Ｎ−アセチル−（Ｒ，Ｓ）−β−アミノ酸アシラーゼ遺伝子
【課題】 Ｎ−アセチル−（Ｒ，Ｓ）−β−アミノ酸アシラーゼの遺伝子を単離同定し、大腸菌のような宿主を用いて、これら遺伝子を高発現する系を構築するために、これらの酵素を菌体から単離精製し、該酵素をコードする遺伝子の塩基配列を決定すること。
【解決手段】Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ ｓｐ． ＡＪ １１０３４８が産生するＮ−アセチル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼ、及び、該酵素をコードする遺伝子。
【解決手段】Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ ｓｐ． ＡＪ １１０３４８が産生するＮ−アセチル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼ、及び、該酵素をコードする遺伝子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なＮ−アセチル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼ及びＮ−アセチル−（Ｓ）−β−アミノ酸アシラーゼ、及びそれらをコードする遺伝子等に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
Ｎ−アセチル−β−アミノ酸に対してアシラーゼ活性を有する酵素は従来知られていなかったが、本発明者等は、Ｎ−アセチル−β−Ｐｈｅ等のＮ−アセチル−β−アミノ酸を培養菌体によって光学選択的に脱アセチル化する菌株としてＶａｒｉｏｖｏｒａｘ ｓｐ． ＡＪ１１０３４８（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０３６７）とＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ． ＡＪ１１０３４９（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０３６６）を初めて見出し、これらの菌体又は菌体粉砕液上清を用いる光学選択的な脱アセチル化方法は特開２００６−４２７２２号公報（特許文献１）に記載されている。尚、これらの菌株は、夫々、平成１６年７月２２日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されたＦＥＲＭ Ｐ−２０１２９及びＦＥＲＭ Ｐ−２０１２８から、２００５年７月４日付けで特許手続上の微生物の寄託等の国際的承認に関するブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、夫々、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０３６７及びＦＥＲＭ ＢＰ−１０３６６が付されている。
【特許文献１】特開２００６−４２７２２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
これら選抜された野生株を用いた変換反応も変換の一手法ではあるが、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｌｉａ ｓｐ．ＡＪ１１０３４９由来Ｎ−アセチル−β−アミノ酸アシラーゼは、（Ｒ）／（Ｓ）双方の光学選択性のアシラーゼを保持しており、野生株を用いて光学選択性の高いβ−アミノ酸を生成することが難しい状況であった。より効果的な変換を達成するためには、反応を触媒する酵素を単離・同定し、更にそのコード遺伝子も同定した上、例えば、大腸菌（Ｅｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のような宿主を用いて、その遺伝子を高発現する系を構築することが重要である。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
従来、ある酵素活性が見出されている菌株から、その活性を担う酵素あるいはその遺伝子を単離・同定する手法に関しては数多く報告されており、具体的には、一つはショットガンクローニングによる遺伝子単離法、もう一つは酵素単離、その部分アミノ酸配列決定、その配列情報に基づく遺伝子単離法が挙げられる。
【０００５】
そこで、本発明者は、特許文献１に記載された菌株からＮ−アセチル−β−アミノ酸を光学選択的に脱アセチル化するＮ−アセチル−β−アミノ酸アシラーゼの遺伝子を取得すべく、まず第一に、常法であるショットガンクローニングによる方法を試みた。
【０００６】
即ち、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｌｉａ ｓｐ． ＡＪ１１０３４９株のゲノムＤＮＡのライブラリーを作成し、Ｎ−アセチル−Ｒ／Ｓ−β−Ｐｈｅを単一炭素源とする培地に塗布し３７℃で１週間培養を行った。
また、供与検体数は、別途ＬＢ培地にライブラリーを塗布し、ＬＢ培地に生育した菌体数から算出した。約１万株に対してスクリーニングを行った結果、Ｎ−アセチル−Ｒ／Ｓ−β−Ｐｈｅを単一炭素源として生育する株は得られなかった。
【０００７】
また、Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ ｓｐ． ＡＪ１１０３４８株に関しても同様に、Ｎ−アセチル−Ｒ／Ｓ−β−Ｐｈｅを単一炭素源とするスクリーニングを約５万１千株に対して行ったが、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｌｉａ ｓｐ． ＡＪ１１０３４９株のスクリーニングの際と同様に、Ｎ−アセチル−Ｒ／Ｓ−β−Ｐｈｅを単一炭素源として生育する株は得られなかった。
【０００８】
以上のように、非常に多くのクローンを調べたにも関わらず、単一炭素源の資化を指標とする様なスクリーニング手法では、目的とする酵素遺伝子の取得には至らなかった。
【０００９】
このため、次に第二の方法である酵素の単離精製からのアプローチを試みることとした。酵素の単離精製の方法は数多く報告されているが、あらゆるタンパク質の単離精製が約束されるような単離精製法の一般則は存在せず、また、精製元の総タンパク質量に占める対象とするタンパク質の存在比によって、単離精製の難易度は大きく異なる。本発明におけるＮ−アセチル−β−アミノ酸アシラーゼの精製方法については後に詳述するが、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ． ＡＪ１１０３４９株からの Ｎ−アセチル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼおよび Ｎ−アセチル−（Ｓ）−β−アミノ酸アシラーゼの精製の場合、無細胞抽出液中での目的酵素の比活性に比べ、単離精製酵素の比活性は数百倍となっており、その精製は非常に困難なものであった。この困難な状況の原因の一つに、酵素生産菌であるＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ． ＡＪ１１０３４９株の性質の内、遠心操作による集菌のし難さが挙げられた。菌体内のタンパク質を単離精製する場合、通常、培地中のタンパク質の混入をさけるため、集菌後、緩衝液を用いて十分に菌体を洗浄する方法が採られるが、本菌株は、集菌手法として通常採用される遠心分離操作においてペレットとして回収されにくく、培地成分由来のタンパク質と菌体由来のタンパク質の分離が困難であった。このため、本株からのタンパク質単離精製は、通常の場合に比べ、多くの夾雑タンパク質が存在する状況から単離を行う必要があり、これが精製の困難さの一因となった。
【００１０】
この問題を解決するため、発明者は通常のタンパク質精製の場合に比べ多くの条件等の検討に鋭意努力し、その結果、当業者でも予想し得ない５種という多くのクロマトグラフィーを用いる精製ステップを経ることによって、初めて上記酵素の単離精製に成功し、その結果、該酵素をコードする遺伝子の塩基配列を決定した。
また、Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ ｓｐ． ＡＪ１１０３４８株に関しては、数種類の酵素を別々に取得する必要がないため、手法を改良し更にショットガンクローニングを継続した。上述したように目的の遺伝子を保持する株が選択的に増殖するような簡便なスクリーニングでは酵素遺伝子の取得には至らなかったため、発明者は、後述するように、各クローンの活性を個別に確認するという非常に時間の掛かる作業を実施し、目的の酵素遺伝子の取得に成功した。
上述のように、非常に多くの工夫を重ねながら、本発明を完成させた。
【００１１】
即ち、本発明は以下の各態様に係るものである。
［態様１］下記のいずれか一つに示す蛋白質をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号８で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ）配列番号８で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Ｎ−アセチル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼ活性を有する蛋白質、及び
（ｃ）配列番号８で示されるアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む蛋白質であり、かつ、Ｎ−アセチル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼ活性を有する蛋白質。
［態様２］下記のいずれか一つに示すＤＮＡを含む遺伝子。
（ａ）配列番号７に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）配列番号７に示される塩基配列の相補鎖を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Ｎ−アセチル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼ活性
を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、及び
（ｃ）配列番号７に示される塩基配列のＤＮＡと７０％以上の配列同一性を示すＤＮＡまたはその部分断片であり、かつ、Ｎ−アセチル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
［態様３］下記のいずれか一つに示す蛋白質をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号１０で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ）配列番号１０で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Ｎ−アセチル−（Ｓ）−β−アミノ酸アシラーゼ活性を有する蛋白質、及び
（ｃ）配列番号１０で示されるアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む蛋白質であり、かつ、Ｎ−アセチル−（Ｓ）−β−アミノ酸アシラーゼ活性を有する蛋白質。
［態様４］下記のいずれか一つに示すＤＮＡを含む遺伝子。
（ａ）配列番号９に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）配列番号９に示される塩基配列の相補鎖を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Ｎ−アセチル−（Ｓ）−β−アミノ酸アシラーゼ活性
を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、及び
（ｃ）配列番号９に示される塩基配列のＤＮＡと７０％以上の配列同一性を示すＤＮＡまたはその部分断片であり、かつ、Ｎ−アセチル−（Ｓ）−β−アミノ酸アシラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
［態様５］下記のいずれか一つに示す蛋白質をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号１２で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ）配列番号１２で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Ｎ−アセチル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼ活性を有する蛋白質、及び
（ｃ）配列番号１２で示されるアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む蛋白質であり、かつ、Ｎ−アセチル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼ活性を有する蛋白質。
［態様６］下記のいずれか一つに示すＤＮＡを含む遺伝子。
（ａ）配列番号１１に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１１に示される塩基配列の相補鎖を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Ｎ−アセチル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼ活性
を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、及び
（ｃ）配列番号１１に示される塩基配列のＤＮＡと７０％以上の配列同一性を示すＤＮＡまたはその部分断片であり、かつ、Ｎ−アセチル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
［態様７］ β−アミノ酸がβ−フェニルアラニン、β−ロイシン、β−ホモロイシン、β−ホモフェニルアラニン、β−チロシン、β−４−フルオロフェニルアラニン、β−アミノブチル酸、3,4-(-O-CH2-O-)-β−フェニルアラニン、及びβ−３−ピリジル−アラニンからなる群から選ばれるいずれかである、態様１〜６のいずれか一項に記載の遺伝子。
［態様８］下記のいずれか一つに示す蛋白質。
（ａ）配列番号８で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ）配列番号８で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Ｎ−アセチル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼ活性を有する蛋白質、及び
（ｃ）配列番号８で示されるアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む蛋白質であり、かつ、Ｎ−アセチル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼ活性を有する蛋白質。
［態様９］下記のいずれか一つに示す蛋白質。
（ａ）配列番号１０で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ）配列番号１０で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Ｎ−アセチル−（Ｓ）−β−アミノ酸アシラーゼ活性を有する蛋白質、及び
（ｃ）配列番号１０で示されるアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む蛋白質であり、かつ、Ｎ−アセチル−（Ｓ）−β−アミノ酸アシラーゼ活性を有する蛋白質。
［態様１０］下記のいずれか一つに示す蛋白質。
（ａ）配列番号１２で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ）配列番号１２で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Ｎ−アセチル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼ活性を有する蛋白質、及び
（ｃ）配列番号１２で示されるアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む蛋白質であり、かつ、Ｎ−アセチル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼ活性を有する蛋白質。
［態様１１］β−アミノ酸がβ−フェニルアラニン、β−ロイシン、β−ホモロイシン、β−ホモフェニルアラニン、β−チロシン、β−４−フルオロフェニルアラニン、β−アミノブチル酸、3,4-(-O-CH2-O-)-β−フェニルアラニン、及びβ−３−ピリジル−アラニンからなる群から選ばれるいずれかである、態様８から１０いずれか一項に記載のβ−アミノ酸アシラーゼ。
[態様１２] 態様１から６のいずれか一項記載の遺伝子によって形質転換された微生物。
[態様１３] 態様１から６のいずれか一項記載の遺伝子によって形質転換された微生物であるEscherichia coli。
[態様１４] 態様１２記載の微生物をＮ−アセチル−β−アミノ酸に接触させ、β−アミノ酸を生成させ、これを回収することを特徴とするβ−アミノ酸の製造法。
[態様１５] 態様１２記載の微生物から得られるＮ−アセチル−β−アミノ酸アシラーゼ活性を有する蛋白質をＮ−アセチル−β−アミノ酸に接触させ、β−アミノ酸を生成させ、これを回収することを特徴とするβ−アミノ酸の製造法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によって、Ｎ−アセチル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼ及びＮ−アセチル−（Ｓ）−β−アミノ酸アシラーゼが単離同定され、更に、それらの遺伝子がクローニングされ、その塩基配列及びその遺伝子がコードする蛋白質のアミノ酸配列が明らかにされた。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】精製したＮ−アセチル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼ（Ａ）およびＮ−アセチル−（Ｓ）−β−アミノ酸アシラーゼ（Ｂ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる観察結果を示したものである。
【図２】Ｎ−アセチル−（Ｒ，Ｓ）−β−Ｐｈｅを基質、精製したＮ−アセチル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼまたはＮ−アセチル−（Ｓ）−β−アミノ酸アシラーゼを酵素源として変換を行った結果をＨＰＬＣにて解析した結果である。ＡはＮ−アセチル−（Ｒ，Ｓ）−β−Ｐｈｅのみで酵素を添加していない場合、ＢおよびＣはそれぞれ（Ｒ）−β−Ｐｈｅおよび（Ｓ）−β−Ｐｈｅ標準標品、Ｄ及びＥはＮ−アセチル−（Ｒ，Ｓ）−β−ＰｈｅをＮ−アセチル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼまたはＮ−アセチル−（Ｓ）−β−アミノ酸アシラーゼで変換した結果をそれぞれ示している。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の遺伝子
本発明の遺伝子は、Ｎ−アセチル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼ又はＮ−アセチル−（Ｓ）−β−アミノ酸アシラーゼをコードするものであり、これらの酵素は、夫々、分子量約８４ｋＤａ及び分子量約４１ｋＤａのサブユニット（構成単位）から成るホモダイマー又はホモトライマーの構造を有している。従って、より具体的には、本発明の遺伝子は、これらの各サブユニットであるポリペプチドをコードするものである。これらの酵素の代表例は、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ． ＡＪ １１０３４９（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０３６６）が産生するものであり、その具体的なアミノ酸配列の一例は、夫々、配列番号８及び配列番号１０に示されたものである。これらの酵素の別の代表例は、Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ ｓｐ． ＡＪ １１０３４８（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０３６７）が産生するものであり、その具体的なアミノ酸配列の一例は、配列番号１２に示されたものである。尚、本発明において、Ｎ−アセチル−（Ｒ，Ｓ）−β−アミノ酸アシラーゼの代表例として、Ｎ−アセチル−（Ｒ，Ｓ）−β−フェニルアラニン（Ｐｈｅ）アシラーゼを挙げることが出来る。Ｎ−アセチル−（Ｒ，Ｓ）−β−アミノ酸アシラーゼが、Ｒ体特異的な活性を有するか、Ｓ体特異的な活性を有するかは、Ｎ−アセチル−（Ｒ，Ｓ）−β−フェニルアラニンを基質として決定する。本発明のＮ−アセチル−（Ｒ，Ｓ）−β−アミノ酸アシラーゼは、α−アミノ酸のＤ体とＬ体を認識するかのごとく、側鎖、アミノ基、カルボキシル基、水素の相対位置を認識する。一方、ＲＳ表記では、β位に結合する側鎖によっては、−Ｃ−ＣＯＯＨと順位法則の優先性が入れ替わることがある。例えば、後述の実施例に示す、Ｎ−アセチル−β−ｈｏｍｏＬｅｕとＮ−アセチル−β−ｈｏｍｏＰｈｅの場合は、Ｎ−アセチル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼからＳ体が、Ｎ−アセチル−（Ｓ）−β−アミノ酸アシラーゼからＲ体がそれぞれ生成している。
【００１５】
又、本明細書において、「Ｎ−アセチル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼ活性又はＮ−アセチル−（Ｓ）−β−アミノ酸アシラーゼ活性を有する蛋白質」とは、ホモダイマー又はホモトライマーの構造を有する各アシラーゼ酵素の構成単位となり得る（構成単位としての機能を有する）蛋白質（ポリペプチド）をも意味する。
【００１６】
本発明遺伝子は当業者に公知の方法で調製することが出来る。
例えば、本明細書の実施例に記載された方法に従い、各プローブを用いるコロニーハイブリダイズによる他、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ． ＡＪ １１０３４９（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０３６６）またはＶａｒｉｏｖｏｒａｘ ｓｐ． ＡＪ １１０３４８（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０３６７）のゲノムＤＮＡを鋳型として、本明細書に開示された本発明ＤＮＡの塩基配列又はアミノ酸配列の情報に基づき適当な作製されるプライマーを使用した、当業者に公知の任意のＰＣＲにより増幅して調製することも出来る。
【００１７】
例えば、９４℃で２分の後、９４℃で１０秒、５５℃で２０秒、７２℃で２分を３０サイクル行い、最後に７２℃で５分を行う。なお、サーマルサイクラーとしては、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製９６００など一般のサーマルサイクラーを用いることができる。耐熱性 ＤＮＡポリメラーゼとしては、ＥｘＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造製）などの一般の市販品を用い、反応液の組成はポリメラーゼに添付の説明書に従って実施する。
【００１８】
更に、当業者に周知の化学合成によって、本発明の各遺伝子を調製することも出来る。
【００１９】
本明細書において、「ストリンジェントな条件下」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件が挙げられる。なお、塩基配列間の同一性は、Ｂｌａｓｔ等の当業者に公知のアルゴリズムを用いて決定することができる。より具体的には、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。このような条件でハイブリダイズするＤＮＡの中には途中にストップコドンが発生したものや、活性中心の変異により活性を失ったものも含まれるが、それらについては、所定のＮ−アセチル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼ又はＮ−アセチル−（Ｓ）−β−アミノ酸アシラーゼ活性を後述の方法で測定し取り除くことができる。
【００２０】
ハイブリダイゼーションは、例えば、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ（ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， １９８７））に記載の方法等、当業界で公知の方法あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。また、市販のライブ、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
【００２１】
本発明の蛋白質
本発明の遺伝子がコードする蛋白質の中で、Ｎ−アセチル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼ又はＮ−アセチル−（Ｓ）−β−アミノ酸アシラーゼを構成するユニットポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号８、配列番号１０又は配列番号１２）において、１個若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、又は付加を含むアミノ酸配列を有する蛋白質であって、上記酵素活性を有するものは、当業者に公知の任意の方法、例えば、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法、及びＰＣＲ法等の当業者に周知の方法を適宜組み合わせて、容易に作成することが可能である。
【００２２】
尚、その際に、実質的に同等の機能を有するためには、当該ポリペプチドを構成するアミノ酸のうち、同族アミノ酸（極性β非極性アミノ酸、疎水性β親水性アミノ酸、陽性β陰性荷電アミノ酸、芳香族アミノ酸など）同士の置換が可能性として考えられる。又、実質的に同等の機能の維持のためには、本発明の各ポリペプチドに含まれる機能ドメイン内のアミノ酸は保持されることが望ましい。
【００２３】
更に、本発明の蛋白質として、上記のアミノ酸配列と、全体の平均で約７０％、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、更に好ましくは約９５％以上であるような高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む蛋白質又はその断片であって、所定のＮ−アセチル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼ又はＮ−アセチル−（Ｓ）−β−アミノ酸アシラーゼを有するものを挙げることができる。尚、アミノ酸配列間の同一性も、当業者に公知のアルゴリズム、例えば、実施例で使用されているＢｌａｓｔ を用いて決定することができる。又、上記酵素の活性は本明細書の実施例に記載した方法で測定することが出来る。又、このような蛋白質も、当業者に公知の任意の方法、例えば、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法、及びＰＣＲ法等の当業者に周知の方法を適宜組み合わせて、容易に作成することが可能である。
尚、本発明のβ-アミノ酸は、下記の構造式で示される。
【００２４】
【化１】
【００２５】
構造式中、Ｒは、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数６〜１４のアリール基、炭素数３〜１０のシクロアルキル基、炭素数７〜１９のアラルキル基、炭素数２〜１１のアルコキシアルキル基、これらの炭素骨格中にヘテロ原子を含む基、およびこれらの炭素骨格中に炭素−炭素不飽和結合を含む基からなる群より選ばれ、これらの基は直鎖であっても分岐していてもよく、さらに置換基を有していてもよい。好ましくは、Ｒは、炭素数１〜４のアルキル基、炭素数６〜７のアリール基、これらの基は直鎖であっても分岐していてもよく、さらに置換基を有していてもよい。好ましくは、β−アミノ酸は、β−フェニルアラニン、β−ロイシン、β−ホモロイシン、β−ホモフェニルアラニン、β−チロシン、β−４−フルオロフェニルアラニン、β−アミノブチル酸、3,4-(-O-CH2-O-)-β−フェニルアラニン、及びβ−３−ピリジル−アラニンから選ばれる。
【００２６】
本発明の遺伝子の発現
上記で得られた本発明遺伝子を当業者に公知の任意の方法によって組換えベクターに組み込み、本発明の組換え発現ベクターを作成することが出来る。
例えば、（１）本発明の遺伝子を含有するＤＮＡ断片を切り出し、（２）該ＤＮＡ断片を適当な組換えベクター中の制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入して該ベクターに連結する挿入することにより製造することができる。組換えベクターに特に制限はなく、例えば、麹菌由来のプラスミド（例えば、ｐＳａｌ２３， ｐＴＡｅｘ３， ｐＮＧＵ１１３， ｐＲＢＧ１， ｐＧＭ３２， ｐＳＥ５２， ｐＮＡＧＬ１４２等）、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＴ７Ｂｌｕｅ Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ、ｐＲＳＥＴ、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１１８）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４）、及び、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５）、等の組換えベクター等を利用することが出来る。
【００２７】
上記組換えベクターには、以上の他に、本発明の転写調節配列の活性を損なわない限り、所望により当該技術分野で公知のプロモーター等の各種転写調節要素、シャイン・ダルガルノ配列、選択マーカー、転写終結シグナル等を付加することができる。また、必要に応じて、本発明の外来遺伝子にコードされた所望の蛋白質を他の蛋白質又はペプチド（例えば、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、ヒスチジンタグ、カルモデュリンバインディング蛋白質、及びプロテインＡ等）との融合蛋白質として発現させることも可能である。このような融合蛋白質は、適当なプロテアーゼを使用して切断し、それぞれの蛋白質に分離することが出来る。
【００２８】
本発明の遺伝子が有効に発現される限り、本発明の組換え発現ベクターを有する微生物（形質転換体）を調製するために使用する宿主の種類及び由来等に特に制限はなく、例えば、大腸菌のような原核細胞、又はサッカロマイセス・セレビシエ（パン酵母）真核細胞等の当業者に公知の任意の微生物細胞を使用することが可能である。
【００２９】
これら宿主細胞の形質転換は、例えば、塩化カルシウム法、パーティクルガン、エレクトロポレーション法等の、当該技術分野で公知の方法に従って行うことが出来る。例えば、以下に記載の文献を参照することが出来る。Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ６９巻、２１１０（１９７２）； Ｇｅｎｅ， １７巻、１０７（１９８２）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８巻， １１１（１９７９）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４巻、１８２−１８７（１９９１）；Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ）、７５巻、１９２９（１９７８）；細胞工学別冊８ 新細胞工学実験プロトコール。２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）；及びＶｉｒｏｌｏｇｙ、５２巻、４５６（１９７３）。
【００３０】
このようにして得られた、本発明の形質転換体は、当該技術分野で公知の方法に従って培養することが出来る。
【００３１】
本発明における蛋白質の製造に際しては、当業者に公知の方法を適宜選択することができる。例えば、該蛋白質を含む培養液から、例えば、各種クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等の当業者に公知の方法を適宜選択、組み合わせることによって、実質的に純粋で均一な蛋白質として分離、精製することができる。
【００３２】
更に、蛋白質をグルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼ蛋白質との融合蛋白質、又はヒスチジンを複数付加させた組換え蛋白質として発現させた場合には、発現させた組換え蛋白質はグルタチオンカラムあるいはニッケルカラムを用いて精製することができる。融合蛋白質の精製後、必要に応じて、目的の蛋白質以外の領域を、トロンビンまたはファクターＸａなどにより切断し、除去することも可能である。或いは、トリプシン、キモトリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グルコシダーゼ等の適当な蛋白質修飾酵素で、精製前又は精製後に蛋白質を処理することにより、任意に修飾を加えたり、部分的にペプチドを除去することもできる。
【００３３】
本発明は、Ｎ−アセチル−β−アミノ酸アシラーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子で形質転換された微生物をＮ−アセチル−β−アミノ酸に接触させ、β−アミノ酸を生成させ、これを回収することを特徴とするβ−アミノ酸の製造法を提供する。また、同微生物から得られるＮ−アセチル−β−アミノ酸アシラーゼ活性を有する蛋白質をＮ−アセチル−β−アミノ酸に接触させ、β−アミノ酸を生成させ、これを回収することを特徴とするβ−アミノ酸の製造法を提供する。
本発明の製造法において、各アシラーゼを作用させる様式、方法、及び条件等は、Ｎ−アセチル−β−アミノ酸の種類及び量、各アシラーゼの種類、製造規模等の諸要件に応じて、当業者に公知の任意のものを適宜選択することが出来る。
例えば、本発明の菌体の懸濁液中にＮ−アセチル−β−アミノ酸を添加したり、又は、該菌体の破砕液上清中にＮ−アセチル−β−アミノ酸を添加することにより該アシラーゼを作用させることが出来る。
反応温度は、好ましくは１０〜６０℃、より好ましくは２０〜４０℃である。また、反応系のｐＨは、好ましくは４〜１０であり、より好ましくは６〜９である。また、反応時間は１０分〜１２０時間、好ましくは、１〜６０時間、より好ましくは１〜４８時間である。反応溶媒は、水溶液、ＭｅＯＨ、ＤＭＦ、ＤＭＳＯなどを用いることもできるし、それらを混合して使用することも可能である。
【実施例】
【００３４】
以下の実施例を示し、本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらによって制限されるものではない。
【００３５】
１．試薬
（Ｒ，Ｓ）−β−Ｐｈｅ（ＤＬ−３−ａｍｉｎｏ−３−ｐｈｅｎｙｌ−ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社より購入した。（Ｒ）−β−Ｐｈｅ及び（Ｓ）−β−Ｐｈｅは渡辺化学より購入した。
その他β−アミノ酸は下記のメーカーより購入した。
（R,S）−β−Ｌｅｕ（ＤＬ−β−Ｌｅｕｃｉｎｅ 、Ｆｌｕｋａ社）；
（R）−β−Ｌｅｕ（Ｌ−β−Ｌｅｕｃiｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、Ｆｌｕｋａ社）；
（R,S）−β−ｈｏｍｏＰｈｅ（ＤＬ−β−Ｈｏｍｏｐｈｙｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ、Ｆｌｕｋａ社）；
（S）−β−ｈｏｍｏＰｈｅ（Ｌ−β−Ｈｏｍｏｐｈｙｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、Ｆｌｕｋａ社）；
（R,S）−β−ｈｏｍｏＬｅｕ（３−ａｍｉｎｏ−５−ｍｅｔｈｙｌ−ｈｅｘａｎｏｉｃ acｉｄ、Ａｓｔａｔｅｃｈ， Ｉｎｃ．社）；
（R）−β−ｈｏｍｏＬｅｕ（（Ｒ）−３−ａｍｉｎｏ−５−ｍｅｔｈｙｌ−ｈｅｘａｎｏｉｃ acｉｄ、Ａｓｔａｔｅｃｈ， Ｉｎｃ．社）；
（R,S）−β−Ｔｙｒ（３−ａｍｉｎｏ−３−（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−ｐｒｏｐａｎｏｉｃ acｉｄ、Ｂｉｏｎｅｔ Ｂｕｉｌｄｉｎｇ Ｂｌｏｃｋｓ社）；
（R）−β−Ｔｙｒ（（Ｒ）−３−ａｍｉｎｏ−３−（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−ｐｒｏｐａｎｏｉｃ acｉｄ、Ｐｅｐｔｅｃｈ社）；
（R,S）−４−Ｆｌｕｏｒｏ−β−Ｐｈｅ（３−ａｍｉｎｏ−３−（４−ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−ｐｒｏｐａｎｏｉｃ acｉｄ、Ｂｉｏｎｅｔ Ｂｕｉｌｄｉｎｇ Ｂｌｏｃｋｓ社）；
（R）−４−Ｆｌｕｏｒｏ−β−Ｐｈｅ（（Ｒ）−３−ａｍｉｎｏ−３−（４−ｆｌｕｏｒｏ−ｐｈｅｎｙｌ）−ｐｒｏｐａｎｏｉｃ acｉｄ、Ｐｅｐｔｅｃｈ社）；及び
（R,S）-β−３−Ｐｙｒ−Ａｌａ（３−ａｍｉｎｏ−３−（３−ｐｙｒｉｄｙｌ）−ｐｒｏｐａｎｏｉｃ ａｃｉｄ、Ｂａｃｈｅｍ社）；
【００３６】
２．合成
各種Ｎ−アセチル−β−アミノ酸は、ラセミ体はラセミ体のβ−アミノ酸を、光学活性体は各光学活性体のβ−アミノ酸をアセチル化して合成した。合成法は以下に示すとおりである。なお、新規物質に関しては、NMRの解析結果を記載した。
２−１．Ｎ−アセチル−（Ｒ，Ｓ）−β−Ｐｈｅの合成
（Ｒ，Ｓ）−β−Ｐｈｅ（５０ｇ，３０３ｍｍｏｌ）を水２００ｍｌに懸濁させ、氷冷下２５％ ＮａＯＨ水溶液を加え、ｐＨ１１−１２に調節した。得られた水溶液のｐＨが１１−１２の範囲をできるだけ保つように２５％ＮａＯＨ水溶液でｐＨを調節しながら、滴下ロートで無水酢酸（６２．８ｍｌ，６６４ｍｍｏｌ）を室温で滴下した。一晩撹拌後、反応混合物の分析を行ったところ原料の残存が認められたため、さらに無水酢酸（６ｍｌ，６３ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物をろ過し、不溶物を除去した後、得られた溶液に濃塩酸を加え、ｐＨを２に調節し結晶を析出させた。結晶をろ過し、水で洗浄し、減圧下６０℃で一晩乾燥し、Ｎ−アセチル−（Ｒ，Ｓ）−β−Ｐｈｅ（５６．９ｇ，２７４．３ｍｍｏｌ，９１％）を得た。
【００３７】
２−２．Ｎ−アセチル−（Ｓ）−β−Ｐｈｅの合成
（Ｓ）−β−Ｐｈｅ（２５０ｍｇ，１．５１ｍｍｏｌ）を水５ｍｌに懸濁させ、氷冷下２０％ ＮａＯＨ水溶液を加え、ｐＨ１１−１２に調節した。得られた水溶液のｐＨが１１−１２の範囲をできるだけ保つように２０％ＮａＯＨ水溶液でｐＨを調節しながら、無水酢酸（０．３３ｍｌ，３．４９ｍｍｏｌ）を室温で滴下した。反応混合物をろ過し、不溶物を除去した後、得られた溶液に濃塩酸を加え、ｐＨを２に調節し結晶を析出させた。結晶をろ過し、水で洗浄し、減圧下５０℃で一晩乾燥し、Ｎ−アセチル−（Ｓ）−β−Ｐｈｅ（２３８ｍｇ，１．１５ｍｍｏｌ，７６％）を得た。
【００３８】
２−３．Ｎ−アセチル−（Ｒ）−β−Ｐｈｅの合成
（Ｒ）−β−Ｐｈｅ塩酸塩（２５０ｍｇ，１．２４ｍｍｏｌ）を水５ｍｌに懸濁させ、氷冷下２０％ ＮａＯＨ水溶液を加え、ｐＨ１１−１２に調節した。得られた水溶液のｐＨが１１−１２の範囲をできるだけ保つように２０％ＮａＯＨ水溶液でｐＨを調節しながら、無水酢酸（０．２８ｍｌ，２．９６ｍｍｏｌ）を室温で滴下した。反応混合物をろ過し、不溶物を除去した後、得られた溶液に濃塩酸を加え、ｐＨを２に調節し結晶を析出させた。結晶をろ過し、水で洗浄し、減圧下５０℃で一晩乾燥し、Ｎ−アセチル−（Ｒ）−β−Ｐｈｅ（２３６ｍｇ，１．１３ｍｍｏｌ，９１％）を得た。
【００３９】
２−４．Ｎ−アセチル−（R,S）-β−Ｌｅｕの合成
（R,S）-β−Ｌｅｕ（９９５ｍｇ、７．５８ｍｍｏｌ）を水８ｍｌに懸濁させ、２０％ ＮａＯＨ水溶液を加え、ｐＨ１１−１２に調節した。得られた水溶液のｐＨが１１−１２の範囲をできるだけ保つように２０％ＮａＯＨ水溶液でｐＨを調節しながら、無水酢酸（１．３ｍｌ、１３．３ｍｍｏｌ）を室温で滴下した。反応混合物をろ過し、不溶物を除去した後、得られた溶液に濃塩酸を加え、ｐＨを２に調節し結晶を析出させた。結晶をろ過し、水で洗浄し、減圧下５０℃で一晩乾燥し、Ｎ−アセチル−（R,S）-β−Ｌｅｕ（３８２ｍｇ、２．２１ｍｍｏｌ、２９．０％）を得た。
ＥＳＩ−ＭＳ ［Ｍ−Ｈ］＝１７２
【００４０】
２−５．Ｎ−アセチル−（R,S）-β−ｈｏｍｏＰｈｅの合成
（R,S）-β−ｈｏｍｏＰｈｅ（１９８ｍｇ、１．１２ｍｍｏｌ）を水５ｍｌに懸濁させ、２０％ ＮａＯＨ水溶液を加え、ｐＨ１１−１２に調節した。得られた水溶液のｐＨが１１−１２の範囲をできるだけ保つように２０％ＮａＯＨ水溶液でｐＨを調節しながら、無水酢酸（０．２４ｍｌ、２．４６ｍｍｏｌ）を室温で滴下した。反応混合物をろ過し、不溶物を除去した後、得られた溶液に濃塩酸を加え、ｐＨを２に調節し結晶を析出させた。結晶をろ過し、水で洗浄し、減圧下５０℃で一晩乾燥し、Ｎ−アセチル−（R,S）-β−ｈｏｍｏＰｈｅ（６４．５ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ，３２．１％）を得た。
ＥＳＩ−ＭＳ ［Ｍ−Ｈ］＝２２０
【００４１】
２−６．Ｎ−アセチル−（R,S）-β−ｈｏｍｏＬｅｕの合成
（R,S）-β−ｈｏｍｏＬｅｕ（１．０１ｇ、６．９ｍｍｏｌ）を水１６ｍｌに懸濁させ、２０％ ＮａＯＨ水溶液を加え、ｐＨ１１−１２に調節した。得られた水溶液のｐＨが１１−１２の範囲をできるだけ保つように２０％ＮａＯＨ水溶液でｐＨを調節しながら、無水酢酸（１．３５ｍｌ、１３．８ｍｍｏｌ）を室温で滴下した。反応混合物をろ過し不溶物を除去した後、得られた溶液に濃塩酸を加え、ｐＨを２に調節し結晶を析出させた。結晶をろ過し、水で洗浄し、減圧下５０℃で一晩乾燥し、Ｎ−アセチル−（R,S）-β−ｈｏｍｏＬｅｕ（６４．５ｍｇ、５．０７ｍｍｏｌ、７３．１％）を得た。この生成物は減圧乾燥により溶解、凝固していたが、ＮＭＲにより確認し、求める物質が生成していたのでそのまま反応に用いた。
ＥＳＩ−ＭＳ ［Ｍ−Ｈ］＝１８６
【００４２】
２−７．Ｎ−アセチル−（R,S）-β−Ｔｙｒの合成
（R,S）-β−Ｔｙｒ（２０２ｍｇ、１．１６ｍｍｏｌ）を水１６ｍｌに懸濁させ、２０％ ＮａＯＨ水溶液を加え、ｐＨ１１−１２に調節した。得られた水溶液のｐＨが１１−１２の範囲をできるだけ保つように２０％ＮａＯＨ水溶液でｐＨを調節しながら、無水酢酸（０．３３ｍｌ、３．３９ｍｍｏｌ）を室温で滴下した。反応混合物をろ過し不溶物を除去した後、得られた溶液に濃塩酸を加え、ｐＨを２に調節し、エバポレーターで濃縮し結晶を析出させた。結晶をろ過し水で洗浄し、減圧下５０℃で一晩乾燥し、Ｎ−アセチル−（R,S）-β−Ｔｙｒ（５５．５ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ、２１．４％）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ， Ｄ２Ｏ）； ２．０５ （ｓ， ３Ｈ）， ２．６０−２．７０（ｍ， ２Ｈ）， ５．１（ｄｄ， １Ｈ， Ｊ＝７．５ , ７．５ Ｈｚ）， ６．８８（ｄ， ２Ｈ， Ｊ＝８．６ Ｈｚ）， ７．２６ （ｄ， ２Ｈ， Ｊ＝８．６ Ｈｚ）
ＥＳＩ−ＭＳ ［Ｍ−Ｈ］＝２２２
【００４３】
２−８．Ｎ−アセチル−（R,S）-４−Ｆｌｕｏｒｏ−β−Ｐｈｅの合成
（R,S）-４−Ｆｌｕｏｒｏ−β−Ｐｈｅ（２０６ｍｇ、１．１２ｍｍｏｌ）を水１６ｍｌに懸濁させ、２０％ ＮａＯＨ水溶液を加え、ｐＨ１１−１２に調節した。得られた水溶液のｐＨが１１−１２の範囲をできるだけ保つように２０％ＮａＯＨ水溶液でｐＨを調節しながら、無水酢酸（０．２２ｍｌ、２．２６ｍｍｏｌ）を室温で滴下した。反応混合物をろ過し不溶物を除去した後、得られた溶液に濃塩酸を加え、ｐＨを２に調節し、エバポレーターで濃縮し結晶を析出させた。結晶をろ過し、水で洗浄し、減圧下５０℃で一晩乾燥し、Ｎ−アセチル−（R,S）-４−Ｆｌｕｏｒｏ−β−Ｐｈｅ（１４３．９ｍｇ，０．６４ｍｍｏｌ，５７．１％）を得た。
ＥＳＩ−ＭＳ ［Ｍ−Ｈ］＝２２４
【００４４】
以上の生成物は結晶を取得後に、ＮＭＲにてチャートを確認し、質量分析を行い目的化合物の生成を確認した。
【００４５】
２−９．Ｎ−アセチル−（R,S）-β−ａｍｉｎｏｂｕｔｙｌｉｃ ａｃｉｄの合成
３−アセトアミド−２−ブテン酸メチルはＪ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ． ２００２， １２４， １４５５２記載の方法に従い調製した。
３−アセトアミド−２−ブテン酸メチル（１．３５ｇ）のメタノール溶液に５％パラジウム−活性炭を加え、１気圧の水素下、３０℃で１６時間撹拌した。反応終了後、ろ過にて５％パラジウム−活性炭を除き、得られた溶液を濃縮して３−アセトアミド−２−酪酸メチル（１．３７ｇ）を得た。
続いて得られた３−アセトアミド−２−ブテン酸メチル（５７０ｍｇ）のエタノール溶液３ｍＬに８Ｍ水酸化水溶液（９００μＬ）を加え、３５℃で１時間撹拌した。反応終了後、６Ｍ塩酸（１．２ｍＬ）を加え中和し、濃縮してジクロロメタン（２０ｍＬ）を加えた。析出した結晶をろ過にて取り除き、ろ液を濃縮して表題化合物２６５ｍｇを得た。
ＮＭＲにて、目的化合物の生成を確認した。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ， ＭｅＯＨ−ｄ４）； １．４１ （ｑ， ３Ｈ， Ｊ＝２．６ Ｈｚ）， １．９９ （ｓ， ３Ｈ）， ２．５５ （ｔ， ２Ｈ， Ｊ＝５．１ Ｈｚ）， ４．２８（ｍ， １Ｈ）
１３Ｃ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ， ＭｅＯＨ−ｄ４）；１７５．６， １７０．８８， ４２．６２， ４０．２２， ２３．６０， ２０．３４
ＥＳＩ−ＭＳ ［Ｍ−Ｈ］＝１４４
【００４６】
２−１０．Ｎ−アセチル−３，４−（−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−）−β−Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ
ＵＳ２００６００３５３４５記載の方法で作成したものを使用した。
【００４７】
２−１１．Ｎ−アセチル−（R,S）-３−Ｐｙｒ−Ａｌａの合成
β-3-Pyr-Ala（２００ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）を水５ｍｌに懸濁させ、２０％ ＮａＯＨ水溶液を加え、ｐＨ１１−１２に調節した。得られた水溶液のｐＨが１１−１２の範囲をできるだけ保つように２０％ＮａＯＨ水溶液でｐＨを調節しながら、無水酢酸（０．２５７ｍｌ、２．４６ｍｍｏｌ）を室温で滴下した。反応混合物をろ過し、不溶物を除去した後、得られた溶液に濃塩酸を加え、ｐＨを２に調整したが沈殿が析出しなかったため、エバポレーターを用いて総て液体を蒸発させて、乾燥物をNMRにより解析し、反応に用いた。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ， Ｄ２Ｏ）； ２．０３ （ｓ， ３Ｈ）， ２．７８−２．９０（ｍ， ２Ｈ）， ５．３３（ｄｄ， １Ｈ， Ｊ＝７．３, ７．３ Ｈｚ），７．９７（ｄｄ， １Ｈ ， Ｊ＝５．７， ８．２ Ｈｚ）， ８．４９ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝８．２ Ｈｚ）， ８．６７（ｄ， １Ｈ， Ｊ＝５．７ Ｈｚ）， ８．７５（s， １Ｈ，）
ＥＳＩ−ＭＳ ［Ｍ−Ｈ］＝２０７
【００４８】
３．酵素活性測定
３−１．アッセイ条件
１０ ｍＭ Ｎ−アセチル−（Ｒ，Ｓ）−β−Ｐｈｅ， ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ ７．６）および適宜酵素サンプルを含む反応液を３０℃にて１５ｍｉｎから２ｈ静置した後、５ｍｉｎの煮沸処理にて反応を停止した。反応液を遠心し、その上清を適宜希釈して、ＨＰＬＣにて分析した。この標準反応条件にて、１ｍｉｎ間に１μｍｏｌの（Ｒ）−β−Ｐｈｅまたは（Ｓ）−β−Ｐｈｅを生成するアシラーゼ活性を１ Ｕｎｉｔと定義した。以後Ｎ−アセチル−（Ｒ，Ｓ）−β−Ｐｈｅから（Ｒ）−β−Ｐｈｅを生成する活性をＮ−アセチル−（Ｒ）−β−Ｐｈｅアシラーゼ活性、（Ｓ）−β−Ｐｈｅを生成する活性をＮ−アセチル−（Ｓ）−β−Ｐｈｅアシラーゼ活性と記述する。
３−２．ＨＰＬＣ
【００４９】
３−２−１．(Ｒ)，(Ｓ)−β−Ｐｈｅ光学分割条件
（Ｒ）−β−Ｐｈｅ、（Ｓ）−β−Ｐｈｅ、Ｎ−アセチル−（Ｒ）−β−ＰｈｅおよびＮ−アセチル−（Ｓ）−β−ＰｈｅはＨＰＬＣによって定量分析した。カラムはジーエルサイエンス社製Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ３（０．４６ｃｍΦ， ５ｃｍ）とダイセル化学社製Ｃｈｉｒａｌｐａｋ ＷＨ（０．４６ｃｍΦ， ２５ｃｍ）をこの順に直列につないで用いた。移動相は０．２５ｍＭ ＣｕＳＯ４， ２％（ｖ／ｖ）アセトニトリルとし、流速１．５ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度５０℃、検出はＵＶ ｄｅｔｅｃｔｏｒ ２１０ｎｍとした。この分析で上記４種化合物は異なる溶出時間に溶出し、溶出順は早いほうから（Ｓ）−β−Ｐｈｅ、（Ｒ）−β−Ｐｈｅ、Ｎ−アセチル−（Ｒ）−β−Ｐｈｅ、Ｎ−アセチル−（Ｓ）−β−Ｐｈｅの順であった。定量は、各標準標品を対照とし、ピークエリア値から算出した。
【００５０】
３−２−２． Ｎ−アセチル−β−Ｐｈｅとβ−Ｐｈｅの分離条件
カラムはＧＬサイエンス社製Ｉｎｅｒｔｓｉｌ Ｐｈ−３（０．４６ｃｍΦ、２５ｃｍ）を用いた。移動相に１０％アセトニトリル（リン酸にてｐＨ３．０に調整）を用い、温度４０℃、流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ、検出ＵＶ２１０ｎｍの条件で各ラセミ体標準品を対照とし、ピークエリア値から算出し定量した。
【００５１】
３−２−３． (Ｒ),(Ｓ)−β−Ｌｅｕ、(Ｒ)，(Ｓ)−β−ｈｏｍｏＬｅｕ、(Ｒ)，(Ｓ)−β−ｈｏｍｏＰｈｅ分割条件
カラムはａｓｔｅｃ社製ＣＨＩＲＯＢＩＯＴＥＣ Ｔ（０．４６ｃｍΦ、２５ｃｍ）を用いた。移動相に９０％ ＭｅＯＨを用い、温度４０℃、流速０．４ｍＬ／ｍｉｎ、検出ＵＶ２０５ｎｍの条件で、(Ｒ)，(Ｓ)体標準品と比較し、光学選択性を決定した。
【００５２】
３−２−４．(Ｒ)，(Ｓ)−β−Ｔｙｒ、(Ｒ)，(Ｓ)−β−４−Ｆｌｕｏｒｏ−Ｐｈｅ分離条件
カラムはジーエルサイエンス社製Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ３（０．４６ｃｍΦ， ５ｃｍ）とダイセル化学社製Ｃｈｉｒａｌｐａｋ ＷＨ（０．４６ｃｍΦ， ２５ｃｍ）をこの順に直列につないで用いた。移動相に１ｍＭ ＣｕＳＯ４、１０％ ＭｅＯＨを用い、温度 ５０℃、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ、検出ＵＶ２１０ｎｍの条件で(Ｒ)，(Ｓ)体標準品と比較し光学選択性を決定した。
【００５３】
４．Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ． ＡＪ１１０３４９由来Ｎ−アセチル−（Ｒ）／（Ｓ）−β−アミノ酸アシラーゼの精製
４−１．使用菌株と培養条件
Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ． ＡＪ１１０３４９を用いた。保存菌株を５ｇ／ｌ Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ， １０ｇ／ｌ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ， １０ｇ／ｌ ｐｅｐｔｏｎｅ， ５ｇ／ｌ ＮａＣｌ， ２０ｇ／ｌ ａｇａｒ （ｐＨ ７．０）から成るＣＭ２Ｇ寒天培地上で、３０℃で４８ｈ静置培養することによりリフレッシュした。これを、１０ｇ／ｌ Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ， １０ｇ／ｌ （ＮＨ４）２ＳＯ４， １０ｇ／ｌ （Ｒ，Ｓ）−β−Ｐｈｅ， ２ｇ／ｌ ｃａｓａｍｉｎｏ ａｃｉｄ， １ｇ／ｌ ＫＨ２ＰＯ４， ０．４ｇ／ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，１ｇ／ｌ ＮａＣｌ， １９．５ｇ／ｌ ２−（Ｎ−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ） ｅｔｈａｎｅｓｕｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ （ＭＥＳ）， ５ｍｇ／ｌ ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ， ０．２ｍｇ／ｌ ｔｈｉａｍｉｎ， １０ｍｇ／ｌ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ， １０ｍｇ／ｌ ＭｎＳＯ４・４〜５Ｈ２Ｏからなる酵素生産培地１００ ｍｌに接種し、５００ｍｌ用の坂口フラスコを用いて３０℃、１２０ｒｐｍで６６ｈ、振盪培養した。
【００５４】
４−２．無細胞抽出液の調製
培養液およそ２，０００ｍｌから、６，８００ｇ，１０ｍｉｎの遠心操作により菌体を集菌した。この際、菌体の沈降が十分に見られなかったため、およそ１，６００ ｍｌの上清を除去し、残りの部分をピペッティングにより均一化した。この濃縮した培養液をバッファー等で洗浄することなく、２００Ｗ， ２０ｍｉｎの超音波処理に供し菌体を破砕した。得られた破砕液を２００，０００ｇ， ３０ｍｉｎ遠心操作し、得られた遠心上清およそ２００ｍｌを無細胞抽出液とした。
【００５５】
４−３．硫安分画
得られた無細胞抽出液に（ＮＨ４）２ＳＯ４を終濃度４０％飽和となるよう加え、氷上１ｈ攪拌した後、９，２００ｇ， １５ｍｉｎ遠心した。得られた沈殿を少量の２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．６）にて溶解後、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）に対して透析した。この透析後の溶液を、以後クロマトグラフィーに供するサンプルとした。
【００５６】
４−４．クロマトグラフィー
４−４−１）Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ２６／１０ （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）
上記で得られた硫安分画画分を２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ７．６）， ０．６Ｍ （ＮＨ４）２ＳＯ４から成る緩衝液に対して透析後、同緩衝液で平衡化したＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ２６／１０に供した。非吸着タンパク質溶出後、緩衝液中の（ＮＨ４）２ＳＯ４濃度を直線的に０．６ Ｍから０ Ｍまで変化させることにより吸着タンパク質を溶出した。この操作によりＮ−アセチル−（Ｒ）−β−Ｐｈｅアシラーゼ活性は、（ＮＨ４）２ＳＯ４濃度およそ０．２Ｍの付近に、Ｎ−アセチル−（Ｓ）−β−Ｐｈｅアシラーゼ活性は（ＮＨ４）２ＳＯ４濃度およそ０．１Ｍの付近にそれぞれ検出された。活性の存在する画分をＮ−アセチル−（Ｒ）−β−Ｐｈｅアシラーゼ溶出画分、Ｎ−アセチル−（Ｓ）−β−Ｐｈｅアシラーゼ活性溶出画分に分けて、それぞれ回収した。
【００５７】
４−４−２）Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ １６／１０ （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍacｉａ）
得られたＰｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ分画画分を濃縮し、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ７．６）に対して透析後、同緩衝液で平衡化したＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ １６／１０に供した。非吸着タンパク質溶出後、緩衝液中のＮａＣｌ濃度を直線的に０ Ｍから０．５Ｍまで変化させることにより吸着タンパク質を溶出した。この操作によりＮ−アセチル−（Ｒ）−β−Ｐｈｅアシラーゼ活性は、ＮａＣｌ濃度およそ０．２２Ｍの付近に、Ｎ−アセチル−（Ｓ）−β−Ｐｈｅアシラーゼ活性はＮａＣｌ濃度およそ０．３Ｍの付近にそれぞれ検出された。活性の存在する画分をそれぞれ回収した。
【００５８】
４−４−３）Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １６／６０ （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）
得られたＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ分画画分を濃縮し、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ７．６）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １６／２０に供した。この操作によりＮ−アセチル−（Ｒ）−β−Ｐｈｅアシラーゼ活性は分子量２０６ｋＤａと見積もられる溶出位置に、Ｎ−アセチル−（Ｓ）−β−Ｐｈｅアシラーゼ活性は分子量１０１ｋＤａと見積もられる溶出位置でそれぞれ検出された。活性の存在する画分をそれぞれ回収した。
【００５９】
４−４−４）Ｒｅｓｏｕｒｃｅ ｐｈｅｎｙｌ （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）
得られたＳｕｐｅｒｄｅｘ分画画分を濃縮し、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ７．６）， ０．６Ｍ （ＮＨ４）２ＳＯ４から成る緩衝液に対して透析後、同緩衝液で平衡化したＲｅｓｏｕｒｃｅ ｐｈｅｎｙｌに供した。非吸着タンパク質溶出後、緩衝液中の（ＮＨ４）２ＳＯ４濃度を直線的に０．６Ｍから０ Ｍまで変化させることにより吸着タンパク質を溶出した。この操作によりＮ−アセチル−（Ｒ）−β−Ｐｈｅアシラーゼ活性は、（ＮＨ４）２ＳＯ４濃度およそ０．３５Ｍの付近に、Ｎ−アセチル−（Ｓ）−β−Ｐｈｅアシラーゼ活性は（ＮＨ４）２ＳＯ４濃度およそ０．４５Ｍの付近にそれぞれ検出された。活性の存在する画分をそれぞれ回収した。
【００６０】
４−４−５）Ｍｏｎｏ Ｑ ５／５ （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）
得られたＲｅｓｏｕｒｃｅ ｐｈｅｎｙｌ分画画分を濃縮し、２５ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ ７．６）に対して透析後、同緩衝液で平衡化したＭｏｎｏ Ｑ ５／５に供した。非吸着タンパク質溶出後、緩衝液中のＮａＣｌ濃度を直線的に０ Ｍから０．５Ｍまで変化させることにより吸着タンパク質を溶出した。この操作によりＮ−アセチル−（Ｒ）−β−Ｐｈｅアシラーゼ活性は、ＮａＣｌ濃度およそ０．２Ｍの付近に、Ｎ−アセチル−（Ｓ）−β−Ｐｈｅアシラーゼ活性はＮａＣｌ濃度およそ０．２８Ｍの付近にそれぞれ検出された。活性の存在する画分をそれぞれ回収し、それぞれ精製Ｎ−アセチル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼ、精製Ｎ−アセチル−（Ｓ）−β−アミノ酸アシラーゼ標品とした。
【００６１】
以上の酵素精製の結果を表１（Ｎ−アセチル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼ）、表２（Ｎ−アセチル−（Ｓ）−β−アミノ酸アシラーゼ）にそれぞれまとめた。この精製操作により、Ｎ−アセチル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼは比活性２６２倍に、Ｎ−アセチル−（Ｓ）−β−アミノ酸アシラーゼは比活性８０９倍にそれぞれ精製された。
【００６２】
【表１】
【００６３】
【表２】
【００６４】
４−５．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
上記で得られた精製Ｎ−アセチル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼおよび精製Ｎ−アセチル−（Ｓ）−β−アミノ酸アシラーゼをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した（Ｆｉｇ．１）。結果、Ｎ−アセチル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼは分子量約８４ｋＤａと見積もられる単一のバンドとして（Ｆｉｇ．１Ａ）、Ｎ−アセチル−（Ｓ）−β−アミノ酸アシラーゼは分子量約４１ｋＤａと見積もられる単一のバンドとして（Ｆｉｇ．１Ｂ）、それぞれ観察された。上記ゲルろ過クロマトグラフィーにおいて、両酵素の未変性状態の分子量はそれぞれ２０６ｋＤａ（Ｎ−アセチル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼ）、１０１ｋＤａ（Ｎ−アセチル−（Ｓ）−β−アミノ酸アシラーゼ）と見積もられたため、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで見積もられた分子量と併せて考えると、何れの酵素もホモダイマーあるいはホモトライマー構造を有している酵素であると考えられた。
【００６５】
４−６．光学特異性
精製酵素を酵素源として、その光学選択性を測定した。上記酵素活性条件において反応時間３０ ｍｉｎ、酵素添加量４．６μｇ／ｍｌ（Ｎ−アセチル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼ）または３．１μｇ／ｍｌ（Ｎ−アセチル−（Ｓ）−β−アミノ酸アシラーゼ）として反応を行った。結果、Ｎ−アセチル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼを酵素源とした場合には（Ｒ）−β−Ｐｈｅの生成のみが観察され、（Ｓ）−β−Ｐｈｅの生成は検出限界以下であった（Ｆｉｇ．２Ｄ）。一方、Ｎ−アセチル−（Ｓ）−β−アミノ酸アシラーゼを酵素源とした場合には（Ｓ）−β−Ｐｈｅの生成のみが観察され、（Ｒ）−β−Ｐｈｅの生成は検出限界以下であった（Ｆｉｇ．２Ｅ）。これらの結果から、両酵素はいずれも高い光学選択性を有していることが示された。
【００６６】
５．Ｎ末端アミノ酸配列解析
精製酵素標品を材料に、そのＮ末端アミノ酸配列を決定した。方法は、酵素標品をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、ＰＶＤＦ膜に転写し、クマシーブルーで染色後、バンドの見られる位置を切り出し、これをプロテインシーケンサーに供することにより行った。結果、Ｎ−アセチル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼの場合は配列番号１に示す２０残基の配列が、Ｎ−アセチル−（Ｓ）−β−アミノ酸アシラーゼの場合は配列番号２に示す２６残基のアミノ酸配列が、それぞれ決定された。
【００６７】
６．遺伝子クローニングと塩基配列決定
決定されたＮ末端アミノ酸配列に基づいて合成プライマーを設計し、Ｔａｋａｒａ社製ＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いて、アシラーゼをコードする遺伝子部分断片の取得を行った。結果、Ｎ−アセチル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼＮ末端近傍をコードする遺伝子領域を含む、５’−ＰｓｔＩ認識配列、３’−ＥｃｏＲＩ認識配列を両端に有する７９４ｂａｓｅのＤＮＡ断片、およびＮ−アセチル−（Ｓ）−β−アミノ酸アシラーゼＮ末端近傍をコードする遺伝子領域を含む、５’−ＰｓｔＩ認識配列、３’−ＳａｌＩ認識配列を両端に有する３９３ｂａｓｅのＤＮＡ断片をそれぞれ得て、その塩基配列を決定した。
【００６８】
塩基配列の決定により得られた情報より、プライマーＲ７Ｆ、Ｒ８Ｒ（配列番号３、４）／プライマーＳ３Ｆ、Ｓ４Ｒ（配列番号５、６）を用いてＢｕｒｋｈｏｌｄｅｌｉａ ｓｐ． ＡＪ１１０３４９のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行いＮ−アセチル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼ／ Ｎ−アセチル−（Ｓ）−β−アミノ酸アシラーゼのＮ末端近傍をコードする遺伝子領域含む０．３ｋｂ／０．４ｋｂのＤＮＡ断片を増幅し、ＤＩＧラベリングを行ってそれぞれをＲ−プローブ／Ｓ−プローブとした。
【００６９】
Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ． ＡＪ１１０３４９染色体ＤＮＡ５μｇをＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ（１００／５０Ｕ）にて切断した後、Ｒ−プローブを用いてサザン解析を行った。ハイブリダイゼーションの条件は、４２℃、１６時間で、ハイブリダイゼーションの溶液にはＤＩＧ Ｅａｓｙ Ｈｙｂ（Ｒｏｃｈｅ社）を用いた。その結果、約５ｋｂにポジティブシグナルを確認した。
【００７０】
次いで、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ． ＡＪ１１０３４９染色体ＤＮＡ５μｇ をＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ（１００／５０Ｕ）処理後、アガロース電気泳動し、５ｋｂ付近の断片を精製し、ｐＵＣ１１８のＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩサイトにライゲートした。この反応液をもちいてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、ライブラリーを作製した。上記プローブをもちいてコロニーハイブリダイズを行い、ポジティブコロニーを取得し、プラスミドを抽出した。得られたプラスミドをｐＢＲＡＣＹ＿Ａ３として、挿入配列について塩基配列を決定したところ、７６０アミノ酸（配列番号８）をコードするＯＲＦ（配列番号７）が存在した。
【００７１】
Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ． ＡＪ１１０３４９染色体ＤＮＡ５μｇをＰｓｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ（各５０Ｕ）にて切断した後、Ｓ−プローブを用いてサザン解析を行った。ハイブリダイゼーションの条件は、４２℃、１６時間で、ハイブリダイゼーションの溶液にはＤＩＧ Ｅａｓｙ Ｈｙｂ（Ｒｏｃｈｅ社）を用いた。その結果、約１．５ｋｂにポジティブシグナルを確認した。
【００７２】
次いで、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ． ＡＪ１１０３４９染色体ＤＮＡ５μｇをＰｓｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ（各５０Ｕ）処理後アガロース電気泳動し、１．５ｋｂ付近の断片を精製し、ｐＵＣ１１８のＰｓｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩサイトにライゲートした。この反応液をもちいてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、ライブラリーを作製した。上記プローブをもちいてコロニーハイブリダイズを行い、ポジティブコロニーを取得し、プラスミドを抽出した。得られたプラスミドをｐＢＳＡＣＹ＿ＰＨとして、挿入配列について塩基配列を決定したところ、３５２アミノ酸（配列番号１０）をコードするＯＲＦ（配列番号９）が存在した。
【００７３】
７． Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ ｓｐ． ＡＪ１１０３４８株由来Ｎ−アセチル−(R)-β−アミノ酸アシラーゼ遺伝子のショットガンクローニングによる取得
Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ ｓｐ．ＡＪ１１０３４８株よりゲノムＤＮＡを抽出し、制限酵素Ｓａｕ３ＡＩにて部分分解した後、約３〜８ｋｂ付近の断片を回収しｐＵＣ１１８へと連結した。この反応液をもちいてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉa cｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、ライブラリーを作製した。
得られた形質転換体をブルーホワイトセレクションにより選別し、単コロニーとして得られた３５００株に対してマスタープレートを作成した。これらの菌株をＮ−アセチル−（Ｒ，Ｓ）−β−Ｐｈｅ液体培地［硫酸アンモニウム１０．０ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ １．０ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．４ｇ／ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １０ｍｇ／ｌ、ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ １０ｍｇ／ｌ、ビタミンＢ１・ＨＣｌ ０．２ｍｇ／ｌ、Ｎ−アセチル−（Ｒ，Ｓ）−β−Ｐｈｅ １．０ｇ／ｌ， ｐＨ８．０、ＩＰＴＧ １００μＭ、Ａｍｐ １００μｇ／ｍｌ］ に１０株ずつ接種し、３７℃、４８時間振とう培養した。
得られた培養上清をＳｉｌｉａｇｅｌ ６０Ｆ２５４プレート（Ｍｅｒｃｋ）、ブタノール：酢酸：水＝４：１：２にて分離し、ＵＶ２５４ｎｍ及びニンヒドリン発色にてβ−Ｐｈｅの生成を確認した。
その結果、混合した培養上清からβ−Ｐｈｅが検出されたので、さらに、１株ずつ同様の手法で培養し、ＴＬＣにて培養上清を確認したところ、Ｋ８３株と命名した株からβ−Ｐｈｅが検出された。
Ｋ８３株のプラスミドＤＮＡを抽出し挿入配列を確認したところ、約３ｋｂの挿入配列が存在した。塩基配列を決定した結果、７７９アミノ酸（配列番号１２）をコードするＯＲＦ（配列番号１１）が存在した。
【００７４】
８．Ｋ８３株の活性測定及び光学選択性の測定
得られたＫ８３株を１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地で３７℃、１６時間前培養した。この培養菌体１ｍＬを、１００ｍｇ／ｌのアンピシリン、１ｍＭ ＩＰＴＧを含むＴＢ培地５０ｍＬに植菌し、３０℃、１６時間培養し得られた菌体を遠心分離にて集菌した。この菌体を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．６）を用いて洗菌し、同緩衝液を用いて菌体懸濁液を調製した。超音波破砕処理によって、菌体を破砕し、遠心分離（１５，０００ｇ、１０分、４℃）により得られる上澄み液を無細胞抽出液として、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、０．２％ Ｎ−アセチル−β−Ｐｈｅ、３７℃、１０分間反応し、Ｎ−アセチル−β−Ｐｈｅとβ−Ｐｈｅの分離条件にてＮ−アセチル−β−アミノ酸アシラーゼ活性を測定したところ、２．３Ｕ／ｍｇであった。
また、β−Ｐｈｅ光学分割条件で、ＨＰＬＣにより光学選択性を決定したところ、(Ｒ)−β−Ｐｈｅ特異的に生成しており、(Ｓ)−β−Ｐｈｅは検出限界以下であった。
【００７５】
９．Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ． ＡＪ１１０３４９由来Ｎ−アセチル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼ高発現株の作成
Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ．ＡＪ１１０３４９染色体ＤＮＡを鋳型として、プライマー Ｒ＿７Ｆ（配列番号１３）、及び Ｒ＿Ｒ＿ＨｉｎｄＩＩＩ（配列番号１４）によりＰＣＲ反応により、得られた２．３ｋｂの増幅断片をＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ処理し、ｐｔｒｐ４（参考文献Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｔａｌｙｓｉｓ Ｂ： Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ３２ （２００５）２０５−２１１）のＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩサイトに挿入し、ｐｔｒｐ４＿３ＢＲとした。このプラスミドによりＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉa cｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換した。この形質転換体をＪＭ１０９／ｐｔｒｐ４＿３ＢＲと命名した。
ＪＭ１０９／ｐｔｒｐ４＿３ＢＲを１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地で３７℃、１６時間前培養した。この培養菌体１ｍＬを、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＭ９カザミノ酸培地５０ｍＬに植菌し、３０℃、１８時間培養し得られた菌体を遠心分離にて集菌した。この菌体を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．６）を用いて洗菌し、同緩衝液を用いて菌体懸濁液を調製した。超音波破砕処理によって、菌体を破砕し、遠心分離（１５，０００ｇ、１０分、４℃）により得られる上澄み液を無細胞抽出液として、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、０．２％ Ｎ−アセチル−（Ｒ，Ｓ）−β−Ｐｈｅ、３７℃、３０分間反応し、生成したβ−Ｐｈｅの量をＨＰＬＣにて測定した。Ｎ−アセチル−β−アミノ酸アシラーゼ活性を測定したところ、０．２９Ｕ／ｍｇであった。また、β−Ｐｈｅ光学分割条件で、ＨＰＬＣにより光学選択性を決定したところ、(Ｒ)−β−Ｐｈｅ特異的に生成しており、(Ｓ)−β−Ｐｈｅは検出限界以下であった。
【００７６】
１０．Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ． ＡＪ１１０３４９由来Ｎ−アセチル−（Ｓ）−β−アミノ酸アシラーゼ高発現株の作成
Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ．ＡＪ１１０３４９染色体ＤＮＡを鋳型として、プライマー Ｓ＿Ｆ＿ＮｄｅＩ＿２（配列番号１５）、及び Ｓ＿Ｒ＿ＨｉｎｄＩＩＩ（配列番号１６）によりＰＣＲ反応により、得られた１．１ｋｂの増幅断片をＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩで処理した。これとは別に、ｐＳＦＮ＿Ｓｍ＿Ａｅｔ（参考文献ＷＯ２００６０７５４８６）をＮｄｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで切断し、３ｋｂ付近のＤＮＡを切り出し精製した。このｐＳＦＮのＮｄｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩサイトに１．１ｋｂＰＣＲ産物を制限酵素にて処理したＤＮＡを挿入し、ｐＳＦＮ＿２ＢＳとした。このプラスミドによりＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉ a cｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換した。この形質転換体をＪＭ１０９／ｐＳＦＮ＿２ＢＳと命名した。
なお、このプラスミドの挿入配列は、配列１０の６残基目のアミノ酸にあたるメチオニンを開始コドンとしているが、発明者らは1残基目からのアミノ酸を開始コドンとするプラスミドとともに作成した。しかしながら、特に活性の違いはなかった。
ＪＭ１０９／ｐＳＦＮ＿２ＢＳを１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地で３７℃、１６時間前培養した。この培養菌体１ｍＬを、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＴＢ培地５０ｍＬに植菌し、３０℃、１６時間培養し得られた菌体を遠心分離にて集菌した。この菌体を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．６）を用いて洗菌し、同緩衝液を用いて菌体懸濁液を調製した。超音波破砕処理によって、菌体を破砕し、遠心分離（１５，０００ｇ、１０分、４℃）により得られる上澄み液を無細胞抽出液として、上記の方法と同様にＮ−アセチル−β−アミノ酸アシラーゼ活性を測定したところ、０．３３Ｕ／ｍｇであった。また、β−Ｐｈｅ光学分割条件で、ＨＰＬＣにより光学選択性を決定したところ、(Ｓ)−β−Ｐｈｅ特異的に生成しており、(Ｒ)−β−Ｐｈｅは検出限界以下であった。
【００７７】
１１．Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ ｓｐ． ＡＪ１１０３４８由来Ｎ−アセチル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼ高発現株の作成
Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ ｓｐ． ＡＪ１１０３４８染色体ＤＮＡを鋳型として、プライマー ＶＲＡＣＹ＿１Ｆ＿ＮｄｅＩ（配列番号１７）、及びＶＲＡＣＹ＿Ｒ＿ＨｉｎｄＩＩＩ（配列番号１８）によりＰＣＲ反応により、得られた２．４ｋｂの増幅断片をＮｄｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで処理した。このＤＮＡ産物を実施例９で作成したｐＳＦＮ ＮｄｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ精製産物のＮｄｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩサイトに挿入し、ｐＳＦＮ＿１ＶＲとした。このプラスミドによりＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉa cｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換した。この形質転換体をＪＭ１０９／ｐＳＦＮ＿１ＶＲと命名した。
ＪＭ１０９／ｐＳＦＮ＿１ＶＲを１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地で３７℃、１６時間前培養した。この培養菌体１ｍＬを、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＴＢ培地５０ｍＬに植菌し、３０℃、１６時間培養し得られた菌体を遠心分離にて集菌した。この菌体を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．６）を用いて洗菌し、同緩衝液を用いて菌体懸濁液を調製した。超音波破砕処理によって、菌体を破砕し、遠心分離（１５，０００ｇ、１０分、４℃）により得られる上澄み液を無細胞抽出液として、上記の方法と同様にＮ−アセチル−β−アミノ酸アシラーゼ活性を測定したところ、１．５Ｕ／ｍｇであった。また、β−Ｐｈｅ光学分割条件で、ＨＰＬＣにより光学選択性を決定したところ、(Ｒ)−β−Ｐｈｅ特異的に生成しており、(Ｓ)−β−Ｐｈｅは検出限界以下であった。
【００７８】
１２．基質特異性の調査
１２−１．各種Ｎ−アセチル−（R,S）-β−アミノ酸への基質特異性調査
ＪＭ１０９／ｐｔｒｐ４＿３ＢＲ、ＪＭ１０９／ｐＳＦＮ＿２ＢＳ、ＪＭ１０９／ｐＳＦＮ＿１ＶＲを１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地で３７℃、１６時間前培養した。この培養菌体１ｍＬを、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＴＢ培地５０ｍＬに植菌し、３０℃、１６時間培養し得られた菌体を遠心分離にて集菌した。この菌体を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．６）を用いて洗菌し、同緩衝液を用いて菌体懸濁液を調製した。超音波破砕処理によって、菌体を破砕し、遠心分離（１５，０００ｇ、１０分、４℃）により得られる上澄み液を無細胞抽出液として、実施例２−１〜９に記した各種Ｎ−アセチル−（Ｒ，Ｓ）−β−アミノ酸への基質特異性を調査した。
酵素は上記の方法で調整後、活性を測定し、Ｎ−アセチル−（Ｒ，Ｓ）−β−Ｐｈｅから１分間に１μｍｏｌのβ−Ｐｈｅを生成する活性を１Ｕとし、各種基質特異性の調査には、５０ｍＵの無細胞抽出液を用いた。ネガティブコントロールとして、上記のように調整した無細胞中質液の代わりに、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．６）を用いて各基質と反応を行ったものを「enzyme-」の実験区とし、各基質の代わりに５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．６）を用いて各無細胞抽出液と反応させたものを「基質-」の実験区とした。
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、０．２％ 各Ｎ−アセチル−（Ｒ，Ｓ）−β−アミノ酸、３７℃、１時間、または２４時間反応し、９６℃、１０分間処理し、反応を停止した。アセチル基の分解により生成した酢酸の量を酢酸キット（Ｒｏｃｈｅ）のプロトコールに従って定量した。
１時間後の酢酸生成量を表３に、２４時間後の酢酸生成量を表４に示した。その結果、Ｎ−アセチル−（R,S）-β−ａｍｉｎｏｂｕｔｙｌｉｃ ａｃｉｄ（Ｎ−アセチル−β−Ａｂａ）、Ｎ−アセチル−（R,S）-β−Ｌｅｕ、Ｎ−アセチル−（R,S）-β−ｈｏｍｏＬｅｕ、Ｎ−アセチル−（R,S）-β−Ｔｙｒ、Ｎ−アセチル−（R,S）-ｈｏｍｏＰｈｅ、Ｎ−アセチル−（R,S）-β−４−Ｆｌｕｏｒｏ−Ｐｈｅを基質とした実験区から酢酸が検出された。
【００７９】
【表３】
【００８０】
【表４】
【００８１】
１２−２．光学特異性の決定
反応24時間後のサンプルを各種キラル分割カラムにて解析し、光学選択性を決定した。
１２−２−１．(R),(S)−β−Ｌｅｕの分離
３−２−３．の分割条件で、標準品は、N−アセチル-(R),(S)−β−Ｌｅｕ、（Ｓ）−β−Ｌｅｕ、（Ｒ）−β−Ｌｅｕの順に溶出された。
ＪＭ１０９／ｐｔｒｐ４＿３ＢＲを用いたＮ−アセチル−β−Ｌｅｕ反応用液では（Ｒ）−β−Ｌｅｕが検出され（Ｓ）−β−Ｌｅｕは検出限界以下であり、> 99 ％ eeであった。
ＪＭ１０９／ｐＳＦＮ＿２ＢＳを用いたＮ−アセチル−β−Ｌｅｕ反応用液では（Ｓ）−β−Ｌｅｕが検出され（Ｒ）−β−Ｌｅｕは検出限界以下であり、> 99 ％ eeであった。
ＪＭ１０９／ｐＳＦＮ＿１ＶＲを用いたＮ−アセチル−β−Ｌｅｕ反応用液では（Ｒ）−β−Ｌｅｕが検出され（Ｓ）−β−Ｌｅｕは検出限界以下であり、> 99 ％ eeであった。
【００８２】
１２−２−２．(R)，(S)−β−ｈｏｍｏＬｅｕの分離
３−２−３．の分割条件で、標準品は、N-アセチル-（R，S）−β−ｈｏｍｏＬｅｕ、（Ｒ）−β−ｈｏｍｏＬｅｕ、（Ｓ）−β−ｈｏｍｏＬｅｕの順に溶出された。
ＪＭ１０９／ｐｔｒｐ４＿３ＢＲを用いたＮ−アセチル−β−ｈｏｍｏＬｅｕ反応用液では（Ｓ）−β−ｈｏｍｏＬｅｕが検出され、少量の（Ｒ）−β−Ｌｅｕは検出され６９％ eeであった。
ＪＭ１０９／ｐＳＦＮ＿２ＢＳを用いたＮ−アセチル−β−ｈｏｍｏＬｅｕ反応用液では（Ｒ）−β−ｈｏｍｏＬｅｕが検出され（Ｓ）−β−Ｌｅｕは検出限界以下であり、> 99 ％ eeであった。
ＪＭ１０９／ｐＳＦＮ＿１ＶＲを用いたＮ−アセチル−β−ｈｏｍｏＬｅｕ反応用液では（Ｓ）−β−ｈｏｍｏＬｅｕが検出され、（Ｒ）−β−ｈｏｍｏＬｅｕは検出限界以下であり、> 99 ％ eeであった。
【００８３】
１２−２−３．（R），（S）−β−ｈｏｍｏＰｈｅの分離
３−２−３．の分割条件で、標準品は、N−アセチル−(R,S) −β−ｈｏｍｏＰｈｅ、（Ｒ）−β−ｈｏｍｏＰｈｅ、（Ｓ）−β−ｈｏｍｏＰｈｅの順に溶出された。
ＪＭ１０９／ｐｔｒｐ４＿３ＢＲを用いたＮ−アセチル−β−ｈｏｍｏＰｈｅ反応用液では（Ｓ）−β−ｈｏｍｏＰｈｅが検出され、微量の（Ｒ）−β−ｈｏｍｏＰｈｅも検出され、９８％ eeであった。
ＪＭ１０９／ｐＳＦＮ＿２ＢＳを用いたＮ−アセチル−β−ｈｏｍｏＰｈｅ反応用液では（Ｒ）−β−ｈｏｍｏＰｈｅが検出され（Ｓ）−β−は検出限界以下であり、> 99 ％ eeであった。
ＪＭ１０９／ｐＳＦＮ＿１ＶＲを用いたＮ−アセチル−β−ｈｏｍｏＰｈｅ反応用液では（Ｓ）−β−ｈｏｍｏＰｈｅが検出され（Ｒ）−β−ｈｏｍｏＰｈｅは検出限界以下であり、> 99 ％ eeであった。
【００８４】
１２−２−４．（Ｒ），（Ｓ）−β−Ｔｙｒの分離
３−２−４．の分離条件で、標準品は、（Ｓ）−β−Ｔｙｒ、（Ｒ）−β−Ｔｙｒ、Ｎ−アセチル−（R）/(S)−β−Ｔｙｒの順に溶出された。(N-アセチル-β-Tyrの標準品はラセミ体であるので、分離はされるものの溶出順は未決)
ＪＭ１０９／ｐｔｒｐ４＿３ＢＲを用いたＮ−アセチル−β−Ｔｙｒ反応用液では（Ｒ）−β−Ｔｙｒが検出され、少量の（Ｓ）−β−Ｔｙｒも検出され６1 ％ eeであった。
ＪＭ１０９／ｐＳＦＮ＿２ＢＳを用いたＮ−アセチル−β−Ｔｙｒ反応用液では（Ｓ）−β−Ｔｙｒが検出され（Ｒ）−β−Ｔｙｒは検出限界以下であり、> 99 ％ eeであった。
ＪＭ１０９／ｐＳＦＮ＿１ＶＲを用いたＮ−アセチル−β−Ｔｙｒ反応用液では（Ｒ）−β−Ｔｙｒが検出され（Ｓ）−β−Ｔｙｒは検出限界以下であり、> 99 ％ eeであった。
【００８５】
１２−２−５．（Ｒ），（Ｓ）−４−Ｆｌｕｏｒｏ−β−Ｐｈｅの分離
３−２−４．の分離条件で、標準品は、（Ｓ）−４−Ｆｌｕｏｒｏ−β−Ｐｈｅ、（Ｒ）−４−Ｆｌｕｏｒｏ−β−Ｐｈｅ、Ｎ−アセチル−（Ｒ）/（Ｓ）−４−Ｆｌｕｏｒｏ−β−Ｐｈｅの順に溶出された。(N-アセチル-4-Fluoro-β-Pheの標準品はラセミ体であるので、分離はされるものの溶出順は未決)
ＪＭ１０９／ｐｔｒｐ４＿３ＢＲを用いたＮ−アセチル−４−Ｆｌｕｏｒｏ−β−Ｐｈｅ反応用液では（Ｒ）−４−Ｆｌｕｏｒｏ−β−Ｐｈｅが検出され、少量の（Ｓ）−４−Ｆｌｕｏｒｏ−β−Ｐｈｅが検出され、９４％ eeであった。
ＪＭ１０９／ｐＳＦＮ＿２ＢＳを用いたＮ−アセチル−４−Ｆｌｕｏｒｏ−β−Ｐｈｅ反応用液では（Ｓ）−４−Ｆｌｕｏｒｏ−β−Ｐｈｅが検出され（Ｒ）−４−Ｆｌｕｏｒｏ−β−Ｐｈｅは検出限界以下であり、> 99 ％ eeであった。
ＪＭ１０９／ｐＳＦＮ＿１ＶＲを用いたＮ−アセチル−４−Ｆｌｕｏｒｏ−β−Ｐｈｅ反応用液では（Ｒ）−４−Ｆｌｕｏｒｏ−β−Ｐｈｅが検出され（Ｓ）−４−Ｆｌｕｏｒｏ−β−Ｐｈｅは検出限界以下であり、> 99 ％ eeであった。
【００８６】
１２−３．Ｎ−アセチル−３，４−（−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−）−β−Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅへの基質特異性調査
ＪＭ１０９／ｐｔｒｐ４＿３ＢＲ、ＪＭ１０９／ｐＳＦＮ＿２ＢＳ、ＪＭ１０９／ｐＳＦＮ＿１ＶＲを上記のような方法で調整し、各種Ｎ−アセチル−３，４−（−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−）−β−Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅへの基質特異性を調査した。
培養液３００μＬを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）で洗浄し、３００μＬの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）に懸濁し、超音波破砕処理によって、菌体を破砕し、遠心分離（１５，０００ｇ、１０分、４℃）により得られる上澄み液を無細胞抽出液として反応に用いた。
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、０．２％ Ｎ−アセチル−（Ｒ）／（Ｓ）−３，４−（−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−）−β−Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ、３７℃、１０分間反応した。Ｎ−アセチル−β−Ｐｈｅとβ−Ｐｈｅの分離条件で、３，４−（−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−）−β−Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅを定量したところ、無細胞抽出液１ｍＬあたりの活性は、ＪＭ１０９／ｐｔｒｐ４＿３ＢＲは０．２Ｕ、ＪＭ１０９／ｐＳＦＮ＿２ＢＳは３．９Ｕ、ＪＭ１０９／ｐＳＦＮ＿１ＶＲは２７．８Ｕであった。
(Ｒ)，(Ｓ)−β−Ｐｈｅ光学分割条件にて標準品を分離したところ、（Ｓ）−３，４−（−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−）−β−Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ、（Ｒ）−３，４−（−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−）−β−Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ、Ｎ−アセチル−（Ｒ）/(S)− ３，４−（−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−）−β−Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅの順に溶出された。(Ｎ−アセチル−（Ｒ）/(S)−３，４−（−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−）−β−Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅの溶出順は未決)
この条件で、反応溶液を解析したところ、ＪＭ１０９／ｐｔｒｐ４＿３ＢＲの反応液からは（Ｒ）-３，４−（−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−）−β−Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅが、ＪＭ１０９／ｐＳＦＮ＿２ＢＳの反応液からは（Ｓ）−３，４−（−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−）−β−Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅが、ＪＭ１０９／ｐＳＦＮ＿１ＶＲの反応液からは（Ｒ）−３，４−（−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−）−β−Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅが検出された。
【００８７】
１２−４．Ｎ−アセチル−３−Ｐｙｒ−Ａｌａへの基質特異性調査
１２−１と同様の菌体を用いて、同様の方法で各酵素を調整し、５０ｍＵの無細胞抽出液を反応に用いた。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１％ Ｎ−アセチル−（Ｒ，Ｓ）−β−３−Ｐｙｒ−Ａｌａ、３７℃、１時間反応し、７０℃、１０分間処理し、反応を停止した。アセチル基の分解により生成した酢酸の量を酢酸キット（Ｒｏｃｈｅ）のプロトコールに従って定量した。
その結果、ＪＭ１０９／ｐｔｒｐ４＿３ＢＲ、ＪＭ１０９／ｐＳＦＮ＿２ＢＳ、ＪＭ１０９／ｐＳＦＮ＿１ＶＲを用いた反応液では、それぞれ３．５ｍＭ、８．４ｍＭ、０．８ｍＭの酢酸が検出され、「基質−」及び「ｅｎｚｙｍｅ−」の実験区からは酢酸は検出されなかった。
【００８８】
１３．蓄積量の評価
ＪＭ１０９／ｐｔｒｐ４＿３ＢＲ、ＪＭ１０９／ｐＳＦＮ＿２ＢＳ、ＪＭ１０９／ｐＳＦＮ＿１ＶＲを１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地で３７℃、１６時間前培養した。この培養菌体１ｍＬを、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＴＢ培地５０ｍＬに植菌し、３０℃、１６時間培養し得られた菌体を遠心分離にて集菌した。この菌体を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．６）を用いて洗菌し、同緩衝液を用いて１０倍に濃縮した菌体懸濁液を調製した。
この菌体懸濁液を用いて、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．６）、５％ Ｎ−アセチル−（Ｒ，Ｓ）−β−Ｐｈｅ、３７℃、２４時間、全量２．５ｍＬで反応した。その後、３−２−１の分析法で反応液を解析した。
ＪＭ１０９／ｐｔｒｐ４＿３ＢＲの１０倍濃縮の菌体懸濁液を５００μＬ加え反応したところ、（Ｒ）−β−Ｐｈｅの収率２１．６％、＞９９％ eeで、（Ｓ）−β−Ｐｈｅは検出限界以下であった。
ＪＭ１０９／ｐＳＦＮ＿２ＢＳの１０倍濃縮の菌体懸濁液を２５０μＬ加え反応したところ、（Ｓ）−β−Ｐｈｅの収率４９．５％、＞９９％ eeで、（Ｒ）−β−Ｐｈｅは検出限界以下であった。
ＪＭ１０９／ｐＳＦＮ＿１ＶＲの１０倍濃縮の菌体懸濁液を１２５μＬ加え反応したところ、（Ｒ）−β−Ｐｈｅの収率４５．４％、＞９９％ eeで、（Ｓ）−β−Ｐｈｅは検出限界以下であった。
【産業上の利用可能性】
【００８９】
本発明で同定された遺伝子を用いた大腸菌（Ｅｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のような宿主を組換えることによって、Ｎ−アセチル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼ及びＮ−アセチル−（Ｓ）−β−アミノ酸アシラーゼを高発現する系を構築することができる。その結果、該酵素を利用してＲ体又はＳ体のβアミノ酸を選択的にする系を簡便かつ安価に提供することが可能となる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なＮ−アセチル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼ及びＮ−アセチル−（Ｓ）−β−アミノ酸アシラーゼ、及びそれらをコードする遺伝子等に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
Ｎ−アセチル−β−アミノ酸に対してアシラーゼ活性を有する酵素は従来知られていなかったが、本発明者等は、Ｎ−アセチル−β−Ｐｈｅ等のＮ−アセチル−β−アミノ酸を培養菌体によって光学選択的に脱アセチル化する菌株としてＶａｒｉｏｖｏｒａｘ ｓｐ． ＡＪ１１０３４８（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０３６７）とＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ． ＡＪ１１０３４９（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０３６６）を初めて見出し、これらの菌体又は菌体粉砕液上清を用いる光学選択的な脱アセチル化方法は特開２００６−４２７２２号公報（特許文献１）に記載されている。尚、これらの菌株は、夫々、平成１６年７月２２日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されたＦＥＲＭ Ｐ−２０１２９及びＦＥＲＭ Ｐ−２０１２８から、２００５年７月４日付けで特許手続上の微生物の寄託等の国際的承認に関するブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、夫々、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０３６７及びＦＥＲＭ ＢＰ−１０３６６が付されている。
【特許文献１】特開２００６−４２７２２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
これら選抜された野生株を用いた変換反応も変換の一手法ではあるが、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｌｉａ ｓｐ．ＡＪ１１０３４９由来Ｎ−アセチル−β−アミノ酸アシラーゼは、（Ｒ）／（Ｓ）双方の光学選択性のアシラーゼを保持しており、野生株を用いて光学選択性の高いβ−アミノ酸を生成することが難しい状況であった。より効果的な変換を達成するためには、反応を触媒する酵素を単離・同定し、更にそのコード遺伝子も同定した上、例えば、大腸菌（Ｅｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のような宿主を用いて、その遺伝子を高発現する系を構築することが重要である。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
従来、ある酵素活性が見出されている菌株から、その活性を担う酵素あるいはその遺伝子を単離・同定する手法に関しては数多く報告されており、具体的には、一つはショットガンクローニングによる遺伝子単離法、もう一つは酵素単離、その部分アミノ酸配列決定、その配列情報に基づく遺伝子単離法が挙げられる。
【０００５】
そこで、本発明者は、特許文献１に記載された菌株からＮ−アセチル−β−アミノ酸を光学選択的に脱アセチル化するＮ−アセチル−β−アミノ酸アシラーゼの遺伝子を取得すべく、まず第一に、常法であるショットガンクローニングによる方法を試みた。
【０００６】
即ち、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｌｉａ ｓｐ． ＡＪ１１０３４９株のゲノムＤＮＡのライブラリーを作成し、Ｎ−アセチル−Ｒ／Ｓ−β−Ｐｈｅを単一炭素源とする培地に塗布し３７℃で１週間培養を行った。
また、供与検体数は、別途ＬＢ培地にライブラリーを塗布し、ＬＢ培地に生育した菌体数から算出した。約１万株に対してスクリーニングを行った結果、Ｎ−アセチル−Ｒ／Ｓ−β−Ｐｈｅを単一炭素源として生育する株は得られなかった。
【０００７】
また、Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ ｓｐ． ＡＪ１１０３４８株に関しても同様に、Ｎ−アセチル−Ｒ／Ｓ−β−Ｐｈｅを単一炭素源とするスクリーニングを約５万１千株に対して行ったが、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｌｉａ ｓｐ． ＡＪ１１０３４９株のスクリーニングの際と同様に、Ｎ−アセチル−Ｒ／Ｓ−β−Ｐｈｅを単一炭素源として生育する株は得られなかった。
【０００８】
以上のように、非常に多くのクローンを調べたにも関わらず、単一炭素源の資化を指標とする様なスクリーニング手法では、目的とする酵素遺伝子の取得には至らなかった。
【０００９】
このため、次に第二の方法である酵素の単離精製からのアプローチを試みることとした。酵素の単離精製の方法は数多く報告されているが、あらゆるタンパク質の単離精製が約束されるような単離精製法の一般則は存在せず、また、精製元の総タンパク質量に占める対象とするタンパク質の存在比によって、単離精製の難易度は大きく異なる。本発明におけるＮ−アセチル−β−アミノ酸アシラーゼの精製方法については後に詳述するが、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ． ＡＪ１１０３４９株からの Ｎ−アセチル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼおよび Ｎ−アセチル−（Ｓ）−β−アミノ酸アシラーゼの精製の場合、無細胞抽出液中での目的酵素の比活性に比べ、単離精製酵素の比活性は数百倍となっており、その精製は非常に困難なものであった。この困難な状況の原因の一つに、酵素生産菌であるＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ． ＡＪ１１０３４９株の性質の内、遠心操作による集菌のし難さが挙げられた。菌体内のタンパク質を単離精製する場合、通常、培地中のタンパク質の混入をさけるため、集菌後、緩衝液を用いて十分に菌体を洗浄する方法が採られるが、本菌株は、集菌手法として通常採用される遠心分離操作においてペレットとして回収されにくく、培地成分由来のタンパク質と菌体由来のタンパク質の分離が困難であった。このため、本株からのタンパク質単離精製は、通常の場合に比べ、多くの夾雑タンパク質が存在する状況から単離を行う必要があり、これが精製の困難さの一因となった。
【００１０】
この問題を解決するため、発明者は通常のタンパク質精製の場合に比べ多くの条件等の検討に鋭意努力し、その結果、当業者でも予想し得ない５種という多くのクロマトグラフィーを用いる精製ステップを経ることによって、初めて上記酵素の単離精製に成功し、その結果、該酵素をコードする遺伝子の塩基配列を決定した。
また、Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ ｓｐ． ＡＪ１１０３４８株に関しては、数種類の酵素を別々に取得する必要がないため、手法を改良し更にショットガンクローニングを継続した。上述したように目的の遺伝子を保持する株が選択的に増殖するような簡便なスクリーニングでは酵素遺伝子の取得には至らなかったため、発明者は、後述するように、各クローンの活性を個別に確認するという非常に時間の掛かる作業を実施し、目的の酵素遺伝子の取得に成功した。
上述のように、非常に多くの工夫を重ねながら、本発明を完成させた。
【００１１】
即ち、本発明は以下の各態様に係るものである。
［態様１］下記のいずれか一つに示す蛋白質をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号８で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ）配列番号８で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Ｎ−アセチル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼ活性を有する蛋白質、及び
（ｃ）配列番号８で示されるアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む蛋白質であり、かつ、Ｎ−アセチル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼ活性を有する蛋白質。
［態様２］下記のいずれか一つに示すＤＮＡを含む遺伝子。
（ａ）配列番号７に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）配列番号７に示される塩基配列の相補鎖を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Ｎ−アセチル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼ活性
を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、及び
（ｃ）配列番号７に示される塩基配列のＤＮＡと７０％以上の配列同一性を示すＤＮＡまたはその部分断片であり、かつ、Ｎ−アセチル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
［態様３］下記のいずれか一つに示す蛋白質をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号１０で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ）配列番号１０で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Ｎ−アセチル−（Ｓ）−β−アミノ酸アシラーゼ活性を有する蛋白質、及び
（ｃ）配列番号１０で示されるアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む蛋白質であり、かつ、Ｎ−アセチル−（Ｓ）−β−アミノ酸アシラーゼ活性を有する蛋白質。
［態様４］下記のいずれか一つに示すＤＮＡを含む遺伝子。
（ａ）配列番号９に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）配列番号９に示される塩基配列の相補鎖を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Ｎ−アセチル−（Ｓ）−β−アミノ酸アシラーゼ活性
を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、及び
（ｃ）配列番号９に示される塩基配列のＤＮＡと７０％以上の配列同一性を示すＤＮＡまたはその部分断片であり、かつ、Ｎ−アセチル−（Ｓ）−β−アミノ酸アシラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
［態様５］下記のいずれか一つに示す蛋白質をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号１２で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ）配列番号１２で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Ｎ−アセチル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼ活性を有する蛋白質、及び
（ｃ）配列番号１２で示されるアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む蛋白質であり、かつ、Ｎ−アセチル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼ活性を有する蛋白質。
［態様６］下記のいずれか一つに示すＤＮＡを含む遺伝子。
（ａ）配列番号１１に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１１に示される塩基配列の相補鎖を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Ｎ−アセチル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼ活性
を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、及び
（ｃ）配列番号１１に示される塩基配列のＤＮＡと７０％以上の配列同一性を示すＤＮＡまたはその部分断片であり、かつ、Ｎ−アセチル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
［態様７］ β−アミノ酸がβ−フェニルアラニン、β−ロイシン、β−ホモロイシン、β−ホモフェニルアラニン、β−チロシン、β−４−フルオロフェニルアラニン、β−アミノブチル酸、3,4-(-O-CH2-O-)-β−フェニルアラニン、及びβ−３−ピリジル−アラニンからなる群から選ばれるいずれかである、態様１〜６のいずれか一項に記載の遺伝子。
［態様８］下記のいずれか一つに示す蛋白質。
（ａ）配列番号８で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ）配列番号８で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Ｎ−アセチル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼ活性を有する蛋白質、及び
（ｃ）配列番号８で示されるアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む蛋白質であり、かつ、Ｎ−アセチル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼ活性を有する蛋白質。
［態様９］下記のいずれか一つに示す蛋白質。
（ａ）配列番号１０で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ）配列番号１０で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Ｎ−アセチル−（Ｓ）−β−アミノ酸アシラーゼ活性を有する蛋白質、及び
（ｃ）配列番号１０で示されるアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む蛋白質であり、かつ、Ｎ−アセチル−（Ｓ）−β−アミノ酸アシラーゼ活性を有する蛋白質。
［態様１０］下記のいずれか一つに示す蛋白質。
（ａ）配列番号１２で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ）配列番号１２で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Ｎ−アセチル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼ活性を有する蛋白質、及び
（ｃ）配列番号１２で示されるアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む蛋白質であり、かつ、Ｎ−アセチル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼ活性を有する蛋白質。
［態様１１］β−アミノ酸がβ−フェニルアラニン、β−ロイシン、β−ホモロイシン、β−ホモフェニルアラニン、β−チロシン、β−４−フルオロフェニルアラニン、β−アミノブチル酸、3,4-(-O-CH2-O-)-β−フェニルアラニン、及びβ−３−ピリジル−アラニンからなる群から選ばれるいずれかである、態様８から１０いずれか一項に記載のβ−アミノ酸アシラーゼ。
[態様１２] 態様１から６のいずれか一項記載の遺伝子によって形質転換された微生物。
[態様１３] 態様１から６のいずれか一項記載の遺伝子によって形質転換された微生物であるEscherichia coli。
[態様１４] 態様１２記載の微生物をＮ−アセチル−β−アミノ酸に接触させ、β−アミノ酸を生成させ、これを回収することを特徴とするβ−アミノ酸の製造法。
[態様１５] 態様１２記載の微生物から得られるＮ−アセチル−β−アミノ酸アシラーゼ活性を有する蛋白質をＮ−アセチル−β−アミノ酸に接触させ、β−アミノ酸を生成させ、これを回収することを特徴とするβ−アミノ酸の製造法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によって、Ｎ−アセチル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼ及びＮ−アセチル−（Ｓ）−β−アミノ酸アシラーゼが単離同定され、更に、それらの遺伝子がクローニングされ、その塩基配列及びその遺伝子がコードする蛋白質のアミノ酸配列が明らかにされた。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】精製したＮ−アセチル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼ（Ａ）およびＮ−アセチル−（Ｓ）−β−アミノ酸アシラーゼ（Ｂ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる観察結果を示したものである。
【図２】Ｎ−アセチル−（Ｒ，Ｓ）−β−Ｐｈｅを基質、精製したＮ−アセチル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼまたはＮ−アセチル−（Ｓ）−β−アミノ酸アシラーゼを酵素源として変換を行った結果をＨＰＬＣにて解析した結果である。ＡはＮ−アセチル−（Ｒ，Ｓ）−β−Ｐｈｅのみで酵素を添加していない場合、ＢおよびＣはそれぞれ（Ｒ）−β−Ｐｈｅおよび（Ｓ）−β−Ｐｈｅ標準標品、Ｄ及びＥはＮ−アセチル−（Ｒ，Ｓ）−β−ＰｈｅをＮ−アセチル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼまたはＮ−アセチル−（Ｓ）−β−アミノ酸アシラーゼで変換した結果をそれぞれ示している。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の遺伝子
本発明の遺伝子は、Ｎ−アセチル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼ又はＮ−アセチル−（Ｓ）−β−アミノ酸アシラーゼをコードするものであり、これらの酵素は、夫々、分子量約８４ｋＤａ及び分子量約４１ｋＤａのサブユニット（構成単位）から成るホモダイマー又はホモトライマーの構造を有している。従って、より具体的には、本発明の遺伝子は、これらの各サブユニットであるポリペプチドをコードするものである。これらの酵素の代表例は、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ． ＡＪ １１０３４９（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０３６６）が産生するものであり、その具体的なアミノ酸配列の一例は、夫々、配列番号８及び配列番号１０に示されたものである。これらの酵素の別の代表例は、Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ ｓｐ． ＡＪ １１０３４８（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０３６７）が産生するものであり、その具体的なアミノ酸配列の一例は、配列番号１２に示されたものである。尚、本発明において、Ｎ−アセチル−（Ｒ，Ｓ）−β−アミノ酸アシラーゼの代表例として、Ｎ−アセチル−（Ｒ，Ｓ）−β−フェニルアラニン（Ｐｈｅ）アシラーゼを挙げることが出来る。Ｎ−アセチル−（Ｒ，Ｓ）−β−アミノ酸アシラーゼが、Ｒ体特異的な活性を有するか、Ｓ体特異的な活性を有するかは、Ｎ−アセチル−（Ｒ，Ｓ）−β−フェニルアラニンを基質として決定する。本発明のＮ−アセチル−（Ｒ，Ｓ）−β−アミノ酸アシラーゼは、α−アミノ酸のＤ体とＬ体を認識するかのごとく、側鎖、アミノ基、カルボキシル基、水素の相対位置を認識する。一方、ＲＳ表記では、β位に結合する側鎖によっては、−Ｃ−ＣＯＯＨと順位法則の優先性が入れ替わることがある。例えば、後述の実施例に示す、Ｎ−アセチル−β−ｈｏｍｏＬｅｕとＮ−アセチル−β−ｈｏｍｏＰｈｅの場合は、Ｎ−アセチル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼからＳ体が、Ｎ−アセチル−（Ｓ）−β−アミノ酸アシラーゼからＲ体がそれぞれ生成している。
【００１５】
又、本明細書において、「Ｎ−アセチル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼ活性又はＮ−アセチル−（Ｓ）−β−アミノ酸アシラーゼ活性を有する蛋白質」とは、ホモダイマー又はホモトライマーの構造を有する各アシラーゼ酵素の構成単位となり得る（構成単位としての機能を有する）蛋白質（ポリペプチド）をも意味する。
【００１６】
本発明遺伝子は当業者に公知の方法で調製することが出来る。
例えば、本明細書の実施例に記載された方法に従い、各プローブを用いるコロニーハイブリダイズによる他、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ． ＡＪ １１０３４９（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０３６６）またはＶａｒｉｏｖｏｒａｘ ｓｐ． ＡＪ １１０３４８（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０３６７）のゲノムＤＮＡを鋳型として、本明細書に開示された本発明ＤＮＡの塩基配列又はアミノ酸配列の情報に基づき適当な作製されるプライマーを使用した、当業者に公知の任意のＰＣＲにより増幅して調製することも出来る。
【００１７】
例えば、９４℃で２分の後、９４℃で１０秒、５５℃で２０秒、７２℃で２分を３０サイクル行い、最後に７２℃で５分を行う。なお、サーマルサイクラーとしては、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製９６００など一般のサーマルサイクラーを用いることができる。耐熱性 ＤＮＡポリメラーゼとしては、ＥｘＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造製）などの一般の市販品を用い、反応液の組成はポリメラーゼに添付の説明書に従って実施する。
【００１８】
更に、当業者に周知の化学合成によって、本発明の各遺伝子を調製することも出来る。
【００１９】
本明細書において、「ストリンジェントな条件下」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件が挙げられる。なお、塩基配列間の同一性は、Ｂｌａｓｔ等の当業者に公知のアルゴリズムを用いて決定することができる。より具体的には、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。このような条件でハイブリダイズするＤＮＡの中には途中にストップコドンが発生したものや、活性中心の変異により活性を失ったものも含まれるが、それらについては、所定のＮ−アセチル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼ又はＮ−アセチル−（Ｓ）−β−アミノ酸アシラーゼ活性を後述の方法で測定し取り除くことができる。
【００２０】
ハイブリダイゼーションは、例えば、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ（ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， １９８７））に記載の方法等、当業界で公知の方法あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。また、市販のライブ、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
【００２１】
本発明の蛋白質
本発明の遺伝子がコードする蛋白質の中で、Ｎ−アセチル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼ又はＮ−アセチル−（Ｓ）−β−アミノ酸アシラーゼを構成するユニットポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号８、配列番号１０又は配列番号１２）において、１個若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、又は付加を含むアミノ酸配列を有する蛋白質であって、上記酵素活性を有するものは、当業者に公知の任意の方法、例えば、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法、及びＰＣＲ法等の当業者に周知の方法を適宜組み合わせて、容易に作成することが可能である。
【００２２】
尚、その際に、実質的に同等の機能を有するためには、当該ポリペプチドを構成するアミノ酸のうち、同族アミノ酸（極性β非極性アミノ酸、疎水性β親水性アミノ酸、陽性β陰性荷電アミノ酸、芳香族アミノ酸など）同士の置換が可能性として考えられる。又、実質的に同等の機能の維持のためには、本発明の各ポリペプチドに含まれる機能ドメイン内のアミノ酸は保持されることが望ましい。
【００２３】
更に、本発明の蛋白質として、上記のアミノ酸配列と、全体の平均で約７０％、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、更に好ましくは約９５％以上であるような高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む蛋白質又はその断片であって、所定のＮ−アセチル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼ又はＮ−アセチル−（Ｓ）−β−アミノ酸アシラーゼを有するものを挙げることができる。尚、アミノ酸配列間の同一性も、当業者に公知のアルゴリズム、例えば、実施例で使用されているＢｌａｓｔ を用いて決定することができる。又、上記酵素の活性は本明細書の実施例に記載した方法で測定することが出来る。又、このような蛋白質も、当業者に公知の任意の方法、例えば、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法、及びＰＣＲ法等の当業者に周知の方法を適宜組み合わせて、容易に作成することが可能である。
尚、本発明のβ-アミノ酸は、下記の構造式で示される。
【００２４】
【化１】
【００２５】
構造式中、Ｒは、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数６〜１４のアリール基、炭素数３〜１０のシクロアルキル基、炭素数７〜１９のアラルキル基、炭素数２〜１１のアルコキシアルキル基、これらの炭素骨格中にヘテロ原子を含む基、およびこれらの炭素骨格中に炭素−炭素不飽和結合を含む基からなる群より選ばれ、これらの基は直鎖であっても分岐していてもよく、さらに置換基を有していてもよい。好ましくは、Ｒは、炭素数１〜４のアルキル基、炭素数６〜７のアリール基、これらの基は直鎖であっても分岐していてもよく、さらに置換基を有していてもよい。好ましくは、β−アミノ酸は、β−フェニルアラニン、β−ロイシン、β−ホモロイシン、β−ホモフェニルアラニン、β−チロシン、β−４−フルオロフェニルアラニン、β−アミノブチル酸、3,4-(-O-CH2-O-)-β−フェニルアラニン、及びβ−３−ピリジル−アラニンから選ばれる。
【００２６】
本発明の遺伝子の発現
上記で得られた本発明遺伝子を当業者に公知の任意の方法によって組換えベクターに組み込み、本発明の組換え発現ベクターを作成することが出来る。
例えば、（１）本発明の遺伝子を含有するＤＮＡ断片を切り出し、（２）該ＤＮＡ断片を適当な組換えベクター中の制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入して該ベクターに連結する挿入することにより製造することができる。組換えベクターに特に制限はなく、例えば、麹菌由来のプラスミド（例えば、ｐＳａｌ２３， ｐＴＡｅｘ３， ｐＮＧＵ１１３， ｐＲＢＧ１， ｐＧＭ３２， ｐＳＥ５２， ｐＮＡＧＬ１４２等）、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＴ７Ｂｌｕｅ Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ、ｐＲＳＥＴ、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１１８）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４）、及び、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５）、等の組換えベクター等を利用することが出来る。
【００２７】
上記組換えベクターには、以上の他に、本発明の転写調節配列の活性を損なわない限り、所望により当該技術分野で公知のプロモーター等の各種転写調節要素、シャイン・ダルガルノ配列、選択マーカー、転写終結シグナル等を付加することができる。また、必要に応じて、本発明の外来遺伝子にコードされた所望の蛋白質を他の蛋白質又はペプチド（例えば、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、ヒスチジンタグ、カルモデュリンバインディング蛋白質、及びプロテインＡ等）との融合蛋白質として発現させることも可能である。このような融合蛋白質は、適当なプロテアーゼを使用して切断し、それぞれの蛋白質に分離することが出来る。
【００２８】
本発明の遺伝子が有効に発現される限り、本発明の組換え発現ベクターを有する微生物（形質転換体）を調製するために使用する宿主の種類及び由来等に特に制限はなく、例えば、大腸菌のような原核細胞、又はサッカロマイセス・セレビシエ（パン酵母）真核細胞等の当業者に公知の任意の微生物細胞を使用することが可能である。
【００２９】
これら宿主細胞の形質転換は、例えば、塩化カルシウム法、パーティクルガン、エレクトロポレーション法等の、当該技術分野で公知の方法に従って行うことが出来る。例えば、以下に記載の文献を参照することが出来る。Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ６９巻、２１１０（１９７２）； Ｇｅｎｅ， １７巻、１０７（１９８２）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８巻， １１１（１９７９）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４巻、１８２−１８７（１９９１）；Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ）、７５巻、１９２９（１９７８）；細胞工学別冊８ 新細胞工学実験プロトコール。２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）；及びＶｉｒｏｌｏｇｙ、５２巻、４５６（１９７３）。
【００３０】
このようにして得られた、本発明の形質転換体は、当該技術分野で公知の方法に従って培養することが出来る。
【００３１】
本発明における蛋白質の製造に際しては、当業者に公知の方法を適宜選択することができる。例えば、該蛋白質を含む培養液から、例えば、各種クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等の当業者に公知の方法を適宜選択、組み合わせることによって、実質的に純粋で均一な蛋白質として分離、精製することができる。
【００３２】
更に、蛋白質をグルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼ蛋白質との融合蛋白質、又はヒスチジンを複数付加させた組換え蛋白質として発現させた場合には、発現させた組換え蛋白質はグルタチオンカラムあるいはニッケルカラムを用いて精製することができる。融合蛋白質の精製後、必要に応じて、目的の蛋白質以外の領域を、トロンビンまたはファクターＸａなどにより切断し、除去することも可能である。或いは、トリプシン、キモトリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グルコシダーゼ等の適当な蛋白質修飾酵素で、精製前又は精製後に蛋白質を処理することにより、任意に修飾を加えたり、部分的にペプチドを除去することもできる。
【００３３】
本発明は、Ｎ−アセチル−β−アミノ酸アシラーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子で形質転換された微生物をＮ−アセチル−β−アミノ酸に接触させ、β−アミノ酸を生成させ、これを回収することを特徴とするβ−アミノ酸の製造法を提供する。また、同微生物から得られるＮ−アセチル−β−アミノ酸アシラーゼ活性を有する蛋白質をＮ−アセチル−β−アミノ酸に接触させ、β−アミノ酸を生成させ、これを回収することを特徴とするβ−アミノ酸の製造法を提供する。
本発明の製造法において、各アシラーゼを作用させる様式、方法、及び条件等は、Ｎ−アセチル−β−アミノ酸の種類及び量、各アシラーゼの種類、製造規模等の諸要件に応じて、当業者に公知の任意のものを適宜選択することが出来る。
例えば、本発明の菌体の懸濁液中にＮ−アセチル−β−アミノ酸を添加したり、又は、該菌体の破砕液上清中にＮ−アセチル−β−アミノ酸を添加することにより該アシラーゼを作用させることが出来る。
反応温度は、好ましくは１０〜６０℃、より好ましくは２０〜４０℃である。また、反応系のｐＨは、好ましくは４〜１０であり、より好ましくは６〜９である。また、反応時間は１０分〜１２０時間、好ましくは、１〜６０時間、より好ましくは１〜４８時間である。反応溶媒は、水溶液、ＭｅＯＨ、ＤＭＦ、ＤＭＳＯなどを用いることもできるし、それらを混合して使用することも可能である。
【実施例】
【００３４】
以下の実施例を示し、本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらによって制限されるものではない。
【００３５】
１．試薬
（Ｒ，Ｓ）−β−Ｐｈｅ（ＤＬ−３−ａｍｉｎｏ−３−ｐｈｅｎｙｌ−ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社より購入した。（Ｒ）−β−Ｐｈｅ及び（Ｓ）−β−Ｐｈｅは渡辺化学より購入した。
その他β−アミノ酸は下記のメーカーより購入した。
（R,S）−β−Ｌｅｕ（ＤＬ−β−Ｌｅｕｃｉｎｅ 、Ｆｌｕｋａ社）；
（R）−β−Ｌｅｕ（Ｌ−β−Ｌｅｕｃiｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、Ｆｌｕｋａ社）；
（R,S）−β−ｈｏｍｏＰｈｅ（ＤＬ−β−Ｈｏｍｏｐｈｙｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ、Ｆｌｕｋａ社）；
（S）−β−ｈｏｍｏＰｈｅ（Ｌ−β−Ｈｏｍｏｐｈｙｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、Ｆｌｕｋａ社）；
（R,S）−β−ｈｏｍｏＬｅｕ（３−ａｍｉｎｏ−５−ｍｅｔｈｙｌ−ｈｅｘａｎｏｉｃ acｉｄ、Ａｓｔａｔｅｃｈ， Ｉｎｃ．社）；
（R）−β−ｈｏｍｏＬｅｕ（（Ｒ）−３−ａｍｉｎｏ−５−ｍｅｔｈｙｌ−ｈｅｘａｎｏｉｃ acｉｄ、Ａｓｔａｔｅｃｈ， Ｉｎｃ．社）；
（R,S）−β−Ｔｙｒ（３−ａｍｉｎｏ−３−（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−ｐｒｏｐａｎｏｉｃ acｉｄ、Ｂｉｏｎｅｔ Ｂｕｉｌｄｉｎｇ Ｂｌｏｃｋｓ社）；
（R）−β−Ｔｙｒ（（Ｒ）−３−ａｍｉｎｏ−３−（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−ｐｒｏｐａｎｏｉｃ acｉｄ、Ｐｅｐｔｅｃｈ社）；
（R,S）−４−Ｆｌｕｏｒｏ−β−Ｐｈｅ（３−ａｍｉｎｏ−３−（４−ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−ｐｒｏｐａｎｏｉｃ acｉｄ、Ｂｉｏｎｅｔ Ｂｕｉｌｄｉｎｇ Ｂｌｏｃｋｓ社）；
（R）−４−Ｆｌｕｏｒｏ−β−Ｐｈｅ（（Ｒ）−３−ａｍｉｎｏ−３−（４−ｆｌｕｏｒｏ−ｐｈｅｎｙｌ）−ｐｒｏｐａｎｏｉｃ acｉｄ、Ｐｅｐｔｅｃｈ社）；及び
（R,S）-β−３−Ｐｙｒ−Ａｌａ（３−ａｍｉｎｏ−３−（３−ｐｙｒｉｄｙｌ）−ｐｒｏｐａｎｏｉｃ ａｃｉｄ、Ｂａｃｈｅｍ社）；
【００３６】
２．合成
各種Ｎ−アセチル−β−アミノ酸は、ラセミ体はラセミ体のβ−アミノ酸を、光学活性体は各光学活性体のβ−アミノ酸をアセチル化して合成した。合成法は以下に示すとおりである。なお、新規物質に関しては、NMRの解析結果を記載した。
２−１．Ｎ−アセチル−（Ｒ，Ｓ）−β−Ｐｈｅの合成
（Ｒ，Ｓ）−β−Ｐｈｅ（５０ｇ，３０３ｍｍｏｌ）を水２００ｍｌに懸濁させ、氷冷下２５％ ＮａＯＨ水溶液を加え、ｐＨ１１−１２に調節した。得られた水溶液のｐＨが１１−１２の範囲をできるだけ保つように２５％ＮａＯＨ水溶液でｐＨを調節しながら、滴下ロートで無水酢酸（６２．８ｍｌ，６６４ｍｍｏｌ）を室温で滴下した。一晩撹拌後、反応混合物の分析を行ったところ原料の残存が認められたため、さらに無水酢酸（６ｍｌ，６３ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物をろ過し、不溶物を除去した後、得られた溶液に濃塩酸を加え、ｐＨを２に調節し結晶を析出させた。結晶をろ過し、水で洗浄し、減圧下６０℃で一晩乾燥し、Ｎ−アセチル−（Ｒ，Ｓ）−β−Ｐｈｅ（５６．９ｇ，２７４．３ｍｍｏｌ，９１％）を得た。
【００３７】
２−２．Ｎ−アセチル−（Ｓ）−β−Ｐｈｅの合成
（Ｓ）−β−Ｐｈｅ（２５０ｍｇ，１．５１ｍｍｏｌ）を水５ｍｌに懸濁させ、氷冷下２０％ ＮａＯＨ水溶液を加え、ｐＨ１１−１２に調節した。得られた水溶液のｐＨが１１−１２の範囲をできるだけ保つように２０％ＮａＯＨ水溶液でｐＨを調節しながら、無水酢酸（０．３３ｍｌ，３．４９ｍｍｏｌ）を室温で滴下した。反応混合物をろ過し、不溶物を除去した後、得られた溶液に濃塩酸を加え、ｐＨを２に調節し結晶を析出させた。結晶をろ過し、水で洗浄し、減圧下５０℃で一晩乾燥し、Ｎ−アセチル−（Ｓ）−β−Ｐｈｅ（２３８ｍｇ，１．１５ｍｍｏｌ，７６％）を得た。
【００３８】
２−３．Ｎ−アセチル−（Ｒ）−β−Ｐｈｅの合成
（Ｒ）−β−Ｐｈｅ塩酸塩（２５０ｍｇ，１．２４ｍｍｏｌ）を水５ｍｌに懸濁させ、氷冷下２０％ ＮａＯＨ水溶液を加え、ｐＨ１１−１２に調節した。得られた水溶液のｐＨが１１−１２の範囲をできるだけ保つように２０％ＮａＯＨ水溶液でｐＨを調節しながら、無水酢酸（０．２８ｍｌ，２．９６ｍｍｏｌ）を室温で滴下した。反応混合物をろ過し、不溶物を除去した後、得られた溶液に濃塩酸を加え、ｐＨを２に調節し結晶を析出させた。結晶をろ過し、水で洗浄し、減圧下５０℃で一晩乾燥し、Ｎ−アセチル−（Ｒ）−β−Ｐｈｅ（２３６ｍｇ，１．１３ｍｍｏｌ，９１％）を得た。
【００３９】
２−４．Ｎ−アセチル−（R,S）-β−Ｌｅｕの合成
（R,S）-β−Ｌｅｕ（９９５ｍｇ、７．５８ｍｍｏｌ）を水８ｍｌに懸濁させ、２０％ ＮａＯＨ水溶液を加え、ｐＨ１１−１２に調節した。得られた水溶液のｐＨが１１−１２の範囲をできるだけ保つように２０％ＮａＯＨ水溶液でｐＨを調節しながら、無水酢酸（１．３ｍｌ、１３．３ｍｍｏｌ）を室温で滴下した。反応混合物をろ過し、不溶物を除去した後、得られた溶液に濃塩酸を加え、ｐＨを２に調節し結晶を析出させた。結晶をろ過し、水で洗浄し、減圧下５０℃で一晩乾燥し、Ｎ−アセチル−（R,S）-β−Ｌｅｕ（３８２ｍｇ、２．２１ｍｍｏｌ、２９．０％）を得た。
ＥＳＩ−ＭＳ ［Ｍ−Ｈ］＝１７２
【００４０】
２−５．Ｎ−アセチル−（R,S）-β−ｈｏｍｏＰｈｅの合成
（R,S）-β−ｈｏｍｏＰｈｅ（１９８ｍｇ、１．１２ｍｍｏｌ）を水５ｍｌに懸濁させ、２０％ ＮａＯＨ水溶液を加え、ｐＨ１１−１２に調節した。得られた水溶液のｐＨが１１−１２の範囲をできるだけ保つように２０％ＮａＯＨ水溶液でｐＨを調節しながら、無水酢酸（０．２４ｍｌ、２．４６ｍｍｏｌ）を室温で滴下した。反応混合物をろ過し、不溶物を除去した後、得られた溶液に濃塩酸を加え、ｐＨを２に調節し結晶を析出させた。結晶をろ過し、水で洗浄し、減圧下５０℃で一晩乾燥し、Ｎ−アセチル−（R,S）-β−ｈｏｍｏＰｈｅ（６４．５ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ，３２．１％）を得た。
ＥＳＩ−ＭＳ ［Ｍ−Ｈ］＝２２０
【００４１】
２−６．Ｎ−アセチル−（R,S）-β−ｈｏｍｏＬｅｕの合成
（R,S）-β−ｈｏｍｏＬｅｕ（１．０１ｇ、６．９ｍｍｏｌ）を水１６ｍｌに懸濁させ、２０％ ＮａＯＨ水溶液を加え、ｐＨ１１−１２に調節した。得られた水溶液のｐＨが１１−１２の範囲をできるだけ保つように２０％ＮａＯＨ水溶液でｐＨを調節しながら、無水酢酸（１．３５ｍｌ、１３．８ｍｍｏｌ）を室温で滴下した。反応混合物をろ過し不溶物を除去した後、得られた溶液に濃塩酸を加え、ｐＨを２に調節し結晶を析出させた。結晶をろ過し、水で洗浄し、減圧下５０℃で一晩乾燥し、Ｎ−アセチル−（R,S）-β−ｈｏｍｏＬｅｕ（６４．５ｍｇ、５．０７ｍｍｏｌ、７３．１％）を得た。この生成物は減圧乾燥により溶解、凝固していたが、ＮＭＲにより確認し、求める物質が生成していたのでそのまま反応に用いた。
ＥＳＩ−ＭＳ ［Ｍ−Ｈ］＝１８６
【００４２】
２−７．Ｎ−アセチル−（R,S）-β−Ｔｙｒの合成
（R,S）-β−Ｔｙｒ（２０２ｍｇ、１．１６ｍｍｏｌ）を水１６ｍｌに懸濁させ、２０％ ＮａＯＨ水溶液を加え、ｐＨ１１−１２に調節した。得られた水溶液のｐＨが１１−１２の範囲をできるだけ保つように２０％ＮａＯＨ水溶液でｐＨを調節しながら、無水酢酸（０．３３ｍｌ、３．３９ｍｍｏｌ）を室温で滴下した。反応混合物をろ過し不溶物を除去した後、得られた溶液に濃塩酸を加え、ｐＨを２に調節し、エバポレーターで濃縮し結晶を析出させた。結晶をろ過し水で洗浄し、減圧下５０℃で一晩乾燥し、Ｎ−アセチル−（R,S）-β−Ｔｙｒ（５５．５ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ、２１．４％）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ， Ｄ２Ｏ）； ２．０５ （ｓ， ３Ｈ）， ２．６０−２．７０（ｍ， ２Ｈ）， ５．１（ｄｄ， １Ｈ， Ｊ＝７．５ , ７．５ Ｈｚ）， ６．８８（ｄ， ２Ｈ， Ｊ＝８．６ Ｈｚ）， ７．２６ （ｄ， ２Ｈ， Ｊ＝８．６ Ｈｚ）
ＥＳＩ−ＭＳ ［Ｍ−Ｈ］＝２２２
【００４３】
２−８．Ｎ−アセチル−（R,S）-４−Ｆｌｕｏｒｏ−β−Ｐｈｅの合成
（R,S）-４−Ｆｌｕｏｒｏ−β−Ｐｈｅ（２０６ｍｇ、１．１２ｍｍｏｌ）を水１６ｍｌに懸濁させ、２０％ ＮａＯＨ水溶液を加え、ｐＨ１１−１２に調節した。得られた水溶液のｐＨが１１−１２の範囲をできるだけ保つように２０％ＮａＯＨ水溶液でｐＨを調節しながら、無水酢酸（０．２２ｍｌ、２．２６ｍｍｏｌ）を室温で滴下した。反応混合物をろ過し不溶物を除去した後、得られた溶液に濃塩酸を加え、ｐＨを２に調節し、エバポレーターで濃縮し結晶を析出させた。結晶をろ過し、水で洗浄し、減圧下５０℃で一晩乾燥し、Ｎ−アセチル−（R,S）-４−Ｆｌｕｏｒｏ−β−Ｐｈｅ（１４３．９ｍｇ，０．６４ｍｍｏｌ，５７．１％）を得た。
ＥＳＩ−ＭＳ ［Ｍ−Ｈ］＝２２４
【００４４】
以上の生成物は結晶を取得後に、ＮＭＲにてチャートを確認し、質量分析を行い目的化合物の生成を確認した。
【００４５】
２−９．Ｎ−アセチル−（R,S）-β−ａｍｉｎｏｂｕｔｙｌｉｃ ａｃｉｄの合成
３−アセトアミド−２−ブテン酸メチルはＪ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ． ２００２， １２４， １４５５２記載の方法に従い調製した。
３−アセトアミド−２−ブテン酸メチル（１．３５ｇ）のメタノール溶液に５％パラジウム−活性炭を加え、１気圧の水素下、３０℃で１６時間撹拌した。反応終了後、ろ過にて５％パラジウム−活性炭を除き、得られた溶液を濃縮して３−アセトアミド−２−酪酸メチル（１．３７ｇ）を得た。
続いて得られた３−アセトアミド−２−ブテン酸メチル（５７０ｍｇ）のエタノール溶液３ｍＬに８Ｍ水酸化水溶液（９００μＬ）を加え、３５℃で１時間撹拌した。反応終了後、６Ｍ塩酸（１．２ｍＬ）を加え中和し、濃縮してジクロロメタン（２０ｍＬ）を加えた。析出した結晶をろ過にて取り除き、ろ液を濃縮して表題化合物２６５ｍｇを得た。
ＮＭＲにて、目的化合物の生成を確認した。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ， ＭｅＯＨ−ｄ４）； １．４１ （ｑ， ３Ｈ， Ｊ＝２．６ Ｈｚ）， １．９９ （ｓ， ３Ｈ）， ２．５５ （ｔ， ２Ｈ， Ｊ＝５．１ Ｈｚ）， ４．２８（ｍ， １Ｈ）
１３Ｃ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ， ＭｅＯＨ−ｄ４）；１７５．６， １７０．８８， ４２．６２， ４０．２２， ２３．６０， ２０．３４
ＥＳＩ−ＭＳ ［Ｍ−Ｈ］＝１４４
【００４６】
２−１０．Ｎ−アセチル−３，４−（−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−）−β−Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ
ＵＳ２００６００３５３４５記載の方法で作成したものを使用した。
【００４７】
２−１１．Ｎ−アセチル−（R,S）-３−Ｐｙｒ−Ａｌａの合成
β-3-Pyr-Ala（２００ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）を水５ｍｌに懸濁させ、２０％ ＮａＯＨ水溶液を加え、ｐＨ１１−１２に調節した。得られた水溶液のｐＨが１１−１２の範囲をできるだけ保つように２０％ＮａＯＨ水溶液でｐＨを調節しながら、無水酢酸（０．２５７ｍｌ、２．４６ｍｍｏｌ）を室温で滴下した。反応混合物をろ過し、不溶物を除去した後、得られた溶液に濃塩酸を加え、ｐＨを２に調整したが沈殿が析出しなかったため、エバポレーターを用いて総て液体を蒸発させて、乾燥物をNMRにより解析し、反応に用いた。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ， Ｄ２Ｏ）； ２．０３ （ｓ， ３Ｈ）， ２．７８−２．９０（ｍ， ２Ｈ）， ５．３３（ｄｄ， １Ｈ， Ｊ＝７．３, ７．３ Ｈｚ），７．９７（ｄｄ， １Ｈ ， Ｊ＝５．７， ８．２ Ｈｚ）， ８．４９ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝８．２ Ｈｚ）， ８．６７（ｄ， １Ｈ， Ｊ＝５．７ Ｈｚ）， ８．７５（s， １Ｈ，）
ＥＳＩ−ＭＳ ［Ｍ−Ｈ］＝２０７
【００４８】
３．酵素活性測定
３−１．アッセイ条件
１０ ｍＭ Ｎ−アセチル−（Ｒ，Ｓ）−β−Ｐｈｅ， ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ ７．６）および適宜酵素サンプルを含む反応液を３０℃にて１５ｍｉｎから２ｈ静置した後、５ｍｉｎの煮沸処理にて反応を停止した。反応液を遠心し、その上清を適宜希釈して、ＨＰＬＣにて分析した。この標準反応条件にて、１ｍｉｎ間に１μｍｏｌの（Ｒ）−β−Ｐｈｅまたは（Ｓ）−β−Ｐｈｅを生成するアシラーゼ活性を１ Ｕｎｉｔと定義した。以後Ｎ−アセチル−（Ｒ，Ｓ）−β−Ｐｈｅから（Ｒ）−β−Ｐｈｅを生成する活性をＮ−アセチル−（Ｒ）−β−Ｐｈｅアシラーゼ活性、（Ｓ）−β−Ｐｈｅを生成する活性をＮ−アセチル−（Ｓ）−β−Ｐｈｅアシラーゼ活性と記述する。
３−２．ＨＰＬＣ
【００４９】
３−２−１．(Ｒ)，(Ｓ)−β−Ｐｈｅ光学分割条件
（Ｒ）−β−Ｐｈｅ、（Ｓ）−β−Ｐｈｅ、Ｎ−アセチル−（Ｒ）−β−ＰｈｅおよびＮ−アセチル−（Ｓ）−β−ＰｈｅはＨＰＬＣによって定量分析した。カラムはジーエルサイエンス社製Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ３（０．４６ｃｍΦ， ５ｃｍ）とダイセル化学社製Ｃｈｉｒａｌｐａｋ ＷＨ（０．４６ｃｍΦ， ２５ｃｍ）をこの順に直列につないで用いた。移動相は０．２５ｍＭ ＣｕＳＯ４， ２％（ｖ／ｖ）アセトニトリルとし、流速１．５ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度５０℃、検出はＵＶ ｄｅｔｅｃｔｏｒ ２１０ｎｍとした。この分析で上記４種化合物は異なる溶出時間に溶出し、溶出順は早いほうから（Ｓ）−β−Ｐｈｅ、（Ｒ）−β−Ｐｈｅ、Ｎ−アセチル−（Ｒ）−β−Ｐｈｅ、Ｎ−アセチル−（Ｓ）−β−Ｐｈｅの順であった。定量は、各標準標品を対照とし、ピークエリア値から算出した。
【００５０】
３−２−２． Ｎ−アセチル−β−Ｐｈｅとβ−Ｐｈｅの分離条件
カラムはＧＬサイエンス社製Ｉｎｅｒｔｓｉｌ Ｐｈ−３（０．４６ｃｍΦ、２５ｃｍ）を用いた。移動相に１０％アセトニトリル（リン酸にてｐＨ３．０に調整）を用い、温度４０℃、流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ、検出ＵＶ２１０ｎｍの条件で各ラセミ体標準品を対照とし、ピークエリア値から算出し定量した。
【００５１】
３−２−３． (Ｒ),(Ｓ)−β−Ｌｅｕ、(Ｒ)，(Ｓ)−β−ｈｏｍｏＬｅｕ、(Ｒ)，(Ｓ)−β−ｈｏｍｏＰｈｅ分割条件
カラムはａｓｔｅｃ社製ＣＨＩＲＯＢＩＯＴＥＣ Ｔ（０．４６ｃｍΦ、２５ｃｍ）を用いた。移動相に９０％ ＭｅＯＨを用い、温度４０℃、流速０．４ｍＬ／ｍｉｎ、検出ＵＶ２０５ｎｍの条件で、(Ｒ)，(Ｓ)体標準品と比較し、光学選択性を決定した。
【００５２】
３−２−４．(Ｒ)，(Ｓ)−β−Ｔｙｒ、(Ｒ)，(Ｓ)−β−４−Ｆｌｕｏｒｏ−Ｐｈｅ分離条件
カラムはジーエルサイエンス社製Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ３（０．４６ｃｍΦ， ５ｃｍ）とダイセル化学社製Ｃｈｉｒａｌｐａｋ ＷＨ（０．４６ｃｍΦ， ２５ｃｍ）をこの順に直列につないで用いた。移動相に１ｍＭ ＣｕＳＯ４、１０％ ＭｅＯＨを用い、温度 ５０℃、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ、検出ＵＶ２１０ｎｍの条件で(Ｒ)，(Ｓ)体標準品と比較し光学選択性を決定した。
【００５３】
４．Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ． ＡＪ１１０３４９由来Ｎ−アセチル−（Ｒ）／（Ｓ）−β−アミノ酸アシラーゼの精製
４−１．使用菌株と培養条件
Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ． ＡＪ１１０３４９を用いた。保存菌株を５ｇ／ｌ Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ， １０ｇ／ｌ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ， １０ｇ／ｌ ｐｅｐｔｏｎｅ， ５ｇ／ｌ ＮａＣｌ， ２０ｇ／ｌ ａｇａｒ （ｐＨ ７．０）から成るＣＭ２Ｇ寒天培地上で、３０℃で４８ｈ静置培養することによりリフレッシュした。これを、１０ｇ／ｌ Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ， １０ｇ／ｌ （ＮＨ４）２ＳＯ４， １０ｇ／ｌ （Ｒ，Ｓ）−β−Ｐｈｅ， ２ｇ／ｌ ｃａｓａｍｉｎｏ ａｃｉｄ， １ｇ／ｌ ＫＨ２ＰＯ４， ０．４ｇ／ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，１ｇ／ｌ ＮａＣｌ， １９．５ｇ／ｌ ２−（Ｎ−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ） ｅｔｈａｎｅｓｕｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ （ＭＥＳ）， ５ｍｇ／ｌ ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ， ０．２ｍｇ／ｌ ｔｈｉａｍｉｎ， １０ｍｇ／ｌ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ， １０ｍｇ／ｌ ＭｎＳＯ４・４〜５Ｈ２Ｏからなる酵素生産培地１００ ｍｌに接種し、５００ｍｌ用の坂口フラスコを用いて３０℃、１２０ｒｐｍで６６ｈ、振盪培養した。
【００５４】
４−２．無細胞抽出液の調製
培養液およそ２，０００ｍｌから、６，８００ｇ，１０ｍｉｎの遠心操作により菌体を集菌した。この際、菌体の沈降が十分に見られなかったため、およそ１，６００ ｍｌの上清を除去し、残りの部分をピペッティングにより均一化した。この濃縮した培養液をバッファー等で洗浄することなく、２００Ｗ， ２０ｍｉｎの超音波処理に供し菌体を破砕した。得られた破砕液を２００，０００ｇ， ３０ｍｉｎ遠心操作し、得られた遠心上清およそ２００ｍｌを無細胞抽出液とした。
【００５５】
４−３．硫安分画
得られた無細胞抽出液に（ＮＨ４）２ＳＯ４を終濃度４０％飽和となるよう加え、氷上１ｈ攪拌した後、９，２００ｇ， １５ｍｉｎ遠心した。得られた沈殿を少量の２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．６）にて溶解後、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）に対して透析した。この透析後の溶液を、以後クロマトグラフィーに供するサンプルとした。
【００５６】
４−４．クロマトグラフィー
４−４−１）Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ２６／１０ （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）
上記で得られた硫安分画画分を２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ７．６）， ０．６Ｍ （ＮＨ４）２ＳＯ４から成る緩衝液に対して透析後、同緩衝液で平衡化したＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ２６／１０に供した。非吸着タンパク質溶出後、緩衝液中の（ＮＨ４）２ＳＯ４濃度を直線的に０．６ Ｍから０ Ｍまで変化させることにより吸着タンパク質を溶出した。この操作によりＮ−アセチル−（Ｒ）−β−Ｐｈｅアシラーゼ活性は、（ＮＨ４）２ＳＯ４濃度およそ０．２Ｍの付近に、Ｎ−アセチル−（Ｓ）−β−Ｐｈｅアシラーゼ活性は（ＮＨ４）２ＳＯ４濃度およそ０．１Ｍの付近にそれぞれ検出された。活性の存在する画分をＮ−アセチル−（Ｒ）−β−Ｐｈｅアシラーゼ溶出画分、Ｎ−アセチル−（Ｓ）−β−Ｐｈｅアシラーゼ活性溶出画分に分けて、それぞれ回収した。
【００５７】
４−４−２）Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ １６／１０ （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍacｉａ）
得られたＰｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ分画画分を濃縮し、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ７．６）に対して透析後、同緩衝液で平衡化したＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ １６／１０に供した。非吸着タンパク質溶出後、緩衝液中のＮａＣｌ濃度を直線的に０ Ｍから０．５Ｍまで変化させることにより吸着タンパク質を溶出した。この操作によりＮ−アセチル−（Ｒ）−β−Ｐｈｅアシラーゼ活性は、ＮａＣｌ濃度およそ０．２２Ｍの付近に、Ｎ−アセチル−（Ｓ）−β−Ｐｈｅアシラーゼ活性はＮａＣｌ濃度およそ０．３Ｍの付近にそれぞれ検出された。活性の存在する画分をそれぞれ回収した。
【００５８】
４−４−３）Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １６／６０ （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）
得られたＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ分画画分を濃縮し、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ７．６）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １６／２０に供した。この操作によりＮ−アセチル−（Ｒ）−β−Ｐｈｅアシラーゼ活性は分子量２０６ｋＤａと見積もられる溶出位置に、Ｎ−アセチル−（Ｓ）−β−Ｐｈｅアシラーゼ活性は分子量１０１ｋＤａと見積もられる溶出位置でそれぞれ検出された。活性の存在する画分をそれぞれ回収した。
【００５９】
４−４−４）Ｒｅｓｏｕｒｃｅ ｐｈｅｎｙｌ （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）
得られたＳｕｐｅｒｄｅｘ分画画分を濃縮し、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ７．６）， ０．６Ｍ （ＮＨ４）２ＳＯ４から成る緩衝液に対して透析後、同緩衝液で平衡化したＲｅｓｏｕｒｃｅ ｐｈｅｎｙｌに供した。非吸着タンパク質溶出後、緩衝液中の（ＮＨ４）２ＳＯ４濃度を直線的に０．６Ｍから０ Ｍまで変化させることにより吸着タンパク質を溶出した。この操作によりＮ−アセチル−（Ｒ）−β−Ｐｈｅアシラーゼ活性は、（ＮＨ４）２ＳＯ４濃度およそ０．３５Ｍの付近に、Ｎ−アセチル−（Ｓ）−β−Ｐｈｅアシラーゼ活性は（ＮＨ４）２ＳＯ４濃度およそ０．４５Ｍの付近にそれぞれ検出された。活性の存在する画分をそれぞれ回収した。
【００６０】
４−４−５）Ｍｏｎｏ Ｑ ５／５ （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）
得られたＲｅｓｏｕｒｃｅ ｐｈｅｎｙｌ分画画分を濃縮し、２５ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ ７．６）に対して透析後、同緩衝液で平衡化したＭｏｎｏ Ｑ ５／５に供した。非吸着タンパク質溶出後、緩衝液中のＮａＣｌ濃度を直線的に０ Ｍから０．５Ｍまで変化させることにより吸着タンパク質を溶出した。この操作によりＮ−アセチル−（Ｒ）−β−Ｐｈｅアシラーゼ活性は、ＮａＣｌ濃度およそ０．２Ｍの付近に、Ｎ−アセチル−（Ｓ）−β−Ｐｈｅアシラーゼ活性はＮａＣｌ濃度およそ０．２８Ｍの付近にそれぞれ検出された。活性の存在する画分をそれぞれ回収し、それぞれ精製Ｎ−アセチル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼ、精製Ｎ−アセチル−（Ｓ）−β−アミノ酸アシラーゼ標品とした。
【００６１】
以上の酵素精製の結果を表１（Ｎ−アセチル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼ）、表２（Ｎ−アセチル−（Ｓ）−β−アミノ酸アシラーゼ）にそれぞれまとめた。この精製操作により、Ｎ−アセチル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼは比活性２６２倍に、Ｎ−アセチル−（Ｓ）−β−アミノ酸アシラーゼは比活性８０９倍にそれぞれ精製された。
【００６２】
【表１】
【００６３】
【表２】
【００６４】
４−５．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
上記で得られた精製Ｎ−アセチル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼおよび精製Ｎ−アセチル−（Ｓ）−β−アミノ酸アシラーゼをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した（Ｆｉｇ．１）。結果、Ｎ−アセチル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼは分子量約８４ｋＤａと見積もられる単一のバンドとして（Ｆｉｇ．１Ａ）、Ｎ−アセチル−（Ｓ）−β−アミノ酸アシラーゼは分子量約４１ｋＤａと見積もられる単一のバンドとして（Ｆｉｇ．１Ｂ）、それぞれ観察された。上記ゲルろ過クロマトグラフィーにおいて、両酵素の未変性状態の分子量はそれぞれ２０６ｋＤａ（Ｎ−アセチル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼ）、１０１ｋＤａ（Ｎ−アセチル−（Ｓ）−β−アミノ酸アシラーゼ）と見積もられたため、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで見積もられた分子量と併せて考えると、何れの酵素もホモダイマーあるいはホモトライマー構造を有している酵素であると考えられた。
【００６５】
４−６．光学特異性
精製酵素を酵素源として、その光学選択性を測定した。上記酵素活性条件において反応時間３０ ｍｉｎ、酵素添加量４．６μｇ／ｍｌ（Ｎ−アセチル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼ）または３．１μｇ／ｍｌ（Ｎ−アセチル−（Ｓ）−β−アミノ酸アシラーゼ）として反応を行った。結果、Ｎ−アセチル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼを酵素源とした場合には（Ｒ）−β−Ｐｈｅの生成のみが観察され、（Ｓ）−β−Ｐｈｅの生成は検出限界以下であった（Ｆｉｇ．２Ｄ）。一方、Ｎ−アセチル−（Ｓ）−β−アミノ酸アシラーゼを酵素源とした場合には（Ｓ）−β−Ｐｈｅの生成のみが観察され、（Ｒ）−β−Ｐｈｅの生成は検出限界以下であった（Ｆｉｇ．２Ｅ）。これらの結果から、両酵素はいずれも高い光学選択性を有していることが示された。
【００６６】
５．Ｎ末端アミノ酸配列解析
精製酵素標品を材料に、そのＮ末端アミノ酸配列を決定した。方法は、酵素標品をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、ＰＶＤＦ膜に転写し、クマシーブルーで染色後、バンドの見られる位置を切り出し、これをプロテインシーケンサーに供することにより行った。結果、Ｎ−アセチル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼの場合は配列番号１に示す２０残基の配列が、Ｎ−アセチル−（Ｓ）−β−アミノ酸アシラーゼの場合は配列番号２に示す２６残基のアミノ酸配列が、それぞれ決定された。
【００６７】
６．遺伝子クローニングと塩基配列決定
決定されたＮ末端アミノ酸配列に基づいて合成プライマーを設計し、Ｔａｋａｒａ社製ＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いて、アシラーゼをコードする遺伝子部分断片の取得を行った。結果、Ｎ−アセチル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼＮ末端近傍をコードする遺伝子領域を含む、５’−ＰｓｔＩ認識配列、３’−ＥｃｏＲＩ認識配列を両端に有する７９４ｂａｓｅのＤＮＡ断片、およびＮ−アセチル−（Ｓ）−β−アミノ酸アシラーゼＮ末端近傍をコードする遺伝子領域を含む、５’−ＰｓｔＩ認識配列、３’−ＳａｌＩ認識配列を両端に有する３９３ｂａｓｅのＤＮＡ断片をそれぞれ得て、その塩基配列を決定した。
【００６８】
塩基配列の決定により得られた情報より、プライマーＲ７Ｆ、Ｒ８Ｒ（配列番号３、４）／プライマーＳ３Ｆ、Ｓ４Ｒ（配列番号５、６）を用いてＢｕｒｋｈｏｌｄｅｌｉａ ｓｐ． ＡＪ１１０３４９のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行いＮ−アセチル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼ／ Ｎ−アセチル−（Ｓ）−β−アミノ酸アシラーゼのＮ末端近傍をコードする遺伝子領域含む０．３ｋｂ／０．４ｋｂのＤＮＡ断片を増幅し、ＤＩＧラベリングを行ってそれぞれをＲ−プローブ／Ｓ−プローブとした。
【００６９】
Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ． ＡＪ１１０３４９染色体ＤＮＡ５μｇをＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ（１００／５０Ｕ）にて切断した後、Ｒ−プローブを用いてサザン解析を行った。ハイブリダイゼーションの条件は、４２℃、１６時間で、ハイブリダイゼーションの溶液にはＤＩＧ Ｅａｓｙ Ｈｙｂ（Ｒｏｃｈｅ社）を用いた。その結果、約５ｋｂにポジティブシグナルを確認した。
【００７０】
次いで、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ． ＡＪ１１０３４９染色体ＤＮＡ５μｇ をＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ（１００／５０Ｕ）処理後、アガロース電気泳動し、５ｋｂ付近の断片を精製し、ｐＵＣ１１８のＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩサイトにライゲートした。この反応液をもちいてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、ライブラリーを作製した。上記プローブをもちいてコロニーハイブリダイズを行い、ポジティブコロニーを取得し、プラスミドを抽出した。得られたプラスミドをｐＢＲＡＣＹ＿Ａ３として、挿入配列について塩基配列を決定したところ、７６０アミノ酸（配列番号８）をコードするＯＲＦ（配列番号７）が存在した。
【００７１】
Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ． ＡＪ１１０３４９染色体ＤＮＡ５μｇをＰｓｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ（各５０Ｕ）にて切断した後、Ｓ−プローブを用いてサザン解析を行った。ハイブリダイゼーションの条件は、４２℃、１６時間で、ハイブリダイゼーションの溶液にはＤＩＧ Ｅａｓｙ Ｈｙｂ（Ｒｏｃｈｅ社）を用いた。その結果、約１．５ｋｂにポジティブシグナルを確認した。
【００７２】
次いで、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ． ＡＪ１１０３４９染色体ＤＮＡ５μｇをＰｓｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ（各５０Ｕ）処理後アガロース電気泳動し、１．５ｋｂ付近の断片を精製し、ｐＵＣ１１８のＰｓｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩサイトにライゲートした。この反応液をもちいてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、ライブラリーを作製した。上記プローブをもちいてコロニーハイブリダイズを行い、ポジティブコロニーを取得し、プラスミドを抽出した。得られたプラスミドをｐＢＳＡＣＹ＿ＰＨとして、挿入配列について塩基配列を決定したところ、３５２アミノ酸（配列番号１０）をコードするＯＲＦ（配列番号９）が存在した。
【００７３】
７． Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ ｓｐ． ＡＪ１１０３４８株由来Ｎ−アセチル−(R)-β−アミノ酸アシラーゼ遺伝子のショットガンクローニングによる取得
Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ ｓｐ．ＡＪ１１０３４８株よりゲノムＤＮＡを抽出し、制限酵素Ｓａｕ３ＡＩにて部分分解した後、約３〜８ｋｂ付近の断片を回収しｐＵＣ１１８へと連結した。この反応液をもちいてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉa cｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、ライブラリーを作製した。
得られた形質転換体をブルーホワイトセレクションにより選別し、単コロニーとして得られた３５００株に対してマスタープレートを作成した。これらの菌株をＮ−アセチル−（Ｒ，Ｓ）−β−Ｐｈｅ液体培地［硫酸アンモニウム１０．０ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ １．０ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．４ｇ／ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １０ｍｇ／ｌ、ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ １０ｍｇ／ｌ、ビタミンＢ１・ＨＣｌ ０．２ｍｇ／ｌ、Ｎ−アセチル−（Ｒ，Ｓ）−β−Ｐｈｅ １．０ｇ／ｌ， ｐＨ８．０、ＩＰＴＧ １００μＭ、Ａｍｐ １００μｇ／ｍｌ］ に１０株ずつ接種し、３７℃、４８時間振とう培養した。
得られた培養上清をＳｉｌｉａｇｅｌ ６０Ｆ２５４プレート（Ｍｅｒｃｋ）、ブタノール：酢酸：水＝４：１：２にて分離し、ＵＶ２５４ｎｍ及びニンヒドリン発色にてβ−Ｐｈｅの生成を確認した。
その結果、混合した培養上清からβ−Ｐｈｅが検出されたので、さらに、１株ずつ同様の手法で培養し、ＴＬＣにて培養上清を確認したところ、Ｋ８３株と命名した株からβ−Ｐｈｅが検出された。
Ｋ８３株のプラスミドＤＮＡを抽出し挿入配列を確認したところ、約３ｋｂの挿入配列が存在した。塩基配列を決定した結果、７７９アミノ酸（配列番号１２）をコードするＯＲＦ（配列番号１１）が存在した。
【００７４】
８．Ｋ８３株の活性測定及び光学選択性の測定
得られたＫ８３株を１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地で３７℃、１６時間前培養した。この培養菌体１ｍＬを、１００ｍｇ／ｌのアンピシリン、１ｍＭ ＩＰＴＧを含むＴＢ培地５０ｍＬに植菌し、３０℃、１６時間培養し得られた菌体を遠心分離にて集菌した。この菌体を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．６）を用いて洗菌し、同緩衝液を用いて菌体懸濁液を調製した。超音波破砕処理によって、菌体を破砕し、遠心分離（１５，０００ｇ、１０分、４℃）により得られる上澄み液を無細胞抽出液として、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、０．２％ Ｎ−アセチル−β−Ｐｈｅ、３７℃、１０分間反応し、Ｎ−アセチル−β−Ｐｈｅとβ−Ｐｈｅの分離条件にてＮ−アセチル−β−アミノ酸アシラーゼ活性を測定したところ、２．３Ｕ／ｍｇであった。
また、β−Ｐｈｅ光学分割条件で、ＨＰＬＣにより光学選択性を決定したところ、(Ｒ)−β−Ｐｈｅ特異的に生成しており、(Ｓ)−β−Ｐｈｅは検出限界以下であった。
【００７５】
９．Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ． ＡＪ１１０３４９由来Ｎ−アセチル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼ高発現株の作成
Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ．ＡＪ１１０３４９染色体ＤＮＡを鋳型として、プライマー Ｒ＿７Ｆ（配列番号１３）、及び Ｒ＿Ｒ＿ＨｉｎｄＩＩＩ（配列番号１４）によりＰＣＲ反応により、得られた２．３ｋｂの増幅断片をＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ処理し、ｐｔｒｐ４（参考文献Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｔａｌｙｓｉｓ Ｂ： Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ３２ （２００５）２０５−２１１）のＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩサイトに挿入し、ｐｔｒｐ４＿３ＢＲとした。このプラスミドによりＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉa cｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換した。この形質転換体をＪＭ１０９／ｐｔｒｐ４＿３ＢＲと命名した。
ＪＭ１０９／ｐｔｒｐ４＿３ＢＲを１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地で３７℃、１６時間前培養した。この培養菌体１ｍＬを、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＭ９カザミノ酸培地５０ｍＬに植菌し、３０℃、１８時間培養し得られた菌体を遠心分離にて集菌した。この菌体を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．６）を用いて洗菌し、同緩衝液を用いて菌体懸濁液を調製した。超音波破砕処理によって、菌体を破砕し、遠心分離（１５，０００ｇ、１０分、４℃）により得られる上澄み液を無細胞抽出液として、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、０．２％ Ｎ−アセチル−（Ｒ，Ｓ）−β−Ｐｈｅ、３７℃、３０分間反応し、生成したβ−Ｐｈｅの量をＨＰＬＣにて測定した。Ｎ−アセチル−β−アミノ酸アシラーゼ活性を測定したところ、０．２９Ｕ／ｍｇであった。また、β−Ｐｈｅ光学分割条件で、ＨＰＬＣにより光学選択性を決定したところ、(Ｒ)−β−Ｐｈｅ特異的に生成しており、(Ｓ)−β−Ｐｈｅは検出限界以下であった。
【００７６】
１０．Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ． ＡＪ１１０３４９由来Ｎ−アセチル−（Ｓ）−β−アミノ酸アシラーゼ高発現株の作成
Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ．ＡＪ１１０３４９染色体ＤＮＡを鋳型として、プライマー Ｓ＿Ｆ＿ＮｄｅＩ＿２（配列番号１５）、及び Ｓ＿Ｒ＿ＨｉｎｄＩＩＩ（配列番号１６）によりＰＣＲ反応により、得られた１．１ｋｂの増幅断片をＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩで処理した。これとは別に、ｐＳＦＮ＿Ｓｍ＿Ａｅｔ（参考文献ＷＯ２００６０７５４８６）をＮｄｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで切断し、３ｋｂ付近のＤＮＡを切り出し精製した。このｐＳＦＮのＮｄｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩサイトに１．１ｋｂＰＣＲ産物を制限酵素にて処理したＤＮＡを挿入し、ｐＳＦＮ＿２ＢＳとした。このプラスミドによりＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉ a cｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換した。この形質転換体をＪＭ１０９／ｐＳＦＮ＿２ＢＳと命名した。
なお、このプラスミドの挿入配列は、配列１０の６残基目のアミノ酸にあたるメチオニンを開始コドンとしているが、発明者らは1残基目からのアミノ酸を開始コドンとするプラスミドとともに作成した。しかしながら、特に活性の違いはなかった。
ＪＭ１０９／ｐＳＦＮ＿２ＢＳを１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地で３７℃、１６時間前培養した。この培養菌体１ｍＬを、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＴＢ培地５０ｍＬに植菌し、３０℃、１６時間培養し得られた菌体を遠心分離にて集菌した。この菌体を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．６）を用いて洗菌し、同緩衝液を用いて菌体懸濁液を調製した。超音波破砕処理によって、菌体を破砕し、遠心分離（１５，０００ｇ、１０分、４℃）により得られる上澄み液を無細胞抽出液として、上記の方法と同様にＮ−アセチル−β−アミノ酸アシラーゼ活性を測定したところ、０．３３Ｕ／ｍｇであった。また、β−Ｐｈｅ光学分割条件で、ＨＰＬＣにより光学選択性を決定したところ、(Ｓ)−β−Ｐｈｅ特異的に生成しており、(Ｒ)−β−Ｐｈｅは検出限界以下であった。
【００７７】
１１．Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ ｓｐ． ＡＪ１１０３４８由来Ｎ−アセチル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼ高発現株の作成
Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ ｓｐ． ＡＪ１１０３４８染色体ＤＮＡを鋳型として、プライマー ＶＲＡＣＹ＿１Ｆ＿ＮｄｅＩ（配列番号１７）、及びＶＲＡＣＹ＿Ｒ＿ＨｉｎｄＩＩＩ（配列番号１８）によりＰＣＲ反応により、得られた２．４ｋｂの増幅断片をＮｄｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで処理した。このＤＮＡ産物を実施例９で作成したｐＳＦＮ ＮｄｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ精製産物のＮｄｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩサイトに挿入し、ｐＳＦＮ＿１ＶＲとした。このプラスミドによりＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉa cｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換した。この形質転換体をＪＭ１０９／ｐＳＦＮ＿１ＶＲと命名した。
ＪＭ１０９／ｐＳＦＮ＿１ＶＲを１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地で３７℃、１６時間前培養した。この培養菌体１ｍＬを、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＴＢ培地５０ｍＬに植菌し、３０℃、１６時間培養し得られた菌体を遠心分離にて集菌した。この菌体を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．６）を用いて洗菌し、同緩衝液を用いて菌体懸濁液を調製した。超音波破砕処理によって、菌体を破砕し、遠心分離（１５，０００ｇ、１０分、４℃）により得られる上澄み液を無細胞抽出液として、上記の方法と同様にＮ−アセチル−β−アミノ酸アシラーゼ活性を測定したところ、１．５Ｕ／ｍｇであった。また、β−Ｐｈｅ光学分割条件で、ＨＰＬＣにより光学選択性を決定したところ、(Ｒ)−β−Ｐｈｅ特異的に生成しており、(Ｓ)−β−Ｐｈｅは検出限界以下であった。
【００７８】
１２．基質特異性の調査
１２−１．各種Ｎ−アセチル−（R,S）-β−アミノ酸への基質特異性調査
ＪＭ１０９／ｐｔｒｐ４＿３ＢＲ、ＪＭ１０９／ｐＳＦＮ＿２ＢＳ、ＪＭ１０９／ｐＳＦＮ＿１ＶＲを１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地で３７℃、１６時間前培養した。この培養菌体１ｍＬを、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＴＢ培地５０ｍＬに植菌し、３０℃、１６時間培養し得られた菌体を遠心分離にて集菌した。この菌体を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．６）を用いて洗菌し、同緩衝液を用いて菌体懸濁液を調製した。超音波破砕処理によって、菌体を破砕し、遠心分離（１５，０００ｇ、１０分、４℃）により得られる上澄み液を無細胞抽出液として、実施例２−１〜９に記した各種Ｎ−アセチル−（Ｒ，Ｓ）−β−アミノ酸への基質特異性を調査した。
酵素は上記の方法で調整後、活性を測定し、Ｎ−アセチル−（Ｒ，Ｓ）−β−Ｐｈｅから１分間に１μｍｏｌのβ−Ｐｈｅを生成する活性を１Ｕとし、各種基質特異性の調査には、５０ｍＵの無細胞抽出液を用いた。ネガティブコントロールとして、上記のように調整した無細胞中質液の代わりに、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．６）を用いて各基質と反応を行ったものを「enzyme-」の実験区とし、各基質の代わりに５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．６）を用いて各無細胞抽出液と反応させたものを「基質-」の実験区とした。
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、０．２％ 各Ｎ−アセチル−（Ｒ，Ｓ）−β−アミノ酸、３７℃、１時間、または２４時間反応し、９６℃、１０分間処理し、反応を停止した。アセチル基の分解により生成した酢酸の量を酢酸キット（Ｒｏｃｈｅ）のプロトコールに従って定量した。
１時間後の酢酸生成量を表３に、２４時間後の酢酸生成量を表４に示した。その結果、Ｎ−アセチル−（R,S）-β−ａｍｉｎｏｂｕｔｙｌｉｃ ａｃｉｄ（Ｎ−アセチル−β−Ａｂａ）、Ｎ−アセチル−（R,S）-β−Ｌｅｕ、Ｎ−アセチル−（R,S）-β−ｈｏｍｏＬｅｕ、Ｎ−アセチル−（R,S）-β−Ｔｙｒ、Ｎ−アセチル−（R,S）-ｈｏｍｏＰｈｅ、Ｎ−アセチル−（R,S）-β−４−Ｆｌｕｏｒｏ−Ｐｈｅを基質とした実験区から酢酸が検出された。
【００７９】
【表３】
【００８０】
【表４】
【００８１】
１２−２．光学特異性の決定
反応24時間後のサンプルを各種キラル分割カラムにて解析し、光学選択性を決定した。
１２−２−１．(R),(S)−β−Ｌｅｕの分離
３−２−３．の分割条件で、標準品は、N−アセチル-(R),(S)−β−Ｌｅｕ、（Ｓ）−β−Ｌｅｕ、（Ｒ）−β−Ｌｅｕの順に溶出された。
ＪＭ１０９／ｐｔｒｐ４＿３ＢＲを用いたＮ−アセチル−β−Ｌｅｕ反応用液では（Ｒ）−β−Ｌｅｕが検出され（Ｓ）−β−Ｌｅｕは検出限界以下であり、> 99 ％ eeであった。
ＪＭ１０９／ｐＳＦＮ＿２ＢＳを用いたＮ−アセチル−β−Ｌｅｕ反応用液では（Ｓ）−β−Ｌｅｕが検出され（Ｒ）−β−Ｌｅｕは検出限界以下であり、> 99 ％ eeであった。
ＪＭ１０９／ｐＳＦＮ＿１ＶＲを用いたＮ−アセチル−β−Ｌｅｕ反応用液では（Ｒ）−β−Ｌｅｕが検出され（Ｓ）−β−Ｌｅｕは検出限界以下であり、> 99 ％ eeであった。
【００８２】
１２−２−２．(R)，(S)−β−ｈｏｍｏＬｅｕの分離
３−２−３．の分割条件で、標準品は、N-アセチル-（R，S）−β−ｈｏｍｏＬｅｕ、（Ｒ）−β−ｈｏｍｏＬｅｕ、（Ｓ）−β−ｈｏｍｏＬｅｕの順に溶出された。
ＪＭ１０９／ｐｔｒｐ４＿３ＢＲを用いたＮ−アセチル−β−ｈｏｍｏＬｅｕ反応用液では（Ｓ）−β−ｈｏｍｏＬｅｕが検出され、少量の（Ｒ）−β−Ｌｅｕは検出され６９％ eeであった。
ＪＭ１０９／ｐＳＦＮ＿２ＢＳを用いたＮ−アセチル−β−ｈｏｍｏＬｅｕ反応用液では（Ｒ）−β−ｈｏｍｏＬｅｕが検出され（Ｓ）−β−Ｌｅｕは検出限界以下であり、> 99 ％ eeであった。
ＪＭ１０９／ｐＳＦＮ＿１ＶＲを用いたＮ−アセチル−β−ｈｏｍｏＬｅｕ反応用液では（Ｓ）−β−ｈｏｍｏＬｅｕが検出され、（Ｒ）−β−ｈｏｍｏＬｅｕは検出限界以下であり、> 99 ％ eeであった。
【００８３】
１２−２−３．（R），（S）−β−ｈｏｍｏＰｈｅの分離
３−２−３．の分割条件で、標準品は、N−アセチル−(R,S) −β−ｈｏｍｏＰｈｅ、（Ｒ）−β−ｈｏｍｏＰｈｅ、（Ｓ）−β−ｈｏｍｏＰｈｅの順に溶出された。
ＪＭ１０９／ｐｔｒｐ４＿３ＢＲを用いたＮ−アセチル−β−ｈｏｍｏＰｈｅ反応用液では（Ｓ）−β−ｈｏｍｏＰｈｅが検出され、微量の（Ｒ）−β−ｈｏｍｏＰｈｅも検出され、９８％ eeであった。
ＪＭ１０９／ｐＳＦＮ＿２ＢＳを用いたＮ−アセチル−β−ｈｏｍｏＰｈｅ反応用液では（Ｒ）−β−ｈｏｍｏＰｈｅが検出され（Ｓ）−β−は検出限界以下であり、> 99 ％ eeであった。
ＪＭ１０９／ｐＳＦＮ＿１ＶＲを用いたＮ−アセチル−β−ｈｏｍｏＰｈｅ反応用液では（Ｓ）−β−ｈｏｍｏＰｈｅが検出され（Ｒ）−β−ｈｏｍｏＰｈｅは検出限界以下であり、> 99 ％ eeであった。
【００８４】
１２−２−４．（Ｒ），（Ｓ）−β−Ｔｙｒの分離
３−２−４．の分離条件で、標準品は、（Ｓ）−β−Ｔｙｒ、（Ｒ）−β−Ｔｙｒ、Ｎ−アセチル−（R）/(S)−β−Ｔｙｒの順に溶出された。(N-アセチル-β-Tyrの標準品はラセミ体であるので、分離はされるものの溶出順は未決)
ＪＭ１０９／ｐｔｒｐ４＿３ＢＲを用いたＮ−アセチル−β−Ｔｙｒ反応用液では（Ｒ）−β−Ｔｙｒが検出され、少量の（Ｓ）−β−Ｔｙｒも検出され６1 ％ eeであった。
ＪＭ１０９／ｐＳＦＮ＿２ＢＳを用いたＮ−アセチル−β−Ｔｙｒ反応用液では（Ｓ）−β−Ｔｙｒが検出され（Ｒ）−β−Ｔｙｒは検出限界以下であり、> 99 ％ eeであった。
ＪＭ１０９／ｐＳＦＮ＿１ＶＲを用いたＮ−アセチル−β−Ｔｙｒ反応用液では（Ｒ）−β−Ｔｙｒが検出され（Ｓ）−β−Ｔｙｒは検出限界以下であり、> 99 ％ eeであった。
【００８５】
１２−２−５．（Ｒ），（Ｓ）−４−Ｆｌｕｏｒｏ−β−Ｐｈｅの分離
３−２−４．の分離条件で、標準品は、（Ｓ）−４−Ｆｌｕｏｒｏ−β−Ｐｈｅ、（Ｒ）−４−Ｆｌｕｏｒｏ−β−Ｐｈｅ、Ｎ−アセチル−（Ｒ）/（Ｓ）−４−Ｆｌｕｏｒｏ−β−Ｐｈｅの順に溶出された。(N-アセチル-4-Fluoro-β-Pheの標準品はラセミ体であるので、分離はされるものの溶出順は未決)
ＪＭ１０９／ｐｔｒｐ４＿３ＢＲを用いたＮ−アセチル−４−Ｆｌｕｏｒｏ−β−Ｐｈｅ反応用液では（Ｒ）−４−Ｆｌｕｏｒｏ−β−Ｐｈｅが検出され、少量の（Ｓ）−４−Ｆｌｕｏｒｏ−β−Ｐｈｅが検出され、９４％ eeであった。
ＪＭ１０９／ｐＳＦＮ＿２ＢＳを用いたＮ−アセチル−４−Ｆｌｕｏｒｏ−β−Ｐｈｅ反応用液では（Ｓ）−４−Ｆｌｕｏｒｏ−β−Ｐｈｅが検出され（Ｒ）−４−Ｆｌｕｏｒｏ−β−Ｐｈｅは検出限界以下であり、> 99 ％ eeであった。
ＪＭ１０９／ｐＳＦＮ＿１ＶＲを用いたＮ−アセチル−４−Ｆｌｕｏｒｏ−β−Ｐｈｅ反応用液では（Ｒ）−４−Ｆｌｕｏｒｏ−β−Ｐｈｅが検出され（Ｓ）−４−Ｆｌｕｏｒｏ−β−Ｐｈｅは検出限界以下であり、> 99 ％ eeであった。
【００８６】
１２−３．Ｎ−アセチル−３，４−（−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−）−β−Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅへの基質特異性調査
ＪＭ１０９／ｐｔｒｐ４＿３ＢＲ、ＪＭ１０９／ｐＳＦＮ＿２ＢＳ、ＪＭ１０９／ｐＳＦＮ＿１ＶＲを上記のような方法で調整し、各種Ｎ−アセチル−３，４−（−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−）−β−Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅへの基質特異性を調査した。
培養液３００μＬを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）で洗浄し、３００μＬの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）に懸濁し、超音波破砕処理によって、菌体を破砕し、遠心分離（１５，０００ｇ、１０分、４℃）により得られる上澄み液を無細胞抽出液として反応に用いた。
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、０．２％ Ｎ−アセチル−（Ｒ）／（Ｓ）−３，４−（−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−）−β−Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ、３７℃、１０分間反応した。Ｎ−アセチル−β−Ｐｈｅとβ−Ｐｈｅの分離条件で、３，４−（−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−）−β−Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅを定量したところ、無細胞抽出液１ｍＬあたりの活性は、ＪＭ１０９／ｐｔｒｐ４＿３ＢＲは０．２Ｕ、ＪＭ１０９／ｐＳＦＮ＿２ＢＳは３．９Ｕ、ＪＭ１０９／ｐＳＦＮ＿１ＶＲは２７．８Ｕであった。
(Ｒ)，(Ｓ)−β−Ｐｈｅ光学分割条件にて標準品を分離したところ、（Ｓ）−３，４−（−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−）−β−Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ、（Ｒ）−３，４−（−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−）−β−Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ、Ｎ−アセチル−（Ｒ）/(S)− ３，４−（−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−）−β−Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅの順に溶出された。(Ｎ−アセチル−（Ｒ）/(S)−３，４−（−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−）−β−Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅの溶出順は未決)
この条件で、反応溶液を解析したところ、ＪＭ１０９／ｐｔｒｐ４＿３ＢＲの反応液からは（Ｒ）-３，４−（−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−）−β−Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅが、ＪＭ１０９／ｐＳＦＮ＿２ＢＳの反応液からは（Ｓ）−３，４−（−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−）−β−Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅが、ＪＭ１０９／ｐＳＦＮ＿１ＶＲの反応液からは（Ｒ）−３，４−（−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−）−β−Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅが検出された。
【００８７】
１２−４．Ｎ−アセチル−３−Ｐｙｒ−Ａｌａへの基質特異性調査
１２−１と同様の菌体を用いて、同様の方法で各酵素を調整し、５０ｍＵの無細胞抽出液を反応に用いた。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１％ Ｎ−アセチル−（Ｒ，Ｓ）−β−３−Ｐｙｒ−Ａｌａ、３７℃、１時間反応し、７０℃、１０分間処理し、反応を停止した。アセチル基の分解により生成した酢酸の量を酢酸キット（Ｒｏｃｈｅ）のプロトコールに従って定量した。
その結果、ＪＭ１０９／ｐｔｒｐ４＿３ＢＲ、ＪＭ１０９／ｐＳＦＮ＿２ＢＳ、ＪＭ１０９／ｐＳＦＮ＿１ＶＲを用いた反応液では、それぞれ３．５ｍＭ、８．４ｍＭ、０．８ｍＭの酢酸が検出され、「基質−」及び「ｅｎｚｙｍｅ−」の実験区からは酢酸は検出されなかった。
【００８８】
１３．蓄積量の評価
ＪＭ１０９／ｐｔｒｐ４＿３ＢＲ、ＪＭ１０９／ｐＳＦＮ＿２ＢＳ、ＪＭ１０９／ｐＳＦＮ＿１ＶＲを１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地で３７℃、１６時間前培養した。この培養菌体１ｍＬを、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＴＢ培地５０ｍＬに植菌し、３０℃、１６時間培養し得られた菌体を遠心分離にて集菌した。この菌体を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．６）を用いて洗菌し、同緩衝液を用いて１０倍に濃縮した菌体懸濁液を調製した。
この菌体懸濁液を用いて、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．６）、５％ Ｎ−アセチル−（Ｒ，Ｓ）−β−Ｐｈｅ、３７℃、２４時間、全量２．５ｍＬで反応した。その後、３−２−１の分析法で反応液を解析した。
ＪＭ１０９／ｐｔｒｐ４＿３ＢＲの１０倍濃縮の菌体懸濁液を５００μＬ加え反応したところ、（Ｒ）−β−Ｐｈｅの収率２１．６％、＞９９％ eeで、（Ｓ）−β−Ｐｈｅは検出限界以下であった。
ＪＭ１０９／ｐＳＦＮ＿２ＢＳの１０倍濃縮の菌体懸濁液を２５０μＬ加え反応したところ、（Ｓ）−β−Ｐｈｅの収率４９．５％、＞９９％ eeで、（Ｒ）−β−Ｐｈｅは検出限界以下であった。
ＪＭ１０９／ｐＳＦＮ＿１ＶＲの１０倍濃縮の菌体懸濁液を１２５μＬ加え反応したところ、（Ｒ）−β−Ｐｈｅの収率４５．４％、＞９９％ eeで、（Ｓ）−β−Ｐｈｅは検出限界以下であった。
【産業上の利用可能性】
【００８９】
本発明で同定された遺伝子を用いた大腸菌（Ｅｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のような宿主を組換えることによって、Ｎ−アセチル−（Ｒ）−β−アミノ酸アシラーゼ及びＮ−アセチル−（Ｓ）−β−アミノ酸アシラーゼを高発現する系を構築することができる。その結果、該酵素を利用してＲ体又はＳ体のβアミノ酸を選択的にする系を簡便かつ安価に提供することが可能となる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記のいずれか一つに示す蛋白質をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号１０で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ）配列番号１０で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Ｎ−アセチル−（Ｓ）−β−アミノ酸アシラーゼ活性を有する蛋白質、及び
（ｃ）配列番号１０で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む蛋白質であり、かつ、Ｎ−アセチル−（Ｓ）−β−アミノ酸アシラーゼ活性を有する蛋白質。
【請求項２】
下記のいずれか一つに示すＤＮＡを含む遺伝子。
（ａ）配列番号９に示される塩基配列からなるＤＮＡ、及び
（ｂ）配列番号９に示される塩基配列のＤＮＡと９０％以上の配列同一性を示すＤＮＡであり、かつ、Ｎ−アセチル−（Ｓ）−β−アミノ酸アシラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項３】
β−アミノ酸がβ−フェニルアラニン、β−ロイシン、β−ホモロイシン、β−ホモフェニルアラニン、β−チロシン、β−４−フルオロフェニルアラニン、β−アミノブチル酸、3,4-(-O-CH2-O-)-β−フェニルアラニン、及びβ−３−ピリジル−アラニンからなる群から選ばれるいずれかである、請求項１又は２に記載の遺伝子。
【請求項４】
下記のいずれか一つに示す蛋白質。
（ａ）配列番号１０で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ）配列番号１０で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Ｎ−アセチル−（Ｓ）−β−アミノ酸アシラーゼ活性を有する蛋白質、及び
（ｃ）配列番号１０で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む蛋白質であり、かつ、Ｎ−アセチル−（Ｓ）−β−アミノ酸アシラーゼ活性を有する蛋白質。
【請求項５】
β−アミノ酸がβ−フェニルアラニン、β−ロイシン、β−ホモロイシン、β−ホモフェニルアラニン、β−チロシン、β−４−フルオロフェニルアラニン、β−アミノブチル酸、3,4-(-O-CH2-O-)-β−フェニルアラニン、及びβ−３−ピリジル−アラニンからなる群から選ばれるいずれかである、請求項４記載のβ−アミノ酸アシラーゼ。
【請求項６】
請求項１から３のいずれか一項記載の遺伝子によって形質転換された微生物。
【請求項７】
請求項１から３のいずれか一項記載の遺伝子によって形質転換された微生物であるEscherichia coli。
【請求項８】
請求項６又は７記載の微生物をＮ−アセチル−β−アミノ酸に接触させ、β−アミノ酸を生成させ、これを回収することを特徴とするβ−アミノ酸の製造法。
【請求項９】
請求項６又は７記載の微生物から得られるＮ−アセチル−β−アミノ酸アシラーゼ活性を有する蛋白質をＮ−アセチル−β−アミノ酸に接触させ、β−アミノ酸を生成させ、これを回収することを特徴とするβ−アミノ酸の製造法。
【請求項１】
下記のいずれか一つに示す蛋白質をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号１０で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ）配列番号１０で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Ｎ−アセチル−（Ｓ）−β−アミノ酸アシラーゼ活性を有する蛋白質、及び
（ｃ）配列番号１０で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む蛋白質であり、かつ、Ｎ−アセチル−（Ｓ）−β−アミノ酸アシラーゼ活性を有する蛋白質。
【請求項２】
下記のいずれか一つに示すＤＮＡを含む遺伝子。
（ａ）配列番号９に示される塩基配列からなるＤＮＡ、及び
（ｂ）配列番号９に示される塩基配列のＤＮＡと９０％以上の配列同一性を示すＤＮＡであり、かつ、Ｎ−アセチル−（Ｓ）−β−アミノ酸アシラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項３】
β−アミノ酸がβ−フェニルアラニン、β−ロイシン、β−ホモロイシン、β−ホモフェニルアラニン、β−チロシン、β−４−フルオロフェニルアラニン、β−アミノブチル酸、3,4-(-O-CH2-O-)-β−フェニルアラニン、及びβ−３−ピリジル−アラニンからなる群から選ばれるいずれかである、請求項１又は２に記載の遺伝子。
【請求項４】
下記のいずれか一つに示す蛋白質。
（ａ）配列番号１０で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ）配列番号１０で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Ｎ−アセチル−（Ｓ）−β−アミノ酸アシラーゼ活性を有する蛋白質、及び
（ｃ）配列番号１０で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む蛋白質であり、かつ、Ｎ−アセチル−（Ｓ）−β−アミノ酸アシラーゼ活性を有する蛋白質。
【請求項５】
β−アミノ酸がβ−フェニルアラニン、β−ロイシン、β−ホモロイシン、β−ホモフェニルアラニン、β−チロシン、β−４−フルオロフェニルアラニン、β−アミノブチル酸、3,4-(-O-CH2-O-)-β−フェニルアラニン、及びβ−３−ピリジル−アラニンからなる群から選ばれるいずれかである、請求項４記載のβ−アミノ酸アシラーゼ。
【請求項６】
請求項１から３のいずれか一項記載の遺伝子によって形質転換された微生物。
【請求項７】
請求項１から３のいずれか一項記載の遺伝子によって形質転換された微生物であるEscherichia coli。
【請求項８】
請求項６又は７記載の微生物をＮ−アセチル−β−アミノ酸に接触させ、β−アミノ酸を生成させ、これを回収することを特徴とするβ−アミノ酸の製造法。
【請求項９】
請求項６又は７記載の微生物から得られるＮ−アセチル−β−アミノ酸アシラーゼ活性を有する蛋白質をＮ−アセチル−β−アミノ酸に接触させ、β−アミノ酸を生成させ、これを回収することを特徴とするβ−アミノ酸の製造法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２０１２−１９６２３１（Ｐ２０１２−１９６２３１Ａ）
【公開日】平成２４年１０月１８日（２０１２．１０．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−１５８２５２（Ｐ２０１２−１５８２５２）
【出願日】平成２４年７月１７日（２０１２．７．１７）
【分割の表示】特願２００７−１９２７２２（Ｐ２００７−１９２７２２）の分割
【原出願日】平成１９年７月２５日（２００７．７．２５）
【出願人】（０００００００６６）味の素株式会社 (887)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１０月１８日（２０１２．１０．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年７月１７日（２０１２．７．１７）
【分割の表示】特願２００７−１９２７２２（Ｐ２００７−１９２７２２）の分割
【原出願日】平成１９年７月２５日（２００７．７．２５）
【出願人】（０００００００６６）味の素株式会社 (887)
【Ｆターム（参考）】
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