ＮＴ−プロＥＴ−１を用いる診断およびリスク層別化
本発明は、心疾患ならびに気道および肺の疾患の診断および／またはリスク層別化のための方法に関する。前記方法によれば、遊離断片のＮ末端プロエンドセリン（ＮＴ−プロＥＴ−１；図１によるプレプロＥＴのＡＳ１８〜５２）、またはその断片および部分ペプチドの１つまたは複数が判定される。本発明の別の目的は、心疾患ならびに気道および肺の疾患のリスク層別化のための方法であって、少なくとも１つのマーカー、またはマーカーの組合せは、インビトロ診断において十分な感受性および特異性を有する方法を提供することである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心疾患ならびに気道および肺の疾患の診断および／またはリスク層別化のための方法であって、遊離断片のＮ末端プロエンドセリン（ＮＴ−プロＥＴ−１；図１によるプレプロＥＴのＡＳ１８〜５２）、またはその断片および部分ペプチドの判定が実施される方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
適切な療法を適用するために、臨床的な決定をする必要性とともに、心疾患ならびに／または気道および肺の疾患の早期診断および区別が緊急治療室において以前から必要である。現況技術では、前駆体タンパク質ビッグ−ＥＴ１（３８ＡＳ、図１を参照されたい）を含めた、成熟ＥＴ−１（２１ＡＳ）が、診断目的で記載されている（非特許文献１；非特許文献２）。さらに、敗血症の診断のためのエンドセリンプロホルモンが、本出願人によって、ＷＯ００／２２４３９およびＥＰ１１２１６００Ｂ１に開示されていることが知られている。
【０００３】
さらに、エンドセリン−１またはビッグ−エンドセリン−１含量を間接的に判定するために、心血管疾患を診断するための、プレプロエンドセリンのアミノ酸配列９３〜２１２または１６８〜２１２を有する、Ｃ末端プロエンドセリン断片（ＣＴ−プロＥＴ−１）（図１、配列番号１）が、ＥＰ１５６４５５８Ｂ１に記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第００／２２４３９号パンフレット
【特許文献２】欧州特許第１１２１６００号明細書
【特許文献３】欧州特許第１５６４５５８号明細書
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｒｏｓｓｉ ＧＰ、Ｓｅｃｃｉａ ＴＭ、Ａｌｂｅｒｔｉｎ Ｇ、Ｐｅｓｓｉｎａ ＡＣ． Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ： ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｕｓｅ． Ａｎｎ Ｃｌｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２０００年；３７（第５部）：６０８〜２６．２
【非特許文献２】Ａｕｂｉｎ Ｐ、Ｌｅ Ｂｒｕｎ Ｇ、Ｍｏｌｄｏｖａｎ Ｆ、Ｖｉｌｌｅｔｔｅ ＪＭ、Ｃｒｅｍｉｎｏｎ Ｃ、Ｄｕｍａｓ Ｊら、Ｓａｎｄｗｉｃｈ−ｔｙｐｅ ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｆｏｒ ｂｉｇ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−Ｉ ｉｎ ｐｌａｓｍａ： ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｈｅａｌｔｈｙ ｈｕｍａｎ ｓｕｂｊｅｃｔｓ ｕｎａｆｆｅｃｔｅｄ ｂｙ ｓｅｘ ｏｒ ｐｏｓｔｕｒｅ． Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ １９９７年；４３巻：６４〜７０頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、これまで知られているマーカーを使用する、既知の診断方法の不利点は続いており、リスク患者の早期および包括的な検出は、必ずしも十分に成功しているとは限らず、したがって、リスク層別化は十分ではない。
【０００７】
したがって、本発明の目的は、リスク患者の検出の改善を可能にする、心疾患ならびに気道および肺の疾患のリスク層別化のための方法を開発することである。
【０００８】
さらに、従来技術において、一般に、マーカーの感受性および／または特異性が不十分であることは不利である。
【０００９】
したがって、別の目的は、心疾患ならびに気道および肺の疾患のリスク層別化のための方法であって、少なくとも１つのマーカー、またはマーカーの組合せは、インビトロ診断において十分な感受性および特異性を有する方法を提供することである。
【００１０】
したがって、本発明の目的は、心疾患ならびに／または気道および肺の疾患の診断および／またはリスク層別化のための方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
この目的は、心疾患ならびに気道および肺の疾患の診断およびリスク層別化のための方法であって、Ｎ末端プロエンドセリン（手短には「ＮＴ−プロＥＴ−１」）またはその断片および部分ペプチドの判定が実施される方法（以後、本発明による方法）によって実現される。
【００１２】
意外にも、ＮＴ−プロＥＴ−１、またはその断片および部分ペプチドは、心疾患ならびに気道および肺の疾患に診断に関して高い感受性および特異性を示す（実施例および図面を参照されたい）。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】プレプロエンドセリン−１のアミノ酸配列（ＡＳ）を示す図であり、セクション１〜１７はシグナルペプチドであり、１８〜５２はＮＴ−プロＥＴ−１であり、５３〜７３は成熟ＥＴ−１であり、５３〜９０はビッグ−ＥＴ−１（または７４〜９０）である。
【図２】心不全の重症度との関数としてのＮＴ−プロＥＴ−１濃度のグラフである。健康な対照患者（ｎ＝２００）、およびＮＹＨＡ重症度スコアに基づいて分類した心不全患者（ＮＹＨＡ Ｉ：ｎ＝２２、ＮＹＨＡ ＩＩ：ｎ＝１２６、ＮＹＨＡ ＩＩＩ：ｎ＝１３２、ＮＹＨＡ ４：ｎ＝１７）の平均値（＋標準誤差）を例示してある。
【図３】肺炎の重症度の関数としてのＮＴ−プロＥＴ−１濃度のグラフである。健康な対照患者（ｎ＝２００）、および肺炎重症度指数に基づいて分類した肺炎患者（ＰＳＩ Ｉ：ｎ＝３６、ＰＳＩ ＩＩ：ｎ＝４４、ＰＳＩ ＩＩＩ：ｎ＝２５、ＰＳＩ ＩＶ：ｎ＝１９、ＰＳＩ Ｖ：ｎ＝１８）の平均値（＋標準誤差）を例示してある。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明による用語「心疾患」は、特に、直ちに生命を危うくする、冠動脈性心疾患の「急性冠状動脈症候群」およびその様々な段階を含む。これは特に、救急医療、具体的には、急性心筋梗塞および／または狭心症、およびまた突然の心臓死に適用する。ＷＨＯ判定基準（ＷＨＯ（１９７９年）：Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ａｎｄ ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｈｅａｒｔ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｊｏｉｎｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ａｎｄ Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ／Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｔａｓｋ ｆｏｒｃｅ ｏｎ ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ５９巻（３号）：６０７〜６０９頁）によって、ＳＴセグメント上昇の変化および／または心筋酵素の増加に関連した、２０分を超えて続く急性胸痛事象として定義される急性心筋梗塞に加えて、用語の不安定狭心症（ＡＰ）も作り出され、これは、本発明によれば、「心疾患」の一部とみなされる（Ｈａｍｍ ＣＷ：Ｌｅｉｔｌｉｎｉｅｎ：Ａｋｕｔｅｓ Ｋｏｒｏｎａｒｓｙｎｄｒｏｍ （ＡＣＳ） − Ｔｅｉｌ １：ＡＣＳ ｏｈｎｅ ｐｅｒｓｉｓｔｉｅｒｅｎｄｅ Ｓ−Ｔ−Ｈｅｂｕｎｇ ［Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ： Ａｃｕｔｅ Ｃｏｒｏｎａｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ （ＡＣＳ） − Ｐａｒｔ １： ＡＣＳ ｗｉｔｈｏｕｔ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ ＳＴ ｓｅｇｍｅｎｔ ｅｌｅｖａｔｉｏｎ］． Ｚ Ｋａｒｄｉｏｌ （２００４年）９３巻：７２〜９０頁）。
【００１５】
本発明の一部として、「心筋梗塞」（心発作、ＡＭＩ（急性心筋梗塞））は、心臓の急性で生命を危うくする疾患を表すものとし、この疾患では、血液供給の制限（虚血）のために、心筋（ｈｅａｒｔ ｍｕｓｃｌｅ）（心筋（ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ））の一部の損傷または死（梗塞）が起こり、これは、一般に２０分を超えて現れる。心発作の主症状は、突然に起こる胸痛であり、これは、２０分を超えて続き、通常重篤であり、肩、腕、下顎および上腹部に広がる場合があり、発汗、吐き気および場合により嘔吐を伴う場合がある。心筋梗塞の結果として、心不全があり得る。
【００１６】
用語「心筋梗塞後」は、過去において、つまり、例えば、１時間超、特に、２０時間、とりわけ１から５日、または３から５日前に心筋梗塞を罹患し、その段階後、現在は生存している患者を意味し、この出来事により、即時の死には至らなかったが、直接および間接的に、別の（引き続く）心筋梗塞、心不全、または死、またはさもなければ患者の悪化などのさらなる不利な事象が予期される。
【００１７】
本発明の脈絡の範囲内で、「心不全」も、「心疾患」に含まれるものとする。
【００１８】
「心不全」は、安静時、または身体活動の間の組織代謝を保証するために、心臓が十分な血液、したがって十分な酸素を組織に供給することができない、急性または慢性の状態である。臨床的には、心不全は、一般的な症状（呼吸困難、疲労、体液貯留）が現れるとき存在し、その根底にある原因は、収縮または拡張機能障害の意味での心機能障害である。慢性心不全（ＣＣＩ）も、本発明によれば含まれる（Ｋａｒｄｉｏｌｏｇｉｅ ｃｏｍｐａｃｔ、Ｃｈｒｉｓｉａｎ Ｍｅｗｉｓ、Ｒｅｉｍｅｒ ＲｉｅｓｓｅｎおよびＩｏａｋｉｍ Ｓｐｙｒｉｄｏｐｏｕｌｏｓ発行、未改訂２版、Ｔｈｉｅｍｅ ２００６年）。以下のものが心不全の原因となり得る：高血圧（ｈｉｇｈ ｂｌｏｏｄ ｐｒｅｓｓｕｒｅ）（高血圧（ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ））および／または冠血管の動脈硬化症（石灰化）（冠動脈性心疾患）に加えて、心弁膜欠陥（ｖａｌｖｕｌａｒ ｈｅａｒｔ ｄｅｆｅｃｔ）（リウマチ熱の長期結果など）、心筋炎（心筋の炎症）、不整脈、心筋梗塞。（うっ血性）心不全を伴った高血圧性心疾患、（うっ血性）心不全を伴った高血圧性心疾患および腎疾患、原発性右心不全、続発性右心不全、不快感を伴わない左心不全（ＮＹＨＡ段階Ｉ）、より高い身体活動の間に不快感を伴う左心不全（ＮＹＨＡ段階ＩＩ）、軽い身体活動の間に不快感を伴う左心不全（ＮＹＨＡ段階ＩＩＩ）、安静時に不快感を伴う左心不全（ＮＹＨＡ段階ＩＶ）、ならびに心原性ショックも、本発明によれば含まれる。
【００１９】
本発明の脈絡の範囲内で、「気道および肺の疾患」は、特に、「肺および気道の感染症」、具体的には、細菌、ウイルス、真菌、または寄生虫によって生じる感染症、例えば、下気道感染症（ＬＲＴＩ）、気管支炎、肺炎、サルコイドーシス、気管支拡張症、または非心臓性肺水腫のような徴候などを意味するものとする。
【００２０】
さらに、本発明によれば、下気道感染症（ＬＲＴＩ）、気管支炎、腐敗性気管支炎、および肺炎は好適である。肺炎、特に、市中感染性肺炎（ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）（ＣＡＰ）、および下気道感染症（ＬＲＴＩ）は特に好適である。
【００２１】
本発明の脈絡の範囲内で、肺炎は、肺組織の急性または慢性の疾患として解釈されるものとし、その感染は、細菌、ウイルス、もしくは真菌、寄生虫によって、まれに毒性物質の吸入によって中毒性をもって、または免疫学的に生じる。臨床医にとっては、肺炎は、胸部Ｘ線像で認識できる少なくとも１つの浸潤とともに、様々な症状（発熱または低体温、悪寒、咳嗽、胸部の胸膜炎性疼痛、痰産生の増加、呼吸数の増加、打診音減衰、気管支呼吸、甲高い水泡音、胸膜の摩擦音）の組合せである（Ｈａｒｒｉｓｏｎｓ Ｉｎｎｅｒｅ Ｍｅｄｉｚｉｎ ［Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ］、Ｍａｎｆｒｅｄ Ｄｉｅｔｅｌ、Ｎｏｒｂｅｒｔ ＳｕｔｔｏｒｐおよびＭａｒｔｉｎ Ｚｅｉｔｚ発行、ＡＢＷ Ｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｓｖｅｒｌａｇｅ ２００５年）。
【００２２】
本発明の脈絡の範囲内で、「気道および肺の疾患」は、特に、「肺および気道の慢性疾患」、具体的には、間質性肺疾患および肺線維症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）のような徴候、特にＣＯＰＤ感染増悪、気管支喘息、特に、気管支喘息を伴った感染増悪、および気管支癌を表す。ＣＯＰＤ、特に、ＣＯＰＤ感染増悪は特に好適である。
【００２３】
本発明によれば、ＣＯＰＤは、咳嗽、喀痰の増加、身体活動の間の息切れを特徴とする一群の慢性疾患を表す。第１に、慢性閉塞性気管支炎および肺気腫が述べられるべきである。両疾患パターンは、特に呼息が困難であることを特徴とする。ＣＯＰＤの主要な症状についての口語的用語は、「喫煙者の咳」でもある。本発明は、急性の増悪に特に有利である。
【００２４】
上述したすべての徴候は、例えば、Ｐｓｃｈｙｒｅｍｂｅｌ、Ｄｅ Ｇｒｕｙｔｅｒ、９版、Ｂｅｒｌｉｎ ２００４年にも記載されている。
【００２５】
本発明によれば、用語「リスク層別化」は、疾患の考えられる最も好ましい経過を可能にすることを目標として、心疾患、特に、急性冠状動脈症候群および心筋梗塞、狭心症および／または心筋梗塞後、心不全、または気道および肺の疾患、特に、感染症および慢性の炎症の、より集中的な診断および療法／治療の目的で、患者、特に予後が好ましくない救急患者およびリスク患者を識別することを含む。したがって、本発明によるリスク層別化により、有効な治療方法が可能になり、これは、例えば、経皮冠動脈インターベンションおよびより新規な薬剤の形態での急性冠状動脈症候群の場合において、または例えば、ＡＣＥ阻害剤、ＡＴ１アンタゴニスト、アンギオテンシンＩＩ受容体遮断薬（サブタイプ１）、β遮断薬ビソプロロール、カルベジロール、メトプロロールおよびネビボロール、バソプレッシン受容体アンタゴニスト、ＮＹＨＡ段階ＩＩＩから開始するアルドステロンアンタゴニスト、カルシウム感受性増強薬（レボシメンダン）を使用する心不全の治療もしくは療法、または抗生物質を使用する、感染症もしくは慢性の気道および肺の疾患の治療もしくは療法のために存在する。
【００２６】
したがって同様に、本発明は、心疾患ならびに気道および肺の疾患についてリスクが増大しており、かつ／または予後が好ましくない患者、具体的には、症候性および／または無症候性の患者、特に救急患者の識別に関する。
【００２７】
特に救急治療および／または集中治療の場合において、信頼できる層別化は、本発明による方法を使用することによって特に有利に実施することができる。したがって本発明による方法により、療法の急速な成功および致死の予防をもたらす臨床的な決定が可能になる。そのような臨床的な決定は、心疾患ならびに気道および肺の疾患の治療または療法のための、薬剤を用いた高度な治療も含む。
【００２８】
したがって、本発明は、患者を入院させる決定を含めた臨床的な決定、例えば、好ましくは時間が極めて重要な集中治療または救急治療における、薬剤を使用する高度な治療および療法などを実施するために、心疾患ならびに／または気道および肺の疾患を有する患者を診断および／またはリスク層別化するための方法にも関する。
【００２９】
さらに好適な実施形態では、したがって、本発明による方法は、心疾患および／または気道の疾患のための療法の管理に関する。
【００３０】
さらに好適な実施形態では、診断および／またはリスク層別化のための本発明による方法は、予後、早期検出および鑑別診断による検出、重症度の評価、および療法に付随する疾患の経過の評価のために実施される。
【００３１】
さらに好適な実施形態では、本発明は、心疾患ならびに／または気道および肺の疾患の早期もしくは鑑別診断、または予後のためにインビトロで診断するための方法であって、ＮＴ−プロＥＴ−１マーカー、またはその断片および部分ペプチドの判定が、検査される患者において実施される方法に関する。
【００３２】
本発明による方法の一実施形態では、体液、好ましくは血液、場合により全血または血清または利用可能な血漿が、検査される患者から試料採取され、診断は、インビトロ／エクスビボ、つまりヒトまたは動物の体外で行われる。ＮＴ−プロＥＴ−１マーカー、またはその断片および部分ペプチドの判定により、高い感受性および特異性が実現され（実施例および図面を参照されたい）、診断またはリスク層別化は、少なくとも１つの患者試料中の利用可能な量に基づいて可能である。
【００３３】
本発明の脈絡の範囲内で、「ＮＴ−プロＥＴ−１」は、ヒトタンパク質またはポリペプチドとして解釈されるものとし、これは、プレプロエンドセリンから得ることができ、プレプロエンドセリンのフレームワーク内で（配列番号１および図１）、アミノ酸１８〜５２を有する遊離断片、ならびにそれから得ることができる断片または部分ペプチド、特に、プレプロＥＴ−１（配列番号１および図１）のＡＰＥＴＡＶＬＧＡＥＬＳＡＶ（配列番号２）Ｐｏｓ．１８〜３１、およびプレプロＥＴ−１（配列番号１および図１）のＧＥＮＧＧＥＫＰＴＰＳＰＰＷＲＬＲＲＳＫＲ（配列番号３）Ｐｏｓ．３２〜５２を含むことができる。さらに、本発明によるこれらのポリペプチドは、翻訳後修飾、例えば、グリコリゼーション（ｇｌｙｃｏｌｉｚａｔｉｏｎ）［原文のまま］、脂質結合または誘導体化などを有することができる。
【００３４】
さらなる実施形態では、ＮＴ−プロＥＴ−１、またはその断片および部分ペプチドの判定は、さらなるマーカー、具体的には、好ましくは、心疾患、特に冠動脈性心疾患、ならびに／または気道および肺の疾患を既に標的とするものとともにさらに実施することができる。
【００３５】
結果として、本発明は、判定が、炎症マーカー、心血管マーカー、神経ホルモンマーカー、または虚血マーカーの群から選択される少なくとも１つのさらなるマーカーを使用して、検査される患者においてさらに実施される、本発明による方法の実施形態に関する。
【００３６】
本発明によれば、炎症マーカーは、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、ＴＮＦ−αなどのサイトカイン、ＩＬ−６などのインターロイキン、プロカルシトニン（１〜１１６、３〜１１６）、およびＶＣＡＭまたはＩＣＡＭなどの接着分子の群の少なくとも１つのマーカーから選択することができ、心血管マーカーは、特に、心筋組織のネクローシスを示すマーカーとすることができ、血圧に影響するマーカーは、クレアチンキナーゼ、ミオグロビン、ミエロペルオキシダーゼ、ナトリウム利尿タンパク質、特にＡＮＰ（もしくはＡＮＦ）、プロＡＮＰ、ＮＴ−プロＡＮＰ、ＢＮＰ、プロＢＮＰ、ＮＴ−プロＢＮＰ、またはこれらの部分配列、心臓トロポニン、ＣＲＰの群の少なくとも１つのマーカーから選択することができる。さらに、これは、調節（プロ）ホルモン、特にプロ−ガストリン放出ペプチド（プロ−ＧＲＰ）、プロエンドセリン−２、プロ−エンドセリン−３、プロ−レプチン、プロ−神経ペプチドＹ、プロ−ソマトスタチン、プロ−神経ペプチドＹＹ、プロ−オピオンメラノコルチン（ｏｐｉｏｎｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎ）、プロ−アドレノメデュリン（プロ−ＡＤＭ）、プロ−バソプレッシン（プロ−ＡＶＰ）、またはこれらの部分配列も含むものとする。
【００３７】
虚血マーカーは、トロポニンＩおよびＴ、ＣＫ−ＭＢの群の少なくとも１つのマーカーから選択することができる。さらに、神経ホルモンマーカーは、少なくとも１つのさらなるナトリウム利尿タンパク質、特にＡＮＰ（もしくはＡＮＦ）、プロＡＮＰ、ＮＴ−プロＡＮＰ、ＢＮＰ、プロＢＮＰ、またはその部分配列とすることができる。
【００３８】
本発明のさらなる実施形態では、本発明による方法は、マーカーの並列または同時判定（例えば、９６以上のウェルを有するマルチタイタープレート）を使用して、インビトロ診断の一部として実施することができ、判定は、少なくとも１つの患者試料を使用して実施される。
【００３９】
さらに、本発明による方法およびその判定は、自動分析システムに基づく診断デバイス、特に、Ｋｒｙｐｔｏｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋｒｙｐｔｏｒ．ｎｅｔ／）によって実施することができる。
【００４０】
さらなる実施形態では、本発明による方法およびその判定は、個々のパラメーター判定であっても、複数のパラメーター判定であっても、迅速試験（側方流動試験またはポイントオブケアなど）を使用して実施することができる。特に好適な実施形態では、これは、自己テストまたは救急診断に適したデバイスである。
【００４１】
本発明はさらに、心疾患ならびに／もしくは気道および肺の疾患のリスク層別化を行い、かつ／あるいは心疾患ならびに／または気道および肺の疾患の早期もしくは鑑別診断、または予後のためのインビトロ診断を行うための、ＮＴ−プロＥＴ−１、またはその断片および部分ペプチドの使用に関する。
【００４２】
別の目的は、本発明による方法を実施するための、対応する診断デバイスまたはその使用を提供することである。
【００４３】
本発明の脈絡の範囲内で、そのような診断デバイスは、特に、アレイまたはアッセイ（イムノアッセイ、ＥＬＩＳＡなど）、最も広い意味において、本発明による方法を実施するためのデバイスとして解釈されるものとする。
【００４４】
本発明はさらに、ＮＴ−プロＥＴ−１、またはその断片および部分ペプチドを判定するための検出試薬、場合により上述したさらなるマーカーを含む、心疾患ならびに／または気道および肺の疾患の診断および／またはリスク層別化のためのキットに関する。そのような検出試薬は、例えば抗体などを含む。
【００４５】
以下の実施例および図面を、本発明をより詳細に説明するために提供するが、本発明を、これらの実施例および図面に限定しない。
【実施例】
【００４６】
実施例および図面
イムノアッセイ
Ｓｔｒｕｃｋら（Ｓｔｒｕｃｋ Ｊ、Ｍｏｒｇｅｎｔｈａｌｅｒ ＮＧ、Ｂｅｒｇｍａｎｎ Ａ． Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｐａｔｔｅｒｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−１ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｉｎ ｖｉｖｏ． Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ２００５年；２６巻；２４８２〜６頁）に記載されているように、ＮＴ−プロＥＴ−１を測定するためにサンドイッチイムノアッセイを使用した。
【００４７】
ペプチド合成：
プレプロＥＴ−１の既知のアミノ酸配列（図１）に由来して、２つの領域を選択した（Ｐｏｓ．１８〜３１、３２〜５２）。この領域は、可溶性ペプチドとして化学的に合成し、１つの場合では、標準的な方法を使用して、Ｎ末端システイン残基を補充し、精製し、その品質は、質量分析法および逆相ＨＰＬＣを使用して管理し、これらをアリコートとして凍結乾燥した（ＪＰＴ ｃｏｍｐａｎｙ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。このペプチドのアミノ酸配列は、プレプロＥＴ−１（図１）のＰＡＶ１５ ＣＡＰＥＴＡＶＬＧＡＥＬＳＡＶ ＰＯＳ．１８〜３１、プレプロＥＴ−１（図１）のＭＰＧＣ２２ ＧＥＮＧＧＥＫＰＴＰＳＰＰＷＲＬＲＲＳＫＲＣ ＰＯＳ．３２〜５２である。さらに、プレプロＥＴ−１の領域Ｐｏｓ．１８〜５２を含むペプチドを合成した（ＰＡＲ３５ ＡＰＥＴＡＶＬＧＡＥＬＳＡＶＧＥＮＧＧＥＫＰＴＰＳＰＰＷＲＬＲＲＳＫＲ）。
【００４８】
コンジュゲーションおよび免疫化
ＭＢＳ（ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）によって、ペプチドのＰＡＶ１５およびＭＰＧＣ２２を、ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシニアン）担体タンパク質にコンジュゲートさせた（ＰＩＥＲＣＥ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡからの指示シート「ＮＨＳ−Ｅｓｔｅｒｓ−Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒｓ」を参照されたい）。これらのコンジュゲートを、以下のレジメンに従って、ヒツジを免疫するのに使用した：それぞれのヒツジに、それぞれ４週間間隔で、最初に１００μｇのコンジュゲート（コンジュゲートのペプチド部分と比べた量の情報）を投与し、引き続いて５０μｇのコンジュゲート（コンジュゲートのペプチド部分と比べた量の情報）を投与した。免疫化を開始して４カ月目から始めて、それぞれのヒツジから４週間間隔で７００ｍｌの血液を採取し、この血液から遠心分離によって抗血清を得た。コンジュゲーション、免疫化、抗血清の生成は、ＭｉｃｒｏＰｈａｒｍ、Ｃａｒｍａｒｔｈｅｎｓｈｉｒｅ、ＵＫによって実施された。
【００４９】
抗体の精製
ワンステップ法では、ペプチド特異抗体は、免疫化して４カ月目から始めて生成してきた抗血清から生成した。この目的で、ペプチドのＰＡＶ１５およびＭＰＧＣ２２を、ＳｕｌｆｏＬｉｎｋゲルに最初にカップリングさせた（ＰＩＥＲＣＥ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡからの指示シート「ＳｕｌｆｏＬｉｎｋ Ｋｉｔ」を参照されたい）。カップリングのために、５ｍｌのゲル当たり、５ｍｇのペプチドを提供した。
【００５０】
このペプチドに対するヒツジ抗血清からのペプチド特異抗体の親和性精製は、以下のように実施した。
【００５１】
ペプチドカラムを、１０ｍｌの溶出緩衝液（５０ｍＭのクエン酸、ｐＨ２．２）と結合緩衝液（１００ｍＮのリン酸ナトリウム、０．１％のＴｗｅｅｎ、ｐＨ６．８）を交互に使用して、最初に３回洗浄した。１００ｍｌの抗血清を０．２μｍに対して濾過し、利用可能なカラム材料と混合した。この最後に、１０ｍｌの結合緩衝液を用いて、ゲルをカラムから定量的にすすいだ。インキュベーションを、旋回運動下で（ｕｎｄｅｒ ｐｉｖｏｔｉｎｇ ｍｏｔｉｏｎ）、室温で一晩実施した。これらのバッチを、空のカラム（ＮＡＰ２５、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、空にした）中に定量的に移した。通過物（ｐａｓｓ）を捨てた。引き続いて、洗浄ステップを、タンパク質を含まない２５０ｍｌの結合緩衝液（洗浄溶出液のタンパク質含量＜０．０２ Ａ２８０ｎｍ）を用いて実施した。洗浄したカラムに溶出緩衝液を添加し、それぞれ１ｍｌの分画を採取した。それぞれの分画について、タンパク質含量を、ＢＣＡ法を使用して求めた（ＰＩＥＲＣＥ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡからの指示シートを参照されたい）。
【００５２】
０．８ｍｇ／ｍｌ超のタンパク質濃度を有する分画をプールした。ＢＣＡ法を使用してプールのタンパク質を求めた後、抗ＰＡＶ１５抗体について２７ｍｇの収量を得、抗ＭＰＧＣ２２抗体について３５ｍｇの収量を得た。
【００５３】
標識
ＮＡＰ−５ゲル濾過カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して、５００μｌの精製した抗ＭＰＧＣ２２抗体（上記を参照されたい）を、指示シートに従って、１ｍｌの１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）中で緩衝液交換にかけた。抗体溶液のタンパク質濃度は、１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）を使用して１．５ｍｇ／ｍｌに調節した。
【００５４】
化学発光標識のために、抗体を以下のようにさらに処理した。６７μｌの抗体溶液を、１０ｍｌのＭＡ７０−Ａｋｒｉｄｉｎｉｕｍ−ＮＨＨ−エステル（１ｍｇ／ｍｌ；ＨＯＥＣＨＳＴ Ｂｅｈｒｉｎｇ）と混合し、室温で１５分間インキュベートした。次いで４２３μｌの１Ｍのグリシンを添加し、さらに１０分間インキュベートした。引き続いて、標識バッチを、指示シートに従って、ＮＡＰ−５ゲル濾過カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して、１ｍｌの溶離液Ａ（５０ｍＭのリン酸カリウム、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中で緩衝液交換にかけ、この過程中で、低分子成分を除いた。抗体に結合していない残りの標識を分離するために、ゲル濾過ＨＰＬＣを実施した（カラム：Ｗａｔｅｒｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐａｋ ＳＷ ３００）。試料を適用し、溶離液Ａを使用して、１ｍｌ／ｍｌの流速でクロマトグラフィーによって分離した。測光器を使用して、波長２８０ｎｍおよび３６８ｎｍを測定した。抗体標識の程度の尺度としての３６８ｎｍ／２８０ｎｍの吸収比は、ピークで０．１０＋／−０．０１であった。モノマー抗体含有分画（保持時間８〜１０分）を採取し、３ｍｌの１００ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５％のウシ血清アルブミン、０．１％アジ化ナトリウム、ｐＨ７．４中に入れた。
【００５５】
カップリング
照射した（ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ）５ｍｌのポリスチレン管（Ｇｒｅｉｎｅｒ）を、精製した抗ＰＡＶ１５抗体で以下のようにコーティングした。抗体を、５０ｍＭのトリス、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．８中で、６．６μｇ／ｍｌの濃度に希釈した。３００μｌのこの溶液を、それぞれの管にピペットで移した。この管を、２２℃で２０時間インキュベートした。この溶液を吸引した。次いで、それぞれの管を、４．２ｍｌの１０ｍＭのリン酸ナトリウム、２％のＫａｒｉｏｎ ＦＰ、０．３％のウシ血清アルブミン、ｐＨ６．５で満たした。２０時間後に、溶液を吸引した。最後に、管を真空乾燥機で乾燥させた。
【００５６】
イムノアッセイの実施および評価
使用した標準物質は、ペプチドＰＡＲ３５であり、これを、通常のウマ血清（ＳＩＧＭＡ）で連続的に希釈した。このようにして作製した標準物質は、最初のペプチド重量に従って、濃縮物（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）に割り当てた。
【００５７】
サンドイッチイムノアッセイは、以下のように開始した。５０μｌの標準物質または試料、および１００万ＲＬＵ（相対光単位）のＭＡ７０標識抗体を含む２００μｌのアッセイ緩衝液（１００ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５％のウシ血清アルブミン、０．１％の非特異的ヒツジＩｇＧ、０．１％のアジ化ナトリウム、ｐＨ７．４）を、抗体でコーティングしたそれぞれの試験管中にピペットで移した。振盪しながら２２℃で２時間、インキュベーションを行った。次いで、管１本当たりそれぞれ１ｍｌの洗浄溶液（０．１％のＴｗｅｅｎ ２０）を使用して、４回の洗浄ステップを実施し、液体は滴り落とさせ、管に結合した化学発光を、ルミノメーター（ＢＥＲＴＨＯＬＤ、ＬＢ９５２Ｔ；塩基試薬ＢＲＡＨＭＳ ＡＧ）を使用して測定した。ＭｕｌｔｉＣａｌｃ（Ｓｐｌｉｎｅ Ｆｉｔ）ソフトウェアを使用して、試料のＮＴ−プロＥＴ−１濃度を検量線から読み取った。
【００５８】
説明したアッセイを使用して測定することができる分析物は、Ｎ末端プロエンドセリン−１（ＮＴ−プロＥＴ−１）と呼ばれる。
【００５９】
臨床価（ｃｌｉｎｉｃａｌ ｖａｌｅｎｃｙ）
正常範囲
ＮＴ−プロＥＴ−１濃度を、健康な対照のヒト（ｎ＝２００）の試料中で求めた。中央値は、３０．５ｐｍｏｌ／ｌであり、測定された最小値は２．０であり、最高値は５３ｐｍｏｌ／ｌであり、第９５百分位数は、１６．３および４７．２ｐｍｏｌ／ｌであった。
【００６０】
心不全／重症度
ＮＴ−プロＥＴ−１濃度を、慢性または急性非代償性心不全を有する患者について測定した。ＮＴ−プロＥＴ−１濃度は、心不全の重症度、特に重症度の増大に関連していた。４つの重症度の分類であるＮＹＨＡ Ｉ〜ＩＶについてのＮＴ−プロＥＴ−１濃度の中央値は、３５．４、３７．３、４５．５および８３．９ｐｍｏｌ／Ｌであった（図２を参照されたい）。
【００６１】
慢性心不全／診断
ＮＴ−プロＥＴ−１値を、慢性心不全を罹患している３１６人の患者、および２００人の健康な対照患者のプールから求めた。受信者動作特性分析は、０．７２のＡＵＣを示した。４９．７ｐｍｏｌ／ｌのカットオフ値について、これは、３４．３％の感受性を生じ、特異性は９８％であった。４７．２ｐｍｏｌ／ｌのカットオフ値について、これは、３８．５％の感受性を生じ、特異性は９５％であった。
【００６２】
慢性心不全／予後
ＮＴ−プロＥＴ−１値を、慢性心不全を罹患している３１６人の患者のプールから求めた。患者は、３６０日の平均期間モニターした。この期間の間に、４２人の患者が死亡し、２７４人が生存した。受信者動作特性分析を使用して、死亡率の予後について、最良のカットオフ値（感受性と特異性の最大の積として定義される）を求めた：５１．３ｐｍｏｌ／ｌ。このカットオフ値で、予後の感受性は７１．４％であり、特異性は７４．５％であった。５１．３ｐｍｏｌ／ｌのカットオフ値で、死亡の尤度比は２．８であった。
【００６３】
【表１】
急性心不全／診断
ＮＴ−プロＥＴ−１値を、急性の息切れを罹患している１２５人の患者のプールから求めた。１２５人の患者のうち６９人が心不全を罹患した。心不全の鑑別診断についての受信者動作特性分析は、０．７２のＡＵＣを示した。１１１ｐｍｏｌ／ｌのカットオフ値について、これは、１０．２％の感受性を生じ、特異性は９８％であった。９０．５ｐｍｏｌ／ｌのカットオフ値について、これは、１７．５％の感受性を生じ、特異性は９５％であった。
【００６４】
急性心不全／予後
ＮＴ−プロＥＴ−１値を、急性非代償性心不全を罹患している６９人の患者のプールから求めた。患者は、３６０日の期間モニターした。この期間の間に、２１人の患者が死亡し、４８人が生存した。受信者動作特性分析を使用して、死亡率の予後について、最良のカットオフ値（感受性と特異性の最大の積として定義される）を求めた：６４ｐｍｏｌ／ｌ。このカットオフ値で、予後の感受性は６６．６％であり、特異性は６８．７％であった。６４ｐｍｏｌ／ｌのカットオフ値で、死亡の尤度比は２．０であった。
【００６５】
【表２】
心筋梗塞／予後
試料を、心発作が起きてから３日後に急性心発作のあった２４６人の患者から得、ＮＴ−プロＥＴ−１を測定した。患者は、６０日の期間モニターした。この期間の間に、２２０人の患者は、有害事象をまったく有さず、２６人は、心不全のために死亡したか、再び入院した。受信者動作特性分析（ＡＵＣ＝０．７０）を使用して、心不全による死亡率または再入院の予後について、最良のカットオフ値（感受性と特異性の最大の積として定義される）を求めた：６３．９ｐｍｏｌ／ｌ。このカットオフ値で、予後の感受性は６５．４％であり、特異性は７３．６％であった。６３．９ｐｍｏｌ／ｌのカットオフ値で、有害事象の尤度比は２．５であった。
【００６６】
【表３】
肺炎／重症度および予後
試料を、病院に入院したとき市中感染性肺炎を有していた１４２人の患者から得、ＮＴ−プロＥＴ−１を測定した。患者は、７０日の期間モニターした。この期間の間に、１０人の患者が死亡した。ＮＴ−プロＥＴ−１濃度は、ＰＳＩ（肺炎重症度指数）、疾患の重症度のスコアとともに上昇し（図３）、５３ｐｍｏｌ／ｌで、これらの患者は、平均で、健康な対照患者（３０．５ｐｍｏｌ／ｌ）より高かった。死亡率の予後について、受信者動作特性分析は、０．８９のＡＵＣを示した。受信者動作特性分析を使用して、死亡率の予後について、最良のカットオフ値（感受性と特異性の最大の積として定義される）を求めた：７７ｐｍｏｌ／ｌ。このカットオフ値で、予後の感受性は１００％であり、特異性は８１．２％であった。７７ｐｍｏｌ／ｌのカットオフ値で、死亡率の尤度比は５．５であった。
【００６７】
【表４】
増悪したＣＯＰＤ
ＮＴ−プロＥＴ−１を、慢性閉塞性肺疾患および同時に下気道の感染症を有する５３人の患者について測定した。４７ｐｍｏｌ／ｌの平均で、これらの患者は、健康な対照患者（３０．５ｐｍｏｌ／ｌ）と比較して高い値を有していたが、肺炎患者（上記の５３ｐｍｏｌ／ｌを参照されたい）より低かった。
【００６８】
表：ニューヨーク心臓協会（ＮＨＹＡ）の分類
ＮＹＨＡ Ｉ 身体活動の制限なし。通常の身体活動は、過度の疲労、リズム障害、呼吸困難または狭心症を引き起こさない。
ＮＹＨＡ ＩＩ 身体活動のわずかな制限。安静時は快適であるが、通常の身体活動が、疲労、リズム障害、呼吸困難または狭心症をもたらす。
ＮＹＨＡ ＩＩＩ 身体活動の著しい制限。安静時は快適であるが、通常より低い身体活動が、疲労、リズム障害、呼吸困難または狭心症を引き起こす。
ＮＹＨＡ ＩＶ 不快感を伴うことなく、いずれの身体活動も実施することができず、安静時も不快である。寝たきりである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心疾患ならびに気道および肺の疾患の診断および／またはリスク層別化のための方法であって、遊離断片のＮ末端プロエンドセリン（ＮＴ−プロＥＴ−１；図１によるプレプロＥＴのＡＳ１８〜５２）、またはその断片および部分ペプチドの判定が実施される方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
適切な療法を適用するために、臨床的な決定をする必要性とともに、心疾患ならびに／または気道および肺の疾患の早期診断および区別が緊急治療室において以前から必要である。現況技術では、前駆体タンパク質ビッグ−ＥＴ１（３８ＡＳ、図１を参照されたい）を含めた、成熟ＥＴ−１（２１ＡＳ）が、診断目的で記載されている（非特許文献１；非特許文献２）。さらに、敗血症の診断のためのエンドセリンプロホルモンが、本出願人によって、ＷＯ００／２２４３９およびＥＰ１１２１６００Ｂ１に開示されていることが知られている。
【０００３】
さらに、エンドセリン−１またはビッグ−エンドセリン−１含量を間接的に判定するために、心血管疾患を診断するための、プレプロエンドセリンのアミノ酸配列９３〜２１２または１６８〜２１２を有する、Ｃ末端プロエンドセリン断片（ＣＴ−プロＥＴ−１）（図１、配列番号１）が、ＥＰ１５６４５５８Ｂ１に記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第００／２２４３９号パンフレット
【特許文献２】欧州特許第１１２１６００号明細書
【特許文献３】欧州特許第１５６４５５８号明細書
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｒｏｓｓｉ ＧＰ、Ｓｅｃｃｉａ ＴＭ、Ａｌｂｅｒｔｉｎ Ｇ、Ｐｅｓｓｉｎａ ＡＣ． Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ： ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｕｓｅ． Ａｎｎ Ｃｌｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２０００年；３７（第５部）：６０８〜２６．２
【非特許文献２】Ａｕｂｉｎ Ｐ、Ｌｅ Ｂｒｕｎ Ｇ、Ｍｏｌｄｏｖａｎ Ｆ、Ｖｉｌｌｅｔｔｅ ＪＭ、Ｃｒｅｍｉｎｏｎ Ｃ、Ｄｕｍａｓ Ｊら、Ｓａｎｄｗｉｃｈ−ｔｙｐｅ ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｆｏｒ ｂｉｇ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−Ｉ ｉｎ ｐｌａｓｍａ： ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｈｅａｌｔｈｙ ｈｕｍａｎ ｓｕｂｊｅｃｔｓ ｕｎａｆｆｅｃｔｅｄ ｂｙ ｓｅｘ ｏｒ ｐｏｓｔｕｒｅ． Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ １９９７年；４３巻：６４〜７０頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、これまで知られているマーカーを使用する、既知の診断方法の不利点は続いており、リスク患者の早期および包括的な検出は、必ずしも十分に成功しているとは限らず、したがって、リスク層別化は十分ではない。
【０００７】
したがって、本発明の目的は、リスク患者の検出の改善を可能にする、心疾患ならびに気道および肺の疾患のリスク層別化のための方法を開発することである。
【０００８】
さらに、従来技術において、一般に、マーカーの感受性および／または特異性が不十分であることは不利である。
【０００９】
したがって、別の目的は、心疾患ならびに気道および肺の疾患のリスク層別化のための方法であって、少なくとも１つのマーカー、またはマーカーの組合せは、インビトロ診断において十分な感受性および特異性を有する方法を提供することである。
【００１０】
したがって、本発明の目的は、心疾患ならびに／または気道および肺の疾患の診断および／またはリスク層別化のための方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
この目的は、心疾患ならびに気道および肺の疾患の診断およびリスク層別化のための方法であって、Ｎ末端プロエンドセリン（手短には「ＮＴ−プロＥＴ−１」）またはその断片および部分ペプチドの判定が実施される方法（以後、本発明による方法）によって実現される。
【００１２】
意外にも、ＮＴ−プロＥＴ−１、またはその断片および部分ペプチドは、心疾患ならびに気道および肺の疾患に診断に関して高い感受性および特異性を示す（実施例および図面を参照されたい）。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】プレプロエンドセリン−１のアミノ酸配列（ＡＳ）を示す図であり、セクション１〜１７はシグナルペプチドであり、１８〜５２はＮＴ−プロＥＴ−１であり、５３〜７３は成熟ＥＴ−１であり、５３〜９０はビッグ−ＥＴ−１（または７４〜９０）である。
【図２】心不全の重症度との関数としてのＮＴ−プロＥＴ−１濃度のグラフである。健康な対照患者（ｎ＝２００）、およびＮＹＨＡ重症度スコアに基づいて分類した心不全患者（ＮＹＨＡ Ｉ：ｎ＝２２、ＮＹＨＡ ＩＩ：ｎ＝１２６、ＮＹＨＡ ＩＩＩ：ｎ＝１３２、ＮＹＨＡ ４：ｎ＝１７）の平均値（＋標準誤差）を例示してある。
【図３】肺炎の重症度の関数としてのＮＴ−プロＥＴ−１濃度のグラフである。健康な対照患者（ｎ＝２００）、および肺炎重症度指数に基づいて分類した肺炎患者（ＰＳＩ Ｉ：ｎ＝３６、ＰＳＩ ＩＩ：ｎ＝４４、ＰＳＩ ＩＩＩ：ｎ＝２５、ＰＳＩ ＩＶ：ｎ＝１９、ＰＳＩ Ｖ：ｎ＝１８）の平均値（＋標準誤差）を例示してある。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明による用語「心疾患」は、特に、直ちに生命を危うくする、冠動脈性心疾患の「急性冠状動脈症候群」およびその様々な段階を含む。これは特に、救急医療、具体的には、急性心筋梗塞および／または狭心症、およびまた突然の心臓死に適用する。ＷＨＯ判定基準（ＷＨＯ（１９７９年）：Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ａｎｄ ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｈｅａｒｔ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｊｏｉｎｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ａｎｄ Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ／Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｔａｓｋ ｆｏｒｃｅ ｏｎ ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ５９巻（３号）：６０７〜６０９頁）によって、ＳＴセグメント上昇の変化および／または心筋酵素の増加に関連した、２０分を超えて続く急性胸痛事象として定義される急性心筋梗塞に加えて、用語の不安定狭心症（ＡＰ）も作り出され、これは、本発明によれば、「心疾患」の一部とみなされる（Ｈａｍｍ ＣＷ：Ｌｅｉｔｌｉｎｉｅｎ：Ａｋｕｔｅｓ Ｋｏｒｏｎａｒｓｙｎｄｒｏｍ （ＡＣＳ） − Ｔｅｉｌ １：ＡＣＳ ｏｈｎｅ ｐｅｒｓｉｓｔｉｅｒｅｎｄｅ Ｓ−Ｔ−Ｈｅｂｕｎｇ ［Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ： Ａｃｕｔｅ Ｃｏｒｏｎａｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ （ＡＣＳ） − Ｐａｒｔ １： ＡＣＳ ｗｉｔｈｏｕｔ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ ＳＴ ｓｅｇｍｅｎｔ ｅｌｅｖａｔｉｏｎ］． Ｚ Ｋａｒｄｉｏｌ （２００４年）９３巻：７２〜９０頁）。
【００１５】
本発明の一部として、「心筋梗塞」（心発作、ＡＭＩ（急性心筋梗塞））は、心臓の急性で生命を危うくする疾患を表すものとし、この疾患では、血液供給の制限（虚血）のために、心筋（ｈｅａｒｔ ｍｕｓｃｌｅ）（心筋（ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ））の一部の損傷または死（梗塞）が起こり、これは、一般に２０分を超えて現れる。心発作の主症状は、突然に起こる胸痛であり、これは、２０分を超えて続き、通常重篤であり、肩、腕、下顎および上腹部に広がる場合があり、発汗、吐き気および場合により嘔吐を伴う場合がある。心筋梗塞の結果として、心不全があり得る。
【００１６】
用語「心筋梗塞後」は、過去において、つまり、例えば、１時間超、特に、２０時間、とりわけ１から５日、または３から５日前に心筋梗塞を罹患し、その段階後、現在は生存している患者を意味し、この出来事により、即時の死には至らなかったが、直接および間接的に、別の（引き続く）心筋梗塞、心不全、または死、またはさもなければ患者の悪化などのさらなる不利な事象が予期される。
【００１７】
本発明の脈絡の範囲内で、「心不全」も、「心疾患」に含まれるものとする。
【００１８】
「心不全」は、安静時、または身体活動の間の組織代謝を保証するために、心臓が十分な血液、したがって十分な酸素を組織に供給することができない、急性または慢性の状態である。臨床的には、心不全は、一般的な症状（呼吸困難、疲労、体液貯留）が現れるとき存在し、その根底にある原因は、収縮または拡張機能障害の意味での心機能障害である。慢性心不全（ＣＣＩ）も、本発明によれば含まれる（Ｋａｒｄｉｏｌｏｇｉｅ ｃｏｍｐａｃｔ、Ｃｈｒｉｓｉａｎ Ｍｅｗｉｓ、Ｒｅｉｍｅｒ ＲｉｅｓｓｅｎおよびＩｏａｋｉｍ Ｓｐｙｒｉｄｏｐｏｕｌｏｓ発行、未改訂２版、Ｔｈｉｅｍｅ ２００６年）。以下のものが心不全の原因となり得る：高血圧（ｈｉｇｈ ｂｌｏｏｄ ｐｒｅｓｓｕｒｅ）（高血圧（ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ））および／または冠血管の動脈硬化症（石灰化）（冠動脈性心疾患）に加えて、心弁膜欠陥（ｖａｌｖｕｌａｒ ｈｅａｒｔ ｄｅｆｅｃｔ）（リウマチ熱の長期結果など）、心筋炎（心筋の炎症）、不整脈、心筋梗塞。（うっ血性）心不全を伴った高血圧性心疾患、（うっ血性）心不全を伴った高血圧性心疾患および腎疾患、原発性右心不全、続発性右心不全、不快感を伴わない左心不全（ＮＹＨＡ段階Ｉ）、より高い身体活動の間に不快感を伴う左心不全（ＮＹＨＡ段階ＩＩ）、軽い身体活動の間に不快感を伴う左心不全（ＮＹＨＡ段階ＩＩＩ）、安静時に不快感を伴う左心不全（ＮＹＨＡ段階ＩＶ）、ならびに心原性ショックも、本発明によれば含まれる。
【００１９】
本発明の脈絡の範囲内で、「気道および肺の疾患」は、特に、「肺および気道の感染症」、具体的には、細菌、ウイルス、真菌、または寄生虫によって生じる感染症、例えば、下気道感染症（ＬＲＴＩ）、気管支炎、肺炎、サルコイドーシス、気管支拡張症、または非心臓性肺水腫のような徴候などを意味するものとする。
【００２０】
さらに、本発明によれば、下気道感染症（ＬＲＴＩ）、気管支炎、腐敗性気管支炎、および肺炎は好適である。肺炎、特に、市中感染性肺炎（ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）（ＣＡＰ）、および下気道感染症（ＬＲＴＩ）は特に好適である。
【００２１】
本発明の脈絡の範囲内で、肺炎は、肺組織の急性または慢性の疾患として解釈されるものとし、その感染は、細菌、ウイルス、もしくは真菌、寄生虫によって、まれに毒性物質の吸入によって中毒性をもって、または免疫学的に生じる。臨床医にとっては、肺炎は、胸部Ｘ線像で認識できる少なくとも１つの浸潤とともに、様々な症状（発熱または低体温、悪寒、咳嗽、胸部の胸膜炎性疼痛、痰産生の増加、呼吸数の増加、打診音減衰、気管支呼吸、甲高い水泡音、胸膜の摩擦音）の組合せである（Ｈａｒｒｉｓｏｎｓ Ｉｎｎｅｒｅ Ｍｅｄｉｚｉｎ ［Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ］、Ｍａｎｆｒｅｄ Ｄｉｅｔｅｌ、Ｎｏｒｂｅｒｔ ＳｕｔｔｏｒｐおよびＭａｒｔｉｎ Ｚｅｉｔｚ発行、ＡＢＷ Ｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｓｖｅｒｌａｇｅ ２００５年）。
【００２２】
本発明の脈絡の範囲内で、「気道および肺の疾患」は、特に、「肺および気道の慢性疾患」、具体的には、間質性肺疾患および肺線維症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）のような徴候、特にＣＯＰＤ感染増悪、気管支喘息、特に、気管支喘息を伴った感染増悪、および気管支癌を表す。ＣＯＰＤ、特に、ＣＯＰＤ感染増悪は特に好適である。
【００２３】
本発明によれば、ＣＯＰＤは、咳嗽、喀痰の増加、身体活動の間の息切れを特徴とする一群の慢性疾患を表す。第１に、慢性閉塞性気管支炎および肺気腫が述べられるべきである。両疾患パターンは、特に呼息が困難であることを特徴とする。ＣＯＰＤの主要な症状についての口語的用語は、「喫煙者の咳」でもある。本発明は、急性の増悪に特に有利である。
【００２４】
上述したすべての徴候は、例えば、Ｐｓｃｈｙｒｅｍｂｅｌ、Ｄｅ Ｇｒｕｙｔｅｒ、９版、Ｂｅｒｌｉｎ ２００４年にも記載されている。
【００２５】
本発明によれば、用語「リスク層別化」は、疾患の考えられる最も好ましい経過を可能にすることを目標として、心疾患、特に、急性冠状動脈症候群および心筋梗塞、狭心症および／または心筋梗塞後、心不全、または気道および肺の疾患、特に、感染症および慢性の炎症の、より集中的な診断および療法／治療の目的で、患者、特に予後が好ましくない救急患者およびリスク患者を識別することを含む。したがって、本発明によるリスク層別化により、有効な治療方法が可能になり、これは、例えば、経皮冠動脈インターベンションおよびより新規な薬剤の形態での急性冠状動脈症候群の場合において、または例えば、ＡＣＥ阻害剤、ＡＴ１アンタゴニスト、アンギオテンシンＩＩ受容体遮断薬（サブタイプ１）、β遮断薬ビソプロロール、カルベジロール、メトプロロールおよびネビボロール、バソプレッシン受容体アンタゴニスト、ＮＹＨＡ段階ＩＩＩから開始するアルドステロンアンタゴニスト、カルシウム感受性増強薬（レボシメンダン）を使用する心不全の治療もしくは療法、または抗生物質を使用する、感染症もしくは慢性の気道および肺の疾患の治療もしくは療法のために存在する。
【００２６】
したがって同様に、本発明は、心疾患ならびに気道および肺の疾患についてリスクが増大しており、かつ／または予後が好ましくない患者、具体的には、症候性および／または無症候性の患者、特に救急患者の識別に関する。
【００２７】
特に救急治療および／または集中治療の場合において、信頼できる層別化は、本発明による方法を使用することによって特に有利に実施することができる。したがって本発明による方法により、療法の急速な成功および致死の予防をもたらす臨床的な決定が可能になる。そのような臨床的な決定は、心疾患ならびに気道および肺の疾患の治療または療法のための、薬剤を用いた高度な治療も含む。
【００２８】
したがって、本発明は、患者を入院させる決定を含めた臨床的な決定、例えば、好ましくは時間が極めて重要な集中治療または救急治療における、薬剤を使用する高度な治療および療法などを実施するために、心疾患ならびに／または気道および肺の疾患を有する患者を診断および／またはリスク層別化するための方法にも関する。
【００２９】
さらに好適な実施形態では、したがって、本発明による方法は、心疾患および／または気道の疾患のための療法の管理に関する。
【００３０】
さらに好適な実施形態では、診断および／またはリスク層別化のための本発明による方法は、予後、早期検出および鑑別診断による検出、重症度の評価、および療法に付随する疾患の経過の評価のために実施される。
【００３１】
さらに好適な実施形態では、本発明は、心疾患ならびに／または気道および肺の疾患の早期もしくは鑑別診断、または予後のためにインビトロで診断するための方法であって、ＮＴ−プロＥＴ−１マーカー、またはその断片および部分ペプチドの判定が、検査される患者において実施される方法に関する。
【００３２】
本発明による方法の一実施形態では、体液、好ましくは血液、場合により全血または血清または利用可能な血漿が、検査される患者から試料採取され、診断は、インビトロ／エクスビボ、つまりヒトまたは動物の体外で行われる。ＮＴ−プロＥＴ−１マーカー、またはその断片および部分ペプチドの判定により、高い感受性および特異性が実現され（実施例および図面を参照されたい）、診断またはリスク層別化は、少なくとも１つの患者試料中の利用可能な量に基づいて可能である。
【００３３】
本発明の脈絡の範囲内で、「ＮＴ−プロＥＴ−１」は、ヒトタンパク質またはポリペプチドとして解釈されるものとし、これは、プレプロエンドセリンから得ることができ、プレプロエンドセリンのフレームワーク内で（配列番号１および図１）、アミノ酸１８〜５２を有する遊離断片、ならびにそれから得ることができる断片または部分ペプチド、特に、プレプロＥＴ−１（配列番号１および図１）のＡＰＥＴＡＶＬＧＡＥＬＳＡＶ（配列番号２）Ｐｏｓ．１８〜３１、およびプレプロＥＴ−１（配列番号１および図１）のＧＥＮＧＧＥＫＰＴＰＳＰＰＷＲＬＲＲＳＫＲ（配列番号３）Ｐｏｓ．３２〜５２を含むことができる。さらに、本発明によるこれらのポリペプチドは、翻訳後修飾、例えば、グリコリゼーション（ｇｌｙｃｏｌｉｚａｔｉｏｎ）［原文のまま］、脂質結合または誘導体化などを有することができる。
【００３４】
さらなる実施形態では、ＮＴ−プロＥＴ−１、またはその断片および部分ペプチドの判定は、さらなるマーカー、具体的には、好ましくは、心疾患、特に冠動脈性心疾患、ならびに／または気道および肺の疾患を既に標的とするものとともにさらに実施することができる。
【００３５】
結果として、本発明は、判定が、炎症マーカー、心血管マーカー、神経ホルモンマーカー、または虚血マーカーの群から選択される少なくとも１つのさらなるマーカーを使用して、検査される患者においてさらに実施される、本発明による方法の実施形態に関する。
【００３６】
本発明によれば、炎症マーカーは、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、ＴＮＦ−αなどのサイトカイン、ＩＬ−６などのインターロイキン、プロカルシトニン（１〜１１６、３〜１１６）、およびＶＣＡＭまたはＩＣＡＭなどの接着分子の群の少なくとも１つのマーカーから選択することができ、心血管マーカーは、特に、心筋組織のネクローシスを示すマーカーとすることができ、血圧に影響するマーカーは、クレアチンキナーゼ、ミオグロビン、ミエロペルオキシダーゼ、ナトリウム利尿タンパク質、特にＡＮＰ（もしくはＡＮＦ）、プロＡＮＰ、ＮＴ−プロＡＮＰ、ＢＮＰ、プロＢＮＰ、ＮＴ−プロＢＮＰ、またはこれらの部分配列、心臓トロポニン、ＣＲＰの群の少なくとも１つのマーカーから選択することができる。さらに、これは、調節（プロ）ホルモン、特にプロ−ガストリン放出ペプチド（プロ−ＧＲＰ）、プロエンドセリン−２、プロ−エンドセリン−３、プロ−レプチン、プロ−神経ペプチドＹ、プロ−ソマトスタチン、プロ−神経ペプチドＹＹ、プロ−オピオンメラノコルチン（ｏｐｉｏｎｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎ）、プロ−アドレノメデュリン（プロ−ＡＤＭ）、プロ−バソプレッシン（プロ−ＡＶＰ）、またはこれらの部分配列も含むものとする。
【００３７】
虚血マーカーは、トロポニンＩおよびＴ、ＣＫ−ＭＢの群の少なくとも１つのマーカーから選択することができる。さらに、神経ホルモンマーカーは、少なくとも１つのさらなるナトリウム利尿タンパク質、特にＡＮＰ（もしくはＡＮＦ）、プロＡＮＰ、ＮＴ−プロＡＮＰ、ＢＮＰ、プロＢＮＰ、またはその部分配列とすることができる。
【００３８】
本発明のさらなる実施形態では、本発明による方法は、マーカーの並列または同時判定（例えば、９６以上のウェルを有するマルチタイタープレート）を使用して、インビトロ診断の一部として実施することができ、判定は、少なくとも１つの患者試料を使用して実施される。
【００３９】
さらに、本発明による方法およびその判定は、自動分析システムに基づく診断デバイス、特に、Ｋｒｙｐｔｏｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋｒｙｐｔｏｒ．ｎｅｔ／）によって実施することができる。
【００４０】
さらなる実施形態では、本発明による方法およびその判定は、個々のパラメーター判定であっても、複数のパラメーター判定であっても、迅速試験（側方流動試験またはポイントオブケアなど）を使用して実施することができる。特に好適な実施形態では、これは、自己テストまたは救急診断に適したデバイスである。
【００４１】
本発明はさらに、心疾患ならびに／もしくは気道および肺の疾患のリスク層別化を行い、かつ／あるいは心疾患ならびに／または気道および肺の疾患の早期もしくは鑑別診断、または予後のためのインビトロ診断を行うための、ＮＴ−プロＥＴ−１、またはその断片および部分ペプチドの使用に関する。
【００４２】
別の目的は、本発明による方法を実施するための、対応する診断デバイスまたはその使用を提供することである。
【００４３】
本発明の脈絡の範囲内で、そのような診断デバイスは、特に、アレイまたはアッセイ（イムノアッセイ、ＥＬＩＳＡなど）、最も広い意味において、本発明による方法を実施するためのデバイスとして解釈されるものとする。
【００４４】
本発明はさらに、ＮＴ−プロＥＴ−１、またはその断片および部分ペプチドを判定するための検出試薬、場合により上述したさらなるマーカーを含む、心疾患ならびに／または気道および肺の疾患の診断および／またはリスク層別化のためのキットに関する。そのような検出試薬は、例えば抗体などを含む。
【００４５】
以下の実施例および図面を、本発明をより詳細に説明するために提供するが、本発明を、これらの実施例および図面に限定しない。
【実施例】
【００４６】
実施例および図面
イムノアッセイ
Ｓｔｒｕｃｋら（Ｓｔｒｕｃｋ Ｊ、Ｍｏｒｇｅｎｔｈａｌｅｒ ＮＧ、Ｂｅｒｇｍａｎｎ Ａ． Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｐａｔｔｅｒｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−１ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｉｎ ｖｉｖｏ． Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ２００５年；２６巻；２４８２〜６頁）に記載されているように、ＮＴ−プロＥＴ−１を測定するためにサンドイッチイムノアッセイを使用した。
【００４７】
ペプチド合成：
プレプロＥＴ−１の既知のアミノ酸配列（図１）に由来して、２つの領域を選択した（Ｐｏｓ．１８〜３１、３２〜５２）。この領域は、可溶性ペプチドとして化学的に合成し、１つの場合では、標準的な方法を使用して、Ｎ末端システイン残基を補充し、精製し、その品質は、質量分析法および逆相ＨＰＬＣを使用して管理し、これらをアリコートとして凍結乾燥した（ＪＰＴ ｃｏｍｐａｎｙ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。このペプチドのアミノ酸配列は、プレプロＥＴ−１（図１）のＰＡＶ１５ ＣＡＰＥＴＡＶＬＧＡＥＬＳＡＶ ＰＯＳ．１８〜３１、プレプロＥＴ−１（図１）のＭＰＧＣ２２ ＧＥＮＧＧＥＫＰＴＰＳＰＰＷＲＬＲＲＳＫＲＣ ＰＯＳ．３２〜５２である。さらに、プレプロＥＴ−１の領域Ｐｏｓ．１８〜５２を含むペプチドを合成した（ＰＡＲ３５ ＡＰＥＴＡＶＬＧＡＥＬＳＡＶＧＥＮＧＧＥＫＰＴＰＳＰＰＷＲＬＲＲＳＫＲ）。
【００４８】
コンジュゲーションおよび免疫化
ＭＢＳ（ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）によって、ペプチドのＰＡＶ１５およびＭＰＧＣ２２を、ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシニアン）担体タンパク質にコンジュゲートさせた（ＰＩＥＲＣＥ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡからの指示シート「ＮＨＳ−Ｅｓｔｅｒｓ−Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒｓ」を参照されたい）。これらのコンジュゲートを、以下のレジメンに従って、ヒツジを免疫するのに使用した：それぞれのヒツジに、それぞれ４週間間隔で、最初に１００μｇのコンジュゲート（コンジュゲートのペプチド部分と比べた量の情報）を投与し、引き続いて５０μｇのコンジュゲート（コンジュゲートのペプチド部分と比べた量の情報）を投与した。免疫化を開始して４カ月目から始めて、それぞれのヒツジから４週間間隔で７００ｍｌの血液を採取し、この血液から遠心分離によって抗血清を得た。コンジュゲーション、免疫化、抗血清の生成は、ＭｉｃｒｏＰｈａｒｍ、Ｃａｒｍａｒｔｈｅｎｓｈｉｒｅ、ＵＫによって実施された。
【００４９】
抗体の精製
ワンステップ法では、ペプチド特異抗体は、免疫化して４カ月目から始めて生成してきた抗血清から生成した。この目的で、ペプチドのＰＡＶ１５およびＭＰＧＣ２２を、ＳｕｌｆｏＬｉｎｋゲルに最初にカップリングさせた（ＰＩＥＲＣＥ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡからの指示シート「ＳｕｌｆｏＬｉｎｋ Ｋｉｔ」を参照されたい）。カップリングのために、５ｍｌのゲル当たり、５ｍｇのペプチドを提供した。
【００５０】
このペプチドに対するヒツジ抗血清からのペプチド特異抗体の親和性精製は、以下のように実施した。
【００５１】
ペプチドカラムを、１０ｍｌの溶出緩衝液（５０ｍＭのクエン酸、ｐＨ２．２）と結合緩衝液（１００ｍＮのリン酸ナトリウム、０．１％のＴｗｅｅｎ、ｐＨ６．８）を交互に使用して、最初に３回洗浄した。１００ｍｌの抗血清を０．２μｍに対して濾過し、利用可能なカラム材料と混合した。この最後に、１０ｍｌの結合緩衝液を用いて、ゲルをカラムから定量的にすすいだ。インキュベーションを、旋回運動下で（ｕｎｄｅｒ ｐｉｖｏｔｉｎｇ ｍｏｔｉｏｎ）、室温で一晩実施した。これらのバッチを、空のカラム（ＮＡＰ２５、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、空にした）中に定量的に移した。通過物（ｐａｓｓ）を捨てた。引き続いて、洗浄ステップを、タンパク質を含まない２５０ｍｌの結合緩衝液（洗浄溶出液のタンパク質含量＜０．０２ Ａ２８０ｎｍ）を用いて実施した。洗浄したカラムに溶出緩衝液を添加し、それぞれ１ｍｌの分画を採取した。それぞれの分画について、タンパク質含量を、ＢＣＡ法を使用して求めた（ＰＩＥＲＣＥ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡからの指示シートを参照されたい）。
【００５２】
０．８ｍｇ／ｍｌ超のタンパク質濃度を有する分画をプールした。ＢＣＡ法を使用してプールのタンパク質を求めた後、抗ＰＡＶ１５抗体について２７ｍｇの収量を得、抗ＭＰＧＣ２２抗体について３５ｍｇの収量を得た。
【００５３】
標識
ＮＡＰ−５ゲル濾過カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して、５００μｌの精製した抗ＭＰＧＣ２２抗体（上記を参照されたい）を、指示シートに従って、１ｍｌの１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）中で緩衝液交換にかけた。抗体溶液のタンパク質濃度は、１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）を使用して１．５ｍｇ／ｍｌに調節した。
【００５４】
化学発光標識のために、抗体を以下のようにさらに処理した。６７μｌの抗体溶液を、１０ｍｌのＭＡ７０−Ａｋｒｉｄｉｎｉｕｍ−ＮＨＨ−エステル（１ｍｇ／ｍｌ；ＨＯＥＣＨＳＴ Ｂｅｈｒｉｎｇ）と混合し、室温で１５分間インキュベートした。次いで４２３μｌの１Ｍのグリシンを添加し、さらに１０分間インキュベートした。引き続いて、標識バッチを、指示シートに従って、ＮＡＰ−５ゲル濾過カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して、１ｍｌの溶離液Ａ（５０ｍＭのリン酸カリウム、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中で緩衝液交換にかけ、この過程中で、低分子成分を除いた。抗体に結合していない残りの標識を分離するために、ゲル濾過ＨＰＬＣを実施した（カラム：Ｗａｔｅｒｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐａｋ ＳＷ ３００）。試料を適用し、溶離液Ａを使用して、１ｍｌ／ｍｌの流速でクロマトグラフィーによって分離した。測光器を使用して、波長２８０ｎｍおよび３６８ｎｍを測定した。抗体標識の程度の尺度としての３６８ｎｍ／２８０ｎｍの吸収比は、ピークで０．１０＋／−０．０１であった。モノマー抗体含有分画（保持時間８〜１０分）を採取し、３ｍｌの１００ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５％のウシ血清アルブミン、０．１％アジ化ナトリウム、ｐＨ７．４中に入れた。
【００５５】
カップリング
照射した（ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ）５ｍｌのポリスチレン管（Ｇｒｅｉｎｅｒ）を、精製した抗ＰＡＶ１５抗体で以下のようにコーティングした。抗体を、５０ｍＭのトリス、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．８中で、６．６μｇ／ｍｌの濃度に希釈した。３００μｌのこの溶液を、それぞれの管にピペットで移した。この管を、２２℃で２０時間インキュベートした。この溶液を吸引した。次いで、それぞれの管を、４．２ｍｌの１０ｍＭのリン酸ナトリウム、２％のＫａｒｉｏｎ ＦＰ、０．３％のウシ血清アルブミン、ｐＨ６．５で満たした。２０時間後に、溶液を吸引した。最後に、管を真空乾燥機で乾燥させた。
【００５６】
イムノアッセイの実施および評価
使用した標準物質は、ペプチドＰＡＲ３５であり、これを、通常のウマ血清（ＳＩＧＭＡ）で連続的に希釈した。このようにして作製した標準物質は、最初のペプチド重量に従って、濃縮物（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）に割り当てた。
【００５７】
サンドイッチイムノアッセイは、以下のように開始した。５０μｌの標準物質または試料、および１００万ＲＬＵ（相対光単位）のＭＡ７０標識抗体を含む２００μｌのアッセイ緩衝液（１００ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５％のウシ血清アルブミン、０．１％の非特異的ヒツジＩｇＧ、０．１％のアジ化ナトリウム、ｐＨ７．４）を、抗体でコーティングしたそれぞれの試験管中にピペットで移した。振盪しながら２２℃で２時間、インキュベーションを行った。次いで、管１本当たりそれぞれ１ｍｌの洗浄溶液（０．１％のＴｗｅｅｎ ２０）を使用して、４回の洗浄ステップを実施し、液体は滴り落とさせ、管に結合した化学発光を、ルミノメーター（ＢＥＲＴＨＯＬＤ、ＬＢ９５２Ｔ；塩基試薬ＢＲＡＨＭＳ ＡＧ）を使用して測定した。ＭｕｌｔｉＣａｌｃ（Ｓｐｌｉｎｅ Ｆｉｔ）ソフトウェアを使用して、試料のＮＴ−プロＥＴ−１濃度を検量線から読み取った。
【００５８】
説明したアッセイを使用して測定することができる分析物は、Ｎ末端プロエンドセリン−１（ＮＴ−プロＥＴ−１）と呼ばれる。
【００５９】
臨床価（ｃｌｉｎｉｃａｌ ｖａｌｅｎｃｙ）
正常範囲
ＮＴ−プロＥＴ−１濃度を、健康な対照のヒト（ｎ＝２００）の試料中で求めた。中央値は、３０．５ｐｍｏｌ／ｌであり、測定された最小値は２．０であり、最高値は５３ｐｍｏｌ／ｌであり、第９５百分位数は、１６．３および４７．２ｐｍｏｌ／ｌであった。
【００６０】
心不全／重症度
ＮＴ−プロＥＴ−１濃度を、慢性または急性非代償性心不全を有する患者について測定した。ＮＴ−プロＥＴ−１濃度は、心不全の重症度、特に重症度の増大に関連していた。４つの重症度の分類であるＮＹＨＡ Ｉ〜ＩＶについてのＮＴ−プロＥＴ−１濃度の中央値は、３５．４、３７．３、４５．５および８３．９ｐｍｏｌ／Ｌであった（図２を参照されたい）。
【００６１】
慢性心不全／診断
ＮＴ−プロＥＴ−１値を、慢性心不全を罹患している３１６人の患者、および２００人の健康な対照患者のプールから求めた。受信者動作特性分析は、０．７２のＡＵＣを示した。４９．７ｐｍｏｌ／ｌのカットオフ値について、これは、３４．３％の感受性を生じ、特異性は９８％であった。４７．２ｐｍｏｌ／ｌのカットオフ値について、これは、３８．５％の感受性を生じ、特異性は９５％であった。
【００６２】
慢性心不全／予後
ＮＴ−プロＥＴ−１値を、慢性心不全を罹患している３１６人の患者のプールから求めた。患者は、３６０日の平均期間モニターした。この期間の間に、４２人の患者が死亡し、２７４人が生存した。受信者動作特性分析を使用して、死亡率の予後について、最良のカットオフ値（感受性と特異性の最大の積として定義される）を求めた：５１．３ｐｍｏｌ／ｌ。このカットオフ値で、予後の感受性は７１．４％であり、特異性は７４．５％であった。５１．３ｐｍｏｌ／ｌのカットオフ値で、死亡の尤度比は２．８であった。
【００６３】
【表１】
急性心不全／診断
ＮＴ−プロＥＴ−１値を、急性の息切れを罹患している１２５人の患者のプールから求めた。１２５人の患者のうち６９人が心不全を罹患した。心不全の鑑別診断についての受信者動作特性分析は、０．７２のＡＵＣを示した。１１１ｐｍｏｌ／ｌのカットオフ値について、これは、１０．２％の感受性を生じ、特異性は９８％であった。９０．５ｐｍｏｌ／ｌのカットオフ値について、これは、１７．５％の感受性を生じ、特異性は９５％であった。
【００６４】
急性心不全／予後
ＮＴ−プロＥＴ−１値を、急性非代償性心不全を罹患している６９人の患者のプールから求めた。患者は、３６０日の期間モニターした。この期間の間に、２１人の患者が死亡し、４８人が生存した。受信者動作特性分析を使用して、死亡率の予後について、最良のカットオフ値（感受性と特異性の最大の積として定義される）を求めた：６４ｐｍｏｌ／ｌ。このカットオフ値で、予後の感受性は６６．６％であり、特異性は６８．７％であった。６４ｐｍｏｌ／ｌのカットオフ値で、死亡の尤度比は２．０であった。
【００６５】
【表２】
心筋梗塞／予後
試料を、心発作が起きてから３日後に急性心発作のあった２４６人の患者から得、ＮＴ−プロＥＴ−１を測定した。患者は、６０日の期間モニターした。この期間の間に、２２０人の患者は、有害事象をまったく有さず、２６人は、心不全のために死亡したか、再び入院した。受信者動作特性分析（ＡＵＣ＝０．７０）を使用して、心不全による死亡率または再入院の予後について、最良のカットオフ値（感受性と特異性の最大の積として定義される）を求めた：６３．９ｐｍｏｌ／ｌ。このカットオフ値で、予後の感受性は６５．４％であり、特異性は７３．６％であった。６３．９ｐｍｏｌ／ｌのカットオフ値で、有害事象の尤度比は２．５であった。
【００６６】
【表３】
肺炎／重症度および予後
試料を、病院に入院したとき市中感染性肺炎を有していた１４２人の患者から得、ＮＴ−プロＥＴ−１を測定した。患者は、７０日の期間モニターした。この期間の間に、１０人の患者が死亡した。ＮＴ−プロＥＴ−１濃度は、ＰＳＩ（肺炎重症度指数）、疾患の重症度のスコアとともに上昇し（図３）、５３ｐｍｏｌ／ｌで、これらの患者は、平均で、健康な対照患者（３０．５ｐｍｏｌ／ｌ）より高かった。死亡率の予後について、受信者動作特性分析は、０．８９のＡＵＣを示した。受信者動作特性分析を使用して、死亡率の予後について、最良のカットオフ値（感受性と特異性の最大の積として定義される）を求めた：７７ｐｍｏｌ／ｌ。このカットオフ値で、予後の感受性は１００％であり、特異性は８１．２％であった。７７ｐｍｏｌ／ｌのカットオフ値で、死亡率の尤度比は５．５であった。
【００６７】
【表４】
増悪したＣＯＰＤ
ＮＴ−プロＥＴ−１を、慢性閉塞性肺疾患および同時に下気道の感染症を有する５３人の患者について測定した。４７ｐｍｏｌ／ｌの平均で、これらの患者は、健康な対照患者（３０．５ｐｍｏｌ／ｌ）と比較して高い値を有していたが、肺炎患者（上記の５３ｐｍｏｌ／ｌを参照されたい）より低かった。
【００６８】
表：ニューヨーク心臓協会（ＮＨＹＡ）の分類
ＮＹＨＡ Ｉ 身体活動の制限なし。通常の身体活動は、過度の疲労、リズム障害、呼吸困難または狭心症を引き起こさない。
ＮＹＨＡ ＩＩ 身体活動のわずかな制限。安静時は快適であるが、通常の身体活動が、疲労、リズム障害、呼吸困難または狭心症をもたらす。
ＮＹＨＡ ＩＩＩ 身体活動の著しい制限。安静時は快適であるが、通常より低い身体活動が、疲労、リズム障害、呼吸困難または狭心症を引き起こす。
ＮＹＨＡ ＩＶ 不快感を伴うことなく、いずれの身体活動も実施することができず、安静時も不快である。寝たきりである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
心疾患ならびに／または肺および気道の疾患のインビトロ診断および／またはリスク層別化のための方法であって、検査される患者において、遊離断片のＮＴ−プロＥＴ−１（１８〜５２）、またはその断片および部分ペプチドの判定が実施されることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記心疾患が、急性冠状動脈症候群、心筋梗塞後、および心不全から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の、心疾患の診断および／またはリスク層別化のための方法。
【請求項３】
前記肺および気道の疾患が細菌、ウイルス、真菌または寄生虫によって生じる感染症、特に下気道感染症（ＬＲＴＩ）、気管支炎、肺炎、サルコイドーシス、気管支拡張症、非心臓性肺水腫ならびに／または肺および気道の慢性疾患、特に間質性肺疾患および肺線維症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、特にＣＯＰＤ感染増悪、気管支喘息、特に気管支喘息を伴った感染増悪から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の、肺および気道の疾患の診断および／またはリスク層別化のための方法。
【請求項４】
心疾患ならびに／または肺および気道の疾患について、リスクが増大しており、かつ／または予後が好ましくない患者を識別するための、請求項１〜３のいずれか一項に記載の、診断および／またはリスク層別化のための方法。
【請求項５】
前記患者が、症候性および／または無症候性の患者、特に救急患者である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の、診断および／またはリスク層別化のための方法。
【請求項６】
特に集中治療または救急治療における、心疾患ならびに／または肺および気道の疾患の療法を管理するための、請求項１〜５のいずれか一項に記載の、診断および／またはリスク層別化のための方法。
【請求項７】
患者を入院させる決定を含めた臨床的な決定、特に集中治療または救急治療における、特に薬剤を使用する高度な治療および療法を実施するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の、心疾患ならびに／または肺および気道の疾患の診断および／またはリスク層別化のための方法。
【請求項８】
予後、早期検出および鑑別診断による検出、重症度の評価、および療法に付随する疾患の経過の評価のための、請求項１〜７のいずれか一項に記載の、心疾患ならびに／または肺および気道の疾患の診断および／またはリスク層別化のための方法。
【請求項９】
さらに、炎症マーカー、心血管マーカー、神経ホルモンマーカー、または虚血マーカーの群から選択される少なくとも１つのさらなるマーカーの判定が実施されることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記炎症マーカーが、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、ＴＮＦ−αなどのサイトカイン、ＩＬ−６などのインターロイキン、プロカルシトニン（１〜１１６、３〜１１６）、およびＶＣＡＭまたはＩＣＡＭなどの接着分子の群の少なくとも１つのマーカーから選択されることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記心血管マーカーが、クレアチンキナーゼ、ミオグロビン、ミエロペルオキシダーゼ、ナトリウム利尿タンパク質、特にＡＮＰ（もしくはＡＮＦ）、プロＡＮＰ、ＮＴ−プロＡＮＰ、ＢＮＰ、プロＢＮＰ、ＮＴ−プロＢＮＰ、またはこれらの部分配列、心臓トロポニン、ＣＲＰ、およびまた調節（プロ）ホルモン、例えば、プロ−ガストリン放出ペプチド（プロ−ＧＲＰ）、プロ−エンドセリン−２、プロ−エンドセリン−３、プロ−レプチン、プロ−神経ペプチドＹ、プロ−ソマトスタチン、プロ−神経ペプチドＹＹ、プロ−オピオンメラノコルチン、プロ−アドレノメデュリン（プロ−ＡＤＭ）、プロ−バソプレッシン（プロ−ＡＶＰ）、またはこれらの部分配列の群の少なくとも１つのマーカーから選択されることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記虚血マーカーが、トロポニンＩおよびＴ、ＣＫ−ＭＫの群の少なくとも１つのマーカーから選択されることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記神経ホルモンマーカーが、少なくとも１つのナトリウム利尿タンパク質、特にＡＮＰ（もしくはＡＮＦ）、プロＡＮＰ、ＮＴ−プロＡＮＰ、ＢＮＰ、プロＢＮＰ、ＮＴ−プロＢＮＰ、またはこれらの部分配列であることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記マーカーの並列または同時の判定が実施されることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記判定が、少なくとも１つの患者試料を使用して実施されることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記判定が、自動分析システムを使用して、特にＫｒｙｐｔｏｒによって実施されることを特徴とする、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記判定が、特に個々または複数のパラメーター判定において、迅速試験を使用して実施されることを特徴とする、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
心疾患ならびに／または肺および気道の疾患の診断および／またはリスク層別化のための、遊離断片のＮＴ−プロＥＴ−１、またはその断片ならびに部分ペプチド、ならびに場合により請求項９から１３のいずれか一項に記載のさらなるマーカーの使用。
【請求項１９】
遊離断片のＮＴ−プロＥＴ−１、またはその断片および部分ペプチドを判定するための検出試薬、ならびに場合により請求項９から１３のいずれか一項に記載のさらなるマーカー、および補助因子を含む、心疾患ならびに／または肺および気道の疾患の診断および／またはリスク層別化のためのキット。
【請求項２０】
請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法を実施するための診断デバイス。
【請求項１】
心疾患ならびに／または肺および気道の疾患のインビトロ診断および／またはリスク層別化のための方法であって、検査される患者において、遊離断片のＮＴ−プロＥＴ−１（１８〜５２）、またはその断片および部分ペプチドの判定が実施されることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記心疾患が、急性冠状動脈症候群、心筋梗塞後、および心不全から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の、心疾患の診断および／またはリスク層別化のための方法。
【請求項３】
前記肺および気道の疾患が細菌、ウイルス、真菌または寄生虫によって生じる感染症、特に下気道感染症（ＬＲＴＩ）、気管支炎、肺炎、サルコイドーシス、気管支拡張症、非心臓性肺水腫ならびに／または肺および気道の慢性疾患、特に間質性肺疾患および肺線維症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、特にＣＯＰＤ感染増悪、気管支喘息、特に気管支喘息を伴った感染増悪から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の、肺および気道の疾患の診断および／またはリスク層別化のための方法。
【請求項４】
心疾患ならびに／または肺および気道の疾患について、リスクが増大しており、かつ／または予後が好ましくない患者を識別するための、請求項１〜３のいずれか一項に記載の、診断および／またはリスク層別化のための方法。
【請求項５】
前記患者が、症候性および／または無症候性の患者、特に救急患者である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の、診断および／またはリスク層別化のための方法。
【請求項６】
特に集中治療または救急治療における、心疾患ならびに／または肺および気道の疾患の療法を管理するための、請求項１〜５のいずれか一項に記載の、診断および／またはリスク層別化のための方法。
【請求項７】
患者を入院させる決定を含めた臨床的な決定、特に集中治療または救急治療における、特に薬剤を使用する高度な治療および療法を実施するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の、心疾患ならびに／または肺および気道の疾患の診断および／またはリスク層別化のための方法。
【請求項８】
予後、早期検出および鑑別診断による検出、重症度の評価、および療法に付随する疾患の経過の評価のための、請求項１〜７のいずれか一項に記載の、心疾患ならびに／または肺および気道の疾患の診断および／またはリスク層別化のための方法。
【請求項９】
さらに、炎症マーカー、心血管マーカー、神経ホルモンマーカー、または虚血マーカーの群から選択される少なくとも１つのさらなるマーカーの判定が実施されることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記炎症マーカーが、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、ＴＮＦ−αなどのサイトカイン、ＩＬ−６などのインターロイキン、プロカルシトニン（１〜１１６、３〜１１６）、およびＶＣＡＭまたはＩＣＡＭなどの接着分子の群の少なくとも１つのマーカーから選択されることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記心血管マーカーが、クレアチンキナーゼ、ミオグロビン、ミエロペルオキシダーゼ、ナトリウム利尿タンパク質、特にＡＮＰ（もしくはＡＮＦ）、プロＡＮＰ、ＮＴ−プロＡＮＰ、ＢＮＰ、プロＢＮＰ、ＮＴ−プロＢＮＰ、またはこれらの部分配列、心臓トロポニン、ＣＲＰ、およびまた調節（プロ）ホルモン、例えば、プロ−ガストリン放出ペプチド（プロ−ＧＲＰ）、プロ−エンドセリン−２、プロ−エンドセリン−３、プロ−レプチン、プロ−神経ペプチドＹ、プロ−ソマトスタチン、プロ−神経ペプチドＹＹ、プロ−オピオンメラノコルチン、プロ−アドレノメデュリン（プロ−ＡＤＭ）、プロ−バソプレッシン（プロ−ＡＶＰ）、またはこれらの部分配列の群の少なくとも１つのマーカーから選択されることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記虚血マーカーが、トロポニンＩおよびＴ、ＣＫ−ＭＫの群の少なくとも１つのマーカーから選択されることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記神経ホルモンマーカーが、少なくとも１つのナトリウム利尿タンパク質、特にＡＮＰ（もしくはＡＮＦ）、プロＡＮＰ、ＮＴ−プロＡＮＰ、ＢＮＰ、プロＢＮＰ、ＮＴ−プロＢＮＰ、またはこれらの部分配列であることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記マーカーの並列または同時の判定が実施されることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記判定が、少なくとも１つの患者試料を使用して実施されることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記判定が、自動分析システムを使用して、特にＫｒｙｐｔｏｒによって実施されることを特徴とする、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記判定が、特に個々または複数のパラメーター判定において、迅速試験を使用して実施されることを特徴とする、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
心疾患ならびに／または肺および気道の疾患の診断および／またはリスク層別化のための、遊離断片のＮＴ−プロＥＴ−１、またはその断片ならびに部分ペプチド、ならびに場合により請求項９から１３のいずれか一項に記載のさらなるマーカーの使用。
【請求項１９】
遊離断片のＮＴ−プロＥＴ−１、またはその断片および部分ペプチドを判定するための検出試薬、ならびに場合により請求項９から１３のいずれか一項に記載のさらなるマーカー、および補助因子を含む、心疾患ならびに／または肺および気道の疾患の診断および／またはリスク層別化のためのキット。
【請求項２０】
請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法を実施するための診断デバイス。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２０１０−５２６３０５（Ｐ２０１０−５２６３０５Ａ）
【公表日】平成２２年７月２９日（２０１０．７．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５０６８００（Ｐ２０１０−５０６８００）
【出願日】平成２０年５月８日（２００８．５．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＤＥ２００８／０００７８１
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１３５０３８
【国際公開日】平成２０年１１月１３日（２００８．１１．１３）
【出願人】（５０９０９１３３２）ブラームズ アクチェンゲゼルシャフト (12)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年７月２９日（２０１０．７．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年５月８日（２００８．５．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＤＥ２００８／０００７８１
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１３５０３８
【国際公開日】平成２０年１１月１３日（２００８．１１．１３）
【出願人】（５０９０９１３３２）ブラームズ アクチェンゲゼルシャフト (12)
【Ｆターム（参考）】
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