ＮＡＤＨ／ＮＡＤ比の制御による２−デオキシ−シロ−イノソースの製造方法
【課題】２−デオキシ−シロ−イノソース（ＤＯＩ）生産性を飛躍的に向上させうる細胞内代謝産物制御技術を提供すること。
【解決手段】２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素又は２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素を発現可能な微生物を利用してグルコース−６−リン酸から２−デオキシ−シロ−イノソースを製造する方法において、反応系におけるＮＡＤＨ／ＮＡＤ比を１．４以下に制御することを特徴とする、２−デオキシ−シロ−イノソースの製造方法。
【解決手段】２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素又は２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素を発現可能な微生物を利用してグルコース−６−リン酸から２−デオキシ−シロ−イノソースを製造する方法において、反応系におけるＮＡＤＨ／ＮＡＤ比を１．４以下に制御することを特徴とする、２−デオキシ−シロ−イノソースの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素を用いて２−デオキシ−シロ−イノソースを製造する方法においてＮＡＤＨ／ＮＡＤ比を制御することを特徴とする２−デオキシ−シロ−イノソースの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、カテコールなどの芳香族化合物の多くは、石油を原料として生産されているが、石油資源の枯渇問題や二酸化炭素排出量の削減などの観点から、バイオマスを利用した環境調和型の新規製造プロセスの開発が求められている。
【０００３】
一方、２−デオキシ−シロ−イノソース（以下、ＤＯＩ）が、産業上有用とされる芳香族化合物（カテコール等）へと変換できることが見出され（非特許文献１）、さらには、このＤＯＩを、バイオマスの構成要素の一つであるグルコースから合成できることが報告された（非特許文献１）。本ＤＯＩ製造プロセスで重要となるのがグルコース−６−リン酸からＤＯＩへと変換する２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素（以下、ＤＯＩ合成酵素）であり、ＤＯＩは上記芳香族化合物への変換のみならず各種有用化合物の中間体ともなり得ることから、ＤＯＩ合成酵素は非常に大きな注目を浴びている。
【０００４】
ＤＯＩ合成酵素はブチロシン生産菌であるＢａｃｉｌｌｕｓ ｃirculans に属する微生物から１９９７年に単離精製（非特許文献２）され、続いて、その遺伝子配列も公開されている（特許文献１）。この他にもＳｔｒｅｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ ｈｉｎｄｕｓｔａｎｕｓ ＪＣＭ３２６８株（非特許文献３）由来のＤＯＩ合成酵素などがこれまでに発見されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０００−２３６８８１号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４１，１９３５−１９３８，２０００
【非特許文献２】Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ５０（５）, ４２４−４２８, １９９７
【非特許文献３】Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ５９（６）, ３５８−３６１, ２００６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、前記ＤＯＩ合成酵素の安定性と比活性などの各種特性は、満足のいくものではなく、また、数千トン規模の工業化製法に向けたＤＯＩ発酵生産に関する研究開発、特に細胞内代謝物の制御に関するものはほとんどなされてこなかった。
本発明は、従来法と比較して、ＤＯＩ発酵生産性を飛躍的に向上させうる細胞内代謝産物制御技術を提供することを解決すべき課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
これらの課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、本発明者らは、ＤＯＩ合成酵素の活性が反応系中のＮＡＤＨ／ＮＡＤ比に予想し得ない領域で影響を受けることを見出し、従来法と比較して、ＤＯＩ発酵生産性を飛躍的に向上させうるＤＯＩ生産技術を見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は以下の［１］〜［７］に示すＤＯＩ製造方法に関するものである。
［１］ ２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素又は２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素を発現可能な微生物を利用してグルコース−６−リン酸から２−デオキシ−シロ−イノソースを製造する方法において、反応系におけるＮＡＤＨ／ＮＡＤ比を１．４以下に制御することを特徴とする、２−デオキシ−シロ−イノソースの製造方法。
［２］ グルコースを構成成分とする多糖類あるいはグルコースを含有する原料を用いることを特徴とする、［１］に記載の方法。
［３］ ２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素が、安定温度範囲が少なくとも４６℃まで安定である耐熱性酵素である、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］ ２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素が、ｐＨ６．０〜 ８．０で安定な酵素である、［１］から［３］の何れか記載の方法。
［５］ ２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素が下記の特性を有する酵素である、［１］又は［２］に記載の方法。
（１）作用：本酵素は、グルコース−６−リン酸を２−デオキシ−シロ−イノソースへと変換する機能を有する。
（２）安定温度範囲：少なくとも４６℃まで安定である。
（３）補酵素としてＮＡＤ+を利用。
（４）至適ｐＨ範囲：７．０〜 ７．７
（５）安定ｐＨ範囲：少なくとも６．０〜 ８．０の範囲で安定である。
（６）至適温度範囲：５５ 〜 ７０ ℃
（７）分子量：３９０００〜４２０００
（８）補因子：Ｃｏ2+イオンの添加により活性向上。
（９）比活性：１．０μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ以上（反応温度６５℃）。
［６］ ２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素が、配列番号２、４、６、８、１０又は１２に記載のアミノ酸配列を有する２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素である、［１］から［２］の何れか記載の方法。
［７］ ２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素が、配列番号２、４、６、８、１０又は１２で示されるアミノ酸配列において１個または複数個のアミノ酸の欠失、付加、及び／又は置換を含み、配列番号２、４、６、８、１０又は１２で示されるアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有して且つ、高温安定性及び／又は広範囲ｐH安定性を持つ２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素である、［１］から［５］の何れか記載の方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によると、菌体あたりのＤＯＩ発酵生産性の向上に寄与することから、短時間で大量のＤＯＩを合成することができる。また、触媒となる菌体量の低減も可能となり、原料利用効率を向上させることもできる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−１）の至適ｐＨ範囲を示す（実施例３）。
【図２】図２は、精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−１）の安定ｐＨ範囲を示す（実施例３）。
【図３】図３は、精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−１）の至適温度範囲を示す（実施例３）。
【図４】図４は、精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−１）の安定温度範囲を示す（実施例３）。
【図５】図５は、精製既知ＤＯＩ合成酵素（ＢｔｒＣ）の安定温度範囲を示す（比較例１）。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明について具体的に説明する。
[ＤＯＩ合成酵素]
本発明を実施するための形態（以下、本実施の形態という）のＤＯＩ合成酵素は、下記の特性を有し、
（１）作用：本酵素は、グルコース−６−リン酸をＤＯＩへと変換する機能を有する。
さらには、下記に示す一部またはすべての特性を有する。
（２）安定温度範囲：少なくとも４６℃まで安定である。
（３）補酵素としてＮＡＤ+を利用。
（４）至適ｐＨ範囲：７．０〜 ７．７
（５）安定ｐＨ範囲：少なくとも６．０〜 ８．０の範囲で安定である。
（６）至適温度範囲：５５ 〜 ７０ ℃
（７）分子量：３９０００〜４２０００
（８）補因子：Ｃｏ2+イオンの添加により活性向上。
（９）比活性：１．０μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ以上（反応温度６５℃）。
【００１３】
配列番号２、４、６、８、１０及び１２に従来のＤＯＩ合成酵素と比較して、耐熱性やpH安定性などの面で優れた新規ＤＯＩ合成酵素のアミノ酸配列を例示するが、このアミノ酸配列からなるタンパク質がＤＯＩ合成酵素活性を有する限り、当該アミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じてもよい。例えば、配列番号２、４、６、８、１０又は１２に示されるアミノ酸配列に対して８０％以上、好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９９％以上の相同性の範囲内で、配列番号２、４、６、８、１０又は１２で表されるアミノ酸配列の１個または複数個（例えば１から５０個、好ましくは１から３０個、さらに好ましくは１から２０個、さらに好ましくは１から１０個、さらに好ましくは１から５個、さらに好ましくは１から３個））のアミノ酸の欠失、付加、及び／又は置換してもよい。
ＤＯＩ合成酵素中のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異を生じさせる方法としては、ＰＣＲ法、エラープローンＰＣＲ法、ＤＮＡシャッフリング法やキメラ酵素を作製する手法等の公知の方法が利用できる。
上記に、新規ＤＯＩ合成酵素を示したが、もちろん本発明は従来のＤＯＩ合成酵素を用いても良い。
ＤＯＩ合成酵素活性を測定する方法としては、例えば、１０００ｍＭグルコース−６−リン酸溶液２０μＬ、１００ｍＭＮＡＤ+溶液５０μＬ、１００ｍＭ塩化コバルト六水和物溶液５０μＬを含むｐＨ７．０の１５０ｍＭＢｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液９００μＬに適当な濃度のＤＯＩ合成酵素液１００μＬを混合し、５〜６０分間程度反応させた後、酵素を失活させ、ＤＯＩを定量する方法などが挙げられる。
酵素の至適温度範囲あるいは至適ｐＨ範囲は、反応温度あるいは反応ｐＨを変化させて酵素活性を測定すればよい。さらにＤＯＩ合成酵素を種々のｐＨ条件下又は温度条件下に一定時間さらした後に酵素活性を測定することにより、安定ｐＨ範囲及び安定温度範囲を調べることができる。例えば、各ｐH条件におけるＤＯＩ合成酵素の評価には、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ５．５〜８．０）およびＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４〜８．０）を用いることができる。
至適ｐＨ範囲とは、最大活性を１００とするときの活性値が７０以上の範囲であり、安定ｐＨ範囲とは最大活性を１００とするときの活性値が７０以上の範囲である。また、至適温度範囲とは、最大活性を１００とするときの活性値が５０以上の範囲であり、安定温度範囲は最大活性を１００とするときの活性値が５０以上の範囲である。
本実施の形態におけるＤＯＩ合成酵素の高温安定性とは、安定温度範囲が４６℃以下、より好ましくは、５０℃以下、さらにより好ましくは６０℃以下、さらに特に好ましくは９５℃以下まで安定なことである。高温安定性を有する２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素としては、例えば、５０℃で１時間インキュベートした後の残存酵素活性（最大活性を１００とする相対活性）が５０以上である酵素を選抜することができる。
本実施の形態における広範囲ｐＨ安定性を持つＤＯＩ合成酵素は、安定ｐＨ範囲が少なくともｐＨ６．０〜７．０、好ましくはｐＨ６．０〜７．４、より好ましくはｐＨ６．０〜７．７、より好ましくはｐＨ６．０〜８．０、特により好ましくはｐＨ４．０〜９．０である特性を有する。
【００１４】
[ＤＯＩ合成酵素遺伝子]
本実施の形態のＤＯＩ合成酵素遺伝子は、メタゲノムや微生物から単離・抽出した天然のものでも良く、また、その塩基配列に従ってＰＣＲ法、人工合成法等の公知の方法によって合成したものでも良い。また、新規ＤＯＩ酵素キメラ遺伝子の作成には、既知ＤＯＩ合成酵素遺伝子を組み合わせてもよく、例示される遺伝子としてはＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＮＢＲＣ１３１５７株、Ｓｔｒｅｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ ｈｉｎｄｕｓｔａｎｕｓ ＪＣＭ３２６８、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｄｉａｅ ＮＢＲＣ１２７７３株などに由来するＤＯＩ合成酵素遺伝子が挙げられる。
【００１５】
配列番号１、３、５、７、９及び１１に新規ＤＯＩ合成酵素遺伝子の塩基配列を例示するが、もちろん本発明は従来のＤＯＩ合成酵素遺伝子を用いても良い。
【００１６】
[組み換えベクター及び形質転換体]
本実施の形態の組換えベクターは、プラスミド等の公知のベクターに本発明の遺伝子を連結（挿入）して得ることができる。前記ベクターは宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えばプラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ等が挙げられる。
【００１７】
前記プラスミドDNAとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えば pBR322, pBR325, pUC18, pUC119, pTrcHis, pBlueBacHis 等）、枯草菌由来のプラスミド（例えば pUB110, pTP5 等）、酵母由来のプラスミド（例えば YEp13, YEp24, YCp50, pYE52 等）などが、ファージ DNAとしてはλファージ等が挙げられる。
【００１８】
前記ベクターへの本発明の遺伝子の挿入は、まず、精製されたDNAを適当な制限酵素で切断し、ベクターDNAの適当な制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法が採用される。
【００１９】
宿主内で外来遺伝子を発現させるためには、構造遺伝子の前に、適当なプロモーターを配置させる必要がある。前記プロモーターは特に限定されず、宿主内で機能することが知られている任意のものを用いることができる。なおプロモーターについては、後述する形質転換体において、宿主ごとに詳述する。また、必要であればエンハンサー等のシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、リボソーム結合配列（SD配列）、ターミネーター配列等を配置させてもよい。
【００２０】
本実施の形態の形質転換体は、本発明の組換えベクターを目的遺伝子が発現しうるように宿主中に導入することによって得ることができる。ここで宿主としては、本発明のDNAを発現できるものであれば特に限定されず、例えば、エッシェリヒア・コリ（Escherichia coli）等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロテイ（Rhizobium meliloti）等のリゾビウム属に属する細菌、またサッカロミセス・セルビシエ（Saccharomyces cerevisiae）等の酵母、その他COS細胞、CHO細胞等の動物細胞、あるいはSf19、Sf21等の昆虫細胞を挙げることができる。
【００２１】
また、本実施の形態の形質転換体として利用する宿主は、グルコース−6−リン酸をグルコース、フルクトース、ガラクトース、キシロースなどの単糖類から合成する機能を有するものが好ましい。また、必要に応じて、二つ以上の単糖が連結した多糖類を分解する機能を有することも好ましい。
【００２２】
大腸菌等の細菌を宿主とする場合は、本発明の組換えベクターが各細菌中で自律複製可能であるとともにプロモーター、リボゾーム結合配列、本発明遺伝子、転写終結配列により構成されていることが望ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていても良い。大腸菌としてはエッシェリヒア・コリ（E. coli）K12、DH1、DH10B（Invitrogen社）、BL21-CodonPlus(DE3)-RIL（ストラタジーン社）、TOP10F等が挙げられ、枯草菌としてはバチルス・ズブチリス（B. subtilis）MI114、207-21 等が挙げられる。
【００２３】
プロモーターとしては大腸菌等の宿主で機能するものであれば特に限定されず、例えばgapAプロモーター、gadAプロモーター、trpプロモーター、lacプロモーター、PLプロモーター、PRプロモーター等の大腸菌由来のプロモーターや、T7プロモーター等のファージ由来のプロモーターを用いることができる。
【００２４】
細菌への組換えベクターの導入方法は、細菌にDNAを導入できる方法であれば特に限定されないが、例えばカルシウムイオンを用いる方法（Cohen, SN et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69 : 2110 (1972)）、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００２５】
酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セルビシエ（S. cerevisiae）、ピヒア・パストリス（Pichia pastoris）等が用いられる。この場合、プロモーターとしては酵母で発現しうるもの、例えばgal1プロモーター、gal10プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、MFα 1プロモーター、PHO5プロモーター、AOXプロモーター等を挙げることができる。
【００２６】
酵母への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法（Becker, D.M. et al. : Methods. Enzymol., 194 : 180 (1990)）、スフェロプラスト法（Hinnen, A. et al. : Proc Natl. Acad. Sci. USA, 75 : 1929 (1978)）、酢酸リチウム法（Itoh, H. : J. Bacteriol., 153 : 163 (1983)）等を挙げることができる。
【００２７】
[ＤＯＩ生産法]
本実施の形態のＤＯＩ生産法では、反応系におけるＮＡＤＨ／ＮＡＤ比を１．４以下に制御することを特徴とする。なお、本実施の形態で言う反応系とは、細胞内でもよいし、インビトロでもよい。ＤＯＩ合成酵素を発現可能な微生物を利用する場合、本実施の形態のＤＯＩ生産法では、反応系（細胞内）のＮＡＤＨ／ＮＡＤ比を制御することを除いては、ＤＯＩ合成酵素産生微生物を常法に従って培養して得られる培養物からＤＯＩを採取することでえられる。
【００２８】
本実施の形態における反応系（細胞内）のＮＡＤＨ／ＮＡＤ比の制御は、菌の培養開始と同時に行っても良いが、より好ましくは、菌の生育およびＤＯＩ合成酵素の発現などの効率性を考慮し、ＤＯＩの生成濃度が２ｇ／Ｌに到達してから開始する。また、ＤＯＩの最終到達濃度が５０ｇ／Ｌを超えるようなＤＯＩ製造プロセスにおいては、ＤＯＩの生成濃度が３０ｇ／Ｌに到達してから反応系（細胞内）のＮＡＤＨ／ＮＡＤ比の制御を開始してもよい。
【００２９】
反応系（細胞内）のＮＡＤＨ／ＮＡＤ比は、好ましくは１．４以下、より好ましくは１．０以下、さらにより好ましくは０．５以下、さらにより好ましくは０．１以下、特により好ましくは０．０２以下である。
【００３０】
反応系（細胞内）のＮＡＤＨ／ＮＡＤ比は、制御開始から少なくとも１．４以下に１分間保てばよく、より好ましくは1時間、より好ましくは１０時間、さらにより好ましくは２４時間、特により好ましくは４８時間保てばよい。
【００３１】
本実施の形態における反応系（細胞内）のＮＡＤＨ／ＮＡＤ比を１．４以下に保つ効果的な手法としては、常法に従えばよく、例えば、非特許文献（Metabolic Engineering Volume 7, Issue 2, March 2005, Pages 104-115）に知られているピルビン酸キナーゼ関連遺伝子欠損が利用でき、本手法を用いれば反応系（細胞内）のＮＡＤＨ／ＮＡＤ比が０．０１０にできることが知られている。本発明における反応系（細胞内）のＮＡＤＨ／ＮＡＤ比の測定は、非特許文献（Metabolic Engineering Volume 7, Issue 2, March 2005, Pages 104-115）に記載の手法などで行うことができる。
【００３２】
また、本実施の形態における反応系（細胞内）のＮＡＤＨ／ＮＡＤ比を１．４以下に保つその他の効果的な手法としては、非特許文献（Appl Microbiol Biotechnol. 2004 Apr;64(3):367-75. Epub 2003 Dec 12.）に記載のグルコースを炭素源とした嫌気（微好気）条件下での培養技術を利用することができる。本技術を用いれば、好気条件で、反応系（細胞内）のＮＡＤＨ／ＮＡＤ比が１．４４にも関わらず、これを嫌気培養することにより０．１３まで低下させることができる。
【００３３】
培養に用いる炭素源としては、形質転換体が資化できるものであればグルコースを構成成分とする多糖類を直接用いてもよく、より好ましくは、単糖類もしくはでんぷんや米ぬかや廃糖蜜などの多糖類を含む原料に由来する単糖類が挙げられ、具体的にはＤ−グルコースなどが挙げられる。また、プロモーターの発現が誘導型である場合には、適時誘導物質を添加すればよい。炭素源以外の栄養源としては、窒素源、無機塩類、その他有機栄養源を含む培地を使用できる。培養温度はその菌の生育可能な温度であれば良い。培養時間には特に制限はないが、１日から７日程度でよい。その後、得られた培養菌体又は培養上清液からＤＯＩを回収すればよい。
【００３４】
炭素源としては、Ｄ−グルコース、ガラクトース、マルトース、サッカロース、トレハロース等の糖類や油脂類や脂肪酸類さらにはｎ−パラフィン等を用いることができる。油脂としては、例えば、ナタネ油、ヤシ油、パーム油、パーム核油などがあげられる。脂肪酸としてはヘキサン酸、オクタン酸、デカン酸、ラウリン酸、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸、リノレン酸、ミリスチン酸などの飽和・不飽和脂肪酸、あるいはこれら脂肪酸のエステルや塩など脂肪酸誘導体などがあげられる。
【００３５】
窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウムなどのアンモニウム塩の他、ペプトン、肉エキス、酵母エキスなどが挙げられる。無機塩類としては、例えば、リン酸水素ナトリウム、リン酸二水素カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、塩化コバルトなどが挙げられる。
【００３６】
その他の有機栄養源としては、アミノ酸類、例えば、アデニン、ヒスチジン、ロイシン、ウラシル、トリプトファンなどが挙げられる。
【００３７】
生成するＤＯＩの確認は、非特許文献（Journal of Biotechnology 129, 502-509 (2007)）に記載の方法などを用いることができる。
【００３８】
本実施の形態において、ＤＯＩの培養液からの回収は，例えば、次のような方法が使用できる。培養終了後、培養液から遠心分離器や濾過装置などで菌体を除き、培養上清液を得る。この培養上清液に対してさらに濾過処理を行い、菌体等の固形物を除き、その濾液にイオン交換樹脂を添加し、蒸留水で溶出を行う。ＩＣＰ発光分析、ｐＨなどを測定しながら不純物を含まないフラクションを分取して、その水溶液の溶媒を取り除くことでＤＯＩを回収することができる。得られたＤＯＩの分析は、例えば、高速液体クロマトグラフィーや核磁気共鳴法などにより行う。
【００３９】
本実施の形態のインビトロ下でのＤＯＩ製造温度は、反応速度や酵素の安定性の点から、好ましくは１０〜９５℃、より好ましくは２０〜７０℃であり、さらに好ましくは３０〜６０℃である。反応ｐＨは広範囲で調整可能であり、酵素の安定性の点から、好ましくはｐＨ２．０〜１０．０、より好ましくはｐＨ４．０〜８．０、さらに好ましくは６．０〜８．０である。
【００４０】
しかしながら、本発明は以上の各種条件に限定されるものではなく、適宜選択することができる。
【００４１】
以下、実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００４２】
[実施例１]
（１）染色体ＤＮＡの調製
常法に従ってＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＮＢＲＣ１３１５７株の染色体ＤＮＡを調製した。
Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＮＢＲＣ１３１５７株をＮＲ寒天プレート（１％ Ｂａｃｔｏ Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．２％ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、１％ エルリッヒカツオエキス、１．５％ Ｂａｃｔｏ Ａｇａｒ、ｐＨ７．０）で、３０℃、１日間培養してコロニーを形成させた。その１白金耳を、ＮＲ培地（１％ Ｂａｃｔｏ Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．２％ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、１％ エルリッヒカツオエキス、ｐＨ７．０）３０ｍＬを１５０ｍＬ三角フラスコに分注したものに接種して、３０℃、１８０ｒｐｍで１日間培養した。この培養液を、４℃で、１，２０００ｇ×１分間遠心分離して上清を除去し、菌体を回収した。
得られた菌体をＬｙｓｉｓバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ グルコース）に懸濁し、よく洗浄した。遠心分離して菌体を回収した後、Ｌｙｓｉｓバッファーに再懸濁し、これにリゾチームを加え３７℃で４５分間インキュベートした。次いでＳＤＳとＲＮａｓｅを添加し、３７℃で４５分間インキュベートした。その後Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋを添加し、５０℃で６０分間穏やかに振盪した。ここで得られた溶液をフェノール−クロロホルム、クロロホルムで処理後、エタノール沈殿し、析出した核酸をガラスピペットに巻きつけて回収した。この核酸を７０％エタノールで洗浄後、乾燥し、ＴＥに再溶解した。この操作により、約１００μｇの染色体ＤＮＡを調製した。
【００４３】
（２）ＤＯＩ合成酵素遺伝子の単離
上記（１）において調製した染色体ＤＮＡからＤＯＩ合成酵素遺伝子を増幅するためのＰＣＲプライマーとして、センスプライマーは配列番号１５の配列を有するオリゴＤＮＡを、アンチセンスプライマーは配列番号１６の配列を有するオリゴＤＮＡをそれぞれ合成した。
ここで得られたＰＣＲプライマーを用い、上記（１）において調製した染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法によるＤＯＩ合成酵素遺伝子の増幅を行い、１１０７塩基対からなるＰＣＲ産物を取得した。
【００４４】
ここで得られたＰＣＲ産物の遺伝子配列をＤＮＡシークエンサーで解析することで確認し、配列番号１３の塩基配列を有する既知ＤＯＩ合成酵素ｂｔｒＣ遺伝子を得た。また、配列番号１４には、既知ＤＯＩ合成酵素ＢｔｒＣのアミノ酸配列を示した。
【００４５】
（３）ＤＯＩ合成酵素遺伝子の発現プラスミドベクターの構築及び形質転換
上記（２）で取得したＰＣＲ産物の平滑末端化、リン酸化を行い、ｐＵＣ１９に大腸菌由来のｇａｐＡプロモーター、ＳＤ配列、ターミネーターを連結したプラスミドにライゲーションした。このプラスミドベクターには大腸菌中で外来遺伝子として連結された遺伝子を効率的に転写できるｇａｐＡプロモーターが導入されており、グルコースを含む培地で組換え微生物を培養した場合においてもＤＯＩ合成酵素遺伝子を効率的に発現・製造させることができる。
ここで得られたプラスミドベクターを、塩化カルシウム法で調製した大腸菌ＪＭ１０９株のコンピテントセルにヒートショック法で形質転換し、組換え微生物を作製した。
【００４６】
（４）耐熱性ＤＯＩ合成酵素遺伝子の取得
上記（３）で取得したプラスミドベクターに対し、常法による変異導入を行うことで、配列番号１（ＤＯＩＳ−１）、配列番号３（ＤＯＩＳ−２）、配列番号５（ＤＯＩＳ−３）、配列番号７（ＤＯＩＳ−４）に記載の耐熱性ＤＯＩ合成酵素遺伝子を得ることができる。また、これらの遺伝子配列に対応するそれぞれのアミノ酸配列を配列番号２、４、６及び８に示した。ここで取得したＤＯＩ合成酵素遺伝子（ＤＯＩＳ−１）についても（３）と同様に形質転換体の取得を行った。
【００４７】
（５）広範囲ｐＨ安定型ＤＯＩ合成酵素遺伝子の取得
上記（３）で取得したプラスミドベクターに対し、常法による変異導入を行うことで、配列番号９（ＤＯＩＳ−５）、配列番号１１（ＤＯＩＳ−６）、に記載の広範囲ｐＨ安定型ＤＯＩ合成酵素遺伝子を得ることができる。また、これらの遺伝子配列に対応するそれぞれのアミノ酸配列を配列番号１０及び１２に示した。
【００４８】
[実施例２]
［精製酵素の取得］
実施例１で作製したＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−１）の形質転換体を１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢプレートで、３７℃、一日間培養して、コロニーを形成させた。
次いで１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地３０ｍＬを１５０ｍＬ容の三角フラスコに入れ、上記プレートからコロニーを白金耳で植菌し、３７℃で、３〜８時間、ＯＤ（６００ｎｍ）が０．５程度になるまで１８０ｒｐｍで回転振盪培養を行い、これを本培養の前培養液とした。
【００４９】
５００ｍＬ容の三角フラスコ３６本に、２ｇ／Ｌのグルコースと１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地を１００ｍＬずつ入れ、それぞれの三角フラスコに０．５ｍLの前培養液を添加し、３７℃で、１６時間、１８０ｒｐｍで回転振盪培養を行った。
次いでこの培養液を、４℃で、１０，０００ｇ×３０分間遠心分離して上清を除去し、０．２ｍｇ／Ｌ塩化コバルト六水和物を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．７）で数回洗浄しながら菌体を回収した。回収した菌体は、−８０℃で凍結保存した。
【００５０】
この凍結保存菌体を０．２ｍｇ／Ｌ塩化コバルト六水和物を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．７）で懸濁し、リゾチーム（Ｓｉｇｍａ社製 卵白由来）を１８０ｍｇとデオキシリボヌクレアーゼＩ（ＷａＫｏ社製 ウシ由来 組換え体溶液）を６０μＬ添加して、３７℃で、５時間、１２０ｒｐｍで振盪し、菌体破砕を行った。
菌体破砕後の溶液を、４℃で、１０，０００ｇ×３０分間遠心分離して菌体残渣を除去し、上清を回収した。
【００５１】
この上清に硫酸アンモニウムを加えて３０％飽和とし、４℃でしばらく攪拌した後に、生じた沈殿を、４℃で、１０，０００ｇ×３０分間遠心分離して除去し、上清を回収した。
この上清にさらに硫酸アンモニウムを加えて４０．０％飽和とし、４℃でしばらく攪拌した後に、生じた沈殿を、４℃で、１０，０００ｇ×３０分間遠心分離して上清を除去し、沈殿を回収した。次いでこの沈殿を０．２ｍｇ／Ｌ塩化コバルト六水和物を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．７）に溶解させた。
【００５２】
この溶解液を４℃で、平均分画分子量１０，０００の限外濾過膜を用いて濃縮し、０．２ｍｇ／Ｌ塩化コバルト六水和物を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．７）を加え、再度、濃縮するという脱塩操作を２〜３回繰り返した。
上記で得られた酵素溶液を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．７）で平衡化した「ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ」（商標）（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス株式会社）に吸着させた後、０〜０．４Ｍの塩化ナトリウムを含有する５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．７）の濃度勾配法によって酵素を溶出させた。
【００５３】
上記で溶出した活性画分を集め、平均分画分子量１０，０００の限外濾過膜を用いて濃縮し、１０重量％の硫酸アンモニウムを含有する５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．７）で懸濁し、１０重量％の硫酸アンモニウムを含有する５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．７）で平衡化した「ＨｉＴｒａｐ Ｐｈｅｎｙｌ ＦＦ （ｈｉｇｈ ｓｕｂ）」（商標）（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス株式会社）に吸着させた後、１０〜０重量％の硫酸アンモニウムを含有する５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．７）の濃度勾配法によって酵素を溶出させた。
上記で溶出した活性画分を集め、平均分画分子量１０，０００の限外濾過膜を用いて濃縮し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．７）で平衡化した「ＭｏｎｏＱ ５／５０ ＧＬ」（商標）（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス株式会社）に吸着させた後、０〜０．２Ｍの塩化ナトリウムを含有する５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．７）の濃度勾配法によって酵素を溶出させた。
【００５４】
上記で溶出した活性画分を集め、平均分画分子量１０，０００の限外濾過膜を用いて濃縮し、０．２ｍｇ／Ｌ塩化コバルト六水和物と０．１ＭＮａＣｌを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．７）で平衡化した「ＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００」（商標）（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス株式会社）に充填した後、同様の緩衝液で溶出を行った。
上記で溶出した活性画分を集め、平均分画分子量１０，０００の限外濾過膜を用いて濃縮し、精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−１）を得た。
【００５５】
上記、一連の精製酵素取得実験と同様にして、精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−２）、精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−３）、精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩ−４）、精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩ−５）および精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩ−６）、精製既知ＤＯＩ合成酵素（ＢｔｒＣ）を取得した。
【００５６】
[実施例３]
［新規ＤＯＩ合成酵素の評価］
実施例２で得られた精製ＤＯＩ合成酵素を用いて、その作用に関する実験を行った。
【００５７】
（１）至適ｐＨ範囲
各ｐＨにおける活性測定では、反応液に精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−１）を適量添加し、グルコース−６−リン酸二ナトリウム塩（オリエンタル酵母製）が２０ｍＭ、ＮＡＤ＋（オリエンタル酵母製）が５ｍＭ、塩化コバルト六水和物が５ｍＭ、各種緩衝液が１００ｍＭとなるようにして反応液を調整した。緩衝液としては、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ６．０〜７．７）およびＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４〜８．０） を使用した。反応温度は３０℃とし、生成するＤＯＩを定量することで活性を測定した。最大活性を１００とする相対活性を求め、この結果を図１に示す。本発明酵素における至適ｐＨ範囲は、ｐＨ７．０〜 ７．７であった。
【００５８】
（２）安定ｐＨ範囲
ｐＨ５．５〜８．０の範囲の１００ｍＭの緩衝液を用いて、精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−１）を各ｐＨで３０℃、６０分間インキュベートし、その残存酵素活性を測定した。インキュベートに用いた緩衝液としては、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ５．５〜８．０）およびＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４〜８．０）を使用した。
残存酵素活性測定は、グルコース−６−リン酸二ナトリウム塩（オリエンタル酵母製）が２０ｍＭ、ＮＡＤ＋（オリエンタル酵母製）が５ｍＭ、塩化コバルト六水和物が５ｍＭとなる１００ｍＭＢｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）中で、反応温度３０℃で実施した。最大活性を１００とする相対活性を求め、この結果を図２に示した。本酵素の安定ｐＨ範囲は、ｐＨ６．０〜 ８．０であり、非常に幅広いｐＨ範囲で安定であった。精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−２）および精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−３）も同様の結果を示した。
【００５９】
（３）至適温度範囲
反応温度１０〜７０℃の各反応温度条件において、グルコース−６−リン酸二ナトリウム塩（オリエンタル酵母製）が２０ｍＭ、ＮＡＤ＋（オリエンタル酵母製）が５ｍＭ、塩化コバルト六水和物が５ｍＭとなる１００ｍＭＢｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）中で、精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−１）の酵素活性測定を実施した。最大活性を１００とする相対活性を求め、この結果を図３に示す。至適温度範囲は５５〜７０℃であり、反応温度６５℃における比活性は１．８μｍｏｌ（ＤＯＩ）／ｍｉｎ／ｍｇ（酵素）と非常に高い値を示した。
【００６０】
（４）安定温度範囲
精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−１）を添加して且つ、ＮＡＤ＋（オリエンタル酵母製）が５ｍＭ、塩化コバルト六水和物が５ｍＭとなるように調整した１００ｍＭＢｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）を、温度範囲２５〜６０℃の各温度で１時間インキュベートした後、それぞれの残存酵素活性を測定した。
残存酵素活性測定は、グルコース−６−リン酸二ナトリウム塩（オリエンタル酵母製）が２０ｍＭ、ＮＡＤ＋（オリエンタル酵母製）が５ｍＭ、塩化コバルト六水和物が５ｍＭとなる１００ｍＭＢｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）中で、反応温度３０℃で実施した。最大活性を１００とする相対活性を求め、この結果を図４に示した。精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−１）の安定温度範囲は５０℃以下であり、精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−２）および精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−３）も同様の結果を示した。これらの高温安定性は、既知酵素にはない新規特性であった。
【００６１】
また、安定化剤として作用することが知られているＮＡＤ＋およびコバルトイオン非存在化でインキュベートした安定温度範囲試験を実施したところ、精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−１）のインキュベート温度４６℃における相対活性は３８、インキュベート温度４２℃における相対活性は８９、インキュベート温度３７℃における相対活性は１００であった。
【００６２】
（５）分子量
分離ゲル濃度が１０％の「レディーゲルＪ」（商標）（日本バイオ・ラッド ラボラトリーズ株式会社）を用いるＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、分子量を求めたところ、精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−１）の分子量は約４０，０００であり、アミノ酸配列から推定される分子量４０，６５６とほぼ一致した。
【００６３】
[比較例１]
［既知ＤＯＩ合成酵素の評価］
配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有する精製既知ＤＯＩ合成酵素（ＢｔｒＣ）に関して、実施例３−（４）安定温度範囲と同様にして以下実験を行った。
精製既知ＤＯＩ合成酵素（ＢｔｒＣ）を添加して且つ、ＮＡＤ＋（オリエンタル酵母製）が５ｍＭ、塩化コバルト六水和物が５ｍＭとなるように調整した１００ｍＭＢｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）を、温度範囲２５〜６０℃の各温度で１時間インキュベートした後、それぞれの残存酵素活性を測定した。
【００６４】
残存酵素活性測定は、グルコース−６−リン酸二ナトリウム塩（オリエンタル酵母製）が２０ｍＭ、ＮＡＤ＋（オリエンタル酵母製）が５ｍＭ、塩化コバルト六水和物が５ｍＭとなる１００ｍＭＢｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）中で、反応温度３０℃で実施した。最大活性を１００とする相対活性を求め、この結果を図５に示した。精製既知ＤＯＩ合成酵素（ＢｔｒＣ）の安定温度範囲は４２℃以下であり、４６℃での相対活性は２３、５０℃での相対活性は０と著しく低い熱安定性を示した。
【００６５】
また、安定化剤として作用することが知られているＮＡＤ＋およびコバルトイオン非存在化でインキュベートした安定温度範囲試験を実施したところ、精製既知ＤＯＩ合成酵素（ＢｔｒＣ）のインキュベート温度４２℃および４６℃における相対活性は０、インキュベート温度３７℃における相対活性は１４であった。本実験からも既存酵素が著しく低い熱安定性を有することが示された。
【００６６】
配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有する精製既知ＤＯＩ合成酵素（ＢｔｒＣ）に関して、実施例３−（２）安定ｐＨ範囲と同様にして以下実験を行った。
精製既知ＤＯＩ合成酵素（ＢｔｒＣ）を各ｐＨで３０℃、６０分間インキュベートし、その残存酵素活性を測定した。インキュベートに用いた緩衝液としては、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ５．５〜７．０）およびＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４〜８．０）を使用した。
残存酵素活性測定は、グルコース−６−リン酸二ナトリウム塩（オリエンタル酵母製）が２０ｍＭ、ＮＡＤ＋（オリエンタル酵母製）が５ｍＭ、塩化コバルト六水和物が５ｍＭとなる１００ｍＭＢｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）中で、反応温度３０℃で実施した。最大活性を１００とする相対活性を求めたところ、ｐH６における相対活性は２７と非常に低い値であった。
【００６７】
[実施例４]
［ＮＡＤＨ／ＮＡＤ比の酵素活性依存性］
ＮＡＤ＋およびＮＡＤＨを表１と表２に記載の濃度となるように調整し且つ、グルコース−６−リン酸二ナトリウム塩（オリエンタル酵母製）が２０ｍＭ、塩化コバルト六水和物が５ｍＭとなる１００ｍＭＢｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）中で、精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−１）の酵素活性測定を実施した。ＮＡＤＨ／ＮＡＤ比が０となる際の活性を１００とするときの活性値をそれぞれ求め、この結果を表１および表２に示した。
表１および表２に示すように、ＮＡＤＨ／ＮＡＤ比にＤＯＩ合成酵素活性は非常に大きな影響を受けることが明らかとなった。
【００６８】
【表１】
【００６９】
【表２】
【産業上の利用可能性】
【００７０】
本発明を用いることにより、利用価値の高いＤＯＩを効率的な製造プロセスを用いて生産することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素を用いて２−デオキシ−シロ−イノソースを製造する方法においてＮＡＤＨ／ＮＡＤ比を制御することを特徴とする２−デオキシ−シロ−イノソースの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、カテコールなどの芳香族化合物の多くは、石油を原料として生産されているが、石油資源の枯渇問題や二酸化炭素排出量の削減などの観点から、バイオマスを利用した環境調和型の新規製造プロセスの開発が求められている。
【０００３】
一方、２−デオキシ−シロ−イノソース（以下、ＤＯＩ）が、産業上有用とされる芳香族化合物（カテコール等）へと変換できることが見出され（非特許文献１）、さらには、このＤＯＩを、バイオマスの構成要素の一つであるグルコースから合成できることが報告された（非特許文献１）。本ＤＯＩ製造プロセスで重要となるのがグルコース−６−リン酸からＤＯＩへと変換する２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素（以下、ＤＯＩ合成酵素）であり、ＤＯＩは上記芳香族化合物への変換のみならず各種有用化合物の中間体ともなり得ることから、ＤＯＩ合成酵素は非常に大きな注目を浴びている。
【０００４】
ＤＯＩ合成酵素はブチロシン生産菌であるＢａｃｉｌｌｕｓ ｃirculans に属する微生物から１９９７年に単離精製（非特許文献２）され、続いて、その遺伝子配列も公開されている（特許文献１）。この他にもＳｔｒｅｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ ｈｉｎｄｕｓｔａｎｕｓ ＪＣＭ３２６８株（非特許文献３）由来のＤＯＩ合成酵素などがこれまでに発見されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０００−２３６８８１号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４１，１９３５−１９３８，２０００
【非特許文献２】Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ５０（５）, ４２４−４２８, １９９７
【非特許文献３】Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ５９（６）, ３５８−３６１, ２００６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、前記ＤＯＩ合成酵素の安定性と比活性などの各種特性は、満足のいくものではなく、また、数千トン規模の工業化製法に向けたＤＯＩ発酵生産に関する研究開発、特に細胞内代謝物の制御に関するものはほとんどなされてこなかった。
本発明は、従来法と比較して、ＤＯＩ発酵生産性を飛躍的に向上させうる細胞内代謝産物制御技術を提供することを解決すべき課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
これらの課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、本発明者らは、ＤＯＩ合成酵素の活性が反応系中のＮＡＤＨ／ＮＡＤ比に予想し得ない領域で影響を受けることを見出し、従来法と比較して、ＤＯＩ発酵生産性を飛躍的に向上させうるＤＯＩ生産技術を見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は以下の［１］〜［７］に示すＤＯＩ製造方法に関するものである。
［１］ ２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素又は２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素を発現可能な微生物を利用してグルコース−６−リン酸から２−デオキシ−シロ−イノソースを製造する方法において、反応系におけるＮＡＤＨ／ＮＡＤ比を１．４以下に制御することを特徴とする、２−デオキシ−シロ−イノソースの製造方法。
［２］ グルコースを構成成分とする多糖類あるいはグルコースを含有する原料を用いることを特徴とする、［１］に記載の方法。
［３］ ２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素が、安定温度範囲が少なくとも４６℃まで安定である耐熱性酵素である、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］ ２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素が、ｐＨ６．０〜 ８．０で安定な酵素である、［１］から［３］の何れか記載の方法。
［５］ ２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素が下記の特性を有する酵素である、［１］又は［２］に記載の方法。
（１）作用：本酵素は、グルコース−６−リン酸を２−デオキシ−シロ−イノソースへと変換する機能を有する。
（２）安定温度範囲：少なくとも４６℃まで安定である。
（３）補酵素としてＮＡＤ+を利用。
（４）至適ｐＨ範囲：７．０〜 ７．７
（５）安定ｐＨ範囲：少なくとも６．０〜 ８．０の範囲で安定である。
（６）至適温度範囲：５５ 〜 ７０ ℃
（７）分子量：３９０００〜４２０００
（８）補因子：Ｃｏ2+イオンの添加により活性向上。
（９）比活性：１．０μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ以上（反応温度６５℃）。
［６］ ２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素が、配列番号２、４、６、８、１０又は１２に記載のアミノ酸配列を有する２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素である、［１］から［２］の何れか記載の方法。
［７］ ２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素が、配列番号２、４、６、８、１０又は１２で示されるアミノ酸配列において１個または複数個のアミノ酸の欠失、付加、及び／又は置換を含み、配列番号２、４、６、８、１０又は１２で示されるアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有して且つ、高温安定性及び／又は広範囲ｐH安定性を持つ２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素である、［１］から［５］の何れか記載の方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によると、菌体あたりのＤＯＩ発酵生産性の向上に寄与することから、短時間で大量のＤＯＩを合成することができる。また、触媒となる菌体量の低減も可能となり、原料利用効率を向上させることもできる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−１）の至適ｐＨ範囲を示す（実施例３）。
【図２】図２は、精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−１）の安定ｐＨ範囲を示す（実施例３）。
【図３】図３は、精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−１）の至適温度範囲を示す（実施例３）。
【図４】図４は、精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−１）の安定温度範囲を示す（実施例３）。
【図５】図５は、精製既知ＤＯＩ合成酵素（ＢｔｒＣ）の安定温度範囲を示す（比較例１）。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明について具体的に説明する。
[ＤＯＩ合成酵素]
本発明を実施するための形態（以下、本実施の形態という）のＤＯＩ合成酵素は、下記の特性を有し、
（１）作用：本酵素は、グルコース−６−リン酸をＤＯＩへと変換する機能を有する。
さらには、下記に示す一部またはすべての特性を有する。
（２）安定温度範囲：少なくとも４６℃まで安定である。
（３）補酵素としてＮＡＤ+を利用。
（４）至適ｐＨ範囲：７．０〜 ７．７
（５）安定ｐＨ範囲：少なくとも６．０〜 ８．０の範囲で安定である。
（６）至適温度範囲：５５ 〜 ７０ ℃
（７）分子量：３９０００〜４２０００
（８）補因子：Ｃｏ2+イオンの添加により活性向上。
（９）比活性：１．０μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ以上（反応温度６５℃）。
【００１３】
配列番号２、４、６、８、１０及び１２に従来のＤＯＩ合成酵素と比較して、耐熱性やpH安定性などの面で優れた新規ＤＯＩ合成酵素のアミノ酸配列を例示するが、このアミノ酸配列からなるタンパク質がＤＯＩ合成酵素活性を有する限り、当該アミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じてもよい。例えば、配列番号２、４、６、８、１０又は１２に示されるアミノ酸配列に対して８０％以上、好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９９％以上の相同性の範囲内で、配列番号２、４、６、８、１０又は１２で表されるアミノ酸配列の１個または複数個（例えば１から５０個、好ましくは１から３０個、さらに好ましくは１から２０個、さらに好ましくは１から１０個、さらに好ましくは１から５個、さらに好ましくは１から３個））のアミノ酸の欠失、付加、及び／又は置換してもよい。
ＤＯＩ合成酵素中のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異を生じさせる方法としては、ＰＣＲ法、エラープローンＰＣＲ法、ＤＮＡシャッフリング法やキメラ酵素を作製する手法等の公知の方法が利用できる。
上記に、新規ＤＯＩ合成酵素を示したが、もちろん本発明は従来のＤＯＩ合成酵素を用いても良い。
ＤＯＩ合成酵素活性を測定する方法としては、例えば、１０００ｍＭグルコース−６−リン酸溶液２０μＬ、１００ｍＭＮＡＤ+溶液５０μＬ、１００ｍＭ塩化コバルト六水和物溶液５０μＬを含むｐＨ７．０の１５０ｍＭＢｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液９００μＬに適当な濃度のＤＯＩ合成酵素液１００μＬを混合し、５〜６０分間程度反応させた後、酵素を失活させ、ＤＯＩを定量する方法などが挙げられる。
酵素の至適温度範囲あるいは至適ｐＨ範囲は、反応温度あるいは反応ｐＨを変化させて酵素活性を測定すればよい。さらにＤＯＩ合成酵素を種々のｐＨ条件下又は温度条件下に一定時間さらした後に酵素活性を測定することにより、安定ｐＨ範囲及び安定温度範囲を調べることができる。例えば、各ｐH条件におけるＤＯＩ合成酵素の評価には、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ５．５〜８．０）およびＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４〜８．０）を用いることができる。
至適ｐＨ範囲とは、最大活性を１００とするときの活性値が７０以上の範囲であり、安定ｐＨ範囲とは最大活性を１００とするときの活性値が７０以上の範囲である。また、至適温度範囲とは、最大活性を１００とするときの活性値が５０以上の範囲であり、安定温度範囲は最大活性を１００とするときの活性値が５０以上の範囲である。
本実施の形態におけるＤＯＩ合成酵素の高温安定性とは、安定温度範囲が４６℃以下、より好ましくは、５０℃以下、さらにより好ましくは６０℃以下、さらに特に好ましくは９５℃以下まで安定なことである。高温安定性を有する２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素としては、例えば、５０℃で１時間インキュベートした後の残存酵素活性（最大活性を１００とする相対活性）が５０以上である酵素を選抜することができる。
本実施の形態における広範囲ｐＨ安定性を持つＤＯＩ合成酵素は、安定ｐＨ範囲が少なくともｐＨ６．０〜７．０、好ましくはｐＨ６．０〜７．４、より好ましくはｐＨ６．０〜７．７、より好ましくはｐＨ６．０〜８．０、特により好ましくはｐＨ４．０〜９．０である特性を有する。
【００１４】
[ＤＯＩ合成酵素遺伝子]
本実施の形態のＤＯＩ合成酵素遺伝子は、メタゲノムや微生物から単離・抽出した天然のものでも良く、また、その塩基配列に従ってＰＣＲ法、人工合成法等の公知の方法によって合成したものでも良い。また、新規ＤＯＩ酵素キメラ遺伝子の作成には、既知ＤＯＩ合成酵素遺伝子を組み合わせてもよく、例示される遺伝子としてはＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＮＢＲＣ１３１５７株、Ｓｔｒｅｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ ｈｉｎｄｕｓｔａｎｕｓ ＪＣＭ３２６８、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｄｉａｅ ＮＢＲＣ１２７７３株などに由来するＤＯＩ合成酵素遺伝子が挙げられる。
【００１５】
配列番号１、３、５、７、９及び１１に新規ＤＯＩ合成酵素遺伝子の塩基配列を例示するが、もちろん本発明は従来のＤＯＩ合成酵素遺伝子を用いても良い。
【００１６】
[組み換えベクター及び形質転換体]
本実施の形態の組換えベクターは、プラスミド等の公知のベクターに本発明の遺伝子を連結（挿入）して得ることができる。前記ベクターは宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えばプラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ等が挙げられる。
【００１７】
前記プラスミドDNAとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えば pBR322, pBR325, pUC18, pUC119, pTrcHis, pBlueBacHis 等）、枯草菌由来のプラスミド（例えば pUB110, pTP5 等）、酵母由来のプラスミド（例えば YEp13, YEp24, YCp50, pYE52 等）などが、ファージ DNAとしてはλファージ等が挙げられる。
【００１８】
前記ベクターへの本発明の遺伝子の挿入は、まず、精製されたDNAを適当な制限酵素で切断し、ベクターDNAの適当な制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法が採用される。
【００１９】
宿主内で外来遺伝子を発現させるためには、構造遺伝子の前に、適当なプロモーターを配置させる必要がある。前記プロモーターは特に限定されず、宿主内で機能することが知られている任意のものを用いることができる。なおプロモーターについては、後述する形質転換体において、宿主ごとに詳述する。また、必要であればエンハンサー等のシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、リボソーム結合配列（SD配列）、ターミネーター配列等を配置させてもよい。
【００２０】
本実施の形態の形質転換体は、本発明の組換えベクターを目的遺伝子が発現しうるように宿主中に導入することによって得ることができる。ここで宿主としては、本発明のDNAを発現できるものであれば特に限定されず、例えば、エッシェリヒア・コリ（Escherichia coli）等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロテイ（Rhizobium meliloti）等のリゾビウム属に属する細菌、またサッカロミセス・セルビシエ（Saccharomyces cerevisiae）等の酵母、その他COS細胞、CHO細胞等の動物細胞、あるいはSf19、Sf21等の昆虫細胞を挙げることができる。
【００２１】
また、本実施の形態の形質転換体として利用する宿主は、グルコース−6−リン酸をグルコース、フルクトース、ガラクトース、キシロースなどの単糖類から合成する機能を有するものが好ましい。また、必要に応じて、二つ以上の単糖が連結した多糖類を分解する機能を有することも好ましい。
【００２２】
大腸菌等の細菌を宿主とする場合は、本発明の組換えベクターが各細菌中で自律複製可能であるとともにプロモーター、リボゾーム結合配列、本発明遺伝子、転写終結配列により構成されていることが望ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていても良い。大腸菌としてはエッシェリヒア・コリ（E. coli）K12、DH1、DH10B（Invitrogen社）、BL21-CodonPlus(DE3)-RIL（ストラタジーン社）、TOP10F等が挙げられ、枯草菌としてはバチルス・ズブチリス（B. subtilis）MI114、207-21 等が挙げられる。
【００２３】
プロモーターとしては大腸菌等の宿主で機能するものであれば特に限定されず、例えばgapAプロモーター、gadAプロモーター、trpプロモーター、lacプロモーター、PLプロモーター、PRプロモーター等の大腸菌由来のプロモーターや、T7プロモーター等のファージ由来のプロモーターを用いることができる。
【００２４】
細菌への組換えベクターの導入方法は、細菌にDNAを導入できる方法であれば特に限定されないが、例えばカルシウムイオンを用いる方法（Cohen, SN et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69 : 2110 (1972)）、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００２５】
酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セルビシエ（S. cerevisiae）、ピヒア・パストリス（Pichia pastoris）等が用いられる。この場合、プロモーターとしては酵母で発現しうるもの、例えばgal1プロモーター、gal10プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、MFα 1プロモーター、PHO5プロモーター、AOXプロモーター等を挙げることができる。
【００２６】
酵母への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法（Becker, D.M. et al. : Methods. Enzymol., 194 : 180 (1990)）、スフェロプラスト法（Hinnen, A. et al. : Proc Natl. Acad. Sci. USA, 75 : 1929 (1978)）、酢酸リチウム法（Itoh, H. : J. Bacteriol., 153 : 163 (1983)）等を挙げることができる。
【００２７】
[ＤＯＩ生産法]
本実施の形態のＤＯＩ生産法では、反応系におけるＮＡＤＨ／ＮＡＤ比を１．４以下に制御することを特徴とする。なお、本実施の形態で言う反応系とは、細胞内でもよいし、インビトロでもよい。ＤＯＩ合成酵素を発現可能な微生物を利用する場合、本実施の形態のＤＯＩ生産法では、反応系（細胞内）のＮＡＤＨ／ＮＡＤ比を制御することを除いては、ＤＯＩ合成酵素産生微生物を常法に従って培養して得られる培養物からＤＯＩを採取することでえられる。
【００２８】
本実施の形態における反応系（細胞内）のＮＡＤＨ／ＮＡＤ比の制御は、菌の培養開始と同時に行っても良いが、より好ましくは、菌の生育およびＤＯＩ合成酵素の発現などの効率性を考慮し、ＤＯＩの生成濃度が２ｇ／Ｌに到達してから開始する。また、ＤＯＩの最終到達濃度が５０ｇ／Ｌを超えるようなＤＯＩ製造プロセスにおいては、ＤＯＩの生成濃度が３０ｇ／Ｌに到達してから反応系（細胞内）のＮＡＤＨ／ＮＡＤ比の制御を開始してもよい。
【００２９】
反応系（細胞内）のＮＡＤＨ／ＮＡＤ比は、好ましくは１．４以下、より好ましくは１．０以下、さらにより好ましくは０．５以下、さらにより好ましくは０．１以下、特により好ましくは０．０２以下である。
【００３０】
反応系（細胞内）のＮＡＤＨ／ＮＡＤ比は、制御開始から少なくとも１．４以下に１分間保てばよく、より好ましくは1時間、より好ましくは１０時間、さらにより好ましくは２４時間、特により好ましくは４８時間保てばよい。
【００３１】
本実施の形態における反応系（細胞内）のＮＡＤＨ／ＮＡＤ比を１．４以下に保つ効果的な手法としては、常法に従えばよく、例えば、非特許文献（Metabolic Engineering Volume 7, Issue 2, March 2005, Pages 104-115）に知られているピルビン酸キナーゼ関連遺伝子欠損が利用でき、本手法を用いれば反応系（細胞内）のＮＡＤＨ／ＮＡＤ比が０．０１０にできることが知られている。本発明における反応系（細胞内）のＮＡＤＨ／ＮＡＤ比の測定は、非特許文献（Metabolic Engineering Volume 7, Issue 2, March 2005, Pages 104-115）に記載の手法などで行うことができる。
【００３２】
また、本実施の形態における反応系（細胞内）のＮＡＤＨ／ＮＡＤ比を１．４以下に保つその他の効果的な手法としては、非特許文献（Appl Microbiol Biotechnol. 2004 Apr;64(3):367-75. Epub 2003 Dec 12.）に記載のグルコースを炭素源とした嫌気（微好気）条件下での培養技術を利用することができる。本技術を用いれば、好気条件で、反応系（細胞内）のＮＡＤＨ／ＮＡＤ比が１．４４にも関わらず、これを嫌気培養することにより０．１３まで低下させることができる。
【００３３】
培養に用いる炭素源としては、形質転換体が資化できるものであればグルコースを構成成分とする多糖類を直接用いてもよく、より好ましくは、単糖類もしくはでんぷんや米ぬかや廃糖蜜などの多糖類を含む原料に由来する単糖類が挙げられ、具体的にはＤ−グルコースなどが挙げられる。また、プロモーターの発現が誘導型である場合には、適時誘導物質を添加すればよい。炭素源以外の栄養源としては、窒素源、無機塩類、その他有機栄養源を含む培地を使用できる。培養温度はその菌の生育可能な温度であれば良い。培養時間には特に制限はないが、１日から７日程度でよい。その後、得られた培養菌体又は培養上清液からＤＯＩを回収すればよい。
【００３４】
炭素源としては、Ｄ−グルコース、ガラクトース、マルトース、サッカロース、トレハロース等の糖類や油脂類や脂肪酸類さらにはｎ−パラフィン等を用いることができる。油脂としては、例えば、ナタネ油、ヤシ油、パーム油、パーム核油などがあげられる。脂肪酸としてはヘキサン酸、オクタン酸、デカン酸、ラウリン酸、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸、リノレン酸、ミリスチン酸などの飽和・不飽和脂肪酸、あるいはこれら脂肪酸のエステルや塩など脂肪酸誘導体などがあげられる。
【００３５】
窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウムなどのアンモニウム塩の他、ペプトン、肉エキス、酵母エキスなどが挙げられる。無機塩類としては、例えば、リン酸水素ナトリウム、リン酸二水素カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、塩化コバルトなどが挙げられる。
【００３６】
その他の有機栄養源としては、アミノ酸類、例えば、アデニン、ヒスチジン、ロイシン、ウラシル、トリプトファンなどが挙げられる。
【００３７】
生成するＤＯＩの確認は、非特許文献（Journal of Biotechnology 129, 502-509 (2007)）に記載の方法などを用いることができる。
【００３８】
本実施の形態において、ＤＯＩの培養液からの回収は，例えば、次のような方法が使用できる。培養終了後、培養液から遠心分離器や濾過装置などで菌体を除き、培養上清液を得る。この培養上清液に対してさらに濾過処理を行い、菌体等の固形物を除き、その濾液にイオン交換樹脂を添加し、蒸留水で溶出を行う。ＩＣＰ発光分析、ｐＨなどを測定しながら不純物を含まないフラクションを分取して、その水溶液の溶媒を取り除くことでＤＯＩを回収することができる。得られたＤＯＩの分析は、例えば、高速液体クロマトグラフィーや核磁気共鳴法などにより行う。
【００３９】
本実施の形態のインビトロ下でのＤＯＩ製造温度は、反応速度や酵素の安定性の点から、好ましくは１０〜９５℃、より好ましくは２０〜７０℃であり、さらに好ましくは３０〜６０℃である。反応ｐＨは広範囲で調整可能であり、酵素の安定性の点から、好ましくはｐＨ２．０〜１０．０、より好ましくはｐＨ４．０〜８．０、さらに好ましくは６．０〜８．０である。
【００４０】
しかしながら、本発明は以上の各種条件に限定されるものではなく、適宜選択することができる。
【００４１】
以下、実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００４２】
[実施例１]
（１）染色体ＤＮＡの調製
常法に従ってＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＮＢＲＣ１３１５７株の染色体ＤＮＡを調製した。
Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＮＢＲＣ１３１５７株をＮＲ寒天プレート（１％ Ｂａｃｔｏ Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．２％ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、１％ エルリッヒカツオエキス、１．５％ Ｂａｃｔｏ Ａｇａｒ、ｐＨ７．０）で、３０℃、１日間培養してコロニーを形成させた。その１白金耳を、ＮＲ培地（１％ Ｂａｃｔｏ Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．２％ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、１％ エルリッヒカツオエキス、ｐＨ７．０）３０ｍＬを１５０ｍＬ三角フラスコに分注したものに接種して、３０℃、１８０ｒｐｍで１日間培養した。この培養液を、４℃で、１，２０００ｇ×１分間遠心分離して上清を除去し、菌体を回収した。
得られた菌体をＬｙｓｉｓバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ グルコース）に懸濁し、よく洗浄した。遠心分離して菌体を回収した後、Ｌｙｓｉｓバッファーに再懸濁し、これにリゾチームを加え３７℃で４５分間インキュベートした。次いでＳＤＳとＲＮａｓｅを添加し、３７℃で４５分間インキュベートした。その後Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋを添加し、５０℃で６０分間穏やかに振盪した。ここで得られた溶液をフェノール−クロロホルム、クロロホルムで処理後、エタノール沈殿し、析出した核酸をガラスピペットに巻きつけて回収した。この核酸を７０％エタノールで洗浄後、乾燥し、ＴＥに再溶解した。この操作により、約１００μｇの染色体ＤＮＡを調製した。
【００４３】
（２）ＤＯＩ合成酵素遺伝子の単離
上記（１）において調製した染色体ＤＮＡからＤＯＩ合成酵素遺伝子を増幅するためのＰＣＲプライマーとして、センスプライマーは配列番号１５の配列を有するオリゴＤＮＡを、アンチセンスプライマーは配列番号１６の配列を有するオリゴＤＮＡをそれぞれ合成した。
ここで得られたＰＣＲプライマーを用い、上記（１）において調製した染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法によるＤＯＩ合成酵素遺伝子の増幅を行い、１１０７塩基対からなるＰＣＲ産物を取得した。
【００４４】
ここで得られたＰＣＲ産物の遺伝子配列をＤＮＡシークエンサーで解析することで確認し、配列番号１３の塩基配列を有する既知ＤＯＩ合成酵素ｂｔｒＣ遺伝子を得た。また、配列番号１４には、既知ＤＯＩ合成酵素ＢｔｒＣのアミノ酸配列を示した。
【００４５】
（３）ＤＯＩ合成酵素遺伝子の発現プラスミドベクターの構築及び形質転換
上記（２）で取得したＰＣＲ産物の平滑末端化、リン酸化を行い、ｐＵＣ１９に大腸菌由来のｇａｐＡプロモーター、ＳＤ配列、ターミネーターを連結したプラスミドにライゲーションした。このプラスミドベクターには大腸菌中で外来遺伝子として連結された遺伝子を効率的に転写できるｇａｐＡプロモーターが導入されており、グルコースを含む培地で組換え微生物を培養した場合においてもＤＯＩ合成酵素遺伝子を効率的に発現・製造させることができる。
ここで得られたプラスミドベクターを、塩化カルシウム法で調製した大腸菌ＪＭ１０９株のコンピテントセルにヒートショック法で形質転換し、組換え微生物を作製した。
【００４６】
（４）耐熱性ＤＯＩ合成酵素遺伝子の取得
上記（３）で取得したプラスミドベクターに対し、常法による変異導入を行うことで、配列番号１（ＤＯＩＳ−１）、配列番号３（ＤＯＩＳ−２）、配列番号５（ＤＯＩＳ−３）、配列番号７（ＤＯＩＳ−４）に記載の耐熱性ＤＯＩ合成酵素遺伝子を得ることができる。また、これらの遺伝子配列に対応するそれぞれのアミノ酸配列を配列番号２、４、６及び８に示した。ここで取得したＤＯＩ合成酵素遺伝子（ＤＯＩＳ−１）についても（３）と同様に形質転換体の取得を行った。
【００４７】
（５）広範囲ｐＨ安定型ＤＯＩ合成酵素遺伝子の取得
上記（３）で取得したプラスミドベクターに対し、常法による変異導入を行うことで、配列番号９（ＤＯＩＳ−５）、配列番号１１（ＤＯＩＳ−６）、に記載の広範囲ｐＨ安定型ＤＯＩ合成酵素遺伝子を得ることができる。また、これらの遺伝子配列に対応するそれぞれのアミノ酸配列を配列番号１０及び１２に示した。
【００４８】
[実施例２]
［精製酵素の取得］
実施例１で作製したＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−１）の形質転換体を１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢプレートで、３７℃、一日間培養して、コロニーを形成させた。
次いで１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地３０ｍＬを１５０ｍＬ容の三角フラスコに入れ、上記プレートからコロニーを白金耳で植菌し、３７℃で、３〜８時間、ＯＤ（６００ｎｍ）が０．５程度になるまで１８０ｒｐｍで回転振盪培養を行い、これを本培養の前培養液とした。
【００４９】
５００ｍＬ容の三角フラスコ３６本に、２ｇ／Ｌのグルコースと１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地を１００ｍＬずつ入れ、それぞれの三角フラスコに０．５ｍLの前培養液を添加し、３７℃で、１６時間、１８０ｒｐｍで回転振盪培養を行った。
次いでこの培養液を、４℃で、１０，０００ｇ×３０分間遠心分離して上清を除去し、０．２ｍｇ／Ｌ塩化コバルト六水和物を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．７）で数回洗浄しながら菌体を回収した。回収した菌体は、−８０℃で凍結保存した。
【００５０】
この凍結保存菌体を０．２ｍｇ／Ｌ塩化コバルト六水和物を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．７）で懸濁し、リゾチーム（Ｓｉｇｍａ社製 卵白由来）を１８０ｍｇとデオキシリボヌクレアーゼＩ（ＷａＫｏ社製 ウシ由来 組換え体溶液）を６０μＬ添加して、３７℃で、５時間、１２０ｒｐｍで振盪し、菌体破砕を行った。
菌体破砕後の溶液を、４℃で、１０，０００ｇ×３０分間遠心分離して菌体残渣を除去し、上清を回収した。
【００５１】
この上清に硫酸アンモニウムを加えて３０％飽和とし、４℃でしばらく攪拌した後に、生じた沈殿を、４℃で、１０，０００ｇ×３０分間遠心分離して除去し、上清を回収した。
この上清にさらに硫酸アンモニウムを加えて４０．０％飽和とし、４℃でしばらく攪拌した後に、生じた沈殿を、４℃で、１０，０００ｇ×３０分間遠心分離して上清を除去し、沈殿を回収した。次いでこの沈殿を０．２ｍｇ／Ｌ塩化コバルト六水和物を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．７）に溶解させた。
【００５２】
この溶解液を４℃で、平均分画分子量１０，０００の限外濾過膜を用いて濃縮し、０．２ｍｇ／Ｌ塩化コバルト六水和物を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．７）を加え、再度、濃縮するという脱塩操作を２〜３回繰り返した。
上記で得られた酵素溶液を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．７）で平衡化した「ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ」（商標）（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス株式会社）に吸着させた後、０〜０．４Ｍの塩化ナトリウムを含有する５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．７）の濃度勾配法によって酵素を溶出させた。
【００５３】
上記で溶出した活性画分を集め、平均分画分子量１０，０００の限外濾過膜を用いて濃縮し、１０重量％の硫酸アンモニウムを含有する５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．７）で懸濁し、１０重量％の硫酸アンモニウムを含有する５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．７）で平衡化した「ＨｉＴｒａｐ Ｐｈｅｎｙｌ ＦＦ （ｈｉｇｈ ｓｕｂ）」（商標）（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス株式会社）に吸着させた後、１０〜０重量％の硫酸アンモニウムを含有する５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．７）の濃度勾配法によって酵素を溶出させた。
上記で溶出した活性画分を集め、平均分画分子量１０，０００の限外濾過膜を用いて濃縮し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．７）で平衡化した「ＭｏｎｏＱ ５／５０ ＧＬ」（商標）（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス株式会社）に吸着させた後、０〜０．２Ｍの塩化ナトリウムを含有する５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．７）の濃度勾配法によって酵素を溶出させた。
【００５４】
上記で溶出した活性画分を集め、平均分画分子量１０，０００の限外濾過膜を用いて濃縮し、０．２ｍｇ／Ｌ塩化コバルト六水和物と０．１ＭＮａＣｌを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．７）で平衡化した「ＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００」（商標）（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス株式会社）に充填した後、同様の緩衝液で溶出を行った。
上記で溶出した活性画分を集め、平均分画分子量１０，０００の限外濾過膜を用いて濃縮し、精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−１）を得た。
【００５５】
上記、一連の精製酵素取得実験と同様にして、精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−２）、精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−３）、精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩ−４）、精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩ−５）および精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩ−６）、精製既知ＤＯＩ合成酵素（ＢｔｒＣ）を取得した。
【００５６】
[実施例３]
［新規ＤＯＩ合成酵素の評価］
実施例２で得られた精製ＤＯＩ合成酵素を用いて、その作用に関する実験を行った。
【００５７】
（１）至適ｐＨ範囲
各ｐＨにおける活性測定では、反応液に精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−１）を適量添加し、グルコース−６−リン酸二ナトリウム塩（オリエンタル酵母製）が２０ｍＭ、ＮＡＤ＋（オリエンタル酵母製）が５ｍＭ、塩化コバルト六水和物が５ｍＭ、各種緩衝液が１００ｍＭとなるようにして反応液を調整した。緩衝液としては、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ６．０〜７．７）およびＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４〜８．０） を使用した。反応温度は３０℃とし、生成するＤＯＩを定量することで活性を測定した。最大活性を１００とする相対活性を求め、この結果を図１に示す。本発明酵素における至適ｐＨ範囲は、ｐＨ７．０〜 ７．７であった。
【００５８】
（２）安定ｐＨ範囲
ｐＨ５．５〜８．０の範囲の１００ｍＭの緩衝液を用いて、精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−１）を各ｐＨで３０℃、６０分間インキュベートし、その残存酵素活性を測定した。インキュベートに用いた緩衝液としては、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ５．５〜８．０）およびＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４〜８．０）を使用した。
残存酵素活性測定は、グルコース−６−リン酸二ナトリウム塩（オリエンタル酵母製）が２０ｍＭ、ＮＡＤ＋（オリエンタル酵母製）が５ｍＭ、塩化コバルト六水和物が５ｍＭとなる１００ｍＭＢｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）中で、反応温度３０℃で実施した。最大活性を１００とする相対活性を求め、この結果を図２に示した。本酵素の安定ｐＨ範囲は、ｐＨ６．０〜 ８．０であり、非常に幅広いｐＨ範囲で安定であった。精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−２）および精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−３）も同様の結果を示した。
【００５９】
（３）至適温度範囲
反応温度１０〜７０℃の各反応温度条件において、グルコース−６−リン酸二ナトリウム塩（オリエンタル酵母製）が２０ｍＭ、ＮＡＤ＋（オリエンタル酵母製）が５ｍＭ、塩化コバルト六水和物が５ｍＭとなる１００ｍＭＢｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）中で、精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−１）の酵素活性測定を実施した。最大活性を１００とする相対活性を求め、この結果を図３に示す。至適温度範囲は５５〜７０℃であり、反応温度６５℃における比活性は１．８μｍｏｌ（ＤＯＩ）／ｍｉｎ／ｍｇ（酵素）と非常に高い値を示した。
【００６０】
（４）安定温度範囲
精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−１）を添加して且つ、ＮＡＤ＋（オリエンタル酵母製）が５ｍＭ、塩化コバルト六水和物が５ｍＭとなるように調整した１００ｍＭＢｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）を、温度範囲２５〜６０℃の各温度で１時間インキュベートした後、それぞれの残存酵素活性を測定した。
残存酵素活性測定は、グルコース−６−リン酸二ナトリウム塩（オリエンタル酵母製）が２０ｍＭ、ＮＡＤ＋（オリエンタル酵母製）が５ｍＭ、塩化コバルト六水和物が５ｍＭとなる１００ｍＭＢｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）中で、反応温度３０℃で実施した。最大活性を１００とする相対活性を求め、この結果を図４に示した。精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−１）の安定温度範囲は５０℃以下であり、精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−２）および精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−３）も同様の結果を示した。これらの高温安定性は、既知酵素にはない新規特性であった。
【００６１】
また、安定化剤として作用することが知られているＮＡＤ＋およびコバルトイオン非存在化でインキュベートした安定温度範囲試験を実施したところ、精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−１）のインキュベート温度４６℃における相対活性は３８、インキュベート温度４２℃における相対活性は８９、インキュベート温度３７℃における相対活性は１００であった。
【００６２】
（５）分子量
分離ゲル濃度が１０％の「レディーゲルＪ」（商標）（日本バイオ・ラッド ラボラトリーズ株式会社）を用いるＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、分子量を求めたところ、精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−１）の分子量は約４０，０００であり、アミノ酸配列から推定される分子量４０，６５６とほぼ一致した。
【００６３】
[比較例１]
［既知ＤＯＩ合成酵素の評価］
配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有する精製既知ＤＯＩ合成酵素（ＢｔｒＣ）に関して、実施例３−（４）安定温度範囲と同様にして以下実験を行った。
精製既知ＤＯＩ合成酵素（ＢｔｒＣ）を添加して且つ、ＮＡＤ＋（オリエンタル酵母製）が５ｍＭ、塩化コバルト六水和物が５ｍＭとなるように調整した１００ｍＭＢｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）を、温度範囲２５〜６０℃の各温度で１時間インキュベートした後、それぞれの残存酵素活性を測定した。
【００６４】
残存酵素活性測定は、グルコース−６−リン酸二ナトリウム塩（オリエンタル酵母製）が２０ｍＭ、ＮＡＤ＋（オリエンタル酵母製）が５ｍＭ、塩化コバルト六水和物が５ｍＭとなる１００ｍＭＢｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）中で、反応温度３０℃で実施した。最大活性を１００とする相対活性を求め、この結果を図５に示した。精製既知ＤＯＩ合成酵素（ＢｔｒＣ）の安定温度範囲は４２℃以下であり、４６℃での相対活性は２３、５０℃での相対活性は０と著しく低い熱安定性を示した。
【００６５】
また、安定化剤として作用することが知られているＮＡＤ＋およびコバルトイオン非存在化でインキュベートした安定温度範囲試験を実施したところ、精製既知ＤＯＩ合成酵素（ＢｔｒＣ）のインキュベート温度４２℃および４６℃における相対活性は０、インキュベート温度３７℃における相対活性は１４であった。本実験からも既存酵素が著しく低い熱安定性を有することが示された。
【００６６】
配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有する精製既知ＤＯＩ合成酵素（ＢｔｒＣ）に関して、実施例３−（２）安定ｐＨ範囲と同様にして以下実験を行った。
精製既知ＤＯＩ合成酵素（ＢｔｒＣ）を各ｐＨで３０℃、６０分間インキュベートし、その残存酵素活性を測定した。インキュベートに用いた緩衝液としては、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ５．５〜７．０）およびＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４〜８．０）を使用した。
残存酵素活性測定は、グルコース−６−リン酸二ナトリウム塩（オリエンタル酵母製）が２０ｍＭ、ＮＡＤ＋（オリエンタル酵母製）が５ｍＭ、塩化コバルト六水和物が５ｍＭとなる１００ｍＭＢｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）中で、反応温度３０℃で実施した。最大活性を１００とする相対活性を求めたところ、ｐH６における相対活性は２７と非常に低い値であった。
【００６７】
[実施例４]
［ＮＡＤＨ／ＮＡＤ比の酵素活性依存性］
ＮＡＤ＋およびＮＡＤＨを表１と表２に記載の濃度となるように調整し且つ、グルコース−６−リン酸二ナトリウム塩（オリエンタル酵母製）が２０ｍＭ、塩化コバルト六水和物が５ｍＭとなる１００ｍＭＢｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）中で、精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−１）の酵素活性測定を実施した。ＮＡＤＨ／ＮＡＤ比が０となる際の活性を１００とするときの活性値をそれぞれ求め、この結果を表１および表２に示した。
表１および表２に示すように、ＮＡＤＨ／ＮＡＤ比にＤＯＩ合成酵素活性は非常に大きな影響を受けることが明らかとなった。
【００６８】
【表１】
【００６９】
【表２】
【産業上の利用可能性】
【００７０】
本発明を用いることにより、利用価値の高いＤＯＩを効率的な製造プロセスを用いて生産することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素又は２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素を発現可能な微生物を利用してグルコース−６−リン酸から２−デオキシ−シロ−イノソースを製造する方法において、反応系におけるＮＡＤＨ／ＮＡＤ比を１．４以下に制御することを特徴とする、２−デオキシ−シロ−イノソースの製造方法。
【請求項２】
グルコースを構成成分とする多糖類あるいはグルコースを含有する原料を用いることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素が、安定温度範囲が少なくとも４６℃まで安定である耐熱性酵素である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素が、ｐＨ６．０〜 ８．０で安定な酵素である、請求項１から３の何れか１項記載の方法。
【請求項５】
２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素が下記の特性を有する酵素である、請求項１または２に記載の方法。
（１）作用：本酵素は、グルコース−６−リン酸を２−デオキシ−シロ−イノソースへと変換する機能を有する。
（２）安定温度範囲：少なくとも４６℃まで安定である。
（３）補酵素としてＮＡＤ+を利用。
（４）至適ｐＨ範囲：７．０〜 ７．７
（５）安定ｐＨ範囲：少なくとも６．０〜 ８．０の範囲で安定である。
（６）至適温度範囲：５５ 〜 ７０ ℃
（７）分子量：３９０００〜４２０００
（８）補因子：Ｃｏ2+イオンの添加により活性向上。
（９）比活性：１．０μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ以上（反応温度６５℃）。
【請求項６】
２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素が、配列番号２、４、６、８、１０又は１２に記載のアミノ酸配列を有する２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素である、請求項１から２の何れか１項記載の方法。
【請求項７】
２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素が、配列番号２、４、６、８、１０又は１２で示されるアミノ酸配列において１個または複数個のアミノ酸の欠失、付加、及び／又は置換を含み、配列番号２、４、６、８、１０又は１２で示されるアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有して且つ、高温安定性及び／又は広範囲ｐH安定性を持つ２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素である、請求項１から５の何れか１項に記載の方法。
【請求項１】
２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素又は２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素を発現可能な微生物を利用してグルコース−６−リン酸から２−デオキシ−シロ−イノソースを製造する方法において、反応系におけるＮＡＤＨ／ＮＡＤ比を１．４以下に制御することを特徴とする、２−デオキシ−シロ−イノソースの製造方法。
【請求項２】
グルコースを構成成分とする多糖類あるいはグルコースを含有する原料を用いることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素が、安定温度範囲が少なくとも４６℃まで安定である耐熱性酵素である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素が、ｐＨ６．０〜 ８．０で安定な酵素である、請求項１から３の何れか１項記載の方法。
【請求項５】
２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素が下記の特性を有する酵素である、請求項１または２に記載の方法。
（１）作用：本酵素は、グルコース−６−リン酸を２−デオキシ−シロ−イノソースへと変換する機能を有する。
（２）安定温度範囲：少なくとも４６℃まで安定である。
（３）補酵素としてＮＡＤ+を利用。
（４）至適ｐＨ範囲：７．０〜 ７．７
（５）安定ｐＨ範囲：少なくとも６．０〜 ８．０の範囲で安定である。
（６）至適温度範囲：５５ 〜 ７０ ℃
（７）分子量：３９０００〜４２０００
（８）補因子：Ｃｏ2+イオンの添加により活性向上。
（９）比活性：１．０μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ以上（反応温度６５℃）。
【請求項６】
２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素が、配列番号２、４、６、８、１０又は１２に記載のアミノ酸配列を有する２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素である、請求項１から２の何れか１項記載の方法。
【請求項７】
２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素が、配列番号２、４、６、８、１０又は１２で示されるアミノ酸配列において１個または複数個のアミノ酸の欠失、付加、及び／又は置換を含み、配列番号２、４、６、８、１０又は１２で示されるアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有して且つ、高温安定性及び／又は広範囲ｐH安定性を持つ２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素である、請求項１から５の何れか１項に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１０−２２７０２３（Ｐ２０１０−２２７０２３Ａ）
【公開日】平成２２年１０月１４日（２０１０．１０．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−７８７１４（Ｐ２００９−７８７１４）
【出願日】平成２１年３月２７日（２００９．３．２７）
【出願人】（３０３０４６３１４）旭化成ケミカルズ株式会社 (2,513)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１０月１４日（２０１０．１０．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年３月２７日（２００９．３．２７）
【出願人】（３０３０４６３１４）旭化成ケミカルズ株式会社 (2,513)
【Ｆターム（参考）】
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