Ｎｏｇｏレセプターアンタゴニストを使用するドーパミンニューロン変性に関する状態の処置
本発明は、Ｎｏｇｏレセプターを使用して、ドーパミンニューロン変性の徴候または症状を示す哺乳動物（パーキンソン病を有するヒトが挙げられる）におけるドーパミンニューロンの再生または生存を促進するための方法を提供する。上記哺乳動物に、治療有効量のＮｇＲ１アンタゴニストを投与する工程を包含する上記方法を提供する。さらに、上記ＮｇＲ１アンタゴニストを中枢神経系に直接投与する上記方法を提供する。また、上記ＮｇＲ１アンタゴニストを黒質または線条に直接投与する上記方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、神経生物学および薬理学に関する。より詳細には、本発明は、Ｎｏｇｏレセプター−１アンタゴニストの投与によってドーパミンニューロン変性に関する状態を処置する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
特定の神経変性障害は、ドーパミンニューロンの変性により特徴付けられる。例えば、パーキンソン病は、中脳の黒質におけるドーパミンニューロンの進行性の破壊と関連している。この破壊は、化学的伝達物質ドーパミンのレベルの減少を生じる。パーキンソン病の肉体的な症状としては、随意運動の欠陥および特徴的な震えを生じる筋肉の群の制御できない律動性の単収縮が挙げられる。
【０００３】
パーキンソン病のための最も広く使用される処置は、ドーパミン前駆体であるＬ−ドーパ（Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン）の投与であり、Ｌ−ドーパは、失われたドーパミンに取って代わることにより間接的に作用する。しかし、不都合な点は、Ｌ−ドーパの使用と関連している。患者は、多くの場合、運動障害、悪心、嘔吐、腹部膨満、および精神医学的な副作用のような副作用を罹患し、患者は、代表的に時間の経過につれてＬ−ドーパ処置にあまり応答しなくなる。シナプス後のドーパミンアゴニストを使用する治療の代替的な形態も副作用を伴う。さらに、Ｌ−ドーパ処置は、患者の生活の質を改善するが、疾患の進行を停止しない。
【０００４】
グリア細胞由来の神経栄養性因子（ＧＤＮＦ）のような他の化合物は、慢性注入によって送達される場合、ヒト患者におけるパーキンソン病の処置に見込みを示した。例えば、非特許文献１を参照のこと。しかし、これらの処置レジメンは、なお開発の初期段階のものである。
【０００５】
多くの他の疾患および障害は、ドーパミンニューロンの変性を伴い得る。これらとしては、多系統萎縮症、線条体黒質変性症、オリーブ橋小脳萎縮、シャイ−ドレーガー症候群、パーキンソン症候群の特徴を有する運動ニューロン疾患、レヴィー小体痴呆、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、前頭側頭葉型痴呆、パーキンソン症候群を伴うアルツハイマー病、ウィルソン病、ハレルフォルデン−シュパッツ症候群、チェディアック−東病、ＳＣＡ−３ 脊髄小脳性運動失調、Ｘ連鎖ジストニーパーキンソン症候群（ＤＹＴ３）、ハンティングトン病（ヴェストファル改変体）、プリオン病、脳血管性パーキンソン症候群、脳性麻痺、繰り返しの頭部外傷、脳炎後のパーキンソン症候群および神経梅毒が挙げられる。
【非特許文献１】Ｇｉｌｌら、「Ｄｉｒｅｃｔ ｂｒａｉｎ ｉｎｆｕｓｉｏｎ ｏｆ ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ ｄｉｓｅａｓｅ」、２００３年、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．、第９巻、ｐ．５８９−９５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、パーキンソン病およびドーパミンニューロンの変性によって特徴付けられる他の状態のためのさらなる処置方法に対する必要性が依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、Ｎｏｇｏレセプター−１アンタゴニストの投与による、ドーパミンニューロン変性に関連する状態（パーキンソン病が挙げられる）の処置の方法に関する。
【０００８】
いくつかの実施形態において、本発明は、ドーパミンニューロン変性の徴候または症状を示す哺乳動物に、治療有効量のＮｇＲ１アンタゴニストを投与する工程を包含する、そのような哺乳動物におけるドーパミンニューロンの再生または生存を促進する方法を提供する。
【０００９】
いくつかの実施形態において、ＮｇＲ１アンタゴニストは、中枢神経系に直接投与される。いくつかの実施形態において、ＮｇＲ１アンタゴニストは、黒質または線条に直接投与される。いくつかの実施形態において、ＮｇＲ１アンタゴニストは、ボーラス注射または慢性注入によって投与される。
【００１０】
いくつかの実施形態において、ＮｇＲ１アンタゴニストは、可溶性形態の哺乳動物のＮｇＲ１を含む。いくつかの実施形態において、可溶性形態の哺乳動物のＮｇＲ１は、ヒトＮｇＲ１（配列番号３）のアミノ酸２６〜３１０を含み、このアミノ酸は、１０個までの保存的アミノ酸置換を有し、機能性膜貫通ドメインおよび機能性シグナルペプチドの両方を欠如する。いくつかの実施形態において、可溶性形態の哺乳動物のＮｇＲ１は、ヒトＮｇＲ１（配列番号４）のアミノ酸２６〜３４４を含み、このアミノ酸は、１０個までの保存的アミノ酸置換を有し、機能性膜貫通ドメインおよび機能性シグナルペプチドの両方を欠如する。いくつかの実施形態において、可溶性形態の哺乳動物のＮｇＲ１は、ラットＮｇＲ１（配列番号５）のアミノ酸２７〜３１０を含み、このアミノ酸は、１０個までの保存的アミノ酸置換を有し、機能性膜貫通ドメインおよび機能性シグナルペプチドの両方を欠如する。いくつかの実施形態において、可溶性形態の哺乳動物のＮｇＲ１は、ラットＮｇＲ１（配列番号６）のアミノ酸２７〜３４４を含み、このアミノ酸は、１０個までの保存的アミノ酸置換を有し、機能性膜貫通ドメインおよび機能性シグナルペプチドの両方を欠如する。
【００１１】
いくつかの実施形態において、可溶性形態の哺乳動物のＮｇＲ１は、さらに融合部分を含む。いくつかの実施形態において、この融合部分は、免疫グロブリン部分である。いくつかの実施形態において、この免疫グロブリン部分は、Ｆｃ部分である。
【００１２】
いくつかの実施形態において、本発明の方法に使用されるＮｇＲ１アンタゴニストは、哺乳動物のＮｇＲ１に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。いくつかの実施形態において、この抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、Ｆｄフラグメント、二重特異性抗体および単鎖抗体からなる群より選択される。
【００１３】
いくつかの実施形態において、この抗体またはその抗原結合フラグメントは、以下：ＨＢ ７Ｅ１１（ＡＴＣＣ（登録商標）登録番号ＰＴＡ−４５８７）、ＨＢ １Ｈ２（ＡＴＣＣ（登録商標）登録番号ＰＴＡ−４５８４）、ＨＢ ３Ｇ５（ＡＴＣＣ（登録商標）登録番号ＰＴＡ−４５８６）、ＨＢ ５Ｂ１０（ＡＴＣＣ（登録商標）登録番号ＰＴＡ−４５８８）およびＨＢ ２Ｆ７（ＡＴＣＣ（登録商標）登録番号ＰＴＡ−４５８５）からなる群より選択されるハイブリドーマによって産生されたモノクローナル抗体に結合されたポリペプチドに結合する。いくつかの実施形態において、このモノクローナル抗体は、ＨＢ ７Ｅ１１ハイブリドーマによって産生される。いくつかの実施形態において、この抗体またはその抗原結合フラグメントは、以下：
【００１４】
【化３】
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合する
いくつかの実施形態において、本発明の方法に使用されるＮｇＲ１アンタゴニストの治療有効量は、０．００１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態において、この治療有効量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１．０ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態において、この治療有効量は、０．０５ｍｇ／ｋｇ〜０．５ｍｇ／ｋｇである。
【００１５】
いくつかの実施形態において、ドーパミンニューロン変性は、パーキンソン病、多系統萎縮症、線条体黒質変性症、オリーブ橋小脳萎縮、シャイ−ドレーガー症候群、パーキンソン症候群の特徴を有する運動ニューロン疾患、レヴィー小体痴呆、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、前頭側頭葉型痴呆、パーキンソン症候群を伴うアルツハイマー病、ウィルソン病、ハレルフォルデン−シュパッツ症候群、チェディアック−東病、ＳＣＡ−３ 脊髄小脳性運動失調、Ｘ連鎖ジストニーパーキンソン症候群（ＤＹＴ３）、ハンティングトン病（ヴェストファル改変体）、プリオン病、脳血管性パーキンソン症候群、脳性麻痺、繰り返しの頭部外傷、脳炎後のパーキンソン症候群および神経梅毒からなる群より選択される疾患または障害と関連している。
【００１６】
いくつかの実施形態において、本発明は、治療有効量のＮｇＲ１アンタゴニストを哺乳動物に投与する工程を包含する、パーキンソン病を処置する方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
（発明の詳細な説明）
他に定義しない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者の一人によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。対立する場合、定義を含む本発明の適用が制御する。また、文脈によって他に必要とされない限り、単数形の用語は、複数を包含し、複数形の単語は、単数を包含する。本明細書中に述べられる全ての出版物、特許および他の参考文献は、個々の出版物または特許出願がそれぞれ個々に具体的に参考として援用されることが示されるように、全ての目的のためにその全体が参考として援用される。
【００１８】
本明細書中に記載される方法および材料に類似するか、等価である方法および材料が、本発明の実施または試験に使用され得るが、適切な方法および材料は、以下に記載される。その材料、方法および実施例は、例示のためのみのものであり、限定することを意図しない。本発明の他の特徴および利点は、詳細な記述および特許請求の範囲から明らかになる。
【００１９】
明細書および特許請求の範囲の全体を通して、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」またはその変形（例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、任意の列挙された整数または整数の群を包含することを示すが、任意のほかの整数または整数の群を排除することを示さない。
【００２０】
本発明をさらに定義するために、以下の用語および定義が提供される。
【００２１】
本明細書中で使用される場合、「抗体」は、インタクトな免疫グロブリンまたはその抗原結合フラグメントを意味する。本発明の抗体は、任意のアイソタイプまたはクラス（例えば、Ｍ、Ｄ、Ｇ、ＥおよびＡ）の抗体、または任意のサブクラス（例えば、Ｇ１−４、Ａ１−２）の抗体であり得、カッパ（κ）軽鎖またはラムダ（λ）軽鎖のどちらかを有し得る。
【００２２】
本明細書中で使用される場合、「ヒト化抗体」は、非ヒト配列の少なくとも一部が、ヒト配列で置換されている抗体を意味する。ヒト化抗体をどのようにして作製するかの例は、米国特許第６，０５４，２９７号および同第５，８８６，１５２号および同第５，８７７，２９３号に見出され得る。
【００２３】
本明細書中で使用される場合、「治療有効量」とは、所望の治療結果を達成するために必要な投薬量および時間において有効である量をいう。
【００２４】
本明細書中で使用される場合、「予防有効量」とは、所望の予防的結果を達成するために必要な投薬量および時間において有効である量をいう。代表的に、予防的用量は、疾患のより早い段階の前、またはその段階で被験体に使用されるので、予防有効量は、治療有効量より少ない。
【００２５】
本明細書中で使用される場合、「患者」は、哺乳動物（例えば、ヒト）を意味する。
【００２６】
本明細書中で使用される場合、「融合タンパク質」は、別の（一般的には異種の）ポリペプチドに融合したポリペプチドを含むタンパク質を意味する。
【００２７】
本明細書中で使用される場合、「Ｎｏｇｏレセプターアンタゴニスト」は、Ｎｏｇｏレセプター−１のリガンド（例えば、ＮｏｇｏＡ、ＮｏｇｏＢ、ＮｏｇｏＣ、ＭＡＧ、ＯＭ−ｇｐ）への結合を阻害する分子を意味する。
【００２８】
本明細書中で使用される場合、「Ｎｏｇｏレセプターポリペプチド」は、全長Ｎｏｇｏレセプター−１タンパク質およびそのフラグメントの両方を包含する。
【００２９】
本発明は、Ｎｏｇｏレセプターアンタゴニストを用いた処置が、損傷後のドーパミン作用性経路の改善された回復、およびドーパミンニューロン変性から生じる症状の顕著な改善を提供するという発見に基づいている。
【００３０】
（Ｎｏｇｏレセプターアンタゴニスト）
任意のＮｏｇｏレセプターアンタゴニストが、本発明の方法に使用され得る。本発明の方法に使用され得るＮｏｇｏレセプターアンタゴニストとしては、例えば、可溶性Ｎｏｇｏレセプターポリペプチド；Ｎｏｇｏレセプタータンパク質に対する抗体およびその抗原結合フラグメント；ならびに低分子アンタゴニストが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３１】
（可溶性Ｎｏｇｏレセプター−１ポリペプチド）
本発明のいくつかの実施形態において、アンタゴニストは、可溶性Ｎｏｇｏレセプター−１ポリペプチドである（Ｎｏｇｏレセプター−１はまた多様に、「Ｎｏｇｏレセプター」、「ＮｏｇｏＲ」、「ＮｏｇｏＲ−１」、「ＮｇＲ」および「ＮｇＲ−１」と呼ばれる）。全長Ｎｏｇｏレセプター−１は、シグナル配列、Ｎ末端領域（ＮＴ）、８個のロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）、ＬＲＲＣＴ領域（８個のロイシンリッチリピートのロイシンリッチリピートドメインＣ末端）、Ｃ末端領域（ＣＴ）およびＧＰＩアンカーからなる。全長ヒトＮｏｇｏレセプターの配列および全長ラットＮｏｇｏレセプターの配列を表１に示す。
【００３２】
（表１．ヒトＮｏｇｏレセプター−１ポリペプチドの配列およびラットＮｏｇｏレセプター−１ポリペプチドの配列）
【００３３】
【表１】
本発明の方法に使用される可溶性Ｎｏｇｏレセプターポリペプチドは、ＮＴドメイン、８個のＬＲＲおよびＬＲＲＣＴドメインを含み、シグナル配列および機能性ＧＰＩアンカーを欠如する（すなわち、ＧＰＩアンカーが存在しないか、または細胞膜へ効率的に結合しないＧＰＩアンカーを有する）。適切なポリペプチドとしては、例えば、ヒトＮｏｇｏレセプターのアミノ酸２６〜３１０（配列番号３）およびアミノ酸２６〜３４４（配列番号４）、ならびにラットＮｏｇｏレセプターのアミノ酸２７〜３１０（配列番号５）およびアミノ酸２７〜３４４（配列番号６）が挙げられる（表２）。本発明の方法に使用され得るさらなるポリペプチドは、例えば、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０２／３２００７号および同ＰＣＴ／ＵＳ０３／２５００４号に記載されている。
【００３４】
（表２．ヒトおよびラット由来の可溶性Ｎｏｇｏレセプターポリペプチド）
【００３５】
【表２】
融合タンパク質の構成要素である可溶性Ｎｏｇｏレセプターポリペプチドはまた、本発明の方法に使用され得る。いくつかの実施形態において、融合タンパク質の異種の部分は、免疫グロブリン定常ドメインである。いくつかの実施形態において、この免疫グロブリン定常ドメインは、重鎖定常ドメインである。
いくつかの実施形態において、この異種ポリペプチドは、Ｆｃフラグメントである。いくつかの実施形態において、Ｆｃは、可溶性ＮｏｇｏレセプターポリペプチドのＣ末端に結合している。いくつかの実施形態において、この融合Ｎｏｇｏレセプタータンパク質は二量体である。
【００３６】
（抗体）
本発明の方法は、免疫原性Ｎｏｇｏレセプター−１ポリペプチドに特異的に結合し、Ｎｏｇｏレセプター−１のリガンド（例えば、ＮｏｇｏＡ、ＮｏｇｏＢ、ＮｏｇｏＣ、ＭＡＧ、ＯＭ−ｇｐ）への結合を阻害する抗体またはその抗原結合フラグメントを使用して実施され得る。本発明の方法に使用される抗体または抗原結合フラグメントは、インビボまたはインビトロで産生され得る。いくつかの実施形態において、抗Ｎｏｇｏレセプター−１抗体またはその抗原結合フラグメントは、マウスまたはヒトのものである。いくつかの実施形態において、抗Ｎｏｇｏレセプター−１抗体またはその抗原結合フラグメントは、組換え、操作された、ヒト化および／またはキメラの抗体または抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態において、抗体は、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０３／２５００４号に記載される抗体から選択される。本発明に有用である抗体は、修飾されてか、または修飾されずに使用され得る。
【００３７】
本発明の方法に使用され得る抗体の例示的な抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｄ、ｄＡｂ、ならびに相補性決定領域（ＣＤＲ）フラグメント、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、キメラ抗体、二重特性抗体を含むフラグメント、ならびにポリペプチドに対する特異的抗原結合を与えるのに十分である免疫グロブリンの少なくとも一部を含むポリペプチド（例えば、イムノアドヘシン）である。
【００３８】
本明細書中で使用される場合、Ｆｄは、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなるフラグメントを意味し；Ｆｖは、抗体の一つの腕のＶＬドメインおよびＶＨドメインからなるフラグメントを意味し；そしてｄＡｂは、ＶＨドメインからなるフラグメントを意味する（Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ、３４１、５４４−４６（１９８９））。本明細書中で使用される場合、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）は、ＶＬ領域およびＶＨ領域が対になって、タンパク質の一本鎖としてつくられることを可能にする合成リンカーによって一価分子を形成する抗体を意味する（Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−２６、（１９８８）およびＨｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：５８７９−８３（１９８８））。本明細書中で使用される場合、二重特異性抗体は、ＶＨドメインおよびＶＬドメインが、単鎖ポリペプチド上に発現される二重特異性の抗体を意味するが、同じ鎖上の二つのドメインの間の対形成を可能にするには短すぎるリンカーを使用してそのドメインを別の鎖の相補性ドメインと対形成させ、二つの抗原結合部位を生成する（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−４８（１９９３）およびＰｏｌｊａｋら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：１１２１〜２３（１９９４）を参照のこと）。
【００３９】
（免疫化）
本発明の方法に使用するための抗体は、適切な宿主（例えば、ヒト、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、爬虫類、魚類、両生類を含む脊椎動物、ならびに鳥類、爬虫類および魚類の卵中の脊椎動物）の免疫化により作製され得る。このような抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得る。抗体を作製するための方法の総説については、例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；Ｙｅｌｔｏｎら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５０：６５７−８０（１９８１）；およびＡｕｓｕｂｅｌら、（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）を参照のこと。免疫原性Ｎｏｇｏレセプターポリペプチドとの免疫反応性の決定は、当該分野で周知である数種の方法のいずれかによりなされ得、それらとしては例えば、免疫ブロットアッセイおよびＥＬＩＳＡが挙げられる。本発明の方法に使用するためのモノクローナル抗体は、例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）（前出）に記載されるような標準的手順によって作製され得る。
【００４０】
例えば、宿主は、アジュバントを有しても有さなくてもよいが、免疫原性Ｎｏｇｏレセプター−１ポリペプチドにより免疫され得る。適切なポリペプチドは、例えば、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０１／３１４８８号、同ＰＣＴ／ＵＳ０２／３２００７号および同ＰＣＴ／ＵＳ０３／２５００４号に記載される。宿主はまた、インタクトの細胞またはばらばらになった細胞の細胞膜およびＮｏｇｏレセプター−１ポリペプチドに結合することによって同定される抗体と結合したＮｏｇｏレセプター１で免疫され得る。抗体を作製するための他の適した技術としては、リンパ球をＮｏｇｏレセプター−１または本発明の免疫原性ポリペプチドにインビトロで曝露すること、またはファージベクターもしくは類似するベクター内の抗体のライブラリーの選択が挙げられる。Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６：１２７５−８１（１９８９）を参照のこと。
【００４１】
本発明の方法に使用される抗Ｎｏｇｏレセプター−１抗体はまた、組換えコンビナトリアル抗体ライブラリーをスクリーニングすることによって単離され得る。このようなライブラリーを調製し、スクリーニングするための方法論は、当該分野で公知である。ファージディスプレイライブラリーのための方法および材料が市販されている（例えば、ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｈａｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号２７−９４００−０１；ｔｈｅ Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ＳｕｒｆＺＡＰＴＭファージディスプレイキット、カタログ番号２４０６１２；およびＭｏｒｐｈｏＳｙｓからの他のもの）。組換え免疫グロブリンディスプレイライブラリー由来の抗Ｎｏｇｏレセプター−１抗体のスクリーニングおよび単離の後、選択された抗体をコードする核酸は、ディスプレイパッケージ（例えば、ファージゲノム由来）から回収され、標準的組換えＤＮＡ技術によって他の発現ベクターにサブクローニングされ得る。コンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離された抗体を発現させるために、抗体重鎖および抗体軽鎖またはその可変領域をコードするＤＮＡを、組換え発現ベクターにクローニングし、宿主細胞に導入する。
【００４２】
（Ｎｏｇｏレセプターアンタゴニストの使用）
本発明は、ドーパミンニューロン変性の徴候または症状を示す哺乳動物において、ドーパミンニューロンの再生または生存を促進する方法に関する。本発明のいくつかの実施形態において、ドーパミンニューロン変性は、パーキンソン病が含まれるが、これに限定されない疾患、障害または状態と関連する。
【００４３】
好ましい実施形態において、この疾患、障害または状態は、パーキンソン病である。
【００４４】
（Ｎｏｇｏレセプターアンタゴニスト薬学的組成物）
本発明の方法に使用されるＮｏｇｏレセプターアンタゴニストは、ヒトを含む哺乳動物に投与するための薬学的組成物に処方され得る。本発明の方法に使用される薬学的組成物は、薬学的に受容可能なキャリアを含有する。
【００４５】
これらの薬学的組成物に有用である薬学的に受容可能なキャリアとしては、例えば、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン）、緩衝物質（例えば、リン酸塩）、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分的グリセリド混合物、水、塩または電解質（例えば、硫酸プロタミン）、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイダルシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースベースの物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレンポリオキシプロピレンブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂が挙げられる。
【００４６】
本発明の方法に使用される組成物は、任意の適した方法（例えば、非経口、脳室内、経口、吸入スプレー、局所、直腸、鼻、口腔、膣、または移植レザバを介して）によって投与され得る。用語「非経口」は、本明細書で使用される場合、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液包内、胸骨内、鞘内、肝臓内、病巣内、および頭蓋内の注射技術または注入技術を包含する。本発明の方法において、Ｎｏｇｏレセプターアンタゴニストは、血液脳関門を横断しなければならない。この横断は、Ｎｏｇｏレセプターアンタゴニスト分子自体に固有の物理化学的な特性、薬学的処方物中の他の成分、または機械的デバイス（例えば、針、カニューレ、または血液脳関門を破るための外科的器具）の使用から生じ得る。Ｎｏｇｏレセプターアンタゴニストが可溶性Ｎｏｇｏレセプター、抗Ｎｏｇｏレセプター抗体または血液脳関門を本質的に横断しない他の分子である場合、投与の適切な経路は、頭蓋内（例えば、黒質または線条に直接の）経路である。Ｎｏｇｏレセプターアンタゴニストが、血液脳関門を本質的に横断する分子である場合、投与の経路は、以下に記載する種々の経路の１つ以上による経路であり得る。
【００４７】
本発明の方法に使用される組成物の滅菌した注入可能な形態は、水性または油性の懸濁液であり得る。これらの懸濁液は、適切な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を使用して当該分野で公知の技術に従って処方され得る。滅菌した注入可能な調製物はまた、無毒性の非経口的に受容可能な希釈剤もしくは溶媒中の滅菌した注入可能な溶液または懸濁液であり得、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液としてであり得る。水、リンガー溶液および等張性塩化ナトリウム溶液は、使用され得る受容可能なビヒクルおよび溶媒の範囲内である。さらに、滅菌した不揮発性油は、溶媒または懸濁媒体として慣習的に使用される。この目的のために、任意の無刺激性の不揮発性油が使用され得、それとしては、合成モノグリセリドまたは合成ジグリセリドが挙げられる。脂肪酸（例えば、オレイン酸）およびそのグリセリド誘導体は、注射可能物質の調製に有用であり、天然の薬学的に受容可能な油（例えば、オリーブ油またはまたはヒマシ油）、特にそのポリオキシエチレン化形態である。これらの油性溶液または油性懸濁液はまた、長鎖アルコール希釈剤もしくは分散剤（例えば、カルボキシメチルセルロース、またはエマルジョンおよび懸濁液を含む薬学的に受容可能な投薬形態の処方物中で一般的に使用される類似した分散剤）を含有し得る。他の一般的に使用される界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ、Ｓｐａｎおよび他の乳化剤）、または薬学的に受容可能な固体投薬形態、液体投薬形態または他の投薬形態の製造に一般的に使用されるバイオアベイラビリティの賦活剤もまた、目的の処方物のために使用され得る。
【００４８】
非経口処方物は、単一のボーラス用量、次いで維持用量で続けられる注入ボーラス用量または負荷ボーラス用量であり得る。これらの組成物は、一日に一回または「必要なとき」に基づいて投与され得る。
【００４９】
本発明の方法に使用される特定の薬学的組成物は、任意の経口的に受容可能な投薬形態で経口投与され得、その形態としては、例えば、カプセル剤、錠剤、水性懸濁液または水溶液が挙げられる。特定の薬学的組成物はまた、鼻エアロゾルまたは鼻吸入によって投与され得る。このような組成物は、ベンジルアルコールまたは他の適切な保存剤、バイオアベイラビリティを増強するための吸収促進剤、フッ化炭素および／または他の従来の可溶化剤もしくは分散剤を使用する生理食塩水中の溶液として調製され得る。
【００５０】
単一投薬形態を作製するためのキャリア物質と合わせられ得るＮｏｇｏレセプターアンタゴニストの量は、処置される宿主および投与の特定の様式に依存して変動する。この組成物は、単一用量として、複数回用量として、または注入の確立された時間にわたって投与され得る。投薬レジメンはまた、最適な所望の応答（例えば、治療応答または予防応答）を提供するように調節され得る。
【００５１】
本発明の方法は、「治療有効量」または「予防有効量」のＮｏｇｏレセプターアンタゴニストを使用する。本発明の方法に使用されるＮｏｇｏレセプターアンタゴニストの治療有効量または予防有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別および体重のような因子によって変動し得る。治療有効量または予防有効量はまた、治療的に有益な効果が中毒作用または有害な効果を完全に上回る量である。
【００５２】
任意の特定の患者のための特定の投薬レジメンおよび処置レジメンは、種々の因子に依存し、その因子としては、特定のＮｏｇｏレセプターアンタゴニスト、患者の年齢、体重、全身的な健康状態、性別および食餌、ならびに投与の時間、排出の速度、薬物の組合せ、ならびに処置される特定の疾患の重篤度に依存する。このような因子の医療介護者による判断は、当業者の範囲内である。アンタゴニストの量はまた、処置される個々の患者、投与の経路、処方の形式、使用される化合物の特徴、疾患の重篤度、および所望される効果に依存する。アンタゴニストの量は、当該分野で周知の薬理学的原則、および薬物動態学的原則によって決定され得る。
【００５３】
本発明の方法において、Ｎｏｇｏレセプターアンタゴニストは、一般的に、脳室内、鞘内に投与されるか、または中枢神経系（ＣＮＳ）（例えば、中脳、黒質または線条）に直接投与される。本発明の方法に従った投与のための組成物は、一日あたり０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重のＮｏｇｏレセプターアンタゴニストの投薬量が投与されるように処方され得る。本発明のいくつかの実施形態において、投薬量は、一日あたり０．０１〜１．０ｍｇ／ｋｇ体重である。いくつかの実施形態において、投薬量は、一日あたり０．０５〜０．５ｍｇ／ｋｇ体重である。
【００５４】
追加の活性化合物がまた、本発明の方法に使用される組成物中に組み込まれ得る。例えば、Ｎｏｇｏレセプター抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは可溶性Ｎｏｇｏレセプターポリペプチドまたは融合タンパク質が、一種以上のさらなる治療剤と同時処方され得、そして／またはそれらと同時投与され得る。
【００５５】
本発明は、選択された標的組織へのＮｏｇｏレセプターアンタゴニストの任意の適切な送達方法を包含し、それらとしては、Ｎｏｇｏレセプターアンタゴニストの水溶液のボーラス注射または徐放系の移植が挙げられる。徐放移植物の使用は、繰り返しの注射に対する必要性を減少させる。
【００５６】
本発明の方法に使用されるＮｏｇｏレセプターアンタゴニストは、脳内に直接注入され得る。化合物の脳への直接注入のための種々の移植物が公知であり、治療化合物の、神経性の障害を罹患するヒト患者への送達に有効である。これらとしては、ポンプ、定位的に移植されたカテーテル、一時的な間隙性カテーテル、永久的な頭蓋内カテーテル移植物および外科的に移植された生分解性の移植物を使用する脳内への慢性注入が挙げられる。例えば、Ｇｉｌｌら、前出；Ｓｃｈａｒｆｅｎら、「Ｈｉｇｈ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｉｏｄｉｎｅ−１２５ Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ Ｉｍｐｌａｎｔ Ｆｏｒ Ｇｌｉｏｍａｓ」、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓ．２４（４）：５８３−９１（１９９２）；Ｇａｓｐａｒら、「Ｐｅｒｍａｎｅｎｔ １２５Ｉ Ｉｍｐｌａｎｔｓ ｆｏｒ Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ Ｍａｌｉｇｎａｎｔ Ｇｌｉｏｍａｓ」、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓ．４３（５）：９７７−８２（１９９９）；Ｇｉｌｄｅｎｂｅｒｇら、Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ（１９９８）中の第６６章、ｐ．５７７−５８０、Ｂｅｌｌｅｚｚａら、「Ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃ Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ Ｂｒａｃｈｙｔｈｅｒａｐｙ」；およびＢｒｅｍら、「Ｔｈｅ Ｓａｆｅｔｙ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ ＢＣＮＵ−Ｌｏａｄｅｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｎｅｗｌｙ Ｄｉａｇｎｏｓｅｄ Ｍａｌｉｇｎａｎｔ Ｇｌｉｏｍａｓ：Ｐｈａｓｅ Ｉ Ｔｒｉａｌ」、Ｊ．Ｎｅｕｒｏ−Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、２６：１１１−２３（１９９５）を参照のこと。
【００５７】
組成物はまた、その化合物の適切な送達系または支持系として機能する生物適合性のキャリア物質中に分散されたＮｏｇｏレセプターアンタゴニストを含有し得る。徐放キャリアの適切な例としては、坐剤またはカプセル剤のような成形した物品の形態の半透性のポリマーマトリクスが挙げられる。移植可能またはマイクロカプセルの徐放マトリクスとしては、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，３１９号；ＥＰ５８，４８１号）、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２：５４７−５６（１９８５））；ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、エチレン酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７（１９８１）；Ｌａｎｇｅｒ、Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５（１９８２））またはポリ−Ｄ−（−）−３ヒドロキシブチル酸（ＥＰ １３３，９８８）が挙げられる。
【００５８】
本発明のいくつかの実施形態において、Ｎｏｇｏレセプターアンタゴニストは、脳の適切な領域に直接注入することにより患者に投与される。例えば、Ｇｉｌｌら、「Ｄｉｒｅｃｔ ｂｒａｉｎ ｉｎｆｕｓｉｏｎ ｏｆ ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ ｄｉｓｅａｓｅ」、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．９：５８９−９５（２００３）を参照のこと。代替的な技術が利用可能であり、本発明に従ったＮｏｇｏレセプターアンタゴニストの投与に適用され得る。例えば、Ｒｉｅｃｈｅｒｔ−ＭｕｎｄｉｎｇｅｒユニットおよびＺＤ（Ｚａｍｏｒａｎｏ−Ｄｕｊｏｖｎｙ）多目的局在化ユニットを使用する、Ｎｏｇｏレセプターアンタゴニストを有するカテーテルまたは移植物の定位的な設置が利用され得る。２ｍｍの厚さの切片によるコントラストを増強したコンピュータ処理した断層撮影法（ＣＴ）スキャン、１２０ｍｌのオムニパーク、３５０ｍｇヨウ素／ｍｌの注入は、三次元多平面処理設計（ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｍｕｌｔｉｐｌａｎａｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｐｌａｎｎｉｎｇ）（ＳＴＰ、Ｆｉｓｃｈｅｒ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を可能にする。この装置は、明瞭な標的の確認のためのＣＴ標的情報およびＭＲＩ標的情報を融合する磁気共鳴映像研究に基づいた設計を可能にする。
【００５９】
ＧＥ ＣＴスキャナー（Ｇｅｎｅｒａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）とともに使用するめに改変したＬｅｋｓｅｌｌ定位固定システム（Ｄｏｗｎｓ Ｓｕｒｇｉｃａｌ，Ｉｎｃ．、Ｄｅｃａｔｕｒ、ＧＡ）ならびにＢｒｏｗｎ−Ｒｏｂｅｒｔｓ−Ｗｅｌｌｓ（ＢＲＷ）定位固定システム（Ｒａｄｉｏｎｉｃｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）が、本発明の目的に使用され得る。従って、移植の初期に、ＢＲＷ定位固定フレームの環状基部リングが、患者の頭蓋に取り付けられ得る。連続的なＣＴ切片が、基部プレートに留められたグラファイトロッドローカライザーフレームを用いて、（標的組織）領域にわたって３ｍｍの間隔で得られ得る。コンピュータ処理設計プログラムは、ＣＴ空間とＢＲＷ空間との間の地図を作るためにグラファイトロッド画像のＣＴ同等物を使用して、ＶＡＸ １１／７８０コンピュータ（Ｄｉｇｉｔａｌ Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｙｎａｒｄ、Ｍａｓｓ．）で実行され得る。
【実施例】
【００６０】
（実施例１：ラットにおける可溶性Ｎｏｇｏレセプター（３１０）−Ｆｃの減少した回転性の挙動および６−ヒドロキシドーパミン損傷後の線条体のドーパミンレベルの増加）
雄性のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（１５０〜２００ｇ、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）を、イソフルランを使用して麻酔し、定位のフレームに配置した。外科的部位をベータダインおよびアルコールで拭き取り、１インチの正中矢状切開を、ブレグマに曝露した。小さい骨孔を、注射部位上の頭蓋上につくり、２μｌの（生理食塩水／０．２％ アスコルビン酸塩）中の２０μｇの６−ヒドロキシドーパミンＨＣｌ（６−ＯＨＤＡ）を、ＡＰ＋０．７、中線に対して２．８ｍｍ側方に、頭蓋の表面に対してＤＶ−５．５ｍｍ腹側の座標で、定位的に左側の線条に注入した。２９ゲージのステンレス鋼カニューレにポリエチレンチューブを取り付けたシリンジポンプを使用して、６−ＯＨＤＡを０．５μｌ／分の速度で４分間にわたって注入した。６−ＯＨＤＡの注入後、カニューレをさらに２分間その位置に保持し、次いでゆっくりと引き抜いた。次いで、５ｍｍの長さのＡｌｚｅｔ脳注入カニューレを同じ骨孔を通して移植し、スーパー接着剤（ｓｕｐｅｒｇｌｕｅ）を使用して頭蓋に固定した。カニューレを、０．２５μｌ／ｈの速度で２８日間継続的に放出する、ＰＢＳまたは５０ｍＭのｓＮｇＲ（３１０）Ｆｃ（ラットＮｏｇｏレセプター−１のアミノ酸２６〜３１０を含む融合タンパク質およびラットのＦｃフラグメント；国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０３／２５００４号を参照のこと）を含む、注入したＡｌｚｅｔ浸透性ポンプ（モデル２００４）に接続した。この浸透性ポンプを、首筋の皮下空間に移植した。この切開部位を、オートクリップを使用して閉じ、ラットを、麻酔から回復するまで加湿したインキュベーター内に配置した。
【００６１】
６−ＯＨＤＡを注入して７日後、１４日後、２１日後、２８日後に、ラットをアンフェタミン（１ｍｇ／ｋｇ ｉｐ）で処置し、２時間にわたって回転行動を測定した。「回転行動」は、黒質線条体のドーパミン経路に片側からの損傷を有する動物が、ドーパミンアゴニスト（例えば、アポモルフィネ）またはドーパミン放出因子（例えば、アンフェタミン）を投与される場合に示す挙動である。その動物は、より大きい線条体のドーパミンレセプター刺激を経験した脳の側から離れた円で繰り返し回転する。回転応答の大きさ、すなわち行なわれる回転の数は、黒質線条体のドーパミン経路に対する損傷の程度に直接的に比例する。例えば、Ｆｕｘｅら、「Ａｎｔｉｐａｒｋｉｎｓｏｎｉａｎ ｄｒｕｇｓ ａｎｄ ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ ｎｅｏｓｔｒｉａｔｉａｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ：ｓｔｕｄｉｅｓ ｉｎ ｒａｔｓ ｗｉｔｈ ｕｎｉｌａｔｅｒａｌ ６−ｈｙｄｒｏｘｙｄｏｐａｍｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｎｉｇｒｏ−ｎｅｏｓｔｒｉａｔａｌ ＤＡ Ｐａｔｈｗａｙ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ ｏｆ ｒｏｔａｔｉｏｎａｌ ｂｅｈａｖｉｏｒ」、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．［Ｂ］２：４１−４７（１９７６）を参照のこと。最後の回転の少なくとも２４時間後、試験ラットをＣＯ２窒息により屠殺した。脳を迅速に取り除き、視交叉の後ろの境界で、前頭面に切断した。線条体を、脳の前部から両側を切開し、ＨＰＬＣ／ＥＣによるカテコールアミン測定のためにドライアイス上で凍結させた。脳の後部を、４％ＰＦＡ中で４８時間浸漬固定し、黒質チロシンヒドロキシラーゼ免疫組織化学のための凍結切断まで、凍結保護のために３０％スクロースに移した。
【００６２】
ｓＮｇＲ（３１０）Ｆｃによる処置は、黒質内のドーパミンニューロンの生存を有意に増加し（図１Ｂ）、線条体の６−ＯＨＤＡ損傷後のアンフェタミン負荷に対する応答における回転行動を有意に減少させた（図２Ｂ）。ｓＮｇＲ（３１０）−Ｆｃ処置したラットの損傷を受けた線条におけるドーパミンレベルが、コントロールと比較して有意に増加した（図３）。インタクトな線条におけるドーパミンレベルは、ｓＮｇＲ（３１０）Ｆｃ処置後、有意に変化しなかった。これらのデータは、ＮｏｇｏレセプターアンタゴニストｓＮｇＲ（３１０）−Ｆｃを用いた処置が、細胞の生存を増加させ、損傷後の脳におけるドーパミン作用性経路における回復を改善させることを示した。
【００６３】
（実施例２．線条の６−ＯＨＤＡ損傷後のＮｇＲヌルマウスにおけるアポモルフィン負荷に対する応答における回転行動の減少）
雄性または雌性のＮｏｇｏレセプターノックアウトマウス、ヘテロ接合体および野生型の同腹仔（１５〜３０ｇ）を、ケタミンおよびキシラジンを使用して（それぞれ１００ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇ、ｉｐ）麻酔し、定位のフレームに配置した。外科的部位を、ベータダインおよびアルコールで拭き取り、０．５ｃｍの正中矢状切開を、ブレグマに曝露した。小さい骨孔を、注射部位上の頭蓋上につくり、１μｌの（生理食塩水／０．２％アスコルビン酸塩）中の１０μｇの６−ヒドロキシドーパミンＨＣｌ（６−ＯＨＤＡ）を、ＡＰ＋０．７、中線に対して２．８ｍｍ側方に、頭蓋の表面に対してＤＶ−５．５ｍｍ腹側の座標で、定位的に左側の線条に注入した。２９ゲージのステンレス鋼カニューレにポリエチレンチューブを取り付けたシリンジポンプを使用して、６−ＯＨＤＡを０．５μｌ／分の速度で２分間にわたって注入した。６−ＯＨＤＡの注入後、カニューレをさらに２分間その位置に保持し、次いでゆっくりと引き抜いた。切開を、創クリップを使用して閉じ、マウスが麻酔から回復するまで加温パッド上に配置した。６−ＯＨＤＡを注入して２８日後、マウスにアポモルフィンを注射し、３０分間にわたって回転行動を記録した。回転行動の測定の少なくとも２４時間後、マウスをＣＯ２窒息により安楽死させた。脳を迅速に取り除き、視交叉の後ろの境界で、前頭面に切断した。脳の後部を、４％ＰＦＡ中で４８時間浸漬固定し、黒質チロシンヒドロキシラーゼ免疫組織化学のための凍結切断まで、凍結保護のために３０％スクロースに移した。
【００６４】
６ＯＨＤＡの側方の注射後４週間のＮｏｇｏレセプターノックアウトマウスにおける黒質内の生存するドーパミンニューロンの数は、ヘテロ接合体および野生型同腹仔コントロールと比較してより多かった（図１Ａ）。ＮｇＲヌルマウスにおけるアポモルフィン負荷に対する応答における回転行動は、ヘテロ接合体および野生型の同腹仔コントロールと比較して、有意に低くかった（図２Ａ）。これらのデータは、神経の生存を増加させ、ＮｇＲ１を欠如するマウスの損傷後の脳におけるドーパミン作用性経路における機能の回復を改善することを示す。
【００６５】
前述の発明は、理解の明瞭性の目的のために、図および実施例によってある程度詳細に記載されるが、添付の特許請求の範囲の精神または範囲を逸脱することなく、特定の変化および改変がなされ得ることが、本発明の教示に鑑みて、当業者に容易に明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】図１Ａは、線条への６−ヒドロキシドーパミンＨＣｌ（６ＯＨＤＡ）注射を片側に注射して４週間後のヘテロ接合体および野生型の同腹仔コントロールと比較した場合のＮｏｇｏレセプターノックアウトマウスにおけるドーパミンニューロンの生存を示す。損傷した黒質におけるチロシン（ＴＨ）ポジティブなニューロンの数を、反対側のインタクトな黒質におけるＴＨポジティブなニューロンの数の百分率として表す。図１Ｂは、線条に６ＯＨＤＡを片側に注射して４週間後の、ｓＮｇＲ（３１０）Ｆｃで処置したラットにおけるドーパミン作用性ニューロンの生存を示す。損傷した黒質におけるチロシン（ＴＨ）ポジティブなニューロンの数を、反対側のインタクトな黒質におけるＴＨポジティブなニューロンの数の百分率として表す。
【図２】図２Ａは、線条への６ＯＨＤＡの片側注射後４週間のＮｏｇｏレセプターノックアウトマウスにおけるアポモルフィンに誘導された回転行動は、ヘテロ接合体および野生型同腹仔コントロールと比較して減少していたことを示す。図２Ｂは、線条体の６ＯＨＤＡの片側注射後７日、１４日、２１日および２８日のｓＮｇＲ（３１０）Ｆｃで処置したラットにおけるアンフェタミンに誘導される回転は、ビヒクルで処置したコントロールと比較して減少していたことを示す。
【図３】図３は、線条への６ＯＨＤＡの片側注射後４週間のｓＮｇＲ（３１０）Ｆｃで処置したラットにおいて、線条体のドーパミンレベルが増加していたことを示す。
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、神経生物学および薬理学に関する。より詳細には、本発明は、Ｎｏｇｏレセプター−１アンタゴニストの投与によってドーパミンニューロン変性に関する状態を処置する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
特定の神経変性障害は、ドーパミンニューロンの変性により特徴付けられる。例えば、パーキンソン病は、中脳の黒質におけるドーパミンニューロンの進行性の破壊と関連している。この破壊は、化学的伝達物質ドーパミンのレベルの減少を生じる。パーキンソン病の肉体的な症状としては、随意運動の欠陥および特徴的な震えを生じる筋肉の群の制御できない律動性の単収縮が挙げられる。
【０００３】
パーキンソン病のための最も広く使用される処置は、ドーパミン前駆体であるＬ−ドーパ（Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン）の投与であり、Ｌ−ドーパは、失われたドーパミンに取って代わることにより間接的に作用する。しかし、不都合な点は、Ｌ−ドーパの使用と関連している。患者は、多くの場合、運動障害、悪心、嘔吐、腹部膨満、および精神医学的な副作用のような副作用を罹患し、患者は、代表的に時間の経過につれてＬ−ドーパ処置にあまり応答しなくなる。シナプス後のドーパミンアゴニストを使用する治療の代替的な形態も副作用を伴う。さらに、Ｌ−ドーパ処置は、患者の生活の質を改善するが、疾患の進行を停止しない。
【０００４】
グリア細胞由来の神経栄養性因子（ＧＤＮＦ）のような他の化合物は、慢性注入によって送達される場合、ヒト患者におけるパーキンソン病の処置に見込みを示した。例えば、非特許文献１を参照のこと。しかし、これらの処置レジメンは、なお開発の初期段階のものである。
【０００５】
多くの他の疾患および障害は、ドーパミンニューロンの変性を伴い得る。これらとしては、多系統萎縮症、線条体黒質変性症、オリーブ橋小脳萎縮、シャイ−ドレーガー症候群、パーキンソン症候群の特徴を有する運動ニューロン疾患、レヴィー小体痴呆、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、前頭側頭葉型痴呆、パーキンソン症候群を伴うアルツハイマー病、ウィルソン病、ハレルフォルデン−シュパッツ症候群、チェディアック−東病、ＳＣＡ−３ 脊髄小脳性運動失調、Ｘ連鎖ジストニーパーキンソン症候群（ＤＹＴ３）、ハンティングトン病（ヴェストファル改変体）、プリオン病、脳血管性パーキンソン症候群、脳性麻痺、繰り返しの頭部外傷、脳炎後のパーキンソン症候群および神経梅毒が挙げられる。
【非特許文献１】Ｇｉｌｌら、「Ｄｉｒｅｃｔ ｂｒａｉｎ ｉｎｆｕｓｉｏｎ ｏｆ ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ ｄｉｓｅａｓｅ」、２００３年、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．、第９巻、ｐ．５８９−９５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、パーキンソン病およびドーパミンニューロンの変性によって特徴付けられる他の状態のためのさらなる処置方法に対する必要性が依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、Ｎｏｇｏレセプター−１アンタゴニストの投与による、ドーパミンニューロン変性に関連する状態（パーキンソン病が挙げられる）の処置の方法に関する。
【０００８】
いくつかの実施形態において、本発明は、ドーパミンニューロン変性の徴候または症状を示す哺乳動物に、治療有効量のＮｇＲ１アンタゴニストを投与する工程を包含する、そのような哺乳動物におけるドーパミンニューロンの再生または生存を促進する方法を提供する。
【０００９】
いくつかの実施形態において、ＮｇＲ１アンタゴニストは、中枢神経系に直接投与される。いくつかの実施形態において、ＮｇＲ１アンタゴニストは、黒質または線条に直接投与される。いくつかの実施形態において、ＮｇＲ１アンタゴニストは、ボーラス注射または慢性注入によって投与される。
【００１０】
いくつかの実施形態において、ＮｇＲ１アンタゴニストは、可溶性形態の哺乳動物のＮｇＲ１を含む。いくつかの実施形態において、可溶性形態の哺乳動物のＮｇＲ１は、ヒトＮｇＲ１（配列番号３）のアミノ酸２６〜３１０を含み、このアミノ酸は、１０個までの保存的アミノ酸置換を有し、機能性膜貫通ドメインおよび機能性シグナルペプチドの両方を欠如する。いくつかの実施形態において、可溶性形態の哺乳動物のＮｇＲ１は、ヒトＮｇＲ１（配列番号４）のアミノ酸２６〜３４４を含み、このアミノ酸は、１０個までの保存的アミノ酸置換を有し、機能性膜貫通ドメインおよび機能性シグナルペプチドの両方を欠如する。いくつかの実施形態において、可溶性形態の哺乳動物のＮｇＲ１は、ラットＮｇＲ１（配列番号５）のアミノ酸２７〜３１０を含み、このアミノ酸は、１０個までの保存的アミノ酸置換を有し、機能性膜貫通ドメインおよび機能性シグナルペプチドの両方を欠如する。いくつかの実施形態において、可溶性形態の哺乳動物のＮｇＲ１は、ラットＮｇＲ１（配列番号６）のアミノ酸２７〜３４４を含み、このアミノ酸は、１０個までの保存的アミノ酸置換を有し、機能性膜貫通ドメインおよび機能性シグナルペプチドの両方を欠如する。
【００１１】
いくつかの実施形態において、可溶性形態の哺乳動物のＮｇＲ１は、さらに融合部分を含む。いくつかの実施形態において、この融合部分は、免疫グロブリン部分である。いくつかの実施形態において、この免疫グロブリン部分は、Ｆｃ部分である。
【００１２】
いくつかの実施形態において、本発明の方法に使用されるＮｇＲ１アンタゴニストは、哺乳動物のＮｇＲ１に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。いくつかの実施形態において、この抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、Ｆｄフラグメント、二重特異性抗体および単鎖抗体からなる群より選択される。
【００１３】
いくつかの実施形態において、この抗体またはその抗原結合フラグメントは、以下：ＨＢ ７Ｅ１１（ＡＴＣＣ（登録商標）登録番号ＰＴＡ−４５８７）、ＨＢ １Ｈ２（ＡＴＣＣ（登録商標）登録番号ＰＴＡ−４５８４）、ＨＢ ３Ｇ５（ＡＴＣＣ（登録商標）登録番号ＰＴＡ−４５８６）、ＨＢ ５Ｂ１０（ＡＴＣＣ（登録商標）登録番号ＰＴＡ−４５８８）およびＨＢ ２Ｆ７（ＡＴＣＣ（登録商標）登録番号ＰＴＡ−４５８５）からなる群より選択されるハイブリドーマによって産生されたモノクローナル抗体に結合されたポリペプチドに結合する。いくつかの実施形態において、このモノクローナル抗体は、ＨＢ ７Ｅ１１ハイブリドーマによって産生される。いくつかの実施形態において、この抗体またはその抗原結合フラグメントは、以下：
【００１４】
【化３】
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合する
いくつかの実施形態において、本発明の方法に使用されるＮｇＲ１アンタゴニストの治療有効量は、０．００１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態において、この治療有効量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１．０ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態において、この治療有効量は、０．０５ｍｇ／ｋｇ〜０．５ｍｇ／ｋｇである。
【００１５】
いくつかの実施形態において、ドーパミンニューロン変性は、パーキンソン病、多系統萎縮症、線条体黒質変性症、オリーブ橋小脳萎縮、シャイ−ドレーガー症候群、パーキンソン症候群の特徴を有する運動ニューロン疾患、レヴィー小体痴呆、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、前頭側頭葉型痴呆、パーキンソン症候群を伴うアルツハイマー病、ウィルソン病、ハレルフォルデン−シュパッツ症候群、チェディアック−東病、ＳＣＡ−３ 脊髄小脳性運動失調、Ｘ連鎖ジストニーパーキンソン症候群（ＤＹＴ３）、ハンティングトン病（ヴェストファル改変体）、プリオン病、脳血管性パーキンソン症候群、脳性麻痺、繰り返しの頭部外傷、脳炎後のパーキンソン症候群および神経梅毒からなる群より選択される疾患または障害と関連している。
【００１６】
いくつかの実施形態において、本発明は、治療有効量のＮｇＲ１アンタゴニストを哺乳動物に投与する工程を包含する、パーキンソン病を処置する方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
（発明の詳細な説明）
他に定義しない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者の一人によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。対立する場合、定義を含む本発明の適用が制御する。また、文脈によって他に必要とされない限り、単数形の用語は、複数を包含し、複数形の単語は、単数を包含する。本明細書中に述べられる全ての出版物、特許および他の参考文献は、個々の出版物または特許出願がそれぞれ個々に具体的に参考として援用されることが示されるように、全ての目的のためにその全体が参考として援用される。
【００１８】
本明細書中に記載される方法および材料に類似するか、等価である方法および材料が、本発明の実施または試験に使用され得るが、適切な方法および材料は、以下に記載される。その材料、方法および実施例は、例示のためのみのものであり、限定することを意図しない。本発明の他の特徴および利点は、詳細な記述および特許請求の範囲から明らかになる。
【００１９】
明細書および特許請求の範囲の全体を通して、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」またはその変形（例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、任意の列挙された整数または整数の群を包含することを示すが、任意のほかの整数または整数の群を排除することを示さない。
【００２０】
本発明をさらに定義するために、以下の用語および定義が提供される。
【００２１】
本明細書中で使用される場合、「抗体」は、インタクトな免疫グロブリンまたはその抗原結合フラグメントを意味する。本発明の抗体は、任意のアイソタイプまたはクラス（例えば、Ｍ、Ｄ、Ｇ、ＥおよびＡ）の抗体、または任意のサブクラス（例えば、Ｇ１−４、Ａ１−２）の抗体であり得、カッパ（κ）軽鎖またはラムダ（λ）軽鎖のどちらかを有し得る。
【００２２】
本明細書中で使用される場合、「ヒト化抗体」は、非ヒト配列の少なくとも一部が、ヒト配列で置換されている抗体を意味する。ヒト化抗体をどのようにして作製するかの例は、米国特許第６，０５４，２９７号および同第５，８８６，１５２号および同第５，８７７，２９３号に見出され得る。
【００２３】
本明細書中で使用される場合、「治療有効量」とは、所望の治療結果を達成するために必要な投薬量および時間において有効である量をいう。
【００２４】
本明細書中で使用される場合、「予防有効量」とは、所望の予防的結果を達成するために必要な投薬量および時間において有効である量をいう。代表的に、予防的用量は、疾患のより早い段階の前、またはその段階で被験体に使用されるので、予防有効量は、治療有効量より少ない。
【００２５】
本明細書中で使用される場合、「患者」は、哺乳動物（例えば、ヒト）を意味する。
【００２６】
本明細書中で使用される場合、「融合タンパク質」は、別の（一般的には異種の）ポリペプチドに融合したポリペプチドを含むタンパク質を意味する。
【００２７】
本明細書中で使用される場合、「Ｎｏｇｏレセプターアンタゴニスト」は、Ｎｏｇｏレセプター−１のリガンド（例えば、ＮｏｇｏＡ、ＮｏｇｏＢ、ＮｏｇｏＣ、ＭＡＧ、ＯＭ−ｇｐ）への結合を阻害する分子を意味する。
【００２８】
本明細書中で使用される場合、「Ｎｏｇｏレセプターポリペプチド」は、全長Ｎｏｇｏレセプター−１タンパク質およびそのフラグメントの両方を包含する。
【００２９】
本発明は、Ｎｏｇｏレセプターアンタゴニストを用いた処置が、損傷後のドーパミン作用性経路の改善された回復、およびドーパミンニューロン変性から生じる症状の顕著な改善を提供するという発見に基づいている。
【００３０】
（Ｎｏｇｏレセプターアンタゴニスト）
任意のＮｏｇｏレセプターアンタゴニストが、本発明の方法に使用され得る。本発明の方法に使用され得るＮｏｇｏレセプターアンタゴニストとしては、例えば、可溶性Ｎｏｇｏレセプターポリペプチド；Ｎｏｇｏレセプタータンパク質に対する抗体およびその抗原結合フラグメント；ならびに低分子アンタゴニストが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３１】
（可溶性Ｎｏｇｏレセプター−１ポリペプチド）
本発明のいくつかの実施形態において、アンタゴニストは、可溶性Ｎｏｇｏレセプター−１ポリペプチドである（Ｎｏｇｏレセプター−１はまた多様に、「Ｎｏｇｏレセプター」、「ＮｏｇｏＲ」、「ＮｏｇｏＲ−１」、「ＮｇＲ」および「ＮｇＲ−１」と呼ばれる）。全長Ｎｏｇｏレセプター−１は、シグナル配列、Ｎ末端領域（ＮＴ）、８個のロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）、ＬＲＲＣＴ領域（８個のロイシンリッチリピートのロイシンリッチリピートドメインＣ末端）、Ｃ末端領域（ＣＴ）およびＧＰＩアンカーからなる。全長ヒトＮｏｇｏレセプターの配列および全長ラットＮｏｇｏレセプターの配列を表１に示す。
【００３２】
（表１．ヒトＮｏｇｏレセプター−１ポリペプチドの配列およびラットＮｏｇｏレセプター−１ポリペプチドの配列）
【００３３】
【表１】
本発明の方法に使用される可溶性Ｎｏｇｏレセプターポリペプチドは、ＮＴドメイン、８個のＬＲＲおよびＬＲＲＣＴドメインを含み、シグナル配列および機能性ＧＰＩアンカーを欠如する（すなわち、ＧＰＩアンカーが存在しないか、または細胞膜へ効率的に結合しないＧＰＩアンカーを有する）。適切なポリペプチドとしては、例えば、ヒトＮｏｇｏレセプターのアミノ酸２６〜３１０（配列番号３）およびアミノ酸２６〜３４４（配列番号４）、ならびにラットＮｏｇｏレセプターのアミノ酸２７〜３１０（配列番号５）およびアミノ酸２７〜３４４（配列番号６）が挙げられる（表２）。本発明の方法に使用され得るさらなるポリペプチドは、例えば、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０２／３２００７号および同ＰＣＴ／ＵＳ０３／２５００４号に記載されている。
【００３４】
（表２．ヒトおよびラット由来の可溶性Ｎｏｇｏレセプターポリペプチド）
【００３５】
【表２】
融合タンパク質の構成要素である可溶性Ｎｏｇｏレセプターポリペプチドはまた、本発明の方法に使用され得る。いくつかの実施形態において、融合タンパク質の異種の部分は、免疫グロブリン定常ドメインである。いくつかの実施形態において、この免疫グロブリン定常ドメインは、重鎖定常ドメインである。
いくつかの実施形態において、この異種ポリペプチドは、Ｆｃフラグメントである。いくつかの実施形態において、Ｆｃは、可溶性ＮｏｇｏレセプターポリペプチドのＣ末端に結合している。いくつかの実施形態において、この融合Ｎｏｇｏレセプタータンパク質は二量体である。
【００３６】
（抗体）
本発明の方法は、免疫原性Ｎｏｇｏレセプター−１ポリペプチドに特異的に結合し、Ｎｏｇｏレセプター−１のリガンド（例えば、ＮｏｇｏＡ、ＮｏｇｏＢ、ＮｏｇｏＣ、ＭＡＧ、ＯＭ−ｇｐ）への結合を阻害する抗体またはその抗原結合フラグメントを使用して実施され得る。本発明の方法に使用される抗体または抗原結合フラグメントは、インビボまたはインビトロで産生され得る。いくつかの実施形態において、抗Ｎｏｇｏレセプター−１抗体またはその抗原結合フラグメントは、マウスまたはヒトのものである。いくつかの実施形態において、抗Ｎｏｇｏレセプター−１抗体またはその抗原結合フラグメントは、組換え、操作された、ヒト化および／またはキメラの抗体または抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態において、抗体は、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０３／２５００４号に記載される抗体から選択される。本発明に有用である抗体は、修飾されてか、または修飾されずに使用され得る。
【００３７】
本発明の方法に使用され得る抗体の例示的な抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｄ、ｄＡｂ、ならびに相補性決定領域（ＣＤＲ）フラグメント、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、キメラ抗体、二重特性抗体を含むフラグメント、ならびにポリペプチドに対する特異的抗原結合を与えるのに十分である免疫グロブリンの少なくとも一部を含むポリペプチド（例えば、イムノアドヘシン）である。
【００３８】
本明細書中で使用される場合、Ｆｄは、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなるフラグメントを意味し；Ｆｖは、抗体の一つの腕のＶＬドメインおよびＶＨドメインからなるフラグメントを意味し；そしてｄＡｂは、ＶＨドメインからなるフラグメントを意味する（Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ、３４１、５４４−４６（１９８９））。本明細書中で使用される場合、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）は、ＶＬ領域およびＶＨ領域が対になって、タンパク質の一本鎖としてつくられることを可能にする合成リンカーによって一価分子を形成する抗体を意味する（Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−２６、（１９８８）およびＨｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：５８７９−８３（１９８８））。本明細書中で使用される場合、二重特異性抗体は、ＶＨドメインおよびＶＬドメインが、単鎖ポリペプチド上に発現される二重特異性の抗体を意味するが、同じ鎖上の二つのドメインの間の対形成を可能にするには短すぎるリンカーを使用してそのドメインを別の鎖の相補性ドメインと対形成させ、二つの抗原結合部位を生成する（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−４８（１９９３）およびＰｏｌｊａｋら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：１１２１〜２３（１９９４）を参照のこと）。
【００３９】
（免疫化）
本発明の方法に使用するための抗体は、適切な宿主（例えば、ヒト、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、爬虫類、魚類、両生類を含む脊椎動物、ならびに鳥類、爬虫類および魚類の卵中の脊椎動物）の免疫化により作製され得る。このような抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得る。抗体を作製するための方法の総説については、例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；Ｙｅｌｔｏｎら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５０：６５７−８０（１９８１）；およびＡｕｓｕｂｅｌら、（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）を参照のこと。免疫原性Ｎｏｇｏレセプターポリペプチドとの免疫反応性の決定は、当該分野で周知である数種の方法のいずれかによりなされ得、それらとしては例えば、免疫ブロットアッセイおよびＥＬＩＳＡが挙げられる。本発明の方法に使用するためのモノクローナル抗体は、例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）（前出）に記載されるような標準的手順によって作製され得る。
【００４０】
例えば、宿主は、アジュバントを有しても有さなくてもよいが、免疫原性Ｎｏｇｏレセプター−１ポリペプチドにより免疫され得る。適切なポリペプチドは、例えば、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０１／３１４８８号、同ＰＣＴ／ＵＳ０２／３２００７号および同ＰＣＴ／ＵＳ０３／２５００４号に記載される。宿主はまた、インタクトの細胞またはばらばらになった細胞の細胞膜およびＮｏｇｏレセプター−１ポリペプチドに結合することによって同定される抗体と結合したＮｏｇｏレセプター１で免疫され得る。抗体を作製するための他の適した技術としては、リンパ球をＮｏｇｏレセプター−１または本発明の免疫原性ポリペプチドにインビトロで曝露すること、またはファージベクターもしくは類似するベクター内の抗体のライブラリーの選択が挙げられる。Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６：１２７５−８１（１９８９）を参照のこと。
【００４１】
本発明の方法に使用される抗Ｎｏｇｏレセプター−１抗体はまた、組換えコンビナトリアル抗体ライブラリーをスクリーニングすることによって単離され得る。このようなライブラリーを調製し、スクリーニングするための方法論は、当該分野で公知である。ファージディスプレイライブラリーのための方法および材料が市販されている（例えば、ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｈａｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号２７−９４００−０１；ｔｈｅ Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ＳｕｒｆＺＡＰＴＭファージディスプレイキット、カタログ番号２４０６１２；およびＭｏｒｐｈｏＳｙｓからの他のもの）。組換え免疫グロブリンディスプレイライブラリー由来の抗Ｎｏｇｏレセプター−１抗体のスクリーニングおよび単離の後、選択された抗体をコードする核酸は、ディスプレイパッケージ（例えば、ファージゲノム由来）から回収され、標準的組換えＤＮＡ技術によって他の発現ベクターにサブクローニングされ得る。コンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離された抗体を発現させるために、抗体重鎖および抗体軽鎖またはその可変領域をコードするＤＮＡを、組換え発現ベクターにクローニングし、宿主細胞に導入する。
【００４２】
（Ｎｏｇｏレセプターアンタゴニストの使用）
本発明は、ドーパミンニューロン変性の徴候または症状を示す哺乳動物において、ドーパミンニューロンの再生または生存を促進する方法に関する。本発明のいくつかの実施形態において、ドーパミンニューロン変性は、パーキンソン病が含まれるが、これに限定されない疾患、障害または状態と関連する。
【００４３】
好ましい実施形態において、この疾患、障害または状態は、パーキンソン病である。
【００４４】
（Ｎｏｇｏレセプターアンタゴニスト薬学的組成物）
本発明の方法に使用されるＮｏｇｏレセプターアンタゴニストは、ヒトを含む哺乳動物に投与するための薬学的組成物に処方され得る。本発明の方法に使用される薬学的組成物は、薬学的に受容可能なキャリアを含有する。
【００４５】
これらの薬学的組成物に有用である薬学的に受容可能なキャリアとしては、例えば、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン）、緩衝物質（例えば、リン酸塩）、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分的グリセリド混合物、水、塩または電解質（例えば、硫酸プロタミン）、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイダルシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースベースの物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレンポリオキシプロピレンブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂が挙げられる。
【００４６】
本発明の方法に使用される組成物は、任意の適した方法（例えば、非経口、脳室内、経口、吸入スプレー、局所、直腸、鼻、口腔、膣、または移植レザバを介して）によって投与され得る。用語「非経口」は、本明細書で使用される場合、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液包内、胸骨内、鞘内、肝臓内、病巣内、および頭蓋内の注射技術または注入技術を包含する。本発明の方法において、Ｎｏｇｏレセプターアンタゴニストは、血液脳関門を横断しなければならない。この横断は、Ｎｏｇｏレセプターアンタゴニスト分子自体に固有の物理化学的な特性、薬学的処方物中の他の成分、または機械的デバイス（例えば、針、カニューレ、または血液脳関門を破るための外科的器具）の使用から生じ得る。Ｎｏｇｏレセプターアンタゴニストが可溶性Ｎｏｇｏレセプター、抗Ｎｏｇｏレセプター抗体または血液脳関門を本質的に横断しない他の分子である場合、投与の適切な経路は、頭蓋内（例えば、黒質または線条に直接の）経路である。Ｎｏｇｏレセプターアンタゴニストが、血液脳関門を本質的に横断する分子である場合、投与の経路は、以下に記載する種々の経路の１つ以上による経路であり得る。
【００４７】
本発明の方法に使用される組成物の滅菌した注入可能な形態は、水性または油性の懸濁液であり得る。これらの懸濁液は、適切な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を使用して当該分野で公知の技術に従って処方され得る。滅菌した注入可能な調製物はまた、無毒性の非経口的に受容可能な希釈剤もしくは溶媒中の滅菌した注入可能な溶液または懸濁液であり得、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液としてであり得る。水、リンガー溶液および等張性塩化ナトリウム溶液は、使用され得る受容可能なビヒクルおよび溶媒の範囲内である。さらに、滅菌した不揮発性油は、溶媒または懸濁媒体として慣習的に使用される。この目的のために、任意の無刺激性の不揮発性油が使用され得、それとしては、合成モノグリセリドまたは合成ジグリセリドが挙げられる。脂肪酸（例えば、オレイン酸）およびそのグリセリド誘導体は、注射可能物質の調製に有用であり、天然の薬学的に受容可能な油（例えば、オリーブ油またはまたはヒマシ油）、特にそのポリオキシエチレン化形態である。これらの油性溶液または油性懸濁液はまた、長鎖アルコール希釈剤もしくは分散剤（例えば、カルボキシメチルセルロース、またはエマルジョンおよび懸濁液を含む薬学的に受容可能な投薬形態の処方物中で一般的に使用される類似した分散剤）を含有し得る。他の一般的に使用される界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ、Ｓｐａｎおよび他の乳化剤）、または薬学的に受容可能な固体投薬形態、液体投薬形態または他の投薬形態の製造に一般的に使用されるバイオアベイラビリティの賦活剤もまた、目的の処方物のために使用され得る。
【００４８】
非経口処方物は、単一のボーラス用量、次いで維持用量で続けられる注入ボーラス用量または負荷ボーラス用量であり得る。これらの組成物は、一日に一回または「必要なとき」に基づいて投与され得る。
【００４９】
本発明の方法に使用される特定の薬学的組成物は、任意の経口的に受容可能な投薬形態で経口投与され得、その形態としては、例えば、カプセル剤、錠剤、水性懸濁液または水溶液が挙げられる。特定の薬学的組成物はまた、鼻エアロゾルまたは鼻吸入によって投与され得る。このような組成物は、ベンジルアルコールまたは他の適切な保存剤、バイオアベイラビリティを増強するための吸収促進剤、フッ化炭素および／または他の従来の可溶化剤もしくは分散剤を使用する生理食塩水中の溶液として調製され得る。
【００５０】
単一投薬形態を作製するためのキャリア物質と合わせられ得るＮｏｇｏレセプターアンタゴニストの量は、処置される宿主および投与の特定の様式に依存して変動する。この組成物は、単一用量として、複数回用量として、または注入の確立された時間にわたって投与され得る。投薬レジメンはまた、最適な所望の応答（例えば、治療応答または予防応答）を提供するように調節され得る。
【００５１】
本発明の方法は、「治療有効量」または「予防有効量」のＮｏｇｏレセプターアンタゴニストを使用する。本発明の方法に使用されるＮｏｇｏレセプターアンタゴニストの治療有効量または予防有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別および体重のような因子によって変動し得る。治療有効量または予防有効量はまた、治療的に有益な効果が中毒作用または有害な効果を完全に上回る量である。
【００５２】
任意の特定の患者のための特定の投薬レジメンおよび処置レジメンは、種々の因子に依存し、その因子としては、特定のＮｏｇｏレセプターアンタゴニスト、患者の年齢、体重、全身的な健康状態、性別および食餌、ならびに投与の時間、排出の速度、薬物の組合せ、ならびに処置される特定の疾患の重篤度に依存する。このような因子の医療介護者による判断は、当業者の範囲内である。アンタゴニストの量はまた、処置される個々の患者、投与の経路、処方の形式、使用される化合物の特徴、疾患の重篤度、および所望される効果に依存する。アンタゴニストの量は、当該分野で周知の薬理学的原則、および薬物動態学的原則によって決定され得る。
【００５３】
本発明の方法において、Ｎｏｇｏレセプターアンタゴニストは、一般的に、脳室内、鞘内に投与されるか、または中枢神経系（ＣＮＳ）（例えば、中脳、黒質または線条）に直接投与される。本発明の方法に従った投与のための組成物は、一日あたり０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重のＮｏｇｏレセプターアンタゴニストの投薬量が投与されるように処方され得る。本発明のいくつかの実施形態において、投薬量は、一日あたり０．０１〜１．０ｍｇ／ｋｇ体重である。いくつかの実施形態において、投薬量は、一日あたり０．０５〜０．５ｍｇ／ｋｇ体重である。
【００５４】
追加の活性化合物がまた、本発明の方法に使用される組成物中に組み込まれ得る。例えば、Ｎｏｇｏレセプター抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは可溶性Ｎｏｇｏレセプターポリペプチドまたは融合タンパク質が、一種以上のさらなる治療剤と同時処方され得、そして／またはそれらと同時投与され得る。
【００５５】
本発明は、選択された標的組織へのＮｏｇｏレセプターアンタゴニストの任意の適切な送達方法を包含し、それらとしては、Ｎｏｇｏレセプターアンタゴニストの水溶液のボーラス注射または徐放系の移植が挙げられる。徐放移植物の使用は、繰り返しの注射に対する必要性を減少させる。
【００５６】
本発明の方法に使用されるＮｏｇｏレセプターアンタゴニストは、脳内に直接注入され得る。化合物の脳への直接注入のための種々の移植物が公知であり、治療化合物の、神経性の障害を罹患するヒト患者への送達に有効である。これらとしては、ポンプ、定位的に移植されたカテーテル、一時的な間隙性カテーテル、永久的な頭蓋内カテーテル移植物および外科的に移植された生分解性の移植物を使用する脳内への慢性注入が挙げられる。例えば、Ｇｉｌｌら、前出；Ｓｃｈａｒｆｅｎら、「Ｈｉｇｈ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｉｏｄｉｎｅ−１２５ Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ Ｉｍｐｌａｎｔ Ｆｏｒ Ｇｌｉｏｍａｓ」、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓ．２４（４）：５８３−９１（１９９２）；Ｇａｓｐａｒら、「Ｐｅｒｍａｎｅｎｔ １２５Ｉ Ｉｍｐｌａｎｔｓ ｆｏｒ Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ Ｍａｌｉｇｎａｎｔ Ｇｌｉｏｍａｓ」、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓ．４３（５）：９７７−８２（１９９９）；Ｇｉｌｄｅｎｂｅｒｇら、Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ（１９９８）中の第６６章、ｐ．５７７−５８０、Ｂｅｌｌｅｚｚａら、「Ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃ Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ Ｂｒａｃｈｙｔｈｅｒａｐｙ」；およびＢｒｅｍら、「Ｔｈｅ Ｓａｆｅｔｙ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ ＢＣＮＵ−Ｌｏａｄｅｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｎｅｗｌｙ Ｄｉａｇｎｏｓｅｄ Ｍａｌｉｇｎａｎｔ Ｇｌｉｏｍａｓ：Ｐｈａｓｅ Ｉ Ｔｒｉａｌ」、Ｊ．Ｎｅｕｒｏ−Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、２６：１１１−２３（１９９５）を参照のこと。
【００５７】
組成物はまた、その化合物の適切な送達系または支持系として機能する生物適合性のキャリア物質中に分散されたＮｏｇｏレセプターアンタゴニストを含有し得る。徐放キャリアの適切な例としては、坐剤またはカプセル剤のような成形した物品の形態の半透性のポリマーマトリクスが挙げられる。移植可能またはマイクロカプセルの徐放マトリクスとしては、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，３１９号；ＥＰ５８，４８１号）、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２：５４７−５６（１９８５））；ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、エチレン酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７（１９８１）；Ｌａｎｇｅｒ、Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５（１９８２））またはポリ−Ｄ−（−）−３ヒドロキシブチル酸（ＥＰ １３３，９８８）が挙げられる。
【００５８】
本発明のいくつかの実施形態において、Ｎｏｇｏレセプターアンタゴニストは、脳の適切な領域に直接注入することにより患者に投与される。例えば、Ｇｉｌｌら、「Ｄｉｒｅｃｔ ｂｒａｉｎ ｉｎｆｕｓｉｏｎ ｏｆ ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ ｄｉｓｅａｓｅ」、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．９：５８９−９５（２００３）を参照のこと。代替的な技術が利用可能であり、本発明に従ったＮｏｇｏレセプターアンタゴニストの投与に適用され得る。例えば、Ｒｉｅｃｈｅｒｔ−ＭｕｎｄｉｎｇｅｒユニットおよびＺＤ（Ｚａｍｏｒａｎｏ−Ｄｕｊｏｖｎｙ）多目的局在化ユニットを使用する、Ｎｏｇｏレセプターアンタゴニストを有するカテーテルまたは移植物の定位的な設置が利用され得る。２ｍｍの厚さの切片によるコントラストを増強したコンピュータ処理した断層撮影法（ＣＴ）スキャン、１２０ｍｌのオムニパーク、３５０ｍｇヨウ素／ｍｌの注入は、三次元多平面処理設計（ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｍｕｌｔｉｐｌａｎａｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｐｌａｎｎｉｎｇ）（ＳＴＰ、Ｆｉｓｃｈｅｒ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を可能にする。この装置は、明瞭な標的の確認のためのＣＴ標的情報およびＭＲＩ標的情報を融合する磁気共鳴映像研究に基づいた設計を可能にする。
【００５９】
ＧＥ ＣＴスキャナー（Ｇｅｎｅｒａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）とともに使用するめに改変したＬｅｋｓｅｌｌ定位固定システム（Ｄｏｗｎｓ Ｓｕｒｇｉｃａｌ，Ｉｎｃ．、Ｄｅｃａｔｕｒ、ＧＡ）ならびにＢｒｏｗｎ−Ｒｏｂｅｒｔｓ−Ｗｅｌｌｓ（ＢＲＷ）定位固定システム（Ｒａｄｉｏｎｉｃｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）が、本発明の目的に使用され得る。従って、移植の初期に、ＢＲＷ定位固定フレームの環状基部リングが、患者の頭蓋に取り付けられ得る。連続的なＣＴ切片が、基部プレートに留められたグラファイトロッドローカライザーフレームを用いて、（標的組織）領域にわたって３ｍｍの間隔で得られ得る。コンピュータ処理設計プログラムは、ＣＴ空間とＢＲＷ空間との間の地図を作るためにグラファイトロッド画像のＣＴ同等物を使用して、ＶＡＸ １１／７８０コンピュータ（Ｄｉｇｉｔａｌ Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｙｎａｒｄ、Ｍａｓｓ．）で実行され得る。
【実施例】
【００６０】
（実施例１：ラットにおける可溶性Ｎｏｇｏレセプター（３１０）−Ｆｃの減少した回転性の挙動および６−ヒドロキシドーパミン損傷後の線条体のドーパミンレベルの増加）
雄性のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（１５０〜２００ｇ、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）を、イソフルランを使用して麻酔し、定位のフレームに配置した。外科的部位をベータダインおよびアルコールで拭き取り、１インチの正中矢状切開を、ブレグマに曝露した。小さい骨孔を、注射部位上の頭蓋上につくり、２μｌの（生理食塩水／０．２％ アスコルビン酸塩）中の２０μｇの６−ヒドロキシドーパミンＨＣｌ（６−ＯＨＤＡ）を、ＡＰ＋０．７、中線に対して２．８ｍｍ側方に、頭蓋の表面に対してＤＶ−５．５ｍｍ腹側の座標で、定位的に左側の線条に注入した。２９ゲージのステンレス鋼カニューレにポリエチレンチューブを取り付けたシリンジポンプを使用して、６−ＯＨＤＡを０．５μｌ／分の速度で４分間にわたって注入した。６−ＯＨＤＡの注入後、カニューレをさらに２分間その位置に保持し、次いでゆっくりと引き抜いた。次いで、５ｍｍの長さのＡｌｚｅｔ脳注入カニューレを同じ骨孔を通して移植し、スーパー接着剤（ｓｕｐｅｒｇｌｕｅ）を使用して頭蓋に固定した。カニューレを、０．２５μｌ／ｈの速度で２８日間継続的に放出する、ＰＢＳまたは５０ｍＭのｓＮｇＲ（３１０）Ｆｃ（ラットＮｏｇｏレセプター−１のアミノ酸２６〜３１０を含む融合タンパク質およびラットのＦｃフラグメント；国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０３／２５００４号を参照のこと）を含む、注入したＡｌｚｅｔ浸透性ポンプ（モデル２００４）に接続した。この浸透性ポンプを、首筋の皮下空間に移植した。この切開部位を、オートクリップを使用して閉じ、ラットを、麻酔から回復するまで加湿したインキュベーター内に配置した。
【００６１】
６−ＯＨＤＡを注入して７日後、１４日後、２１日後、２８日後に、ラットをアンフェタミン（１ｍｇ／ｋｇ ｉｐ）で処置し、２時間にわたって回転行動を測定した。「回転行動」は、黒質線条体のドーパミン経路に片側からの損傷を有する動物が、ドーパミンアゴニスト（例えば、アポモルフィネ）またはドーパミン放出因子（例えば、アンフェタミン）を投与される場合に示す挙動である。その動物は、より大きい線条体のドーパミンレセプター刺激を経験した脳の側から離れた円で繰り返し回転する。回転応答の大きさ、すなわち行なわれる回転の数は、黒質線条体のドーパミン経路に対する損傷の程度に直接的に比例する。例えば、Ｆｕｘｅら、「Ａｎｔｉｐａｒｋｉｎｓｏｎｉａｎ ｄｒｕｇｓ ａｎｄ ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ ｎｅｏｓｔｒｉａｔｉａｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ：ｓｔｕｄｉｅｓ ｉｎ ｒａｔｓ ｗｉｔｈ ｕｎｉｌａｔｅｒａｌ ６−ｈｙｄｒｏｘｙｄｏｐａｍｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｎｉｇｒｏ−ｎｅｏｓｔｒｉａｔａｌ ＤＡ Ｐａｔｈｗａｙ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ ｏｆ ｒｏｔａｔｉｏｎａｌ ｂｅｈａｖｉｏｒ」、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．［Ｂ］２：４１−４７（１９７６）を参照のこと。最後の回転の少なくとも２４時間後、試験ラットをＣＯ２窒息により屠殺した。脳を迅速に取り除き、視交叉の後ろの境界で、前頭面に切断した。線条体を、脳の前部から両側を切開し、ＨＰＬＣ／ＥＣによるカテコールアミン測定のためにドライアイス上で凍結させた。脳の後部を、４％ＰＦＡ中で４８時間浸漬固定し、黒質チロシンヒドロキシラーゼ免疫組織化学のための凍結切断まで、凍結保護のために３０％スクロースに移した。
【００６２】
ｓＮｇＲ（３１０）Ｆｃによる処置は、黒質内のドーパミンニューロンの生存を有意に増加し（図１Ｂ）、線条体の６−ＯＨＤＡ損傷後のアンフェタミン負荷に対する応答における回転行動を有意に減少させた（図２Ｂ）。ｓＮｇＲ（３１０）−Ｆｃ処置したラットの損傷を受けた線条におけるドーパミンレベルが、コントロールと比較して有意に増加した（図３）。インタクトな線条におけるドーパミンレベルは、ｓＮｇＲ（３１０）Ｆｃ処置後、有意に変化しなかった。これらのデータは、ＮｏｇｏレセプターアンタゴニストｓＮｇＲ（３１０）−Ｆｃを用いた処置が、細胞の生存を増加させ、損傷後の脳におけるドーパミン作用性経路における回復を改善させることを示した。
【００６３】
（実施例２．線条の６−ＯＨＤＡ損傷後のＮｇＲヌルマウスにおけるアポモルフィン負荷に対する応答における回転行動の減少）
雄性または雌性のＮｏｇｏレセプターノックアウトマウス、ヘテロ接合体および野生型の同腹仔（１５〜３０ｇ）を、ケタミンおよびキシラジンを使用して（それぞれ１００ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇ、ｉｐ）麻酔し、定位のフレームに配置した。外科的部位を、ベータダインおよびアルコールで拭き取り、０．５ｃｍの正中矢状切開を、ブレグマに曝露した。小さい骨孔を、注射部位上の頭蓋上につくり、１μｌの（生理食塩水／０．２％アスコルビン酸塩）中の１０μｇの６−ヒドロキシドーパミンＨＣｌ（６−ＯＨＤＡ）を、ＡＰ＋０．７、中線に対して２．８ｍｍ側方に、頭蓋の表面に対してＤＶ−５．５ｍｍ腹側の座標で、定位的に左側の線条に注入した。２９ゲージのステンレス鋼カニューレにポリエチレンチューブを取り付けたシリンジポンプを使用して、６−ＯＨＤＡを０．５μｌ／分の速度で２分間にわたって注入した。６−ＯＨＤＡの注入後、カニューレをさらに２分間その位置に保持し、次いでゆっくりと引き抜いた。切開を、創クリップを使用して閉じ、マウスが麻酔から回復するまで加温パッド上に配置した。６−ＯＨＤＡを注入して２８日後、マウスにアポモルフィンを注射し、３０分間にわたって回転行動を記録した。回転行動の測定の少なくとも２４時間後、マウスをＣＯ２窒息により安楽死させた。脳を迅速に取り除き、視交叉の後ろの境界で、前頭面に切断した。脳の後部を、４％ＰＦＡ中で４８時間浸漬固定し、黒質チロシンヒドロキシラーゼ免疫組織化学のための凍結切断まで、凍結保護のために３０％スクロースに移した。
【００６４】
６ＯＨＤＡの側方の注射後４週間のＮｏｇｏレセプターノックアウトマウスにおける黒質内の生存するドーパミンニューロンの数は、ヘテロ接合体および野生型同腹仔コントロールと比較してより多かった（図１Ａ）。ＮｇＲヌルマウスにおけるアポモルフィン負荷に対する応答における回転行動は、ヘテロ接合体および野生型の同腹仔コントロールと比較して、有意に低くかった（図２Ａ）。これらのデータは、神経の生存を増加させ、ＮｇＲ１を欠如するマウスの損傷後の脳におけるドーパミン作用性経路における機能の回復を改善することを示す。
【００６５】
前述の発明は、理解の明瞭性の目的のために、図および実施例によってある程度詳細に記載されるが、添付の特許請求の範囲の精神または範囲を逸脱することなく、特定の変化および改変がなされ得ることが、本発明の教示に鑑みて、当業者に容易に明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】図１Ａは、線条への６−ヒドロキシドーパミンＨＣｌ（６ＯＨＤＡ）注射を片側に注射して４週間後のヘテロ接合体および野生型の同腹仔コントロールと比較した場合のＮｏｇｏレセプターノックアウトマウスにおけるドーパミンニューロンの生存を示す。損傷した黒質におけるチロシン（ＴＨ）ポジティブなニューロンの数を、反対側のインタクトな黒質におけるＴＨポジティブなニューロンの数の百分率として表す。図１Ｂは、線条に６ＯＨＤＡを片側に注射して４週間後の、ｓＮｇＲ（３１０）Ｆｃで処置したラットにおけるドーパミン作用性ニューロンの生存を示す。損傷した黒質におけるチロシン（ＴＨ）ポジティブなニューロンの数を、反対側のインタクトな黒質におけるＴＨポジティブなニューロンの数の百分率として表す。
【図２】図２Ａは、線条への６ＯＨＤＡの片側注射後４週間のＮｏｇｏレセプターノックアウトマウスにおけるアポモルフィンに誘導された回転行動は、ヘテロ接合体および野生型同腹仔コントロールと比較して減少していたことを示す。図２Ｂは、線条体の６ＯＨＤＡの片側注射後７日、１４日、２１日および２８日のｓＮｇＲ（３１０）Ｆｃで処置したラットにおけるアンフェタミンに誘導される回転は、ビヒクルで処置したコントロールと比較して減少していたことを示す。
【図３】図３は、線条への６ＯＨＤＡの片側注射後４週間のｓＮｇＲ（３１０）Ｆｃで処置したラットにおいて、線条体のドーパミンレベルが増加していたことを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ドーパミンニューロン変性の徴候または症状を示す哺乳動物において、ドーパミンニューロンの再生または生存を促進する方法であって、該哺乳動物に、治療有効量のＮｇＲ１アンタゴニストを投与する工程を包含する、方法。
【請求項２】
前記ＮｇＲ１アンタゴニストが、中枢神経系に直接投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＮｇＲ１アンタゴニストが、黒質または線条に直接投与される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＮｇＲ１アンタゴニストが、ボーラス注射または慢性注入によって投与される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記ＮｇＲ１アンタゴニストが、可溶性形態の哺乳動物のＮｇＲ１を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記可溶性形態の哺乳動物のＮｇＲ１が、（ａ）１０個までの保存的アミノ酸置換を有するヒトＮｇＲ１のアミノ酸２６〜３１０（配列番号３）を含み；そして（ｂ）（ｉ）機能性膜貫通ドメイン、および（ｉｉ）機能性シグナルペプチドを欠如する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記可溶性形態の哺乳動物のＮｇＲ１が、（ａ）１０個までの保存的アミノ酸置換を有するヒトＮｇＲ１のアミノ酸２６〜３４４（配列番号４）を含み；そして（ｂ）（ｉ）機能性膜貫通ドメイン、および（ｉｉ）機能性シグナルペプチドを欠如する、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記可溶性形態の哺乳動物のＮｇＲ１が、（ａ）１０個までの保存的アミノ酸置換を有するラットＮｇＲ１のアミノ酸２７〜３１０（配列番号５）を含み、そして（ｂ）（ｉ）機能性膜貫通ドメイン、および（ｉｉ）機能性シグナルペプチドを欠如する、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記可溶性形態の哺乳動物のＮｇＲ１が、（ａ）１０個までの保存的アミノ酸置換を有するラットＮｇＲ１のアミノ酸２７〜３４４（配列番号６）を含み、そして（ｂ）（ｉ）機能性膜貫通ドメイン、および（ｉｉ）機能性シグナルペプチドを欠如する、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記可溶性形態の哺乳動物のＮｇＲ１が、融合部分をさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
前記融合部分が、免疫グロブリン部分である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記免疫グロブリン部分が、Ｆｃ部分である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＮｇＲ１アンタゴニストが、哺乳動物のＮｇＲ１に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗体が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、Ｆｄフラグメント、二重特異性抗体および単鎖抗体からなる群より選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、ＨＢ ７Ｅ１１（ＡＴＣＣ（登録商標）登録番号ＰＴＡ−４５８７）、ＨＢ １Ｈ２（ＡＴＣＣ（登録商標）登録番号ＰＴＡ−４５８４）、ＨＢ ３Ｇ５（ＡＴＣＣ（登録商標）登録番号ＰＴＡ−４５８６）、ＨＢ ５Ｂ１０（ＡＴＣＣ（登録商標）登録番号ＰＴＡ−４５８８）およびＨＢ ２Ｆ７（ＡＴＣＣ（登録商標）登録番号ＰＴＡ−４５８５）からなる群より選択されるハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体によって結合されるポリペプチドに結合する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記モノクローナル抗体が、ＨＢ ７Ｅ１１ハイブリドーマによって産生される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ポリペプチドが、以下：
【化１】
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ポリペプチドが、以下：
【化２】
からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記治療有効量が、０．００１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇである、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記治療有効量が、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１．０ｍｇ／ｋｇである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記治療有効量が、０．０５ｍｇ／ｋｇ〜０．５ｍｇ／ｋｇである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ドーパミンニューロン変性が、パーキンソン病、多系統萎縮症、線条体黒質変性症、オリーブ橋小脳萎縮、シャイ−ドレーガー症候群、パーキンソン症候群の特徴を有する運動ニューロン疾患、レヴィー小体痴呆、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、前頭側頭葉型痴呆、パーキンソン症候群を伴うアルツハイマー病、ウィルソン病、ハレルフォルデン−シュパッツ症候群、チェディアック−東病、ＳＣＡ−３ 脊髄小脳性運動失調、Ｘ連鎖ジストニーパーキンソン症候群（ＤＹＴ３）、ハンティングトン病（ヴェストファル改変体）、プリオン病、脳血管性パーキンソン症候群、脳性麻痺、繰り返しの頭部外傷、脳炎後のパーキンソン症候群および神経梅毒からなる群より選択される疾患または障害と関連する、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
哺乳動物に、治療有効量のＮｇＲ１アンタゴニストを投与する工程を包含する、パーキンソン病を処置する方法。
【請求項１】
ドーパミンニューロン変性の徴候または症状を示す哺乳動物において、ドーパミンニューロンの再生または生存を促進する方法であって、該哺乳動物に、治療有効量のＮｇＲ１アンタゴニストを投与する工程を包含する、方法。
【請求項２】
前記ＮｇＲ１アンタゴニストが、中枢神経系に直接投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＮｇＲ１アンタゴニストが、黒質または線条に直接投与される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＮｇＲ１アンタゴニストが、ボーラス注射または慢性注入によって投与される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記ＮｇＲ１アンタゴニストが、可溶性形態の哺乳動物のＮｇＲ１を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記可溶性形態の哺乳動物のＮｇＲ１が、（ａ）１０個までの保存的アミノ酸置換を有するヒトＮｇＲ１のアミノ酸２６〜３１０（配列番号３）を含み；そして（ｂ）（ｉ）機能性膜貫通ドメイン、および（ｉｉ）機能性シグナルペプチドを欠如する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記可溶性形態の哺乳動物のＮｇＲ１が、（ａ）１０個までの保存的アミノ酸置換を有するヒトＮｇＲ１のアミノ酸２６〜３４４（配列番号４）を含み；そして（ｂ）（ｉ）機能性膜貫通ドメイン、および（ｉｉ）機能性シグナルペプチドを欠如する、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記可溶性形態の哺乳動物のＮｇＲ１が、（ａ）１０個までの保存的アミノ酸置換を有するラットＮｇＲ１のアミノ酸２７〜３１０（配列番号５）を含み、そして（ｂ）（ｉ）機能性膜貫通ドメイン、および（ｉｉ）機能性シグナルペプチドを欠如する、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記可溶性形態の哺乳動物のＮｇＲ１が、（ａ）１０個までの保存的アミノ酸置換を有するラットＮｇＲ１のアミノ酸２７〜３４４（配列番号６）を含み、そして（ｂ）（ｉ）機能性膜貫通ドメイン、および（ｉｉ）機能性シグナルペプチドを欠如する、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記可溶性形態の哺乳動物のＮｇＲ１が、融合部分をさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
前記融合部分が、免疫グロブリン部分である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記免疫グロブリン部分が、Ｆｃ部分である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＮｇＲ１アンタゴニストが、哺乳動物のＮｇＲ１に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗体が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、Ｆｄフラグメント、二重特異性抗体および単鎖抗体からなる群より選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、ＨＢ ７Ｅ１１（ＡＴＣＣ（登録商標）登録番号ＰＴＡ−４５８７）、ＨＢ １Ｈ２（ＡＴＣＣ（登録商標）登録番号ＰＴＡ−４５８４）、ＨＢ ３Ｇ５（ＡＴＣＣ（登録商標）登録番号ＰＴＡ−４５８６）、ＨＢ ５Ｂ１０（ＡＴＣＣ（登録商標）登録番号ＰＴＡ−４５８８）およびＨＢ ２Ｆ７（ＡＴＣＣ（登録商標）登録番号ＰＴＡ−４５８５）からなる群より選択されるハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体によって結合されるポリペプチドに結合する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記モノクローナル抗体が、ＨＢ ７Ｅ１１ハイブリドーマによって産生される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ポリペプチドが、以下：
【化１】
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ポリペプチドが、以下：
【化２】
からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記治療有効量が、０．００１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇである、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記治療有効量が、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１．０ｍｇ／ｋｇである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記治療有効量が、０．０５ｍｇ／ｋｇ〜０．５ｍｇ／ｋｇである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ドーパミンニューロン変性が、パーキンソン病、多系統萎縮症、線条体黒質変性症、オリーブ橋小脳萎縮、シャイ−ドレーガー症候群、パーキンソン症候群の特徴を有する運動ニューロン疾患、レヴィー小体痴呆、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、前頭側頭葉型痴呆、パーキンソン症候群を伴うアルツハイマー病、ウィルソン病、ハレルフォルデン−シュパッツ症候群、チェディアック−東病、ＳＣＡ−３ 脊髄小脳性運動失調、Ｘ連鎖ジストニーパーキンソン症候群（ＤＹＴ３）、ハンティングトン病（ヴェストファル改変体）、プリオン病、脳血管性パーキンソン症候群、脳性麻痺、繰り返しの頭部外傷、脳炎後のパーキンソン症候群および神経梅毒からなる群より選択される疾患または障害と関連する、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
哺乳動物に、治療有効量のＮｇＲ１アンタゴニストを投与する工程を包含する、パーキンソン病を処置する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２００７−５１９７３７（Ｐ２００７−５１９７３７Ａ）
【公表日】平成１９年７月１９日（２００７．７．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５５１４５６（Ｐ２００６−５５１４５６）
【出願日】平成１７年１月２８日（２００５．１．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００２５３５
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０７４９７２
【国際公開日】平成１７年８月１８日（２００５．８．１８）
【出願人】（５９２２２１５２８）バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド (224)
【出願人】（３９２０１９３５２）イェール ユニバーシティ (38)
【氏名又は名称原語表記】ＹＡＬＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年７月１９日（２００７．７．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１月２８日（２００５．１．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００２５３５
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０７４９７２
【国際公開日】平成１７年８月１８日（２００５．８．１８）
【出願人】（５９２２２１５２８）バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド (224)
【出願人】（３９２０１９３５２）イェール ユニバーシティ (38)
【氏名又は名称原語表記】ＹＡＬＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]