Ｎ−アシル保護またはＮ−グアニジル保護１，４−ブタンジアミン前駆体を介する１，４−ブタンジアミンの調製方法
本発明は、１，４−ジアミノブタン［ＤＡＢ］の調製のための新規な方法に関する。本発明による方法には、ＤＡＢの少なくとも１つのＮ−保護前駆体の生体触媒による生成を含む、少なくとも１つの生体触媒ステップが含まれる。本発明はまた、少なくとも１つの生体触媒ステップを含むＤＡＢの調製方法であって、ａ）ＤＡＢのＮ−保護前駆体を生体触媒により調製するステップであって、ＤＡＢのＮ−保護前駆体を含有する生体触媒反応混合物を生じさせるステップと、ｂ）生体触媒反応混合物からＮ−保護前駆体を回収するステップと、ｃ）Ｎ−保護前駆体をＤＡＢに変換するステップとを含む方法に関する。より具体的には、本発明は、ＤＡＢの少なくとも１つのＮ−保護前駆体が、Ｎ５−保護オルニチン、Ｎ−保護ＤＡＢ、およびＮ−保護４−アミノブチルアルデヒドからなる群から選択される、ＤＡＢの調製方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、少なくとも１つの生体触媒ステップを含む、１，４−ジアミノブタン［ＤＡＢ］の調製方法に関する。
【０００２】
化合物ＤＡＢは、主要なエンジニアリングプラスチックの一部、すなわちホモポリマー形態のポリアミド−４，６、または例えば約５重量％のポリアミド−６モノマー（カプロラクタム）と共重合したポリアミド−４，６を製造するための重要な原料である。ホモポリマーポリアミド−４、６（ナイロン４，６）は、早くも１９３８年に記載がある（米国特許第２，１３０，９４８（Ａ）号明細書、カロザーズ（Ｃａｒｏｔｈｅｒｓ））。これはモノマーＤＡＢおよびアジピン酸の重縮合生成物である。現在、特にポリアミド−４，６の化合物は、スタニル（ＳＴＡＮＹＬ）（登録商標）の商品名でオランダのＤＳＭが製造し、販売している。
【０００３】
ＤＡＢの合成については、いくつかの化学ルートが知られている。これらの化学ルートには、再生が不可能であると考えられる供給源から出発物質を入手しなければならないという欠点がある。しかしながら、再生可能な炭素源から出発し、生化学的プロセス（「生体内変換」とも呼ばれる）を使用するＤＡＢ合成のための実現可能な新ルートを提供する実質的な必要性が存在する。
【０００４】
少なくとも１つの発酵ステップを含むＤＡＢの調製方法が、国際公開第２００６／００５６０３号パンフレットおよび国際公開第２００６／００５０４号パンフレットとして公表されたＰＣＴ出願に記載されている。両方の文書には、高レベルのオルニチンデカルボキシラーゼ活性を有する微生物における、ＤＡＢの発酵による製造が記載されている。
【０００５】
本方法は、ＤＡＢの代替調製方法に関する。本発明による方法は、ＤＡＢの少なくとも１つのＮ−保護前駆体の生体触媒による生成とその後のＮ−保護前駆体のＤＡＢへのインビトロ変換とを含む、少なくとも１つの生体触媒ステップを含む。
【０００６】
生体触媒による生成後のＤＡＢの回収は、相当な困難を伴うことが見出された。国際公開第２００７／０７９９４４号パンフレットには、ＤＡＢなどの有機アミンの回収が記載されている。そこに記載の特定の実施形態では、アミンの硫酸塩またはリン酸塩（したがって例えば、ＤＡＢ二硫酸塩）を含有する無細胞培養液が濃縮され、アンモニアのような塩基が添加される。条件に応じて、２層系が形成される。主として有機化合物を含有する層から、所望のアミンが回収され得る。
[発明の詳細な説明］
【０００７】
一実施形態によれば、ＤＡＢの調製方法は、少なくとも１つの生体触媒ステップを含み、（ａ）ＤＡＢのＮ−保護前駆体を生体触媒により調製するステップであって、ＤＡＢのＮ−保護前駆体を含有する生体触媒反応混合物を生じさせるステップと、（ｂ）生体触媒反応混合物からＮ−保護前駆体を回収するステップと、（ｃ）Ｎ−保護前駆体をＤＡＢに変換するステップとを含む。
【０００８】
特定の実施形態によれば、ＤＡＢを生成させる本発明は、少なくとも１つの生体触媒ステップを含み、このステップは、Ｎ５−保護オルニチン、Ｎ−保護ＤＡＢ、およびＮ−保護４−アミノブチルアルデヒドからなる群から選択される、ＤＡＢの少なくとも１つのＮ−保護前駆体の生体触媒による生成、およびその後のＮ−保護前駆体のＤＡＢへのインビトロ変換を含む。
【０００９】
本明細書において「インビトロ変換」とは、細胞外の培地中においてＤＡＢのＮ−保護前駆体がＤＡＢへ変換されることを意味する。このインビトロ変換は、少なくとも１つの生体触媒による変換であってもよく、もしくは少なくとも１つの化学ステップを含む化学変換であってもよく、または少なくとも１つの生体触媒ステップと少なくとも１つの化学ステップとの組合せであってもよい。
【００１０】
本明細書において「ＤＡＢのＮ−保護前駆体」とは、保護アミノ基を含有し、少なくとも１つの化学反応もしくは生体触媒反応、または化学反応と生体触媒反応との組合せによってＤＡＢに変換され得る化合物を意味する。
【００１１】
本明細書において「Ｎ５−保護オルニチン」とは、Ｎ５原子に保護基を有するオルニチン分子を意味する。本明細書において「Ｎ−保護ＤＡＢ」とは、アミノ基の１つに保護基を有するＤＡＢ分子を意味する。本明細書において「Ｎ−保護４−アミノブチルアルデヒド」とは、アミノ基に保護基を有する４−アミノブチルアルデヒド分子を意味する。
【００１２】
上述の保護基は、１〜６個の炭素原子を有するアシル類からなる群から選択してもよく、またはグアニジル基であってもよい。このような保護基は、生体触媒による生成、生体触媒反応混合物（例えば発酵培養液）からのＮ−保護前駆体の容易な回収、ならびにその後の最終的にＤＡＢを生成するための生体触媒反応および／または化学反応の少なくとも１つを可能にさせるように選択すべきである。
【００１３】
Ｎ−保護ＤＡＢ前駆体は、例えば４−アミノブチルアルデヒドまたはオルニチンのアシル化によって調製することができる。例えば、ギ酸中での無水酢酸によるアシル化によってホルミル保護基を導入すること、またはＣ２〜Ｃ６カルボン酸無水物もしくは塩化アシルの反応によってＮ−アセチル、Ｎ−プロピオニル、Ｎ−ブチリル、Ｎ−バレリル、もしくはＮ−カプロイル保護基をそれぞれ導入すること。
【００１４】
Ｎ−グアニジル保護前駆体は、例えばタンパク新生のアルギニンまたはＮ−グアニジル−アミノブチルアルデヒドもしくはＮ−グアニジルＤＡＢである。発酵ルートが、例えば欧州特許第１２６０５８８号明細書に記載されており、その明細書ではアルギニンデカルボキシラーゼの影響下でアルギニンからアグマチンが生化学的に生成されることが記載されている。アグマチンは、Ｎ−グアニジル保護ＤＡＢである。アグマチン（Ｎ−グアニジル保護ＤＡＢ）は、酸加水分解によって、例えば濃塩酸または濃硫酸などの濃鉱酸水溶液中でアグマチンを還流することによって支障なく脱保護されてＤＡＢになり得る。これにより、ＤＡＢの二酸塩ならびに副生成物の二酸化炭素およびアンモニア（後者は使用される鉱酸のアンモニウム塩の形）が得られる。ＤＡＢをその遊離アミン形で得るために、形成された二酸塩を単離し、再溶解し、塩基で中和すべきである。
【００１５】
さらに特定の実施形態によれば、本発明は、ＤＡＢの少なくとも１つのＮ−保護前駆体が生成され、そのＮ−保護前駆体がＮ５−アセチルオルニチン、Ｎ−アセチルＤＡＢ、およびＮ−アセチル４−アミノブチルアルデヒドからなる群から選択される、ＤＡＢの調製方法に関する。
【００１６】
特定の一実施形態によれば、少なくとも１つの生体触媒ステップを含むＤＡＢの調製方法は、（ａ）Ｎ５−アセチルオルニチンを生体触媒により調製するステップであって、Ｎ５−アセチルオルニチンを含有する生体触媒反応混合物を生じさせるステップと、（ｂ）生体触媒反応混合物からＮ５−アセチルオルニチンを回収するステップと、（ｃ）Ｎ５−アセチルオルニチンをＤＡＢに変換するステップとを含む。
【００１７】
特定の一実施形態によれば、少なくとも１つの生体触媒ステップを含むＤＡＢの調製方法は、（ａ）Ｎ−アセチルＤＡＢを生体触媒により調製するステップであって、Ｎ−アセチルＤＡＢを含有する生体触媒反応混合物を生じさせるステップと、（ｂ）生体触媒反応混合物からＮ−アセチルＤＡＢを回収するステップと、（ｃ）Ｎ−アセチルＤＡＢをＤＡＢに変換するステップとを含む。
【００１８】
特定の一実施形態によれば、少なくとも１つの生体触媒ステップを含むＤＡＢの調製方法は、（ａ）Ｎ−アセチル４−アミノブチルアルデヒドを生体触媒により調製するステップであって、Ｎ−アセチル４−アミノブチルアルデヒドを含有する生体触媒反応混合物を生じさせるステップと、（ｂ）生体触媒反応混合物からＮ−アセチル４−アミノブチルアルデヒドを回収するステップと、（ｃ）Ｎ−アセチル４−アミノブチルアルデヒドをＤＡＢに変換するステップとを含む。
【００１９】
本明細書において、アミンまたはＮ−保護アミン、例えばＮ−保護ＤＡＢを明示的または黙示的に言及する場合、これらの用語は、中性のアミン基、それに対応する荷電を有するプロトン化アミン、およびその塩を含むことを意味する。
【００２０】
［定義］
本明細書において使用する用語「または（ｏｒ）」は、別段の指定がない限り「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」として定義される。
【００２１】
本明細書において使用する用語「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」は、別段の指定がない限り「少なくとも１つ」として定義される。
【００２２】
単数形の名詞（例えば化合物（ａ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）、添加物（ａｎ ａｄｄｉｔｉｖｅ）等）に言及する場合、その複数形も含まれることを意味する。
【００２３】
立体異性体が存在する化合物に言及する場合、その化合物はそのような立体異性体のいずれであっても、またはそれらの組合せであってもよい。したがって、例えば鏡像異性体が存在するアミノ酸に言及する場合、そのアミノ酸はＬ−鏡像異性体であっても、もしくはＤ−鏡像異性体であっても、またはそれらの組合せであってもよい。天然の立体異性体が存在する場合、その化合物は天然の立体異性体であることが好ましい。
【００２４】
酵素がカッコ内の酵素クラス（ＥＣ）を付して言及される場合、その酵素クラスは、国際生化学・分子生物学連合の命名法委員会（Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）（ＮＣ−ＩＵＢＭＢ）によって規定された酵素命名法に基づいて、その酵素が分類されるか、または分類され得るクラスであり、この命名法は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈｅｍ．ｑｍｕｌ．ａｃ．ｕｋ／ｉｕｂｍｂ／ｅｎｚｙｍｅ／に見つけることができる。特定のクラスに（まだ）分類されていないが、そういうものとして分類され得る他の適切な酵素も含まれることを意味する。
【００２５】
用語「同種（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）」または「ホモログ」または「オルソログ」は、機能的な関係を有し、配列同一性の程度に基づいて一般に決定される関連配列を指す。これらの用語により、ある種、亜種、変種、培養変種、系統の中で見出された遺伝子と別の種、亜種、変種、培養変種、または系統の中の対応するまたは等価な遺伝子との間の関係について記述することができる。また、これらの用語により、天然に見出された遺伝子と人為的に構築された遺伝子との間の関係、または２つの人為的に構築された遺伝子間の関係について記述することができる。機能的な関係は、これらに限定されないが、（ａ）配列同一性の程度、（ｂ）同じかまたは類似した生物学的機能を含む、いくつかの方法のいずれか１つで示すことができる。（ａ）および（ｂ）の両方が示されることが好ましい。用語ホモログにはまた、遺伝暗号の縮重により別の核酸配列とは異なり、かつ同じポリペプチド配列をコードする核酸配列（ポリヌクレオチド配列）も含まれることを意味する。
【００２６】
用語「ホモログ」を、ポリペプチドに関して本明細書において使用する場合はいつでも、この用語は、参照ポリペプチドと同じかまたは類似の生物学的機能および一定の配列同一性を有するポリペプチドを指すことを意図する。具体的には、この用語は、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、具体的には少なくとも８５％、より具体的には少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を示すことを意図する。
【００２７】
本明細書においては、「配列同一性」または「配列類似性」は、配列の比較により決定される、２つ以上のポリペプチド配列間または２つ以上の核酸配列間の関係として定義される。通常、配列同一性または配列類似性は配列の全長にわたって比較するが、互いにアライメントした配列の一部に対してのみ比較する場合もある。当技術分野では、「同一性」または「類似性」はまた、場合によってはそのような配列間の一致によって決定される、ポリペプチド配列間または核酸配列間の配列関連性の程度を意味する。同一性または類似性を決定する好ましい方法は、検査される配列間に最大の一致を与えるように設計されている。本発明の枠内では、２つの配列間の同一性および類似性を決定する好ましいコンピュータプログラム法としては、ＮＣＢＩならびに他の供給源（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ら、ＮＣＢＩ ＮＬＭ ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ ２０８９４）から公的に入手できるＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＮ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９０、２１５、４０３〜４１０）が挙げられる。ＢＬＡＳＴＰを使用するポリペプチド配列比較用の好ましいパラメーターは、ギャップ開始１０．０、ギャップ伸長０．５、Ｂｌｏｓｕｍ６２マトリックスである。ＢＬＡＳＴＮを使用する核酸配列比較用の好ましいパラメーターは、ギャップ開始１０．０、ギャップ伸長０．５、ＤＮＡ完全マトリックス（ＤＮＡ同一性マトリックス）である。
【００２８】
本明細書において「生体内変換」または「生体触媒反応」とは、酵素が触媒として使用される生化学反応を意味する。本明細書において本発明に従う場合はいつでも、生体触媒が使用されること、すなわち、この方法の少なくとも１つの反応ステップが、生物学的供給源に由来する生体物質または生体成分、例えば生物またはそれから由来する生体分子によって触媒されることを示す。生体内変換は、具体的には発酵プロセスの場合もある。生体触媒は、具体的には１つまたは複数の酵素を含むことができる。生体触媒は、任意の形態で使用することができる。特定の実施形態では、１つまたは複数の酵素を、自然環境から単離して（それを産生した生物から単離して）、例えば溶液、エマルジョン、分散液、凍結乾燥細胞（の懸濁液）として、溶解物として、または支持体上に固定して使用する。一実施形態では、１つまたは複数の酵素が、生体（生きている細胞全体など）の一部を形成する。これらの酵素は、細胞内で触媒機能を果たすことができる。細胞が存在している培地中に、この酵素を分泌させることも可能である。
【００２９】
本明細書において「生体触媒反応混合物」とは、生体触媒反応が起こる環境を意味する。この環境は、細胞環境（細胞内または細胞外の生体触媒反応のための）の場合も、または無細胞環境の場合もある。
【００３０】
本明細書において「発酵プロセス」とは、特定の化学成分の形成または変換が、単細胞の宿主の中で、より具体的には細胞培養物中の微生物の中で起こる生産プロセスを意味する。本明細書において「発酵による調製」とは、発酵可能な炭素源を含む細胞培養物中に生体触媒を含み、この炭素源が、調製すべき特定の化学成分に変換されることになる前記化合物のいずれかを含有するか、またはこの細胞が、炭素源から調製すべき特定の化学成分に変換されることになる化合物を調製する微生物中で特定の化学成分を生成させることを意味する。この微生物は、特定の化学成分の天然の生産者である場合も、または組換えＤＮＡ技術を使用して、少なくとも１つの適切な酵素をコードする遺伝子によって形質転換されることにより、特定の化学成分を生成する能力を得ている場合もある。特定の化学成分の天然の生産者はまた、所望の特定の化学成分の生成を増大させるために、および／または所望の特定の化学成分の生産性を妨害し得るか、もしくは本発明によるプロセスにおけるさらなるステップを妨害することになる成分の生成を低下させるために、組換えＤＮＡを使用して、少なくとも１つの適切な酵素をコードする遺伝子によって形質転換される場合もある。
【００３１】
ＤＡＢのＮ−保護前駆体を発酵により調製するための好ましい微生物は、真核生物起源の場合も、または原核生物起源の場合もある。具体的には、微生物は、動物（ヒトを含む）細胞、植物細胞、細菌、古細菌、酵母、および菌類から選択することができる。より具体的には、微生物は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（具体的にはＢ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（具体的にはＢ．ケトグルタミカム（Ｂ．ｋｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ））、コリネバクテリア属（ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）（具体的にはＣ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ））、エシェリヒア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）（具体的にはＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ））、クレブシェラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）（具体的にはＫ．ニューモニア（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ））、ラクトバチリ属（ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）（具体的にはＬ．ラクチス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ））、プロピオンバクテリウム属（ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シュードモナス属（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（具体的にはＰ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ））、ロドコッカス属（Ｒｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）（具体的にはＲ．エリスロポリス（Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ））、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）（具体的にはＳ．セリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｒ）およびＳ．クラブリゲラス（Ｓ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ））などの細菌、クリベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）（具体的にはＫ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ））、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）（具体的にはＰ．クリソゲナム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ））、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）（具体的にはＳ．セルビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）（具体的にはＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ））、ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）（具体的にはＰ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ））、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）（具体的にはＳ．ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ））、ヤロウィア属（Ｙａｒｏｗｉａ）（具体的にはＹ．リポリチカ（Ｙ．ｌｙｐｏｌｙｔｉｃａ））などの酵母、タラロミセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）などの菌類からなる群から選択することができる。
【００３２】
最も好ましい実施形態では、Ｎ−保護前駆体の発酵生成は、Ｎ−保護前駆体がインビボで形成される微生物の中で行なわれる。本発明によるＮ−保護前駆体の形成が、任意の適切な炭素源に由来するＮ−保護前駆体への生体内変換であることが好ましい。
【００３３】
この発酵プロセス用の炭素源は、具体的には、一価アルコール、多価アルコール、カルボン酸、二酸化炭素、脂肪酸、グリセリドの群から、前記化合物のいずれかを含む混合物も含めて、選択される少なくとも１つの化合物を含有することができる。適切な一価アルコールにはメタノールおよびエタノールが含まれ、適切な多価アルコールにはグリセロールおよび炭水化物が含まれる。適切な脂肪酸またはグリセリドは、具体的には、食用油、好ましくは植物起源の食用油の形で供給することができる。
【００３４】
具体的には、炭水化物は、通常、農産物、好ましくは農業廃棄物質など、生物学的に再生可能な資源から大量に得ることができるので、使用することができる。炭水化物は、グルコース、フルクトース、スクロース、ラクトース、サッカロース、デンプン、セルロース、およびヘミセルロースの群から選択して使用することが好ましい。グルコース、グルコースを含むオリゴ糖、およびグルコースを含む多糖が特に好ましい。
【００３５】
さらに、炭素源として、アミノ酸もしくはその誘導体、グルタメートもしくはその誘導体、および／またはオルニチンもしくはその誘導体を使用することができる。
【００３６】
窒素源として、アンモニア、アンモニア塩、尿素、硝酸塩、および亜硝酸塩などの無機窒素含有化合物、またはアミノ酸もしくはその誘導体、より具体的にはグルタメートもしくはその誘導体および／またはオルニチンもしくはその誘導体などの有機窒素含有化合物を使用することができる。
【００３７】
本明細書において生体触媒に言及する場合、生体触媒は、生体触媒機能に関連する少なくとも１つの酵素を発現する生物を指す場合も、または生物から得られたかまたは由来した少なくとも１つの酵素を指す場合もある。この生物は真核生物の場合も、または原核生物の場合もある。具体的には、この生物は、動物（ヒトを含む）、植物、細菌、古細菌、酵母、および菌類から選択することができる。
【００３８】
一実施形態では、生体触媒は、動物に、具体的にはその一部、例えば肝臓、膵臓、脳、腎臓、心臓、またはその他の器官に由来する。この動物は、具体的には哺乳動物の群から選択し、より具体的には霊長類（ｐｒｉｍａｔｅｓ）（ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）など）、ウサギ科（Ｌｅｐｏｒｉｄａｅ）、ネズミ科（Ｍｕｒｉｄａｅ）、イノシシ科（Ｓｕｉｄａｅ）、およびウシ科（Ｂｏｖｉｄａｅ）から選択することができる。
【００３９】
生体触媒の起源として適切な植物は、具体的には、チャセンシダ属（Ａｓｐｌｅｎｉｕｍ）；ウリ科（Ｃｕｃｕｒｂｉｔｃｅａｅ）、具体的にはカボチャ属（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ）、例えばカボチャ（ｓｑｕａｓｈ）、またはキュウリ属；メルクリアリス属（Ｍｅｒｃｕｒｉａｌｉｓ）、例えばメルクリアリス・ペレンニス（Ｍｅｒｃｕｒｉａｌｉｓ ｐｅｒｅｎｎｉｓ）；ヒドノカルプス属（Ｈｙｄｎｏｃａｒｐｕｓ）；およびイナゴマメ属（Ｃｅｒａｔｏｎｉａ）の群から選択される植物である。
【００４０】
生体触媒の起源として適切な細菌は、具体的には、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、コリネバクテリア属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、デイノコッカス属（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ゲオバチルス属（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、クレブシェラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、ミコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）、ノボスフィンゴビウム属（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）、パラコッカス属（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ラルストニア属（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、ロードバクスター属（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、ロドシュードモナス属（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、サームス属（Ｔｈｅｒｍｕｓ）、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）およびザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）の群の中から選択することができる。
【００４１】
生体触媒の起源として適切な古細菌は、具体的には、アエロピルム属（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ）、アーケオグロブス属（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ）、ハロバクテリウム属（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、メタノバクテリウム属（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、メタノブレビバクター属（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ）、メタノカルドコッカス属（Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ）、メタノコックス属（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ）、メタノピラス属（Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ）、メタノサルシーナ属（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ）、メタノスピリラム属（Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｈａｅｒａ）、ピュロバクルム属（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ）、およびサーモプラズマ属（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ）の群の中から選択することができる。
【００４２】
生体触媒の起源として適切な菌類は、具体的には、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、リゾプス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、およびトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の群の中から選択することができる。
【００４３】
生体触媒の起源として適切な酵母は、具体的には、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、シトファギア属（Ｃｙｔｏｐｈａｇｉａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、クリベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ケカビ属（Ｍｕｃｏｒ）、リゾクトニア属（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、およびヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）の群の中から選択することができる。
【００４４】
天然に存在する生体触媒（野生型）、または本発明による方法における、適切な活性を有する、天然に存在する生体触媒の変異体を使用できることは、当業者には明らかである。天然に存在する生体触媒の特性は、例えば分子進化または合理的設計など、当業者に知られている生物学的手法によって改善することができる。例えば、当業者には知られている突然変異誘発手法（ランダム突然変異誘発、部位特異的変異誘発、定向進化、遺伝子組換え等）を使用して、生体触媒として働くことができるか、または生体触媒成分（酵素など）を生成させることができる生物のコードするＤＮＡを改変することにより、野生型生体触媒の変異体を作製することができる。具体的には、ＤＮＡを改変して、そのＤＮＡが野生型酵素と少なくとも１つのアミノ酸が異なる酵素をコードし、その結果、野生型と比較して１つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含む酵素をコードするように、または適切な（宿主）細胞にこのように改変されたＤＮＡを発現させることによって変異体が２つ以上の親酵素の配列を結合するようにできる。後者は、例えば国際公開第２００８／０００６３２号パンフレットに記載の方法に基づいて、コドン最適化またはコドンペア最適化など、当業者に知られている方法によって達成することができる。
【００４５】
変異体生体触媒は、例えば、基質選択性、活性、安定性、溶媒耐性、ｐＨ特性、温度特性、基質特性、阻害感受性、補因子利用、および基質親和性の中の１つまたは複数の点に関して改良された特性を有することができる。特性が改良された変異体は、例えば当業者に知られている方法に基づく適切なハイスループットスクリーニングまたは選択の方法を適用することによって同定することができる。
【００４６】
特定の供給源に由来する生体触媒（具体的には酵素）に言及する場合、ドナー生物に起源があるが、実際には（遺伝子改変）宿主生物中で産生される組換え生体触媒（具体的には酵素）は、その最初の生物に由来する生体触媒（具体的には酵素）として含まれることを明確に意味する。
【００４７】
本発明の枠内における、任意の生体触媒ステップに対する反応条件は、生体触媒（具体的には酵素）に対する既知の条件、本明細書において開示の情報、および場合によってはいくつかのルーチン実験に基づいて選ぶことができる。
【００４８】
使用される反応媒体のｐＨは、生体触媒がそのｐＨ条件下で活性である限り、広範囲から選ぶことができる。生体触媒および他の要因に応じて、アルカリ性、中性、または酸性の条件を使用することができる。例えば本発明の方法による酵素を発現させるために微生物を使用することがその方法に含まれる場合、ｐＨは、微生物がその意図する機能または複数機能を果たすことができるように選択する。ｐＨは、具体的には中性ｐＨ未満の４つのｐＨ単位および中性ｐＨを超える２つのｐＨ単位の範囲内、すなわち２５℃の基本的に水性の系の場合にはｐＨ３とｐＨ９との間の範囲から選択することできる。水が唯一の溶媒であるか、または水が主な溶媒（全液体を基準にして＞５０重量％、具体的には＞９０重量％）であり、存在し得る微生物が活性を保持する濃度で、例えば少量（全液体を基準にして＜５０重量％、具体的には＜１０重量％）のアルコールまたは別の溶媒が溶解（例えば炭素源として）している場合、系は水性であるとみなす。具体的には、酵母および／または菌類を使用する場合、酸性条件が好ましいことがあり、具体的にはそのｐＨを、２５℃における基本的に水性の系に基づいてｐＨ３からｐＨ８の範囲にすることができる。所望される場合には、ｐＨを、酸および／もしくは塩基を用いて調整することも、または酸および塩基を適切に組合せて緩衝することも可能である。
【００４９】
インキュベーション条件は、生体触媒が十分な活性および／または増殖を示す限り、広範囲から選ぶことができる。これには好気性条件、微好気性条件、酸素制限条件、および嫌気性条件が含まれる。
【００５０】
本明細書においては嫌気性条件は、酸素が全く存在しないか、またはその生体触媒、具体的には微生物によって実質上酸素が消費されない条件と定義され、通常この条件は５ｍｍｏｌ／ｌ・時未満、具体的には２．５ｍｍｏｌ／ｌ・時未満、または１ｍｍｏｌ／ｌ・時未満の酸素消費量に相当する。
【００５１】
好気性条件は、媒体中に無制限な増殖にとって十分なレベルの酸素を溶解し、少なくとも１０ｍｍｏｌ／ｌ・時の、より好ましくは２０ｍｍｏｌ／ｌ・時を超える、より一層好ましくは５０ｍｍｏｌ／ｌ・時を超える、最も好ましくは１００ｍｍｏｌ／ｌ・時を超える酸素消費速度を支えることができる条件である。
【００５２】
酸素制限条件は、酸素消費が気体から液体への酸素移動によって制限される条件と定義される。酸素制限条件の下限値は、嫌気性条件の上限値、すなわち通常は少なくとも１ｍｍｏｌ／ｌ・時、具体的には少なくとも２．５ｍｍｏｌ／ｌ・時、または少なくとも５ｍｍｏｌ／ｌ・時によって決まる。酸素制限条件の上限値は、好気性条件の下限値、すなわち１００ｍｍｏｌ／ｌ・時未満、５０ｍｍｏｌ／ｌ・時未満、２０ｍｍｏｌ／ｌ・時未満、または１０ｍｍｏｌ／ｌ・時未満によって決まる。
【００５３】
条件が好気性であるか、嫌気性であるか、または酸素制限であるかは、その方法を実施する条件、具体的には流入する気体流の量および組成、使用する設備の実際の混合／物質移動特性、使用する微生物の種類、および微生物密度に依存している。
【００５４】
使用する温度は、生体触媒、具体的には酵素が実質的に活性を示す限り重要ではない。一般に、温度は少なくとも０℃、具体的には少なくとも１５℃、より具体的には少なくとも２０℃とすることができる。望ましい最高温度は、生体触媒に依存する。一般に、そのような最高温度は当該技術分野で知られており、例えば市販の生体触媒の場合は製品データシートに示されているか、または普通の一般知識および本明細書中で開示する情報に基づいてルーチン的に決めることができる。温度は、通常９０℃以下、好ましくは７０℃以下、具体的には５０℃以下、またはより具体的には４０℃以下である。
【００５５】
具体的には、生体触媒反応が宿主生物の外側で行われる場合、その媒体中で十分な活性を保持する酵素が使用される場合には有機溶媒を含む反応媒体を、高濃度（例えば５０重量％を超える、または９０重量％を超える）で使用することができる。
【００５６】
好ましい実施形態では、本発明は、ＤＡＢのＮ−保護前駆体としてＮ５−保護オルニチンを生成させる生体触媒プロセスに関する。例えば、Ｎ５−アセチルオルニチンの調製は、次の酵素触媒反応の１つまたは複数を含むことができる。
１）グルタメートからＮ−アセチル−グルタメート
２）Ｎ−アセチル−グルタメートからＮ−アセチル−グルタメート５−ホスフェート
３）Ｎ−アセチル−グルタメート５−ホスフェートからＮ−アセチル−グルタメートセミアルデヒド
４）Ｎ−アセチル−グルタメートセミアルデヒドからＮ２−アセチル−オルニチン
５）Ｎ２−アセチル−オルニチンからＮ５−アセチル−オルニチン
【００５７】
反応１）は、アシルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．３．１）の群から、好ましくはアミノ酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．３．１．１）の群から選択される酵素によって触媒することができる。この酵素はアセチル基ドナーとしてのアセチルＣｏＡに、アセチル基アクセプターとしてのグルタメートに特異的であることが好ましい。アミノ酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼは原核生物由来でも、または真核生物由来でもよい。反応１）を触媒することができる代表的なタンパク質を、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース中のその受託番号およびその（微）生物源と共に表１に示す。
【００５８】
反応２）は、アセチル−グルタメートキナーゼ（ＥＣ ２．７．２．８）の群から選択される酵素によって触媒することができる。この酵素は補因子としてＡＴＰを使用することができる。アセチル−グルタメートキナーゼは原核生物由来でも、または真核生物由来でもよい。反応２）を触媒することができる代表的なタンパク質を、Ｕｎｉｐｒｏｔ中のその受託番号およびその（微）生物源と共に表１に示す。
【００５９】
反応３）は、オキシドレダクターゼ（ＥＣ １．２．１）の群から、好ましくはＮ−アセチル−γ−グルタミル−ホスフェートレダクターゼ（ＥＣ １．２．１．３８）の群から選択される酵素によって触媒することができる。この酵素は補因子としてＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを使用することができる。Ｎ−アセチル−γ−グルタミル−ホスフェートレダクターゼは原核生物由来でも、または真核生物由来でもよい。反応３）を触媒することができる代表的なタンパク質を、Ｕｎｉｐｒｏｔ中のその受託番号およびその（微）生物源と共に表１に示す。
【００６０】
反応４）は、トランスアミナーゼ（ＥＣ ２．６．１）の群から、好ましくはアセチルオルニチントランスアミナーゼ（ＥＣ ２．６．１．１１）の群から選択される酵素によって触媒することができる。この酵素はアミノ基ドナーとしてグルタメートを使用することができる。アセチルオルニチントランスアミナーゼは原核生物由来でも、または真核生物由来でもよい。反応４）を触媒することができる代表的なタンパク質を、Ｕｎｉｐｒｏｔ中のその受託番号およびその（微）生物源と共に表１に示す。
【００６１】
反応５）は、グルタメートＮ−アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．３．１．３５）などのＮ−アシルトランスフェラーゼによって触媒することができる。
【００６２】
グルタメートは当技術分野でよく知られているグルタメート生合成反応を介して適切な炭素源から得ることができる。大量のグルタミン酸を蓄積する微生物、例えばコリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）を使用することが好ましい。グルタミン酸産生を、例えば遺伝子工学によって改善する方法は、当技術分野でよく知られている（Ｋｉｍｕｒａ Ｅ．、Ａｄｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｅｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００３；７９：３７〜５７）。
【００６３】
代替的に、Ｎ５−アセチルオルニチンの調製は、次の酵素触媒反応の１つまたは複数を含むことができる。
６）グルタメートからＮ−アセチル−グルタメート
７）Ｎ−アセチル−グルタメートおよびオルニチンからＮ２−アセチル−オルニチン
８）Ｎ２−アセチル−オルニチンからＮ５−アセチル−オルニチン
【００６４】
【表１】
【００６５】
反応６）は、反応１）と同一であり、同型の酵素によって触媒することができる。
【００６６】
反応７）は、アシルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．３．１）の群から、好ましくはグルタメートＮ−アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．３．１．３５）から選択される酵素によって触媒することができる。この酵素がアセチル基アクセプターとしてオルニチンを使用し、それによって、反応生成物としてグルタメートおよびＮ−アセチル−オルニチンを生成することが好ましい。グルタメートＮ−アセチルトランスフェラーゼは、Ｎ−アセチル−グルタメートに対して加水分解活性を有し、加水分解生成物としてグルタメートおよびアセテートを生成する可能性がある。使用する酵素は検出可能な加水分解活性を有しないことが好ましい。代替的に、加水分解活性が野生型酵素と比較して実質的に低下するように野生型酵素を改変することができる。グルタメートＮ−アセチルトランスフェラーゼは、原核生物由来でも、または真核生物由来でもよい。反応７）を触媒することができる代表的なタンパク質を、Ｕｎｉｐｒｏｔ中のその受託番号およびその（微）生物源と共に表１に示す。
【００６７】
反応８）は反応５と同一であり、同じ酵素によって触媒することができる。
【００６８】
さらに好ましい実施形態では、本発明は、Ｎ−保護ＤＡＢがＮ５−保護オルニチンから生成される生体触媒プロセスに関する。一般に、適切なデカルボキシラーゼは、Ｎ５−保護オルニチンのＮ−保護ＤＡＢへの変換を触媒することができるＮ５−保護オルニチンデカルボキシラーゼ活性を有する。
【００６９】
Ｎ５−保護オルニチンを脱炭酸できる酵素は、具体的には、デカルボキシラーゼ（ＥＣ．４．１．１）の群から、好ましくはオルニチンデカルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１．１７）、ジアミノピメレートデカルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１．２０）、分岐鎖α−ケト酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１．７２）、α−ケトイソバレレートデカルボキシラーゼ、α−ケトグルタレートデカルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１．７１）の群から選択することができる。
【００７０】
１つまたは複数の他の適切なデカルボキシラーゼは、オキサレートデカルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１．２）、アセトアセテートデカルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１．４）、バリンデカルボキシラーゼ／ロイシンデカルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１．１４）、アスパルテート１−デカルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１．１１）、３−ヒドロキシグルタメートデカルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１．１６）、リジンデカルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１．１８）、アルギニンデカルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１．１９）、２−オキソグルタレートデカルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１．７１）、およびジアミノブチレートデカルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１．８６）の群の中から選択することができる。
【００７１】
デカルボキシラーゼは、具体的には、カボチャ；キュウリ；酵母；菌類、例えば、カンジダ・フラレリ（Ｃａｎｄｉｄａ ｆｌａｒｅｒｉ）、ハンゼヌラ種（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｓｐ．）、クリベロミセス・マルキシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、ニューロスポア・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、リゾプス・ジャバニクス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｊａｖａｎｉｃｕｓ）、およびサッカロミセス・セレビシア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）；哺乳類、具体的には哺乳類脳由来；およびバチルス・カダベリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｄａｖｅｒｉｓ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、シュードモナス種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、およびザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）などの細菌の群から選択される生物のデカルボキシラーゼとすることができる。
【００７２】
さらに好ましい実施形態では、本発明は、Ｎ−保護ＤＡＢがＮ−保護４−アミノブチルアルデヒドを介して生成される生体触媒プロセスに関する。例えば、Ｎ−アセチル−ＤＡＢの調製は、次の酵素触媒反応の１つまたは複数を含むことができる。
９）グルタメートから４−アミノブチレート
１０）４−アミノブチレートからＮ−アセチル−４−アミノブチレート
１１）Ｎ−アセチル−４−アミノブチレートからＮ−アセチル−４−アミノブチルアルデヒド
１２）Ｎ−アセチル−４−アミノブチルアルデヒドからＮ−アセチル−ＤＡＢ
【００７３】
反応９）は、デカルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１）の群から、好ましくはグルタメートデカルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１．１５）の群から選択される酵素によって触媒することができる。グルタメートデカルボキシラーゼは原核生物由来でも、または真核生物由来でも、または古細菌由来でもよい。
【００７４】
反応１０）は、アシルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．３．１）の群から、好ましくはアミノ酸Ｎ―アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．３．１．１）、グリシンＮ−アシルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．３．１．１３）、アスパルテートＮ―アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．３．１．１７）、グルタメートＮ−アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．３．１．３５）、Ｄ−アミノ酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．３．１．３６）、およびジアミンＮ−アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．３．１．５７）の群から選択される酵素によって触媒することができる。使用する酵素は、基質である４−アミノブチレートに対して選択的であることが好ましい。野生型酵素は、アミノ基アクセプターとしての４−アミノブチレートに対して低い活性／選択性を有している可能性がある。このような野生型酵素は、４−アミノブチレートに対する活性／選択性が野生型酵素と比較して実質的に高くなるように改変することができる。使用する酵素は、アセチル基ドナーとしてアセチルＣｏＡを使用することができる。代替的に、この酵素は、アセチル基ドナーとしてＮ−アセチル−グルタメートなどのＮ−アセチル化アミノ酸を使用することもできる。この酵素は、原核生物由来でも、または真核生物由来でも、または古細菌由来でもよい。
【００７５】
代替的に、次の酵素触媒反応によって、Ｎ−アセチル−４−アミノブチレートをＮ−アセチル−４−アミノブチルアルデヒドに変換することができる。
１１ａ）Ｎ−アセチル−４−アミノブチレートからＮ−アセチル−４−アミノブチレートホスフェート
１１ｂ）Ｎ−アセチル−４−アミノブチレートホスフェートからＮ−アセチル−４−アミノブチルアルデヒド
【００７６】
反応１１ａ）は、ホスホトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．７．２）の群から、好ましくはアセテートキナーゼ（ＥＣ ２．７．２．１）、アスパルテートキナーゼ（ＥＣ ２．７．２．４）、ブチレートキナーゼ（ＥＣ ２．７．２．７）、アセチルグルタメートキナーゼ（２．７．２．８）、およびグルタメート５−キナーゼ（２．７．２．１１）の群から選択される酵素によって触媒することができる。
【００７７】
反応１１ｂ）は、オキシドレダクターゼ（ＥＣ １．２．１）の群から、好ましくはＮ−アセチル−γ−グルタミルホスフェートレダクターゼ（ＥＣ １．２．１．３８）の群から選択される酵素によって触媒することができる。
【００７８】
反応ステップ９）から１１）を触媒することができる代表的なタンパク質を、Ｕｎｉｐｒｏｔ中のその受託番号およびその（微）生物源と共に表２に示す。
【００７９】
【表２】
【００８０】
反応１２）は、Ｎ−保護ＤＡＢがＮ−保護４−アミノブチルアルデヒドから生成される生体触媒プロセスに関する。
【００８１】
一般に、適切なアミノトランスフェラーゼは、Ｎ−保護４−アミノブチルアルデヒドのＮ−保護ＤＡＢへの変換を触媒することができるＮ−保護４−アミノブチルアルデヒドアミノトランスフェラーゼ活性を有する。
【００８２】
アミノトランスフェラーゼは、具体的には、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ、ω−アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６．１）、クラスＩＩＩ―アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６．１）、４−アミノ−ブチレートアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６．１．１９）、Ｌ―リジン６−アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６．１．３６）、５−アミノバレレートアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６．１．４８）、リジン：ピルベート６−アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６．１．７１）、およびプトレッシン−アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６．１．８２）の群の中から選択することができる。
【００８３】
一実施形態では、アミノトランスフェラーゼは、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６．１．２）、ロイシンアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６．１．６）、アラニン−オキソ酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６．１．１２）、β−アラニン−ピルベートアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６．１．１８）、（Ｓ）−３−アミノ−２−メチルプロピオネートアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６．１．２２）、Ｌ，Ｌ−ジアミノピメレートアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６．１．８３）の群の中から選択することができる。
【００８４】
アミノトランスフェラーゼは、具体的には、哺乳類、植物、または微生物に由来するアミノトランスフェラーゼの中から選択することができる。より具体的には、アミノトランスフェラーゼは、アスプレニウム属（Ａｓｐｌｅｎｉｕｍ）、より具体的にはアスプレニウム・ユニラテラーレ（Ａｓｐｌｅｎｉｕｍ ｕｎｉｌａｔｅｒａｌｅ）またはアスプレニウム・セプテントリオナーレ（Ａｓｐｌｅｎｉｕｍ ｓｅｐｔｅｎｔｒｉｏｎａｌｅ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、具体的にはバチルス・ウェイヘンステファネンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）およびバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、セラトニア属、より具体的にはセラトニア・シリクア（Ｃｅｒａｔｏｎｉａ ｓｉｌｉｑｕａ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、より具体的にはＥ．カロトボラ（Ｅ．ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、より具体的にはＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、メルクリアリス属（Ｍｅｒｃｕｒｉａｌｉｓ）、具体的にはメルクリアリス・ペレンニス（Ｍｅｒｃｕｒｉａｌｉｓ ｐｅｒｅｎｎｉｓ）、より具体的にはメルクリアリス・ペレンニス（Ｍｅｒｃｕｒｉａｌｉｓ ｐｅｒｅｎｎｉｓ）の苗条、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、具体的にはシュードモナス・エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、ロドバクター属（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、具体的にはロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、ロドシュードモナス属（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、より具体的にはＳ．チフィ（Ｓ．ｔｙｐｈｉ）、Ｓ．パラチフィ（Ｓ．ｐａｒａｔｙｐｈｉ）、シゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、より具体的にはＳｈ．ボイディ（Ｓｈ．ｂｏｙｄｉｉ）、Ｓｈ．フレクスネリ（Ｓｈ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、Ｓ．ソネイ（Ｓ．ｓｏｎｎｅｉ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、具体的にはスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）、具体的にはビブリオ・フルビアリス（Ｖｉｂｒｉｏ ｆｌｕｖｉａｌｉｓ）、または酵母、具体的にはサッカロミセス・セレビシア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に由来することができる。
【００８５】
この酵素が哺乳類の酵素である場合、具体的には、哺乳類の腎臓、哺乳類の肝臓、哺乳類の心臓、または哺乳類の脳に由来することができる。例えば、適切な酵素は、哺乳類の肝臓由来の４−アミノ−ブチレートアミノトランスフェラーゼ、具体的にはブタ肝臓由来の４−アミノ−ブチレートアミノトランスフェラーゼ；哺乳類の脳由来の４−アミノブチレートアミノトランスフェラーゼ、具体的にはヒト、ブタ、またはラットの脳由来の４−アミノブチレートアミノトランスフェラーゼ；ビブリオ・フルビアリス（Ｖｉｂｒｉｏ ｆｌｕｖａｉｌｉｓ）のω−アミノトランスフェラーゼ、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来の４−アミノ−ブチレートアミノトランスフェラーゼ、およびクロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）由来、具体的にはクロストリジウム・アミノワレリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｕ ａｍｉｎｏｖａｌｅｒｉｃｕｍ）由来の５−アミノバレレートアミノトランスフェラーゼの群の中から選択することができる。
【００８６】
具体的には、アミノドナーは、アンモニア、アンモニウムイオン、アミン、およびアミノ酸の群から選択することができる。適切なアミンは、第一級アミンおよび第二級アミンである。アミノ酸は、Ｄ−立体配置であっても、またはＬ−立体配置であってもよい。アミノドナーの例は、アラニン、グルタメート、イソプロピルアミン、２−アミノブタン、２−アミノヘプタン、フェニルメタンアミン、１−フェニル−１−アミノエタン、グルタミン、チロシン、フェニルアラニン、アスパルテート、α−アミノイソブチラート、β−アラニン、４−アミノブチレート、およびα−アミノアジペートである。
【００８７】
さらに好ましい実施形態では、Ｎ−保護ＤＡＢを調製する方法は、ドナーのＣＨ−ＮＨ２基に作用するオキシドレダクターゼ（ＥＣ １．４）の群から、具体的にはアミノ酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ．１．４．１）の群から選択される、アンモニア源の存在下における還元的アミノ化反応を触媒することができる酵素の存在下における生体触媒反応を含む。一般には、適切なアミノ酸デヒドロゲナーゼは、Ｎ−保護４−アミノブチルアルデヒドのＮ−保護ＤＡＢへの変換を触媒する６−アミノカプロン酸６−デヒドロゲナーゼ活性を有する。具体的には、適切なアミノ酸デヒドロゲナーゼは、ジアミノピメレートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．４．１．１６）、リジン６−デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．４．１．１８）、グルタメートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．４．１．３； ＥＣ １．４．１．４）、およびロイシンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．４．１．９）の群の中から選択することができる。
【００８８】
一実施形態では、アミノ酸デヒドロゲナーゼは、ＮＡＤまたはＮＡＤＰをアクセプターとして作用するグルタメートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．４．１．３）、ＮＡＤＰをアクセプターとして作用するグルタメートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．４．１．４）、ロイシンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．４．１．９）、ジアミノピメレートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．４．１．１６）、およびリジン６−デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．４．１．１８）として分類されるアミノ酸デヒドロゲナーゼの中から選択することができる。
【００８９】
アミノ酸デヒドロゲナーゼは、具体的には、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、具体的にはコリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）；プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、具体的にはプロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）；アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、具体的にはアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）；ゲオバチルス属（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、具体的にはゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）；アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、具体的には アシネトバクター種ＡＤＰ１（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＡＤＰ１）；ラルストニア属（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、具体的にはラルストニア・ソラナセラム（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）；サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、具体的にはサルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）；サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、具体的にはサッカロミセス・セレビシア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）；ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、具体的にはブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）；およびバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、具体的にはバチルス・スファエリクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、またはバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の群から選択される生物に由来することができる。例えば、適切なアミノ酸デヒドロゲナーゼは、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、具体的にはバチルス・スファエリクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）由来のジアミノピメレートデヒドロゲナーゼ；ブレビバクテリウム種（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）由来のジアミノピメレートデヒドロゲナーゼ；コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）由来のジアミノピメレートデヒドロゲナーゼ、具体的にはコリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）由来のジアミノピメレートデヒドロゲナーゼ；プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）由来のジアミノピメレートデヒドロゲナーゼ、具体的にはプロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）由来のジアミノピメレートデヒドロゲナーゼ；アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、具体的にはアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）由来のリジン６−デヒドロゲナーゼ、ゲオバチルス属（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、具体的にはゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のリジン６−デヒドロゲナーゼ；ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを補因子として作用する、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）由来のグルタメートデヒドロゲナーゼ、具体的にはアシネトバクター種ＡＤＰ１（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＡＤＰ１）由来のグルタメートデヒドロゲナーゼ；ラルストニア属（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）由来のグルタメートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．４．１．３）、具体的にはラルストニア・ソラナセラム（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）由来のグルタメートデヒドロゲナーゼ；ＮＡＤＰＨを補因子として作用する、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）由来のグルタメートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．４．１．４）、具体的にはサルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）由来のグルタメートデヒドロゲナーゼ；サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）由来のグルタメートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．４．１．４）、具体的にはサッカロミセス・セレビシア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のグルタメートデヒドロゲナーゼ；ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）由来のグルタメートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．４．１．４）、具体的にはブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）由来のグルタメートデヒドロゲナーゼ；およびバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来のロイシンデヒドロゲナーゼ、具体的にはバチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）またはバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のロイシンデヒドロゲナーゼの中から選択することができる。
【００９０】
生体触媒酵素は、任意の形態で使用することができる。例えば、生体触媒酵素は、―例えば分散液、エマルジョン、溶液の形態、または固定された形態（例えば、支持体、例えば粒状または一体化した担体物質上にロードされた）で、−粗酵素として、市販の酵素として、市販の調製物からさらに精製された酵素として、知られている精製法を組合せてその供給源から得られた酵素として、天然にまたは遺伝子改変を介して加水分解活性を有する細胞全体（場合によっては透過性にしかつ／または固定化した）で、またはそのような活性を有する細胞の溶解物で使用することができる。
【００９１】
生体触媒酵素は、任意の生物、具体的には動物、植物、細菌、カビ、酵母、または菌類から得ることまたは引き出すことができる。
【００９２】
本発明によるプロセスにおいて、生体触媒活性を有する、天然に存在する（野生型）酵素の変異体も使用することができることは、当業者にとって明らかである。野生型酵素の変異体は、例えば、ＤＮＡが野生型酵素とは少なくとも１つのアミノ酸が異なる酵素をコードするように、または野生型に比較して短い酵素をコードするように、当業者に知られている突然変異誘発手法（ランダム突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発、定向進化、遺伝子シャフリングなど）を使用して、野生型酵素をコードするＤＮＡを改変し、適切な（宿主）細胞において、このように改変されたＤＮＡを発現させることによって作製することができる。生体触媒酵素の変異体は、例えば、基質選択性、活性、安定性、溶媒耐性、ｐＨ特性、温度特性、基質特性の中の１つまたは複数の点に関して改良された特性を有することができる。
【００９３】
特定の供給源に由来する酵素に言及する場合、第１の生物に起源があるが、実際には（遺伝子改変された）第２の生物の中で産生される組換え酵素は、第１の生物に由来する酵素として含まれることを明確に意味する。
【００９４】
本発明の方法において１つまたはいくつかの反応ステップを触媒する１つまたは複数の酵素を含む細胞、具体的には組換え細胞は、それ自体当技術分野で知られている分子生物学的手法を使用して構築することができる（Ｍａｎｉａｔｉｓら １９８２「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ」．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．； Ｍｉｌｌｅｒ １９７２「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ； ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ ２００１「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ」 （第３版）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ； Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、「Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９８７）。例えば、１つまたは複数の生体触媒を組換え細胞（異種系である場合もある）の中で産生させようとする場合、１つまたは複数の前記生体触媒をコードする１つまたは複数の遺伝子を含むベクター（組換えベクターなど）を用意するために、このような手法を使用することができる。それぞれが１つまたは複数のこのような遺伝子を含む１つまたは複数のベクターを使用することができる。このようなベクターは、１つまたは複数の調節エレメント、例えば生体触媒をコードする遺伝子に作動可能に結合し得る１つまたは複数のプロモーターを含むことができる。
【００９５】
本明細書において使用する用語「作動可能に結合した」とは、機能的な関係におけるポリヌクレオチドエレメント（またはコード配列もしくは核酸配列）の結合を指す。核酸配列は、それが別の核酸配列と機能的な関係に配置されている場合、「作動可能に結合して」いる。例えばプロモーターまたはエンハンサーがコード配列の転写に影響を及ぼす場合、それはコード配列と作動可能に結合している。
【００９６】
本明細書において使用する用語「プロモーター」とは、遺伝子の転写開始部位の転写の方向に関して上流に位置して１つまたは複数の遺伝子の転写を制御するように機能し、かつＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに対する結合部位と、転写開始部位と、これらには限定されないが転写因子結合部位、リプレッサーおよびアクチベータータンパク質結合部位、およびプロモーター由来の転写の量を調節するように直接的または間接的に働くことが当業者に知られている任意の他のヌクレオチド配列を含む任意の他のＤＮＡ配列との存在によって構造的に同定される核酸フラグメントを指す。「構成的」プロモーターとは、ほとんどの環境および発生の条件下で活性なプロモーターである。「誘導性」プロモーターとは、環境および発生の調節下で活性なプロモーターである。所与の（組換え）核酸またはポリペプチド分子と所与の宿主生物または宿主細胞との間の関係を示すために使用する場合、用語「同種」とは、自然界ではその核酸またはポリペプチド分子が、同じ種の、好ましくは同じ品種または株の宿主細胞または生物によって産生されることを意味するものと理解される。
【００９７】
本明細書において上述したような本発明の方法で使用する酵素、具体的にはアミノトランスフェラーゼ、アミノ酸デヒドロゲナーゼ、またはデカルボキシラーゼをコードする核酸配列の発現を達成するために使用することができるプロモーターは、その発現される酵素をコードする核酸配列にとって本来のものであってもよく、またそれが作動可能に結合している核酸配列（コード配列）にとって異種であってもよい。プロモーターは、その宿主細胞と同種、すなわち内因性であることが好ましい。
【００９８】
異種プロモーター（目的酵素をコードする核酸配列にとって）を使用する場合、この異種プロモーターは、そのコード配列にとって本来のものであるプロモーターより、高い定常状態レベルでそのコード配列を含む転写産物を産生することができる（または、単位時間当たり、より多くの転写分子すなわちｍＲＮＡ分子を産生することができる）ことが好ましい。本発明の枠内で適切なプロモーターには、構成的および誘導性の両方の天然プロモーターならびに人工プロモーターが挙げられ、これらは当業者にはよく知られている。
【００９９】
「強力な構成的プロモーター」とは、天然の宿主細胞に比べて、ｍＲＮＡを高頻度で開始させるプロモーターである。グラム陽性微生物におけるこのような強力な構成的プロモーターの例としては、ＳＰ０１−２６、ＳＰ０１−１５、ｖｅｇ、ｐｙｃ（ピルベートカルボキシラーゼプロモーター）、およびａｍｙＥが挙げられる。
【０１００】
グラム陽性微生物における誘導性プロモーターの例としては、ＩＰＴＧ誘導性Ｐｓｐａｃプロモーター、キシロース誘導性ＰｘｙｌＡプロモーターが挙げられる。
【０１０１】
グラム陰性微生物における構成的および誘導性プロモーターの例としては、これらに限定されないが、ｔａｃ、ｔｅｔ、ｔｒｐ−ｔｅｔ、ｌｐｐ、ｌａｃ、ｌｐｐ−ｌａｃ、ｌａｃｌｑ、Ｔ７、Ｔ５、Ｔ３、ｇａｌ、ｔｒｃ、ａｒａ（ＰＢＡＤ）、ＳＰ６、λ−ＰＲ、およびλ−ＰＬが挙げられる。
【０１０２】
（糸状の）菌類細胞のプロモーターは当技術分野で知られており、例えばグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼｇｐｄＡプロモーター、ｐｅｐＡ、ｐｅｐＢ、ｐｅｐＣなどのプロテアーゼプロモーター、グルコアミラーゼｇｌａＡプロモーター、アミラーゼａｍｙＡ、ａｍｙＢプロモーター、カタラーゼｃａｔＲまたはｃａｔＡプロモーター、グルコースオキシダーゼｇｏｘＣプロモーター、β−ガラクトシダーゼｌａｃＡプロモーター、α−グルコシダーゼａｇｌＡプロモーター、翻訳伸長因子ｔｅｆＡプロモーター、ｘｌｎＡ、ｘｌｎＢ、ｘｌｎＣ、ｘｌｎＤなどのキシラナーゼプロモーター、ｅｇｌＡ、ｅｇｌＢ、ｃｂｈＡなどのセルラーゼプロモーター、ａｒｅＡ、ｃｒｅＡ、ｘｌｎＲ、ｐａｃＣ、ｐｒｆＴなどの転写調節因子のプロモーター、または別のプロモーターであってもよく、ＮＣＢＩウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／）で容易に見つけることができる。
【０１０３】
用語「異種」とは、核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）またはタンパク質に関して使用する場合、それが存在する生物、細胞、ゲノム、またはＤＮＡもしくはＲＮＡ配列の一部としては天然に存在しない核酸またはタンパク質を指すか、あるいはそれが自然界に見出されるものとは異なる細胞の中に、またはゲノムまたはＤＮＡもしくはＲＮＡ配列の中の部位または複数部位の中に見出される核酸またはタンパク質を指す。これら異種の核酸またはタンパク質は、それが導入される細胞にとって内因性のものではないが、別の細胞から得られたか、または合成もしくは組換えにより生成されたものである。必ずしもそうとは限らないが、一般にそのような核酸は、そのＤＮＡが転写または発現される細胞によって通常は産生されないタンパク質をコードする。同様に外因性ＲＮＡは、その外因性ＲＮＡが存在する細胞中で通常は発現されないタンパク質をコードする。これら異種の核酸およびタンパク質はまた、外来の核酸およびタンパク質と呼ぶこともできる。それを発現させる細胞にとって異種または外来であると当業者が認識する任意の核酸またはタンパク質は、異種の核酸およびタンパク質という用語によって本明細書に包含される。
【０１０４】
本発明による方法は、新規であり得る宿主生物で行うことができる。
【０１０５】
したがって本発明はまた、本発明の方法において少なくとも１つの反応ステップを触媒することができる１つまたは複数の酵素を含む宿主細胞に関する。
【０１０６】
特定の実施形態では、本発明による宿主細胞は、アミノ基転移反応もしくはＮ−保護グルタメートセミアルデヒドからＮ２−保護オルニチンを形成するための還元的アミノ化反応を触媒することができる酵素をコードするか、またはＮ５−保護オルニチンからＮ２−保護オルニチンを形成するためのＮ−アシルトランスフェラーゼ反応を触媒することができる酵素をコードするか、またはＮ−保護４−アミノブチルアルデヒドからＮ−保護ＤＡＢを形成するためのアミノトランスフェラーゼ反応を触媒することができる酵素をコードする核酸配列を含む組換え細胞である。前記配列は、ベクターの一部である場合も、または染色体ＤＮＡに挿入されている場合もある。
【０１０７】
［ＤＡＢのＮ−保護前駆体の回収］
Ｎ−保護前駆体のＤＡＢへの変換の前に、Ｎ−保護前駆体は生体触媒反応混合物から回収することになる。
【０１０８】
生体触媒反応混合物からのＮ−保護前駆体の回収は、生体触媒反応混合物から類似の化学成分を回収するための当技術分野で知られている方法によって行うことができる。具体的には、発酵生産プロセスにおけるこのような回収プロセスは、細胞分離（細胞を除くための濾過、膜分離（ＭＦ）、沈降（重力および遠心力など）、結晶化）からなる群から選択される少なくとも１つのステップを含むことができる。経済的に有利な精製には、Ｎ−保護前駆体のさらなる濃縮および精製が必要とされることがある。さらなる濃縮については、蒸発および膜分離（ＲＯ、ＮＦ、およびＵＦ）のような手法を適用することができる。また、（共晶）凍結濃縮のような手法も使用することができる。
【０１０９】
さらなる単離には、イオン交換（クロマトグラフィー）または結晶化／沈殿のいずれかが必要になるかもしれない。
【０１１０】
このプロセスでは、必ずしもＮ−保護前駆体を綿密に精製することはないが、Ｎ−保護前駆体は少なくとも、その後のＮ−保護前駆体のＤＡＢへの変換が混入物および生体触媒反応混合物に由来する副産物によって実質的に妨げられことがない程度に精製されるべきである。場合によっては、Ｎ−保護前駆体を濃縮してもよい。
【０１１１】
さらに、Ｎ−保護前駆体は、少なくとも１つの次の変換ステップに対して最適化されている媒体に移すことができる。
【０１１２】
［ＤＡＢのＮ−保護前駆体のＤＡＢへの変換］
本発明による、Ｎ−保護前駆体のＤＡＢへの直接的または間接的変換には、少なくとも１つの生体触媒（具体的には酵素）的変換ステップまたは化学的変換ステップを含むことができる。さらに、その変換には生体触媒的変換ステップと化学的変換ステップとの組合せも含むことができる。
【０１１３】
例えば、生体触媒により生成されたＮ−保護ＤＡＢの無保護ＤＡＢへの変換は、生体触媒的または化学的加水分解プロセスによって行なうことができる。生体触媒プロセスについては、適切な加水分解酵素を使用することができる。本発明の有利な方法では、脱アシル化が生体触媒的に行われる。具体的には、Ｎ−Ａｃ−ＤＡＢの脱アシル化を触媒することができる、より具体的にはＮ−アセチル−ＤＡＢの脱アセチルを触媒することができる加水分解酵素を使用することができる。
【０１１４】
Ｎ−アセチル−ＤＡＢが化学的または生体触媒的加水分解によってＤＡＢに変換される場合、一般にＤＡＢとアセテートの両方が形成される。ＤＡＢの回収後、アセテート含有部分をこのプロセスで再使用することが好ましい。発酵プロセスの場合には、発酵プロセスにおいて、微生物を増殖させるための炭素源として、またはＮ−保護ＤＡＢもしくはＮ−保護ＤＡＢに変換され得る化合物を生成させるための炭素源としてアセテートを再使用することができる。
【０１１５】
用語「加水分解酵素」は、本明細書においては分類群Ｅ．Ｃ．３由来の酵素に対して使用される。１つまたは複数の加水分解酵素が、カルボン酸エステルヒドロラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１）、チオールエステルヒドロラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．２）、およびペプチダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．４）の群から選択されて使用されることが好ましい。
【０１１６】
具体的には、ペプチダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．４）を使用することができる。好ましいペプチダーゼは、セリン型カルボキシペプチダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．４．１６）、金属カルボキシペプチダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．４．１７）、システイン型カルボキシペプチダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．４．１８）、セリンエンドペプチダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．４．２１）、システインエンドペプチダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．４．２２）、アスパラギン酸エンドペプチダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．４．２３）、および金属エンドペプチダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．４．２４）の群から、具体的にはセリンエンドペプチダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．４．２１）から選択されるペプチダーゼである。具体的には、セリンエンドペプチダーゼ、好ましくはサブチリシンカールスバーグなどのサブチリシン（Ｅ．Ｃ．３．４．２１．６２）を用いて好結果が得られた。
【０１１７】
加水分解酵素が由来し得る生物の例としては、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）由来などのトリコデルマ種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐ，）；リゾプス・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）由来などのリゾプス種（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐ．）；バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・クラウジイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・レンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・アルカロフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・ハロデュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）由来などのバチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）；アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）またはアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）由来などのアスペルギルス種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、カスピトサス・ストレプトミセス（ｃａｅｓｐｉｔｏｓｕｓ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）またはストレプトミセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）由来などのストレプトミセス種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）；カンジダ種（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐ．）；菌類；フミコラ種（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｓｐ．）；リゾクトニア種（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｐ．）；シトファギア（Ｃｙｔｏｐｈａｇｉａ）；ムコール種（Ｍｕｃｏｒ ｓｐ．）；および動物組織、具体的にはブタ膵臓、ウシ膵臓、またはヒツジ膵臓由来などの膵臓由来が挙げられる。
【０１１８】
上述のように、好ましい酵素はサブチリシンである。様々なサブチリシンが当技術分野で知られており、例えば米国特許第５，３１６，９３５号明細書およびそこに引用の文献を参照されたい。サブチリシンＡはノボザイムズ社（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）が市販するサブチリシンである。具体的には、サブチリシンカールスバーグが好ましい。アルカラーゼ（Ａｌｃａｌａｓｅ）（登録商標）は、本発明の方法で使用するのに特に適していることがわかっている。この製品はノボザイムズ社（バウスヴェア、デンマーク（Ｂａｇｓｖａｅｒｄ、Ｄｅｎｍａｒｋ））から入手可能である。アルカラーゼ（登録商標）は安価であり、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）によって産生される、工業的に利用可能なタンパク質分解酵素混合物（主要な酵素成分としてサブチリシンカールスバーグを含有する）である。精製されたサブチリシンによる実験によって、サブチリシンがエステル転移反応、活性化、およびペプチド結合形成を触媒することが確認された。
【０１１９】
デンマーク国バウスヴェアのノボザイムズ社は、オボザイム（ｏｖｏｚｙｍｅ）、リカナーゼ（ｌｉｑｕａｎａｓｅ）、アルカナーゼ（登録商標）、アルカナーゼウルトラ（Ａｌｃａｌａｓｅ−ｕｌｔｒａ）（登録商標）（特に、アルカリ性ｐＨで効果的）、デュラミル（ｄｕｒａｍｙｌ）、エスペラーゼ（ｅｓｐｅｒａｓｅ）、カンナーゼ（ｋａｎｎａｓｅ）、サビナーゼ（ｓａｖｉｎａｓｅ）、サビナーゼウルトラ（ｓａｖｉｎａｓｅ ｕｌｔｒａ）、ターマミル（ｔｅｒｍａｍｙｌ）、ターマミルウルトラ（ｔｅｒｍａｍｙｌ ｕｌｔｒａ）、ノボベート（ｎｏｖｏｂａｔｅ）、ポラザイム（ｐｏｌａｒｚｙｍｅ）、ニュートラーゼ（ｎｅｕｔｒａｓｅ）、ノボリン（ｎｏｖｏｌｉｎｅ）、ピラーゼ（ｐｙｒａｓｅ）、ノボコル（ｎｏｖｏｃｏｒ）（細菌アルカリ性プロテアーゼ）を提供する。
【０１２０】
プロテイナーゼＫは、米国マサチューセッツ州イプスウィッチのニューイングランド・バイオラボ社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、（Ｉｐｓｗｉｃｈ ＭＡ，ＵＳＡ））から入手可能である。
【０１２１】
米国ノースカロライナ州フランクリントンのノボ・ノルディスク・バイオケム・ノース・アメリカ社（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ Ｉｎｃ（Ｆｒａｎｋｌｉｎｔｏｎ ＮＣ，ＵＳＡ）は、バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）プロテアーゼ（エスペラーゼ６．０Ｔ；サビナーゼ６．０Ｔ）、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）プロテアーゼ（ニュートラーゼ１．５ＭＧ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）プロテアーゼ（アルカラーゼ３．０Ｔ）を提供する。
【０１２２】
米国バージニア州トロイのアマノ・インターナショナル・エンザイム社（Ａｍａｎｏ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｎｚｙｍｅ Ｃｏ（Ｔｒｏｙ，Ｖａ，ＵＳＡ））は、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）プロテアーゼ（プロレザー；プロテアーゼＮ（Ｐｒｏｌｅａｔｈｅｒ；Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｎ））およびアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）プロテアーゼ（プロザイム６（Ｐｒｏｚｙｍｅ ６））を提供する。
【０１２３】
この種の適切な酵素としては、例えばリゾプス・ジャポニカス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）リパーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）のリパーゼＡＰ−６、アルカリゲネス種（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｓｐ．）のリパーゼＱＬ、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）のプロテアーゼＢ（配列番号１９）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のデルボラーゼ（Ｄｅｌｖｏｌａｓｅ）（配列番号２０）、リゾプス・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）リパーゼ、エスペラーゼ、アルカラーゼ、アスペルギルス種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ）アシラーゼ、プロザイム（Ｐｒｐｚｙｍｅ）、プロテアーゼＭ（Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｍ）、プロテアーゼＮが挙げられる。加水分解酵素は、エステル結合に作用する加水分解酵素（リパーゼ、エステラーゼ）（ＥＣ ３．１）、ペプチド結合に作用するペプチドヒドロラーゼ（ペプチダーゼ、プロテイナーゼ）（ＥＣ ３．４）、およびペプチド結合以外のＣ−Ｎ結合に作用する加水分解酵素（ＥＣ ３．５）の群から選択されることが好ましい。
【０１２４】
具体的には、ペプチド結合以外のＣ−Ｎ結合に作用する加水分解酵素は、カルボン酸エステルヒドロラーゼ（ＥＣ ３．１．１）および直鎖状アミドに作用するアミダーゼ（ＥＣ ３．５．１）の群から、具体的にはアミノアミダーゼの群から、より具体的にはマイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）由来のアミノアミダーゼ、より具体的にはマイコバクテリウム・ネオオーラム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｅｏａｕｒｕｍ）由来のアミノアミダーゼの群から選択することができる。
【０１２５】
Ｎ−保護ＤＡＢの化学的加水分解に、類似の反応に対して当技術分野で知られているプロセスを含むことができる。適切な方法には、トリフェニルホスフェートの溶液を塩素で滴定することによりインサイチュー（ｉｎ ｓｉｔｕ）で調製された（ＰｈＯ）３Ｐ・Ｃｌ２試薬による脱アシル化が含まれる。この方法は、Ｓａｇｇｉａｒｉら（Ｏｒｇａｎｉｃ Ｌｅｔｔｅｒｓ （２００４）、６（２２）、３８８５〜３８８８頁）に概ね記載されている。
【０１２６】
Ｎ５−保護オルニチンの無保護ＤＡＢへの変換では、以前に記載のように、最初にＮ５−保護オルニチンを特異的に脱炭酸させる処理を行い、Ｎ−保護ＤＡＢを得た後、 Ｎ−保護ＤＡＢを加水分解させて無保護ＤＡＢを生じさせた。
【０１２７】
Ｎ−保護ＤＡＢを生じさせるＮ５−保護オルニチンの特異的脱炭酸のために、リアーゼ活性を有する酵素などの適切な生体触媒を使用することができる。リアーゼ活性を有する適切な酵素はクラスＥＣ４に属する。より具体的には、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のオルニチンデカルボキシラーゼ（ＳｐｅＣ）（ＥＣ ４．１．１．１７）、ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）の分枝鎖α−ケト酸デカルボキシラーゼ（ＫｄｃＡ；配列番号８）およびα−ケトイソバレレートデカルボキシラーゼ（ＫｉｖＤ；配列番号１０）、ならびにエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のリジンデカルボキシラーゼ（ＬｙｓＡ；配列番号１２）によって例示される、カルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１）などの炭素−炭素リアーゼ（ＥＣ ４．１）を使用することができる。
【０１２８】
代替的に、最初に述べたＮ５−保護オルニチンの特異的脱炭酸は、類似の化学成分に対して当技術分野で知られている化学変換を用いて行うことができる。この目的のための適切な化学的脱炭酸反応は、高温沸騰したジフェニルメタンなどの溶媒中で、場合によっては触媒量の有機過酸化物の存在下で、化合物を加熱することによって行うことができ、または１等量または複数等量のケトンもしくはアルデヒドと共に化合物を加熱することによって行うことができる。
【０１２９】
その後のＮ−保護ＤＡＢの加水分解は、生体触媒により生成されたＮ−保護ＤＡＢに対して上述したように、生体触媒プロセスまたは化学プロセスによって行うことができる。
【０１３０】
上述の２ステップ変換の代替として、Ｎ５−保護オルニチンからＤＡＢを生成させるワンポットプロセスを使用することができる。このプロセスは、類似の化合物に対して当技術分野で知られている方法に従って、最初にＮ５−保護オルニチンを脱アシル化し、次いで脱炭酸するか、または最初にＮ５−保護オルニチンを脱炭酸し、次いで脱アシル化するかのいずれかによって行うことができる。脱炭酸は上述のように行うことができる。脱アシル化はＮ−保護ＤＡＢについての上述の方法によって行うことができる。
【０１３１】
Ｎ−保護４−アミノブチルアルデヒドの無保護ＤＡＢへの変換は、最初にアルデヒド酸素をアミノ基に特異的に置換してＮ−保護ＤＡＢを形成させて、次いで後者を脱保護することによって行うことができる。最初の変換のために、上述のようにトランスフェラーゼ活性（ＥＣ ２）を有する酵素などの適切な生体触媒を使用することができる。この特定の目的のための、トランスフェラーゼ活性を有する適切な酵素は、窒素含有基を転移させるトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６）、より具体的にはアミノトランスフェラーゼ（トランスアミナーゼ）（ＥＣ ２．６．１）、さらに具体的には哺乳類肝臓由来の４−アミノ−ブチレートアミノトランスフェラーゼ、より具体的にはブタ肝臓由来の４−アミノ−ブチレートアミノトランスフェラーゼ；哺乳類脳由来の４−アミノ−ブチレートアミノトランスフェラーゼ、より具体的にはヒト、ブタまたはラットの脳由来の４−アミノブチレートアミノトランスフェラーゼ；ビブリオ・フルビアリス（Ｖｉｂｒｉｏ ｆｌｕｖｉａｌｉｓ）のω−アミノトランスフェラーゼ、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来の４−アミノ−ブチレートアミノトランスフェラーゼ、ならびにクロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）由来、より具体的にはクロストリジウム・アミノワレリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｍｉｎｏｖａｌｅｒｉｃｕｍ）由来の５−アミノバレレートアミノトランスフェラーゼ、例えばシゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）またはサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）のオルニチントランスアミナーゼ（ＥＣ ２．６．１．１１）、Ｌ−アラニン：３−オキソプロピオネートアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６．２．１８）、およびプトレッシンアミノトランスフェラーゼによって例示される。特に適切なアミノトランスフェラーゼとしては例えば、ビブリオ・フルビアリス（Ｖｉｂｒｉｏ ｆｌｕｖｉａｌｉｓ）のω−アミノトランスフェラーゼ（配列番号５）、またはシュードモナス・エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（ｇｉ９９４６１４３（配列番号１）もしくはｇｉ９９５１０７２（配列番号３））、パラコッカス・デニトリフィカンス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）（ＺＰ００６２８５７７；配列番号１４）、バチルス・ウェイヘンステファネンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓ）（ＺＰ０１１８６９６０（配列番号１６））のアミノトランスフェラーゼがある。
【０１３２】
Ｎ−保護４−アミノブチルアルデヒドをＮ−保護ＤＡＢへ変換するための他の適切な生体触媒は、オキシドレダクターゼ（ＥＣ １）を有する酵素、より具体的にはドナーのＣＨ−ＮＨ２基（ＥＣ １．４）またはＣＨ−ＮＨ基（ＥＣ １．５）に作用するオキシドレダクターゼ、ならびにより具体的にはクラスＥＣ １．４．１、１．４．３（好ましくは１．４．３．４）および１．４．９９の酵素である。
【０１３３】
代替的に、Ｎ−保護４−アミノブチルアルデヒドの最初の変換は、類似の化学成分に対して当技術分野で知られている化学変換によって行なうことができる。この目的のために適切な化学反応は、類似の化合物に対して当技術分野で知られている方法に従って、Ｎ−保護４−アミノブチルアルデヒドを還元的アミノ化することによって実施することができる（例えば独国特許第４３２２０６５号明細書を参照されたい）。適切な方法は、例えば不均一触媒（ＲａＮｉ、Ｎｉ／ＳｉＯ２および／もしくはＡｌ２Ｏ３、Ｒｕ／Ｃ、Ｒｈ／Ｃなど）または均一触媒（均一Ｒｈ触媒など）上でアンモニアおよび水素を使用する反応である。
【０１３４】
その後のＮ−保護ＤＡＢの加水分解は、生体触媒により生成されたＮ−保護ＤＡＢについて上述したように、生体触媒プロセスまたは化学プロセスによって行なうことができる。
【図面の簡単な説明】
【０１３５】
【図１】Ｎ−Ａｃ−オルニチンのＮ−Ａｃ−ＤＡＢへの生物変換の終了時点の試料のＴＬＣを示す図である。１）グルタメートＤＣ；２）アスパルテートＤＣ；３）ＬｙｓＡ；４）ＫｄｃＡ；５）ＫｉｖＤ；６）Ｋｇｄ；７）リジンＤＣ；８）ＯＤＣ ＬＪ１１０；９）ＯＤＣ ＤＨ５α；１０）酵素ブランク；１１）化学ブランク；１２）Ｎ−Ａｃ−オルニチン参照試料；１３）Ｎ−Ａｃ−ＤＡＢ参照試料；１４）Ｎ−Ａｃ−オルニチンおよびＮ−ＡｃーＤＡＢ参照試料。
【０１３６】
［実施例］
［全般的方法］
［分子および遺伝子の手法］
標準的な遺伝子および分子生物学の手法については、当技術分野で一般に知られており、以前に記載されている（Ｍａｎｉａｔｉｓら １９８２ 「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．；Ｍｉｌｌｅｒ １９７２ 「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ ２００１ 「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ」（第３版）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌら編 「Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９８７）。
【０１３７】
［プラスミドおよび株］
ｐＢＡＤ／Ｍｙｃ−ＨｉｓＣは、米国カリフォルニア州カールスバードのインビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ， ＵＳＡ））から入手した。国際公開第２００５／０６８６４３号パンフレットに記載のように構築したプラスミドｐＢＡＤ／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ−ＤＥＳＴは、タンパク質発現のために使用した。Ｅ．コリ（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０（インビトロジェン社、カールスバード、カリフォルニア州、米国（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ））は、すべてのクローニング手法および標的遺伝子発現のために使用した。
【０１３８】
［培地］
ＬＢ培地（１０ｇ／ｌのトリプトン、５ｇ／ｌの酵母抽出物、５ｇ／ｌのＮａＣｌ）は、Ｅ．コリ（Ｅ． ｃｏｌｉ）の増殖用に使用した。プラスミドを維持するために抗生物質（５０μｇ／ｍｌのカルベニシリン）を補った。ｐＢＡＤ／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ−ＤＥＳＴ由来プラスミドにおいて、ＰＢＡＤプロモーターの制御下で遺伝子発現を誘導するために、Ｌ−アラビノースを最終濃度０．２％（Ｗ／Ｖ）になるように加えた。
【０１３９】
［Ｍ．ネオオーラム（Ｍ．ｎｅｏａｕｒｕｍ）のアミノアミダーゼの産生］
アミノアミダーゼは、以下の条件下におけるマイコバクテリウム・ネオオーラム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｅｏａｕｒｕｍ）株ＡＴＣＣ２５７９５の増殖によって得た。４．８ｇ／ｌのニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、４ｇ／ｌの尿素、６ｇ／ｌのグルコース、２０ｇ／ｌの酵母カーボンベース（Ｄｉｆｃｏ製ＹＣＢ）、１．５５ｇ／ｌのＫ２ＨＰＯ４、および０．８５ｇ／ｌのＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏを含有する１ｌのマイコメド（Ｍｙｃｏｍｅｄ）培地をｐＨ７に調整し、それにマイコバクテリウム・ネオオーラム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｅｏａｕｒｕｍ）株ＡＴＣＣ２５７９５のグリセロール保存培養物をイノキュレートした。前培養物をニュー・ブランズウィック・サイエンティフィック（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）Ｇ５３シェーカー（１５０ｒｐｍ、振幅４ｃｍ）にて、３７℃、１６８時間振とうした。３．４５の光学濃度（ＯＤ６２Ｏｎｍ）に達したとき、前培養物５００ｍｌを使用してマイコメド培地９ｌにイノキュレートした。マイコメド培地中に存在するＮＴＡによってアミダーゼの発現を誘導した。発酵培養物を０．５〜２ｌ／分の通気速度のもとで３７５〜７５０ｒｐｍにて撹拌した。Ｈ３ＰＯ４およびＮａＯＨの添加によって、ｐＨを７に一定に保持した。培養温度は３７℃とした。４４時間の培養後、１０ｇ／ｌのＹＣＢを添加して培養物に栄養を与えた。６８時間の培養後、１０ｇ／ｌのグルコースを添加して培養物に栄養を与えた。９４時間の培養後、１２，０００ｇにて１０分間遠心分離して培養物を採取した。細胞ペレットを２０ｍＭのＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７）中で洗浄し、次いで保存のために凍結乾燥した。
【０１４０】
［プラスミドの同定］
相異なる遺伝子を保持するプラスミドを、形質転換細胞の抗生物質に対する抵抗性、形質転換細胞のＰＣＲ診断分析またはプラスミドＤＮＡの精製、精製プラスミドＤＮＡの制限酵素分析またはＤＮＡ配列分析などの当技術分野で一般に知られている遺伝的、生化学的および／または表現型手段によって同定した。
【０１４１】
［標的遺伝子のクローニング］
［発現構築物の設計］
ゲートウェイ（Ｇａｔｅｗａｙ）技術（インビトロジェン社、カールスバード、カリフォルニア州、米国）を使用するクローニングを容易にするために、すべての遺伝子にａｔｔＢ部位を、リボソーム結合部位および開始コドンの上流、ならびに停止コドンの下流に付加した。
【０１４２】
［遺伝子合成およびプラスミドの構築］
合成遺伝子を、ＤＮＡ２．０から得て、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現させるためにＤＮＡ２．０の標準的手順に従ってコドンを最適化した。ビブリオ・フルビアリス（Ｖｉｂｒｉｏ ｆｌｕｖｉａｌｉｓ）ＪＳ１７ω−アミノトランスフェラーゼ［配列番号６］およびバチルス・ウェイヘンステファネンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓ）ＫＢＡＢ４アミノトランスフェラーゼ（ＺＰ＿０１１８６９６０）［配列番号１７］をそれぞれコードするＶ．フルビアリス（Ｖ．ｆｌｕｖｉａｌｉｓ）ＪＳ１７［配列番号５］およびＢ．ウェイヘンステファネンシス（Ｂ．ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓ）ＫＢＡＢ４［配列番号１６］由来のアミノトランスフェラーゼ遺伝子をコドン最適化し、その結果として得られた配列［配列番号７］および［配列番号１８］をＤＮＡ合成によって得た。
【０１４３】
この遺伝子構築物を、製造業者のプロトコール（ｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ）に従い、導入したａｔｔＢ部位およびエントリーベクターとしてｐＤＯＮＲ２０１（インビトロジェン社）を介して、ゲートウェイ技術（インビトロジェン社）によりｐＢＡＤ／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ−ＤＥＳＴ発現ベクターの中にクローン化した。このようにして発現ベクターｐＢＡＤ−Ｖｆｌ＿ＡＴおよびｐＢＡＤ−Ｂｗｅ＿ＡＴをそれぞれ得た。化学的にコンピテントなＥ．コリ（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０（インビトロジェン社）を、それぞれのｐＢＡＤ−発現ベクターにより形質転換して、対応する発現株を得た。
【０１４４】
同様な方法で、配列番号１５のアミノ酸配列をコードする、パラコッカス・デニトリフィカンス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）由来のアミノトランスフェラーゼ遺伝子［配列番号１４］の発現ベクターを作製した。
【０１４５】
［ＰＣＲによるクローニング］
製造業者の仕様書に従ってＰＣＲ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（インビトロジェン社）を使用し、表３に載せたプライマーを用いることにより、アミノトランスフェラーゼ遺伝子をゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。
【０１４６】
【表３】
【０１４７】
ＰＣＲ反応物をアガロースゲル電気泳動により分析し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（キアゲン社、ヒルデン、ドイツ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ））を用いて適当な大きさのＰＣＲ産物をゲルから溶出した。精製ＰＣＲ産物を、製造業者のプロトコールに記載のように、導入したａｔｔＢ部位およびエントリーベクターとしてｐＤＯＮＲ−ｚｅｏ（インビトロジェン社）を介して、ゲートウェイ技術（インビトロジェン社）によりｐＢＡＤ／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ−ＤＥＳＴ発現ベクターの中にクローン化した。ＰＣＲによってクローン化した遺伝子の配列を、ＤＮＡシークエンシングにより検証した。このようにして発現ベクターｐＢＡＤ−Ｐａｅ＿ｇｉ９９４６１４３＿ＡＴ、ｐＢＡＤ−Ｐａｅ＿ｇｉ９９５１０７２＿ＡＴ、およびｐＢＡＤ−Ｐｄｅ＿ＡＴ＿ＺＰ００６２８５７７を得た。化学的にコンピテントなＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０（インビトロジェン社）をｐＢＡＤ構築物により形質転換して、対応する発現株を得た。
【０１４８】
［タンパク質発現用のＥ．コリ（Ｅ． ｃｏｌｉ）の増殖］
０．０２％（ｗ／ｖ）のＬ−アラビノースを含有する培地９４０μｌの入った９６ディープウェルプレート中で小規模増殖を行った。９６ウェルスタンプ（キューネル社、ビルスフェルデン、スイス（Ｋｕｅｈｎｅｒ，Ｂｉｒｓｆｅｌｄｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））によって凍結保存培養物から細胞を移すことにより、イノキュレーションを行った。プレートは、２５℃で４８時間、旋回シェーカー（３００ｒｐｍ、振幅５ｃｍ）上でインキュベートした。通常は、２〜４のＯＤ６２０ｎｍが得られた。
【０１４９】
［細胞溶解物の調製］
［溶菌緩衝液の調製］
溶菌緩衝液は、表４に載せた成分を含有した。
【０１５０】
【表４】
【０１５１】
この溶液は、使用直前に新たに調製した。
【０１５２】
［溶菌による無細胞抽出物の調製］
小規模の増殖（前段落を参照されたい）から得られた細胞を、遠心分離によって集め、上清を廃棄した。遠心分離の間に形成された細胞ペレットを、−２０℃で少なくとも１６時間冷凍し、次いで氷上で解凍した。新たに調製した溶菌緩衝液５００μｌを各ウェルに加え、プレートを２〜５分間激しく渦撹拌することによって細胞を再懸濁させた。溶菌を達成するためにプレートを室温で３０分間インキュベートした。細胞片を除去するためにプレートを４℃、６０００ｇで２０分間遠心分離した。上清を新たなプレートに移し、次に使用するまで氷上で保持した。
【０１５３】
［超音波処理による無細胞抽出物の調製］
中規模の増殖（前段落を参照されたい）から得られた細胞を、遠心分離によって集め、上清を廃棄した。湿細胞ペレット０．５ｇにリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）１ｍｌを加え、激しく渦撹拌することによって細胞を再懸濁させた。溶菌を達成するために細胞を２０分間超音波処理した。細胞片を除去するために溶解物を４℃、６０００ｇで２０分間遠心分離した。上清を新たなチューブに移し、次に使用するまで−２０℃で冷凍した。
【０１５４】
［Ｎ−アセチル−４−アミノブチルアルデヒドのＮ−アセチル−ＤＡＢへの生物変換］
［スクリーニング条件］
酵素はすべて、最終容積１００μｌになるように１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁した。酵素反応は、アミンドナー（Ｌ−アラニンまたは（Ｓ）−αメチルベンジルアミン）および補因子（ＰＬＰ）を含有する保存溶液１５０μｌを添加することにより開始させた。反応混合物２５０μｌ中の最終濃度は、Ｎ−アセチル−アミノブタナール（７０ｍＭ）、アミンドナー（１４０ｍＭ）、ＰＬＰ（１２．５ｍＭ）とした。２種類のアミンドナーは別々に実験した。反応混合物を、ＩＫＡの旋回シェーカー上にて５６０ｒｐｍで振とうさせながら、２８℃で一晩（１６．５および１６時間）インキュベートした。インキュベーション後、０．２％のギ酸を含む６０％稀釈のアセトニトリル７５０μｌを添加してこの反応混合物を停止させ、希釈した。マイクロタイタープレートを３５００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。分析はＬＣ−ＭＳ分析によって行った（分析ジョブ２００９−０２−００６４９を参照されたい）。
【０１５５】
［分析法：］
合計１４８の試料をジョブ２００９−０１−００３０６に記載の分析法を用いて、ＬＣ−ＭＳによって分析した。検出限界；直線範囲：アミンドナーＬ−アラニンに対して、０μｍｏｌ／Ｌ〜５５０μｍｏｌ／Ｌ、アミンドナー（Ｓ）−αメチルベンジルアミンに対して０μｍｏｌ／Ｌ〜２８０μｍｏｌ／Ｌ。
【０１５６】
［Ｎ−アセチル−４−アミノブチルアルデヒドのＮ−アセチル−ＤＡＢへの生物変換の結果］
合計１４８のトランスアミナーゼ酵素を、Ｎ−アセチル−４−アミノブチルアルデヒドのＮ−アセチル−ＤＡＢへの経路に対してスクリーニングした。すべての試料を、この変換に関してＬＣ−ＭＳによって分析した。この変換はＮ−アセチル−ＤＡＢの形成に基づいて計算した。アミンドナーとしてＬ−アラニンを使用した場合に、合計３１のアミノトランスフェラーゼでヒット（２％を超える変換）が得られた。さらに、これらのうちの２０が、アミンドナーとして（Ｓ）−α−メチルベンジルアミンを使用した場合でも陽性であった。これら陽性ヒットのうちの５つを表５に例示する。
【０１５７】
【表５】
【０１５８】
［Ｎ−アセチル−ＤＡＢのＤＡＢへの生物変換］
［スクリーニング条件］
酵素はすべて、１００ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ７．５）に最終容積１００μｌになるように懸濁した。酵素反応は、１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液中の１３．３３ｍｇ／ｍｌのＮ−アセチル−ＤＡＢ・ＨＣｌ溶液１５０μｌ（最終反応濃度、８ｍｇ／ｍｌ≒４８ｍＭのＮ−アセチル−ＤＡＢ）を添加して開始させた。反応混合物を、ＩＫＡの旋回シェーカー上にて４６０ｒｐｍで振とうさせながら、３７℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、Ｈ２Ｏ中の１００ｍＭのＨＣｌＯ４７５０μｌ（ｐＨ１．０）を添加してこの反応混合物を停止させ、希釈した。マイクロプレートを３５００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、以下に記載のようにＨＰＬＣ−ＰＣＲ−ＦＬ分析を用いてＤＡＢについて分析した。
【０１５９】
［ＤＡＢ測定のためのＨＰＬＣ−ＭＳ分析法］
［試料調製：］
０．２％のギ酸を含む、アセトニトリルと水との混合物を用いて、試料を希釈した。アセトニトリルの割合は少なくとも５０％にしなければならない。
【０１６０】
【表６】
【０１６１】
適用条件下で、ＤＡＢは６．３分に溶出する。
【０１６２】
［Ｎ−アセチル−ＤＡＢのＤＡＢへの生物変換の結果］
試験した酵素の中から、Ｎ−アセチル−ＤＡＢのＤＡＢへの生物変換において加水分解活性を示した酵素を選択して表６に載せた。これらの酵素の中のいくつかについては、本特許出願に組み入れられた配列情報によっても特徴付けられる。
【０１６３】
【表７】
【０１６４】
［結論］
多くの加水分解酵素が、Ｎ−アセチル−ＤＡＢのＤＡＢへの変換のための生体触媒として有用であることが見出された。
【０１６５】
他のアシル保護基を有するＮ−保護ＤＡＢ前駆体は、例えば４−アミノブチルアルデヒドまたはオルニチンのアシル化によって調製することができる。例えば、ギ酸中で無水酢酸によるアシル化によってホルミル保護基を導入すること、またはＣ２〜Ｃ６カルボン酸無水物もしくは塩化アシルの反応によってＮ−アセチル、Ｎ−プロピオニル、Ｎ−ブチリル、Ｎ−バレリルもしくはＮ−カプロイル保護基をそれぞれ導入すること。Ｎ−ホルミル−ＤＡＢおよびＣ３〜Ｃ６アシル保護基を有する高級同族体などのＮ−保護ＤＡＢ前駆体は、上記の酵素によって同様に変換されることが予想される。
【０１６６】
［Ｎ５−アセチル−オルニチンのＮ−アセチル−ＤＡＢへの生物変換］
［細胞培養および発現］
この生物変換はデカルボキシラーゼを用いて行われた。大部分のデカルボキシラーゼは標準条件下でＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現させた。
【０１６７】
前培養物は、ｐＢＡＤ−ＤＥＳＴ＿ｌｙｓＡ、ｐＢＡＤ−ＤＥＳＴ＿ｋｄｃＡ、ｐＢＡＤ−ＤＥＳＴ＿ｋｉｖＤ、またはｐＢＡＤ−ＤＥＳＴ＿ｋｇｄを内包するＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔｏｐ１０を、グリセロールストックからＬＢｃａｒｂ培地５ｍｌにイノキュレーションして作製した。前培養物は、２８℃で一晩インキュベートした。各前培養物０．５ｍｌを、ＬＢｃａｒｂ培地５０ｍｌ中に希釈した。ＯＤ６００が０．６に到達する（平均して３〜４時間後）まで、この培養物を２８℃でインキュベートした。タンパク質発現は、最終濃度０．０２％までアラビノースを添加することにより誘導した。２８℃で一晩のインキュベーション後、細胞を採取した（１０分、５０００ｒｐｍ、４℃）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析のために、誘導前、誘導３時間後、および一晩の後に、試料１ｍｌを採取した。細胞をペレット化し（５分、１３，０００ｒｐｍ）、そのペレットを−２０℃で保存した。
【０１６８】
２つのオルニチンデカルボキシラーゼ、ｐＢＡＤ２＿ＯＤＣ Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α／ＬＪ１１０を、わずかに異なった条件下で増殖および発現させた。ここで、５０μＭのＩＰＴＧによる誘導前に、ＯＤ６２０が１．５になるまで本培養物を増殖させた。他のすべての条件は上記と同じとした。
【０１６９】
［超音波処理によるＣＦＥの調製］
細胞ペレットを氷上で解凍し、２容積の５０ｍＭリン酸カリウム（ＫＰｉ）緩衝液（ｐＨ７．５）に再懸濁した。この細胞懸濁液を、１０秒間パルスで１０分間断続的に超音波処理した。超音波処理後、細胞片を遠心分離（２０分、１３，２００ｒｐｍ、４℃）によってペレットにした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を用いて発現レベルを測定し、ＣＦＥを−２０℃で保存した。
【０１７０】
【表８】
【０１７１】
Ｎ−Ａｃ−オルニチンのＮ−Ａｃ−ＤＡＢへの反応はすべて、３７℃で撹拌およびインキュベートした。試料を０、２、１８、２８、および４４時間の時点で採取し、−２０℃に保存した。分析のために、各試料５００μｌをアセトニトリル５００μｌに加え、最高速度で１０分間回転させた。試料をＴＬＣ上で分析するために、アンモニア：メタノール（１：１）の溶離液で流し、ニンヒドリンスプレーで染色した。定量分析のために、下記の方法に従って、ＬＣ−ＭＳ−ＭＳにより試料を測定した。
【０１７２】
［Ｎ−アセチル−ＤＡＢ測定のためのＨＰＬＣ−ＭＳ分析法］
［試料調製：］
０．２％のギ酸を含む、アセトニトリルと水との混合物を用いて、試料を希釈した。アセトニトリルの割合は少なくとも５０％にしなければならない。
【０１７３】
実験はアプライド・バイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のＰＥ ＳＣＩＥＸ ＡＰＩ２０００ ＬＣ−ＭＳ／ＭＳで行った。
【０１７４】
【表９】
【０１７５】
適用条件下で、Ｎ−Ａｃ−ＤＡＢは４．２分に溶出する。
【０１７６】
Ｎ５−アセチル−オルニチンのＮ−アセチル−ＤＡＢへの生物変換の結果
オルニチンのＤＡＢへの変換については、終了時点の試料（４４時間）をＴＬＣ上で分析した（図１）。
【０１７７】
終了時点の試料はすべてＬＣ−ＭＳ−ＭＳにより分析した。対照試料のレベルより少なくとも３μｍｏｌ超の値を示す試料を表８に示す。
【０１７８】
【表１０】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、少なくとも１つの生体触媒ステップを含む、１，４−ジアミノブタン［ＤＡＢ］の調製方法に関する。
【０００２】
化合物ＤＡＢは、主要なエンジニアリングプラスチックの一部、すなわちホモポリマー形態のポリアミド−４，６、または例えば約５重量％のポリアミド−６モノマー（カプロラクタム）と共重合したポリアミド−４，６を製造するための重要な原料である。ホモポリマーポリアミド−４、６（ナイロン４，６）は、早くも１９３８年に記載がある（米国特許第２，１３０，９４８（Ａ）号明細書、カロザーズ（Ｃａｒｏｔｈｅｒｓ））。これはモノマーＤＡＢおよびアジピン酸の重縮合生成物である。現在、特にポリアミド−４，６の化合物は、スタニル（ＳＴＡＮＹＬ）（登録商標）の商品名でオランダのＤＳＭが製造し、販売している。
【０００３】
ＤＡＢの合成については、いくつかの化学ルートが知られている。これらの化学ルートには、再生が不可能であると考えられる供給源から出発物質を入手しなければならないという欠点がある。しかしながら、再生可能な炭素源から出発し、生化学的プロセス（「生体内変換」とも呼ばれる）を使用するＤＡＢ合成のための実現可能な新ルートを提供する実質的な必要性が存在する。
【０００４】
少なくとも１つの発酵ステップを含むＤＡＢの調製方法が、国際公開第２００６／００５６０３号パンフレットおよび国際公開第２００６／００５０４号パンフレットとして公表されたＰＣＴ出願に記載されている。両方の文書には、高レベルのオルニチンデカルボキシラーゼ活性を有する微生物における、ＤＡＢの発酵による製造が記載されている。
【０００５】
本方法は、ＤＡＢの代替調製方法に関する。本発明による方法は、ＤＡＢの少なくとも１つのＮ−保護前駆体の生体触媒による生成とその後のＮ−保護前駆体のＤＡＢへのインビトロ変換とを含む、少なくとも１つの生体触媒ステップを含む。
【０００６】
生体触媒による生成後のＤＡＢの回収は、相当な困難を伴うことが見出された。国際公開第２００７／０７９９４４号パンフレットには、ＤＡＢなどの有機アミンの回収が記載されている。そこに記載の特定の実施形態では、アミンの硫酸塩またはリン酸塩（したがって例えば、ＤＡＢ二硫酸塩）を含有する無細胞培養液が濃縮され、アンモニアのような塩基が添加される。条件に応じて、２層系が形成される。主として有機化合物を含有する層から、所望のアミンが回収され得る。
[発明の詳細な説明］
【０００７】
一実施形態によれば、ＤＡＢの調製方法は、少なくとも１つの生体触媒ステップを含み、（ａ）ＤＡＢのＮ−保護前駆体を生体触媒により調製するステップであって、ＤＡＢのＮ−保護前駆体を含有する生体触媒反応混合物を生じさせるステップと、（ｂ）生体触媒反応混合物からＮ−保護前駆体を回収するステップと、（ｃ）Ｎ−保護前駆体をＤＡＢに変換するステップとを含む。
【０００８】
特定の実施形態によれば、ＤＡＢを生成させる本発明は、少なくとも１つの生体触媒ステップを含み、このステップは、Ｎ５−保護オルニチン、Ｎ−保護ＤＡＢ、およびＮ−保護４−アミノブチルアルデヒドからなる群から選択される、ＤＡＢの少なくとも１つのＮ−保護前駆体の生体触媒による生成、およびその後のＮ−保護前駆体のＤＡＢへのインビトロ変換を含む。
【０００９】
本明細書において「インビトロ変換」とは、細胞外の培地中においてＤＡＢのＮ−保護前駆体がＤＡＢへ変換されることを意味する。このインビトロ変換は、少なくとも１つの生体触媒による変換であってもよく、もしくは少なくとも１つの化学ステップを含む化学変換であってもよく、または少なくとも１つの生体触媒ステップと少なくとも１つの化学ステップとの組合せであってもよい。
【００１０】
本明細書において「ＤＡＢのＮ−保護前駆体」とは、保護アミノ基を含有し、少なくとも１つの化学反応もしくは生体触媒反応、または化学反応と生体触媒反応との組合せによってＤＡＢに変換され得る化合物を意味する。
【００１１】
本明細書において「Ｎ５−保護オルニチン」とは、Ｎ５原子に保護基を有するオルニチン分子を意味する。本明細書において「Ｎ−保護ＤＡＢ」とは、アミノ基の１つに保護基を有するＤＡＢ分子を意味する。本明細書において「Ｎ−保護４−アミノブチルアルデヒド」とは、アミノ基に保護基を有する４−アミノブチルアルデヒド分子を意味する。
【００１２】
上述の保護基は、１〜６個の炭素原子を有するアシル類からなる群から選択してもよく、またはグアニジル基であってもよい。このような保護基は、生体触媒による生成、生体触媒反応混合物（例えば発酵培養液）からのＮ−保護前駆体の容易な回収、ならびにその後の最終的にＤＡＢを生成するための生体触媒反応および／または化学反応の少なくとも１つを可能にさせるように選択すべきである。
【００１３】
Ｎ−保護ＤＡＢ前駆体は、例えば４−アミノブチルアルデヒドまたはオルニチンのアシル化によって調製することができる。例えば、ギ酸中での無水酢酸によるアシル化によってホルミル保護基を導入すること、またはＣ２〜Ｃ６カルボン酸無水物もしくは塩化アシルの反応によってＮ−アセチル、Ｎ−プロピオニル、Ｎ−ブチリル、Ｎ−バレリル、もしくはＮ−カプロイル保護基をそれぞれ導入すること。
【００１４】
Ｎ−グアニジル保護前駆体は、例えばタンパク新生のアルギニンまたはＮ−グアニジル−アミノブチルアルデヒドもしくはＮ−グアニジルＤＡＢである。発酵ルートが、例えば欧州特許第１２６０５８８号明細書に記載されており、その明細書ではアルギニンデカルボキシラーゼの影響下でアルギニンからアグマチンが生化学的に生成されることが記載されている。アグマチンは、Ｎ−グアニジル保護ＤＡＢである。アグマチン（Ｎ−グアニジル保護ＤＡＢ）は、酸加水分解によって、例えば濃塩酸または濃硫酸などの濃鉱酸水溶液中でアグマチンを還流することによって支障なく脱保護されてＤＡＢになり得る。これにより、ＤＡＢの二酸塩ならびに副生成物の二酸化炭素およびアンモニア（後者は使用される鉱酸のアンモニウム塩の形）が得られる。ＤＡＢをその遊離アミン形で得るために、形成された二酸塩を単離し、再溶解し、塩基で中和すべきである。
【００１５】
さらに特定の実施形態によれば、本発明は、ＤＡＢの少なくとも１つのＮ−保護前駆体が生成され、そのＮ−保護前駆体がＮ５−アセチルオルニチン、Ｎ−アセチルＤＡＢ、およびＮ−アセチル４−アミノブチルアルデヒドからなる群から選択される、ＤＡＢの調製方法に関する。
【００１６】
特定の一実施形態によれば、少なくとも１つの生体触媒ステップを含むＤＡＢの調製方法は、（ａ）Ｎ５−アセチルオルニチンを生体触媒により調製するステップであって、Ｎ５−アセチルオルニチンを含有する生体触媒反応混合物を生じさせるステップと、（ｂ）生体触媒反応混合物からＮ５−アセチルオルニチンを回収するステップと、（ｃ）Ｎ５−アセチルオルニチンをＤＡＢに変換するステップとを含む。
【００１７】
特定の一実施形態によれば、少なくとも１つの生体触媒ステップを含むＤＡＢの調製方法は、（ａ）Ｎ−アセチルＤＡＢを生体触媒により調製するステップであって、Ｎ−アセチルＤＡＢを含有する生体触媒反応混合物を生じさせるステップと、（ｂ）生体触媒反応混合物からＮ−アセチルＤＡＢを回収するステップと、（ｃ）Ｎ−アセチルＤＡＢをＤＡＢに変換するステップとを含む。
【００１８】
特定の一実施形態によれば、少なくとも１つの生体触媒ステップを含むＤＡＢの調製方法は、（ａ）Ｎ−アセチル４−アミノブチルアルデヒドを生体触媒により調製するステップであって、Ｎ−アセチル４−アミノブチルアルデヒドを含有する生体触媒反応混合物を生じさせるステップと、（ｂ）生体触媒反応混合物からＮ−アセチル４−アミノブチルアルデヒドを回収するステップと、（ｃ）Ｎ−アセチル４−アミノブチルアルデヒドをＤＡＢに変換するステップとを含む。
【００１９】
本明細書において、アミンまたはＮ−保護アミン、例えばＮ−保護ＤＡＢを明示的または黙示的に言及する場合、これらの用語は、中性のアミン基、それに対応する荷電を有するプロトン化アミン、およびその塩を含むことを意味する。
【００２０】
［定義］
本明細書において使用する用語「または（ｏｒ）」は、別段の指定がない限り「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」として定義される。
【００２１】
本明細書において使用する用語「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」は、別段の指定がない限り「少なくとも１つ」として定義される。
【００２２】
単数形の名詞（例えば化合物（ａ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）、添加物（ａｎ ａｄｄｉｔｉｖｅ）等）に言及する場合、その複数形も含まれることを意味する。
【００２３】
立体異性体が存在する化合物に言及する場合、その化合物はそのような立体異性体のいずれであっても、またはそれらの組合せであってもよい。したがって、例えば鏡像異性体が存在するアミノ酸に言及する場合、そのアミノ酸はＬ−鏡像異性体であっても、もしくはＤ−鏡像異性体であっても、またはそれらの組合せであってもよい。天然の立体異性体が存在する場合、その化合物は天然の立体異性体であることが好ましい。
【００２４】
酵素がカッコ内の酵素クラス（ＥＣ）を付して言及される場合、その酵素クラスは、国際生化学・分子生物学連合の命名法委員会（Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）（ＮＣ−ＩＵＢＭＢ）によって規定された酵素命名法に基づいて、その酵素が分類されるか、または分類され得るクラスであり、この命名法は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈｅｍ．ｑｍｕｌ．ａｃ．ｕｋ／ｉｕｂｍｂ／ｅｎｚｙｍｅ／に見つけることができる。特定のクラスに（まだ）分類されていないが、そういうものとして分類され得る他の適切な酵素も含まれることを意味する。
【００２５】
用語「同種（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）」または「ホモログ」または「オルソログ」は、機能的な関係を有し、配列同一性の程度に基づいて一般に決定される関連配列を指す。これらの用語により、ある種、亜種、変種、培養変種、系統の中で見出された遺伝子と別の種、亜種、変種、培養変種、または系統の中の対応するまたは等価な遺伝子との間の関係について記述することができる。また、これらの用語により、天然に見出された遺伝子と人為的に構築された遺伝子との間の関係、または２つの人為的に構築された遺伝子間の関係について記述することができる。機能的な関係は、これらに限定されないが、（ａ）配列同一性の程度、（ｂ）同じかまたは類似した生物学的機能を含む、いくつかの方法のいずれか１つで示すことができる。（ａ）および（ｂ）の両方が示されることが好ましい。用語ホモログにはまた、遺伝暗号の縮重により別の核酸配列とは異なり、かつ同じポリペプチド配列をコードする核酸配列（ポリヌクレオチド配列）も含まれることを意味する。
【００２６】
用語「ホモログ」を、ポリペプチドに関して本明細書において使用する場合はいつでも、この用語は、参照ポリペプチドと同じかまたは類似の生物学的機能および一定の配列同一性を有するポリペプチドを指すことを意図する。具体的には、この用語は、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、具体的には少なくとも８５％、より具体的には少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を示すことを意図する。
【００２７】
本明細書においては、「配列同一性」または「配列類似性」は、配列の比較により決定される、２つ以上のポリペプチド配列間または２つ以上の核酸配列間の関係として定義される。通常、配列同一性または配列類似性は配列の全長にわたって比較するが、互いにアライメントした配列の一部に対してのみ比較する場合もある。当技術分野では、「同一性」または「類似性」はまた、場合によってはそのような配列間の一致によって決定される、ポリペプチド配列間または核酸配列間の配列関連性の程度を意味する。同一性または類似性を決定する好ましい方法は、検査される配列間に最大の一致を与えるように設計されている。本発明の枠内では、２つの配列間の同一性および類似性を決定する好ましいコンピュータプログラム法としては、ＮＣＢＩならびに他の供給源（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ら、ＮＣＢＩ ＮＬＭ ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ ２０８９４）から公的に入手できるＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＮ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９０、２１５、４０３〜４１０）が挙げられる。ＢＬＡＳＴＰを使用するポリペプチド配列比較用の好ましいパラメーターは、ギャップ開始１０．０、ギャップ伸長０．５、Ｂｌｏｓｕｍ６２マトリックスである。ＢＬＡＳＴＮを使用する核酸配列比較用の好ましいパラメーターは、ギャップ開始１０．０、ギャップ伸長０．５、ＤＮＡ完全マトリックス（ＤＮＡ同一性マトリックス）である。
【００２８】
本明細書において「生体内変換」または「生体触媒反応」とは、酵素が触媒として使用される生化学反応を意味する。本明細書において本発明に従う場合はいつでも、生体触媒が使用されること、すなわち、この方法の少なくとも１つの反応ステップが、生物学的供給源に由来する生体物質または生体成分、例えば生物またはそれから由来する生体分子によって触媒されることを示す。生体内変換は、具体的には発酵プロセスの場合もある。生体触媒は、具体的には１つまたは複数の酵素を含むことができる。生体触媒は、任意の形態で使用することができる。特定の実施形態では、１つまたは複数の酵素を、自然環境から単離して（それを産生した生物から単離して）、例えば溶液、エマルジョン、分散液、凍結乾燥細胞（の懸濁液）として、溶解物として、または支持体上に固定して使用する。一実施形態では、１つまたは複数の酵素が、生体（生きている細胞全体など）の一部を形成する。これらの酵素は、細胞内で触媒機能を果たすことができる。細胞が存在している培地中に、この酵素を分泌させることも可能である。
【００２９】
本明細書において「生体触媒反応混合物」とは、生体触媒反応が起こる環境を意味する。この環境は、細胞環境（細胞内または細胞外の生体触媒反応のための）の場合も、または無細胞環境の場合もある。
【００３０】
本明細書において「発酵プロセス」とは、特定の化学成分の形成または変換が、単細胞の宿主の中で、より具体的には細胞培養物中の微生物の中で起こる生産プロセスを意味する。本明細書において「発酵による調製」とは、発酵可能な炭素源を含む細胞培養物中に生体触媒を含み、この炭素源が、調製すべき特定の化学成分に変換されることになる前記化合物のいずれかを含有するか、またはこの細胞が、炭素源から調製すべき特定の化学成分に変換されることになる化合物を調製する微生物中で特定の化学成分を生成させることを意味する。この微生物は、特定の化学成分の天然の生産者である場合も、または組換えＤＮＡ技術を使用して、少なくとも１つの適切な酵素をコードする遺伝子によって形質転換されることにより、特定の化学成分を生成する能力を得ている場合もある。特定の化学成分の天然の生産者はまた、所望の特定の化学成分の生成を増大させるために、および／または所望の特定の化学成分の生産性を妨害し得るか、もしくは本発明によるプロセスにおけるさらなるステップを妨害することになる成分の生成を低下させるために、組換えＤＮＡを使用して、少なくとも１つの適切な酵素をコードする遺伝子によって形質転換される場合もある。
【００３１】
ＤＡＢのＮ−保護前駆体を発酵により調製するための好ましい微生物は、真核生物起源の場合も、または原核生物起源の場合もある。具体的には、微生物は、動物（ヒトを含む）細胞、植物細胞、細菌、古細菌、酵母、および菌類から選択することができる。より具体的には、微生物は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（具体的にはＢ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（具体的にはＢ．ケトグルタミカム（Ｂ．ｋｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ））、コリネバクテリア属（ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）（具体的にはＣ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ））、エシェリヒア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）（具体的にはＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ））、クレブシェラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）（具体的にはＫ．ニューモニア（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ））、ラクトバチリ属（ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）（具体的にはＬ．ラクチス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ））、プロピオンバクテリウム属（ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シュードモナス属（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（具体的にはＰ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ））、ロドコッカス属（Ｒｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）（具体的にはＲ．エリスロポリス（Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ））、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）（具体的にはＳ．セリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｒ）およびＳ．クラブリゲラス（Ｓ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ））などの細菌、クリベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）（具体的にはＫ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ））、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）（具体的にはＰ．クリソゲナム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ））、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）（具体的にはＳ．セルビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）（具体的にはＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ））、ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）（具体的にはＰ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ））、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）（具体的にはＳ．ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ））、ヤロウィア属（Ｙａｒｏｗｉａ）（具体的にはＹ．リポリチカ（Ｙ．ｌｙｐｏｌｙｔｉｃａ））などの酵母、タラロミセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）などの菌類からなる群から選択することができる。
【００３２】
最も好ましい実施形態では、Ｎ−保護前駆体の発酵生成は、Ｎ−保護前駆体がインビボで形成される微生物の中で行なわれる。本発明によるＮ−保護前駆体の形成が、任意の適切な炭素源に由来するＮ−保護前駆体への生体内変換であることが好ましい。
【００３３】
この発酵プロセス用の炭素源は、具体的には、一価アルコール、多価アルコール、カルボン酸、二酸化炭素、脂肪酸、グリセリドの群から、前記化合物のいずれかを含む混合物も含めて、選択される少なくとも１つの化合物を含有することができる。適切な一価アルコールにはメタノールおよびエタノールが含まれ、適切な多価アルコールにはグリセロールおよび炭水化物が含まれる。適切な脂肪酸またはグリセリドは、具体的には、食用油、好ましくは植物起源の食用油の形で供給することができる。
【００３４】
具体的には、炭水化物は、通常、農産物、好ましくは農業廃棄物質など、生物学的に再生可能な資源から大量に得ることができるので、使用することができる。炭水化物は、グルコース、フルクトース、スクロース、ラクトース、サッカロース、デンプン、セルロース、およびヘミセルロースの群から選択して使用することが好ましい。グルコース、グルコースを含むオリゴ糖、およびグルコースを含む多糖が特に好ましい。
【００３５】
さらに、炭素源として、アミノ酸もしくはその誘導体、グルタメートもしくはその誘導体、および／またはオルニチンもしくはその誘導体を使用することができる。
【００３６】
窒素源として、アンモニア、アンモニア塩、尿素、硝酸塩、および亜硝酸塩などの無機窒素含有化合物、またはアミノ酸もしくはその誘導体、より具体的にはグルタメートもしくはその誘導体および／またはオルニチンもしくはその誘導体などの有機窒素含有化合物を使用することができる。
【００３７】
本明細書において生体触媒に言及する場合、生体触媒は、生体触媒機能に関連する少なくとも１つの酵素を発現する生物を指す場合も、または生物から得られたかまたは由来した少なくとも１つの酵素を指す場合もある。この生物は真核生物の場合も、または原核生物の場合もある。具体的には、この生物は、動物（ヒトを含む）、植物、細菌、古細菌、酵母、および菌類から選択することができる。
【００３８】
一実施形態では、生体触媒は、動物に、具体的にはその一部、例えば肝臓、膵臓、脳、腎臓、心臓、またはその他の器官に由来する。この動物は、具体的には哺乳動物の群から選択し、より具体的には霊長類（ｐｒｉｍａｔｅｓ）（ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）など）、ウサギ科（Ｌｅｐｏｒｉｄａｅ）、ネズミ科（Ｍｕｒｉｄａｅ）、イノシシ科（Ｓｕｉｄａｅ）、およびウシ科（Ｂｏｖｉｄａｅ）から選択することができる。
【００３９】
生体触媒の起源として適切な植物は、具体的には、チャセンシダ属（Ａｓｐｌｅｎｉｕｍ）；ウリ科（Ｃｕｃｕｒｂｉｔｃｅａｅ）、具体的にはカボチャ属（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ）、例えばカボチャ（ｓｑｕａｓｈ）、またはキュウリ属；メルクリアリス属（Ｍｅｒｃｕｒｉａｌｉｓ）、例えばメルクリアリス・ペレンニス（Ｍｅｒｃｕｒｉａｌｉｓ ｐｅｒｅｎｎｉｓ）；ヒドノカルプス属（Ｈｙｄｎｏｃａｒｐｕｓ）；およびイナゴマメ属（Ｃｅｒａｔｏｎｉａ）の群から選択される植物である。
【００４０】
生体触媒の起源として適切な細菌は、具体的には、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、コリネバクテリア属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、デイノコッカス属（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ゲオバチルス属（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、クレブシェラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、ミコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）、ノボスフィンゴビウム属（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）、パラコッカス属（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ラルストニア属（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、ロードバクスター属（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、ロドシュードモナス属（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、サームス属（Ｔｈｅｒｍｕｓ）、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）およびザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）の群の中から選択することができる。
【００４１】
生体触媒の起源として適切な古細菌は、具体的には、アエロピルム属（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ）、アーケオグロブス属（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ）、ハロバクテリウム属（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、メタノバクテリウム属（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、メタノブレビバクター属（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ）、メタノカルドコッカス属（Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ）、メタノコックス属（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ）、メタノピラス属（Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ）、メタノサルシーナ属（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ）、メタノスピリラム属（Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｈａｅｒａ）、ピュロバクルム属（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ）、およびサーモプラズマ属（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ）の群の中から選択することができる。
【００４２】
生体触媒の起源として適切な菌類は、具体的には、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、リゾプス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、およびトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の群の中から選択することができる。
【００４３】
生体触媒の起源として適切な酵母は、具体的には、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、シトファギア属（Ｃｙｔｏｐｈａｇｉａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、クリベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ケカビ属（Ｍｕｃｏｒ）、リゾクトニア属（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、およびヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）の群の中から選択することができる。
【００４４】
天然に存在する生体触媒（野生型）、または本発明による方法における、適切な活性を有する、天然に存在する生体触媒の変異体を使用できることは、当業者には明らかである。天然に存在する生体触媒の特性は、例えば分子進化または合理的設計など、当業者に知られている生物学的手法によって改善することができる。例えば、当業者には知られている突然変異誘発手法（ランダム突然変異誘発、部位特異的変異誘発、定向進化、遺伝子組換え等）を使用して、生体触媒として働くことができるか、または生体触媒成分（酵素など）を生成させることができる生物のコードするＤＮＡを改変することにより、野生型生体触媒の変異体を作製することができる。具体的には、ＤＮＡを改変して、そのＤＮＡが野生型酵素と少なくとも１つのアミノ酸が異なる酵素をコードし、その結果、野生型と比較して１つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含む酵素をコードするように、または適切な（宿主）細胞にこのように改変されたＤＮＡを発現させることによって変異体が２つ以上の親酵素の配列を結合するようにできる。後者は、例えば国際公開第２００８／０００６３２号パンフレットに記載の方法に基づいて、コドン最適化またはコドンペア最適化など、当業者に知られている方法によって達成することができる。
【００４５】
変異体生体触媒は、例えば、基質選択性、活性、安定性、溶媒耐性、ｐＨ特性、温度特性、基質特性、阻害感受性、補因子利用、および基質親和性の中の１つまたは複数の点に関して改良された特性を有することができる。特性が改良された変異体は、例えば当業者に知られている方法に基づく適切なハイスループットスクリーニングまたは選択の方法を適用することによって同定することができる。
【００４６】
特定の供給源に由来する生体触媒（具体的には酵素）に言及する場合、ドナー生物に起源があるが、実際には（遺伝子改変）宿主生物中で産生される組換え生体触媒（具体的には酵素）は、その最初の生物に由来する生体触媒（具体的には酵素）として含まれることを明確に意味する。
【００４７】
本発明の枠内における、任意の生体触媒ステップに対する反応条件は、生体触媒（具体的には酵素）に対する既知の条件、本明細書において開示の情報、および場合によってはいくつかのルーチン実験に基づいて選ぶことができる。
【００４８】
使用される反応媒体のｐＨは、生体触媒がそのｐＨ条件下で活性である限り、広範囲から選ぶことができる。生体触媒および他の要因に応じて、アルカリ性、中性、または酸性の条件を使用することができる。例えば本発明の方法による酵素を発現させるために微生物を使用することがその方法に含まれる場合、ｐＨは、微生物がその意図する機能または複数機能を果たすことができるように選択する。ｐＨは、具体的には中性ｐＨ未満の４つのｐＨ単位および中性ｐＨを超える２つのｐＨ単位の範囲内、すなわち２５℃の基本的に水性の系の場合にはｐＨ３とｐＨ９との間の範囲から選択することできる。水が唯一の溶媒であるか、または水が主な溶媒（全液体を基準にして＞５０重量％、具体的には＞９０重量％）であり、存在し得る微生物が活性を保持する濃度で、例えば少量（全液体を基準にして＜５０重量％、具体的には＜１０重量％）のアルコールまたは別の溶媒が溶解（例えば炭素源として）している場合、系は水性であるとみなす。具体的には、酵母および／または菌類を使用する場合、酸性条件が好ましいことがあり、具体的にはそのｐＨを、２５℃における基本的に水性の系に基づいてｐＨ３からｐＨ８の範囲にすることができる。所望される場合には、ｐＨを、酸および／もしくは塩基を用いて調整することも、または酸および塩基を適切に組合せて緩衝することも可能である。
【００４９】
インキュベーション条件は、生体触媒が十分な活性および／または増殖を示す限り、広範囲から選ぶことができる。これには好気性条件、微好気性条件、酸素制限条件、および嫌気性条件が含まれる。
【００５０】
本明細書においては嫌気性条件は、酸素が全く存在しないか、またはその生体触媒、具体的には微生物によって実質上酸素が消費されない条件と定義され、通常この条件は５ｍｍｏｌ／ｌ・時未満、具体的には２．５ｍｍｏｌ／ｌ・時未満、または１ｍｍｏｌ／ｌ・時未満の酸素消費量に相当する。
【００５１】
好気性条件は、媒体中に無制限な増殖にとって十分なレベルの酸素を溶解し、少なくとも１０ｍｍｏｌ／ｌ・時の、より好ましくは２０ｍｍｏｌ／ｌ・時を超える、より一層好ましくは５０ｍｍｏｌ／ｌ・時を超える、最も好ましくは１００ｍｍｏｌ／ｌ・時を超える酸素消費速度を支えることができる条件である。
【００５２】
酸素制限条件は、酸素消費が気体から液体への酸素移動によって制限される条件と定義される。酸素制限条件の下限値は、嫌気性条件の上限値、すなわち通常は少なくとも１ｍｍｏｌ／ｌ・時、具体的には少なくとも２．５ｍｍｏｌ／ｌ・時、または少なくとも５ｍｍｏｌ／ｌ・時によって決まる。酸素制限条件の上限値は、好気性条件の下限値、すなわち１００ｍｍｏｌ／ｌ・時未満、５０ｍｍｏｌ／ｌ・時未満、２０ｍｍｏｌ／ｌ・時未満、または１０ｍｍｏｌ／ｌ・時未満によって決まる。
【００５３】
条件が好気性であるか、嫌気性であるか、または酸素制限であるかは、その方法を実施する条件、具体的には流入する気体流の量および組成、使用する設備の実際の混合／物質移動特性、使用する微生物の種類、および微生物密度に依存している。
【００５４】
使用する温度は、生体触媒、具体的には酵素が実質的に活性を示す限り重要ではない。一般に、温度は少なくとも０℃、具体的には少なくとも１５℃、より具体的には少なくとも２０℃とすることができる。望ましい最高温度は、生体触媒に依存する。一般に、そのような最高温度は当該技術分野で知られており、例えば市販の生体触媒の場合は製品データシートに示されているか、または普通の一般知識および本明細書中で開示する情報に基づいてルーチン的に決めることができる。温度は、通常９０℃以下、好ましくは７０℃以下、具体的には５０℃以下、またはより具体的には４０℃以下である。
【００５５】
具体的には、生体触媒反応が宿主生物の外側で行われる場合、その媒体中で十分な活性を保持する酵素が使用される場合には有機溶媒を含む反応媒体を、高濃度（例えば５０重量％を超える、または９０重量％を超える）で使用することができる。
【００５６】
好ましい実施形態では、本発明は、ＤＡＢのＮ−保護前駆体としてＮ５−保護オルニチンを生成させる生体触媒プロセスに関する。例えば、Ｎ５−アセチルオルニチンの調製は、次の酵素触媒反応の１つまたは複数を含むことができる。
１）グルタメートからＮ−アセチル−グルタメート
２）Ｎ−アセチル−グルタメートからＮ−アセチル−グルタメート５−ホスフェート
３）Ｎ−アセチル−グルタメート５−ホスフェートからＮ−アセチル−グルタメートセミアルデヒド
４）Ｎ−アセチル−グルタメートセミアルデヒドからＮ２−アセチル−オルニチン
５）Ｎ２−アセチル−オルニチンからＮ５−アセチル−オルニチン
【００５７】
反応１）は、アシルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．３．１）の群から、好ましくはアミノ酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．３．１．１）の群から選択される酵素によって触媒することができる。この酵素はアセチル基ドナーとしてのアセチルＣｏＡに、アセチル基アクセプターとしてのグルタメートに特異的であることが好ましい。アミノ酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼは原核生物由来でも、または真核生物由来でもよい。反応１）を触媒することができる代表的なタンパク質を、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース中のその受託番号およびその（微）生物源と共に表１に示す。
【００５８】
反応２）は、アセチル−グルタメートキナーゼ（ＥＣ ２．７．２．８）の群から選択される酵素によって触媒することができる。この酵素は補因子としてＡＴＰを使用することができる。アセチル−グルタメートキナーゼは原核生物由来でも、または真核生物由来でもよい。反応２）を触媒することができる代表的なタンパク質を、Ｕｎｉｐｒｏｔ中のその受託番号およびその（微）生物源と共に表１に示す。
【００５９】
反応３）は、オキシドレダクターゼ（ＥＣ １．２．１）の群から、好ましくはＮ−アセチル−γ−グルタミル−ホスフェートレダクターゼ（ＥＣ １．２．１．３８）の群から選択される酵素によって触媒することができる。この酵素は補因子としてＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを使用することができる。Ｎ−アセチル−γ−グルタミル−ホスフェートレダクターゼは原核生物由来でも、または真核生物由来でもよい。反応３）を触媒することができる代表的なタンパク質を、Ｕｎｉｐｒｏｔ中のその受託番号およびその（微）生物源と共に表１に示す。
【００６０】
反応４）は、トランスアミナーゼ（ＥＣ ２．６．１）の群から、好ましくはアセチルオルニチントランスアミナーゼ（ＥＣ ２．６．１．１１）の群から選択される酵素によって触媒することができる。この酵素はアミノ基ドナーとしてグルタメートを使用することができる。アセチルオルニチントランスアミナーゼは原核生物由来でも、または真核生物由来でもよい。反応４）を触媒することができる代表的なタンパク質を、Ｕｎｉｐｒｏｔ中のその受託番号およびその（微）生物源と共に表１に示す。
【００６１】
反応５）は、グルタメートＮ−アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．３．１．３５）などのＮ−アシルトランスフェラーゼによって触媒することができる。
【００６２】
グルタメートは当技術分野でよく知られているグルタメート生合成反応を介して適切な炭素源から得ることができる。大量のグルタミン酸を蓄積する微生物、例えばコリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）を使用することが好ましい。グルタミン酸産生を、例えば遺伝子工学によって改善する方法は、当技術分野でよく知られている（Ｋｉｍｕｒａ Ｅ．、Ａｄｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｅｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００３；７９：３７〜５７）。
【００６３】
代替的に、Ｎ５−アセチルオルニチンの調製は、次の酵素触媒反応の１つまたは複数を含むことができる。
６）グルタメートからＮ−アセチル−グルタメート
７）Ｎ−アセチル−グルタメートおよびオルニチンからＮ２−アセチル−オルニチン
８）Ｎ２−アセチル−オルニチンからＮ５−アセチル−オルニチン
【００６４】
【表１】
【００６５】
反応６）は、反応１）と同一であり、同型の酵素によって触媒することができる。
【００６６】
反応７）は、アシルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．３．１）の群から、好ましくはグルタメートＮ−アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．３．１．３５）から選択される酵素によって触媒することができる。この酵素がアセチル基アクセプターとしてオルニチンを使用し、それによって、反応生成物としてグルタメートおよびＮ−アセチル−オルニチンを生成することが好ましい。グルタメートＮ−アセチルトランスフェラーゼは、Ｎ−アセチル−グルタメートに対して加水分解活性を有し、加水分解生成物としてグルタメートおよびアセテートを生成する可能性がある。使用する酵素は検出可能な加水分解活性を有しないことが好ましい。代替的に、加水分解活性が野生型酵素と比較して実質的に低下するように野生型酵素を改変することができる。グルタメートＮ−アセチルトランスフェラーゼは、原核生物由来でも、または真核生物由来でもよい。反応７）を触媒することができる代表的なタンパク質を、Ｕｎｉｐｒｏｔ中のその受託番号およびその（微）生物源と共に表１に示す。
【００６７】
反応８）は反応５と同一であり、同じ酵素によって触媒することができる。
【００６８】
さらに好ましい実施形態では、本発明は、Ｎ−保護ＤＡＢがＮ５−保護オルニチンから生成される生体触媒プロセスに関する。一般に、適切なデカルボキシラーゼは、Ｎ５−保護オルニチンのＮ−保護ＤＡＢへの変換を触媒することができるＮ５−保護オルニチンデカルボキシラーゼ活性を有する。
【００６９】
Ｎ５−保護オルニチンを脱炭酸できる酵素は、具体的には、デカルボキシラーゼ（ＥＣ．４．１．１）の群から、好ましくはオルニチンデカルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１．１７）、ジアミノピメレートデカルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１．２０）、分岐鎖α−ケト酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１．７２）、α−ケトイソバレレートデカルボキシラーゼ、α−ケトグルタレートデカルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１．７１）の群から選択することができる。
【００７０】
１つまたは複数の他の適切なデカルボキシラーゼは、オキサレートデカルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１．２）、アセトアセテートデカルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１．４）、バリンデカルボキシラーゼ／ロイシンデカルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１．１４）、アスパルテート１−デカルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１．１１）、３−ヒドロキシグルタメートデカルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１．１６）、リジンデカルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１．１８）、アルギニンデカルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１．１９）、２−オキソグルタレートデカルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１．７１）、およびジアミノブチレートデカルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１．８６）の群の中から選択することができる。
【００７１】
デカルボキシラーゼは、具体的には、カボチャ；キュウリ；酵母；菌類、例えば、カンジダ・フラレリ（Ｃａｎｄｉｄａ ｆｌａｒｅｒｉ）、ハンゼヌラ種（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｓｐ．）、クリベロミセス・マルキシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、ニューロスポア・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、リゾプス・ジャバニクス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｊａｖａｎｉｃｕｓ）、およびサッカロミセス・セレビシア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）；哺乳類、具体的には哺乳類脳由来；およびバチルス・カダベリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｄａｖｅｒｉｓ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、シュードモナス種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、およびザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）などの細菌の群から選択される生物のデカルボキシラーゼとすることができる。
【００７２】
さらに好ましい実施形態では、本発明は、Ｎ−保護ＤＡＢがＮ−保護４−アミノブチルアルデヒドを介して生成される生体触媒プロセスに関する。例えば、Ｎ−アセチル−ＤＡＢの調製は、次の酵素触媒反応の１つまたは複数を含むことができる。
９）グルタメートから４−アミノブチレート
１０）４−アミノブチレートからＮ−アセチル−４−アミノブチレート
１１）Ｎ−アセチル−４−アミノブチレートからＮ−アセチル−４−アミノブチルアルデヒド
１２）Ｎ−アセチル−４−アミノブチルアルデヒドからＮ−アセチル−ＤＡＢ
【００７３】
反応９）は、デカルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１）の群から、好ましくはグルタメートデカルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１．１５）の群から選択される酵素によって触媒することができる。グルタメートデカルボキシラーゼは原核生物由来でも、または真核生物由来でも、または古細菌由来でもよい。
【００７４】
反応１０）は、アシルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．３．１）の群から、好ましくはアミノ酸Ｎ―アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．３．１．１）、グリシンＮ−アシルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．３．１．１３）、アスパルテートＮ―アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．３．１．１７）、グルタメートＮ−アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．３．１．３５）、Ｄ−アミノ酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．３．１．３６）、およびジアミンＮ−アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．３．１．５７）の群から選択される酵素によって触媒することができる。使用する酵素は、基質である４−アミノブチレートに対して選択的であることが好ましい。野生型酵素は、アミノ基アクセプターとしての４−アミノブチレートに対して低い活性／選択性を有している可能性がある。このような野生型酵素は、４−アミノブチレートに対する活性／選択性が野生型酵素と比較して実質的に高くなるように改変することができる。使用する酵素は、アセチル基ドナーとしてアセチルＣｏＡを使用することができる。代替的に、この酵素は、アセチル基ドナーとしてＮ−アセチル−グルタメートなどのＮ−アセチル化アミノ酸を使用することもできる。この酵素は、原核生物由来でも、または真核生物由来でも、または古細菌由来でもよい。
【００７５】
代替的に、次の酵素触媒反応によって、Ｎ−アセチル−４−アミノブチレートをＮ−アセチル−４−アミノブチルアルデヒドに変換することができる。
１１ａ）Ｎ−アセチル−４−アミノブチレートからＮ−アセチル−４−アミノブチレートホスフェート
１１ｂ）Ｎ−アセチル−４−アミノブチレートホスフェートからＮ−アセチル−４−アミノブチルアルデヒド
【００７６】
反応１１ａ）は、ホスホトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．７．２）の群から、好ましくはアセテートキナーゼ（ＥＣ ２．７．２．１）、アスパルテートキナーゼ（ＥＣ ２．７．２．４）、ブチレートキナーゼ（ＥＣ ２．７．２．７）、アセチルグルタメートキナーゼ（２．７．２．８）、およびグルタメート５−キナーゼ（２．７．２．１１）の群から選択される酵素によって触媒することができる。
【００７７】
反応１１ｂ）は、オキシドレダクターゼ（ＥＣ １．２．１）の群から、好ましくはＮ−アセチル−γ−グルタミルホスフェートレダクターゼ（ＥＣ １．２．１．３８）の群から選択される酵素によって触媒することができる。
【００７８】
反応ステップ９）から１１）を触媒することができる代表的なタンパク質を、Ｕｎｉｐｒｏｔ中のその受託番号およびその（微）生物源と共に表２に示す。
【００７９】
【表２】
【００８０】
反応１２）は、Ｎ−保護ＤＡＢがＮ−保護４−アミノブチルアルデヒドから生成される生体触媒プロセスに関する。
【００８１】
一般に、適切なアミノトランスフェラーゼは、Ｎ−保護４−アミノブチルアルデヒドのＮ−保護ＤＡＢへの変換を触媒することができるＮ−保護４−アミノブチルアルデヒドアミノトランスフェラーゼ活性を有する。
【００８２】
アミノトランスフェラーゼは、具体的には、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ、ω−アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６．１）、クラスＩＩＩ―アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６．１）、４−アミノ−ブチレートアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６．１．１９）、Ｌ―リジン６−アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６．１．３６）、５−アミノバレレートアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６．１．４８）、リジン：ピルベート６−アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６．１．７１）、およびプトレッシン−アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６．１．８２）の群の中から選択することができる。
【００８３】
一実施形態では、アミノトランスフェラーゼは、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６．１．２）、ロイシンアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６．１．６）、アラニン−オキソ酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６．１．１２）、β−アラニン−ピルベートアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６．１．１８）、（Ｓ）−３−アミノ−２−メチルプロピオネートアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６．１．２２）、Ｌ，Ｌ−ジアミノピメレートアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６．１．８３）の群の中から選択することができる。
【００８４】
アミノトランスフェラーゼは、具体的には、哺乳類、植物、または微生物に由来するアミノトランスフェラーゼの中から選択することができる。より具体的には、アミノトランスフェラーゼは、アスプレニウム属（Ａｓｐｌｅｎｉｕｍ）、より具体的にはアスプレニウム・ユニラテラーレ（Ａｓｐｌｅｎｉｕｍ ｕｎｉｌａｔｅｒａｌｅ）またはアスプレニウム・セプテントリオナーレ（Ａｓｐｌｅｎｉｕｍ ｓｅｐｔｅｎｔｒｉｏｎａｌｅ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、具体的にはバチルス・ウェイヘンステファネンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）およびバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、セラトニア属、より具体的にはセラトニア・シリクア（Ｃｅｒａｔｏｎｉａ ｓｉｌｉｑｕａ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、より具体的にはＥ．カロトボラ（Ｅ．ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、より具体的にはＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、メルクリアリス属（Ｍｅｒｃｕｒｉａｌｉｓ）、具体的にはメルクリアリス・ペレンニス（Ｍｅｒｃｕｒｉａｌｉｓ ｐｅｒｅｎｎｉｓ）、より具体的にはメルクリアリス・ペレンニス（Ｍｅｒｃｕｒｉａｌｉｓ ｐｅｒｅｎｎｉｓ）の苗条、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、具体的にはシュードモナス・エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、ロドバクター属（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、具体的にはロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、ロドシュードモナス属（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、より具体的にはＳ．チフィ（Ｓ．ｔｙｐｈｉ）、Ｓ．パラチフィ（Ｓ．ｐａｒａｔｙｐｈｉ）、シゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、より具体的にはＳｈ．ボイディ（Ｓｈ．ｂｏｙｄｉｉ）、Ｓｈ．フレクスネリ（Ｓｈ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、Ｓ．ソネイ（Ｓ．ｓｏｎｎｅｉ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、具体的にはスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）、具体的にはビブリオ・フルビアリス（Ｖｉｂｒｉｏ ｆｌｕｖｉａｌｉｓ）、または酵母、具体的にはサッカロミセス・セレビシア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に由来することができる。
【００８５】
この酵素が哺乳類の酵素である場合、具体的には、哺乳類の腎臓、哺乳類の肝臓、哺乳類の心臓、または哺乳類の脳に由来することができる。例えば、適切な酵素は、哺乳類の肝臓由来の４−アミノ−ブチレートアミノトランスフェラーゼ、具体的にはブタ肝臓由来の４−アミノ−ブチレートアミノトランスフェラーゼ；哺乳類の脳由来の４−アミノブチレートアミノトランスフェラーゼ、具体的にはヒト、ブタ、またはラットの脳由来の４−アミノブチレートアミノトランスフェラーゼ；ビブリオ・フルビアリス（Ｖｉｂｒｉｏ ｆｌｕｖａｉｌｉｓ）のω−アミノトランスフェラーゼ、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来の４−アミノ−ブチレートアミノトランスフェラーゼ、およびクロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）由来、具体的にはクロストリジウム・アミノワレリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｕ ａｍｉｎｏｖａｌｅｒｉｃｕｍ）由来の５−アミノバレレートアミノトランスフェラーゼの群の中から選択することができる。
【００８６】
具体的には、アミノドナーは、アンモニア、アンモニウムイオン、アミン、およびアミノ酸の群から選択することができる。適切なアミンは、第一級アミンおよび第二級アミンである。アミノ酸は、Ｄ−立体配置であっても、またはＬ−立体配置であってもよい。アミノドナーの例は、アラニン、グルタメート、イソプロピルアミン、２−アミノブタン、２−アミノヘプタン、フェニルメタンアミン、１−フェニル−１−アミノエタン、グルタミン、チロシン、フェニルアラニン、アスパルテート、α−アミノイソブチラート、β−アラニン、４−アミノブチレート、およびα−アミノアジペートである。
【００８７】
さらに好ましい実施形態では、Ｎ−保護ＤＡＢを調製する方法は、ドナーのＣＨ−ＮＨ２基に作用するオキシドレダクターゼ（ＥＣ １．４）の群から、具体的にはアミノ酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ．１．４．１）の群から選択される、アンモニア源の存在下における還元的アミノ化反応を触媒することができる酵素の存在下における生体触媒反応を含む。一般には、適切なアミノ酸デヒドロゲナーゼは、Ｎ−保護４−アミノブチルアルデヒドのＮ−保護ＤＡＢへの変換を触媒する６−アミノカプロン酸６−デヒドロゲナーゼ活性を有する。具体的には、適切なアミノ酸デヒドロゲナーゼは、ジアミノピメレートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．４．１．１６）、リジン６−デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．４．１．１８）、グルタメートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．４．１．３； ＥＣ １．４．１．４）、およびロイシンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．４．１．９）の群の中から選択することができる。
【００８８】
一実施形態では、アミノ酸デヒドロゲナーゼは、ＮＡＤまたはＮＡＤＰをアクセプターとして作用するグルタメートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．４．１．３）、ＮＡＤＰをアクセプターとして作用するグルタメートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．４．１．４）、ロイシンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．４．１．９）、ジアミノピメレートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．４．１．１６）、およびリジン６−デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．４．１．１８）として分類されるアミノ酸デヒドロゲナーゼの中から選択することができる。
【００８９】
アミノ酸デヒドロゲナーゼは、具体的には、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、具体的にはコリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）；プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、具体的にはプロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）；アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、具体的にはアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）；ゲオバチルス属（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、具体的にはゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）；アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、具体的には アシネトバクター種ＡＤＰ１（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＡＤＰ１）；ラルストニア属（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、具体的にはラルストニア・ソラナセラム（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）；サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、具体的にはサルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）；サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、具体的にはサッカロミセス・セレビシア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）；ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、具体的にはブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）；およびバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、具体的にはバチルス・スファエリクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、またはバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の群から選択される生物に由来することができる。例えば、適切なアミノ酸デヒドロゲナーゼは、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、具体的にはバチルス・スファエリクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）由来のジアミノピメレートデヒドロゲナーゼ；ブレビバクテリウム種（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）由来のジアミノピメレートデヒドロゲナーゼ；コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）由来のジアミノピメレートデヒドロゲナーゼ、具体的にはコリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）由来のジアミノピメレートデヒドロゲナーゼ；プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）由来のジアミノピメレートデヒドロゲナーゼ、具体的にはプロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）由来のジアミノピメレートデヒドロゲナーゼ；アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、具体的にはアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）由来のリジン６−デヒドロゲナーゼ、ゲオバチルス属（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、具体的にはゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のリジン６−デヒドロゲナーゼ；ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを補因子として作用する、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）由来のグルタメートデヒドロゲナーゼ、具体的にはアシネトバクター種ＡＤＰ１（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＡＤＰ１）由来のグルタメートデヒドロゲナーゼ；ラルストニア属（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）由来のグルタメートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．４．１．３）、具体的にはラルストニア・ソラナセラム（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）由来のグルタメートデヒドロゲナーゼ；ＮＡＤＰＨを補因子として作用する、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）由来のグルタメートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．４．１．４）、具体的にはサルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）由来のグルタメートデヒドロゲナーゼ；サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）由来のグルタメートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．４．１．４）、具体的にはサッカロミセス・セレビシア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のグルタメートデヒドロゲナーゼ；ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）由来のグルタメートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．４．１．４）、具体的にはブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）由来のグルタメートデヒドロゲナーゼ；およびバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来のロイシンデヒドロゲナーゼ、具体的にはバチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）またはバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のロイシンデヒドロゲナーゼの中から選択することができる。
【００９０】
生体触媒酵素は、任意の形態で使用することができる。例えば、生体触媒酵素は、―例えば分散液、エマルジョン、溶液の形態、または固定された形態（例えば、支持体、例えば粒状または一体化した担体物質上にロードされた）で、−粗酵素として、市販の酵素として、市販の調製物からさらに精製された酵素として、知られている精製法を組合せてその供給源から得られた酵素として、天然にまたは遺伝子改変を介して加水分解活性を有する細胞全体（場合によっては透過性にしかつ／または固定化した）で、またはそのような活性を有する細胞の溶解物で使用することができる。
【００９１】
生体触媒酵素は、任意の生物、具体的には動物、植物、細菌、カビ、酵母、または菌類から得ることまたは引き出すことができる。
【００９２】
本発明によるプロセスにおいて、生体触媒活性を有する、天然に存在する（野生型）酵素の変異体も使用することができることは、当業者にとって明らかである。野生型酵素の変異体は、例えば、ＤＮＡが野生型酵素とは少なくとも１つのアミノ酸が異なる酵素をコードするように、または野生型に比較して短い酵素をコードするように、当業者に知られている突然変異誘発手法（ランダム突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発、定向進化、遺伝子シャフリングなど）を使用して、野生型酵素をコードするＤＮＡを改変し、適切な（宿主）細胞において、このように改変されたＤＮＡを発現させることによって作製することができる。生体触媒酵素の変異体は、例えば、基質選択性、活性、安定性、溶媒耐性、ｐＨ特性、温度特性、基質特性の中の１つまたは複数の点に関して改良された特性を有することができる。
【００９３】
特定の供給源に由来する酵素に言及する場合、第１の生物に起源があるが、実際には（遺伝子改変された）第２の生物の中で産生される組換え酵素は、第１の生物に由来する酵素として含まれることを明確に意味する。
【００９４】
本発明の方法において１つまたはいくつかの反応ステップを触媒する１つまたは複数の酵素を含む細胞、具体的には組換え細胞は、それ自体当技術分野で知られている分子生物学的手法を使用して構築することができる（Ｍａｎｉａｔｉｓら １９８２「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ」．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．； Ｍｉｌｌｅｒ １９７２「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ； ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ ２００１「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ」 （第３版）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ； Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、「Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９８７）。例えば、１つまたは複数の生体触媒を組換え細胞（異種系である場合もある）の中で産生させようとする場合、１つまたは複数の前記生体触媒をコードする１つまたは複数の遺伝子を含むベクター（組換えベクターなど）を用意するために、このような手法を使用することができる。それぞれが１つまたは複数のこのような遺伝子を含む１つまたは複数のベクターを使用することができる。このようなベクターは、１つまたは複数の調節エレメント、例えば生体触媒をコードする遺伝子に作動可能に結合し得る１つまたは複数のプロモーターを含むことができる。
【００９５】
本明細書において使用する用語「作動可能に結合した」とは、機能的な関係におけるポリヌクレオチドエレメント（またはコード配列もしくは核酸配列）の結合を指す。核酸配列は、それが別の核酸配列と機能的な関係に配置されている場合、「作動可能に結合して」いる。例えばプロモーターまたはエンハンサーがコード配列の転写に影響を及ぼす場合、それはコード配列と作動可能に結合している。
【００９６】
本明細書において使用する用語「プロモーター」とは、遺伝子の転写開始部位の転写の方向に関して上流に位置して１つまたは複数の遺伝子の転写を制御するように機能し、かつＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに対する結合部位と、転写開始部位と、これらには限定されないが転写因子結合部位、リプレッサーおよびアクチベータータンパク質結合部位、およびプロモーター由来の転写の量を調節するように直接的または間接的に働くことが当業者に知られている任意の他のヌクレオチド配列を含む任意の他のＤＮＡ配列との存在によって構造的に同定される核酸フラグメントを指す。「構成的」プロモーターとは、ほとんどの環境および発生の条件下で活性なプロモーターである。「誘導性」プロモーターとは、環境および発生の調節下で活性なプロモーターである。所与の（組換え）核酸またはポリペプチド分子と所与の宿主生物または宿主細胞との間の関係を示すために使用する場合、用語「同種」とは、自然界ではその核酸またはポリペプチド分子が、同じ種の、好ましくは同じ品種または株の宿主細胞または生物によって産生されることを意味するものと理解される。
【００９７】
本明細書において上述したような本発明の方法で使用する酵素、具体的にはアミノトランスフェラーゼ、アミノ酸デヒドロゲナーゼ、またはデカルボキシラーゼをコードする核酸配列の発現を達成するために使用することができるプロモーターは、その発現される酵素をコードする核酸配列にとって本来のものであってもよく、またそれが作動可能に結合している核酸配列（コード配列）にとって異種であってもよい。プロモーターは、その宿主細胞と同種、すなわち内因性であることが好ましい。
【００９８】
異種プロモーター（目的酵素をコードする核酸配列にとって）を使用する場合、この異種プロモーターは、そのコード配列にとって本来のものであるプロモーターより、高い定常状態レベルでそのコード配列を含む転写産物を産生することができる（または、単位時間当たり、より多くの転写分子すなわちｍＲＮＡ分子を産生することができる）ことが好ましい。本発明の枠内で適切なプロモーターには、構成的および誘導性の両方の天然プロモーターならびに人工プロモーターが挙げられ、これらは当業者にはよく知られている。
【００９９】
「強力な構成的プロモーター」とは、天然の宿主細胞に比べて、ｍＲＮＡを高頻度で開始させるプロモーターである。グラム陽性微生物におけるこのような強力な構成的プロモーターの例としては、ＳＰ０１−２６、ＳＰ０１−１５、ｖｅｇ、ｐｙｃ（ピルベートカルボキシラーゼプロモーター）、およびａｍｙＥが挙げられる。
【０１００】
グラム陽性微生物における誘導性プロモーターの例としては、ＩＰＴＧ誘導性Ｐｓｐａｃプロモーター、キシロース誘導性ＰｘｙｌＡプロモーターが挙げられる。
【０１０１】
グラム陰性微生物における構成的および誘導性プロモーターの例としては、これらに限定されないが、ｔａｃ、ｔｅｔ、ｔｒｐ−ｔｅｔ、ｌｐｐ、ｌａｃ、ｌｐｐ−ｌａｃ、ｌａｃｌｑ、Ｔ７、Ｔ５、Ｔ３、ｇａｌ、ｔｒｃ、ａｒａ（ＰＢＡＤ）、ＳＰ６、λ−ＰＲ、およびλ−ＰＬが挙げられる。
【０１０２】
（糸状の）菌類細胞のプロモーターは当技術分野で知られており、例えばグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼｇｐｄＡプロモーター、ｐｅｐＡ、ｐｅｐＢ、ｐｅｐＣなどのプロテアーゼプロモーター、グルコアミラーゼｇｌａＡプロモーター、アミラーゼａｍｙＡ、ａｍｙＢプロモーター、カタラーゼｃａｔＲまたはｃａｔＡプロモーター、グルコースオキシダーゼｇｏｘＣプロモーター、β−ガラクトシダーゼｌａｃＡプロモーター、α−グルコシダーゼａｇｌＡプロモーター、翻訳伸長因子ｔｅｆＡプロモーター、ｘｌｎＡ、ｘｌｎＢ、ｘｌｎＣ、ｘｌｎＤなどのキシラナーゼプロモーター、ｅｇｌＡ、ｅｇｌＢ、ｃｂｈＡなどのセルラーゼプロモーター、ａｒｅＡ、ｃｒｅＡ、ｘｌｎＲ、ｐａｃＣ、ｐｒｆＴなどの転写調節因子のプロモーター、または別のプロモーターであってもよく、ＮＣＢＩウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／）で容易に見つけることができる。
【０１０３】
用語「異種」とは、核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）またはタンパク質に関して使用する場合、それが存在する生物、細胞、ゲノム、またはＤＮＡもしくはＲＮＡ配列の一部としては天然に存在しない核酸またはタンパク質を指すか、あるいはそれが自然界に見出されるものとは異なる細胞の中に、またはゲノムまたはＤＮＡもしくはＲＮＡ配列の中の部位または複数部位の中に見出される核酸またはタンパク質を指す。これら異種の核酸またはタンパク質は、それが導入される細胞にとって内因性のものではないが、別の細胞から得られたか、または合成もしくは組換えにより生成されたものである。必ずしもそうとは限らないが、一般にそのような核酸は、そのＤＮＡが転写または発現される細胞によって通常は産生されないタンパク質をコードする。同様に外因性ＲＮＡは、その外因性ＲＮＡが存在する細胞中で通常は発現されないタンパク質をコードする。これら異種の核酸およびタンパク質はまた、外来の核酸およびタンパク質と呼ぶこともできる。それを発現させる細胞にとって異種または外来であると当業者が認識する任意の核酸またはタンパク質は、異種の核酸およびタンパク質という用語によって本明細書に包含される。
【０１０４】
本発明による方法は、新規であり得る宿主生物で行うことができる。
【０１０５】
したがって本発明はまた、本発明の方法において少なくとも１つの反応ステップを触媒することができる１つまたは複数の酵素を含む宿主細胞に関する。
【０１０６】
特定の実施形態では、本発明による宿主細胞は、アミノ基転移反応もしくはＮ−保護グルタメートセミアルデヒドからＮ２−保護オルニチンを形成するための還元的アミノ化反応を触媒することができる酵素をコードするか、またはＮ５−保護オルニチンからＮ２−保護オルニチンを形成するためのＮ−アシルトランスフェラーゼ反応を触媒することができる酵素をコードするか、またはＮ−保護４−アミノブチルアルデヒドからＮ−保護ＤＡＢを形成するためのアミノトランスフェラーゼ反応を触媒することができる酵素をコードする核酸配列を含む組換え細胞である。前記配列は、ベクターの一部である場合も、または染色体ＤＮＡに挿入されている場合もある。
【０１０７】
［ＤＡＢのＮ−保護前駆体の回収］
Ｎ−保護前駆体のＤＡＢへの変換の前に、Ｎ−保護前駆体は生体触媒反応混合物から回収することになる。
【０１０８】
生体触媒反応混合物からのＮ−保護前駆体の回収は、生体触媒反応混合物から類似の化学成分を回収するための当技術分野で知られている方法によって行うことができる。具体的には、発酵生産プロセスにおけるこのような回収プロセスは、細胞分離（細胞を除くための濾過、膜分離（ＭＦ）、沈降（重力および遠心力など）、結晶化）からなる群から選択される少なくとも１つのステップを含むことができる。経済的に有利な精製には、Ｎ−保護前駆体のさらなる濃縮および精製が必要とされることがある。さらなる濃縮については、蒸発および膜分離（ＲＯ、ＮＦ、およびＵＦ）のような手法を適用することができる。また、（共晶）凍結濃縮のような手法も使用することができる。
【０１０９】
さらなる単離には、イオン交換（クロマトグラフィー）または結晶化／沈殿のいずれかが必要になるかもしれない。
【０１１０】
このプロセスでは、必ずしもＮ−保護前駆体を綿密に精製することはないが、Ｎ−保護前駆体は少なくとも、その後のＮ−保護前駆体のＤＡＢへの変換が混入物および生体触媒反応混合物に由来する副産物によって実質的に妨げられことがない程度に精製されるべきである。場合によっては、Ｎ−保護前駆体を濃縮してもよい。
【０１１１】
さらに、Ｎ−保護前駆体は、少なくとも１つの次の変換ステップに対して最適化されている媒体に移すことができる。
【０１１２】
［ＤＡＢのＮ−保護前駆体のＤＡＢへの変換］
本発明による、Ｎ−保護前駆体のＤＡＢへの直接的または間接的変換には、少なくとも１つの生体触媒（具体的には酵素）的変換ステップまたは化学的変換ステップを含むことができる。さらに、その変換には生体触媒的変換ステップと化学的変換ステップとの組合せも含むことができる。
【０１１３】
例えば、生体触媒により生成されたＮ−保護ＤＡＢの無保護ＤＡＢへの変換は、生体触媒的または化学的加水分解プロセスによって行なうことができる。生体触媒プロセスについては、適切な加水分解酵素を使用することができる。本発明の有利な方法では、脱アシル化が生体触媒的に行われる。具体的には、Ｎ−Ａｃ−ＤＡＢの脱アシル化を触媒することができる、より具体的にはＮ−アセチル−ＤＡＢの脱アセチルを触媒することができる加水分解酵素を使用することができる。
【０１１４】
Ｎ−アセチル−ＤＡＢが化学的または生体触媒的加水分解によってＤＡＢに変換される場合、一般にＤＡＢとアセテートの両方が形成される。ＤＡＢの回収後、アセテート含有部分をこのプロセスで再使用することが好ましい。発酵プロセスの場合には、発酵プロセスにおいて、微生物を増殖させるための炭素源として、またはＮ−保護ＤＡＢもしくはＮ−保護ＤＡＢに変換され得る化合物を生成させるための炭素源としてアセテートを再使用することができる。
【０１１５】
用語「加水分解酵素」は、本明細書においては分類群Ｅ．Ｃ．３由来の酵素に対して使用される。１つまたは複数の加水分解酵素が、カルボン酸エステルヒドロラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１）、チオールエステルヒドロラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．２）、およびペプチダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．４）の群から選択されて使用されることが好ましい。
【０１１６】
具体的には、ペプチダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．４）を使用することができる。好ましいペプチダーゼは、セリン型カルボキシペプチダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．４．１６）、金属カルボキシペプチダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．４．１７）、システイン型カルボキシペプチダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．４．１８）、セリンエンドペプチダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．４．２１）、システインエンドペプチダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．４．２２）、アスパラギン酸エンドペプチダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．４．２３）、および金属エンドペプチダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．４．２４）の群から、具体的にはセリンエンドペプチダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．４．２１）から選択されるペプチダーゼである。具体的には、セリンエンドペプチダーゼ、好ましくはサブチリシンカールスバーグなどのサブチリシン（Ｅ．Ｃ．３．４．２１．６２）を用いて好結果が得られた。
【０１１７】
加水分解酵素が由来し得る生物の例としては、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）由来などのトリコデルマ種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐ，）；リゾプス・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）由来などのリゾプス種（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐ．）；バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・クラウジイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・レンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・アルカロフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・ハロデュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）由来などのバチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）；アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）またはアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）由来などのアスペルギルス種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、カスピトサス・ストレプトミセス（ｃａｅｓｐｉｔｏｓｕｓ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）またはストレプトミセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）由来などのストレプトミセス種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）；カンジダ種（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐ．）；菌類；フミコラ種（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｓｐ．）；リゾクトニア種（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｐ．）；シトファギア（Ｃｙｔｏｐｈａｇｉａ）；ムコール種（Ｍｕｃｏｒ ｓｐ．）；および動物組織、具体的にはブタ膵臓、ウシ膵臓、またはヒツジ膵臓由来などの膵臓由来が挙げられる。
【０１１８】
上述のように、好ましい酵素はサブチリシンである。様々なサブチリシンが当技術分野で知られており、例えば米国特許第５，３１６，９３５号明細書およびそこに引用の文献を参照されたい。サブチリシンＡはノボザイムズ社（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）が市販するサブチリシンである。具体的には、サブチリシンカールスバーグが好ましい。アルカラーゼ（Ａｌｃａｌａｓｅ）（登録商標）は、本発明の方法で使用するのに特に適していることがわかっている。この製品はノボザイムズ社（バウスヴェア、デンマーク（Ｂａｇｓｖａｅｒｄ、Ｄｅｎｍａｒｋ））から入手可能である。アルカラーゼ（登録商標）は安価であり、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）によって産生される、工業的に利用可能なタンパク質分解酵素混合物（主要な酵素成分としてサブチリシンカールスバーグを含有する）である。精製されたサブチリシンによる実験によって、サブチリシンがエステル転移反応、活性化、およびペプチド結合形成を触媒することが確認された。
【０１１９】
デンマーク国バウスヴェアのノボザイムズ社は、オボザイム（ｏｖｏｚｙｍｅ）、リカナーゼ（ｌｉｑｕａｎａｓｅ）、アルカナーゼ（登録商標）、アルカナーゼウルトラ（Ａｌｃａｌａｓｅ−ｕｌｔｒａ）（登録商標）（特に、アルカリ性ｐＨで効果的）、デュラミル（ｄｕｒａｍｙｌ）、エスペラーゼ（ｅｓｐｅｒａｓｅ）、カンナーゼ（ｋａｎｎａｓｅ）、サビナーゼ（ｓａｖｉｎａｓｅ）、サビナーゼウルトラ（ｓａｖｉｎａｓｅ ｕｌｔｒａ）、ターマミル（ｔｅｒｍａｍｙｌ）、ターマミルウルトラ（ｔｅｒｍａｍｙｌ ｕｌｔｒａ）、ノボベート（ｎｏｖｏｂａｔｅ）、ポラザイム（ｐｏｌａｒｚｙｍｅ）、ニュートラーゼ（ｎｅｕｔｒａｓｅ）、ノボリン（ｎｏｖｏｌｉｎｅ）、ピラーゼ（ｐｙｒａｓｅ）、ノボコル（ｎｏｖｏｃｏｒ）（細菌アルカリ性プロテアーゼ）を提供する。
【０１２０】
プロテイナーゼＫは、米国マサチューセッツ州イプスウィッチのニューイングランド・バイオラボ社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、（Ｉｐｓｗｉｃｈ ＭＡ，ＵＳＡ））から入手可能である。
【０１２１】
米国ノースカロライナ州フランクリントンのノボ・ノルディスク・バイオケム・ノース・アメリカ社（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ Ｉｎｃ（Ｆｒａｎｋｌｉｎｔｏｎ ＮＣ，ＵＳＡ）は、バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）プロテアーゼ（エスペラーゼ６．０Ｔ；サビナーゼ６．０Ｔ）、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）プロテアーゼ（ニュートラーゼ１．５ＭＧ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）プロテアーゼ（アルカラーゼ３．０Ｔ）を提供する。
【０１２２】
米国バージニア州トロイのアマノ・インターナショナル・エンザイム社（Ａｍａｎｏ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｎｚｙｍｅ Ｃｏ（Ｔｒｏｙ，Ｖａ，ＵＳＡ））は、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）プロテアーゼ（プロレザー；プロテアーゼＮ（Ｐｒｏｌｅａｔｈｅｒ；Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｎ））およびアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）プロテアーゼ（プロザイム６（Ｐｒｏｚｙｍｅ ６））を提供する。
【０１２３】
この種の適切な酵素としては、例えばリゾプス・ジャポニカス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）リパーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）のリパーゼＡＰ−６、アルカリゲネス種（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｓｐ．）のリパーゼＱＬ、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）のプロテアーゼＢ（配列番号１９）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のデルボラーゼ（Ｄｅｌｖｏｌａｓｅ）（配列番号２０）、リゾプス・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）リパーゼ、エスペラーゼ、アルカラーゼ、アスペルギルス種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ）アシラーゼ、プロザイム（Ｐｒｐｚｙｍｅ）、プロテアーゼＭ（Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｍ）、プロテアーゼＮが挙げられる。加水分解酵素は、エステル結合に作用する加水分解酵素（リパーゼ、エステラーゼ）（ＥＣ ３．１）、ペプチド結合に作用するペプチドヒドロラーゼ（ペプチダーゼ、プロテイナーゼ）（ＥＣ ３．４）、およびペプチド結合以外のＣ−Ｎ結合に作用する加水分解酵素（ＥＣ ３．５）の群から選択されることが好ましい。
【０１２４】
具体的には、ペプチド結合以外のＣ−Ｎ結合に作用する加水分解酵素は、カルボン酸エステルヒドロラーゼ（ＥＣ ３．１．１）および直鎖状アミドに作用するアミダーゼ（ＥＣ ３．５．１）の群から、具体的にはアミノアミダーゼの群から、より具体的にはマイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）由来のアミノアミダーゼ、より具体的にはマイコバクテリウム・ネオオーラム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｅｏａｕｒｕｍ）由来のアミノアミダーゼの群から選択することができる。
【０１２５】
Ｎ−保護ＤＡＢの化学的加水分解に、類似の反応に対して当技術分野で知られているプロセスを含むことができる。適切な方法には、トリフェニルホスフェートの溶液を塩素で滴定することによりインサイチュー（ｉｎ ｓｉｔｕ）で調製された（ＰｈＯ）３Ｐ・Ｃｌ２試薬による脱アシル化が含まれる。この方法は、Ｓａｇｇｉａｒｉら（Ｏｒｇａｎｉｃ Ｌｅｔｔｅｒｓ （２００４）、６（２２）、３８８５〜３８８８頁）に概ね記載されている。
【０１２６】
Ｎ５−保護オルニチンの無保護ＤＡＢへの変換では、以前に記載のように、最初にＮ５−保護オルニチンを特異的に脱炭酸させる処理を行い、Ｎ−保護ＤＡＢを得た後、 Ｎ−保護ＤＡＢを加水分解させて無保護ＤＡＢを生じさせた。
【０１２７】
Ｎ−保護ＤＡＢを生じさせるＮ５−保護オルニチンの特異的脱炭酸のために、リアーゼ活性を有する酵素などの適切な生体触媒を使用することができる。リアーゼ活性を有する適切な酵素はクラスＥＣ４に属する。より具体的には、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のオルニチンデカルボキシラーゼ（ＳｐｅＣ）（ＥＣ ４．１．１．１７）、ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）の分枝鎖α−ケト酸デカルボキシラーゼ（ＫｄｃＡ；配列番号８）およびα−ケトイソバレレートデカルボキシラーゼ（ＫｉｖＤ；配列番号１０）、ならびにエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のリジンデカルボキシラーゼ（ＬｙｓＡ；配列番号１２）によって例示される、カルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１）などの炭素−炭素リアーゼ（ＥＣ ４．１）を使用することができる。
【０１２８】
代替的に、最初に述べたＮ５−保護オルニチンの特異的脱炭酸は、類似の化学成分に対して当技術分野で知られている化学変換を用いて行うことができる。この目的のための適切な化学的脱炭酸反応は、高温沸騰したジフェニルメタンなどの溶媒中で、場合によっては触媒量の有機過酸化物の存在下で、化合物を加熱することによって行うことができ、または１等量または複数等量のケトンもしくはアルデヒドと共に化合物を加熱することによって行うことができる。
【０１２９】
その後のＮ−保護ＤＡＢの加水分解は、生体触媒により生成されたＮ−保護ＤＡＢに対して上述したように、生体触媒プロセスまたは化学プロセスによって行うことができる。
【０１３０】
上述の２ステップ変換の代替として、Ｎ５−保護オルニチンからＤＡＢを生成させるワンポットプロセスを使用することができる。このプロセスは、類似の化合物に対して当技術分野で知られている方法に従って、最初にＮ５−保護オルニチンを脱アシル化し、次いで脱炭酸するか、または最初にＮ５−保護オルニチンを脱炭酸し、次いで脱アシル化するかのいずれかによって行うことができる。脱炭酸は上述のように行うことができる。脱アシル化はＮ−保護ＤＡＢについての上述の方法によって行うことができる。
【０１３１】
Ｎ−保護４−アミノブチルアルデヒドの無保護ＤＡＢへの変換は、最初にアルデヒド酸素をアミノ基に特異的に置換してＮ−保護ＤＡＢを形成させて、次いで後者を脱保護することによって行うことができる。最初の変換のために、上述のようにトランスフェラーゼ活性（ＥＣ ２）を有する酵素などの適切な生体触媒を使用することができる。この特定の目的のための、トランスフェラーゼ活性を有する適切な酵素は、窒素含有基を転移させるトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６）、より具体的にはアミノトランスフェラーゼ（トランスアミナーゼ）（ＥＣ ２．６．１）、さらに具体的には哺乳類肝臓由来の４−アミノ−ブチレートアミノトランスフェラーゼ、より具体的にはブタ肝臓由来の４−アミノ−ブチレートアミノトランスフェラーゼ；哺乳類脳由来の４−アミノ−ブチレートアミノトランスフェラーゼ、より具体的にはヒト、ブタまたはラットの脳由来の４−アミノブチレートアミノトランスフェラーゼ；ビブリオ・フルビアリス（Ｖｉｂｒｉｏ ｆｌｕｖｉａｌｉｓ）のω−アミノトランスフェラーゼ、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来の４−アミノ−ブチレートアミノトランスフェラーゼ、ならびにクロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）由来、より具体的にはクロストリジウム・アミノワレリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｍｉｎｏｖａｌｅｒｉｃｕｍ）由来の５−アミノバレレートアミノトランスフェラーゼ、例えばシゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）またはサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）のオルニチントランスアミナーゼ（ＥＣ ２．６．１．１１）、Ｌ−アラニン：３−オキソプロピオネートアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６．２．１８）、およびプトレッシンアミノトランスフェラーゼによって例示される。特に適切なアミノトランスフェラーゼとしては例えば、ビブリオ・フルビアリス（Ｖｉｂｒｉｏ ｆｌｕｖｉａｌｉｓ）のω−アミノトランスフェラーゼ（配列番号５）、またはシュードモナス・エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（ｇｉ９９４６１４３（配列番号１）もしくはｇｉ９９５１０７２（配列番号３））、パラコッカス・デニトリフィカンス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）（ＺＰ００６２８５７７；配列番号１４）、バチルス・ウェイヘンステファネンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓ）（ＺＰ０１１８６９６０（配列番号１６））のアミノトランスフェラーゼがある。
【０１３２】
Ｎ−保護４−アミノブチルアルデヒドをＮ−保護ＤＡＢへ変換するための他の適切な生体触媒は、オキシドレダクターゼ（ＥＣ １）を有する酵素、より具体的にはドナーのＣＨ−ＮＨ２基（ＥＣ １．４）またはＣＨ−ＮＨ基（ＥＣ １．５）に作用するオキシドレダクターゼ、ならびにより具体的にはクラスＥＣ １．４．１、１．４．３（好ましくは１．４．３．４）および１．４．９９の酵素である。
【０１３３】
代替的に、Ｎ−保護４−アミノブチルアルデヒドの最初の変換は、類似の化学成分に対して当技術分野で知られている化学変換によって行なうことができる。この目的のために適切な化学反応は、類似の化合物に対して当技術分野で知られている方法に従って、Ｎ−保護４−アミノブチルアルデヒドを還元的アミノ化することによって実施することができる（例えば独国特許第４３２２０６５号明細書を参照されたい）。適切な方法は、例えば不均一触媒（ＲａＮｉ、Ｎｉ／ＳｉＯ２および／もしくはＡｌ２Ｏ３、Ｒｕ／Ｃ、Ｒｈ／Ｃなど）または均一触媒（均一Ｒｈ触媒など）上でアンモニアおよび水素を使用する反応である。
【０１３４】
その後のＮ−保護ＤＡＢの加水分解は、生体触媒により生成されたＮ−保護ＤＡＢについて上述したように、生体触媒プロセスまたは化学プロセスによって行なうことができる。
【図面の簡単な説明】
【０１３５】
【図１】Ｎ−Ａｃ−オルニチンのＮ−Ａｃ−ＤＡＢへの生物変換の終了時点の試料のＴＬＣを示す図である。１）グルタメートＤＣ；２）アスパルテートＤＣ；３）ＬｙｓＡ；４）ＫｄｃＡ；５）ＫｉｖＤ；６）Ｋｇｄ；７）リジンＤＣ；８）ＯＤＣ ＬＪ１１０；９）ＯＤＣ ＤＨ５α；１０）酵素ブランク；１１）化学ブランク；１２）Ｎ−Ａｃ−オルニチン参照試料；１３）Ｎ−Ａｃ−ＤＡＢ参照試料；１４）Ｎ−Ａｃ−オルニチンおよびＮ−ＡｃーＤＡＢ参照試料。
【０１３６】
［実施例］
［全般的方法］
［分子および遺伝子の手法］
標準的な遺伝子および分子生物学の手法については、当技術分野で一般に知られており、以前に記載されている（Ｍａｎｉａｔｉｓら １９８２ 「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．；Ｍｉｌｌｅｒ １９７２ 「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ ２００１ 「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ」（第３版）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌら編 「Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９８７）。
【０１３７】
［プラスミドおよび株］
ｐＢＡＤ／Ｍｙｃ−ＨｉｓＣは、米国カリフォルニア州カールスバードのインビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ， ＵＳＡ））から入手した。国際公開第２００５／０６８６４３号パンフレットに記載のように構築したプラスミドｐＢＡＤ／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ−ＤＥＳＴは、タンパク質発現のために使用した。Ｅ．コリ（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０（インビトロジェン社、カールスバード、カリフォルニア州、米国（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ））は、すべてのクローニング手法および標的遺伝子発現のために使用した。
【０１３８】
［培地］
ＬＢ培地（１０ｇ／ｌのトリプトン、５ｇ／ｌの酵母抽出物、５ｇ／ｌのＮａＣｌ）は、Ｅ．コリ（Ｅ． ｃｏｌｉ）の増殖用に使用した。プラスミドを維持するために抗生物質（５０μｇ／ｍｌのカルベニシリン）を補った。ｐＢＡＤ／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ−ＤＥＳＴ由来プラスミドにおいて、ＰＢＡＤプロモーターの制御下で遺伝子発現を誘導するために、Ｌ−アラビノースを最終濃度０．２％（Ｗ／Ｖ）になるように加えた。
【０１３９】
［Ｍ．ネオオーラム（Ｍ．ｎｅｏａｕｒｕｍ）のアミノアミダーゼの産生］
アミノアミダーゼは、以下の条件下におけるマイコバクテリウム・ネオオーラム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｅｏａｕｒｕｍ）株ＡＴＣＣ２５７９５の増殖によって得た。４．８ｇ／ｌのニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、４ｇ／ｌの尿素、６ｇ／ｌのグルコース、２０ｇ／ｌの酵母カーボンベース（Ｄｉｆｃｏ製ＹＣＢ）、１．５５ｇ／ｌのＫ２ＨＰＯ４、および０．８５ｇ／ｌのＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏを含有する１ｌのマイコメド（Ｍｙｃｏｍｅｄ）培地をｐＨ７に調整し、それにマイコバクテリウム・ネオオーラム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｅｏａｕｒｕｍ）株ＡＴＣＣ２５７９５のグリセロール保存培養物をイノキュレートした。前培養物をニュー・ブランズウィック・サイエンティフィック（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）Ｇ５３シェーカー（１５０ｒｐｍ、振幅４ｃｍ）にて、３７℃、１６８時間振とうした。３．４５の光学濃度（ＯＤ６２Ｏｎｍ）に達したとき、前培養物５００ｍｌを使用してマイコメド培地９ｌにイノキュレートした。マイコメド培地中に存在するＮＴＡによってアミダーゼの発現を誘導した。発酵培養物を０．５〜２ｌ／分の通気速度のもとで３７５〜７５０ｒｐｍにて撹拌した。Ｈ３ＰＯ４およびＮａＯＨの添加によって、ｐＨを７に一定に保持した。培養温度は３７℃とした。４４時間の培養後、１０ｇ／ｌのＹＣＢを添加して培養物に栄養を与えた。６８時間の培養後、１０ｇ／ｌのグルコースを添加して培養物に栄養を与えた。９４時間の培養後、１２，０００ｇにて１０分間遠心分離して培養物を採取した。細胞ペレットを２０ｍＭのＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７）中で洗浄し、次いで保存のために凍結乾燥した。
【０１４０】
［プラスミドの同定］
相異なる遺伝子を保持するプラスミドを、形質転換細胞の抗生物質に対する抵抗性、形質転換細胞のＰＣＲ診断分析またはプラスミドＤＮＡの精製、精製プラスミドＤＮＡの制限酵素分析またはＤＮＡ配列分析などの当技術分野で一般に知られている遺伝的、生化学的および／または表現型手段によって同定した。
【０１４１】
［標的遺伝子のクローニング］
［発現構築物の設計］
ゲートウェイ（Ｇａｔｅｗａｙ）技術（インビトロジェン社、カールスバード、カリフォルニア州、米国）を使用するクローニングを容易にするために、すべての遺伝子にａｔｔＢ部位を、リボソーム結合部位および開始コドンの上流、ならびに停止コドンの下流に付加した。
【０１４２】
［遺伝子合成およびプラスミドの構築］
合成遺伝子を、ＤＮＡ２．０から得て、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現させるためにＤＮＡ２．０の標準的手順に従ってコドンを最適化した。ビブリオ・フルビアリス（Ｖｉｂｒｉｏ ｆｌｕｖｉａｌｉｓ）ＪＳ１７ω−アミノトランスフェラーゼ［配列番号６］およびバチルス・ウェイヘンステファネンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓ）ＫＢＡＢ４アミノトランスフェラーゼ（ＺＰ＿０１１８６９６０）［配列番号１７］をそれぞれコードするＶ．フルビアリス（Ｖ．ｆｌｕｖｉａｌｉｓ）ＪＳ１７［配列番号５］およびＢ．ウェイヘンステファネンシス（Ｂ．ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓ）ＫＢＡＢ４［配列番号１６］由来のアミノトランスフェラーゼ遺伝子をコドン最適化し、その結果として得られた配列［配列番号７］および［配列番号１８］をＤＮＡ合成によって得た。
【０１４３】
この遺伝子構築物を、製造業者のプロトコール（ｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ）に従い、導入したａｔｔＢ部位およびエントリーベクターとしてｐＤＯＮＲ２０１（インビトロジェン社）を介して、ゲートウェイ技術（インビトロジェン社）によりｐＢＡＤ／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ−ＤＥＳＴ発現ベクターの中にクローン化した。このようにして発現ベクターｐＢＡＤ−Ｖｆｌ＿ＡＴおよびｐＢＡＤ−Ｂｗｅ＿ＡＴをそれぞれ得た。化学的にコンピテントなＥ．コリ（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０（インビトロジェン社）を、それぞれのｐＢＡＤ−発現ベクターにより形質転換して、対応する発現株を得た。
【０１４４】
同様な方法で、配列番号１５のアミノ酸配列をコードする、パラコッカス・デニトリフィカンス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）由来のアミノトランスフェラーゼ遺伝子［配列番号１４］の発現ベクターを作製した。
【０１４５】
［ＰＣＲによるクローニング］
製造業者の仕様書に従ってＰＣＲ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（インビトロジェン社）を使用し、表３に載せたプライマーを用いることにより、アミノトランスフェラーゼ遺伝子をゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。
【０１４６】
【表３】
【０１４７】
ＰＣＲ反応物をアガロースゲル電気泳動により分析し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（キアゲン社、ヒルデン、ドイツ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ））を用いて適当な大きさのＰＣＲ産物をゲルから溶出した。精製ＰＣＲ産物を、製造業者のプロトコールに記載のように、導入したａｔｔＢ部位およびエントリーベクターとしてｐＤＯＮＲ−ｚｅｏ（インビトロジェン社）を介して、ゲートウェイ技術（インビトロジェン社）によりｐＢＡＤ／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ−ＤＥＳＴ発現ベクターの中にクローン化した。ＰＣＲによってクローン化した遺伝子の配列を、ＤＮＡシークエンシングにより検証した。このようにして発現ベクターｐＢＡＤ−Ｐａｅ＿ｇｉ９９４６１４３＿ＡＴ、ｐＢＡＤ−Ｐａｅ＿ｇｉ９９５１０７２＿ＡＴ、およびｐＢＡＤ−Ｐｄｅ＿ＡＴ＿ＺＰ００６２８５７７を得た。化学的にコンピテントなＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０（インビトロジェン社）をｐＢＡＤ構築物により形質転換して、対応する発現株を得た。
【０１４８】
［タンパク質発現用のＥ．コリ（Ｅ． ｃｏｌｉ）の増殖］
０．０２％（ｗ／ｖ）のＬ−アラビノースを含有する培地９４０μｌの入った９６ディープウェルプレート中で小規模増殖を行った。９６ウェルスタンプ（キューネル社、ビルスフェルデン、スイス（Ｋｕｅｈｎｅｒ，Ｂｉｒｓｆｅｌｄｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））によって凍結保存培養物から細胞を移すことにより、イノキュレーションを行った。プレートは、２５℃で４８時間、旋回シェーカー（３００ｒｐｍ、振幅５ｃｍ）上でインキュベートした。通常は、２〜４のＯＤ６２０ｎｍが得られた。
【０１４９】
［細胞溶解物の調製］
［溶菌緩衝液の調製］
溶菌緩衝液は、表４に載せた成分を含有した。
【０１５０】
【表４】
【０１５１】
この溶液は、使用直前に新たに調製した。
【０１５２】
［溶菌による無細胞抽出物の調製］
小規模の増殖（前段落を参照されたい）から得られた細胞を、遠心分離によって集め、上清を廃棄した。遠心分離の間に形成された細胞ペレットを、−２０℃で少なくとも１６時間冷凍し、次いで氷上で解凍した。新たに調製した溶菌緩衝液５００μｌを各ウェルに加え、プレートを２〜５分間激しく渦撹拌することによって細胞を再懸濁させた。溶菌を達成するためにプレートを室温で３０分間インキュベートした。細胞片を除去するためにプレートを４℃、６０００ｇで２０分間遠心分離した。上清を新たなプレートに移し、次に使用するまで氷上で保持した。
【０１５３】
［超音波処理による無細胞抽出物の調製］
中規模の増殖（前段落を参照されたい）から得られた細胞を、遠心分離によって集め、上清を廃棄した。湿細胞ペレット０．５ｇにリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）１ｍｌを加え、激しく渦撹拌することによって細胞を再懸濁させた。溶菌を達成するために細胞を２０分間超音波処理した。細胞片を除去するために溶解物を４℃、６０００ｇで２０分間遠心分離した。上清を新たなチューブに移し、次に使用するまで−２０℃で冷凍した。
【０１５４】
［Ｎ−アセチル−４−アミノブチルアルデヒドのＮ−アセチル−ＤＡＢへの生物変換］
［スクリーニング条件］
酵素はすべて、最終容積１００μｌになるように１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁した。酵素反応は、アミンドナー（Ｌ−アラニンまたは（Ｓ）−αメチルベンジルアミン）および補因子（ＰＬＰ）を含有する保存溶液１５０μｌを添加することにより開始させた。反応混合物２５０μｌ中の最終濃度は、Ｎ−アセチル−アミノブタナール（７０ｍＭ）、アミンドナー（１４０ｍＭ）、ＰＬＰ（１２．５ｍＭ）とした。２種類のアミンドナーは別々に実験した。反応混合物を、ＩＫＡの旋回シェーカー上にて５６０ｒｐｍで振とうさせながら、２８℃で一晩（１６．５および１６時間）インキュベートした。インキュベーション後、０．２％のギ酸を含む６０％稀釈のアセトニトリル７５０μｌを添加してこの反応混合物を停止させ、希釈した。マイクロタイタープレートを３５００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。分析はＬＣ−ＭＳ分析によって行った（分析ジョブ２００９−０２−００６４９を参照されたい）。
【０１５５】
［分析法：］
合計１４８の試料をジョブ２００９−０１−００３０６に記載の分析法を用いて、ＬＣ−ＭＳによって分析した。検出限界；直線範囲：アミンドナーＬ−アラニンに対して、０μｍｏｌ／Ｌ〜５５０μｍｏｌ／Ｌ、アミンドナー（Ｓ）−αメチルベンジルアミンに対して０μｍｏｌ／Ｌ〜２８０μｍｏｌ／Ｌ。
【０１５６】
［Ｎ−アセチル−４−アミノブチルアルデヒドのＮ−アセチル−ＤＡＢへの生物変換の結果］
合計１４８のトランスアミナーゼ酵素を、Ｎ−アセチル−４−アミノブチルアルデヒドのＮ−アセチル−ＤＡＢへの経路に対してスクリーニングした。すべての試料を、この変換に関してＬＣ−ＭＳによって分析した。この変換はＮ−アセチル−ＤＡＢの形成に基づいて計算した。アミンドナーとしてＬ−アラニンを使用した場合に、合計３１のアミノトランスフェラーゼでヒット（２％を超える変換）が得られた。さらに、これらのうちの２０が、アミンドナーとして（Ｓ）−α−メチルベンジルアミンを使用した場合でも陽性であった。これら陽性ヒットのうちの５つを表５に例示する。
【０１５７】
【表５】
【０１５８】
［Ｎ−アセチル−ＤＡＢのＤＡＢへの生物変換］
［スクリーニング条件］
酵素はすべて、１００ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ７．５）に最終容積１００μｌになるように懸濁した。酵素反応は、１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液中の１３．３３ｍｇ／ｍｌのＮ−アセチル−ＤＡＢ・ＨＣｌ溶液１５０μｌ（最終反応濃度、８ｍｇ／ｍｌ≒４８ｍＭのＮ−アセチル−ＤＡＢ）を添加して開始させた。反応混合物を、ＩＫＡの旋回シェーカー上にて４６０ｒｐｍで振とうさせながら、３７℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、Ｈ２Ｏ中の１００ｍＭのＨＣｌＯ４７５０μｌ（ｐＨ１．０）を添加してこの反応混合物を停止させ、希釈した。マイクロプレートを３５００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、以下に記載のようにＨＰＬＣ−ＰＣＲ−ＦＬ分析を用いてＤＡＢについて分析した。
【０１５９】
［ＤＡＢ測定のためのＨＰＬＣ−ＭＳ分析法］
［試料調製：］
０．２％のギ酸を含む、アセトニトリルと水との混合物を用いて、試料を希釈した。アセトニトリルの割合は少なくとも５０％にしなければならない。
【０１６０】
【表６】
【０１６１】
適用条件下で、ＤＡＢは６．３分に溶出する。
【０１６２】
［Ｎ−アセチル−ＤＡＢのＤＡＢへの生物変換の結果］
試験した酵素の中から、Ｎ−アセチル−ＤＡＢのＤＡＢへの生物変換において加水分解活性を示した酵素を選択して表６に載せた。これらの酵素の中のいくつかについては、本特許出願に組み入れられた配列情報によっても特徴付けられる。
【０１６３】
【表７】
【０１６４】
［結論］
多くの加水分解酵素が、Ｎ−アセチル−ＤＡＢのＤＡＢへの変換のための生体触媒として有用であることが見出された。
【０１６５】
他のアシル保護基を有するＮ−保護ＤＡＢ前駆体は、例えば４−アミノブチルアルデヒドまたはオルニチンのアシル化によって調製することができる。例えば、ギ酸中で無水酢酸によるアシル化によってホルミル保護基を導入すること、またはＣ２〜Ｃ６カルボン酸無水物もしくは塩化アシルの反応によってＮ−アセチル、Ｎ−プロピオニル、Ｎ−ブチリル、Ｎ−バレリルもしくはＮ−カプロイル保護基をそれぞれ導入すること。Ｎ−ホルミル−ＤＡＢおよびＣ３〜Ｃ６アシル保護基を有する高級同族体などのＮ−保護ＤＡＢ前駆体は、上記の酵素によって同様に変換されることが予想される。
【０１６６】
［Ｎ５−アセチル−オルニチンのＮ−アセチル−ＤＡＢへの生物変換］
［細胞培養および発現］
この生物変換はデカルボキシラーゼを用いて行われた。大部分のデカルボキシラーゼは標準条件下でＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現させた。
【０１６７】
前培養物は、ｐＢＡＤ−ＤＥＳＴ＿ｌｙｓＡ、ｐＢＡＤ−ＤＥＳＴ＿ｋｄｃＡ、ｐＢＡＤ−ＤＥＳＴ＿ｋｉｖＤ、またはｐＢＡＤ−ＤＥＳＴ＿ｋｇｄを内包するＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔｏｐ１０を、グリセロールストックからＬＢｃａｒｂ培地５ｍｌにイノキュレーションして作製した。前培養物は、２８℃で一晩インキュベートした。各前培養物０．５ｍｌを、ＬＢｃａｒｂ培地５０ｍｌ中に希釈した。ＯＤ６００が０．６に到達する（平均して３〜４時間後）まで、この培養物を２８℃でインキュベートした。タンパク質発現は、最終濃度０．０２％までアラビノースを添加することにより誘導した。２８℃で一晩のインキュベーション後、細胞を採取した（１０分、５０００ｒｐｍ、４℃）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析のために、誘導前、誘導３時間後、および一晩の後に、試料１ｍｌを採取した。細胞をペレット化し（５分、１３，０００ｒｐｍ）、そのペレットを−２０℃で保存した。
【０１６８】
２つのオルニチンデカルボキシラーゼ、ｐＢＡＤ２＿ＯＤＣ Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α／ＬＪ１１０を、わずかに異なった条件下で増殖および発現させた。ここで、５０μＭのＩＰＴＧによる誘導前に、ＯＤ６２０が１．５になるまで本培養物を増殖させた。他のすべての条件は上記と同じとした。
【０１６９】
［超音波処理によるＣＦＥの調製］
細胞ペレットを氷上で解凍し、２容積の５０ｍＭリン酸カリウム（ＫＰｉ）緩衝液（ｐＨ７．５）に再懸濁した。この細胞懸濁液を、１０秒間パルスで１０分間断続的に超音波処理した。超音波処理後、細胞片を遠心分離（２０分、１３，２００ｒｐｍ、４℃）によってペレットにした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を用いて発現レベルを測定し、ＣＦＥを−２０℃で保存した。
【０１７０】
【表８】
【０１７１】
Ｎ−Ａｃ−オルニチンのＮ−Ａｃ−ＤＡＢへの反応はすべて、３７℃で撹拌およびインキュベートした。試料を０、２、１８、２８、および４４時間の時点で採取し、−２０℃に保存した。分析のために、各試料５００μｌをアセトニトリル５００μｌに加え、最高速度で１０分間回転させた。試料をＴＬＣ上で分析するために、アンモニア：メタノール（１：１）の溶離液で流し、ニンヒドリンスプレーで染色した。定量分析のために、下記の方法に従って、ＬＣ−ＭＳ−ＭＳにより試料を測定した。
【０１７２】
［Ｎ−アセチル−ＤＡＢ測定のためのＨＰＬＣ−ＭＳ分析法］
［試料調製：］
０．２％のギ酸を含む、アセトニトリルと水との混合物を用いて、試料を希釈した。アセトニトリルの割合は少なくとも５０％にしなければならない。
【０１７３】
実験はアプライド・バイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のＰＥ ＳＣＩＥＸ ＡＰＩ２０００ ＬＣ−ＭＳ／ＭＳで行った。
【０１７４】
【表９】
【０１７５】
適用条件下で、Ｎ−Ａｃ−ＤＡＢは４．２分に溶出する。
【０１７６】
Ｎ５−アセチル−オルニチンのＮ−アセチル−ＤＡＢへの生物変換の結果
オルニチンのＤＡＢへの変換については、終了時点の試料（４４時間）をＴＬＣ上で分析した（図１）。
【０１７７】
終了時点の試料はすべてＬＣ−ＭＳ−ＭＳにより分析した。対照試料のレベルより少なくとも３μｍｏｌ超の値を示す試料を表８に示す。
【０１７８】
【表１０】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの生体触媒ステップを含む１，４−ジアミノブタン［ＤＡＢ］の調製方法であって、少なくとも１つのＤＡＢのＮ−保護前駆体の生体触媒による生成とその後の前記Ｎ−保護前駆体のＤＡＢへのインビトロ変換とを含む方法。
【請求項２】
少なくとも１つの生体触媒ステップを含むＤＡＢの調製方法であって、
ａ）ＤＡＢのＮ−保護前駆体を生体触媒により調製するステップであって、ＤＡＢのＮ−保護前駆体を含有する生体触媒反応混合物を生じさせるステップと、
ｂ）前記生体触媒反応混合物から前記Ｎ−保護前駆体を回収するステップと、
ｃ）前記Ｎ−保護前駆体をＤＡＢに変換するステップと
を含む方法。
【請求項３】
ＤＡＢの前記Ｎ−保護前駆体が、Ｎ５−保護オルニチン、Ｎ−保護ＤＡＢ、およびＮ−保護４−アミノブチルアルデヒドからなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ＤＡＢの少なくとも１つの前記Ｎ−保護前駆体が、Ｎ５−アセチルオルニチン、Ｎ−アセチルＤＡＢ、およびＮ−アセチル４−アミノブチルアルデヒドからなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記生体触媒ステップが醗酵ステップである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
前記発酵ステップが単細胞宿主の中で起こる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記発酵ステップが、動物細胞、植物細胞、細菌、古細菌、酵母、および菌類からなる群から選択される宿主細胞の中で起こる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記生体触媒反応混合物からの前記Ｎ−保護前駆体の回収が、ろ過、沈降、結晶化、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、膜分離、および蒸発からなる群から選択される少なくとも１つのステップによって行われる、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記Ｎ−保護前駆体のＤＡＢへの変換ステップｃ）が、少なくとも１つの酵素処理ステップまたは化学処理ステップを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
前記Ｎ−保護ＤＡＢが、加水分解酵素を使用してＤＡＢに変換される、請求項１〜９のいずれか一項に記載のＤＡＢの調製方法。
【請求項１１】
加水分解酵素が、カルボン酸エステルヒドロラーゼ、チオールエステルヒドロラーゼ、リパーゼ、およびペプチダーゼからなる群から、具体的にはリパーゼおよびペプチダーゼから選択されて使用される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記加水分解酵素が、セリン型カルボキシペプチダーゼ、金属カルボキシペプチダーゼ、システイン型カルボキシペプチダーゼ、セリンエンドペプチダーゼ、システインエンドペプチダーゼ、アスパラギン酸エンドペプチダーゼ、および金属エンドペプチダーゼの群から、具体的にはセリンエンドペプチダーゼから選択されるペプチダーゼである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記セリンエンドペプチダーゼが、サブチリシン、好ましくはサブチリシンカールスバーグである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１】
少なくとも１つの生体触媒ステップを含む１，４−ジアミノブタン［ＤＡＢ］の調製方法であって、少なくとも１つのＤＡＢのＮ−保護前駆体の生体触媒による生成とその後の前記Ｎ−保護前駆体のＤＡＢへのインビトロ変換とを含む方法。
【請求項２】
少なくとも１つの生体触媒ステップを含むＤＡＢの調製方法であって、
ａ）ＤＡＢのＮ−保護前駆体を生体触媒により調製するステップであって、ＤＡＢのＮ−保護前駆体を含有する生体触媒反応混合物を生じさせるステップと、
ｂ）前記生体触媒反応混合物から前記Ｎ−保護前駆体を回収するステップと、
ｃ）前記Ｎ−保護前駆体をＤＡＢに変換するステップと
を含む方法。
【請求項３】
ＤＡＢの前記Ｎ−保護前駆体が、Ｎ５−保護オルニチン、Ｎ−保護ＤＡＢ、およびＮ−保護４−アミノブチルアルデヒドからなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ＤＡＢの少なくとも１つの前記Ｎ−保護前駆体が、Ｎ５−アセチルオルニチン、Ｎ−アセチルＤＡＢ、およびＮ−アセチル４−アミノブチルアルデヒドからなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記生体触媒ステップが醗酵ステップである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
前記発酵ステップが単細胞宿主の中で起こる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記発酵ステップが、動物細胞、植物細胞、細菌、古細菌、酵母、および菌類からなる群から選択される宿主細胞の中で起こる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記生体触媒反応混合物からの前記Ｎ−保護前駆体の回収が、ろ過、沈降、結晶化、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、膜分離、および蒸発からなる群から選択される少なくとも１つのステップによって行われる、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記Ｎ−保護前駆体のＤＡＢへの変換ステップｃ）が、少なくとも１つの酵素処理ステップまたは化学処理ステップを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
前記Ｎ−保護ＤＡＢが、加水分解酵素を使用してＤＡＢに変換される、請求項１〜９のいずれか一項に記載のＤＡＢの調製方法。
【請求項１１】
加水分解酵素が、カルボン酸エステルヒドロラーゼ、チオールエステルヒドロラーゼ、リパーゼ、およびペプチダーゼからなる群から、具体的にはリパーゼおよびペプチダーゼから選択されて使用される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記加水分解酵素が、セリン型カルボキシペプチダーゼ、金属カルボキシペプチダーゼ、システイン型カルボキシペプチダーゼ、セリンエンドペプチダーゼ、システインエンドペプチダーゼ、アスパラギン酸エンドペプチダーゼ、および金属エンドペプチダーゼの群から、具体的にはセリンエンドペプチダーゼから選択されるペプチダーゼである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記セリンエンドペプチダーゼが、サブチリシン、好ましくはサブチリシンカールスバーグである、請求項１２に記載の方法。
【図１】
【公表番号】特表２０１３−５００００５（Ｐ２０１３−５００００５Ａ）
【公表日】平成２５年１月７日（２０１３．１．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５２１０１８（Ｐ２０１２−５２１０１８）
【出願日】平成２２年７月２０日（２０１０．７．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０６０４８０
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／００９８５９
【国際公開日】平成２３年１月２７日（２０１１．１．２７）
【出願人】（５０３２２０３９２）ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ． (873)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年１月７日（２０１３．１．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年７月２０日（２０１０．７．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０６０４８０
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／００９８５９
【国際公開日】平成２３年１月２７日（２０１１．１．２７）
【出願人】（５０３２２０３９２）ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ． (873)
【Ｆターム（参考）】
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