Ｐ４５０遺伝子クラスターに関するノックアウトマウス
本発明は、薬物代謝に関与する遺伝子のクラスターがノックアウトされた薬物代謝マウスモデルの作出に関する。治療用途や他の目的のための新しい薬物や化学薬品の開発は非常に複雑である。特に重要なのは、このような化学薬品が、適切な薬物動態を有していようと、代謝の結果として如何なる安全性の問題が生じようと、体内でどのように処理されるか把握することである。薬物の代謝や処理、排出に関与するタンパク質の多くは、遺伝子の数や機能、調節において非常に顕著な種差を示す多重遺伝子族のメンバーである。このような理由から、代謝経路や毒性を確かめるために実験動物で行う実験は、大幅に妥協したものになることがあり、その結果、ヒトの状況を忠実に示すことがなくなる。このような複雑さの一例は、哺乳動物シトクロムＰ４５０系（即ち、特定の代謝機能を実施するタンパク質の多重遺伝子族のサイズが種間で大きく異なる）において反映される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬物代謝に関与する遺伝子のクラスターがノックアウトされた薬物代謝マウスモデルの作出に関する。
【背景技術】
【０００２】
治療用途や他の目的のための新しい薬物や化学薬品の開発は非常に複雑である。特に重要なのは、このような化学薬品が、適切な薬物動態を有していようと代謝の結果として何らかの安全性の問題を生じさせるものであろうと、体内でどのように処理されるか把握することである。薬物の代謝や処理(disposition)、排出に関与するタンパク質の多くは、遺伝子の数や機能、調節において非常に顕著な種差を示す多重遺伝子族のメンバーである。このような理由から、代謝経路や毒性を確かめるために実験動物で行う実験は、大幅に妥協したものになることがあり、その結果、ヒトの状況を忠実に示すことがなくなる。
【０００３】
このような複雑さの一例は、哺乳動物シトクロムＰ４５０系で見られる。即ち、この系では特定の代謝機能を担うタンパク質の多重遺伝子族のサイズが種によって大きく異なる。ヒトＰ４５０遺伝子をマウスゲノムに導入することによってヒト化マウスモデルを作出する提案が文献報告されている。しかし、導入と同時にマウス遺伝子を無効化しないと、該遺伝子の活性からの干渉が大きくなり、最終的には、その系からの如何なる読み出しも無意味になる。より高度なアプローチにおいては、ヒト化の際に等価なマウス遺伝子を無効化することが提案されており（ＷＯ２００６／０６４１９７参照）、これによってマウスの機能をヒト配列で置換することができる。
【０００４】
しかし、Nelsonら、２００４年（Pharmacogenomics 14(1): 1）によると、マウスには約７２種類の機能性遺伝子が存在するが、ヒトにおいては約２７種類しか存在しない。従って、多くの遺伝子に対し、直接的にオルソロガスな遺伝子は少なく（例えば、ＣＹＰ２Ｅ１やＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２）、ヒトにおいてはごく僅かな遺伝子しか存在しないが、マウスにおいて多数の等価な遺伝子が存在する。その例としては、ＣＹＰ２Ａ／２Ｂ遺伝子ファミリーやＣＹＰ２Ｄが挙げられる。ＷＯ２００６／０６４１９７では、個々のヒト遺伝子をクラスター内の複数の等価なマウス遺伝子と交換することが提案されており、これによって、マウスモデルでヒト薬物代謝の特性を詳細に解析することが可能になることが期待されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、マウスＰ４５０遺伝子のクラスターの機能をヒト等価物で置換せずに該クラスターを欠失させる試みは未だになされていない。このようなＰ４５０酵素によって行われる酵素反応は、非常に重要な生命プロセスに関与する。実際、多数のＣＹＰ遺伝子における変異は先天性代謝異常に関与し、また、数々の重要な臨床的に価値のある疾患に寄与する。
【０００６】
しかし、上述の重要な代謝機能の検討を可能にするマウスを作出できるよう、全シトクロムＰ４５０遺伝子クラスターを個々に組み合わせて欠失させることができれば非常に有利であろう。複数の遺伝子クラスターが欠失したマウスによって、化学／薬物動態や体内分布、毒性を定める上でのシトクロムＰ４５０系の一般的な役割を確認することができるであろう。このようなモデルはそれ自身でも、また、特定の遺伝子ファミリー又はクラスターに関してヒト化したモデルと組み合わせても非常に有用で多くの用途があると考えられる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明によると、薬物代謝酵素をコードする多重遺伝子クラスターの全てのメンバーが機能しないようにされており（rendered inoperable）、欠失クラスターの中の遺伝子と等価な機能を有するヒト置換遺伝子を含まないマウスが提供される。
【０００８】
本明細書においては、マウスの全組織内の特定のＰ４５０クラスターからシトクロムＰ４５０遺伝子全てを欠失させることによって、見かけ上正常で生存可能なマウス系が得られることが示される。この知見から、上述のシトクロムＰ４５０酵素に起因するハウスキーピング的な役割が、予測される表現型の結果と著しく違うことにおいて、結局は生存や受精に必須ではあり得ないことが暗示され、マウスにおける個々の複数のＰ４５０遺伝子クラスターノックアウトの開発への道が開かれる。
【０００９】
これはかなり驚くべきことである。現在まで文献においては、Ｐ４５０薬物代謝酵素をコードする遺伝子クラスターが欠失したマウスについては報告されていない。この一理由としては、シトクロムＰ４５０系が、外来化学薬品の代謝や処理において主な役割を果たすことに加え、胚発生や正常なホメオスタシスに必須の多数のホルモンの代謝や処理に関与することが分かっていることが考えられる。例としては、レチノイン酸やステロイドホルモンが挙げられる。全シトクロムＰ４５０遺伝子クラスターの欠失によって胚や新生児の致死がもたらされることが予想されよう。結局はこのようなことが生じないのは、かなり驚くべきことである。
【００１０】
こうして作出したモデルにおいては、上述の薬物代謝機能が完全に欠失している。従って、このようなモデルは幅広い潜在的用途を有する。第１の例においては、例えば、このようなモデルを用いて、薬物や化学薬品の有効性や毒性、薬物動態、分布におけるＰ４５０代謝の役割を確かめることができる。他の可能性は、第２相薬物代謝酵素のクラスター（例えば、ＵＧＴ１Ａ及び／又はＧＳＴ遺伝子）の完全な除去である。
【００１１】
本発明者らは、このような研究を行う際には、関連機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を試験動物においてできるだけ多く欠失させることが最も重要であると考えている。この一理由は、各種薬物代謝遺伝子同士の間（特に、Ｐ４５０遺伝子間）で高度な冗長性が見られるためである。一例としてはＣＹＰ２Ｄ６Ｐ４５０クラスターを挙げることができるが、該クラスターにおいては、ヒトにおける唯一の機能性遺伝子に対応して、基質特異性が重複する９種類の機能性遺伝子が存在する。この理由から、マウスクラスター内の遺伝子の１個のみを欠失させ、残りを機能性モジュールとして保持するのは殆ど意味がない。
【００１２】
「多重遺伝子クラスター」とは、薬物代謝酵素をコードする二を超える遺伝子のクラスターを意味する。本明細書において「クラスター」とは、二を超える遺伝子産物を産生する能力を有し、同一遺伝子の複数のスプライシングを含むゲノムの如何なる領域をも指す。
【００１３】
例えば、マウスには７種類のＰ４５０遺伝子クラスター、即ち、Ｃｙｐ２ａｂｆｇｓｔクラスター、Ｃｙｐ２ｃクラスター、Ｃｙｐ２ｄクラスター、Ｃｙｐ２ｊクラスター、Ｃｙｐ３ａクラスター、Ｃｙｐ４ａｂｘクラスター及びＣｙｐ４ｆクラスターが存在すると考えられる。
【００１４】
現在の知見によると、Ｃｙｐ２ａｂｆｇｓｔクラスターは次の機能性遺伝子、即ち、２ｓ１、２ｂ１０、２ｂ１３、２ｂ９、２ａ４、２ｂ２３、２ｂ１９、２ｇ１、２ａ５、２ａ２２、２ａ１２、２ｆ２及び２ｔ４を含む。従って、本発明はその一様相において、これらの遺伝子が全組織で機能しないようにされており、該クラスター内の遺伝子の機能に対して等価な機能を有する置換遺伝子を含まないマウスを提供する。これらの遺伝子１３種全てが欠失しているのが好ましいが、これらの遺伝子の一部のみ（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２種のみ）が欠失の対象とされ得る状況であってもよい。
【００１５】
現在の知見によると、Ｃｙｐ２ｃクラスターは次の機能性遺伝子、即ち、２ｃ５５、２ｃ６５、２ｃ６６、２ｃ２９、２ｃ３８、２ｃ３９、２ｃ６７、２ｃ６８、２ｃ４０、２ｃ６９、２ｃ３７、２ｃ５４、２ｃ５０、２ｃ７０及び２ｃ４４を含む。従って、本発明はその一様相において、これらの遺伝子が全組織で機能しないようにされており、該クラスター内の遺伝子の機能に対して等価な機能を有する置換遺伝子を含まないマウスを提供する。
【００１６】
これらの遺伝子１５種全てが欠失しているのが好ましいが、これらの遺伝子の一部のみ（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４種のみ）が欠失の対象とされ得る状況であってもよい。例えば、実施例２に記載のノックアウトから２ｃ４４遺伝子を特異的に排除したが、これは、該遺伝子が主要マウスＣｙｐ２ｃクラスターの４．１Ｍｂ下流に位置し、Ｃｙｐ遺伝子と何ら関係の無い遺伝子数個分だけ主要クラスターから離れていることに基づく。結果として、これらの無関係な遺伝子の除去は望ましくなく、得られる表現型を複雑にするであろう。
【００１７】
現在の知見によると、Ｃｙｐ２ｄクラスターは次の機能性遺伝子、即ち、２ｄ２２、２ｄ１１、２ｄ１０、２ｄ９、２ｄ１２、２ｄ３４、２ｄ１３、２ｄ４０及び２ｄ２６を含む。従って、本発明はその一様相において、これらの遺伝子が全組織で機能しないようにされており、該クラスター内の遺伝子の機能に対して等価な機能を有する置換遺伝子を含まないマウスを提供する。これらの遺伝子９種全てが欠失しているのが好ましいが、これらの遺伝子の一部のみ（例えば、３、４、５、６、７又は８種のみ）が欠失の対象とされ得る状況であってもよい。コーカソイドの約６％においては等価なヒト遺伝子クラスター発現からのＣＹＰ２Ｄ６の発現が無いため、このマウスクラスター内の遺伝子の欠失は実際に真のヒト多型を反映する。このタンパク質は神経遮断薬（例えば、抗うつ薬や統合失調症治療用薬物）の代謝において主要な役割を果たすため、かなり重要である。製薬会社はＣＹＰ２Ｄ６によって代謝される薬物を撤退（back）させたがらないため、薬物を開発している間にその薬物のＣＹＰ２Ｄ６ライアビリティーの有無をできるだけ早く知る必要がある。従って、ＣＹＰ２Ｄ６レベルの存在下及び非存在下の両方で薬物（特に抗うつ薬）の代謝について研究し得ることは大きな利益となる。
【００１８】
現在の知見によると、Ｃｙｐ２ｊクラスターは次の機能性遺伝子、即ち、２ｊ１３、２ｊ１２、２ｊ７、２ｊ１１、２ｊ８、２ｊ６、２ｊ９及び２ｊ５を含む。従って、本発明はその一様相において、これらの遺伝子が全組織で機能しないようにされており、該クラスター内の遺伝子の機能に対して等価な機能を有する置換遺伝子を含まないマウスを提供する。これらの遺伝子８種全てが欠失しているのが好ましいが、これらの遺伝子の一部のみ（例えば３、４、５、６又は７種のみ）が欠失の対象とされ得る状況であってもよい。
【００１９】
現在の知見によると、Ｃｙｐ３ａクラスターは次の機能性遺伝子、即ち、３ａ１３、３ａ５７、３ａ１６、３ａ４１、３ａ１１、３ａ２５及び３ａ５９を含む。従って、本発明はその一様相において、これらの遺伝子が全組織で機能しないようにされており、該クラスター内の遺伝子の機能に対して等価な機能を有する置換遺伝子を含まないマウスを提供する。これらの遺伝子７種全てが欠失していてもよいが、これらの遺伝子の一部のみ（例えば、３、４、５又は６種のみ）が欠失の対象とされ得る状況であってもよい。例えば、本発明の好ましい実施形態は、３ａ５７、３ａ１６、３ａ４１、３ａ１１及び３ａ２５遺伝子が欠失しているが、３ａ１３及び３ａ５９遺伝子の一方又は両方が無傷のまま残っているマウスである。これらの遺伝子の両方は物理的に該クラスターの外側に位置し、Ｃｙｐファミリーに属さない遺伝子によってＣｙｐ３ａ遺伝子の残りから離れている。Ｃｙｐと無関係の遺伝子の欠失は本発明のモデルの価値を分かりにくくするため、これは理想的ではなく、よってあまり好ましくない。また、これらの遺伝子も含むクラスターのノックアウトは技術的に難しく、該クラスターの残りの欠失も含む細胞においてＥＳ細胞レベルでこれらの特定遺伝子を更にノックアウトすることによってのみ成し得る。
【００２０】
現在の知見によると、Ｃｙｐ４ａｂｘクラスターは次の機能性遺伝子、即ち、４ｘ１、４ａ２９、４ａ１２ａ、４ａ１２ｂ、４ａ３０ｂ、４ａ１４、４ａ１０、４ａ３１、４ａ３２及び４ｂ１を含む。従って、本発明はその一様相において、これらの遺伝子が全組織で機能しないようにされており、該クラスター内の遺伝子の機能に対して等価な機能を有する置換遺伝子を含まないマウスを提供する。これらの遺伝子１０種全てが欠失しているのが好ましいが、これらの遺伝子の一部のみ（例えば、３、４、５、６、７、８又は９種のみ）が欠失の対象とされ得る状況であってもよい。
【００２１】
現在の知見によると、Ｃｙｐ４ｆクラスターは次の機能性遺伝子、即ち、４ｆ３９、４ｆ１７、４ｆ１６、４ｆ３７、４ｆ４０、４ｆ１５、４ｆ１４及び４ｆ１３を含む。従って、本発明はその一様相において、これらの遺伝子が全組織で機能しないようにされており、該クラスター内の遺伝子の機能に対して等価な機能を有する置換遺伝子を含まないマウスを提供する。これらの遺伝子８種全てが欠失しているのが好ましいが、これらの遺伝子の一部のみ（例えば、３、４、５、６又は７種のみ）が欠失の対象とされ得る状況であってもよい。
【００２２】
ＵＧＴ１Ａクラスターは次の機能性遺伝子、即ち、１ａ１、１ａ２、１ａ５、１ａ６、１ａ６ａ、１ａ７ｃ、１ａ８、１ａ９及び１ａ１０を含む。従って、本発明はその一様相において、これらの遺伝子が全組織で機能しないようにされており、該クラスター内の遺伝子の機能に対して等価な機能を有する置換遺伝子を含まないマウスを提供する。これらの遺伝子９種全てが欠失しているが、これらの遺伝子の一部のみ（例えば、３、４、５、６、７又は８種のみ）が欠失の対象とされ得る状況であってもよい。ＵＧＴ１ａ１遺伝子の欠失によって疾患が生じるため、この遺伝子を欠失させないのが好ましい。
【００２３】
本発明の方法においては、クラスター欠失の組合せも考えられる。従って、本発明の或る実施形態においては、複数のＰ４５０クラスターを機能しないようにすることができる。例えば、Ｃｙｐ２ａｂｆｇｓｔクラスター、Ｃｙｐ２ｃクラスター、Ｃｙｐ２ｄクラスター、Ｃｙｐ２ｊクラスター、Ｃｙｐ３ａクラスター、Ｃｙｐ４ａｂｘクラスター及びＣｙｐ４ｆクラスターのいずれか２種を同一動物内で欠失させることができる。他の実施形態においては、完全ヌルＰ４５０バックグラウンドのマウスを作出するために、該遺伝子クラスターの３種、４種、５種、６種又は全７種を欠失させることができる。ノックアウトするクラスターの好ましい組合せとしては、Ｃｙｐ３ａ、２ｃ及び２ｄの内の２種又は全３種を含むもの、例えば、Ｃｙｐ３ａとＣｙｐ２ｃ、Ｃｙｐ２ｃとＣｙｐ２ｄ、及びＣｙｐ３ａとＣｙｐ２ｄが挙げられる。Ｃｙｐ３ａ及びＣｙｐ２ｃクラスターの欠失の組合せが好ましく、これによってＰ４５０代謝の大部分がノックアウトされる。
【００２４】
これらのモデルは、同一遺伝子ファミリーのメンバー間（実際には、遺伝子ファミリー間）の機能的冗長性のため、個々のシトクロムＰ４５０アイソザイムの欠失に比べて大きな利益をもたらす。
【００２５】
本発明の動物の全組織においてＰ４５０の機能性が欠失しているのが好ましい。肝臓が薬物代謝に関して真に重要な唯一の組織であるという間違った考えが広く受け入れられている。真実はこれとは程遠く、実際、Ｐ４５０の機能は、肝臓以外の様々な組織（特に、消化管や血液脳関門等が挙げられる）で発現される。従って、全組織での機能の完全抑止は、Ｐ４５０クラスターノックアウトの作用を適切に評価するために必要である。現在利用可能な技術を用いる場合、このようなことは、胚性幹細胞段階でＰ４５０クラスター内の全遺伝子の発現をノックアウトする技術によってのみ実際に成し遂げられる。Ｐ４５０酵素に割り当てられている発生学的役割のため、その大規模なノックアウトは不可能であろうことが常に推測される。
【００２６】
従って、本発明のモデルは、特定のＰ４５０系が不活性化された他のモデルよりも利益をもたらす。他のモデルの一例としては、肝臓でしか生じないシトクロムＰ４５０レダクターゼの条件的不活性化が挙げられる。これに対し、本発明のモデルにおいては、好ましいことに該酵素の欠失が全組織で生じ得る。
【００２７】
ある状況下では、全クラスター又はクラスターの組合せのノックアウトが致死の原因となる可能性もあるが、本発明によると、このシナリオにおいては、一組織のみにおいて遺伝子、遺伝子の組合せ又はクラスターをノックアウトするのが好ましい場合もある。このような状況下でノックアウトを限定すべき最も適切な組織は、薬物代謝における役割を考慮すれば肝臓となるであろう。
【００２８】
また、多くの理由から、本発明の実験的アプローチもシトクロムＰ４５０阻害剤の使用に比べて大きな利益をもたらす。第一に、特異性を欠く阻害剤はそれ自体が薬理学的作用や毒物学的作用を有する。第二に、このような分子は慢性的な投薬状況下では用いることができない。更に、阻害剤は、試験対象の化合物の治療特性や毒物学的特性を調節することが多い。また、阻害剤は、特定の遺伝子ファミリー内の全シトクロムＰ４５０を等価な効力レベルで同時に阻害する能力を有しない。最後に、阻害剤を用いた実験は遥かに面倒且つ複雑で解釈が難しい。
【００２９】
本発明に係るマウス系の作出によって、ヒトにおける薬物反応や化学反応を決める因子に対する我々の理解が顕著に増すであろう。このようなモデルは、多くの異なるスクリーニングシナリオ（例えば、効力スクリーニングやＰＫ／ＰＤモデリング、薬物安全性試験等）に適用することができる。本発明のノックアウトモデルは、ヒトにおいて見られないげっ歯類特異性代謝産物が生成し、従来の動物試験から得た効力、ＰＫ／ＰＤ又は安全性の結果を分かりにくくしているような場合には特に注目され得る。
【００３０】
本発明のマウスモデルの有用性に関する根拠は、一般にＰ４５０代謝速度が遅いため、マウスが多くの薬物をヒトよりも遥かに速く（ほぼ１０倍速く）代謝することである。従って、等価な薬物の半減期がヒトにおいて数時間である場合には、マウスでは半減期は恐らく３０分間となるであろう。当然のことながら、マウスでは正常な処理経路がマスクされるという作用が得られるが、これは、該経路が有効になる機会が無いためである。従って、一以上のマウスＰ４５０クラスター（特に、支配的なＣｙｐ３ａ及び２ｃクラスター）を欠失させることによって、このような薬物処理経路を論点から排除する効果が得られる。このようなノックアウトマウスをヒトＰ４５０クラスターに関してヒト化することによって、ヒト薬物代謝経路を内在性マウス酵素からの干渉無しに評価することができるであろう。
【００３１】
本発明の動物モデルはそれ自体が薬物モデルとして興味深い。例えば、該動物モデルによって、欠失していなければ薬物を代謝する機能を有していたであろう酵素の非存在下で薬物代謝を評価することができる。従って、本発明の動物モデルによって、Ｐ４５０系内の冗長性の程度を評価することができ、第１の選択酵素が存在しない場合には他のＰ４５０酵素が引き継ぐことができる。また、これによって、第２の選択酵素が恐らく異なる反応経路を用いて作用し、通常は産生しないであろう毒性の二次代謝物を生じさせるかどうかを評価することもできる。
【００３２】
本発明のマウスの特徴は、Ｐ４５０クラスター内の遺伝子の機能に対して等価な機能を有する置換遺伝子を含まないことである。これは、該クラスターによってコードされるＰ４５０機能が真に機能しないようにされており、他の生体由来の相同又はオルソロガスなクラスターで置換されていないことを意味する。このような動物はそれ自身が有用であり、下流においても作出することができる（例えば、ヒトＰ４５０遺伝子クラスターをマウスに導入した動物）。しかし、このような動物については本発明の範囲から意図的に除外する。
【００３３】
「等価な機能」とは、機能しないようにするＰ４５０機能に対して機能的に取って代わることのできる如何なる遺伝子又は遺伝子クラスターをも意味する。従って、その例としては、他の生体における認知されたオルソロガスなカウンターパートが挙げられる。ヒト及びマウスのオルソログの例は当業者には公知であり、その多くはNelsonら、２００４年（Pharmacogenomics 14(1): 1）に記載されている。
【００３４】
本発明に係る好ましい薬物モデルは、Ｃｙｐ３ａクラスターが全組織で機能しないようにされており、Ｃｙｐ３ａクラスター内の遺伝子の機能に対して等価な機能を有する置換遺伝子を含まないマウスである。Ｃｙｐ３ａマウスクラスターに対するヒト等価遺伝子は、ＣＹＰ３Ａ４、３Ａ５、３Ａ７及び３Ａ４３である。遺伝子３ａ５７、３ａ１６、３ａ４１、３ａ１１、３ａ２５及び３ａ５９の全てが欠失した、本発明のこの様相に係るマウスの作出及び部分的特徴付けは実施例に記載されているが、このマウスは本発明の一様相を構成する。既存の定説によると、このようなホモ接合的欠失は胚の致死の原因となり得るため、上述のように、この遺伝子型の生存可能なマウスが作出されたということは大いに驚くべきことであると共に非常に意義のある結果である。
【００３５】
本発明のこの様相に係るＣｙｐ３ａクラスターＫＯの最初の特徴付けから、以下の表現型の特徴が明らかになった。
【００３６】
Ａ．一実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスの血漿臨床化学パラメータ（トリグリセリド、アラニントランスフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アルブミン、総ビリルビン、クレアチンキナーゼ、高密度リポタンパク質及び低密度リポタンパク質）は、未処理野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）の公知の正常範囲内である。
【００３７】
Ｂ．第二の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスの、ＩＰ投与後のミダゾラムの薬物動態プロファイルは、野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）で見られるのと同様の濃度／時間曲線下総面積である（即ち、野生型マウスの場合の８０％〜１２０％）。
【００３８】
Ｃ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスに対しリファンピシンで前処理（例えば、６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）した上でミダゾラムをＩＰ投与した後の算出濃度／時間曲線下総面積が、未処理Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯマウスの場合と比べて、好ましくは１７０％〜３７０％、より好ましくは２２０％〜３２０％、より好ましくは２４０％〜３００％、より好ましくは２５０％〜２９０％、より好ましくは２６０％〜２８０％、より好ましくは２６５％〜２７５％減少している。
【００３９】
Ｄ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、肝ミクロソームによる７−ベンジルオキシキノリンの酸化に関して野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて有意な低下、即ち、野生型マウスで記録されたものに対して＜５０％のレベル、より好ましくは＜４０％のレベル、より好ましくは＜３０％のレベル、より好ましくは＜２０％のレベルまでの低下が見られる。
【００４０】
Ｅ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、肝ミクロソームによるミダゾラムの１’−水酸化に関して野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて有意な低下、即ち、野生型マウスで記録されたものに対して＜５０％のレベル、より好ましくは＜４０％のレベル、より好ましくは＜３０％のレベル、より好ましくは＜２０％のレベルまでの低下が見られる。
【００４１】
Ｆ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、リファンピシンによる前処理（例えば、６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）後の肝ミクロソームによるミダゾラムの１’−水酸化に関して野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて有意な低下、即ち、野生型マウスで記録されたものに対して＜５０％のレベル、好ましくは＜４０％のレベル、より好ましくは＜３０％のレベル、より好ましくは＜２０％のレベル、より好ましくは＜１０％のレベルまでの低下が見られる。
【００４２】
Ｇ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、肝ミクロソームによるミダゾラムの４’−水酸化に関して野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて有意な低下、即ち、野生型マウスで記録されたものに対して＜８０％のレベル、好ましくは＜７０％のレベル、より好ましくは＜６５％のレベルまでの低下が見られる。
【００４３】
Ｈ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、リファンピシンによる前処理（例えば、６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）後の肝ミクロソームによるミダゾラムの４’−水酸化に関して野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて有意な低下、即ち、野生型マウスで記録されたものに対して＜５０％のレベル、好ましくは＜４０％のレベル、より好ましくは＜３５％のレベル、好ましくは＜３０％のレベル、より好ましくは＜２５％のレベルまでの低下が見られる。
【００４４】
Ｉ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、リファンピシンによる処理（例えば、６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）後のミダゾラムの水酸化が未処理Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯマウスと比べて僅かに増加、即ち、好ましくは１０１％〜１５０％、より好ましくは１１０％〜１４０％、より好ましくは１２０〜１３０％増加する。また、水酸化の増加は、野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）においてリファンピシン処理時の水酸化で見られる増加に比べて有意に少なく、水酸化の増加は野生型マウスで見られる増加の＜６０％が好ましく、野生型マウスで見られる増加の＜５０％が好ましく、野生型マウスで見られる増加の＜４０％がより好ましく、野生型マウスで見られる増加の＜３５％がより好ましい。
【００４５】
Ｊ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、リファンピシンによる前処理（例えば、６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）に続くミダゾラムのＩＶ投与後の１’−ヒドロキシミダゾラムの薬物動態プロファイルにおいて、ＡＵＣが野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）で記録されたものに比べて低く、即ち、ＡＵＣは野生型マウスで記録されたものの＜６０％が好ましく、＜５０％がより好ましく、＜４０％がより好ましく、＜３５％がより好ましい。
【００４６】
Ｋ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、リファンピシンによる前処理（例えば、６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）に続くミダゾラムの経口投与後の１’−ヒドロキシミダゾラムの薬物動態プロファイルにおいて、ＡＵＣが野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）で記録されたものに比べて低く、即ち、ＡＵＣは野生型マウスで記録されたものの＜９０％が好ましく、＜８５％がより好ましく、＜８０％がより好ましい。
【００４７】
Ｌ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、リファンピシンによる前処理（例えば、６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）後の肝ミクロソームによる７−ベンジルオキシキノリンの酸化に関して野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて有意な低下、即ち、野生型マウスで記録されたものに対して＜５０％のレベル、より好ましくは＜４０％のレベル、より好ましくは＜３０％のレベル、より好ましくは＜２０％のレベル、より好ましくは＜１０％のレベルまでの低下が見られる。
【００４８】
Ｍ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、リファンピシンによる前処理（例えば、６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）後の肝ミクロソームによるトリアゾラムの酸化に関して野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて有意な低下、即ち、野生型マウスで記録されたものに対して＜５０％のレベル、より好ましくは＜２５％のレベル、より好ましくは＜１０％のレベル、より好ましくは＜５％のレベル、より好ましくは＜２．５％のレベルまでの低下が見られる。
【００４９】
Ｎ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、リファンピシンによる前処理（例えば、６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）後の腸ミクロソームによるトリアゾラムの酸化に関して野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて有意な低下、即ち、野生型マウスで記録されたものに対して＜５０％のレベル、より好ましくは＜２５％のレベル、より好ましくは＜１０％のレベル、より好ましくは＜５％のレベル、より好ましくは＜２．５％のレベルまでの低下が見られる。
【００５０】
Ｏ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、リファンピシンによる前処理（例えば、６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）後の肝ミクロソームによるニフェジピンの酸化に関して野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて有意な低下、即ち、野生型マウスで記録されたものに対して＜５０％のレベル、より好ましくは＜４０％のレベル、より好ましくは＜３５％のレベル、より好ましくはＣ５７ＢＬ／６Ｊの＜３０％のレベル、より好ましくは＜２５％のレベルまでの低下が見られる。
【００５１】
Ｐ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、リファンピシンによる前処理（例えば、６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）後の肝ミクロソームによるテストステロンの６β水酸化に関して野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて有意な低下、即ち、野生型で記録されたものに対して＜５０％のレベル、より好ましくは＜４０％のレベル、より好ましくは＜３５％のレベル、より好ましくは＜３０％のレベルまでの低下が見られる。
【００５２】
Ｑ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、リファンピシンによる前処理（例えば、６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）後の肝ミクロソームによるテストステロンの１６β水酸化に関して野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて有意な増加、即ち、野生型マウスで記録されたものに対して＞１５０％のレベル、より好ましくは＞２００％のレベル、より好ましくは＞２５０％のレベル、より好ましくは＞３００％のレベルまでの増加が見られる。
【００５３】
Ｒ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、リファンピシンによる前処理（例えば、６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）後の肝ミクロソームによるジベンジルフルオレシンの酸化に関して野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて有意な低下、即ち、野生型マウスで記録されたものに対して＜２５％のレベル、より好ましくは＜２０％のレベル、より好ましくは＜１５％のレベル、より好ましくは＜１２．５％のレベルまでの低下が見られる。
【００５４】
Ｓ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、リファンピシンによる前処理（例えば、６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）後の腸ミクロソームによる４−トリフルオロメチルクマリンの野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べての有意な増加、即ち、野生型マウスで記録されたものに対して＞１５０％のレベル、より好ましくは＞１７５％のレベル、より好ましくは＞２００％のレベルまでの増加が見られる。
【００５５】
Ｔ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べてベンゾキシレゾルフィンＯ−脱ベンジル化活性の低下、即ち、野生型マウスで記録されたものに対して好ましくは＜９０％のレベル、より好ましくは＜８０％のレベル、より好ましくは＜７０％のレベル、より好ましくは＜６０％のレベル、より好ましくは＜５０％のレベルまでのＯ−脱ベンジル化活性の低下が見られる。
【００５６】
Ｕ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、リファンピシンで前処理（例えば、６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）を行った際、野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べてベンゾキシレゾルフィンＯ−脱ベンジル化活性の低下、即ち、野生型マウスで記録されたものに対して好ましくは＜５０％のレベル、より好ましくは＜４０％のレベル、より好ましくは＜３５％のレベル、より好ましくは＜３０％のレベルまでのＯ−脱ベンジル化活性の低下が見られる。
【００５７】
Ｖ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスは、実施形態Ａ〜Ｕの代謝表現型の内の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又は全２１種を示す。
【００５８】
Ｗ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、ウェスタンブロッティングで確認される検出可能レベルのＣｙｐ３ａは肝ミクロソームにおいては発現されない。
【００５９】
Ｘ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、ウェスタンブロッティングで確認される肝ミクロソームでのＣｙｐ１ａの発現レベルがＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスと比べて高い。
【００６０】
Ｙ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、ウェスタンブロッティングで確認される肝ミクロソームにおけるＣｙｐ２ｃタンパク質の発現が野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて増加する。
【００６１】
Ｚ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、ウェスタンブロッティングで確認される肝ミクロソームにおけるＣｙｐ２ｄタンパク質のレベルが野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて正常であり、肝ミクロソームにおけるＣｙｐ２ｄタンパク質のレベルが野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて高い。
【００６２】
ＡＡ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、ウェスタンブロッティングで確認される肝ミクロソーム及び腸ミクロソームの両方におけるＣｙｐ２ｅタンパク質のレベルに関し、野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて有意差が無い。
【００６３】
ＡＢ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、シトクロムＣレダクターゼ活性で確認されるＰ４５０オキシドレダクターゼ（ＰＯＲ）タンパク質の発現レベルに関し、野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて有意差が無い。
【００６４】
ＡＣ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、総Ｐ４５０レベルは野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）で記録されたものに比べて有意に高いが、リファンピシンによる前処理（例えば、６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）の際には有意に変化しない。
【００６５】
ＡＤ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスは、実施形態Ｗ〜ＡＣのタンパク質発現表現型の内の１、２、３、４、５、６又は全７種を示す。
【００６６】
ＡＥ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、Ｃｙｐ３ａ１１、Ｃｙｐ３ａ１６及びＣｙｐ３ａ２５の肝転写産物（liver transcript）レベルが野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて、好ましくは＞５０倍、より好ましくは＞１００倍、より好ましくは＞１００倍抑制されている。
【００６７】
ＡＦ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、Ｃｙｐ４ａ１３の肝転写産物レベルが野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて、より好ましくは＞５倍、より好ましくは＞１０倍、より好ましくは＞１２．５倍、より好ましくは＞１５倍抑制されている。
【００６８】
ＡＧ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、Ｃｙｐ２ｃ３８の肝転写産物レベルが野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて、好ましくは＞２倍、より好ましくは＞３倍、より好ましくは＞４倍、より好ましくは＞４．５倍アップレギュレートされている。
【００６９】
ＡＨ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、Ｃｙｐ２ａ４の肝転写産物レベルが野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて、好ましくは＞１．５倍、より好ましくは＞２倍、より好ましくは＞２．５倍、より好ましくは＞２．８倍アップレギュレートされている。
【００７０】
ＡＩ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、ＧＳＴＰ１の肝転写産物レベルが野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて、好ましくは＞１．５倍、より好ましくは＞２倍、より好ましくは＞２．４倍アップレギュレートされている。
【００７１】
ＡＪ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、ＭＧＳＴ３の肝転写産物レベルが野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて、好ましくは＞１．５倍、より好ましくは＞２倍、より好ましくは＞２．３倍抑制されている。
【００７２】
ＡＫ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、ＵＧＴ２Ｂ１７の肝転写産物レベルが野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて、好ましくは＞１．５倍、より好ましくは＞２倍、より好ましくは＞２．５倍、より好ましくは＞２．８倍アップレギュレートされている。
【００７３】
ＡＬ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、ＡＢＣＢ１０の肝転写産物レベルが野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて、好ましくは＞１．５倍、より好ましくは＞２倍、より好ましくは＞２．２倍アップレギュレートされている。
【００７４】
ＡＭ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、ＣＡＭＫ２Ｂの肝転写産物レベルが野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて、好ましくは＞１．５倍、より好ましくは＞２倍、より好ましくは＞２．６倍アップレギュレートされている。
【００７５】
ＡＮ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、ＣＩＴＥＤ２の肝転写産物レベルが野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて、好ましくは＞１．５倍、より好ましくは＞２倍、より好ましくは＞２．２倍アップレギュレートされている。
【００７６】
ＡＯ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、ＤＮＡＪＣ１２の肝転写産物レベルが野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて、好ましくは＞２倍、より好ましくは＞３倍、より好ましくは＞４．１倍抑制されている。
【００７７】
ＡＰ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、ＦＭＯ５の肝転写産物レベルが野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて、好ましくは＞２倍、より好ましくは＞２．５倍、より好ましくは＞３倍アップレギュレートされている。
【００７８】
ＡＱ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、ＨＳＤ２Ｂ３の肝転写産物レベルが野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて、好ましくは＞２倍、より好ましくは＞２．５倍、より好ましくは＞３倍アップレギュレートされている。
【００７９】
ＡＲ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、ＪＵＮの肝転写産物レベルが野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて、好ましくは＞２倍、より好ましくは＞３倍、より好ましくは＞４倍、より好ましくは＞４．１倍抑制されている。
【００８０】
ＡＳ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、ＪＵＮＢの肝転写産物レベルが野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて、好ましくは＞３倍、より好ましくは＞４倍、より好ましくは＞５倍、より好ましくは＞５．１倍抑制されている。
【００８１】
ＡＴ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、ＭＡＰ２Ｋ６の肝転写産物レベルが野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて、好ましくは＞２倍、好ましくは＞２．５倍、好ましくは＞３倍、好ましくは＞３．３倍アップレギュレートされている。
【００８２】
ＡＵ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、ＭＡＰ３Ｋ１の肝転写産物レベルが野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて、好ましくは＞１．５倍、より好ましくは＞２倍、より好ましくは＞２．３倍抑制されている。
【００８３】
ＡＶ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、ＭＡＰ３Ｋ３の肝転写産物レベルが野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて、好ましくは＞２倍、より好ましくは＞２．５倍、より好ましくは＞２．８倍抑制されている。
【００８４】
ＡＷ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、ＳＴＩＰ１の肝転写産物レベルが野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて、好ましくは＞１．５倍、より好ましくは＞２倍、より好ましくは＞２．３倍アップレギュレートされている。
【００８５】
ＡＸ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、Ｃｙｐ２ａ４の肝転写産物レベルがリファンピシンによる株の前処理（例えば、６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）後に野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて、好ましくは＞２倍、より好ましくは＞２．５倍、より好ましくは＞３倍、より好ましくは＞３．４倍アップレギュレートされている。
【００８６】
ＡＹ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、Ｃｙｐ２ｂ１３の肝転写産物レベルがリファンピシンによる株の前処理（例えば、６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）後に野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて、好ましくは＞２．５倍、より好ましくは＞４倍、より好ましくは＞４．５倍、より好ましくは＞５倍、より好ましくは＞５．５倍アップレギュレートされている。
【００８７】
ＡＺ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、Ｃｙｐ２ｂ１０の肝転写産物レベルがリファンピシンによる株の前処理（例えば、６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）後に野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて、好ましくは＞４倍、好ましくは＞５倍、好ましくは＞６倍、好ましくは＞７倍、好ましくは＞７．２倍アップレギュレートされている。
【００８８】
ＢＡ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、Ｃｙｐ２ｂ９の肝転写産物レベルがリファンピシンによる株の前処理（例えば、６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）後に野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて、好ましくは＞２倍、より好ましくは＞２．５倍、より好ましくは＞３倍、より好ましくは＞３．２倍アップレギュレートされている。
【００８９】
ＢＢ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、Ｃｙｐ２ｃ５４の肝転写産物レベルがリファンピシンによる株の前処理（例えば、６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）後に野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて、好ましくは＞２倍、より好ましくは＞２．５倍、より好ましくは＞２．７倍アップレギュレートされている。
【００９０】
ＢＣ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、Ｃｙｐ２ｃ５４の肝転写産物レベルがリファンピシンによる株の前処理（例えば、６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）後に野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて、好ましくは＞２倍、より好ましくは＞２．５倍、より好ましくは＞２．７倍アップレギュレートされている。
【００９１】
ＢＤ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、Ｃｙｐ４ａ２ｂの肝転写産物レベルがリファンピシンによる株の前処理（例えば、６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）後に野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて、好ましくは＞２倍、より好ましくは＞２．５倍、より好ましくは＞３倍、より好ましくは＞３．３倍アップレギュレートされている。
【００９２】
ＢＥ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、ＭＧＳＴ１の肝転写産物レベルがリファンピシンによる株の前処理（例えば、６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）後に野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて、好ましくは＞２倍、より好ましくは＞２．５倍、より好ましくは＞２．７倍アップレギュレートされている。
【００９３】
ＢＦ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、ＭＧＳＴ３の肝転写産物レベルがリファンピシンによる株の前処理（例えば、６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）後に野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて、好ましくは＞１．５倍、より好ましくは＞２倍、より好ましくは＞２．４倍抑制されている。
【００９４】
ＢＧ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、ＡＢＣＤ１の肝転写産物レベルがリファンピシンによる株の前処理（例えば、６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）後に野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて、好ましくは＞２倍、より好ましくは＞２．５倍、より好ましくは＞２．７倍アップレギュレートされている。
【００９５】
ＢＨ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、ＡＢＣＤ３の肝転写産物レベルがリファンピシンによる株の前処理（例えば、６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）後に野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて、好ましくは＞２倍、より好ましくは＞２．５倍、より好ましくは＞３倍、より好ましくは＞３．５倍アップレギュレートされている。
【００９６】
ＢＩ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、ＡＢＣＧ８の肝転写産物レベルがリファンピシンによる株の前処理（例えば、６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）後に野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて、好ましくは＞２倍、より好ましくは＞２．５倍、より好ましくは＞２．７倍アップレギュレートされている。
【００９７】
ＢＪ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、ＡＲＫ１Ｃ１４の肝転写産物レベルがリファンピシンによる株の前処理（例えば、６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）後に野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて、好ましくは＞２倍、より好ましくは＞２．５倍、より好ましくは＞２．７倍アップレギュレートされている。
【００９８】
ＢＫ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、ＣＡＭＫ２Ｂの肝転写産物レベルがリファンピシンによる株の前処理（例えば、６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）後に野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて、好ましくは＞２倍、より好ましくは＞３倍、より好ましくは＞３．７倍アップレギュレートされている。
【００９９】
ＢＬ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、ＣＩＴＥＤ２の肝転写産物レベルがリファンピシンによる株の前処理（例えば、６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）後に野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて、好ましくは＞２倍、より好ましくは＞２．５倍、より好ましくは＞２．８倍アップレギュレートされている。
【０１００】
ＢＭ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、ＦＭＯ５の肝転写産物レベルがリファンピシンによる株の前処理（例えば、６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）後に野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて、好ましくは＞２倍、より好ましくは＞３倍、より好ましくは＞４倍、より好ましくは＞４．７倍アップレギュレートされている。
【０１０１】
ＢＮ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、ＨＳＤ３Ｂ３の肝転写産物レベルがリファンピシンによる株の前処理（例えば、６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）後にＣ５７ＢＬ／６Ｊと比べて、好ましくは＞２倍、より好ましくは＞３倍、より好ましくは＞４倍、より好ましくは＞４．９倍アップレギュレートされている。
【０１０２】
ＢＯ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、ＪＵＮＢの肝転写産物レベルがリファンピシンによる株の前処理（例えば、６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）後に野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて、好ましくは＞２倍、より好ましくは＞２．５倍、より好ましくは＞３倍抑制されている。
【０１０３】
ＢＰ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、ＭＡＰ２Ｋ６の肝転写産物レベルがリファンピシンによる株の前処理（例えば、６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）後に野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて、好ましくは＞２倍、より好ましくは＞２．５倍、より好ましくは＞３倍、より好ましくは＞３．６倍アップレギュレートされている。
【０１０４】
ＢＱ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、ＭＡＰ３Ｋ１の肝転写産物レベルがリファンピシンによる株の前処理（例えば、６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）後に野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて、好ましくは＞２倍、好ましくは＞２．５倍、好ましくは＞２．７倍抑制されている。
【０１０５】
ＢＲ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスは、実施形態ＡＥ〜ＢＱのトランスクリプトーム表現型の内の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８又は全３９種を示す。
【０１０６】
ＢＳ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスは、実施形態Ａ〜ＢＲの表現型の特徴の内の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０又は全７１種を示す。
【０１０７】
本発明に係る他の好ましいモデルは、Ｃｙｐ２ｃクラスターが全組織で機能しないようにされており、Ｃｙｐ２ｃクラスター内の遺伝子の機能に対して等価な機能を有する置換遺伝子を含まないマウスである。Ｃｙｐ２ｃマウスクラスターに対するヒト等価遺伝子は２Ｃ８、２Ｃ９、２Ｃ１８及び２Ｃ１９である。遺伝子２ｃ５５、２ｃ６５、２ｃ６６、２ｃ２９、２ｃ３８、２ｃ３９、２ｃ６７、２ｃ６８、２ｃ４０、２ｃ６９、２ｃ３７、２ｃ５４、２ｃ５０、２ｃ７０及び２ｃ４４の全てが全組織で機能しないようにされている本発明のこの様相に係るマウスを作出するための戦略は実施例に記載される。ホモ接合体Ｃｙｐ２ｃノックアウトマウスが作出された。
【０１０８】
本発明に係る他の好ましいモデルは、Ｃｙｐ２ｄクラスターが全組織で機能しないようにされており、Ｃｙｐ２ｄクラスター内の遺伝子の機能に対して等価な機能を有する置換遺伝子を含まないマウスである。Ｃｙｐ２ｄマウスクラスターに対するヒト等価遺伝子は２Ｄ６、２Ｄ７及び２Ｄ８である。遺伝子２ｄ２２、２ｄ１１、２ｄ１０、２ｄ９、２ｄ１２、２ｄ３４、２ｄ１３、２ｄ４０及び２ｄ２６の全てが全組織で機能しないようにされている本発明のこの様相に係るマウスを作出するための戦略は実施例に記載されている。ホモ接合体Ｃｙｐ２ｄノックアウトマウスが作出された。
【０１０９】
一実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、ブフラロールＩＰ投与後の算出した濃度／時間曲線下総面積が、野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）の場合と比べて、好ましくは＞５倍、より好ましくは＞１０倍、より好ましくは＞１５倍、より好ましくは＞２０倍増加する。
【０１１０】
本発明に係る更に好ましいモデルは、Ｃｙｐ３ａクラスター及びＣｙｐ２ｃクラスターの両方が全組織で機能しないようにされているマウスである。遺伝子３ａ５７、３ａ１６、３ａ４１、３ａ１１、３ａ２５、３ａ５９、２ｃ５５、２ｃ６５、２ｃ６６、２ｃ２９、２ｃ３８、２ｃ３９、２ｃ６７、２ｃ６８、２ｃ４０、２ｃ６９、２ｃ３７、２ｃ５４、２ｃ５０、２ｃ７０及び２ｃ４４の全てが欠失した、本発明のこの様相に係るマウスの作出及び部分的特徴付けは実施例に記載されているが、このマウスは本発明の一様相を構成する。
【０１１１】
本発明においては、如何なるＰ４５０クラスターをも機能しないようにすることができる。「機能しないようにする」とは、遺伝子又は遺伝子機能を欠失させることを意味する。これは、遺伝子のコード配列をマウスゲノムから完全に欠失させることによって行うことができる。或いは、コード配列を他の配列の挿入、欠失又は置換によって変異させて欠失させることができる。例えば、一以上の変異（フレームシフト変異等）は、得られるＲＮＡ転写産物が非機能性タンパク質又は切断型タンパク質をコードするように生じさせることができる。或いは、染色体配列に挿入を行ってアミノ酸コードを分断することができる。
【０１１２】
同様に、欠失対象のＰ４５０遺伝子配列をある配列（例えば、成功した欠失体をスクリーニングするための基準として用いることができる選択配列やマーカー配列）と交換することができる。このような一戦略はWallaceら（Cell 128, 197-209 2007）によって考案されており、遺伝子交換のコンテクスト内ではあるが、本発明の方法に適用可能である。この方法では、ベクターを用いた置換配列が内在性ゲノムマウス配列に取って代わるのに２種の分子間相同組換えイベントが必要となるような、マウス染色体とＢＡＣ又はＹＡＣベクターとの間での配列の交換が想定されている。
【０１１３】
好ましい一システムにおいては、相同組換えのメカニズムを用いて遺伝子クラスターを該クラスターが存在しない他の配列と交換する。このような方法は、次の段階：
ａ）置換対象のマウス標的遺伝子クラスターが各々の端で組換え部位と隣接するように相同組換えによってマウス染色体に一対の部位特異的組換え部位を組込むことと、
ｂ）部位特異的組換え部位間で組換えを行い、マウス標的遺伝子クラスターが染色体から除去され、残存部位特異的組換え部位で置換されるようにすることと、を含むのが好ましい。
【０１１４】
相同組換えを行うための方法は当該技術分野では公知であり、外部から供給されたＤＮＡ分子と標的染色体との間で相同領域を用いてＲＴ部位を導入する。この方法においては、置換配列内の５’及び３’相同アームによって置換配列と標的との間の組換えが促進され、遺伝子クラスターが欠失されるようになる。この戦略を用いた方法は、本出願人による２００７年９月１４日出願の同時係属特許出願Ｎｏ．ＧＢ０７１８０２９．２「発明の名称：二段階のクラスター欠失及びヒト化」に報告されている。この戦略は上述のWallaceの技術に比べて遥かに効率的であり、分子内組換えイベントが約１０6分の１の頻度で生じる。
【０１１５】
しかし、多くのクラスターは数百キロベースのゲノムの相当のストレッチに及ぶ。一例としてはマウスＣＹＰ３ａ遺伝子クラスターが挙げられ、Ｃｙｐ３ａ１３が含まれていなくても約８００ｋｂに及ぶ。このようなシナリオにおいては、２種の別個の置換核酸をその間にクラスター全体が広がるようにマウスゲノム内に導入し、その後、この２種の置換核酸間での組換えによって該核酸間にある遺伝子クラスターを除去する戦略を用いるのが遥かに効率的である。
【０１１６】
この構成においては、置換配列の各々は、５’相同アームと３’相同アームとの間に選択マーカー及び少なくとも１種のリコンビナーゼ標的（ＲＴ）部位（例えば、ｌｏｘＰやｌｏｘ５１７１、ＦＲＴ、Ｆ３）があるようにデザインする。このように、両方の置換核酸をうまく組込んで、欠失対象クラスターに隣接するように選択することが可能である。ＲＴ部位を認識する適切な部位特異的リコンビナーゼ（ＳＳＲ）にマウス細胞を曝露することによってクラスターを除去するのは技術的に容易である。「ＳＳＲ」とは、特定のＤＮＡ遺伝子座におけるＤＮＡ再構成を仲介する組換え系の如何なるタンパク質成分をも意味し、例えば、インテグラーゼ又はレゾルバーゼ／インベルターゼクラスのＳＳＲ（Abremski, K.E. and Hoess, R.H. (1992) Protein Engineering 5, 87-91; Khan, et al, (1991) Nucleic acids Res. 19, 851-860; Nunes-Duby et al, (1998) Nucleic Acids Res 26 391-406; Thorpe and Smith, (1998) P.N.A.S USA 95 5505-10）及びイントロンコード化エンドヌクレアーゼによって仲介される部位特異的組換え（Perrin et al, (1993) EMBO J. 12, 2939-2947）が挙げられる。ＳＳＲ酵素活性に曝露することによって、ＲＴ部位の配置で確認されるＤＮＡ再構成が生じ、その結果、直線ＤＮＡ分子内で介在配列が除去又は切除される。
【０１１７】
当該技術分野で周知であり、以下に更に説明する方法に従って、上述の組換え段階はマウス胚性幹細胞内で行うのが好ましい。胚性幹細胞は全能性細胞の培養細胞株であり、該細胞を初期胚に導入すると発育して生体の全組織に定着するようになる。
【０１１８】
本発明の方法の第１の段階は、一対のＲＴ部位をマウス染色体内に組込むことである。置換対象のマウス標的遺伝子クラスター配列は、各々の端においてＲＴ部位と隣接する必要がある。２個のＲＴ部位間での組換えによって介在遺伝子クラスターが切除される。ＲＴ部位を染色体内に組込むための方法は当業者には公知であろうが、相同組換えプロセスを用いて行うのが好ましい。
【０１１９】
ＲＴ対は、ＬｏｘＰ、ＦＲＴ、ａｔｔＰ／ａｔｔＢ及びｒｏｘ（Sauer and McDermott. Nucleic Acids Res. 32(20): 6086-95, 2004）から成る群から選択されるのが好ましい。このリストはほんの一例として挙げたに過ぎず、これらに限定されるものではない。この様相においては、前記部位特異的組換え部位対間の組換えは、対応する部位特異的リコンビナーゼ（即ち、Ｃｒｅ、ＦＬＰ、ＰｈｉＣ３１及びＤｒｅ）によって行われる。前記部位特異的組換えはインビボ又はインビトロで実施し得ることは理解されよう。
【０１２０】
実際には、各ＲＴ部位は、選択可能マーカーと連結する（好ましくは、連続する）ように構築する必要がある。選択可能マーカーを組込むことによってマウス染色体内のＲＴ部位を検出することができ、それによって、ＲＴ部位対の挿入が成功したかどうかをモニターすることができる。各選択可能マーカーは、マウス標的配列とＲＴ部位との間の空間にあるように配置するのが好ましい。これは、組換えが成功した際には、選択可能マーカーが染色体から除去され、本発明の方法においてはこれ以上参加しないことを意味する。このように、ヒト化後に染色体内に残るヒト配列の調節を選択可能マーカーが乱すことがないことは確実であり得る。選択可能マーカーの各々は互いに異なっているのが好ましい。これによって、各組換え部位の挿入を互いに別々に独立してモニターすることができる。選択可能マーカーは、成長ＥＳ細胞が曝露され得る化学化合物（例えば、抗生物質）に対するある種の耐性をコードする遺伝子であるのが好ましい。その例としては、細胞成長培地に添加される抗生物質に対する耐性を付与する選択可能マーカー（例えば、Ｇ４１８、ハイグロマイシン又はピューロマイシンに対する耐性を付与するネオマイシン耐性マーカー）の使用が挙げられる。更なる例としては、本発明の上述の様相における核酸配列（又はその一部）に相補的であり、それに対してハイブリダイズする核酸配列を用いた検出が挙げられる。例えば、サザンブロット解析やノーザンブロット解析、ＰＣＲが挙げられる。
【０１２１】
好ましい戦略においては、変化したマウス胚性幹細胞の作出（好ましくは、別々の段階での作出）を伴い、これによって、各ＲＴ部位がその選択可能マーカーと共に別々に組込まれる。その後、変化した胚性幹細胞を胚盤胞に挿入することができる。従来、胚盤胞は雌性マウスから交配の約３日後に単離している。最大２０個の変化した胚性幹細胞（好ましくは、約１６個）をそのような胚盤胞に同時に挿入し得ることは理解されよう。変化した胚性幹細胞を胚盤胞に挿入することにより、好ましくは、妊娠マウスの特性を反映するように誘導された偽妊娠マウスに移植することによって、胚性幹細胞は発育初期胚に組込まれるようになる。この方法によると、変化した胚性幹細胞を含む胚盤胞は偽妊娠マウスの子宮壁内に移植され、妊娠期間が終了するまで該マウス内で発育し続ける。変化した胚性幹細胞は増殖し、分裂して発育トランスジェニックマウスの全組織（生殖系列を含む）に定着するようになる。
【０１２２】
本発明の方法の一様相においては、作出したトランスジェニックマウスは、各体細胞組織及び生殖系列内に変化した細胞と未変化の細胞を含むキメラとなり得る。
【０１２３】
大きいＤＮＡ断片（２００ｋｂ〜数メガベース）の欠失に適したＣｒｅ／ｌｏｘ介在欠失を仲介するための方法は以下の論文に記載されている（Li ZW, Stark G, Gotz J, Rulicke T, Gschwind M, Huber G, Muller U, Weissmann C. Generation of mice with a 200-kb amyloid precursor protein gene deletion by Cre recombinase-mediated site-specific recombination in embryonic stem cells Proc Natl Acad Sci U S A. 1996 Jun 11;93(12):6158-62. Erratum in: Proc Natl Acad Sci U S A 1996 Oct 15;93(21):12052; in Su H, Wang X, Bradley A. Nested chromosomal deletions induced with retroviral vectors in mice. Nat Genet. 2000 Jan;24(l):92-5）; Call LM, Moore CS, Stetten G, Gearhart JD. A cre-lox recombination system for the targeted integration of circular yeast artificial chromosomes into embryonic stem cells. Hum Mol Genet. 2000 JuI 22;9(12):1745-51）。
【０１２４】
ＲＴ部位間で組換えを行うためには、ゲノムをＳＳＲ酵素形態のＳＳＲ活性に曝露する必要がある。上述のように、部位特異的組換えイベントはインビトロ又はインビボで行うことができる。部位特異的組換えは、トランスジェニックマウス内でＳＳＲの活性を誘導することによって行うことができる。実際、生体系で遺伝子型を変化させるために部位特異的組換えをうまく利用するには、組換えイベントを調節するための戦略が必要である。これは、得られる発現パターンが上述の組織特異的な要素が活性となる時間及び場所に制限されるように、リコンビナーゼｍＲＮＡ又はタンパク質の発現を制御することによって行うことができる（Baubonis and Sauer (1993) Nucl Acids Res. 21, 2025-2029; Sauer B, (1994) Curr Opin Biotechnol 5:521-7; Rajewsky et al., (1996) J Clin Invest 98, 600-3; Metzger and Feil, (1999) Curr. Opinions Biotechnology 10, 470-476)。
【０１２５】
研究者らは、ＳＳＲ酵素を発現させるために、直接トランスフェクションや組換えウイルスによる感染、ＳＳＲタンパク質をコードするＤＮＡやｍＲＮＡ又は該タンパク質自身の注入を用いてきた（Konsolaki et al, (1992) New Biol. 4: 551-557）。このようなＳＳＲ酵素の発現ではなく活性を調節することによって、より正確に制御することができる。一戦略においては、ＳＳＲ酵素をステロイド受容体のリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）に融合させた融合タンパク質を用いてＳＳＲ−ＬＢＤタンパク質を得る（EP-B-0 707 599；Logie and Stewart (1995) P.N.A.S. USA 92: 5940-5944; Brocard et al, (1997) P.N.A.S. USA 94: 14559-14563; Akagi et al, (1997) Nucleic Acids Res 25, 1766-73参照）。この戦略は、ＳＳＲ活性を活性化するステロイド受容体のリガンドをリガンドが受容体部分に結合している場合のみ用いることに依存している。該受容体のＬＢＤは、同族リガンドの非存在下ではＳＳＲの活性を抑制する。同族リガンドの送達によってＳＳＲの抑制を軽減し、ＲＴ部位間での組換えを行うことができる。
【０１２６】
このように、誘導については、前記ＳＳＲの転写を誘導するか、ＳＳＲの翻訳を誘導するか、又はＳＳＲから阻害剤を除去することによって行うことができる。或いは、ＳＳＲを前記トランスジェニックマウスに人工的に導入することができる。本発明の方法の一要素は、トランスジェニックマウス内で部位特異的組換えを行うことによってマウス標的遺伝子の除去と同時にヒト化マウスの作出が可能であることである。
【０１２７】
トランスジェニックマウスを欠失株マウスと交雑させることによって部位特異的組換えを実施し得るのが好ましい。本明細書において「欠失株」とは、生殖系列で部位特異的リコンビナーゼを発現するマウスに関するが、これを、トランスジェニックマウスと交雑させてマウス標的遺伝子配列を除去することができる。このように、インビボ組換えによって着目遺伝子に対してヘテロ接合性の子孫が産生する。こうして、トランスジェニックマウスを欠失株と交雑させることによって、後代が産生すると共に、ヒト置換遺伝子配列と部位特異的リコンビナーゼを含有するように変化したマウス染色体を含む細胞が産生し、その結果、マウス標的遺伝子が除去され、細胞の機能的ヒト化が生じる。従って、このようなトランスジェニックマウスは、特定の遺伝子又は遺伝子クラスターに関するヒト化に対してヘテロ接合性となる。
【０１２８】
ある実施形態においては、部位特異的リコンビナーゼがリコンビナーゼ株マウスのある組織でのみ発現するのが望ましいことがある。ある遺伝子又は遺伝子クラスターの欠失が致死的であるか又は亜致死性の表現型作用をもたらし得ることは、当該技術分野では知られている。また、このような遺伝子をそのヒト等価物で置換しても致死を防止できない場合がある。このような状況下では、部位特異的リコンビナーゼをある組織（例えば、肝臓）でのみ発現させることによって、致死に関する如何なるこのような問題をも克服し得る。これは、特定の遺伝子がある組織において必須である場合、このように部位特異的リコンビナーゼを発現させることによってマウス遺伝子が該組織において存続し得るため、特に有利となる。
【０１２９】
本発明のこの様相においては、ＳＳＲはアルブミン−Ｃｒｅであり得る。アルブミン−Ｃｒｅは、ＲＴ部位ＬｏｘＰに作用するＳＳＲ Ｃｒｅの特定のバリアントである。アルブミン−Ｃｒｅは肝臓においてのみ発現するため、マウス標的配列を肝臓以外の全ての組織で存続させることができ、致死に関する潜在的な問題を克服する一方、機能的にヒト化された肝臓が得られる。
【０１３０】
最終的には、上述の方法によって作出した２種のヘテロ接合体マウスを交雑させて、着目遺伝子のヒト対立遺伝子に対してホモ接合性のトランスジェニックマウスを作出することができる。２種のヘテロ接合体トランスジェニックマウスの交雑によって、欠失に対してホモ接合性の後代の一部が産生するであろう。
【０１３１】
本発明の更なる実施形態においては、以降に開示の方法によって、トランスジェニック非ヒト動物を上述の特徴を全て有するように新しく作出する。
【０１３２】
また、部位特異的組換えイベントを体細胞において行うことも可能であり、その後、該細胞をＷＯ００／５１４２４の方法に記載のクローン化マウス又はそのバリアントのコロニーを形成するために核移植ドナーとして用いることができる。
【０１３３】
本発明の他の実施形態においては、本発明のマウスを交雑によって作出する。例えば、特定のクラスターの遺伝子の一部が欠失した部分欠失体を他の部分欠失体と交雑させて、特定のクラスター内の遺伝子機能が全て欠失した動物を作出することができるであろう。
【０１３４】
本発明の更なる実施形態においては、以降に開示の方法によって、トランスジェニックマウスを上述の特徴を全て有するように新しく作出する。
【０１３５】
トランスジェニックな組合せ
最終的には、本発明の動物モデルをヌルバックグラウンドとして用い、げっ歯類酵素の機能に取って代わり得るヒト遺伝子を同一の染色体領域に直接組込むか、又は他の部位に組込むことによって該遺伝子の導入を行うことができる。ヒト遺伝子を同一の染色体領域に組込むのが好ましいが、これは、染色体の完全性が保持されるため、発現や組織分布の生理学的パターンが同様に保持される可能性が高いからである。従って、上述の細胞やマウスの調製に関する本発明の実施形態においては、該細胞や動物を更なる遺伝子組換えに付すことができるが、該遺伝子組換えは更なる遺伝子又はタンパク質コード核酸配列の導入である。該遺伝子組換えは、細胞又は細胞株の一過性又は安定トランスフェクション、細胞又は細胞株におけるエピソーム発現系、又は、前核マイクロインジェクションや非胚性幹（ＥＳ）細胞における組換えイベント、非ヒト胚性幹（ＥＳ）細胞におけるランダムな遺伝子組換え、又は核移植クローニング手順においてドナー核として用いる核を有する細胞のトランスフェクションによるトランスジェニック非ヒト動物の調製であり得る。
【０１３６】
特に、一以上のＰ４５０遺伝子クラスターが機能しないようにされている本発明に係るマウスを一以上のヒト遺伝子に関してヒト化し得ることが予想される。欠失したクラスターはＣｙｐ３ａクラスター、Ｃｙｐ２ｃクラスター及び／又はＣｙｐ２ｄクラスターであるのが好ましい。後述のように、これらのクラスターとヒト化薬物輸送体、ヒト化転写因子又はヒト化第ＩＩ相薬物代謝酵素との如何なる単一又は複数の組合せも好ましい。
【０１３７】
例えば、このようなマウスを転写因子に関してヒト化することができる。好適な転写因子の例としては、プレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）や構成的アンドロスタン受容体（ＣＡＲ）、ＰＰＡＲ（α、δ及びγ）、ＮＲＦ２、Ａｈ受容体、ＨＮＦ１、ＨＮＦ４が挙げられる。これらの転写因子の１種、２種又はそれ以上に関してマウスをヒト化することができる。また、ＷＯ２００６／０６４１９７に記載のように、内在性等価マウス遺伝子が無効化されたのも好ましい。ヌルバックグラウンドに関してＰ４５０クラスター欠失と二重ヒト化ｈＣＡＲ及び／又はｈＰＸＲマウスの組合せは、本発明に係る好ましいモデルである。
【０１３８】
また、本発明に係るマウスを第２相薬物代謝酵素に関してヒト化することもできる。このような酵素の例としては、グルクロニルトランスフェラーゼ（例えば、ＵＧＴ１Ａ遺伝子又は遺伝子クラスター）やグルタチオントランスフェラーゼ（例えば、ＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）（ＧＳＴ−ｍ１及び／又はｔ１クラスターを含む））、スルホニルトランスフェラーゼ、アセチルトランスフェラーゼが挙げられる。また、ＷＯ２００６／０６４１９７に記載のように、内在性等価マウス遺伝子が無効化されたものも好ましい。
【０１３９】
また、本発明に係るマウスを薬物輸送タンパク質に関してヒト化することもできるが、その例としては、多剤耐性タンパク質（例えば、ｍｄｒ１やｍｄｒ３）や多剤耐性関連タンパク質（ＭＲＰ）（例えば、ＭＲＰ１及び／又はＭＲＰ２及び／又はＭＲＰ６）、有機アニオン輸送ポリペプチド（ＯＡＴＰ）由来のものが挙げられる。また、ＷＯ２００６／０６４１９７に記載のように、内在性等価マウス遺伝子が無効化されたのも好ましい。
【０１４０】
細胞
本発明の他の様相は、本発明の上述のいずれか一様相における特性を有するように改変された細胞に関する。本発明に係る好ましい細胞型は肝細胞及び神経細胞である。該細胞はマウス細胞であることができる。
【０１４１】
本発明のこの様相における細胞は、本発明の知見を十分体得した当業者には明らかなように、本発明に係るトランスジェニックマウスから標準的な技法を用いて作出することができる。好適な方法は多くの標準的な実験マニュアル、例えば、Davisら、Basic Methods in Molecular Biology (1986); Sambrook Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Third Edition (2000); Ausubel et al., 1991 [supra]; Spector, Goldman & Leinwald, 1998)に記載されている。
【０１４２】
このような細胞を作出する好ましい一方法は、上述のようにヒト化マウスをＳＶ４０不死化マウス（例えば、不死マウス（タコニック））と交雑させることである。次に、当該技術分野で周知の技法によってこのような動物から細胞を単離することができる。肝臓でのみ活性であるため肝細胞しか産生することができないアルブミンプロモーターを用いる先行技術のトランスジェニック系とは対照的に、本発明において作出されるトランスジェニック動物由来の細胞は、薬物動態解析にかなり重要な細胞（例えば、肝細胞や神経細胞）等の様々な細胞型から選択することができる。
【０１４３】
上述の特性を有する、本発明に係るトランスジェニック動物から単離された幹細胞も本発明の有用な様相である。このような細胞は多能性であってもよく、部分的に分化していてもよい。幹細胞は成体幹細胞であってもよく、胚性幹細胞であってもよい。より一般には、用いる幹細胞は後胚発達段階（例えば、胎生期や新生期、幼若期、成体期）で得られることができる。このように単離された幹細胞を用いて特定の細胞型（例えば、肝細胞や神経細胞）を作出することができる。このような細胞も本発明の一様相を構成する。
本発明の方法によって作出した細胞又は動物をモデル系として用いて、他の生体（特にヒト）における薬物や他の生体異物化合物の代謝を確認することができる。
【０１４４】
アッセイ
本発明の動物、組織及び細胞を用いて、薬物化合物がどのように代謝されるか確認することができる。単一又は複数のシトクロムＰ４５０遺伝子クラスターが欠失したマウス系、或いは、シトクロムＰ４５０遺伝子クラスター交換を薬物の代謝や処理に関連する他の遺伝子と組合わせたマウス系の作出によって、ヒトにおける薬物反応や化学反応を決める因子、更にはこのような遺伝子と化学毒性の関連性についての我々の理解が顕著に増すであろう。このようなモデルは、効力スクリーニングやＰＫ／ＰＤモデリング、薬物安全性試験に適用することができる。
【０１４５】
本発明のクラスターノックアウトによってヒト化及び更なるノックアウト実験を行うことができる。作出する動物の性質に応じて、多数の異なるアッセイプロセスに着目することができる。特に、特定の薬物代謝遺伝子クラスターの如何なる薬物化合物の代謝への関与も確認することができる。また、特定のクラスターが欠失した際に第２の選択経路による代謝への代償作用があるとすれば、それを評価することによって如何なる薬物代謝系における冗長性の程度も確認することができる。また、如何なる毒性二次代謝物の生成も別々の代謝酵素に帰属させることができる。また、体組織内での転写因子や薬物代謝酵素、薬物輸送タンパク質の処理や分布に薬物化合物が影響を及ぼすかどうか調べることができる。また、転写因子や薬物代謝酵素、薬物輸送タンパク質の発現の持続期間に薬物化合物が影響を及ぼすかどうか調べることができる。有用なアッセイプロセスの他の例は当業者には明らかであろう。
【０１４６】
動物における表現型の変化（例えば、生理学的作用）を測定することができる。このような生理学的作用としては、例えば、病態（胆管壊死等）や中毒性副作用を挙げることができる。
【０１４７】
薬物化合物の代謝速度を調べることができる。この代謝速度は、該化合物の投与によってもたらされる毒性や活性を測定するか、該化合物の半減期を測定するか、又は薬物代謝酵素のレベルを測定することによって求めることができる。例えば、該化合物の代謝速度は、酸化生成物の生成速度や酸化中間体から次に産生される生成物の生成速度として測定することができる。或いは、この代謝速度は、最初の化合物（initial compound）の半減期や消失速度として、又は最初の化合物や最初の化合物から産生される代謝産物の毒性や活性の変化として表わすことができる。半減期は、様々な時点で採取したサンプルに存在する薬物化合物の量を求めることによって測定することができる。薬物化合物の量は、標準的な方法（例えば、高速液体クロマトグラフィーや質量分析、化合物特異的抗体を用いたウェスタンブロット解析、他の適切な方法）によって測定することができる。
【０１４８】
また、薬物化合物が特定の状況下で毒性代謝物や発癌性代謝産物に代謝されるかどうかを、例えば、該化合物の組織やタンパク質、ＤＮＡへの共有結合を測定するか、又はグルタチオンの欠乏を測定することによって調べることもできる。
【０１４９】
上述の種の測定は、薬物化合物投与後、１を越える時点、３時点、５時点又は１０以上の時点で行うのが好ましい。
【０１５０】
従って、本発明の更なる様相は、転写因子や薬物代謝酵素、薬物輸送タンパク質の活性や発現レベルに対する薬物化合物の作用を確認するために提供されるスクリーニング方法に関する。このような方法は、本発明の上述のいずれか一様相におけるトランスジェニック動物、又は該動物由来の組織又は細胞に薬物化合物を投与することを含む。
【０１５１】
スクリーニング段階は、転写因子や薬物代謝酵素、薬物輸送タンパク質をコードする遺伝子の誘導を測定することを含むことができる。また、スクリーニング段階は、転写因子や薬物代謝酵素、薬物輸送タンパク質の発現のレベル、又はこのような発現の持続期間を測定することを含むことができる。また、スクリーニング段階は、転写因子や薬物代謝酵素、薬物輸送タンパク質の発現の分布を測定することを含むことができる。
【０１５２】
薬物化合物の存在下及び非存在下でアッセイを行って、分布や代謝、毒性の差を確認することができる。様々なトランスジェニック動物や細胞、組織に対する薬物化合物の作用を評価することによって、特定の遺伝子の存在下及び非存在下における薬物化合物の作用を確認することができる。例えば、ヌルバックグラウンドを有する動物と着目遺伝子（例えば、ＰＸＲやＣＡＲ、ＭＤＲ１、第１相代謝酵素、第２相代謝酵素）に関してヒト化した動物との間で薬物化合物の作用を評価することも可能である。
【０１５３】
従って、更なる様相において、本発明は、本明細書に記載の生体異物の代謝又は毒性を調べるための方法であって、本明細書に記載の非ヒト動物、組織又は細胞の２種以上、３種以上、４種以上、５種以上、６種以上、７種以上、８種以上、９種以上又は１０種以上に対して薬物化合物を投与することを含む方法を提供する。このような方法は、異なる非ヒト動物、組織又は細胞に関して得られた実験結果を比較する段階を更に含むのが好ましい。
【０１５４】
二種以上の薬物化合物を投与することができる。例えば、ある薬物化合物がＣＡＲ遺伝子の誘導をもたらす場合、該化合物はＣＡＲ転写因子を活性化すると判断される。また、対照としてのヒトＣＡＲ受容体を発現する動物にＣＡＲ受容体インバースアゴニスト（例えば、クロトリマゾール）を投与することもできる。
【０１５５】
本発明の更なる様相におけるアッセイによって、第１の薬物化合物の代謝が第２の薬物化合物で調節されるかどうか確認するためのスクリーニング方法を提供することができる。この方法は、第２の化合物の存在下及び非存在下で第１の化合物を本発明の上述のいずれか一様相におけるトランスジェニック動物、又は該動物由来の組織又は細胞に投与することと、表現型効果をモニタリングすることとを含む。或いは、上述のように、スクリーニング段階は、遺伝子の誘導、転写因子や薬物代謝酵素、薬物輸送タンパク質の発現のレベルや持続期間、分布を測定することを含むことができる。第２の化合物がこれらの試験因子のいずれか一因子の変化をもたらす場合、第２の化合物は第１の化合物の代謝を調節することが確認される。例えば、第１の化合物の投与によってもたらされる毒性や活性を測定するか、又は第１の薬物化合物の半減期を測定することによって生理学的作用をアッセイすることができる。
【０１５６】
このように、アッセイを用いて、特定のタンパク質の発現を活性化又は誘導する能力が低いか又は検出できないために、副作用が少ないか又はインビボでの半減期が長いことが期待される薬物化合物の類似体を容易に同定することができる。
【０１５７】
以下、本発明の様々な様相や実施形態を実施例によって更に詳細に説明する。本発明の範囲を逸脱することなく詳細な変更を実施し得ることは理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【０１５８】
【図１ａ】マウスＣｙｐ３ａクラスター欠失のための戦略。（Ａ）マウスＣｙｐ３ａクラスター内の機能性遺伝子の染色体の構成及び方向の概略図（出典：Nelsonら、２００４年）。偽遺伝子は示されていない。（Ｂ）Ｃｙｐ３ａ５７及びＣｙｐ３ａ５９のエクソン／イントロン構造。エクソンは黒い棒で示し、ＡＴＧは両遺伝子の翻訳開始点を示す。相同組換えのターゲティングアームの位置をそれぞれ、薄灰色線（Ｃｙｐ３ａ５７）及び濃灰色線（Ｃｙｐ３ａ５９）でハイライトする。（Ｃ）相同組換えによりＣｙｐ３ａ５７（左）及びＣｙｐ３ａ５９（右）のターゲティングに用いたベクター。ＬｏｘＰ部位、ｌｏｘ５１７１部位、ｆｒｔ部位及びｆ３部位をそれぞれ、白い三角、縞模様の三角、点模様の三角、及び黒い三角で示す。（Ｄ）Ｃｙｐ３ａ５７及びＣｙｐ３ａ５９遺伝子座における同一対立遺伝子上での相同組換え後の二重標的ＥＳ細胞内のＣｙｐ３ａクラスターのゲノム構成。（Ｅ）ｌｏｘＰ部位におけるＣｒｅ介在組換え後のマウスＣｙｐ３ａクラスターの欠失。Ｃｙｐ３ａ５７、Ｃｙｐ３ａ１６、Ｃｙｐ３ａ４１、Ｃｙｐ３ａ１１及びＣｙｐ３ａ２５由来の全てのエクソンとイントロンは完全に欠失し、エクソン１〜４及びＣｙｐ３ａ５９のプロモーターも欠失する。従って、Ｃｒｅ介在欠失後に残存する唯一の機能性Ｃｙｐ３ａ遺伝子はＣｙｐ３ａ１３であり、これは、＞８００ｋｂのゲノムＤＮＡやＣｙｐと無関係の多数の機能性遺伝子によってクラスターの残りから離れている。マウスＣｙｐ３ａクラスターの欠失が成功したことを実証するのに用いたプライマーを矢印で示す。 分かり易くするため、配列は一定の縮尺率では示していない。ＴＫ＝チミジンキナーゼ発現カセット、Ｈｙｇｒｏ＝ハイグロマイシン発現カセット、ＺｓＧｒｅｅｎ＝ＺｓＧｒｅｅｎ発現カセット、Ｐ＝ネオマイシンの発現を促進するプロモーター、５’ΔＮｅｏ＝ＡＴＧ欠損ネオマイシン。
【図１ｂ−１】Ｃｙｐ３ａクラスター欠失に対するマウスホモ接合性のＰＣＲ確認。
【図１ｂ−２】Ｃｙｐ３ａクラスター欠失に対するマウスホモ接合性のＰＣＲ確認。
【図１ｃ】対照（Ｃｏｎ）とリファンピシン（ＲＩＦ、６０ｍｇ／ｋｇ、３日間）で処理したＣ５７ＢＬ／６Ｊ（ＷＴ）及びＣｙｐ３ａクラスターＫＯマウスから得た代表的な肝臓切片のヘマトキシリン及びエオシン染色。２０倍の対物レンズを用いてＣｙｐ３ａクラスターＫＯ（Ｃｏｎ）の画像を得た。他の画像の全てについては１０倍の対物レンズを用いた。
【図１ｄ】対照（Ｃｏｎ）とリファンピシン（ＲＩＦ、６０ｍｇ／ｋｇ、３日間）で処理したＣ５７ＢＬ／６Ｊ（ＷＴ）及びＣｙｐ３ａクラスターＫＯマウスから得た代表的な小腸切片のヘマトキシリン及びエオシン染色。１０倍の対物レンズを用いて画像を得た。
【図１ｅ】対照（Ｃｏｎ）とリファンピシン（ＲＩＦ、６０ｍｇ／ｋｇ、３日間）で処理したＣ５７ＢＬ／６Ｊ（ＷＴ）及びＣｙｐ３ａクラスターＫＯマウスから得た代表的な腎臓切片のヘマトキシリン及びエオシン染色。１０倍の対物レンズを用いて画像を得た。
【図１ｆ】対照（Ｃｏｎ）とリファンピシン（ＲＩＦ、６０ｍｇ／ｋｇ、３日間）で処理したＣ５７ＢＬ／６Ｊ（ＷＴ）及びＣｙｐ３ａクラスターＫＯマウスから得た代表的な肝臓切片のオイルレッドＯ染色。４０倍の対物レンズを用いて画像を得た。
【図１ｇ】対照とリファンピシン（６０ｍｇ／ｋｇ、３日間）で処理したＣ５７ＢＬ／６Ｊ及びＣｙｐ３ａクラスターＫＯマウスの血漿の臨床化学解析：トリグリセリド、低密度リポタンパク（ＬＤＬ）、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、クレアチンキナーゼ（ＣＲＥ）、総ビリルビン（ＢＩＬ−Ｔ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アラニントランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、アルブミン。データは平均±Ｓ．Ｄ．で示す（ｎ＝４）。
【図１ｈ】図１ｈ：コーン油（３日間投与）（Ａ）又はリファンピシン（６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）（Ｂ）で処理後４日目の野生型及びＣｙｐ３ａクラスターＫＯマウスにおけるミダゾラム（１ｍｇ／ｋｇ）薬物動態（誤差棒はＳＤを示す）。Ｎ．Ｂ．：リファンピシン処理Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの１０分時点でのＳＤは４５ｎｇ／ｍＬであった。グラフＡとＢのスケールを同じに保つため、対応する誤差棒は一部のみを示した。
【図１ｉ】ＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェアの非コンパートメント解析を用いたミダゾラムＰＫから算出した濃度／時間曲線下総面積（ＡＵＣ）。
【図１ｊ】Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ及びＣｙｐ３ａクラスターＫＯマウスにおけるＣｙｐ３ａアイソフォームの発現及び活性。Ａ）ウェスタンブロッティング；肝ミクロソーム由来のタンパク質１μｇを７．５％ＳＤＳｐａｇｅゲルに添加した。正の対照にはＣＸＲバイオサイエンシーズから入手した０．１ｐｍｏｌのＣｙｐ３ａ１１組換えタンパク質（ｈｉｓタグ）を用いた。一次抗体としてはウサギ抗ＣＹＰ３Ａ２（Colin Henderson, Ninewells Hospital, Dundee）を１：２０００の濃度で用いた。Ｂ）７−ＢＱの酸化、Ｃ）ミダゾラムの１’−水酸化及びＤ）ミダゾラムの４−水酸化。データは平均±ＳＤで示す（ｎ＝４）。活性は対応のないｔ検定（両側Ｐ値）で比較した。＊：有意差有り（＊＊：Ｐ＜０．０１、＊＊＊：Ｐ＜０．００１）。
【図１ｋ】媒体（対照）とリファンピシン（ＲＩＦ；６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）で処理したＣ５７ＢＬ／６Ｊ及びＣｙｐ３ａクラスターＫＯマウスの肝ミクロソームにおけるＣｙｐ１ａタンパク質の発現及び活性。（Ａ）−ウェスタンブロッティング；肝ミクロソーム由来のタンパク質２μｇを７．５％ＳＤＳｐａｇｅゲルに添加した。正の対照にはＣＸＲバイオサイエンシーズから入手した０．１ｐｍｏｌのＣｙｐ１ａ１組換えタンパク質を用いた。一次抗体としてはヤギ抗Ｃｙｐ１ａ１／１ａ２（ＢＤゲンテスト、ｃａｔ＃４５８１３１）を１：２０００の濃度で用いた。（Ｂ）−エトシキレゾルフィン脱エチル化、（Ｃ）−メトキシレゾルフィン脱メチル化。データは平均±ＳＤで示す（ｎ＝４）。活性は対応のないｔ検定（両側Ｐ値）で比較した。＊：対照との有意差有り（＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１）。
【図１ｌ】媒体（対照）とリファンピシン（ＲＩＦ；６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）で処理したＣ５７ＢＬ／６Ｊ及びＣｙｐ３ａクラスターＫＯマウスの（Ａ）肝ミクロソーム及び（Ｂ）腸ミクロソームにおけるＣｙｐ２ｂタンパク質の発現。肝ミクロソーム及び腸ミクロソーム由来のタンパク質２μｇを７．５％ＳＤＳｐａｇｅゲルに添加した。正の対照にはＣＸＲバイオサイエンシーズから入手した０．０１ｐｍｏｌのＣｙｐ２ｂ２０組換えタンパク質（ｈｉｓタグ）を用いた。一次抗体としてはウサギ抗Ｃｙｐ２ｂ（Colin Henderson, Ninewells Hospital, Dundee）を１：２０００の濃度で用いた。（Ｃ）−ペントキシレゾルフィン脱ペンチル化。（Ｄ）−ベンゾキシレゾルフィン脱ベンジル化。データは平均±ＳＤで示す（ｎ＝４）。活性は対応のないｔ検定（両側Ｐ値）で比較した。＊：対照との有意差有り（＊：Ｐ＜０．０５）。
【図１ｍ】媒体（対照）とリファンピシン（ＲＩＦ；６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）で処理したＣ５７ＢＬ／６Ｊ（ＷＴ）及びＣｙｐ３ａクラスターＫＯ（ＫＯ）マウスの肝ミクロソームにおけるＣｙｐ２ｃタンパク質の発現。肝ミクロソーム由来のタンパク質２μｇを７．５％ＳＤＳｐａｇｅゲルに添加した。正の対照にはＣＸＲバイオサイエンシーズから入手したＣｙｐ２ｃ２９（０．５ｐｍｏｌ）組換えタンパク質を用いた。一次抗体としてはウサギ抗Ｃｙｐ２ｃ（Colin Henderson, Ninewells Hospital, Dundee）を１：５００００の濃度で用いた。
【図１ｎ】媒体（対照）とリファンピシン（ＲＩＦ；６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）で処理したＣ５７ＢＬ／６Ｊ（ＷＴ）及びＣｙｐ３ａクラスターＫＯ（ＫＯ）マウスの（Ａ）肝ミクロソーム及び（Ｂ）腸ミクロソーム。肝ミクロソーム及び腸ミクロソーム由来のタンパク質２μｇを７．５％ＳＤＳｐａｇｅゲルに添加した。正の対照にはＣＸＲバイオサイエンシーズから入手した組換えＣｙｐ２ｄ２２（０．２ｐｍｏｌ）を用いた。一次抗体としてはヒツジ抗Ｃｙｐ２ｄ（Colin Henderson, Ninewells Hospital, Dundee）を１：２００００の濃度で用いた。
【図１ｏ】媒体（対照）とリファンピシン（ＲＩＦ；６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）で処理したＣ５７ＢＬ／６Ｊ（ＷＴ）及びＣｙｐ３ａクラスターＫＯ（ＫＯ）マウスの（Ａ）肝ミクロソーム及び（Ｂ）腸ミクロソームにおけるＣｙｐ２ｅの発現。肝ミクロソーム及び腸ミクロソーム由来のタンパク質２μｇを７．５％ＳＤＳｐａｇｅゲルに添加した。正の対照にはＣＸＲバイオサイエンシーズから入手した０．２ｐｍｏｌのＣｙｐ２ｅ１組換えタンパク質を用いた。一次抗体としてはヒツジ抗Ｃｙｐ２ｅ（ＳＡＰＵ ＢＲＣ）を１：４０００の濃度で用いた。
【図１ｐ】媒体（対照）とリファンピシン（ＲＩＦ；６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）で処理したＣ５７ＢＬ／６Ｊ及びＣｙｐ３ａクラスターＫＯマウスの肝ミクロソームにおけるＣｙｐ４ａタンパク質の発現。肝ミクロソーム由来のタンパク質２μｇを７．５％ＳＤＳｐａｇｅゲルに添加した。正の対照にはＣＸＲバイオサイエンシーズから入手した１μｇのＡＰＦＯ誘導ラットミクロソームを用いた。一次抗体としてはウサギ抗Ｃｙｐ４ａ（Colin Henderson, Ninewells Hospital, Dundee）を１：２００００の濃度で用いた。
【図１ｑ】（Ａ）媒体（対照）とリファンピシン（ＲＩＦ；６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）で処理したＣ５７ＢＬ／６Ｊ（ＷＴ）及びＣｙｐ３ａクラスターＫＯマウス（ＫＯ）の肝ミクロソームにおけるＰ４５０オキシドレダクターゼタンパク質の発現。肝ミクロソーム由来のタンパク質２μｇを７．５％ＳＤＳｐａｇｅゲルに添加した。正の対照にはＢＤゲンテスト（ｃａｔ＃４５２１７２）から入手した３μｇの雄性ヒト肝ミクロソーム（プール）を用いた。一次抗体としてはウサギ抗Ｐ４５０レダクターゼ（ＣＸＲバイオサイエンシーズ）を１：５０００の濃度で用いた。（Ｂ）−Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ及びＣｙｐ３ａクラスターＫＯマウスのマウス肝ミクロソームにおけるシトクロムＣレダクターゼ活性。データは平均±ＳＤで示す（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（ｎ＝３）、Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯ（ｎ＝４））。
【図１ｒ】媒体とリファンピシン（６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）で処理したＣ５７ＢＬ／６Ｊ及びＣｙｐ３ａクラスターＫＯマウスの肝ミクロソームにおける総Ｐ４５０量。データは平均±ＳＤで示す（ｎ＝４）。活性は対応のないｔ検定（両側Ｐ値）で比較した。＊：対照との有意差有り（＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１、＊＊＊：Ｐ＜０．００１）。
【図１ｓ】（Ａ）−リファンピシン（６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）による処理後４日目にミダゾラム（１ｍｇ／ｋｇ）をＩＶ投与した後の野生型、Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯ及びＣｙｐ３ａ１１ＫＯマウスにおける１’−ヒドロキシミダゾラム薬物動態（誤差棒はＳＤを示す）。（Ｂ）１’−ヒドロキシミダゾラムＰＫから算出した曲線下面積（ＡＵＣ）。
【図１ｔ】リファンピシン（６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）による処理後４日目にミダゾラム（２ｍｇ／ｋｇ）を経口投与した後の野生型、Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯ及びＣｙｐ３ａ１１ＫＯマウスにおける１’−ヒドロキシミダゾラム薬物動態（誤差棒はＳＤを示す）。（Ｂ）１’−ヒドロキシミダゾラムＰＫから算出した曲線下面積（ＡＵＣ）。
【図１ｕ】Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯ及びＣｙｐ３ａ１１ＫＯマウスの肝ミクロソーム及び腸ミクロソームによるトリアゾラムのα水酸化。データは平均＋ＳＤで示す（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ及びＣｙｐ３ａ１１ＫＯの肝ミクロソーム（ｎ＝４）、Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯの肝ミクロソーム及びＣ５７ＢＬ／６Ｊの腸ミクロソーム（ｎ＝３））。活性は対応のないｔ検定（両側Ｐ値）で比較した。＊：有意差有り（＊＊＊：Ｐ＜０．００１）。Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯ及びＣｙｐ３ａ１１ＫＯの腸ミクロソームの活性は定量下限未満であった。
【図１ｖ】Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯ及びＣｙｐ３ａ１１ＫＯマウスの肝ミクロソーム及び腸ミクロソームによるニフェジピンの酸化。データは平均＋ＳＤで示す（Ｃ５７ＢＬ／１６Ｊ及びＣｙｐ３ａ１１ＫＯのミクロソーム（ｎ＝４）、Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯ（ｎ＝３））。活性は対応のないｔ検定（両側Ｐ値）で比較した。＊：有意差有り（＊＊＊：Ｐ＜０．００１）。
【図１ｗ】Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯ及びＣｙｐ３ａ１１ＫＯマウスの肝ミクロソーム及び腸ミクロソームによるテストステロンの６β水酸化。データは平均＋ＳＤで示す（肝ミクロソーム（ｎ＝４）、腸ミクロソーム（ｎ＝３））。活性は対応のないｔ検定（両側Ｐ値）で比較した。＊：有意差有り（＊＊＊：Ｐ＜０．００１、＊＊：ｐ＜０．０１）。
【図１ｘ】Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯ及びＣｙｐ３ａ１１ＫＯマウスの肝ミクロソームによるテストステロンの１６β水酸化。データは平均＋ＳＤで示す（ｎ＝４）。活性は対応のないｔ検定（両側Ｐ値）で比較した。＊：有意差有り（＊＊：ｐ＜０．０１）。
【図１ｙ】Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯ及びＣｙｐ３ａ１１ＫＯマウスの肝ミクロソーム及び腸ミクロソームによるＤＢＦの酸化。データは平均＋ＳＤで示す（肝ミクロソーム（ｎ＝４）、腸ミクロソーム（ｎ＝３））。活性は対応のないｔ検定（両側Ｐ値）で比較した。＊：有意差有り（＊＊＊：Ｐ＜０．００１、＊：ｐ＜０．０５）。
【図１ｚ】Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯ及びＣｙｐ３ａ１１ＫＯマウスの肝ミクロソーム及び腸ミクロソームによるＢＦＣの酸化。データは平均＋／−ＳＤで示す（肝ミクロソーム（ｎ＝４）、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊの腸ミクロソーム（ｎ＝４）、Ｃｙｐ３ａ１１ＫＯの腸ミクロソーム（ｎ＝３）、Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯの腸ミクロソーム（ｎ＝２））。活性は対応のないｔ検定（両側Ｐ値）で比較した。＊：有意差有り（＊：ｐ＜０．０５）。
【図２ａ】図２ａ〜２ｃはＣｙｐ２ｃクラスター交換のための方法を示す。Ａ）マウスＣｙｐ２ｃクラスターの５’ターゲティング、Ｂ）マウスＣｙｐ２ｃクラスターの３’ターゲティング、Ｃ）概要：Ｃｙｐ２ｃクラスターノックアウト、Ｄ）マウスＩＤ２３４２５４のゲノムからのマウスＣｙｐ３ａ クラスター欠如のＰＣＲ確認、Ｅ）マウスＩＤ２３４２５４のゲノムからのマウス３ａ クラスター欠如のＰＣＲ確認。
【図２ｂ】図２ａ〜２ｃはＣｙｐ２ｃクラスター交換のための方法を示す。Ａ）マウスＣｙｐ２ｃクラスターの５’ターゲティング、Ｂ）マウスＣｙｐ２ｃクラスターの３’ターゲティング、Ｃ）概要：Ｃｙｐ２ｃクラスターノックアウト、Ｄ）マウスＩＤ２３４２５４のゲノムからのマウスＣｙｐ３ａ クラスター欠如のＰＣＲ確認、Ｅ）マウスＩＤ２３４２５４のゲノムからのマウス３ａ クラスター欠如のＰＣＲ確認。
【図２ｃ】図２ａ〜２ｃはＣｙｐ２ｃクラスター交換のための方法を示す。Ａ）マウスＣｙｐ２ｃクラスターの５’ターゲティング、Ｂ）マウスＣｙｐ２ｃクラスターの３’ターゲティング、Ｃ）概要：Ｃｙｐ２ｃクラスターノックアウト、Ｄ）マウスＩＤ２３４２５４のゲノムからのマウスＣｙｐ３ａ クラスター欠如のＰＣＲ確認、Ｅ）マウスＩＤ２３４２５４のゲノムからのマウス３ａ クラスター欠如のＰＣＲ確認。
【図２ｄ−１】Ｃｙｐ２ｃクラスター欠失に対するマウスホモ接合性のＰＣＲ確認。
【図２ｄ−２】Ｃｙｐ２ｃクラスター欠失に対するマウスホモ接合性のＰＣＲ確認。
【図２ｅ】Ｃｙｐ３ａ／Ｃｙｐ２ｓ複合クラスターＫＯ株の構築のＰＣＲ確認。
【図２ｆ】Ｃｙｐ３ａ／Ｃｙｐ２ｓ複合クラスターＫＯ株の構築のＰＣＲ確認。
【図３ａ】Ｃｙｐ２ｄクラスター交換のための方法を示す。Ａ）マウスＣｙｐ２ｄ２６の３’ターゲティング。
【図３ｂ】Ｃｙｐ２ｄクラスター交換のための方法を示す。Ｂ）マウスＣｙｐ２ｄクラスターの５’ターゲティング。
【図３ｃ】Ｃｙｐ２ｄクラスター交換のための方法を示す。Ｃ）概要：Ｃｙｐ２ｄノックアウト。
【図３ｄ−１】Ｃｙｐ２ｄクラスター欠失に対するマウスホモ接合性のＰＣＲ確認。
【図３ｄ−２】Ｃｙｐ２ｄクラスター欠失に対するマウスホモ接合性のＰＣＲ確認。
【図３ｅ】野生型（例えば、Ｃ７５ＢＬ／６Ｊ）及びＣｙｐ２ｄクラスターＫＯマウスにおけるブフラロール（１０ｍｇ／ｋｇ、単回経口投与）の薬物動態。データは、投与後２４０分まで全血中で検出されたブフラロール濃度の平均±ＳＤ（ｎ＝４）で示す。
【図４ａ】ＣＹＰ１Ａノックアウトのための方法を示す。Ａ）マウスＣｙｐ１ａの５’ターゲティング。
【図４ｂ】ＣＹＰ１Ａノックアウトのための方法を示す。Ｂ）マウスＣｙｐ１ａの３’ターゲティング。
【図４ｃ】ＣＹＰ１Ａノックアウトのための方法を示す。Ｃ）概要：Ｃｙｐ１ａノックアウト。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【０１５９】
実施例１：Ｃｙｐ３ａクラスター交換
相同組換えによってマウスＣｙｐ３ａクラスターの５’末端を標的にして、図１ａに示すように、ｆｒｔ、ｌｏｘ５１７１及び野生型ｌｏｘＰ部位がＣｙｐ３ａ５７遺伝子のエクソン１の下流に挿入されるようにした。更に、図示のように、ハイグロマイシン耐性カセットとチミジンキナーゼ（ＴＫ）発現カセットを共導入した。
【０１６０】
マウスＣｙｐ３ａクラスターの３’末端における次の相同組換え段階によって、正しくターゲティングされたＥＳ細胞を更に改変して、野生型ｌｏｘＰ及びｆ３部位がＣｙｐ３ａ５９遺伝子のエクソン４の下流に挿入されるようにした。図１ｂに示すように、５’欠損ネオマイシン耐性カセットとＴＫ発現カセットを共導入した。翻訳開始ＡＴＧは、ｌｏｘＰ部位によって５’欠損ネオマイシン耐性カセットからインフレームで分離させて、ｌｏｘＰ部位によってコードされる他のアミノ酸がネオマイシンタンパク質のＮ末端に付着するようにする。
【０１６１】
Ｃｒｅ介在組換えによってマウスＣｙｐ３ａクラスターの欠失を可能とするためには、クラスター両端におけるターゲティングを同一対立遺伝子上で行う必要がある。これについては、Ｃｒｅを用いた二重標的ＥＳ細胞のトランスフェクションとそれに続くガンシクロビルを用いた選択によってインビトロで試験した。図１ｅに示すように、同一対立遺伝子上でターゲティングを行った細胞においてのみ、ＴＫ遺伝子はクラスターの両端で欠失し、ヌクレオシド類似体ガンシクロビルから毒性三リン酸類似体へのＴＫ介在転化が防止される。従って、同一対立遺伝子上でターゲティングを行ったＥＳ細胞のみがガンシクロビル選択後も生存する。
【０１６２】
生存ＥＳ細胞クローンをＰＣＲで更に解析し、マウスＣｙｐ３ａクラスターが欠失し、ＰＣＲ陽性クローンが胚盤胞に注入されてキメラマウスが作出されたことを確認した。その後の交雑によって、Ｃｙｐ３ａクラスターがホモ欠損したマウスを最終的に作出した。
【０１６３】
その後、ＥＳ細胞に残存する野生型ｌｏｘＰ及びｌｏｘ５１７１部位を用い、Ｃｒｅ介在挿入によって置換遺伝子（例えば、ヒトＣＹＰ３Ａクラスター）をマウスクラスターの前の位置において挿入することができる。残存プロモーター、ＡＴＧ及びインフレーム野生型ｌｏｘＰ部位を用いて、５’欠損選択カセット（例えば、５’欠損ネオマイシン）を再度挿入し、高効率で正しく挿入されたクローンを選択することができる。更なるｆｒｔ部位及びｆ３部位が正しい方向に置換カセットと共に共導入されている場合には、両端におけるｆｒｔ部位及びｆ３部位を用い、Ｆｌｐ介在欠失によって、置換遺伝子と共に導入された選択カセットを欠失させることができる。
【０１６４】
Ｃｙｐ３ａ５７の８００ｂｐ上流に位置し、Ｃｙｐと無関係の多数の遺伝子によってマウスＣｙｐ３ａクラスターから離れているＣｙｐ３ａ１３遺伝子は、上述のマウスＣｙｐ３ａクラスターの欠失に影響されない。
【０１６５】
図１ｂは、ＩＤが２１９６７８、２１９６７９、２１９６８０、２１９６８１及び２１９６８２のマウスのゲノムからのマウスＣｙｐ３ａクラスター欠如のＰＣＲ確認を示す。
【０１６６】
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊとの比較によるＣｙｐ３ａクラスターＫＯマウスの解析
研究は４群（４匹／群）で行った。マウスには、リファンピシン（６０ｍｇ／ｋｇ）を３日間、腹腔内（ＩＰ）投与した。研究４日目に、ミダゾラム（１ｍｇ／ｋｇ）をＩＰ注射により投与し、１０μＬの血液サンプルを１０分、２０分、４０分、６０分、１２０分、２４０分及び３６０分で採取してＰＫ解析を行った（表１）。
【０１６７】
【表１】
【０１６８】
病理学
肝腫
媒体処理Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯマウスにおいては、生物学的に無関係と思われる媒体処理Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスと比べて、肝臓／身体重量比が僅か（〜６％）ではあるが統計的に有意に増加した。リファンピシン処理の場合には、いずれのマウス株においても肝腫は生じなかった（表２）。
【０１６９】
【表２】
【０１７０】
病理組織学
ヘマトキシリン及びエオシン染色
全群のマウス全ての腎臓サンプル、肝臓サンプル及び小腸サンプルに対して病理組織学的検討を行った。処理Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいては軽度の小葉中心性肝細胞肥大が認められた。Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯマウスの肝臓には微細な小葉中心性肥大の徴候もあった。このような変化はリファンピシンによる処理に関連すると考えられた。肝臓で記録された他の微視的な知見は全て、処理マウスと対照マウスとの間で有意差が無かった。いずれの差もランダムな事象であり、自然発生的であり、マウスで通常見られる正常なバックグラウンド病理の範囲内であると見なされた（図１ｃ）。腎臓及び小腸においてはリファンピシン処理に関連する微視的知見は記録されなかった（図１ｄ〜１ｅ）。この研究の条件下では、２種の異なるマウス株に対してリファンピシン（６０ｍｇ／ｋｇ体重）を３日間反復投与することによって、両方の株で肝細胞肥大の病理学的証拠が得られた。トランスジェニックマウス（Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯ）ではあまり大きな影響を受けないように思われた。
【０１７１】
オイルレッドＯ染色
オイルレッドＯ染色により脂質沈着について肝臓サンプルを調べた。媒体処理マウス肝臓のいずれにおいても脂肪蓄積の徴候は無かった（図１ｆ）。リファンピシン処理Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの肝臓においては、核周辺に中程度（グレード１）の滴模様のオイルレッドＯ染色が観察された。これは、リファンピシン処理Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯマウスの肝臓切片では検出できなかった。
【０１７２】
臨床化学
全てのマウスから血漿サンプルを採取し、トリグリセリド、アラニントランスフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アルブミン、ビリルビン（総ビリルビン及び直接ビリルビン）、クレアチンキナーゼ、高密度リポタンパク質、低密度リポタンパク質及びγ−グルタミルトランスフェラーゼについて解析した。γ−グルタミルトランスフェラーゼ活性及び直接ビリルビンレベルは定量限界未満であった。他の血漿臨床化学パラメータの値は全て、未処理Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの公知の正常範囲内であった（図１ｇ）。
【０１７３】
分子／生化学的表現型
ミダゾラムの薬物動態
野生型及びＣｙｐ３ａクラスターＫＯマウスにおけるミダゾラムの薬物動態を図１ｈに示す。
【０１７４】
両方のマウス株はＩＰ投与後に基質の速やかな吸収を示した。これは、３日間のリファンピシンの先行投与によっては影響を受けなかった。ミダゾラムのＡＵＣは、野生型及びＣｙｐ３ａクラスターＫＯ対照マウスにおいて同様であった（図１ｉ）。リファンピシン処理によって両方のマウス株で基質の排除が促進されたが、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいてより高い作用が示された。アイソフォーム特異的基質が腹腔内投与された場合、肝臓における代謝シトクロムＰ４５０の発現レベルは該基質のＡＵＣに反比例することが先に示されている。従って、ミダゾラムのＡＵＣは、Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯマウスではその主要代謝酵素のクラスターが欠失しているため、より高いことが予測された。しかし、この場合にはそうではなく、恐らく、次の文献（van Waterschoot et al., 2008）に記載ものと同様の何らかの代償性変化が関与していることが示唆される。
【０１７５】
Ｃｙｐ３ａタンパク質の発現及び活性
Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯマウスの肝ミクロソームにおけるＣｙｐ３ａの発現は、処理マウス及び対照マウスの両方においてウェスタンブロッティングによる検出限界未満のレベルまで低下した（図１ｊ）。これは、対応するＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス実験群と比べてＣｙｐ３ａ特異的基質７−ＢＱの酸化が有意に低下（対照マウスにおいては１８％、リファンピシン処理マウスにおいては６．７％まで低下）したことと関連付けられた。Ｃｙｐ３ａアイソフォーム及びＣｙｐ２ｃアイソフォームの両方によって触媒されるミダゾラムの１’−水酸化は、対照マウス及び処理マウスでそれぞれ５３％、１８％まで低下した。ミダゾラムの４−水酸化の低下（６５％まで）は小さく、対照Ｃ５７ＢＬ／６Ｊと比べてＣｙｐ３ａクラスターＫＯ対照群では統計的に有意ではなかった。これは、４−水酸化がマウスＣｙｐ３ａによって支配的に触媒されることが示されている（Perl off et al., 2000）ことを考慮すると予期せぬ結果であった。ミダゾラムの４−水酸化は、Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯリファンピシン処理群においては野生型マウスと比べて２３％まで低下した。
【０１７６】
Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯマウスのリファンピシンによる前処理によって、７−ＢＱの酸化は僅かではあるが（１６８％）、統計的に有意に（Ｐ＜０．０５）増加した。Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯマウスにおけるミダゾラムの水酸化に対するリファンピシンの作用は小さく（１’−水酸化では１２３％増加、４−水酸化では１１２％）、統計的に有意ではなかった。
【０１７７】
腸ミクロソームのウェスタンブロッティングでは如何なるＣｙｐ３ａバンドも得られなかった（データは示さず）。
【０１７８】
腸ミクロソームの比活性の測定によって得たデータの不整合性が高かったが、これは、上皮細胞を擦り取って腸ミクロソームを調製する際にむらがあることを反映しているように思われる（Bonkovsky et al., 1985; Mohri and Uesawa, 2001）（データは示さず）。
【０１７９】
本研究に用いた抗体は、試験したサブファミリー由来の主要な組換えシトクロムＰ４５０との相互作用後にウェスタンブロット上で明確なバンドを示した。しかし、１種のＰ４５０サブファミリー内の異なるアイソフォームに対する抗体の特異性については検討しなかった。
【０１８０】
Ｃｙｐ１ａタンパク質の発現及び活性
ウェスタンブロッティングで確認したＣｙｐ１ａの発現は、Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯマウスの肝ミクロソームにおいては野生型に比べて僅かに高かった（図１ｋ）。リファンピシン処理によって、両方のマウス株でＣｙｐ１ａが僅かにダウンレギュレートされた。エトキシレゾルフィン脱エチル化活性（ＥＲＯＤ）は、Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯマウスの肝ミクロソーム及び野生型マウスの肝ミクロソームの両方において同様であった。ＥＲＯＤはＣｙｐ１ａ１アイソフォーム及びＣｙｐ１ａ２アイソフォームの両方によって触媒されるが、Ｃｙｐ１ａ１の方が主に寄与する。リファンピシン処理によって、両方の株でＥＲＯＤ代謝が僅かに誘導された。野生型マウスとＣｙｐ３ａクラスターＫＯマウスとの間でメトキシレゾルフィン脱メチル化（ＭＲＯＤ）活性の差は無かった。ＭＲＯＤは主にＣｙｐ１ａ２によって触媒される。
【０１８１】
Ｃｙｐ２ｂタンパク質の発現及び活性
マウス肝ミクロソームでのＣｙｐ２ｂの発現は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス及びＣｙｐ３ａクラスターＫＯマウスの両方において低かった（図１ｌ）。リファンピシン処理によって、両方の株でＣｙｐ２ｂが僅かに誘導された。これはＰＲＯＤ活性の増加が少ないことと関連付けられた。腸ミクロソームでは顕著に高いＣｙｐ２ｂの発現が示されたが、リファンピシン処理に対して感受性が低かった。媒体処理Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯマウスの肝ミクロソームでは、ベンゾキシレゾルフィンＯ−脱アルキル化（ＢＲＯＤ）活性が野生型に比べて低いことが示された。ＢＲＯＤは先にマウスＣｙｐ２ｂの基質として用いられた（Donato et al., 2003）。リファンピシン処理によって、試験した両方の株においてＢＲＯＤが誘導された。これらのデータから、Ｃｙｐ３ａ（更に、恐らくはＣｙｐ２ｃアイソフォーム）由来の酵素がＢＲＯＤに関与し得ることが示唆される。
【０１８２】
Ｃｙｐ２ｃタンパク質の発現
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ及びＣｙｐ３ａクラスターＫＯマウスの肝ミクロソームにおけるＣｙｐ２ｃタンパク質の発現はウェスタンブロッティングによって評価した（図１ｍ）。タンパク質バンド強度は、野生型と比べて、対照Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯマウス由来のサンプルにおいて僅かに増加した。両方のマウス株では、リファンピシン処理後に顕著なＣｙｐ２ｃ誘導が示された。
【０１８３】
Ｃｙｐ２ｄタンパク質の発現
Ｃｙｐ２ｄタンパク質のバンドは、肝臓サンプル及び腸サンプルの両方において検出された（図１ｎ）。未処理野生型マウスの肝臓サンプルとＣｙｐ３ａクラスターＫＯマウスの肝臓サンプルとの間でＣｙｐ２ｄタンパク質バンド強度に顕著な差は無かった。リファンピシン処理によって、Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスではＣｙｐ２ｄの発現が僅かに低下したが、Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯマウスでは僅かに増加した。野生型に比べて、Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯでは腸Ｃｙｐ２ｄレベルが僅かに増加した。腸ミクロソームでのＣｙｐ２ｄレベルに対するリファンピシン処理の顕著な作用はいずれのマウス株でも見られなかった。
【０１８４】
Ｃｙｐ２ｅタンパク質の発現
Ｃｙｐ２ｅタンパク質バンド強度は、野生型と比べてＣｙｐ３ａクラスターＫＯマウスの肝ミクロソームでは僅かに高かった（図１ｏ）。肝ミクロソームにおけるＣｙｐ２ｅレベルは、いずれのマウス株においてもリファンピシン処理によっては顕著に変化しなかった。同様に、Ｃｙｐ２ｅ発現のレベルは、野生型と比べてＣｙｐ３ａクラスターＫＯマウスの腸においては高かった。リファンピシン処理によって、Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯマウスでは腸Ｃｙｐ２ｅが僅かに誘導されたが、野生型マウスでは腸Ｃｙｐ２ｅが僅かにダウンレギュレートされた。
【０１８５】
Ｃｙｐ４ａタンパク質の発現
Ｃｙｐ４ａタンパク質は両方のマウス株の肝ミクロソームで検出された（図１ｐ）。野生型マウス由来サンプルにおけるＣｙｐ４ａ発現レベルはリファンピシン処理後に顕著に増加した。
【０１８６】
マウスＰ４５０オキシドレダクターゼ（ＰＯＲ）タンパク質の発現
シトクロムＰ４５０オキシドレダクターゼレベルは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ及びＣｙｐ３ａクラスターＫＯマウスの肝ミクロソームにおいては同様であった（図１ｑ）。両方のマウス株は、ＰＯＲのタンパク質発現レベルの顕著な増加によってリファンピシン処理に反応した。リファンピシン処理マウスの肝ミクロソームでは、野生型マウスと比べてシトクロムＣの還元における活性が僅かに高いことが示された。この増加は統計的に有意ではなかった。
【０１８７】
総Ｐ４５０量
Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯマウスでは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスと比べて、媒体処理マウスの肝ミクロソームの総Ｐ４５０量が僅かではあるが統計的に有意に増加することが示された（図１ｒ）。リファンピシン処理によって、野生型マウスでは総Ｐ４５０量が顕著に増加した。しかし、Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯマウスの肝ミクロソームのＰ４５０量は変化しなかった。
【０１８８】
結論
Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯマウスの場合、血漿、肝臓、腎臓又は小腸においては、如何なる遺伝子型誘導の病理学的変化も示されなかった。このモデルで示されたＣｙｐ３ａ発現のレベルは、ウェスタンブロッティングによる検出限界未満であった。Ｃｙｐ３ａ特異的基質７−ＢＱに対する活性が顕著に低下（野生型マウスと比べて２０％未満のレベルまで）した。ミダゾラムクリアランスに関するインビトロデータから、Ｃｙｐ３ａサブファミリー由来のＰ４５０はこの基質の排除に関与する唯一の代謝酵素ではないことが示唆された。未処理Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯマウスの肝ミクロソームのミダゾラム水酸化活性は、野生型株のものに対して〜６０％であった。このことは、その酸化における他のＰ４５０（例えば、Ｃｙｐ２ｃ）の関与によって説明できよう（Perloff et al., 2000; van Waterschoot et al., 2008）。リファンピシン処理によって野生型ではＣｙｐ３ａが誘導されたが、Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯでは誘導されなかった。これによって、処理Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯマウスの肝ミクロソームにおけるミダゾラム水酸化活性にはより顕著な差（野生型に比べて２０％）がもたらされた。ミダゾラムＰＫデータによって、ミダゾラム排除への複数の代謝酵素の関与についての更なる証拠が得られた。未処理Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯマウスとＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスとの間ではミダゾラムＰＫの差は無かったが、これは先に公表されたデータと関連付けられ、Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯ株におけるＰ４５０（例えば、Ｃｙｐ２ｃサブファミリー由来）の多少のアップレギュレーションに起因し得る（van Waterschoot et al., 2008）。リファンピシンの投与によって両方のマウス株でミダゾラムの排除が促進された。これは代謝酵素の誘導を示し、野生型マウス及びＣｙｐ３ａクラスターＫＯマウスにおいてそれぞれ、最大４７０％及び２７０％であった（概算はＡＵＣの変化に基づいて為された）。誘導Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの肝ミクロソームでもミダゾラム水酸化活性の高い増加（最大３８０％）を示したが、Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯ株の肝ミクロソームで示されたミダゾラム水酸化の誘導はほんの僅かであった（最大１２５％）。インビトロ及びインビボでのミダゾラムクリアランスに対するリファンピシンの作用の差は、Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯマウスのインビボでのミダゾラム排除の代替経路の誘導を暗示する。
【０１８９】
更なる実験を行い、１’−ヒドロキシミダゾラムのＰＫプロファイル及び他のＣｙｐ３ａ基質の酵素修飾について比較した。
【０１９０】
研究は９群で行った（表３）。マウスにはリファンピシン（６０ｍｇ／ｋｇ）を３日間腹腔内（ｉｐ）投与した。研究４日目に、ミダゾラムを１〜６群のマウスにはＩＶ注射によって投与（１ｍｇ／ｋｇ）し、７〜９群のマウスには経口投与（２ｍｇ／ｋｇ）した。血液サンプルをＩＶ投与後２分、５分、１０分、２０分、３０分、４５分、６０分、９０分、１２０分及び１５０分（連続出血）で採取し、また、経口投与後１０分、２０分、４０分、６０分、９０分、１２０分、２４０分及び３６０分で採取し、ＰＫ解析を行った（表３）。
【０１９１】
【表３】
【０１９２】
１’−ヒドロキシミダゾラムの薬物動態
先のリファンピシン処理によって野生型マウスではＣｙｐ３ａが誘導されたが、Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯマウスでは誘導されなかった。これによって、２種類のマウス株間ではインビトロでのミダゾラム水酸化活性に顕著な差がもたらされた。しかし、インビボでのミダゾラム排除における差はあまり顕著ではなく、これは、Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯマウスにおけるインビボでのミダゾラム排除の代替経路の誘導を示唆している。本研究では、Ｐ４５０発現レベル概算のためのより高感度で具体的な方法として、リファンピシン誘導マウスへのミダゾラムのＩＶ投与及び経口投与後に１’−ヒドロキシミダゾラムの薬物代謝（一次代謝産物）をモニターした。血液をＢ−グルクロニダーゼで前処理した後に１’−ヒドロキシミダゾラムの総濃度を測定した。親化合物をＩＶ注入した後の１’−ヒドロキシミダゾラムの薬物動態を図１ｓに示す。
【０１９３】
曲線の終末段階はＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス及びＣｙｐ３ａ１１ＫＯマウスの両方において同様であるが、これは、この代謝産物のクリアランスにおける株差が非常に小さいことを示唆する。Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯマウスＰＫの終末段階は、１’−ヒドロキシミダゾラムの排除が他の株と比べて僅かに遅いことを示す。１’−ヒドロキシミダゾラムのＡＵＣは、Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯマウスでは野生型株と比べて顕著に（〜３倍）低下したが、これは、Ｃｙｐ３ａサブファミリー由来のシトクロムＰ４５０がこの代謝産物生成の主要な経路であることを示す。Ｃｙｐ３ａ１１ＫＯマウスにおけるＡＵＣの低下はあまり顕著ではなかった（〜２倍）が、これは、１’−ヒドロキシミダゾラムの生成にＣｙｐ３ａサブファミリーの他のメンバーが多少関与していることを示唆する。ミダゾラム経口投与後の１’−ヒドロキシミダゾラムの薬物動態を図１ｔに示す。
【０１９４】
曲線の終末段階は全ての株で同様であった。しかし、初期の吸収段階では差が見られた。野生型マウスと比べて、Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯマウスやＣｙｐ３ａ１１ＫＯマウスではバイオアベイラビリティが低かった。これは、ミダゾラム経口投与後の１’−ヒドロキシミダゾラムの生成に腸シトクロムＰ４５０が大きく寄与していることを示す。このことは、ＩＶ注入後に野生型マウスとＫＯマウスとの間で１’−ヒドロキシミダゾラムのＡＵＣが非常に大きく異なっていることを示したＩＶデータによって支持された。本研究においては、曲線の吸収段階を定めるデータ点が非常に少なかったため、Ｃ５７ＢＬ／６ＪにおけるＣｙｐ３ａ酵素からの影響は過小評価されているように思われる。
【０１９５】
Ｃｙｐ３ａ酵素活性
肝ミクロソーム及び腸ミクロソームによるＣｙｐ３ａ特異的基質の酸化は、トリアゾラム、ニフェジピン、テストステロン、ジベンジルフルオレセイン（ＤＢＦ）及び７−ベンジルオキシ−４−トリフルオロメチルクマリン（ＢＦＣ）を用いて試験した。トリアゾラム、ニフェジピン及びテストステロンは、１０種のＣＹＰ３Ａ４基質の様々なＣＹＰ３Ａ４リガンドとの相互作用の統計的解析に基づき、ＣＹＰ３Ａ４内の異なる基質グループに帰属された（Kenworthy et al., 1999）。ＤＢＦとＢＦＣは蛍光代謝物を産生し、ＣＹＰ３Ａ４阻害剤のハイスループットスクリーニングにおいて広く応用されている。他の蛍光基質である７−ベンジルオキシキノリン（ＢＱ）は、Ｃｙｐ３ａに対して良好な特異性を示している。
【０１９６】
関連するグラフの全てにおいて、小腸由来サンプルの活性は右のＹ軸スケールを参照し、肝ミクロソームの活性は左のＹ軸スケールを参照されたい。
【０１９７】
トリアゾラムα−水酸化
肝ミクロソーム及び腸ミクロソームによるトリアゾラム酸化の結果を図１ｕに示す。Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯマウス及びＣｙｐ３ａ１１ＫＯマウスの両方においてトリアゾラムの水酸化は顕著に低下した。このことは、公表データ（Perloff et a1.,200O）とよく関連付けられ、トリアゾラムはＣｙｐ３ａサブファミリー由来のマウスシトクロムＰ４５０に対して高い特異性を有する基質であることが示された。また、このデータから、Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯ及びＣｙｐ３ａ１１ＫＯの活性は非常に低く、統計的に違いが無かったため、水酸化にはＣｙｐ３ａ１１が大きく寄与し、他のＣｙｐ３ａ酵素からの影響は無視できることも分かった。
【０１９８】
ニフェジピン酸化
Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯ及びＣｙｐ３ａ１１ＫＯマウスの肝ミクロソームによるニフェジピン酸化は、野生型マウスと比べて有意に（Ｐ＜０．００１）低下した（図１ｖ）。この低下はトリアゾラムの場合と比べてあまり顕著ではなかったが、これは、異なるサブファミリー由来の酵素の潜在的な関与を示す。Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯ及びＣｙｐ３ａ１１ＫＯの平均値は異なったが、統計的な有意差は無かった。腸ミクロソームによるニフェジピン酸化においては統計的な有意差は無かった。
【０１９９】
テストステロン水酸化
テストステロンは、数種の異なるシトクロムＰ４５０によって水酸化される。６ｐ−水酸化は通常、Ｃｙｐ３ａサブファミリー由来の酵素に起因するが、１６Ｂ−水酸化はＣｙｐ２ｂ１０及びＣｙｐ２ｃ２９によって触媒される（Honkakoski et al., 1992）。Ｃｙｐ３ａクラスターノックアウトマウスにおけるＣｙｐ２ｃサブファミリー由来酵素のアップレギュレーションは先に報告されている（van Waterschoot et al., 2008）。従って、両方の水酸化については肝ミクロソーム及び腸ミクロソームを用いて検討した（図１ｗ〜１ｘ）。
【０２００】
Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯマウス及びＣｙｐ３ａ１１ＫＯマウスの両方においてテストステロンの６β−水酸化は有意に低下した。トランスジェニックマウス株の肝ミクロソームによる６β−テストステロンの生成においては差が無かった。Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯマウスの腸ミクロソームの活性はＣｙｐ３ａ１１ＫＯマウスの場合と比べて低かった（Ｐ＜０．０５）が、これは、マウス小腸によるテストステロン６β−水酸化に他のＣｙｐ３ａ酵素が関与していることを示し得る。テストステロンの１６β−水酸化は、野生型マウスと比べて両方のトランスジェニック株の肝ミクロソームで増加したが、これは何らかの代償性変化を示唆し、この変化は、Ｃｙｐ２ｃサブファミリー由来の酵素の過剰発現であると思われる（van Waterschoot et al., 2008）。Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯの平均値はＣｙｐ３ａ１１ＫＯの場合と比べて高かったが、統計的な有意差は無かった。
【０２０１】
ＤＢＦの酸化
ＤＢＦの酸化の結果を図１ｙに示す。肝ミクロソームによるＤＢＦ酸化は、Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯマウス及びＣｙｐ３ａ１１ＫＯマウスの両方に由来するサンプルにおいては顕著な低下を示した。２種のノックアウト株間では統計的な有意差は無かったが、これは、Ｃｙｐ３ａ１１が主要な代謝酵素であることを示唆する。腸ミクロソームによるＤＢＦ酸化においては、野生型株とノックアウト株との間で統計的な有意差は無かった。
【０２０２】
ＢＦＣの酸化
ＢＦＣの酸化の結果を図１ｚに示す。
肝ミクロソームサンプル間でＢＦＣ活性に差は無かった。腸ミクロソームにおいては、僅かではあるが統計的に有意な増加が見られたが、これは、ＢＦＣを酸化する、トランスジェニックマウスにおける他のサブファミリー由来のシトクロムＰ４５０のアップレギュレーションを示唆する。
【０２０３】
結論
Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯモデルは先に基質特異的挙動を示した。このモデルと野生型マウスとの明らかな差は７−ＢＱの酸化に見られた。しかし、ミダゾラムの水酸化では差が見られず、これは、この反応における他のＰ４５０（例えば、Ｃｙｐ２ｃ）の関与を示唆する（Perloff et al., 2000; van Waterschoot et al., 2008）。リファンピシン処理によって野生型ではＣｙｐ３ａが誘導されたが、Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯでは誘導されなかった。この結果、処理Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯマウスの肝ミクロソームにおけるミダゾラム水酸化活性は顕著に低下した。ミダゾラムＡＵＣで示されたように、インビボでの差はあまり顕著ではなかったが、これは、Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯマウスにおけるミダゾラム排除の代替経路の誘導を示唆する。このことは、ミダゾラム代謝産物の薬物動態によって、Ｃｙｐ３ａ発現レベルをより具体的且つ高感度に概算し得ることを暗示した。
【０２０４】
親化合物をＩＶ投与した後の１’−ヒドロキシミダゾラムのＡＵＣはＣｙｐ３ａクラスターＫＯマウスにおいて顕著に（〜３倍）低下したが、これは、この代謝産物の生成にＣｙｐ３ａサブファミリーが大きく寄与することを示す。この方法は、先に用いられた方法の改良であり、ミダゾラムＡＵＣの測定（１．６倍）に基づいた。しかし、インビトロで見られた差（６倍）には完全に対応しなかった。この違いは、親化合物及び代謝産物自身の両方の分布量やクリアランスからの代謝産物ＡＵＣの複合依存性によって説明し得る（Rowland and Tozer, 1995）。腸代謝や吸収が代謝産物の処理に関与する場合には、親薬物の経口投与後に他の複雑な因子が存在する。マウス株間の基質酸化における差は、肝ミクロソームと腸ミクロソームとの間でテストステロンやトリアゾラムに関してはよく対応した。しかし、ニフェジピン、ＤＢＦ及びＢＦＣの酸化に関してはパターンが異なった。これは、後者の反応に様々な酵素が関与し、これらの酵素の相対濃度が肝臓や小腸で異なることを示し得る。このことは、シトクロムＰ４５０の発現レベルの概算において、経口投与後の代謝物ＡＵＣがＩＶ注入後の代謝物ＡＵＣと比べて有益ではないことを示唆した。本研究に用いたＣｙｐ３ａ基質は、その酸化におけるＣｙｐ３ａサブファミリーの影響の点で次のようにランク付けすることができる（トリアゾラム＞ＤＢＦ：テストステロン＞ニフェジピン＞＞ＢＦＣ）。
【０２０５】
ＣＹＰ３Ａ４基質であるＢＦＣの酸化に関するデータから、Ｃｙｐ３ａサブファミリー由来のマウスシトクロムＰ４５０に対するこの化合物の特異性が低いことが分かる。このことは、先に報告されたＢＦＣ酸化におけるヒトシトクロムＰ４５０とラットシトクロムＰ４５０との間の差（Stresser et al., 2002）と一致する。
【０２０６】
Ｃｙｐ３ａクラスターノックアウトの作用に関しては、全ゲノムマイクロアレイ及び肝臓から調製したＲＮＡを用いて転写レベルでも評価した。本研究においては、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｗｈｏｌｅ Ｍｏｕｓｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｏｌｉｇｏ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙスライド（Ｇ４１２２−６０５１０）及びＡｇｉｌｅｎｔ ４４ＫガスケットスライドＧ２５３４−６０００５を用いた。
【０２０７】
マウスには、表１に示すように、リファンピシン／コーン油（６０ｍｇ／ｋｇ／３日間）又は媒体のみを腹腔内注射によって投与した。遺伝子発現の変化倍数（Fold changes）を表４に示す。
【０２０８】
【表４−１】
【０２０９】
【表４−２】
【０２１０】
【表４−３】
【０２１１】
実施例２：Ｃｙｐ２ｃクラスター交換
相同組換えによってマウスＣｙｐ２ｃクラスターの５’末端を標的にして、野生型ｌｏｘＰ及びｆ３部位がＣｙｐ２ｃ５５遺伝子のエクソン１の下流に挿入されるようにした。図２ａに示すように、５’欠損ネオマイシン耐性カセットとＴＫ発現カセットを共導入した。翻訳開始ＡＴＧは、ｌｏｘＰ部位によって５’欠損ネオマイシン耐性カセットからインフレームで分離させて、ｌｏｘＰ部位によってコードされる他のアミノ酸がネオマイシンタンパク質のＮ末端に付着するようにする。
【０２１２】
マウスＣｙｐ２ｃクラスターの３’末端における次の相同組換え段階によって、正しくターゲティングされたＥＳ細胞を更に改変して、図２ｂに示すように、ｆｒｔ、ｌｏｘ５１７１及び野生型ｌｏｘＰ部位がＣｙｐ２ｃ７０遺伝子のエクソン５の下流に挿入されるようにした。更に、図示のように、ハイグロマイシン耐性カセットとチミジンキナーゼ（ＴＫ）発現カセットを共導入した。
【０２１３】
Ｃｒｅ介在組換えによってマウスＣｙｐ２ｃクラスターの欠失を可能とするためには、クラスター両端におけるターゲティングを同一対立遺伝子上で行う必要がある。これについては、Ｃｒｅを用いた二重標的ＥＳ細胞のトランスフェクションとそれに続くガンシクロビルを用いた選択によってインビトロで試験した。図２ｃに示すように、同一対立遺伝子上でターゲティングを行った細胞においてのみ、ＴＫ遺伝子はクラスターの両端で欠失し、ヌクレオシド類似体ガンシクロビルから毒性三リン酸類似体へのＴＫ介在転化が防止される。従って、同一対立遺伝子上でターゲティングを行ったＥＳ細胞のみがガンシクロビル選択後も生存する。生存ＥＳ細胞クローンをＰＣＲで更に解析し、マウスＣｙｐ２ｃクラスターが欠失し、ＰＣＲ陽性クローンが胚盤胞に注入されてキメラマウスが作出されたことを確認した。その後の交雑によって、Ｃｙｐ２ｃクラスターがホモ欠損したマウスを作出した。
【０２１４】
その後、ＥＳ細胞に残存する野生型ｌｏｘＰ及びｌｏｘ５１７１部位を用い、Ｃｒｅ介在挿入によって置換遺伝子（例えば、ヒトＣＹＰ２Ｃクラスター）をマウスクラスターの前の位置において挿入することができる。残存プロモーター、ＡＴＧ及びインフレーム野生型ｌｏｘＰ部位を用いて、５’欠損選択カセット（例えば、５’欠損ネオマイシン）を再度挿入し、高効率で正しく挿入されたクローンを選択することができる。更なるｆｒｔ部位及びｆ３部位が正しい方向に置換カセットと共に共導入されている場合には、両端におけるｆｒｔ部位及びｆ３部位を用い、Ｆｌｐ介在欠失によって、置換遺伝子と共に導入された選択カセットを欠失させることができる。このホモ接合性クラスターＫＯ作出のＰＣＲによる実証を図２ｄに示す。
【０２１５】
実施例３：ホモ接合体Ｃｙｐ３ａクラスターノックアウト／Ｃｙｐ２ｃクラスターノックアウトマウス
Ｃｙｐ３ａＫＯマウスとＣｙｐ２ｃＫＯマウスを交雑させて生存可能なマウス（ＩＤ２３４２５４）を繁殖させた。このマウスは、マウスＣｙｐ３ａクラスター（７個の遺伝子が欠失）及びＣｙｐ２ｃクラスター（１４個の遺伝子が欠失）の両方がホモ欠損している。
【０２１６】
図２ｅは、マウスＩＤ２３４２５４のゲノムからマウスＣｙｐ３ａクラスターが欠如していることのＰＣＲ確認を示す。図２ｆは、同一マウスのゲノムからマウスＣｙｐ２ｃクラスターが欠如していることのＰＣＲ確認を示す。
【０２１７】
ホモ接合体Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯ／Ｃｙｐ２ｃクラスターＫＯマウスは、実施例１で詳述するように、その病理組織学、生化学、タンパク質発現及びｍＲＮＡ転写レベルに関して特徴付けされよう。また、公知で仮定のＣｙｐ２ｃＰ４５０アイソフォーム基質を用いた該株の更なる特徴付けも実施されよう。
【０２１８】
実施例４：Ｃｙｐ２ｄクラスター欠失
相同組換えによってマウスＣｙｐ２ｄクラスターの３’末端を標的にして、図３ａに示すように、ｆｒｔ、ｌｏｘ５１７１及び野生型ｌｏｘＰ部位がＣｙｐ２ｄ２６遺伝子のエクソン１の下流に挿入されるようにした。更に、図示のように、ハイグロマイシン耐性カセットを共導入した。続くマウスクラスターの欠失によって無傷のＣｙｐ２ｄ２６プロモーターとＣｙｐ２ｄ２６遺伝子のエクソン１が残るが、これらは、後述のようにクラスターの５’末端において挿入されるヒトＣＹＰ２Ｄ６の発現を妨げる可能性があるため、Ｃｙｐ２ｄ２６プロモーターからの発現を終結させる３’ターゲティングベクターにスプライスアクセプターポリアデニル化モチーフ（ｓＡｐＡ）を含有させた。
【０２１９】
マウスＣｙｐ２ｄクラスターの５’末端における次の相同組換え段階によって、正しくターゲティングされたＥＳ細胞を更に改変して、図３ｂに示すように、ｆｒｔ部位、野生型ｌｏｘＰ部位及びネオマイシン耐性カセット３’によってｌｏｘＰ部位に隣接させたヒトＣＹＰ２Ｄ６発現カセットがＣｙｐ２ｄ２２遺伝子のエクソン３の下流に挿入されるようにした。
【０２２０】
ｌｏｘＰ部位におけるＣｒｅ介在組換えによってヒト発現カセットを維持しながらマウスＣｙｐ２ｄクラスターを欠失させることができるが、Ｃｙｐ２ｄ遺伝子座の完全なノックアウト（図３ｃに示す）をもたらすマウスクラスターとヒト発現カセットの同時欠失は、ｆｒｔ部位におけるＦｌｐ介在組換えの結果である。
【０２２１】
Ｃｒｅ介在又はＦｌｐ介在組換えによってマウスＣｙｐ２ｄクラスターの欠失を可能とするためには、クラスター両端におけるターゲティングを同一対立遺伝子上で行う必要がある。従って、Ｃｒｅを用いたインビトロ欠失によって二重標的ＥＳクローンを更に解析した後、クラスターの欠失を可能とするプライマー対を用いてＰＣＲ解析を行った。インビトロＣｒｅ欠失はトランスフェクト細胞の一部でしか生じず、また、欠失が成功した個々の細胞を選択することができないため、ＰＣＲ解析は欠失クローン及び未欠失クローンのプールに対して行った。ＰＣＲ陽性未欠失親クローンを胚盤胞に注入してキメラマウスを作出した。Ｃｒｅ又はＦｌｐ欠失株、或いは各リコンビナーゼを組織特異的に発現する株と交雑させた後に交雑受精させることによって、全身又は特定の組織において欠失し、ヒト発現カセットを含む（又は含まない）ホモ接合Ｃｙｐ２ｄクラスター欠失マウスが作出されよう。
【０２２２】
このホモ接合性クラスターＫＯ作出のＰＣＲによる実証を図３ｄに示す。
【０２２３】
Ｃｙｐ２ｄＫＯマウスにおけるブフラロールＰＫ
Ｃｙｐ２ｄ特異的基質であるブフラロールの薬物動態をＣｙｐ２ｄＫＯマウス（Ｃｙｐ２ｄアイソフォーム全てが無効化されたマウス）において検討した。野生型であるＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを対照として用いた。ブフラロールのＡＵＣは、野生型マウスと比べるとＣｙｐ２ｄＫＯマウスでは顕著に増加したことが示された（図３ｅ）。このことは、インビトロデータ（Bogaards et al., 2000）（即ち、ブフラロール水酸化の速度は、ヒト肝ミクロソームと比べてマウス肝ミクロソームでは〜１０倍高いことが示された）とよく関連付けられた。
【０２２４】
参考文献
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Zhou, J., Zhang, J., and Xie, W. (2005). Xenobiotic nuclear receptor-mediated regulation of UDP-glucuronosyl-transferases. Curr Drug Metab. 6, 289-98.
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬物代謝に関与する遺伝子のクラスターがノックアウトされた薬物代謝マウスモデルの作出に関する。
【背景技術】
【０００２】
治療用途や他の目的のための新しい薬物や化学薬品の開発は非常に複雑である。特に重要なのは、このような化学薬品が、適切な薬物動態を有していようと代謝の結果として何らかの安全性の問題を生じさせるものであろうと、体内でどのように処理されるか把握することである。薬物の代謝や処理(disposition)、排出に関与するタンパク質の多くは、遺伝子の数や機能、調節において非常に顕著な種差を示す多重遺伝子族のメンバーである。このような理由から、代謝経路や毒性を確かめるために実験動物で行う実験は、大幅に妥協したものになることがあり、その結果、ヒトの状況を忠実に示すことがなくなる。
【０００３】
このような複雑さの一例は、哺乳動物シトクロムＰ４５０系で見られる。即ち、この系では特定の代謝機能を担うタンパク質の多重遺伝子族のサイズが種によって大きく異なる。ヒトＰ４５０遺伝子をマウスゲノムに導入することによってヒト化マウスモデルを作出する提案が文献報告されている。しかし、導入と同時にマウス遺伝子を無効化しないと、該遺伝子の活性からの干渉が大きくなり、最終的には、その系からの如何なる読み出しも無意味になる。より高度なアプローチにおいては、ヒト化の際に等価なマウス遺伝子を無効化することが提案されており（ＷＯ２００６／０６４１９７参照）、これによってマウスの機能をヒト配列で置換することができる。
【０００４】
しかし、Nelsonら、２００４年（Pharmacogenomics 14(1): 1）によると、マウスには約７２種類の機能性遺伝子が存在するが、ヒトにおいては約２７種類しか存在しない。従って、多くの遺伝子に対し、直接的にオルソロガスな遺伝子は少なく（例えば、ＣＹＰ２Ｅ１やＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２）、ヒトにおいてはごく僅かな遺伝子しか存在しないが、マウスにおいて多数の等価な遺伝子が存在する。その例としては、ＣＹＰ２Ａ／２Ｂ遺伝子ファミリーやＣＹＰ２Ｄが挙げられる。ＷＯ２００６／０６４１９７では、個々のヒト遺伝子をクラスター内の複数の等価なマウス遺伝子と交換することが提案されており、これによって、マウスモデルでヒト薬物代謝の特性を詳細に解析することが可能になることが期待されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、マウスＰ４５０遺伝子のクラスターの機能をヒト等価物で置換せずに該クラスターを欠失させる試みは未だになされていない。このようなＰ４５０酵素によって行われる酵素反応は、非常に重要な生命プロセスに関与する。実際、多数のＣＹＰ遺伝子における変異は先天性代謝異常に関与し、また、数々の重要な臨床的に価値のある疾患に寄与する。
【０００６】
しかし、上述の重要な代謝機能の検討を可能にするマウスを作出できるよう、全シトクロムＰ４５０遺伝子クラスターを個々に組み合わせて欠失させることができれば非常に有利であろう。複数の遺伝子クラスターが欠失したマウスによって、化学／薬物動態や体内分布、毒性を定める上でのシトクロムＰ４５０系の一般的な役割を確認することができるであろう。このようなモデルはそれ自身でも、また、特定の遺伝子ファミリー又はクラスターに関してヒト化したモデルと組み合わせても非常に有用で多くの用途があると考えられる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明によると、薬物代謝酵素をコードする多重遺伝子クラスターの全てのメンバーが機能しないようにされており（rendered inoperable）、欠失クラスターの中の遺伝子と等価な機能を有するヒト置換遺伝子を含まないマウスが提供される。
【０００８】
本明細書においては、マウスの全組織内の特定のＰ４５０クラスターからシトクロムＰ４５０遺伝子全てを欠失させることによって、見かけ上正常で生存可能なマウス系が得られることが示される。この知見から、上述のシトクロムＰ４５０酵素に起因するハウスキーピング的な役割が、予測される表現型の結果と著しく違うことにおいて、結局は生存や受精に必須ではあり得ないことが暗示され、マウスにおける個々の複数のＰ４５０遺伝子クラスターノックアウトの開発への道が開かれる。
【０００９】
これはかなり驚くべきことである。現在まで文献においては、Ｐ４５０薬物代謝酵素をコードする遺伝子クラスターが欠失したマウスについては報告されていない。この一理由としては、シトクロムＰ４５０系が、外来化学薬品の代謝や処理において主な役割を果たすことに加え、胚発生や正常なホメオスタシスに必須の多数のホルモンの代謝や処理に関与することが分かっていることが考えられる。例としては、レチノイン酸やステロイドホルモンが挙げられる。全シトクロムＰ４５０遺伝子クラスターの欠失によって胚や新生児の致死がもたらされることが予想されよう。結局はこのようなことが生じないのは、かなり驚くべきことである。
【００１０】
こうして作出したモデルにおいては、上述の薬物代謝機能が完全に欠失している。従って、このようなモデルは幅広い潜在的用途を有する。第１の例においては、例えば、このようなモデルを用いて、薬物や化学薬品の有効性や毒性、薬物動態、分布におけるＰ４５０代謝の役割を確かめることができる。他の可能性は、第２相薬物代謝酵素のクラスター（例えば、ＵＧＴ１Ａ及び／又はＧＳＴ遺伝子）の完全な除去である。
【００１１】
本発明者らは、このような研究を行う際には、関連機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を試験動物においてできるだけ多く欠失させることが最も重要であると考えている。この一理由は、各種薬物代謝遺伝子同士の間（特に、Ｐ４５０遺伝子間）で高度な冗長性が見られるためである。一例としてはＣＹＰ２Ｄ６Ｐ４５０クラスターを挙げることができるが、該クラスターにおいては、ヒトにおける唯一の機能性遺伝子に対応して、基質特異性が重複する９種類の機能性遺伝子が存在する。この理由から、マウスクラスター内の遺伝子の１個のみを欠失させ、残りを機能性モジュールとして保持するのは殆ど意味がない。
【００１２】
「多重遺伝子クラスター」とは、薬物代謝酵素をコードする二を超える遺伝子のクラスターを意味する。本明細書において「クラスター」とは、二を超える遺伝子産物を産生する能力を有し、同一遺伝子の複数のスプライシングを含むゲノムの如何なる領域をも指す。
【００１３】
例えば、マウスには７種類のＰ４５０遺伝子クラスター、即ち、Ｃｙｐ２ａｂｆｇｓｔクラスター、Ｃｙｐ２ｃクラスター、Ｃｙｐ２ｄクラスター、Ｃｙｐ２ｊクラスター、Ｃｙｐ３ａクラスター、Ｃｙｐ４ａｂｘクラスター及びＣｙｐ４ｆクラスターが存在すると考えられる。
【００１４】
現在の知見によると、Ｃｙｐ２ａｂｆｇｓｔクラスターは次の機能性遺伝子、即ち、２ｓ１、２ｂ１０、２ｂ１３、２ｂ９、２ａ４、２ｂ２３、２ｂ１９、２ｇ１、２ａ５、２ａ２２、２ａ１２、２ｆ２及び２ｔ４を含む。従って、本発明はその一様相において、これらの遺伝子が全組織で機能しないようにされており、該クラスター内の遺伝子の機能に対して等価な機能を有する置換遺伝子を含まないマウスを提供する。これらの遺伝子１３種全てが欠失しているのが好ましいが、これらの遺伝子の一部のみ（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２種のみ）が欠失の対象とされ得る状況であってもよい。
【００１５】
現在の知見によると、Ｃｙｐ２ｃクラスターは次の機能性遺伝子、即ち、２ｃ５５、２ｃ６５、２ｃ６６、２ｃ２９、２ｃ３８、２ｃ３９、２ｃ６７、２ｃ６８、２ｃ４０、２ｃ６９、２ｃ３７、２ｃ５４、２ｃ５０、２ｃ７０及び２ｃ４４を含む。従って、本発明はその一様相において、これらの遺伝子が全組織で機能しないようにされており、該クラスター内の遺伝子の機能に対して等価な機能を有する置換遺伝子を含まないマウスを提供する。
【００１６】
これらの遺伝子１５種全てが欠失しているのが好ましいが、これらの遺伝子の一部のみ（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４種のみ）が欠失の対象とされ得る状況であってもよい。例えば、実施例２に記載のノックアウトから２ｃ４４遺伝子を特異的に排除したが、これは、該遺伝子が主要マウスＣｙｐ２ｃクラスターの４．１Ｍｂ下流に位置し、Ｃｙｐ遺伝子と何ら関係の無い遺伝子数個分だけ主要クラスターから離れていることに基づく。結果として、これらの無関係な遺伝子の除去は望ましくなく、得られる表現型を複雑にするであろう。
【００１７】
現在の知見によると、Ｃｙｐ２ｄクラスターは次の機能性遺伝子、即ち、２ｄ２２、２ｄ１１、２ｄ１０、２ｄ９、２ｄ１２、２ｄ３４、２ｄ１３、２ｄ４０及び２ｄ２６を含む。従って、本発明はその一様相において、これらの遺伝子が全組織で機能しないようにされており、該クラスター内の遺伝子の機能に対して等価な機能を有する置換遺伝子を含まないマウスを提供する。これらの遺伝子９種全てが欠失しているのが好ましいが、これらの遺伝子の一部のみ（例えば、３、４、５、６、７又は８種のみ）が欠失の対象とされ得る状況であってもよい。コーカソイドの約６％においては等価なヒト遺伝子クラスター発現からのＣＹＰ２Ｄ６の発現が無いため、このマウスクラスター内の遺伝子の欠失は実際に真のヒト多型を反映する。このタンパク質は神経遮断薬（例えば、抗うつ薬や統合失調症治療用薬物）の代謝において主要な役割を果たすため、かなり重要である。製薬会社はＣＹＰ２Ｄ６によって代謝される薬物を撤退（back）させたがらないため、薬物を開発している間にその薬物のＣＹＰ２Ｄ６ライアビリティーの有無をできるだけ早く知る必要がある。従って、ＣＹＰ２Ｄ６レベルの存在下及び非存在下の両方で薬物（特に抗うつ薬）の代謝について研究し得ることは大きな利益となる。
【００１８】
現在の知見によると、Ｃｙｐ２ｊクラスターは次の機能性遺伝子、即ち、２ｊ１３、２ｊ１２、２ｊ７、２ｊ１１、２ｊ８、２ｊ６、２ｊ９及び２ｊ５を含む。従って、本発明はその一様相において、これらの遺伝子が全組織で機能しないようにされており、該クラスター内の遺伝子の機能に対して等価な機能を有する置換遺伝子を含まないマウスを提供する。これらの遺伝子８種全てが欠失しているのが好ましいが、これらの遺伝子の一部のみ（例えば３、４、５、６又は７種のみ）が欠失の対象とされ得る状況であってもよい。
【００１９】
現在の知見によると、Ｃｙｐ３ａクラスターは次の機能性遺伝子、即ち、３ａ１３、３ａ５７、３ａ１６、３ａ４１、３ａ１１、３ａ２５及び３ａ５９を含む。従って、本発明はその一様相において、これらの遺伝子が全組織で機能しないようにされており、該クラスター内の遺伝子の機能に対して等価な機能を有する置換遺伝子を含まないマウスを提供する。これらの遺伝子７種全てが欠失していてもよいが、これらの遺伝子の一部のみ（例えば、３、４、５又は６種のみ）が欠失の対象とされ得る状況であってもよい。例えば、本発明の好ましい実施形態は、３ａ５７、３ａ１６、３ａ４１、３ａ１１及び３ａ２５遺伝子が欠失しているが、３ａ１３及び３ａ５９遺伝子の一方又は両方が無傷のまま残っているマウスである。これらの遺伝子の両方は物理的に該クラスターの外側に位置し、Ｃｙｐファミリーに属さない遺伝子によってＣｙｐ３ａ遺伝子の残りから離れている。Ｃｙｐと無関係の遺伝子の欠失は本発明のモデルの価値を分かりにくくするため、これは理想的ではなく、よってあまり好ましくない。また、これらの遺伝子も含むクラスターのノックアウトは技術的に難しく、該クラスターの残りの欠失も含む細胞においてＥＳ細胞レベルでこれらの特定遺伝子を更にノックアウトすることによってのみ成し得る。
【００２０】
現在の知見によると、Ｃｙｐ４ａｂｘクラスターは次の機能性遺伝子、即ち、４ｘ１、４ａ２９、４ａ１２ａ、４ａ１２ｂ、４ａ３０ｂ、４ａ１４、４ａ１０、４ａ３１、４ａ３２及び４ｂ１を含む。従って、本発明はその一様相において、これらの遺伝子が全組織で機能しないようにされており、該クラスター内の遺伝子の機能に対して等価な機能を有する置換遺伝子を含まないマウスを提供する。これらの遺伝子１０種全てが欠失しているのが好ましいが、これらの遺伝子の一部のみ（例えば、３、４、５、６、７、８又は９種のみ）が欠失の対象とされ得る状況であってもよい。
【００２１】
現在の知見によると、Ｃｙｐ４ｆクラスターは次の機能性遺伝子、即ち、４ｆ３９、４ｆ１７、４ｆ１６、４ｆ３７、４ｆ４０、４ｆ１５、４ｆ１４及び４ｆ１３を含む。従って、本発明はその一様相において、これらの遺伝子が全組織で機能しないようにされており、該クラスター内の遺伝子の機能に対して等価な機能を有する置換遺伝子を含まないマウスを提供する。これらの遺伝子８種全てが欠失しているのが好ましいが、これらの遺伝子の一部のみ（例えば、３、４、５、６又は７種のみ）が欠失の対象とされ得る状況であってもよい。
【００２２】
ＵＧＴ１Ａクラスターは次の機能性遺伝子、即ち、１ａ１、１ａ２、１ａ５、１ａ６、１ａ６ａ、１ａ７ｃ、１ａ８、１ａ９及び１ａ１０を含む。従って、本発明はその一様相において、これらの遺伝子が全組織で機能しないようにされており、該クラスター内の遺伝子の機能に対して等価な機能を有する置換遺伝子を含まないマウスを提供する。これらの遺伝子９種全てが欠失しているが、これらの遺伝子の一部のみ（例えば、３、４、５、６、７又は８種のみ）が欠失の対象とされ得る状況であってもよい。ＵＧＴ１ａ１遺伝子の欠失によって疾患が生じるため、この遺伝子を欠失させないのが好ましい。
【００２３】
本発明の方法においては、クラスター欠失の組合せも考えられる。従って、本発明の或る実施形態においては、複数のＰ４５０クラスターを機能しないようにすることができる。例えば、Ｃｙｐ２ａｂｆｇｓｔクラスター、Ｃｙｐ２ｃクラスター、Ｃｙｐ２ｄクラスター、Ｃｙｐ２ｊクラスター、Ｃｙｐ３ａクラスター、Ｃｙｐ４ａｂｘクラスター及びＣｙｐ４ｆクラスターのいずれか２種を同一動物内で欠失させることができる。他の実施形態においては、完全ヌルＰ４５０バックグラウンドのマウスを作出するために、該遺伝子クラスターの３種、４種、５種、６種又は全７種を欠失させることができる。ノックアウトするクラスターの好ましい組合せとしては、Ｃｙｐ３ａ、２ｃ及び２ｄの内の２種又は全３種を含むもの、例えば、Ｃｙｐ３ａとＣｙｐ２ｃ、Ｃｙｐ２ｃとＣｙｐ２ｄ、及びＣｙｐ３ａとＣｙｐ２ｄが挙げられる。Ｃｙｐ３ａ及びＣｙｐ２ｃクラスターの欠失の組合せが好ましく、これによってＰ４５０代謝の大部分がノックアウトされる。
【００２４】
これらのモデルは、同一遺伝子ファミリーのメンバー間（実際には、遺伝子ファミリー間）の機能的冗長性のため、個々のシトクロムＰ４５０アイソザイムの欠失に比べて大きな利益をもたらす。
【００２５】
本発明の動物の全組織においてＰ４５０の機能性が欠失しているのが好ましい。肝臓が薬物代謝に関して真に重要な唯一の組織であるという間違った考えが広く受け入れられている。真実はこれとは程遠く、実際、Ｐ４５０の機能は、肝臓以外の様々な組織（特に、消化管や血液脳関門等が挙げられる）で発現される。従って、全組織での機能の完全抑止は、Ｐ４５０クラスターノックアウトの作用を適切に評価するために必要である。現在利用可能な技術を用いる場合、このようなことは、胚性幹細胞段階でＰ４５０クラスター内の全遺伝子の発現をノックアウトする技術によってのみ実際に成し遂げられる。Ｐ４５０酵素に割り当てられている発生学的役割のため、その大規模なノックアウトは不可能であろうことが常に推測される。
【００２６】
従って、本発明のモデルは、特定のＰ４５０系が不活性化された他のモデルよりも利益をもたらす。他のモデルの一例としては、肝臓でしか生じないシトクロムＰ４５０レダクターゼの条件的不活性化が挙げられる。これに対し、本発明のモデルにおいては、好ましいことに該酵素の欠失が全組織で生じ得る。
【００２７】
ある状況下では、全クラスター又はクラスターの組合せのノックアウトが致死の原因となる可能性もあるが、本発明によると、このシナリオにおいては、一組織のみにおいて遺伝子、遺伝子の組合せ又はクラスターをノックアウトするのが好ましい場合もある。このような状況下でノックアウトを限定すべき最も適切な組織は、薬物代謝における役割を考慮すれば肝臓となるであろう。
【００２８】
また、多くの理由から、本発明の実験的アプローチもシトクロムＰ４５０阻害剤の使用に比べて大きな利益をもたらす。第一に、特異性を欠く阻害剤はそれ自体が薬理学的作用や毒物学的作用を有する。第二に、このような分子は慢性的な投薬状況下では用いることができない。更に、阻害剤は、試験対象の化合物の治療特性や毒物学的特性を調節することが多い。また、阻害剤は、特定の遺伝子ファミリー内の全シトクロムＰ４５０を等価な効力レベルで同時に阻害する能力を有しない。最後に、阻害剤を用いた実験は遥かに面倒且つ複雑で解釈が難しい。
【００２９】
本発明に係るマウス系の作出によって、ヒトにおける薬物反応や化学反応を決める因子に対する我々の理解が顕著に増すであろう。このようなモデルは、多くの異なるスクリーニングシナリオ（例えば、効力スクリーニングやＰＫ／ＰＤモデリング、薬物安全性試験等）に適用することができる。本発明のノックアウトモデルは、ヒトにおいて見られないげっ歯類特異性代謝産物が生成し、従来の動物試験から得た効力、ＰＫ／ＰＤ又は安全性の結果を分かりにくくしているような場合には特に注目され得る。
【００３０】
本発明のマウスモデルの有用性に関する根拠は、一般にＰ４５０代謝速度が遅いため、マウスが多くの薬物をヒトよりも遥かに速く（ほぼ１０倍速く）代謝することである。従って、等価な薬物の半減期がヒトにおいて数時間である場合には、マウスでは半減期は恐らく３０分間となるであろう。当然のことながら、マウスでは正常な処理経路がマスクされるという作用が得られるが、これは、該経路が有効になる機会が無いためである。従って、一以上のマウスＰ４５０クラスター（特に、支配的なＣｙｐ３ａ及び２ｃクラスター）を欠失させることによって、このような薬物処理経路を論点から排除する効果が得られる。このようなノックアウトマウスをヒトＰ４５０クラスターに関してヒト化することによって、ヒト薬物代謝経路を内在性マウス酵素からの干渉無しに評価することができるであろう。
【００３１】
本発明の動物モデルはそれ自体が薬物モデルとして興味深い。例えば、該動物モデルによって、欠失していなければ薬物を代謝する機能を有していたであろう酵素の非存在下で薬物代謝を評価することができる。従って、本発明の動物モデルによって、Ｐ４５０系内の冗長性の程度を評価することができ、第１の選択酵素が存在しない場合には他のＰ４５０酵素が引き継ぐことができる。また、これによって、第２の選択酵素が恐らく異なる反応経路を用いて作用し、通常は産生しないであろう毒性の二次代謝物を生じさせるかどうかを評価することもできる。
【００３２】
本発明のマウスの特徴は、Ｐ４５０クラスター内の遺伝子の機能に対して等価な機能を有する置換遺伝子を含まないことである。これは、該クラスターによってコードされるＰ４５０機能が真に機能しないようにされており、他の生体由来の相同又はオルソロガスなクラスターで置換されていないことを意味する。このような動物はそれ自身が有用であり、下流においても作出することができる（例えば、ヒトＰ４５０遺伝子クラスターをマウスに導入した動物）。しかし、このような動物については本発明の範囲から意図的に除外する。
【００３３】
「等価な機能」とは、機能しないようにするＰ４５０機能に対して機能的に取って代わることのできる如何なる遺伝子又は遺伝子クラスターをも意味する。従って、その例としては、他の生体における認知されたオルソロガスなカウンターパートが挙げられる。ヒト及びマウスのオルソログの例は当業者には公知であり、その多くはNelsonら、２００４年（Pharmacogenomics 14(1): 1）に記載されている。
【００３４】
本発明に係る好ましい薬物モデルは、Ｃｙｐ３ａクラスターが全組織で機能しないようにされており、Ｃｙｐ３ａクラスター内の遺伝子の機能に対して等価な機能を有する置換遺伝子を含まないマウスである。Ｃｙｐ３ａマウスクラスターに対するヒト等価遺伝子は、ＣＹＰ３Ａ４、３Ａ５、３Ａ７及び３Ａ４３である。遺伝子３ａ５７、３ａ１６、３ａ４１、３ａ１１、３ａ２５及び３ａ５９の全てが欠失した、本発明のこの様相に係るマウスの作出及び部分的特徴付けは実施例に記載されているが、このマウスは本発明の一様相を構成する。既存の定説によると、このようなホモ接合的欠失は胚の致死の原因となり得るため、上述のように、この遺伝子型の生存可能なマウスが作出されたということは大いに驚くべきことであると共に非常に意義のある結果である。
【００３５】
本発明のこの様相に係るＣｙｐ３ａクラスターＫＯの最初の特徴付けから、以下の表現型の特徴が明らかになった。
【００３６】
Ａ．一実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスの血漿臨床化学パラメータ（トリグリセリド、アラニントランスフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アルブミン、総ビリルビン、クレアチンキナーゼ、高密度リポタンパク質及び低密度リポタンパク質）は、未処理野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）の公知の正常範囲内である。
【００３７】
Ｂ．第二の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスの、ＩＰ投与後のミダゾラムの薬物動態プロファイルは、野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）で見られるのと同様の濃度／時間曲線下総面積である（即ち、野生型マウスの場合の８０％〜１２０％）。
【００３８】
Ｃ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスに対しリファンピシンで前処理（例えば、６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）した上でミダゾラムをＩＰ投与した後の算出濃度／時間曲線下総面積が、未処理Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯマウスの場合と比べて、好ましくは１７０％〜３７０％、より好ましくは２２０％〜３２０％、より好ましくは２４０％〜３００％、より好ましくは２５０％〜２９０％、より好ましくは２６０％〜２８０％、より好ましくは２６５％〜２７５％減少している。
【００３９】
Ｄ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、肝ミクロソームによる７−ベンジルオキシキノリンの酸化に関して野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて有意な低下、即ち、野生型マウスで記録されたものに対して＜５０％のレベル、より好ましくは＜４０％のレベル、より好ましくは＜３０％のレベル、より好ましくは＜２０％のレベルまでの低下が見られる。
【００４０】
Ｅ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、肝ミクロソームによるミダゾラムの１’−水酸化に関して野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて有意な低下、即ち、野生型マウスで記録されたものに対して＜５０％のレベル、より好ましくは＜４０％のレベル、より好ましくは＜３０％のレベル、より好ましくは＜２０％のレベルまでの低下が見られる。
【００４１】
Ｆ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、リファンピシンによる前処理（例えば、６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）後の肝ミクロソームによるミダゾラムの１’−水酸化に関して野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて有意な低下、即ち、野生型マウスで記録されたものに対して＜５０％のレベル、好ましくは＜４０％のレベル、より好ましくは＜３０％のレベル、より好ましくは＜２０％のレベル、より好ましくは＜１０％のレベルまでの低下が見られる。
【００４２】
Ｇ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、肝ミクロソームによるミダゾラムの４’−水酸化に関して野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて有意な低下、即ち、野生型マウスで記録されたものに対して＜８０％のレベル、好ましくは＜７０％のレベル、より好ましくは＜６５％のレベルまでの低下が見られる。
【００４３】
Ｈ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、リファンピシンによる前処理（例えば、６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）後の肝ミクロソームによるミダゾラムの４’−水酸化に関して野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて有意な低下、即ち、野生型マウスで記録されたものに対して＜５０％のレベル、好ましくは＜４０％のレベル、より好ましくは＜３５％のレベル、好ましくは＜３０％のレベル、より好ましくは＜２５％のレベルまでの低下が見られる。
【００４４】
Ｉ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、リファンピシンによる処理（例えば、６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）後のミダゾラムの水酸化が未処理Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯマウスと比べて僅かに増加、即ち、好ましくは１０１％〜１５０％、より好ましくは１１０％〜１４０％、より好ましくは１２０〜１３０％増加する。また、水酸化の増加は、野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）においてリファンピシン処理時の水酸化で見られる増加に比べて有意に少なく、水酸化の増加は野生型マウスで見られる増加の＜６０％が好ましく、野生型マウスで見られる増加の＜５０％が好ましく、野生型マウスで見られる増加の＜４０％がより好ましく、野生型マウスで見られる増加の＜３５％がより好ましい。
【００４５】
Ｊ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、リファンピシンによる前処理（例えば、６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）に続くミダゾラムのＩＶ投与後の１’−ヒドロキシミダゾラムの薬物動態プロファイルにおいて、ＡＵＣが野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）で記録されたものに比べて低く、即ち、ＡＵＣは野生型マウスで記録されたものの＜６０％が好ましく、＜５０％がより好ましく、＜４０％がより好ましく、＜３５％がより好ましい。
【００４６】
Ｋ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、リファンピシンによる前処理（例えば、６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）に続くミダゾラムの経口投与後の１’−ヒドロキシミダゾラムの薬物動態プロファイルにおいて、ＡＵＣが野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）で記録されたものに比べて低く、即ち、ＡＵＣは野生型マウスで記録されたものの＜９０％が好ましく、＜８５％がより好ましく、＜８０％がより好ましい。
【００４７】
Ｌ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、リファンピシンによる前処理（例えば、６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）後の肝ミクロソームによる７−ベンジルオキシキノリンの酸化に関して野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて有意な低下、即ち、野生型マウスで記録されたものに対して＜５０％のレベル、より好ましくは＜４０％のレベル、より好ましくは＜３０％のレベル、より好ましくは＜２０％のレベル、より好ましくは＜１０％のレベルまでの低下が見られる。
【００４８】
Ｍ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、リファンピシンによる前処理（例えば、６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）後の肝ミクロソームによるトリアゾラムの酸化に関して野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて有意な低下、即ち、野生型マウスで記録されたものに対して＜５０％のレベル、より好ましくは＜２５％のレベル、より好ましくは＜１０％のレベル、より好ましくは＜５％のレベル、より好ましくは＜２．５％のレベルまでの低下が見られる。
【００４９】
Ｎ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、リファンピシンによる前処理（例えば、６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）後の腸ミクロソームによるトリアゾラムの酸化に関して野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて有意な低下、即ち、野生型マウスで記録されたものに対して＜５０％のレベル、より好ましくは＜２５％のレベル、より好ましくは＜１０％のレベル、より好ましくは＜５％のレベル、より好ましくは＜２．５％のレベルまでの低下が見られる。
【００５０】
Ｏ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、リファンピシンによる前処理（例えば、６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）後の肝ミクロソームによるニフェジピンの酸化に関して野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて有意な低下、即ち、野生型マウスで記録されたものに対して＜５０％のレベル、より好ましくは＜４０％のレベル、より好ましくは＜３５％のレベル、より好ましくはＣ５７ＢＬ／６Ｊの＜３０％のレベル、より好ましくは＜２５％のレベルまでの低下が見られる。
【００５１】
Ｐ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、リファンピシンによる前処理（例えば、６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）後の肝ミクロソームによるテストステロンの６β水酸化に関して野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて有意な低下、即ち、野生型で記録されたものに対して＜５０％のレベル、より好ましくは＜４０％のレベル、より好ましくは＜３５％のレベル、より好ましくは＜３０％のレベルまでの低下が見られる。
【００５２】
Ｑ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、リファンピシンによる前処理（例えば、６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）後の肝ミクロソームによるテストステロンの１６β水酸化に関して野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて有意な増加、即ち、野生型マウスで記録されたものに対して＞１５０％のレベル、より好ましくは＞２００％のレベル、より好ましくは＞２５０％のレベル、より好ましくは＞３００％のレベルまでの増加が見られる。
【００５３】
Ｒ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、リファンピシンによる前処理（例えば、６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）後の肝ミクロソームによるジベンジルフルオレシンの酸化に関して野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて有意な低下、即ち、野生型マウスで記録されたものに対して＜２５％のレベル、より好ましくは＜２０％のレベル、より好ましくは＜１５％のレベル、より好ましくは＜１２．５％のレベルまでの低下が見られる。
【００５４】
Ｓ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、リファンピシンによる前処理（例えば、６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）後の腸ミクロソームによる４−トリフルオロメチルクマリンの野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べての有意な増加、即ち、野生型マウスで記録されたものに対して＞１５０％のレベル、より好ましくは＞１７５％のレベル、より好ましくは＞２００％のレベルまでの増加が見られる。
【００５５】
Ｔ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べてベンゾキシレゾルフィンＯ−脱ベンジル化活性の低下、即ち、野生型マウスで記録されたものに対して好ましくは＜９０％のレベル、より好ましくは＜８０％のレベル、より好ましくは＜７０％のレベル、より好ましくは＜６０％のレベル、より好ましくは＜５０％のレベルまでのＯ−脱ベンジル化活性の低下が見られる。
【００５６】
Ｕ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、リファンピシンで前処理（例えば、６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）を行った際、野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べてベンゾキシレゾルフィンＯ−脱ベンジル化活性の低下、即ち、野生型マウスで記録されたものに対して好ましくは＜５０％のレベル、より好ましくは＜４０％のレベル、より好ましくは＜３５％のレベル、より好ましくは＜３０％のレベルまでのＯ−脱ベンジル化活性の低下が見られる。
【００５７】
Ｖ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスは、実施形態Ａ〜Ｕの代謝表現型の内の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又は全２１種を示す。
【００５８】
Ｗ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、ウェスタンブロッティングで確認される検出可能レベルのＣｙｐ３ａは肝ミクロソームにおいては発現されない。
【００５９】
Ｘ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、ウェスタンブロッティングで確認される肝ミクロソームでのＣｙｐ１ａの発現レベルがＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスと比べて高い。
【００６０】
Ｙ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、ウェスタンブロッティングで確認される肝ミクロソームにおけるＣｙｐ２ｃタンパク質の発現が野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて増加する。
【００６１】
Ｚ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、ウェスタンブロッティングで確認される肝ミクロソームにおけるＣｙｐ２ｄタンパク質のレベルが野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて正常であり、肝ミクロソームにおけるＣｙｐ２ｄタンパク質のレベルが野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて高い。
【００６２】
ＡＡ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、ウェスタンブロッティングで確認される肝ミクロソーム及び腸ミクロソームの両方におけるＣｙｐ２ｅタンパク質のレベルに関し、野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて有意差が無い。
【００６３】
ＡＢ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、シトクロムＣレダクターゼ活性で確認されるＰ４５０オキシドレダクターゼ（ＰＯＲ）タンパク質の発現レベルに関し、野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて有意差が無い。
【００６４】
ＡＣ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、総Ｐ４５０レベルは野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）で記録されたものに比べて有意に高いが、リファンピシンによる前処理（例えば、６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）の際には有意に変化しない。
【００６５】
ＡＤ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスは、実施形態Ｗ〜ＡＣのタンパク質発現表現型の内の１、２、３、４、５、６又は全７種を示す。
【００６６】
ＡＥ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、Ｃｙｐ３ａ１１、Ｃｙｐ３ａ１６及びＣｙｐ３ａ２５の肝転写産物（liver transcript）レベルが野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて、好ましくは＞５０倍、より好ましくは＞１００倍、より好ましくは＞１００倍抑制されている。
【００６７】
ＡＦ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、Ｃｙｐ４ａ１３の肝転写産物レベルが野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて、より好ましくは＞５倍、より好ましくは＞１０倍、より好ましくは＞１２．５倍、より好ましくは＞１５倍抑制されている。
【００６８】
ＡＧ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、Ｃｙｐ２ｃ３８の肝転写産物レベルが野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて、好ましくは＞２倍、より好ましくは＞３倍、より好ましくは＞４倍、より好ましくは＞４．５倍アップレギュレートされている。
【００６９】
ＡＨ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、Ｃｙｐ２ａ４の肝転写産物レベルが野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて、好ましくは＞１．５倍、より好ましくは＞２倍、より好ましくは＞２．５倍、より好ましくは＞２．８倍アップレギュレートされている。
【００７０】
ＡＩ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、ＧＳＴＰ１の肝転写産物レベルが野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて、好ましくは＞１．５倍、より好ましくは＞２倍、より好ましくは＞２．４倍アップレギュレートされている。
【００７１】
ＡＪ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、ＭＧＳＴ３の肝転写産物レベルが野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて、好ましくは＞１．５倍、より好ましくは＞２倍、より好ましくは＞２．３倍抑制されている。
【００７２】
ＡＫ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、ＵＧＴ２Ｂ１７の肝転写産物レベルが野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて、好ましくは＞１．５倍、より好ましくは＞２倍、より好ましくは＞２．５倍、より好ましくは＞２．８倍アップレギュレートされている。
【００７３】
ＡＬ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、ＡＢＣＢ１０の肝転写産物レベルが野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて、好ましくは＞１．５倍、より好ましくは＞２倍、より好ましくは＞２．２倍アップレギュレートされている。
【００７４】
ＡＭ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、ＣＡＭＫ２Ｂの肝転写産物レベルが野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて、好ましくは＞１．５倍、より好ましくは＞２倍、より好ましくは＞２．６倍アップレギュレートされている。
【００７５】
ＡＮ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、ＣＩＴＥＤ２の肝転写産物レベルが野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて、好ましくは＞１．５倍、より好ましくは＞２倍、より好ましくは＞２．２倍アップレギュレートされている。
【００７６】
ＡＯ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、ＤＮＡＪＣ１２の肝転写産物レベルが野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて、好ましくは＞２倍、より好ましくは＞３倍、より好ましくは＞４．１倍抑制されている。
【００７７】
ＡＰ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、ＦＭＯ５の肝転写産物レベルが野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて、好ましくは＞２倍、より好ましくは＞２．５倍、より好ましくは＞３倍アップレギュレートされている。
【００７８】
ＡＱ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、ＨＳＤ２Ｂ３の肝転写産物レベルが野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて、好ましくは＞２倍、より好ましくは＞２．５倍、より好ましくは＞３倍アップレギュレートされている。
【００７９】
ＡＲ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、ＪＵＮの肝転写産物レベルが野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて、好ましくは＞２倍、より好ましくは＞３倍、より好ましくは＞４倍、より好ましくは＞４．１倍抑制されている。
【００８０】
ＡＳ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、ＪＵＮＢの肝転写産物レベルが野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて、好ましくは＞３倍、より好ましくは＞４倍、より好ましくは＞５倍、より好ましくは＞５．１倍抑制されている。
【００８１】
ＡＴ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、ＭＡＰ２Ｋ６の肝転写産物レベルが野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて、好ましくは＞２倍、好ましくは＞２．５倍、好ましくは＞３倍、好ましくは＞３．３倍アップレギュレートされている。
【００８２】
ＡＵ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、ＭＡＰ３Ｋ１の肝転写産物レベルが野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて、好ましくは＞１．５倍、より好ましくは＞２倍、より好ましくは＞２．３倍抑制されている。
【００８３】
ＡＶ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、ＭＡＰ３Ｋ３の肝転写産物レベルが野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて、好ましくは＞２倍、より好ましくは＞２．５倍、より好ましくは＞２．８倍抑制されている。
【００８４】
ＡＷ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、ＳＴＩＰ１の肝転写産物レベルが野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて、好ましくは＞１．５倍、より好ましくは＞２倍、より好ましくは＞２．３倍アップレギュレートされている。
【００８５】
ＡＸ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、Ｃｙｐ２ａ４の肝転写産物レベルがリファンピシンによる株の前処理（例えば、６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）後に野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて、好ましくは＞２倍、より好ましくは＞２．５倍、より好ましくは＞３倍、より好ましくは＞３．４倍アップレギュレートされている。
【００８６】
ＡＹ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、Ｃｙｐ２ｂ１３の肝転写産物レベルがリファンピシンによる株の前処理（例えば、６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）後に野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて、好ましくは＞２．５倍、より好ましくは＞４倍、より好ましくは＞４．５倍、より好ましくは＞５倍、より好ましくは＞５．５倍アップレギュレートされている。
【００８７】
ＡＺ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、Ｃｙｐ２ｂ１０の肝転写産物レベルがリファンピシンによる株の前処理（例えば、６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）後に野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて、好ましくは＞４倍、好ましくは＞５倍、好ましくは＞６倍、好ましくは＞７倍、好ましくは＞７．２倍アップレギュレートされている。
【００８８】
ＢＡ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、Ｃｙｐ２ｂ９の肝転写産物レベルがリファンピシンによる株の前処理（例えば、６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）後に野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて、好ましくは＞２倍、より好ましくは＞２．５倍、より好ましくは＞３倍、より好ましくは＞３．２倍アップレギュレートされている。
【００８９】
ＢＢ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、Ｃｙｐ２ｃ５４の肝転写産物レベルがリファンピシンによる株の前処理（例えば、６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）後に野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて、好ましくは＞２倍、より好ましくは＞２．５倍、より好ましくは＞２．７倍アップレギュレートされている。
【００９０】
ＢＣ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、Ｃｙｐ２ｃ５４の肝転写産物レベルがリファンピシンによる株の前処理（例えば、６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）後に野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて、好ましくは＞２倍、より好ましくは＞２．５倍、より好ましくは＞２．７倍アップレギュレートされている。
【００９１】
ＢＤ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、Ｃｙｐ４ａ２ｂの肝転写産物レベルがリファンピシンによる株の前処理（例えば、６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）後に野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて、好ましくは＞２倍、より好ましくは＞２．５倍、より好ましくは＞３倍、より好ましくは＞３．３倍アップレギュレートされている。
【００９２】
ＢＥ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、ＭＧＳＴ１の肝転写産物レベルがリファンピシンによる株の前処理（例えば、６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）後に野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて、好ましくは＞２倍、より好ましくは＞２．５倍、より好ましくは＞２．７倍アップレギュレートされている。
【００９３】
ＢＦ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、ＭＧＳＴ３の肝転写産物レベルがリファンピシンによる株の前処理（例えば、６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）後に野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて、好ましくは＞１．５倍、より好ましくは＞２倍、より好ましくは＞２．４倍抑制されている。
【００９４】
ＢＧ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、ＡＢＣＤ１の肝転写産物レベルがリファンピシンによる株の前処理（例えば、６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）後に野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて、好ましくは＞２倍、より好ましくは＞２．５倍、より好ましくは＞２．７倍アップレギュレートされている。
【００９５】
ＢＨ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、ＡＢＣＤ３の肝転写産物レベルがリファンピシンによる株の前処理（例えば、６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）後に野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて、好ましくは＞２倍、より好ましくは＞２．５倍、より好ましくは＞３倍、より好ましくは＞３．５倍アップレギュレートされている。
【００９６】
ＢＩ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、ＡＢＣＧ８の肝転写産物レベルがリファンピシンによる株の前処理（例えば、６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）後に野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて、好ましくは＞２倍、より好ましくは＞２．５倍、より好ましくは＞２．７倍アップレギュレートされている。
【００９７】
ＢＪ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、ＡＲＫ１Ｃ１４の肝転写産物レベルがリファンピシンによる株の前処理（例えば、６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）後に野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて、好ましくは＞２倍、より好ましくは＞２．５倍、より好ましくは＞２．７倍アップレギュレートされている。
【００９８】
ＢＫ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、ＣＡＭＫ２Ｂの肝転写産物レベルがリファンピシンによる株の前処理（例えば、６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）後に野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて、好ましくは＞２倍、より好ましくは＞３倍、より好ましくは＞３．７倍アップレギュレートされている。
【００９９】
ＢＬ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、ＣＩＴＥＤ２の肝転写産物レベルがリファンピシンによる株の前処理（例えば、６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）後に野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて、好ましくは＞２倍、より好ましくは＞２．５倍、より好ましくは＞２．８倍アップレギュレートされている。
【０１００】
ＢＭ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、ＦＭＯ５の肝転写産物レベルがリファンピシンによる株の前処理（例えば、６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）後に野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて、好ましくは＞２倍、より好ましくは＞３倍、より好ましくは＞４倍、より好ましくは＞４．７倍アップレギュレートされている。
【０１０１】
ＢＮ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、ＨＳＤ３Ｂ３の肝転写産物レベルがリファンピシンによる株の前処理（例えば、６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）後にＣ５７ＢＬ／６Ｊと比べて、好ましくは＞２倍、より好ましくは＞３倍、より好ましくは＞４倍、より好ましくは＞４．９倍アップレギュレートされている。
【０１０２】
ＢＯ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、ＪＵＮＢの肝転写産物レベルがリファンピシンによる株の前処理（例えば、６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）後に野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて、好ましくは＞２倍、より好ましくは＞２．５倍、より好ましくは＞３倍抑制されている。
【０１０３】
ＢＰ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、ＭＡＰ２Ｋ６の肝転写産物レベルがリファンピシンによる株の前処理（例えば、６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）後に野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて、好ましくは＞２倍、より好ましくは＞２．５倍、より好ましくは＞３倍、より好ましくは＞３．６倍アップレギュレートされている。
【０１０４】
ＢＱ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、ＭＡＰ３Ｋ１の肝転写産物レベルがリファンピシンによる株の前処理（例えば、６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）後に野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と比べて、好ましくは＞２倍、好ましくは＞２．５倍、好ましくは＞２．７倍抑制されている。
【０１０５】
ＢＲ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスは、実施形態ＡＥ〜ＢＱのトランスクリプトーム表現型の内の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８又は全３９種を示す。
【０１０６】
ＢＳ．他の実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスは、実施形態Ａ〜ＢＲの表現型の特徴の内の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０又は全７１種を示す。
【０１０７】
本発明に係る他の好ましいモデルは、Ｃｙｐ２ｃクラスターが全組織で機能しないようにされており、Ｃｙｐ２ｃクラスター内の遺伝子の機能に対して等価な機能を有する置換遺伝子を含まないマウスである。Ｃｙｐ２ｃマウスクラスターに対するヒト等価遺伝子は２Ｃ８、２Ｃ９、２Ｃ１８及び２Ｃ１９である。遺伝子２ｃ５５、２ｃ６５、２ｃ６６、２ｃ２９、２ｃ３８、２ｃ３９、２ｃ６７、２ｃ６８、２ｃ４０、２ｃ６９、２ｃ３７、２ｃ５４、２ｃ５０、２ｃ７０及び２ｃ４４の全てが全組織で機能しないようにされている本発明のこの様相に係るマウスを作出するための戦略は実施例に記載される。ホモ接合体Ｃｙｐ２ｃノックアウトマウスが作出された。
【０１０８】
本発明に係る他の好ましいモデルは、Ｃｙｐ２ｄクラスターが全組織で機能しないようにされており、Ｃｙｐ２ｄクラスター内の遺伝子の機能に対して等価な機能を有する置換遺伝子を含まないマウスである。Ｃｙｐ２ｄマウスクラスターに対するヒト等価遺伝子は２Ｄ６、２Ｄ７及び２Ｄ８である。遺伝子２ｄ２２、２ｄ１１、２ｄ１０、２ｄ９、２ｄ１２、２ｄ３４、２ｄ１３、２ｄ４０及び２ｄ２６の全てが全組織で機能しないようにされている本発明のこの様相に係るマウスを作出するための戦略は実施例に記載されている。ホモ接合体Ｃｙｐ２ｄノックアウトマウスが作出された。
【０１０９】
一実施形態においては、本発明のこの様相に係るマウスでは、ブフラロールＩＰ投与後の算出した濃度／時間曲線下総面積が、野生型マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）の場合と比べて、好ましくは＞５倍、より好ましくは＞１０倍、より好ましくは＞１５倍、より好ましくは＞２０倍増加する。
【０１１０】
本発明に係る更に好ましいモデルは、Ｃｙｐ３ａクラスター及びＣｙｐ２ｃクラスターの両方が全組織で機能しないようにされているマウスである。遺伝子３ａ５７、３ａ１６、３ａ４１、３ａ１１、３ａ２５、３ａ５９、２ｃ５５、２ｃ６５、２ｃ６６、２ｃ２９、２ｃ３８、２ｃ３９、２ｃ６７、２ｃ６８、２ｃ４０、２ｃ６９、２ｃ３７、２ｃ５４、２ｃ５０、２ｃ７０及び２ｃ４４の全てが欠失した、本発明のこの様相に係るマウスの作出及び部分的特徴付けは実施例に記載されているが、このマウスは本発明の一様相を構成する。
【０１１１】
本発明においては、如何なるＰ４５０クラスターをも機能しないようにすることができる。「機能しないようにする」とは、遺伝子又は遺伝子機能を欠失させることを意味する。これは、遺伝子のコード配列をマウスゲノムから完全に欠失させることによって行うことができる。或いは、コード配列を他の配列の挿入、欠失又は置換によって変異させて欠失させることができる。例えば、一以上の変異（フレームシフト変異等）は、得られるＲＮＡ転写産物が非機能性タンパク質又は切断型タンパク質をコードするように生じさせることができる。或いは、染色体配列に挿入を行ってアミノ酸コードを分断することができる。
【０１１２】
同様に、欠失対象のＰ４５０遺伝子配列をある配列（例えば、成功した欠失体をスクリーニングするための基準として用いることができる選択配列やマーカー配列）と交換することができる。このような一戦略はWallaceら（Cell 128, 197-209 2007）によって考案されており、遺伝子交換のコンテクスト内ではあるが、本発明の方法に適用可能である。この方法では、ベクターを用いた置換配列が内在性ゲノムマウス配列に取って代わるのに２種の分子間相同組換えイベントが必要となるような、マウス染色体とＢＡＣ又はＹＡＣベクターとの間での配列の交換が想定されている。
【０１１３】
好ましい一システムにおいては、相同組換えのメカニズムを用いて遺伝子クラスターを該クラスターが存在しない他の配列と交換する。このような方法は、次の段階：
ａ）置換対象のマウス標的遺伝子クラスターが各々の端で組換え部位と隣接するように相同組換えによってマウス染色体に一対の部位特異的組換え部位を組込むことと、
ｂ）部位特異的組換え部位間で組換えを行い、マウス標的遺伝子クラスターが染色体から除去され、残存部位特異的組換え部位で置換されるようにすることと、を含むのが好ましい。
【０１１４】
相同組換えを行うための方法は当該技術分野では公知であり、外部から供給されたＤＮＡ分子と標的染色体との間で相同領域を用いてＲＴ部位を導入する。この方法においては、置換配列内の５’及び３’相同アームによって置換配列と標的との間の組換えが促進され、遺伝子クラスターが欠失されるようになる。この戦略を用いた方法は、本出願人による２００７年９月１４日出願の同時係属特許出願Ｎｏ．ＧＢ０７１８０２９．２「発明の名称：二段階のクラスター欠失及びヒト化」に報告されている。この戦略は上述のWallaceの技術に比べて遥かに効率的であり、分子内組換えイベントが約１０6分の１の頻度で生じる。
【０１１５】
しかし、多くのクラスターは数百キロベースのゲノムの相当のストレッチに及ぶ。一例としてはマウスＣＹＰ３ａ遺伝子クラスターが挙げられ、Ｃｙｐ３ａ１３が含まれていなくても約８００ｋｂに及ぶ。このようなシナリオにおいては、２種の別個の置換核酸をその間にクラスター全体が広がるようにマウスゲノム内に導入し、その後、この２種の置換核酸間での組換えによって該核酸間にある遺伝子クラスターを除去する戦略を用いるのが遥かに効率的である。
【０１１６】
この構成においては、置換配列の各々は、５’相同アームと３’相同アームとの間に選択マーカー及び少なくとも１種のリコンビナーゼ標的（ＲＴ）部位（例えば、ｌｏｘＰやｌｏｘ５１７１、ＦＲＴ、Ｆ３）があるようにデザインする。このように、両方の置換核酸をうまく組込んで、欠失対象クラスターに隣接するように選択することが可能である。ＲＴ部位を認識する適切な部位特異的リコンビナーゼ（ＳＳＲ）にマウス細胞を曝露することによってクラスターを除去するのは技術的に容易である。「ＳＳＲ」とは、特定のＤＮＡ遺伝子座におけるＤＮＡ再構成を仲介する組換え系の如何なるタンパク質成分をも意味し、例えば、インテグラーゼ又はレゾルバーゼ／インベルターゼクラスのＳＳＲ（Abremski, K.E. and Hoess, R.H. (1992) Protein Engineering 5, 87-91; Khan, et al, (1991) Nucleic acids Res. 19, 851-860; Nunes-Duby et al, (1998) Nucleic Acids Res 26 391-406; Thorpe and Smith, (1998) P.N.A.S USA 95 5505-10）及びイントロンコード化エンドヌクレアーゼによって仲介される部位特異的組換え（Perrin et al, (1993) EMBO J. 12, 2939-2947）が挙げられる。ＳＳＲ酵素活性に曝露することによって、ＲＴ部位の配置で確認されるＤＮＡ再構成が生じ、その結果、直線ＤＮＡ分子内で介在配列が除去又は切除される。
【０１１７】
当該技術分野で周知であり、以下に更に説明する方法に従って、上述の組換え段階はマウス胚性幹細胞内で行うのが好ましい。胚性幹細胞は全能性細胞の培養細胞株であり、該細胞を初期胚に導入すると発育して生体の全組織に定着するようになる。
【０１１８】
本発明の方法の第１の段階は、一対のＲＴ部位をマウス染色体内に組込むことである。置換対象のマウス標的遺伝子クラスター配列は、各々の端においてＲＴ部位と隣接する必要がある。２個のＲＴ部位間での組換えによって介在遺伝子クラスターが切除される。ＲＴ部位を染色体内に組込むための方法は当業者には公知であろうが、相同組換えプロセスを用いて行うのが好ましい。
【０１１９】
ＲＴ対は、ＬｏｘＰ、ＦＲＴ、ａｔｔＰ／ａｔｔＢ及びｒｏｘ（Sauer and McDermott. Nucleic Acids Res. 32(20): 6086-95, 2004）から成る群から選択されるのが好ましい。このリストはほんの一例として挙げたに過ぎず、これらに限定されるものではない。この様相においては、前記部位特異的組換え部位対間の組換えは、対応する部位特異的リコンビナーゼ（即ち、Ｃｒｅ、ＦＬＰ、ＰｈｉＣ３１及びＤｒｅ）によって行われる。前記部位特異的組換えはインビボ又はインビトロで実施し得ることは理解されよう。
【０１２０】
実際には、各ＲＴ部位は、選択可能マーカーと連結する（好ましくは、連続する）ように構築する必要がある。選択可能マーカーを組込むことによってマウス染色体内のＲＴ部位を検出することができ、それによって、ＲＴ部位対の挿入が成功したかどうかをモニターすることができる。各選択可能マーカーは、マウス標的配列とＲＴ部位との間の空間にあるように配置するのが好ましい。これは、組換えが成功した際には、選択可能マーカーが染色体から除去され、本発明の方法においてはこれ以上参加しないことを意味する。このように、ヒト化後に染色体内に残るヒト配列の調節を選択可能マーカーが乱すことがないことは確実であり得る。選択可能マーカーの各々は互いに異なっているのが好ましい。これによって、各組換え部位の挿入を互いに別々に独立してモニターすることができる。選択可能マーカーは、成長ＥＳ細胞が曝露され得る化学化合物（例えば、抗生物質）に対するある種の耐性をコードする遺伝子であるのが好ましい。その例としては、細胞成長培地に添加される抗生物質に対する耐性を付与する選択可能マーカー（例えば、Ｇ４１８、ハイグロマイシン又はピューロマイシンに対する耐性を付与するネオマイシン耐性マーカー）の使用が挙げられる。更なる例としては、本発明の上述の様相における核酸配列（又はその一部）に相補的であり、それに対してハイブリダイズする核酸配列を用いた検出が挙げられる。例えば、サザンブロット解析やノーザンブロット解析、ＰＣＲが挙げられる。
【０１２１】
好ましい戦略においては、変化したマウス胚性幹細胞の作出（好ましくは、別々の段階での作出）を伴い、これによって、各ＲＴ部位がその選択可能マーカーと共に別々に組込まれる。その後、変化した胚性幹細胞を胚盤胞に挿入することができる。従来、胚盤胞は雌性マウスから交配の約３日後に単離している。最大２０個の変化した胚性幹細胞（好ましくは、約１６個）をそのような胚盤胞に同時に挿入し得ることは理解されよう。変化した胚性幹細胞を胚盤胞に挿入することにより、好ましくは、妊娠マウスの特性を反映するように誘導された偽妊娠マウスに移植することによって、胚性幹細胞は発育初期胚に組込まれるようになる。この方法によると、変化した胚性幹細胞を含む胚盤胞は偽妊娠マウスの子宮壁内に移植され、妊娠期間が終了するまで該マウス内で発育し続ける。変化した胚性幹細胞は増殖し、分裂して発育トランスジェニックマウスの全組織（生殖系列を含む）に定着するようになる。
【０１２２】
本発明の方法の一様相においては、作出したトランスジェニックマウスは、各体細胞組織及び生殖系列内に変化した細胞と未変化の細胞を含むキメラとなり得る。
【０１２３】
大きいＤＮＡ断片（２００ｋｂ〜数メガベース）の欠失に適したＣｒｅ／ｌｏｘ介在欠失を仲介するための方法は以下の論文に記載されている（Li ZW, Stark G, Gotz J, Rulicke T, Gschwind M, Huber G, Muller U, Weissmann C. Generation of mice with a 200-kb amyloid precursor protein gene deletion by Cre recombinase-mediated site-specific recombination in embryonic stem cells Proc Natl Acad Sci U S A. 1996 Jun 11;93(12):6158-62. Erratum in: Proc Natl Acad Sci U S A 1996 Oct 15;93(21):12052; in Su H, Wang X, Bradley A. Nested chromosomal deletions induced with retroviral vectors in mice. Nat Genet. 2000 Jan;24(l):92-5）; Call LM, Moore CS, Stetten G, Gearhart JD. A cre-lox recombination system for the targeted integration of circular yeast artificial chromosomes into embryonic stem cells. Hum Mol Genet. 2000 JuI 22;9(12):1745-51）。
【０１２４】
ＲＴ部位間で組換えを行うためには、ゲノムをＳＳＲ酵素形態のＳＳＲ活性に曝露する必要がある。上述のように、部位特異的組換えイベントはインビトロ又はインビボで行うことができる。部位特異的組換えは、トランスジェニックマウス内でＳＳＲの活性を誘導することによって行うことができる。実際、生体系で遺伝子型を変化させるために部位特異的組換えをうまく利用するには、組換えイベントを調節するための戦略が必要である。これは、得られる発現パターンが上述の組織特異的な要素が活性となる時間及び場所に制限されるように、リコンビナーゼｍＲＮＡ又はタンパク質の発現を制御することによって行うことができる（Baubonis and Sauer (1993) Nucl Acids Res. 21, 2025-2029; Sauer B, (1994) Curr Opin Biotechnol 5:521-7; Rajewsky et al., (1996) J Clin Invest 98, 600-3; Metzger and Feil, (1999) Curr. Opinions Biotechnology 10, 470-476)。
【０１２５】
研究者らは、ＳＳＲ酵素を発現させるために、直接トランスフェクションや組換えウイルスによる感染、ＳＳＲタンパク質をコードするＤＮＡやｍＲＮＡ又は該タンパク質自身の注入を用いてきた（Konsolaki et al, (1992) New Biol. 4: 551-557）。このようなＳＳＲ酵素の発現ではなく活性を調節することによって、より正確に制御することができる。一戦略においては、ＳＳＲ酵素をステロイド受容体のリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）に融合させた融合タンパク質を用いてＳＳＲ−ＬＢＤタンパク質を得る（EP-B-0 707 599；Logie and Stewart (1995) P.N.A.S. USA 92: 5940-5944; Brocard et al, (1997) P.N.A.S. USA 94: 14559-14563; Akagi et al, (1997) Nucleic Acids Res 25, 1766-73参照）。この戦略は、ＳＳＲ活性を活性化するステロイド受容体のリガンドをリガンドが受容体部分に結合している場合のみ用いることに依存している。該受容体のＬＢＤは、同族リガンドの非存在下ではＳＳＲの活性を抑制する。同族リガンドの送達によってＳＳＲの抑制を軽減し、ＲＴ部位間での組換えを行うことができる。
【０１２６】
このように、誘導については、前記ＳＳＲの転写を誘導するか、ＳＳＲの翻訳を誘導するか、又はＳＳＲから阻害剤を除去することによって行うことができる。或いは、ＳＳＲを前記トランスジェニックマウスに人工的に導入することができる。本発明の方法の一要素は、トランスジェニックマウス内で部位特異的組換えを行うことによってマウス標的遺伝子の除去と同時にヒト化マウスの作出が可能であることである。
【０１２７】
トランスジェニックマウスを欠失株マウスと交雑させることによって部位特異的組換えを実施し得るのが好ましい。本明細書において「欠失株」とは、生殖系列で部位特異的リコンビナーゼを発現するマウスに関するが、これを、トランスジェニックマウスと交雑させてマウス標的遺伝子配列を除去することができる。このように、インビボ組換えによって着目遺伝子に対してヘテロ接合性の子孫が産生する。こうして、トランスジェニックマウスを欠失株と交雑させることによって、後代が産生すると共に、ヒト置換遺伝子配列と部位特異的リコンビナーゼを含有するように変化したマウス染色体を含む細胞が産生し、その結果、マウス標的遺伝子が除去され、細胞の機能的ヒト化が生じる。従って、このようなトランスジェニックマウスは、特定の遺伝子又は遺伝子クラスターに関するヒト化に対してヘテロ接合性となる。
【０１２８】
ある実施形態においては、部位特異的リコンビナーゼがリコンビナーゼ株マウスのある組織でのみ発現するのが望ましいことがある。ある遺伝子又は遺伝子クラスターの欠失が致死的であるか又は亜致死性の表現型作用をもたらし得ることは、当該技術分野では知られている。また、このような遺伝子をそのヒト等価物で置換しても致死を防止できない場合がある。このような状況下では、部位特異的リコンビナーゼをある組織（例えば、肝臓）でのみ発現させることによって、致死に関する如何なるこのような問題をも克服し得る。これは、特定の遺伝子がある組織において必須である場合、このように部位特異的リコンビナーゼを発現させることによってマウス遺伝子が該組織において存続し得るため、特に有利となる。
【０１２９】
本発明のこの様相においては、ＳＳＲはアルブミン−Ｃｒｅであり得る。アルブミン−Ｃｒｅは、ＲＴ部位ＬｏｘＰに作用するＳＳＲ Ｃｒｅの特定のバリアントである。アルブミン−Ｃｒｅは肝臓においてのみ発現するため、マウス標的配列を肝臓以外の全ての組織で存続させることができ、致死に関する潜在的な問題を克服する一方、機能的にヒト化された肝臓が得られる。
【０１３０】
最終的には、上述の方法によって作出した２種のヘテロ接合体マウスを交雑させて、着目遺伝子のヒト対立遺伝子に対してホモ接合性のトランスジェニックマウスを作出することができる。２種のヘテロ接合体トランスジェニックマウスの交雑によって、欠失に対してホモ接合性の後代の一部が産生するであろう。
【０１３１】
本発明の更なる実施形態においては、以降に開示の方法によって、トランスジェニック非ヒト動物を上述の特徴を全て有するように新しく作出する。
【０１３２】
また、部位特異的組換えイベントを体細胞において行うことも可能であり、その後、該細胞をＷＯ００／５１４２４の方法に記載のクローン化マウス又はそのバリアントのコロニーを形成するために核移植ドナーとして用いることができる。
【０１３３】
本発明の他の実施形態においては、本発明のマウスを交雑によって作出する。例えば、特定のクラスターの遺伝子の一部が欠失した部分欠失体を他の部分欠失体と交雑させて、特定のクラスター内の遺伝子機能が全て欠失した動物を作出することができるであろう。
【０１３４】
本発明の更なる実施形態においては、以降に開示の方法によって、トランスジェニックマウスを上述の特徴を全て有するように新しく作出する。
【０１３５】
トランスジェニックな組合せ
最終的には、本発明の動物モデルをヌルバックグラウンドとして用い、げっ歯類酵素の機能に取って代わり得るヒト遺伝子を同一の染色体領域に直接組込むか、又は他の部位に組込むことによって該遺伝子の導入を行うことができる。ヒト遺伝子を同一の染色体領域に組込むのが好ましいが、これは、染色体の完全性が保持されるため、発現や組織分布の生理学的パターンが同様に保持される可能性が高いからである。従って、上述の細胞やマウスの調製に関する本発明の実施形態においては、該細胞や動物を更なる遺伝子組換えに付すことができるが、該遺伝子組換えは更なる遺伝子又はタンパク質コード核酸配列の導入である。該遺伝子組換えは、細胞又は細胞株の一過性又は安定トランスフェクション、細胞又は細胞株におけるエピソーム発現系、又は、前核マイクロインジェクションや非胚性幹（ＥＳ）細胞における組換えイベント、非ヒト胚性幹（ＥＳ）細胞におけるランダムな遺伝子組換え、又は核移植クローニング手順においてドナー核として用いる核を有する細胞のトランスフェクションによるトランスジェニック非ヒト動物の調製であり得る。
【０１３６】
特に、一以上のＰ４５０遺伝子クラスターが機能しないようにされている本発明に係るマウスを一以上のヒト遺伝子に関してヒト化し得ることが予想される。欠失したクラスターはＣｙｐ３ａクラスター、Ｃｙｐ２ｃクラスター及び／又はＣｙｐ２ｄクラスターであるのが好ましい。後述のように、これらのクラスターとヒト化薬物輸送体、ヒト化転写因子又はヒト化第ＩＩ相薬物代謝酵素との如何なる単一又は複数の組合せも好ましい。
【０１３７】
例えば、このようなマウスを転写因子に関してヒト化することができる。好適な転写因子の例としては、プレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）や構成的アンドロスタン受容体（ＣＡＲ）、ＰＰＡＲ（α、δ及びγ）、ＮＲＦ２、Ａｈ受容体、ＨＮＦ１、ＨＮＦ４が挙げられる。これらの転写因子の１種、２種又はそれ以上に関してマウスをヒト化することができる。また、ＷＯ２００６／０６４１９７に記載のように、内在性等価マウス遺伝子が無効化されたのも好ましい。ヌルバックグラウンドに関してＰ４５０クラスター欠失と二重ヒト化ｈＣＡＲ及び／又はｈＰＸＲマウスの組合せは、本発明に係る好ましいモデルである。
【０１３８】
また、本発明に係るマウスを第２相薬物代謝酵素に関してヒト化することもできる。このような酵素の例としては、グルクロニルトランスフェラーゼ（例えば、ＵＧＴ１Ａ遺伝子又は遺伝子クラスター）やグルタチオントランスフェラーゼ（例えば、ＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）（ＧＳＴ−ｍ１及び／又はｔ１クラスターを含む））、スルホニルトランスフェラーゼ、アセチルトランスフェラーゼが挙げられる。また、ＷＯ２００６／０６４１９７に記載のように、内在性等価マウス遺伝子が無効化されたものも好ましい。
【０１３９】
また、本発明に係るマウスを薬物輸送タンパク質に関してヒト化することもできるが、その例としては、多剤耐性タンパク質（例えば、ｍｄｒ１やｍｄｒ３）や多剤耐性関連タンパク質（ＭＲＰ）（例えば、ＭＲＰ１及び／又はＭＲＰ２及び／又はＭＲＰ６）、有機アニオン輸送ポリペプチド（ＯＡＴＰ）由来のものが挙げられる。また、ＷＯ２００６／０６４１９７に記載のように、内在性等価マウス遺伝子が無効化されたのも好ましい。
【０１４０】
細胞
本発明の他の様相は、本発明の上述のいずれか一様相における特性を有するように改変された細胞に関する。本発明に係る好ましい細胞型は肝細胞及び神経細胞である。該細胞はマウス細胞であることができる。
【０１４１】
本発明のこの様相における細胞は、本発明の知見を十分体得した当業者には明らかなように、本発明に係るトランスジェニックマウスから標準的な技法を用いて作出することができる。好適な方法は多くの標準的な実験マニュアル、例えば、Davisら、Basic Methods in Molecular Biology (1986); Sambrook Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Third Edition (2000); Ausubel et al., 1991 [supra]; Spector, Goldman & Leinwald, 1998)に記載されている。
【０１４２】
このような細胞を作出する好ましい一方法は、上述のようにヒト化マウスをＳＶ４０不死化マウス（例えば、不死マウス（タコニック））と交雑させることである。次に、当該技術分野で周知の技法によってこのような動物から細胞を単離することができる。肝臓でのみ活性であるため肝細胞しか産生することができないアルブミンプロモーターを用いる先行技術のトランスジェニック系とは対照的に、本発明において作出されるトランスジェニック動物由来の細胞は、薬物動態解析にかなり重要な細胞（例えば、肝細胞や神経細胞）等の様々な細胞型から選択することができる。
【０１４３】
上述の特性を有する、本発明に係るトランスジェニック動物から単離された幹細胞も本発明の有用な様相である。このような細胞は多能性であってもよく、部分的に分化していてもよい。幹細胞は成体幹細胞であってもよく、胚性幹細胞であってもよい。より一般には、用いる幹細胞は後胚発達段階（例えば、胎生期や新生期、幼若期、成体期）で得られることができる。このように単離された幹細胞を用いて特定の細胞型（例えば、肝細胞や神経細胞）を作出することができる。このような細胞も本発明の一様相を構成する。
本発明の方法によって作出した細胞又は動物をモデル系として用いて、他の生体（特にヒト）における薬物や他の生体異物化合物の代謝を確認することができる。
【０１４４】
アッセイ
本発明の動物、組織及び細胞を用いて、薬物化合物がどのように代謝されるか確認することができる。単一又は複数のシトクロムＰ４５０遺伝子クラスターが欠失したマウス系、或いは、シトクロムＰ４５０遺伝子クラスター交換を薬物の代謝や処理に関連する他の遺伝子と組合わせたマウス系の作出によって、ヒトにおける薬物反応や化学反応を決める因子、更にはこのような遺伝子と化学毒性の関連性についての我々の理解が顕著に増すであろう。このようなモデルは、効力スクリーニングやＰＫ／ＰＤモデリング、薬物安全性試験に適用することができる。
【０１４５】
本発明のクラスターノックアウトによってヒト化及び更なるノックアウト実験を行うことができる。作出する動物の性質に応じて、多数の異なるアッセイプロセスに着目することができる。特に、特定の薬物代謝遺伝子クラスターの如何なる薬物化合物の代謝への関与も確認することができる。また、特定のクラスターが欠失した際に第２の選択経路による代謝への代償作用があるとすれば、それを評価することによって如何なる薬物代謝系における冗長性の程度も確認することができる。また、如何なる毒性二次代謝物の生成も別々の代謝酵素に帰属させることができる。また、体組織内での転写因子や薬物代謝酵素、薬物輸送タンパク質の処理や分布に薬物化合物が影響を及ぼすかどうか調べることができる。また、転写因子や薬物代謝酵素、薬物輸送タンパク質の発現の持続期間に薬物化合物が影響を及ぼすかどうか調べることができる。有用なアッセイプロセスの他の例は当業者には明らかであろう。
【０１４６】
動物における表現型の変化（例えば、生理学的作用）を測定することができる。このような生理学的作用としては、例えば、病態（胆管壊死等）や中毒性副作用を挙げることができる。
【０１４７】
薬物化合物の代謝速度を調べることができる。この代謝速度は、該化合物の投与によってもたらされる毒性や活性を測定するか、該化合物の半減期を測定するか、又は薬物代謝酵素のレベルを測定することによって求めることができる。例えば、該化合物の代謝速度は、酸化生成物の生成速度や酸化中間体から次に産生される生成物の生成速度として測定することができる。或いは、この代謝速度は、最初の化合物（initial compound）の半減期や消失速度として、又は最初の化合物や最初の化合物から産生される代謝産物の毒性や活性の変化として表わすことができる。半減期は、様々な時点で採取したサンプルに存在する薬物化合物の量を求めることによって測定することができる。薬物化合物の量は、標準的な方法（例えば、高速液体クロマトグラフィーや質量分析、化合物特異的抗体を用いたウェスタンブロット解析、他の適切な方法）によって測定することができる。
【０１４８】
また、薬物化合物が特定の状況下で毒性代謝物や発癌性代謝産物に代謝されるかどうかを、例えば、該化合物の組織やタンパク質、ＤＮＡへの共有結合を測定するか、又はグルタチオンの欠乏を測定することによって調べることもできる。
【０１４９】
上述の種の測定は、薬物化合物投与後、１を越える時点、３時点、５時点又は１０以上の時点で行うのが好ましい。
【０１５０】
従って、本発明の更なる様相は、転写因子や薬物代謝酵素、薬物輸送タンパク質の活性や発現レベルに対する薬物化合物の作用を確認するために提供されるスクリーニング方法に関する。このような方法は、本発明の上述のいずれか一様相におけるトランスジェニック動物、又は該動物由来の組織又は細胞に薬物化合物を投与することを含む。
【０１５１】
スクリーニング段階は、転写因子や薬物代謝酵素、薬物輸送タンパク質をコードする遺伝子の誘導を測定することを含むことができる。また、スクリーニング段階は、転写因子や薬物代謝酵素、薬物輸送タンパク質の発現のレベル、又はこのような発現の持続期間を測定することを含むことができる。また、スクリーニング段階は、転写因子や薬物代謝酵素、薬物輸送タンパク質の発現の分布を測定することを含むことができる。
【０１５２】
薬物化合物の存在下及び非存在下でアッセイを行って、分布や代謝、毒性の差を確認することができる。様々なトランスジェニック動物や細胞、組織に対する薬物化合物の作用を評価することによって、特定の遺伝子の存在下及び非存在下における薬物化合物の作用を確認することができる。例えば、ヌルバックグラウンドを有する動物と着目遺伝子（例えば、ＰＸＲやＣＡＲ、ＭＤＲ１、第１相代謝酵素、第２相代謝酵素）に関してヒト化した動物との間で薬物化合物の作用を評価することも可能である。
【０１５３】
従って、更なる様相において、本発明は、本明細書に記載の生体異物の代謝又は毒性を調べるための方法であって、本明細書に記載の非ヒト動物、組織又は細胞の２種以上、３種以上、４種以上、５種以上、６種以上、７種以上、８種以上、９種以上又は１０種以上に対して薬物化合物を投与することを含む方法を提供する。このような方法は、異なる非ヒト動物、組織又は細胞に関して得られた実験結果を比較する段階を更に含むのが好ましい。
【０１５４】
二種以上の薬物化合物を投与することができる。例えば、ある薬物化合物がＣＡＲ遺伝子の誘導をもたらす場合、該化合物はＣＡＲ転写因子を活性化すると判断される。また、対照としてのヒトＣＡＲ受容体を発現する動物にＣＡＲ受容体インバースアゴニスト（例えば、クロトリマゾール）を投与することもできる。
【０１５５】
本発明の更なる様相におけるアッセイによって、第１の薬物化合物の代謝が第２の薬物化合物で調節されるかどうか確認するためのスクリーニング方法を提供することができる。この方法は、第２の化合物の存在下及び非存在下で第１の化合物を本発明の上述のいずれか一様相におけるトランスジェニック動物、又は該動物由来の組織又は細胞に投与することと、表現型効果をモニタリングすることとを含む。或いは、上述のように、スクリーニング段階は、遺伝子の誘導、転写因子や薬物代謝酵素、薬物輸送タンパク質の発現のレベルや持続期間、分布を測定することを含むことができる。第２の化合物がこれらの試験因子のいずれか一因子の変化をもたらす場合、第２の化合物は第１の化合物の代謝を調節することが確認される。例えば、第１の化合物の投与によってもたらされる毒性や活性を測定するか、又は第１の薬物化合物の半減期を測定することによって生理学的作用をアッセイすることができる。
【０１５６】
このように、アッセイを用いて、特定のタンパク質の発現を活性化又は誘導する能力が低いか又は検出できないために、副作用が少ないか又はインビボでの半減期が長いことが期待される薬物化合物の類似体を容易に同定することができる。
【０１５７】
以下、本発明の様々な様相や実施形態を実施例によって更に詳細に説明する。本発明の範囲を逸脱することなく詳細な変更を実施し得ることは理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【０１５８】
【図１ａ】マウスＣｙｐ３ａクラスター欠失のための戦略。（Ａ）マウスＣｙｐ３ａクラスター内の機能性遺伝子の染色体の構成及び方向の概略図（出典：Nelsonら、２００４年）。偽遺伝子は示されていない。（Ｂ）Ｃｙｐ３ａ５７及びＣｙｐ３ａ５９のエクソン／イントロン構造。エクソンは黒い棒で示し、ＡＴＧは両遺伝子の翻訳開始点を示す。相同組換えのターゲティングアームの位置をそれぞれ、薄灰色線（Ｃｙｐ３ａ５７）及び濃灰色線（Ｃｙｐ３ａ５９）でハイライトする。（Ｃ）相同組換えによりＣｙｐ３ａ５７（左）及びＣｙｐ３ａ５９（右）のターゲティングに用いたベクター。ＬｏｘＰ部位、ｌｏｘ５１７１部位、ｆｒｔ部位及びｆ３部位をそれぞれ、白い三角、縞模様の三角、点模様の三角、及び黒い三角で示す。（Ｄ）Ｃｙｐ３ａ５７及びＣｙｐ３ａ５９遺伝子座における同一対立遺伝子上での相同組換え後の二重標的ＥＳ細胞内のＣｙｐ３ａクラスターのゲノム構成。（Ｅ）ｌｏｘＰ部位におけるＣｒｅ介在組換え後のマウスＣｙｐ３ａクラスターの欠失。Ｃｙｐ３ａ５７、Ｃｙｐ３ａ１６、Ｃｙｐ３ａ４１、Ｃｙｐ３ａ１１及びＣｙｐ３ａ２５由来の全てのエクソンとイントロンは完全に欠失し、エクソン１〜４及びＣｙｐ３ａ５９のプロモーターも欠失する。従って、Ｃｒｅ介在欠失後に残存する唯一の機能性Ｃｙｐ３ａ遺伝子はＣｙｐ３ａ１３であり、これは、＞８００ｋｂのゲノムＤＮＡやＣｙｐと無関係の多数の機能性遺伝子によってクラスターの残りから離れている。マウスＣｙｐ３ａクラスターの欠失が成功したことを実証するのに用いたプライマーを矢印で示す。 分かり易くするため、配列は一定の縮尺率では示していない。ＴＫ＝チミジンキナーゼ発現カセット、Ｈｙｇｒｏ＝ハイグロマイシン発現カセット、ＺｓＧｒｅｅｎ＝ＺｓＧｒｅｅｎ発現カセット、Ｐ＝ネオマイシンの発現を促進するプロモーター、５’ΔＮｅｏ＝ＡＴＧ欠損ネオマイシン。
【図１ｂ−１】Ｃｙｐ３ａクラスター欠失に対するマウスホモ接合性のＰＣＲ確認。
【図１ｂ−２】Ｃｙｐ３ａクラスター欠失に対するマウスホモ接合性のＰＣＲ確認。
【図１ｃ】対照（Ｃｏｎ）とリファンピシン（ＲＩＦ、６０ｍｇ／ｋｇ、３日間）で処理したＣ５７ＢＬ／６Ｊ（ＷＴ）及びＣｙｐ３ａクラスターＫＯマウスから得た代表的な肝臓切片のヘマトキシリン及びエオシン染色。２０倍の対物レンズを用いてＣｙｐ３ａクラスターＫＯ（Ｃｏｎ）の画像を得た。他の画像の全てについては１０倍の対物レンズを用いた。
【図１ｄ】対照（Ｃｏｎ）とリファンピシン（ＲＩＦ、６０ｍｇ／ｋｇ、３日間）で処理したＣ５７ＢＬ／６Ｊ（ＷＴ）及びＣｙｐ３ａクラスターＫＯマウスから得た代表的な小腸切片のヘマトキシリン及びエオシン染色。１０倍の対物レンズを用いて画像を得た。
【図１ｅ】対照（Ｃｏｎ）とリファンピシン（ＲＩＦ、６０ｍｇ／ｋｇ、３日間）で処理したＣ５７ＢＬ／６Ｊ（ＷＴ）及びＣｙｐ３ａクラスターＫＯマウスから得た代表的な腎臓切片のヘマトキシリン及びエオシン染色。１０倍の対物レンズを用いて画像を得た。
【図１ｆ】対照（Ｃｏｎ）とリファンピシン（ＲＩＦ、６０ｍｇ／ｋｇ、３日間）で処理したＣ５７ＢＬ／６Ｊ（ＷＴ）及びＣｙｐ３ａクラスターＫＯマウスから得た代表的な肝臓切片のオイルレッドＯ染色。４０倍の対物レンズを用いて画像を得た。
【図１ｇ】対照とリファンピシン（６０ｍｇ／ｋｇ、３日間）で処理したＣ５７ＢＬ／６Ｊ及びＣｙｐ３ａクラスターＫＯマウスの血漿の臨床化学解析：トリグリセリド、低密度リポタンパク（ＬＤＬ）、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、クレアチンキナーゼ（ＣＲＥ）、総ビリルビン（ＢＩＬ−Ｔ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アラニントランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、アルブミン。データは平均±Ｓ．Ｄ．で示す（ｎ＝４）。
【図１ｈ】図１ｈ：コーン油（３日間投与）（Ａ）又はリファンピシン（６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）（Ｂ）で処理後４日目の野生型及びＣｙｐ３ａクラスターＫＯマウスにおけるミダゾラム（１ｍｇ／ｋｇ）薬物動態（誤差棒はＳＤを示す）。Ｎ．Ｂ．：リファンピシン処理Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの１０分時点でのＳＤは４５ｎｇ／ｍＬであった。グラフＡとＢのスケールを同じに保つため、対応する誤差棒は一部のみを示した。
【図１ｉ】ＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェアの非コンパートメント解析を用いたミダゾラムＰＫから算出した濃度／時間曲線下総面積（ＡＵＣ）。
【図１ｊ】Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ及びＣｙｐ３ａクラスターＫＯマウスにおけるＣｙｐ３ａアイソフォームの発現及び活性。Ａ）ウェスタンブロッティング；肝ミクロソーム由来のタンパク質１μｇを７．５％ＳＤＳｐａｇｅゲルに添加した。正の対照にはＣＸＲバイオサイエンシーズから入手した０．１ｐｍｏｌのＣｙｐ３ａ１１組換えタンパク質（ｈｉｓタグ）を用いた。一次抗体としてはウサギ抗ＣＹＰ３Ａ２（Colin Henderson, Ninewells Hospital, Dundee）を１：２０００の濃度で用いた。Ｂ）７−ＢＱの酸化、Ｃ）ミダゾラムの１’−水酸化及びＤ）ミダゾラムの４−水酸化。データは平均±ＳＤで示す（ｎ＝４）。活性は対応のないｔ検定（両側Ｐ値）で比較した。＊：有意差有り（＊＊：Ｐ＜０．０１、＊＊＊：Ｐ＜０．００１）。
【図１ｋ】媒体（対照）とリファンピシン（ＲＩＦ；６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）で処理したＣ５７ＢＬ／６Ｊ及びＣｙｐ３ａクラスターＫＯマウスの肝ミクロソームにおけるＣｙｐ１ａタンパク質の発現及び活性。（Ａ）−ウェスタンブロッティング；肝ミクロソーム由来のタンパク質２μｇを７．５％ＳＤＳｐａｇｅゲルに添加した。正の対照にはＣＸＲバイオサイエンシーズから入手した０．１ｐｍｏｌのＣｙｐ１ａ１組換えタンパク質を用いた。一次抗体としてはヤギ抗Ｃｙｐ１ａ１／１ａ２（ＢＤゲンテスト、ｃａｔ＃４５８１３１）を１：２０００の濃度で用いた。（Ｂ）−エトシキレゾルフィン脱エチル化、（Ｃ）−メトキシレゾルフィン脱メチル化。データは平均±ＳＤで示す（ｎ＝４）。活性は対応のないｔ検定（両側Ｐ値）で比較した。＊：対照との有意差有り（＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１）。
【図１ｌ】媒体（対照）とリファンピシン（ＲＩＦ；６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）で処理したＣ５７ＢＬ／６Ｊ及びＣｙｐ３ａクラスターＫＯマウスの（Ａ）肝ミクロソーム及び（Ｂ）腸ミクロソームにおけるＣｙｐ２ｂタンパク質の発現。肝ミクロソーム及び腸ミクロソーム由来のタンパク質２μｇを７．５％ＳＤＳｐａｇｅゲルに添加した。正の対照にはＣＸＲバイオサイエンシーズから入手した０．０１ｐｍｏｌのＣｙｐ２ｂ２０組換えタンパク質（ｈｉｓタグ）を用いた。一次抗体としてはウサギ抗Ｃｙｐ２ｂ（Colin Henderson, Ninewells Hospital, Dundee）を１：２０００の濃度で用いた。（Ｃ）−ペントキシレゾルフィン脱ペンチル化。（Ｄ）−ベンゾキシレゾルフィン脱ベンジル化。データは平均±ＳＤで示す（ｎ＝４）。活性は対応のないｔ検定（両側Ｐ値）で比較した。＊：対照との有意差有り（＊：Ｐ＜０．０５）。
【図１ｍ】媒体（対照）とリファンピシン（ＲＩＦ；６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）で処理したＣ５７ＢＬ／６Ｊ（ＷＴ）及びＣｙｐ３ａクラスターＫＯ（ＫＯ）マウスの肝ミクロソームにおけるＣｙｐ２ｃタンパク質の発現。肝ミクロソーム由来のタンパク質２μｇを７．５％ＳＤＳｐａｇｅゲルに添加した。正の対照にはＣＸＲバイオサイエンシーズから入手したＣｙｐ２ｃ２９（０．５ｐｍｏｌ）組換えタンパク質を用いた。一次抗体としてはウサギ抗Ｃｙｐ２ｃ（Colin Henderson, Ninewells Hospital, Dundee）を１：５００００の濃度で用いた。
【図１ｎ】媒体（対照）とリファンピシン（ＲＩＦ；６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）で処理したＣ５７ＢＬ／６Ｊ（ＷＴ）及びＣｙｐ３ａクラスターＫＯ（ＫＯ）マウスの（Ａ）肝ミクロソーム及び（Ｂ）腸ミクロソーム。肝ミクロソーム及び腸ミクロソーム由来のタンパク質２μｇを７．５％ＳＤＳｐａｇｅゲルに添加した。正の対照にはＣＸＲバイオサイエンシーズから入手した組換えＣｙｐ２ｄ２２（０．２ｐｍｏｌ）を用いた。一次抗体としてはヒツジ抗Ｃｙｐ２ｄ（Colin Henderson, Ninewells Hospital, Dundee）を１：２００００の濃度で用いた。
【図１ｏ】媒体（対照）とリファンピシン（ＲＩＦ；６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）で処理したＣ５７ＢＬ／６Ｊ（ＷＴ）及びＣｙｐ３ａクラスターＫＯ（ＫＯ）マウスの（Ａ）肝ミクロソーム及び（Ｂ）腸ミクロソームにおけるＣｙｐ２ｅの発現。肝ミクロソーム及び腸ミクロソーム由来のタンパク質２μｇを７．５％ＳＤＳｐａｇｅゲルに添加した。正の対照にはＣＸＲバイオサイエンシーズから入手した０．２ｐｍｏｌのＣｙｐ２ｅ１組換えタンパク質を用いた。一次抗体としてはヒツジ抗Ｃｙｐ２ｅ（ＳＡＰＵ ＢＲＣ）を１：４０００の濃度で用いた。
【図１ｐ】媒体（対照）とリファンピシン（ＲＩＦ；６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）で処理したＣ５７ＢＬ／６Ｊ及びＣｙｐ３ａクラスターＫＯマウスの肝ミクロソームにおけるＣｙｐ４ａタンパク質の発現。肝ミクロソーム由来のタンパク質２μｇを７．５％ＳＤＳｐａｇｅゲルに添加した。正の対照にはＣＸＲバイオサイエンシーズから入手した１μｇのＡＰＦＯ誘導ラットミクロソームを用いた。一次抗体としてはウサギ抗Ｃｙｐ４ａ（Colin Henderson, Ninewells Hospital, Dundee）を１：２００００の濃度で用いた。
【図１ｑ】（Ａ）媒体（対照）とリファンピシン（ＲＩＦ；６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）で処理したＣ５７ＢＬ／６Ｊ（ＷＴ）及びＣｙｐ３ａクラスターＫＯマウス（ＫＯ）の肝ミクロソームにおけるＰ４５０オキシドレダクターゼタンパク質の発現。肝ミクロソーム由来のタンパク質２μｇを７．５％ＳＤＳｐａｇｅゲルに添加した。正の対照にはＢＤゲンテスト（ｃａｔ＃４５２１７２）から入手した３μｇの雄性ヒト肝ミクロソーム（プール）を用いた。一次抗体としてはウサギ抗Ｐ４５０レダクターゼ（ＣＸＲバイオサイエンシーズ）を１：５０００の濃度で用いた。（Ｂ）−Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ及びＣｙｐ３ａクラスターＫＯマウスのマウス肝ミクロソームにおけるシトクロムＣレダクターゼ活性。データは平均±ＳＤで示す（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（ｎ＝３）、Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯ（ｎ＝４））。
【図１ｒ】媒体とリファンピシン（６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）で処理したＣ５７ＢＬ／６Ｊ及びＣｙｐ３ａクラスターＫＯマウスの肝ミクロソームにおける総Ｐ４５０量。データは平均±ＳＤで示す（ｎ＝４）。活性は対応のないｔ検定（両側Ｐ値）で比較した。＊：対照との有意差有り（＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１、＊＊＊：Ｐ＜０．００１）。
【図１ｓ】（Ａ）−リファンピシン（６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）による処理後４日目にミダゾラム（１ｍｇ／ｋｇ）をＩＶ投与した後の野生型、Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯ及びＣｙｐ３ａ１１ＫＯマウスにおける１’−ヒドロキシミダゾラム薬物動態（誤差棒はＳＤを示す）。（Ｂ）１’−ヒドロキシミダゾラムＰＫから算出した曲線下面積（ＡＵＣ）。
【図１ｔ】リファンピシン（６０ｍｇ／ｋｇ、３日間投与）による処理後４日目にミダゾラム（２ｍｇ／ｋｇ）を経口投与した後の野生型、Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯ及びＣｙｐ３ａ１１ＫＯマウスにおける１’−ヒドロキシミダゾラム薬物動態（誤差棒はＳＤを示す）。（Ｂ）１’−ヒドロキシミダゾラムＰＫから算出した曲線下面積（ＡＵＣ）。
【図１ｕ】Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯ及びＣｙｐ３ａ１１ＫＯマウスの肝ミクロソーム及び腸ミクロソームによるトリアゾラムのα水酸化。データは平均＋ＳＤで示す（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ及びＣｙｐ３ａ１１ＫＯの肝ミクロソーム（ｎ＝４）、Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯの肝ミクロソーム及びＣ５７ＢＬ／６Ｊの腸ミクロソーム（ｎ＝３））。活性は対応のないｔ検定（両側Ｐ値）で比較した。＊：有意差有り（＊＊＊：Ｐ＜０．００１）。Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯ及びＣｙｐ３ａ１１ＫＯの腸ミクロソームの活性は定量下限未満であった。
【図１ｖ】Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯ及びＣｙｐ３ａ１１ＫＯマウスの肝ミクロソーム及び腸ミクロソームによるニフェジピンの酸化。データは平均＋ＳＤで示す（Ｃ５７ＢＬ／１６Ｊ及びＣｙｐ３ａ１１ＫＯのミクロソーム（ｎ＝４）、Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯ（ｎ＝３））。活性は対応のないｔ検定（両側Ｐ値）で比較した。＊：有意差有り（＊＊＊：Ｐ＜０．００１）。
【図１ｗ】Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯ及びＣｙｐ３ａ１１ＫＯマウスの肝ミクロソーム及び腸ミクロソームによるテストステロンの６β水酸化。データは平均＋ＳＤで示す（肝ミクロソーム（ｎ＝４）、腸ミクロソーム（ｎ＝３））。活性は対応のないｔ検定（両側Ｐ値）で比較した。＊：有意差有り（＊＊＊：Ｐ＜０．００１、＊＊：ｐ＜０．０１）。
【図１ｘ】Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯ及びＣｙｐ３ａ１１ＫＯマウスの肝ミクロソームによるテストステロンの１６β水酸化。データは平均＋ＳＤで示す（ｎ＝４）。活性は対応のないｔ検定（両側Ｐ値）で比較した。＊：有意差有り（＊＊：ｐ＜０．０１）。
【図１ｙ】Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯ及びＣｙｐ３ａ１１ＫＯマウスの肝ミクロソーム及び腸ミクロソームによるＤＢＦの酸化。データは平均＋ＳＤで示す（肝ミクロソーム（ｎ＝４）、腸ミクロソーム（ｎ＝３））。活性は対応のないｔ検定（両側Ｐ値）で比較した。＊：有意差有り（＊＊＊：Ｐ＜０．００１、＊：ｐ＜０．０５）。
【図１ｚ】Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯ及びＣｙｐ３ａ１１ＫＯマウスの肝ミクロソーム及び腸ミクロソームによるＢＦＣの酸化。データは平均＋／−ＳＤで示す（肝ミクロソーム（ｎ＝４）、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊの腸ミクロソーム（ｎ＝４）、Ｃｙｐ３ａ１１ＫＯの腸ミクロソーム（ｎ＝３）、Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯの腸ミクロソーム（ｎ＝２））。活性は対応のないｔ検定（両側Ｐ値）で比較した。＊：有意差有り（＊：ｐ＜０．０５）。
【図２ａ】図２ａ〜２ｃはＣｙｐ２ｃクラスター交換のための方法を示す。Ａ）マウスＣｙｐ２ｃクラスターの５’ターゲティング、Ｂ）マウスＣｙｐ２ｃクラスターの３’ターゲティング、Ｃ）概要：Ｃｙｐ２ｃクラスターノックアウト、Ｄ）マウスＩＤ２３４２５４のゲノムからのマウスＣｙｐ３ａ クラスター欠如のＰＣＲ確認、Ｅ）マウスＩＤ２３４２５４のゲノムからのマウス３ａ クラスター欠如のＰＣＲ確認。
【図２ｂ】図２ａ〜２ｃはＣｙｐ２ｃクラスター交換のための方法を示す。Ａ）マウスＣｙｐ２ｃクラスターの５’ターゲティング、Ｂ）マウスＣｙｐ２ｃクラスターの３’ターゲティング、Ｃ）概要：Ｃｙｐ２ｃクラスターノックアウト、Ｄ）マウスＩＤ２３４２５４のゲノムからのマウスＣｙｐ３ａ クラスター欠如のＰＣＲ確認、Ｅ）マウスＩＤ２３４２５４のゲノムからのマウス３ａ クラスター欠如のＰＣＲ確認。
【図２ｃ】図２ａ〜２ｃはＣｙｐ２ｃクラスター交換のための方法を示す。Ａ）マウスＣｙｐ２ｃクラスターの５’ターゲティング、Ｂ）マウスＣｙｐ２ｃクラスターの３’ターゲティング、Ｃ）概要：Ｃｙｐ２ｃクラスターノックアウト、Ｄ）マウスＩＤ２３４２５４のゲノムからのマウスＣｙｐ３ａ クラスター欠如のＰＣＲ確認、Ｅ）マウスＩＤ２３４２５４のゲノムからのマウス３ａ クラスター欠如のＰＣＲ確認。
【図２ｄ−１】Ｃｙｐ２ｃクラスター欠失に対するマウスホモ接合性のＰＣＲ確認。
【図２ｄ−２】Ｃｙｐ２ｃクラスター欠失に対するマウスホモ接合性のＰＣＲ確認。
【図２ｅ】Ｃｙｐ３ａ／Ｃｙｐ２ｓ複合クラスターＫＯ株の構築のＰＣＲ確認。
【図２ｆ】Ｃｙｐ３ａ／Ｃｙｐ２ｓ複合クラスターＫＯ株の構築のＰＣＲ確認。
【図３ａ】Ｃｙｐ２ｄクラスター交換のための方法を示す。Ａ）マウスＣｙｐ２ｄ２６の３’ターゲティング。
【図３ｂ】Ｃｙｐ２ｄクラスター交換のための方法を示す。Ｂ）マウスＣｙｐ２ｄクラスターの５’ターゲティング。
【図３ｃ】Ｃｙｐ２ｄクラスター交換のための方法を示す。Ｃ）概要：Ｃｙｐ２ｄノックアウト。
【図３ｄ−１】Ｃｙｐ２ｄクラスター欠失に対するマウスホモ接合性のＰＣＲ確認。
【図３ｄ−２】Ｃｙｐ２ｄクラスター欠失に対するマウスホモ接合性のＰＣＲ確認。
【図３ｅ】野生型（例えば、Ｃ７５ＢＬ／６Ｊ）及びＣｙｐ２ｄクラスターＫＯマウスにおけるブフラロール（１０ｍｇ／ｋｇ、単回経口投与）の薬物動態。データは、投与後２４０分まで全血中で検出されたブフラロール濃度の平均±ＳＤ（ｎ＝４）で示す。
【図４ａ】ＣＹＰ１Ａノックアウトのための方法を示す。Ａ）マウスＣｙｐ１ａの５’ターゲティング。
【図４ｂ】ＣＹＰ１Ａノックアウトのための方法を示す。Ｂ）マウスＣｙｐ１ａの３’ターゲティング。
【図４ｃ】ＣＹＰ１Ａノックアウトのための方法を示す。Ｃ）概要：Ｃｙｐ１ａノックアウト。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【０１５９】
実施例１：Ｃｙｐ３ａクラスター交換
相同組換えによってマウスＣｙｐ３ａクラスターの５’末端を標的にして、図１ａに示すように、ｆｒｔ、ｌｏｘ５１７１及び野生型ｌｏｘＰ部位がＣｙｐ３ａ５７遺伝子のエクソン１の下流に挿入されるようにした。更に、図示のように、ハイグロマイシン耐性カセットとチミジンキナーゼ（ＴＫ）発現カセットを共導入した。
【０１６０】
マウスＣｙｐ３ａクラスターの３’末端における次の相同組換え段階によって、正しくターゲティングされたＥＳ細胞を更に改変して、野生型ｌｏｘＰ及びｆ３部位がＣｙｐ３ａ５９遺伝子のエクソン４の下流に挿入されるようにした。図１ｂに示すように、５’欠損ネオマイシン耐性カセットとＴＫ発現カセットを共導入した。翻訳開始ＡＴＧは、ｌｏｘＰ部位によって５’欠損ネオマイシン耐性カセットからインフレームで分離させて、ｌｏｘＰ部位によってコードされる他のアミノ酸がネオマイシンタンパク質のＮ末端に付着するようにする。
【０１６１】
Ｃｒｅ介在組換えによってマウスＣｙｐ３ａクラスターの欠失を可能とするためには、クラスター両端におけるターゲティングを同一対立遺伝子上で行う必要がある。これについては、Ｃｒｅを用いた二重標的ＥＳ細胞のトランスフェクションとそれに続くガンシクロビルを用いた選択によってインビトロで試験した。図１ｅに示すように、同一対立遺伝子上でターゲティングを行った細胞においてのみ、ＴＫ遺伝子はクラスターの両端で欠失し、ヌクレオシド類似体ガンシクロビルから毒性三リン酸類似体へのＴＫ介在転化が防止される。従って、同一対立遺伝子上でターゲティングを行ったＥＳ細胞のみがガンシクロビル選択後も生存する。
【０１６２】
生存ＥＳ細胞クローンをＰＣＲで更に解析し、マウスＣｙｐ３ａクラスターが欠失し、ＰＣＲ陽性クローンが胚盤胞に注入されてキメラマウスが作出されたことを確認した。その後の交雑によって、Ｃｙｐ３ａクラスターがホモ欠損したマウスを最終的に作出した。
【０１６３】
その後、ＥＳ細胞に残存する野生型ｌｏｘＰ及びｌｏｘ５１７１部位を用い、Ｃｒｅ介在挿入によって置換遺伝子（例えば、ヒトＣＹＰ３Ａクラスター）をマウスクラスターの前の位置において挿入することができる。残存プロモーター、ＡＴＧ及びインフレーム野生型ｌｏｘＰ部位を用いて、５’欠損選択カセット（例えば、５’欠損ネオマイシン）を再度挿入し、高効率で正しく挿入されたクローンを選択することができる。更なるｆｒｔ部位及びｆ３部位が正しい方向に置換カセットと共に共導入されている場合には、両端におけるｆｒｔ部位及びｆ３部位を用い、Ｆｌｐ介在欠失によって、置換遺伝子と共に導入された選択カセットを欠失させることができる。
【０１６４】
Ｃｙｐ３ａ５７の８００ｂｐ上流に位置し、Ｃｙｐと無関係の多数の遺伝子によってマウスＣｙｐ３ａクラスターから離れているＣｙｐ３ａ１３遺伝子は、上述のマウスＣｙｐ３ａクラスターの欠失に影響されない。
【０１６５】
図１ｂは、ＩＤが２１９６７８、２１９６７９、２１９６８０、２１９６８１及び２１９６８２のマウスのゲノムからのマウスＣｙｐ３ａクラスター欠如のＰＣＲ確認を示す。
【０１６６】
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊとの比較によるＣｙｐ３ａクラスターＫＯマウスの解析
研究は４群（４匹／群）で行った。マウスには、リファンピシン（６０ｍｇ／ｋｇ）を３日間、腹腔内（ＩＰ）投与した。研究４日目に、ミダゾラム（１ｍｇ／ｋｇ）をＩＰ注射により投与し、１０μＬの血液サンプルを１０分、２０分、４０分、６０分、１２０分、２４０分及び３６０分で採取してＰＫ解析を行った（表１）。
【０１６７】
【表１】
【０１６８】
病理学
肝腫
媒体処理Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯマウスにおいては、生物学的に無関係と思われる媒体処理Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスと比べて、肝臓／身体重量比が僅か（〜６％）ではあるが統計的に有意に増加した。リファンピシン処理の場合には、いずれのマウス株においても肝腫は生じなかった（表２）。
【０１６９】
【表２】
【０１７０】
病理組織学
ヘマトキシリン及びエオシン染色
全群のマウス全ての腎臓サンプル、肝臓サンプル及び小腸サンプルに対して病理組織学的検討を行った。処理Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいては軽度の小葉中心性肝細胞肥大が認められた。Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯマウスの肝臓には微細な小葉中心性肥大の徴候もあった。このような変化はリファンピシンによる処理に関連すると考えられた。肝臓で記録された他の微視的な知見は全て、処理マウスと対照マウスとの間で有意差が無かった。いずれの差もランダムな事象であり、自然発生的であり、マウスで通常見られる正常なバックグラウンド病理の範囲内であると見なされた（図１ｃ）。腎臓及び小腸においてはリファンピシン処理に関連する微視的知見は記録されなかった（図１ｄ〜１ｅ）。この研究の条件下では、２種の異なるマウス株に対してリファンピシン（６０ｍｇ／ｋｇ体重）を３日間反復投与することによって、両方の株で肝細胞肥大の病理学的証拠が得られた。トランスジェニックマウス（Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯ）ではあまり大きな影響を受けないように思われた。
【０１７１】
オイルレッドＯ染色
オイルレッドＯ染色により脂質沈着について肝臓サンプルを調べた。媒体処理マウス肝臓のいずれにおいても脂肪蓄積の徴候は無かった（図１ｆ）。リファンピシン処理Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの肝臓においては、核周辺に中程度（グレード１）の滴模様のオイルレッドＯ染色が観察された。これは、リファンピシン処理Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯマウスの肝臓切片では検出できなかった。
【０１７２】
臨床化学
全てのマウスから血漿サンプルを採取し、トリグリセリド、アラニントランスフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アルブミン、ビリルビン（総ビリルビン及び直接ビリルビン）、クレアチンキナーゼ、高密度リポタンパク質、低密度リポタンパク質及びγ−グルタミルトランスフェラーゼについて解析した。γ−グルタミルトランスフェラーゼ活性及び直接ビリルビンレベルは定量限界未満であった。他の血漿臨床化学パラメータの値は全て、未処理Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの公知の正常範囲内であった（図１ｇ）。
【０１７３】
分子／生化学的表現型
ミダゾラムの薬物動態
野生型及びＣｙｐ３ａクラスターＫＯマウスにおけるミダゾラムの薬物動態を図１ｈに示す。
【０１７４】
両方のマウス株はＩＰ投与後に基質の速やかな吸収を示した。これは、３日間のリファンピシンの先行投与によっては影響を受けなかった。ミダゾラムのＡＵＣは、野生型及びＣｙｐ３ａクラスターＫＯ対照マウスにおいて同様であった（図１ｉ）。リファンピシン処理によって両方のマウス株で基質の排除が促進されたが、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいてより高い作用が示された。アイソフォーム特異的基質が腹腔内投与された場合、肝臓における代謝シトクロムＰ４５０の発現レベルは該基質のＡＵＣに反比例することが先に示されている。従って、ミダゾラムのＡＵＣは、Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯマウスではその主要代謝酵素のクラスターが欠失しているため、より高いことが予測された。しかし、この場合にはそうではなく、恐らく、次の文献（van Waterschoot et al., 2008）に記載ものと同様の何らかの代償性変化が関与していることが示唆される。
【０１７５】
Ｃｙｐ３ａタンパク質の発現及び活性
Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯマウスの肝ミクロソームにおけるＣｙｐ３ａの発現は、処理マウス及び対照マウスの両方においてウェスタンブロッティングによる検出限界未満のレベルまで低下した（図１ｊ）。これは、対応するＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス実験群と比べてＣｙｐ３ａ特異的基質７−ＢＱの酸化が有意に低下（対照マウスにおいては１８％、リファンピシン処理マウスにおいては６．７％まで低下）したことと関連付けられた。Ｃｙｐ３ａアイソフォーム及びＣｙｐ２ｃアイソフォームの両方によって触媒されるミダゾラムの１’−水酸化は、対照マウス及び処理マウスでそれぞれ５３％、１８％まで低下した。ミダゾラムの４−水酸化の低下（６５％まで）は小さく、対照Ｃ５７ＢＬ／６Ｊと比べてＣｙｐ３ａクラスターＫＯ対照群では統計的に有意ではなかった。これは、４−水酸化がマウスＣｙｐ３ａによって支配的に触媒されることが示されている（Perl off et al., 2000）ことを考慮すると予期せぬ結果であった。ミダゾラムの４−水酸化は、Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯリファンピシン処理群においては野生型マウスと比べて２３％まで低下した。
【０１７６】
Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯマウスのリファンピシンによる前処理によって、７−ＢＱの酸化は僅かではあるが（１６８％）、統計的に有意に（Ｐ＜０．０５）増加した。Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯマウスにおけるミダゾラムの水酸化に対するリファンピシンの作用は小さく（１’−水酸化では１２３％増加、４−水酸化では１１２％）、統計的に有意ではなかった。
【０１７７】
腸ミクロソームのウェスタンブロッティングでは如何なるＣｙｐ３ａバンドも得られなかった（データは示さず）。
【０１７８】
腸ミクロソームの比活性の測定によって得たデータの不整合性が高かったが、これは、上皮細胞を擦り取って腸ミクロソームを調製する際にむらがあることを反映しているように思われる（Bonkovsky et al., 1985; Mohri and Uesawa, 2001）（データは示さず）。
【０１７９】
本研究に用いた抗体は、試験したサブファミリー由来の主要な組換えシトクロムＰ４５０との相互作用後にウェスタンブロット上で明確なバンドを示した。しかし、１種のＰ４５０サブファミリー内の異なるアイソフォームに対する抗体の特異性については検討しなかった。
【０１８０】
Ｃｙｐ１ａタンパク質の発現及び活性
ウェスタンブロッティングで確認したＣｙｐ１ａの発現は、Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯマウスの肝ミクロソームにおいては野生型に比べて僅かに高かった（図１ｋ）。リファンピシン処理によって、両方のマウス株でＣｙｐ１ａが僅かにダウンレギュレートされた。エトキシレゾルフィン脱エチル化活性（ＥＲＯＤ）は、Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯマウスの肝ミクロソーム及び野生型マウスの肝ミクロソームの両方において同様であった。ＥＲＯＤはＣｙｐ１ａ１アイソフォーム及びＣｙｐ１ａ２アイソフォームの両方によって触媒されるが、Ｃｙｐ１ａ１の方が主に寄与する。リファンピシン処理によって、両方の株でＥＲＯＤ代謝が僅かに誘導された。野生型マウスとＣｙｐ３ａクラスターＫＯマウスとの間でメトキシレゾルフィン脱メチル化（ＭＲＯＤ）活性の差は無かった。ＭＲＯＤは主にＣｙｐ１ａ２によって触媒される。
【０１８１】
Ｃｙｐ２ｂタンパク質の発現及び活性
マウス肝ミクロソームでのＣｙｐ２ｂの発現は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス及びＣｙｐ３ａクラスターＫＯマウスの両方において低かった（図１ｌ）。リファンピシン処理によって、両方の株でＣｙｐ２ｂが僅かに誘導された。これはＰＲＯＤ活性の増加が少ないことと関連付けられた。腸ミクロソームでは顕著に高いＣｙｐ２ｂの発現が示されたが、リファンピシン処理に対して感受性が低かった。媒体処理Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯマウスの肝ミクロソームでは、ベンゾキシレゾルフィンＯ−脱アルキル化（ＢＲＯＤ）活性が野生型に比べて低いことが示された。ＢＲＯＤは先にマウスＣｙｐ２ｂの基質として用いられた（Donato et al., 2003）。リファンピシン処理によって、試験した両方の株においてＢＲＯＤが誘導された。これらのデータから、Ｃｙｐ３ａ（更に、恐らくはＣｙｐ２ｃアイソフォーム）由来の酵素がＢＲＯＤに関与し得ることが示唆される。
【０１８２】
Ｃｙｐ２ｃタンパク質の発現
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ及びＣｙｐ３ａクラスターＫＯマウスの肝ミクロソームにおけるＣｙｐ２ｃタンパク質の発現はウェスタンブロッティングによって評価した（図１ｍ）。タンパク質バンド強度は、野生型と比べて、対照Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯマウス由来のサンプルにおいて僅かに増加した。両方のマウス株では、リファンピシン処理後に顕著なＣｙｐ２ｃ誘導が示された。
【０１８３】
Ｃｙｐ２ｄタンパク質の発現
Ｃｙｐ２ｄタンパク質のバンドは、肝臓サンプル及び腸サンプルの両方において検出された（図１ｎ）。未処理野生型マウスの肝臓サンプルとＣｙｐ３ａクラスターＫＯマウスの肝臓サンプルとの間でＣｙｐ２ｄタンパク質バンド強度に顕著な差は無かった。リファンピシン処理によって、Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスではＣｙｐ２ｄの発現が僅かに低下したが、Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯマウスでは僅かに増加した。野生型に比べて、Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯでは腸Ｃｙｐ２ｄレベルが僅かに増加した。腸ミクロソームでのＣｙｐ２ｄレベルに対するリファンピシン処理の顕著な作用はいずれのマウス株でも見られなかった。
【０１８４】
Ｃｙｐ２ｅタンパク質の発現
Ｃｙｐ２ｅタンパク質バンド強度は、野生型と比べてＣｙｐ３ａクラスターＫＯマウスの肝ミクロソームでは僅かに高かった（図１ｏ）。肝ミクロソームにおけるＣｙｐ２ｅレベルは、いずれのマウス株においてもリファンピシン処理によっては顕著に変化しなかった。同様に、Ｃｙｐ２ｅ発現のレベルは、野生型と比べてＣｙｐ３ａクラスターＫＯマウスの腸においては高かった。リファンピシン処理によって、Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯマウスでは腸Ｃｙｐ２ｅが僅かに誘導されたが、野生型マウスでは腸Ｃｙｐ２ｅが僅かにダウンレギュレートされた。
【０１８５】
Ｃｙｐ４ａタンパク質の発現
Ｃｙｐ４ａタンパク質は両方のマウス株の肝ミクロソームで検出された（図１ｐ）。野生型マウス由来サンプルにおけるＣｙｐ４ａ発現レベルはリファンピシン処理後に顕著に増加した。
【０１８６】
マウスＰ４５０オキシドレダクターゼ（ＰＯＲ）タンパク質の発現
シトクロムＰ４５０オキシドレダクターゼレベルは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ及びＣｙｐ３ａクラスターＫＯマウスの肝ミクロソームにおいては同様であった（図１ｑ）。両方のマウス株は、ＰＯＲのタンパク質発現レベルの顕著な増加によってリファンピシン処理に反応した。リファンピシン処理マウスの肝ミクロソームでは、野生型マウスと比べてシトクロムＣの還元における活性が僅かに高いことが示された。この増加は統計的に有意ではなかった。
【０１８７】
総Ｐ４５０量
Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯマウスでは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスと比べて、媒体処理マウスの肝ミクロソームの総Ｐ４５０量が僅かではあるが統計的に有意に増加することが示された（図１ｒ）。リファンピシン処理によって、野生型マウスでは総Ｐ４５０量が顕著に増加した。しかし、Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯマウスの肝ミクロソームのＰ４５０量は変化しなかった。
【０１８８】
結論
Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯマウスの場合、血漿、肝臓、腎臓又は小腸においては、如何なる遺伝子型誘導の病理学的変化も示されなかった。このモデルで示されたＣｙｐ３ａ発現のレベルは、ウェスタンブロッティングによる検出限界未満であった。Ｃｙｐ３ａ特異的基質７−ＢＱに対する活性が顕著に低下（野生型マウスと比べて２０％未満のレベルまで）した。ミダゾラムクリアランスに関するインビトロデータから、Ｃｙｐ３ａサブファミリー由来のＰ４５０はこの基質の排除に関与する唯一の代謝酵素ではないことが示唆された。未処理Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯマウスの肝ミクロソームのミダゾラム水酸化活性は、野生型株のものに対して〜６０％であった。このことは、その酸化における他のＰ４５０（例えば、Ｃｙｐ２ｃ）の関与によって説明できよう（Perloff et al., 2000; van Waterschoot et al., 2008）。リファンピシン処理によって野生型ではＣｙｐ３ａが誘導されたが、Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯでは誘導されなかった。これによって、処理Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯマウスの肝ミクロソームにおけるミダゾラム水酸化活性にはより顕著な差（野生型に比べて２０％）がもたらされた。ミダゾラムＰＫデータによって、ミダゾラム排除への複数の代謝酵素の関与についての更なる証拠が得られた。未処理Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯマウスとＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスとの間ではミダゾラムＰＫの差は無かったが、これは先に公表されたデータと関連付けられ、Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯ株におけるＰ４５０（例えば、Ｃｙｐ２ｃサブファミリー由来）の多少のアップレギュレーションに起因し得る（van Waterschoot et al., 2008）。リファンピシンの投与によって両方のマウス株でミダゾラムの排除が促進された。これは代謝酵素の誘導を示し、野生型マウス及びＣｙｐ３ａクラスターＫＯマウスにおいてそれぞれ、最大４７０％及び２７０％であった（概算はＡＵＣの変化に基づいて為された）。誘導Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの肝ミクロソームでもミダゾラム水酸化活性の高い増加（最大３８０％）を示したが、Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯ株の肝ミクロソームで示されたミダゾラム水酸化の誘導はほんの僅かであった（最大１２５％）。インビトロ及びインビボでのミダゾラムクリアランスに対するリファンピシンの作用の差は、Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯマウスのインビボでのミダゾラム排除の代替経路の誘導を暗示する。
【０１８９】
更なる実験を行い、１’−ヒドロキシミダゾラムのＰＫプロファイル及び他のＣｙｐ３ａ基質の酵素修飾について比較した。
【０１９０】
研究は９群で行った（表３）。マウスにはリファンピシン（６０ｍｇ／ｋｇ）を３日間腹腔内（ｉｐ）投与した。研究４日目に、ミダゾラムを１〜６群のマウスにはＩＶ注射によって投与（１ｍｇ／ｋｇ）し、７〜９群のマウスには経口投与（２ｍｇ／ｋｇ）した。血液サンプルをＩＶ投与後２分、５分、１０分、２０分、３０分、４５分、６０分、９０分、１２０分及び１５０分（連続出血）で採取し、また、経口投与後１０分、２０分、４０分、６０分、９０分、１２０分、２４０分及び３６０分で採取し、ＰＫ解析を行った（表３）。
【０１９１】
【表３】
【０１９２】
１’−ヒドロキシミダゾラムの薬物動態
先のリファンピシン処理によって野生型マウスではＣｙｐ３ａが誘導されたが、Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯマウスでは誘導されなかった。これによって、２種類のマウス株間ではインビトロでのミダゾラム水酸化活性に顕著な差がもたらされた。しかし、インビボでのミダゾラム排除における差はあまり顕著ではなく、これは、Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯマウスにおけるインビボでのミダゾラム排除の代替経路の誘導を示唆している。本研究では、Ｐ４５０発現レベル概算のためのより高感度で具体的な方法として、リファンピシン誘導マウスへのミダゾラムのＩＶ投与及び経口投与後に１’−ヒドロキシミダゾラムの薬物代謝（一次代謝産物）をモニターした。血液をＢ−グルクロニダーゼで前処理した後に１’−ヒドロキシミダゾラムの総濃度を測定した。親化合物をＩＶ注入した後の１’−ヒドロキシミダゾラムの薬物動態を図１ｓに示す。
【０１９３】
曲線の終末段階はＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス及びＣｙｐ３ａ１１ＫＯマウスの両方において同様であるが、これは、この代謝産物のクリアランスにおける株差が非常に小さいことを示唆する。Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯマウスＰＫの終末段階は、１’−ヒドロキシミダゾラムの排除が他の株と比べて僅かに遅いことを示す。１’−ヒドロキシミダゾラムのＡＵＣは、Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯマウスでは野生型株と比べて顕著に（〜３倍）低下したが、これは、Ｃｙｐ３ａサブファミリー由来のシトクロムＰ４５０がこの代謝産物生成の主要な経路であることを示す。Ｃｙｐ３ａ１１ＫＯマウスにおけるＡＵＣの低下はあまり顕著ではなかった（〜２倍）が、これは、１’−ヒドロキシミダゾラムの生成にＣｙｐ３ａサブファミリーの他のメンバーが多少関与していることを示唆する。ミダゾラム経口投与後の１’−ヒドロキシミダゾラムの薬物動態を図１ｔに示す。
【０１９４】
曲線の終末段階は全ての株で同様であった。しかし、初期の吸収段階では差が見られた。野生型マウスと比べて、Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯマウスやＣｙｐ３ａ１１ＫＯマウスではバイオアベイラビリティが低かった。これは、ミダゾラム経口投与後の１’−ヒドロキシミダゾラムの生成に腸シトクロムＰ４５０が大きく寄与していることを示す。このことは、ＩＶ注入後に野生型マウスとＫＯマウスとの間で１’−ヒドロキシミダゾラムのＡＵＣが非常に大きく異なっていることを示したＩＶデータによって支持された。本研究においては、曲線の吸収段階を定めるデータ点が非常に少なかったため、Ｃ５７ＢＬ／６ＪにおけるＣｙｐ３ａ酵素からの影響は過小評価されているように思われる。
【０１９５】
Ｃｙｐ３ａ酵素活性
肝ミクロソーム及び腸ミクロソームによるＣｙｐ３ａ特異的基質の酸化は、トリアゾラム、ニフェジピン、テストステロン、ジベンジルフルオレセイン（ＤＢＦ）及び７−ベンジルオキシ−４−トリフルオロメチルクマリン（ＢＦＣ）を用いて試験した。トリアゾラム、ニフェジピン及びテストステロンは、１０種のＣＹＰ３Ａ４基質の様々なＣＹＰ３Ａ４リガンドとの相互作用の統計的解析に基づき、ＣＹＰ３Ａ４内の異なる基質グループに帰属された（Kenworthy et al., 1999）。ＤＢＦとＢＦＣは蛍光代謝物を産生し、ＣＹＰ３Ａ４阻害剤のハイスループットスクリーニングにおいて広く応用されている。他の蛍光基質である７−ベンジルオキシキノリン（ＢＱ）は、Ｃｙｐ３ａに対して良好な特異性を示している。
【０１９６】
関連するグラフの全てにおいて、小腸由来サンプルの活性は右のＹ軸スケールを参照し、肝ミクロソームの活性は左のＹ軸スケールを参照されたい。
【０１９７】
トリアゾラムα−水酸化
肝ミクロソーム及び腸ミクロソームによるトリアゾラム酸化の結果を図１ｕに示す。Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯマウス及びＣｙｐ３ａ１１ＫＯマウスの両方においてトリアゾラムの水酸化は顕著に低下した。このことは、公表データ（Perloff et a1.,200O）とよく関連付けられ、トリアゾラムはＣｙｐ３ａサブファミリー由来のマウスシトクロムＰ４５０に対して高い特異性を有する基質であることが示された。また、このデータから、Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯ及びＣｙｐ３ａ１１ＫＯの活性は非常に低く、統計的に違いが無かったため、水酸化にはＣｙｐ３ａ１１が大きく寄与し、他のＣｙｐ３ａ酵素からの影響は無視できることも分かった。
【０１９８】
ニフェジピン酸化
Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯ及びＣｙｐ３ａ１１ＫＯマウスの肝ミクロソームによるニフェジピン酸化は、野生型マウスと比べて有意に（Ｐ＜０．００１）低下した（図１ｖ）。この低下はトリアゾラムの場合と比べてあまり顕著ではなかったが、これは、異なるサブファミリー由来の酵素の潜在的な関与を示す。Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯ及びＣｙｐ３ａ１１ＫＯの平均値は異なったが、統計的な有意差は無かった。腸ミクロソームによるニフェジピン酸化においては統計的な有意差は無かった。
【０１９９】
テストステロン水酸化
テストステロンは、数種の異なるシトクロムＰ４５０によって水酸化される。６ｐ−水酸化は通常、Ｃｙｐ３ａサブファミリー由来の酵素に起因するが、１６Ｂ−水酸化はＣｙｐ２ｂ１０及びＣｙｐ２ｃ２９によって触媒される（Honkakoski et al., 1992）。Ｃｙｐ３ａクラスターノックアウトマウスにおけるＣｙｐ２ｃサブファミリー由来酵素のアップレギュレーションは先に報告されている（van Waterschoot et al., 2008）。従って、両方の水酸化については肝ミクロソーム及び腸ミクロソームを用いて検討した（図１ｗ〜１ｘ）。
【０２００】
Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯマウス及びＣｙｐ３ａ１１ＫＯマウスの両方においてテストステロンの６β−水酸化は有意に低下した。トランスジェニックマウス株の肝ミクロソームによる６β−テストステロンの生成においては差が無かった。Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯマウスの腸ミクロソームの活性はＣｙｐ３ａ１１ＫＯマウスの場合と比べて低かった（Ｐ＜０．０５）が、これは、マウス小腸によるテストステロン６β−水酸化に他のＣｙｐ３ａ酵素が関与していることを示し得る。テストステロンの１６β−水酸化は、野生型マウスと比べて両方のトランスジェニック株の肝ミクロソームで増加したが、これは何らかの代償性変化を示唆し、この変化は、Ｃｙｐ２ｃサブファミリー由来の酵素の過剰発現であると思われる（van Waterschoot et al., 2008）。Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯの平均値はＣｙｐ３ａ１１ＫＯの場合と比べて高かったが、統計的な有意差は無かった。
【０２０１】
ＤＢＦの酸化
ＤＢＦの酸化の結果を図１ｙに示す。肝ミクロソームによるＤＢＦ酸化は、Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯマウス及びＣｙｐ３ａ１１ＫＯマウスの両方に由来するサンプルにおいては顕著な低下を示した。２種のノックアウト株間では統計的な有意差は無かったが、これは、Ｃｙｐ３ａ１１が主要な代謝酵素であることを示唆する。腸ミクロソームによるＤＢＦ酸化においては、野生型株とノックアウト株との間で統計的な有意差は無かった。
【０２０２】
ＢＦＣの酸化
ＢＦＣの酸化の結果を図１ｚに示す。
肝ミクロソームサンプル間でＢＦＣ活性に差は無かった。腸ミクロソームにおいては、僅かではあるが統計的に有意な増加が見られたが、これは、ＢＦＣを酸化する、トランスジェニックマウスにおける他のサブファミリー由来のシトクロムＰ４５０のアップレギュレーションを示唆する。
【０２０３】
結論
Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯモデルは先に基質特異的挙動を示した。このモデルと野生型マウスとの明らかな差は７−ＢＱの酸化に見られた。しかし、ミダゾラムの水酸化では差が見られず、これは、この反応における他のＰ４５０（例えば、Ｃｙｐ２ｃ）の関与を示唆する（Perloff et al., 2000; van Waterschoot et al., 2008）。リファンピシン処理によって野生型ではＣｙｐ３ａが誘導されたが、Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯでは誘導されなかった。この結果、処理Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯマウスの肝ミクロソームにおけるミダゾラム水酸化活性は顕著に低下した。ミダゾラムＡＵＣで示されたように、インビボでの差はあまり顕著ではなかったが、これは、Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯマウスにおけるミダゾラム排除の代替経路の誘導を示唆する。このことは、ミダゾラム代謝産物の薬物動態によって、Ｃｙｐ３ａ発現レベルをより具体的且つ高感度に概算し得ることを暗示した。
【０２０４】
親化合物をＩＶ投与した後の１’−ヒドロキシミダゾラムのＡＵＣはＣｙｐ３ａクラスターＫＯマウスにおいて顕著に（〜３倍）低下したが、これは、この代謝産物の生成にＣｙｐ３ａサブファミリーが大きく寄与することを示す。この方法は、先に用いられた方法の改良であり、ミダゾラムＡＵＣの測定（１．６倍）に基づいた。しかし、インビトロで見られた差（６倍）には完全に対応しなかった。この違いは、親化合物及び代謝産物自身の両方の分布量やクリアランスからの代謝産物ＡＵＣの複合依存性によって説明し得る（Rowland and Tozer, 1995）。腸代謝や吸収が代謝産物の処理に関与する場合には、親薬物の経口投与後に他の複雑な因子が存在する。マウス株間の基質酸化における差は、肝ミクロソームと腸ミクロソームとの間でテストステロンやトリアゾラムに関してはよく対応した。しかし、ニフェジピン、ＤＢＦ及びＢＦＣの酸化に関してはパターンが異なった。これは、後者の反応に様々な酵素が関与し、これらの酵素の相対濃度が肝臓や小腸で異なることを示し得る。このことは、シトクロムＰ４５０の発現レベルの概算において、経口投与後の代謝物ＡＵＣがＩＶ注入後の代謝物ＡＵＣと比べて有益ではないことを示唆した。本研究に用いたＣｙｐ３ａ基質は、その酸化におけるＣｙｐ３ａサブファミリーの影響の点で次のようにランク付けすることができる（トリアゾラム＞ＤＢＦ：テストステロン＞ニフェジピン＞＞ＢＦＣ）。
【０２０５】
ＣＹＰ３Ａ４基質であるＢＦＣの酸化に関するデータから、Ｃｙｐ３ａサブファミリー由来のマウスシトクロムＰ４５０に対するこの化合物の特異性が低いことが分かる。このことは、先に報告されたＢＦＣ酸化におけるヒトシトクロムＰ４５０とラットシトクロムＰ４５０との間の差（Stresser et al., 2002）と一致する。
【０２０６】
Ｃｙｐ３ａクラスターノックアウトの作用に関しては、全ゲノムマイクロアレイ及び肝臓から調製したＲＮＡを用いて転写レベルでも評価した。本研究においては、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｗｈｏｌｅ Ｍｏｕｓｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｏｌｉｇｏ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙスライド（Ｇ４１２２−６０５１０）及びＡｇｉｌｅｎｔ ４４ＫガスケットスライドＧ２５３４−６０００５を用いた。
【０２０７】
マウスには、表１に示すように、リファンピシン／コーン油（６０ｍｇ／ｋｇ／３日間）又は媒体のみを腹腔内注射によって投与した。遺伝子発現の変化倍数（Fold changes）を表４に示す。
【０２０８】
【表４−１】
【０２０９】
【表４−２】
【０２１０】
【表４−３】
【０２１１】
実施例２：Ｃｙｐ２ｃクラスター交換
相同組換えによってマウスＣｙｐ２ｃクラスターの５’末端を標的にして、野生型ｌｏｘＰ及びｆ３部位がＣｙｐ２ｃ５５遺伝子のエクソン１の下流に挿入されるようにした。図２ａに示すように、５’欠損ネオマイシン耐性カセットとＴＫ発現カセットを共導入した。翻訳開始ＡＴＧは、ｌｏｘＰ部位によって５’欠損ネオマイシン耐性カセットからインフレームで分離させて、ｌｏｘＰ部位によってコードされる他のアミノ酸がネオマイシンタンパク質のＮ末端に付着するようにする。
【０２１２】
マウスＣｙｐ２ｃクラスターの３’末端における次の相同組換え段階によって、正しくターゲティングされたＥＳ細胞を更に改変して、図２ｂに示すように、ｆｒｔ、ｌｏｘ５１７１及び野生型ｌｏｘＰ部位がＣｙｐ２ｃ７０遺伝子のエクソン５の下流に挿入されるようにした。更に、図示のように、ハイグロマイシン耐性カセットとチミジンキナーゼ（ＴＫ）発現カセットを共導入した。
【０２１３】
Ｃｒｅ介在組換えによってマウスＣｙｐ２ｃクラスターの欠失を可能とするためには、クラスター両端におけるターゲティングを同一対立遺伝子上で行う必要がある。これについては、Ｃｒｅを用いた二重標的ＥＳ細胞のトランスフェクションとそれに続くガンシクロビルを用いた選択によってインビトロで試験した。図２ｃに示すように、同一対立遺伝子上でターゲティングを行った細胞においてのみ、ＴＫ遺伝子はクラスターの両端で欠失し、ヌクレオシド類似体ガンシクロビルから毒性三リン酸類似体へのＴＫ介在転化が防止される。従って、同一対立遺伝子上でターゲティングを行ったＥＳ細胞のみがガンシクロビル選択後も生存する。生存ＥＳ細胞クローンをＰＣＲで更に解析し、マウスＣｙｐ２ｃクラスターが欠失し、ＰＣＲ陽性クローンが胚盤胞に注入されてキメラマウスが作出されたことを確認した。その後の交雑によって、Ｃｙｐ２ｃクラスターがホモ欠損したマウスを作出した。
【０２１４】
その後、ＥＳ細胞に残存する野生型ｌｏｘＰ及びｌｏｘ５１７１部位を用い、Ｃｒｅ介在挿入によって置換遺伝子（例えば、ヒトＣＹＰ２Ｃクラスター）をマウスクラスターの前の位置において挿入することができる。残存プロモーター、ＡＴＧ及びインフレーム野生型ｌｏｘＰ部位を用いて、５’欠損選択カセット（例えば、５’欠損ネオマイシン）を再度挿入し、高効率で正しく挿入されたクローンを選択することができる。更なるｆｒｔ部位及びｆ３部位が正しい方向に置換カセットと共に共導入されている場合には、両端におけるｆｒｔ部位及びｆ３部位を用い、Ｆｌｐ介在欠失によって、置換遺伝子と共に導入された選択カセットを欠失させることができる。このホモ接合性クラスターＫＯ作出のＰＣＲによる実証を図２ｄに示す。
【０２１５】
実施例３：ホモ接合体Ｃｙｐ３ａクラスターノックアウト／Ｃｙｐ２ｃクラスターノックアウトマウス
Ｃｙｐ３ａＫＯマウスとＣｙｐ２ｃＫＯマウスを交雑させて生存可能なマウス（ＩＤ２３４２５４）を繁殖させた。このマウスは、マウスＣｙｐ３ａクラスター（７個の遺伝子が欠失）及びＣｙｐ２ｃクラスター（１４個の遺伝子が欠失）の両方がホモ欠損している。
【０２１６】
図２ｅは、マウスＩＤ２３４２５４のゲノムからマウスＣｙｐ３ａクラスターが欠如していることのＰＣＲ確認を示す。図２ｆは、同一マウスのゲノムからマウスＣｙｐ２ｃクラスターが欠如していることのＰＣＲ確認を示す。
【０２１７】
ホモ接合体Ｃｙｐ３ａクラスターＫＯ／Ｃｙｐ２ｃクラスターＫＯマウスは、実施例１で詳述するように、その病理組織学、生化学、タンパク質発現及びｍＲＮＡ転写レベルに関して特徴付けされよう。また、公知で仮定のＣｙｐ２ｃＰ４５０アイソフォーム基質を用いた該株の更なる特徴付けも実施されよう。
【０２１８】
実施例４：Ｃｙｐ２ｄクラスター欠失
相同組換えによってマウスＣｙｐ２ｄクラスターの３’末端を標的にして、図３ａに示すように、ｆｒｔ、ｌｏｘ５１７１及び野生型ｌｏｘＰ部位がＣｙｐ２ｄ２６遺伝子のエクソン１の下流に挿入されるようにした。更に、図示のように、ハイグロマイシン耐性カセットを共導入した。続くマウスクラスターの欠失によって無傷のＣｙｐ２ｄ２６プロモーターとＣｙｐ２ｄ２６遺伝子のエクソン１が残るが、これらは、後述のようにクラスターの５’末端において挿入されるヒトＣＹＰ２Ｄ６の発現を妨げる可能性があるため、Ｃｙｐ２ｄ２６プロモーターからの発現を終結させる３’ターゲティングベクターにスプライスアクセプターポリアデニル化モチーフ（ｓＡｐＡ）を含有させた。
【０２１９】
マウスＣｙｐ２ｄクラスターの５’末端における次の相同組換え段階によって、正しくターゲティングされたＥＳ細胞を更に改変して、図３ｂに示すように、ｆｒｔ部位、野生型ｌｏｘＰ部位及びネオマイシン耐性カセット３’によってｌｏｘＰ部位に隣接させたヒトＣＹＰ２Ｄ６発現カセットがＣｙｐ２ｄ２２遺伝子のエクソン３の下流に挿入されるようにした。
【０２２０】
ｌｏｘＰ部位におけるＣｒｅ介在組換えによってヒト発現カセットを維持しながらマウスＣｙｐ２ｄクラスターを欠失させることができるが、Ｃｙｐ２ｄ遺伝子座の完全なノックアウト（図３ｃに示す）をもたらすマウスクラスターとヒト発現カセットの同時欠失は、ｆｒｔ部位におけるＦｌｐ介在組換えの結果である。
【０２２１】
Ｃｒｅ介在又はＦｌｐ介在組換えによってマウスＣｙｐ２ｄクラスターの欠失を可能とするためには、クラスター両端におけるターゲティングを同一対立遺伝子上で行う必要がある。従って、Ｃｒｅを用いたインビトロ欠失によって二重標的ＥＳクローンを更に解析した後、クラスターの欠失を可能とするプライマー対を用いてＰＣＲ解析を行った。インビトロＣｒｅ欠失はトランスフェクト細胞の一部でしか生じず、また、欠失が成功した個々の細胞を選択することができないため、ＰＣＲ解析は欠失クローン及び未欠失クローンのプールに対して行った。ＰＣＲ陽性未欠失親クローンを胚盤胞に注入してキメラマウスを作出した。Ｃｒｅ又はＦｌｐ欠失株、或いは各リコンビナーゼを組織特異的に発現する株と交雑させた後に交雑受精させることによって、全身又は特定の組織において欠失し、ヒト発現カセットを含む（又は含まない）ホモ接合Ｃｙｐ２ｄクラスター欠失マウスが作出されよう。
【０２２２】
このホモ接合性クラスターＫＯ作出のＰＣＲによる実証を図３ｄに示す。
【０２２３】
Ｃｙｐ２ｄＫＯマウスにおけるブフラロールＰＫ
Ｃｙｐ２ｄ特異的基質であるブフラロールの薬物動態をＣｙｐ２ｄＫＯマウス（Ｃｙｐ２ｄアイソフォーム全てが無効化されたマウス）において検討した。野生型であるＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを対照として用いた。ブフラロールのＡＵＣは、野生型マウスと比べるとＣｙｐ２ｄＫＯマウスでは顕著に増加したことが示された（図３ｅ）。このことは、インビトロデータ（Bogaards et al., 2000）（即ち、ブフラロール水酸化の速度は、ヒト肝ミクロソームと比べてマウス肝ミクロソームでは〜１０倍高いことが示された）とよく関連付けられた。
【０２２４】
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Zhou, J., Zhang, J., and Xie, W. (2005). Xenobiotic nuclear receptor-mediated regulation of UDP-glucuronosyl-transferases. Curr Drug Metab. 6, 289-98.
【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬物代謝酵素をコードする遺伝子クラスターの全てのメンバーが機能しないようにされており、欠失したクラスター内の遺伝子と等価な機能を有するヒト置換遺伝子を含まないマウス。
【請求項２】
該遺伝子クラスターは全ての組織において機能しないようにされている、請求項１に記載のマウス。
【請求項３】
薬物代謝酵素をコードする遺伝子クラスターは、Ｐ４５０遺伝子クラスター等の第Ｉ相薬物代謝酵素遺伝子クラスターである、請求項１又は請求項２に記載のマウス。
【請求項４】
薬物代謝酵素をコードする遺伝子クラスターは、ＵＧＴ遺伝子クラスター等の第ＩＩ相薬物代謝酵素遺伝子クラスターである、請求項１又は請求項２に記載のマウス。
【請求項５】
第Ｉ相薬物代謝酵素遺伝子クラスターは、Ｃｙｐ２ａｂｆｇｓｔクラスター、Ｃｙｐ２ｃクラスター、Ｃｙｐ２ｄクラスター、Ｃｙｐ２ｊクラスター、Ｃｙｐ３ａクラスター、Ｃｙｐ４ａｂｘクラスター及びＣｙｐ４ｆクラスターから成る群から選択される、請求項３に記載のマウス。
【請求項６】
第Ｉ相薬物代謝酵素遺伝子クラスターは、Ｃｙｐ３ａクラスター、Ｃｙｐ２ｃクラスター、Ｃｙｐ２ｄクラスター、又はＣｙｐ３ａクラスターとＣｙｐ２ｃクラスターの多重ノックアウトである、請求項５に記載のマウス。
【請求項７】
第Ｉ相、第ＩＩ相及び／又は第ＩＩＩ相薬物代謝酵素及び／又は薬物輸送体をコードする多重遺伝子クラスターが機能しないようにされている、先の請求項のいずれか１項に記載のマウス。
【請求項８】
該遺伝子クラスターは、コード配列の欠失によって機能しないようにされている、先の請求項のいずれか１項に記載のマウス。
【請求項９】
コード配列の欠失は、相同組換えのメカニズムによって為されている、請求項８に記載のマウス。
【請求項１０】
マウス染色体への更なるヒト遺伝子の導入を伴う更なる遺伝子組換えが行われている、先の請求項のいずれか１項に記載のマウス。
【請求項１１】
前記更なるヒト遺伝子は、プレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）、構成的アンドロスタン受容体（ＣＡＲ）、ＰＰＡＲ（α、δ及びγ）、ＮＲＦ２、Ａｈ受容体、ＨＮＦ１及びＨＮＦ４の一以上から選択される、請求項１０に記載のマウス。
【請求項１２】
前記更なるヒト遺伝子は、グルクロニルトランスフェラーゼ（例えば、ＵＧＴ１Ａ遺伝子）、グルタチオントランスフェラーゼ（例えば、ＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ））、スルホトランスフェラーゼ及びアセチルトランスフェラーゼから選択される、請求項１０又は請求項１１に記載のマウス。
【請求項１３】
前記更なるヒト遺伝子は、多剤耐性タンパク質（例えば、ｍｄｒ１及びｍｄｒ３）及び多剤耐性関連タンパク質（ＭＲＰ）（例えば、ＭＲＰ１及び／又はＭＲＰ２及び／又はＭＲＰ６）、又は有機アニオン輸送ポリペプチド（ＯＡＴＰ）から選択される、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載のマウス。
【請求項１４】
先の請求項のいずれか１項に記載のマウスから単離された細胞。
【請求項１５】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のマウス又は請求項１４に記載の細胞の集団を用いるアッセイ方法。
【請求項１６】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のマウスを作出する方法であって、
ａ）置換対象のマウス標的遺伝子クラスターが各々の端で組換え部位と隣接するように相同組換えによってマウス染色体に一対の部位特異的組換え部位を組込むことと、
ｂ）部位特異的組換え部位間で組換えを行い、マウス標的遺伝子クラスターが染色体から除去され、残存部位特異的組換え部位で置換されるようにすることとを含む方法。
【請求項１】
薬物代謝酵素をコードする遺伝子クラスターの全てのメンバーが機能しないようにされており、欠失したクラスター内の遺伝子と等価な機能を有するヒト置換遺伝子を含まないマウス。
【請求項２】
該遺伝子クラスターは全ての組織において機能しないようにされている、請求項１に記載のマウス。
【請求項３】
薬物代謝酵素をコードする遺伝子クラスターは、Ｐ４５０遺伝子クラスター等の第Ｉ相薬物代謝酵素遺伝子クラスターである、請求項１又は請求項２に記載のマウス。
【請求項４】
薬物代謝酵素をコードする遺伝子クラスターは、ＵＧＴ遺伝子クラスター等の第ＩＩ相薬物代謝酵素遺伝子クラスターである、請求項１又は請求項２に記載のマウス。
【請求項５】
第Ｉ相薬物代謝酵素遺伝子クラスターは、Ｃｙｐ２ａｂｆｇｓｔクラスター、Ｃｙｐ２ｃクラスター、Ｃｙｐ２ｄクラスター、Ｃｙｐ２ｊクラスター、Ｃｙｐ３ａクラスター、Ｃｙｐ４ａｂｘクラスター及びＣｙｐ４ｆクラスターから成る群から選択される、請求項３に記載のマウス。
【請求項６】
第Ｉ相薬物代謝酵素遺伝子クラスターは、Ｃｙｐ３ａクラスター、Ｃｙｐ２ｃクラスター、Ｃｙｐ２ｄクラスター、又はＣｙｐ３ａクラスターとＣｙｐ２ｃクラスターの多重ノックアウトである、請求項５に記載のマウス。
【請求項７】
第Ｉ相、第ＩＩ相及び／又は第ＩＩＩ相薬物代謝酵素及び／又は薬物輸送体をコードする多重遺伝子クラスターが機能しないようにされている、先の請求項のいずれか１項に記載のマウス。
【請求項８】
該遺伝子クラスターは、コード配列の欠失によって機能しないようにされている、先の請求項のいずれか１項に記載のマウス。
【請求項９】
コード配列の欠失は、相同組換えのメカニズムによって為されている、請求項８に記載のマウス。
【請求項１０】
マウス染色体への更なるヒト遺伝子の導入を伴う更なる遺伝子組換えが行われている、先の請求項のいずれか１項に記載のマウス。
【請求項１１】
前記更なるヒト遺伝子は、プレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）、構成的アンドロスタン受容体（ＣＡＲ）、ＰＰＡＲ（α、δ及びγ）、ＮＲＦ２、Ａｈ受容体、ＨＮＦ１及びＨＮＦ４の一以上から選択される、請求項１０に記載のマウス。
【請求項１２】
前記更なるヒト遺伝子は、グルクロニルトランスフェラーゼ（例えば、ＵＧＴ１Ａ遺伝子）、グルタチオントランスフェラーゼ（例えば、ＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ））、スルホトランスフェラーゼ及びアセチルトランスフェラーゼから選択される、請求項１０又は請求項１１に記載のマウス。
【請求項１３】
前記更なるヒト遺伝子は、多剤耐性タンパク質（例えば、ｍｄｒ１及びｍｄｒ３）及び多剤耐性関連タンパク質（ＭＲＰ）（例えば、ＭＲＰ１及び／又はＭＲＰ２及び／又はＭＲＰ６）、又は有機アニオン輸送ポリペプチド（ＯＡＴＰ）から選択される、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載のマウス。
【請求項１４】
先の請求項のいずれか１項に記載のマウスから単離された細胞。
【請求項１５】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のマウス又は請求項１４に記載の細胞の集団を用いるアッセイ方法。
【請求項１６】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のマウスを作出する方法であって、
ａ）置換対象のマウス標的遺伝子クラスターが各々の端で組換え部位と隣接するように相同組換えによってマウス染色体に一対の部位特異的組換え部位を組込むことと、
ｂ）部位特異的組換え部位間で組換えを行い、マウス標的遺伝子クラスターが染色体から除去され、残存部位特異的組換え部位で置換されるようにすることとを含む方法。
【図１ａ】
【図１ｂ−１】
【図１ｂ−２】
【図１ｃ】
【図１ｄ】
【図１ｅ】
【図１ｆ】
【図１ｇ】
【図１ｈ】
【図１ｉ】
【図１ｊ】
【図１ｋ】
【図１ｌ】
【図１ｍ】
【図１ｎ】
【図１ｏ】
【図１ｐ】
【図１ｑ】
【図１ｒ】
【図１ｓ】
【図１ｔ】
【図１ｕ】
【図１ｖ】
【図１ｗ】
【図１ｘ】
【図１ｙ】
【図１ｚ】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図２ｃ】
【図２ｄ−１】
【図２ｄ−２】
【図２ｅ】
【図２ｆ】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図３ｃ】
【図３ｄ−１】
【図３ｄ−２】
【図３ｅ】
【図４ａ】
【図４ｂ】
【図４ｃ】
【図１ｂ−１】
【図１ｂ−２】
【図１ｃ】
【図１ｄ】
【図１ｅ】
【図１ｆ】
【図１ｇ】
【図１ｈ】
【図１ｉ】
【図１ｊ】
【図１ｋ】
【図１ｌ】
【図１ｍ】
【図１ｎ】
【図１ｏ】
【図１ｐ】
【図１ｑ】
【図１ｒ】
【図１ｓ】
【図１ｔ】
【図１ｕ】
【図１ｖ】
【図１ｗ】
【図１ｘ】
【図１ｙ】
【図１ｚ】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図２ｃ】
【図２ｄ−１】
【図２ｄ−２】
【図２ｅ】
【図２ｆ】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図３ｃ】
【図３ｄ−１】
【図３ｄ−２】
【図３ｅ】
【図４ａ】
【図４ｂ】
【図４ｃ】
【公表番号】特表２０１１−５０００４８（Ｐ２０１１−５０００４８Ａ）
【公表日】平成２３年１月６日（２０１１．１．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５２９４５１（Ｐ２０１０−５２９４５１）
【出願日】平成２０年１０月１７日（２００８．１０．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００８／００３５３１
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０５０４８４
【国際公開日】平成２１年４月２３日（２００９．４．２３）
【出願人】（５０７１９４０８４）アイティーアイ・スコットランド・リミテッド (30)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年１月６日（２０１１．１．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１０月１７日（２００８．１０．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００８／００３５３１
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０５０４８４
【国際公開日】平成２１年４月２３日（２００９．４．２３）
【出願人】（５０７１９４０８４）アイティーアイ・スコットランド・リミテッド (30)
【Ｆターム（参考）】
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