ポテックスウイルスであるＭａｌｖａモザイクウイルス（ＭａＭＶ）、およびＭａＭＶの外被タンパク質を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）の、免疫原性特性が開示される。ＭａＭＶ外被タンパク質から調製されるＶＬＰ、ＶＬＰを調製するための方法、ＭａＭＶ外被タンパク質ポリペプチドおよび外被タンパク質をコードするポリヌクレオチドが教示される。さらに、ＭａＭＶまたはＭａＭＶの外被タンパク質を含むＶＬＰのみを、またはこれと１もしくは２以上の抗原とを組み合わせて含む免疫原性組成物、および前記組成物の、動物においてワクチン接種する、および／または免疫反応を誘発するための使用もまた教示される。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ワクチン製剤およびアジュバントの分野、および特に植物ウイルス粒子に基づくワクチンおよびアジュバントに関する。
【背景技術】
【０００２】
ワクチン開発の多数の新しいアプローチの中で、ウイルスヌクレオカプシドから作製されたウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、期待が持てる戦略として登場してきた。現在まで２つのＶＬＰワクチン、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）およびヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）が、ヒトにおいて効率的に機能することが示されている（Fagan et al., 1987, J. Med. Virol, 21:49-56；Harper et al., 2004, Lancet, 364:1757-1765）。例えば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）主要カプシドタンパク質Ｌ１から作製されたＶＬＰは、女性の子宮頸癌の発症に対して１００％の防御を与えることが示された（Ault, K.A., 2006, Obstet. Gynecol. Surv. 61 :S26-S31; Harper et al., 2004, Lancet 364: 1757- 1765、また国際特許出願PCT/US01/18701 (WO 02/04007)も参照のこと）。バクテリオファージＱβ（Maurer et al., 2005, Eur. J. Immunol. 35:2031-2040）、ウイルスコアタンパク質から作製されたＢ型肝炎ウイルスＶＬＰ（Mihailova et al., 2006, Vaccine 24:4369-4377；Pumpens et al., 2002, Intervirology 45:24-32）、およびパルボウイルスＶＬＰ（Antonis et al., 2006, Vaccine 24:5481-5490；Ogasawara et al., 2006, In Vivo 20:319-324）もまた、エピトープを担持し、強い抗体反応を誘発することが示された。同様に、米国特許第6,627,202号には、ＨＢＶカプシド結合ペプチドにより架橋された抗原を含むＨＢＶコアタンパク質の、種々のウイルスおよび細菌を標的とした抗原、またはこれらに由来する抗原を含むエピトープ送達システムとしての使用が記載されている。
【０００３】
植物ウイルスからのＶＬＰの、エピトープ提示系としての使用は記載されている。植物ウイルスは主に高度に免疫原性であるタンパク質から構成され、複雑な反復性の結晶組織を有する。さらにこれらは、系統発生学的に動物の免疫系からは離れており、そのことが、これらをワクチン開発の良好な候補者にしている。例えば、ササゲ（cowpea）モザイクウイルス（ＣＰＭＶ）、ジョンソングラスモザイクウイルス（ＪＧＭＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）、およびアルファルファモザイクウイルス（ＡＩＭＶ）が、目的のエピトープ提示のために改変された（Canizares, M. C. et al., 2005, Immunol. Cell. Biol. 83:263-270；Brennan et al., 2001, Molec. Biol. 17: 15-26；Saini and Vrati, 2003, J. Virol. 77:3487-3494）。国際特許出願PCT/GB97/01065 (WO 97/39134)には、外被タンパク質および非ウイルス性タンパク質を含み、例えばペプチドエピトープの提示のために用いることができる、キメラウイルス様粒子が記載されている。国際特許出願PCT/USOl/07355 (WO 01/66778)には、リンカーを介してＮ末端において、病原体微生物のエピトープを含んでよい目的のポリペプチドに融合した、植物ウイルス外被タンパク質、および具体的にはトバモウイルス（tobamovirus）外被タンパク質が記載されている。国際特許出願PCT/USO1/20272 (WO 02/00169)には、外来ペプチドに、および具体的にはニューカッスル病ウイルスまたはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）エピトープに融合した、ジャガイモウイルスＹ外被タンパク質または切断型インゲン黄斑モザイクウイルス外被タンパク質のどちらかを含むワクチンが記載されている。また、米国特許第6,042,832号には、例えば病原体エピトープなどのポリペプチドの、アルファルファモザイクウイルスまたはイラルウイルス（ilarvirus）カプシドタンパク質への融合物を動物に投与して、免疫反応を高めるための方法が記載されている。
【０００４】
パパイアモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）の外被タンパク質由来のＶＬＰ、およびそれらの免疫増強剤としての使用が記載されている（国際特許出願PCT/CA03/00985 (WO 2004/004761)および米国特許出願第11/556,678号(US2007/0166322)）。大腸菌におけるＰａｐＭＶ外被タンパク質の発現は、反復性かつ結晶様式での数百のＣＰサブユニットから構成されるＶＬＰの自己集合をもたらす（Tremblay et al., 2006, FEBS J 273: 14）。ＰａｐＭＶ ＣＰ欠失コンストラクトの発現および精製の研究はさらに、ＣＰサブユニットの自己集合（または多量体形成）が、機能に重要であることを示す（Lecours et al., 2006, Protein Expression and Purification, 47:273-280）。ｇｐ１００またはインフルエンザウイルスＭ１タンパク質のどちらかからのエピトープを含むＰａｐＭＶ ＶＬＰの能力は、エピトープのＭＨＣクラスＩ交差提示を誘発し、特異的ヒトＴ細胞の増幅（expansion）をもたらすことが示された（Leclerc, D., et al, J. Virol, 2007, 81(3):1319-26; Epub. ahead of print November 22, 2006）。さらに、Ｃ型肝炎ウイルスＥ２エンベロープタンパク質由来のエピトープを含むＰａｐＭＶ ＶＬＰは、マウスにおいて、ＰａｐＭＶ ＶＬＰおよびＥ２ペプチドに対して体液性の反応を誘発することが示された（Denis et al., 2007, Virology, 363(1): 59-68）。
【０００５】
plasmodiophora brassicaeの休眠胞子を結合することのできる、親和性ペプチドに融合したパパイアモザイクウイルスＶＬＰの使用も記載されている（Morin et al., 2007, J. Biotechnology, 128: 423-434）。ＶＬＰは、P. brassicae胞子を高い親和力で結合できることが示され、P. brassicaeの検出のための抗体の代替として提唱された。
【０００６】
ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＥＢＶまたはインフルエンザウイルスからの種々の抗原決定基を担持するジャガイモウイルスＸ（ＰＶＸ）由来のＶＬＰが、記載されている（欧州特許出願第1 167 530号）。ＨＩＶエピトープを担持するＰＶＸ ＶＬＰの、マウスにおいて体液性および細胞媒介性経路を介して抗体産生を誘発する能力もまた、記載されている。追加のアジュバントをＰＶＸ ＶＬＰと併用すると、この効果が増強された。
【０００７】
Ｂ型肝炎コアタンパク質またはパルボウイルスＶＬＰは、これらが遺伝情報を担持しない場合であってもＣＴＬ反応を誘発することが報告されており（Ruedl et al., 2002, Eur. J. Immunol. 32; 818-825；Martinez et al., 2003, Virology, 305; 428-435）、それらが陥入した細胞において活性に複製することができない。リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）または鶏卵アルブミンからのエピトープを担持するＶＬＰの、in vivoでの樹状細胞による交差提示も記載されている（Ruedl et al., 2002、同上；Moron, et al., 2003, J. Immunol. 171 :2242-2250）。ＬＣＭＶからのエピープを担持するＢ型肝炎コアタンパク質ＶＬＰの、ＣＴＬ反応をプライムする能力も記載されているが、しかしこのＶＬＰは、それのみで投与された場合にはＣＴＬ反応を誘発できず、ウイルスチャレンジに対する効果的な防御を媒介することができなかった。有効なＣＴＬ反応は、ＶＬＰを抗ＣＤ４０抗体またはＣｐＧオリゴヌクレオチドと併用した場合にのみ、誘発された（Storni, et al., 2002, J. Immunol. 168:2880-2886）。初期の報告によれば、ＬＣＭＶからのペプチドを担持する豚パルボウイルス様粒子（ＰＰＭＶ）が、マウスを致死的なＬＣＭＶチャレンジに対して保護できたことが示された（Sedlik, et al., 2000, J. Virol. 74:5769-5775）。
【０００８】
ポテックスウイルスであるＭａｌｖａ葉脈壊死ポテックスウイルス（ＭＶＮＶ）は、１９９０年にブラジルにおいてＭａｌｖａ parviflora（ウサギアオイ）に感染するウイルスとして報告され（Brunt et al., (eds.) 1996 onwards. "Plant Viruses Online: Descriptions and Lists from the VIDE Database. Version: 20^th August 1996"）、Ｍａｌｖａ parviflora上に局所的な病変部および全体的な葉脈壊死が検出された。
【０００９】
この背景情報は、本出願人が本発明に関連する可能性があると信じる既知の情報を明らかにする目的で提供されている。任意の前述の情報が、本発明に対する先行技術を構成するとの認定は必ずしも意図されず、またそのように解釈されるべきではない。
【発明の概要】
【００１０】
本発明の目的は、Ｍａｌｖａモザイクウイルスおよびウイルス様粒子（ＶＬＰ）、ならびにこれらの使用を提供することである。本発明の１つの側面により、Ｍａｌｖａモザイクウイルス（ＭａＭＶ）またはＭａＭＶ外被タンパク質を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）、および薬学的に許容し得る担体を含む、免疫原性組成物が提供される。
【００１１】
本発明の他の側面により、動物において免疫反応を誘発するための方法であって、前記動物に対して、本発明の免疫原性組成物の有効量を投与することを含む前記方法が提供される。
【００１２】
本発明の他の側面により、動物に、疾病、疾患、または感染に対するワクチン接種するための方法であって、該動物対して、Ｍａｌｖａモザイクウイルス（ＭａＭＶ）またはＭａＭＶ外被タンパク質を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）、および１または２以上の抗原を含む、免疫原性組成物の有効量を投与することを含む、前記方法が提供される。
【００１３】
本発明の他の側面により、Ｍａｌｖａモザイクウイルス（ＭａＭＶ）またはＭａＭＶ外被タンパク質を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）の、免疫原性組成物の調製における使用が提供される。
【００１４】
本発明の他の側面により、Ｍａｌｖａモザイクウイルス（ＭａＭＶ）外被タンパク質を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）が提供される。
【００１５】
本発明の他の側面により、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を調製するための方法であって、Ｍａｌｖａモザイクウイルス（ＭａＭＶ）外被タンパク質を宿主細胞中に発現するステップを含む、前記方法が提供される。
【００１６】
本発明の他の側面により、抗原に融合したＭａｌｖａモザイクウイルス（ＭａＭＶ）外被タンパク質を含む、融合タンパク質が提供される。
【００１７】
他の側面により、抗原に融合したＭａｌｖａモザイクウイルス（ＭａＭＶ）外被タンパク質を含む、融合タンパク質をコードする、単離ポリヌクレオチドが提供される。
【００１８】
他の側面により、抗原に融合したＭａｌｖａモザイクウイルス（ＭａＭＶ）外被タンパク質を含む融合タンパク質をコードするポリポリヌクレオチドにより遺伝子操作された、宿主細胞が提供される。
【００１９】
他の側面により、抗原に融合したＭａｌｖａモザイクウイルス（ＭａＭＶ）外被タンパク質を含む融合タンパク質、抗原に融合したＭａｌｖａモザイクウイルス（ＭａＭＶ）外被タンパク質を含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、または、抗原に融合したＭａｌｖａモザイクウイルス（ＭａＭＶ）外被タンパク質を含む融合タンパク質をコードするポリポリヌクレオチドにより遺伝子操作された宿主細胞の、ウイルス様粒子の調製のための使用が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
本発明のこれらおよび他の特徴は、添付の図を参照した以下の詳細な説明において、さらに明らかにされる。
【００２１】
【図１Ａ】図１Ａは、Ｍａｌｖａモザイクウイルスのゲノム配列を示す（配列番号１）。配列は、GenBankアクセッション番号DQ660333のもとで入手可能である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、Ｍａｌｖａモザイクウイルスのゲノム配列を示す（配列番号１）。配列は、GenBankアクセッション番号DQ660333のもとで入手可能である。
【図１Ｃ】図１Ｃは、Ｍａｌｖａモザイクウイルスのゲノム配列を示す（配列番号１）。配列は、GenBankアクセッション番号DQ660333のもとで入手可能である。
【００２２】
【図２】図２は、Ｍａｌｖａモザイクウイルスの外被タンパク質のアミノ酸配列を示す（配列番号２）。
【００２３】
【図３】図３は、Ｍａｌｖａモザイクウイルスの外被タンパク質をコードするヌクレオチド配列を示す（配列番号３）。
【００２４】
【図４】図４は、（Ａ）Ｍａｌｖａモザイクウイルスに感染したＭａｌｖａ種上のモザイク症状を示す写真、（Ｂ）Ｍａｌｖａ neglecta Wallr.に感染した葉からの抽出物を接種した場合の、Chenopodium quinoa（キノア）上のモザイク症状を示す写真、（Ｃ）C. quinoaの感染した葉からの抽出物を接種した場合のC. quinoa上に観察されるモザイク病変部を示す写真、および（Ｄ）精製したＭａｌｖａモザイクウイルスの電子顕微鏡写真（バーは５０ｎｍを表わす）である。
【００２５】
【図５】Ｍａｌｖａモザイクウイルスの５’末端の解析結果を示す。バーは、配列決定した全てのクローンに見出された各々の配列の頻度を表わす。
【００２６】
【図６】図６（Ａ）は、Ｍａｌｖａモザイクウイルス（ＭａＭＶ）のゲノム構成の模式図であり、（Ｂ）は、健康な（レーン１）、または感染した（レーン２）Chenopodium quinoaから、ＭａＭＶ外被タンパク質に指向するプローブを用いて抽出した全ＲＮＡを示す、ノーザンブロットであり、および（Ｃ）は、種々のポテックスウイルスのオクタヌクレオチド推定ｓｇプロモーター配列の配列アラインメントを示す（高度に保存された領域は、黒または灰色の四角で強調した）。
【００２７】
【図７】図７は、Ｍａｌｖａモザイクウイルス３’非翻訳領域の二次構造の模式図である。
【００２８】
【図８】図８は、Ｍａｌｖａモザイクウイルスおよび他のポテックスウイルスのレプリカーゼおよびカプシドタンパク質の系統学的解析結果を示す図である。
【００２９】
【図９】図９（Ａ）は、大腸菌から単離された、精製組換えＭａｌｖａモザイクウイルス（ＭａＭＶ）外被タンパク質を表わすＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを、および（Ｂ）は、組換え外被タンパク質を含むＭａＭＶ ＶＬＰの電子顕微鏡写真を示す。バーは５０ｎｍである。
【００３０】
【図１０】図１０は、（Ａ）プラスミドｐＭａＭＶ−ＣＰ−６Ｈ中に含有されたＭａＭＶ外被タンパク質遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号２３）（開始コドンは下線で、および終止コドンは太字イタリック体で表す）；（Ｂ）ＭａＭＶ ＣＰ−ＳＭタンパク質をコードするヌクレオチド配列（配列番号６２）（イタリック体で下線の配列は、２つの制限酵素認識配列を表す）；および（Ｃ）ＭａＭＶ ＣＰ ｇｌ−ＳＭタンパク質をコードするヌクレオチド配列（配列番号６４）（イタリック体で下線の配列は、２つの制限酵素認識配列およびスペーサーをコードする配列を表す）を示す。
【００３１】
【図１１】図１１は、（Ａ）プラスミドｐＭａＭＶ−ＣＰ−６Ｈ中に含有されたＭａＭＶ外被タンパク質遺伝子によりコードされた外被タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２４）；（Ｂ）ＭａＭＶ ＣＰ−ＳＭタンパク質のアミノ酸配列（配列番号６３）（イタリック体で下線の配列は、コードされたヌクレオチド配列中の２つの制限酵素認識配列の封入により挿入されたアミノ酸を表す）；および（Ｃ）ＭａＭＶ ＣＰ ｇｌ−ＳＭタンパク質のアミノ酸配列（配列番号６５）（イタリック体で下線の配列は、コードされたヌクレオチド配列およびスペーサー配列中の２つの制限酵素認識配列の封入により挿入されたアミノ酸を表す）を示す。それぞれの配列におけるＨｉｓタグは太字で示す。
【００３２】
【図１２】図１２は、以下の産生を表すグラフである：（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）：それぞれ、アジュバント不在のもとで、ｓ．ｃ．によりＭａＭＶ ＶＬＰを１度注射したＢａｌｂ／Ｃマウスにおける、総ＩｇＧ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ（ＥＬＩＳＡにより測定）；および（Ｄ）、（Ｅ）および（Ｆ）：それぞれ、同じマウスにおいて、アジュバント不在のもとで、ｓ．ｃ．によりＭａＭＶ ＶＬＰを２回目（４０日目）に注射した場合の、総ＩｇＧ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ。ＥＬＩＳＡは、最初の免疫化後５日目、１０日目、１４日目において採取した血液、および２回目の免疫化後４日目に採取した血液で実施した。＋の記号は、ＥＬＩＳＡのベースラインとして用いた陰性対照（免疫前血清）を表す。
【００３３】
【図１３】図１３は、チフス菌から精製されたポリンであるＯｍｐＣおよびＯｍｐＦのプロファイルを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの図である。
【００３４】
【図１４】図１４は、ｇｐ１００（配列番号５９）およびインフルエンザＭ１タンパク質（配列番号６０）からのＨＬＡ−Ａ＊０２０１エピトープ（太字および下線）を、それぞれそのフランキング配列と共に示した図である。
【００３５】
【図１５】図１５は、Ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルであって、それぞれ以下を示す：第１レーン：分子量マーカー、第２レーン：インサートなしで発現ベクターｐＥＴ−３Ｄのみを含有する細菌溶解物、第３レーン：ＭａＭＶ ＣＰを発現する大腸菌細胞の溶解物、および第４レーン：親和性クロマトグラフィにより精製されたＭａＭＶ ＣＰ；Ｂ）組換えＭａＭＶ ＣＰを含むＭａＭＶウイルス様粒子の電子顕微鏡写真；Ｃ）ゲルろ過クロマトグラフィの溶出プロファイルであって、精製ＭａＭＶ ＣＰが高分子量であり、カラムから排除されたことを示し、すなわち、全てのタンパク質が、５００ｋＤａを超える分子量のオリゴマー化状態にあることを示唆する。
【００３６】
【図１６Ａ−Ｃ】図１６Ａ−Ｃは、Fluviral（登録商標）に対する（Ａ）総ＩｇＧ、（Ｂ）ＩｇＧ１および（Ｃ）ＩｇＧ２ａの産生を実証するグラフであって、これは、ＭａＭＶ ＶＬＰ（３または３０μｇ）またはミョウバンをアジュバントとしたFluviral（登録商標）での免疫化後１４日目に、１群当たり５匹のＢａｌｂ／Ｃマウスの血清において測定したものである。
【図１６Ｄ】図１６Ｄは、Fluviral（登録商標）に対するＮＰタンパク質に対するＩｇＧ２ａの産生を実証するグラフであって、これは、ＭａＭＶ ＶＬＰ（３または３０μｇ）またはミョウバンをアジュバントとしたFluviral（登録商標）での免疫化後１４日目に、１群当たり５匹のＢａｌｂ／Ｃマウスの血清において測定したものである。
【００３７】
【図１７】図１７は、次をコードするヌクレオチド配列である：（Ａ）ＭａＭＶ−Ｍ１タンパク質（配列番号６６）（Ｍ１エピトープをコードする配列は下線で示す）；（Ｂ）ＭａＭＶ−ｇｐ１００タンパク質（配列番号６８）（ｇｐ１００エピトープをコードする配列は下線で示す）；（Ｃ）ＭａＭＶ ｇ１−Ｆ３タンパク質（配列番号７０）（Ｆ３ペプチドをコードする配列は下線で示す）。
【００３８】
【図１８】図１８は、次のアミノ酸配列である：（Ａ）ＭａＭＶ−Ｍ１タンパク質（配列番号６７）（Ｍ１エピトープは太字下線で示す）；（Ｂ）ＭａＭＶ−ｇｐ１００タンパク質（配列番号６９）（ｇｐ１００エピトープは太字下線で示す）；（Ｃ）ＭａＭＶ ｇ１−Ｆ３タンパク質（配列番号７１）（Ｆ３ペプチドは太字下線で示す）。各配列のＨｉｓ−ｔａｇは太字で示す。
【００３９】
【図１９】図１９は、Ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルであって、それぞれ以下を示す：第１レーン：分子量マーカー、第２レーン：インサートなしで発現ベクターｐＥＴ−３Ｄのみを含有する細菌溶解物、第３レーン：ＭａＭＶ−ＳＭタンパク質を発現する大腸菌細胞の溶解物、および第４レーン：親和性クロマトグラフィにより精製されたＭａＭＶ−ＳＭタンパク質；Ｂ）組換えＭａＭＶ−ＳＭタンパク質を含むＭａＭＶウイルス様粒子の電子顕微鏡写真；Ｃ）ゲルろ過クロマトグラフィの溶出プロファイルであって、精製ＭａＭＶ−ＳＭタンパク質が高分子量であり、カラムから排除されたことを示し、すなわち、全てのタンパク質が、５００ｋＤａを超える分子量のオリゴマー化状態にあることを示唆する。
【００４０】
【図２０】図２０は、Ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルであって、それぞれ以下を示す：第１レーン：分子量マーカー、第２レーン：インサートなしで発現ベクターｐＥＴ−３Ｄのみを含有する細菌溶解物、第３レーン：ＭａＭＶ ｇ１−ＳＭタンパク質を発現する大腸菌細胞の溶解物、および第４レーン：親和性クロマトグラフィにより精製されたＭａＭＶ ｇ１−ＳＭタンパク質；Ｂ）組換えＭａＭＶ ｇ１−ＳＭタンパク質を含むＭａＭＶウイルス様粒子の電子顕微鏡写真；Ｃ）ゲルろ過クロマトグラフィの溶出プロファイルであって、精製ＭａＭＶ ｇ１−ＳＭタンパク質が高分子量であり、カラムから排除されたことを示し、すなわち、全てのタンパク質が、５００ｋＤａを超える分子量のオリゴマー化状態にあることを示唆する。
【００４１】
【図２１】図２１は、Ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルであって、それぞれ以下を示す：第１レーン：分子量マーカー、第２レーン：インサートなしで発現ベクターｐＥＴ−３Ｄのみを含有する細菌溶解物、第３レーン：ＭａＭＶ−Ｍ１タンパク質を発現する大腸菌細胞の溶解物、および第４レーン：親和性クロマトグラフィにより精製されたＭａＭＶ−Ｍ１タンパク質；Ｂ）組換えＭａＭＶ−Ｍ１タンパク質を含むＭａＭＶウイルス様粒子の電子顕微鏡写真；Ｃ）ゲルろ過クロマトグラフィの溶出プロファイルであって、精製ＭａＭＶ−Ｍ１タンパク質が高分子量であり、カラムから排除されたことを示し、すなわち、全てのタンパク質が、５００ｋＤａを超える分子量のオリゴマー化状態にあることを示唆する。
【００４２】
【図２２】図２２は、Ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルであって、それぞれ以下を示す：第１レーン：分子量マーカー、第２レーン：インサートなしで発現ベクターｐＥＴ−３Ｄのみを含有する細菌溶解物、第３レーン：ＭａＭＶ−ｇｐ１００タンパク質を発現する大腸菌細胞の溶解物、および第４レーン：親和性クロマトグラフィにより精製されたＭａＭＶ−ｇｐ１００タンパク質；Ｂ）組換えＭａＭＶ−ｇｐ１００タンパク質を含むＭａＭＶウイルス様粒子の電子顕微鏡写真；Ｃ）ゲルろ過クロマトグラフィの溶出プロファイルであって、精製ＭａＭＶ−ｇｐ１００タンパク質が高分子量であり、カラムから排除されたことを示し、すなわち、全てのタンパク質が、５００ｋＤａを超える分子量のオリゴマー化状態にあることを示唆する。
【００４３】
【図２３】図２３は、Ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルであって、それぞれ以下を示す：第１レーン：分子量マーカー、第２レーン：インサートなしで発現ベクターｐＥＴ−３Ｄのみを含有する細菌溶解物、第３レーン：ＭａＭＶ ｇ１−Ｆ３タンパク質を発現する大腸菌細胞の溶解物、および第４レーン：親和性クロマトグラフィにより精製されたＭａＭＶ ｇ１−Ｆ３タンパク質；Ｂ）組換えＭａＭＶ ｇ１−Ｆ３タンパク質を含むＭａＭＶウイルス様粒子の電子顕微鏡写真；Ｃ）ゲルろ過クロマトグラフィの溶出プロファイルであって、精製ＭａＭＶ ｇ１−Ｆ３タンパク質が高分子量であり、カラムから排除されたことを示し、すなわち、全てのタンパク質が、５００ｋＤａを超える分子量のオリゴマー化状態にあることを示唆する。
【００４４】
【図２４】図２４は、異なるＭａＭＶ ＶＬＰの平均長（各組換えコンストラクトから１００個のＶＬＰを測定した）を示すグラフである。
【００４５】
【図２５】図２５は、ＣＤ４０活性化Ｂリンパ球を、蛍光標識パパイアモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）ＶＬＰ、ＭａＭＶ ＶＬＰおよびＭａＭＶ−Ｍ１ ＶＬＰでパルスした、フローサイトメトリーの結果を示す図である。
【００４６】
【図２６】図２６は、（Ａ）Ｔ２細胞を、蛍光標識パパイアモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）ＶＬＰおよびＭａＭＶ ＶＬＰでパルスしたフローサイトメトリーの結果であり、時間と共にＶＬＰの取り込みを示す；および（Ｂ）は、ＰａｐＭＶ ＶＬＰおよびＭａＭＶ ＶＬＰのＴ２細胞による取り込みを、時間に渡り平均蛍光強度（ＭＦＩ）で測定した結果のグラフ表示である。
【００４７】
【図２７】図２７は、以下を示すグラフである：Ｍ１エピトープ（左）もしくはｇｐ１００エピトープ（右）を担持するＰａｐＭＶ ＶＬＰまたはＭａＭＶ ＶＬＰ、または対応するＭ１もしくはｇｐ１００ペプチドによってパルスされたＴ２細胞に添加された場合の、Ｍ１特異的Ｔリンパ球により分泌されたＩＦＮ−γの量；（Ｂ）Ｍ１エピトープ（左）もしくはｇｐ１００エピトープ（右）を担持する異なる量のＭａＭＶ ＶＬＰ、または対応するＭ１もしくはｇｐ１００ペプチドによってパルスされたＴ２細胞に添加された場合の、Ｍ１特異的Ｔリンパ球により分泌されたＩＦＮ−γの量；および（Ｃ）４℃にて、Ｍ１エピトープ（左）もしくはｇｐ１００エピトープ（右）を担持するＰａｐＭＶ ＶＬＰまたはＭａＭＶ ＶＬＰ、または対応するＭ１もしくはｇｐ１００ペプチドによってパルスされたＴ２細胞に添加された場合の、Ｍ１特異的Ｔリンパ球により分泌されたＩＦＮ−γの量。ＩＦＮ−γの分泌は、ＥＬＩＳＡにより評価した。
【００４８】
【図２８】図２８は、インフルエンザＭ１ペプチドを担持するＰａｐＭＶ ＶＬＰまたはＭａＭＶ ＶＬＰを用いた、ドナー＃４０５に対するin vitroでのＴ細胞の感作結果を示す：（Ａ）表示のようにパルスしたＴ２細胞との共培養により評価した、産生されたＴ細胞の特異性を示し；（Ｂ）対照として、特異的Ｔ細胞系を、インフルエンザＭ１ペプチドまたはｇｐ１００ペプチドの滴定濃度と共培養した結果を示す。
【００４９】
【図２９】図２９は、インフルエンザＭ１ペプチドを担持するＰａｐＭＶ ＶＬＰまたはＭａＭＶ ＶＬＰを用いた、ドナー＃５４２に対するin vitroでのＴ細胞の感作結果を示す：（Ａ）表示のようにパルスしたＴ２細胞との共培養により評価した、産生されたＴ細胞の特異性を示し；（Ｂ）対照として、特異的Ｔ細胞系を、インフルエンザＭ１ペプチドまたはｇｐ１００ペプチドの滴定濃度と共培養した結果を示す。
【００５０】
【図３０】図３０は、インフルエンザＭ１ペプチドを担持するＰａｐＭＶ ＶＬＰまたはＭａＭＶ ＶＬＰを用いた、ドナー＃６１４に対するin vitroでのＴ細胞の感作結果を示す：（Ａ）表示のようにパルスしたＴ２細胞との共培養により評価した、産生されたＴ細胞の特異性を示し；（Ｂ）対照として、特異的Ｔ細胞系を、インフルエンザＭ１ペプチドまたはｇｐ１００ペプチドの滴定濃度と共培養した結果を示す。
【００５１】
【図３１】図３１は、インフルエンザＭ１ペプチドを担持するＰａｐＭＶ ＶＬＰまたはＭａＭＶ ＶＬＰを用いた、ドナー＃６２１に対するin vitroでのＴ細胞の感作結果を示す：（Ａ）表示のようにパルスしたＴ２細胞との共培養により評価した、産生されたＴ細胞の特異性を示し；（Ｂ）対照として、特異的Ｔ細胞系を、インフルエンザＭ１ペプチドまたはｇｐ１００ペプチドの滴定濃度と共培養した結果を示す。
【００５２】
【図３２】図３２は、ＭａＭＶ−ＳＭ ＶＬＰ、ＭａＭＶ ｇ１−Ｆ３ ＶＬＰ、ＭａＭＶ ｇ１−ＳＭ ＶＬＰ＋Ｆ３、ＭａＭＶ−Ｍ１ ＶＬＰ、またはＭａＭＶ−ｇｐ１００ ＶＬＰを注射したマウス（１群当たり１０匹）において、（Ａ）ペプチドＦ３、Ｍ１またはｇｐ１００、および（Ｂ）ＭａＭＶ ＣＰに対する総ＩｇＧ応答を示す、ＥＬＩＳＡの結果を表す。
【００５３】
【図３３】図３３は、（Ａ）ＭａＭＶおよびＰａｐＭＶ ＣＰアミノ酸配列のアラインメントであって、２つのＣＰ間で３１．２％の同一性を示した；（Ｂ）ＭａＭＶ ＣＰに指向された抗体は、ＰａｐＭＶ ＶＬＰを認識できないことを示すＥＬＩＳＡの結果；および（Ｃ）ＭａＭＶ ＣＰに指向された抗体は、ＰａｐＭＶ ＶＬＰを認識できないことを示すＥＬＩＳＡの結果である。
【００５４】
発明の詳細な説明
本発明は、ポテックスウイルスであるＭａｌｖａモザイクウイルス（ＭａＭＶ）およびＭａＭＶの外被タンパク質を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）の、本明細書において同定された免疫原性特性に関する。本発明は、ＭａＭＶおよびＭａＭＶ ＶＬＰのこれらの免疫原性特性に基づく、動物における免疫反応の生成に関連する種々の態様を包含する。１つの側面において、例えば、本発明は以下を提供する：ＭａＭＶまたはＭａＭＶ外被タンパク質を含むＶＬＰの、免疫原性組成物の調製のための使用；ＭａＭＶまたはＭａＭＶ外被タンパク質を含むウイルス様粒子、および任意に１または２以上の抗原を含む、免疫原性組成物；およびこれら組成物の、動物において免疫反応を誘発するための、および／または動物にワクチン接種するための使用。本発明の他の側面は、ＭａＭＶ外被タンパク質の、ＶＬＰの調製のための使用；ＭａＭＶ外被タンパク質から調製されたＶＬＰ；かかるＶＬＰを調製するための方法；ＶＬＰおよびこれをコードするポリヌクレオチドを調製するのに好適な外被タンパク質ポリペプチドを、提供する。
【００５５】
いくつかの態様において、ＭａＭＶまたはＭａＭＶ外被タンパク質を含むＶＬＰのみの投与は、免疫反応を引き起こすのに十分であり、かかる投与は、例えば、抗原の投与の前に、免疫システムを「プライムする」ために用いることができる。ＭａＭＶおよびＭａＭＶ ＶＬＰはまた、アジュバントとして用いることもでき、この状況では、それらの免疫原性特性は、例えば抗原に対する免疫反応を増強するのに有用である。このような状況での抗原は、ＭａＭＶまたはＶＬＰの前に、ＭａＭＶまたはＶＬＰの後に、またはＭａＭＶもしくはＶＬＰと同時に投与することができる。同時投与の場合、抗原はＭａＭＶまたはＶＬＰに付着させることができ、または別にすることができる。本発明の１つの態様において、抗原は、ＭａＭＶまたはＭａＭＶ ＶＬＰの外被タンパク質に付着させる。ＭａＭＶおよびＭａＭＶ ＶＬＰはまた、ワクチンの調製においても用いることができる。
【００５６】
本発明の１つの態様により、ＭａＭＶまたはＭａＭＶ ＶＬＰおよび１または２以上の抗原を含む免疫原性組成物は、動物において体液性および／または細胞性免疫反応を誘発することができる。
【００５７】
定義
他の定義がない限り、本明細書で用いる全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野の業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。
【００５８】
本明細書において、用語「約」は、与えられた値からのおよそ＋／−１０％の変動を意味する。かかる変動は、本明細書に与えられる全ての値において、具体的に言及されるかどうかに関わらず、常に含まれることが理解されるべきである。
【００５９】
本明細書において用語「ウイルス様粒子（ＶＬＰ）」は、ウイルス粒子と類似の外観を有する、自己集合粒子を意味する。ＶＬＰは、ウイルス核酸を含んでも含まなくてもよい。ＶＬＰは通常、複製不能である。
【００６０】
本明細書において用語「偽ウイルス」とは、プラスミド形態の核酸を含むＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸配列を含有するＶＬＰを意味する。偽ウイルスは一般に、複製不能である。
【００６１】
本明細書において、「融合タンパク質」は、例えばタンパク質またはタンパク質断片などの２つの別々のポリペプチドをコードする、２種または３種以上のポリヌクレオチドが遺伝的に組み合わされて、２種のポリペプチドの組合せである１つのタンパク質（「融合タンパク質」）をコードする第３のポリヌクレオチドを提供する場合に生成されるタンパク質である。例えば、ＭａＭＶ外被タンパク質のアミノ酸配列と、抗原のアミノ酸とを含むポリペプチドは、融合タンパク質と考えられる。
【００６２】
本明細書において用語「アジュバント」は、動物において免疫反応を増大、刺激、作動、増強、および／または調節する剤を意味する。
【００６３】
本明細書において用語「免疫原性」とは、動物において検出可能な免疫反応を誘発する、物質の能力を意味する。
【００６４】
本明細書において用語「免疫反応」とは、物質（例えば化合物、分子、材料など）の投与に応答した、動物の免疫系の反応性における変化を意味し、これには、抗体産生、細胞媒介性免疫性の誘発、補体活性化、免疫学的耐性の発達、またはこれらの組合せを含んでよい。
【００６５】
本明細書において用語「免疫防御反応」とは、１または２以上の抗原に対する免疫反応であって、これにより、１または２以上の抗原が由来する作用物質によって引き起こされた状態（例えば疾病または疾患）および／または感染に対して防御するための、前記免疫反応を意味する。本発明の目的のために、状態および／または感染に対する免疫防御は、状態または感染の絶対的な防御のみでなく、状態または感染を患う未処置の動物と比べた場合の、処置した動物における、状態または感染の程度または速度における任意の検出可能な低下、または状態の重篤度または作用物質の感染から生じる任意の症状における任意の検出可能な低下をも含む。免疫防御反応は、前に状態を患っていなかった動物において、作用物質に感染していなかった動物において、および／または処置時に状態または感染を有していない動物において、誘発することができる。免疫防御反応はまた、既に状態を患っている動物、または処置時に病原体に感染している動物においても、誘発することができる。免疫防御反応は、体液性および／または細胞性免疫を含む、１または２以上のメカニズムの結果であることができる。
【００６６】
本明細書において同義で用いられる用語「免疫刺激（immuno stimulation）」および「免疫刺激（immunostimulation）」とは、ＭａＭＶ ＶＬＰなどの、動物病原体や疾病と関連しない分子の能力であって、免疫系を刺激することによる、および／または前記感染または疾病に応答する免疫系の容量を改善することによる、前記病原体による感染に対する、または前記疾病に対する、防御を提供する前記能力を意味する。免疫刺激は、予防効果、治療効果、またはこれらの組合せを有することができる。
【００６７】
本明細書において用語「ワクチン接種」は、免疫防御反応を生成する目的で、対象に対してワクチンを投与することを意味する。ワクチン接種は、予防効果、治療効果、またはこれらの組合せを有することができる。ワクチン接種は、処置する対象に応じて種々の方法を用いて実施でき、これには限定することなく、非経口投与、例えば腹腔内注射（ｉ．ｐ．）、静脈内注射（ｉ．ｖ．）、または筋肉内注射（ｉ．ｍ．）；経口投与；鼻腔内投与；皮内投与、経皮投与、および液浸を含む。
【００６８】
本明細書において用語「ワクチン」とは、免疫防御反応を生成する目的で、対象に対して投与される組成物を意味する。
【００６９】
本明細書において用語「天然の」とは、物に適用する場合、物が自然界で見出せるとの事実を意味する。例えば、生物（ウイルスを含む）、または生物中に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列であって、天然の給源から単離でき、研究室で人間によって意図的に改変されていないものは、天然のものである。
【００７０】
本明細書において「ポリペプチド」または「ペプチド」は、ペプチド結合により結合された少なくとも４個のアミノ酸が存在する分子を意味することを意図する。
【００７１】
本明細書において表現「ウイルス核酸」とは、ウイルスのゲノムもしくはその一部、または該ゲノムもしくはその一部に対して塩基配列が相補的である核酸分子を意味する。ウイルスＲＮＡに相補的なＤＮＡ分子もまた、ウイルスＤＮＡの塩基配列に相補的なＲＮＡ分子であるために、ウイルス核酸と考えられる。
【００７２】
本明細書において用語「免疫原」および「抗原」とは、１個の分子、複数分子、分子の一部分、分子の複数部分、または分子の組合せであって、全細胞および組織までを含み、それらのみで、またはアジュバントと組み合わせて、対象において免疫反応を誘発することができるものを意味する。免疫原／抗原は、単一のエピトープを含んでよく、または複数エピトープを含んでもよい。例えば、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、炭水化物、リポ多糖類、核酸、小分子、および種々の微生物の、その全体または一部であって、ウイルス、細菌および寄生生物、および他の感染粒子を含むものはしたがって、免疫反応を誘発することができる限りにおいて、抗原であることができる。ハプテンおよびミモトープ（mimotope）もまた、本明細書において用語「免疫原」および「抗原」に包含されると考えられる。
【００７３】
本明細書において、用語「プライムする」およびその文法的な変形は、動物において、抗原投与の前に、免疫反応を刺激すること、および／または作動させることを意味する。
【００７４】
本明細書において、用語「処置する(treat)」、「処置される(treated)」、または「処置している(treating)」とは、疾病または疾患などの状態または感染体に関連して用いる場合、対象の、状態または病原体による感染に対する抵抗性を増加させる処置（すなわち、対象が状態になる可能性、または感染体に感染する可能性を低下させる）、および対象が状態になるか感染した後で、状態または感染に対して戦うための処置（例えば、状態もしくは感染またはそれに付随する症状を、低減させ、消滅させ、改善し、または安定化させる）を意味する。
【００７５】
本明細書において用語「対象」または「患者」とは、処置の必要な動物を意味する。
【００７６】
本明細書において用語「動物」とは、ヒトおよび非ヒト動物の両方を意味する。非ヒト動物は、限定することなく、哺乳類、鳥類、爬虫類および魚類を含み、家畜（ペットを含む）、農場の動物、実験動物、動物園の動物および野生動物を包含し、例えばウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、および他の有蹄動物；イヌ；ネコ；ニワトリ、カモ類おおび他の鳥類；非ヒト霊長類；モルモット；ウサギ；フェレット（クロアシイタチ）；ラット；ハムスターおよびマウスである。
【００７７】
本明細書において、核酸またはアミノ酸配列との関連で用いる用語「実質的に同一」とは、最適に配列された場合に、例えば以下に記載の方法を用いて、核酸配列またはアミノ酸配列が、規定の第２核酸配列またはアミノ酸配列（または「参照配列」）に対して、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有することを示す。「実質的な同一性」は、配列の種々の型および長さを指すために用いることができ、例えば全長配列、機能ドメイン、コードおよび／または制限配列、プロモーター、およびゲノム配列などである。２つのアミノ酸配列または核酸配列の間のパーセント同一性は、当分野の業者の技能内である種々の方法により決定することができ、例えば、次のような公開されたコンピューターソフトウェアを用いて決定可能である：Smith Waterman Alignment（Smith, T. F. and M. S. Waterman (1981) JMoI Biol 147: 195-7）；「BestFit」（Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics, 482-489 (1981)）、これはGeneMatcher Plus（登録商標）Schwarz and Dayhof (1979) Atlas of Protein Sequence and Structure, Dayhof, M. O., Ed pp 353-358に組み込まれている；BLASTプログラム（Basic Local Alignment Search Tool (Altschul, S. F., W. Gish, et al. (1990) J MoI Biol 215: 403-10)、およびこれらの変形であって、BLAST-2、BLAST-P、BLAST-N、BLAST-X、WU-BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2、CLUSTALおよびMegalign（DNASTAR）ソフトウェアを含むもの。さらに当業者は、アラインメントを測定するための適切なパラメータを、比較する配列の長さにわたり最大アラインメントを達成するのに必要なアルゴリズムも含んで、決定することができる。一般に、アミノ酸配列に対して、比較配列の長さは少なくも１０アミノ酸である。当業者は、アラインメントに用いる実際の長さは、比較する配列全体の長さに依存し、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも２００アミノ酸であってよく、またはアミノ酸配列の全長であってもよいことを理解する。核酸については、比較配列の長さは一般に少なくとも２５ヌクレオチドであるが、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０、少なくとも５００、少なくとも５５０、または少なくとも６００であってよく、または、核酸配列の全長であってもよい。
【００７８】
用語「に一致している」または「に一致する」とは、核酸配列が、参照核酸配列の全体または一部と同一であることを示す。これと対照的に、本明細書において用語「に相補的」とは、核酸配列が、参照核酸配列の相補鎖の全体または一部と同一であることを示す。例としては、核酸配列「ＴＡＴＡＣ」は、参照配列「ＴＡＴＡＣ」に一致し、参照配列「ＧＴＡＴＡ」に相補的である。
【００７９】
ＭａＭＶまたはＭａＭＶウイルス様粒子を含む免疫原性組成物
本発明は、ＭａＭＶまたはＭａＭＶ ＶＬＰおよび任意に１または２以上の抗原を含む免疫原性組成物を提供する。免疫原性組成物はさらに、好適な担体、賦形剤など、および／または前記組成物の安定性、味のよさ、薬物動態、バイオアベイラビリティ等を改善する、医薬組成物の他の標準成分を任意に含んでもよい。
【００８０】
Ｍａｌｖａモザイクウイルス
本発明の免疫原性組成物での使用に好適なＭａＭＶの代表的な例は、カナダ・ブリティッシュコロンビアのサマーランド近郊で収穫されたゼニバアオイ（Ｍａｌｖａ neglecta）から単離され、これは例１に記載されている。本明細書の例１〜４に記載されているように、ウイルスのゲノム配列および物理的特性の分析により、ＭａＭＶはポテックスウイルス属のメンバーであり、フレキシウイルス科（Flexiviridae）の可能性が高い。
【００８１】
ＭａＭＶは、長さが約４５０ｎｍ〜約６００ｎｍで幅が約１０ｎｍ〜約１８ｎｍの間の、柔軟な糸状のビリオン（ウイルス粒子：virion）の特徴を有する。図４Ｄに示す例示のウイルスは、約５２０〜５６０ｎｍの長さと、約１２〜約１６ｎｍの幅である。
【００８２】
M. neglectaのＭａＭＶによる感染は、モザイク症状および葉脈の透明化（clearing）をもたらす。ＭａＭＶはまた、Chenopodiaceae科のメンバー、例えばChenopodium quinoa上で繁殖するその能力を特徴とする。
【００８３】
ＭａＭＶのさらなる特徴は、配列番号１に記載の配列と実質的に同一のゲノム配列を有することである（図１およびGenBankアクセッション番号DQ660333も参照）。ＭａＭＶゲノムＲＮＡは６８５８ヌクレオチド（ｎｔ）長（ポリ（Ａ）尾を除く）で、ＧＣ含有量が４５％である。ゲノム構成は他のポテックスウイルスと類似しており、推定ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）と、続いてＴＧＢタンパク質をコードする３つのオーバーラップ遺伝子と、最後に外被タンパク質とを含む（図６Ａ参照）。ＭａＭＶはさらに、感染の間に３つの主要なウイルスＲＮＡを産生することを特徴とする：１つの大きなゲノムＲＮＡ、および、それぞれ２０００個および８００個のヌクレオチドのＲＮＡとして移動している２つのサブゲノム種である（図６Ｂ参照）。
【００８４】
ＭａＭＶはさらに、配列番号２に記載の配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する外被タンパク質を有することを特徴とする（図２も参照）。
【００８５】
当業者に知られているように、ウイルス種はしばしば、同じ特徴を共有する多数の異なる株によって表される。したがって本発明は、例１に記載のＭａＭＶの変異株であって、これと同じ物理的特性および、配列番号１と少なくとも約８０％の配列同一性を有するゲノム配列を有する、前記変異株も包含する。本発明の１つの態様において、変異株は、例１に記載のＭａＭＶと同じ物理的特性および、配列番号１と少なくとも約９０％の配列同一性を有するゲノム配列を有する。本発明の１つの態様において、変異株は、例１に記載のＭａＭＶと同じ物理的特性および、配列番号１と少なくとも約９５％の配列同一性を有するゲノム配列を有する。
【００８６】
ＭａＭＶウイルス様粒子（ＶＬＰ）
本発明のＭａＭＶ ＶＬＰは、ＭａＭＶ外被タンパク質に由来するのが好ましい。「に由来する」とは、ＶＬＰが、野生型ＭａＭＶ外被タンパク質の配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する外被タンパク質を含み、任意に、以下にさらに詳細に記載するように、前記外被タンパク質に付着した１または２以上の抗原を含んでよいことを意味する。ＶＬＰに含まれるＭａＭＶ外被タンパク質はしたがって、野生型外被タンパク質またはその組換え型であることができ、野生型タンパク質の配列またはこの配列の改変型であって、多量体化および自己集合可能でＶＬＰを形成することができる前記配列を有してよい。野生型配列および改変配列を有する外被タンパク質の組合せを含むＶＬＰもまた、意図される。
【００８７】
ＭａＭＶ ＶＬＰは、多量体化および自己集合する能力を保持したＭａＭＶ外被タンパク質から形成される。集合した場合、各々のＶＬＰは、外被タンパク質サブユニットの長いらせん状アレイを含む。ＶＬＰが含む外被タンパク質の数は、例えば約４０〜約１６００まで変化することができる。
【００８８】
本発明のＶＬＰは、同一のアミノ酸配列を有する複数の外被タンパク質から、集合した場合の最終的なＶＬＰが、同一の外被タンパク質サブユニットを含むようにして調製することができ、または、ＶＬＰは、異なるアミノ酸配列を有する複数の外被タンパク質から、集合した場合の最終的なＶＬＰが、その外被タンパク質サブユニットにおける変化を含むようにして調製することができる。
【００８９】
ＶＬＰを形成するために用いる外被タンパク質は、全長外被タンパク質または、多量体化してＶＬＰを形成することができる、全長外被タンパク質の一部であってよい。外被タンパク質配列は、天然の（野生型）配列であることができ、または、本明細書に記載のように、改変された外被タンパク質が多量体化しＶＬＰ内に集合する能力を保持している限りにおいて、野生型配列の遺伝的な改変型であってよく、例えば、１または２以上のアミノ酸の欠失、挿入、置き換えなどを含む。例１に記載のＭａＭＶの外被タンパク質のアミノ酸配列は、本明細書において配列番号２（図２参照）として提供され、これはまた、GenBankからもアクセス可能である（GenBankアクセッション番号ABG48664）。ＭａＭＶの外被タンパク質のヌクレオチド配列もまた、本明細書に配列番号３（図３参照）として提供され、GenBankからもアクセス可能である（GenBankアクセッション番号DQ660333（ヌクレオチド６０５７〜６７８８））。
【００９０】
上に述べたように、ＶＬＰに含まれる外被タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２に記載の野生型配列に正確に一致する必要はなく、すなわち、改変配列であってよい。例えば、外被タンパク質の配列は、１または２以上のアミノ酸残基の置換、挿入または欠失により改変されていてもよく、そのためその変更部位（単数または複数）における残基は、野生型（参照）配列に一致しない。例えば、外被タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、酵素切断部位の付加により改変されてよく、その結果、コードされる外被タンパク質の、例えば、１個〜数個のアミノ酸の、Ｃ末端、Ｎ末端、もしくは両方における、またはこれらの近傍における付加による改変が生じる。当業者はしかし、かかる変異は拡張的（extensive）ではなく、改変外被タンパク質の、多量体化しＶＬＰに集合する能力を妨害しないことを理解する。かかる変異はしかし、ＭａＭＶ外被タンパク質の自己集合する能力を改善し、および／またはＰａｐＭＶ外被タンパク質について前に示されたような、より長いＶＬＰの形成をもたらす（Laliberte et al., 2008, FEBS Journal, 275: 1474-1484）。ＭａＭＶ外被タンパク質の改変型の、ＶＬＰに集合する能力は、例えば、標準の技法による電子顕微鏡法により評価することができ、例示の方法が本明細書の実施例に提供される。
【００９１】
一般に、好適な改変外被タンパク質は、配列番号２に記載された野生型配列と少なくとも約８０％同一のアミノ酸配列を含む。１つの態様において、好適な改変外被タンパク質は、配列番号２に記載された野生型配列と少なくとも約８５％同一のアミノ酸配列を含む。別の態様において、好適な改変外被タンパク質は、配列番号２に記載された野生型配列と少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含む。他の態様において、好適な改変外被タンパク質は、配列番号２に記載された野生型配列と少なくとも約９１％同一の、少なくとも約９２％同一の、少なくとも約９３％同一の、少なくとも約９４％同一の、少なくとも約９５％同一の、少なくとも約９６％同一の、少なくとも約９７％同一の、少なくとも約９８％同一の、または少なくとも約９９％同一の、アミノ酸配列を含む。
【００９２】
多量体化しＶＬＰに集合する能力を保持する野生型タンパク質の断片である外被タンパク質（すなわち、「機能性」断片）もまた、本発明により意図される。例えば、機能性断片は、タンパク質のＮ末端、Ｃ末端または内部からの、１または２以上のアミノ酸の欠失、またはそれらの組合せを含んでよい。一般に、機能性断片は、配列番号２に記載の配列の少なくとも約１５０の隣接アミノ酸（contiguous amino acid）を含む。本発明の１つの態様において、機能性断片は、配列番号２に記載の配列の少なくとも約１８０の隣接アミノ酸を含む。別の態様において、機能性断片は、配列番号２に記載の配列の少なくとも約１９０の隣接アミノ酸を含む。他の態様において、機能性断片は、配列番号２に記載の配列の、少なくとも約２００の隣接アミノ酸を、少なくとも約２１０の隣接アミノ酸を、少なくとも約２２０の隣接アミノ酸を、少なくとも約２２５の隣接アミノ酸を、少なくとも約２３０の隣接アミノ酸を含む。タンパク質のＮ末端またはＣ末端での欠失は、タンパク質の多量体化する能力を保持するために、一般に２５個以下のアミノ酸を除去すべきである。例えば、１つの態様において、Ｎ末端での欠失は、２０個以下のアミノ酸を除去する。他の態様において、Ｎ末端での欠失は、１５個以下のアミノ酸を、１２個以下のアミノ酸を、１０個以下のアミノ酸を、８個以下のアミノ酸を、および５個以下のアミノ酸を除去する。
【００９３】
本発明の１つの態様において、ＶＬＰは、ＭａＭＶ外被タンパク質の組換え型を含む。他の態様において、ＶＬＰは、ＭａＭＶ外被タンパク質の遺伝的改変型を含む。
【００９４】
外被タンパク質が、１または２以上のアミノ酸置換を含む改変配列を含む場合、これらは、「保存的」置換または「非保存的」置換であることができる。保存的置換は、１つのアミノ酸残基を、類似の側鎖特性を有する他の残基と置き換えることを含む。当分野で知られているように、２０種の天然のアミノ酸は、それらの側鎖の物理化学的特性に従って分類可能である。適切な分類としては、例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、フェニルアラニンおよびトリプトファン（疎水性側鎖）；グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミン（極性の非荷電側鎖）；アスパラギン酸およびグルタミン酸（酸性側鎖）およびリシン、アルギニンおよびヒスチジン（塩基性側鎖）を含む。アミノ酸の他の分類は、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシン（芳香族側鎖）である。保存的置換は、１つのアミノ酸を、同じ群の別のアミノ酸で置換することが関与する。非保存的置換は、１つのアミノ酸残基を、異なる側鎖特性を有する別の残基で置き換えることが関与し、例えば、酸性残基の中性または塩基性残基による置き換え、中性残基の酸性または塩基性残基による置き換え、疎水性残基の親水性残基による置き換えなどである。
【００９５】
外被タンパク質をコードする核酸配列も同様に、野生型配列に正確に一致する必要はないが、遺伝子コードの縮退のために、および／または、上記の改変アミノ酸配列をコードするように、変化してよい。本発明の１つの態様において、したがって、外被タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号３に記載の配列と少なくとも約７０％同一である。他の態様において、外被タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号３に記載の配列と少なくとも約７５％同一である。別の態様において、外被タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号３に記載の配列と少なくとも約８０％同一である。他の態様において、外被タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号３に記載の配列と少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％同一である。
【００９６】
以下にさらに詳細に記載するように、ＶＬＰ外被タンパク質は任意に、１もしくは２以上の抗原、親和性ペプチドもしくは他の短ペプチド配列、またはこれらの組合せに遺伝子的に融合してよく、１または２以上の抗原の付着を促進する。
【００９７】
抗原
免疫原性組成物は任意に、１または２以上の抗原を含んでよく、これらはＭａＭＶまたはＭａＭＶ ＶＬＰとは別であっても、またはＭａＭＶもしくはＭａＭＶ ＶＬＰに接合していてもよい。接合および非接合抗原の両方を含む免疫原性組成物もまた、意図される。この後者の場合、非接合抗原は、付加的単離抗原（ＡＩＡ）として考えることができる。ＡＩＡは、接合抗原（単数または複数）と同じであっても、異なっていてもよい。接合は、例えば、外被タンパク質との遺伝子融合、または共有結合、非共有結合もしくは親和性手段を介した結合であることができる。本発明の１つの態様において、１または２以上の抗原は、市販のワクチンの形態で提供されることができる。
【００９８】
ワクチン開発に好適な多種多様な抗原が、当分野に知られている。本発明の免疫原性組成物に含めるのに好適な抗原は、例えば、それが指向されるところの疾病または疾患などの免疫原性組成物の所望の最終用途、組成物の様式、組成物が多価ワクチンもしくは単価ワクチンとしての使用を意図されているのか、および／または投与される動物などに基づいて、当業者が容易に選択することができる。
【００９９】
例えば、抗原は、動物において、例えば癌、感染症、アレルギー反応、または自己免疫疾患などの疾病または疾患を引き起こすことができる作用物質に由来することができる。またはこれは、薬剤、ホルモンもしくは毒素関連の疾病または疾患に対する免疫反応を誘発するために用いるのに好適な、抗原であることができる。抗原は、当分野に知られている病原体から、例えば細菌、ウイルス、原生動物、真菌、寄生生物、または例えばプリオンなどの感染粒子から由来してよい。または抗原は、腫瘍関連抗原、自己抗原、またはアレルゲンであってよい。あるいは、抗原は、抗原のＢ細胞エピトープまたはＴ細胞エピトープを含んでよい。
【０１００】
１または２以上の抗原は、免疫原性組成物中に種々の様式で、上記のように、および下にさらに詳細に記載するようにして、含めることができる。免疫原性組成物中に含むための１または２以上の抗原は、したがって、選択した様式に依存してサイズが異なることができる。抗原は、例えば、ペプチド、タンパク質、核酸、多糖類、小分子、またはこれらの組合せであって、病原体全体またはその一部を含み、例えば、生きた、不活性化または減衰型の病原体である。
【０１０１】
免疫原性組成物が１より多くの抗原を含む場合、組成物中に含めるために選択される抗原は、同一であることができ、または異なっていてもよく、単一の源から、または複数の源から由来してよい。各抗原は、特定の免疫反応を引き起こすことができる１つのエピトープを有するか、または各抗原は、１つより多くのエピトープを有してもよい。
【０１０２】
抗原は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞およびマクロファージ上の表面構造により、またはクラスＩもしくはクラスＩＩのＡＰＣ関連細胞表面構造により、またはこれらの組合せにより認識されるエピトープを含んでよい。１つの態様において、本発明は、免疫原性組成物が、小さなおよび／または弱い免疫原性抗原に対して特に有用であることを意図する。
【０１０３】
本発明の免疫原性組成物に含むための抗原はまた、病原体または他の目的の源から、当分野に知られた方法により選択し、当分野に知られた標準の免疫学的技法を用いて、動物において免疫反応を誘発するそれらの能力についてスクリーニングしてよい。例えば、抗原タンパク質内でのエピトープの予測のための方法は、Nussinov R and Wolfson H J, Comb Chem High Throughput Screen (1999) 2(5):261に記載されており、ＣＴＬエピトープの予測のための方法は、Rothbard et al, EMBO J. (1988) 7:93-100およびde Groot M S et al, Vaccine (2001) 19(31):4385-95に記載されている。他の方法は、Rammensee H-G. et al., Immunogenetics (1995) 41: 178-228およびSchirle M et al, Eur J Immunol (2000) 30(18):2216-2225に記載されている。
【０１０４】
有用なウイルス抗原は、例えば、以下の科のメンバーに由来するものを含む：アデノウイルス科；アレナウイルス科（例えばＩｐｐｙウイルスおよびラッサウイルス）；ビルナウイルス科；ブニヤウイルス科；カリシウイルス科；コロナウイルス科；フィロウイルス科；フラビウイルス科（例えば黄熱病ウイルス、デング熱ウイルスおよびＣ型肝炎ウイルス）；ヘパドナウイルス科（Hepadnaviradae）（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス）；ヘルペスウイルス科（例えばヒト単純ヘルペスウイルス１型）；オルトミクソウイルス科（例えば、Ａ型、Ｂ型よびＣ型インフルエンザウイルス）；パラミクソウイルス科（例えば流行性耳下腺炎ウイルス、ヒト・メタニューモウイルス、麻疹ウイルス、および呼吸器合胞体ウイルス）；ピコルナウイルス科（例えば、ポリオウイルスおよびＡ型肝炎ウイルス）；ポックスウイルス科；レオウイルス科；レトロウイルス科（例えばＢＬＶ−ＨＴＬＶレトロウイルス、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ウシ免疫不全ウイルスおよびネコ免疫不全ウイルス）；ラブドウイルス科（例えば狂犬病ウイルス）、およびトガウイルス科（例えば風疹ウイルス）。１つの態様において、免疫原性組成物は、以下のような主要なウイルス病原体に由来する１または２以上の抗原を含む：種々の肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、種々のインフルエンザウイルス、ウェストナイルウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、狂犬病ウイルス、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、ポリオーマウイルス、またはＳＡＲＳコロナウイルス。
【０１０５】
Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、デルタ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）、およびＧ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）を含む肝炎ウイルス由来のウイルス抗原は、当分野に知られている。例えば、抗原は、ＨＣＶコアタンパク質、Ｅ１タンパク質、Ｅ２タンパク質、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４タンパク質またはＮＳ５タンパク質から、ＨＶＢ ＨｂｓＡｇ抗原またはＨＢＶコア抗原から、およびＨＤＶデルタ抗原から由来することができる（例えば、米国特許第5,378,814号を参照）。次の米国特許は、例えば、ＨＣＶコアタンパク質に基づく種々の抗原について記載している；第6,596,476号；第6,592,871号；第6,183,949号；第6,235,284号；第6,780,967号；第5,981,286号；第5,910,404号；第6,613,530号；第6,709,828号；第6,667,387号；第6,007,982号；第6,165,730号；第6,649,735号、および第6,576,417号。
【０１０６】
ヘルペスウイルス科からの既知の抗原の非限定的例としては、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１および２型、例えばＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２糖タンパク質ｇＢ、ｇＤおよびｇＨに由来するものが挙げられる。
【０１０７】
ＨＩＶ抗原の非限定的例としては、ｇｐ１２０由来抗原、ｇｐ１６０およびｇｐ４１などの種々のエンベロープタンパク質由来の抗原、ｐ２４ｇａｇおよびｐ５５ｇａｇなどのｇａｇ抗原、ならびにＨＩＶのｐｏｌ、ｅｎｖ、ｔａｔ、ｖｉｆ ｒｅｖ、ｎｅｆ ｖｐｒ、ｖｐｕおよびＬＴＲ領域に由来するタンパク質が挙げられる。多数のＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２分離株からのｇｐ１２０配列であって、ＨＩＶの種々の遺伝的サブタイプのメンバーを含むものが知られている（例えば、Myers et al., Los Alamos Database, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, N. Mex. (1992)およびModrow et al, J. Virol. (1987) 61:570 578)を参照）。
【０１０８】
他のウイルス抗原の非限定的例としては、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、およびＣＭＶ ｇＢおよびｇＨを含むサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）；および他のヒトヘルペスウイルス、例えばＨＨＶ６およびＨＨＶ７などからの抗原が挙げられる（例えば、Chee et al. (1990) Cytomegaloviruses (J. K. McDougall, ed., Springer-Verlag, pp. 125 169)；McGeoch et al. (1988) J. Gen. Virol. 69:1531 1574；米国特許第5,171,568号；Baer et al. (1984) Nature 310:207 211；およびDavison et al. (1986) J. Gen. Virol. 67:1759 1816を参照）。
【０１０９】
抗原はまた、インフルエンザウイルスから、例えば赤血球凝集素（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、核タンパク質（ＮＰ）、マトリクスタンパク質（Ｍ１およびＭ２）、ポリメラーゼ酸性タンパク質（ＰＡ）、およびポリメラーゼ塩基性タンパク質サブユニット（ＰＢ１、ＰＢ２）から由来することもできる。これらタンパク質の配列は当分野で知られており、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）により維持されているGenBankデータベースから容易にアクセスできる。ＨＡ、ＮＰおよびマトリクスタンパク質の好適な抗原性断片としては、限定はしないが、以下が挙げられる：赤血球凝集素エピトープとして、ＨＡ９１−１０８、ＨＡ３０７−３１９およびＨＡ３０６−３２４（Rothbard, Cell, 1988, 52:515-523）、ＨＡ４５８−４６７（J. Immunol. 1997, 159(10): 4753-61）、ＨＡ２１３−２２７、ＨＡ２４１−２５５、ＨＡ５２９−５４３およびＨＡ５３５−５４７（Gao, W. et al, J. Virol, 2006, 80:1959-1964）；核タンパク質エピトープとして、ＮＰ２０６−２２９（Brett, 1991, J Immunol. 147:984-991）、ＮＰ３３５−３５０およびＮＰ３８０−３９３（Dyer and Middleton, 1993, In: Histocompatibility testing, a practical approach (Ed.: Rickwood, D. and Hames, B. D.) IRL Press, Oxford, p. 292; Gulukota and DeLisi, 1996, Genetic Analysis: Biomolecular Engineering, 13:81）、ＮＰ３０５−３１３（DiBrino, 1993, PNAS 90: 1508-12）；ＮＰ３８４−３９４（Kvist, 1991, Nature. 348:446-448）；ＮＰ８９−１０１（Cerundolo, 1991, Proc. R. Soc. Lon. 244:169-7）；ＮＰ９１−９９（Silver et al, 1993, Nature. 360: 367-369）；ＮＰ３８０−３８８（Suhrbier, 1993, J. Immunology 79: 171- 173）；ＮＰ４４−５２およびＮＰ２６５−２７３（DiBrino, 1993、同上）；およびＮＰ３６５−３８０（Townsend, 1986, Cell. 44:959-968）；マトリクスタンパク質（Ｍ１）エピトープとして、Ｍ１ ２−２２、Ｍ１ ２−１２、Ｍ１ ３−１１、Ｍ１ ３−１２、Ｍ１ ４１−５１、Ｍ１ ５０−５９、Ｍ１ ５１−５９、Ｍ１ １３４−１４２、Ｍ１ １４５−１５５、Ｍ１ １６４−１７２、Ｍ１ １６４−１７３（全て、Nijman, 1993, Eur. J. Immunol. 23:1215-1219に記載）；Ｍ１ １７−３１、Ｍ１ ５５−７３、Ｍ１ ５７−６８（Carreno, 1992, MoI Immunol 29: 1131-1140）；Ｍ１ ２７−３５、Ｍ１ ２３２−２４０（DiBrino, 1993、同上）、Ｍ１ ５９−６８およびＭ１ ６０−６８（Eur. J. Immunol. 1994, 24(3): 777-80）；およびＭ１ １２８−１３５（Eur. J. Immunol. 1996, 26(2): 335-39）；ＰＡ ４１２−４２２（Heiny AT, et al., 2007, PLoS ONE, 21;2(1l):el190）；ＰＢ１ １５−５１（Heiny AT, et al., 2007, PLoS ONE, 21;2(1l):el190）およびＰＢ２ ６８５−６９６（Heiny AT, et al., 2007, PLoS ONE, 21;2(ll):el190）。
【０１１０】
その他の例としては、ＨＡタンパク質由来のＦ３ペプチドであり、これは次の配列を有する：KAYSNCYPYDVPDY（配列番号７２）（Lu et al., 2002, Int. Arch. Allergy Immunol, 127: 245-250）、およびＭ１タンパク質からのＣＴＬエピトープであり、これは次の配列を有する：SPLTKGILGFVFTLTVPSE（配列番号７３）、およびGILGFVFTL（配列番号６０）。
【０１１１】
他の関連する抗原性領域およびエピトープも知られている。例えば、インフルエンザイオンチャネルタンパク質（Ｍ２）の断片であって、これはＭ２ｅペプチド（Ｍ２の細胞外ドメイン）を含む。このペプチドの配列は、インフルエンザの異なる株にわたって高度に保存されている。Ｍ２ｅペプチド配列の例は表１に配列番号４として示されている。この配列の変異形が同定されており、そのいくつかも表１に示されている。
表１：Ｍ２ｅペプチドおよびその変異
【表１】

＊米国特許出願第2006/0246092号参照
【０１１２】
Ｍ２ｅ配列の全体または一部を用いることができ、例えば、変異体にわたって保存されている部分配列であり、例としてはアミノ酸２〜１０により規定される領域内の断片、または保存エピトープEVETPIRN（配列番号９）（Ｍ２ｅ配列のアミノ酸６〜１３）。６〜１３エピトープは、GenBankで利用可能なヒトＡ型インフルエンザ株の８４％において不変であることが見出されている。同定されているこの配列の変異形には以下がある：EVETLTRN（配列番号１０）（９．６％）、EVETPIRS（配列番号１１）（２．３％）、EVETPTRN（配列番号１２）（１．１％）、EVETPTKN（配列番号１３）（１．１％）、ならびにEVDTLTRN（配列番号１４）、EVETPIRK（配列番号１５）およびEVETLTKN（配列番号１６）（それぞれ０．６％）（Zou, P., et al., 2005, Int Immunopharmacology, 5:631-635；Liu et al. 2005, Microbes and Infection, 7: 171-177を参照）。
【０１１３】
他の有用な抗原としては、生ウイルス、弱毒化ウイルス、および不活化ウイルスであって、例えば不活化ポリオウイルス（Jiang et al, J. Biol. Stand., (1986) 14:103-9）、Ａ型肝炎ウイルスの弱毒株（Bradley et al, J. Med. Virol, (1984) 14:373-86）、弱毒麻疹ウイルス（James et al, N. Engl. J. Med, (1995) 332:1262-6）、および百日咳ウイルスのエピトープ（例えば、ACEL-IMUNE（登録商標）無細胞ＤＴＰ、Wyeth-Lederle Vaccines and Pediatrics）である。
【０１１４】
抗原はまた、非定型ウイルスまたはウイルス様物質に由来することもでき、例としては、当分野で知られているように、以下のものがある：クールーの原因物質、クロイツフェルトヤコブ病（ＣＪＤ）、スクラピー、伝染性ミンク脳症、および慢性消耗性疾患、または狂牛病に関連するプリオンなどのタンパク性感染粒子。
【０１１５】
有用な細菌性抗原としては、例えば、リポ多糖類、莢膜抗原（本質的に、タンパク様または多糖類）などの表在性細菌性抗原成分、または鞭毛成分が挙げられ、これらは次のような疾病に関与する既知の原因物質から得るか、または由来することができる：ジフテリア、百日咳、破傷風、結核、細菌性または真菌性肺炎、コレラ、腸チフス、ペスト、細菌性赤痢またはサルモネラ症、レジオネラ病、ライム病、ハンセン病、マラリア、鉤虫症、オンコセルカ症、住血吸虫症、トリパマソーマ症（trypamasomialsis）、レスマニア症（lesmaniasis）、ジアルジア鞭毛虫症、アメーバ症、フィラリア症、ボレリア、および旋毛虫症。
【０１１６】
腸内細菌科のグラム陰性菌に由来する抗原の例としては、限定はしないが、腸チフス菌Ｖｉ（莢膜多糖類）抗原、大腸菌ＫおよびＣＦＡ（莢膜成分）抗原および、大腸菌線毛付着抗原（Ｋ８８およびＫ９９）が挙げられる。抗原タンパク質の例としては、ポリン（Secundino et al., 2006, Immunology 117:59）としても知られている外膜タンパク質（Ｏｍｐ）；腸チフス菌鉄調節外膜タンパク質などの関連するポリン（IROMP, Sood et al., 2005, MoI Cell Biochem 273:69-78）、および、限定することなく腸チフス菌ＨＳＰ４０（Sagi et al., 2006, Vaccine 24:7135-7141）を含む、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）が挙げられる。抗原性ポリンの非限定的例としては、ＯｍｐＣおよびＯｍｐＦが挙げられ、これらは多数のサルモネラ種および大腸菌種に見出される。ＯｍｐＣおよびＯｍｐＦのオルソログもまた、他の腸内細菌科に見出されており、これらは本発明の目的のための好適な抗原タンパク質である。さらに、腸内細菌科のポリンタンパク質中に見出される配列の保存領域に基づいて（Diaz-Quinonez et al., 2004, Infect, and Immunity 72:3059- 3062）、Ｏｍｐ１Ｂ（Shigella flexneri）、ＯｍｐＣ２（Yersinia pestis）、ＯｍｐＤ（S. enteria）、ＯｍｐＫ３６（Klebsiella pneumonie）、ＯｍｐＮ（大腸菌）およびＯｍｐＳ（S. enterica）も好適であることができる。
【０１１７】
種々の腸内細菌からの抗原タンパク質の配列は、当分野に知られており、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）により維持されているGenBankデータベースから容易にアクセスできる。例えば、GenBankアクセッション番号P0A264およびGenBankアクセッション番号NP_804453：ＯｍｐＣ（S. enterica subsp. enterica serovar Typhi Ty2）；GenBankアクセッション番号CAD05399：ＯｍｐＦ前駆体タンパク質（S. enterica subsp. enterica serovar Typhi CTl 8）；GenBankアクセッション番号16761195：ＯｍｐＣ（S. enterica serovar Typhimurium）；GenBankアクセッション番号47797：ＯｍｐＣ（S. enterica serovar Typhi）；GenBankアクセッション番号8953564：ＯｍｐＣ（S. enterica serovar Minnesota）；GenBankアクセッション番号19743624：ＯｍｐＣ（S. enterica serovar Dublin）；GenBankアクセッション番号19743622：ＯｍｐＣ（S. enterica serovar Gallinarum）；GenBankアクセッション番号26248604：ＯｍｐＣ（大腸菌）；GenBankアクセッション番号24113600：Ｏｍｐ１Ｂ（Shigella flexneri）；GenBankアクセッション番号16764875：ＯｍｐＣ２（Yersinia pestis）；GenBankアクセッション番号16764916：ＯｍｐＤ（S. enterica Serovar Typhimurium）；GenBankアクセッション番号151149831：ＯｍｐＫ３６（Klebsiella pneumonie）；GenBankアクセッション番号3273514：ＯｍｐＮ（大腸菌）、およびGenBankアクセッション番号16760442：ＯｍｐＳ（S. enterica serovar Typhi）。
【０１１８】
種々の腫瘍関連抗原が当分野に知られている。代表的な例としては、限定はしないが、以下が挙げられる：Ｈｅｒ２（乳癌）；ＧＤ２（神経芽細胞腫）；ＥＧＦ−Ｒ（悪性グリア芽細胞腫）；ＣＥＡ（髄様甲状腺癌）；ＣＤ５２（白血病）；ヒトメラノーマタンパク質ｇｐ１００（例えばエピトープ：IMDQVPFSV（配列癌号５９）を含む抗原）；ヒトメラノーマタンパク質ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１；ヒトDickkopf1（ＤＫＫ１）タンパク質、ヒトアンギオモチン（Ａｍｏｔ）、ＮＡ１７；ＮＡ１７−Ａｎｔタンパク質；ｐ５３タンパク質；ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ２、ＭＡＧＥ３（ＨＬＡ−Ａ１タンパク質）およびＭＡＧＥ４を含む種々のＭＡＧＥ（メラノーマ関連抗原Ｅ）；種々のチロシナーゼ（ＨＬＡ−Ａ２ペプチド）；変異ｒａｓ；ｐ９７メラノーマ抗原；進行癌に関連するＲａｓぺプチドおよびｐ５３ペプチド；子宮頸癌に関連するＨＰＶ１６／１８およびＥ６／Ｅ７抗原；乳癌関連ＭＵＣ１−ＫＬＨ抗原；結腸直腸癌に関連するＣＥＡ（癌胎児性抗原）、および前立腺癌関連ＰＳＡ抗原。
【０１１９】
有用なアレルゲンとしては、花粉、動物鱗屑、草、カビ、粉塵、抗生物質、刺咬昆虫毒物からのアレルゲン、および種々の環境、薬物および食物アレルゲンが挙げられるが、これらに限定されない。一般的な樹木アレルゲンとしては、ハコヤナギ、ポプラ、セイヨウトリネコ、カバノキ、メープル、オーク、ニレ、ヒッコリー、およびペカンの木からの花粉が挙げられる。一般的な植物アレルゲンとしては、ライ麦、ブタクサ、イギリスオオバコ、スイバ（sorrel dock）およびアカザからのものが挙げられ、植物接触アレルゲンとしては、ウルシ、ツタウルシおよびイラクサからのものが挙げられる。一般的な草のアレルゲンとしては、オオアワガエリ、ジョンソングラス、ギョウギシバ、ウシノケグサ、およびブルーグラスアレルゲンが挙げられる。一般的なアレルゲンは、鱗屑または真菌類から、例えばアルテルナリア属、フザリウム属、ホルモデンドラム属、アスペルギラス属、ミクロポリスポラ属、ケカビ属および好熱性の放線菌からも得ることができる。ペニシリン、スルホンアミドおよびテトラサイクリンは、一般的な抗生物質アレルゲンである。表皮性のアレルゲンは、ハウスダストまたは有機ダスト（典型的には真菌類から）から、イエダニ（dermatphagoides pterosinyssis）などの昆虫から、または羽毛、およびネコおよびイヌの鱗屑などの動物源から、得ることができる。一般的な食物アレルゲンとしては、牛乳およびチーズ（乳製品）、卵、小麦、ナッツ（例えばピーナッツ）、魚介類（例えば、貝）、エンドウ豆、豆、およびグルテンアレルゲンなどが挙げられる。一般的な薬物アレルゲンとしては、局所麻酔薬およびサリチル酸塩アレルゲンが挙げられ、一般的な昆虫アレルゲンとしては、ハチ、スズメバチ、カリバチおよびアリ毒物、およびゴキブリがく（calyx）アレルゲンが挙げられる。
【０１２０】
特に良好に特徴付けられているアレルゲンとしては、限定はされないが、以下が挙げられる：イエダニアレルゲンＤｅｒ ｐＩおよびＤｅｒ ｐＩＩ（Chua, et al., J. Exp. Med., 167:175 182, 1988；およびChua, et al, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol, (1990) 91 : 124-129）、Ｄｅｒ ｐＩＩアレルゲンのＴ細胞エピトープペプチド（Joost van Neerven, et al, J. Immunol, (1993) 151 :2326-2335を参照）、非常に豊富な抗原Ｅ（Ａｍｂ ａＩ）ブタクサ花粉アレルゲン（Rafnar, et al, J. Biol. Chem., (1991) 266: 1229-1236を参照）、ホスホリパーゼＡ２（ハチ毒物）アレルゲンおよびその中のＴ細胞エピトープ（Dhillon, et al, J. Allergy Clin. Immunol, (1992) 42参照）、シラカバ花粉（Ｂｅｔｖ１）（Breiteneder, et al, EMBO, (1989) 8:1935-1938参照）、Ｆｅ１ ｄＩ主要な家猫アレルゲン（Rogers, et al, MoI Immunol, (1993) 30:559-568参照）、樹木花粉（Elsayed et al, Scand. J. Clin. Lab. Invest. Suppl, (1991) 204: 17-31参照）、およびマルチエピトープ組換え草（grassアレルゲンｒＫＢＧ８．３（Cao et al Immunology (1997) 90:46-51）。これらおよび他の好適なアレルゲンは市販されており、および/または既知の技術に従って用意に調製可能である。
【０１２１】
自己抗原に付随する状態に関連する抗原も、当業者に知られている。かかる抗原の代表的な例としては、限定はしないが、リンホトキシン、リンホトキシン受容体、核因子ｋＢリガンドの受容体アクチベーター（ＲＡＮＫＬ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、血管内皮成長因子受容体（ＶＥＧＦ−Ｒ）、インターロイキン−５、インターロイキン−１７、インターロイキン−１３、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＬ１２、ＳＤＦ−１、ＭＣＰ−１、エンドグリン、レジスチン、ＧＨＲＨ、ＬＨＲＨ、ＴＲＨ、ＭＩＦ、エオタキシン、ブラジキニン、ＢＬＶＣ、腫瘍壊死因子αおよびアミロイドβペプチド、および免疫学的反応を引き出すために使用可能なこれら各々の断片が挙げられる。
【０１２２】
有用な毒素は、一般に有毒な植物、動物、および微生物の天然産物であるか、またはこれらの化合物の断片である。かかる化合物は、例えば、アフラトキシン、シガテラ毒素、百日咳毒素およびテトロドトキシンを含む。
【０１２３】
レクリエーショナルドラッグ中毒に関連して有用な抗原は当分野に知られており、例えば、コデイン、フェンタニル、ヘロイン、モルヒネ、およびアヘンなどの、オピオイドおよびモルヒネ誘導体；アンフェタミン、コカイン、ＭＤＭＡ（メチレンジオキシメタンフェタミン）、メタンフェタミン、メチルフェニデート、およびニコチンなどの興奮薬；ＬＳＤ、メスカリンおよびプシロシビンなどの幻覚発現物質；ハシシおよびマリファナなどのカンナビノイド（大麻）、その他の常習性薬物または化合物、および派生物、副産物、変異体およびかかる化合物の複合体を含む。
【０１２４】
本発明の１つの態様において、免疫原性化合物に含まれる抗原（単数または複数）は、タンパク質抗原である。タンパク質抗原は、全長タンパク質、実質的に全長のタンパク質（例えば、約２５個未満のアミノ酸のＮ末端および／またはＣ末端での欠失を含むタンパク質）、タンパク質の抗原断片、またはこれらの組合せであることができる。全長タンパク質は、適用可能である場合は、タンパク質の前駆体形態またはタンパク質の成熟（処理）形態であってよい。タンパク質は翻訳後修飾されていてもよく、例えば、糖タンパク質またはリポタンパク質であってよい。抗原断片は１または複数のエピトープを含むことができ、したがって数個のアミノ酸（例えば、少なくとも４個のアミノ酸）の１ペプチドから、数百のアミノ酸長のポリペプチドまでの大きさであってよい。本発明の１つの態様において、免疫原性組成物中に含まれるのに好適な抗原断片は、約４アミノ酸〜約２５０アミノ酸の長さである。他の態様において、免疫原性組成物中に含まれるのに好適な抗原断片は、約５アミノ酸〜約２００アミノ酸の長さである。他の態様において、免疫原性組成物中に含まれるのに好適な抗原断片は、約５アミノ酸〜約１５０アミノ酸の長さ、約５アミノ酸〜約１００アミノ酸の長さ、約５アミノ酸〜約７５アミノ酸の長さ、約５アミノ酸〜約７０アミノ酸の長さ、約５アミノ酸〜約６０アミノ酸の長さ、および、約５アミノ酸〜約５０アミノ酸の長さである。
【０１２５】
上記のように、本発明の１つの態様において、免疫原性組成物中に含まれる１または２以上の抗原は、市販のワクチン形態であることができる。種々のヒトワクチンが当分野に知られており、以下に対するワクチンが含まれるが、これらに限定はされない：
炭疽菌（anthrax）、例えばBioThrax（登録商標）（BioPort Corporation）；
Ｂ型インフルエンザ菌（Hib）、例えばActHIB（登録商標）（Sanofi-aventis）、PedvaxHIB（登録商標）（Merck）およびHibTITER（登録商標）（Wyeth）；
Ａ型肝炎、例えばHavrix（登録商標）（GlaxoSmithKline）およびVaqta（登録商標）（Merck）；
Ｂ型肝炎、例えばEngerix-B（登録商標）（GlaxoSmithKline）およびRecombivax HB（登録商標）（Merck）；
帯状疱疹（shingles）、例えばZostavax（登録商標）（Merck）；
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、例えばGardasil（登録商標）（Merck）；
インフルエンザ、例えばFluarix（登録商標）およびFluviral（登録商標）（GlaxoSmithKline）、FluLaval（登録商標）（ID Biomedical Corp of Quebec）；FluMist（登録商標）（鼻腔内）（Medimmune）、Fluvirin（登録商標）（Chiron）、およびFluzone（登録商標）（Sanofi-aventis）；
日本脳炎、例えばJE-Vax（登録商標）（Sanofi-aventis）；
麻疹、例えばAttenuvax（登録商標）（Merck）；
髄膜炎菌性髄膜炎、例えばMenomune（登録商標）Meningococcal Polysaccharide（Sanofi-aventis）；
流行性耳下腺炎、例えばMumpsvax（登録商標）（Merck）；
肺炎級菌による疾病、例えばPneumovax 23（登録商標）Pneumococcal Polysaccharide（Sanofi-aventis）およびPrevnar（登録商標）Pneumococcal Conjugate（Wyeth）；
ポリオ、例えばIpol（登録商標）（Sanofi-aventis）およびPoliovax（登録商標）（Sanofi-Pasteur）；
狂犬病、例えばBioRab（登録商標）（BioPort Corporation）、RabAvert（登録商標）（Chiron）およびImovax（登録商標）Ravies (Sanofi-aventis)；
ロタウイルス、例えばRotaTeq（登録商標）（Merck）；
風疹、例えばMeruvax II（登録商標）（Merck）；
腸チフス菌（腸チフス）、例えばTyphim Vi（登録商標）（Sanofi-aventis）およびVivotif（登録商標）Berna （経口）（Berna）；
肺結核（ＢＣＧ）、例えばTheraCys（登録商標）およびImmuCyst（登録商標）（Sanofi-aventis）；TICE（登録商標）BCGおよびOncotice（商標）（Organon Teknika Corporation）；Pacis（商標）;およびMycobax（登録商標）（Sanofi-Pasteur）；
種痘症（天然痘）、例えばDryvax（登録商標）（Wyeth）；
水痘（鶏痘)、例えばVarivax（登録商標）（Merck）；
黄熱病、例えばYF-Vax（登録商標）（Sanofi-aventis）；
Ａ型肝炎／Ｂ型肝炎、例えばTwinrix（登録商標）（GlaxoSmithKline）；
Ｂ型肝炎およびＨｉｂ、例えばComvax（登録商標）（Merck）；
破傷風／Ｈｉｂ、例えばActHIB（登録商標）（Sanofi-Pasteur）；
ジフテリア／Ｈｉｂ、例えばHibTITER（登録商標）（Wyeth Pharmaceuticals）；
Ｈｉｂ／髄膜炎、例えばPedVaxHIB（登録商標）（Merck & Co）；
髄膜炎／ジフテリア、例えばMenactra（登録商標）Meningococcal Conjugate（Sanofi-Pasteur）；
破傷風／ジフテリア（Ｔｄ）、例えばDecavac（登録商標）（Sanofi-aventis）；
ジフテリア／破傷風／百日咳（ＤＴａＰ／ＤＴまたはＤＴａＰ）、例えばDaptacel（登録商標）およびTripedia（登録商標）（Sanofi-aventis）およびInfanrix（登録商標）（GlaxoSmithKline）；
破傷風／ジフテリア／百日咳（Ｔｄａｐ）、例えばBoostrix（登録商標）（GlaxoSmithKline）およびAdacel（登録商標）（Sanofi-Pasteur）；
ＤＴａＰ／Ｈｉｂ、例えばTriHIBit（登録商標）（Sanofi-aventis）；
ＤＴａＰ／ポリオ／Ｂ型肝炎、例えばPediarix（登録商標）（GlaxoSmithKline）；
麻疹／流行性耳下腺炎／風疹（ＭＭＲ）、例えばM-M-R II（Merck）および
麻疹／流行性耳下腺炎／風疹／鶏痘、例えばProQuad（登録商標）（Merck）。
【０１２６】
獣医による使用の例としては、限定することなく、以下に対するワクチンが挙げられる：
Lawsonia intracellulars（例えば、EnterisolおよびIleitis）、Porphyromonas gulaeおよびP. denticanis （例えば、Priovac）、ストレプトコッカス・エクイ（例えば、Equilis StrepE）、Chlamydophila abortus（例えば、OvilisおよびEnzovax）、Mycoplasma synoviae（例えば、Vaxsafe MS）、Mycoplasma gallisepticum （例えば、Vaxsafe MG）、Bordetella avium（例えば、Art Vax）、Actinobacillus pleuropneumoniae（例えば、PleuroStar APP）、Actinobacillus pleuropneumoniae（例えば、Porcilis APP）、サルモネラ（例えば、Megan VaclおよびMeganEgg）、ウシ流産菌（例えば、RB-51）、アイメリア種（例えば、Coccivac、Immucox、Paracox、Advent、およびNobilis Cox ATM）、アイメリア種（例えば、Inovocox）、E. tenella（例えば、Livacox）、Toxoplasma gondii（例えば、OvilisおよびToxovax）、仮性狂犬病ウイルス（例えば、Suvaxyn Aujeszky）、古典的豚コレラウイルス（例えば、Porcilis PestiおよびBayovac CSF E2）、ウマインフルエンザウイルス（例えば、PROTEQ-FLUおよびRecombitek）、ニューカッスル病ウイルス（例えば、Vectormune FP-ND）、鳥インフルエンザウイルス（例えば、Poulvac FluFend I AI H5N3 RG）、鳥インフルエンザウイルス（例えば、Trovac AI H5）、狂犬病ウイルス（例えば、RaboralおよびPurevax Feline Rabies）、ネコ白血病ウイルス（例えば、EURIFEL FeLV）、イヌパルボウイルス１（例えば、RECOMBITEK Canine Parvo）、イヌコロナウイルス（例えば、RECOMBITEK Corona MLV）、イヌジステンパーウイルス（例えば、RECOMBITEK rDistemperおよびPUREV AXFerret Distemper）、ＩＨＮウイルス（例えば、Apex-IHN）。獣医用ワクチンの他の例は、ＬＨＲＨ（例えば、Vaxstrate、Improvac、Equito、イヌゴナドトロピン放出因子免疫治療薬、およびGonaCon）およびアンドロステンジオン（例えば、Fecundin、 AndrovaxおよびOvastim）などの生殖調節ワクチンを含む。
【０１２７】
本発明の１つの態様において、免疫原性組成物中に含まれる抗原は、既知のインフルエンザワクチンの形態である。ほとんどの市販のインフルエンザワクチンは、表面の糖タンパク質を取り除くためにインフルエンザウイルスを有機溶媒で処理した、スプリット・ウイルスワクチン、サブユニットワクチン、または弱毒化生ウイルスワクチン、またはこれらの組合せである。一般に市販のインフルエンザワクチンは、インフルエンザの３つの株に対する防御を提供することにおいて３価であり、これらは例えば２００７〜２００８年のシーズンにおいては、Ａ型／ソロモン諸島／３／２００６（Ｈ１Ｎ１）様、Ａ型／ウィスコンシン／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）様、およびＢ型／マレーシア／２５０６／２００４様である。
【０１２８】
現在市販されているインフルエンザワクチンとしては、限定はしないが、Fluzone（登録商標）およびVaxigrip（登録商標）（Sanofi-aventis）、Fluvirin（登録商標）（Novartis Vaccine）、Fluarix（登録商標）、FluLaval（登録商標）およびFluviral S/F（登録商標）（GlaxoSmithKline）、Afluria（CSL Biotherapies）、FluMist（登録商標）（Medlmmune）およびInfluvac（商標）（Solvay Pharma）が挙げられる。
【０１２９】
抗原−ＭａＭＶおよび抗原 ＭａＭＶ−ＶＬＰの組合せ
上記のように、免疫原性組成物に含まれる１または２以上の抗原は、ＭａＭＶまたはＭａＭＶ ＶＬＰの外被タンパク質に接合することができ、または非接合形態で組成物中に存在してもよく（すなわち、ＭａＭＶまたはＭａＭＶ ＶＬＰと単純に混合されている）、または、接合および非接合形態の両方で存在してもよい。接合は、例えば、外被タンパク質との遺伝子融合、または共有結合、非共有結合もしくは親和性手段を介した結合であることができる。抗原（単数または複数）とＭａＭＶまたはＶＬＰとの組合せは、しかし、抗原の宿主免疫系による認識を、またはＭａＭＶもしくはＶＬＰの免疫反応を増強する能力を妨げてはならない。
【０１３０】
本発明の１つの態様により、免疫原性組成物に含まれる１または２以上の抗原は、ＭａＭＶ ＶＬＰの外被タンパク質に接合される。ＶＬＰが自己集合外被タンパク質の複数のコピーを含むため、抗原の外被タンパク質への付着は、ＶＬＰの表面上での複数の抗原の提示を可能とする。
【０１３１】
ＶＬＰの表面上での抗原の提示を可能とし、抗原の免疫認識を強化するために、抗原は、ＶＬＰの外表面上に配置された外被タンパク質の領域に付着するのが好ましい。したがって、抗原は、外被タンパク質のアミノ−（Ｎ−）またはカルボキシ−（Ｃ−）末端の近傍またはその位置に挿入することができ、または、ＶＬＰの外表面上に配置された外被タンパク質の内部領域に付着することができる。抗原接合外被タンパク質の、他の融合外被タンパク質、または野生型外被タンパク質と集合して、ＶＬＰを形成する能力は保持されるべきであり、この能力は、本明細書に記載のものを含む既知の方法により容易に試験することができる。１つの態様において、抗原は、外被タンパク質のＣ末端に、またはこの近傍に付着する。
【０１３２】
本発明の１つの態様により、免疫原性組成物は、１または２以上の抗原に遺伝子的に融合したＭａＭＶ外被タンパク質を含む。抗原が、ＭａＭＶ外被タンパク質−抗原融合体の、ＶＬＰに自己集合する能力を妨げる可能性を避けるために、ＭａＭＶ外被タンパク質への遺伝子融合のために選択される抗原は、一般に、約５０個以下のアミノ酸長であり、例えば約４５個以下のアミノ酸長である。
【０１３３】
所望により、スペーサーを、抗原と外被タンパク質の間に含むことができる。この目的のために好適なスペーサーは当分野で知られており、例えば、約３〜約１０個のアミノ酸の短いアミノ酸配列を含む。一般に、この状況でのアミノ酸スペーサーは、グリシン、ロイシン、バリンおよびイソロイシンなどの中性アミノ酸から構成される。１つの態様において、抗原がＭａＭＶ外被タンパク質に遺伝子的に融合されている場合、融合は、約３〜約１０個の中性アミノ酸のペプチドスペーサーを含む。
【０１３４】
より長い抗原も、ＭａＭＶまたはＶＬＰと単純に混合することにより、または化学的架橋または親和性付着により、免疫原性組成物中に組み込むことができ、これは以下にさらに詳細に記載する。
【０１３５】
抗原（単数または複数）は、例えば、共有結合または非共有結合（例えばイオン性、疎水性、水素結合など）による付着により、化学的に外被タンパク質に架橋することができる。抗原および／または外被タンパク質は、当分野に知られているようにして、かかる架橋を促進するように修飾することができ、これは例えば、官能基または化学部分をタンパク質および／または抗原に、例えばＣもしくはＮ末端または内部の位置において添加することによる。例示の修飾には、Ｓ−アセチルメルカプトコハク酸無水物（ＳＡＭＳＡ）またはＳ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）などの官能基の添加、または１もしくは２以上のシステイン残基の添加を含む。他の架橋試薬は当分野に知られており、多くは市販されている（例えば、Pierce Chemical Co.およびigma-Aldrichからのカタログ参照）。例としては以下を含むが、これらに限定されない：ジアミン類、例えば１，６−ジアミノヘキサン、１，３−ジアミノプロパンおよび１，３−ジアミノエタン；ジアルデヒド類、例えばグルタールアルデヒド；スクシンイミドエステル類、例えばエチレングリコール−ビス（コハク酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、ジスクシンイミジルグルタレート、ジスクシンイミジルスベラート、Ｎ−（ｇ−マレイミドブチリルオキシ）スルホスクシンイミドエステルおよびエチレングリコール−ビス（スクシンイミジルスクシネート）；ジイソシアネート類、例えばヘキサメチレンジイソシアネート；ビスオキシラン類、例えば１，４−ブタンジイルジグリシジルエーテル；ジカルボン酸類、例えばジサリチル酸サクシニル；３−マレイミドプロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、その他。上述の架橋剤の多くは、親和性部分をＶＬＰから離すためのスペーサーを組み込む。他のスペーサーの使用もまた本発明により意図される。種々のスペーサーが当分野に知られており、限定することなく、６−アミノヘキサン酸；１，３−ジアミノプロパン；１，３−ジアミノエタン；およびポリグリシン配列などの、１〜５アミノ酸の短いアミノ酸配列を含む。
【０１３６】
１または２以上の抗原の、ＶＬＰの外被タンパク質への共有結合的付着を促進するために、外被タンパク質は、ＶＬＰの表面に露出され、抗原の化学的付着に対する適切な部位を提供する、短ペプチドまたはアミノ酸リンカーに遺伝子的に融合することができる。例えば、システイン残基を含む短ペプチド、または共有結合を形成可能な側鎖、または当分野で知られているようにして共有結合を形成するように容易に修飾できる側鎖を有するアミノ酸残基（例えば、酸性および塩基性残基）である。アミノ酸リンカーまたはペプチドは、例えば、１〜約２０のアミノ酸長であることができる。１つの態様において、外被タンパク質は、１または２以上のレジン残基を含む短ペプチドに融合し、これは例えば抗原のシステイン残基と、上記の好適な架橋剤の使用を通して共有結合することができる。
【０１３７】
本発明のさらなる態様においては、抗原は、外被タンパク質上に存在する親和性部分を介して付着する。この態様によれば、ＭａＭＶ ＶＬＰは、自己集合の後にＶＬＰの表面上に露出され、抗原に特異的に結合することができる、ペプチドなどの親和性部分を含む。親和性部分は、ＭａＭＶまたはＶＬＰに、遺伝子的に融合するか（ペプチドまたはタンパク質断片の場合）、または共有結合もしくは非共有結合的に付着してよい。抗原の、親和性部分への結合は、宿主免疫系による抗原の認識を妨げてはならない。親和性部分は、全タンパク質を結合でき、またはタンパク質断片もしくはペプチドを結合できる。
【０１３８】
好適な親和性部分の例としては、抗体および抗体断片（例えばＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆａｂ’−ＳＨ断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、Ｆｖ断片、二機能性抗体（diabody）および単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子）、ストレプトアビジン（ビオチン標識抗原を結合する）、抗原に特異的に結合する親和性ペプチドまたはタンパク質断片が挙げられるが、これに限定されない。
【０１３９】
親和性部分として用いるのに好適なペプチドまたは抗体（抗体断片を含む）は、当分野で知られている技法、例えばファージまたは酵母提示技術により、選択することができる。ペプチドは、天然、組換え、合成またはこれらの組合せであってよい。例えば、ペプチドは天然のタンパク質またはポリペプチドの断片であってよい。ペプチドの用語はまた、ペプチドアナログ、ペプチド誘導体およびペプチド模倣化合物も包含する。かかる化合物は当分野に知られており、天然のペプチドに対して利点を有する可能性があり、これには例えば、より大きな化学的安定性、タンパク質分解に対する抵抗性の増加、および／または抗原性の低下などを含む。
【０１４０】
親和性部分として用いるのに好適なペプチドは、約３アミノ酸長〜約５０アミノ酸長であることができる。本発明の１つの態様により、親和性結合ペプチドは、少なくとも５アミノ酸長である。本発明の他の態様により、親和性結合ペプチドは、少なくとも７アミノ酸長である。本発明の他の態様により、親和性結合ペプチドは、約５〜約５０アミノ酸長である。本発明の他の態様により、親和性結合ペプチドは、約７〜約５０アミノ酸長である。本発明の他の態様により、親和性結合ペプチドは、約５〜約４５アミノ酸長、約５〜約４０アミノ酸長、約５〜約３５アミノ酸長、および約５〜約３０アミノ酸長である。本発明の特定の態様により、親和性結合ペプチドは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５アミノ酸長である。当業者により理解されるように、抗原を親和性部分に結合するために選択されるペプチドの長さは、ＭａＭＶ ＶＬＰの自己集合の能力、または宿主の免疫系による、一度結合された抗原の認識の能力を妨げてはならない。
【０１４１】
ＭａＭＶまたはＶＬＰが含む親和性部分は、単一ペプチドまたはペプチドの縦列もしくは複数配置であってよい。所望の場合には、大きな抗原の結合を促進するために、スペーサーを、親和性部分と外被タンパク質の間に含むこともできる。好適なスペーサーは、例えばグリシンなどの中性アミノ酸の短い範囲を含む。例えば、約３〜約１０個の中性アミノ酸の範囲である。
【０１４２】
ファージ提示を用いて、目的の抗原タンパク質に結合する特定のペプチドを選択することができ、ここで標準の技法（例えば、Current Protocols in Immunology, ed. Coligan et al., J. Wiley & Sons, New York, NY参照）、および／または市販のファージ提示キット（例えば、New England Biolabsから入手可能なPh.Dシリーズのキット、およびNovagenより入手可能なT7-Select（登録商標）キット）を用いて行う。ファージ提示によるペプチドの選択の例は、以下の例８にも提供される。
【０１４３】
ＭａＭＶおよびＭａＭＶ ＶＬＰの調製
本発明は、組換えＭａＭＶ外被タンパク質由来のＭａＭＶ ＶＬＰを、ならびにＭａＭＶまたはＭａＭＶ ＶＬＰを含む免疫原性組成物を提供する。本発明はさらに、１または２以上の抗原または親和性部分を、外被タンパク質との遺伝子融合で含む、ＭａＭＶ ＶＬＰを提供する。これらの組換え外被タンパク質は、多量体化およびＶＬＰへの集合が可能である。抗原または親和性ペプチドを、抗原へ、また外被たんぱく質への結合のために遺伝子的に融合する方法は当分野に知られており、代表的な例が以下および実施例に記載される。種々の分子をタンパク質に化学的に架橋する方法も当分野でよく知られており、用いることができる。
【０１４４】
Ｍａｌｖａモザイクウイルス
本明細書の例の節に記載されているように、ＭａＭＶはＭａｌｖａ neglecta Wallr（一般のアオイ科植物）から単離することができる。ウイルスは、容易にM. neglectaに、またはアカザ科、例えば例１に記すようにChenopodiaceae quinoaからの植物種に繁殖させることができる。
【０１４５】
ウイルスは、簡潔に述べると、Chenopodiaceae quinoa（４枚葉ステージ）の健康な葉を、例えば約４０μＬなどの適切な容積の担体中の約１０〜１００μｇの精製ウイルスでこすることにより、容易に繁殖させることができる。あるいは、乳鉢中で水中の感染した葉（例えば、２ｍｌの水中に１ｇの感染した葉）をひいて得た液を用いて、健康な植物に接種することができる。カーボランダム（研磨剤）をそっと、ウイルスまたは液でこする前の健康な葉の表面に落とす。感染は、指でそっとこすって微小な損傷部を作ることで開始され、これを通してウイルスは植物細胞中に浸入する。こすった約１０分後、接種した葉を水で洗浄して、カーボランダムおよび任意の残留物を取り除く。接種した植物は、感染がモザイクまたは局所病変部の症状を示すまで、さらにおよそ５〜１４日間成長させる（光および光周期の環境条件に依存する）。通常植物は、１６時間の明期および８時間の暗期で、明期間は２２℃で、および暗期間には１６℃で成長させる。植物は、製造業者のプロトコルに従い２０−２０−２０の肥料を用いて施肥する。一般に１００〜１０００ｇの感染植物の葉が、ウイルス精製のために必要である。
【０１４６】
ウイルスは、感染した葉から、標準のポテックスウイルス単離技術（例えばAbouHaidar MG, et al. (1998) Methods MoI Cell Biol 81 : 131-143およびTremblay, M.-H., et al., (2006). FEBS J 273: 14-25を参照）により単離することができる。好適な方法のさらなる例は以下である。感染した葉を収穫し、好適な緩衝液中に均質化し、続いてフィルタリングおよび／または遠心分離して砕片を取り除く。得られた懸濁液をブタノールおよび任意に洗浄剤で処理し、次に氷上で撹拌する。溶液を次に遠心分離し、得られたペレットを適切な緩衝液に再懸濁させる。ペレットを均質化し、次に再度遠心分離する。ビリオンを上清から、スクロースクッション上の超遠心分離によりペレット化し、得られたペレットを適切な緩衝液中にホモジナイザーを用いて再懸濁させる。ウイルス溶液は、所望により、０．４５μＭシリンジフィルターを通す前の追加の遠心分離ステップにより、清浄にすることができる。
【０１４７】
精製したビリオンは、例えば４℃にて冷蔵保存することができる。
【０１４８】
ＭａＭＶ ＶＬＰ
本発明のＶＬＰの調製に好適な組換えＭａＭＶ外被タンパク質は、標準の遺伝子操作技術を用いて、野生型外被タンパク質の配列を提供された当業者により、容易に調製可能である。タンパク質の遺伝子操作の方法は当分野によく知られている（例えば、Ausubel et al. (1994 & updates) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New Yorkを参照）。野生型ＭａＭＶ外被タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）および野生型タンパク質をコードするヌクレオチド配列（配列番号３）は本明細に提供されており、これらはまた、上記したようにGenBankから公的に入手可能である。
【０１４９】
野生型タンパク質をコードする核酸配列の単離およびクローニングは、標準の技法を用いて（例えば、Ausubel et al.、同上を参照）、例えばＭａＭＶから標準の技法でＲＮＡを抽出し、次にＲＮＡテンプレートからｃＤＮＡを合成する（例えば、ＲＴ−ＰＣＲにより）ことにより、実施することができる。ＭａＭＶは、モザイク症状を示す感染植物の葉から、上記した標準の技法により（本明細書に記載の例１も参照）精製することができる。
【０１５０】
代替的に、外被タンパク質をコードする遺伝子を、標準の技法を用いて人工的に構成することができる。例えば、いくつか（例えば１８〜２０個）のオーバーラップしたリン酸化オリゴヌクレオチド（約８０ヌクレオチド長）で、遺伝子配列全体を提示するものを、標準技法を用いて合成可能である。各ヌクレオチドは、それらの５’末端または３’末端において、例えば約２０個のヌクレオチドがオーバーラップしていなければならず、ただし、３’末端においてのみオーバーラップする最終の５’オリゴと、５’末端においてのみオーバーラップする最終の３’オリゴは除く。オリゴヌクレオチドは適切な緩衝液内（例えば１０ｍＭのトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８および２５ｍＭのＮａＣｌ）にプールし、９０℃に１５分間加熱し、室温にゆっくり冷却して、オリゴヌクレオチド間のアニーリングおよび、全長ＭａＭＶ ＣＰ遺伝子の生成を可能とすることができる。リガーゼ緩衝液へのＴ４ ＤＮＡリガーゼの添加は、オリゴヌクレオチドの集合を完了させる。任意に、ＭａＭＶ ＣＰ遺伝子の５’および３’末端を含むオリゴヌクレオチドはユニークな制限部位を含むことができ、これは、アニールされたＤＮＡを細菌プラスミドなどの適切なベクターにクローニングするのに用いることができる。このベクターは、プラスミド大腸菌などの適切な宿主細胞を形質転換して、プラスミドを増幅し、オリゴヌクレオチドのライゲーションを完了させるために用いることができる。全てのオリゴヌクレオチドのアニーリングは、これらを２つずつ順番にアニーリングし、続いてオリゴヌクレオチドの各ペアを２つずつアニーリングし、これを続けて、全長遺伝子が生成されるまで行うことにより、改善することができる。
【０１５１】
代替的に、全長ＭａＭＶ ＣＰ遺伝子は、適切なプラスミド（例としてはｐＥＴ−３Ｄ）にクローニングして大腸菌内（例えばＢＬ２１（ＤＥ３））でタンパク質を発現させる前に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅することができる。
【０１５２】
全長遺伝子配列はまた、合成遺伝子を作製する多くの営利会社の１つによるサービスを通して得ることもできる（例えば、GenScript Corp.（Piscataway, NY）、Geneart AG（Regensberg, Bavaria）およびMolecular Cloning Laboratories（San Francisco, CA））。
【０１５３】
外被タンパク質をコードする核酸配列は次に、好適な発現ベクターに、直接挿入するか、または１もしくは２以上のサブクローニングステップの後に挿入する。当業者は、用いる正確なベクターは本発明に決定的に重要ではないことを理解する。好適なベクターとしては、プラスミド、ファージミド、コスミド、バクテリオファージ、バキュロウイルス、レトロウイルス、またはＤＮＡウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。外被タンパク質は次に、以下にさらに詳細に記載されるようにして、発現および精製することができる。ＭａＭＶ外被タンパク質を含むベクター（プラスミドｐＭａＭＶ−ＣＰ−６Ｈ（ＭａＭＶ外被タンパク質を含むｐＥＴ−３Ｄ））の例は、例６に記載される。プラスミドｐＭａＭＶ−ＣＰ−６Ｈに含まれているＭａＭＶ外被タンパク質遺伝子のヌクレオチド配列は、図１０Ａ（配列番号２３）に、およびコードされた外被タンパク質のアミノ酸配列は、図１１Ａ（配列番号２４）に提供される。
【０１５４】
任意に、外被タンパク質をコードする核酸配列をさらに操作して、当分野で知られている標準のin vitro部位特異的突然変異誘発技術により、上記のものなどのように１または２以上の変異を導入することができる。突然変異は、コード配列を作っている１または２以上のヌクレオチドの、欠失、挿入、置換、逆位、またはこれらの組合せにより、導入可能である。これは、例えば、１または２以上のヌクレオチドミスマッチ、挿入または欠失を組み込むプライマーが設計されたＰＣＲに基づく技法により、実現することができる。突然変異の存在は、多くの標準技法、例えば、制限解析またはＤＮＡ配列決定により確認可能である。
【０１５５】
上述のように、外被タンパク質はまた、外被タンパク質に融合した１または２以上の抗原、親和性ペプチドおよび／またはスペーサーペプチドを含む、融合タンパク質を産生するように、操作することもできる。融合タンパク質を作製するための方法は、当業者によく知られている。融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、上記のように、好適な発現ベクターに挿入することができる。
【０１５６】
当業者は、外被タンパク質または融合タンパク質をコードするＤＮＡを、コードされたタンパク質の活性に影響を与えることなく、種々の方法で変更できることを理解する。例えば、ＤＮＡ配列の変化を用いて、タンパク質を発現するために用いる宿主細胞のコドンの選好を最適化することができ、またはＤＮＡ配列の変化は、発現を促進する他の配列の変化を含んでもよい。
【０１５７】
当業者は、発現ベクターは、外被もしくは融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列の効率的な転写に必要な調節要素、例えば転写要素などをさらに含んでよいことを理解する。ベクターに組み込むことができる調節要素の例は、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、およびポリアデニル化シグナルを含むが、これに限定しない。したがって本発明は、外被タンパク質または融合タンパク質をコードする核酸配列に動作可能に結合された調節要素を含む、ベクターを提供する。当業者は、好適な調節要素の選択は、タンパク質の発現について選択された宿主細胞に依存し、かかる調節要素は、細菌、真菌、ウイルス、哺乳類または昆虫の遺伝子を含む種々の源に由来し得ることを理解する。
【０１５８】
必要に応じて、発現ベクターは、当分野に知られているような、発現されたタンパク質の精製を促進する異種（非相同）核酸配列をさらに含んでよい。かかる異種核酸配列の例は、金属親和性タグなどの親和性タグ、ヒスチジンタグ、アビジン／ストレプトアビジンコード配列、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）コード配列およびビオチンコード配列を含むが、これに限定しない。得られた異種アミノ酸配列は、当分野に知られている方法に従って用いる前に、発現されたタンパク質から除去することができる。代替的に、異種アミノ酸配列は、続くＶＬＰへのタンパク質の集合を妨害しない場合には、タンパク質上に保持することもできる。本発明の１つの態様において、外被タンパク質はヒスチジンタグ・タンパク質として発現される。異種アミノ酸配列は、外被タンパク質のカルボキシル末端またはアミノ末端に位置させることができる。
【０１５９】
発現ベクターは、好適な宿主細胞または組織内に、当分野で知られている種々の方法の１つを用いて、導入することができる。かかる方法は、Ausubel et al.（同上）に一般的に記載されており、例えば、安定または過渡的なトランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、および組換えウイルスベクターによる感染を含む。当業者は、外被タンパク質の発現のための適切な宿主細胞の選択は、選択したベクターに依存することを理解する。宿主細胞の例は、細菌、酵母、昆虫、植物および哺乳類細胞を含むが、これに限定しない。用いる正確な宿主細胞は、本発明に重要ではない。外被タンパク質は、原核生物宿主（例えば、大腸菌、A. salmonicidaまたはB. subtilis）または真核生物宿主（例えば、SaccharomycesまたはPichia；哺乳類細胞、例えばＣＯＳ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、またはＨｅＬａ細胞；または昆虫細胞）において産生することができる。本発明の１つの態様において、組換え外被タンパク質は、植物または細菌細胞中に発現させることができる。他の態様において、組換え外被タンパク質は、細菌細胞中に発現させる。他の態様において、組換え外被タンパク質は、大腸菌細胞中に発現させる。
【０１６０】
必要に応じて、発現されたタンパク質は宿主細胞から、当分野で知られている標準の技法により（例えば、Current Protocols in Protein Science, ed. Coligan, J.E., et al., Wiley & Sons, New York, NYを参照）精製でき、標準のペプチド配列決定技法により、無傷のタンパク質またはそのタンパク質分解断片を用いて配列決定して、タンパク質の同一性を確認することができる。
【０１６１】
本発明の１つの態様により、組換え外被タンパク質は、多量体化およびＶＬＰへの集合が可能である。一般に、ＶＬＰ集合は、外被タンパク質を発現する宿主細胞内で起こる。ＶＬＰは宿主細胞から、本明細書に記載の実施例の節に記載されているような標準の技法により単離可能である。ＶＬＰは、クトマトグラフィなどの標準の技法によりさらに精製して、汚染宿主細胞タンパク質またはＬＰＳなどの他の化合物を除去することができる。
【０１６２】
本発明の１つの態様において、外被タンパク質は集合して宿主細胞内にウイルスまたは偽ウイルスを提供し、これは核酸およびタンパク質を含む感染ウイルス粒子の産生に用いることができる。これにより、感染ウイルスまたは偽ウイルス粒子による隣接する細胞の感染、およびその中のタンパク質の発現が可能である。この態様において、ウイルスまたは偽ウイルスを複製するために用いる宿主細胞は、ウイルスの複製を可能とする、植物細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞または細菌細胞であることができる。これらの細胞は、ウイルスに対する天然の宿主細胞であって、これからウイルス様粒子が導出されるものであってよいが、しかし必ずしもそうである必要はない。宿主細胞は、初めに粒子形態のウイルスまたは偽ウイルス（すなわち、核酸およびタンパク質を含む集合したロッド）により感染されるか、または代替的に、初期感染に用いるウイルス核酸が複製可能であり、全ウイルス粒子の産生をもたらす場合には、核酸形態において（すなわち、ウイルスＲＮＡなどのＲＮＡ；ｃＤＮＡまたはｃＤＮＡから調製されるランオフ転写物）感染されることができる。
【０１６３】
ＭａＭＶまたはＭａＭＶ ＶＬＰのストックの産生
組換えＭａＭＶまたはＶＬＰのストックを、標準技法により調製する。例えば、組換え外被タンパク質を含むＭａＭＶまたは偽ウイルスを、例えばChenopodium quinoaなどの適切な宿主内に、十分なＭａＭＶまたは偽ウイルスが収穫できるように、繁殖させることができる。
【０１６４】
ＭａＭＶ ＶＬＰのストックは、適切は宿主細胞から、例えば、上述のようにして調製された、ＶＬＰを作る組換え外被タンパク質をコードする発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた大腸菌などから、調製することができる。宿主細胞は次に、当分野で知られているように、コードされたタンパク質の発現に有利な条件下で培養される。発現された外被タンパク質は多量体化して宿主細胞のＶＬＰに集合することができ、これは上述のような標準の技法で、例えば細胞を破壊して、細胞可溶化物を１または２以上のクロマトグラフィによる精製ステップに供することにより、細胞から単離することができる。
【０１６５】
ＭａＭＶおよびＭａＭＶ ＶＬＰのストックは、例えば４℃にて冷蔵庫内で保存することができる。
【０１６６】
組換えおよび改変外被タンパク質の特徴
組換え外被タンパク質および、抗原、親和性ペプチドおよび／またはスペーサーペプチドが結合した外被タンパク質を、それらの多量体化およびＶＬＰへ自己集合する能力について、標準の技法により解析することができる。これは例えば、精製タンパク質を電子顕微鏡法により視覚化することによる（例えば、例６を参照）。ＶＬＰの形成はまた、超遠心分離法により決定してもよく、円偏光二色性（ＣＤ）分光法を用いて、組換えもしくは改変タンパク質とＷＴウイルスの二次構造を比較することができる（例えば、Tremblay, et al, FEBSJ, 2006, 273: 14-25参照）。
【０１６７】
ＶＬＰおよびＭａＭＶの安定性を、必要に応じて、当分野で知られている技法、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびトリプシン分解分析（例えば、Tremblay, et al, 2006、上記）により、決定することができる。
【０１６８】
有効性の評価
本発明の免疫原性組成物の、動物において免疫反応を誘発する能力を、当分野に知られた方法、例えば以下および例に記載されたものなどにより、試験することができる。例えば、ＭａＭＶ、ＭａＭＶ ＶＬＰまたはこれを含む免疫原性組成物を、好適な動物モデルに、例えば皮下注射により、または鼻腔内に投与することができ、抗体の発生を評価する。
【０１６９】
細胞性免疫反応はまた、当分野で知られている技法により評価することができる。例えば、細胞性免疫反応は、ＭａＭＶ ＶＬＰに発現されたエピトープの、in vitroおよびin vivoでの樹状細胞による特異的Ｔリンパ球へのプロセシングおよび交差提示（cross presentation）を評価することにより、決定することができる。細胞性免疫（Ｔリンパ球）の誘発を評価する他の有用な技法としては、Ｔ細胞増殖およびＩＦＮ−γ分泌放出のモニタリング、例えばＥＬＩＳＡによりサイトカインの誘発をモニタリングすること（例えば、Leclerc, D., et al, J. Virol, 2007, 81(3):1319-26参照）などを含む。
【０１７０】
ＭａＭＶまたはＭａＭＶ ＶＬＰおよび１もしくは２以上の抗原を含む免疫原性組成物の、ワクチンとしての有効性を評価するために、チャレンジ試験を実施することができる。かかる試験は、試験動物（例えばマウス、ラットまたはフェレット）の群に、本発明の免疫原性組成物を標準技法により接種することを含む。非接種動物および／または市販のワクチンを接種した動物を含む対照群、または他の陽性対照は、平行して設定する。ワクチン接種後の適切な時間の後、動物を、天然の抗原含有物質または有機体によりチャレンジする。動物から、接種前および接種後、およびチャレンジ後に採取した血液試料を、ウイルスに対する抗体反応について分析する。抗体反応についての好適な試験は、ウェスタンブロット解析および酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）などを含むがこれに限定されない。動物はまた、抗原含有物質または有機体に関連する状態の症状の発生についてもモニタリングすることができる。
【０１７１】
同様に、腫瘍関連抗原を含有する免疫原性組成物の、それらの予防効果についての試験は、試験動物に接種し、続いて、癌細胞を動物に例えば皮下的に移植することによるチャレンジ、および動物における腫瘍の発達のモニタリングにより、行うことができる。代替的に、免疫原性組成物の治療効果を、癌細胞の移植および腫瘍の確立後に組成物を試験動物に投与し、腫瘍の増殖および／または転移のモニタリングにより、試験することができる。
【０１７２】
医薬組成物
上述のように、ＭａＭＶまたはＭａＭＶ ＶＬＰおよび任意に１もしくは２以上の抗原を含む免疫原性組成物は、さらに任意に、好適な担体、賦形剤など、および／または組成物の安定性、味のよさ、薬物動態、バイオアベイラビリティ等を改善する医薬組成物のその他の標準成分を含んでよい。本発明の１つの態様において、免疫原性組成物は、アジュバントとして用いるために製剤化される。他の態様において、免疫原性組成物は、ワクチンとして用いるために製剤化される。
【０１７３】
組成物は、種々の経路による投与のために製剤化可能である。例えば、組成物は、経口、局所、直腸、鼻腔、または非経口投与用に製剤化でき、または吸入もしくはスプレーによる投与用に製剤化できる。本明細書において用語、非経口的とは、皮下注射、静脈内、筋肉内、髄腔内、胸骨内注射または注入技法を含む。対象への鼻腔内投与は、医薬組成物を、対象の鼻道または鼻腔の粘膜に投与することを含む。本発明の１つの態様において、組成物は局所、直腸もしくは非経口投与用に、または吸入もしくはスプレーによる、例えば鼻腔内経路による投与用に製剤化される。他の態様において、組成物は非経口投与用に製剤化される。
【０１７４】
組成物は好ましくは、本発明の免疫原性組成物の有効量を含む。本明細書において用語「有効量」とは、検出可能な免疫反応を生成するのに必要な組成物の量をいう。与えられた適用に対しての免疫原性組成物の有効量は最初に、例えば細胞培養アッセイまたは動物モデルにおいて、通常はげっ歯類、ウサギ、イヌ、ブタ、または霊長類において、推定可能である。動物モデルはまた、好適な濃度範囲および投与経路を決定するために用いてもよい。かかる情報は次に、ヒトを含む処置すべき動物における、有用な用量および投与経路の決定に用いることができる。本発明の１つの態様において、単位用量は、約５μｇ〜約１０ｍｇの外被タンパク質を含む。他の態様において、単位用量は、約１０μｇ〜約１０ｍｇの外被タンパク質を含む。さらに他の態様において、単位用量は、約５μｇ〜約５ｍｇの外被タンパク質を含む。他の態様において、単位用量は、約１０μｇ〜約５ｍｇの外被タンパク質を、約１０μｇ〜約２ｍｇの外被タンパク質を、約１５μｇ〜約５ｍｇの外被タンパク質を、および約２０μｇ〜約５ｍｇの外被タンパク質を含む。１また２以上の用量を用いて動物を免疫化することができ、これらは、同じ日に投与することも、または数日もしくは数週間の期間にわたって投与することもできる。
【０１７５】
上述のように、本発明の免疫原性組成物は複数の抗原（接合および／または非接合形態）を含んでよく、したがって多価ワクチン製剤を提供することができる。複数のＶＬＰを含む多価ワクチン組成物であって、各ＶＬＰが異なる抗原に接合しているものもまた、意図される。多価ワクチン製剤は、２価および３価の製剤を、より高い価のワクチンに加えて含む。
【０１７６】
一定の態様において、複数の（すなわち、２または３以上の）異なる抗原を含む多価ワクチン製剤も、製剤中のより多くの数のエピトープにより、改善された防御を提供することができる。抗原は、接合形態（例えば、各々が異なる抗原に接合した多数の異なるＶＬＰにより）、または非接合形態において、または接合および非接合形態の両方において、含むことができる。
【０１７７】
経口使用のための組成物は、例えば、錠剤、トローチ剤、ロゼンジ、水性もしくは油性の懸濁液、分散粉末または顆粒、乳剤、硬質もしくは軟質カプセル、またはシロップまたはエリキシル剤として、製剤化可能である。かかる組成物は、当分野で知られている医薬組成物の製造の標準的方法により製造可能であり、甘味料、香味剤、着色剤および保存剤の群から選択される１または２以上の剤を、薬学的に洗練された味のよい調製物を提供するために、含んでよい。錠剤は、免疫原性組成物を、好適な無毒性の薬学的に許容し得る賦形剤、例えば以下に記載の賦形剤と組み合わせて含む：不活性の希釈剤、例えば炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム、またはリン酸ナトリウム；顆粒化または崩壊剤、例えばコーンスターチ、またはアルギン酸；結合剤、例えばスターチ、ゼラチンまたはアカシア、および湿潤剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルク。錠剤は被覆されていなくてもよく、または、消化管での分解および吸収を遅延させ、これにより長期の持続作用を提供するために、既知の技術により被覆されてもよい。例えば、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルなどの時間遅延材料を用いてもよい。
【０１７８】
経口使用のための組成物はまた、免疫原性組成物が不活性の固体希釈剤、例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウムまたはカオリンと混合される、硬質ゼラチンカプセルとして提供することもでき、あるいは、活性成分が水またはピーナツ油、液体パラフィンまたはオリーブ油などの油性媒体と混合される、軟質ゼラチンカプセルとしても提供可能である。
【０１７９】
鼻腔内投与用の医薬組成物は、例えば、鼻腔用スプレー、鼻腔用のドロップ、懸濁液、溶液、ゲル、軟膏、クリーム、および粉末を含むことができる。組成物は、例えばAccuspray（登録商標）（Becton Dickinson）などの好適な市販の鼻腔用噴霧器を介する投与用に製剤化することができる。鼻腔内投与他の方法は、当分野で知られている。
【０１８０】
水性懸濁液として製剤化される組成物は、免疫原性組成物を１または２以上の好適な賦形剤と組み合わせて含み、これは例えば、懸濁剤であって例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、トラガカント・ゴムおよびアカシア・ゴム；分散剤または湿潤剤、例えば天然のホスファチド、例えばレシチン、または酸化アルキレンと脂肪酸との縮合生成物、例えばステアリン酸ポリオキシエチレン、または酸化エチレンと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物、例えばヘプタ−デカエチレンオキシセタノール、または酸化エチレンと脂肪酸／ヘキシトール由来の部分エステルとの縮合生成物、例えばポリエチレンソルビトールモノオレエート、または酸化エチレンと脂肪酸／ヘキシトール無水物由来の部分エステルとの縮合生成物、例えばポリエチレンソルビタンモノオレエートなどである。水性懸濁液はまた、１もしくは２以上の保存剤、例えばエチル、またはｎ−プロピルｐ−ヒドロキシベンゾエート、１もしくは２以上の着色剤、１もしくは２以上の香味剤または１もしくは２以上の甘味料、例えばスクロースもしくはサッカリンを含んでよい。
【０１８１】
組成物は、油性懸濁液として、免疫原性組成物を例えばラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油またはココナツ油などの植物油中に、または液体パラフィンなどの鉱油中に懸濁させることにより、製剤化することもできる。油性懸濁液は、増粘剤、例えば蜜ろう、硬質パラフィンまたはセチルアルコールなどを含んでよい。上記などの甘味料、および／または香味剤を任意に加えて、口に合う経口製剤を提供することができる。これらの組成物は、アスコルビン酸などの抗酸化剤の添加により、保存することができる。
【０１８２】
組成物は、分散性の粉末または顆粒として製剤化でき、これは次に、水を添加して水性懸濁液の調製に用いることができる。かかる分散性の粉末または顆粒は、免疫原性組成物を、１または２以上の分散剤または湿潤剤、懸濁剤および／または保存剤と組み合わせて提供する。好適な分散剤または湿潤剤、および懸濁剤は、上記で既に例示されている。追加の賦計剤、例えば、甘味料、香味剤および着色剤もまた、これらの組成物に含むことができる。
【０１８３】
本発明の組成物はまた、水中油型乳剤としても製剤化可能である。油相は、オリーブ油もしくはラッカセイ油などの植物油、または液体パラフィンなどの鉱油、またはこれらの油の混合物でもよい。これらの組成物に含めるのに好適な乳化剤は、天然のゴム、例えばアカシアゴムもしくはトラガカントゴム；天然のホスファチド、例えば大豆、レシチン；または脂肪酸とヘキシトール由来のエステルもしくは部分エステル、無水物例えばモノオレイン酸ソルビタン、および前記部分エステルと酸化エチレンとの縮合生成物、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートを含む。乳剤はまた、任意に甘味料および香味剤を含むことができる。
【０１８４】
組成物は、シロップまたはエリキシル剤として、免疫原性組成物を１または２以上の甘味料、例えばグリセロール、プロピレングリコール、ソルビトールまたはスクロースなどと混合することにより製剤化することができる。かかる製剤はまた、１または２以上の粘滑剤、保存剤、香味剤および／または着色剤を任意に含むことができる。
【０１８５】
組成物は、無菌の注射用水性または油性懸濁液として、当分野で知られている方法により、上述のものなどの、好適な１または２以上の分散剤または湿潤剤および／または懸濁剤を用いて、製剤化することができる。無菌の注射用調製物は、無毒性の非経口的に許容し得る希釈剤または溶媒中の、無菌の注射用溶液または懸濁液であってよく、例えば１，３−ブタンジオール中の溶液である。用いることのできる、許容し得るビヒクルおよび溶媒は、水、リンガー溶液、乳酸化リンガー溶液および等張食塩水を含むが、これに限定されない。他の例には、従来から溶媒または懸濁媒体として用いられている無菌の固定油、および種々の無刺激性の固定油であって、例えば合成モノ−およびジグリセリドなどを含む。オレイン酸などの脂肪酸もまた、注射物の調製に用いることができる。
【０１８６】
任意に、本発明の組成物は、保存剤例えば抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤および不活性ガスなど、および／または安定化剤例えば炭水化物（例えばソルビトール、マンニトール、スターチ、スクロース、グルコース、またはデキストラン）、タンパク質（例えばアルブミンまたはカゼイン）、またはタンパク質含有剤（例えばウシ血清アルブミンまたはスキムミルク）を、好適な緩衝液（例えばリン酸緩衝液）と共に含んでよい。組成物のｐＨおよび種々の成分の正確な濃度は、周知のパラメータにしたがって調節してよい。
【０１８７】
さらに、アジュバント活性を有する１または２以上の化合物も、ワクチン組成物に任意に加えてよい。好適なアジュバントは、例えば、水酸化、リン酸化、または酸化アルミニウム；油型乳剤（例えばBayol F（登録商標）またはMarcol52（登録商標））；サポニン、またはビタミンＥ可溶化物を含む。オプソニン化ワクチン組成物も本発明に包含され、例えば、ワクチンにより前に免疫化した動物またはヒトから単離された抗体を含む、ワクチン組成物である。ワクチンにより前に免疫化した動物またはヒトから単離された抗体に基づく組換え抗体も、ワクチン組成物をオプソニン化するために用いることができる。
【０１８８】
他の医薬組成物および医薬組成物を調製するための方法は、当分野で知られており、例えばRemington: The Science and Practice of Pharmacy”（旧タイトル：“Remingtons Pharmaceutical Sciences”）；Gennaro, A., Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2000)に記載されている。
【０１８９】
さらに、１または２以上の従来のアジュバントも、組成物に任意に加えてよい。好適なアジュバントは、例えば、ミョウバンアジュバント（例えば水酸化、リン酸化、または酸化アルミニウム）；油型乳剤（例えばBayol F（登録商標）またはMarcol52（登録商標））；サポニン、またはビタミンＥ可溶化物を含む。ビロソーム(virosome)もアジュバント特性を有するとして知られており（Adjuvant and Antigen Delivery Properties of Virosomes, Glueck, R., et al., 2005, Current Drug Delivery, 2:395-400）、S. typhiポリンタンパク質（例えばＯｍｐＣ）も同様にこれを有し、本発明の組成物に任意に含むことができる。
【０１９０】
さらに、本発明は、免疫原性組成物が抗原に融合したＭａＭＶ ＶＬＰを含む場合、該組成物はまた、組成物中のＶＬＰ全体のアジュバント効果を増加するために、非融合タンパク質に由来するＭａＭＶ ＶＬＰも含んでよいことを意図する。
【０１９１】
組成物は任意に、オプソニンを、例えば、抗原、ＭａＭＶ、もしくはＭａＭＶ ＶＬＰで前に免疫化した動物またはヒトから単離された抗体を、含んでもよい。抗原、ＭａＭＶ、もしくはＭａＭＶ ＶＬＰで前に免疫化した動物またはヒトから単離された抗体に基づく組換え抗体もまた、オプソニンとして用いることができる。
【０１９２】
本発明にさらに包含されるのは、ＭａＭＶまたはＭａＭＶ ＶＬＰを、上記のような市販のワクチンと組み合わせて含む組成物である。
【０１９３】
免疫原性組成物の使用
本発明は、ＭａＭＶ、ＭａＭＶ ＶＬＰおよびこれを含む免疫原性組成物の、多くの使用を提供する。非限定的例としては、免疫原性組成物の、アジュバント、免疫促進剤として、またはワクチンとしての使用が挙げられる。１または２以上の抗原に接合したＭａＭＶ ＶＬＰもまた、抗原（単数または複数）に対する抗体のスクリーニングのために用いることができる。したがって、本発明は、免疫原性組成物を投与することにより、動物に免疫反応を誘発する方法、および免疫原性組成物の、例えばアジュバント、免疫促進剤、ワクチン、および／または医薬組成物などの医薬の調製のための使用も提供する。
【０１９４】
本発明の免疫原性組成物は、ヒトおよび、家畜用動物と農場用動物を含む非ヒト動物における使用に好適である。免疫原性組成物の投与形態は、任意の他の一般に認められたワクチン接種プログラムと違っている必要はない。例えば、効果的な免疫反応を引き出すのに十分な量での免疫原性組成物の単回投与を用いてよく、または代替的に、免疫原性組成物の初回投与に続いて、抗原のみで、または抗原と免疫原性組成物でのブースティングという他の形態を用いてもよい。同様に、免疫原性組成物または抗原のどちらかによるブースティングは、抗体価が許容レベルを下回った場合には、初回投与の後の時点で行ってもよい。免疫原性組成物の正確な投与方法は、例えば、組成物の成分（例えば、組成物が抗原を含むか、またはアジュバントとして提供されるのか）、処置する動物、および処置の所望の最終効果に依存する。適切な投与方法は、経験ある施術者により容易に決定することができる。
【０１９５】
免疫原性組成物が１または２以上の非接合抗原を含む場合、ＭａＭＶまたはＶＬＰ成分は、１または２以上の抗原と同時に投与することができ、または、免疫反応を必要とする対象の必要性に応じて、抗原の投与の前に、またはこれに続いて、投与することができる。
【０１９６】
免疫原性組成物は、予防的に、例えば、ウイルス、細菌もしくは他の感染粒子による感染を、または疾病もしくは腫瘍の発症を防ぐために用いることができ、または、これは、例えば感染症または癌に関連する疾病もしくは疾患の影響を改善するために治療的に用いてもよい。本発明の１つの態様において、免疫原性組成物は、予防的に用いる。この状況において、免疫原性組成物は、１または２以上の抗原を含むことができ、または免疫原性組成物は、ＭａＭＶもしくはＭａＭＶ ＶＬＰのみを含んでもよく、これは、低レベルの感染などの感染症または疾患に対する抵抗性を誘発するのに十分であり得る。
【０１９７】
免疫原性組成物は、組成物中の含有について、または組成物との使用について選択された抗原に依存して、種々の疾病または疾患の予防または処置において用いることができる。非限定的な例としては以下が挙げられる：インフルエンザ（種々のインフルエンザウイルスからの抗原を使用）、腸チフス（S. typhiからの抗原を使用）、ＨＣＶ感染（ＨＣＶ抗原を使用）、ＨＢＶ感染（ＨＢＶ抗原を使用）、ＨＡＶ感染（ＨＡＶ抗原を使用）、ＨＩＶ感染（ＨＩＶ抗原を使用）、ポリオ（ポリオウイルス抗原を使用）、ジフテリア（ジフテリア毒素由来の抗原を使用）、ＥＢＶ感染（ＥＢＶ抗原を使用）、アレルギー反応（種々のアレルゲンを使用）、および癌（種々の癌関連抗原を使用）が挙げられる。他の使用としては、例えば、炎症性疾患（例えば関節炎）、および鳥インフルエンザウイルス、ヒト呼吸器合胞体ウイルス、デング熱ウイルス、麻疹ウイルス、単純ヘルペスウイルス、ヒトパピローマウイルス、偽ウイルス、豚ロタウイルス、豚パルボウイルス、ニューカッスル病ウイルス、口蹄病ウイルス、豚コレラ（hog cholera）ウイルス、豚コレラ（African swine fever）ウイルス、感染性ウシ鼻気管炎ウイルス、感染性咽頭気管炎ウイルス、ラクロスウイルス、新生子牛下痢ウイルス、ウシ呼吸器合胞体ウイルス、ウシウイルス性下痢ウイルス、豚マイコプラズマ肺炎菌、連鎖球菌、淋菌、腸内細菌および寄生生物（例えばリーシュマニアおよびマラリア）が挙げられる。
【０１９８】
本発明の免疫原性組成物はまた、例えば、該組成物が異なる病原物質からの複数の抗原を含む場合、多価ワクチンとして用いるのに好適である。
【０１９９】
免疫原性組成物はまた、従来のワクチンと併せて用いて、ワクチンの有効性を改善し、または多価ワクチンを提供することができる。この状況において用いることのできる、市販のワクチンの非限定的例は上に提供されている。市販のワクチンは、ヒトワクチンまたは獣医学的使用を意図されたワクチンであってよい。
【０２００】
１つの態様において、本発明はまた、以前にポテックスウイルスベースのワクチンを接種された対象に対するワクチン接種のための、免疫原性組成物の使用も提供する。このアプローチは、第２のワクチンの有効性が、第１のワクチンにおいてポテックスウイルスに対して増殖した抗体との相互作用のために、低下しないことを保証することができる。例えば、ＰａｐＭＶベースのワクチンプラットフォームが記載されている（例えば、国際特許出願PCT/CA03/00985 (WO 2004/004761)および米国特許出願第11/556,678号(US2007/0166322)を参照）。動物またはヒトの、ＰａｐＭＶ ＶＬＰでアジュバント化したワクチンによる免疫化は、アジュバントの主要成分であるＰａｐＭＶ外被タンパク質に指向された多量の抗体を生成することができる。同じ患者を、同じＰａｐＭＶプラットフォームで免疫化すると、常在の抗体の新しく投与されたワクチンに対する免疫反応を、ＰａｐＭＶプラットフォームに直接結合することにより制限する可能性がある。したがって、ＭａＭＶまたはＭａＭＶ ＶＬＰに基づく第２のワクチンの使用はこの効果を避けるのに有用であり、より効率的なワクチン接種プログラムの保証を支援する。
【０２０１】
本発明はまた、１または２以上の抗原に接合したＭａＭＶ ＶＬＰの、スクリーニング剤としての使用、例えば、１または２以上の抗原に対する抗体をスクリーニングするための使用も提供する。ＶＬＰは従来の免疫的技術、例えば酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）またはウェスタンブロッティングなどに容易に適合でき、したがって診断および研究の文脈において有用である。
【０２０２】
キット
本発明はさらに、ＭａＭＶ、ＭａＭＶ ＶＬＰ、または本発明の免疫原性組成物を含むキットの、アジュバントまたはワクチンとしての使用を提供する。ＭａＭＶ、ＭａＭＶ ＶＬＰ、または免疫原性組成物が、市販のワクチンを含む、別の抗原製剤と共に用いることが意図される場合、キットは任意に、該抗原製剤を含むことができる。
【０２０３】
キットの個々の成分は別々の容器に入れられて、かかる容器に付随して、薬学的または生物学的製品の製造、使用または販売を規制している政府機関による所定の形態における、該機関による製造、使用または販売の承認を反映する注意書きがあってよい。キットは任意に、アジュバントまたはワクチンの使用または投与の方法を概説する使用説明書または指示書を含んでよい。
【０２０４】
キットの１または２以上の成分が溶液として、例えば水溶液、または無菌の水溶液として提供される場合、容器はそれ自体が、吸入器、シリンジ、ピペット、点眼容器、または他の類似の機器であってよく、これから溶液を対象に投与でき、またはキットの他の成分にこれを適用して混合することができる。
【０２０５】
キットの成分はまた、乾燥または凍結乾燥形態で提供してもよく、キットは追加して凍結乾燥成分の再構成のための好適な溶媒を含むことができる。容器の数または種類と無関係に、本発明のキットはまた、患者への組成物の投与を支援するための機器も含んでよい。かかる機器は、吸入器、シリンジ、ピペット、鉗子、計量スプーン、点眼容器、または類似の医学的に承認された送達ビヒクルであってよい。
【０２０６】
抗体検出に用いるための、１または２以上の抗原に接合したＭａＭＶ ＶＬＰを含むスクリーニングキットも提供される。キットは、診断用キットまたは研究目的のキットであることができる。キットの個別の成分は別々の容器に入れられ、かかる容器に付随して、生物学的製品の製造、使用または販売を規制している政府機関による所定の形態における、該機関による製造、使用または販売の承認を反映する注意書きがあってよい。キットは任意に、免疫原性組成物の使用方法を概説する使用説明書または指示書を含んでよい。
【０２０７】
本明細書に記載の発明のよりよい理解を得るために、以下の実施例を示す。これらの例は、本発明の例示の態様を記載することを意図し、どのようであれ本発明の範囲の限定を意図するものではないことが理解される。
【０２０８】
例
例１：Ｍａｌｖａモザイクウイルスの増幅、精製、およびＲＮＡ抽出
新しいポテックスウイルスであるＭａｌｖａモザイクウイルス（ＭａＭＶ）を、Ｍａｌｖａ neglecta Wallr.（一般のアオイ科ゼニアオイ属）から単離した。最初に感染したＭａｌｖａ neglecta植物は、カナダ・ブリティッシュコロンビア州サマーランド周辺の地域で収集した。ウイルス感染によるモザイク症状および葉脈の透明化のみが、Ｍａｌｖａ neglectaにおいて観察された症状であった（図４Ａ参照）。
【０２０９】
ウイルスによるChenopodium quinoaの感染は、植物全体を移動する強いモザイクパターンを生成した（図４Ｂ参照）。C. quinoaは、したがって、増殖の宿主として用い、これを用いてウイルス精製のための多量の感染葉を収集した。C. quinoaでの増殖のために接種物をC. quinoaの感染葉からとった際に、局所病変が認められた（図４Ｃ参照）。局所病変の誘発は、接種に用いる汁液中でのウイルス濃度に関連するようであり（感染したC. quinoaの葉にはより多くのウイルス）、これは、同一宿主上での症状の差を説明する。
【０２１０】
ＭａＭＶを次のようにして増幅および精製した。Ｍａｌｖａ neglectaの感染した葉を、サマーランドＢ．Ｃ．周辺の地域で収穫し、ケベックにある発明者らの研究室に送った。Ｍａｌｖａ neglectaの感染した葉を、液体窒素中乳鉢／乳棒で粉砕して、葉の粉末を得た。粉末は水中に再懸濁させて、増殖宿主のChenopodium quinoa上に、葉をカーボランダムでこすることにより接種した。葉は、接種２〜３週間後に感染症状を示した（すなわち、感染した葉の上の、モザイクおよび葉脈透明化）。感染した葉を、１０ｍＭのＥＤＴＡおよび０．１％の重炭酸ナトリウムを含有する１００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．６に均質化した。ホモジェネートを、チーズクロス（粗い綿布）の層を通してフィルタリングし、７，８００ｇで２０分間遠心分離した。TritonX-100および２％のブタノールを１滴ずつ上清に加え、氷上で６０分間撹拌した。溶液を７，８００ｇで２０分間遠心分離した。次に上清を１００，０００ｇで９０分間超遠心分離し、得られたペレットを１００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．６に再懸濁させた。ペレットを、Dyna-Mixホモジナイザー（Fisher Scientific、セッティング２）で均質化し、次に７，８００ｇで５分間、再度遠心分離した。ウイルスは上清から、１００，０００ｇで３時間の超遠心分離により、３０％のスクロースクッション上にペレット化し、これを再度、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０中にDyna-Mixホモジナイザーにより再懸濁させた。ウイルス溶液を、７，８００ｇで５分間の最後の遠心分離により清浄にし、最後に０．４５μＭシリンジフィルターユニット（Nalgene）を通した。精製ウイルスは、電子顕微鏡法またはウイルスＲＮＡ抽出用に用いるまで、４℃で保存した。
【０２１１】
ウイルスＲＮＡを、ウイルス溶液から、フェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈殿により抽出した。プロテイナーゼＫ処理を用いて、任意の残留タンパク質をＲＮＡから取り除いた。ＲＮＡは、必要となるまで−２０℃で保存した。
【０２１２】
ウイルスの電子顕微鏡分析には、精製ウイルス粒子をホルムバール／炭素被覆カッパーグリッド上に載せ、１％タングステン酸メチルアミンで染色した。試料は、ＪＥＯＬ透過電子顕微鏡で分析した。感染したC. quinoaの葉から得た精製ウイルスの電子顕微鏡分析により、ウイルスが約５４０×１３ｎｍの柔軟な繊維状ビリオンであることが示され（図４、バーは５０ｎｍを表す）、これはポテックスウイルス科のメンバーに典型的である（Adams et al., 2004. Arch. Virol. 149, 1045-1060）。
【０２１３】
例２：Ｍａｌｖａモザイクウイルスのクローニングおよび配列決定
ＭａＭＶをさらなる試験のために、以下のようにしてクローニングおよび配列決定した。
【０２１４】
第１のｃＤＮＡ鎖を、例１に記載のようにして調製したＭａＭＶ ＲＮＡから、Supercsript（登録商標）のＲＴ−ＰＣＲ（Invitrogen）用の第１鎖合成システムを製造業者の指示に従って用いて、ランダムヘキサヌクレオチドまたはポリ−ｄＴプライマーで合成した。次に、ターミナルトランスフェラーゼ（New England Biolabs）を製造業者の指示に従って用いて、ｃＤＮＡの３’末端おいてポリデオキシシチジン尾を添加する前に未使用のプライマーを取り除くため、ｃＤＮＡをＰＣＲ精製キットカラム（QIAGEN）を通した。Ａｓｃ ＩまたはＰａｃ Ｉ制限部位でタグしたポリデオキシグアノシンプライマーをｃＤＮＡにハイブリダイズして、製造業者の指示に従って大腸菌ＤＮＡポリメラーゼクレノウ断片（New England Biolabs）を用いて、第２鎖を合成した。得られた二本鎖ＤＮＡを、フェノール／クロロホルムおよびエタノール沈殿により精製し、次に製造業者の記載に従ってＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ（New England Biolabs）で処理して、平滑末端を作製した。平滑末端ＤＮＡを適切な制限酵素で消化して、次にｐＮＥＢ１９３ベクター（New England Biolabs）中１６℃で一晩、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（New England Biolabs）にライゲーションした。ライゲーション反応を大腸菌ＤＨ５α中に転換し、形質転換細胞をＬＢ寒天プレート上アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を用いて増殖させた。抵抗性コロニーからのプラスミドＤＮＡをQIAprep spin miniprepキット（QIAGEN）を用いて抽出し、次にABI 3730XLシーケンサーで配列決定した。ＭａＭＶゲノム配列の３つのオーバーラッピング断片を含有するクローンを得た；１つはＣＰおよび３つの遺伝子ブロックを含み、１つは複製の残りを含み、いくつかのクローンはＭａＭＶの５’末端を含む（図６Ａ参照）。ＭａＭＶゲノムに対応する得られたＤＮＡ配列を、図１（配列番号１）に示す。
【０２１５】
例３：Ｍａｌｖａモザイクウイルスの５’末端の同定
ＭａＭＶの５’末端配列は、次のようにして同定した。ゲノムＲＮＡ（例１のようにして調製）を最初に、５０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ６．０、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のβ−メルカプトエタノールおよび０．０１％のトリトンＸ−１００中の２Ｕのタバコ酸性ピロホスファターゼ（Epicentre Biotechnologies）により、３７℃で６０分間処理して、５’キャップ構造を取り除いた。反応は、フェノール−クロロホルム抽出（０．５ｖｏｌ．／０．５ｖｏｌ）により停止させ、ＲＮＡを、上記のように逆転写する前に、ただしプライマー００２３−１１を用いて、エタノール沈殿した；このプライマーは、ゲノムＲＮＡの４９８〜５２０位置においてハイブリダイズする（5'-ACATGTAAGCTAAACTAGTGTC-S'、配列番号１７）。オリゴヌクレオチドＥＭＳＡ１（5'-GTGATAAAGTTATGACCATAACCTATGTCGTAGGATATGCATTAACTAAT-3'、配列番号１８）を、次にｃＤＮＡの３’末端に、２０ＵのＲＮＡリガーゼを用いて製造業者記載の条件下で（New England Biolabs）加えた。第２鎖を次に、キット「Expand High Fidelity PCR System」を製造業者の記載に従って用いて（Roche Diagnostics）、プライマー００２３−１１およびＥＭＳＡ２（5'- ATTAGTTAATGCATATCCTACGACATAGGTTATGGTCATAACTTTATCAC-3'、配列番号１９）の存在下で、合成して増幅した；これはＥＭＳＡ１に相補的である。ＤＮＡを９４℃で２分間変性させ、次に３３周期（９４℃で４５秒間、６０℃で４５秒間、および７２℃で６０秒間）のＰＣＲにより増幅した。増幅産物は、TOPO TAクローニングキット（Invitrogen）を用いて、ベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ中に直接クローニングした。ライゲーション産物を大腸菌ＤＨ５α内に形質転換して増幅し、プラスミドＤＮＡを例２に記載のようにして抽出および配列決定した。いくつかのクローンを正確に配列決定して、ＭａＭＶゲノムの５’末端を正確に評価した。
【０２１６】
ＭａＭＶゲノムの５’末端の配列の分析により、以下が決定された。５’非翻訳領域（ＵＴＲ）は８１ヌクレオチドのＡＣに富んだドメインであり、これは、安定性の弱い２つの推定ステムループがそれぞれヌクレオチド２６〜３６および４８〜７８に存在することを除いて、ほとんどが非構造化されている。ほとんどのポテックスウイルスと同様に、逆転写の前にタバコ酸性ピロホスファターゼ（ＴＡＰ）で処理したＲＮＡに観察される優勢な５’末端モチーフは、コンセンサスモチーフGAAAAである（１６のうちの１０の配列）（図５）。図５は、逆転写反応の前に、タバコ酸性ピロホスファターゼで未処理（−ＴＡＰ）および前処理（＋ＴＡＰ）されたＲＮＡについて得られた配列を、それぞれ上の図および下の図に示す。バーは、配列決定された全クローンにおいて見出された各配列の頻度を表す。図５でわかるように、タバコ酸性ピロホスファターゼ処理を省略した場合、優勢なモチーフは、ScaVX、CymMVおよびAIsVXにおいて観察されように、GGAAAAであった（１７配列中、１０）（Wong et al., 1997. Arch. Virol. 142, 383-391；Kim et al., 1998. Mol. Cell. 8, 181-188；Chen et al., 2002. Arch Virol. 147, 683-693；Fuji et al., 2005. Arch Virol. 150, 2377-2385.）。最後のケースの場合、コンセンサスGAAAA配列は２回のみ観察された。この差異は、ほとんどの逆転写酵素がターミナルトランスフェラーゼおよびテンプレートスイッチ活性を有することにより、部分的に説明可能である。Superscript IIは、これがキャップ終端を有するin vitroで転写されたＲＮＡで、製造業者が推奨するバッファー条件を用いて試験された場合に、選好的に１つの追加のシトシン残基をｃＤＮＡの３’末端に付加することが示されている（Schmidt et Mueller, 1999. Nucleic Acids Res. 27, e31）。Schmidtはまた、逆転写酵素によるｄＣＭＰテーリングが、５’−ＯＨ ＲＮＡと比べた場合に、キャップされたＲＮＡテンプレートで１０倍も効率的であることを観察した。この観察は、本明細書で観察された結果を説明できる可能性があり、その理由は、ｃＤＮＡの３’末端に付加したシトシン残基は、ＲＮＡの５’末端において余分なグアノシンとして読み取られ得るからである。未処理のＲＮＡで観察されたこの追加のＧ残基は、事実、前に記載した逆転写酵素のターミナルトランスフェラーゼ活性のために人工的（artefactual）であり、そのため、ゲノムＲＮＡの５’末端において見出される正しいモチーフを正確に提示しない。したがって、ＴＡＰ処理したＲＮＡで得られた結果は、宿主中に見出されるＭａＭＶの天然の集団についてのゲノム配列をより正確に反映すると考えられる。
【０２１７】
興味深いことには、５’末端のGGAAAAモチーフは、いくつかのポテックスウイルス、例えばＡＩｓＶＸ、ＬＶＸ、ＳｃａＶＸなどに見出されている。これらのウイルスが、in vivoでこの特異なGGAAAA配列を示す可能性は完全には排除できないが、上記の結果は、かかるモチーフの発見が用いたプロトコルに結びついており、宿主中に見出されるゲノム集団を正確に表しているわけではなく、コンセンサスGAAAAモチーフは、ポテックスウイルス属に一般に広がっている特長となり得ることを示唆している。
【０２１８】
例４：Ｍａｌｖａモザイクウイルスの、配列解析、系統発生解析、およびゲノム構成による特徴づけ
ＭａＭＶを以下のようにさらに特徴付ける。
【０２１９】
配列解析
例２に記載のようにして得たＭａＭＶ配列をスクリーニングし、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のＢＬＡＳＴｎデータベースと比較した（Altschul et al., 1997. Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402.）。ウイルス配列を、Contig Assembly Program（ＣＡＰ）ソフトウェア（Huang, 1992. Genomics. 14, 18-25）を用いて解析およびアセンブルした。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を、ＮＣＢＩのＯＲＦファインダーで同定した。同一性／類似性分析をWisconsin（ＧＣＧ）パッケージversion 10.3からのプログラムＧＡＰにより、アミノ酸比較について８個のギャップ創造（creation）ペナルティー、および２個のギャップ延長（extension）ペナルティーを用いて行った（Anon, 2001. Wisconsin Package version 10.3. Accelrys Inc., San Diego, Ca, USA）。レプリカーゼ、ＴＧＢ１および種々のポテックスウイルス株からのカプシドタンパク質のアミノ酸配列を決定し、Clustal Wソフトウェア（version 1.83）により生成した複数のアラインメント内に入れて、SeqLabアプリケーション（Wisconsin package version 10.3; Accelrys）の最終目視検査を通して修正した。
【０２２０】
ポリ（Ａ）尾を除き、ＭａＭＶゲノムＲＮＡは、ＧＣ含量４５％の６８５８個のヌクレオチド（ｎｔ）長である（GenBankアクセッション番号DQ660333）。ゲノム構成は他のポテックスウイルスに類似しており、推定のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）、続いてＴＧＢタンパク質をコードする３つのオーバーラッピング遺伝子、および最後に外被タンパク質を含む（図６Ａ；レプリカーゼは白の四角で表し、３つの遺伝子ブロックタンパク質は薄い灰色の四角で、および外被タンパク質は濃い灰色の四角で表す。黒丸および菱形は、それぞれＴＧＢ１およびＣＰｓｇプロモーターを示す（略号：ＭＴ：メチルトランスフェラーゼ；ＡｌｋＢ：ＤＮＡ／ＲＮＡ修復ドメイン；ＨＥＬ：ヘリカーゼ；ＰＯＬ：ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ；ＣＰ：外被タンパク質））。レプリカーゼについて示唆されたＡＵＧ開始コドンはヌクレオチド８１〜８３に位置し、この部位からの翻訳により、１７７．９６ｋＤａの計算分子量に対して１５７１アミノ酸（ａａ）のタンパク質を産生する。ＯＲＦ１由来のＭａＭＶレプリカーゼは、少なくとも３つの異なるドメインから構成され（図６Ａ）、これらは、Ｎ末端メチルトランスフェラーゼ様ドメイン（ａａ３１〜３９０）、ＮＴＰ結合／ヘリカーゼ様ドメイン（ａａ８２４〜１０５９）、およびＣ末端ＲｄＲｐ２ドメイン（ａａ１１３７〜１５３５）である。これらのドメインは通常良好に保存され、すべてのポテックスウイルスのレプリカーゼ内で提示されている（Rozanov et al., 1992. J. Gen. Virol. 73, 2129-2134；Koonin and Dolja, 1993. Crit. Rev. Biochem. MoI. Biol. 28, 375-430；Longstaff et al., 1993. EMBOJ. 12, 379-386；Davenport and Baulcombe, 1997. J. Gen. Virol. 78, 1247-1251；Batten et al., 2003. Molecular Plant Pathology. 4, 125-131.）。この解析はまた、ＤＮＡ修復タンパク質ＡｌｋＢと相同性を共有するドメインの存在を強調する。主としてFlexiviridae科からのいくつかの他の植物ＲＮＡウイルスも、これらのレプリカーゼ内に類似のモチーフを有する（Aravind and Koonin, 2001. Genome Biology. 2, research0007.1-0007.8；Bratlie and Drablos, 2005. BMC Genomics. 6, 1-15）。図６Ａに示すように、ＭａＭＶのアミノ酸配列とゲノム構成は、他のポテックスウイルスで見出されるものと類似している。
【０２２１】
次の３つのＯＲＦは、ポテックスウイルスＴＧＢと類似性を示すオーバーラッピング遺伝子であり、これはウイルス移動に関与する（Beck et al., 1991. Virology. 183, 695-702；Batten et al., 2003.上記；Morozov and Solovyev, 2003. J. Gen. Virol. 84, 1351-1366）。ＴＧＢ１（ＯＲＦ２）は、低下した分子量２６．３ｋＤａの２３５ａａタンパク質である。これは、非常に高い含量のロイシンと荷電された残基（それぞれ１３．２％および２１．７％）を有する。これは、全てのポテックスウイルス中最も酸性のＴＧＢ１であり、等電点（ｐＩ）は４．８４である。この配列は、典型的なＮＴＰアーゼ／ヘリカーゼドメインを有し、これのin vitroでのＰＶＸおよび２つのホルデイウイルス（hordeivirus）ＴＧＢ１タンパク質に対する活性が実証されている（Kalinina, N.O., et al, (2002) Virology 296(2):321-9）。ＴＧＢ１は、ＲＮＡスライシングの阻害において役割を果たし得ることも示唆されている。ＴＧＢ２タンパク質（ＯＲＦ３）は、１３ｋＤａの計算分子量に対して１１９ａａ長であり、その理論的ｐＩは９．４２で、一方ＯＲＦ４またはＴＧＢ３は、中性ｐＩの８４ａａの短いタンパク質（９ｋＤａ）である（図７）。ＰＶＸにおいて、これら最後の２つのタンパク質は膜および細胞壁と会合し、その機能は主としてＴＧＢ１活性を調節することである（Morozov et al., 1991. J. Gen. Virol. 72, 2039-2042；Yang et al., 2000. MoI. Plant-Microbe Interact. 13, 599-605；Morozov and Solovyev, 2003.上記）。ＭａＭＶ ＴＧＢタンパク質の保存された配列および疎水性プロファイルは、他のポテックスウイルスＴＧＢタンパク質のそれらに典型的であり、これらが類似の活性を有し得ることを示唆している。
【０２２２】
ポテックスウイルスのカプシドまたは外被タンパク質（ＣＰ）は、ゲノム保護およびウイルス移動に関与する。ＭａＭＶ ＣＰは、保存された両親媒性コア配列KYAGFDFFDGVT（配列番号２０；ｎｔ６５４５〜６５８１によりコードされる）を含み、これは、疎水性相互作用を介してポテックスウイルスＲＮＡのＣＰへの結合に役割を果たすことが提唱されている（Bancroft et al., 1991. J. Gen. Virol. 72, 2173-2181；Dolja et al., 1991. Virology. 184, 79-86；Wong et al., 1997.上記；Cotillon et al., 2002. Arch. Virol. 147, 2231-2238；Thompson and Jelkmann, 2004. Arch. Virol. 149, 1897-1909；Chen et al., 2005. Arch. Virol. 150, 825-832; Fuji et al., 2005. 上記）。ＭａＭＶ ＣＰは２４３ａａタンパク質であり（図２および配列番号２参照）、推定分子量は２６ｋＤａである。
【０２２３】
ＭａＭＶアミノ酸配列を他のポテックスウイルスと比較し、結果を下の表２にまとめて示す。ＭａＭＶとより緊密に関連するウイルスにはアスタリスク（＊）を付した。ＭａＭＶと最大の相同性を有するタンパク質は太字で示した。略号およびGenBankアクセッション番号は以下である：ＡＩｓＶＸ：NC_007408；ＢａＭＶ：NC_001642；ＣＶＸ：NC_002815；ＣｓＣＭＶ：NC_001658；ＣｌＹＭＶ：NC_001753；ＣｙｍＭＶ：NC_001812；ＦｄＭＶ：NC_001483；ＨｄＲＳＶ：NC_006943；ＬＶＸ：NC_007192；ＭＶＸ；NC_006948；ＮＭＶ：NC_01441；ＯＶＸ：NC_006060；ＰａｐＭＶ：NC_001748；ＰｅｐＭＶ：NC_004067；ＰｌＡＭＶ：NC_003849；ＰＡＭＶ：NC_03632；ＰＶＸ：NC_001455；ＳｃａＶＸ：NC_003400；ＳＭＹＥＶ：NC_003794；ＴＶＸ：NC_04322；ＷＣｌＭＶ：NC_003820；ＺＶＸ：NC_06059。
表２：ＭａＭＶと他のポテックスウイルスのアミノ酸同一性／相同性
【表２】

ａこのタンパク質に対して得られた同一性／相同性の結果は、修正ＮＭＶ外被タンパク質配列を用いて得られた（下記参照）。
【０２２４】
この比較から、ＯＲＦ（レプリカーゼ）はＳｃａＶＸからの相同タンパク質と最大の同一性を有し、一方他の全てのＯＲＦ（ＴＧＢ１、２および３、および外被タンパク質）は、それらのＮＭＶ対応物とより関連することが示された。ＰｅｐＭＶおよびＡｌｓＶＸはまた、ＭａＭＶと、特にレプリカーゼおよびカプシドタンパク質において良好な局所的相同性を示した。しかし、ＡｌｓＶＸおよびＰｅｐＭＶは全体的にはＭａＭＶから遠く離れており、これは主として、それらのそれぞれのＴＧＢタンパク質間の低い相同性による。上で示したように、相同性解析により、最大のアミノ酸同一性スコアが、ＭａＭＶとＳｃａＶＸのレプリカーゼの間（６７．２％）、およびＭａＭＶとＮＭＶのカプシドタンパク質の間（７５．６％）で明らかにされた。これらの値は上記のAdams et al. (2004)が確立した種の分画（species demarcation）の分子分類より低いため、ＭａＭＶは以前に公開されている全てのポテックスウイルスとは異なる種であると考えることができる。
【０２２５】
Ｍａｌｖａ葉脈壊死ポテックスウイルス（ＭＶＮＶ）は、１９９０年にブラジルにおいてＭａｌｖａ parvifloraに感染するウイルスとして報告されており（Brunt et al., (eds.) 1996 onwards. "Plant Viruses Online: Descriptions and Lists from the VIDE Database. Version: 20^th August 1996"）、Ｍａｌｖａ parvifloraには局所病変部と全体の葉脈壊死が検出された。ＭＶＮＶのヌクレオチド配列は現在利用可能ではない。ＭＶＮＶが単離された元の宿主は、ＭａＭＶについての天然の宿主と類似であるが、この２つのウイルスは次の理由により異なっている：ａ）電子顕微鏡で観察されたＭａＭＶ粒子はＭＶＮＶよりも長い、およびｂ）ＭＶＮＶはＭａｌｖａ種に局所的病変を誘発することが示されたが、ＭａＭＶはモザイク症状を誘発する。
【０２２６】
系統発生解析
系統発生解析は、MEGA version 3.1（Kumar et al., 2004. Brief Bioinform. 5(2), 150-163）により距離法（distance method）と隣接結合アルゴリズム（neighbour-joining algorithm）を用いて行った。ツリーの位相幾何的精度は、５００個のブートストラップ複製を用いて評価した。５’および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の構造解析は、プログラムmfold version 3.2（Zuker, 2003. Nucleic Acids Res. 31, 3406-3415）を用いて行った。タンパク質ドメインの多重アラインメントおよびプロファイルは、ケンブリッジのWellcome Trust Sanger Instituteのウェブサイトにあるタンパク質ファミリーのPfamデータベース（version 18）により、デフォルトパラメータを用いて行った（Bateman et al., 2004. Nucleic Acids Res. 32, 138-141）。多重アラインメントは、ＮＭＶ ＣＰ（NC_001441）のＣ末端領域におけるフレームシフトエラーを強調し、これは、このタンパク質の最後の４５のａａが他の任意のポテックスウイルスとまったく関連していないことを示す。したがって、修正ＮＭＶ配列を相同性／系統発生解析に用いた。
【０２２７】
系統発生解析は、ＭａＭＶと他のポテックスウイルスとの間の関係をより正確に試験するために行った。解析は、レプリカーゼおよびカプシドアミノ酸配列のもっとも保存された領域を用いて（図８）、およびＴＧＢ１タンパク質の完全な配列を用いて行った。図８は、ＭａＭＶと他のポテックスウイルスのレプリカーゼおよびカプシドタンパク質の系統発生解析を示す。レプリカーゼおよび外被タンパク質の系統発生ツリーは、それぞれ右と左の図である。数字は、各枝のブートストラップの値（５００複製）を示す。アスタリスクで強調したウイルスは、ＭａＭＶの３’末端非翻訳領域において同定されたものと類似の推定偽結節構造を有する。
【０２２８】
系統発生解析により、ポテックスウイルスに通常検出される保存配列は、ＭａＭＶ内にも見出されることが示された。系統発生解析は、ＭａＭＶが、ＮＭＶ、ＳｃａＶＸ、ＡｌｓＶＸおよびＰｅｐＭＶを含むポテックスウイルスのサブグループに最も緊密に関連するように見えるとの前の観察を支持し、ここでこれらのウイルスの後者２つは、系統発生学的にわずかに遠い位置にある。解析された全てのツリーにおいて、ＭａＭＶ、ＮＭＶおよびＳｃａＶＸは常に一緒のグループにあり、この緊密な関係をここでも支持している。しかし、レプリカーゼおよびカプシドタンパク質に対する、このサブグループ内で観察されてブートストラップの低い値（それぞれお６６％および３９％）は、これら２つのウイルスのどちらに対してＭａＭＶが最も緊密に関係するかについての、明確な結論を引き出すことを許容しなかった。ＴＧＢ１を用いて行った系統発生解析も類似の結果を示し、ＭａＭＶに最も近い親戚についての結論は得られなかった。
【０２２９】
サブゲノムプロモーターおよび保存ＲＮＡプロモーター要素の解析
全ＲＮＡを、健康なC. quinoa植物およびＭａＭＶ感染のC. quinoa植物から次のようにして抽出した。C. quinoaの感染した葉および非感染の葉を収穫し、液体窒素中で粉砕した。全ＲＮＡを、フェノール／クロロホルムを用いて抽出し、ＲＮＡスピンカラム（Qiagen）を用いてさらに精製した。全ＲＮＡの解析を、ノーザンブロッティングにより次のようにして行った：ＲＮＡ（２０μｇ）をホルムアルデヒドアガロースゲル（１％）上で分離し、次にナイロン膜（Amersham Biosciences）に移した。不動化したＲＮＡを、ＰＣＲによりジゴキシゲニン（Roche Diagnostics）で標識したＭａＭＶ外被タンパク質のｃＤＮＡ断片でプローブした。製造業者のプロトコルに従ってハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションシグナルを、化学発光基質CDP-Star（Roche Diagnostics）で可視化した。
【０２３０】
ノーザンブロットにより、３つの主要なウイルスＲＮＡが感染中に産生されることが示された：これらは、１つの大きなゲノムＲＮＡおよび、それぞれ約２０００および８００ヌクレオチドのＲＮＡとして移動している、２つのサブゲノム種である（図６Ｂ）。サブゲノム種は、３重遺伝子ブロックおよびウイルスＣＰ（２００ｎｔ長のＲＮＡ）およびウイルスＣＰのみ（８００ｎｔのＲＮＡ）をコードする、ウイルスサブゲノムＲＮＡに対応するはずである。ＭａＭＶ中のｓｇプロモーターコンセンサス配列の同定は、ＴＧＢとＣＰが、それらの独自のｓｇＲＮＡからin vivoで翻訳されることを強く示唆する。しかし、これらが、ゲノムＲＮＡの内部開始により産生可能であるとの可能性も除外できず、その理由は、このメカニズムが少なくともＰＶＸ ＣＰに対して前に観察されているからである（Hefferon et al., 1997. J. Gen. Virol. 78, 3051-3059）。
【０２３１】
オクタヌクレオチドサブゲノムプロモーター配列は、レプリカーゼとＴＧＢ１遺伝子の間（ｎｔ４８５１〜４８５８）およびＴＧＢ３コード配列の３’末端のｎｔ５９８２〜５９８９の間の遺伝子間領域に見出されている。図６Ｃは、オクタヌクレオチドの推定ｓｇプロモーター配列の配列アラインメントを示す。右と左の図は、それぞれＴＧＢ（黒丸）およびＣＰ（黒の菱形）ｓｇプロモーターコンセンサス配列を示す。コンセンサスオクタヌクレオチド内に高度に保存されたヌクレオチドを、それぞれ黒または灰色の四角で強調する。コンセンサス配列と異なるヌクレオチドは、白字で示す。
【０２３２】
両方のプロモーターは、ほとんどのポテックスウイルスにおいて取り出される正確なコンセンサス配列GTTAAGTTを有する（Skryabin et al., 1988. FEBS. 240, 33-40；Kim and Hemenway, 1997. Virology. 232, 187-197；Batten et al., 2003.上記）。ＰＶＸについて報告されたＴＧＢ２／ＴＧＢ３ｓｇプロモーターコンセンサス配列は、ＴＧＢ１およびＣＰのそれらのようには良好に定義されず、その結果、かかるドメインの正確な同定は、より不明確である（Skryabin et al., 1988.上記）。活性なＴＧＢ２／ＴＧＢ３プロモーターに相関する種に対応するｓｇＲＮＡは、これらの感染植物中に検出されなかった。これらのｓｇＲＮＡ種が存在する場合には、それらはＴＧＢ１およびＣＰのｓｇＲＮＡのように豊富ではない可能性が高い。
【０２３３】
３’ＵＴＲは７０ｎｔ長で、他のポテックスウイルスで同定されたように、ｔＲＮＡ様の二次構造内に畳まれていると推定される（Thompson and Jelkmann, 2004.上記）。３’ＵＴＲはポリアデニル化シグナルAAUAAAをポリアデニル化部位の１４ｎｔ上流に含み、また今日まで配列決定された全てのポテックスウイルス中に存在する保存ヘキサマーACUUAAを含む（ｎｔ６７９９〜６８０４）。両方の配列は、３つのステムループ構造の異なるループ内に局在する（それぞれＳＬ３およびＳＬ１）（図７）。図７は、ＭａＭＶ３’非翻訳領域の二次構造の模式図である。３つのステムループ構造は、ＳＬ１、ＳＬ２およびＳＬ３として同定される。全てのポテックスウイルス中で見出されるコンセンサス配列ACUUAAは、ＳＬ１内の淡い灰色のヌクレオチドにより強調され、一方、ＳＬ３に存在するポリアデニル化シグナルは濃い灰色で示す。プログラムmfoldにより得た二次構造は、挿入図内に示す。ＳＬ１とＳＬ２の間の新規な推定偽結節は、点線により示す。クエスチョンマーク（？）は、偽結節が推定のものであり、溶液中のこの構造の畳み込みはまだ決定されていないことを示す。
【０２３４】
この解析により、ＳＬ１とＳＬ２のループに存在するヌクレオチド間の５塩基対の偽結節が明らかにされた。類似の構造が前にＰＶＸについて記載されたが、この場合、相補的領域は、サブゲノムプロモーターからのヌクレオチドとＳＬ１のACUUAA保存配列の間であった（Kim and Hemenway, 1997.上記）。他のポテックスウイルスの３’末端の解析は、類似の偽結節がいくつかの他のウイルス、例えばＮＭＶ、ＣｙｍＭＶ、ＳｃａＶＸ、およびＰｅｐＭＶに検出できることを示した。しかし、後者２つのウイルスにおいて偽結節を形成する相補的配列は、わずか４ヌクレオチド長である。
【０２３５】
例５：Ｍａｌｖａモザイクウイルス外被タンパク質の産生、精製および大腸菌への自己集合
完全なＭａＭＶ外被タンパク質遺伝子を、ゲノムＲＮＡの３’末端全体を包含するシーケンシングプラスミド（ＣＰおよび３重遺伝子ブロックをコードする配列を含有；例２参照）から、ＰＣＲにて、フォワードプライマー（5'-GGTACATGTCGAACTCTGGTTCAGCCG-3'、配列番号２１）およびリバースプライマー（5'-TACGGATCCTCAATGGTGATGGTGATGGTGGAATTCTGGGGGGGCTTCAA TGG-3'、配列番号２２）を用いて増幅した。フォワードプライマーはＡｆ１ ＩＩＩ制限部位（下線部）を含み、これはＰＣＲ産物をｐＥＴ−３Ｄ発現ベクター内にクローニングするための開始コドンを含み、一方、リバースプライマーは、６Ｘ−Ｈｉｓタグ（下線部）をＣＰ遺伝子の３’末端に付加して、ニッケル親和性カラム上でのさらなるタンパク質の精製を可能とする。ＰＣＲ反応は、次のように行った： Expand（登録商標）High FidelityＰＣＲシステム（Roche Diagnostics）を用い、製造業者推奨の標準条件化において、９４℃で３分間の前インキュベーションの後、９４℃で４５秒、６５℃で４５秒、および７２℃で６０秒を３３サイクル。ＰＣＲ産物はＡｆ１ ＩＩＩ／Ｂａｍ Ｈ１制限酵素で消化して、次にｐＥＴ−３Ｄ適合のＮｃｏ Ｉ／Ｂａｍ Ｈ１制限部位にライゲーションした。ライゲーション産物は、大腸菌ＤＨ５α中に転換して増幅し、例２に記載のようにして、プラスミドＤＮＡを抽出および配列決定した。
【０２３６】
ＣＰ遺伝子（ｐＭａＭＶ−ＣＰ−６Ｈ）を含有することが同定されたプラスミドを用いて、大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＩＬ細胞（Invitrogen）を形質転換した。形質転換細胞を２Ｘ ＹＴ寒天プレート上に５０μｇ／ｍｌのアンピシリンとともに広げて、３７℃で一晩インキュベートした。培養培地（２Ｘ ＹＴ、５０μｇ／ｍｌのアンピシリン）に、約１０個の単離したコロニーの前培養物を播種し、ＯＤが０．６〜０．８となるまで増殖させた。タンパク質の発現を、ＩＰＴＧ（Promega）を最終濃度１ｍＭまで添加して誘発し、培養物を２２℃で１６時間、２２５ＲＰＭで振とうしつつインキュベートした。次に細胞を遠心分離し、溶解緩衝液中（５０ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ８．０）に２０μＭのＰＭＳＦ（EM Science）、１Ｘのプロテアーゼカクテル阻害剤（Roche）および１ｍｇ／ｍｌのリソザイム（Sigma）の存在下で再懸濁させ、その後氷上でSonic Dismembrator model 500超音波処理器（Fisher Scientific）で超音波処理した。タンパク質溶液を遠心分離し、上清を、２．５ｍｌのニッケル−ＮＴＡアガロースビーズの存在下で４℃で３時間インキュベートし、次に溶出カラム内（Bio Rad）に注いだ。ビーズはそれぞれ２５ｍｌの次の緩衝液で洗浄した：洗浄緩衝液１（５０ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４、３００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ８．０）、洗浄緩衝液２（５０ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４、３００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ８．０）、および洗浄緩衝液３（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、５０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ８．０）。ビーズを次に、溶出緩衝液（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１Ｍのイミダゾール、ｐＨ８．０）の存在下で３０分間インキュベートして、タンパク質を溶出した。得られた溶出タンパク質を、上記のように１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび電子顕微鏡法で解析し、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の形成をチェックした。
【０２３７】
タンパク質抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を用いて、３４〜３５ｋＤａの優勢な形態を検出した（図９Ａ；レーン１：タンパク質分子量マーカー。分子量マーカーは左側にｋＤａで示す；レーン２：大腸菌内に産生された精製外被タンパク質；レーン３:感染植物からの精製ＭａＭＶから単離された外被タンパク質）。外被タンパク質の、ポリアクリルアミドゲル上での移動性は、他のポテックスウイルス外被タンパク質と整合する（Tremblay et al, 2006. FEBS. 273, 14-25；Hu and Ghabrial 1995, J. Virol. Meth. 55, 367-379；Hammond and Hull, 1981. J. Gen. Virol. 54, 75- 90）。大腸菌内に産生されたＭａＭＶ ＣＰの分子量は、野生型タンパク質を比べてわずかに異なるが、これは追加の６Ｘ−Ｈｉｓタグにより説明可能である（図９Ａ）。
【０２３８】
最後に、精製された組換えタンパク質を電子顕微鏡法で観察し、これにより、ＭａＭＶ ＣＰの過剰発現が、大腸菌の外被タンパク質の、天然ウイルスと非常によく似たウイルス様粒子への自己集合をもたらすことが確認された（図９Ｂ参照、この図は、精製組換えタンパク質ＭａＭＶ ＣＰから作られたウイルス様粒子の電子顕微鏡写真である（バーは５０ｎｍの長さ））。
【０２３９】
プラスミドｐＭａＭＶ−ＣＰ−６Ｈに含有される、ＭａＭＶ外被タンパク質遺伝子のヌクレオチド長を、図１０（配列番号２３）に示し、コードされた外被タンパク質のアミノ酸配列を図１１（配列番号２４）に示す。
【０２４０】
例６：精製組換えＭａｌｖａモザイクウイルス外被タンパク質のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析による解析
例５からの精製組換え外被タンパク質を、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析（Eastern Quebec Proteomics Centre, Centre Hospitalier de l'Universite Laval, Quebec）により解析した。試料は凍結乾燥し、その後還元し、５０ｍＭの重炭酸アンモニウム緩衝液中の４５ｍＭのジチオトレイトールおよび１００ｍＭのヨードアセトアミドでアルキル化した。アセトニトリルに希釈後、トリプシン消化を３７℃で一晩、０．２μｇの配列決定グレードの修飾トリプシン（Promega）を用いて行った。消化は蟻酸を用いて停止させ、２μＬの試料を質量分析計に注入した。ペプチドＭＳ／ＭＳスペクトルを、ナノスプレーインターフェイスを有するＬＴＱ（Thermo-Electron, San Jose, CA, USA）四重極ＩＴ質量分析計と連結した、キャピラリー液体クロマトグラフィにより得た。クロマトグラフィ分離は、PicoFritカラムBioBasic C18、１０ｃｍ×７５μｍ（New Objective, Woburn, MA）上、２〜５０％の線形勾配の溶媒Ｂ（アセトニトリル、０．１％蟻酸）で３０分間、２００ｎＬ／分にて実施した。ペプチドは、カラムを通り直接ＬＴＱ線形イオントラップ質量分析計に溶出したが、この時スプレー電圧は１．８ｋＶ、および移送キャピラリー温度は２２５℃に設定した。質量スペクトルの取得は、Xcalibur 2.0 SR 2ソフトウェア（ThermoElectron Corp）によりデータ依存性取得モードを用いて制御したが、このモードにおいては、各フルスキャン質量スペクトル（４００〜２０００ｍ／ｚ）に続いて、７つの最も激しいイオンの衝突誘発性解離がある。動的排除機能が可能であり、相対的衝突断片化エネルギーは３５％に設定した。
【０２４１】
得られたＭＳ／ＭＳスペクトルは、MASCOT（Matrix Science, London, UK; version 2.2.0）を用いて解釈し、３つの異なるデータベースを探索した：１つは目的のタンパク質を含むもの、Uniref Humanデータバンク、およびUniref大腸菌データベース（version 8.0、それぞれ９４９８５および４０５６７エントリーを含む）。システインのカルバミドメチル化、およびメチオニンの部分的酸化、２つの欠如した開裂、およびペプチドに対して２．０Ｄａおよび断片に対して０．５Ｄａの誤差耐性を、探索において考慮した。Scaffold（version Scaffold-01_06_18, Proteome Software Inc., Portland, OR）を用いて、ＭＳ／ＭＳに基づくペプチドおよびタンパク質の同定を確認した。ペプチドの同定は、それらがPeptide Prophetアルゴリズム（Keller, A et al. 2002; Anal. Chem. 74(20):5383-92）により特定された９０．０％を超える確率で確立された場合に、認定された。タンパク質の同定は、それらが９０．０％を超える確率で確立され、少なくとも２つの同定されたペプチドを含む場合に、認定された。タンパク質の確率は、Peptide Prophetアルゴリズム（Nesvizhskii, A.I., 2003, Anal Chem. 75(17):4646-58）により割り当てられた。類似のペプチドを含み、ＭＳ／ＭＳ解析のみに基づいては識別できなかったタンパク質は、節減の原理（principles of parsimony）を満たすためにグループ化した。
【０２４２】
精製組換えタンパク質のトリプシンによる消化は３０個のペプチドを生成し、これはＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより解析され、全てのペプチドがＭａＭＶ ＣＰ配列に属することを確認した。ＭａＭＶ ＣＰは、２５，９６１．２Ｄａの分子量を有する。生成された３０個のペプチドは、ＭａＭＶタンパク質の予測された断片に１００％対応する質量を有した。ペプチドは、ＭａＭＶ ＣＰのアミノ酸配列の９３％をカバーし、精製され大腸菌に過剰発現されたタンパク質の同一性を確認した。表３は、トリプシン消化により生成されたＭａＭＶ外被タンパク質ペプチドのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析を示す（配列番号２５〜５３）。
表３：ＭａＭＶ外被タンパク質ペプチドのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析
【表３】

【０２４３】
例７：ＭａｌｖａモザイクウイルスＶＬＰの免疫原性効果
ＭａＭＶ外被タンパク質遺伝子を、大腸菌ＢＬ２１（ｐＬｙｓＳ）中に、プラスミドｐＭａＭＶ−ＣＰ−６Ｈから次のようにして発現させた：ｐＭａＭＶ−ＣＰ−６Ｈを含有する大腸菌ＢＬ２１（ｐＬｙｓＳ）の培養物１Ｌを調製し、コードされた外被タンパク質の発現を、１ｍＭのＩＰＴＧにより誘発した。発現は、２５℃でＯ／Ｎに進むことを可能とした。細胞を収穫し、フレンチプレスを７５０ｐｓｉ（溶解緩衝液：５０ｍＭのＮａＰ緩衝液、ｐＨ８、２０ｍＭのイミダゾールおよび３００ｍＭのＮａＣｌ）で用いて細胞溶解した。砕片を１０，０００ｇでの遠心分離を２回、それぞれ４５分間および３０分間行って除去し、上清を保持した。１２ｍｌのＮｉ^２＋ビーズ（Qiagen）を１Ｌの細菌培養物中に加え、バッチＯ／Ｎで４℃にてゆっくり振とうしつつインキュベートした。結合タンパク質を含有するビーズをエコノカラム（econo-column）に入れ、以下により洗浄した：（ａ）５０ｍｌの洗浄緩衝液（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８＋５０ｍＭのイミダゾール）、続いて（ｂ）５０ｍｌの洗浄緩衝液＋０．５％のTriton X-100、（ｃ）５０ｍｌの洗浄緩衝液、（ｄ）５０ｍｌの洗浄緩衝液＋１％のZwittergen、および（ｅ）５０ｍｌの洗浄緩衝液。タンパク質を次に１Ｍのイミダゾールで溶出した。
【０２４４】
溶出したタンパク質は、３Ｌの１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８に対して１時間透析した。緩衝液を新鮮なものに交換し、透析をさらに１時間続けた。緩衝液を最後に交換し、Ｏ／Ｎで透析を継続した。タンパク質を次に、３ＬのＰＢＳに対して、２０分間隔で緩衝液を３回変えて透析した。次にＮａＣｌの濃度を５００ｍＭに増加させ、懸濁液を高速（１００，０００ｇ）で３時間遠心分離して、ＶＬＰをペレット化した。
【０２４５】
ＶＬＰペレットを無菌のＰＢＳ中に再懸濁させ、０．４５ミクロンフィルターを通してろ過した。最後に、タンパク質の濃度を１ｍｇ／ｍｌに調節した。ＶＬＰの存在を電子顕微鏡を用いて確認し、任意のＬＰＳ混入物の存在を、Limulus試験を用いて決定した。
【０２４６】
ＭａＭＶ ＶＬＰの免疫原性および免疫反応を引き出す能力を、標準のプロトコルに従ってマウスにおいて試験した。簡潔に述べると、５匹のＢａｌｂ／Ｃマウスに対し、０日目に１００μｇのＭａＭＶ ＶＬＰ（アジュバントなし）を注射した。血液試料を免疫化後５、１０および１４日目に採取した。血清中に存在するＶＬＰに指向されたＩｇＧの総量、ＩｇＧ１の量、およびＩｇＧ２ａの量を、標準のＥＬＩＳＡにより測定した（図１２Ａ〜Ｃ参照）。
【０２４７】
同じマウスを、４０日目に、１００μｇのＭａＭＶ ＶＬＰでｓ．ｃ．にてアジュバントなしで２度目に免疫化した。血清中に存在するＶＬＰに指向されたＩｇＧの総量、ＩｇＧ１の量、およびＩｇＧ２ａの量を、再度、標準のＥＬＩＳＡにより測定した（図１２Ｄ〜Ｆ参照）。
【０２４８】
結果は、ＩｇＧおよびＩｇＧ１の高いレベルを示し、これは、ＭａＭＶ ＶＬＰが高度に免疫原性であり、効率的な抗体反応を引き起こし得ることを示す。さらに、ＩｇＧ２ａの存在は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞の活性化および抗体クラススイッチの効率的な誘発を示唆する。この結果は、バランスの取れたＴＨ１およびＴＨ２反応が誘発されることを示唆する。
【０２４９】
例８：腸チフス菌ポリンタンパク質の精製
以下の精製手順を用いて、ＭａＭＶまたはＭａＭＶ ＶＬＰと併用して抗原として用いるのに好適な、腸チフス菌ＯｍｐＣおよびＯｍｐＦタンパク質を精製した。精製手順は、Secundino et al. (2006), Immunology 117:59の記載に基づく。
【０２５０】
２種のタンパク質を腸チフス菌から共精製した。ＯｍｐＣおよびＯｍｐＦの個別の精製は、ＯｍｐＣ［ＳＴＹＣ１７１（ＯｍｐＣ）］またはＯｍｐＦ［ＳＴＹＦ３０２（ＯｍｐＦ）］のオープンリーディングフレームのいずれかが分断されている、腸チフス菌のノックアウト変異体を用いて行った。共精製については、細菌のノックアウト変異形態からの個別のタンパク質の精製法に従った。この方法を以下に概説する。
【０２５１】
細菌株Salmonella typhi 9, 12, Vi:d（ＡＴＣＣ９９９３）を、酵母抽出物、マグネシウム、およびグルコースを補足した最少培地Ａの中で３７℃、２００ｒｐｍで増殖させた。酵母抽出物、マグネシウム、およびグルコースを補足した１０Ｌの最少培地Ａの処方は、以下のとおりである：５．０ｇの無水Ｎａ−クエン酸塩（ＮａＣ_６Ｈ_５Ｏ_７：２Ｈ_２Ｏ）、３１．０ｇの一塩基性ＮａＰＯ_４（Ｎａ_２Ｈ_２ＰＯ_４）、７０．０ｇの二塩基性ＮａＰＯ_４（Ｎａ_２ＨＰＯ_４）、１０．０ｇの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、２００ｍＬの酵母抽出物溶液５％（３００ｍＬ中１５．０ｇ）。１．４３４Ｌの培地を４Ｌエルレンマイヤーフラスコに分散させた。滅菌を、１２１℃、１平方インチ当たり１５ｌｂの加圧で１５分間行った。次に各フラスコに以下を加えた：６．０ｍＬの無菌ＭｇＳＯ_４溶液２５％、および６０．０ｍＬのグルコース溶液１２．５％。フラスコに腸チフス菌の一晩培養物を播種し、ＯＤ_５４０が１．０に達した時にインキュベーションを停止し、培養物を７，５００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心分離した。ペレットを１００ｍＬの最終容量のトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．７（６．０ｇのトリス−塩基／Ｌ）に再懸濁させ、バイオマス（生物量）を氷上で９０分間超音波処理し、次に７，５００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離した。１０ｍＬの上清の各々に、２．７７ｍＬの１ＭのＭｇＣｌ_２、２５ｍＬのＲＮアーゼＡ（１０，０００Ｕ／ｍｌ）、２５ｍｌのＤＮアーゼＡ（１０，０００Ｕ／ｍｌ）を加えた。混合物を次に１２０ｒｐｍ、３７℃で３０分間遠心分離した。
【０２５２】
混合物からのポリン抽出は、次のようにして行った：
１．超遠心分離を、４５，０００ｒｐｍ、４℃で４５分間行い、ペレットを保持した。
２．ペレットを１０ｍＬの２％トリス−ＨＣｌ−ＳＤＳに再懸濁させ、均質化した。
３．インキュベーションを、１２０ｒｐｍ、３２℃で３０分間行った。
４．超遠心分離を、４０，０００ｒｐｍ、２０℃で３０分間行い、ペレットを保持した。
５．ペレットを５ｍＬの２％トリス−ＨＣｌ−ＳＤＳに再懸濁させ、均質化した。
６．インキュベーションを、１２０ｒｐｍ、３２℃で３０分間行った。
７．超遠心分離を、４０，０００ｒｐｍ、２０℃で３０分間行い、ペレットを保持した。
８．ペレットを２０ｍＬのNikaido緩衝液−１％ＳＤＳに再懸濁させ、均質化した。［１ＬのNikaido緩衝液に対して：６．０ｇのトリス−塩基、１０．０ｇのＳＤＳ、２３．４ｇのＮａＣｌ、１．９ｇのＥＤＴＡを水に溶解し、ｐＨを７．７に調整した。次に０．５ｍＬのβ−メルカプトエタノール溶液を加えた］。
９．混合物を１２０ｒｐｍ、３７℃で１２０分間インキュベートした。
１０．超遠心分離を、４０，０００ｒｐｍ、２０℃で４５分間行った。ポリン抽出物を含む上清を回収した。
【０２５３】
ポリンを上清から高速タンパク質液体クロマトグラフィ（ＦＰＬＣ）で精製した。β−メルカプトエタノール非含有の０．５ＸNikaido緩衝液（上記参照）を、精製過程中用いた。タンパク質をSephacryl S-200（FPLC WATERS 650E）を用いて１０ｍＬ／分のフラックス速度で分離した。カラムに２２ｍＬの上清を負荷した。溶出断片を２６０ｎｍおよび２８０ｎｍでモニタリングした。精製ポリンを含有する主ピークを保持し、４℃で保管した。精製ポリンは長期間安定であった（１年間以上）。
【０２５４】
図１３は、上記の方法で精製したポリン、ＯｍｐＣおよびＯｍｐＦのＳＤＳ−ＰＡＧＥプロファイルを示す。
【０２５５】
例９：腸チフス菌ポリンのＭａｌｖａモザイクウイルスＶＬＰへの付着に好適な親和性ペプチドの産生
精製ＯｍｐＣおよびＯｍｐＦに対する特異的ペプチドを、Ph.D-7 Phage Display Peptide Library Kit（New England Biolabs, Inc.）を用いて選択した。用いたプロトコルは、「パニング」として知られているin vitro選択法であり、これは製造業者のプロトコルに従って行った。簡潔に述べると、２×１０^１１個のファージを、ＥＬＩＳＡプレートのウェルのベースに結合した１０μｇの精製ＯｍｐＣまたはＯｍｐＦに加え、ウェルの内容物を室温で１時間ゆっくり混合した。非結合ファージを１ｍｌの２００ｍＭのグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．２）で、室温で１０分間インキュベートすることにより溶出した。上清を中和するために、およびファージを殺さないために、１５０μｌの１Ｍのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．１）を加えた。溶出したファージを次に増幅し、追加の結合／増幅サイクルに供して、結合配列に利するようにプールを豊富化させた。洗浄緩衝液は、パニングの第１ラウンド用に０．１％のTween 20を含有し、これは次のラウンド用に０．５％に増加させた。選択したファージを大腸菌ＥＲ２７３８中、各パニングのラウンドの間増幅させた。このサイクルを３回繰り返して、それぞれのポリンタンパク質に対して最高の親和性のペプチドを選択した。こうして同定したペプチドを表４に示す。
表４：ＯｍｐＣおよびＯｍｐＦ親和性ペプチドの配列および出現頻度
【表４】

【０２５６】
上で同定された親和性ペプチドをＭａＭＶ外被タンパク質のＣ末端に、例えばＰＣＲにより導入することができ、得られた融合タンパク質を大腸菌に発現させて、融合タンパク質からのＶＬＰを産生する。ＶＬＰを次に、溶液中でそれらの同族ポリンと、例えば１：１の比率で混合することができ、ＶＬＰおよびポリンを含む複合体を提供する。この複合体はそれのみか、または追加のポリンと組み合わせて、続いて腸チフス菌のチャレンジに対してマウスを免疫化するのに用いることができる。
【０２５７】
例１０：市販ワクチン上でのＭａｌｖａモザイクウイルスのアジュバント効果
配列番号２４に記載の配列（図１１Ａ参照）を有する組換えＭａＭＶ ＣＰを、大腸菌に２２℃で１６〜２２時間過剰発現させた。細菌をフレンチプレスを用いて溶解し、試料を遠心分離して砕片を取り除き、親和性精製のためにＮｉ^２＋カラム上に負荷した。親和性クロマトグラフィにより精製した外被タンパク質を図１５Ａに示す。これらのＣＰから形成されたＶＬＰは異なる長さを有するが、しかしＷＴウイルスに類似しており（図１５Ｂ）、全てのタンパク質が高分子量形態（５００ｋＤａを超えるＶＬＰ）で見出されるSuperdex 200ゲルろ過からは除外したが、これは、単量体または低い多重形態（５００ｋＤａ未満）の形態が検出されなかったからである（図１５Ｃ）。ＭａＭＶ ＶＬＰ調製物中のＬＰＳレベルを、２４．０ＥＵ／ｍｇにおいて評価した。続く免疫化において（下記参照）、３または３０μｇのＶＬＰを用いたが、これらの量に対してＬＰＳ汚染は無視できると考えられる。
【０２５８】
ＭａＭＶ ＶＬＰのアジュバント特性を測定するために、３価のインフルエンザワクチンFluviral（登録商標）（GlaxoSmithKline）をモデル系として用いた。ヒト用量の５分の１のFluviral（登録商標）を、３μｇまたは３０μｇのどちらかのＭａＭＶ ＶＬＰで、または従来のアジュバントであるミョウバンで、アジュバント化し、皮下的にＢａｌｂ／Ｃマウス（１群あたり５匹）に投与した。免疫化後１４日目に出血させ、Fluviral（登録商標）または精製したインフルエンザＮＰ（インフルエンザＷＳＮ／３３のヌクレオカプシド）タンパク質への免疫反応をＥＬＩＳＡにより実施した。Fluviral（登録商標）に対する総ＩｇＧ（図１６Ａ）、ＩｇＧ１（図１６Ｂ）、ＩｇＧ２ａ（図１６Ｃ）を測定した。ＮＰに対するＩｇＧ２ａも測定した（図１６Ｄ）。
【０２５９】
図１６に示す結果は、３０μｇのＭａＭＶ ＶＬＰが、Fluviral（登録商標）に対する免疫反応を大幅に改善できることを示す。総ＩｇＧ（図１６Ａ）、ＩｇＧ１（図１６Ｂ）およびＩｇＧ２ａ（図１６Ｃ）の大幅な増加が、Fluviral（登録商標）タンパク質に対して観察され、一方、ミョウバンは、総ＩｇＧおよびＩｇＧ２ａの量を大幅に改善できなかった。ＭａＭＶ ＶＬＰはまた、Ｔ_Ｈ２免疫反応（ＩｇＧ１）を誘発し、これについてはミョウバンと類似の有効性を示す（図１６Ｂ）。さらにＭａＭＶ ＶＬＰは、ＮＰタンパク質に指向されたＩｇＧ２ａの産生を誘発することが示された（図１６Ｃ）。ミョウバンでアジュバント化されたFluviral（登録商標）およびFluviral（登録商標）は、ＮＰタンパク質に対していかなるＩｇＧ２ａの産生も誘発できなかった。この結果は、インフルエンザウイルス内部に見出され、またFluviral（登録商標）調製物中に存在するＮＰタンパク質が、ＭａＭＶ ＶＬＰの存在下でのみ、免疫原性となることを示唆する。この結果はまた、クラススイッチが多量のＩｇＧ１２ａアイソタイプの産生をもたらすために、Ｔ_Ｈ１免疫反応が誘発されたことも示唆し、これは、ウイルス感染に対する防御のための理想的な反応であり、ＭａＭＶ ＶＬＰが優れたアジュバント特性を有することを実証する。
【０２６０】
ＮＰタンパク質は、インフルエンザの全株中もっとも保存されたタンパク質の１つである（９２％を超える同一性）。したがって、ＭａＭＶベースのアジュバントを用いた、このタンパク質に対する、またはFluviral（登録商標）ワクチンに見出される任意のその他の保存エピトープに対する免疫反応の誘発は、市販のワクチンに見出されるものと無関連であるインフルエンザ株に対する防御を提供することが期待され、すなわち、ＭａＭＶベースのアジュバントを市販のインフルエンザワクチンに添加すると、インフルエンザの複数株への防御を提供可能な製剤を提供できる可能性がある。
【０２６１】
例１１：抗原に遺伝子的に融合した外被タンパク質を含むＭａｌｖａモザイクルイスＶＬＰの産生および試験
以下の例は、ＭａＭＶ ＶＬＰがワクチンプラットフォームとして使用可能であることを実証する。この例に記載されている全ての外被タンパク質は、前の例に記載されたものと同じＣＰ精製手順を用いて精製した。
【０２６２】
ＭａＭＶ外被タンパク質のＣ末端は、ＳｐｅＩおよびＭｌｕＩ制限部位を含んで、外被タンパク質のＣ末端において直接適切な抗原をコードする小さいアニーリングされたオリゴヌクレオチドのクローニングを容易にするように操作された。ＳｐｅＩ／ＭｌｕＩ部位を含む配列5' ACTAGTACGCGT 3'（配列番号６１）は、図１０に示す外被タンパク質遺伝子の最後のアミノ酸（フェニルアラニン：Ｆ）の直後で６ｘＨタグの前の位置にクローニングされた。それぞれの酵素の認識配列は以下である：
ＳｐｅＩ＝ACTAGT
ＭｌｕＩ＝ACGCGT
【０２６３】
得られたＭａＭＶ ＣＰは、ＭａＭＶ ＣＰ−ＳＭと名付けられた。このＭａＭＶ ＣＰ−ＳＭをコードするヌクレオチド配列を図１０Ｂ（配列番号６２）に、およびＭａＭＶ ＣＰ−ＳＭタンパク質のアミノ酸配列を図１１Ｂ（配列番号６３）に示す。
【０２６４】
良好に定義された腫瘍抗原ｇｐ１００（IMQVPFSV；配列番号５９）から、およびインフルエンザＭ１タンパク質（GILGFVFTL；配列番号６０）からの９マーＨＬＡ−Ａ＊２０１エピトープを、ＭａＭＶ ＣＰとの融合に選択した。９マーＨＬＡ−Ａ＊２０１エピトープを、Ｎ−およびＣ-末端側にそれぞれの天然配列から５残基離して隣接させ（フランクさせ）て、プロテアソームによる自然のプロセシングを有利にした（図１４）。インフルエンザまたはｇｐ１００エピトープとの融合の際、アミノ酸ＴＳおよびＴＲは、融合エピトープのＮ末端およびＣ末端にそれぞれ融合する。
【０２６５】
ＭａＭＶ−ＳＭコンストラクトを用いて、２つの異なる融合物を生成した。１番目（ＭａＭＶ−Ｍ１またはＭａＭＶ Ｆｌｕ−Ｍ１）は、インフルエンザのＭ１タンパク質由来のＣＴＬエピトープを含んでいた。ＭａＭＶ−Ｍ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列を図１７Ａ（配列番号６６）に、およびＭａＭＶ−Ｍ１のアミノ酸配列を図１８Ａ（配列番号６７）に示す。２番目（ＭａＭＶ−ｇｐ１００）は、ｇｐ１００タンパク質由来のＣＴＬエピトープを含んでいた。ＭａＭＶ−Ｍ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列を図１７Ｂ（配列番号６８）に、およびＭａＭＶ−Ｍ１のアミノ酸配列を図１８Ｂ（配列番号６９）に示す。
【０２６６】
第３の融合物も、第２ＭａＭＶ ＣＰ（ＭａＭＶ ｇｌ−ＳＭ）およびインフルエンザＨ３株のＨＡに由来するＦ３ペプチド（KAYSNCYPYDVPDY；配列番号７２）を用いて生成した。ＭａＭＶ ｇｌ−ＳＭはＭａＭＶ ＳＭコンストラクトの配列を有するが、しかし、GGGLLLスペーサーを含む。ＭａＭＶ ｇｌ−ＳＭをコードするヌクレオチド配列を図１０Ｃ（配列番号６４）に、およびＭａＭＶ ｇｌ−ＳＭのアミノ酸配列を図１１Ｃ（配列番号６５）に示す。
【０２６７】
ＭａＭＶ ｇｌ−ＳＭとＦ３ペプチドの融合は、コンストラクトＭａＭＶ ｇｌ−Ｆ３をもたらす。ＭａＭＶ ｇｌ−Ｆ３をコードするヌクレオチド配列を図１７Ｃ（配列番号７０）に、およびＭａＭＶ ｇｌ−Ｆ３のアミノ酸配列を図１８Ｃ（配列番号７１）に示す。
【０２６８】
それぞれの外被タンパク質の精製プロファイル、得られたＶＬＰの電子顕微鏡写真、およびＶＬＰのＦＰＬＣプロファイルをそれぞれ図１９（ＭａＭＶ−ＳＭ）、図２０（ＭａＭＶ ｇｌ−ＳＭ）、図２１（ＭａＭＶ−Ｍ１）、図２２（ＭａＭＶ−ｇｐ１００）および図２３（ＭａＭＶ ｇｌ−Ｆ３）に示す。これら組換えタンパク質の各々のＶＬＰの長さを測定したが、それらの間に有意な差は観察されなかった（図２４）。ＶＬＰの平均長は６０ｎｍであるが、２００ｎｍを超えるいくつかのＶＬＰも測定された。
【０２６９】
上記の結果は、ＭａＭＶ ＣＰが、それらのＶＬＰを形成する能力を失うことなく、いくつかの異なるペプチド配列の融合を耐容できることを実証する。
【０２７０】
例１２：ＭａｌｖａモザイクウイルスＶＬＰのリンパ球による内在化（インターナリゼーション）
抗原提示細胞（ＡＰＣ）の異なる源の、ＭａＭＶ ＶＬＰを取り込み内在化する能力を、前に記載の技術（Leclerc D, et al. (2007) J Virol 81: 1319-1326）を用いて評価し、パパイアモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）の外被タンパク質由来のＶＬＰの取り込みおよび内在化と比較した。
【０２７１】
簡潔に述べると、ＰａｐＭＶ ＣＰ、ＭａＭＶ ＣＰまたはＭａＭＶ−Ｍ１から形成されたＶＬＰ（例１１参照）を、蛍光標識（アロフィコシアニンまたはＡＰＣ）と接合し、ＣＤ４０活性化Ｂリンパ球上で２０時間パルスした。ＣＤ４０活性化Ｂリンパ球は効率的なＡＰＣであり、樹状細胞（ＤＣ）と類似の特性を有する。次に細胞を洗浄し、蛍光をフローサイトメトリーで評価した。
【０２７２】
結果を図２５に示す；ＰａｐＭＶ、ＭａＭＶおよびＭａＭＶ−Ｍ１のＶＬＰは類似の効率で内在化されることを実証する。４℃での染色により、全てのＶＬＰが細胞表面に結合可能であることが示唆される。２つのピーク（中程度および高い平均蛍光強度、またはＭＦＩ）の存在は、ＶＬＰが異なる様式で細胞内に内在化され／細胞と会合するが、しかし、ＭａＭＶとＭａＭＶ−Ｍ１のＶＬＰの間に大きな違いはないことを示唆する。
【０２７３】
ＢおよびＴリンパ球のヘテロハイブリドーマ細胞株を、次にＡＰＣの源として試験した。この細胞株（Ｔ２細胞）は、抗原プロセシング（ＴＡＰ）と会合するトランスポーターにおいて欠けている。Ｔ２細胞による時系列の取り込みアッセイを実施し、ここでＴ２細胞を図２６に示す時点で３７℃でパルスし、洗浄し、フローサイトメトリーで分析した。
【０２７４】
結果を図２６Ａおよび２６Ｂに示す；ＰａｐＭＶ、ＭａＭＶおよびＭａＭＶ−Ｍ１のＶＬＰは時間とともに類似の効率で内在化される。再度、２つのピーク（中程度および高いＭＦＩ）が観察され、これは、ＶＬＰが異なる様式でＴ２細胞に内在化され／これと会合することを示唆する。時間に伴うＭＦＩの増加によれば、ＭａＭＶ ＶＬＰはより効率的に取り込まれるように見える。しかし、ＰａｐＭＶ ＶＬＰはより迅速に分解し、その結果みかけの総ＭＦＩがより低くなることも可能である。
【０２７５】
これらの結果は、ＭａＭＶ ＶＬＰおよびＰａｐＭＶ ＶＬＰが同等の有効性でＡＰＣに内在化されることを示し、したがって、これらがワクチンプラットフォームとして同等の有効性を有することを示唆する。
【０２７６】
例１３：ＭａｌｖａモザイクウイルスＶＬＰの、ＣＴＬエピトープのＭＨＣクラスＩ提示を引き出す能力
ＰａｐＭＶは、プロテアソーム非依存性のメカニズムのもとで、ＭＨＣクラスＩエピトープ交差提示を媒介する能力を実証した（Leclerc D, et al. (2007) J Virol 81: 1319-1326）。図１２に示すように、ＰａｐＭＶおよびＭａＭＶの両方は細胞を結合し、同様に内在化される。したがって、ＰａｐＭＶと同様の様式で、共有結合的に結合したＭＨＣクラスＩエピトープの提示を引き出すＭａＭＶの能力を、次に前に記載の技術を用いて検討した（Leclerc et al. (2007)上記）。
【０２７７】
簡潔に述べると、ＰａｐＭＶ外被タンパク質またはＭａＭＶ外被タンパク質由来のＶＬＰに、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１インフルエンザＭ１エピトープをＣ末端に挿入したもの（ＰａｐＭＶ-Ｍ１およびＭａＭＶ−Ｍ１；例１１参照）、およびインフルエンザＭ１エピトープに対応する合成ペプチドを、Ｔ２細胞上で２０時間パルスした。細胞を洗浄し、関連ＨＬＡ−Ａ＊０２０１ＭＨＣクラスＩ分子に結合したＭ１インフルエンザエピトープに特異的なＴ細胞を、さらに２０時間加えた。上清を収穫し、インターフェロン（ＩＦＮ）−γ分泌をＥＬＩＳＡにより評価した。ＩＦＮ−γは、ＭＨＣ／ペプチド複合体を認識するＴ細胞により分泌される。
【０２７８】
データを図２７Ａに示す。Ｇｐ１００は陰性の特異性対照として機能し、これは陰性でなければならない。結果は、ＰａｐＭＶとＭａＭＶ両方のＶＬＰが、Ｍ１エピトープを交差提示する能力を有することを示す。ＭａＭＶ ＶＬＰについては、１０μｇ／ｍｌにおいて改善された認識が、および５０μｇ／ｍｌでパルスされた場合には認識の顕著な低下が観察された。
【０２７９】
ＭａＭＶ−Ｍ１を用いて同様の実験を行って、用量反応を評価した（図２７Ｂ）。Ｇｐ１００は陰性の特異性対照として機能し、これは陰性でなければならない。
【０２８０】
プロテアーゼは、上記実験においてＡＰＣを培養するために用いたヒト血清中に存在するため、ＡＰＣのパルスが、ＶＬＰの内在化、プロセシング、およびＡＰＣでの内在化後のＭＨＣ負荷からではなく、培養倍地中でのＶＬＰの分解後に達成される可能性がある。この可能性を除外するために、Ｔ２細胞をＭａＭＶ−Ｍ１ ＶＬＰで４℃でパルスした低い温度は、ＶＬＰの任意の潜在的な分解を阻害するために用いた。ペプチドが外部に放出される場合、これらはＭＨＣクラスＩを細胞の外側から負荷しなければならないが、図２７Ｃに示すように、そうではなかった（図２７Ｂに示す実験は同時に実施され、３７℃における陽性対照として機能する）。対照として、合成ペプチドを同様にパルスし、これらは４℃または３７℃においてパルスした場合に認識された。
【０２８１】
図２７Ｂおよび図２７Ｃに示す結果は、用量反応がＭａＭＶ−Ｍ１に対する認識効率と相関することを実証する。しかし、より高い用量でパルスすると（５０ｍｇ／ｍｌ）、認識の顕著な低下をもたらす（図２７Ｂ）。Ｍ１エピトープは、ヒト血清を含有する培養培地中での分解により放出されないことが示された（図２７Ｃ）。最後に、上記および例１２の実験がＴＡＰ欠乏したＴ２細胞中で行われたため、これらの結果により、交差提示メカニズムはプロテアソーム／ＴＡＰ媒介性ではないことがさらに確認される。
【０２８２】
例１４：ＭａｌｖａモザイクウイルスＶＬＰによる休止エピトープ特異的Ｔリンパ球の感作
４人の異なるドナー（＃４０５、＃５４２、＃６１４および＃６２１）からの休止Ｔリンパ球を用いて、ＶＬＰでパルスしたＡＰＣの、インフルエンザＭ１タンパク質特異的Ｔ細胞の増殖（expansion）を誘発する能力を評価した。このアッセイは、「Ｔ細胞感作」または「in vitroワクチン接種」と呼ばれる。かかるアッセイにおいて、Ｍ１エピトープを担持するＶＬＰが、３週間の培養アッセイにおいて、特異的Ｔ細胞を増殖させるのに効率的であるかどうかを評価することができる。
【０２８３】
各ドナーに対して、自己由来ＡＰＣ（ＣＤ４０−活性化Ｂリンパ球）を初めに培養した。これらの細胞を、Ｍ１エピトープを担持するＰａｐＭＶ ＶＬＰまたはＭａＭＶ ＶＬＰ（例１１参照）（２５μｇ／ｍｌ）のどちらか、またはＭ１エピトープを含有する合成ペプチドでパルスした。パルスしたＡＰＣを次に、自己由来血液Ｔリンパ球で７日間共培養し、つぎに、同じパルスしたＡＰＣで再刺激した。全部で２１日の培養後、培養したＴリンパ球の、関連するインフルエンザＭ１エピトープに対する特異性を評価した。
【０２８４】
産生したＴリンパ球の、各ドナーに対する特異性を図２８〜３１に示す。ドナー＃４０５に対し（図２８）、ＭａＭＶ−Ｍ１ ＶＬＰは、特異的Ｔ細胞の働きの増大をもたらしたが、しかしＰａｐＭＶ−Ｍ１ ＶＬＰはもたらさなかった。いくつかのペプチド特異株は、ＭａＭＶ−Ｍ１ ＶＬＰと比べた場合に、よりアビディティが高いことが観察された。ドナー＃５４２に対し（図２９）、ＰａｐＭＶ−Ｍ１ ＶＬＰまたはＭａＭＶ−Ｍ１ ＶＬＰのどちらかを用いて産生されたＴ細胞株は、ＭａＭＶ−Ｍ１をよりよく認識する。全体としてこのドナーに対して、ＶＬＰはペプチドパルスよりも、より高いアビディティのＴ細胞を生成する傾向があった。ドナー＃６１４に対し（図３０）、ＭａＭＶ−Ｍ１ ＶＬＰを用いて産生されたＴ細胞株は、ＶＬＰ−Ｍ１をよりよく認識する。全体として、ＶＬＰを用いて生成されたＴ細胞は、低いペプチド濃度（０．００１ｍＭ；これは対数スケールであることに注意）でのペプチドパルスに比べて、より高いアビディティのＴ細胞を産生する。ドナー＃６２１に対し（図３１）、ＰａｐＭＶ−Ｍ１ ＶＬＰまたはＭａＭＶ−Ｍ１ ＶＬＰのどちらかを用いて産生されたＴ細胞株は、ＶＬＰ−Ｍ１を認識する。ＭａＭＶ−Ｍ１Ｔ細胞株は、ＰａｐＭＶ−Ｍ１Ｔ細胞株に比べてより高いアビディティを有するようであり、ＶＬＰＴ細胞株は全体としてペプチドパルスより優れていた。
【０２８５】
結論として、ＭａＭＶ−Ｍ１ ＶＬＰおよびＰａｐＭＶ−Ｍ１ ＶＬＰの両方は、このin vitroのＴ細胞感作アッセイにおいて抗原特異的Ｔリンパ球を生成するのに一般に効率的であり、全体として、ＭａＭＶ ＶＬＰおよびＰａｐＭＶ ＶＬＰの両方は、ペプチドのみよりも良好に作用した。驚くべきことには、抗プラットフォームＴリンパ球はＭａＭＶまたはＰａｐＭＶ ＶＬＰの両方について観察されなかった。全体として、ＭａＭＶ ＶＬＰおよびＰａｐＭＶ ＶＬＰの両方は、同等であるように見られた。ドナー間での変化は予想された。
【０２８６】
例１２および１３は、ＭａＭＶ−ｇｐ１００およびＭａＭＶ−Ｍ１が、これらのＣＴＬエピトープのヒトＡＰＣのＭＨＣクラス１での交差提示を誘発できること、および、ＣＤ８＋特異的細胞の増殖を誘発できることを実証する。これらの結果は、ＭａＭＶプラットフォームが、ヒトまたは動物において、ＣＴＬ反応を誘発可能であることを、強く示唆する。
【０２８７】
さらに、例１２〜１４は、ＭａＭＶプラットフォームが、その外被タンパク質の配列がＰａｐＭＶプラットフォームの外被タンパク質の配列とアミノ酸の６９％で非常に異なるにもかかわらず、ＰａｐＭＶプラットフォームと同様の免疫原性特性を有することを実証する。両方のプラットフォームはワクチン開発において大きな可能性を示し、これらが同一のワクチン接種プロトコルにおいて一緒に用いられて、与えられたエピトープへの免疫反応を最適化すること、または同じ患者において交互に用いて、前の処置のプラットフォームに指向された抗体による交差中性化を避けることが、期待される。
【０２８８】
例１５：抗原に融合したＭａｌｖａモザイクウイルスＶＬＰの、in vivo免疫反応を引き出す能力
ＭａＭＶ−ｇｐ１００、ＭａＭＶ−Ｍ１またはＭａＭＶ ｇｌ−Ｆ３を含むＶＬＰ（例１１参照）を試験して、融合ペプチドに対する免疫反応が、Ｂａｌｂ／Ｃマウスにおいて検出できるかどうかを確認した。
【０２８９】
簡潔に述べると、マウスに２回の皮下注射を１４日の間隔で表５に示すように施した。各注射の前に血液を採取し（０日目および１４日目）、また最後の注射の１４日目後にも採取した（２８日目）。
表５：マウスの免疫化
【表５】

【０２９０】
１４日目および２８日目に採取した血液を用いてＥＬＩＳＡを行い、総抗ペプチドおよび総抗ＭａＭＶ ＩｇＧ価を定量した。
【０２９１】
各組換えタンパク質についてＬＰＳ含量を評価し、各ケースにおいて１５ＥＵ／ｍｇ未満であった。これは、注射した組成物のＬＰＳ含量が基本的に無視できることを示す。
【０２９２】
驚くべきことには、ほとんどのマウスはＭａＭＶ ＣＰに融合したペプチドに対してＩｇＧ反応を示さなかった（図３２Ａ）。ＭａＭＶ ｇ１-Ｆ３コンストラクトで処置した１０匹のうち２匹のマウスは、ペプチドについてセロコンバージョンを示し、ＭａＭＶ−Ｍ１コンストラクトで処置した１０匹のうち１匹のマウスは、ペプチドについてセロコンバージョンを示した。ＭａＭＶ−ｇｐ１００コンストラクトで処置したマウス、またはＦ３ペプチドで処置したマウス（Ｆ３ペプチドがＭａＭＶプラットフォームに融合しなかった場合）は、いかなる反応も示さなかった。
【０２９３】
この点について、Ｍ１またはｇｐ−１００タンパク質由来のＣＴＬエピトープの選択は、マウスにおける体液性の反応を評価するにはおそらく最適ではなかったことが指摘でき、その理由はおそらく、実験に用いたマウスの免疫レパートリーに、これらのペプチドを認識できるＢ細胞が含まれていないことである。これはまた、Ｆ３ペプチドについても同様である。
【０２９４】
前の例では、ＭａＭＶが強力なアジュバントであることを実証した。本例ではしかし、試験動物の免疫レパートリーが抗原を認識できない場合には、強いＩｇＧ反応を誘発できないことを確認する。アジュバントは、目的の抗原に特異的なＢ細胞が利用可能である場合にのみ、Ｂ細胞反応を増幅できる。この結論は、ＭａＭＶ ＣＰに対して全ケースで非常に強いＩｇＧ反応が測定できるという事実によって支持され、プラットフォームが高度に免疫原性であることを示す（図３２Ｂ）。これは、ワクチンプラットフォームとしては重要な性質であり、なぜならば、一般に、ＨＢＶ ＶＬＰまたはＰａｐＭＶ ＶＬＰなどのワクチンプラットフォームについて、プラットフォーム自体の本質的な免疫原性が、ＶＬＰの表面の融合エピトープまたはペプチドに指向された免疫反応を駆動することが、よく認識されているためである。したがって、ＭａＭＶ ＶＬＰは高度に免疫原性であることが示されたので、より適切なエピトープ（例えば、インフルエンザのＭ２タンパク質のＭ２ｅエピトープ（Denis et al., 2008, Vaccine, 26:3395-3403参照））が、ペプチドに対して常に強い免疫反応を生じさせることが予想される。
【０２９５】
さらに、将来の実験について、スペーサーを融合ペプチドとＭａＭＶＣＰの間にクローニングして、ペプチドをＶＬＰの表面に押し出すことが可能であり、これは、この実験では最適化されなかったＢ細胞との架橋（cross link）を改善することが期待される。
【０２９６】
例１６：パパイアモザイクウイルスＶＬＰおよびＭａｌｖａモザイクウイルスＶＬＰに対する抗体の交差反応性
ＰａｐＭＶ ＣＰおよびＭａＭＶ ＣＰは、３１％の配列同一性を共有するのみである（図３３Ａ参照）。配列における差はまた、各々の外被タンパク質に特異的な抗体における交差反応性の欠如にも明らかである。例えば図３３Ｂは、ＭａＭＶ ＣＰに指向された抗体を用いたＥＬＩＳＡの結果を示し、これは、ＰａｐＭＶ ＶＬＰを認識しないことがわかる。ＰａｐＭＶ ＣＰに指向された抗体による同様の実験により、ＰａｐＭＶ抗体はＭａＭＶプラットフォームに結合しないことも明らかにされた（図３３Ｃ）。この結果は、２つのＶＬＰの表面は非常に異なっていることを示唆する。２つのプラットフォームはしたがって、ワクチン投与計画において一緒に用いて、より優れた効率的なワクチン接種プログラムを保証することができ、その理由は、第１のプラットフォームに指向された抗体が、第２のプラットフォームを妨害できないからである。
【０２９７】
例１７：Ｍａｌｖａモザイクウイルスの免疫原性効果
以下のプロトコルは、ＭａＭＶおよび弱い免疫原を含む組成物の免疫原性効果を評価するために従うことができる、代替的プロトコルである。
【０２９８】
生得的免疫反応の抗体反応への翻訳は、アジュバントを弱い免疫原性ワクチンと共同投与した場合に観察される。アジュバントは、抗原に対する抗体または細胞の免疫反応を強化または増強可能な物質である。ＭａＭＶが他の抗原に対する長期の抗体反応を促進可能なアジュバントであるかどうかを決定するために、ＢＡＬＢ／ｃマウスを弱い免疫原、オボアルブミン（ＯＶＡ）またはニワトリ卵白リゾチーム（ＨＥＬ）で、それらのみで、またはＭａＭＶと共に免疫化した。ＣＦＡまたはＬＰＳなどの他のアジュバントと、ＯＶＡまたはＨＥＬとの組合せを陽性対照として用いることができる。次に、ＯＶＡまたはＨＥＬに特異的なＩｇＧ抗体価を、適切な時点でＥＬＩＳＡにより測定することができる。
【０２９９】
ＭａＭＶ精製
以下の実験で用いるＭａＭＶは、例１に記載のようにして精製することができる。
【０３００】
抗原およびアジュバント
ＬＰＳ非含有ＯＶＡグレードＶＩは、Sigma-Aldrich Chemical Co., St Louis, MOから購入可能であり、ニワトリ卵白リゾチーム（ＨＥＬ）は、Research Organics Inc. Cleveland, OHから購入可能である。大腸菌Ｏ１１１：Ｂ４からのＬＰＳは、Sigma-Aldrich, St Louis, MOから購入可能である。
【０３０１】
免疫化
６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスを、医薬品安全性試験実施基準に準拠した条件下で飼育し維持する。試験アジュバントの効果を試験するために、マウスの群を２ｍｇのＯＶＡもしくはＨＥＬのみ、または３０ｍｇのＭａＭＶ、ＣＦＡ１：１（ｖ／ｖ）、または５ｍｇの大腸菌Ｏ１１１：Ｂ４からのＬＰＳ（Sigma-Aldrich）で、０日目に腹腔内で免疫化した。対照マウスには、生理食塩水のみを注射した。血液試料は、後方眼窩洞から様々な時点で採取した。個々の血清試料は分析まで−２０℃で保存した。各実験に３匹のマウスを用いた。
【０３０２】
ＥＬＩＳＡによる抗体価の決定
高結合９６ウェルポリスチレンプレート（Corning（登録商標）、New York, NY）を、０．１Ｍの炭酸−重炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）中の１ｍｇ／ｍＬのＭａＭＶ、１００ｍｇ／ｍＬのＨＥＬ、または１５０ｍｇ／ｍＬのＯＶＡで被覆した。プレートを３７℃で１時間、次に４℃で一晩インキュベートした。次の朝、使用前に、プレートを０．０５％Tween-20（Sigma-Aldrich）含有のＰＢＳ（ｐＨ７．２）（ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄した。非特異的結合を、ＰＢＳに希釈した５％の脱脂粉乳（ＰＢＳ−Ｍ）を用いて３７℃で１時間ブロックした。洗浄後、マウス血清をＰＢＳ−Ｍ中１：４０に希釈し、２倍連続希釈液をウェルに加えた。プレートを３７℃で１時間インキュベートし、次にＰＢＳ−Ｔで４回洗浄した。ペルオキシダーゼ接合ウサギ抗マウスＩｇＭ（最適希釈１：１０００）ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ抗体（Zymed, San Francisco, CA）またはＩｇＧ３（最適希釈１：３０００）（Rockland, Gilbertsville, PA）を加え、プレートを３７℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。３０％過酸化水素含有の０．１Ｍのクエン酸緩衝液（ｐＨ５．６）中のオルトフェニレンジアミン（０．５ｍｇ／ｍＬ；Sigma-Aldrich）を、酵素基質として用いた。反応を２．５ＮのＨ_２ＳＯ_４で停止させ、吸収を、BIOLINX 2.22ソフトウェアと自動ＥＬＩＳＡプレートリーダー（Dynex Technologies MRII, Chantilly, VA, USA）を用いて、４９０ｎｍにて決定した。抗体価は、−log2希釈×４０として与える。正の力価は、陰性対照の平均値の上の３ＳＤとして定義した。
【０３０３】
例１８：ＭａｌｖａモザイクウイルスおよびＭａｌｖａモザイクウイルスＶＬＰによる、亜致死量のインフルエンザウイルスに対する抵抗性の誘発
ＭａＭＶまたは組換えＭａＭＶ ＶＬＰの、亜致死量のインフルエンザウイルスに対する抵抗性を、抗原の不在下において誘発する能力を、マウスにおいて試験することができる。簡潔に述べると、マウスを鼻腔内経路で１００ｕｇのＭａＭＶで７日間隔で３回処置する。最後の処置の２日後に、動物を亜致死量のインフルエンザウイルスに暴露する（Ａ／ＷＳＮ／３３）（１ＬＤ_５０）。動物中で複製されるウイルスの量を、感染後に２日の間隔で鼻での分泌をサンプリングして測定する。動物の体温と体重を、チャレンジ後７日間毎日モニタリングする。感染による病的状態を、感染後の１０日間、スコア化する。
【０３０４】
本発明を、ある特定の態様を参照して記載したが、これらについての種々の改変は、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、当業者には明らかである。当業者に明らかであるかかる改変の全ては、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｍａｌｖａモザイクウイルス（ＭａＭＶ）またはＭａＭＶ外被タンパク質を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）、および薬学的に許容し得る担体を含む、免疫原性組成物。
【請求項２】
１または２以上の抗原をさらに含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項３】
１または２以上の抗原がＭａＭＶまたはＶＬＰに付着している、請求項２に記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
免疫原性組成物がＶＬＰを含み、１または２以上の抗原が前記ＶＬＰに含まれる外被タンパク質に遺伝子的に融合している、請求項２に記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
ＭａＭＶ外被タンパク質が、配列番号２に記載の配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１、２、３または４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
ＭａＭＶ外被タンパク質が、配列番号２に記載の配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１、２、３または４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
ＭａＭＶ外被タンパク質が、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１、２、３または４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項８】
動物において免疫反応を誘発するための方法であって、前記動物に対して、請求項１、２、３、４、５、６または７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物の有効量を投与することを含む、前記方法。
【請求項９】
免疫反応が、抗体の産生を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
免疫反応が、細胞性反応を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
免疫原性組成物を注射により投与する、請求項８、９または１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
免疫原性組成物を鼻腔内に投与する、請求項８、９または１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
動物が哺乳類、鳥類、魚類または爬虫類である、請求項８、９、１０、１１または１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
動物がヒトである、請求項８、９、１０、１１または１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
動物に、疾病、疾患、または感染に対してワクチン接種するための方法であって、前記動物に対して、Ｍａｌｖａモザイクウイルス（ＭａＭＶ）またはＭａＭＶ外被タンパク質を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）、および１または２以上の抗原を含む免疫原性組成物の、有効量を投与することを含む、前記方法。
【請求項１６】
ＭａＭＶ外被タンパク質が、配列番号２に記載の配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ＭａＭＶ外被タンパク質が、配列番号２に記載の配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
ＭａＭＶ外被タンパク質が、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
１または２以上の抗原がＭａＭＶまたはＶＬＰに付着している、請求項１５、１６、１７または１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
免疫原性組成物がＶＬＰを含み、１または２以上の抗原が、前記ＶＬＰに含まれる外被タンパク質に遺伝子的に融合している、請求項１５、１６、１７または１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
免疫原性組成物および１または２以上の抗原を、注射により投与する、請求項１５、１６、１７、１８、１９または２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
動物が哺乳類である、請求項１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
動物がヒトである、請求項１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
Ｍａｌｖａモザイクウイルス（ＭａＭＶ）またはＭａＭＶ外被タンパク質を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）の、免疫原性組成物の調製における使用。
【請求項２５】
ＭａＭＶ外被タンパク質が、配列番号２に記載の配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
ＭａＭＶ外被タンパク質が、配列番号２に記載の配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２４に記載の使用。
【請求項２７】
ＭａＭＶ外被タンパク質が、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む、請求項２４に記載の使用。
【請求項２８】
免疫原性組成物が、ＭａＭＶまたはＶＬＰに付着している１または２以上の抗原をさらに含む、請求項２４、２５、２６または２７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２９】
免疫原性組成物が、ＶＬＰを含み、前記ＶＬＰに含まれる外被タンパク質に遺伝子的に融合している１または２以上の抗原をさらに含む、請求項２４、２５、２６または２７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３０】
Ｍａｌｖａモザイクウイルス（ＭａＭＶ）外被タンパク質を含む、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項３１】
ＭａＭＶ外被タンパク質が、配列番号２に記載の配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項３０に記載のＶＬＰ。
【請求項３２】
ＭａＭＶ外被タンパク質が、配列番号２に記載の配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項３０に記載のＶＬＰ。
【請求項３３】
ＭａＭＶ外被タンパク質が、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む、請求項３０に記載のＶＬＰ。
【請求項３４】
ＶＬＰに付着している１または２以上の抗原をさらに含む、請求項３０、３１、３２または３３のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
【請求項３５】
ＭａＭＶ外被タンパク質に遺伝子的に融合している１または２以上の抗原をさらに含む、請求項３０、３１、３２または３３のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
【請求項３６】
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を調製するための方法であって、Ｍａｌｖａモザイクウイルス（ＭａＭＶ）外被タンパク質を宿主細胞中に発現するステップを含む、前記方法。
【請求項３７】
ＭａＭＶ外被タンパク質が、配列番号２に記載の配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
ＭａＭＶ外被タンパク質が、配列番号２に記載の配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
ＭａＭＶ外被タンパク質が、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
ＭａＭＶ外被タンパク質が、外被タンパク質に遺伝子的に融合した１または２以上の抗原を含む融合タンパク質である、請求項３６、３７、３８または３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
宿主細胞が細菌細胞である、請求項３６、３７、３８、３９または４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
宿主細胞が大腸菌細胞である、請求項３６、３７、３８、３９または４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
抗原に融合したＭａｌｖａモザイクウイルス（ＭａＭＶ）外被タンパク質を含む、融合タンパク質。
【請求項４４】
ＭａＭＶ外被タンパク質が、配列番号２に記載の配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項４３に記載の融合タンパク質。
【請求項４５】
ＭａＭＶ外被タンパク質が、配列番号２に記載の配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項４３に記載の融合タンパク質。
【請求項４６】
ＭａＭＶ外被タンパク質が、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む、請求項４３に記載の融合タンパク質。
【請求項４７】
請求項４３、４４、４５または４６のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする、単離ポリヌクレオチド。
【請求項４８】
請求項４７に記載のポリヌクレオチドにより遺伝子操作された、宿主細胞。
【請求項４９】
請求項４３、４４、４５または４６のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項４７に記載のポリヌクレオチド、または請求項４８に記載の宿主細胞の、ウイルス様粒子を調製するための使用。

【図１Ａ】

【図１Ｂ】

【図１Ｃ】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６Ａ−Ｃ】

【図１６Ｄ】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【図２２】

【図２３】

【図２４】

【図２５】

【図２６】

【図２７】

【図２８】

【図２９】

【図３０】

【図３１】

【図３２】

【図３３】

【公表番号】特表２０１０−５３８６１９（Ｐ２０１０−５３８６１９Ａ）
【公表日】平成２２年１２月１６日（２０１０．１２．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５２４３１８（Ｐ２０１０−５２４３１８）
【出願日】平成２０年９月１１日（２００８．９．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２００８／００１６０３
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０３３２７６
【国際公開日】平成２１年３月１９日（２００９．３．１９）
【出願人】（５１００６６３７４）ユニベルシテ　ラヴァル (1)
【Ｆターム（参考）】