Ｎアセチルガラクトサミンの製造方法
【課題】Ｎアセチルガラクトサミンの有効な製造方法の提供。
【解決手段】出発原料であるＮアセチルグルコサミンを、酵素を含む反応溶液と、ＡＴＰおよびＵＤＰ−糖の存在下で作用させることにより、Ｎアセチルガラクトサミンを製造する方法。
【解決手段】出発原料であるＮアセチルグルコサミンを、酵素を含む反応溶液と、ＡＴＰおよびＵＤＰ−糖の存在下で作用させることにより、Ｎアセチルガラクトサミンを製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｎアセチルグルコサミンを、ＡＴＰおよびＵＤＰ−糖の存在下にて、酵素と反応させることにより、Ｎアセチルガラクトサミンを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｎアセチルガラクトサミンは糖鎖中によく見られる単糖の一つであり、糖鎖を利用した機能性物質の原料として期待されている。しかしながら、Ｎアセチルガラクトサミンを豊富に含んだ天然産の糖質は多量に存在しない。これまでに、Ｎアセチルガラクトサミンの製造方法としては、鮭軟骨などから抽出されるコンドロイチン硫酸の酸加水分解分解物からガラクトサミンを抽出後Ｎ−アセチル化することにより製造する方法が知られている（非特許文献１を参照）。
【０００３】
しかしながら、この方法では、出発物質の含有量の低さなどから、産業的に有効な製造法とはいえず、そのためにＮアセチルガラクトサミンは非常に高価な物質であった。
【０００４】
【非特許文献１】Jeanloz, RZ編、“The Amino Sugars /volume 1A”, Academic Press (1969)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従来法では、安価に効率的にＮアセチルガラクトサミンを製造することはできなかった。従って、Ｎアセチルガラクトサミンの、有効な製造方法の確立が望まれていた。
【０００６】
本発明は、Ｎアセチルグルコサミンを、ＡＴＰおよびＵＤＰ−糖の存在下にて、酵素と反応させることにより、Ｎアセチルガラクトサミンを製造する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、鋭意検討した結果、出発原料であるＮアセチルグルコサミンを、ＡＴＰおよびＵＤＰ−糖の存在下、以下の(i)〜(iii)の酵素：(i) ＵＤＰ−ＮアセチルグルコサミンをＵＤＰ−Ｎアセチルガラクトサミンに変換する酵素；(ii) ＵＤＰ−ＮアセチルグルコサミンとＮアセチルガラクトサミン１−リン酸間でＵＭＰ単位の交換反応をする酵素；ならびに(iii) ＮアセチルグルコサミンとＡＴＰからＮアセチルグルコサミン１−リン酸とＡＤＰを生じる酵素およびＮアセチルガラクトサミンとＡＴＰからＮアセチルガラクトサミン１−リン酸とＡＤＰを生じる酵素、またはその両活性を持つ酵素、と同時に作用させることにより、Ｎアセチルガラクトサミンを製造できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］ 出発原料であるＮアセチルグルコサミンを、ＡＴＰおよびＵＤＰ−糖の存在下で、以下の(i)〜(iii)の酵素と同時に作用させることにより、Ｎアセチルガラクトサミンを製造する方法：
(i) ＵＤＰ−ＮアセチルグルコサミンをＵＤＰ−Ｎアセチルガラクトサミンに変換する酵素；
(ii) ＵＤＰ−ＮアセチルグルコサミンとＮアセチルガラクトサミン１−リン酸間でＵＭＰ単位の交換反応をする酵素；ならびに
(iii) ＮアセチルグルコサミンとＡＴＰからＮアセチルグルコサミン１−リン酸とＡＤＰを生じる酵素およびＮアセチルガラクトサミンとＡＴＰからＮアセチルガラクトサミン１−リン酸とＡＤＰを生じる酵素、またはその両活性を持つ酵素。
【０００９】
［２］ ＵＤＰ−糖が、ＵＤＰ−グルコース、ＵＤＰ−ガラクトース、ＵＤＰ−Ｎアセチルグルコサミン、ＵＤＰ−Ｎアセチルガラクトサミンまたはそれらの少なくとも２つの混合物からなる群から選択される、［１］の方法。
［３］ ＵＤＰ−糖が、ＵＤＰ−グルコースまたはＵＤＰ−Ｎアセチルグルコサミンである、［２］の方法。
【００１０】
［４］ (i)の酵素が、ＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼである、［１］〜［３］のいずれかの方法。
［５］ ＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼが、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）に由来する、［４］の方法。
【００１１】
［６］ (ii)の酵素が、ＵＤＰ−グルコース−ヘキソース１リン酸ウリジリルトランスフェラーゼである、［１］〜［３］のいずれかの方法。
［７］ ＵＤＰ−グルコース−ヘキソース１リン酸ウリジリルトランスフェラーゼが、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）に由来する、［６］の方法。
【００１２】
［８］ (iii)の酵素が、Ｎアセチルヘキソサミン１キナーゼである、［１］〜［３］のいずれかの方法。
［９］ Ｎアセチルヘキソサミン１キナーゼが、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）に由来する、［８］の方法。
【００１３】
［１０］ (i)の酵素としてＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼ、(ii)の酵素としてＵＤＰ−グルコース−ヘキソース１リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、(iii)の酵素としてＮアセチルヘキソサミン１キナーゼを同時に作用させる、［１］〜［３］のいずれかの方法。
［１１］ 作用させる全ての酵素が、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）に由来する［１０］の方法。
［１２］ さらに、製造されたＮアセチルガラクトサミンを精製する工程を含む、［１］〜［９］のいずれかの方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明では安価に得られるＮアセチルグルコサミンを出発原料として、ＡＴＰおよびＵＤＰ−糖の存在下、(i) ＵＤＰ−ＮアセチルグルコサミンをＵＤＰ−Ｎアセチルガラクトサミンに変換する酵素、(ii) ＵＤＰ−ＮアセチルグルコサミンとＮアセチルガラクトサミン１−リン酸間でＵＭＰ単位の交換反応をする酵素、ならびに(iii) ＮアセチルグルコサミンとＡＴＰからＮアセチルグルコサミン１−リン酸とＡＤＰを生じる酵素およびＮアセチルガラクトサミンとＡＴＰからＮアセチルガラクトサミン１−リン酸とＡＤＰを生じる酵素、またはその両活性を持つ酵素を同時に作用させることにより一段階でＮアセチルガラクトサミンを製造できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
出発原料であるＮアセチルグルコサミンの濃度は、特に限定されるものではないが、好ましくは１０ｍＭ〜２Ｍ、より好ましくは１００ｍＭ〜１Ｍ、さらに好ましくは６００ｍＭである。
【００１６】
(i)の酵素は、ＵＤＰ−ＮアセチルグルコサミンをＵＤＰ−Ｎアセチルガラクトサミンに変換する活性を有する限り、特に限定されないが、ＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼのうち、ＵＤＰ−Ｎアセチルグルコサミンにも活性を示す酵素を用いるのが好ましい。このような酵素としては、ヒト由来、Bacillus属細菌由来、ビフィズス菌由来のＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼ（Thoden, J. B.ら Structural analysis of the Y299C mutant of Escherichia coli UDP-galactose 4-epimerase. Teaching an old dog new tricks. The Journal of Biological Chemistry. 277:27528-27534 (2002)、再表01／038555、Genbank登録番号AB303839）を用いることができるが、好ましくは、ビフィドバクテリウム・ロンガムに由来するＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼを用いる。
【００１７】
(ii)の酵素は、ＵＤＰ−ＮアセチルグルコサミンとＮアセチルガラクトサミン１−リン酸間でＵＭＰ単位の交換反応を触媒する活性を有する限り、特に限定しないが、ビフィズス菌由来のＵＤＰ−グルコース−ヘキソース１リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（西本ら、第５８回日本生物工学会大会講演要旨集p. 92 (2006)、Genbank登録番号AB303839）を用いるのが好ましい。特に好ましくは、ビフィドバクテリウム・ロンガムに由来するＵＤＰ−グルコース−ヘキソース１リン酸ウリジリルトランスフェラーゼを用いる。
【００１８】
(iii)の酵素は、ＮアセチルグルコサミンとＡＴＰからＮアセチルグルコサミン１−リン酸とＡＤＰを生じる活性を持つ酵素およびＮアセチルガラクトサミンとＡＴＰからＮアセチルガラクトサミン１−リン酸とＡＤＰを生じる活性を持つ酵素、またはその両活性を持つ酵素である限り、特に限定されないが、ビフィズス菌由来のＮアセチルヘキソサミン１キナーゼ（特開２００７−９７５１７、Genbank登録番号AB303839）を用いるのが好ましい。特に好ましくは、ビフィドバクテリウム・ロンガムに由来するＮアセチルヘキソサミン１キナーゼを用いる。
【００１９】
通常、(iii)に示す様な活性の酵素はキナーゼと呼ばれており、一般的にはその逆反応の利用はほとんど省みられたことはなかった。この逆反応は、本発明者により初めて見出されたものであり、本発明では、この酵素の逆反応をＮアセチルガラクトサミンを生じる最終段階で利用している。
【００２０】
これらの酵素は、天然の生物または遺伝子組換え生物（もしくは細胞）により産生されたもの、あるいは市販されているものを用いることができる。遺伝子組換え生物（もしくは細胞）は、当業者に公知である分子生物学的手法を用いて、当該酵素をコードする遺伝子を適当なベクターに組み込み、そのベクターを用いて適当な宿主生物（例えば、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞など）を形質転換することにより得ることができる（Sambrook J.ら、“Molecular Cloning A LBORATORY MANUAL /second edition”, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)参照）。
【００２１】
上記生物により産生された酵素は、通常の方法を用いて、当該生物の培養物より単離精製できる。ここで「培養物」とは、培養上清、培養細胞もしくは培養菌体または細胞もしくは細胞の破砕物を意味する。培養後、目的の酵素が菌体内または細胞内に生産される場合には、細胞を遠心分離により回収し、緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を回収する。あるいは、目的の酵素が菌体外または細胞外に生産される場合には、遠心分離などにより菌体または細胞を除去し、培養液を回収する。この無細胞抽出液を遠心分離し、得られた上清から、または上記培養液から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、陰イオン交換クロマトグラフィー法、陽イオン交換クロマトグラフィー法、疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用いて、精製酵素を得ることができる。
【００２２】
本発明方法において用いられる酵素は、精製された形態であっても、上記無細胞抽出液または培養液のような粗製物の形態であってもよい。
【００２３】
本発明における反応において、上記酵素群は、以下の一連の反応を触媒し、ＡＴＰおよびＵＤＰ−糖の存在下、Ｎアセチルグルコサミンより、Ｎアセチルガラクトサミンを生成する：
図中の略語：
ＧｌｃＮＡｃ：Ｎアセチルグルコサミン
ＧｌｃＮＡｃ１Ｐ：Ｎアセチルグルコサミン１−リン酸
ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ：ＵＤＰ−Ｎアセチルガラクトサミン
ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ：ＵＤＰ−Ｎアセチルグルコサミン
ＧａｌＮＡｃ１Ｐ：Ｎアセチルガラクトサミン１−リン酸
ＧａｌＮＡｃ：Ｎアセチルガラクトサミン。
【００２４】
反応液中の酵素の濃度は、０．０１Ｕ〜２００Ｕ／ｍｌ、好ましくは、０．０５Ｕ〜１００Ｕ／ｍｌの範囲で適宜設定でき、例えば、Ｎアセチルヘキソサミンキナーゼであれば１．０Ｕ〜１０Ｕ／ｍｌ、ＵＤＰグルコース−ヘキソース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼであれば０．０５Ｕ／ｍｌ、ＵＤＰグルコース−４−エピメラーゼであれば１００Ｕ／ｍｌで用いるのが好ましい。
【００２５】
反応液中のＡＴＰの濃度は、特に限定されるものではないが、好ましくは０．０１ｍＭ〜１００ｍＭ、より好ましくは０．１ｍＭ〜１０ｍＭ以下、さらに好ましくは、０．７５ｍＭ〜２．０ｍＭである。
【００２６】
用いるＵＤＰ−糖としては、ＵＤＰ−グルコース、ＵＤＰ−ガラクトース、ＵＤＰ−Ｎアセチルグルコサミン、ＵＤＰ−Ｎアセチルガラクトサミンのいずれかまたはそれらの少なくとも２つの混合物を用いることができる。好ましくは、ＵＤＰ−グルコースまたはＵＤＰ−Ｎアセチルグルコサミンを用いる。反応液中のＵＤＰ−糖の濃度は、特に限定されるものではないが、好ましくは０．００５ｍＭ〜５０ｍＭ、より好ましくは０．０５ｍＭ〜１０ｍＭ、さらに好ましくは、０．２ｍＭ〜０．６ｍＭである。
【００２７】
反応液のｐHは好ましくは５〜９、さらに好ましくは、６．５である。反応温度は特に限定されるものではないが好ましくは５℃〜８０℃、より好ましくは２０℃〜６０℃、さらに好ましくは、３０℃である。反応時間は、１時間〜３０日間、好ましくは２４時間〜１０日間、さらに好ましくは５日間である。必要に応じて撹拌しながら反応を行っても良い。
【００２８】
反応系は特に限定されるものではないが通常水溶液あるいは緩衝液中で行われる。緩衝液としては、酵素反応に一般的に用いられるもの、例えば、トリス塩酸緩衝液、トリス酢酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、クエン酸ナトリウム緩衝液などを使用できるが、ＭＯＰＳ緩衝液を用いるのが好ましい。使用濃度は、１０ｍＭ〜５００ｍＭ、好ましくは１０ｍＭ〜３００ｍＭ、さらに好ましくは１００ｍＭである。
【００２９】
反応は、固定化酵素リアクターを用いて行うことも可能である。酵素を固定化することによって、酵素が安定化され、連続反復使用が可能となる点において有効である。酵素の固定化は、担体結合法、架橋法、包括法を用いて行うことができる。担体結合法では、酵素を担体（例えば、セルロース、デキストラン、アガロースなどの多糖類の誘導体、ポリアクリルアミドゲル、ポリスチレン樹脂、多孔性ガラス、金属酸化物など）に、物理的吸着、イオン結合および共有結合等を用いて結合させることができる。架橋法では、２個またはそれ以上の官能基を持つ試薬を用いて、酵素同士を互いに架橋することによって固定化する。架橋試薬としては、Schiff塩基をつくるグルタルアルデヒド、ペプチド結合をするイソシアン酸誘導体、N,N’−エチレンマレイミド、ジアゾカップリングをするビスジアゾベンジン、あるいはアルキル化するN,N’−ポリメチレンビスヨードアセトアミドなどを用いることができる。包括法では、高分子ゲルの細かい格子の中に酵素を取り込む格子型と、半透膜の高分子の皮膜によって酵素を皮膜するマイクロカプセル型を用いる。格子型の方法では、合成高分子物質のポリアクリルアミドゲル、ポリビニルアルコール、光硬化性樹脂および天然高分子物質のデンプン、コンニャク粉、ゼラチン、アルギン酸、カラギーナンなどの高分子化合物を用いることができる。マイクロカプセル型の方法では、ヘキサメチレンジアミン、セバコイルクロリド、ポリスチレン、レシチンなどを用いることができる（福井三郎、千畑一郎、鈴木周一、「酵素工学」東京化学同人発行、１９８１年）。
【００３０】
担体は、３種の酵素を固定化したものを用いてもよいし、それぞれの酵素を固定化した複数の担体を用いてもよい。
【００３１】
本発明の方法により、用いたＮアセチルグルコサミンの少なくとも２０％、好ましくは少なくとも２５％がＮアセチルガラクトサミンに変換される。
【００３２】
生成したＮアセチルガラクトサミンは、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ゲル濾過法など各種のクロマトグラフィー、向流分配、向流抽出など二液相間の分配を利用する方法、濃縮、冷却、有機溶媒添加など溶解度の差を利用する方法、および、塩析などの通常の精製法を単独で、あるいは適宜組み合わせて用いて、出発原料であるＮアセチルグルコサミンと分離することが可能である。好ましくは、Ｎアセチルガラクトサミンは、強イオン性陽イオン交換クロマトグラフィーのような方法により、Ｎアセチルグルコサミンと分離することができる。
【００３３】
得られたＮアセチルガラクトサミンは、例えば医薬品、化粧品、食品添加物等の材料として好適に用いることができる。
【実施例】
【００３４】
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００３５】
実施例１：酵素の調製
Ｎアセチルヘキソサミン１キナーゼの調製
ビフィドバクテリウム・ロンガムのＮアセチルヘキソサミン１キナーゼの遺伝子配列（配列番号１）を基に、以下のプライマー作製し：
フォーワードプライマー：aacggaccccatatgaccgaaagcaatgaagttttattc（配列番号２）
リバースプライマー：gctgacctcgagcctggcagcctccatgatgtcggctac（配列番号３）、
ビフィドバクテリウム・ロンガムＪＣＭ １２１７株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＮアセチルヘキソサミン１キナーゼのＯＲＦ全長をＰＣＲにより増幅した。
【００３６】
ＰＣＲ産物を制限酵素ＮｃｏＩ及びＸｈｏＩで消化後、同様に処理した市販の遺伝子発現用プラスミドｐＥＴ（ノバジェン社製）にＤＮＡライゲーションキット（宝酒造株式会社製）を用いて連結した。さらに、これらのプラスミドを用いてSambrook，J.，Fritsch, E. F. and Maniatis, T. "Molecular Cloning, A Laboratory Manual 第２版”1.７４章 Vo1. 1 (1989)に記載された方法に従い、大腸菌を形質転換した。
【００３７】
以上のようにして得た形質転換体を用い、常法に従って該遺伝子の発現及び組換えタンパク質の生産を行った。得られた組換えタンパク質を、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース（キアゲン社製）を用いたカラムクロマトグラフィーにより精製して、精製酵素標品を得た。得られた精製酵素の比活性は１．５Ｕ／ｍｇであった。
【００３８】
ＵＤＰグルコース−ヘキソース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼの調製
ビフィドバクテリウム・ロンガムのＵＤＰグルコース−ヘキソース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼの配列（配列番号４）を基に、以下のプライマーを作製し：
フォーワードプライマー：gatatatacatatgaacgatcagctgaccgaggta（配列番号５）
リバースプライマー：tgacctctcgagcctagcggcaaaaccaaggctttcga（配列番号６）、
ビフィドバクテリウム・ロンガムＪＣＭ １２１７株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＵＤＰグルコース−ヘキソース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ遺伝子をＰＣＲにより増幅した。
【００３９】
ＰＣＲ産物を制限酵素ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩで消化後、同様に処理した市販の遺伝子発現用プラスミドｐＥＴ３０（ノバジェン社製）にＤＮＡライゲーションキット（宝酒造株式会社製）を用いて連結した。さらに、これらのプラスミドを用いてSambrook，J.，Fritsch, E. F. and Maniatis, T. "Molecular Cloning, A Laboratory Manual 第２版”1.７４章 Vo1. 1 (1989)に記載された方法に従い、大腸菌を形質転換した。
【００４０】
以上のようにして得た形質転換体を用い、常法に従って該遺伝子の発現及び組換えタンパク質の生産を行った。得られた組換えタンパク質はＮｉ−ＮＴＡアガロース（キアゲン社製）を用いたカラムクロマトグラフィーにより精製して、精製酵素標品を得た。得られた精製酵素の比活性は１．１Ｕ／ｍｇであった。
【００４１】
ＵＤＰグルコース−４−エピメラーゼの調製
ビフィドバクテリウム・ロンガムのＵＤＰグルコース−４−エピメラーゼの配列（配列番号７）を基に、以下のプライマーを作製し：
フォーワードプライマー：gatatacatatgactactgttctggttacgggc（配列番号８）
リバースプライマー：ctgctcctcgagctccgcgtcgcggaaaccgttggggttc（配列番号９）、
ビフィドバクテリウム・ロンガムＪＣＭ １２１７株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＵＤＰグルコース−ヘキソース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ遺伝子をＰＣＲにより増幅した。
【００４２】
ＰＣＲ産物を制限酵素ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩで消化後、同様に処理した市販の遺伝子発現用プラスミドｐＥＴ３０（ノバジェン社製）にＤＮＡライゲーションキット（宝酒造株式会社製）を用いて連結した。さらに、これらのプラスミドを用いてSambrook，J.，Fritsch, E. F. and Maniatis, T. "Molecular Cloning, A Laboratory Manual 第２版”1.７４章 Vo1. 1 (1989)に記載された方法に従い、大腸菌を形質転換した。
【００４３】
以上のようにして得た形質転換体を用い、常法に従って該遺伝子の発現及び組換えタンパク質の生産を行った。得られた組換えタンパク質はＮｉ−ＮＴＡアガロース（キアゲン社製）を用いたカラムクロマトグラフィーにより精製し、精製酵素標品を得た。得られた精製酵素の比活性は１５８Ｕ／ｍｇであった。
以上のようにして得た酵素を以下の反応液に用いた。
【００４４】
実施例２：反応液の調製
［反応液１］
１００ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．５）中に、最終濃度が６００ｍＭのＮアセチルグルコサミン、０．６ｍＭのＵＤＰ−Ｎアセチルグルコサミン、２．０ｍＭのＡＴＰ、１０ｍＭの塩化マグネシウム、０．０５％アジ化ナトリウム、１．０Ｕ／ｍｌのＮアセチルヘキソサミン１キナーゼ（ビフィドバクテリウム・ロンガム由来精製酵素）、０．０５Ｕ／ｍｌのＵＤＰグルコース−ヘキソース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（ビフィドバクテリウム・ロンガム由来精製酵素）、５０Ｕ／ｍｌのＵＤＰグルコース−４−エピメラーゼ（ビフィドバクテリウム・ロンガム由来精製酵素）となるように、それぞれを加えて反応液１を調製した。
【００４５】
［反応液２］
１００ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．５）中に、最終濃度が６００ｍＭのＮアセチルグルコサミン、０．６ｍＭのＵＤＰ−グルコース、０．７５ｍＭのＡＴＰ、１０ｍＭの塩化マグネシウム、０．０５％アジ化ナトリウム、１０Ｕ／ｍｌのＮアセチルヘキソサミンキナーゼ（ビフィドバクテリウム・ロンガム由来精製酵素）、０．０５Ｕ／ｍｌのＵＤＰグルコース−ヘキソース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（ビフィドバクテリウム・ロンガム由来精製酵素）、１００Ｕ／ｍｌのＵＤＰグルコース−４−エピメラーゼ（ビフィドバクテリウム・ロンガム由来精製酵素）となるように、それぞれを加えて反応液２を調製した。
【００４６】
［反応液３］
１００ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．５）中に、最終濃度が６００ｍＭのＮアセチルグルコサミン、０．２ｍＭのＵＤＰ−グルコース、１．０ｍＭのＡＴＰ、１０ｍＭの塩化マグネシウム、０．０５％アジ化ナトリウム、１０Ｕ／ｍｌのＮアセチルヘキソサミンキナーゼ（ビフィドバクテリウム・ロンガム由来精製酵素）、０．０５Ｕ／ｍｌのＵＤＰグルコース−ヘキソース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（ビフィドバクテリウム・ロンガム由来精製酵素）、１００Ｕ／ｍｌのＵＤＰグルコース−４−エピメラーゼ（ビフィドバクテリウム・ロンガム由来精製酵素）となるように、それぞれを加えて反応液を調製した。
【００４７】
実施例３：Ｎアセチルガラクトサミンの生成
実施例２で調製した反応液１、反応液２、および反応液３をそれぞれ恒温器で３０℃、５日間インキュベートし、酵素反応を行った。反応終了後、反応液を適宜希釈して高速液体クロマトグラフィー（島津製作所製）を用いて、ＮアセチルグルコサミンとＮアセチルガラクトサミンの濃度を調べ、モル収率を算出した。
【００４８】
この結果、反応液１、反応液２、および反応液３におけるＮアセチルガラクトサミンのモル収率はそれぞれ２７．７％、２８．０％、２４．７％であった。反応液１のタイムコースを図１に示す。
【００４９】
実施例４：Ｎアセチルガラクトサミンの精製
ＮアセチルグルコサミンとＮアセチルガラクトサミンの分離は、カラム剤：イオン交換樹脂（ダウエックス、ザ・ダウ・ケミカル・カンパニー製）、流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ、移動相：水、の条件下で行うことができる。反応液を電気透析し脱塩した後、サンプル５ｍｌをカラム（２．６ｃｍ×４０ｃｍ、２００ｍｌカラム剤）に供し、４ｍｌずつ分画した。各フラクションをＨＰＬＣで分析した結果を図２に示す。図２に示すようにＮアセチルグルコサミンとＮアセチルガラクトサミンを分離し、Ｎアセチルガラクトサミンを精製することができる。
【００５０】
以上の結果より、本願発明に係る方法を用いることによって、出発原料のＮアセチルグルコサミンのうち約３０％程度をＮアセチルガラクトサミンに変換できることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明は、Ｎアセチルグルコサミンを出発原料として用いて、Ｎアセチルガラクトサミンを製造することを可能とする。本発明は、Ｎアセチルガラクトサミンの有効な製造法である上に、Ｎアセチルガラクトサミンを安価に、かつ一工程で製造できるという利点を有する。製造されたＮアセチルガラクトサミンは食品、医薬品あるいはそれらの原料として用いることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】実施例３における、反応液１のタイムコースを示す図である。
【図２】実施例４における各フラクションをＨＰＬＣで分析した結果を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｎアセチルグルコサミンを、ＡＴＰおよびＵＤＰ−糖の存在下にて、酵素と反応させることにより、Ｎアセチルガラクトサミンを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｎアセチルガラクトサミンは糖鎖中によく見られる単糖の一つであり、糖鎖を利用した機能性物質の原料として期待されている。しかしながら、Ｎアセチルガラクトサミンを豊富に含んだ天然産の糖質は多量に存在しない。これまでに、Ｎアセチルガラクトサミンの製造方法としては、鮭軟骨などから抽出されるコンドロイチン硫酸の酸加水分解分解物からガラクトサミンを抽出後Ｎ−アセチル化することにより製造する方法が知られている（非特許文献１を参照）。
【０００３】
しかしながら、この方法では、出発物質の含有量の低さなどから、産業的に有効な製造法とはいえず、そのためにＮアセチルガラクトサミンは非常に高価な物質であった。
【０００４】
【非特許文献１】Jeanloz, RZ編、“The Amino Sugars /volume 1A”, Academic Press (1969)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従来法では、安価に効率的にＮアセチルガラクトサミンを製造することはできなかった。従って、Ｎアセチルガラクトサミンの、有効な製造方法の確立が望まれていた。
【０００６】
本発明は、Ｎアセチルグルコサミンを、ＡＴＰおよびＵＤＰ−糖の存在下にて、酵素と反応させることにより、Ｎアセチルガラクトサミンを製造する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、鋭意検討した結果、出発原料であるＮアセチルグルコサミンを、ＡＴＰおよびＵＤＰ−糖の存在下、以下の(i)〜(iii)の酵素：(i) ＵＤＰ−ＮアセチルグルコサミンをＵＤＰ−Ｎアセチルガラクトサミンに変換する酵素；(ii) ＵＤＰ−ＮアセチルグルコサミンとＮアセチルガラクトサミン１−リン酸間でＵＭＰ単位の交換反応をする酵素；ならびに(iii) ＮアセチルグルコサミンとＡＴＰからＮアセチルグルコサミン１−リン酸とＡＤＰを生じる酵素およびＮアセチルガラクトサミンとＡＴＰからＮアセチルガラクトサミン１−リン酸とＡＤＰを生じる酵素、またはその両活性を持つ酵素、と同時に作用させることにより、Ｎアセチルガラクトサミンを製造できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］ 出発原料であるＮアセチルグルコサミンを、ＡＴＰおよびＵＤＰ−糖の存在下で、以下の(i)〜(iii)の酵素と同時に作用させることにより、Ｎアセチルガラクトサミンを製造する方法：
(i) ＵＤＰ−ＮアセチルグルコサミンをＵＤＰ−Ｎアセチルガラクトサミンに変換する酵素；
(ii) ＵＤＰ−ＮアセチルグルコサミンとＮアセチルガラクトサミン１−リン酸間でＵＭＰ単位の交換反応をする酵素；ならびに
(iii) ＮアセチルグルコサミンとＡＴＰからＮアセチルグルコサミン１−リン酸とＡＤＰを生じる酵素およびＮアセチルガラクトサミンとＡＴＰからＮアセチルガラクトサミン１−リン酸とＡＤＰを生じる酵素、またはその両活性を持つ酵素。
【０００９】
［２］ ＵＤＰ−糖が、ＵＤＰ−グルコース、ＵＤＰ−ガラクトース、ＵＤＰ−Ｎアセチルグルコサミン、ＵＤＰ−Ｎアセチルガラクトサミンまたはそれらの少なくとも２つの混合物からなる群から選択される、［１］の方法。
［３］ ＵＤＰ−糖が、ＵＤＰ−グルコースまたはＵＤＰ−Ｎアセチルグルコサミンである、［２］の方法。
【００１０】
［４］ (i)の酵素が、ＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼである、［１］〜［３］のいずれかの方法。
［５］ ＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼが、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）に由来する、［４］の方法。
【００１１】
［６］ (ii)の酵素が、ＵＤＰ−グルコース−ヘキソース１リン酸ウリジリルトランスフェラーゼである、［１］〜［３］のいずれかの方法。
［７］ ＵＤＰ−グルコース−ヘキソース１リン酸ウリジリルトランスフェラーゼが、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）に由来する、［６］の方法。
【００１２】
［８］ (iii)の酵素が、Ｎアセチルヘキソサミン１キナーゼである、［１］〜［３］のいずれかの方法。
［９］ Ｎアセチルヘキソサミン１キナーゼが、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）に由来する、［８］の方法。
【００１３】
［１０］ (i)の酵素としてＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼ、(ii)の酵素としてＵＤＰ−グルコース−ヘキソース１リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、(iii)の酵素としてＮアセチルヘキソサミン１キナーゼを同時に作用させる、［１］〜［３］のいずれかの方法。
［１１］ 作用させる全ての酵素が、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）に由来する［１０］の方法。
［１２］ さらに、製造されたＮアセチルガラクトサミンを精製する工程を含む、［１］〜［９］のいずれかの方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明では安価に得られるＮアセチルグルコサミンを出発原料として、ＡＴＰおよびＵＤＰ−糖の存在下、(i) ＵＤＰ−ＮアセチルグルコサミンをＵＤＰ−Ｎアセチルガラクトサミンに変換する酵素、(ii) ＵＤＰ−ＮアセチルグルコサミンとＮアセチルガラクトサミン１−リン酸間でＵＭＰ単位の交換反応をする酵素、ならびに(iii) ＮアセチルグルコサミンとＡＴＰからＮアセチルグルコサミン１−リン酸とＡＤＰを生じる酵素およびＮアセチルガラクトサミンとＡＴＰからＮアセチルガラクトサミン１−リン酸とＡＤＰを生じる酵素、またはその両活性を持つ酵素を同時に作用させることにより一段階でＮアセチルガラクトサミンを製造できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
出発原料であるＮアセチルグルコサミンの濃度は、特に限定されるものではないが、好ましくは１０ｍＭ〜２Ｍ、より好ましくは１００ｍＭ〜１Ｍ、さらに好ましくは６００ｍＭである。
【００１６】
(i)の酵素は、ＵＤＰ−ＮアセチルグルコサミンをＵＤＰ−Ｎアセチルガラクトサミンに変換する活性を有する限り、特に限定されないが、ＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼのうち、ＵＤＰ−Ｎアセチルグルコサミンにも活性を示す酵素を用いるのが好ましい。このような酵素としては、ヒト由来、Bacillus属細菌由来、ビフィズス菌由来のＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼ（Thoden, J. B.ら Structural analysis of the Y299C mutant of Escherichia coli UDP-galactose 4-epimerase. Teaching an old dog new tricks. The Journal of Biological Chemistry. 277:27528-27534 (2002)、再表01／038555、Genbank登録番号AB303839）を用いることができるが、好ましくは、ビフィドバクテリウム・ロンガムに由来するＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼを用いる。
【００１７】
(ii)の酵素は、ＵＤＰ−ＮアセチルグルコサミンとＮアセチルガラクトサミン１−リン酸間でＵＭＰ単位の交換反応を触媒する活性を有する限り、特に限定しないが、ビフィズス菌由来のＵＤＰ−グルコース−ヘキソース１リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（西本ら、第５８回日本生物工学会大会講演要旨集p. 92 (2006)、Genbank登録番号AB303839）を用いるのが好ましい。特に好ましくは、ビフィドバクテリウム・ロンガムに由来するＵＤＰ−グルコース−ヘキソース１リン酸ウリジリルトランスフェラーゼを用いる。
【００１８】
(iii)の酵素は、ＮアセチルグルコサミンとＡＴＰからＮアセチルグルコサミン１−リン酸とＡＤＰを生じる活性を持つ酵素およびＮアセチルガラクトサミンとＡＴＰからＮアセチルガラクトサミン１−リン酸とＡＤＰを生じる活性を持つ酵素、またはその両活性を持つ酵素である限り、特に限定されないが、ビフィズス菌由来のＮアセチルヘキソサミン１キナーゼ（特開２００７−９７５１７、Genbank登録番号AB303839）を用いるのが好ましい。特に好ましくは、ビフィドバクテリウム・ロンガムに由来するＮアセチルヘキソサミン１キナーゼを用いる。
【００１９】
通常、(iii)に示す様な活性の酵素はキナーゼと呼ばれており、一般的にはその逆反応の利用はほとんど省みられたことはなかった。この逆反応は、本発明者により初めて見出されたものであり、本発明では、この酵素の逆反応をＮアセチルガラクトサミンを生じる最終段階で利用している。
【００２０】
これらの酵素は、天然の生物または遺伝子組換え生物（もしくは細胞）により産生されたもの、あるいは市販されているものを用いることができる。遺伝子組換え生物（もしくは細胞）は、当業者に公知である分子生物学的手法を用いて、当該酵素をコードする遺伝子を適当なベクターに組み込み、そのベクターを用いて適当な宿主生物（例えば、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞など）を形質転換することにより得ることができる（Sambrook J.ら、“Molecular Cloning A LBORATORY MANUAL /second edition”, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)参照）。
【００２１】
上記生物により産生された酵素は、通常の方法を用いて、当該生物の培養物より単離精製できる。ここで「培養物」とは、培養上清、培養細胞もしくは培養菌体または細胞もしくは細胞の破砕物を意味する。培養後、目的の酵素が菌体内または細胞内に生産される場合には、細胞を遠心分離により回収し、緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を回収する。あるいは、目的の酵素が菌体外または細胞外に生産される場合には、遠心分離などにより菌体または細胞を除去し、培養液を回収する。この無細胞抽出液を遠心分離し、得られた上清から、または上記培養液から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、陰イオン交換クロマトグラフィー法、陽イオン交換クロマトグラフィー法、疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用いて、精製酵素を得ることができる。
【００２２】
本発明方法において用いられる酵素は、精製された形態であっても、上記無細胞抽出液または培養液のような粗製物の形態であってもよい。
【００２３】
本発明における反応において、上記酵素群は、以下の一連の反応を触媒し、ＡＴＰおよびＵＤＰ−糖の存在下、Ｎアセチルグルコサミンより、Ｎアセチルガラクトサミンを生成する：
図中の略語：
ＧｌｃＮＡｃ：Ｎアセチルグルコサミン
ＧｌｃＮＡｃ１Ｐ：Ｎアセチルグルコサミン１−リン酸
ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ：ＵＤＰ−Ｎアセチルガラクトサミン
ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ：ＵＤＰ−Ｎアセチルグルコサミン
ＧａｌＮＡｃ１Ｐ：Ｎアセチルガラクトサミン１−リン酸
ＧａｌＮＡｃ：Ｎアセチルガラクトサミン。
【００２４】
反応液中の酵素の濃度は、０．０１Ｕ〜２００Ｕ／ｍｌ、好ましくは、０．０５Ｕ〜１００Ｕ／ｍｌの範囲で適宜設定でき、例えば、Ｎアセチルヘキソサミンキナーゼであれば１．０Ｕ〜１０Ｕ／ｍｌ、ＵＤＰグルコース−ヘキソース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼであれば０．０５Ｕ／ｍｌ、ＵＤＰグルコース−４−エピメラーゼであれば１００Ｕ／ｍｌで用いるのが好ましい。
【００２５】
反応液中のＡＴＰの濃度は、特に限定されるものではないが、好ましくは０．０１ｍＭ〜１００ｍＭ、より好ましくは０．１ｍＭ〜１０ｍＭ以下、さらに好ましくは、０．７５ｍＭ〜２．０ｍＭである。
【００２６】
用いるＵＤＰ−糖としては、ＵＤＰ−グルコース、ＵＤＰ−ガラクトース、ＵＤＰ−Ｎアセチルグルコサミン、ＵＤＰ−Ｎアセチルガラクトサミンのいずれかまたはそれらの少なくとも２つの混合物を用いることができる。好ましくは、ＵＤＰ−グルコースまたはＵＤＰ−Ｎアセチルグルコサミンを用いる。反応液中のＵＤＰ−糖の濃度は、特に限定されるものではないが、好ましくは０．００５ｍＭ〜５０ｍＭ、より好ましくは０．０５ｍＭ〜１０ｍＭ、さらに好ましくは、０．２ｍＭ〜０．６ｍＭである。
【００２７】
反応液のｐHは好ましくは５〜９、さらに好ましくは、６．５である。反応温度は特に限定されるものではないが好ましくは５℃〜８０℃、より好ましくは２０℃〜６０℃、さらに好ましくは、３０℃である。反応時間は、１時間〜３０日間、好ましくは２４時間〜１０日間、さらに好ましくは５日間である。必要に応じて撹拌しながら反応を行っても良い。
【００２８】
反応系は特に限定されるものではないが通常水溶液あるいは緩衝液中で行われる。緩衝液としては、酵素反応に一般的に用いられるもの、例えば、トリス塩酸緩衝液、トリス酢酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、クエン酸ナトリウム緩衝液などを使用できるが、ＭＯＰＳ緩衝液を用いるのが好ましい。使用濃度は、１０ｍＭ〜５００ｍＭ、好ましくは１０ｍＭ〜３００ｍＭ、さらに好ましくは１００ｍＭである。
【００２９】
反応は、固定化酵素リアクターを用いて行うことも可能である。酵素を固定化することによって、酵素が安定化され、連続反復使用が可能となる点において有効である。酵素の固定化は、担体結合法、架橋法、包括法を用いて行うことができる。担体結合法では、酵素を担体（例えば、セルロース、デキストラン、アガロースなどの多糖類の誘導体、ポリアクリルアミドゲル、ポリスチレン樹脂、多孔性ガラス、金属酸化物など）に、物理的吸着、イオン結合および共有結合等を用いて結合させることができる。架橋法では、２個またはそれ以上の官能基を持つ試薬を用いて、酵素同士を互いに架橋することによって固定化する。架橋試薬としては、Schiff塩基をつくるグルタルアルデヒド、ペプチド結合をするイソシアン酸誘導体、N,N’−エチレンマレイミド、ジアゾカップリングをするビスジアゾベンジン、あるいはアルキル化するN,N’−ポリメチレンビスヨードアセトアミドなどを用いることができる。包括法では、高分子ゲルの細かい格子の中に酵素を取り込む格子型と、半透膜の高分子の皮膜によって酵素を皮膜するマイクロカプセル型を用いる。格子型の方法では、合成高分子物質のポリアクリルアミドゲル、ポリビニルアルコール、光硬化性樹脂および天然高分子物質のデンプン、コンニャク粉、ゼラチン、アルギン酸、カラギーナンなどの高分子化合物を用いることができる。マイクロカプセル型の方法では、ヘキサメチレンジアミン、セバコイルクロリド、ポリスチレン、レシチンなどを用いることができる（福井三郎、千畑一郎、鈴木周一、「酵素工学」東京化学同人発行、１９８１年）。
【００３０】
担体は、３種の酵素を固定化したものを用いてもよいし、それぞれの酵素を固定化した複数の担体を用いてもよい。
【００３１】
本発明の方法により、用いたＮアセチルグルコサミンの少なくとも２０％、好ましくは少なくとも２５％がＮアセチルガラクトサミンに変換される。
【００３２】
生成したＮアセチルガラクトサミンは、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ゲル濾過法など各種のクロマトグラフィー、向流分配、向流抽出など二液相間の分配を利用する方法、濃縮、冷却、有機溶媒添加など溶解度の差を利用する方法、および、塩析などの通常の精製法を単独で、あるいは適宜組み合わせて用いて、出発原料であるＮアセチルグルコサミンと分離することが可能である。好ましくは、Ｎアセチルガラクトサミンは、強イオン性陽イオン交換クロマトグラフィーのような方法により、Ｎアセチルグルコサミンと分離することができる。
【００３３】
得られたＮアセチルガラクトサミンは、例えば医薬品、化粧品、食品添加物等の材料として好適に用いることができる。
【実施例】
【００３４】
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００３５】
実施例１：酵素の調製
Ｎアセチルヘキソサミン１キナーゼの調製
ビフィドバクテリウム・ロンガムのＮアセチルヘキソサミン１キナーゼの遺伝子配列（配列番号１）を基に、以下のプライマー作製し：
フォーワードプライマー：aacggaccccatatgaccgaaagcaatgaagttttattc（配列番号２）
リバースプライマー：gctgacctcgagcctggcagcctccatgatgtcggctac（配列番号３）、
ビフィドバクテリウム・ロンガムＪＣＭ １２１７株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＮアセチルヘキソサミン１キナーゼのＯＲＦ全長をＰＣＲにより増幅した。
【００３６】
ＰＣＲ産物を制限酵素ＮｃｏＩ及びＸｈｏＩで消化後、同様に処理した市販の遺伝子発現用プラスミドｐＥＴ（ノバジェン社製）にＤＮＡライゲーションキット（宝酒造株式会社製）を用いて連結した。さらに、これらのプラスミドを用いてSambrook，J.，Fritsch, E. F. and Maniatis, T. "Molecular Cloning, A Laboratory Manual 第２版”1.７４章 Vo1. 1 (1989)に記載された方法に従い、大腸菌を形質転換した。
【００３７】
以上のようにして得た形質転換体を用い、常法に従って該遺伝子の発現及び組換えタンパク質の生産を行った。得られた組換えタンパク質を、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース（キアゲン社製）を用いたカラムクロマトグラフィーにより精製して、精製酵素標品を得た。得られた精製酵素の比活性は１．５Ｕ／ｍｇであった。
【００３８】
ＵＤＰグルコース−ヘキソース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼの調製
ビフィドバクテリウム・ロンガムのＵＤＰグルコース−ヘキソース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼの配列（配列番号４）を基に、以下のプライマーを作製し：
フォーワードプライマー：gatatatacatatgaacgatcagctgaccgaggta（配列番号５）
リバースプライマー：tgacctctcgagcctagcggcaaaaccaaggctttcga（配列番号６）、
ビフィドバクテリウム・ロンガムＪＣＭ １２１７株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＵＤＰグルコース−ヘキソース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ遺伝子をＰＣＲにより増幅した。
【００３９】
ＰＣＲ産物を制限酵素ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩで消化後、同様に処理した市販の遺伝子発現用プラスミドｐＥＴ３０（ノバジェン社製）にＤＮＡライゲーションキット（宝酒造株式会社製）を用いて連結した。さらに、これらのプラスミドを用いてSambrook，J.，Fritsch, E. F. and Maniatis, T. "Molecular Cloning, A Laboratory Manual 第２版”1.７４章 Vo1. 1 (1989)に記載された方法に従い、大腸菌を形質転換した。
【００４０】
以上のようにして得た形質転換体を用い、常法に従って該遺伝子の発現及び組換えタンパク質の生産を行った。得られた組換えタンパク質はＮｉ−ＮＴＡアガロース（キアゲン社製）を用いたカラムクロマトグラフィーにより精製して、精製酵素標品を得た。得られた精製酵素の比活性は１．１Ｕ／ｍｇであった。
【００４１】
ＵＤＰグルコース−４−エピメラーゼの調製
ビフィドバクテリウム・ロンガムのＵＤＰグルコース−４−エピメラーゼの配列（配列番号７）を基に、以下のプライマーを作製し：
フォーワードプライマー：gatatacatatgactactgttctggttacgggc（配列番号８）
リバースプライマー：ctgctcctcgagctccgcgtcgcggaaaccgttggggttc（配列番号９）、
ビフィドバクテリウム・ロンガムＪＣＭ １２１７株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＵＤＰグルコース−ヘキソース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ遺伝子をＰＣＲにより増幅した。
【００４２】
ＰＣＲ産物を制限酵素ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩで消化後、同様に処理した市販の遺伝子発現用プラスミドｐＥＴ３０（ノバジェン社製）にＤＮＡライゲーションキット（宝酒造株式会社製）を用いて連結した。さらに、これらのプラスミドを用いてSambrook，J.，Fritsch, E. F. and Maniatis, T. "Molecular Cloning, A Laboratory Manual 第２版”1.７４章 Vo1. 1 (1989)に記載された方法に従い、大腸菌を形質転換した。
【００４３】
以上のようにして得た形質転換体を用い、常法に従って該遺伝子の発現及び組換えタンパク質の生産を行った。得られた組換えタンパク質はＮｉ−ＮＴＡアガロース（キアゲン社製）を用いたカラムクロマトグラフィーにより精製し、精製酵素標品を得た。得られた精製酵素の比活性は１５８Ｕ／ｍｇであった。
以上のようにして得た酵素を以下の反応液に用いた。
【００４４】
実施例２：反応液の調製
［反応液１］
１００ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．５）中に、最終濃度が６００ｍＭのＮアセチルグルコサミン、０．６ｍＭのＵＤＰ−Ｎアセチルグルコサミン、２．０ｍＭのＡＴＰ、１０ｍＭの塩化マグネシウム、０．０５％アジ化ナトリウム、１．０Ｕ／ｍｌのＮアセチルヘキソサミン１キナーゼ（ビフィドバクテリウム・ロンガム由来精製酵素）、０．０５Ｕ／ｍｌのＵＤＰグルコース−ヘキソース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（ビフィドバクテリウム・ロンガム由来精製酵素）、５０Ｕ／ｍｌのＵＤＰグルコース−４−エピメラーゼ（ビフィドバクテリウム・ロンガム由来精製酵素）となるように、それぞれを加えて反応液１を調製した。
【００４５】
［反応液２］
１００ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．５）中に、最終濃度が６００ｍＭのＮアセチルグルコサミン、０．６ｍＭのＵＤＰ−グルコース、０．７５ｍＭのＡＴＰ、１０ｍＭの塩化マグネシウム、０．０５％アジ化ナトリウム、１０Ｕ／ｍｌのＮアセチルヘキソサミンキナーゼ（ビフィドバクテリウム・ロンガム由来精製酵素）、０．０５Ｕ／ｍｌのＵＤＰグルコース−ヘキソース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（ビフィドバクテリウム・ロンガム由来精製酵素）、１００Ｕ／ｍｌのＵＤＰグルコース−４−エピメラーゼ（ビフィドバクテリウム・ロンガム由来精製酵素）となるように、それぞれを加えて反応液２を調製した。
【００４６】
［反応液３］
１００ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．５）中に、最終濃度が６００ｍＭのＮアセチルグルコサミン、０．２ｍＭのＵＤＰ−グルコース、１．０ｍＭのＡＴＰ、１０ｍＭの塩化マグネシウム、０．０５％アジ化ナトリウム、１０Ｕ／ｍｌのＮアセチルヘキソサミンキナーゼ（ビフィドバクテリウム・ロンガム由来精製酵素）、０．０５Ｕ／ｍｌのＵＤＰグルコース−ヘキソース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（ビフィドバクテリウム・ロンガム由来精製酵素）、１００Ｕ／ｍｌのＵＤＰグルコース−４−エピメラーゼ（ビフィドバクテリウム・ロンガム由来精製酵素）となるように、それぞれを加えて反応液を調製した。
【００４７】
実施例３：Ｎアセチルガラクトサミンの生成
実施例２で調製した反応液１、反応液２、および反応液３をそれぞれ恒温器で３０℃、５日間インキュベートし、酵素反応を行った。反応終了後、反応液を適宜希釈して高速液体クロマトグラフィー（島津製作所製）を用いて、ＮアセチルグルコサミンとＮアセチルガラクトサミンの濃度を調べ、モル収率を算出した。
【００４８】
この結果、反応液１、反応液２、および反応液３におけるＮアセチルガラクトサミンのモル収率はそれぞれ２７．７％、２８．０％、２４．７％であった。反応液１のタイムコースを図１に示す。
【００４９】
実施例４：Ｎアセチルガラクトサミンの精製
ＮアセチルグルコサミンとＮアセチルガラクトサミンの分離は、カラム剤：イオン交換樹脂（ダウエックス、ザ・ダウ・ケミカル・カンパニー製）、流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ、移動相：水、の条件下で行うことができる。反応液を電気透析し脱塩した後、サンプル５ｍｌをカラム（２．６ｃｍ×４０ｃｍ、２００ｍｌカラム剤）に供し、４ｍｌずつ分画した。各フラクションをＨＰＬＣで分析した結果を図２に示す。図２に示すようにＮアセチルグルコサミンとＮアセチルガラクトサミンを分離し、Ｎアセチルガラクトサミンを精製することができる。
【００５０】
以上の結果より、本願発明に係る方法を用いることによって、出発原料のＮアセチルグルコサミンのうち約３０％程度をＮアセチルガラクトサミンに変換できることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明は、Ｎアセチルグルコサミンを出発原料として用いて、Ｎアセチルガラクトサミンを製造することを可能とする。本発明は、Ｎアセチルガラクトサミンの有効な製造法である上に、Ｎアセチルガラクトサミンを安価に、かつ一工程で製造できるという利点を有する。製造されたＮアセチルガラクトサミンは食品、医薬品あるいはそれらの原料として用いることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】実施例３における、反応液１のタイムコースを示す図である。
【図２】実施例４における各フラクションをＨＰＬＣで分析した結果を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
出発原料であるＮアセチルグルコサミンを、ＡＴＰおよびＵＤＰ−糖の存在下で、以下の(i)〜(iii)の酵素と同時に作用させることにより、Ｎアセチルガラクトサミンを製造する方法：
(i) ＵＤＰ−ＮアセチルグルコサミンをＵＤＰ−Ｎアセチルガラクトサミンに変換する酵素；
(ii) ＵＤＰ−ＮアセチルグルコサミンとＮアセチルガラクトサミン１−リン酸間でＵＭＰ単位の交換反応をする酵素；ならびに
(iii) ＮアセチルグルコサミンとＡＴＰからＮアセチルグルコサミン１−リン酸とＡＤＰを生じる酵素およびＮアセチルガラクトサミンとＡＴＰからＮアセチルガラクトサミン１−リン酸とＡＤＰを生じる酵素、またはその両活性を持つ酵素。
【請求項２】
ＵＤＰ−糖が、ＵＤＰ−グルコース、ＵＤＰ−ガラクトース、ＵＤＰ−Ｎアセチルグルコサミン、ＵＤＰ−Ｎアセチルガラクトサミンおよびそれらの少なくとも２つの混合物からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＵＤＰ−糖が、ＵＤＰ−グルコースまたはＵＤＰ−Ｎアセチルグルコサミンである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
(i)の酵素が、ＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼが、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）に由来する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
(ii)の酵素が、ＵＤＰ−グルコース−ヘキソース１リン酸ウリジリルトランスフェラーゼである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
ＵＤＰ−グルコース−ヘキソース１リン酸ウリジリルトランスフェラーゼが、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）に由来する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
(iii)の酵素が、Ｎアセチルヘキソサミン１キナーゼである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
Ｎアセチルヘキソサミン１キナーゼが、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）に由来する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
(i)の酵素としてＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼ、(ii)の酵素としてＵＤＰ−グルコース−ヘキソース１リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、(iii)の酵素としてＮアセチルヘキソサミン１キナーゼを同時に作用させる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
作用させる全ての酵素が、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）に由来する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
さらに、製造されたＮアセチルガラクトサミンを精製する工程を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１】
出発原料であるＮアセチルグルコサミンを、ＡＴＰおよびＵＤＰ−糖の存在下で、以下の(i)〜(iii)の酵素と同時に作用させることにより、Ｎアセチルガラクトサミンを製造する方法：
(i) ＵＤＰ−ＮアセチルグルコサミンをＵＤＰ−Ｎアセチルガラクトサミンに変換する酵素；
(ii) ＵＤＰ−ＮアセチルグルコサミンとＮアセチルガラクトサミン１−リン酸間でＵＭＰ単位の交換反応をする酵素；ならびに
(iii) ＮアセチルグルコサミンとＡＴＰからＮアセチルグルコサミン１−リン酸とＡＤＰを生じる酵素およびＮアセチルガラクトサミンとＡＴＰからＮアセチルガラクトサミン１−リン酸とＡＤＰを生じる酵素、またはその両活性を持つ酵素。
【請求項２】
ＵＤＰ−糖が、ＵＤＰ−グルコース、ＵＤＰ−ガラクトース、ＵＤＰ−Ｎアセチルグルコサミン、ＵＤＰ−Ｎアセチルガラクトサミンおよびそれらの少なくとも２つの混合物からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＵＤＰ−糖が、ＵＤＰ−グルコースまたはＵＤＰ−Ｎアセチルグルコサミンである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
(i)の酵素が、ＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼが、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）に由来する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
(ii)の酵素が、ＵＤＰ−グルコース−ヘキソース１リン酸ウリジリルトランスフェラーゼである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
ＵＤＰ−グルコース−ヘキソース１リン酸ウリジリルトランスフェラーゼが、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）に由来する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
(iii)の酵素が、Ｎアセチルヘキソサミン１キナーゼである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
Ｎアセチルヘキソサミン１キナーゼが、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）に由来する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
(i)の酵素としてＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼ、(ii)の酵素としてＵＤＰ−グルコース−ヘキソース１リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、(iii)の酵素としてＮアセチルヘキソサミン１キナーゼを同時に作用させる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
作用させる全ての酵素が、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）に由来する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
さらに、製造されたＮアセチルガラクトサミンを精製する工程を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００９−２７９７１（Ｐ２００９−２７９７１Ａ）
【公開日】平成２１年２月１２日（２００９．２．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１９４８６７（Ｐ２００７−１９４８６７）
【出願日】平成１９年７月２６日（２００７．７．２６）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１９年度独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構生物系特定産業技術研究支援センター委託研究による成果（産業活力再生特別措置法第３０条の適用を受けるもの）
【出願人】（５０１２０３３４４）独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 (827)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年２月１２日（２００９．２．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年７月２６日（２００７．７．２６）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１９年度独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構生物系特定産業技術研究支援センター委託研究による成果（産業活力再生特別措置法第３０条の適用を受けるもの）
【出願人】（５０１２０３３４４）独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 (827)
【Ｆターム（参考）】
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