ＯＡＴＰ１Ｂ３ｍＲＮＡの新規な選択的スプライシングバリアント
【課題】新規ながんマーカーおよびその用途を提供する。より詳細には、新規ながんマーカー、当該がんマーカーの測定方法および測定用キット、これを用いたがんの検出方法、がんの検出用キット、がんの予防および／または治療剤のスクリーニング方法、並びに、がんワクチン等の医薬を提供する。
【解決手段】被検試料中のＯＡＴＰ１Ｂ３ ｍＲＮＡの選択的スプライシングバリアントの測定方法。当該測定方法は、生体から分離した被検試料中の、特定の塩基配列を含むｍＲＮＡを、他の塩基配列を含むｍＲＮＡと識別して測定することを含む。当該測定方法は、がんの検出やがんの予防および／または治療剤のスクリーニングに有用である。
【解決手段】被検試料中のＯＡＴＰ１Ｂ３ ｍＲＮＡの選択的スプライシングバリアントの測定方法。当該測定方法は、生体から分離した被検試料中の、特定の塩基配列を含むｍＲＮＡを、他の塩基配列を含むｍＲＮＡと識別して測定することを含む。当該測定方法は、がんの検出やがんの予防および／または治療剤のスクリーニングに有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規ながんマーカーに関する。より詳細には、本発明は、ＯＡＴＰ１Ｂ３ ｍＲＮＡの新規な選択的スプライシングバリアント、およびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
最近の医療技術の進歩により、がんの治療技術も大幅に改善されており、ある種のがんについては、死亡率の減少傾向を示すものもある。しかしながら、がんの発症を早期に発見することは、その治療効果に影響を与えるものであるため、がんの早期発見を可能にする方法の確立が望まれている。
【０００３】
がんの診断には、がん組織を超音波またはＸ線検査などにより視覚的に捉える方法のほか、患者から採取した組織を免疫組織学的手法により細胞形態等の異常を発見する方法、並びに、特定のがんの発症に伴い発現に変化が生じるタンパク質または遺伝子などのいわゆるがんマーカーの動態を検出する生化学的、免疫化学的方法などが知られている。
【０００４】
これらの方法において、組織を免疫組織学的手法によりその形態を観察する方法は、組織の標本化が必要であるため、がんの発症の有無の確認に時間を要し、また、観察された形態からがんの発症の有無を見極めるためにはかなりの熟練が必要となる。
【０００５】
したがって、比較的簡便でかつ客観的にがん発症の有無を判断することができるがんマーカーを用いる方法の適用が、しばしばおこなわれるようになってきた。しかしながら、ヒトのがんの診断において使用されるがんマーカーの多くは、正常組織細胞にもある程度発現していることから、当該がんマーカーの発現の変動をがん化の指標として用いなくてはならないことが多く、誤診断の可能性が常に存在している。
【０００６】
したがって、がん発症の有無を客観的により正確に検出するために、非がん細胞にはその存在が認められず、がん化した細胞だけが産生する物質をがんマーカーとして用いることが望ましい。例えば膵臓がんを例に挙げると、現時点において膵臓がんには有効なスクリーニング検査法が存在しないため、がん症状が表れた時には手遅れになっていることが多く、膵臓がんの早期発見のためには膵臓がん特異的ながんマーカーの使用が必要とされている。
【０００７】
ところで、有機アニオン輸送ポリペプチド１Ｂ３（ＯＡＴＰ１Ｂ３；Organic Anion Transporting Polypeptide 1B3、遺伝子名SLCO1B3）は、細胞膜上に発現するトランスポーターであり、幅広い基質認識性を示し、抗がん剤を含む多くの化合物の細胞内取り込みを担っている。ＯＡＴＰ１Ｂ３は通常肝細胞に特異的に発現するが、他の臓器でもがん化に伴い発現が認められるようになる。これまで、乳がんおよび前立腺がんにおいてＯＡＴＰ１Ｂ３の発現や機能が患者の生存率に影響を及ぼすことが報告されている（非特許文献１および２を参照）。また、大腸がん細胞を用いた解析では、ＯＡＴＰ１Ｂ３の発現が細胞にアポトーシス抵抗性を付与するとの報告がある（非特許文献３を参照）。
【０００８】
以上のことから、ＯＡＴＰ１Ｂ３はがん細胞においてなんらかの役割を担っていると考えられる。このため、ＯＡＴＰ１Ｂ３の検出はがん治療における予後の診断や抗がん剤有効性診断に有用ながんマーカーとして期待されている。例えば、特許文献１には、ＬＳＴ−２（ＯＡＴＰ１Ｂ３の別名である）のＣ末端側細胞内ドメインを認識する抗ＬＳＴ−２モノクローナル抗体を用いて女性大腸がん患者のがん組織におけるＬＳＴ−２の発現を測定し、この測定値に基づいて当該患者の予後を予測する技術が開示されている。
【０００９】
しかしながら、がん細胞におけるＯＡＴＰ１Ｂ３の発現・機能については依然として不明な点が多く、がんマーカーとしての利用形態が十分に確立しているとはいえないのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００７−１１９３９０号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Muto et al. Human liver-specific organic anion transporter-2 is a potent prognostic factor for human breast carcinoma. (2007) Cancer Sci. 98:1570-6
【非特許文献２】Hamada et al. Effect of SLCO1B3 Haplotype on Testosterone Transport and Clinical Outcome in Caucasian Patients with Androgen-Independent Prostatic Cancer. (2008) Clin. Cancer Res. 14:3312-8
【非特許文献３】Lee et al. Overexpression of OATP1B3 confers apoptotic resistance in colon cancer. (2008) Cancer Res. 68:10315-23
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
上述したような従来技術に鑑み、本発明は、新規ながんマーカーおよびその用途を提供することを目的とする。より詳細には、本発明は、新規ながんマーカー、当該がんマーカーの測定方法および測定用キット、これを用いたがんの検出方法、がんの検出用キット、がんの予防および／または治療剤のスクリーニング方法、並びに、がんワクチン等の医薬を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上述した従来技術に鑑み、ＯＡＴＰ１Ｂ３の発現・機能のさらなる探索を目的として、鋭意研究をおこなった。その過程で、驚くべきことに：
（１）従来報告されているＯＡＴＰ１Ｂ３ ｍＲＮＡ（本明細書中、「ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔ」とも称する；「ｗｔ」とは野生型（Ｗｉｌｄ Ｔｙｐｅ）の意である）の選択的スプライシングバリアントが存在すること、
（２）この新たな選択的スプライシングバリアントが、がん細胞・組織において特異的に強く発現すること；および、
（３）この新たな選択的スプライシングバリアントから、いくつかのペプチドまたはタンパク質が発現しうること、
の３つの知見を得て（本明細書中、この選択的スプライシングバリアントを「ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔ」とも称する；「ｃｔ」とはがん型（Ｃａｎｃｅｒ Ｔｙｐｅ）の意である）、これらの知見に基づき、本発明を完成させるに至った。
【００１４】
すなわち、本発明の第１の形態によれば、被検試料中のＯＡＴＰ１Ｂ３ ｍＲＮＡの選択的スプライシングバリアントの測定方法が提供される。当該測定方法は、生体から分離した被検試料中の、配列表の配列番号：１で表される塩基配列を含むｍＲＮＡを、配列番号：２で表される塩基配列を含むｍＲＮＡと識別して測定することを含む。
【００１５】
この際、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔは、配列番号：１で表される塩基配列におけるエキソンＳＶの存在を指標として測定されることが好ましい（「エキソンＳＶ」についての詳細は後述する）。また、この測定は、例えば、エキソンＳＶを含む領域に設定したプライマーを一方のプライマーとして用いる核酸増幅法により、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔまたはそのｃＤＮＡの部分領域を特異的に増幅し、増幅産物を測定することを含む。なお、前記プライマーの塩基数は、好ましくは１５〜３５程度である。また、前記核酸増幅法は、好ましくはＲＴ−ＰＣＲ法である。
【００１６】
また、本発明の第２の形態によれば、以下の条件を満足する核酸を提供する：
（１）配列番号：１で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする；
（２）配列番号：２で表される塩基配列を含む核酸が共存する場合に、ストリンジェントな条件下で、当該核酸とはハイブリダイズしないか、または、当該核酸とハイブリダイズした場合であってもその３’末端がミスマッチとなる。
【００１７】
この際、当該核酸は、エキソンＳＶを含む領域とハイブリダイズすることが好ましい。また、当該核酸の塩基数は、好ましくは１０程度以上であり、より好ましくは１５〜３５程度である。さらに、当該核酸は、配列番号：１で表される塩基配列または当該塩基配列の部分領域と同じ塩基配列またはこれらの塩基配列のうち１０％以下の塩基が置換されてなる塩基配列からなることが好ましい。当該核酸は、ＯＡＴＰ１Ｂ３ ｍＲＮＡの選択的スプライシングバリアントの測定に好適に用いられる。この際、当該核酸は、好ましくは核酸増幅用のプライマー、またはプローブである。
【００１８】
さらに、本発明の第３の形態によれば、本発明の第２の形態により提供される核酸を含む、ＯＡＴＰ１Ｂ３ ｍＲＮＡの選択的スプライシングバリアントの測定用キットが提供される。
【００１９】
また、本発明の第４の形態によれば、がんの検出方法も提供される。当該検出方法は、本発明の第１の形態により提供される測定方法により、または、本発明の第３の形態により提供される測定用キットを用いて、生体から分離した被検試料中のＯＡＴＰ１Ｂ３ ｍＲＮＡの選択的スプライシングバリアントを測定することを含む。この際、配列番号：１で表される塩基配列を含むＯＡＴＰ１Ｂ３ ｍＲＮＡの選択的スプライシングバリアントを測定することが好ましい。また、当該検出方法において、がんは、大腸がんまたは膵臓がんであることが好ましい。
【００２０】
さらに、本発明の第５の形態によれば、がんの予防および／または治療剤のスクリーニング方法もまた、提供される。当該スクリーニング方法は、本発明の第１の形態により提供される測定方法により、または、本発明の第３の形態により提供される測定用キットを用いて、がん細胞を被検物質の存在下で培養して得られる培養細胞中のＯＡＴＰ１Ｂ３ ｍＲＮＡの選択的スプライシングバリアントを測定する工程と、得られた測定結果を、前記被検物質の非存在下における場合と比較および／または評価する工程とを含む。
【００２１】
そして、本発明の第６の形態によれば、配列番号：１で表される塩基配列を含む、ＯＡＴＰ１Ｂ３ ｍＲＮＡの選択的スプライシングバリアント自体もまた、提供される。本選択的スプライシングバリアントは、例えば、該バリアントを培養細胞等に導入し強制発現させることにより、がん化培養細胞等を作成し、本発明の第５の形態のスクリーニング方法にも利用できる。
【００２２】
また、本発明の第７の形態によれば、
（１）配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を含み、かつ、がん細胞またはがん組織において発現が増強するポリペプチド、あるいは、
（２）配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列において、１０％以下のアミノ酸が置換、欠失、および／または挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ、がん細胞またはがん組織において発現が増強するポリペプチドが提供される。当該ポリペプチドは、好ましくは、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
【００２３】
さらに、本発明の第８の形態によれば、第７の形態のポリペプチドをコードする核酸や、当該核酸を含む発現ベクター、当該発現ベクターで形質転換された細胞もまた、提供される。
【００２４】
また、本発明の第９の形態によれば、第７の形態のポリペプチドに結合する抗体や、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、または配列番号：１０で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、少なくとも１５塩基を有する核酸もまた、提供される。
【００２５】
そして、本発明の第１０の形態によれば、生体から分離した被検試料中の、上記第７の形態のポリペプチドの量を測定することを含む、がんの検出方法が提供される。この際、上記第９の形態の抗体を測定に用いることが好ましい。また、当該抗体を含む、がんの検出用キットも提供されうる。
【００２６】
本発明の第１１の形態では、医薬が提供される。当該医薬は、第７の形態のポリペプチドまたはその断片や、第８の形態の核酸またはその断片を含み、特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するためのものである。当該医薬は、好ましくはがんワクチンである。
【発明の効果】
【００２７】
本発明によれば、新規ながんマーカーとしてヒトＯＡＴＰ１Ｂ３ ｍＲＮＡの新規な選択的スプライシングバリアントが提供され、その測定方法、当該測定に利用可能な核酸、および当該測定方法を実施するための手段（測定用キット）が提供される。また、本発明によれば、新規ながんの検出方法も提供され、さらには、がんの予防および／または治療剤の新規なスクリーニング方法も提供される。そして、がんの検出に用いられうるポリペプチドやこれに結合する抗体、当該ポリペプチドの量を指標としたがんの検出方法、当該抗体を含むがんの検出用キット、がんワクチン等としての医薬などもまた、提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔのｃＤＮＡの塩基配列（配列番号：１）およびＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔのｃＤＮＡの塩基配列（配列番号：２）をアライメントした結果を示す図である。図１において、アステリスク（＊）は、２つの塩基配列間でヌクレオチドが一致していることを意味する。
【図２】ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を示す図である。
【図３】実施例の「５．ＳＬＣＯ１Ｂ３遺伝子の転写開始点の決定」において、ヒト大腸がん由来ｔｏｔａｌ ＲＮＡまたは白人種肝由来ｔｏｔａｌ ＲＮＡをテンプレートとしてＲＬＭ−５’−ＲＡＣＥ法をおこなった結果を可視化するためのアガロースゲル電気泳動の結果を示す写真である。
【図４】ヒトＳＬＣＯ１Ｂ３遺伝子の構造を示す模式図である。図４には、既知および新規の転写開始点の位置が示されている。また、実施例においてＲＴ−ＰＣＲをおこなった際に用いたプライマーセットがハイブリダイズする位置もそれぞれ矢印で示されている。
【図５】実施例の「６．ｃＤＮＡの作製およびＲＴ−ＰＣＲ法によるｍＲＮＡ発現解析」において、ＬＳ１８０細胞ｔｏｔａｌ ＲＮＡ、ＰＫ４５ｐ細胞、ヒト大腸がん／正常大腸ペアＲＮＡおよび白人種肝由来のｔｏｔａｌ ＲＮＡをテンプレートとしてＲＴ−ＰＣＲをおこなった結果を可視化するためのアガロースゲル電気泳動の結果を示す写真である。
【図６】実施例の「８．定量的リアルタイムＰＣＲによるｍＲＮＡ発現解析」の結果（ｍＲＮＡ発現プロファイル）を示すグラフである。図６のＡは、各組織・細胞におけるＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔの発現レベルを示す。また、図６のＢは、各組織・細胞におけるＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔの発現レベルを示す。さらに、図６のＣは、発現レベルの比（ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔのコピー数／ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔのコピー数）を示す。
【図７】ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔ上に存在する４つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を表す図である。ｃＤＮＡの塩基配列を上列に示し、下列にコードされるアミノ酸配列を示す。また、下線がＯＲＦを示し、太字ＡＴＧはＯＲＦの上流にある推定翻訳開始コドンを示す。コードされるアミノ酸配列において「ＧＦＰ」とあるのは、実施例で発現プラスミドを作製した際に緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする塩基配列を挿入した部位を示す。なお、フレーム２については、Ｎ末端２０アミノ酸をコードする領域の後にＧＦＰをコードする塩基配列を挿入して発現プラスミドを作製した。
【図８】実施例の「１０．リバーストランスフェクション」の結果を示すグラフである。なお、緑色はＧＦＰ由来の蛍光であり、赤色はトランスフェクションコントロールであるmCherry由来の蛍光である。また、両蛍光の重ね合わせをMergeとして示し、微分干渉像をPhaseとして示す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
ヒトＳＬＣＯ１Ｂ３遺伝子は、染色体１２ｐ１２上に位置する約１０６ｋｂｐの遺伝子であり、この遺伝子から、２７１２ｂｐ（１５エキソン）からなるＯＡＴＰ１Ｂ３ ｍＲＮＡ（ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔ；Ｒｅｆｓｅｑ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿０１９８４４）が転写される。既に報告されているこのＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔのｃＤＮＡの塩基配列を配列番号：２および図１に示す。このＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔは、７０２アミノ酸からなるタンパク質（ＯＡＴＰ１Ｂ３タンパク質；ＲｅｆＳｅｑ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿０６２８１８）をコードしている。このＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：３および図２に示す。なお、配列番号：２で表される塩基配列において、５’末端から１番目の塩基（本明細書中、「１ｎｔ」のように称する。他の位置の塩基も同様に５’末端から何番目に位置するかの数字にｎｔを付けて称する）から６１ｎｔまでがエキソン１、６２ｎｔ〜２１０ｎｔがエキソン２、２１１ｎｔ〜１９９１ｎｔがエキソン３〜エキソン１４であり、１９９２ｎｔ〜２７１２ｎｔがエキソン１５である。なお、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔのコード領域（ＣＤＳ；Coding Sequence）は、エキソン２〜エキソン１５に跨る１２７〜２２３５ｎｔ（終止コドンＴＡＡを含む）であり、図１において大文字で表記されている。一方、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔの非コード領域は、図１において小文字で表記されている。
【００３０】
後述する実施例に記載するように、本発明者らは、ヒトＳＬＣＯ１Ｂ３遺伝子の転写開始点を決定する目的で、ヒト大腸がん組織由来のｔｏｔａｌ ＲＮＡをテンプレートとしてＲＬＭ−５’−ＲＡＣＥ法をおこなったところ、既に報告されている転写開始点（図１に示す「ＴＳＳ」）の情報から予想されるサイズよりも分子量の小さい増幅産物が検出されることを見出した。そして、ＳＬＣＯ１Ｂ３遺伝子の新規転写開始点付近の塩基配列をヒトゲノムＤＮＡのデータベースと照合したところ、新規転写開始点はＳＬＣＯ１Ｂ３遺伝子のイントロン２の領域内に存在し、さらにここに新たなエキソンが存在することが明らかとなった（この新たなエキソンを「エキソンＳＶ」と称する）。また、このエキソンＳＶはＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔでいうエキソン３へとスプライシングされていた（後述する図４を参照）。このようにして発見されたＯＡＴＰ１Ｂ３ ｍＲＮＡの新規な選択的スプライシングバリアント（ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔ）のｃＤＮＡの塩基配列を配列番号：１および図１に示す。
【００３１】
上述したように、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔのエキソンＳＶはＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔのエキソン３へとスプライシングされていた。すなわち、配列番号：１で表される塩基配列において、１ｎｔ〜１３９ｎｔがエキソンＳＶである。また、配列番号：１で表される塩基配列における１４０ｎｔ〜１９２０ｎｔは、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔのエキソン３〜エキソン１４と実質的に同一の塩基配列を有する。そして、配列番号：１で表される塩基配列における１９２１ｎｔ〜２１７０ｎｔは、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔのエキソン１５の対応部分と同一の塩基配列を有する。
【００３２】
本発明において見出された選択的スプライシングバリアント（例えば、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔ）は、後述する実施例に記載のように、がん細胞においてその発現量が増大していることが確認された。したがって、生体から分離した被検試料中の当該選択的スプライシングバリアントを測定することにより、がんの検出が可能である。
【００３３】
以下、本発明の具体的な好ましい実施形態についてより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載に基づいて定められるべきであり、以下の具体的な実施形態や実施例によって限定されるべきではない。
【００３４】
本発明の第１の形態により提供されるＯＡＴＰ１Ｂ３ ｍＲＮＡの選択的スプライシングバリアントの測定方法では、生体から分離した被検試料中の、配列番号：１で表される塩基配列を含むｍＲＮＡ（例えば、配列番号：１で表される塩基配列からなるｍＲＮＡ）を、配列番号：２で表される塩基配列を含むｍＲＮＡ（例えば、配列番号：２で表される塩基配列からなるｍＲＮＡ）と識別して測定することを含む。なお、配列番号：１の塩基配列は、ｍＲＮＡおよびこれをテンプレートとして得られるｃＤＮＡの塩基配列を兼用して示すものであり、ｍＲＮＡを示す場合には、当然ながら、チミン（ｔ）に代えてウラシル（ｕ）が含まれるため、ｔをｕに読み替える。また、「測定」には、定量、半定量および検出のいずれの概念も包含される。さらに、「ｍＲＮＡを測定する」ことには、ｍＲＮＡを直接的に測定する場合のほか、ｍＲＮＡを一旦ｃＤＮＡへと変換した後に当該ｃＤＮＡを測定する場合（後述するＲＴ−ＰＣＲ等）や、ｍＲＮＡの翻訳産物を測定する場合のように、ｍＲＮＡを間接的に測定する場合も包含される。また、以下の説明では、配列番号：１で表される塩基配列を含むｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、核酸等を、「配列番号：１のｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、核酸等」と称することがある。
【００３５】
なお、配列表には、規則により、二本鎖核酸であってもそのうちの一本鎖（ポリペプチドをコードする核酸ではセンス鎖）のみを記載することになっている。このため、二本鎖核酸の場合には、配列表に現実に記載されている配列は一本鎖であっても、実際にはその相補鎖も配列表に記載されていると解することができる。したがって、本願明細書においても、ある配列番号で表される塩基配列を含むもしくはこれからなる核酸が二本鎖核酸である場合または二本鎖核酸であってもよい場合には、その配列番号で表される塩基配列は、文脈上そうでないことが明らかな場合を除き、その相補鎖をも包含するものとする。例えば、「配列番号：１で表される塩基配列を含む核酸とハイブリダイズする核酸」とは、配列番号：１に現実に記載されているセンス鎖にハイブリダイズする核酸のほか、当該センス鎖に相補的な塩基配列からなるアンチセンス鎖にハイブリダイズする核酸をも意味するのである。
【００３６】
配列番号：１のｍＲＮＡを配列番号：２のｍＲＮＡと識別して測定することは、当業者にとって容易であり、種々の方法により可能である。例えば、エキソンＳＶ内とエキソン３以降の領域にプライマーを設定して逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）をおこない、増幅産物の分子量に基づいて、そのｍＲＮＡがＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔか選択的スプライシングバリアント（例えば、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔ）かを識別してｍＲＮＡを測定することができる。また、得られた増幅産物について塩基配列を決定してもよい（ダイレクトシークエンス）。
【００３７】
配列番号：１のｍＲＮＡには、上述したように、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔには存在しないエキソンであるエキソンＳＶが存在する。このため、このエキソンＳＶの存在を指標として選択的スプライシングバリアントを測定することができる。すなわち、配列番号：１で表される塩基配列におけるエキソンＳＶの存在を指標として、配列番号：１で表される塩基配列を含む選択的スプライシングバリアントを測定することができる。
【００３８】
エキソンＳＶの存在を指標として選択的スプライシングバリアントを測定する好ましい方法としては、エキソンＳＶを含む領域にハイブリダイズするプライマーを用いた核酸増幅法を用いる方法や、エキソンＳＶを含む領域にハイブリダイズするプローブを用いる方法を挙げることができる。
【００３９】
核酸増幅法を用いる方法には、エキソンＳＶを含む領域に設定したプライマーを一方のプライマーとして用いる核酸増幅法により配列番号：１で表される塩基配列を含むｍＲＮＡまたはそのｃＤＮＡの部分領域を特異的に増幅し、増幅産物を測定することを含む。ここで、「領域に設定した」とは、その領域とハイブリダイズするという意味であり、また、ＰＣＲのような核酸増幅法により増幅される核酸は二本鎖であるから、上述したように、配列表に現実に記載されているセンス鎖にハイブリダイズするプライマー（リバース側プライマー）を用いる場合と、当該センス鎖に相補的なアンチセンス鎖にハイブリダイズするプライマー（フォワード側プライマー）を用いる場合の両者が包含される。したがって、例えば、「エキソンＳＶを含む領域に設定したプライマー」とは、配列番号：１に現実に記載されたセンス鎖のエキソンＳＶを含む領域（つまり、１ｎｔ〜１３９ｎｔ）にハイブリダイズするプライマー（リバース側プライマー）または当該プライマーに相補的な塩基配列を有するプライマー（フォワード側プライマー）を意味する。また、「特異的に増幅する」とは、配列番号：１で表される塩基配列を含むｍＲＮＡまたはそのｃＤＮＡの部分領域は増幅されるが、配列番号：２で表される塩基配列を含むｍＲＮＡまたはそのｃＤＮＡの部分領域は増幅されないことを意味する。なお、配列番号：１で表される塩基配列において、１ｎｔ〜１３９ｎｔがエキソンＳＶであり、エキソン３は１４０ｎｔから始まる。したがって、配列番号：１で表される塩基配列において、１３９ｎｔと１４０ｎｔとの融合点は、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔには存在しないエキソンＳＶとエキソン３との特異的融合点である。ただし、図１からも明らかなように、上記特異的融合点の上流側２塩基は、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔとＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔとで共通している。したがって、配列番号：１で表される塩基配列における１３９ｎｔと１４０ｎｔとの融合点よりも、これに最も近接した他の特異的融合点である１３７ｎｔと１３８ｎｔとの融合点が、エキソンＳＶとエキソン３との特異的融合点としてより適切である。このことから、本明細書において、「エキソンＳＶを含む領域」としては、１ｎｔ〜１３７ｎｔがより好ましい。
【００４０】
テンプレートとなるｍＲＮＡの部分領域と同じ塩基配列（ただしｕはｔになる）を有するＤＮＡを増幅する核酸増幅法の好ましい例として、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）が挙げられる。ＲＴ−ＰＣＲでは、細胞からｍＲＮＡを常法により抽出し、逆転写酵素の作用によりｍＲＮＡをテンプレートとして第一鎖ｃＤＮＡを生成させ、さらにこの第一鎖ｃＤＮＡをテンプレートとして相補鎖を生成させて、二本鎖ｃＤＮＡを得る。次いで、得られた二本鎖ｃＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲをおこない、該ｃＤＮＡまたはその部分領域を増幅する。ＲＴ−ＰＣＲ自体は周知の技術であり、そのためのキットや装置も市販されているため、容易に実施することができる。選択的スプライシングバリアント由来のｃＤＮＡを特異的に増幅するために、上述した特異的融合点を含む領域に設定したプライマーを一方のプライマーとして用いる。他方のプライマーは、増幅すべきスプライシングバリアントの任意の領域に設定することができる。なお、プライマーのサイズは特に限定されないが、通常１５〜３５塩基程度であり、好ましくは１５〜２５塩基程度である。
【００４１】
例えば、配列番号：１のｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲにより測定する場合、配列番号：１で表される塩基配列中のエクソンＳＶを含む領域に設定したプライマーを一方のプライマー（フォワード側プライマーでもリバース側プライマーでもよい）として用いる。ここで、選択的スプライシングバリアント由来のｃＤＮＡを特異的に増幅するためには、プライマーとして、ストリンジェントな条件下で、配列番号：１のｃＤＮＡにはハイブリダイズするが、配列番号：２のｃＤＮＡにはハイブリダイズしないものを用いることが好ましい。ここで「ストリンジェントな条件」とは、プライマーがｃＤＮＡに対して特異的にハイブリダイゼーションする条件をいい、例えば成書に記載の条件（サムブルック（Sambrook）ら編、「モレキュラークローニング，ア ラボラトリーマニュアル 第２版」、１９８９年、コールドスプリングハーバーラボラトリー、特に１１．４５節“Conditions for Hybridization of Oligonucleotide probes”等）にしたがって決定でき、特に制限されない。ストリンジェントな条件は、塩濃度、温度、およびその他の条件によって決まり、例えば、塩濃度が低いほど、温度が高いほど、ストリンジェンシーは高くなり、プライマーとｃＤＮＡとがハイブリダイゼーションしにくくなる。塩濃度は、一般に、ＳＳＣ溶液（ＮａＣｌ＋クエン酸三ナトリウム）の濃度を調節することによって調節され、ストリンジェントな塩濃度は、例えば、ＮａＣｌ約２５０ｍＭ以下およびクエン酸三ナトリウム約２５ｍＭ以下である。ストリンジェントな温度は、一般に、完全ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）より１５〜２５℃低い温度であり、例えば、約３０℃以上である。溶液に有機溶媒（例えばホルムアミド）を加えることにより、温度を下げることができる。その他の条件としては、ハイブリダイゼーション時間、洗浄剤（例えば、ＳＤＳ）の濃度、およびキャリアーＤＮＡの存否等であり、これらの条件を組み合わせることによって、様々なストリンジェンシーを設定することができる。好ましい例として、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ クエン酸三ナトリウム、１％ ＳＤＳ、５０％ ホルムアミド、２００μg／ｍＬの変性サケ精子ＤＮＡの条件で、４２℃の温度によりハイブリダイゼーションをおこなう。また、ハイブリダイゼーション後の洗浄の条件もストリンジェンシーに影響する。この洗浄条件もまた、塩濃度および温度によって定義され、塩濃度の減少と温度の上昇によって洗浄のストリンジェンシーは増加する。好ましい例として、１５ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ クエン酸三ナトリウムおよび０．１％ ＳＤＳの条件で、６８℃の温度にて洗浄をおこなう。
【００４２】
配列番号：１のｃＤＮＡにはハイブリダイズするが、配列番号：２のｃＤＮＡにはハイブリダイズしないことを確保するために、ストリンジェントな条件下で、プライマーの２０％以上がエキソンＳＶを含む領域とハイブリダイズするものであることが好ましい。あるいは、ストリンジェントな条件下でも配列番号：２のｃＤＮＡとハイブリダイズした場合には、プライマーの３’末端がミスマッチとなるプライマーを用いることが好ましい。たとえストリンジェントな条件下で配列番号：２のｃＤＮＡとハイブリダイズしても、プライマーの３’末端がミスマッチであれば増幅は実質的に起きない。さらには、その少なくとも２０％以上がエキソンＳＶ内の領域とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするものであって、かつ、その３’末端が配列番号：２のｃＤＮＡとはミスマッチになるプライマーを用いることが特に好ましい。以上のようなプライマーを一方のプライマーとして用いることにより、配列番号：２のｃＤＮＡの共存下であっても、配列番号：１のｃＤＮＡのみを特異的に増幅することができる。なお、プライマーとしては、プライマーがハイブリダイズする配列番号：１の塩基配列中の領域と完全に相補的なものが好ましいが、通常、１０％以下程度のミスマッチがあってもプライマーとして利用できる場合が多い（ただし、上述したようにプライマーの３’末端がミスマッチとなるものは除く）。
【００４３】
ＰＣＲ自体は常法に従っておこなうことができる。そして、ＰＣＲによる増幅後に、増幅産物を測定する。かような増幅産物の測定も、常法によりおこなうことができる。上述したように、本発明における「測定」には、検出および定量の両者が包含される。さらに、増幅産物の電気泳動バンドの蛍光強度測定や、太さの目視判定のような、簡易定量または半定量も「測定」の概念に包含される。増幅産物の測定は、例えば増幅産物を電気泳動にかけ、増幅バンドを検出することによりおこなうことができる。また、蛍光標識したヌクレオチド三リン酸の存在下にＰＣＲをおこなうことによって増幅産物を蛍光標識し、増幅バンドの蛍光強度を測定することによっても、増幅産物の測定をおこなうことができる。さらに、電気泳動パターンをナイロンやニトロセルロースからなるメンブレンに転写し、増幅産物にハイブリダイズする標識プローブをハイブリダイズさせて、標識を検出または定量する（ＰＣＲ−サザン（Southern）法）によってもおこなうことができる。さらには、増幅産物にハイブリダイズするプローブを固相化し、上記増幅工程を標識ヌクレオチド三リン酸の存在下におこない、固相化プローブに増幅産物を結合させ、固相に結合された増幅産物を測定することによってもおこなうことができる。これらはいずれも常法であり、周知の知見が適宜参照されうる。
【００４４】
あるいは、上述したＲＴ−ＰＣＲのＰＣＲを、リアルタイム検出ＰＣＲによりおこなうと、より正確に増幅産物を定量することができるため、好ましい。リアルタイム検出ＰＣＲでは、通常のＰＣＲを、増幅産物にハイブリダイズする２種類の蛍光色素を結合したプローブの存在下でおこなう。２種類の蛍光色素の一方は、他方の蛍光色素からの蛍光発光を打ち消すクエンチャー色素であり、２種類の蛍光色素が同一のプローブ分子に結合されている状態では蛍光は測定されない。これに対し、ＰＣＲにより増幅が起きると、まず、プローブが増幅産物にハイブリダイズする。そして、増幅に用いられるＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性によりプローブが消化されて２種類の蛍光色素がバラバラになると、クエンチャー色素による消光が起きないので蛍光が測定されるようになるのである。測定される蛍光強度が急激に大きくなるサイクル数が、試料中の核酸テンプレートの濃度に依存して変化することから、連続的に反応溶液の蛍光を測定することにより試料中の鋳型核酸の濃度を定量することができる。なお、リアルタイム検出ＰＣＲ自体は周知の技術であり、そのためのキットも市販されているため、この市販のキットを用いて容易に実施することができる。
【００４５】
なお、ＲＴ−ＰＣＲをおこなう場合、最初のｍＲＮＡの抽出時に混入するゲノムＤＮＡに含まれる偽遺伝子を鋳型とする増幅が起きる場合がある。従って、用いるプライマーセットは、このような偽遺伝子に起因する増幅が起きないプライマーを選択したセットであることが好ましい。偽遺伝子に起因する増幅が起きるか否かは、例えば、そのプライマーセットを用い、ゲノムＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲをおこなった場合に、ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲをおこなった場合と同じサイズの増幅産物のみが生成するか否かにより判定することができる。後述する実施例で具体的に用いられているプライマーセット（表３）は、このような偽遺伝子による増幅が起きないものである。また、場合によっては、ＲＴ−ＰＣＲをおこなう前に、用いる予定のＲＮＡをテンプレートとして、ヒトグリセルアルデヒド−３−デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）などのハウスキーピング遺伝子を増幅するプライマーセット（例えば、表１に記載のもの）を用いたＰＣＲをおこない、増幅産物が得られないことを確認することによっても、ゲノムＤＮＡの混入がないことが保証されうる。
【００４６】
以上、本発明の測定方法をＲＴ−ＰＣＲ法によりおこなう場合を例に挙げて詳細に説明したが、本発明の測定方法は、上述したプライマーを用いて選択的スプライシングバリアントのｍＲＮＡもしくはｃＤＮＡまたはその部分領域の増幅をおこなう方法であれば、ＲＴ−ＰＣＲ法によりおこなわれるものに限定されず、他のいずれの核酸増幅法を利用するものであってもよい。例えば、ＮＡＳＢＡ法（３ＳＲ法、ＴＭＡ法）によりｍＲＮＡを増幅することもできる。ＮＡＳＢＡ法では、リバース側プライマーの５’末端にＴ７プロモーター配列を付加したものをリバース側プライマーとして、ＡＭＴ−ＲＴ等の逆転写酵素の存在下で、ｍＲＮＡをテンプレートとしてｃＤＮＡ鎖（アンチセンス鎖）を形成する。得られたＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖ハイブリッドのＲＮＡ鎖をＲＮａｓｅＨにより分解して一本鎖ｃＤＮＡ（アンチセンス鎖）とする。次に、この一本鎖ｃＤＮＡをテンプレートとし、フォワード側プライマーを用いてＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素としてＡＭＴ−ＲＴを用いる場合には、ＡＭＴ−ＲＴがＤＮＡポリメラーゼ活性を有するため、これで兼用する）の存在下で相補鎖を形成して、二本鎖ｃＤＮＡとする。この二本鎖ｃＤＮＡは、Ｔ７プロモーター配列を含んでいることから、これにＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを作用させると、転写によりＲＮＡ（アンチセンス鎖）が次々に形成される。さらに、形成された二本鎖ｃＤＮＡについて、変性工程、上記フォワード側プライマー及びリバース側プライマーとのアニーリング工程、相補鎖の伸長工程を繰り返すことにより、二本鎖ｃＤＮＡが増幅され、これを鋳型とした転写によってさらにＲＮＡ（アンチセンス鎖）が形成される。このようなＮＡＳＢＡ法においても、一方のプライマーとして、上記したプライマーを用いることにより、選択的スプライシングバリアントのみを増幅することができる（ただし、生成物は上記の通りアンチセンス鎖である）。なお、ＮＡＳＢＡ法自体は周知の技術であり、このためのキットも市販されているため、この市販のキットを用いて容易に実施することができる。
【００４７】
エキソンＳＶの存在を指標として選択的スプライシングバリアントを測定する他の好ましい方法としては、このエキソンＳＶを含む領域にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするプローブを用いる方法がある（ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法）。プローブとしては、ストリンジェントな条件下で、配列番号：１で表される塩基配列を有する核酸中のエキソンＳＶの領域にハイブリダイズするが、配列番号：２で表される塩基配列を有する核酸にはハイブリダイズしないものが用いられる。このような特異性を確保するために、プローブの全長の２０〜８０％、より好ましくは４０〜６０％がエキソンＳＶ領域にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、残りが隣接するエキソン３領域にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするものであることが好ましい。プローブのサイズは、特に限定されないが、オリゴヌクレオチドの場合、通常、１０塩基〜全長であり、１０塩基〜１００塩基程度が好ましく、さらに好ましくは１５塩基〜３５塩基程度であり、ｃＲＮＡやｃＤＮＡの場合、通常、３００塩基〜８００塩基程度である。また、プライマーの場合と同様、プローブがハイブリダイズする領域と完全に同一の塩基配列を有することが最も好ましいが、プローブ全長の１０％以下の塩基が置換していてもよい。
【００４８】
プローブは、上記核酸に蛍光標識、ビオチン標識、放射標識、酵素標識等の周知の標識を結合して標識プローブとすることもできる。また、プローブは、例えば固相化プローブとして用いる場合に、固相に結合させる領域や、分枝プローブにおける標識を結合させるための分枝のような、被検核酸とは無関係な任意の核酸が結合されたものであってもよい。
【００４９】
プローブは、被検試料中に含まれる選択的スプライシングバリアントのｍＲＮＡの直接的な測定に用いることもできるし、ｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ等の核酸増幅法で増幅した後、増幅された増幅核酸を測定する目的にも用いることができる。増幅産物をプローブで特異的に測定する場合、核酸増幅には、エキソンＳＶが増幅産物中に含まれるようにプライマーを設定する。この場合のプライマーは、選択的スプライシングバリアントに特異的なものである必要はなく、測定の特異性はプローブにより確保される。
【００５０】
本発明はまた、配列番号：１で表される塩基配列を含む核酸とはハイブリダイズするが、配列番号：２で表される塩基配列を含む核酸が共存していても当該核酸とはハイブリダイズしない核酸、または、配列番号：２で表される塩基配列を含む核酸とハイブリダイズした場合にその３’末端がミスマッチとなる核酸をも提供する。このような核酸は、上述したプライマーやプローブとして用いることができる。このような核酸としては、配列番号：１で表される塩基配列におけるエキソンＳＶを含む領域とハイブリダイズするが、配列番号：２で表される塩基配列を含む核酸が共存していても当該核酸とはハイブリダイズしない核酸、または、配列番号：２で表される塩基配列を含む核酸とハイブリダイズした場合にその３’末端がミスマッチとなる核酸が、選択的スプライシングバリアントの特異的な測定のためには好ましい。このような本発明の核酸は、塩基数が１０以上であることが好ましく、特に塩基数が１５〜３５であることが好ましい。また、本発明の核酸は、配列番号：１で表される塩基配列またはその部分領域と同じ塩基配列または当該塩基配列のうち１０％以下の塩基が置換した塩基配列を有することが好ましく、特に配列番号：１で表される塩基配列またはその部分領域と同じ塩基配列をからなることが好ましい。
【００５１】
このような本発明の核酸は、核酸増幅法のプライマーやプローブ等の、選択的スプライシングバリアントの測定用核酸として用いられうる。
【００５２】
さらに、本発明は、上述した本発明の測定用核酸を含む、ＯＡＴＰ１Ｂ３ ｍＲＮＡの選択的スプライシングバリアントの測定用キットをも提供する。キットに含まれる試薬類は、本発明の測定用核酸以外は周知のものであってよく、例えば、プライマーセットのほか、逆転写酵素、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、ランダムプライマー、ＲＮａｓｅ阻害剤、緩衝液等を含めて測定用キットにすることができる。あるいは、キットは、フォワード側プライマーおよびリバース側プライマーのみからなるプライマーセットとし、他の試薬類は、市販のＲＴ−ＰＣＲ用キット等を利用するようにしてもよい。
【００５３】
上述した選択的スプライシングバリアントは、がんマーカーとして利用することができる。すなわち、本発明により提供される選択的スプライシングバリアントは、がん細胞・組織において特異的に強く発現することが判明している。よって、本発明により提供される測定方法や測定用キットは、がんの検出に利用することができる。この際、検出対象とされるがんの種類は特に制限されず、例えば、大腸がん、膵臓がん、乳がん、肺がん、前立腺がん、食道がん、胃がん、肝臓がん、胆道がん、脾臓がん、腎がん、膀胱がん、子宮がん、卵巣がん、精巣がん、甲状腺がん、脳腫瘍、造血器腫瘍などの検出に利用されうる。特に、後述する実施例に記載のように、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔは、ヒト大腸がん組織に加えて、ヒトの大腸がん由来の細胞（ＬＳ１８０、ＨＣＴ１１６）およびヒトの膵臓がん由来の細胞（ＰＫ４５ｐ）にも強く発現していることが確認されている。これに対し、ヒト正常大腸由来の組織にはＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔの発現が確認されなかったことから、本発明により提供される選択的スプライシングバリアントは、大腸がんおよび膵臓がんのマーカーとして特に有用である。
【００５４】
本発明の他の形態によれば、がんの予防および／または治療剤のスクリーニング方法が提供される。このスクリーニング方法は、まず、がん細胞を被検物質の存在下で培養する。そして、得られる培養細胞において、上述した本発明の選択的スプライシングバリアントを測定する。次いで、得られた測定結果を、上記被検物質の非存在下における場合と比較および／または評価する。
【００５５】
具体的には、上述した各種がん由来のがん細胞株を、抗がん剤、抗がん候補物質、低分子化合物、天然有機高分子物質、天然の動植物の抽出物、ペプチドなどの被検物質の存在下で培養し、当該培養細胞における本発明の選択的スプライシングバリアントを測定（検出、半定量、または定量）し、選択的スプライシングバリアントの形態が、被検物質の非存在下における場合と比べて有意に減少しているときに、被検物質は上記細胞株が由来とするがんの予防および／または治療剤として有用である可能性があると判断する。
【００５６】
本発明のスクリーニング方法において、ヒト大腸がん由来の細胞株（例えば、ＬＳ１８０やＨＣＴ１１６）を用いることで、ヒト大腸がんの予防および／または治療剤のスクリーニングをおこなうことができる。同様に、ヒト膵臓がん由来の細胞株（例えば、ＰＫ４５ｐ）を用いることで、ヒト膵臓がんの予防および／または治療剤のスクリーニングをおこなうことができる。その他の周知のがん・腫瘍由来の細胞株についても、同様に用いることで各種がん・腫瘍の予防および／または治療剤のスクリーニングをおこなうことが可能である。
【００５７】
また、本発明のスクリーニング方法において、選択的スプライシングバリアントを測定する方法としては、上述した本発明の測定方法や測定用キットが同様に用いられうる。よって、ここでは詳細な説明を省略する。
【００５８】
本発明者らの検討によれば、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔ ｍＲＮＡから少なくとも４種のポリペプチドが発現しうることが判明した。具体的には、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、および配列番号：１１のそれぞれで表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔ ｍＲＮＡから発現しうることが確認された。これらのポリペプチドは、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔ ｍＲＮＡからは理論上発現できず、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔ ｍＲＮＡに特異的なものである。このため、これらのポリペプチドは、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔ ｍＲＮＡと同様にがんマーカーとしての有用性を有するものである。
【００５９】
上記の観点から、本発明の他の形態によれば、
（１）配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；および、
（２）配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を含み、かつ、がん細胞またはがん組織において発現が増強するポリペプチド、あるいは、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列において、１０％以下のアミノ酸が置換、欠失、および／または挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ、がん細胞またはがん組織において発現が増強するポリペプチド（以下、「機能的等価改変体」とも称する）；および、
が提供される。
【００６０】
「（２）機能的等価改変体」としては、「配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を含み、かつ、がん細胞またはがん組織において発現が増強するポリペプチド」、あるいは、「配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列において、０〜１０％、好ましくは０〜７％、さらに好ましくは０〜５％、特に好ましくは０〜２％のアミノ酸が置換、欠失、および／または挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ、がん細胞またはがん組織において発現が増強するポリペプチド」が含まれる。
【００６１】
「がん細胞またはがん組織において発現が増強する」とは、非がん細胞または非がん組織と比較してがん細胞またはがん組織において発現が２倍以上増強することを意味する。
【００６２】
以上、本形態のポリペプチドについて説明したが、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、および上記機能的等価改変体を総称して、以下、「本発明のポリペプチド」とも称する。また、「本発明のポリペプチド」のうち、配列番号：５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを「ｆ１−１」、配列番号：７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを「ｆ１−２」、配列番号：９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを「ｆ２」、配列番号：１１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを「ｆ３」とそれぞれ称する。
【００６３】
本発明のポリペプチドとしては、ｆ１−１またはｆ３が特に好ましい。
【００６４】
本発明のさらに他の形態によれば、本発明のポリペプチドをコードする核酸もまた、提供される。
【００６５】
ここで、本発明のポリペプチドであるｆ１−１をコードする塩基配列からなる核酸は、配列番号：５で表されるアミノ酸配列からなるｆ１−１、またはその機能的等価改変体をコードする塩基配列であれば特に制限はない。好ましくは、配列番号：５で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸であり、さらに好ましくは、配列番号:４で表される塩基配列からなる核酸である。
【００６６】
同様に、本発明のポリペプチドであるｆ１−２をコードする塩基配列からなる核酸は、配列番号：７で表されるアミノ酸配列からなるｆ１−２、またはその機能的等価改変体をコードする塩基配列であれば特に制限はない。好ましくは、配列番号：７で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸であり、さらに好ましくは、配列番号:６で表される塩基配列からなる核酸である。
【００６７】
また、本発明のポリペプチドであるｆ２をコードする塩基配列からなる核酸は、配列番号：９で表されるアミノ酸配列からなるｆ２、またはその機能的等価改変体をコードする塩基配列であれば特に制限はない。好ましくは、配列番号：９で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸であり、さらに好ましくは、配列番号:８で表される塩基配列からなる核酸である。
【００６８】
さらに、本発明のポリペプチドであるｆ３をコードする塩基配列からなる核酸は、配列番号：１１で表されるアミノ酸配列からなるｆ３、またはその機能的等価改変体をコードする塩基配列であれば特に制限はない。好ましくは、配列番号：１１で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸であり、さらに好ましくは、配列番号:１０で表される塩基配列からなる核酸である。
【００６９】
また、本発明のさらに他の形態によれば、上記核酸を含む発現ベクター、当該発現ベクターで形質転換された細胞もまた、提供される。
【００７０】
本発明の発現ベクターや細胞は、従来公知の知見を参照することにより作製することができる。例えば、単離された本発明の核酸を、適当なベクターＤＮＡに再び組込むことにより、真核生物または原核生物の宿主細胞を形質転換させることができる。また、これらのベクターに適当なプロモーターおよび形質発現に関連する配列を導入することにより、それぞれの宿主細胞において核酸を発現させることが可能である。
【００７１】
本発明の発現ベクターは、本発明の核酸を含む限り、特に限定されるものではなく、例えば、用いる宿主細胞に応じて適宜選択した公知の発現ベクターに、本発明の核酸を挿入することにより得られる発現ベクターを挙げることができる。
【００７２】
また、本発明の細胞も、本発明の発現ベクターでトランスフェクションされ、本発明の核酸を含む限り、特に限定されるものではなく、例えば、本発明の核酸が、宿主細胞の染色体に組み込まれた細胞であってもよいし、あるいは、本発明の核酸を含む発現ベクターの形で含有する細胞であってもよい。また、本発明のポリペプチドを発現している細胞であってもよいし、あるいは、本発明のポリペプチドを発現していない細胞であってもよい。本発明の細胞は、例えば、本発明の発現ベクターにより、所望の宿主細胞をトランスフェクションすることにより得ることができる。
【００７３】
上記で得られる所望の細胞は、常法に従い培養することができ、該培養により本発明のポリペプチドが生産される。該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものが適宜選択されうる。
【００７４】
上記により、形質転換細胞に生産される本発明のポリペプチドは、その物理的性質や生化学的性質等を利用した各種の公知の分離操作法により、分離・精製することができる。
【００７５】
本発明のポリペプチドは、マーカー配列とインフレームで融合して発現させることで、その発現の確認、精製等が可能になる。マーカー配列としては、例えば、ＦＬＡＧ ｅｐｉｔｏｐｅ、Ｈｅｘａ−Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ ｔａｇ、Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｔａｇ、ｍｙｃ ｅｐｉｔｏｐｅなどがある。また、マーカー配列とポリペプチドとの間にエンテロキナーゼ、ファクターＸａ、トロンビンなどのプロテアーゼが認識する特異的なアミノ酸配列を挿入することにより、マーカー配列部分をこれらのプロテアーゼにより切断除去することも可能である。
【００７６】
本発明の核酸は、それ自体、またはその一部をがんの検出方法においてハイブリダイズプローブとして用いることができ、がんの検出に有用である。また、本発明のポリペプチドは、本発明のポリペプチドを特異的に認識する抗体の作製や、発現レベルを検出・定量する際のコントロールとして用いることができる。
【００７７】
本発明によれば、本発明のポリペプチドに結合する抗体（以下、「本発明の抗体」とも称する）もまた、提供されうる。本発明の抗体の製造方法は、特に限定されるものではない。本発明の抗体（例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体）は、例えば、各種動物に配列番号：５で表されるアミノ酸配列を含み、かつ、がん細胞またはがん組織において発現が増強するポリペプチド、配列番号：５で表されるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、および／または挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ、がん細胞またはがん組織において発現が増強するポリペプチド、あるいは、配列番号：５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの全部またはその断片を直接投与することにより、得ることができる。また、前記ポリペプチドをコードする遺伝子を導入したプラスミドを用いてＤＮＡワクチン法（Ｒａｚ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，９５１９−９５２３，１９９４；Ｄｏｎｎｅｌｌｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１７３，３１４−３２０，１９９６）によっても得ることができる。
【００７８】
ポリクローナル抗体は前記ポリペプチドまたはその断片をフロイント完全アジュバントなどの適当なアジュバントに乳濁し、腹腔、皮下または静脈等に免疫して感作した動物、例えばウサギ、ラット、ヤギ、またはニワトリ等の血清または卵から製造される。このように製造されたポリクローナル抗体は常法のタンパク質単離精製法により、分離精製することができ、常法のタンパク質単離精製法としては例えば、遠心分離、透析、硫酸アンモニウムによる塩析、ＤＥＡＥ−セルロース、ハイドロキシアパタイト、プロテインＡアガロース等によるクロマトグラフィー法が挙げられる。
【００７９】
モノクローナル抗体は、ケーラーとミルスタインの細胞融合法（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７，１９７５）により当業者が容易に製造することが可能である。
【００８０】
本発明のさらに他の形態によれば、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、少なくとも１５塩基を有する核酸もまた、提供される。なお、「ストリンジェントな条件」については上述した通りである。このような核酸は、本発明の核酸を検出、単離するためのプローブとして、また、本発明の核酸を増幅するためのプライマーとして利用することが可能である。プライマーとして用いる場合には、通常、１５ｂｐ〜１００ｂｐ、好ましくは１５ｂｐ〜４０ｂｐの鎖長を有する。プライマーとして好ましい塩基配列は、後述する実施例の「９．緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）融合ｃｔＯＡＴＰ１Ｂ３ペプチド発現プラスミドの作製」においてｆ１−１、ｆ１−２、ｆ２およびｆ３のそれぞれを増幅するのに用いられているプライマーの塩基配列が挙げられる。また、プローブとして用いる場合には、本発明の核酸の一部もしくは全部の配列（またはその相補配列）を有し、少なくとも１５ｂｐの鎖長のＤＮＡが用いられる。
【００８１】
上記核酸を用いたプローブやプライマーは、がんの検出に利用することができる。
【００８２】
なお、本発明に基づいて、本発明の核酸の塩基配列またはその断片を含むオリゴヌクレオチドプローブのアレイを構築することもできる。アレイ技法は公知で、遺伝子発現を解析するために用いられている（Ｃｈｅｅ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ，．２７４，６１０−６１３）。
【００８３】
本発明のポリペプチドは、がんの検出方法にも適用されうる。すなわち、本発明の他の形態によれば、生体から分離した被検試料中の、本発明のポリペプチドの量を測定することを含む、がんの検出方法が提供される。この際、上述した本発明の抗体を測定に用いることが好ましい。また、当該抗体を含む、がんの検出用キットも提供されうる。以下、この形態について、より詳細に説明する。
【００８４】
被検試料中の、本発明のポリペプチドの検出は、例えば、被検試料を各種の分子量測定法、例えば、ゲル電気泳動や、各種の分離精製法（例：イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなど）、イオン化法（例：電子衝撃イオン化法、フィールドディソープション法、二次イオン化法、高速原子衝突法、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（MALDI）法、エレクトロスプレーイオン化法など）、質量分析計（例：二重収束質量分析計、四重極型分析計、飛行時間型質量分析計、フーリエ変換質量分析計、イオンサイクロトロン質量分析計など）を組み合わせる方法等に供し、本発明のポリペプチドの分子量と一致するバンドもしくはスポット、またはピークを検出することによりおこなうことができるが、これらに限定されない。本発明のポリペプチドはアミノ酸配列が既知であることから、当該アミノ酸配列を認識する抗体を作製して、ウエスタンブロッティングや各種イムノアッセイにより本発明のポリペプチドを検出する方法が、より好ましく用いられうる。なお、当該抗体の作製方法については、上述した通りである。本発明の抗体を用いて本発明のポリペプチドを検出する方法は、最適化されたイムノアッセイ系を構築してこれをキット化すれば、質量分析装置のような特殊な装置を使用することなく、高感度かつ高精度に本発明のポリペプチドを検出することができる点で、特に有用である。
【００８５】
本発明の抗体を用いる本発明のがんの検出方法は、特に制限されないが、被検試料中の抗原量に対応した抗体、抗原または抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法等が好適に用いられる。
【００８６】
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔125I〕、〔131I〕、〔3H〕、〔14C〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β-ガラクトシダーゼ、β-グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレセインイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン-アビジン系を用いることもできる。
【００８７】
抗原または抗体の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、また通常タンパク質あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体としては、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、またはガラス等が挙げられる。
【００８８】
サンドイッチ法においては、不溶化した本発明の抗体に被検試料を反応させ（１次反応）、さらに標識化した別の本発明の抗体を反応させ（２次反応）た後、不溶化担体上の標識剤の量（活性）を測定することにより、被検試料中の本発明のペプチド量を定量することができる。１次反応と２次反応は逆の順序におこなっても、また、同時におこなってもよいし時間をずらしておこなってもよい。
【００８９】
本発明のポリペプチドに対するモノクローナル抗体を、サンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることもできる。
【００９０】
競合法では、被検試料中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させた後、未反応の標識抗原（Ｆ）と、抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ／Ｆいずれかの標識量を測定し、被検試料中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコール、前記抗体に対する第２抗体などを用いる液相法、および、第１抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
【００９１】
イムノメトリック法では、被検試料の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、または、被検試料中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させた後、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し被検試料中の抗原量を定量する。
【００９２】
また、ネフロメトリーでは、ゲル内または溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検試料中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
【００９３】
これら個々の免疫学的測定法を本発明の検出方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のポリペプチドの測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。
例えば、入江 寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和49年発行）、入江 寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和54年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和53年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第2版）（医学書院、昭和57年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第3版）（医学書院、昭和62年発行）、「Methods in ENZYMOLOGY」 Vol. 70 (Immunochemical Techniques (Part A))、同書 Vol. 73 (Immunochemical Techniques (Part B))、同書 Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part C))、同書 Vol. 84 (Immunochemical Techniques (Part D: Selected Immunoassays))、同書 Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E: Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods))、同書 Vol. 121 (Immunochemical Techniques (Part I: HybridomaTechnology and Monoclonal Antibodies))（以上、アカデミックプレス社発行）などを参照することができる。
【００９４】
あるいは、本発明の抗体を用いる別の本発明の検出方法として、当該抗体を上述したような質量分析計に適合しうるプローブの表面上に固定化し、当該プローブ上の当該抗体に被検試料を接触させ、当該抗体に捕捉された生体試料成分を質量分析にかけ、当該抗体が認識するマーカーペプチドの分子量に相当するピークを検出する方法が挙げられる。
【００９５】
上記のいずれかの方法により、被検試料において、本発明のポリペプチドが、コントロール試料におけるレベルと統計学的に有意な差をもって検出された場合には、被検試料中にがん細胞またはがん組織が含まれている可能性が高いと診断することができる。
【００９６】
本発明のさらに他の形態では、医薬が提供される。当該医薬は、上述した本発明のポリペプチドもしくはその断片、または本発明の核酸もしくはその断片を含み、特異的な細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を誘導するためのものである。当該医薬は、好ましくはがんワクチンである。以下、この形態について、より詳細に説明する。
【００９７】
本発明の医薬が本発明のポリペプチドまたはその断片を含む場合、当該ポリペプチドまたはその断片は、ＨＬＡと結合して特異的な細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を誘導しうるものである必要がある。この観点から、当該ポリペプチドまたはその断片は、本発明のポリペプチドにおける連続する８〜１１個のアミノ酸残基からなることが好ましい。なお、特異的なＣＴＬを誘導するポリペプチドの断片は、本技術分野における公知の知見を参照して容易に作製することができる。
【００９８】
「ＨＬＡと結合して特異的なＣＴＬを誘導しうる」とは、本発明のポリペプチドもしくはその断片、または本発明の核酸もしくはその断片がＨＬＡと結合して複合体を形成し、かかる複合体をＣＴＬが認識できることをいう。換言すれば、本発明のポリペプチドもしくはその断片、または本発明の核酸もしくはその断片が、ＨＬＡとの結合活性を有し、かつ、ＨＬＡとの複合体の形で、特異的なＣＴＬを誘導する活性を有することを意味する。
【００９９】
一方、本発明の医薬が本発明の核酸またはその断片を含む場合、当該核酸がコードするアミノ酸配列を有するポリペプチドは、それ自体がＣＴＬにより認識され、当該ＣＴＬを活性化するか、そのような活性を有するポリペプチド断片を与えることができ、腫瘍抗原として機能しうる。本形態において用いられる核酸またはその断片は、本発明のポリペプチドをコードする領域に対応する少なくとも２４個以上の塩基からなるポリヌクレオチドまたはその相補鎖であることが好ましい。このようなポリヌクレオチドは、例えば公知のタンパク質発現系を利用して発現ペプチドを確認することにより選択されうる。
【０１００】
本発明の医薬は、例えば、がんワクチンとして使用することができる。１種類のポリペプチドもしくはその断片または核酸もしくはその断片のみでもがんワクチンとして有効であるが、複数種類のものを組み合わせて使用するのが好ましい。これは、がん患者のＣＴＬが複数の異なる種類の腫瘍抗原を認識する細胞の集団であることから、複数種類の腫瘍抗原を組み合わせてがんワクチンとして使用する方がより効果的であると期待されるためである。また、本発明のポリペプチドや本発明の核酸は、これら以外のポリペプチドや核酸と併用されてもよい。
【０１０１】
本発明により提供されるがんワクチンは、適当なアジュバントの存在または非存在下で、単独で、または製薬的に許容される担体と結合して使用することができる。担体は、人体に有害な作用を起こさなければ特に制限はなく、例えば、セルロース、重合アミノ酸、アルブミン等が使用できる。剤形は、ペプチド製剤について周知の剤形が選択可能である。投与量は、ＣＴＬによる認識性、治療すべき疾患、患者の年齢、体重等により変化するが、ペプチドの場合、活性本体として、通常、0.0001mg〜1000mg、好ましくは0.001mg〜1000mg、より好ましくは0.1mg〜100mg、さらに好ましくは0.1〜10ｍｇ／日／成人ヒトである。これを数日、数週、または数ヶ月に１回投与すればよい。
【０１０２】
本発明の医薬はまた、本発明のポリペプチドまたはその断片をコードする核酸またはその断片を適当なベクターに組み込み、in vivoまたはex vivoで導入するのに利用することができる。ベクターとしては、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス等が挙げられるが、レトロウイルス系が好ましい。投与量は、ＣＴＬによる認識性により変化するが、ＤＮＡ含量として０．１μｇ〜１００ｍｇ／日／成人ヒト、好ましくは１μｇ〜５０ｍｇ／日／成人ヒトである。これを数日、数週、または数ヶ月に１回投与すればよい。
【実施例】
【０１０３】
以下、実施例および参考例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらに限定されない。
【０１０４】
１．プライマー
ゲノムＤＮＡコンタミネーションチェック、５’ｃＤＮＡ末端のＲＮＡリガーゼ媒介迅速増幅（RLM-RACE;RNA ligase-mediated rapid amplification of 5’cDNA）、逆転写ＰＣＲ（RT-PCR;Reverse Transcription-Polymeraze Chain Reaction）、ｃＤＮＡクローニング、定量的リアルタイムＰＣＲ（Quantitative real-time PCR）、およびＧＦＰ融合ペプチド発現プラスミドからのペプチド発現に用いたプライマーは、インビトロジェン（カールスバッド，カリフォルニア州，アメリカ）またはグライナー−バイオ−ワン（タウフキルヒェン，ドイツ）に依頼して合成したものであり、それぞれ下記の表１〜表６に示す塩基配列を有する。
【０１０５】
【表１】
【０１０６】
【表２】
【０１０７】
【表３】
【０１０８】
【表４】
【０１０９】
【表５】
【０１１０】
【表６】
【０１１１】
２．細胞培養法
ヒト結腸がん由来細胞株であるＬＳ１８０細胞は大日本住友製薬（大阪）より購入した。ヒト大腸がん由来細胞株であるＨＣＴ１１６細胞はボーゲルシュタイン博士（Ｄｒ．Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ）（ジョンズホプキンス大学、ボルチモア、メリーランド州）よりご恵与いただいた。ヒト膵臓がん由来細胞株であるＰＫ４５ｐ細胞は東北大学加齢医学研究所付属医用細胞資源センター（仙台）より入手した。ＬＳ１８０細胞およびＰＫ４５ｐ細胞は、それぞれ１０％非働化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ジェミニ バイオ−プロダクツ，カリフォルニア州）および５０単位／ｍＬペニシリン−５０μｇ／ｍＬストレプトマイシン（インビトロジェン）を加えた最小必須培地（MEM;Minimum Essential Medium）（インビトロジェン）またはＲＰＭＩ（Roswell Park Memorial Institute）１６４０培地（インビトロジェン）を培地とし、５％ＣＯ２／９５％Ａｉｒを気相とした３７℃のＣＯ２インキュベーター内にて培養した。
【０１１２】
３．実験検体
白人種肝検体は、ＨＡＢ（Human and Animal Bridging）協議会（東京）より入手した。上記検体は、米国立疾病研究互助組織（NDRI;National Disease Research Interchange）（フィラデルフィア，ペンシルバニア州）を介して米国から輸入された移植不適合のヒト肝組織である。なお、上記肝組織は肝炎等の感染症のないものを用いた。なお、本研究におけるこれら検体の研究利用は、千葉大学大学院薬学研究院倫理委員会において事前に承認されている。
【０１１３】
４．Ｔｏｔａｌ ＲＮＡの抽出
細胞からのｔｏｔａｌ ＲＮＡ抽出は、FastPureTMRNA Isolation Kit（タカラバイオ株式会社，滋賀）を用いてプロトコールに従いおこなった。抽出したｔｏｔａｌ ＲＮＡにゲノムＤＮＡの混入がないことを、２０μＬ中にＧｏＴａｑ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（プロメガ，マディソン，ワイオミング州）１０μＬ、並びに、プライマー（上記表１に記載のヒトグリセルアルデヒド−３−デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ） ＦおよびＧＡＰＤＨ Ｒ）各０．５μＬ、ＲＮＡ １μＬを含む反応溶液を用いたＰＣＲにより確認した。ＰＣＲ反応は、９５℃にて３０秒間加熱した後、９５℃１０秒、５０℃１０秒および７２℃３０秒のサイクルを４０回おこなった。白人種肝からのｔｏｔａｌ ＲＮＡ抽出についても、FastPureTM RNA Isolation Kitを用いてプロトコールに従いおこなった。ヒト大腸がん/正常大腸ペアｔｏｔａｌ ＲＮＡは、アプライドバイオシステムズ（フォスターシティ，マサチューセッツ州）より購入した。
【０１１４】
５．ＳＬＣＯ１Ｂ３遺伝子の転写開始点の決定
GeneRacerTMKit（インビトロジェン）を用いたＲＬＭ−５’−ＲＡＣＥ法により、ＳＬＣＯ１Ｂ３遺伝子の転写開始点を決定した。テンプレートとしてヒト大腸がん由来ｔｏｔａｌ ＲＮＡまたは白人種肝由来ｔｏｔａｌ ＲＮＡを用い、手順はプロトコールに従いおこなった。ＰＣＲ反応は、２０μＬ中にGoTaq Green Master Mix １０μＬ、Reverse transcriptionテンプレート １μＬ、１０μＭ GeneRacerTM５’プライマーおよびReverse gene specificプライマー（上記表２に記載の「SLCO1B3 648R」）各０．５μＬを含むＰＣＲ反応溶液を調製し、これを９４℃にて２分間加熱した後、９４℃３０秒、６８℃３０秒、７２℃１分のサイクルを５回、９４℃３０秒、６６℃３０秒、７２℃１分のサイクルを５回、９４℃３０秒、６５℃３０秒、７２℃１分のサイクルを３０回繰り返したＴｏｕｃｈ−ｄｏｗｎＰＣＲをおこなった。このＴｏｕｃｈ−ｄｏｗｎＰＣＲの後、ＰＣＲ反応溶液を滅菌水で５倍希釈したものをテンプレートとして、Ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲをおこなった。Ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲは、２０μＬ中にGoTaq Green Master Mix １０μＬ、テンプレート１μＬ、１０μＭ GeneRacerTM５’ NestedプライマーおよびReverse Nested gene specificプライマー（上記表２に記載の「SLCO1B3 424Rnest」）各０．５μＬを含むＰＣＲ反応溶液を調製し、これを９５℃にて３０秒間加熱した後、９５℃１０秒、５３℃１０秒および７２℃３０秒のサイクルを４０回繰り返した。ＰＣＲ産物は３％アガロースゲル電気泳動をおこない、エチジウムブロマイド染色により可視化した。電気泳動の結果を図３に示す。図３に示すように、白人種肝由来ｔｏｔａｌ ＲＮＡをテンプレートとして用いたサンプルでは、既報の転写開始点（図１に示す「ＴＳＳ」）由来のバンドが確認された。これに対し、ヒト大腸がん由来ｔｏｔａｌ ＲＮＡをテンプレートとして用いたサンプルでは、既報の転写開始点由来のバンドよりも塩基長の短いバンドが確認された。この結果から、ヒト大腸がん由来ＯＡＴＰ１Ｂ３ ｍＲＮＡにおいては、既報とは異なる（既報のものよりも下流（３’）側に位置する）転写開始点が存在することが示唆された。なお、図３に示す「Non-template control」とは、テンプレートを含まない陰性コントロールである（後述する図５における「ＮＴＣ」も同旨である）。
【０１１５】
続いて、上記で得られたＮｅｓｔｅｄ−ＰＣＲ産物を含むＤＮＡ断片を分離精製した後、DynaExpress TA PCR Cloning Kit（株式会社バイオダイナミクス研究所、東京）を用いてｐＴＡＣ−１ベクターに挿入し、アンピシリンを用いて選択した。プラスミドＤＮＡはPlasmid Miniprep Kit（バイオ−ラッド ラボラトリーズ）を用いて精製した。得られたプラスミドＤＮＡの塩基配列は、CEQTM DTCS-Quick Start Mix（ベックマン コールター、フラートン、カリフォルニア州）を用いてサイクルシークエンス反応をおこない、CEQ 2000 XL DNA analysis system（ベックマン コールター）により解析し、ＳＬＣＯ１Ｂ３遺伝子の新規な転写開始点を同定した。
【０１１６】
ＳＬＣＯ１Ｂ３遺伝子の新規転写開始点付近の塩基配列をヒトゲノムＤＮＡのデータベースと照合したところ、新規転写開始点はＳＬＣＯ１Ｂ３遺伝子のイントロン２の領域内に存在し、さらにここに新たなエキソン（エキソンＳＶ）が存在することが明らかとなった。また、このエキソンＳＶはＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔのエキソン３へとスプライシングされていた（図４を参照）。
【０１１７】
６．ｃＤＮＡの作製およびＲＴ−ＰＣＲ法によるｍＲＮＡ発現解析
上記４．に記載の手法により抽出したＬＳ１８０細胞ｔｏｔａｌ ＲＮＡ、ＰＫ４５ｐ細胞、ヒト大腸がん／正常大腸ペアＲＮＡおよび白人種肝由来のｔｏｔａｌ ＲＮＡをテンプレートとして用い、High Capacity cDNA Reverse Transcription kit（アプライド バイオシステムズ）を用いて逆転写反応をおこない、ｃＤＮＡを作製した。このｃＤＮＡをテンプレートとしてＲＴ−ＰＣＲをおこない、新規ＯＡＴＰ１Ｂ３ ｍＲＮＡの発現量を解析した。ＰＣＲは、２０μＬ中にGoTaq Green Master Mix １０μＬ、テンプレートｃＤＮＡ 1μＬ、１０μＭ ＦｏｒｗａｒｄおよびＲｅｖｅｒｓｅプライマー（上記表３に記載の「SLCO1B3 TSS in cancer 33F」および「SLCO1B3 TSS in cancer 145R」）各０．５μＬを含むＰＣＲ反応溶液を調製し、これを９５℃にて３０秒間加熱した後、９５℃１０秒、各プライマーに適したアニーリング温度（上記表３に記載の「アニーリング温度」）１０秒および７２℃１５〜２０秒のサイクルを３８回おこなった。ＰＣＲ産物は３％アガロースゲル電気泳動をおこない、エチジウムブロマイド染色により可視化した。電気泳動の結果を図５に示す。図５に示すように、ヒト大腸がん組織に加え、大腸がん由来ＬＳ１８０細胞およびＨＣＴ１１６細胞、膵臓がん由来ＰＫ４５ｐ細胞においても新規ＯＡＴＰ１Ｂ３ ｍＲＮＡの発現が認められた。一方、正常ヒト大腸組織においてはこのｍＲＮＡの発現は認められなかった。これらの結果より、新規ＯＡＴＰ１Ｂ３ ｍＲＮＡはがん細胞／組織に高く発現する分子種であると考えられることから、これを「ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔ」とした。
【０１１８】
７．ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔのｃＤＮＡクローニング
ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔのｃＤＮＡクローニングは、ヒト大腸がん由来のｃＤＮＡをテンプレートとして、上記表４に記載のプライマーセット（ctSLCO1B3 cloning F33およびctSLCO1B3 cloning 2149R）並びにPrimeSTAR HS DNA polymerase（タカラバイオ株式会社，滋賀）を用いたＰＣＲによりおこなった。なお、表４に示すように、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔのｃＤＮＡクローニングに用いたフォワードプライマーは、上記「６．ｃＤＮＡの作製およびＲＴ−ＰＣＲ法によるｍＲＮＡ発現解析」のＲＴ−ＰＣＲに用いた「SLCO1B3 TSS in cancer 33F」と同一である。ＰＣＲは９４℃３分の後、９８℃１０分、５８℃５秒、７２℃２分３０秒を４０サイクル繰り返し、７２℃３分を最終ステップとした条件でおこなった。得られたＰＣＲ産物は１％アガロースゲル電気泳動により分離し、抽出精製した後、pCR Blunt-II TOPO vector（インビトロジェン）に挿入した。得られた構築物をXbaI（ニッポンジーン、東京）およびBamHI（ニッポンジーン）で処理することにより、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔ ｃＤＮＡを切り出し、これを同様に処理したpcDNA3.1(-) Neo vector（インビトロジェン）とライゲーションすることにより、OATP1B3/ct/pcDNA3.1(-)を作製した。
【０１１９】
なお、同様の手法により、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔのｃＤＮＡクローニングもおこなった。具体的には、白人種肝由来のｃＤＮＡをテンプレートとして、上記表４に記載のプライマーセット（SLCO1B3 F27およびSLCO1B3 2184R）並びにKOD-plus-Polymerase （TOYOBO、大阪）を用いたＰＣＲによりおこなった。ＰＣＲ反応は９４℃３分の後、９４℃３０秒、４８℃３０秒、６８℃２分３０秒を３５サイクル繰り返し、６８℃５分を最終ステップとした条件でおこなった。得られたＰＣＲ産物は１％アガロースゲル電気泳動により分離し、抽出精製した後、pCR Blunt-II TOPO vector（インビトロジェン）に挿入した。得られた構築物をApaI（ニッポンジーン）およびＢａｍＨＩで処理することによってＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔ ｃＤＮＡを切り出し、これを同様に処理したpcDNA3.1(-) Neo vectorとライゲーションすることにより、OATP1B3/wt/pcDNA3.1(-)を作製した。
【０１２０】
上記で作製した２つのプラスミド中のＯＡＴＰ１Ｂ３/ｃｔまたはＯＡＴＰ１Ｂ３/ｗｔの塩基配列を、CEQ 2000 Dye terminator Cycle Sequencing with Quick Start Kit（ベックマン コールター）およびCEQ 2000 XL DNA analysis system（ベックマン コールター）を用いて解析した。図１には、これにより配列決定されたＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔのｃＤＮＡ配列（配列番号：１）が、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔのｃＤＮＡ配列（Ｒｅｆｓｅｑ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿０１９８４４、配列番号：２）とともに示されている。また、図１および図４に示すように、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔでは、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔのエキソン１およびエキソン２が欠失しており、これに代えてエキソンＳＶが存在し、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔのエキソン３へとスプライシングされていることが確認される。
【０１２１】
８．定量的リアルタイムＰＣＲによるｍＲＮＡ発現解析
上記６．に記載の手法により作製したGHL pool（５つの日本人肝サンプルから調製したｃＤＮＡプール）、HHL pool（５つの白人種肝サンプルから調製したｃＤＮＡプール）、ヒト大腸がん組織、ＬＳ１８０細胞、ＰＫ４５ｐ細胞、およびＨＣＴ１１６細胞のそれぞれのｃＤＮＡ、並びに、上記７．に記載の手法により作製したプラスミドを用いて定量的リアルタイムＰＣＲをおこない、検量線法を用いてＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔおよびＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔのそれぞれのｍＲＮＡの定量をおこなった。ＰＣＲおよびＤＮＡ増幅の検出には、ABI PRISM（登録商標） 7000（アプライド バイオシステムズ）を用いた。
【０１２２】
ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔ ｍＲＮＡの検出は、２０μＬ中にｃＤＮＡテンプレート １μＬ、２×ＦastStart Universal Probe Master (ROX)（ロシュ、ペンツバーグ、ドイツ）１０μＬ、Universal Probe ＃59 (ロシュ) ０．２μＬ、および上記表５に記載のプライマーセット（ctSLCO1B3 Left 59-76、およびctSLCO1B3Right 130-151）各０．４μＬを含むＰＣＲ反応溶液を調製し、これを９５℃５分の後、９５℃１５秒、６０℃１分のサイクルを４５回繰り返した２ ｓｔｅｐ ＰＣＲでおこなった。
【０１２３】
一方、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔ ｍＲＮＡの検出は、２０μＬ中にｃＤＮＡテンプレート １ μＬ、２×SYBER Premix Ex Taq II（タカラバイオ）１０μＬ、５０×ROX Reference Dye（タカラバイオ）０．４μＬおよび上記表５に記載のプライマーセット（SLCO1B3 F153 for real-time、およびSLCO1B3R194 for real-time）各０．８μＬを含むＰＣＲ反応溶液を調製し、これを９５℃２０秒の後、９５℃５秒、６０℃３３秒のサイクルを４０回繰り返した２ ｓｔｅｐ ＰＣＲでおこなった。
【０１２４】
検量線用サンプルは、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔ ｍＲＮＡ測定には上記７．に記載の手法により作製したＯＡＴＰ１Ｂ３／ｐＴＯＰＯをテンプレートとし、１ウェルあたりのモル数が２．８６×１０−２３〜１．４３×１０−１７モル内の５点を用いて作製した。一方、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔ ｍＲＮＡ測定には上記７．に記載の手法により作製したＯＡＴＰ１Ｂ３／ｐｃＤＮＡ３．１（−）をテンプレートとし、１ウェルあたりのモル数が１．０９×１０−２３〜１．０９×１０−１７モル内の５点を用いて作製した。ＰＣＲおよびＤＮＡ増幅の検出はｃＤＮＡサンプルと同様におこなった。また、検量線は最小二乗法により直線回帰して得た。
【０１２５】
定量的リアルタイムＰＣＲの結果得られたｍＲＮＡ発現プロファイルを図６に示す。図６のＡは、各組織・細胞におけるＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔの発現レベルを示す。また、図６のＢは、各組織・細胞におけるＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔの発現レベルを示す。なお、図６に示す棒グラフは、ＯＡＴＰ１Ｂ３ ｍＲＮＡのコピー数を、３回の独立した実験における平均値±標準偏差として示したものである。さらに、図６のＣは、発現レベルの比（ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔのコピー数／ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔのコピー数）を示す。
【０１２６】
図６のＡに示すように、ｔｏｔａｌ ＲＮＡ １ｎｇ中に存在するＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔ ｍＲＮＡコピー数はGHL pool（日本人肝）では８であり、HHL pool（白人種肝）では４であった。これに対し、ヒト大腸がん組織h colon Tu ＃1 および ＃2ではそれぞれ１８１２、８９であり、また、ＬＳ１８０細胞では２４１１、ＰＫ４５ｐ細胞では２８９、ＨＣＴ１１６細胞では６４４であった。一方、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔ ｍＲＮＡコピー数はGHL poolでは１２１８７、HHL poolでは７４７３であり、h colon Tu ＃1および＃2ではそれぞれ３０、３であり、また、ＬＳ１８０細胞では８６５、ＰＫ４５ｐ細胞では２、ＨＣＴ１１６細胞では１７２であった。したがって、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔ ｍＲＮＡ発現量はＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔ ｍＲＮＡ発現量に対して、ヒト大腸がん組織であるh colon Tu ＃1および ＃2 でそれぞれ６０倍、３０倍、ヒト大腸がん由来細胞であるＬＳ１８０細胞で２．８倍、ＰＫ４５ｐ細胞で１４４．５倍、ＨＣＴ１１６細胞で３．７倍と高かった（図６のＣ）。一方、GHL poolおよびHHL poolでは、ＯＡＴＰ１Ｂ３/ｃｔ ｍＲＮＡの発現量はＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔ発現量のそれぞれ約１／１５００、約１／１７００であった。以上のことから、ヒト大腸がん組織ではＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔ ｍＲＮＡがほぼ特異的に発現しており、また、ヒト大腸がん由来細胞においても、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔ ｍＲＮＡが非常に優位に発現していることが示される。つまり、本願の発明者らによって、がん細胞・組織で発現しているのは既報のＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔではなく、今回新たに発見された選択的スプライシングバリアントであるということが明らかとされたのである。
【０１２７】
９．緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）融合ｃｔＯＡＴＰ１Ｂ３ペプチド発現プラスミドの作製
図７に示すように、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔ ｍＲＮＡの各フレームには推定オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ；Ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）が存在する。フレーム１の２つのＯＲＦはそれぞれ１０アミノ酸からなるペプチドおよび２７アミノ酸からなるペプチドをコードすると推定される（ｆ１−１、ｆ１−２）。また、フレーム２のＯＲＦはＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔのフレームの途中を開始コドンとしてそのままＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔの終止コドンを共有する６５５アミノ酸からなるタンパク質をコードすると推定される（ｆ２）。さらに、フレーム３のＯＲＦは４３アミノ酸からなるペプチドをコードすると推定される（ｆ３）。これら翻訳産物の発現を解析するため、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔ ｍＲＮＡのフレーム１およびフレーム３に存在するペプチドコード領域（ｆ１−１、ｆ１−２、ｆ３）並びに、フレーム２に存在するタンパク質コード領域のＮ末端領域２０アミノ酸（ｆ２）のＣ末端側のそれぞれにＧＦＰを融合したタンパク質（ｆ１−１／ＧＦＰ、ｆ１−２／ＧＦＰ、ｆ２／ＧＦＰ、ｆ３／ＧＦＰ）を発現させるプラスミドを作製した。
【０１２８】
OATP1B3/ct/pcDNA3.1(-)をテンプレートとして、ｆ１−２領域、ｆ２領域およびｆ３領域を表６に示すプライマーを用いてＰＣＲ（９５℃３０秒の後、９５℃10秒、６０℃１０秒、７２℃２０秒を４０回繰り返し、７２℃１０秒を最終ステップ）により増幅した。また、ＧＦＰおよびｆ１−１／ＧＦＰについては、pAcGFP-c1をテンプレートとして表６に示すプライマーを用いてＰＣＲ（９４℃３分の後、９８℃１０秒、５９℃５秒、７２℃５０秒を４０回繰り返し、７２℃３分を最終ステップ）により増幅した。ＧＦＰのＰＣＲ産物をＢａｍＨＩ処理し、同様にＢａｍＨＩ処理したｆ１−２、ｆ２およびｆ３のそれぞれのＰＣＲ産物とライゲーションした。これをテンプレートとして表６に示すプライマーを用いてＰＣＲ（９４℃２分の後、９４℃１０秒、６０℃３０秒、７２℃６０秒を３５回繰り返し、７２℃３０秒を最終ステップ）により増幅した。得られたｆ１−２／ＧＦＰ、ｆ３／ＧＦＰはDynaExpress TA PCR Cloning Kit (BioDynamics Laboratory Inc., 東京) を用いてpTAC-1vectorに挿入した。また、得られたｆ１−１／ＧＦＰ、ｆ２／ＧＦＰはpCR Blunt-II TOPO vector（インビトロジェン）に挿入した。これらプラスミドをＸｂａＩおよびＫｐｎＩで処理し、同様に処理したpcDNA3.1(-)Neoとライゲーションして、f1-1/GFP/pcDNA3.1、f1-2/GFP/pcDNA3.1、f2/GFP/pcDNA3.1、f3/GFP/pcDNA3.1を作製した。
【０１２９】
１０．リバーストランスフェクション
mCherry/pcDNA3.1(-) ３２０ｎｇ／ウェルと、各ＧＦＰ融合ペプチド発現プラスミドまたはempty pcDNA3.1 (-)Neo（mock） ３２０ｎｇ／ウェルとの混合物にOPTI-MEM（登録商標）（インビトロジェン）１００μＬ／ウェル、およびPlus Reagent（インビトロジェン）０．５μＬ／ウェルを混合し、Lipofectamin LTX（インビトロジェン）１．６μＬ／ウェルを加え２９３ＦＴ細胞３．５×１０５細胞／ウェルとともに２４ウェルプレートに播種した。播種から２４時間後、ＧＦＰ由来の緑色蛍光およびmCherry由来の赤色蛍光をOlympus Fluoview ver2.3（オリンパス、東京）を用いて観察した。結果を図８に示す。ここで、図８において、緑色はＧＦＰ由来の蛍光であり、赤色はトランスフェクションコントロールであるmCherry由来の蛍光である。また、両蛍光の重ね合わせをMergeとして示し、微分干渉像をPhaseとして示す。なお、解析に用いたレーザー強度・照射時間は全て等しくした。
【０１３０】
図８に示すように、トランスフェクションした２９３ＦＴ細胞においてｆ１−１／ＧＦＰおよびｆ３／ＧＦＰ由来と考えられる強い蛍光が認められた（図８（ｂ）および（ｅ））。また、ｆ２／ＧＦＰ（図８（ｄ））由来の蛍光も認められた。一方、ｆ１−２／ＧＦＰについては、非常に弱い蛍光が認められた（図８（ｃ））。また、同時におこなったｍｏｃｋを用いた実験では緑色蛍光は認められなかった（図８（ａ））。なお、いずれの実験においてもmCherry由来の赤色蛍光は同等の発色レベルを示した。
【配列表フリーテキスト】
【０１３１】
〔配列番号：１〕
ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔのｃＤＮＡの塩基配列を表す。
〔配列番号：２〕
ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔのｃＤＮＡの塩基配列を表す。
〔配列番号：３〕
ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を表す。
〔配列番号：４〕
ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔのフレーム１−１（終止コドン含む）の塩基配列を表す。
〔配列番号：５〕
ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔのフレーム１−１によりコードされるペプチド（ｆ１−１）のアミノ酸配列を表す。
〔配列番号：６〕
ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔのフレーム１−２（終止コドン含む）の塩基配列を表す。
〔配列番号：７〕
ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔのフレーム１−２によりコードされるペプチド（ｆ１−２）のアミノ酸配列を表す。
〔配列番号：８〕
ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔのフレーム２（終止コドン含む）の塩基配列を表す。
〔配列番号：９〕
ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔのフレーム２によりコードされるポリペプチド（ｆ２）のアミノ酸配列を表す。
〔配列番号：１０〕
ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔのフレーム３（終止コドン含む）の塩基配列を表す。
〔配列番号：１１〕
ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔのフレーム３によりコードされるペプチド（ｆ３）のアミノ酸配列を表す。
〔配列番号：１２〕
ヒトＧＡＰＤＨ遺伝子の増幅に用いたフォワードプライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：１３〕
ヒトＧＡＰＤＨ遺伝子の増幅に用いたリバースプライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：１４〕
ＲＬＭ−５’−ＲＡＣＥのTouch-down PCRに用いたリバースプライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：１５〕
ＲＬＭ−５’−ＲＡＣＥのNested-PCRに用いたリバースプライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：１６〕
ＲＴ−ＰＣＲおよびＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔのｃＤＮＡクローニングに用いたフォワード
プライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：１７〕
ＲＴ−ＰＣＲに用いたリバースプライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：１８〕
ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔのｃＤＮＡクローニングに用いたリバースプライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：１９〕
ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔのｃＤＮＡクローニングに用いたフォワードプライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：２０〕
ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔのｃＤＮＡクローニングに用いたリバースプライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：２１〕
定量的リアルタイムＰＣＲにおいてＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔの検出に用いたフォワードプライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：２２〕
定量的リアルタイムＰＣＲにおいてＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔの検出に用いたリバースプライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：２３〕
定量的リアルタイムＰＣＲにおいてＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔの検出に用いたフォワードプライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：２４〕
定量的リアルタイムＰＣＲにおいてＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔの検出に用いたリバースプライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：２５〕
f1-1/GFP/pcDNA3.1からの配列番号：５のアミノ酸配列からなるペプチドの発現に用いたフォワードプライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：２６〕
f1-1/GFP/pcDNA3.1からの配列番号：５のアミノ酸配列からなるペプチドの発現に用いたリバースプライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：２７〕
f1-2/GFP/pcDNA3.1からの配列番号：７のアミノ酸配列からなるペプチドの発現、f2/GFP/pcDNA3.1からの配列番号：９のアミノ酸配列からなるタンパク質の発現、およびf3/GFP/pcDNA3.1からの配列番号：１１のアミノ酸配列からなるペプチドの発現に用いたフォワードプライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：２８〕
f1-2/GFP/pcDNA3.1からの配列番号：７のアミノ酸配列からなるペプチドの発現に用いたリバースプライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：２９〕
f2/GFP/pcDNA3.1からの配列番号：９のアミノ酸配列からなるタンパク質の発現に用いたリバースプライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：３０〕
F3/GFP/pcDNA3.1からの配列番号：１１のアミノ酸配列からなるペプチドの発現に用いたリバースプライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：３１〕
F1-1/GFP/pcDNA3.1、f1-2/GFP/pcDNA3.1、f2/GFP/pcDNA3.1、およびf3/GFP/pcDNA3.1からのＧＦＰタンパク質の発現に用いたフォワードプライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：３２〕
F1-1/GFP/pcDNA3.1、f1-2/GFP/pcDNA3.1、f2/GFP/pcDNA3.1、およびf3/GFP/pcDNA3.1からのＧＦＰタンパク質の発現に用いたリバースプライマーの塩基配列を表す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規ながんマーカーに関する。より詳細には、本発明は、ＯＡＴＰ１Ｂ３ ｍＲＮＡの新規な選択的スプライシングバリアント、およびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
最近の医療技術の進歩により、がんの治療技術も大幅に改善されており、ある種のがんについては、死亡率の減少傾向を示すものもある。しかしながら、がんの発症を早期に発見することは、その治療効果に影響を与えるものであるため、がんの早期発見を可能にする方法の確立が望まれている。
【０００３】
がんの診断には、がん組織を超音波またはＸ線検査などにより視覚的に捉える方法のほか、患者から採取した組織を免疫組織学的手法により細胞形態等の異常を発見する方法、並びに、特定のがんの発症に伴い発現に変化が生じるタンパク質または遺伝子などのいわゆるがんマーカーの動態を検出する生化学的、免疫化学的方法などが知られている。
【０００４】
これらの方法において、組織を免疫組織学的手法によりその形態を観察する方法は、組織の標本化が必要であるため、がんの発症の有無の確認に時間を要し、また、観察された形態からがんの発症の有無を見極めるためにはかなりの熟練が必要となる。
【０００５】
したがって、比較的簡便でかつ客観的にがん発症の有無を判断することができるがんマーカーを用いる方法の適用が、しばしばおこなわれるようになってきた。しかしながら、ヒトのがんの診断において使用されるがんマーカーの多くは、正常組織細胞にもある程度発現していることから、当該がんマーカーの発現の変動をがん化の指標として用いなくてはならないことが多く、誤診断の可能性が常に存在している。
【０００６】
したがって、がん発症の有無を客観的により正確に検出するために、非がん細胞にはその存在が認められず、がん化した細胞だけが産生する物質をがんマーカーとして用いることが望ましい。例えば膵臓がんを例に挙げると、現時点において膵臓がんには有効なスクリーニング検査法が存在しないため、がん症状が表れた時には手遅れになっていることが多く、膵臓がんの早期発見のためには膵臓がん特異的ながんマーカーの使用が必要とされている。
【０００７】
ところで、有機アニオン輸送ポリペプチド１Ｂ３（ＯＡＴＰ１Ｂ３；Organic Anion Transporting Polypeptide 1B3、遺伝子名SLCO1B3）は、細胞膜上に発現するトランスポーターであり、幅広い基質認識性を示し、抗がん剤を含む多くの化合物の細胞内取り込みを担っている。ＯＡＴＰ１Ｂ３は通常肝細胞に特異的に発現するが、他の臓器でもがん化に伴い発現が認められるようになる。これまで、乳がんおよび前立腺がんにおいてＯＡＴＰ１Ｂ３の発現や機能が患者の生存率に影響を及ぼすことが報告されている（非特許文献１および２を参照）。また、大腸がん細胞を用いた解析では、ＯＡＴＰ１Ｂ３の発現が細胞にアポトーシス抵抗性を付与するとの報告がある（非特許文献３を参照）。
【０００８】
以上のことから、ＯＡＴＰ１Ｂ３はがん細胞においてなんらかの役割を担っていると考えられる。このため、ＯＡＴＰ１Ｂ３の検出はがん治療における予後の診断や抗がん剤有効性診断に有用ながんマーカーとして期待されている。例えば、特許文献１には、ＬＳＴ−２（ＯＡＴＰ１Ｂ３の別名である）のＣ末端側細胞内ドメインを認識する抗ＬＳＴ−２モノクローナル抗体を用いて女性大腸がん患者のがん組織におけるＬＳＴ−２の発現を測定し、この測定値に基づいて当該患者の予後を予測する技術が開示されている。
【０００９】
しかしながら、がん細胞におけるＯＡＴＰ１Ｂ３の発現・機能については依然として不明な点が多く、がんマーカーとしての利用形態が十分に確立しているとはいえないのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００７−１１９３９０号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Muto et al. Human liver-specific organic anion transporter-2 is a potent prognostic factor for human breast carcinoma. (2007) Cancer Sci. 98:1570-6
【非特許文献２】Hamada et al. Effect of SLCO1B3 Haplotype on Testosterone Transport and Clinical Outcome in Caucasian Patients with Androgen-Independent Prostatic Cancer. (2008) Clin. Cancer Res. 14:3312-8
【非特許文献３】Lee et al. Overexpression of OATP1B3 confers apoptotic resistance in colon cancer. (2008) Cancer Res. 68:10315-23
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
上述したような従来技術に鑑み、本発明は、新規ながんマーカーおよびその用途を提供することを目的とする。より詳細には、本発明は、新規ながんマーカー、当該がんマーカーの測定方法および測定用キット、これを用いたがんの検出方法、がんの検出用キット、がんの予防および／または治療剤のスクリーニング方法、並びに、がんワクチン等の医薬を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上述した従来技術に鑑み、ＯＡＴＰ１Ｂ３の発現・機能のさらなる探索を目的として、鋭意研究をおこなった。その過程で、驚くべきことに：
（１）従来報告されているＯＡＴＰ１Ｂ３ ｍＲＮＡ（本明細書中、「ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔ」とも称する；「ｗｔ」とは野生型（Ｗｉｌｄ Ｔｙｐｅ）の意である）の選択的スプライシングバリアントが存在すること、
（２）この新たな選択的スプライシングバリアントが、がん細胞・組織において特異的に強く発現すること；および、
（３）この新たな選択的スプライシングバリアントから、いくつかのペプチドまたはタンパク質が発現しうること、
の３つの知見を得て（本明細書中、この選択的スプライシングバリアントを「ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔ」とも称する；「ｃｔ」とはがん型（Ｃａｎｃｅｒ Ｔｙｐｅ）の意である）、これらの知見に基づき、本発明を完成させるに至った。
【００１４】
すなわち、本発明の第１の形態によれば、被検試料中のＯＡＴＰ１Ｂ３ ｍＲＮＡの選択的スプライシングバリアントの測定方法が提供される。当該測定方法は、生体から分離した被検試料中の、配列表の配列番号：１で表される塩基配列を含むｍＲＮＡを、配列番号：２で表される塩基配列を含むｍＲＮＡと識別して測定することを含む。
【００１５】
この際、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔは、配列番号：１で表される塩基配列におけるエキソンＳＶの存在を指標として測定されることが好ましい（「エキソンＳＶ」についての詳細は後述する）。また、この測定は、例えば、エキソンＳＶを含む領域に設定したプライマーを一方のプライマーとして用いる核酸増幅法により、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔまたはそのｃＤＮＡの部分領域を特異的に増幅し、増幅産物を測定することを含む。なお、前記プライマーの塩基数は、好ましくは１５〜３５程度である。また、前記核酸増幅法は、好ましくはＲＴ−ＰＣＲ法である。
【００１６】
また、本発明の第２の形態によれば、以下の条件を満足する核酸を提供する：
（１）配列番号：１で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする；
（２）配列番号：２で表される塩基配列を含む核酸が共存する場合に、ストリンジェントな条件下で、当該核酸とはハイブリダイズしないか、または、当該核酸とハイブリダイズした場合であってもその３’末端がミスマッチとなる。
【００１７】
この際、当該核酸は、エキソンＳＶを含む領域とハイブリダイズすることが好ましい。また、当該核酸の塩基数は、好ましくは１０程度以上であり、より好ましくは１５〜３５程度である。さらに、当該核酸は、配列番号：１で表される塩基配列または当該塩基配列の部分領域と同じ塩基配列またはこれらの塩基配列のうち１０％以下の塩基が置換されてなる塩基配列からなることが好ましい。当該核酸は、ＯＡＴＰ１Ｂ３ ｍＲＮＡの選択的スプライシングバリアントの測定に好適に用いられる。この際、当該核酸は、好ましくは核酸増幅用のプライマー、またはプローブである。
【００１８】
さらに、本発明の第３の形態によれば、本発明の第２の形態により提供される核酸を含む、ＯＡＴＰ１Ｂ３ ｍＲＮＡの選択的スプライシングバリアントの測定用キットが提供される。
【００１９】
また、本発明の第４の形態によれば、がんの検出方法も提供される。当該検出方法は、本発明の第１の形態により提供される測定方法により、または、本発明の第３の形態により提供される測定用キットを用いて、生体から分離した被検試料中のＯＡＴＰ１Ｂ３ ｍＲＮＡの選択的スプライシングバリアントを測定することを含む。この際、配列番号：１で表される塩基配列を含むＯＡＴＰ１Ｂ３ ｍＲＮＡの選択的スプライシングバリアントを測定することが好ましい。また、当該検出方法において、がんは、大腸がんまたは膵臓がんであることが好ましい。
【００２０】
さらに、本発明の第５の形態によれば、がんの予防および／または治療剤のスクリーニング方法もまた、提供される。当該スクリーニング方法は、本発明の第１の形態により提供される測定方法により、または、本発明の第３の形態により提供される測定用キットを用いて、がん細胞を被検物質の存在下で培養して得られる培養細胞中のＯＡＴＰ１Ｂ３ ｍＲＮＡの選択的スプライシングバリアントを測定する工程と、得られた測定結果を、前記被検物質の非存在下における場合と比較および／または評価する工程とを含む。
【００２１】
そして、本発明の第６の形態によれば、配列番号：１で表される塩基配列を含む、ＯＡＴＰ１Ｂ３ ｍＲＮＡの選択的スプライシングバリアント自体もまた、提供される。本選択的スプライシングバリアントは、例えば、該バリアントを培養細胞等に導入し強制発現させることにより、がん化培養細胞等を作成し、本発明の第５の形態のスクリーニング方法にも利用できる。
【００２２】
また、本発明の第７の形態によれば、
（１）配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を含み、かつ、がん細胞またはがん組織において発現が増強するポリペプチド、あるいは、
（２）配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列において、１０％以下のアミノ酸が置換、欠失、および／または挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ、がん細胞またはがん組織において発現が増強するポリペプチドが提供される。当該ポリペプチドは、好ましくは、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
【００２３】
さらに、本発明の第８の形態によれば、第７の形態のポリペプチドをコードする核酸や、当該核酸を含む発現ベクター、当該発現ベクターで形質転換された細胞もまた、提供される。
【００２４】
また、本発明の第９の形態によれば、第７の形態のポリペプチドに結合する抗体や、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、または配列番号：１０で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、少なくとも１５塩基を有する核酸もまた、提供される。
【００２５】
そして、本発明の第１０の形態によれば、生体から分離した被検試料中の、上記第７の形態のポリペプチドの量を測定することを含む、がんの検出方法が提供される。この際、上記第９の形態の抗体を測定に用いることが好ましい。また、当該抗体を含む、がんの検出用キットも提供されうる。
【００２６】
本発明の第１１の形態では、医薬が提供される。当該医薬は、第７の形態のポリペプチドまたはその断片や、第８の形態の核酸またはその断片を含み、特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するためのものである。当該医薬は、好ましくはがんワクチンである。
【発明の効果】
【００２７】
本発明によれば、新規ながんマーカーとしてヒトＯＡＴＰ１Ｂ３ ｍＲＮＡの新規な選択的スプライシングバリアントが提供され、その測定方法、当該測定に利用可能な核酸、および当該測定方法を実施するための手段（測定用キット）が提供される。また、本発明によれば、新規ながんの検出方法も提供され、さらには、がんの予防および／または治療剤の新規なスクリーニング方法も提供される。そして、がんの検出に用いられうるポリペプチドやこれに結合する抗体、当該ポリペプチドの量を指標としたがんの検出方法、当該抗体を含むがんの検出用キット、がんワクチン等としての医薬などもまた、提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔのｃＤＮＡの塩基配列（配列番号：１）およびＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔのｃＤＮＡの塩基配列（配列番号：２）をアライメントした結果を示す図である。図１において、アステリスク（＊）は、２つの塩基配列間でヌクレオチドが一致していることを意味する。
【図２】ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を示す図である。
【図３】実施例の「５．ＳＬＣＯ１Ｂ３遺伝子の転写開始点の決定」において、ヒト大腸がん由来ｔｏｔａｌ ＲＮＡまたは白人種肝由来ｔｏｔａｌ ＲＮＡをテンプレートとしてＲＬＭ−５’−ＲＡＣＥ法をおこなった結果を可視化するためのアガロースゲル電気泳動の結果を示す写真である。
【図４】ヒトＳＬＣＯ１Ｂ３遺伝子の構造を示す模式図である。図４には、既知および新規の転写開始点の位置が示されている。また、実施例においてＲＴ−ＰＣＲをおこなった際に用いたプライマーセットがハイブリダイズする位置もそれぞれ矢印で示されている。
【図５】実施例の「６．ｃＤＮＡの作製およびＲＴ−ＰＣＲ法によるｍＲＮＡ発現解析」において、ＬＳ１８０細胞ｔｏｔａｌ ＲＮＡ、ＰＫ４５ｐ細胞、ヒト大腸がん／正常大腸ペアＲＮＡおよび白人種肝由来のｔｏｔａｌ ＲＮＡをテンプレートとしてＲＴ−ＰＣＲをおこなった結果を可視化するためのアガロースゲル電気泳動の結果を示す写真である。
【図６】実施例の「８．定量的リアルタイムＰＣＲによるｍＲＮＡ発現解析」の結果（ｍＲＮＡ発現プロファイル）を示すグラフである。図６のＡは、各組織・細胞におけるＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔの発現レベルを示す。また、図６のＢは、各組織・細胞におけるＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔの発現レベルを示す。さらに、図６のＣは、発現レベルの比（ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔのコピー数／ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔのコピー数）を示す。
【図７】ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔ上に存在する４つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を表す図である。ｃＤＮＡの塩基配列を上列に示し、下列にコードされるアミノ酸配列を示す。また、下線がＯＲＦを示し、太字ＡＴＧはＯＲＦの上流にある推定翻訳開始コドンを示す。コードされるアミノ酸配列において「ＧＦＰ」とあるのは、実施例で発現プラスミドを作製した際に緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする塩基配列を挿入した部位を示す。なお、フレーム２については、Ｎ末端２０アミノ酸をコードする領域の後にＧＦＰをコードする塩基配列を挿入して発現プラスミドを作製した。
【図８】実施例の「１０．リバーストランスフェクション」の結果を示すグラフである。なお、緑色はＧＦＰ由来の蛍光であり、赤色はトランスフェクションコントロールであるmCherry由来の蛍光である。また、両蛍光の重ね合わせをMergeとして示し、微分干渉像をPhaseとして示す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
ヒトＳＬＣＯ１Ｂ３遺伝子は、染色体１２ｐ１２上に位置する約１０６ｋｂｐの遺伝子であり、この遺伝子から、２７１２ｂｐ（１５エキソン）からなるＯＡＴＰ１Ｂ３ ｍＲＮＡ（ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔ；Ｒｅｆｓｅｑ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿０１９８４４）が転写される。既に報告されているこのＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔのｃＤＮＡの塩基配列を配列番号：２および図１に示す。このＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔは、７０２アミノ酸からなるタンパク質（ＯＡＴＰ１Ｂ３タンパク質；ＲｅｆＳｅｑ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿０６２８１８）をコードしている。このＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：３および図２に示す。なお、配列番号：２で表される塩基配列において、５’末端から１番目の塩基（本明細書中、「１ｎｔ」のように称する。他の位置の塩基も同様に５’末端から何番目に位置するかの数字にｎｔを付けて称する）から６１ｎｔまでがエキソン１、６２ｎｔ〜２１０ｎｔがエキソン２、２１１ｎｔ〜１９９１ｎｔがエキソン３〜エキソン１４であり、１９９２ｎｔ〜２７１２ｎｔがエキソン１５である。なお、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔのコード領域（ＣＤＳ；Coding Sequence）は、エキソン２〜エキソン１５に跨る１２７〜２２３５ｎｔ（終止コドンＴＡＡを含む）であり、図１において大文字で表記されている。一方、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔの非コード領域は、図１において小文字で表記されている。
【００３０】
後述する実施例に記載するように、本発明者らは、ヒトＳＬＣＯ１Ｂ３遺伝子の転写開始点を決定する目的で、ヒト大腸がん組織由来のｔｏｔａｌ ＲＮＡをテンプレートとしてＲＬＭ−５’−ＲＡＣＥ法をおこなったところ、既に報告されている転写開始点（図１に示す「ＴＳＳ」）の情報から予想されるサイズよりも分子量の小さい増幅産物が検出されることを見出した。そして、ＳＬＣＯ１Ｂ３遺伝子の新規転写開始点付近の塩基配列をヒトゲノムＤＮＡのデータベースと照合したところ、新規転写開始点はＳＬＣＯ１Ｂ３遺伝子のイントロン２の領域内に存在し、さらにここに新たなエキソンが存在することが明らかとなった（この新たなエキソンを「エキソンＳＶ」と称する）。また、このエキソンＳＶはＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔでいうエキソン３へとスプライシングされていた（後述する図４を参照）。このようにして発見されたＯＡＴＰ１Ｂ３ ｍＲＮＡの新規な選択的スプライシングバリアント（ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔ）のｃＤＮＡの塩基配列を配列番号：１および図１に示す。
【００３１】
上述したように、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔのエキソンＳＶはＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔのエキソン３へとスプライシングされていた。すなわち、配列番号：１で表される塩基配列において、１ｎｔ〜１３９ｎｔがエキソンＳＶである。また、配列番号：１で表される塩基配列における１４０ｎｔ〜１９２０ｎｔは、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔのエキソン３〜エキソン１４と実質的に同一の塩基配列を有する。そして、配列番号：１で表される塩基配列における１９２１ｎｔ〜２１７０ｎｔは、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔのエキソン１５の対応部分と同一の塩基配列を有する。
【００３２】
本発明において見出された選択的スプライシングバリアント（例えば、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔ）は、後述する実施例に記載のように、がん細胞においてその発現量が増大していることが確認された。したがって、生体から分離した被検試料中の当該選択的スプライシングバリアントを測定することにより、がんの検出が可能である。
【００３３】
以下、本発明の具体的な好ましい実施形態についてより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載に基づいて定められるべきであり、以下の具体的な実施形態や実施例によって限定されるべきではない。
【００３４】
本発明の第１の形態により提供されるＯＡＴＰ１Ｂ３ ｍＲＮＡの選択的スプライシングバリアントの測定方法では、生体から分離した被検試料中の、配列番号：１で表される塩基配列を含むｍＲＮＡ（例えば、配列番号：１で表される塩基配列からなるｍＲＮＡ）を、配列番号：２で表される塩基配列を含むｍＲＮＡ（例えば、配列番号：２で表される塩基配列からなるｍＲＮＡ）と識別して測定することを含む。なお、配列番号：１の塩基配列は、ｍＲＮＡおよびこれをテンプレートとして得られるｃＤＮＡの塩基配列を兼用して示すものであり、ｍＲＮＡを示す場合には、当然ながら、チミン（ｔ）に代えてウラシル（ｕ）が含まれるため、ｔをｕに読み替える。また、「測定」には、定量、半定量および検出のいずれの概念も包含される。さらに、「ｍＲＮＡを測定する」ことには、ｍＲＮＡを直接的に測定する場合のほか、ｍＲＮＡを一旦ｃＤＮＡへと変換した後に当該ｃＤＮＡを測定する場合（後述するＲＴ−ＰＣＲ等）や、ｍＲＮＡの翻訳産物を測定する場合のように、ｍＲＮＡを間接的に測定する場合も包含される。また、以下の説明では、配列番号：１で表される塩基配列を含むｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、核酸等を、「配列番号：１のｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、核酸等」と称することがある。
【００３５】
なお、配列表には、規則により、二本鎖核酸であってもそのうちの一本鎖（ポリペプチドをコードする核酸ではセンス鎖）のみを記載することになっている。このため、二本鎖核酸の場合には、配列表に現実に記載されている配列は一本鎖であっても、実際にはその相補鎖も配列表に記載されていると解することができる。したがって、本願明細書においても、ある配列番号で表される塩基配列を含むもしくはこれからなる核酸が二本鎖核酸である場合または二本鎖核酸であってもよい場合には、その配列番号で表される塩基配列は、文脈上そうでないことが明らかな場合を除き、その相補鎖をも包含するものとする。例えば、「配列番号：１で表される塩基配列を含む核酸とハイブリダイズする核酸」とは、配列番号：１に現実に記載されているセンス鎖にハイブリダイズする核酸のほか、当該センス鎖に相補的な塩基配列からなるアンチセンス鎖にハイブリダイズする核酸をも意味するのである。
【００３６】
配列番号：１のｍＲＮＡを配列番号：２のｍＲＮＡと識別して測定することは、当業者にとって容易であり、種々の方法により可能である。例えば、エキソンＳＶ内とエキソン３以降の領域にプライマーを設定して逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）をおこない、増幅産物の分子量に基づいて、そのｍＲＮＡがＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔか選択的スプライシングバリアント（例えば、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔ）かを識別してｍＲＮＡを測定することができる。また、得られた増幅産物について塩基配列を決定してもよい（ダイレクトシークエンス）。
【００３７】
配列番号：１のｍＲＮＡには、上述したように、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔには存在しないエキソンであるエキソンＳＶが存在する。このため、このエキソンＳＶの存在を指標として選択的スプライシングバリアントを測定することができる。すなわち、配列番号：１で表される塩基配列におけるエキソンＳＶの存在を指標として、配列番号：１で表される塩基配列を含む選択的スプライシングバリアントを測定することができる。
【００３８】
エキソンＳＶの存在を指標として選択的スプライシングバリアントを測定する好ましい方法としては、エキソンＳＶを含む領域にハイブリダイズするプライマーを用いた核酸増幅法を用いる方法や、エキソンＳＶを含む領域にハイブリダイズするプローブを用いる方法を挙げることができる。
【００３９】
核酸増幅法を用いる方法には、エキソンＳＶを含む領域に設定したプライマーを一方のプライマーとして用いる核酸増幅法により配列番号：１で表される塩基配列を含むｍＲＮＡまたはそのｃＤＮＡの部分領域を特異的に増幅し、増幅産物を測定することを含む。ここで、「領域に設定した」とは、その領域とハイブリダイズするという意味であり、また、ＰＣＲのような核酸増幅法により増幅される核酸は二本鎖であるから、上述したように、配列表に現実に記載されているセンス鎖にハイブリダイズするプライマー（リバース側プライマー）を用いる場合と、当該センス鎖に相補的なアンチセンス鎖にハイブリダイズするプライマー（フォワード側プライマー）を用いる場合の両者が包含される。したがって、例えば、「エキソンＳＶを含む領域に設定したプライマー」とは、配列番号：１に現実に記載されたセンス鎖のエキソンＳＶを含む領域（つまり、１ｎｔ〜１３９ｎｔ）にハイブリダイズするプライマー（リバース側プライマー）または当該プライマーに相補的な塩基配列を有するプライマー（フォワード側プライマー）を意味する。また、「特異的に増幅する」とは、配列番号：１で表される塩基配列を含むｍＲＮＡまたはそのｃＤＮＡの部分領域は増幅されるが、配列番号：２で表される塩基配列を含むｍＲＮＡまたはそのｃＤＮＡの部分領域は増幅されないことを意味する。なお、配列番号：１で表される塩基配列において、１ｎｔ〜１３９ｎｔがエキソンＳＶであり、エキソン３は１４０ｎｔから始まる。したがって、配列番号：１で表される塩基配列において、１３９ｎｔと１４０ｎｔとの融合点は、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔには存在しないエキソンＳＶとエキソン３との特異的融合点である。ただし、図１からも明らかなように、上記特異的融合点の上流側２塩基は、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔとＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔとで共通している。したがって、配列番号：１で表される塩基配列における１３９ｎｔと１４０ｎｔとの融合点よりも、これに最も近接した他の特異的融合点である１３７ｎｔと１３８ｎｔとの融合点が、エキソンＳＶとエキソン３との特異的融合点としてより適切である。このことから、本明細書において、「エキソンＳＶを含む領域」としては、１ｎｔ〜１３７ｎｔがより好ましい。
【００４０】
テンプレートとなるｍＲＮＡの部分領域と同じ塩基配列（ただしｕはｔになる）を有するＤＮＡを増幅する核酸増幅法の好ましい例として、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）が挙げられる。ＲＴ−ＰＣＲでは、細胞からｍＲＮＡを常法により抽出し、逆転写酵素の作用によりｍＲＮＡをテンプレートとして第一鎖ｃＤＮＡを生成させ、さらにこの第一鎖ｃＤＮＡをテンプレートとして相補鎖を生成させて、二本鎖ｃＤＮＡを得る。次いで、得られた二本鎖ｃＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲをおこない、該ｃＤＮＡまたはその部分領域を増幅する。ＲＴ−ＰＣＲ自体は周知の技術であり、そのためのキットや装置も市販されているため、容易に実施することができる。選択的スプライシングバリアント由来のｃＤＮＡを特異的に増幅するために、上述した特異的融合点を含む領域に設定したプライマーを一方のプライマーとして用いる。他方のプライマーは、増幅すべきスプライシングバリアントの任意の領域に設定することができる。なお、プライマーのサイズは特に限定されないが、通常１５〜３５塩基程度であり、好ましくは１５〜２５塩基程度である。
【００４１】
例えば、配列番号：１のｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲにより測定する場合、配列番号：１で表される塩基配列中のエクソンＳＶを含む領域に設定したプライマーを一方のプライマー（フォワード側プライマーでもリバース側プライマーでもよい）として用いる。ここで、選択的スプライシングバリアント由来のｃＤＮＡを特異的に増幅するためには、プライマーとして、ストリンジェントな条件下で、配列番号：１のｃＤＮＡにはハイブリダイズするが、配列番号：２のｃＤＮＡにはハイブリダイズしないものを用いることが好ましい。ここで「ストリンジェントな条件」とは、プライマーがｃＤＮＡに対して特異的にハイブリダイゼーションする条件をいい、例えば成書に記載の条件（サムブルック（Sambrook）ら編、「モレキュラークローニング，ア ラボラトリーマニュアル 第２版」、１９８９年、コールドスプリングハーバーラボラトリー、特に１１．４５節“Conditions for Hybridization of Oligonucleotide probes”等）にしたがって決定でき、特に制限されない。ストリンジェントな条件は、塩濃度、温度、およびその他の条件によって決まり、例えば、塩濃度が低いほど、温度が高いほど、ストリンジェンシーは高くなり、プライマーとｃＤＮＡとがハイブリダイゼーションしにくくなる。塩濃度は、一般に、ＳＳＣ溶液（ＮａＣｌ＋クエン酸三ナトリウム）の濃度を調節することによって調節され、ストリンジェントな塩濃度は、例えば、ＮａＣｌ約２５０ｍＭ以下およびクエン酸三ナトリウム約２５ｍＭ以下である。ストリンジェントな温度は、一般に、完全ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）より１５〜２５℃低い温度であり、例えば、約３０℃以上である。溶液に有機溶媒（例えばホルムアミド）を加えることにより、温度を下げることができる。その他の条件としては、ハイブリダイゼーション時間、洗浄剤（例えば、ＳＤＳ）の濃度、およびキャリアーＤＮＡの存否等であり、これらの条件を組み合わせることによって、様々なストリンジェンシーを設定することができる。好ましい例として、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ クエン酸三ナトリウム、１％ ＳＤＳ、５０％ ホルムアミド、２００μg／ｍＬの変性サケ精子ＤＮＡの条件で、４２℃の温度によりハイブリダイゼーションをおこなう。また、ハイブリダイゼーション後の洗浄の条件もストリンジェンシーに影響する。この洗浄条件もまた、塩濃度および温度によって定義され、塩濃度の減少と温度の上昇によって洗浄のストリンジェンシーは増加する。好ましい例として、１５ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ クエン酸三ナトリウムおよび０．１％ ＳＤＳの条件で、６８℃の温度にて洗浄をおこなう。
【００４２】
配列番号：１のｃＤＮＡにはハイブリダイズするが、配列番号：２のｃＤＮＡにはハイブリダイズしないことを確保するために、ストリンジェントな条件下で、プライマーの２０％以上がエキソンＳＶを含む領域とハイブリダイズするものであることが好ましい。あるいは、ストリンジェントな条件下でも配列番号：２のｃＤＮＡとハイブリダイズした場合には、プライマーの３’末端がミスマッチとなるプライマーを用いることが好ましい。たとえストリンジェントな条件下で配列番号：２のｃＤＮＡとハイブリダイズしても、プライマーの３’末端がミスマッチであれば増幅は実質的に起きない。さらには、その少なくとも２０％以上がエキソンＳＶ内の領域とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするものであって、かつ、その３’末端が配列番号：２のｃＤＮＡとはミスマッチになるプライマーを用いることが特に好ましい。以上のようなプライマーを一方のプライマーとして用いることにより、配列番号：２のｃＤＮＡの共存下であっても、配列番号：１のｃＤＮＡのみを特異的に増幅することができる。なお、プライマーとしては、プライマーがハイブリダイズする配列番号：１の塩基配列中の領域と完全に相補的なものが好ましいが、通常、１０％以下程度のミスマッチがあってもプライマーとして利用できる場合が多い（ただし、上述したようにプライマーの３’末端がミスマッチとなるものは除く）。
【００４３】
ＰＣＲ自体は常法に従っておこなうことができる。そして、ＰＣＲによる増幅後に、増幅産物を測定する。かような増幅産物の測定も、常法によりおこなうことができる。上述したように、本発明における「測定」には、検出および定量の両者が包含される。さらに、増幅産物の電気泳動バンドの蛍光強度測定や、太さの目視判定のような、簡易定量または半定量も「測定」の概念に包含される。増幅産物の測定は、例えば増幅産物を電気泳動にかけ、増幅バンドを検出することによりおこなうことができる。また、蛍光標識したヌクレオチド三リン酸の存在下にＰＣＲをおこなうことによって増幅産物を蛍光標識し、増幅バンドの蛍光強度を測定することによっても、増幅産物の測定をおこなうことができる。さらに、電気泳動パターンをナイロンやニトロセルロースからなるメンブレンに転写し、増幅産物にハイブリダイズする標識プローブをハイブリダイズさせて、標識を検出または定量する（ＰＣＲ−サザン（Southern）法）によってもおこなうことができる。さらには、増幅産物にハイブリダイズするプローブを固相化し、上記増幅工程を標識ヌクレオチド三リン酸の存在下におこない、固相化プローブに増幅産物を結合させ、固相に結合された増幅産物を測定することによってもおこなうことができる。これらはいずれも常法であり、周知の知見が適宜参照されうる。
【００４４】
あるいは、上述したＲＴ−ＰＣＲのＰＣＲを、リアルタイム検出ＰＣＲによりおこなうと、より正確に増幅産物を定量することができるため、好ましい。リアルタイム検出ＰＣＲでは、通常のＰＣＲを、増幅産物にハイブリダイズする２種類の蛍光色素を結合したプローブの存在下でおこなう。２種類の蛍光色素の一方は、他方の蛍光色素からの蛍光発光を打ち消すクエンチャー色素であり、２種類の蛍光色素が同一のプローブ分子に結合されている状態では蛍光は測定されない。これに対し、ＰＣＲにより増幅が起きると、まず、プローブが増幅産物にハイブリダイズする。そして、増幅に用いられるＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性によりプローブが消化されて２種類の蛍光色素がバラバラになると、クエンチャー色素による消光が起きないので蛍光が測定されるようになるのである。測定される蛍光強度が急激に大きくなるサイクル数が、試料中の核酸テンプレートの濃度に依存して変化することから、連続的に反応溶液の蛍光を測定することにより試料中の鋳型核酸の濃度を定量することができる。なお、リアルタイム検出ＰＣＲ自体は周知の技術であり、そのためのキットも市販されているため、この市販のキットを用いて容易に実施することができる。
【００４５】
なお、ＲＴ−ＰＣＲをおこなう場合、最初のｍＲＮＡの抽出時に混入するゲノムＤＮＡに含まれる偽遺伝子を鋳型とする増幅が起きる場合がある。従って、用いるプライマーセットは、このような偽遺伝子に起因する増幅が起きないプライマーを選択したセットであることが好ましい。偽遺伝子に起因する増幅が起きるか否かは、例えば、そのプライマーセットを用い、ゲノムＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲをおこなった場合に、ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲをおこなった場合と同じサイズの増幅産物のみが生成するか否かにより判定することができる。後述する実施例で具体的に用いられているプライマーセット（表３）は、このような偽遺伝子による増幅が起きないものである。また、場合によっては、ＲＴ−ＰＣＲをおこなう前に、用いる予定のＲＮＡをテンプレートとして、ヒトグリセルアルデヒド−３−デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）などのハウスキーピング遺伝子を増幅するプライマーセット（例えば、表１に記載のもの）を用いたＰＣＲをおこない、増幅産物が得られないことを確認することによっても、ゲノムＤＮＡの混入がないことが保証されうる。
【００４６】
以上、本発明の測定方法をＲＴ−ＰＣＲ法によりおこなう場合を例に挙げて詳細に説明したが、本発明の測定方法は、上述したプライマーを用いて選択的スプライシングバリアントのｍＲＮＡもしくはｃＤＮＡまたはその部分領域の増幅をおこなう方法であれば、ＲＴ−ＰＣＲ法によりおこなわれるものに限定されず、他のいずれの核酸増幅法を利用するものであってもよい。例えば、ＮＡＳＢＡ法（３ＳＲ法、ＴＭＡ法）によりｍＲＮＡを増幅することもできる。ＮＡＳＢＡ法では、リバース側プライマーの５’末端にＴ７プロモーター配列を付加したものをリバース側プライマーとして、ＡＭＴ−ＲＴ等の逆転写酵素の存在下で、ｍＲＮＡをテンプレートとしてｃＤＮＡ鎖（アンチセンス鎖）を形成する。得られたＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖ハイブリッドのＲＮＡ鎖をＲＮａｓｅＨにより分解して一本鎖ｃＤＮＡ（アンチセンス鎖）とする。次に、この一本鎖ｃＤＮＡをテンプレートとし、フォワード側プライマーを用いてＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素としてＡＭＴ−ＲＴを用いる場合には、ＡＭＴ−ＲＴがＤＮＡポリメラーゼ活性を有するため、これで兼用する）の存在下で相補鎖を形成して、二本鎖ｃＤＮＡとする。この二本鎖ｃＤＮＡは、Ｔ７プロモーター配列を含んでいることから、これにＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを作用させると、転写によりＲＮＡ（アンチセンス鎖）が次々に形成される。さらに、形成された二本鎖ｃＤＮＡについて、変性工程、上記フォワード側プライマー及びリバース側プライマーとのアニーリング工程、相補鎖の伸長工程を繰り返すことにより、二本鎖ｃＤＮＡが増幅され、これを鋳型とした転写によってさらにＲＮＡ（アンチセンス鎖）が形成される。このようなＮＡＳＢＡ法においても、一方のプライマーとして、上記したプライマーを用いることにより、選択的スプライシングバリアントのみを増幅することができる（ただし、生成物は上記の通りアンチセンス鎖である）。なお、ＮＡＳＢＡ法自体は周知の技術であり、このためのキットも市販されているため、この市販のキットを用いて容易に実施することができる。
【００４７】
エキソンＳＶの存在を指標として選択的スプライシングバリアントを測定する他の好ましい方法としては、このエキソンＳＶを含む領域にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするプローブを用いる方法がある（ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法）。プローブとしては、ストリンジェントな条件下で、配列番号：１で表される塩基配列を有する核酸中のエキソンＳＶの領域にハイブリダイズするが、配列番号：２で表される塩基配列を有する核酸にはハイブリダイズしないものが用いられる。このような特異性を確保するために、プローブの全長の２０〜８０％、より好ましくは４０〜６０％がエキソンＳＶ領域にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、残りが隣接するエキソン３領域にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするものであることが好ましい。プローブのサイズは、特に限定されないが、オリゴヌクレオチドの場合、通常、１０塩基〜全長であり、１０塩基〜１００塩基程度が好ましく、さらに好ましくは１５塩基〜３５塩基程度であり、ｃＲＮＡやｃＤＮＡの場合、通常、３００塩基〜８００塩基程度である。また、プライマーの場合と同様、プローブがハイブリダイズする領域と完全に同一の塩基配列を有することが最も好ましいが、プローブ全長の１０％以下の塩基が置換していてもよい。
【００４８】
プローブは、上記核酸に蛍光標識、ビオチン標識、放射標識、酵素標識等の周知の標識を結合して標識プローブとすることもできる。また、プローブは、例えば固相化プローブとして用いる場合に、固相に結合させる領域や、分枝プローブにおける標識を結合させるための分枝のような、被検核酸とは無関係な任意の核酸が結合されたものであってもよい。
【００４９】
プローブは、被検試料中に含まれる選択的スプライシングバリアントのｍＲＮＡの直接的な測定に用いることもできるし、ｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ等の核酸増幅法で増幅した後、増幅された増幅核酸を測定する目的にも用いることができる。増幅産物をプローブで特異的に測定する場合、核酸増幅には、エキソンＳＶが増幅産物中に含まれるようにプライマーを設定する。この場合のプライマーは、選択的スプライシングバリアントに特異的なものである必要はなく、測定の特異性はプローブにより確保される。
【００５０】
本発明はまた、配列番号：１で表される塩基配列を含む核酸とはハイブリダイズするが、配列番号：２で表される塩基配列を含む核酸が共存していても当該核酸とはハイブリダイズしない核酸、または、配列番号：２で表される塩基配列を含む核酸とハイブリダイズした場合にその３’末端がミスマッチとなる核酸をも提供する。このような核酸は、上述したプライマーやプローブとして用いることができる。このような核酸としては、配列番号：１で表される塩基配列におけるエキソンＳＶを含む領域とハイブリダイズするが、配列番号：２で表される塩基配列を含む核酸が共存していても当該核酸とはハイブリダイズしない核酸、または、配列番号：２で表される塩基配列を含む核酸とハイブリダイズした場合にその３’末端がミスマッチとなる核酸が、選択的スプライシングバリアントの特異的な測定のためには好ましい。このような本発明の核酸は、塩基数が１０以上であることが好ましく、特に塩基数が１５〜３５であることが好ましい。また、本発明の核酸は、配列番号：１で表される塩基配列またはその部分領域と同じ塩基配列または当該塩基配列のうち１０％以下の塩基が置換した塩基配列を有することが好ましく、特に配列番号：１で表される塩基配列またはその部分領域と同じ塩基配列をからなることが好ましい。
【００５１】
このような本発明の核酸は、核酸増幅法のプライマーやプローブ等の、選択的スプライシングバリアントの測定用核酸として用いられうる。
【００５２】
さらに、本発明は、上述した本発明の測定用核酸を含む、ＯＡＴＰ１Ｂ３ ｍＲＮＡの選択的スプライシングバリアントの測定用キットをも提供する。キットに含まれる試薬類は、本発明の測定用核酸以外は周知のものであってよく、例えば、プライマーセットのほか、逆転写酵素、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、ランダムプライマー、ＲＮａｓｅ阻害剤、緩衝液等を含めて測定用キットにすることができる。あるいは、キットは、フォワード側プライマーおよびリバース側プライマーのみからなるプライマーセットとし、他の試薬類は、市販のＲＴ−ＰＣＲ用キット等を利用するようにしてもよい。
【００５３】
上述した選択的スプライシングバリアントは、がんマーカーとして利用することができる。すなわち、本発明により提供される選択的スプライシングバリアントは、がん細胞・組織において特異的に強く発現することが判明している。よって、本発明により提供される測定方法や測定用キットは、がんの検出に利用することができる。この際、検出対象とされるがんの種類は特に制限されず、例えば、大腸がん、膵臓がん、乳がん、肺がん、前立腺がん、食道がん、胃がん、肝臓がん、胆道がん、脾臓がん、腎がん、膀胱がん、子宮がん、卵巣がん、精巣がん、甲状腺がん、脳腫瘍、造血器腫瘍などの検出に利用されうる。特に、後述する実施例に記載のように、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔは、ヒト大腸がん組織に加えて、ヒトの大腸がん由来の細胞（ＬＳ１８０、ＨＣＴ１１６）およびヒトの膵臓がん由来の細胞（ＰＫ４５ｐ）にも強く発現していることが確認されている。これに対し、ヒト正常大腸由来の組織にはＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔの発現が確認されなかったことから、本発明により提供される選択的スプライシングバリアントは、大腸がんおよび膵臓がんのマーカーとして特に有用である。
【００５４】
本発明の他の形態によれば、がんの予防および／または治療剤のスクリーニング方法が提供される。このスクリーニング方法は、まず、がん細胞を被検物質の存在下で培養する。そして、得られる培養細胞において、上述した本発明の選択的スプライシングバリアントを測定する。次いで、得られた測定結果を、上記被検物質の非存在下における場合と比較および／または評価する。
【００５５】
具体的には、上述した各種がん由来のがん細胞株を、抗がん剤、抗がん候補物質、低分子化合物、天然有機高分子物質、天然の動植物の抽出物、ペプチドなどの被検物質の存在下で培養し、当該培養細胞における本発明の選択的スプライシングバリアントを測定（検出、半定量、または定量）し、選択的スプライシングバリアントの形態が、被検物質の非存在下における場合と比べて有意に減少しているときに、被検物質は上記細胞株が由来とするがんの予防および／または治療剤として有用である可能性があると判断する。
【００５６】
本発明のスクリーニング方法において、ヒト大腸がん由来の細胞株（例えば、ＬＳ１８０やＨＣＴ１１６）を用いることで、ヒト大腸がんの予防および／または治療剤のスクリーニングをおこなうことができる。同様に、ヒト膵臓がん由来の細胞株（例えば、ＰＫ４５ｐ）を用いることで、ヒト膵臓がんの予防および／または治療剤のスクリーニングをおこなうことができる。その他の周知のがん・腫瘍由来の細胞株についても、同様に用いることで各種がん・腫瘍の予防および／または治療剤のスクリーニングをおこなうことが可能である。
【００５７】
また、本発明のスクリーニング方法において、選択的スプライシングバリアントを測定する方法としては、上述した本発明の測定方法や測定用キットが同様に用いられうる。よって、ここでは詳細な説明を省略する。
【００５８】
本発明者らの検討によれば、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔ ｍＲＮＡから少なくとも４種のポリペプチドが発現しうることが判明した。具体的には、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、および配列番号：１１のそれぞれで表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔ ｍＲＮＡから発現しうることが確認された。これらのポリペプチドは、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔ ｍＲＮＡからは理論上発現できず、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔ ｍＲＮＡに特異的なものである。このため、これらのポリペプチドは、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔ ｍＲＮＡと同様にがんマーカーとしての有用性を有するものである。
【００５９】
上記の観点から、本発明の他の形態によれば、
（１）配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；および、
（２）配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を含み、かつ、がん細胞またはがん組織において発現が増強するポリペプチド、あるいは、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列において、１０％以下のアミノ酸が置換、欠失、および／または挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ、がん細胞またはがん組織において発現が増強するポリペプチド（以下、「機能的等価改変体」とも称する）；および、
が提供される。
【００６０】
「（２）機能的等価改変体」としては、「配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を含み、かつ、がん細胞またはがん組織において発現が増強するポリペプチド」、あるいは、「配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列において、０〜１０％、好ましくは０〜７％、さらに好ましくは０〜５％、特に好ましくは０〜２％のアミノ酸が置換、欠失、および／または挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ、がん細胞またはがん組織において発現が増強するポリペプチド」が含まれる。
【００６１】
「がん細胞またはがん組織において発現が増強する」とは、非がん細胞または非がん組織と比較してがん細胞またはがん組織において発現が２倍以上増強することを意味する。
【００６２】
以上、本形態のポリペプチドについて説明したが、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、および上記機能的等価改変体を総称して、以下、「本発明のポリペプチド」とも称する。また、「本発明のポリペプチド」のうち、配列番号：５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを「ｆ１−１」、配列番号：７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを「ｆ１−２」、配列番号：９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを「ｆ２」、配列番号：１１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを「ｆ３」とそれぞれ称する。
【００６３】
本発明のポリペプチドとしては、ｆ１−１またはｆ３が特に好ましい。
【００６４】
本発明のさらに他の形態によれば、本発明のポリペプチドをコードする核酸もまた、提供される。
【００６５】
ここで、本発明のポリペプチドであるｆ１−１をコードする塩基配列からなる核酸は、配列番号：５で表されるアミノ酸配列からなるｆ１−１、またはその機能的等価改変体をコードする塩基配列であれば特に制限はない。好ましくは、配列番号：５で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸であり、さらに好ましくは、配列番号:４で表される塩基配列からなる核酸である。
【００６６】
同様に、本発明のポリペプチドであるｆ１−２をコードする塩基配列からなる核酸は、配列番号：７で表されるアミノ酸配列からなるｆ１−２、またはその機能的等価改変体をコードする塩基配列であれば特に制限はない。好ましくは、配列番号：７で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸であり、さらに好ましくは、配列番号:６で表される塩基配列からなる核酸である。
【００６７】
また、本発明のポリペプチドであるｆ２をコードする塩基配列からなる核酸は、配列番号：９で表されるアミノ酸配列からなるｆ２、またはその機能的等価改変体をコードする塩基配列であれば特に制限はない。好ましくは、配列番号：９で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸であり、さらに好ましくは、配列番号:８で表される塩基配列からなる核酸である。
【００６８】
さらに、本発明のポリペプチドであるｆ３をコードする塩基配列からなる核酸は、配列番号：１１で表されるアミノ酸配列からなるｆ３、またはその機能的等価改変体をコードする塩基配列であれば特に制限はない。好ましくは、配列番号：１１で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸であり、さらに好ましくは、配列番号:１０で表される塩基配列からなる核酸である。
【００６９】
また、本発明のさらに他の形態によれば、上記核酸を含む発現ベクター、当該発現ベクターで形質転換された細胞もまた、提供される。
【００７０】
本発明の発現ベクターや細胞は、従来公知の知見を参照することにより作製することができる。例えば、単離された本発明の核酸を、適当なベクターＤＮＡに再び組込むことにより、真核生物または原核生物の宿主細胞を形質転換させることができる。また、これらのベクターに適当なプロモーターおよび形質発現に関連する配列を導入することにより、それぞれの宿主細胞において核酸を発現させることが可能である。
【００７１】
本発明の発現ベクターは、本発明の核酸を含む限り、特に限定されるものではなく、例えば、用いる宿主細胞に応じて適宜選択した公知の発現ベクターに、本発明の核酸を挿入することにより得られる発現ベクターを挙げることができる。
【００７２】
また、本発明の細胞も、本発明の発現ベクターでトランスフェクションされ、本発明の核酸を含む限り、特に限定されるものではなく、例えば、本発明の核酸が、宿主細胞の染色体に組み込まれた細胞であってもよいし、あるいは、本発明の核酸を含む発現ベクターの形で含有する細胞であってもよい。また、本発明のポリペプチドを発現している細胞であってもよいし、あるいは、本発明のポリペプチドを発現していない細胞であってもよい。本発明の細胞は、例えば、本発明の発現ベクターにより、所望の宿主細胞をトランスフェクションすることにより得ることができる。
【００７３】
上記で得られる所望の細胞は、常法に従い培養することができ、該培養により本発明のポリペプチドが生産される。該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものが適宜選択されうる。
【００７４】
上記により、形質転換細胞に生産される本発明のポリペプチドは、その物理的性質や生化学的性質等を利用した各種の公知の分離操作法により、分離・精製することができる。
【００７５】
本発明のポリペプチドは、マーカー配列とインフレームで融合して発現させることで、その発現の確認、精製等が可能になる。マーカー配列としては、例えば、ＦＬＡＧ ｅｐｉｔｏｐｅ、Ｈｅｘａ−Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ ｔａｇ、Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｔａｇ、ｍｙｃ ｅｐｉｔｏｐｅなどがある。また、マーカー配列とポリペプチドとの間にエンテロキナーゼ、ファクターＸａ、トロンビンなどのプロテアーゼが認識する特異的なアミノ酸配列を挿入することにより、マーカー配列部分をこれらのプロテアーゼにより切断除去することも可能である。
【００７６】
本発明の核酸は、それ自体、またはその一部をがんの検出方法においてハイブリダイズプローブとして用いることができ、がんの検出に有用である。また、本発明のポリペプチドは、本発明のポリペプチドを特異的に認識する抗体の作製や、発現レベルを検出・定量する際のコントロールとして用いることができる。
【００７７】
本発明によれば、本発明のポリペプチドに結合する抗体（以下、「本発明の抗体」とも称する）もまた、提供されうる。本発明の抗体の製造方法は、特に限定されるものではない。本発明の抗体（例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体）は、例えば、各種動物に配列番号：５で表されるアミノ酸配列を含み、かつ、がん細胞またはがん組織において発現が増強するポリペプチド、配列番号：５で表されるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、および／または挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ、がん細胞またはがん組織において発現が増強するポリペプチド、あるいは、配列番号：５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの全部またはその断片を直接投与することにより、得ることができる。また、前記ポリペプチドをコードする遺伝子を導入したプラスミドを用いてＤＮＡワクチン法（Ｒａｚ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，９５１９−９５２３，１９９４；Ｄｏｎｎｅｌｌｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１７３，３１４−３２０，１９９６）によっても得ることができる。
【００７８】
ポリクローナル抗体は前記ポリペプチドまたはその断片をフロイント完全アジュバントなどの適当なアジュバントに乳濁し、腹腔、皮下または静脈等に免疫して感作した動物、例えばウサギ、ラット、ヤギ、またはニワトリ等の血清または卵から製造される。このように製造されたポリクローナル抗体は常法のタンパク質単離精製法により、分離精製することができ、常法のタンパク質単離精製法としては例えば、遠心分離、透析、硫酸アンモニウムによる塩析、ＤＥＡＥ−セルロース、ハイドロキシアパタイト、プロテインＡアガロース等によるクロマトグラフィー法が挙げられる。
【００７９】
モノクローナル抗体は、ケーラーとミルスタインの細胞融合法（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７，１９７５）により当業者が容易に製造することが可能である。
【００８０】
本発明のさらに他の形態によれば、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、少なくとも１５塩基を有する核酸もまた、提供される。なお、「ストリンジェントな条件」については上述した通りである。このような核酸は、本発明の核酸を検出、単離するためのプローブとして、また、本発明の核酸を増幅するためのプライマーとして利用することが可能である。プライマーとして用いる場合には、通常、１５ｂｐ〜１００ｂｐ、好ましくは１５ｂｐ〜４０ｂｐの鎖長を有する。プライマーとして好ましい塩基配列は、後述する実施例の「９．緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）融合ｃｔＯＡＴＰ１Ｂ３ペプチド発現プラスミドの作製」においてｆ１−１、ｆ１−２、ｆ２およびｆ３のそれぞれを増幅するのに用いられているプライマーの塩基配列が挙げられる。また、プローブとして用いる場合には、本発明の核酸の一部もしくは全部の配列（またはその相補配列）を有し、少なくとも１５ｂｐの鎖長のＤＮＡが用いられる。
【００８１】
上記核酸を用いたプローブやプライマーは、がんの検出に利用することができる。
【００８２】
なお、本発明に基づいて、本発明の核酸の塩基配列またはその断片を含むオリゴヌクレオチドプローブのアレイを構築することもできる。アレイ技法は公知で、遺伝子発現を解析するために用いられている（Ｃｈｅｅ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ，．２７４，６１０−６１３）。
【００８３】
本発明のポリペプチドは、がんの検出方法にも適用されうる。すなわち、本発明の他の形態によれば、生体から分離した被検試料中の、本発明のポリペプチドの量を測定することを含む、がんの検出方法が提供される。この際、上述した本発明の抗体を測定に用いることが好ましい。また、当該抗体を含む、がんの検出用キットも提供されうる。以下、この形態について、より詳細に説明する。
【００８４】
被検試料中の、本発明のポリペプチドの検出は、例えば、被検試料を各種の分子量測定法、例えば、ゲル電気泳動や、各種の分離精製法（例：イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなど）、イオン化法（例：電子衝撃イオン化法、フィールドディソープション法、二次イオン化法、高速原子衝突法、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（MALDI）法、エレクトロスプレーイオン化法など）、質量分析計（例：二重収束質量分析計、四重極型分析計、飛行時間型質量分析計、フーリエ変換質量分析計、イオンサイクロトロン質量分析計など）を組み合わせる方法等に供し、本発明のポリペプチドの分子量と一致するバンドもしくはスポット、またはピークを検出することによりおこなうことができるが、これらに限定されない。本発明のポリペプチドはアミノ酸配列が既知であることから、当該アミノ酸配列を認識する抗体を作製して、ウエスタンブロッティングや各種イムノアッセイにより本発明のポリペプチドを検出する方法が、より好ましく用いられうる。なお、当該抗体の作製方法については、上述した通りである。本発明の抗体を用いて本発明のポリペプチドを検出する方法は、最適化されたイムノアッセイ系を構築してこれをキット化すれば、質量分析装置のような特殊な装置を使用することなく、高感度かつ高精度に本発明のポリペプチドを検出することができる点で、特に有用である。
【００８５】
本発明の抗体を用いる本発明のがんの検出方法は、特に制限されないが、被検試料中の抗原量に対応した抗体、抗原または抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法等が好適に用いられる。
【００８６】
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔125I〕、〔131I〕、〔3H〕、〔14C〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β-ガラクトシダーゼ、β-グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレセインイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン-アビジン系を用いることもできる。
【００８７】
抗原または抗体の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、また通常タンパク質あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体としては、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、またはガラス等が挙げられる。
【００８８】
サンドイッチ法においては、不溶化した本発明の抗体に被検試料を反応させ（１次反応）、さらに標識化した別の本発明の抗体を反応させ（２次反応）た後、不溶化担体上の標識剤の量（活性）を測定することにより、被検試料中の本発明のペプチド量を定量することができる。１次反応と２次反応は逆の順序におこなっても、また、同時におこなってもよいし時間をずらしておこなってもよい。
【００８９】
本発明のポリペプチドに対するモノクローナル抗体を、サンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることもできる。
【００９０】
競合法では、被検試料中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させた後、未反応の標識抗原（Ｆ）と、抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ／Ｆいずれかの標識量を測定し、被検試料中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコール、前記抗体に対する第２抗体などを用いる液相法、および、第１抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
【００９１】
イムノメトリック法では、被検試料の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、または、被検試料中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させた後、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し被検試料中の抗原量を定量する。
【００９２】
また、ネフロメトリーでは、ゲル内または溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検試料中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
【００９３】
これら個々の免疫学的測定法を本発明の検出方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のポリペプチドの測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。
例えば、入江 寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和49年発行）、入江 寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和54年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和53年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第2版）（医学書院、昭和57年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第3版）（医学書院、昭和62年発行）、「Methods in ENZYMOLOGY」 Vol. 70 (Immunochemical Techniques (Part A))、同書 Vol. 73 (Immunochemical Techniques (Part B))、同書 Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part C))、同書 Vol. 84 (Immunochemical Techniques (Part D: Selected Immunoassays))、同書 Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E: Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods))、同書 Vol. 121 (Immunochemical Techniques (Part I: HybridomaTechnology and Monoclonal Antibodies))（以上、アカデミックプレス社発行）などを参照することができる。
【００９４】
あるいは、本発明の抗体を用いる別の本発明の検出方法として、当該抗体を上述したような質量分析計に適合しうるプローブの表面上に固定化し、当該プローブ上の当該抗体に被検試料を接触させ、当該抗体に捕捉された生体試料成分を質量分析にかけ、当該抗体が認識するマーカーペプチドの分子量に相当するピークを検出する方法が挙げられる。
【００９５】
上記のいずれかの方法により、被検試料において、本発明のポリペプチドが、コントロール試料におけるレベルと統計学的に有意な差をもって検出された場合には、被検試料中にがん細胞またはがん組織が含まれている可能性が高いと診断することができる。
【００９６】
本発明のさらに他の形態では、医薬が提供される。当該医薬は、上述した本発明のポリペプチドもしくはその断片、または本発明の核酸もしくはその断片を含み、特異的な細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を誘導するためのものである。当該医薬は、好ましくはがんワクチンである。以下、この形態について、より詳細に説明する。
【００９７】
本発明の医薬が本発明のポリペプチドまたはその断片を含む場合、当該ポリペプチドまたはその断片は、ＨＬＡと結合して特異的な細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を誘導しうるものである必要がある。この観点から、当該ポリペプチドまたはその断片は、本発明のポリペプチドにおける連続する８〜１１個のアミノ酸残基からなることが好ましい。なお、特異的なＣＴＬを誘導するポリペプチドの断片は、本技術分野における公知の知見を参照して容易に作製することができる。
【００９８】
「ＨＬＡと結合して特異的なＣＴＬを誘導しうる」とは、本発明のポリペプチドもしくはその断片、または本発明の核酸もしくはその断片がＨＬＡと結合して複合体を形成し、かかる複合体をＣＴＬが認識できることをいう。換言すれば、本発明のポリペプチドもしくはその断片、または本発明の核酸もしくはその断片が、ＨＬＡとの結合活性を有し、かつ、ＨＬＡとの複合体の形で、特異的なＣＴＬを誘導する活性を有することを意味する。
【００９９】
一方、本発明の医薬が本発明の核酸またはその断片を含む場合、当該核酸がコードするアミノ酸配列を有するポリペプチドは、それ自体がＣＴＬにより認識され、当該ＣＴＬを活性化するか、そのような活性を有するポリペプチド断片を与えることができ、腫瘍抗原として機能しうる。本形態において用いられる核酸またはその断片は、本発明のポリペプチドをコードする領域に対応する少なくとも２４個以上の塩基からなるポリヌクレオチドまたはその相補鎖であることが好ましい。このようなポリヌクレオチドは、例えば公知のタンパク質発現系を利用して発現ペプチドを確認することにより選択されうる。
【０１００】
本発明の医薬は、例えば、がんワクチンとして使用することができる。１種類のポリペプチドもしくはその断片または核酸もしくはその断片のみでもがんワクチンとして有効であるが、複数種類のものを組み合わせて使用するのが好ましい。これは、がん患者のＣＴＬが複数の異なる種類の腫瘍抗原を認識する細胞の集団であることから、複数種類の腫瘍抗原を組み合わせてがんワクチンとして使用する方がより効果的であると期待されるためである。また、本発明のポリペプチドや本発明の核酸は、これら以外のポリペプチドや核酸と併用されてもよい。
【０１０１】
本発明により提供されるがんワクチンは、適当なアジュバントの存在または非存在下で、単独で、または製薬的に許容される担体と結合して使用することができる。担体は、人体に有害な作用を起こさなければ特に制限はなく、例えば、セルロース、重合アミノ酸、アルブミン等が使用できる。剤形は、ペプチド製剤について周知の剤形が選択可能である。投与量は、ＣＴＬによる認識性、治療すべき疾患、患者の年齢、体重等により変化するが、ペプチドの場合、活性本体として、通常、0.0001mg〜1000mg、好ましくは0.001mg〜1000mg、より好ましくは0.1mg〜100mg、さらに好ましくは0.1〜10ｍｇ／日／成人ヒトである。これを数日、数週、または数ヶ月に１回投与すればよい。
【０１０２】
本発明の医薬はまた、本発明のポリペプチドまたはその断片をコードする核酸またはその断片を適当なベクターに組み込み、in vivoまたはex vivoで導入するのに利用することができる。ベクターとしては、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス等が挙げられるが、レトロウイルス系が好ましい。投与量は、ＣＴＬによる認識性により変化するが、ＤＮＡ含量として０．１μｇ〜１００ｍｇ／日／成人ヒト、好ましくは１μｇ〜５０ｍｇ／日／成人ヒトである。これを数日、数週、または数ヶ月に１回投与すればよい。
【実施例】
【０１０３】
以下、実施例および参考例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらに限定されない。
【０１０４】
１．プライマー
ゲノムＤＮＡコンタミネーションチェック、５’ｃＤＮＡ末端のＲＮＡリガーゼ媒介迅速増幅（RLM-RACE;RNA ligase-mediated rapid amplification of 5’cDNA）、逆転写ＰＣＲ（RT-PCR;Reverse Transcription-Polymeraze Chain Reaction）、ｃＤＮＡクローニング、定量的リアルタイムＰＣＲ（Quantitative real-time PCR）、およびＧＦＰ融合ペプチド発現プラスミドからのペプチド発現に用いたプライマーは、インビトロジェン（カールスバッド，カリフォルニア州，アメリカ）またはグライナー−バイオ−ワン（タウフキルヒェン，ドイツ）に依頼して合成したものであり、それぞれ下記の表１〜表６に示す塩基配列を有する。
【０１０５】
【表１】
【０１０６】
【表２】
【０１０７】
【表３】
【０１０８】
【表４】
【０１０９】
【表５】
【０１１０】
【表６】
【０１１１】
２．細胞培養法
ヒト結腸がん由来細胞株であるＬＳ１８０細胞は大日本住友製薬（大阪）より購入した。ヒト大腸がん由来細胞株であるＨＣＴ１１６細胞はボーゲルシュタイン博士（Ｄｒ．Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ）（ジョンズホプキンス大学、ボルチモア、メリーランド州）よりご恵与いただいた。ヒト膵臓がん由来細胞株であるＰＫ４５ｐ細胞は東北大学加齢医学研究所付属医用細胞資源センター（仙台）より入手した。ＬＳ１８０細胞およびＰＫ４５ｐ細胞は、それぞれ１０％非働化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ジェミニ バイオ−プロダクツ，カリフォルニア州）および５０単位／ｍＬペニシリン−５０μｇ／ｍＬストレプトマイシン（インビトロジェン）を加えた最小必須培地（MEM;Minimum Essential Medium）（インビトロジェン）またはＲＰＭＩ（Roswell Park Memorial Institute）１６４０培地（インビトロジェン）を培地とし、５％ＣＯ２／９５％Ａｉｒを気相とした３７℃のＣＯ２インキュベーター内にて培養した。
【０１１２】
３．実験検体
白人種肝検体は、ＨＡＢ（Human and Animal Bridging）協議会（東京）より入手した。上記検体は、米国立疾病研究互助組織（NDRI;National Disease Research Interchange）（フィラデルフィア，ペンシルバニア州）を介して米国から輸入された移植不適合のヒト肝組織である。なお、上記肝組織は肝炎等の感染症のないものを用いた。なお、本研究におけるこれら検体の研究利用は、千葉大学大学院薬学研究院倫理委員会において事前に承認されている。
【０１１３】
４．Ｔｏｔａｌ ＲＮＡの抽出
細胞からのｔｏｔａｌ ＲＮＡ抽出は、FastPureTMRNA Isolation Kit（タカラバイオ株式会社，滋賀）を用いてプロトコールに従いおこなった。抽出したｔｏｔａｌ ＲＮＡにゲノムＤＮＡの混入がないことを、２０μＬ中にＧｏＴａｑ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（プロメガ，マディソン，ワイオミング州）１０μＬ、並びに、プライマー（上記表１に記載のヒトグリセルアルデヒド−３−デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ） ＦおよびＧＡＰＤＨ Ｒ）各０．５μＬ、ＲＮＡ １μＬを含む反応溶液を用いたＰＣＲにより確認した。ＰＣＲ反応は、９５℃にて３０秒間加熱した後、９５℃１０秒、５０℃１０秒および７２℃３０秒のサイクルを４０回おこなった。白人種肝からのｔｏｔａｌ ＲＮＡ抽出についても、FastPureTM RNA Isolation Kitを用いてプロトコールに従いおこなった。ヒト大腸がん/正常大腸ペアｔｏｔａｌ ＲＮＡは、アプライドバイオシステムズ（フォスターシティ，マサチューセッツ州）より購入した。
【０１１４】
５．ＳＬＣＯ１Ｂ３遺伝子の転写開始点の決定
GeneRacerTMKit（インビトロジェン）を用いたＲＬＭ−５’−ＲＡＣＥ法により、ＳＬＣＯ１Ｂ３遺伝子の転写開始点を決定した。テンプレートとしてヒト大腸がん由来ｔｏｔａｌ ＲＮＡまたは白人種肝由来ｔｏｔａｌ ＲＮＡを用い、手順はプロトコールに従いおこなった。ＰＣＲ反応は、２０μＬ中にGoTaq Green Master Mix １０μＬ、Reverse transcriptionテンプレート １μＬ、１０μＭ GeneRacerTM５’プライマーおよびReverse gene specificプライマー（上記表２に記載の「SLCO1B3 648R」）各０．５μＬを含むＰＣＲ反応溶液を調製し、これを９４℃にて２分間加熱した後、９４℃３０秒、６８℃３０秒、７２℃１分のサイクルを５回、９４℃３０秒、６６℃３０秒、７２℃１分のサイクルを５回、９４℃３０秒、６５℃３０秒、７２℃１分のサイクルを３０回繰り返したＴｏｕｃｈ−ｄｏｗｎＰＣＲをおこなった。このＴｏｕｃｈ−ｄｏｗｎＰＣＲの後、ＰＣＲ反応溶液を滅菌水で５倍希釈したものをテンプレートとして、Ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲをおこなった。Ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲは、２０μＬ中にGoTaq Green Master Mix １０μＬ、テンプレート１μＬ、１０μＭ GeneRacerTM５’ NestedプライマーおよびReverse Nested gene specificプライマー（上記表２に記載の「SLCO1B3 424Rnest」）各０．５μＬを含むＰＣＲ反応溶液を調製し、これを９５℃にて３０秒間加熱した後、９５℃１０秒、５３℃１０秒および７２℃３０秒のサイクルを４０回繰り返した。ＰＣＲ産物は３％アガロースゲル電気泳動をおこない、エチジウムブロマイド染色により可視化した。電気泳動の結果を図３に示す。図３に示すように、白人種肝由来ｔｏｔａｌ ＲＮＡをテンプレートとして用いたサンプルでは、既報の転写開始点（図１に示す「ＴＳＳ」）由来のバンドが確認された。これに対し、ヒト大腸がん由来ｔｏｔａｌ ＲＮＡをテンプレートとして用いたサンプルでは、既報の転写開始点由来のバンドよりも塩基長の短いバンドが確認された。この結果から、ヒト大腸がん由来ＯＡＴＰ１Ｂ３ ｍＲＮＡにおいては、既報とは異なる（既報のものよりも下流（３’）側に位置する）転写開始点が存在することが示唆された。なお、図３に示す「Non-template control」とは、テンプレートを含まない陰性コントロールである（後述する図５における「ＮＴＣ」も同旨である）。
【０１１５】
続いて、上記で得られたＮｅｓｔｅｄ−ＰＣＲ産物を含むＤＮＡ断片を分離精製した後、DynaExpress TA PCR Cloning Kit（株式会社バイオダイナミクス研究所、東京）を用いてｐＴＡＣ−１ベクターに挿入し、アンピシリンを用いて選択した。プラスミドＤＮＡはPlasmid Miniprep Kit（バイオ−ラッド ラボラトリーズ）を用いて精製した。得られたプラスミドＤＮＡの塩基配列は、CEQTM DTCS-Quick Start Mix（ベックマン コールター、フラートン、カリフォルニア州）を用いてサイクルシークエンス反応をおこない、CEQ 2000 XL DNA analysis system（ベックマン コールター）により解析し、ＳＬＣＯ１Ｂ３遺伝子の新規な転写開始点を同定した。
【０１１６】
ＳＬＣＯ１Ｂ３遺伝子の新規転写開始点付近の塩基配列をヒトゲノムＤＮＡのデータベースと照合したところ、新規転写開始点はＳＬＣＯ１Ｂ３遺伝子のイントロン２の領域内に存在し、さらにここに新たなエキソン（エキソンＳＶ）が存在することが明らかとなった。また、このエキソンＳＶはＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔのエキソン３へとスプライシングされていた（図４を参照）。
【０１１７】
６．ｃＤＮＡの作製およびＲＴ−ＰＣＲ法によるｍＲＮＡ発現解析
上記４．に記載の手法により抽出したＬＳ１８０細胞ｔｏｔａｌ ＲＮＡ、ＰＫ４５ｐ細胞、ヒト大腸がん／正常大腸ペアＲＮＡおよび白人種肝由来のｔｏｔａｌ ＲＮＡをテンプレートとして用い、High Capacity cDNA Reverse Transcription kit（アプライド バイオシステムズ）を用いて逆転写反応をおこない、ｃＤＮＡを作製した。このｃＤＮＡをテンプレートとしてＲＴ−ＰＣＲをおこない、新規ＯＡＴＰ１Ｂ３ ｍＲＮＡの発現量を解析した。ＰＣＲは、２０μＬ中にGoTaq Green Master Mix １０μＬ、テンプレートｃＤＮＡ 1μＬ、１０μＭ ＦｏｒｗａｒｄおよびＲｅｖｅｒｓｅプライマー（上記表３に記載の「SLCO1B3 TSS in cancer 33F」および「SLCO1B3 TSS in cancer 145R」）各０．５μＬを含むＰＣＲ反応溶液を調製し、これを９５℃にて３０秒間加熱した後、９５℃１０秒、各プライマーに適したアニーリング温度（上記表３に記載の「アニーリング温度」）１０秒および７２℃１５〜２０秒のサイクルを３８回おこなった。ＰＣＲ産物は３％アガロースゲル電気泳動をおこない、エチジウムブロマイド染色により可視化した。電気泳動の結果を図５に示す。図５に示すように、ヒト大腸がん組織に加え、大腸がん由来ＬＳ１８０細胞およびＨＣＴ１１６細胞、膵臓がん由来ＰＫ４５ｐ細胞においても新規ＯＡＴＰ１Ｂ３ ｍＲＮＡの発現が認められた。一方、正常ヒト大腸組織においてはこのｍＲＮＡの発現は認められなかった。これらの結果より、新規ＯＡＴＰ１Ｂ３ ｍＲＮＡはがん細胞／組織に高く発現する分子種であると考えられることから、これを「ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔ」とした。
【０１１８】
７．ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔのｃＤＮＡクローニング
ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔのｃＤＮＡクローニングは、ヒト大腸がん由来のｃＤＮＡをテンプレートとして、上記表４に記載のプライマーセット（ctSLCO1B3 cloning F33およびctSLCO1B3 cloning 2149R）並びにPrimeSTAR HS DNA polymerase（タカラバイオ株式会社，滋賀）を用いたＰＣＲによりおこなった。なお、表４に示すように、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔのｃＤＮＡクローニングに用いたフォワードプライマーは、上記「６．ｃＤＮＡの作製およびＲＴ−ＰＣＲ法によるｍＲＮＡ発現解析」のＲＴ−ＰＣＲに用いた「SLCO1B3 TSS in cancer 33F」と同一である。ＰＣＲは９４℃３分の後、９８℃１０分、５８℃５秒、７２℃２分３０秒を４０サイクル繰り返し、７２℃３分を最終ステップとした条件でおこなった。得られたＰＣＲ産物は１％アガロースゲル電気泳動により分離し、抽出精製した後、pCR Blunt-II TOPO vector（インビトロジェン）に挿入した。得られた構築物をXbaI（ニッポンジーン、東京）およびBamHI（ニッポンジーン）で処理することにより、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔ ｃＤＮＡを切り出し、これを同様に処理したpcDNA3.1(-) Neo vector（インビトロジェン）とライゲーションすることにより、OATP1B3/ct/pcDNA3.1(-)を作製した。
【０１１９】
なお、同様の手法により、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔのｃＤＮＡクローニングもおこなった。具体的には、白人種肝由来のｃＤＮＡをテンプレートとして、上記表４に記載のプライマーセット（SLCO1B3 F27およびSLCO1B3 2184R）並びにKOD-plus-Polymerase （TOYOBO、大阪）を用いたＰＣＲによりおこなった。ＰＣＲ反応は９４℃３分の後、９４℃３０秒、４８℃３０秒、６８℃２分３０秒を３５サイクル繰り返し、６８℃５分を最終ステップとした条件でおこなった。得られたＰＣＲ産物は１％アガロースゲル電気泳動により分離し、抽出精製した後、pCR Blunt-II TOPO vector（インビトロジェン）に挿入した。得られた構築物をApaI（ニッポンジーン）およびＢａｍＨＩで処理することによってＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔ ｃＤＮＡを切り出し、これを同様に処理したpcDNA3.1(-) Neo vectorとライゲーションすることにより、OATP1B3/wt/pcDNA3.1(-)を作製した。
【０１２０】
上記で作製した２つのプラスミド中のＯＡＴＰ１Ｂ３/ｃｔまたはＯＡＴＰ１Ｂ３/ｗｔの塩基配列を、CEQ 2000 Dye terminator Cycle Sequencing with Quick Start Kit（ベックマン コールター）およびCEQ 2000 XL DNA analysis system（ベックマン コールター）を用いて解析した。図１には、これにより配列決定されたＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔのｃＤＮＡ配列（配列番号：１）が、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔのｃＤＮＡ配列（Ｒｅｆｓｅｑ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿０１９８４４、配列番号：２）とともに示されている。また、図１および図４に示すように、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔでは、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔのエキソン１およびエキソン２が欠失しており、これに代えてエキソンＳＶが存在し、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔのエキソン３へとスプライシングされていることが確認される。
【０１２１】
８．定量的リアルタイムＰＣＲによるｍＲＮＡ発現解析
上記６．に記載の手法により作製したGHL pool（５つの日本人肝サンプルから調製したｃＤＮＡプール）、HHL pool（５つの白人種肝サンプルから調製したｃＤＮＡプール）、ヒト大腸がん組織、ＬＳ１８０細胞、ＰＫ４５ｐ細胞、およびＨＣＴ１１６細胞のそれぞれのｃＤＮＡ、並びに、上記７．に記載の手法により作製したプラスミドを用いて定量的リアルタイムＰＣＲをおこない、検量線法を用いてＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔおよびＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔのそれぞれのｍＲＮＡの定量をおこなった。ＰＣＲおよびＤＮＡ増幅の検出には、ABI PRISM（登録商標） 7000（アプライド バイオシステムズ）を用いた。
【０１２２】
ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔ ｍＲＮＡの検出は、２０μＬ中にｃＤＮＡテンプレート １μＬ、２×ＦastStart Universal Probe Master (ROX)（ロシュ、ペンツバーグ、ドイツ）１０μＬ、Universal Probe ＃59 (ロシュ) ０．２μＬ、および上記表５に記載のプライマーセット（ctSLCO1B3 Left 59-76、およびctSLCO1B3Right 130-151）各０．４μＬを含むＰＣＲ反応溶液を調製し、これを９５℃５分の後、９５℃１５秒、６０℃１分のサイクルを４５回繰り返した２ ｓｔｅｐ ＰＣＲでおこなった。
【０１２３】
一方、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔ ｍＲＮＡの検出は、２０μＬ中にｃＤＮＡテンプレート １ μＬ、２×SYBER Premix Ex Taq II（タカラバイオ）１０μＬ、５０×ROX Reference Dye（タカラバイオ）０．４μＬおよび上記表５に記載のプライマーセット（SLCO1B3 F153 for real-time、およびSLCO1B3R194 for real-time）各０．８μＬを含むＰＣＲ反応溶液を調製し、これを９５℃２０秒の後、９５℃５秒、６０℃３３秒のサイクルを４０回繰り返した２ ｓｔｅｐ ＰＣＲでおこなった。
【０１２４】
検量線用サンプルは、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔ ｍＲＮＡ測定には上記７．に記載の手法により作製したＯＡＴＰ１Ｂ３／ｐＴＯＰＯをテンプレートとし、１ウェルあたりのモル数が２．８６×１０−２３〜１．４３×１０−１７モル内の５点を用いて作製した。一方、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔ ｍＲＮＡ測定には上記７．に記載の手法により作製したＯＡＴＰ１Ｂ３／ｐｃＤＮＡ３．１（−）をテンプレートとし、１ウェルあたりのモル数が１．０９×１０−２３〜１．０９×１０−１７モル内の５点を用いて作製した。ＰＣＲおよびＤＮＡ増幅の検出はｃＤＮＡサンプルと同様におこなった。また、検量線は最小二乗法により直線回帰して得た。
【０１２５】
定量的リアルタイムＰＣＲの結果得られたｍＲＮＡ発現プロファイルを図６に示す。図６のＡは、各組織・細胞におけるＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔの発現レベルを示す。また、図６のＢは、各組織・細胞におけるＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔの発現レベルを示す。なお、図６に示す棒グラフは、ＯＡＴＰ１Ｂ３ ｍＲＮＡのコピー数を、３回の独立した実験における平均値±標準偏差として示したものである。さらに、図６のＣは、発現レベルの比（ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔのコピー数／ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔのコピー数）を示す。
【０１２６】
図６のＡに示すように、ｔｏｔａｌ ＲＮＡ １ｎｇ中に存在するＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔ ｍＲＮＡコピー数はGHL pool（日本人肝）では８であり、HHL pool（白人種肝）では４であった。これに対し、ヒト大腸がん組織h colon Tu ＃1 および ＃2ではそれぞれ１８１２、８９であり、また、ＬＳ１８０細胞では２４１１、ＰＫ４５ｐ細胞では２８９、ＨＣＴ１１６細胞では６４４であった。一方、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔ ｍＲＮＡコピー数はGHL poolでは１２１８７、HHL poolでは７４７３であり、h colon Tu ＃1および＃2ではそれぞれ３０、３であり、また、ＬＳ１８０細胞では８６５、ＰＫ４５ｐ細胞では２、ＨＣＴ１１６細胞では１７２であった。したがって、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔ ｍＲＮＡ発現量はＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔ ｍＲＮＡ発現量に対して、ヒト大腸がん組織であるh colon Tu ＃1および ＃2 でそれぞれ６０倍、３０倍、ヒト大腸がん由来細胞であるＬＳ１８０細胞で２．８倍、ＰＫ４５ｐ細胞で１４４．５倍、ＨＣＴ１１６細胞で３．７倍と高かった（図６のＣ）。一方、GHL poolおよびHHL poolでは、ＯＡＴＰ１Ｂ３/ｃｔ ｍＲＮＡの発現量はＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔ発現量のそれぞれ約１／１５００、約１／１７００であった。以上のことから、ヒト大腸がん組織ではＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔ ｍＲＮＡがほぼ特異的に発現しており、また、ヒト大腸がん由来細胞においても、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔ ｍＲＮＡが非常に優位に発現していることが示される。つまり、本願の発明者らによって、がん細胞・組織で発現しているのは既報のＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔではなく、今回新たに発見された選択的スプライシングバリアントであるということが明らかとされたのである。
【０１２７】
９．緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）融合ｃｔＯＡＴＰ１Ｂ３ペプチド発現プラスミドの作製
図７に示すように、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔ ｍＲＮＡの各フレームには推定オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ；Ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）が存在する。フレーム１の２つのＯＲＦはそれぞれ１０アミノ酸からなるペプチドおよび２７アミノ酸からなるペプチドをコードすると推定される（ｆ１−１、ｆ１−２）。また、フレーム２のＯＲＦはＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔのフレームの途中を開始コドンとしてそのままＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔの終止コドンを共有する６５５アミノ酸からなるタンパク質をコードすると推定される（ｆ２）。さらに、フレーム３のＯＲＦは４３アミノ酸からなるペプチドをコードすると推定される（ｆ３）。これら翻訳産物の発現を解析するため、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔ ｍＲＮＡのフレーム１およびフレーム３に存在するペプチドコード領域（ｆ１−１、ｆ１−２、ｆ３）並びに、フレーム２に存在するタンパク質コード領域のＮ末端領域２０アミノ酸（ｆ２）のＣ末端側のそれぞれにＧＦＰを融合したタンパク質（ｆ１−１／ＧＦＰ、ｆ１−２／ＧＦＰ、ｆ２／ＧＦＰ、ｆ３／ＧＦＰ）を発現させるプラスミドを作製した。
【０１２８】
OATP1B3/ct/pcDNA3.1(-)をテンプレートとして、ｆ１−２領域、ｆ２領域およびｆ３領域を表６に示すプライマーを用いてＰＣＲ（９５℃３０秒の後、９５℃10秒、６０℃１０秒、７２℃２０秒を４０回繰り返し、７２℃１０秒を最終ステップ）により増幅した。また、ＧＦＰおよびｆ１−１／ＧＦＰについては、pAcGFP-c1をテンプレートとして表６に示すプライマーを用いてＰＣＲ（９４℃３分の後、９８℃１０秒、５９℃５秒、７２℃５０秒を４０回繰り返し、７２℃３分を最終ステップ）により増幅した。ＧＦＰのＰＣＲ産物をＢａｍＨＩ処理し、同様にＢａｍＨＩ処理したｆ１−２、ｆ２およびｆ３のそれぞれのＰＣＲ産物とライゲーションした。これをテンプレートとして表６に示すプライマーを用いてＰＣＲ（９４℃２分の後、９４℃１０秒、６０℃３０秒、７２℃６０秒を３５回繰り返し、７２℃３０秒を最終ステップ）により増幅した。得られたｆ１−２／ＧＦＰ、ｆ３／ＧＦＰはDynaExpress TA PCR Cloning Kit (BioDynamics Laboratory Inc., 東京) を用いてpTAC-1vectorに挿入した。また、得られたｆ１−１／ＧＦＰ、ｆ２／ＧＦＰはpCR Blunt-II TOPO vector（インビトロジェン）に挿入した。これらプラスミドをＸｂａＩおよびＫｐｎＩで処理し、同様に処理したpcDNA3.1(-)Neoとライゲーションして、f1-1/GFP/pcDNA3.1、f1-2/GFP/pcDNA3.1、f2/GFP/pcDNA3.1、f3/GFP/pcDNA3.1を作製した。
【０１２９】
１０．リバーストランスフェクション
mCherry/pcDNA3.1(-) ３２０ｎｇ／ウェルと、各ＧＦＰ融合ペプチド発現プラスミドまたはempty pcDNA3.1 (-)Neo（mock） ３２０ｎｇ／ウェルとの混合物にOPTI-MEM（登録商標）（インビトロジェン）１００μＬ／ウェル、およびPlus Reagent（インビトロジェン）０．５μＬ／ウェルを混合し、Lipofectamin LTX（インビトロジェン）１．６μＬ／ウェルを加え２９３ＦＴ細胞３．５×１０５細胞／ウェルとともに２４ウェルプレートに播種した。播種から２４時間後、ＧＦＰ由来の緑色蛍光およびmCherry由来の赤色蛍光をOlympus Fluoview ver2.3（オリンパス、東京）を用いて観察した。結果を図８に示す。ここで、図８において、緑色はＧＦＰ由来の蛍光であり、赤色はトランスフェクションコントロールであるmCherry由来の蛍光である。また、両蛍光の重ね合わせをMergeとして示し、微分干渉像をPhaseとして示す。なお、解析に用いたレーザー強度・照射時間は全て等しくした。
【０１３０】
図８に示すように、トランスフェクションした２９３ＦＴ細胞においてｆ１−１／ＧＦＰおよびｆ３／ＧＦＰ由来と考えられる強い蛍光が認められた（図８（ｂ）および（ｅ））。また、ｆ２／ＧＦＰ（図８（ｄ））由来の蛍光も認められた。一方、ｆ１−２／ＧＦＰについては、非常に弱い蛍光が認められた（図８（ｃ））。また、同時におこなったｍｏｃｋを用いた実験では緑色蛍光は認められなかった（図８（ａ））。なお、いずれの実験においてもmCherry由来の赤色蛍光は同等の発色レベルを示した。
【配列表フリーテキスト】
【０１３１】
〔配列番号：１〕
ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔのｃＤＮＡの塩基配列を表す。
〔配列番号：２〕
ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔのｃＤＮＡの塩基配列を表す。
〔配列番号：３〕
ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を表す。
〔配列番号：４〕
ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔのフレーム１−１（終止コドン含む）の塩基配列を表す。
〔配列番号：５〕
ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔのフレーム１−１によりコードされるペプチド（ｆ１−１）のアミノ酸配列を表す。
〔配列番号：６〕
ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔのフレーム１−２（終止コドン含む）の塩基配列を表す。
〔配列番号：７〕
ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔのフレーム１−２によりコードされるペプチド（ｆ１−２）のアミノ酸配列を表す。
〔配列番号：８〕
ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔのフレーム２（終止コドン含む）の塩基配列を表す。
〔配列番号：９〕
ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔのフレーム２によりコードされるポリペプチド（ｆ２）のアミノ酸配列を表す。
〔配列番号：１０〕
ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔのフレーム３（終止コドン含む）の塩基配列を表す。
〔配列番号：１１〕
ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔのフレーム３によりコードされるペプチド（ｆ３）のアミノ酸配列を表す。
〔配列番号：１２〕
ヒトＧＡＰＤＨ遺伝子の増幅に用いたフォワードプライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：１３〕
ヒトＧＡＰＤＨ遺伝子の増幅に用いたリバースプライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：１４〕
ＲＬＭ−５’−ＲＡＣＥのTouch-down PCRに用いたリバースプライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：１５〕
ＲＬＭ−５’−ＲＡＣＥのNested-PCRに用いたリバースプライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：１６〕
ＲＴ−ＰＣＲおよびＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔのｃＤＮＡクローニングに用いたフォワード
プライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：１７〕
ＲＴ−ＰＣＲに用いたリバースプライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：１８〕
ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔのｃＤＮＡクローニングに用いたリバースプライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：１９〕
ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔのｃＤＮＡクローニングに用いたフォワードプライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：２０〕
ＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔのｃＤＮＡクローニングに用いたリバースプライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：２１〕
定量的リアルタイムＰＣＲにおいてＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔの検出に用いたフォワードプライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：２２〕
定量的リアルタイムＰＣＲにおいてＯＡＴＰ１Ｂ３／ｃｔの検出に用いたリバースプライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：２３〕
定量的リアルタイムＰＣＲにおいてＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔの検出に用いたフォワードプライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：２４〕
定量的リアルタイムＰＣＲにおいてＯＡＴＰ１Ｂ３／ｗｔの検出に用いたリバースプライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：２５〕
f1-1/GFP/pcDNA3.1からの配列番号：５のアミノ酸配列からなるペプチドの発現に用いたフォワードプライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：２６〕
f1-1/GFP/pcDNA3.1からの配列番号：５のアミノ酸配列からなるペプチドの発現に用いたリバースプライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：２７〕
f1-2/GFP/pcDNA3.1からの配列番号：７のアミノ酸配列からなるペプチドの発現、f2/GFP/pcDNA3.1からの配列番号：９のアミノ酸配列からなるタンパク質の発現、およびf3/GFP/pcDNA3.1からの配列番号：１１のアミノ酸配列からなるペプチドの発現に用いたフォワードプライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：２８〕
f1-2/GFP/pcDNA3.1からの配列番号：７のアミノ酸配列からなるペプチドの発現に用いたリバースプライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：２９〕
f2/GFP/pcDNA3.1からの配列番号：９のアミノ酸配列からなるタンパク質の発現に用いたリバースプライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：３０〕
F3/GFP/pcDNA3.1からの配列番号：１１のアミノ酸配列からなるペプチドの発現に用いたリバースプライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：３１〕
F1-1/GFP/pcDNA3.1、f1-2/GFP/pcDNA3.1、f2/GFP/pcDNA3.1、およびf3/GFP/pcDNA3.1からのＧＦＰタンパク質の発現に用いたフォワードプライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：３２〕
F1-1/GFP/pcDNA3.1、f1-2/GFP/pcDNA3.1、f2/GFP/pcDNA3.1、およびf3/GFP/pcDNA3.1からのＧＦＰタンパク質の発現に用いたリバースプライマーの塩基配列を表す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体から分離した被検試料中のＯＡＴＰ１Ｂ３（Organic Anion Transporting Polypeptide 1B3）ｍＲＮＡの選択的スプライシングバリアントの測定方法であって、
前記被検試料中の、配列番号：１で表される塩基配列を含むｍＲＮＡを、配列番号：２で表される塩基配列を含むｍＲＮＡと識別して測定することを含む、測定方法。
【請求項２】
配列番号：１で表される塩基配列におけるエキソンＳＶの存在を指標として、配列番号：１で表される塩基配列を含むｍＲＮＡを測定する、請求項１に記載の測定方法。
【請求項３】
前記エキソンＳＶを含む領域に設定したプライマーを一方のプライマーとして用いる核酸増幅法により、配列表の配列番号：１で表される塩基配列を含むｍＲＮＡまたはそのｃＤＮＡの部分領域を特異的に増幅し、増幅産物を測定することを含む、請求項２に記載の測定方法。
【請求項４】
前記プライマーの塩基数が１５〜３５である、請求項３に記載の測定方法。
【請求項５】
前記核酸増幅法がＲＴ−ＰＣＲ法である、請求項３または４に記載の測定方法。
【請求項６】
以下の条件を満足する核酸：
（１）配列番号：１で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする；
（２）配列番号：２で表される塩基配列を含む核酸が共存する場合に、ストリンジェントな条件下で、当該核酸とハイブリダイズしないか、または、当該核酸とハイブリダイズした場合であってもその３’末端がミスマッチとなる。
【請求項７】
配列番号：１で表される塩基配列におけるエキソンＳＶを含む領域とハイブリダイズする、請求項６に記載の核酸。
【請求項８】
塩基数が１０以上である、請求項６または７に記載の核酸。
【請求項９】
塩基数が１５〜３５である、請求項８に記載の核酸。
【請求項１０】
配列番号：１で表される塩基配列または当該塩基配列の部分領域と同じ塩基配列またはこれらの塩基配列のうち１０％以下の塩基が置換されてなる塩基配列からなる、請求項６〜９のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１１】
ＯＡＴＰ１Ｂ３ ｍＲＮＡの選択的スプライシングバリアントの測定に用いられる、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１２】
核酸増幅用のプライマー、またはプローブである、請求項１１に記載の核酸。
【請求項１３】
請求項１１または１２に記載の核酸を含む、ＯＡＴＰ１Ｂ３ ｍＲＮＡの選択的スプライシングバリアントの測定用キット。
【請求項１４】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の測定方法により、または、請求項１３に記載の測定用キットを用いて、生体から分離した被検試料中のＯＡＴＰ１Ｂ３ ｍＲＮＡの選択的スプライシングバリアントを測定することを含む、がんの検出方法。
【請求項１５】
配列番号：１で表される塩基配列を含むＯＡＴＰ１Ｂ３ ｍＲＮＡの選択的スプライシングバリアントを測定する、請求項１４に記載の検出方法。
【請求項１６】
前記がんが大腸がんまたは膵臓がんである、請求項１４または１５に記載の検出方法。
【請求項１７】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の測定方法により、または、請求項１３に記載の測定用キットを用いて、がん細胞を被検物質の存在下で培養して得られる培養細胞中のＯＡＴＰ１Ｂ３ ｍＲＮＡの選択的スプライシングバリアントを測定する工程と、
得られた測定結果を、前記被検物質の非存在下における場合と比較および／または評価する工程と、
を含む、がんの予防および／または治療剤のスクリーニング方法。
【請求項１８】
配列番号：１で表される塩基配列を含む、ＯＡＴＰ１Ｂ３（Organic Anion Transporting Polypeptide 1B3）ｍＲＮＡの選択的スプライシングバリアント。
【請求項１９】
（１）配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を含み、かつ、がん細胞またはがん組織において発現が増強するポリペプチド、あるいは、
（２）配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列において、１０％以下のアミノ酸が置換、欠失、および／または挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ、がん細胞またはがん組織において発現が増強するポリペプチド。
【請求項２０】
配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項２１】
請求項１９または２０に記載のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項２２】
請求項２１に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項２３】
請求項２２に記載の発現ベクターで形質転換された細胞。
【請求項２４】
請求項１９または２０に記載のポリペプチドに結合する抗体。
【請求項２５】
配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、少なくとも１５塩基を有する核酸。
【請求項２６】
生体から分離した被検試料中の、請求項１９または２０に記載のポリペプチドの量を測定することを含む、がんの検出方法。
【請求項２７】
請求項２４に記載の抗体を測定に用いる、請求項２６に記載の検出方法。
【請求項２８】
請求項２４に記載の抗体を含む、がんの検出用キット。
【請求項２９】
請求項１９または２０に記載のポリペプチドもしくはその断片、または、請求項２１に記載の核酸もしくはその断片を含む、特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するための医薬。
【請求項３０】
がんワクチンである、請求項２９に記載の医薬。
【請求項１】
生体から分離した被検試料中のＯＡＴＰ１Ｂ３（Organic Anion Transporting Polypeptide 1B3）ｍＲＮＡの選択的スプライシングバリアントの測定方法であって、
前記被検試料中の、配列番号：１で表される塩基配列を含むｍＲＮＡを、配列番号：２で表される塩基配列を含むｍＲＮＡと識別して測定することを含む、測定方法。
【請求項２】
配列番号：１で表される塩基配列におけるエキソンＳＶの存在を指標として、配列番号：１で表される塩基配列を含むｍＲＮＡを測定する、請求項１に記載の測定方法。
【請求項３】
前記エキソンＳＶを含む領域に設定したプライマーを一方のプライマーとして用いる核酸増幅法により、配列表の配列番号：１で表される塩基配列を含むｍＲＮＡまたはそのｃＤＮＡの部分領域を特異的に増幅し、増幅産物を測定することを含む、請求項２に記載の測定方法。
【請求項４】
前記プライマーの塩基数が１５〜３５である、請求項３に記載の測定方法。
【請求項５】
前記核酸増幅法がＲＴ−ＰＣＲ法である、請求項３または４に記載の測定方法。
【請求項６】
以下の条件を満足する核酸：
（１）配列番号：１で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする；
（２）配列番号：２で表される塩基配列を含む核酸が共存する場合に、ストリンジェントな条件下で、当該核酸とハイブリダイズしないか、または、当該核酸とハイブリダイズした場合であってもその３’末端がミスマッチとなる。
【請求項７】
配列番号：１で表される塩基配列におけるエキソンＳＶを含む領域とハイブリダイズする、請求項６に記載の核酸。
【請求項８】
塩基数が１０以上である、請求項６または７に記載の核酸。
【請求項９】
塩基数が１５〜３５である、請求項８に記載の核酸。
【請求項１０】
配列番号：１で表される塩基配列または当該塩基配列の部分領域と同じ塩基配列またはこれらの塩基配列のうち１０％以下の塩基が置換されてなる塩基配列からなる、請求項６〜９のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１１】
ＯＡＴＰ１Ｂ３ ｍＲＮＡの選択的スプライシングバリアントの測定に用いられる、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１２】
核酸増幅用のプライマー、またはプローブである、請求項１１に記載の核酸。
【請求項１３】
請求項１１または１２に記載の核酸を含む、ＯＡＴＰ１Ｂ３ ｍＲＮＡの選択的スプライシングバリアントの測定用キット。
【請求項１４】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の測定方法により、または、請求項１３に記載の測定用キットを用いて、生体から分離した被検試料中のＯＡＴＰ１Ｂ３ ｍＲＮＡの選択的スプライシングバリアントを測定することを含む、がんの検出方法。
【請求項１５】
配列番号：１で表される塩基配列を含むＯＡＴＰ１Ｂ３ ｍＲＮＡの選択的スプライシングバリアントを測定する、請求項１４に記載の検出方法。
【請求項１６】
前記がんが大腸がんまたは膵臓がんである、請求項１４または１５に記載の検出方法。
【請求項１７】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の測定方法により、または、請求項１３に記載の測定用キットを用いて、がん細胞を被検物質の存在下で培養して得られる培養細胞中のＯＡＴＰ１Ｂ３ ｍＲＮＡの選択的スプライシングバリアントを測定する工程と、
得られた測定結果を、前記被検物質の非存在下における場合と比較および／または評価する工程と、
を含む、がんの予防および／または治療剤のスクリーニング方法。
【請求項１８】
配列番号：１で表される塩基配列を含む、ＯＡＴＰ１Ｂ３（Organic Anion Transporting Polypeptide 1B3）ｍＲＮＡの選択的スプライシングバリアント。
【請求項１９】
（１）配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を含み、かつ、がん細胞またはがん組織において発現が増強するポリペプチド、あるいは、
（２）配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列において、１０％以下のアミノ酸が置換、欠失、および／または挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ、がん細胞またはがん組織において発現が増強するポリペプチド。
【請求項２０】
配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項２１】
請求項１９または２０に記載のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項２２】
請求項２１に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項２３】
請求項２２に記載の発現ベクターで形質転換された細胞。
【請求項２４】
請求項１９または２０に記載のポリペプチドに結合する抗体。
【請求項２５】
配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、少なくとも１５塩基を有する核酸。
【請求項２６】
生体から分離した被検試料中の、請求項１９または２０に記載のポリペプチドの量を測定することを含む、がんの検出方法。
【請求項２７】
請求項２４に記載の抗体を測定に用いる、請求項２６に記載の検出方法。
【請求項２８】
請求項２４に記載の抗体を含む、がんの検出用キット。
【請求項２９】
請求項１９または２０に記載のポリペプチドもしくはその断片、または、請求項２１に記載の核酸もしくはその断片を含む、特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するための医薬。
【請求項３０】
がんワクチンである、請求項２９に記載の医薬。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２０１１−１８８８５３（Ｐ２０１１−１８８８５３Ａ）
【公開日】平成２３年９月２９日（２０１１．９．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−３２５０１（Ｐ２０１１−３２５０１）
【出願日】平成２３年２月１７日（２０１１．２．１７）
【出願人】（３０４０２１８３１）国立大学法人 千葉大学 (601)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年９月２９日（２０１１．９．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年２月１７日（２０１１．２．１７）
【出願人】（３０４０２１８３１）国立大学法人 千葉大学 (601)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]