Ｏ６−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）の使用方法
【課題】Ｏ6−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）を用いた、標識を基質からＡＧＴを含む融合タンパク質に移転する方法の提供。
【解決手段】新たな物理学的または化学的特性を融合タンパク質に導入する分子を融合タンパク質に結合させることによって、インビトロとインビボとの双方での融合タンパク質の検出および／または操作を可能にする。そのような分子の例は、とりわけ、分光学的プローブもしくはリポーター分子、親和性タグ、反応性ラジカルを発生できる分子、架橋結合剤、タンパク質−タンパク質相互作用を仲介するリガンド、または融合タンパク質の固定化に適した分子である。
【解決手段】新たな物理学的または化学的特性を融合タンパク質に導入する分子を融合タンパク質に結合させることによって、インビトロとインビボとの双方での融合タンパク質の検出および／または操作を可能にする。そのような分子の例は、とりわけ、分光学的プローブもしくはリポーター分子、親和性タグ、反応性ラジカルを発生できる分子、架橋結合剤、タンパク質−タンパク質相互作用を仲介するリガンド、または融合タンパク質の固定化に適した分子である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標識を基質から、対象となるタンパク質およびＯ6−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）を含む融合タンパク質へと移転する方法、特に、標識付けられた融合タンパク質を検出かつ／または操作することをさらに含む方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
複雑な生物系の理解における進歩は、裏面にある生体分子、特にタンパク質の相互作用を特性評価することに依存する。増加する数の生物のＤＮＡ配列決定は、それらの読み枠（ＯＲＦ）を同定したが、対応するタンパク質の生細胞内での挙動を調べ、インビボおよびインビトロにおける多数のタンパク質の相互作用を特性評価できる可能性は、限られている。この目的の実現を目指すほとんどの方針は、結合したタンパク質の環境内での変化に応じ、物理学的、生理学的または化学的応答を引き出す融合タンパク質を構成することに基づく。その例は、酵母ツーハイブリッドシステム、分割ユビキチン、および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）融合タンパク質を含む。しかし、これらの手法は、すべて、様々な限定または短所を有する。
【０００３】
ドイツ国特許願第199 03 895A（Kai Johnsson）は、Ｏ6−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）の検出のためのＥＬＩＳＡアッセイを記載している。Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソ尿素のような求電子剤の突然変異誘発および発癌効果は、主として、ＤＮＡ中のグアニンのＯ6−アルキル化による。自身をＤＮＡアルキル化から防護するために、哺乳動物および細菌は、Ｏ6−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）というタンパク質を保有していて、それがこれらの損傷を修復する［Pegg et al., 1995］。ＡＧＴは、アルキル基を、ＳN２反応で、それ自身のシステインの一つに移転し、その結果、不可逆的にアルキル化された酵素を生じる。腫瘍細胞内でのＡＧＴの過剰発現は、薬物耐性、特にプロカルバジン、ダカルバジン、テモゾロミドおよびビス−２−クロロエチル−Ｎ−ニトロソ尿素のようなアルキル化薬物に対するそれを獲得するのを可能にするため、ＡＧＴの阻害剤が、増感剤として化学療法に用いるために提唱されている［Pegg et al., 1995］。DE 199 03 895Aは、ビオチニル化されたＯ6−アルキルグアニン誘導体とＡＧＴとの間の、ＡＧＴのビオチニル化へと導く反応に依拠する、ＡＧＴレベルを測定するアッセイを開示している。次いで、これは、ストレプトアビジン被覆プレート上でのＡＧＴの分離と、例えばＥＬＩＳＡアッセイでの、その検出とを可能にする。このアッセイは、腫瘍組織中のＡＧＴレベルを追跡すること、ＡＧＴ阻害剤を化学療法における増感剤として用いて処置を調整すること、およびＡＧＴ阻害剤についてスクリーニングするのに用いることが示唆されている。
【０００４】
Damoiseaux、KepplerおよびJohnsson［ChemBiochem., 4: 285-287, 2001］は、やはり癌細胞内のこの酵素のレベルを検出するのを容易にして、研究および化学療法の際の助けにするために、ＡＧＴ標識付けのための化学プローブのように用いるための、オリゴデオキシリボヌクレオチドに組み込んだ改質Ｏ6−アルキル化グアニン誘導体を開示している。２種類の変種ＡＧＴ基質、およびビオチンで標識付けするＡＧＴ（DE 199 03 895 Aに記載されたのと同じ）についてのアッセイが開示されている。加えて、ＡＧＴの指向性進化にこれらのＯ6−アルキル化誘導体を用いることが示唆されている。
【０００５】
発明の要約
広義には、本発明は、ある系内の対象となるタンパク質またはペプチドを標識付けし、場合により、次いで操作および／もしくは検出する方法に、Ｏ6−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）をさらに用いることに関するものであって、該方法では、該タンパク質またはペプチドとＡＧＴとの融合を、標識付けられた基質に接触させる結果、ＡＧＴが該標識を基質からＡＧＴ融合に移転し、そのため、移転された標識により、標識付けられたＡＧＴ−タンパク質融合が操作かつ／または検出されるのを可能にする。これは、ＡＧＴが融合タンパク質として存在しない、ＡＧＴレベル測定用アッセイの従来の用い方とは対照的である。
【０００６】
上記により、第一の態様では、本発明は、対象となるタンパク質およびＯ6−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）を含む融合タンパク質と、標識を有する基質とを接触させる結果、ＡＧＴが標識を、それが該融合タンパク質に共有結合させるように移転することを含む方法を提供する。融合タンパク質への標識の移転後は、該方法は、標識付けられた融合タンパク質を検出および／または操作する、その後の工程をさらに包含してもよい。
【０００７】
一実施態様では、本発明は、対象となるタンパク質およびＯ6−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）を含む融合タンパク質を標識付けする方法であって、融合タンパク質と、標識を有する基質とを接触させる結果、ＡＧＴが標識を、それが該融合タンパク質に共有結合させるように移転することを含む方法を提供する。
【０００８】
いくつかの実施態様では、該方法は、例えば、標識付けられた融合タンパク質を検出および／または操作する、その後の一つもしくはそれ以上の工程を含む。
【０００９】
さらに一つの態様では、本発明は、対象となるタンパク質およびＯ6−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）を含む融合タンパク質を検出する方法であって、該融合タンパク質と、標識を有する基質とを接触させる結果、ＡＧＴが、ラベルを、それが該融合タンパク質に共有結合させるように移転すること、および該標識を用いて、タンパク質構成体を検出することを含む方法を提供する。
【００１０】
さらに一つの態様では、本発明は、対象となるタンパク質およびＯ6−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）を含む融合タンパク質を操作する方法であって、該融合タンパク質と、標識を有する基質とを接触させる結果、ＡＧＴが標識を、それが該融合タンパク質に共有結合させるように移転すること、および融合タンパク質を、標識によって融合タンパク質に導入された物理学的および／または化学的特性を用いて操作することを含む方法を提供する。
【００１１】
本発明のこの態様のいくつかの実施態様では、該方法は、標識を用いてタンパク質構成体を検出することを含んでよい。
【００１２】
さらに一つの態様では、本発明は、対象となるタンパク質およびＯ6−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）を含む融合タンパク質を固体支持体に固定化する方法であって、該融合タンパク質を、固体支持体に結合されるか、または結合され得る、標識を有する基質に接触させ、ＡＧＴが標識を、それが該融合タンパク質に共有結合させるように移転し、そのため、該融合タンパク質が固体支持体に結合されるか、またはその後に結合することができることを含む方法を提供する。本発明の、標識を初めに固体支持体に結合させない実施態様では、該方法は、標識付けられた融合タンパク質を固体支持体に接触させる結果、それが固体支持体上で固定化される工程をさらに含んでよい。本発明のこの態様のこの好ましい実施態様では、標識が移転されたときか、またはその後の反応の際のいずれかに、標識は、共有結合で固体支持体に結合してよいか、あるいは特異的結合対の一方の成員であってよくて、その他方の成員が、共有結合によってか、またはその他の手段によって（例えば、ビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジンの結合対を用いて）該固体支持体に結合されるか、もしくは結合され得る。
【００１３】
さらに一つの態様では、本発明は、ＡＧＴ融合タンパク質をインビボとインビトロとの双方で標識付けする方法を提供する。ＡＧＴ融合タンパク質のインビボ標識付けという用語は、細胞のすべての区画内での標識付けはもとより、細胞外空間を指向するＡＧＴ融合タンパク質の標識付けも含む。ＡＧＴ融合タンパク質の標識付けをインビボで実施し、ＡＧＴに融合されたタンパク質が原形質膜タンパク質であるならば、融合タンパク質のＡＧＴ部分は、原形質膜の細胞質側または細胞外側のいずれにも結合することができる。標識付けをインビトロで実施するならば、融合タンパク質の標識付けは、細胞抽出物中でか、またはＡＧＴ融合タンパク質の精製された形態もしくは富化された形態のいずれで実施することもできる。
【００１４】
さらに一つの態様では、本発明は、候補化合物または候補化合物のライブラリーと、標的物質または標的物質のライブラリーとの相互作用を決定する方法を提供する。該化合物および物質の例は、リガンドおよびタンパク質、薬物および該薬物の標的、または小分子およびタンパク質を含む。この方法では、ＡＧＴに融合した対象となるタンパク質は、転写因子のＤＮＡ結合ドメイン、または転写因子の活性化ドメインを含み、標的物質または標的物質のライブラリーを、該ＤＮＡ結合ドメインの他方、または該転写因子の活性化ドメインに結合させ、かつ標識が、標的物質と作用し合うと想定される候補化合物または候補化合物のライブラリーである。
【００１５】
好ましい実施態様では、該方法は、候補化合物または候補化合物のライブラリーを、ＡＧＴタンパク質融合に移転すること、および候補化合物で標識付けしたＡＧＴ融合タンパク質と、標的物質とを接触させる結果、ＡＧＴ融合タンパク質に結合した候補化合物と、標的物質との相互作用が、転写因子を活性化することをさらに含む。そうして、活性化された転写因子は、リポーターの発現を駆動し、それは、該方法を細胞内で実施するならば、リポーターの発現が細胞に選択的な利点を与えた場合に、検出することができる。いくつかの実施態様では、該方法は、候補化合物または標的物質を検出、単離、同定または特性評価することのような、追加的な一つもしくはそれ以上の工程を包含してもよい。
【００１６】
本願では、Ｏ6−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼまたは「ＡＧＴ」は、基質に存在する標識を、融合タンパク質のＡＧＴ形成部分のシステイン残基の一つに移転するという特性を有する。好ましい実施態様では、ＡＧＴは、Ｏ6−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ、例えば、Peggら（1995）およびその中の引用文献に記載されている、ヒトＯ6−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼである。しかし、他のアルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ、例えばRoyら（1995）に記載されているこの酵素のマウスまたはラット形態も公知であって、それらが上に定義された特性を有することを条件に、本発明に用いることができる。本発明では、Ｏ6−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼは、一つまたはそれ以上のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加によって異なり得るが、基質に存在する標識を、融合を形成しているＡＧＴまたはタンパク質もしくはペプチドに移転するという特性は依然として保持している、野生型ＡＧＴの変種も含む。ＡＧＴのその他の変種は、当業者には周知の手法を用いて化学的に改質してもよい。ＡＧＴの変種は、当業者に公知のタンパク質工学の手法を用い、かつ／または新たなＯ6−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼを発生かつ選択する分子的進化を用いて、生成してよい。
【００１７】
本発明では、融合タンパク質のＡＧＴを有するタンパク質部分の基準は、いかなる長さのタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドを含み、かつ二次、三次または四次構造を保有するものと保有しないものとの双方を含む。本発明の適用の例を下記に示す。
【００１８】
本発明では、標識付け基質は、好ましくは、標識付けベンジルグアニン基質であり、より好ましくは、Ｏ6−ベンジルグアニン誘導体である。そのような誘導体の例は、下記の一般式：
【００１９】
【化３】
【００２０】
［式中、
Ｒ1は、プロトン、β−Ｄ−２′−デオキシリボシル、またはオリゴデオキシリボヌクレオチドの一部であり、好ましくは２〜９９ヌクレオチドの長さを有するβ−Ｄ−２′−デオキシリボシルであり；
【００２１】
Ｒ2は、リンカー基、例えば、置換または非置換アルキル鎖、ポリエチレングリコールのような柔軟なリンカーであり；そして
【００２２】
labelは、本明細書に記載されたとおりの、融合タンパク質を検出かつ／または操作する原因となる分子である］
を有する、ベンジル環の４位が誘導体化された、Ｏ6−ベンジルグアニン誘導体である。
【００２３】
本発明に従って用いるのに適した改質Ｏ6−ベンジルグアニン誘導体の例を、図１に示す。さらに、本発明者らは、ＡＧＴが、基質の同一性におけるかなりの程度の自由度を許容して、下記の一般式：
【００２４】
【化４】
【００２５】
［式中、
Ｒ1は、ＡＧＴによって受容されて、ＡＧＴが標識をタンパク質の融合へと移転するのを許す基、例えば、置換もしくは非置換アルキル鎖、環の大きさが３〜１０炭素の置換もしくは非置換シクロアルキル基、環の大きさが３〜１０炭素の置換もしくは非置換複素環、または環の大きさが３〜１０炭素の置換もしくは非置換芳香族複素環であり；
【００２６】
Ｒ2は、リンカー基、例えば、置換もしくは非置換アルキル鎖、またはポリエチレングリコールのような、様々な長さの柔軟なリンカーであり；そして
【００２７】
Ｒ3は、プロトン、β−Ｄ−２′−デオキシリボシル、または好ましくは２〜９９ヌクレオチドの長さを有する、オリゴデオキシリボヌクレオチドの一部であるβ−Ｄ−２′−デオキシリボシルであり；
【００２８】
labelは、本明細書に記載されたとおりの、融合タンパク質を検出かつ／または操作する原因となる分子である］
を有する、広範囲の基質が用いられるのを可能とすることができることを見出した。
【００２９】
基質の標識部分は、融合タンパク質が意図される適用に応じて、当業者が選ぶことができる。標識の例は、下記のものを含む：
【００３０】
（１）発蛍光団、発色団、磁気プローブまたは造量剤のような、分光学的プローブ；
【００３１】
（２）放射性標識付け分子；
【００３２】
（３）パートナーに特異的に結合できる特異的結合対の一方の部分である分子。そのような特異的結合対は、当技術に周知であり、例えば、アビジンまたはストレプトアビジンに結合することができるビオチンを含む；
【００３３】
（４）その他の生体分子と作用し合うと思われる分子；
【００３４】
（５）その他の生体分子と作用し合うと思われる分子のライブラリー；
【００３５】
（６）当業者に公知のとおり［Nadeau et al., 2002］、その他の生体分子と架橋結合できる分子；
【００３６】
（７）束縛された金属キレートのような［Hori et al., 2002］、Ｈ2Ｏ2およびアスコルビン酸塩に接触するとヒドロキシルラジカルを発生できる分子（最終原稿を確認されたい）；
【００３７】
（８）マラカイトグリーンのような［Jay et al., 1999］、光を照射すると反応性ラジカルを発生できる分子；
【００３８】
（９）スライドグラス、微量滴定プレート、または一般に当業者に公知のいかなる重合体であってもよい、固体支持体に共有結合させる分子；
【００３９】
（１０）その相補鎖との塩基対合をなし得る核酸またはその誘導体；
【００４０】
（１１）脂質、または他の膜挿入特性を有する疎水性分子；
【００４１】
（１２）望ましい酵素的、化学的または物理的特性を有する生体分子；
【００４２】
（１３）上記に列挙された特性のいずれかの組合せを保有する分子。
【００４３】
例示のために、ここで、本発明の実施態様を、添付の図面を参照して、より詳しく説明する。
【００４４】
詳細な説明
本発明の下記の適用は、例示のために提供され、限定のためではない。本明細書に開示された方法は、一般的には、ある範囲の応用に適用することができ、融合タンパク質を、（１）標識付けられた融合タンパク質の環境における変化を感知かつ誘導できる標識、ならびに／または（２）標識が融合タンパク質に特異的に導入した物理および／もしくは化学的特性によって融合タンパク質を操作する助けとなる標識で、融合タンパク質を特異的に、かつ共有結合で標識化することができる。本明細書に開示された方法は、インビボとインビトロとの双方で、ＡＧＴ融合タンパク質を標識付けするのに用いることができる。
【００４５】
本発明は、所望のタンパク質への標識の特異的な結合は、問題のそのタンパク質と、ヒトのＤＮＡ修復酵素であるＯ6−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ｈＡＧＴ）のようなＯ6−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼとの間の融合タンパク質を構成し、後者の機序を利用することによって、実施することができるとの理解に基づく。この酵素は、アルキル基を、その基質、すなわちＯ6−アルキルグアニン−ＤＮＡからそのシステイン残基の一つに不可逆的に移転する（図１）。ｈＡＧＴと急速に反応する基質類似体は、Ｏ6−ベンジルグアニンであって、二次速度定数は、約１０3秒-1M-1である（図１）。本発明者らは、Ｏ6−ベンジルグアニンのベンジル環のＣ４での置換が、Ｏ6−ベンジルグアニン誘導体に対するｈＡＧＴの反応性に有意には影響しないことを示した。これは、標識付けられたＡＧＴ融合タンパク質をインビボまたはインビトロで、共有結合によって特異的に結合するのに、標識がベンジル環のＣ４に結合したＯ6−ベンジルグアニン誘導体を用いることを可能にする（図１Ｄ）。標識付けは、融合タンパク質の性質には無関係である。
【００４６】
標識付けをインビボまたは細胞抽出物中で実施するならば、宿主の内在ＡＧＴの標識付けを考慮に入れるのが好都合である。宿主の内在ＡＧＴがＯ6−ベンジルグアニン誘導体または関連化合物を基質として受容しないならば、融合タンパク質の標識付けは特異的である。哺乳動物細胞（ヒト、マウス、ラット）では、内在ＡＧＴの標識付けは可能である。内在ＡＧＴとＡＧＴ融合問題との同時標識付けが問題を提起する、これらの実験では、以前に記載したＡＧＴ欠乏細胞系を用いることができる［Kaina et al., 1991］。一般的には、本発明は、融合タンパク質との標識の共有結合による特異的な結合を用いて、ＡＧＴ融合タンパク質の挙動を監視するか、もしくはそれに影響を与えるか、または導入された標識によってＡＧＴ融合タンパク質を操作する手法のすべての適用に利用することができる。この技術を用いるための適用の例を、以下に述べる。
【００４７】
（１）分光学的プローブまたはリポーター基としての標識
ＡＧＴに移転できる、検出可能な標識、例えば発蛍光団、発色団、磁気プローブ、放射性標識付け分子またはその他のいかなる分光学的プローブをも基質が担持する、標識付けＡＧＴ基質、例えばＯ6−ベンジルグアニン誘導体の使用は、本発明を、検出できる標識を細胞内、細胞表面（インビボ）またはインビトロのいずれかでＡＧＴ融合タンパク質に特異的に共有結合によって結合するのに用いることを可能とする。これは、ＡＧＴ融合タンパク質のインビボまたはインビトロでの検出および特性評価を可能とする。インビボという用語は、細胞のすべての区画内での標識付けはもとより、細胞外空間を指向するＡＧＴ融合タンパク質の標識付けも含む。この方法は、対象となるタンパク質にやはり遺伝学的に融合され、生細胞内でのその探索を可能とする、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の適用と対比することができる。ＧＦＰおよびその突然変異体の短所は、それが、主として、自然に産する発蛍光団の使用に限られることである。
【００４８】
（２）ＡＧＴ融合タンパク質を検出かつ単離するためのタグとしての標識
ビオチンのような親和性タグで標識付けしたＡＧＴ基質、例えばＯ6−ベンジルグアニン誘導体の使用は、親和性タグをＡＧＴ−タンパク質融合に移転し、そのため親和性タグの結合パートナーによって、融合タンパク質を結合するのに、本発明を用いることを可能にする。例としては、ビオチンのような親和性タグで標識付けしたＡＧＴ基質を、ＡＧＴ融合タンパク質を発現する（細菌性または真核性の）細胞にか、またはそのような細胞の細胞抽出物、もしくは精製されたＡＧＴ融合タンパク質に付加することは、親和性タグによる融合タンパク質の共有結合的修飾へと導くことになる。そうして、これは、親和性タグとその結合パートナー、例えばビオチンの場合、固定化されたアビジンまたはストレプトアビジンとの間の相互作用を用いる、融合タンパク質の単離を可能にする。標識を、切断できる結合、例えばジスルフィド架橋を含有するリンカーを介してＡＧＴ融合タンパク質に結合するか、またはリンカーが光切断できるならば、ＡＧＴ融合タンパク質は、親和性タグから、その単離後に遊離させることができる。
【００４９】
（３）反応性ラジカルの源泉としての標識
ＡＧＴ基質、例えばＯ6−ベンジルグアニン誘導体は、外部刺激に触れると反応性ラジカル、例えばヒドロキシルラジカルを発生できる、ＡＧＴ融合タンパク質に、標識を導入するのに用いることができる。そうして、発生したラジカルは、ＡＧＴ融合タンパク質はもとより、ＡＧＴ融合タンパク質のごく近傍にあるようなタンパク質も不活性化することができて、これらのタンパク質の役割の研究を可能にする。そのような標識の例は、Ｈ2Ｏ2やアスコルビン酸塩に接触するとヒドロキシルラジカルを生ずる、束縛された金属−キレート錯体、およびレーザー照射されるとヒドロキシルラジカルを生ずるマラカイトグリーンのような、発色団である。ヒドロキシルラジカルを発生させるのに発色団やレーザーを用いることは、レーザー分子不活性化法（ＣＡＬＩ）として当技術で公知である［Jay et al., 1998］。ＣＡＬＩは、細胞内の一定のタンパク質を、時間的に制御され、空間的に分解された方式で、特異的に不活性化するのに用いられる方法であり、発色団およびタンパク質の空間的近傍を基礎にしている。レーザー照射されると、発色団は、ヒドロキシルラジカルを発生し、それが、発色団内、およびそのわずか約０．１nm以内のすべてのタンパク質を不活性化する。従来、発色団は、対象となるタンパク質の空間的近傍に、対象となるタンパク質に特異的な発色団標識付け抗体を微量注入することによって近付けている。本発明では、マラカイトグリーンのような発色団によるＡＧＴ融合タンパク質の標識付け、およびその後のレーザー照射は、ＡＧＴ融合タンパク質はもとより、ＡＧＴ融合タンパク質と作用し合うようなタンパク質も、時間的に制御され、空間的に分解された方式で不活性化するのを可能にすると思われる。この方法は、インビボまたはインビトロの双方で適用することができる。
【００５０】
同様にして、ＡＧＴ融合タンパク質は、束縛された金属−キレートで標識付けすることができ、ＡＧＴ融合タンパク質、およびＡＧＴ融合タンパク質と作用し合うようなタンパク質は、Ｈ2Ｏ2およびアスコルビン酸塩に接触させると、特異的な方式で不活性化することができる。この方法は、ＡＧＴ融合タンパク質、またはＡＧＴ融合タンパク質のごく近傍にあるそれの機能を調べることばかりでなく、ＡＧＴ融合タンパク質のごく近傍にあるようなタンパク質を同定することにも用いることができる。ここで、ＡＧＴ融合タンパク質のごく近傍にあるタンパク質は、該タンパク質のフラグメントの特異的な抗体による検出、高分離能２Ｄ電気泳動ゲル上のこれらのタンパク質の消滅、または切断されたタンパク質フラグメントの、分離、および質量分析法もしくはＮ末端分解によるタンパク質配列決定のような配列決定手法による同定のいずれかによって同定されるようなものとして同定することができる。
【００５１】
（４）タンパク質−タンパク質相互作用を仲介するリガンドとしての標識
標識付けられたＡＧＴ基質、例えばＯ6−ベンジルグアニン誘導体は、リガンドをＡＧＴ−タンパク質融合に移転するのに用いることができる。これは、リガンドのパートナー、例えばタンパク質をＡＧＴ−タンパク質融合に結合するのを可能にする。例えば、標識が、結合パートナーに結合できるリガンドである場合、そのような基質とＡＧＴ融合タンパク質とを接触させることは、融合タンパク質とのリガンドの特異的結合へと導くことになる。リガンドが、もう一つのタンパク質Ｙに結合し、タンパク質Ｙと標識付けられたＡＧＴ融合タンパク質との二量体化が、生物学的機能、または測定できるシグナルへと導くならば、この生物学的機能または測定可能シグナルは、標識を担持するＡＧＴ基質の付加に依存する。具体的な例は、小分子で遺伝子発現を調節するための、Hoら、1996が記載した、いわゆる三雑種系におけるＡＧＴ基質およびＡＧＴ融合タンパク質の使用であると思われる。この場合は、ＡＧＴを、転写因子のＤＮＡ結合ドメインに融合させる。リガンド、例えばＦＫ５０６に結合するタンパク質Ｙ、例えばＦＫＢＰを、転写因子の活性化ドメインに結合させる。リガンド、この例ではＦＫ５０６を担持するＡＧＴ基質を細胞に供給することが、機能的な転写因子の形成、および遺伝子発現へと導くことになる。
【００５２】
（５）その標的が未知である薬物または生物学的活性分子としての標識
標識を担持し、その標識が、未だ同定されていないタンパク質Ｙに結合する薬物または生物学的活性小分子である、Ｏ6−ベンジルグアニン誘導体または関連ＡＧＴ基質の使用。ここでは、目標は、生物学的活性分子の標的であるタンパク質Ｙを同定することになると思われる。この場合は、ＡＧＴを、転写因子のＤＮＡ結合ドメインに融合させる。未知の標的タンパク質Ｙを発現する生物のｃＤＮＡライブラリーを、転写因子の活性化ドメインに融合させる。標識を担持し、その標識が薬物または生物学的活性小分子である、Ｏ6−ベンジルグアニン誘導体または関連ＡＧＴ基質の付加が、この分子が、ｃＤＮＡライブラリー内に存在し、活性化ドメインに融合した、その標的タンパク質Ｙに結合する場合にのみ、機能的転写因子の形成、および遺伝子発現へと導くことになる。遺伝子発現を選択的な利点に結び付けるならば、該薬物または生体活性分子の標的遺伝子Ｙを有するプラスミドを担持する、対応する宿主を同定することができる。
【００５３】
（６）タンパク質Ｙに結合する分子を同定するための小分子のライブラリーとしての標識
標識を担持し、その標識が、化学的分子のライブラリーである、Ｏ6−ベンジルグアニンまたは関連ＡＧＴ基質の使用：ここでは、目標は、インビボ条件下でタンパク質Ｙに結合する、潜在的な薬物標的であり得る小分子を同定することになると思われる。この場合は、ＡＧＴを、転写因子のＤＮＡ結合ドメインに融合させる。標的タンパク質Ｙを、転写因子の活性化ドメインに融合させる。標識として結合させた小分子のライブラリーを、Ｏ6−ベンジルグアニン誘導体に付加することが、標識（すなわち小分子）が、活性化ドメインに融合したその標的タンパク質Ｙに結合する場合にのみ、機能的転写因子の形成、および遺伝子発現へと導くことになる。遺伝子発現を選択的な利点に結び付けるならば、ライブラリーの、宿主の成長へと導くような分子を同定することができる。
【００５４】
（７）ＡＧＴ融合タンパク質を固定化し、かつ／またはＡＧＴ融合タンパク質のタンパク質アレーを創出するためのＢＧ誘導体の使用
標識を担持し、その標識が、担体の表面に共有結合で結合されているか、または該標識が、それ自体該表面に結合されたもう一つの分子によって非共有結合で結合され得る分子である、Ｏ6−ベンジルグアニン誘導体または関連ＡＧＴ基質の使用。後者の取組み方についての例は、標識がビオチンであり、表面に結合された分子がストレプトアビジンまたはアビジンである場合である。担体についてのあり得る例は、スライドガラス、微量滴定プレート、または機能化された任意の重合体のいずれかでもあると思われる。標識によるＡＧＴ基質の固定化は、標識の融合タンパク質への移転によって、担体へのＡＧＴ融合タンパク質のその後の固定化を可能にする。空間的に分解された方式での（異なる）ＡＧＴ融合タンパク質の担体でのスポット形成は、タンパク質アレーの生成を可能にする。
【００５５】
（８）ＡＧＴ融合タンパク質と作用し合うタンパク質を検出するための架橋結合剤としての標識
標識を担持し、その標識が、他のタンパク質と架橋結合することができる分子である、Ｏ6−ベンジルグアニン誘導体または関連ＡＧＴ基質の使用。そのような架橋結合剤の例は、マレイミド、活性エステルまたはアジ化物およびその他の、当業者に公知であり、Nadeauら、2002に記載されたもののような、官能基を含有する分子である。そのようなＡＧＴ基質を、他のタンパク質と作用し合うＡＧＴ融合タンパク質と（インビボまたはインビトロで）接触させることは、ＡＧＴ融合タンパク質と、標識を介して作用し合うそのタンパク質との共有結合での架橋結合へと導くことができる。これは、ＡＧＴ融合タンパク質と作用し合うタンパク質の同定を可能にする。
【００５６】
実施例
下記の実施例は、本発明を実施する方法の完全な開示および記載を当業者に提供するために説明するもので、本発明の対象範囲を限定することを意図するものではない。
【００５７】
実施例Ａ：大腸菌におけるＡＧＴ融合タンパク質の共有結合による標識付け
下記の例、すなわちＢＧ−Ｂｔを用いた、大腸菌におけるＰｅｐ−ｈＡＧＴの標識付けは、大腸菌におけるｈＡＧＴ融合タンパク質の共有結合による標識付けの実施可能性を立証した。ｈＡＧＴのＮ末端に融合したペプチド（Ｐｅｐ−ｈＡＧＴを生じる）の配列は、（一字コードでは）ＭＨＨＨＨＨＨＳＳＡであって、ｈＡＧＴの最初のアミノ酸である、メチオニンがこれに続く。Ｎ末端融合ペプチドを有するｈＡＧＴ、すなわちＰｅｐ−ｈＡＧＴをコーディングしている、ｐＥＴ−１５ｂ（Novagen）に基づく発現ベクターを含有するＸＬ−１Blueという大腸菌細胞の液体培養物を、０．６の光学的密度ＯＤ600nmまで増殖させた。ＩＰＴＧを１mMの最終濃度までを加えることによって、Ｐｅｐ−ｈＡＧＴの発現を誘導した。同時に、ＢＧ−Ｂｔを１０μMの最終濃度まで加え、細菌を３７℃で２時間温置した。細胞を遠心分離によって採集し、ペレットを２回洗浄して、過剰なＢＧ−Ｂｔを除去した。再懸濁させた細胞のアリコートを、ウエスタンブロット分析によって分析した。ビオチニル化タンパク質を、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ複合体（NEN）および化学発光性ペルオキシダーゼ基質（Renaissance reagent plus, NEN）を用いて検出した（図２）。
【００５８】
実施例Ｂ：酵母におけるＡＧＴ融合タンパク質の共有結合による標識付け
下記の実施例は、酵母におけるｈＡＧＴ融合タンパク質の共有結合による標識付けの実施可能性を立証した。ここでは、ＢＧ−Ｂｔを用いて、ｈＡＧＴ−ＤＨＦＲ−ＨＡという融合タンパク質を酵母中でビオチニル化した。この融合タンパク質は、標準的な分子生物学の手順を用いて、ＤＮＡレベルで構成される。略述すると、ｈＡＧＴの停止コドンを、アミノ酸ＲＳＧＩに対するコドンで置き換え、次いで、マウスからのＤＨＦＲの第１アミノ酸、すなわちメチオニンに対するコドンで後続させた［Nunberg et al., 1980］。ｈＡＧＴとＤＨＦＲとの間のリンカーに対するコドンは、ＢｇｌII部位もコード化していて、そのＤＮＡ配列は、AGATCTである。ＤＨＦＲとＨＡタグとの間の融合を構成するために、ＤＨＦＲの停止コドンを、ＨＡ−タグの第１アミノ酸に対するコドンで置き換えた［Kolodziej, 1991］。ＨＡ−タグに停止コドンを後続させた。ｈＡＧＴ−ＤＨＦＲ−ＨＡというタンパク質がｐcup1プロモーターの制御下にある、発現ベクターｐ３１４ＡＫ１を含有する、Ｌ４０という酵母細胞の培養を、０．６のＯＤ600まで増殖させた。ｈＡＧＴ−ＤＨＦＲ−ＨＡの発現は、ＣｕＳＯ4を１００μMの濃度まで加えることによって誘導し、ＢＧ−Ｂｔを、１０μMの濃度まで同時に加えた。２．５時間および５時間後にアリコートを採取し、遠心分離によって、細胞を採集した。ペレットを２回洗浄して、残留ＢＧ−Ｂｔを除去した。凍結／融解周期の循環によって酵母細胞を溶解した後、細胞抽出物を、ＥＬＩＳＡを用いて、ビオチニル化ｈＡＧＴ−ＤＨＦＲ−ＨＡ融合タンパク質の存在について分析した。略述すると、ビオチニル化ｈＡＧＴ−ＤＨＦＲ−ＨＡを、ストレプトアビジン被覆した微量滴定ウェル内に固定化し、抗ＨＡ抗体（Babco）を一次抗体として、かつ抗マウスＨＲＰ複合体（Sigma）を二次抗体として用いることによって検出した（図１）［Kolodziej, 1991］。ＥＬＩＳＡは、ペルオキシダーゼ基質ＡＢＴＳを用いて展開し、シグナル（吸光度）をＯＤ405nmで測定した。インビボビオチニル化ｈＡＧＴ−ＤＨＦＲ−ＨＡ融合タンパク質についてのシグナルは、バックグラウンドを少なくとも５倍上回った。バックグラウンドシグナルは、厳密に上記のとおり処理したが、ＢＧ−Ｂｔの添加を省いた細胞から得られた、細胞溶解物のＯＤ405nmとして定義した。
【００５９】
実施例Ｃ：酵母におけるｈＡＧＴ融合タンパク質の共有結合による標識付け
下記の実施例は、酵母におけるｈＡＧＴ融合タンパク質の共有結合による標識付けの実施可能性を立証した。ここでは、ＢＧ−ＤＩＧを用いて、ｈＡＧＴ−ＤＨＦＲ−ＨＡ融合タンパク質を酵母中でジゴキシゲニンで標識付けした。ｈＡＧＴ−ＤＨＦＲ−ＨＡ融合の構成は、実施例Ｂに記載されている。ｈＡＧＴ−ＤＨＦＲ融合タンパク質の遺伝子がｐcup1プロモーターの制御下にある、発現ベクターｐ３１４ＡＫ１を含有する、Ｌ４０という酵母細胞の培養を、１．２のＯＤ600nmまで増殖させた。ｈＡＧＴ−ＤＨＦＲ融合タンパク質の発現は、ＣｕＳＯ4を１００μMの濃度まで加えることによって誘導し、ＢＧ−ＤＩＧを、２０μMの濃度まで同時に加えた。２時間後、振盪フラスコ培養体１mlからの細胞を、遠心分離によって採集した。ペレットを培地で３回洗浄して、残留ＢＩＧ−ＤＩＧを除去した。凍結／融解周期の循環によって酵母細胞を溶解した後、細胞抽出物を、ジゴキシゲニン化ｈＡＧＴ−ＤＨＦＲ融合タンパク質の存在について、ウエスタンブロット分析によって分析した。ジゴキシゲニン化タンパク質は、抗ジゴキシゲニン−ペルオキシダーゼ複合体（Roche）、および化学発光性ペルオキシダーゼ基質（Renaissance reagent plus, NEN）を用いて検出した（図２）。
【００６０】
実施例Ｄ：ヒト細胞系におけるｈＡＧＴ融合タンパク質の共有結合による標識付け
下記の実施例は、哺乳動物細胞におけるＡＧＴ融合タンパク質の共有結合による標識付けの実施可能性を立証した。ここでは、ヒトの細胞（ＨＥＫ２９３）内の内在性ｈＡＧＴを、ＢＧ−ＡｃＦｃを用いてフルオレセインで標識付けした。ＨＥＫ２９３細胞を、５μMのＢＧ−ＡｃＦｃとともにＰＢＳ中に５分間温置した。アセチル化されたフルオレセイン誘導体であるＢＧ−ＡｃＦｃは、細胞浸透性であり、非蛍光性であるが、細胞内で急速に水解されて、蛍光性のＢＧ−Ｆｃを生じることが期待できる。次いで、細胞を、ＰＢＳを変えることによって洗浄して、いかなる過剰な基質ＢＧ−ＡｃＦｃも除去し、ＰＢＳ中に２０分間温置した。次いで、共焦点蛍光顕微鏡で画像を得た（励起４９２nm；発光５１０nm）。対照実験として、ＨＥＫ２９３細胞を上記のとおり処理したが、ＢＧ−ＡｃＦｃを加える前に、Ｏ6−ベンジルグアニン（１μM）とともに終夜温置した。これは、内在性ｈＡＧＴを不活性化し、そのため核内での蛍光の蓄積を防止するはずであった。期待されたとおり、細胞をＯ6−ベンジルグアニンとともに前温置したとき、核内での蛍光蓄積は、全く観察されなかった。ｈＡＧＴがＢＧ−Ｆｃを基質として受容することを、独立に確認するため、組換えＰｅｐ−ｈＡＧＴ（１０μM、実施例Ａに記載のとおり）を、１００μMのＢＧ−Ｆｃとともに２５℃で、５０mMトリス−Ｃｌ、１０mMＤＴＴ、１mMＥＤＴＡ、２００μg/mlのＢＳＡ、１０％グリセリン、pH７．４中で１０分間温置した後、ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水：１３７mMＮａＣｌ、２．７mMＫＣｌ、１０mMＮａ2ＨＰＯ4、１．８mMＫＨ2ＰＯ4、pH７．４）９００μlを加えた。過剰な基質ＢＧ−Ｆｃの分離は、ＮＡＰ（登録商標）−１０カラム（Pharmacia）で、供給者の指示によるゲル濾過によって達成した。次いで、Ｐｅｐ−ｈＡＧＴを、標準的な蛍光分光光度計で特性評価した。サンプルは、それぞれ、２２２、２３８および４９０nmで励起し、波長５２３nmで最大発光を示し、このタンパク質が、フルオレセインで標識付けられたことを確認した。ＰＢＳ中２０nMのＢＧ−Ｆｃの溶液を、参照として測定した。基質の発光波長は、５１９nmであった（励起は、それぞれ、２３７、３２３および４９０nm）。
【００６１】
実施例Ｅ：細胞抽出物中でのＡＧＴ融合タンパク質の共有結合による標識付け
ＡＧＴとの融合タンパク質は、細胞抽出物中では直接標識付けし、かつ操作（ここでは固定化）することができることを立証するため、下記のｈＡＧＴとのＮ−およびＣ−末端融合タンパク質を、標準的な分子クローニングの手順によって構成し、酵母の発現ベクター内にクローニングした：
【００６２】
（ｉ）Ｖ５−ＮＬＳ−Ｂ４２−ｈＡＧＴ（ここで、Ｖ５はＶ５エピトープを、ＮＬＳはＳＶ４０の大Ｔ抗原核局在配列を、またＢ４２は、人工転写活性化因子であるＢ４２［Ma et al., 1987］を意味する）。Ｂ４２のトランス活性化ドメインの最後のコドンに、２１アミノ酸の配列ASKKGTELGSTTSNGRQCAGILを後続させた。最後の３コドンは、Ｂ４２にｈＡＧＴをＣ末端クローニングするためのＥｃｏＲＩ部位を含んでいる。ＮｏｔＩ部位は、ｈＡＧＴに対するＣ末端制限部位であって、その配列は、停止コドンを含む；
【００６３】
（ii）ｈＡＧＴ−ＨＡ−Ｕｒａ３（ここで、Ｕｒａ３は、酵母の酵素オロチン酸デカルボキシラーゼを意味し、ＨＡは、Ｈａエピトープを意味する）。ここでは、ｈＡＧＴに対する停止コドンを、ＲＳリンカーで置き換え、ＨＡ−タグの最初のアミノ酸を後続させた。ＨＡ−タグは、Ｕｒａ３遺伝子が直接後続する；
【００６４】
（iii）ｈＡＧＴ−ＤＨＦＲ−ＨＡ（ここで、ＤＨＦＲは、マウスのジヒドロ葉酸レダクターゼを意味し、ＨＡは、Ｈａエピトープを意味する）。構成については、実施例Ｂを参照されたい；および
【００６５】
（iv）ＳＳＮ６−ｈＡＧＴ（ここで、ＳＳＮ６は、酵母のＤＮＡ転写リプレッサー［Schultz et al., 1987］を意味する）。ここでは、ｈＡＧＴの停止コドンを、アミノ酸ＲＳＧＳＧに対するコドンで置き換えて、そうして、酵母のＳＳＮ６の最初のアミノ酸、すなわちメチオニンに対するコドンが後続する。
【００６６】
遺伝子の発現は、すべて、ｐcup1プロモーターによって制御した。融合タンパク質の一つをコーディングしている発現ベクターを含有するＬ４０酵母細胞を、０．６のＯＤ600まで増殖させ、融合タンパク質の発現は、ＣｕＳＯ4を１００μMの濃度まで加えることによって誘導した。アリコート（２ml）を５時間後に採取し、遠心分離によって細胞を採集した。凍結／融解周期の循環によって細胞を溶解した後、酵母抽出物を、ＢＧ−Ｂｔ−ｏｌｉｇｏ（１０pmol）とともに室温で２０分間温置して、融合タンパク質のビオチニル化へと導いた。次いで、懸濁液を、ストレプトアビジン被覆した微量滴定プレート（Roche molecular biochemicals）内に移し、１時間温置した。ウェルをＰＢＳで徹底的に洗浄した後、固定化された融合タンパク質を、抗ＨＡ抗体（Babco）または抗ｈＡＧＴ抗体（ＳＳＮ６−ｈＡＧＴ融合タンパク質の場合）のいずれかを一次抗体として、かつ抗マウスペルオキシダーゼ複合体（Sigma、#A4416）を二次抗体として用い、次いで、標準的な生化学手順を用いて、ペルオキシダーゼの基質ＡＢＴＳとともに温置することによって、検出した。すべての場合に、ＯＤ405nmとして測定されたシグナルは、バックグラウンドを少なくとも５倍上回った。バックグラウンドは、各融合タンパク質について、ＢＧ−Ｂｔ−ｏｌｉｇｏの細胞抽出物への添加を省くことによって測定した。
【００６７】
参考文献
本明細書に引用された参考文献は、すべて、特に参照として組み込まれる。参考文献は、アルファベット順である。
【００６８】
【表１】
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】（Ａ）Ｏ6−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼの機序を示す図である。（Ｂ）Ｏ6−ベンジルグアニンの構造を示す図である。（Ｃ）実施例に用いたＯ6−ベンジルグアニン誘導体の一般的構造を示す図である。（Ｄ）ＡＧＴ融合タンパク質を標識付けする一般的スキームであって、Ｘは、ＡＧＴに融合させたタンパク質である。（Ｅ）実施例に用いたＡＧＴ基質の構造を示す図である。オリゴヌクレオチド（２２量体）の配列は、5′-GTGGTGGGCGCTGXAGGCGTGG-3′であって、Ｘ＝ＢＧ−Ｂｔである。
【図２】インビボでＡＧＴ融合タンパク質を標識付けした後のウエスタンブロット分析を示す図である。（Ａ）培地中にＢＧ−Ｂｔを含む場合と含まない場合の、Ｐｅｐ−ｈＡＧＴを発現する大腸菌の全細胞抽出物のウエスタンブロット分析。ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ複合体を用いて、ビオチニル化タンパク質を検出。２０kDの帯域は、ＢＧ−Ｂｔの不在下での大腸菌内でビオチニル化タンパク質に相当する。（Ｂ）培地中にＢＧ−ＤＩＧを含む場合と含まない場合の、ｈＡＧＴ−ＤＨＦＲ−ＨＡ融合タンパク質を発現する酵母の全細胞抽出物のウエスタンブロット分析。抗ジゴキシゲニン−ペルオキシダーゼ複合体を用いて、ジゴキシゲニン標識付けタンパク質を検出。
【図３】ＢＧ−ＡｃＦｃとともに温置し、蛍光および光学顕微鏡測定によって分析したＨＥＫ２９３細胞を示す図である。蛍光が細胞核に蓄積されているのを認めることができる。これは、ｈＡＧＴが核に局在するのが知られていることから［Ali et al., 1998］、期待された結果である。第三の図面は、蛍光および光学顕微鏡測定から得られた画像を重ね合わせたものである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標識を基質から、対象となるタンパク質およびＯ6−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）を含む融合タンパク質へと移転する方法、特に、標識付けられた融合タンパク質を検出かつ／または操作することをさらに含む方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
複雑な生物系の理解における進歩は、裏面にある生体分子、特にタンパク質の相互作用を特性評価することに依存する。増加する数の生物のＤＮＡ配列決定は、それらの読み枠（ＯＲＦ）を同定したが、対応するタンパク質の生細胞内での挙動を調べ、インビボおよびインビトロにおける多数のタンパク質の相互作用を特性評価できる可能性は、限られている。この目的の実現を目指すほとんどの方針は、結合したタンパク質の環境内での変化に応じ、物理学的、生理学的または化学的応答を引き出す融合タンパク質を構成することに基づく。その例は、酵母ツーハイブリッドシステム、分割ユビキチン、および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）融合タンパク質を含む。しかし、これらの手法は、すべて、様々な限定または短所を有する。
【０００３】
ドイツ国特許願第199 03 895A（Kai Johnsson）は、Ｏ6−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）の検出のためのＥＬＩＳＡアッセイを記載している。Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソ尿素のような求電子剤の突然変異誘発および発癌効果は、主として、ＤＮＡ中のグアニンのＯ6−アルキル化による。自身をＤＮＡアルキル化から防護するために、哺乳動物および細菌は、Ｏ6−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）というタンパク質を保有していて、それがこれらの損傷を修復する［Pegg et al., 1995］。ＡＧＴは、アルキル基を、ＳN２反応で、それ自身のシステインの一つに移転し、その結果、不可逆的にアルキル化された酵素を生じる。腫瘍細胞内でのＡＧＴの過剰発現は、薬物耐性、特にプロカルバジン、ダカルバジン、テモゾロミドおよびビス−２−クロロエチル−Ｎ−ニトロソ尿素のようなアルキル化薬物に対するそれを獲得するのを可能にするため、ＡＧＴの阻害剤が、増感剤として化学療法に用いるために提唱されている［Pegg et al., 1995］。DE 199 03 895Aは、ビオチニル化されたＯ6−アルキルグアニン誘導体とＡＧＴとの間の、ＡＧＴのビオチニル化へと導く反応に依拠する、ＡＧＴレベルを測定するアッセイを開示している。次いで、これは、ストレプトアビジン被覆プレート上でのＡＧＴの分離と、例えばＥＬＩＳＡアッセイでの、その検出とを可能にする。このアッセイは、腫瘍組織中のＡＧＴレベルを追跡すること、ＡＧＴ阻害剤を化学療法における増感剤として用いて処置を調整すること、およびＡＧＴ阻害剤についてスクリーニングするのに用いることが示唆されている。
【０００４】
Damoiseaux、KepplerおよびJohnsson［ChemBiochem., 4: 285-287, 2001］は、やはり癌細胞内のこの酵素のレベルを検出するのを容易にして、研究および化学療法の際の助けにするために、ＡＧＴ標識付けのための化学プローブのように用いるための、オリゴデオキシリボヌクレオチドに組み込んだ改質Ｏ6−アルキル化グアニン誘導体を開示している。２種類の変種ＡＧＴ基質、およびビオチンで標識付けするＡＧＴ（DE 199 03 895 Aに記載されたのと同じ）についてのアッセイが開示されている。加えて、ＡＧＴの指向性進化にこれらのＯ6−アルキル化誘導体を用いることが示唆されている。
【０００５】
発明の要約
広義には、本発明は、ある系内の対象となるタンパク質またはペプチドを標識付けし、場合により、次いで操作および／もしくは検出する方法に、Ｏ6−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）をさらに用いることに関するものであって、該方法では、該タンパク質またはペプチドとＡＧＴとの融合を、標識付けられた基質に接触させる結果、ＡＧＴが該標識を基質からＡＧＴ融合に移転し、そのため、移転された標識により、標識付けられたＡＧＴ−タンパク質融合が操作かつ／または検出されるのを可能にする。これは、ＡＧＴが融合タンパク質として存在しない、ＡＧＴレベル測定用アッセイの従来の用い方とは対照的である。
【０００６】
上記により、第一の態様では、本発明は、対象となるタンパク質およびＯ6−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）を含む融合タンパク質と、標識を有する基質とを接触させる結果、ＡＧＴが標識を、それが該融合タンパク質に共有結合させるように移転することを含む方法を提供する。融合タンパク質への標識の移転後は、該方法は、標識付けられた融合タンパク質を検出および／または操作する、その後の工程をさらに包含してもよい。
【０００７】
一実施態様では、本発明は、対象となるタンパク質およびＯ6−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）を含む融合タンパク質を標識付けする方法であって、融合タンパク質と、標識を有する基質とを接触させる結果、ＡＧＴが標識を、それが該融合タンパク質に共有結合させるように移転することを含む方法を提供する。
【０００８】
いくつかの実施態様では、該方法は、例えば、標識付けられた融合タンパク質を検出および／または操作する、その後の一つもしくはそれ以上の工程を含む。
【０００９】
さらに一つの態様では、本発明は、対象となるタンパク質およびＯ6−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）を含む融合タンパク質を検出する方法であって、該融合タンパク質と、標識を有する基質とを接触させる結果、ＡＧＴが、ラベルを、それが該融合タンパク質に共有結合させるように移転すること、および該標識を用いて、タンパク質構成体を検出することを含む方法を提供する。
【００１０】
さらに一つの態様では、本発明は、対象となるタンパク質およびＯ6−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）を含む融合タンパク質を操作する方法であって、該融合タンパク質と、標識を有する基質とを接触させる結果、ＡＧＴが標識を、それが該融合タンパク質に共有結合させるように移転すること、および融合タンパク質を、標識によって融合タンパク質に導入された物理学的および／または化学的特性を用いて操作することを含む方法を提供する。
【００１１】
本発明のこの態様のいくつかの実施態様では、該方法は、標識を用いてタンパク質構成体を検出することを含んでよい。
【００１２】
さらに一つの態様では、本発明は、対象となるタンパク質およびＯ6−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）を含む融合タンパク質を固体支持体に固定化する方法であって、該融合タンパク質を、固体支持体に結合されるか、または結合され得る、標識を有する基質に接触させ、ＡＧＴが標識を、それが該融合タンパク質に共有結合させるように移転し、そのため、該融合タンパク質が固体支持体に結合されるか、またはその後に結合することができることを含む方法を提供する。本発明の、標識を初めに固体支持体に結合させない実施態様では、該方法は、標識付けられた融合タンパク質を固体支持体に接触させる結果、それが固体支持体上で固定化される工程をさらに含んでよい。本発明のこの態様のこの好ましい実施態様では、標識が移転されたときか、またはその後の反応の際のいずれかに、標識は、共有結合で固体支持体に結合してよいか、あるいは特異的結合対の一方の成員であってよくて、その他方の成員が、共有結合によってか、またはその他の手段によって（例えば、ビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジンの結合対を用いて）該固体支持体に結合されるか、もしくは結合され得る。
【００１３】
さらに一つの態様では、本発明は、ＡＧＴ融合タンパク質をインビボとインビトロとの双方で標識付けする方法を提供する。ＡＧＴ融合タンパク質のインビボ標識付けという用語は、細胞のすべての区画内での標識付けはもとより、細胞外空間を指向するＡＧＴ融合タンパク質の標識付けも含む。ＡＧＴ融合タンパク質の標識付けをインビボで実施し、ＡＧＴに融合されたタンパク質が原形質膜タンパク質であるならば、融合タンパク質のＡＧＴ部分は、原形質膜の細胞質側または細胞外側のいずれにも結合することができる。標識付けをインビトロで実施するならば、融合タンパク質の標識付けは、細胞抽出物中でか、またはＡＧＴ融合タンパク質の精製された形態もしくは富化された形態のいずれで実施することもできる。
【００１４】
さらに一つの態様では、本発明は、候補化合物または候補化合物のライブラリーと、標的物質または標的物質のライブラリーとの相互作用を決定する方法を提供する。該化合物および物質の例は、リガンドおよびタンパク質、薬物および該薬物の標的、または小分子およびタンパク質を含む。この方法では、ＡＧＴに融合した対象となるタンパク質は、転写因子のＤＮＡ結合ドメイン、または転写因子の活性化ドメインを含み、標的物質または標的物質のライブラリーを、該ＤＮＡ結合ドメインの他方、または該転写因子の活性化ドメインに結合させ、かつ標識が、標的物質と作用し合うと想定される候補化合物または候補化合物のライブラリーである。
【００１５】
好ましい実施態様では、該方法は、候補化合物または候補化合物のライブラリーを、ＡＧＴタンパク質融合に移転すること、および候補化合物で標識付けしたＡＧＴ融合タンパク質と、標的物質とを接触させる結果、ＡＧＴ融合タンパク質に結合した候補化合物と、標的物質との相互作用が、転写因子を活性化することをさらに含む。そうして、活性化された転写因子は、リポーターの発現を駆動し、それは、該方法を細胞内で実施するならば、リポーターの発現が細胞に選択的な利点を与えた場合に、検出することができる。いくつかの実施態様では、該方法は、候補化合物または標的物質を検出、単離、同定または特性評価することのような、追加的な一つもしくはそれ以上の工程を包含してもよい。
【００１６】
本願では、Ｏ6−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼまたは「ＡＧＴ」は、基質に存在する標識を、融合タンパク質のＡＧＴ形成部分のシステイン残基の一つに移転するという特性を有する。好ましい実施態様では、ＡＧＴは、Ｏ6−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ、例えば、Peggら（1995）およびその中の引用文献に記載されている、ヒトＯ6−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼである。しかし、他のアルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ、例えばRoyら（1995）に記載されているこの酵素のマウスまたはラット形態も公知であって、それらが上に定義された特性を有することを条件に、本発明に用いることができる。本発明では、Ｏ6−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼは、一つまたはそれ以上のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加によって異なり得るが、基質に存在する標識を、融合を形成しているＡＧＴまたはタンパク質もしくはペプチドに移転するという特性は依然として保持している、野生型ＡＧＴの変種も含む。ＡＧＴのその他の変種は、当業者には周知の手法を用いて化学的に改質してもよい。ＡＧＴの変種は、当業者に公知のタンパク質工学の手法を用い、かつ／または新たなＯ6−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼを発生かつ選択する分子的進化を用いて、生成してよい。
【００１７】
本発明では、融合タンパク質のＡＧＴを有するタンパク質部分の基準は、いかなる長さのタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドを含み、かつ二次、三次または四次構造を保有するものと保有しないものとの双方を含む。本発明の適用の例を下記に示す。
【００１８】
本発明では、標識付け基質は、好ましくは、標識付けベンジルグアニン基質であり、より好ましくは、Ｏ6−ベンジルグアニン誘導体である。そのような誘導体の例は、下記の一般式：
【００１９】
【化３】
【００２０】
［式中、
Ｒ1は、プロトン、β−Ｄ−２′−デオキシリボシル、またはオリゴデオキシリボヌクレオチドの一部であり、好ましくは２〜９９ヌクレオチドの長さを有するβ−Ｄ−２′−デオキシリボシルであり；
【００２１】
Ｒ2は、リンカー基、例えば、置換または非置換アルキル鎖、ポリエチレングリコールのような柔軟なリンカーであり；そして
【００２２】
labelは、本明細書に記載されたとおりの、融合タンパク質を検出かつ／または操作する原因となる分子である］
を有する、ベンジル環の４位が誘導体化された、Ｏ6−ベンジルグアニン誘導体である。
【００２３】
本発明に従って用いるのに適した改質Ｏ6−ベンジルグアニン誘導体の例を、図１に示す。さらに、本発明者らは、ＡＧＴが、基質の同一性におけるかなりの程度の自由度を許容して、下記の一般式：
【００２４】
【化４】
【００２５】
［式中、
Ｒ1は、ＡＧＴによって受容されて、ＡＧＴが標識をタンパク質の融合へと移転するのを許す基、例えば、置換もしくは非置換アルキル鎖、環の大きさが３〜１０炭素の置換もしくは非置換シクロアルキル基、環の大きさが３〜１０炭素の置換もしくは非置換複素環、または環の大きさが３〜１０炭素の置換もしくは非置換芳香族複素環であり；
【００２６】
Ｒ2は、リンカー基、例えば、置換もしくは非置換アルキル鎖、またはポリエチレングリコールのような、様々な長さの柔軟なリンカーであり；そして
【００２７】
Ｒ3は、プロトン、β−Ｄ−２′−デオキシリボシル、または好ましくは２〜９９ヌクレオチドの長さを有する、オリゴデオキシリボヌクレオチドの一部であるβ−Ｄ−２′−デオキシリボシルであり；
【００２８】
labelは、本明細書に記載されたとおりの、融合タンパク質を検出かつ／または操作する原因となる分子である］
を有する、広範囲の基質が用いられるのを可能とすることができることを見出した。
【００２９】
基質の標識部分は、融合タンパク質が意図される適用に応じて、当業者が選ぶことができる。標識の例は、下記のものを含む：
【００３０】
（１）発蛍光団、発色団、磁気プローブまたは造量剤のような、分光学的プローブ；
【００３１】
（２）放射性標識付け分子；
【００３２】
（３）パートナーに特異的に結合できる特異的結合対の一方の部分である分子。そのような特異的結合対は、当技術に周知であり、例えば、アビジンまたはストレプトアビジンに結合することができるビオチンを含む；
【００３３】
（４）その他の生体分子と作用し合うと思われる分子；
【００３４】
（５）その他の生体分子と作用し合うと思われる分子のライブラリー；
【００３５】
（６）当業者に公知のとおり［Nadeau et al., 2002］、その他の生体分子と架橋結合できる分子；
【００３６】
（７）束縛された金属キレートのような［Hori et al., 2002］、Ｈ2Ｏ2およびアスコルビン酸塩に接触するとヒドロキシルラジカルを発生できる分子（最終原稿を確認されたい）；
【００３７】
（８）マラカイトグリーンのような［Jay et al., 1999］、光を照射すると反応性ラジカルを発生できる分子；
【００３８】
（９）スライドグラス、微量滴定プレート、または一般に当業者に公知のいかなる重合体であってもよい、固体支持体に共有結合させる分子；
【００３９】
（１０）その相補鎖との塩基対合をなし得る核酸またはその誘導体；
【００４０】
（１１）脂質、または他の膜挿入特性を有する疎水性分子；
【００４１】
（１２）望ましい酵素的、化学的または物理的特性を有する生体分子；
【００４２】
（１３）上記に列挙された特性のいずれかの組合せを保有する分子。
【００４３】
例示のために、ここで、本発明の実施態様を、添付の図面を参照して、より詳しく説明する。
【００４４】
詳細な説明
本発明の下記の適用は、例示のために提供され、限定のためではない。本明細書に開示された方法は、一般的には、ある範囲の応用に適用することができ、融合タンパク質を、（１）標識付けられた融合タンパク質の環境における変化を感知かつ誘導できる標識、ならびに／または（２）標識が融合タンパク質に特異的に導入した物理および／もしくは化学的特性によって融合タンパク質を操作する助けとなる標識で、融合タンパク質を特異的に、かつ共有結合で標識化することができる。本明細書に開示された方法は、インビボとインビトロとの双方で、ＡＧＴ融合タンパク質を標識付けするのに用いることができる。
【００４５】
本発明は、所望のタンパク質への標識の特異的な結合は、問題のそのタンパク質と、ヒトのＤＮＡ修復酵素であるＯ6−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ｈＡＧＴ）のようなＯ6−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼとの間の融合タンパク質を構成し、後者の機序を利用することによって、実施することができるとの理解に基づく。この酵素は、アルキル基を、その基質、すなわちＯ6−アルキルグアニン−ＤＮＡからそのシステイン残基の一つに不可逆的に移転する（図１）。ｈＡＧＴと急速に反応する基質類似体は、Ｏ6−ベンジルグアニンであって、二次速度定数は、約１０3秒-1M-1である（図１）。本発明者らは、Ｏ6−ベンジルグアニンのベンジル環のＣ４での置換が、Ｏ6−ベンジルグアニン誘導体に対するｈＡＧＴの反応性に有意には影響しないことを示した。これは、標識付けられたＡＧＴ融合タンパク質をインビボまたはインビトロで、共有結合によって特異的に結合するのに、標識がベンジル環のＣ４に結合したＯ6−ベンジルグアニン誘導体を用いることを可能にする（図１Ｄ）。標識付けは、融合タンパク質の性質には無関係である。
【００４６】
標識付けをインビボまたは細胞抽出物中で実施するならば、宿主の内在ＡＧＴの標識付けを考慮に入れるのが好都合である。宿主の内在ＡＧＴがＯ6−ベンジルグアニン誘導体または関連化合物を基質として受容しないならば、融合タンパク質の標識付けは特異的である。哺乳動物細胞（ヒト、マウス、ラット）では、内在ＡＧＴの標識付けは可能である。内在ＡＧＴとＡＧＴ融合問題との同時標識付けが問題を提起する、これらの実験では、以前に記載したＡＧＴ欠乏細胞系を用いることができる［Kaina et al., 1991］。一般的には、本発明は、融合タンパク質との標識の共有結合による特異的な結合を用いて、ＡＧＴ融合タンパク質の挙動を監視するか、もしくはそれに影響を与えるか、または導入された標識によってＡＧＴ融合タンパク質を操作する手法のすべての適用に利用することができる。この技術を用いるための適用の例を、以下に述べる。
【００４７】
（１）分光学的プローブまたはリポーター基としての標識
ＡＧＴに移転できる、検出可能な標識、例えば発蛍光団、発色団、磁気プローブ、放射性標識付け分子またはその他のいかなる分光学的プローブをも基質が担持する、標識付けＡＧＴ基質、例えばＯ6−ベンジルグアニン誘導体の使用は、本発明を、検出できる標識を細胞内、細胞表面（インビボ）またはインビトロのいずれかでＡＧＴ融合タンパク質に特異的に共有結合によって結合するのに用いることを可能とする。これは、ＡＧＴ融合タンパク質のインビボまたはインビトロでの検出および特性評価を可能とする。インビボという用語は、細胞のすべての区画内での標識付けはもとより、細胞外空間を指向するＡＧＴ融合タンパク質の標識付けも含む。この方法は、対象となるタンパク質にやはり遺伝学的に融合され、生細胞内でのその探索を可能とする、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の適用と対比することができる。ＧＦＰおよびその突然変異体の短所は、それが、主として、自然に産する発蛍光団の使用に限られることである。
【００４８】
（２）ＡＧＴ融合タンパク質を検出かつ単離するためのタグとしての標識
ビオチンのような親和性タグで標識付けしたＡＧＴ基質、例えばＯ6−ベンジルグアニン誘導体の使用は、親和性タグをＡＧＴ−タンパク質融合に移転し、そのため親和性タグの結合パートナーによって、融合タンパク質を結合するのに、本発明を用いることを可能にする。例としては、ビオチンのような親和性タグで標識付けしたＡＧＴ基質を、ＡＧＴ融合タンパク質を発現する（細菌性または真核性の）細胞にか、またはそのような細胞の細胞抽出物、もしくは精製されたＡＧＴ融合タンパク質に付加することは、親和性タグによる融合タンパク質の共有結合的修飾へと導くことになる。そうして、これは、親和性タグとその結合パートナー、例えばビオチンの場合、固定化されたアビジンまたはストレプトアビジンとの間の相互作用を用いる、融合タンパク質の単離を可能にする。標識を、切断できる結合、例えばジスルフィド架橋を含有するリンカーを介してＡＧＴ融合タンパク質に結合するか、またはリンカーが光切断できるならば、ＡＧＴ融合タンパク質は、親和性タグから、その単離後に遊離させることができる。
【００４９】
（３）反応性ラジカルの源泉としての標識
ＡＧＴ基質、例えばＯ6−ベンジルグアニン誘導体は、外部刺激に触れると反応性ラジカル、例えばヒドロキシルラジカルを発生できる、ＡＧＴ融合タンパク質に、標識を導入するのに用いることができる。そうして、発生したラジカルは、ＡＧＴ融合タンパク質はもとより、ＡＧＴ融合タンパク質のごく近傍にあるようなタンパク質も不活性化することができて、これらのタンパク質の役割の研究を可能にする。そのような標識の例は、Ｈ2Ｏ2やアスコルビン酸塩に接触するとヒドロキシルラジカルを生ずる、束縛された金属−キレート錯体、およびレーザー照射されるとヒドロキシルラジカルを生ずるマラカイトグリーンのような、発色団である。ヒドロキシルラジカルを発生させるのに発色団やレーザーを用いることは、レーザー分子不活性化法（ＣＡＬＩ）として当技術で公知である［Jay et al., 1998］。ＣＡＬＩは、細胞内の一定のタンパク質を、時間的に制御され、空間的に分解された方式で、特異的に不活性化するのに用いられる方法であり、発色団およびタンパク質の空間的近傍を基礎にしている。レーザー照射されると、発色団は、ヒドロキシルラジカルを発生し、それが、発色団内、およびそのわずか約０．１nm以内のすべてのタンパク質を不活性化する。従来、発色団は、対象となるタンパク質の空間的近傍に、対象となるタンパク質に特異的な発色団標識付け抗体を微量注入することによって近付けている。本発明では、マラカイトグリーンのような発色団によるＡＧＴ融合タンパク質の標識付け、およびその後のレーザー照射は、ＡＧＴ融合タンパク質はもとより、ＡＧＴ融合タンパク質と作用し合うようなタンパク質も、時間的に制御され、空間的に分解された方式で不活性化するのを可能にすると思われる。この方法は、インビボまたはインビトロの双方で適用することができる。
【００５０】
同様にして、ＡＧＴ融合タンパク質は、束縛された金属−キレートで標識付けすることができ、ＡＧＴ融合タンパク質、およびＡＧＴ融合タンパク質と作用し合うようなタンパク質は、Ｈ2Ｏ2およびアスコルビン酸塩に接触させると、特異的な方式で不活性化することができる。この方法は、ＡＧＴ融合タンパク質、またはＡＧＴ融合タンパク質のごく近傍にあるそれの機能を調べることばかりでなく、ＡＧＴ融合タンパク質のごく近傍にあるようなタンパク質を同定することにも用いることができる。ここで、ＡＧＴ融合タンパク質のごく近傍にあるタンパク質は、該タンパク質のフラグメントの特異的な抗体による検出、高分離能２Ｄ電気泳動ゲル上のこれらのタンパク質の消滅、または切断されたタンパク質フラグメントの、分離、および質量分析法もしくはＮ末端分解によるタンパク質配列決定のような配列決定手法による同定のいずれかによって同定されるようなものとして同定することができる。
【００５１】
（４）タンパク質−タンパク質相互作用を仲介するリガンドとしての標識
標識付けられたＡＧＴ基質、例えばＯ6−ベンジルグアニン誘導体は、リガンドをＡＧＴ−タンパク質融合に移転するのに用いることができる。これは、リガンドのパートナー、例えばタンパク質をＡＧＴ−タンパク質融合に結合するのを可能にする。例えば、標識が、結合パートナーに結合できるリガンドである場合、そのような基質とＡＧＴ融合タンパク質とを接触させることは、融合タンパク質とのリガンドの特異的結合へと導くことになる。リガンドが、もう一つのタンパク質Ｙに結合し、タンパク質Ｙと標識付けられたＡＧＴ融合タンパク質との二量体化が、生物学的機能、または測定できるシグナルへと導くならば、この生物学的機能または測定可能シグナルは、標識を担持するＡＧＴ基質の付加に依存する。具体的な例は、小分子で遺伝子発現を調節するための、Hoら、1996が記載した、いわゆる三雑種系におけるＡＧＴ基質およびＡＧＴ融合タンパク質の使用であると思われる。この場合は、ＡＧＴを、転写因子のＤＮＡ結合ドメインに融合させる。リガンド、例えばＦＫ５０６に結合するタンパク質Ｙ、例えばＦＫＢＰを、転写因子の活性化ドメインに結合させる。リガンド、この例ではＦＫ５０６を担持するＡＧＴ基質を細胞に供給することが、機能的な転写因子の形成、および遺伝子発現へと導くことになる。
【００５２】
（５）その標的が未知である薬物または生物学的活性分子としての標識
標識を担持し、その標識が、未だ同定されていないタンパク質Ｙに結合する薬物または生物学的活性小分子である、Ｏ6−ベンジルグアニン誘導体または関連ＡＧＴ基質の使用。ここでは、目標は、生物学的活性分子の標的であるタンパク質Ｙを同定することになると思われる。この場合は、ＡＧＴを、転写因子のＤＮＡ結合ドメインに融合させる。未知の標的タンパク質Ｙを発現する生物のｃＤＮＡライブラリーを、転写因子の活性化ドメインに融合させる。標識を担持し、その標識が薬物または生物学的活性小分子である、Ｏ6−ベンジルグアニン誘導体または関連ＡＧＴ基質の付加が、この分子が、ｃＤＮＡライブラリー内に存在し、活性化ドメインに融合した、その標的タンパク質Ｙに結合する場合にのみ、機能的転写因子の形成、および遺伝子発現へと導くことになる。遺伝子発現を選択的な利点に結び付けるならば、該薬物または生体活性分子の標的遺伝子Ｙを有するプラスミドを担持する、対応する宿主を同定することができる。
【００５３】
（６）タンパク質Ｙに結合する分子を同定するための小分子のライブラリーとしての標識
標識を担持し、その標識が、化学的分子のライブラリーである、Ｏ6−ベンジルグアニンまたは関連ＡＧＴ基質の使用：ここでは、目標は、インビボ条件下でタンパク質Ｙに結合する、潜在的な薬物標的であり得る小分子を同定することになると思われる。この場合は、ＡＧＴを、転写因子のＤＮＡ結合ドメインに融合させる。標的タンパク質Ｙを、転写因子の活性化ドメインに融合させる。標識として結合させた小分子のライブラリーを、Ｏ6−ベンジルグアニン誘導体に付加することが、標識（すなわち小分子）が、活性化ドメインに融合したその標的タンパク質Ｙに結合する場合にのみ、機能的転写因子の形成、および遺伝子発現へと導くことになる。遺伝子発現を選択的な利点に結び付けるならば、ライブラリーの、宿主の成長へと導くような分子を同定することができる。
【００５４】
（７）ＡＧＴ融合タンパク質を固定化し、かつ／またはＡＧＴ融合タンパク質のタンパク質アレーを創出するためのＢＧ誘導体の使用
標識を担持し、その標識が、担体の表面に共有結合で結合されているか、または該標識が、それ自体該表面に結合されたもう一つの分子によって非共有結合で結合され得る分子である、Ｏ6−ベンジルグアニン誘導体または関連ＡＧＴ基質の使用。後者の取組み方についての例は、標識がビオチンであり、表面に結合された分子がストレプトアビジンまたはアビジンである場合である。担体についてのあり得る例は、スライドガラス、微量滴定プレート、または機能化された任意の重合体のいずれかでもあると思われる。標識によるＡＧＴ基質の固定化は、標識の融合タンパク質への移転によって、担体へのＡＧＴ融合タンパク質のその後の固定化を可能にする。空間的に分解された方式での（異なる）ＡＧＴ融合タンパク質の担体でのスポット形成は、タンパク質アレーの生成を可能にする。
【００５５】
（８）ＡＧＴ融合タンパク質と作用し合うタンパク質を検出するための架橋結合剤としての標識
標識を担持し、その標識が、他のタンパク質と架橋結合することができる分子である、Ｏ6−ベンジルグアニン誘導体または関連ＡＧＴ基質の使用。そのような架橋結合剤の例は、マレイミド、活性エステルまたはアジ化物およびその他の、当業者に公知であり、Nadeauら、2002に記載されたもののような、官能基を含有する分子である。そのようなＡＧＴ基質を、他のタンパク質と作用し合うＡＧＴ融合タンパク質と（インビボまたはインビトロで）接触させることは、ＡＧＴ融合タンパク質と、標識を介して作用し合うそのタンパク質との共有結合での架橋結合へと導くことができる。これは、ＡＧＴ融合タンパク質と作用し合うタンパク質の同定を可能にする。
【００５６】
実施例
下記の実施例は、本発明を実施する方法の完全な開示および記載を当業者に提供するために説明するもので、本発明の対象範囲を限定することを意図するものではない。
【００５７】
実施例Ａ：大腸菌におけるＡＧＴ融合タンパク質の共有結合による標識付け
下記の例、すなわちＢＧ−Ｂｔを用いた、大腸菌におけるＰｅｐ−ｈＡＧＴの標識付けは、大腸菌におけるｈＡＧＴ融合タンパク質の共有結合による標識付けの実施可能性を立証した。ｈＡＧＴのＮ末端に融合したペプチド（Ｐｅｐ−ｈＡＧＴを生じる）の配列は、（一字コードでは）ＭＨＨＨＨＨＨＳＳＡであって、ｈＡＧＴの最初のアミノ酸である、メチオニンがこれに続く。Ｎ末端融合ペプチドを有するｈＡＧＴ、すなわちＰｅｐ−ｈＡＧＴをコーディングしている、ｐＥＴ−１５ｂ（Novagen）に基づく発現ベクターを含有するＸＬ−１Blueという大腸菌細胞の液体培養物を、０．６の光学的密度ＯＤ600nmまで増殖させた。ＩＰＴＧを１mMの最終濃度までを加えることによって、Ｐｅｐ−ｈＡＧＴの発現を誘導した。同時に、ＢＧ−Ｂｔを１０μMの最終濃度まで加え、細菌を３７℃で２時間温置した。細胞を遠心分離によって採集し、ペレットを２回洗浄して、過剰なＢＧ−Ｂｔを除去した。再懸濁させた細胞のアリコートを、ウエスタンブロット分析によって分析した。ビオチニル化タンパク質を、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ複合体（NEN）および化学発光性ペルオキシダーゼ基質（Renaissance reagent plus, NEN）を用いて検出した（図２）。
【００５８】
実施例Ｂ：酵母におけるＡＧＴ融合タンパク質の共有結合による標識付け
下記の実施例は、酵母におけるｈＡＧＴ融合タンパク質の共有結合による標識付けの実施可能性を立証した。ここでは、ＢＧ−Ｂｔを用いて、ｈＡＧＴ−ＤＨＦＲ−ＨＡという融合タンパク質を酵母中でビオチニル化した。この融合タンパク質は、標準的な分子生物学の手順を用いて、ＤＮＡレベルで構成される。略述すると、ｈＡＧＴの停止コドンを、アミノ酸ＲＳＧＩに対するコドンで置き換え、次いで、マウスからのＤＨＦＲの第１アミノ酸、すなわちメチオニンに対するコドンで後続させた［Nunberg et al., 1980］。ｈＡＧＴとＤＨＦＲとの間のリンカーに対するコドンは、ＢｇｌII部位もコード化していて、そのＤＮＡ配列は、AGATCTである。ＤＨＦＲとＨＡタグとの間の融合を構成するために、ＤＨＦＲの停止コドンを、ＨＡ−タグの第１アミノ酸に対するコドンで置き換えた［Kolodziej, 1991］。ＨＡ−タグに停止コドンを後続させた。ｈＡＧＴ−ＤＨＦＲ−ＨＡというタンパク質がｐcup1プロモーターの制御下にある、発現ベクターｐ３１４ＡＫ１を含有する、Ｌ４０という酵母細胞の培養を、０．６のＯＤ600まで増殖させた。ｈＡＧＴ−ＤＨＦＲ−ＨＡの発現は、ＣｕＳＯ4を１００μMの濃度まで加えることによって誘導し、ＢＧ−Ｂｔを、１０μMの濃度まで同時に加えた。２．５時間および５時間後にアリコートを採取し、遠心分離によって、細胞を採集した。ペレットを２回洗浄して、残留ＢＧ−Ｂｔを除去した。凍結／融解周期の循環によって酵母細胞を溶解した後、細胞抽出物を、ＥＬＩＳＡを用いて、ビオチニル化ｈＡＧＴ−ＤＨＦＲ−ＨＡ融合タンパク質の存在について分析した。略述すると、ビオチニル化ｈＡＧＴ−ＤＨＦＲ−ＨＡを、ストレプトアビジン被覆した微量滴定ウェル内に固定化し、抗ＨＡ抗体（Babco）を一次抗体として、かつ抗マウスＨＲＰ複合体（Sigma）を二次抗体として用いることによって検出した（図１）［Kolodziej, 1991］。ＥＬＩＳＡは、ペルオキシダーゼ基質ＡＢＴＳを用いて展開し、シグナル（吸光度）をＯＤ405nmで測定した。インビボビオチニル化ｈＡＧＴ−ＤＨＦＲ−ＨＡ融合タンパク質についてのシグナルは、バックグラウンドを少なくとも５倍上回った。バックグラウンドシグナルは、厳密に上記のとおり処理したが、ＢＧ−Ｂｔの添加を省いた細胞から得られた、細胞溶解物のＯＤ405nmとして定義した。
【００５９】
実施例Ｃ：酵母におけるｈＡＧＴ融合タンパク質の共有結合による標識付け
下記の実施例は、酵母におけるｈＡＧＴ融合タンパク質の共有結合による標識付けの実施可能性を立証した。ここでは、ＢＧ−ＤＩＧを用いて、ｈＡＧＴ−ＤＨＦＲ−ＨＡ融合タンパク質を酵母中でジゴキシゲニンで標識付けした。ｈＡＧＴ−ＤＨＦＲ−ＨＡ融合の構成は、実施例Ｂに記載されている。ｈＡＧＴ−ＤＨＦＲ融合タンパク質の遺伝子がｐcup1プロモーターの制御下にある、発現ベクターｐ３１４ＡＫ１を含有する、Ｌ４０という酵母細胞の培養を、１．２のＯＤ600nmまで増殖させた。ｈＡＧＴ−ＤＨＦＲ融合タンパク質の発現は、ＣｕＳＯ4を１００μMの濃度まで加えることによって誘導し、ＢＧ−ＤＩＧを、２０μMの濃度まで同時に加えた。２時間後、振盪フラスコ培養体１mlからの細胞を、遠心分離によって採集した。ペレットを培地で３回洗浄して、残留ＢＩＧ−ＤＩＧを除去した。凍結／融解周期の循環によって酵母細胞を溶解した後、細胞抽出物を、ジゴキシゲニン化ｈＡＧＴ−ＤＨＦＲ融合タンパク質の存在について、ウエスタンブロット分析によって分析した。ジゴキシゲニン化タンパク質は、抗ジゴキシゲニン−ペルオキシダーゼ複合体（Roche）、および化学発光性ペルオキシダーゼ基質（Renaissance reagent plus, NEN）を用いて検出した（図２）。
【００６０】
実施例Ｄ：ヒト細胞系におけるｈＡＧＴ融合タンパク質の共有結合による標識付け
下記の実施例は、哺乳動物細胞におけるＡＧＴ融合タンパク質の共有結合による標識付けの実施可能性を立証した。ここでは、ヒトの細胞（ＨＥＫ２９３）内の内在性ｈＡＧＴを、ＢＧ−ＡｃＦｃを用いてフルオレセインで標識付けした。ＨＥＫ２９３細胞を、５μMのＢＧ−ＡｃＦｃとともにＰＢＳ中に５分間温置した。アセチル化されたフルオレセイン誘導体であるＢＧ−ＡｃＦｃは、細胞浸透性であり、非蛍光性であるが、細胞内で急速に水解されて、蛍光性のＢＧ−Ｆｃを生じることが期待できる。次いで、細胞を、ＰＢＳを変えることによって洗浄して、いかなる過剰な基質ＢＧ−ＡｃＦｃも除去し、ＰＢＳ中に２０分間温置した。次いで、共焦点蛍光顕微鏡で画像を得た（励起４９２nm；発光５１０nm）。対照実験として、ＨＥＫ２９３細胞を上記のとおり処理したが、ＢＧ−ＡｃＦｃを加える前に、Ｏ6−ベンジルグアニン（１μM）とともに終夜温置した。これは、内在性ｈＡＧＴを不活性化し、そのため核内での蛍光の蓄積を防止するはずであった。期待されたとおり、細胞をＯ6−ベンジルグアニンとともに前温置したとき、核内での蛍光蓄積は、全く観察されなかった。ｈＡＧＴがＢＧ−Ｆｃを基質として受容することを、独立に確認するため、組換えＰｅｐ−ｈＡＧＴ（１０μM、実施例Ａに記載のとおり）を、１００μMのＢＧ−Ｆｃとともに２５℃で、５０mMトリス−Ｃｌ、１０mMＤＴＴ、１mMＥＤＴＡ、２００μg/mlのＢＳＡ、１０％グリセリン、pH７．４中で１０分間温置した後、ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水：１３７mMＮａＣｌ、２．７mMＫＣｌ、１０mMＮａ2ＨＰＯ4、１．８mMＫＨ2ＰＯ4、pH７．４）９００μlを加えた。過剰な基質ＢＧ−Ｆｃの分離は、ＮＡＰ（登録商標）−１０カラム（Pharmacia）で、供給者の指示によるゲル濾過によって達成した。次いで、Ｐｅｐ−ｈＡＧＴを、標準的な蛍光分光光度計で特性評価した。サンプルは、それぞれ、２２２、２３８および４９０nmで励起し、波長５２３nmで最大発光を示し、このタンパク質が、フルオレセインで標識付けられたことを確認した。ＰＢＳ中２０nMのＢＧ−Ｆｃの溶液を、参照として測定した。基質の発光波長は、５１９nmであった（励起は、それぞれ、２３７、３２３および４９０nm）。
【００６１】
実施例Ｅ：細胞抽出物中でのＡＧＴ融合タンパク質の共有結合による標識付け
ＡＧＴとの融合タンパク質は、細胞抽出物中では直接標識付けし、かつ操作（ここでは固定化）することができることを立証するため、下記のｈＡＧＴとのＮ−およびＣ−末端融合タンパク質を、標準的な分子クローニングの手順によって構成し、酵母の発現ベクター内にクローニングした：
【００６２】
（ｉ）Ｖ５−ＮＬＳ−Ｂ４２−ｈＡＧＴ（ここで、Ｖ５はＶ５エピトープを、ＮＬＳはＳＶ４０の大Ｔ抗原核局在配列を、またＢ４２は、人工転写活性化因子であるＢ４２［Ma et al., 1987］を意味する）。Ｂ４２のトランス活性化ドメインの最後のコドンに、２１アミノ酸の配列ASKKGTELGSTTSNGRQCAGILを後続させた。最後の３コドンは、Ｂ４２にｈＡＧＴをＣ末端クローニングするためのＥｃｏＲＩ部位を含んでいる。ＮｏｔＩ部位は、ｈＡＧＴに対するＣ末端制限部位であって、その配列は、停止コドンを含む；
【００６３】
（ii）ｈＡＧＴ−ＨＡ−Ｕｒａ３（ここで、Ｕｒａ３は、酵母の酵素オロチン酸デカルボキシラーゼを意味し、ＨＡは、Ｈａエピトープを意味する）。ここでは、ｈＡＧＴに対する停止コドンを、ＲＳリンカーで置き換え、ＨＡ−タグの最初のアミノ酸を後続させた。ＨＡ−タグは、Ｕｒａ３遺伝子が直接後続する；
【００６４】
（iii）ｈＡＧＴ−ＤＨＦＲ−ＨＡ（ここで、ＤＨＦＲは、マウスのジヒドロ葉酸レダクターゼを意味し、ＨＡは、Ｈａエピトープを意味する）。構成については、実施例Ｂを参照されたい；および
【００６５】
（iv）ＳＳＮ６−ｈＡＧＴ（ここで、ＳＳＮ６は、酵母のＤＮＡ転写リプレッサー［Schultz et al., 1987］を意味する）。ここでは、ｈＡＧＴの停止コドンを、アミノ酸ＲＳＧＳＧに対するコドンで置き換えて、そうして、酵母のＳＳＮ６の最初のアミノ酸、すなわちメチオニンに対するコドンが後続する。
【００６６】
遺伝子の発現は、すべて、ｐcup1プロモーターによって制御した。融合タンパク質の一つをコーディングしている発現ベクターを含有するＬ４０酵母細胞を、０．６のＯＤ600まで増殖させ、融合タンパク質の発現は、ＣｕＳＯ4を１００μMの濃度まで加えることによって誘導した。アリコート（２ml）を５時間後に採取し、遠心分離によって細胞を採集した。凍結／融解周期の循環によって細胞を溶解した後、酵母抽出物を、ＢＧ−Ｂｔ−ｏｌｉｇｏ（１０pmol）とともに室温で２０分間温置して、融合タンパク質のビオチニル化へと導いた。次いで、懸濁液を、ストレプトアビジン被覆した微量滴定プレート（Roche molecular biochemicals）内に移し、１時間温置した。ウェルをＰＢＳで徹底的に洗浄した後、固定化された融合タンパク質を、抗ＨＡ抗体（Babco）または抗ｈＡＧＴ抗体（ＳＳＮ６−ｈＡＧＴ融合タンパク質の場合）のいずれかを一次抗体として、かつ抗マウスペルオキシダーゼ複合体（Sigma、#A4416）を二次抗体として用い、次いで、標準的な生化学手順を用いて、ペルオキシダーゼの基質ＡＢＴＳとともに温置することによって、検出した。すべての場合に、ＯＤ405nmとして測定されたシグナルは、バックグラウンドを少なくとも５倍上回った。バックグラウンドは、各融合タンパク質について、ＢＧ−Ｂｔ−ｏｌｉｇｏの細胞抽出物への添加を省くことによって測定した。
【００６７】
参考文献
本明細書に引用された参考文献は、すべて、特に参照として組み込まれる。参考文献は、アルファベット順である。
【００６８】
【表１】
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】（Ａ）Ｏ6−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼの機序を示す図である。（Ｂ）Ｏ6−ベンジルグアニンの構造を示す図である。（Ｃ）実施例に用いたＯ6−ベンジルグアニン誘導体の一般的構造を示す図である。（Ｄ）ＡＧＴ融合タンパク質を標識付けする一般的スキームであって、Ｘは、ＡＧＴに融合させたタンパク質である。（Ｅ）実施例に用いたＡＧＴ基質の構造を示す図である。オリゴヌクレオチド（２２量体）の配列は、5′-GTGGTGGGCGCTGXAGGCGTGG-3′であって、Ｘ＝ＢＧ−Ｂｔである。
【図２】インビボでＡＧＴ融合タンパク質を標識付けした後のウエスタンブロット分析を示す図である。（Ａ）培地中にＢＧ−Ｂｔを含む場合と含まない場合の、Ｐｅｐ−ｈＡＧＴを発現する大腸菌の全細胞抽出物のウエスタンブロット分析。ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ複合体を用いて、ビオチニル化タンパク質を検出。２０kDの帯域は、ＢＧ−Ｂｔの不在下での大腸菌内でビオチニル化タンパク質に相当する。（Ｂ）培地中にＢＧ−ＤＩＧを含む場合と含まない場合の、ｈＡＧＴ−ＤＨＦＲ−ＨＡ融合タンパク質を発現する酵母の全細胞抽出物のウエスタンブロット分析。抗ジゴキシゲニン−ペルオキシダーゼ複合体を用いて、ジゴキシゲニン標識付けタンパク質を検出。
【図３】ＢＧ−ＡｃＦｃとともに温置し、蛍光および光学顕微鏡測定によって分析したＨＥＫ２９３細胞を示す図である。蛍光が細胞核に蓄積されているのを認めることができる。これは、ｈＡＧＴが核に局在するのが知られていることから［Ali et al., 1998］、期待された結果である。第三の図面は、蛍光および光学顕微鏡測定から得られた画像を重ね合わせたものである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象となるタンパク質およびＯ6−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）を含む融合タンパク質と、標識を有する基質とを接触させる結果、ＡＧＴが標識を、それが該融合タンパク質に共有結合させるように移転することを含む方法。
【請求項２】
さらに、融合タンパク質を標識を用いて検出することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
標識付けられた融合タンパク質をインビトロ系内で検出することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
インビトロ系内で、標識付けを細胞抽出物中でか、または融合タンパク質の精製もしくは富化された形態を用いて実施する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
標識付けられた融合タンパク質をインビボ系内で検出することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
インビボ系が細胞である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
さらに、対照配列に連結された融合タンパク質をコーディングしている核酸を含む発現ベクターで細胞を形質転換し、その発現を導くという最初の工程を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
さらに、標識付けられた融合タンパク質を、標識によって融合タンパク質に導入された特性を用いて操作することを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
対象となるタンパク質を、ＡＧＴのＮ−末端またはＣ−末端に融合させる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
Ｏ6−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼが、ヒトのＯ6−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
Ｏ6−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼが、マウスまたはラットのＯ6−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
Ｏ6−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼが、一つ以上のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加によってヒト、ラットまたはマウスＯ6−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼと異なるアミノ酸配列を有するが、基質に存在する標識をＡＧＴ−タンパク質融合に移転するという特性は保持している突然変異Ｏ6−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
標識を融合タンパク質のシステイン残基に共有結合で結合させる、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
標識付けられた基質を核酸分子に組み込む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
核酸分子が２〜９９ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
標識付けられた基質がベンジルグアニン基質である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
ベンジルグアニン基質が、ベンジル環のＣ４位が標識で置換されている、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
標識付けベンジルグアニン基質が、一般式：
【化１】
［式中、
Ｒ1は、プロトン、β−Ｄ−２′−デオキシリボシル、またはオリゴデオキシリボヌクレオチドの一部であるβ−Ｄ−２′−デオキシリボシルであり；
Ｒ2は、リンカー基であり；そして
labelは、融合タンパク質を検出かつ／または操作するのに用いられる基を表す］
で示される、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
リンカー基Ｒ2が、置換もしくは非置換アルキル鎖またはポリエチレングリコールである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
標識付けられたベンジルグアニン基質が、一般式：
【化２】
［式中、
Ｒ1は、ＡＧＴによって受容されて、ＡＧＴが標識をタンパク質融合へと移転するのを許す基であり；
Ｒ2は、リンカー基であり；
Ｒ3は、プロトン、β−Ｄ−２′−デオキシリボシル、またはオリゴデオキシリボヌクレオチドの一部であるβ−Ｄ−２′−デオキシリボシルであり；そして
labelは、融合タンパク質を検出かつ／または操作するのに用いられる基を表す］
で示される、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
Ｒ1が、置換もしくは非置換アルキル鎖、環の大きさが３〜１０炭素の置換もしくは非置換シクロアルキル基、環の大きさが３〜１０炭素の置換もしくは非置換複素環、または環の大きさが３〜１０炭素の置換もしくは非置換芳香族複素環である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
リンカー基Ｒ2が、置換もしくは非置換アルキル鎖またはポリエチレングリコールである、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
オリゴデオキシリボヌクレオチドが２〜９９ヌクレオチドの長さを有する、請求項１８〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
標識が、分光学的プローブ、親和性タグ、特異的な結合対の第二の成員に特異的に結合できる、特異的結合対の第一の成員、反応性ラジカルを発生できる分子、固相であるか、または固相に結合されるか、もしくは固相に結合され得る分子、候補化合物もしくは候補化合物のライブラリー、他の生体分子に架橋結合できる分子、その相補鎖と塩基対合をなし得る核酸もしくはその誘導体、脂質、あるいは膜挿入特性を有する疎水性分子のうち一つ以上である、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
分光学的プローブが、発蛍光団、染料もしくは造量剤、放射性標識付け分子、または磁気プローブである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
分光学的プローブを用いて、融合タンパク質をインビトロもしくはインビボで検出するか、または特性評価する、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
親和性タグがビオチン、アビジンまたはストレプトアビジンである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
親和性タグを、切断できるリンカーを介して融合タンパク質に結合する結果、該融合タンパク質を該親和性タグから遊離させることができる、請求項２４または２７に記載の方法。
【請求項２９】
親和性タグを、光切断できるリンカーを介して融合タンパク質に結合する結果、該融合タンパク質を親和性タグから遊離させることができる、請求項２４または２７に記載の方法。
【請求項３０】
融合タンパク質を、固体支持体に結合されるか、または結合され得る標識付け基質に接触させることによって、融合タンパク質を固定化することをさらに含んで、ＡＧＴが標識を、それが該融合タンパク質に共有結合で結合され、そのため、標識付けられた融合タンパク質が固体支持体に結合されるか、またはその後に結合され得るように移転する、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
さらに、標識を初めに固体支持体に結合させず、該方法が、標識付けられた融合タンパク質を固体支持体に接触させる結果、それが固体支持体上で固定化される工程を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
標識が特異的結合対の一方の成員であり、その他方の成員を、固体支持体に結合させるか、または結合させ得る、請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項３３】
特異的結合対がビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジンである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
標識を、該標識の移転によってか、またはその後の反応中に、固体支持体に共有結合で結合させる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
標識を、切断できるリンカーを介して融合タンパク質に結合する結果、該融合タンパク質を、固体支持体への固定化後に標識から遊離させることができる、請求項３０〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
標識を、光切断できるリンカーを介して融合タンパク質に結合する結果、該融合タンパク質を、固体支持体への固定化後に標識から遊離させることができる、請求項３０〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
対象となる複数のタンパク質を固体支持体に固定化することを含む、請求項３０〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
対象となるタンパク質を、整列させて固体支持体に固定化する、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
アレーが、複数の空間分解位置を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
固体支持体が、ガラスまたは重合体を含む、請求項３０〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
反応性ラジカルを発生できる分子が、反応性ヒドロキシルラジカルを発生する、請求項２４に記載の方法。
【請求項４２】
反応性ヒドロキシルラジカルを発生できる分子が、Ｈ2Ｏ2およびアスコルビン酸塩に接触するとラジカルを発生する、束縛された金属キレートである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
反応性ヒドロキシルラジカルを発生できる分子が、光を照射するとラジカルを発生する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
反応性ヒドロキシルラジカルを発生できる分子がマラカイトグリーンである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
ラジカルが、融合タンパク質、または融合タンパク質の近傍に位置するもう一つのタンパク質を不活性化する、請求項２４または４１〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
ラジカルが、タンパク質のフラグメント、または融合タンパク質の近傍に位置するもう一つのタンパク質を発生する、請求項４１〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
フラグメントの発生を、融合タンパク質のごく近傍のタンパク質の同定に用いる、請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
タンパク質またはもう一つのタンパク質の不活性化が、レーザー分子不活性化法（ＣＡＬＩ）を用いる、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
標識が、特異的結合対の第一の成員である、請求項２４に記載の方法。
【請求項５０】
さらに、融合タンパク質を、特異的結合対の第二の成員を含む分子に接触させることを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
特異的結合対の第一および第二の成員の相互作用または結合が、検出できる結果を生じる、請求項４９または５０に記載の方法。
【請求項５２】
特異的結合対の第一および第二の成員が、第一および第二のタンパク質、抗体および抗原、酵素および基質、またはリガンドおよび受容体である、請求項４９〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
ＡＧＴに融合した対象となるタンパク質が、転写因子のＤＮＡ結合ドメイン、または転写因子の活性化ドメインを含み、標的物質または標的物質のライブラリーを、該ＤＮＡ結合ドメインまたは該転写因子の活性化ドメインの他方に結合させ、かつ標識が、標的物質と作用し合うと想定される候補化合物または候補化合物のライブラリーである、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
候補化合物または候補化合物のライブラリー、および標的物質または標的物質のライブラリーが、リガンドおよびタンパク質、薬物および該薬物の標的、小分子およびタンパク質、ならびに酵素およびその基質または阻害剤から選択される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
候補化合物または候補化合物のライブラリーを、ＡＧＴタンパク質融合に移転することを含む、請求項５３または５４に記載の方法。
【請求項５６】
候補化合物で標識付けしたＡＧＴ融合タンパク質と、標的物質とを接触させる結果、ＡＧＴ融合タンパク質に結合した候補化合物と、標的物質との相互作用が、転写因子を再構成かつ活性化することをさらに含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
活性化された転写因子が、リポーターの発現を発動する、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
リポーターが、測定できるシグナルへとその活性が導くタンパク質、酵素または核酸である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
該方法が、細胞内で実施され、リポーターの発現が、選択的な利点を細胞に与える、請求項５３〜５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
ＡＧＴ融合タンパク質、および／またはＡＧＴタンパク質融合と作用し合う標的物質を単離することをさらに含む、請求項５３〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
標的物質と作用し合う候補化合物を検出かつ／または同定することをさらに含む、請求項５３〜６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
標識が、タンパク質を架橋結合することができる、請求項２４に記載の方法。
【請求項６３】
架橋結合する標識が、マレイミド基、エステル基またはアジド基を含む、請求項６２記載の方法。
【請求項６４】
融合タンパク質を、候補タンパク質の結合パートナーに接触させ、架橋結合する標識を反応させる結果、作用し合う融合タンパク質と候補タンパク質とが互いに共有結合させる、請求項６２または６３に記載の方法。
【請求項６５】
架橋結合した融合タンパク質および／または候補タンパク質を検出かつ／もしくは同定することをさらに含む、請求項６２〜６４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１】
対象となるタンパク質およびＯ6−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）を含む融合タンパク質と、標識を有する基質とを接触させる結果、ＡＧＴが標識を、それが該融合タンパク質に共有結合させるように移転することを含む方法。
【請求項２】
さらに、融合タンパク質を標識を用いて検出することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
標識付けられた融合タンパク質をインビトロ系内で検出することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
インビトロ系内で、標識付けを細胞抽出物中でか、または融合タンパク質の精製もしくは富化された形態を用いて実施する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
標識付けられた融合タンパク質をインビボ系内で検出することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
インビボ系が細胞である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
さらに、対照配列に連結された融合タンパク質をコーディングしている核酸を含む発現ベクターで細胞を形質転換し、その発現を導くという最初の工程を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
さらに、標識付けられた融合タンパク質を、標識によって融合タンパク質に導入された特性を用いて操作することを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
対象となるタンパク質を、ＡＧＴのＮ−末端またはＣ−末端に融合させる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
Ｏ6−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼが、ヒトのＯ6−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
Ｏ6−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼが、マウスまたはラットのＯ6−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
Ｏ6−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼが、一つ以上のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加によってヒト、ラットまたはマウスＯ6−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼと異なるアミノ酸配列を有するが、基質に存在する標識をＡＧＴ−タンパク質融合に移転するという特性は保持している突然変異Ｏ6−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
標識を融合タンパク質のシステイン残基に共有結合で結合させる、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
標識付けられた基質を核酸分子に組み込む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
核酸分子が２〜９９ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
標識付けられた基質がベンジルグアニン基質である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
ベンジルグアニン基質が、ベンジル環のＣ４位が標識で置換されている、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
標識付けベンジルグアニン基質が、一般式：
【化１】
［式中、
Ｒ1は、プロトン、β−Ｄ−２′−デオキシリボシル、またはオリゴデオキシリボヌクレオチドの一部であるβ−Ｄ−２′−デオキシリボシルであり；
Ｒ2は、リンカー基であり；そして
labelは、融合タンパク質を検出かつ／または操作するのに用いられる基を表す］
で示される、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
リンカー基Ｒ2が、置換もしくは非置換アルキル鎖またはポリエチレングリコールである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
標識付けられたベンジルグアニン基質が、一般式：
【化２】
［式中、
Ｒ1は、ＡＧＴによって受容されて、ＡＧＴが標識をタンパク質融合へと移転するのを許す基であり；
Ｒ2は、リンカー基であり；
Ｒ3は、プロトン、β−Ｄ−２′−デオキシリボシル、またはオリゴデオキシリボヌクレオチドの一部であるβ−Ｄ−２′−デオキシリボシルであり；そして
labelは、融合タンパク質を検出かつ／または操作するのに用いられる基を表す］
で示される、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
Ｒ1が、置換もしくは非置換アルキル鎖、環の大きさが３〜１０炭素の置換もしくは非置換シクロアルキル基、環の大きさが３〜１０炭素の置換もしくは非置換複素環、または環の大きさが３〜１０炭素の置換もしくは非置換芳香族複素環である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
リンカー基Ｒ2が、置換もしくは非置換アルキル鎖またはポリエチレングリコールである、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
オリゴデオキシリボヌクレオチドが２〜９９ヌクレオチドの長さを有する、請求項１８〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
標識が、分光学的プローブ、親和性タグ、特異的な結合対の第二の成員に特異的に結合できる、特異的結合対の第一の成員、反応性ラジカルを発生できる分子、固相であるか、または固相に結合されるか、もしくは固相に結合され得る分子、候補化合物もしくは候補化合物のライブラリー、他の生体分子に架橋結合できる分子、その相補鎖と塩基対合をなし得る核酸もしくはその誘導体、脂質、あるいは膜挿入特性を有する疎水性分子のうち一つ以上である、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
分光学的プローブが、発蛍光団、染料もしくは造量剤、放射性標識付け分子、または磁気プローブである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
分光学的プローブを用いて、融合タンパク質をインビトロもしくはインビボで検出するか、または特性評価する、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
親和性タグがビオチン、アビジンまたはストレプトアビジンである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
親和性タグを、切断できるリンカーを介して融合タンパク質に結合する結果、該融合タンパク質を該親和性タグから遊離させることができる、請求項２４または２７に記載の方法。
【請求項２９】
親和性タグを、光切断できるリンカーを介して融合タンパク質に結合する結果、該融合タンパク質を親和性タグから遊離させることができる、請求項２４または２７に記載の方法。
【請求項３０】
融合タンパク質を、固体支持体に結合されるか、または結合され得る標識付け基質に接触させることによって、融合タンパク質を固定化することをさらに含んで、ＡＧＴが標識を、それが該融合タンパク質に共有結合で結合され、そのため、標識付けられた融合タンパク質が固体支持体に結合されるか、またはその後に結合され得るように移転する、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
さらに、標識を初めに固体支持体に結合させず、該方法が、標識付けられた融合タンパク質を固体支持体に接触させる結果、それが固体支持体上で固定化される工程を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
標識が特異的結合対の一方の成員であり、その他方の成員を、固体支持体に結合させるか、または結合させ得る、請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項３３】
特異的結合対がビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジンである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
標識を、該標識の移転によってか、またはその後の反応中に、固体支持体に共有結合で結合させる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
標識を、切断できるリンカーを介して融合タンパク質に結合する結果、該融合タンパク質を、固体支持体への固定化後に標識から遊離させることができる、請求項３０〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
標識を、光切断できるリンカーを介して融合タンパク質に結合する結果、該融合タンパク質を、固体支持体への固定化後に標識から遊離させることができる、請求項３０〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
対象となる複数のタンパク質を固体支持体に固定化することを含む、請求項３０〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
対象となるタンパク質を、整列させて固体支持体に固定化する、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
アレーが、複数の空間分解位置を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
固体支持体が、ガラスまたは重合体を含む、請求項３０〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
反応性ラジカルを発生できる分子が、反応性ヒドロキシルラジカルを発生する、請求項２４に記載の方法。
【請求項４２】
反応性ヒドロキシルラジカルを発生できる分子が、Ｈ2Ｏ2およびアスコルビン酸塩に接触するとラジカルを発生する、束縛された金属キレートである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
反応性ヒドロキシルラジカルを発生できる分子が、光を照射するとラジカルを発生する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
反応性ヒドロキシルラジカルを発生できる分子がマラカイトグリーンである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
ラジカルが、融合タンパク質、または融合タンパク質の近傍に位置するもう一つのタンパク質を不活性化する、請求項２４または４１〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
ラジカルが、タンパク質のフラグメント、または融合タンパク質の近傍に位置するもう一つのタンパク質を発生する、請求項４１〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
フラグメントの発生を、融合タンパク質のごく近傍のタンパク質の同定に用いる、請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
タンパク質またはもう一つのタンパク質の不活性化が、レーザー分子不活性化法（ＣＡＬＩ）を用いる、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
標識が、特異的結合対の第一の成員である、請求項２４に記載の方法。
【請求項５０】
さらに、融合タンパク質を、特異的結合対の第二の成員を含む分子に接触させることを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
特異的結合対の第一および第二の成員の相互作用または結合が、検出できる結果を生じる、請求項４９または５０に記載の方法。
【請求項５２】
特異的結合対の第一および第二の成員が、第一および第二のタンパク質、抗体および抗原、酵素および基質、またはリガンドおよび受容体である、請求項４９〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
ＡＧＴに融合した対象となるタンパク質が、転写因子のＤＮＡ結合ドメイン、または転写因子の活性化ドメインを含み、標的物質または標的物質のライブラリーを、該ＤＮＡ結合ドメインまたは該転写因子の活性化ドメインの他方に結合させ、かつ標識が、標的物質と作用し合うと想定される候補化合物または候補化合物のライブラリーである、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
候補化合物または候補化合物のライブラリー、および標的物質または標的物質のライブラリーが、リガンドおよびタンパク質、薬物および該薬物の標的、小分子およびタンパク質、ならびに酵素およびその基質または阻害剤から選択される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
候補化合物または候補化合物のライブラリーを、ＡＧＴタンパク質融合に移転することを含む、請求項５３または５４に記載の方法。
【請求項５６】
候補化合物で標識付けしたＡＧＴ融合タンパク質と、標的物質とを接触させる結果、ＡＧＴ融合タンパク質に結合した候補化合物と、標的物質との相互作用が、転写因子を再構成かつ活性化することをさらに含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
活性化された転写因子が、リポーターの発現を発動する、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
リポーターが、測定できるシグナルへとその活性が導くタンパク質、酵素または核酸である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
該方法が、細胞内で実施され、リポーターの発現が、選択的な利点を細胞に与える、請求項５３〜５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
ＡＧＴ融合タンパク質、および／またはＡＧＴタンパク質融合と作用し合う標的物質を単離することをさらに含む、請求項５３〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
標的物質と作用し合う候補化合物を検出かつ／または同定することをさらに含む、請求項５３〜６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
標識が、タンパク質を架橋結合することができる、請求項２４に記載の方法。
【請求項６３】
架橋結合する標識が、マレイミド基、エステル基またはアジド基を含む、請求項６２記載の方法。
【請求項６４】
融合タンパク質を、候補タンパク質の結合パートナーに接触させ、架橋結合する標識を反応させる結果、作用し合う融合タンパク質と候補タンパク質とが互いに共有結合させる、請求項６２または６３に記載の方法。
【請求項６５】
架橋結合した融合タンパク質および／または候補タンパク質を検出かつ／もしくは同定することをさらに含む、請求項６２〜６４のいずれか１項に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００８−１５４５８７（Ｐ２００８−１５４５８７Ａ）
【公開日】平成２０年７月１０日（２００８．７．１０）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２００７−３２８７５７（Ｐ２００７−３２８７５７）
【出願日】平成１９年１２月２０日（２００７．１２．２０）
【分割の表示】特願２００２−５８２２７４（Ｐ２００２−５８２２７４）の分割
【原出願日】平成１４年４月５日（２００２．４．５）
【出願人】（５０３１８３２９３）ウペエフエル・エコル・ポリテクニック・フェデラル・ドゥ・ローザンヌ (11)
【氏名又は名称原語表記】ＥＰＦＬ ＥＣＯＬＥ ＰＯＬＹＴＥＣＨＮＩＱＵＥＦＥＤＥＲＡＬＥ ＤＥ ＬＡＵＳＡＮＮＥ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年７月１０日（２００８．７．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−３２８７５７（Ｐ２００７−３２８７５７）
【出願日】平成１９年１２月２０日（２００７．１２．２０）
【分割の表示】特願２００２−５８２２７４（Ｐ２００２−５８２２７４）の分割
【原出願日】平成１４年４月５日（２００２．４．５）
【出願人】（５０３１８３２９３）ウペエフエル・エコル・ポリテクニック・フェデラル・ドゥ・ローザンヌ (11)
【氏名又は名称原語表記】ＥＰＦＬ ＥＣＯＬＥ ＰＯＬＹＴＥＣＨＮＩＱＵＥＦＥＤＥＲＡＬＥ ＤＥ ＬＡＵＳＡＮＮＥ
【Ｆターム（参考）】
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