Ｎ−アシル−ホスファチジル−エタノールアミンを生産する方法
この文献は、式（Ｉ）のＮ−アシル−ホスファチジルエタノールアミンを工業規模で調製する方法を記載している。式中、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は、互いに独立して、飽和、単不飽和または多不飽和アシルＣ10−Ｃ30の純粋なまたは互いに混合したものであり、Ｘ＝ＯＨまたはＯＭ、Ｍ＝アルカリ金属またはアルカリ土類、アンモニウムまたはアルキルアンモニウムである。本件の方法は、合成または天然起源のレシチンを、限られたモル過剰のＮ−アシル−エタノールアミンを使用して、酵素ホスホリパーゼＤの存在下および工業規模の生産に適した条件で、ホスファチジル基転移反応により、式（Ｉ）の高純度なＮ−アシル−ホスファチジルエタノールアミンに変換することを可能にする。ここでアシルは、式（Ｉ）に対して先に定義されたとおりである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の対象は、式（Ｉ）のＮ−アシル−ホスファチジル−エタノールアミンを工業規模で調製する方法である。
【０００２】
【化１】
【０００３】
式中、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は、互いに独立して、飽和、単不飽和または多不飽和アシルＣ10−Ｃ30の純粋なまたは互いに混合されたものであり、Ｘ＝ＯＨまたはＯＭ、Ｍ＝アルカリ金属またはアルカリ土類、アンモニウムまたはアルキルアンモニウムである。
【０００４】
本発明の方法の対象は、合成または天然起源のレシチンを、限られたモル過剰の試薬Ｎ−アシル−エタノールアミンを使用して、酵素ホスホリパーゼＤの存在下および工業規模の生産に適した条件で、ホスファチジル基転移反応（ｔｒａｎｓｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌａｔｉｏｎ）により、高純度な式（Ｉ）のＮ−アシル−ホスファチジル−エタノールアミンに変換することを可能にする。ここでアシルは、式（Ｉ）に対して先に定義したとおりである。
【背景技術】
【０００５】
Ｎ−アシル−ホスファチジル−エタノールアミン（以下“ＮＡＰＥ”とも呼ばれる）は、生物学的組織から抽出された脂質混合物の少数要素として存在する天然リン脂質である。
【０００６】
小麦粉で最初に同定されているが（非特許文献１）、これらは大豆レシチンに含まれる約２％の極性脂質に代表される野菜起源の生産物内、および微生物内に存在する（非特許文献２）。
【０００７】
ＮＡＰＥｓにおける興味は、例えばカンナビノイド受容体のためのリガンドの前駆体（アナンドアミド）としての研究およびそれらの天然における役割の両方、およびコレステロール低下薬（例えば特許文献１を参照）、食欲抑制薬（例えば特許文献２を参照）としての使用に関して絶えず拡大している。それらは、リポソーム製剤の主要成分として（例えば特許文献３を参照）および抗酸化剤としても使用される。
【０００８】
天然起源の原料からＮＡＰＥｓを単離することは、低パーセンテージのＮＡＰＥの存在および脂質抽出物の他の成分からの分離の困難性により、不利とされている。それ故に、求められる用途でＮＡＰＥｓを使用するためには、それらを以下のスキームＩに従って、ホスファチジルエタノールアミン（以後ＰＥと呼ぶ）から分離するのが好ましい。
【０００９】
【化２】
【００１０】
この合成は、窒素に結合したアシル基が規定されたＮＡＰＥを得ることを可能にするが、これは高価で市場入手性の低いＰＥの使用を意味する。
【００１１】
特許文献４は、ＮＡＰＥｓを含む種々の生産物へホスファチジルコリン（ＰＣ）を変換（転化）する可能性と、反応の収量への言及は依然として無いものの、ホスホリパーゼＤＭとして知られる新しい酵素の利用の可能性を記載している。この特許に示されている実験条件は、それらを工業規模での使用に役立たない。なぜなら、それらは反応がエチルエーテルを含む混合溶媒中で高希釈度の基質で行われることを見越したものだからである。更に、反応前に開始基質（ＰＣ）が超音波処理にかけられて乳化される。
【００１２】
スキームＩＩに示されたホスファチジル基転移反応において、酵素ホスホリパーゼＤは、異なるアルコール基の間の交換であって、リン脂質の極性頭部のホスフェート基をエステル化するものを促進する。
【００１３】
【化３】
【００１４】
この変換は、薬学的及び栄養学的に多大な興味のあるリン脂質の生産について、工業規模においても、非常に有用であることが示されている。
【００１５】
アルコール型（ａｌｃｏｈｏｌｉｃ）試薬のセリン、グリセロールおよびエタノールアミンを使用して、ＰＣをそれぞれホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロールおよびホスファチジルエタノールアミンへ転移する反応は、十分に実証されている。
【００１６】
特許文献５は、ホスホリパーゼＤ存在下でのセリンとのホスファチジル基転移により、異なる起源のレシチンのホスファチジルセリンへの転移を記載している。この出願において、競合する加水分解反応に対してホスファチジル基転移反応を促進するために、リン脂質基質に対して少なくとも４モル／モルのセリンの量が使用された。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】特許ＵＳ４２５４１１５
【特許文献２】特許出願ＷＯ０３０６８２１０
【特許文献３】特許ＵＳ６２９４１９１
【特許文献４】特許ＵＳ４７８３４０２
【特許文献５】特許出願ＥＰ１０４８７３８
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Ｂｏｍｓｔｅｉｎ，Ｒ．Ａ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９６５）２１ ４９
【非特許文献２】Ｃｌａｒｋｅ ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐｉｄｓ（１９７６）１７ ２２２
【非特許文献３】Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．（１９７８）１０１ ２２１
【非特許文献４】Ｂｉｏｔｅｃｈｎ．Ｔｅｃｈｎ．（１９９３）７ ７９５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
上記の欠点を克服し、広く利用可能で安価な原料からＮＡＰＥを、市場で要求される量および純度で製造することを可能にする方法の必要性が現時点で存在する。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明は、それゆえ、式（Ｉ）のＮ−アシル−ホスファチジル−エタノールアミンを調製する方法により代表される。
【００２１】
【化４】
【００２２】
式中、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は、互いに独立して、飽和、単不飽和および／または多不飽和アシルＣ10−Ｃ30、Ｘ＝ＯＨまたはＯＭ、Ｍ＝アルカリ金属、アルカリ土類、アンモニウムまたはアルキルアンモニウムであり、この方法は、式（ＩＩ）のホスファチドと、
【００２３】
【化５】
【００２４】
（式中、Ｒ1およびＲ2は先に定義されたのと同じ意味を有し、Ｒ4＝ＣＨ2−ＣＨ2−Ｎ+（ＣＨ3）3および／またはＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ3+である。）式（ＩＩＩ）の化合物を、
【００２５】
【化６】
【００２６】
（式中、Ｒ3は先に定義されたのと同じ意味を有する。）ホスホリパーゼＤの存在下で反応することを含み、前記反応は水中、または、水と少なくとも１つの炭化水素との混合物中で行われることを特徴とする。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明の一態様によれば、式（ＩＩＩ）の化合物と式（ＩＩ）のホスファチドとの間のモル比は、好ましくは４未満であり、更により好ましくは１および３の間である。
【００２８】
本発明の更なる態様によれば、Ｒ1、Ｒ2および／またはＲ3は、好ましくはアシルＣ12−Ｃ24であり、更により好ましくは、Ｒ3はオレオイル、パルミトイルおよびアラキドイルから選択される。
【００２９】
本発明の方法は、限られたモル過剰の試薬Ｎ−アシル−エタノールアミン（ここでアシル（基）は、式（Ｉ）に対して先に定義したとおりである。）を使用し、酵素ホスホリパーゼＤの存在下及び工業規模での生産に適した条件で、ホスファチジル基転位反応により、合成又は天然起源のレシチンを高純度な式（Ｉ）のＮＡＰＥへ変換することを可能にする。
【００３０】
先行技術に記載されているホスファチジル基転移反応に関与するアルコール型の種（セリン、グリセロールおよびエタノールアミン）は、水への高い溶解性によって特徴付けられるが、本発明のホスファチジル基転位反応に関与するアルコール型の種である脂肪酸でアシル化されたエタノールアミンは、水にほとんど溶解しない化合物である。更に、前記のアルコール型の種は、少なくとも１２の炭素原子を含有する分子構造を有し、６を超える炭素原子からなる脂肪族鎖を備えたアルコールが、ホスファチジル基転移反応に関与する能力をほとんど有さないことが知られている（非特許文献３を参照）。
【００３１】
これらの不利な条件にも関わらず、我々は、驚くべきことに、合成および天然レシチンのホスファチジル基転移反応を行い、工業規模での生産に役立つ状態でＮＡＰＥを得られることを見出した。
【００３２】
本発明の方法によるＮＡＰＥｓの生産は、必要とされる原材料の幅広い利用可能性と、合成スキームの簡素さとを考慮すると、特に魅力的である。
【００３３】
スキームＩＩＩは、本発明の方法に従った、Ｎ−オレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（以後“ＮＯＰＥ”ともいう）の合成を示す。
【００３４】
【化７】
【００３５】
式中、Ｒ1、Ｒ2およびＲ4は、先に定義されたのと同じ意味を有する。
【００３６】
驚くべきことに、本発明の方法により、開始レシチンの終了ＮＡＰＥへの非常に高い転化率が得られることが見出された。このような条件において、ホスファチジン酸の形成につながる競合する加水分解が、実際上無視できるものであることも見出された。それゆえ、反応のために提供されたホスホリピドのモル当たり３モル未満のＮ−アシル−エタノールアミンのモル比を使用して、ホスファチジル基転移反応を行い、結果的に工業規模でのホスファチジル基転移においてホスファチジン酸の形成を制限するのに使用される大モル過剰を避けることができた。
【００３７】
本発明の興味深い特徴は、次の事実に代表される。すなわち、３０から３５％のような低い値にまで制限されたホスファチジルコリン（ＰＣ）含有量の流体レシチンのような、安価で広く入手可能な原材料を使用しながら、高純度のＮＡＰＥｓが得られ、これは、工業規模での生産手段に良く適合した単純な方法を使用することによって単離することができる。実際に、31Ｐ−ＮＭＲ測定は、本発明の教示に従って得られた生産物の純度および含有量が、典型的には８５％を超えることを示している。
【００３８】
本発明のホスファチジル基転移反応は、水性緩衝液からなる水性成分と、炭化水素溶媒からなる任意選択的な有機成分とからなる媒体中で行われる。
【００３９】
本発明を実行するためには、これらの成分の相対量は、明確に定義された範囲を守らなければならない。即ちこれは、そのような成分および本方法の原材料を構成する基質の量の間の比が制御されなければならないということである。
【００４０】
特に、炭化水素溶媒の量は、好ましくは１リットル／水１リットル未満であり、更に好ましくは、それは０．３および０．７リットル／水１リットルの間である。この比が０．３および０．７リットル／リットルの間であるときは、ホスファチジン酸の形成が非常に少ないため、使用された分析方法（31Ｐ−ＮＭＲ）の感度（０．２％）を下回ることが指摘されている。
【００４１】
更に、反応のために提供されたホスファチドの量に対する、反応において存在する溶媒の全量（水と任意選択的な炭化水素溶媒との合計）は、好ましくはホスファチドのｋｇ当たり５および４０リットルの間であり、更により好ましくは６および２０リットルの間である。
【００４２】
本発明により効果的なホスファチジル基転移反応を行うことが可能であることは、酵素ホスホリパーゼＤが存在する水相においてリン脂質基質も試薬アルコールも溶解しないことを考慮すれば、まったく驚くべきことである。実際に、リン脂質基質は水相に分散され、試薬アルコールもまた水相に分散されまたは任意選択的に使用されるときは炭化水素溶媒中に存在する。あるいは、ホスファチジル基転移反応のより十分に説明された場合においては、試薬アルコールは、酵素ホスホリパーゼＤも存在する同じ水相に溶解され、こうして酵素ホスホリパーゼＤが反応に関与するのをより容易にしていると思われる。
【００４３】
これらの条件で操作することにより、反応は、驚くほど早くかつ選択的であり、６時間未満の反応時間でホスファチドのほぼ完全な変換：即ち31Ｐ−ＮＭＲ分析が３％未満の残留ＰＣの存在、および加水分解生成物（ホスファチジン酸）の同時形成を示すことに繋がることが見出されている。
【００４４】
本発明のこの最後の態様は、ホスファチジン酸を他のリン脂質から分離する際の公知の困難性を考慮すると、特に有意義であり、従って、反応の過程でその形成を避けることは、後続のＮＡＰＥの精製にとって実質的に有利である。
【００４５】
本発明の方法において原材料として用いられ得るリン脂質は、（大豆および向日葵のような）野菜起源または（卵、オキアミ、魚および魚卵のような）動物起源の天然レシチンである。単細胞種の発酵から得ることができるリン脂質の混合物も、この方法における基質として有利に使用することができる。
【００４６】
このようなレシチンは、異なる純度にすることができ、かつ、５０重量％を下回るホスファチジルコリン含有量を有することができる。
【００４７】
本発明の一態様によれば、式（ＩＩ）のホスファチドは、２０および９５重量％の間のホスファチジルコリンおよび／またはホスファチジルエタノールアミン含有量を有する天然起源のホスファチドの混合物であり；本発明の方法は、２５および４５重量％の間のホスファチジルコリンおよび／またはホスファチジルエタノールアミン含有量を有する天然起源のホスファチドの混合物を使用して有利に行うこともできる。
【００４８】
規定された組成の脂肪酸を有するＮＡＰＥを得るためには、例えば１，２−ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、１，２−ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）のような合成ホスファチドを使用することもできる。
【００４９】
使用できるＮ−アシル−エタノールアミンは、異なる起源のものとすることができ、それらは異なる純度を有することができ、アシル基は、１０から３０までの炭素原子を含有するカルボン酸から誘導することができ、個別にまたは互いに混合されて存在することができる。このような酸は、飽和、不飽和または多不飽和脂肪酸とすることができる。特に、アラキドン酸、パルミチン酸およびオレイン酸が好ましい。
【００５０】
炭化水素溶媒については、好ましくは４から１０までの炭素原子、更により好ましくは６から８までの炭素原子を有する芳香族および脂肪族溶媒の両方を有利に使用することができ；より有利にはトルエンまたはｎ−ヘプタンが使用される。
【００５１】
ホスファチジル基転移反応は、２０および７０℃の間、好ましくは３０および５０℃の間の温度で行うことができる。この反応のｐＨは、使用される酵素の起源によって変化することが可能であり、好ましくは、３．５および９の間、更により好ましくは４および５．５の間の範囲に入る。
【００５２】
攪拌のタイプは、反応速度に影響を与え、機械的攪拌、任意選択的に磁気攪拌によって有利に行うことができる。水性の反応相は、好ましくは、０．０１Ｍおよび０．２Ｍの間の濃度の緩衝液からなる。異なるタイプの緩衝液を使用することができ、好ましくは緩衝アセテートが使用される。
【００５３】
例えばカルシウムまたはマグネシウムのような二価の金属イオンの存在は、ホスホリパーゼＤにより触媒されるホスファチジル基転移反応を促進し；このようなイオンは好ましくは塩または酸化物の形で使用され；更により好ましくは、この反応は塩化カルシウムの存在下で行われる。前記二価の金属イオンの濃度は、好ましくは０．０５および０．５Ｍの範囲に入る。
【００５４】
反応を行うためには、加水分解活性に比べて高いホスファチジル基転移活性を示すホスホリパーゼＤ酵素を選択するのが有利である。
【００５５】
このような酵素は、必ずしも精製される必要は無い。有利には、発酵起源の酵素を使用することが可能であり、これは好ましくはＡＴＣＣ５５７１７として申請された微生物の発酵で得られるもののようなストレプトミセス属の菌株から産生される。
【００５６】
酵素の量は、好ましくは、反応のために提供されるホスホリピドのグラムあたり１０および１００ユニットの間の範囲に入る。酵素活性は、非特許文献４に記載された方法で決定される。
【００５７】
その例から明らかとなるように、反応混合物が水および少なくとも１つの炭化水素からなるとき、これは、式（ＩＩ）のホスファチドを含む緩衝水性分散物を、式（ＩＩＩ）の化合物の炭化水素溶液若しくは分散物と化合させることにより通常得られ；ホスホリパーゼＤは式（ＩＩ）のホスファチドを含む緩衝水性分散物に既に存在することができ、またはそれは既に形成された反応混合物に後の段階で添加され得る。代替的に、反応は、式（ＩＩ）のホスファチド、式（ＩＩＩ）の化合物、およびホスホリパーゼＤを含有する緩衝水性分散物中で行うことができる。
【００５８】
ＮＡＰＥｓを単離するためには、有利には、アセトンからの液液抽出および沈殿のような、当業者に知られた方法を使用することが可能である。
【実施例】
【００５９】
以下の実施例は、本発明を実施する幾つかの方法を単に例示するだけの目的を有し、決して限定して考慮されてはならない。
【００６０】
実施例１
７５ｇのＰｈｏｓａｌ３５（登録商標）、ホスホリピドＧｍｂＨによって３５％に等しいＰＣ含有量で生産された流動性大豆レシチンを、７５０ｍＬのアセトンを含有する１Ｌフラスコ内に攪拌下で導入した。上澄みを除去し、１０ｇの塩化カルシウムを含有する３２０ｍＬのアセテート緩衝液０．１Ｍ ｐＨ＝４．５をこのフラスコ内に添加した。残留アセトンを蒸発により低圧で除去した。混合物を４３℃に加熱し、攪拌下で３０分間維持した。温度と攪拌を維持しながら、ｎ−ヘプタン１４０ｍＬ中のＮ−オレオイル−エタノールアミン３１ｇの溶液、次いで同じ緩衝液２０ｍＬ中の、ＡＴＣＣ５５７１７（比活性度３２００Ｕ／ｇ）から得たホスホリパーゼＤ０．７５ｇの懸濁液を添加した。
【００６１】
混合物をその温度で機械攪拌しながら５時間維持した。これを室温に冷却し、反応生成物のサンプルを取り、それをＮＭＲで分析した。
【００６２】
31Ｐ−ＮＭＲスペクトルは、８６．８％のＮＡＰＥと１．４％のＰＣの存在を示した。ＰＡは検出限界（０．２％）を下回った。
【００６３】
実施例２
２８ｇのＰｈｏｓｐｈｏｌｉｐｏｎ９０（登録商標）、ホスホリピドＧｍｂＨによって９５％に等しいＰＣ含有量で生産された流動性大豆レシチンを、１０ｇの塩化カルシウムを含有する３２０ｍＬのアセテート緩衝液０．１Ｍ ｐＨ＝４．５を入れた１Ｌフラスコ内に導入した。混合物を４３℃に加熱し、攪拌下で６０分間維持した。温度と攪拌を維持しながら、ｎ−ヘプタン１４０ｍＬ中Ｎ−オレオイル−エタノールアミン３１ｇの溶液、次いで同じ緩衝液２０ｍＬ中の、ＡＴＣＣ５５７１７（比活性度３２００Ｕ／ｇ）から得たホスホリパーゼＤ０．７５ｇの懸濁液を添加した。
【００６４】
混合物をその温度で機械攪拌しながら５時間維持した。これを室温に冷却し、反応生成物のサンプルを取り、それをＮＭＲで分析した。
【００６５】
31Ｐ−ＮＭＲスペクトルは、９４．９％のＮＡＰＥと０．９％のＰＣの存在を示した。ＰＡは検出限界（０．２％）を下回った。
【００６６】
実施例３
２８ｇの１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、Ｃｈｅｍｉ ＳｐＡによって生産された合成ホスホリピドを、１０ｇの塩化カルシウムを含有する３２０ｍＬのアセテート緩衝液０．１Ｍ ｐＨ＝４．５を入れた１Ｌフラスコ内に導入した。残留アセトンを蒸発により低圧で除去した。混合物を４３℃に加熱し、攪拌下で６０分間維持した。温度と攪拌を維持しながら、ｎ−ヘプタン１４０ｍＬ中Ｎ−オレオイル−エタノールアミン３１ｇの溶液、次いで同じ緩衝液２０ｍＬ中の、ＡＴＣＣ５５７１７（比活性度３２００Ｕ／ｇ）から得たホスホリパーゼＤ０．７５ｇの懸濁液を添加した。
【００６７】
混合物をその温度で機械攪拌しながら５時間維持した。これを室温に冷却し、反応生成物のサンプルを取り、それをＮＭＲで分析した。
【００６８】
31Ｐ−ＮＭＲスペクトルは、９４．４％のＮＡＰＥと１．９％のＰＣの存在を示した。ＰＡは検出限界（０．２％）を下回った。
【００６９】
実施例４
７５ｇのＰｈｏｓａｌ３５（登録商標）、ホスホリピドＧｍｂＨによって３５％に等しいＰＣ含有量で生産された流動性大豆レシチンを、７５０ｍＬのアセトンを入れた１Ｌフラスコ内に攪拌下で導入した。上澄みを除去し、１０ｇの塩化カルシウムを含有する３２０ｍＬのアセテート緩衝液０．１Ｍ ｐＨ＝４．５をこのフラスコ内に添加した。残留アセトンを蒸発により低圧で除去した。混合物を４３℃に加熱し、攪拌下で３０分間維持した。温度と攪拌を維持しながら、３１ｇのＮ−オレオイル−エタノールアミン、次いで同じ緩衝液２０ｍＬ中の、ＡＴＣＣ５５７１７（比活性度３２００Ｕ／ｇ）から得たホスホリパーゼＤ０．７５ｇの懸濁液とを添加した。
【００７０】
混合物をその温度で機械攪拌しながら５時間維持した。これを室温に冷却し、反応生成物のサンプルを取り、それをＮＭＲで分析した。
【００７１】
31Ｐ−ＮＭＲスペクトルは、８５．５％のＮＡＰＥ、３．９％のＰＣおよび１．３％のＰＡの存在を示した。
【００７２】
実施例５
７５ｇのＰｈｏｓａｌ３５（登録商標）、ホスホリピドＧｍｂＨによって３５％に等しいＰＣ含有量で生産された流動性大豆レシチンを、７５０ｍＬのアセトンを入れた１Ｌフラスコ内に攪拌下で導入した。上澄みを除去し、１０ｇの塩化カルシウムを含有する３２０ｍＬのアセテート緩衝液０．１Ｍ ｐＨ＝４．５をこのフラスコ内に添加した。残留アセトンを蒸発により低圧で除去した。混合物を４３℃に加熱し、攪拌下で３０分間維持した。温度と攪拌を維持しながら、トルエン１４０ｍＬ中のＮ−オレオイル−エタノールアミン３１ｇの溶液、次いで同じ緩衝液２０ｍＬ中の、ＡＴＣＣ５５７１７（比活性度３２００Ｕ／ｇ）から得たホスホリパーゼＤ０．７５ｇの懸濁液とを添加した。
【００７３】
混合物をその温度で機械攪拌しながら５時間維持した。これを室温に冷却し、反応生成物のサンプルを取り、それをＮＭＲで分析した。
【００７４】
31Ｐ−ＮＭＲスペクトルは、８６．２％のＮＡＰＥと１．６％のＰＣの存在を示した。ＰＡは、検出限界（０．２％）を下回った。
【００７５】
実施例６
７５ｇのＰｈｏｓａｌ３５（登録商標）、ホスホリピドＧｍｂＨによって３５％に等しいＰＣ含有量で生産された流動性大豆レシチンを、７５０ｍＬのアセトンを入れた１Ｌフラスコ内に攪拌下で導入した。上澄みを除去し、１０ｇの塩化カルシウムを含有する３２０ｍＬのアセテート緩衝液０．１Ｍ ｐＨ＝４．５をこのフラスコ内に添加した。残留アセトンを蒸発により低圧で除去した。混合物を４３℃に加熱し攪拌下で３０分間維持した。温度と攪拌を維持しながら、ｎ−ヘプタン１４０ｍＬ中のＮ−オレオイル−エタノールアミン３１ｇの溶液、次いで同じ緩衝液２０ｍＬ中の、会社ヤクルト（比活性度８５００Ｕ／ｇ）によって生産されたホスホリパーゼＤ０．２８ｇの懸濁液とを添加した。
【００７６】
混合物をその温度で機械攪拌しながら５時間維持した。これを室温に冷却し、反応生成物のサンプルを取り、それをＮＭＲで分析した。
【００７７】
31Ｐ−ＮＭＲスペクトルは、８５．２％のＮＡＰＥと２．４％のＰＣの存在を示した。ＰＡは、検出限界（０．２％）を下回った。
【００７８】
実施例７
７５ｇのＰｈｏｓａｌ３５（登録商標）、ホスホリピドＧｍｂＨによって３５％に等しいＰＣ含有量で生産された流動性大豆レシチンを、７５０ｍＬのアセトンを入れた１Ｌフラスコ内に攪拌下で導入した。上澄みを除去し、１０ｇの塩化カルシウムを含有する３２０ｍＬのアセテート緩衝液０．１Ｍ ｐＨ＝４．５をこのフラスコ内に添加した。残留アセトンを蒸発により低圧で除去した。混合物を４３℃に加熱し、攪拌下で３０分間維持した。温度と攪拌を維持しながら、ｎ−ヘプタン２３０ｍＬ中のＮ−パルミトイル−エタノールアミン２９ｇの溶液、次いで同じ緩衝液２０ｍＬ中の、ＡＴＣＣ５５７１７（比活性度３２００Ｕ／ｇ）から得たホスホリパーゼＤ０．７５ｇの懸濁液とを添加した。
【００７９】
混合物をその温度で機械攪拌しながら６時間維持した。これを室温に冷却し、反応生成物のサンプルを取り、それをＮＭＲで分析した。
【００８０】
31Ｐ−ＮＭＲスペクトルは、８５．２％のＮＡＰＥと２．８％のＰＣの存在を示した。ＰＡは、検出限界（０．２％）を下回った。
【００８１】
実施例８
７５ｇのＰｈｏｓａｌ３５（登録商標）、ホスホリピドＧｍｂＨによって３５％に等しいＰＣ含有量で生産された流動性大豆レシチンを、７５０ｍＬのアセトンを入れた１Ｌフラスコ内に攪拌下で導入した。上澄みを除去し、５ｇの塩化カルシウムを含む１５０ｍＬのアセテート緩衝液０．１Ｍ ｐＨ＝４．５をこのフラスコ内に添加した。残留アセトンを蒸発により低圧で除去した。混合物を４３℃に加熱し、攪拌下で３０分間維持した。温度と攪拌を維持しながら、ｎ−ヘプタン３１０ｍＬ中のＮ−オレオイル−エタノールアミン３１ｇの溶液、次いで同じ緩衝液２０ｍＬ中の、ＡＴＣＣ５５７１７（比活性度３２００Ｕ／ｇ）から得たホスホリパーゼＤ０．７５ｇの懸濁液とを添加した。
【００８２】
混合物をその温度で機械攪拌しながら５時間維持した。これを室温に冷却し、反応生成物のサンプルを取り、それをＮＭＲで分析した。
【００８３】
31Ｐ−ＮＭＲスペクトルは、３８．６％のＮＡＰＥ、４４．７％のＰＣおよび１．３％のＰＡの存在を示した。
【００８４】
実施例９
７５ｇのＰｈｏｓａｌ３５（登録商標）、ホスホリピドＧｍｂＨによって３５％に等しいＰＣ含有量で生産された流動性大豆レシチンを、７５０ｍＬのアセトンを入れた１Ｌフラスコ内に攪拌下で導入した。上澄みを除去し、２ｇの塩化カルシウムを含有する６０ｍＬのアセテート緩衝液０．１Ｍ ｐＨ＝４．５をこのフラスコ内に添加した。残留アセトンを蒸発により低圧で除去した。混合物を４３℃に加熱し、攪拌下で３０分間維持した。温度と攪拌を維持しながら、ｎ−ヘプタン３０ｍＬ中のＮ−オレオイル−エタノールアミン３１ｇ、次いで同じ緩衝液２０ｍＬ中の、ＡＴＣＣ５５７１７（比活性度３２００Ｕ／ｇ）から得たホスホリパーゼＤ０．７５ｇの懸濁液とを添加した。
【００８５】
混合物をその温度で機械攪拌しながら５時間維持した。これを室温に冷却し、反応生成物のサンプルを取り、それをＮＭＲで分析した。
【００８６】
31Ｐ−ＮＭＲスペクトルは、３４．３％のＮＡＰＥ、４９．７％のＰＣおよび１．３％のＰＡの存在を示した。
【００８７】
実施例１０
７５ｇのＰｈｏｓａｌ３５（登録商標）、ホスホリピドＧｍｂＨによって３５％に等しいＰＣ含有量で生産された流動性大豆レシチンを、７５０ｍＬのアセトンを入れた２Ｌフラスコ内に攪拌下で導入した。上澄みを除去し、３５ｇの塩化カルシウムを含有する１．２Ｌのアセテート緩衝液０．１Ｍ ｐＨ＝４．５をこのフラスコ内に添加した。残留アセトンを蒸発により低圧で除去した。混合物を４３℃に加熱し、攪拌下で３０分間維持した。温度と攪拌を維持しながら、ｎ−ヘプタン５６０ｍＬ中のＮ−オレオイル−エタノールアミン３１ｇの溶液、次いで同じ緩衝液２０ｍＬ中のＡＴＣＣ５５７１７（比活性度３２００Ｕ／ｇ）からの０．７５ｇのホスホリパーゼＤの懸濁液とを添加した。
【００８８】
混合物をその温度で５時間機械攪拌して維持した。これを室温に冷却し、反応生成物のサンプルを得てそれをＮＭＲで分析した。
【００８９】
31Ｐ−ＮＭＲスペクトルは、８３．２％のＮＡＰＥ、４．６％のＰＣおよび２．６％のＰＡの存在を示した。
【技術分野】
【０００１】
本発明の対象は、式（Ｉ）のＮ−アシル−ホスファチジル−エタノールアミンを工業規模で調製する方法である。
【０００２】
【化１】
【０００３】
式中、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は、互いに独立して、飽和、単不飽和または多不飽和アシルＣ10−Ｃ30の純粋なまたは互いに混合されたものであり、Ｘ＝ＯＨまたはＯＭ、Ｍ＝アルカリ金属またはアルカリ土類、アンモニウムまたはアルキルアンモニウムである。
【０００４】
本発明の方法の対象は、合成または天然起源のレシチンを、限られたモル過剰の試薬Ｎ−アシル−エタノールアミンを使用して、酵素ホスホリパーゼＤの存在下および工業規模の生産に適した条件で、ホスファチジル基転移反応（ｔｒａｎｓｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌａｔｉｏｎ）により、高純度な式（Ｉ）のＮ−アシル−ホスファチジル−エタノールアミンに変換することを可能にする。ここでアシルは、式（Ｉ）に対して先に定義したとおりである。
【背景技術】
【０００５】
Ｎ−アシル−ホスファチジル−エタノールアミン（以下“ＮＡＰＥ”とも呼ばれる）は、生物学的組織から抽出された脂質混合物の少数要素として存在する天然リン脂質である。
【０００６】
小麦粉で最初に同定されているが（非特許文献１）、これらは大豆レシチンに含まれる約２％の極性脂質に代表される野菜起源の生産物内、および微生物内に存在する（非特許文献２）。
【０００７】
ＮＡＰＥｓにおける興味は、例えばカンナビノイド受容体のためのリガンドの前駆体（アナンドアミド）としての研究およびそれらの天然における役割の両方、およびコレステロール低下薬（例えば特許文献１を参照）、食欲抑制薬（例えば特許文献２を参照）としての使用に関して絶えず拡大している。それらは、リポソーム製剤の主要成分として（例えば特許文献３を参照）および抗酸化剤としても使用される。
【０００８】
天然起源の原料からＮＡＰＥｓを単離することは、低パーセンテージのＮＡＰＥの存在および脂質抽出物の他の成分からの分離の困難性により、不利とされている。それ故に、求められる用途でＮＡＰＥｓを使用するためには、それらを以下のスキームＩに従って、ホスファチジルエタノールアミン（以後ＰＥと呼ぶ）から分離するのが好ましい。
【０００９】
【化２】
【００１０】
この合成は、窒素に結合したアシル基が規定されたＮＡＰＥを得ることを可能にするが、これは高価で市場入手性の低いＰＥの使用を意味する。
【００１１】
特許文献４は、ＮＡＰＥｓを含む種々の生産物へホスファチジルコリン（ＰＣ）を変換（転化）する可能性と、反応の収量への言及は依然として無いものの、ホスホリパーゼＤＭとして知られる新しい酵素の利用の可能性を記載している。この特許に示されている実験条件は、それらを工業規模での使用に役立たない。なぜなら、それらは反応がエチルエーテルを含む混合溶媒中で高希釈度の基質で行われることを見越したものだからである。更に、反応前に開始基質（ＰＣ）が超音波処理にかけられて乳化される。
【００１２】
スキームＩＩに示されたホスファチジル基転移反応において、酵素ホスホリパーゼＤは、異なるアルコール基の間の交換であって、リン脂質の極性頭部のホスフェート基をエステル化するものを促進する。
【００１３】
【化３】
【００１４】
この変換は、薬学的及び栄養学的に多大な興味のあるリン脂質の生産について、工業規模においても、非常に有用であることが示されている。
【００１５】
アルコール型（ａｌｃｏｈｏｌｉｃ）試薬のセリン、グリセロールおよびエタノールアミンを使用して、ＰＣをそれぞれホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロールおよびホスファチジルエタノールアミンへ転移する反応は、十分に実証されている。
【００１６】
特許文献５は、ホスホリパーゼＤ存在下でのセリンとのホスファチジル基転移により、異なる起源のレシチンのホスファチジルセリンへの転移を記載している。この出願において、競合する加水分解反応に対してホスファチジル基転移反応を促進するために、リン脂質基質に対して少なくとも４モル／モルのセリンの量が使用された。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】特許ＵＳ４２５４１１５
【特許文献２】特許出願ＷＯ０３０６８２１０
【特許文献３】特許ＵＳ６２９４１９１
【特許文献４】特許ＵＳ４７８３４０２
【特許文献５】特許出願ＥＰ１０４８７３８
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Ｂｏｍｓｔｅｉｎ，Ｒ．Ａ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９６５）２１ ４９
【非特許文献２】Ｃｌａｒｋｅ ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐｉｄｓ（１９７６）１７ ２２２
【非特許文献３】Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．（１９７８）１０１ ２２１
【非特許文献４】Ｂｉｏｔｅｃｈｎ．Ｔｅｃｈｎ．（１９９３）７ ７９５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
上記の欠点を克服し、広く利用可能で安価な原料からＮＡＰＥを、市場で要求される量および純度で製造することを可能にする方法の必要性が現時点で存在する。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明は、それゆえ、式（Ｉ）のＮ−アシル−ホスファチジル−エタノールアミンを調製する方法により代表される。
【００２１】
【化４】
【００２２】
式中、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は、互いに独立して、飽和、単不飽和および／または多不飽和アシルＣ10−Ｃ30、Ｘ＝ＯＨまたはＯＭ、Ｍ＝アルカリ金属、アルカリ土類、アンモニウムまたはアルキルアンモニウムであり、この方法は、式（ＩＩ）のホスファチドと、
【００２３】
【化５】
【００２４】
（式中、Ｒ1およびＲ2は先に定義されたのと同じ意味を有し、Ｒ4＝ＣＨ2−ＣＨ2−Ｎ+（ＣＨ3）3および／またはＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ3+である。）式（ＩＩＩ）の化合物を、
【００２５】
【化６】
【００２６】
（式中、Ｒ3は先に定義されたのと同じ意味を有する。）ホスホリパーゼＤの存在下で反応することを含み、前記反応は水中、または、水と少なくとも１つの炭化水素との混合物中で行われることを特徴とする。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明の一態様によれば、式（ＩＩＩ）の化合物と式（ＩＩ）のホスファチドとの間のモル比は、好ましくは４未満であり、更により好ましくは１および３の間である。
【００２８】
本発明の更なる態様によれば、Ｒ1、Ｒ2および／またはＲ3は、好ましくはアシルＣ12−Ｃ24であり、更により好ましくは、Ｒ3はオレオイル、パルミトイルおよびアラキドイルから選択される。
【００２９】
本発明の方法は、限られたモル過剰の試薬Ｎ−アシル−エタノールアミン（ここでアシル（基）は、式（Ｉ）に対して先に定義したとおりである。）を使用し、酵素ホスホリパーゼＤの存在下及び工業規模での生産に適した条件で、ホスファチジル基転位反応により、合成又は天然起源のレシチンを高純度な式（Ｉ）のＮＡＰＥへ変換することを可能にする。
【００３０】
先行技術に記載されているホスファチジル基転移反応に関与するアルコール型の種（セリン、グリセロールおよびエタノールアミン）は、水への高い溶解性によって特徴付けられるが、本発明のホスファチジル基転位反応に関与するアルコール型の種である脂肪酸でアシル化されたエタノールアミンは、水にほとんど溶解しない化合物である。更に、前記のアルコール型の種は、少なくとも１２の炭素原子を含有する分子構造を有し、６を超える炭素原子からなる脂肪族鎖を備えたアルコールが、ホスファチジル基転移反応に関与する能力をほとんど有さないことが知られている（非特許文献３を参照）。
【００３１】
これらの不利な条件にも関わらず、我々は、驚くべきことに、合成および天然レシチンのホスファチジル基転移反応を行い、工業規模での生産に役立つ状態でＮＡＰＥを得られることを見出した。
【００３２】
本発明の方法によるＮＡＰＥｓの生産は、必要とされる原材料の幅広い利用可能性と、合成スキームの簡素さとを考慮すると、特に魅力的である。
【００３３】
スキームＩＩＩは、本発明の方法に従った、Ｎ−オレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（以後“ＮＯＰＥ”ともいう）の合成を示す。
【００３４】
【化７】
【００３５】
式中、Ｒ1、Ｒ2およびＲ4は、先に定義されたのと同じ意味を有する。
【００３６】
驚くべきことに、本発明の方法により、開始レシチンの終了ＮＡＰＥへの非常に高い転化率が得られることが見出された。このような条件において、ホスファチジン酸の形成につながる競合する加水分解が、実際上無視できるものであることも見出された。それゆえ、反応のために提供されたホスホリピドのモル当たり３モル未満のＮ−アシル−エタノールアミンのモル比を使用して、ホスファチジル基転移反応を行い、結果的に工業規模でのホスファチジル基転移においてホスファチジン酸の形成を制限するのに使用される大モル過剰を避けることができた。
【００３７】
本発明の興味深い特徴は、次の事実に代表される。すなわち、３０から３５％のような低い値にまで制限されたホスファチジルコリン（ＰＣ）含有量の流体レシチンのような、安価で広く入手可能な原材料を使用しながら、高純度のＮＡＰＥｓが得られ、これは、工業規模での生産手段に良く適合した単純な方法を使用することによって単離することができる。実際に、31Ｐ−ＮＭＲ測定は、本発明の教示に従って得られた生産物の純度および含有量が、典型的には８５％を超えることを示している。
【００３８】
本発明のホスファチジル基転移反応は、水性緩衝液からなる水性成分と、炭化水素溶媒からなる任意選択的な有機成分とからなる媒体中で行われる。
【００３９】
本発明を実行するためには、これらの成分の相対量は、明確に定義された範囲を守らなければならない。即ちこれは、そのような成分および本方法の原材料を構成する基質の量の間の比が制御されなければならないということである。
【００４０】
特に、炭化水素溶媒の量は、好ましくは１リットル／水１リットル未満であり、更に好ましくは、それは０．３および０．７リットル／水１リットルの間である。この比が０．３および０．７リットル／リットルの間であるときは、ホスファチジン酸の形成が非常に少ないため、使用された分析方法（31Ｐ−ＮＭＲ）の感度（０．２％）を下回ることが指摘されている。
【００４１】
更に、反応のために提供されたホスファチドの量に対する、反応において存在する溶媒の全量（水と任意選択的な炭化水素溶媒との合計）は、好ましくはホスファチドのｋｇ当たり５および４０リットルの間であり、更により好ましくは６および２０リットルの間である。
【００４２】
本発明により効果的なホスファチジル基転移反応を行うことが可能であることは、酵素ホスホリパーゼＤが存在する水相においてリン脂質基質も試薬アルコールも溶解しないことを考慮すれば、まったく驚くべきことである。実際に、リン脂質基質は水相に分散され、試薬アルコールもまた水相に分散されまたは任意選択的に使用されるときは炭化水素溶媒中に存在する。あるいは、ホスファチジル基転移反応のより十分に説明された場合においては、試薬アルコールは、酵素ホスホリパーゼＤも存在する同じ水相に溶解され、こうして酵素ホスホリパーゼＤが反応に関与するのをより容易にしていると思われる。
【００４３】
これらの条件で操作することにより、反応は、驚くほど早くかつ選択的であり、６時間未満の反応時間でホスファチドのほぼ完全な変換：即ち31Ｐ−ＮＭＲ分析が３％未満の残留ＰＣの存在、および加水分解生成物（ホスファチジン酸）の同時形成を示すことに繋がることが見出されている。
【００４４】
本発明のこの最後の態様は、ホスファチジン酸を他のリン脂質から分離する際の公知の困難性を考慮すると、特に有意義であり、従って、反応の過程でその形成を避けることは、後続のＮＡＰＥの精製にとって実質的に有利である。
【００４５】
本発明の方法において原材料として用いられ得るリン脂質は、（大豆および向日葵のような）野菜起源または（卵、オキアミ、魚および魚卵のような）動物起源の天然レシチンである。単細胞種の発酵から得ることができるリン脂質の混合物も、この方法における基質として有利に使用することができる。
【００４６】
このようなレシチンは、異なる純度にすることができ、かつ、５０重量％を下回るホスファチジルコリン含有量を有することができる。
【００４７】
本発明の一態様によれば、式（ＩＩ）のホスファチドは、２０および９５重量％の間のホスファチジルコリンおよび／またはホスファチジルエタノールアミン含有量を有する天然起源のホスファチドの混合物であり；本発明の方法は、２５および４５重量％の間のホスファチジルコリンおよび／またはホスファチジルエタノールアミン含有量を有する天然起源のホスファチドの混合物を使用して有利に行うこともできる。
【００４８】
規定された組成の脂肪酸を有するＮＡＰＥを得るためには、例えば１，２−ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、１，２−ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）のような合成ホスファチドを使用することもできる。
【００４９】
使用できるＮ−アシル−エタノールアミンは、異なる起源のものとすることができ、それらは異なる純度を有することができ、アシル基は、１０から３０までの炭素原子を含有するカルボン酸から誘導することができ、個別にまたは互いに混合されて存在することができる。このような酸は、飽和、不飽和または多不飽和脂肪酸とすることができる。特に、アラキドン酸、パルミチン酸およびオレイン酸が好ましい。
【００５０】
炭化水素溶媒については、好ましくは４から１０までの炭素原子、更により好ましくは６から８までの炭素原子を有する芳香族および脂肪族溶媒の両方を有利に使用することができ；より有利にはトルエンまたはｎ−ヘプタンが使用される。
【００５１】
ホスファチジル基転移反応は、２０および７０℃の間、好ましくは３０および５０℃の間の温度で行うことができる。この反応のｐＨは、使用される酵素の起源によって変化することが可能であり、好ましくは、３．５および９の間、更により好ましくは４および５．５の間の範囲に入る。
【００５２】
攪拌のタイプは、反応速度に影響を与え、機械的攪拌、任意選択的に磁気攪拌によって有利に行うことができる。水性の反応相は、好ましくは、０．０１Ｍおよび０．２Ｍの間の濃度の緩衝液からなる。異なるタイプの緩衝液を使用することができ、好ましくは緩衝アセテートが使用される。
【００５３】
例えばカルシウムまたはマグネシウムのような二価の金属イオンの存在は、ホスホリパーゼＤにより触媒されるホスファチジル基転移反応を促進し；このようなイオンは好ましくは塩または酸化物の形で使用され；更により好ましくは、この反応は塩化カルシウムの存在下で行われる。前記二価の金属イオンの濃度は、好ましくは０．０５および０．５Ｍの範囲に入る。
【００５４】
反応を行うためには、加水分解活性に比べて高いホスファチジル基転移活性を示すホスホリパーゼＤ酵素を選択するのが有利である。
【００５５】
このような酵素は、必ずしも精製される必要は無い。有利には、発酵起源の酵素を使用することが可能であり、これは好ましくはＡＴＣＣ５５７１７として申請された微生物の発酵で得られるもののようなストレプトミセス属の菌株から産生される。
【００５６】
酵素の量は、好ましくは、反応のために提供されるホスホリピドのグラムあたり１０および１００ユニットの間の範囲に入る。酵素活性は、非特許文献４に記載された方法で決定される。
【００５７】
その例から明らかとなるように、反応混合物が水および少なくとも１つの炭化水素からなるとき、これは、式（ＩＩ）のホスファチドを含む緩衝水性分散物を、式（ＩＩＩ）の化合物の炭化水素溶液若しくは分散物と化合させることにより通常得られ；ホスホリパーゼＤは式（ＩＩ）のホスファチドを含む緩衝水性分散物に既に存在することができ、またはそれは既に形成された反応混合物に後の段階で添加され得る。代替的に、反応は、式（ＩＩ）のホスファチド、式（ＩＩＩ）の化合物、およびホスホリパーゼＤを含有する緩衝水性分散物中で行うことができる。
【００５８】
ＮＡＰＥｓを単離するためには、有利には、アセトンからの液液抽出および沈殿のような、当業者に知られた方法を使用することが可能である。
【実施例】
【００５９】
以下の実施例は、本発明を実施する幾つかの方法を単に例示するだけの目的を有し、決して限定して考慮されてはならない。
【００６０】
実施例１
７５ｇのＰｈｏｓａｌ３５（登録商標）、ホスホリピドＧｍｂＨによって３５％に等しいＰＣ含有量で生産された流動性大豆レシチンを、７５０ｍＬのアセトンを含有する１Ｌフラスコ内に攪拌下で導入した。上澄みを除去し、１０ｇの塩化カルシウムを含有する３２０ｍＬのアセテート緩衝液０．１Ｍ ｐＨ＝４．５をこのフラスコ内に添加した。残留アセトンを蒸発により低圧で除去した。混合物を４３℃に加熱し、攪拌下で３０分間維持した。温度と攪拌を維持しながら、ｎ−ヘプタン１４０ｍＬ中のＮ−オレオイル−エタノールアミン３１ｇの溶液、次いで同じ緩衝液２０ｍＬ中の、ＡＴＣＣ５５７１７（比活性度３２００Ｕ／ｇ）から得たホスホリパーゼＤ０．７５ｇの懸濁液を添加した。
【００６１】
混合物をその温度で機械攪拌しながら５時間維持した。これを室温に冷却し、反応生成物のサンプルを取り、それをＮＭＲで分析した。
【００６２】
31Ｐ−ＮＭＲスペクトルは、８６．８％のＮＡＰＥと１．４％のＰＣの存在を示した。ＰＡは検出限界（０．２％）を下回った。
【００６３】
実施例２
２８ｇのＰｈｏｓｐｈｏｌｉｐｏｎ９０（登録商標）、ホスホリピドＧｍｂＨによって９５％に等しいＰＣ含有量で生産された流動性大豆レシチンを、１０ｇの塩化カルシウムを含有する３２０ｍＬのアセテート緩衝液０．１Ｍ ｐＨ＝４．５を入れた１Ｌフラスコ内に導入した。混合物を４３℃に加熱し、攪拌下で６０分間維持した。温度と攪拌を維持しながら、ｎ−ヘプタン１４０ｍＬ中Ｎ−オレオイル−エタノールアミン３１ｇの溶液、次いで同じ緩衝液２０ｍＬ中の、ＡＴＣＣ５５７１７（比活性度３２００Ｕ／ｇ）から得たホスホリパーゼＤ０．７５ｇの懸濁液を添加した。
【００６４】
混合物をその温度で機械攪拌しながら５時間維持した。これを室温に冷却し、反応生成物のサンプルを取り、それをＮＭＲで分析した。
【００６５】
31Ｐ−ＮＭＲスペクトルは、９４．９％のＮＡＰＥと０．９％のＰＣの存在を示した。ＰＡは検出限界（０．２％）を下回った。
【００６６】
実施例３
２８ｇの１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、Ｃｈｅｍｉ ＳｐＡによって生産された合成ホスホリピドを、１０ｇの塩化カルシウムを含有する３２０ｍＬのアセテート緩衝液０．１Ｍ ｐＨ＝４．５を入れた１Ｌフラスコ内に導入した。残留アセトンを蒸発により低圧で除去した。混合物を４３℃に加熱し、攪拌下で６０分間維持した。温度と攪拌を維持しながら、ｎ−ヘプタン１４０ｍＬ中Ｎ−オレオイル−エタノールアミン３１ｇの溶液、次いで同じ緩衝液２０ｍＬ中の、ＡＴＣＣ５５７１７（比活性度３２００Ｕ／ｇ）から得たホスホリパーゼＤ０．７５ｇの懸濁液を添加した。
【００６７】
混合物をその温度で機械攪拌しながら５時間維持した。これを室温に冷却し、反応生成物のサンプルを取り、それをＮＭＲで分析した。
【００６８】
31Ｐ−ＮＭＲスペクトルは、９４．４％のＮＡＰＥと１．９％のＰＣの存在を示した。ＰＡは検出限界（０．２％）を下回った。
【００６９】
実施例４
７５ｇのＰｈｏｓａｌ３５（登録商標）、ホスホリピドＧｍｂＨによって３５％に等しいＰＣ含有量で生産された流動性大豆レシチンを、７５０ｍＬのアセトンを入れた１Ｌフラスコ内に攪拌下で導入した。上澄みを除去し、１０ｇの塩化カルシウムを含有する３２０ｍＬのアセテート緩衝液０．１Ｍ ｐＨ＝４．５をこのフラスコ内に添加した。残留アセトンを蒸発により低圧で除去した。混合物を４３℃に加熱し、攪拌下で３０分間維持した。温度と攪拌を維持しながら、３１ｇのＮ−オレオイル−エタノールアミン、次いで同じ緩衝液２０ｍＬ中の、ＡＴＣＣ５５７１７（比活性度３２００Ｕ／ｇ）から得たホスホリパーゼＤ０．７５ｇの懸濁液とを添加した。
【００７０】
混合物をその温度で機械攪拌しながら５時間維持した。これを室温に冷却し、反応生成物のサンプルを取り、それをＮＭＲで分析した。
【００７１】
31Ｐ−ＮＭＲスペクトルは、８５．５％のＮＡＰＥ、３．９％のＰＣおよび１．３％のＰＡの存在を示した。
【００７２】
実施例５
７５ｇのＰｈｏｓａｌ３５（登録商標）、ホスホリピドＧｍｂＨによって３５％に等しいＰＣ含有量で生産された流動性大豆レシチンを、７５０ｍＬのアセトンを入れた１Ｌフラスコ内に攪拌下で導入した。上澄みを除去し、１０ｇの塩化カルシウムを含有する３２０ｍＬのアセテート緩衝液０．１Ｍ ｐＨ＝４．５をこのフラスコ内に添加した。残留アセトンを蒸発により低圧で除去した。混合物を４３℃に加熱し、攪拌下で３０分間維持した。温度と攪拌を維持しながら、トルエン１４０ｍＬ中のＮ−オレオイル−エタノールアミン３１ｇの溶液、次いで同じ緩衝液２０ｍＬ中の、ＡＴＣＣ５５７１７（比活性度３２００Ｕ／ｇ）から得たホスホリパーゼＤ０．７５ｇの懸濁液とを添加した。
【００７３】
混合物をその温度で機械攪拌しながら５時間維持した。これを室温に冷却し、反応生成物のサンプルを取り、それをＮＭＲで分析した。
【００７４】
31Ｐ−ＮＭＲスペクトルは、８６．２％のＮＡＰＥと１．６％のＰＣの存在を示した。ＰＡは、検出限界（０．２％）を下回った。
【００７５】
実施例６
７５ｇのＰｈｏｓａｌ３５（登録商標）、ホスホリピドＧｍｂＨによって３５％に等しいＰＣ含有量で生産された流動性大豆レシチンを、７５０ｍＬのアセトンを入れた１Ｌフラスコ内に攪拌下で導入した。上澄みを除去し、１０ｇの塩化カルシウムを含有する３２０ｍＬのアセテート緩衝液０．１Ｍ ｐＨ＝４．５をこのフラスコ内に添加した。残留アセトンを蒸発により低圧で除去した。混合物を４３℃に加熱し攪拌下で３０分間維持した。温度と攪拌を維持しながら、ｎ−ヘプタン１４０ｍＬ中のＮ−オレオイル−エタノールアミン３１ｇの溶液、次いで同じ緩衝液２０ｍＬ中の、会社ヤクルト（比活性度８５００Ｕ／ｇ）によって生産されたホスホリパーゼＤ０．２８ｇの懸濁液とを添加した。
【００７６】
混合物をその温度で機械攪拌しながら５時間維持した。これを室温に冷却し、反応生成物のサンプルを取り、それをＮＭＲで分析した。
【００７７】
31Ｐ−ＮＭＲスペクトルは、８５．２％のＮＡＰＥと２．４％のＰＣの存在を示した。ＰＡは、検出限界（０．２％）を下回った。
【００７８】
実施例７
７５ｇのＰｈｏｓａｌ３５（登録商標）、ホスホリピドＧｍｂＨによって３５％に等しいＰＣ含有量で生産された流動性大豆レシチンを、７５０ｍＬのアセトンを入れた１Ｌフラスコ内に攪拌下で導入した。上澄みを除去し、１０ｇの塩化カルシウムを含有する３２０ｍＬのアセテート緩衝液０．１Ｍ ｐＨ＝４．５をこのフラスコ内に添加した。残留アセトンを蒸発により低圧で除去した。混合物を４３℃に加熱し、攪拌下で３０分間維持した。温度と攪拌を維持しながら、ｎ−ヘプタン２３０ｍＬ中のＮ−パルミトイル−エタノールアミン２９ｇの溶液、次いで同じ緩衝液２０ｍＬ中の、ＡＴＣＣ５５７１７（比活性度３２００Ｕ／ｇ）から得たホスホリパーゼＤ０．７５ｇの懸濁液とを添加した。
【００７９】
混合物をその温度で機械攪拌しながら６時間維持した。これを室温に冷却し、反応生成物のサンプルを取り、それをＮＭＲで分析した。
【００８０】
31Ｐ−ＮＭＲスペクトルは、８５．２％のＮＡＰＥと２．８％のＰＣの存在を示した。ＰＡは、検出限界（０．２％）を下回った。
【００８１】
実施例８
７５ｇのＰｈｏｓａｌ３５（登録商標）、ホスホリピドＧｍｂＨによって３５％に等しいＰＣ含有量で生産された流動性大豆レシチンを、７５０ｍＬのアセトンを入れた１Ｌフラスコ内に攪拌下で導入した。上澄みを除去し、５ｇの塩化カルシウムを含む１５０ｍＬのアセテート緩衝液０．１Ｍ ｐＨ＝４．５をこのフラスコ内に添加した。残留アセトンを蒸発により低圧で除去した。混合物を４３℃に加熱し、攪拌下で３０分間維持した。温度と攪拌を維持しながら、ｎ−ヘプタン３１０ｍＬ中のＮ−オレオイル−エタノールアミン３１ｇの溶液、次いで同じ緩衝液２０ｍＬ中の、ＡＴＣＣ５５７１７（比活性度３２００Ｕ／ｇ）から得たホスホリパーゼＤ０．７５ｇの懸濁液とを添加した。
【００８２】
混合物をその温度で機械攪拌しながら５時間維持した。これを室温に冷却し、反応生成物のサンプルを取り、それをＮＭＲで分析した。
【００８３】
31Ｐ−ＮＭＲスペクトルは、３８．６％のＮＡＰＥ、４４．７％のＰＣおよび１．３％のＰＡの存在を示した。
【００８４】
実施例９
７５ｇのＰｈｏｓａｌ３５（登録商標）、ホスホリピドＧｍｂＨによって３５％に等しいＰＣ含有量で生産された流動性大豆レシチンを、７５０ｍＬのアセトンを入れた１Ｌフラスコ内に攪拌下で導入した。上澄みを除去し、２ｇの塩化カルシウムを含有する６０ｍＬのアセテート緩衝液０．１Ｍ ｐＨ＝４．５をこのフラスコ内に添加した。残留アセトンを蒸発により低圧で除去した。混合物を４３℃に加熱し、攪拌下で３０分間維持した。温度と攪拌を維持しながら、ｎ−ヘプタン３０ｍＬ中のＮ−オレオイル−エタノールアミン３１ｇ、次いで同じ緩衝液２０ｍＬ中の、ＡＴＣＣ５５７１７（比活性度３２００Ｕ／ｇ）から得たホスホリパーゼＤ０．７５ｇの懸濁液とを添加した。
【００８５】
混合物をその温度で機械攪拌しながら５時間維持した。これを室温に冷却し、反応生成物のサンプルを取り、それをＮＭＲで分析した。
【００８６】
31Ｐ−ＮＭＲスペクトルは、３４．３％のＮＡＰＥ、４９．７％のＰＣおよび１．３％のＰＡの存在を示した。
【００８７】
実施例１０
７５ｇのＰｈｏｓａｌ３５（登録商標）、ホスホリピドＧｍｂＨによって３５％に等しいＰＣ含有量で生産された流動性大豆レシチンを、７５０ｍＬのアセトンを入れた２Ｌフラスコ内に攪拌下で導入した。上澄みを除去し、３５ｇの塩化カルシウムを含有する１．２Ｌのアセテート緩衝液０．１Ｍ ｐＨ＝４．５をこのフラスコ内に添加した。残留アセトンを蒸発により低圧で除去した。混合物を４３℃に加熱し、攪拌下で３０分間維持した。温度と攪拌を維持しながら、ｎ−ヘプタン５６０ｍＬ中のＮ−オレオイル−エタノールアミン３１ｇの溶液、次いで同じ緩衝液２０ｍＬ中のＡＴＣＣ５５７１７（比活性度３２００Ｕ／ｇ）からの０．７５ｇのホスホリパーゼＤの懸濁液とを添加した。
【００８８】
混合物をその温度で５時間機械攪拌して維持した。これを室温に冷却し、反応生成物のサンプルを得てそれをＮＭＲで分析した。
【００８９】
31Ｐ−ＮＭＲスペクトルは、８３．２％のＮＡＰＥ、４．６％のＰＣおよび２．６％のＰＡの存在を示した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）のＮ−アシル−ホスファチジル−エタノールアミンを調製する方法であって、
【化１】
（式中、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は、互いに独立して、飽和、単不飽和および／または多不飽和アシルＣ10−Ｃ30、Ｘ＝ＯＨまたはＯＭ、Ｍ＝アルカリ金属、アルカリ土類、アンモニウムまたはアルキルアンモニウムである。）式（ＩＩ）のホスファチドを、
【化２】
（式中、Ｒ1およびＲ2が先に定義されたのと同じ意味を有し、およびＲ4＝ＣＨ2−ＣＨ2−Ｎ+（ＣＨ3）3および／またはＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ3+である。）式（ＩＩＩ）の化合物と、
【化３】
（式中、Ｒ3は先に定義されたのと同じ意味を有する。）ホスホリパーゼＤの存在下で反応することを含み、前記反応が、水中、または、水および少なくとも１つの炭化水素の混合物中で行われることを特徴とする方法。
【請求項２】
水および少なくとも１つの炭化水素の前記混合物が、式（ＩＩ）のホスファチドを含有する緩衝水性分散物を、式（ＩＩＩ）の化合物の炭化水素溶液若しくは分散物と組み合わせることにより得られることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記反応が、式（ＩＩ）のホスファチドおよび式（ＩＩＩ）の化合物を含有する緩衝水性分散物中で行われることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
式（ＩＩＩ）の化合物および式（ＩＩ）のホスファチドの間のモル比が、４未満であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
式（ＩＩＩ）の化合物および式（ＩＩ）のホスファチドの間のモル比が、１および３の間であることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
Ｒ1、Ｒ2および／またはＲ3が、アシルＣ12−Ｃ24であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
Ｒ3が、オレオイル、パルミトイルおよびアラキドイルから選択されることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
水が、３．５および９の間、好ましくは４および５．５の間のｐＨで緩衝されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】
カルシウムおよび／またはマグネシウムイオンの存在下で行われることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ホスホリパーゼＤが、発酵起源であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ホスホリパーゼＤが、ストレプトミセス属の菌株から産生されることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
式（ＩＩ）の前記ホスファチドが、２０重量％および９５重量％の間のホスファチジルコリンおよび／またはエタノールアミン含有量を有する天然起源のホスファチドの混合物であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
式（ＩＩ）の前記ホスファチドが、２５重量％および４５重量％の間のホスファチジルコリンおよび／またはエタノールアミン含有量を有する天然起源のホスファチドの混合物であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
式（ＩＩ）の前記ホスファチドが、５０重量％未満のホスファチジルコリン含有量を有するレシチンであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
式（ＩＩ）の前記ホスファチドが、大豆および／または卵レシチンであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
式（ＩＩ）の前記ホスファチドが、例えば１，２−ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、１，２−ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）のような、合成起源のホスファチドであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記炭化水素が、炭化水素Ｃ4−Ｃ10、好ましくはＣ6−Ｃ8であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記炭化水素が、トルエンおよびｈ−ヘプタンから選択されることを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記炭化水素が、１リットル／水１リットル未満の量で存在することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記炭化水素が、０．３および０．７リットル／水１リットルの間の量で存在することを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
水および任意選択的な炭化水素溶媒が、５および４０リットル／Ｋｇの間の式（ＩＩ）のホスファチド、好ましくは６および２０リットル／Ｋｇの間のホスファチドの総量で存在することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
２０および７０℃の間、好ましくは３０および５０℃の間の温度で行われることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
界面活性剤の添加および／または超音波処理無しで行われることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１】
式（Ｉ）のＮ−アシル−ホスファチジル−エタノールアミンを調製する方法であって、
【化１】
（式中、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は、互いに独立して、飽和、単不飽和および／または多不飽和アシルＣ10−Ｃ30、Ｘ＝ＯＨまたはＯＭ、Ｍ＝アルカリ金属、アルカリ土類、アンモニウムまたはアルキルアンモニウムである。）式（ＩＩ）のホスファチドを、
【化２】
（式中、Ｒ1およびＲ2が先に定義されたのと同じ意味を有し、およびＲ4＝ＣＨ2−ＣＨ2−Ｎ+（ＣＨ3）3および／またはＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ3+である。）式（ＩＩＩ）の化合物と、
【化３】
（式中、Ｒ3は先に定義されたのと同じ意味を有する。）ホスホリパーゼＤの存在下で反応することを含み、前記反応が、水中、または、水および少なくとも１つの炭化水素の混合物中で行われることを特徴とする方法。
【請求項２】
水および少なくとも１つの炭化水素の前記混合物が、式（ＩＩ）のホスファチドを含有する緩衝水性分散物を、式（ＩＩＩ）の化合物の炭化水素溶液若しくは分散物と組み合わせることにより得られることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記反応が、式（ＩＩ）のホスファチドおよび式（ＩＩＩ）の化合物を含有する緩衝水性分散物中で行われることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
式（ＩＩＩ）の化合物および式（ＩＩ）のホスファチドの間のモル比が、４未満であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
式（ＩＩＩ）の化合物および式（ＩＩ）のホスファチドの間のモル比が、１および３の間であることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
Ｒ1、Ｒ2および／またはＲ3が、アシルＣ12−Ｃ24であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
Ｒ3が、オレオイル、パルミトイルおよびアラキドイルから選択されることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
水が、３．５および９の間、好ましくは４および５．５の間のｐＨで緩衝されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】
カルシウムおよび／またはマグネシウムイオンの存在下で行われることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ホスホリパーゼＤが、発酵起源であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ホスホリパーゼＤが、ストレプトミセス属の菌株から産生されることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
式（ＩＩ）の前記ホスファチドが、２０重量％および９５重量％の間のホスファチジルコリンおよび／またはエタノールアミン含有量を有する天然起源のホスファチドの混合物であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
式（ＩＩ）の前記ホスファチドが、２５重量％および４５重量％の間のホスファチジルコリンおよび／またはエタノールアミン含有量を有する天然起源のホスファチドの混合物であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
式（ＩＩ）の前記ホスファチドが、５０重量％未満のホスファチジルコリン含有量を有するレシチンであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
式（ＩＩ）の前記ホスファチドが、大豆および／または卵レシチンであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
式（ＩＩ）の前記ホスファチドが、例えば１，２−ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、１，２−ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）のような、合成起源のホスファチドであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記炭化水素が、炭化水素Ｃ4−Ｃ10、好ましくはＣ6−Ｃ8であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記炭化水素が、トルエンおよびｈ−ヘプタンから選択されることを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記炭化水素が、１リットル／水１リットル未満の量で存在することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記炭化水素が、０．３および０．７リットル／水１リットルの間の量で存在することを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
水および任意選択的な炭化水素溶媒が、５および４０リットル／Ｋｇの間の式（ＩＩ）のホスファチド、好ましくは６および２０リットル／Ｋｇの間のホスファチドの総量で存在することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
２０および７０℃の間、好ましくは３０および５０℃の間の温度で行われることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
界面活性剤の添加および／または超音波処理無しで行われることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【公表番号】特表２０１１−５２７５６６（Ｐ２０１１−５２７５６６Ａ）
【公表日】平成２３年１１月４日（２０１１．１１．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５１７３１９（Ｐ２０１１−５１７３１９）
【出願日】平成２０年７月８日（２００８．７．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＴ２００８／０００４６０
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／００４５９７
【国際公開日】平成２２年１月１４日（２０１０．１．１４）
【出願人】（５０３３７５１７５）ケミー ソシエタ ペル アチオニ (3)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年１１月４日（２０１１．１１．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年７月８日（２００８．７．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＴ２００８／０００４６０
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／００４５９７
【国際公開日】平成２２年１月１４日（２０１０．１．１４）
【出願人】（５０３３７５１７５）ケミー ソシエタ ペル アチオニ (3)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]