含む機構中で作用すると考えられている。抗イディオタイプネットワークの誘発に加えて、本発明の結合剤の投与は、ＭＵＣ−１との複合体の形成につながり、これは免疫系に対するより有効な抗原提示を誘発すると仮定される。抗原と抗体との間の複合体形成は、いくつかの効果を有し得る。本発明の好ましい結合剤は、循環性および細胞性ＭＵＣ−１腫瘍関連抗原の両者に結合することができる。したがって、ＭＵＣ−１抗原の可能性ある免疫抑制効果は、循環系から複合体を除去することによって不活性化され得る。抗原と抗体の複合体は、Ｆｃ受容体または膜Ｉｇ受容体（マクロファージ、樹状細胞、Ｂ細胞）を保持する抗原提示細胞に対して向けられる。特異抗原−提示細胞による抗原の取り込みの増加は、Ｔ細胞への抗原誘導ペプチドの大きな提示の増加をもたらすであろう。抗原と抗体との複合体形成は、抗原がどのように抗原提示細胞内で処理されるかを変更して、新規な免疫休眠または潜在的エピトープに露出し、しがって、腫瘍関連抗原に対する許容範囲を克服する。本発明の結合剤が、少なくとも部分的に炭水化物であるエピトープを結合するから、これらはＴ細胞上のレクチン受容体の炭水化物の相互作用を阻止することによって免疫抑制を阻止するようにも作用する。もちろん、光力学剤に結合する本発明の結合剤の実施形態は、腫瘍細胞への直接的な細胞毒を通じても作用することができる。
【００２６】
したがって、第２の態様では、本発明は、腫瘍関連ＭＵＣ−１抗原を含む腫瘍を保有する哺乳動物を治療的に処置する方法を提供する。本発明のこの態様における方法は、本発明の有効量の結合剤を哺乳動物に投与することを含む。好ましくは、結合剤はペプチド、またはペプチド疑似体であり、もっとも好ましくは抗体または抗体誘導体、またはこれらのペプチド疑似体である。好ましくは、哺乳動物はヒトである。結合剤は好ましくは非経口、より好ましくは静脈内または皮下投与される。ある好ましい実施形態では、静脈内注射がアジュバントの非存在下で実施される。ある好ましい実施形態では、結合剤は、ＲＩＢＩなどのアジュバントの存在下で皮下投与される。ある実施形態では、結合剤はＫＬＨまたは外因性免疫グロブリンなどの免疫原性担体分子に共有結合されている。ある好ましい実施形態では、本発明の方法は非放射性標識化されている結合剤を使用する。本発明方法のある好ましい実施形態は、循環性および腫瘍結合性腫瘍関連ＭＵＣ−１の両方に結合する結合剤を使用する。ここで、「腫瘍関連」とは、腫瘍対する近接性よりも、むしろ腫瘍細胞によって作成されたＭＵＣ−１の改変グリコシル化をいう。
【００２７】
好ましくは、結合剤は約８ｍｇ／３０ｋｇ体重未満、好ましくは約３ｍｇ／３０ｋｇ体重未満、より好ましくは約０．５〜約２ｍｇ／３０ｋｇ体重、なおもより好ましくは約０．５〜約１．５ｍｇ／３０ｋｇ体重、およびもっとも好ましくは約１ｍｇ／３０ｋｇ体重の投与量で投与する。ある実施態様では、投与量は抗体媒介毒性を誘発しない結合剤の最大量であるであろう。ある実施態様では、投与量はＡＤＣＣ ＯＲ ＣＤＣを産生しない結合剤の最大量である。これらの実施態様では、ＡＤＣＣは本発明の結合剤とともに５１Ｃｒ−標識腫瘍細胞をインキュベートし、新鮮なヒトＰＢＭＣを添加し、続いて４時間、インキュベートして、特異的分解を測定して評価する。ＡＤＣＣは、もしも特異的分解が１５％未満であるなら、存在しないとみなされる。「抗体媒介毒性」は、異常血清化学、腎臓機能障害、血清病またはアナフィラキシーの徴候および症状などの臨床的毒性を意味する。ある実施態様では、単一のかかる投与量は哺乳動物を治療的に処置するであろう。他の実施態様では、処置は例えば１年に４回、３年以上、継続してもよい。
【００２８】
「有効量」との用語は、哺乳動物を治療的に処置するのに十分な量を意味する。「治療的に処置する」、「治療的処置」、「結合剤」、「ペプチド」、「ペプチド疑似体」、「抗体」および「抗体誘導体」との用語は、全て本発明の第１の態様について記載したように使用される。
【００２９】
下記実施例は、本発明のある好ましい実施態様をさらに説明するよう意図され、本発明の範囲を狭めるように解釈されるものではない。下記実施例に使用した結合剤は、特に断りがない限り、Ａｌｔ−１である。
【実施例】
【００３０】
例１
結合剤を産生するためのハイブリドーマの生成
結合剤はＭＵＣ１(Talor-Papadimitriou. Int. J. Cancer 49:1, 1990)として知られる腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を発現する腫瘍を有する患者の免疫療法において使用するために調製された。結合剤は、活性マウスモノクローナル抗体（ＭＡｂ）、ＩｇＧｌｋサブクラス免疫グロブリンである。結合剤は、多くの腫瘍上に発現する高分子量糖タンパク質であるＭＵＣ１へ高い親和性で結合する(Ho, et al., Cancer Res. 53:641, 1993)。結合剤は、ＭＵＣ１タンデム型反復ペプチド配列内に配列ＤＴＲＰＡＰを特異的に認識する。この結合剤は、Ａｌｔ−１と呼ばれる。結合剤を分泌するマウス細胞系またはハイブリドーマは、ＭＵＣ１でマウスを免疫化し、抗体−分泌脾臓細胞を収集および不死化することによって生成する。ハイブリドーマ発生に関する工程は、（ａ）いくつかの起源からのＭＵＣ１でのＢＡＬＢ／ｃＣｒＡｌｔＢＭ雌マウスの免疫化、（ｂ）マウスからの脾臓細胞の収集、（ｃ）ミエローマ細胞系ＳＰ２／０−ＡｇＩ４とそれらを融合することによる、脾臓細胞の不死化、（ｄ）ＭＵＣ１結合能力に関して分泌抗体をアッセイすることによる所望のクローンのスクリーニングおよび選択、（ｅ）適当な培地中での選択クローンの増殖、（ｆ）ＩｇＭからＩｇＧへのクローンのイソタイプ転換、および（ｇ）連続０．２μｍ濾過および配合緩衝液（１０ｍＭピロリン酸ナトリウム−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）を用いた希釈を含んでいた。ＭＵＣ１発現乳癌細胞およびＭＵＣ１形質転換マウス細胞に対する結合剤の特異的結合性は、ＦＡＣＳ、蛍光顕微鏡法および他の結合アッセイ法で実証された。
【００３１】
例２
結合剤の精製、調製物活性化および配合
成長培地は例１のハイブリドーマから収集した。結合剤は、（ａ）０．２２μｍフィルターを用いた微量濾過による成長培地の清澄、（ｂ）平衡時の４０ｍＭから溶出時の１３０ｍへのＮａＣｌ勾配を使用する５０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ８．０中のＱセファロース(登録商標)ＦＦ(Amersham Pharmacia Biotech)上の陰イオン交換クロマトグラフィーによって、成長培地から精製した。これに続いて、０．２２μｍ微量濾過、（ｃ）平衡用１．０Ｍグリシン、３．０Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．８から、２００ｍＭグリシン、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ２．８を含む溶出緩衝液への緩衝液中の変化の後に溶出させる、プロテインＡセファロース(S登録商標)ＦＦ(Amersham Pharmacia Biotech)のアフィニティクロマトグラフィー、（ｄ）ｐＨ３．５で４０分間のインキュベーション、（ｅ）０．２２μｍ微量濾過に続くＶｉｒｅｓｏｌｖｅフィルター(Millipore Corporation)上でのナノメーター濾過、（ｅ）０．２２μｍ微量濾過に続く５０ｋＤ ＮＭＷＣＯ Ｂｉｏｍａｘ膜(Millipore Corporation)を用いた接線フロー限外濾過による濃縮およびダイアフィルトレーションを行った。
【００３２】
次いで、精製結合剤は、以下の様式で活性化した。精製結合剤（低モル濃度リン酸塩中、５ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ５〜１０）のバルク液体を賦形剤（塩化第一スズ）および還元剤（ピロリン酸ナトリウム）と混合して、１つのランプ当たり３〜９ワットの８個のランプからの２００〜４００ｎｍ照射で、９０％が３００ｎｍ＋／−２０ｎｍに曝露して、活性結合剤を得た。活性結合剤は同じ還元剤および緩衝液複合体とともに、凍結または凍結乾燥形態の活性結合剤２ｍｇを含むバイアル中に供給した。最終配合物の調製は、結合剤の投与前４時間以内に無菌条件下で行った。結合剤は、無菌方法を用いた以下の手法で調製した。本発明者は、結合剤バイアル最上部の金属タブを折り曲げ、アルコールでゴムセプタムを消毒した。適切なシリンジ中に、塩化ナトリウム注入ＵＳＰ２．０ｍＬを引き上げ、バイアルに添加した。本発明者はバイアルをゆっくり回すことによりバイアル内容物を混合して、結合剤溶液を生成させた。本発明者は泡が形成するように激しく混合しなかった。本発明者はこの工程後、直ちに時計の時刻を記録した。バイアルは溶液が外来または微粒子物質を確実に含有しないために試験した。
【００３３】
例３
正常および腫瘍組織と結合剤の反応
例２の結合剤の組織反応性を、色凍結組織を染色する、アビジン−ビオチン増幅免疫ペルオキシダーゼ技法を用いた免疫組織化学的手法によって試験した。予備的研究では、結合剤を用いて、正常ヒト組織およびヒト腫瘍の選択パネル中のＭＵＣ１抗原の発現および分布を試験し、ＭＵＣ−１発現組織の特異的染色のための抗体または最終生成物の最適濃度を決定した。特異的染色は乳房、大腸および肺の腫瘍細胞中、ならびに正常乳房、腎臓、大腸および肺の上皮細胞中で観察された。第２の研究では、正常ヒト組織およびヒト腫瘍のより広いパネルへの結合剤の結合および分布を、対照としてイソタイプ適合抗体（ＭＯＰＣ−２１）を使用して行った。結合剤との特異的染色は、乳癌、大腸癌、食道扁平上皮癌、膵臓癌および前立腺癌に見られた。いくつかの特異的染色もまた、黒色腫および肉腫でも観察された。結合剤による染色は、いくつかの正常組織においても観察され、上皮細胞へ主に局在化していた。これらの結果は、正常ヒト組織およびヒト腫瘍におけるＭＵＣ１ペプチドの発現およびＭＵＣ１ｍＲＮＡに関する文献報告と一致し、これらの組織への本発明の結合剤の反応性を証明している。
【００３４】
例４
抗イディオタイプ応答の生成
例２の結合剤は、イディオタイプとして知られている抗原（ＭＵＣ１）認識に特異的な可変領域を有する。これらの可変領域は、それ自体、免疫原性であり、Ａｂ２として知られている一連の抗イディオタイプ抗体を生成することができる。これらのＡｂ２のいくつかは、元の抗原（ＭＵＣ１）の三次元構造またはペプチド配列を有効に模倣し、元の抗原によって誘発される免疫応答と類似した特異的な免疫応答を生じるために使用することができる。したがって、結合剤の投与は、Ａｂ２の形態で抗原疑似体または内部の像抗原を生成すると期待され、特異的な抗ＭＵＣ１免疫応答を生じることができる。結合剤によるＡｂ２の誘発を証明するために、ＲＡＳアジュバント(RIBI Adjuvant System)と組み合せて、ＢＡＬＢ／ｃマウスをＫＬＨ(Keyhole Limpet Hemicyanin)に結合した結合剤で免疫化した。ＫＬＨおよびアジュバントは、マウス抗体（抗原として）に対するマウスでの通常、弱い免疫応答を増強させるために、これらの実験に含まれていた。イソタイプ適合抗体は対照として作用した。６回の各注射を投与した後（腹腔内投与と皮下投与間で交互に）、血清を固相上の結合剤のＦ（ａｂ’）２断片を使用したサンドイッチアッセイ法で分析した。結合マウス抗体は、トレーサーとしてヤギ抗マウスＩｇＧ−（Ｆｃ−特異的）−ＨＰＲにより検出した。ＫＬＨに結合した結合剤の注射は、イソタイプ適合対照ＭＡｂよりも大きな抗イディオタイプ抗体（Ａｂ２）の産生を生じる結果となった。測定可能な体液応答を誘発するためには、用量５０μｇ／マウス（０．８３ｍｇ／ｍ２）で、最少４回注射を必要とした。血清中の抗結合剤（Ａｂ２）がタイプＡｂ２（β）であることを証明するために、結合剤に対する結合性をＭＵＣ１の存在下で試験した。この結合性はＡｂ２（β）タイプ抗体において予期されたように、ＭＵＣ１の存在によって阻止された。Ａｂ３抗体はＭＵＣ１ ＥＬＩＳＡを使用して血清試料中で測定した。抗−抗イディオタイプ抗体（Ａｂ３）は対照血清に対する結合剤で免疫化されたマウスの血清中にて検出された。Ａｂ２レベルと同様に、Ａｂ３レベルは、６回の注射後にはそのピークに達した。さらに、結合剤に対して生じたマウスモノクローナルＡｂ２は、次に、ラットでの抗−抗イディオタイプ（Ａｂ３）抗体を生成するために使用された。このようにして免疫化された３匹のラット中、２匹はマウスモノクローナル抗体Ａｂ２に対して陽性結合を示した。異なった種における抗ＭＵＣ１抗体の生成が、基準抗原、すなわちＭＵＣ１によってＡｂ１およびＡｂ２の間の結合性を阻止する能力に加えて、Ａｂ２βの分類においても重要な判定基準であると考えられた。
【００３５】
例５
細胞応答の誘発
Ｔ細胞増殖は、例２の結合剤およびＭＵＣ１の注射に対する特異的応答を示し、イディオタイプ特異的Ｔ細胞（Ｔ２）および抗イディオタイプ特異的Ｔ細胞（Ｔ３）の存在を示した。さらに、マウスモノクローナル抗体Ａｂ２もまたＭＵＣ１特異的Ｔ細胞によって認識される能力について評価した。Ａｂ２に対する応答におけるこのようなＴ細胞の増殖は、３Ｈ−チミジン取り込みによってモニターされ、ＭＵＣ１と比較された。このアッセイは、３Ｈ−チミジン取り込み研究として行った。脾臓を、免疫化マウスの各群から取り出し、リンパ球をＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ１０７７(Sigma)上の赤血球細胞から分離した。細胞を９６ウェルＵ字底プレート(Becton Dickinson)中へ、ＡＩＭ−Ｖ無血清培地(Gibco)１００μＬ中、２×１０５細胞／ウエルの濃度で播種した。刺激剤を３倍添加し、３日間、細胞とともにインキュベートした。細胞を１ウエル当たり、１μＣｉ［３Ｈ−メチル］チミジンとともに２４時間、パルスにかけた。細胞を細胞収穫器(Skatron)中に収集し、放射能をベータカウンター(Beckman)でアッセイした。刺激剤(stimulator)は、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−１ペプチド、抗ＭＵＣ−１抗体、対照抗体およびフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）を含んでいた。Ａｂ２およびＭＵＣ１は細胞性免疫応答のさらなる証拠をもたらす同様な反応性を示す。
【００３６】
例６
用量計画の決定
ラット抗マウス抗体（ＲｔＡＭＡ）およびラット抗イディオタイプ抗体（Ａｂ２）の発生に関する例２の結合剤の用量応答は、正常ラットにおいて検討した。雄スプラークドーリーラットを静脈内投与によって２６μｇ〜２１３μｇの範囲の用量、および皮下投与によって１０６μｇ１回用量にて、結合剤で免疫化した。免疫化は２週間の間隔で５回実施した。基線および試験血清試料（注射後１週間）を各ラットから得た。２つのＥＬＩＳＡアッセイをＲｔＡＭＡおよびＡｂ２を測定するために行った。ＲｔＡＭＡ ＥＬＩＳＡは、マウスＩｇＧ１抗体の定常領域に結合する抗体量を測定する。Ａｂ２ ＥＬＩＳＡは、結合剤の結合領域に反応性を示す抗体量を測定する。５３μｇ（１．３ｍｇ／ｍ２）の用量は、静脈内注射によりＲｔＡＭＡを誘発する際に最適であることが明らかになった。アジュバントとの抗体の皮下注射は、静脈内投与された同じ用量よりも３倍高く、かつ、最も有効な静脈内用量（１．３ｍｇ／ｍ２）よりも２倍高いという、より強い応答を誘発した。用量１．３ｍｇ／ｍ２が持続性ＲｔＨＡＭＡ応答を誘発した。２．６ｍｇ／ｍ２の注射回数を増加させて応答が低下し、かつ、試験した最も高い用量（５．２ｍｇ／ｍ２）では無反応が得られたため、より高い用量はアネルギーを誘発するようである。結合剤はまた、抗イディオタイプ応答を誘発したが、その応答は注射した用量に比例していなかった。ＲｔＡＭＡにおいて効果的な同じ用量もまた、抗イディオタイプ抗体の誘発における最適用量であることが観察された。静脈内用量スケジュールでは、用量１．３ｍｇ／ｍ２が強いＡｂ２応答を誘発するのに有効な唯一の用量であった。全体として最も強いＡｂ２応答を誘発する皮下用量２．６ｍｇ／ｍ２での抗体の皮下注射を用いて、より良い応答を生じた。全体では、ＲｔＡＭＡとＡｂ２応答の間に相関関係が見られ、同じ静脈内投与用量における最適応答を示す。しかしながら、Ａｂ２およびＲｔＡＭＡの絶対量は直接的に比較できなかった。用量１．３ｍｇ／ｍ２（およそ２ｍｇ／６０ｋｇ患者に等しい）が、結合剤の静脈投与後に体液応答を誘発するのに最適であるようである。ＲｔＡＭＡは早くも最初の免疫化後、６週間目で検出され、Ａｂ２は４週間目（皮下免疫化）、または１０週間目（静脈内免疫化）に検出することができた。静脈内経路は皮下経路よりも免疫応答を誘発するにはより強い免疫化を必要とした。このより弱い免疫応答は、この関連種、ラットでのマウスタンパクの低下した免疫原性によるものであろう。これらの実験から、治療的処置において示唆される用量は、免疫応答で循環するいかなる抗原の影響を考慮しなければ、患者当たり約２ｍｇである。
【００３７】
例７
用量計画の確認
ラットで行った研究と同様に、ウサギにおける免疫応答を誘発するのに必要な用量を検討するために用量増大研究を行った。ウサギは、ラットまたはマウスのいずれかよりもマウスＭＡｂに対して、ヒト（外来として認識）において見られる応答に一層近接するために使用した。ウサギを種々の量の抗体で免疫化し、血清試料をＡｂ２およびウサギ抗マウス抗体（ＲＡＭＡ）について分析した。雌ニュージーランド白ウサギを、静脈内投与によって３つの用量レベル（１２５、２５０および５００μｇ）および皮下投与によって１つの用量（１２５μｇ）にて、例２の結合剤で免疫化した。基線および試験血清試料（およそ２週間毎に得た）は、各ウサギから得た。２つのＥＬＩＳＡ分析を、ＲＡＭＡおよびＡｂ２を測定するために実施した。ＲＡＭＡ ＥＬＩＳＡは、マウスＩｇＧ１抗体の定常領域に結合する抗体量を測定する。Ａｂ２ ＥＬＩＡは結合剤の結合領域に反応性である抗体量を測定する。ＲＡＭＡ応答は注射マウス抗体の定常領域に対する宿主の体液応答を示す。用量０．５７５ｍｇ／ｍ２は、陽性対照として皮下注射した。３つの異なった用量：０．５７５、１．１５および２．３ｍｇ／ｍ２を静脈内投与した。ＲＡＭＡ応答は２５０μｇ／ウサギのＭＡｂ−ＡＬＴ−１で静脈内注射して、続いて、１２５μｇ／ウサギの皮下注射、５００μｇ／ウサギの静脈内注射、および１２５μｇ／ウサギの静脈内注射したウサギにおいて最も強かった。Ａｂ２およびＲＡＭＡに両方としてウサギにおいて免疫応答を誘発した結合剤は、最初から最後の出血試料中に見出された。用量２５０μｇ／ウサギ（１．１５ｍｇ／ｍ２、２ｍｇ／６０ｋｇ患者に等しい）は、抗体Ａｂ２およびＲＡＭＡの両タイプにおいて最も高い応答を誘発した。この誘発Ａｂ２は、ＭＵＣ１で阻止され得るが、ＭＵＣ１ペプチドまたはＣＡ１９．９によって阻止されな得なかった。結合剤はまた、ウサギにおいて抗イディオタイプ応答を誘発したが、Ａｂ２応答は注射した用量に直接に相関していなかった。用量２５０μｇ／ウサギが３つの静脈内投与用量のうち最も高いＡｂ２応答を生じることが観察された。１２５μｇ／ウサギでの抗体の皮下注射は、全体として最も強いＡｂ２応答を誘発した。誘発Ａｂ２はＭＵＣ１と競合したが、試験した濃度ではＭＵＣ１ペプチドと競合しなかった。投与経路が免疫応答のタイプに影響を与えることに注目することは興味深いことである。Ａｂ２応答は皮下免疫化したウサギにおいて最も強かったが、一方、一般的なＲＡＭＡ応答は静脈注射したウサギにおいて最も優れていた。全体として、ＲＡＭＡおよびＡｂ２応答は相関し、同じ静脈内投与用量に関して最適応答を示す。これらの結果は、用量１．１５ｍｇ／ｍ２（２ｍｇ／６０ｋｇ患者に等しい）がＭＡｂ−ＡＬＴ−１の静脈内注射後の体液応答を誘発するのに最適であることを実証した。ＲＡＭＡおよびＡｂ２が早くも最初の免疫化から２週間目に検出することができた。したがって、ウサギの免疫応答は、ラットの抗体応答（静脈内投与の８週間目に検出）よりも優れていた。したがって、これらの実験から、治療的処置に対する示唆用量は、免疫応答の循環する抗原の影響を考慮しなければ、患者６０ｋｇ当たり約２ｍｇである。
【００３８】
例８
初期腫瘍治療研究
動物モデルに使用した腫瘍細胞は、宿主適合性とＭＵＣ１発現の両方を有するべきである。マウス腫瘍細胞系にトランスフェクトしたＭＵＣ１遺伝子のみがマウスでのモデルとして認定された。２つにＭＵＣ１形質導入体細胞系、ＭＴおよび４１３ＢＣＲが評価された。これらの細胞系の両者に、マウス乳癌細胞系４１０．４から誘導され、２０個以上のタンデム型反復エピトープを含む全長ＭＵＣ１遺伝子を形質導入した。両細胞系はＢＡＬＢ／ｃおよびＣＢＧＦ１マウスに適合している。これらの細胞系は、ＦＡＣＳ分析により、これらの細胞に対する例２の結合剤の結合によって分析されたように、ＭＵＣ１抗原を多く発現する。ＭＴ細胞はＣＢ６Ｆ１マウス中へ静脈内注射され、肺へ移植された。腫瘍病巣は注射後、３０〜４０日目に肺に見られ、マウスは処置しないで５０〜６０日目に死亡した。組織病理的分析からも肺中の腫瘍および腫瘍組織上のＭＵＣ１発現を確認した。この細胞系は比較的高い濃度、マウス当たり２×１０７個の細胞を注射した場合ですら、皮下に腫瘍を形成しない。４１３ＢＣＲ細胞をＢＡＬＢ／ｃマウスに、種々の細胞濃度（マウス当たり２．５〜５×１０６個の細胞）にて脇腹(flank)または乳房脂肪パッド中へ皮下注射した。腫瘍は１０〜１５日目に発症し、腫瘍が乳房脂肪パッド中へ移植した場合、より低い拒絶反応速度であった。治療的研究では、腫瘍は式：（ａ×ｂ２）／２、（式中、ａは最長直径、およびｂは最短直径を示す。）により腫瘍容積について測定した。in vivoでの形質導入体のＭＵＣ１発現を証明するために、ＭＴ腫瘍保有マウスを絶命させ、肺を無菌的に取り出した。腫瘍組織を肺から除去し、小片に切断し、トリプシンで１０分間、消化した。次いで、腫瘍細胞を３日間、培養して、ＦＡＣＳ分析を行った。その結果はＭＴ形質導入体細胞の８０％以上がin vivoでの成長１ケ月後にＭＵＣ１抗原を発現していたことを示した。ＭＵＣ１抗原に対する抗体−ＫＬＨ結合体（ＫＬＨはマウスでのマウス抗体の免疫原性を増加させるために使用した。）の結合能力は、２つの方法、ＥＬＩＳＡおよびＲＩＡで測定し、in vivoでその標的を認識する免疫原性の能力を証明した。２つの異なったタイプのアジュバント、ＲＡＳ（ＲＩＢＩ Adjuvant Systems)およびＱｕｉ Ａをこれらの研究で使用した。ＲＡＳはフロイド完全アジュバント（ＦＣＡ）の主要な成分である生物、ミコバクテリウム結核菌(Mycobacterium tuberculosis)から得た高度に精製した細菌成分を含む安定な水中油乳化液である。Ｑｕｉ Ａは別なものとして使用される表面活性剤であるが、皮下注射のみできる。両アジュバントは別な実験で使用した。実験を通して得た血清試料は、Ａｂ２および／またはＡｂ３含量についてはＥＬＩＳＡによって分析した。リンパ球増殖アッセイは、免疫化マウスの脾臓から単離したリンパ球を使用する標準的プロトコールによる３Ｈ−チミジン取り込みの測定によって行った。免疫刺激剤はＭＵＣ１、ＭＵＣ１ペプチド、抗ＭＵＣ１抗体、対照抗体およびフェトヘマグルチニン（ＰＨＡ）を含んでいた。ＣＢ６Ｆ１マウスを使用する各実験の終了時に、動物を絶命させ、肺中の腫瘍病巣数を直接計数法によって分析した。さらに、マウスの選択群に、１２５Ｉ−デオキシウリジンを動物の死亡４時間前にマウスへ注射した。肺はγ線カウンターで放射活性をアッセイして、腫瘍負荷を計数した。免疫応答および結合剤、結合剤−ＫＬＨ、結合剤−ｈＩｇＧおよび結合剤−ＭＵＣ１複合体の有効性は、腫瘍保持ＢＡＬＢ／ｃおよび腫瘍保持ＣＢ６Ｆ１マウスにおいて分析した。
【００３９】
実験の最初のシリーズは、体液応答（抗マウス抗体、Ａｂ２およびＡｂ３）、細胞応答（Ｔ細胞増殖）、ならびに腫瘍成長および／または大きさにおけるこれらの化合物の影響の誘発における、例２の結合剤（ＫＬＨ）の結合体(conjugate)または複合体（結合剤−ＭＵＣ１）の効果を評価した。マウスには免疫シリーズの開始後、２週間目に４１３ＢＣＲ腫瘍細胞を移植した（皮下、静脈内、または両経路の組み合せにて）。体液応答は結合および複合した結合剤の両者で処置したマウスで誘発されたことを見出した。結合剤に対するいわゆるＴ２細胞応答はこれらのマウスで誘発されたが、Ｔ３集合体（ＭＵＣ１またはＭＵＣ１ペプチドに対する応答）は明白ではなかった（Ｔ２はＡｂ１イディオタイプ特異的Ｔ細胞であり、Ｔ３はＡｂ２イディオタイプ特異的Ｔ細胞である）。これらの研究で統計的有意性は示されなかったが、結合または複合結合剤で処置したマウスの腫瘍の容積および大きさにおける低下傾向も示された。
【００４０】
例９
確証的腫瘍処置研究
ＢＡＬＢ／ｃマウス腫瘍モデル実験から得たシリーズ１および２は、ＣＢ６Ｆ１腫瘍モデルで繰り返した。Ａｂ２、Ａｂ３およびＴ細胞増殖を体液および細胞応答を決定するために再び測定した。種々の配合剤を注射した後にマウスに生じた腫瘍病巣数は、１つのシリーズで評価し、腫瘍大きさの評価はin vivoでの１２５Ｉ−ウリジンの取り込みを評価しておこなった。実験のこのシリーズの最後では、肺腫瘍モデルを移植したマウスの生存に影響を与える対照ＭＡｂおよびＰＢＳに比べて例２の結合剤の能力を評価した。実験のこの確証的セットでは、ＭＵＣ１に対するＴ細胞応答は観察されなかったけれども、体液および細胞応答はこれらのマウス中に誘発されたようである。腫瘍負荷における有意な低下は観察されなかったが、腫瘍の大きさは減少したようであった。対照ＭＡｂまたはＰＢＳを注射したものに比べて、結合剤を注射したマウスは有利にも生存していたようである。図１に示されるように、ＰＢＳ処置マウス以上にＭＡｂ−ＡＬＴ−１で処置したマウスには生存率において有意な改善があった。ＰＢＳ処置以上にＭＡｂ−ＡＬＴ−１を使用した処置のスチューデントＴ検定で測定したｐ−値は、＜０．０５であった。静脈注射によって投与した自然抗体、ＭＡｂ−ＡＬＴ−１は、ＭＴ−ＣＢ６Ｆ１マウス腫瘍モデルで抗腫瘍効果を示した。抗体のより少量の注射による先の実験では効果がなかったから（データは示されない）、腫瘍細胞注射前の最小量の３回注射および続いての４回注射は、この効果を示すために必要であった。
【００４１】
例１０
微粒子−カプセル化結合剤
抗体のリポソーム配合剤はイディオタイプ応答を増大することができるから、この研究はヒト乳癌腫瘍保有マウスに投与した微粒子−カプセル化結合剤の免疫応答を検討するために行った。結合剤は二重乳化技術によってＰＬＧＡ微粒子中に混合した。各ＢＡＬＢ／ｃマウスに研究０日に皮下から５×１０６個の４１３ＢＣＲ腫瘍細胞の注射を行った。１週間後に、４匹の動物からなる群のマウスを、次の処置群：ＰＢＳ、ＩｇＧ−ＫＬＨ、結合剤−ＫＬＨ、微粒子（ＭＳ）、結合剤−モノホスホリル脂質Ａ微粒子（ＭＰＬＡ−ＭＳ）、およびＭＵＣ−１に分けた。血清を１／１００に希釈し、Ａｂ２およびＡｂ３応答を各免疫前にＥＬＩＳＡで測定した。腫瘍容積を２日毎に二次元にてカリパスで測定した。微粒子カプセル化結合剤は、ＫＬＨを結合した結合剤またはＭＵＣ−１との複合体中の結合剤よりも優れたイディオタイプ免疫応答を誘発した。微粒子カプセル化結合剤は腫瘍成長のいくらかの抑制を示したが、統計的有意性は達成されなかった。これは、マウスがこの実験の抗体で前免疫化されていなかった事実によるからであろう。
【００４２】
例１１
腫瘍関連ＭＵＣ−１の特異性
９９ｍＴｃ標識結合剤の生物学的配置もまた、培養ヒト乳癌（ＺＲ−７５−１）細胞を移植した免疫欠損（ヌード）マウスへのその投与によって測定した。これらの細胞は既に試験されて、ＭＵＣ１抗原の発現は確認されている。９９ｍＴｃ標識結合剤は静脈内注射され（結合剤２０μｇ上に２０μＣｉの９９ｍＴｃ）、動物は標準的プロトコールにより注射から、３、６および２４時間後に絶命させた。目的の器官および組織を取りだし、γ線カウンターで放射活性を分析した。同じサブクラスの第２の非ＭＵＣ１反応性抗体（９９ｍＴｃ標識ＭＯＰＣ−２１）を注射から、６および２４時間後に動物の他の群にて同様に試験した。２つの抗体間における体内分布の全体的パターンは、９９ｍＴｃ標識ＭＯＰＣ−２１については肝臓および脾臓での取り込みがより高かったことを例外として、ほとんどの器官において同様であった。これは、多分、調剤中に存在する一層多量の９９ｍＴｃ高分子量凝集体、および腫瘍部位における９９ｍＴｃ標識結合剤の有意により高い取り込みによるのであろう。２つの放射性標識ＭＡｂにおける平均腫瘍取り込みの差異は、不対２尾ｔ検定を使用して分析して、注射から、６および２４時間後で統計的に有意（ｐ＜０．００１）であると判断した。したがって、９９ｍＴｃ標識結合剤の非特異的組織局在化は、他の同様に調製されたＩｇＧ１マウスモノクローナル抗体のものを代表するようである。この取り込みは、トレーサー分布および抗体代謝に関連したものなど、正常な組織蓄積方法の代表例であり、高い肝臓、血液および腎臓値にそれぞれ反映する。腫瘍取り込み値は、注射から、２４時間後の９９ｍＴｃ標識ＭＯＰＣ−２１調製剤に比べて、９９ｍＴｃ標識結合剤の標的組織蓄積において、ほとんど５倍増加を示す。この非常に有意な差異は、腫瘍異種移植片組織を発現するＭＵＣ１内の特異的抗原結合性による優先的９９ｍＴｃ標識結合剤の保持をほとんど確かに示している。この取り込みはやがて腫瘍対血液の比率の連続上昇という結果となり、２４時間で２．１の高さに達する。これはほとんどの他の組織では１．０未満の値である（腎臓の１．５を除く）のに比べての値であり、トレーサーの積極的な特異的保持を意味する。
【００４３】
例１２
グリコシル化ＭＵＣ−１の優先的結合
その表面にＭＵＣ−１糖タンパクを発現するＺＲ−７５−１細胞は、３７℃で４８時間、４ｍＭフェニル−Ｎ−α−Ｄ−グルコサミドによる処理によって脱グリコシル化された。例２の結合剤の結合を、Ａｌｔ−１またはＭＵＣ−１の全てのペプチドエピトープを結合することが知られている対照抗体（ＳＭ３）を使用するＦＡＣＳａｎ分析による未処置および脱グリコシルＭＵＣ−１と比較した。表１に示されるように、未処置ＭＵＣ−１の結合においてわずかな優先性が存在した。これらの結果は、結合剤が少なくともいくつかの炭水化物を含むエピトープを結合することを示す。
【００４４】
【表１】
【００４５】
例１３
外因性抗体を使用する腫瘍免疫治療
ＭＵＣ−１形質導入マウス４１３ＢＣＲ腫瘍細胞を、ＢＡＬＢ／ｃマウス中へ接種した。次いで、マウスにＡｌｔ−１単独、またはＫＬＨまたはｈＩｇＧに結合したＡｌｔ−１を５回（皮下）注射した。対照として、ＫＬＨまたはｈＩｇＧに結合したマウスＩｇＧを使用した。免疫応答は抗イディオタイプ抗体（Ａｂ２）を測定して評価した。Ａｂ２検出には、ＥＬＩＳＡプレートを１００μｌのＡｌｔ−１ Ｆ（ａｂ）２（２．５μｇ／ｍｌ）で被覆し、希釈試料とともにインキュベートした。結合Ａｂ２はＨＲＰおよびＡＢＴＳに結合した抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ特異的）を使用して検出した。これらの結果は、４０５／４９２ｎｍ＋ＳＤでの平均吸光度として、図２に示される。これらの結果は、外因性コンテクスト中に現れるか、あるいはＫＬＨに結合したＡｌｔ−１が、Ａｂ２を産生する結果となることを示すが、一方、Ａｌｔ−１または対照のいずれもはそうではなかった。
【００４６】
Ａｌｔ−１に特異的なＴ−細胞を刺激する抗原提示細胞として作用する腫瘍細胞の能力は、以下のように評価した。４１３ＢＣＲ細胞を、ＰＨＡ培地（陽性対照）、Ａｌｔ−１、ｈＩｇＧ、ｈＩｇＧに結合したＡｌｔ−１、マウス抗ヒト抗体（ＭＡＨＡ）、またはｈＩｇＧおよびマウス抗ヒト抗体（ＭＡＨＡ）に結合したＡｌｔ−１とともに、３７℃で２４時間インキュベートした。腫瘍細胞は、ｈＩｇＧで免疫化したマウスから得た精製Ｔ細胞を刺激するために、ＡＰＣとして使用した。Ｔ細胞増殖は、［３Ｈ］−チミジン取り込みを使用して測定した。その結果を図３に示す。ｈＩｇＧおよびマウス抗ヒト抗体（ＭＡＨＡ）に結合したＡｌｔ−１のみが細胞を処置した。これらの結果は、腫瘍細胞がそれを内部移行する条件下で、腫瘍細胞への異種コンテクスト中にＡｌｔ−１が提示された場合、処置された腫瘍細胞が、Ａｌｔ−１に特異的なＴ細胞応答を生じるＡＰＣとして作用することができることを示す。
【００４７】
抗癌効果を、腫瘍質量を秤量して評価した。４１３ＢＣＲ腫瘍保持マウスに先に記載したように異なる抗体配合剤を５回（皮下）注射した。マウスを２６日目に絶命させ、腫瘍を取りだし、秤量した。その結果を、５匹のマウスから得た腫瘍の平均＋ＳＤとして、図４に示す。統計的分析はｔ検定によって実施した。これらの結果は、外因性コンテクスト中に提示されたＡｌｔ−１は腫瘍負荷において統計的に有意な低下をもたらすことを示す。
まとめると、これらの結果は、本発明の結合剤が、抗イディオタイプおよび細胞応答の両者を生じることができ、この応答が腫瘍治療に効果的であることを示す。
【００４８】
例１４
ｈＰＢＬ−再構成腫瘍保持ＳＣＩＤマウスの処置
ＳＣＩＤ／ＢＧマウスに、８０℃に貯蔵されていた１０７個のｈＰＢＬを注射した。血液を１２日目にマウスから採取し、マウスが再構成されているか否かを決定するためにｈＩｇＧの存在について試験した。注射した７匹のマウスのうち、５匹は再構成されていた。再構成マウスを０日目にＰＢＳまたは１００μｇのＡｌｔ−１または対照ＩｇＧ１で腹腔内処置し、７日目および１４日目に繰返し処置した。１７日目にマウスに５×１０６個の腫瘍細胞（ＮＩＨ ＯＶＣＡＲ−３）＋２０％マトリゲルを皮下移植した。マウスを２１日目に出血させて、２１日目および２８日目にＰＢＳまたは１００μｇのＡｌｔ−１または対照ＩｇＧを静脈注射して処置した。マウスを２８、３２、３５、３９および４３日目に絶命させ、その腫瘍容積を測定した。その結果を図５に示す。これらの結果は、外因性結合剤Ａｌｔ−１がアジュバントまたは担体タンパク質の非存在下にですら、腫瘍容積の統計的に有意な低下をもたらすことを示す。
【００４９】
例１５
ハイポクレリンに結合した結合剤の調製
長期循環性、立体的安定化ＨＢＢＡ−Ｒ２リポソーム（ＳＬ）および免疫リポソーム（ＳＩＬ）配合剤は、ＤＰＰＣ／マレイミド−ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ（９４：６モル比）およびＤＳＰＣ／コレステロール／マレイミド−ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ（６４：３０：６モル比）それぞれから構成される。対照ＨＢＢＡ−Ｒ２リポソーム（ＣＬ）はＤＰＰＣ／ＤＰＰＧ（９：１モル比）から構成される。ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＰＰＧおよびコレステロールはＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ(Alabaster, AL, USA)から購入し、マレイミド−ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥはShearwater Polymers Inc.(Huntsville, AL, USA)から購入した。
【００５０】
ハイポクレリンの合成は、当該分野で認識されている手法を使用する（例えば、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９８／００２３５号を参照）。２つの方法はリポソーム中へハイポクレリンを負荷するために使用した。ＨＢＢＡ−Ｒ２は溶媒注入法によって、脂質対薬剤モル比１５：１にて予め形成されたＳＬおよびＳＩＬ中へ負荷するか、あるいは溶媒希釈法によって、ＣＬ（脂質対薬剤１５：１）中に負荷した。
【００５１】
溶媒希釈法では、脂質と薬剤をまず、有機溶媒のストック溶液から互いに混合し、次いで乾燥した。メタノールを最終脂質濃度２００ｍＭになるまで添加した。脂質／薬剤溶液を加熱緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ １４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）の５００μｌ分取量を添加して、６５℃で１０ｍＭ脂質になるまでゆっくりと希釈する際にリポソームを形成した。得られたリポソームはセファデックスＧ５０を使用してゲル濾過し、上記緩衝液で溶出して精製した。
【００５２】
溶媒注入法では、（ＨＢＢＡ−Ｒ２）−ＳＬリポソーをまず、１０ｍＭ脂質、２ｍＭ ＭＯＰＳＯ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．７の最終濃度まで、乾燥した薄フィルムを水和して調製した。ＨＢＢＡ−Ｒ２ （ＰＥＧ３００中、１０ｍＭ）を６５℃まで加熱し、リポソームの６５℃溶液中に滴下し、１５分間、インキュベートした。得られたハイポクレリン−リポソームは、平均ベシクルサイズ１００ｎｍになるＬｉｐｅｘ Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ(North Vancouver, BC)押出装置を使用して、８０ｎｍポリカーボネート膜から押し出した。
【００５３】
免疫リポソームは以下のようにして製造した。抗体をまず２０ｍＭピロリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し、次いで、３０モル過剰量の２−イミノチオレーンとともに１時間、２２℃でインキュベートした。チオール化した抗体を精製し、ｐＨを、２０ｍＭ ＭＯＰＳＯ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．７緩衝液を使用するゲルクロマトグラフィーによって低下させた。チオール化した抗体は、上記マレイミド−リポソームの一部とともに、２２℃で一夜、２５〜５０μｇＭＡｂ／μモル脂質濃度でインキュベートした。リポソームのセットは、結合抗体の有無にかかわらず、双方ともセファロースＣＬ−４Ｂを使用してゲル濾過し、かつ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ １４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４緩衝液を用いて溶出して精製した。約９０〜９５％の抗体がリポソームへ結合した。
【００５４】
ハイポクレリン−リポソーム溶液は、Sartorious AG.(Goettingen, Germany) ＣｅｎｔｒｉｓａｒｔＩ遠心分離濃縮器（３００，０００ＭＷカットオフ）を使用して濃縮した。全てのリポソーム調製物は、Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶ ０．２２μｍ無菌フィルターユニット(Millipore Bedford, MA USA)を使用してフィルター滅菌し、脂質および薬剤濃度を分析し、次いで、滅菌緩衝（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ １４０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．４）を使用して所望濃度にまで希釈した。薬剤対最終脂質のモル比、２０：１は、通常、全ての配合剤において得られた。
【００５５】
長期循環性、立体的安定化ＨＢＢＡ−Ｒ２およびＨＢＥＡ−Ｒ１／２リポソーム（ＳＬ）および免疫リポソーム（ＳＩＬ）配合剤は、それぞれＤＰＰＣ／マレイミド−ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ（９４：６モル比）およびＤＳＰＣ／コレステロール／マレイミド−ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ（６４：３０：６モル比）から構成される。対照ＨＢＢＡ−Ｒ２リポソーム（ＣＬ）はＤＰＰＣ／ＤＰＰＧ（９：１モル比）から構成される。ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＰＰＧおよびコレステロールはＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ(Alabaster, AL, USA)から購入し、マレイミド−ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥはShearwater Polymers Inc. (Huntsville, AL, USA)から購入した。
【００５６】
ハイポクレリンをリポソームへ負荷するために２つの方法を使用した。ＨＢＢＡ−Ｒ２を予め形成したＳＬおよびＳＩＬ中へ、脂質対薬剤モル比１５：１にて溶媒注入法で負荷した。ＨＢＢＡ−Ｒ２をＣＬ（脂質：薬剤１５：１）中に、およびＨＢＥＡ−Ｒ１／２をＳＬおよびＳＩＬ（脂質：薬剤２：１）中に溶媒希釈法にて負荷した。
【００５７】
溶媒注入法では、リポソームはまず、ＳＬ調製には２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ １４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４またはＳＩＬ調製には２０ｍＭ ＭＯＰＳＯ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．７のいずれかを使用して、最終濃度１０ｍＭ脂質になるまで、種々の脂質の乾燥薄膜を水和して調製した。溶媒に溶解した薬剤（メタノール中、約１０〜２０ｍＭまたはＰＥＧ３００中、約５〜１０ｍＭ）を、６５℃まで加熱し、リポソームの６５℃溶液中に滴下した。
【００５８】
溶媒希釈法では、脂質と薬剤をまず、有機溶媒中のストック溶液から互いに混合して、次いで乾燥した。次いで、メタノールまたはＰＥＧ３００を、それぞれ最終脂質濃度２００ｍＭまたは５０ｍＭになるように添加した。脂質と薬剤溶液が、少量の加熱緩衝液（ＣＬおよびＳＬ調製には２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ １４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４またはＳＩＬ調製には２０ｍＭ ＭＯＰＳＯ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．７）を添加して、６５℃で１０ｍＭ脂質にまで希釈されたとき、リポソームが形成された。
【００５９】
得られたハイポクレリン−リポソームは、平均気孔サイズ１００ｎｍになるよう、Ｌｉｐｅｘ Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ(North Vancouver, BC)押出装置を使用して、８０ｎｍポリカーボネート膜から押し出す。次いでリポソームをゲル濾過によって精製し、脂質および薬剤濃度を分析する。最終脂質対薬剤モル比２０：１が、通常、全ての配合剤について得られた。
【００６０】
免疫リポソームは以下のようにして作製した。抗体をまず２０ｍＭピロリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し、次いで、２−イミノチオレーンの１５〜３０モル過剰量とともに１時間、２２℃でインキュベートした。チオール化した抗体は精製し、ｐＨを、２０ｍＭ ＭＯＰＳＯ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４緩衝液を使用するゲルクロマトグラフィーによって低下させた。チオール化した抗体を、マレイミド−リポソーム（上記した）とともに、２５〜５０μｇＭＡｂ／μモル脂質の濃度で一夜、２２℃でインキュベートした。未結合抗体をゲル濾過で除去し、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ １４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４緩衝液を使用して溶出した。約９０〜９５％の抗体がリポソームに結合した。
【００６１】
所要に応じて、ハイポクレリン−リポソーム溶液をAmicon, Inc (Beverly, MA USA）ＣｅｎｔｒｉｃｏｎまたはSartorious AG. (Goettingen, Germany)ＣｅｎｔｒｉｓａｒｔＩ遠心分離濃縮器（それぞれ、１００，０００または３００，０００ＭＷカットオフ）を使用して濃縮した。
【００６２】
例１６
腫瘍保持マウスモデルにおける光力学治療
ＢＡＬＢ／ｃマウスは右脇腹中へ２×１０６個の４１３ＢＣＲ細胞を皮下注射した。腫瘍は７〜１０日後に出現した。腫瘍が直径約５ｍｍに達したとき、例１５の結合体、または薬剤とともに対照リポソーム、ただし異なったＩｇＧ１を用いて、１ｍｇ／ｋｇにて静脈内投与した。２時間後、マウスに、スライドプロジェクターを使用して、＞５９０ｎｍ（赤カットオフフィルター）、４０Ｊ／ｃｍ２、２０ｍｍＷ／ｃｍ２にて照射した。対照マウスには照射しなかった。その結果を図６に示す。これらの結果は、本発明の結合体が、光の存在下で腫瘍を完全に取り除くことを示す。
【００６３】
例１７
マウス腫瘍生存研究
ＣＢ６Ｆ１マウスを腫瘍移植前にＡｌｔ−１結合剤、ＰＢＳ、マウスＩｇＧまたは非関連マウスモノクローナル抗体（０．２ｍｌＰＢＳ中、５０μｇ、静脈注射）を使用して、３回免疫化した。マウスにＭＴ腫瘍細胞系４１０．４、完全長ＭＵＣ−１ ＤＮＡをトランスフェクトしたマウス乳癌細胞系を移植した。腫瘍細胞を２×１０５細胞／マウスにて静脈注射し、肺に転移させた。腫瘍移植後、１週間目にマウスを再びＡｌｔ−１結合剤、マウスＩｇＧまたは非関連マウスモノクローナル抗体（０．２ｍｌＰＢＳ中、５０μｇ）を使用して免疫化した。マウスは体重、目および柔毛を含めた一般的な状態変化を隔日に観察した。ひどい病状になるか、あるいは元の体重の２５％以上を損なう徴候を示すなら、マウスを安楽死させた。
その結果を下記表に示す。
【００６４】
【表２】
【００６５】
これらの結果は、Ａｌｔ−１のみがＭＵＣ−１を発現する腫瘍細胞から統計的に有意な保護をもたらすことを示す（ＰＢＳに対して、Ｐ＝０．０３８；非関連抗体に対してＰ＝０．１５９）。
【００６６】
例１８
ヒト患者におけるＨＡＭＡ応答の確立
１７名の患者をＡｌｔ−１抗体で処置した。１４名が女性であって、そのうち、１１名が乳癌を発症していた。処置した他の癌は甲状腺（１）、大腸（２）、子宮内膜（１）、子宮（１）および唾液腺（１）であった。Ａｌｔ−１を１、３、５、９、１３および１７週目に２０〜３０分間にわたって静脈注射によって投与した。投薬は３つの集団に、患者当たり１、２および４ｍｇであった。１ｍｇの集団では、５名の患者のうち、２名がＨＡＭＡのいくらかの増加を示し、１名は＞２００ｎｇ／ｍｌの増加を示し、１名が２０００ｎｇ／ｍｌ以上の増加を示した。２ｍｇの集団では、５名の患者全員がＨＡＭＡのいくらかの増加を示し、２名患者は＞２００ｎｇ／ｍｌの増加を示し、１名が＞２０００ｎｇ／ｍｌの増加を示した。４ｍｇの集団では、２名患者がＨＡＭＡのいくらかの増加を示し、両者は＞２００ｎｇ／ｍｌであった。ＨＡＭＡは抗原に対して発生した全体的免疫応答の範囲を示すものとして考えられる。したがって、これらの結果は、１〜２ｍｇＡｌｔ−１のように僅かな量が強力な免疫応答を誘発することができることを示唆する。
【００６７】
例１９
腫瘍特異的抗原の低下
患者を例１８に記載したように処置した。腫瘍抗原ＣＡ１５．３の連続測定値は、市販のＭＵＣ−１アッセイ法を利用して得た。ＣＡ１５．３レベルの安定化または低下を示す患者の割合は、１ｍｇＡｌｔ−１では患者０％であり、２ｍｇで８０％および４ｍｇで６０％であった。最大低下は、それぞれ３７％と２５％の滴下を経験した２ｍｇ用量群の２名の患者において観察された。
【００６８】
例２０
Ａｂ２形成
患者を例１８に記載したように処置した。Ａｂ２のレベルを本研究の最後に測定した。２ｍｇ群の２名の患者は、Ａｂ２レベルがそれぞれ＞１２４０Ｕ／ｍｌおよび１７８４Ｕ／ｍｌを有していた。４ｍｇ投与群の１名は?１１０２Ｕ／ｍｌのＡｂ２レベルを有していた。正常範囲は０〜２００Ｕ／ｍｌである。
【００６９】
例２１
抗ＭＵＣ−１抗体の生成
患者を例１８に記載したように処置した。抗ＭＵＣ−１抗体レベルを本研究の最後に測定した。２ｍｇ用量群では、２名の患者がそれぞれ６６７Ｕ／ｍｌおよび２４６４Ｕ／ｍｌで、基線値を３倍以上越えた。１ｍｇ処置群の２名の患者および４ｍｇ用量群の１名の患者は、基線レベルの３倍の抗ＭＵＣ−１抗体レベルを有していた。正常レベルは３０〜２５０Ｕ／ｍｌである。まとめると、これらのデータは２ｍｇ用量がおそらく最適であることを示す。
【技術分野】
【０００１】
［発明の背景］
［発明の分野］
本発明は、癌治療のための治療用組成物に関する。特に、本発明は、ＭＵＣ−１抗原を発現する癌の治療的処置に関する。
【背景技術】
【０００２】
［関連技術の概要］
腫瘍関連抗原ＭＵＣ１は、多くの腺癌で発現する高分子量糖タンパク質である。Gender, et al., Biol. Chem. 265:15286, 1990, Gender, et al., P.N.A.S. U.S.A., 84:6060, 1987, Siddiqui, et al., P.N.A.S. U.S.A. 85:2320, 1988およびLigtenberg, et al., J. Biol. Chem. 265:5573 1990は、不可欠な膜糖タンパク質の細胞外ドメインは、セリン、トレオニンおよびプロリンに富む２０個のアミノ酸コア配列、ＧＳＴＡＰＰＡＨＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰの３０〜９０タンデム型反復から主として構成されることを教示する。Burchell, et al., Cancer Surv. 18:135, 1993 は、個体によって発現される反復数は、遺伝的に決定され、サイズ多型を生じることを教示する。
【０００３】
Price, et al., Breast 2:3, 1993は、ほとんどのＭＵＣ１反応性モノクローナル抗体全ての最小配列認識は、ＡＰＤＴＲＰＡＰ内に存在し、タイプ１β-ターンであると考えられることを教示する。Burchell, et al., Cancer Surv. 18:135, 1993は、ＭＵＣ１タンデム型反復中の配列ＳＡＰＤＴＲＰは、免疫優性Ｂ細胞エピトープであり、タンデム型反復のＴ細胞エピトープは、五量体ＰＤＴＲＰに位置付けられてきたことを開示する。隣接アミノ酸および糖残基は、自然の分子の結合において重要な役割を果たし得る。１分子当たり３０〜９０の範囲で、多数のタンデム型反復は、ＭＵＣ１ムチンに存在し得る。
【０００４】
腫瘍ＭＵＣ−１は、一般には低グリコシル化されていて、グリコシル化部位はしばしば異常型糖鎖伸長を有する。Magnani, et al., Cancer Res. 43:5489, 1983は、この異常型グリコシル化が正常な潜在的(cryptic)ペプチドエピトープの露出および新規炭水化物エピトープの創出という結果を生じることを教示している。それらの高分子量（２×１０５〜５×１０７ダルトン）ならびに広範囲なグリコシル化のために、細胞膜ムチンは柔軟な杆状体として存在し、細胞表面から比較的大きな距離で突出している。したがって、ムチンは、多糖外皮の重要な成分を形成し、おそらく抗体と免疫系の細胞との細胞接触の第１のポイントである。
【０００５】
Rittenhouse, et al., Lab. Med. 16:556, 1985; Price, et al., Breast 2:3, 1993; Metzgar, et al., P.N.A.S. U.S.A. 81:5242, 1984; Magnani et al., Cancer Res, 46:5489, 1983; Burchell, et al., Int. J. Cancer 34:763, 1984; Linsley, et al., Cancer Res. 46:5444, 1986; and Neura, et al., in Physiology of the Gastrointenstinal Tract, Johnson, L.R. ed., 2 edition, Raven Press, New York, p 975-1009, 1987は、正常組織ムチンは、通常、上皮細胞の頂端表面、特に粘膜表面上でのみ露呈および分泌されることを教示する。 Ho et al., Cancer Res. 53:641, 1993は、ＭＵＣ１ムチンは、気管支、胸部、唾液腺、膵臓、前立腺および子宮の頂端膜上で多く発現され、胃表面細胞、胆嚢、小腸および結腸上皮上でわずかに発現することを教示する。細胞表面ＭＵＣ−１は、タンパク質分解性の分解に対する保護を含み、微生物毒性に対するバリアをもたらす重要な機能を果たす。Jentoff, Trends Biol. Sci. 15:29 1990; Parry, et al., Exp. Cell Res. 188:302, 1990; Wong, et al., J. Immunol. 144:1455, 1990; Devine and Mackenzie, BioEssays 14:619 1993は、それらは、病原体と競合する共生株の選択のために、膜貫通シグナル変換、細胞-細胞相互作用、細胞成長の調節、ならびに極性の維持のために、上皮表面の潤滑、それらの排泄を助ける微生物のための炭水化物受容体の提示として作用することもできることを教示する。
【０００６】
腫瘍ムチンは、体内の腫瘍生存の決定的機能を果たすと考えられる。それらは、腫瘍内での高い代謝活性によって生じる低ｐHから腫瘍細胞を保護し得る。ＭＵＣ１は、腫瘍細胞が腫瘍組織と緊密凝集体を形成して、それによって転移潜在性を増加させることを阻止すると考えられている。Regimbald et al., Cancer Res. 56:4244, 1996は、ＭＵＣ１は、正常細胞上に存在するＩＣＡＭ１との分子相互作用によって、腫瘍細胞を遠い部位へ循環するホーミングに関与していることを教示する。ムチンはまた、免疫系による認識から腫瘍細胞を保護し得る。Devine and MacKenzie, BioEssays 14:619, 1993は、ＭＵＣ−１が循環中に流れると、細胞性および体液性免疫エフェクターに対する細胞表面抗原に立体障害を提供することにより、おそらく観察される腫瘍特異的免疫抑制にてある役割を果たすことを教示する。Codington, et al., in Biomembranes, Mansoe, L.A., ed., Plenum Pub. Corp, New York, pp 207-259, 1983; Miller, et al., J. Cell Biol. 72:511, 1977; Hull, et al., Cancer Commun. 1:261, 1989は、細胞膜ＭＵＣ−１が他の細胞表面抗原を遮蔽し、免疫攻撃から癌細胞を保護することができることを教示する。
【０００７】
患者の血清中の腫瘍関連ＭＵＣ−１の濃度上昇はまた、疾病の進行を示す腫瘍負担の増加と相関してきた。Price et al., Breast 2:3, 1993 and Pihl et al., Pathol, 12:439, 1980は、ＭＵＣ−１の高い血清レベルは、癌患者の予後が不十分であることと相関していることを教示する。
【０００８】
したがって、腫瘍関連ＭＵＣ−１に選択的に結合し、癌におけるその影響を低減、逆転または予防することができる新規治療用組成物が必要とされている。米国特許第５，５０６，３４３号(Kufe, 1996)は、完全にグリコシル化されていないペプチドが抗体によって認識されるときにのみ、腫瘍関連ＭＵＣ−１抗体の特異性が達成され得ることを教示する。しかしながら、残念なことに、この抗体は、腫瘍関連ＭＵＣ−１を発現する腫瘍に対して治療的に有効であることを示してはいなかった。腫瘍関連ＭＵＣ−１はグリコシル化を低減および変化させられるが、これらはなおも癌に対して特異的な炭水化物構造を保持している。したがって、ペプチドおよび腫瘍特異的炭水化物の両方を含むＭＵＣ−１のエピトープに結合することができる結合剤を含む治療用組成物が特に必要とされている。
【発明の概要】
【０００９】
［本発明の簡単な概要］
本発明は、腫瘍関連ＭＵＣ−１に特異的に結合し、癌においてそれらの影響を低減、逆転または予防する結合剤を含む治療用組成物を提供する。特に、本発明は、このような腫瘍関連ＭＵＣ−１上のペプチドおよび炭水化物の両方を含むエピトープに特異的に結合することができる結合剤を含む治療用組成物を提供する。さらに、本発明は、癌治療におけるこのような治療用組成物の使用方法を提供する。本発明者らはおどろくべきことに、腫瘍関連ＭＵＣ−１に対する相対的特異性は、炭水化物を含むエピトープを認識する結合剤の場合に、かならずしも犠牲にされないことを見出した。本発明の組成物および方法は、腫瘍関連ＭＵＣ−１抗原を産生する腫瘍の治療的処置において新しい期待を提供する。
【００１０】
第１態様では、本発明は、腫瘍関連ＭＵＣ−１に特異的に結合し、かつ、腫瘍関連ＭＵＣ−１を発現する腫瘍を有する哺乳動物の腫瘍負担を低減するか、または生存を延ばすことにおいて有効である結合剤を含む治療用組成物を提供する。ある好ましい実施態様では、ＭＵＣ−１は、ヒトＭＵＣ−１である。好ましい結合剤は、炭水化物を含むＭＵＣ−１エピトープに対して特異的に結合する。特に好ましい結合剤としては、抗体および抗体誘導体を含むペプチドまたはペプチド擬似体が挙げられる。
【００１１】
第２態様では、本発明は、腫瘍関連ＭＵＣ−１抗原を含む腫瘍を保有する哺乳動物を治療的に処置する方法を提供する。本発明のこの態様による方法は、本発明の結合剤の有効量を哺乳動物へ投与することを含む。好ましくは、結合剤は低投与量で静脈内または皮下投与される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の結合剤を投与したマウスと対照マウスの生存研究の結果を示す。
【図２】本発明の結合剤を投与したマウスと対照マウスのＡｂ２産生研究の結果を示す。
【図３】腫瘍細胞がＡＰＣとして作用して、結合剤特異的Ｔ細胞応答を生じることを示す研究の結果を示す。
【図４】本発明の結合剤を投与したマウスと対照マウスの腫瘍低下研究の結果を示す。
【図５】本発明の結合剤を投与したｈＰＢＬ−再構築ＳＣＩＤマウスの腫瘍低下研究の結果を示す。
【図６】光力学剤を結合した本発明の結合剤を使用した腫瘍低下研究の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
［好ましい実施形態の詳しい説明］
本発明は、癌治療のための治療用組成物に関する。特に、本発明は、ＭＵＣ−１抗原を発現する癌の治療的処置に関する。本明細書中に記載する特許および刊行物は、この分野の知識を反映し、その全体を参照として本明細書に援用される。これらの参照文献のいずれかおよび本明細書の教示間に矛盾がある場合には、後者を優先させる。
【００１４】
本発明は、腫瘍関連ＭＵＣ−１のエピトープに特異的に結合し、かつ、癌におけるそれらの影響を低減、逆転または予防する結合剤を含む治療用組成物を提供する。特に、本発明は、このような腫瘍関連ＭＵＣ−１のペプチドおよび炭水化物の両方を含むエピトープに特異的に結合することができる結合剤を含む治療用組成物を提供する。さらに、本発明は、癌治療においてこのような治療用組成物を使用する方法を提供する。本発明の組成物および方法は、腫瘍関連ＭＵＣ−１を産生する腫瘍の治療的処理において新規な期待を提供する。
【００１５】
第１態様では、本発明は、腫瘍関連ＭＵＣ−１に特異的に結合し、かつ、腫瘍関連ＭＵＣ−１を発現する腫瘍を有する哺乳動物を治療的に処置するに有効である結合剤を含む治療用組成物を提供する。ある好ましい態様では、ＭＵＣ−１は、ヒトＭＵＣ−１である。本明細書中に使用する「治療的に処置する」または「治療的処置」との用語は、腫瘍容積において統計的に有意な低減を生じるか、あるいは腫瘍を保有する哺乳動物の生存を統計的に有意に延ばすことを意味する。「結合剤」とは、生理的条件下にてＭＵＣ−１に結合し、その生物活性を阻止する分子または高分子である。「特異的に結合する」および「生理的条件下にて結合する」とは、体内またはイオン強度に関して生理学的条件に近い条件で（例えば、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２）、少なくとも１０６Ｍ−１、最も好ましくは少なくとも１０９Ｍ−１の親和性を有する共有または非共有結合を形成することを意味する。実際には、腫瘍負担の低減または延命から、体内のこのような結合が推測されるであろう。好ましい実施態様では、結合剤は、炭水化物を含む免疫学的決定基を含むエピトープを特異的に結合する。腫瘍ＭＵＣ−１は、一般的には低グリコシル化されていて、グリコシル化部位は異常型糖鎖伸長で充填され、したがって、腫瘍ＭＵＣ−１と通常、区別されている。異常型グリコシル化は、通常、潜在的ペプチドエピトープの露出および新規炭水化物エピトープの創出を生じる結果となる。本発明の好ましい結合剤は、これらの新規エピトープに結合することができる。「エピトープ」とは、本発明の結合剤によって生理学的条件下にて結合される抗原の一部分である。「免疫学的決定基」とは、エピトープの全体の三次元形状に寄与する三次形状である。好ましい実施態様では、結合剤は、アミノ酸配列ＤＴＲＰＡＰを有するペプチドのアミノ酸残基からの免疫学的決定基を含むエピトープを結合する。「アミノ酸残基」とは、特定のペプチドの適所にあるアミノ酸である。本明細書中で使用する「生物活性の阻止」とは、腫瘍を保有する動物または患者において、腫瘍負担の統計的に有意な低減か、または統計的に有意な延命を意味する。このような統計的有意な阻止は、本明細書の例で説明される。本発明の結合剤のある好ましい実施態様は、非放射標識性である。本発明のある結合剤は、循環性および腫瘍結合性腫瘍関連ＭＵＣ−１の両方に結合し、ここで、「腫瘍関連」とは、腫瘍へのその近接性よりもむしろ腫瘍細胞により作製されるＭＵＣ−１の改変グリコシル化を言う。特に好ましい結合剤は、Ａｌｔ−１(ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−９７５)である。
【００１６】
治療のための好ましい腫瘍としては、乳癌、結腸癌、食道扁平上皮癌、膵臓癌、前立腺癌および多発性骨髄腫が挙げられあるが、これらに特に制限されない。
【００１７】
好ましくは、本発明の結合剤は、ペプチドまたはペプチド擬似体である。本発明の目的において、「ペプチド」とは、ペプチド結合によって直線配列で互いに連結したアミノ酸残基の一次元配列を含む分子である。本発明のかかるペプチドとしては、約３〜約５００個のアミノ酸を含んでもよく、さらに、二次、三次または四次構造、ならびに他のペプチドまたは他の非ペプチド分子との分子間結合を含んでもよい。このような分子間結合としては、共有結合（例えば、ジスルフィド結合）を介して、またはキレート化、静電気相互作用、疎水性相互作用、水素結合、イオン双極子相互作用、双極子−双極子相互作用、または上記の組合せを介してもよいが、これらに特に限定されない。
【００１８】
ある好ましい実施態様では、このような結合剤は、生理的条件下にて炭水化物を含むＭＵＣ−１エピトープに結合する抗体の相補的決定領域、またはこのような相補的決定領域のペプチド擬似体を含む。本発明の目的では、抗体の「相補的決定領域」（ＣＤＲ）は、生理条件下にてエピトープに結合する抗体の一部であり、かかる結合に必要なフレームワーク領域を含み、好ましくはヒト重鎖Ｖ、ＤおよびＪ領域、ヒト軽鎖ＶおよびＪ領域、および／またはそれらの組合せによりコードされるアミノ酸残基のサブセットからなる。ある好ましい抗体は外因性抗体であり、すなわち、それらは抗体を投与される種とは異なる種に由来する。このような抗体は、ヒト抗外因性抗体（ＨＡＸＡ）の誘発を引き起こすであろう。好ましい抗体としては、マウス抗体が挙げられ、それはヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答を誘発する。
【００１９】
当業者は、本明細書に開示する抗体から、当業者は様々な抗体誘導体を作製することが可能であると認識するであろう。例えば、Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)は、ヒト抗体のＣＤＲをマウス抗体から得られるもので置換することを開示する。Marx, Science 229:445-456 (1985)は、マウス可変領域およびヒト定常領域を有するキメラ抗体について議論している。Rodwell, Nature 342:99-100(1989)は、抗体CDR情報から得られる低分子量認識要素について議論している。Clackson, Br, J. Rheumatol. 3052:36-39 (1991)は、Ｆｖ断片誘導体、１本鎖抗体、融合タンパク質キメラ抗体およびヒト化ゲッ歯類抗体を含む、遺伝子的に操作したモノクローナル抗体について議論している。Reichman et al., Nature 332:323-327 (1988)は、ラット高頻度可変領域がグラフトされているヒト抗体について議論している。Verhoeyen, et al., Science 239:1534-1536(1988)は、ヒト抗体上へのマウス抗原結合部位のグラフトを教示する。
【００２０】
さらに、本明細書中に開示する抗体から、当業者はこのような相補的決定領域と同等または優れた結合特性を有するペプチド擬似体を設計および製造することが可能である（例えば、Horwell et al., Bioorg. Med. Chem. 4:153 (1996); Liskamp et al., Recl. Trav. Chim. Pays-Bas 1:113 (1994); Gante et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:1699 (1994); Seebach et al., Helv. Chim. Acta 79:913 (1996)を参照）。したがって、かかる抗体誘導体およびこれらのペプチド擬似体の全てが、本発明の範囲内にあると考えられる。本発明の組成物は、生理学的に許容可能な希釈剤、安定剤、局在化剤または緩衝剤をさらに含んでいてもよい。
【００２１】
いくつかの好ましい実施態様では、本発明の結合剤は、好ましくは化学的または光力学的アプローチによって活性化される。好ましい化学的アプローチは、ホルムアミジンスルホン酸などの有機還元剤、水銀（Ｉ）イオン、スズ（ＩＩ）イオン、シアニドイオン、水素化シアノホウ素ナトリウムおよび水素化ホウ素ナトリウムなどの無機還元剤、ジチオトレイトール、メルカプトエタノールおよびメルカプトエタノールアミンなどのチオール交換試薬、チオレドキシンなどのタンパク還元剤を含む。これらの試薬の使用により、結合剤内のいくつかのジスフィドの還元が生じ、いくつかのスルフヒドリル基を有する結合剤が生産される。かかる基の存在は結合剤の三次構造を変化させることができる。このような構造変化は結合剤の免疫反応性を変調することができる。このような変調は結合剤が投与される固体の抗イディオタイプ応答および／または細胞性応答を改善することにつながり得る。
【００２２】
ある実施態様では、活性化は、光力学的アプローチを利用する。例えば、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９３／０６３８８を参照。好ましくは結合剤は、好ましくは約１０〜約８２０ｎｍのスペクトル範囲にある紫外線を照射される。より好ましくは、少なくとも９０％及び最も好ましくは少なくとも９９％の照射が、２５０〜３２０ｎｍスペクトル範囲にある。このようなＵＶ照射は、水素または重水素放出ランプ、キセノンアークランプ、または水銀ランプなどの光源から便宜的に供給される。従来のフィルターは、最適スペクトル波長を得るために使用してもよい（例えば、Photochemistry, pp. 686-798 (John Wiley & Sons, N.Y., 1996を参照)。
【００２３】
ある好ましい実施態様では、本発明の好ましい結合剤は、光力学剤と任意に結合させてもよい。好ましくは、このような結合剤は、共有結合、またはリポソーム会合による。リポソーム会合は、好ましくはリポソーム形成試薬の存在下で光力剤を結合剤と混合することにより達成させる。ある好ましい実施態様では、本発明の結合剤は、リポソーム形成試薬に共有結合している。好ましい光力剤はハイポクレリン(hypocrellin)である。
【００２４】
いくつかの好ましい実施態様では、本発明の結合剤は、下記モノクローナル抗体：ＨＭＰＶ、ＶＵ−３−Ｃ６、ＭＦ０６、ＶＵ−１１−Ｄ１、ＭＦ３０、ＢＣＰ８、ＤＦ３、ＢＣ２、Ｂ２７．２９、ＶＵ−３−Ｄ１、７５４０ＭＲ、ＭＦ１１、Ｂｃ４Ｅ５４９、ＶＵ−１１−Ｅ２、Ｍ３８、Ｅ２９、ＧＰ１．４、２１４Ｄ４、ＢＣ４Ｗ１５４、ＨＭＦＧ−１、ＨＭＦＧ−２、Ｃ５９５、Ｍｃ５およびＡ７６−Ａ／Ｃ７を特に除外する。これらの各名称は、抗−ＭＵＣ−１抗体に関する文献で使用されている。
【００２５】
理論により拘束されることを望むものではないが、本発明のある結合剤は、一般的に抗イディオタイプネットワークを含む機構中で作用すると考えられている。抗イディオタイプネットワークの誘発に加えて、本発明の結合剤の投与は、ＭＵＣ−１との複合体の形成につながり、これは免疫系に対するより有効な抗原提示を誘発すると仮定される。抗原と抗体との間の複合体形成は、いくつかの効果を有し得る。本発明の好ましい結合剤は、循環性および細胞性ＭＵＣ−１腫瘍関連抗原の両者に結合することができる。したがって、ＭＵＣ−１抗原の可能性ある免疫抑制効果は、循環系から複合体を除去することによって不活性化され得る。抗原と抗体の複合体は、Ｆｃ受容体または膜Ｉｇ受容体（マクロファージ、樹状細胞、Ｂ細胞）を保持する抗原提示細胞に対して向けられる。特異抗原−提示細胞による抗原の取り込みの増加は、Ｔ細胞への抗原誘導ペプチドの大きな提示の増加をもたらすであろう。抗原と抗体との複合体形成は、抗原がどのように抗原提示細胞内で処理されるかを変更して、新規な免疫休眠または潜在的エピトープに露出し、しがって、腫瘍関連抗原に対する許容範囲を克服する。本発明の結合剤が、少なくとも部分的に炭水化物であるエピトープを結合するから、これらはＴ細胞上のレクチン受容体の炭水化物の相互作用を阻止することによって免疫抑制を阻止するようにも作用する。もちろん、光力学剤に結合する本発明の結合剤の実施形態は、腫瘍細胞への直接的な細胞毒を通じても作用することができる。
【００２６】
したがって、第２の態様では、本発明は、腫瘍関連ＭＵＣ−１抗原を含む腫瘍を保有する哺乳動物を治療的に処置する方法を提供する。本発明のこの態様における方法は、本発明の有効量の結合剤を哺乳動物に投与することを含む。好ましくは、結合剤はペプチド、またはペプチド疑似体であり、もっとも好ましくは抗体または抗体誘導体、またはこれらのペプチド疑似体である。好ましくは、哺乳動物はヒトである。結合剤は好ましくは非経口、より好ましくは静脈内または皮下投与される。ある好ましい実施形態では、静脈内注射がアジュバントの非存在下で実施される。ある好ましい実施形態では、結合剤は、ＲＩＢＩなどのアジュバントの存在下で皮下投与される。ある実施形態では、結合剤はＫＬＨまたは外因性免疫グロブリンなどの免疫原性担体分子に共有結合されている。ある好ましい実施形態では、本発明の方法は非放射性標識化されている結合剤を使用する。本発明方法のある好ましい実施形態は、循環性および腫瘍結合性腫瘍関連ＭＵＣ−１の両方に結合する結合剤を使用する。ここで、「腫瘍関連」とは、腫瘍対する近接性よりも、むしろ腫瘍細胞によって作成されたＭＵＣ−１の改変グリコシル化をいう。
【００２７】
好ましくは、結合剤は約８ｍｇ／３０ｋｇ体重未満、好ましくは約３ｍｇ／３０ｋｇ体重未満、より好ましくは約０．５〜約２ｍｇ／３０ｋｇ体重、なおもより好ましくは約０．５〜約１．５ｍｇ／３０ｋｇ体重、およびもっとも好ましくは約１ｍｇ／３０ｋｇ体重の投与量で投与する。ある実施態様では、投与量は抗体媒介毒性を誘発しない結合剤の最大量であるであろう。ある実施態様では、投与量はＡＤＣＣ ＯＲ ＣＤＣを産生しない結合剤の最大量である。これらの実施態様では、ＡＤＣＣは本発明の結合剤とともに５１Ｃｒ−標識腫瘍細胞をインキュベートし、新鮮なヒトＰＢＭＣを添加し、続いて４時間、インキュベートして、特異的分解を測定して評価する。ＡＤＣＣは、もしも特異的分解が１５％未満であるなら、存在しないとみなされる。「抗体媒介毒性」は、異常血清化学、腎臓機能障害、血清病またはアナフィラキシーの徴候および症状などの臨床的毒性を意味する。ある実施態様では、単一のかかる投与量は哺乳動物を治療的に処置するであろう。他の実施態様では、処置は例えば１年に４回、３年以上、継続してもよい。
【００２８】
「有効量」との用語は、哺乳動物を治療的に処置するのに十分な量を意味する。「治療的に処置する」、「治療的処置」、「結合剤」、「ペプチド」、「ペプチド疑似体」、「抗体」および「抗体誘導体」との用語は、全て本発明の第１の態様について記載したように使用される。
【００２９】
下記実施例は、本発明のある好ましい実施態様をさらに説明するよう意図され、本発明の範囲を狭めるように解釈されるものではない。下記実施例に使用した結合剤は、特に断りがない限り、Ａｌｔ−１である。
【実施例】
【００３０】
例１
結合剤を産生するためのハイブリドーマの生成
結合剤はＭＵＣ１(Talor-Papadimitriou. Int. J. Cancer 49:1, 1990)として知られる腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を発現する腫瘍を有する患者の免疫療法において使用するために調製された。結合剤は、活性マウスモノクローナル抗体（ＭＡｂ）、ＩｇＧｌｋサブクラス免疫グロブリンである。結合剤は、多くの腫瘍上に発現する高分子量糖タンパク質であるＭＵＣ１へ高い親和性で結合する(Ho, et al., Cancer Res. 53:641, 1993)。結合剤は、ＭＵＣ１タンデム型反復ペプチド配列内に配列ＤＴＲＰＡＰを特異的に認識する。この結合剤は、Ａｌｔ−１と呼ばれる。結合剤を分泌するマウス細胞系またはハイブリドーマは、ＭＵＣ１でマウスを免疫化し、抗体−分泌脾臓細胞を収集および不死化することによって生成する。ハイブリドーマ発生に関する工程は、（ａ）いくつかの起源からのＭＵＣ１でのＢＡＬＢ／ｃＣｒＡｌｔＢＭ雌マウスの免疫化、（ｂ）マウスからの脾臓細胞の収集、（ｃ）ミエローマ細胞系ＳＰ２／０−ＡｇＩ４とそれらを融合することによる、脾臓細胞の不死化、（ｄ）ＭＵＣ１結合能力に関して分泌抗体をアッセイすることによる所望のクローンのスクリーニングおよび選択、（ｅ）適当な培地中での選択クローンの増殖、（ｆ）ＩｇＭからＩｇＧへのクローンのイソタイプ転換、および（ｇ）連続０．２μｍ濾過および配合緩衝液（１０ｍＭピロリン酸ナトリウム−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）を用いた希釈を含んでいた。ＭＵＣ１発現乳癌細胞およびＭＵＣ１形質転換マウス細胞に対する結合剤の特異的結合性は、ＦＡＣＳ、蛍光顕微鏡法および他の結合アッセイ法で実証された。
【００３１】
例２
結合剤の精製、調製物活性化および配合
成長培地は例１のハイブリドーマから収集した。結合剤は、（ａ）０．２２μｍフィルターを用いた微量濾過による成長培地の清澄、（ｂ）平衡時の４０ｍＭから溶出時の１３０ｍへのＮａＣｌ勾配を使用する５０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ８．０中のＱセファロース(登録商標)ＦＦ(Amersham Pharmacia Biotech)上の陰イオン交換クロマトグラフィーによって、成長培地から精製した。これに続いて、０．２２μｍ微量濾過、（ｃ）平衡用１．０Ｍグリシン、３．０Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．８から、２００ｍＭグリシン、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ２．８を含む溶出緩衝液への緩衝液中の変化の後に溶出させる、プロテインＡセファロース(S登録商標)ＦＦ(Amersham Pharmacia Biotech)のアフィニティクロマトグラフィー、（ｄ）ｐＨ３．５で４０分間のインキュベーション、（ｅ）０．２２μｍ微量濾過に続くＶｉｒｅｓｏｌｖｅフィルター(Millipore Corporation)上でのナノメーター濾過、（ｅ）０．２２μｍ微量濾過に続く５０ｋＤ ＮＭＷＣＯ Ｂｉｏｍａｘ膜(Millipore Corporation)を用いた接線フロー限外濾過による濃縮およびダイアフィルトレーションを行った。
【００３２】
次いで、精製結合剤は、以下の様式で活性化した。精製結合剤（低モル濃度リン酸塩中、５ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ５〜１０）のバルク液体を賦形剤（塩化第一スズ）および還元剤（ピロリン酸ナトリウム）と混合して、１つのランプ当たり３〜９ワットの８個のランプからの２００〜４００ｎｍ照射で、９０％が３００ｎｍ＋／−２０ｎｍに曝露して、活性結合剤を得た。活性結合剤は同じ還元剤および緩衝液複合体とともに、凍結または凍結乾燥形態の活性結合剤２ｍｇを含むバイアル中に供給した。最終配合物の調製は、結合剤の投与前４時間以内に無菌条件下で行った。結合剤は、無菌方法を用いた以下の手法で調製した。本発明者は、結合剤バイアル最上部の金属タブを折り曲げ、アルコールでゴムセプタムを消毒した。適切なシリンジ中に、塩化ナトリウム注入ＵＳＰ２．０ｍＬを引き上げ、バイアルに添加した。本発明者はバイアルをゆっくり回すことによりバイアル内容物を混合して、結合剤溶液を生成させた。本発明者は泡が形成するように激しく混合しなかった。本発明者はこの工程後、直ちに時計の時刻を記録した。バイアルは溶液が外来または微粒子物質を確実に含有しないために試験した。
【００３３】
例３
正常および腫瘍組織と結合剤の反応
例２の結合剤の組織反応性を、色凍結組織を染色する、アビジン−ビオチン増幅免疫ペルオキシダーゼ技法を用いた免疫組織化学的手法によって試験した。予備的研究では、結合剤を用いて、正常ヒト組織およびヒト腫瘍の選択パネル中のＭＵＣ１抗原の発現および分布を試験し、ＭＵＣ−１発現組織の特異的染色のための抗体または最終生成物の最適濃度を決定した。特異的染色は乳房、大腸および肺の腫瘍細胞中、ならびに正常乳房、腎臓、大腸および肺の上皮細胞中で観察された。第２の研究では、正常ヒト組織およびヒト腫瘍のより広いパネルへの結合剤の結合および分布を、対照としてイソタイプ適合抗体（ＭＯＰＣ−２１）を使用して行った。結合剤との特異的染色は、乳癌、大腸癌、食道扁平上皮癌、膵臓癌および前立腺癌に見られた。いくつかの特異的染色もまた、黒色腫および肉腫でも観察された。結合剤による染色は、いくつかの正常組織においても観察され、上皮細胞へ主に局在化していた。これらの結果は、正常ヒト組織およびヒト腫瘍におけるＭＵＣ１ペプチドの発現およびＭＵＣ１ｍＲＮＡに関する文献報告と一致し、これらの組織への本発明の結合剤の反応性を証明している。
【００３４】
例４
抗イディオタイプ応答の生成
例２の結合剤は、イディオタイプとして知られている抗原（ＭＵＣ１）認識に特異的な可変領域を有する。これらの可変領域は、それ自体、免疫原性であり、Ａｂ２として知られている一連の抗イディオタイプ抗体を生成することができる。これらのＡｂ２のいくつかは、元の抗原（ＭＵＣ１）の三次元構造またはペプチド配列を有効に模倣し、元の抗原によって誘発される免疫応答と類似した特異的な免疫応答を生じるために使用することができる。したがって、結合剤の投与は、Ａｂ２の形態で抗原疑似体または内部の像抗原を生成すると期待され、特異的な抗ＭＵＣ１免疫応答を生じることができる。結合剤によるＡｂ２の誘発を証明するために、ＲＡＳアジュバント(RIBI Adjuvant System)と組み合せて、ＢＡＬＢ／ｃマウスをＫＬＨ(Keyhole Limpet Hemicyanin)に結合した結合剤で免疫化した。ＫＬＨおよびアジュバントは、マウス抗体（抗原として）に対するマウスでの通常、弱い免疫応答を増強させるために、これらの実験に含まれていた。イソタイプ適合抗体は対照として作用した。６回の各注射を投与した後（腹腔内投与と皮下投与間で交互に）、血清を固相上の結合剤のＦ（ａｂ’）２断片を使用したサンドイッチアッセイ法で分析した。結合マウス抗体は、トレーサーとしてヤギ抗マウスＩｇＧ−（Ｆｃ−特異的）−ＨＰＲにより検出した。ＫＬＨに結合した結合剤の注射は、イソタイプ適合対照ＭＡｂよりも大きな抗イディオタイプ抗体（Ａｂ２）の産生を生じる結果となった。測定可能な体液応答を誘発するためには、用量５０μｇ／マウス（０．８３ｍｇ／ｍ２）で、最少４回注射を必要とした。血清中の抗結合剤（Ａｂ２）がタイプＡｂ２（β）であることを証明するために、結合剤に対する結合性をＭＵＣ１の存在下で試験した。この結合性はＡｂ２（β）タイプ抗体において予期されたように、ＭＵＣ１の存在によって阻止された。Ａｂ３抗体はＭＵＣ１ ＥＬＩＳＡを使用して血清試料中で測定した。抗−抗イディオタイプ抗体（Ａｂ３）は対照血清に対する結合剤で免疫化されたマウスの血清中にて検出された。Ａｂ２レベルと同様に、Ａｂ３レベルは、６回の注射後にはそのピークに達した。さらに、結合剤に対して生じたマウスモノクローナルＡｂ２は、次に、ラットでの抗−抗イディオタイプ（Ａｂ３）抗体を生成するために使用された。このようにして免疫化された３匹のラット中、２匹はマウスモノクローナル抗体Ａｂ２に対して陽性結合を示した。異なった種における抗ＭＵＣ１抗体の生成が、基準抗原、すなわちＭＵＣ１によってＡｂ１およびＡｂ２の間の結合性を阻止する能力に加えて、Ａｂ２βの分類においても重要な判定基準であると考えられた。
【００３５】
例５
細胞応答の誘発
Ｔ細胞増殖は、例２の結合剤およびＭＵＣ１の注射に対する特異的応答を示し、イディオタイプ特異的Ｔ細胞（Ｔ２）および抗イディオタイプ特異的Ｔ細胞（Ｔ３）の存在を示した。さらに、マウスモノクローナル抗体Ａｂ２もまたＭＵＣ１特異的Ｔ細胞によって認識される能力について評価した。Ａｂ２に対する応答におけるこのようなＴ細胞の増殖は、３Ｈ−チミジン取り込みによってモニターされ、ＭＵＣ１と比較された。このアッセイは、３Ｈ−チミジン取り込み研究として行った。脾臓を、免疫化マウスの各群から取り出し、リンパ球をＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ１０７７(Sigma)上の赤血球細胞から分離した。細胞を９６ウェルＵ字底プレート(Becton Dickinson)中へ、ＡＩＭ−Ｖ無血清培地(Gibco)１００μＬ中、２×１０５細胞／ウエルの濃度で播種した。刺激剤を３倍添加し、３日間、細胞とともにインキュベートした。細胞を１ウエル当たり、１μＣｉ［３Ｈ−メチル］チミジンとともに２４時間、パルスにかけた。細胞を細胞収穫器(Skatron)中に収集し、放射能をベータカウンター(Beckman)でアッセイした。刺激剤(stimulator)は、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−１ペプチド、抗ＭＵＣ−１抗体、対照抗体およびフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）を含んでいた。Ａｂ２およびＭＵＣ１は細胞性免疫応答のさらなる証拠をもたらす同様な反応性を示す。
【００３６】
例６
用量計画の決定
ラット抗マウス抗体（ＲｔＡＭＡ）およびラット抗イディオタイプ抗体（Ａｂ２）の発生に関する例２の結合剤の用量応答は、正常ラットにおいて検討した。雄スプラークドーリーラットを静脈内投与によって２６μｇ〜２１３μｇの範囲の用量、および皮下投与によって１０６μｇ１回用量にて、結合剤で免疫化した。免疫化は２週間の間隔で５回実施した。基線および試験血清試料（注射後１週間）を各ラットから得た。２つのＥＬＩＳＡアッセイをＲｔＡＭＡおよびＡｂ２を測定するために行った。ＲｔＡＭＡ ＥＬＩＳＡは、マウスＩｇＧ１抗体の定常領域に結合する抗体量を測定する。Ａｂ２ ＥＬＩＳＡは、結合剤の結合領域に反応性を示す抗体量を測定する。５３μｇ（１．３ｍｇ／ｍ２）の用量は、静脈内注射によりＲｔＡＭＡを誘発する際に最適であることが明らかになった。アジュバントとの抗体の皮下注射は、静脈内投与された同じ用量よりも３倍高く、かつ、最も有効な静脈内用量（１．３ｍｇ／ｍ２）よりも２倍高いという、より強い応答を誘発した。用量１．３ｍｇ／ｍ２が持続性ＲｔＨＡＭＡ応答を誘発した。２．６ｍｇ／ｍ２の注射回数を増加させて応答が低下し、かつ、試験した最も高い用量（５．２ｍｇ／ｍ２）では無反応が得られたため、より高い用量はアネルギーを誘発するようである。結合剤はまた、抗イディオタイプ応答を誘発したが、その応答は注射した用量に比例していなかった。ＲｔＡＭＡにおいて効果的な同じ用量もまた、抗イディオタイプ抗体の誘発における最適用量であることが観察された。静脈内用量スケジュールでは、用量１．３ｍｇ／ｍ２が強いＡｂ２応答を誘発するのに有効な唯一の用量であった。全体として最も強いＡｂ２応答を誘発する皮下用量２．６ｍｇ／ｍ２での抗体の皮下注射を用いて、より良い応答を生じた。全体では、ＲｔＡＭＡとＡｂ２応答の間に相関関係が見られ、同じ静脈内投与用量における最適応答を示す。しかしながら、Ａｂ２およびＲｔＡＭＡの絶対量は直接的に比較できなかった。用量１．３ｍｇ／ｍ２（およそ２ｍｇ／６０ｋｇ患者に等しい）が、結合剤の静脈投与後に体液応答を誘発するのに最適であるようである。ＲｔＡＭＡは早くも最初の免疫化後、６週間目で検出され、Ａｂ２は４週間目（皮下免疫化）、または１０週間目（静脈内免疫化）に検出することができた。静脈内経路は皮下経路よりも免疫応答を誘発するにはより強い免疫化を必要とした。このより弱い免疫応答は、この関連種、ラットでのマウスタンパクの低下した免疫原性によるものであろう。これらの実験から、治療的処置において示唆される用量は、免疫応答で循環するいかなる抗原の影響を考慮しなければ、患者当たり約２ｍｇである。
【００３７】
例７
用量計画の確認
ラットで行った研究と同様に、ウサギにおける免疫応答を誘発するのに必要な用量を検討するために用量増大研究を行った。ウサギは、ラットまたはマウスのいずれかよりもマウスＭＡｂに対して、ヒト（外来として認識）において見られる応答に一層近接するために使用した。ウサギを種々の量の抗体で免疫化し、血清試料をＡｂ２およびウサギ抗マウス抗体（ＲＡＭＡ）について分析した。雌ニュージーランド白ウサギを、静脈内投与によって３つの用量レベル（１２５、２５０および５００μｇ）および皮下投与によって１つの用量（１２５μｇ）にて、例２の結合剤で免疫化した。基線および試験血清試料（およそ２週間毎に得た）は、各ウサギから得た。２つのＥＬＩＳＡ分析を、ＲＡＭＡおよびＡｂ２を測定するために実施した。ＲＡＭＡ ＥＬＩＳＡは、マウスＩｇＧ１抗体の定常領域に結合する抗体量を測定する。Ａｂ２ ＥＬＩＡは結合剤の結合領域に反応性である抗体量を測定する。ＲＡＭＡ応答は注射マウス抗体の定常領域に対する宿主の体液応答を示す。用量０．５７５ｍｇ／ｍ２は、陽性対照として皮下注射した。３つの異なった用量：０．５７５、１．１５および２．３ｍｇ／ｍ２を静脈内投与した。ＲＡＭＡ応答は２５０μｇ／ウサギのＭＡｂ−ＡＬＴ−１で静脈内注射して、続いて、１２５μｇ／ウサギの皮下注射、５００μｇ／ウサギの静脈内注射、および１２５μｇ／ウサギの静脈内注射したウサギにおいて最も強かった。Ａｂ２およびＲＡＭＡに両方としてウサギにおいて免疫応答を誘発した結合剤は、最初から最後の出血試料中に見出された。用量２５０μｇ／ウサギ（１．１５ｍｇ／ｍ２、２ｍｇ／６０ｋｇ患者に等しい）は、抗体Ａｂ２およびＲＡＭＡの両タイプにおいて最も高い応答を誘発した。この誘発Ａｂ２は、ＭＵＣ１で阻止され得るが、ＭＵＣ１ペプチドまたはＣＡ１９．９によって阻止されな得なかった。結合剤はまた、ウサギにおいて抗イディオタイプ応答を誘発したが、Ａｂ２応答は注射した用量に直接に相関していなかった。用量２５０μｇ／ウサギが３つの静脈内投与用量のうち最も高いＡｂ２応答を生じることが観察された。１２５μｇ／ウサギでの抗体の皮下注射は、全体として最も強いＡｂ２応答を誘発した。誘発Ａｂ２はＭＵＣ１と競合したが、試験した濃度ではＭＵＣ１ペプチドと競合しなかった。投与経路が免疫応答のタイプに影響を与えることに注目することは興味深いことである。Ａｂ２応答は皮下免疫化したウサギにおいて最も強かったが、一方、一般的なＲＡＭＡ応答は静脈注射したウサギにおいて最も優れていた。全体として、ＲＡＭＡおよびＡｂ２応答は相関し、同じ静脈内投与用量に関して最適応答を示す。これらの結果は、用量１．１５ｍｇ／ｍ２（２ｍｇ／６０ｋｇ患者に等しい）がＭＡｂ−ＡＬＴ−１の静脈内注射後の体液応答を誘発するのに最適であることを実証した。ＲＡＭＡおよびＡｂ２が早くも最初の免疫化から２週間目に検出することができた。したがって、ウサギの免疫応答は、ラットの抗体応答（静脈内投与の８週間目に検出）よりも優れていた。したがって、これらの実験から、治療的処置に対する示唆用量は、免疫応答の循環する抗原の影響を考慮しなければ、患者６０ｋｇ当たり約２ｍｇである。
【００３８】
例８
初期腫瘍治療研究
動物モデルに使用した腫瘍細胞は、宿主適合性とＭＵＣ１発現の両方を有するべきである。マウス腫瘍細胞系にトランスフェクトしたＭＵＣ１遺伝子のみがマウスでのモデルとして認定された。２つにＭＵＣ１形質導入体細胞系、ＭＴおよび４１３ＢＣＲが評価された。これらの細胞系の両者に、マウス乳癌細胞系４１０．４から誘導され、２０個以上のタンデム型反復エピトープを含む全長ＭＵＣ１遺伝子を形質導入した。両細胞系はＢＡＬＢ／ｃおよびＣＢＧＦ１マウスに適合している。これらの細胞系は、ＦＡＣＳ分析により、これらの細胞に対する例２の結合剤の結合によって分析されたように、ＭＵＣ１抗原を多く発現する。ＭＴ細胞はＣＢ６Ｆ１マウス中へ静脈内注射され、肺へ移植された。腫瘍病巣は注射後、３０〜４０日目に肺に見られ、マウスは処置しないで５０〜６０日目に死亡した。組織病理的分析からも肺中の腫瘍および腫瘍組織上のＭＵＣ１発現を確認した。この細胞系は比較的高い濃度、マウス当たり２×１０７個の細胞を注射した場合ですら、皮下に腫瘍を形成しない。４１３ＢＣＲ細胞をＢＡＬＢ／ｃマウスに、種々の細胞濃度（マウス当たり２．５〜５×１０６個の細胞）にて脇腹(flank)または乳房脂肪パッド中へ皮下注射した。腫瘍は１０〜１５日目に発症し、腫瘍が乳房脂肪パッド中へ移植した場合、より低い拒絶反応速度であった。治療的研究では、腫瘍は式：（ａ×ｂ２）／２、（式中、ａは最長直径、およびｂは最短直径を示す。）により腫瘍容積について測定した。in vivoでの形質導入体のＭＵＣ１発現を証明するために、ＭＴ腫瘍保有マウスを絶命させ、肺を無菌的に取り出した。腫瘍組織を肺から除去し、小片に切断し、トリプシンで１０分間、消化した。次いで、腫瘍細胞を３日間、培養して、ＦＡＣＳ分析を行った。その結果はＭＴ形質導入体細胞の８０％以上がin vivoでの成長１ケ月後にＭＵＣ１抗原を発現していたことを示した。ＭＵＣ１抗原に対する抗体−ＫＬＨ結合体（ＫＬＨはマウスでのマウス抗体の免疫原性を増加させるために使用した。）の結合能力は、２つの方法、ＥＬＩＳＡおよびＲＩＡで測定し、in vivoでその標的を認識する免疫原性の能力を証明した。２つの異なったタイプのアジュバント、ＲＡＳ（ＲＩＢＩ Adjuvant Systems)およびＱｕｉ Ａをこれらの研究で使用した。ＲＡＳはフロイド完全アジュバント（ＦＣＡ）の主要な成分である生物、ミコバクテリウム結核菌(Mycobacterium tuberculosis)から得た高度に精製した細菌成分を含む安定な水中油乳化液である。Ｑｕｉ Ａは別なものとして使用される表面活性剤であるが、皮下注射のみできる。両アジュバントは別な実験で使用した。実験を通して得た血清試料は、Ａｂ２および／またはＡｂ３含量についてはＥＬＩＳＡによって分析した。リンパ球増殖アッセイは、免疫化マウスの脾臓から単離したリンパ球を使用する標準的プロトコールによる３Ｈ−チミジン取り込みの測定によって行った。免疫刺激剤はＭＵＣ１、ＭＵＣ１ペプチド、抗ＭＵＣ１抗体、対照抗体およびフェトヘマグルチニン（ＰＨＡ）を含んでいた。ＣＢ６Ｆ１マウスを使用する各実験の終了時に、動物を絶命させ、肺中の腫瘍病巣数を直接計数法によって分析した。さらに、マウスの選択群に、１２５Ｉ−デオキシウリジンを動物の死亡４時間前にマウスへ注射した。肺はγ線カウンターで放射活性をアッセイして、腫瘍負荷を計数した。免疫応答および結合剤、結合剤−ＫＬＨ、結合剤−ｈＩｇＧおよび結合剤−ＭＵＣ１複合体の有効性は、腫瘍保持ＢＡＬＢ／ｃおよび腫瘍保持ＣＢ６Ｆ１マウスにおいて分析した。
【００３９】
実験の最初のシリーズは、体液応答（抗マウス抗体、Ａｂ２およびＡｂ３）、細胞応答（Ｔ細胞増殖）、ならびに腫瘍成長および／または大きさにおけるこれらの化合物の影響の誘発における、例２の結合剤（ＫＬＨ）の結合体(conjugate)または複合体（結合剤−ＭＵＣ１）の効果を評価した。マウスには免疫シリーズの開始後、２週間目に４１３ＢＣＲ腫瘍細胞を移植した（皮下、静脈内、または両経路の組み合せにて）。体液応答は結合および複合した結合剤の両者で処置したマウスで誘発されたことを見出した。結合剤に対するいわゆるＴ２細胞応答はこれらのマウスで誘発されたが、Ｔ３集合体（ＭＵＣ１またはＭＵＣ１ペプチドに対する応答）は明白ではなかった（Ｔ２はＡｂ１イディオタイプ特異的Ｔ細胞であり、Ｔ３はＡｂ２イディオタイプ特異的Ｔ細胞である）。これらの研究で統計的有意性は示されなかったが、結合または複合結合剤で処置したマウスの腫瘍の容積および大きさにおける低下傾向も示された。
【００４０】
例９
確証的腫瘍処置研究
ＢＡＬＢ／ｃマウス腫瘍モデル実験から得たシリーズ１および２は、ＣＢ６Ｆ１腫瘍モデルで繰り返した。Ａｂ２、Ａｂ３およびＴ細胞増殖を体液および細胞応答を決定するために再び測定した。種々の配合剤を注射した後にマウスに生じた腫瘍病巣数は、１つのシリーズで評価し、腫瘍大きさの評価はin vivoでの１２５Ｉ−ウリジンの取り込みを評価しておこなった。実験のこのシリーズの最後では、肺腫瘍モデルを移植したマウスの生存に影響を与える対照ＭＡｂおよびＰＢＳに比べて例２の結合剤の能力を評価した。実験のこの確証的セットでは、ＭＵＣ１に対するＴ細胞応答は観察されなかったけれども、体液および細胞応答はこれらのマウス中に誘発されたようである。腫瘍負荷における有意な低下は観察されなかったが、腫瘍の大きさは減少したようであった。対照ＭＡｂまたはＰＢＳを注射したものに比べて、結合剤を注射したマウスは有利にも生存していたようである。図１に示されるように、ＰＢＳ処置マウス以上にＭＡｂ−ＡＬＴ−１で処置したマウスには生存率において有意な改善があった。ＰＢＳ処置以上にＭＡｂ−ＡＬＴ−１を使用した処置のスチューデントＴ検定で測定したｐ−値は、＜０．０５であった。静脈注射によって投与した自然抗体、ＭＡｂ−ＡＬＴ−１は、ＭＴ−ＣＢ６Ｆ１マウス腫瘍モデルで抗腫瘍効果を示した。抗体のより少量の注射による先の実験では効果がなかったから（データは示されない）、腫瘍細胞注射前の最小量の３回注射および続いての４回注射は、この効果を示すために必要であった。
【００４１】
例１０
微粒子−カプセル化結合剤
抗体のリポソーム配合剤はイディオタイプ応答を増大することができるから、この研究はヒト乳癌腫瘍保有マウスに投与した微粒子−カプセル化結合剤の免疫応答を検討するために行った。結合剤は二重乳化技術によってＰＬＧＡ微粒子中に混合した。各ＢＡＬＢ／ｃマウスに研究０日に皮下から５×１０６個の４１３ＢＣＲ腫瘍細胞の注射を行った。１週間後に、４匹の動物からなる群のマウスを、次の処置群：ＰＢＳ、ＩｇＧ−ＫＬＨ、結合剤−ＫＬＨ、微粒子（ＭＳ）、結合剤−モノホスホリル脂質Ａ微粒子（ＭＰＬＡ−ＭＳ）、およびＭＵＣ−１に分けた。血清を１／１００に希釈し、Ａｂ２およびＡｂ３応答を各免疫前にＥＬＩＳＡで測定した。腫瘍容積を２日毎に二次元にてカリパスで測定した。微粒子カプセル化結合剤は、ＫＬＨを結合した結合剤またはＭＵＣ−１との複合体中の結合剤よりも優れたイディオタイプ免疫応答を誘発した。微粒子カプセル化結合剤は腫瘍成長のいくらかの抑制を示したが、統計的有意性は達成されなかった。これは、マウスがこの実験の抗体で前免疫化されていなかった事実によるからであろう。
【００４２】
例１１
腫瘍関連ＭＵＣ−１の特異性
９９ｍＴｃ標識結合剤の生物学的配置もまた、培養ヒト乳癌（ＺＲ−７５−１）細胞を移植した免疫欠損（ヌード）マウスへのその投与によって測定した。これらの細胞は既に試験されて、ＭＵＣ１抗原の発現は確認されている。９９ｍＴｃ標識結合剤は静脈内注射され（結合剤２０μｇ上に２０μＣｉの９９ｍＴｃ）、動物は標準的プロトコールにより注射から、３、６および２４時間後に絶命させた。目的の器官および組織を取りだし、γ線カウンターで放射活性を分析した。同じサブクラスの第２の非ＭＵＣ１反応性抗体（９９ｍＴｃ標識ＭＯＰＣ−２１）を注射から、６および２４時間後に動物の他の群にて同様に試験した。２つの抗体間における体内分布の全体的パターンは、９９ｍＴｃ標識ＭＯＰＣ−２１については肝臓および脾臓での取り込みがより高かったことを例外として、ほとんどの器官において同様であった。これは、多分、調剤中に存在する一層多量の９９ｍＴｃ高分子量凝集体、および腫瘍部位における９９ｍＴｃ標識結合剤の有意により高い取り込みによるのであろう。２つの放射性標識ＭＡｂにおける平均腫瘍取り込みの差異は、不対２尾ｔ検定を使用して分析して、注射から、６および２４時間後で統計的に有意（ｐ＜０．００１）であると判断した。したがって、９９ｍＴｃ標識結合剤の非特異的組織局在化は、他の同様に調製されたＩｇＧ１マウスモノクローナル抗体のものを代表するようである。この取り込みは、トレーサー分布および抗体代謝に関連したものなど、正常な組織蓄積方法の代表例であり、高い肝臓、血液および腎臓値にそれぞれ反映する。腫瘍取り込み値は、注射から、２４時間後の９９ｍＴｃ標識ＭＯＰＣ−２１調製剤に比べて、９９ｍＴｃ標識結合剤の標的組織蓄積において、ほとんど５倍増加を示す。この非常に有意な差異は、腫瘍異種移植片組織を発現するＭＵＣ１内の特異的抗原結合性による優先的９９ｍＴｃ標識結合剤の保持をほとんど確かに示している。この取り込みはやがて腫瘍対血液の比率の連続上昇という結果となり、２４時間で２．１の高さに達する。これはほとんどの他の組織では１．０未満の値である（腎臓の１．５を除く）のに比べての値であり、トレーサーの積極的な特異的保持を意味する。
【００４３】
例１２
グリコシル化ＭＵＣ−１の優先的結合
その表面にＭＵＣ−１糖タンパクを発現するＺＲ−７５−１細胞は、３７℃で４８時間、４ｍＭフェニル−Ｎ−α−Ｄ−グルコサミドによる処理によって脱グリコシル化された。例２の結合剤の結合を、Ａｌｔ−１またはＭＵＣ−１の全てのペプチドエピトープを結合することが知られている対照抗体（ＳＭ３）を使用するＦＡＣＳａｎ分析による未処置および脱グリコシルＭＵＣ−１と比較した。表１に示されるように、未処置ＭＵＣ−１の結合においてわずかな優先性が存在した。これらの結果は、結合剤が少なくともいくつかの炭水化物を含むエピトープを結合することを示す。
【００４４】
【表１】
【００４５】
例１３
外因性抗体を使用する腫瘍免疫治療
ＭＵＣ−１形質導入マウス４１３ＢＣＲ腫瘍細胞を、ＢＡＬＢ／ｃマウス中へ接種した。次いで、マウスにＡｌｔ−１単独、またはＫＬＨまたはｈＩｇＧに結合したＡｌｔ−１を５回（皮下）注射した。対照として、ＫＬＨまたはｈＩｇＧに結合したマウスＩｇＧを使用した。免疫応答は抗イディオタイプ抗体（Ａｂ２）を測定して評価した。Ａｂ２検出には、ＥＬＩＳＡプレートを１００μｌのＡｌｔ−１ Ｆ（ａｂ）２（２．５μｇ／ｍｌ）で被覆し、希釈試料とともにインキュベートした。結合Ａｂ２はＨＲＰおよびＡＢＴＳに結合した抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ特異的）を使用して検出した。これらの結果は、４０５／４９２ｎｍ＋ＳＤでの平均吸光度として、図２に示される。これらの結果は、外因性コンテクスト中に現れるか、あるいはＫＬＨに結合したＡｌｔ−１が、Ａｂ２を産生する結果となることを示すが、一方、Ａｌｔ−１または対照のいずれもはそうではなかった。
【００４６】
Ａｌｔ−１に特異的なＴ−細胞を刺激する抗原提示細胞として作用する腫瘍細胞の能力は、以下のように評価した。４１３ＢＣＲ細胞を、ＰＨＡ培地（陽性対照）、Ａｌｔ−１、ｈＩｇＧ、ｈＩｇＧに結合したＡｌｔ−１、マウス抗ヒト抗体（ＭＡＨＡ）、またはｈＩｇＧおよびマウス抗ヒト抗体（ＭＡＨＡ）に結合したＡｌｔ−１とともに、３７℃で２４時間インキュベートした。腫瘍細胞は、ｈＩｇＧで免疫化したマウスから得た精製Ｔ細胞を刺激するために、ＡＰＣとして使用した。Ｔ細胞増殖は、［３Ｈ］−チミジン取り込みを使用して測定した。その結果を図３に示す。ｈＩｇＧおよびマウス抗ヒト抗体（ＭＡＨＡ）に結合したＡｌｔ−１のみが細胞を処置した。これらの結果は、腫瘍細胞がそれを内部移行する条件下で、腫瘍細胞への異種コンテクスト中にＡｌｔ−１が提示された場合、処置された腫瘍細胞が、Ａｌｔ−１に特異的なＴ細胞応答を生じるＡＰＣとして作用することができることを示す。
【００４７】
抗癌効果を、腫瘍質量を秤量して評価した。４１３ＢＣＲ腫瘍保持マウスに先に記載したように異なる抗体配合剤を５回（皮下）注射した。マウスを２６日目に絶命させ、腫瘍を取りだし、秤量した。その結果を、５匹のマウスから得た腫瘍の平均＋ＳＤとして、図４に示す。統計的分析はｔ検定によって実施した。これらの結果は、外因性コンテクスト中に提示されたＡｌｔ−１は腫瘍負荷において統計的に有意な低下をもたらすことを示す。
まとめると、これらの結果は、本発明の結合剤が、抗イディオタイプおよび細胞応答の両者を生じることができ、この応答が腫瘍治療に効果的であることを示す。
【００４８】
例１４
ｈＰＢＬ−再構成腫瘍保持ＳＣＩＤマウスの処置
ＳＣＩＤ／ＢＧマウスに、８０℃に貯蔵されていた１０７個のｈＰＢＬを注射した。血液を１２日目にマウスから採取し、マウスが再構成されているか否かを決定するためにｈＩｇＧの存在について試験した。注射した７匹のマウスのうち、５匹は再構成されていた。再構成マウスを０日目にＰＢＳまたは１００μｇのＡｌｔ−１または対照ＩｇＧ１で腹腔内処置し、７日目および１４日目に繰返し処置した。１７日目にマウスに５×１０６個の腫瘍細胞（ＮＩＨ ＯＶＣＡＲ−３）＋２０％マトリゲルを皮下移植した。マウスを２１日目に出血させて、２１日目および２８日目にＰＢＳまたは１００μｇのＡｌｔ−１または対照ＩｇＧを静脈注射して処置した。マウスを２８、３２、３５、３９および４３日目に絶命させ、その腫瘍容積を測定した。その結果を図５に示す。これらの結果は、外因性結合剤Ａｌｔ−１がアジュバントまたは担体タンパク質の非存在下にですら、腫瘍容積の統計的に有意な低下をもたらすことを示す。
【００４９】
例１５
ハイポクレリンに結合した結合剤の調製
長期循環性、立体的安定化ＨＢＢＡ−Ｒ２リポソーム（ＳＬ）および免疫リポソーム（ＳＩＬ）配合剤は、ＤＰＰＣ／マレイミド−ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ（９４：６モル比）およびＤＳＰＣ／コレステロール／マレイミド−ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ（６４：３０：６モル比）それぞれから構成される。対照ＨＢＢＡ−Ｒ２リポソーム（ＣＬ）はＤＰＰＣ／ＤＰＰＧ（９：１モル比）から構成される。ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＰＰＧおよびコレステロールはＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ(Alabaster, AL, USA)から購入し、マレイミド−ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥはShearwater Polymers Inc.(Huntsville, AL, USA)から購入した。
【００５０】
ハイポクレリンの合成は、当該分野で認識されている手法を使用する（例えば、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９８／００２３５号を参照）。２つの方法はリポソーム中へハイポクレリンを負荷するために使用した。ＨＢＢＡ−Ｒ２は溶媒注入法によって、脂質対薬剤モル比１５：１にて予め形成されたＳＬおよびＳＩＬ中へ負荷するか、あるいは溶媒希釈法によって、ＣＬ（脂質対薬剤１５：１）中に負荷した。
【００５１】
溶媒希釈法では、脂質と薬剤をまず、有機溶媒のストック溶液から互いに混合し、次いで乾燥した。メタノールを最終脂質濃度２００ｍＭになるまで添加した。脂質／薬剤溶液を加熱緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ １４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）の５００μｌ分取量を添加して、６５℃で１０ｍＭ脂質になるまでゆっくりと希釈する際にリポソームを形成した。得られたリポソームはセファデックスＧ５０を使用してゲル濾過し、上記緩衝液で溶出して精製した。
【００５２】
溶媒注入法では、（ＨＢＢＡ−Ｒ２）−ＳＬリポソーをまず、１０ｍＭ脂質、２ｍＭ ＭＯＰＳＯ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．７の最終濃度まで、乾燥した薄フィルムを水和して調製した。ＨＢＢＡ−Ｒ２ （ＰＥＧ３００中、１０ｍＭ）を６５℃まで加熱し、リポソームの６５℃溶液中に滴下し、１５分間、インキュベートした。得られたハイポクレリン−リポソームは、平均ベシクルサイズ１００ｎｍになるＬｉｐｅｘ Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ(North Vancouver, BC)押出装置を使用して、８０ｎｍポリカーボネート膜から押し出した。
【００５３】
免疫リポソームは以下のようにして製造した。抗体をまず２０ｍＭピロリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し、次いで、３０モル過剰量の２−イミノチオレーンとともに１時間、２２℃でインキュベートした。チオール化した抗体を精製し、ｐＨを、２０ｍＭ ＭＯＰＳＯ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．７緩衝液を使用するゲルクロマトグラフィーによって低下させた。チオール化した抗体は、上記マレイミド−リポソームの一部とともに、２２℃で一夜、２５〜５０μｇＭＡｂ／μモル脂質濃度でインキュベートした。リポソームのセットは、結合抗体の有無にかかわらず、双方ともセファロースＣＬ−４Ｂを使用してゲル濾過し、かつ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ １４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４緩衝液を用いて溶出して精製した。約９０〜９５％の抗体がリポソームへ結合した。
【００５４】
ハイポクレリン−リポソーム溶液は、Sartorious AG.(Goettingen, Germany) ＣｅｎｔｒｉｓａｒｔＩ遠心分離濃縮器（３００，０００ＭＷカットオフ）を使用して濃縮した。全てのリポソーム調製物は、Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶ ０．２２μｍ無菌フィルターユニット(Millipore Bedford, MA USA)を使用してフィルター滅菌し、脂質および薬剤濃度を分析し、次いで、滅菌緩衝（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ １４０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．４）を使用して所望濃度にまで希釈した。薬剤対最終脂質のモル比、２０：１は、通常、全ての配合剤において得られた。
【００５５】
長期循環性、立体的安定化ＨＢＢＡ−Ｒ２およびＨＢＥＡ−Ｒ１／２リポソーム（ＳＬ）および免疫リポソーム（ＳＩＬ）配合剤は、それぞれＤＰＰＣ／マレイミド−ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ（９４：６モル比）およびＤＳＰＣ／コレステロール／マレイミド−ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ（６４：３０：６モル比）から構成される。対照ＨＢＢＡ−Ｒ２リポソーム（ＣＬ）はＤＰＰＣ／ＤＰＰＧ（９：１モル比）から構成される。ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＰＰＧおよびコレステロールはＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ(Alabaster, AL, USA)から購入し、マレイミド−ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥはShearwater Polymers Inc. (Huntsville, AL, USA)から購入した。
【００５６】
ハイポクレリンをリポソームへ負荷するために２つの方法を使用した。ＨＢＢＡ−Ｒ２を予め形成したＳＬおよびＳＩＬ中へ、脂質対薬剤モル比１５：１にて溶媒注入法で負荷した。ＨＢＢＡ−Ｒ２をＣＬ（脂質：薬剤１５：１）中に、およびＨＢＥＡ−Ｒ１／２をＳＬおよびＳＩＬ（脂質：薬剤２：１）中に溶媒希釈法にて負荷した。
【００５７】
溶媒注入法では、リポソームはまず、ＳＬ調製には２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ １４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４またはＳＩＬ調製には２０ｍＭ ＭＯＰＳＯ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．７のいずれかを使用して、最終濃度１０ｍＭ脂質になるまで、種々の脂質の乾燥薄膜を水和して調製した。溶媒に溶解した薬剤（メタノール中、約１０〜２０ｍＭまたはＰＥＧ３００中、約５〜１０ｍＭ）を、６５℃まで加熱し、リポソームの６５℃溶液中に滴下した。
【００５８】
溶媒希釈法では、脂質と薬剤をまず、有機溶媒中のストック溶液から互いに混合して、次いで乾燥した。次いで、メタノールまたはＰＥＧ３００を、それぞれ最終脂質濃度２００ｍＭまたは５０ｍＭになるように添加した。脂質と薬剤溶液が、少量の加熱緩衝液（ＣＬおよびＳＬ調製には２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ １４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４またはＳＩＬ調製には２０ｍＭ ＭＯＰＳＯ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．７）を添加して、６５℃で１０ｍＭ脂質にまで希釈されたとき、リポソームが形成された。
【００５９】
得られたハイポクレリン−リポソームは、平均気孔サイズ１００ｎｍになるよう、Ｌｉｐｅｘ Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ(North Vancouver, BC)押出装置を使用して、８０ｎｍポリカーボネート膜から押し出す。次いでリポソームをゲル濾過によって精製し、脂質および薬剤濃度を分析する。最終脂質対薬剤モル比２０：１が、通常、全ての配合剤について得られた。
【００６０】
免疫リポソームは以下のようにして作製した。抗体をまず２０ｍＭピロリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し、次いで、２−イミノチオレーンの１５〜３０モル過剰量とともに１時間、２２℃でインキュベートした。チオール化した抗体は精製し、ｐＨを、２０ｍＭ ＭＯＰＳＯ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４緩衝液を使用するゲルクロマトグラフィーによって低下させた。チオール化した抗体を、マレイミド−リポソーム（上記した）とともに、２５〜５０μｇＭＡｂ／μモル脂質の濃度で一夜、２２℃でインキュベートした。未結合抗体をゲル濾過で除去し、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ １４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４緩衝液を使用して溶出した。約９０〜９５％の抗体がリポソームに結合した。
【００６１】
所要に応じて、ハイポクレリン−リポソーム溶液をAmicon, Inc (Beverly, MA USA）ＣｅｎｔｒｉｃｏｎまたはSartorious AG. (Goettingen, Germany)ＣｅｎｔｒｉｓａｒｔＩ遠心分離濃縮器（それぞれ、１００，０００または３００，０００ＭＷカットオフ）を使用して濃縮した。
【００６２】
例１６
腫瘍保持マウスモデルにおける光力学治療
ＢＡＬＢ／ｃマウスは右脇腹中へ２×１０６個の４１３ＢＣＲ細胞を皮下注射した。腫瘍は７〜１０日後に出現した。腫瘍が直径約５ｍｍに達したとき、例１５の結合体、または薬剤とともに対照リポソーム、ただし異なったＩｇＧ１を用いて、１ｍｇ／ｋｇにて静脈内投与した。２時間後、マウスに、スライドプロジェクターを使用して、＞５９０ｎｍ（赤カットオフフィルター）、４０Ｊ／ｃｍ２、２０ｍｍＷ／ｃｍ２にて照射した。対照マウスには照射しなかった。その結果を図６に示す。これらの結果は、本発明の結合体が、光の存在下で腫瘍を完全に取り除くことを示す。
【００６３】
例１７
マウス腫瘍生存研究
ＣＢ６Ｆ１マウスを腫瘍移植前にＡｌｔ−１結合剤、ＰＢＳ、マウスＩｇＧまたは非関連マウスモノクローナル抗体（０．２ｍｌＰＢＳ中、５０μｇ、静脈注射）を使用して、３回免疫化した。マウスにＭＴ腫瘍細胞系４１０．４、完全長ＭＵＣ−１ ＤＮＡをトランスフェクトしたマウス乳癌細胞系を移植した。腫瘍細胞を２×１０５細胞／マウスにて静脈注射し、肺に転移させた。腫瘍移植後、１週間目にマウスを再びＡｌｔ−１結合剤、マウスＩｇＧまたは非関連マウスモノクローナル抗体（０．２ｍｌＰＢＳ中、５０μｇ）を使用して免疫化した。マウスは体重、目および柔毛を含めた一般的な状態変化を隔日に観察した。ひどい病状になるか、あるいは元の体重の２５％以上を損なう徴候を示すなら、マウスを安楽死させた。
その結果を下記表に示す。
【００６４】
【表２】
【００６５】
これらの結果は、Ａｌｔ−１のみがＭＵＣ−１を発現する腫瘍細胞から統計的に有意な保護をもたらすことを示す（ＰＢＳに対して、Ｐ＝０．０３８；非関連抗体に対してＰ＝０．１５９）。
【００６６】
例１８
ヒト患者におけるＨＡＭＡ応答の確立
１７名の患者をＡｌｔ−１抗体で処置した。１４名が女性であって、そのうち、１１名が乳癌を発症していた。処置した他の癌は甲状腺（１）、大腸（２）、子宮内膜（１）、子宮（１）および唾液腺（１）であった。Ａｌｔ−１を１、３、５、９、１３および１７週目に２０〜３０分間にわたって静脈注射によって投与した。投薬は３つの集団に、患者当たり１、２および４ｍｇであった。１ｍｇの集団では、５名の患者のうち、２名がＨＡＭＡのいくらかの増加を示し、１名は＞２００ｎｇ／ｍｌの増加を示し、１名が２０００ｎｇ／ｍｌ以上の増加を示した。２ｍｇの集団では、５名の患者全員がＨＡＭＡのいくらかの増加を示し、２名患者は＞２００ｎｇ／ｍｌの増加を示し、１名が＞２０００ｎｇ／ｍｌの増加を示した。４ｍｇの集団では、２名患者がＨＡＭＡのいくらかの増加を示し、両者は＞２００ｎｇ／ｍｌであった。ＨＡＭＡは抗原に対して発生した全体的免疫応答の範囲を示すものとして考えられる。したがって、これらの結果は、１〜２ｍｇＡｌｔ−１のように僅かな量が強力な免疫応答を誘発することができることを示唆する。
【００６７】
例１９
腫瘍特異的抗原の低下
患者を例１８に記載したように処置した。腫瘍抗原ＣＡ１５．３の連続測定値は、市販のＭＵＣ−１アッセイ法を利用して得た。ＣＡ１５．３レベルの安定化または低下を示す患者の割合は、１ｍｇＡｌｔ−１では患者０％であり、２ｍｇで８０％および４ｍｇで６０％であった。最大低下は、それぞれ３７％と２５％の滴下を経験した２ｍｇ用量群の２名の患者において観察された。
【００６８】
例２０
Ａｂ２形成
患者を例１８に記載したように処置した。Ａｂ２のレベルを本研究の最後に測定した。２ｍｇ群の２名の患者は、Ａｂ２レベルがそれぞれ＞１２４０Ｕ／ｍｌおよび１７８４Ｕ／ｍｌを有していた。４ｍｇ投与群の１名は?１１０２Ｕ／ｍｌのＡｂ２レベルを有していた。正常範囲は０〜２００Ｕ／ｍｌである。
【００６９】
例２１
抗ＭＵＣ−１抗体の生成
患者を例１８に記載したように処置した。抗ＭＵＣ−１抗体レベルを本研究の最後に測定した。２ｍｇ用量群では、２名の患者がそれぞれ６６７Ｕ／ｍｌおよび２４６４Ｕ／ｍｌで、基線値を３倍以上越えた。１ｍｇ処置群の２名の患者および４ｍｇ用量群の１名の患者は、基線レベルの３倍の抗ＭＵＣ−１抗体レベルを有していた。正常レベルは３０〜２５０Ｕ／ｍｌである。まとめると、これらのデータは２ｍｇ用量がおそらく最適であることを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本質的に、腫瘍関連ＭＵＣ−１のエピトープに特異的に結合し、かつ、腫瘍関連ＭＵＣ−１を発現する腫瘍を有する哺乳動物を治療的に処置するのに有効である非放射標識結合剤からなる治療用組成物。
【請求項２】
腫瘍関連ＭＵＣ−１のエピトープに特異的に結合し、かつ、腫瘍関連ＭＵＣ−１を発現する腫瘍を有する哺乳動物を治療的に処置するのに有効である、ＨＭＦＧ１以外の結合剤を含む治療用組成物。
【請求項３】
可溶性および腫瘍結合性腫瘍関連ＭＵＣ−１の両方に特異的に結合し、かつ、腫瘍関連ＭＵＣ−１を発現する腫瘍を有する哺乳動物を治療的に処置するのに有効である結合剤を含む治療用組成物。
【請求項４】
結合剤が、ＨＭＰＶ、ＶＵ−３−Ｃ６、ＭＦ０６、ＶＵ−１１−Ｄ１、ＭＦ３０、ＢＣＰ８、ＤＦ３、ＢＣ２、Ｂ２７．２９、ＶＵ−３−Ｄ１、７５４０ＭＲ、ＭＦ１１、Ｂｃ４Ｅ５４９、ＶＵ−１１−Ｅ２、Ｍ３８、Ｅ２９、ＧＰ１．４、２１４Ｄ４、ＢＣ４Ｗ１５４、ＨＭＦＧ−２、Ｃ５９５、Ｍｃ５およびＡ７６−Ａ／Ｃ７から選択されるモノクローナル抗体ではない、請求項２に記載の治療用組成物。
【請求項５】
結合剤が、哺乳動物において抗イディオタイプ応答および細胞免疫応答を誘発する、請求項１、２または３に記載の治療用組成物。
【請求項６】
アミノ酸配列ＤＴＲＰＡＰを有するペプチドのアミノ酸残基からの免疫学的決定基を結合する結合剤。
【請求項７】
Ａｌｔ−１と同じエピトープを結合する結合剤。
【請求項８】
Ａｌｔ−１。
【請求項９】
請求項６に記載の結合剤、請求項７に記載の結合剤およびＡｌｔ−１からなる群から選択される結合剤を含む治療用組成物。
【請求項１０】
腫瘍関連ＭＵＣ−１のエピトープに特異的に結合し、かつ、腫瘍関連ＭＵＣ−１を発現する腫瘍を有する哺乳動物を治療的に処置するのに有効である活性結合剤を含む治療用組成物。
【請求項１１】
結合剤が、光活性化されている、請求項９に記載の治療用組成物。
【請求項１２】
結合剤が、光力学剤に結合している、請求項２に記載の治療用組成物。
【請求項１３】
光力学剤は、ハイポクレリンおよびハイポクレリン誘導体を包含する、請求項１２に記載の治療用組成物。
【請求項１４】
エピトープは、炭水化物を含む免疫学的決定基を含む、請求項１または２に記載の治療用組成物。
【請求項１５】
請求項１〜５および９〜１３のいずれか１項に記載の治療用組成物の有効量を哺乳動物に投与することを含む、腫瘍を保有する哺乳動物を治療的に処置する方法。
【請求項１６】
腫瘍関連ＭＵＣ−１のエピトープに特異的に結合し、かつ、腫瘍関連ＭＵＣ−１を発現する腫瘍を有する哺乳動物を治療的に処置する結合剤を含む治療用組成物の有効量を哺乳動物に投与することを含む、腫瘍を保有する哺乳動物を治療的に処置する方法であって、有効量は、約８ｍｇ／３０ｋｇ体重未満の投与量である、前記方法。
【請求項１７】
腫瘍関連ＭＵＣ−１のエピトープに特異的に結合し、かつ、腫瘍関連ＭＵＣ−１を発現する腫瘍を有する哺乳動物を治療的に処置するに有効である結合剤を含む治療用組成物の有効量を哺乳動物に静脈内投与することを含む、腫瘍を保有する哺乳動物を治療的に処置する方法。
【請求項１８】
腫瘍関連ＭＵＣ−１のエピトープに特異的に結合し、かつ、腫瘍関連ＭＵＣ−１を発現する腫瘍を有する哺乳動物を治療的に処置するに有効である結合剤を含む治療用組成物の有効量を哺乳動物に皮下投与することを含む、腫瘍を保有する哺乳動物を治療的に処置する方法。
【請求項１９】
結合剤が静脈内投与される、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項２０】
結合剤が皮下投与される、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項２１】
有効量が、８ｍｇ／３０ｋｇ体重未満である、請求項１５〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
結合剤が、約３ｍｇ／３０ｋｇ体重未満の投与量で投与される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
結合剤が、約２ｍｇ／患者の投与量で投与される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
結合剤が、約０．５〜約２ｍｇ／３０ｋｇ体重の投与量で投与される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
結合剤が、約０．５〜約１．５ｍｇ／３０ｋｇ体重の投与量で投与される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
結合剤が、約１ｍｇ／３０ｋｇ体重の投与量で投与される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
結合剤が、抗体媒介毒性を誘発しない結合剤の最大量である投与量で投与される、請求項１５〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
結合剤が、ＡＤＣＣまたはＣＤＣを産生しない結合剤の最大量である投与量で投与される、請求項１５〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
結合剤が、ＨＡＸＡ応答＞２００Ｕ／ｍｌを誘発する投与量で投与される、請求項１５〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
結合剤が、ＨＡＸＡ応答＞２０００Ｕ／ｍｌを誘発する投与量で投与される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ＨＡＸＡ応答が、ＨＡＭＡ応答である、請求項２９または３０に記載の方法。
【請求項３２】
結合剤が、腫瘍抗原ＣＡ１５．３のレベルを低減させる投与量で投与される、請求項１５〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
結合剤が、アジュバントの非存在下にて投与される、請求項１７または１９に記載の方法。
【請求項３４】
結合剤が、アジュバントの存在下にて投与される、請求項１６または１８に記載の方法。
【請求項３５】
有効量の請求項１２または１３に記載の治療用組成物を哺乳動物に投与することを含む、腫瘍を保有する哺乳動物を治療的に処置する方法。
【請求項３６】
可視光線源で哺乳動物を照射することをさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３７】
結合剤が、循環性および腫瘍結合性ＭＵＣ−１の両方に結合する、請求項１５に記載の方法。
【請求項３８】
有効量の請求項３に記載の結合剤を哺乳動物に投与することを含む、腫瘍を保有する哺乳動物を治療的に処置する方法。
【請求項３９】
腫瘍を保持する哺乳動物を治療的に処置する方法であって、動物は、抗ＭＵＣ−１抗体の基線レベルを有し、基線レベルに比べて抗ＭＵＣ−１抗体において少なくとも３倍の増加を生じて、腫瘍関連ＭＵＣ−１のエピトープに特異的に結合し、かつ、腫瘍関連ＭＵＣ−１を発現する腫瘍を有する哺乳動物を治療的に処置するのに有効である結合剤を含む治療用組成物の有効量を哺乳動物に皮下投与することを含む、前記方法。
【請求項１】
本質的に、腫瘍関連ＭＵＣ−１のエピトープに特異的に結合し、かつ、腫瘍関連ＭＵＣ−１を発現する腫瘍を有する哺乳動物を治療的に処置するのに有効である非放射標識結合剤からなる治療用組成物。
【請求項２】
腫瘍関連ＭＵＣ−１のエピトープに特異的に結合し、かつ、腫瘍関連ＭＵＣ−１を発現する腫瘍を有する哺乳動物を治療的に処置するのに有効である、ＨＭＦＧ１以外の結合剤を含む治療用組成物。
【請求項３】
可溶性および腫瘍結合性腫瘍関連ＭＵＣ−１の両方に特異的に結合し、かつ、腫瘍関連ＭＵＣ−１を発現する腫瘍を有する哺乳動物を治療的に処置するのに有効である結合剤を含む治療用組成物。
【請求項４】
結合剤が、ＨＭＰＶ、ＶＵ−３−Ｃ６、ＭＦ０６、ＶＵ−１１−Ｄ１、ＭＦ３０、ＢＣＰ８、ＤＦ３、ＢＣ２、Ｂ２７．２９、ＶＵ−３−Ｄ１、７５４０ＭＲ、ＭＦ１１、Ｂｃ４Ｅ５４９、ＶＵ−１１−Ｅ２、Ｍ３８、Ｅ２９、ＧＰ１．４、２１４Ｄ４、ＢＣ４Ｗ１５４、ＨＭＦＧ−２、Ｃ５９５、Ｍｃ５およびＡ７６−Ａ／Ｃ７から選択されるモノクローナル抗体ではない、請求項２に記載の治療用組成物。
【請求項５】
結合剤が、哺乳動物において抗イディオタイプ応答および細胞免疫応答を誘発する、請求項１、２または３に記載の治療用組成物。
【請求項６】
アミノ酸配列ＤＴＲＰＡＰを有するペプチドのアミノ酸残基からの免疫学的決定基を結合する結合剤。
【請求項７】
Ａｌｔ−１と同じエピトープを結合する結合剤。
【請求項８】
Ａｌｔ−１。
【請求項９】
請求項６に記載の結合剤、請求項７に記載の結合剤およびＡｌｔ−１からなる群から選択される結合剤を含む治療用組成物。
【請求項１０】
腫瘍関連ＭＵＣ−１のエピトープに特異的に結合し、かつ、腫瘍関連ＭＵＣ−１を発現する腫瘍を有する哺乳動物を治療的に処置するのに有効である活性結合剤を含む治療用組成物。
【請求項１１】
結合剤が、光活性化されている、請求項９に記載の治療用組成物。
【請求項１２】
結合剤が、光力学剤に結合している、請求項２に記載の治療用組成物。
【請求項１３】
光力学剤は、ハイポクレリンおよびハイポクレリン誘導体を包含する、請求項１２に記載の治療用組成物。
【請求項１４】
エピトープは、炭水化物を含む免疫学的決定基を含む、請求項１または２に記載の治療用組成物。
【請求項１５】
請求項１〜５および９〜１３のいずれか１項に記載の治療用組成物の有効量を哺乳動物に投与することを含む、腫瘍を保有する哺乳動物を治療的に処置する方法。
【請求項１６】
腫瘍関連ＭＵＣ−１のエピトープに特異的に結合し、かつ、腫瘍関連ＭＵＣ−１を発現する腫瘍を有する哺乳動物を治療的に処置する結合剤を含む治療用組成物の有効量を哺乳動物に投与することを含む、腫瘍を保有する哺乳動物を治療的に処置する方法であって、有効量は、約８ｍｇ／３０ｋｇ体重未満の投与量である、前記方法。
【請求項１７】
腫瘍関連ＭＵＣ−１のエピトープに特異的に結合し、かつ、腫瘍関連ＭＵＣ−１を発現する腫瘍を有する哺乳動物を治療的に処置するに有効である結合剤を含む治療用組成物の有効量を哺乳動物に静脈内投与することを含む、腫瘍を保有する哺乳動物を治療的に処置する方法。
【請求項１８】
腫瘍関連ＭＵＣ−１のエピトープに特異的に結合し、かつ、腫瘍関連ＭＵＣ−１を発現する腫瘍を有する哺乳動物を治療的に処置するに有効である結合剤を含む治療用組成物の有効量を哺乳動物に皮下投与することを含む、腫瘍を保有する哺乳動物を治療的に処置する方法。
【請求項１９】
結合剤が静脈内投与される、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項２０】
結合剤が皮下投与される、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項２１】
有効量が、８ｍｇ／３０ｋｇ体重未満である、請求項１５〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
結合剤が、約３ｍｇ／３０ｋｇ体重未満の投与量で投与される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
結合剤が、約２ｍｇ／患者の投与量で投与される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
結合剤が、約０．５〜約２ｍｇ／３０ｋｇ体重の投与量で投与される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
結合剤が、約０．５〜約１．５ｍｇ／３０ｋｇ体重の投与量で投与される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
結合剤が、約１ｍｇ／３０ｋｇ体重の投与量で投与される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
結合剤が、抗体媒介毒性を誘発しない結合剤の最大量である投与量で投与される、請求項１５〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
結合剤が、ＡＤＣＣまたはＣＤＣを産生しない結合剤の最大量である投与量で投与される、請求項１５〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
結合剤が、ＨＡＸＡ応答＞２００Ｕ／ｍｌを誘発する投与量で投与される、請求項１５〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
結合剤が、ＨＡＸＡ応答＞２０００Ｕ／ｍｌを誘発する投与量で投与される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ＨＡＸＡ応答が、ＨＡＭＡ応答である、請求項２９または３０に記載の方法。
【請求項３２】
結合剤が、腫瘍抗原ＣＡ１５．３のレベルを低減させる投与量で投与される、請求項１５〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
結合剤が、アジュバントの非存在下にて投与される、請求項１７または１９に記載の方法。
【請求項３４】
結合剤が、アジュバントの存在下にて投与される、請求項１６または１８に記載の方法。
【請求項３５】
有効量の請求項１２または１３に記載の治療用組成物を哺乳動物に投与することを含む、腫瘍を保有する哺乳動物を治療的に処置する方法。
【請求項３６】
可視光線源で哺乳動物を照射することをさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３７】
結合剤が、循環性および腫瘍結合性ＭＵＣ−１の両方に結合する、請求項１５に記載の方法。
【請求項３８】
有効量の請求項３に記載の結合剤を哺乳動物に投与することを含む、腫瘍を保有する哺乳動物を治療的に処置する方法。
【請求項３９】
腫瘍を保持する哺乳動物を治療的に処置する方法であって、動物は、抗ＭＵＣ−１抗体の基線レベルを有し、基線レベルに比べて抗ＭＵＣ−１抗体において少なくとも３倍の増加を生じて、腫瘍関連ＭＵＣ−１のエピトープに特異的に結合し、かつ、腫瘍関連ＭＵＣ−１を発現する腫瘍を有する哺乳動物を治療的に処置するのに有効である結合剤を含む治療用組成物の有効量を哺乳動物に皮下投与することを含む、前記方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１２−４６５１８（Ｐ２０１２−４６５１８Ａ）
【公開日】平成２４年３月８日（２０１２．３．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１９３４３０（Ｐ２０１１−１９３４３０）
【出願日】平成２３年９月６日（２０１１．９．６）
【分割の表示】特願２００１−５１６５６２（Ｐ２００１−５１６５６２）の分割
【原出願日】平成１２年８月１８日（２０００．８．１８）
【出願人】（５０４００４２７８）アルタレックス メディカル コーポレイション (2)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年３月８日（２０１２．３．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年９月６日（２０１１．９．６）
【分割の表示】特願２００１−５１６５６２（Ｐ２００１−５１６５６２）の分割
【原出願日】平成１２年８月１８日（２０００．８．１８）
【出願人】（５０４００４２７８）アルタレックス メディカル コーポレイション (2)
【Ｆターム（参考）】
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