Ｐ糖タンパク質の排出機能抑制剤
【課題】細胞内に取り込まれた薬剤が能動輸送により細胞外に排出されるのを抑制することができる、Ｐ糖タンパク質の排出機能抑制剤を提供することである。
【解決手段】Ｐ糖タンパク質の排出機能抑制剤は、ミルナシプランを有効成分として含む。本発明のＰ糖タンパク質の排出機能抑制剤は、Ｐ糖タンパク質の排出機能を抑制することができるため、Ｐ糖タンパク質の基質となる薬剤と併用することで、薬剤の効果を高めることができる。
【解決手段】Ｐ糖タンパク質の排出機能抑制剤は、ミルナシプランを有効成分として含む。本発明のＰ糖タンパク質の排出機能抑制剤は、Ｐ糖タンパク質の排出機能を抑制することができるため、Ｐ糖タンパク質の基質となる薬剤と併用することで、薬剤の効果を高めることができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞内に取り込まれた薬剤が細胞外に排出されることを抑制する、Ｐ糖タンパク質の排出機能抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｐ糖タンパク質は、肝臓の毛細胆管、腸の管腔側膜、腎臓の近位尿細管、脳の毛細血管内皮などにおいて、細胞の細胞膜を貫通するように発現している。Ｐ糖タンパク質は、細胞内に取り込まれた細胞毒性を有する化合物などを、能動輸送により細胞内から細胞外に排出する、排出ポンプとして機能している。
【０００３】
また、Ｐ糖タンパク質は、癌細胞の細胞膜にも発現しており、癌細胞の多剤耐性化に関与していることが報告されている（例えば、非特許文献１および２参照）。抗癌剤（抗悪性腫瘍薬）による癌の治療では、治療の初期では抗癌剤が効いていたにもかかわらず、長期間治療していると抗癌剤が次第に効かなくなることがある。また、投与したことのない抗癌剤が、効かないこともある。これは、癌細胞が、投与した抗癌剤に対して耐性になるとともに、投与していない他の抗癌剤に対しても耐性になることを意味している。このように、細胞が様々な薬剤に耐性をもつ現象は、細胞の多剤耐性化と呼ばれている。そして、多剤耐性化された癌細胞の細胞膜には、Ｐ糖タンパク質が過剰に発現していることが知られている。癌細胞は、過剰に発現したＰ糖タンパク質が細胞内に取り込まれた様々な薬剤を細胞外に排出することで、多剤耐性化する。
【０００４】
Ｐ糖タンパク質の基質としては、抗悪性腫瘍薬の他にも、ＨＩＶプロテアーゼ阻害薬、抗菌薬、免疫抑制薬、強心配糖体、ステロイド、鎮吐薬、ＨＭＧ＿ＣｏＡ阻害薬、Ｈ１受容体拮抗薬、不整脈治療薬、抗精神病薬、抗うつ薬などが知られている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Fardel O., et al., "Up-regulation of P-glycoprotein expression in rat liver cells by acute doxorubicin treatment", Eur. J. Biochem., Vol.246, pp.186-192.
【非特許文献２】Shi, Y., et al., "Overexpression of ZNRD1 promotes multidrug-resistant phenotype of gastric cancer cells through upregulation of P-glycoprotein.", Cancer Biol. Ther., Vol.3, No.4, pp.377-81.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
前述した各薬剤は、抗癌剤と同様に、長期治療中に効き目が悪くなることが知られている。また、前述した薬剤は、Ｐ糖タンパク質の基質となることから、各薬剤の対象疾患においても、癌細胞と同様に、細胞がＰ糖タンパク質の排出機能により多剤耐性化している可能性がある。したがって、多剤耐性化した細胞内における薬剤の濃度を高めるべく、Ｐ糖タンパク質の排出機能を抑制することが望まれている。
【０００７】
本発明は、かかる点に鑑みてなされたものであり、細胞内に取り込まれた薬剤が細胞外に排出されることを抑制することができる、Ｐ糖タンパク質の排出機能抑制剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記課題を解決するべく鋭意研究を行った結果、ミルナシプランがＰ糖タンパク質の排出機能を抑制できることを見出し、さらに検討を加えて本発明を完成させた。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下のＰ糖タンパク質の排出機能抑制剤に関する。
［１］ミルナシプランを有効成分として含む、Ｐ糖タンパク質の排出機能抑制剤。
［２］細胞内に取り込まれた薬剤がＰ糖タンパク質により細胞外に排出されることを抑制する、［１］に記載のＰ糖タンパク質の排出機能抑制剤。
［３］前記薬剤は、抗悪性腫瘍薬、抗精神病薬または抗うつ薬である、［２］に記載のＰ糖タンパク質の排出機能抑制剤。
［４］前記細胞は、神経細胞である、［２］または［３］に記載のＰ糖タンパク質の排出機能抑制剤。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、Ｐ糖タンパク質の排出機能を抑制することができる。したがって、Ｐ糖タンパク質の基質となる薬剤と本発明の抑制剤とを併用することで、当該薬剤の効果を高めることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１Ａは、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲの結果を示すグラフである。図１Ｂは、融解曲線分析の結果を示すグラフである。
【図２】図２Ａは、Ａｂｃｂ１ａおよび１８Ｓ ｒＲＮＡの増幅曲線を示すグラフである。図２Ｂは、ベクターを導入していないＨＴ２２細胞におけるＡｂｃｂ１ａのｍＲＮＡの発現量に対する、ベクターを導入したＨＴ２２細胞におけるＡｂｃｂ１ａのｍＲＮＡの相対発現量を示すグラフである。
【図３】図３Ａは、Ａｂｃｂ１ｂおよび１８Ｓ ｒＲＮＡの増幅曲線を示すグラフである。図３Ｂは、ベクターを導入していないＨＴ２２細胞におけるＡｂｃｂ１ｂのｍＲＮＡの発現量に対する、ベクターを導入したＨＴ２２細胞におけるＡｂｃｂ１ｂのｍＲＮＡの相対発現量を示すグラフである。
【図４】ウェスタンブロットの結果を示すグラフである。
【図５】シクロスポリンＡの濃度とローダミンの蛍光強度との関係を示すグラフである。
【図６】パロキセチンの濃度とローダミンの蛍光強度との関係を示すグラフである。
【図７】ミルナシプランの濃度とローダミンの蛍光強度との関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明のＰ糖タンパク質の排出機能抑制剤（以下「本発明のＰ糖タンパク質抑制剤」ともいう）は、式（１）のミルナシプランを有効成分として含むことを特徴とし、その他の任意の成分を含むことができる。また、本発明のＰ糖タンパク質抑制剤に含まれるミルナシプランは、塩であってもよい。ミルナシプランは、有機酸塩または無機酸塩であることが好ましく、塩酸塩（ミルナシプラン塩酸塩）であることが特に好ましい。
【化１】
【００１３】
Ｐ糖タンパク質は、分子量が１７万〜１８万であり、１２８０個のアミノ酸から構成されるＡＢＣトランスポーターのＭＤＲ／ＴＡＰサブファミリーに属する分子である。Ｐ糖タンパク質は、１２回膜貫通型の細胞膜糖タンパク質であり、１２個ある膜貫通ドメインのうち６つ目と７つ目の間およびカルボキシル基末端にＡＴＰ結合ドメインを有している。そして、ＡＴＰの加水分解によるエネルギーを利用して、細胞内に取り込まれた細胞毒性を有する化合物（薬剤など）を細胞外に排出する。Ｐ糖タンパク質をコードするヒト遺伝子は、ＡＢＣＢ１（ATP-binding Cassette Sub-family B Member 1）またはＭＤＲ１（Multiple drug resistance 1）と呼ばれている。マウスおよびラットでは、Ａｂｃｂ１ａ（Ｍｄｒ１ａ）およびＡｂｃｂ１ｂ（Ｍｄｒ１ｂ）が対応する。
【００１４】
Ｐ糖タンパク質は、副腎皮質、肝臓、腎臓、小腸、大腸、胎盤などに発現している。消化管粘膜のＰ糖タンパク質は、薬物を管腔内に排出する。また、脳血管内皮細胞のＰ糖タンパク質は、薬物の脳組織内への分布を制御している。
【００１５】
Ｐ糖タンパク質の基質としては、抗悪性腫瘍薬（ビンクリスチン、ドキソルビシン、エトポシド）、ＨＩＶプロテアーゼ阻害薬（インジナビル、ネルフィナビル、サキナビル）、抗菌薬（エリスロマイシン、グレパフロキサシン、スパルフロキサシン）、免疫抑制薬（シクロスポリンＡ、シロリムス、タクロリムス）、強心配糖体（ジゴキシン）、ステロイド（デキサメタゾン、メチルプレドニゾロン）、鎮吐薬（オンダンセトロン、ドンペリドン）、ＨＭＧ＿ＣｏＡ阻害薬（アトルバスタチン、ロバスタチン）、Ｈ１受容体拮抗薬（フェキソフェナジン、テルフェナジン）、不整脈治療薬（キニジン）、抗精神病薬（リスペリドン、オランザピン、クエチアピン、アリピプラゾール、ペロスピペロン）、抗うつ薬（アミトリプチリン、ノリトリプチリン、サートラリン、フルボキサミン、パロキセチン）などが知られている。これらの薬剤の対象疾患に関係する細胞においても、Ｐ糖タンパク質が過剰に発現することで、薬剤の効き目が悪くなることが考えられる。そこで、本発明者は、過剰に発現したＰ糖タンパク質の排出機能を抑制することで、これらの薬剤の薬効を改善させることができると考えた。そして、そのような作用を有する化合物を検討した結果、抗うつ薬であるミルナシプランが、Ｐ糖タンパク質の排出機能を抑制する有効成分として作用しうることを見出した。
【００１６】
本発明のＰ糖タンパク質抑制剤に含まれるミルナシプランは、当業者に知られる方法を用いて製造したものでもよいが、市販の製剤を利用してもよい。このような市販の製剤の例には、旭化成ファーマ株式会社の「トレドミン錠」、アルフレッサファーマ株式会社の「ミルナシプラン塩酸塩錠「ＡＦＰ」」、ニプロファーマ株式会社の「ミルナシプラン塩酸塩錠「ＮＴ」」、東和薬品株式会社の「ミルナシプラン塩酸塩錠「トーワ」」、日医工株式会社の「ミルナシプラン塩酸塩錠「日医工」」、太洋薬品工業株式会社の「ミルナシプラン塩酸塩錠「タイヨー」」、沢井製薬株式会社の「ミルナシプラン塩酸塩錠「サワイ」」、マイラン製薬株式会社の「ミルナシプラン塩酸塩錠「マイラン」」、興和デバ株式会社および大正薬品工業株式会社の「ミルナシプラン塩酸塩錠「ＴＫＹ」」、日本ジェネリック株式会社の「ミルナシプラン塩酸塩錠「ＪＧ」」などのミルナシプラン塩酸塩製剤が含まれる。
【００１７】
前述した製剤の剤形は、特に限定されず、錠剤や顆粒剤、細粒剤、丸剤、散剤、カプセル剤など、任意である。たとえば、錠剤の場合には、１日あたり約２〜９錠を経口投与することで、１日当たりの投与量が満足できるようにミルナシプランの１錠当たりの含量を設定し、常法通り打錠すればよい。
【００１８】
当該製剤の１日当たりの投与量は、Ｐ糖タンパク質の排出機能を抑制する量であって副作用の少ない量のミルナシプランを投与しうる量であれば特に限定されない。たとえば、ミルナシプラン塩酸塩をミルナシプランとして１日当たり２５〜１００ｍｇ程度投与しうる量であればよい。当該製剤全量に対するミルナシプランの配合量（割合）は特に限定されず、剤形に応じて適宜設定すればよい。
【００１９】
当該製剤の用法は、Ｐ糖タンパク質の排出機能を抑制することができれば特に限定されない。たとえば、前記１日当たりの投与量（たとえば、ミルナシプラン塩酸塩をミルナシプランとして２５〜１００ｍｇ程度含む量）を３回に分けて食前、食間または食後に経口投与すればよい。
【００２０】
本発明のＰ糖タンパク質抑制剤は、Ｐ糖タンパク質の排出機能を抑制することができる。したがって、本発明のＰ糖タンパク質抑制剤は、Ｐ糖タンパク質の基質となる薬剤と併用することで、当該薬剤の効果を高めることができる。本発明の抑制剤と併用される薬剤の種類は、Ｐ糖タンパク質の基質となる薬剤であれば特に限定されない。
【００２１】
前述の非特許文献２には、Ｐ糖タンパク質の発現量を増加させた癌細胞（ＳＧＣ７９０１細胞）が、Ｐ糖タンパク質の基質となる抗悪性腫瘍薬（ビンクリスチン、アドリアマイシンおよびエトポシドなど）に対して耐性を有することが記載されている。そして、薬剤耐性となった癌細胞に、抗悪性腫瘍薬とベラパミル（Ｐ糖タンパク質抑制剤）とを併用して投与すると、癌細胞が再び抗悪性腫瘍薬に感受性を示すことが示されている。本発明のＰ糖タンパク質抑制剤も、Ｐ糖タンパク質の基質となる薬剤と併用することで、当該薬剤に耐性を有する細胞に対する効果を高めることができると期待される。
【００２２】
この後の実施例において示すように、本発明者は、Ｐ糖タンパク質が脳の神経細胞において発現していることを見出した。このため、本発明のＰ糖タンパク質抑制剤は、脳腫瘍や精神病、うつ病などの脳関連の疾患を対象とする抗悪性腫瘍薬、抗精神病薬、抗うつ薬などと併用して使用されることが期待される。
【００２３】
以下、本発明を実施例を参照して詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されない。
【実施例】
【００２４】
［実施例１］
実施例１では、ＨＴ２２細胞（マウス海馬由来の神経細胞株）を用いて、ＡＢＣＢ１（Ｐ糖タンパク質）抑制剤としてのミルナシプランの効果を評価した結果を示す。
【００２５】
１．ＡＢＣＢ１の発現の確認
まず、ＨＴ２２細胞においてＡＢＣＢ１が発現していることを確認した。
【００２６】
（１）ＲＮＡレベルでの発現の確認
既存の方法を用いて、ＨＴ２２細胞から全ＲＮＡを抽出した。抽出した全ＲＮＡ（２μｇ）から市販のキット（High Capacity RNA-to-cDNA Kit；Applied Biosystems社）を用いてｃＤＮＡを合成した。
【００２７】
得られたｃＤＮＡを鋳型ＤＮＡとしてリアルタイムＲＴ-ＰＣＲ（インターカレーター法）を行うことにより、Ａｂｃｂ１ａおよびＡｂｃｂ１ｂのｍＲＮＡの発現を調べた。Ａｂｃｂ１ａのプライマーは、配列番号１（フォワードプライマー）および配列番号２（リバースプライマー）に示されるものを使用した。Ａｂｃｂ１ｂのプライマーは、配列番号３（フォワードプライマー）および配列番号４（リバースプライマー）に示されるものを使用した。１８Ｓ ｒＲＮＡ（コントロール）のプライマーは、配列番号５（フォワードプライマー）および配列番号６（リバースプライマー）に示されるものを使用した。また、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行った後に、融解曲線分析により増幅産物の確認を行った。
【００２８】
図１Ａは、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲの結果を示すグラフである。図中の「Ａ」は１８Ｓ ｒＲＮＡの増幅曲線であり、「Ｂ」はＡｂｃｂ１ａの増幅曲線であり、「Ｃ」はＡｂｃｂ１ｂの増幅曲線である。この結果から、ＨＴ２２細胞中にＡｂｃｂ１ａおよびＡｂｃｂ１ｂのｍＲＮＡが存在していることがわかる。このことは、ＨＴ２２細胞において、Ａｂｃｂ１ａおよびＡｂｃｂ１ｂが発現していることを示唆している。
【００２９】
図１Ｂは、融解曲線分析の結果を示すグラフである。図中の「Ａ」は１８Ｓ ｒＲＮＡの融解曲線であり、「Ｂ」はＡｂｃｂ１ａの融解曲線であり、「Ｃ」はＡｂｃｂ１ｂの融解曲線である。この結果から、目的のＰＣＲ産物を得られていることがわかる。
【００３０】
（２）ｓｉＲＮＡを使用したノックダウン
Ａｂｃｂ１のｓｉＲＮＡ（配列番号７）を導入したｐＧＦＰ−Ｖ−ＲＳ ｓｈＲＮＡベクターを調製した。市販のトランスフェクション試薬（TransIT-2020；Mirus Bio社）を用いて、調製したベクターをＨＴ２２細胞に導入した。
【００３１】
ベクターを導入してから７２時間後のＨＴ２２細胞におけるＡｂｃｂ１ａおよびＡｂｃｂ１ｂのｍＲＮＡの発現量を、リアルタイムＲＴ-ＰＣＲを行うことにより調べた。Ａｂｃｂ１ａおよびＡｂｃｂ１ｂのｍＲＮＡの発現量は、１８Ｓ ｒＲＮＡの発現量を基準とする相対定量法により算出した。リアルタイムＲＴ-ＰＣＲの手順は、上記（１）で説明した手順と同じである。
【００３２】
図２Ａは、Ａｂｃｂ１ａおよび１８Ｓ ｒＲＮＡの増幅曲線を示すグラフである。図中の「Ａ」は、ベクターを導入していないＨＴ２２細胞由来のサンプルを用いたときの１８Ｓ ｒＲＮＡの増幅曲線である。「Ｂ」は、ベクターを導入したＨＴ２２細胞由来のサンプルを用いたときの１８Ｓ ｒＲＮＡの増幅曲線である。「Ｃ」は、ベクターを導入していないＨＴ２２細胞由来のサンプルを用いたときのＡｂｃｂ１ａの増幅曲線である。「Ｄ」は、ベクターを導入したＨＴ２２細胞由来のサンプルを用いたときのＡｂｃｂ１ａの増幅曲線である。
【００３３】
図２Ｂは、ベクターを導入していないＨＴ２２細胞におけるＡｂｃｂ１ａのｍＲＮＡの発現量に対する、ベクターを導入したＨＴ２２細胞におけるＡｂｃｂ１ａのｍＲＮＡの相対発現量を示すグラフである。図中の「−」は、ベクターを導入していないＨＴ２２細胞におけるＡｂｃｂ１ａのｍＲＮＡの発現量を示す。「＋」は、ベクターを導入したＨＴ２２細胞におけるＡｂｃｂ１ａのｍＲＮＡの発現量を示す。このグラフでは、ベクターを導入していないＨＴ２２細胞におけるＡｂｃｂ１ａのｍＲＮＡの発現量を「１．０」としている。
【００３４】
図３Ａは、Ａｂｃｂ１ｂおよび１８Ｓ ｒＲＮＡの増幅曲線を示すグラフである。図中の「Ａ」は、ベクターを導入していないＨＴ２２細胞由来のサンプルを用いたときの１８Ｓ ｒＲＮＡの増幅曲線である。「Ｂ」は、ベクターを導入したＨＴ２２細胞由来のサンプルを用いたときの１８Ｓ ｒＲＮＡの増幅曲線である。「Ｃ」は、ベクターを導入していないＨＴ２２細胞由来のサンプルを用いたときのＡｂｃｂ１ｂの増幅曲線である。「Ｄ」は、ベクターを導入したＨＴ２２細胞由来のサンプルを用いたときのＡｂｃｂ１ｂの増幅曲線である。
【００３５】
図３Ｂは、ベクターを導入していないＨＴ２２細胞におけるＡｂｃｂ１ｂのｍＲＮＡの発現量に対する、ベクターを導入したＨＴ２２細胞におけるＡｂｃｂ１ｂのｍＲＮＡの相対発現量を示すグラフである。図中の「−」は、ベクターを導入していないＨＴ２２細胞におけるＡｂｃｂ１ｂのｍＲＮＡの発現量を示す。「＋」は、ベクターを導入したＨＴ２２細胞におけるＡｂｃｂ１ｂのｍＲＮＡの発現量を示す。このグラフでは、ベクターを導入していないＨＴ２２細胞におけるＡｂｃｂ１ｂのｍＲＮＡの発現量を「１．０」としている。
【００３６】
これらの結果から、ＨＴ２２細胞におけるＡｂｃｂ１ａおよびＡｂｃｂ１ｂのｍＲＮＡの発現量が、ｓｉＲＮＡの導入により顕著に減少していることがわかる（Ａｂｃｂ１ａ：５８％減少、Ａｂｃｂ１ｂ：７５％減少）。このことは、ＨＴ２２細胞において、Ａｂｃｂ１ａおよびＡｂｃｂ１ｂが発現していることを強く示唆している。
【００３７】
（３）タンパク質レベルでの発現の確認
ベクターを導入していないＨＴ２２細胞およびベクターを導入したＨＴ２２細胞から、既存の方法により全タンパク質を抽出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、ウェスタンブロット法によりＡＢＣＢ１の発現の有無を調べた。また、デンシトメーターを用いてＡＢＣＢ１の相対発現量を数値化した。
【００３８】
図４は、ウェスタンブロットの結果を示すグラフである。図中の「−」は、ベクターを導入していないＨＴ２２細胞におけるＡＢＣＢ１の発現量を示す。「＋」は、ベクターを導入したＨＴ２２細胞におけるＡＢＣＢ１の発現量を示す。このグラフでは、ベクターを導入していないＨＴ２２細胞におけるＡＢＣＢ１の発現量を「１．０」としている。この結果から、ＨＴ２２細胞において、ＡＢＣＢ１が発現していることがわかる。また、ＨＴ２２細胞におけるＡＢＣＢ１の発現量が、ｓｉＲＮＡの導入により顕著に減少していることがわかる（８０％減少）。このことは、ＨＴ２２細胞において、ＡＢＣＢ１が発現していることを意味している。
【００３９】
２．ＡＢＣＢ１に対する抑制能の評価
次に、ＨＴ２２細胞を用いて、ＡＢＣＢ１抑制剤としてのミルナシプランの効果を確認した。本実験では、ＡＢＣＢ１の基質として知られているローダミン（蛍光色素）を細胞内に導入した後、ローダミンの細胞外への排出が被験化合物によりどの程度抑制されるかを評価した。被験化合物としては、シクロスポリンＡ（cyclosporinA；免疫抑制剤）、パロキセチン（paroxetine；ＳＳＲＩ）およびミルナシプランを使用した。シクロスポリンＡおよびパロキセチンは、ＡＢＣＢ１に対する抑制能を有することが知られている。
【００４０】
ＤＭＥＭ培地（ＦＢＳ１０％、ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ファンギゾン１．２５μｇ／ｍｌを含む）が入った６ウェルプレートに、１２×１０５個／ウェルとなるようにＨＴ２２細胞を蒔いて、３７℃で２４時間（５％ ＣＯ２）培養した。培養後、ＤＭＥＭ培地（ＦＢＳ＋）をＦＢＳおよび抗生物質を含まないＤＭＥＭ培地（ＦＢＳ−）に置換し、３０分間静置して、ＦＢＳ、ペニシリンおよびファンギゾンを除去した。次いで、ＤＭＥＭ培地（ＦＢＳ−）を、所定の濃度で被験化合物を含むＤＭＥＭ培地（ＦＢＳ−）に置換した（２ｍｌ／ウェル）。３７℃で所定の時間培養して（５％ ＣＯ２）、各被験化合物をＨＴ２２細胞内に取り込ませた。表１に、被験化合物の濃度と培養時間を示す。
【００４１】
【表１】
【００４２】
各被験化合物をＨＴ２２細胞に取り込ませた後、終濃度が０．５μＭとなるようにローダミンを培地に添加し、３７℃で９０分間培養した（５％ ＣＯ２）。各ウェルにおいて、各細胞をＰＢＳ（Ｔｗｅｅｎ２０を０．２５％含む）で４回洗浄した後、１．５ｍＬチューブにおいて、各細胞を３００μＬ ＰＢＳ（Ｔｗｅｅｎ２０を４％含む）で３回洗浄して、細胞外のローダミンを除去した。洗浄した各細胞を、フリーザー（−８０℃）を用いて３０分間凍結した。解凍後、室温に戻したサンプル中のローダミンの蛍光強度をマルチラベルプレートカウンター（Wallac 1420 ARVO MX-2；Perkin Elmer社）で測定した。
【００４３】
図５は、シクロスポリンＡの濃度とローダミンの蛍光強度との関係を示すグラフである。ローダミンの蛍光強度は、シクロスポリンＡを添加していない場合（０μＭ）におけるローダミンの蛍光強度を１００％としたときの相対値を示している。図５に示されるように、シクロスポリンＡを添加していない場合と比較して、終濃度が０．２５μＭとなるようにシクロスポリンＡを添加すると、蛍光強度が１６６％に増加した。このことから、シクロスポリンＡがＡＢＣＢ１の排出機能を抑制していることがわかる。
【００４４】
図６は、パロキセチンの濃度とローダミンの蛍光強度との関係を示すグラフである。ローダミンの蛍光強度は、パロキセチンを添加していない場合（０μＭ）におけるローダミンの蛍光強度を１００％としたときの相対値を示している。図６に示されるように、パロキセチンを添加していない場合と比較して、終濃度が１μＭとなるようにパロキセチンを添加すると、蛍光強度が１１８％に増加した。このことから、パロキセチンがＡＢＣＢ１の排出機能を抑制していることがわかる。
【００４５】
図７は、ミルナシプランの濃度とローダミンの蛍光強度との関係を示すグラフである。ローダミンの蛍光強度は、ミルナシプランを添加していない場合（０μＭ）におけるローダミンの蛍光強度を１００％としたときの相対値を示している。図７に示されるように、ミルナシプランを添加していない場合と比較して、終濃度が１μＭとなるようにミルナシプランを添加すると、蛍光強度が１８６％に増加した。このことから、ミルナシプランは、シクロスポリンＡおよびパロキセチンと同様に、ＡＢＣＢ１の排出機能を抑制していることがわかる。また、図５〜図７の結果を比較すると、ミルナシプランが、最もＰ糖タンパク質の排出機能を抑制できることもわかる。
【００４６】
［実施例２］
実施例２では、パロキセチン（抗うつ薬）のみの投与では抗うつ効果が認められなかった３名のうつ病患者に対して、パロキセチンに加えてミルナシプランを投与した例を示す。
【００４７】
症例１（３５歳、女性）
女性は、５月、父親との口論から大量に薬物を服薬し、リストカットをした。その後、女性は、パロキセチン４０ｍｇ／日およびドスレピン２５ｍｇ／日の服用を開始したが、抑うつの症状が持続していた。
【００４８】
女性は、同年７月には会社に出勤できなくなり、休職して自宅療養を行っていたが、抑うつの症状は改善しなかった。このとき、女性のハミルトンうつ病評価尺度（ＨＡＭＤ）は、２９点であった。女性は、同年８月３１日になっても抑うつの症状が改善しなかったため、ミルナシプラン３０ｍｇ／日を追加で服用した。さらに、同年９月１７日からミルナシプランの服用量を４５ｍｇ／日に増量した。
【００４９】
同年１１月２６日には、抑うつ気分もほとんど良くなり、外出および朝３０分のジョギングができるようになった。このときのＨＡＭＤは、４点であった。同年１２月からは、半日出勤できるようになり、抑うつ状態は改善した。このときのＨＡＭＤは、０点であった。翌年１月２０日から通常の出勤ができるようになった。
【００５０】
症例２（４３歳、女性）
女性は、１月からうつ病にて、パロキセチン４０ｍｇ／日、クロミプラミン１００ｍｇ／日およびブロマゼパム２０ｍｇ／日を服用していたが、抑うつの症状が持続していた。
【００５１】
女性は、同年３月、抑うつの症状が悪化し、焦燥感が強くなった。女性は、左手首を長さ３ｃｍリストカットしたため、ミルナシプラン３０ｍｇ／日を追加で服用した。このときのＨＡＭＤは、３２点であった。同年４月でも焦燥感が持続しており、意思の低下も強く、家事もほとんどできない状態が持続していたため、ミルナシプランの服用量を７５ｍｇ／日に増量した。
【００５２】
同年５月には、焦燥感および自殺念慮が消失すると共に、意欲の低下も改善され、午後から家事ができるようになった。このときのＨＡＭＤは、５点であり、抑うつの症状が軽快した。同年６月には、ほとんどの家事ができるようになった。このときのＨＡＭＤは、０点であり、抑うつの症状が改善した。
【００５３】
症例３（５４歳、女性）
女性は、１２月からパロキセチン３０ｍｇ／日を服用したが、中等度の抑うつ気分、食欲の低下、自殺念慮、意欲の低下により、昼過ぎまで横になっている生活が持続していた。翌年６月になっても抑うつの症状が持続し、さらに目のかすみ、眼痛、頭痛、胸部痛、意欲の低下が悪化し、家事がほとんどできなくなったため、ミルナシプラン３０ｍｇ／日を追加で服用した。このときのＨＡＭＤは、３５点であった。
【００５４】
同年８月には、思考抑制、頭痛などの自律神経症状、中等度の抑うつ症状が持続していたため、ミルナシプランの服用量を５０ｍｇ／日に増量した。同年９月になっても抑うつの症状は持続しており、ミルナシプランの服用量を７５ｍｇ／日に増量した。さらに、同年１０月には、ミルナシプランの服用量を１２５ｍｇ／日に増量した。
【００５５】
同年１２月には、家事もできるようになり、意欲の低下、思考の抑制、抑うつ症状が改善した。このときのＨＡＭＤは、３点であった。
【００５６】
以上の３つの症例では、ミルナシプランが、血液脳関門や神経細胞内からＰ糖タンパク質によるパロキセチンの排出を抑制したと推測される。このようにパロキセチンとミルナシプランを併用することで、脳内のパロキセチン濃度、さらには神経細胞内のパロキセチン濃度が上昇し、抑うつの症状が改善されたことが示唆される。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
たとえば、本発明のＰ糖タンパク質の排出機能抑制剤は、Ｐ糖タンパク質の基質となる薬剤の効果を高める医薬品として有用である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞内に取り込まれた薬剤が細胞外に排出されることを抑制する、Ｐ糖タンパク質の排出機能抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｐ糖タンパク質は、肝臓の毛細胆管、腸の管腔側膜、腎臓の近位尿細管、脳の毛細血管内皮などにおいて、細胞の細胞膜を貫通するように発現している。Ｐ糖タンパク質は、細胞内に取り込まれた細胞毒性を有する化合物などを、能動輸送により細胞内から細胞外に排出する、排出ポンプとして機能している。
【０００３】
また、Ｐ糖タンパク質は、癌細胞の細胞膜にも発現しており、癌細胞の多剤耐性化に関与していることが報告されている（例えば、非特許文献１および２参照）。抗癌剤（抗悪性腫瘍薬）による癌の治療では、治療の初期では抗癌剤が効いていたにもかかわらず、長期間治療していると抗癌剤が次第に効かなくなることがある。また、投与したことのない抗癌剤が、効かないこともある。これは、癌細胞が、投与した抗癌剤に対して耐性になるとともに、投与していない他の抗癌剤に対しても耐性になることを意味している。このように、細胞が様々な薬剤に耐性をもつ現象は、細胞の多剤耐性化と呼ばれている。そして、多剤耐性化された癌細胞の細胞膜には、Ｐ糖タンパク質が過剰に発現していることが知られている。癌細胞は、過剰に発現したＰ糖タンパク質が細胞内に取り込まれた様々な薬剤を細胞外に排出することで、多剤耐性化する。
【０００４】
Ｐ糖タンパク質の基質としては、抗悪性腫瘍薬の他にも、ＨＩＶプロテアーゼ阻害薬、抗菌薬、免疫抑制薬、強心配糖体、ステロイド、鎮吐薬、ＨＭＧ＿ＣｏＡ阻害薬、Ｈ１受容体拮抗薬、不整脈治療薬、抗精神病薬、抗うつ薬などが知られている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Fardel O., et al., "Up-regulation of P-glycoprotein expression in rat liver cells by acute doxorubicin treatment", Eur. J. Biochem., Vol.246, pp.186-192.
【非特許文献２】Shi, Y., et al., "Overexpression of ZNRD1 promotes multidrug-resistant phenotype of gastric cancer cells through upregulation of P-glycoprotein.", Cancer Biol. Ther., Vol.3, No.4, pp.377-81.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
前述した各薬剤は、抗癌剤と同様に、長期治療中に効き目が悪くなることが知られている。また、前述した薬剤は、Ｐ糖タンパク質の基質となることから、各薬剤の対象疾患においても、癌細胞と同様に、細胞がＰ糖タンパク質の排出機能により多剤耐性化している可能性がある。したがって、多剤耐性化した細胞内における薬剤の濃度を高めるべく、Ｐ糖タンパク質の排出機能を抑制することが望まれている。
【０００７】
本発明は、かかる点に鑑みてなされたものであり、細胞内に取り込まれた薬剤が細胞外に排出されることを抑制することができる、Ｐ糖タンパク質の排出機能抑制剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記課題を解決するべく鋭意研究を行った結果、ミルナシプランがＰ糖タンパク質の排出機能を抑制できることを見出し、さらに検討を加えて本発明を完成させた。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下のＰ糖タンパク質の排出機能抑制剤に関する。
［１］ミルナシプランを有効成分として含む、Ｐ糖タンパク質の排出機能抑制剤。
［２］細胞内に取り込まれた薬剤がＰ糖タンパク質により細胞外に排出されることを抑制する、［１］に記載のＰ糖タンパク質の排出機能抑制剤。
［３］前記薬剤は、抗悪性腫瘍薬、抗精神病薬または抗うつ薬である、［２］に記載のＰ糖タンパク質の排出機能抑制剤。
［４］前記細胞は、神経細胞である、［２］または［３］に記載のＰ糖タンパク質の排出機能抑制剤。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、Ｐ糖タンパク質の排出機能を抑制することができる。したがって、Ｐ糖タンパク質の基質となる薬剤と本発明の抑制剤とを併用することで、当該薬剤の効果を高めることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１Ａは、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲの結果を示すグラフである。図１Ｂは、融解曲線分析の結果を示すグラフである。
【図２】図２Ａは、Ａｂｃｂ１ａおよび１８Ｓ ｒＲＮＡの増幅曲線を示すグラフである。図２Ｂは、ベクターを導入していないＨＴ２２細胞におけるＡｂｃｂ１ａのｍＲＮＡの発現量に対する、ベクターを導入したＨＴ２２細胞におけるＡｂｃｂ１ａのｍＲＮＡの相対発現量を示すグラフである。
【図３】図３Ａは、Ａｂｃｂ１ｂおよび１８Ｓ ｒＲＮＡの増幅曲線を示すグラフである。図３Ｂは、ベクターを導入していないＨＴ２２細胞におけるＡｂｃｂ１ｂのｍＲＮＡの発現量に対する、ベクターを導入したＨＴ２２細胞におけるＡｂｃｂ１ｂのｍＲＮＡの相対発現量を示すグラフである。
【図４】ウェスタンブロットの結果を示すグラフである。
【図５】シクロスポリンＡの濃度とローダミンの蛍光強度との関係を示すグラフである。
【図６】パロキセチンの濃度とローダミンの蛍光強度との関係を示すグラフである。
【図７】ミルナシプランの濃度とローダミンの蛍光強度との関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明のＰ糖タンパク質の排出機能抑制剤（以下「本発明のＰ糖タンパク質抑制剤」ともいう）は、式（１）のミルナシプランを有効成分として含むことを特徴とし、その他の任意の成分を含むことができる。また、本発明のＰ糖タンパク質抑制剤に含まれるミルナシプランは、塩であってもよい。ミルナシプランは、有機酸塩または無機酸塩であることが好ましく、塩酸塩（ミルナシプラン塩酸塩）であることが特に好ましい。
【化１】
【００１３】
Ｐ糖タンパク質は、分子量が１７万〜１８万であり、１２８０個のアミノ酸から構成されるＡＢＣトランスポーターのＭＤＲ／ＴＡＰサブファミリーに属する分子である。Ｐ糖タンパク質は、１２回膜貫通型の細胞膜糖タンパク質であり、１２個ある膜貫通ドメインのうち６つ目と７つ目の間およびカルボキシル基末端にＡＴＰ結合ドメインを有している。そして、ＡＴＰの加水分解によるエネルギーを利用して、細胞内に取り込まれた細胞毒性を有する化合物（薬剤など）を細胞外に排出する。Ｐ糖タンパク質をコードするヒト遺伝子は、ＡＢＣＢ１（ATP-binding Cassette Sub-family B Member 1）またはＭＤＲ１（Multiple drug resistance 1）と呼ばれている。マウスおよびラットでは、Ａｂｃｂ１ａ（Ｍｄｒ１ａ）およびＡｂｃｂ１ｂ（Ｍｄｒ１ｂ）が対応する。
【００１４】
Ｐ糖タンパク質は、副腎皮質、肝臓、腎臓、小腸、大腸、胎盤などに発現している。消化管粘膜のＰ糖タンパク質は、薬物を管腔内に排出する。また、脳血管内皮細胞のＰ糖タンパク質は、薬物の脳組織内への分布を制御している。
【００１５】
Ｐ糖タンパク質の基質としては、抗悪性腫瘍薬（ビンクリスチン、ドキソルビシン、エトポシド）、ＨＩＶプロテアーゼ阻害薬（インジナビル、ネルフィナビル、サキナビル）、抗菌薬（エリスロマイシン、グレパフロキサシン、スパルフロキサシン）、免疫抑制薬（シクロスポリンＡ、シロリムス、タクロリムス）、強心配糖体（ジゴキシン）、ステロイド（デキサメタゾン、メチルプレドニゾロン）、鎮吐薬（オンダンセトロン、ドンペリドン）、ＨＭＧ＿ＣｏＡ阻害薬（アトルバスタチン、ロバスタチン）、Ｈ１受容体拮抗薬（フェキソフェナジン、テルフェナジン）、不整脈治療薬（キニジン）、抗精神病薬（リスペリドン、オランザピン、クエチアピン、アリピプラゾール、ペロスピペロン）、抗うつ薬（アミトリプチリン、ノリトリプチリン、サートラリン、フルボキサミン、パロキセチン）などが知られている。これらの薬剤の対象疾患に関係する細胞においても、Ｐ糖タンパク質が過剰に発現することで、薬剤の効き目が悪くなることが考えられる。そこで、本発明者は、過剰に発現したＰ糖タンパク質の排出機能を抑制することで、これらの薬剤の薬効を改善させることができると考えた。そして、そのような作用を有する化合物を検討した結果、抗うつ薬であるミルナシプランが、Ｐ糖タンパク質の排出機能を抑制する有効成分として作用しうることを見出した。
【００１６】
本発明のＰ糖タンパク質抑制剤に含まれるミルナシプランは、当業者に知られる方法を用いて製造したものでもよいが、市販の製剤を利用してもよい。このような市販の製剤の例には、旭化成ファーマ株式会社の「トレドミン錠」、アルフレッサファーマ株式会社の「ミルナシプラン塩酸塩錠「ＡＦＰ」」、ニプロファーマ株式会社の「ミルナシプラン塩酸塩錠「ＮＴ」」、東和薬品株式会社の「ミルナシプラン塩酸塩錠「トーワ」」、日医工株式会社の「ミルナシプラン塩酸塩錠「日医工」」、太洋薬品工業株式会社の「ミルナシプラン塩酸塩錠「タイヨー」」、沢井製薬株式会社の「ミルナシプラン塩酸塩錠「サワイ」」、マイラン製薬株式会社の「ミルナシプラン塩酸塩錠「マイラン」」、興和デバ株式会社および大正薬品工業株式会社の「ミルナシプラン塩酸塩錠「ＴＫＹ」」、日本ジェネリック株式会社の「ミルナシプラン塩酸塩錠「ＪＧ」」などのミルナシプラン塩酸塩製剤が含まれる。
【００１７】
前述した製剤の剤形は、特に限定されず、錠剤や顆粒剤、細粒剤、丸剤、散剤、カプセル剤など、任意である。たとえば、錠剤の場合には、１日あたり約２〜９錠を経口投与することで、１日当たりの投与量が満足できるようにミルナシプランの１錠当たりの含量を設定し、常法通り打錠すればよい。
【００１８】
当該製剤の１日当たりの投与量は、Ｐ糖タンパク質の排出機能を抑制する量であって副作用の少ない量のミルナシプランを投与しうる量であれば特に限定されない。たとえば、ミルナシプラン塩酸塩をミルナシプランとして１日当たり２５〜１００ｍｇ程度投与しうる量であればよい。当該製剤全量に対するミルナシプランの配合量（割合）は特に限定されず、剤形に応じて適宜設定すればよい。
【００１９】
当該製剤の用法は、Ｐ糖タンパク質の排出機能を抑制することができれば特に限定されない。たとえば、前記１日当たりの投与量（たとえば、ミルナシプラン塩酸塩をミルナシプランとして２５〜１００ｍｇ程度含む量）を３回に分けて食前、食間または食後に経口投与すればよい。
【００２０】
本発明のＰ糖タンパク質抑制剤は、Ｐ糖タンパク質の排出機能を抑制することができる。したがって、本発明のＰ糖タンパク質抑制剤は、Ｐ糖タンパク質の基質となる薬剤と併用することで、当該薬剤の効果を高めることができる。本発明の抑制剤と併用される薬剤の種類は、Ｐ糖タンパク質の基質となる薬剤であれば特に限定されない。
【００２１】
前述の非特許文献２には、Ｐ糖タンパク質の発現量を増加させた癌細胞（ＳＧＣ７９０１細胞）が、Ｐ糖タンパク質の基質となる抗悪性腫瘍薬（ビンクリスチン、アドリアマイシンおよびエトポシドなど）に対して耐性を有することが記載されている。そして、薬剤耐性となった癌細胞に、抗悪性腫瘍薬とベラパミル（Ｐ糖タンパク質抑制剤）とを併用して投与すると、癌細胞が再び抗悪性腫瘍薬に感受性を示すことが示されている。本発明のＰ糖タンパク質抑制剤も、Ｐ糖タンパク質の基質となる薬剤と併用することで、当該薬剤に耐性を有する細胞に対する効果を高めることができると期待される。
【００２２】
この後の実施例において示すように、本発明者は、Ｐ糖タンパク質が脳の神経細胞において発現していることを見出した。このため、本発明のＰ糖タンパク質抑制剤は、脳腫瘍や精神病、うつ病などの脳関連の疾患を対象とする抗悪性腫瘍薬、抗精神病薬、抗うつ薬などと併用して使用されることが期待される。
【００２３】
以下、本発明を実施例を参照して詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されない。
【実施例】
【００２４】
［実施例１］
実施例１では、ＨＴ２２細胞（マウス海馬由来の神経細胞株）を用いて、ＡＢＣＢ１（Ｐ糖タンパク質）抑制剤としてのミルナシプランの効果を評価した結果を示す。
【００２５】
１．ＡＢＣＢ１の発現の確認
まず、ＨＴ２２細胞においてＡＢＣＢ１が発現していることを確認した。
【００２６】
（１）ＲＮＡレベルでの発現の確認
既存の方法を用いて、ＨＴ２２細胞から全ＲＮＡを抽出した。抽出した全ＲＮＡ（２μｇ）から市販のキット（High Capacity RNA-to-cDNA Kit；Applied Biosystems社）を用いてｃＤＮＡを合成した。
【００２７】
得られたｃＤＮＡを鋳型ＤＮＡとしてリアルタイムＲＴ-ＰＣＲ（インターカレーター法）を行うことにより、Ａｂｃｂ１ａおよびＡｂｃｂ１ｂのｍＲＮＡの発現を調べた。Ａｂｃｂ１ａのプライマーは、配列番号１（フォワードプライマー）および配列番号２（リバースプライマー）に示されるものを使用した。Ａｂｃｂ１ｂのプライマーは、配列番号３（フォワードプライマー）および配列番号４（リバースプライマー）に示されるものを使用した。１８Ｓ ｒＲＮＡ（コントロール）のプライマーは、配列番号５（フォワードプライマー）および配列番号６（リバースプライマー）に示されるものを使用した。また、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行った後に、融解曲線分析により増幅産物の確認を行った。
【００２８】
図１Ａは、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲの結果を示すグラフである。図中の「Ａ」は１８Ｓ ｒＲＮＡの増幅曲線であり、「Ｂ」はＡｂｃｂ１ａの増幅曲線であり、「Ｃ」はＡｂｃｂ１ｂの増幅曲線である。この結果から、ＨＴ２２細胞中にＡｂｃｂ１ａおよびＡｂｃｂ１ｂのｍＲＮＡが存在していることがわかる。このことは、ＨＴ２２細胞において、Ａｂｃｂ１ａおよびＡｂｃｂ１ｂが発現していることを示唆している。
【００２９】
図１Ｂは、融解曲線分析の結果を示すグラフである。図中の「Ａ」は１８Ｓ ｒＲＮＡの融解曲線であり、「Ｂ」はＡｂｃｂ１ａの融解曲線であり、「Ｃ」はＡｂｃｂ１ｂの融解曲線である。この結果から、目的のＰＣＲ産物を得られていることがわかる。
【００３０】
（２）ｓｉＲＮＡを使用したノックダウン
Ａｂｃｂ１のｓｉＲＮＡ（配列番号７）を導入したｐＧＦＰ−Ｖ−ＲＳ ｓｈＲＮＡベクターを調製した。市販のトランスフェクション試薬（TransIT-2020；Mirus Bio社）を用いて、調製したベクターをＨＴ２２細胞に導入した。
【００３１】
ベクターを導入してから７２時間後のＨＴ２２細胞におけるＡｂｃｂ１ａおよびＡｂｃｂ１ｂのｍＲＮＡの発現量を、リアルタイムＲＴ-ＰＣＲを行うことにより調べた。Ａｂｃｂ１ａおよびＡｂｃｂ１ｂのｍＲＮＡの発現量は、１８Ｓ ｒＲＮＡの発現量を基準とする相対定量法により算出した。リアルタイムＲＴ-ＰＣＲの手順は、上記（１）で説明した手順と同じである。
【００３２】
図２Ａは、Ａｂｃｂ１ａおよび１８Ｓ ｒＲＮＡの増幅曲線を示すグラフである。図中の「Ａ」は、ベクターを導入していないＨＴ２２細胞由来のサンプルを用いたときの１８Ｓ ｒＲＮＡの増幅曲線である。「Ｂ」は、ベクターを導入したＨＴ２２細胞由来のサンプルを用いたときの１８Ｓ ｒＲＮＡの増幅曲線である。「Ｃ」は、ベクターを導入していないＨＴ２２細胞由来のサンプルを用いたときのＡｂｃｂ１ａの増幅曲線である。「Ｄ」は、ベクターを導入したＨＴ２２細胞由来のサンプルを用いたときのＡｂｃｂ１ａの増幅曲線である。
【００３３】
図２Ｂは、ベクターを導入していないＨＴ２２細胞におけるＡｂｃｂ１ａのｍＲＮＡの発現量に対する、ベクターを導入したＨＴ２２細胞におけるＡｂｃｂ１ａのｍＲＮＡの相対発現量を示すグラフである。図中の「−」は、ベクターを導入していないＨＴ２２細胞におけるＡｂｃｂ１ａのｍＲＮＡの発現量を示す。「＋」は、ベクターを導入したＨＴ２２細胞におけるＡｂｃｂ１ａのｍＲＮＡの発現量を示す。このグラフでは、ベクターを導入していないＨＴ２２細胞におけるＡｂｃｂ１ａのｍＲＮＡの発現量を「１．０」としている。
【００３４】
図３Ａは、Ａｂｃｂ１ｂおよび１８Ｓ ｒＲＮＡの増幅曲線を示すグラフである。図中の「Ａ」は、ベクターを導入していないＨＴ２２細胞由来のサンプルを用いたときの１８Ｓ ｒＲＮＡの増幅曲線である。「Ｂ」は、ベクターを導入したＨＴ２２細胞由来のサンプルを用いたときの１８Ｓ ｒＲＮＡの増幅曲線である。「Ｃ」は、ベクターを導入していないＨＴ２２細胞由来のサンプルを用いたときのＡｂｃｂ１ｂの増幅曲線である。「Ｄ」は、ベクターを導入したＨＴ２２細胞由来のサンプルを用いたときのＡｂｃｂ１ｂの増幅曲線である。
【００３５】
図３Ｂは、ベクターを導入していないＨＴ２２細胞におけるＡｂｃｂ１ｂのｍＲＮＡの発現量に対する、ベクターを導入したＨＴ２２細胞におけるＡｂｃｂ１ｂのｍＲＮＡの相対発現量を示すグラフである。図中の「−」は、ベクターを導入していないＨＴ２２細胞におけるＡｂｃｂ１ｂのｍＲＮＡの発現量を示す。「＋」は、ベクターを導入したＨＴ２２細胞におけるＡｂｃｂ１ｂのｍＲＮＡの発現量を示す。このグラフでは、ベクターを導入していないＨＴ２２細胞におけるＡｂｃｂ１ｂのｍＲＮＡの発現量を「１．０」としている。
【００３６】
これらの結果から、ＨＴ２２細胞におけるＡｂｃｂ１ａおよびＡｂｃｂ１ｂのｍＲＮＡの発現量が、ｓｉＲＮＡの導入により顕著に減少していることがわかる（Ａｂｃｂ１ａ：５８％減少、Ａｂｃｂ１ｂ：７５％減少）。このことは、ＨＴ２２細胞において、Ａｂｃｂ１ａおよびＡｂｃｂ１ｂが発現していることを強く示唆している。
【００３７】
（３）タンパク質レベルでの発現の確認
ベクターを導入していないＨＴ２２細胞およびベクターを導入したＨＴ２２細胞から、既存の方法により全タンパク質を抽出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、ウェスタンブロット法によりＡＢＣＢ１の発現の有無を調べた。また、デンシトメーターを用いてＡＢＣＢ１の相対発現量を数値化した。
【００３８】
図４は、ウェスタンブロットの結果を示すグラフである。図中の「−」は、ベクターを導入していないＨＴ２２細胞におけるＡＢＣＢ１の発現量を示す。「＋」は、ベクターを導入したＨＴ２２細胞におけるＡＢＣＢ１の発現量を示す。このグラフでは、ベクターを導入していないＨＴ２２細胞におけるＡＢＣＢ１の発現量を「１．０」としている。この結果から、ＨＴ２２細胞において、ＡＢＣＢ１が発現していることがわかる。また、ＨＴ２２細胞におけるＡＢＣＢ１の発現量が、ｓｉＲＮＡの導入により顕著に減少していることがわかる（８０％減少）。このことは、ＨＴ２２細胞において、ＡＢＣＢ１が発現していることを意味している。
【００３９】
２．ＡＢＣＢ１に対する抑制能の評価
次に、ＨＴ２２細胞を用いて、ＡＢＣＢ１抑制剤としてのミルナシプランの効果を確認した。本実験では、ＡＢＣＢ１の基質として知られているローダミン（蛍光色素）を細胞内に導入した後、ローダミンの細胞外への排出が被験化合物によりどの程度抑制されるかを評価した。被験化合物としては、シクロスポリンＡ（cyclosporinA；免疫抑制剤）、パロキセチン（paroxetine；ＳＳＲＩ）およびミルナシプランを使用した。シクロスポリンＡおよびパロキセチンは、ＡＢＣＢ１に対する抑制能を有することが知られている。
【００４０】
ＤＭＥＭ培地（ＦＢＳ１０％、ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ファンギゾン１．２５μｇ／ｍｌを含む）が入った６ウェルプレートに、１２×１０５個／ウェルとなるようにＨＴ２２細胞を蒔いて、３７℃で２４時間（５％ ＣＯ２）培養した。培養後、ＤＭＥＭ培地（ＦＢＳ＋）をＦＢＳおよび抗生物質を含まないＤＭＥＭ培地（ＦＢＳ−）に置換し、３０分間静置して、ＦＢＳ、ペニシリンおよびファンギゾンを除去した。次いで、ＤＭＥＭ培地（ＦＢＳ−）を、所定の濃度で被験化合物を含むＤＭＥＭ培地（ＦＢＳ−）に置換した（２ｍｌ／ウェル）。３７℃で所定の時間培養して（５％ ＣＯ２）、各被験化合物をＨＴ２２細胞内に取り込ませた。表１に、被験化合物の濃度と培養時間を示す。
【００４１】
【表１】
【００４２】
各被験化合物をＨＴ２２細胞に取り込ませた後、終濃度が０．５μＭとなるようにローダミンを培地に添加し、３７℃で９０分間培養した（５％ ＣＯ２）。各ウェルにおいて、各細胞をＰＢＳ（Ｔｗｅｅｎ２０を０．２５％含む）で４回洗浄した後、１．５ｍＬチューブにおいて、各細胞を３００μＬ ＰＢＳ（Ｔｗｅｅｎ２０を４％含む）で３回洗浄して、細胞外のローダミンを除去した。洗浄した各細胞を、フリーザー（−８０℃）を用いて３０分間凍結した。解凍後、室温に戻したサンプル中のローダミンの蛍光強度をマルチラベルプレートカウンター（Wallac 1420 ARVO MX-2；Perkin Elmer社）で測定した。
【００４３】
図５は、シクロスポリンＡの濃度とローダミンの蛍光強度との関係を示すグラフである。ローダミンの蛍光強度は、シクロスポリンＡを添加していない場合（０μＭ）におけるローダミンの蛍光強度を１００％としたときの相対値を示している。図５に示されるように、シクロスポリンＡを添加していない場合と比較して、終濃度が０．２５μＭとなるようにシクロスポリンＡを添加すると、蛍光強度が１６６％に増加した。このことから、シクロスポリンＡがＡＢＣＢ１の排出機能を抑制していることがわかる。
【００４４】
図６は、パロキセチンの濃度とローダミンの蛍光強度との関係を示すグラフである。ローダミンの蛍光強度は、パロキセチンを添加していない場合（０μＭ）におけるローダミンの蛍光強度を１００％としたときの相対値を示している。図６に示されるように、パロキセチンを添加していない場合と比較して、終濃度が１μＭとなるようにパロキセチンを添加すると、蛍光強度が１１８％に増加した。このことから、パロキセチンがＡＢＣＢ１の排出機能を抑制していることがわかる。
【００４５】
図７は、ミルナシプランの濃度とローダミンの蛍光強度との関係を示すグラフである。ローダミンの蛍光強度は、ミルナシプランを添加していない場合（０μＭ）におけるローダミンの蛍光強度を１００％としたときの相対値を示している。図７に示されるように、ミルナシプランを添加していない場合と比較して、終濃度が１μＭとなるようにミルナシプランを添加すると、蛍光強度が１８６％に増加した。このことから、ミルナシプランは、シクロスポリンＡおよびパロキセチンと同様に、ＡＢＣＢ１の排出機能を抑制していることがわかる。また、図５〜図７の結果を比較すると、ミルナシプランが、最もＰ糖タンパク質の排出機能を抑制できることもわかる。
【００４６】
［実施例２］
実施例２では、パロキセチン（抗うつ薬）のみの投与では抗うつ効果が認められなかった３名のうつ病患者に対して、パロキセチンに加えてミルナシプランを投与した例を示す。
【００４７】
症例１（３５歳、女性）
女性は、５月、父親との口論から大量に薬物を服薬し、リストカットをした。その後、女性は、パロキセチン４０ｍｇ／日およびドスレピン２５ｍｇ／日の服用を開始したが、抑うつの症状が持続していた。
【００４８】
女性は、同年７月には会社に出勤できなくなり、休職して自宅療養を行っていたが、抑うつの症状は改善しなかった。このとき、女性のハミルトンうつ病評価尺度（ＨＡＭＤ）は、２９点であった。女性は、同年８月３１日になっても抑うつの症状が改善しなかったため、ミルナシプラン３０ｍｇ／日を追加で服用した。さらに、同年９月１７日からミルナシプランの服用量を４５ｍｇ／日に増量した。
【００４９】
同年１１月２６日には、抑うつ気分もほとんど良くなり、外出および朝３０分のジョギングができるようになった。このときのＨＡＭＤは、４点であった。同年１２月からは、半日出勤できるようになり、抑うつ状態は改善した。このときのＨＡＭＤは、０点であった。翌年１月２０日から通常の出勤ができるようになった。
【００５０】
症例２（４３歳、女性）
女性は、１月からうつ病にて、パロキセチン４０ｍｇ／日、クロミプラミン１００ｍｇ／日およびブロマゼパム２０ｍｇ／日を服用していたが、抑うつの症状が持続していた。
【００５１】
女性は、同年３月、抑うつの症状が悪化し、焦燥感が強くなった。女性は、左手首を長さ３ｃｍリストカットしたため、ミルナシプラン３０ｍｇ／日を追加で服用した。このときのＨＡＭＤは、３２点であった。同年４月でも焦燥感が持続しており、意思の低下も強く、家事もほとんどできない状態が持続していたため、ミルナシプランの服用量を７５ｍｇ／日に増量した。
【００５２】
同年５月には、焦燥感および自殺念慮が消失すると共に、意欲の低下も改善され、午後から家事ができるようになった。このときのＨＡＭＤは、５点であり、抑うつの症状が軽快した。同年６月には、ほとんどの家事ができるようになった。このときのＨＡＭＤは、０点であり、抑うつの症状が改善した。
【００５３】
症例３（５４歳、女性）
女性は、１２月からパロキセチン３０ｍｇ／日を服用したが、中等度の抑うつ気分、食欲の低下、自殺念慮、意欲の低下により、昼過ぎまで横になっている生活が持続していた。翌年６月になっても抑うつの症状が持続し、さらに目のかすみ、眼痛、頭痛、胸部痛、意欲の低下が悪化し、家事がほとんどできなくなったため、ミルナシプラン３０ｍｇ／日を追加で服用した。このときのＨＡＭＤは、３５点であった。
【００５４】
同年８月には、思考抑制、頭痛などの自律神経症状、中等度の抑うつ症状が持続していたため、ミルナシプランの服用量を５０ｍｇ／日に増量した。同年９月になっても抑うつの症状は持続しており、ミルナシプランの服用量を７５ｍｇ／日に増量した。さらに、同年１０月には、ミルナシプランの服用量を１２５ｍｇ／日に増量した。
【００５５】
同年１２月には、家事もできるようになり、意欲の低下、思考の抑制、抑うつ症状が改善した。このときのＨＡＭＤは、３点であった。
【００５６】
以上の３つの症例では、ミルナシプランが、血液脳関門や神経細胞内からＰ糖タンパク質によるパロキセチンの排出を抑制したと推測される。このようにパロキセチンとミルナシプランを併用することで、脳内のパロキセチン濃度、さらには神経細胞内のパロキセチン濃度が上昇し、抑うつの症状が改善されたことが示唆される。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
たとえば、本発明のＰ糖タンパク質の排出機能抑制剤は、Ｐ糖タンパク質の基質となる薬剤の効果を高める医薬品として有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミルナシプランを有効成分として含む、Ｐ糖タンパク質の排出機能抑制剤。
【請求項２】
細胞内に取り込まれた薬剤がＰ糖タンパク質により細胞外に排出されることを抑制する、請求項１に記載のＰ糖タンパク質の排出機能抑制剤。
【請求項３】
前記薬剤は、抗悪性腫瘍薬、抗精神病薬または抗うつ薬である、請求項２に記載のＰ糖タンパク質の排出機能抑制剤。
【請求項４】
前記細胞は、神経細胞である、請求項２に記載のＰ糖タンパク質の排出機能抑制剤。
【請求項１】
ミルナシプランを有効成分として含む、Ｐ糖タンパク質の排出機能抑制剤。
【請求項２】
細胞内に取り込まれた薬剤がＰ糖タンパク質により細胞外に排出されることを抑制する、請求項１に記載のＰ糖タンパク質の排出機能抑制剤。
【請求項３】
前記薬剤は、抗悪性腫瘍薬、抗精神病薬または抗うつ薬である、請求項２に記載のＰ糖タンパク質の排出機能抑制剤。
【請求項４】
前記細胞は、神経細胞である、請求項２に記載のＰ糖タンパク質の排出機能抑制剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図５】
【図６】
【図７】
【図４】
【図２】
【図３】
【図５】
【図６】
【図７】
【図４】
【公開番号】特開２０１３−３５８３６（Ｐ２０１３−３５８３６Ａ）
【公開日】平成２５年２月２１日（２０１３．２．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−１５８６７９（Ｐ２０１２−１５８６７９）
【出願日】平成２４年７月１７日（２０１２．７．１７）
【出願人】（５９６１６５５８９）学校法人 聖マリアンナ医科大学 (53)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年２月２１日（２０１３．２．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年７月１７日（２０１２．７．１７）
【出願人】（５９６１６５５８９）学校法人 聖マリアンナ医科大学 (53)
【Ｆターム（参考）】
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