ＮＰＭ１遺伝子のｅｘｏｎ１２変異の検出用プローブおよびその用途
【課題】NPM1遺伝子のexon12変異を検出するのに有効なプローブを特定し、NPM1遺伝子のexon12変異を検出する方法、およびそのためのキットを提供する。
【解決手段】NPM1遺伝子のexon12の変異を検出するためのプローブであって、特定の塩基配列における特定部位の12〜50塩基長の配列に相補的な配列またはそれに相同な配列、および前記配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、前記特定部位の第１塩基に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチドから選択される、少なくとも１種の蛍光標識オリゴヌクレオチドからなることを特徴とする多型検出用プローブ。
【解決手段】NPM1遺伝子のexon12の変異を検出するためのプローブであって、特定の塩基配列における特定部位の12〜50塩基長の配列に相補的な配列またはそれに相同な配列、および前記配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、前記特定部位の第１塩基に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチドから選択される、少なくとも１種の蛍光標識オリゴヌクレオチドからなることを特徴とする多型検出用プローブ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、NPM1遺伝子のexon12変異を検出する方法、ならびにそのための核酸プローブおよびキットに関する。
【０００２】
急性骨髄性白血病（AML）の病因に関連する DNA 変異は多数発見されている。NPM1遺伝子変異は成人の急性骨髄性白血病患者に見つかり、FLT3-ITD遺伝子変異の結果と組み合わせて考えることで予後予測に関連することが報告されている（非特許文献１）。NPM1遺伝子の変異タイプとしては、例えば、非特許文献２−７に記載されており、報告症例数の多さや変異が起こる塩基配列箇所から代表的な変異としては、タイプA、タイプB、タイプD、タイプ７、タイプQ、タイプ１０、タイプE、タイプ６などが挙げられる。
【０００３】
塩基の多型を検出する方法としては、以下の方法が知られている。
非特許文献７には、PCRで増幅した後に電気泳動で分離し、そこから切出したゲルから増幅産物を精製し、ダイレクトシークエンスする方法が記載されている。非特許文献８には、DHPLC法とシークエンス法により検出する方法が記載されている。
しかしながら、これらの方法は、(1)増幅産物を取り出すので、コンタミネーションの危険性があり、(2)操作が自動化されておらず、また各項目それぞれについて操作が必要であることから、手間とコストを必要とし、(3)結果解析に専門知識や専門スキルを必要とし、そして、(4)シークエンス解析の検出特異性は20%程度と低いため、正常細胞の割合が多い癌細胞では、検出が難しいという問題があった。
【０００４】
一方、変異を含む領域をPCRで増幅した後、蛍光色素で標識された核酸プローブを用いて融解曲線分析を行い、融解曲線分析の結果に基づいて変異を解析する方法が知られている（特許文献１，２）。これらの文献においては、プローブの設計に関し、末端部が蛍光色素により標識された消光プローブが標的核酸にハイブリダイゼーションしたとき、末端部分においてプローブ−核酸ハイブリッドの複数塩基対が少なくとも一つのGとCのペアを形成するように設計するという教示はある。しかしながら、これらの方法は実施する上で全ての任意配列で実施可能ではないという問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００１−２８６３００号公報
【特許文献２】特開２００２−１１９２９１号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Blood. 2007;109 : 874-885
【非特許文献２】New Eng J Med 352： 254-266, 2005
【非特許文献３】Blood. 2005;106：1419-1422
【非特許文献４】Blood. 2005;106：3740-3746
【非特許文献５】Blood. 2005;106：3733-3739
【非特許文献６】Blood. 2006;108：1999-2005
【非特許文献７】Blood. 2005;106：2854-2861
【非特許文献８】Haematologica 2007; 92 : 1268-1269
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、NPM1遺伝子のexon12変異を検出するのに有効なプローブを特定し、NPM1遺伝
子のexon12変異を検出する方法、およびそのためのキットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、NPM1遺伝子のexon12変異を含む特定の領域に基づいてプローブを設計し、該プローブを用いる融解曲線分析を行うことにより当該変異を検出できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）NPM1遺伝子のexon12の変異を検出するためのプローブであって、下記P5、P5'、P6、P6'、P7、P7'、P1、P1'、P2およびP2'から選択される少なくとも１種の蛍光標識オリゴヌクレオチドからなることを特徴とする多型検出用プローブ。
(P5)配列番号2に示す塩基配列において、塩基番号145〜156を含む12〜50塩基長の塩基配列に相補的な配列またはそれに相同な配列を有し、塩基番号145に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
(P5')配列番号2に示す塩基配列において、塩基番号145〜156を含む12〜50塩基長の塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、塩基番号145に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
(P6)配列番号2に示す塩基配列において、塩基番号145〜156を含む12〜50塩基長の塩基配列に相補的な配列またはそれに相同な配列を有し、塩基番号153番目に対応する塩基がグアニンであり、塩基番号145に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
(P6')配列番号2に示す塩基配列において、塩基番号145〜156を含む12〜50塩基長の塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、塩基番号153番目に対応する塩基がグアニンであり、塩基番号145に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
(P7)配列番号2に示す塩基配列において、塩基番号145〜156を含む12〜50塩基長の塩基配列に相補的な配列またはそれに相同な配列を有し、塩基番号153番目に対応する塩基がグアニンであり、塩基番号154番目に対応する塩基がチミンであり、塩基番号145に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
(P7')配列番号2に示す塩基配列において、塩基番号145〜156を含む12〜50塩基長の塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、塩基番号153番目に対応する塩基がグアニンであり、塩基番号154番目に対応する塩基がチミンであり、塩基番号145に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
(P1)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号135〜150を含む16〜50塩基長の塩基配列に相補的な配列またはそれに相同な配列であり、塩基番号135に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
(P1')配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号135〜150を含む16〜50塩基長の塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、塩基番号135に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
(P2)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号164〜182を含む19〜50塩基長の塩基配列に相補的な配列またはそれに相同な配列であり、塩基番号182に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、および
(P2')配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号164〜182を含む19〜50塩基長の塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、塩基番号182に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド。
（２）P5、P5'、P6、P6'、P7およびP7'のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号145に対応する塩基を3'末端から数えて1〜3番目の位置に有し、
P1およびP1'のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号135に対応する塩基を3'末端から数えて1〜3番目の位置に有し、
P2およびP2'のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号182に対応する塩基を5'末端から数えて1〜3番目の位置に有する、（１）記載のプローブ。
（３）P5、P5'、P6、P6'、P7およびP7'のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号145に対応する塩基を3'末端に有し、
P1およびP1'のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号135に対応する塩基を3'末端に有し、
P2およびP2'のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号182に対応する塩基を5'末端に有する、（１）記載のプローブ。
（４）P1およびP1'のオリゴヌクレオチドは、塩基番号153-156のいずれかの塩基に対応する塩基を5'末端とし、蛍光色素で標識された塩基番号135に対応する塩基を3'末端に有し、
P2およびP2'のオリゴヌクレオチドは、塩基番号153-156のいずれかの塩基に対応する塩基を3'末端とし、蛍光色素で標識された塩基番号182に対応する塩基を5'末端に有する、（１）記載のプローブ。
（５）P5、P5'、P6、P6'、P7およびP7'のオリゴヌクレオチドは、塩基番号162を5'末端とし、蛍光色素で標識された塩基番号145に対応する塩基を3'末端に有し、
P1およびP1'のオリゴヌクレオチドは、塩基番号155を5'末端とし、蛍光色素で標識された塩基番号135に対応する塩基を3'末端に有し、
P2およびP2'のオリゴヌクレオチドは、塩基番号156を3'末端とし、蛍光色素で標識された塩基番号182に対応する塩基を5'末端に有する、（１）記載のプローブ。
（６）前記オリゴヌクレオチドは、標的配列にハイブリダイズしないときに蛍光を発し、且つ標的配列にハイブリダイズしたときに蛍光強度が減少するかまたは増加する、（１）〜（５）のいずれか１項記載のプローブ。
（７）前記オリゴヌクレオチドが、標的配列にハイブリダイズしないときに蛍光を発し、標的配列にハイブリダイズしたときに蛍光強度が減少する、（６）記載のプローブ。
（８）前記プローブが、融解曲線分析用のプローブである、（１）〜（７）のいずれか１項に記載のプローブ。
（９）P5、P5'、P6、P6'、P7およびP7'のオリゴヌクレオチドの塩基長が12〜35で、P1およびP1'のオリゴヌクレオチドの塩基長が16〜35で、P2およびP2'のオリゴヌクレオチドが19〜35である、（１）〜（８）のいずれか１項記載の多型検出用プローブ。
（１０）NPM1遺伝子のexon12における多型の検出方法であって、（１）〜（９）のいずれか１項に記載のプローブを少なくとも１種用いることを特徴とする方法。
（１１）NPM1遺伝子のexon12における多型の検出方法であって、下記工程（Ｉ）〜（IＶ）を含むことを特徴とする方法。
（Ｉ）核酸を含有する試料に、（１）〜（９）のいずれか１項に記載のプローブを添加して前記核酸に前記プローブをハイブリダイズさせる工程、
（ＩＩ）温度を変化させて前記核酸と前記プローブとのハイブリッド形成体を解離させ、ハイブリッド形成体の解離に基づくシグナルの変動を測定する工程、
（ＩＩＩ）前記シグナルの変動を解析して前記試料中の一本鎖核酸におけるＴｍ値を検出する工程、および
（ＩＶ）前記Ｔｍ値から前記試料中の一本鎖核酸における、目的の多型の有無または多型を有する一本鎖核酸の存在比を検出する工程。
（１２）さらに、（Ｉ）の工程の前または（Ｉ）の工程と同時にDNAを増幅することを含む、（１１）に記載の方法。
（１３）（１０）〜（１２）のいずれか１項に記載の方法により、NPM1遺伝子のexon12における多型を検出する工程、および多型の有無を決定する工程を含む、急性骨髄性白血病のかかりやすさ、病態および/または予後を分析する方法。
（１４）（１）〜（９）のいずれか１項に記載のプローブを含む、NPM1遺伝子における多型を検出するための試薬キット。
（１５）さらに、NPM1遺伝子の配列番号1に示す塩基配列におけるP5、P5'、P6、P6'、P7
、P7'、P1、P1'、P2、P2'のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする配列を含む領域を増幅するためのプライマーを含む、（１４）に記載の試薬キット。
（１６）前記プライマーが、下記P3およびP4並びにP3'およびP4'から選択される多型検出用プライマーである、（１４）または（１５）に記載の試薬キット。
(P3)106番目の塩基Tを3'末端とし配列番号1に相同的な10〜50塩基のオリゴヌクレオチド、および
(P4)205番目の塩基Tを3'末端とし配列番号1の相補鎖に相同性を有する10〜50塩基のオリゴヌクレオチド並びに
(P3')106番目の塩基Tを3'末端とし配列番号1の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有する10〜50塩基のオリゴヌクレオチド、および
(P4')205番目の塩基Tを3'末端とし配列番号1の塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有する10〜50塩基のオリゴヌクレオチド。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のプローブを添加して融解曲線分析（Tm解析）を行うだけでNPM1遺伝子のexon12の変異の検出が可能となる。本発明のプローブは、特異性が高く、検出感度が高い。本発明の方法を用いることにより、PCRを行う場合であっても、増幅産物を取り出す必要がないため、コンタミネーションの危険性がほぼ無い。また、本発明の方法は、操作が簡単なので自動化が容易である。本発明のプローブを使用すれば、現在報告されている変異の中の代表的な8つの変異タイプの内、7つの変異が識別可能である。また代表的な2つの変異タイプ（タイプA,E）については、野生型に含まれる変異が10%であっても検出可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】（Ａ）核酸混合物の融解曲線、及び（Ｂ）微分融解曲線の一例を示す図である。
【図２】検量線の一例を示す図である。
【図３】本発明のプローブの設計概略図を示す。実施例において使用される本発明のプローブの位置を示す。また、比較例において使用されるプローブの位置を示す。
【図４】実施例１のＷＴ（相補鎖オリゴヌクレオチド）についてのTm解析における単位時間当たりのＴＡＭＲＡ（３Ｔ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ１）の蛍光強度の変化量（d蛍光強度増加量/t）を縦軸とし、温度を横軸とし、これらの関係を示す。以下の図においても、縦軸と横軸の関係は同様である。
【図５】実施例１のmt type A（相補鎖オリゴヌクレオチド）についてのTm解析において、プローブにＴＡＭＲＡ（３Ｔ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ１）を用いた。
【図６】実施例１のmt type B（相補鎖オリゴヌクレオチド）についてのTm解析において、プローブにＴＡＭＲＡ（３Ｔ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ１）を用いた。
【図７】実施例１のmt type D（相補鎖オリゴヌクレオチド）についてのTm解析において、プローブにＴＡＭＲＡ（３Ｔ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ１）を用いた。
【図８】実施例１のmt type 7（相補鎖オリゴヌクレオチド）についてのTm解析において、プローブにＴＡＭＲＡ（３Ｔ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ１）を用いた。
【図９】実施例１のWT（相補鎖オリゴヌクレオチド）についてのTm解析において、プローブにＴＡＭＲＡ（５Ｔ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ２）を用いた。
【図１０】実施例１のmt type Q（相補鎖オリゴヌクレオチド）についてのTm解析において、プローブにＴＡＭＲＡ（５Ｔ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ２）を用いた。
【図１１】実施例１のmt type 10（相補鎖オリゴヌクレオチド）についてのTm解析において、プローブにＴＡＭＲＡ（５Ｔ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ２）を用いた。
【図１２】実施例１のmt type E（相補鎖オリゴヌクレオチド）についてのTm解析において、プローブにＴＡＭＲＡ（５Ｔ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ２）を用いた。
【図１３】実施例１のmt type 6（相補鎖オリゴヌクレオチド）についてのTm解析において、プローブにＴＡＭＲＡ（５Ｔ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ２）を用いた。
【図１４】比較例１のＷＴ（相補鎖オリゴヌクレオチド）についてのTm解析において、プローブにＴＡＭＲＡ（３Ｔ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ３）を用いた。
【図１５】比較例１のmt type A（相補鎖オリゴヌクレオチド）についてのTm解析において、プローブにＴＡＭＲＡ（３Ｔ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ３）を用いた。
【図１６】比較例１のmt type B（相補鎖オリゴヌクレオチド）についてのTm解析において、プローブにＴＡＭＲＡ（３Ｔ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ３）を用いた。
【図１７】比較例１のmt type D（相補鎖オリゴヌクレオチド）についてのTm解析において、プローブにＴＡＭＲＡ（３Ｔ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ３）を用いた。
【図１８】比較例１のmt type 7（相補鎖オリゴヌクレオチド）についてのTm解析において、プローブにＴＡＭＲＡ（３Ｔ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ３）を用いた。
【図１９】比較例１のmt type Q（相補鎖オリゴヌクレオチド）についてのTm解析において、プローブにＴＡＭＲＡ（３Ｔ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ３）を用いた。
【図２０】比較例１のmt type 10（相補鎖オリゴヌクレオチド）についてのTm解析において、プローブにＴＡＭＲＡ（３Ｔ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ３）を用いた。
【図２１】比較例１のmt type E（相補鎖オリゴヌクレオチド）についてのTm解析において、プローブにＴＡＭＲＡ（３Ｔ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ３）を用いた。
【図２２】比較例１のmt type 6（相補鎖オリゴヌクレオチド）についてのTm解析において、プローブにＴＡＭＲＡ（３Ｔ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ３）を用いた。
【図２３】実施例２の血液検体についてのPCR反応後のTm解析において、プローブにＢＯＤＩＰＹ ＦＬ（３ＦＬ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ１）（左図）とＴＡＭＲＡ（５Ｔ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ２）（右図）を用いた。
【図２４】実施例２のＷＴ １００％（プラスミド）についてのPCR反応後のTm解析において、プローブにＢＯＤＩＰＹ ＦＬ（３ＦＬ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ１）（左図）とＴＡＭＲＡ（５Ｔ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ２）（右図）を用いた。
【図２５】実施例２のmt type A １００％（プラスミド）についてのPCR反応後のTm解析において、プローブにＢＯＤＩＰＹ ＦＬ（３ＦＬ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ１）（左図）とＴＡＭＲＡ（５Ｔ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ２）（右図）を用いた。
【図２６】実施例２のmt type A ３０％、Wt ７０％（プラスミド）についてのPCR反応後のTm解析において、プローブにＢＯＤＩＰＹ ＦＬ（３ＦＬ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ１）（左図）とＴＡＭＲＡ（５Ｔ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ２）（右図）を用いた。
【図２７】実施例２のmt type A ２０％、Wt ８０％（プラスミド）についてのPCR反応後のTm解析において、プローブにＢＯＤＩＰＹ ＦＬ（３ＦＬ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ１）（左図）とＴＡＭＲＡ（５Ｔ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ２）（右図）を用いた。
【図２８】実施例２のmt type A １０％、Wt ９０％（プラスミド）についてのPCR反応後のTm解析において、プローブにＢＯＤＩＰＹ ＦＬ（３ＦＬ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ１）（左図）とＴＡＭＲＡ（５Ｔ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ２）（右図）を用いた。
【図２９】実施例２のmt type E １００％（プラスミド）についてのPCR反応後のTm解析において、プローブにＢＯＤＩＰＹ ＦＬ（３ＦＬ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ１）（左図）とＴＡＭＲＡ（５Ｔ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ２）（右図）を用いた。
【図３０】実施例２のmt type E ３０％、Wt ７０％（プラスミド）についてのPCR反応後のTm解析において、プローブにＢＯＤＩＰＹ ＦＬ（３ＦＬ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ１）（左図）とＴＡＭＲＡ（５Ｔ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ２）（右図）を用いた。
【図３１】実施例２のmt type E ２０％、Wt ８０％（プラスミド）についてのPCR反応後のTm解析において、プローブにＢＯＤＩＰＹ ＦＬ（３ＦＬ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ１）（左図）とＴＡＭＲＡ（５Ｔ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ２）（右図）を用いた。
【図３２】実施例２のmt type E １０％、Wt ９０％（プラスミド）についてのPCR反応後のTm解析において、プローブにＢＯＤＩＰＹ ＦＬ（３ＦＬ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ１）（左図）とＴＡＭＲＡ（５Ｔ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ２）（右図）を用いた。
【図３３】比較例２の血液検体についてのPCR反応後のTm解析において、プローブにＴＡＭＲＡ（３Ｔ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ３）を用いた。
【図３４】比較例２のWt １００％（プラスミド）についてのPCR反応後のTm解析において、プローブにＴＡＭＲＡ（３Ｔ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ３）を用いた。
【図３５】比較例２のmt type A １００％（プラスミド）についてのPCR反応後のTm解析において、プローブにＴＡＭＲＡ（３Ｔ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ３）を用いた。
【図３６】比較例２のmt type A ２０％、Wt ８０％（プラスミド）についてのPCR反応後のTm解析において、プローブにＴＡＭＲＡ（３Ｔ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ３）を用いた。
【図３７】比較例２のmt type E １００％（プラスミド）についてのPCR反応後のTm解析において、プローブにＴＡＭＲＡ（３Ｔ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ３）を用いた。
【図３８】比較例２のmt type E ２０％、Wt ８０％（プラスミド）についてのPCR反応後のTm解析において、プローブにＴＡＭＲＡ（３Ｔ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ３）を用いた。
【図３９】実施例４のmt type A（プラスミド）についてのPCR反応後のTm解析において、プローブにPacific Blue（mtA-R4）を用いた。
【図４０】実施例４のmt type A（プラスミド）についてのPCR反応後のTm解析において、プローブにTAMRA（mtB-R5）を用いた。
【図４１】実施例４のmt type A（プラスミド）についてのPCR反応後のTm解析において、プローブにBODIPY FL（mtD-R6）を用いた。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
＜１＞本発明プローブおよび本発明検出方法
本発明プローブは、NPM1遺伝子のexon12の変異を検出するためのプローブであって、下記(P5)、(P5')、(P6)、(P6')、(P7)、(P7')、(P1), (P1'), (P2), および(P2')から選択される少なくとも１種の蛍光標識オリゴヌクレオチドからなることを特徴とする多型検出用プローブである。
(P5)配列番号2に示す塩基配列において、塩基番号145〜156を含む12〜50塩基長の塩基配列に相補的な配列またはそれに相同な配列を有し、塩基番号145に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
(P5')配列番号2に示す塩基配列において、塩基番号145〜156を含む12〜50塩基長の塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、塩基番号145に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
(P6)配列番号2に示す塩基配列において、塩基番号145〜156を含む12〜50塩基長の塩基配列に相補的な配列またはそれに相同な配列を有し、塩基番号153番目に対応する塩基がグアニンであり、塩基番号145に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
(P6')配列番号2に示す塩基配列において、塩基番号145〜156を含む12〜50塩基長の塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、塩基番号153番目に対応する塩基がグアニンであり、塩基番号145に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
(P7)配列番号2に示す塩基配列において、塩基番号145〜156を含む12〜50塩基長の塩基配列に相補的な配列またはそれに相同な配列を有し、塩基番号153番目に対応する塩基がグアニンであり、塩基番号154番目に対応する塩基がチミンであり、塩基番号145に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
(P7')配列番号2に示す塩基配列において、塩基番号145〜156を含む12〜50塩基長の塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、塩基番号153番目に対応する塩基がグアニンであり、塩基番号154番目に対応する塩基がチミンであり、塩基番号145に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
(P1)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号135〜150を含む16〜50塩基長の塩基配
列に相補的な配列またはそれに相同な配列であり、塩基番号135に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
(P1')配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号135〜150を含む16〜50塩基長の塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、塩基番号135に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
(P2)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号164〜182を含む19〜50塩基長の塩基配列に相補的な配列またはそれに相同な配列であり、塩基番号182に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、および
(P2')配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号164〜182を含む19〜50塩基長の塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、塩基番号182に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド。
【００１３】
本発明プローブは、配列番号２に示す塩基配列（NPM1遺伝子のexon12の変異タイプAの塩基を有する配列）において上記(P5)、(P5')、(P6)、(P6')、(P7)、(P7')に特定された配列を有し、(P6)、(P6')については、塩基番号153番目に対応する塩基がグアニンであり、(P7)、(P7')については、さらに塩基番号154番目に対応する塩基がチミンである他は、特許文献１，２に記載された消光プローブと同様にして作製できる。また、本発明プローブは、配列番号１に示す塩基配列（NPM1遺伝子のexon12の野生型の塩基を有する配列）において上記(P1), (P1'), (P2)および(P2')に特定された配列を有する他は、特許文献１，２に記載された消光プローブと同様にして作製できる。なお、本発明の配列番号１に示す配列は、GenBankのアクセッションナンバーNG_016018の27689番目から28278番目である。また、配列番号２に示す配列は、塩基番号１５３〜１５７番目の４塩基が付加されている点でのみ配列番号１に示す配列と異なる。
【００１４】
本発明のプローブの長さとしては、P5、P5'、P6、P6'、P7、P7'については、例えば、１２〜５０塩基長、１２〜３５塩基長、または１２〜３０塩基長である。P1, P1'については、例えば、１６〜５０塩基長、１６〜３５塩基長、または１６〜３０塩基長である。P2, P2'については、例えば、１９〜５０塩基長、１９〜３５塩基長、または１９〜３０塩基長である。
本発明プローブは、例えば、配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号153-156（下記表１のgcag）のいずれかの塩基に対応する塩基を末端とするプローブであり、P1, P1'については、塩基番号153-156のいずれかの塩基を5'末端とし、P2, P2'については、塩基番号153-156のいずれかの塩基を3'末端とする。本発明のプローブは、例えば、配列番号1に示す塩基配列において、P1, P1'については、塩基番号155の塩基を5'末端とし、P2, P2'については、塩基番号156の塩基を3'末端とする。
【００１５】
本願における「相同性」とは、特定の塩基配列において、塩基配列の相補鎖に例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の同一性を有する配列を有している塩基配列をさす。本願においては、１００％の同一性を有していてもよい。
本願におけるハイブリダイゼーションは、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ３ｒｄ（Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ． Ｐｒｅｓｓ， ２００１）
に記載の方法等に従って行うことができる。この文献は、参照により本明細書に組み入れられるものとする。
ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。典型的なストリンジェントな条件とは、例えば、カリウム濃度は約２５mＭ〜約５０ｍＭ、及びマグネシウム濃度は約１．０ｍＭ〜約５．０ｍＭ中において、ハイブリダイゼーションを行う条件があげられる。本発明の条件の１例としてＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）、２５ｍＭのＫＣｌ、及び１．５ｍＭのＭｇＣｌ2中においてハイブリダイゼーションを行う条件が、挙げられるが、これに限定されるものではない。その他、ストリンジェントな条件としては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ３ｒｄ（Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ． Ｐｒｅｓｓ， ２００１）に記載されている。この文献は、参照により本明細書に組み入れられるものとする。当業者は、ハイブリダイゼーション反応や、ハイブリダイゼーション反応液の塩濃度等を変化させることによって、このような条件を容易に選択することができる。
【００１６】
さらに、本発明における前記P5、P5'、P6、P6'、P7、P7'、P1、P1'、P2、P2'の蛍光標識オリゴヌクレオチドには、それぞれ前記P5、P5'、P6、P6'、P7、P7'、P1、P1'、P2、P2'の蛍光標識オリゴヌクレオチドに塩基が挿入、欠失又は置換した蛍光標識オリゴヌクレオチドも包含される。
当該塩基が挿入、欠失又は置換した蛍光標識オリゴヌクレオチドは、前記P5、P5'、P6、P6'、P7、P7'、P1、P1'、P2、P2'の蛍光標識オリゴヌクレオチドと同等程度の作用を示せばよく、塩基が挿入、欠失又は置換されている場合、その挿入、欠失又は置換の位置は、特に限定されない。挿入、欠失又は置換した塩基の数としては１塩基又は２塩基以上が挙げられ、蛍光標識オリゴヌクレオチド全体の長さによって異なるが、例えば１塩基〜１０塩基又は１塩基〜５塩基が挙げられる。
【００１７】
挿入、欠失又は置換の中でも、本発明における前記P5、P5'、P6、P6'、P7、P7'、P1、P1'、P2、P2'の蛍光標識オリゴヌクレオチドとしては、それぞれ前記P5、P5'、P6、P6'、P7、P7'、P1、P1'、P2、P2'の蛍光標識オリゴヌクレオチドの塩基が置換した蛍光標識オリゴヌクレオチドが挙げられる。置換の位置は、特に限定されない。例えば、検出感度の観点より、配列番号２で示される配列のうち１５２番目〜１６６番目の塩基以外の位置、または配列番号１で示される配列のうち１５２番目〜１６２番目の塩基以外の位置の塩基が置換されることが挙げられる。置換される塩基の数としては１塩基又は２塩基以上が挙げられる。置換される塩基の数は、蛍光標識オリゴヌクレオチド全体の長さによって異なるが、例えば１塩基〜５塩基、又は１塩基〜３塩基が挙げられる。
【００１８】
前記蛍光標識オリゴヌクレオチドにおける、オリゴヌクレオチドとしては、オリゴヌクレオチドの他、修飾されたオリゴヌクレオチドも含まれる。
前記オリゴヌクレオチドの構成単位としては、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、人工核酸等が挙げられる。前記人工核酸としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＲＮＡアナログであるＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）；ペプチド核酸であるＰＮＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）；架橋化核酸であるＢＮＡ（Ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）等が挙げられる。
前記オリゴヌクレオチドは、前記構成単位のうち、一種類から構成されてもよいし、複数種類から構成されてもよい。
【００１９】
本発明において使用されるNPM1遺伝子のexon12の変異を検出するためのプローブの塩基配列の例としては、P5としては、5'-cactgcCAGAcagagatc-3'（配列番号５６）が挙げられ、P6としては、5'-cactgcCATGcagagatc-3'（配列番号５７）が挙げられ、P7としては、5'-cactgcCAGGcagagatc-3'（配列番号５８）が挙げられ、P1としては、5'-tgccagagatcttgaatagcc-3'（配列番号４）が挙げられ、P2としては、5'-ctattttcttaaagagacttcctccac-3'（配列番号５）が挙げられる。
蛍光色素としては、特許文献１，２に記載されたものが使用できるが、具体例としては、Pacific Blue(商標)、FAM(商標)、TAMRA(商標)、BODIPY FL(商標)等が挙げられる。蛍光色素のオリゴヌクレオチドへの結合方法は、通常の方法、例えば特許文献１，２に記載の方法に従って行うことができる。
【００２０】
本発明の(P5),(P5'),(P6),(P6'),(P7),(P7'),（P1）, (P1'), (P2)または（P2'）のいずれか１つのオリゴヌクレオチドを用いることにより、例えば、(P5),(P6),(P7)または(P5'),(P6'),(P7')の３つのオリゴヌクレオチドを用いることにより、例えば、（P1）および（P2）または（P1'）および（P2'）の２つのオリゴヌクレオチドを用いることにより、本実施例３，４に示される配列番号５６−５８に示すプローブを用いることにより、または、本実施例１，２に示される配列番号４，５に示すプローブを用いることにより、NPM1遺伝子のexon12の変異を検出することができる（図３）。
【００２１】
本発明プローブは、標的配列にハイブリダイゼーションしないときに蛍光色素の蛍光が発光し、標的配列にハイブリダイゼーションしたときに蛍光色素の蛍光が減少または増加することが好ましい。本発明プローブは、例えば、ハイブリダイゼーションしないときに蛍光色素の蛍光が発光し、ハイブリダイゼーションしたときに蛍光色素の蛍光が消光する、消光プローブである。
また、本発明プローブは、５’または３’末端から数えて１〜３番目の塩基が蛍光色素により標識化されていることが好ましく、３’末端が蛍光色素により標識されていることがより好ましい。なお、本明細書において、「５’末端から数えて１〜３番目」という場合は、５’末端を１番目として数え、「３’末端から数えて１〜３番目」という場合は、３’末端を１番目として数える。
なお、本発明プローブにおいて蛍光色素により標識されている塩基は、P5,P5',P6,P6',P7,P7'については、配列番号２における１４５番目の塩基であり、P1, P1'については、配列番号１における１３５番目の塩基であり、P2, P2'については、配列番号１における１８２番目の塩基である。
【００２２】
本発明のオリゴヌクレオチドにより検出することのできるNPM1遺伝子のexon12の変異は、例えば、以下の表１に記載されており、タイプA、タイプB、タイプD、タイプC、タイプE、タイプGm、タイプKm、タイプNm、タイプOm、タイプQm、タイプ3、タイプ4、タイプ6、タイプ7、タイプ13、タイプ10、タイプG+、タイプH+、タイプI+、タイプJ+、およびタイプIからなる群より選択される少なくとも１つ以上の変異を検出できる。
【００２３】
【表１】
【００２４】
(P5),(P5'),(P6),(P6'),(P7),(P7')のオリゴヌクレオチドを用いる場合には、タイプA、タイプB、タイプD、タイプC、タイプGm、タイプKm、タイプNm、タイプOm、タイプQm、タイプ3、タイプ4、タイプ13、タイプG+、タイプH+、タイプI+、タイプJ+、およびタイプIなどを検出することができる。
配列番号１に示す塩基配列において塩基番号153-156の領域より５’側の配列のプローブ、例えば、（P1）,(P1')のオリゴヌクレオチドを用いる場合には、タイプA、タイプB、タイプD、およびタイプ７などを検出することができる。
配列番号１に示す塩基配列において塩基番号153-156の領域より３’側の配列のプローブ、例えば、（P2）,(P2')のオリゴヌクレオチドを用いる場合には、タイプ１０、タイプE、およびタイプ６などを検出することができる。
また、本発明の(P5),(P5'),(P6),(P6'),(P7),(P7')のいずれか１つのオリゴヌクレオチド、または（P1）もしくは(P1')および(P2)もしくは（P2'）のオリゴヌクレオチドを用いることにより、NPM1遺伝子のexon12の変異の有無を検出することができ、急性骨髄性白血病のかかりやすさ、病態および/または予後の診断が可能となる。
【００２５】
本実施例に示される配列番号５６，５７，５８，４，５のプローブを用いることにより、NPM1遺伝子のexon12の変異を検出することができる。配列番号５６−５８，４に示すプローブについては、３’末端が蛍光色素で標識され、配列番号５に示すプローブについては、５’末端が蛍光色素で標識されている。
【００２６】
本発明の検出方法は、上記のような本発明のプローブを用いることを特徴とする。すなわち、本発明の検出方法は、配列番号２に示す塩基配列において、塩基番号157-160の領域（配列番号１の塩基番号153-156に対応）を含む1つ以上のプローブを用いることもできるし、上記P5,P5',P6,P6',P7,P7'の１つ以上のプローブを用いることもできる。また、本発明の検出方法は、配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号153-156の領域を末端とする1つ以上のプローブを用いることもできるし、上記P1, P1', P2およびP2'の１つ以上のプローブを用いることもできる。
【００２７】
本発明の検出方法は、例えば、本発明のプローブを使用し、以下の工程を含むことを特徴とする。
（Ｉ）核酸を含有する試料に、本発明のプローブを添加して前記核酸に前記プローブをハイブリダイズさせる工程、
（ＩＩ）温度を変化させて前記核酸と前記プローブとのハイブリッド形成体を解離させ、ハイブリッド形成体の解離に基づくシグナルの変動を測定する工程、
（ＩＩＩ）前記シグナルの変動を解析して前記試料中の一本鎖核酸におけるＴｍ値を検出する工程、および
（ＩＶ）前記Ｔｍ値から前記試料中の一本鎖核酸における、目的の多型の有無または多型を有する一本鎖核酸の存在比を検出する工程。
【００２８】
本発明検出方法は、本発明プローブを用いることの他は、通常の核酸増幅および融解曲線分析（Tm解析）の方法に従って行うことができる。また、本発明の検出方法は、前記工程（Ｉ）の前または工程（Ｉ）と同時に核酸を増幅することを含んでいてもよい。
【００２９】
核酸増幅の方法としては、ポリメラーゼを用いる方法が好ましく、その例としては、PCR、ICAN、LAMP等が挙げられる。ポリメラーゼを用いる方法により増幅する場合は、本発明プローブの存在下で増幅を行うことが好ましい。用いるプローブに応じて、増幅の反応条件等を調整することは当業者であれば容易である。これにより、核酸の増幅後にプローブのTm値を解析するだけなので、反応終了後増幅産物を取り扱う必要がない。よって、増幅産物による汚染の心配がない。また、増幅に必要な機器と同じ機器で検出することが可能なので、容器を移動する必要すらない。よって、自動化も容易である。
【００３０】
なお、工程（III）でＴｍ値を決定することには、Ｔｍの温度を決定することだけでなく、Ｔｍのピークの高さを決定することを含む。ピークの高さにより、多型を有する塩基配列の存在比を決定することができる。なお、多型を有する塩基配列の存在比をより定量的に決定するには、下記に示すような検量線を作成し、それに基づいて存在比を決定することが好ましい。
【００３１】
多型を有する塩基配列の存在比を定量的に決定する方法について、野生型と特定の変異型の存在比の決定を例に挙げて以下に示す。ただし、この方法は一例にすぎず、多型を有する塩基配列の存在比の決定の仕方はこれに限定されない。
【００３２】
まず、野生型の核酸Ｗｔと変異型の核酸Ｍｔとの２種類の核酸の存在比を各々異ならせた複数の核酸混合物を作製し、複数の核酸混合物の各々について、融解曲線解析装置等を用いて融解曲線を得る。
図１（Ａ）に、ある１つの核酸混合物の温度と蛍光強度との関係で表された融解曲線、
及び図１（Ｂ）に温度と蛍光強度の微分値との関係で表された融解曲線（微分融解曲線ともいう）を示す。この微分融解曲線からピークを検出することにより、核酸Ｗｔの融解温度ＴｍW及び核酸Ｍｔの融解温度ＴｍMを検出して、ＴｍW及びＴｍMを含む温度範囲の各々を設定する。ＴｍWを含む温度範囲ΔＴWとしては、例えば、ＴｍWとＴｍMとの間で蛍光強度の微分値が最小となる温度を下限、蛍光強度のピークの裾野に対応する温度を上限とする温度範囲を設定することができる。また、ＴｍMを含む温度範囲ΔＴMとしては、例えば、ＴｍWとＴｍMとの間で蛍光強度の微分値が最小となる温度を上限、蛍光強度のピークの裾野に対応する温度を下限とする温度範囲を設定することができる。なお、温度範囲ΔＴW及び温度範囲ΔＴMは、同一の幅（例えば、１０℃）または異なる幅（例えば、温度範囲ΔＴWが１０℃、温度範囲ΔＴMが７℃）となるように設定することができる。また、温度範囲ΔＴW及び温度範囲ΔＴMは、それぞれの融解温度ＴｍからプラスＸ℃、マイナスＸ℃の幅（Ｘ℃は例えば１５℃以内、望ましくは１０℃以内）というように設定することができる。
【００３３】
次に、温度範囲ΔＴW及び温度範囲ΔＴMの各々について、微分融解曲線の温度範囲の下限に対応する点と上限に対応する点とを通る直線と微分融解曲線とで囲まれた面積（図１（Ｂ）の斜線部分）を求める。面積の求め方の一例として、具体的に以下のように求めることができる。温度Ｔにおける蛍光強度の微分値をｆ（Ｔ）とし、温度Ｔにおけるベース値をＢ（Ｔ）として、下記（１）式により求める。
面積Ｓ＝｛ｆ（Ｔs+1）−Ｂ（Ｔs+1）｝＋｛ｆ（Ｔs+2）−Ｂ（Ｔs+2）｝
＋・・・＋｛ｆ（Ｔe-1）−Ｂ（Ｔe-1）｝ ・・・（１）
ただし、Ｔsは各温度範囲における下限値、Ｔeは上限値である。また、各温度Ｔにおけるベース値Ｂ（Ｔ）は、下記（２）式により求まる値であり、蛍光強度の検出信号に含まれるバックグラウンドレベルを表すものである。このベース値を蛍光強度の微分値から減算することにより、蛍光強度の検出信号に含まれるバックグラウンドの影響を除去する。
Ｂ（Ｔ）＝ａ×（Ｔ−Ｔs）＋ｆ（Ｔs） ・・・（２）
ただし、ａ＝｛ｆ（Ｔe）−ｆ（Ｔs）｝／（Ｔe−Ｔs） である。
【００３４】
上記（１）式及び（２）式に従って、各核酸混合物について、温度範囲ΔＴWにおける面積ＳW及び温度範囲ΔＴWにおける面積ＳMを求め、面積比と各核酸混合物の存在比との関係を表す検量線を作成する。図２に、横軸に存在比（核酸混合物の総量に対する核酸Ｍｔの割合）をとり、縦軸に面積比（ＳM／ＳW）をとった検量線の一例を示す。なお、面積比はＳW／ＳMで定めてもよい。
実際の試料を用いて得られた融解曲線と微分融解曲線から面積比を算出し、上記のようにしてあらかじめ作成した検量線に基づいて、実際の試料中に含まれる多型を有する塩基配列の存在比を決定することができる。
【００３５】
本発明において、試料中のＤＮＡは、一本鎖ＤＮＡでもよいし二本鎖ＤＮＡであってもよい。前記ＤＮＡが二本鎖ＤＮＡの場合は、例えば、前記ハイブリダイズ工程に先立って、加熱により前記試料中の二本鎖ＤＮＡを解離させる工程を含むことが好ましい。二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離することによって、次のハイブリダイズ工程において、検出用プローブとのハイブリダイズが可能となる。
【００３６】
本発明において、前記試料中のＤＮＡに対する、本発明のプローブの添加割合（モル比）は、制限されないが、検出シグナルを十分に確保できることから、試料中のＤＮＡに対して１倍以下が好ましく、０．１倍以下がより好ましい。この際、試料中のＤＮＡとは、例えば、検出目的の多型が発生している検出対象ＤＮＡと前記多型が発生していない非検出対象ＤＮＡとの合計でもよいし、検出目的の多型が発生している検出対象配列を含む増幅産物と前記多型が発生していない非検出対象配列を含む増幅産物との合計でもよい。なお、試料中のＤＮＡにおける前記検出対象ＤＮＡの割合は、通常、不明であるが、結果的に、前記プローブの添加割合（モル比）は、検出対象ＤＮＡ（検出対象配列を含む増幅産物）に対して例えば、１０倍以下、５倍以下、または３倍以下である。また、その下限は特に制限されないが、例えば、０．００１倍以上、０．０１倍以上であり、または０．１倍以上である。
【００３７】
前記ＤＮＡに対する本発明のプローブの添加割合は、例えば、二本鎖ＤＮＡに対するモル比でもよいし、一本鎖ＤＮＡに対するモル比でもよい。
【００３８】
Ｔｍ値について説明する。二本鎖ＤＮＡを含む溶液を加熱していくと、２６０ｎｍにおける吸光度が上昇する。これは、二本鎖ＤＮＡにおける両鎖間の水素結合が加熱によってほどけ、一本鎖ＤＮＡに解離（ＤＮＡの融解）することが原因である。この現象に基づき、融解温度Ｔｍとは、一般に、吸光度が、吸光度全上昇分の５０％に達した時の温度と定義される。
【００３９】
本発明において、前記P5、P5'、P6、P6'、P7、P7'、P1、P1'、P2、P2'の蛍光標識オリゴヌクレオチドが相補的な塩基配列を有するＤＮＡとハイブリダイズした場合のＴｍ値と、非相補的なＤＮＡとハイブリダイズした場合のＴｍ値との差は、例えば５℃以上が挙げられる。前記Ｔｍ値の差が５℃以上であることで、上述の変異をより高感度に検出することができる。
また、前記Ｔｍ値の差としては、５℃以上、又は７℃以上等が挙げられる。
前記Ｔｍ値の差を大きくする方法としては、プローブ配列においてそのハイブリダイズする塩基配列に対してミスマッチとなる塩基を含める方法や、例えばＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ（１９９７）ｖｏｌ１５ ｐ．３３１−３３５に記載の方法などが挙げられる。
【００４０】
本発明において、Ｔｍ値を決定するための温度変化に伴うシグナル変動の測定は、前述のような原理から２６０ｎｍの吸光度測定により行うこともできるが、本発明のプローブに付加した標識のシグナルに基づくシグナルであってＤＮＡとプローブとのハイブリッド形成の状態に応じて変動するシグナルを測定することが好ましい。このため、本発明のプローブとして、前述の標識化プローブを使用することが好ましい。前記標識化プローブとしては、例えば、標的配列にハイブリダイズしないときに蛍光を発し、且つ標的配列にハイブリダイズしたときに蛍光強度が減少（消光）する蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブ、または標的配列にハイブリダイズしないときに蛍光を発し、且つ標的配列にハイブリダイズしたときに蛍光強度が増加する蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブが挙げられる。前者のようなプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖ＤＮＡ）を形成している際にはシグナルを示さないか、シグナルが弱いが、加熱によりプローブが遊離するとシグナルを示すようになるか、シグナルが増加する。また、後者のプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖ＤＮＡ）を形成することによってシグナルを示し、加熱によりプローブが遊離するとシグナルが減少（消失）する。したがって、この標識に基づくシグナルの変化をシグナル特有の条件（吸光度等）で検出することによって、前記２６０ｎｍの吸光度測定と同様に、融解の進行ならびにＴｍ値の決定を行うことができる。標識化プローブにおける標識化物質は、例えば、前述のとおりであるが蛍光色素標識化プローブが好ましい。
【００４１】
核酸増幅を行う際の鋳型となる核酸としては、核酸を含んでいればよく、特に制限されないが、例えば、血液、口腔粘膜懸濁液、爪や毛髪等の体細胞、生殖細胞、乳、腹水液、パラフィン包埋組織、胃液、胃洗浄液、腹膜液、羊水、細胞培養などの任意の生物学的起源に由来する又は由来しうるものである。鋳型となる核酸は、該起源から得られたままで直接的に、または該サンプルの特性を改変するために前処理した後で使用することができる。
【００４２】
以下、PCRを用いる場合を例として、さらに説明する。PCRに用いるプライマー対は、本発明プローブがハイブリダイゼーションできる領域が増幅されるようにする他は、通常のPCRにおけるプライマー対の設定方法と同様にして設定することができる。プライマーの長さおよびTm値は、通常には、12mer〜40merで40〜70℃、または16mer〜30merで55〜60℃である。プライマー対の各プライマーの長さは同一でなくてもよいが、両プライマーのTmはほぼ同一（通常には、相違が２℃以内）であることが好ましい。なお、Tm値は最近接塩基対(Nearest Neighbor)法により算出した値である。プライマー対の例としては、配列番号１６，１７に示す塩基配列を有するプライマーからなるものが挙げられる。
【００４３】
PCRは、本発明で使用される本発明プローブの存在下で行うことが好ましい。これにより、増幅反応終了後に増幅産物を精製などすることなくTm解析を行うことができる。用いるプローブに応じて、プライマーのTm値やPCRの反応条件を調整することは当業者であれば容易である。
【００４４】
Tm解析の結果に基づくNPM1遺伝子のexon12の変異の検出は通常の方法に従って行うことができる。本発明における検出とは、変異の有無の検出および多型を有する核酸の存在比の決定を包含する。
【００４５】
なお、本発明のプローブおよび多型検出方法により、NPM1遺伝子のexon12の変異を検出することができ、検出された変異の有無に基づいて、急性骨髄性白血病のなりやすさ、病態および/または予後を診断することができる。
【００４６】
＜２＞本発明キット
本発明キットは、本発明の検出方法に用いるためのキットである。このキットは、本発明の多型検出用プローブを含むことを特徴とする。なお、本発明のキットは、急性骨髄性白血病のかかりやすさ、病態および/予後を判断するのにも使用できる。
プローブについては、本発明プローブに関し、上記に説明した通りである。
【００４７】
本発明検出キットは、プローブの他に、本発明の検出方法における核酸増幅を行うのに必要とされる試薬類、特にDNAポリメラーゼを用いる増幅のための上述のプライマーをさらに含んでいてもよい。
本発明検出キットにおいてプローブ、プライマーおよびその他の試薬類は、別個に収容されていてもよいし、それらの一部が混合物とされていてもよい。
【００４８】
本発明において、検出対象となる試料中の試料核酸、多型検出用プローブ又はプライマーの個々の配列に関して、これら互いの相補的な関係に基づいて記述された事項は、特に断らない限り、それぞれの配列と、各配列に対して相補的な配列とについても適用される。各配列に対して相補的な当該配列について本発明の事項を適用する際には、当該相補的な配列が認識する配列は、当業者にとっての技術常識の範囲内で、対応する本明細書に記載された配列に相補的な配列に、明細書全体を読み替えるものとする。
【００４９】
以下に、本発明を実施例により具体的に説明する。だだし、これらの実施例は例示であり、これらに限定されない。
【実施例】
【００５０】
実施例１（相補鎖オリゴヌクレオチドを検出対象とし、P1,P2プローブを用いる場合）
NPM1遺伝子のexon12の塩基配列（配列番号１（野生型））に基づき、表２に示す、末端部にCを有するプローブを設計した。表２中、プローブの位置は、配列番号１に示す塩基配列における塩基番号を示す。３’末端のPは、リン酸化されていることを示す。TAMRAによる標識は、常法に従って行った。
また、検出対象として使用した相補鎖オリゴヌクレオチドの配列を表２に示す。表２中、オリゴヌクレオチドの位置は、配列番号１に示す塩基配列における塩基番号を示す。
【００５１】
【表２】
【００５２】
NPM1遺伝子のExon12領域の変異を2つのプローブで検出するために設計したプローブの性能を確認するため、NPM1 exon12領域の野生型配列と各種変異配列の相補鎖を準備し、プローブと相補鎖オリゴヌクレオチドを含む以下の試薬溶液を調製した。
プローブ3T-NPM1-e12-R1に対して相補鎖オリゴヌクレオチドは WT、mt type A、B、D、または7を、プローブ5T-NPM1-e12-R2に対して相補鎖オリゴヌクレオチドは WT、mt type Q、10、E、または6を添加した。
【００５３】
【表３】
【００５４】
Tm解析の条件は下記の通りである。Tm解析における励起波長および検出波長は、それぞれ520〜555 nmおよび585〜700 nm（TAMRA）であった。
調製した試薬溶液をi-densy 反応チューブに添加し、試薬が蒸発しないようにミネラルオイル30μLを重層し、以下の反応条件でTm解析を実施してTAMRAの蛍光値の変化量を解析した。
【００５５】
【表４】
【００５６】
表２のプローブを用いてTm解析を行った結果、3T-NPM1-e12-R1（配列番号４）については、ＴＡＭＲＡのピークが、６５℃（WT）、５９℃（タイプA）、６０℃（タイプB）、６０℃（タイプD）、５５℃（タイプ７）付近で見られた（図４〜８）。
このように、WT、各変異で検出ピークが確認できた。また、WTと各変異のTm値の差（ΔTm）は5〜10℃であり、変異を検出するために十分なTm値の差があることが分かり、変異を検出することに適したプローブであることが分かった。
結果を表５に示す。
【００５７】
【表５】
【００５８】
また、5T-NPM1-e12-R2（配列番号５）については、ＴＡＭＲＡのピークが、６４℃（WT）、６２℃（タイプQ）、５２℃（タイプ１０）、５２℃（タイプE）、４９℃（タイプ６）付近で見られた（図９〜１３）。
このように、WT、各変異で検出ピークが確認できた。また、WTと変異タイプQのTm値の差（ΔTm）は2℃であったが、他の変異タイプでは十分なTm値の差があることが分かり、変異を検出することに適したプローブであることが分かった。
結果を表６に示す。
【００５９】
【表６】
【００６０】
実施例１の結果より、Ｐ１（配列番号４）およびＰ２（配列番号５）のプローブを用いたとき、NPM1遺伝子のexon12変異の多型（タイプA、タイプB、タイプD、タイプ７、タイプ１０、タイプE、タイプ６）について、Tm解析で分析可能な蛍光強度の変化が認められた。すなわち、変異型は、野生型のピークに加えて、他のピークを有するものであり、固有の蛍光強度の変化量のパターンの変化が存在する。従って、Ｐ１（配列番号４）およびＰ２（配列番号５）のプローブを用いることにより、NPM1遺伝子のexon12変異の多型を検出することができる。
【００６１】
比較例１（相補鎖オリゴヌクレオチドを検出対象とする場合）
NPM1遺伝子のExon12領域の変異を1つのプローブで検出するために設計したプローブの性能を確認するため、NPM1 exon12領域の野生型配列と各種変異配列の相補鎖を準備し、プローブと相補鎖を含む以下の試薬溶液を調製した。
試薬溶液は実施例1と同様とし、プローブのみ以下のプローブを用いた。またTm解析も実施例1と同様に実施した。
また、変異の検出のために使用したプローブの配列を表７に示す。表７中、プローブの位置は、配列番号１に示す塩基配列における塩基番号を示す。
【００６２】
【表７】
【００６３】
WTやいくつかの変異タイプでは問題なく検出できたが、変異タイプA、D、7では検出ピークが確認できず、様々な変異の検出に適していないプローブであることが分かった（図１４−２２）。
結果を表８に示す。
【００６４】
【表８】
【００６５】
実施例２（血液検体または人工核酸プラスミドを検出対象として用いる場合）
核酸増幅した後、Tm解析による検出が可能であるかを検討するため、血液検体を用いて反応を行った。また、NPM1遺伝子のexon12変異がどの程度混ざった検体まで検出が可能であるか、野生型配列と変異配列（AタイプとEタイプ）の人工核酸プラスミドの混合比率を振り、その検出波形を確認した。人工核酸はpUCプラスミドベクターにNPM1遺伝子のexon12周辺配列の野生型配列（590bp、配列番号1）、変異タイプA（594bp、配列番号2）、変異タイプE（594bp、配列番号3）を挿入したプラスミドを用いた。
全自動SNPｓ検査装置（商品名i-densy IS-5310、アークレイ社製）を用いてPCR及びTm解析を行った。PCRおよびTm解析の条件は下記の表１１の通りである。
また、変異の検出に使用したプローブおよびプライマーの配列を表１２に示す。表１２中、プローブおよびプライマーの位置は、配列番号１に示す塩基配列における塩基番号を示す。
Tm解析における励起波長および検出波長は、それぞれ420〜485 nmおよび520〜555 nm（BODIPY FL）、または、それぞれ520〜555 nmおよび585〜700 nm（TAMRA）とした。
試薬溶液は以下の通りであった。
【００６６】
【表９】
【００６７】
＜全血の調製＞
全血10μlを希釈液(1) 70μlに加え、よく混合した後、この混合液10μlを希釈液(2)
70μlに加えた。この混合液17μlを95℃で10分加熱して4μlの前処理済全血を得た。これを1 testあたりのtemplateとして使用した。
【００６８】
【表１０】
【００６９】
＜人工核酸プラスミド＞
任意の割合で野生型と変異型を混合した500コピー/μｌの人工核酸プラスミドを４μｌ使用した。
【００７０】
【表１１】
【００７１】
【表１２】
【００７２】
血液検体を用いてi-densyで測定した結果、問題なく検出ピークが確認できた（図２３）。
人工核酸プラスミドを用いた検出波形を確認したところ、BODIPY FLは63℃、TAMRAも63℃に野生型の検出ピークが確認できた（図２４）。
変異タイプAの場合、BODIPY FLの56-57℃に検出ピークが確認され（図２５の左図）、変異タイプEの場合、TAMRAの50-51℃に検出ピークが確認できた（図２９の右図）。任意に割合で混合させたプラスミドの場合、変異タイプAとEの両方で10%の変異配列が混合された状態でも変異の検出ピークが確認できた（図２８の左図、図３２の右図）。
【００７３】
実施例２の結果より、Ｐ１（配列番号４）およびＰ２（配列番号５）のプローブを用いたとき、血液検体を用いた場合、そして、１０％の変異配列が混合される場合でも、NPM1遺伝子のexon12変異の多型（タイプA、タイプE）について、Tm解析で解析の可能な蛍光強度の変化が認められた。従って、Ｐ１（配列番号４）およびＰ２（配列番号５）のプローブを用いることにより、NPM1遺伝子のexon12変異の多型を検出することができる。
【００７４】
比較例２
比較例として、3T-NPM1-e12-R3プローブを用いた。以下の溶液を用いて核酸増幅した後、Tm解析による検出が可能であるかを検討した。プライマー配列や反応条件は実施例2と同様とした。プラスミド溶液（500コピー/μL）を4μL反応チューブに添加して、以下の反応条件でi-densyで反応した。Tm解析ではTAMRAの蛍光値の変化量を解析した。
【００７５】
【表１３】
【００７６】
【表１４】
【００７７】
血液を用いた場合と人工核酸プラスミドの野生型と変異タイプEを検体として用いた場合は、問題なく検出ピークが得られた（図３３，３４，３７）。しかしながら、変異タイプA100%を検体とした場合は検出ピークが確認できなかった（図３５）。さらに、変異タイプAまたはEを20%混合させた人工核酸を反応させた場合、変異タイプの検出ピークが確認できず、野生型の検出ピークしか確認できなかった（図３６，３８）。これらの結果から、実施例2の結果と比較して、3T-NPM1-e12-R3のプローブはNPM1のexon12の変異の検出に適していないと判断される。
【００７８】
実施例３（相補鎖オリゴヌクレオチドを検出対象とし、P5,P6,P7プローブを用いる場合）
NPM1遺伝子のexon12変異は多種の配列が報告されているが、そのほとんどはタイプA、B、Dである（表1参照）。そのためタイプA、B、Dが明確に検出することが、NPM1遺伝子のexon12変異検出用プローブとして有用である。
NPM1遺伝子のexon12の塩基配列（配列番号２（変異タイプA））に基づき、表１５に示す、末端部にCを有するプローブを設計した。表１５中、プローブの位置は、配列番号２に示す塩基配列における塩基番号を示す。Pacific Blue, TAMRAおよびPODIPY FLによる標識は、常法に従って行った。
試薬溶液は実施例1と同様とし、プローブのみ以下のプローブを用いた。またTm解析も実施例1と同様に実施した。
また、検出対象として使用した相補鎖オリゴヌクレオチドの配列を表１に記載されており、表1に記載の４の部分に挿入変異を持つ配列である。
【００７９】
【表１５】
【００８０】
Tm解析における励起波長および検出波長は、それぞれ365〜415 nmおよび445〜480 nm（Pacific Blue）、520〜555 nmおよび585〜700 nm（TAMRA）、420〜485 nmおよび520〜555 nm（BODIPY FL）であった。
【００８１】
上記に示したプローブを用いて、実施例1と同様にTm解析による検出ピーク（Tm値）の確認を行った。また、野生型の相補鎖に対するTm値と各変異配列に対するTm値の差を確認した。
3PB-NPM1-mtA-R4（配列番号５６）については、WTと変異タイプM、N、Gm、１２、IとのTm値の差（ΔTm）は４℃以下であったが、他の変異タイプでは十分なTm値の差があることが分かり、変異を検出することに適したプローブであることが分かった。
3T-NPM1-mtB-R5（配列番号５７）については、WTと変異タイプM、N、１２とのTm値の差（ΔTm）は４℃以下であったが、他の変異タイプでは十分なTm値の差があることが分かり、変異を検出することに適したプローブであることが分かった。
3FL-NPM1-mtD-R6（配列番号５８）については、WTと変異タイプM、N、３、１２、IとのTm値の差（ΔTm）は４℃以下であったが、他の変異タイプでは十分なTm値の差があることが分かり、変異を検出することに適したプローブであることが分かった。
結果を表１６に示す。
【００８２】
【表１６】
【００８３】
mtA-R4プローブは、WT配列（14mer）に加えてタイプAに特有の「ｔｃｔｇ」配列を4mer挿入した塩基配列に相補的なプローブである。mtA-R4プローブは、タイプA配列と18mer一致、タイプB配列と16mer一致、タイプDと配列17mer一致するため、WT相補鎖の（14mer一致）よりも高いTm値（高い親和性）が得られ、これら変異配列を検出することができる。
同様に、タイプB配列に相補的なmtB-R5プローブは、タイプA配列と16mer一致、タイプB配列と18mer一致、タイプD配列と17mer一致し、WT相補鎖よりも高いTm値が得られる。
同様に、タイプD配列に相補的なmtD-R6プローブは、タイプA配列と17mer一致、タイプB配列と17mer一致、タイプD配列と18mer一致し、WT相補鎖よりも高いTm値が得られる。
【００８４】
実施例４（相補鎖オリゴヌクレオチドを検出対象として検出感度を確認する場合）
NPM1遺伝子のexon12変異のタイプAがどの程度混ざった検体まで検出が可能であるか、野生型配列と変異配列の人工核酸プラスミドの混合比率を振り、その検出波形を確認した。人工核酸はpUCプラスミドベクターにNPM1遺伝子のexon12周辺配列の野生型配列（590bp、配列番号1）、変異タイプA（594bp、配列番号2）を挿入したプラスミドを用いた。
【００８５】
【表１７】
【００８６】
PCRおよびTm解析の条件は実施例２の表１１と同様とした。Tm解析における励起波長および検出波長は、それぞれ365〜415 nmおよび445〜480 nm（Pacific Blue）、520〜555 nmおよび585〜700 nm（TAMRA）、420〜485 nmおよび520〜555 nm（BODIPY FL）であった。
【００８７】
表１５のプローブを用いてTm解析を行った結果、mtA-R4プローブは、mtA 10%や3%の時に61-62℃に（図３９）、mtB-R5プローブは、mtA 10%の時に53℃に（図４０）、mtD-R6プローブは、mtA 10%や3%の時に59-60℃に（図４１）、変異タイプAと考えられる検出ピークが確認できた。
【００８８】
実施例４の結果より、mtA-R4（配列番号５６）、mtB-R5（配列番号５７）、mtD-R6（配列番号５８）のプローブを用いたとき、NPM1遺伝子のexon12変異の多型（タイプA）について、Tm解析で分析可能な蛍光強度の変化が認められた。すなわち、変異型は、野生型のピークに加えて、他のピークを有するものであり、固有の蛍光強度の変化量のパターンの変化が存在する。従って、mtA-R4（配列番号５６）、mtB-R5（配列番号５７）、mtD-R6（配列番号５８）のプローブを用いることにより、NPM1遺伝子のexon12変異の多型（タイプA）が少量混在する検体から当該変異を高い感度で検出可能であることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【００８９】
本発明のプローブを用いることより、急性骨髄性白血病のかかりやすさ、病態および/または予後を診断することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、NPM1遺伝子のexon12変異を検出する方法、ならびにそのための核酸プローブおよびキットに関する。
【０００２】
急性骨髄性白血病（AML）の病因に関連する DNA 変異は多数発見されている。NPM1遺伝子変異は成人の急性骨髄性白血病患者に見つかり、FLT3-ITD遺伝子変異の結果と組み合わせて考えることで予後予測に関連することが報告されている（非特許文献１）。NPM1遺伝子の変異タイプとしては、例えば、非特許文献２−７に記載されており、報告症例数の多さや変異が起こる塩基配列箇所から代表的な変異としては、タイプA、タイプB、タイプD、タイプ７、タイプQ、タイプ１０、タイプE、タイプ６などが挙げられる。
【０００３】
塩基の多型を検出する方法としては、以下の方法が知られている。
非特許文献７には、PCRで増幅した後に電気泳動で分離し、そこから切出したゲルから増幅産物を精製し、ダイレクトシークエンスする方法が記載されている。非特許文献８には、DHPLC法とシークエンス法により検出する方法が記載されている。
しかしながら、これらの方法は、(1)増幅産物を取り出すので、コンタミネーションの危険性があり、(2)操作が自動化されておらず、また各項目それぞれについて操作が必要であることから、手間とコストを必要とし、(3)結果解析に専門知識や専門スキルを必要とし、そして、(4)シークエンス解析の検出特異性は20%程度と低いため、正常細胞の割合が多い癌細胞では、検出が難しいという問題があった。
【０００４】
一方、変異を含む領域をPCRで増幅した後、蛍光色素で標識された核酸プローブを用いて融解曲線分析を行い、融解曲線分析の結果に基づいて変異を解析する方法が知られている（特許文献１，２）。これらの文献においては、プローブの設計に関し、末端部が蛍光色素により標識された消光プローブが標的核酸にハイブリダイゼーションしたとき、末端部分においてプローブ−核酸ハイブリッドの複数塩基対が少なくとも一つのGとCのペアを形成するように設計するという教示はある。しかしながら、これらの方法は実施する上で全ての任意配列で実施可能ではないという問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００１−２８６３００号公報
【特許文献２】特開２００２−１１９２９１号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Blood. 2007;109 : 874-885
【非特許文献２】New Eng J Med 352： 254-266, 2005
【非特許文献３】Blood. 2005;106：1419-1422
【非特許文献４】Blood. 2005;106：3740-3746
【非特許文献５】Blood. 2005;106：3733-3739
【非特許文献６】Blood. 2006;108：1999-2005
【非特許文献７】Blood. 2005;106：2854-2861
【非特許文献８】Haematologica 2007; 92 : 1268-1269
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、NPM1遺伝子のexon12変異を検出するのに有効なプローブを特定し、NPM1遺伝
子のexon12変異を検出する方法、およびそのためのキットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、NPM1遺伝子のexon12変異を含む特定の領域に基づいてプローブを設計し、該プローブを用いる融解曲線分析を行うことにより当該変異を検出できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）NPM1遺伝子のexon12の変異を検出するためのプローブであって、下記P5、P5'、P6、P6'、P7、P7'、P1、P1'、P2およびP2'から選択される少なくとも１種の蛍光標識オリゴヌクレオチドからなることを特徴とする多型検出用プローブ。
(P5)配列番号2に示す塩基配列において、塩基番号145〜156を含む12〜50塩基長の塩基配列に相補的な配列またはそれに相同な配列を有し、塩基番号145に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
(P5')配列番号2に示す塩基配列において、塩基番号145〜156を含む12〜50塩基長の塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、塩基番号145に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
(P6)配列番号2に示す塩基配列において、塩基番号145〜156を含む12〜50塩基長の塩基配列に相補的な配列またはそれに相同な配列を有し、塩基番号153番目に対応する塩基がグアニンであり、塩基番号145に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
(P6')配列番号2に示す塩基配列において、塩基番号145〜156を含む12〜50塩基長の塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、塩基番号153番目に対応する塩基がグアニンであり、塩基番号145に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
(P7)配列番号2に示す塩基配列において、塩基番号145〜156を含む12〜50塩基長の塩基配列に相補的な配列またはそれに相同な配列を有し、塩基番号153番目に対応する塩基がグアニンであり、塩基番号154番目に対応する塩基がチミンであり、塩基番号145に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
(P7')配列番号2に示す塩基配列において、塩基番号145〜156を含む12〜50塩基長の塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、塩基番号153番目に対応する塩基がグアニンであり、塩基番号154番目に対応する塩基がチミンであり、塩基番号145に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
(P1)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号135〜150を含む16〜50塩基長の塩基配列に相補的な配列またはそれに相同な配列であり、塩基番号135に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
(P1')配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号135〜150を含む16〜50塩基長の塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、塩基番号135に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
(P2)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号164〜182を含む19〜50塩基長の塩基配列に相補的な配列またはそれに相同な配列であり、塩基番号182に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、および
(P2')配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号164〜182を含む19〜50塩基長の塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、塩基番号182に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド。
（２）P5、P5'、P6、P6'、P7およびP7'のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号145に対応する塩基を3'末端から数えて1〜3番目の位置に有し、
P1およびP1'のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号135に対応する塩基を3'末端から数えて1〜3番目の位置に有し、
P2およびP2'のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号182に対応する塩基を5'末端から数えて1〜3番目の位置に有する、（１）記載のプローブ。
（３）P5、P5'、P6、P6'、P7およびP7'のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号145に対応する塩基を3'末端に有し、
P1およびP1'のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号135に対応する塩基を3'末端に有し、
P2およびP2'のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号182に対応する塩基を5'末端に有する、（１）記載のプローブ。
（４）P1およびP1'のオリゴヌクレオチドは、塩基番号153-156のいずれかの塩基に対応する塩基を5'末端とし、蛍光色素で標識された塩基番号135に対応する塩基を3'末端に有し、
P2およびP2'のオリゴヌクレオチドは、塩基番号153-156のいずれかの塩基に対応する塩基を3'末端とし、蛍光色素で標識された塩基番号182に対応する塩基を5'末端に有する、（１）記載のプローブ。
（５）P5、P5'、P6、P6'、P7およびP7'のオリゴヌクレオチドは、塩基番号162を5'末端とし、蛍光色素で標識された塩基番号145に対応する塩基を3'末端に有し、
P1およびP1'のオリゴヌクレオチドは、塩基番号155を5'末端とし、蛍光色素で標識された塩基番号135に対応する塩基を3'末端に有し、
P2およびP2'のオリゴヌクレオチドは、塩基番号156を3'末端とし、蛍光色素で標識された塩基番号182に対応する塩基を5'末端に有する、（１）記載のプローブ。
（６）前記オリゴヌクレオチドは、標的配列にハイブリダイズしないときに蛍光を発し、且つ標的配列にハイブリダイズしたときに蛍光強度が減少するかまたは増加する、（１）〜（５）のいずれか１項記載のプローブ。
（７）前記オリゴヌクレオチドが、標的配列にハイブリダイズしないときに蛍光を発し、標的配列にハイブリダイズしたときに蛍光強度が減少する、（６）記載のプローブ。
（８）前記プローブが、融解曲線分析用のプローブである、（１）〜（７）のいずれか１項に記載のプローブ。
（９）P5、P5'、P6、P6'、P7およびP7'のオリゴヌクレオチドの塩基長が12〜35で、P1およびP1'のオリゴヌクレオチドの塩基長が16〜35で、P2およびP2'のオリゴヌクレオチドが19〜35である、（１）〜（８）のいずれか１項記載の多型検出用プローブ。
（１０）NPM1遺伝子のexon12における多型の検出方法であって、（１）〜（９）のいずれか１項に記載のプローブを少なくとも１種用いることを特徴とする方法。
（１１）NPM1遺伝子のexon12における多型の検出方法であって、下記工程（Ｉ）〜（IＶ）を含むことを特徴とする方法。
（Ｉ）核酸を含有する試料に、（１）〜（９）のいずれか１項に記載のプローブを添加して前記核酸に前記プローブをハイブリダイズさせる工程、
（ＩＩ）温度を変化させて前記核酸と前記プローブとのハイブリッド形成体を解離させ、ハイブリッド形成体の解離に基づくシグナルの変動を測定する工程、
（ＩＩＩ）前記シグナルの変動を解析して前記試料中の一本鎖核酸におけるＴｍ値を検出する工程、および
（ＩＶ）前記Ｔｍ値から前記試料中の一本鎖核酸における、目的の多型の有無または多型を有する一本鎖核酸の存在比を検出する工程。
（１２）さらに、（Ｉ）の工程の前または（Ｉ）の工程と同時にDNAを増幅することを含む、（１１）に記載の方法。
（１３）（１０）〜（１２）のいずれか１項に記載の方法により、NPM1遺伝子のexon12における多型を検出する工程、および多型の有無を決定する工程を含む、急性骨髄性白血病のかかりやすさ、病態および/または予後を分析する方法。
（１４）（１）〜（９）のいずれか１項に記載のプローブを含む、NPM1遺伝子における多型を検出するための試薬キット。
（１５）さらに、NPM1遺伝子の配列番号1に示す塩基配列におけるP5、P5'、P6、P6'、P7
、P7'、P1、P1'、P2、P2'のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする配列を含む領域を増幅するためのプライマーを含む、（１４）に記載の試薬キット。
（１６）前記プライマーが、下記P3およびP4並びにP3'およびP4'から選択される多型検出用プライマーである、（１４）または（１５）に記載の試薬キット。
(P3)106番目の塩基Tを3'末端とし配列番号1に相同的な10〜50塩基のオリゴヌクレオチド、および
(P4)205番目の塩基Tを3'末端とし配列番号1の相補鎖に相同性を有する10〜50塩基のオリゴヌクレオチド並びに
(P3')106番目の塩基Tを3'末端とし配列番号1の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有する10〜50塩基のオリゴヌクレオチド、および
(P4')205番目の塩基Tを3'末端とし配列番号1の塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有する10〜50塩基のオリゴヌクレオチド。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のプローブを添加して融解曲線分析（Tm解析）を行うだけでNPM1遺伝子のexon12の変異の検出が可能となる。本発明のプローブは、特異性が高く、検出感度が高い。本発明の方法を用いることにより、PCRを行う場合であっても、増幅産物を取り出す必要がないため、コンタミネーションの危険性がほぼ無い。また、本発明の方法は、操作が簡単なので自動化が容易である。本発明のプローブを使用すれば、現在報告されている変異の中の代表的な8つの変異タイプの内、7つの変異が識別可能である。また代表的な2つの変異タイプ（タイプA,E）については、野生型に含まれる変異が10%であっても検出可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】（Ａ）核酸混合物の融解曲線、及び（Ｂ）微分融解曲線の一例を示す図である。
【図２】検量線の一例を示す図である。
【図３】本発明のプローブの設計概略図を示す。実施例において使用される本発明のプローブの位置を示す。また、比較例において使用されるプローブの位置を示す。
【図４】実施例１のＷＴ（相補鎖オリゴヌクレオチド）についてのTm解析における単位時間当たりのＴＡＭＲＡ（３Ｔ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ１）の蛍光強度の変化量（d蛍光強度増加量/t）を縦軸とし、温度を横軸とし、これらの関係を示す。以下の図においても、縦軸と横軸の関係は同様である。
【図５】実施例１のmt type A（相補鎖オリゴヌクレオチド）についてのTm解析において、プローブにＴＡＭＲＡ（３Ｔ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ１）を用いた。
【図６】実施例１のmt type B（相補鎖オリゴヌクレオチド）についてのTm解析において、プローブにＴＡＭＲＡ（３Ｔ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ１）を用いた。
【図７】実施例１のmt type D（相補鎖オリゴヌクレオチド）についてのTm解析において、プローブにＴＡＭＲＡ（３Ｔ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ１）を用いた。
【図８】実施例１のmt type 7（相補鎖オリゴヌクレオチド）についてのTm解析において、プローブにＴＡＭＲＡ（３Ｔ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ１）を用いた。
【図９】実施例１のWT（相補鎖オリゴヌクレオチド）についてのTm解析において、プローブにＴＡＭＲＡ（５Ｔ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ２）を用いた。
【図１０】実施例１のmt type Q（相補鎖オリゴヌクレオチド）についてのTm解析において、プローブにＴＡＭＲＡ（５Ｔ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ２）を用いた。
【図１１】実施例１のmt type 10（相補鎖オリゴヌクレオチド）についてのTm解析において、プローブにＴＡＭＲＡ（５Ｔ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ２）を用いた。
【図１２】実施例１のmt type E（相補鎖オリゴヌクレオチド）についてのTm解析において、プローブにＴＡＭＲＡ（５Ｔ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ２）を用いた。
【図１３】実施例１のmt type 6（相補鎖オリゴヌクレオチド）についてのTm解析において、プローブにＴＡＭＲＡ（５Ｔ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ２）を用いた。
【図１４】比較例１のＷＴ（相補鎖オリゴヌクレオチド）についてのTm解析において、プローブにＴＡＭＲＡ（３Ｔ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ３）を用いた。
【図１５】比較例１のmt type A（相補鎖オリゴヌクレオチド）についてのTm解析において、プローブにＴＡＭＲＡ（３Ｔ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ３）を用いた。
【図１６】比較例１のmt type B（相補鎖オリゴヌクレオチド）についてのTm解析において、プローブにＴＡＭＲＡ（３Ｔ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ３）を用いた。
【図１７】比較例１のmt type D（相補鎖オリゴヌクレオチド）についてのTm解析において、プローブにＴＡＭＲＡ（３Ｔ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ３）を用いた。
【図１８】比較例１のmt type 7（相補鎖オリゴヌクレオチド）についてのTm解析において、プローブにＴＡＭＲＡ（３Ｔ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ３）を用いた。
【図１９】比較例１のmt type Q（相補鎖オリゴヌクレオチド）についてのTm解析において、プローブにＴＡＭＲＡ（３Ｔ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ３）を用いた。
【図２０】比較例１のmt type 10（相補鎖オリゴヌクレオチド）についてのTm解析において、プローブにＴＡＭＲＡ（３Ｔ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ３）を用いた。
【図２１】比較例１のmt type E（相補鎖オリゴヌクレオチド）についてのTm解析において、プローブにＴＡＭＲＡ（３Ｔ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ３）を用いた。
【図２２】比較例１のmt type 6（相補鎖オリゴヌクレオチド）についてのTm解析において、プローブにＴＡＭＲＡ（３Ｔ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ３）を用いた。
【図２３】実施例２の血液検体についてのPCR反応後のTm解析において、プローブにＢＯＤＩＰＹ ＦＬ（３ＦＬ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ１）（左図）とＴＡＭＲＡ（５Ｔ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ２）（右図）を用いた。
【図２４】実施例２のＷＴ １００％（プラスミド）についてのPCR反応後のTm解析において、プローブにＢＯＤＩＰＹ ＦＬ（３ＦＬ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ１）（左図）とＴＡＭＲＡ（５Ｔ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ２）（右図）を用いた。
【図２５】実施例２のmt type A １００％（プラスミド）についてのPCR反応後のTm解析において、プローブにＢＯＤＩＰＹ ＦＬ（３ＦＬ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ１）（左図）とＴＡＭＲＡ（５Ｔ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ２）（右図）を用いた。
【図２６】実施例２のmt type A ３０％、Wt ７０％（プラスミド）についてのPCR反応後のTm解析において、プローブにＢＯＤＩＰＹ ＦＬ（３ＦＬ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ１）（左図）とＴＡＭＲＡ（５Ｔ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ２）（右図）を用いた。
【図２７】実施例２のmt type A ２０％、Wt ８０％（プラスミド）についてのPCR反応後のTm解析において、プローブにＢＯＤＩＰＹ ＦＬ（３ＦＬ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ１）（左図）とＴＡＭＲＡ（５Ｔ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ２）（右図）を用いた。
【図２８】実施例２のmt type A １０％、Wt ９０％（プラスミド）についてのPCR反応後のTm解析において、プローブにＢＯＤＩＰＹ ＦＬ（３ＦＬ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ１）（左図）とＴＡＭＲＡ（５Ｔ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ２）（右図）を用いた。
【図２９】実施例２のmt type E １００％（プラスミド）についてのPCR反応後のTm解析において、プローブにＢＯＤＩＰＹ ＦＬ（３ＦＬ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ１）（左図）とＴＡＭＲＡ（５Ｔ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ２）（右図）を用いた。
【図３０】実施例２のmt type E ３０％、Wt ７０％（プラスミド）についてのPCR反応後のTm解析において、プローブにＢＯＤＩＰＹ ＦＬ（３ＦＬ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ１）（左図）とＴＡＭＲＡ（５Ｔ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ２）（右図）を用いた。
【図３１】実施例２のmt type E ２０％、Wt ８０％（プラスミド）についてのPCR反応後のTm解析において、プローブにＢＯＤＩＰＹ ＦＬ（３ＦＬ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ１）（左図）とＴＡＭＲＡ（５Ｔ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ２）（右図）を用いた。
【図３２】実施例２のmt type E １０％、Wt ９０％（プラスミド）についてのPCR反応後のTm解析において、プローブにＢＯＤＩＰＹ ＦＬ（３ＦＬ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ１）（左図）とＴＡＭＲＡ（５Ｔ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ２）（右図）を用いた。
【図３３】比較例２の血液検体についてのPCR反応後のTm解析において、プローブにＴＡＭＲＡ（３Ｔ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ３）を用いた。
【図３４】比較例２のWt １００％（プラスミド）についてのPCR反応後のTm解析において、プローブにＴＡＭＲＡ（３Ｔ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ３）を用いた。
【図３５】比較例２のmt type A １００％（プラスミド）についてのPCR反応後のTm解析において、プローブにＴＡＭＲＡ（３Ｔ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ３）を用いた。
【図３６】比較例２のmt type A ２０％、Wt ８０％（プラスミド）についてのPCR反応後のTm解析において、プローブにＴＡＭＲＡ（３Ｔ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ３）を用いた。
【図３７】比較例２のmt type E １００％（プラスミド）についてのPCR反応後のTm解析において、プローブにＴＡＭＲＡ（３Ｔ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ３）を用いた。
【図３８】比較例２のmt type E ２０％、Wt ８０％（プラスミド）についてのPCR反応後のTm解析において、プローブにＴＡＭＲＡ（３Ｔ−ＮＰＭ１−ｅ１２−Ｒ３）を用いた。
【図３９】実施例４のmt type A（プラスミド）についてのPCR反応後のTm解析において、プローブにPacific Blue（mtA-R4）を用いた。
【図４０】実施例４のmt type A（プラスミド）についてのPCR反応後のTm解析において、プローブにTAMRA（mtB-R5）を用いた。
【図４１】実施例４のmt type A（プラスミド）についてのPCR反応後のTm解析において、プローブにBODIPY FL（mtD-R6）を用いた。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
＜１＞本発明プローブおよび本発明検出方法
本発明プローブは、NPM1遺伝子のexon12の変異を検出するためのプローブであって、下記(P5)、(P5')、(P6)、(P6')、(P7)、(P7')、(P1), (P1'), (P2), および(P2')から選択される少なくとも１種の蛍光標識オリゴヌクレオチドからなることを特徴とする多型検出用プローブである。
(P5)配列番号2に示す塩基配列において、塩基番号145〜156を含む12〜50塩基長の塩基配列に相補的な配列またはそれに相同な配列を有し、塩基番号145に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
(P5')配列番号2に示す塩基配列において、塩基番号145〜156を含む12〜50塩基長の塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、塩基番号145に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
(P6)配列番号2に示す塩基配列において、塩基番号145〜156を含む12〜50塩基長の塩基配列に相補的な配列またはそれに相同な配列を有し、塩基番号153番目に対応する塩基がグアニンであり、塩基番号145に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
(P6')配列番号2に示す塩基配列において、塩基番号145〜156を含む12〜50塩基長の塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、塩基番号153番目に対応する塩基がグアニンであり、塩基番号145に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
(P7)配列番号2に示す塩基配列において、塩基番号145〜156を含む12〜50塩基長の塩基配列に相補的な配列またはそれに相同な配列を有し、塩基番号153番目に対応する塩基がグアニンであり、塩基番号154番目に対応する塩基がチミンであり、塩基番号145に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
(P7')配列番号2に示す塩基配列において、塩基番号145〜156を含む12〜50塩基長の塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、塩基番号153番目に対応する塩基がグアニンであり、塩基番号154番目に対応する塩基がチミンであり、塩基番号145に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
(P1)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号135〜150を含む16〜50塩基長の塩基配
列に相補的な配列またはそれに相同な配列であり、塩基番号135に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
(P1')配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号135〜150を含む16〜50塩基長の塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、塩基番号135に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
(P2)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号164〜182を含む19〜50塩基長の塩基配列に相補的な配列またはそれに相同な配列であり、塩基番号182に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、および
(P2')配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号164〜182を含む19〜50塩基長の塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、塩基番号182に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド。
【００１３】
本発明プローブは、配列番号２に示す塩基配列（NPM1遺伝子のexon12の変異タイプAの塩基を有する配列）において上記(P5)、(P5')、(P6)、(P6')、(P7)、(P7')に特定された配列を有し、(P6)、(P6')については、塩基番号153番目に対応する塩基がグアニンであり、(P7)、(P7')については、さらに塩基番号154番目に対応する塩基がチミンである他は、特許文献１，２に記載された消光プローブと同様にして作製できる。また、本発明プローブは、配列番号１に示す塩基配列（NPM1遺伝子のexon12の野生型の塩基を有する配列）において上記(P1), (P1'), (P2)および(P2')に特定された配列を有する他は、特許文献１，２に記載された消光プローブと同様にして作製できる。なお、本発明の配列番号１に示す配列は、GenBankのアクセッションナンバーNG_016018の27689番目から28278番目である。また、配列番号２に示す配列は、塩基番号１５３〜１５７番目の４塩基が付加されている点でのみ配列番号１に示す配列と異なる。
【００１４】
本発明のプローブの長さとしては、P5、P5'、P6、P6'、P7、P7'については、例えば、１２〜５０塩基長、１２〜３５塩基長、または１２〜３０塩基長である。P1, P1'については、例えば、１６〜５０塩基長、１６〜３５塩基長、または１６〜３０塩基長である。P2, P2'については、例えば、１９〜５０塩基長、１９〜３５塩基長、または１９〜３０塩基長である。
本発明プローブは、例えば、配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号153-156（下記表１のgcag）のいずれかの塩基に対応する塩基を末端とするプローブであり、P1, P1'については、塩基番号153-156のいずれかの塩基を5'末端とし、P2, P2'については、塩基番号153-156のいずれかの塩基を3'末端とする。本発明のプローブは、例えば、配列番号1に示す塩基配列において、P1, P1'については、塩基番号155の塩基を5'末端とし、P2, P2'については、塩基番号156の塩基を3'末端とする。
【００１５】
本願における「相同性」とは、特定の塩基配列において、塩基配列の相補鎖に例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の同一性を有する配列を有している塩基配列をさす。本願においては、１００％の同一性を有していてもよい。
本願におけるハイブリダイゼーションは、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ３ｒｄ（Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ． Ｐｒｅｓｓ， ２００１）
に記載の方法等に従って行うことができる。この文献は、参照により本明細書に組み入れられるものとする。
ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。典型的なストリンジェントな条件とは、例えば、カリウム濃度は約２５mＭ〜約５０ｍＭ、及びマグネシウム濃度は約１．０ｍＭ〜約５．０ｍＭ中において、ハイブリダイゼーションを行う条件があげられる。本発明の条件の１例としてＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）、２５ｍＭのＫＣｌ、及び１．５ｍＭのＭｇＣｌ2中においてハイブリダイゼーションを行う条件が、挙げられるが、これに限定されるものではない。その他、ストリンジェントな条件としては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ３ｒｄ（Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ． Ｐｒｅｓｓ， ２００１）に記載されている。この文献は、参照により本明細書に組み入れられるものとする。当業者は、ハイブリダイゼーション反応や、ハイブリダイゼーション反応液の塩濃度等を変化させることによって、このような条件を容易に選択することができる。
【００１６】
さらに、本発明における前記P5、P5'、P6、P6'、P7、P7'、P1、P1'、P2、P2'の蛍光標識オリゴヌクレオチドには、それぞれ前記P5、P5'、P6、P6'、P7、P7'、P1、P1'、P2、P2'の蛍光標識オリゴヌクレオチドに塩基が挿入、欠失又は置換した蛍光標識オリゴヌクレオチドも包含される。
当該塩基が挿入、欠失又は置換した蛍光標識オリゴヌクレオチドは、前記P5、P5'、P6、P6'、P7、P7'、P1、P1'、P2、P2'の蛍光標識オリゴヌクレオチドと同等程度の作用を示せばよく、塩基が挿入、欠失又は置換されている場合、その挿入、欠失又は置換の位置は、特に限定されない。挿入、欠失又は置換した塩基の数としては１塩基又は２塩基以上が挙げられ、蛍光標識オリゴヌクレオチド全体の長さによって異なるが、例えば１塩基〜１０塩基又は１塩基〜５塩基が挙げられる。
【００１７】
挿入、欠失又は置換の中でも、本発明における前記P5、P5'、P6、P6'、P7、P7'、P1、P1'、P2、P2'の蛍光標識オリゴヌクレオチドとしては、それぞれ前記P5、P5'、P6、P6'、P7、P7'、P1、P1'、P2、P2'の蛍光標識オリゴヌクレオチドの塩基が置換した蛍光標識オリゴヌクレオチドが挙げられる。置換の位置は、特に限定されない。例えば、検出感度の観点より、配列番号２で示される配列のうち１５２番目〜１６６番目の塩基以外の位置、または配列番号１で示される配列のうち１５２番目〜１６２番目の塩基以外の位置の塩基が置換されることが挙げられる。置換される塩基の数としては１塩基又は２塩基以上が挙げられる。置換される塩基の数は、蛍光標識オリゴヌクレオチド全体の長さによって異なるが、例えば１塩基〜５塩基、又は１塩基〜３塩基が挙げられる。
【００１８】
前記蛍光標識オリゴヌクレオチドにおける、オリゴヌクレオチドとしては、オリゴヌクレオチドの他、修飾されたオリゴヌクレオチドも含まれる。
前記オリゴヌクレオチドの構成単位としては、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、人工核酸等が挙げられる。前記人工核酸としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＲＮＡアナログであるＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）；ペプチド核酸であるＰＮＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）；架橋化核酸であるＢＮＡ（Ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）等が挙げられる。
前記オリゴヌクレオチドは、前記構成単位のうち、一種類から構成されてもよいし、複数種類から構成されてもよい。
【００１９】
本発明において使用されるNPM1遺伝子のexon12の変異を検出するためのプローブの塩基配列の例としては、P5としては、5'-cactgcCAGAcagagatc-3'（配列番号５６）が挙げられ、P6としては、5'-cactgcCATGcagagatc-3'（配列番号５７）が挙げられ、P7としては、5'-cactgcCAGGcagagatc-3'（配列番号５８）が挙げられ、P1としては、5'-tgccagagatcttgaatagcc-3'（配列番号４）が挙げられ、P2としては、5'-ctattttcttaaagagacttcctccac-3'（配列番号５）が挙げられる。
蛍光色素としては、特許文献１，２に記載されたものが使用できるが、具体例としては、Pacific Blue(商標)、FAM(商標)、TAMRA(商標)、BODIPY FL(商標)等が挙げられる。蛍光色素のオリゴヌクレオチドへの結合方法は、通常の方法、例えば特許文献１，２に記載の方法に従って行うことができる。
【００２０】
本発明の(P5),(P5'),(P6),(P6'),(P7),(P7'),（P1）, (P1'), (P2)または（P2'）のいずれか１つのオリゴヌクレオチドを用いることにより、例えば、(P5),(P6),(P7)または(P5'),(P6'),(P7')の３つのオリゴヌクレオチドを用いることにより、例えば、（P1）および（P2）または（P1'）および（P2'）の２つのオリゴヌクレオチドを用いることにより、本実施例３，４に示される配列番号５６−５８に示すプローブを用いることにより、または、本実施例１，２に示される配列番号４，５に示すプローブを用いることにより、NPM1遺伝子のexon12の変異を検出することができる（図３）。
【００２１】
本発明プローブは、標的配列にハイブリダイゼーションしないときに蛍光色素の蛍光が発光し、標的配列にハイブリダイゼーションしたときに蛍光色素の蛍光が減少または増加することが好ましい。本発明プローブは、例えば、ハイブリダイゼーションしないときに蛍光色素の蛍光が発光し、ハイブリダイゼーションしたときに蛍光色素の蛍光が消光する、消光プローブである。
また、本発明プローブは、５’または３’末端から数えて１〜３番目の塩基が蛍光色素により標識化されていることが好ましく、３’末端が蛍光色素により標識されていることがより好ましい。なお、本明細書において、「５’末端から数えて１〜３番目」という場合は、５’末端を１番目として数え、「３’末端から数えて１〜３番目」という場合は、３’末端を１番目として数える。
なお、本発明プローブにおいて蛍光色素により標識されている塩基は、P5,P5',P6,P6',P7,P7'については、配列番号２における１４５番目の塩基であり、P1, P1'については、配列番号１における１３５番目の塩基であり、P2, P2'については、配列番号１における１８２番目の塩基である。
【００２２】
本発明のオリゴヌクレオチドにより検出することのできるNPM1遺伝子のexon12の変異は、例えば、以下の表１に記載されており、タイプA、タイプB、タイプD、タイプC、タイプE、タイプGm、タイプKm、タイプNm、タイプOm、タイプQm、タイプ3、タイプ4、タイプ6、タイプ7、タイプ13、タイプ10、タイプG+、タイプH+、タイプI+、タイプJ+、およびタイプIからなる群より選択される少なくとも１つ以上の変異を検出できる。
【００２３】
【表１】
【００２４】
(P5),(P5'),(P6),(P6'),(P7),(P7')のオリゴヌクレオチドを用いる場合には、タイプA、タイプB、タイプD、タイプC、タイプGm、タイプKm、タイプNm、タイプOm、タイプQm、タイプ3、タイプ4、タイプ13、タイプG+、タイプH+、タイプI+、タイプJ+、およびタイプIなどを検出することができる。
配列番号１に示す塩基配列において塩基番号153-156の領域より５’側の配列のプローブ、例えば、（P1）,(P1')のオリゴヌクレオチドを用いる場合には、タイプA、タイプB、タイプD、およびタイプ７などを検出することができる。
配列番号１に示す塩基配列において塩基番号153-156の領域より３’側の配列のプローブ、例えば、（P2）,(P2')のオリゴヌクレオチドを用いる場合には、タイプ１０、タイプE、およびタイプ６などを検出することができる。
また、本発明の(P5),(P5'),(P6),(P6'),(P7),(P7')のいずれか１つのオリゴヌクレオチド、または（P1）もしくは(P1')および(P2)もしくは（P2'）のオリゴヌクレオチドを用いることにより、NPM1遺伝子のexon12の変異の有無を検出することができ、急性骨髄性白血病のかかりやすさ、病態および/または予後の診断が可能となる。
【００２５】
本実施例に示される配列番号５６，５７，５８，４，５のプローブを用いることにより、NPM1遺伝子のexon12の変異を検出することができる。配列番号５６−５８，４に示すプローブについては、３’末端が蛍光色素で標識され、配列番号５に示すプローブについては、５’末端が蛍光色素で標識されている。
【００２６】
本発明の検出方法は、上記のような本発明のプローブを用いることを特徴とする。すなわち、本発明の検出方法は、配列番号２に示す塩基配列において、塩基番号157-160の領域（配列番号１の塩基番号153-156に対応）を含む1つ以上のプローブを用いることもできるし、上記P5,P5',P6,P6',P7,P7'の１つ以上のプローブを用いることもできる。また、本発明の検出方法は、配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号153-156の領域を末端とする1つ以上のプローブを用いることもできるし、上記P1, P1', P2およびP2'の１つ以上のプローブを用いることもできる。
【００２７】
本発明の検出方法は、例えば、本発明のプローブを使用し、以下の工程を含むことを特徴とする。
（Ｉ）核酸を含有する試料に、本発明のプローブを添加して前記核酸に前記プローブをハイブリダイズさせる工程、
（ＩＩ）温度を変化させて前記核酸と前記プローブとのハイブリッド形成体を解離させ、ハイブリッド形成体の解離に基づくシグナルの変動を測定する工程、
（ＩＩＩ）前記シグナルの変動を解析して前記試料中の一本鎖核酸におけるＴｍ値を検出する工程、および
（ＩＶ）前記Ｔｍ値から前記試料中の一本鎖核酸における、目的の多型の有無または多型を有する一本鎖核酸の存在比を検出する工程。
【００２８】
本発明検出方法は、本発明プローブを用いることの他は、通常の核酸増幅および融解曲線分析（Tm解析）の方法に従って行うことができる。また、本発明の検出方法は、前記工程（Ｉ）の前または工程（Ｉ）と同時に核酸を増幅することを含んでいてもよい。
【００２９】
核酸増幅の方法としては、ポリメラーゼを用いる方法が好ましく、その例としては、PCR、ICAN、LAMP等が挙げられる。ポリメラーゼを用いる方法により増幅する場合は、本発明プローブの存在下で増幅を行うことが好ましい。用いるプローブに応じて、増幅の反応条件等を調整することは当業者であれば容易である。これにより、核酸の増幅後にプローブのTm値を解析するだけなので、反応終了後増幅産物を取り扱う必要がない。よって、増幅産物による汚染の心配がない。また、増幅に必要な機器と同じ機器で検出することが可能なので、容器を移動する必要すらない。よって、自動化も容易である。
【００３０】
なお、工程（III）でＴｍ値を決定することには、Ｔｍの温度を決定することだけでなく、Ｔｍのピークの高さを決定することを含む。ピークの高さにより、多型を有する塩基配列の存在比を決定することができる。なお、多型を有する塩基配列の存在比をより定量的に決定するには、下記に示すような検量線を作成し、それに基づいて存在比を決定することが好ましい。
【００３１】
多型を有する塩基配列の存在比を定量的に決定する方法について、野生型と特定の変異型の存在比の決定を例に挙げて以下に示す。ただし、この方法は一例にすぎず、多型を有する塩基配列の存在比の決定の仕方はこれに限定されない。
【００３２】
まず、野生型の核酸Ｗｔと変異型の核酸Ｍｔとの２種類の核酸の存在比を各々異ならせた複数の核酸混合物を作製し、複数の核酸混合物の各々について、融解曲線解析装置等を用いて融解曲線を得る。
図１（Ａ）に、ある１つの核酸混合物の温度と蛍光強度との関係で表された融解曲線、
及び図１（Ｂ）に温度と蛍光強度の微分値との関係で表された融解曲線（微分融解曲線ともいう）を示す。この微分融解曲線からピークを検出することにより、核酸Ｗｔの融解温度ＴｍW及び核酸Ｍｔの融解温度ＴｍMを検出して、ＴｍW及びＴｍMを含む温度範囲の各々を設定する。ＴｍWを含む温度範囲ΔＴWとしては、例えば、ＴｍWとＴｍMとの間で蛍光強度の微分値が最小となる温度を下限、蛍光強度のピークの裾野に対応する温度を上限とする温度範囲を設定することができる。また、ＴｍMを含む温度範囲ΔＴMとしては、例えば、ＴｍWとＴｍMとの間で蛍光強度の微分値が最小となる温度を上限、蛍光強度のピークの裾野に対応する温度を下限とする温度範囲を設定することができる。なお、温度範囲ΔＴW及び温度範囲ΔＴMは、同一の幅（例えば、１０℃）または異なる幅（例えば、温度範囲ΔＴWが１０℃、温度範囲ΔＴMが７℃）となるように設定することができる。また、温度範囲ΔＴW及び温度範囲ΔＴMは、それぞれの融解温度ＴｍからプラスＸ℃、マイナスＸ℃の幅（Ｘ℃は例えば１５℃以内、望ましくは１０℃以内）というように設定することができる。
【００３３】
次に、温度範囲ΔＴW及び温度範囲ΔＴMの各々について、微分融解曲線の温度範囲の下限に対応する点と上限に対応する点とを通る直線と微分融解曲線とで囲まれた面積（図１（Ｂ）の斜線部分）を求める。面積の求め方の一例として、具体的に以下のように求めることができる。温度Ｔにおける蛍光強度の微分値をｆ（Ｔ）とし、温度Ｔにおけるベース値をＢ（Ｔ）として、下記（１）式により求める。
面積Ｓ＝｛ｆ（Ｔs+1）−Ｂ（Ｔs+1）｝＋｛ｆ（Ｔs+2）−Ｂ（Ｔs+2）｝
＋・・・＋｛ｆ（Ｔe-1）−Ｂ（Ｔe-1）｝ ・・・（１）
ただし、Ｔsは各温度範囲における下限値、Ｔeは上限値である。また、各温度Ｔにおけるベース値Ｂ（Ｔ）は、下記（２）式により求まる値であり、蛍光強度の検出信号に含まれるバックグラウンドレベルを表すものである。このベース値を蛍光強度の微分値から減算することにより、蛍光強度の検出信号に含まれるバックグラウンドの影響を除去する。
Ｂ（Ｔ）＝ａ×（Ｔ−Ｔs）＋ｆ（Ｔs） ・・・（２）
ただし、ａ＝｛ｆ（Ｔe）−ｆ（Ｔs）｝／（Ｔe−Ｔs） である。
【００３４】
上記（１）式及び（２）式に従って、各核酸混合物について、温度範囲ΔＴWにおける面積ＳW及び温度範囲ΔＴWにおける面積ＳMを求め、面積比と各核酸混合物の存在比との関係を表す検量線を作成する。図２に、横軸に存在比（核酸混合物の総量に対する核酸Ｍｔの割合）をとり、縦軸に面積比（ＳM／ＳW）をとった検量線の一例を示す。なお、面積比はＳW／ＳMで定めてもよい。
実際の試料を用いて得られた融解曲線と微分融解曲線から面積比を算出し、上記のようにしてあらかじめ作成した検量線に基づいて、実際の試料中に含まれる多型を有する塩基配列の存在比を決定することができる。
【００３５】
本発明において、試料中のＤＮＡは、一本鎖ＤＮＡでもよいし二本鎖ＤＮＡであってもよい。前記ＤＮＡが二本鎖ＤＮＡの場合は、例えば、前記ハイブリダイズ工程に先立って、加熱により前記試料中の二本鎖ＤＮＡを解離させる工程を含むことが好ましい。二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離することによって、次のハイブリダイズ工程において、検出用プローブとのハイブリダイズが可能となる。
【００３６】
本発明において、前記試料中のＤＮＡに対する、本発明のプローブの添加割合（モル比）は、制限されないが、検出シグナルを十分に確保できることから、試料中のＤＮＡに対して１倍以下が好ましく、０．１倍以下がより好ましい。この際、試料中のＤＮＡとは、例えば、検出目的の多型が発生している検出対象ＤＮＡと前記多型が発生していない非検出対象ＤＮＡとの合計でもよいし、検出目的の多型が発生している検出対象配列を含む増幅産物と前記多型が発生していない非検出対象配列を含む増幅産物との合計でもよい。なお、試料中のＤＮＡにおける前記検出対象ＤＮＡの割合は、通常、不明であるが、結果的に、前記プローブの添加割合（モル比）は、検出対象ＤＮＡ（検出対象配列を含む増幅産物）に対して例えば、１０倍以下、５倍以下、または３倍以下である。また、その下限は特に制限されないが、例えば、０．００１倍以上、０．０１倍以上であり、または０．１倍以上である。
【００３７】
前記ＤＮＡに対する本発明のプローブの添加割合は、例えば、二本鎖ＤＮＡに対するモル比でもよいし、一本鎖ＤＮＡに対するモル比でもよい。
【００３８】
Ｔｍ値について説明する。二本鎖ＤＮＡを含む溶液を加熱していくと、２６０ｎｍにおける吸光度が上昇する。これは、二本鎖ＤＮＡにおける両鎖間の水素結合が加熱によってほどけ、一本鎖ＤＮＡに解離（ＤＮＡの融解）することが原因である。この現象に基づき、融解温度Ｔｍとは、一般に、吸光度が、吸光度全上昇分の５０％に達した時の温度と定義される。
【００３９】
本発明において、前記P5、P5'、P6、P6'、P7、P7'、P1、P1'、P2、P2'の蛍光標識オリゴヌクレオチドが相補的な塩基配列を有するＤＮＡとハイブリダイズした場合のＴｍ値と、非相補的なＤＮＡとハイブリダイズした場合のＴｍ値との差は、例えば５℃以上が挙げられる。前記Ｔｍ値の差が５℃以上であることで、上述の変異をより高感度に検出することができる。
また、前記Ｔｍ値の差としては、５℃以上、又は７℃以上等が挙げられる。
前記Ｔｍ値の差を大きくする方法としては、プローブ配列においてそのハイブリダイズする塩基配列に対してミスマッチとなる塩基を含める方法や、例えばＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ（１９９７）ｖｏｌ１５ ｐ．３３１−３３５に記載の方法などが挙げられる。
【００４０】
本発明において、Ｔｍ値を決定するための温度変化に伴うシグナル変動の測定は、前述のような原理から２６０ｎｍの吸光度測定により行うこともできるが、本発明のプローブに付加した標識のシグナルに基づくシグナルであってＤＮＡとプローブとのハイブリッド形成の状態に応じて変動するシグナルを測定することが好ましい。このため、本発明のプローブとして、前述の標識化プローブを使用することが好ましい。前記標識化プローブとしては、例えば、標的配列にハイブリダイズしないときに蛍光を発し、且つ標的配列にハイブリダイズしたときに蛍光強度が減少（消光）する蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブ、または標的配列にハイブリダイズしないときに蛍光を発し、且つ標的配列にハイブリダイズしたときに蛍光強度が増加する蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブが挙げられる。前者のようなプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖ＤＮＡ）を形成している際にはシグナルを示さないか、シグナルが弱いが、加熱によりプローブが遊離するとシグナルを示すようになるか、シグナルが増加する。また、後者のプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖ＤＮＡ）を形成することによってシグナルを示し、加熱によりプローブが遊離するとシグナルが減少（消失）する。したがって、この標識に基づくシグナルの変化をシグナル特有の条件（吸光度等）で検出することによって、前記２６０ｎｍの吸光度測定と同様に、融解の進行ならびにＴｍ値の決定を行うことができる。標識化プローブにおける標識化物質は、例えば、前述のとおりであるが蛍光色素標識化プローブが好ましい。
【００４１】
核酸増幅を行う際の鋳型となる核酸としては、核酸を含んでいればよく、特に制限されないが、例えば、血液、口腔粘膜懸濁液、爪や毛髪等の体細胞、生殖細胞、乳、腹水液、パラフィン包埋組織、胃液、胃洗浄液、腹膜液、羊水、細胞培養などの任意の生物学的起源に由来する又は由来しうるものである。鋳型となる核酸は、該起源から得られたままで直接的に、または該サンプルの特性を改変するために前処理した後で使用することができる。
【００４２】
以下、PCRを用いる場合を例として、さらに説明する。PCRに用いるプライマー対は、本発明プローブがハイブリダイゼーションできる領域が増幅されるようにする他は、通常のPCRにおけるプライマー対の設定方法と同様にして設定することができる。プライマーの長さおよびTm値は、通常には、12mer〜40merで40〜70℃、または16mer〜30merで55〜60℃である。プライマー対の各プライマーの長さは同一でなくてもよいが、両プライマーのTmはほぼ同一（通常には、相違が２℃以内）であることが好ましい。なお、Tm値は最近接塩基対(Nearest Neighbor)法により算出した値である。プライマー対の例としては、配列番号１６，１７に示す塩基配列を有するプライマーからなるものが挙げられる。
【００４３】
PCRは、本発明で使用される本発明プローブの存在下で行うことが好ましい。これにより、増幅反応終了後に増幅産物を精製などすることなくTm解析を行うことができる。用いるプローブに応じて、プライマーのTm値やPCRの反応条件を調整することは当業者であれば容易である。
【００４４】
Tm解析の結果に基づくNPM1遺伝子のexon12の変異の検出は通常の方法に従って行うことができる。本発明における検出とは、変異の有無の検出および多型を有する核酸の存在比の決定を包含する。
【００４５】
なお、本発明のプローブおよび多型検出方法により、NPM1遺伝子のexon12の変異を検出することができ、検出された変異の有無に基づいて、急性骨髄性白血病のなりやすさ、病態および/または予後を診断することができる。
【００４６】
＜２＞本発明キット
本発明キットは、本発明の検出方法に用いるためのキットである。このキットは、本発明の多型検出用プローブを含むことを特徴とする。なお、本発明のキットは、急性骨髄性白血病のかかりやすさ、病態および/予後を判断するのにも使用できる。
プローブについては、本発明プローブに関し、上記に説明した通りである。
【００４７】
本発明検出キットは、プローブの他に、本発明の検出方法における核酸増幅を行うのに必要とされる試薬類、特にDNAポリメラーゼを用いる増幅のための上述のプライマーをさらに含んでいてもよい。
本発明検出キットにおいてプローブ、プライマーおよびその他の試薬類は、別個に収容されていてもよいし、それらの一部が混合物とされていてもよい。
【００４８】
本発明において、検出対象となる試料中の試料核酸、多型検出用プローブ又はプライマーの個々の配列に関して、これら互いの相補的な関係に基づいて記述された事項は、特に断らない限り、それぞれの配列と、各配列に対して相補的な配列とについても適用される。各配列に対して相補的な当該配列について本発明の事項を適用する際には、当該相補的な配列が認識する配列は、当業者にとっての技術常識の範囲内で、対応する本明細書に記載された配列に相補的な配列に、明細書全体を読み替えるものとする。
【００４９】
以下に、本発明を実施例により具体的に説明する。だだし、これらの実施例は例示であり、これらに限定されない。
【実施例】
【００５０】
実施例１（相補鎖オリゴヌクレオチドを検出対象とし、P1,P2プローブを用いる場合）
NPM1遺伝子のexon12の塩基配列（配列番号１（野生型））に基づき、表２に示す、末端部にCを有するプローブを設計した。表２中、プローブの位置は、配列番号１に示す塩基配列における塩基番号を示す。３’末端のPは、リン酸化されていることを示す。TAMRAによる標識は、常法に従って行った。
また、検出対象として使用した相補鎖オリゴヌクレオチドの配列を表２に示す。表２中、オリゴヌクレオチドの位置は、配列番号１に示す塩基配列における塩基番号を示す。
【００５１】
【表２】
【００５２】
NPM1遺伝子のExon12領域の変異を2つのプローブで検出するために設計したプローブの性能を確認するため、NPM1 exon12領域の野生型配列と各種変異配列の相補鎖を準備し、プローブと相補鎖オリゴヌクレオチドを含む以下の試薬溶液を調製した。
プローブ3T-NPM1-e12-R1に対して相補鎖オリゴヌクレオチドは WT、mt type A、B、D、または7を、プローブ5T-NPM1-e12-R2に対して相補鎖オリゴヌクレオチドは WT、mt type Q、10、E、または6を添加した。
【００５３】
【表３】
【００５４】
Tm解析の条件は下記の通りである。Tm解析における励起波長および検出波長は、それぞれ520〜555 nmおよび585〜700 nm（TAMRA）であった。
調製した試薬溶液をi-densy 反応チューブに添加し、試薬が蒸発しないようにミネラルオイル30μLを重層し、以下の反応条件でTm解析を実施してTAMRAの蛍光値の変化量を解析した。
【００５５】
【表４】
【００５６】
表２のプローブを用いてTm解析を行った結果、3T-NPM1-e12-R1（配列番号４）については、ＴＡＭＲＡのピークが、６５℃（WT）、５９℃（タイプA）、６０℃（タイプB）、６０℃（タイプD）、５５℃（タイプ７）付近で見られた（図４〜８）。
このように、WT、各変異で検出ピークが確認できた。また、WTと各変異のTm値の差（ΔTm）は5〜10℃であり、変異を検出するために十分なTm値の差があることが分かり、変異を検出することに適したプローブであることが分かった。
結果を表５に示す。
【００５７】
【表５】
【００５８】
また、5T-NPM1-e12-R2（配列番号５）については、ＴＡＭＲＡのピークが、６４℃（WT）、６２℃（タイプQ）、５２℃（タイプ１０）、５２℃（タイプE）、４９℃（タイプ６）付近で見られた（図９〜１３）。
このように、WT、各変異で検出ピークが確認できた。また、WTと変異タイプQのTm値の差（ΔTm）は2℃であったが、他の変異タイプでは十分なTm値の差があることが分かり、変異を検出することに適したプローブであることが分かった。
結果を表６に示す。
【００５９】
【表６】
【００６０】
実施例１の結果より、Ｐ１（配列番号４）およびＰ２（配列番号５）のプローブを用いたとき、NPM1遺伝子のexon12変異の多型（タイプA、タイプB、タイプD、タイプ７、タイプ１０、タイプE、タイプ６）について、Tm解析で分析可能な蛍光強度の変化が認められた。すなわち、変異型は、野生型のピークに加えて、他のピークを有するものであり、固有の蛍光強度の変化量のパターンの変化が存在する。従って、Ｐ１（配列番号４）およびＰ２（配列番号５）のプローブを用いることにより、NPM1遺伝子のexon12変異の多型を検出することができる。
【００６１】
比較例１（相補鎖オリゴヌクレオチドを検出対象とする場合）
NPM1遺伝子のExon12領域の変異を1つのプローブで検出するために設計したプローブの性能を確認するため、NPM1 exon12領域の野生型配列と各種変異配列の相補鎖を準備し、プローブと相補鎖を含む以下の試薬溶液を調製した。
試薬溶液は実施例1と同様とし、プローブのみ以下のプローブを用いた。またTm解析も実施例1と同様に実施した。
また、変異の検出のために使用したプローブの配列を表７に示す。表７中、プローブの位置は、配列番号１に示す塩基配列における塩基番号を示す。
【００６２】
【表７】
【００６３】
WTやいくつかの変異タイプでは問題なく検出できたが、変異タイプA、D、7では検出ピークが確認できず、様々な変異の検出に適していないプローブであることが分かった（図１４−２２）。
結果を表８に示す。
【００６４】
【表８】
【００６５】
実施例２（血液検体または人工核酸プラスミドを検出対象として用いる場合）
核酸増幅した後、Tm解析による検出が可能であるかを検討するため、血液検体を用いて反応を行った。また、NPM1遺伝子のexon12変異がどの程度混ざった検体まで検出が可能であるか、野生型配列と変異配列（AタイプとEタイプ）の人工核酸プラスミドの混合比率を振り、その検出波形を確認した。人工核酸はpUCプラスミドベクターにNPM1遺伝子のexon12周辺配列の野生型配列（590bp、配列番号1）、変異タイプA（594bp、配列番号2）、変異タイプE（594bp、配列番号3）を挿入したプラスミドを用いた。
全自動SNPｓ検査装置（商品名i-densy IS-5310、アークレイ社製）を用いてPCR及びTm解析を行った。PCRおよびTm解析の条件は下記の表１１の通りである。
また、変異の検出に使用したプローブおよびプライマーの配列を表１２に示す。表１２中、プローブおよびプライマーの位置は、配列番号１に示す塩基配列における塩基番号を示す。
Tm解析における励起波長および検出波長は、それぞれ420〜485 nmおよび520〜555 nm（BODIPY FL）、または、それぞれ520〜555 nmおよび585〜700 nm（TAMRA）とした。
試薬溶液は以下の通りであった。
【００６６】
【表９】
【００６７】
＜全血の調製＞
全血10μlを希釈液(1) 70μlに加え、よく混合した後、この混合液10μlを希釈液(2)
70μlに加えた。この混合液17μlを95℃で10分加熱して4μlの前処理済全血を得た。これを1 testあたりのtemplateとして使用した。
【００６８】
【表１０】
【００６９】
＜人工核酸プラスミド＞
任意の割合で野生型と変異型を混合した500コピー/μｌの人工核酸プラスミドを４μｌ使用した。
【００７０】
【表１１】
【００７１】
【表１２】
【００７２】
血液検体を用いてi-densyで測定した結果、問題なく検出ピークが確認できた（図２３）。
人工核酸プラスミドを用いた検出波形を確認したところ、BODIPY FLは63℃、TAMRAも63℃に野生型の検出ピークが確認できた（図２４）。
変異タイプAの場合、BODIPY FLの56-57℃に検出ピークが確認され（図２５の左図）、変異タイプEの場合、TAMRAの50-51℃に検出ピークが確認できた（図２９の右図）。任意に割合で混合させたプラスミドの場合、変異タイプAとEの両方で10%の変異配列が混合された状態でも変異の検出ピークが確認できた（図２８の左図、図３２の右図）。
【００７３】
実施例２の結果より、Ｐ１（配列番号４）およびＰ２（配列番号５）のプローブを用いたとき、血液検体を用いた場合、そして、１０％の変異配列が混合される場合でも、NPM1遺伝子のexon12変異の多型（タイプA、タイプE）について、Tm解析で解析の可能な蛍光強度の変化が認められた。従って、Ｐ１（配列番号４）およびＰ２（配列番号５）のプローブを用いることにより、NPM1遺伝子のexon12変異の多型を検出することができる。
【００７４】
比較例２
比較例として、3T-NPM1-e12-R3プローブを用いた。以下の溶液を用いて核酸増幅した後、Tm解析による検出が可能であるかを検討した。プライマー配列や反応条件は実施例2と同様とした。プラスミド溶液（500コピー/μL）を4μL反応チューブに添加して、以下の反応条件でi-densyで反応した。Tm解析ではTAMRAの蛍光値の変化量を解析した。
【００７５】
【表１３】
【００７６】
【表１４】
【００７７】
血液を用いた場合と人工核酸プラスミドの野生型と変異タイプEを検体として用いた場合は、問題なく検出ピークが得られた（図３３，３４，３７）。しかしながら、変異タイプA100%を検体とした場合は検出ピークが確認できなかった（図３５）。さらに、変異タイプAまたはEを20%混合させた人工核酸を反応させた場合、変異タイプの検出ピークが確認できず、野生型の検出ピークしか確認できなかった（図３６，３８）。これらの結果から、実施例2の結果と比較して、3T-NPM1-e12-R3のプローブはNPM1のexon12の変異の検出に適していないと判断される。
【００７８】
実施例３（相補鎖オリゴヌクレオチドを検出対象とし、P5,P6,P7プローブを用いる場合）
NPM1遺伝子のexon12変異は多種の配列が報告されているが、そのほとんどはタイプA、B、Dである（表1参照）。そのためタイプA、B、Dが明確に検出することが、NPM1遺伝子のexon12変異検出用プローブとして有用である。
NPM1遺伝子のexon12の塩基配列（配列番号２（変異タイプA））に基づき、表１５に示す、末端部にCを有するプローブを設計した。表１５中、プローブの位置は、配列番号２に示す塩基配列における塩基番号を示す。Pacific Blue, TAMRAおよびPODIPY FLによる標識は、常法に従って行った。
試薬溶液は実施例1と同様とし、プローブのみ以下のプローブを用いた。またTm解析も実施例1と同様に実施した。
また、検出対象として使用した相補鎖オリゴヌクレオチドの配列を表１に記載されており、表1に記載の４の部分に挿入変異を持つ配列である。
【００７９】
【表１５】
【００８０】
Tm解析における励起波長および検出波長は、それぞれ365〜415 nmおよび445〜480 nm（Pacific Blue）、520〜555 nmおよび585〜700 nm（TAMRA）、420〜485 nmおよび520〜555 nm（BODIPY FL）であった。
【００８１】
上記に示したプローブを用いて、実施例1と同様にTm解析による検出ピーク（Tm値）の確認を行った。また、野生型の相補鎖に対するTm値と各変異配列に対するTm値の差を確認した。
3PB-NPM1-mtA-R4（配列番号５６）については、WTと変異タイプM、N、Gm、１２、IとのTm値の差（ΔTm）は４℃以下であったが、他の変異タイプでは十分なTm値の差があることが分かり、変異を検出することに適したプローブであることが分かった。
3T-NPM1-mtB-R5（配列番号５７）については、WTと変異タイプM、N、１２とのTm値の差（ΔTm）は４℃以下であったが、他の変異タイプでは十分なTm値の差があることが分かり、変異を検出することに適したプローブであることが分かった。
3FL-NPM1-mtD-R6（配列番号５８）については、WTと変異タイプM、N、３、１２、IとのTm値の差（ΔTm）は４℃以下であったが、他の変異タイプでは十分なTm値の差があることが分かり、変異を検出することに適したプローブであることが分かった。
結果を表１６に示す。
【００８２】
【表１６】
【００８３】
mtA-R4プローブは、WT配列（14mer）に加えてタイプAに特有の「ｔｃｔｇ」配列を4mer挿入した塩基配列に相補的なプローブである。mtA-R4プローブは、タイプA配列と18mer一致、タイプB配列と16mer一致、タイプDと配列17mer一致するため、WT相補鎖の（14mer一致）よりも高いTm値（高い親和性）が得られ、これら変異配列を検出することができる。
同様に、タイプB配列に相補的なmtB-R5プローブは、タイプA配列と16mer一致、タイプB配列と18mer一致、タイプD配列と17mer一致し、WT相補鎖よりも高いTm値が得られる。
同様に、タイプD配列に相補的なmtD-R6プローブは、タイプA配列と17mer一致、タイプB配列と17mer一致、タイプD配列と18mer一致し、WT相補鎖よりも高いTm値が得られる。
【００８４】
実施例４（相補鎖オリゴヌクレオチドを検出対象として検出感度を確認する場合）
NPM1遺伝子のexon12変異のタイプAがどの程度混ざった検体まで検出が可能であるか、野生型配列と変異配列の人工核酸プラスミドの混合比率を振り、その検出波形を確認した。人工核酸はpUCプラスミドベクターにNPM1遺伝子のexon12周辺配列の野生型配列（590bp、配列番号1）、変異タイプA（594bp、配列番号2）を挿入したプラスミドを用いた。
【００８５】
【表１７】
【００８６】
PCRおよびTm解析の条件は実施例２の表１１と同様とした。Tm解析における励起波長および検出波長は、それぞれ365〜415 nmおよび445〜480 nm（Pacific Blue）、520〜555 nmおよび585〜700 nm（TAMRA）、420〜485 nmおよび520〜555 nm（BODIPY FL）であった。
【００８７】
表１５のプローブを用いてTm解析を行った結果、mtA-R4プローブは、mtA 10%や3%の時に61-62℃に（図３９）、mtB-R5プローブは、mtA 10%の時に53℃に（図４０）、mtD-R6プローブは、mtA 10%や3%の時に59-60℃に（図４１）、変異タイプAと考えられる検出ピークが確認できた。
【００８８】
実施例４の結果より、mtA-R4（配列番号５６）、mtB-R5（配列番号５７）、mtD-R6（配列番号５８）のプローブを用いたとき、NPM1遺伝子のexon12変異の多型（タイプA）について、Tm解析で分析可能な蛍光強度の変化が認められた。すなわち、変異型は、野生型のピークに加えて、他のピークを有するものであり、固有の蛍光強度の変化量のパターンの変化が存在する。従って、mtA-R4（配列番号５６）、mtB-R5（配列番号５７）、mtD-R6（配列番号５８）のプローブを用いることにより、NPM1遺伝子のexon12変異の多型（タイプA）が少量混在する検体から当該変異を高い感度で検出可能であることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【００８９】
本発明のプローブを用いることより、急性骨髄性白血病のかかりやすさ、病態および/または予後を診断することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
NPM1遺伝子のexon12の変異を検出するためのプローブであって、下記P5、P5'、P6、P6'、P7、P7'、P1、P1'、P2およびP2'から選択される少なくとも１種の蛍光標識オリゴヌクレオチドからなることを特徴とする多型検出用プローブ。
(P5)配列番号2に示す塩基配列において、塩基番号145〜156を含む12〜50塩基長の塩基配列に相補的な配列またはそれに相同な配列を有し、塩基番号145に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
(P5')配列番号2に示す塩基配列において、塩基番号145〜156を含む12〜50塩基長の塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、塩基番号145に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
(P6)配列番号2に示す塩基配列において、塩基番号145〜156を含む12〜50塩基長の塩基配列に相補的な配列またはそれに相同な配列を有し、塩基番号153番目に対応する塩基がグアニンであり、塩基番号145に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
(P6')配列番号2に示す塩基配列において、塩基番号145〜156を含む12〜50塩基長の塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、塩基番号153番目に対応する塩基がグアニンであり、塩基番号145に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
(P7)配列番号2に示す塩基配列において、塩基番号145〜156を含む12〜50塩基長の塩基配列に相補的な配列またはそれに相同な配列を有し、塩基番号153番目に対応する塩基がグアニンであり、塩基番号154番目に対応する塩基がチミンであり、塩基番号145に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
(P7')配列番号2に示す塩基配列において、塩基番号145〜156を含む12〜50塩基長の塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、塩基番号153番目に対応する塩基がグアニンであり、塩基番号154番目に対応する塩基がチミンであり、塩基番号145に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
(P1)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号135〜150を含む16〜50塩基長の塩基配列に相補的な配列またはそれに相同な配列であり、塩基番号135に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
(P1')配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号135〜150を含む16〜50塩基長の塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、塩基番号135に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
(P2)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号164〜182を含む19〜50塩基長の塩基配列に相補的な配列またはそれに相同な配列であり、塩基番号182に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、および
(P2')配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号164〜182を含む19〜50塩基長の塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、塩基番号182に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
P5、P5'、P6、P6'、P7およびP7'のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号145に対応する塩基を3'末端から数えて1〜3番目の位置に有し、
P1およびP1'のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号135に対応する塩基を3'末端から数えて1〜3番目の位置に有し、
P2およびP2'のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号182に対応する塩基を5'末端から数えて1〜3番目の位置に有する、請求項1記載のプローブ。
【請求項３】
P5、P5'、P6、P6'、P7およびP7'のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号145に対応する塩基を3'末端に有し、
P1およびP1'のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号135に対応する塩基を3'末端に有し、
P2およびP2'のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号182に対応する塩基を5'末端に有する、請求項1記載のプローブ。
【請求項４】
P1およびP1'のオリゴヌクレオチドは、塩基番号153-156のいずれかの塩基に対応する塩基を5'末端とし、蛍光色素で標識された塩基番号135に対応する塩基を3'末端に有し、
P2およびP2'のオリゴヌクレオチドは、塩基番号153-156のいずれかの塩基に対応する塩基を3'末端とし、蛍光色素で標識された塩基番号182に対応する塩基を5'末端に有する、請求項1記載のプローブ。
【請求項５】
P5、P5'、P6、P6'、P7およびP7'のオリゴヌクレオチドは、塩基番号162を5'末端とし、蛍光色素で標識された塩基番号145に対応する塩基を3'末端に有し、
P1およびP1'のオリゴヌクレオチドは、塩基番号155を5'末端とし、蛍光色素で標識された塩基番号135に対応する塩基を3'末端に有し、
P2およびP2'のオリゴヌクレオチドは、塩基番号156を3'末端とし、蛍光色素で標識された塩基番号182に対応する塩基を5'末端に有する、請求項1記載のプローブ。
【請求項６】
前記オリゴヌクレオチドは、標的配列にハイブリダイズしないときに蛍光を発し、且つ標的配列にハイブリダイズしたときに蛍光強度が減少するかまたは増加する、請求項1〜5のいずれか１項記載のプローブ。
【請求項７】
前記オリゴヌクレオチドが、標的配列にハイブリダイズしないときに蛍光を発し、標的配列にハイブリダイズしたときに蛍光強度が減少する、請求項6記載のプローブ。
【請求項８】
前記プローブが、融解曲線分析用のプローブである、請求項1〜7のいずれか１項に記載のプローブ。
【請求項９】
P5、P5'、P6、P6'、P7およびP7'のオリゴヌクレオチドの塩基長が12〜35で、P1およびP1'のオリゴヌクレオチドの塩基長が16〜35で、P2およびP2'のオリゴヌクレオチドが19〜35である、請求項1〜8のいずれか１項記載の多型検出用プローブ。
【請求項１０】
NPM1遺伝子のexon12における多型の検出方法であって、請求項1〜9のいずれか１項に記載のプローブを少なくとも１種用いることを特徴とする方法。
【請求項１１】
NPM1遺伝子のexon12における多型の検出方法であって、下記工程（Ｉ）〜（IＶ）を含むことを特徴とする方法。
（Ｉ）核酸を含有する試料に、請求項1〜9のいずれか１項に記載のプローブを添加して前記核酸に前記プローブをハイブリダイズさせる工程、
（ＩＩ）温度を変化させて前記核酸と前記プローブとのハイブリッド形成体を解離させ、ハイブリッド形成体の解離に基づくシグナルの変動を測定する工程、
（ＩＩＩ）前記シグナルの変動を解析して前記試料中の一本鎖核酸におけるＴｍ値を検出する工程、および
（ＩＶ）前記Ｔｍ値から前記試料中の一本鎖核酸における、目的の多型の有無または多型を有する一本鎖核酸の存在比を決定する工程。
【請求項１２】
さらに、（Ｉ）の工程の前または（Ｉ）の工程と同時にDNAを増幅することを含む、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
請求項10〜12のいずれか１項に記載の方法により、NPM1遺伝子のexon12における多型を検
出する工程、および多型の有無を決定する工程を含む、急性骨髄性白血病のかかりやすさ、病態および/または予後を分析する方法。
【請求項１４】
請求項1〜9のいずれか１項に記載のプローブを含む、NPM1遺伝子における多型を検出するための試薬キット。
【請求項１５】
さらに、NPM1遺伝子の配列番号1に示す塩基配列におけるP5、P5'、P6、P6'、P7、P7'P1、P1'、P2、P2'のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする配列を含む領域を増幅するためのプライマーを含む、請求項14に記載の試薬キット。
【請求項１６】
前記プライマーが、下記P3およびP4またはP3'およびP4'から選択される多型検出用プライマーである、請求項１４または１５に記載の試薬キット。
(P3)106番目の塩基Tを3'末端とし配列番号1に相同的な10〜50塩基のオリゴヌクレオチド、および
(P4)205番目の塩基Tを3'末端とし配列番号1の相補鎖に相同性を有する10〜50塩基のオリゴヌクレオチド、ならびに
(P3')106番目の塩基Tを3'末端とし配列番号1の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有する10〜50塩基のオリゴヌクレオチド、および
(P4')205番目の塩基Tを3'末端とし配列番号1の塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有する10〜50塩基のオリゴヌクレオチド。
【請求項１】
NPM1遺伝子のexon12の変異を検出するためのプローブであって、下記P5、P5'、P6、P6'、P7、P7'、P1、P1'、P2およびP2'から選択される少なくとも１種の蛍光標識オリゴヌクレオチドからなることを特徴とする多型検出用プローブ。
(P5)配列番号2に示す塩基配列において、塩基番号145〜156を含む12〜50塩基長の塩基配列に相補的な配列またはそれに相同な配列を有し、塩基番号145に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
(P5')配列番号2に示す塩基配列において、塩基番号145〜156を含む12〜50塩基長の塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、塩基番号145に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
(P6)配列番号2に示す塩基配列において、塩基番号145〜156を含む12〜50塩基長の塩基配列に相補的な配列またはそれに相同な配列を有し、塩基番号153番目に対応する塩基がグアニンであり、塩基番号145に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
(P6')配列番号2に示す塩基配列において、塩基番号145〜156を含む12〜50塩基長の塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、塩基番号153番目に対応する塩基がグアニンであり、塩基番号145に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
(P7)配列番号2に示す塩基配列において、塩基番号145〜156を含む12〜50塩基長の塩基配列に相補的な配列またはそれに相同な配列を有し、塩基番号153番目に対応する塩基がグアニンであり、塩基番号154番目に対応する塩基がチミンであり、塩基番号145に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
(P7')配列番号2に示す塩基配列において、塩基番号145〜156を含む12〜50塩基長の塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、塩基番号153番目に対応する塩基がグアニンであり、塩基番号154番目に対応する塩基がチミンであり、塩基番号145に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
(P1)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号135〜150を含む16〜50塩基長の塩基配列に相補的な配列またはそれに相同な配列であり、塩基番号135に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
(P1')配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号135〜150を含む16〜50塩基長の塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、塩基番号135に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
(P2)配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号164〜182を含む19〜50塩基長の塩基配列に相補的な配列またはそれに相同な配列であり、塩基番号182に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、および
(P2')配列番号1に示す塩基配列において、塩基番号164〜182を含む19〜50塩基長の塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、塩基番号182に対応する塩基がシトシンであり蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
P5、P5'、P6、P6'、P7およびP7'のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号145に対応する塩基を3'末端から数えて1〜3番目の位置に有し、
P1およびP1'のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号135に対応する塩基を3'末端から数えて1〜3番目の位置に有し、
P2およびP2'のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号182に対応する塩基を5'末端から数えて1〜3番目の位置に有する、請求項1記載のプローブ。
【請求項３】
P5、P5'、P6、P6'、P7およびP7'のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号145に対応する塩基を3'末端に有し、
P1およびP1'のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号135に対応する塩基を3'末端に有し、
P2およびP2'のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基番号182に対応する塩基を5'末端に有する、請求項1記載のプローブ。
【請求項４】
P1およびP1'のオリゴヌクレオチドは、塩基番号153-156のいずれかの塩基に対応する塩基を5'末端とし、蛍光色素で標識された塩基番号135に対応する塩基を3'末端に有し、
P2およびP2'のオリゴヌクレオチドは、塩基番号153-156のいずれかの塩基に対応する塩基を3'末端とし、蛍光色素で標識された塩基番号182に対応する塩基を5'末端に有する、請求項1記載のプローブ。
【請求項５】
P5、P5'、P6、P6'、P7およびP7'のオリゴヌクレオチドは、塩基番号162を5'末端とし、蛍光色素で標識された塩基番号145に対応する塩基を3'末端に有し、
P1およびP1'のオリゴヌクレオチドは、塩基番号155を5'末端とし、蛍光色素で標識された塩基番号135に対応する塩基を3'末端に有し、
P2およびP2'のオリゴヌクレオチドは、塩基番号156を3'末端とし、蛍光色素で標識された塩基番号182に対応する塩基を5'末端に有する、請求項1記載のプローブ。
【請求項６】
前記オリゴヌクレオチドは、標的配列にハイブリダイズしないときに蛍光を発し、且つ標的配列にハイブリダイズしたときに蛍光強度が減少するかまたは増加する、請求項1〜5のいずれか１項記載のプローブ。
【請求項７】
前記オリゴヌクレオチドが、標的配列にハイブリダイズしないときに蛍光を発し、標的配列にハイブリダイズしたときに蛍光強度が減少する、請求項6記載のプローブ。
【請求項８】
前記プローブが、融解曲線分析用のプローブである、請求項1〜7のいずれか１項に記載のプローブ。
【請求項９】
P5、P5'、P6、P6'、P7およびP7'のオリゴヌクレオチドの塩基長が12〜35で、P1およびP1'のオリゴヌクレオチドの塩基長が16〜35で、P2およびP2'のオリゴヌクレオチドが19〜35である、請求項1〜8のいずれか１項記載の多型検出用プローブ。
【請求項１０】
NPM1遺伝子のexon12における多型の検出方法であって、請求項1〜9のいずれか１項に記載のプローブを少なくとも１種用いることを特徴とする方法。
【請求項１１】
NPM1遺伝子のexon12における多型の検出方法であって、下記工程（Ｉ）〜（IＶ）を含むことを特徴とする方法。
（Ｉ）核酸を含有する試料に、請求項1〜9のいずれか１項に記載のプローブを添加して前記核酸に前記プローブをハイブリダイズさせる工程、
（ＩＩ）温度を変化させて前記核酸と前記プローブとのハイブリッド形成体を解離させ、ハイブリッド形成体の解離に基づくシグナルの変動を測定する工程、
（ＩＩＩ）前記シグナルの変動を解析して前記試料中の一本鎖核酸におけるＴｍ値を検出する工程、および
（ＩＶ）前記Ｔｍ値から前記試料中の一本鎖核酸における、目的の多型の有無または多型を有する一本鎖核酸の存在比を決定する工程。
【請求項１２】
さらに、（Ｉ）の工程の前または（Ｉ）の工程と同時にDNAを増幅することを含む、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
請求項10〜12のいずれか１項に記載の方法により、NPM1遺伝子のexon12における多型を検
出する工程、および多型の有無を決定する工程を含む、急性骨髄性白血病のかかりやすさ、病態および/または予後を分析する方法。
【請求項１４】
請求項1〜9のいずれか１項に記載のプローブを含む、NPM1遺伝子における多型を検出するための試薬キット。
【請求項１５】
さらに、NPM1遺伝子の配列番号1に示す塩基配列におけるP5、P5'、P6、P6'、P7、P7'P1、P1'、P2、P2'のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする配列を含む領域を増幅するためのプライマーを含む、請求項14に記載の試薬キット。
【請求項１６】
前記プライマーが、下記P3およびP4またはP3'およびP4'から選択される多型検出用プライマーである、請求項１４または１５に記載の試薬キット。
(P3)106番目の塩基Tを3'末端とし配列番号1に相同的な10〜50塩基のオリゴヌクレオチド、および
(P4)205番目の塩基Tを3'末端とし配列番号1の相補鎖に相同性を有する10〜50塩基のオリゴヌクレオチド、ならびに
(P3')106番目の塩基Tを3'末端とし配列番号1の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有する10〜50塩基のオリゴヌクレオチド、および
(P4')205番目の塩基Tを3'末端とし配列番号1の塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有する10〜50塩基のオリゴヌクレオチド。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１】
【公開番号】特開２０１２−２３５７７７（Ｐ２０１２−２３５７７７Ａ）
【公開日】平成２４年１２月６日（２０１２．１２．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−１０２６２６（Ｐ２０１２−１０２６２６）
【出願日】平成２４年４月２７日（２０１２．４．２７）
【出願人】（０００１４１８９７）アークレイ株式会社 (288)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１２月６日（２０１２．１２．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年４月２７日（２０１２．４．２７）
【出願人】（０００１４１８９７）アークレイ株式会社 (288)
【Ｆターム（参考）】
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