ＮＫ細胞の増殖
閉鎖型細胞培養システムにおける、ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞の大規模増殖および同時活性化のための方法であって、該増殖した細胞が増加した細胞傷害性を示す方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、細胞培養および免疫療法、特に、治療に使用するためのナチュラルキラー細胞(以下、ＮＫ細胞と記す）およびナチュラルキラー様Ｔ細胞（以下、ＮＫＴ細胞と記す）細胞の大規模増殖および同時活性化に関する。該細胞を、閉鎖型自動化培養システム、例えばバイオリアクターを用いて増殖させる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
癌に対する細胞免疫療法の使用は、１９８０年代半ばにリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞が導入されて以来、徹底して調査されている（Grimm EA. et al., 1982; Rosenberg S., 1985）。
【０００３】
最も研究された手法の１つは、移植片対腫瘍（ＧｖＴ）効果をもたらし腫瘍細胞を殺す可能性のある、自己（autologous）または同種異系（allogeneic）の細胞傷害性エフェクターの養子移植であった。可能性のある抗腫瘍効果を有する種々のエフェクター集団のうち、ＮＫおよびＮＫＴ細胞は、それらの高い細胞傷害能により注目されている（Sutlu T and Alici E., 2009）。
【０００４】
ＮＫおよびＮＫＴ細胞は通常、末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）およびＬＡＫ細胞のようなエフェクター細胞調製物中に少数しか存在しない。故に、健常なドナー（Carlens S. et al., 2001 および US 10／242,788）ならびにＢ細胞慢性リンパ性白血病を有する患者（Guven H. et al., 2003）および多発性骨髄腫（ＭＭ）を発症した患者（Alici E. et al., 2008）由来のＰＢＭＣを用いて細胞培養フラスコ中、ポリクローナルＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞の増殖を可能とする、現在の良好な製造法であるｃＧＭＰ適合の成分を含む方法が開発されている。これらの細胞は、臨床の場で評価される可能性を開く、ヒト腫瘍のインビトロモデルおよび実験モデル（Guimaraes F. et al., 2006）において、新鮮なヒト腫瘍細胞に対して特定の細胞傷害活性を発揮することが示されている。しかしながら、従来のフラスコベースの培養は、多大な労力を要し、かつ扱いにくく、故に、実際に扱える細胞数に限りがある。エフェクター細胞調製物を対象とする既報のプロトコール（例えば、Miller JS. et al., 1994；Pierson BA. et al., 1996；Luhm J. et al., 2002；Klingermann HG and Martinson J., 2004）は、培養前のＮＫ前駆体またはＣＤ５６の単離、およびフィーダー細胞またはｃＧＭＰ不適合成分の使用のような工程も含む。これらの不都合は、既報のプロトコールが大規模な臨床研究を支持するのに至適ではなく、かつ実施不能であることを示す。
【０００５】
さらに、細胞培養フラスコ中でのＮＫ細胞の増殖は、外部物質への暴露および汚染の固有のリスクを有する。このリスクは、ＧＭＰ適合の実験室環境で最小化されるが、閉鎖型自動化システムの使用は、それが十分量の細胞を供給する限り間違いなく好ましい。
【０００６】
造血細胞はせん断に比較的感受性であるため、高せん断処理は、エクスビボ増殖には好ましくない（Nielsen, 1999）との仮定は当然である。故に、外部フィルターおよび高流速に依存する振盪タンク型バイオリアクター（Pierson. et al., 1996）またはかん流培養システムは、高効率を達成する可能性が低い。
【０００７】
癌の処置用の免疫療法に基づくＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞を用いる多くの有望な方法がある。しかしながら、ＧＭＰ適合の閉鎖系でのこれらのエフェクター細胞のエクスビボ増殖および活性化は、臨床的な使用機会を増加させるための非常に重要な因子である。
【０００８】
ＮＫ細胞をエクスボビで増殖および／または活性化するための他の研究者による試みもされており、精製／静止に用いる複数の処理オプションがあり、短時間でまたは高度に精製され、かつ長時間活性化されるＮＫ細胞が研究されている。これらの研究は、ＮＫ細胞注入が良好な耐容性を示し、部分的に有効であることを報告する。しかし、エフェクター細胞調製に一般的に用いられるプロトコールは、培養前のＮＫ前駆体またはＣＤ５６の単離、およびフィーダー細胞および／またはｃＧＭＰ不適合成分の使用のようなさらなる工程を含む。これらの不都合は、かかるプロトコールを、ＧＭＰ適合生産に適当ではなく、大規模な臨床研究を支持することを不可能にする。
【０００９】
上記の報告の詳細な評価は、ＮＫ細胞の最適化エクスビボ増殖のための自動化法の必要性を示す。常套のフラスコベースの培養の１つの問題は、規模に関し、すなわち細胞数がフラスコ操作の煩雑さのために制限されることに関する。さらに、細菌感染の危険性は、該システムが培地交換や細胞の分配時に周囲環境に曝されるために、極めて高い。解決されるべきさらなる問題には、費用対効果が高く、取り扱いが容易で、明確に定義されたｃＧＭＰ品質の成分を含む、エフェクター細胞の増殖法の開発が含まれる。好ましくは、培養システムはまた、動物由来成分およびフィーダー細胞を含まない。
【発明の概要】
【００１０】
発明の概要
本発明は、細胞治療薬として使用されるべき、ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞の大規模増殖および同時活性化のための閉鎖型システムに関する。特に、本発明は、表現型ＣＤ３−ＣＤ５６＋のＮＫ細胞および表現型ＣＤ３＋ＣＤ５６＋のＮＫＴ細胞の大規模増殖および同時活性化のための方法であって、該増殖細胞が、同一または類似の条件下で、例えばフラスコのような常套法を用いて培養された細胞と比較して、増加した細胞傷害性を示す方法を開示する。本発明の方法は、発明の詳細な説明、非限定的実施例および特許請求の範囲にさらに開示され得る。
【００１１】
本発明者らは、閉鎖型システムを用いる大規模ＮＫ細胞増殖の実現可能性を調査した。２つの異なる閉鎖型システム（細胞培養バッグおよび自動化バイオリアクター）を、ＮＫ細胞の大規模生産が免疫療法に用いられるのを可能とする自動化ＧＭＰ適合プロトコールを開発する目的で、健常なドナーおよび多発性骨髄腫（ＭＭ）の患者由来のＰＢＭＣを用いて、常套の細胞培養フラスコと比較して評価した。
【００１２】
同時に、本発明者らは、癌患者の第Ｉ相臨床試験での同種異型処置におけるこの細胞薬の安全性評価を成功裏に完了した（Barkholt L. et al., 2009）。
【００１３】
本発明の第一の態様によれば、特定の細胞タイプの大規模増殖および同時活性化のための方法を提供し、ここで、閉鎖型細胞培養系を用い、この方法によって得られた増殖した細胞は、インビトロの細胞傷害性試験で決定される通り増加した細胞傷害性を示す。好ましくは、該細胞型は、表現型ＣＤ３−ＣＤ５６＋のＮＫ細胞および／または表現型ＣＤ３＋ＣＤ５６＋のＮＫＴ細胞である。
【００１４】
好ましい態様によれば、本発明の方法は、該細胞を、血清、インターロイキン−２（ＩＬ−２）および抗ＣＤ３抗体を補充した増殖培地を含む該閉鎖システムに添加し；該細胞を、増殖した細胞集団の少なくとも３５％が活性化ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞となるまで振盪(agitation)および加熱して該システム内で増殖させ；該増殖した細胞が、インビトロ細胞傷害性試験で決定される通り増加した細胞傷害性を示す工程を含む。
【００１５】
記載した方法の一態様によれば、血清は、ヒト血清および自己血清からなる群から選択される。培地には、約５０ないし約１５００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２、約１ないし約５０ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体および約１ないし約４０％の血清を補充する。
【００１６】
別の態様によれば、振盪および加熱を以下の条件下で行う：約３６−４０℃の温度；約４．７−５．１％のＣＯ２濃度；および、細胞が閉鎖型細胞システムの表面に付着できる速度および角度での穏やかな振盪。振盪を、約４−８／分の振盪速度、および約４−８°の振盪角度で行う。
【００１７】
増殖は、好ましくは、全細胞数が、少なくとも１０倍に増すか、または増殖した細胞集団の少なくとも約５０％が活性化ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞それぞれを含むまで行われる。
【００１８】
該細胞を増殖させるために用いる細胞サンプルは、好ましくは、末梢血、細胞株またはサイトカインで刺激した末梢血のサンプルである。最も好ましくは、細胞サンプルは、末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）サンプルである。
【００１９】
該方法の一態様によれば、細胞サンプルを健常な対象から集める。
【００２０】
別の態様によれば、細胞サンプルを、腫瘍を有する対象、好ましくは血液系腫瘍および固形腫瘍からなる群から選択される腫瘍を有する対象から集める。
【００２１】
別の態様によれば、細胞は、主に、表現型ＣＤ３−ＣＤ５６＋のＮＫ細胞で構成される。
【００２２】
閉鎖型細胞システムに最初に添加される細胞の濃度は、好ましくは、増殖培地１ｍｌ当たり、約０．５ｘ１０６ないし約２ｘ１０６である。
【００２３】
本発明の一態様において、本発明の方法は、１日当たり、全培養量の約５０％に相当する量の血清およびＩＬ−２を補充した培地を添加し、該閉鎖型細胞システムから１日当たりおよそ同量の増殖培地を捨てる工程をさらに含み、ここで該工程は、全細胞密度が、最初の細胞密度の少なくとも約１．５倍に増大したときに行われる。
【００２４】
好ましくは、該工程は、全細胞密度が、最初の細胞密度から少なくとも約３００％増大したときに行われ、その場合は、全培養量の約７５％を交換する。
【００２５】
別法として、該工程は、全細胞密度が、最初の細胞密度から少なくとも約５００％増大したときに行われ、その場合は、全培養量の約１００％を交換する。
【００２６】
さらに別の態様によれば、上記の態様の１つ以上を自由に組合せて、細胞を少なくとも約１０日間インキュベートする。
【００２７】
一態様によれば、閉鎖型細胞システムは予め滅菌したバッグである。
【００２８】
別の態様によれば、該閉鎖型細胞システムは、バイオリアクターである。
【００２９】
本発明の別の態様は、増加した細胞傷害性を示す、表現型ＣＤ３−ＣＤ５６＋のＮＫ細胞および表現型ＣＤ３＋ＣＤ５６＋のＮＫＴ細胞の懸濁液である。
【００３０】
好ましくは、これらの細胞は、フラスコ中で増加させた細胞と比較して、インビトロ細胞傷害性試験で決定される通り、増加した細胞傷害性を示す。
【００３１】
本発明の表現型ＣＤ３−ＣＤ５６＋のＮＫ細胞および表現型ＣＤ３＋ＣＤ５６＋のＮＫＴ細胞の懸濁液中、増殖した細胞集団の少なくとも３５％、好ましくは少なくとも５０％は、活性化ＮＫ細胞からなる。
【００３２】
本明細書中、バイオリアクターは、再利用可能な自動チャンバーシステムであって、生物学的に活性な環境を支持する何らかの装置またはシステムを意味し得る。記載した本発明の範囲内において、用語バイオリアクターは、細胞培養に関して、細胞または組織を増殖させることを意図する装置またはシステムを意味する。バイオリアクターシステムの非限定的例は、GE−Healthcareから提供されるWave bioreactor system 2／10であるが、当業者は、他の供給者から提供される別のバイオリアクターを利用可能であることを理解し得るか、または本発明の方法を実行可能なバイオリアクターを構築可能である。
【００３３】
本明細書中、閉鎖型システムは、さらなる処理工程を経ることなくエクスビボで効率的かつ迅速に細胞を増殖させ得る中央の細胞培養バッグからなる細胞増殖チャンバーシステムである。
【００３４】
用語“細胞傷害性”は、細胞に対する傷害性を意味する。傷害性物質の例には、化学物質、または細胞傷害性Ｔ細胞、ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞のような細胞傷害性リンパ球のような免疫細胞が含まれる。ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞は、それらの高い細胞傷害能により注目される。
【００３５】
当業者は、利用可能な方法を用いて細胞傷害性を決定できる。細胞が増加した細胞傷害性を示すかどうかを決定する１つの方法は、標準的な４時間の５１Ｃｒ−放出アッセイを用いて、Ｋ５６２細胞に対する細胞媒介性細胞傷害のインビトロ分析を用いることである。あるいは、脱顆粒アッセイを用い得る。これらの両方法を、以下の実施例に記載する。
【００３６】
本明細書中、用語“活性化”および“活性化ＮＫ細胞”は、活性化シグナルを受容したＮＫ細胞を意味する。活性化ＮＫ細胞は、ＭＨＣクラスＩ発現が低下している細胞を殺し得る。
【００３７】
用語「ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞の“同時活性化”」は、細胞が、実質的に同時に、好ましくは、同じ細胞培養において、活性化されることを意味する。
【００３８】
それらの強力な細胞傷害活性および自己反応性の可能性を考慮して、ＮＫ細胞活性は、厳密に制御される。ＭＨＣクラスＩ発現を喪失したか、またはそれが異常な細胞を殺すために、ＮＫ細胞は活性化される必要がある。ＮＫ細胞は、種々の形態をとり得る活性化シグナルを受容しなければならず、中でもサイトカイン、Ｆｃ−受容体、活性化受容体および阻害性受容体が最も重要である。
【００３９】
本明細書中、用語“細胞増殖”は、一連の細胞分裂過程を経て、故に培養中に存在する細胞数が増大する細胞の培養に関する。故に、用語“ＮＫ細胞増殖”は、一連の細胞分裂過程を経て、故に培養中に存在する細胞数が増大するＮＫ細胞の培養に関する。用語“増殖したＮＫ細胞”は、ＮＫ細胞増殖を介して得られたＮＫ細胞に関する。より具体的には、一態様において、用語“増殖したＮＫ細胞”は、特定のｃＧＭＰグレードの環境およびｃＧＭＰグレードの培地中で増殖される、慢性的に活性化したＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞ならびに表現型ＣＤ３＋ＣＤ５６＋のＮＫＴ細胞のポリクローナル群に関する。
【００４０】
本明細書中、用語“エフェクター細胞”は、免疫系の細胞のような、刺激に応答して特定の機能を果たす細胞に関する。一態様において、エフェクター細胞は、細胞傷害能（すなわち、他の細胞に細胞死を誘導する能力）を有するリンパ球の一種である。別の態様は、分泌型抗体に積極的に関与するリンパ球である。エフェクター細胞の非限定的例は、ＮＫ細胞、Ｔ細胞およびＮＫＴ細胞である。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
図面の簡単な説明
【図１】図１Ａ−Ｄは、フラスコおよびバッグ（１Ａ）ならびにフラスコおよびバイオリアクター（１Ｂ）における増殖倍の比較、ならびにフラスコおよびバッグ（１Ｃ）ならびにフラスコおよびバイオリアクター（１Ｄ）における最終産物の純度を示す図である。
【図２】図２Ａ−Ｃは、異なる増殖プロトコールで増殖させた細胞の表現型（ＡおよびＢ）および細胞傷害活性（Ｃ）の比較を示す図である。
【図３】図３Ａ−Ｄは、フラスコと比較して、バイオリアクターで開始した細胞培養の増殖を示す図である。
【図４】図４Ａ−Ｂは、バイオリアクターおよびフラスコそれぞれで直接増殖させた細胞の機能的比較を示す図である。
【図５】図５は、バイオリアクターおよびフラスコそれぞれで直接増殖させたＮＫ細胞の表現型の比較を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
発明の詳細な説明
本発明を記載する前に、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲およびその均等物でのみ限定され得るから、本明細書で用いる専門用語は、特定の態様を記載する目的でのみ用いられ、限定すべきことを意図しないことが、理解されるべきである。
【００４３】
他に特に記載がなければ、本明細書で用いる用語および技術用語は、本発明が属する分野の当業者に通常理解される意味を有することを意図する。
【００４４】
本明細書および添付の特許請求の範囲に用いられる、単数形“ａ”、“ａｎ”および“ｔｈｅ”は、文中に他に明記されない限り、複数形も含むことに留意すべきである。
【００４５】
また、用語“約”は、適用されるとき、所定の値の＋／−２％、好ましくは、＋／−５％、最も好ましくは、＋／−１０％の数値の偏差を示すために用いる。
【００４６】
悪性疾患に罹患した患者に対するＮＫ細胞のエクスビボ増殖および再注入は、かかる疾患に対抗する新規かつ可能性のある興味深い治療方法を提供する。このための必要条件は、臨床用途の要求を満たすＮＫ細胞の増殖および使用の可能性である。本発明者らは、驚くべきことに、臨床適用のために大規模でＮＫ細胞を増殖させることができた。従って、臨床で適用可能なエフェクター集団に富むＮＫおよびＮＫＴ細胞の大規模製造のためのＧＭＰ適合自動化閉鎖型培養システムを提供する。
【００４７】
以下の実施例に示す通り、本発明の方法は、満足できる細胞傷害能（すなわち、他の細胞の細胞死を誘導する能力）を有するＮＫ細胞を増殖および活性化させる。他の細胞に対するＮＫ細胞の細胞傷害性は、例えば、活性化ＮＫ細胞に暴露する前後で細胞を計数する従来の方法により、容易に測定可能である。かかる方法は、当業者によく知られている。
【実施例】
【００４８】
実施例
１．末梢血由来のＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞のエクスビボ増殖
材料および方法
末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）のサンプリングおよび単離
バフィーコート、末梢血および血液成分（apheresis product）を、Karolinska University Hospital, Huddingeの血液バンクに登録された健常なドナーまたはＭＭ患者から得た。実験プロトコールは、倫理委員会の承認を得た。
【００４９】
末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）を、Lymphoprep （Nyegaard, Oslo, Norway）を用いる勾配遠心分離により単離した。ＰＢＭＣを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Gibco, Grand Island, NY, USA）で２回洗浄し、細胞の生存を、トリパンブルー色素排除試験により評価した。
【００５０】
増殖培地および細胞計数
全てのシステムに関して、５％ヒト血清（Biowhittaker−Cambrex, Walkersville, MD, USA）および５００Ｕ／ｍｌ ｒｈＩＬ−２（Proleukin（商標）, Novartis Pharmaceuticals, East Hanover, NJ, USA）を添加したCellGro SCGM血清不含有培地（CellGenix, Freiburg, Germany）を増殖培地として用いた。培養開始時、培地に、モノクローナル抗ＣＤ３抗体（Orthoclone OKT−3, Ortho Biotech, Raritan, NJ, USA）を終濃度１０ｎｇ／ｍｌでさらに添加した。全細胞数を、培養０日、５−６日、９−１０日、１４−１５日および２１日目にトリパンブルー色素を用いて細胞を染色して評価した。最終製品を、安全性、純度および同一性（細胞生存能および表現型）について評価した。細胞の絶対数を、全細胞数とフローサイトメトリー（BD FacsCalibur; BD Biosciences, San Jose, CA, USA）により決定されたこれらの亜集団の割合を乗ずることにより計算した。
【００５１】
細胞培養フラスコでの増殖
細胞培養フラスコ中での細胞傷害性細胞の増殖のための培養条件は、健常な個体由来のＰＢＭＣ（Carlens S. et al., 2001）に対して予め最適化した。簡単には、ＰＢＭＣを、Ｔ２５フラスコ（TPP, Trasadingen, Switzerland）中で、初め０．５ｘ１０６細胞／ｍｌの濃度で培養した。５日後、培養を、培養が終了するまでの間、５％ヒト血清およびＩＬ−２（５００Ｕ／ｍｌ）を含むがＯＫＴ−３を含まない新鮮な培地を２−３日毎に補充して行った。細胞増殖の接触阻止を阻止するため(Heiskala M. et al., 1987）、細胞を、より大きなフラスコ（T75 または T150: TPP, Trasadingen, Switzerland）に移すか、または必要なとき、複数のフラスコに移した。培地の補充において、細胞濃度を、１０日目までは０．５ｘ１０５細胞／ｍｌに、１０日目以降は１ｘ１０６細胞／ｍｌに合わせた。時には、細胞の一部を、扱いやすいフラスコ数に維持するために凍結した。
【００５２】
Waveのバイオリアクターシステムでの増殖
Waveのバイオリアクターは、温度およびＣＯ２が制御された、振とう加熱プラットホーム上に置く使い捨ての滅菌バッグ内で細胞を増殖させる細胞培養システムである。発明者らは、Waveのバイオリアクターシステム 2／10 （GE Healthcare, Somerset, NJ, USA）を用いた。このシステムでの本発明者らの以前の結果は、低容量および少数の細胞で培養を開始したとき不十分な効率を示した。しかし、ドナーの末梢血サンプル中の細胞数は、該バイオリアクターで直接培養を開始するのを可能にしない。故に、本発明者らは、最初の最適化実験においてフラスコ中で培養を開始し、十分な細胞数に達した時点のおよそ５日目に該細胞をバイオリアクターに移した。この日のバイオリアクター培養は、８００ｍｌ中に、２ｘ１０６細胞／ｍｌで開始した。
【００５３】
最後の立証実験において、ドナー由来の末梢血全血または血液成分を得て、培養を０日目からバイオリアクターで直接開始した。バイオリアクターの設定は、全ての時点で以下の通りであった：温度：３７℃、ＣＯ２：５％、気流：０．１、振とう速度：６／分、振とう角度：６°。細胞を１日おきにサンプリングし、計数し、さらなる培地供給を、細胞密度が３ｘ１０６細胞／ｍｌに達するまで行わなかった。以降、培養物に１日当たり５００ｍｌの培地を供給した（５０ｍｌ／回）。細胞が６ｘ１０６細胞／ｍｌの密度に達したとき、培地供給を７５０ｍｌ／日に増し、１ｘ１０７細胞／ｍｌに達した後に１０００ｍｌ／日に増した。
【００５４】
Vuelife（商標）バッグでの増殖
Vuelife（商標）(American Fluoroseal Corporation, MD, USA）は、生物学的、免疫学的および化学的に不活性なフッ素化エチレン−プロピレン製の滅菌細胞培養バッグである。それは、高度にガス透過性であり、光学的に透明である。Vuelife バッグ中での培養を、７２ｍｌのVuelife バッグを用いて、培地６０ｍｌ中に５ｘ１０５細胞／ｍｌで開始した。該バッグを、３７℃および５％ＣＯ２で加湿インキュベーター中でインキュベートした。新鮮な培地を２−３日毎に添加して、１０日目まで１ｘ１０６細胞／ｍｌの濃度に調節し、１０日目以降、２ｘ１０６細胞／ｍｌの濃度に調節した。必要なとき、細胞をより大きなバッグに分割した。
【００５５】
２．フローサイトメトリーによるリンパ球サブセットおよび
表現型の分析
材料および方法
細胞の表現型および亜集団の割合を、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ４５およびＣＤ５６に対するｍＡｂｓと結合した蛍光色素を用いて、標準法により、培養０日目、５−６日目、９−１０日目、１４−１５日目および２０日目にフローサイトメトリーによって分析した。
【００５６】
最初の最適化実験において、各増殖条件からの０日目および２０日目の細胞を、より詳細な免疫表現型分析に付した。細胞収集中の変動を避けるために、全ての凍結サンプルを、フローサイトメトリーによりＮＫ細胞サブセットの詳細な表現型特性化を行うために同時に解凍した。このパネルは、以下の表面抗原：ＣＤ１１ａ（ＨＩ１１１）、ＣＤ３（ＵＣＨＴ−１）、ＣＤ７（Ｍ−Ｔ７０１）、ＣＤ１４（ＭＯＰ９）、ＣＤ１６（３Ｇ８）、ＣＤ１９（ＨＩＢ１９）、ＣＤ２５（Ｍ−Ａ２５１）、ＣＤ２７（Ｍ−Ｔ２７１）、ＣＤ５６（Ｂ１５９）、ＣＤ５７（ＮＫ−１）、ＣＤ２２６（ＤＸ１１）、ＮＫＢ１（ＤＸ９）およびＣＤ６２Ｌ（ＤＲＥＧ５６）（BD Biosciences, San Jose, CA, USAから購入）；ＣＤ２４４（２Ｂ４）（Ｃ１．７）、ＮＫＧ２Ｄ（ＯＮ７１）、ＮＫｐ３０（Ｚ２５）、ＮＫｐ４４（Ｚ２３１）、ＮＫｐ４６（ＢＡＢ２８１）（Beckman Coulter Inc., Fullerton, CA, USAから購入）；ＮＫＧ２Ａ（１３１４１１）、ＮＫＧ２Ｃ（１３４５９１）、ＫＩＲ２ＤＬ１（１４３２１１）、ＫＩＲ２ＤＬ３（１８０７０１）（R＆D Systems, Minneapolis, MN, USAから購入）に対するｍＡｂｓと結合した蛍光色素を含んだ。
【００５７】
フローサイトメトリー用の全ての抗体染色は、以下のプロトコールに従って行った。細胞をＰＢＳで１回洗浄し、適当量の抗体と共に４℃で３０分間インキュベートした。その後、データ収集前に、標識した細胞をＰＢＳで洗浄し、４％ＰＦＡで固定化した。データ収集を、FACSCalibur（ＢＤ）またはCyFlow ML（Partec GmbH, Munster, Germany）で行い、データをCellQuestまたはFloMaxソフトウェアで分析した。分析に関して、ＣＤ１４−ＣＤ１９−リンパ球集団付近の適当なＳＳＣ／ＦＳＣゲートを用いた。ＮＫ細胞は、ＣＤ３−ＣＤ５６＋集団としてゲートを通した。ＮＫＴ細胞およびＴ細胞は、ＣＤ３＋ＣＤ５６＋およびＣＤ３＋ＣＤ５６−集団としてそれぞれゲートを通した。
【００５８】
各細胞表面受容体を分析するために、平均蛍光強度（ＭＦＩ）値を、０日目および２０日目のサンプルで計測した。受容体発現の変化を概算するために、本発明者らは、各受容体についてＭＦＩ比（ＭＦＩｄａｙ２０／ＭＦＩｄａｙ０）を計測した。２０日目のサンプルのＭＦＩが０日目のものよりも高かったとき、ＭＦＩ比は１より大きく、それは、その受容体の上方制御の相対的程度を示す。同様に、ＭＦＩ比が１以下のときは、その受容体の発現が下方制御されたと解釈した。
【００５９】
３．細胞媒介性細胞傷害の評価
材料および方法
最終産物の細胞傷害能を、Ｋ５６２細胞に対する標準的な４時間の５１Ｃｒ−放出アッセイを用いてインビトロで評価した（Aktas E. et al., 2009; Alter, G. et al., 2004）。簡単には、Ｋ５６２標的細胞を、３７℃で１時間かけて１００μＣｉの５１Ｃｒで標識し、ＰＢＳで２回洗浄し、ＲＰＭＩ培地に再懸濁した。１００μｌのＲＰＭＩ培地中、全量３ｘ１０４の標的細胞を、Ｖ底型の９６ウェルプレートにトリプリケートで播種し、エフェクター：標的比が１：３ないし１０：１となるよう適当な濃度で１００μｌのエフェクター細胞と共に４時間インキュベートした。上清のアリコートを、Packard Cobra Auto−Gamma 5000 Series Counting System （Meridien, CT, USA）を用いてカウントした。特異的な５１Ｃｒ放出の割合を、式に当てはめて計算した：特異的放出割合＝［（実験による放出−非特異的放出）／（最大放出−非特異的放出）］ｘ１００。
【００６０】
ＮＫ細胞脱顆粒の分析
増殖産物を、丸底９６ウェルプレート中で、３７℃および５％ＣＯ２で６時間、終量２００μｌ中に１：１比でＫ５６２標的細胞と共にインキュベートした。蛍光色素結合抗ＣＤ１０７ａ ｍＡｂまたは対応するＩｇＧ１イソ型対照を、アッセイの開始時に添加した。１時間、共にインキュベーション後、Monensin (GolgiStop, Becton Dickinson）を、１：１００希釈して添加した。表面染色を、抗ＣＤ３および抗ＣＤ５６ ｍＡｂｓと共に氷上で３０分間インキュベートして行った。その後、細胞を洗浄し、ＰＢＳに再懸濁し、フローサイトメトリーで直ちに分析した。
【００６１】
４．統計的分析
データ分析、グラフの作成および統計比較を、GraphPad Prism ソフトウェア(GraphPad Software Inc. CA, USA）を用いて行った。
【００６２】
結果
細胞培養バッグおよびバイオリアクターのＮＫ細胞増殖に関する評価
ＮＫ細胞の増殖に関して閉鎖型培養システムを利用する試みにおいて、本発明者らは、初めに、５名の健常なドナー由来のＰＢＭＣを用いて、細胞培養バッグとフラスコを比較した。図１Ａは、増殖期の最後での各ドナー由来のバルク細胞ならびにＮＫおよびＮＫＴ細胞の増殖倍率を示す。平均バルク細胞増殖は、バッグにおいて５３０倍であり、一方、フラスコにおいて平均１１００倍の増殖が得られた。バッグ中でのＮＫ細胞増殖は、とりわけ、５名中３名のドナーで、フラスコでの培養と比較したとき有利に見えた。しかしながら、最終産物中のＮＫ細胞の割合を考慮したとき（図１Ｃ）、バッグ中での増殖は、フラスコ中での増殖と相関せず、培養終了時点でより低いＮＫ細胞純度となり得ることが分かった。バッグ中の最終産物は、ＮＫ細胞を平均３１％含み、一方で、フラスコの最終産物中のＮＫ細胞割合は５３％であった。
【００６３】
フラスコと同程度かつ対応する収率をもたらす閉鎖型増殖システムの探索において、発明者らは、５名の健常なドナー由来のＰＢＭＣを用いて、フラスコでの増殖と比較した自動化バイオリアクターシステムの使用を評価した。発明者らは、バルク細胞の増殖を観察し（平均増殖：フラスコ：７７０倍、バイオリアクター：７７倍）、一方で、ＮＫ細胞が優先的に増殖し、両条件下で全体に占めるＮＫ細胞の割合を増加させた。ＮＫ細胞の増加倍率（図１Ｂ）は、５名中４名のドナーでフラスコでの増加よりも低かったが、最終産物中のこれらの亜集団の割合は、フラスコ増殖とより同程度かつ対応していた（図１Ｄ）。増殖プロトコールの最終産物は、バイオリアクター中で平均３８％のＮＫ細胞を有し、一方、フラスコ中で４４％のＮＫ細胞および１６％が存在した。
【００６４】
バッグについての上記の結果と比較したとき、バイオリアクターでのＮＫ細胞の割合は、このドナー集団が、フラスコ増殖でのＮＫ細胞の純度が悪かったという事実にもかかわらず、バッグでのＮＫ細胞の割合よりも高かった。まとめると、上記の結果は、ＮＫ細胞の増殖はバッグでの方がより増加し、一方、その純度は、バイオリアクターでの増殖がわずかに高いことを示唆する。
【００６５】
異なるドナー群の使用およびＮＫ細胞増殖の個人差の高さ故に、バッグとバイオリアクターシステムの相対的効率を直接見いだすことは不可能であった。これらの異なる群中の５名のドナーのうち２名が、実際に同一の個人であった（ドナー１および２）という事実によって、発明者らは、増殖効率を直接的に比較する機会を得た。増殖倍率が低かったが、バイオリアクターは、フラスコ（７４％）と比較して、最終産物中に同程度の割合のＮＫ細胞を有し（６４％）、バッグ（４７％）での増殖よりも高かった。ＮＫＴ細胞の場合には、３つ全てのシステムで５％にかなり近い割合であった。
【００６６】
これらの２名のドナー由来の増殖産物を、受容体発現の変化のパターンを観察するために、さらなる表現型分析に付した。通常通り個人差があったが、異なる最終産物中の受容体発現レベルの変化は、非常に似ていた（図２Ａおよび２Ｂ）。所定の受容体の上方または下方制御の程度は、培養プロトコールが用いられるかどうかに関わらず同じであることは、明確に理解され得る。
【００６７】
異なるシステムの最終産物中のＮＫ細胞が、同様の活性状態を保持し、同程度の細胞傷害性を示すかどうかを明らかにするために、発明者らは、ＮＫ感受性細胞株Ｋ５６２に対する最終産物の細胞傷害能を評価した（図２Ｃ）。本発明者らは、異なる条件下で増殖させた細胞調製物の細胞傷害活性の顕著な相違を見いださなかった。これらの結果は、検討した方法が、増加した細胞傷害能を有する細胞調製物を産生するのに十分であることを保証する。
【００６８】
バイオリアクターでのＮＫ細胞増殖法の検討
増殖法へのバイオリアクターの使用可能性を明らかにした後、本発明者らは、０日目からバイオリアクターで直接培養を開始するために、血液成分または末梢血全体を用いるｃＧＭＰ条適合件下で、バイオリアクターでの増殖法の検討を継続した。２名の健常なドナーおよび２名のＭＭ患者由来のＰＢＭＣを、この検討で用いた。比較のために、出発物質であるＰＢＭＣを、フラスコを並行して用いて増殖させた。図３は、バイオリアクターおよびフラスコ中の全てのドナーについてのバルク細胞およびリンパ球サブ集団の増殖曲線を示す。達した全細胞数は、バイオリアクター増殖で非常に多く、平均３７．５％純度であるが、フラスコでは４３％純度であった。ＮＫ細胞純度はバイオリアクターでわずかに低かったが、達したＮＫ細胞の最終的な数は、癌の免疫療法設定における増殖したＮＫ細胞の臨床使用を容易にするのに十分である。
【００６９】
バイオリアクター中で増殖したＮＫ細胞は、より高い細胞傷害能を示す
上記の実験において、増殖をフラスコで開始し、その後バイオリアクターに移したとき、本発明者らは、フラスコでの増殖と比較して、最終産物の細胞傷害能および表現型に相違を検出しなかった。興味深いことに、発明者らは、バイオリアクターで直接増殖を開始したとき、Ｋ５６２細胞に対する最終産物の細胞傷害活性が、４名中３名のドナーで、フラスコで増殖させた最終産物と比較して顕著に高かったことを見いだした（図４Ａ）。この現象をよく調べるために、本発明者らは、Ｋ５６２細胞に対する脱顆粒アッセイを行い、各リンパ球サブ集団中の脱顆粒細胞の割合を測定した（図４Ｂ）。驚くことに、本発明者らは、バイオリアクター増殖からのＮＫ細胞画分にて観察される脱顆粒の程度が、４名全てのドナーにおいてフラスコ増殖からのＮＫ細胞よりも顕著に高いことを見いだした。同様に、ＮＫＴ細胞画分の脱顆粒は、４名中３名のドナーで顕著に高かった。纏めると、これらの結果は、バイオリアクターで行われる増殖法が、ＮＫ細胞の細胞傷害能を上げる点で、より良いことを示唆する。
【００７０】
バイオリアクターおよびフラスコ増殖からの最終産物の細胞傷害能の相違を説明するために、発明者らは、マルチカラーフローサイトメトリーを用いてＮＫ細胞の詳細な表現型特性化を行った。図５は、バイオリアクターおよびフラスコ増殖からのＮＫ細胞上の種々の表面受容体の発現を示し、全てのドナーの結果をまとめて、バイオリアクター増殖とフラスコ増殖の表現型の比較全体図を示す。概して、最終産物中のＮＫ細ＳＳＳ胞は、何れの増殖システムを用いるかに関わらず同様であって、ＣＤ１１ｂ、ＮＫＧ２ＤおよびＮＫｐ４４の発現レベルがわずかであるが、顕著に異なる。ＮＫｐ４４の上方制御は、上昇した細胞傷害能の鍵となる要因の１つである。
【００７１】
この研究は、閉鎖型自動化システムでＧＭＰ適合品質のエフェクター細胞を生産し得る可能性を検討する試みにおいて、ヒトドナーのバルクＰＢＭＣに由来するＮＫおよびＮＫＴ細胞のエクスビボ増殖のための細胞培養フラスコ、バッグおよびバイオリアクターの使用を比較評価する。
【００７２】
発明者らは、細胞培養フラスコ中で活性化ＮＫ細胞の選択的富化を促進するＧＭＰ適合培養培地を以前に報告した（Carlens S. et al., 2001）。そこで、本発明者らは、臨床適用可能な、エフェクター集団に富む大規模ＮＫ細胞の調製のためのＧＭＰ適合品質の自動化閉鎖型培養システムを最適化する最終工程を示し（Miller JS. et al., 1994；Luhm J. et al., 2002；Klingemann HG and Martinson J., 2004；Koehl U. et al., 2005）、および／またはフィーダー細胞株の使用（Ishikawa E. et al., 2004；Torelli GF, et al., 2005）が、既報の通り、ＮＫ細胞増殖に広く用いられていたことを示した。この研究において、本発明者らは、ＮＫ細胞含有量および抗腫瘍活性（Bordignon C. et al., 1999）の両方に関して、如何なる単離工程も用いないが、ＬＡＫ（Ramsdell FJ and Golub SH., 1987）およびサイトカイン誘導性キラー（ＣＩＫ）細胞（Chan JK. et al., 2006；Lu PH and Negrin RS., 1994）とは別のＮＫ細胞に富む細胞集団をもたらすバルクＰＢＭＣを用いた。
【００７３】
本発明者らは、バッグおよびバイオリアクターシステムの両方が、ＮＫ細胞を増殖させることを証明した。この研究で利用される２つの閉鎖型システムの増殖率比較および最終製品純度の全体的な比較は、バッグと比較したとき、バイオリアクターシステムが、より高い純度を有する十分量のＮＫ細胞を提供し、さらに最終産物中のＴ細胞をより少なくすることを明らかにする。
【００７４】
驚くことに、本発明者らは、ＮＫ細胞活性が、フラスコからの増殖産物と比較して、バイオリアクターからの増殖産物で顕著に高いことを見いだした。受容体発現レベルとＫ５６２に対するＮＫ細胞の反応との相関関係は、ＣＤ１３２、ＣＤ２５、ＣＤ５７およびＮＫＧ２Ｃ発現レベルが、その反応と逆相関しており、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４およびＮＫｐ４６の発現レベルが、直接的に相関することを明らかにした。活性化ＮＫ細胞受容体ＮＫＧ２Ｃの発現で逆相関を観察することは珍しくないが、標的Ｋ５６２細胞が、そのリガンドＨＬＡ−Ｅの発現を欠失することが公知の通りであり、この場合にはあまり意味がない（Khalil−Daher I. et al., 1999）。ＮＫ細胞応答と相関する受容体の統計的分析により、ＮＫｐ４４は、反応に正に相関し、フラスコ増殖と比較したとき、バイオリアクター製品で顕著に高レベルで発現されることが明らかとなった。このことは、少なくとも１つには、バイオリアクター産物の高い細胞毒性能の観察を説明し得る。他のＮＣＲとは異なり、ＮＫｐ４４（Vitale M. et al., 1998）は、活性化ＮＫ細胞でのみ発現され、インビトロでのＩＬ−２刺激後に上方制御される（Biassoni R. et al., 2002）。故に、この場合、培養中にＩＬ−２がどのくらいの頻度で用いられているか、およびＮＫ細胞集団の活性化がどの程度かを、代理マーカーとして示し得る。従って、ＮＫｐ４４の上昇した発現は、常套の細胞培養フラスコよりもバイオリアクターで行われる増殖法に機能的意義を提供する。
【００７５】
実用性に関して、本発明者らは、当該全てのシステムには有利点と不利点があることを明らかにした。細胞培養フラスコでの増殖は、外部物質および汚染物質への暴露という固有の危険性がある。この危険性は、ＧＭＰ適合の実験室環境で最小化されるが、閉鎖型自動化システムの使用は、それが十分量の細胞を供給する限り好まれることは明らかである。フラスコでの培養開始は、多くの細胞を必要としないが、細胞は、取り扱い不可能な数のフラスコ数になるまで、増殖中、新しいフラスコに分けられる間、ある程度の濃度内に維持されなければならない（Heiskala M. et al., 1987）。培養はまた、小さなバッグ中で少量の細胞で開始可能であり、良好な増殖をもたらすが、ＮＫ細胞の純度は、他のシステムよりも低く、細胞は、２個以上のバッグに分けられる必要がある。しかし、バッグでの増殖は、さらなる装置に投資を必要とすることなく、標準的な細胞培養実験室で容易に最適化され得る。２種以上の増殖が、インキュベーターのスペースが限界でない限り、バッグを用いて同時に行われ得て、バイオリアクターは、機械の購入のために追加の投資を必要とするが、一度に一回の増殖に用いられ得る。
【００７６】
バイオリアクターは、要する時間が最小限であるために、最も実用的な方法である。しかしながら、このシステムの開始には多くの細胞が必要とされ、増殖率が低い。バイオリアクターの連続した振とう動作は、例えば均一な培養条件、サンプリングの容易さならびにｐＨおよび溶存酸素の測定のような良好な制御処理品質のような多くの利点を提供する、同時かつ同種の培養環境を確実にする。そのような同時培養条件の利用は、バイオリアクター中でより濃縮される細胞増殖が実行可能かどうかに関与する主な要因であるはずである。このことは、培地またはさらなる成分の無駄遣いを避け、処理全体の費用を劇的に減少させる。プロトコール毎に平均増殖曲線を用いて、本発明者らは、同程度のＮＫ細胞数を得るために、バイオリアクターシステムは、バッグに用いる培地成分のおよそ１／１０倍、およびフラスコに用いる培地成分の１／２５倍を用いることを概算した。培地およびサイトカインの消費は、フラスコでよりも多い（バッグのおよそ２．５倍）。
【００７７】
当然、エクスビボ培養のための同時バイオリアクターシステムの使用は、幾つかの要因が慎重に評価されることを要する。造血細胞培養は、せん断に比較的感受性であり、高せん断処理がエクスビボ増殖に不適当であるという仮定は合理的である（Nielsen LK., 1999）。従って、振盪タンク型バイオリアクター（Pierson BA. et al., 1996）または外部フィルターおよび高流速に依存するかん流培養システムは、高い効率を提供しない。バイオリアクターの最大限の利点を達成するために、培地を除去するための内部かん流フィルターを備える低せん断力生成システムの使用が望ましく（Nielsen LK., 1999）、この実験で用いるバイオリアクターシステムは、これらの予想に合致し得る。
【００７８】
慎重に考慮する別の要因は、培養環境で用いられる材料である。わずかな材料のみが、効率的な造血細胞の増殖を支持し得て、洗浄、滅菌および再利用のような要因が、それらのパフォーマンスにかなり影響を及ぼす（LaIuppa JA. et al., 1997）。従って、使い捨てで、かつ予め滅菌された適当な材料の使用が好ましい。この実験で用いるバッグおよびバイオリアクターシステムの両方が、この点で生産に好適である。
【００７９】
フラスコと比較するとき、観察される１つの違いは、バイオリアクターおよびバッグ増殖の最終産物中の細胞のわずかに低い生存率であった。このことは、主に、死んだ細胞が、フラスコ培養において２−３日毎に継続的に流されているという事実のためであり、培地を交換するとき、閉鎖型システムではかかる操作を伴わない。しかし、投与前に、培養終了時のＧＭＰ適合品質の洗浄工程を常に利用可能である。
【００８０】
問題とする全てのシステムは、特定の実施上の有利点および不利点がある。細胞培養フラスコ中のＮＫ細胞の増殖は、外部物質および汚染物質への暴露の固有の危険性を有する。この危険性は、ＧＭＰ適合実験室環境で最小化されるが、閉鎖型自動化システムの使用は、それが十分量の細胞を供給する限り、間違いなく好ましい。フラスコでの培養は、非常に少ない数の細胞で開始できるが、細胞は、取り扱い不可能なフラスコ数になるまで、増殖中、新しいフラスコに分けられる間、ある程度の濃度内に維持されなければならない。
【００８１】
培養はまた、小さなバッグ中で少量の細胞で開始可能で良好な増殖をもたらすが、ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞の純度は、他のシステムよりも低く、細胞は、２個以上のバッグに分けられる必要がある。バッグでの増殖は、さらなる装置に投資を必要とすることなく、標準的な細胞培養実験室で容易に最適化され得る。２個以上の増殖が、インキュベーターのスペースが限界でない限り、バッグを用いて同時に行われ得て、バイオリアクターは、一度に一回の増殖に用いられ得る。
【００８２】
結論として、本明細書に記載の結果は、適用可能な免疫療法適用に予想される使用のための大量の高度に活性化されたエフェクター細胞が、ＧＭＰ適合条件下で、閉鎖型培養システムで生産され得ることを、明確に証明する。
【００８３】
特定の態様が明細書中に詳細に記載されるが、これは説明のみを目的とし、例示として記載されたもので、添付の特許請求の範囲を限定することを意図しない。特に、種々の置換、変更および修正が、特許請求の範囲によって定義される本発明の精神および範囲から逸脱することなく本発明にされ得ることは、本発明者らにより考慮されている。
【００８４】
参考文献
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US 10/242,7881
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、細胞培養および免疫療法、特に、治療に使用するためのナチュラルキラー細胞(以下、ＮＫ細胞と記す）およびナチュラルキラー様Ｔ細胞（以下、ＮＫＴ細胞と記す）細胞の大規模増殖および同時活性化に関する。該細胞を、閉鎖型自動化培養システム、例えばバイオリアクターを用いて増殖させる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
癌に対する細胞免疫療法の使用は、１９８０年代半ばにリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞が導入されて以来、徹底して調査されている（Grimm EA. et al., 1982; Rosenberg S., 1985）。
【０００３】
最も研究された手法の１つは、移植片対腫瘍（ＧｖＴ）効果をもたらし腫瘍細胞を殺す可能性のある、自己（autologous）または同種異系（allogeneic）の細胞傷害性エフェクターの養子移植であった。可能性のある抗腫瘍効果を有する種々のエフェクター集団のうち、ＮＫおよびＮＫＴ細胞は、それらの高い細胞傷害能により注目されている（Sutlu T and Alici E., 2009）。
【０００４】
ＮＫおよびＮＫＴ細胞は通常、末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）およびＬＡＫ細胞のようなエフェクター細胞調製物中に少数しか存在しない。故に、健常なドナー（Carlens S. et al., 2001 および US 10／242,788）ならびにＢ細胞慢性リンパ性白血病を有する患者（Guven H. et al., 2003）および多発性骨髄腫（ＭＭ）を発症した患者（Alici E. et al., 2008）由来のＰＢＭＣを用いて細胞培養フラスコ中、ポリクローナルＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞の増殖を可能とする、現在の良好な製造法であるｃＧＭＰ適合の成分を含む方法が開発されている。これらの細胞は、臨床の場で評価される可能性を開く、ヒト腫瘍のインビトロモデルおよび実験モデル（Guimaraes F. et al., 2006）において、新鮮なヒト腫瘍細胞に対して特定の細胞傷害活性を発揮することが示されている。しかしながら、従来のフラスコベースの培養は、多大な労力を要し、かつ扱いにくく、故に、実際に扱える細胞数に限りがある。エフェクター細胞調製物を対象とする既報のプロトコール（例えば、Miller JS. et al., 1994；Pierson BA. et al., 1996；Luhm J. et al., 2002；Klingermann HG and Martinson J., 2004）は、培養前のＮＫ前駆体またはＣＤ５６の単離、およびフィーダー細胞またはｃＧＭＰ不適合成分の使用のような工程も含む。これらの不都合は、既報のプロトコールが大規模な臨床研究を支持するのに至適ではなく、かつ実施不能であることを示す。
【０００５】
さらに、細胞培養フラスコ中でのＮＫ細胞の増殖は、外部物質への暴露および汚染の固有のリスクを有する。このリスクは、ＧＭＰ適合の実験室環境で最小化されるが、閉鎖型自動化システムの使用は、それが十分量の細胞を供給する限り間違いなく好ましい。
【０００６】
造血細胞はせん断に比較的感受性であるため、高せん断処理は、エクスビボ増殖には好ましくない（Nielsen, 1999）との仮定は当然である。故に、外部フィルターおよび高流速に依存する振盪タンク型バイオリアクター（Pierson. et al., 1996）またはかん流培養システムは、高効率を達成する可能性が低い。
【０００７】
癌の処置用の免疫療法に基づくＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞を用いる多くの有望な方法がある。しかしながら、ＧＭＰ適合の閉鎖系でのこれらのエフェクター細胞のエクスビボ増殖および活性化は、臨床的な使用機会を増加させるための非常に重要な因子である。
【０００８】
ＮＫ細胞をエクスボビで増殖および／または活性化するための他の研究者による試みもされており、精製／静止に用いる複数の処理オプションがあり、短時間でまたは高度に精製され、かつ長時間活性化されるＮＫ細胞が研究されている。これらの研究は、ＮＫ細胞注入が良好な耐容性を示し、部分的に有効であることを報告する。しかし、エフェクター細胞調製に一般的に用いられるプロトコールは、培養前のＮＫ前駆体またはＣＤ５６の単離、およびフィーダー細胞および／またはｃＧＭＰ不適合成分の使用のようなさらなる工程を含む。これらの不都合は、かかるプロトコールを、ＧＭＰ適合生産に適当ではなく、大規模な臨床研究を支持することを不可能にする。
【０００９】
上記の報告の詳細な評価は、ＮＫ細胞の最適化エクスビボ増殖のための自動化法の必要性を示す。常套のフラスコベースの培養の１つの問題は、規模に関し、すなわち細胞数がフラスコ操作の煩雑さのために制限されることに関する。さらに、細菌感染の危険性は、該システムが培地交換や細胞の分配時に周囲環境に曝されるために、極めて高い。解決されるべきさらなる問題には、費用対効果が高く、取り扱いが容易で、明確に定義されたｃＧＭＰ品質の成分を含む、エフェクター細胞の増殖法の開発が含まれる。好ましくは、培養システムはまた、動物由来成分およびフィーダー細胞を含まない。
【発明の概要】
【００１０】
発明の概要
本発明は、細胞治療薬として使用されるべき、ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞の大規模増殖および同時活性化のための閉鎖型システムに関する。特に、本発明は、表現型ＣＤ３−ＣＤ５６＋のＮＫ細胞および表現型ＣＤ３＋ＣＤ５６＋のＮＫＴ細胞の大規模増殖および同時活性化のための方法であって、該増殖細胞が、同一または類似の条件下で、例えばフラスコのような常套法を用いて培養された細胞と比較して、増加した細胞傷害性を示す方法を開示する。本発明の方法は、発明の詳細な説明、非限定的実施例および特許請求の範囲にさらに開示され得る。
【００１１】
本発明者らは、閉鎖型システムを用いる大規模ＮＫ細胞増殖の実現可能性を調査した。２つの異なる閉鎖型システム（細胞培養バッグおよび自動化バイオリアクター）を、ＮＫ細胞の大規模生産が免疫療法に用いられるのを可能とする自動化ＧＭＰ適合プロトコールを開発する目的で、健常なドナーおよび多発性骨髄腫（ＭＭ）の患者由来のＰＢＭＣを用いて、常套の細胞培養フラスコと比較して評価した。
【００１２】
同時に、本発明者らは、癌患者の第Ｉ相臨床試験での同種異型処置におけるこの細胞薬の安全性評価を成功裏に完了した（Barkholt L. et al., 2009）。
【００１３】
本発明の第一の態様によれば、特定の細胞タイプの大規模増殖および同時活性化のための方法を提供し、ここで、閉鎖型細胞培養系を用い、この方法によって得られた増殖した細胞は、インビトロの細胞傷害性試験で決定される通り増加した細胞傷害性を示す。好ましくは、該細胞型は、表現型ＣＤ３−ＣＤ５６＋のＮＫ細胞および／または表現型ＣＤ３＋ＣＤ５６＋のＮＫＴ細胞である。
【００１４】
好ましい態様によれば、本発明の方法は、該細胞を、血清、インターロイキン−２（ＩＬ−２）および抗ＣＤ３抗体を補充した増殖培地を含む該閉鎖システムに添加し；該細胞を、増殖した細胞集団の少なくとも３５％が活性化ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞となるまで振盪(agitation)および加熱して該システム内で増殖させ；該増殖した細胞が、インビトロ細胞傷害性試験で決定される通り増加した細胞傷害性を示す工程を含む。
【００１５】
記載した方法の一態様によれば、血清は、ヒト血清および自己血清からなる群から選択される。培地には、約５０ないし約１５００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２、約１ないし約５０ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体および約１ないし約４０％の血清を補充する。
【００１６】
別の態様によれば、振盪および加熱を以下の条件下で行う：約３６−４０℃の温度；約４．７−５．１％のＣＯ２濃度；および、細胞が閉鎖型細胞システムの表面に付着できる速度および角度での穏やかな振盪。振盪を、約４−８／分の振盪速度、および約４−８°の振盪角度で行う。
【００１７】
増殖は、好ましくは、全細胞数が、少なくとも１０倍に増すか、または増殖した細胞集団の少なくとも約５０％が活性化ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞それぞれを含むまで行われる。
【００１８】
該細胞を増殖させるために用いる細胞サンプルは、好ましくは、末梢血、細胞株またはサイトカインで刺激した末梢血のサンプルである。最も好ましくは、細胞サンプルは、末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）サンプルである。
【００１９】
該方法の一態様によれば、細胞サンプルを健常な対象から集める。
【００２０】
別の態様によれば、細胞サンプルを、腫瘍を有する対象、好ましくは血液系腫瘍および固形腫瘍からなる群から選択される腫瘍を有する対象から集める。
【００２１】
別の態様によれば、細胞は、主に、表現型ＣＤ３−ＣＤ５６＋のＮＫ細胞で構成される。
【００２２】
閉鎖型細胞システムに最初に添加される細胞の濃度は、好ましくは、増殖培地１ｍｌ当たり、約０．５ｘ１０６ないし約２ｘ１０６である。
【００２３】
本発明の一態様において、本発明の方法は、１日当たり、全培養量の約５０％に相当する量の血清およびＩＬ−２を補充した培地を添加し、該閉鎖型細胞システムから１日当たりおよそ同量の増殖培地を捨てる工程をさらに含み、ここで該工程は、全細胞密度が、最初の細胞密度の少なくとも約１．５倍に増大したときに行われる。
【００２４】
好ましくは、該工程は、全細胞密度が、最初の細胞密度から少なくとも約３００％増大したときに行われ、その場合は、全培養量の約７５％を交換する。
【００２５】
別法として、該工程は、全細胞密度が、最初の細胞密度から少なくとも約５００％増大したときに行われ、その場合は、全培養量の約１００％を交換する。
【００２６】
さらに別の態様によれば、上記の態様の１つ以上を自由に組合せて、細胞を少なくとも約１０日間インキュベートする。
【００２７】
一態様によれば、閉鎖型細胞システムは予め滅菌したバッグである。
【００２８】
別の態様によれば、該閉鎖型細胞システムは、バイオリアクターである。
【００２９】
本発明の別の態様は、増加した細胞傷害性を示す、表現型ＣＤ３−ＣＤ５６＋のＮＫ細胞および表現型ＣＤ３＋ＣＤ５６＋のＮＫＴ細胞の懸濁液である。
【００３０】
好ましくは、これらの細胞は、フラスコ中で増加させた細胞と比較して、インビトロ細胞傷害性試験で決定される通り、増加した細胞傷害性を示す。
【００３１】
本発明の表現型ＣＤ３−ＣＤ５６＋のＮＫ細胞および表現型ＣＤ３＋ＣＤ５６＋のＮＫＴ細胞の懸濁液中、増殖した細胞集団の少なくとも３５％、好ましくは少なくとも５０％は、活性化ＮＫ細胞からなる。
【００３２】
本明細書中、バイオリアクターは、再利用可能な自動チャンバーシステムであって、生物学的に活性な環境を支持する何らかの装置またはシステムを意味し得る。記載した本発明の範囲内において、用語バイオリアクターは、細胞培養に関して、細胞または組織を増殖させることを意図する装置またはシステムを意味する。バイオリアクターシステムの非限定的例は、GE−Healthcareから提供されるWave bioreactor system 2／10であるが、当業者は、他の供給者から提供される別のバイオリアクターを利用可能であることを理解し得るか、または本発明の方法を実行可能なバイオリアクターを構築可能である。
【００３３】
本明細書中、閉鎖型システムは、さらなる処理工程を経ることなくエクスビボで効率的かつ迅速に細胞を増殖させ得る中央の細胞培養バッグからなる細胞増殖チャンバーシステムである。
【００３４】
用語“細胞傷害性”は、細胞に対する傷害性を意味する。傷害性物質の例には、化学物質、または細胞傷害性Ｔ細胞、ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞のような細胞傷害性リンパ球のような免疫細胞が含まれる。ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞は、それらの高い細胞傷害能により注目される。
【００３５】
当業者は、利用可能な方法を用いて細胞傷害性を決定できる。細胞が増加した細胞傷害性を示すかどうかを決定する１つの方法は、標準的な４時間の５１Ｃｒ−放出アッセイを用いて、Ｋ５６２細胞に対する細胞媒介性細胞傷害のインビトロ分析を用いることである。あるいは、脱顆粒アッセイを用い得る。これらの両方法を、以下の実施例に記載する。
【００３６】
本明細書中、用語“活性化”および“活性化ＮＫ細胞”は、活性化シグナルを受容したＮＫ細胞を意味する。活性化ＮＫ細胞は、ＭＨＣクラスＩ発現が低下している細胞を殺し得る。
【００３７】
用語「ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞の“同時活性化”」は、細胞が、実質的に同時に、好ましくは、同じ細胞培養において、活性化されることを意味する。
【００３８】
それらの強力な細胞傷害活性および自己反応性の可能性を考慮して、ＮＫ細胞活性は、厳密に制御される。ＭＨＣクラスＩ発現を喪失したか、またはそれが異常な細胞を殺すために、ＮＫ細胞は活性化される必要がある。ＮＫ細胞は、種々の形態をとり得る活性化シグナルを受容しなければならず、中でもサイトカイン、Ｆｃ−受容体、活性化受容体および阻害性受容体が最も重要である。
【００３９】
本明細書中、用語“細胞増殖”は、一連の細胞分裂過程を経て、故に培養中に存在する細胞数が増大する細胞の培養に関する。故に、用語“ＮＫ細胞増殖”は、一連の細胞分裂過程を経て、故に培養中に存在する細胞数が増大するＮＫ細胞の培養に関する。用語“増殖したＮＫ細胞”は、ＮＫ細胞増殖を介して得られたＮＫ細胞に関する。より具体的には、一態様において、用語“増殖したＮＫ細胞”は、特定のｃＧＭＰグレードの環境およびｃＧＭＰグレードの培地中で増殖される、慢性的に活性化したＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞ならびに表現型ＣＤ３＋ＣＤ５６＋のＮＫＴ細胞のポリクローナル群に関する。
【００４０】
本明細書中、用語“エフェクター細胞”は、免疫系の細胞のような、刺激に応答して特定の機能を果たす細胞に関する。一態様において、エフェクター細胞は、細胞傷害能（すなわち、他の細胞に細胞死を誘導する能力）を有するリンパ球の一種である。別の態様は、分泌型抗体に積極的に関与するリンパ球である。エフェクター細胞の非限定的例は、ＮＫ細胞、Ｔ細胞およびＮＫＴ細胞である。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
図面の簡単な説明
【図１】図１Ａ−Ｄは、フラスコおよびバッグ（１Ａ）ならびにフラスコおよびバイオリアクター（１Ｂ）における増殖倍の比較、ならびにフラスコおよびバッグ（１Ｃ）ならびにフラスコおよびバイオリアクター（１Ｄ）における最終産物の純度を示す図である。
【図２】図２Ａ−Ｃは、異なる増殖プロトコールで増殖させた細胞の表現型（ＡおよびＢ）および細胞傷害活性（Ｃ）の比較を示す図である。
【図３】図３Ａ−Ｄは、フラスコと比較して、バイオリアクターで開始した細胞培養の増殖を示す図である。
【図４】図４Ａ−Ｂは、バイオリアクターおよびフラスコそれぞれで直接増殖させた細胞の機能的比較を示す図である。
【図５】図５は、バイオリアクターおよびフラスコそれぞれで直接増殖させたＮＫ細胞の表現型の比較を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
発明の詳細な説明
本発明を記載する前に、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲およびその均等物でのみ限定され得るから、本明細書で用いる専門用語は、特定の態様を記載する目的でのみ用いられ、限定すべきことを意図しないことが、理解されるべきである。
【００４３】
他に特に記載がなければ、本明細書で用いる用語および技術用語は、本発明が属する分野の当業者に通常理解される意味を有することを意図する。
【００４４】
本明細書および添付の特許請求の範囲に用いられる、単数形“ａ”、“ａｎ”および“ｔｈｅ”は、文中に他に明記されない限り、複数形も含むことに留意すべきである。
【００４５】
また、用語“約”は、適用されるとき、所定の値の＋／−２％、好ましくは、＋／−５％、最も好ましくは、＋／−１０％の数値の偏差を示すために用いる。
【００４６】
悪性疾患に罹患した患者に対するＮＫ細胞のエクスビボ増殖および再注入は、かかる疾患に対抗する新規かつ可能性のある興味深い治療方法を提供する。このための必要条件は、臨床用途の要求を満たすＮＫ細胞の増殖および使用の可能性である。本発明者らは、驚くべきことに、臨床適用のために大規模でＮＫ細胞を増殖させることができた。従って、臨床で適用可能なエフェクター集団に富むＮＫおよびＮＫＴ細胞の大規模製造のためのＧＭＰ適合自動化閉鎖型培養システムを提供する。
【００４７】
以下の実施例に示す通り、本発明の方法は、満足できる細胞傷害能（すなわち、他の細胞の細胞死を誘導する能力）を有するＮＫ細胞を増殖および活性化させる。他の細胞に対するＮＫ細胞の細胞傷害性は、例えば、活性化ＮＫ細胞に暴露する前後で細胞を計数する従来の方法により、容易に測定可能である。かかる方法は、当業者によく知られている。
【実施例】
【００４８】
実施例
１．末梢血由来のＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞のエクスビボ増殖
材料および方法
末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）のサンプリングおよび単離
バフィーコート、末梢血および血液成分（apheresis product）を、Karolinska University Hospital, Huddingeの血液バンクに登録された健常なドナーまたはＭＭ患者から得た。実験プロトコールは、倫理委員会の承認を得た。
【００４９】
末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）を、Lymphoprep （Nyegaard, Oslo, Norway）を用いる勾配遠心分離により単離した。ＰＢＭＣを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Gibco, Grand Island, NY, USA）で２回洗浄し、細胞の生存を、トリパンブルー色素排除試験により評価した。
【００５０】
増殖培地および細胞計数
全てのシステムに関して、５％ヒト血清（Biowhittaker−Cambrex, Walkersville, MD, USA）および５００Ｕ／ｍｌ ｒｈＩＬ−２（Proleukin（商標）, Novartis Pharmaceuticals, East Hanover, NJ, USA）を添加したCellGro SCGM血清不含有培地（CellGenix, Freiburg, Germany）を増殖培地として用いた。培養開始時、培地に、モノクローナル抗ＣＤ３抗体（Orthoclone OKT−3, Ortho Biotech, Raritan, NJ, USA）を終濃度１０ｎｇ／ｍｌでさらに添加した。全細胞数を、培養０日、５−６日、９−１０日、１４−１５日および２１日目にトリパンブルー色素を用いて細胞を染色して評価した。最終製品を、安全性、純度および同一性（細胞生存能および表現型）について評価した。細胞の絶対数を、全細胞数とフローサイトメトリー（BD FacsCalibur; BD Biosciences, San Jose, CA, USA）により決定されたこれらの亜集団の割合を乗ずることにより計算した。
【００５１】
細胞培養フラスコでの増殖
細胞培養フラスコ中での細胞傷害性細胞の増殖のための培養条件は、健常な個体由来のＰＢＭＣ（Carlens S. et al., 2001）に対して予め最適化した。簡単には、ＰＢＭＣを、Ｔ２５フラスコ（TPP, Trasadingen, Switzerland）中で、初め０．５ｘ１０６細胞／ｍｌの濃度で培養した。５日後、培養を、培養が終了するまでの間、５％ヒト血清およびＩＬ−２（５００Ｕ／ｍｌ）を含むがＯＫＴ−３を含まない新鮮な培地を２−３日毎に補充して行った。細胞増殖の接触阻止を阻止するため(Heiskala M. et al., 1987）、細胞を、より大きなフラスコ（T75 または T150: TPP, Trasadingen, Switzerland）に移すか、または必要なとき、複数のフラスコに移した。培地の補充において、細胞濃度を、１０日目までは０．５ｘ１０５細胞／ｍｌに、１０日目以降は１ｘ１０６細胞／ｍｌに合わせた。時には、細胞の一部を、扱いやすいフラスコ数に維持するために凍結した。
【００５２】
Waveのバイオリアクターシステムでの増殖
Waveのバイオリアクターは、温度およびＣＯ２が制御された、振とう加熱プラットホーム上に置く使い捨ての滅菌バッグ内で細胞を増殖させる細胞培養システムである。発明者らは、Waveのバイオリアクターシステム 2／10 （GE Healthcare, Somerset, NJ, USA）を用いた。このシステムでの本発明者らの以前の結果は、低容量および少数の細胞で培養を開始したとき不十分な効率を示した。しかし、ドナーの末梢血サンプル中の細胞数は、該バイオリアクターで直接培養を開始するのを可能にしない。故に、本発明者らは、最初の最適化実験においてフラスコ中で培養を開始し、十分な細胞数に達した時点のおよそ５日目に該細胞をバイオリアクターに移した。この日のバイオリアクター培養は、８００ｍｌ中に、２ｘ１０６細胞／ｍｌで開始した。
【００５３】
最後の立証実験において、ドナー由来の末梢血全血または血液成分を得て、培養を０日目からバイオリアクターで直接開始した。バイオリアクターの設定は、全ての時点で以下の通りであった：温度：３７℃、ＣＯ２：５％、気流：０．１、振とう速度：６／分、振とう角度：６°。細胞を１日おきにサンプリングし、計数し、さらなる培地供給を、細胞密度が３ｘ１０６細胞／ｍｌに達するまで行わなかった。以降、培養物に１日当たり５００ｍｌの培地を供給した（５０ｍｌ／回）。細胞が６ｘ１０６細胞／ｍｌの密度に達したとき、培地供給を７５０ｍｌ／日に増し、１ｘ１０７細胞／ｍｌに達した後に１０００ｍｌ／日に増した。
【００５４】
Vuelife（商標）バッグでの増殖
Vuelife（商標）(American Fluoroseal Corporation, MD, USA）は、生物学的、免疫学的および化学的に不活性なフッ素化エチレン−プロピレン製の滅菌細胞培養バッグである。それは、高度にガス透過性であり、光学的に透明である。Vuelife バッグ中での培養を、７２ｍｌのVuelife バッグを用いて、培地６０ｍｌ中に５ｘ１０５細胞／ｍｌで開始した。該バッグを、３７℃および５％ＣＯ２で加湿インキュベーター中でインキュベートした。新鮮な培地を２−３日毎に添加して、１０日目まで１ｘ１０６細胞／ｍｌの濃度に調節し、１０日目以降、２ｘ１０６細胞／ｍｌの濃度に調節した。必要なとき、細胞をより大きなバッグに分割した。
【００５５】
２．フローサイトメトリーによるリンパ球サブセットおよび
表現型の分析
材料および方法
細胞の表現型および亜集団の割合を、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ４５およびＣＤ５６に対するｍＡｂｓと結合した蛍光色素を用いて、標準法により、培養０日目、５−６日目、９−１０日目、１４−１５日目および２０日目にフローサイトメトリーによって分析した。
【００５６】
最初の最適化実験において、各増殖条件からの０日目および２０日目の細胞を、より詳細な免疫表現型分析に付した。細胞収集中の変動を避けるために、全ての凍結サンプルを、フローサイトメトリーによりＮＫ細胞サブセットの詳細な表現型特性化を行うために同時に解凍した。このパネルは、以下の表面抗原：ＣＤ１１ａ（ＨＩ１１１）、ＣＤ３（ＵＣＨＴ−１）、ＣＤ７（Ｍ−Ｔ７０１）、ＣＤ１４（ＭＯＰ９）、ＣＤ１６（３Ｇ８）、ＣＤ１９（ＨＩＢ１９）、ＣＤ２５（Ｍ−Ａ２５１）、ＣＤ２７（Ｍ−Ｔ２７１）、ＣＤ５６（Ｂ１５９）、ＣＤ５７（ＮＫ−１）、ＣＤ２２６（ＤＸ１１）、ＮＫＢ１（ＤＸ９）およびＣＤ６２Ｌ（ＤＲＥＧ５６）（BD Biosciences, San Jose, CA, USAから購入）；ＣＤ２４４（２Ｂ４）（Ｃ１．７）、ＮＫＧ２Ｄ（ＯＮ７１）、ＮＫｐ３０（Ｚ２５）、ＮＫｐ４４（Ｚ２３１）、ＮＫｐ４６（ＢＡＢ２８１）（Beckman Coulter Inc., Fullerton, CA, USAから購入）；ＮＫＧ２Ａ（１３１４１１）、ＮＫＧ２Ｃ（１３４５９１）、ＫＩＲ２ＤＬ１（１４３２１１）、ＫＩＲ２ＤＬ３（１８０７０１）（R＆D Systems, Minneapolis, MN, USAから購入）に対するｍＡｂｓと結合した蛍光色素を含んだ。
【００５７】
フローサイトメトリー用の全ての抗体染色は、以下のプロトコールに従って行った。細胞をＰＢＳで１回洗浄し、適当量の抗体と共に４℃で３０分間インキュベートした。その後、データ収集前に、標識した細胞をＰＢＳで洗浄し、４％ＰＦＡで固定化した。データ収集を、FACSCalibur（ＢＤ）またはCyFlow ML（Partec GmbH, Munster, Germany）で行い、データをCellQuestまたはFloMaxソフトウェアで分析した。分析に関して、ＣＤ１４−ＣＤ１９−リンパ球集団付近の適当なＳＳＣ／ＦＳＣゲートを用いた。ＮＫ細胞は、ＣＤ３−ＣＤ５６＋集団としてゲートを通した。ＮＫＴ細胞およびＴ細胞は、ＣＤ３＋ＣＤ５６＋およびＣＤ３＋ＣＤ５６−集団としてそれぞれゲートを通した。
【００５８】
各細胞表面受容体を分析するために、平均蛍光強度（ＭＦＩ）値を、０日目および２０日目のサンプルで計測した。受容体発現の変化を概算するために、本発明者らは、各受容体についてＭＦＩ比（ＭＦＩｄａｙ２０／ＭＦＩｄａｙ０）を計測した。２０日目のサンプルのＭＦＩが０日目のものよりも高かったとき、ＭＦＩ比は１より大きく、それは、その受容体の上方制御の相対的程度を示す。同様に、ＭＦＩ比が１以下のときは、その受容体の発現が下方制御されたと解釈した。
【００５９】
３．細胞媒介性細胞傷害の評価
材料および方法
最終産物の細胞傷害能を、Ｋ５６２細胞に対する標準的な４時間の５１Ｃｒ−放出アッセイを用いてインビトロで評価した（Aktas E. et al., 2009; Alter, G. et al., 2004）。簡単には、Ｋ５６２標的細胞を、３７℃で１時間かけて１００μＣｉの５１Ｃｒで標識し、ＰＢＳで２回洗浄し、ＲＰＭＩ培地に再懸濁した。１００μｌのＲＰＭＩ培地中、全量３ｘ１０４の標的細胞を、Ｖ底型の９６ウェルプレートにトリプリケートで播種し、エフェクター：標的比が１：３ないし１０：１となるよう適当な濃度で１００μｌのエフェクター細胞と共に４時間インキュベートした。上清のアリコートを、Packard Cobra Auto−Gamma 5000 Series Counting System （Meridien, CT, USA）を用いてカウントした。特異的な５１Ｃｒ放出の割合を、式に当てはめて計算した：特異的放出割合＝［（実験による放出−非特異的放出）／（最大放出−非特異的放出）］ｘ１００。
【００６０】
ＮＫ細胞脱顆粒の分析
増殖産物を、丸底９６ウェルプレート中で、３７℃および５％ＣＯ２で６時間、終量２００μｌ中に１：１比でＫ５６２標的細胞と共にインキュベートした。蛍光色素結合抗ＣＤ１０７ａ ｍＡｂまたは対応するＩｇＧ１イソ型対照を、アッセイの開始時に添加した。１時間、共にインキュベーション後、Monensin (GolgiStop, Becton Dickinson）を、１：１００希釈して添加した。表面染色を、抗ＣＤ３および抗ＣＤ５６ ｍＡｂｓと共に氷上で３０分間インキュベートして行った。その後、細胞を洗浄し、ＰＢＳに再懸濁し、フローサイトメトリーで直ちに分析した。
【００６１】
４．統計的分析
データ分析、グラフの作成および統計比較を、GraphPad Prism ソフトウェア(GraphPad Software Inc. CA, USA）を用いて行った。
【００６２】
結果
細胞培養バッグおよびバイオリアクターのＮＫ細胞増殖に関する評価
ＮＫ細胞の増殖に関して閉鎖型培養システムを利用する試みにおいて、本発明者らは、初めに、５名の健常なドナー由来のＰＢＭＣを用いて、細胞培養バッグとフラスコを比較した。図１Ａは、増殖期の最後での各ドナー由来のバルク細胞ならびにＮＫおよびＮＫＴ細胞の増殖倍率を示す。平均バルク細胞増殖は、バッグにおいて５３０倍であり、一方、フラスコにおいて平均１１００倍の増殖が得られた。バッグ中でのＮＫ細胞増殖は、とりわけ、５名中３名のドナーで、フラスコでの培養と比較したとき有利に見えた。しかしながら、最終産物中のＮＫ細胞の割合を考慮したとき（図１Ｃ）、バッグ中での増殖は、フラスコ中での増殖と相関せず、培養終了時点でより低いＮＫ細胞純度となり得ることが分かった。バッグ中の最終産物は、ＮＫ細胞を平均３１％含み、一方で、フラスコの最終産物中のＮＫ細胞割合は５３％であった。
【００６３】
フラスコと同程度かつ対応する収率をもたらす閉鎖型増殖システムの探索において、発明者らは、５名の健常なドナー由来のＰＢＭＣを用いて、フラスコでの増殖と比較した自動化バイオリアクターシステムの使用を評価した。発明者らは、バルク細胞の増殖を観察し（平均増殖：フラスコ：７７０倍、バイオリアクター：７７倍）、一方で、ＮＫ細胞が優先的に増殖し、両条件下で全体に占めるＮＫ細胞の割合を増加させた。ＮＫ細胞の増加倍率（図１Ｂ）は、５名中４名のドナーでフラスコでの増加よりも低かったが、最終産物中のこれらの亜集団の割合は、フラスコ増殖とより同程度かつ対応していた（図１Ｄ）。増殖プロトコールの最終産物は、バイオリアクター中で平均３８％のＮＫ細胞を有し、一方、フラスコ中で４４％のＮＫ細胞および１６％が存在した。
【００６４】
バッグについての上記の結果と比較したとき、バイオリアクターでのＮＫ細胞の割合は、このドナー集団が、フラスコ増殖でのＮＫ細胞の純度が悪かったという事実にもかかわらず、バッグでのＮＫ細胞の割合よりも高かった。まとめると、上記の結果は、ＮＫ細胞の増殖はバッグでの方がより増加し、一方、その純度は、バイオリアクターでの増殖がわずかに高いことを示唆する。
【００６５】
異なるドナー群の使用およびＮＫ細胞増殖の個人差の高さ故に、バッグとバイオリアクターシステムの相対的効率を直接見いだすことは不可能であった。これらの異なる群中の５名のドナーのうち２名が、実際に同一の個人であった（ドナー１および２）という事実によって、発明者らは、増殖効率を直接的に比較する機会を得た。増殖倍率が低かったが、バイオリアクターは、フラスコ（７４％）と比較して、最終産物中に同程度の割合のＮＫ細胞を有し（６４％）、バッグ（４７％）での増殖よりも高かった。ＮＫＴ細胞の場合には、３つ全てのシステムで５％にかなり近い割合であった。
【００６６】
これらの２名のドナー由来の増殖産物を、受容体発現の変化のパターンを観察するために、さらなる表現型分析に付した。通常通り個人差があったが、異なる最終産物中の受容体発現レベルの変化は、非常に似ていた（図２Ａおよび２Ｂ）。所定の受容体の上方または下方制御の程度は、培養プロトコールが用いられるかどうかに関わらず同じであることは、明確に理解され得る。
【００６７】
異なるシステムの最終産物中のＮＫ細胞が、同様の活性状態を保持し、同程度の細胞傷害性を示すかどうかを明らかにするために、発明者らは、ＮＫ感受性細胞株Ｋ５６２に対する最終産物の細胞傷害能を評価した（図２Ｃ）。本発明者らは、異なる条件下で増殖させた細胞調製物の細胞傷害活性の顕著な相違を見いださなかった。これらの結果は、検討した方法が、増加した細胞傷害能を有する細胞調製物を産生するのに十分であることを保証する。
【００６８】
バイオリアクターでのＮＫ細胞増殖法の検討
増殖法へのバイオリアクターの使用可能性を明らかにした後、本発明者らは、０日目からバイオリアクターで直接培養を開始するために、血液成分または末梢血全体を用いるｃＧＭＰ条適合件下で、バイオリアクターでの増殖法の検討を継続した。２名の健常なドナーおよび２名のＭＭ患者由来のＰＢＭＣを、この検討で用いた。比較のために、出発物質であるＰＢＭＣを、フラスコを並行して用いて増殖させた。図３は、バイオリアクターおよびフラスコ中の全てのドナーについてのバルク細胞およびリンパ球サブ集団の増殖曲線を示す。達した全細胞数は、バイオリアクター増殖で非常に多く、平均３７．５％純度であるが、フラスコでは４３％純度であった。ＮＫ細胞純度はバイオリアクターでわずかに低かったが、達したＮＫ細胞の最終的な数は、癌の免疫療法設定における増殖したＮＫ細胞の臨床使用を容易にするのに十分である。
【００６９】
バイオリアクター中で増殖したＮＫ細胞は、より高い細胞傷害能を示す
上記の実験において、増殖をフラスコで開始し、その後バイオリアクターに移したとき、本発明者らは、フラスコでの増殖と比較して、最終産物の細胞傷害能および表現型に相違を検出しなかった。興味深いことに、発明者らは、バイオリアクターで直接増殖を開始したとき、Ｋ５６２細胞に対する最終産物の細胞傷害活性が、４名中３名のドナーで、フラスコで増殖させた最終産物と比較して顕著に高かったことを見いだした（図４Ａ）。この現象をよく調べるために、本発明者らは、Ｋ５６２細胞に対する脱顆粒アッセイを行い、各リンパ球サブ集団中の脱顆粒細胞の割合を測定した（図４Ｂ）。驚くことに、本発明者らは、バイオリアクター増殖からのＮＫ細胞画分にて観察される脱顆粒の程度が、４名全てのドナーにおいてフラスコ増殖からのＮＫ細胞よりも顕著に高いことを見いだした。同様に、ＮＫＴ細胞画分の脱顆粒は、４名中３名のドナーで顕著に高かった。纏めると、これらの結果は、バイオリアクターで行われる増殖法が、ＮＫ細胞の細胞傷害能を上げる点で、より良いことを示唆する。
【００７０】
バイオリアクターおよびフラスコ増殖からの最終産物の細胞傷害能の相違を説明するために、発明者らは、マルチカラーフローサイトメトリーを用いてＮＫ細胞の詳細な表現型特性化を行った。図５は、バイオリアクターおよびフラスコ増殖からのＮＫ細胞上の種々の表面受容体の発現を示し、全てのドナーの結果をまとめて、バイオリアクター増殖とフラスコ増殖の表現型の比較全体図を示す。概して、最終産物中のＮＫ細ＳＳＳ胞は、何れの増殖システムを用いるかに関わらず同様であって、ＣＤ１１ｂ、ＮＫＧ２ＤおよびＮＫｐ４４の発現レベルがわずかであるが、顕著に異なる。ＮＫｐ４４の上方制御は、上昇した細胞傷害能の鍵となる要因の１つである。
【００７１】
この研究は、閉鎖型自動化システムでＧＭＰ適合品質のエフェクター細胞を生産し得る可能性を検討する試みにおいて、ヒトドナーのバルクＰＢＭＣに由来するＮＫおよびＮＫＴ細胞のエクスビボ増殖のための細胞培養フラスコ、バッグおよびバイオリアクターの使用を比較評価する。
【００７２】
発明者らは、細胞培養フラスコ中で活性化ＮＫ細胞の選択的富化を促進するＧＭＰ適合培養培地を以前に報告した（Carlens S. et al., 2001）。そこで、本発明者らは、臨床適用可能な、エフェクター集団に富む大規模ＮＫ細胞の調製のためのＧＭＰ適合品質の自動化閉鎖型培養システムを最適化する最終工程を示し（Miller JS. et al., 1994；Luhm J. et al., 2002；Klingemann HG and Martinson J., 2004；Koehl U. et al., 2005）、および／またはフィーダー細胞株の使用（Ishikawa E. et al., 2004；Torelli GF, et al., 2005）が、既報の通り、ＮＫ細胞増殖に広く用いられていたことを示した。この研究において、本発明者らは、ＮＫ細胞含有量および抗腫瘍活性（Bordignon C. et al., 1999）の両方に関して、如何なる単離工程も用いないが、ＬＡＫ（Ramsdell FJ and Golub SH., 1987）およびサイトカイン誘導性キラー（ＣＩＫ）細胞（Chan JK. et al., 2006；Lu PH and Negrin RS., 1994）とは別のＮＫ細胞に富む細胞集団をもたらすバルクＰＢＭＣを用いた。
【００７３】
本発明者らは、バッグおよびバイオリアクターシステムの両方が、ＮＫ細胞を増殖させることを証明した。この研究で利用される２つの閉鎖型システムの増殖率比較および最終製品純度の全体的な比較は、バッグと比較したとき、バイオリアクターシステムが、より高い純度を有する十分量のＮＫ細胞を提供し、さらに最終産物中のＴ細胞をより少なくすることを明らかにする。
【００７４】
驚くことに、本発明者らは、ＮＫ細胞活性が、フラスコからの増殖産物と比較して、バイオリアクターからの増殖産物で顕著に高いことを見いだした。受容体発現レベルとＫ５６２に対するＮＫ細胞の反応との相関関係は、ＣＤ１３２、ＣＤ２５、ＣＤ５７およびＮＫＧ２Ｃ発現レベルが、その反応と逆相関しており、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４およびＮＫｐ４６の発現レベルが、直接的に相関することを明らかにした。活性化ＮＫ細胞受容体ＮＫＧ２Ｃの発現で逆相関を観察することは珍しくないが、標的Ｋ５６２細胞が、そのリガンドＨＬＡ−Ｅの発現を欠失することが公知の通りであり、この場合にはあまり意味がない（Khalil−Daher I. et al., 1999）。ＮＫ細胞応答と相関する受容体の統計的分析により、ＮＫｐ４４は、反応に正に相関し、フラスコ増殖と比較したとき、バイオリアクター製品で顕著に高レベルで発現されることが明らかとなった。このことは、少なくとも１つには、バイオリアクター産物の高い細胞毒性能の観察を説明し得る。他のＮＣＲとは異なり、ＮＫｐ４４（Vitale M. et al., 1998）は、活性化ＮＫ細胞でのみ発現され、インビトロでのＩＬ−２刺激後に上方制御される（Biassoni R. et al., 2002）。故に、この場合、培養中にＩＬ−２がどのくらいの頻度で用いられているか、およびＮＫ細胞集団の活性化がどの程度かを、代理マーカーとして示し得る。従って、ＮＫｐ４４の上昇した発現は、常套の細胞培養フラスコよりもバイオリアクターで行われる増殖法に機能的意義を提供する。
【００７５】
実用性に関して、本発明者らは、当該全てのシステムには有利点と不利点があることを明らかにした。細胞培養フラスコでの増殖は、外部物質および汚染物質への暴露という固有の危険性がある。この危険性は、ＧＭＰ適合の実験室環境で最小化されるが、閉鎖型自動化システムの使用は、それが十分量の細胞を供給する限り好まれることは明らかである。フラスコでの培養開始は、多くの細胞を必要としないが、細胞は、取り扱い不可能な数のフラスコ数になるまで、増殖中、新しいフラスコに分けられる間、ある程度の濃度内に維持されなければならない（Heiskala M. et al., 1987）。培養はまた、小さなバッグ中で少量の細胞で開始可能であり、良好な増殖をもたらすが、ＮＫ細胞の純度は、他のシステムよりも低く、細胞は、２個以上のバッグに分けられる必要がある。しかし、バッグでの増殖は、さらなる装置に投資を必要とすることなく、標準的な細胞培養実験室で容易に最適化され得る。２種以上の増殖が、インキュベーターのスペースが限界でない限り、バッグを用いて同時に行われ得て、バイオリアクターは、機械の購入のために追加の投資を必要とするが、一度に一回の増殖に用いられ得る。
【００７６】
バイオリアクターは、要する時間が最小限であるために、最も実用的な方法である。しかしながら、このシステムの開始には多くの細胞が必要とされ、増殖率が低い。バイオリアクターの連続した振とう動作は、例えば均一な培養条件、サンプリングの容易さならびにｐＨおよび溶存酸素の測定のような良好な制御処理品質のような多くの利点を提供する、同時かつ同種の培養環境を確実にする。そのような同時培養条件の利用は、バイオリアクター中でより濃縮される細胞増殖が実行可能かどうかに関与する主な要因であるはずである。このことは、培地またはさらなる成分の無駄遣いを避け、処理全体の費用を劇的に減少させる。プロトコール毎に平均増殖曲線を用いて、本発明者らは、同程度のＮＫ細胞数を得るために、バイオリアクターシステムは、バッグに用いる培地成分のおよそ１／１０倍、およびフラスコに用いる培地成分の１／２５倍を用いることを概算した。培地およびサイトカインの消費は、フラスコでよりも多い（バッグのおよそ２．５倍）。
【００７７】
当然、エクスビボ培養のための同時バイオリアクターシステムの使用は、幾つかの要因が慎重に評価されることを要する。造血細胞培養は、せん断に比較的感受性であり、高せん断処理がエクスビボ増殖に不適当であるという仮定は合理的である（Nielsen LK., 1999）。従って、振盪タンク型バイオリアクター（Pierson BA. et al., 1996）または外部フィルターおよび高流速に依存するかん流培養システムは、高い効率を提供しない。バイオリアクターの最大限の利点を達成するために、培地を除去するための内部かん流フィルターを備える低せん断力生成システムの使用が望ましく（Nielsen LK., 1999）、この実験で用いるバイオリアクターシステムは、これらの予想に合致し得る。
【００７８】
慎重に考慮する別の要因は、培養環境で用いられる材料である。わずかな材料のみが、効率的な造血細胞の増殖を支持し得て、洗浄、滅菌および再利用のような要因が、それらのパフォーマンスにかなり影響を及ぼす（LaIuppa JA. et al., 1997）。従って、使い捨てで、かつ予め滅菌された適当な材料の使用が好ましい。この実験で用いるバッグおよびバイオリアクターシステムの両方が、この点で生産に好適である。
【００７９】
フラスコと比較するとき、観察される１つの違いは、バイオリアクターおよびバッグ増殖の最終産物中の細胞のわずかに低い生存率であった。このことは、主に、死んだ細胞が、フラスコ培養において２−３日毎に継続的に流されているという事実のためであり、培地を交換するとき、閉鎖型システムではかかる操作を伴わない。しかし、投与前に、培養終了時のＧＭＰ適合品質の洗浄工程を常に利用可能である。
【００８０】
問題とする全てのシステムは、特定の実施上の有利点および不利点がある。細胞培養フラスコ中のＮＫ細胞の増殖は、外部物質および汚染物質への暴露の固有の危険性を有する。この危険性は、ＧＭＰ適合実験室環境で最小化されるが、閉鎖型自動化システムの使用は、それが十分量の細胞を供給する限り、間違いなく好ましい。フラスコでの培養は、非常に少ない数の細胞で開始できるが、細胞は、取り扱い不可能なフラスコ数になるまで、増殖中、新しいフラスコに分けられる間、ある程度の濃度内に維持されなければならない。
【００８１】
培養はまた、小さなバッグ中で少量の細胞で開始可能で良好な増殖をもたらすが、ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞の純度は、他のシステムよりも低く、細胞は、２個以上のバッグに分けられる必要がある。バッグでの増殖は、さらなる装置に投資を必要とすることなく、標準的な細胞培養実験室で容易に最適化され得る。２個以上の増殖が、インキュベーターのスペースが限界でない限り、バッグを用いて同時に行われ得て、バイオリアクターは、一度に一回の増殖に用いられ得る。
【００８２】
結論として、本明細書に記載の結果は、適用可能な免疫療法適用に予想される使用のための大量の高度に活性化されたエフェクター細胞が、ＧＭＰ適合条件下で、閉鎖型培養システムで生産され得ることを、明確に証明する。
【００８３】
特定の態様が明細書中に詳細に記載されるが、これは説明のみを目的とし、例示として記載されたもので、添付の特許請求の範囲を限定することを意図しない。特に、種々の置換、変更および修正が、特許請求の範囲によって定義される本発明の精神および範囲から逸脱することなく本発明にされ得ることは、本発明者らにより考慮されている。
【００８４】
参考文献
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US 10/242,7881
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表現型ＣＤ３−ＣＤ５６＋のＮＫ細胞および表現型ＣＤ３＋ＣＤ５６＋のＮＫＴ細胞の大規模増殖および同時活性化のための方法であって、該増殖および活性化を閉鎖型システムで行い、得られた増殖細胞が、インビトロ細胞傷害性試験により増加した細胞傷害性を示す、方法。
【請求項２】
−細胞を、血清、インターロイキン−２（ＩＬ−２）および抗ＣＤ３抗体を添加した増殖培地を含む閉鎖型システムに加え；
−該システム内の細胞を、増殖した細胞集団の少なくとも３５％が活性化ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞を含むまで振盪および加熱しながら増殖させる（ここで、該増殖した細胞が、インビトロ細胞傷害性試験により増加した細胞傷害性を示す。）、
手順を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
振盪および加熱を、約３６℃ないし約４０℃の温度；約４．７ないし約５．１％のＣＯ２濃度；および、細胞が閉鎖型細胞システムの表面に接着する速度および角度でゆっくりと振盪するという条件下で行う、請求項２記載の方法。
【請求項４】
振盪を、約４−８／分の振盪速度で行う、請求項２記載の方法。
【請求項５】
振盪を、約４−８°の振盪角度で行う、請求項２記載の方法。
【請求項６】
増殖を、全細胞数が、少なくとも約１０倍に増殖するまで行う、請求項２記載の方法。
【請求項７】
増殖を、増殖細胞集団の少なくとも約５０％が、活性化ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞それぞれを含むまで行う、請求項２記載の方法。
【請求項８】
細胞サンプルが、末梢血、細胞株、またはサイトカインで刺激した末梢血サンプルである、請求項１−７のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
細胞サンプルが、末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
閉鎖型細胞システムに最初に添加される細胞濃度が、約０．５ｘ１０６ないし約２ｘ１０６／ｍｌ増殖培地である、請求項２記載の方法。
【請求項１１】
１日当たり、全培養量の約５０％に相当する量の血清およびＩＬ−２を含む培地を添加し、閉鎖型細胞システムからほぼ同量の増殖培地を捨てる工程を含み、該工程を、全細胞密度が、初期細胞密度の少なくとも約５０％増加したときに行う、請求項１−１０のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
細胞密度が、初期細胞密度から少なくとも約３００％増加したときに請求項１１記載の工程を繰り返すが、全培地量の約７５％を添加および破棄することを含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
細胞密度が、初期細胞密度から少なくとも約５００％増加したときに請求項１１記載の工程を繰り返すが、全培地量の約１００％を添加および破棄することを含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
細胞を少なくとも約１０日間インキュベートする、請求項１−１３のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
閉鎖型細胞システムが予め滅菌したバッグである、請求項１−１４のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
閉鎖型細胞システムがバイオリアクターである、請求項１ないし１５のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
血清が、ヒト血清および自家血清からなる群から選択される、請求項２記載の方法。
【請求項１８】
培地に、約５０ないし約１５００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２、約１ないし約５０ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体および約１ないし約４０％血清を添加する、請求項２記載の方法。
【請求項１９】
細胞サンプルを、健常な対象から採取する、請求項１ないし１９のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０】
細胞サンプルを、腫瘍を有する対象から採取する、請求項１ないし１９のいずれか一項記載の方法。
【請求項２１】
腫瘍が、血液系腫瘍および固形腫瘍からなる群から選択される、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
細胞が、主に、表現型ＣＤ３−ＣＤ５６＋のＮＫ細胞である、請求項１−２１のいずれか一項記載の方法。
【請求項２３】
請求項１−２１のいずれか一項記載の方法により得られる、表現型ＣＤ３−ＣＤ５６＋のＮＫ細胞および表現型ＣＤ３＋ＣＤ５６＋のＮＫＴ細胞の懸濁液。
【請求項２４】
インビトロ細胞傷害性試験により決定される通り、フラスコ中で増殖した細胞と比較して増加した細胞傷害性を示す、表現型ＣＤ３−ＣＤ５６＋のＮＫ細胞および表現型ＣＤ３＋ＣＤ５６＋のＮＫＴ細胞の懸濁液。
【請求項２５】
増殖した細胞集団の少なくとも３５％、好ましくは少なくとも５０％が活性化ＮＫ細胞を含む、表現型ＣＤ３−ＣＤ５６＋のＮＫ細胞および表現型ＣＤ３＋ＣＤ５６＋のＮＫＴ細胞の懸濁液。
【請求項１】
表現型ＣＤ３−ＣＤ５６＋のＮＫ細胞および表現型ＣＤ３＋ＣＤ５６＋のＮＫＴ細胞の大規模増殖および同時活性化のための方法であって、該増殖および活性化を閉鎖型システムで行い、得られた増殖細胞が、インビトロ細胞傷害性試験により増加した細胞傷害性を示す、方法。
【請求項２】
−細胞を、血清、インターロイキン−２（ＩＬ−２）および抗ＣＤ３抗体を添加した増殖培地を含む閉鎖型システムに加え；
−該システム内の細胞を、増殖した細胞集団の少なくとも３５％が活性化ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞を含むまで振盪および加熱しながら増殖させる（ここで、該増殖した細胞が、インビトロ細胞傷害性試験により増加した細胞傷害性を示す。）、
手順を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
振盪および加熱を、約３６℃ないし約４０℃の温度；約４．７ないし約５．１％のＣＯ２濃度；および、細胞が閉鎖型細胞システムの表面に接着する速度および角度でゆっくりと振盪するという条件下で行う、請求項２記載の方法。
【請求項４】
振盪を、約４−８／分の振盪速度で行う、請求項２記載の方法。
【請求項５】
振盪を、約４−８°の振盪角度で行う、請求項２記載の方法。
【請求項６】
増殖を、全細胞数が、少なくとも約１０倍に増殖するまで行う、請求項２記載の方法。
【請求項７】
増殖を、増殖細胞集団の少なくとも約５０％が、活性化ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞それぞれを含むまで行う、請求項２記載の方法。
【請求項８】
細胞サンプルが、末梢血、細胞株、またはサイトカインで刺激した末梢血サンプルである、請求項１−７のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
細胞サンプルが、末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
閉鎖型細胞システムに最初に添加される細胞濃度が、約０．５ｘ１０６ないし約２ｘ１０６／ｍｌ増殖培地である、請求項２記載の方法。
【請求項１１】
１日当たり、全培養量の約５０％に相当する量の血清およびＩＬ−２を含む培地を添加し、閉鎖型細胞システムからほぼ同量の増殖培地を捨てる工程を含み、該工程を、全細胞密度が、初期細胞密度の少なくとも約５０％増加したときに行う、請求項１−１０のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
細胞密度が、初期細胞密度から少なくとも約３００％増加したときに請求項１１記載の工程を繰り返すが、全培地量の約７５％を添加および破棄することを含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
細胞密度が、初期細胞密度から少なくとも約５００％増加したときに請求項１１記載の工程を繰り返すが、全培地量の約１００％を添加および破棄することを含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
細胞を少なくとも約１０日間インキュベートする、請求項１−１３のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
閉鎖型細胞システムが予め滅菌したバッグである、請求項１−１４のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
閉鎖型細胞システムがバイオリアクターである、請求項１ないし１５のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
血清が、ヒト血清および自家血清からなる群から選択される、請求項２記載の方法。
【請求項１８】
培地に、約５０ないし約１５００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２、約１ないし約５０ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体および約１ないし約４０％血清を添加する、請求項２記載の方法。
【請求項１９】
細胞サンプルを、健常な対象から採取する、請求項１ないし１９のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０】
細胞サンプルを、腫瘍を有する対象から採取する、請求項１ないし１９のいずれか一項記載の方法。
【請求項２１】
腫瘍が、血液系腫瘍および固形腫瘍からなる群から選択される、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
細胞が、主に、表現型ＣＤ３−ＣＤ５６＋のＮＫ細胞である、請求項１−２１のいずれか一項記載の方法。
【請求項２３】
請求項１−２１のいずれか一項記載の方法により得られる、表現型ＣＤ３−ＣＤ５６＋のＮＫ細胞および表現型ＣＤ３＋ＣＤ５６＋のＮＫＴ細胞の懸濁液。
【請求項２４】
インビトロ細胞傷害性試験により決定される通り、フラスコ中で増殖した細胞と比較して増加した細胞傷害性を示す、表現型ＣＤ３−ＣＤ５６＋のＮＫ細胞および表現型ＣＤ３＋ＣＤ５６＋のＮＫＴ細胞の懸濁液。
【請求項２５】
増殖した細胞集団の少なくとも３５％、好ましくは少なくとも５０％が活性化ＮＫ細胞を含む、表現型ＣＤ３−ＣＤ５６＋のＮＫ細胞および表現型ＣＤ３＋ＣＤ５６＋のＮＫＴ細胞の懸濁液。
【図５】
【公表番号】特表２０１２−５２１２１５（Ｐ２０１２−５２１２１５Ａ）
【公表日】平成２４年９月１３日（２０１２．９．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５０１９６５（Ｐ２０１２−５０１９６５）
【出願日】平成２２年３月２５日（２０１０．３．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＥ２０１０／０５０３３３
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１１０７３４
【国際公開日】平成２２年９月３０日（２０１０．９．３０）
【出願人】（５０５３０５９２７）アヴァリス・アクチエボラーグ (5)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年９月１３日（２０１２．９．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月２５日（２０１０．３．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＥ２０１０／０５０３３３
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１１０７３４
【国際公開日】平成２２年９月３０日（２０１０．９．３０）
【出願人】（５０５３０５９２７）アヴァリス・アクチエボラーグ (5)
【Ｆターム（参考）】
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