説明

NF−κBのレセプター活性化因子−レセプターはTNFレセプタースーパーファミリーの一員である

【課題】免疫システムを効率よく機能させるために免疫調節活性を持つサイトカインレセプターを提供する。
【解決手段】ヒトTNF(腫瘍壊死因子)レセプタースーパーファミリーに属するRANK。単離されたレセプター、そのようなレセプターをコードするDNA、およびそれから作り出された医薬組成物。単離されたレセプターは、免疫応答を調節するために用いることができる。また、レセプターは、その阻害剤のスクリーニングにも有用である。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
発明の属する技術分野
本発明は、一般的には、サイトカインレセプター、より具体的には、免疫調節活性を持つサイトカインレセプター/リガンド対の分野に関する。
【背景技術】
【0002】
発明の背景
免疫システムが効率良く機能するには、細胞の増殖と分化および細胞死の間の良好なバランスが必要であり、免疫システムが外来抗原と反応するが自己抗原とは反応しないことを確実にする。免疫応答および炎症応答を調節するプロセスには、様々な構成員からなる腫瘍壊死因子(TNF)レセプター/神経増殖因子レセプターのスーパーファミリーが関与している(Smithら、Science,248,1019、1990)。このファミリーのレセプターには、2つの異なるTNFレセプター(I型およびII型、Smithら、上記、およびSchallら、Cell,61,361、1990)、神経増殖因子レセプター(Johnsonら、Cell,47,545、1986)、B細胞抗原CD40(Stamenkovicら、EMBO J.,8,1403、1989)、CD27(Cameriniら、J.Immunol.,147,3165、1991)、CD30(Durkopら、Cell,68,421、1992)、T細胞抗原OX40(Mallettら、EMBO J.,9,1063、1990)、ヒトFas抗原(Itohら、Cel,66,233、1991)、ネズミ4−1BBレセプター(Kwonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86,1963、1989)およびアポトーシス−誘導レセプター(Apoptosis-Inducing Receptor) (AIR)(USSN 08/720,864、1996年10月4日出願)と名付けられたレセプターが含まれる。
【0003】
CD40は、Bリンパ球、上皮細胞およびいくつかのカルシノーマ細胞系上に存在するレセプターであり、活性化T細胞上に認められるリガンドCD40L(USSN08/249,189、1994年5月24日出願)と相互作用する。このリガンド/レセプター対の相互作用は、細胞性および体液性の免疫応答の両方で重要である。CD40によるシグナル伝達は、この分子の細胞質ドメインとTNFレセプター−関連因子(TNF receptor-associated factors) (TRAFs;BakerおよびReddy,Oncogene,12,1、1996)の構成員との関連を通して仲介される。最近、TRAF3をコードする遺伝子内の標的化破壊によってTRAF3発現が欠損しているマウスは、誕生時には正常に見えるが、進行性低血糖症および末梢白血球の減少が進み、日齢約10日で死に至ることが分かった(Xuら、Immunity、5,407、1996)。TRAF3−/− 胎児肝細胞で再構築されたキメラマウスの免疫応答においては、TRAF3−/− B細胞は機能的に正常に見えるものの、CD40−欠損マウスの免疫応答に類似する。
【0004】
シグナル伝達でのTRAF3の重要な役割は、TNFレセプタースーパーファミリーのその他の構成員の一員、例えばT細胞上に存在するCD30またはCD27、とTRAF3の相互作用の点であろう。代わりに、TRAF3と相互作用し生後の発達ならびに適格な免疫システムの発達に重要な役割を演ずるこのレセプターのファミリーの未だ同定されていない構成員の様な、その他の構成員が存在するかも知れない。TNFレセプタースーパーファミリーのさらなる構成員の同定は、免疫応答および炎症応答を調節するさらなる手段を提供し、ならびに哺乳動物での生後の発達のさらなる知識を提供する可能性がある。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【0005】
発明の概要
本発明は、TNFレセプタースーパーファミリーの一員であるRANK(NF−κBのレセプター活性化因子)(receptor activator of NF-κB)と呼ばれる新規のレセプターを提供する。RANKは、TRAF3と相互作用する616アミノ酸残基を持つI型のトランスメンブランタンパク質である。過剰発現、RANKおよび膜結合RANKリガンド(RANKL)の同時発現、ならびに可溶性RANKLまたはアゴニスト抗体のRANKへの付加によってRANKが誘発されると、その結果、免疫システム細胞に最も広範囲に利用されている普遍的な転写因子である転写因子NF−κBがアップレギュレーションされる。
【0006】
可溶型のレセプターを調製して使用すると、膜結合RANKを通してのシグナル伝達、従ってNF−κBのアップレギュレーションを阻害することができる;従って、可溶型の新規レセプターを含む医薬組成物もまた提供される。RANKアンタゴニストによるNF−κBの阻害は、RANKの引き金により生じる炎症性応答の不所望な影響の改善、例えば中毒性ショックまたは敗血症、移植片対宿主反応、または急性炎症性反応の治療、に有用であることができる。また、可溶型レセプターは、インビトロでのRANK活性のアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニングに有用であろう。
【0007】
RANKの細胞質ドメインは、シグナル伝達の阻害剤のアッセイの開発、例えば、TRAF2またはTRAF3とのRANKの相互作用を阻害する分子のスクリーニング、に有用であろう。また、新規のレセプターを含む欠失型および融合タンパク質についても開示されている。
【0008】
また、本発明では、RANKLと呼ばれるRANKの相手構造(counter structure)
またはリガンドを同定している。RANKLは、約50アミノ酸より少ない細胞内ドメイン、トランスメンブランドメインおよび約240から250アミノ酸の細胞外ドメインを持つ2型のトランスメンブランタンパク質である。それが属するTNFファミリーのその他の構成員と同様に、RANKLは、トランスメンブランドメインとレセプター結合ドメインとの間に、レセプターの結合には必要ではない、「スペーサー」領域を持つ。従って、可溶型RANKLは、レセプター結合領域を含む細胞外ドメイン全体またはそのフラグメントを含むことができる。
【0009】
本発明のこれらのおよびその他の態様は、本発明の以下の詳細な説明を参考に明らかになるであろう。
【0010】
発明の詳細な説明
ヒト骨髄由来の樹状突起細胞(DC)から作り出されたcDNAの配列情報を含むデータベース中に、CD40に対してある程度の類似性を持ち、予想されるオープンリーディングフレームを持つ新規の部分的cDNA挿入物を同定した。この挿入物を用いて、全長のcDNAを含むDC cDNAライブラリーから生成されたコロニーブロットとハイブリダイズした。いくつかのコロニーハイブリダイゼーションを行い、そして2つのクローン(配列番号1および3)を単離した。配列番号5は、配列番号1および3のオーバーラップする配列のアライメントを基に予想した全長タンパク質のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示している。
【0011】
RANKは、TNFレセプタースーパーファミリーの一員であり;細胞外領域ではCD40と非常に良く似ている。CD40と同様に、RANKは、Rotheら、Cell,
83,1243、1995に記載した方法に実質上従って、同時免疫沈降アッセイ(co-immunoprecipitation assays)によって決定した場合、TRAF2およびTRAF3と関
連している。TRAFは、免疫応答および炎症性応答の調節に極めて重要である。TNFレセプタースーパーファミリーの様々な構成員とそれらが関連することによって、シグナルが細胞に伝達される。そのシグナルは、どのレセプター(類)が誘発されるか、そしてどのTRAF(s)がレセプター(類)と関連するかによって、細胞の増殖、分化またはアポトーシスを生ずる結果となる;つまり、様々なシグナル化イベントを連動させることによって、異なるシグナルを細胞に伝達することができる。このように、このファミリーの一員を通して伝達されたシグナルは、細胞に伝達されたその他のシグナルおよび/または細胞の分化の状態によって、増殖性、分化性またはアポトーシス性であることができる。この増殖性/アポトーシス性経路のそのような精巧な制御は、病原体に対する防御を発達させ維持するために必要であり;その不均衡は、自己免疫病を生ずる可能性がある。
【0012】
RANKは、上皮細胞、いくつかのB細胞系、および活性化T細胞上に発現する。しかしながら、活性化T細胞上でのその発現は遅く、活性化の約4日後である。発現のこの時間経過は、既知のアポトーシス因子であるFasの発現と一致する。RANKは抗アポトーシスシグナルとして作用することができ、CD40で知られているように、RANKを発現する細胞をアポトーシスから救済する。代わりに、RANKは、適当な環境下では、再びCD40と同様に、アポトーシス性シグナルをますます強めることもできる。RANKおよびそのリガンドは、免疫応答および炎症性応答の調節に不可欠の役割を演ずるらしい。
【0013】
さらに、TRAF3遺伝子が標的崩壊されたマウスの生後死亡率は、この分子が免疫応答のみならず発生にも重要であることを証明している。TRAF3と関連するタンパク質としてのRANKおよびそのリガンドを単離すると、このシグナル化経路がさらに明確になり、そして自己免疫病および/または炎症性疾病の領域での使用への診断適用および治療適用の開発が可能になるであろう。
【0014】
DNA、タンパク質および類似体
本発明は、単離されたRANKポリペプチドおよび天然分子によって示される活性を持つその類似体(またはムテイン)(即ち、細胞上に発現したかあるいは表面上に固定化されたRANKリガンド又はRANK特異的抗体に特異的に結合するRANKムテイン;RANKを通してRANKリガンドが誘導するシグナル伝達を阻害するその可溶型)を提供する。そのようなタンパク質は、実質上、内因性物質の混入がなく、所望により、関連する天然のパターンのグリコシル化を含まない。本発明の範囲内のRANK誘導体には、生物活性を保持している本来のタンパク質の様々な構造形もまた含まれる。イオン化されうるアミノ基およびカルボキシル基の存在により、例えば、RANKタンパク質は、酸性塩または塩基性塩の形で存在することができ、また中性の形で存在することもできる。また、個々のアミノ酸残基を、酸化または還元により修飾することもできる。本来のアミノ酸構造を、グリコシル基、脂質、リン酸、アセチル基およびその類似物のようなその他の化学部分と共有結合または凝集結合を形成することによって、またはアミノ酸配列変異体を作り出すことによって、修飾することができる。共有結合誘導体は、アミノ酸側鎖またはN−あるいはC−末端に特定の官能基を連結することにより、調製される。
【0015】
また、M−マレイミドベンゾイルスクシンイミドエステルおよびN−ヒドロキシスクシンイミドのような架橋剤をシステインおよびリジン残基に作用させることによって、RANK誘導体を得ることもできる。また、本発明のタンパク質を、臭化シアン−活性化、ビスオキシラン−活性化、カルボニルジイミダゾール−活性化またはトシル−活性化されたアガロース構造のような様々な不溶性物質に活性側基を通して共有結合させ、または(グルタルアルデヒド架橋を伴うあるいは伴わずに)ポリオレフィン表面に吸着させることに
よって、結合させることもできる。ひとたび、物質と結合させたならば、そのタンパク質を用いて、上記タンパク質に対して、またはRANKあるいはRANKLに類似したその他のタンパク質類、ならびにRANKあるいはRANKLあるいはその同族体と結合するその他のタンパク質に対して作成した抗体と(アッセイまたは精製の目的で)選択的に結合させるために用いることができる。
【0016】
RANKの可溶型もまた、本発明の範囲内にある。RANKのヌクレオチド配列および予想されるアミノ酸配列を配列番号1から6に示す。コンピューターによる分析から、タンパク質は、N−末端にシグナルペプチドを持ち;予想される切断部位は残基24の次であることが、示された。当業者らは、実際の切断位置がコンピューター分析によって予想されたそれとは異なることもあり得ることを認識しているであろう。従って、切断されたペプチドのN−末端アミノ酸は、残基24に続く予想された、好ましい切断部位のいずれかの側の約5のアミノ酸残基内にあると、予想される。さらに、アミノ酸33で始まる可溶型が調製され;この可溶型は、RANKLと結合した。シグナルペプチドの後に、188アミノ酸からなる細胞外ドメイン、21アミノ酸のトランスメンブランドメインおよび383アミノ酸の細胞質尾部が続くと予想される。
【0017】
可溶性RANKは、シグナルペプチドおよび細胞外ドメイン(配列番号6の残基1から213)またはそのフラグメントを含む。代わりに、天然のリーダー配列を、配列番号6の残基1で始まり、アミノ酸24から33(その両端のアミノ酸を含む)からなる群から選択された一残基に続く異なるシグナルペプチドと置換することもできる。さらに、細胞外ドメインのフラグメントも、RANKの可溶型を提供するであろう。フラグメントは、細胞外領域の所望の部分を単離するために既知の技術を用いて調製することができ、例えば、細胞外領域をTNFRのその他の構成員の細胞外領域と比較し、そしてその他のファミリー構成員について調製されたそれらと類似した型を選択することによって調製することもできる。代わりに、ユニークな制限部位またはこの技術分野で既知のPCR技術を用いて、数多くの先端切除型を調製し、発現させてその活性について分析することもできる。
【0018】
フラグメントは、既知の技術を用いて細胞外領域の所望の部分を単離して調製することができ、例えば、細胞外領域をTNFRファミリー(RANKもその一員である)のその他の構成員の細胞外領域と比較して、その他のファミリー構成員について調製されたそれらと類似した形を選択することによって、調製することもできる。代わりに、ユニークな制限部位またはこの技術分野で既知のPCR技術を用いて、数多くの先端切除型を調製し、発現させてその活性を分析することもできる。
【0019】
本発明の範囲内にあるRANKタンパク質のその他の誘導体には、N−末端またはC−末端融合のような組換え培養での合成によるように、RANKタンパク質またはそれらのフラグメントとその他のタンパク質またはポリペプチドとの共有結合体または凝集結合体が含まれる。例えば、共有結合されるペプチドは、合成された部位から、それが機能する細胞膜あるいは細胞壁の内側または外側の部位へのタンパク質の移動を、翻訳と同時にまたは翻訳後に指示する、タンパク質のN−末端領域に存在するシグナル(またはリーダー)ポリペプチド配列(例えば、酵母のα−因子リーダー)であることができる。
【0020】
タンパク質融合物は、RANKタンパク質およびその同族体の精製または同定を容易にするために加えられるペプチド(例えばポリ−His)を含むことができる。また、本発明のタンパク質のアミノ酸配列を、Hoppら、Bio/Technology,6,1204(1988)に記載されたような同定ペプチドと連結することもできる。そのような高抗原性ペプチドは、特異的モノクローナル抗体が可逆的に結合するエピトープを提供し、迅速なアッセイを可能にし、発現した組み換えタンパク質の精製を容易にする。また、Hoppらの配列は、ウシ粘膜エンテロキナーゼによって特異的に切断され、精製タンパク質からのペプチドの除去を可能にする。そのようなペプチドでキャップされた融合タンパク質はまた、大腸菌内の細胞内分解に耐性であることができる。
【0021】
さらに、融合タンパク質は、イムノグロブリンFc領域に連結したRANKのアミノ酸配列を含む。例示的Fc領域は、配列番号8に示したアミノ酸配列のヌクレオチドを持つヒトIgGである。また、Fc領域のフラグメントを、Fcムテインとして、用いることもできる。例えば、Fc領域のヒンジ領域内のある残基は、FcγR1への高アフィニティー結合に重要である。CanfieldおよびMorrison(J.Exp.Med.,173,1483、1991)は、Leu(234) およびLeu(235) がU937細胞上に存在するFcγR1へのIgGの高アフィニティー結合に重要であると、報告した。同様の結果は、Lundら(J.Immunol.,147,2657、1991;Molecular Immunol.,29,53、1991)によっても得られた。そのような変異を、単独でまたは組み合わせて、IgGFc領域内に作成し、FcRへのIgGのアフィニティーを減少させることもできる。用いられたFc領域の部分によっては、融合タンパク質を、鎖間ジスルフィド結合の形成を通して、ダイマーとして発現させることができる。融合タンパク質が抗体の重鎖および軽鎖の両方で作られているならば、4つまでのRANK領域を持つタンパク質オリゴマーを作成することができる。
【0022】
もう一つの実施態様では、RANKタンパク質は、さらに、ロイシンジッパードメインのようなオリゴマー化したペプチドを含む。ロイシンジッパーは、はじめは様々なDNA−結合タンパク質内で同定された(Landschulzら、Science,240,1759、1988)。ロイシンジッパードメインは、これら(およびその他)のタンパク質内に存在する保存ペプチドドメインを指すために用いられた用語であり、タンパク質のダイマー化の原因となる。このロイシンジッパードメイン(ここでは、また、オリゴマー化ドメインまたはオリゴマー−形成ドメインとも呼ばれている)は、その他のアミノ酸に散在する4または5のロイシン残基を持つ、7個の反復性繰り返しを含む。ロイシンジッパードメインの例は、酵母転写因子GCN4に見出されたもの、およびラット肝臓内で見いだされた熱安定性DNA−結合タンパク質(C/EBP;Landscheulzら、Science,243,1681、1989)である。2つの核形質転換タンパク質、fosおよびjun、もまた、ネズミのプロト−オンコジーンの遺伝子生成物c−myc(Landschulzら、Science,240,1759、1988)がそうであるように、ロイシンジッパードメインを提示している。核オンコジーンfosおよびjunの生成物は、優先的にヘテロダイマーを形成するロイシンジッパードメインを含む(O’Sheaら、Science,245,646、1989;TurnerおよびTjian、Science,243,1689、1989)。ロイシンジッパードメインは、これらタンパク質の生物学的活性(DNA結合性)に必要である。
【0023】
パラミクソウイルス、コロナウイルス、麻疹ウイルス、および数多くのレトロウイルスを含む異なる様々なウイルスの融合形成タンパク質もまた、ロイシンジッパードメインを持っている(BucklandおよびWild、Nature,338,547、1989;Britton,Nature,353,394、1991;DelwartおよびMosialos、AIDS Research and Human Retroviruses,6,703、1990)。これらの融合形成ウイルスタンパク質内のロイシンジッパードメインは、タンパク質のトランスメンブラン領域の近くにあり;ロイシンジッパードメインが融合形成タンパク質のオリゴマー構造に寄与しうることを示唆した。融合形成ウイルスタンパク質のオリゴマー化は、融合ポア形成に関与する(Spruceら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88,3523,1991)。また、ロイシンジッパードメインは、熱ショック転写因子のオリゴマー化に役割を演ずることが、最近報告された(Rabindranら、Science,259,230、199
3)。
【0024】
ロイシンジッパードメインは、短いパラレルコイルドコイル(平行高次コイル)として巻かれている(O’Sheaら、Science,254,539、1991)。パラレルコイルドコイルの一般的組み立ては、良く特徴が調べられており、1953年にCrick(Acta Crystallogr.6,689)によって提案されたような「ノブと穴(knobs-into-holes)」パッキングを持つ(Acta Crystallogr,6,689)。ロイシンジッパードメインによって形成されたダイマーは、McLachlanおよびStewart(J.Mol.Biol..98.293、1975)の表記法に従って、(abcdefg)(式中、残基aおよびdはヘリックスの同じ面上に整列する概ね疎水性の残基であり、dはロイシンである)で表される7つの繰り返しによって安定化されている。一般に位置gおよびeには、反対にチャージした残基が存在している。従って、2つのヘリカルロイシンジッパードメインから形成されたパラレルコイルドコイル内では、第一のヘリックスの疎水性側鎖によって形成される「ノブ」は、第二のヘリックスの側鎖の間に形成される「穴」の中に詰め込まれている。
【0025】
位置dのロイシン残基は、大きな疎水性安定化エネルギーを提供し、ダイマー形成に重要である(Krystekら、Int.J.Peptide Res.,38,229、1991)。Lovejoyらは、最近、ヘリックスがアップ−アップ−ダウンに走る三本鎖α−らせん束の合成について、報告している(Science,259,1288、1993)。これらの研究から疎水性安定化エネルギーは、らせんモノマーからコイルドコイルを形成するための主な駆動力を提供することが、確認された。また、これらの研究は、静電的相互作用がコイルドコイルの化学量論および幾何に寄与することを、示している。
【0026】
保存的なアミノ酸により、個々のロイシン残基のそれぞれを、ダイマー化する能力の減少を最少に維持しつつ置換できるが;複数の変化は通常この能力を失う結果となることが、いくつかの研究から示された(Landshulzら、Science,243,1681、1989;TurnerおよびTjian、Science,243,1689、1989;Huら、Science,250,1400、1990)。van Heekerenらは、GCN4のロイシンジッパー内では異なる数多くのアミノ酸をロイシン残基の代わりに置換することができ、さらに2つのロイシン置換を含むいくつかのGCN4タンパク質は弱い活性を持つことが分かった、と報告した(Nucl.Acids Res.,20,3721、1992)。麻疹ウイルス融合タンパク質(the measles virus fusion protein)(MVF)のロイシンジッパードメインの第一および第二の7つのロイシンの変異は、シンシチウムの形成(ウイルスが誘導する細胞融合の指標である)に影響を与えなかったが;4つのロイシン残基のすべてを変異すると、融合は完全に妨害された(Bucklandら、J.Gen.Virol.,73,1703、1992)。変異は、いずれもテトラマーを形成するMVFの能力に影響を与えなかった。
【0027】
GCN4ロイシンジッパードメインを表す合成ペプチドのaおよびd残基のアミノ酸を置換すると、ロイシンジッパードメインのオリゴマー化特性が変化することが分かった(Alber、Sixth Symposium of the Protein Society,San Diego,CA)。位置aのすべての残基をイソロイシンに変えても、ロイシンジッパーは、依然としてパラレルダイマーを形成する。この変化に加えて、位置dのすべてのロイシン残基をイソロイシンに変えると、得られたペプチドは、溶液中でトリマー化したパラレルコイルドコイルを自発的に形成する。位置dのすべてのアミノ酸をイソロイシンに、そして位置aの全アミノ酸をロイシンに置換すると、その結果、テトラマー化したペプチドが生じた。これらの置換を含むペプチドも、なお、ロイシンジッパードメインと呼ばれる。
【0028】
また、本発明の範囲内には、RANKの細胞内ドメインのフラグメントまたは誘導体も含まれる。そのようなフラグメントは、ここに記載された任意の技術によって調製され、配列番号5に示したようなRANKまたは配列番号15に示したようなネズミのRANKの細胞質ドメインと同一のペプチドおよびそれらの細胞質領域の一部分を含むペプチドを含む。また、可溶型の調製に用いられるすべての技術を、細胞質ドメインのフラグメントまたは類似体の調製に用いることができる(即ち、先端切除型を調製するためのRT−PCR技術または選択された制限酵素の使用)。細胞質内ドメインのすべてまたはフラグメントをコードするDNAは、例えば本明細書中に記載された免疫沈降技術または酵母2−ハイブリッドシステムのようなその他の技術(Rotheら、上記)を用いると、RANKシグナル化と関連するその他のタンパク質を同定するために有用であろう。
【0029】
また、本発明は、関連する天然型グリコシル化を持つまたは持たないRANKを含む。酵母または哺乳動物発現システム、例えばCOS−7細胞、で発現させたタンパク質は、発現システムによって、天然分子よりも分子量およびグリコシル化型が類似しているかまたはわずかに異なるであろう。大腸菌のような細菌内での本発明のタンパク質をコードするDNAsの発現は、グリコシル化されていない分子を提供する。不活性化されたN−グリコシル化部位を持つRANKタンパク質の機能的変異類似体は、オリゴヌクレオチドの合成および連結によって、または部位特異的変異技術によって、作り出すことができる。これらの類似体タンパク質は、酵母発現システムを用いて、良い収率で、均一で少なく炭水化物化された型として作り出すことができる。真核生物タンパク質内のN−グリコシル化部位は、アミノ酸トリプレットAsn−A−Z(式中、A1はProを除く任意のア
ミノ酸であり、そしてZはSerまたはThrである)を特徴とする。この配列では、アスパラギンが炭水化物に共有結合付加する側鎖アミノ基を提供する。そのような部位は、Asnまたは残基Zをその他のアミノ酸で置換する、AsnまたはZを欠失させる、またはAおよびZの間にZでないアミノ酸を、あるいはAsnおよびAの間にAsn以外のアミノ酸を挿入することによって、消去することができる。
【0030】
また、未変性のRANKまたはそのサブユニットを変異させることによって、RANKタンパク質誘導体を得ることもできる。ここに示されるように、RANK変異タンパク質は、それぞれ、未変性のRANKタンパク質に相同なポリペプチドであるが、一つのあるいは複数の欠失、挿入または置換故に、未変性のタンパク質とは異なるアミノ酸配列を持っている。変異ペプチドをコードするDNAで作り出された任意の変異の影響は、変異ペプチドが特異的様式でその相手構造と結合する能力を分析することによって、容易に測定することができる。さらに、RANK類似体、ムテインまたは誘導体の活性は、本明細書中に記載された任意のアッセイ(例えば、転写を活性化するRANKの能力の阻害)によって測定することができる。
【0031】
本発明のタンパク質の類似体は、例えば、残基あるいは配列の様々な置換を作り出す、または末端あるいは内部残基あるいは生物学的活性に必要でない配列を欠失させる、ことによって構築することができる。例えば、システイン残基を欠失させるかまたはその他のタンパク質で置き換えると、復元時の不適切な細胞内ジスルフィド架橋の形成を防ぐことができる。突然変異誘発へのその他のアプローチには、KEX2プロテアーゼ活性が存在する酵母システムでの発現を強化する隣接する二塩基性アミノ酸残基の修飾が含まれる。
【0032】
欠失または挿入ストラテジーを採用する場合、生物学的活性への欠失または挿入の潜在的影響を考慮しなければならない。本発明のタンパク質のサブユニットは、末端あるいは内部の残基または配列を欠失することによって、構築することができる。RANKの可溶型は、容易に調製され、RANK誘導NF−κB活性化を阻害するそれらの能力について試験することができる。細胞質領域に相当するポリペプチドおよびそのフラグメント[例
えばデスドメイン(death domein)]を類似の技術によって調製することができる。作り出すことのできる変異の型に関してのさらなるガイダンスは、RANK配列を類似の構造を持つタンパク質と比較することによって、ならびに本発明のRANKタンパク質の構造的分析を行うことによって、提供される。
【0033】
一般的に、置換は、保守的に行われるべきである;即ち、最も好ましい置換アミノ酸は、RANKの生物学的活性に影響を与えないそれらである(即ち実質上等価な様式で相当する天然のタンパク質に対する抗体と結合する本発明のタンパク質の能力、実質上同様の様式で未変性タンパク質のような相手構造を結合する能力、RANKシグナルを伝達する能力、または例として一過性トランスフェクションシステム内で過剰発現時にNF−κB活性を誘導する能力)。保守的置換の例としては、結合ドメイン(細胞外ドメインのリガンド/レセプターあるいは抗体のいずれかの結合領域、またはその他と相互作用する領域、細胞質ドメインの細胞内タンパク質)の外側のアミノ酸置換、ならびに、天然タンパク質の二次および/または三次構造を変化させないアミノ酸の置換、が含まれる。さらなる例としては、一つの脂肪族残基をIle、Val、LeuまたはAlaのようなその他の残基と、互いに置換すること、またはLysおよびArg;GluおよびAsp;またはGlnおよびAsn間のように、一つの極性残基ともう一つの極性残基との置換、が含まれる。その他のそのような保守的置換、例えば類似の疎水性特性を持つ領域全体の置換、もまた良く知られている。
【0034】
類似体タンパク質またはそのフラグメントの発現のために構築されるヌクレオチド配列の変異は、もちろん、コード配列のリーディングフレーム相を保存しなければならず、好ましくは、ハイブリダイズしてmRNAの翻訳に逆影響を与えるループまたはヘアピンのようなmRNAの二次構造を作り出す可能性がある相補領域を含まないであろう。
【0035】
RANKタンパク質またはそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列の変異のすべてが最終生成物に現れるとは限らない、例えば、発現を強めるように、主に転写されたmRNAの二次構造ループを防ぐように(EPA75,444A、ここに参照として採用する、を参照のこと)、または選択された宿主によってより容易に翻訳されるコドン、例えば大腸菌で発現させるための周知の大腸菌優先コドン、を提供するように、ヌクレオチド置換を作り出すことができる。
【0036】
変異部位を前もって決めることができるが、変異の種類それ自体を前もって決める必要はない。例えば、最適な特性を持つ変異体を選択するためには、ランダム変異誘発を行い、そして発現した変異タンパク質を好ましい活性についてスクリーニングすることができる。天然配列のフラグメントとの連結を可能にする制限部位に隣接させて、変異体配列を含むオリゴヌクレオチドを合成することによって、特定の座に変異を導入することができる。連結の後、得られた再構築配列は、好ましいアミノ酸の挿入、置換または欠失を含む類似体をコードする。
【0037】
代わりに、オリゴヌクレオチドへの部位特異的変異誘発法を用いて、要求される置換、欠失または挿入に従って変化した特定のコドンを持つ変化した遺伝子を提供することもできる。上記の変化を作り出す例示的方法は、Walderら(Gene,42,133、1986);Bauerら(Gene,37,73、1985);Craik(BioTechniques,12−19、1985年1月);Smithら(Genetic Engineering:Princeples and Methods,Plenum Presss、1981);ならびに合衆国特許第4,518,584号および第4,737,462号に開示されており、ここに参照として採用される。
【0038】
本発明のタンパク質のその他の実施態様には、中程度のストリンジェント条件下(5x
SSC、0.5%SDS、1.0mM EDTA、pH8.0の前洗浄溶液、50℃、5xSSC、一晩のハイブリダイゼーション条件)で配列番号6のDNAに、RANKをコードするDNA配列に、またはより好ましくはストリンジェント条件下(例えば6xSSC、63℃で一晩ハイブリダイゼーション、3xSSC、55℃で洗浄)でハイブリダイズする能力を持つDNAによってコードされるRANKポリペプチド、およびそれらのRANKをコードするその他の縮重配列を含む。一つの実施態様では、RANKポリペプチドは、配列番号5に示した天然型RANKタンパク質のアミノ酸配列に、アミノ酸配列で少なくとも約70%同一である。好ましい実施態様では、RANKポリペプチドは、RANKの天然型とアミノ酸配列で少なくとも約80%同一であり;最も好ましいポリペプチドは、天然型RANKと少なくとも約90%同一であるそれらである。
【0039】
同一性の割合を、コンピュータープログラム、例えばDevereuxら(Nucl,Acids Res.,12,387、1984)に記載されておりウイスコンシン大学の遺伝子コンピューターグループ(the University of Wisconsin Genetics Computer Group)(UWGCG)より入手可能なGAPコンピュータープログラム、を用いて決定することができる。RANKタンパク質から誘導されたフラグメントでは、フラグメント内に存在するRANKタンパク質該当部分をもとにして同一性を計算する。
【0040】
RANK類似体またはムテインの生物学的活性は、転写の活性化を阻害する類似体またはムテインの能力を、例えば本明細書中の実施例に記載した方法に従って、試験することによって、測定することができる。代わりの方法として、天然型RANKと結合する抗体または可溶型RANKLを用いた適当なアッセイ、例えば酵素イムノアッセイまたはドットブロットを用いると、RANK類似体またはムテインの活性を評価することができ、さらには、RANKLを発現する細胞を用いてアッセイをしてもよい。また、適当なアッセイには、例えば、シグナル伝達アッセイが含まれ、シグナル伝達に関与するその他の細胞内タンパク質(即ちTRAF2および3)と関連するRANKの細胞質領域の能力を評価する方法もまた、RANK類似体またはムテインの活性の評価に有用であろう。そのような方法は、この技術分野では周知である。
【0041】
RANKヌクレオチド配列のフラグメントもまた有用である。一つの実施態様では、そのようなフラグメントは、本明細書中に開示された少なくとも約17の連続的ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約25のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも30の連続ヌクレオチドのRANK DNAを含む。そのようなフラグメントのDNAおよびRNA相補体を、配列番号5の一本鎖型および二本鎖型の両方のRANK DNA、および前述のポリペプチドをコードするそれらと共に、ここに提供する。一般的には、RANK DNAのフラグメントは、少なくとも約17ヌクレオチド、好ましくは約17から約30のヌクレオチドを含む。そのような核酸フラグメント(例えばRANKの細胞外ドメインに相当するプローブ)が、ポリメラーゼ鎖反応(PCR)中でプローブとしてまたはプライマーとして用いられる。
【0042】
また、プローブは、インビトロアッセイでのRANK核酸の存在の検出に、およびノーザンおよびサザンブロットのような方法に、用いられることが分かる。RANKを発現する細胞型もまた、同定することができる。そのような方法は周知であり、当業者らは、特別に計画された適用によって、適当な長さのプローブを選ぶことができる。PCRでは、所望のRANK DNA配列の末端に相当する5’および3’プライマーが、慣用の技術を用いて、その配列を増幅するために用いられる。
【0043】
RANK核酸のその他の有用なフラグメントは、標的RANK mRNA(センス)またはRANK DNA(アンチセンス)配列と結合する能力を持つ一本鎖の核酸配列(RNAまたはDNAのいずれか)を含むアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドであ
る。与えられたタンパク質のcDNA配列に基づいて、アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドを作り出す技術は、例えば、SteinおよびCohen、Cancer Res.,48,2659、1988およびvan der Krolら、BioTechniques,6,958、1988に記載されている。
【0044】
DNA、タンパク質および類似体の用途
本明細書中に記載のRANK DNAs、タンパク質および類似体は、医薬組成物の製造を含む、数多くの用途を持つであろう。例えば、可溶型RANKは、RANK仲介NF−κB活性化のアンタゴニストとして、ならびにRANKを通してのシグナルの伝達を阻害するために、有用であろう。RANK組成物(タンパク質およびDNAの両方)もまた、RANKへのアゴニストおよびアンタゴニストの両方の抗体の開発に有用であろう。本発明のDNAsは、組換えタンパク質の発現に、そしてRANK転写物の存在あるいは分布の(量的または質的のいずれかの)分析のためのプローブとして、有用である。
【0045】
また、本発明のタンパク質は、例えば患者検体内で、可溶性RANKまたはRANKLを検出する、またはRANK関連活性をモニターするために用いられるキットの調製に有用であろう。また、RANKタンパク質には、この活性のアンタゴニストまたは擬態(mimetic)をスクリーニングする場合に必要であるような、その他のサンプルまたは組成物(例えば相互作用をそれぞれに阻害または擬態するペプチドまたは小分子)のRANK関連活性をモニターする用途も、見出されるであろう。様々なアッセイフォーマットは、(限定するわけではないが)ELISA、ドットブロット、(バイオセンサーを用いるそれらのような)固相結合アッセイ、ラピッドフォーマットアッセイ、およびバイオアッセイを含む、そのようなキットに有用である。
【0046】
本発明に従って精製されたRANKは、RANK阻害剤、従って(NF−κB活性化の阻害を通しての)炎症性応答の阻害剤の発見を容易にするであろう。潜在的阻害剤のスクリーニングに精製RANKポリペプチドを用いることは重要であり、混入物により反応が妨害される可能性を事実上排除することができる。そのようなスクリーニングアッセイには、RANKの細胞外ドメイン、細胞内ドメインまたはこれらポリペプチドのいずれかのフラグメントのいずれかを用いることができる。典型的には、分子の阻害活性の検出には、RANKを結合し、そして例えばアゴニスト抗体あるいはRANKLの結合を阻害する能力を持つ分子を検出するためのスクリーニングアッセイには細胞外ドメインから誘導された可溶型RANKを用いること、またはRANKとその他のシグナル伝達に関与する細胞内タンパク質との相互作用の阻害を検出するためのアッセイには細胞内ドメインから誘導されたポリペプチドを用いること、が含まれるであろう。
【0047】
さらに、インビトロでのシステムは、RANK活性に拮抗または作動する分子の能力を確認するために用いることもできる。その様な方法に含まれるのは、RANKキメラ、例えば既知のリガンドを持つタンパク質から誘導されたRANK細胞内ドメインおよび細胞外ドメインのキメラ、の使用である。様々な分子のシグナル伝達への影響を、シグナルを伝達する既知のリガンドを用いることによって、モニターすることができる。
【0048】
さらに、RANKポリペプチドはまた、RANK阻害剤の構造を基本とする設計に用いることができる。そのような構造を基本とする設計もまた、「合理的薬剤設計」として知られている。RANKポリペプチドを、例えばX線結晶学、核磁気共鳴または相同性モデル化(そのすべては周知の方法である)によって三次元的に分析することができる。阻害剤設計を助ける分子モデル化ソフトウェアシステムでのRANK構造情報の使用もまた、本発明の内にある。そのようなコンピューターを用いたモデル化および薬剤設計は、化学的配座分析、分子のエレクトロスタティックポテンシャル、タンパク質の折り畳みのような情報を用いることができる。本発明の特別な方法は、基質の有望な結合部位についての
RANKの三次元構造の分析、予想される反応部位を持つ新規分子の合成、および上記のような新規分子のアッセイを含む。
【0049】
組換えRANKの発現
本発明のタンパク質は、RANKタンパク質およびその類似体をコードするDNA配列を組み換え発現ベクター内に挿入し、そして発現を促進する条件下、組換え体発現システムでDNA配列を発現することによる、組換え型DNA法によって作成するのが好ましい。本発明によって提供されるタンパク質をコードするDNA配列を、cDNAフラグメントおよび短いオリゴヌクレオチドリンカーから、または一連のオリゴヌクレオチドから組み立てると、組換え発現ベクター内に挿入され組換え転写ユニット内で発現する能力を持つ合成遺伝子を提供することができる。
【0050】
組換え発現ベクターは、哺乳動物、微生物、ウイルスまたは昆虫の遺伝子から誘導された適当な転写または翻訳調節エレメントに機能できるように連結された、RANK、または相同体、ムテインまたはその生物学的に等価な類似体、をコードする合成またはcDNA由来のDNAフラグメントを含む。そのような調節エレメントは、転写プロモーター、転写を調節するための所望のオペレーター配列、適当なmRNAリボソーム結合部位をコードする配列、および転写および翻訳の終止を調節する配列が含まれ、以下にその詳細を記載する。さらに通常複製開始点によって提供される宿主内で複製する能力および形質転換体の認識を容易にする選択遺伝子を、取り入れることができる。
【0051】
DNA領域が互いに機能的に関係する場合、それらは機能するように連結される。例えば、シグナルペプチド(分泌リーダー)用DNAが、もしポリペプチドの分泌に関係する前駆体として発現される場合は、それは、ポリペプチド用DNAと機能するように連結されていることを意味する;もしプロモーターが配列の転写を調節するならば、それはコード配列に機能する様に連結されている;またはもしリボソーム結合部位を適当な位置に置くことによって翻訳が可能になるならば、リボソーム結合部位はコード配列と機能するように連結されている。一般的に、「機能するように連結する」とは、連続的であることを、そして分泌リーダーの場合には連続的で且つリーディングフレーム内であることを意味する。微生物内で発現されるべきRANK、または相同体またはその類似体をコードするDNA配列は、好ましくは、mRNAへのDNAの転写を未熟なままに終結させるおそれがあるイントロンを含まないであろう。
【0052】
細菌での使用に有用な発現ベクターは、市販されている周知のクローニングベクターpBR322(ATCC37017)の遺伝子エレメントを含むプラスミドから誘導された、選択可能マーカーおよび細菌の複製開始点を含むことができる。そのような市販のベクターには、例えば、pKK223−3(Pharmacia Fine Chemicals,Uppsala,Sweden)およびpGEM1(Promega Biotec,Madison,WI,USA)が含まれる。これらのpBR322「骨格」部分を、適当なプロモーターおよび構造配列と結合して、発現させる。典型的には、大腸菌種から誘導されたプラスミドであるpBR322の誘導体を用いて、大腸菌を形質転換する(Bolivarら、Gene,2,95、1977)。pBR322は、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性遺伝子を含み、このことによって、形質転換された細胞を同定するための単純な手段が提供される。
【0053】
微生物の組換え発現ベクターに共通して用いられるプロモーターには、β−ラクタマーゼ(ペニシリナーゼ)およびラクトースプロモーターシステム(Changら、Nature、275,615、1978;およびGoeddelら、Nature,281,544、1979)、トリプトファン(trp)プロモーターシステム(Goeddelら、Nucl.Acids Res.,8,4057、1980;およびEPA36,776)ならびにtacプロモーター(Maniatis,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory、412頁、1982)が含まれる。特に有用な細菌の発現システムは、ファージλPプロモーターおよびc1857ts熱感受性レプレッサーを用いる。American Type Culture Collectionから入手できるλPL プロモーターの誘導体を採用したプラスミドベクターは、大腸菌JMB9株(ATCC37092)に常在するプラスミドpHUB2、および大腸菌RR1(ATCC53082)に常在するpPLc28を含む。
【0054】
酵母ベクターに適当なプロモーター配列には、メタロチオネイン、3−ホスホグリセレートキナーゼ(Hitzemanら、J.Biol.Chem.,255,2073、1980)またはエノラーゼ、グリセルアルデヒド−3−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホフラクトキナーゼ、グルコース−6−リン酸イソメラーゼ、3−ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼのような、その他の解糖系酵素(Hessら、J.Adv.Enzyme Reg.,7,149、1968;およびHollandら、Biochem.,17,4900、1978)のプロモーターが含まれる。さらに、酵母での発現に用いるに適当なベクターおよびプロモーターは、R.Hitzemanら、EPA73,657に記載されている。
【0055】
好ましい酵母ベクターは、大腸菌での分泌および複製用のpBR322からのDNA配列(amp遺伝子および複製開始点)、ならびにグルコース−抑制ADH2プロモーターおよびα−因子分泌リーダーを含む酵母のDNA配列を用いて、組み立てることができる。ADH2プロモーターは、Russellら(J.Biol.Chem.,258,2674、1982)およびBeierら(Nature,300,724、1982)に記載されている。酵母α−因子リーダーは、外来タンパク質の分泌に関係し、プロモーターと発現される構造遺伝子との間に挿入することができる。Kurjanら、Cell,30,933、1982;およびBitterら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81,5330、1984を参照のこと。リーダー配列を修飾して、その3’末端付近に、一つまたはそれより多くの有用な制限部位を含ませて、リーダー配列の外来遺伝子への融合を促進することもできる。
【0056】
脊椎動物細胞の形質転換に用いられる発現ベクター内の転写および翻訳調節配列を、ウイルス起源で提供することもできる。例えば、共通に用いられるプロモーターおよびエンハンサーは、ポリオーマ、アデノウイルス2、サルウイルス40(SV40)およびヒトのサイトメガロウイルスから誘導される。SV40ウイルスゲノム、例えばSV40開始点、早期および後期プロモーター、エンハンサー、スプライスおよびポリアデニル化部位、から誘導したDNA配列を用いて、外来DNA配列の発現に必要なその他の遺伝子エレメントを提供することもできる。早期および後期プロモーターは、その両方がSV40ウイルス複製開始点をも含むフラグメントとしてウイルスから容易に得られるため、特に有用である(Fiersら、Nature,273,113,1978)。ウイルス複製開始点内に位置するHindIII 部位からBglI部位に向かって伸びるおおよそ250bpの配列が含まれる限りにおいて、より小さいまたはより大きいSV40フラグメントもまた、用いることができる。さらに、そのようなコントロール配列が選択された宿主細胞に適合する限りにおいて、ウイルスゲノムプロモーター、コントロールおよび/またはシグナル配列を用いることもできる。例として、ベクターは、OkayamaおよびBerg(Mol.Cell Biol.,3,280,1983)に開示の方法に従って、構築することもできる。
【0057】
C127ネズミ乳房上皮細胞内での哺乳動物のレセプターcDNAsの安定な高レベル発現の有用なシステムは、実質上、Cosmanら、(Mol.Immunol.23,935、1986)に記載の方法に従って、構築することができる。RANK DNAを発現するための好ましい真核生物ベクターは、pDC406と呼ばれ(McMahanら、EMBO J.,10,2821、1991)、SV40、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、およびエプステイン−バールウイルス(Epstein-Barr virus)(EBV)から誘導された調節配列を含む。その他の好ましいベクターには、pDC406から誘導された、pDC409およびpDC410が含まれる。pDC410は、EBV複製開始点をSV40ラージT抗原をコードする配列で置換することによってpDC406から誘導された。pDC409は、マルチプルクローニング部位の外側のBglII制限部位を欠失させて、マルチプルクローニング部位内に唯一のBglII部位を作成した点でpDC406とは異なる。
【0058】
pDC406およびpDC409のような、EBV複製開始点を含む、発現ベクターのエピソームでの複製を可能にする有用な細胞系は、CV−1/EBNA(ATCC CRL10478)である。CV−1/EBNA細胞系は、エプスタイン−バーウイルスの核抗原−1(EBNA−1)をコードする遺伝子をCV−1細胞系にトランスフェクションすることによって誘導され、ヒトCMV即時−早期エンハンサー/プロモーターから誘導されたEBNA−1を構成的に発現する。
【0059】
宿主細胞
形質転換された宿主細胞は、組換えDNA技術用いて構築し、本発明のタンパク質をコードする配列を含む、発現ベクターで形質転換されるかまたはトランスフェクトされた細胞である。形質転換された宿主細胞は、所望のタンパク質(RANKまたはその相同体あるいは類似体)を発現することができるが、本発明のDNAをクローニングするかまたは増幅する目的で形質転換された宿主細胞は、タンパク質を発現する必要がない。発現したタンパク質は、好ましくは、選択されたDNAによって、培養上清内に分泌されるであろうが、細胞膜内に留め置くことも可能であろう。
【0060】
タンパク質の発現に適当な宿主細胞には、適当なプロモーター調節下の、原核生物、酵母またはより高等の真核生物が含まれる。原核生物には、グラム(−)またはグラム(+)の生物体、例えば大腸菌またはバシラス属、が含まれる。より高等な真核細胞には、以下に記載したような哺乳動物起源の確立された細胞系が含まれる。また、無細胞翻訳システムを用いて、本明細書中に開示されたDNA構築物から誘導されたRNAを用いて、タンパク質を生成することもできる。細菌、真菌、酵母および哺乳動物細胞宿主での使用に適当なクローニングおよび発現ベクターは、Pouwelsら(Cloning Vector;A Laboratory Manual,Elsevier,New York、1985)に記載されており、その関連開示はここに参照として採用される。
【0061】
原核生物発現宿主を用いて、広範囲のタンパク質分解およびジスルフィドプロセシングを必要としない、RANKまたはその同族体あるいは類似体の発現させることができる。原核生物発現ベクターは、一般的には、一つまたはそれより多くの表現型選択可能マーカー、例えば抗生物質耐性を授与するかまたは独立栄養要求性を与えるタンパク質をコードする遺伝子、および宿主内での増幅を確立するための宿主によって認識される複製開始点、が含まれる。形質転換に適当な原核生物宿主には、大腸菌、枯草菌、ネズミチフス菌、およびシュードモナス、ストレプトマイセスおよびスタフィロコッカスの属内の様々な種が含まれるが、その他もまた、選択次第で用いることができる。
【0062】
組換えRANKはまた、酵母宿主内で、好ましくは、S.cerevisiaeの様なサッカロミセス種から、発現させることができる。PichiaまたはKluyvero
mycesのような酵母のその他の属もまた、用いることができる。一般的には、酵母ベクターは、2μ酵母プラスミドからの複製開始点または自己複製配列(autonomously replicating sequence)(ARS)、プロモーター、タンパク質をコードするDNA、ポリアデニル化および転写終結のための配列、選択可能遺伝子を含むであろう。好ましくは、酵母ベクターは、複製開始点および酵母および大腸菌の両方の形質転換を可能にする選択可能マーカー(例えば大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子およびトリプトファン内で増殖する能力の欠如した酵母の変異株に選択マーカーを提供する、S.cerevisiae trp1遺伝子)ならびに下流の構造配列の転写を誘導するために高発現酵母遺伝子から誘導されたプロモーター、を含むであろう。次いで、酵母宿主細胞ゲノム内にtrp1障害を存在させておいて、トリプトファンの不在下での増殖によって形質転換を検出するための有効な環境を提供する。
【0063】
適当な酵母形質転換プロトコールは、当業者らに既知であり;例示的技術は、Hinnenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75,1929、1978に記載されおり、0,67%の酵母窒素塩基、0.5%カザミノ酸、2%グルコース、10μg/mlのアデニンおよび20μg/mlのウラシルからなる選択培地内でtrp形質転換株について選択される。ADH2プロモーターを含むベクターによって形質転換された宿主株を、80μg/mlのアデニンおよび80μg/mlのウラシルを補足した1%酵母エキス、2%ペプトンおよび1%グルコースからなる豊富培地内での発現用に増殖させることができる。ADH2プロモーターの抑制解除は、培地グルコースの涸渇時に起こる。酵母の粗上清をろ過によって集め、さらに精製する迄、4℃に保つ。
【0064】
様々な哺乳動物または昆虫細胞培養システムを用いて、組換えタンパク質を発現することができる。昆虫細胞内で外来タンパク質を生成するためのバキュロウイルスシステムは、LuckowおよびSummers,Bio/Technology,6,47(1988)によって論評されている。適当な哺乳動物宿主細胞系の例としては、Gluzman,Cell,23,175,1981に記載されているサル腎臓細胞のCOS−7系、例えば、CV−1/EBNA(ATCC CRL10478)、L細胞、C127、3T3、チャイニーズハムスターの卵巣(CHO)、HeLaおよびBHK細胞系を含む適当なベクターを発現する能力を持つその他の細胞系が含まれる。哺乳動物発現ベクターは、複製開始点、発現される遺伝子に連結された適当なプロモーターおよびエンハンサーならびにその他の5’または3’フランキング非転写配列のような非転写エレメント、ならびに、必須のリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位および転写終止配列のような、5’または3’非翻訳配列を含むことができる。
【0065】
組換えRANKの精製
本発明のDNAの組換え翻訳生成物を発現する適当な宿主/ベクターシステムを培養し、次いで培養液または細胞抽出物を精製することにより、精製RANKおよびその同族体あるいは類似体を調製する。例えば、最初に、培養液中に組み換えタンパク質を分泌するシステムからの上清を、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばAmiconまたはMillipore Pelliconの限外ろ過ユニット、を用いて濃縮することができる。
【0066】
濃縮段階に次いで、濃縮物を適当な精製マトリックスにかけることができる。例えば、適当なアフィニティーマトリックスは、適当な支持体に結合した相手構造のタンパク質またはレシチンあるいは抗体分子を含むことができる。代わりに、アニオン変換樹脂、例えば、ジエチルアミノエチル(DEAE)付属基を持つマトリックスまたは基質を、用いることもできる。マトリックスは、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロースまたはタンパク質精製に通常用いられるその他の型であることができる。代わりに、カチオン交換工程を用いることもできる。適当なカチオン交換体には、スルホプロピルまた
はカルボキシメシル基を含む様々な不溶性マトリックスが含まれる。スルホプロピル基が好ましい。ゲルろ過クロマトグラフィーもまた、本発明のタンパク質の精製手段として提供される。
【0067】
アフィニティークロマトグラフィーは、RANKおよびその同族体の精製に特に好ましい方法である。例えば、イムノグロブリンFc領域を含む融合タンパク質として発現するRANKを、プロテインAまたはプロテインGアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製することができる。さらに、オリゴマー化ジッパードメインを含むRANKタンパク質を、オリゴマー化ジッパードメインに特異的な抗体を含む樹脂上で精製することができる。RANKタンパク質に対するモノクローナル抗体もまた、この技術分野で周知の方法を用いることによって、アフィニティークロマトグラフィー精製に有用であろう。リガンドもまた、RANKのアフィニティー精製のアフィニティーマトリックスの調製に用いることができる。
【0068】
最終的に、疎水性RP−HPLC媒体、例えばメチルまたはその他の脂肪族の付属基を持つシリカゲル、を用いる一つまたはそれより多くの逆相−高速液体クロマトグラフィー(RP−HPLC)段階を、RANK組成物のさらなる精製に用いることができる。また、前述の精製段階のいくつかまたはすべてを、様々に組み合わせて用いて、均一な組換えタンパク質を提供することができる。
【0069】
通常、細胞培養物内に生成した組換えタンパク質は、最初に細胞ペレットから抽出し、次いで一回またはそれより多くの濃縮、塩析、水性イオン交換またはサイズ排除クロマトグラフィー段階によって、単離される。最後に、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を最終精製段階として用いることができる。組換えタンパク質発現に用いられる微生物細胞は、凍結−解凍の繰り返し、音波処理、機械的崩壊、または細胞溶解剤の使用を含む、任意の慣用の方法で崩壊させることができる。
【0070】
分泌タンパク質として本発明のタンパク質を発現する酵母の発酵は、精製が非常に単純である。大規模発酵から得られた分泌組換えタンパク質を、Urdalら(J.Chromatog.296,171、1984)によって開示されたそれらに類似の方法によって精製することができる。この文献は、調製用HPLCカラムでヒト組換えGM−CSFを精製するために逆相HPLCを二度連続して行う段階について、記載している。
【0071】
組換え培養物内で合成されたタンパク質に関して、タンパク質を含めて混在する細胞成分の量および性質について調べるが、それは培養物からの本発明のタンパク質の回収に用いられた精製段階に依存する。これらの成分は、通常は、酵母、原核生物または非ヒト高等真核生物の起源のものであり、好ましくは、約1重量%より少ないオーダーの無害の量の混入物として存在する。さらに、組換え細胞培養物は、もとの動物種に天然に見出される、通常は該タンパク質と関連するその他のタンパク質を含まない本発明のタンパク質の生成を可能にする。
【0072】
RANK組成物の用途および投与
本発明は、有効量のタンパク質および適当な希釈剤およびキャリヤーを含む治療組成物を用いる方法、ならびに免疫応答または炎症応答を調節する方法を提供する。可溶性サイトカインレセプターあるいはサイトカインまたはその他の免疫調節分子と一緒にRANKを用いることもまた、計画されている。
【0073】
治療的使用では、適応症に適当な様式で治療するために、精製タンパク質を患者、好ましくはヒト、に投与する。従って、例えば、免疫機能を調節するために投与されるRANKタンパク質組成物は、ボーラス注射、連続注入、インプラントからの持続的放出、また
はその他の適当な技術によって、与えることができる。典型的には、治療薬剤は、生理的に許容しうるキャリヤー、補助剤または希釈剤と一緒に、精製されたRANKを含む組成物の形で、投与されるであろう。そのようなキャリヤーは、用いられる投与量および濃度では、宿主に無害であろう。
【0074】
通常、そのようなタンパク質組成物の調製は、バッファー、アスコルビン酸のような抗酸化剤、(約10残基より少ない)低分子量ポリペプチド、タンパク質、アミノ酸、グルコース、スクロースまたはデキストリンを含む炭水化物、EDTAのようなキレート剤、グルタチオンおよびその他の安定剤ならびに補助剤と、本発明のタンパク質を合わせることを必要とする。中性バッファー塩類溶液または同種の血清アルブミンと混合した塩類溶液は、適当な例示的希釈剤である。好ましくは、生成物は適当な補助溶液(例えばスクロース)を希釈剤として用いた、凍結乾燥物として調合される。適当な投与量は、試行後に決めることができる。投与の量および頻度は、もちろん、治療する症状の性質および程度、期待される応答、患者の状態などのようなそのような因子に依存するであろう。
【0075】
可溶型のRANKおよびアンタゴニスト的なモノクローナル抗体のようなその他のRANKアンタゴニストをRANKの誘導するNF−κB活性の誘導を阻害する目的で投与することができる。NF−κBは、細胞の免疫システムに広範囲に用いられている転写因子であり、炎症応答に役割を演ずる。このように、RANKによるシグナル伝達の阻害は、RANKによるシグナル伝達が好ましくない結果、例えば毒性あるいは敗血症性ショックまたは移植片−対−宿主反応、をもたらす様な状態の治療に有用であろう。また、それらは、細胞形質転換でのNF−κBの役割の妨害に有用であろう。そのようなNF−κBがブロックされる場合、腫瘍細胞は照射に対してより敏感であり、従って、可溶性RANK(またはRANKシグナル伝達のその他のアンタゴニスト)は、RANKを発現する新形成細胞を特徴とする疾病の補助療法として有用であろう。
【0076】
以下の実施例は、説明のため提供されており、本発明の制限を意図して提供されているものではない。当業者らは、実施例に記載された本発明からの変法を、特に本明細書中に引用された様々な参考文献の教え、参考文献によって採用された開示にかんがみて、作り出すことができる。
【実施例】
【0077】
実施例1
本実施例は、TNFレセプタースーパーファミリーの新たな一員をコードするDNAの同定および単離について説明している。CD40(B細胞の増殖および分化に重要な役割を演ずることが示されたヒトの正常および新形成の両B細胞の表面上に存在する細胞表面抗原;Stamenkovicら、EMBO J.,8,1403、1989)とある種の類似性を持ち、予想されるオープンリーディングフレームを持つ部分的cDNA挿入物を、ヒト骨髄誘導樹状突起細胞(DC)から生成したcDNAからの配列情報を含むデータベースで同定した。挿入物を、制限エンドヌクレアーゼ消化によりベクターから切り出し、ゲル精製し、32Pで標識化し、そして高いストリンジェンシーでのハイブリダイゼーションおよび洗浄技術(5xSSC、50%ホルムアミド中、42℃で一晩、ハイブリダイゼーション;63℃、0.5xSSC中で洗浄)を用いて、より大きいcDNA挿入物を含むDC cDNAライブラリーから作成したコロニーブロットとのハイブリダイズに使用した;その他の適当な高ストリンジェンシー条件は、Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第2版(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY;1989)、9.52−9.55に開示されている。最初の実験では、9D−8A(配列番号1)と名付けられたクローンが得られ;続いて行われた分析では、このクローンが5’末端の一番端を除いて新規cDNAの全体を含むことが示され、5’末端には予想されるイントロン配列(配列番号1のヌクレオチド1−92)を有していた。さらなるコロニーハイブリダイゼーションを行い、第二のクローンを単離した。9D−15C(配列番号3)と名付けられた第二のクローンは、イントロン介在のない5’末端を含むが3’末端全体は含まなかった。配列番号5は、配列番号1および3のオーバーラッピング配列のアライメントに基づいた予想される全長のタンパク質のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示している。
【0078】
コードされているタンパク質は、NF−κBのレセプター活性化物質であるため、RANKと名付けられた。cDNAは、予想される24のアミノ酸シグナル配列(コンピューター予想の切断部位はLeu24の後である)、188アミノ酸の細胞外ドメイン、21アミノ酸のトランスメンブランドメイン、および383アミノ酸の細胞質尾部を持つ、616アミノ酸残基を持つ予想されるI型トランスメンブランタンパク質をコードする。RANKの細胞外領域は、CD40と有意のアミノ酸相同性(38.5%の同一性、52.3%の類似性)を示した。ヒトのRANK配列を含むクローニングベクター(pBluescriptSK)は、pBluescript:huRANK(大腸菌DH10B内)と名付けられ、ブダペスト条約の条件下でAmerican Type Culture Collection,Rockville,MD(ATCC)に1996年12月20日に寄託された(寄託番号98285)。
【0079】
実施例2
本実施例は、RANK/Fc融合タンパク質を発現するRANK DNA構築物の構築について説明している。ヒトIgG1のFc領域に融合した可溶型RANKを、哺乳動物発現ベクターpDC409(USSN08/571,579)内に構築した。この発現ベクターは、サイトメガロウイルス(CMV)オープンリーディングフレームR27080(配列番号9)のリーダー配列、次にRANKのアミノ酸33−213、次にFcレセプターに対してアフィニティーの減少を示すヒトIgGの定常ドメインの変異型(配列番号8;融合タンパク質として、構築物のFc部分は、Arg3からLys232からなる)をコードする。また、RANKのアミノ酸1−213(天然のリーダー配列を用いる)次いでIgGムテインを含む、代わりの発現ベクターを、調製した。両発現ベクターは、形質転換細胞内でRANK/Fc融合タンパク質の高レベル発現を誘導することが分かった。
【0080】
RANK/Fcタンパク質を得るために、RANK/Fc発現プラスミドをCV−1/EBNA細胞内にトランスフェクトし、上清を約一週間集めた。RANK/Fc融合タンパク質を、Fc融合タンパク質を精製するためのこの技術分野で周知の手段、例えば製造者(即ち、Pharmacia,Uppsala,Sweden)らの指示書に従ってプロテインAセファロースカラムクロマトグラフィーによって、精製する。SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析から、精製されたRANK/Fcタンパク質は、還元剤存在下では〜55kDaの分子量、に、そして還元剤不在下では〜110kDaの分子量で移動した。
【0081】
CMV R27080リーダーを用いて作成された精製タンパク質のN−末端アミノ酸のシークエンシングは、Ala20の後ろで60%の切断、Pro22の後ろで20%の切断、Arg28の後ろで20%の切断(これらはフューリン(Furin)切断部位であり
、アミノ酸残基は配列番号9に相当する)を示し;天然リーダーを伴って発現した融合タンパク質のN−末端アミノ酸分析は、Gln25の後に顕著な切断を示した(Glu25の後ろでは80%、Arg23の後ろでは、20%、アミノ酸残基は、全長のRANKである配列番号6に相当する)。両方の融合タンパク質は、特異的様式でRANKのリガンドを結合することができ(即ち、それらはネズミ胸腺腫細胞系であるEL4のような様々な細胞系の表面に結合した)、RANKのN−末端へのさらなるアミノ酸の存在がRAN
KLと結合するその能力を妨害しないことが示された。さらに、CMVリーダーを含む構築物は、アミノ酸33で始まるRANKをコードし、Arg23およびPro33を含めてその間のアミノ酸をN−末端として持つRANKペプチドは、特異的様式でRANKのリガンドを結合する能力があると期待される。
【0082】
TNFレセプタースーパーファミリーのその他の構成員は、トランスメンブランドメインおよびリガンド結合ドメインの間に「スペーサー」領域と呼ばれるアミノ酸領域を持つが、それはリガンドの結合に必須ではない。RANKでは、196と213の間のアミノ酸は、そのようなスペーサー領域を形成すると予想される。従って、この領域内のアミノ酸で終止する可溶型RANKは、特異的様式でRANKのリガンドと結合する能力を残していると期待される。可溶性RANKペプチドの好ましいC−末端アミノ酸は、配列番号6のアミノ酸213および196からなる群から選択されるが、スペーサー領域内のその他のアミノ酸をc−末端として用いることもできる。
【0083】
実施例3
本実施例は、RANKに対するモノクローナル抗体の調製について説明している。例えば、精製された組換えRANKの調製物、または高レベルのRANKを発現するトランスフェクトされた細胞を用いて、合衆国特許第4,411,993号に開示された技術のような慣用の技術を用いて、RANKに対するモノクローナル抗体を作り出す。また、RANKをコードするDNAを、免疫原として、例えば、PardollおよびBeckerleg、Immunity,3,165、1995に論評されている方法に従って、用いることができる。そのような抗体は、RANKによって誘導されるシグナルの妨害に(アンタゴニストまたはブロッキング抗体)、またはRANKあるいはRANK活性についての診断アッセイまたは研究アッセイの成分としての、架橋RANK(アンタゴニスト抗体)によるシグナルの誘導に、またはRANKのアフィニティー精製に、有用であると考えられる。
【0084】
齧歯類を免疫化するために、RANK免疫原を、[完全または不完全なフロイントアジュバント、ミョウバン、または、RibiアジュバントR700(Ribi,Hamilton,MT)のようなそれ以外のアジュバントのような]アジュバント内に乳化し、10−100μgの範囲の量を選択された齧歯類、例えばBALB/cマウスあるいはLewisラット内に、皮下注射する。DNAを、皮内(Razら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91,9519、1994)または筋肉内(Wangら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90,4156、1993)に投与することができ;食塩水は、DNAを基本とした抗原の適当な希釈剤であることが分かった。10日から3週間後、免疫化された動物をさらなる免疫原で追加免疫化し、そしてその後も毎週、隔週、または3週間毎の免疫化スケジュールで、その後も定期的に追加免疫化する。
【0085】
血清サンプルを、ドット−ブロットアッセイ(抗体サンドイッチ)、ELISA(酵素連結イムノソルベントアッセイ)、免疫沈降、またはFACS分析を含むその他の適当なアッセイによる試験のために、眼窩後部採血または尾先端切除により定期的に採取する。適当な抗体力価を検出した後、陽性動物に食塩水中の抗原を静脈内注射する。3−4日後、動物を屠殺し、脾臓細胞を収集し、そしてネズミのミエローマ細胞系[例えば、NS1または好ましくはAg8.653(ATCC CRL1580)]と融合させる。この方法によって作り出されたハイブリドーマ細胞系を選択培地(例えば、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンまたはHATを含む培地)を含む複数のミクロタイタープレート内に播いて、非融合細胞、ミエローマ−ミエローマハイブリッドおよび脾臓細胞−脾臓細胞ハイブリッドの増殖を止める。
【0086】
このようにして作り出されたハイブリドーマクローンは、例えば、Engvallら、Immunochem.,8,871、1971および合衆国特許第4,703,004号に開示された技術を適用することによって、RANKとの反応性をELISAによって、スクリーニングすることができる。好ましいスクリーング技術は、Beckmanら、J.Immunol.,144,4212、1990に記載された抗体捕獲技術である。次いで、陽性のクローンを同系の齧歯類の腹膜腔内に注射すると、高濃度(>1mg/ml)の抗−RANKモノクローナル抗体を含む腹水が生成される。得られたモノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム沈殿、次いでゲル排除クロマトグラフィーによって精製することができる。代わりに、RANKタンパク質への結合を基本にしたアフィニティークロマトグラフィーを用いることができ、同様に、プロテインAまたはプロテインGへの抗体の結合を基本としたアフィニティークロマトグラフィーを用いることもできる。
【0087】
免疫原としてRANK/Fc融合タンパク質を用いて、モノクローナル抗体を生成させた。RANKタンパク質に対する反応性を確認するために、これらの試薬をスクリーニングした。mAbsの活性をモニターするために本明細書中に記載の方法を用いて、ブロッキング(即ちRANKと結合しRANKへのリガンドの結合を阻害する抗体)およびノンブロッキング(即ちRANKと結合してリガンド結合を阻害しない抗体)の両方を単離した。
【0088】
実施例4
本実施例は、293/EBNA細胞[細胞系はヒトCMV即時−早期エンハンサー/プロモーターから誘導されるエプスタイン−バーウイルスの核抗原−1(Epstein Barr Virus nuclear antigen-1)(EBNA−1)を構成的に発現するEBNA−1をコードする遺伝子を持つ293細胞系のトランスフェクションによって誘導された]内のRANKによるNF−κB活性の誘導について説明している。Yaoら(immunity,3,811、1995)に記載の方法に実質上従って、NF−κB活性の活性化を293/EBNA細胞内で測定した。核抽出物を調製し、NF−κB結合部位を含む25塩基対のオリゴヌクレオチドを用いて、ゲル遅延アッセイによってNF−κB活性について分析した。200万の細胞を、DNAトランスフェクションの2日前に10cmの皿内に種付けし、2.5%FBS(ウシ胎児血清)を含むDMEM−F12培地内で培養した。DNAトランスフェクションは、本明細書に記載の方法に従って、IL−8プロモーター/レポーターアッセイのために行った。
【0089】
単離された核を400mM NaClで可溶化することによって、核抽出物を調製した(Yaoら、上記)。NF−κB結合部位を含むオリゴヌクレオチドをアニールし、T4
DNAポリヌクレオチドキナーゼを用いて32Pで末端標識した。移動度シフト反応は、10μgの核抽出物、4μgのポリ(dI−dC)および15,000cpmの標識された二本鎖オリゴヌクレオチドを含み、そして室温で20分間インキュベートした。得られたタンパク質−DNA複合体を、0.25xトリス−ホウ酸−EDTAバッファー中の6%の未変性ポリアクリルアミドゲル上で解析した。
【0090】
RANKの過剰発現は、ゲル上の放射能プローブの移動度のおおよそのシフトにより示されたように、結果としてNF−κB活性の誘導した。RANKを結合し、そしてレセプターを発現する細胞にシグナルを伝達する(即ち、ヒトRANKおよびネズミRANKL
DNAで細胞を同時トランスフェクトすることによって;以下の実施例7を参照のこと)リガンドによって、RANKを誘発させた場合にも類似の結果が認められ、このことから誘発がアゴニスト抗体で行われる場合にも起こると期待される。
【0091】
実施例5
本実施例は、インビボでの遺伝子転写の活性化を分析するために用いられたヒトのイン
ターロイキン−8(IL−8)プロモーターを基にした遺伝子プロモーター/レポーターシステムについて説明している。サイトカインであるインターロイキン−1(IL−1)または腫瘍壊死因子−α(TNF−α)によるヒトIL−8遺伝子転写物の誘導は、インタクトなNF−κBおよびNF−IL−6転写因子結合部位に依存するものであることが知られている。ネズミIL−4レセプター(mIL−4R)をコードするcDNAとサイトカイン応答性IL−8プロモーターを融合させると、トランスフェクトされた細胞の細胞表面上の異種レポータータンパク質(mIL−4R)を検出することにより、プロモーター活性化の測定が可能になる。
【0092】
ヒト腎臓上皮細胞(293/EBNA)を、1)レポーター/プロモーター構築物(pIL−8repと名付けた)および2)興味あるcDNA:をコードするプラスミドで(DEAE/DEXTRAN法を通して)トランスフェクトした。DNA濃度は、常に、空のベクターDNAを加えることによって一定に保たれている。293/EBNA細胞を6穴プレートに2.5x10細胞/ml(3ml/穴)の密度で播き、トランスフェクションする前に2日間インキュベートする。トランスフェクションの2日後、mIL−4レセプターを、以下に記載のラジオイムノアッセイ(RIA)によって検出する。
【0093】
一つのそのような実験では、293/EBNA細胞を、RANKをコードするDNAおよびRANKLをコードするDNAで同時トランスフェクションした(以下の実施例7を参照のこと)。細胞によるこのレセプターとその相手構造の同時発現は、結果として、RANKのシグナル化プロセスを活性化する。そのような同時トランスフェクション研究では、DEAEトランスフェクションのためのDNA濃度/穴は、以下の通りである:40ngのpIL−8rep[pBluescriptSK−ベクター(Stratagene)];0.4ngのCD40(CD40をコードするDNA、コントロールレセプター;pCDM8ベクター);0.4ngのRANK(RANKをコードするDNA;pDC409ベクター)、および1−50ngのCD40L(CD40のリガンドをコードするDNA、CD40と同時トランスフェクトした場合には正のコントロールとして働き、RANKと同時トランスフェクトした場合には負のコントロールとして働く、pDC304内)またはRANKL(RANKのリガンドをコードするDNA、pDC406内)のいずれか。類似の実験を、可溶性RANKLまたはRANKに対するアゴニスト抗体を用いて行い、RANKでトランスフェクトされた細胞を誘発することができる。
【0094】
mIL−4R特異的RIAでは、mIL−4Rと反応するモノクローナル抗体を、クロラミンT結合法を用いて125Iで標識する:得られた比活性は、典型的には、1.5x1016cpm/nmolである。48時間後、トランスフェクトされた細胞を培地(DMEM/F12;5%FBS)で一度洗浄する。非特異的結合部位は、前もって暖めておいた5%脱脂乾燥ミルクを含む結合培地を加え、そして37℃/5%CO、組織培養インキュベーター中で1時間インキュベートすることによって、ブロックする。ブロッキング培地をデカントし、125I抗−mIL−4R(クローンM1;ラットIgG1)を含むブロックバッファーを細胞に加え、そして室温で1時間揺らしながらインキュベートする。放射能標識した抗体と細胞とをインキュベーションした後、細胞を結合バッファー(2x)で十分に、そしてリン酸塩バッファー溶液(PBS)で二度洗浄する。細胞を1mlの0.5M NaOHで溶解し、そして全放射能をガンマカウンターで測定する。
【0095】
このアッセイを用いると、RANKをコードするDNAで同時トランスフェクトされた293/EBNAは、細胞表面上のmuIL−4Rを検出することによって示されるような、転写活性を持つことが証明された。RANKの過剰発現は、結果としてRANKLによるRANKの誘発のような、muIL−4Rの転写を生ずる。RANKをアゴニスト抗体で誘発する場合にも、同様の結果が認められる。
【0096】
実施例6
本実施例は、TRAFタンパク質とRANKの関係について説明している。細胞質TRAFタンパク質とRANKの相互作用を、実質上Hsuら、(Cell,84,299、1996)に記載された方法に従って、同時免疫沈降法によって証明した。簡単に言えば、293/EBNA細胞を、RANKおよびエピトープ−タグ(FLAG;配列番号7)TRAF2またはTRAF3の合成を指示するプラスミドで同時トランスフェクトした。トランスフェクションの2日後、表面タンパク質を、ビオチン−エステルで標識し、0.5%NP−40を含むバッファー中で細胞を溶解した。このレセプターに関連するRANKおよびタンパク質を抗RANKで免疫沈降し、十分に洗浄し、6−10%のSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動分離によって解析し、そしてウエスタンブロッティングを行うためにニトロセルロース膜に電気的にトランスファーした。RANKとTRAF2およびTRAF3タンパク質との関連を、FLAGエピトープを特異的に認識する抗体で膜をプローブ化することによって、可視化した。TRAF2および3は、RANK発現がない場合には、抗−RANKで免疫沈降しなかった。
【0097】
実施例7
本実施例は、RANKLと名付けられたRANKリガンドの直接発現クローニングによる単離について、説明している。リガンドを、CD40Lに関するUSSN08/249,189、1994年5月24日出願(ここに参照として採用される適切な開示)に記載の方法に実質上従って、クローン化した。簡単に言えば、FACS(fluorescence activated cell sorter)(蛍光活性化細胞選別器)内でビオチニル化されたCD40/Fc融合タンパク質で5回選別することによって誘導された、EL−40.5と名付けられたマウスの胸腺腫細胞系EL−4(ATCC TIB39)のクローンから、ライブラリーを調製した。cDNAライブラリーを標準方法論を用いて作成し;プラスミドDNAを単離し、DEAE−デキストラン法を用いてサブコンフルエント状態の融合CV1−EBNA細胞内にトランスフェクトした。実施例2で調製したRANK/Fc融合タンパク質との二段階結合法を用いたRANKL発現についてのスライドオートラジオグラフィーによって、次いで放射性ヨウ素標識ヤギ抗−ヒトIgG抗体を使用することによって、トランスフェクタントをスクリーニングした。
【0098】
RANKを特異的に結合するタンパク質をコードするクローンを単離し、そして配列決定した;このクローンを11Hと名付けた。pDC406:muRANK−L(大腸菌DH10B内)と名付けられたネズミRANKL配列を含む発現ベクターは、ブダペスト条約の条件に従って、the American Type Culture Collection,Rockville,MD(ATCC)に1996年12月20日に寄託された(寄託番号98284)。このクローンのヌクレオチド配列および予想されるアミノ酸配列を、配列番号10に図示している。このクローンは、開始コドンであるメチオニンを含んでいなかった;さらなる全長クローンを(実質上、合衆国特許第5,599,905号、1997年2月4日発行、に記載の方法に従って調製された)7B9ライブラリーより得た;5’領域は、残基9のThrのGlyへの置換を除いて、配列番号12のアミノ酸1から22に示したヒトRANKLのそれと同一あることが分かった。
【0099】
このリガンドは、数多くの異なるアッセイによってRANKLと結合するRANKの能力を評価するために有用である。例えば、RANKLを発現するトランスフェクトされた細胞は、FACSアッセイ(または類似のアッセイ)に用いると、RANKLと結合する可溶性RANKの能力を評価することができる。さらに、RANKLの可溶型を調製し、この技術分野で既知のアッセイ(即ち、実質上、USSN08/249,189、1994年5月24日出願、に記載したようなELISAまたはBIAcoreアッセイ)に用いることができる。また、RANKLは、RANKのアフィニティー精製に、そしてサンプル中のRANKレベルを測定する方法での試薬として、有用である。また、可溶性RANKLは、NF−κB活性化の誘導、また、それ故RANKを発現する細胞のアポトーシスからの防御に有用である。
【0100】
実施例8
本実施例は、PCRに基づく技術を用いたヒトRANKリガンド(RANKL)の単離について説明している。ネズミRANKリガンド−特異的オリゴヌクレオチドプライマーを、鋳型としてヒト細胞系−誘導第一鎖cDNAを用いてPCR反応に用いた。これらのプライマーは、ネズミRANKリガンド(配列番号10)のヌクレオチド478−497、およびヌクレオチド858−878の相補体に相当する。ヒト上皮細胞系KB(ATCC CCL−17)を用いた一つの反応から増幅されたおおよそ400bp長のバンドをゲル精製し、そのヌクレオチド配列を決定した;配列は、ネズミRANKリガンドの相当する領域と85%の同一性を示し、フラグメントがヒトRANKLからのものであることが確認された。
【0101】
全長のヒトRANKL cDNAを得るために、KB PCR生成ヌクレオチド配列から誘導された2つのヒトRANKL−特異的オリゴヌクレオチドを放射標識し、ハイブリダイゼーションプローブとして用いて、実質上、合衆国特許第5,599,905号(1997年2月4日発行)に記載の方法に従って、λgt10(Stratagene,La Jolla,CA)内に調製されたヒトPBL cDNAライブラリーをスクリーニングした。いくつかの正のハイブリダイズプラークを同定し、そして精製し、それらの挿入物をpBluescript SK(Stratagene,La Jolla,CA)内にサブクローン化し、それらのヌクレオチド配列を決定した。一つの単離株PBL3は、予想されるヒトRANKLの大部分をコードすることが分かったが、5’コード領域のおおよそ200bpを失っているらしかった。第二の単離株PBL5は、全5’末端および5’非翻訳配列のさらなる200bpを含む、予想されるヒトRANKLの多くの部分をコードすることが分かった。
【0102】
PBL5の5’末端およびPBL3の3’末端を連結して、ヒトRANKLをコードする全長のcDNAを形成させた。全長のヒトRANKリガンドのヌクレオチドおよび予想されるアミノ酸配列を、配列番号12に示す。ヒトRANKリガンドは、ネズミのRANKリガンドと83%のヌクレオチド同一性および84%のアミノ酸同一性を持つ。pBluescript:huRANK−L(大腸菌DH10B中)と名付けられたヒトRANKL配列を含むプラスミドベクターは、ブダペスト条約の条件下、the American Type Culture Collection,Rockville、MD(ATCC)に1997年3月11日に寄託された(寄託番号98354)。
【0103】
ネズミおよびヒトのRANKLは、2型のトランスメンブランタンパク質である。ネズミRANKLは、予想される48アミノ酸からなる細胞内ドメイン、21アミノ酸のトランスメンブランドメインおよび247の細胞外ドメインを含む。ヒトRANKLは、予想される47アミノ酸からなる細胞内ドメイン、21アミノ酸のトランスメンブランドメインおよび249アミノ酸の細胞外ドメインを含む。
【0104】
実施例9
本実施例は、PCRに基づくマッピングストラテジーを用いたヒトRANKの染色体マッピングについて説明している。最初のヒト染色体アサインメントは、RANKおよびRANKL−特異的PCRプライマーならびにBIOS Laboratories(New Haven,CT)からのBIOS体細胞ハイブリッドPCR可能DNAキット(BIOS Somatic Cell Hybrid PCRable DNA kit)を、製造者らの指示書に従って、用いて作成した。RANKはヒト染色体18にマッピングされ;RANKリガンドはヒト染色体13にマッピングされた。さらなる詳細なマッピングを、放射線ハイブリッドマッピングパネル、Genebridge 4 Radiation Hybrid Panel(Research Genetics,Huntsville,AL;Walter,MAら、Nature Genetics,7,22−28、1994に記載されている)を用いて、行った。次に、この分析からのデータを、MIT Radiation Hybrid Mapper(URL;http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/contig/rhmapper.pl)に、それらの内に含まれる指示に従って、電子提出した。この分析から、特定の遺伝子マーカー名が得られ、それをNCBI Entrez browser(URL:http://www3.ncbi,nlm.nih.gov/htbin-post/Entrez/query?db=c&form=0)に電子提出して、具体的な地図上の位置が決定された。RANKは、染色体18q22.1にマッピングされ、そしてRANKLは染色体13q14にマッピングされた。
【0105】
実施例10
本実施例は、RANKLに対するモノクローナル抗体の調製について説明している。例えば、精製された組換えRANKLの調製、またはRANKLを高レベル発現する穿刺細胞(transfixed cell)、を用い、合衆国特許第4,411,993号に開示された技術
のような慣用の技術を用いてRANKLに対するモノクローナル抗体を作成する。また、RANKLをコードするDNAを、例えばPardollおよびBeckerleg,Immunity,3:165,1995に論評されている方法に従って、免疫原として用いることもできる。そのような抗体は、RANKLシグナル化の妨害(アンタゴニスト抗体またはブロッキング抗体)のため、RANKLまたはRANKL活性についての診断用または研究アッセイの成分として、またはRANKLのアフィニティー精製に有用である。
【0106】
齧歯類を免疫化するために、RANKL免疫原を、[完全または不完全フロイントアジュバント、ミョウバン、またはRibiアジュバントR700(Ribi,Hamilton,MT)のようなそれ以外のアジュバンドのような]アジュバントで乳化し、そして選択された齧歯類、例えばBALB/cマウスまたはLewisラットに、10−100μgの範囲の量を、皮下注射する。DNAを皮内(Razら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91.9519、1994)または筋肉内(Wangら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90,4156、1993)に投与することもでき;食塩水は、DNAを基本とした抗原の適当な希釈剤であることが分かった。10日から3週間後、免疫化された動物をさらなる免疫原で追加免役し、その後、毎週、隔週または3週毎の免疫化スケジュールで周期的に追加免役する。
【0107】
血清サンプルを、ドット−ブロットアッセイ(抗体サンドイッチ)、ELISA(酵素連結イムノソルベントアッセイ)、免疫沈降、またはFACS分析を含むその他の適当なアッセイによる試験のために、眼窩後部採血または尾先端切除により定期的に採取する。適当な抗体力価を検出した後、陽性動物に食塩水中の抗原を静脈内注射で投与する。3ー4日後、動物を屠殺し、脾臓細胞を収集し、そしてネズミのミエローマ細胞系[例えば、NS1または好ましくはAg8.653(ACC CRL1580)]と融合させる。この方法によって作り出されたハイブリドーマ細胞系を選択培地(例えば、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培地、またはHAT)を含む複数のミクロタイタープレート内に塗布して、非融合細胞、ミエローマ−ミエローマハイブリッドおよび脾臓細胞−脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害する。
【0108】
このようにして作り出されたハイブリドーマクローンを、RANKとの反応性に関してELISAによって、例えばEngvallら、Immunochem.,8,871、1971および合衆国特許第4,703,004号に開示された技術を適用することによって、スクリーニングすることができる。好ましいスクリーング技術は、Beckmanら、J.Immunol.,144,4212(1990)に記載された抗体捕獲技術である。次いで、陽性のクローンを同系の齧歯類の腹膜腔内に注射すると、高濃度(>1mg/ml)の抗−RANKモノクローナル抗体を含む腹水が生成される。得られたモノクローナル抗体を、硫酸アンモニウム沈殿、次いでゲル排除クロマトグラフィーによって精製することができる。代わりに、RANKLタンパク質への結合を基本にしたアフィニティークロマトグラフィーを用い、あるいはプロテインAまたはプロテインGへの抗体の結合を基本としたアフィニティークロマトグラフィーを用いることもできる。mABsの活性をモニターするためにここの記載された方法を用いて、ブロッキング(即ちRANKLと結合してRANKへの結合を阻害する抗体)および非ブロッキング(即ちRANKLと結合するがRANKとの結合を阻害しない抗体)の両抗体を単離する。
【0109】
実施例11
本実施例は、RANK発現をアップレギュレートすることができることについて説明している。ヒトの末梢血液T細胞は、フローサイトメトリーソーティングによって、または抗体コートビーズを用いた負の選択によって精製することができ、インターロイキン−4(IL−4)、形質転換増殖因子−β(TGF−β)およびその他の市販されているサイトカイン(IL1−α、IL−2、IL−3、IL−6、IL−7、IL−8、IL−10、IL−12、IL−15、IFN−γ、TNF−α)を含む、様々なサイトカインの存在下または不在下で、抗−CD3(OKT3、Dako)コートプレートまたはフィトヘマグルチニンで活性化した。以下の表に示すように、RANKの発現を、マウスのモノクローナル抗体mAb144(実施例3に記載の方法によって調製された)を用いて、2−8日間の時間経過実験でFACSによって評価した。結果を抗−RANKでの染色強度の相対的増加に応じて、+から++++で表した。また、抗−RANK及び抗−CD8または抗−CD4抗体の両方を用いた二重標識実験も行った。
【0110】
【表1】

【0111】
試験されたサイトカインの内、IL−4およびTGF−βは、CD8+細胞毒性およびCD4+ヘルパーT細胞の両方で4から8日間RANK発現のレベルを上昇させた。IL
−4とTGF−βの組み合わせは、相乗的に作用し、活性化されたT細胞上のこのレセプターの発現をアップレギュレートした。サイトカインのこの特定の組み合わせは、サプレッサーT細胞によって分泌されるので、寛容の生成に重要であると考えられ(MitchisonおよびSieper、Z.Rheumatol.,54,141、1995に論評されている)、寛容または活性免疫応答誘導のいずれかに対する免疫応答の調節にRANKが相互作用していることを示している。
【0112】
実施例12
本実施例は、活性化されたT細胞の増殖へのRANK.FcおよびhRANKLの影響について説明している。抗−CD3活性化ヒト末梢血液Tリンパ球にTGFβを加えると、増殖停止、そして結果的に培養のはじめ数日以内に大部分のリンパ球の死を誘導する。我々は、RANK.Fcまたは可溶性ヒトRANKLをT細胞培養に加えることによって、TGFβ−処理T細胞へのRANK:RANKL相互作用の影響について試験した。
【0113】
ヒト末梢血液T細胞(7x10PBT)を、抗−CD3(OKT3、5μg/ml)および抗−Flag(M1、5μg/ml)でコートした24穴プレート上、TGFβ(1ng/ml)およびIL−4(10ng/ml)存在下、組換えFLAG−タグ付け可溶性hRANKL(1μg/ml)またはRANK.Fc(10μg/ml)を加えて、または加えずに、6日間培養した。トリパンブルー染色を3回行うことによって、生存可能なT細胞回収率を測定した。
【0114】
RANK.Fcを添加すると、6日後に回収された生存可能なT細胞の数が有意に減少したが、これに対して可溶性RANKLは、生存可能なT細胞の回収を著しく増加させた(図1)。このように、内因性または外因性のRANKLは、TGFβの存在下で生成された生存可能なT細胞数を増加する。TGFβは、IL−4と共に、T3/調節T細胞サブセットによって分泌された場合、免疫応答調節にかかわる。これらのT細胞は、エフェクターT細胞のバイスタンダー(bystander)抑制を仲介すると考えられる。従って、RANKおよびそのリガンドは、自己/パラ分泌様式で作用し、T細胞寛容に影響を与えることができる。さらに、TGFβは、ある病原性または日和見感染生物によって影響を受ける免疫システムの回避に役割を演ずることが知られている。寛容の発達に役割を果たすことに加えて、RANKは、また、病原体による免疫システムの回避にも役割を果たす可能性がある。
【0115】
実施例13
本実施例は、CD1a樹状突起細胞(DC)上でのRANKの相互作用の影響について説明している。機能的に成熟した樹状突起細胞(DC)を、CD34+骨髄(BM)始原細胞からインビトロで生成した。簡単に言えば、正常な健康なボランティアからのヒトBM細胞を、Ficoll培地を用いて濃度分画し、CD34BM細胞を抗−CD34マトリックスカラム(Ceprate,CellPro)を用いてイムノアフィニティーで単離した。次いで、CD34+BM細胞を、10%のウシ胎児血清を補充したSuper McCoyの培地中のヒトGM−CSF(20ng/ml)、ヒトIL−4(20ng/ml)、ヒトTNF−α(20ng/ml)、ヒトCHO−誘導Flt3L(FL:100ng/ml)中で、充分に湿気を与えた37℃のインキュベーター中(5%CO)で14日間、培養した。次いで、CD1a+、HLA−DR+DCを、FACStar PlusTMを用いて選別し、そしてRANKの生物学的評価に用いた。
【0116】
CD34骨髄細胞から誘導されたヒトのCD1a DC上では、フローサイトメト
リー分析による評価では、CD1aDCのサブセット(20−30%)のみが細胞表面にRANKを発現した。しかしながら、DC培地へのCD40Lの付加は、結果として大部分のCD1aDC上でRANKを表面に発現した。DC40Lは、インビトロでの
クラスター形成を強化し、DCの形態変化を誘導し、そしてHLA−DR、CD54、CD58、CD80およびCD86の発現をアップレギュレートすることによってDCを活性化することが分かった。
【0117】
DC培地にRANKLを加えると、DC40Lで認められた影響(図2)と同様に、対照培地以上にDC凝集およびクラスター形成の程度が有意に増加した。選別されたヒトCD1aDCを、サイトカイン混液(GM−CSF、IL−4、TNF−αおよびFL)(左上方パネル)中、混液+CD40L(1μg/ml)(右上方)中、混液+RANKL(1μg/ml)(左下方)中、または混液+熱不活性化(ΔH)RANKL(1μg/ml)(右下方)中、1ml培養液を含む24穴の平底培養プレート中で、48−72時間培養し、次いで、反転顕微鏡を用いて写真撮影した。熱不活性化RANKLを用いた場合、対照培地以上のDC凝集およびクラスター形成の増加は、明らかではなく、この影響は、生物学的に活性なタンパク質に依存することが示された。しかしながら、粘着分子発現の最初の表現型分析は、RANKL−誘導クラスター化が、CD2、CD11a、CD54またはCD58のレベルの増加によるものではないことを、示した。
【0118】
RANKLをCD1aDCに加えると、CD40L−培養DCと比較して、混合リンパ球反応物中(mixed lymphocyte reaction)(MLR)では少なくとも3−10倍に
、それらの同種刺激能力を強化した(図3)。0.2mlの培養液を含む96穴の丸底培養プレート中で、図2で上に示したように培養した様々な数の照射(2000rad)DCと共に、4日間、同種異系のT細胞(1x10)をインキュベートした。培養物を、8時間、0.5mCi[H]−チミジンでパルス標識し、そして、気相βカウンターで計測するために、細胞をグラス繊維シート上に集めた。単独で培養されたT細胞またはDCのいずれかのみのバックグラウンド計数は、<100cpmであった。値は、3回の培養の平均値±SDで表している。熱不活性化RANKLは効果がなかった。DC同種刺激活性は、RANKLおよびCD40Lを組み合わせて使用しても、それ以上は強化されず、これはおそらく、DCの作用能力がいずれかのサイトカイン単独で最高レベルに到達したためであろう。RANKLのみならずCD40Lも、3日の培養期間に、インビトロでのDCの増殖を強化しなかった。CD40Lとは異なり、RANKLは、HLA−DRの発現レベルも、またCD80あるいはCD86の発現のレベルも、有意には増加しなかった。
【0119】
RANKLは、細胞粘着性(CD18、CD54)、抗原提示(HLA−DR)または共刺激(CD86)に含まれる既知の分子を修飾することなくDCクラスター形成および作用能力を強化することができるが、それらの分子のすべては、CD40/CD40Lシグナル化によって制御される。これらの分子の発現への影響の欠如は、RANKLがCD40/CD40Lとは別の代わりの経路を通して、DC機能を制御するらしいことを示唆している。CD40Lがインビトロで生成されたDC上のRANK表面発現を調節し、そしてDC−T細胞が相互作用している間、CD40Lが活性化T細胞上でアップレギュレートされることから、RANKおよびそのリガンドは、DCの仲介によってT細胞が膨張する間に誘導される活性化カスケードの重要な部分を形成すると考えられる。さらに、RANKL中でDCを培養すると、その結果、CD1b/c発現レベルが減少し、CD83レベルが上昇する。これらの分子は両方とも、DCが成熟する間、CD40Lによって同じ様に修飾され(Cauxら、J.Exp.Med.,180,1263、1994)、RANKLがDCの成熟を誘導することが示唆される。
【0120】
樹状突起細胞は、「専門的」抗原提示細胞と呼ばれ、MHC制限T細胞の感作に高い能力を持つ。腫瘍または感染症ワクチンアジュバントとしてエキソビボで樹状突起細胞を用いることに興味が増している(例えば、Romaniら、J.Exp.Med.,180,83、1994を参照のこと)。それ故、DCの成熟を誘導し、免疫応答を刺激する樹状突起細胞の能力を強化するRANKLのような抗原は、様々な疾病の免疫療法に有用であろう。
【0121】
実施例14
本実施例は、muRANKと名付けられた、ネズミRANKの同族体の単離について説明している。muRANKを、交差種PCRおよびコロニーハイブリダイゼーションの組み合わせによって単離した。TNFRスーパーファミリー構成タンパク質の細胞外ドメインのCysに富むシュードリピート内でのCys残基の保存を利用して、ヒトRANKに基づくPCRプライマーを設計して、様々な種からのネズミの第一鎖cDNAに対して用いた。センス上流プライマーおよびアンチセンス下流プライマーは両方とも、Cys残基内にそれらの3’末端終止を持つように設計された。
【0122】
上流センスプライマーは、配列番号5のヌクレオチド272−295(アミノ酸79−86をコードする領域)をコードし;下流アンチセンスプライマーは、ヌクレオチド409−427(アミノ酸124−130をコードする領域)の相補体をコードする。これらのプライマーおよび様々なネズミの細胞系あるいは組織原からの第一鎖cDNAを用いて、標準PCR反応を計画し実施した。94℃で30秒、50℃で30秒、そして72℃で20秒の30回の反応を行った。PCR生成物を電気泳動によって分析し、特異的バンドがいくつかのサンプルで認められた。一つのサンプルからのバンドをゲル精製し、DNAシークエンシングにより、プライマー間の配列は相当するヒトRANKヌクレオチド配列とおおよそ85%同一であることが分かった。
【0123】
ネズミ胎児肝臓上皮細胞系FLE18(上のPCRスクリーニングで陽性と同定された細胞系の一つ)から調製されたプラスミドに基づくcDNAライブラリーを、PCR生成物のシークエンシングから決定されたネズミのRANK配列から誘導されたネズミRANK−特異的オリゴヌクレオチドプローブを用いて、全長のRANK cDNAをスクリーニングした。一つは(全長のヒトRANKとの配列比較に基づいて)全長のネズミRANKの5’末端をコードし、もう一つは3’末端をコードする、2つのcDNAを再結合して全長のネズミRANK cDNAを作り出した。muRANKのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を配列番号14および15に示す。
【0124】
このcDNAは、予想される30アミノ酸からなるシグナル配列、184のアミノ酸細胞外ドメイン、21アミノ酸のトランスメンブランドメインおよび390アミノ酸の細胞質尾部を持つ、1型トランスメンブランタンパク質と予想される625アミノ酸残基をコードする。muRANKの細胞外領域は、huRANKと有意のアミノ酸相同性(69.7%の同一性、80.8%の類似性)を示す。当業者らは、正確な切断部位がコンピューターで予想されたそれとは異る可能性があり、従って、RANKのN−末端はアミノ酸25からアミノ酸35の間にあることを認識するであろう。
【0125】
TNFレセプタースーパーファミリーのその他の構成員は、トランスメンブランドメインとリガンド結合ドメインとの間に、「スペーサー」領域と呼ばれるリガンド結合に必要ではないアミノ酸領域を持つ。muRANKでは、197と214の間のアミノ酸がそのようなスペーサー領域を形成すると予想される。従って、この領域のアミノ酸で終結している可溶型RANKは、特異的様式でRANKのリガンドと結合する能力を残していると予想される。可溶型RANKペプチドの好ましいC−末端アミノ酸は、配列番号14のアミノ酸214および197からなる群より選択されるが、しかしスペーサー領域のその他のアミノ酸もC−末端として利用することができる。
【0126】
実施例15
本実施例は、様々な異なる可溶型RANKおよびRANKLの調製について説明してい
る。制限酵素による切断および連結の標準技術を、慣用の制限部位の存在しないフラグメントのPCRに基づく単離と組み合わせて、用いた。PCRを用いた場合、PCR生成物を配列決定して、任意の変異が導入されていないかについて確認したが;そのような変異は、全く認められなかった。
【0127】
実施例2に記載したhuRANK/Fcに加えて、もう一つのRANK/Fc融合タンパク質が、配列番号6のアミノ酸1−213をコードするDNAを、前述のFcムテイン(配列番号8)のアミノ酸3−232をコードするDNAに連結することによって、調製された。全長のネズミRANK(配列番号15)のアミノ酸1−213をコードするDNAを、Fcムテイン(配列番号8)のアミノ酸3−232をコードするDNAに連結して、ネズミRANKについても類似の構築物を調製した。
【0128】
huRANKLの可溶型タグ付ポリーHis体(version)は、イムノグロブリンκ鎖
(配列番号16)からのリーダーペプチドをコードするDNAを、FLAGTMタグ(配列番号17)の短い変形をコードするDNAに、次にGlySerをコードするコドン、その後ポリ−Hisタグ(配列番号18)、次いでGlyThrSerをコードするコドン、そして配列番号13のアミノ酸138−317をコードするDNAに連結することによって、調製された。ネズミRANKLの可溶性ポリ−Hisタグ変形は、CMVリーダー(配列番号9)をコードするDNAを、ArgThrSerをコードするコドンに、次いでポリ−His(配列番号18)をコードするDNA、次いで配列番号11のアミノ酸119−294をコードするDNAに連結することによって、調製された。
【0129】
可溶性オリゴマー型のhuRANKLは、CMVリーダー(配列番号9)をコードするDNAを、Aspをコードするコドンに、次いでトリマー型「ロイシン」ジッパー(配列番号19)をコードするDNA、その後ThrArgSerをコードするコドン、次いで配列番号13のアミノ酸138−317に連結することによって、調製された。
【0130】
これらおよびその他の構築物は日常の実験で調製される。次いで、これらの様々なDNAを適当な発現ベクター内に挿入し、発現させる。特に好ましい発現ベクターは、哺乳動物細胞に用いることのできるそれらである。例えば、ここに記載されたpDC409およびpDC304は、一過性の発現に有用である。安定なトランスフェクションのためには、CHO細胞の使用が好ましいく;いくつかの有用なベクターは、USSN08/785,150に記載されており、そこで検討された2A5−3λ−誘導発現ベクターの一つを例示することができる。
【0131】
実施例16
本実施例は、RANKL発現をネズミのT細胞上でアップレギュレートできることを示している。細胞をC57BL/6マウスの腸間膜リンパ節から得、そして、実質上ここに記載されているように、抗−CD3コートプレート、コンカナバリンA(ConA)またはホルボールミリステートアセテートを、イオノマイシン(抗−CD3:500A2、Immunex Corporation,Seattle WA;ConA,PMA,イオノマイシン、Sigma,St.Louis,MO)と組み合わせて活性化し、そして約2−5日間培養した。RANKLの発現を、ここに記載された方法に従って調製された、T細胞マーカーCD4、CD8およびCD45RB、ならびにRANK/Fcに対する抗体を用いて、FACSによる三色分析で評価した。
【0132】
RANKLは、刺激されていないマウスのT細胞上では、発現されなかった。抗−CD3、ConAまたはPMA/イオノマイシンのいずれかで刺激されたR細胞は、RANKLを差別的に発現した:CD4/CD45RBLoおよびCD4/CD45RBHi細胞は、RANKL陽性であるが、CD8+細胞はそうではなかった。RANKLは
、ヒト細胞で認められた結果と同様に、B細胞上では認められなかった。
【0133】
実施例17
本実施例は、細胞増殖および活性化へのネズミのRANKLの影響について説明している。免疫応答に役割を果たす細胞を代表する様々な細胞または細胞系(ネズミ脾臓、胸腺およびリンパ節)を、RANKLの存在または非存在下で、それらの生命力を促進する条件下でそれらを培養することによって、評価した。RANKLは、試験したいずれの細胞の増殖も刺激しなかった。一つの細胞系である、RAW264.7と呼ばれるマクロファージ細胞系(ATCC寄託番号TIB71)は、活性化のいくらかのサインを示した。
【0134】
RAW細胞は、少量のTNF−αを本質的に生成する。ヒトまたはネズミのいずれかのRANKLを含むインキュベーションは、投与量依存様式で、これらの細胞によるTNF−αの生成を強化した。RANKLを10分間煮沸すると、TNF−αは生成されなくなるが、これに対して精製されたエンドトキシン(LPS)を同様に処理しても、LPSのTNF−αの生成刺激能力は影響されなかったことから、この結果は、RANKL調製物へのエンドトキシンの混入によるものではなかった。RANKLがTNF−αの生成に関するマクロファージ細胞系RAW T64.7を活性化するという事実にもかかわらず、ヒトRANKLも、またネズミRANKLも、これら細胞による硝酸酸化物の生成を刺激しなかった。
【0135】
実施例18
本実施例は、胎児マウス内の胸腺の成長および発達へのネズミRANKLの影響について説明している。妊娠マウスに、1mgのRANK/Fcまたはベヒクル対照タンパク質(ネズミ血清アルブミン;MSA)を、妊娠13日、16日および19日に注射した。誕生後、新生児に、RANK/Fcを、毎日投与量1μgから始めて、4日毎に投与量を倍増しながら、最終的に4μgの投与量を腹腔内投与し続けた。新生児は生後1日、8日および15日で捕らえ、それらの胸腺および脾臓を収集し、その大きさ、細胞充実性および表現型組成について試験した。
【0136】
RANK/Fcを注射した雌に産まれた新生児では、1日で胸腺サイズにわずかな減少が認められた;同様のサイズの減少は、対照の新生児では認められなかった。8日では、胸腺サイズおよび細胞充実性は、MSA処理マウスと比較して、RANK/Fc処理動物では約50%減少した。表現型分析では、胸腺内の異なるT細胞集団の相対割合が対照マウスとRANK/Fcマウスでは同じであることが証明され、このことから、細胞充実性の減少は、特定の集団での減少ではなく、胸腺のT細胞数の全体的な抑制によることを示唆している。RANK/Fcで処理した生後15日の新生児は、胸腺細胞のサイズ、細胞充実性、表現型のいずれに関しても、対照新生児と有意な差はなかった。評価したいずれの時点でも、脾臓の大きさ、細胞充実性または組成に、有意な差異は認められなかった。生後15日ではなく8日で細胞充実性に差異が認められたことは、RANK/Fcが胸腺発達の早期にその影響を示しうることが、示唆される。
【0137】
実施例19
本実施例は、RANKの細胞質ドメインのC−末端領域が異なる様々なTRAFタンパク質の結合に重要であることを示している。RANKは、TRAFドッキング部位と考えられる少なくとも2つの認識可能なPXQX(X)Tモチーフを含んでいる。従って、TRAF結合に関するRANKの細胞質ドメインの様々な領域の重要性を評価した。RANK/GST融合タンパク質を、実質上、SmithおよびJohnson、Gene,67,31、1988に記載の方法に従って調製し、以下に記載した、様々な先端切除型の調製に用いた。
【0138】
ネズミおよびヒトのRANKのヌクレオチド配列の比較から、TRAF結合に重要でありうるいくつかの保存領域があることが示された。従って、PCRに基づく技術を発展させて、保存領域を残しているであろう様々なC−末端先端切除型の調製を行った。終止コドンおよび制限酵素部位を選択された場所に導入するように、PCRプライマーを設計して、以下の表1に記載した先端切除型を得た。シークエンシングにより、非所望の変異が構築物内に導入されていないことを、確認した。
【0139】
放射能標識した(35S−Met、Cys)TRAFタンパク質を、市販の網状赤血球溶解キットを製造者ら(Promega)の指示に従って用いて、インビトロでの翻訳により調製した。先端切除型GST融合タンパク質を、実質上、SmithおよびJohnson(上記)に記載の方法に従って精製した。簡単に言えば、大腸菌を融合タンパク質をコードする発現ベクターでトランスフェクトし、タンパク質の発現を誘導した。細菌を溶解し、不溶物質を除去し、そして融合タンパク質をグルタチオン−コートビーズ(Sepharose 4B、Pharmasia,Uppsala Sweden)で沈殿させることにより、単離した。
【0140】
ビーズを洗浄し、様々な放射能標識したTRAFタンパク質と共にインキュベートした。インキュベーションおよび洗浄段階の後、融合タンパク質/TRAF複合体を、0.1%SDS+β−メルカプトエタノール中で煮沸することにより、ビーズから除去し、そして12%SDSゲル(Novex)上に負荷した。ゲルをオートラジオグラフィーにかけ、放射能標識した物質の存在または不在を記録した。結果を以下の表2に示す。
【0141】
【表2】

【0142】
これらの結果は、TRAF1、TRAF2、TRAF3、TRAF5およびTRAF6が、RANK細胞質ドメインの最も遠位の部分(アミノ酸G544およびA616)と結合することを示している。また、TRAF6は、S339とY421の間にも結合部位を持つ。この実験では、TRAF5もまた、RANKの細胞質ドメインと結合した。
【図面の簡単な説明】
【0143】
【図1】図1は、活性化T細胞の増殖へのRANK-FcおよびhRANKLの影響について示している。ヒト末梢血液T細胞を実施例12に記載の方法に従って培養し;生きたT細胞の回収率をトリパンブルー計数を3回行うことによって測定した。
【図2】図2は、ヒトのDCクラスター形成を誘導するRANKLの能力について、示している。機能的に成熟した樹状突起細胞(dendritic cells)(DC)をインビトロでCD34 骨髄(BM)始原細胞から生成させ、実施例13記載の方法に従って培養した。CD1aDCを、サイトカイン混液単独(図2A)中、混液+CD40L(図2B)、RANKL(図2C)または加熱不活性化(ΔH)RANKL(図2D)中で培養し、次いで、反転顕微鏡を用いて写真撮影した。
【図3】図3は、RANKLがDCの同種刺激能力(allo-stimulatory capacity)を強化することについて、示している。同種(allogenic)T細胞を、実施例13記載の方法に従って培養された様々な数の照射DCと共にインキュベートした。培地は、[H]−チミジンでパルス標識し、細胞を計数用ガラス繊維シート上に集めた。値は、3回の培養の平均±標準偏差(SD)を表している。
【図4】図4は、ヒトRANKとその他のTNFRファミリー構成員の、構造的に保存された細胞外のシステインに富むシュードリピート領域内のアライメントを、示している。予想されるジスルフィド結合(DS1−DS3)を示す。RANKおよびCD40は、第二のシュードリピート中のDS2をなくすような同一のアミノ酸置換(C^H、C^G)を含む。
【図5−1】図5は、ヒトのRANKLとその他のTNFファミリー構成員とのアライメントを示している。
【図5−2】図5は、ヒトのRANKLとその他のTNFファミリー構成員とのアライメントを示している。

【特許請求の範囲】
【請求項1】
(a) 配列番号6に示したアミノ酸配列を持つタンパク質をコードするDNAであって、該タンパク質は、配列番号6のアミノ酸1とアミノ酸33の間のアミノ酸(アミノ酸1および33を含む)からなる群から選択されたアミノ末端、ならびにアミノ酸196とアミノ酸616の間のアミノ酸(196および616を含む)からなる群より選択されたカルボキシ末端を持つ、上記のタンパク質をコードするDNA;
(b) 配列番号15に示したアミノ酸配列を持つタンパク質をコードするDNAであって、該タンパク質は、配列番号15のアミノ酸1とアミノ酸31の間のアミノ酸(アミノ酸1および31を含む)からなる群より選択されたアミノ末端、ならびにアミノ酸197とアミノ酸625の間のアミノ酸(197および625を含む)からなる群より選択されたカルボキシ末端を持つ、上記のタンパク質をコードするDNA;
(c) 50℃、5×SSCで一晩という条件を含む、ストリンジェント条件下で(a)または(b)のDNAにハイブリダイゼーションする能力を持ち、生物学的に活性なRANKをコードするDNA分子;および
(d) (a)、(b)または(c)のDNAによってコードされたタンパク質のフラグメントをコードするDNA分子、ここにおいて、上記フラグメントは生物学的に活性である:
からなる群より選択される単離されたDNA。
【請求項2】
天然型RANKとアミノ酸配列に関して少なくとも約80%の同一性を有するRANKポリペプチドをコードする、請求項1記載の単離されたDNA。
【請求項3】
可溶性RANKポリペプチドをコードする、請求項1または2記載の単離されたDNA。
【請求項4】
さらに、イムノグロブリンFcドメイン、イムノグロブリンFcムテイン、FLAGTMタグ、少なくとも約6のHis残基を含むペプチド、ロイシンジッパーおよびそれらの組み合わせ、からなる群より選択されたポリペプチドをコードするDNAを含む、請求項3記載の単離されたDNA。
【請求項5】
請求項1ないし4のいずれか1項に記載のDNA配列を含む、組換え発現ベクター。
【請求項6】
請求項5記載の発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項7】
請求項6記載の宿主細胞を、発現を促進する条件下で培養し、そしてRANKを回収することを含む、RANKタンパク質の調製方法。
【請求項8】
配列番号5のヌクレオチド残基39−1886または配列番号14のヌクレオチド残基1−1878のフラグメントである、少なくとも約17ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチド、少なくとも約25ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチド、および少なくとも約30ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドからなる群より選択された、単離されたDNA。
【請求項9】
(a) 配列番号6のアミノ酸33から196のアミノ酸配列を持つポリペプチド;
(b) 配列番号15のアミノ酸31から197のアミノ酸配列を持つポリペプチド;
(c) ストリンジェント条件下で(a)または(b)のタンパク質をコードするDNAとハイブリダイゼーションする能力を持つDNAによってコードされる、生物学的に活性である、RANKポリペプチド;および、
(d) 生物学的に活性である、(a)、(b)または(c)のポリペプチドのフラグメント;
からなる群より選択された、単離されたRANKポリペプチド。
【請求項10】
配列番号6または配列番号15と少なくとも約80%同一であるアミノ酸配列を持つ、請求項9記載のタンパク質。
【請求項11】
可溶性のRANKである、請求項9または10に記載のタンパク質。
【請求項12】
さらに、イムノグロブリンFcドメイン、イムノグロブリンFcムテイン、FLAGTMタグ、少なくとも約6のHis残基を含むペプチド、ロイシンジッパーおよびそれらの組み合わせからなる群より選択されたペプチドを含む、可溶性RANKタンパク質。
【請求項13】
請求項9記載のRANKポリペプチドと免疫反応する抗体。
【請求項14】
モノクローナル抗体である、請求項13記載の抗体。
【請求項15】
NF−κBの活性化を阻害する方法であって、膜関連RANKを発現する細胞を可溶性RANKとin vitroで接触させて、可溶性RANKをRANKLへ結合させ、そして上記細胞へのRANKLの結合を阻害することを含む、上記のNF−κB活性化阻害方法。
【請求項16】
NF−κBの活性化を阻害する方法に使用するための、可溶性RANKを含む組成物であって、前記方法は、膜関連RANKを発現する細胞を前記組成物と接触させて、可溶性RANKをRANKLへ結合させ、そして上記細胞へのRANKLの結合を阻害することを含む、前記組成物。
【請求項17】
免疫応答または炎症応答を調節する方法に使用するための、可溶性RANKポリペプチドを含む組成物であって、前記方法は、前記組成物を免疫応答または炎症応答の危険性を有する個人に投与し、そして可溶性RANKをRANKLへ結合させて、RANKを発現する細胞へのRANKLの結合を阻害することを含む、前記組成物。
【請求項18】
NF−κB活性化の阻害を介しての抗炎症反応の阻害剤を検出するための、あるいはRANKポリペプチドに結合できる分子を検出するためのスクリーニング方法であって、請求項1−4のいずれか1項にコードされるDNAによってコードされる精製RANKポリペプチドを用いることを含む、前記スクリーニング方法。
【請求項19】
RANK活性に拮抗または作動する分子の能力を決定するための方法であって、請求項1−4のいずれか1項にコードされるDNAによってコードされる精製RANKポリペプチドを用いることを含む、前記方法。

【図1】
image rotate

【図2】
image rotate

【図3】
image rotate

【図4】
image rotate

【図5−1】
image rotate

【図5−2】
image rotate


【公開番号】特開2008−113656(P2008−113656A)
【公開日】平成20年5月22日(2008.5.22)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2007−266393(P2007−266393)
【出願日】平成19年10月12日(2007.10.12)
【分割の表示】特願2006−203204(P2006−203204)の分割
【原出願日】平成9年12月22日(1997.12.22)
【出願人】(591123609)イミュネックス・コーポレーション (24)
【氏名又は名称原語表記】IMMUNEX CORPORATION
【Fターム(参考)】