Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの温度感受性ワクチン株およびその使用
本発明は、列挙された遺伝子のうちの少なくとも１つに変異を含むか、またはＮａｔｉｏｎａｌ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（オーストラリア）に受入番号ＮＭ０４／４１２５９で寄託されているＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）ワクチン株であって、温度感受性でありかつ弱毒化されている株、このような株を含むワクチンならびに方法そのおよび使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）株、このような株を含むワクチン、およびブタにおいてマイコプラズマ性肺炎から保護するためのこのようなワクチンの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）は、豚マイコプラズマ性肺炎（流行性肺炎（ＥＰ）とも呼ばれる）の病原体である。豚マイコプラズマ性肺炎は、世界中のブタ生産に影響を及ぼす最も一般的でかつ経済的に重要な呼吸器疾患のうちの１つである。この疾患は二次感染、高罹患率および低死亡率、低飼料要求率と関係し、１年あたり約１０億ドルと見積もられる全世界の経済的損失の原因となりうる。
【０００３】
ＥＰにおいては、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）細菌は、ブタの肺の中の上皮細胞の繊毛に付着し、健常な正常な繊毛を破壊して、平素無害菌（ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｓｔｉｃ ｏｒｇａｎｉｓｍｓ）がその呼吸器組織に定着することを可能にし、疾患を引き起こす。ひとたび定着すると、Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）はブタの肺に病変を引き起こす。
【０００４】
この疾患は非常に感染性が高く、伝染は、通常、感染した呼吸器分泌物、例えばくしゃみまたは咳嗽の際に鼻部または口から放出される液滴、との直接接触による。
【０００５】
Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）に対するいくつかのワクチンが、現在、存在する。ほとんどの現在のワクチンは約１０社によって提供されており、２２のワクチン銘柄が一価または二価／多価のいずれかとして登録されている。すべては、死滅したまたは不活化したＭ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）調製物である。
【０００６】
全細胞性の不活化したＭ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）ワクチンの例としては、ＲＥＳＰＩＳＵＲＥ（商標）およびＳＴＥＬＬＡＭＵＮＥ（商標）（Ｐｆｉｚｅｒ（ファイザー））、ＳＵＶＡＸＹＮ Ｍ．ＨＹＯ（商標）（Ｆｏｒｔ Ｄｏｄｇｅ（フォート・ドッジ））、ＨＹＯＲＥＳＰ（商標）（Ｍｅｒｉｅｌ（メリアル））、Ｍ＋ＰＡＣ（商標）（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ（シェリング・プラウ））およびＰＯＲＣＩＬＩＳ（商標）（Ｉｎｔｅｒｖｅｔ（インターベット））が挙げられる。
【０００７】
いくつかのワクチンはＥＰの重症度を低減できる一方で、入手できる全細胞性の死菌ワクチンまたは不活化ワクチンのうちで、Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）感染からの完全防御を提供するものはない。このため、より有効なワクチンについてのニーズがある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
流行性肺炎を防止するためのワクチン接種における使用に適したＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ニューモニエ、肺炎マイコプラズマ）の生きた株を提供することが、本発明の好ましい実施形態の目的である。
【０００９】
本願明細書で引用されるすべての引用文献（あらゆる特許または特許出願を含む）は、参照により本願明細書に援用する。いくつかの先行技術の刊行物が本願明細書中で言及されるが、この引用は、これらの文献のいずれかが当該技術分野における共通の一般的な知識の一部を形成するということを認めるものではない、ということは明確に理解されるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、全体として、ブタにおいて流行性肺炎から保護することにおいて有効である生ワクチンを生産するために使用することができる、生きた弱毒化されたＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）株を提供する。
【００１１】
第１の態様は、表１に列挙されている遺伝子のうちの少なくとも１つにおいて変異を含む弱毒化されたＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）ワクチン株を提供する。
【００１２】
１つの実施形態では、このワクチン株は、表１に列挙されている遺伝子のうちのすべてにおいて変異を含む。
【００１３】
１つの実施形態では、このワクチン株は温度感受性である。
【００１４】
弱毒ワクチンは一般に好都合である。なぜなら、弱毒ワクチンは、自然の形態にある感染病原体の関係する免疫原性決定因子のすべてを宿主の免疫系に提示し、そしてワクチン接種を受けた宿主の中で免疫剤が増殖することができるため、比較的少量のその免疫剤しか必要としないからである。弱毒化するための方法としては、毒性のある株を複数回継代すること、または照射もしくは化学物質への曝露が挙げられる。これらの方法は、ゲノムの中に変異を導入し、その変異が当該微生物を、毒性はより低いがまだ複製することができるものにするということが想定される。
【００１５】
これらのアプローチの短所は、これらのアプローチが、分子レベルで特徴づけられないランダム変異を導入するということである。また、関係づけられた温度感受性について選択することによるなど、弱毒化のために選択するための方法は、時間がかかることが多く、誤った結果をもたらすことが多い。というのも、温度感受性株は弱毒化されていないかもしれず、そして弱毒株は温度感受性でない必要があり、そして多大な試行錯誤を必要とするからである。加えて、この弱毒株は、さらなる変異を受けて病原性に戻る可能性がある。
【００１６】
マイコプラズマ性肺炎に対する生ワクチンを提供することを目的として、本発明者らは、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）分離株を化学的な変異生成にかけて、温度感受性であるクローンを選択した。本発明者らは、生きた変異体細菌を凍結乾燥し、そして、その細菌が一週間後に再構成することができ、連続継代後も生存能力があり続け、従ってＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）についてのワクチン株として適切である、ということを見出した。このワクチン株およびマスター株は配列決定され、その配列の比較から、そのワクチンにおいて変異している遺伝子を特定した。これにより、その弱毒株の遺伝子的特徴づけが可能となった。
【００１７】
第２の態様は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（国立標準研究所）（オーストラリア）に受入番号ＮＭ０４／４１２５９で寄託された弱毒化されたＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）ワクチン株を提供する。この株は温度感受性でありかつ弱毒化されている。
【００１８】
この第２の態様のワクチン株は、防御免疫を与えることは示されるが、この株は連続継代にもかかわらず病原性への復帰変異は示さない（データは示さず）。
【００１９】
第３の態様は、第１または第２の態様のワクチン株を製造する方法であって、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）の適切な出発分離株を化学的変異生成にかける工程と、連続継代後に生存率を保持する変異体を選択する工程とを含む方法を含む。
【００２０】
１つの実施形態では、変異体は、温度感受性に基づき最初に選択される。
【００２１】
第４の態様は、第１または第２の態様のＭ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）ワクチン株と、担体、任意に佐剤，および／または任意に少なくとも１つの付加的な感染病原体とを含むワクチン組成物であって、免疫量の当該ワクチンはＭ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）によって引き起こされる疾患に対する防御免疫を誘発することができる、ワクチン組成物を提供する。この感染病原体は、ウイルス、細菌、真菌または寄生生物であってもよい。
【００２２】
第５の態様は、ブタ類動物においてＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）によって引き起こされる疾患から防御するための方法であって、免疫量の第４の態様のワクチン組成物をブタ類動物に投与することを含む方法を提供する。
【００２３】
第６の態様は、ブタ類動物においてＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）によって引き起こされる疾患から防御するための、第４の態様のワクチンを提供する。
【００２４】
第７の態様は、第４の態様に係るワクチンを製造する方法であって、第１または第２の態様のＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）株を担体、任意に佐剤および／または任意に少なくとも１つの付加的な感染病原体と合わせる工程を含む方法を提供する。感染病原体は、ウイルス、細菌、真菌または寄生生物であってもよい。
【００２５】
第８の態様は、ブタ類動物においてＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）によって引き起こされる疾患から防御するための医薬の製造における、第１または第２の態様のＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）ワクチン株の使用を提供する。
【００２６】
第４から第７の態様の実施形態では、「Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）によって引き起こされる疾患」は、流行性肺炎またはブタマイコプラズマ性肺炎である。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】高過量でワクチン接種を受けたブタにおけるｔｓ１９ワクチン株の鼻内コロニー形成。
【図２】ｔｓ１９ワクチンを用いて高過量でワクチン接種を受けたブタにおける、ワクチン接種後の日数（ＤＰＶ）５９日での気管でのコロニー形成。
【図３】種々の用量でｔｓ１９ワクチン株を用いてワクチン接種を受けたブタにおける鼻内コロニー形成。
【図４】研究期間（１０５日間）にわたる全体重の差。
【図５】ｔｓ１９についての最小防御用量の決定。
【図６】肺病変の重症度の軽減に基づくｔｓ１９および市販のワクチンの防御指数。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）株「ＬＫＲ」は、もともと、屠殺場検体から単離された（ＬｌｏｙｄおよびＥｔｈｅｒｉｄｇｅ １９８１、Ｊ ｏｆ Ｃｏｍｐ Ｐａｔｈ ９１：７７−８３）。この生物は、無細胞培地中で約１０回継代される前に、実験的に感染したブタから再単離され、クローン単離に到達した（ＣＳＩＲＯ（オーストラリア連邦科学産業研究機構）、ビクトリア州（Ｖｉｃｔｏｒｉａ））。次いでこのクローンは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｄｅｌａｉｄｅ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（アデレード大学マイコプラズマコレクション）、南オーストラリア州に提出された。次いでこのＬＫＲ分離株は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ（メルボルン大学獣医学科）（マイコプラズマグループ）によって得られ、そこでは、このＬＫＲ分離株は保存のために改変Ｆｒｉｓｓブロス中での３回のインビトロでの継代を経た。保存されたバイアルは、「ＬＫＲ Ｐ３ ２９／５／９７」と名付けられた。このクローンは親株を表す。
【００２９】
ＬＫＲ Ｐ３ ２９／５／９７はインビトロで継代され、これまでに記載された方法（ＮｏｎａｍｕｒａおよびＩｍａｄａ（１９８２） Ａｖｉａｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ２６：７６３−７７５）を使用してＮＴＧ変異生成（２００ｍｇ／ｍＬ）にかけられた。温度感受性クローン（「ｔｓ−１９」）は、寒天プレートから選択され、３ｍＬの改変Ｆｒｉｓｓブロス中で培養された。このクローンについての継代数は、「Ｐ０」と名付けられ、その後、改変Ｆｒｉｓｓブロス中での継代１回あたり１：４ ｖ／ｖ希釈でさらに４回のインビトロでの継代を経た。最終継代レベルを「ＬＫＲ ｔｓ−１９ Ｐ４ ＭＳ」と名付けた。
【００３０】
ＬＫＲ ｔｓ−１９ Ｐ４ ＭＳは、改変Ｆｒｉｓｓブロス中での何回かのインビトロでの希釈継代を経て、３．２×１０−２１の希釈に到達した。この最終変異体クローンを「ＬＫＲ ｔｓ−１９ ３．２×１０−２１」と名付けた。
【００３１】
ＬＫＲ ｔｓ−１９ ３．２×１０−２１は凍結乾燥され、Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（オーストラリア政府分析研究室）（特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約）に、受入番号ＮＭ０４／４１２５９で提出された。
【００３２】
Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ（マイコプラズマ）は、非常に縮小されたゲノムサイズを有し、これは、その限定された生合成能力および宿主に対するその寄生生物のような依存性を反映するものである。そのゲノムにおける限定された冗長度を考慮すると、経路の特定の成分のＮＴＧ変異生成は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ（マイコプラズマ）細胞の生存に対して著しい効果を有する可能性がある。ＮＴＧ変異生成は、ゲノム内でランダム変異（ヌクレオチドのトランジション（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）、トランスバージョン（ｔｒａｎｓｖｅｒｓｉｏｎ）、欠失または挿入）を生じる。これは、各々いずれか１以上の変異を含有するバリアントゲノムの集団を生じるであろう。おそらくは、このバリアントゲノムのうちの多くは、重大な遺伝子（１つまたは複数）が機能不全にされることに起因して、生存しないであろう。この変異が、生物が生長する能力に対して有害な効果を蒙らないのであれば、生存しているバリアント生物は、さらなる選択（例えば、温度選択）を受けることができる。ｔｓ１９の開発において、選択は、バリアント株が３３℃の温度で高力価まで成長する能力、および３９．５℃で成長する能力の低下に基づいていた。Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）ワクチン株ｔｓ１９と、親株（ＬＫＲ）との間の全ゲノム配列比較に基づいて、いくつかの変異（ヌクレオチド変化）が、ｔｓ１９のゲノム内で特定された。これらの変異としては、ヌクレオチド置換（トランジションおよびトランスバージョン）、ならびに欠失および挿入が挙げられた。
【００３３】
この変異は、ゲノム全体のあちこちに位置しており、ある範囲の発現された遺伝子、ならびに機能未知タンパク質（ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ）および非コード配列を含んでいる。表１は、塩基置換、欠失または挿入によって変異された公知の遺伝子を列挙する。これらの遺伝子は、それらの主な機能に従って分類されてきた。当業者なら、提供された参照配列（例えばＹＰ＿２７８９０１．１）と当該弱毒株の配列との間に差異があるかどうかを判定することにより、Ｍ．ｈｙｏ株が表１に列挙される遺伝子のうちの１つにおいて変異を含有するかどうかを検出する方法をすぐに理解するであろう。ＮＭ０４／４１２５９として寄託されたｔｓ１９は、表１に列挙される変異のうちのすべてを含む弱毒株である。
【００３４】
１つの実施形態では、当該弱毒株は、表１に列挙される変異のうちの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４またはすべてを含む。１つの実施形態では、当該弱毒株は、上記病原因子のうちの１つもしくは各々、ならびに／または炭水化物代謝に関与する遺伝子、および／もしくはリン脂質代謝に関与する遺伝子、および／もしくは補因子代謝に関与する遺伝子のうちの１つもしくは各々、ならびに／または転写または翻訳に関与する遺伝子のうちの１つもしくは各々、ならびに／または膜輸送に関与する遺伝子のうちの１つもしくは各々、ならびに／またはＤＮＡ複製、修復または代謝に関与する遺伝子のうちの１つもしくは各々、ならびに／または表１に列挙されるトランスポサーゼ遺伝子において変異を含む。
【００３５】
１つの実施形態では、当該弱毒株は、病原因子の各々において変異を含む。
【００３６】
【表１】
【表２】
【表３】
【００３７】
本願明細書に記載される菌種は、生きた温度感受性でかつ弱毒化された株であり、生ワクチンにおいて使用することができる。
【００３８】
生きた弱毒株は、菌種の病原特性を低下または「弱毒化」する条件下で培養された生きた菌種である。生ワクチンは、典型的には、不活化されたまたは死滅した微生物よりも耐久性のある免疫反応を引き起こす。
【００３９】
第１の態様に係るワクチン株は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）分離株の化学的変異によって生成されてもよい。この化学的変異は、特に、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）を用いた処理による変異生成（ＮｏｎａｍｕｒａおよびＩｍａｄａ（１９８２）、Ａｖｉａｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ２６； ７６３−７７５）を含む。温度感受性変異体細菌は、許容温度（３３℃）で成長しかつ非許容温度（３９．５℃）で成長できないという能力について選択されてもよい。ワクチンにおける使用のために、この温度感受性変異体は連続継代および希釈を経る。
【００４０】
第１の態様に係るＭｙｃｏｐｌａｓｍａ（マイコプラズマ）細菌ワクチン株は生存可能である（または生きている）。生存率は、一般に「生存のための能力」を意味し、より具体的には、好ましい条件下で生きること、発生分化すること、または発芽することのための能力を意味するために使用される。細菌細胞が適切なブロスまたは寒天培地のいずれかの中で成長することができる場合は、その細菌細胞は生存可能である。
【００４１】
ブダペスト条約に基づいてＮＭ０４／４１２５９として寄託された菌種は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ Ｇｒｏｕｐ（メルボルン大学マイコプラズマグループ）によって、オーストラリアのＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）分離株ＬＫＲ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｄｅｌａｉｄｅ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（アデレード大学マイコプラズマコレクション）から入手した）を３回（３×）インビトロで継代（改変Ｆｒｉｓｓブロス中１：４ ｖ／ｖ）してＬＫＲ Ｐ３を生成することによって生成された。次いでこのＬＫＲ Ｐ３分離株は、ＮＴＧ変異生成にかけられた。突然変異を誘発されたＬＫＲ Ｐ３は、３３℃（許容温度）および３９．５℃（非許容温度）で、寒天上で成長させた。３３℃では成長したが３９．５℃では成長しなかった変異体クローンが選択された。選択されたクローンは、数回のインビトロ継代および段階希釈を経た。継代の最終回で、選択されたクローン（ｔｓ１９）は、ブダペスト条約に基づき、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（国立標準研究所）（後に、Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（オーストラリア政府分析研究室）と呼ばれる）に凍結乾燥された培養物として寄託された。これらの試料は、保存の一週間後に再構成され、生存可能であることが見出された。
【００４２】
用語「インビトロでの連続継代」は、培地中での細菌の繰り返された継代の実施を指す。これには、ブロス培地に生きた細菌培養物を接種することが伴い、この生きた細菌培養物には、適切な温度でインキュベーションするためのいくらかの時間が与えられる。次いで、インキュベーションした培養物の一部は、新しい滅菌された培養物を接種するために使用され、今度は、この新しい滅菌された培養物に、インキュベーションするためのいくらかの時間が与えられる。このサイクルが続けられ、所望の数の継代が成し遂げられる。成長および再接種の各回は、一代継代と呼ばれる。
【００４３】
第３の態様は、第１の態様の菌種と、Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）増殖培地、滅菌水または滅菌された等張性生理食塩水などの担体とを含むワクチンを提供する。
【００４４】
ワクチンは、特定の疾患への免疫を確立するかまたは改善する生物学的調製物である。ワクチンは、予防的（例えば、病原体による将来の感染の効果を防止または改善するため）、または治療的（例えば、感染を処置するため）であることができる。第２の態様のワクチンは、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）によって引き起こされる疾患に対して予防的である。
【００４５】
上記適切な担体は、当業者にとっては明らかであろうし、主に投与経路に依存することになろう。当該ワクチンは、１以上の付加的な成分（懸濁剤、安定剤、または分散剤が挙げられるが、これらに限定されない）をさらに含んでもよい。
【００４６】
当該ワクチンの中に存在してもよいさらに付加的な構成成分は、佐剤、防腐剤、化学的安定剤、または他の抗原タンパク質である。典型的には、安定剤、佐剤、および防腐剤は、標的動物における有効性のための最良の製剤化（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）を確定する（ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ）ように最適化される。適切な例示的な防腐剤としては、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン類、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、およびパラクロロフェノールが挙げられる。使用されてもよい適切な安定化成分としては、例えば、カザミノ酸、スクロース、ゼラチン、フェノールレッド、Ｎ−Ｚアミン、リン酸一カリウム、ラクトース、ラクトアルブミン加水分解生成物、および粉乳が挙げられる。白血球を誘引するかまたは免疫応答を増進させるために、従来の佐剤が使用される。このような佐剤としては、とりわけ、ＭＰＬ（商標）（３−Ｏ−脱アシル化脱アシル化モノホスホリルリピドＡ；ＲＩＢＩ ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．（リビ・イムノケム・リサーチ社）、モンタナ州、ハミルトン（Ｈａｍｉｌｔｏｎ））、鉱油および水、水酸化アルミニウム、アンフィジェン（Ａｍｐｈｉｇｅｎ）、アブリジン（Ａｖｒｉｄｉｎｅ）、Ｌ１２１／スクアレン、Ｄ−ラクチド−ポリラクチド／グリコシド、プルロニックポリオール（ｐｌｕｒｏｎｉｃ ｐｌｙｏｉｓ）、ムラミルジペプチド、死滅したＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ（ボルデテラ）、サポニン、Ｑｕｉｌ ＡまたはＳｔｉｉｔｉｕｌｏｎ（商標） ＱＳ−２１（Ａｑｕｉｌａ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（アクイラ・バイオファーマシューティカルズ社）、マサチューセッツ州、フレーミングハム（Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ）など）およびコレラ毒素（野生型または変異型のいずれかにあるもの、例えば、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９９／２２５２０号に従って、アミノ酸位置２９にあるグルタミン酸が、別のアミノ酸、好ましくはヒスチジンによって置き換えられているもの）が挙げられる。
【００４７】
１つの実施形態では、当該ワクチンは、注入されても、注入の部位での有害反応または望まれない反応、例えば、皮膚刺激作用、腫脹、発疹、壊死、皮膚感作がほとんどないか、またはまったくない。
【００４８】
第４の態様における本発明は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）によって引き起こされる疾患から防御することに関する。第３の態様のワクチンは、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）によって引き起こされる疾患に対して予防的である。
【００４９】
本願明細書中で言及される場合の「予防」または「予防的」または「防止的」治療または「〜から防御すること」は、感染が発生しないようにすること、またはＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）によって引き起こされる疾患の発生もしくは重症度を妨げるかもしくはそれらから守るかもしくは防御することを包含し、これは、ある疾患に感染しやすい可能性があるが、まだその疾患に罹っているとは診断されていない対象において、その疾患の症候または特徴の重症度を防止すること、防御することまたは軽減することを包含する。また、「予防」または「予防的」または「防止的」治療または「〜から防御すること」は、感染の期間を短くすることまたは症候の発生率を下げること、および何らかの病変のサイズを減少させることを包含する。
【００５０】
本願明細書で使用する場合の「予防」は、疾患の防止全体または疾患の程度または症候の軽減に及ぶ。また「予防」は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｍｏｎｉａ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）の伝染の軽減もしくは阻害、または細菌が宿主に定着することを防止すること、または他のＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｍｏｎｉａ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）株または他の感染病原体による二次感染からの防御を指す。
【００５１】
第３の態様のワクチンは、例えば、液体、粉末、エアロゾル、錠剤、カプセル、腸溶性の被覆錠剤またはカプセル、または座薬の形態での、ブタへの投与のために調製されてもよい。投与経路としては、非経口投与、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、局所投与、鼻腔内投与、肺内投与、直腸投与、膣内投与などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５２】
好ましい実施形態では、当該ワクチンは、例えば鼻腔内投与、エアロゾル投与または口または鼻による吸入による投与によって、気道に投与するために製剤化される。Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）に対する防御免疫の本質は、循環抗体からではなく、疾患を防止することにおける局所（肺）免疫および細胞性免疫であってもよいので、この投与経路は好ましい。気道へのワクチンの提示は、局所免疫応答を刺激する可能性がある。それゆえ、当該ワクチンの局所的な投与は、より有効である可能性がある。さらには、当該ワクチンを囲まれた家畜小屋または空間の中で投与すること（粗スプレーによる大量投与（ｃｏａｒｓｅ ｓｐｒａｙ ｍａｓｓ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ））およびブタに当該ワクチンを吸入させることにより、多数の動物をワクチン接種することに伴う労力は少なくなる。エアロゾルワクチン接種（またはスプレーワクチン接種（ｓｐｒａｙ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ））は、特定の疾患に対して家禽を有効にワクチン接種するために、現在、商業ベースで使用されており、本発明の実施例で、ブタをワクチン接種するのに適していることが示された。
【００５３】
鼻腔内投与は、鼻孔または鼻部を介したあらゆる投与に及ぶ。当該ワクチンは、溶液、懸濁液または乾燥粉末として鼻腔に付与される。溶液および懸濁液は、例えばピペット、点滴器またはスプレー、任意にエアロゾルスプレーを使用して鼻腔内に投与されてもよい。乾燥粉末は、吸入によって鼻腔内に投与されてもよい。
【００５４】
エアロゾル投与は、ガスの中の微細な固体粒子または液滴の懸濁物としての当該ワクチンの投与を指す。
【００５５】
吸入（吸気としても知られる）は、外部環境からの、気道を通っての、および肺の中の肺胞の中への空気の移動である。
【００５６】
治療的に用いられるべきワクチンの有効用量は、例えば治療目的、投与経路、およびブタの状態に依存することになる。
【００５７】
当該ワクチンについての投与量レベルは、通常、１用量あたり、１ｍＬあたり約１０４〜１０８の色調変化単位（ｃｏｌｏｕｒ ｃｈａｎｇｉｎｇ ｕｎｉｔｓ、ＣＣＵ）、好ましくは１用量あたり、１ｍＬあたり約１０５〜１０７ＣＣＵの程度にあるであろう。
【００５８】
しかしながら、いずれかの特定のブタ類動物についての具体的な用量レベルは、用いられる具体的な化合物の活性、年齢、体重、全般的な健康状態、性別、食習慣、投与の時期および投与経路を含めた様々な要因に依存することになるということは理解されたい。
【００５９】
有効用量の選択および増大方向または減少方向の調整は、当該技術分野の技術の範囲内である。
【００６０】
好ましい実施形態では、当該ワクチンは、エアロゾルによりまたは吸入により、鼻腔内に投与される。
【００６１】
用語「ブタ類」および「ブタ」は、本願明細書では交換可能に使用されて、子ブタ、成体の雌ブタ、若い雌ブタ、去勢ブタ、雄ブタおよびイノシシ科の仲間を指す。
【００６２】
本願明細書全体を通して、文脈と矛盾しない限り、語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変化形は、明記された要素もしくは整数または要素もしくは整数の群を内包することを意味するが、いずれの他の要素もしくは整数または要素もしくは整数の群の排除は意味しないと理解されたい。
【００６３】
本願明細書中で使用される場合、単数形「１つの（ａ、ａｎ）」および「その、当該（ｔｈｅ）」は、文脈と明らかに矛盾する場合を除いて、複数の態様を包含するということにも留意されたい。
【００６４】
本発明は明確さおよび理解を目的として少し詳しく説明されたが、本願明細書に記載される実施形態および方法に対する種々の改変および変更が、本願明細書に開示される本発明の技術思想の範囲から逸脱せずになされてもよいということは、当業者には明らかであろう。
【００６５】
本発明は、これより、以下の実施例を参照して詳細にさらに説明される。この実施例は、説明のためだけに提供され、特段の記載がない限り、限定するものであるとは意図されていない。従って、本発明は、本願明細書に提示される教示の結果として明らかになるいずれかおよびすべての変化形を包含する。
【実施例】
【００６６】
実施例１：ワクチン株の調製
オーストラリアのＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）分離株ＬＫＲは、典型的な流行性肺炎疾患を呈するブタの肺の、屠殺場検体である（ＬｌｏｙｄおよびＥｔｈｅｒｉｄｇｅ（１９８１）、Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｐａｔｈ． ９１：７７−８３）。この分離株を培養し、南オーストラリア州のＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｄｅｌａｉｄｅ（アデレード大学）のＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（マイコプラズマ・リファレンス・カルチャー・コレクション）で保存した。その後、この分離株の培養物は、ビクトリア州のＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ（メルボルン大学）のＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｒｏｕｐ（マイコプラズマグループ）によって得られた。
【００６７】
この培養物をインビトロで３回継代し、その後、これまでに記載された方法（ＮｏｎａｍｕｒａおよびＩｍａｄａ（１９８２）Ａｖｉａｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ２６：７６３−７７５）を使用して、２００ｍｇ／ｍＬのＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）を使用する変異生成にかけた。簡潔に言えば、Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）株ＬＫＲの培養物を対数増殖期後期まで成長させ、遠心分離によってペレット化した。この細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で洗浄し、ＮＴＧに曝した。この細胞をペレット化し、改変Ｆｒｉｉｓ培地（Ｆｒｉｉｓ，Ｎ．Ｆ． １９７５）中に再懸濁し、３３℃で４時間インキュベーションした。次いでこの培養物を０．４５μｍのフィルターに通し、適切な希釈を行い、一定分量を寒天プレートの上に置いて、３３℃でインキュベーションした。成長したコロニーを３ｍＬのブロスの中へとクローン化し、３３℃でインキュベーションした。このクローンのアンプルを−７０℃で保存し、各クローンの温度感受性を決定した。
【００６８】
３３℃および３９．５℃での二重の滴定およびインキュベーションを行うことにより、ｔｓ１９の温度感受性を判定した。力価は、典型的には、３３℃で＞１×１０８ＣＣＵ／ｍＬ、および３９．５℃で＜１×１０２ＣＣＵ／ｍＬである。
【００６９】
このｔｓ１９株を、ブダペスト条約に基づきＮＭ０４／４１２５９として寄託した。
【００７０】
標準的な技術を使用してｔｓ１９株およびＬＫＲ株を配列決定し、これにより、当該弱毒株が遺伝子的に特徴づけられることとなった。ｔｓ１９株は、そのマスター株と比べていくつかの遺伝子的変異を含有することが判明した。これらの変異を含有する遺伝子を表１で特定する。
【００７１】
実施例２：ワクチン調製
ワクチンを調製するために、ｔｓ１９の培養物を、酸による色調変化が観察されるまで、フェノールレッド（ｐＨ指示薬）を含有する改変Ｆｒｉｉｓ培地中、３３℃で成長させた。９６穴のマイクロタイタープレートを使用して、ワクチンを改変Ｆｒｉｉｓ培地中で滴定した。マイクロタイタープレートの１２列のうちの最初の１０列にわたって、一連の１０倍希釈を行った。最後の２レーンは接種しないまま残り、培地のみの（陰性）対照としての役割を果たした。６つまでのマイクロタイタープレートを、各滴定で使用した。
【００７２】
３週間までのインキュベーション後、色調変化について当該プレートを採点し、最確数（ＭＰＮ）を使用して平均力価を決定した。最終の平均力価は、１ｍＬあたりの色調変化単位（ＣＣＵ）として表される。
【００７３】
ｔｓ１９ワクチン培養物は、−７０℃〜−８０℃での長期の保存で、「湿潤凍結（ｗｅｔ ｆｒｏｚｅｎ）」型として保たれた。あるいは、ｔｓ１９ワクチン培養物は、凍結乾燥され（フリーズドライされ）、−２０℃での長期の保存で保たれた。
【００７４】
実施例３：ワクチンの安全性およびコロニー形成の研究
ｔｓ１９ワクチン株の安全性プロファイルを評価するために、研究を行った。この研究デザインは、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ（マイコプラズマ）を含まないブタ群から得た６週齢のブタの使用を必要とした。この研究は、ＣＳＩＲＯ（Ｃｏｍｍｏｎｗｅａｌｔｈ Ｓｅｒｕｍ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｏｒｇａｎｉｓａｔｉｏｎ（オーストラリア連邦科学産業研究機構）、オーストラリア、ビクトリア州、ウェロビー（Ｗｅｒｒｉｂｅｅ）で、ＰＣ２バイオセキュリティーレベルのもとで行った。合計２０匹のブタを、各１０匹のブタの２つの群に無作為に割り当てた（表２を参照）。
【００７５】
【表４】
【００７６】
当該ワクチンを鼻腔内経路を介して送達し、これにより当該ワクチンの粘膜提示についての安全性だけを試験した。群１（ワクチン接種をしていない対照）および群２（高過量でワクチン接種を受けたブタ）を、臨床所見のために５９日間保持した（表２）。
【００７７】
ワクチン接種の１日前に始めて、さらにワクチン接種後４日間、この安全性研究におけるすべてのブタを、直腸温について毎日２回モニターした。また、すべてのブタを、咳嗽、くしゃみ、呼吸困難および頻呼吸を含めた呼吸の徴候についてモニターした。すべてのブタを、顕微鏡的な肺病変および巨視的な肺病変について評価した。巨視的な肺病変は、Ｈａｎｎａｎら、１９８２の方法を使用して採点した。加えて、拭き取り検体試料を、ＰＣＲ分析のために鼻内、肺および気管から採取した。
【００７８】
また、各群からのブタを、ＰＣＲ技術を使用して、ワクチン接種後３週間、鼻腔中のＭ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）の存在について、試験した。最後に、ブタを、研究期間にわたって、体重増加についてモニターした。結果から、いずれのブタにも臨床徴候はまったく認められないということが示された。ワクチン接種を受けた群とワクチン接種をしていない対照群との間で、有意な体温上昇は検出されなかった。さらには、ワクチン接種を受けた群とワクチン接種をしていない対照群との間で、体重増加の有意差は認められなかった。剖検で、高過量群からの１０匹のうちの２匹のブタが、各々、流行性肺炎に典型的な小さい巨視的病変を有していた。さらなる病変は、肺組織の顕微鏡分析によって認められなかった。全体としては、温度感受性ワクチン株ｔｓ１９は、高過量においてさえも安全であるということが示された。
【００７９】
（Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）に特異的なプライマーを使用する）ＰＣＲ分析によって、ワクチン接種後３週間および８週間で、ワクチン接種を受けたブタの鼻孔中のＭ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）の存在が示された（図１を参照）。また、ＰＣＲ分析を使用するＭ．ｈｙｏｐｎｕｅｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）コロニー形成研究によっても、気管中（上部、中央部および下部領域のいずれか）、および集団として見たワクチン接種を受けたブタの気管の少なくとも６０％におけるＭ．ｈｙｏｐｎｕｅｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）の存在が示された（図２を参照）。これらの結果は、鼻孔および気管の孔でのｔｓ１９ワクチン株のコロニー形成を示す。
【００８０】
実施例４：ワクチンの有効性研究 抗原投与モデル − 防御を示す
ｔｓ１９ワクチン株の有効性を評価するために、研究を行った。この研究デザインは、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ（マイコプラズマ）を含まないブタ群から得た６週齢のブタの使用を必要とした。この研究は、ＣＳＩＲＯ（Ｃｏｍｍｏｎｗｅａｌｔｈ Ｓｅｒｕｍ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｏｒｇａｎｉｓａｔｉｏｎ（オーストラリア連邦科学産業研究機構）、オーストラリア、ビクトリア州、ウェロビー（Ｗｅｒｒｉｂｅｅ）で、ＰＣ２バイオセキュリティーレベルのもとで行った。合計５６匹のブタを、各ワクチン接種を受けた群について１２匹のブタの３群および対照群の各々について１０匹のブタに無作為に割り当てた（表３を参照）。
【００８１】
【表５】
【００８２】
当該ワクチンを鼻腔内経路を介して送達し、これにより当該ワクチンの粘膜提示についての有効性だけを試験した。ワクチン接種をせず、抗原投与をしない陰性群を除くすべての群を、ワクチン接種後２２日目に、Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）のオーストラリア野外分離株の鼻腔内投与によって抗原投与した。死後検査を、３日間（ワクチン接種後５７日目、５８日目および５９日目）にわたって行った。この研究全体を通して、すべての群を、咳嗽、くしゃみ、呼吸困難および頻呼吸を含めた呼吸の徴候について毎日モニターした。体重測定を、この研究の開始時および終了時に行った。ワクチン接種後２２日目に（かつ抗原投与に先立って）、ＰＣＲ分析のために鼻内拭き取り検体を採取し、各群から、Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）の存在について判定した。
【００８３】
結果から、試験したすべての群において、臨床徴候も体重増加の有意差も認められないということが示された。鼻内拭き取り検体分析から、抗原投与前の、ワクチン接種を受けたブタのうちの６０〜７０％において、ワクチン接種後２２日目に、Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）の存在が示された（図３を参照）。すべての偽ワクチン接種を受けた対照のブタは、ＰＣＲ分析によっては、Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）について陰性であった。剖検において、巨視的病変分析（Ｈａｎｎａｎら、１９８２）から、偽ワクチン接種を受けた対照群、ならびに１０６および１０７ＣＣＵ／ｍＬ／用量でワクチン接種を受けた群における病変の不存在が示された。１０８ＣＣＵ／ｍＬ／用量でワクチン接種を受けた１０匹のブタのうちの１匹は、小さい巨視的病変の存在を示した。しかしながら、ワクチン接種をしていないが抗原投与を受けた１０匹のブタのうちの４匹は、咳嗽およびくしゃみの臨床徴候を示した。剖検で、上記４匹のブタからの肺の検査から、Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）感染に典型的な巨視的な肺病変が示された。
【００８４】
全体としては、温度感受性ワクチン株ｔｓ１９は、Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）感染から防御することにおいて有効であるということが示された。
【００８５】
実施例５：異なる用量におけるワクチン有効性および市販の死菌ワクチンとの比較
４つの異なる用量におけるｔｓ１９ワクチン株の有効性を評価するために、研究を行った。この研究デザインは、３〜４週齢のｓｐｆブタの使用を必要とした。この研究は、Ｃｅｎｔｒｏ ｄｅ Ｎａｃｉｏｎａｌ ｄｅ Ｓｅｒｖｉｃｉｏｓ ｄｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｏ ｅｎ Ｓａｌｕｄ Ａｎｉｍａｌ（国立家畜衛生診断サービスセンター）、ＣＥＮＡＳＡ） − メキシコ、テカマック（Ｔｅｃａｍａｃ）にある政府機関の試験施設 − にあるＰＣ２施設の中で行った。合計７０匹のブタを、各々１０匹のブタを含む７つの群に無作為に割り当てた（表４）。
【００８６】
【表６】
【００８７】
４つの異なる用量のｔｓ１９ワクチン（１０３、１０４、１０５、１０６ＣＣＵ／ｍＬ）を、４つの別々の群のブタに鼻腔内経路によって送達した。５番目の群は２ｍＬの市販の不活化ワクチンを投与され、この不活化ワクチンは筋肉内経路によって送達された。陽性（ワクチン接種をしていないが抗原投与した）および陰性（ワクチン接種をせず、抗原投与をしない）群もこの研究の中に含めた。陰性対照群を除くすべての群を、２つの時間点で抗原投与した。第１の抗原投与は、ワクチン接種後２２日目に、Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）（アイオワ（ＩＯＷＡ）株１９４）という米国分離株を使用して鼻腔内投与によって行った。第２の抗原投与は、同じ抗原投与株を使用してワクチン接種後８４日目に行った。この研究全体を通して、すべての群を、咳嗽、くしゃみ、呼吸困難および頻呼吸を含めた臨床徴候について毎日モニターした。体重測定を、この研究の開始時および終了時に行った。
【００８８】
結果から、１０５日間の試験期間全体にわたって臨床徴候がないことが示された。陽性対照群とワクチン接種を受けた群の各々との間の体重成績についての分散分析から、１０５および１０６ＣＣＵ／ｍＬの用量のｔｓ１９は、陽性対照群と比較して有意な体重増加を示すということが示された（図４）。市販のワクチンでワクチン接種を受けた群は、陽性対照群と比較しても、体重増加の有意差をまったく示さなかった（図４、表５）。剖検で、巨視的な病変分析を、各群について行った。最小防御用量（ｍｉｎｉｍｕｍ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｄｏｓｅ）の決定についての基準は、肺病変の重症度の低下に関する７０％以上の防御指数（ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｉｎｄｅｘ）に基づいていた。ｔｓ１９についての最小防御用量は、１０４ＣＣＵ／ｍＬであると決定された。なぜなら７０％という防御指数は、肺病変の重症度の低下に関してはこの用量で達成されたからである（図５）。より高い用量のｔｓ１９（１０５および１０６ＣＣＵ／ｍＬ）も試験し、肺病変の重症度の低下に関しては、それぞれ８３％および８８％というＰＩを与えることを見出した（図６）。市販の不活化ワクチンはわずか３７％というＰＩしか成し遂げず、この値は、使用したｔｓ１９の最小用量（１０３ＣＣＵ／ｍＬ。これは６０％のＰＩを成し遂げた）よりもかなり低い。
【００８９】
【表７】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）株、このような株を含むワクチン、およびブタにおいてマイコプラズマ性肺炎から保護するためのこのようなワクチンの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）は、豚マイコプラズマ性肺炎（流行性肺炎（ＥＰ）とも呼ばれる）の病原体である。豚マイコプラズマ性肺炎は、世界中のブタ生産に影響を及ぼす最も一般的でかつ経済的に重要な呼吸器疾患のうちの１つである。この疾患は二次感染、高罹患率および低死亡率、低飼料要求率と関係し、１年あたり約１０億ドルと見積もられる全世界の経済的損失の原因となりうる。
【０００３】
ＥＰにおいては、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）細菌は、ブタの肺の中の上皮細胞の繊毛に付着し、健常な正常な繊毛を破壊して、平素無害菌（ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｓｔｉｃ ｏｒｇａｎｉｓｍｓ）がその呼吸器組織に定着することを可能にし、疾患を引き起こす。ひとたび定着すると、Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）はブタの肺に病変を引き起こす。
【０００４】
この疾患は非常に感染性が高く、伝染は、通常、感染した呼吸器分泌物、例えばくしゃみまたは咳嗽の際に鼻部または口から放出される液滴、との直接接触による。
【０００５】
Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）に対するいくつかのワクチンが、現在、存在する。ほとんどの現在のワクチンは約１０社によって提供されており、２２のワクチン銘柄が一価または二価／多価のいずれかとして登録されている。すべては、死滅したまたは不活化したＭ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）調製物である。
【０００６】
全細胞性の不活化したＭ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）ワクチンの例としては、ＲＥＳＰＩＳＵＲＥ（商標）およびＳＴＥＬＬＡＭＵＮＥ（商標）（Ｐｆｉｚｅｒ（ファイザー））、ＳＵＶＡＸＹＮ Ｍ．ＨＹＯ（商標）（Ｆｏｒｔ Ｄｏｄｇｅ（フォート・ドッジ））、ＨＹＯＲＥＳＰ（商標）（Ｍｅｒｉｅｌ（メリアル））、Ｍ＋ＰＡＣ（商標）（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ（シェリング・プラウ））およびＰＯＲＣＩＬＩＳ（商標）（Ｉｎｔｅｒｖｅｔ（インターベット））が挙げられる。
【０００７】
いくつかのワクチンはＥＰの重症度を低減できる一方で、入手できる全細胞性の死菌ワクチンまたは不活化ワクチンのうちで、Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）感染からの完全防御を提供するものはない。このため、より有効なワクチンについてのニーズがある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
流行性肺炎を防止するためのワクチン接種における使用に適したＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ニューモニエ、肺炎マイコプラズマ）の生きた株を提供することが、本発明の好ましい実施形態の目的である。
【０００９】
本願明細書で引用されるすべての引用文献（あらゆる特許または特許出願を含む）は、参照により本願明細書に援用する。いくつかの先行技術の刊行物が本願明細書中で言及されるが、この引用は、これらの文献のいずれかが当該技術分野における共通の一般的な知識の一部を形成するということを認めるものではない、ということは明確に理解されるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、全体として、ブタにおいて流行性肺炎から保護することにおいて有効である生ワクチンを生産するために使用することができる、生きた弱毒化されたＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）株を提供する。
【００１１】
第１の態様は、表１に列挙されている遺伝子のうちの少なくとも１つにおいて変異を含む弱毒化されたＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）ワクチン株を提供する。
【００１２】
１つの実施形態では、このワクチン株は、表１に列挙されている遺伝子のうちのすべてにおいて変異を含む。
【００１３】
１つの実施形態では、このワクチン株は温度感受性である。
【００１４】
弱毒ワクチンは一般に好都合である。なぜなら、弱毒ワクチンは、自然の形態にある感染病原体の関係する免疫原性決定因子のすべてを宿主の免疫系に提示し、そしてワクチン接種を受けた宿主の中で免疫剤が増殖することができるため、比較的少量のその免疫剤しか必要としないからである。弱毒化するための方法としては、毒性のある株を複数回継代すること、または照射もしくは化学物質への曝露が挙げられる。これらの方法は、ゲノムの中に変異を導入し、その変異が当該微生物を、毒性はより低いがまだ複製することができるものにするということが想定される。
【００１５】
これらのアプローチの短所は、これらのアプローチが、分子レベルで特徴づけられないランダム変異を導入するということである。また、関係づけられた温度感受性について選択することによるなど、弱毒化のために選択するための方法は、時間がかかることが多く、誤った結果をもたらすことが多い。というのも、温度感受性株は弱毒化されていないかもしれず、そして弱毒株は温度感受性でない必要があり、そして多大な試行錯誤を必要とするからである。加えて、この弱毒株は、さらなる変異を受けて病原性に戻る可能性がある。
【００１６】
マイコプラズマ性肺炎に対する生ワクチンを提供することを目的として、本発明者らは、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）分離株を化学的な変異生成にかけて、温度感受性であるクローンを選択した。本発明者らは、生きた変異体細菌を凍結乾燥し、そして、その細菌が一週間後に再構成することができ、連続継代後も生存能力があり続け、従ってＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）についてのワクチン株として適切である、ということを見出した。このワクチン株およびマスター株は配列決定され、その配列の比較から、そのワクチンにおいて変異している遺伝子を特定した。これにより、その弱毒株の遺伝子的特徴づけが可能となった。
【００１７】
第２の態様は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（国立標準研究所）（オーストラリア）に受入番号ＮＭ０４／４１２５９で寄託された弱毒化されたＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）ワクチン株を提供する。この株は温度感受性でありかつ弱毒化されている。
【００１８】
この第２の態様のワクチン株は、防御免疫を与えることは示されるが、この株は連続継代にもかかわらず病原性への復帰変異は示さない（データは示さず）。
【００１９】
第３の態様は、第１または第２の態様のワクチン株を製造する方法であって、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）の適切な出発分離株を化学的変異生成にかける工程と、連続継代後に生存率を保持する変異体を選択する工程とを含む方法を含む。
【００２０】
１つの実施形態では、変異体は、温度感受性に基づき最初に選択される。
【００２１】
第４の態様は、第１または第２の態様のＭ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）ワクチン株と、担体、任意に佐剤，および／または任意に少なくとも１つの付加的な感染病原体とを含むワクチン組成物であって、免疫量の当該ワクチンはＭ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）によって引き起こされる疾患に対する防御免疫を誘発することができる、ワクチン組成物を提供する。この感染病原体は、ウイルス、細菌、真菌または寄生生物であってもよい。
【００２２】
第５の態様は、ブタ類動物においてＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）によって引き起こされる疾患から防御するための方法であって、免疫量の第４の態様のワクチン組成物をブタ類動物に投与することを含む方法を提供する。
【００２３】
第６の態様は、ブタ類動物においてＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）によって引き起こされる疾患から防御するための、第４の態様のワクチンを提供する。
【００２４】
第７の態様は、第４の態様に係るワクチンを製造する方法であって、第１または第２の態様のＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）株を担体、任意に佐剤および／または任意に少なくとも１つの付加的な感染病原体と合わせる工程を含む方法を提供する。感染病原体は、ウイルス、細菌、真菌または寄生生物であってもよい。
【００２５】
第８の態様は、ブタ類動物においてＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）によって引き起こされる疾患から防御するための医薬の製造における、第１または第２の態様のＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）ワクチン株の使用を提供する。
【００２６】
第４から第７の態様の実施形態では、「Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）によって引き起こされる疾患」は、流行性肺炎またはブタマイコプラズマ性肺炎である。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】高過量でワクチン接種を受けたブタにおけるｔｓ１９ワクチン株の鼻内コロニー形成。
【図２】ｔｓ１９ワクチンを用いて高過量でワクチン接種を受けたブタにおける、ワクチン接種後の日数（ＤＰＶ）５９日での気管でのコロニー形成。
【図３】種々の用量でｔｓ１９ワクチン株を用いてワクチン接種を受けたブタにおける鼻内コロニー形成。
【図４】研究期間（１０５日間）にわたる全体重の差。
【図５】ｔｓ１９についての最小防御用量の決定。
【図６】肺病変の重症度の軽減に基づくｔｓ１９および市販のワクチンの防御指数。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）株「ＬＫＲ」は、もともと、屠殺場検体から単離された（ＬｌｏｙｄおよびＥｔｈｅｒｉｄｇｅ １９８１、Ｊ ｏｆ Ｃｏｍｐ Ｐａｔｈ ９１：７７−８３）。この生物は、無細胞培地中で約１０回継代される前に、実験的に感染したブタから再単離され、クローン単離に到達した（ＣＳＩＲＯ（オーストラリア連邦科学産業研究機構）、ビクトリア州（Ｖｉｃｔｏｒｉａ））。次いでこのクローンは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｄｅｌａｉｄｅ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（アデレード大学マイコプラズマコレクション）、南オーストラリア州に提出された。次いでこのＬＫＲ分離株は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ（メルボルン大学獣医学科）（マイコプラズマグループ）によって得られ、そこでは、このＬＫＲ分離株は保存のために改変Ｆｒｉｓｓブロス中での３回のインビトロでの継代を経た。保存されたバイアルは、「ＬＫＲ Ｐ３ ２９／５／９７」と名付けられた。このクローンは親株を表す。
【００２９】
ＬＫＲ Ｐ３ ２９／５／９７はインビトロで継代され、これまでに記載された方法（ＮｏｎａｍｕｒａおよびＩｍａｄａ（１９８２） Ａｖｉａｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ２６：７６３−７７５）を使用してＮＴＧ変異生成（２００ｍｇ／ｍＬ）にかけられた。温度感受性クローン（「ｔｓ−１９」）は、寒天プレートから選択され、３ｍＬの改変Ｆｒｉｓｓブロス中で培養された。このクローンについての継代数は、「Ｐ０」と名付けられ、その後、改変Ｆｒｉｓｓブロス中での継代１回あたり１：４ ｖ／ｖ希釈でさらに４回のインビトロでの継代を経た。最終継代レベルを「ＬＫＲ ｔｓ−１９ Ｐ４ ＭＳ」と名付けた。
【００３０】
ＬＫＲ ｔｓ−１９ Ｐ４ ＭＳは、改変Ｆｒｉｓｓブロス中での何回かのインビトロでの希釈継代を経て、３．２×１０−２１の希釈に到達した。この最終変異体クローンを「ＬＫＲ ｔｓ−１９ ３．２×１０−２１」と名付けた。
【００３１】
ＬＫＲ ｔｓ−１９ ３．２×１０−２１は凍結乾燥され、Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（オーストラリア政府分析研究室）（特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約）に、受入番号ＮＭ０４／４１２５９で提出された。
【００３２】
Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ（マイコプラズマ）は、非常に縮小されたゲノムサイズを有し、これは、その限定された生合成能力および宿主に対するその寄生生物のような依存性を反映するものである。そのゲノムにおける限定された冗長度を考慮すると、経路の特定の成分のＮＴＧ変異生成は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ（マイコプラズマ）細胞の生存に対して著しい効果を有する可能性がある。ＮＴＧ変異生成は、ゲノム内でランダム変異（ヌクレオチドのトランジション（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）、トランスバージョン（ｔｒａｎｓｖｅｒｓｉｏｎ）、欠失または挿入）を生じる。これは、各々いずれか１以上の変異を含有するバリアントゲノムの集団を生じるであろう。おそらくは、このバリアントゲノムのうちの多くは、重大な遺伝子（１つまたは複数）が機能不全にされることに起因して、生存しないであろう。この変異が、生物が生長する能力に対して有害な効果を蒙らないのであれば、生存しているバリアント生物は、さらなる選択（例えば、温度選択）を受けることができる。ｔｓ１９の開発において、選択は、バリアント株が３３℃の温度で高力価まで成長する能力、および３９．５℃で成長する能力の低下に基づいていた。Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）ワクチン株ｔｓ１９と、親株（ＬＫＲ）との間の全ゲノム配列比較に基づいて、いくつかの変異（ヌクレオチド変化）が、ｔｓ１９のゲノム内で特定された。これらの変異としては、ヌクレオチド置換（トランジションおよびトランスバージョン）、ならびに欠失および挿入が挙げられた。
【００３３】
この変異は、ゲノム全体のあちこちに位置しており、ある範囲の発現された遺伝子、ならびに機能未知タンパク質（ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ）および非コード配列を含んでいる。表１は、塩基置換、欠失または挿入によって変異された公知の遺伝子を列挙する。これらの遺伝子は、それらの主な機能に従って分類されてきた。当業者なら、提供された参照配列（例えばＹＰ＿２７８９０１．１）と当該弱毒株の配列との間に差異があるかどうかを判定することにより、Ｍ．ｈｙｏ株が表１に列挙される遺伝子のうちの１つにおいて変異を含有するかどうかを検出する方法をすぐに理解するであろう。ＮＭ０４／４１２５９として寄託されたｔｓ１９は、表１に列挙される変異のうちのすべてを含む弱毒株である。
【００３４】
１つの実施形態では、当該弱毒株は、表１に列挙される変異のうちの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４またはすべてを含む。１つの実施形態では、当該弱毒株は、上記病原因子のうちの１つもしくは各々、ならびに／または炭水化物代謝に関与する遺伝子、および／もしくはリン脂質代謝に関与する遺伝子、および／もしくは補因子代謝に関与する遺伝子のうちの１つもしくは各々、ならびに／または転写または翻訳に関与する遺伝子のうちの１つもしくは各々、ならびに／または膜輸送に関与する遺伝子のうちの１つもしくは各々、ならびに／またはＤＮＡ複製、修復または代謝に関与する遺伝子のうちの１つもしくは各々、ならびに／または表１に列挙されるトランスポサーゼ遺伝子において変異を含む。
【００３５】
１つの実施形態では、当該弱毒株は、病原因子の各々において変異を含む。
【００３６】
【表１】
【表２】
【表３】
【００３７】
本願明細書に記載される菌種は、生きた温度感受性でかつ弱毒化された株であり、生ワクチンにおいて使用することができる。
【００３８】
生きた弱毒株は、菌種の病原特性を低下または「弱毒化」する条件下で培養された生きた菌種である。生ワクチンは、典型的には、不活化されたまたは死滅した微生物よりも耐久性のある免疫反応を引き起こす。
【００３９】
第１の態様に係るワクチン株は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）分離株の化学的変異によって生成されてもよい。この化学的変異は、特に、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）を用いた処理による変異生成（ＮｏｎａｍｕｒａおよびＩｍａｄａ（１９８２）、Ａｖｉａｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ２６； ７６３−７７５）を含む。温度感受性変異体細菌は、許容温度（３３℃）で成長しかつ非許容温度（３９．５℃）で成長できないという能力について選択されてもよい。ワクチンにおける使用のために、この温度感受性変異体は連続継代および希釈を経る。
【００４０】
第１の態様に係るＭｙｃｏｐｌａｓｍａ（マイコプラズマ）細菌ワクチン株は生存可能である（または生きている）。生存率は、一般に「生存のための能力」を意味し、より具体的には、好ましい条件下で生きること、発生分化すること、または発芽することのための能力を意味するために使用される。細菌細胞が適切なブロスまたは寒天培地のいずれかの中で成長することができる場合は、その細菌細胞は生存可能である。
【００４１】
ブダペスト条約に基づいてＮＭ０４／４１２５９として寄託された菌種は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ Ｇｒｏｕｐ（メルボルン大学マイコプラズマグループ）によって、オーストラリアのＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）分離株ＬＫＲ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｄｅｌａｉｄｅ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（アデレード大学マイコプラズマコレクション）から入手した）を３回（３×）インビトロで継代（改変Ｆｒｉｓｓブロス中１：４ ｖ／ｖ）してＬＫＲ Ｐ３を生成することによって生成された。次いでこのＬＫＲ Ｐ３分離株は、ＮＴＧ変異生成にかけられた。突然変異を誘発されたＬＫＲ Ｐ３は、３３℃（許容温度）および３９．５℃（非許容温度）で、寒天上で成長させた。３３℃では成長したが３９．５℃では成長しなかった変異体クローンが選択された。選択されたクローンは、数回のインビトロ継代および段階希釈を経た。継代の最終回で、選択されたクローン（ｔｓ１９）は、ブダペスト条約に基づき、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（国立標準研究所）（後に、Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（オーストラリア政府分析研究室）と呼ばれる）に凍結乾燥された培養物として寄託された。これらの試料は、保存の一週間後に再構成され、生存可能であることが見出された。
【００４２】
用語「インビトロでの連続継代」は、培地中での細菌の繰り返された継代の実施を指す。これには、ブロス培地に生きた細菌培養物を接種することが伴い、この生きた細菌培養物には、適切な温度でインキュベーションするためのいくらかの時間が与えられる。次いで、インキュベーションした培養物の一部は、新しい滅菌された培養物を接種するために使用され、今度は、この新しい滅菌された培養物に、インキュベーションするためのいくらかの時間が与えられる。このサイクルが続けられ、所望の数の継代が成し遂げられる。成長および再接種の各回は、一代継代と呼ばれる。
【００４３】
第３の態様は、第１の態様の菌種と、Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）増殖培地、滅菌水または滅菌された等張性生理食塩水などの担体とを含むワクチンを提供する。
【００４４】
ワクチンは、特定の疾患への免疫を確立するかまたは改善する生物学的調製物である。ワクチンは、予防的（例えば、病原体による将来の感染の効果を防止または改善するため）、または治療的（例えば、感染を処置するため）であることができる。第２の態様のワクチンは、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）によって引き起こされる疾患に対して予防的である。
【００４５】
上記適切な担体は、当業者にとっては明らかであろうし、主に投与経路に依存することになろう。当該ワクチンは、１以上の付加的な成分（懸濁剤、安定剤、または分散剤が挙げられるが、これらに限定されない）をさらに含んでもよい。
【００４６】
当該ワクチンの中に存在してもよいさらに付加的な構成成分は、佐剤、防腐剤、化学的安定剤、または他の抗原タンパク質である。典型的には、安定剤、佐剤、および防腐剤は、標的動物における有効性のための最良の製剤化（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）を確定する（ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ）ように最適化される。適切な例示的な防腐剤としては、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン類、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、およびパラクロロフェノールが挙げられる。使用されてもよい適切な安定化成分としては、例えば、カザミノ酸、スクロース、ゼラチン、フェノールレッド、Ｎ−Ｚアミン、リン酸一カリウム、ラクトース、ラクトアルブミン加水分解生成物、および粉乳が挙げられる。白血球を誘引するかまたは免疫応答を増進させるために、従来の佐剤が使用される。このような佐剤としては、とりわけ、ＭＰＬ（商標）（３−Ｏ−脱アシル化脱アシル化モノホスホリルリピドＡ；ＲＩＢＩ ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．（リビ・イムノケム・リサーチ社）、モンタナ州、ハミルトン（Ｈａｍｉｌｔｏｎ））、鉱油および水、水酸化アルミニウム、アンフィジェン（Ａｍｐｈｉｇｅｎ）、アブリジン（Ａｖｒｉｄｉｎｅ）、Ｌ１２１／スクアレン、Ｄ−ラクチド−ポリラクチド／グリコシド、プルロニックポリオール（ｐｌｕｒｏｎｉｃ ｐｌｙｏｉｓ）、ムラミルジペプチド、死滅したＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ（ボルデテラ）、サポニン、Ｑｕｉｌ ＡまたはＳｔｉｉｔｉｕｌｏｎ（商標） ＱＳ−２１（Ａｑｕｉｌａ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（アクイラ・バイオファーマシューティカルズ社）、マサチューセッツ州、フレーミングハム（Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ）など）およびコレラ毒素（野生型または変異型のいずれかにあるもの、例えば、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９９／２２５２０号に従って、アミノ酸位置２９にあるグルタミン酸が、別のアミノ酸、好ましくはヒスチジンによって置き換えられているもの）が挙げられる。
【００４７】
１つの実施形態では、当該ワクチンは、注入されても、注入の部位での有害反応または望まれない反応、例えば、皮膚刺激作用、腫脹、発疹、壊死、皮膚感作がほとんどないか、またはまったくない。
【００４８】
第４の態様における本発明は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）によって引き起こされる疾患から防御することに関する。第３の態様のワクチンは、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）によって引き起こされる疾患に対して予防的である。
【００４９】
本願明細書中で言及される場合の「予防」または「予防的」または「防止的」治療または「〜から防御すること」は、感染が発生しないようにすること、またはＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）によって引き起こされる疾患の発生もしくは重症度を妨げるかもしくはそれらから守るかもしくは防御することを包含し、これは、ある疾患に感染しやすい可能性があるが、まだその疾患に罹っているとは診断されていない対象において、その疾患の症候または特徴の重症度を防止すること、防御することまたは軽減することを包含する。また、「予防」または「予防的」または「防止的」治療または「〜から防御すること」は、感染の期間を短くすることまたは症候の発生率を下げること、および何らかの病変のサイズを減少させることを包含する。
【００５０】
本願明細書で使用する場合の「予防」は、疾患の防止全体または疾患の程度または症候の軽減に及ぶ。また「予防」は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｍｏｎｉａ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）の伝染の軽減もしくは阻害、または細菌が宿主に定着することを防止すること、または他のＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｍｏｎｉａ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）株または他の感染病原体による二次感染からの防御を指す。
【００５１】
第３の態様のワクチンは、例えば、液体、粉末、エアロゾル、錠剤、カプセル、腸溶性の被覆錠剤またはカプセル、または座薬の形態での、ブタへの投与のために調製されてもよい。投与経路としては、非経口投与、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、局所投与、鼻腔内投与、肺内投与、直腸投与、膣内投与などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５２】
好ましい実施形態では、当該ワクチンは、例えば鼻腔内投与、エアロゾル投与または口または鼻による吸入による投与によって、気道に投与するために製剤化される。Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）に対する防御免疫の本質は、循環抗体からではなく、疾患を防止することにおける局所（肺）免疫および細胞性免疫であってもよいので、この投与経路は好ましい。気道へのワクチンの提示は、局所免疫応答を刺激する可能性がある。それゆえ、当該ワクチンの局所的な投与は、より有効である可能性がある。さらには、当該ワクチンを囲まれた家畜小屋または空間の中で投与すること（粗スプレーによる大量投与（ｃｏａｒｓｅ ｓｐｒａｙ ｍａｓｓ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ））およびブタに当該ワクチンを吸入させることにより、多数の動物をワクチン接種することに伴う労力は少なくなる。エアロゾルワクチン接種（またはスプレーワクチン接種（ｓｐｒａｙ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ））は、特定の疾患に対して家禽を有効にワクチン接種するために、現在、商業ベースで使用されており、本発明の実施例で、ブタをワクチン接種するのに適していることが示された。
【００５３】
鼻腔内投与は、鼻孔または鼻部を介したあらゆる投与に及ぶ。当該ワクチンは、溶液、懸濁液または乾燥粉末として鼻腔に付与される。溶液および懸濁液は、例えばピペット、点滴器またはスプレー、任意にエアロゾルスプレーを使用して鼻腔内に投与されてもよい。乾燥粉末は、吸入によって鼻腔内に投与されてもよい。
【００５４】
エアロゾル投与は、ガスの中の微細な固体粒子または液滴の懸濁物としての当該ワクチンの投与を指す。
【００５５】
吸入（吸気としても知られる）は、外部環境からの、気道を通っての、および肺の中の肺胞の中への空気の移動である。
【００５６】
治療的に用いられるべきワクチンの有効用量は、例えば治療目的、投与経路、およびブタの状態に依存することになる。
【００５７】
当該ワクチンについての投与量レベルは、通常、１用量あたり、１ｍＬあたり約１０４〜１０８の色調変化単位（ｃｏｌｏｕｒ ｃｈａｎｇｉｎｇ ｕｎｉｔｓ、ＣＣＵ）、好ましくは１用量あたり、１ｍＬあたり約１０５〜１０７ＣＣＵの程度にあるであろう。
【００５８】
しかしながら、いずれかの特定のブタ類動物についての具体的な用量レベルは、用いられる具体的な化合物の活性、年齢、体重、全般的な健康状態、性別、食習慣、投与の時期および投与経路を含めた様々な要因に依存することになるということは理解されたい。
【００５９】
有効用量の選択および増大方向または減少方向の調整は、当該技術分野の技術の範囲内である。
【００６０】
好ましい実施形態では、当該ワクチンは、エアロゾルによりまたは吸入により、鼻腔内に投与される。
【００６１】
用語「ブタ類」および「ブタ」は、本願明細書では交換可能に使用されて、子ブタ、成体の雌ブタ、若い雌ブタ、去勢ブタ、雄ブタおよびイノシシ科の仲間を指す。
【００６２】
本願明細書全体を通して、文脈と矛盾しない限り、語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変化形は、明記された要素もしくは整数または要素もしくは整数の群を内包することを意味するが、いずれの他の要素もしくは整数または要素もしくは整数の群の排除は意味しないと理解されたい。
【００６３】
本願明細書中で使用される場合、単数形「１つの（ａ、ａｎ）」および「その、当該（ｔｈｅ）」は、文脈と明らかに矛盾する場合を除いて、複数の態様を包含するということにも留意されたい。
【００６４】
本発明は明確さおよび理解を目的として少し詳しく説明されたが、本願明細書に記載される実施形態および方法に対する種々の改変および変更が、本願明細書に開示される本発明の技術思想の範囲から逸脱せずになされてもよいということは、当業者には明らかであろう。
【００６５】
本発明は、これより、以下の実施例を参照して詳細にさらに説明される。この実施例は、説明のためだけに提供され、特段の記載がない限り、限定するものであるとは意図されていない。従って、本発明は、本願明細書に提示される教示の結果として明らかになるいずれかおよびすべての変化形を包含する。
【実施例】
【００６６】
実施例１：ワクチン株の調製
オーストラリアのＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）分離株ＬＫＲは、典型的な流行性肺炎疾患を呈するブタの肺の、屠殺場検体である（ＬｌｏｙｄおよびＥｔｈｅｒｉｄｇｅ（１９８１）、Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｐａｔｈ． ９１：７７−８３）。この分離株を培養し、南オーストラリア州のＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｄｅｌａｉｄｅ（アデレード大学）のＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（マイコプラズマ・リファレンス・カルチャー・コレクション）で保存した。その後、この分離株の培養物は、ビクトリア州のＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ（メルボルン大学）のＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｒｏｕｐ（マイコプラズマグループ）によって得られた。
【００６７】
この培養物をインビトロで３回継代し、その後、これまでに記載された方法（ＮｏｎａｍｕｒａおよびＩｍａｄａ（１９８２）Ａｖｉａｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ２６：７６３−７７５）を使用して、２００ｍｇ／ｍＬのＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）を使用する変異生成にかけた。簡潔に言えば、Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）株ＬＫＲの培養物を対数増殖期後期まで成長させ、遠心分離によってペレット化した。この細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で洗浄し、ＮＴＧに曝した。この細胞をペレット化し、改変Ｆｒｉｉｓ培地（Ｆｒｉｉｓ，Ｎ．Ｆ． １９７５）中に再懸濁し、３３℃で４時間インキュベーションした。次いでこの培養物を０．４５μｍのフィルターに通し、適切な希釈を行い、一定分量を寒天プレートの上に置いて、３３℃でインキュベーションした。成長したコロニーを３ｍＬのブロスの中へとクローン化し、３３℃でインキュベーションした。このクローンのアンプルを−７０℃で保存し、各クローンの温度感受性を決定した。
【００６８】
３３℃および３９．５℃での二重の滴定およびインキュベーションを行うことにより、ｔｓ１９の温度感受性を判定した。力価は、典型的には、３３℃で＞１×１０８ＣＣＵ／ｍＬ、および３９．５℃で＜１×１０２ＣＣＵ／ｍＬである。
【００６９】
このｔｓ１９株を、ブダペスト条約に基づきＮＭ０４／４１２５９として寄託した。
【００７０】
標準的な技術を使用してｔｓ１９株およびＬＫＲ株を配列決定し、これにより、当該弱毒株が遺伝子的に特徴づけられることとなった。ｔｓ１９株は、そのマスター株と比べていくつかの遺伝子的変異を含有することが判明した。これらの変異を含有する遺伝子を表１で特定する。
【００７１】
実施例２：ワクチン調製
ワクチンを調製するために、ｔｓ１９の培養物を、酸による色調変化が観察されるまで、フェノールレッド（ｐＨ指示薬）を含有する改変Ｆｒｉｉｓ培地中、３３℃で成長させた。９６穴のマイクロタイタープレートを使用して、ワクチンを改変Ｆｒｉｉｓ培地中で滴定した。マイクロタイタープレートの１２列のうちの最初の１０列にわたって、一連の１０倍希釈を行った。最後の２レーンは接種しないまま残り、培地のみの（陰性）対照としての役割を果たした。６つまでのマイクロタイタープレートを、各滴定で使用した。
【００７２】
３週間までのインキュベーション後、色調変化について当該プレートを採点し、最確数（ＭＰＮ）を使用して平均力価を決定した。最終の平均力価は、１ｍＬあたりの色調変化単位（ＣＣＵ）として表される。
【００７３】
ｔｓ１９ワクチン培養物は、−７０℃〜−８０℃での長期の保存で、「湿潤凍結（ｗｅｔ ｆｒｏｚｅｎ）」型として保たれた。あるいは、ｔｓ１９ワクチン培養物は、凍結乾燥され（フリーズドライされ）、−２０℃での長期の保存で保たれた。
【００７４】
実施例３：ワクチンの安全性およびコロニー形成の研究
ｔｓ１９ワクチン株の安全性プロファイルを評価するために、研究を行った。この研究デザインは、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ（マイコプラズマ）を含まないブタ群から得た６週齢のブタの使用を必要とした。この研究は、ＣＳＩＲＯ（Ｃｏｍｍｏｎｗｅａｌｔｈ Ｓｅｒｕｍ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｏｒｇａｎｉｓａｔｉｏｎ（オーストラリア連邦科学産業研究機構）、オーストラリア、ビクトリア州、ウェロビー（Ｗｅｒｒｉｂｅｅ）で、ＰＣ２バイオセキュリティーレベルのもとで行った。合計２０匹のブタを、各１０匹のブタの２つの群に無作為に割り当てた（表２を参照）。
【００７５】
【表４】
【００７６】
当該ワクチンを鼻腔内経路を介して送達し、これにより当該ワクチンの粘膜提示についての安全性だけを試験した。群１（ワクチン接種をしていない対照）および群２（高過量でワクチン接種を受けたブタ）を、臨床所見のために５９日間保持した（表２）。
【００７７】
ワクチン接種の１日前に始めて、さらにワクチン接種後４日間、この安全性研究におけるすべてのブタを、直腸温について毎日２回モニターした。また、すべてのブタを、咳嗽、くしゃみ、呼吸困難および頻呼吸を含めた呼吸の徴候についてモニターした。すべてのブタを、顕微鏡的な肺病変および巨視的な肺病変について評価した。巨視的な肺病変は、Ｈａｎｎａｎら、１９８２の方法を使用して採点した。加えて、拭き取り検体試料を、ＰＣＲ分析のために鼻内、肺および気管から採取した。
【００７８】
また、各群からのブタを、ＰＣＲ技術を使用して、ワクチン接種後３週間、鼻腔中のＭ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）の存在について、試験した。最後に、ブタを、研究期間にわたって、体重増加についてモニターした。結果から、いずれのブタにも臨床徴候はまったく認められないということが示された。ワクチン接種を受けた群とワクチン接種をしていない対照群との間で、有意な体温上昇は検出されなかった。さらには、ワクチン接種を受けた群とワクチン接種をしていない対照群との間で、体重増加の有意差は認められなかった。剖検で、高過量群からの１０匹のうちの２匹のブタが、各々、流行性肺炎に典型的な小さい巨視的病変を有していた。さらなる病変は、肺組織の顕微鏡分析によって認められなかった。全体としては、温度感受性ワクチン株ｔｓ１９は、高過量においてさえも安全であるということが示された。
【００７９】
（Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）に特異的なプライマーを使用する）ＰＣＲ分析によって、ワクチン接種後３週間および８週間で、ワクチン接種を受けたブタの鼻孔中のＭ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）の存在が示された（図１を参照）。また、ＰＣＲ分析を使用するＭ．ｈｙｏｐｎｕｅｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）コロニー形成研究によっても、気管中（上部、中央部および下部領域のいずれか）、および集団として見たワクチン接種を受けたブタの気管の少なくとも６０％におけるＭ．ｈｙｏｐｎｕｅｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）の存在が示された（図２を参照）。これらの結果は、鼻孔および気管の孔でのｔｓ１９ワクチン株のコロニー形成を示す。
【００８０】
実施例４：ワクチンの有効性研究 抗原投与モデル − 防御を示す
ｔｓ１９ワクチン株の有効性を評価するために、研究を行った。この研究デザインは、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ（マイコプラズマ）を含まないブタ群から得た６週齢のブタの使用を必要とした。この研究は、ＣＳＩＲＯ（Ｃｏｍｍｏｎｗｅａｌｔｈ Ｓｅｒｕｍ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｏｒｇａｎｉｓａｔｉｏｎ（オーストラリア連邦科学産業研究機構）、オーストラリア、ビクトリア州、ウェロビー（Ｗｅｒｒｉｂｅｅ）で、ＰＣ２バイオセキュリティーレベルのもとで行った。合計５６匹のブタを、各ワクチン接種を受けた群について１２匹のブタの３群および対照群の各々について１０匹のブタに無作為に割り当てた（表３を参照）。
【００８１】
【表５】
【００８２】
当該ワクチンを鼻腔内経路を介して送達し、これにより当該ワクチンの粘膜提示についての有効性だけを試験した。ワクチン接種をせず、抗原投与をしない陰性群を除くすべての群を、ワクチン接種後２２日目に、Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）のオーストラリア野外分離株の鼻腔内投与によって抗原投与した。死後検査を、３日間（ワクチン接種後５７日目、５８日目および５９日目）にわたって行った。この研究全体を通して、すべての群を、咳嗽、くしゃみ、呼吸困難および頻呼吸を含めた呼吸の徴候について毎日モニターした。体重測定を、この研究の開始時および終了時に行った。ワクチン接種後２２日目に（かつ抗原投与に先立って）、ＰＣＲ分析のために鼻内拭き取り検体を採取し、各群から、Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）の存在について判定した。
【００８３】
結果から、試験したすべての群において、臨床徴候も体重増加の有意差も認められないということが示された。鼻内拭き取り検体分析から、抗原投与前の、ワクチン接種を受けたブタのうちの６０〜７０％において、ワクチン接種後２２日目に、Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）の存在が示された（図３を参照）。すべての偽ワクチン接種を受けた対照のブタは、ＰＣＲ分析によっては、Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）について陰性であった。剖検において、巨視的病変分析（Ｈａｎｎａｎら、１９８２）から、偽ワクチン接種を受けた対照群、ならびに１０６および１０７ＣＣＵ／ｍＬ／用量でワクチン接種を受けた群における病変の不存在が示された。１０８ＣＣＵ／ｍＬ／用量でワクチン接種を受けた１０匹のブタのうちの１匹は、小さい巨視的病変の存在を示した。しかしながら、ワクチン接種をしていないが抗原投与を受けた１０匹のブタのうちの４匹は、咳嗽およびくしゃみの臨床徴候を示した。剖検で、上記４匹のブタからの肺の検査から、Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）感染に典型的な巨視的な肺病変が示された。
【００８４】
全体としては、温度感受性ワクチン株ｔｓ１９は、Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）感染から防御することにおいて有効であるということが示された。
【００８５】
実施例５：異なる用量におけるワクチン有効性および市販の死菌ワクチンとの比較
４つの異なる用量におけるｔｓ１９ワクチン株の有効性を評価するために、研究を行った。この研究デザインは、３〜４週齢のｓｐｆブタの使用を必要とした。この研究は、Ｃｅｎｔｒｏ ｄｅ Ｎａｃｉｏｎａｌ ｄｅ Ｓｅｒｖｉｃｉｏｓ ｄｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｏ ｅｎ Ｓａｌｕｄ Ａｎｉｍａｌ（国立家畜衛生診断サービスセンター）、ＣＥＮＡＳＡ） − メキシコ、テカマック（Ｔｅｃａｍａｃ）にある政府機関の試験施設 − にあるＰＣ２施設の中で行った。合計７０匹のブタを、各々１０匹のブタを含む７つの群に無作為に割り当てた（表４）。
【００８６】
【表６】
【００８７】
４つの異なる用量のｔｓ１９ワクチン（１０３、１０４、１０５、１０６ＣＣＵ／ｍＬ）を、４つの別々の群のブタに鼻腔内経路によって送達した。５番目の群は２ｍＬの市販の不活化ワクチンを投与され、この不活化ワクチンは筋肉内経路によって送達された。陽性（ワクチン接種をしていないが抗原投与した）および陰性（ワクチン接種をせず、抗原投与をしない）群もこの研究の中に含めた。陰性対照群を除くすべての群を、２つの時間点で抗原投与した。第１の抗原投与は、ワクチン接種後２２日目に、Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ）（アイオワ（ＩＯＷＡ）株１９４）という米国分離株を使用して鼻腔内投与によって行った。第２の抗原投与は、同じ抗原投与株を使用してワクチン接種後８４日目に行った。この研究全体を通して、すべての群を、咳嗽、くしゃみ、呼吸困難および頻呼吸を含めた臨床徴候について毎日モニターした。体重測定を、この研究の開始時および終了時に行った。
【００８８】
結果から、１０５日間の試験期間全体にわたって臨床徴候がないことが示された。陽性対照群とワクチン接種を受けた群の各々との間の体重成績についての分散分析から、１０５および１０６ＣＣＵ／ｍＬの用量のｔｓ１９は、陽性対照群と比較して有意な体重増加を示すということが示された（図４）。市販のワクチンでワクチン接種を受けた群は、陽性対照群と比較しても、体重増加の有意差をまったく示さなかった（図４、表５）。剖検で、巨視的な病変分析を、各群について行った。最小防御用量（ｍｉｎｉｍｕｍ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｄｏｓｅ）の決定についての基準は、肺病変の重症度の低下に関する７０％以上の防御指数（ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｉｎｄｅｘ）に基づいていた。ｔｓ１９についての最小防御用量は、１０４ＣＣＵ／ｍＬであると決定された。なぜなら７０％という防御指数は、肺病変の重症度の低下に関してはこの用量で達成されたからである（図５）。より高い用量のｔｓ１９（１０５および１０６ＣＣＵ／ｍＬ）も試験し、肺病変の重症度の低下に関しては、それぞれ８３％および８８％というＰＩを与えることを見出した（図６）。市販の不活化ワクチンはわずか３７％というＰＩしか成し遂げず、この値は、使用したｔｓ１９の最小用量（１０３ＣＣＵ／ｍＬ。これは６０％のＰＩを成し遂げた）よりもかなり低い。
【００８９】
【表７】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表１に列挙されている遺伝子のうちの少なくとも１つにおいて変異を含むＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅワクチン株。
【請求項２】
温度感受性でありかつ弱毒化されている、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（オーストラリア）に受入番号ＮＭ０４／４１２５９で寄託されたＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅワクチン株。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載の株を製造する方法であって、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの適切な出発株を化学的変異生成にかける工程と、連続的なインビトロでの継代後に生存可能であり続ける温度感受性変異体を選択する工程と、を含む方法。
【請求項４】
前記出発株は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株ＬＫＲ Ｐ３である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ワクチン組成物であって、請求項１もしくは請求項２に記載のＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株、または請求項３に記載の方法によって調製されたＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株と、担体と、任意に佐剤と，および／または任意に少なくとも１つの付加的な感染病原体とを含み、免疫量の前記ワクチンは、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅによって引き起こされる疾患に対する防御免疫を誘発することができる、ワクチン組成物。
【請求項６】
前記感染病原体はウイルス、細菌、真菌または寄生生物である、請求項５に記載のワクチン組成物。
【請求項７】
気道への投与のために製剤化されている、請求項５または請求項６に記載のワクチン組成物。
【請求項８】
エアロゾル製剤の状態の、請求項５または請求項６に記載のワクチン組成物。
【請求項９】
ブタ類動物における、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅによって引き起こされる疾患を防止するための方法であって、免疫量の、請求項５から請求項８のいずれか１項に記載のワクチン組成物を前記ブタ類動物に投与することを含む、方法。
【請求項１０】
ブタ類動物における、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅによって引き起こされる疾患を防止するための、請求項５から請求項８のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項１１】
前記ワクチンは気道に投与される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記ワクチンは、吸入によって、鼻腔内に、またはエアロゾルによって投与される、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
請求項５に記載のワクチンを製造する方法であって、請求項１または請求項２に記載のＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株を担体、任意に佐剤および／または任意に少なくとも１つの付加的な感染病原体と合わせる工程と含む、方法。
【請求項１４】
ブタ類動物における、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅによって引き起こされる疾患を防止するための医薬の製造における、請求項１または請求項２に記載のＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株の使用。
【請求項１５】
Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅによって引き起こされる前記疾患は流行性肺炎またはブタマイコプラズマ性肺炎である、請求項５に記載のワクチン、請求項９に記載の方法、または請求項１０に記載の使用。
【請求項１】
表１に列挙されている遺伝子のうちの少なくとも１つにおいて変異を含むＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅワクチン株。
【請求項２】
温度感受性でありかつ弱毒化されている、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（オーストラリア）に受入番号ＮＭ０４／４１２５９で寄託されたＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅワクチン株。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載の株を製造する方法であって、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの適切な出発株を化学的変異生成にかける工程と、連続的なインビトロでの継代後に生存可能であり続ける温度感受性変異体を選択する工程と、を含む方法。
【請求項４】
前記出発株は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株ＬＫＲ Ｐ３である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ワクチン組成物であって、請求項１もしくは請求項２に記載のＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株、または請求項３に記載の方法によって調製されたＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株と、担体と、任意に佐剤と，および／または任意に少なくとも１つの付加的な感染病原体とを含み、免疫量の前記ワクチンは、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅによって引き起こされる疾患に対する防御免疫を誘発することができる、ワクチン組成物。
【請求項６】
前記感染病原体はウイルス、細菌、真菌または寄生生物である、請求項５に記載のワクチン組成物。
【請求項７】
気道への投与のために製剤化されている、請求項５または請求項６に記載のワクチン組成物。
【請求項８】
エアロゾル製剤の状態の、請求項５または請求項６に記載のワクチン組成物。
【請求項９】
ブタ類動物における、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅによって引き起こされる疾患を防止するための方法であって、免疫量の、請求項５から請求項８のいずれか１項に記載のワクチン組成物を前記ブタ類動物に投与することを含む、方法。
【請求項１０】
ブタ類動物における、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅによって引き起こされる疾患を防止するための、請求項５から請求項８のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項１１】
前記ワクチンは気道に投与される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記ワクチンは、吸入によって、鼻腔内に、またはエアロゾルによって投与される、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
請求項５に記載のワクチンを製造する方法であって、請求項１または請求項２に記載のＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株を担体、任意に佐剤および／または任意に少なくとも１つの付加的な感染病原体と合わせる工程と含む、方法。
【請求項１４】
ブタ類動物における、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅによって引き起こされる疾患を防止するための医薬の製造における、請求項１または請求項２に記載のＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株の使用。
【請求項１５】
Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅによって引き起こされる前記疾患は流行性肺炎またはブタマイコプラズマ性肺炎である、請求項５に記載のワクチン、請求項９に記載の方法、または請求項１０に記載の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２０１２−５２７２１８（Ｐ２０１２−５２７２１８Ａ）
【公表日】平成２４年１１月８日（２０１２．１１．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５１１０９３（Ｐ２０１２−５１１０９３）
【出願日】平成２２年５月１９日（２０１０．５．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＡＵ２０１０／０００５９０
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１３２９３２
【国際公開日】平成２２年１１月２５日（２０１０．１１．２５）
【出願人】（５１１２８１０８４）バイオプロパティーズ ピーティーワイ リミテッド (1)
【出願人】（５０９０６００３９）ザ ユニヴァーシティー オブ メルボルン (6)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１１月８日（２０１２．１１．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年５月１９日（２０１０．５．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＡＵ２０１０／０００５９０
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１３２９３２
【国際公開日】平成２２年１１月２５日（２０１０．１１．２５）
【出願人】（５１１２８１０８４）バイオプロパティーズ ピーティーワイ リミテッド (1)
【出願人】（５０９０６００３９）ザ ユニヴァーシティー オブ メルボルン (6)
【Ｆターム（参考）】
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