Ｏ６−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼの突然変異体
本発明は、野生型ヒトＡＧＴと比較したときに、（ａ）ＤＮＡ相互作用の低下；（ｂ）もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化；（ｃ）各種宿主における溶解性タンパク質としての発現収率の向上および安定性の向上；（ｄ）酸化条件下での安定性の向上；（ｅ）基質との反応後の細胞内での安定性の向上；（ｆ）基質との反応前後の細胞外部での安定性の向上；（ｇ）試験管内溶解度の向上；（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上；（ｉ）ＤＮＡベース基質に対する反応性の低下；および（ｊ）Ｎ９−置換Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性の低下；から選択された２つ以上の利点を示す、ＡＧＴ突然変異体に関する。上記の向上した特性を備えたこのようなＡＧＴ突然変異体は、野生型ヒトＡＧＴの１〜２５個のアミノ酸が他のアミノ酸によって置換され、場合により連続鎖からの１〜５個のアミノ酸が１、２、または３つの位置で欠損または付加され、および／またはＮ末端の１〜４個のアミノ酸またはＣ末端の１〜４０個のアミノ酸が欠損している突然変異体である。本発明は更に、本発明のＡＧＴ突然変異体を有する融合タンパク質に組み込まれている対象となるタンパク質を検出および／または操作する方法に関する。本発明の別の目的は、このようなＡＧＴ突然変異体および対象となるタンパク質を含むＡＧＴ融合タンパク質である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、野生型ヒトＯ６−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ｈＡＧＴ）の突然変異体、および標識を基質からこれらのＯ６−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ突然変異体および対象となるタンパク質からなる融合タンパク質へ転移させる方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソ尿素などの求電子物質の変異原性および発癌性作用は、主に、ＤＮＡにおけるグアニンのＯ６−アルキル化による。哺乳類および細菌は、ＤＮＡアルキル化からそれら自体を保護するために、これらの損傷を修復するタンパク質であるＯ６−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）を所有する。ＡＧＴは、アルキル基をアルキル化グアニンおよびグアニン誘導体の位置Ｏ−６から、自身のシステインの１つのメルカプト基に転移させて、非可逆的にアルキル化されたＡＧＴを生じさせる。基礎を成すメカニズムは、ＳＮ２タイプの求核反応であり、これはメチル基だけでなく、ベンジル基も容易に転用される理由を説明する。腫瘍細胞におけるヒトＡＧＴ（ｈＡＧＴ、配列番号：１）の過剰発現は、アルキル化薬、例えばプロカルバジン、ダカルバジン、テモゾロミド、およびビス−２−クロロエチル−Ｎ−ニトロソ尿素に対する耐性の主な理由であるため、ＡＧＴの阻害剤は、化学療法での増感剤として使用するために提案されてきた（Peggら, Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 51: 167-223,1995）。米国特許第５，６９１，３０７号は、ベンジル基内に各種の置換基を有するＯ６−ベンジルグアニンおよび腫瘍細胞でのＡＧＴレベルを枯渇させ、それによりアルキル化抗腫瘍薬に対する反応性を上昇させるためのその使用について記載している。同様に国際公開公報第９７／２０８４３号は、Ｏ６−ベンジル−およびＯ６−ヘテロアリールメチル−ピリミジン誘導体に相当するＡＧＴ枯渇剤を更に開示している。
【０００３】
ドイツ特許第１９９ ０３ ８９５号は、ＡＧＴのビオチン化を引き起こす、ビオチン化Ｏ６−アルキルグアニン誘導体とヒトＡＧＴとの間の反応に依存するＡＧＴのレベルを測定するアッセイを開示している。これは次に、ストレプトアビジンコーティングプレート上のＡＧＴの分離および例えばＥＬＩＳＡアッセイでのその検出を可能にする。腫瘍細胞中のＡＧＴのレベルを監視するための、そしてＡＧＴ阻害剤のスクリーニングで使用するためのアッセイが提案されている。
【０００４】
Damoiseauxら、Chem Biochem 4: 285-287,2001は、研究および化学療法での支援のために癌細胞におけるこの酵素のレベルの検出を再び容易なものとするために、ヒトＡＧＴを標識する化学プローブとして使用するための、オリゴデオキシリボヌクレオチドに組み込まれた修飾Ｏ６−アルキル化グアニン誘導体を開示している。
【０００５】
国際公開公報第０２／０８３９３７号は、対象となるタンパク質を検出および／または操作する方法を開示し、該方法ではタンパク質を、ＡＧＴに融合し、標識を担持するＡＧＴ基質とＡＧＴ融合タンパク質を接触し、標識を使用してＡＧＴ融合タンパク質を検出し、場合により更に操作する。使用される複数のＡＧＴ融合タンパク質、ＡＧＴ基質および広範に渡る標識の一般的構造原理、ならびに該方法で有用な標識を検出する方法が記載されている。ＡＧＴの他の形に触れられているが、ヒトＡＧＴのみが例示されている。
【０００６】
ＰＣＴ／ＥＰ０３／１０８５９（国際公開公報第２００４／０３１４０４号）は、対象となるタンパク質を検出および／または操作するための言及された方法で使用される特定のＡＧＴ融合タンパク質と、この方法によって得られる標識融合タンパク質と、特定のＡＧＴ融合タンパク質を使用する方法について記載している。
【０００７】
ＰＣＴ／ＥＰ０３／１０８８９（国際公開公報第２００４／０３１４０５号）は、対象となるタンパク質を検出および／または操作するための言及した方法で特に適切な標識を担持する追加のＡＧＴ基質と、このような特に標識された基質の応用について開示している。この特許出願は、この追加のＡＧＴ基質の製造方法についても記載している。
【０００８】
ヒトＡＧＴ突然変異型Ｇｌｙ１６０Ｔｒｐ（Xu-Welliverら、Biochemical Pharmacology 58: 1279-1285,1999）は、ベンジルグアニン誘導体に対して、野生型ヒトＡＧＴよりも多少反応性である。Juilleratら, Chem Biol 10: 313-317,2003は、ＡＧＴ融合タンパク質の合成基質による生体内（細胞内）標識に有効な更に反応性のパートナーを求めて、ヒトＡＧＴの多数の突然変異体を作成した。位置１４０、１５７、１５９、および１６０における突然変異体が報告された。突然変異型Ａｓｎ１５７ＧｌｙＳｅｒ１５９Ｇｌｕは、野生型ＡＧＴと比較しておおよそ２０倍の、ベンジルグアニン誘導体に対する活性の上昇を示している。
【０００９】
ｈＡＧＴにおける以下の追加の突然変異体は、ｈＡＧＴのＤＮＡ結合を妨害するが、ベンジルグアニン誘導体に対する活性に著しく干渉しないことが示されている：Ｌｙｓ１２５Ａｌａ、Ａｌａ１２７ＴｈｒおよびＡｒｇ１２８Ａ１ａ。Ｌｉｍら、ＥＭＢＯ Ｊ １５：４０５０−４０６０，１９９６，およびＤａｎｉｅｌｓら，ＥＭＢＯ Ｊ １９：１７１９−１７３０，２０００を参照。
【００１０】
ヒトＡＧＴ（ｐｄｂ−ＩＤ １ＥＨ６、Ｄａｎｉｅｌｓら、ＥＭＢＯ Ｊ １９：１７１９，２０００）の結晶構造は、Ａｓｎ２０７の後で切断された機能性タンパク質を使用して解明された。
【００１１】
発明の概要
本発明は、野生型ヒトＡＧＴと比較したときに、
（ａ）ＤＮＡ相互作用の低下；
（ｂ）もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化；
（ｃ）各種宿主における溶解性タンパク質としての発現収率の向上および安定性の向上；
（ｄ）酸化条件下での安定性の向上；
（ｅ）基質との反応後の細胞内での安定性の向上；
（ｆ）基質との反応前後の細胞外部での安定性の向上；
（ｇ）試験管内溶解度の向上；
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上；
（ｉ）ＤＮＡベース基質に対する反応性の低下；ならびに
（ｊ）Ｎ９−置換Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性の低下；
より選択される２つ以上の利点を示す、ＡＧＴ突然変異体に関する。
【００１２】
本発明のＡＧＴ突然変異体は、野生型ヒトＡＧＴの１〜２５個のアミノ酸が他のアミノ酸によって置換され、場合により連続鎖からの１〜５個のアミノ酸が１、２、または３つの位置で欠損または付加され、および／またはＮ末端の１〜４個のアミノ酸またはＣ末端の１〜４０個のアミノ酸が欠損している、上記の向上した特性を備えた突然変異体である。
【００１３】
本発明は更に、本発明のＡＧＴ突然変異体を有する融合タンパク質に組み込まれている対象となるタンパク質を検出および／または操作する方法に関する。本発明の別の目的は、このようなＡＧＴ突然変異体および対象となるタンパク質を含むＡＧＴ融合タンパク質である。
【００１４】
発明の詳細な説明
対象となるタンパク質を、ＡＧＴ融合タンパク質に組み込み、ＡＧＴ融合タンパク質を、標識を担持する特定のＡＧＴ基質と接触させ、ＡＧＴ融合タンパク質を、標識を認識および／処理するために設計された系において、標識を使用して検出し、場合により更に操作する、対象となるタンパク質を検出および／または操作するための前に記載の方法において、ＡＧＴの性能を、野生型ヒトＡＧＴを突然変異型ＡＧＴと置換することによって更に向上できる。突然変異型ＡＧＴを包含するこのような向上方法は、本発明の目的である。別の目的は上記方法に特に適したＡＧＴ突然変異体であり、ＡＧＴ融合タンパク質は、このようなＡＧＴ突然変異体および少なくとも１種の対象となるタンパク質を含む１種以上の他のタンパク質を含む。対象となるタンパク質は、いかなるタンパク質であってもよい。
【００１５】
本発明のＡＧＴ突然変異体は、例えば、野生型ヒトＡＧＴまたは既知のＡＧＴ突然変異体と比較したときに、
（ａ）ＤＮＡ相互作用の低下；
（ｂ）もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化；
（ｃ）各種宿主における溶解性タンパク質としての発現収率の向上および安定性の向上；
（ｄ）酸化条件下での安定性の向上；
（ｅ）基質との反応後の細胞内での安定性の向上；
（ｆ）基質との反応前後の細胞外部での安定性の向上；
（ｇ）試験管内溶解度の向上；
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上；
（ｉ）ＤＮＡベース基質に対する反応性の低下；
（ｊ）Ｎ９−置換Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性の低下；
より選択される２つ以上の特性を示す突然変異体を含む。
【００１６】
（ａ）ＤＮＡ相互作用の低下
「ＤＮＡ相互作用の低下」のある本発明の突然変異型ＡＧＴは、野生型ヒトＡＧＴまたは「ＰＧＥＧ−ｈＡＧＴ」（Juilleratら、Chem Biol 10: 313-317,2003）などの既知のＡＧＴ突然変異体と比較したときに、２０％未満のＤＮＡ結合、好ましくは２％未満のＤＮＡ結合を示し、最も好ましくは検出可能なＤＮＡ結合を示さない。ＤＮＡとの相互作用は例えば、低塩およびＤＮａｓｅ非存在の条件下でＥ．ｃｏｌｉ抽出物から同時精製されたＤＮＡの量を評価することによって定量される。これは野生型（ヒト）および突然変異型ＡＧＴの融合タンパク質（例えばＧＳＴへの融合）の並行精製の間で分光法によって比較される（２６０および２８０ｎｍでの吸収率の比）。あるいはＡＧＴのＤＮＡとの相互作用は、ＤＮＡの存在下での、基質としてのＢＧ−Ｃｙ３（Ｃｙ３に結合されたＯ６−（４−アミノエチル−ベンジル）−グアニン）とのＡＧＴ反応性の阻害として測定される。この手法は、ＢＧ−Ｃｙ３のＡＧＴとの反応時におけるＣｙ３蛍光物質の蛍光の著しい増加を利用する。ＡＧＴのＣｙ３−標識ベンジルグアニン誘導体との反応動力学には、サケ精子ＤＮＡの各種の濃度での数時間に渡る蛍光強度測定が続く。野生型ｈＡＧＴは、ＤＮＡにテトラマーとして結合するのに対して、未結合ｈＡＧＴタンパク質はモノマーのままであることが示された（Rasimasら、J Biol Chem 278(10): 7973-80,2003）。ＤＮＡに結合できないＡＧＴ突然変異体もテトラマー化しない。
【００１７】
（ｂ）もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化
「もはや核に限定されない局在化」を伴う本発明の突然変異型ＡＧＴは、真核細胞、例えば哺乳類細胞での発現時に細胞での突然変異型ＡＧＴの実質的に均一な局在化を示す。ＡＧＴ突然変異体の細胞内局在化は、ＡＧＴ欠損ＨｅＬａ細胞またはＣＨＯ細胞を構成的発現のための構築物をヒトサイトメガロウィルス前初期プロモータの下で用いて一過性に形質移入することによって調査する。細胞を細胞膜透過性ジアセチルフルオレセイン修飾Ｏ６−ベンジルグアニンによって染色して（Juilleratら、Chem Biol 10: 313-317,2003の物質４）、共焦点レーザ顕微鏡法によって解析する。細胞質および核の蛍光強度を突然変異型ＡＧＴと野生型ＡＧＴで比較する。野生型ヒトＡＧＴは、核での優先的局在化と、細胞質でのもっぱらわずかな局在化を示す。
【００１８】
（ｃ）各種宿主における溶解性タンパク質としての発現収率の向上および安定性の向上、
「溶解性タンパク質（すなわち細胞溶解後に溶解性画分に見出され、封入体には見出されないタンパク質）としての発現収率の向上」を伴う本発明の突然変異型ＡＧＴは、野生型ヒトＡＧＴと比較したときに、溶解タンパク質として３倍を超える発現収率、好ましくは５倍を超える発現収率、最も好ましくは１０倍を超える発現収率を示す。この発現収率の向上は、同時に、発現に使用される「宿主での安定性」の尺度となる。発現収率は、Ｅ．ｃｏｌｉまたは遺伝子組換えタンパク質用の他のいずれかの標準的生産細胞、例えば酵母、あるいは好ましくは昆虫細胞、ＣＨＯ細胞もしくはＨｅＬａ細胞において測定する。発現収率を定量するために、融合パートナーが容易な精製および定量を可能にするように、ＡＧＴ融合タンパク質を選択できる。例えばＥ．ｃｏｌｉでの発現収率は、Ｅ．ｃｏｌｉの並行させた発現培養からの溶解性および非溶解性ＧＳＴ野生型ＡＧＴ融合タンパク質ならびにＧＳＴ突然変異型ＡＧＴ融合タンパク質の収率を測定および比較することによって決定する。細胞溶解後の溶解性画分および非溶解性画分（すなわち封入体）のサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけて、相当するＡＧＴ融合タンパク質のバンド染色強度を比較する。溶解性タンパク質は、アフィニティクロマトグラフィーによる細胞抽出物からの融合タンパク質（例えばグルタチオンセファロースによるＧＳＴ−ＡＧＴ融合タンパク質の場合）の精製後、精製した画分にタンパク質濃度のアッセイを行うことによって定量する（Bradford,Anal Biochem 72: 248-54,1976）。溶解性画分中の同様のタンパク質の発現収率（点突然変異での相違）は、精製状態と同様に、未精製状態でのタンパク質安定性の尺度として使用できる（Ohageら、J Mol Biol 291: 1119-1128,1999、Wirzら、Protein Sci 8: 2245-50,1999）。したがって、これは折畳み安定性および凝集傾向の尺度として見なされる。
【００１９】
（ｃ’）実用的な見地から、Ｅ．ｃｏｌｉにおける溶解性タンパク質としての発現収率の向上が特に重要である。
【００２０】
（ｄ）酸化条件下での安定性の向上
「酸化条件下での安定性の向上」を伴う本発明の突然変異型ＡＧＴは、野生型ＡＧＴまたは「ＰＧＥＧ−ｈＡＧＴ」（Juilleratら、Chem Biol 10: 313-317,2003）などの既知のＡＧＴ突然変異体と比較したときに、２倍を超える活性タンパク質の収率、好ましくは５倍を超える活性タンパク質の収率、最も好ましくは１０倍を超える活性タンパク質の収率を示し、すなわちＡＧＴタンパク質は、緩衝水溶液（例えば１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、ジチオスレイトールまたはベータ−メルカプトエタノール無添加）中、酸化条件下で１時間以上のインキュベーション時間の後に、ＡＧＴ基質に対してその活性を維持する。ＡＧＴ基質に対する活性は、ジチオスレイトールまたはベータ−メルカプトエタノールなどの還元剤を添加せずに精製後に測定する。あるいは突然変異型ＡＧＴおよび野生型ヒトの活性を、適切なシグナル配列へのそれらの融合による酸化性酸化還元電位を有する細胞コンパートメント（例えばＥ．ｃｏｌｉのペリプラズム）内へのエクスポート後に比較する。還元および酸化条件下でのＡＧＴ基質に対する活性は、ジチオスレイトールまたはベータ−メルカプトエタノールなどの還元剤の存在下または非存在下で反応を実施することによって比較する。
【００２１】
（ｅ）基質との反応後の細胞内での安定性の向上
「細胞内での向上した安定性」を備えた本発明の突然変異型ＡＧＴは、野生型ＡＧＴまたは「ＰＧＥＧ−ｈＡＧＴ」（Juilleratら、Chem Biol 10: 313-317,2003）などの既知のＡＧＴ突然変異体と比較したときに、細胞（例えば哺乳類細胞）内での細胞透過性基質との反応後に、２倍を超える安定性、好ましくは３倍を超える安定性、最も好ましくは６倍を超える安定性を示す。安定性は、突然変異型ＡＧＴ融合タンパク質について、ＡＧＴ基質との反応後に、ＡＧＴ融合タンパク質の強度および局在化を、共焦点レーザ走査顕微鏡法を用いて解析することによって決定する。
【００２２】
（ｆ）基質との反応前後の細胞外部での安定性の向上
「細胞外部での向上した安定性」を備えた本発明の突然変異型ＡＧＴは、野生型ＡＧＴまたは「ＰＧＥＧ−ｈＡＧＴ」（Juilleratら、Chem Biol 10: 313-317,2003）などの既知のＡＧＴ突然変異体と比較したときに、２倍を超える安定性、好ましくは４倍を超える安定性、最も好ましくは６倍を超える安定性を示す。反応前の安定性は、突然変異型ＡＧＴまたは突然変異型ＡＧＴ融合タンパク質について、精製サンプルを緩衝水溶液中で４℃にて２週間まで、−２０℃にて６ヶ月までインキュベートすることによって決定する。複数の時点にてアリコートを取り、Juilleratら、Chem Biol 10: 313-317,2003によって記載されているように反応性ＡＧＴの濃度を概算する。標識基質との反応後の、そして未反応基質からの続いての分離後の野生型ＡＧＴおよびＡＧＴ突然変異体の安定性は、４℃にて２週間および−２０℃にて３ヶ月に渡って溶解性画分中の標識の濃度を定量することによって決定される。
【００２３】
（ｆ’）実際的な観点から、標識基質との反応後の安定性は特に重要である。
【００２４】
（ｇ）試験管内溶解度の向上
「試験管内溶解度の向上」を備えた本発明の突然変異型ＡＧＴは、野生型ヒトＡＧＴと比較したときに、２倍を超える溶解度、好ましくは５倍を超える溶解度、最も好ましくは１０倍を超える溶解度を示す。野生型ＡＧＴおよびＡＧＴ突然変異体の試験管内溶解度は、適切な緩衝液（例えば１００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、２０％グリセロール、１ｍＭ ＤＴＴ）にて確立された１つ以上の濃度での４℃または最高３７℃での精製サンプルの一晩に渡るインキュベーション後に残存するタンパク質の量を決定することによって測定する。
【００２５】
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上
「向上した反応性」を備えた本発明の突然変異型ＡＧＴは、野生型ヒトＡＧＴと比較したときに、３倍を超える反応性、好ましくは５倍を超える反応性、最も好ましくは１０倍を超える反応性を示す。Ｏ６−ベンジルグアニン基質に対する活性は、Juilleratら、Chem Biol 10: 313-317,2003によって記載されているように測定する。
【００２６】
（ｉ）ＤＮＡベース基質に対する反応性の低下
「ＤＮＡベース基質に対する反応性の低下」を備えた本発明の突然変異型ＡＧＴは、野生型ヒトＡＧＴと比較したときに、ＤＮＡベース基質に対する１０％未満の反応性、好ましくはＤＮＡベース基質に対する１％未満の反応性を示し、最も好ましくはＤＮＡベース基質に対する検出可能な反応性を示さない。野生型ＡＧＴまたは突然変異型ＡＧＴがアルキル化ＤＮＡ基質と反応する能力は、Ｏ６−ベンジルグアニンを含有する合成オリゴヌクレオチド（配列番号：２、位置１４にて修飾）によるその不活性化の反応として測定する。次に反応をビオチン化Ｏ６−アルキルグアニンによるインキュベーションにより失活させる。サンプルにウェスタンブロッティングおよびストレプトアビジン誘導体により検出させて、これらの基質の速度定数を得る。あるいは野生型または突然変異型ＡＧＴがアルキル化ＤＮＡ基質と反応する能力をＡＧＴ蛍光基質と競合するその標識効率によって測定する。ＢＧ−Ｃｙ３（Ｃｙ３に結合したＯ６−ベンジルグアニン）によるＡＧＴの反応速度論の後には、Ｏ６−ベンジルグアニンを含有する競合する合成オリゴヌクレオチド（配列番号：２、位置１４にて修飾）の各種濃度での蛍光強度測定が続く。
【００２７】
（ｊ）Ｎ９−置換Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性の低下
「Ｎ９−置換Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性の低下」を備えた本発明の突然変異型ＡＧＴは、野生型ＡＧＴまたは「ＰＧＥＧ−ｈＡＧＴ」（Juilleratら、Chem Biol 10: 313-317,2003）などの既知のＡＧＴ突然変異体と比較したときに、Ｎ９−置換Ｏ６−アルキルグアニン基質に対して１０％未満の反応性、好ましくは２％未満の反応性を示し、最も好ましくは検出可能な反応性を示さない。このようなＮ９−置換Ｏ６−アルキルグアニン基質は、野生型ＡＧＴの天然基質である。野生型ＡＧＴまたは突然変異型ＡＧＴがＮ９−修飾Ｏ６−アルキルグアニン基質と反応する能力は、競合実験でのビオチン化Ｎ９−非置換Ｏ６−アルキルグアニン基質の存在下でのこのような基質との、例えば低分子量Ｎ９−シクロペンチル−Ｏ６−ベンジルグアニンとのその反応の速度として測定する。次にサンプルにウェスタンブロッティングおよびストレプトアビジン誘導体による検出を受けさせて、これらの基質の速度定数を得る。あるいはこのような基質に対する反応性を、ＡＧＴとＢＧ−Ｃｙ３との反応の阻害として測定する。ＡＧＴのＢＧ−Ｃｙ３との反応の後に、プレインキュベーション後の、またはＮ９−修飾Ｏ６−アルキルグアニン基質との直接競合におけるＡＧＴへの結合時のＣｙ３蛍光強度の上昇が続く。
【００２８】
本発明の好ましいＡＧＴ突然変異体は、共通する複数の好ましい特性を有する突然変異体、例えば
（ｃ）各種宿主における溶解性タンパク質としての発現収率の向上および安定性の向上、ならびに
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上；
あるいは
（ｃ）各種宿主における溶解性タンパク質としての発現収率の向上および安定性の向上、
（ｄ）酸化条件下での安定性の向上、
（ｇ）試験管内溶解度の向上、ならびに
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上；
あるいは
（ｃ）各種宿主における溶解性タンパク質としての発現収率の向上および安定性の向上、
（ｄ）酸化条件下での安定性の向上、
（ｆ）基質との反応前後の細胞外部での安定性の向上、
（ｇ）試験管内溶解度の向上、ならびに
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上；
あるいは
（ａ）ＤＮＡ相互作用の低下、
（ｂ）もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
（ｃ）各種宿主における溶解性タンパク質としての発現収率の向上および安定性の向上、
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上、ならびに
（ｉ）ＤＮＡベース基質に対する反応性の低下；
あるいは
（ａ）ＤＮＡ相互作用の低下、
（ｂ）もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
（ｃ）各種宿主における溶解性タンパク質としての発現収率の向上および安定性の向上、
（ｅ）基質との反応後の細胞内での安定性の向上、
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上、ならびに
（ｉ）ＤＮＡベース基質に対する反応性の低下；
あるいは
（ａ）ＤＮＡ相互作用の低下、
（ｂ）もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
（ｃ）各種宿主における溶解性タンパク質としての発現収率の向上および安定性の向上、
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上、
（ｉ）ＤＮＡベース基質に対する反応性の低下、ならびに
（ｊ）Ｎ９−置換Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性の低下；
あるいは
（ａ）ＤＮＡ相互作用の低下、
（ｂ）もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
（ｃ）各種宿主における溶解性タンパク質としての発現収率の向上および安定性の向上、
（ｅ）基質との反応後の細胞内での安定性の向上、
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上、
（ｉ）ＤＮＡベース基質に対する反応性の低下、ならびに
（ｊ）Ｎ９−置換Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性の低下；
を示す突然変異体である。
【００２９】
更に好ましいＡＧＴ突然変異体は、
（ｃ）各種の宿主における、溶解性タンパク質としての５倍を超える発現収率および安定性の向上、特にＥ．ｃｏｌｉにおける（ｃ’）ならびに
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上；
あるいは
（ｃ）各種の宿主における、溶解性タンパク質としての５倍を超える発現収率および安定性の向上、特にＥ．ｃｏｌｉにおける（ｃ’）、
（ｄ）酸化条件下での５倍を超える安定性、
（ｇ）５倍を超える試験管内溶解度、ならびに
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する５倍を超える反応性；
あるいは
（ｃ）各種の宿主における、溶解性タンパク質としての５倍を超える発現収率および安定性の向上、特にＥ．ｃｏｌｉにおける（ｃ’）、
（ｄ）酸化条件下での５倍を超える安定性、
（ｆ）基質との反応前の、細胞外での４倍を超える安定性、特に基質との反応後の（ｆ’）、
（ｇ）５倍を超える試験管内溶解度、ならびに
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上；
あるいは
（ａ）２％未満のＤＮＡ結合、
（ｂ）もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
（ｃ）各種の宿主における、溶解性タンパク質としての５倍を超える発現収率および安定性の向上、特にＥ．ｃｏｌｉにおける（ｃ’）、
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する５倍を超える反応性、ならびに
（ｉ）ＤＮＡベース基質に対する１％未満の反応性；
あるいは
（ａ）２％未満のＤＮＡ結合、
（ｂ）もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
（ｃ）各種の宿主における、溶解性タンパク質としての５倍を超える発現収率および安定性の向上、特にＥ．ｃｏｌｉにおける（ｃ’）、
（ｅ）基質との反応後の細胞内での３倍を超える安定性、
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する５倍を超える反応性、ならびに
（ｉ）ＤＮＡベース基質に対する１％未満の反応性；
あるいは
（ａ）２％未満のＤＮＡ結合、
（ｂ）もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
（ｃ）各種の宿主における、溶解性タンパク質としての５倍を超える発現収率および安定性の向上、特にＥ．ｃｏｌｉにおける（ｃ’）、
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する５倍を超える反応性、
（ｉ）ＤＮＡベース基質に対する１％未満の反応性、ならびに
（ｊ）Ｎ９−置換Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する２％未満の反応性；
あるいは
（ａ）２％未満のＤＮＡ結合、
（ｂ）もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
（ｃ）各種の宿主における、溶解性タンパク質としての５倍を超える発現収率および安定性の向上、特にＥ．ｃｏｌｉにおける（ｃ’）、
（ｅ）基質との反応後の細胞内での３倍を超える安定性、
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する５倍を超える反応性、
（ｉ）ＤＮＡベース基質に対する１％未満の反応性、
（ｊ）Ｎ９−置換Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する２％未満の反応性；
を示す突然変異体である。
【００３０】
最も好ましいＡＧＴ突然変異体は
（ｃ）各種の宿主における、溶解性タンパク質としての１０倍を超える発現収率および安定性の向上、特にＥ．ｃｏｌｉにおける（ｃ’）、
（ｄ）酸化条件下での１０倍を超える安定性、
（ｆ）基質との反応前の、細胞外での６倍を超える安定性、特に基質との反応後の（ｆ’）、
（ｇ）１０倍を超える試験管内溶解度、ならびに
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する１０倍を超える反応性；
あるいは
（ａ）検出不能なＤＮＡ結合、
（ｂ）もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
（ｃ）各種の宿主における、溶解性タンパク質としての１０倍を超える発現収率および安定性の向上、特にＥ．ｃｏｌｉにおける（ｃ’）、
（ｅ）基質との反応後の細胞内での６倍を超える安定性、
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する１０倍を超える反応性、ならびに
（ｉ）ＤＮＡベース基質に対する検出不能な反応性；
あるいは
（ａ）検出不能なＤＮＡ結合、
（ｂ）もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
（ｃ）各種の宿主における、溶解性タンパク質としての１０倍を超える発現収率および安定性の向上、特にＥ．ｃｏｌｉにおける（ｃ’）、
（ｅ）基質との反応後の細胞内での６倍を超える安定性、
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する１０倍を超える反応性、
（ｉ）ＤＮＡベース基質に対する検出不能な反応性、ならびに
（ｊ）Ｎ９−置換Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する検出不能な反応性；
あるいは
（ａ）ＤＮＡ相互作用の低下、
（ｂ）もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
（ｃ）各種の宿主における、溶解性タンパク質としての１０倍を超える発現収率および安定性の向上、特にＥ．ｃｏｌｉにおける（ｃ’）、
（ｄ）酸化条件下での１０倍を超える安定性、
（ｅ）基質との反応後の細胞内での６倍を超える安定性、
（ｆ）基質との反応前の、細胞外での６倍を超える安定性、特に基質との反応後の（ｆ’）、
（ｇ）１０倍を超える試験管内溶解度、
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する１０倍を超える反応性、ならびに
（ｉ）ＤＮＡベース基質に対する検出不能な反応性；
あるいは
（ａ）ＤＮＡ相互作用の低下、
（ｂ）もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
（ｃ）各種の宿主における、溶解性タンパク質としての１０倍を超える発現収率および安定性の向上、特にＥ．ｃｏｌｉにおける（ｃ’）、
（ｄ）酸化条件下での１０倍を超える安定性、
（ｅ）基質との反応後の細胞内での６倍を超える安定性、
（ｆ）基質との反応前の、細胞外での６倍を超える安定性、特に基質との反応後の（ｆ’）、
（ｇ）１０倍を超える試験管内溶解度、
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する１０倍を超える反応性、
（ｉ）ＤＮＡベース基質に対する検出不能な反応性、ならびに
（ｊ）Ｎ９−置換Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する検出不能な反応性；
を示す突然変異体である。
【００３１】
当技術水準のＡＧＴ突然変異体は、多くの所望の特性の一部のみを有する。例えばLimら、EMBO J 15: 4050-4060,1996によって記載されている突然変異体は、哺乳類細胞内での発現時に、ＤＮＡ結合の減少および細胞質内への局在化を示す。Juilleratら、Chem Biol 10: 313-317,2003で記載されている突然変異体は、Ｏ６−ベンジルグアニン誘導体に対する反応性の上昇を示す。
【００３２】
本発明のＡＧＴ突然変異体は、野生型ヒトＡＧＴと比較して上述の向上した特性を備えた突然変異体であり、そこでは野生型ヒトＡＧＴの１〜２５個、好ましくは６〜２２個、特に特に７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９個のアミノ酸が、他のアミノ酸によって置換され、場合により連続鎖中の１〜５個のアミノ酸が、１、２、または３つの位置にて欠損もしくは付加され、および／またはＮ末端にて１〜４個のアミノ酸が、またはＣ末端にて１〜４０個の、好ましくは２０〜３５個の、特に２５〜３０個のアミノ酸が欠損している。
【００３３】
好ましくは、以下の位置のアミノ酸が置換される：
（Ａ）Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現収率を上昇させ、タンパク質に酸化をより受けにくくする、ＡｌａまたはＶａｌによって、好ましくはＡｌａによって置換されたＣｙｓ６２。
（Ｂ）他のアミノ酸置換、好ましくはＣｙｓ１５０−Ｓｅｒ１５１−Ｓｅｒ１５２の置換、特にＣｙｓ１５０の置換と組合された、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現を上昇させて、野生型ヒトＡＧＴに匹敵する基質反応性を維持する、Ａｌａ−Ａｓｎ、Ａｓｎ−Ａｓｎ、Ｓｅｒ−Ｈｉｓ、Ｓｅｒ−Ｓｅｒ、Ｐｒｏ−Ｐｒｏ、Ｐｒｏ−Ｓｅｒ、Ｐｒｏ−Ｔｈｒ、またはＴｈｒ−Ｓｅｒ、好ましくはＳｅｒ−Ｈｉｓによって置換されたＧｌｎ１１５−Ｇｌｎ１１６。
（Ｃ）他のアミノ酸置換、好ましくはＧｌｎ１１５−Ｇｌｎ１１６／Ｃｙｓ１５０−Ｓｅｒ１５１−Ｓｅｒ１５２の置換またはＧｌｙ１３１−Ｇｌｙ１３２／Ｍｅｔ１３４−Ａｒｇ１３５の置換、特にＣｙｓ６２／Ｇｌｎ１１５−Ｇｌｎ１１６／Ｇｌｙ１３１−Ｇｌｙ１３２／Ｍｅｔ１３４−Ａｒｇ１３５／Ｃｙｓ１５０−Ｓｅｒ１５１−Ｓｅｒ１５２の置換および１８２の後での切断と組合された、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現収率を上昇させ、ＤＮＡ結合を減少させて、哺乳類細胞での核局在化を無効にする（Limら、EMBO J 15: 4050-4060,1996）、Ａｌａによって置換されたＬｙｓ１２５およびＴｈｒ−Ａｌａによって置換されたＡｌａ１２７−Ａｒｇ１２８。
（Ｄ）Ｅ．ｃｏｌｉのペリプラズムおよび細胞質における発現収率を上昇させ、ＤＮＡ結合を減少させて、オリゴヌクレオチド（Ｏ６−アルキル−Ｎ９−デオキシリボシルグアニンを含有する）、Ｏ６−アルキル−Ｎ９−デオキシリボシルグアニンおよびＮ９−シクロペンチル−Ｏ６−ベンジルグアニンまたは他のＮ９置換Ｏ６−ベンジルグアニンとの反応性を無効にするのに対して、Ｎ９位置で置換されていないＯ６−アルキルグアニン基質に対する反応性を上昇させる、Ｖａｌ−Ｈｉｓ／Ｌｅｕ−Ａｒｇ、Ｌｙｓ−Ｔｈｒ／Ｌｅｕ−Ｓｅｒ、Ｇｌｎ−Ｖａｌ／Ｌｅｕ−Ｓｅｒ、またはＭｅｔ−Ｔｈｒ／Ｍｅｔ−Ｖａｌ、好ましくはＬｙｓ−Ｔｈｒ／Ｌｅｕ−Ｓｅｒによって置換されたＧｌｙ１３１−Ｇｌｙ１３２／Ｍｅｔ１３４−Ａｒｇ１３５、あるいはＶａｌ−Ｈｉｓ／Ｌｅｕによって置換されたＧｌｙ１３１−Ｇｌｙ１３２／Ｍｅｔ１３４。
（Ｅ）野生型ｈＡＧＴと比較してＥ．ｃｏｌｉのペリプラズムにおいてより効率的な発現を可能にして、Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性を維持し、タンパク質に酸化をより受けにくくして、ＤＮＡ結合を減少させる、Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ、Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ、Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−、またはＳｅｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−、好ましくはＡｓｎ−Ｉｌｅ−Ａｓｎによって置換されたＣｙｓ１５０−Ｓｅｒ１５１−Ｓｅｒ１５２、あるいはＰｈｅ−ＡｓｎまたはＡｒｇ−Ａｓｎによって置換されたＣｙｓ１５０−Ｓｅｒ１５１、あるいはＨｉｓ／Ｔｈｒ、Ｌｅｕ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／ＰｒｏまたはＰｒｏ／Ｌｅｕによって置換されたＣｙｓ１５０／Ｓｅｒ１５２、またはＳｅｒもしくはＴｈｒによって置換されたＣｙｓ１５０。
（Ｆ）Ｎ９位置で置換されていないＯ６−アルキルグアニン基質に対する反応速度を上昇させる（Juilleratら、Chem Biol 10: 313-317,2003）のに対して、Ｅ．ｃｏｌｉのペリプラズムおよび細胞質における発現収率を上昇させ、ＤＮＡ結合を減少させて、オリゴヌクレオチド（Ｏ６−アルキル−Ｎ９−デオキシリボシルグアニンを含有する）、Ｏ６−アルキル−Ｎ９−デオキシリボシルグアニンおよびＮ９−シクロペンチル−Ｏ６−ベンジルグアニンとの反応性を無効にする、他のアミノ酸置換、好ましくはＧｌｎ１１５−Ｇｌｎ１１６／Ｃｙｓ１５０−Ｓｅｒ１５１−Ｓｅｒ１５２の置換またはＧｌｙ１３１−Ｇｌｙ１３２／Ｍｅｔ１３４−Ａｒｇ１３５の置換、特にＣｙｓ６２／Ｇｌｎ１１５−Ｇｌｎ１１６／Ｌｙｓ１２５／Ａｌａ１２７−Ａｒｇ１２８／Ｇｌｙ１３１−Ｇｌｙ１３２／Ｍｅｔ１３４−Ａｒｇ１３５／Ｃｙｓ１５０−Ｓｅｒ１５１−Ｓｅｒ１５２の置換および１８２の後での切断と組合された、Ｐｈｅ／Ａｒｇ／Ｇｌｕによって置換されたＰｒｏ１４０／Ａｓｎ１５７／Ｓｅｒ１５９、あるいはＭｅｔ／Ｔｒｐ／Ｖａｌによって置換されたＰｒｏ１４０／Ａｓｎ１５７／Ｇｌｙ１６０、あるいはＧｌｙ／Ｇｌｕ−Ａｌａ、Ｇｌｙ／Ａｓｎ−Ｔｒｐ、Ｐｒｏ／Ｇｌｎ−ＣｙｓまたはＧｌｙ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ、最も好ましくはＧｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｌａによって置換されたＡｓｎ１５７／Ｓｅｒ１５９−Ｇｌｙ１６０、あるいはＧｌｙ／Ｇｌｕ（特に好ましい）によって置換されたＡｓｎ１５７／Ｓｅｒ１５９、ＧｌｙまたはＡｒｇによって置換されたＡｓｎ１５７。
（Ｇ）発現収率をやや上昇させる、Ｇｌｙ１８２の後の切断（アミノ酸１８３−２０７の欠損）。
【００３４】
本発明の突然変異体は、特に、修飾（Ａ）、（Ｂ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）および（Ｇ）のうち２つが、そして場合により１〜１０個の、特に３〜７個の追加のアミノ酸修飾が存在する突然変異体、および修飾（Ａ）〜（Ｇ）のうちの３つ以上、例えば３または４つが、そして場合により１〜１０個の、特に３〜７個の追加のアミノ酸修飾が存在する突然変異体である。他の好ましい突然変異体は、修飾（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｅ）、（Ｆ）、および（Ｇ）のうち３つ以上、例えば３または４つが、そして場合により１〜１０個の、特に３〜７個の追加のアミノ酸修飾が存在する突然変異体である。
【００３５】
特に好ましいのは、
Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現収率の上昇、酸化に対する感受性の低下、ＣＨＯ細胞を通じての細胞質全体への分布、ＤＮＡ結合の減少、およびＯ６−ベンジルグアニン基質に対する反応性の上昇を示す、突然変異型Ｃｙｓ６２Ａｌａ、Ｌｙｓ１２５Ａｌａ、Ａｌａ１２７Ｔｈｒ、Ａｒｇ１２８Ａｌａ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ、Ｇｌｙ１８２の後の切断、
Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現収率の上昇、少なくとも１０００分の１に減少したＤＮＡ結合、Ｏ６−ベンジルグアニン基質に対する反応性の上昇、およびＯ６−アルキル−Ｎ９−デオキシリボシルグアニンまたはＮ９−シクロペンチル−Ｏ６−ベンジルグアニンに対する反応性の実質的な低下を示す、突然変異型Ｇｌｙ１３１Ｌｙｓ、Ｇｌｙ１３２Ｔｈｒ、Ｍｅｔ１３４Ｌｅｕ、Ａｒｇ１３５Ｓｅｒ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ、
Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現収率の実質的な上昇を示すが、Ｏ６−ベンジルグアニジン基質に対する活性を維持する、突然変異型Ｇｌｎ１１５Ｓｅｒ、Ｇｌｎ１１６Ｈｉｓ、Ｃｙｓ１５０Ａｓｎ、Ｓｅｒ１５１Ｉｌｅ、Ｓｅｒ１５２Ａｓｎ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ、
Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現収率の上昇、酸化に対する感受性の低下、ＣＨＯ細胞における細胞質全体への分布、少なくとも１０００分の１に減少したＤＮＡ結合、Ｏ６−ベンジルグアニン基質に対する反応性の上昇、およびＯ６−アルキル−Ｎ９−デオキシリボシルグアニンまたはＮ９−シクロペンチル−Ｏ６−ベンジルグアニンに対する少なくとも１００分の１に減少した反応性を示す、突然変異型Ｃｙｓ６２Ａｌａ、Ｇｌｎ１１５Ｓｅｒ、Ｇｌｎ１１６Ｈｉｓ、Ｌｙｓ１２５Ａｌａ、Ａｌａ１２７Ｔｈｒ、Ａｒｇ１２８Ａｌａ、Ｇｌｙ１３１Ｌｙｓ、Ｇｌｙ１３２Ｔｈｒ、Ｍｅｔ１３４Ｌｅｕ、Ａｒｇ１３５Ｓｅｒ、Ｃｙｓ１５０Ａｓｎ、Ｓｅｒ１５１Ｉｌｅ、Ｓｅｒ１５２Ａｓｎ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ、Ｇｌｙ１８２の後の切断、および、
Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現収率の上昇、酸化に対する感受性の低下、ＣＨＯ細胞における細胞質全体への分布、少なくとも１０００分の１に減少したＤＮＡ結合、Ｏ６−ベンジルグアニン基質に対する反応性の上昇を示すが、Ｏ６−アルキル−Ｎ９−デオキシリボシルグアニンまたはＮ９−シクロペンチル−Ｏ６−ベンジルグアニンに対する反応性を維持する、突然変異型Ｃｙｓ６２Ａｌａ、Ｇｌｎ１１５Ｓｅｒ、Ｇｌｎ１１６Ｈｉｓ、Ｌｙｓ１２５Ａｌａ、Ａｌａ１２７Ｔｈｒ、Ａｒｇ１２８Ａｌａ、Ｃｙｓ１５０Ａｓｎ、Ｓｅｒ１５１Ｉｌｅ、Ｓｅｒ１５２Ａｓｎ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ、Ｇｌｙ１８２の後の切断
である。
【００３６】
検討される更なる突然変異体は、修飾Ｃｙｓ６２Ａｌａ、Ｌｙｓ１２５Ａｌａ、Ａｌａ１２７Ｔｈｒ、Ａｒｇ１２８Ａｌａ、Ｇｌｙ１３１Ｌｙｓ、Ｇｌｙ１３２Ｔｈｒ、Ｍｅｔ１３４Ｌｅｕ、Ａｒｇ１３５Ｓｅｒ、Ｃｙｓ１５０Ｓｅｒ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ、Ｇｌｙ１８２の後の切断、および場合により１〜１５個の、好ましくは１〜１０個の、特に３〜７個の追加のアミノ酸修飾、例えば
Ｇｌｕ１１５Ｓｅｒ、Ｇｌｎ１１６Ｈｉｓ；
Ｓｅｒ１５０Ａｓｎ、Ｓｅｒ１５１Ｉｌｅ、Ｓｅｒ１５２Ａｓｎ；
Ｌｙｓ８Ｔｈｒ、Ｌｙｓ３２Ｉｌｅ、Ｌｅｕ３３Ｐｈｅ、Ｔｈｒ１２７Ａｌａ、Ｓｅｒ１５０Ａｓｐ、Ｓｅｒ１５１Ｇｌｙ、Ａｌａ１５４Ｔｈｒ；
Ｌｙｓ３２Ｉｌｅ、Ｌｅｕ３３Ｐｈｅ、Ｓｅｒ１５０Ｖａｌ、Ｓｅｒ１５２Ａｒｇ、Ｇｌｙ１５３Ａｓｐ、Ａｌａ１５４Ａｓｐ；
Ｌｙｓ３２Ｉｌｅ、Ｌｅｕ３３Ｐｈｅ、Ｓｅｒ１５０Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５１Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５２Ａｓｐ、Ａｌａ１５４Ａｓｐ；
Ｓｅｒ１５０Ｖａｌ、Ａｌａ１５４Ａｓｐ；
Ｓｅｒ１５０Ｇｌｕ、Ｓｅｒ１５１Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５２Ｇｌｕ、Ａｌａ１５４Ａｒｇ；
Ｌｙｓ８Ｔｈｒ、Ｔｈｒ１２７Ａｌａ、Ａｌａ１５４Ｔｈｒ；
Ｌｙｓ３２Ｉｌｅ、Ｌｅｕ３３Ｐｈｅ；
Ａｌａ１５４Ｔｈｒ；
Ｌｅｕ３３Ｐｈｅ；
Ｓｅｒ１５１Ｇｌｙ；
Ｓｅｒ１５０Ａｓｐ；
Ｔｈｒ１２７Ａｌａ；ならびに
Ｌｙｓ３２Ｉｌｅ、Ｌｅｕ３３Ｐｈｅ、およびＬｅｕ３４の欠損；
より選択される更なる突然変異を有する、ＡＧＴ突然変異体である。
【００３７】
同様に検討される突然変異体は、修飾Ｃｙｓ６２Ａｌａ、Ｇｌｎ１１５Ｓｅｒ、Ｇｌｎ１１６Ｈｉｓ、Ｌｙｓ１２５Ａｌａ、Ａｌａ１２７Ｔｈｒ、Ａｒｇ１２８Ａｌａ、Ｃｙｓ１５０Ａｓｎ、Ｓｅｒ１５１Ｉｌｅ、Ｓｅｒ１５２Ａｓｎ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ、Ｇｌｙ１８２の後の切断、および場合により１〜１０個の、特に３〜７個の追加のアミノ酸修飾、例えば
Ｌｙｓ８Ｔｈｒ、Ｌｙｓ３２Ｉｌｅ、Ｌｅｕ３３Ｐｈｅ、Ｔｈｒ１２７Ａｌａ、Ａｓｎ１５０Ａｓｐ、Ｉｌｅ１５１Ｇｌｙ、Ａｌａ１５４Ｔｈｒ；
Ｌｙｓ３２Ｉｌｅ、Ｌｅｕ３３Ｐｈｅ、Ａｓｎ１５０Ｖａｌ、Ｉｌｅ１５１Ｓｅｒ、Ａｓｎ１５２Ａｒｇ、Ｇｌｙ１５３Ａｓｐ、Ａｌａ１５４Ａｓｐ；
Ｌｙｓ３２Ｉｌｅ、Ｌｅｕ３３Ｐｈｅ、Ａｓｎ１５０Ｇｌｙ、Ｉｌｅ１５１Ｇｌｙ、Ａｓｎ１５２Ａｓｐ、Ａｌａ１５４Ａｓｐ；
Ａｓｎ１５０Ｖａｌ、Ａｌａ１５４Ａｓｐ；
Ａｓｎ１５０Ｇｌｕ、Ｉｌｅ１５１Ｇｌｙ、Ａｓｎ１５２Ｇｌｕ、Ａｌａ１５４Ａｒｇ；
Ｌｙｓ８Ｔｈｒ、Ｔｈｒ１２７Ａｌａ、Ａｌａ１５４Ｔｈｒ；
Ｌｙｓ３２Ｉｌｅ、Ｌｅｕ３３Ｐｈｅ；
Ａｌａ１５４Ｔｈｒ；
Ｌｅｕ３３Ｐｈｅ；
Ｉｌｅ１５１Ｇｌｙ；
Ａｓｎ１５０Ａｓｐ；
Ｔｈｒ１２７Ａｌａ；ならびに
Ｌｙｓ３２Ｉｌｅ、Ｌｅｕ３３Ｐｈｅ、およびＬｅｕ３４の欠損；
より選択される更なる突然変異を有する、ＡＧＴ突然変異体である。
【００３８】
同様に好ましいのは、修飾Ｃｙｓ６２Ａｌａ、Ｌｙｓ１２５Ａｌａ、Ａｌａ１２７Ｔｈｒ、Ａｒｇ１２８Ａｌａ、Ｃｙｓ１５０Ｓｅｒ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ、Ｇｌｙ１８２の後の切断を有するＡＧＴ突然変異体；および修飾Ｃｙｓ６２Ａｌａ、Ｌｙｓ１２５Ａｌａ、Ａｌａ１２７Ｔｈｒ、Ａｒｇ１２８Ａｌａ、Ｇｌｙ１３１Ｌｙｓ、Ｇｌｙ１３２Ｔｈｒ、Ｍｅｔ１３４Ｌｅｕ、Ａｒｇ１３５Ｓｅｒ、Ｃｙｓ１５０Ｓｅｒ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ、Ｇｌｙ１８２の後の切断を有するＡＧＴ突然変異体である。
【００３９】
特に好ましいのは、実施例の、特に実施例２〜７および表１の化合物である。
【００４０】
突然変異体は、当業者に公知の技法によって得られる。ＡＧＴ変異体は、好ましくは、新しいＯ６−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼを産生および選択するために、当業者に既知のタンパク質工学技法を使用して、および／または分子進化を使用して生成できる。このような技法は、例えば、部位特異的変異誘発、飽和変異誘発、変異を配列の任意の箇所に導入するためのエラープローン（error prone）ＰＣＲ、および飽和変異誘発の後に使用されるＤＮＡシャッフリングである。ファージ提示法を活用すると、突然変異体は、本発明のＯ６−ベンジルグアニンおよびＡＧＴ基質に対する活性の著しい向上ならびに酸化条件下での安定性の向上と共に見出される。ＡＧＴは、繊維状ファージ上にファージカプシドタンパク質ｐＩＩＩを有する融合タンパク質として機能的に提示することが可能であり、ＡＧＴの異常なメカニズムを使用して、向上した特性、反応速度の上昇を備えたＡＧＴを提示するファージを選択できる、例えばJuilleratら, Chem Biol 10: 313-317,2003を参照。
【００４１】
本発明において、対象となるタンパク質またはペプチドは、上記のＡＧＴ突然変異体に融合される。対象となるタンパク質またはペプチドは、いかなる長さでもよく、二次、三次、または四次構造を有していても、有していなくてもよく、好ましくは少なくとも１２個のアミノ酸および最大２０００個のアミノ酸からなる。このような対象となるタンパク質またはペプチドの例を以下に与えるが、例えば酵素、ＤＮＡ結合タンパク質、転写調節タンパク質、膜タンパク質、核レセプタタンパク質、核局在化シグナルタンパク質、タンパク質補助因子、小型モノマー性ＧＴＰａｓｅ、ＡＴＰ結合カセットタンパク質、細胞内構造タンパク質、タンパク質を特定の細胞コンパートメントに標的化させることに関与する配列を備えたタンパク質、ラベルまたは親和性タグとして一般に使用されるタンパク質および上述のタンパク質のドメインまたはサブドメインである。対象となるタンパク質またはペプチドは好ましくはＡＧＴ突然変異体に、酵素によって開裂できるリンカーによって、例えばＤＮＡ段階にて適切な制限酵素、例えばＢｇｌＩＩによって開裂できるＡＧＡＴＣＴによって、および／またはタンパク質段階にて適切な酵素、例えばタバコエッチウィルスＮｌａ（ＴＥＶ）プロテアーゼによって開裂可能なリンカーによって融合される。融合タンパク質は、原核宿主、好ましくはＥ．ｃｏｌｉにて、または真核宿主、例えば酵母、昆虫、または哺乳類細胞にて発現できる。
【００４２】
ＡＧＴ突然変異体は、以下に記載する適切な基質上に存在する標識を融合タンパク質のＡＧＴ部分のシステイン残基の１つに標識を転移する特性を有する。
【００４３】
対象となるタンパク質およびＡＧＴ突然変異体を含む融合タンパク質を、標識を有する特定の基質に以下に記載するように接触させる。ＡＧＴ突然変異体が基質と反応して、基質の標識を転移するような反応条件を選択する。通常の条件は、室温、例えば約２５℃で約ｐＨ７の緩衝溶液である。しかしながら、ＡＧＴ突然変異体は、多様な他の条件の下でも反応し、本明細書で挙げるこれらの条件は、本発明の範囲を制限しないことが理解される。
【００４４】
基質の標識部分は、融合タンパク質が対象とする用途に応じて当業者が選択できる。ＡＧＴ突然変異体を含む融合タンパク質を基質に接触させた後に、標識は融合タンパク質に共有結合する。次に標識ＡＧＴ突然変異型融合タンパク質は、転移された標識によって更に操作および／または検出される。標識は、複数の同じまたは異なる標識からなる場合がある。基質が１つを超える標識を含有する場合、対応する標識ＡＧＴ突然変異型融合タンパク質も、標識融合タンパク質を更に操作および／または検出するための更なる選択肢を与える、１つを超える標識を含むことになる。
【００４５】
「操作」の下では、いずれの物理または化学処理も理解される。例えば操作は、細胞からの単離、標準精製技法、例えばクロマトグラフィーを用いた精製、化学試薬との、または特に結合パートナーが固相に固定されている場合の結合対の結合パートナーとの反応などを意味し得る。このような操作は、標識Ｌに依存することがあり、標識融合タンパク質の「検出」に加えて行うことができる。標識融合タンパク質に操作および検出の両方を行う場合、検出は、操作の前または後でもよく、あるいは本明細書で定義されたような操作の間に実施できる。
【００４６】
特定のＡＧＴ基質は、特許出願ＰＣＴ／ＥＰ０３／１０８８９（国際公開公報第２００４／０３１４０５号）に開示されているようなＡＧＴ基質、例えば式（Ｉ）
【００４７】
【化１】
【００４８】
〔式中、
Ｒ１−Ｒ２は、ＡＧＴによって基質として認識される基であり；
Ｘは、酸素または硫黄であり；
Ｒ３は、芳香族またはヘテロ芳香族基、あるいは場合によりＣＨ２に結合された二重結合を有する、置換不飽和アルキル、シクロアルキル、またはヘテロシクリル基であり；
Ｒ４は、リンカーであり；そして
Ｌは、標識、複数の同じまたは異なる標識、Ｒ４をＲ１に結合して環式基質を生成する結合、または更なる基−Ｒ３−ＣＨ２−Ｘ−Ｒ１−Ｒ２である。〕
の化合物であり、
【００４９】
基Ｒ１−Ｒ２において、残基Ｒ１は、好ましくは、ＡＧＴによって基質として認識される、窒素原子１〜５個を含有するヘテロ芳香族基、好ましくは式（ＩＩ）
【００５０】
【化２】
【００５１】
〔式中、
Ｒ２は、水素、炭素原子１〜１０個のアルキル、または糖部分であり；
Ｒ５は、水素、ハロゲン、例えばクロロまたはブロモ、トリフルオロメチル、またはヒドロキシであり；そして
Ｒ６は、水素、ヒドロキシ、または非置換もしくは置換のアミノである。〕
のプリンラジカルであり、
【００５２】
Ｒ５またはＲ６がヒドロキシである場合、プリンラジカルは主にその互変異性形で存在し、互変異性形ではＲ５またはＲ６を保持する炭素原子に隣接する窒素が水素原子を有し、この窒素原子とＲ５またはＲ６を保持する炭素原子との間の二重結合が単結合であり、そしてＲ５またはＲ６がそれぞれ二重結合された酸素である。
【００５３】
Ｒ６が非置換であるか、または置換のアミノであり、そしてプリンラジカルの結合に接続された残基Ｘが酸素である場合、式（ＩＩ）の残基は、グアニン誘導体である。
【００５４】
本発明の方法で有用な他の特定の基質は、Ｒ１が、式（ＩＩ）のプリンラジカルであり、Ｒ２が、シクロアルキル、例えばシクロペンチル、あるいはアルキル、例えばプロピルまたはイソブチル、あるいは置換アルキル、例えばシアノメチルである、式（Ｉ）の化合物である。
【００５５】
本発明は、生体内（細胞内）および試験管内の両方での標識ＡＧＴ突然変異型融合タンパク質のための方法を提供する。ＡＧＴ突然変異型融合タンパク質の生体内標識化という用語は、細胞のコンパートメントすべてはもちろんのこと、細胞外スペースを指示するＡＧＴ突然変異型融合タンパク質のコンパートメントすべてでの標識化を含む。ＡＧＴ突然変異型融合タンパク質の標識化が、生体内で実施され、そしてＡＧＴ突然変異体に融合したタンパク質が膜タンパク質、より詳細には原形質膜タンパク質である場合、融合タンパク質のＡＧＴ部分は膜のどちら側にも結合することが可能であり、例えば原形質膜の細胞質側または細胞外側に結合することが可能である。
【００５６】
標識化を試験管内で実施する場合、融合タンパク質の標識化は、ＡＧＴ突然変異型融合タンパク質の細胞抽出物中で、あるいはその精製または濃縮形を用いてのどちらかで実施できる。
【００５７】
標識化を生体内（細胞内）で、または細胞抽出物中で実施する場合、宿主の内因性ＡＧＴの標識化を好都合に考慮できる。宿主の内因性ＡＧＴがＯ６−アルキルグアニン誘導体または関連化合物を基質として受入れない場合、融合タンパク質の標識化は、特異的である。哺乳類細胞において、例えばヒト、マウス、またはラット細胞において、内因性ＡＧＴの標識化は可能である。これらの実験において、内因性ＡＧＴはもちろんのこと、ＡＧＴ突然変異型融合タンパク質の同時標識化が問題を引き起こす、このような実験においては、既知のＡＧＴ欠損細胞株を使用できる。
【００５８】
特定の基質に対して非反応性であり、次に内因性ＡＧＴによって認識される突然変異型ＡＧＴ融合タンパク質を使用する場合、内因性ＡＧＴの活性を遮断するために、特定の突然変異型ＡＧＴ融合タンパク質と反応するように設計された基質を用いて細胞をインキュベートする前またはその間に、このような非反応性基質を使用できる。例えばＮ９−置換Ｏ６−アルキルグアニン誘導体と、例えばＮ９−シクロペンチル−Ｏ６−ベンジルグアニンと反応しない突然変異型ＡＧＴを使用できる。内因性ＡＧＴを含有する哺乳類細胞において、この野生型ＡＧＴは、次に、標識化の前に、または突然変異型ＡＧＴ融合タンパク質をこの突然変異型ＡＧＴによって認識された別の基質によって標識化する間に、Ｎ９−シクロペンチル−Ｏ６−ベンジルグアニンによって遮断できる。
【００５９】
有効濃度の内因性野生型ＡＧＴが特定の生体サンプル中に存在しない場合、実験用に選択された突然変異型ＡＧＴが反応性でない基質を使用して、内因性ＡＧＴを事前に不活性化する必要はないであろう。このような条件下では、野生型ＡＧＴの特定の基質と反応しない突然変異型ＡＧＴ融合タンパク質を利用することにより、ＡＧＴの２つの異なる突然変異体（あるいはＡＧＴの１つの突然変異体および野生型ＡＧＴ）を２つの異なる基質によって選択的に標識化できる。このことは、野生型ｈＡＧＴタンパク質と比較して低分子量の基質に対して選択性を示す、ここでは「ＡＧＴ−Ａ」と呼ぶ突然変異型ＡＧＴ、および特定の基質と野生型ｈＡＧＴの１０分の１、好ましくは１００分の１の速さで反応する、「ＡＧＴ−Ｂ」と呼ぶ別の突然変異型ＡＧＴを使用することによって実施される。突然変異型「ＡＧＴ−Ａ」（または野生型ＡＧＴ）および突然変異型「ＡＧＴ−Ｂ」の両方を生体サンプルに存在させて、その生体サンプル−例えば細胞抽出物または無傷の細胞−を最初に突然変異型「ＡＧＴ−Ａ」（または野生型ＡＧＴ）によって選択的に認識される基質と一定時間反応させて、基質「Ａ」による突然変異型「ＡＧＴ−Ａ」タンパク質（または野生型ＡＧＴ）の完全な、またはほぼ完全なターンオーバーを引き起こす。しかし、突然変異型「ＡＧＴ−Ｂ」タンパク質は未反応またはほぼ未反応のまま残し、次いで突然変異型「ＡＧＴ−Ｂ」と反応性である（そして突然変異型「ＡＧＴ−Ａ」または野生型ＡＧＴも反応性であり得る）基質「Ｂ」を用いてインキュベーションし、突然変異型「ＡＧＴ−Ｂ」タンパク質と基質「Ｂ」との優先的反応も引き起こす。なぜならば、突然変異型「ＡＧＴ−Ａ」タンパク質（または野生型ＡＧＴ）が基質「Ａ」によって既に不活性化されているためである。同様に、基質「Ｂ」の選択した濃度の存在下でさえ、選択した濃度での突然変異型「ＡＧＴ−Ａ」（または野生型ＡＧＴ）の基質「Ａ」に対する反応性が突然変異型「ＡＧＴ−Ａ」（または野生型ＡＧＴ）の基質「Ａ」との優先的反応を引き起こすという条件で、突然変異型「ＡＧＴ−Ｂ」および突然変異型「ＡＧＴ−Ａ」（または野生型ＡＧＴ）を含有する混合物を、基質「Ａ」および基質「Ｂ」と同時にインキュベートし、突然変異型「ＡＧＴ−Ａ」（または野生型ＡＧＴ）の基質「Ａ」との優先的反応および突然変異型「ＡＧＴ−Ｂ」の基質「Ｂ」との優先的反応を引き起すことができる。２つの異なる基質「Ａ」および「Ｂ」は例えば、蛍光共鳴エネルギー移動対（ＦＲＥＴ）の２つの化合物、または近接アッセイのための１つの蛍光物質および１つのクエンチャーを保持してもよい。
【００６０】
本発明は、対象となるタンパク質を検出および／または操作する方法にも関し、該方法では対象となるタンパク質を融合タンパク質内にＡＧＴ突然変異体と共に組み込み、標識を有する特定のＡＧＴ基質とＡＧＴ融合タンパク質を接触させ、標識を認識および／または処理するために設計された系において標識を使用してＡＧＴ融合タンパク質を検出し、場合により操作する。このことは前の段落に記載するように、ＡＧＴ突然変異体と１つの基質との優先的な（または特に低い）反応性を利用している。特に本発明は、対象となるタンパク質およびＡＧＴ突然変異体のＡＧＴ融合タンパク質、ならびに更なるＡＧＴ融合タンパク質を含有するＡＧＴ融合タンパク質混合物を、ＡＧＴ突然変異体または更なるＡＧＴのどちらかに対して選択的である特定の基質と接触させて、混合物を更なる基質と処理して、対象となるタンパク質およびＡＧＴ突然変異体のＡＧＴ融合タンパク質を、標識を認識および／または処理するために設計された系において標識を使用して検出し、場合により更に操作する方法に関する。更なる基質は、混合物と特定の基質の反応終了後に、または特定の基質と共にＡＧＴ融合タンパク質混合物に添加できる。
【００６１】
より詳細には、本発明は、特定の基質の標識が更なる基質の標識と相互作用し、例えば標識が蛍光共鳴エネルギー移動対（ＦＲＥＴ）の化合物あるいは近接アッセイのための１つの蛍光物質および１つのクエンチャーである、これらの方法に関する。
【実施例】
【００６２】
使用した省略形：
ＡＧＴＭ＝修飾Ｃｙｓ６２Ａｌａ、Ｇｌｎ１１５Ｓｅｒ、Ｇｌｎ１１６Ｈｉｓ、Ｌｙｓ１２５Ａｌａ、Ａｌａ１２７Ｔｈｒ、Ａｒｇ１２８Ａｌａ、Ｇｌｙ１３１Ｌｙｓ、Ｇｌｙ１３２Ｔｈｒ、Ｍｅｔ１３４Ｌｅｕ、Ａｒｇ１３５Ｓｅｒ、Ｃｙｓ１５０Ａｓｎ、Ｓｅｒ１５１Ｉｌｅ、Ｓｅｒ１５２Ａｓｎ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ、Ｇｌｙ１８２の後の切断を有するＡＧＴ突然変異型
ＢＧ−Ｂｔ＝ビオチンに結合されたＯ６−（４−アミノメチル−ベンジル）−グアニン
ＢＧ−Ｃｙ３＝Ｃｙ３に結合されたＯ６−（４−アミノメチル−ベンジル）−グアニン
ＤＴＴ＝１，４−ジチオスレイトール
ＧＳＴ＝グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ 由来）
ＨＥＰＥＳ＝２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸
ＩＰＴＧ＝イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド
ＰＥＧ＝ポリエチレングリコール
ＰＭＳＦ＝フェニルメタンスルホニルフルオリド
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ＝ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動
【００６３】
〔実施例１〕
突然変異Ｌｙｓ１２５Ａｌａ、Ａｌａ１２７Ｔｈｒ、Ａｒｇ１２８Ａｌａ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ
ＰＧＥＧ−ｈＡＧＴ遺伝子の２つの特に重複する領域である、突然変異Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕを含有するＡＧＴ（Juilleratら、Chem Biol 10: 313-317,2003）を配列番号：３、配列番号：６および配列番号：４、配列番号：５のプライマーによって別個の反応にて増幅した。その部分相補性に関して、これらの２つの部分を更なるＰＣＲ反応にて構築し、配列番号：３および配列番号：４のプライマーによって増幅して、ここで突然変異Ｌｙｓ１２５Ａｌａ、Ａｌａ１２７Ｔｈｒ、Ａｒｇ１２８Ａｌａを更に含有する完全な遺伝子を産生させた。続いて遺伝子を発現ベクターｐＧＥＸ−２Ｔ（Pharmacia）ＢａｍＨＩ部位とＥｃｏＲＩ部位との間でクローニングした。これにより遺伝子がベクターによって提供されたＧＳＴタンパク質のＣ末端融合物として挿入遺伝子の発現が可能となる。
【００６４】
このベクターからのタンパク質発現をＥ．ｃｏｌｉ菌株ＢＬ２１で実施した。指数関数的に増殖する培養は、０．５ｍＭ ＩＰＴＧによって誘起して、発現を２４℃にて３．５時間実施した。
【００６５】
精製：収穫した細胞を１ｍＭ ＰＭＳＦおよび２μｇ／ｍｌアプロチニンを添加した、５０ｍＭホスフェート、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴを含有する緩衝液で再懸濁させて、リゾチームおよび超音波処理によって破壊した。細胞破片を４００００ｘｇでの遠心分離によって分離した。抽出物を事前に平衡にしたグルタチオンセファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に加え、次に２０ベッドボリューム（５０ｍＭホスフェート、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ）で洗浄した。変異したＧＳＴ−ＡＧＴ融合タンパク質を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、ｐＨ７．９中の１０ｍＭ還元グルタチオンで溶出させた。精製したタンパク質を５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２、１ｍＭ ＤＴＴ、３０％グリセロールで透析して、次に−８０℃にて保存した。
【００６６】
タンパク質収率の決定：ＧＳＴ−ＡＧＴ融合タンパク質の純度および相対量をＳＤＳ−ＰＡＧＥにサンプルをかけることによって比較した。純粋画分のＵＶスペクトルは、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌａｍｂｄａ １０を使用して記録した。大量のＤＮＡを含有しないタンパク質サンプルでは、タンパク質含有率の尺度として２８０ｎｍでの吸光度を同じ条件下で生成した野生型ｈＡＧＴまたはＰＧＥＧ−ｈＡＧＴの吸光度と比較した。
【００６７】
試験管内でタンパク質のＤＮＡ結合特性を比較するために、収穫した細胞を再懸濁させ、同じ方法の後に、しかし５０ｍＭホスフェート、０．１Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴを含有する緩衝液中でＧＳＴ融合タンパク質を精製した。透析サンプルにおいて、次に同時精製されたＤＮＡの量をＵＶ分光法によって見積もった。スペクトルは、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌａｍｂｄａ １０を使用して記録した。ＤＮＡの含有率は、２８０および２６０ｎｍにおける吸光度の比に相当する。この値を、野生型ｈＡＧＴまたはＰＧＥＧ−ｈＡＧＴを精製して得られた値とそれぞれ比較した。
【００６８】
活性アッセイ：精製した変異ＧＳＴ−ＡＧＴは、ビオチン化Ｏ６−ベンジルグアニン（ＢＧ−Ｂｔ、Juilleratら, Chem Biol 10: 313-317,2003の物質３ａ）を用いて試験管内でインキュベートした。総反応物量８０μｌにて、０．２μＭ ＧＳＴ−ＡＧＴを５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．２および１ｍＭ ＤＴＴ中の１μＭ基質を用いて室温にてインキュベートした。複数の時点にてアリコートをＳＤＳ−Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液中の１ｍＭ Ｏ６−ベンジルグアニン（Ｓｉｇｍａ）で失活させて、ウェスタンブロッティング分析を受けさせた（ニュートラアビジン−ペルオキシダーゼコンジュゲート（ＰＩＥＲＣＥ），Ｒｅｎａｉｓｓａｎｃｅ ｒｅａｇｅｎｔ ｐｌｕｓ（ＮＥＮ））。対応するバンドの強度は、Ｋｏｄａｋ Ｉｍａｇｅ Ｓｔａｔｉｏｎ ４４０によって定量した。
【００６９】
生体内局在化：変異ＡＧＴ（Ｌｙｓ１２５Ａｌａ、Ａｌａ１２７Ｔｈｒ、Ａｒｇｌ２８Ａｌａ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ）遺伝子を配列番号：７、配列番号：８のプライマーで増幅して、ベクターｐＥＧＦＰ−Ｎｕｃ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のＮｈｅＩ部位とＢａｍＨＩ部位との間でクローニングした。この構築物を内因性ＡＧＴが欠損したＣＨＯ細胞に形質移入した（B.Kainaら、Carcinogenesis 12,1857-1867,1991）。２４時間のＡＧＴ一過性発現の後に、細胞をJuilleratら、Chem Biol 10: 313-317,2003の物質４の０．５μＭ で５分間インキュベートして、ＰＢＳで３０分間洗浄した。細胞を、水（１．２開口数）対物レンズを備えたＺｅｉｓｓ ＬＳＭ ５１０顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ ＡＧ）での４８８ｎｍアルゴン／クリプトンレーザ線を使用して、レーザ走査共焦顕微鏡法によって撮像した。
【００７０】
Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、突然変異型ＡＧＴ Ｌｙｓ１２５Ａｌａ、Ａｌａ１２７Ｔｈｒ、Ａｒｇ１２８Ａｌａ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９ＧｌｕのＧＳＴ融合は、ＰＧＥＧ−ｈＡＧＴの少なくとも３倍の溶解性タンパク質を生じる。それは少なくとも１０分の１に減少したＤＮＡ結合を示し、Ｏ６−ベンジルグアニン基質に対する活性を維持している。ＣＨＯ細胞では、蛍光標識変異ＡＧＴは、細胞質全体に分布しており、優先的な核局在化は検出できない。
【００７１】
〔実施例２〕
突然変異Ｃｙｓ６２Ａｌａ、Ｌｙｓ１２５Ａｌａ、Ａｌａ１２７Ｔｈｒ、Ａｒｇ１２８Ａｌａ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ
実施例１の突然変異型ＡＧＴ遺伝子を、配列番号：３、配列番号：１０および配列番号：４、配列番号：９のオリゴヌクレオチドを用いて実施例１に記載するように増幅およびクローニングすると、ＰＣＲによるその取込み時に遺伝子内に更なる突然変異Ｃｙｓ６２Ａｌａを引き起こさせた。タンパク質発現、精製および収率の決定は、実施例１に記載するように実施した。突然変異型遺伝子は、ベクターｐＡＫ１００内の繊維状ファージのｇ３タンパク質へ融合させて遺伝子をサブクローニングするために、ＳｆｉＩ制限部位を含有する配列番号：１１、配列番号：１２のプライマーによってＰＣＲ増幅した（Krebberら、J Immunol Methods 201: 35-55,1997）。非サプレッサ菌株Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１内で遺伝子を発現させるときに、アンバー停止コドンは、ＡＧＴ遺伝子後の翻訳を終止させる。したがって、このベクターからの突然変異型ＡＧＴタンパク質のペリプラズム発現を実施例１で記載するように実施した。収穫した細胞を１ｍＭ ＰＭＳＦおよび２μｇ／ｍｌアプロチニンを添加した、５０ｍＭホスフェート、１Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴを含有する緩衝液で再懸濁させて、リゾチームおよび超音波処理によって破壊した。細胞破片を４００００ｘｇでの遠心分離によって分離した。実施例１で記載するように、上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥによるタンパク質収率の定量および活性アッセイに直接供した。
【００７２】
突然変異型Ｃｙｓ６２Ａｌａ、Ｌｙｓ１２５Ａｌａ、Ａｌａ１２７Ｔｈｒ、Ａｒｇ１２８Ａｌａ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕは、Ｏ６−ベンジルグアニン基質に対する活性を保持している。この突然変異型ＡＧＴからの溶解性ＧＳＴ融合タンパク質の収率は、実施例１の突然変異型Ｌｙｓ１２５Ａｌａ、Ａｌａ１２７Ｔｈｒ、Ａｒｇ１２８Ａｌａ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕの収率の少なくとも２倍である。Ｅ．ｃｏｌｉのペリプラズムでの発現による活性ＡＧＴ突然変異体の収率は、ＰＧＥＧ−ｈＡＧＴの収率の少なくとも３倍である。
【００７３】
〔実施例３〕
１８２での切断、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ
ＰＧＥＧ−ｈＡＧＴ遺伝子（Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ、Ｊｕｉｌｌｅｒａｔら、Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ １０：３１３−３１７，２００３を参照）を配列番号：３、配列番号：１３のプライマーによって増幅して、コドン１８２の後に停止コドンおよびＥｃｏＲＩを導入して、次に発現ベクターｐＧＥＸ２Ｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のＢａｍＨＩ部位とＥｃｏＲＩ部位との間でクローニングした。タンパク質発現、精製および発現収率の見積りは、実施例１に記載するように実施した。
【００７４】
切断ＰＧＥＧ−ｈＡＧＴ突然変異体は、Ｏ６−ベンジルグアニン基質に対する活性を保持している。溶解性突然変異型ＧＳＴ−ＡＧＴ融合タンパク質の収率は、突然変異型ＰＧＥＧ−ｈＡＧＴの収率の少なくとも２倍である。
【００７５】
〔実施例４〕
突然変異Ｇｌｙ１３１Ｌｙｓ、Ｇｌｙ１３２Ｔｈｒ、Ｍｅｔ１３４Ｌｅｕ、Ａｒｇ１３５Ｓｅｒ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ
ＰＧＥＧ−ｈＡＧＴ遺伝子（Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ、Ｊｕｉｌｌｅｒａｔら、Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ １０：３１３−３１７，２００３を参照）を、実施例１に記載するように配列番号：１１、配列番号：１５および配列番号：１２、配列番号：１４のプライマーでＰＣＲ増幅して、構築した。プライマーは、ヌクレオチド混合物ＮＮＫ（Ｎ＝Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ；Ｋ＝ＧまたはＴ）をｈＡＧＴ遺伝子のコドン１３１、１３２、１３４、１３５に相当する位置に含有する。遺伝子を繊維状ファージのｇ３タンパク質へ融合させて、ＳｆｉＩ制限部位を介してベクターｐＡＫ１００内にクローニングした。生じた遺伝子ライブラリをファージ提示に使用した。
【００７６】
このライブラリのファージの産生をＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０１細胞にて実施した。指数関数的培養物にヘルパーファージを重感染させて、２４℃にて一晩培養した。この培養物の上清を１μＭジゴキシゲニン化Ｏ６−ベンジルグアニン（Juilleratら, Chem Biol 10: 313-317,2003の物質２）によって６分間インキュベートした。次の選択ラウンドでは、反応時間がそれぞれ９０秒および４５秒まで短縮し、基質の濃度は、１０ｎＭまで低下して選択圧を上昇させた。この反応からのファージを４％ ＰＥＧ／３％ ＮａＣｌを用いた沈殿によって精製した。ジゴキシゲニンによって今や共有結合的に標識された突然変異型ＡＧＴを有するファージを、抗ジゴキシゲニン抗体（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）でコーティングした磁気ビーズを用いたインキュベーションによって単離して、細菌の再感染に使用した。
【００７７】
選択したＡＧＴ突然変異体を実施例１に記載するように、ｐＧＥＸ２Ｔ内にサブクローニングして、発現させて、精製およびキャラクタリゼーションした。Ｎ９−置換およびＮ９−非置換Ｏ６−ベンジルグアニン基質間の識別は、Ｎ９−置換およびＮ９−非置換Ｏ６−ベンジルグアニンを用いた精製された変異ＧＳＴ−ＡＧＴのインビトロでの競合実験によって評価した。０．２μＭ ＧＳＴ−ＡＧＴのアリコートを、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３、および１ｍＭ ＤＴＴ中の様々な濃度のＮ９−置換基質（０、０．５〜１００μＭまで）および０．５μＭビオチン化Ｏ６−ベンジルグアニン（ＢＧ−Ｂｔ、Juilleratら, Chem Biol 10: 313-317, 2003の物質３ａ）を用いて室温にてインキュベートした。４５分後、ＳＤＳ−Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液の添加および熱変性によって反応を停止させた。サンプルにＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティング分析に供した（ニュートラアビジン−ペルオキシダーゼコンジュゲート（ＰＩＥＲＣＥ），Ｒｅｎａｉｓｓａｎｃｅ ｒｅａｇｅｎｔ ｐｌｕｓ（ＮＥＮ））。対応するバンドの強度は、Ｋｏｄａｋ Ｉｍａｇｅ Ｓｔａｔｉｏｎ ４４０によって定量した。
【００７８】
この突然変異型ＡＧＴからの溶解性ＧＳＴ融合タンパク質の収率は、ＰＧＥＧ−ｈＡＧＴの収率の少なくとも２倍である。突然変異型ＡＧＴは、Ｏ６−ベンジルグアニン基質に対して少なくとも２倍更に上昇した活性を示す。Ｏ６−アルキル−Ｎ９−デオキシリボシルグアニンまたはＮ９−シクロペンチル−Ｏ６−ベンジルグアニンに対する反応性は、ＰＧＥＧ−ｈＡＧＴと比較して、少なくとも１０分の１に、特定のクローンでは少なくとも１００分の１に低下する。オリゴヌクレオチド、例えば位置１４のグアニンがＯ６−ベンジル基を有する配列番号：２のオリゴヌクレオチドとの反応性は、ＰＧＥＧ−ｈＡＧＴと比較して、少なくとも１０００分の１に低下する。
【００７９】
〔実施例５〕
突然変異Ｇｌｎ１１５Ｓｅｒ、Ｇｌｎ１１６Ｈｉｓ、Ｃｙｓ１５０Ａｓｎ、Ｓｅｒ１５１Ｉｌｅ、Ｓｅｒ１５２Ａｓｎ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ
実施例４に記載したように、３つのＰＣＲ断片から配列番号：１１、配列番号：１７、配列番号：１６、配列番号：１９および配列番号：１２、配列番号：１８のプライマーの組合せを使用して、３回の別個のＰＣＲ反応で、ＡＧＴ突然変異体のライブラリを構築した。遺伝子を部分的に重複する断片から構築して、断片のうち２つは、コドン１１５−１１６および１５０−１５２にそれぞれ対応する位置に、ランダムヌクレオチド混合物ＮＮＫを含有している。ファージ提示選択は、Juilleratら, Chem Biol 10: 313-317,2003に記載されているように実施した。選択したタンパク質を実施例１に記載するように、ｐＧＥＸ内にサブクローニングして、発現させ、精製およびキャラクタリゼーションした。ペリプラズム発現は実施例２に記載するように実施した。
【００８０】
この突然変異型ＡＧＴからの溶解性ＧＳＴ融合タンパク質の収率は、ＰＧＥＧ−ｈＡＧＴからの収率の少なくとも２倍である。突然変異型ＡＧＴは、Ｏ６−ベンジルグアニン基質に対する活性を保持している。Ｅ．ｃｏｌｉのペリプラズムでの発現による活性ＡＧＴ突然変異体の収率は、ＰＧＥＧ−ｈＡＧＴの収率の少なくとも２倍である。
【００８１】
〔実施例６〕
突然変異Ｃｙｓ６２Ａｌａ、ＧＩｎ１１５Ｓｅｒ、Ｇｌｎ１１６Ｈｉｓ、Ｌｙｓ１２５Ａｌａ、Ａｌａ１２７Ｔｈｒ、Ａｒａ１２８Ａｌａ、Ｇｌｙ１３１Ｌｙｓ、Ｇｌｙ１３２Ｔｈｒ、Ｍｅｔ１３４Ｌｅｕ、Ａｒａ１３５Ｓｅｒ、Ｃｙｓ１５０Ａｓｎ、Ｓｅｒ１５１Ｉｌｅ、Ｓｅｒ１５２Ａｓｎ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ、１８２での切断、「ＡＧＴＭ」
実施例２、３、４、５による突然変異を組合せた。実施例１からの突然変異型ＡＧＴ遺伝子の４つの重複断片（Ｃｙｓ６２Ａｌａ、Ｌｙｓ１２５Ａｌａ、Ａｌａ１２７Ｔｈｒ、Ａｒｇ１２８Ａｌａ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ）を、配列番号：３、配列番号：２３；配列番号：２１、配列番号：２２；配列番号：２０、配列番号：２５および配列番号：２４、配列番号：１３のプライマー組合せを使用して増幅し、遺伝子へと構築して、実施例１に記載するようにｐＧＥＸ２Ｔ内へサブクローニングした。実施例１に記載するように、突然変異型ＡＧＴ（「ＡＧＴＭ」）を発現させ、精製およびキャラクタリゼーションした。
【００８２】
適切な緩衝液（例えば１００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、２０％グリセロール）中で確立された１つ以上の濃度において４℃または最高３７℃での精製サンプルの一晩に渡るインキュベーション後に溶解性画分中に残存するタンパク質の量を決定することによって、ＡＧＴＭまたはＡＧＴＭ融合タンパク質の試験管内での溶解度を測定して、野生型ＡＧＴまたは既知のＡＧＴ突然変異体、例えば「ＰＧＥＧ−ｈＡＧＴ」の溶解度と比較した（Juilleratら、Chem Biol 10: 313-317,2003）。
【００８３】
突然変異型ＡＧＴＭは、実施例１〜５に記載する突然変異体と比較して少なくとも２倍の発現速度の更なる上昇を示し、野生型ＡＧＴと比較したときに少なくとも４倍の試験管内での溶解度の上昇を有する。それはＯ６−ベンジルグアニンに対する反応性を保持しているが、Ｎ９−置換Ｏ６−アルキルグアニン誘導体との少なくとも１０分の１までの反応性の著しい低下、ＤＮＡ基質との少なくとも１００分の１までの反応性の低下を示す。
【００８４】
酸化条件下での安定性：配列番号：１１および配列番号：２８のプライマーを使用して突然変異型遺伝子をＰＣＲ増幅して、実施例２で記載するように、該遺伝子をｐＡＫ１００内にサブクローニングした。実施例２に記載するようにタンパク質発現および細胞溶解を行って、透明な細胞溶解物を得た。ＰＧＥＡ−ｈＡＧＴ（Ｊｕｉｌｌｅｒａｔら，Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ １０： ３１３−３１７，２００３）および突然変異体の反応性を比較するために、１μＭ ＢＧ−Ｂｔを用いてサンプルを５０分間インキュベートして、ＳＤＳ−Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液で失活させ、ニュートラアビジン−ペルオキシダーゼコンジュゲート（Ｐｉｅｒｃｅ）またはモノクローナルマウス抗ＦＬＡＧ ＩｇＧ抗体（Ｍ２、Ｓｉｇｍａ）および二次抗マウスＩｇＧ：：ＨＲＰコンジュゲート、ならびにＲｅｎａｉｓｓａｎｃｅ ｒｅａｇｅｎｔ ｐｌｕｓ（ＮＥＮ）を用いてウェスタンブロッティングによって分析した。ブロットをＫｏｄａｋ Ｉｍａｇｅ ｓｔａｔｉｏｎ ４４０で視覚化した。抗ＦＬＡＧ ＩｇＧ抗体を使用して、溶解性ＡＧＴタンパク質の総量を見積もったが、ニュートラアビジンは、その反応性部分のみを定量した。ＡＧＴ突然変異体の予想分子量は、それぞれ２１および２４ｋＤａである。
【００８５】
ペリプラズム発現は２〜３倍のＡＧＴＭをもたらすが、突然変異型ＰＧＥＡ−ｈＡＧＴでは、少なくとも１０倍のこの突然変異体の活性タンパク質をもたらす（タンパク質収率へ正規化）。
【００８６】
ＢＧ−Ｃｙ３アッセイで測定したＤＮＡベース基質に対する反応性：前に記載したＯ６−（４−アミノエチル−ベンジル）グアニン（Kepplerら、Nature Biotechnol.21: 86-89,2003）をＣｙ３の市販のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｃｙ３−ＮＨＳ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）と反応させることによって、ＢＧ−Ｃｙ３を調製した。カップリング反応は周囲温度にて、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中でトリエチルアミン１当量の存在下で実施した。ＢＧ−Ｃｙ３コンジュゲートは、Ｃ１８カラムでの逆相ＨＰＬＣによって、０．１％トリフルオロ酢酸〜アセトニトリルの線形勾配を使用して精製した。溶媒蒸発後、ＢＧ−Ｃｙ３をジメチルスルホキシドに溶解させ、−２０℃にて保存した。ＤＮＡベース基質との反応性を測定するために、反応緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２、１ｍＭ ＤＴＴ、２００ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）中に各種の濃度（０〜５μＭ）の配列番号：２のオリゴヌクレオチド（位置１４で修飾）、０．２μＭ ＧＳＴ−ＡＧＴ融合タンパク質、および０．５μＭ ＢＧ−Ｃｙ３を含有する反応混合物をマイクロタイタープレートでインキュベートした。Ｃｙ３誘導体の蛍光（励起５１９ｎｍ、発光５７２ｎｍ）をＳｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｇｅｍｉｎｉプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で測定した。
【００８７】
突然変異型ＡＧＴＭは、５μＭまでのＢＧ修飾オリゴヌクレオチドの存在下でＢＧ−Ｃｙ３とのその反応の低下を示していない（図１Ａ）。ＰＧＥＧ−ｈＡＧＴの活性は、０．５μＭ（またはそれ以上）ＢＧ修飾オリゴヌクレオチドの存在下でバックグラウンドレベル以下（３％未満）である（図１Ｂ）。
【００８８】
ＤＮＡ結合：ＤＮＡ結合は、ＡＧＴ突然変異体とＢＧ誘導体との反応のＤＮＡによる阻害として測定した。オリゴヌクレオチドの代わりにサケ精子ＤＮＡ（２５μｇ／ｍｌ）を含有する反応混合物中のＡＧＴ突然変異体の反応速度をＢＧ−Ｃｙ３アッセイによって測定した。反応速度は、得られたデータを単指数上昇に最大まで適合させることによって決定した。
【００８９】
ＡＧＴＭのＢＧ−Ｃｙ３に対する反応速度は、ＤＮＡの存在下で不変であるのに対して、ＰＧＥＧ−ｈＡＧＴのＢＧ−Ｃｙ３に対する速度は、ＤＮＡの存在下で５分の１に低下している。
【００９０】
反応後の安定性：１２ｘＨｉｓ−タグならびにＳｂｆＩおよびＡｓｃＩクローニング部位を含めるために合成オリゴヌクレオチド（配列番号：２９および配列番号：３０）ＮｃｏＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間でクローニングすることによって、ベクターｐＢＡＤ／Ｈｉｓ Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を修飾した。ＡＧＴＭの遺伝子は、配列番号：３１および配列番号：３２のプライマーによって増幅して、ＳｂｆＩ／ＡｓｃＩ部位間にてこのベクター内へクローニングした。野生型ＡＧＴおよび突然変異型ＡＧＴ（Ｌｙｓ１２５Ａｌａ、Ａｌａｌ２７Ｔｈｒ、Ａｒｇ１２８Ａｌａ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ）を配列番号：３１および配列番号：３３のプライマーによって増幅して、このベクター内へクローニングした。Ｅ．ｃｏｌｉ菌株Ｔｏｐ１０においてタンパク質発現を実施した。指数関数的に増殖する培養物を０．２％アラビノースによって誘起し、発現を２８℃にて１６時間に渡って実施した。０．５Ｍ ＮａＣｌ、８０ｍＭイミダゾール、１％ Ｔｒｉｔｏｎ、２５０μＭ ＰＭＳＦ、１ｍＭ β−メルカプトエタノール、５ｍｇ／ｍｌリゾチーム、２０μｇ／ｍｌ ＤＮａｓｅを含有する緩衝液を１０ｍｇ／ｇまで添加することによって細胞を溶解させ、４５分間撹拌した。１０，０００ｇにて３０分間の遠心分離後の上清を平衡したＮｉ−ＮＴＡ（Ｑｉａｇｅｎ）カラムに装填して０．５Ｍ ＮａＣｌ、１００ｍＭイミダゾール、１ｍＭ β−メルカプトエタノールの２０カラム体積で、続いて０．２５Ｍ ＮａＣｌ、１００ｍＭイミダゾール、２０％グリセロールの３カラム体積で洗浄した。タンパク質を０．２５Ｍ ＮａＣｌ、４００ｍＭイミダゾール、２０％グリセロールで溶出させた。１ｍＭ ＤＴＴを添加した後、タンパク質を−８０℃で保存した。
【００９１】
ＡＧＴタンパク質（１０μＭにて）をフルオレセイン修飾Ｏ６−ベンジルグアニン（Juilleratら、Chem Biol 10: 313-317,2003の物質５、ＢＧ−ＦＬ、２０μＭ）と定量的に反応させて、サイズ排除カラム（Ｅｃｏｎｏｐａｃ １０ＤＧ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で精製し、７日間インキュベートした。各種の時点にて、アリコートを２５，０００ｇにて遠心分離して、１％ ＳＤＳを上清に添加した。上清の蛍光をＶｉｃｔｏｒ２蛍光プレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、４８５／５３５ｎｍにて励起／発光）で測定した。
【００９２】
７日間に渡って溶解性蛍光タンパク質の約６０％を失うｈＡＧＴまたは突然変異型（Ｌｙｓ１２５Ａｌａ、Ａｌａ１２７Ｔｈｒ、Ａｒｇ１２８Ａｌａ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ）とは対照的に、標識突然変異型ＡＧＴＭは、７日間を超えて溶液中にて安定なままである。
【００９３】
Ｎ９−修飾Ｏ６−ベンジルグアニン誘導体に対するＡＧＴの反応性：実験は、ＢＧ−Ｃｙ３アッセイに基づく。ＡＧＴのＢＧ−Ｃｙ３との反応時に、Ｃｙ３の蛍光放出強度の２〜３倍の上昇が認められる。化合物Ｎ９−イソブチル−Ｏ６−ベンジルグアニン、Ｎ９−プロピル−Ｏ６−ベンジルグアニン、またはＮ９−ニトリル−Ｏ６−ベンジルグアニンに対する、ＡＧＴＭ（実施例６）対ＰＧＥＧ−ｈＡＧＴ（Juilleratら2003、突然変異Ｎ１５７Ｇ、Ｓ１５９Ｅを含有する）の反応性を、ＧＳＴ−ＡＧＴ融合タンパク質１０μＭのサンプルを反応緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０、１ｍＭ ＤＴＴ）中のこれらのサンプル１００μＭによって室温にて１５分間に渡って事前にインキュベートすることによって調査した。次にＢＧ−Ｃｙ３（２０μＭ最終濃度）を添加して、反応物を室温にて更に１時間インキュベートした。サンプルを反応緩衝液によって１：２０で希釈して、マイクロタイタープレートに移動した。Ｃｙ３蛍光物質の蛍光強度（励起：５１９ｎｍ、発光：５７２ｎｍ）をＳｐｅｃｔｒａ Ｍａｘ Ｇｅｍｉｎｉマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）によって測定した。
【００９４】
両方のＡＧＴ突然変異体をＢＧ（１００μＭ、１５分の反応時間）によって効率的に予備遮断した（図３、Ｎｏ．３）。ＡＧＴＭの５％は、ＢＧでの予備遮断後に活性のままである（灰色棒）。Ｎ９−修飾ＢＧ誘導体に対するＡＧＴＭとＰＧＥＧ−ｈＡＧＴとの反応性の著しい差が見られる。ＡＧＴＭは、１％〜１０％の範囲でＮ９−修飾ＢＧ誘導体と反応する（図３、Ｎｏ．４、５、６、灰色棒）。ＡＧＴＭとは対照的に、ＰＧＥＧ−ｈＡＧＴは、３つすべてのＮ９−修飾ＢＧ誘導体と効率的に反応する。ＢＧ−Ｃｙ３による次のインキュベーション時にはバックグラウンドを超える蛍光の増加は認められず、Ｎ９−置換化合物との完全な反応を示す（図３、Ｎｏ．４、５、６、黒色棒）。
【００９５】
〔実施例７〕
１つの生体サンプル中に存在する２つの異なるＡＧＴの変異体と２つの異なる基質との反応
実施例６（ＡＧＴＭ）の突然変異型ＡＧＴを配列番号：２６および配列番号：２７のプライマーによってＰＣＲ増幅して、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩを介してｐＥＴ１５ｂ内へサブクローニングした。このベクターからの遺伝子発現を実施例１に記載するようにＥ．ｃｏｌｉ菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）にて実施し、ベクターによってコードされるＮ末端融合されたＨｉｓ−タグを有するタンパク質を生じさせた。細胞を収穫して、実施例１に記載するように、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、５０ｍＭホスフェート、ｐＨ８．０を含有する抽出緩衝液中に抽出した。タンパク質を含有する抽出物を事前に平衡にされたＮｉ−ＮＴＡ−セファロース（Ｑｉａｇｅｎ）に加え、次にこれを、２０ｍＭイミダゾールを含有する緩衝液２０ベッドボリュームで洗浄した。２５０ｍＭイミダゾールを含有する緩衝液を用いてＨｉｓ−タグ化タンパク質を溶出させた。実施例１に記載するように精製したタンパク質を透析し、保存して、後でキャラクタリゼーションした。
【００９６】
実験では、２つのＡＧＴタンパク質には異なるサイズの２つのタグを使用した：Ｈｉｓ−タグ化 ＡＧＴＭ（約２０ｋＤａ）およびＧＳＴ−ｈＡＧＴ（実施例１に記載するようにクローニングおよび調製、しかし野生型ｈＡＧＴ遺伝子から開始、約４８ｋＤａ）を、５０ｍＭＨＥＰＥＳ、１ｍＭＤＴＴ、２００ｍｇ／ｍＬＢＳＡを含有する反応緩衝液（ｐＨ７．３）でそれぞれ０．２μＭおよび１．２μＭ最終濃度まで希釈した。サンプルを基質Ｎ９−シクロペンチル−Ｏ６−ブロモテニル−グアニン（ＣＰＴＧ、０、５および１０μＭ最終濃度）およびビオチン化Ｏ６−ベンジルグアニン（ＢＧ−Ｂｔ、５μＭ最終濃度）の混合物で３０分間インキュベートした。反応物をＳＤＳ−Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液の添加によって失活させ、ウェスタンブロッティング分析に供した（実施例１）。２つのＡＧＴ変異体は異なる質量を有するため、２つのタンパク質はアクリルアミドゲルで分離して、独立して分析できる。ＧＳＴ−ｈＡＧＴに対するＣＰＴＧの高い特異性が認められる。同じ濃度では（どちらの基質も５μＭ最終濃度）、ＧＳＴ−ｈＡＧＴの９５％がＣＰＴＧと反応するのに対して、Ｈｉｓ−タグ化 ＡＧＴＭはわずか５％である。
【００９７】
基質ＣＰＴＧは、シクロペンテニルメチルカーボネートによる６−クロログアニンの位置Ｎ−９のシクロペンテニル化と、６−クロロ−Ｎ９−シクロペンチル−グアニンへの還元と、３級アミンの存在下での４−ブロモ−２−ヒドロキシメチルチオフェンとの反応によって入手できる。
【００９８】
【化３】
【００９９】
更なる実験において、実施例６に記載する突然変異型ＡＧＴＭを配列番号：３４および配列番号：３６のプライマーによって増幅し、ベクターｐＥＧＦＰ−ＮｕｃのＮｈｅＩ部位とＢｇｌＩＩ部位との間へクローニングした。酵母β−ガラクトシダーゼ遺伝子を配列番号：３７および配列番号：３８のプライマーによって増幅して、ＢｇｌＩＩ／ＢａｍＨＩを介してこのベクターへサブクローニングして、ＡＧＴＭ−β−ＧａＩ融合遺伝子を有するベクターを生成させた。ｈＡＧＴ遺伝子を実施例１に記載する原理に基づいて、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：３４、および配列番号：３５のプライマーによって増幅し、ＮｈｅＩ／ＢｇｌＩＩを介してｐＥＧＦＰ−Ｎｕｃ内へクローニングして、突然変異Ｇｌｙ１６０ＴｒｐをコードするＡＧＴ−ＮＬＳ３融合遺伝子を生成させた。ＡＧＴ突然変異体両方の同時の一過性発現後に、細胞を５μＭ ＣＰＴＧで１０分間、次にJuilleratら、Chem Biol 10: 313-317,2003の物質４５μＭで２０分間インキュベートした。実施例１に記載するように細胞を洗浄および撮像した。
【０１００】
ＣＨＯ細胞において、細胞質に局在化したＡＧＴＭ−β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質を蛍光基質物質４との反応によって、選択的に蛍光標識化した。核内の他のＡＧＴ融合タンパク質の著しい標識化は認められない。ＡＧＴ（Ｇｌｙ１６０Ｔｒｐ）が細胞内でＣＰＴＧと効率的に反応して、それゆえその後、蛍光基質によって標識できないことが結論付けられる。実施例６（ＡＧＴＭ）の突然変異体は、細胞内でＣＰＴＧによる事前のインキュベーション後に蛍光基質に対して反応性のままであり、したがって第１のステップでＣＰＴＧと反応しない。
【０１０１】
〔実施例８〕
化合物Ｃｙｓ６２Ａｌａ、Ｇｌｎ１１５Ｓｅｒ、Ｇｌｎ１１６Ｈｉｓ、Ｌｙｓ１２５Ａｌａ、Ａｌａ１２７Ｔｈｒ、Ａｒｇ１２８Ａｌａ、Ｇｌｙ１３１Ｌｙｓ、Ｇｌｙ１３２Ｔｈｒ、Ｍｅｔ１３４Ｌｅｕ、Ａｒｇ１３５Ｓｅｒ、Ｃｙｓ１５０Ａｓｎ、Ｓｅｒ１５１Ｉｌｅ、Ｓｅｒ１５２Ａｓｎ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ、１８２での切断における更なる突然変異
Ａ）エラープローンＰＣＲ：ベクターｐＡＫ１００からの実施例６のＡＧＴＭの遺伝子を、配列番号：４２のプライマーおよび配列番号：４１のビオチン化プライマーによってＴａｑ−ポリメラーゼを使用して、１２０μＭ（６−（２−デオキシ−β−Ｄ−エリスロ−ペント−フラノシル）−３，４−ジヒドロ−６Ｈ，８Ｈ−ピリミド［４，５−ｃ］［１，２］オキサジン−２−オン）−５’−トリホスフェートおよび４８０μＭ ２’−デオキシ−８−オキソ−グアノシン−トリホスフェート（どちらもＴｒｉｌｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓより）でスパイクしたエラープローンＰＣＲ反応によって増幅した。生成物をストレプトアビジンコーティングビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２８０、Ｄｙｎａｌ）上に捕捉して、次に配列番号：４３および配列番号：４４のプライマーを用いて標準ＰＣＲによって増幅した。
【０１０２】
Ｂ）飽和突然変異誘発、領域１５０−１５４：ＡＧＴＭ（実施例６の突然変異体）の遺伝子を配列番号：１１、配列番号：４５、配列番号：４６および配列番号：２８のプライマーを用いてＰＣＲによって実施例１に記載するように増幅して、ＳｆｉＩを介してｐＡＫ１００内へサブクローニングした。プライマーは、ｈＡＧＴ遺伝子のコドン１５０−１５４に相当する位置にヌクレオチド混合物ＮＮＫ（Ｎ＝Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ；Ｋ＝ＧまたはＴ）を含有する。
【０１０３】
Ｃ）飽和突然変異誘発、領域３１−３５：ＡＧＴＭ（実施例６の突然変異体）をコードする遺伝子を配列番号：１１、配列番号：４８、配列番号：４７および配列番号：２８のプライマーを用いてＰＣＲによって実施例１に記載するように増幅して、ＳｆｉＩを介してｐＡＫ１００内へサブクローニングした。プライマー４７は、ｈＡＧＴ遺伝子のコドン３１−３５に相当する位置にヌクレオチド混合物ＮＮＫ（Ｎ＝Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ；Ｋ＝ＧまたはＴ）を含有し プライマー４８は、アンチセンスストランドのための混合物ＭＮＮ（Ｍ＝ＣまたはＡ）を含有する。
【０１０４】
増幅生成物を繊維状ファージのｇ３遺伝子に融合させて、ＳｆｉＩ制限部位を介してベクターｐＡＫ１００へクローニングした。実施例４に記載したように、生じた遺伝子ライブラリをファージ提示に使用した。ライブラリの突然変異体をＢＧ−Ｂｔ ５〜５０ｎＭによって１０分間に渡って選択した。選択された突然変異体を配列番号：３および配列番号：１３のプライマーを使用してｐＧＥＸ内へサブクローニングした。突然変異型ＡＧＴの反応速度を実施例６、ＤＮＡベース基質に対する反応性（ＢＧ−Ｃｙ３アッセイ）に記載するように決定した。
【０１０５】
突然変異の組合せ：ＢＧ誘導体との反応速度を向上するために見出された選択からの突然変異を、鋳型として１つの突然変異型遺伝子を使用して、そして突然変異の点にてミスマッチであるプライマー配列での更なる突然変異を含めて、配列番号：３および配列番号：１３のプライマーにより実施例１に記載するようにＰＣＲによって組合せた。突然変異を重複し６０℃以下でハイブリダイズするのに十分な長さを有する２つの各変異原性プライマーを選択して、相補性ストランドの一方へそれぞれアニーリングさせた。アニーリング温度は、各Ｇ／Ｃ対では４℃および各Ａ／Ｔ対では２℃の寄与を想定して計算した。生じた遺伝子を実施例１に記載するように、ｐＧＥＸ内へサブクローニングした。実施例１、４および６に記載するように、突然変異型ＡＧＴタンパク質を調製およびキャラクタリゼーションした。
【０１０６】
これらの選択からの組合せ突然変異を有するＡＧＴ突然変異体は、実施例１〜６の突然変異体について記載した好都合な特性を示す。突然変異体は、実施例１〜５に記載する突然変異体に匹敵する発現速度を有し、野生型ＡＧＴと比較したときに試験管内で少なくとも４倍の溶解度の上昇を有する。それらは少なくとも１０分の１へのＮ９−置換Ｏ６−アルキルグアニン誘導体との反応性の低下と、少なくとも１００分の１へのＤＮＡまたはＤＮＡ基質との相互作用および反応性それぞれの低下を示す。Ｅ．ｃｏｌｉのペリプラズムにおける発現からの活性ＡＧＴ突然変異体の収率は、ＰＧＥＧ−ｈＡＧＴの収率よりも少なくとも５倍の高さである。ＣＨＯ細胞において、蛍光標識化変異ＡＧＴは細胞質全体に分布しており、優先的な核局在化は検出できない。その上、これらのＡＧＴ突然変異体は野生型ｈＡＧＴと比較したときに、Ｏ６−ベンジルグアニン基質に対する反応性のかなりの上昇を示す（表１を参照）。
【０１０７】
【表１】
【０１０８】
ＢＧ−Ｃｙ３活性アッセイによって反応速度を決定して、野生型ｈＡＧＴについてこのアッセイで得られた値（ｋｏｂｓ＝１１６Ｍ−１ｃｍ−１）で割った。活性アッセイでは、精製したＧＳＴ融合タンパク質を、「ｐ．」のマークが付いた（実施例１に記載するように調製した）突然変異体について使用した；ペリプラズム抽出物を、「ｘ．」のマークが付いた（実施例２に記載するように調製した）突然変異体について使用した。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】表示濃度でのＢＧ修飾オリゴヌクレオチド（配列番号：２）の存在下でのＡＧＴＭ（実施例６、Ａの突然変異体）またはＰＧＥＧ−ｈＡＧＴ（Ｂ）のＢＧ−Ｃｙ３との反応。Ｓｐｅｃｔｒａ Ｍａｘ Ｇｅｍｉｎｉプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で検出した任意単位［ａ．ｕ．］の蛍光ＦＬ（励起５１９ｎｍ、５７２ｎｍにて放出）は、時間（ｔ）（分［ｍｉｎ］）にプロットされている。
【図２】実施例７に記載するような、野生型ｈＡＧＴ（ＧＳＴ−ｈＡＧＴ融合タンパク質）およびＡＧＴＭと、２つの基質Ｎ９−シクロペンチル−Ｏ６−ブロモテニル−グアニン（ＣＰＴＧ）およびビオチン化Ｏ６−ベンジルグアニン（ＢＧ−Ｂｔ、Ｊｕｉｌｌｅｒａｔら２００３の物質３ａ）との反応のウェスタンブロット。ＢＧ−Ｂｔは、すべてのサンプル中に５μＭで存在する。ＢＧ−Ｂｔと反応したＡＧＴを検出する、ニュートラアビジン−ペルオキシダーゼコンジュゲートおよび発光ペルオキシダーゼ基質を用いた検出。同じ濃度のＣＰＴＧおよびＢＧ−Ｂｔを用いた同様のインキュベーションの下でさえ、ＧＳＴ−ｈＡＧＴのわずか５％が基質ＢＧ−Ｂｔと反応する。
【図３】Ｎ９−修飾ＢＧ誘導体とのＡＧＴ突然変異体の反応性。１０μＭ ＡＧＴＭ（灰色バー）またはＰＧＥＧ−ｈＡＧＴ（黒色バー）を１００μＭ Ｎ９−修飾ＢＧ誘導体（以下のリストを参照）で予備遮断して、次に２０μＭ ＢＧ−Ｃｙ３で標識した。１時間の反応時間の後、５９５ｎｍにて任意単位［ａ．ｕ．］で示した蛍光強度（ＦＩ）を測定する。黒色実線は、タンパク質に結合していない蛍光物質のバックグラウンド蛍光に相当する条件１の測定値に設定されている。この線より上の値は、Ｎ９−修飾ＢＧ誘導体との低速または不完全な反応を示す。１ タンパク質を含まないＢＧ−Ｃｙ３の蛍光、バックグラウンド蛍光。２ ＢＧ−Ｃｙ３との反応；予備遮断なし、正の対照。３ ＢＧ−Ｃｙ３との反応、１００μＭ ＢＧによって予備遮断。４ ＢＧ−Ｃｙ３との反応、１００μＭ Ｎ９−イソブチル−Ｏ６−ベンジルグアニンによって予備遮断。５ ＢＧ−Ｃｙ３との反応、１００μＭ Ｎ９−プロピル−Ｏ６−ベンジルグアニンによって予備遮断。６ ＢＧ−Ｃｙ３との反応、１００μＭ Ｎ９−シアノメチル−Ｏ６−ベンジルグアニンによって予備遮断。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、野生型ヒトＯ６−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ｈＡＧＴ）の突然変異体、および標識を基質からこれらのＯ６−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ突然変異体および対象となるタンパク質からなる融合タンパク質へ転移させる方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソ尿素などの求電子物質の変異原性および発癌性作用は、主に、ＤＮＡにおけるグアニンのＯ６−アルキル化による。哺乳類および細菌は、ＤＮＡアルキル化からそれら自体を保護するために、これらの損傷を修復するタンパク質であるＯ６−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）を所有する。ＡＧＴは、アルキル基をアルキル化グアニンおよびグアニン誘導体の位置Ｏ−６から、自身のシステインの１つのメルカプト基に転移させて、非可逆的にアルキル化されたＡＧＴを生じさせる。基礎を成すメカニズムは、ＳＮ２タイプの求核反応であり、これはメチル基だけでなく、ベンジル基も容易に転用される理由を説明する。腫瘍細胞におけるヒトＡＧＴ（ｈＡＧＴ、配列番号：１）の過剰発現は、アルキル化薬、例えばプロカルバジン、ダカルバジン、テモゾロミド、およびビス−２−クロロエチル−Ｎ−ニトロソ尿素に対する耐性の主な理由であるため、ＡＧＴの阻害剤は、化学療法での増感剤として使用するために提案されてきた（Peggら, Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 51: 167-223,1995）。米国特許第５，６９１，３０７号は、ベンジル基内に各種の置換基を有するＯ６−ベンジルグアニンおよび腫瘍細胞でのＡＧＴレベルを枯渇させ、それによりアルキル化抗腫瘍薬に対する反応性を上昇させるためのその使用について記載している。同様に国際公開公報第９７／２０８４３号は、Ｏ６−ベンジル−およびＯ６−ヘテロアリールメチル−ピリミジン誘導体に相当するＡＧＴ枯渇剤を更に開示している。
【０００３】
ドイツ特許第１９９ ０３ ８９５号は、ＡＧＴのビオチン化を引き起こす、ビオチン化Ｏ６−アルキルグアニン誘導体とヒトＡＧＴとの間の反応に依存するＡＧＴのレベルを測定するアッセイを開示している。これは次に、ストレプトアビジンコーティングプレート上のＡＧＴの分離および例えばＥＬＩＳＡアッセイでのその検出を可能にする。腫瘍細胞中のＡＧＴのレベルを監視するための、そしてＡＧＴ阻害剤のスクリーニングで使用するためのアッセイが提案されている。
【０００４】
Damoiseauxら、Chem Biochem 4: 285-287,2001は、研究および化学療法での支援のために癌細胞におけるこの酵素のレベルの検出を再び容易なものとするために、ヒトＡＧＴを標識する化学プローブとして使用するための、オリゴデオキシリボヌクレオチドに組み込まれた修飾Ｏ６−アルキル化グアニン誘導体を開示している。
【０００５】
国際公開公報第０２／０８３９３７号は、対象となるタンパク質を検出および／または操作する方法を開示し、該方法ではタンパク質を、ＡＧＴに融合し、標識を担持するＡＧＴ基質とＡＧＴ融合タンパク質を接触し、標識を使用してＡＧＴ融合タンパク質を検出し、場合により更に操作する。使用される複数のＡＧＴ融合タンパク質、ＡＧＴ基質および広範に渡る標識の一般的構造原理、ならびに該方法で有用な標識を検出する方法が記載されている。ＡＧＴの他の形に触れられているが、ヒトＡＧＴのみが例示されている。
【０００６】
ＰＣＴ／ＥＰ０３／１０８５９（国際公開公報第２００４／０３１４０４号）は、対象となるタンパク質を検出および／または操作するための言及された方法で使用される特定のＡＧＴ融合タンパク質と、この方法によって得られる標識融合タンパク質と、特定のＡＧＴ融合タンパク質を使用する方法について記載している。
【０００７】
ＰＣＴ／ＥＰ０３／１０８８９（国際公開公報第２００４／０３１４０５号）は、対象となるタンパク質を検出および／または操作するための言及した方法で特に適切な標識を担持する追加のＡＧＴ基質と、このような特に標識された基質の応用について開示している。この特許出願は、この追加のＡＧＴ基質の製造方法についても記載している。
【０００８】
ヒトＡＧＴ突然変異型Ｇｌｙ１６０Ｔｒｐ（Xu-Welliverら、Biochemical Pharmacology 58: 1279-1285,1999）は、ベンジルグアニン誘導体に対して、野生型ヒトＡＧＴよりも多少反応性である。Juilleratら, Chem Biol 10: 313-317,2003は、ＡＧＴ融合タンパク質の合成基質による生体内（細胞内）標識に有効な更に反応性のパートナーを求めて、ヒトＡＧＴの多数の突然変異体を作成した。位置１４０、１５７、１５９、および１６０における突然変異体が報告された。突然変異型Ａｓｎ１５７ＧｌｙＳｅｒ１５９Ｇｌｕは、野生型ＡＧＴと比較しておおよそ２０倍の、ベンジルグアニン誘導体に対する活性の上昇を示している。
【０００９】
ｈＡＧＴにおける以下の追加の突然変異体は、ｈＡＧＴのＤＮＡ結合を妨害するが、ベンジルグアニン誘導体に対する活性に著しく干渉しないことが示されている：Ｌｙｓ１２５Ａｌａ、Ａｌａ１２７ＴｈｒおよびＡｒｇ１２８Ａ１ａ。Ｌｉｍら、ＥＭＢＯ Ｊ １５：４０５０−４０６０，１９９６，およびＤａｎｉｅｌｓら，ＥＭＢＯ Ｊ １９：１７１９−１７３０，２０００を参照。
【００１０】
ヒトＡＧＴ（ｐｄｂ−ＩＤ １ＥＨ６、Ｄａｎｉｅｌｓら、ＥＭＢＯ Ｊ １９：１７１９，２０００）の結晶構造は、Ａｓｎ２０７の後で切断された機能性タンパク質を使用して解明された。
【００１１】
発明の概要
本発明は、野生型ヒトＡＧＴと比較したときに、
（ａ）ＤＮＡ相互作用の低下；
（ｂ）もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化；
（ｃ）各種宿主における溶解性タンパク質としての発現収率の向上および安定性の向上；
（ｄ）酸化条件下での安定性の向上；
（ｅ）基質との反応後の細胞内での安定性の向上；
（ｆ）基質との反応前後の細胞外部での安定性の向上；
（ｇ）試験管内溶解度の向上；
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上；
（ｉ）ＤＮＡベース基質に対する反応性の低下；ならびに
（ｊ）Ｎ９−置換Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性の低下；
より選択される２つ以上の利点を示す、ＡＧＴ突然変異体に関する。
【００１２】
本発明のＡＧＴ突然変異体は、野生型ヒトＡＧＴの１〜２５個のアミノ酸が他のアミノ酸によって置換され、場合により連続鎖からの１〜５個のアミノ酸が１、２、または３つの位置で欠損または付加され、および／またはＮ末端の１〜４個のアミノ酸またはＣ末端の１〜４０個のアミノ酸が欠損している、上記の向上した特性を備えた突然変異体である。
【００１３】
本発明は更に、本発明のＡＧＴ突然変異体を有する融合タンパク質に組み込まれている対象となるタンパク質を検出および／または操作する方法に関する。本発明の別の目的は、このようなＡＧＴ突然変異体および対象となるタンパク質を含むＡＧＴ融合タンパク質である。
【００１４】
発明の詳細な説明
対象となるタンパク質を、ＡＧＴ融合タンパク質に組み込み、ＡＧＴ融合タンパク質を、標識を担持する特定のＡＧＴ基質と接触させ、ＡＧＴ融合タンパク質を、標識を認識および／処理するために設計された系において、標識を使用して検出し、場合により更に操作する、対象となるタンパク質を検出および／または操作するための前に記載の方法において、ＡＧＴの性能を、野生型ヒトＡＧＴを突然変異型ＡＧＴと置換することによって更に向上できる。突然変異型ＡＧＴを包含するこのような向上方法は、本発明の目的である。別の目的は上記方法に特に適したＡＧＴ突然変異体であり、ＡＧＴ融合タンパク質は、このようなＡＧＴ突然変異体および少なくとも１種の対象となるタンパク質を含む１種以上の他のタンパク質を含む。対象となるタンパク質は、いかなるタンパク質であってもよい。
【００１５】
本発明のＡＧＴ突然変異体は、例えば、野生型ヒトＡＧＴまたは既知のＡＧＴ突然変異体と比較したときに、
（ａ）ＤＮＡ相互作用の低下；
（ｂ）もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化；
（ｃ）各種宿主における溶解性タンパク質としての発現収率の向上および安定性の向上；
（ｄ）酸化条件下での安定性の向上；
（ｅ）基質との反応後の細胞内での安定性の向上；
（ｆ）基質との反応前後の細胞外部での安定性の向上；
（ｇ）試験管内溶解度の向上；
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上；
（ｉ）ＤＮＡベース基質に対する反応性の低下；
（ｊ）Ｎ９−置換Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性の低下；
より選択される２つ以上の特性を示す突然変異体を含む。
【００１６】
（ａ）ＤＮＡ相互作用の低下
「ＤＮＡ相互作用の低下」のある本発明の突然変異型ＡＧＴは、野生型ヒトＡＧＴまたは「ＰＧＥＧ−ｈＡＧＴ」（Juilleratら、Chem Biol 10: 313-317,2003）などの既知のＡＧＴ突然変異体と比較したときに、２０％未満のＤＮＡ結合、好ましくは２％未満のＤＮＡ結合を示し、最も好ましくは検出可能なＤＮＡ結合を示さない。ＤＮＡとの相互作用は例えば、低塩およびＤＮａｓｅ非存在の条件下でＥ．ｃｏｌｉ抽出物から同時精製されたＤＮＡの量を評価することによって定量される。これは野生型（ヒト）および突然変異型ＡＧＴの融合タンパク質（例えばＧＳＴへの融合）の並行精製の間で分光法によって比較される（２６０および２８０ｎｍでの吸収率の比）。あるいはＡＧＴのＤＮＡとの相互作用は、ＤＮＡの存在下での、基質としてのＢＧ−Ｃｙ３（Ｃｙ３に結合されたＯ６−（４−アミノエチル−ベンジル）−グアニン）とのＡＧＴ反応性の阻害として測定される。この手法は、ＢＧ−Ｃｙ３のＡＧＴとの反応時におけるＣｙ３蛍光物質の蛍光の著しい増加を利用する。ＡＧＴのＣｙ３−標識ベンジルグアニン誘導体との反応動力学には、サケ精子ＤＮＡの各種の濃度での数時間に渡る蛍光強度測定が続く。野生型ｈＡＧＴは、ＤＮＡにテトラマーとして結合するのに対して、未結合ｈＡＧＴタンパク質はモノマーのままであることが示された（Rasimasら、J Biol Chem 278(10): 7973-80,2003）。ＤＮＡに結合できないＡＧＴ突然変異体もテトラマー化しない。
【００１７】
（ｂ）もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化
「もはや核に限定されない局在化」を伴う本発明の突然変異型ＡＧＴは、真核細胞、例えば哺乳類細胞での発現時に細胞での突然変異型ＡＧＴの実質的に均一な局在化を示す。ＡＧＴ突然変異体の細胞内局在化は、ＡＧＴ欠損ＨｅＬａ細胞またはＣＨＯ細胞を構成的発現のための構築物をヒトサイトメガロウィルス前初期プロモータの下で用いて一過性に形質移入することによって調査する。細胞を細胞膜透過性ジアセチルフルオレセイン修飾Ｏ６−ベンジルグアニンによって染色して（Juilleratら、Chem Biol 10: 313-317,2003の物質４）、共焦点レーザ顕微鏡法によって解析する。細胞質および核の蛍光強度を突然変異型ＡＧＴと野生型ＡＧＴで比較する。野生型ヒトＡＧＴは、核での優先的局在化と、細胞質でのもっぱらわずかな局在化を示す。
【００１８】
（ｃ）各種宿主における溶解性タンパク質としての発現収率の向上および安定性の向上、
「溶解性タンパク質（すなわち細胞溶解後に溶解性画分に見出され、封入体には見出されないタンパク質）としての発現収率の向上」を伴う本発明の突然変異型ＡＧＴは、野生型ヒトＡＧＴと比較したときに、溶解タンパク質として３倍を超える発現収率、好ましくは５倍を超える発現収率、最も好ましくは１０倍を超える発現収率を示す。この発現収率の向上は、同時に、発現に使用される「宿主での安定性」の尺度となる。発現収率は、Ｅ．ｃｏｌｉまたは遺伝子組換えタンパク質用の他のいずれかの標準的生産細胞、例えば酵母、あるいは好ましくは昆虫細胞、ＣＨＯ細胞もしくはＨｅＬａ細胞において測定する。発現収率を定量するために、融合パートナーが容易な精製および定量を可能にするように、ＡＧＴ融合タンパク質を選択できる。例えばＥ．ｃｏｌｉでの発現収率は、Ｅ．ｃｏｌｉの並行させた発現培養からの溶解性および非溶解性ＧＳＴ野生型ＡＧＴ融合タンパク質ならびにＧＳＴ突然変異型ＡＧＴ融合タンパク質の収率を測定および比較することによって決定する。細胞溶解後の溶解性画分および非溶解性画分（すなわち封入体）のサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけて、相当するＡＧＴ融合タンパク質のバンド染色強度を比較する。溶解性タンパク質は、アフィニティクロマトグラフィーによる細胞抽出物からの融合タンパク質（例えばグルタチオンセファロースによるＧＳＴ−ＡＧＴ融合タンパク質の場合）の精製後、精製した画分にタンパク質濃度のアッセイを行うことによって定量する（Bradford,Anal Biochem 72: 248-54,1976）。溶解性画分中の同様のタンパク質の発現収率（点突然変異での相違）は、精製状態と同様に、未精製状態でのタンパク質安定性の尺度として使用できる（Ohageら、J Mol Biol 291: 1119-1128,1999、Wirzら、Protein Sci 8: 2245-50,1999）。したがって、これは折畳み安定性および凝集傾向の尺度として見なされる。
【００１９】
（ｃ’）実用的な見地から、Ｅ．ｃｏｌｉにおける溶解性タンパク質としての発現収率の向上が特に重要である。
【００２０】
（ｄ）酸化条件下での安定性の向上
「酸化条件下での安定性の向上」を伴う本発明の突然変異型ＡＧＴは、野生型ＡＧＴまたは「ＰＧＥＧ−ｈＡＧＴ」（Juilleratら、Chem Biol 10: 313-317,2003）などの既知のＡＧＴ突然変異体と比較したときに、２倍を超える活性タンパク質の収率、好ましくは５倍を超える活性タンパク質の収率、最も好ましくは１０倍を超える活性タンパク質の収率を示し、すなわちＡＧＴタンパク質は、緩衝水溶液（例えば１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、ジチオスレイトールまたはベータ−メルカプトエタノール無添加）中、酸化条件下で１時間以上のインキュベーション時間の後に、ＡＧＴ基質に対してその活性を維持する。ＡＧＴ基質に対する活性は、ジチオスレイトールまたはベータ−メルカプトエタノールなどの還元剤を添加せずに精製後に測定する。あるいは突然変異型ＡＧＴおよび野生型ヒトの活性を、適切なシグナル配列へのそれらの融合による酸化性酸化還元電位を有する細胞コンパートメント（例えばＥ．ｃｏｌｉのペリプラズム）内へのエクスポート後に比較する。還元および酸化条件下でのＡＧＴ基質に対する活性は、ジチオスレイトールまたはベータ−メルカプトエタノールなどの還元剤の存在下または非存在下で反応を実施することによって比較する。
【００２１】
（ｅ）基質との反応後の細胞内での安定性の向上
「細胞内での向上した安定性」を備えた本発明の突然変異型ＡＧＴは、野生型ＡＧＴまたは「ＰＧＥＧ−ｈＡＧＴ」（Juilleratら、Chem Biol 10: 313-317,2003）などの既知のＡＧＴ突然変異体と比較したときに、細胞（例えば哺乳類細胞）内での細胞透過性基質との反応後に、２倍を超える安定性、好ましくは３倍を超える安定性、最も好ましくは６倍を超える安定性を示す。安定性は、突然変異型ＡＧＴ融合タンパク質について、ＡＧＴ基質との反応後に、ＡＧＴ融合タンパク質の強度および局在化を、共焦点レーザ走査顕微鏡法を用いて解析することによって決定する。
【００２２】
（ｆ）基質との反応前後の細胞外部での安定性の向上
「細胞外部での向上した安定性」を備えた本発明の突然変異型ＡＧＴは、野生型ＡＧＴまたは「ＰＧＥＧ−ｈＡＧＴ」（Juilleratら、Chem Biol 10: 313-317,2003）などの既知のＡＧＴ突然変異体と比較したときに、２倍を超える安定性、好ましくは４倍を超える安定性、最も好ましくは６倍を超える安定性を示す。反応前の安定性は、突然変異型ＡＧＴまたは突然変異型ＡＧＴ融合タンパク質について、精製サンプルを緩衝水溶液中で４℃にて２週間まで、−２０℃にて６ヶ月までインキュベートすることによって決定する。複数の時点にてアリコートを取り、Juilleratら、Chem Biol 10: 313-317,2003によって記載されているように反応性ＡＧＴの濃度を概算する。標識基質との反応後の、そして未反応基質からの続いての分離後の野生型ＡＧＴおよびＡＧＴ突然変異体の安定性は、４℃にて２週間および−２０℃にて３ヶ月に渡って溶解性画分中の標識の濃度を定量することによって決定される。
【００２３】
（ｆ’）実際的な観点から、標識基質との反応後の安定性は特に重要である。
【００２４】
（ｇ）試験管内溶解度の向上
「試験管内溶解度の向上」を備えた本発明の突然変異型ＡＧＴは、野生型ヒトＡＧＴと比較したときに、２倍を超える溶解度、好ましくは５倍を超える溶解度、最も好ましくは１０倍を超える溶解度を示す。野生型ＡＧＴおよびＡＧＴ突然変異体の試験管内溶解度は、適切な緩衝液（例えば１００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、２０％グリセロール、１ｍＭ ＤＴＴ）にて確立された１つ以上の濃度での４℃または最高３７℃での精製サンプルの一晩に渡るインキュベーション後に残存するタンパク質の量を決定することによって測定する。
【００２５】
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上
「向上した反応性」を備えた本発明の突然変異型ＡＧＴは、野生型ヒトＡＧＴと比較したときに、３倍を超える反応性、好ましくは５倍を超える反応性、最も好ましくは１０倍を超える反応性を示す。Ｏ６−ベンジルグアニン基質に対する活性は、Juilleratら、Chem Biol 10: 313-317,2003によって記載されているように測定する。
【００２６】
（ｉ）ＤＮＡベース基質に対する反応性の低下
「ＤＮＡベース基質に対する反応性の低下」を備えた本発明の突然変異型ＡＧＴは、野生型ヒトＡＧＴと比較したときに、ＤＮＡベース基質に対する１０％未満の反応性、好ましくはＤＮＡベース基質に対する１％未満の反応性を示し、最も好ましくはＤＮＡベース基質に対する検出可能な反応性を示さない。野生型ＡＧＴまたは突然変異型ＡＧＴがアルキル化ＤＮＡ基質と反応する能力は、Ｏ６−ベンジルグアニンを含有する合成オリゴヌクレオチド（配列番号：２、位置１４にて修飾）によるその不活性化の反応として測定する。次に反応をビオチン化Ｏ６−アルキルグアニンによるインキュベーションにより失活させる。サンプルにウェスタンブロッティングおよびストレプトアビジン誘導体により検出させて、これらの基質の速度定数を得る。あるいは野生型または突然変異型ＡＧＴがアルキル化ＤＮＡ基質と反応する能力をＡＧＴ蛍光基質と競合するその標識効率によって測定する。ＢＧ−Ｃｙ３（Ｃｙ３に結合したＯ６−ベンジルグアニン）によるＡＧＴの反応速度論の後には、Ｏ６−ベンジルグアニンを含有する競合する合成オリゴヌクレオチド（配列番号：２、位置１４にて修飾）の各種濃度での蛍光強度測定が続く。
【００２７】
（ｊ）Ｎ９−置換Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性の低下
「Ｎ９−置換Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性の低下」を備えた本発明の突然変異型ＡＧＴは、野生型ＡＧＴまたは「ＰＧＥＧ−ｈＡＧＴ」（Juilleratら、Chem Biol 10: 313-317,2003）などの既知のＡＧＴ突然変異体と比較したときに、Ｎ９−置換Ｏ６−アルキルグアニン基質に対して１０％未満の反応性、好ましくは２％未満の反応性を示し、最も好ましくは検出可能な反応性を示さない。このようなＮ９−置換Ｏ６−アルキルグアニン基質は、野生型ＡＧＴの天然基質である。野生型ＡＧＴまたは突然変異型ＡＧＴがＮ９−修飾Ｏ６−アルキルグアニン基質と反応する能力は、競合実験でのビオチン化Ｎ９−非置換Ｏ６−アルキルグアニン基質の存在下でのこのような基質との、例えば低分子量Ｎ９−シクロペンチル−Ｏ６−ベンジルグアニンとのその反応の速度として測定する。次にサンプルにウェスタンブロッティングおよびストレプトアビジン誘導体による検出を受けさせて、これらの基質の速度定数を得る。あるいはこのような基質に対する反応性を、ＡＧＴとＢＧ−Ｃｙ３との反応の阻害として測定する。ＡＧＴのＢＧ−Ｃｙ３との反応の後に、プレインキュベーション後の、またはＮ９−修飾Ｏ６−アルキルグアニン基質との直接競合におけるＡＧＴへの結合時のＣｙ３蛍光強度の上昇が続く。
【００２８】
本発明の好ましいＡＧＴ突然変異体は、共通する複数の好ましい特性を有する突然変異体、例えば
（ｃ）各種宿主における溶解性タンパク質としての発現収率の向上および安定性の向上、ならびに
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上；
あるいは
（ｃ）各種宿主における溶解性タンパク質としての発現収率の向上および安定性の向上、
（ｄ）酸化条件下での安定性の向上、
（ｇ）試験管内溶解度の向上、ならびに
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上；
あるいは
（ｃ）各種宿主における溶解性タンパク質としての発現収率の向上および安定性の向上、
（ｄ）酸化条件下での安定性の向上、
（ｆ）基質との反応前後の細胞外部での安定性の向上、
（ｇ）試験管内溶解度の向上、ならびに
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上；
あるいは
（ａ）ＤＮＡ相互作用の低下、
（ｂ）もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
（ｃ）各種宿主における溶解性タンパク質としての発現収率の向上および安定性の向上、
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上、ならびに
（ｉ）ＤＮＡベース基質に対する反応性の低下；
あるいは
（ａ）ＤＮＡ相互作用の低下、
（ｂ）もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
（ｃ）各種宿主における溶解性タンパク質としての発現収率の向上および安定性の向上、
（ｅ）基質との反応後の細胞内での安定性の向上、
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上、ならびに
（ｉ）ＤＮＡベース基質に対する反応性の低下；
あるいは
（ａ）ＤＮＡ相互作用の低下、
（ｂ）もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
（ｃ）各種宿主における溶解性タンパク質としての発現収率の向上および安定性の向上、
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上、
（ｉ）ＤＮＡベース基質に対する反応性の低下、ならびに
（ｊ）Ｎ９−置換Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性の低下；
あるいは
（ａ）ＤＮＡ相互作用の低下、
（ｂ）もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
（ｃ）各種宿主における溶解性タンパク質としての発現収率の向上および安定性の向上、
（ｅ）基質との反応後の細胞内での安定性の向上、
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上、
（ｉ）ＤＮＡベース基質に対する反応性の低下、ならびに
（ｊ）Ｎ９−置換Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性の低下；
を示す突然変異体である。
【００２９】
更に好ましいＡＧＴ突然変異体は、
（ｃ）各種の宿主における、溶解性タンパク質としての５倍を超える発現収率および安定性の向上、特にＥ．ｃｏｌｉにおける（ｃ’）ならびに
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上；
あるいは
（ｃ）各種の宿主における、溶解性タンパク質としての５倍を超える発現収率および安定性の向上、特にＥ．ｃｏｌｉにおける（ｃ’）、
（ｄ）酸化条件下での５倍を超える安定性、
（ｇ）５倍を超える試験管内溶解度、ならびに
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する５倍を超える反応性；
あるいは
（ｃ）各種の宿主における、溶解性タンパク質としての５倍を超える発現収率および安定性の向上、特にＥ．ｃｏｌｉにおける（ｃ’）、
（ｄ）酸化条件下での５倍を超える安定性、
（ｆ）基質との反応前の、細胞外での４倍を超える安定性、特に基質との反応後の（ｆ’）、
（ｇ）５倍を超える試験管内溶解度、ならびに
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上；
あるいは
（ａ）２％未満のＤＮＡ結合、
（ｂ）もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
（ｃ）各種の宿主における、溶解性タンパク質としての５倍を超える発現収率および安定性の向上、特にＥ．ｃｏｌｉにおける（ｃ’）、
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する５倍を超える反応性、ならびに
（ｉ）ＤＮＡベース基質に対する１％未満の反応性；
あるいは
（ａ）２％未満のＤＮＡ結合、
（ｂ）もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
（ｃ）各種の宿主における、溶解性タンパク質としての５倍を超える発現収率および安定性の向上、特にＥ．ｃｏｌｉにおける（ｃ’）、
（ｅ）基質との反応後の細胞内での３倍を超える安定性、
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する５倍を超える反応性、ならびに
（ｉ）ＤＮＡベース基質に対する１％未満の反応性；
あるいは
（ａ）２％未満のＤＮＡ結合、
（ｂ）もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
（ｃ）各種の宿主における、溶解性タンパク質としての５倍を超える発現収率および安定性の向上、特にＥ．ｃｏｌｉにおける（ｃ’）、
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する５倍を超える反応性、
（ｉ）ＤＮＡベース基質に対する１％未満の反応性、ならびに
（ｊ）Ｎ９−置換Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する２％未満の反応性；
あるいは
（ａ）２％未満のＤＮＡ結合、
（ｂ）もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
（ｃ）各種の宿主における、溶解性タンパク質としての５倍を超える発現収率および安定性の向上、特にＥ．ｃｏｌｉにおける（ｃ’）、
（ｅ）基質との反応後の細胞内での３倍を超える安定性、
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する５倍を超える反応性、
（ｉ）ＤＮＡベース基質に対する１％未満の反応性、
（ｊ）Ｎ９−置換Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する２％未満の反応性；
を示す突然変異体である。
【００３０】
最も好ましいＡＧＴ突然変異体は
（ｃ）各種の宿主における、溶解性タンパク質としての１０倍を超える発現収率および安定性の向上、特にＥ．ｃｏｌｉにおける（ｃ’）、
（ｄ）酸化条件下での１０倍を超える安定性、
（ｆ）基質との反応前の、細胞外での６倍を超える安定性、特に基質との反応後の（ｆ’）、
（ｇ）１０倍を超える試験管内溶解度、ならびに
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する１０倍を超える反応性；
あるいは
（ａ）検出不能なＤＮＡ結合、
（ｂ）もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
（ｃ）各種の宿主における、溶解性タンパク質としての１０倍を超える発現収率および安定性の向上、特にＥ．ｃｏｌｉにおける（ｃ’）、
（ｅ）基質との反応後の細胞内での６倍を超える安定性、
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する１０倍を超える反応性、ならびに
（ｉ）ＤＮＡベース基質に対する検出不能な反応性；
あるいは
（ａ）検出不能なＤＮＡ結合、
（ｂ）もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
（ｃ）各種の宿主における、溶解性タンパク質としての１０倍を超える発現収率および安定性の向上、特にＥ．ｃｏｌｉにおける（ｃ’）、
（ｅ）基質との反応後の細胞内での６倍を超える安定性、
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する１０倍を超える反応性、
（ｉ）ＤＮＡベース基質に対する検出不能な反応性、ならびに
（ｊ）Ｎ９−置換Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する検出不能な反応性；
あるいは
（ａ）ＤＮＡ相互作用の低下、
（ｂ）もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
（ｃ）各種の宿主における、溶解性タンパク質としての１０倍を超える発現収率および安定性の向上、特にＥ．ｃｏｌｉにおける（ｃ’）、
（ｄ）酸化条件下での１０倍を超える安定性、
（ｅ）基質との反応後の細胞内での６倍を超える安定性、
（ｆ）基質との反応前の、細胞外での６倍を超える安定性、特に基質との反応後の（ｆ’）、
（ｇ）１０倍を超える試験管内溶解度、
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する１０倍を超える反応性、ならびに
（ｉ）ＤＮＡベース基質に対する検出不能な反応性；
あるいは
（ａ）ＤＮＡ相互作用の低下、
（ｂ）もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
（ｃ）各種の宿主における、溶解性タンパク質としての１０倍を超える発現収率および安定性の向上、特にＥ．ｃｏｌｉにおける（ｃ’）、
（ｄ）酸化条件下での１０倍を超える安定性、
（ｅ）基質との反応後の細胞内での６倍を超える安定性、
（ｆ）基質との反応前の、細胞外での６倍を超える安定性、特に基質との反応後の（ｆ’）、
（ｇ）１０倍を超える試験管内溶解度、
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する１０倍を超える反応性、
（ｉ）ＤＮＡベース基質に対する検出不能な反応性、ならびに
（ｊ）Ｎ９−置換Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する検出不能な反応性；
を示す突然変異体である。
【００３１】
当技術水準のＡＧＴ突然変異体は、多くの所望の特性の一部のみを有する。例えばLimら、EMBO J 15: 4050-4060,1996によって記載されている突然変異体は、哺乳類細胞内での発現時に、ＤＮＡ結合の減少および細胞質内への局在化を示す。Juilleratら、Chem Biol 10: 313-317,2003で記載されている突然変異体は、Ｏ６−ベンジルグアニン誘導体に対する反応性の上昇を示す。
【００３２】
本発明のＡＧＴ突然変異体は、野生型ヒトＡＧＴと比較して上述の向上した特性を備えた突然変異体であり、そこでは野生型ヒトＡＧＴの１〜２５個、好ましくは６〜２２個、特に特に７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９個のアミノ酸が、他のアミノ酸によって置換され、場合により連続鎖中の１〜５個のアミノ酸が、１、２、または３つの位置にて欠損もしくは付加され、および／またはＮ末端にて１〜４個のアミノ酸が、またはＣ末端にて１〜４０個の、好ましくは２０〜３５個の、特に２５〜３０個のアミノ酸が欠損している。
【００３３】
好ましくは、以下の位置のアミノ酸が置換される：
（Ａ）Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現収率を上昇させ、タンパク質に酸化をより受けにくくする、ＡｌａまたはＶａｌによって、好ましくはＡｌａによって置換されたＣｙｓ６２。
（Ｂ）他のアミノ酸置換、好ましくはＣｙｓ１５０−Ｓｅｒ１５１−Ｓｅｒ１５２の置換、特にＣｙｓ１５０の置換と組合された、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現を上昇させて、野生型ヒトＡＧＴに匹敵する基質反応性を維持する、Ａｌａ−Ａｓｎ、Ａｓｎ−Ａｓｎ、Ｓｅｒ−Ｈｉｓ、Ｓｅｒ−Ｓｅｒ、Ｐｒｏ−Ｐｒｏ、Ｐｒｏ−Ｓｅｒ、Ｐｒｏ−Ｔｈｒ、またはＴｈｒ−Ｓｅｒ、好ましくはＳｅｒ−Ｈｉｓによって置換されたＧｌｎ１１５−Ｇｌｎ１１６。
（Ｃ）他のアミノ酸置換、好ましくはＧｌｎ１１５−Ｇｌｎ１１６／Ｃｙｓ１５０−Ｓｅｒ１５１−Ｓｅｒ１５２の置換またはＧｌｙ１３１−Ｇｌｙ１３２／Ｍｅｔ１３４−Ａｒｇ１３５の置換、特にＣｙｓ６２／Ｇｌｎ１１５−Ｇｌｎ１１６／Ｇｌｙ１３１−Ｇｌｙ１３２／Ｍｅｔ１３４−Ａｒｇ１３５／Ｃｙｓ１５０−Ｓｅｒ１５１−Ｓｅｒ１５２の置換および１８２の後での切断と組合された、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現収率を上昇させ、ＤＮＡ結合を減少させて、哺乳類細胞での核局在化を無効にする（Limら、EMBO J 15: 4050-4060,1996）、Ａｌａによって置換されたＬｙｓ１２５およびＴｈｒ−Ａｌａによって置換されたＡｌａ１２７−Ａｒｇ１２８。
（Ｄ）Ｅ．ｃｏｌｉのペリプラズムおよび細胞質における発現収率を上昇させ、ＤＮＡ結合を減少させて、オリゴヌクレオチド（Ｏ６−アルキル−Ｎ９−デオキシリボシルグアニンを含有する）、Ｏ６−アルキル−Ｎ９−デオキシリボシルグアニンおよびＮ９−シクロペンチル−Ｏ６−ベンジルグアニンまたは他のＮ９置換Ｏ６−ベンジルグアニンとの反応性を無効にするのに対して、Ｎ９位置で置換されていないＯ６−アルキルグアニン基質に対する反応性を上昇させる、Ｖａｌ−Ｈｉｓ／Ｌｅｕ−Ａｒｇ、Ｌｙｓ−Ｔｈｒ／Ｌｅｕ−Ｓｅｒ、Ｇｌｎ−Ｖａｌ／Ｌｅｕ−Ｓｅｒ、またはＭｅｔ−Ｔｈｒ／Ｍｅｔ−Ｖａｌ、好ましくはＬｙｓ−Ｔｈｒ／Ｌｅｕ−Ｓｅｒによって置換されたＧｌｙ１３１−Ｇｌｙ１３２／Ｍｅｔ１３４−Ａｒｇ１３５、あるいはＶａｌ−Ｈｉｓ／Ｌｅｕによって置換されたＧｌｙ１３１−Ｇｌｙ１３２／Ｍｅｔ１３４。
（Ｅ）野生型ｈＡＧＴと比較してＥ．ｃｏｌｉのペリプラズムにおいてより効率的な発現を可能にして、Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性を維持し、タンパク質に酸化をより受けにくくして、ＤＮＡ結合を減少させる、Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ、Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ、Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−、またはＳｅｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−、好ましくはＡｓｎ−Ｉｌｅ−Ａｓｎによって置換されたＣｙｓ１５０−Ｓｅｒ１５１−Ｓｅｒ１５２、あるいはＰｈｅ−ＡｓｎまたはＡｒｇ−Ａｓｎによって置換されたＣｙｓ１５０−Ｓｅｒ１５１、あるいはＨｉｓ／Ｔｈｒ、Ｌｅｕ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／ＰｒｏまたはＰｒｏ／Ｌｅｕによって置換されたＣｙｓ１５０／Ｓｅｒ１５２、またはＳｅｒもしくはＴｈｒによって置換されたＣｙｓ１５０。
（Ｆ）Ｎ９位置で置換されていないＯ６−アルキルグアニン基質に対する反応速度を上昇させる（Juilleratら、Chem Biol 10: 313-317,2003）のに対して、Ｅ．ｃｏｌｉのペリプラズムおよび細胞質における発現収率を上昇させ、ＤＮＡ結合を減少させて、オリゴヌクレオチド（Ｏ６−アルキル−Ｎ９−デオキシリボシルグアニンを含有する）、Ｏ６−アルキル−Ｎ９−デオキシリボシルグアニンおよびＮ９−シクロペンチル−Ｏ６−ベンジルグアニンとの反応性を無効にする、他のアミノ酸置換、好ましくはＧｌｎ１１５−Ｇｌｎ１１６／Ｃｙｓ１５０−Ｓｅｒ１５１−Ｓｅｒ１５２の置換またはＧｌｙ１３１−Ｇｌｙ１３２／Ｍｅｔ１３４−Ａｒｇ１３５の置換、特にＣｙｓ６２／Ｇｌｎ１１５−Ｇｌｎ１１６／Ｌｙｓ１２５／Ａｌａ１２７−Ａｒｇ１２８／Ｇｌｙ１３１−Ｇｌｙ１３２／Ｍｅｔ１３４−Ａｒｇ１３５／Ｃｙｓ１５０−Ｓｅｒ１５１−Ｓｅｒ１５２の置換および１８２の後での切断と組合された、Ｐｈｅ／Ａｒｇ／Ｇｌｕによって置換されたＰｒｏ１４０／Ａｓｎ１５７／Ｓｅｒ１５９、あるいはＭｅｔ／Ｔｒｐ／Ｖａｌによって置換されたＰｒｏ１４０／Ａｓｎ１５７／Ｇｌｙ１６０、あるいはＧｌｙ／Ｇｌｕ−Ａｌａ、Ｇｌｙ／Ａｓｎ−Ｔｒｐ、Ｐｒｏ／Ｇｌｎ−ＣｙｓまたはＧｌｙ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ、最も好ましくはＧｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｌａによって置換されたＡｓｎ１５７／Ｓｅｒ１５９−Ｇｌｙ１６０、あるいはＧｌｙ／Ｇｌｕ（特に好ましい）によって置換されたＡｓｎ１５７／Ｓｅｒ１５９、ＧｌｙまたはＡｒｇによって置換されたＡｓｎ１５７。
（Ｇ）発現収率をやや上昇させる、Ｇｌｙ１８２の後の切断（アミノ酸１８３−２０７の欠損）。
【００３４】
本発明の突然変異体は、特に、修飾（Ａ）、（Ｂ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）および（Ｇ）のうち２つが、そして場合により１〜１０個の、特に３〜７個の追加のアミノ酸修飾が存在する突然変異体、および修飾（Ａ）〜（Ｇ）のうちの３つ以上、例えば３または４つが、そして場合により１〜１０個の、特に３〜７個の追加のアミノ酸修飾が存在する突然変異体である。他の好ましい突然変異体は、修飾（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｅ）、（Ｆ）、および（Ｇ）のうち３つ以上、例えば３または４つが、そして場合により１〜１０個の、特に３〜７個の追加のアミノ酸修飾が存在する突然変異体である。
【００３５】
特に好ましいのは、
Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現収率の上昇、酸化に対する感受性の低下、ＣＨＯ細胞を通じての細胞質全体への分布、ＤＮＡ結合の減少、およびＯ６−ベンジルグアニン基質に対する反応性の上昇を示す、突然変異型Ｃｙｓ６２Ａｌａ、Ｌｙｓ１２５Ａｌａ、Ａｌａ１２７Ｔｈｒ、Ａｒｇ１２８Ａｌａ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ、Ｇｌｙ１８２の後の切断、
Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現収率の上昇、少なくとも１０００分の１に減少したＤＮＡ結合、Ｏ６−ベンジルグアニン基質に対する反応性の上昇、およびＯ６−アルキル−Ｎ９−デオキシリボシルグアニンまたはＮ９−シクロペンチル−Ｏ６−ベンジルグアニンに対する反応性の実質的な低下を示す、突然変異型Ｇｌｙ１３１Ｌｙｓ、Ｇｌｙ１３２Ｔｈｒ、Ｍｅｔ１３４Ｌｅｕ、Ａｒｇ１３５Ｓｅｒ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ、
Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現収率の実質的な上昇を示すが、Ｏ６−ベンジルグアニジン基質に対する活性を維持する、突然変異型Ｇｌｎ１１５Ｓｅｒ、Ｇｌｎ１１６Ｈｉｓ、Ｃｙｓ１５０Ａｓｎ、Ｓｅｒ１５１Ｉｌｅ、Ｓｅｒ１５２Ａｓｎ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ、
Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現収率の上昇、酸化に対する感受性の低下、ＣＨＯ細胞における細胞質全体への分布、少なくとも１０００分の１に減少したＤＮＡ結合、Ｏ６−ベンジルグアニン基質に対する反応性の上昇、およびＯ６−アルキル−Ｎ９−デオキシリボシルグアニンまたはＮ９−シクロペンチル−Ｏ６−ベンジルグアニンに対する少なくとも１００分の１に減少した反応性を示す、突然変異型Ｃｙｓ６２Ａｌａ、Ｇｌｎ１１５Ｓｅｒ、Ｇｌｎ１１６Ｈｉｓ、Ｌｙｓ１２５Ａｌａ、Ａｌａ１２７Ｔｈｒ、Ａｒｇ１２８Ａｌａ、Ｇｌｙ１３１Ｌｙｓ、Ｇｌｙ１３２Ｔｈｒ、Ｍｅｔ１３４Ｌｅｕ、Ａｒｇ１３５Ｓｅｒ、Ｃｙｓ１５０Ａｓｎ、Ｓｅｒ１５１Ｉｌｅ、Ｓｅｒ１５２Ａｓｎ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ、Ｇｌｙ１８２の後の切断、および、
Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現収率の上昇、酸化に対する感受性の低下、ＣＨＯ細胞における細胞質全体への分布、少なくとも１０００分の１に減少したＤＮＡ結合、Ｏ６−ベンジルグアニン基質に対する反応性の上昇を示すが、Ｏ６−アルキル−Ｎ９−デオキシリボシルグアニンまたはＮ９−シクロペンチル−Ｏ６−ベンジルグアニンに対する反応性を維持する、突然変異型Ｃｙｓ６２Ａｌａ、Ｇｌｎ１１５Ｓｅｒ、Ｇｌｎ１１６Ｈｉｓ、Ｌｙｓ１２５Ａｌａ、Ａｌａ１２７Ｔｈｒ、Ａｒｇ１２８Ａｌａ、Ｃｙｓ１５０Ａｓｎ、Ｓｅｒ１５１Ｉｌｅ、Ｓｅｒ１５２Ａｓｎ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ、Ｇｌｙ１８２の後の切断
である。
【００３６】
検討される更なる突然変異体は、修飾Ｃｙｓ６２Ａｌａ、Ｌｙｓ１２５Ａｌａ、Ａｌａ１２７Ｔｈｒ、Ａｒｇ１２８Ａｌａ、Ｇｌｙ１３１Ｌｙｓ、Ｇｌｙ１３２Ｔｈｒ、Ｍｅｔ１３４Ｌｅｕ、Ａｒｇ１３５Ｓｅｒ、Ｃｙｓ１５０Ｓｅｒ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ、Ｇｌｙ１８２の後の切断、および場合により１〜１５個の、好ましくは１〜１０個の、特に３〜７個の追加のアミノ酸修飾、例えば
Ｇｌｕ１１５Ｓｅｒ、Ｇｌｎ１１６Ｈｉｓ；
Ｓｅｒ１５０Ａｓｎ、Ｓｅｒ１５１Ｉｌｅ、Ｓｅｒ１５２Ａｓｎ；
Ｌｙｓ８Ｔｈｒ、Ｌｙｓ３２Ｉｌｅ、Ｌｅｕ３３Ｐｈｅ、Ｔｈｒ１２７Ａｌａ、Ｓｅｒ１５０Ａｓｐ、Ｓｅｒ１５１Ｇｌｙ、Ａｌａ１５４Ｔｈｒ；
Ｌｙｓ３２Ｉｌｅ、Ｌｅｕ３３Ｐｈｅ、Ｓｅｒ１５０Ｖａｌ、Ｓｅｒ１５２Ａｒｇ、Ｇｌｙ１５３Ａｓｐ、Ａｌａ１５４Ａｓｐ；
Ｌｙｓ３２Ｉｌｅ、Ｌｅｕ３３Ｐｈｅ、Ｓｅｒ１５０Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５１Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５２Ａｓｐ、Ａｌａ１５４Ａｓｐ；
Ｓｅｒ１５０Ｖａｌ、Ａｌａ１５４Ａｓｐ；
Ｓｅｒ１５０Ｇｌｕ、Ｓｅｒ１５１Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５２Ｇｌｕ、Ａｌａ１５４Ａｒｇ；
Ｌｙｓ８Ｔｈｒ、Ｔｈｒ１２７Ａｌａ、Ａｌａ１５４Ｔｈｒ；
Ｌｙｓ３２Ｉｌｅ、Ｌｅｕ３３Ｐｈｅ；
Ａｌａ１５４Ｔｈｒ；
Ｌｅｕ３３Ｐｈｅ；
Ｓｅｒ１５１Ｇｌｙ；
Ｓｅｒ１５０Ａｓｐ；
Ｔｈｒ１２７Ａｌａ；ならびに
Ｌｙｓ３２Ｉｌｅ、Ｌｅｕ３３Ｐｈｅ、およびＬｅｕ３４の欠損；
より選択される更なる突然変異を有する、ＡＧＴ突然変異体である。
【００３７】
同様に検討される突然変異体は、修飾Ｃｙｓ６２Ａｌａ、Ｇｌｎ１１５Ｓｅｒ、Ｇｌｎ１１６Ｈｉｓ、Ｌｙｓ１２５Ａｌａ、Ａｌａ１２７Ｔｈｒ、Ａｒｇ１２８Ａｌａ、Ｃｙｓ１５０Ａｓｎ、Ｓｅｒ１５１Ｉｌｅ、Ｓｅｒ１５２Ａｓｎ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ、Ｇｌｙ１８２の後の切断、および場合により１〜１０個の、特に３〜７個の追加のアミノ酸修飾、例えば
Ｌｙｓ８Ｔｈｒ、Ｌｙｓ３２Ｉｌｅ、Ｌｅｕ３３Ｐｈｅ、Ｔｈｒ１２７Ａｌａ、Ａｓｎ１５０Ａｓｐ、Ｉｌｅ１５１Ｇｌｙ、Ａｌａ１５４Ｔｈｒ；
Ｌｙｓ３２Ｉｌｅ、Ｌｅｕ３３Ｐｈｅ、Ａｓｎ１５０Ｖａｌ、Ｉｌｅ１５１Ｓｅｒ、Ａｓｎ１５２Ａｒｇ、Ｇｌｙ１５３Ａｓｐ、Ａｌａ１５４Ａｓｐ；
Ｌｙｓ３２Ｉｌｅ、Ｌｅｕ３３Ｐｈｅ、Ａｓｎ１５０Ｇｌｙ、Ｉｌｅ１５１Ｇｌｙ、Ａｓｎ１５２Ａｓｐ、Ａｌａ１５４Ａｓｐ；
Ａｓｎ１５０Ｖａｌ、Ａｌａ１５４Ａｓｐ；
Ａｓｎ１５０Ｇｌｕ、Ｉｌｅ１５１Ｇｌｙ、Ａｓｎ１５２Ｇｌｕ、Ａｌａ１５４Ａｒｇ；
Ｌｙｓ８Ｔｈｒ、Ｔｈｒ１２７Ａｌａ、Ａｌａ１５４Ｔｈｒ；
Ｌｙｓ３２Ｉｌｅ、Ｌｅｕ３３Ｐｈｅ；
Ａｌａ１５４Ｔｈｒ；
Ｌｅｕ３３Ｐｈｅ；
Ｉｌｅ１５１Ｇｌｙ；
Ａｓｎ１５０Ａｓｐ；
Ｔｈｒ１２７Ａｌａ；ならびに
Ｌｙｓ３２Ｉｌｅ、Ｌｅｕ３３Ｐｈｅ、およびＬｅｕ３４の欠損；
より選択される更なる突然変異を有する、ＡＧＴ突然変異体である。
【００３８】
同様に好ましいのは、修飾Ｃｙｓ６２Ａｌａ、Ｌｙｓ１２５Ａｌａ、Ａｌａ１２７Ｔｈｒ、Ａｒｇ１２８Ａｌａ、Ｃｙｓ１５０Ｓｅｒ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ、Ｇｌｙ１８２の後の切断を有するＡＧＴ突然変異体；および修飾Ｃｙｓ６２Ａｌａ、Ｌｙｓ１２５Ａｌａ、Ａｌａ１２７Ｔｈｒ、Ａｒｇ１２８Ａｌａ、Ｇｌｙ１３１Ｌｙｓ、Ｇｌｙ１３２Ｔｈｒ、Ｍｅｔ１３４Ｌｅｕ、Ａｒｇ１３５Ｓｅｒ、Ｃｙｓ１５０Ｓｅｒ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ、Ｇｌｙ１８２の後の切断を有するＡＧＴ突然変異体である。
【００３９】
特に好ましいのは、実施例の、特に実施例２〜７および表１の化合物である。
【００４０】
突然変異体は、当業者に公知の技法によって得られる。ＡＧＴ変異体は、好ましくは、新しいＯ６−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼを産生および選択するために、当業者に既知のタンパク質工学技法を使用して、および／または分子進化を使用して生成できる。このような技法は、例えば、部位特異的変異誘発、飽和変異誘発、変異を配列の任意の箇所に導入するためのエラープローン（error prone）ＰＣＲ、および飽和変異誘発の後に使用されるＤＮＡシャッフリングである。ファージ提示法を活用すると、突然変異体は、本発明のＯ６−ベンジルグアニンおよびＡＧＴ基質に対する活性の著しい向上ならびに酸化条件下での安定性の向上と共に見出される。ＡＧＴは、繊維状ファージ上にファージカプシドタンパク質ｐＩＩＩを有する融合タンパク質として機能的に提示することが可能であり、ＡＧＴの異常なメカニズムを使用して、向上した特性、反応速度の上昇を備えたＡＧＴを提示するファージを選択できる、例えばJuilleratら, Chem Biol 10: 313-317,2003を参照。
【００４１】
本発明において、対象となるタンパク質またはペプチドは、上記のＡＧＴ突然変異体に融合される。対象となるタンパク質またはペプチドは、いかなる長さでもよく、二次、三次、または四次構造を有していても、有していなくてもよく、好ましくは少なくとも１２個のアミノ酸および最大２０００個のアミノ酸からなる。このような対象となるタンパク質またはペプチドの例を以下に与えるが、例えば酵素、ＤＮＡ結合タンパク質、転写調節タンパク質、膜タンパク質、核レセプタタンパク質、核局在化シグナルタンパク質、タンパク質補助因子、小型モノマー性ＧＴＰａｓｅ、ＡＴＰ結合カセットタンパク質、細胞内構造タンパク質、タンパク質を特定の細胞コンパートメントに標的化させることに関与する配列を備えたタンパク質、ラベルまたは親和性タグとして一般に使用されるタンパク質および上述のタンパク質のドメインまたはサブドメインである。対象となるタンパク質またはペプチドは好ましくはＡＧＴ突然変異体に、酵素によって開裂できるリンカーによって、例えばＤＮＡ段階にて適切な制限酵素、例えばＢｇｌＩＩによって開裂できるＡＧＡＴＣＴによって、および／またはタンパク質段階にて適切な酵素、例えばタバコエッチウィルスＮｌａ（ＴＥＶ）プロテアーゼによって開裂可能なリンカーによって融合される。融合タンパク質は、原核宿主、好ましくはＥ．ｃｏｌｉにて、または真核宿主、例えば酵母、昆虫、または哺乳類細胞にて発現できる。
【００４２】
ＡＧＴ突然変異体は、以下に記載する適切な基質上に存在する標識を融合タンパク質のＡＧＴ部分のシステイン残基の１つに標識を転移する特性を有する。
【００４３】
対象となるタンパク質およびＡＧＴ突然変異体を含む融合タンパク質を、標識を有する特定の基質に以下に記載するように接触させる。ＡＧＴ突然変異体が基質と反応して、基質の標識を転移するような反応条件を選択する。通常の条件は、室温、例えば約２５℃で約ｐＨ７の緩衝溶液である。しかしながら、ＡＧＴ突然変異体は、多様な他の条件の下でも反応し、本明細書で挙げるこれらの条件は、本発明の範囲を制限しないことが理解される。
【００４４】
基質の標識部分は、融合タンパク質が対象とする用途に応じて当業者が選択できる。ＡＧＴ突然変異体を含む融合タンパク質を基質に接触させた後に、標識は融合タンパク質に共有結合する。次に標識ＡＧＴ突然変異型融合タンパク質は、転移された標識によって更に操作および／または検出される。標識は、複数の同じまたは異なる標識からなる場合がある。基質が１つを超える標識を含有する場合、対応する標識ＡＧＴ突然変異型融合タンパク質も、標識融合タンパク質を更に操作および／または検出するための更なる選択肢を与える、１つを超える標識を含むことになる。
【００４５】
「操作」の下では、いずれの物理または化学処理も理解される。例えば操作は、細胞からの単離、標準精製技法、例えばクロマトグラフィーを用いた精製、化学試薬との、または特に結合パートナーが固相に固定されている場合の結合対の結合パートナーとの反応などを意味し得る。このような操作は、標識Ｌに依存することがあり、標識融合タンパク質の「検出」に加えて行うことができる。標識融合タンパク質に操作および検出の両方を行う場合、検出は、操作の前または後でもよく、あるいは本明細書で定義されたような操作の間に実施できる。
【００４６】
特定のＡＧＴ基質は、特許出願ＰＣＴ／ＥＰ０３／１０８８９（国際公開公報第２００４／０３１４０５号）に開示されているようなＡＧＴ基質、例えば式（Ｉ）
【００４７】
【化１】
【００４８】
〔式中、
Ｒ１−Ｒ２は、ＡＧＴによって基質として認識される基であり；
Ｘは、酸素または硫黄であり；
Ｒ３は、芳香族またはヘテロ芳香族基、あるいは場合によりＣＨ２に結合された二重結合を有する、置換不飽和アルキル、シクロアルキル、またはヘテロシクリル基であり；
Ｒ４は、リンカーであり；そして
Ｌは、標識、複数の同じまたは異なる標識、Ｒ４をＲ１に結合して環式基質を生成する結合、または更なる基−Ｒ３−ＣＨ２−Ｘ−Ｒ１−Ｒ２である。〕
の化合物であり、
【００４９】
基Ｒ１−Ｒ２において、残基Ｒ１は、好ましくは、ＡＧＴによって基質として認識される、窒素原子１〜５個を含有するヘテロ芳香族基、好ましくは式（ＩＩ）
【００５０】
【化２】
【００５１】
〔式中、
Ｒ２は、水素、炭素原子１〜１０個のアルキル、または糖部分であり；
Ｒ５は、水素、ハロゲン、例えばクロロまたはブロモ、トリフルオロメチル、またはヒドロキシであり；そして
Ｒ６は、水素、ヒドロキシ、または非置換もしくは置換のアミノである。〕
のプリンラジカルであり、
【００５２】
Ｒ５またはＲ６がヒドロキシである場合、プリンラジカルは主にその互変異性形で存在し、互変異性形ではＲ５またはＲ６を保持する炭素原子に隣接する窒素が水素原子を有し、この窒素原子とＲ５またはＲ６を保持する炭素原子との間の二重結合が単結合であり、そしてＲ５またはＲ６がそれぞれ二重結合された酸素である。
【００５３】
Ｒ６が非置換であるか、または置換のアミノであり、そしてプリンラジカルの結合に接続された残基Ｘが酸素である場合、式（ＩＩ）の残基は、グアニン誘導体である。
【００５４】
本発明の方法で有用な他の特定の基質は、Ｒ１が、式（ＩＩ）のプリンラジカルであり、Ｒ２が、シクロアルキル、例えばシクロペンチル、あるいはアルキル、例えばプロピルまたはイソブチル、あるいは置換アルキル、例えばシアノメチルである、式（Ｉ）の化合物である。
【００５５】
本発明は、生体内（細胞内）および試験管内の両方での標識ＡＧＴ突然変異型融合タンパク質のための方法を提供する。ＡＧＴ突然変異型融合タンパク質の生体内標識化という用語は、細胞のコンパートメントすべてはもちろんのこと、細胞外スペースを指示するＡＧＴ突然変異型融合タンパク質のコンパートメントすべてでの標識化を含む。ＡＧＴ突然変異型融合タンパク質の標識化が、生体内で実施され、そしてＡＧＴ突然変異体に融合したタンパク質が膜タンパク質、より詳細には原形質膜タンパク質である場合、融合タンパク質のＡＧＴ部分は膜のどちら側にも結合することが可能であり、例えば原形質膜の細胞質側または細胞外側に結合することが可能である。
【００５６】
標識化を試験管内で実施する場合、融合タンパク質の標識化は、ＡＧＴ突然変異型融合タンパク質の細胞抽出物中で、あるいはその精製または濃縮形を用いてのどちらかで実施できる。
【００５７】
標識化を生体内（細胞内）で、または細胞抽出物中で実施する場合、宿主の内因性ＡＧＴの標識化を好都合に考慮できる。宿主の内因性ＡＧＴがＯ６−アルキルグアニン誘導体または関連化合物を基質として受入れない場合、融合タンパク質の標識化は、特異的である。哺乳類細胞において、例えばヒト、マウス、またはラット細胞において、内因性ＡＧＴの標識化は可能である。これらの実験において、内因性ＡＧＴはもちろんのこと、ＡＧＴ突然変異型融合タンパク質の同時標識化が問題を引き起こす、このような実験においては、既知のＡＧＴ欠損細胞株を使用できる。
【００５８】
特定の基質に対して非反応性であり、次に内因性ＡＧＴによって認識される突然変異型ＡＧＴ融合タンパク質を使用する場合、内因性ＡＧＴの活性を遮断するために、特定の突然変異型ＡＧＴ融合タンパク質と反応するように設計された基質を用いて細胞をインキュベートする前またはその間に、このような非反応性基質を使用できる。例えばＮ９−置換Ｏ６−アルキルグアニン誘導体と、例えばＮ９−シクロペンチル−Ｏ６−ベンジルグアニンと反応しない突然変異型ＡＧＴを使用できる。内因性ＡＧＴを含有する哺乳類細胞において、この野生型ＡＧＴは、次に、標識化の前に、または突然変異型ＡＧＴ融合タンパク質をこの突然変異型ＡＧＴによって認識された別の基質によって標識化する間に、Ｎ９−シクロペンチル−Ｏ６−ベンジルグアニンによって遮断できる。
【００５９】
有効濃度の内因性野生型ＡＧＴが特定の生体サンプル中に存在しない場合、実験用に選択された突然変異型ＡＧＴが反応性でない基質を使用して、内因性ＡＧＴを事前に不活性化する必要はないであろう。このような条件下では、野生型ＡＧＴの特定の基質と反応しない突然変異型ＡＧＴ融合タンパク質を利用することにより、ＡＧＴの２つの異なる突然変異体（あるいはＡＧＴの１つの突然変異体および野生型ＡＧＴ）を２つの異なる基質によって選択的に標識化できる。このことは、野生型ｈＡＧＴタンパク質と比較して低分子量の基質に対して選択性を示す、ここでは「ＡＧＴ−Ａ」と呼ぶ突然変異型ＡＧＴ、および特定の基質と野生型ｈＡＧＴの１０分の１、好ましくは１００分の１の速さで反応する、「ＡＧＴ−Ｂ」と呼ぶ別の突然変異型ＡＧＴを使用することによって実施される。突然変異型「ＡＧＴ−Ａ」（または野生型ＡＧＴ）および突然変異型「ＡＧＴ−Ｂ」の両方を生体サンプルに存在させて、その生体サンプル−例えば細胞抽出物または無傷の細胞−を最初に突然変異型「ＡＧＴ−Ａ」（または野生型ＡＧＴ）によって選択的に認識される基質と一定時間反応させて、基質「Ａ」による突然変異型「ＡＧＴ−Ａ」タンパク質（または野生型ＡＧＴ）の完全な、またはほぼ完全なターンオーバーを引き起こす。しかし、突然変異型「ＡＧＴ−Ｂ」タンパク質は未反応またはほぼ未反応のまま残し、次いで突然変異型「ＡＧＴ−Ｂ」と反応性である（そして突然変異型「ＡＧＴ−Ａ」または野生型ＡＧＴも反応性であり得る）基質「Ｂ」を用いてインキュベーションし、突然変異型「ＡＧＴ−Ｂ」タンパク質と基質「Ｂ」との優先的反応も引き起こす。なぜならば、突然変異型「ＡＧＴ−Ａ」タンパク質（または野生型ＡＧＴ）が基質「Ａ」によって既に不活性化されているためである。同様に、基質「Ｂ」の選択した濃度の存在下でさえ、選択した濃度での突然変異型「ＡＧＴ−Ａ」（または野生型ＡＧＴ）の基質「Ａ」に対する反応性が突然変異型「ＡＧＴ−Ａ」（または野生型ＡＧＴ）の基質「Ａ」との優先的反応を引き起こすという条件で、突然変異型「ＡＧＴ−Ｂ」および突然変異型「ＡＧＴ−Ａ」（または野生型ＡＧＴ）を含有する混合物を、基質「Ａ」および基質「Ｂ」と同時にインキュベートし、突然変異型「ＡＧＴ−Ａ」（または野生型ＡＧＴ）の基質「Ａ」との優先的反応および突然変異型「ＡＧＴ−Ｂ」の基質「Ｂ」との優先的反応を引き起すことができる。２つの異なる基質「Ａ」および「Ｂ」は例えば、蛍光共鳴エネルギー移動対（ＦＲＥＴ）の２つの化合物、または近接アッセイのための１つの蛍光物質および１つのクエンチャーを保持してもよい。
【００６０】
本発明は、対象となるタンパク質を検出および／または操作する方法にも関し、該方法では対象となるタンパク質を融合タンパク質内にＡＧＴ突然変異体と共に組み込み、標識を有する特定のＡＧＴ基質とＡＧＴ融合タンパク質を接触させ、標識を認識および／または処理するために設計された系において標識を使用してＡＧＴ融合タンパク質を検出し、場合により操作する。このことは前の段落に記載するように、ＡＧＴ突然変異体と１つの基質との優先的な（または特に低い）反応性を利用している。特に本発明は、対象となるタンパク質およびＡＧＴ突然変異体のＡＧＴ融合タンパク質、ならびに更なるＡＧＴ融合タンパク質を含有するＡＧＴ融合タンパク質混合物を、ＡＧＴ突然変異体または更なるＡＧＴのどちらかに対して選択的である特定の基質と接触させて、混合物を更なる基質と処理して、対象となるタンパク質およびＡＧＴ突然変異体のＡＧＴ融合タンパク質を、標識を認識および／または処理するために設計された系において標識を使用して検出し、場合により更に操作する方法に関する。更なる基質は、混合物と特定の基質の反応終了後に、または特定の基質と共にＡＧＴ融合タンパク質混合物に添加できる。
【００６１】
より詳細には、本発明は、特定の基質の標識が更なる基質の標識と相互作用し、例えば標識が蛍光共鳴エネルギー移動対（ＦＲＥＴ）の化合物あるいは近接アッセイのための１つの蛍光物質および１つのクエンチャーである、これらの方法に関する。
【実施例】
【００６２】
使用した省略形：
ＡＧＴＭ＝修飾Ｃｙｓ６２Ａｌａ、Ｇｌｎ１１５Ｓｅｒ、Ｇｌｎ１１６Ｈｉｓ、Ｌｙｓ１２５Ａｌａ、Ａｌａ１２７Ｔｈｒ、Ａｒｇ１２８Ａｌａ、Ｇｌｙ１３１Ｌｙｓ、Ｇｌｙ１３２Ｔｈｒ、Ｍｅｔ１３４Ｌｅｕ、Ａｒｇ１３５Ｓｅｒ、Ｃｙｓ１５０Ａｓｎ、Ｓｅｒ１５１Ｉｌｅ、Ｓｅｒ１５２Ａｓｎ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ、Ｇｌｙ１８２の後の切断を有するＡＧＴ突然変異型
ＢＧ−Ｂｔ＝ビオチンに結合されたＯ６−（４−アミノメチル−ベンジル）−グアニン
ＢＧ−Ｃｙ３＝Ｃｙ３に結合されたＯ６−（４−アミノメチル−ベンジル）−グアニン
ＤＴＴ＝１，４−ジチオスレイトール
ＧＳＴ＝グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ 由来）
ＨＥＰＥＳ＝２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸
ＩＰＴＧ＝イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド
ＰＥＧ＝ポリエチレングリコール
ＰＭＳＦ＝フェニルメタンスルホニルフルオリド
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ＝ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動
【００６３】
〔実施例１〕
突然変異Ｌｙｓ１２５Ａｌａ、Ａｌａ１２７Ｔｈｒ、Ａｒｇ１２８Ａｌａ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ
ＰＧＥＧ−ｈＡＧＴ遺伝子の２つの特に重複する領域である、突然変異Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕを含有するＡＧＴ（Juilleratら、Chem Biol 10: 313-317,2003）を配列番号：３、配列番号：６および配列番号：４、配列番号：５のプライマーによって別個の反応にて増幅した。その部分相補性に関して、これらの２つの部分を更なるＰＣＲ反応にて構築し、配列番号：３および配列番号：４のプライマーによって増幅して、ここで突然変異Ｌｙｓ１２５Ａｌａ、Ａｌａ１２７Ｔｈｒ、Ａｒｇ１２８Ａｌａを更に含有する完全な遺伝子を産生させた。続いて遺伝子を発現ベクターｐＧＥＸ−２Ｔ（Pharmacia）ＢａｍＨＩ部位とＥｃｏＲＩ部位との間でクローニングした。これにより遺伝子がベクターによって提供されたＧＳＴタンパク質のＣ末端融合物として挿入遺伝子の発現が可能となる。
【００６４】
このベクターからのタンパク質発現をＥ．ｃｏｌｉ菌株ＢＬ２１で実施した。指数関数的に増殖する培養は、０．５ｍＭ ＩＰＴＧによって誘起して、発現を２４℃にて３．５時間実施した。
【００６５】
精製：収穫した細胞を１ｍＭ ＰＭＳＦおよび２μｇ／ｍｌアプロチニンを添加した、５０ｍＭホスフェート、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴを含有する緩衝液で再懸濁させて、リゾチームおよび超音波処理によって破壊した。細胞破片を４００００ｘｇでの遠心分離によって分離した。抽出物を事前に平衡にしたグルタチオンセファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に加え、次に２０ベッドボリューム（５０ｍＭホスフェート、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ）で洗浄した。変異したＧＳＴ−ＡＧＴ融合タンパク質を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、ｐＨ７．９中の１０ｍＭ還元グルタチオンで溶出させた。精製したタンパク質を５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２、１ｍＭ ＤＴＴ、３０％グリセロールで透析して、次に−８０℃にて保存した。
【００６６】
タンパク質収率の決定：ＧＳＴ−ＡＧＴ融合タンパク質の純度および相対量をＳＤＳ−ＰＡＧＥにサンプルをかけることによって比較した。純粋画分のＵＶスペクトルは、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌａｍｂｄａ １０を使用して記録した。大量のＤＮＡを含有しないタンパク質サンプルでは、タンパク質含有率の尺度として２８０ｎｍでの吸光度を同じ条件下で生成した野生型ｈＡＧＴまたはＰＧＥＧ−ｈＡＧＴの吸光度と比較した。
【００６７】
試験管内でタンパク質のＤＮＡ結合特性を比較するために、収穫した細胞を再懸濁させ、同じ方法の後に、しかし５０ｍＭホスフェート、０．１Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴを含有する緩衝液中でＧＳＴ融合タンパク質を精製した。透析サンプルにおいて、次に同時精製されたＤＮＡの量をＵＶ分光法によって見積もった。スペクトルは、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌａｍｂｄａ １０を使用して記録した。ＤＮＡの含有率は、２８０および２６０ｎｍにおける吸光度の比に相当する。この値を、野生型ｈＡＧＴまたはＰＧＥＧ−ｈＡＧＴを精製して得られた値とそれぞれ比較した。
【００６８】
活性アッセイ：精製した変異ＧＳＴ−ＡＧＴは、ビオチン化Ｏ６−ベンジルグアニン（ＢＧ−Ｂｔ、Juilleratら, Chem Biol 10: 313-317,2003の物質３ａ）を用いて試験管内でインキュベートした。総反応物量８０μｌにて、０．２μＭ ＧＳＴ−ＡＧＴを５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．２および１ｍＭ ＤＴＴ中の１μＭ基質を用いて室温にてインキュベートした。複数の時点にてアリコートをＳＤＳ−Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液中の１ｍＭ Ｏ６−ベンジルグアニン（Ｓｉｇｍａ）で失活させて、ウェスタンブロッティング分析を受けさせた（ニュートラアビジン−ペルオキシダーゼコンジュゲート（ＰＩＥＲＣＥ），Ｒｅｎａｉｓｓａｎｃｅ ｒｅａｇｅｎｔ ｐｌｕｓ（ＮＥＮ））。対応するバンドの強度は、Ｋｏｄａｋ Ｉｍａｇｅ Ｓｔａｔｉｏｎ ４４０によって定量した。
【００６９】
生体内局在化：変異ＡＧＴ（Ｌｙｓ１２５Ａｌａ、Ａｌａ１２７Ｔｈｒ、Ａｒｇｌ２８Ａｌａ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ）遺伝子を配列番号：７、配列番号：８のプライマーで増幅して、ベクターｐＥＧＦＰ−Ｎｕｃ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のＮｈｅＩ部位とＢａｍＨＩ部位との間でクローニングした。この構築物を内因性ＡＧＴが欠損したＣＨＯ細胞に形質移入した（B.Kainaら、Carcinogenesis 12,1857-1867,1991）。２４時間のＡＧＴ一過性発現の後に、細胞をJuilleratら、Chem Biol 10: 313-317,2003の物質４の０．５μＭ で５分間インキュベートして、ＰＢＳで３０分間洗浄した。細胞を、水（１．２開口数）対物レンズを備えたＺｅｉｓｓ ＬＳＭ ５１０顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ ＡＧ）での４８８ｎｍアルゴン／クリプトンレーザ線を使用して、レーザ走査共焦顕微鏡法によって撮像した。
【００７０】
Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、突然変異型ＡＧＴ Ｌｙｓ１２５Ａｌａ、Ａｌａ１２７Ｔｈｒ、Ａｒｇ１２８Ａｌａ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９ＧｌｕのＧＳＴ融合は、ＰＧＥＧ−ｈＡＧＴの少なくとも３倍の溶解性タンパク質を生じる。それは少なくとも１０分の１に減少したＤＮＡ結合を示し、Ｏ６−ベンジルグアニン基質に対する活性を維持している。ＣＨＯ細胞では、蛍光標識変異ＡＧＴは、細胞質全体に分布しており、優先的な核局在化は検出できない。
【００７１】
〔実施例２〕
突然変異Ｃｙｓ６２Ａｌａ、Ｌｙｓ１２５Ａｌａ、Ａｌａ１２７Ｔｈｒ、Ａｒｇ１２８Ａｌａ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ
実施例１の突然変異型ＡＧＴ遺伝子を、配列番号：３、配列番号：１０および配列番号：４、配列番号：９のオリゴヌクレオチドを用いて実施例１に記載するように増幅およびクローニングすると、ＰＣＲによるその取込み時に遺伝子内に更なる突然変異Ｃｙｓ６２Ａｌａを引き起こさせた。タンパク質発現、精製および収率の決定は、実施例１に記載するように実施した。突然変異型遺伝子は、ベクターｐＡＫ１００内の繊維状ファージのｇ３タンパク質へ融合させて遺伝子をサブクローニングするために、ＳｆｉＩ制限部位を含有する配列番号：１１、配列番号：１２のプライマーによってＰＣＲ増幅した（Krebberら、J Immunol Methods 201: 35-55,1997）。非サプレッサ菌株Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１内で遺伝子を発現させるときに、アンバー停止コドンは、ＡＧＴ遺伝子後の翻訳を終止させる。したがって、このベクターからの突然変異型ＡＧＴタンパク質のペリプラズム発現を実施例１で記載するように実施した。収穫した細胞を１ｍＭ ＰＭＳＦおよび２μｇ／ｍｌアプロチニンを添加した、５０ｍＭホスフェート、１Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴを含有する緩衝液で再懸濁させて、リゾチームおよび超音波処理によって破壊した。細胞破片を４００００ｘｇでの遠心分離によって分離した。実施例１で記載するように、上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥによるタンパク質収率の定量および活性アッセイに直接供した。
【００７２】
突然変異型Ｃｙｓ６２Ａｌａ、Ｌｙｓ１２５Ａｌａ、Ａｌａ１２７Ｔｈｒ、Ａｒｇ１２８Ａｌａ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕは、Ｏ６−ベンジルグアニン基質に対する活性を保持している。この突然変異型ＡＧＴからの溶解性ＧＳＴ融合タンパク質の収率は、実施例１の突然変異型Ｌｙｓ１２５Ａｌａ、Ａｌａ１２７Ｔｈｒ、Ａｒｇ１２８Ａｌａ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕの収率の少なくとも２倍である。Ｅ．ｃｏｌｉのペリプラズムでの発現による活性ＡＧＴ突然変異体の収率は、ＰＧＥＧ−ｈＡＧＴの収率の少なくとも３倍である。
【００７３】
〔実施例３〕
１８２での切断、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ
ＰＧＥＧ−ｈＡＧＴ遺伝子（Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ、Ｊｕｉｌｌｅｒａｔら、Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ １０：３１３−３１７，２００３を参照）を配列番号：３、配列番号：１３のプライマーによって増幅して、コドン１８２の後に停止コドンおよびＥｃｏＲＩを導入して、次に発現ベクターｐＧＥＸ２Ｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のＢａｍＨＩ部位とＥｃｏＲＩ部位との間でクローニングした。タンパク質発現、精製および発現収率の見積りは、実施例１に記載するように実施した。
【００７４】
切断ＰＧＥＧ−ｈＡＧＴ突然変異体は、Ｏ６−ベンジルグアニン基質に対する活性を保持している。溶解性突然変異型ＧＳＴ−ＡＧＴ融合タンパク質の収率は、突然変異型ＰＧＥＧ−ｈＡＧＴの収率の少なくとも２倍である。
【００７５】
〔実施例４〕
突然変異Ｇｌｙ１３１Ｌｙｓ、Ｇｌｙ１３２Ｔｈｒ、Ｍｅｔ１３４Ｌｅｕ、Ａｒｇ１３５Ｓｅｒ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ
ＰＧＥＧ−ｈＡＧＴ遺伝子（Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ、Ｊｕｉｌｌｅｒａｔら、Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ １０：３１３−３１７，２００３を参照）を、実施例１に記載するように配列番号：１１、配列番号：１５および配列番号：１２、配列番号：１４のプライマーでＰＣＲ増幅して、構築した。プライマーは、ヌクレオチド混合物ＮＮＫ（Ｎ＝Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ；Ｋ＝ＧまたはＴ）をｈＡＧＴ遺伝子のコドン１３１、１３２、１３４、１３５に相当する位置に含有する。遺伝子を繊維状ファージのｇ３タンパク質へ融合させて、ＳｆｉＩ制限部位を介してベクターｐＡＫ１００内にクローニングした。生じた遺伝子ライブラリをファージ提示に使用した。
【００７６】
このライブラリのファージの産生をＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０１細胞にて実施した。指数関数的培養物にヘルパーファージを重感染させて、２４℃にて一晩培養した。この培養物の上清を１μＭジゴキシゲニン化Ｏ６−ベンジルグアニン（Juilleratら, Chem Biol 10: 313-317,2003の物質２）によって６分間インキュベートした。次の選択ラウンドでは、反応時間がそれぞれ９０秒および４５秒まで短縮し、基質の濃度は、１０ｎＭまで低下して選択圧を上昇させた。この反応からのファージを４％ ＰＥＧ／３％ ＮａＣｌを用いた沈殿によって精製した。ジゴキシゲニンによって今や共有結合的に標識された突然変異型ＡＧＴを有するファージを、抗ジゴキシゲニン抗体（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）でコーティングした磁気ビーズを用いたインキュベーションによって単離して、細菌の再感染に使用した。
【００７７】
選択したＡＧＴ突然変異体を実施例１に記載するように、ｐＧＥＸ２Ｔ内にサブクローニングして、発現させて、精製およびキャラクタリゼーションした。Ｎ９−置換およびＮ９−非置換Ｏ６−ベンジルグアニン基質間の識別は、Ｎ９−置換およびＮ９−非置換Ｏ６−ベンジルグアニンを用いた精製された変異ＧＳＴ−ＡＧＴのインビトロでの競合実験によって評価した。０．２μＭ ＧＳＴ−ＡＧＴのアリコートを、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３、および１ｍＭ ＤＴＴ中の様々な濃度のＮ９−置換基質（０、０．５〜１００μＭまで）および０．５μＭビオチン化Ｏ６−ベンジルグアニン（ＢＧ−Ｂｔ、Juilleratら, Chem Biol 10: 313-317, 2003の物質３ａ）を用いて室温にてインキュベートした。４５分後、ＳＤＳ−Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液の添加および熱変性によって反応を停止させた。サンプルにＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティング分析に供した（ニュートラアビジン−ペルオキシダーゼコンジュゲート（ＰＩＥＲＣＥ），Ｒｅｎａｉｓｓａｎｃｅ ｒｅａｇｅｎｔ ｐｌｕｓ（ＮＥＮ））。対応するバンドの強度は、Ｋｏｄａｋ Ｉｍａｇｅ Ｓｔａｔｉｏｎ ４４０によって定量した。
【００７８】
この突然変異型ＡＧＴからの溶解性ＧＳＴ融合タンパク質の収率は、ＰＧＥＧ−ｈＡＧＴの収率の少なくとも２倍である。突然変異型ＡＧＴは、Ｏ６−ベンジルグアニン基質に対して少なくとも２倍更に上昇した活性を示す。Ｏ６−アルキル−Ｎ９−デオキシリボシルグアニンまたはＮ９−シクロペンチル−Ｏ６−ベンジルグアニンに対する反応性は、ＰＧＥＧ−ｈＡＧＴと比較して、少なくとも１０分の１に、特定のクローンでは少なくとも１００分の１に低下する。オリゴヌクレオチド、例えば位置１４のグアニンがＯ６−ベンジル基を有する配列番号：２のオリゴヌクレオチドとの反応性は、ＰＧＥＧ−ｈＡＧＴと比較して、少なくとも１０００分の１に低下する。
【００７９】
〔実施例５〕
突然変異Ｇｌｎ１１５Ｓｅｒ、Ｇｌｎ１１６Ｈｉｓ、Ｃｙｓ１５０Ａｓｎ、Ｓｅｒ１５１Ｉｌｅ、Ｓｅｒ１５２Ａｓｎ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ
実施例４に記載したように、３つのＰＣＲ断片から配列番号：１１、配列番号：１７、配列番号：１６、配列番号：１９および配列番号：１２、配列番号：１８のプライマーの組合せを使用して、３回の別個のＰＣＲ反応で、ＡＧＴ突然変異体のライブラリを構築した。遺伝子を部分的に重複する断片から構築して、断片のうち２つは、コドン１１５−１１６および１５０−１５２にそれぞれ対応する位置に、ランダムヌクレオチド混合物ＮＮＫを含有している。ファージ提示選択は、Juilleratら, Chem Biol 10: 313-317,2003に記載されているように実施した。選択したタンパク質を実施例１に記載するように、ｐＧＥＸ内にサブクローニングして、発現させ、精製およびキャラクタリゼーションした。ペリプラズム発現は実施例２に記載するように実施した。
【００８０】
この突然変異型ＡＧＴからの溶解性ＧＳＴ融合タンパク質の収率は、ＰＧＥＧ−ｈＡＧＴからの収率の少なくとも２倍である。突然変異型ＡＧＴは、Ｏ６−ベンジルグアニン基質に対する活性を保持している。Ｅ．ｃｏｌｉのペリプラズムでの発現による活性ＡＧＴ突然変異体の収率は、ＰＧＥＧ−ｈＡＧＴの収率の少なくとも２倍である。
【００８１】
〔実施例６〕
突然変異Ｃｙｓ６２Ａｌａ、ＧＩｎ１１５Ｓｅｒ、Ｇｌｎ１１６Ｈｉｓ、Ｌｙｓ１２５Ａｌａ、Ａｌａ１２７Ｔｈｒ、Ａｒａ１２８Ａｌａ、Ｇｌｙ１３１Ｌｙｓ、Ｇｌｙ１３２Ｔｈｒ、Ｍｅｔ１３４Ｌｅｕ、Ａｒａ１３５Ｓｅｒ、Ｃｙｓ１５０Ａｓｎ、Ｓｅｒ１５１Ｉｌｅ、Ｓｅｒ１５２Ａｓｎ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ、１８２での切断、「ＡＧＴＭ」
実施例２、３、４、５による突然変異を組合せた。実施例１からの突然変異型ＡＧＴ遺伝子の４つの重複断片（Ｃｙｓ６２Ａｌａ、Ｌｙｓ１２５Ａｌａ、Ａｌａ１２７Ｔｈｒ、Ａｒｇ１２８Ａｌａ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ）を、配列番号：３、配列番号：２３；配列番号：２１、配列番号：２２；配列番号：２０、配列番号：２５および配列番号：２４、配列番号：１３のプライマー組合せを使用して増幅し、遺伝子へと構築して、実施例１に記載するようにｐＧＥＸ２Ｔ内へサブクローニングした。実施例１に記載するように、突然変異型ＡＧＴ（「ＡＧＴＭ」）を発現させ、精製およびキャラクタリゼーションした。
【００８２】
適切な緩衝液（例えば１００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、２０％グリセロール）中で確立された１つ以上の濃度において４℃または最高３７℃での精製サンプルの一晩に渡るインキュベーション後に溶解性画分中に残存するタンパク質の量を決定することによって、ＡＧＴＭまたはＡＧＴＭ融合タンパク質の試験管内での溶解度を測定して、野生型ＡＧＴまたは既知のＡＧＴ突然変異体、例えば「ＰＧＥＧ−ｈＡＧＴ」の溶解度と比較した（Juilleratら、Chem Biol 10: 313-317,2003）。
【００８３】
突然変異型ＡＧＴＭは、実施例１〜５に記載する突然変異体と比較して少なくとも２倍の発現速度の更なる上昇を示し、野生型ＡＧＴと比較したときに少なくとも４倍の試験管内での溶解度の上昇を有する。それはＯ６−ベンジルグアニンに対する反応性を保持しているが、Ｎ９−置換Ｏ６−アルキルグアニン誘導体との少なくとも１０分の１までの反応性の著しい低下、ＤＮＡ基質との少なくとも１００分の１までの反応性の低下を示す。
【００８４】
酸化条件下での安定性：配列番号：１１および配列番号：２８のプライマーを使用して突然変異型遺伝子をＰＣＲ増幅して、実施例２で記載するように、該遺伝子をｐＡＫ１００内にサブクローニングした。実施例２に記載するようにタンパク質発現および細胞溶解を行って、透明な細胞溶解物を得た。ＰＧＥＡ−ｈＡＧＴ（Ｊｕｉｌｌｅｒａｔら，Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ １０： ３１３−３１７，２００３）および突然変異体の反応性を比較するために、１μＭ ＢＧ−Ｂｔを用いてサンプルを５０分間インキュベートして、ＳＤＳ−Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液で失活させ、ニュートラアビジン−ペルオキシダーゼコンジュゲート（Ｐｉｅｒｃｅ）またはモノクローナルマウス抗ＦＬＡＧ ＩｇＧ抗体（Ｍ２、Ｓｉｇｍａ）および二次抗マウスＩｇＧ：：ＨＲＰコンジュゲート、ならびにＲｅｎａｉｓｓａｎｃｅ ｒｅａｇｅｎｔ ｐｌｕｓ（ＮＥＮ）を用いてウェスタンブロッティングによって分析した。ブロットをＫｏｄａｋ Ｉｍａｇｅ ｓｔａｔｉｏｎ ４４０で視覚化した。抗ＦＬＡＧ ＩｇＧ抗体を使用して、溶解性ＡＧＴタンパク質の総量を見積もったが、ニュートラアビジンは、その反応性部分のみを定量した。ＡＧＴ突然変異体の予想分子量は、それぞれ２１および２４ｋＤａである。
【００８５】
ペリプラズム発現は２〜３倍のＡＧＴＭをもたらすが、突然変異型ＰＧＥＡ−ｈＡＧＴでは、少なくとも１０倍のこの突然変異体の活性タンパク質をもたらす（タンパク質収率へ正規化）。
【００８６】
ＢＧ−Ｃｙ３アッセイで測定したＤＮＡベース基質に対する反応性：前に記載したＯ６−（４−アミノエチル−ベンジル）グアニン（Kepplerら、Nature Biotechnol.21: 86-89,2003）をＣｙ３の市販のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｃｙ３−ＮＨＳ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）と反応させることによって、ＢＧ−Ｃｙ３を調製した。カップリング反応は周囲温度にて、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中でトリエチルアミン１当量の存在下で実施した。ＢＧ−Ｃｙ３コンジュゲートは、Ｃ１８カラムでの逆相ＨＰＬＣによって、０．１％トリフルオロ酢酸〜アセトニトリルの線形勾配を使用して精製した。溶媒蒸発後、ＢＧ−Ｃｙ３をジメチルスルホキシドに溶解させ、−２０℃にて保存した。ＤＮＡベース基質との反応性を測定するために、反応緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２、１ｍＭ ＤＴＴ、２００ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）中に各種の濃度（０〜５μＭ）の配列番号：２のオリゴヌクレオチド（位置１４で修飾）、０．２μＭ ＧＳＴ−ＡＧＴ融合タンパク質、および０．５μＭ ＢＧ−Ｃｙ３を含有する反応混合物をマイクロタイタープレートでインキュベートした。Ｃｙ３誘導体の蛍光（励起５１９ｎｍ、発光５７２ｎｍ）をＳｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｇｅｍｉｎｉプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で測定した。
【００８７】
突然変異型ＡＧＴＭは、５μＭまでのＢＧ修飾オリゴヌクレオチドの存在下でＢＧ−Ｃｙ３とのその反応の低下を示していない（図１Ａ）。ＰＧＥＧ−ｈＡＧＴの活性は、０．５μＭ（またはそれ以上）ＢＧ修飾オリゴヌクレオチドの存在下でバックグラウンドレベル以下（３％未満）である（図１Ｂ）。
【００８８】
ＤＮＡ結合：ＤＮＡ結合は、ＡＧＴ突然変異体とＢＧ誘導体との反応のＤＮＡによる阻害として測定した。オリゴヌクレオチドの代わりにサケ精子ＤＮＡ（２５μｇ／ｍｌ）を含有する反応混合物中のＡＧＴ突然変異体の反応速度をＢＧ−Ｃｙ３アッセイによって測定した。反応速度は、得られたデータを単指数上昇に最大まで適合させることによって決定した。
【００８９】
ＡＧＴＭのＢＧ−Ｃｙ３に対する反応速度は、ＤＮＡの存在下で不変であるのに対して、ＰＧＥＧ−ｈＡＧＴのＢＧ−Ｃｙ３に対する速度は、ＤＮＡの存在下で５分の１に低下している。
【００９０】
反応後の安定性：１２ｘＨｉｓ−タグならびにＳｂｆＩおよびＡｓｃＩクローニング部位を含めるために合成オリゴヌクレオチド（配列番号：２９および配列番号：３０）ＮｃｏＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間でクローニングすることによって、ベクターｐＢＡＤ／Ｈｉｓ Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を修飾した。ＡＧＴＭの遺伝子は、配列番号：３１および配列番号：３２のプライマーによって増幅して、ＳｂｆＩ／ＡｓｃＩ部位間にてこのベクター内へクローニングした。野生型ＡＧＴおよび突然変異型ＡＧＴ（Ｌｙｓ１２５Ａｌａ、Ａｌａｌ２７Ｔｈｒ、Ａｒｇ１２８Ａｌａ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ）を配列番号：３１および配列番号：３３のプライマーによって増幅して、このベクター内へクローニングした。Ｅ．ｃｏｌｉ菌株Ｔｏｐ１０においてタンパク質発現を実施した。指数関数的に増殖する培養物を０．２％アラビノースによって誘起し、発現を２８℃にて１６時間に渡って実施した。０．５Ｍ ＮａＣｌ、８０ｍＭイミダゾール、１％ Ｔｒｉｔｏｎ、２５０μＭ ＰＭＳＦ、１ｍＭ β−メルカプトエタノール、５ｍｇ／ｍｌリゾチーム、２０μｇ／ｍｌ ＤＮａｓｅを含有する緩衝液を１０ｍｇ／ｇまで添加することによって細胞を溶解させ、４５分間撹拌した。１０，０００ｇにて３０分間の遠心分離後の上清を平衡したＮｉ−ＮＴＡ（Ｑｉａｇｅｎ）カラムに装填して０．５Ｍ ＮａＣｌ、１００ｍＭイミダゾール、１ｍＭ β−メルカプトエタノールの２０カラム体積で、続いて０．２５Ｍ ＮａＣｌ、１００ｍＭイミダゾール、２０％グリセロールの３カラム体積で洗浄した。タンパク質を０．２５Ｍ ＮａＣｌ、４００ｍＭイミダゾール、２０％グリセロールで溶出させた。１ｍＭ ＤＴＴを添加した後、タンパク質を−８０℃で保存した。
【００９１】
ＡＧＴタンパク質（１０μＭにて）をフルオレセイン修飾Ｏ６−ベンジルグアニン（Juilleratら、Chem Biol 10: 313-317,2003の物質５、ＢＧ−ＦＬ、２０μＭ）と定量的に反応させて、サイズ排除カラム（Ｅｃｏｎｏｐａｃ １０ＤＧ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で精製し、７日間インキュベートした。各種の時点にて、アリコートを２５，０００ｇにて遠心分離して、１％ ＳＤＳを上清に添加した。上清の蛍光をＶｉｃｔｏｒ２蛍光プレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、４８５／５３５ｎｍにて励起／発光）で測定した。
【００９２】
７日間に渡って溶解性蛍光タンパク質の約６０％を失うｈＡＧＴまたは突然変異型（Ｌｙｓ１２５Ａｌａ、Ａｌａ１２７Ｔｈｒ、Ａｒｇ１２８Ａｌａ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ）とは対照的に、標識突然変異型ＡＧＴＭは、７日間を超えて溶液中にて安定なままである。
【００９３】
Ｎ９−修飾Ｏ６−ベンジルグアニン誘導体に対するＡＧＴの反応性：実験は、ＢＧ−Ｃｙ３アッセイに基づく。ＡＧＴのＢＧ−Ｃｙ３との反応時に、Ｃｙ３の蛍光放出強度の２〜３倍の上昇が認められる。化合物Ｎ９−イソブチル−Ｏ６−ベンジルグアニン、Ｎ９−プロピル−Ｏ６−ベンジルグアニン、またはＮ９−ニトリル−Ｏ６−ベンジルグアニンに対する、ＡＧＴＭ（実施例６）対ＰＧＥＧ−ｈＡＧＴ（Juilleratら2003、突然変異Ｎ１５７Ｇ、Ｓ１５９Ｅを含有する）の反応性を、ＧＳＴ−ＡＧＴ融合タンパク質１０μＭのサンプルを反応緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０、１ｍＭ ＤＴＴ）中のこれらのサンプル１００μＭによって室温にて１５分間に渡って事前にインキュベートすることによって調査した。次にＢＧ−Ｃｙ３（２０μＭ最終濃度）を添加して、反応物を室温にて更に１時間インキュベートした。サンプルを反応緩衝液によって１：２０で希釈して、マイクロタイタープレートに移動した。Ｃｙ３蛍光物質の蛍光強度（励起：５１９ｎｍ、発光：５７２ｎｍ）をＳｐｅｃｔｒａ Ｍａｘ Ｇｅｍｉｎｉマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）によって測定した。
【００９４】
両方のＡＧＴ突然変異体をＢＧ（１００μＭ、１５分の反応時間）によって効率的に予備遮断した（図３、Ｎｏ．３）。ＡＧＴＭの５％は、ＢＧでの予備遮断後に活性のままである（灰色棒）。Ｎ９−修飾ＢＧ誘導体に対するＡＧＴＭとＰＧＥＧ−ｈＡＧＴとの反応性の著しい差が見られる。ＡＧＴＭは、１％〜１０％の範囲でＮ９−修飾ＢＧ誘導体と反応する（図３、Ｎｏ．４、５、６、灰色棒）。ＡＧＴＭとは対照的に、ＰＧＥＧ−ｈＡＧＴは、３つすべてのＮ９−修飾ＢＧ誘導体と効率的に反応する。ＢＧ−Ｃｙ３による次のインキュベーション時にはバックグラウンドを超える蛍光の増加は認められず、Ｎ９−置換化合物との完全な反応を示す（図３、Ｎｏ．４、５、６、黒色棒）。
【００９５】
〔実施例７〕
１つの生体サンプル中に存在する２つの異なるＡＧＴの変異体と２つの異なる基質との反応
実施例６（ＡＧＴＭ）の突然変異型ＡＧＴを配列番号：２６および配列番号：２７のプライマーによってＰＣＲ増幅して、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩを介してｐＥＴ１５ｂ内へサブクローニングした。このベクターからの遺伝子発現を実施例１に記載するようにＥ．ｃｏｌｉ菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）にて実施し、ベクターによってコードされるＮ末端融合されたＨｉｓ−タグを有するタンパク質を生じさせた。細胞を収穫して、実施例１に記載するように、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、５０ｍＭホスフェート、ｐＨ８．０を含有する抽出緩衝液中に抽出した。タンパク質を含有する抽出物を事前に平衡にされたＮｉ−ＮＴＡ−セファロース（Ｑｉａｇｅｎ）に加え、次にこれを、２０ｍＭイミダゾールを含有する緩衝液２０ベッドボリュームで洗浄した。２５０ｍＭイミダゾールを含有する緩衝液を用いてＨｉｓ−タグ化タンパク質を溶出させた。実施例１に記載するように精製したタンパク質を透析し、保存して、後でキャラクタリゼーションした。
【００９６】
実験では、２つのＡＧＴタンパク質には異なるサイズの２つのタグを使用した：Ｈｉｓ−タグ化 ＡＧＴＭ（約２０ｋＤａ）およびＧＳＴ−ｈＡＧＴ（実施例１に記載するようにクローニングおよび調製、しかし野生型ｈＡＧＴ遺伝子から開始、約４８ｋＤａ）を、５０ｍＭＨＥＰＥＳ、１ｍＭＤＴＴ、２００ｍｇ／ｍＬＢＳＡを含有する反応緩衝液（ｐＨ７．３）でそれぞれ０．２μＭおよび１．２μＭ最終濃度まで希釈した。サンプルを基質Ｎ９−シクロペンチル−Ｏ６−ブロモテニル−グアニン（ＣＰＴＧ、０、５および１０μＭ最終濃度）およびビオチン化Ｏ６−ベンジルグアニン（ＢＧ−Ｂｔ、５μＭ最終濃度）の混合物で３０分間インキュベートした。反応物をＳＤＳ−Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液の添加によって失活させ、ウェスタンブロッティング分析に供した（実施例１）。２つのＡＧＴ変異体は異なる質量を有するため、２つのタンパク質はアクリルアミドゲルで分離して、独立して分析できる。ＧＳＴ−ｈＡＧＴに対するＣＰＴＧの高い特異性が認められる。同じ濃度では（どちらの基質も５μＭ最終濃度）、ＧＳＴ−ｈＡＧＴの９５％がＣＰＴＧと反応するのに対して、Ｈｉｓ−タグ化 ＡＧＴＭはわずか５％である。
【００９７】
基質ＣＰＴＧは、シクロペンテニルメチルカーボネートによる６−クロログアニンの位置Ｎ−９のシクロペンテニル化と、６−クロロ−Ｎ９−シクロペンチル−グアニンへの還元と、３級アミンの存在下での４−ブロモ−２−ヒドロキシメチルチオフェンとの反応によって入手できる。
【００９８】
【化３】
【００９９】
更なる実験において、実施例６に記載する突然変異型ＡＧＴＭを配列番号：３４および配列番号：３６のプライマーによって増幅し、ベクターｐＥＧＦＰ−ＮｕｃのＮｈｅＩ部位とＢｇｌＩＩ部位との間へクローニングした。酵母β−ガラクトシダーゼ遺伝子を配列番号：３７および配列番号：３８のプライマーによって増幅して、ＢｇｌＩＩ／ＢａｍＨＩを介してこのベクターへサブクローニングして、ＡＧＴＭ−β−ＧａＩ融合遺伝子を有するベクターを生成させた。ｈＡＧＴ遺伝子を実施例１に記載する原理に基づいて、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：３４、および配列番号：３５のプライマーによって増幅し、ＮｈｅＩ／ＢｇｌＩＩを介してｐＥＧＦＰ−Ｎｕｃ内へクローニングして、突然変異Ｇｌｙ１６０ＴｒｐをコードするＡＧＴ−ＮＬＳ３融合遺伝子を生成させた。ＡＧＴ突然変異体両方の同時の一過性発現後に、細胞を５μＭ ＣＰＴＧで１０分間、次にJuilleratら、Chem Biol 10: 313-317,2003の物質４５μＭで２０分間インキュベートした。実施例１に記載するように細胞を洗浄および撮像した。
【０１００】
ＣＨＯ細胞において、細胞質に局在化したＡＧＴＭ−β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質を蛍光基質物質４との反応によって、選択的に蛍光標識化した。核内の他のＡＧＴ融合タンパク質の著しい標識化は認められない。ＡＧＴ（Ｇｌｙ１６０Ｔｒｐ）が細胞内でＣＰＴＧと効率的に反応して、それゆえその後、蛍光基質によって標識できないことが結論付けられる。実施例６（ＡＧＴＭ）の突然変異体は、細胞内でＣＰＴＧによる事前のインキュベーション後に蛍光基質に対して反応性のままであり、したがって第１のステップでＣＰＴＧと反応しない。
【０１０１】
〔実施例８〕
化合物Ｃｙｓ６２Ａｌａ、Ｇｌｎ１１５Ｓｅｒ、Ｇｌｎ１１６Ｈｉｓ、Ｌｙｓ１２５Ａｌａ、Ａｌａ１２７Ｔｈｒ、Ａｒｇ１２８Ａｌａ、Ｇｌｙ１３１Ｌｙｓ、Ｇｌｙ１３２Ｔｈｒ、Ｍｅｔ１３４Ｌｅｕ、Ａｒｇ１３５Ｓｅｒ、Ｃｙｓ１５０Ａｓｎ、Ｓｅｒ１５１Ｉｌｅ、Ｓｅｒ１５２Ａｓｎ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ、１８２での切断における更なる突然変異
Ａ）エラープローンＰＣＲ：ベクターｐＡＫ１００からの実施例６のＡＧＴＭの遺伝子を、配列番号：４２のプライマーおよび配列番号：４１のビオチン化プライマーによってＴａｑ−ポリメラーゼを使用して、１２０μＭ（６−（２−デオキシ−β−Ｄ−エリスロ−ペント−フラノシル）−３，４−ジヒドロ−６Ｈ，８Ｈ−ピリミド［４，５−ｃ］［１，２］オキサジン−２−オン）−５’−トリホスフェートおよび４８０μＭ ２’−デオキシ−８−オキソ−グアノシン−トリホスフェート（どちらもＴｒｉｌｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓより）でスパイクしたエラープローンＰＣＲ反応によって増幅した。生成物をストレプトアビジンコーティングビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２８０、Ｄｙｎａｌ）上に捕捉して、次に配列番号：４３および配列番号：４４のプライマーを用いて標準ＰＣＲによって増幅した。
【０１０２】
Ｂ）飽和突然変異誘発、領域１５０−１５４：ＡＧＴＭ（実施例６の突然変異体）の遺伝子を配列番号：１１、配列番号：４５、配列番号：４６および配列番号：２８のプライマーを用いてＰＣＲによって実施例１に記載するように増幅して、ＳｆｉＩを介してｐＡＫ１００内へサブクローニングした。プライマーは、ｈＡＧＴ遺伝子のコドン１５０−１５４に相当する位置にヌクレオチド混合物ＮＮＫ（Ｎ＝Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ；Ｋ＝ＧまたはＴ）を含有する。
【０１０３】
Ｃ）飽和突然変異誘発、領域３１−３５：ＡＧＴＭ（実施例６の突然変異体）をコードする遺伝子を配列番号：１１、配列番号：４８、配列番号：４７および配列番号：２８のプライマーを用いてＰＣＲによって実施例１に記載するように増幅して、ＳｆｉＩを介してｐＡＫ１００内へサブクローニングした。プライマー４７は、ｈＡＧＴ遺伝子のコドン３１−３５に相当する位置にヌクレオチド混合物ＮＮＫ（Ｎ＝Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ；Ｋ＝ＧまたはＴ）を含有し プライマー４８は、アンチセンスストランドのための混合物ＭＮＮ（Ｍ＝ＣまたはＡ）を含有する。
【０１０４】
増幅生成物を繊維状ファージのｇ３遺伝子に融合させて、ＳｆｉＩ制限部位を介してベクターｐＡＫ１００へクローニングした。実施例４に記載したように、生じた遺伝子ライブラリをファージ提示に使用した。ライブラリの突然変異体をＢＧ−Ｂｔ ５〜５０ｎＭによって１０分間に渡って選択した。選択された突然変異体を配列番号：３および配列番号：１３のプライマーを使用してｐＧＥＸ内へサブクローニングした。突然変異型ＡＧＴの反応速度を実施例６、ＤＮＡベース基質に対する反応性（ＢＧ−Ｃｙ３アッセイ）に記載するように決定した。
【０１０５】
突然変異の組合せ：ＢＧ誘導体との反応速度を向上するために見出された選択からの突然変異を、鋳型として１つの突然変異型遺伝子を使用して、そして突然変異の点にてミスマッチであるプライマー配列での更なる突然変異を含めて、配列番号：３および配列番号：１３のプライマーにより実施例１に記載するようにＰＣＲによって組合せた。突然変異を重複し６０℃以下でハイブリダイズするのに十分な長さを有する２つの各変異原性プライマーを選択して、相補性ストランドの一方へそれぞれアニーリングさせた。アニーリング温度は、各Ｇ／Ｃ対では４℃および各Ａ／Ｔ対では２℃の寄与を想定して計算した。生じた遺伝子を実施例１に記載するように、ｐＧＥＸ内へサブクローニングした。実施例１、４および６に記載するように、突然変異型ＡＧＴタンパク質を調製およびキャラクタリゼーションした。
【０１０６】
これらの選択からの組合せ突然変異を有するＡＧＴ突然変異体は、実施例１〜６の突然変異体について記載した好都合な特性を示す。突然変異体は、実施例１〜５に記載する突然変異体に匹敵する発現速度を有し、野生型ＡＧＴと比較したときに試験管内で少なくとも４倍の溶解度の上昇を有する。それらは少なくとも１０分の１へのＮ９−置換Ｏ６−アルキルグアニン誘導体との反応性の低下と、少なくとも１００分の１へのＤＮＡまたはＤＮＡ基質との相互作用および反応性それぞれの低下を示す。Ｅ．ｃｏｌｉのペリプラズムにおける発現からの活性ＡＧＴ突然変異体の収率は、ＰＧＥＧ−ｈＡＧＴの収率よりも少なくとも５倍の高さである。ＣＨＯ細胞において、蛍光標識化変異ＡＧＴは細胞質全体に分布しており、優先的な核局在化は検出できない。その上、これらのＡＧＴ突然変異体は野生型ｈＡＧＴと比較したときに、Ｏ６−ベンジルグアニン基質に対する反応性のかなりの上昇を示す（表１を参照）。
【０１０７】
【表１】
【０１０８】
ＢＧ−Ｃｙ３活性アッセイによって反応速度を決定して、野生型ｈＡＧＴについてこのアッセイで得られた値（ｋｏｂｓ＝１１６Ｍ−１ｃｍ−１）で割った。活性アッセイでは、精製したＧＳＴ融合タンパク質を、「ｐ．」のマークが付いた（実施例１に記載するように調製した）突然変異体について使用した；ペリプラズム抽出物を、「ｘ．」のマークが付いた（実施例２に記載するように調製した）突然変異体について使用した。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】表示濃度でのＢＧ修飾オリゴヌクレオチド（配列番号：２）の存在下でのＡＧＴＭ（実施例６、Ａの突然変異体）またはＰＧＥＧ−ｈＡＧＴ（Ｂ）のＢＧ−Ｃｙ３との反応。Ｓｐｅｃｔｒａ Ｍａｘ Ｇｅｍｉｎｉプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で検出した任意単位［ａ．ｕ．］の蛍光ＦＬ（励起５１９ｎｍ、５７２ｎｍにて放出）は、時間（ｔ）（分［ｍｉｎ］）にプロットされている。
【図２】実施例７に記載するような、野生型ｈＡＧＴ（ＧＳＴ−ｈＡＧＴ融合タンパク質）およびＡＧＴＭと、２つの基質Ｎ９−シクロペンチル−Ｏ６−ブロモテニル−グアニン（ＣＰＴＧ）およびビオチン化Ｏ６−ベンジルグアニン（ＢＧ−Ｂｔ、Ｊｕｉｌｌｅｒａｔら２００３の物質３ａ）との反応のウェスタンブロット。ＢＧ−Ｂｔは、すべてのサンプル中に５μＭで存在する。ＢＧ−Ｂｔと反応したＡＧＴを検出する、ニュートラアビジン−ペルオキシダーゼコンジュゲートおよび発光ペルオキシダーゼ基質を用いた検出。同じ濃度のＣＰＴＧおよびＢＧ−Ｂｔを用いた同様のインキュベーションの下でさえ、ＧＳＴ−ｈＡＧＴのわずか５％が基質ＢＧ−Ｂｔと反応する。
【図３】Ｎ９−修飾ＢＧ誘導体とのＡＧＴ突然変異体の反応性。１０μＭ ＡＧＴＭ（灰色バー）またはＰＧＥＧ−ｈＡＧＴ（黒色バー）を１００μＭ Ｎ９−修飾ＢＧ誘導体（以下のリストを参照）で予備遮断して、次に２０μＭ ＢＧ−Ｃｙ３で標識した。１時間の反応時間の後、５９５ｎｍにて任意単位［ａ．ｕ．］で示した蛍光強度（ＦＩ）を測定する。黒色実線は、タンパク質に結合していない蛍光物質のバックグラウンド蛍光に相当する条件１の測定値に設定されている。この線より上の値は、Ｎ９−修飾ＢＧ誘導体との低速または不完全な反応を示す。１ タンパク質を含まないＢＧ−Ｃｙ３の蛍光、バックグラウンド蛍光。２ ＢＧ−Ｃｙ３との反応；予備遮断なし、正の対照。３ ＢＧ−Ｃｙ３との反応、１００μＭ ＢＧによって予備遮断。４ ＢＧ−Ｃｙ３との反応、１００μＭ Ｎ９−イソブチル−Ｏ６−ベンジルグアニンによって予備遮断。５ ＢＧ−Ｃｙ３との反応、１００μＭ Ｎ９−プロピル−Ｏ６−ベンジルグアニンによって予備遮断。６ ＢＧ−Ｃｙ３との反応、１００μＭ Ｎ９−シアノメチル−Ｏ６−ベンジルグアニンによって予備遮断。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｏ６−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）突然変異体であって、
野生型ヒトＡＧＴと比較したときに、
（ａ）ＤＮＡ相互作用の低下；
（ｂ）もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化；
（ｃ）各種宿主における溶解性タンパク質としての発現収率の向上および安定性の向上；
（ｄ）酸化条件下での安定性の向上；
（ｅ）基質との反応後の細胞内での安定性の向上；
（ｆ）基質との反応前後の細胞外部での安定性の向上；
（ｇ）試験管内溶解度の向上；
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上；
（ｉ）ＤＮＡベース基質に対する反応性の低下；ならびに
（ｊ）Ｎ９−置換Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性の低下；
より選択される２つ以上の利点を示す、ＡＧＴ突然変異体。
【請求項２】
好都合な特性が
（ｃ）各種宿主における溶解性タンパク質としての発現収率の向上および安定性の向上、ならびに
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上；
あるいは
（ｃ）各種宿主における溶解性タンパク質としての発現収率の向上および安定性の向上、
（ｄ）酸化条件下での安定性の向上、
（ｇ）試験管内溶解度の向上、ならびに
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上；
あるいは
（ｃ）各種宿主における溶解性タンパク質としての発現収率の向上および安定性の向上、
（ｄ）酸化条件下での安定性の向上、
（ｆ）基質との反応前後の細胞外部での安定性の向上、
（ｇ）試験管内溶解度の向上、ならびに
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上；
あるいは
（ａ）ＤＮＡ相互作用の低下、
（ｂ）もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
（ｃ）各種宿主における溶解性タンパク質としての発現収率の向上および安定性の向上、
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上、ならびに
（ｉ）ＤＮＡベース基質に対する反応性の低下；
あるいは
（ａ）ＤＮＡ相互作用の低下、
（ｂ）もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
（ｃ）各種宿主における溶解性タンパク質としての発現収率の向上および安定性の向上、
（ｅ）基質との反応後の細胞内での安定性の向上、
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上、ならびに
（ｉ）ＤＮＡベース基質に対する反応性の低下；
あるいは
（ａ）ＤＮＡ相互作用の低下、
（ｂ）もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
（ｃ）各種宿主における溶解性タンパク質としての発現収率の向上および安定性の向上、
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上、
（ｉ）ＤＮＡベース基質に対する反応性の低下、ならびに
（ｊ）Ｎ９−置換Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性の低下；
あるいは
（ａ）ＤＮＡ相互作用の低下、
（ｂ）もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
（ｃ）各種宿主における溶解性タンパク質としての発現収率の向上および安定性の向上、
（ｅ）基質との反応後の細胞内での安定性の向上、
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上、
（ｉ）ＤＮＡベース基質に対する反応性の低下、ならびに
（ｊ）Ｎ９−置換Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性の低下；
である、請求項１記載のＡＧＴ突然変異体。
【請求項３】
好都合な特性が
（ｃ’）Ｅ．ｃｏｌｉにおける溶解性タンパク質としての発現収率の向上および安定性の向上、ならびに
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上；
あるいは
（ｃ’）Ｅ．ｃｏｌｉにおける溶解性タンパク質としての発現収率の向上および安定性の向上、
（ｄ）酸化条件下での安定性の向上、
（ｇ）試験管内溶解度の向上、ならびに
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上；
あるいは
（ｃ’）Ｅ．ｃｏｌｉにおける溶解性タンパク質としての発現収率の向上および安定性の向上、
（ｄ）酸化条件下での安定性の向上、
（ｆ’）基質との反応後の、細胞外での安定性の向上、
（ｇ）試験管内溶解度の向上、ならびに
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上；
あるいは
（ａ）ＤＮＡ相互作用の低下、
（ｂ）もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
（ｃ’）Ｅ．ｃｏｌｉにおける溶解性タンパク質としての発現収率の向上および安定性の向上、
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上、ならびに
（ｉ）ＤＮＡベース基質に対する反応性の低下；
あるいは
（ａ）ＤＮＡ相互作用の低下、
（ｂ）もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
（ｃ’）Ｅ．ｃｏｌｉにおける溶解性タンパク質としての発現収率の向上および安定性の向上、
（ｅ）基質との反応後の細胞内での安定性の向上、
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上、ならびに
（ｉ）ＤＮＡベース基質に対する反応性の低下；
あるいは
（ａ）ＤＮＡ相互作用の低下、
（ｂ）もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
（ｃ’）Ｅ．ｃｏｌｉにおける溶解性タンパク質としての発現収率の向上および安定性の向上、
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上、
（ｉ）ＤＮＡベース基質に対する反応性の低下、ならびに
（ｊ）Ｎ９−置換Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性の低下；
あるいは
（ａ）ＤＮＡ相互作用の低下、
（ｂ）もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
（ｃ’）Ｅ．ｃｏｌｉにおける溶解性タンパク質としての発現収率の向上および安定性の向上、
（ｅ）基質との反応後の細胞内での安定性の向上、
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上、
（ｉ）ＤＮＡベース基質に対する反応性の低下、ならびに
（ｊ）Ｎ９−置換Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性の低下；
である、請求項１記載のＡＧＴ突然変異体。
【請求項４】
好都合な特性が
（ｃ）各種の宿主における、溶解性タンパク質としての５倍を超える発現収率および安定性の向上、ならびに
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上；
あるいは
（ｃ）各種の宿主における、溶解性タンパク質としての５倍を超える発現収率および安定性の向上、
（ｄ）酸化条件下での５倍を超える安定性、
（ｇ）５倍を超える試験管内溶解度、ならびに
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する５倍を超える反応性；
あるいは
（ｃ）各種の宿主における、溶解性タンパク質としての５倍を超える発現収率および安定性の向上、
（ｄ）酸化条件下での５倍を超える安定性、
（ｆ）基質との反応前および後の、細胞外での４倍を超える安定性、
（ｇ）５倍を超える試験管内溶解度、ならびに
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上；
あるいは
（ａ）２％未満のＤＮＡ結合、
（ｂ）もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
（ｃ）各種の宿主における、溶解性タンパク質としての５倍を超える発現収率および安定性の向上、
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する５倍を超える反応性、ならびに
（ｉ）ＤＮＡベース基質に対する１％未満の反応性；
あるいは
（ａ）２％未満のＤＮＡ結合、
（ｂ）もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
（ｃ）各種の宿主における、溶解性タンパク質としての５倍を超える発現収率および安定性の向上、
（ｅ）基質との反応後の細胞内での３倍を超える安定性、
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する５倍を超える反応性、ならびに
（ｉ）ＤＮＡベース基質に対する１％未満の反応性；
あるいは
（ａ）２％未満のＤＮＡ結合、
（ｂ）もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
（ｃ）各種の宿主における、溶解性タンパク質としての５倍を超える発現収率および安定性の向上、
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する５倍を超える反応性、
（ｉ）ＤＮＡベース基質に対する１％未満の反応性、ならびに
（ｊ）Ｎ９−置換Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する２％未満の反応性；
あるいは
（ａ）２％未満のＤＮＡ結合、
（ｂ）もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
（ｃ）各種の宿主における、溶解性タンパク質としての５倍を超える発現収率および安定性の向上、
（ｅ）基質との反応後の細胞内での３倍を超える安定性、
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する５倍を超える反応性、
（ｉ）ＤＮＡベース基質に対する１％未満の反応性、ならびに
（ｊ）Ｎ９−置換Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する２％未満の反応性；
である、請求項１または２記載のＡＧＴ突然変異体。
【請求項５】
好都合な特性が
（ｃ’）Ｅ．ｃｏｌｉにおける、溶解性タンパク質としての５倍を超える発現収率および安定性の向上、ならびに
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上；
あるいは
（ｃ’）Ｅ．ｃｏｌｉにおける、溶解性タンパク質としての５倍を超える発現収率および安定性の向上、
（ｄ）酸化条件下での５倍を超える安定性、
（ｇ）５倍を超える試験管内溶解度、ならびに
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する５倍を超える反応性；
あるいは
（ｃ’）Ｅ．ｃｏｌｉにおける、溶解性タンパク質としての５倍を超える発現収率および安定性の向上、
（ｄ）酸化条件下での５倍を超える安定性、
（ｆ’）基質との反応後の、細胞外での４倍を超える安定性、
（ｇ）５倍を超える試験管内溶解度、ならびに
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上；
あるいは
（ａ）２％未満のＤＮＡ結合、
（ｂ）もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
（ｃ’）Ｅ．ｃｏｌｉにおける、溶解性タンパク質としての５倍を超える発現収率および安定性の向上、
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する５倍を超える反応性、ならびに
（ｉ）ＤＮＡベース基質に対する１％未満の反応性；
あるいは
（ａ）２％未満のＤＮＡ結合、
（ｂ）もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
（ｃ’）Ｅ．ｃｏｌｉにおける、溶解性タンパク質としての５倍を超える発現収率および安定性の向上、
（ｅ）基質との反応後の細胞内での３倍を超える安定性、
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する５倍を超える反応性、ならびに
（ｉ）ＤＮＡベース基質に対する１％未満の反応性；
あるいは
（ａ）２％未満のＤＮＡ結合、
（ｂ）もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
（ｃ’）Ｅ．ｃｏｌｉにおける、溶解性タンパク質としての５倍を超える発現収率および安定性の向上、
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する５倍を超える反応性、
（ｉ）ＤＮＡベース基質に対する１％未満の反応性、ならびに
（ｊ）Ｎ９−置換Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する２％未満の反応性；
あるいは
（ａ）２％未満のＤＮＡ結合、
（ｂ）もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
（ｃ’）Ｅ．ｃｏｌｉにおける、溶解性タンパク質としての５倍を超える発現収率および安定性の向上、
（ｅ）基質との反応後の細胞内での３倍を超える安定性、
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する５倍を超える反応性、
（ｉ）ＤＮＡベース基質に対する１％未満の反応性、ならびに
（ｊ）Ｎ９−置換Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する２％未満の反応性；
である、請求項１または３記載のＡＧＴ突然変異体。
【請求項６】
好都合な特性が
（ｃ）各種の宿主における、溶解性タンパク質としての１０倍を超える発現収率および安定性の向上、
（ｄ）酸化条件下での１０倍を超える安定性、
（ｆ）基質との反応前および後の、細胞外での６倍を超える安定性、
（ｇ）１０倍を超える試験管内溶解度、
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する１０倍を超える反応性；
あるいは
（ａ）検出不能なＤＮＡ結合、
（ｂ）もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
（ｃ）各種の宿主における、溶解性タンパク質としての１０倍を超える発現収率および安定性の向上、
（ｅ）基質との反応後の細胞内での６倍を超える安定性、
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する１０倍を超える反応性、ならびに
（ｉ）ＤＮＡベース基質に対する検出不能な反応性；
あるいは
（ａ）検出不能なＤＮＡ結合、
（ｂ）もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
（ｃ）各種の宿主における、溶解性タンパク質としての１０倍を超える発現収率および安定性の向上、
（ｅ）基質との反応後の細胞内での６倍を超える安定性、
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する１０倍を超える反応性
（ｉ）ＤＮＡベース基質に対する検出不能な反応性、ならびに
（ｊ）Ｎ９置換Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する検出不能な反応性；
あるいは
（ａ）ＤＮＡ相互作用の低下、
（ｂ）もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
（ｃ）各種の宿主における、溶解性タンパク質としての１０倍を超える発現収率および安定性の向上、
（ｄ）酸化条件下での１０倍を超える安定性、
（ｅ）基質との反応後の細胞内での６倍を超える安定性、
（ｆ）基質との反応前および後の、細胞外での６倍を超える安定性、
（ｇ）１０倍を超える試験管内溶解度、
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する１０倍を超える反応性、ならびに
（ｉ）ＤＮＡベース基質に対する検出不能な反応性；
あるいは
（ａ）ＤＮＡ相互作用の低下、
（ｂ）もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
（ｃ）各種の宿主における、溶解性タンパク質としての１０倍を超える発現収率および安定性の向上、
（ｄ）酸化条件下での１０倍を超える安定性、
（ｅ）基質との反応後の細胞内での６倍を超える安定性、
（ｆ）基質との反応前および後の、細胞外での６倍を超える安定性、
（ｇ）１０倍を超える試験管内溶解度、
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する１０倍を超える反応性、
（ｉ）ＤＮＡベース基質に対する検出不能な反応性、ならびに
（ｊ）Ｎ９−置換Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する検出不能な反応性；
である、請求項１または２記載のＡＧＴ突然変異体。
【請求項７】
好都合な特性が
（ｃ’）Ｅ．ｃｏｌｉにおける、溶解性タンパク質としての１０倍を超える発現収率および安定性の向上、
（ｄ）酸化条件下での１０倍を超える安定性、
（ｆ’）基質との反応後の細胞外での６倍を超える安定性、
（ｇ）１０倍を超える試験管内溶解度、ならびに
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する１０倍を超える反応性；
あるいは
（ａ）検出不能なＤＮＡ結合、
（ｂ）もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
（ｃ’）Ｅ．ｃｏｌｉにおける、溶解性タンパク質としての１０倍を超える発現収率および安定性の向上、
（ｅ）基質との反応後の細胞内での６倍を超える安定性、
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する１０倍を超える反応性、ならびに
（ｉ）ＤＮＡベース基質に対する検出不能な反応性；
あるいは
（ａ）検出不能なＤＮＡ結合、
（ｂ）もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
（ｃ’）Ｅ．ｃｏｌｉにおける、溶解性タンパク質としての１０倍を超える発現収率および安定性の向上、
（ｅ）基質との反応後の細胞内での６倍を超える安定性、
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する１０倍を超える反応性、
（ｉ）ＤＮＡベース基質に対する検出不能な反応性、ならびに
（ｊ）Ｎ９−置換Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する検出不能な反応性；
あるいは
（ａ）ＤＮＡ相互作用の低下、
（ｂ）もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
（ｃ’）Ｅ．ｃｏｌｉにおける、溶解性タンパク質としての１０倍を超える発現収率および安定性の向上、
（ｄ）酸化条件下での１０倍を超える安定性、
（ｅ）基質との反応後の細胞内での６倍を超える安定性、
（ｆ’）基質との反応後の細胞外での６倍を超える安定性、
（ｇ）１０倍を超える試験管内溶解度、
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する１０倍を超える反応性、ならびに
（ｉ）ＤＮＡベース基質に対する検出不能な反応性；
あるいは
（ａ）ＤＮＡ相互作用の低下、
（ｂ）もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
（ｃ’）Ｅ．ｃｏｌｉにおける、溶解性タンパク質としての１０倍を超える発現収率および安定性の向上、
（ｄ）酸化条件下での１０倍を超える安定性、
（ｅ）基質との反応後の細胞内での６倍を超える安定性、
（ｆ’）基質との反応後の細胞外での６倍を超える安定性、
（ｇ）１０倍を超える試験管内溶解度、
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する１０倍を超える反応性、
（ｉ）ＤＮＡベース基質に対する検出不能な反応性、ならびに
（ｊ）Ｎ９−置換Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する検出不能な反応性；
である、請求項１または３記載のＡＧＴ突然変異体。
【請求項８】
野生型ヒトＡＧＴの１〜２５個のアミノ酸が、他のアミノ酸によって置換され、場合により連続鎖からの１〜５個のアミノ酸が１、２、または３つの位置で欠損または付加され、および／またはＮ末端の１〜４個のアミノ酸またはＣ末端の１〜４０個のアミノ酸が欠損している、請求項１〜７のいずれか一項記載のＡＧＴ突然変異体。
【請求項９】
２つ以上の修飾が
（Ａ）ＡｌａまたはＶａｌによって置換されたＣｙｓ６２；
（Ｂ）Ａｌａ−Ａｓｎ、Ａｓｎ−Ａｓｎ、Ｓｅｒ−Ｈｉｓ、Ｓｅｒ−Ｓｅｒ、Ｐｒｏ−Ｐｒｏ、Ｐｒｏ−Ｓｅｒ、Ｐｒｏ−Ｔｈｒ、またはＴｈｒ−Ｓｅｒによって置換されたＧｌｎ１１５−Ｇｌｎ１１６；
（Ｄ）Ｖａｌ−Ｈｉｓ／Ｌｅｕ−Ａｒｇ、Ｌｙｓ−Ｔｈｒ／Ｌｅｕ−Ｓｅｒ、Ｇｌｎ−Ｖａｌ／Ｌｅｕ−Ｓｅｒ、またはＭｅｔ−Ｔｈｒ／Ｍｅｔ−Ｖａｌによって置換されたＧｌｙ１３１−Ｇｌｙ１３２／Ｍｅｔ１３４−Ａｒｇ１３５、あるいはＶａｌ−Ｈｉｓ／Ｌｅｕによって置換されたＧｌｙ１３１−Ｇｌｙ１３２／Ｍｅｔ１３４；
（Ｅ）Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ、Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ、Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−、またはＳｅｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−によって置換されたＣｙｓ１５０−Ｓｅｒ１５１−Ｓｅｒ１５２、あるいはＰｈｅ−ＡｓｎまたはＡｒｇ−Ａｓｎによって置換されたＣｙｓ１５０−Ｓｅｒ１５１、あるいはＨｉｓ／Ｔｈｒ、Ｌｅｕ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／ＰｒｏまたはＰｒｏ／Ｌｅｕによって置換されたＣｙｓ１５０／Ｓｅｒ１５２、あるいはＳｅｒまたはＴｈｒによって置換されたＣｙｓ１５０；
（Ｆ）Ｐｈｅ／Ａｒｇ／Ｇｌｕによって置換されたＰｒｏ１４０／Ａｓｎ１５７／Ｓｅｒ１５９、あるいはＭｅｔ／Ｔｒｐ／Ｖａｌによって置換されたＰｒｏ１４０／Ａｓｎ１５７／Ｇｌｙ１６０、あるいはＧｌｙ／Ｇｌｕ−Ａｌａ、Ｇｌｙ／Ａｓｎ−Ｔｒｐ、Ｐｒｏ／Ｇｌｎ−ＣｙｓまたはＧｌｙ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐによって置換されたＡｓｎ１５７／Ｓｅｒ１５９−Ｇｌｙ１６０、あるいはＧｌｙ／Ｇｌｕによって置換されたＡｓｎ１５７／Ｓｅｒ１５９、あるいはＧｌｙまたはＡｒｇによって置換されたＡｓｎ１５７；ならびに
（Ｇ）Ｇｌｙ１８２の後の切断；
そして、場合により、１〜１０個の追加のアミノ酸修飾
より選択される、請求項８記載のＡＧＴ突然変異体。
【請求項１０】
３つ以上の修飾が
（Ａ）ＡｌａまたはＶａｌによって置換されたＣｙｓ６２；
（Ｂ）Ａｌａ−Ａｓｎ、Ａｓｎ−Ａｓｎ、Ｓｅｒ−Ｈｉｓ、Ｓｅｒ−Ｓｅｒ、Ｐｒｏ−Ｐｒｏ、Ｐｒｏ−Ｓｅｒ、Ｐｒｏ−Ｔｈｒ、またはＴｈｒ−Ｓｅｒによって置換されたＧｌｎ１１５−Ｇｌｎ１１６；
（ｃ）Ａｌａによって置換されたＬｙｓ１２５およびＴｈｒ−Ａｌａによって置換されたＡｌａ１２７−Ａｒｇ１２８；
（Ｄ）Ｖａｌ−Ｈｉｓ／Ｌｅｕ−Ａｒｇ、Ｌｙｓ−Ｔｈｒ／Ｌｅｕ−Ｓｅｒ、Ｇｌｎ−Ｖａｌ／Ｌｅｕ−Ｓｅｒ、またはＭｅｔ−Ｔｈｒ／Ｍｅｔ−Ｖａｌによって置換されたＧｌｙ１３１−Ｇｌｙ１３２／Ｍｅｔ１３４−Ａｒｇ１３５、あるいはＶａｌ−Ｈｉｓ／Ｌｅｕによって置換されたＧｌｙ１３１−Ｇｌｙ１３２／Ｍｅｔ１３４；
（Ｅ）Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ、Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ、Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−、またはＳｅｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−によって置換されたＣｙｓ１５０−Ｓｅｒ１５１−Ｓｅｒ１５２、あるいはＰｈｅ−ＡｓｎまたはＡｒｇ−Ａｓｎによって置換されたＣｙｓ１５０−Ｓｅｒ１５１、あるいはＨｉｓ／Ｔｈｒ、Ｌｅｕ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／ＰｒｏまたはＰｒｏ／Ｌｅｕによって置換されたＣｙｓ１５０／Ｓｅｒ１５２、あるいはＳｅｒまたはＴｈｒによって置換されたＣｙｓ１５０；
（Ｆ）Ｐｈｅ／Ａｒｇ／Ｇｌｕによって置換されたＰｒｏ１４０／Ａｓｎ１５７／Ｓｅｒ１５９、あるいはＭｅｔ／Ｔｒｐ／Ｖａｌによって置換されたＰｒｏ１４０／Ａｓｎ１５７／Ｇｌｙ１６０、あるいはＧｌｙ／Ｇｌｕ−Ａｌａ、Ｇｌｙ／Ａｓｎ−Ｔｒｐ、Ｐｒｏ／Ｇｌｎ−ＣｙｓまたはＧｌｙ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐによって置換されたＡｓｎ１５７／Ｓｅｒ１５９−Ｇｌｙ１６０、あるいはＧｌｙ／Ｇｌｕによって置換されたＡｓｎ１５７／Ｓｅｒ１５９、あるいはＧｌｙまたはＡｒｇによって置換されたＡｓｎ１５７；ならびに
（Ｇ）Ｇｌｙ１８２の後の切断；
そして、場合により、１〜１０個の追加のアミノ酸修飾
より選択される、請求項８記載のＡＧＴ突然変異体。
【請求項１１】
２つ以上の修飾が
（Ａ）Ａｌａによって置換されたＣｙｓ６２；
（Ｂ）Ｓｅｒ−Ｈｉｓによって置換されたＧｌｎ１１５−Ｇｌｎ１１６；
（Ｄ）Ｌｙｓ−Ｔｈｒ／Ｌｅｕ−Ｓｅｒによって置換されたＧｌｙ１３１−Ｇｌｙ１３２／Ｍｅｔ１３４−Ａｒｇ１３５、またはＶａｌ−Ｈｉｓ／Ｌｅｕによって置換されたＧｌｙ１３１−Ｇｌｙ１３２／Ｍｅｔ１３４；
（Ｅ）Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ａｓｎによって置換されたＣｙｓ１５０−Ｓｅｒ１５１−Ｓｅｒ１５２、またはＳｅｒもしくはＴｈｒによって置換されたＣｙｓ１５０；
（Ｆ）あるいはＧｌｙ／Ｇｌｕによって置換されたＡｓｎ１５７／Ｓｅｒ１５９；ならびに
（Ｇ）Ｇｌｙ１８２の後の切断；
そして、場合により、１〜１０個の追加のアミノ酸修飾
より選択される、請求項８記載のＡＧＴ突然変異体。
【請求項１２】
３つ以上の修飾が
（Ａ）Ａｌａによって置換されたＣｙｓ６２；
（Ｂ）Ｓｅｒ−Ｈｉｓによって置換されたＧｌｎ１１５−Ｇｌｎ１１６；
（Ｃ）Ａｌａによって置換されたＬｙｓ１２５およびＴｈｒ−Ａｌａによって置換されたＡｌａ１２７−Ａｒｇ１２８；
（Ｄ）Ｌｙｓ−Ｔｈｒ／Ｌｅｕ−Ｓｅｒによって置換されたＧｌｙ１３１−Ｇｌｙ１３２／Ｍｅｔ１３４−Ａｒｇ１３５、またはＶａｌ−Ｈｉｓ／Ｌｅｕによって置換されたＧｌｙ１３１−Ｇｌｙ１３２／Ｍｅｔ１３４；
（Ｅ）Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ａｓｎによって置換されたＣｙｓ１５０−Ｓｅｒ１５１−Ｓｅｒ１５２、またはＳｅｒもしくはＴｈｒによって置換されたＣｙｓ１５０；
（Ｆ）あるいはＧｌｙ／Ｇｌｕによって置換されたＡｓｎ１５７／Ｓｅｒ１５９；ならびに
（Ｇ）Ｇｌｙ１８２の後の切断；
そして、場合により、１〜１０個の追加のアミノ酸修飾
より選択される、請求項８記載のＡＧＴ突然変異体。
【請求項１３】
３つ以上の修飾が
（Ａ）Ａｌａによって置換されたＣｙｓ６２；
（Ｂ）Ｓｅｒ−Ｈｉｓによって置換されたＧｌｎ１１５−Ｇｌｎ１１６；
（Ｃ）Ａｌａによって置換されたＬｙｓ１２５およびＴｈｒ−Ａｌａによって置換されたＡｌａ１２７−Ａｒｇ１２８；
（Ｅ）Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ａｓｎによって置換されたＣｙｓ１５０−Ｓｅｒ１５１−Ｓｅｒ１５２、またはＳｅｒもしくはＴｈｒによって置換されたＣｙｓ１５０；
（Ｆ）あるいはＧｌｙ／Ｇｌｕによって置換されたＡｓｎ１５７／Ｓｅｒ１５９；ならびに
（Ｇ）Ｇｌｙ１８２の後の切断；
そして、場合により、１〜１０個の追加のアミノ酸修飾
より選択される、請求項８記載のＡＧＴ突然変異体。
【請求項１４】
修飾
Ｃｙｓ６２Ａｌａ、Ｌｙｓ１２５Ａｌａ、Ａｌａ１２７Ｔｈｒ、Ａｒｇ１２８Ａｌａ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ、Ｇｌｙ１８２の後の切断；
Ｇｌｙ１３１Ｌｙｓ、Ｇｌｙ１３２Ｔｈｒ、Ｍｅｔ１３４Ｌｅｕ、Ａｒｇ１３５Ｓｅｒ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ；
Ｇｌｎ１１５Ｓｅｒ、Ｇｌｎ１１６Ｈｉｓ、Ｃｙｓ１５０Ａｓｎ、Ｓｅｒ１５１Ｉｌｅ、Ｓｅｒ１５２Ａｓｎ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ；ならびに
Ｃｙｓ６２Ａｌａ、Ｇｌｎ１１５Ｓｅｒ、Ｇｌｎ１１６Ｈｉｓ、Ｌｙｓ１２５Ａｌａ、Ａｌａ１２７Ｔｈｒ、Ａｒｇ１２８Ａｌａ、Ｇｌｙ１３１Ｌｙｓ、Ｇｌｙ１３２Ｔｈｒ、Ｍｅｔ１３４Ｌｅｕ、Ａｒｇ１３５Ｓｅｒ、Ｃｙｓ１５０Ａｓｎ、Ｓｅｒ１５１Ｉｌｅ、Ｓｅｒ１５２Ａｓｎ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ、Ｇｌｙ１８２の後の切断；
を有する突然変異体より選択される、請求項８記載のＡＧＴ突然変異体。
【請求項１５】
修飾Ｃｙｓ６２Ａｌａ、Ｇｌｎ１１５Ｓｅｒ、Ｇｌｎ１１６Ｈｉｓ、Ｌｙｓ１２５Ａｌａ、Ａｌａ１２７Ｔｈｒ、Ａｒｇ１２８Ａｌａ、Ｃｙｓ１５０Ａｓｎ、Ｓｅｒ１５１Ｉｌｅ、Ｓｅｒ１５２Ａｓｎ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ、Ｇｌｙ１８２の後の切断を有する、請求項８記載のＡＧＴ突然変異体。
【請求項１６】
修飾Ｃｙｓ６２Ａｌａ、Ｇｌｎ１１５Ｓｅｒ、Ｇｌｎ１１６Ｈｉｓ、Ｌｙｓ１２５Ａｌａ、Ａｌａ１２７Ｔｈｒ、Ａｒｇ１２８Ａｌａ、Ｇｌｙ１３１Ｌｙｓ、Ｇｌｙ１３２Ｔｈｒ、Ｍｅｔ１３４Ｌｅｕ、Ａｒｇ１３５Ｓｅｒ、Ｃｙｓ１５０Ａｓｎ、Ｓｅｒ１５１Ｉｌｅ、Ｓｅｒ１５２Ａｓｎ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ、Ｇｌｙ１８２の後の切断および場合により１〜１０個の追加のアミノ酸修飾を有する、請求項８記載のＡＧＴ突然変異体。
【請求項１７】
修飾Ｃｙｓ６２Ａｌａ、Ｇｌｎｌ１５Ｓｅｒ、Ｇｌｎ１１６Ｈｉｓ、Ｌｙｓ１２５Ａｌａ、Ａｌａ１２７Ｔｈｒ、Ａｒｇ１２８Ａｌａ、Ｇｌｙ１３１Ｌｙｓ、Ｇｌｙ１３２Ｔｈｒ、Ｍｅｔ１３４Ｌｅｕ、Ａｒｇ１３５Ｓｅｒ、Ｃｙｓ１５０Ａｓｎ、Ｓｅｒ１５１Ｉｌｅ、Ｓｅｒ１５２Ａｓｎ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ、Ｇｌｙ１８２の後の切断および場合により３〜７個の追加のアミノ酸修飾を有する、請求項１６記載のＡＧＴ突然変異体。
【請求項１８】
修飾Ｃｙｓ６２Ａｌａ、Ｌｙｓ１２５Ａｌａ、Ａｌａ１２７Ｔｈｒ、Ａｒｇ１２８Ａｌａ、Ｇｌｙ１３１Ｌｙｓ、Ｇｌｙ１３２Ｔｈｒ、Ｍｅｔ１３４Ｌｅｕ、Ａｒｇ１３５Ｓｅｒ、Ｃｙｓ１５０Ｓｅｒ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ、Ｇｌｙ１８２の後の切断、ならびに場合により
Ｇｌｎ１１５Ｓｅｒ、Ｇｌｎ１１６Ｈｉｓ；
Ｓｅｒ１５０Ａｓｎ、Ｓｅｒ１５１Ｉｌｅ、Ｓｅｒ１５２Ａｓｎ；
Ｌｙｓ８Ｔｈｒ、Ｌｙｓ３２Ｉｌｅ、Ｌｅｕ３３Ｐｈｅ、Ｔｈｒ１２７Ａｌａ、Ｓｅｒ１５０Ａｓｐ、Ｓｅｒ１５１Ｇｌｙ、Ａｌａ１５４Ｔｈｒ；
Ｌｙｓ３２Ｉｌｅ、Ｌｅｕ３３Ｐｈｅ、Ｓｅｒ１５０Ｖａｌ、Ｓｅｒ１５２Ａｒｇ、Ｇｌｙ１５３Ａｓｐ、Ａｌａ１５４Ａｓｐ；
Ｌｙｓ３２Ｉｌｅ、Ｌｅｕ３３Ｐｈｅ、Ｓｅｒ１５０Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５１Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５２Ａｓｐ、Ａｌａ１５４Ａｓｐ；
Ｓｅｒ１５０Ｖａｌ、Ａｌａ１５４Ａｓｐ；
Ｓｅｒ１５０Ｇｌｕ、Ｓｅｒ１５１Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５２Ｇｌｕ、Ａｌａ１５４Ａｒｇ；
Ｌｙｓ８Ｔｈｒ、Ｔｈｒ１２７Ａｌａ、Ａｌａ１５４Ｔｈｒ；
Ｌｙｓ３２Ｉｌｅ、Ｌｅｕ３３Ｐｈｅ；
Ａｌａ１５４Ｔｈｒ；
Ｌｅｕ３３Ｐｈｅ；
Ｓｅｒ１５１Ｇｌｙ；
Ｓｅｒ１５０Ａｓｐ；
Ｔｈｒ１２７Ａｌａ；ならびに
Ｌｙｓ３２Ｉｌｅ、Ｌｅｕ３３Ｐｈｅ、およびＬｅｕ３４の欠損；
より選択される更なる突然変異を有する、請求項１６記載のＡＧＴ突然変異体。
【請求項１９】
修飾Ｃｙｓ６２Ａｌａ、Ｇｌｎ１１５Ｓｅｒ、Ｇｌｎ１１６Ｈｉｓ、Ｌｙｓ１２５Ａｌａ、Ａｌａ１２７Ｔｈｒ、Ａｒｇ１２８Ａｌａ、Ｃｙｓ１５０Ａｓｎ、Ｓｅｒ１５１Ｉｌｅ、Ｓｅｒ１５２Ａｓｎ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ、Ｇｌｙ１８２の後の切断および場合により１〜１０個の追加のアミノ酸修飾を有する、請求項８記載のＡＧＴ突然変異体。
【請求項２０】
修飾Ｃｙｓ６２Ａｌａ、Ｇｌｎ１１５Ｓｅｒ、Ｇｌｎ１１６Ｈｉｓ、Ｌｙｓ１２５Ａｌａ、Ａｌａ１２７Ｔｈｒ、Ａｒｇ１２８Ａｌａ、Ｃｙｓ１５０Ａｓｎ、Ｓｅｒ１５１Ｉｌｅ、Ｓｅｒ１５２Ａｓｎ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ、Ｇｌｙ１８２の後の切断および場合により３〜７個の追加のアミノ酸修飾を有する、請求項１９記載のＡＧＴ突然変異体。
【請求項２１】
修飾Ｃｙｓ６２Ａｌａ、Ｇｌｎ１１５Ｓｅｒ、Ｇｌｎ１１６Ｈｉｓ、Ｌｙｓ１２５Ａｌａ、Ａｌａ１２７Ｔｈｒ、Ａｒｇ１２８Ａｌａ、Ｃｙｓ１５０Ｓｅｒ、Ａｓｎ１５７Ｇ１ｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇ１ｕ、Ｇｌｙ１８２の後の切断、ならびに場合により
Ｇｌｎ１１５Ｓｅｒ、Ｇｌｎ１１６Ｈｉｓ；
Ｓｅｒ１５０Ａｓｎ、Ｓｅｒ１５１Ｉｌｅ、Ｓｅｒ１５２Ａｓｎ；
Ｌｙｓ８Ｔｈｒ、Ｌｙｓ３２Ｉｌｅ、Ｌｅｕ３３Ｐｈｅ、Ｔｈｒ１２７Ａｌａ、Ｓｅｒ１５０Ａｓｐ、Ｓｅｒ１５１Ｇｌｙ、Ａｌａ１５４Ｔｈｒ；
Ｌｙｓ３２Ｉｌｅ、Ｌｅｕ３３Ｐｈｅ、Ｓｅｒ１５０Ｖａｌ、Ｓｅｒ１５２Ａｒｇ、Ｇｌｙ１５３Ａｓｐ、Ａｌａ１５４Ａｓｐ；
Ｌｙｓ３２Ｉｌｅ、Ｌｅｕ３３Ｐｈｅ、Ｓｅｒ１５０Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５１Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５２Ａｓｐ、Ａｌａ１５４Ａｓｐ；
Ｓｅｒ１５０Ｖａｌ、Ａｌａ１５４Ａｓｐ；
Ｓｅｒ１５０Ｇｌｕ、Ｓｅｒ１５１Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５２Ｇｌｕ、Ａｌａ１５４Ａｒｇ；
Ｌｙｓ８Ｔｈｒ、Ｔｈｒ１２７Ａｌａ、Ａｌａ１５４Ｔｈｒ；
Ｌｙｓ３２Ｉｌｅ、Ｌｅｕ３３Ｐｈｅ；
Ａｌａ１５４Ｔｈｒ；
Ｌｅｕ３３Ｐｈｅ；
Ｓｅｒ１５１Ｇｌｙ；
Ｓｅｒ１５０Ａｓｐ；
Ｔｈｒ１２７Ａｌａ；ならびに
Ｌｙｓ３２Ｉｌｅ、Ｌｅｕ３３Ｐｈｅ、およびＬｅｕ３４の欠損；
より選択される更なる突然変異を有する、請求項８記載のＡＧＴ突然変異体。
【請求項２２】
修飾Ｃｙｓ６２Ａｌａ、Ｌｙｓ１２５Ａｌａ、Ａｌａ１２７Ｔｈｒ、Ａｒｇ１２８Ａｌａ、Ｃｙｓ１５０Ｓｅｒ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ、Ｇｌｙ１８２の後の切断を有する、請求項８記載のＡＧＴ突然変異体。
【請求項２３】
修飾Ｃｙｓ６２Ａｌａ、Ｌｙｓ１２５Ａｌａ、Ａｌａ１２７Ｔｈｒ、Ａｒｇ１２８Ａｌａ、Ｇｌｙ１３１Ｌｙｓ、Ｇｌｙ１３２Ｔｈｒ、Ｍｅｔ１３４Ｌｅｕ、Ａｒｇ１３５Ｓｅｒ、Ｃｙｓ１５０Ｓｅｒ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ、Ｇｌｙ１８２の後の切断を有する、請求項８記載のＡＧＴ突然変異体。
【請求項２４】
修飾Ｌｙｓ３２Ｉｌｅ、Ｌｅｕ３３Ｐｈｅ，Ｃｙｓ６２Ａｌａ、Ｌｙｓ１２５Ａｌａ、Ａｌａ１２７Ｔｈｒ、Ａｒｇ１２８Ａｌａ、Ｃｙｓ１５０Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５１Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５２Ａｓｐ、Ａｌａ１５４Ａｓｐ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ、Ｇｌｙ１８２の後の切断、ならびに場合により
Ｇｌｎ１１５Ｓｅｒ、Ｇｌｎ１１６Ｈｉｓ；
Ｇｌｙ１３１Ｌｙｓ、Ｇｌｙ１３２Ｔｈｒ、Ｍｅｔ１３４Ｌｅｕ、Ａｒｇ１３５Ｓｅｒ；および
Ｌｅｕ３４の欠損；
より選択される更なる突然変異を有する、請求項８記載のＡＧＴ突然変異体。
【請求項２５】
修飾Ｌｙｓ３２Ｉｌｅ、Ｌｅｕ３３Ｐｈｅ、Ｃｙｓ６２Ａｌａ、Ｌｙｓ１２５Ａｌａ、Ａｌａ１２７Ｔｈｒ、Ａｒｇ１２８Ａｌａ、Ｃｙｓ１５０Ｖａｌ、Ｓｅｒ１５２Ａｒｇ、Ｇｌｙ１５３Ａｓｐ、Ａｌａ１５４Ａｓｐ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ、Ｇｌｙ１８２の後の切断および場合により
Ｇｌｎ１１５Ｓｅｒ、Ｇｌｎ１１６Ｈｉｓ；
Ｇｌｙ１３１Ｌｙｓ、Ｇｌｙ１３２Ｔｈｒ、Ｍｅｔ１３４Ｌｅｕ、Ａｒｇ１３５Ｓｅｒ；ならびに
Ｌｅｕ３４の欠損；
より選択される更なる突然変異を有する、請求項８記載のＡＧＴ突然変異体。
【請求項２６】
修飾Ｌｙｓ３２Ｉｌｅ、Ｌｅｕ３３Ｐｈｅ、Ｃｙｓ６２Ａｌａ、Ｌｙｓ１２５Ａｌａ、Ａｌａ１２７Ｔｈｒ、Ａｒｇ１２８Ａｌａ、Ｃｙｓ１５０Ａｓｎ、Ｓｅｒ１５１Ｉｌｅ、Ｓｅｒ１５２Ａｓｎ、Ａｌａ１５４Ｔｈｒ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ、Ｇｌｙ１８２の後の切断、ならびに場合により
Ｇｌｎ１１５Ｓｅｒ、Ｇｌｎ１１６Ｈｉｓ；
Ｇｌｙ１３１Ｌｙｓ、Ｇｌｙ１３２Ｔｈｒ、Ｍｅｔ１３４Ｌｅｕ、Ａｒｇ１３５Ｓｅｒ；ならびに
Ｌｅｕ３４の欠損；
より選択される更なる突然変異を有する、請求項８記載のＡＧＴ突然変異体。
【請求項２７】
修飾Ｌｙｓ３２Ｉｌｅ、Ｌｅｕ３３Ｐｈｅ、Ｃｙｓ６２Ａｌａ、Ｌｙｓ１２５Ａｌａ、Ａｌａ１２７Ｔｈｒ、Ａｒｇ１２８Ａｌａ、Ｃｙｓ１５０Ｓｅｒ、Ａｌａ１５４Ｔｈｒ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ、Ｇｌｙ１８２の後の切断、ならびに場合により
Ｇｌｎ１１５Ｓｅｒ、Ｇｌｎ１１６Ｈｉｓ；
Ｇｌｙ１３１Ｌｙｓ、Ｇｌｙ１３２Ｔｈｒ、Ｍｅｔ１３４Ｌｅｕ、Ａｒｇ１３５Ｓｅｒ；および
Ｌｅｕ３４の欠損；
より選択される更なる突然変異を有する、請求項８記載のＡＧＴ突然変異体。
【請求項２８】
修飾Ｃｙｓ６２Ａｌａ、Ｌｙｓ１２５Ａｌａ、Ａｌａ１２７Ｔｈｒ、Ａｒｇ１２８Ａｌａ、Ｃｙｓ１５０Ｖａｌ、Ｓｅｒ１５２Ａｒｇ、Ｇｌｙ１５３Ａｓｐ、Ａｌａ１５４Ａｓｐ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ、Ｇｌｙ１８２の後の切断、ならびに場合により
Ｇｌｎ１１５Ｓｅｒ、Ｇｌｎ１１６Ｈｉｓ；
Ｇｌｙ１３１Ｌｙｓ、Ｇｌｙ１３２Ｔｈｒ、Ｍｅｔ１３４Ｌｅｕ、Ａｒｇ１３５Ｓｅｒ；ならびに
Ｌｅｕ３４の欠損；
を有する、請求項８記載のＡＧＴ突然変異体。
【請求項２９】
修飾Ｃｙｓ６２Ａｌａ、Ｌｙｓ１２５Ａｌａ、Ａｌａ１２７Ｔｈｒ、Ａｒｇ１２８Ａｌａ、Ｃｙｓ１５０Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５１Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５２Ａｓｐ、Ａｌａ１５４Ａｓｐ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ、Ｇｌｙ１８２の後の切断、ならびに場合により
Ｇｌｎ１１５Ｓｅｒ、Ｇｌｎ１１６Ｈｉｓ；
Ｇｌｙ１３１Ｌｙｓ、Ｇｌｙ１３２Ｔｈｒ、Ｍｅｔ１３４Ｌｅｕ、Ａｒｇ１３５Ｓｅｒ；および
Ｌｅｕ３４の欠損；
より選択される更なる突然変異を有する、請求項８記載のＡＧＴ突然変異体。
【請求項３０】
修飾Ｃｙｓ６２Ａｌａ、Ｌｙｓｌ２５Ａｌａ，Ａｌａ１２７Ｔｈｒ、Ａｒｇ１２８Ａｌａ、Ｃｙｓ１５０Ｇｌｕ、Ｓｅｒ１５１Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５２Ｇｌｕ、Ａｌａ１５４Ａｒｇ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ、Ｇｌｙ１８２の後の切断、ならびに場合により
Ｇｌｎ１１５Ｓｅｒ、Ｇｌｎ１１６Ｈｉｓ；
Ｇｌｙ１３１Ｌｙｓ、Ｇｌｙ１３２Ｔｈｒ、Ｍｅｔｌ３４Ｌｅｕ、Ａｒｇｌ３５Ｓｅｒ；および
Ｌｅｕ３４の欠損；
より選択される更なる突然変異を有する、請求項８記載のＡＧＴ突然変異体。
【請求項３１】
対象となるタンパク質を検出および／または操作する方法であって、対象となるタンパク質を、請求項１〜３０のいずれか一項記載のＡＧＴ突然変異体を有する融合タンパク質に組み込み、ＡＧＴ融合タンパク質を、標識を担持する特定のＡＧＴ基質と接触させ、ＡＧＴ融合タンパク質を、標識を認識および／処理するために設計された系において標識を使用して検出し、場合により更に操作する方法。
【請求項３２】
対象となるタンパク質およびＡＧＴ突然変異体のＡＧＴ融合タンパク質、ならびに更なるＡＧＴ融合タンパク質を含有するＡＧＴ融合タンパク質混合物を、ＡＧＴ突然変異体または更なるＡＧＴのいずれかに対して、選択性を有する特定の基質と接触させ、混合物を更なる基質によって処理し、対象となるタンパク質およびＡＧＴ突然変異体のＡＧＴ融合タンパク質を、標識を認識および／処理するために設計された系において標識を使用して検出し、場合により更に操作する、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
混合物と特定の基質との反応終了後に、更なる基質をＡＧＴ融合タンパク質混合物に添加する、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
更なる基質を、ＡＧＴ融合タンパク質混合物に特定の基質と共に添加する、請求項３２記載の方法。
【請求項３５】
標識を認識および／処理するために設計された系において、特定の基質の標識を、更なる基質の標識と相互作用させる、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
特定の基質の標識およびさらなる基質の標識が、蛍光共鳴エネルギー移動対（ＦＲＥＴ）の化合物または近接アッセイのための１つの蛍光物質および１つのクエンチャーである、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
請求項１〜３０のいずれか一項記載のＡＧＴ突然変異体および対象となるタンパク質を含む、ＡＧＴ融合タンパク質。
【請求項１】
Ｏ６−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）突然変異体であって、
野生型ヒトＡＧＴと比較したときに、
（ａ）ＤＮＡ相互作用の低下；
（ｂ）もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化；
（ｃ）各種宿主における溶解性タンパク質としての発現収率の向上および安定性の向上；
（ｄ）酸化条件下での安定性の向上；
（ｅ）基質との反応後の細胞内での安定性の向上；
（ｆ）基質との反応前後の細胞外部での安定性の向上；
（ｇ）試験管内溶解度の向上；
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上；
（ｉ）ＤＮＡベース基質に対する反応性の低下；ならびに
（ｊ）Ｎ９−置換Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性の低下；
より選択される２つ以上の利点を示す、ＡＧＴ突然変異体。
【請求項２】
好都合な特性が
（ｃ）各種宿主における溶解性タンパク質としての発現収率の向上および安定性の向上、ならびに
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上；
あるいは
（ｃ）各種宿主における溶解性タンパク質としての発現収率の向上および安定性の向上、
（ｄ）酸化条件下での安定性の向上、
（ｇ）試験管内溶解度の向上、ならびに
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上；
あるいは
（ｃ）各種宿主における溶解性タンパク質としての発現収率の向上および安定性の向上、
（ｄ）酸化条件下での安定性の向上、
（ｆ）基質との反応前後の細胞外部での安定性の向上、
（ｇ）試験管内溶解度の向上、ならびに
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上；
あるいは
（ａ）ＤＮＡ相互作用の低下、
（ｂ）もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
（ｃ）各種宿主における溶解性タンパク質としての発現収率の向上および安定性の向上、
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上、ならびに
（ｉ）ＤＮＡベース基質に対する反応性の低下；
あるいは
（ａ）ＤＮＡ相互作用の低下、
（ｂ）もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
（ｃ）各種宿主における溶解性タンパク質としての発現収率の向上および安定性の向上、
（ｅ）基質との反応後の細胞内での安定性の向上、
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上、ならびに
（ｉ）ＤＮＡベース基質に対する反応性の低下；
あるいは
（ａ）ＤＮＡ相互作用の低下、
（ｂ）もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
（ｃ）各種宿主における溶解性タンパク質としての発現収率の向上および安定性の向上、
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上、
（ｉ）ＤＮＡベース基質に対する反応性の低下、ならびに
（ｊ）Ｎ９−置換Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性の低下；
あるいは
（ａ）ＤＮＡ相互作用の低下、
（ｂ）もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
（ｃ）各種宿主における溶解性タンパク質としての発現収率の向上および安定性の向上、
（ｅ）基質との反応後の細胞内での安定性の向上、
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上、
（ｉ）ＤＮＡベース基質に対する反応性の低下、ならびに
（ｊ）Ｎ９−置換Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性の低下；
である、請求項１記載のＡＧＴ突然変異体。
【請求項３】
好都合な特性が
（ｃ’）Ｅ．ｃｏｌｉにおける溶解性タンパク質としての発現収率の向上および安定性の向上、ならびに
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上；
あるいは
（ｃ’）Ｅ．ｃｏｌｉにおける溶解性タンパク質としての発現収率の向上および安定性の向上、
（ｄ）酸化条件下での安定性の向上、
（ｇ）試験管内溶解度の向上、ならびに
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上；
あるいは
（ｃ’）Ｅ．ｃｏｌｉにおける溶解性タンパク質としての発現収率の向上および安定性の向上、
（ｄ）酸化条件下での安定性の向上、
（ｆ’）基質との反応後の、細胞外での安定性の向上、
（ｇ）試験管内溶解度の向上、ならびに
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上；
あるいは
（ａ）ＤＮＡ相互作用の低下、
（ｂ）もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
（ｃ’）Ｅ．ｃｏｌｉにおける溶解性タンパク質としての発現収率の向上および安定性の向上、
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上、ならびに
（ｉ）ＤＮＡベース基質に対する反応性の低下；
あるいは
（ａ）ＤＮＡ相互作用の低下、
（ｂ）もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
（ｃ’）Ｅ．ｃｏｌｉにおける溶解性タンパク質としての発現収率の向上および安定性の向上、
（ｅ）基質との反応後の細胞内での安定性の向上、
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上、ならびに
（ｉ）ＤＮＡベース基質に対する反応性の低下；
あるいは
（ａ）ＤＮＡ相互作用の低下、
（ｂ）もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
（ｃ’）Ｅ．ｃｏｌｉにおける溶解性タンパク質としての発現収率の向上および安定性の向上、
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上、
（ｉ）ＤＮＡベース基質に対する反応性の低下、ならびに
（ｊ）Ｎ９−置換Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性の低下；
あるいは
（ａ）ＤＮＡ相互作用の低下、
（ｂ）もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
（ｃ’）Ｅ．ｃｏｌｉにおける溶解性タンパク質としての発現収率の向上および安定性の向上、
（ｅ）基質との反応後の細胞内での安定性の向上、
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上、
（ｉ）ＤＮＡベース基質に対する反応性の低下、ならびに
（ｊ）Ｎ９−置換Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性の低下；
である、請求項１記載のＡＧＴ突然変異体。
【請求項４】
好都合な特性が
（ｃ）各種の宿主における、溶解性タンパク質としての５倍を超える発現収率および安定性の向上、ならびに
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上；
あるいは
（ｃ）各種の宿主における、溶解性タンパク質としての５倍を超える発現収率および安定性の向上、
（ｄ）酸化条件下での５倍を超える安定性、
（ｇ）５倍を超える試験管内溶解度、ならびに
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する５倍を超える反応性；
あるいは
（ｃ）各種の宿主における、溶解性タンパク質としての５倍を超える発現収率および安定性の向上、
（ｄ）酸化条件下での５倍を超える安定性、
（ｆ）基質との反応前および後の、細胞外での４倍を超える安定性、
（ｇ）５倍を超える試験管内溶解度、ならびに
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上；
あるいは
（ａ）２％未満のＤＮＡ結合、
（ｂ）もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
（ｃ）各種の宿主における、溶解性タンパク質としての５倍を超える発現収率および安定性の向上、
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する５倍を超える反応性、ならびに
（ｉ）ＤＮＡベース基質に対する１％未満の反応性；
あるいは
（ａ）２％未満のＤＮＡ結合、
（ｂ）もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
（ｃ）各種の宿主における、溶解性タンパク質としての５倍を超える発現収率および安定性の向上、
（ｅ）基質との反応後の細胞内での３倍を超える安定性、
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する５倍を超える反応性、ならびに
（ｉ）ＤＮＡベース基質に対する１％未満の反応性；
あるいは
（ａ）２％未満のＤＮＡ結合、
（ｂ）もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
（ｃ）各種の宿主における、溶解性タンパク質としての５倍を超える発現収率および安定性の向上、
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する５倍を超える反応性、
（ｉ）ＤＮＡベース基質に対する１％未満の反応性、ならびに
（ｊ）Ｎ９−置換Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する２％未満の反応性；
あるいは
（ａ）２％未満のＤＮＡ結合、
（ｂ）もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
（ｃ）各種の宿主における、溶解性タンパク質としての５倍を超える発現収率および安定性の向上、
（ｅ）基質との反応後の細胞内での３倍を超える安定性、
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する５倍を超える反応性、
（ｉ）ＤＮＡベース基質に対する１％未満の反応性、ならびに
（ｊ）Ｎ９−置換Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する２％未満の反応性；
である、請求項１または２記載のＡＧＴ突然変異体。
【請求項５】
好都合な特性が
（ｃ’）Ｅ．ｃｏｌｉにおける、溶解性タンパク質としての５倍を超える発現収率および安定性の向上、ならびに
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上；
あるいは
（ｃ’）Ｅ．ｃｏｌｉにおける、溶解性タンパク質としての５倍を超える発現収率および安定性の向上、
（ｄ）酸化条件下での５倍を超える安定性、
（ｇ）５倍を超える試験管内溶解度、ならびに
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する５倍を超える反応性；
あるいは
（ｃ’）Ｅ．ｃｏｌｉにおける、溶解性タンパク質としての５倍を超える発現収率および安定性の向上、
（ｄ）酸化条件下での５倍を超える安定性、
（ｆ’）基質との反応後の、細胞外での４倍を超える安定性、
（ｇ）５倍を超える試験管内溶解度、ならびに
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する反応性の向上；
あるいは
（ａ）２％未満のＤＮＡ結合、
（ｂ）もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
（ｃ’）Ｅ．ｃｏｌｉにおける、溶解性タンパク質としての５倍を超える発現収率および安定性の向上、
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する５倍を超える反応性、ならびに
（ｉ）ＤＮＡベース基質に対する１％未満の反応性；
あるいは
（ａ）２％未満のＤＮＡ結合、
（ｂ）もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
（ｃ’）Ｅ．ｃｏｌｉにおける、溶解性タンパク質としての５倍を超える発現収率および安定性の向上、
（ｅ）基質との反応後の細胞内での３倍を超える安定性、
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する５倍を超える反応性、ならびに
（ｉ）ＤＮＡベース基質に対する１％未満の反応性；
あるいは
（ａ）２％未満のＤＮＡ結合、
（ｂ）もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
（ｃ’）Ｅ．ｃｏｌｉにおける、溶解性タンパク質としての５倍を超える発現収率および安定性の向上、
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する５倍を超える反応性、
（ｉ）ＤＮＡベース基質に対する１％未満の反応性、ならびに
（ｊ）Ｎ９−置換Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する２％未満の反応性；
あるいは
（ａ）２％未満のＤＮＡ結合、
（ｂ）もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
（ｃ’）Ｅ．ｃｏｌｉにおける、溶解性タンパク質としての５倍を超える発現収率および安定性の向上、
（ｅ）基質との反応後の細胞内での３倍を超える安定性、
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する５倍を超える反応性、
（ｉ）ＤＮＡベース基質に対する１％未満の反応性、ならびに
（ｊ）Ｎ９−置換Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する２％未満の反応性；
である、請求項１または３記載のＡＧＴ突然変異体。
【請求項６】
好都合な特性が
（ｃ）各種の宿主における、溶解性タンパク質としての１０倍を超える発現収率および安定性の向上、
（ｄ）酸化条件下での１０倍を超える安定性、
（ｆ）基質との反応前および後の、細胞外での６倍を超える安定性、
（ｇ）１０倍を超える試験管内溶解度、
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する１０倍を超える反応性；
あるいは
（ａ）検出不能なＤＮＡ結合、
（ｂ）もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
（ｃ）各種の宿主における、溶解性タンパク質としての１０倍を超える発現収率および安定性の向上、
（ｅ）基質との反応後の細胞内での６倍を超える安定性、
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する１０倍を超える反応性、ならびに
（ｉ）ＤＮＡベース基質に対する検出不能な反応性；
あるいは
（ａ）検出不能なＤＮＡ結合、
（ｂ）もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
（ｃ）各種の宿主における、溶解性タンパク質としての１０倍を超える発現収率および安定性の向上、
（ｅ）基質との反応後の細胞内での６倍を超える安定性、
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する１０倍を超える反応性
（ｉ）ＤＮＡベース基質に対する検出不能な反応性、ならびに
（ｊ）Ｎ９置換Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する検出不能な反応性；
あるいは
（ａ）ＤＮＡ相互作用の低下、
（ｂ）もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
（ｃ）各種の宿主における、溶解性タンパク質としての１０倍を超える発現収率および安定性の向上、
（ｄ）酸化条件下での１０倍を超える安定性、
（ｅ）基質との反応後の細胞内での６倍を超える安定性、
（ｆ）基質との反応前および後の、細胞外での６倍を超える安定性、
（ｇ）１０倍を超える試験管内溶解度、
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する１０倍を超える反応性、ならびに
（ｉ）ＤＮＡベース基質に対する検出不能な反応性；
あるいは
（ａ）ＤＮＡ相互作用の低下、
（ｂ）もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
（ｃ）各種の宿主における、溶解性タンパク質としての１０倍を超える発現収率および安定性の向上、
（ｄ）酸化条件下での１０倍を超える安定性、
（ｅ）基質との反応後の細胞内での６倍を超える安定性、
（ｆ）基質との反応前および後の、細胞外での６倍を超える安定性、
（ｇ）１０倍を超える試験管内溶解度、
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する１０倍を超える反応性、
（ｉ）ＤＮＡベース基質に対する検出不能な反応性、ならびに
（ｊ）Ｎ９−置換Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する検出不能な反応性；
である、請求項１または２記載のＡＧＴ突然変異体。
【請求項７】
好都合な特性が
（ｃ’）Ｅ．ｃｏｌｉにおける、溶解性タンパク質としての１０倍を超える発現収率および安定性の向上、
（ｄ）酸化条件下での１０倍を超える安定性、
（ｆ’）基質との反応後の細胞外での６倍を超える安定性、
（ｇ）１０倍を超える試験管内溶解度、ならびに
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する１０倍を超える反応性；
あるいは
（ａ）検出不能なＤＮＡ結合、
（ｂ）もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
（ｃ’）Ｅ．ｃｏｌｉにおける、溶解性タンパク質としての１０倍を超える発現収率および安定性の向上、
（ｅ）基質との反応後の細胞内での６倍を超える安定性、
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する１０倍を超える反応性、ならびに
（ｉ）ＤＮＡベース基質に対する検出不能な反応性；
あるいは
（ａ）検出不能なＤＮＡ結合、
（ｂ）もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
（ｃ’）Ｅ．ｃｏｌｉにおける、溶解性タンパク質としての１０倍を超える発現収率および安定性の向上、
（ｅ）基質との反応後の細胞内での６倍を超える安定性、
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する１０倍を超える反応性、
（ｉ）ＤＮＡベース基質に対する検出不能な反応性、ならびに
（ｊ）Ｎ９−置換Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する検出不能な反応性；
あるいは
（ａ）ＤＮＡ相互作用の低下、
（ｂ）もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
（ｃ’）Ｅ．ｃｏｌｉにおける、溶解性タンパク質としての１０倍を超える発現収率および安定性の向上、
（ｄ）酸化条件下での１０倍を超える安定性、
（ｅ）基質との反応後の細胞内での６倍を超える安定性、
（ｆ’）基質との反応後の細胞外での６倍を超える安定性、
（ｇ）１０倍を超える試験管内溶解度、
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する１０倍を超える反応性、ならびに
（ｉ）ＤＮＡベース基質に対する検出不能な反応性；
あるいは
（ａ）ＤＮＡ相互作用の低下、
（ｂ）もはや核に限定されない、真核細胞での発現タンパク質の局在化、
（ｃ’）Ｅ．ｃｏｌｉにおける、溶解性タンパク質としての１０倍を超える発現収率および安定性の向上、
（ｄ）酸化条件下での１０倍を超える安定性、
（ｅ）基質との反応後の細胞内での６倍を超える安定性、
（ｆ’）基質との反応後の細胞外での６倍を超える安定性、
（ｇ）１０倍を超える試験管内溶解度、
（ｈ）Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する１０倍を超える反応性、
（ｉ）ＤＮＡベース基質に対する検出不能な反応性、ならびに
（ｊ）Ｎ９−置換Ｏ６−アルキルグアニン基質に対する検出不能な反応性；
である、請求項１または３記載のＡＧＴ突然変異体。
【請求項８】
野生型ヒトＡＧＴの１〜２５個のアミノ酸が、他のアミノ酸によって置換され、場合により連続鎖からの１〜５個のアミノ酸が１、２、または３つの位置で欠損または付加され、および／またはＮ末端の１〜４個のアミノ酸またはＣ末端の１〜４０個のアミノ酸が欠損している、請求項１〜７のいずれか一項記載のＡＧＴ突然変異体。
【請求項９】
２つ以上の修飾が
（Ａ）ＡｌａまたはＶａｌによって置換されたＣｙｓ６２；
（Ｂ）Ａｌａ−Ａｓｎ、Ａｓｎ−Ａｓｎ、Ｓｅｒ−Ｈｉｓ、Ｓｅｒ−Ｓｅｒ、Ｐｒｏ−Ｐｒｏ、Ｐｒｏ−Ｓｅｒ、Ｐｒｏ−Ｔｈｒ、またはＴｈｒ−Ｓｅｒによって置換されたＧｌｎ１１５−Ｇｌｎ１１６；
（Ｄ）Ｖａｌ−Ｈｉｓ／Ｌｅｕ−Ａｒｇ、Ｌｙｓ−Ｔｈｒ／Ｌｅｕ−Ｓｅｒ、Ｇｌｎ−Ｖａｌ／Ｌｅｕ−Ｓｅｒ、またはＭｅｔ−Ｔｈｒ／Ｍｅｔ−Ｖａｌによって置換されたＧｌｙ１３１−Ｇｌｙ１３２／Ｍｅｔ１３４−Ａｒｇ１３５、あるいはＶａｌ−Ｈｉｓ／Ｌｅｕによって置換されたＧｌｙ１３１−Ｇｌｙ１３２／Ｍｅｔ１３４；
（Ｅ）Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ、Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ、Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−、またはＳｅｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−によって置換されたＣｙｓ１５０−Ｓｅｒ１５１−Ｓｅｒ１５２、あるいはＰｈｅ−ＡｓｎまたはＡｒｇ−Ａｓｎによって置換されたＣｙｓ１５０−Ｓｅｒ１５１、あるいはＨｉｓ／Ｔｈｒ、Ｌｅｕ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／ＰｒｏまたはＰｒｏ／Ｌｅｕによって置換されたＣｙｓ１５０／Ｓｅｒ１５２、あるいはＳｅｒまたはＴｈｒによって置換されたＣｙｓ１５０；
（Ｆ）Ｐｈｅ／Ａｒｇ／Ｇｌｕによって置換されたＰｒｏ１４０／Ａｓｎ１５７／Ｓｅｒ１５９、あるいはＭｅｔ／Ｔｒｐ／Ｖａｌによって置換されたＰｒｏ１４０／Ａｓｎ１５７／Ｇｌｙ１６０、あるいはＧｌｙ／Ｇｌｕ−Ａｌａ、Ｇｌｙ／Ａｓｎ−Ｔｒｐ、Ｐｒｏ／Ｇｌｎ−ＣｙｓまたはＧｌｙ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐによって置換されたＡｓｎ１５７／Ｓｅｒ１５９−Ｇｌｙ１６０、あるいはＧｌｙ／Ｇｌｕによって置換されたＡｓｎ１５７／Ｓｅｒ１５９、あるいはＧｌｙまたはＡｒｇによって置換されたＡｓｎ１５７；ならびに
（Ｇ）Ｇｌｙ１８２の後の切断；
そして、場合により、１〜１０個の追加のアミノ酸修飾
より選択される、請求項８記載のＡＧＴ突然変異体。
【請求項１０】
３つ以上の修飾が
（Ａ）ＡｌａまたはＶａｌによって置換されたＣｙｓ６２；
（Ｂ）Ａｌａ−Ａｓｎ、Ａｓｎ−Ａｓｎ、Ｓｅｒ−Ｈｉｓ、Ｓｅｒ−Ｓｅｒ、Ｐｒｏ−Ｐｒｏ、Ｐｒｏ−Ｓｅｒ、Ｐｒｏ−Ｔｈｒ、またはＴｈｒ−Ｓｅｒによって置換されたＧｌｎ１１５−Ｇｌｎ１１６；
（ｃ）Ａｌａによって置換されたＬｙｓ１２５およびＴｈｒ−Ａｌａによって置換されたＡｌａ１２７−Ａｒｇ１２８；
（Ｄ）Ｖａｌ−Ｈｉｓ／Ｌｅｕ−Ａｒｇ、Ｌｙｓ−Ｔｈｒ／Ｌｅｕ−Ｓｅｒ、Ｇｌｎ−Ｖａｌ／Ｌｅｕ−Ｓｅｒ、またはＭｅｔ−Ｔｈｒ／Ｍｅｔ−Ｖａｌによって置換されたＧｌｙ１３１−Ｇｌｙ１３２／Ｍｅｔ１３４−Ａｒｇ１３５、あるいはＶａｌ−Ｈｉｓ／Ｌｅｕによって置換されたＧｌｙ１３１−Ｇｌｙ１３２／Ｍｅｔ１３４；
（Ｅ）Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ、Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ、Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−、またはＳｅｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−によって置換されたＣｙｓ１５０−Ｓｅｒ１５１−Ｓｅｒ１５２、あるいはＰｈｅ−ＡｓｎまたはＡｒｇ−Ａｓｎによって置換されたＣｙｓ１５０−Ｓｅｒ１５１、あるいはＨｉｓ／Ｔｈｒ、Ｌｅｕ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／ＰｒｏまたはＰｒｏ／Ｌｅｕによって置換されたＣｙｓ１５０／Ｓｅｒ１５２、あるいはＳｅｒまたはＴｈｒによって置換されたＣｙｓ１５０；
（Ｆ）Ｐｈｅ／Ａｒｇ／Ｇｌｕによって置換されたＰｒｏ１４０／Ａｓｎ１５７／Ｓｅｒ１５９、あるいはＭｅｔ／Ｔｒｐ／Ｖａｌによって置換されたＰｒｏ１４０／Ａｓｎ１５７／Ｇｌｙ１６０、あるいはＧｌｙ／Ｇｌｕ−Ａｌａ、Ｇｌｙ／Ａｓｎ−Ｔｒｐ、Ｐｒｏ／Ｇｌｎ−ＣｙｓまたはＧｌｙ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐによって置換されたＡｓｎ１５７／Ｓｅｒ１５９−Ｇｌｙ１６０、あるいはＧｌｙ／Ｇｌｕによって置換されたＡｓｎ１５７／Ｓｅｒ１５９、あるいはＧｌｙまたはＡｒｇによって置換されたＡｓｎ１５７；ならびに
（Ｇ）Ｇｌｙ１８２の後の切断；
そして、場合により、１〜１０個の追加のアミノ酸修飾
より選択される、請求項８記載のＡＧＴ突然変異体。
【請求項１１】
２つ以上の修飾が
（Ａ）Ａｌａによって置換されたＣｙｓ６２；
（Ｂ）Ｓｅｒ−Ｈｉｓによって置換されたＧｌｎ１１５−Ｇｌｎ１１６；
（Ｄ）Ｌｙｓ−Ｔｈｒ／Ｌｅｕ−Ｓｅｒによって置換されたＧｌｙ１３１−Ｇｌｙ１３２／Ｍｅｔ１３４−Ａｒｇ１３５、またはＶａｌ−Ｈｉｓ／Ｌｅｕによって置換されたＧｌｙ１３１−Ｇｌｙ１３２／Ｍｅｔ１３４；
（Ｅ）Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ａｓｎによって置換されたＣｙｓ１５０−Ｓｅｒ１５１−Ｓｅｒ１５２、またはＳｅｒもしくはＴｈｒによって置換されたＣｙｓ１５０；
（Ｆ）あるいはＧｌｙ／Ｇｌｕによって置換されたＡｓｎ１５７／Ｓｅｒ１５９；ならびに
（Ｇ）Ｇｌｙ１８２の後の切断；
そして、場合により、１〜１０個の追加のアミノ酸修飾
より選択される、請求項８記載のＡＧＴ突然変異体。
【請求項１２】
３つ以上の修飾が
（Ａ）Ａｌａによって置換されたＣｙｓ６２；
（Ｂ）Ｓｅｒ−Ｈｉｓによって置換されたＧｌｎ１１５−Ｇｌｎ１１６；
（Ｃ）Ａｌａによって置換されたＬｙｓ１２５およびＴｈｒ−Ａｌａによって置換されたＡｌａ１２７−Ａｒｇ１２８；
（Ｄ）Ｌｙｓ−Ｔｈｒ／Ｌｅｕ−Ｓｅｒによって置換されたＧｌｙ１３１−Ｇｌｙ１３２／Ｍｅｔ１３４−Ａｒｇ１３５、またはＶａｌ−Ｈｉｓ／Ｌｅｕによって置換されたＧｌｙ１３１−Ｇｌｙ１３２／Ｍｅｔ１３４；
（Ｅ）Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ａｓｎによって置換されたＣｙｓ１５０−Ｓｅｒ１５１−Ｓｅｒ１５２、またはＳｅｒもしくはＴｈｒによって置換されたＣｙｓ１５０；
（Ｆ）あるいはＧｌｙ／Ｇｌｕによって置換されたＡｓｎ１５７／Ｓｅｒ１５９；ならびに
（Ｇ）Ｇｌｙ１８２の後の切断；
そして、場合により、１〜１０個の追加のアミノ酸修飾
より選択される、請求項８記載のＡＧＴ突然変異体。
【請求項１３】
３つ以上の修飾が
（Ａ）Ａｌａによって置換されたＣｙｓ６２；
（Ｂ）Ｓｅｒ−Ｈｉｓによって置換されたＧｌｎ１１５−Ｇｌｎ１１６；
（Ｃ）Ａｌａによって置換されたＬｙｓ１２５およびＴｈｒ−Ａｌａによって置換されたＡｌａ１２７−Ａｒｇ１２８；
（Ｅ）Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ａｓｎによって置換されたＣｙｓ１５０−Ｓｅｒ１５１−Ｓｅｒ１５２、またはＳｅｒもしくはＴｈｒによって置換されたＣｙｓ１５０；
（Ｆ）あるいはＧｌｙ／Ｇｌｕによって置換されたＡｓｎ１５７／Ｓｅｒ１５９；ならびに
（Ｇ）Ｇｌｙ１８２の後の切断；
そして、場合により、１〜１０個の追加のアミノ酸修飾
より選択される、請求項８記載のＡＧＴ突然変異体。
【請求項１４】
修飾
Ｃｙｓ６２Ａｌａ、Ｌｙｓ１２５Ａｌａ、Ａｌａ１２７Ｔｈｒ、Ａｒｇ１２８Ａｌａ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ、Ｇｌｙ１８２の後の切断；
Ｇｌｙ１３１Ｌｙｓ、Ｇｌｙ１３２Ｔｈｒ、Ｍｅｔ１３４Ｌｅｕ、Ａｒｇ１３５Ｓｅｒ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ；
Ｇｌｎ１１５Ｓｅｒ、Ｇｌｎ１１６Ｈｉｓ、Ｃｙｓ１５０Ａｓｎ、Ｓｅｒ１５１Ｉｌｅ、Ｓｅｒ１５２Ａｓｎ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ；ならびに
Ｃｙｓ６２Ａｌａ、Ｇｌｎ１１５Ｓｅｒ、Ｇｌｎ１１６Ｈｉｓ、Ｌｙｓ１２５Ａｌａ、Ａｌａ１２７Ｔｈｒ、Ａｒｇ１２８Ａｌａ、Ｇｌｙ１３１Ｌｙｓ、Ｇｌｙ１３２Ｔｈｒ、Ｍｅｔ１３４Ｌｅｕ、Ａｒｇ１３５Ｓｅｒ、Ｃｙｓ１５０Ａｓｎ、Ｓｅｒ１５１Ｉｌｅ、Ｓｅｒ１５２Ａｓｎ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ、Ｇｌｙ１８２の後の切断；
を有する突然変異体より選択される、請求項８記載のＡＧＴ突然変異体。
【請求項１５】
修飾Ｃｙｓ６２Ａｌａ、Ｇｌｎ１１５Ｓｅｒ、Ｇｌｎ１１６Ｈｉｓ、Ｌｙｓ１２５Ａｌａ、Ａｌａ１２７Ｔｈｒ、Ａｒｇ１２８Ａｌａ、Ｃｙｓ１５０Ａｓｎ、Ｓｅｒ１５１Ｉｌｅ、Ｓｅｒ１５２Ａｓｎ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ、Ｇｌｙ１８２の後の切断を有する、請求項８記載のＡＧＴ突然変異体。
【請求項１６】
修飾Ｃｙｓ６２Ａｌａ、Ｇｌｎ１１５Ｓｅｒ、Ｇｌｎ１１６Ｈｉｓ、Ｌｙｓ１２５Ａｌａ、Ａｌａ１２７Ｔｈｒ、Ａｒｇ１２８Ａｌａ、Ｇｌｙ１３１Ｌｙｓ、Ｇｌｙ１３２Ｔｈｒ、Ｍｅｔ１３４Ｌｅｕ、Ａｒｇ１３５Ｓｅｒ、Ｃｙｓ１５０Ａｓｎ、Ｓｅｒ１５１Ｉｌｅ、Ｓｅｒ１５２Ａｓｎ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ、Ｇｌｙ１８２の後の切断および場合により１〜１０個の追加のアミノ酸修飾を有する、請求項８記載のＡＧＴ突然変異体。
【請求項１７】
修飾Ｃｙｓ６２Ａｌａ、Ｇｌｎｌ１５Ｓｅｒ、Ｇｌｎ１１６Ｈｉｓ、Ｌｙｓ１２５Ａｌａ、Ａｌａ１２７Ｔｈｒ、Ａｒｇ１２８Ａｌａ、Ｇｌｙ１３１Ｌｙｓ、Ｇｌｙ１３２Ｔｈｒ、Ｍｅｔ１３４Ｌｅｕ、Ａｒｇ１３５Ｓｅｒ、Ｃｙｓ１５０Ａｓｎ、Ｓｅｒ１５１Ｉｌｅ、Ｓｅｒ１５２Ａｓｎ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ、Ｇｌｙ１８２の後の切断および場合により３〜７個の追加のアミノ酸修飾を有する、請求項１６記載のＡＧＴ突然変異体。
【請求項１８】
修飾Ｃｙｓ６２Ａｌａ、Ｌｙｓ１２５Ａｌａ、Ａｌａ１２７Ｔｈｒ、Ａｒｇ１２８Ａｌａ、Ｇｌｙ１３１Ｌｙｓ、Ｇｌｙ１３２Ｔｈｒ、Ｍｅｔ１３４Ｌｅｕ、Ａｒｇ１３５Ｓｅｒ、Ｃｙｓ１５０Ｓｅｒ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ、Ｇｌｙ１８２の後の切断、ならびに場合により
Ｇｌｎ１１５Ｓｅｒ、Ｇｌｎ１１６Ｈｉｓ；
Ｓｅｒ１５０Ａｓｎ、Ｓｅｒ１５１Ｉｌｅ、Ｓｅｒ１５２Ａｓｎ；
Ｌｙｓ８Ｔｈｒ、Ｌｙｓ３２Ｉｌｅ、Ｌｅｕ３３Ｐｈｅ、Ｔｈｒ１２７Ａｌａ、Ｓｅｒ１５０Ａｓｐ、Ｓｅｒ１５１Ｇｌｙ、Ａｌａ１５４Ｔｈｒ；
Ｌｙｓ３２Ｉｌｅ、Ｌｅｕ３３Ｐｈｅ、Ｓｅｒ１５０Ｖａｌ、Ｓｅｒ１５２Ａｒｇ、Ｇｌｙ１５３Ａｓｐ、Ａｌａ１５４Ａｓｐ；
Ｌｙｓ３２Ｉｌｅ、Ｌｅｕ３３Ｐｈｅ、Ｓｅｒ１５０Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５１Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５２Ａｓｐ、Ａｌａ１５４Ａｓｐ；
Ｓｅｒ１５０Ｖａｌ、Ａｌａ１５４Ａｓｐ；
Ｓｅｒ１５０Ｇｌｕ、Ｓｅｒ１５１Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５２Ｇｌｕ、Ａｌａ１５４Ａｒｇ；
Ｌｙｓ８Ｔｈｒ、Ｔｈｒ１２７Ａｌａ、Ａｌａ１５４Ｔｈｒ；
Ｌｙｓ３２Ｉｌｅ、Ｌｅｕ３３Ｐｈｅ；
Ａｌａ１５４Ｔｈｒ；
Ｌｅｕ３３Ｐｈｅ；
Ｓｅｒ１５１Ｇｌｙ；
Ｓｅｒ１５０Ａｓｐ；
Ｔｈｒ１２７Ａｌａ；ならびに
Ｌｙｓ３２Ｉｌｅ、Ｌｅｕ３３Ｐｈｅ、およびＬｅｕ３４の欠損；
より選択される更なる突然変異を有する、請求項１６記載のＡＧＴ突然変異体。
【請求項１９】
修飾Ｃｙｓ６２Ａｌａ、Ｇｌｎ１１５Ｓｅｒ、Ｇｌｎ１１６Ｈｉｓ、Ｌｙｓ１２５Ａｌａ、Ａｌａ１２７Ｔｈｒ、Ａｒｇ１２８Ａｌａ、Ｃｙｓ１５０Ａｓｎ、Ｓｅｒ１５１Ｉｌｅ、Ｓｅｒ１５２Ａｓｎ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ、Ｇｌｙ１８２の後の切断および場合により１〜１０個の追加のアミノ酸修飾を有する、請求項８記載のＡＧＴ突然変異体。
【請求項２０】
修飾Ｃｙｓ６２Ａｌａ、Ｇｌｎ１１５Ｓｅｒ、Ｇｌｎ１１６Ｈｉｓ、Ｌｙｓ１２５Ａｌａ、Ａｌａ１２７Ｔｈｒ、Ａｒｇ１２８Ａｌａ、Ｃｙｓ１５０Ａｓｎ、Ｓｅｒ１５１Ｉｌｅ、Ｓｅｒ１５２Ａｓｎ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ、Ｇｌｙ１８２の後の切断および場合により３〜７個の追加のアミノ酸修飾を有する、請求項１９記載のＡＧＴ突然変異体。
【請求項２１】
修飾Ｃｙｓ６２Ａｌａ、Ｇｌｎ１１５Ｓｅｒ、Ｇｌｎ１１６Ｈｉｓ、Ｌｙｓ１２５Ａｌａ、Ａｌａ１２７Ｔｈｒ、Ａｒｇ１２８Ａｌａ、Ｃｙｓ１５０Ｓｅｒ、Ａｓｎ１５７Ｇ１ｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇ１ｕ、Ｇｌｙ１８２の後の切断、ならびに場合により
Ｇｌｎ１１５Ｓｅｒ、Ｇｌｎ１１６Ｈｉｓ；
Ｓｅｒ１５０Ａｓｎ、Ｓｅｒ１５１Ｉｌｅ、Ｓｅｒ１５２Ａｓｎ；
Ｌｙｓ８Ｔｈｒ、Ｌｙｓ３２Ｉｌｅ、Ｌｅｕ３３Ｐｈｅ、Ｔｈｒ１２７Ａｌａ、Ｓｅｒ１５０Ａｓｐ、Ｓｅｒ１５１Ｇｌｙ、Ａｌａ１５４Ｔｈｒ；
Ｌｙｓ３２Ｉｌｅ、Ｌｅｕ３３Ｐｈｅ、Ｓｅｒ１５０Ｖａｌ、Ｓｅｒ１５２Ａｒｇ、Ｇｌｙ１５３Ａｓｐ、Ａｌａ１５４Ａｓｐ；
Ｌｙｓ３２Ｉｌｅ、Ｌｅｕ３３Ｐｈｅ、Ｓｅｒ１５０Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５１Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５２Ａｓｐ、Ａｌａ１５４Ａｓｐ；
Ｓｅｒ１５０Ｖａｌ、Ａｌａ１５４Ａｓｐ；
Ｓｅｒ１５０Ｇｌｕ、Ｓｅｒ１５１Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５２Ｇｌｕ、Ａｌａ１５４Ａｒｇ；
Ｌｙｓ８Ｔｈｒ、Ｔｈｒ１２７Ａｌａ、Ａｌａ１５４Ｔｈｒ；
Ｌｙｓ３２Ｉｌｅ、Ｌｅｕ３３Ｐｈｅ；
Ａｌａ１５４Ｔｈｒ；
Ｌｅｕ３３Ｐｈｅ；
Ｓｅｒ１５１Ｇｌｙ；
Ｓｅｒ１５０Ａｓｐ；
Ｔｈｒ１２７Ａｌａ；ならびに
Ｌｙｓ３２Ｉｌｅ、Ｌｅｕ３３Ｐｈｅ、およびＬｅｕ３４の欠損；
より選択される更なる突然変異を有する、請求項８記載のＡＧＴ突然変異体。
【請求項２２】
修飾Ｃｙｓ６２Ａｌａ、Ｌｙｓ１２５Ａｌａ、Ａｌａ１２７Ｔｈｒ、Ａｒｇ１２８Ａｌａ、Ｃｙｓ１５０Ｓｅｒ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ、Ｇｌｙ１８２の後の切断を有する、請求項８記載のＡＧＴ突然変異体。
【請求項２３】
修飾Ｃｙｓ６２Ａｌａ、Ｌｙｓ１２５Ａｌａ、Ａｌａ１２７Ｔｈｒ、Ａｒｇ１２８Ａｌａ、Ｇｌｙ１３１Ｌｙｓ、Ｇｌｙ１３２Ｔｈｒ、Ｍｅｔ１３４Ｌｅｕ、Ａｒｇ１３５Ｓｅｒ、Ｃｙｓ１５０Ｓｅｒ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ、Ｇｌｙ１８２の後の切断を有する、請求項８記載のＡＧＴ突然変異体。
【請求項２４】
修飾Ｌｙｓ３２Ｉｌｅ、Ｌｅｕ３３Ｐｈｅ，Ｃｙｓ６２Ａｌａ、Ｌｙｓ１２５Ａｌａ、Ａｌａ１２７Ｔｈｒ、Ａｒｇ１２８Ａｌａ、Ｃｙｓ１５０Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５１Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５２Ａｓｐ、Ａｌａ１５４Ａｓｐ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ、Ｇｌｙ１８２の後の切断、ならびに場合により
Ｇｌｎ１１５Ｓｅｒ、Ｇｌｎ１１６Ｈｉｓ；
Ｇｌｙ１３１Ｌｙｓ、Ｇｌｙ１３２Ｔｈｒ、Ｍｅｔ１３４Ｌｅｕ、Ａｒｇ１３５Ｓｅｒ；および
Ｌｅｕ３４の欠損；
より選択される更なる突然変異を有する、請求項８記載のＡＧＴ突然変異体。
【請求項２５】
修飾Ｌｙｓ３２Ｉｌｅ、Ｌｅｕ３３Ｐｈｅ、Ｃｙｓ６２Ａｌａ、Ｌｙｓ１２５Ａｌａ、Ａｌａ１２７Ｔｈｒ、Ａｒｇ１２８Ａｌａ、Ｃｙｓ１５０Ｖａｌ、Ｓｅｒ１５２Ａｒｇ、Ｇｌｙ１５３Ａｓｐ、Ａｌａ１５４Ａｓｐ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ、Ｇｌｙ１８２の後の切断および場合により
Ｇｌｎ１１５Ｓｅｒ、Ｇｌｎ１１６Ｈｉｓ；
Ｇｌｙ１３１Ｌｙｓ、Ｇｌｙ１３２Ｔｈｒ、Ｍｅｔ１３４Ｌｅｕ、Ａｒｇ１３５Ｓｅｒ；ならびに
Ｌｅｕ３４の欠損；
より選択される更なる突然変異を有する、請求項８記載のＡＧＴ突然変異体。
【請求項２６】
修飾Ｌｙｓ３２Ｉｌｅ、Ｌｅｕ３３Ｐｈｅ、Ｃｙｓ６２Ａｌａ、Ｌｙｓ１２５Ａｌａ、Ａｌａ１２７Ｔｈｒ、Ａｒｇ１２８Ａｌａ、Ｃｙｓ１５０Ａｓｎ、Ｓｅｒ１５１Ｉｌｅ、Ｓｅｒ１５２Ａｓｎ、Ａｌａ１５４Ｔｈｒ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ、Ｇｌｙ１８２の後の切断、ならびに場合により
Ｇｌｎ１１５Ｓｅｒ、Ｇｌｎ１１６Ｈｉｓ；
Ｇｌｙ１３１Ｌｙｓ、Ｇｌｙ１３２Ｔｈｒ、Ｍｅｔ１３４Ｌｅｕ、Ａｒｇ１３５Ｓｅｒ；ならびに
Ｌｅｕ３４の欠損；
より選択される更なる突然変異を有する、請求項８記載のＡＧＴ突然変異体。
【請求項２７】
修飾Ｌｙｓ３２Ｉｌｅ、Ｌｅｕ３３Ｐｈｅ、Ｃｙｓ６２Ａｌａ、Ｌｙｓ１２５Ａｌａ、Ａｌａ１２７Ｔｈｒ、Ａｒｇ１２８Ａｌａ、Ｃｙｓ１５０Ｓｅｒ、Ａｌａ１５４Ｔｈｒ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ、Ｇｌｙ１８２の後の切断、ならびに場合により
Ｇｌｎ１１５Ｓｅｒ、Ｇｌｎ１１６Ｈｉｓ；
Ｇｌｙ１３１Ｌｙｓ、Ｇｌｙ１３２Ｔｈｒ、Ｍｅｔ１３４Ｌｅｕ、Ａｒｇ１３５Ｓｅｒ；および
Ｌｅｕ３４の欠損；
より選択される更なる突然変異を有する、請求項８記載のＡＧＴ突然変異体。
【請求項２８】
修飾Ｃｙｓ６２Ａｌａ、Ｌｙｓ１２５Ａｌａ、Ａｌａ１２７Ｔｈｒ、Ａｒｇ１２８Ａｌａ、Ｃｙｓ１５０Ｖａｌ、Ｓｅｒ１５２Ａｒｇ、Ｇｌｙ１５３Ａｓｐ、Ａｌａ１５４Ａｓｐ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ、Ｇｌｙ１８２の後の切断、ならびに場合により
Ｇｌｎ１１５Ｓｅｒ、Ｇｌｎ１１６Ｈｉｓ；
Ｇｌｙ１３１Ｌｙｓ、Ｇｌｙ１３２Ｔｈｒ、Ｍｅｔ１３４Ｌｅｕ、Ａｒｇ１３５Ｓｅｒ；ならびに
Ｌｅｕ３４の欠損；
を有する、請求項８記載のＡＧＴ突然変異体。
【請求項２９】
修飾Ｃｙｓ６２Ａｌａ、Ｌｙｓ１２５Ａｌａ、Ａｌａ１２７Ｔｈｒ、Ａｒｇ１２８Ａｌａ、Ｃｙｓ１５０Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５１Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５２Ａｓｐ、Ａｌａ１５４Ａｓｐ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ、Ｇｌｙ１８２の後の切断、ならびに場合により
Ｇｌｎ１１５Ｓｅｒ、Ｇｌｎ１１６Ｈｉｓ；
Ｇｌｙ１３１Ｌｙｓ、Ｇｌｙ１３２Ｔｈｒ、Ｍｅｔ１３４Ｌｅｕ、Ａｒｇ１３５Ｓｅｒ；および
Ｌｅｕ３４の欠損；
より選択される更なる突然変異を有する、請求項８記載のＡＧＴ突然変異体。
【請求項３０】
修飾Ｃｙｓ６２Ａｌａ、Ｌｙｓｌ２５Ａｌａ，Ａｌａ１２７Ｔｈｒ、Ａｒｇ１２８Ａｌａ、Ｃｙｓ１５０Ｇｌｕ、Ｓｅｒ１５１Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５２Ｇｌｕ、Ａｌａ１５４Ａｒｇ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ、Ｇｌｙ１８２の後の切断、ならびに場合により
Ｇｌｎ１１５Ｓｅｒ、Ｇｌｎ１１６Ｈｉｓ；
Ｇｌｙ１３１Ｌｙｓ、Ｇｌｙ１３２Ｔｈｒ、Ｍｅｔｌ３４Ｌｅｕ、Ａｒｇｌ３５Ｓｅｒ；および
Ｌｅｕ３４の欠損；
より選択される更なる突然変異を有する、請求項８記載のＡＧＴ突然変異体。
【請求項３１】
対象となるタンパク質を検出および／または操作する方法であって、対象となるタンパク質を、請求項１〜３０のいずれか一項記載のＡＧＴ突然変異体を有する融合タンパク質に組み込み、ＡＧＴ融合タンパク質を、標識を担持する特定のＡＧＴ基質と接触させ、ＡＧＴ融合タンパク質を、標識を認識および／処理するために設計された系において標識を使用して検出し、場合により更に操作する方法。
【請求項３２】
対象となるタンパク質およびＡＧＴ突然変異体のＡＧＴ融合タンパク質、ならびに更なるＡＧＴ融合タンパク質を含有するＡＧＴ融合タンパク質混合物を、ＡＧＴ突然変異体または更なるＡＧＴのいずれかに対して、選択性を有する特定の基質と接触させ、混合物を更なる基質によって処理し、対象となるタンパク質およびＡＧＴ突然変異体のＡＧＴ融合タンパク質を、標識を認識および／処理するために設計された系において標識を使用して検出し、場合により更に操作する、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
混合物と特定の基質との反応終了後に、更なる基質をＡＧＴ融合タンパク質混合物に添加する、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
更なる基質を、ＡＧＴ融合タンパク質混合物に特定の基質と共に添加する、請求項３２記載の方法。
【請求項３５】
標識を認識および／処理するために設計された系において、特定の基質の標識を、更なる基質の標識と相互作用させる、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
特定の基質の標識およびさらなる基質の標識が、蛍光共鳴エネルギー移動対（ＦＲＥＴ）の化合物または近接アッセイのための１つの蛍光物質および１つのクエンチャーである、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
請求項１〜３０のいずれか一項記載のＡＧＴ突然変異体および対象となるタンパク質を含む、ＡＧＴ融合タンパク質。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２００７−５２５９８８（Ｐ２００７−５２５９８８Ａ）
【公表日】平成１９年９月１３日（２００７．９．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５０１２８４（Ｐ２００７−５０１２８４）
【出願日】平成１７年３月１日（２００５．３．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０５０８９９
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０８５４３１
【国際公開日】平成１７年９月１５日（２００５．９．１５）
【出願人】（５０３１８３２９３）ウペエフエル・エコル・ポリテクニック・フェデラル・ドゥ・ローザンヌ (11)
【氏名又は名称原語表記】ＥＰＦＬ ＥＣＯＬＥ ＰＯＬＹＴＥＣＨＮＩＱＵＥＦＥＤＥＲＡＬＥ ＤＥ ＬＡＵＳＡＮＮＥ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年９月１３日（２００７．９．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年３月１日（２００５．３．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０５０８９９
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０８５４３１
【国際公開日】平成１７年９月１５日（２００５．９．１５）
【出願人】（５０３１８３２９３）ウペエフエル・エコル・ポリテクニック・フェデラル・ドゥ・ローザンヌ (11)
【氏名又は名称原語表記】ＥＰＦＬ ＥＣＯＬＥ ＰＯＬＹＴＥＣＨＮＩＱＵＥＦＥＤＥＲＡＬＥ ＤＥ ＬＡＵＳＡＮＮＥ
【Ｆターム（参考）】
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