ＮＫ細胞活性化剤、ＮＫ細胞活性化方法及びスクリーニング方法
【課題】選択的にがん細胞及び感染細胞を阻害又は抑制する技術を提供する。
【解決手段】下記式（１）で表される化合物を有効成分とすることを特徴とする。
【化１】
（上記式（１）中、Ｒ１〜Ｒ１０は、それぞれ独立して水素原子、水酸基、炭素数１〜５のアルキル基又は炭素数１〜４のアルコキシ基であり、Ｒ１〜Ｒ１０のうちの少なくとも４個が炭素数１〜４のアルコキシ基である）
【解決手段】下記式（１）で表される化合物を有効成分とすることを特徴とする。
【化１】
（上記式（１）中、Ｒ１〜Ｒ１０は、それぞれ独立して水素原子、水酸基、炭素数１〜５のアルキル基又は炭素数１〜４のアルコキシ基であり、Ｒ１〜Ｒ１０のうちの少なくとも４個が炭素数１〜４のアルコキシ基である）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ナチュラルキラー細胞活性化剤、活性化されたナチュラルキラー細胞の製造方法及びスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリメトキシフラボンは、カンキツの果皮に多く含まれている成分である。癌又は感染症の予防又は治療のために、ポリメトキシフラボンを活性成分として用いる技術がいくつか知られている。
【０００３】
特許文献１には、柑橘類フラボノイドを含む、癌の予防または治療のための組成物が記載されている。
【０００４】
特許文献２には、動物内の腫瘍細胞の増殖を阻害するために、４’，５，６，７，８−ペンタメトキシフラボンおよび３’，４’，５，６，７，８−ヘキサメトキシフラボンを含むオレンジの皮の抽出物を動物に投与する方法が記載されている。
【０００５】
特許文献３には、ウイルスあるいは寄生虫感染症を治療するために、ポリメトキシフラボンなどのフラビン類を投与する方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２００３−５１０２４０号公報（２００３年３月１８日公表）
【特許文献２】特表２００３−５０９４４７号公報（２００３年３月１１日公表）
【特許文献３】特表２００３−５０４３２７号公報（２００３年２月４日公表）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、上述のような従来技術では、化合物を直接投与するため、がん細胞及び感染細胞だけでなく、正常細胞も影響を受けるおそれがある。そのため、選択的にがん細胞及び感染細胞を阻害又は抑制する方法の開発が望まれている。
【０００８】
本発明は、上記の従来技術が有する問題に鑑みてなされたものであり、その目的は、選択的にがん細胞及び感染細胞を阻害又は抑制する技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために、がん細胞及び感染細胞を選択的に傷害し、排除する機能を有する免疫細胞の一種であるナチュラルキラー細胞（以下、「ＮＫ細胞」ともいう。）に着目した。そして、鋭意検討を行い、所定の構造を有するポリメトキシフラボン類がＮＫ細胞を直接活性化し、ＮＫ細胞のがん細胞に対する傷害活性を高めることを見出し、本発明を完成させた。
【００１０】
本発明に係るナチュラルキラー細胞活性化剤（以下、「ＮＫ細胞活性化剤」ともいう。）は、下記式（１）で表される化合物を有効成分とすることを特徴とする。
【００１１】
【化１】
【００１２】
（上記式（１）中、Ｒ１〜Ｒ１０は、それぞれ独立して水素原子、水酸基、炭素数１〜５のアルキル基又は炭素数１〜４のアルコキシ基であり、Ｒ１〜Ｒ１０のうちの少なくとも４個が炭素数１〜４のアルコキシ基である）
また、本発明に係るナチュラルキラー細胞活性化剤では、上記式（１）中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ９、Ｒ１０はそれぞれ独立して水素原子、炭素数１〜５のアルキル基又は炭素数１〜４のアルコキシ基であり、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ９、Ｒ１０のうちの少なくとも２個が炭素数１〜４のアルコキシ基であり、Ｒ４、Ｒ８は炭素数１〜４のアルコキシ基であり、Ｒ６は水素原子又は炭素数１〜５のアルキル基であることが好ましい。
【００１３】
また、本発明に係るナチュラルキラー細胞活性化剤では、上記式（１）中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ９、Ｒ１０はそれぞれ独立して水素原子又はメトキシ基であり、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ９、Ｒ１０のうちの少なくとも２個がメトキシ基であり、Ｒ４、Ｒ８はメトキシ基であり、Ｒ２は水素原子、水酸基又はメトキシ基であり、Ｒ６は水素原子であることが好ましい。
【００１４】
また、本発明に係るナチュラルキラー細胞活性化剤では、上記化合物は、シネンセチン、タンゲレチン、ノビレチン、ガルデニン、３，７，３’，４’，５’−ペンタメトキシフラボン、５，７，３’，４’，５’−ペンタメトキシフラボン、３’，４’，５’，５，６，７−ヘキサメトキシフラボン、及び３，７，８，２’，４’−ペンタメトキシフラボンからなる群より選択されることが好ましい。
【００１５】
本発明に係るナチュラルキラー細胞活性化方法は、ナチュラルキラー細胞を、上述したいずれかのナチュラルキラー細胞活性化剤に接触させる活性化工程を含むことを特徴とする。
【００１６】
本発明に係るナチュラルキラー細胞の製造方法は、ナチュラルキラー細胞を、上述したいずれかのナチュラルキラー細胞活性化剤に接触させる活性化工程を含むことを特徴とする。
【００１７】
本発明に係るナチュラルキラー細胞活性化能を有する化合物のスクリーニング方法は、ナチュラルキラー細胞を試験化合物に接触させて処理する試験化合物処理工程と、上記試験化合物処理工程において処理されたナチュラルキラー細胞とがん細胞との混合液を得る混合工程と、上記混合液中の乳酸脱水素酵素活性を測定する測定工程とを含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、選択的にがん細胞及び感染細胞を阻害又は抑制する技術を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ＮＫ細胞の細胞傷害活性を促進する化合物のスクリーニング結果を示す棒グラフである。
【図２】（Ａ）〜（Ｄ）は、ノビレチン（Ａ）、タンゲレチン（Ｂ）、３’，４’，５’，５，６，７−ヘキサメトキシフラボン（Ｃ）、及び３，７，８，２’，４’−ペンタメトキシフラボン（Ｄ）の構造式を示す図である。
【図３】（Ａ）〜（Ｄ）は、ノビレチン（Ａ）、タンゲレチン（Ｂ）、３’，４’，５’，５，６，７−ヘキサメトキシフラボン（Ｃ）、及び３，７，８，２’，４’−ペンタメトキシフラボン（Ｄ）により処理されたＫＨＹＧ−１細胞の細胞傷害活性を示すグラフである。
【図４】ノビレチン（Ａ）、タンゲレチン（Ｂ）、３’，４’，５’，５，６，７−ヘキサメトキシフラボン（Ｃ）、及び３，７，８，２’，４’−ペンタメトキシフラボン（Ｄ）そのものの細胞傷害活性を示すグラフである。
【図５】ノビレチン（Ａ）、タンゲレチン（Ｂ）、３’，４’，５’，５，６，７−ヘキサメトキシフラボン（Ｃ）、及び３，７，８，２’，４’−ペンタメトキシフラボン（Ｄ）を処理したＫＨＹＧ−１細胞の培養上清の細胞傷害活性を示すグラフである。
【図６】（ａ）〜（ｃ）は、ノビレチン（Ａ）、タンゲレチン（Ｂ）、３’，４’，５’，５，６，７−ヘキサメトキシフラボン（Ｃ）、及び３，７，８，２’，４’−ペンタメトキシフラボン（Ｄ）を処理したＫＨＹＧ−１細胞におけるＩＦＮ−γ遺伝子（ａ）、パーフォリン遺伝子（ｂ）及びグランザイムＢ遺伝子（ｃ）の発現量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
〔ＮＫ細胞活性化剤〕
本発明に係るＮＫ細胞活性化剤は、上記式（１）で表される化合物を有効成分とする。
【００２１】
上記式（１）中、Ｒ１〜Ｒ１０は、それぞれ独立して水素原子、水酸基、炭素数１〜５のアルキル基又は炭素数１〜４のアルコキシ基である。Ｒ１〜Ｒ１０のうちの少なくとも４個がアルコキシ基である。また、Ｒ１〜Ｒ１０のうちの４個〜７個がアルコキシ基であることが好ましく、５個又は６個がアルコキシ基であることがより好ましい。
【００２２】
Ｒ１〜Ｒ１０のうちのアルコキシ基は、炭素数１〜２であることが好ましく、メトキシ基であることがより好ましい。言い換えれば、Ｒ１〜Ｒ１０は、それぞれ独立して水素原子、水酸基又は炭素数１〜２のアルコキシ基であることが好ましく、それぞれ独立して水素原子、水酸基又はメトキシ基であることがより好ましい。
【００２３】
Ｒ１〜Ｒ１０のうちのアルキル基は、炭素数１〜３であることが好ましく、炭素数１〜２であることがより好ましい。
【００２４】
Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ９、Ｒ１０は、それぞれ独立して水素原子、炭素数１〜５のアルキル基又は炭素数１〜４のアルコキシ基であることが好ましく、それぞれ独立して水素原子、炭素数１〜３のアルキル基又は炭素数１〜２のアルコキシ基であることがより好ましく、それぞれ独立して水素原子又はメトキシ基であることがさらに好ましい。
【００２５】
Ｒ４、Ｒ８は、それぞれ独立して炭素数１〜４のアルコキシ基であることが好ましく、それぞれ独立して炭素数１〜２のアルコキシ基であることがより好ましく、メトキシ基であることがさらに好ましい。
【００２６】
Ｒ６は水素原子又は炭素数１〜５のアルキル基であることが好ましく、水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基であることがより好ましく、水素原子であることがさらに好ましい。
【００２７】
また、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ９、Ｒ１０がそれぞれ独立して水素原子、炭素数１〜５のアルキル基又は炭素数１〜４のアルコキシ基であり、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ９、Ｒ１０のうちの少なくとも２個が炭素数１〜４のアルコキシ基であり、Ｒ４、Ｒ８が炭素数１〜４のアルコキシ基であり、Ｒ６が水素原子又は炭素数１〜５のアルキル基であることが好ましい。
【００２８】
また、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ９、Ｒ１０がそれぞれ独立して水素原子又はメトキシ基であり、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ９、Ｒ１０のうちの少なくとも２個がメトキシ基であり、Ｒ４、Ｒ８がメトキシ基であり、Ｒ２が水素原子、水酸基又はメトキシ基であり、Ｒ６が水素原子であることがより好ましい。
【００２９】
さらに、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ８がそれぞれ独立して炭素数１〜４のアルコキシ基であり、Ｒ１、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ９、Ｒ１０がそれぞれ独立して水素原子、水酸基又は炭素数１〜５のアルキル基であることが好ましい。
【００３０】
また、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ８、Ｒ９がそれぞれ独立して炭素数１〜４のアルコキシ基であり、Ｒ１、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ１０がそれぞれ独立して水素原子、水酸基又は炭素数１〜５のアルキル基であることが好ましい。
【００３１】
また、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９がそれぞれ独立して炭素数１〜４のアルコキシ基であり、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ１０がそれぞれ独立して水素原子、水酸基又は炭素数１〜５のアルキル基であることが好ましい。
【００３２】
また、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９がそれぞれ独立して炭素数１〜４のアルコキシ基であり、Ｒ１、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ１０がそれぞれ独立して水素原子、水酸基又は炭素数１〜５のアルキル基であることが好ましい。
【００３３】
また、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ８、Ｒ１０がそれぞれ独立して炭素数１〜４のアルコキシ基であり、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ９がそれぞれ独立して水素原子、水酸基又は炭素数１〜５のアルキル基であることが好ましい。
【００３４】
上記式（１）で表される化合物は、いわゆるポリメトキシフラボンであることが好ましい。ポリメトキシフラボンは、複数のメトキシ基を有するフラボンであればよく、天然化合物であってもよいし、非天然化合物であってもよい。
【００３５】
上記式（１）で表される化合物としては、例えばシネンセチン、タンゲレチン、ノビレチン、ガルデニン、３，７，３’，４’，５’−ペンタメトキシフラボン、５，７，３’，４’，５’−ペンタメトキシフラボン、３’，４’，５’，５，６，７−ヘキサメトキシフラボン、３，７，８，２’，４’−ペンタメトキシフラボン、ナツダイダイン、３，５，６，７，３’，４’−ヘキサメトキシフラボン、３，５，６，７，８，３’，４’−ヘプタメトキシフラボン、及びこれらの代謝産物などが挙げられる。なかでも、シネンセチン、タンゲレチン、ノビレチン、ガルデニン、３，７，３’，４’，５’−ペンタメトキシフラボン、５，７，３’，４’，５’−ペンタメトキシフラボン、３’，４’，５’，５，６，７−ヘキサメトキシフラボン、及び３，７，８，２’，４’−ペンタメトキシフラボンからなる群より選択されることが好ましい。
【００３６】
代謝産物としては、例えば脱メチル化された化合物等であってもよく、例えば４’−デメチルノビレチン、３’，４’−ジデメチルノビレチン等が挙げられる。
【００３７】
上記式（１）で表される化合物は、人工的に合成されたものであってもよい。合成方法としては、公知の方法を用いることができる。また、上記式（１）で表される化合物は、天然から取得したものであってもよい。例えばポリメトキシフラボンのうちのいくつかは、カンキツの果皮等から抽出することができる。抽出方法としては、公知の方法を利用することができる。ＮＫ細胞活性化剤は、上記式（１）で表される化合物を、カンキツからの抽出物として含んでいてもよい。
【００３８】
本発明に係るＮＫ細胞活性化剤中、上記式（１）で表される化合物は、溶媒中に溶解していてもよい。溶媒としては、例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エタノール等を用いることができる。
【００３９】
本発明に係るＮＫ細胞活性化剤は、生理活性物質（サイトカイン等）、血清、バッファー、培地、添加剤等をさらに含んでいてもよい。また、ＮＫ細胞活性化剤は、賦形剤、崩壊剤、乳化剤、可塑剤、緩衝剤（ＨＥＰＥＳ等）、糖類、ビタミン類（アスコルビン酸等）、ｐＨ調整剤、香料、アミノ酸、公知のＮＫ細胞活性化剤等をさらに含んでいてもよい。
【００４０】
本発明に係るＮＫ細胞活性化剤は、ＮＫ細胞の細胞傷害活性を高め、活性化することができる。この活性化されたＮＫ細胞を用いれば、がん細胞及び感染細胞を選択的に傷害させることができる。したがって、本発明を利用することによって、選択的にがん細胞及び感染細胞を阻害又は抑制することができる。
【００４１】
本発明は、例えば免疫細胞療法（特に活性化ＮＫ細胞療法）に有用である。また、本発明に係るＮＫ細胞活性化剤は、免疫機能強化のための医薬、食品、飲料、サプリメント等に好適に利用することができる。また、本発明に係るＮＫ細胞活性化剤は、活性化剤、阻害剤などの実験用試薬に好適に利用することができる。
【００４２】
〔組成物〕
本発明はまた、新規な組成物を提供する。本発明に係る組成物は、少なくとも上記式（１）で表される化合物を含む。
【００４３】
上記式（１）中、Ｒ１〜Ｒ１０は、ＮＫ細胞活性化剤の項目で例示したものと同様であってよい。また、上記式（１）で表される化合物として、ＮＫ細胞活性化剤の項目で例示した化合物を好適に用いることができる。
【００４４】
また、組成物は、上記式（１）で表される化合物を溶解させるための溶媒をさらに含んでいてもよい。溶媒としては、ＮＫ細胞活性化剤の項目で例示したものを用いることができる。組成物は、生理活性物質（サイトカイン等）、血清、バッファー、培地、添加剤等をさらに含んでいてもよい。また、組成物は、賦形剤、崩壊剤、乳化剤、可塑剤、緩衝剤（ＨＥＰＥＳ等）、糖類、ビタミン類（アスコルビン酸等）、ｐＨ調整剤、香料、アミノ酸、公知のＮＫ細胞活性化剤等をさらに含んでいてもよい。
【００４５】
以上の構成により、本発明に係る組成物は、上記式（１）で表される化合物を含んでいるため、ＮＫ細胞の活性化に好適に利用することができる。この活性化されたＮＫ細胞を用いれば、がん細胞及び感染細胞を選択的に傷害させることができる。したがって、本発明を利用することによって、選択的にがん細胞及び感染細胞を阻害又は抑制することができる。
【００４６】
本発明は、免疫細胞療法、免疫機能強化のための医薬、食品、飲料、サプリメント等、及び実験用試薬等に好適に利用することができる。
【００４７】
〔ＮＫ細胞活性化方法〕
本発明はまた、ＮＫ細胞活性化方法を提供する。本発明に係るＮＫ細胞活性化方法は、ＮＫ細胞を、本発明に係るＮＫ細胞活性化剤に接触させる活性化工程を含む。すなわち、活性化工程では、ＮＫ細胞を上記式（１）で表される化合物に接触させる。
【００４８】
ＮＫ細胞をＮＫ細胞活性化剤に接触させる方法としては、特に限定されないが、例えば、ＮＫ細胞活性化剤を添加した培地中でＮＫ細胞を培養する方法などを用いることができる。
【００４９】
活性化工程においてＮＫ細胞をＮＫ細胞活性化剤に接触させる際、上記式（１）で表される化合物の反応液中の濃度は、１μＭ〜３０μＭであることが好ましい。また、接触させる時間は４時間〜２４時間が好ましい。なお、ＮＫ細胞活性化剤を添加した培地中でＮＫ細胞を培養する場合、培養条件としては、公知の条件を好適に用いることができる。
【００５０】
なお、活性化工程は、体外において行なってもよい。
【００５１】
本発明に係るＮＫ細胞活性化方法を用いれば、ＮＫ細胞を効率よく活性化することができる。したがって、がん細胞及び感染細胞を選択的に阻害又は抑制することができるＮＫ細胞を効率よく提供することができる。
【００５２】
〔活性化されたＮＫ細胞の製造方法〕
本発明はまた、上述した活性化工程を含む、活性化されたＮＫ細胞の製造方法を提供する。なお、活性化工程は、体外において行なってもよい。
【００５３】
「活性化されたＮＫ細胞」とは、未処理のＮＫ細胞と比較して高い細胞傷害活性を有するＮＫ細胞をさす。活性化されたＮＫ細胞は、未処理のＮＫ細胞の１．５倍以上の細胞傷害活性を有していることが好ましい。
【００５４】
本発明に係る活性化されたＮＫ細胞の製造方法によれば、活性化されたＮＫ細胞を効率よく製造することができる。したがって、本発明を利用することによって、がん細胞及び感染細胞を選択的に阻害又は抑制することができる。
【００５５】
〔スクリーニング方法〕
本発明はまた、ＮＫ細胞活性化能を有する化合物のスクリーニング方法を提供する。本発明に係るスクリーニング方法は、試験化合物処理工程と、混合工程と、測定工程とを含む。
【００５６】
試験化合物処理工程は、ＮＫ細胞を試験化合物に接触させて処理する工程である。接触させる方法としては、特に限定されないが、例えば、試験化合物を添加した培地中でＮＫ細胞を培養する方法などを用いることができる。
【００５７】
試験化合物処理工程は、ＮＫ細胞以外の他の細胞を含まない系で行なうことが好ましい。例えば、株化したＮＫ細胞を用いることが好ましい。これにより、ＮＫ細胞を直接活性化することができる化合物を選抜することが可能となる。
【００５８】
混合工程は、試験化合物処理工程において処理されたＮＫ細胞とがん細胞との混合液を得る工程である。混合する方法は、特に限定されないが、例えばそれぞれの細胞の懸濁液を混合する方法を用いてもよい。混合工程におけるＮＫ細胞とがん細胞との細胞数の比は、２０：１〜５：１であることが好ましい。
【００５９】
測定工程は、混合液中のＬＤＨ活性を測定する工程である。これにより、傷害を受けたがん細胞から遊離するＬＤＨの活性を測定することができる。このＬＤＨ活性から、試験化合物の細胞傷害活性を求めることができる。例えば、混合液中のほぼ全てのがん細胞が傷害を受けた場合のＬＤＨ活性に対する、測定工程において測定されたＬＤＨ活性の割合を求め、これを細胞傷害活性とすることができる。
【００６０】
混合液中のほぼ全てのがん細胞が傷害を受けた場合のＬＤＨ活性は、例えば、混合工程において用いるがん細胞と同数のがん細胞に、細胞傷害性の試薬（例えば界面活性剤等）を添加した後に測定されるＬＤＨ活性としてもよい。
【００６１】
本発明では、細胞傷害活性の指標として、傷害を受けた細胞から遊離するＬＤＨの活性を用いる。したがって、アイソトープを使用する方法などを用いる場合と比較して、アイソトープ実験に必要とする各種手続きを行なったり、アイソトープ実験に必要な設備を整えたり、アイソトープの管理等を行なったりする必要がない。そのため、より容易に細胞傷害活性を測定することが可能である。
【００６２】
本発明に係るスクリーニング方法は、さらに選抜工程を含んでいてもよい。選抜工程は、測定工程において測定されたＬＤＨ活性から細胞傷害活性を算出し、その細胞傷害活性が、未処理のＮＫ細胞が有する細胞傷害活性よりも大きい場合に、試験化合物処理工程にて用いた試験化合物を選抜する工程である。例えば、算出された細胞傷害活性が、未処理のＮＫ細胞が有する細胞傷害活性の１．５倍以上である場合に、試験化合物処理工程にて用いた試験化合物を選抜してもよい。
【００６３】
選抜工程において選抜された試験化合物は、ＮＫ細胞活性化能を有する化合物である。したがって、本発明によれば、ＮＫ細胞活性化剤の有効成分となりうる有用な化合物をスクリーニングすることができる。この有用な化合物を利用することによって、選択的にがん細胞及び感染細胞を阻害又は抑制することができる。
【００６４】
以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。
【実施例】
【００６５】
〔実施例１：スクリーニング〕
まず、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の細胞傷害活性を促進する化合物のスクリーニングを行なった。試験成分としては、下記表１に示す７１種類の化合物を用いた。なお、試験成分の入手先を表１の括弧内に示す。
【００６６】
【表１】
【００６７】
（表１続き）
【００６８】
（材料）
ＮＫ細胞としてＫＨＹＧ−１を用いた。また、がん細胞として前骨髄性白血病細胞株Ｋ５６２を用いた。ＫＨＹＧ−１及びＫ５６２は、ヒューマンサイエンス研究資源バンクより購入した。ＲＰＭＩ−１６４０培地、ペニシリン・ストレプトマイシン溶液、ヒトＩＬ−２、及びＲＮＡ抽出試薬（ＩＳＯＧＥＮ）は、和光純薬株式会社から購入した。
【００６９】
Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＬＤＨ）およびリアルタイムＰＣＲ用マスターミックス（ＦａｓｔＳｔａｒｔ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｘ））は、ロシュ社から購入した。Ａｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ１６４０培地は、ライフテクノロジーズ社から購入した。ウシ胎児血清（ＦＢＳ）は、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社から購入した。ｃＤＮＡ合成試薬（ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（商品名）ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ）は、タカラバイオ社から購入した。
【００７０】
（細胞培養）
ＫＨＹＧ−１細胞は、３７℃，５％ＣＯ２下、１０％ＦＢＳ、５０ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ−２、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリンＧ、及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ−１６４０培地中において維持し、３日おきに継代した。
【００７１】
Ｋ５６２細胞は、３７℃，５％ＣＯ２下、１０％ＦＢＳ、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリンＧ、及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ−１６４０培地中において維持し、３日おきに継代した。
【００７２】
ＫＨＹＧ−１細胞およびＫ５６２細胞は、６０ｍｍ培養ディッシュを用いて培養した。
【００７３】
（細胞傷害活性試験）
次に、各試験化合物によってＫＨＹＧ−１細胞を処理し、細胞傷害活性を評価した。本実施例では、細胞傷害の指標として、傷害を受けた細胞から遊離するＬＤＨの活性を用いた。
【００７４】
各試験化合物は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解してストック溶液とした。このストック溶液を、ＫＨＹＧ−１細胞の継代時にそれぞれ終濃度３０μＭとなるよう培地に添加した。なお、添加後の培地中に含まれるＤＭＳＯの濃度は、０．１％以下となるようにした。
【００７５】
各試験化合物を含む培地で３日間培養したＫＨＹＧ−１細胞を、遠心分離により回収し、培地に含まれる試験化合物を除いた。回収した細胞を、１％ＦＢＳを含むＡｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ−１６４０培地に１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるよう懸濁し、ＫＨＹＧ−１細胞液を調製した。
【００７６】
一方、Ｋ５６２細胞を、ＫＨＹＧ−１と同様の方法により回収し、１％ＦＢＳを含むＡｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ−１６４０培地に５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるよう懸濁し、Ｋ５６２細胞液を調製した。
【００７７】
なお、本実験において細胞傷害の指標とする乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）は、血清中にも含まれており、バックグラウンドを抑えるためには血清濃度を抑えた条件下で行うことが望ましい。本実施例では、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ−１６４０培地を使用することにより、低血清条件とすることができ、かつ安定した結果を得ることができた。
【００７８】
９６ウェルプレート（Ｕ底）のウェルに、ＫＨＹＧ−１細胞とＫ５６２細胞とを含む液（ＥＴＣｍｉｘ：ｅｆｆｅｃｔｏｒ−ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌ ｍｉｘ）を入れた。ＥＴＣｍｉｘにおけるＫＨＹＧ−１細胞とＫ５６２細胞との割合は、２０：１とした。
【００７９】
また、この９６ウェルプレートの他のウェルに、各コントロール溶液を入れた。コントロール溶液としては、培地のみ（ＢＣ：ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ）、Ｋ５６２細胞液に界面活性剤を添加（ＨＣ：ｈｉｇｈ ｃｏｎｔｒｏｌ）、Ｋ５６２細胞液のみ（ＬＣ：ｌｏｗ ｃｏｎｔｒｏｌ）、ＫＨＹＧ−１細胞液のみ（ＥＣＣ：ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｅｌｌ ｃｏｎｔｒｏｌ）を用いた。
【００８０】
なお、Ｋ５６２細胞液に界面活性剤を添加したコントロール（ＨＣ）は、Ｋ５６２細胞がほぼ全て傷害を受けたときの活性を測定するためのものである。
【００８１】
具体的には、調製したＫＨＹＧ−１細胞液を、ＥＴＣｍｉｘ用及びＥＣＣ用のウェルに、１００μｌ（１×１０５ｃｅｌｌｓ）ずつ分注した。また、Ｋ５６２細胞液を、ＥＴＣｍｉｘ用、ＨＣ用、及びＬＣ用のウェルに１００μｌ（５×１０３ｃｅｌｌｓ）ずつ分注した。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を２％含む培地を、ＨＣ用のウェルに１００μｌ（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００の終濃度１％）添加した。また、培地のみを、ＬＣ用のウェルに１００μｌ添加し、ＢＣ用のウェルに２００μｌ添加した。
【００８２】
ＥＴＣｍｉｘおよび各コントロールについての実験は、３連（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）で行なった。プレートをＣＯ２インキュベーター内（３７℃，５％ＣＯ２）で４時間静置し、遠心分離したのち上清８０μｌを９６ウェルアッセイプレート（平底）に移した。Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＬＤＨ）に添付の説明書にしたがって用事調製した反応液（ジアホラーゼ、ＮＡＤ＋、ヨードテトラゾリウムクロライド、乳酸ナトリウムの各成分を含む）を各ウェルに８０μｌずつ添加し、暗所に１５分から３０分静置した。発色を確認後、可視光プレートリーダーを用いて４９０ｎｍで吸光度を測定した。対照波長は６００ｎｍとした。
【００８３】
そして、各ウェルの吸光度からバックグラウンド（ＢＣ）を差し引いた値を求めた。この値を基に、細胞傷害活性（％）＝（（ＥＴＣｍｉｘ−ＥＣＣ）−ＬＣ）／（ＨＣ−ＬＣ）×１００を求めた。この細胞傷害活性（％）は、Ｋ５６２細胞がほぼ全て傷害を受けたときの活性を１００とした場合の百分率である。
【００８４】
本スクリーニングにおいては、１枚の９６ウェルプレートあたり、１０種類前後の試験化合物について試験した。また、各試験（各プレート）では、未処理のＫＨＹＧ−１細胞の細胞傷害活性を同時に評価した。
【００８５】
図１は、ＮＫ細胞の細胞傷害活性を促進する化合物のスクリーニング結果を示す棒グラフである。図１において、縦軸は、未処理のＫＨＹＧ−１細胞の細胞傷害活性を１とした場合における、各試験化合物についての細胞傷害活性の相対値を表す。また、白いバーは、ポリメトキシフラボンに属する試験化合物の結果であることを示す。
【００８６】
まず１〜６０番の試験化合物について試験したところ、ＫＨＹＧ−１細胞の細胞傷害活性の相対値が１．５以上を示す試験化合物はシトラール（１６）、シネンセチン（２７）、タンゲレチン（３５）、及びノビレチン（５２）の４つであった。このうちシネンセチン、タンゲレチン及びノビレチンの３つは、ＫＨＹＧ−１細胞の細胞傷害活性を促進する活性について再現性が見られた。一方、シトラールについては、細胞傷害活性の促進についての再現性が見られなかった。
【００８７】
シネンセチン、タンゲレチン及びノビレチンの３つは、ポリメトキシフラボンに属する化合物である。そこで次に、他のポリメトキシフラボン（６１〜７１）について、同様に試験した。その結果、多くのポリメトキシフラボンが、ＫＨＹＧ−１細胞の細胞傷害活性を促進する活性を有していることが示された。特に高い活性を示したポリメトキシフラボンは、ガルデニン（６３）、３，７，３’，４’，５’−ペンタメトキシフラボン（６４）、５，７，３’，４’，５’−ペンタメトキシフラボン（６５）、３’，４’，５’，５，６，７−ヘキサメトキシフラボン（６６）、３，７，８，２’，４’−ペンタメトキシフラボン（６９）であった。
【００８８】
以上の結果より、多くのポリメトキシフラボンがＮＫ細胞の細胞傷害活性を促進する活性、すなわちＮＫ細胞活性化能を有していることが示された。
【００８９】
〔実施例２：ポリメトキシフラボンによるＮＫ細胞活性化に対する濃度依存性の検討〕
実施例１におけるスクリーニングで、ＮＫ細胞の細胞傷害活性を促進する活性を有することが明らかとなったポリメトキシフラボンのうちのいくつかの化合物について、以下、実施例２〜５を行なった。
【００９０】
実施例２では、これらのポリメトキシフラボンについて、ＮＫ細胞活性化に対する濃度依存性を検討した。実施例１では、試験化合物の終濃度を３０μＭとしたが、これより低い濃度でもＮＫ細胞を活性化するかどうかを検討した。
【００９１】
本実施例では、ノビレチン（５２）、タンゲレチン（３５）、３’，４’，５’，５，６，７−ヘキサメトキシフラボン（６６）、及び３，７，８，２’，４’−ペンタメトキシフラボン（６９）について検討した。図２（Ａ）〜（Ｄ）は、ノビレチン（Ａ）、タンゲレチン（Ｂ）、３’，４’，５’，５，６，７−ヘキサメトキシフラボン（Ｃ）、及び３，７，８，２’，４’−ペンタメトキシフラボン（Ｄ）の構造式を示す図である。
【００９２】
これらの化合物の終濃度を３０μＭ又は１０μＭとし、実施例１と同様の方法及び条件によって細胞の培養及び調製、ＮＫ細胞の処理、ならびに細胞傷害活性試験を行なった。
【００９３】
この結果を図３（Ａ）〜（Ｄ）に示す。図３（Ａ）〜（Ｄ）は、ノビレチン（Ａ）、タンゲレチン（Ｂ）、３’，４’，５’，５，６，７−ヘキサメトキシフラボン（Ｃ）、及び３，７，８，２’，４’−ペンタメトキシフラボン（Ｄ）により処理されたＫＨＹＧ−１細胞の細胞傷害活性を示すグラフである。図３（Ａ）〜（Ｄ）の縦軸は、Ｋ５６２細胞がほぼ全て傷害された場合の活性を１００としたときの百分率を示す。
【００９４】
図３（Ａ）〜（Ｄ）に示すように、これらの化合物は、濃度依存的にＮＫ細胞の細胞傷害活性を亢進した。
【００９５】
〔実施例３：ポリメトキシフラボン自体によるＫ５６２細胞に対する細胞傷害活性の検討〕
本実施例では、ポリメトキシフラボンそのものがＫ５６２細胞に対する細胞傷害活性を有するか否かを検討することとした。
【００９６】
ポリメトキシフラボンを含まない条件下で３日間培養したＫＨＹＧ−１細胞を遠心分離により回収した。回収した細胞を、１％ＦＢＳを含むＡｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ−１６４０培地に１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるよう懸濁し、ＫＨＹＧ−１細胞液を調製した。また、３日間培養したＫ５６２細胞を、同様に遠心分離により回収し、１％ＦＢＳを含むＡｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ−１６４０培地に５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるよう懸濁し、Ｋ５６２細胞液を調製した。また、３０μＭのポリメトキシフラボンを含むＡｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ−１６４０培地を準備した。
【００９７】
細胞傷害活性試験は、実施例１と同様に、ＥＴＣｍｉｘと、実施例１と同じコントロールとを揃えた条件で行なった。さらに、Ｋ５６２細胞に直接ポリメトキシフラボンを添加するためのウェルを設けた。このウェルには、１００μｌのＫ５６２細胞液（５×１０３ｃｅｌｌｓ）、及び１００μｌのポリメトキシフラボン（終濃度１５μＭ）を含む培地を添加した。
【００９８】
９６ウェルプレートをＣＯ２インキュベーター内（３７℃，５％ＣＯ２）で４時間静置し、遠心分離したのち上清８０μｌを９６ウェルアッセイプレート（平底）に移した。各ウェルに用事調製した反応液を８０μｌずつ添加し、暗所で１５分から３０分静置して反応させた。発色を確認後、可視光プレートリーダーを用いて４９０ｎｍで吸光度を測定した。対照波長は６００ｎｍとした。
【００９９】
そして、各ウェルの吸光度からバックグラウンド（ＢＣ）を差し引いた値を求めた。この値を基に、細胞傷害活性（％）＝((ＥＴＣｍｉｘ−ＥＣＣ）−ＬＣ）／（ＨＣ−ＬＣ）×１００を求めた。Ｋ５６２細胞に直接ポリメトキシフラボンを添加したウェルの評価については、細胞傷害活性（％）＝（対象ウェルの吸光度−ＬＣ）／（ＨＣ−ＬＣ）×１００を求めた。
【０１００】
図４は、ノビレチン（Ａ）、タンゲレチン（Ｂ）、３’，４’，５’，５，６，７−ヘキサメトキシフラボン（Ｃ）、及び３，７，８，２’，４’−ペンタメトキシフラボン（Ｄ）そのものの細胞傷害活性を示すグラフである。図４の縦軸は、Ｋ５６２細胞がほぼ全て傷害された場合の活性を１００としたときの百分率を示す。図４におけるコントロール（ｃｏｎ）は、ＬＣの結果を示す。なお、図示していないがＥＴＣｍｉｘの細胞傷害活性は約４０％であった。
【０１０１】
図４に示すように、本実施例の条件下（インキュベート時間：４時間）においては、ノビレチン、タンゲレチン、３’，４’，５’，５，６，７−ヘキサメトキシフラボン、及び３，７，８，２’，４’−ペンタメトキシフラボンそのものには、細胞傷害活性が認められなかった。したがって、ポリメトキシフラボン自体は細胞傷害活性を有さないことが示唆された。
【０１０２】
〔実施例４：ＫＨＹＧ−１細胞のｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍによるＫ５６２細胞に対する細胞傷害活性の検討〕
実施例１及び２における細胞傷害活性試験では、試験化合物処理後のＫＨＹＧ−１細胞を、培地交換により洗浄してから使用した。しかし、ＫＨＹＧ−１細胞の培養上清（すなわちｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ（ＣＭ））が残存していた可能性も考えられる。そこで、Ｋ５６２細胞をＫＨＹＧ−１細胞のＣＭで処理することにより、そこに含まれる何らかの液性因子がＫ５６２細胞に対する傷害性を持つかどうか検討することとした。
【０１０３】
ポリメトキシフラボンを３０μＭ含む条件下、またはポリメトキシフラボンを含まない条件下で、３日間培養したＫＨＹＧ−１細胞の培養上清を遠心分離により回収した。回収した培養上清には、ＫＨＹＧ−１細胞から放出された液性因子が含まれる。また、ポリメトキシフラボンを含む条件下の培養上清にはポリメトキシフラボンも含まれる。
【０１０４】
また、細胞傷害活性のコントロールとして、ポリメトキシフラボンを含まない条件下で３日間培養したＫＨＹＧ−１細胞を、遠心分離により回収した。回収した細胞は１％ＦＢＳを含むＡｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ−１６４０培地に１×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるよう懸濁し、ＫＨＹＧ−１細胞液を調製した。
【０１０５】
一方、３日間培養したＫ５６２細胞を、ＫＨＹＧ−１細胞と同様に遠心分離により回収し、１％ＦＢＳを含むＡｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ−１６４０培地に５×１０４ ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるよう懸濁し、ＫＨＹＧ−１細胞液を調製した。
【０１０６】
細胞傷害活性試験は、ＥＴＣｍｉｘと、実施例１と同じコントロールとを揃えた条件で行った。さらに、Ｋ５６２細胞にＫＨＹＧ−１細胞のＣＭを添加するためのウェルを設けた。このウェルには、１００μｌのＫ５６２細胞液（５×１０３ｃｅｌｌｓ）、及び１００μｌのＣＭを添加した。
【０１０７】
９６ウェルプレートをＣＯ２インキュベーター内（３７℃，５％ＣＯ２）で４時間静置して反応させ、遠心分離したのち上清８０μｌを９６ウェルアッセイプレート（平底）に移した。各ウェルに用事調製した反応液を８０μｌずつ添加し、暗所で１５分から３０分反応させた。発色を確認後、可視光プレートリーダーを用いて４９０ｎｍで吸光度を測定した。対照波長は６００ｎｍとした。
【０１０８】
そして、各ウェルの吸光度からバックグラウンド（ＢＣ）を差し引いた値を求めた。この値を基に、細胞傷害活性（％）＝（（ＥＴＣｍｉｘ−ＥＣＣ）−ＬＣ）／（ＨＣ−ＬＣ）×１００を求めた。Ｋ５６２細胞にＫＨＹＧ−１細胞のＣＭを添加したウェルの評価については、細胞傷害活性（％）＝（対象ウェルの吸光度−ＬＣ）／（ＨＣ−ＬＣ）×１００を求めた。
【０１０９】
図５は、ノビレチン（Ａ）、タンゲレチン（Ｂ）、３’，４’，５’，５，６，７−ヘキサメトキシフラボン（Ｃ）、及び３，７，８，２’，４’−ペンタメトキシフラボン（Ｄ）を処理したＫＨＹＧ−１細胞の培養上清の細胞傷害活性を示すグラフである。図５の縦軸は、Ｋ５６２細胞がほぼ全て傷害された場合の活性を１００としたときの百分率を示す。図５におけるコントロール（ｃｏｎ）は、ポリメトキシフラボンを含まない条件下での培養上清の細胞傷害活性を示す。なお、図示していないが、ＥＴＣｍｉｘの細胞傷害活性は約４０％であった。
【０１１０】
図５に示すように、ＫＨＹＧ−１細胞の培養上清は、細胞傷害活性を示さなかった。なお、実施例３の結果より、ポリメトキシフラボン自体が細胞傷害活性を有さないことは明らかである。これに加え、本実施例では、培養上清に含まれるＫＨＹＧ−１細胞から放出された液性因子もまた細胞傷害活性を有さないことが示された。したがって、ポリメトキシフラボンによる細胞傷害活性の発揮には、活性化されたＫＨＹＧ−１が必要であることが示された。
【０１１１】
〔実施例５：ＫＨＹＧ−１細胞における細胞傷害活性関連遺伝子の発現解析〕
ＫＨＹＧ−１細胞を、３０μＭのポリメトキシフラボンを含む培地で２日間培養した。培養には２４ウェルプレートを用い、各化合物について４ウェルずつ使用した。遠心分離で回収した細胞にＲＮＡ抽出試薬を添加し、試薬の取扱説明書に従い全ＲＮＡを抽出した。これを基に合成したｃＤＮＡを鋳型として、リアルタイムＰＣＲを行ない、細胞傷害活性関連遺伝子の発現を解析した。
【０１１２】
細胞傷害活性関連遺伝子として、ＩＦＮ−γ遺伝子、パーフォリン（ｐｅｒｆｏｒｉｎ）遺伝子、及びグランザイムＢ（ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂ）遺伝子について解析した。また、内部標準として、ＧＡＰＤＨ遺伝子を用いた。それぞれの遺伝子のＰＣＲに使用したプライマー配列は以下の通りである。
【０１１３】
ＧＡＰＤＨ ｆｏｒｗａｒｄ：配列番号１
ＧＡＰＤＨ ｒｅｖｅｒｓｅ：配列番号２
ＩＦＮ−γ ｆｏｒｗａｒｄ：配列番号３
ＩＦＮ−γ ｒｅｖｅｒｓｅ：配列番号４
ｐｅｒｆｏｒｉｎ ｆｏｒｗａｒｄ：配列番号５
ｐｅｒｆｏｒｉｎ ｒｅｖｅｒｓｅ：配列番号６
ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂ ｆｏｒｗａｒｄ：配列番号７
ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂ ｒｅｖｅｒｓｅ：配列番号８。
【０１１４】
各遺伝子の発現レベルは、内部標準として用いたＧＡＰＤＨ遺伝子に対する相対値として表し、各試験化合物の４つの独立したウェルにおける相対値の平均値及び標準偏差を算出した。
【０１１５】
図６（ａ）〜（ｃ）は、ノビレチン（Ａ）、タンゲレチン（Ｂ）、３’，４’，５’，５，６，７−ヘキサメトキシフラボン（Ｃ）、及び３，７，８，２’，４’−ペンタメトキシフラボン（Ｄ）を処理したＫＨＹＧ−１細胞におけるＩＦＮ−γ遺伝子（ａ）、パーフォリン遺伝子（ｂ）及びグランザイムＢ遺伝子（ｃ）の発現量を示すグラフである。図６（ａ）〜（ｃ）に示す各発現量は、ポリメトキシフラボンを処理していないＫＨＹＧ−１細胞における発現量を１としたときの相対値として表される。また、図６（ａ）〜（ｃ）におけるコントロール（ｃｏｎ）は、ポリメトキシフラボンを処理していないＫＨＹＧ−１細胞における発現量を示す。
【０１１６】
以上の結果より、ノビレチン、タンゲレチン、３’，４’，５’，５，６，７−ヘキサメトキシフラボン、及び３，７，８，２’，４’−ペンタメトキシフラボンは、それぞれ差はあるものの、ＫＨＹＧ−１細胞において、ＩＦＮ−γ遺伝子、パーフォリン遺伝子及びグランザイムＢ遺伝子の発現を上昇させることがわかった。特に、３’，４’，５’，５，６，７−ヘキサメトキシフラボンは、各遺伝子の発現を顕著に上昇させた。
【０１１７】
ＩＦＮ−γ遺伝子、パーフォリン遺伝子及びグランザイムＢ遺伝子は、細胞傷害を誘導する、ＮＫ細胞に特徴的なエフェクター因子をコードする遺伝子である。本実施例から、ノビレチン、タンゲレチン、３’，４’，５’，５，６，７−ヘキサメトキシフラボン、及び３，７，８，２’，４’−ペンタメトキシフラボンがＮＫ細胞を活性化しうることがさらに証明された。
【０１１８】
また、ノビレチン、タンゲレチン、３’，４’，５’，５，６，７−ヘキサメトキシフラボン、及び３，７，８，２’，４’−ペンタメトキシフラボンは、ＮＫ細胞のＩＦＮ−γ遺伝子の発現を亢進することから、Ｔｈ２細胞を抑制する可能性がある。つまり、これらの化合物は、アレルギー症状を緩和させる効果をも有する可能性がある。
【０１１９】
また、これらの化合物、特に３’，４’，５’，５，６，７−ヘキサメトキシフラボンは、ＩＦＮ−γ遺伝子の発現を顕著に亢進することから、より高い効果を有する医薬の開発のリード化合物として利用しうる。
【産業上の利用可能性】
【０１２０】
本発明は、免疫細胞療法（特に活性化ＮＫ細胞療法）、免疫機能強化のための医薬、食品、飲料、サプリメント等、及び試薬等に好適に利用することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ナチュラルキラー細胞活性化剤、活性化されたナチュラルキラー細胞の製造方法及びスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリメトキシフラボンは、カンキツの果皮に多く含まれている成分である。癌又は感染症の予防又は治療のために、ポリメトキシフラボンを活性成分として用いる技術がいくつか知られている。
【０００３】
特許文献１には、柑橘類フラボノイドを含む、癌の予防または治療のための組成物が記載されている。
【０００４】
特許文献２には、動物内の腫瘍細胞の増殖を阻害するために、４’，５，６，７，８−ペンタメトキシフラボンおよび３’，４’，５，６，７，８−ヘキサメトキシフラボンを含むオレンジの皮の抽出物を動物に投与する方法が記載されている。
【０００５】
特許文献３には、ウイルスあるいは寄生虫感染症を治療するために、ポリメトキシフラボンなどのフラビン類を投与する方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２００３−５１０２４０号公報（２００３年３月１８日公表）
【特許文献２】特表２００３−５０９４４７号公報（２００３年３月１１日公表）
【特許文献３】特表２００３−５０４３２７号公報（２００３年２月４日公表）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、上述のような従来技術では、化合物を直接投与するため、がん細胞及び感染細胞だけでなく、正常細胞も影響を受けるおそれがある。そのため、選択的にがん細胞及び感染細胞を阻害又は抑制する方法の開発が望まれている。
【０００８】
本発明は、上記の従来技術が有する問題に鑑みてなされたものであり、その目的は、選択的にがん細胞及び感染細胞を阻害又は抑制する技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために、がん細胞及び感染細胞を選択的に傷害し、排除する機能を有する免疫細胞の一種であるナチュラルキラー細胞（以下、「ＮＫ細胞」ともいう。）に着目した。そして、鋭意検討を行い、所定の構造を有するポリメトキシフラボン類がＮＫ細胞を直接活性化し、ＮＫ細胞のがん細胞に対する傷害活性を高めることを見出し、本発明を完成させた。
【００１０】
本発明に係るナチュラルキラー細胞活性化剤（以下、「ＮＫ細胞活性化剤」ともいう。）は、下記式（１）で表される化合物を有効成分とすることを特徴とする。
【００１１】
【化１】
【００１２】
（上記式（１）中、Ｒ１〜Ｒ１０は、それぞれ独立して水素原子、水酸基、炭素数１〜５のアルキル基又は炭素数１〜４のアルコキシ基であり、Ｒ１〜Ｒ１０のうちの少なくとも４個が炭素数１〜４のアルコキシ基である）
また、本発明に係るナチュラルキラー細胞活性化剤では、上記式（１）中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ９、Ｒ１０はそれぞれ独立して水素原子、炭素数１〜５のアルキル基又は炭素数１〜４のアルコキシ基であり、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ９、Ｒ１０のうちの少なくとも２個が炭素数１〜４のアルコキシ基であり、Ｒ４、Ｒ８は炭素数１〜４のアルコキシ基であり、Ｒ６は水素原子又は炭素数１〜５のアルキル基であることが好ましい。
【００１３】
また、本発明に係るナチュラルキラー細胞活性化剤では、上記式（１）中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ９、Ｒ１０はそれぞれ独立して水素原子又はメトキシ基であり、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ９、Ｒ１０のうちの少なくとも２個がメトキシ基であり、Ｒ４、Ｒ８はメトキシ基であり、Ｒ２は水素原子、水酸基又はメトキシ基であり、Ｒ６は水素原子であることが好ましい。
【００１４】
また、本発明に係るナチュラルキラー細胞活性化剤では、上記化合物は、シネンセチン、タンゲレチン、ノビレチン、ガルデニン、３，７，３’，４’，５’−ペンタメトキシフラボン、５，７，３’，４’，５’−ペンタメトキシフラボン、３’，４’，５’，５，６，７−ヘキサメトキシフラボン、及び３，７，８，２’，４’−ペンタメトキシフラボンからなる群より選択されることが好ましい。
【００１５】
本発明に係るナチュラルキラー細胞活性化方法は、ナチュラルキラー細胞を、上述したいずれかのナチュラルキラー細胞活性化剤に接触させる活性化工程を含むことを特徴とする。
【００１６】
本発明に係るナチュラルキラー細胞の製造方法は、ナチュラルキラー細胞を、上述したいずれかのナチュラルキラー細胞活性化剤に接触させる活性化工程を含むことを特徴とする。
【００１７】
本発明に係るナチュラルキラー細胞活性化能を有する化合物のスクリーニング方法は、ナチュラルキラー細胞を試験化合物に接触させて処理する試験化合物処理工程と、上記試験化合物処理工程において処理されたナチュラルキラー細胞とがん細胞との混合液を得る混合工程と、上記混合液中の乳酸脱水素酵素活性を測定する測定工程とを含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、選択的にがん細胞及び感染細胞を阻害又は抑制する技術を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ＮＫ細胞の細胞傷害活性を促進する化合物のスクリーニング結果を示す棒グラフである。
【図２】（Ａ）〜（Ｄ）は、ノビレチン（Ａ）、タンゲレチン（Ｂ）、３’，４’，５’，５，６，７−ヘキサメトキシフラボン（Ｃ）、及び３，７，８，２’，４’−ペンタメトキシフラボン（Ｄ）の構造式を示す図である。
【図３】（Ａ）〜（Ｄ）は、ノビレチン（Ａ）、タンゲレチン（Ｂ）、３’，４’，５’，５，６，７−ヘキサメトキシフラボン（Ｃ）、及び３，７，８，２’，４’−ペンタメトキシフラボン（Ｄ）により処理されたＫＨＹＧ−１細胞の細胞傷害活性を示すグラフである。
【図４】ノビレチン（Ａ）、タンゲレチン（Ｂ）、３’，４’，５’，５，６，７−ヘキサメトキシフラボン（Ｃ）、及び３，７，８，２’，４’−ペンタメトキシフラボン（Ｄ）そのものの細胞傷害活性を示すグラフである。
【図５】ノビレチン（Ａ）、タンゲレチン（Ｂ）、３’，４’，５’，５，６，７−ヘキサメトキシフラボン（Ｃ）、及び３，７，８，２’，４’−ペンタメトキシフラボン（Ｄ）を処理したＫＨＹＧ−１細胞の培養上清の細胞傷害活性を示すグラフである。
【図６】（ａ）〜（ｃ）は、ノビレチン（Ａ）、タンゲレチン（Ｂ）、３’，４’，５’，５，６，７−ヘキサメトキシフラボン（Ｃ）、及び３，７，８，２’，４’−ペンタメトキシフラボン（Ｄ）を処理したＫＨＹＧ−１細胞におけるＩＦＮ−γ遺伝子（ａ）、パーフォリン遺伝子（ｂ）及びグランザイムＢ遺伝子（ｃ）の発現量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
〔ＮＫ細胞活性化剤〕
本発明に係るＮＫ細胞活性化剤は、上記式（１）で表される化合物を有効成分とする。
【００２１】
上記式（１）中、Ｒ１〜Ｒ１０は、それぞれ独立して水素原子、水酸基、炭素数１〜５のアルキル基又は炭素数１〜４のアルコキシ基である。Ｒ１〜Ｒ１０のうちの少なくとも４個がアルコキシ基である。また、Ｒ１〜Ｒ１０のうちの４個〜７個がアルコキシ基であることが好ましく、５個又は６個がアルコキシ基であることがより好ましい。
【００２２】
Ｒ１〜Ｒ１０のうちのアルコキシ基は、炭素数１〜２であることが好ましく、メトキシ基であることがより好ましい。言い換えれば、Ｒ１〜Ｒ１０は、それぞれ独立して水素原子、水酸基又は炭素数１〜２のアルコキシ基であることが好ましく、それぞれ独立して水素原子、水酸基又はメトキシ基であることがより好ましい。
【００２３】
Ｒ１〜Ｒ１０のうちのアルキル基は、炭素数１〜３であることが好ましく、炭素数１〜２であることがより好ましい。
【００２４】
Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ９、Ｒ１０は、それぞれ独立して水素原子、炭素数１〜５のアルキル基又は炭素数１〜４のアルコキシ基であることが好ましく、それぞれ独立して水素原子、炭素数１〜３のアルキル基又は炭素数１〜２のアルコキシ基であることがより好ましく、それぞれ独立して水素原子又はメトキシ基であることがさらに好ましい。
【００２５】
Ｒ４、Ｒ８は、それぞれ独立して炭素数１〜４のアルコキシ基であることが好ましく、それぞれ独立して炭素数１〜２のアルコキシ基であることがより好ましく、メトキシ基であることがさらに好ましい。
【００２６】
Ｒ６は水素原子又は炭素数１〜５のアルキル基であることが好ましく、水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基であることがより好ましく、水素原子であることがさらに好ましい。
【００２７】
また、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ９、Ｒ１０がそれぞれ独立して水素原子、炭素数１〜５のアルキル基又は炭素数１〜４のアルコキシ基であり、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ９、Ｒ１０のうちの少なくとも２個が炭素数１〜４のアルコキシ基であり、Ｒ４、Ｒ８が炭素数１〜４のアルコキシ基であり、Ｒ６が水素原子又は炭素数１〜５のアルキル基であることが好ましい。
【００２８】
また、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ９、Ｒ１０がそれぞれ独立して水素原子又はメトキシ基であり、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ９、Ｒ１０のうちの少なくとも２個がメトキシ基であり、Ｒ４、Ｒ８がメトキシ基であり、Ｒ２が水素原子、水酸基又はメトキシ基であり、Ｒ６が水素原子であることがより好ましい。
【００２９】
さらに、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ８がそれぞれ独立して炭素数１〜４のアルコキシ基であり、Ｒ１、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ９、Ｒ１０がそれぞれ独立して水素原子、水酸基又は炭素数１〜５のアルキル基であることが好ましい。
【００３０】
また、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ８、Ｒ９がそれぞれ独立して炭素数１〜４のアルコキシ基であり、Ｒ１、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ１０がそれぞれ独立して水素原子、水酸基又は炭素数１〜５のアルキル基であることが好ましい。
【００３１】
また、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９がそれぞれ独立して炭素数１〜４のアルコキシ基であり、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ１０がそれぞれ独立して水素原子、水酸基又は炭素数１〜５のアルキル基であることが好ましい。
【００３２】
また、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９がそれぞれ独立して炭素数１〜４のアルコキシ基であり、Ｒ１、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ１０がそれぞれ独立して水素原子、水酸基又は炭素数１〜５のアルキル基であることが好ましい。
【００３３】
また、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ８、Ｒ１０がそれぞれ独立して炭素数１〜４のアルコキシ基であり、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ９がそれぞれ独立して水素原子、水酸基又は炭素数１〜５のアルキル基であることが好ましい。
【００３４】
上記式（１）で表される化合物は、いわゆるポリメトキシフラボンであることが好ましい。ポリメトキシフラボンは、複数のメトキシ基を有するフラボンであればよく、天然化合物であってもよいし、非天然化合物であってもよい。
【００３５】
上記式（１）で表される化合物としては、例えばシネンセチン、タンゲレチン、ノビレチン、ガルデニン、３，７，３’，４’，５’−ペンタメトキシフラボン、５，７，３’，４’，５’−ペンタメトキシフラボン、３’，４’，５’，５，６，７−ヘキサメトキシフラボン、３，７，８，２’，４’−ペンタメトキシフラボン、ナツダイダイン、３，５，６，７，３’，４’−ヘキサメトキシフラボン、３，５，６，７，８，３’，４’−ヘプタメトキシフラボン、及びこれらの代謝産物などが挙げられる。なかでも、シネンセチン、タンゲレチン、ノビレチン、ガルデニン、３，７，３’，４’，５’−ペンタメトキシフラボン、５，７，３’，４’，５’−ペンタメトキシフラボン、３’，４’，５’，５，６，７−ヘキサメトキシフラボン、及び３，７，８，２’，４’−ペンタメトキシフラボンからなる群より選択されることが好ましい。
【００３６】
代謝産物としては、例えば脱メチル化された化合物等であってもよく、例えば４’−デメチルノビレチン、３’，４’−ジデメチルノビレチン等が挙げられる。
【００３７】
上記式（１）で表される化合物は、人工的に合成されたものであってもよい。合成方法としては、公知の方法を用いることができる。また、上記式（１）で表される化合物は、天然から取得したものであってもよい。例えばポリメトキシフラボンのうちのいくつかは、カンキツの果皮等から抽出することができる。抽出方法としては、公知の方法を利用することができる。ＮＫ細胞活性化剤は、上記式（１）で表される化合物を、カンキツからの抽出物として含んでいてもよい。
【００３８】
本発明に係るＮＫ細胞活性化剤中、上記式（１）で表される化合物は、溶媒中に溶解していてもよい。溶媒としては、例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エタノール等を用いることができる。
【００３９】
本発明に係るＮＫ細胞活性化剤は、生理活性物質（サイトカイン等）、血清、バッファー、培地、添加剤等をさらに含んでいてもよい。また、ＮＫ細胞活性化剤は、賦形剤、崩壊剤、乳化剤、可塑剤、緩衝剤（ＨＥＰＥＳ等）、糖類、ビタミン類（アスコルビン酸等）、ｐＨ調整剤、香料、アミノ酸、公知のＮＫ細胞活性化剤等をさらに含んでいてもよい。
【００４０】
本発明に係るＮＫ細胞活性化剤は、ＮＫ細胞の細胞傷害活性を高め、活性化することができる。この活性化されたＮＫ細胞を用いれば、がん細胞及び感染細胞を選択的に傷害させることができる。したがって、本発明を利用することによって、選択的にがん細胞及び感染細胞を阻害又は抑制することができる。
【００４１】
本発明は、例えば免疫細胞療法（特に活性化ＮＫ細胞療法）に有用である。また、本発明に係るＮＫ細胞活性化剤は、免疫機能強化のための医薬、食品、飲料、サプリメント等に好適に利用することができる。また、本発明に係るＮＫ細胞活性化剤は、活性化剤、阻害剤などの実験用試薬に好適に利用することができる。
【００４２】
〔組成物〕
本発明はまた、新規な組成物を提供する。本発明に係る組成物は、少なくとも上記式（１）で表される化合物を含む。
【００４３】
上記式（１）中、Ｒ１〜Ｒ１０は、ＮＫ細胞活性化剤の項目で例示したものと同様であってよい。また、上記式（１）で表される化合物として、ＮＫ細胞活性化剤の項目で例示した化合物を好適に用いることができる。
【００４４】
また、組成物は、上記式（１）で表される化合物を溶解させるための溶媒をさらに含んでいてもよい。溶媒としては、ＮＫ細胞活性化剤の項目で例示したものを用いることができる。組成物は、生理活性物質（サイトカイン等）、血清、バッファー、培地、添加剤等をさらに含んでいてもよい。また、組成物は、賦形剤、崩壊剤、乳化剤、可塑剤、緩衝剤（ＨＥＰＥＳ等）、糖類、ビタミン類（アスコルビン酸等）、ｐＨ調整剤、香料、アミノ酸、公知のＮＫ細胞活性化剤等をさらに含んでいてもよい。
【００４５】
以上の構成により、本発明に係る組成物は、上記式（１）で表される化合物を含んでいるため、ＮＫ細胞の活性化に好適に利用することができる。この活性化されたＮＫ細胞を用いれば、がん細胞及び感染細胞を選択的に傷害させることができる。したがって、本発明を利用することによって、選択的にがん細胞及び感染細胞を阻害又は抑制することができる。
【００４６】
本発明は、免疫細胞療法、免疫機能強化のための医薬、食品、飲料、サプリメント等、及び実験用試薬等に好適に利用することができる。
【００４７】
〔ＮＫ細胞活性化方法〕
本発明はまた、ＮＫ細胞活性化方法を提供する。本発明に係るＮＫ細胞活性化方法は、ＮＫ細胞を、本発明に係るＮＫ細胞活性化剤に接触させる活性化工程を含む。すなわち、活性化工程では、ＮＫ細胞を上記式（１）で表される化合物に接触させる。
【００４８】
ＮＫ細胞をＮＫ細胞活性化剤に接触させる方法としては、特に限定されないが、例えば、ＮＫ細胞活性化剤を添加した培地中でＮＫ細胞を培養する方法などを用いることができる。
【００４９】
活性化工程においてＮＫ細胞をＮＫ細胞活性化剤に接触させる際、上記式（１）で表される化合物の反応液中の濃度は、１μＭ〜３０μＭであることが好ましい。また、接触させる時間は４時間〜２４時間が好ましい。なお、ＮＫ細胞活性化剤を添加した培地中でＮＫ細胞を培養する場合、培養条件としては、公知の条件を好適に用いることができる。
【００５０】
なお、活性化工程は、体外において行なってもよい。
【００５１】
本発明に係るＮＫ細胞活性化方法を用いれば、ＮＫ細胞を効率よく活性化することができる。したがって、がん細胞及び感染細胞を選択的に阻害又は抑制することができるＮＫ細胞を効率よく提供することができる。
【００５２】
〔活性化されたＮＫ細胞の製造方法〕
本発明はまた、上述した活性化工程を含む、活性化されたＮＫ細胞の製造方法を提供する。なお、活性化工程は、体外において行なってもよい。
【００５３】
「活性化されたＮＫ細胞」とは、未処理のＮＫ細胞と比較して高い細胞傷害活性を有するＮＫ細胞をさす。活性化されたＮＫ細胞は、未処理のＮＫ細胞の１．５倍以上の細胞傷害活性を有していることが好ましい。
【００５４】
本発明に係る活性化されたＮＫ細胞の製造方法によれば、活性化されたＮＫ細胞を効率よく製造することができる。したがって、本発明を利用することによって、がん細胞及び感染細胞を選択的に阻害又は抑制することができる。
【００５５】
〔スクリーニング方法〕
本発明はまた、ＮＫ細胞活性化能を有する化合物のスクリーニング方法を提供する。本発明に係るスクリーニング方法は、試験化合物処理工程と、混合工程と、測定工程とを含む。
【００５６】
試験化合物処理工程は、ＮＫ細胞を試験化合物に接触させて処理する工程である。接触させる方法としては、特に限定されないが、例えば、試験化合物を添加した培地中でＮＫ細胞を培養する方法などを用いることができる。
【００５７】
試験化合物処理工程は、ＮＫ細胞以外の他の細胞を含まない系で行なうことが好ましい。例えば、株化したＮＫ細胞を用いることが好ましい。これにより、ＮＫ細胞を直接活性化することができる化合物を選抜することが可能となる。
【００５８】
混合工程は、試験化合物処理工程において処理されたＮＫ細胞とがん細胞との混合液を得る工程である。混合する方法は、特に限定されないが、例えばそれぞれの細胞の懸濁液を混合する方法を用いてもよい。混合工程におけるＮＫ細胞とがん細胞との細胞数の比は、２０：１〜５：１であることが好ましい。
【００５９】
測定工程は、混合液中のＬＤＨ活性を測定する工程である。これにより、傷害を受けたがん細胞から遊離するＬＤＨの活性を測定することができる。このＬＤＨ活性から、試験化合物の細胞傷害活性を求めることができる。例えば、混合液中のほぼ全てのがん細胞が傷害を受けた場合のＬＤＨ活性に対する、測定工程において測定されたＬＤＨ活性の割合を求め、これを細胞傷害活性とすることができる。
【００６０】
混合液中のほぼ全てのがん細胞が傷害を受けた場合のＬＤＨ活性は、例えば、混合工程において用いるがん細胞と同数のがん細胞に、細胞傷害性の試薬（例えば界面活性剤等）を添加した後に測定されるＬＤＨ活性としてもよい。
【００６１】
本発明では、細胞傷害活性の指標として、傷害を受けた細胞から遊離するＬＤＨの活性を用いる。したがって、アイソトープを使用する方法などを用いる場合と比較して、アイソトープ実験に必要とする各種手続きを行なったり、アイソトープ実験に必要な設備を整えたり、アイソトープの管理等を行なったりする必要がない。そのため、より容易に細胞傷害活性を測定することが可能である。
【００６２】
本発明に係るスクリーニング方法は、さらに選抜工程を含んでいてもよい。選抜工程は、測定工程において測定されたＬＤＨ活性から細胞傷害活性を算出し、その細胞傷害活性が、未処理のＮＫ細胞が有する細胞傷害活性よりも大きい場合に、試験化合物処理工程にて用いた試験化合物を選抜する工程である。例えば、算出された細胞傷害活性が、未処理のＮＫ細胞が有する細胞傷害活性の１．５倍以上である場合に、試験化合物処理工程にて用いた試験化合物を選抜してもよい。
【００６３】
選抜工程において選抜された試験化合物は、ＮＫ細胞活性化能を有する化合物である。したがって、本発明によれば、ＮＫ細胞活性化剤の有効成分となりうる有用な化合物をスクリーニングすることができる。この有用な化合物を利用することによって、選択的にがん細胞及び感染細胞を阻害又は抑制することができる。
【００６４】
以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。
【実施例】
【００６５】
〔実施例１：スクリーニング〕
まず、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の細胞傷害活性を促進する化合物のスクリーニングを行なった。試験成分としては、下記表１に示す７１種類の化合物を用いた。なお、試験成分の入手先を表１の括弧内に示す。
【００６６】
【表１】
【００６７】
（表１続き）
【００６８】
（材料）
ＮＫ細胞としてＫＨＹＧ−１を用いた。また、がん細胞として前骨髄性白血病細胞株Ｋ５６２を用いた。ＫＨＹＧ−１及びＫ５６２は、ヒューマンサイエンス研究資源バンクより購入した。ＲＰＭＩ−１６４０培地、ペニシリン・ストレプトマイシン溶液、ヒトＩＬ−２、及びＲＮＡ抽出試薬（ＩＳＯＧＥＮ）は、和光純薬株式会社から購入した。
【００６９】
Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＬＤＨ）およびリアルタイムＰＣＲ用マスターミックス（ＦａｓｔＳｔａｒｔ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｘ））は、ロシュ社から購入した。Ａｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ１６４０培地は、ライフテクノロジーズ社から購入した。ウシ胎児血清（ＦＢＳ）は、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社から購入した。ｃＤＮＡ合成試薬（ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（商品名）ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ）は、タカラバイオ社から購入した。
【００７０】
（細胞培養）
ＫＨＹＧ−１細胞は、３７℃，５％ＣＯ２下、１０％ＦＢＳ、５０ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ−２、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリンＧ、及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ−１６４０培地中において維持し、３日おきに継代した。
【００７１】
Ｋ５６２細胞は、３７℃，５％ＣＯ２下、１０％ＦＢＳ、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリンＧ、及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ−１６４０培地中において維持し、３日おきに継代した。
【００７２】
ＫＨＹＧ−１細胞およびＫ５６２細胞は、６０ｍｍ培養ディッシュを用いて培養した。
【００７３】
（細胞傷害活性試験）
次に、各試験化合物によってＫＨＹＧ−１細胞を処理し、細胞傷害活性を評価した。本実施例では、細胞傷害の指標として、傷害を受けた細胞から遊離するＬＤＨの活性を用いた。
【００７４】
各試験化合物は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解してストック溶液とした。このストック溶液を、ＫＨＹＧ−１細胞の継代時にそれぞれ終濃度３０μＭとなるよう培地に添加した。なお、添加後の培地中に含まれるＤＭＳＯの濃度は、０．１％以下となるようにした。
【００７５】
各試験化合物を含む培地で３日間培養したＫＨＹＧ−１細胞を、遠心分離により回収し、培地に含まれる試験化合物を除いた。回収した細胞を、１％ＦＢＳを含むＡｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ−１６４０培地に１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるよう懸濁し、ＫＨＹＧ−１細胞液を調製した。
【００７６】
一方、Ｋ５６２細胞を、ＫＨＹＧ−１と同様の方法により回収し、１％ＦＢＳを含むＡｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ−１６４０培地に５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるよう懸濁し、Ｋ５６２細胞液を調製した。
【００７７】
なお、本実験において細胞傷害の指標とする乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）は、血清中にも含まれており、バックグラウンドを抑えるためには血清濃度を抑えた条件下で行うことが望ましい。本実施例では、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ−１６４０培地を使用することにより、低血清条件とすることができ、かつ安定した結果を得ることができた。
【００７８】
９６ウェルプレート（Ｕ底）のウェルに、ＫＨＹＧ−１細胞とＫ５６２細胞とを含む液（ＥＴＣｍｉｘ：ｅｆｆｅｃｔｏｒ−ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌ ｍｉｘ）を入れた。ＥＴＣｍｉｘにおけるＫＨＹＧ−１細胞とＫ５６２細胞との割合は、２０：１とした。
【００７９】
また、この９６ウェルプレートの他のウェルに、各コントロール溶液を入れた。コントロール溶液としては、培地のみ（ＢＣ：ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ）、Ｋ５６２細胞液に界面活性剤を添加（ＨＣ：ｈｉｇｈ ｃｏｎｔｒｏｌ）、Ｋ５６２細胞液のみ（ＬＣ：ｌｏｗ ｃｏｎｔｒｏｌ）、ＫＨＹＧ−１細胞液のみ（ＥＣＣ：ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｅｌｌ ｃｏｎｔｒｏｌ）を用いた。
【００８０】
なお、Ｋ５６２細胞液に界面活性剤を添加したコントロール（ＨＣ）は、Ｋ５６２細胞がほぼ全て傷害を受けたときの活性を測定するためのものである。
【００８１】
具体的には、調製したＫＨＹＧ−１細胞液を、ＥＴＣｍｉｘ用及びＥＣＣ用のウェルに、１００μｌ（１×１０５ｃｅｌｌｓ）ずつ分注した。また、Ｋ５６２細胞液を、ＥＴＣｍｉｘ用、ＨＣ用、及びＬＣ用のウェルに１００μｌ（５×１０３ｃｅｌｌｓ）ずつ分注した。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を２％含む培地を、ＨＣ用のウェルに１００μｌ（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００の終濃度１％）添加した。また、培地のみを、ＬＣ用のウェルに１００μｌ添加し、ＢＣ用のウェルに２００μｌ添加した。
【００８２】
ＥＴＣｍｉｘおよび各コントロールについての実験は、３連（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）で行なった。プレートをＣＯ２インキュベーター内（３７℃，５％ＣＯ２）で４時間静置し、遠心分離したのち上清８０μｌを９６ウェルアッセイプレート（平底）に移した。Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＬＤＨ）に添付の説明書にしたがって用事調製した反応液（ジアホラーゼ、ＮＡＤ＋、ヨードテトラゾリウムクロライド、乳酸ナトリウムの各成分を含む）を各ウェルに８０μｌずつ添加し、暗所に１５分から３０分静置した。発色を確認後、可視光プレートリーダーを用いて４９０ｎｍで吸光度を測定した。対照波長は６００ｎｍとした。
【００８３】
そして、各ウェルの吸光度からバックグラウンド（ＢＣ）を差し引いた値を求めた。この値を基に、細胞傷害活性（％）＝（（ＥＴＣｍｉｘ−ＥＣＣ）−ＬＣ）／（ＨＣ−ＬＣ）×１００を求めた。この細胞傷害活性（％）は、Ｋ５６２細胞がほぼ全て傷害を受けたときの活性を１００とした場合の百分率である。
【００８４】
本スクリーニングにおいては、１枚の９６ウェルプレートあたり、１０種類前後の試験化合物について試験した。また、各試験（各プレート）では、未処理のＫＨＹＧ−１細胞の細胞傷害活性を同時に評価した。
【００８５】
図１は、ＮＫ細胞の細胞傷害活性を促進する化合物のスクリーニング結果を示す棒グラフである。図１において、縦軸は、未処理のＫＨＹＧ−１細胞の細胞傷害活性を１とした場合における、各試験化合物についての細胞傷害活性の相対値を表す。また、白いバーは、ポリメトキシフラボンに属する試験化合物の結果であることを示す。
【００８６】
まず１〜６０番の試験化合物について試験したところ、ＫＨＹＧ−１細胞の細胞傷害活性の相対値が１．５以上を示す試験化合物はシトラール（１６）、シネンセチン（２７）、タンゲレチン（３５）、及びノビレチン（５２）の４つであった。このうちシネンセチン、タンゲレチン及びノビレチンの３つは、ＫＨＹＧ−１細胞の細胞傷害活性を促進する活性について再現性が見られた。一方、シトラールについては、細胞傷害活性の促進についての再現性が見られなかった。
【００８７】
シネンセチン、タンゲレチン及びノビレチンの３つは、ポリメトキシフラボンに属する化合物である。そこで次に、他のポリメトキシフラボン（６１〜７１）について、同様に試験した。その結果、多くのポリメトキシフラボンが、ＫＨＹＧ−１細胞の細胞傷害活性を促進する活性を有していることが示された。特に高い活性を示したポリメトキシフラボンは、ガルデニン（６３）、３，７，３’，４’，５’−ペンタメトキシフラボン（６４）、５，７，３’，４’，５’−ペンタメトキシフラボン（６５）、３’，４’，５’，５，６，７−ヘキサメトキシフラボン（６６）、３，７，８，２’，４’−ペンタメトキシフラボン（６９）であった。
【００８８】
以上の結果より、多くのポリメトキシフラボンがＮＫ細胞の細胞傷害活性を促進する活性、すなわちＮＫ細胞活性化能を有していることが示された。
【００８９】
〔実施例２：ポリメトキシフラボンによるＮＫ細胞活性化に対する濃度依存性の検討〕
実施例１におけるスクリーニングで、ＮＫ細胞の細胞傷害活性を促進する活性を有することが明らかとなったポリメトキシフラボンのうちのいくつかの化合物について、以下、実施例２〜５を行なった。
【００９０】
実施例２では、これらのポリメトキシフラボンについて、ＮＫ細胞活性化に対する濃度依存性を検討した。実施例１では、試験化合物の終濃度を３０μＭとしたが、これより低い濃度でもＮＫ細胞を活性化するかどうかを検討した。
【００９１】
本実施例では、ノビレチン（５２）、タンゲレチン（３５）、３’，４’，５’，５，６，７−ヘキサメトキシフラボン（６６）、及び３，７，８，２’，４’−ペンタメトキシフラボン（６９）について検討した。図２（Ａ）〜（Ｄ）は、ノビレチン（Ａ）、タンゲレチン（Ｂ）、３’，４’，５’，５，６，７−ヘキサメトキシフラボン（Ｃ）、及び３，７，８，２’，４’−ペンタメトキシフラボン（Ｄ）の構造式を示す図である。
【００９２】
これらの化合物の終濃度を３０μＭ又は１０μＭとし、実施例１と同様の方法及び条件によって細胞の培養及び調製、ＮＫ細胞の処理、ならびに細胞傷害活性試験を行なった。
【００９３】
この結果を図３（Ａ）〜（Ｄ）に示す。図３（Ａ）〜（Ｄ）は、ノビレチン（Ａ）、タンゲレチン（Ｂ）、３’，４’，５’，５，６，７−ヘキサメトキシフラボン（Ｃ）、及び３，７，８，２’，４’−ペンタメトキシフラボン（Ｄ）により処理されたＫＨＹＧ−１細胞の細胞傷害活性を示すグラフである。図３（Ａ）〜（Ｄ）の縦軸は、Ｋ５６２細胞がほぼ全て傷害された場合の活性を１００としたときの百分率を示す。
【００９４】
図３（Ａ）〜（Ｄ）に示すように、これらの化合物は、濃度依存的にＮＫ細胞の細胞傷害活性を亢進した。
【００９５】
〔実施例３：ポリメトキシフラボン自体によるＫ５６２細胞に対する細胞傷害活性の検討〕
本実施例では、ポリメトキシフラボンそのものがＫ５６２細胞に対する細胞傷害活性を有するか否かを検討することとした。
【００９６】
ポリメトキシフラボンを含まない条件下で３日間培養したＫＨＹＧ−１細胞を遠心分離により回収した。回収した細胞を、１％ＦＢＳを含むＡｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ−１６４０培地に１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるよう懸濁し、ＫＨＹＧ−１細胞液を調製した。また、３日間培養したＫ５６２細胞を、同様に遠心分離により回収し、１％ＦＢＳを含むＡｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ−１６４０培地に５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるよう懸濁し、Ｋ５６２細胞液を調製した。また、３０μＭのポリメトキシフラボンを含むＡｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ−１６４０培地を準備した。
【００９７】
細胞傷害活性試験は、実施例１と同様に、ＥＴＣｍｉｘと、実施例１と同じコントロールとを揃えた条件で行なった。さらに、Ｋ５６２細胞に直接ポリメトキシフラボンを添加するためのウェルを設けた。このウェルには、１００μｌのＫ５６２細胞液（５×１０３ｃｅｌｌｓ）、及び１００μｌのポリメトキシフラボン（終濃度１５μＭ）を含む培地を添加した。
【００９８】
９６ウェルプレートをＣＯ２インキュベーター内（３７℃，５％ＣＯ２）で４時間静置し、遠心分離したのち上清８０μｌを９６ウェルアッセイプレート（平底）に移した。各ウェルに用事調製した反応液を８０μｌずつ添加し、暗所で１５分から３０分静置して反応させた。発色を確認後、可視光プレートリーダーを用いて４９０ｎｍで吸光度を測定した。対照波長は６００ｎｍとした。
【００９９】
そして、各ウェルの吸光度からバックグラウンド（ＢＣ）を差し引いた値を求めた。この値を基に、細胞傷害活性（％）＝((ＥＴＣｍｉｘ−ＥＣＣ）−ＬＣ）／（ＨＣ−ＬＣ）×１００を求めた。Ｋ５６２細胞に直接ポリメトキシフラボンを添加したウェルの評価については、細胞傷害活性（％）＝（対象ウェルの吸光度−ＬＣ）／（ＨＣ−ＬＣ）×１００を求めた。
【０１００】
図４は、ノビレチン（Ａ）、タンゲレチン（Ｂ）、３’，４’，５’，５，６，７−ヘキサメトキシフラボン（Ｃ）、及び３，７，８，２’，４’−ペンタメトキシフラボン（Ｄ）そのものの細胞傷害活性を示すグラフである。図４の縦軸は、Ｋ５６２細胞がほぼ全て傷害された場合の活性を１００としたときの百分率を示す。図４におけるコントロール（ｃｏｎ）は、ＬＣの結果を示す。なお、図示していないがＥＴＣｍｉｘの細胞傷害活性は約４０％であった。
【０１０１】
図４に示すように、本実施例の条件下（インキュベート時間：４時間）においては、ノビレチン、タンゲレチン、３’，４’，５’，５，６，７−ヘキサメトキシフラボン、及び３，７，８，２’，４’−ペンタメトキシフラボンそのものには、細胞傷害活性が認められなかった。したがって、ポリメトキシフラボン自体は細胞傷害活性を有さないことが示唆された。
【０１０２】
〔実施例４：ＫＨＹＧ−１細胞のｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍによるＫ５６２細胞に対する細胞傷害活性の検討〕
実施例１及び２における細胞傷害活性試験では、試験化合物処理後のＫＨＹＧ−１細胞を、培地交換により洗浄してから使用した。しかし、ＫＨＹＧ−１細胞の培養上清（すなわちｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ（ＣＭ））が残存していた可能性も考えられる。そこで、Ｋ５６２細胞をＫＨＹＧ−１細胞のＣＭで処理することにより、そこに含まれる何らかの液性因子がＫ５６２細胞に対する傷害性を持つかどうか検討することとした。
【０１０３】
ポリメトキシフラボンを３０μＭ含む条件下、またはポリメトキシフラボンを含まない条件下で、３日間培養したＫＨＹＧ−１細胞の培養上清を遠心分離により回収した。回収した培養上清には、ＫＨＹＧ−１細胞から放出された液性因子が含まれる。また、ポリメトキシフラボンを含む条件下の培養上清にはポリメトキシフラボンも含まれる。
【０１０４】
また、細胞傷害活性のコントロールとして、ポリメトキシフラボンを含まない条件下で３日間培養したＫＨＹＧ−１細胞を、遠心分離により回収した。回収した細胞は１％ＦＢＳを含むＡｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ−１６４０培地に１×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるよう懸濁し、ＫＨＹＧ−１細胞液を調製した。
【０１０５】
一方、３日間培養したＫ５６２細胞を、ＫＨＹＧ−１細胞と同様に遠心分離により回収し、１％ＦＢＳを含むＡｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ−１６４０培地に５×１０４ ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるよう懸濁し、ＫＨＹＧ−１細胞液を調製した。
【０１０６】
細胞傷害活性試験は、ＥＴＣｍｉｘと、実施例１と同じコントロールとを揃えた条件で行った。さらに、Ｋ５６２細胞にＫＨＹＧ−１細胞のＣＭを添加するためのウェルを設けた。このウェルには、１００μｌのＫ５６２細胞液（５×１０３ｃｅｌｌｓ）、及び１００μｌのＣＭを添加した。
【０１０７】
９６ウェルプレートをＣＯ２インキュベーター内（３７℃，５％ＣＯ２）で４時間静置して反応させ、遠心分離したのち上清８０μｌを９６ウェルアッセイプレート（平底）に移した。各ウェルに用事調製した反応液を８０μｌずつ添加し、暗所で１５分から３０分反応させた。発色を確認後、可視光プレートリーダーを用いて４９０ｎｍで吸光度を測定した。対照波長は６００ｎｍとした。
【０１０８】
そして、各ウェルの吸光度からバックグラウンド（ＢＣ）を差し引いた値を求めた。この値を基に、細胞傷害活性（％）＝（（ＥＴＣｍｉｘ−ＥＣＣ）−ＬＣ）／（ＨＣ−ＬＣ）×１００を求めた。Ｋ５６２細胞にＫＨＹＧ−１細胞のＣＭを添加したウェルの評価については、細胞傷害活性（％）＝（対象ウェルの吸光度−ＬＣ）／（ＨＣ−ＬＣ）×１００を求めた。
【０１０９】
図５は、ノビレチン（Ａ）、タンゲレチン（Ｂ）、３’，４’，５’，５，６，７−ヘキサメトキシフラボン（Ｃ）、及び３，７，８，２’，４’−ペンタメトキシフラボン（Ｄ）を処理したＫＨＹＧ−１細胞の培養上清の細胞傷害活性を示すグラフである。図５の縦軸は、Ｋ５６２細胞がほぼ全て傷害された場合の活性を１００としたときの百分率を示す。図５におけるコントロール（ｃｏｎ）は、ポリメトキシフラボンを含まない条件下での培養上清の細胞傷害活性を示す。なお、図示していないが、ＥＴＣｍｉｘの細胞傷害活性は約４０％であった。
【０１１０】
図５に示すように、ＫＨＹＧ−１細胞の培養上清は、細胞傷害活性を示さなかった。なお、実施例３の結果より、ポリメトキシフラボン自体が細胞傷害活性を有さないことは明らかである。これに加え、本実施例では、培養上清に含まれるＫＨＹＧ−１細胞から放出された液性因子もまた細胞傷害活性を有さないことが示された。したがって、ポリメトキシフラボンによる細胞傷害活性の発揮には、活性化されたＫＨＹＧ−１が必要であることが示された。
【０１１１】
〔実施例５：ＫＨＹＧ−１細胞における細胞傷害活性関連遺伝子の発現解析〕
ＫＨＹＧ−１細胞を、３０μＭのポリメトキシフラボンを含む培地で２日間培養した。培養には２４ウェルプレートを用い、各化合物について４ウェルずつ使用した。遠心分離で回収した細胞にＲＮＡ抽出試薬を添加し、試薬の取扱説明書に従い全ＲＮＡを抽出した。これを基に合成したｃＤＮＡを鋳型として、リアルタイムＰＣＲを行ない、細胞傷害活性関連遺伝子の発現を解析した。
【０１１２】
細胞傷害活性関連遺伝子として、ＩＦＮ−γ遺伝子、パーフォリン（ｐｅｒｆｏｒｉｎ）遺伝子、及びグランザイムＢ（ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂ）遺伝子について解析した。また、内部標準として、ＧＡＰＤＨ遺伝子を用いた。それぞれの遺伝子のＰＣＲに使用したプライマー配列は以下の通りである。
【０１１３】
ＧＡＰＤＨ ｆｏｒｗａｒｄ：配列番号１
ＧＡＰＤＨ ｒｅｖｅｒｓｅ：配列番号２
ＩＦＮ−γ ｆｏｒｗａｒｄ：配列番号３
ＩＦＮ−γ ｒｅｖｅｒｓｅ：配列番号４
ｐｅｒｆｏｒｉｎ ｆｏｒｗａｒｄ：配列番号５
ｐｅｒｆｏｒｉｎ ｒｅｖｅｒｓｅ：配列番号６
ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂ ｆｏｒｗａｒｄ：配列番号７
ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂ ｒｅｖｅｒｓｅ：配列番号８。
【０１１４】
各遺伝子の発現レベルは、内部標準として用いたＧＡＰＤＨ遺伝子に対する相対値として表し、各試験化合物の４つの独立したウェルにおける相対値の平均値及び標準偏差を算出した。
【０１１５】
図６（ａ）〜（ｃ）は、ノビレチン（Ａ）、タンゲレチン（Ｂ）、３’，４’，５’，５，６，７−ヘキサメトキシフラボン（Ｃ）、及び３，７，８，２’，４’−ペンタメトキシフラボン（Ｄ）を処理したＫＨＹＧ−１細胞におけるＩＦＮ−γ遺伝子（ａ）、パーフォリン遺伝子（ｂ）及びグランザイムＢ遺伝子（ｃ）の発現量を示すグラフである。図６（ａ）〜（ｃ）に示す各発現量は、ポリメトキシフラボンを処理していないＫＨＹＧ−１細胞における発現量を１としたときの相対値として表される。また、図６（ａ）〜（ｃ）におけるコントロール（ｃｏｎ）は、ポリメトキシフラボンを処理していないＫＨＹＧ−１細胞における発現量を示す。
【０１１６】
以上の結果より、ノビレチン、タンゲレチン、３’，４’，５’，５，６，７−ヘキサメトキシフラボン、及び３，７，８，２’，４’−ペンタメトキシフラボンは、それぞれ差はあるものの、ＫＨＹＧ−１細胞において、ＩＦＮ−γ遺伝子、パーフォリン遺伝子及びグランザイムＢ遺伝子の発現を上昇させることがわかった。特に、３’，４’，５’，５，６，７−ヘキサメトキシフラボンは、各遺伝子の発現を顕著に上昇させた。
【０１１７】
ＩＦＮ−γ遺伝子、パーフォリン遺伝子及びグランザイムＢ遺伝子は、細胞傷害を誘導する、ＮＫ細胞に特徴的なエフェクター因子をコードする遺伝子である。本実施例から、ノビレチン、タンゲレチン、３’，４’，５’，５，６，７−ヘキサメトキシフラボン、及び３，７，８，２’，４’−ペンタメトキシフラボンがＮＫ細胞を活性化しうることがさらに証明された。
【０１１８】
また、ノビレチン、タンゲレチン、３’，４’，５’，５，６，７−ヘキサメトキシフラボン、及び３，７，８，２’，４’−ペンタメトキシフラボンは、ＮＫ細胞のＩＦＮ−γ遺伝子の発現を亢進することから、Ｔｈ２細胞を抑制する可能性がある。つまり、これらの化合物は、アレルギー症状を緩和させる効果をも有する可能性がある。
【０１１９】
また、これらの化合物、特に３’，４’，５’，５，６，７−ヘキサメトキシフラボンは、ＩＦＮ−γ遺伝子の発現を顕著に亢進することから、より高い効果を有する医薬の開発のリード化合物として利用しうる。
【産業上の利用可能性】
【０１２０】
本発明は、免疫細胞療法（特に活性化ＮＫ細胞療法）、免疫機能強化のための医薬、食品、飲料、サプリメント等、及び試薬等に好適に利用することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）で表される化合物を有効成分とすることを特徴とするナチュラルキラー細胞活性化剤。
【化１】
（上記式（１）中、Ｒ１〜Ｒ１０は、それぞれ独立して水素原子、水酸基、炭素数１〜５のアルキル基又は炭素数１〜４のアルコキシ基であり、Ｒ１〜Ｒ１０のうちの少なくとも４個が炭素数１〜４のアルコキシ基である）
【請求項２】
上記式（１）中、
Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ９、Ｒ１０はそれぞれ独立して水素原子、炭素数１〜５のアルキル基又は炭素数１〜４のアルコキシ基であり、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ９、Ｒ１０のうちの少なくとも２個が炭素数１〜４のアルコキシ基であり、
Ｒ４、Ｒ８は炭素数１〜４のアルコキシ基であり、
Ｒ６は水素原子又は炭素数１〜５のアルキル基であることを特徴とする請求項１に記載のナチュラルキラー細胞活性化剤。
【請求項３】
上記式（１）中、
Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ９、Ｒ１０はそれぞれ独立して水素原子又はメトキシ基であり、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ９、Ｒ１０のうちの少なくとも２個がメトキシ基であり、
Ｒ４、Ｒ８はメトキシ基であり、
Ｒ２は水素原子、水酸基又はメトキシ基であり、
Ｒ６は水素原子であることを特徴とする請求項１に記載のナチュラルキラー細胞活性化剤。
【請求項４】
上記化合物は、シネンセチン、タンゲレチン、ノビレチン、ガルデニン、３，７，３’，４’，５’−ペンタメトキシフラボン、５，７，３’，４’，５’−ペンタメトキシフラボン、３’，４’，５’，５，６，７−ヘキサメトキシフラボン、及び３，７，８，２’，４’−ペンタメトキシフラボンからなる群より選択されることを特徴とする請求項１に記載のナチュラルキラー細胞活性化剤。
【請求項５】
ナチュラルキラー細胞を、請求項１〜４のいずれか１項に記載のナチュラルキラー細胞活性化剤に接触させる活性化工程を含むことを特徴とするナチュラルキラー細胞活性化方法。
【請求項６】
ナチュラルキラー細胞を、請求項１〜４のいずれか１項に記載のナチュラルキラー細胞活性化剤に接触させる活性化工程を含むことを特徴とする活性化されたナチュラルキラー細胞の製造方法。
【請求項７】
ナチュラルキラー細胞を試験化合物に接触させて処理する試験化合物処理工程と、
上記試験化合物処理工程において処理されたナチュラルキラー細胞とがん細胞との混合液を得る混合工程と、
上記混合液中の乳酸脱水素酵素活性を測定する測定工程とを含むことを特徴とするナチュラルキラー細胞活性化能を有する化合物のスクリーニング方法。
【請求項１】
下記式（１）で表される化合物を有効成分とすることを特徴とするナチュラルキラー細胞活性化剤。
【化１】
（上記式（１）中、Ｒ１〜Ｒ１０は、それぞれ独立して水素原子、水酸基、炭素数１〜５のアルキル基又は炭素数１〜４のアルコキシ基であり、Ｒ１〜Ｒ１０のうちの少なくとも４個が炭素数１〜４のアルコキシ基である）
【請求項２】
上記式（１）中、
Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ９、Ｒ１０はそれぞれ独立して水素原子、炭素数１〜５のアルキル基又は炭素数１〜４のアルコキシ基であり、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ９、Ｒ１０のうちの少なくとも２個が炭素数１〜４のアルコキシ基であり、
Ｒ４、Ｒ８は炭素数１〜４のアルコキシ基であり、
Ｒ６は水素原子又は炭素数１〜５のアルキル基であることを特徴とする請求項１に記載のナチュラルキラー細胞活性化剤。
【請求項３】
上記式（１）中、
Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ９、Ｒ１０はそれぞれ独立して水素原子又はメトキシ基であり、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ９、Ｒ１０のうちの少なくとも２個がメトキシ基であり、
Ｒ４、Ｒ８はメトキシ基であり、
Ｒ２は水素原子、水酸基又はメトキシ基であり、
Ｒ６は水素原子であることを特徴とする請求項１に記載のナチュラルキラー細胞活性化剤。
【請求項４】
上記化合物は、シネンセチン、タンゲレチン、ノビレチン、ガルデニン、３，７，３’，４’，５’−ペンタメトキシフラボン、５，７，３’，４’，５’−ペンタメトキシフラボン、３’，４’，５’，５，６，７−ヘキサメトキシフラボン、及び３，７，８，２’，４’−ペンタメトキシフラボンからなる群より選択されることを特徴とする請求項１に記載のナチュラルキラー細胞活性化剤。
【請求項５】
ナチュラルキラー細胞を、請求項１〜４のいずれか１項に記載のナチュラルキラー細胞活性化剤に接触させる活性化工程を含むことを特徴とするナチュラルキラー細胞活性化方法。
【請求項６】
ナチュラルキラー細胞を、請求項１〜４のいずれか１項に記載のナチュラルキラー細胞活性化剤に接触させる活性化工程を含むことを特徴とする活性化されたナチュラルキラー細胞の製造方法。
【請求項７】
ナチュラルキラー細胞を試験化合物に接触させて処理する試験化合物処理工程と、
上記試験化合物処理工程において処理されたナチュラルキラー細胞とがん細胞との混合液を得る混合工程と、
上記混合液中の乳酸脱水素酵素活性を測定する測定工程とを含むことを特徴とするナチュラルキラー細胞活性化能を有する化合物のスクリーニング方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１２−１８０３０７（Ｐ２０１２−１８０３０７Ａ）
【公開日】平成２４年９月２０日（２０１２．９．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−４４１９５（Ｐ２０１１−４４１９５）
【出願日】平成２３年３月１日（２０１１．３．１）
【出願人】（５０１２０３３４４）独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 (827)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年９月２０日（２０１２．９．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年３月１日（２０１１．３．１）
【出願人】（５０１２０３３４４）独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 (827)
【Ｆターム（参考）】
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