ＰＡＲ−２に結合する抗原結合性タンパク質
本発明は、抗ＰＡＲ−２抗体に関するかまたは該抗体から得られる組成物および方法を提供する。特定の態様において、本発明は、ＰＡＲ−２に結合するヒト抗体、こうした抗体のＰＡＲ−２結合性断片および誘導体、ならびにこうした断片を含むＰＡＲ−２結合性ポリペプチドを提供する。他の態様は、こうした抗体、抗体断片および誘導体およびポリペプチドをコードする核酸、こうしたポリヌクレオチドを含む細胞、こうした抗体、抗体断片および誘導体およびポリペプチドを作製する方法、ならびにこうした抗体、抗体断片および誘導体およびポリペプチドを用いる方法であって、ＰＡＲ−２に関連する障害または状態を有する被験体の治療法または診断法を含む方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対するクロスリファレンス
本出願は、米国仮出願第６１／０５８，０９４号、２００８年６月２日出願および米国仮出願第６０／９４７，２６４号、２００７年６月２９日出願の優先権を請求し、該出願は本明細書に援用される。
【０００２】
発明の分野
本出願は、ＰＡＲ−２抗原結合性タンパク質に関する組成物および方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
プロテイナーゼ活性化受容体（ＰＡＲ）ファミリーは、７回膜貫通Ｇタンパク質共役型受容体スーパーファミリーの一部である。現在、４つの既知のＰＡＲがあり、このうち３つ（ＰＡＲ−１、−３、および−４）はトロンビンによって活性化され；４番目（ＰＡＲ−２）はトリプシンまたはマスト細胞トリプターゼによって活性化されるが、トロンビンによっては活性化されない。ＰＡＲは、多様な組織に広く分布し、そして血小板凝集、炎症および心臓血管機能、消化機能または呼吸機能などの、多くの生理学的現象または病態生理学的現象に関与する。
【０００４】
ＰＡＲは、活性化がＰＡＲのＮ末端のタンパク質分解的切断によって開始され、これが次に、係留されたリガンドを形成して、同じ受容体ポリペプチドの細胞外領域（ループ２）と相互作用する点で、他の受容体と異なる。ＰＡＲ−２の切断は、ヒト、ネズミおよびラットのＰＡＲ−２間で保存されるプロテアーゼ切断ドメイン、ＳＫＧＲＳＬＩＧ（配列番号２のアミノ酸３３〜４０）のＲおよびＳ残基間で生じる。係留されたリガンドを模倣するペプチドは、ＰＡＲ−２に対して、アゴニスト性効果を有することが示されてきている（Ｓａｉｆｅｄｄｉｎｅら， Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １１８（３）：５２１−３０［１９９６］； ＭｃＧｕｉｒｅら， Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ ３０９（３）：１１２４−３１［２００４］）。
【０００５】
ＰＡＲ−２は、Ｇタンパク質共役型受容体が仲介する共通するシグナル伝達経路である、イノシトール１，４，５−三リン酸産生およびＣａ（２＋）可動化、ならびにＥＲＫ、ｐ３８ＭＡＰＫ、ＪＮＫ、およびＩＫＫを含む多数のキナーゼ経路を活性化する。ＰＡＲ−２は、腎臓、膵臓、胃、腸、気道、皮膚、膀胱および脳において、上皮細胞および内皮細胞、筋細胞、線維芽細胞、免疫細胞、ニューロンおよびグリア細胞上に存在する。ＰＡＲ−２を活性化するプロテアーゼは、炎症中に存在し、そしてＰＡＲ−２は、腫瘍壊死因子アルファ、インターロイキン１アルファおよびリポ多糖などの炎症性因子によって上方制御される。さらに、ＰＡＲ−２不全マウスまたは過剰発現マウスを利用した研究は、炎症におけるこの受容体の役割を確認する（Ｓｃｈｍｉｄｌｉｎら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６９， ５３１５−５３２１［２００２］； Ｆｅｒｒｅｌｌら， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １１１， ３５−４１［２００３］）。したがって、当該技術分野には、炎症状態を治療するかまたは改善するのに有用であろう、ＰＡＲ−２活性化のアンタゴニストを発展させる必要性がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｓａｉｆｅｄｄｉｎｅら， Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １１８（３）：５２１−３０［１９９６］
【非特許文献２】ＭｃＧｕｉｒｅら， Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ ３０９（３）：１１２４−３１［２００４］
【非特許文献３】Ｓｃｈｍｉｄｌｉｎら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６９， ５３１５−５３２１［２００２］
【非特許文献４】Ｆｅｒｒｅｌｌら， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １１１， ３５−４１［２００３］
【発明の概要】
【０００７】
１つの側面において、本発明は、ヒトＰＡＲ−２に特異的に結合する単離抗原結合性タンパク質を提供する。本発明の別の側面において、抗原結合性タンパク質は、非ヒト霊長類、カニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｏｕｓ ｍｏｎｋｅｙ）、チンパンジー（ｃｈｉｍｐａｎｚｅｅ）、非霊長類哺乳動物、げっ歯類、マウス、ラット、ハムスター（ｈａｍｓｔｅｒ）、モルモット（ｇｕｉｎｅａ ｐｉｇ）、ネコ、またはイヌのＰＡＲ−２に特異的に結合する。別の態様において、単離抗原結合性タンパク質は：ａ． ヒト抗体； ｂ． キメラ抗体； ｃ． モノクローナル抗体； ｄ． 組換え抗体； ｅ． 抗原結合性抗体断片； ｆ． 一本鎖抗体； ｇ． ディアボディ； ｈ． トリアボディ； ｉ． テトラボディ； ｊ． Ｆａｂ断片； ｋ． Ｆ（ａｂ’）２断片； ｌ． ドメイン抗体； ｍ． ＩｇＤ抗体； ｎ． ＩｇＥ抗体； ｏ． ＩｇＭ抗体； ｐ． ＩｇＧ１抗体； ｑ． ＩｇＧ２抗体； ｒ． ＩｇＧ３抗体； ｓ． ＩｇＧ４抗体；またはｔ． Ｈ鎖内ジスルフィド結合を形成する傾向を軽減する、ヒンジ領域中の少なくとも１つの突然変異を有するＩｇＧ４抗体を含む。
【０００８】
本発明の別の側面において、本発明は、重鎖および軽鎖を有する単離抗原結合性タンパク質であって、配列番号９に少なくとも９５％同一である可変領域を含む重鎖、および配列番号１１に少なくとも９５％同一である可変領域を含む軽鎖を有する、単離抗原結合性タンパク質を提供する。別の態様において、重鎖可変領域は配列番号３１に少なくとも９５％同一であり、そして軽鎖可変領域は配列番号３５に少なくとも９５％同一である。本発明の別の側面において、軽鎖可変領域は配列番号３９のアミノ酸配列を有し、そして重鎖可変領域は配列番号４０のアミノ酸配列を有する。本発明の別の態様において、軽鎖可変領域は配列番号４１のアミノ酸配列を有し、そして重鎖可変領域は配列番号４２のアミノ酸配列を有する。
【０００９】
本発明の１つの態様において、重鎖可変領域は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と称される３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、そして軽鎖可変領域は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と称される３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。本発明の別の側面において、重鎖可変領域は、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４と称される４つのフレームワーク領域（ＦＲ）をさらに含み、そして軽鎖可変領域は、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４と称される４つのフレームワーク領域（ＦＲ）をさらに含む。本発明の１つの態様において、重鎖ＣＤＲは、配列番号９、１３、１７、２３、２７、３１、および３５に示されるアミノ酸配列を有するペプチドのＣＤＲの中から選択され、そして軽鎖ＣＤＲは、配列番号１１、１５、１９、２５、２９、３３および３７に示されるアミノ酸配列を有するペプチドのＣＤＲの中から選択される。
【００１０】
本発明の１つの側面において、３つの重鎖ＣＤＲはすべて同じペプチドから選択され、例えば、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は配列番号９由来であり、そして軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は配列番号１１由来であるなどである。本発明の別の態様において、ＣＤＲは異なるペプチドの中から選択され、例えば、重鎖ＣＤＲ１は配列番号９由来であり、ＣＤＲ２は配列番号１３由来であり、そしてＣＤＲ３は配列番号１７由来であり、そして軽鎖ＣＤＲ１は配列番号１１由来であり、ＣＤＲ２は配列番号１５由来であり、そしてＣＤＲ３は配列番号１９由来であるなどである。あるいは、２つのＣＤＲが単一ペプチドより選択され、そして第三のＣＤＲが別のペプチドより選択されてもよい。多数のこうした組み合わせが可能である。別の側面において、フレームワーク領域は同じペプチドより選択されてもよいし、または１以上のフレームワーク領域が異なるペプチドより選択されてもよい。
【００１１】
本発明の１つの側面において、本発明は、前述のポリペプチドをコードする核酸を提供する。本発明の別の側面において、核酸はベクターである。本発明の別の態様において、本発明は、本発明の核酸で形質転換またはトランスフェクションされている、宿主細胞を提供する。本発明の別の側面において、ポリペプチドを調製する方法であって、ポリペプチドの発現を促進する条件下で、宿主細胞をインキュベーションし、そしてポリペプチドを採取する工程を含む、前記方法を提供する。
【００１２】
別の側面において、本発明は、ＰＡＲ−２に結合する抗原結合性タンパク質を分泌する単離細胞を提供する。別の態様において、細胞はハイブリドーマである。別の態様において、本発明は、ヒトＰＡＲ−２に結合する抗原結合性タンパク質を作製する方法であって、前記抗原結合性タンパク質を発現することを可能にする条件下で、前記単離細胞をインキュベーションする工程を含む、前記方法を提供する。
【００１３】
１つの側面において、本発明は、プロテイナーゼ活性化受容体−２（ＰＡＲ−２）に結合する単離抗原結合性タンパク質を提供する。別の態様において、単離抗原結合性タンパク質は、ヒトＰＡＲ−２に結合した際、タンパク質分解的切断、および／または前記ヒトＰＡＲ−２を通じた、それに続くシグナル伝達を阻害する。別の態様において、単離抗原結合性タンパク質は、約８０％より多く、ＰＡＲ−２のタンパク質分解的活性化を阻害する。別の態様において、単離抗原結合性タンパク質は、非切断ＰＡＲ−２に結合し、そしてより少ない度合いで、切断ＰＡＲ−２に結合する。別の態様において、単離抗原結合性タンパク質は、約１０％より少なく、ＰＡＲ−２のタンパク質分解的活性化を阻害する。別の態様において、単離抗原結合性タンパク質は、切断および非切断ＰＡＲ−２の両方に、実質的に同等に結合する。
【００１４】
別の側面において、本発明は、抗原結合性タンパク質を含む薬学的組成物を提供する。１つの態様において、本発明は、被験体における状態を治療する方法であって、前記被験体に前記薬学的組成物を投与する工程を含み、前記状態が、前記被験体において、ＰＡＲ−２活性を減少させることによって治療可能である、前記方法を提供する。別の態様において、前記被験体はヒトである。別の態様において、前記状態は、皮膚、関節、胃腸系および／または気道の炎症状態である。別の態様において、該方法は、前記被験体に第二の治療を投与する工程をさらに含む。別の態様において、前記薬学的組成物を前記被験体に投与する前に、および／またはそれと同時に、および／またはその後に、前記の第二の治療を前記被験体に投与する。別の態様において、前記の第二の治療は、抗炎症剤を含む。別の態様において、前記の第二の薬学的組成物は、非ステロイド抗炎症性薬剤、ステロイド、および免疫調節剤からなる群より選択される剤を含む。別の態様において、前記方法は、前記被験体に第三の治療を投与する工程を含む。
【００１５】
別の側面において、本発明は、被験体の寿命を増加させる方法であって、前記薬学的組成物を前記被験体に投与する工程を含む、前記方法を提供する。
別の側面において、本発明は、ＰＡＲ−２活性を減少させる必要がある被験体において、ＰＡＲ−２活性を減少させる方法であって、前記薬学的組成物を前記被験体に投与する工程を含む、前記方法を提供する。
【００１６】
別の側面において、本発明は、ＰＡＲ−２シグナル伝達を減少させる必要がある被験体において、ＰＡＲ−２シグナル伝達を減少させる方法であって、前記薬学的組成物を前記被験体に投与する工程を含む、前記方法を提供する。
【００１７】
別の側面において、本発明は、ＰＡＲ−２のタンパク質分解的活性化を阻害する必要がある被験体において、ＰＡＲ−２のタンパク質分解的活性化を阻害する方法であって、前記薬学的組成物を前記被験体に投与する工程を含む、前記方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１−１】図１は、アジュバント誘導性関節炎モデルにおける、ラット由来の足組織中に存在する特定の炎症促進性サイトカインのレベルを比較するグラフのセットを提供する。
【図１−２】図１は、アジュバント誘導性関節炎モデルにおける、ラット由来の足組織中に存在する特定の炎症促進性サイトカインのレベルを比較するグラフのセットを提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、プロテイナーゼ活性化受容体２（「ＰＡＲ−２」）に結合する分子であって、ＰＡＲ−２をアゴナイズするかまたはアンタゴナイズする分子、例えば抗ＰＡＲ−２抗体、抗体断片、および抗体誘導体、例えばアンタゴニスト性抗ＰＡＲ−２抗体、抗体断片、または抗体誘導体を含む分子に関連する、組成物、キット、および方法を提供する。やはり提供するのは、ＰＡＲ−２に結合するポリペプチドのすべてまたは一部をコードするヌクレオチドの配列を含む、核酸、ならびにその誘導体および断片、例えば抗ＰＡＲ−２抗体、抗体断片、または抗体誘導体のすべてまたは一部をコードする核酸、こうした核酸を含むプラスミドおよびベクター、ならびにこうした核酸および／またはベクターおよびプラスミドを含む細胞または細胞株である。提供する方法には、例えば、ＰＡＲ−２に結合する分子、例えば抗ＰＡＲ−２抗体を作製するか、同定するか、または単離する方法、分子がＰＡＲ−２に結合するかどうかを決定する方法、分子がＰＡＲ−２をアゴナイズするかまたはアンタゴナイズするかどうかを決定する方法、ＰＡＲ−２に結合する分子を含む、薬学的組成物などの組成物を作製する方法、ならびにＰＡＲ−２に結合する分子を被験体に投与するための方法、例えばＰＡＲ−２によって仲介される状態を治療するための方法、およびＰＡＲ−２の生物学的活性をｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏでアゴナイズするかまたはアンタゴナイズするための方法が含まれる。
【００２０】
ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列は、標準的な１文字または３文字略記を用いて示される。別に示さない限り、各ポリペプチド配列は、アミノ末端を左側に、そしてカルボキシ末端を右側に有し；各一本鎖核酸配列、および各二本鎖核酸配列の上部鎖は、５’端を左に、そして３’端を右に有する。特定のポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列はまた、参照配列とどのように異なるかを説明することによって記載されうる。
【００２１】
本明細書において、別に定義しない限り、本発明と関連して用いられる科学的および技術的用語は、一般の当業者に一般的に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈によって必要とされない限り、単数形の用語は複数のものを含み、そして複数形の用語は単数形を含むものとする。一般的に、本明細書に記載する、細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質および核酸化学およびハイブリダイゼーションと関連して用いられる術語、ならびにそれらの技術は、当該技術分野に周知であり、そして一般的に用いられるものである。本発明の方法および技術は、別に示さない限り、一般的に、当該技術分野に周知の慣用法にしたがって、そして本明細書全体で引用され、そして論じられる、多様な一般的な参考文献およびより特異的な参考文献に記載されるように、行われる。例えば、本明細書に援用される、Ｓａｍｂｒｏｏｋら Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８９）、ならびにＡｕｓｕｂｅｌら， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２）、ならびにＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９９０）を参照されたい。酵素反応および精製技術は、当該技術分野に一般的に達成されるように、または本明細書に記載するように、製造者の指定にしたがって行われる。本明細書記載の分析化学、合成有機化学、ならびに医学的および薬学的化学と関連して用いられる専門用語、ならびにこうした化学の実験法および技術は、当該技術分野に周知であり、そして一般的に知られるものである。化学合成、化学分析、薬学的調製、配合、および送達、ならびに患者の治療には、標準的技術を用いてもよい。
【００２２】
以下の用語は、別に示さない限り、以下の意味を有すると理解されるべきである：
用語「単離分子」は（分子が、例えばポリペプチド、ポリヌクレオチド、または抗体である場合）、その起源または派生供給源によって、（１）天然状態で該分子に付随する、天然に関連する構成要素と関連していないか、（２）同じ種由来の他の分子を実質的に含まないか、（３）異なる種由来の細胞によって発現されるか、または（４）人の介入なしに天然には存在しない分子である。したがって、化学的に合成されたか、または天然に由来する細胞とは異なる細胞系において合成される分子は、天然に関連する構成要素から「単離されている」であろう。分子はまた、当該技術分野に周知の精製技術を用いた単離によって、天然に関連する構成要素を実質的に含まないようにされうる。当該技術分野に周知のいくつかの手段によって、分子純度または均一性をアッセイしてもよい。例えば、当該技術分野に周知の技術を用いて、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用い、そしてゲルを染色してポリペプチドを視覚化して、ポリペプチド試料の純度をアッセイしてもよい。特定の目的のため、ＨＰＬＣまたは当該技術分野に周知の精製のための他の手段を用いることによって、より高い解像度を提供してもよい。
【００２３】
用語「ＰＡＲ−２阻害剤」および「ＰＡＲ−２アンタゴニスト」は交換可能に用いられる。各々は、ＰＡＲ−２の少なくとも１つの機能を検出可能に阻害する分子である。逆に、「ＰＡＲ−２アゴニスト」は、ＰＡＲ−２の少なくとも１つの機能を検出可能に増加させる分子である。ＰＡＲ−２阻害剤によって引き起こされる阻害は、アッセイを用いて検出可能である限り、完全である必要はない。ＰＡＲ−２の機能のいかなるアッセイを用いてもよく、それらの例を本明細書に提供する。ＰＡＲ−２阻害剤によって阻害可能なＰＡＲ−２の機能またはＰＡＲ−２アゴニストによって増加可能なＰＡＲ−２の機能の例には、プロテアーゼが活性化するリガンド結合、下流シグナル伝達などが含まれる。ＰＡＲ−２阻害剤およびＰＡＲ−２アゴニストの種類の例には、限定されるわけではないが、抗原結合性タンパク質（例えばＰＡＲ−２阻害性抗原結合性タンパク質）、抗体、抗体断片、および抗体誘導体などの、ＰＡＲ−２結合性ポリペプチドが含まれる。
【００２４】
用語「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」は、各々、ペプチド結合によって互いに連結された２以上のアミノ酸残基を含む分子を指す。これらの用語は、例えば天然および人工的タンパク質、タンパク質断片、およびタンパク質配列のポリペプチド類似体（突然変異タンパク質（ｍｕｔｅｉｎ）、変異体、および融合タンパク質など）、ならびに翻訳後、あるいは別の共有的または非共有的修飾タンパク質を含む。ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、単量体性または多量体性であってもよい。
【００２５】
用語「ポリペプチド断片」は、本明細書において、対応する全長タンパク質に比較した際、アミノ末端および／またはカルボキシ末端欠失を有するポリペプチドを指す。断片は、例えば、少なくとも長さ５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、５０、７０、８０、９０、１００、１５０または２００アミノ酸であってもよい。断片はまた、例えば、最大で、長さ１，０００、７５０、５００、２５０、２００、１７５、１５０、１２５、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１４、１３、１２、１１、または１０アミノ酸であってもよい。断片は、さらに、どちらかまたは両方の端に、１以上のさらなるアミノ酸、例えば異なる天然存在タンパク質（例えばＦｃまたはロイシンジッパードメイン）または人工的アミノ酸配列（例えば人工的リンカー配列またはタグタンパク質）由来のアミノ酸配列を含んでもよい。
【００２６】
本発明のポリペプチドには、例えば：（１）タンパク質分解に対する感受性を減少させ、（２）酸化に対する感受性を減少させ、（３）タンパク質複合体を形成するための結合アフィニティを改変し、（４）結合アフィニティを改変し、そして（４）他の物理化学特性または機能特性を与えるかまたはこうした特性を修正するように、いずれかの方式で、そしていずれかの理由のために修飾されているポリペプチドが含まれる。類似体には、ポリペプチドの突然変異タンパク質が含まれる。例えば、単数または多数のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）を天然存在配列において（例えば、分子間接触を形成するドメイン（単数または複数）外のポリペプチドの部分において）行うことも可能である。「保存的アミノ酸置換」は、親配列の構造特徴を実質的に変化させないものである（例えば置換アミノ酸は、親配列に存在するらせんを中断させるか、あるいは親配列を特徴付けるかまたはその機能に必要な他の種類の二次構造を破壊する傾向があってはならない）。当該技術分野に認識されるポリペプチド二次構造および三次構造の例が、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ監修， Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ， ニューヨーク（１９８４））； Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｃ． ＢｒａｎｄｅｎおよびＪ． Ｔｏｏｚｅ監修， Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， ニューヨーク州ニューヨーク（１９９１））；およびＴｈｏｒｎｔｏｎら Ｎａｔｕｒｅ ３５４：１０５（１９９１）に記載され、これらは各々、本明細書に援用される。
【００２７】
本発明はまた、ＰＡＲ−２結合性ポリペプチドの非ペプチド類似体も提供する。非ペプチド類似体は、テンプレート・ペプチドのものに類似の特性を持つ薬剤として、薬剤産業において一般的に用いられる。これらの種類の非ペプチド化合物は、「ペプチド模倣体」（「ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｉｍｅｔｉｃｓ」または「ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ」）と称され、例えば、本明細書に援用される、Ｆａｕｃｈｅｒｅ， Ｊ． Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ． １５：２９（１９８６）； ＶｅｂｅｒおよびＦｒｅｉｄｉｎｇｅｒ ＴＩＮＳ ｐ．３９２（１９８５）；ならびにＥｖａｎｓら Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３０：１２２９（１９８７）を参照されたい。療法的に有用なペプチドに構造的に類似のペプチド模倣体を用いて、同等の療法効果または予防効果を生じることも可能である。一般的に、ペプチド模倣体は、ヒト抗体などの模範（ｐａｒａｄｉｇｍ）ポリペプチド（すなわち所望の生化学的特性または薬理学的活性を有するポリペプチド）に構造的に類似であるが、当該技術分野に周知の方法によって：−−ＣＨ２ＮＨ−−、−−ＣＨ２Ｓ−−、−−ＣＨ２−−ＣＨ２−−、−−ＣＨ＝ＣＨ−（シスおよびトランス）、−−ＣＯＣＨ２−−、−−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−−、および−−ＣＨ２ＳＯ−−からなる群より選択される連結により、場合によって置換された１以上のペプチド連結を有する。コンセンサス配列の１以上のアミノ酸を、同じ種類のＤ−アミノ酸（例えばＬ−リジンの代わりにＤ−リジン）で体系的に置換して、より安定なペプチドを生成することも可能である。さらに、コンセンサス配列または実質的に同一なコンセンサス配列変動を含む、制約された（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ）ペプチドを、当該技術分野に知られる方法（本明細書に援用される、ＲｉｚｏおよびＧｉｅｒａｓｃｈ Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６１：３８７（１９９２））によって生成することも可能であり、これは例えば、ペプチドを環状化する、分子内ジスルフィド架橋を形成可能な内部システイン残基を付加することによる。
【００２８】
ポリペプチド（例えば抗体）の「変異体」は、別のポリペプチド配列に比較して、１以上のアミノ酸残基がアミノ酸配列内に挿入され、該配列から欠失し、そして／または該配列内に置換された、アミノ酸配列を含む。本発明の変異体には融合タンパク質が含まれる。
【００２９】
ポリペプチドの「誘導体」は、例えば別の化学部分（例えばポリエチレングリコール、またはアルブミン、例えばヒト血清アルブミンなど）へのコンジュゲート化、リン酸化、およびグリコシル化を介して、化学的に修飾されているポリペプチド（例えば抗体）である。別に示さない限り、用語「抗体」には、２つの全長重鎖および２つの全長軽鎖を含む抗体に加えて、その誘導体、変異体、断片、および突然変異タンパク質が含まれ、それらの例を以下に記載する。
【００３０】
「抗原結合性タンパク質」は、抗原に結合する部分、および場合によって、抗原結合性部分が、抗原結合性タンパク質の抗原への結合を促進するコンホメーションを採用するのを可能にする足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）またはフレームワーク部分を含む、タンパク質である。抗原結合性タンパク質の例には、抗体、抗体断片（例えば抗体の抗原結合性部分）、抗体誘導体、および抗体類似体が含まれる。抗原結合性タンパク質は、例えば移植されたＣＤＲまたはＣＤＲ誘導体を含む別のタンパク質足場または人工的足場を含むことも可能である。こうした足場には、限定されるわけではないが、例えば抗原結合性タンパク質の三次元構造を安定化させるために導入された突然変異を含む抗体由来足場、ならびに例えば生体適合性ポリマーを含む完全に合成の足場が含まれる。例えば、Ｋｏｒｎｄｏｒｆｅｒら， ２００３， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｆｕｎｃｔｉｏｎ， ａｎｄ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ， 第５３巻， 第１号：１２１−１２９； Ｒｏｑｕｅら， ２００４， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｐｒｏｇ． ２０：６３９−６５４を参照されたい。さらに、ペプチド抗体模倣体（「ＰＡＭ」）、ならびにフィブロネクチン構成要素を足場として利用する抗体模倣体に基づく足場を使用してもよい。
【００３１】
抗原結合性タンパク質は、例えば、天然存在免疫グロブリンの構造を有することも可能である。「免疫グロブリン」は、四量体分子である。天然存在免疫グロブリンにおいて、各四量体は、２つの同一対のポリペプチド鎖で構成され、各対は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分には、主に抗原認識に関与する、約１００〜１１０以上のアミノ酸の可変領域が含まれる。各鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクター機能に関与する、定常領域を明示する。ヒト軽鎖は、カッパまたはラムダ軽鎖と分類される。重鎖は、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファ、またはイプシロンと分類され、そしてそれぞれ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥとして、抗体のアイソタイプを定義する。軽鎖および重鎖内で、可変領域および定常領域は、約１２以上のアミノ酸の「Ｊ」領域で連結され、重鎖はまた、約１０以上のアミノ酸の「Ｄ」領域も含む。一般的に、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ 第７章（Ｐａｕｌ， Ｗ．監修， 第２版 Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク（１９８９））（あらゆる目的のため、その全体が本明細書に援用される）を参照されたい。各軽鎖／重鎖対の可変領域は、損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）免疫グロブリンが２つの結合性部位を有するように、抗体結合性部位を形成する。
【００３２】
天然存在免疫グロブリン鎖の可変領域は、相補性決定領域またはＣＤＲとも呼ばれる、３つの超可変領域によって連結される、比較的保存されるフレームワーク領域（ＦＲ）の、同じ一般構造を示す。軽鎖および重鎖はどちらも、Ｎ末端からＣ末端に、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含む。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、ＫａｂａｔらのＳｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， 第５版， 米国保健社会福祉省， ＰＨＳ， ＮＩＨ， ＮＩＨ刊行物第９１−３２４２号， １９９１の定義にしたがう。免疫グロブリン鎖中のアミノ酸に関する他の番号付け系には、ＩＭＧＴ（登録商標）（国際ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ情報系； Ｌｅｆｒａｎｃら， Ｄｅｖ． Ｃｏｍｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２９：１８５−２０３； ２００５）およびＡＨｏ（ＨｏｎｅｇｇｅｒおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３０９（３）：６５７−６７０； ２００１）が含まれる。
【００３３】
多様な抗原特異性を有する免疫グロブリンを含有する血清または血漿などの供給源から、抗体を得てもよい。こうした抗体をアフィニティ精製に供すると、特定の抗原特異性に関して濃縮可能である。抗体のこうした濃縮調製物は、通常、特定の抗原に関する特異的結合活性を有する、約１０％未満の抗体で構成される。これらの調製物をアフィニティ精製に数回供すると、抗原に関して特異的結合活性を有する抗体の比率を増加させうる。この方式で調製される抗体は、しばしば、「単一特異性」と称される。単一特異性抗体調製物は、特定の抗原に関する特異的結合活性を有する抗体、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、または９９．９％で構成されうる。
【００３４】
「抗体」は、別に明記しない限り、損なわれていない免疫グロブリン、または特異的結合に関して、損なわれていない抗体と競合する、その抗原結合性部分を指す。抗原結合性部分は、組換えＤＮＡ技術によって、あるいは損なわれていない抗体の酵素的切断または化学的切断によって、産生可能である。抗原結合性部分には、とりわけ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、および相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、キメラ抗体、ディアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ならびに少なくとも、ポリペプチドへの特異的抗原結合性を与えるのに十分な免疫グロブリン部分を含有するポリペプチドが含まれる。
【００３５】
Ｆａｂ断片は、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインを有する一価断片であり；Ｆ（ａｂ’）２断片は、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結される２つのＦａｂ断片を有する二価断片であり；Ｆｄ断片は、ＶＨおよびＣＨ１ドメインを有し；Ｆｖ断片は、抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインを有し；そしてｄＡｂ断片は、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、あるいはＶＨまたはＶＬドメインの抗原結合性断片を有する（米国特許第６，８４６，６３４号、第６，６９６，２４５号、米国出願公報第０５／０２０２５１２号、第０４／０２０２９９５号、第０４／００３８２９１号、第０４／０００９５０７号、第０３／００３９９５８号、Ｗａｒｄら， Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６， １９８９）。
【００３６】
一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）は、ＶＬおよびＶＨ領域がリンカー（例えばアミノ酸残基の合成配列）を介して連結されて、連続タンパク質鎖を形成する抗体であり、ここでリンカーは、タンパク質鎖が、それ自体、折り畳まれ、そして一価抗原結合性部位を形成するのを可能にするのに十分に長い（例えば、Ｂｉｒｄら， １９８８， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−２６およびＨｕｓｔｏｎら， １９８８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：５８７９−８３を参照されたい）。ディアボディは、２つのポリペプチド鎖を含む二価抗体であって、各ポリペプチド鎖は、同じ鎖上の２つのドメイン間で対形成するのを可能にするにはあまりにも短く、したがって各ドメインが別のポリペプチド鎖上の相補ドメインと対形成するのを可能にするリンカーによって連結されたＶＨおよびＶＬドメインを含む（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒら， １９９３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：６４４４−４８、およびＰｏｌｊａｋら， １９９４， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：１１２１−２３を参照されたい）。ディアボディの２つのポリペプチド鎖が同一であるならば、その対形成から生じるディアボディは、２つの同一の抗原結合性部位を有するであろう。異なる配列を有するポリペプチド鎖を用いて、２つの異なる抗原結合性部位を持つディアボディを作製することも可能である。同様に、トリボディおよびテトラボディは、それぞれ、３つおよび４つのポリペプチド鎖を含み、そして、同じであってもまた異なってもよい、それぞれ、３つおよび４つの抗原結合性部位を形成する抗体である。
【００３７】
Ｋａｂａｔら、上記；Ｌｅｆｒａｎｃら、上記およびまたはＨｏｎｅｇｇｅｒおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、上記に記載される系を用いて、所定の抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびフレームワーク領域（ＦＲ）を同定してもよい。１以上のＣＤＲを共有的または非共有的のいずれかで分子内に取り込んで、抗原結合性タンパク質にすることも可能である。抗原結合性タンパク質は、より長いポリペプチド鎖の一部としてＣＤＲ（単数または複数）を取り込むことも可能であるし、別のポリペプチド鎖にＣＤＲ（単数または複数）を共有結合させることも可能であるし、または非共有的にＣＤＲ（単数または複数）を取り込むことも可能である。ＣＤＲは、抗原結合性タンパク質が、関心対象の特定の抗原に特異的に結合するのを可能にする。
【００３８】
抗原結合性タンパク質は、１以上の結合性部位を有してもよい。１より多い結合性部位がある場合、結合性部位は、互いに同一であっても、また異なってもよい。例えば、天然存在ヒト免疫グロブリンは、典型的には２つの同一の結合性部位を有し、一方、「二重特異性」または「二官能性」抗体は、２つの異なる結合性部位を有する。
【００３９】
用語「ヒト抗体」には、ヒト免疫グロブリン配列に由来する１以上の可変領域および定常領域を有する抗体すべてが含まれる。１つの態様において、可変ドメインおよび定常ドメインのすべてがヒト免疫グロブリン配列に由来する（完全ヒト抗体）。これらの抗体は、多様な方法で調製可能であり、その例を以下に記載し、これらには、ヒト重鎖および／または軽鎖をコードする遺伝子に由来する抗体を発現するように遺伝子修飾されたマウスの、関心対象の抗原での免疫を通じたものが含まれる。
【００４０】
ヒト化抗体は、ヒト被験体に投与された際、非ヒト種抗体に比較すると、免疫応答を誘導する可能性がより低く、そして／またはより重度でない免疫応答を誘導するように、１以上のアミノ酸置換、欠失、および／または付加によって、非ヒト種に由来する抗体の配列と異なる配列を有する。１つの態様において、非ヒト種抗体の重鎖および／または軽鎖のフレームワークおよび定常ドメイン中の特定のアミノ酸を突然変異させて、ヒト化抗体を産生する。別の態様において、ヒト抗体由来の定常ドメイン（単数または複数）を、非ヒト種の可変ドメイン（単数または複数）に融合させる。別の態様において、非ヒト抗体の１以上のＣＤＲ配列中の１以上のアミノ酸残基を変化させて、ヒト被験体に投与された際、非ヒト抗体のありうる免疫原性を減少させ、ここで抗原へのヒト化抗体の結合が、抗原への非ヒト抗体の結合より有意に劣らないように、変化させるアミノ酸残基は、抗原への抗体の免疫特異的結合に必須でないか、または作製されるアミノ酸配列への変化が保存的変化であるか、いずれかである。ヒト化抗体をどのように作製するかの例を、米国特許第６，０５４，２９７号、第５，８８６，１５２号、および第５，８７７，２９３号に見出すことも可能である。
【００４１】
用語「キメラ抗体」は、１つの抗体由来の１以上の領域および１以上の他の抗体由来の１以上の他の領域を含有する抗体を指す。１つの態様において、１以上のＣＤＲが、ヒト抗ＰＡＲ−２抗体に由来する。別の態様において、すべてのＣＤＲが、ヒト抗ＰＡＲ−２抗体に由来する。別の態様において、１より多いヒト抗ＰＡＲ−２抗体由来のＣＤＲを混合し、そしてキメラ抗体中でマッチングさせる。例えば、キメラ抗体は、第一のヒト抗ＰＡＲ−２抗体の軽鎖由来のＣＤＲ１、第二のヒト抗ＰＡＲ−２抗体の軽鎖由来のＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに第三の抗ＰＡＲ−２抗体由来の重鎖由来のＣＤＲを含んでもよい。他の組み合わせが可能であり、そして本発明の態様内に含まれる。
【００４２】
さらに、フレームワーク領域は、同じ抗ＰＡＲ−２抗体の１つに、ヒト抗体などの１以上の異なる抗体に、またはヒト化抗体に由来してもよい。キメラ抗体の１つの例において、重鎖および／または軽鎖の部分は、特定の種由来であるか、あるいは特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体と、同一であるか、該抗体に相同であるか、または該抗体に由来する一方、鎖（単数または複数）の残りは、別の種由来であるか、あるいは別の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体（単数または複数）と、同一であるか、該抗体に相同であるか、または該抗体に由来する。やはり含まれるのは、所望の生物学的活性（すなわちＰＡＲ−２に特異的に結合する能力）を示す、こうした抗体の断片である。例えば米国特許第４，８１６，５６７号およびＭｏｒｒｉｓｏｎ， １９８５， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２−０７を参照されたい。
【００４３】
「中和抗体」または「阻害性抗体」は、本明細書において実施例に記載するものなどのアッセイを用いて、過剰な抗ＰＡＲ−２抗体が、活性化の量を、少なくとも約２０％減少させる場合の、ＰＡＲ−２のタンパク質分解的活性化を阻害する抗体である。多様な態様において、抗原結合性タンパク質は、ＰＡＲ−２のタンパク質分解的活性化の量を、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、および９９．９％減少させる。
【００４４】
抗体の断片または類似体は、本明細書の解説にしたがって、そして当該技術分野に周知の技術を用いて、一般の当業者によって、容易に調製可能である。断片または類似体の好ましいアミノ末端およびカルボキシ末端は、機能ドメインの境界近傍に存在する。公共のまたは私有の（ｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ）配列データベースに、ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列データを比較することによって、構造ドメインおよび機能ドメインを同定することも可能である。コンピュータ比較法を用いて、既知の構造および／または機能を持つ他のタンパク質に存在する配列モチーフまたは予測されるタンパク質コンホメーションドメインを同定してもよい。既知の三次元構造にフォールディングするタンパク質配列を同定する方法が知られる。例えばＢｏｗｉｅら， １９９１， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３：１６４を参照されたい。
【００４５】
「ＣＤＲ移植抗体」は、特定の種またはアイソタイプの抗体由来の１以上のＣＤＲ、および同じまたは異なる種またはアイソタイプの別の抗体のフレームワークを含む抗体である。
【００４６】
「多重特異性抗体」は、１以上の抗原上の１より多いエピトープを認識する抗体である。この種の抗体のサブクラスは、同じまたは異なる抗原上の２つの別個のエピトープを認識する「二重特異性抗体」である。
【００４７】
抗原結合性タンパク質は、１ナノモル以下の解離定数で、抗原に結合する場合、抗原（例えばヒトＰＡＲ−２）に「特異的に結合する」。
「抗原結合性ドメイン」、「抗原結合性領域」、または「抗原結合性部位」は、抗原と相互作用して、そして抗原に対する抗原結合性タンパク質の特異性およびアフィニティに寄与するアミノ酸残基（または他の部分）を含有する抗原結合性タンパク質の部分である。抗原に特異的に結合する抗体に関しては、ＣＤＲドメインの少なくとも１つの少なくとも部分を含むであろう。
【００４８】
「エピトープ」は、抗原結合性タンパク質によって（例えば抗体によって）結合される分子の部分である。エピトープは、分子の非隣接部分を含んでもよい（例えばポリペプチドでは、ポリペプチドの一次配列においては隣接しないが、ポリペプチドの三次構造および四次構造の関連においては、互いに、抗原結合性タンパク質によって結合されるのに十分に近い、アミノ酸残基）。
【００４９】
２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチド配列の「同一性パーセント」は、デフォルト・パラメータを用い、ＧＡＰコンピュータ・プログラム（ＧＣＧウィスコンシン・パッケージ、バージョン１０．３（Ａｃｃｅｌｒｙｓ、カリフォルニア州サンディエゴ）の一部）を用いて、配列を比較することによって決定される。
【００５０】
用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書全体を通じて交換可能に用いられ、そしてＤＮＡ分子（例えばｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）、ヌクレオチド類似体（例えばペプチド核酸および非天然存在ヌクレオチド類似体）を用いて生成されるＤＮＡまたはＲＮＡの類似体、およびそれらのハイブリッドを含む。核酸分子は、一本鎖または二本鎖であることも可能である。１つの態様において、本発明の核酸分子は、本発明の抗体、あるいはその断片、誘導体、突然変異タンパク質、または変異体をコードする、隣接オープンリーディングフレームを含む。
【００５１】
２つの一本鎖ポリヌクレオチドは、ギャップを導入することなく、そしていずれの配列の５’端または３’端にも、対形成しないヌクレオチドを伴わずに、一方のポリヌクレオチド中のすべてのヌクレオチドが、他方のポリヌクレオチド中の相補的ヌクレオチドと反対であるように、逆平行配向で並列可能であるならば、互いに「相補体」である。ポリヌクレオチドは、中程度にストリンジェントな条件下で、２つのポリヌクレオチドが互いにハイブリダイズ可能であるならば、別のポリヌクレオチドに「相補的」である。したがって、ポリヌクレオチドは、別のポリヌクレオチドの相補体であることなく、該ポリヌクレオチドに相補的であることも可能である。
【００５２】
「ベクター」は、連結された別の核酸を、細胞内に導入するために使用可能な核酸である。ベクターの１種類は「プラスミド」であり、その内部にさらなる核酸セグメントを連結可能な、直鎖または環状二重鎖ＤＮＡ分子を指す。別の種類のベクターはウイルスベクター（例えば複製不全レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）であり、ここで、さらなるＤＮＡセグメントをウイルスゲノム内に導入可能である。特定のベクターは、導入された宿主細胞において、自律的に複製可能である（例えば細菌複製起点を含む細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。宿主細胞内への導入に際して、宿主細胞のゲノム内に他のベクター（例えば非エピソーム哺乳動物ベクター）を組み込んで、そしてそれによって宿主ゲノムと一緒に複製させる。「発現ベクター」は、選択したポリヌクレオチドの発現を指示することも可能なベクターの種類である。
【００５３】
ヌクレオチド配列は、制御配列が該ヌクレオチド配列の発現（例えば発現のレベル、時期、または位置）に影響を及ぼすならば、該制御配列に「機能可能であるように連結されて」いる。「制御配列」は、機能可能であるように連結されている核酸の発現（例えば発現のレベル、時期、または位置）に影響を及ぼす核酸である。制御配列は、例えば、制御される核酸に対して直接、または１以上の他の分子（例えば制御配列および／または核酸に結合するポリペプチド）の作用を通じて、その効果を発揮する。制御配列の例には、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現調節要素（例えばポリアデニル化シグナル）が含まれる。制御配列のさらなる例は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ， １９９０， Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， カリフォルニア州サンディエゴ、およびＢａｒｏｎら， １９９５， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２３：３６０５−０６に記載される。
【００５４】
「宿主細胞」は、核酸、例えば本発明の核酸を発現するために使用可能な細胞である。宿主細胞は、原核生物、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）であってもよいし、または真核生物、例えば単細胞真核生物（例えば酵母（ｙｅａｓｔ）または他の真菌）、植物細胞（例えばタバコ（ｔｏｂａｃｃｏ）またはトマト（ｔｏｍａｔｏ）植物細胞）、動物細胞（例えばヒト細胞、サル細胞、ハムスター細胞、ラット細胞、マウス細胞、または昆虫細胞）またはハイブリドーマであってもよい。宿主細胞の例には、サル腎臓細胞のＣＯＳ−７株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）（Ｇｌｕｚｍａｎら， １９８１， Ｃｅｌｌ ２３：１７５を参照されたい）、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはＶｅｇｇｉｅ ＣＨＯなどのその誘導体および血清不含培地中で増殖する関連細胞株（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎら， １９９８， Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２８：３１を参照されたい）またはＤＨＦＲが欠損しているＣＨＯ株ＤＸ−Ｂ１１（Ｕｒｌａｕｂら， １９８０， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７：４２１６−２０を参照されたい）、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １０）細胞株、アフリカミドリザル（Ａｆｒｉｃａｎ ｇｒｅｅｎ ｍｏｎｋｅｙ）腎臓細胞株ＣＶ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）由来のＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞株（ＭｃＭａｈａｎら， １９９１， ＥＭＢＯ Ｊ． １０：２８２１を参照されたい）、ヒト胚性腎細胞、例えば２９３、２９３ ＥＢＮＡまたはＭＳＲ ２９３、ヒト上皮Ａ４３１細胞、ヒトＣｏｌｏ２０５細胞、他の形質転換霊長類細胞株、正常二倍体細胞、初代組織のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養由来の細胞株、初代外植片、ＨＬ−６０、Ｕ９３７、ＨａＫまたはＪｕｒｋａｔ細胞が含まれる。典型的には、宿主細胞は、その後、宿主細胞で発現可能なポリペプチドをコードする核酸で形質転換またはトランスフェクションされることが可能な、培養細胞である。句「組換え宿主細胞」を用いて、発現しようとする核酸で形質転換されているかまたはトランスフェクションされている宿主細胞を示すことも可能である。宿主細胞はまた、核酸を含むが、機能可能であるように核酸と連結されるように、制御配列が宿主細胞に導入されない限り、所望のレベルで該核酸を発現しない、細胞であってもよい。用語、宿主細胞は、特定の対象の細胞だけでなく、こうした細胞の子孫または潜在的な子孫も指すことが理解される。例えば、突然変異または環境的影響によって、続く世代で特定の修飾が起こりうるため、こうした子孫は、実際、親細胞と同一でない可能性もあるが、なお、本明細書において、この用語の範囲内に含まれる。
【００５５】
ＰＡＲ−２
先に論じたように、ＰＡＲ−２は、７回膜貫通Ｇタンパク質共役型受容体スーパーファミリーのメンバーであり；係留されたリガンドを形成するＮ末端のタンパク質分解的切断によって活性化が開始される。ヒトＰＡＲ−２のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を配列番号１および２に示し；マウスＰＡＲ−２のアミノ酸配列を配列番号３に示し、そしてラットＰＡＲ−２のアミノ酸配列を配列番号４に示す。タンパク質分解的切断は、この受容体の活性化型を生じ、この型は、本明細書において、交換可能に「切断」または「切り取り」ＰＡＲ−２と称される。
【００５６】
抗原結合性タンパク質
１つの側面において、本発明は、ＰＡＲ−２、例えばヒトＰＡＲ−２に結合する、抗原結合性タンパク質（例えば抗体、抗体断片、抗体誘導体、抗体突然変異タンパク質、および抗体変異体）を提供する。
【００５７】
本発明にしたがった抗原結合性タンパク質には、ＰＡＲ−２の生物学的活性を阻害する抗原結合性タンパク質が含まれる。こうした生物学的活性の例には、Ｇタンパク質共役型受容体が仲介する共通するシグナル伝達経路、例えばイノシトール１，４，５−三リン酸産生およびＣａ（２＋）可動化、ならびにＥＲＫ、ｐ３８ＭＡＰＫ、ＪＮＫ、およびＩＫＫを含む多数のキナーゼ経路の活性化が含まれる。他の生物学的活性には、外傷および炎症に対する反応など、ＰＡＲ−２がｉｎ ｖｉｖｏで仲介するものが含まれ；特に、ＰＡＲ−２は、心臓血管系、肺系および胃腸系に関与し、こうした系において、炎症および痛覚（痛みの知覚）を制御する。ＰＡＲ−２活性化はまた、炎症性反応においても役割を果たし、こうした反応の慢性的活性化は、疾患状態を導きうる。
【００５８】
異なる抗原結合性タンパク質は、ＰＡＲ−２の異なるドメインまたはエピトープに結合するか、あるいは異なる作用機構によって作用することも可能である。例には、限定されるわけではないが、ＰＡＲ−２のタンパク質分解的活性化に干渉するか、またはシグナル伝達を阻害する抗原結合性タンパク質が含まれる。作用部位は、例えば、細胞内（例えば細胞内シグナル伝達カスケードに干渉することによる）または細胞外であることも可能である。抗原結合性タンパク質は、本発明における使用を見出すために、ＰＡＲ−２が誘導する活性を完全に阻害する必要はなく；むしろ、ＰＡＲ−２の特定の活性を減少させる抗原結合性タンパク質もまた、使用のために意図される（特定の疾患を治療する際のＰＡＲ−２結合性抗原結合性タンパク質の特定の作用機構の本明細書の考察は、例示のみであり、そして本明細書に提示する方法は、それに束縛されない）。
【００５９】
本発明の範囲内の抗ＰＡＲ−２抗体の他の誘導体には、抗ＰＡＲ−２抗体ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合した異種ポリペプチドを含む組換え融合タンパク質の発現によるなどの、他のタンパク質またはポリペプチドとの抗ＰＡＲ−２抗体またはその断片の共有または凝集コンジュゲートが含まれる。例えば、コンジュゲート化されるペプチドは、異種シグナル（またはリーダー）ポリペプチド、例えば酵母アルファ因子リーダー、またはエピトープタグなどのペプチドであってもよい。抗原結合性タンパク質を含有する融合タンパク質は、抗原結合性タンパク質の精製または同定を促進するために付加されるペプチド（例えばポリＨｉｓ）を含んでもよい。また、抗原結合性タンパク質を、Ｈｏｐｐら， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１２０４， １９８８、および米国特許第５，０１１，９１２号に記載されるような、ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチド、Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）（配列番号７）に連結してもよい。ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドは、非常に抗原性であり、そして特異的モノクローナル抗体（ｍＡｂ）によって可逆的に結合されるエピトープを提供し、発現された組換えタンパク質の迅速なアッセイおよび容易な精製を可能にする。ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドが所定のポリペプチドに融合される融合タンパク質を調製するのに有用な試薬が、商業的に入手可能である（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）。
【００６０】
１以上の抗原結合性タンパク質を含有するオリゴマーをＰＡＲ−２アンタゴニストとして使用してもよい。オリゴマーは、共有結合したまたは非共有結合した、二量体、三量体、またはより高次のオリゴマーの形であることも可能である。２以上の抗原結合性タンパク質を含むオリゴマーが使用のために意図され、一例がホモ二量体である。他のオリゴマーには、ヘテロ二量体、ホモ三量体、ヘテロ三量体、ホモ四量体、ヘテロ四量体等が含まれる。
【００６１】
１つの態様は、抗原結合性タンパク質に融合したペプチド部分間の共有相互作用または非共有相互作用を介して連結された、多数の抗原結合性タンパク質を含むオリゴマーに向けられる。こうしたペプチドは、ペプチド・リンカー（スペーサー）、またはオリゴマー化を促進する特性を有するペプチドであってもよい。以下により詳細に記載するように、ロイシンジッパー、および抗体由来の特定のポリペプチドが、それに付着した抗原結合性タンパク質のオリゴマー化を促進可能なペプチドの中にある。
【００６２】
特定の態様において、オリゴマーは、２〜４の抗原結合性タンパク質を含む。オリゴマーの抗原結合性タンパク質は、上述の型のいずれか、例えば変異体または断片などの、いかなる型であってもよい。好ましくは、オリゴマーは、ＰＡＲ−２結合活性を有する、抗原結合性タンパク質を含む。
【００６３】
１つの態様において、免疫グロブリン由来のポリペプチドを用いて、オリゴマーを調製する。抗体由来ポリペプチドの多様な部分（Ｆｃドメインを含む）に融合した特定の異種ポリペプチドを含む、融合タンパク質の調製は、例えばＡｓｈｋｅｎａｚｉら， １９９１， ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８８：１０５３５； Ｂｙｒｎら， １９９０， Ｎａｔｕｒｅ ３４４：６７７；およびＨｏｌｌｅｎｂａｕｇｈら， １９９２ "Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ"， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ中， 補遺４， １０．１９．１−１０．１９．１１ページによって記載されてきている。
【００６４】
本発明の１つの態様は、抗ＰＡＲ−２抗体のＰＡＲ−２結合性断片を、抗体のＦｃ領域に融合させることによって生成される２つの融合タンパク質を含む二量体に向けられる。二量体は、例えば、融合タンパク質をコードする遺伝子融合体を、適切な発現ベクター内に挿入し、組換え発現ベクターで形質転換した宿主細胞において、遺伝子融合体を発現させ、そして発現された融合タンパク質を抗体分子とそっくりに集合させて、その際、Ｆｃ部分間に鎖間ジスルフィド結合が形成されるのを可能にして、二量体を生じることによって、作製可能である。
【００６５】
用語「Ｆｃポリペプチド」には、本明細書において、抗体のＦｃ領域由来のポリペプチドの天然型および突然変異タンパク質型が含まれる。二量体化を促進するヒンジ領域を含有する、こうしたポリペプチドの一部切除（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）型もまた含まれる。Ｆｃ部分を含む融合タンパク質（およびそこから形成されるオリゴマー）は、プロテインＡまたはプロテインＧカラム上のアフィニティクロマトグラフィーによって精製が容易であるという利点を提供する。
【００６６】
１つの適切なＦｃポリペプチドは、ＰＣＴ出願ＷＯ ９３／１０１５１（本明細書に援用される）に記載される、ヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ領域のＮ末端ヒンジ領域から天然Ｃ末端に渡る一本鎖ポリペプチドである。別の有用なＦｃポリペプチドは、米国特許第５，４５７，０３５号およびＢａｕｍら， １９９４， ＥＭＢＯ Ｊ． １３：３９９２−４００１に記載されるＦｃ突然変異タンパク質である。この突然変異タンパク質のアミノ酸配列は、アミノ酸１９がＬｅｕからＡｌａに変化し、アミノ酸２０がＬｅｕからＧｌｕに変化し、そしてアミノ酸２２がＧｌｙからＡｌａに変化していることを除けば、ＷＯ ９３／１０１５１に示される天然Ｆｃ配列のものと同一である。該突然変異タンパク質は、Ｆｃ受容体に対し、減少したアフィニティを示す。
【００６７】
他の態様において、抗ＰＡＲ−２抗体の重鎖および／または軽鎖の可変部分を、抗体重鎖および／または軽鎖の可変部分に対して置換してもよい。
あるいは、オリゴマーは、ペプチド・リンカー（スペーサー・ペプチド）を含むかまたは含まない、多数の抗原結合性タンパク質を含む融合タンパク質である。適切なペプチド・リンカーの中には、米国特許第４，７５１，１８０号および第４，９３５，２３３号に記載されるものがある。
【００６８】
オリゴマー性抗原結合性タンパク質を調製するための別の方法は、ロイシンジッパーの使用を伴う。ロイシンジッパードメインは、これらが見られるタンパク質のオリゴマー化を促進するペプチドである。ロイシンジッパーは、元来、いくつかのＤＮＡ結合性タンパク質で同定され（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚら， １９８８， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１７５９）、そして以来、多様な異なるタンパク質で発見されてきた。既知のロイシンジッパーの中には、二量体化または三量体化する天然存在ペプチドおよびその誘導体がある。可溶性オリゴマー性タンパク質を産生するのに適したロイシンジッパードメインの例が、本明細書に援用される、ＰＣＴ出願ＷＯ ９４／１０３０８に記載され、そして肺界面活性タンパク質Ｄ（ＳＰＤ）に由来するロイシンジッパーが、Ｈｏｐｐｅら， １９９４， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３４４：１９１に記載される。融合された異種タンパク質の安定な三量体化を可能にする、修飾ロイシンジッパーの使用が、Ｆａｎｓｌｏｗら， １９９４， Ｓｅｍｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ６：２６７−７８に記載される。１つのアプローチにおいて、ロイシンジッパーペプチドに融合した抗ＰＡＲ−２抗体断片または誘導体を含む組換え融合タンパク質を、適切な宿主細胞において発現させて、そして形成される可溶性オリゴマー性抗ＰＡＲ−２抗体断片または誘導体を、培養上清から回収する。
【００６９】
１つの側面において、本発明は、ＰＡＲ−２のタンパク質分解的活性化に干渉する抗原結合性タンパク質を提供する。ＰＡＲ−２、あるいはその断片、変異体または誘導体に対して、こうした抗原結合性タンパク質を作製し、そしてＰＡＲ−２のタンパク質分解的活性化に干渉する能力に関して、慣用的なアッセイでスクリーニングしてもよい。適切なアッセイの例は、ＰＡＲ−２を発現している細胞のタンパク質分解的活性化を阻害する能力に関して、抗原結合性タンパク質を試験するアッセイ、あるいは細胞表面ＰＡＲ−２受容体のタンパク質分解的活性化から生じる生物学的反応または細胞性反応を減少させる能力に関して、抗原結合性タンパク質を試験するアッセイである。抗原結合性タンパク質を試験する、さらなるアッセイには、タンパク質分解的に切断されたＰＡＲ−２ポリペプチドの結合に対して、全長非切断ＰＡＲ−２ポリペプチドへの抗原結合性タンパク質の結合を定性的にまたは定量的に比較するものが含まれ、そのいくつかの例を本明細書に開示する。
【００７０】
別の態様において、本発明は、切断ＰＡＲ−２および非切断ＰＡＲ−２の両方に結合する抗原結合性タンパク質を提供する。こうした抗原結合性タンパク質を作製し、そして上述のものなどの慣用的アッセイにおいてスクリーニングしてもよい。
【００７１】
別の側面において、本発明は、種選択性を示す抗原結合性タンパク質を提供する。１つの態様において、抗原結合性タンパク質は、１以上の哺乳動物ＰＡＲ−２に、例えばヒトＰＡＲ−２に、そしてマウス、ラット、モルモット、ハムスター、スナネズミ（ｇｅｒｂｉｌ）、ネコ、ウサギ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ラクダ、および非ヒト霊長類ＰＡＲ−２の１以上に結合する。別の態様において、抗原結合性タンパク質は、１以上の霊長類ＰＡＲ−２に、例えば、ヒトＰＡＲ−２に、そしてカニクイザル、マーモセット（ｍａｒｍｏｓｅｔ）、アカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ）およびチンパンジーＰＡＲ−２の１以上に結合する。別の態様において、抗原結合性タンパク質は、ヒト、カニクイザル、マーモセット、アカゲザル、またはチンパンジーＰＡＲ−２に特異的に結合する。別の態様において、抗原結合性タンパク質は、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、スナネズミ、ネコ、ウサギ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ラクダ、および非ヒト霊長類ＰＡＲ−２の１以上に結合しない。別の態様において、抗原結合性タンパク質は、マーモセットなどの新世界ザル種には結合しない。
【００７２】
別の態様において、抗原結合性タンパク質は、ＰＡＲ−２以外の天然存在タンパク質のいずれにも特異的結合を示さない。別の態様において、抗原結合性タンパク質は、哺乳動物ＰＡＲ−２以外の天然存在タンパク質のいずれにも特異的結合を示さない。別の態様において、抗原結合性タンパク質は、霊長類ＰＡＲ−２以外の天然存在タンパク質のいずれにも特異的結合を示さない。別の態様において、抗原結合性タンパク質は、ヒトＰＡＲ−２以外の天然存在タンパク質のいずれにも特異的結合を示さない。別の態様において、抗原結合性タンパク質は、マウス、ラット、カニクイザル、およびヒトＰＡＲ−２に特異的に結合する。別の態様において、抗原結合性タンパク質は、マウス、ラット、カニクイザル、およびヒトＰＡＲ−２に、類似の結合アフィニティで、特異的に結合する。別の態様において、抗原結合性タンパク質は、マウス、ラット、カニクイザル、およびヒトＰＡＲ−２のタンパク質分解的活性化の結合を遮断する。別の態様において、抗原結合性タンパク質は、Ｃａ２＋可動化アッセイにおいて、マウス、ラット、カニクイザル、およびヒトのＰＡＲ−２に対して、類似のＩＣ５０を有する。
【００７３】
当該技術分野に周知の方法を用いて、そして本明細書の解説にしたがって、ＰＡＲ−２に対する抗原結合性タンパク質の選択性を測定してもよい。例えば、ウェスタンブロット、ＦＡＣＳ、ＥＬＩＳＡまたはＲＩＡを用いて、選択性を測定してもよい。
【００７４】
別の側面において、本発明は、以下の特性：ヒトおよびネズミＰＡＲ−２の両方に結合する特性、ヒトＰＡＲ−２のタンパク質分解的活性化を阻害する特性、ネズミＰＡＲ−２のタンパク質分解的活性化を阻害する特性、ＰＡＲ−２のタンパク質分解的切断部位に、またはその近傍に結合する特性、細胞表面に発現されたＰＡＲ−２の下方制御を比較的少ししか引き起こさない特性の１以上を有する、ＰＡＲ−２結合性抗原結合性タンパク質（例えば、抗ＰＡＲ−２抗体）を提供する。
【００７５】
慣用的技術によって、本発明の抗原結合性タンパク質の抗原結合性断片を産生してもよい。こうした断片の例には、限定されるわけではないが、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片が含まれる。遺伝子操作技術によって産生される抗体断片および誘導体もまた意図される。
【００７６】
さらなる態様には、キメラ抗体、例えば非ヒト（例えばネズミ）モノクローナル抗体のヒト化型が含まれる。既知の技術によって、こうしたヒト化抗体を調製してもよく、そしてこうした抗体は、ヒトに投与された際、免疫原性が減少しているという利点を提供する。１つの態様において、ヒト化モノクローナル抗体は、ネズミ抗体の可変ドメイン（あるいはその抗原結合性部位のすべてまたは一部）およびヒト抗体由来の定常ドメインを含む。あるいは、ヒト化抗体断片は、ネズミモノクローナル抗体の抗原結合性部位およびヒト抗体由来の可変ドメイン断片（抗原結合性部位を欠く）を含んでもよい。キメラ抗体およびさらに操作されたモノクローナル抗体の産生法には、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら， １９８８， Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３， Ｌｉｕら， １９８７， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４：３４３９， Ｌａｒｒｉｃｋら， １９８９， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：９３４， およびＷｉｎｔｅｒら， １９９３， ＴＩＰＳ １４：１３９に記載されるものが含まれる。１つの態様において、キメラ抗体はＣＤＲ移植抗体である。抗体をヒト化するための技術は、例えば米国特許出願第１０／１９４，９７５号（２００３年２月２７日公開）、米国特許第５，８６９，６１９号、第５，２２５，５３９号、第５，８２１，３３７号、第５，８５９，２０５号、Ｐａｄｌａｎら， １９９５， ＦＡＳＥＢ Ｊ． ９：１３３−３９， およびＴａｍｕｒａら， ２０００， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６４：１４３２−４１に論じられる。
【００７７】
非ヒト動物において、ヒト抗体または部分的ヒト抗体を生成するための方法が開発されてきている。例えば、１以上の内因性免疫グロブリン遺伝子が、多様な手段によって不活性化されたマウスが用意されてきている。ヒト免疫グロブリン遺伝子が該マウスに導入され、不活性化されたマウス遺伝子が置換されている。該動物において産生される抗体は、動物に導入されたヒト遺伝物質にコードされるヒト免疫グロブリンポリペプチド鎖を取り込む。１つの態様において、ＰＡＲ−２ポリペプチドに対して向けられる抗体がトランスジェニックマウスなどの非ヒト動物において生成されるように、該動物をＰＡＲ−２ポリペプチドで免疫する。適切な免疫原の一例は、ＰＡＲ−２のタンパク質分解的切断部位を含むポリペプチドなどの可溶性ヒトＰＡＲ−２、または他の免疫原性断片ＰＡＲ−２である。適切な免疫原の別の例は、高レベルのＰＡＲ−２を発現している細胞、または該細胞に由来する細胞膜調製物である。
【００７８】
ヒト抗体または部分的ヒト抗体の産生用のトランスジェニック動物の産生および使用のための技術の例が、米国特許第５，８１４，３１８号、第５，５６９，８２５号、および第５，５４５，８０６号、Ｄａｖｉｓら， ２００３， “Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ，” Ｌｏ監修 Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ中， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， ＮＪ：１９１−２００， Ｋｅｌｌｅｒｍａｎｎら， ２００２， Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １３：５９３−９７， Ｒｕｓｓｅｌら， ２０００， Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ． ６８：１８２０−２６， Ｇａｌｌｏら， ２０００， Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎ． ３０：５３４−４０， Ｄａｖｉｓら， １９９９， Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ． １８：４２１−２５， Ｇｒｅｅｎ， １９９９， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ． ２３１：１１−２３， Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ， １９９８， Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ ３１：３３−４２， Ｇｒｅｅｎら， １９９８， Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ． １８８：４８３−９５， Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ Ａ， １９９８， Ｅｘｐ． Ｏｐｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． Ｄｒｕｇｓ． ７：６０７−１４， Ｔｓｕｄａら， １９９７， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ． ４２：４１３−２１， Ｍｅｎｄｅｚら， １９９７， Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ． １５：１４６−５６， Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ， １９９４， Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ． ４：７６１−６３， Ａｒｂｏｎｅｓら， １９９４， Ｉｍｍｕｎｉｔｙ． １：２４７−６０， Ｇｒｅｅｎら， １９９４， Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ． ７：１３−２１， Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら， １９９３， Ｎａｔｕｒｅ． ３６２：２５５−５８， Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら， １９９３， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． ９０：２５５１−５５． Ｃｈｅｎ， Ｊ．ら ｌｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ５：６４７−６５６， Ｃｈｏｉら， １９９３， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ４：１１７−２３， Ｆｉｓｈｗｉｌｄら， １９９６， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８４５−５１， Ｈａｒｄｉｎｇら， １９９５， Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ， Ｌｏｎｂｅｒｇら， １９９４， Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６−５９， Ｌｏｎｂｅｒｇ， １９９４， “Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ Ｈｕｍａｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ” Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ中 １１３：４９−１０１， Ｌｏｎｂｅｒｇら， １９９５， Ｉｎｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３：６５−９３， Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ， １９９６， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １４：８２６， Ｔａｙｌｏｒら， １９９２， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０：６２８７−９５， Ｔａｙｌｏｒら， １９９４， Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６：５７９−９１， Ｔｏｍｉｚｕｋａら， １９９７， Ｎａｔ Ｇｅｎ １６：１３３−４３， Ｔｏｍｉｚｕｋａら， ２０００， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９７： ７２２−２７， Ｔｕａｉｌｌｏｎら， １９９３， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０：３７２０−２４， およびＴｕａｉｌｌｏｎら， １９９４， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５２：２９１２−２０に記載される。これらの例および他の例はまた、米国特許出願公開２００７−００９８７１５、２００７年３月５日公開に論じられる。
【００７９】
別の側面において、本発明は、ＰＡＲ−２に結合するモノクローナル抗体を提供する。当該技術分野に知られる技術いずれかを用いて、例えば、免疫スケジュールの完了後に、トランスジェニック動物から採取した脾臓細胞を不死化することによって、モノクローナル抗体を産生してもよい。当該技術分野に知られる技術いずれかを用いて、例えば、骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを産生することによって、脾臓細胞を不死化してもよい。ハイブリドーマを産生する融合法で使用するための骨髄腫細胞は、好ましくは、非抗体産生性であり、高い融合効率を有し、そして所望の融合細胞（ハイブリドーマ）のみの増殖を支持する特定の選択培地中で増殖することが不可能であるようにする酵素不全を有する。マウス融合体で使用するのに適した細胞株の例には、Ｓｐ−２０、Ｐ３−Ｘ６３／Ａｇ８、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、ＮＳ１／１．Ａｇ ４ １、Ｓｐ２１０−Ａｇ１４、ＦＯ、ＮＳＯ／Ｕ、ＭＰＣ−１１、ＭＰＣ１１−Ｘ４５−ＧＴＧ １．７およびＳ１９４／５ＸＸ０ Ｂｕｌが含まれ；ラット融合体で使用する細胞株の例には、Ｒ２１０．ＲＣＹ３、Ｙ３−Ａｇ １．２．３、ＩＲ９８３Ｆおよび４Ｂ２１０が含まれる。細胞融合に有用な他の細胞株は、Ｕ−２６６、ＧＭ１５００−ＧＲＧ２、ＬＩＣＲ−ＬＯＮ−ＨＭｙ２およびＵＣ７２９−６である。
【００８０】
１つの態様において、動物（例えばヒト免疫グロブリン配列を有するトランスジェニック動物）をＰＡＲ−２免疫原で免疫し；免疫動物から脾臓細胞を採取し；採取した脾臓細胞を骨髄腫細胞株と融合させ、それによってハイブリドーマ細胞を生成し；ハイブリドーマ細胞からハイブリドーマ細胞株を樹立し、そしてＰＡＲ−２ポリペプチドに結合する抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定することによって、ハイブリドーマ細胞株を産生する。こうしたハイブリドーマ細胞株、およびこれらに産生される抗ＰＡＲ−２モノクローナル抗体が、本発明に含まれる。
【００８１】
当該技術分野に知られるいかなる技術を用いて、ハイブリドーマ細胞株に分泌されるモノクローナル抗体を精製してもよい。ハイブリドーマまたはｍＡｂをさらにスクリーニングして、ＰＡＲ−２が誘導する活性を遮断する能力などの、特定の特性を持つｍＡｂを同定してもよい。こうしたスクリーニングの例を以下の実施例に提供する。
【００８２】
また、遺伝子免疫と称されるプロセスを用いて、モノクローナル抗体を産生してもよい。例えば、ウイルスベクター（アデノウイルスベクターなど）内に、関心対象の抗原をコードする核酸を取り込んでもよい。次いで、生じたベクターを用いて、適切な宿主動物（例えば、非肥満糖尿病またはＮＯＤマウス）において、関心対象の抗原に対する免疫応答を発展させる。この技術は、Ｒｉｔｔｅｒら， Ｂｉｏｄｒｕｇｓ１６（１）：３−１０（２００２）に実質的に記載され、該文献の開示は本明細書に援用される。
【００８３】
抗体結合性部位の中央の相補性決定領域（ＣＤＲ）の分子進化もまた、増加したアフィニティを持つ抗体、例えばＳｃｈｉｅｒら， １９９６， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２６３：５５１に記載されるように、ｃ−ｅｒｂＢ−２に対して増加したアフィニティを有する抗体を単離するのに用いられてきている。したがって、こうした技術は、ＰＡＲ−２に対する抗体を調製する際に有用である。
【００８４】
ＰＡＲ−２に対して向けられる抗原結合性タンパク質は、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのいずれかで、ＰＡＲ−２ポリペプチドの存在を検出するアッセイにおいて使用可能である。抗原結合性タンパク質はまた、イムノアフィニティクロマトグラフィーによってＰＡＲ−２タンパク質を精製する際にも使用可能である。さらにＰＡＲ−２のタンパク質分解的活性化を遮断可能な抗原結合性タンパク質を用いて、こうした結合から生じる生物学的活性を阻害してもよい。遮断性抗原結合性タンパク質は、本発明の方法において使用可能である。ＰＡＲ−２アンタゴニストとして機能するこうした抗原結合性タンパク質は、限定されるわけではないが、炎症状態を含む、ＰＡＲ−２が誘導する状態のいずれかを治療する際に使用可能である。１つの態様において、こうした状態を治療する際に、トランスジェニックマウスの免疫を伴う方法によって生成されるヒト抗ＰＡＲ−２モノクローナル抗体を使用する。
【００８５】
抗原結合性タンパク質を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ法で使用するか、またはｉｎ ｖｉｖｏで投与して、ＰＡＲ−２が誘導する生物学的活性を阻害してもよい。このようにして、その例が本明細書に提供される、ＰＡＲ−２のタンパク質分解的活性化によって引き起こされるかまたは悪化させられる（直接または間接的に）障害を、治療してもよい。１つの態様において、本発明は、ＰＡＲ−２が誘導する生物学的活性を減少させるのに有効な量で、その必要がある哺乳動物に、ＰＡＲ−２遮断性抗原結合性タンパク質をｉｎ ｖｉｖｏ投与することを含む療法を提供する。
【００８６】
本発明の抗原結合性タンパク質には、ＰＡＲ−２の生物学的活性を阻害する、部分的ヒトおよび完全ヒト・モノクローナル抗体が含まれる。１つの態様は、ヒトＰＡＲ−２のタンパク質分解的活性化を少なくとも部分的に遮断する、ヒト・モノクローナル抗体に向けられる。１つの態様において、ＰＡＲ−２免疫原でトランスジェニックマウスを免疫することによって、抗体を生成する。別の態様において、免疫原は、ヒトＰＡＲ−２ポリペプチド（例えばＰＡＲ−２切断部位のすべてまたは一部を含む可溶性断片）である。こうした免疫マウスから得られるハイブリドーマ細胞株であって、ＰＡＲ−２に結合するモノクローナル抗体を分泌する、前記ハイブリドーマ細胞株もまた、本明細書に提供する。
【００８７】
ヒト抗体、部分的ヒト抗体、またはヒト化抗体は、多くの適用、特にヒト被験体への抗体の投与を伴うものに適切であろうが、特定の適用には、他の種類の抗原結合性タンパク質が適切であろう。本発明の非ヒト抗体は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ロバ、または非ヒト霊長類（サル（例えばカニクイザルまたはアカゲザル）または類人猿（例えばチンパンジー）など）などの抗体産生動物いずれに由来してもよい。本発明の非ヒト抗体を、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏおよび細胞培養に基づく適用、あるいは本発明の抗体に対する免疫応答が起こらないか、重要でないか、防止可能であるか、それに関する懸念がないか、またはそれが望ましい、他の適用いずれかにおいて、使用してもよい。１つの態様において、本発明の非ヒト抗体を、非ヒト被験体に投与する。別の態様において、非ヒト抗体は、非ヒト被験体において、免疫応答を誘発しない。別の態様において、非ヒト抗体は、非ヒト被験体と同じ種由来であり、例えば本発明のマウス抗体をマウスに投与する。特定の種由来の抗体を、例えば、その種の動物を所望の免疫原（例えば可溶性ＰＡＲ−２ポリペプチド）で免疫するか、またはその種の抗体を生成するための人工的系（例えば特定の種の抗体を生成するための細菌またはファージ・ディスプレイに基づく系）を用いることによって、あるいは例えば抗体の定常領域を他の種由来の定常領域で置換することにより、１つの種由来の抗体を別の種由来の抗体に変換することによって、あるいは他の種由来の抗体の配列により緊密に似るように、抗体の１以上のアミノ酸残基を置換することによって、作製してもよい。１つの態様において、抗体は、２以上の異なる種由来の抗体に由来するアミノ酸配列を含むキメラ抗体である。
【００８８】
いくつかの慣用的技術のいずれによって、抗原結合性タンパク質を調製してもよい。例えば、当該技術分野に知られる技術いずれかを用いて、天然に該タンパク質を発現する細胞から精製してもよいし（例えば抗体を産生するハイブリドーマから抗体を精製してもよい）、または組換え発現系で産生してもよい。例えば、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ： Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ， Ｋｅｎｎｅｔら（監修）， Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク（１９８０）；ならびにＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｄ（監修）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８８）を参照されたい。
【００８９】
当該技術分野に知られるいかなる発現系を用いて、本発明の組換えポリペプチドを作製してもよい。一般的に、所望のポリペプチドをコードするＤＮＡを含む組換え発現ベクターで、宿主細胞を形質転換する。使用可能な宿主細胞の中には、原核生物、酵母またはより高次の真核細胞がある。原核生物には、グラム陰性またはグラム陽性生物、例えば大腸菌またはバチルス（ｂａｃｉｌｌｉ）が含まれる。より高次の真核細胞には、昆虫細胞および哺乳動物起源の樹立細胞株が含まれる。適切な哺乳動物宿主細胞株の例には、サル腎臓細胞のＣＯＳ−７株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）（Ｇｌｕｚｍａｎら， １９８１， Ｃｅｌｌ ２３：１７５）、Ｌ細胞、２９３細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １０）細胞株、およびＭｃＭａｈａｎら， １９９１， ＥＭＢＯ Ｊ． １０：２８２１に記載されるような、アフリカミドリザル腎臓細胞株ＣＶ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）由来のＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞株が含まれる。細菌、真菌、酵母、および哺乳動物細胞宿主で使用するための適切なクローニングおよび発現ベクターが、Ｐｏｕｗｅｌｓら（Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， ニューヨーク， １９８５）に記載される。
【００９０】
ポリペプチドの発現を促進する条件下で形質転換細胞を培養し、そして慣用的なタンパク質精製法によってポリペプチドを回収してもよい。１つのこうした精製法には、例えば結合したＰＡＲ−２のすべてまたは一部（例えば細胞外ドメイン）を有するマトリックス上での、アフィニティクロマトグラフィーの使用が含まれる。本明細書において使用が意図されるポリペプチドには、混入する内因性物質を実質的に含まない、実質的に均質な組換え哺乳動物抗ＰＡＲ−２抗体ポリペプチドが含まれる。
【００９１】
いくつかの既知の技術のいずれによって、抗原結合性タンパク質を調製し、そして所望の特性に関してスクリーニングしてもよい。特定の技術は、関心対象の抗原結合性タンパク質（例えば抗ＰＡＲ−２抗体）のポリペプチド鎖（またはその一部）をコードする核酸を単離し、そして組換えＤＮＡ技術を通じて核酸を操作することを伴う。核酸を、関心対象の別の核酸に融合させるか、または改変して（例えば突然変異誘発または他の慣用的技術によって）、例えば、１以上のアミノ酸残基を付加するか、欠失させるか、または置換してもよい。
【００９２】
１つの側面において、本発明は、本発明の抗ＰＡＲ−２抗体の抗原結合性断片を提供する。こうした断片は、完全に抗体由来配列からなってもよいし、またはさらなる配列を含んでもよい。抗原結合性断片の例には、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体、ディアボディ、トリアボディ、テトラボディ、およびドメイン抗体が含まれる。他の例が、Ｌｕｎｄｅら， ２００２， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｔｒａｎｓ． ３０：５００−０６に提供される。
【００９３】
一本鎖抗体は、アミノ酸架橋（短いペプチド・リンカー）を介して、重鎖および軽鎖可変ドメイン（Ｆｖ領域）断片を連結して、単一ポリペプチド鎖を生じることによって形成してもよい。こうした一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は、２つの可変ドメイン・ポリペプチド（ＶＬおよびＶＨ）をコードするＤＮＡ間に、ペプチド・リンカーをコードするＤＮＡを融合させることによって、調製されてきている。２つの可変ドメイン間の柔軟なリンカーの長さに応じて、生じるポリペプチドは、それ自体、折り畳まれて、抗原結合性単量体を形成することも可能であるし、または多量体（例えば二量体、三量体、または四量体）を形成することも可能である（Ｋｏｒｔｔら， １９９７， Ｐｒｏｔ． Ｅｎｇ． １０：４２３； Ｋｏｒｔｔら， ２００１， Ｂｉｏｍｏｌ． Ｅｎｇ． １８：９５−１０８）。異なるＶＬおよびＶＨを含むポリペプチドを組み合わせることによって、異なるエピトープに結合する多量体ｓｃＦｖを形成することも可能である（Ｋｒｉａｎｇｋｕｍら， ２００１， Ｂｉｏｍｏｌ． Ｅｎｇ． １８：３１−４０）。一本鎖抗体産生のために開発された技術には、米国特許第４，９４６，７７８号； Ｂｉｒｄ， １９８８， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３； Ｈｕｓｔｏｎら， １９８８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：５８７９； Ｗａｒｄら， １９８９， Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５４４， ｄｅ Ｇｒａａｆら， ２００２， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． １７８：３７９−８７に記載されるものが含まれる。
【００９４】
本発明の抗原結合性タンパク質（例えば抗体、抗体断片、および抗体誘導体）は、当該技術分野に知られる定常領域いずれを含んでもよい。軽鎖定常領域は、例えば、カッパまたはラムダ型軽鎖定常領域、例えばヒト・カッパまたはラムダ型軽鎖定常領域であってもよい。重鎖定常領域は、例えば、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、またはミュー型重鎖定常領域、例えばヒト・アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、またはミュー型重鎖定常領域であってもよい。１つの態様において、軽鎖または重鎖定常領域は、天然存在定常領域の断片、誘導体、変異体、または突然変異タンパク質である。
【００９５】
関心対象の抗体から、異なるサブクラスまたはアイソタイプの抗体を得るための技術、すなわちサブクラス・スイッチングが知られる。したがって、例えば、ＩｇＭ抗体からＩｇＧ抗体を得ることも可能であり、そして逆も可能である。こうした技術は、所定の抗体（親抗体）の抗原結合特性を所持するが、親抗体のものと異なる抗体アイソタイプまたはサブクラスと関連する生物学的特性もまた示す、新規抗体の調製を可能にする。組換えＤＮＡ技術を使用してもよい。特定の抗体ポリペプチドをコードする、クローニングされたＤＮＡ、例えば所望のアイソタイプの抗体の定常ドメインをコードするＤＮＡを、こうした方法において使用してもよい。Ｌａｎｔｔｏら， ２００２， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．１７８：３０３−１６もまた参照されたい。さらに、ＩｇＧ４が望ましい場合、本明細書に援用される、Ｂｌｏｏｍら， １９９７， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６：４０７に記載されるようなヒンジ領域中の点突然変異（ＣＰＳＣＰ→ＣＰＰＣＰ）を導入して、ＩｇＧ４抗体における不均一性（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）を導きうる、Ｈ鎖内ジスルフィド結合を形成する傾向を軽減することが望ましい可能性もまたある。
【００９６】
さらに、異なる特性（すなわち結合する抗原に対する多様なアフィニティ）を有する抗原結合性タンパク質を得るための技術もまた知られる。鎖シャッフリングと呼ばれる１つのこうした技術は、糸状バクテリオファージの表面上に免疫グロブリン可変ドメイン遺伝子レパートリーをディスプレイすることを伴い、しばしばファージ・ディスプレイと呼ばれる。鎖シャッフリングは、Ｍａｒｋｓら， １９９２， ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １０：７７９に記載されるように、ハプテン２−フェニルオキサゾール−５−オンに対する高アフィニティ抗体を調製するのに用いられてきている。
【００９７】
特定の態様において、本発明の抗原結合性タンパク質は、ＰＡＲ−２に対して、少なくとも１０６の結合アフィニティ（Ｋａ）を有する。他の態様において、抗原結合性タンパク質は、少なくとも１０７、少なくとも１０８、少なくとも１０９、または少なくとも１０１０のＫａを示す。別の態様において、抗原結合性タンパク質は、本明細書において実施例に記載する抗体のものと実質的に同じＫａを示す。
【００９８】
別の態様において、本発明は、ＰＡＲ−２からの低い解離速度を有する抗原結合性タンパク質を提供する。１つの態様において、抗原結合性タンパク質は、１ｘ１０−４ｓ−１以下のＫｏｆｆを有する。別の態様において、Ｋｏｆｆは５ｘ１０−５ｓ−１以下である。別の態様において、Ｋｏｆｆは、本明細書において実施例に記載する抗体と実質的に同じである。別の態様において、抗原結合性タンパク質は、本明細書において実施例に記載する抗体と実質的に同じＫｏｆｆで、ＰＡＲ−２に結合する。
【００９９】
別の側面において、本発明は、ＰＡＲ−２の活性、例えばＣａ２＋可動化を阻害する抗原結合性タンパク質を提供する。１つの態様において、抗原結合性タンパク質は、１０００ｎＭ以下のＩＣ５０を有する。別の態様において、ＩＣ５０は１００ｎＭ以下であり；別の態様において、ＩＣ５０は１０ｎＭ以下である。別の態様において、ＩＣ５０は、本明細書において実施例に記載する抗体のものと実質的に同じである。別の態様において、抗原結合性タンパク質は、本明細書において実施例に記載する抗体と実質的に同じＩＣ５０で、ＰＡＲ−２の活性を阻害する。
【０１００】
別の態様において、本発明は、全長ＰＡＲ−２に結合し、そしてより少ない度合いで、切断されたＰＡＲ−２に結合する、抗原結合性タンパク質を提供する。多様な態様において、抗原結合性タンパク質は、切断されたＰＡＲ−２に結合するよりも、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、および９９．９％多く、全長ＰＡＲ−２に結合する。
【０１０１】
別の側面において、本発明は、ヒトＰＡＲ−２のプロテアーゼ切断部位に、またはその近傍に結合する抗原結合性タンパク質を提供する。１つの態様において、抗原結合性タンパク質は切断部位の下流に結合する（すなわち、全長およびアミノ末端一部切除ＰＡＲ−２−Ｆｃに結合する）；別の態様において、抗原結合性タンパク質は切断部位の上流に結合する（すなわち、全長ＰＡＲ−２／Ｆｃのみに結合する）。当該技術分野に知られるいかなる技術を用いて、プロテアーゼ切断部位に結合する抗原結合性タンパク質を作製してもよい。例えば、全長ＰＡＲ−２ポリペプチド（例えば膜に結合した調製物中）、ＰＡＲ−２の可溶性細胞外ドメイン断片、あるいはプロテアーゼ切断部位を含むかまたはプロテアーゼ切断部位からなるＰＡＲ−２細胞外ドメインのより小さい断片を用いて、こうした抗原結合性タンパク質を単離してもよい（これらの例を本明細書に提供する）。当該技術分野に知られるいかなる方法を用いて、こうして単離された抗原結合性タンパク質をスクリーニングして、その結合特異性を決定してもよい（これらの例を本明細書に提供する）。
【０１０２】
別の態様において、本発明は、ＰＡＲ−２への結合に関して、本明細書に開示する抗体と競合する抗原結合性タンパク質を提供する。当該技術分野に周知の方法によって、例えばウェスタンブロット（またはペプチドに基づく別のアッセイ）中のＰＡＲ−２／Ｆｃへの結合における競合によって、または本明細書に記載するようなＣａ２＋流動アッセイにおける競合によって、こうした競合能を決定してもよい。１つの側面において、ＰＡＲ−２への結合に関して、本明細書に開示する抗体と競合する抗原結合性タンパク質は、該抗体と同じエピトープに結合する。別の側面において、ＰＡＲ−２への結合に関して、本明細書に開示する抗体と競合する抗原結合性タンパク質は、ＰＡＲ−２のタンパク質分解的活性化を阻害する。
【０１０３】
別の側面において、本発明は、細胞表面上に発現されたヒトＰＡＲ−２に結合し、そしてこうして結合した際、細胞表面上のＰＡＲ−２の量の有意な減少を引き起こすことなく、細胞におけるＰＡＲ−２シグナル伝達活性を阻害する、抗原結合性タンパク質を提供する。細胞表面上および／または細胞内部のＰＡＲ−２の量を測定するかまたは概算するためのいかなる方法を用いてもよい。１つの態様において、本発明は、細胞表面上に発現されたヒトＰＡＲ−２のプロテアーゼ切断部位に、またはその近傍に結合し、そしてこうして結合した際、細胞表面からのＰＡＲ−２の内在化速度を有意に増加させることなく、細胞におけるＰＡＲ−２シグナル伝達活性を阻害する、抗原結合性タンパク質を提供する。他の態様において、ＰＡＲ−２発現細胞への抗原結合性タンパク質の結合は、細胞表面ＰＡＲ−２の約７５％、５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、５％、１％、または０．１％未満の内在化を引き起こす。
【０１０４】
別の側面において、本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで（例えばヒト被験体に投与した際）、少なくとも１日の半減期を有する抗原結合性タンパク質を提供する。１つの態様において、抗原結合性タンパク質は、少なくとも３日の半減期を有する。別の態様において、抗原結合性タンパク質は、４日以上の半減期を有する。別の態様において、抗原結合性タンパク質は、８日以上の半減期を有する。別の態様において、非誘導体化または非修飾抗原結合性タンパク質に比較した際、抗原結合性タンパク質が、より長い半減期を有するように、抗原結合性タンパク質を誘導体化するかまたは修飾する。別の態様において、抗原結合性タンパク質は、本明細書に援用される、２０００年２月２４日公開のＷＯ ００／０９５６０に記載されるような、血清半減期を増加させる１以上の点突然変異を含有する。
【０１０５】
本発明は、多重特異性抗原結合性タンパク質、例えば、二重特異性抗原結合性タンパク質、例えば、２つの異なる抗原結合性部位または領域を介して、ＰＡＲ−２の２つの異なるエピトープに、またはＰＡＲ−２のエピトープおよび別の分子のエピトープに結合する、抗原結合性タンパク質をさらに提供する。さらに、本明細書に開示するような二重特異性抗原結合性タンパク質は、他の刊行物に言及して、本明細書に記載するものを含めて、本明細書に記載する抗体の１つ由来のＰＡＲ−２結合性部位および本明細書に記載する別の抗体由来の第二のＰＡＲ−２結合領域を含むことも可能である。あるいは、二重特異性抗原結合性タンパク質は、本明細書に記載する抗体の１つに由来する抗原結合性部位、および当該技術分野に知られる別のＰＡＲ−２抗体由来、あるいは既知の方法または本明細書に記載する方法によって調製される抗体由来の第二の抗原結合性部位を含んでもよい。
【０１０６】
二重特異性抗体を調製する多くの方法が当該技術分野に知られ、そして２００１年４月２０日出願の米国特許出願０９／８３９，６３２（本明細書に援用される）に論じられる。こうした方法には、Ｍｉｌｓｔｅｉｎら， １９８３， Ｎａｔｕｒｅ ３０５：５３７、および他のもの（米国特許第４，４７４，８９３号、米国特許第６，１０６，８３３号）に記載されるようなハイブリッド−ハイブリドーマの使用、ならびに抗体断片の化学的カップリングの使用（Ｂｒｅｎｎａｎら，１９８５， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８１； Ｇｌｅｎｎｉｅら，１９８７， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３９：２３６７；米国特許第６，０１０，９０２号）が含まれる。さらに、例えばロイシンジッパー部分（すなわち、優先的にヘテロ二量体を形成する、ＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質由来のもの； Ｋｏｓｔｅｌｎｙら， １９９２， Ｊ． Ｉｍｍｎｏｌ． １４８：１５４７）または米国特許第５，５８２，９９６号に記載されるような、他の錠前および鍵の相互作用ドメイン構造を用いることによって、組換え手段を介して、二重特異性抗体を産生可能である。さらなる有用な技術には、Ｋｏｒｔｔら、１９９７、上記；米国特許第５，９５９，０８３号；および米国特許第５，８０７，７０６号に記載されるものが含まれる。
【０１０７】
別の側面において、本発明の抗原結合性タンパク質は、抗体の誘導体を含む。誘導体化抗体は、特定の使用における半減期増加など、抗体に望ましい特性を与える分子または物質いずれかを含んでもよい。誘導体化抗体は、例えば、検出可能（または標識）部分（例えば放射性、比色、抗原性または酵素性分子、検出可能ビーズ（磁気ビーズまたは電子密度が高い（ｅｌｅｃｔｒｏｄｅｎｓｅ）（例えば金）ビーズ）、または別の分子に結合する分子（例えばビオチンまたはストレプトアビジン））、療法または診断部分（例えば放射性、細胞傷害性、または薬学的活性部分）、あるいは特定の使用（例えばヒト被験体などの被験体への投与、あるいは他のｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ使用）のための抗体の適合性を増加させる分子を含むことも可能である。抗体を誘導体化するのに使用可能な分子の例には、アルブミン（例えばヒト血清アルブミン）およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれる。当該技術分野に周知の技術を用いて、抗体のアルブミン連結およびＰＥＧ化誘導体を調製することも可能である。１つの態様において、抗体をトランスサイレチン（ＴＴＲ）またはＴＴＲ変異体にコンジュゲート化するかまたは別の方式で連結させる。ＴＴＲまたはＴＴＲ変異体を、例えば、デキストラン、ポリ（ｎ−ビニルピロリドン（ｐｙｕｒｒｏｌｉｄｏｎｅ））、ポリエチレングリコール、プロプロピレン（ｐｒｏｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）グリコール・ホモ二量体、酸化ポリプロピレン／酸化エチレン・コポリマー、ポリオキシエチル化ポリオールおよびポリビニルアルコールからなる群より選択される化学薬品で化学的に修飾してもよい。米国特許出願第２００３０１９５１５４号。
【０１０８】
別の側面において、本発明は、本発明の抗原結合性タンパク質を用いて、ＰＡＲ−２に結合する分子に関してスクリーニングする方法を提供する。いかなる適切なスクリーニング技術を用いてもよい。１つの態様において、本発明の抗原結合性タンパク質が結合するＰＡＲ−２分子またはその断片を、本発明の抗原結合性タンパク質および別の分子と接触させ、ここで、他の分子が、ＰＡＲ−２への抗原結合性タンパク質の結合を減少させるならば、該分子はＰＡＲ−２に結合する。適切な方法いずれか、例えばＥＬＩＳＡを用いて、抗原結合性タンパク質の結合を検出してもよい。ＰＡＲ−２への抗原結合性タンパク質の結合の検出は、上に論じるように、抗原結合性タンパク質を検出可能に標識することによって、単純化可能である。別の態様において、ＰＡＲ−２結合性分子をさらに分析して、ＰＡＲ−２活性化および／またはシグナル伝達を該分子が阻害するかどうかを決定する。
【０１０９】
核酸
１つの側面において、本発明は、単離核酸分子を提供する。該核酸は、例えば、抗原結合性タンパク質のすべてまたは一部、例えば本発明の抗体の一方または両方の鎖、あるいはその断片、誘導体、突然変異タンパク質、または変異体をコードするポリヌクレオチド、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを同定するか、分析するか、突然変異させるかまたは増幅するための、ハイブリダイゼーション・プローブ、ＰＣＲプライマーまたは配列決定プライマーとして使用するのに十分なポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドの発現を阻害するためのアンチセンス核酸、および前述のものの相補配列を含む。核酸はいかなる長さであってもよい。これらは、例えば、長さ５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、７５０、１，０００、１，５００、３，０００、５，０００またはそれより長いヌクレオチドであってもよく、そして／または１以上のさらなる配列、例えば制御配列を含んでもよく、そして／またはより大きい核酸、例えばベクターの一部であってもよい。核酸は、一本鎖または二本鎖であってもよく、そしてＲＮＡおよび／またはＤＮＡヌクレオチド、ならびに人工的変異体（例えばペプチド核酸）を含んでもよい。
【０１１０】
抗体ポリペプチド（例えば重鎖または軽鎖、可変ドメインのみ、または全長）をコードする核酸を、ＰＡＲ−２で免疫されているマウスのＢ細胞から単離してもよい。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの慣用法によって、核酸を単離してもよい。
【０１１１】
本発明は、特定のハイブリダイゼーション条件下で、他の核酸にハイブリダイズする核酸をさらに提供する。核酸をハイブリダイズさせるための方法は当該技術分野に周知である。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， ニューヨーク（１９８９）， ６．３．１−６．３．６を参照されたい。本明細書に定義するように、中程度にストリンジェントなハイブリダーゼション条件は、５ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を含有する前洗浄溶液、約５０％ホルムアミド、６ｘＳＳＣのハイブリダイゼーション緩衝液、および５５℃のハイブリダイゼーション温度（または４２℃のハイブリダイゼーション温度を伴う、約５０％ホルムアミドを含有するものなどの他の同様のハイブリダイゼーション溶液）、ならびに約６０℃、０．５ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中の洗浄条件を使用する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、６ｘＳＳＣ、４５℃でハイブリダイズさせ、その後、０．１ｘＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ中、６８℃での１以上の洗浄が続く。さらに、当業者は、少なくとも６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８または９９％互いに同一であるヌクレオチド配列を含む核酸が、典型的には互いにハイブリダイズしたままであるように、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを増加させるかまたは減少させるように、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件を操作することも可能である。ハイブリダイゼーション条件の選択に影響を及ぼす基本的なパラメータおよび適切な条件を考案するための指針が、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｆｒｉｔｓｃｈ， およびＭａｎｉａｔｉｓ（１９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク州コールドスプリングハーバー， 第９章および第１１章；ならびにＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １９９５， Ａｕｓｕｂｅｌら監修， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， セクション２．１０および６．３−６．４）に示され、そして例えばＤＮＡの長さおよび／または塩基組成に基づいて、一般の当業者が容易に決定可能である。
【０１１２】
核酸内への突然変異によって変化を導入し、それによってコードするポリペプチド（例えば抗原結合性タンパク質）のアミノ酸配列の変化を導くことも可能である。当該技術分野に知られるいかなる技術を用いて、突然変異を導入してもよい。１つの態様において、例えば部位特異的突然変異誘発プロトコルを用いて、１以上の特定のアミノ酸残基を変化させる。別の態様において、例えばランダム突然変異誘発プロトコルを用いて、１以上のランダムに選択された残基を変化させる。どのように作製されても、突然変異体ポリペプチドを発現させ、そして所望の特性（例えば、ＰＡＲ−２への結合、またはＰＡＲ−２のタンパク質分解的活性化の遮断）に関してスクリーニングしてもよい。
【０１１３】
コードするポリペプチドの生物学的活性を有意に改変することなく、核酸内に突然変異を導入することも可能である。例えば、非必須アミノ酸残基でのアミノ酸置換を導くヌクレオチド置換を行ってもよい。１つの態様において、アミノ酸残基の１以上の欠失または置換を含むアミノ酸配列をコードするように、ヌクレオチド配列、あるいはその所望の断片、変異体、または誘導体を突然変異させる。別の態様において、突然変異誘発は、１以上のアミノ酸残基に隣接してアミノ酸を挿入する。あるいは、コードするポリペプチドの生物学的活性（例えば、ＰＡＲ−２の結合、ＰＡＲ−２のタンパク質分解的活性化の阻害など）を選択的に変化させる１以上の突然変異を核酸に導入してもよい。例えば、突然変異は、定量的にまたは定性的に、生物学的活性を変化させうる。定量的変化の例には、活性の増加、減少、または排除が含まれる。定性的変化の例には、抗原結合性タンパク質の抗原特異性を変化させることが含まれる。
【０１１４】
別の側面において、本発明は、本発明の核酸配列の検出のため、プライマーまたはハイブリダイゼーション・プローブとして使用するのに適した核酸分子を提供する。本発明の核酸分子は、本発明の全長ポリペプチドをコードする核酸配列の一部のみを含んでもよく、例えば、プローブまたはプライマーとして使用可能な断片、あるいは本発明のポリペプチドの活性部分（例えばＰＡＲ−２結合性部分）をコードする断片を含んでもよい。
【０１１５】
本発明の核酸の配列に基づくプローブを用いて、核酸または類似の核酸、例えば本発明のポリペプチドをコードする転写物を検出してもよい。プローブは、標識基、例えば放射性同位体、蛍光化合物、酵素、または酵素補因子を含んでもよい。こうしたプローブを用いて、ポリペプチドを発現する細胞を同定してもよい。
【０１１６】
別の側面において、本発明は、本発明のポリペプチドをコードする核酸またはその一部を含むベクターを提供する。ベクターの例には、限定されるわけではないが、プラスミド、ウイルスベクター、非エピソーム哺乳動物ベクターおよび発現ベクター、例えば組換え発現ベクターが含まれる。
【０１１７】
本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に適した型で、本発明の核酸を含むことも可能である。組換え発現ベクターには、発現に用いようとする宿主に基づいて選択される、発現させようとする核酸配列に機能可能であるように連結された、１以上の制御配列が含まれる。制御配列には、宿主細胞の多くの種類において、ヌクレオチド配列の恒常的発現を導くもの（例えばＳＶ４０初期遺伝子エンハンサー、ラウス肉腫ウイルスプロモーターおよびサイトメガロウイルスプロモーター）、特定の宿主細胞においてのみ、ヌクレオチド配列の発現を導くもの（例えば組織特異的制御配列、その全体が本明細書に援用される、Ｖｏｓｓら， １９８６， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ． １１：２８７， Ｍａｎｉａｔｉｓら， １９８７， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６：１２３７を参照されたい）、および特定の処理または条件に応答して、ヌクレオチド配列の誘導性発現を導くもの（例えば、哺乳動物細胞におけるメタロチオネインプロモーター、ならびに原核系および真核系の両方における、ｔｅｔ応答性および／またはストレプトマイシン応答性プロモーター（同文献を参照されたい））が含まれる。当業者は、発現ベクターの設計は、形質転換しようとする宿主細胞の選択、タンパク質の所望の発現レベル等の要因に応じうることを認識するであろう。本発明の発現ベクターを宿主細胞内に導入して、それによって本明細書に記載するような核酸にコードされる、融合タンパク質またはペプチドを含む、タンパク質またはペプチドを産生してもよい。
【０１１８】
別の側面において、本発明は、本発明の組換え発現ベクターが導入されている宿主細胞を提供する。宿主細胞は、いかなる原核細胞（例えば大腸菌）または真核細胞（例えば、酵母、昆虫、または哺乳動物細胞（例えばＣＨＯ細胞））であってもよい。慣用的な形質転換またはトランスフェクション技術を介して、原核または真核細胞内にベクターＤＮＡを導入してもよい。哺乳動物細胞の安定トランスフェクションのため、用いる発現ベクターおよびトランスフェクション技術に応じて、少ない割合の細胞のみが、ゲノム内に外来（ｆｏｒｅｉｇｎ）ＤＮＡを組み込みうることが知られる。これらの組込み体を同定し、そして選択するため、選択可能マーカー（例えば抗生物質に対する耐性に関するもの）をコードする遺伝子を、一般的に、関心対象の遺伝子とともに、宿主細胞内に導入する。好ましい選択可能マーカーには、Ｇ４１８、ハイグロマイシンおよびメトトレキセートなどの薬剤に対する耐性を与えるものが含まれる。導入された核酸で安定にトランスフェクションされた細胞を、他の方法の中でも、薬剤選択によって、同定してもよい（例えば選択可能マーカー遺伝子を取り込んだ細胞は生き残り、一方、他の細胞は死ぬであろう）。
【０１１９】
適応症
１つの側面において、本発明は被験体を治療する方法を提供する。該方法は、例えば、被験体に対して、一般的に健康によい効果を有することも可能であり、例えば被験体の予期される寿命を増加させることも可能である。あるいは、該方法は、例えば、疾患、障害、状態、または疾病（「状態」）を治療するか、防止するか、治癒させるか、軽減するか、または改善する（「治療する」）ことも可能である。本発明にしたがって治療すべき状態の中には、ＰＡＲ−２の不適切な発現または活性によって特徴付けられる状態がある。いくつかのこうした状態においては、発現または活性レベルがあまりにも高く、そして治療は、本明細書に記載するようなＰＡＲ−２アンタゴニストを投与することを含む。
【０１２０】
本発明の抗原結合性タンパク質で治療可能であるかまたは防止可能である特定の医学的状態および疾患には、胃腸系の炎症状態が含まれ、セリアック病、クローン病；潰瘍性結腸炎；特発性胃不全麻痺；慢性膵炎を含む膵炎；胃潰瘍および十二指腸潰瘍を含む炎症性腸疾患および潰瘍が含まれる。本発明の抗原結合性タンパク質はまた、喘息（外因性喘息および内因性喘息、ならびに関連する気道の慢性炎症性状態、または過敏症が含まれる）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ、すなわち慢性気管支炎、気腫）、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）、呼吸窮迫症候群、嚢胞性線維症、肺高血圧、肺血管収縮、急性肺傷害、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、過敏性肺炎、好酸球性肺炎、気管支炎、アレルギー性気管支炎気管支拡張症、結核、過敏性肺炎、職業性喘息、喘息様障害、類肉腫、反応性気道疾患（または機能不全）症候群、綿肺、間質性肺疾患、好酸球増加症候群、鼻炎、副鼻腔炎、および寄生虫性肺疾患、ウイルスが関与する状態（例えば呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）、ライノウイルス（ＲＶ）およびアデノウイルス）と関連する気道過敏等の、気道の炎症状態を治療するかまたは改善する際にも有用である。
【０１２１】
本発明の抗原結合性タンパク質で治療可能なリウマチ性障害には、成人および若年性関節リウマチ；強皮症；全身性エリテマトーデス；ループス様症候群；未分化結合組織疾患；通風；変形性関節症；リウマチ性多発筋痛症；強直性脊椎炎を含む血清陰性脊椎関節症、ならびにライター病、乾癬性関節炎および慢性ライム関節炎が含まれる。これらのポリペプチドでやはり治療可能であるかまたは防止可能であるのは、スティル病、および関節リウマチに関連するブドウ膜炎である。さらに、本発明のポリペプチド療法を、皮膚筋炎、封入体筋炎、多発性筋炎、およびリンパ脈管筋腫症を含む、随意筋および他の筋肉の炎症を生じる障害を治療する際に用いる。ギラン−バレー病、Ｉ型糖尿病、グレーブズ病、アジソン病、レイノー現象（レイノー病およびレイノー症候群を含む）、自己免疫肝炎、ＧＶＨＤ（移植片対宿主病）等を含むさらなる疾患もまた、本発明で治療可能である。
【０１２２】
本明細書記載の障害を、他のサイトカイン、サイトカイン阻害剤および試薬（本明細書において、免疫調節剤とも称される）と組み合わせて、本発明の抗原結合性タンパク質で治療してもよい。例えば、免疫調節剤には、可溶性ＩＬ−１８受容体、ＩＬ−１８またはＩＬ−１８受容体に対する抗体、ＩＬ−１８結合性タンパク質などの、ＩＬ−１８アンタゴニスト；ＥＮＢＲＥＬ（登録商標）を含むＴＮＦ阻害剤；Ｉ型ＩＬ−１Ｒ、ＩＩ型ＩＬ−１Ｒの可溶性型、ＩＬ−１に対する抗体、Ｉ型ＩＬ−１Ｒに対する抗体を含む、ＩＬ−１阻害剤；ならびにあるいは開示する医学的状態および疾患を治療する際に有効である他の活性剤が含まれる。
【０１２３】
本発明の組成物および／または方法はまた、例えば、美容的治療において、獣医学的治療において、寿命を増加させるため、生殖欠陥を治療するため、そして多様なＰＡＲ−２関連障害を治療するためにも使用可能である。さらに、特定のこうした状態において、ＰＡＲ−２の発現または活性レベルが非常に低く、そして治療は、ＰＡＲ−２アゴニストを投与する工程を含み；こうした治療もまた、本明細書に含まれる。
【０１２４】
抗原結合性タンパク質の療法および投与
本明細書に提供する特定の方法は、被験体にＰＡＲ−２結合性抗原結合性タンパク質を投与し、それによって、特定の状態において役割を果たす、ＰＡＲ−２が誘導する生物学的応答を減少させることを含む。特定の態様において、本発明の方法は、例えば、被験体への投与を介して、またはｅｘ ｖｉｖｏ法において、ＰＡＲ−２結合性抗原結合性タンパク質と、内因性ＰＡＲ−２を接触させることを伴う。
【０１２５】
用語「治療」は、障害の少なくとも１つの症状または他の側面の軽減または予防、あるいは疾患重症度の減少等を含む。抗原結合性タンパク質は、発展しうる療法剤を構成するために、完全な治癒を達成するか、あるいは疾患のすべての症状または徴候を根絶する必要はない。関連分野で認識されるように、療法剤として使用される薬剤は、所定の疾患状態の重症度を減少させることも可能であるが、有用な療法剤と見なされるために、疾患のすべての徴候を無効にする必要はない。同様に、予防的に投与される治療は、発展しうる予防剤を構成するために、状態の開始を防止する際に完全に有効である必要はない。単に疾患の影響を減少させる（例えば、症状の数または重症度を減少させることによって、あるいは別の治療の有効性を増加させることによって、あるいは別の有益な効果を生じることによって）か、あるいは疾患が被験体で生じるかまたは悪化する可能性を減少させれば十分である。本発明の１つの態様は、特定の障害の重症度を反映する指標のベースラインを超えた、持続する改善を誘導するのに十分な量および時間、患者にＰＡＲ−２アンタゴニストを投与することを含む方法に向けられる。
【０１２６】
関連分野で理解されるように、本発明の分子を含む薬学的組成物を、適応症に適した方式で、被験体に投与する。限定されるわけではないが、非経口、局所、または吸入によるものを含む、いかなる適切な技術によって、薬学的組成物を投与してもよい。注射する場合、薬学的組成物を、例えば、動脈内、静脈内、筋内、病巣内、腹腔内または皮下経路を介して、ボーラス注射によって、あるいは連続注入によって、投与してもよい。局在化投与、例えば疾患または傷害部位での投与が意図され、経皮送達および移植物からの持続放出も同様である。吸入による送達には、例えば、鼻または経口吸入、ネブライザーの使用、エアロゾル型でのアンタゴニストの吸入等が含まれる。他の代替物には、点眼剤；丸剤、シロップ、ロゼンジまたはチューインガムを含む経口調製物；ならびにローション、ジェル、スプレー、および軟膏などの局所調製物が含まれる。
【０１２７】
ｅｘ ｖｉｖｏ法での抗原結合性タンパク質の使用もまた意図される。例えば、患者の血液または他の体液を、ｅｘ ｖｉｖｏで、ＰＡＲ−２に結合する抗原結合性タンパク質と接触させてもよい。抗原結合性タンパク質を適切な不溶性マトリックスまたは固体支持体材料に結合させてもよい。
【０１２８】
好適には、抗原結合性タンパク質を、生理学的に許容しうるキャリアー、賦形剤または希釈剤などの１以上のさらなる構成要素を含む組成物の形で投与する。場合によって、組成物はさらに、１以上の生理学的活性剤、例えば第二の炎症または免疫阻害物質、抗血管形成物質、鎮痛性物質等を含み、その非排他的な例を本明細書に提供する。多様な特定の態様において、組成物は、ＰＡＲ−２結合性抗原結合性タンパク質に加えて、１、２、３、４、５、または６つの生理学的活性剤を含む。
【０１２９】
１つの態様において、薬学的組成物は、本発明の抗原結合性タンパク質を、緩衝剤、アスコルビン酸などの酸化防止剤、低分子量ポリペプチド（１０アミノ酸未満を有するものなど）、タンパク質、アミノ酸、グルコース、スクロースまたはデキストリンなどの炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレート剤、グルタチオン、安定化剤、ならびに賦形剤からなる群より選択される１以上の物質とともに、含む。中性緩衝生理食塩水または同種血清アルブミンと混合された生理食塩水が、適切な希釈剤の例である。適切な産業標準にしたがって、ベンジルアルコールなどの保存剤もまた添加してもよい。組成物は、適切な賦形剤溶液（例えばスクロース）を希釈剤として用いた凍結乾燥物として配合されてもよい。適切な構成要素は、使用する投薬量および濃度でレシピエントに非毒性である。薬学的配合物に使用可能な構成要素のさらなる例が、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， 第１６版（１９８０）および第２０版（２０００）， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， ペンシルバニア州イーストンに提示される。
【０１３０】
開業医が使用するためのキットには、本発明のＰＡＲ−２阻害物質、および本明細書に論じる状態いずれかを治療する際に使用するためのラベルまたは他の使用説明書が含まれる。１つの態様において、キットには、１以上のＰＡＲ−２結合性抗原結合性タンパク質の無菌調製物が含まれ、該調製物は、上に開示するような組成物の形であってもよく、そして１以上のバイアル中にあってもよい。
【０１３１】
投薬量および投与頻度は、投与経路、使用する特定の抗原結合性タンパク質、治療しようとする疾患の性質および重症度、状態が急性または慢性であるか、ならびに被験体のサイズおよび全身状態などの要因に応じて、多様でありうる。関連技術において知られる方法によって、例えば用量の段階的増大研究を伴いうる臨床試験において、適切な投薬量を決定してもよい。
【０１３２】
本発明のＰＡＲ−２阻害物質を、例えば１回または１回より多く、例えばある期間に渡って定期的な間隔で、投与してもよい。特定の態様において、抗原結合性タンパク質を、少なくとも１ヶ月以上、例えば１ヶ月、２ヶ月、または３ヶ月、あるいは無期限にさえ、投与する。慢性状態を治療するためには、一般的に、長期治療が最も有効である。しかし、急性状態を治療するため、より短い期間、例えば１〜６週間の投与で十分である可能性もある。一般的に、患者が、選択した単数または複数の指標に関して、ベースラインを超えた、医学的に適切な度合いの改善を示すまで、抗原結合性タンパク質を投与する。
【０１３３】
本発明の特定の態様は、１日あたり被験体の体重ｋｇあたり約１ｎｇ（「１ｎｇ／ｋｇ／日」）〜約１０ｍｇ／ｋｇ／日、より好ましくは、約５００ｎｇ／ｋｇ／日〜約５ｍｇ／ｋｇ／日、そして最も好ましくは、約５μｇ／ｋｇ／日〜約２ｍｇ／ｋｇ／日の抗原結合性タンパク質の投薬量で、抗原結合性タンパク質を被験体に投与することを伴う。さらなる態様において、抗原結合性タンパク質を、週あたり１回、週あたり２回、または週あたり３回以上、成人に投与して、ＰＡＲ−２が仲介する疾患、状態または障害、例えば本明細書に開示する医学的障害を治療する。注射した場合、成人用量あたりの抗原結合性タンパク質の有効量は、１〜２０ｍｇ／ｍ２の範囲であってもよく、そして好ましくは約５〜１２ｍｇ／ｍ２である。あるいは、一定の用量を投与してもよく；量は５〜１００ｍｇ／用量の範囲であってもよい。一定用量の１つの範囲は、用量あたり約２０〜３０ｍｇである。本発明の１つの態様において、２５ｍｇ／用量の一定用量を注射によって反復投与する。注射以外の投与経路を用いる場合、標準的医療行為にしたがって、用量を適切に調整する。療法措置の一例は、約２０〜３０ｍｇの抗原結合性タンパク質の用量を、少なくとも３週間の期間に渡って、週あたり１〜３回注射することを伴うが、望ましい度合いの改善を誘導するには、より長い期間に渡る治療が必要である可能性もある。小児被験体（４〜１７歳）に関しては、１つの例示的な適切な措置は、週あたり２または３回投与される、最大用量２５ｍｇまでの抗原結合性タンパク質の０．４ｍｇ／ｋｇの皮下注射を伴う。
【０１３４】
本明細書に提供する方法の特定の態様は、週あたり１回または２回の、０．５ｍｇ〜１０ｍｇ、好ましくは３〜５ｍｇの抗原結合性タンパク質の皮下注射を伴う。別の態様は、週あたり１回の３ｍｇ以上の抗原結合性タンパク質の肺投与（例えばネブライザーによる）に向けられる。
【０１３５】
本明細書に提供する療法措置の例は、ＰＡＲ−２シグナル伝達が役割を果たす状態を治療するため、週１回、１．５〜３ｍｇの用量の、抗原結合性タンパク質の皮下注射を含む。こうした状態の例を本明細書に提供し、そしてこうした状態には、例えば、先に記載するようなリウマチ性状態、ならびに過剰な炎症が役割を果たす他の状態（本明細書に記載する；例えば炎症性腸疾患、膵炎など）が含まれる。望ましい結果が達成されるまで、例えば被験体の症状が鎮まるまで、抗原結合性タンパク質の毎週の投与を続ける。必要に応じて治療を再開してもよいし、あるいは維持用量を投与してもよい。
【０１３６】
本明細書に提供する療法措置の他の例は、被験体の体重キログラムあたり、本発明のＰＡＲ−２阻害剤の１、３、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１５、または２０ミリグラム（ｍｇ／ｋｇ）の用量の皮下または静脈内投与を含む。用量を１回、または特定の間隔で１回より多く、例えば１日１回、週３回、週２回、週１回、月３回、月２回、月１回、２ヶ月ごとに１回、３ヶ月ごとに１回、６ヶ月ごとに１回、または年１回、被験体に投与してもよい。治療期間、および治療の用量および／または頻度に対するいかなる変化も、被験体の特定の必要性を満たすため、治療経過中に改変するかまたは変化させてもよい。
【０１３７】
別の態様において、治療中の障害の重症度を反映する少なくとも１つの指標において、改善、好ましくは持続する改善を誘導するのに十分な量および期間、抗原結合性タンパク質を被験体に投与する。治療の量および期間が十分であるかどうかを決定するため、被験体の疾病、疾患または状態の度合いを反映する多様な指標を評価してもよい。こうした指標には、例えば疾患重症度、症状、または問題の障害の徴候の臨床的に認識される指標が含まれる。１つの態様において、被験体が、２〜４週間離れた少なくとも２回の機会に、改善を示すならば、改善は持続していると見なされる。改善の度合いは、一般的に、医師によって決定され、医師は、徴候、症状、生検、または他の試験結果に基づいて、この決定を行うことも可能であり、そしてまた、所定の疾患に関して開発された、生活の質アンケートなど、被験体に行われるアンケートも使用してもよい。
【０１３８】
上昇したレベルのＰＡＲ−２および／またはＰＡＲ−２の活性化は、例えば、皮膚、関節、胃腸系および／または気道の炎症状態を含む、いくつかの障害と関連する。所定の障害を持つ被験体をスクリーニングして、ＰＡＲ−２活性化が上昇している個体を同定し、それによって、ＰＡＲ−２結合性抗原結合性タンパク質を用いた治療から最も利益を得る可能性がある被験体を同定してもよい。したがって、本明細書に提供する治療法は、場合によって、被験体のＰＡＲ−２活性化レベルを測定する第一の工程を含む。ＰＡＲ−２活性化が正常より高く上昇している被験体に、抗原結合性タンパク質を投与してもよい。
【０１３９】
抗原結合性タンパク質での治療前、治療中および／または治療後に、ＰＡＲ−２活性の被験体のレベルを監視して、あるとすればＰＡＲ−２活性の変化を検出してもよい。いくつかの障害に関して、ＰＡＲ−２活性上昇の発生率は、疾患のステージまたは疾患の特定の型などの要因に応じて、多様でありうる。例えば被験体血清、血液または組織試料における、ＰＡＲ−２活性を測定するため、既知の技術を使用してもよい。適切な技術いずれかを用いて、ＰＡＲ−２活性を測定してもよい。
【０１４０】
本発明の方法および組成物の特定の態様は、抗原結合性タンパク質および１以上のさらなるＰＡＲ−２アンタゴニスト、例えば２以上の本発明の抗原結合性タンパク質、または本発明の抗原結合性タンパク質および１以上の他のＰＡＲ−２アンタゴニストの使用を伴う。さらなる態様において、抗原結合性タンパク質を単独で、または患者が罹患している状態を治療するのに有用な他の剤と組み合わせて、投与する。こうした剤の例には、タンパク質性薬剤および非タンパク質性薬剤の両方が含まれる。多数の療法剤を共投与する場合、投薬量は、関連技術分野に認識されるように、適宜、調整可能である。「同時投与」および併用療法は、同時の投与に限定されず、患者に少なくとも１つの他の療法剤を投与することを伴う治療の経過中、抗原結合性タンパク質を少なくとも１回投与する治療措置もまた含まれる。
【０１４１】
抗原結合性タンパク質と同時投与してもよい他の剤の例は、治療しようとする特定の状態にしたがって選択される、他の抗原結合性タンパク質または療法ポリペプチドである。あるいは、上に論じる特定の状態の１つを治療する際に有用な非タンパク質性薬剤を、ＰＡＲ−２アンタゴニストと同時投与してもよい。
【０１４２】
併用療法
別の側面において、本発明は、ＰＡＲ−２阻害性抗原結合性タンパク質および１以上の他の治療で、被験体を治療する方法を提供する。１つの態様において、こうした併用療法は、例えば腫瘍の多数の部位または分子ターゲットを攻撃することによって、相乗効果または付加的効果を達成する。本発明と関連して使用可能な併用療法の種類には、単一の疾患関連経路、ターゲット細胞における多数の経路、およびターゲット組織内の多数の細胞種における多数のノードを阻害するかまたは活性化する（適切なように）ことが含まれる。
【０１４３】
別の態様において、併用療法は、被験体に、本明細書記載の２、３、４、５、６、またはそれより多いＰＡＲ−２アゴニストまたはアンタゴニストを投与することを含む。別の態様において、方法は、ＰＡＲ−２が仲介するシグナル伝達を、一緒に阻害するかまたは活性化する（直接または間接的に）、２以上の治療を被験体に投与することを含む。こうした方法の例には、２以上のＰＡＲ−２阻害性抗原結合性タンパク質の併用、ＰＡＲ−２阻害性抗原結合性タンパク質および抗炎症特性を有する１以上の他の療法部分（例えば非ステロイド性抗炎症剤、ステロイド、および／または免疫調節剤）、またはＰＡＲ−２阻害性抗原結合性タンパク質および１以上の他の治療（例えば手術、超音波、または炎症を減少させるのに有効な治療）の併用が含まれる。さらに、１以上の抗ＰＡＲ−２抗体または抗体誘導体を、１以上の分子または他の治療と併用してもよく、ここで、他の分子（単数または複数）および／または治療（単数または複数）は、直接ＰＡＲ−２に結合せず、また影響を及ぼさないが、治療中の状態を治療するかまたは防止するために、併用が有効である。１つの態様において、１以上の分子（単数または複数）および／または治療（単数または複数）は、療法の経過中に、１以上の他の分子（単数または複数）または治療（単数または複数）によって引き起こされる状態、例えば吐き気、疲労、脱毛症、悪液質、不眠症などを治療するかまたは防止する。分子および／または他の治療を併用するすべての場合で、有効である、いかなる順序で、いかなる長さの期間に渡って、例えば同時に、連続して、または交互に、個々の分子（単数または複数）および／または治療（単数または複数）を投与してもよい。１つの態様において、治療法は、第二の治療経過が始まる前に、１つの分子または他の治療での第一の治療経過を完了することを含む。第一の治療経過終了および第二の治療経過開始の間の時間の長さは、全療法経過が有効であることを可能にするいかなる長さであってもよく、例えば秒、分、時間、日、週、月、または年でさえあってもよい。
【０１４４】
別の態様において、方法は、本明細書記載の１以上のＰＡＲ−２アンタゴニストおよび１以上の他の治療（例えば療法または苦痛軽減治療）を投与することを含む。方法が１より多い治療を被験体に投与することを含む場合、投与の順序、時期、回数、濃度、および体積は、治療の医学的必要性および限界によってのみ限定され、すなわち、２つの治療を、例えば同時に、連続して、交互に、またはいかなる他の措置にしたがって、被験体に投与してもよいことが理解されるものとする。
【０１４５】
実際の実施例および予言的実施例の両方の以下の実施例を、本発明の特定の態様または特徴を例示する目的のために提供し、そして該実施例は、本発明の範囲を限定しない。
【実施例】
【０１４６】
実施例１：モノクローナル抗体の調製
可溶性ＰＡＲ−２ペプチド（コンジュゲート化を促進するためにさらなるＣ末端システイン残基を有し、マレイミド活性化キーホールリンペット（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ）・ヘモシアニン［ＫＬＨ；例えばＰｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｉｎｃ．、イリノイ州ロックフォードから入手可能］にコンジュゲート化された、ＰＡＲ−２のループ１ペプチド（ＴＮＲＳＳＫＧＲＳＬＩＧＫＶＤＧＴＳ；配列番号２のアミノ酸２９〜４６）、ＰＡＲ−２／Ｆｃ融合タンパク質、および細胞に結合したＰＡＲ−２（例えば配列番号２のポリペプチドをコードするヒト全長ＰＡＲ−２ ｃＤＮＡでＣＨＯ細胞をトランスフェクションすることによって得られうる、細胞表面にヒトＰＡＲ−２を発現するＣＨＯトランスフェクタント）を含むＰＡＲ−２抗原の１以上の適切な型、またはその組み合わせを用いて、免疫を行う。
【０１４７】
その開示が本明細書に援用される、米国特許出願第０８／７５９，６２０号、１９９６年１２月３日出願、ならびに国際特許出願第ＷＯ ９８／２４８９３号、１９９８年６月１１日公開および第ＷＯ／００／７６３１０号、２０００年１２月２１日公開に開示される方法にしたがって、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅＴＭにおいて、初回免疫に適した量の免疫原（すなわち１０マイクログラム／マウスの可溶性ＰＡＲ−２または３ｘ１０６細胞／マウスのトランスフェクションＣＨＯ細胞）を用いる。初回免疫後、免疫原の続くブースト免疫（５μｇ／マウスの可溶性ＰＡＲ−２または１．５ｘ１０６ ＰＡＲ−２トランスフェクション細胞／マウス）を、スケジュール通りに、そしてマウスにおいて、適切な力価の抗ＰＡＲ−２抗体を誘導するのに必要な期間、投与する。任意の適切な方法、例えば酵素イムノアッセイまたは蛍光活性化細胞分取によって、あるいは他の方法（これらの組み合わせを含む）によって、力価を決定する。
【０１４８】
適切な力価を示す動物を同定し、そして流入領域リンパ節からリンパ球を得て、そして必要であれば、各コホートに関してプールする。適切な培地（例えばダルベッコの修飾イーグル培地；ＤＭＥＭ； Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッドより入手可能）中ですりつぶしてリンパ組織から細胞を遊離させることによって、リンパ球をリンパ組織から解離させ、そしてＤＭＥＭ中に懸濁してもよい。適切な方法を用いて、Ｂ細胞を選択し、そして／または増殖させ、そして適切な融合パートナー、例えば非分泌性骨髄腫Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ＣＲＬ １５８０； Ｋｅａｒｎｅｙら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １２３， １９７９， １５４８−１５５０）と融合させる。
【０１４９】
１つの適切な融合法において、１：４の比で、リンパ球を融合パートナー細胞と混合する。細胞混合物を、４００ｘｇで４分間遠心分離することによって穏やかにペレットにし、上清をデカントし、そして細胞混合物を穏やかに（例えば、１ｍｌピペットを用いることによって）混合する。ＰＥＧ／ＤＭＳＯ（ポリエチレングリコール／ジメチルスルホキシド； Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ， ミズーリ州セントルイス； １００万のリンパ球あたり１ｍｌ）で融合を誘導する。穏やかに攪拌しながら、１分間に渡ってＰＥＧ／ＤＭＳＯをゆっくりと添加し、その後、１分間混合する。次いで、穏やかに攪拌しながら、２分間に渡ってＩＤＭＥＭ（グルタミンを含まないＤＭＥＭ； １００万のＢ細胞あたり２ｍｌ）を添加し、その後、３分間に渡ってさらなるＩＤＭＥＭ（１００万のＢ細胞あたり８ｍｌ）を添加する。
【０１５０】
融合した細胞を穏やかにペレットにし（４００ｘｇ、６分間）、そして１００万のＢ細胞あたり２０ｍｌの選択培地（例えばアザセリンおよびヒポキサンチン［ＨＡ］ならびに必要に応じて他の補充物質を含有するＤＭＥＭ）中に再懸濁する。細胞を３７℃で２０〜３０分間インキュベーションし、そして次いで、２００ｍｌ選択培地中に再懸濁し、そして９６ウェルにプレーティングする前に、Ｔ１７５フラスコ中で３〜４日間培養する。
【０１５１】
標準的技術を用いて、細胞を９６ウェルプレートに分配して、生じるコロニーのクローン性を最大限にする。数日間培養した後、上清を収集し、そして以下の実施例に詳述するような、ヒトＰＡＲ−２への結合の確認、他種ＰＡＲ−２（例えば、カニクイザルおよび／またはネズミＰＡＲ−２）との交差反応性の評価、切断対非切断ＰＡＲ−２への結合、およびＰＡＲ−２のタンパク質分解的活性化を阻害する能力を含む、スクリーニングアッセイに供する。陽性細胞をさらに選択し、そして標準的クローニングおよびサブクローニング技術に供する。クローン株をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで増殖させ、そして分析のため、分泌されたヒト抗体を得る。
【０１５２】
こうして生成したハイブリドーマクローンを、ＰＡＲ−２との反応性に関してスクリーニングする。ハイブリドーマ上清の最初のスクリーニングは、ペプチドＥＬＩＳＡ、全細胞ＥＬＩＳＡ、および／またはハイスループットスクリーニングに適した、細胞に基づくアッセイ（Ｆｉｓｃｅｌｌａら， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２１：３０２−３０７； ２００３に実質的に記載されるような、蛍光分析微量アッセイ技術またはＦＭＡＴ）を利用してもよい。このスクリーニング法で陽性であるハイブリドーマをさらに培養して、より多量の抗体を提供してもよく、次いで、以下に記載するようにこれを精製して、そして細胞に基づくさらなるアッセイ（単数または複数）（例えば、Ｌｅ Ｐｏｕｌら， Ｊ． Ｂｉｏｍｏｌ． Ｓｃｒｅｅｎ．７（１）：５７−６５； ２００２に実質的に記載されるような、Ｃａ２＋感受性光タンパク質であるアポエクオリン、およびＰＡＲ−２を同時発現している細胞を用いた、フラッシュプレートアッセイ）、あるいはＳ． Ｐｉｔｃｈｆｏｒｄ， Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｎｅｗｓ 第１８巻， 第１５号（１９９８）および／またはＳｕｌｌｉｖａｎら， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ． １１４， ｐｐ１２５−１３３（１９９９）に実質的に記載されるような、細胞内Ｃａ２＋レベルの変化を決定するのに用いられる、蛍光分析画像化プレート読取り装置（ＦＬＩＰＲ）アッセイによってスクリーニングしてもよく、これらの文献は、本明細書に援用される。
【０１５３】
この方式において、およそ２〜２．５ヶ月の期間に渡って、全部で１９または２０回の免疫のため、可溶性ＰＡＲ−２、ＰＡＲ−２発現細胞またはＰＡＲ−２／Ｆｃタンパク質のいずれかでマウスを免疫し；ＰＡＲ−２特異的抗体を分泌するいくつかの細胞株を得て、そして抗体をさらに性質決定した。その配列を配列表に提示し、そして以下の表１に要約し、そしてこれらの抗体を用いた多様な試験の結果を本明細書に示す。当業者は、フレームワークおよび相補性決定領域間の境界が多様でありうることを認識し；例えば、軽鎖ＦＲ１のアミノ酸２２は、いくつかの場合、ＣＤＲ１の一部と見なされうるなどである。さらに、いくつかの番号付け系は、重鎖のＣＤＲ３およびＦＲ４をＪ領域と称し、そしてＦＲ３およびＣＤＲ３の間にＤ領域を含みうる。したがって、以下に示す領域の番号付けは、１〜５アミノ酸異なる可能性もある。
【０１５４】
表１
【０１５５】
【表１】
【０１５６】
実施例２：スクリーニングのための抗ＰＡＲ−２ハイブリドーマ抗体の精製
ハイブリドーマ細胞を、約３５ｍｌのハイブリドーマ上清液の試料を得る期間および条件下で培養する。適切な方法を用いて、例えばプロテインＡを用いて、モノクローナル抗体を精製する。各試料に、１２ｍｌの４ｘプロテインＡ結合緩衝液（１．６Ｍクエン酸、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ９．１５）およびＭａｂＳｅｌｅｃｔＴＭ培地（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）の６７％スラリー約３００μｌを添加する。生じたスラリーを４℃で一晩、穏やかに回転させる。
【０１５７】
一晩インキュベーションした後、試料を、例えば、Ｇ３．８遠心分離装置ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、カリフォルニア州フラートン）中、４℃、２，０００ＲＰＭで５分間、ブレーキを掛けずに遠心分離して、樹脂およびそれに結合したモノクローナル抗体を沈降させる。約３００μｌを除いて上清液をすべて取り除き、そして樹脂を再懸濁して、濃縮スラリーを形成する。
【０１５８】
濃縮スラリーを微量遠心管に移し、そして十分な１ｘプロテインＡ結合緩衝液（４００ｍＭクエン酸、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．９）を添加して、最終体積を約１ｍｌにする。スラリーを再懸濁し、次いで、約１４，０００ｇで５秒間遠心分離する。生じたペレットから上清液を取り除き、同様の方式で（すなわち約１ｍｌの１ｘプロテインＡ結合緩衝液中に再懸濁し、遠心分離し、上清を取り除き、そして新鮮な緩衝液中に再懸濁することによって）、全部で３回洗浄する。
【０１５９】
３回洗浄した後、ペレットを４００μｌ溶出緩衝液（２００ｍＭギ酸）中に再懸濁し、そして室温で１０分間攪拌し、次いで１４，０００ｇで５秒間遠心分離する。上清を溶出液として注意深く取り除き、そして全部で３回の溶出サイクルのため、上述のものと類似の方式で、ペレットを再び溶出させる。３回の溶出サイクルからの溶出液を合わせて、室温で、１４，０００ｇで５分間遠心分離して、そして新鮮な試験管に移す。２Ｍのｔｒｉｓ塩基（２３５ｍＭｆ）を添加し、そして迅速に混合することによって、ｐＨを７．８〜８．２に調整する。試料を、室温で、１４，０００ｇで５分間、再び遠心分離し、そしてｐＨシフト可溶物と称する。各試料（２０μｌの試料を７００μｌの水に添加することによって希釈）のスペクトルスキャンを２５０〜３５０ｎｍで行い、そして適切な抗体標準とともに、還元４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に、各０．５μｇの抗体含有試料を装填することによって、タンパク質濃度を検証する。
【０１６０】
実施例３：ＰＡＲ−２／Ｆｃポリペプチドの精製
Ｎ末端ＰＡＲ−２／Ｆｃポリペプチド（配列番号６）をＣＨＯ細胞などの適切な哺乳動物細胞中で発現させる。血清不含培地中で培養したＣＨＯ発現細胞からの発現上清は、活性化Ａｒｇ−Ｓｅｒ結合でＰＡＲ−２／Ｆｃを切断する、ＣＨＯ細胞トリプシン様セリンプロテアーゼを含有し、ＰＡＲ−２／Ｆｃポリペプチドの「切り取り」型を生じる。１０％ウシ胎児血清（ＣＨＯ細胞トリプシン様セリンプロテアーゼの濃度よりはるかに過剰な濃度の、正常レベルの血漿プロテイナーゼ阻害剤を含有する）中で培養したＣＨＯ発現細胞は、培養上清中、Ｎ末端非切断ＰＡＲ−２／Ｆｃを発現する。Ｆｃ領域を含むタンパク質の単離および精製に適した方法を用いて（例えば、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ， ニュージャージー州ピスカタウェイのＭａｂＳｅｌｅｃｔＴＭ樹脂系を用いて）、切り取りおよび非切断タンパク質の両方を精製する。必要に応じて、アミノ末端配列分析（エドマン分解）、サイズ排除クロマトグラフィー、吸光度スペクトルスキャン、および質量分析によって、生じた精製Ｆｃ構築物を分析する。
【０１６１】
適切な精製系の一例において、ＰＡＲ−２／Ｆｃを含有する馴化培地を、６ｍｌ／分および７℃で、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅの１０ｍｌプロテインＡ ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ ＨｉＴｒａｐカラム上に装填する。二価陽イオンを含まない数カラム体積のダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水でカラムを洗浄し、そして次いで、ｐＨ３．０の１００ｍＭグリシンで溶出させる。溶出したタンパク質をＴｒｉｓ緩衝液中で希釈し、そして１Ｍ Ｈ３ＰＯ４でｐＨを７．０に調整する。次いで、溶出液を、Ｓ緩衝液Ａ（２０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．０）中、５ｍｌ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＳＰ−ＨＰ ＨｉＴｒａｐカラム上に５ｍｌ／分および７℃で装填する。数カラム体積のＳ緩衝液Ａでカラムを洗浄した後、５ｍｌ／分および７℃で、２０カラム体積の４０％ Ｓ緩衝液Ｂ（２０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）への直線勾配で溶出させ、その後、１００％Ｓ緩衝液Ｂの工程が続いた。クーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分画を分析し、そしてプールしてもよい。０．２２μｍ酢酸セルロース・フィルターを通じて、プールした分画をろ過し；そして計算分子量３０，２２６および計算吸光計数３５，４１０Ｍ−１ｃｍ−１を用いて、試料に対してスペクトル・スキャンを行ってもよい。プールした物質を濃縮し（例えば、室温でＰａｌｌ Ｍａｃｒｏｓｅｐ（登録商標）１０ｋＤａ膜を用い、その後、０．２２μｍ酢酸セルロース・フィルターを通じてろ過することによる）；別のスペクトル・スキャンを行って、濃縮を検証してもよい。次いで、クーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜２０％ １．０ｍｍ ｔｒｉｓ−グリシン・ゲル）および５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．９中で、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｘ Ｂｉｏｓｅｐ ３０００カラム（７．８ｘ３００ｍｍ）を用いたＳＥ−ＨＰＬＣによって、最終産物を分析してもよい。
【０１６２】
実施例４：ＰＡＲ−２／Ｆｃ：ＦＬＡＧ（登録商標）／Ｆｃヘテロ二量体の発現および精製
ヘテロ二量体ＰＡＲ−２／Ｆｃ：ＦＬＡＧ（登録商標）／Ｆｃタンパク質を発現させ、そして精製して、ＰＡＲ−２に対する抗体のアビディティおよびアフィニティの分析を容易にする。適切な細胞、例えば哺乳動物細胞またはＨＥＫ２９３細胞などのヒト細胞を、ＰＡＲ−２／Ｆｃをコードする核酸（配列番号５）およびＦＬＡＧ（登録商標）／Ｆｃをコードする核酸（配列番号４３）で同時トランスフェクションする。適切な条件下で（例えば低ＩｇＧ血清を含有する培地中で）トランスフェクション細胞を培養すると、ホモ二量体ＰＡＲ−２／Ｆｃ、ホモ二量体ＦＬＡＧ（登録商標）／Ｆｃおよびヘテロ二量体ＰＡＲ−２／Ｆｃ：ＦＬＡＧ（登録商標）／Ｆｃタンパク質が発現する。後者は、実質的に以下に記載するように、連続精製工程によって得られる。
【０１６３】
適切な精製系の一例において、ＰＡＲ−２／Ｆｃ：ＦＬＡＧ（登録商標）／Ｆｃを含有する馴化培地を、ＰＡＲ−２／Ｆｃに関して先に記載する方法に類似の、Ｆｃタンパク質の精製を促進する精製法に供する。簡潔には、プロテインＡにＦｃが結合するのを可能にする条件下で、馴化培地をプロテインＡカラム上に装填する。カラムを数カラム体積のＰＢＳで洗浄し、そして次いで、低ｐＨで溶出させる。溶出したタンパク質を希釈し、そしてイオン交換クロマトグラフィーによってさらに精製する（例えば、Ｓ緩衝液Ａ（２０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．０）中のＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＳＰ ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ−高性能カラムを用いて、これを数カラム体積のＳ緩衝液で洗浄し、そして５ｍｌ／分で１〜２０％の２０カラム体積直線勾配および２０〜５０％ Ｓ緩衝液Ｂ（２０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）の２０カラム体積直線勾配で溶出させ、その後、１００％ Ｓ緩衝液Ｂの工程が続く）。
【０１６４】
クーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分画を分析し、そして所望の産物の大部分を含有する分画をプールする。次いで、プールした物質を抗ＦＬＡＧ（登録商標）Ｍ２アフィニティゲル（Ｓｉｇｍａ Ａ２２２０； Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ， ミズーリ州セントルイス）と一晩インキュベーションする。次いで、樹脂をＴｒｉｓ緩衝生理食塩水で洗浄し、そして１００ｍＭ ＨＯＡＣ、ｐＨ３．５で溶出させる。１Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ８．０で、最終プールをｐＨ７．０に中和する。
【０１６５】
任意の所望の時点で、０．２２μｍ酢酸セルロース・フィルターを通じて物質をろ過してもよく；計算分子量３０，２２６および計算吸光計数３５，４１０Ｍ−１ｃｍ−１を用いて、試料に対してスペクトル・スキャンを行ってもよい。望ましい場合、最終プール物質を濃縮してもよく（例えば、室温でＰａｌｌ Ｍａｃｒｏｓｅｐ（登録商標）１０ｋＤａ膜を用い、その後、０．２２μｍ酢酸セルロース・フィルターを通じてろ過することによる）；別のスペクトル・スキャンを行って、濃縮を検証してもよい。次いで、クーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜２０％ １．０ｍｍ ｔｒｉｓ−グリシン・ゲル）および５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．９中で、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｘ Ｂｉｏｓｅｐ ３０００カラム（７．８ｘ３００ｍｍ）を用いたＳＥ−ＨＰＬＣによって、最終産物を分析してもよい。
【０１６６】
Ｎ末端アミノ酸配列決定を用いて、この方式で精製した物質がＰＡＲ−２／Ｆｃ：ＦＬＡＧ（登録商標）／Ｆｃヘテロ二量体を含有することを検証した。２つの配列を検出した：ＴＩＱＧＴＮＲＳＳＫＧ（配列番号２のアミノ酸２５〜３５に対応する）、およびＤＤＹＫＤＤＤＤ（配列番号７に対応する）。２つのペプチドの比は１に近かった。クーマシー染色およびＳＥＣ分析によって、物質がＰＡＲ−２／Ｆｃ：ＦＬＡＧ（登録商標）／Ｆｃヘテロ二量体タンパク質であることが確認され、ホモ二量体タンパク質は検出不能なレベルであった。
【０１６７】
実施例５：ウェスタンブロットによるＰＡＲ−２抗体の分析
非切断対切断ＰＡＲ−２への結合を分析するため、多様な量の精製非切断およびＮ末端切り取りＰＡＲ２−Ｆｃを、Ｔｒｉｓ−グリシン緩衝系において、８〜１６％ポリアクリルアミド勾配ゲル（Ｎｏｖｅｘゲル、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥに供する。分子量同定のため、Ｓｅｅ Ｂｌｕｅ標準（Ｎｏｖｅｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有するゲルレーンもまた含む。電気泳動後、Ｎｏｖｅｘ ＸＣｅｌｌ ＩＩブロット・モジュール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、ニトロセルロース膜上に、タンパク質をゲルからトランスファーする。膜を１：１のＯｄｙｓｓｅｙブロッキング緩衝液、ＯＢＢ（ＬＩ−ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）：ＴＢＳ（Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水）で、振盪しながら４℃で一晩ブロッキングする。分析しようとする抗体を、１：１ ＯＢＢ：ＴＢＳ中、所望の最終濃度に室温で１時間希釈する。ＴＢＳ中の０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で膜を徹底的に洗浄する（〜１時間にわたって、１００ｍｌを３〜４回交換）。次いで、１：１（ＯＢＢ：ＴＢＳ）中で１：５０００に希釈した、適切な二次抗体−Ａｌｅｘａ６８０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）コンジュゲート（ヤギ抗ウサギＩｇＧ、またはヤギ抗マウスＩｇＧ）に膜を曝露する。上述のように膜を洗浄し、そして望ましい場合、ＬＩ−ＣＯＲ Ｏｄｙｓｓｅｙ赤外線撮像系（ＬＩ−ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて分析する。
【０１６８】
実施例６：ＰＡＲ−２抗体の結合活性
本実施例は、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）バイオセンサー（ＢＩＡｃｏｒｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＡＢ、スウェーデン・ウプサラ）を用いた表面プラズモン共鳴によって評価した際の結合活性を記載する。簡潔には、標準的アミン・カップリング法および製造者の指示にしたがった試薬を用いて、抗ヒトＦｃ（または抗ネズミＦｃ）をバイオセンサー・チップ（すなわち、ＣＭ５チップ）に共有結合させる。ＰＡＲ−２抗体（ヒトまたはネズミ、あるいはキメラ、例えば配列番号３８）または対照抗体を、固定抗Ｆｃ上に注入し、そして多様な量のＰＡＲ−２（ホモ二量体ＰＡＲ−２−ｈｕＦｃまたはヘテロ二量体ＰＡＲ−２−ｈｕＦｃ／ＦＬＡＧ−ｈｕＦｃいずれか）を、無関係な抗体カップリングチップ（陰性対照）ならびに抗ＰＡＲ−２コーティングチップ上に、独立に通した。１０マイクロリットル／分で１００ｍＭリン酸１０マイクロリットルを１回パルス処理して、チップの再生を達成してもよい。すべての結合をＨＢＳ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３．４ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％ＮａＮ３、０．００５％界面活性剤Ｐ２Ｏ、ｐＨ７．４）または同等物中で行う。
【０１６９】
実施例７：ＰＡＲ−２抗体の比較
いくつかのＰＡＲ−２抗体を異なるアッセイ形式で試験した；表２は結果を要約する。先に記載するＣａ２＋可動化に関して、ＦＬＩＰＲアッセイにおいて、ＩＣ５０値を決定し；先に記載するウェスタンブロットアッセイを用いて、切断部位の下流領域に対する切断部位の上流領域への結合を決定した。
【０１７０】
表２
【０１７１】
【表２】
【０１７２】
＊このウェスタンブロットにおいて、切断部位の下流に結合する抗体は、全長およびアミノ末端一部切除ＰＡＲ−２−Ｆｃの両方に結合する一方、切断部位の上流に結合する抗体は、全長ＰＡＲ−２／Ｆｃのみに結合するであろう。
【０１７３】
実施例８：アジュバント誘導性関節炎（ＡＩＡ）モデル
本実施例は、関節炎の急性および慢性モデルを記載する。両モデルにおいて、関節内（ＩＡ）、関節周囲（ＰＡ）注射または皮内（ＩＤ）注射すべてのため、例えば、ケタミン／キシラジン混合物（それぞれマウス混合物またはラット混合物）またはイソフルランによって、動物を麻酔する。
【０１７４】
関節注射、ＩＡまたはＰＡは、膝または後肢足のいずれかを対象にする。ＰＡ注射は、関心対象の関節を取り巻く４つの部位に等しく分けられる。後足の足底領域内に足注射をＩＤ投与する。内部対照として働くように、一方の膝または後肢足にビヒクルのみまたは無菌ＰＢＳを注射する。注射領域の用意には、動物麻酔後の関節領域の剃毛、およびヨウ素溶液、その後のアルコール殺菌剤でのスクラブが含まれる。すべての関節注射を３０ゲージ針または同等物、そして必要な場合、小注射体積（すなわち１０マイクロＬ）用に、気密（すなわちＨａｍｉｌｔｏｎ）シリンジで投与する。
【０１７５】
急性ＡＩＡ（ａＡＩＡ）を誘導するため、第０日（Ｄ０）、動物に、ＩＡ注射によって、生理食塩水中の１〜４％ラムダ−カラギーナンおよび１〜４％カオリン（Ｃ／Ｋ）を注射する。両化合物の濃度は、意図される疾患重症度に依存する。誘導剤の総注射体積は、マウスでは１０〜２０マイクロＬ、そしてラットでは６０〜８０マイクロＬの間である。濃度および注射体積は、どちらも、公表される方法論と一致する（Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ． ２００３； １１１（１）：３５−４１、およびＪ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ． ２００６； ３１６（３）：１０１７−２４）。あるいは、特異的ＰＡＲ−２ペプチド・アゴニスト、または他の炎症活性化因子（トリプシン、またはヒト・ベータ−トリプターゼなど［Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ． ２００３； １１１（１）：３５−４１， Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ． ２００６； ３１６（３）：１０１７−２４， Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｃｉ． ２００５ ９７（１）：３８−４２、およびＢｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． １９９９ １２７（５）：１０８３−９０］）あるいは同等物を用いてもよい。意図される疾患重症度に関して、用いる濃度を選択し、そして総注射体積は、注射される動物に適切である。
【０１７６】
慢性ＡＩＡ（ｃＡＩＡ）の誘導のため、第０日（Ｄ０）、動物に、ＩＡ注射によって、１０ｍｇ／ｍＬ Ｈ３７Ｒａ結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（Ｍ．ｔｂ．））を補ったフロイントのアジュバント［完全フロイントアジュバント； ＣＦＡ］１０〜２０マイクロＬ（マウス）および６０〜８０マイクロＬ（ラット）を、その後、ＰＡ注射によって、４０〜８０マイクロＬ（マウス）および１２０〜２００マイクロＬ（ラット）を注射する。濃度、注射体積、および注射措置は、公表される方法論と一致する（Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ． ２００３；１１１（１）：３５−４１）。アジュバント使用は、内部ＩＡＣＵＣ全体アジュバント使用標準にしたがい、マウスに関しては総量０．４ｍＬ、そしてラットに関しては総量１ｍＬを超えない。すべての注射は、内部施設動物飼育および使用委員会（ＩＡＣＵＣ）用量投与標準にしたがい、マウスに関しては２０ｍＬ／ｋｇＩＰ、１ｍＬ／ｋｇ ＩＡ、および５ｍＬ／ｋｇ ＩＶ、そしてラットに関しては１０ｍＬ／ｋｇ ＩＰ、０．５ｍＬ／ｋｇ ＩＡ、および５ｍＬ／ｇ ＩＶより多くを含まない。
【０１７７】
治療介入には、腹腔内（ＩＰ）、関節内（ＩＡ）、または静脈内（ＩＶ）投与経路が含まれ；これらの代わりにまたはこれらに加えて、他の適切な投与経路を用いてもよい。ＩＡ注射を介した任意の治療措置を、Ｄ０以外の時点で投与するか、またはＤ０であるが、同じ関節中の異なる注射部位に連続して投与する（例えば第一の注射は膝の内面内であり、そして第二の注射は外面内である）。
【０１７８】
急性および慢性ＡＩＡ研究の両方のため、いかなる注射の前にも、すべての関心対象の関節の関節直径のキャリパー測定を行う。疾患追跡には、関節直径のキャリパー測定ならびに関節外周の柔軟テープ測定、および視覚的スコア付けが含まれてもよい。別の方法（すなわち、足容積測定装置（ｐｌｅｔｈｙｓｍｏｍｅｔｅｒ）の使用）もまた用いてもよい。以下に示す基準の一方または両方によって、ｃＡＩＡの重症度をスコア付けする：
【０１７９】
【表３】
【０１８０】
急性モデルに関しては、この方式で、６〜８週齢のＬｅｗｉｓラットの左膝中にＣ／Ｋに加えて治療（または対照）を、そして各右膝中に陰性対照を注射した。３回のキャリパー読み取り値の平均を用いて、治療後の設定時点で、関節の厚みを測定した。右膝に比較した際の左膝の厚みの変化を変化パーセントとして表し、そして以下の表３に示す。
【０１８１】
表３
【０１８２】
【表４】
【０１８３】
値は、群平均±ＳＥＭに相当する。Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉを伴う２方向ＡＮＯＶＡによって、統計を計算する。モノクローナル抗体１Ａ１をｈＩｇＧに対して比較し；ＳＬＩＧＲＬをＰＢＳに対して比較した。
【０１８４】
＊ ｐ＜０．０５
＊＊ ｐ＜０．０１
＊＊＊ ｐ＜０．００１
これらの結果は、アンタゴニスト性抗ＰＡＲ−２抗体が、アジュバント誘導性関節炎モデルにおいて観察される炎症を減少させることを立証する。
【０１８５】
実施例９：アジュバント誘導性関節炎（ＡＩＡ）モデル
本実施例は、実質的に先に記載するような急性ＡＩＡモデルにおける足浮腫に対するＰＡＲ−２抗体の効果を記載する。簡潔には、６〜８週齢のＳｐｒａｇｕｅ ＤａｗｌｅｙまたはＬｅｗｉｓラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、マサチューセッツ州ウィルミントン）の後足足底領域中、一方の後足には１％ラムダ・カラギーナンを、そしてもう一方には対照（生理食塩水）を皮下（ＳＣ）注射した。１．５ｍｇ／ラット（およそ８〜１０ｍｇ／ｋｇ）の遮断ＰＡＲ−２モノクローナル抗体（１Ａ１）または対照（陽性または陰性対照；表４の脚注を参照されたい）を、アジュバント注射の１８時間前に腹腔内（ＩＰ）投与し、次いで、選択した時点で、足容積測定装置によって浮腫を測定した。足に関するベースライン測定に対して、その足あたりに置換された水のミリリットル（ｍＬ）体積として、データを表した。代表的な実験の結果を、以下の表４〜５に示す。
【０１８６】
表４：Ｌｅｗｉｓラットにおける足浮腫
【０１８７】
【表５】
【０１８８】
１２Ｂ５：陽性対照抗ＰＧＥ２、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、ミシガン州アナーバー
２２Ｃ６：陰性対照結合性非遮断抗ＰＡＲ２ ｍＡｂ
対照に対するＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定を伴う２方向ＡＮＯＶＡによる、＊ ｐ＜０．０５、＊＊ ｐ＜０．０１、＊＊＊ ｐ＜０．００１。
【０１８９】
表５：Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットにおける足浮腫
【０１９０】
【表６】
【０１９１】
１５ｍｇ／ｋｇのインドメタシン陽性対照
２２Ｃ６：陰性対照結合性非遮断抗ＰＡＲ２ ｍＡｂ
対照に対するＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定を伴う２方向ＡＮＯＶＡによる、＊ ｐ＜０．０５、＊＊ ｐ＜０．０１、＊＊＊ ｐ＜０．００１。
【０１９２】
さらなる実験において、遮断ＰＡＲ−２抗体（１Ａ１）は、ＩＰ投与された際、足腫脹を有意に減少させたが、ＳＣ投与された際は減少させなかった；続く薬物動態学的分析によって、足浮腫研究において、ＳＣ投与１Ａ１の生物学的利用能は最適未満であることが明らかになった。さらに、ＩＰ投与された遮断ＰＡＲ−２抗体による腫脹の阻害は、用量依存方式で起こった。これらの結果によって、アンタゴニスト性抗ＰＡＲ−２抗体が、アジュバント誘導性関節炎モデルにおいて観察される炎症を減少させるという先の知見が確認された。
【０１９３】
実施例１０：炎症促進性サイトカインにおける変化
本実施例は、炎症促進性サイトカインの誘導に対するＰＡＲ−２抗体またはベンチマーク陽性対照抗体（すなわち、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ由来の抗ＰＧＥ２ ２Ｂ５）の効果を記載する。簡潔には、溶解緩衝液中で刻み、そしてＱｉａｇｅｎ組織溶解装置上に置くことによって、炎症ラット足または対照（未処置）足から組織溶解物を調製した。試料アリコットをプールし、微量体積分光測定系（ＮａｎｏＤｒｏｐＴＭ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、マサチューセッツ州ウォルサム）を用いて吸光度（Ａ２８０）によって総タンパク質に関して評価し、そしてＲｏｄｅｎｔ Ｐａｎｅｌ ｖ２．０上での多数分析物プロフィール（ＭＡＰ）分析のため、Ｒｕｌｅｓ−Ｂａｓｅｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｉｎｃ．（テキサス州オースティン）に提出した。多くの分析物は、疾患活性とともに変化し、示す比較には、１Ａ１および２Ｂ５治療によって差別化されるものが含まれた。分析物を総タンパク質に対して標準化し（すなわち、（ｐｇ、ｎｇ、マイクロｇ）／ｍｇ総タンパク質）；データを図１に示す。これらの結果によって、サイトカインおよびプロスタグランジンなどの炎症促進性仲介因子の放出増加が、カラギーナン誘導性浮腫の特質であるという文献の知見が確認された。抗ＰＡＲ−２アンタゴニスト性抗体で治療した動物において、足溶解物中、これらの因子がより低いレベルで観察されるということは、これらの抗体がＰＡＲ−２に結合し、そして続いて、炎症促進性仲介因子の産生を有意に減少させることを示唆する。これらの分析物の産生が減少することは、ＰＡＲ−２中和抗体に抗炎症活性があることを裏付ける。
【０１９４】
実施例１１：抗原結合性タンパク質の結合特性
本実施例は、溶液相において結合事象を測定し、そして実質的に先にＸｉｅら Ｊ． Ｉｍｍ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ３０４：１（２００５）およびＲａｔｈａｎａｓｗａｍｉら Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３７３：５２（２００８）に記載されるように、ＫＤ、ＫｏｎおよびＫｏｆｆ（ＫｉｎＥｘＡ（登録商標）；Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、アイダホ州ボイシ）を計算するのに使用可能な動力学排除アッセイを利用した、細胞表面に発現されたＰＡＲ−２へのＰＡＲ−２抗原結合性タンパク質の結合特性の分析を記載する。簡潔には、修飾ＤＭＥＭ培地（１０％熱不活化ＦＢＳ、０．１ｍＭ ＭＥＭ非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、ペニシリン−ストレプトマイシン−グルタミン、および０．０２５％（ｗ／ｗ）アジ化ナトリウムを含有するフェノールレッド不含）中、ヒトＰＡＲ−２を発現する細胞（例えば、配列番号２のポリペプチドをコードするヒト全長ＰＡＲ−２ ｃＤＮＡでＣＨＯ細胞をトランスフェクションすることによって得られうる、細胞表面にヒトＰＡＲ−２を発現するＣＨＯトランスフェクタント）および対照細胞（すなわち非トランスフェクションＣＨＯ細胞）の連続希釈を、一定量の抗体と、回転させながら４℃で２４〜３６時間インキュベーションする。インキュベーション時間の終了時、遠心分離（すなわち、２０００ｒｐｍで４分間）によって細胞をペレットにし、そして非結合（遊離）抗体を含有する上清を取り除く。Ｒａｔｈａｎａｓｗａｍｉら Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎ：１００４（２００５）に記載されるように、適切な捕捉ビーズおよびＣｙ５コンジュゲート化抗ヒト二次抗体を用いて、ＫｉｎＥｘＡ（登録商標）によって、遊離ｍＡｂを測定する。ＫｉｎＥｘＡ（登録商標）ソフトウェアを用い、そして所定の曲線すべてを、同時に単一のＫＤ値に適合させる「ｎ曲線分析」（Ｒａｔｈａｎａｓｗａｍｉら ２００５およびＸｉｅら、上記）によって、平衡解離定数（ＫＤ）を得る。
【０１９５】
この方式で、特定のＰＡＲ−２抗体のＫＤを決定した。ＫｉｎＥｘＡ（登録商標）によって測定されるように、細胞表面で発現されたヒトＰＡＲ−２への抗ＰＡＲ−２抗体１Ａ１の相互作用のＫＤは６２．８ｐＭであり、９５％信頼区間は２４．８〜１３４．７ｐＭ（Ｎ＝５の実験の平均）である。この系において、抗体１Ｂ５の最初の分析では３．３９ｎＭのＫＤが示され、９５％信頼区間は１．３６〜５．４７ｐＭ（Ｎ＝２の実験）であった。
【０１９６】
実施例１２：コラーゲン誘導性関節炎の誘導
本実施例は、ラットを利用する、コラーゲン誘導性関節炎モデルを記載する。使用２日前、ブタＩＩ型コラーゲン（１０ｍｇ； Ｃｈｏｎｄｒｅｘ、ワシントン州レッドモンド）を、２〜４℃の回転プレート上で、０．１Ｎ酢酸（５ｍＬ）中に溶解する。続いて、乳化針およびガラスシリンジを用いて、フロイントの不完全アジュバント（ＩＦＡ； Ｄｉｆｃｏ、ミシガン州デトロイト）とコラーゲンを１：１で乳化して、１ｍｇ／ｍＬの最終濃度を生じる。背中の１０の異なる部位に、ＩＦＡ中の乳化コラーゲンを皮内注射する（部位あたり１００マイクロＬ）ことによって、８週齢メスＬｅｗｉｓラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ、マサチューセッツ州ウィルミントン）において、疾患を誘導する。後足腫脹および歩行困難によって示されるような、関節炎の臨床的開始は、通常、１０〜１２日の間で多様である。コラーゲン免疫する前に、ラットを治療群にランダム化し、そしてＰＡＲ−２中和抗体、対照抗体（すなわちＰＡＲ−２非遮断抗体）またはビヒクル対照（Ａ５Ｓｕ）のｉ．ｐ．投与で療法を開始する。開始前日、第９日に、抗体およびビヒクルの第二の用量を投与する。
【０１９７】
研究中、キャリパーを用いた後足直径の断続的な測定によって、炎症の進行を臨床的に評価する。関節炎誘導前、開始日（第１０日）、第１１〜１７日、および剖検時（第１８日）に、脛骨足根骨（足首）関節で読み取りを行う。式：
［（ビヒクル治療ＣＩＡ―治療ＣＩＡ）／（ビヒクル治療ＣＩＡ）］ｘ１００
にしたがって、曲線下面積（ＡＵＣ）に基づいて、足炎症の阻害を計算する。
【０１９８】
さらに、追加終点として、治療措置中、総体重を毎日測定し、これはこの関節炎モデルにおいては、体重喪失が関節炎症の進行と平行するためである。
研究終了時、骨ミネラル密度（ＢＭＤ）の喪失に関して、ならびにマイトジェン活性化プロテインキナーゼ活性化キナーゼ２（ＭＡＰＫＡＰＫ−２またはＭＫ−２）のリン酸化における変化に関して、足首関節を評価してもよい。剖検後の適切な時点で、二重エネルギーＸ線吸収測定法（ＤＥＸＡ）を用いて、ＢＭＤを検査する。後足を毛皮の線（足首のすぐ近位［膝］）で取り外し、７０％エタノールに浸し、そしてＢＭＤを測定するまで、室温で保存する。次いで、実質的にＦｅｉｇｅら， Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ５７：１４５７；２０００によって記載されるように、扇ビームＸ線密度計（モデルＱＤＲ−４５００Ａ； Ｈｏｌｏｇｉｃ、マサチューセッツ州ウォルサム）を用いて、水平方向で、関節をスキャンする。スキャン後、分析しようとする部位の輪郭を描くため、長方形ボックス（２９ｘ２５ｍｍ）を踵骨中心に配置して、そして用いる装置に関して検証されたアルゴリズム（例えばＨｏｌｏｇｉｃソフトウェア）を用いて、骨面積、骨ミネラル含量、および骨ミネラル密度を計算する。リン分析のため、１つの足首を液体Ｎ２中で凍結させてタンパク質粉末に粉砕し、これを商業的に入手可能なＭＫ−２アッセイを用いたウェスタンブロットで分析する。
【０１９９】
本明細書に引用する各参考文献は、解説するすべてに関して、そしてすべての目的で、その全体が本明細書に援用される。
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対するクロスリファレンス
本出願は、米国仮出願第６１／０５８，０９４号、２００８年６月２日出願および米国仮出願第６０／９４７，２６４号、２００７年６月２９日出願の優先権を請求し、該出願は本明細書に援用される。
【０００２】
発明の分野
本出願は、ＰＡＲ−２抗原結合性タンパク質に関する組成物および方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
プロテイナーゼ活性化受容体（ＰＡＲ）ファミリーは、７回膜貫通Ｇタンパク質共役型受容体スーパーファミリーの一部である。現在、４つの既知のＰＡＲがあり、このうち３つ（ＰＡＲ−１、−３、および−４）はトロンビンによって活性化され；４番目（ＰＡＲ−２）はトリプシンまたはマスト細胞トリプターゼによって活性化されるが、トロンビンによっては活性化されない。ＰＡＲは、多様な組織に広く分布し、そして血小板凝集、炎症および心臓血管機能、消化機能または呼吸機能などの、多くの生理学的現象または病態生理学的現象に関与する。
【０００４】
ＰＡＲは、活性化がＰＡＲのＮ末端のタンパク質分解的切断によって開始され、これが次に、係留されたリガンドを形成して、同じ受容体ポリペプチドの細胞外領域（ループ２）と相互作用する点で、他の受容体と異なる。ＰＡＲ−２の切断は、ヒト、ネズミおよびラットのＰＡＲ−２間で保存されるプロテアーゼ切断ドメイン、ＳＫＧＲＳＬＩＧ（配列番号２のアミノ酸３３〜４０）のＲおよびＳ残基間で生じる。係留されたリガンドを模倣するペプチドは、ＰＡＲ−２に対して、アゴニスト性効果を有することが示されてきている（Ｓａｉｆｅｄｄｉｎｅら， Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １１８（３）：５２１−３０［１９９６］； ＭｃＧｕｉｒｅら， Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ ３０９（３）：１１２４−３１［２００４］）。
【０００５】
ＰＡＲ−２は、Ｇタンパク質共役型受容体が仲介する共通するシグナル伝達経路である、イノシトール１，４，５−三リン酸産生およびＣａ（２＋）可動化、ならびにＥＲＫ、ｐ３８ＭＡＰＫ、ＪＮＫ、およびＩＫＫを含む多数のキナーゼ経路を活性化する。ＰＡＲ−２は、腎臓、膵臓、胃、腸、気道、皮膚、膀胱および脳において、上皮細胞および内皮細胞、筋細胞、線維芽細胞、免疫細胞、ニューロンおよびグリア細胞上に存在する。ＰＡＲ−２を活性化するプロテアーゼは、炎症中に存在し、そしてＰＡＲ−２は、腫瘍壊死因子アルファ、インターロイキン１アルファおよびリポ多糖などの炎症性因子によって上方制御される。さらに、ＰＡＲ−２不全マウスまたは過剰発現マウスを利用した研究は、炎症におけるこの受容体の役割を確認する（Ｓｃｈｍｉｄｌｉｎら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６９， ５３１５−５３２１［２００２］； Ｆｅｒｒｅｌｌら， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １１１， ３５−４１［２００３］）。したがって、当該技術分野には、炎症状態を治療するかまたは改善するのに有用であろう、ＰＡＲ−２活性化のアンタゴニストを発展させる必要性がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｓａｉｆｅｄｄｉｎｅら， Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １１８（３）：５２１−３０［１９９６］
【非特許文献２】ＭｃＧｕｉｒｅら， Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ ３０９（３）：１１２４−３１［２００４］
【非特許文献３】Ｓｃｈｍｉｄｌｉｎら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６９， ５３１５−５３２１［２００２］
【非特許文献４】Ｆｅｒｒｅｌｌら， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １１１， ３５−４１［２００３］
【発明の概要】
【０００７】
１つの側面において、本発明は、ヒトＰＡＲ−２に特異的に結合する単離抗原結合性タンパク質を提供する。本発明の別の側面において、抗原結合性タンパク質は、非ヒト霊長類、カニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｏｕｓ ｍｏｎｋｅｙ）、チンパンジー（ｃｈｉｍｐａｎｚｅｅ）、非霊長類哺乳動物、げっ歯類、マウス、ラット、ハムスター（ｈａｍｓｔｅｒ）、モルモット（ｇｕｉｎｅａ ｐｉｇ）、ネコ、またはイヌのＰＡＲ−２に特異的に結合する。別の態様において、単離抗原結合性タンパク質は：ａ． ヒト抗体； ｂ． キメラ抗体； ｃ． モノクローナル抗体； ｄ． 組換え抗体； ｅ． 抗原結合性抗体断片； ｆ． 一本鎖抗体； ｇ． ディアボディ； ｈ． トリアボディ； ｉ． テトラボディ； ｊ． Ｆａｂ断片； ｋ． Ｆ（ａｂ’）２断片； ｌ． ドメイン抗体； ｍ． ＩｇＤ抗体； ｎ． ＩｇＥ抗体； ｏ． ＩｇＭ抗体； ｐ． ＩｇＧ１抗体； ｑ． ＩｇＧ２抗体； ｒ． ＩｇＧ３抗体； ｓ． ＩｇＧ４抗体；またはｔ． Ｈ鎖内ジスルフィド結合を形成する傾向を軽減する、ヒンジ領域中の少なくとも１つの突然変異を有するＩｇＧ４抗体を含む。
【０００８】
本発明の別の側面において、本発明は、重鎖および軽鎖を有する単離抗原結合性タンパク質であって、配列番号９に少なくとも９５％同一である可変領域を含む重鎖、および配列番号１１に少なくとも９５％同一である可変領域を含む軽鎖を有する、単離抗原結合性タンパク質を提供する。別の態様において、重鎖可変領域は配列番号３１に少なくとも９５％同一であり、そして軽鎖可変領域は配列番号３５に少なくとも９５％同一である。本発明の別の側面において、軽鎖可変領域は配列番号３９のアミノ酸配列を有し、そして重鎖可変領域は配列番号４０のアミノ酸配列を有する。本発明の別の態様において、軽鎖可変領域は配列番号４１のアミノ酸配列を有し、そして重鎖可変領域は配列番号４２のアミノ酸配列を有する。
【０００９】
本発明の１つの態様において、重鎖可変領域は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と称される３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、そして軽鎖可変領域は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と称される３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。本発明の別の側面において、重鎖可変領域は、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４と称される４つのフレームワーク領域（ＦＲ）をさらに含み、そして軽鎖可変領域は、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４と称される４つのフレームワーク領域（ＦＲ）をさらに含む。本発明の１つの態様において、重鎖ＣＤＲは、配列番号９、１３、１７、２３、２７、３１、および３５に示されるアミノ酸配列を有するペプチドのＣＤＲの中から選択され、そして軽鎖ＣＤＲは、配列番号１１、１５、１９、２５、２９、３３および３７に示されるアミノ酸配列を有するペプチドのＣＤＲの中から選択される。
【００１０】
本発明の１つの側面において、３つの重鎖ＣＤＲはすべて同じペプチドから選択され、例えば、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は配列番号９由来であり、そして軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は配列番号１１由来であるなどである。本発明の別の態様において、ＣＤＲは異なるペプチドの中から選択され、例えば、重鎖ＣＤＲ１は配列番号９由来であり、ＣＤＲ２は配列番号１３由来であり、そしてＣＤＲ３は配列番号１７由来であり、そして軽鎖ＣＤＲ１は配列番号１１由来であり、ＣＤＲ２は配列番号１５由来であり、そしてＣＤＲ３は配列番号１９由来であるなどである。あるいは、２つのＣＤＲが単一ペプチドより選択され、そして第三のＣＤＲが別のペプチドより選択されてもよい。多数のこうした組み合わせが可能である。別の側面において、フレームワーク領域は同じペプチドより選択されてもよいし、または１以上のフレームワーク領域が異なるペプチドより選択されてもよい。
【００１１】
本発明の１つの側面において、本発明は、前述のポリペプチドをコードする核酸を提供する。本発明の別の側面において、核酸はベクターである。本発明の別の態様において、本発明は、本発明の核酸で形質転換またはトランスフェクションされている、宿主細胞を提供する。本発明の別の側面において、ポリペプチドを調製する方法であって、ポリペプチドの発現を促進する条件下で、宿主細胞をインキュベーションし、そしてポリペプチドを採取する工程を含む、前記方法を提供する。
【００１２】
別の側面において、本発明は、ＰＡＲ−２に結合する抗原結合性タンパク質を分泌する単離細胞を提供する。別の態様において、細胞はハイブリドーマである。別の態様において、本発明は、ヒトＰＡＲ−２に結合する抗原結合性タンパク質を作製する方法であって、前記抗原結合性タンパク質を発現することを可能にする条件下で、前記単離細胞をインキュベーションする工程を含む、前記方法を提供する。
【００１３】
１つの側面において、本発明は、プロテイナーゼ活性化受容体−２（ＰＡＲ−２）に結合する単離抗原結合性タンパク質を提供する。別の態様において、単離抗原結合性タンパク質は、ヒトＰＡＲ−２に結合した際、タンパク質分解的切断、および／または前記ヒトＰＡＲ−２を通じた、それに続くシグナル伝達を阻害する。別の態様において、単離抗原結合性タンパク質は、約８０％より多く、ＰＡＲ−２のタンパク質分解的活性化を阻害する。別の態様において、単離抗原結合性タンパク質は、非切断ＰＡＲ−２に結合し、そしてより少ない度合いで、切断ＰＡＲ−２に結合する。別の態様において、単離抗原結合性タンパク質は、約１０％より少なく、ＰＡＲ−２のタンパク質分解的活性化を阻害する。別の態様において、単離抗原結合性タンパク質は、切断および非切断ＰＡＲ−２の両方に、実質的に同等に結合する。
【００１４】
別の側面において、本発明は、抗原結合性タンパク質を含む薬学的組成物を提供する。１つの態様において、本発明は、被験体における状態を治療する方法であって、前記被験体に前記薬学的組成物を投与する工程を含み、前記状態が、前記被験体において、ＰＡＲ−２活性を減少させることによって治療可能である、前記方法を提供する。別の態様において、前記被験体はヒトである。別の態様において、前記状態は、皮膚、関節、胃腸系および／または気道の炎症状態である。別の態様において、該方法は、前記被験体に第二の治療を投与する工程をさらに含む。別の態様において、前記薬学的組成物を前記被験体に投与する前に、および／またはそれと同時に、および／またはその後に、前記の第二の治療を前記被験体に投与する。別の態様において、前記の第二の治療は、抗炎症剤を含む。別の態様において、前記の第二の薬学的組成物は、非ステロイド抗炎症性薬剤、ステロイド、および免疫調節剤からなる群より選択される剤を含む。別の態様において、前記方法は、前記被験体に第三の治療を投与する工程を含む。
【００１５】
別の側面において、本発明は、被験体の寿命を増加させる方法であって、前記薬学的組成物を前記被験体に投与する工程を含む、前記方法を提供する。
別の側面において、本発明は、ＰＡＲ−２活性を減少させる必要がある被験体において、ＰＡＲ−２活性を減少させる方法であって、前記薬学的組成物を前記被験体に投与する工程を含む、前記方法を提供する。
【００１６】
別の側面において、本発明は、ＰＡＲ−２シグナル伝達を減少させる必要がある被験体において、ＰＡＲ−２シグナル伝達を減少させる方法であって、前記薬学的組成物を前記被験体に投与する工程を含む、前記方法を提供する。
【００１７】
別の側面において、本発明は、ＰＡＲ−２のタンパク質分解的活性化を阻害する必要がある被験体において、ＰＡＲ−２のタンパク質分解的活性化を阻害する方法であって、前記薬学的組成物を前記被験体に投与する工程を含む、前記方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１−１】図１は、アジュバント誘導性関節炎モデルにおける、ラット由来の足組織中に存在する特定の炎症促進性サイトカインのレベルを比較するグラフのセットを提供する。
【図１−２】図１は、アジュバント誘導性関節炎モデルにおける、ラット由来の足組織中に存在する特定の炎症促進性サイトカインのレベルを比較するグラフのセットを提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、プロテイナーゼ活性化受容体２（「ＰＡＲ−２」）に結合する分子であって、ＰＡＲ−２をアゴナイズするかまたはアンタゴナイズする分子、例えば抗ＰＡＲ−２抗体、抗体断片、および抗体誘導体、例えばアンタゴニスト性抗ＰＡＲ−２抗体、抗体断片、または抗体誘導体を含む分子に関連する、組成物、キット、および方法を提供する。やはり提供するのは、ＰＡＲ−２に結合するポリペプチドのすべてまたは一部をコードするヌクレオチドの配列を含む、核酸、ならびにその誘導体および断片、例えば抗ＰＡＲ−２抗体、抗体断片、または抗体誘導体のすべてまたは一部をコードする核酸、こうした核酸を含むプラスミドおよびベクター、ならびにこうした核酸および／またはベクターおよびプラスミドを含む細胞または細胞株である。提供する方法には、例えば、ＰＡＲ−２に結合する分子、例えば抗ＰＡＲ−２抗体を作製するか、同定するか、または単離する方法、分子がＰＡＲ−２に結合するかどうかを決定する方法、分子がＰＡＲ−２をアゴナイズするかまたはアンタゴナイズするかどうかを決定する方法、ＰＡＲ−２に結合する分子を含む、薬学的組成物などの組成物を作製する方法、ならびにＰＡＲ−２に結合する分子を被験体に投与するための方法、例えばＰＡＲ−２によって仲介される状態を治療するための方法、およびＰＡＲ−２の生物学的活性をｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏでアゴナイズするかまたはアンタゴナイズするための方法が含まれる。
【００２０】
ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列は、標準的な１文字または３文字略記を用いて示される。別に示さない限り、各ポリペプチド配列は、アミノ末端を左側に、そしてカルボキシ末端を右側に有し；各一本鎖核酸配列、および各二本鎖核酸配列の上部鎖は、５’端を左に、そして３’端を右に有する。特定のポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列はまた、参照配列とどのように異なるかを説明することによって記載されうる。
【００２１】
本明細書において、別に定義しない限り、本発明と関連して用いられる科学的および技術的用語は、一般の当業者に一般的に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈によって必要とされない限り、単数形の用語は複数のものを含み、そして複数形の用語は単数形を含むものとする。一般的に、本明細書に記載する、細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質および核酸化学およびハイブリダイゼーションと関連して用いられる術語、ならびにそれらの技術は、当該技術分野に周知であり、そして一般的に用いられるものである。本発明の方法および技術は、別に示さない限り、一般的に、当該技術分野に周知の慣用法にしたがって、そして本明細書全体で引用され、そして論じられる、多様な一般的な参考文献およびより特異的な参考文献に記載されるように、行われる。例えば、本明細書に援用される、Ｓａｍｂｒｏｏｋら Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８９）、ならびにＡｕｓｕｂｅｌら， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２）、ならびにＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９９０）を参照されたい。酵素反応および精製技術は、当該技術分野に一般的に達成されるように、または本明細書に記載するように、製造者の指定にしたがって行われる。本明細書記載の分析化学、合成有機化学、ならびに医学的および薬学的化学と関連して用いられる専門用語、ならびにこうした化学の実験法および技術は、当該技術分野に周知であり、そして一般的に知られるものである。化学合成、化学分析、薬学的調製、配合、および送達、ならびに患者の治療には、標準的技術を用いてもよい。
【００２２】
以下の用語は、別に示さない限り、以下の意味を有すると理解されるべきである：
用語「単離分子」は（分子が、例えばポリペプチド、ポリヌクレオチド、または抗体である場合）、その起源または派生供給源によって、（１）天然状態で該分子に付随する、天然に関連する構成要素と関連していないか、（２）同じ種由来の他の分子を実質的に含まないか、（３）異なる種由来の細胞によって発現されるか、または（４）人の介入なしに天然には存在しない分子である。したがって、化学的に合成されたか、または天然に由来する細胞とは異なる細胞系において合成される分子は、天然に関連する構成要素から「単離されている」であろう。分子はまた、当該技術分野に周知の精製技術を用いた単離によって、天然に関連する構成要素を実質的に含まないようにされうる。当該技術分野に周知のいくつかの手段によって、分子純度または均一性をアッセイしてもよい。例えば、当該技術分野に周知の技術を用いて、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用い、そしてゲルを染色してポリペプチドを視覚化して、ポリペプチド試料の純度をアッセイしてもよい。特定の目的のため、ＨＰＬＣまたは当該技術分野に周知の精製のための他の手段を用いることによって、より高い解像度を提供してもよい。
【００２３】
用語「ＰＡＲ−２阻害剤」および「ＰＡＲ−２アンタゴニスト」は交換可能に用いられる。各々は、ＰＡＲ−２の少なくとも１つの機能を検出可能に阻害する分子である。逆に、「ＰＡＲ−２アゴニスト」は、ＰＡＲ−２の少なくとも１つの機能を検出可能に増加させる分子である。ＰＡＲ−２阻害剤によって引き起こされる阻害は、アッセイを用いて検出可能である限り、完全である必要はない。ＰＡＲ−２の機能のいかなるアッセイを用いてもよく、それらの例を本明細書に提供する。ＰＡＲ−２阻害剤によって阻害可能なＰＡＲ−２の機能またはＰＡＲ−２アゴニストによって増加可能なＰＡＲ−２の機能の例には、プロテアーゼが活性化するリガンド結合、下流シグナル伝達などが含まれる。ＰＡＲ−２阻害剤およびＰＡＲ−２アゴニストの種類の例には、限定されるわけではないが、抗原結合性タンパク質（例えばＰＡＲ−２阻害性抗原結合性タンパク質）、抗体、抗体断片、および抗体誘導体などの、ＰＡＲ−２結合性ポリペプチドが含まれる。
【００２４】
用語「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」は、各々、ペプチド結合によって互いに連結された２以上のアミノ酸残基を含む分子を指す。これらの用語は、例えば天然および人工的タンパク質、タンパク質断片、およびタンパク質配列のポリペプチド類似体（突然変異タンパク質（ｍｕｔｅｉｎ）、変異体、および融合タンパク質など）、ならびに翻訳後、あるいは別の共有的または非共有的修飾タンパク質を含む。ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、単量体性または多量体性であってもよい。
【００２５】
用語「ポリペプチド断片」は、本明細書において、対応する全長タンパク質に比較した際、アミノ末端および／またはカルボキシ末端欠失を有するポリペプチドを指す。断片は、例えば、少なくとも長さ５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、５０、７０、８０、９０、１００、１５０または２００アミノ酸であってもよい。断片はまた、例えば、最大で、長さ１，０００、７５０、５００、２５０、２００、１７５、１５０、１２５、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１４、１３、１２、１１、または１０アミノ酸であってもよい。断片は、さらに、どちらかまたは両方の端に、１以上のさらなるアミノ酸、例えば異なる天然存在タンパク質（例えばＦｃまたはロイシンジッパードメイン）または人工的アミノ酸配列（例えば人工的リンカー配列またはタグタンパク質）由来のアミノ酸配列を含んでもよい。
【００２６】
本発明のポリペプチドには、例えば：（１）タンパク質分解に対する感受性を減少させ、（２）酸化に対する感受性を減少させ、（３）タンパク質複合体を形成するための結合アフィニティを改変し、（４）結合アフィニティを改変し、そして（４）他の物理化学特性または機能特性を与えるかまたはこうした特性を修正するように、いずれかの方式で、そしていずれかの理由のために修飾されているポリペプチドが含まれる。類似体には、ポリペプチドの突然変異タンパク質が含まれる。例えば、単数または多数のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）を天然存在配列において（例えば、分子間接触を形成するドメイン（単数または複数）外のポリペプチドの部分において）行うことも可能である。「保存的アミノ酸置換」は、親配列の構造特徴を実質的に変化させないものである（例えば置換アミノ酸は、親配列に存在するらせんを中断させるか、あるいは親配列を特徴付けるかまたはその機能に必要な他の種類の二次構造を破壊する傾向があってはならない）。当該技術分野に認識されるポリペプチド二次構造および三次構造の例が、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ監修， Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ， ニューヨーク（１９８４））； Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｃ． ＢｒａｎｄｅｎおよびＪ． Ｔｏｏｚｅ監修， Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， ニューヨーク州ニューヨーク（１９９１））；およびＴｈｏｒｎｔｏｎら Ｎａｔｕｒｅ ３５４：１０５（１９９１）に記載され、これらは各々、本明細書に援用される。
【００２７】
本発明はまた、ＰＡＲ−２結合性ポリペプチドの非ペプチド類似体も提供する。非ペプチド類似体は、テンプレート・ペプチドのものに類似の特性を持つ薬剤として、薬剤産業において一般的に用いられる。これらの種類の非ペプチド化合物は、「ペプチド模倣体」（「ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｉｍｅｔｉｃｓ」または「ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ」）と称され、例えば、本明細書に援用される、Ｆａｕｃｈｅｒｅ， Ｊ． Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ． １５：２９（１９８６）； ＶｅｂｅｒおよびＦｒｅｉｄｉｎｇｅｒ ＴＩＮＳ ｐ．３９２（１９８５）；ならびにＥｖａｎｓら Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３０：１２２９（１９８７）を参照されたい。療法的に有用なペプチドに構造的に類似のペプチド模倣体を用いて、同等の療法効果または予防効果を生じることも可能である。一般的に、ペプチド模倣体は、ヒト抗体などの模範（ｐａｒａｄｉｇｍ）ポリペプチド（すなわち所望の生化学的特性または薬理学的活性を有するポリペプチド）に構造的に類似であるが、当該技術分野に周知の方法によって：−−ＣＨ２ＮＨ−−、−−ＣＨ２Ｓ−−、−−ＣＨ２−−ＣＨ２−−、−−ＣＨ＝ＣＨ−（シスおよびトランス）、−−ＣＯＣＨ２−−、−−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−−、および−−ＣＨ２ＳＯ−−からなる群より選択される連結により、場合によって置換された１以上のペプチド連結を有する。コンセンサス配列の１以上のアミノ酸を、同じ種類のＤ−アミノ酸（例えばＬ−リジンの代わりにＤ−リジン）で体系的に置換して、より安定なペプチドを生成することも可能である。さらに、コンセンサス配列または実質的に同一なコンセンサス配列変動を含む、制約された（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ）ペプチドを、当該技術分野に知られる方法（本明細書に援用される、ＲｉｚｏおよびＧｉｅｒａｓｃｈ Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６１：３８７（１９９２））によって生成することも可能であり、これは例えば、ペプチドを環状化する、分子内ジスルフィド架橋を形成可能な内部システイン残基を付加することによる。
【００２８】
ポリペプチド（例えば抗体）の「変異体」は、別のポリペプチド配列に比較して、１以上のアミノ酸残基がアミノ酸配列内に挿入され、該配列から欠失し、そして／または該配列内に置換された、アミノ酸配列を含む。本発明の変異体には融合タンパク質が含まれる。
【００２９】
ポリペプチドの「誘導体」は、例えば別の化学部分（例えばポリエチレングリコール、またはアルブミン、例えばヒト血清アルブミンなど）へのコンジュゲート化、リン酸化、およびグリコシル化を介して、化学的に修飾されているポリペプチド（例えば抗体）である。別に示さない限り、用語「抗体」には、２つの全長重鎖および２つの全長軽鎖を含む抗体に加えて、その誘導体、変異体、断片、および突然変異タンパク質が含まれ、それらの例を以下に記載する。
【００３０】
「抗原結合性タンパク質」は、抗原に結合する部分、および場合によって、抗原結合性部分が、抗原結合性タンパク質の抗原への結合を促進するコンホメーションを採用するのを可能にする足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）またはフレームワーク部分を含む、タンパク質である。抗原結合性タンパク質の例には、抗体、抗体断片（例えば抗体の抗原結合性部分）、抗体誘導体、および抗体類似体が含まれる。抗原結合性タンパク質は、例えば移植されたＣＤＲまたはＣＤＲ誘導体を含む別のタンパク質足場または人工的足場を含むことも可能である。こうした足場には、限定されるわけではないが、例えば抗原結合性タンパク質の三次元構造を安定化させるために導入された突然変異を含む抗体由来足場、ならびに例えば生体適合性ポリマーを含む完全に合成の足場が含まれる。例えば、Ｋｏｒｎｄｏｒｆｅｒら， ２００３， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｆｕｎｃｔｉｏｎ， ａｎｄ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ， 第５３巻， 第１号：１２１−１２９； Ｒｏｑｕｅら， ２００４， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｐｒｏｇ． ２０：６３９−６５４を参照されたい。さらに、ペプチド抗体模倣体（「ＰＡＭ」）、ならびにフィブロネクチン構成要素を足場として利用する抗体模倣体に基づく足場を使用してもよい。
【００３１】
抗原結合性タンパク質は、例えば、天然存在免疫グロブリンの構造を有することも可能である。「免疫グロブリン」は、四量体分子である。天然存在免疫グロブリンにおいて、各四量体は、２つの同一対のポリペプチド鎖で構成され、各対は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分には、主に抗原認識に関与する、約１００〜１１０以上のアミノ酸の可変領域が含まれる。各鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクター機能に関与する、定常領域を明示する。ヒト軽鎖は、カッパまたはラムダ軽鎖と分類される。重鎖は、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファ、またはイプシロンと分類され、そしてそれぞれ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥとして、抗体のアイソタイプを定義する。軽鎖および重鎖内で、可変領域および定常領域は、約１２以上のアミノ酸の「Ｊ」領域で連結され、重鎖はまた、約１０以上のアミノ酸の「Ｄ」領域も含む。一般的に、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ 第７章（Ｐａｕｌ， Ｗ．監修， 第２版 Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク（１９８９））（あらゆる目的のため、その全体が本明細書に援用される）を参照されたい。各軽鎖／重鎖対の可変領域は、損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）免疫グロブリンが２つの結合性部位を有するように、抗体結合性部位を形成する。
【００３２】
天然存在免疫グロブリン鎖の可変領域は、相補性決定領域またはＣＤＲとも呼ばれる、３つの超可変領域によって連結される、比較的保存されるフレームワーク領域（ＦＲ）の、同じ一般構造を示す。軽鎖および重鎖はどちらも、Ｎ末端からＣ末端に、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含む。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、ＫａｂａｔらのＳｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， 第５版， 米国保健社会福祉省， ＰＨＳ， ＮＩＨ， ＮＩＨ刊行物第９１−３２４２号， １９９１の定義にしたがう。免疫グロブリン鎖中のアミノ酸に関する他の番号付け系には、ＩＭＧＴ（登録商標）（国際ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ情報系； Ｌｅｆｒａｎｃら， Ｄｅｖ． Ｃｏｍｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２９：１８５−２０３； ２００５）およびＡＨｏ（ＨｏｎｅｇｇｅｒおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３０９（３）：６５７−６７０； ２００１）が含まれる。
【００３３】
多様な抗原特異性を有する免疫グロブリンを含有する血清または血漿などの供給源から、抗体を得てもよい。こうした抗体をアフィニティ精製に供すると、特定の抗原特異性に関して濃縮可能である。抗体のこうした濃縮調製物は、通常、特定の抗原に関する特異的結合活性を有する、約１０％未満の抗体で構成される。これらの調製物をアフィニティ精製に数回供すると、抗原に関して特異的結合活性を有する抗体の比率を増加させうる。この方式で調製される抗体は、しばしば、「単一特異性」と称される。単一特異性抗体調製物は、特定の抗原に関する特異的結合活性を有する抗体、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、または９９．９％で構成されうる。
【００３４】
「抗体」は、別に明記しない限り、損なわれていない免疫グロブリン、または特異的結合に関して、損なわれていない抗体と競合する、その抗原結合性部分を指す。抗原結合性部分は、組換えＤＮＡ技術によって、あるいは損なわれていない抗体の酵素的切断または化学的切断によって、産生可能である。抗原結合性部分には、とりわけ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、および相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、キメラ抗体、ディアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ならびに少なくとも、ポリペプチドへの特異的抗原結合性を与えるのに十分な免疫グロブリン部分を含有するポリペプチドが含まれる。
【００３５】
Ｆａｂ断片は、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインを有する一価断片であり；Ｆ（ａｂ’）２断片は、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結される２つのＦａｂ断片を有する二価断片であり；Ｆｄ断片は、ＶＨおよびＣＨ１ドメインを有し；Ｆｖ断片は、抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインを有し；そしてｄＡｂ断片は、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、あるいはＶＨまたはＶＬドメインの抗原結合性断片を有する（米国特許第６，８４６，６３４号、第６，６９６，２４５号、米国出願公報第０５／０２０２５１２号、第０４／０２０２９９５号、第０４／００３８２９１号、第０４／０００９５０７号、第０３／００３９９５８号、Ｗａｒｄら， Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６， １９８９）。
【００３６】
一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）は、ＶＬおよびＶＨ領域がリンカー（例えばアミノ酸残基の合成配列）を介して連結されて、連続タンパク質鎖を形成する抗体であり、ここでリンカーは、タンパク質鎖が、それ自体、折り畳まれ、そして一価抗原結合性部位を形成するのを可能にするのに十分に長い（例えば、Ｂｉｒｄら， １９８８， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−２６およびＨｕｓｔｏｎら， １９８８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：５８７９−８３を参照されたい）。ディアボディは、２つのポリペプチド鎖を含む二価抗体であって、各ポリペプチド鎖は、同じ鎖上の２つのドメイン間で対形成するのを可能にするにはあまりにも短く、したがって各ドメインが別のポリペプチド鎖上の相補ドメインと対形成するのを可能にするリンカーによって連結されたＶＨおよびＶＬドメインを含む（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒら， １９９３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：６４４４−４８、およびＰｏｌｊａｋら， １９９４， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：１１２１−２３を参照されたい）。ディアボディの２つのポリペプチド鎖が同一であるならば、その対形成から生じるディアボディは、２つの同一の抗原結合性部位を有するであろう。異なる配列を有するポリペプチド鎖を用いて、２つの異なる抗原結合性部位を持つディアボディを作製することも可能である。同様に、トリボディおよびテトラボディは、それぞれ、３つおよび４つのポリペプチド鎖を含み、そして、同じであってもまた異なってもよい、それぞれ、３つおよび４つの抗原結合性部位を形成する抗体である。
【００３７】
Ｋａｂａｔら、上記；Ｌｅｆｒａｎｃら、上記およびまたはＨｏｎｅｇｇｅｒおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、上記に記載される系を用いて、所定の抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびフレームワーク領域（ＦＲ）を同定してもよい。１以上のＣＤＲを共有的または非共有的のいずれかで分子内に取り込んで、抗原結合性タンパク質にすることも可能である。抗原結合性タンパク質は、より長いポリペプチド鎖の一部としてＣＤＲ（単数または複数）を取り込むことも可能であるし、別のポリペプチド鎖にＣＤＲ（単数または複数）を共有結合させることも可能であるし、または非共有的にＣＤＲ（単数または複数）を取り込むことも可能である。ＣＤＲは、抗原結合性タンパク質が、関心対象の特定の抗原に特異的に結合するのを可能にする。
【００３８】
抗原結合性タンパク質は、１以上の結合性部位を有してもよい。１より多い結合性部位がある場合、結合性部位は、互いに同一であっても、また異なってもよい。例えば、天然存在ヒト免疫グロブリンは、典型的には２つの同一の結合性部位を有し、一方、「二重特異性」または「二官能性」抗体は、２つの異なる結合性部位を有する。
【００３９】
用語「ヒト抗体」には、ヒト免疫グロブリン配列に由来する１以上の可変領域および定常領域を有する抗体すべてが含まれる。１つの態様において、可変ドメインおよび定常ドメインのすべてがヒト免疫グロブリン配列に由来する（完全ヒト抗体）。これらの抗体は、多様な方法で調製可能であり、その例を以下に記載し、これらには、ヒト重鎖および／または軽鎖をコードする遺伝子に由来する抗体を発現するように遺伝子修飾されたマウスの、関心対象の抗原での免疫を通じたものが含まれる。
【００４０】
ヒト化抗体は、ヒト被験体に投与された際、非ヒト種抗体に比較すると、免疫応答を誘導する可能性がより低く、そして／またはより重度でない免疫応答を誘導するように、１以上のアミノ酸置換、欠失、および／または付加によって、非ヒト種に由来する抗体の配列と異なる配列を有する。１つの態様において、非ヒト種抗体の重鎖および／または軽鎖のフレームワークおよび定常ドメイン中の特定のアミノ酸を突然変異させて、ヒト化抗体を産生する。別の態様において、ヒト抗体由来の定常ドメイン（単数または複数）を、非ヒト種の可変ドメイン（単数または複数）に融合させる。別の態様において、非ヒト抗体の１以上のＣＤＲ配列中の１以上のアミノ酸残基を変化させて、ヒト被験体に投与された際、非ヒト抗体のありうる免疫原性を減少させ、ここで抗原へのヒト化抗体の結合が、抗原への非ヒト抗体の結合より有意に劣らないように、変化させるアミノ酸残基は、抗原への抗体の免疫特異的結合に必須でないか、または作製されるアミノ酸配列への変化が保存的変化であるか、いずれかである。ヒト化抗体をどのように作製するかの例を、米国特許第６，０５４，２９７号、第５，８８６，１５２号、および第５，８７７，２９３号に見出すことも可能である。
【００４１】
用語「キメラ抗体」は、１つの抗体由来の１以上の領域および１以上の他の抗体由来の１以上の他の領域を含有する抗体を指す。１つの態様において、１以上のＣＤＲが、ヒト抗ＰＡＲ−２抗体に由来する。別の態様において、すべてのＣＤＲが、ヒト抗ＰＡＲ−２抗体に由来する。別の態様において、１より多いヒト抗ＰＡＲ−２抗体由来のＣＤＲを混合し、そしてキメラ抗体中でマッチングさせる。例えば、キメラ抗体は、第一のヒト抗ＰＡＲ−２抗体の軽鎖由来のＣＤＲ１、第二のヒト抗ＰＡＲ−２抗体の軽鎖由来のＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに第三の抗ＰＡＲ−２抗体由来の重鎖由来のＣＤＲを含んでもよい。他の組み合わせが可能であり、そして本発明の態様内に含まれる。
【００４２】
さらに、フレームワーク領域は、同じ抗ＰＡＲ−２抗体の１つに、ヒト抗体などの１以上の異なる抗体に、またはヒト化抗体に由来してもよい。キメラ抗体の１つの例において、重鎖および／または軽鎖の部分は、特定の種由来であるか、あるいは特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体と、同一であるか、該抗体に相同であるか、または該抗体に由来する一方、鎖（単数または複数）の残りは、別の種由来であるか、あるいは別の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体（単数または複数）と、同一であるか、該抗体に相同であるか、または該抗体に由来する。やはり含まれるのは、所望の生物学的活性（すなわちＰＡＲ−２に特異的に結合する能力）を示す、こうした抗体の断片である。例えば米国特許第４，８１６，５６７号およびＭｏｒｒｉｓｏｎ， １９８５， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２−０７を参照されたい。
【００４３】
「中和抗体」または「阻害性抗体」は、本明細書において実施例に記載するものなどのアッセイを用いて、過剰な抗ＰＡＲ−２抗体が、活性化の量を、少なくとも約２０％減少させる場合の、ＰＡＲ−２のタンパク質分解的活性化を阻害する抗体である。多様な態様において、抗原結合性タンパク質は、ＰＡＲ−２のタンパク質分解的活性化の量を、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、および９９．９％減少させる。
【００４４】
抗体の断片または類似体は、本明細書の解説にしたがって、そして当該技術分野に周知の技術を用いて、一般の当業者によって、容易に調製可能である。断片または類似体の好ましいアミノ末端およびカルボキシ末端は、機能ドメインの境界近傍に存在する。公共のまたは私有の（ｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ）配列データベースに、ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列データを比較することによって、構造ドメインおよび機能ドメインを同定することも可能である。コンピュータ比較法を用いて、既知の構造および／または機能を持つ他のタンパク質に存在する配列モチーフまたは予測されるタンパク質コンホメーションドメインを同定してもよい。既知の三次元構造にフォールディングするタンパク質配列を同定する方法が知られる。例えばＢｏｗｉｅら， １９９１， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３：１６４を参照されたい。
【００４５】
「ＣＤＲ移植抗体」は、特定の種またはアイソタイプの抗体由来の１以上のＣＤＲ、および同じまたは異なる種またはアイソタイプの別の抗体のフレームワークを含む抗体である。
【００４６】
「多重特異性抗体」は、１以上の抗原上の１より多いエピトープを認識する抗体である。この種の抗体のサブクラスは、同じまたは異なる抗原上の２つの別個のエピトープを認識する「二重特異性抗体」である。
【００４７】
抗原結合性タンパク質は、１ナノモル以下の解離定数で、抗原に結合する場合、抗原（例えばヒトＰＡＲ−２）に「特異的に結合する」。
「抗原結合性ドメイン」、「抗原結合性領域」、または「抗原結合性部位」は、抗原と相互作用して、そして抗原に対する抗原結合性タンパク質の特異性およびアフィニティに寄与するアミノ酸残基（または他の部分）を含有する抗原結合性タンパク質の部分である。抗原に特異的に結合する抗体に関しては、ＣＤＲドメインの少なくとも１つの少なくとも部分を含むであろう。
【００４８】
「エピトープ」は、抗原結合性タンパク質によって（例えば抗体によって）結合される分子の部分である。エピトープは、分子の非隣接部分を含んでもよい（例えばポリペプチドでは、ポリペプチドの一次配列においては隣接しないが、ポリペプチドの三次構造および四次構造の関連においては、互いに、抗原結合性タンパク質によって結合されるのに十分に近い、アミノ酸残基）。
【００４９】
２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチド配列の「同一性パーセント」は、デフォルト・パラメータを用い、ＧＡＰコンピュータ・プログラム（ＧＣＧウィスコンシン・パッケージ、バージョン１０．３（Ａｃｃｅｌｒｙｓ、カリフォルニア州サンディエゴ）の一部）を用いて、配列を比較することによって決定される。
【００５０】
用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書全体を通じて交換可能に用いられ、そしてＤＮＡ分子（例えばｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）、ヌクレオチド類似体（例えばペプチド核酸および非天然存在ヌクレオチド類似体）を用いて生成されるＤＮＡまたはＲＮＡの類似体、およびそれらのハイブリッドを含む。核酸分子は、一本鎖または二本鎖であることも可能である。１つの態様において、本発明の核酸分子は、本発明の抗体、あるいはその断片、誘導体、突然変異タンパク質、または変異体をコードする、隣接オープンリーディングフレームを含む。
【００５１】
２つの一本鎖ポリヌクレオチドは、ギャップを導入することなく、そしていずれの配列の５’端または３’端にも、対形成しないヌクレオチドを伴わずに、一方のポリヌクレオチド中のすべてのヌクレオチドが、他方のポリヌクレオチド中の相補的ヌクレオチドと反対であるように、逆平行配向で並列可能であるならば、互いに「相補体」である。ポリヌクレオチドは、中程度にストリンジェントな条件下で、２つのポリヌクレオチドが互いにハイブリダイズ可能であるならば、別のポリヌクレオチドに「相補的」である。したがって、ポリヌクレオチドは、別のポリヌクレオチドの相補体であることなく、該ポリヌクレオチドに相補的であることも可能である。
【００５２】
「ベクター」は、連結された別の核酸を、細胞内に導入するために使用可能な核酸である。ベクターの１種類は「プラスミド」であり、その内部にさらなる核酸セグメントを連結可能な、直鎖または環状二重鎖ＤＮＡ分子を指す。別の種類のベクターはウイルスベクター（例えば複製不全レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）であり、ここで、さらなるＤＮＡセグメントをウイルスゲノム内に導入可能である。特定のベクターは、導入された宿主細胞において、自律的に複製可能である（例えば細菌複製起点を含む細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。宿主細胞内への導入に際して、宿主細胞のゲノム内に他のベクター（例えば非エピソーム哺乳動物ベクター）を組み込んで、そしてそれによって宿主ゲノムと一緒に複製させる。「発現ベクター」は、選択したポリヌクレオチドの発現を指示することも可能なベクターの種類である。
【００５３】
ヌクレオチド配列は、制御配列が該ヌクレオチド配列の発現（例えば発現のレベル、時期、または位置）に影響を及ぼすならば、該制御配列に「機能可能であるように連結されて」いる。「制御配列」は、機能可能であるように連結されている核酸の発現（例えば発現のレベル、時期、または位置）に影響を及ぼす核酸である。制御配列は、例えば、制御される核酸に対して直接、または１以上の他の分子（例えば制御配列および／または核酸に結合するポリペプチド）の作用を通じて、その効果を発揮する。制御配列の例には、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現調節要素（例えばポリアデニル化シグナル）が含まれる。制御配列のさらなる例は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ， １９９０， Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， カリフォルニア州サンディエゴ、およびＢａｒｏｎら， １９９５， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２３：３６０５−０６に記載される。
【００５４】
「宿主細胞」は、核酸、例えば本発明の核酸を発現するために使用可能な細胞である。宿主細胞は、原核生物、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）であってもよいし、または真核生物、例えば単細胞真核生物（例えば酵母（ｙｅａｓｔ）または他の真菌）、植物細胞（例えばタバコ（ｔｏｂａｃｃｏ）またはトマト（ｔｏｍａｔｏ）植物細胞）、動物細胞（例えばヒト細胞、サル細胞、ハムスター細胞、ラット細胞、マウス細胞、または昆虫細胞）またはハイブリドーマであってもよい。宿主細胞の例には、サル腎臓細胞のＣＯＳ−７株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）（Ｇｌｕｚｍａｎら， １９８１， Ｃｅｌｌ ２３：１７５を参照されたい）、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはＶｅｇｇｉｅ ＣＨＯなどのその誘導体および血清不含培地中で増殖する関連細胞株（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎら， １９９８， Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２８：３１を参照されたい）またはＤＨＦＲが欠損しているＣＨＯ株ＤＸ−Ｂ１１（Ｕｒｌａｕｂら， １９８０， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７：４２１６−２０を参照されたい）、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １０）細胞株、アフリカミドリザル（Ａｆｒｉｃａｎ ｇｒｅｅｎ ｍｏｎｋｅｙ）腎臓細胞株ＣＶ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）由来のＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞株（ＭｃＭａｈａｎら， １９９１， ＥＭＢＯ Ｊ． １０：２８２１を参照されたい）、ヒト胚性腎細胞、例えば２９３、２９３ ＥＢＮＡまたはＭＳＲ ２９３、ヒト上皮Ａ４３１細胞、ヒトＣｏｌｏ２０５細胞、他の形質転換霊長類細胞株、正常二倍体細胞、初代組織のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養由来の細胞株、初代外植片、ＨＬ−６０、Ｕ９３７、ＨａＫまたはＪｕｒｋａｔ細胞が含まれる。典型的には、宿主細胞は、その後、宿主細胞で発現可能なポリペプチドをコードする核酸で形質転換またはトランスフェクションされることが可能な、培養細胞である。句「組換え宿主細胞」を用いて、発現しようとする核酸で形質転換されているかまたはトランスフェクションされている宿主細胞を示すことも可能である。宿主細胞はまた、核酸を含むが、機能可能であるように核酸と連結されるように、制御配列が宿主細胞に導入されない限り、所望のレベルで該核酸を発現しない、細胞であってもよい。用語、宿主細胞は、特定の対象の細胞だけでなく、こうした細胞の子孫または潜在的な子孫も指すことが理解される。例えば、突然変異または環境的影響によって、続く世代で特定の修飾が起こりうるため、こうした子孫は、実際、親細胞と同一でない可能性もあるが、なお、本明細書において、この用語の範囲内に含まれる。
【００５５】
ＰＡＲ−２
先に論じたように、ＰＡＲ−２は、７回膜貫通Ｇタンパク質共役型受容体スーパーファミリーのメンバーであり；係留されたリガンドを形成するＮ末端のタンパク質分解的切断によって活性化が開始される。ヒトＰＡＲ−２のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を配列番号１および２に示し；マウスＰＡＲ−２のアミノ酸配列を配列番号３に示し、そしてラットＰＡＲ−２のアミノ酸配列を配列番号４に示す。タンパク質分解的切断は、この受容体の活性化型を生じ、この型は、本明細書において、交換可能に「切断」または「切り取り」ＰＡＲ−２と称される。
【００５６】
抗原結合性タンパク質
１つの側面において、本発明は、ＰＡＲ−２、例えばヒトＰＡＲ−２に結合する、抗原結合性タンパク質（例えば抗体、抗体断片、抗体誘導体、抗体突然変異タンパク質、および抗体変異体）を提供する。
【００５７】
本発明にしたがった抗原結合性タンパク質には、ＰＡＲ−２の生物学的活性を阻害する抗原結合性タンパク質が含まれる。こうした生物学的活性の例には、Ｇタンパク質共役型受容体が仲介する共通するシグナル伝達経路、例えばイノシトール１，４，５−三リン酸産生およびＣａ（２＋）可動化、ならびにＥＲＫ、ｐ３８ＭＡＰＫ、ＪＮＫ、およびＩＫＫを含む多数のキナーゼ経路の活性化が含まれる。他の生物学的活性には、外傷および炎症に対する反応など、ＰＡＲ−２がｉｎ ｖｉｖｏで仲介するものが含まれ；特に、ＰＡＲ−２は、心臓血管系、肺系および胃腸系に関与し、こうした系において、炎症および痛覚（痛みの知覚）を制御する。ＰＡＲ−２活性化はまた、炎症性反応においても役割を果たし、こうした反応の慢性的活性化は、疾患状態を導きうる。
【００５８】
異なる抗原結合性タンパク質は、ＰＡＲ−２の異なるドメインまたはエピトープに結合するか、あるいは異なる作用機構によって作用することも可能である。例には、限定されるわけではないが、ＰＡＲ−２のタンパク質分解的活性化に干渉するか、またはシグナル伝達を阻害する抗原結合性タンパク質が含まれる。作用部位は、例えば、細胞内（例えば細胞内シグナル伝達カスケードに干渉することによる）または細胞外であることも可能である。抗原結合性タンパク質は、本発明における使用を見出すために、ＰＡＲ−２が誘導する活性を完全に阻害する必要はなく；むしろ、ＰＡＲ−２の特定の活性を減少させる抗原結合性タンパク質もまた、使用のために意図される（特定の疾患を治療する際のＰＡＲ−２結合性抗原結合性タンパク質の特定の作用機構の本明細書の考察は、例示のみであり、そして本明細書に提示する方法は、それに束縛されない）。
【００５９】
本発明の範囲内の抗ＰＡＲ−２抗体の他の誘導体には、抗ＰＡＲ−２抗体ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合した異種ポリペプチドを含む組換え融合タンパク質の発現によるなどの、他のタンパク質またはポリペプチドとの抗ＰＡＲ−２抗体またはその断片の共有または凝集コンジュゲートが含まれる。例えば、コンジュゲート化されるペプチドは、異種シグナル（またはリーダー）ポリペプチド、例えば酵母アルファ因子リーダー、またはエピトープタグなどのペプチドであってもよい。抗原結合性タンパク質を含有する融合タンパク質は、抗原結合性タンパク質の精製または同定を促進するために付加されるペプチド（例えばポリＨｉｓ）を含んでもよい。また、抗原結合性タンパク質を、Ｈｏｐｐら， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１２０４， １９８８、および米国特許第５，０１１，９１２号に記載されるような、ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチド、Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）（配列番号７）に連結してもよい。ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドは、非常に抗原性であり、そして特異的モノクローナル抗体（ｍＡｂ）によって可逆的に結合されるエピトープを提供し、発現された組換えタンパク質の迅速なアッセイおよび容易な精製を可能にする。ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドが所定のポリペプチドに融合される融合タンパク質を調製するのに有用な試薬が、商業的に入手可能である（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）。
【００６０】
１以上の抗原結合性タンパク質を含有するオリゴマーをＰＡＲ−２アンタゴニストとして使用してもよい。オリゴマーは、共有結合したまたは非共有結合した、二量体、三量体、またはより高次のオリゴマーの形であることも可能である。２以上の抗原結合性タンパク質を含むオリゴマーが使用のために意図され、一例がホモ二量体である。他のオリゴマーには、ヘテロ二量体、ホモ三量体、ヘテロ三量体、ホモ四量体、ヘテロ四量体等が含まれる。
【００６１】
１つの態様は、抗原結合性タンパク質に融合したペプチド部分間の共有相互作用または非共有相互作用を介して連結された、多数の抗原結合性タンパク質を含むオリゴマーに向けられる。こうしたペプチドは、ペプチド・リンカー（スペーサー）、またはオリゴマー化を促進する特性を有するペプチドであってもよい。以下により詳細に記載するように、ロイシンジッパー、および抗体由来の特定のポリペプチドが、それに付着した抗原結合性タンパク質のオリゴマー化を促進可能なペプチドの中にある。
【００６２】
特定の態様において、オリゴマーは、２〜４の抗原結合性タンパク質を含む。オリゴマーの抗原結合性タンパク質は、上述の型のいずれか、例えば変異体または断片などの、いかなる型であってもよい。好ましくは、オリゴマーは、ＰＡＲ−２結合活性を有する、抗原結合性タンパク質を含む。
【００６３】
１つの態様において、免疫グロブリン由来のポリペプチドを用いて、オリゴマーを調製する。抗体由来ポリペプチドの多様な部分（Ｆｃドメインを含む）に融合した特定の異種ポリペプチドを含む、融合タンパク質の調製は、例えばＡｓｈｋｅｎａｚｉら， １９９１， ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８８：１０５３５； Ｂｙｒｎら， １９９０， Ｎａｔｕｒｅ ３４４：６７７；およびＨｏｌｌｅｎｂａｕｇｈら， １９９２ "Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ"， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ中， 補遺４， １０．１９．１−１０．１９．１１ページによって記載されてきている。
【００６４】
本発明の１つの態様は、抗ＰＡＲ−２抗体のＰＡＲ−２結合性断片を、抗体のＦｃ領域に融合させることによって生成される２つの融合タンパク質を含む二量体に向けられる。二量体は、例えば、融合タンパク質をコードする遺伝子融合体を、適切な発現ベクター内に挿入し、組換え発現ベクターで形質転換した宿主細胞において、遺伝子融合体を発現させ、そして発現された融合タンパク質を抗体分子とそっくりに集合させて、その際、Ｆｃ部分間に鎖間ジスルフィド結合が形成されるのを可能にして、二量体を生じることによって、作製可能である。
【００６５】
用語「Ｆｃポリペプチド」には、本明細書において、抗体のＦｃ領域由来のポリペプチドの天然型および突然変異タンパク質型が含まれる。二量体化を促進するヒンジ領域を含有する、こうしたポリペプチドの一部切除（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）型もまた含まれる。Ｆｃ部分を含む融合タンパク質（およびそこから形成されるオリゴマー）は、プロテインＡまたはプロテインＧカラム上のアフィニティクロマトグラフィーによって精製が容易であるという利点を提供する。
【００６６】
１つの適切なＦｃポリペプチドは、ＰＣＴ出願ＷＯ ９３／１０１５１（本明細書に援用される）に記載される、ヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ領域のＮ末端ヒンジ領域から天然Ｃ末端に渡る一本鎖ポリペプチドである。別の有用なＦｃポリペプチドは、米国特許第５，４５７，０３５号およびＢａｕｍら， １９９４， ＥＭＢＯ Ｊ． １３：３９９２−４００１に記載されるＦｃ突然変異タンパク質である。この突然変異タンパク質のアミノ酸配列は、アミノ酸１９がＬｅｕからＡｌａに変化し、アミノ酸２０がＬｅｕからＧｌｕに変化し、そしてアミノ酸２２がＧｌｙからＡｌａに変化していることを除けば、ＷＯ ９３／１０１５１に示される天然Ｆｃ配列のものと同一である。該突然変異タンパク質は、Ｆｃ受容体に対し、減少したアフィニティを示す。
【００６７】
他の態様において、抗ＰＡＲ−２抗体の重鎖および／または軽鎖の可変部分を、抗体重鎖および／または軽鎖の可変部分に対して置換してもよい。
あるいは、オリゴマーは、ペプチド・リンカー（スペーサー・ペプチド）を含むかまたは含まない、多数の抗原結合性タンパク質を含む融合タンパク質である。適切なペプチド・リンカーの中には、米国特許第４，７５１，１８０号および第４，９３５，２３３号に記載されるものがある。
【００６８】
オリゴマー性抗原結合性タンパク質を調製するための別の方法は、ロイシンジッパーの使用を伴う。ロイシンジッパードメインは、これらが見られるタンパク質のオリゴマー化を促進するペプチドである。ロイシンジッパーは、元来、いくつかのＤＮＡ結合性タンパク質で同定され（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚら， １９８８， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１７５９）、そして以来、多様な異なるタンパク質で発見されてきた。既知のロイシンジッパーの中には、二量体化または三量体化する天然存在ペプチドおよびその誘導体がある。可溶性オリゴマー性タンパク質を産生するのに適したロイシンジッパードメインの例が、本明細書に援用される、ＰＣＴ出願ＷＯ ９４／１０３０８に記載され、そして肺界面活性タンパク質Ｄ（ＳＰＤ）に由来するロイシンジッパーが、Ｈｏｐｐｅら， １９９４， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３４４：１９１に記載される。融合された異種タンパク質の安定な三量体化を可能にする、修飾ロイシンジッパーの使用が、Ｆａｎｓｌｏｗら， １９９４， Ｓｅｍｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ６：２６７−７８に記載される。１つのアプローチにおいて、ロイシンジッパーペプチドに融合した抗ＰＡＲ−２抗体断片または誘導体を含む組換え融合タンパク質を、適切な宿主細胞において発現させて、そして形成される可溶性オリゴマー性抗ＰＡＲ−２抗体断片または誘導体を、培養上清から回収する。
【００６９】
１つの側面において、本発明は、ＰＡＲ−２のタンパク質分解的活性化に干渉する抗原結合性タンパク質を提供する。ＰＡＲ−２、あるいはその断片、変異体または誘導体に対して、こうした抗原結合性タンパク質を作製し、そしてＰＡＲ−２のタンパク質分解的活性化に干渉する能力に関して、慣用的なアッセイでスクリーニングしてもよい。適切なアッセイの例は、ＰＡＲ−２を発現している細胞のタンパク質分解的活性化を阻害する能力に関して、抗原結合性タンパク質を試験するアッセイ、あるいは細胞表面ＰＡＲ−２受容体のタンパク質分解的活性化から生じる生物学的反応または細胞性反応を減少させる能力に関して、抗原結合性タンパク質を試験するアッセイである。抗原結合性タンパク質を試験する、さらなるアッセイには、タンパク質分解的に切断されたＰＡＲ−２ポリペプチドの結合に対して、全長非切断ＰＡＲ−２ポリペプチドへの抗原結合性タンパク質の結合を定性的にまたは定量的に比較するものが含まれ、そのいくつかの例を本明細書に開示する。
【００７０】
別の態様において、本発明は、切断ＰＡＲ−２および非切断ＰＡＲ−２の両方に結合する抗原結合性タンパク質を提供する。こうした抗原結合性タンパク質を作製し、そして上述のものなどの慣用的アッセイにおいてスクリーニングしてもよい。
【００７１】
別の側面において、本発明は、種選択性を示す抗原結合性タンパク質を提供する。１つの態様において、抗原結合性タンパク質は、１以上の哺乳動物ＰＡＲ−２に、例えばヒトＰＡＲ−２に、そしてマウス、ラット、モルモット、ハムスター、スナネズミ（ｇｅｒｂｉｌ）、ネコ、ウサギ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ラクダ、および非ヒト霊長類ＰＡＲ−２の１以上に結合する。別の態様において、抗原結合性タンパク質は、１以上の霊長類ＰＡＲ−２に、例えば、ヒトＰＡＲ−２に、そしてカニクイザル、マーモセット（ｍａｒｍｏｓｅｔ）、アカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ）およびチンパンジーＰＡＲ−２の１以上に結合する。別の態様において、抗原結合性タンパク質は、ヒト、カニクイザル、マーモセット、アカゲザル、またはチンパンジーＰＡＲ−２に特異的に結合する。別の態様において、抗原結合性タンパク質は、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、スナネズミ、ネコ、ウサギ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ラクダ、および非ヒト霊長類ＰＡＲ−２の１以上に結合しない。別の態様において、抗原結合性タンパク質は、マーモセットなどの新世界ザル種には結合しない。
【００７２】
別の態様において、抗原結合性タンパク質は、ＰＡＲ−２以外の天然存在タンパク質のいずれにも特異的結合を示さない。別の態様において、抗原結合性タンパク質は、哺乳動物ＰＡＲ−２以外の天然存在タンパク質のいずれにも特異的結合を示さない。別の態様において、抗原結合性タンパク質は、霊長類ＰＡＲ−２以外の天然存在タンパク質のいずれにも特異的結合を示さない。別の態様において、抗原結合性タンパク質は、ヒトＰＡＲ−２以外の天然存在タンパク質のいずれにも特異的結合を示さない。別の態様において、抗原結合性タンパク質は、マウス、ラット、カニクイザル、およびヒトＰＡＲ−２に特異的に結合する。別の態様において、抗原結合性タンパク質は、マウス、ラット、カニクイザル、およびヒトＰＡＲ−２に、類似の結合アフィニティで、特異的に結合する。別の態様において、抗原結合性タンパク質は、マウス、ラット、カニクイザル、およびヒトＰＡＲ−２のタンパク質分解的活性化の結合を遮断する。別の態様において、抗原結合性タンパク質は、Ｃａ２＋可動化アッセイにおいて、マウス、ラット、カニクイザル、およびヒトのＰＡＲ−２に対して、類似のＩＣ５０を有する。
【００７３】
当該技術分野に周知の方法を用いて、そして本明細書の解説にしたがって、ＰＡＲ−２に対する抗原結合性タンパク質の選択性を測定してもよい。例えば、ウェスタンブロット、ＦＡＣＳ、ＥＬＩＳＡまたはＲＩＡを用いて、選択性を測定してもよい。
【００７４】
別の側面において、本発明は、以下の特性：ヒトおよびネズミＰＡＲ−２の両方に結合する特性、ヒトＰＡＲ−２のタンパク質分解的活性化を阻害する特性、ネズミＰＡＲ−２のタンパク質分解的活性化を阻害する特性、ＰＡＲ−２のタンパク質分解的切断部位に、またはその近傍に結合する特性、細胞表面に発現されたＰＡＲ−２の下方制御を比較的少ししか引き起こさない特性の１以上を有する、ＰＡＲ−２結合性抗原結合性タンパク質（例えば、抗ＰＡＲ−２抗体）を提供する。
【００７５】
慣用的技術によって、本発明の抗原結合性タンパク質の抗原結合性断片を産生してもよい。こうした断片の例には、限定されるわけではないが、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片が含まれる。遺伝子操作技術によって産生される抗体断片および誘導体もまた意図される。
【００７６】
さらなる態様には、キメラ抗体、例えば非ヒト（例えばネズミ）モノクローナル抗体のヒト化型が含まれる。既知の技術によって、こうしたヒト化抗体を調製してもよく、そしてこうした抗体は、ヒトに投与された際、免疫原性が減少しているという利点を提供する。１つの態様において、ヒト化モノクローナル抗体は、ネズミ抗体の可変ドメイン（あるいはその抗原結合性部位のすべてまたは一部）およびヒト抗体由来の定常ドメインを含む。あるいは、ヒト化抗体断片は、ネズミモノクローナル抗体の抗原結合性部位およびヒト抗体由来の可変ドメイン断片（抗原結合性部位を欠く）を含んでもよい。キメラ抗体およびさらに操作されたモノクローナル抗体の産生法には、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら， １９８８， Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３， Ｌｉｕら， １９８７， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４：３４３９， Ｌａｒｒｉｃｋら， １９８９， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：９３４， およびＷｉｎｔｅｒら， １９９３， ＴＩＰＳ １４：１３９に記載されるものが含まれる。１つの態様において、キメラ抗体はＣＤＲ移植抗体である。抗体をヒト化するための技術は、例えば米国特許出願第１０／１９４，９７５号（２００３年２月２７日公開）、米国特許第５，８６９，６１９号、第５，２２５，５３９号、第５，８２１，３３７号、第５，８５９，２０５号、Ｐａｄｌａｎら， １９９５， ＦＡＳＥＢ Ｊ． ９：１３３−３９， およびＴａｍｕｒａら， ２０００， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６４：１４３２−４１に論じられる。
【００７７】
非ヒト動物において、ヒト抗体または部分的ヒト抗体を生成するための方法が開発されてきている。例えば、１以上の内因性免疫グロブリン遺伝子が、多様な手段によって不活性化されたマウスが用意されてきている。ヒト免疫グロブリン遺伝子が該マウスに導入され、不活性化されたマウス遺伝子が置換されている。該動物において産生される抗体は、動物に導入されたヒト遺伝物質にコードされるヒト免疫グロブリンポリペプチド鎖を取り込む。１つの態様において、ＰＡＲ−２ポリペプチドに対して向けられる抗体がトランスジェニックマウスなどの非ヒト動物において生成されるように、該動物をＰＡＲ−２ポリペプチドで免疫する。適切な免疫原の一例は、ＰＡＲ−２のタンパク質分解的切断部位を含むポリペプチドなどの可溶性ヒトＰＡＲ−２、または他の免疫原性断片ＰＡＲ−２である。適切な免疫原の別の例は、高レベルのＰＡＲ−２を発現している細胞、または該細胞に由来する細胞膜調製物である。
【００７８】
ヒト抗体または部分的ヒト抗体の産生用のトランスジェニック動物の産生および使用のための技術の例が、米国特許第５，８１４，３１８号、第５，５６９，８２５号、および第５，５４５，８０６号、Ｄａｖｉｓら， ２００３， “Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ，” Ｌｏ監修 Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ中， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， ＮＪ：１９１−２００， Ｋｅｌｌｅｒｍａｎｎら， ２００２， Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １３：５９３−９７， Ｒｕｓｓｅｌら， ２０００， Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ． ６８：１８２０−２６， Ｇａｌｌｏら， ２０００， Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎ． ３０：５３４−４０， Ｄａｖｉｓら， １９９９， Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ． １８：４２１−２５， Ｇｒｅｅｎ， １９９９， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ． ２３１：１１−２３， Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ， １９９８， Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ ３１：３３−４２， Ｇｒｅｅｎら， １９９８， Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ． １８８：４８３−９５， Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ Ａ， １９９８， Ｅｘｐ． Ｏｐｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． Ｄｒｕｇｓ． ７：６０７−１４， Ｔｓｕｄａら， １９９７， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ． ４２：４１３−２１， Ｍｅｎｄｅｚら， １９９７， Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ． １５：１４６−５６， Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ， １９９４， Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ． ４：７６１−６３， Ａｒｂｏｎｅｓら， １９９４， Ｉｍｍｕｎｉｔｙ． １：２４７−６０， Ｇｒｅｅｎら， １９９４， Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ． ７：１３−２１， Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら， １９９３， Ｎａｔｕｒｅ． ３６２：２５５−５８， Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら， １９９３， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． ９０：２５５１−５５． Ｃｈｅｎ， Ｊ．ら ｌｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ５：６４７−６５６， Ｃｈｏｉら， １９９３， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ４：１１７−２３， Ｆｉｓｈｗｉｌｄら， １９９６， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８４５−５１， Ｈａｒｄｉｎｇら， １９９５， Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ， Ｌｏｎｂｅｒｇら， １９９４， Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６−５９， Ｌｏｎｂｅｒｇ， １９９４， “Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ Ｈｕｍａｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ” Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ中 １１３：４９−１０１， Ｌｏｎｂｅｒｇら， １９９５， Ｉｎｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３：６５−９３， Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ， １９９６， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １４：８２６， Ｔａｙｌｏｒら， １９９２， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０：６２８７−９５， Ｔａｙｌｏｒら， １９９４， Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６：５７９−９１， Ｔｏｍｉｚｕｋａら， １９９７， Ｎａｔ Ｇｅｎ １６：１３３−４３， Ｔｏｍｉｚｕｋａら， ２０００， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９７： ７２２−２７， Ｔｕａｉｌｌｏｎら， １９９３， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０：３７２０−２４， およびＴｕａｉｌｌｏｎら， １９９４， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５２：２９１２−２０に記載される。これらの例および他の例はまた、米国特許出願公開２００７−００９８７１５、２００７年３月５日公開に論じられる。
【００７９】
別の側面において、本発明は、ＰＡＲ−２に結合するモノクローナル抗体を提供する。当該技術分野に知られる技術いずれかを用いて、例えば、免疫スケジュールの完了後に、トランスジェニック動物から採取した脾臓細胞を不死化することによって、モノクローナル抗体を産生してもよい。当該技術分野に知られる技術いずれかを用いて、例えば、骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを産生することによって、脾臓細胞を不死化してもよい。ハイブリドーマを産生する融合法で使用するための骨髄腫細胞は、好ましくは、非抗体産生性であり、高い融合効率を有し、そして所望の融合細胞（ハイブリドーマ）のみの増殖を支持する特定の選択培地中で増殖することが不可能であるようにする酵素不全を有する。マウス融合体で使用するのに適した細胞株の例には、Ｓｐ−２０、Ｐ３−Ｘ６３／Ａｇ８、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、ＮＳ１／１．Ａｇ ４ １、Ｓｐ２１０−Ａｇ１４、ＦＯ、ＮＳＯ／Ｕ、ＭＰＣ−１１、ＭＰＣ１１−Ｘ４５−ＧＴＧ １．７およびＳ１９４／５ＸＸ０ Ｂｕｌが含まれ；ラット融合体で使用する細胞株の例には、Ｒ２１０．ＲＣＹ３、Ｙ３−Ａｇ １．２．３、ＩＲ９８３Ｆおよび４Ｂ２１０が含まれる。細胞融合に有用な他の細胞株は、Ｕ−２６６、ＧＭ１５００−ＧＲＧ２、ＬＩＣＲ−ＬＯＮ−ＨＭｙ２およびＵＣ７２９−６である。
【００８０】
１つの態様において、動物（例えばヒト免疫グロブリン配列を有するトランスジェニック動物）をＰＡＲ−２免疫原で免疫し；免疫動物から脾臓細胞を採取し；採取した脾臓細胞を骨髄腫細胞株と融合させ、それによってハイブリドーマ細胞を生成し；ハイブリドーマ細胞からハイブリドーマ細胞株を樹立し、そしてＰＡＲ−２ポリペプチドに結合する抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定することによって、ハイブリドーマ細胞株を産生する。こうしたハイブリドーマ細胞株、およびこれらに産生される抗ＰＡＲ−２モノクローナル抗体が、本発明に含まれる。
【００８１】
当該技術分野に知られるいかなる技術を用いて、ハイブリドーマ細胞株に分泌されるモノクローナル抗体を精製してもよい。ハイブリドーマまたはｍＡｂをさらにスクリーニングして、ＰＡＲ−２が誘導する活性を遮断する能力などの、特定の特性を持つｍＡｂを同定してもよい。こうしたスクリーニングの例を以下の実施例に提供する。
【００８２】
また、遺伝子免疫と称されるプロセスを用いて、モノクローナル抗体を産生してもよい。例えば、ウイルスベクター（アデノウイルスベクターなど）内に、関心対象の抗原をコードする核酸を取り込んでもよい。次いで、生じたベクターを用いて、適切な宿主動物（例えば、非肥満糖尿病またはＮＯＤマウス）において、関心対象の抗原に対する免疫応答を発展させる。この技術は、Ｒｉｔｔｅｒら， Ｂｉｏｄｒｕｇｓ１６（１）：３−１０（２００２）に実質的に記載され、該文献の開示は本明細書に援用される。
【００８３】
抗体結合性部位の中央の相補性決定領域（ＣＤＲ）の分子進化もまた、増加したアフィニティを持つ抗体、例えばＳｃｈｉｅｒら， １９９６， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２６３：５５１に記載されるように、ｃ−ｅｒｂＢ−２に対して増加したアフィニティを有する抗体を単離するのに用いられてきている。したがって、こうした技術は、ＰＡＲ−２に対する抗体を調製する際に有用である。
【００８４】
ＰＡＲ−２に対して向けられる抗原結合性タンパク質は、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのいずれかで、ＰＡＲ−２ポリペプチドの存在を検出するアッセイにおいて使用可能である。抗原結合性タンパク質はまた、イムノアフィニティクロマトグラフィーによってＰＡＲ−２タンパク質を精製する際にも使用可能である。さらにＰＡＲ−２のタンパク質分解的活性化を遮断可能な抗原結合性タンパク質を用いて、こうした結合から生じる生物学的活性を阻害してもよい。遮断性抗原結合性タンパク質は、本発明の方法において使用可能である。ＰＡＲ−２アンタゴニストとして機能するこうした抗原結合性タンパク質は、限定されるわけではないが、炎症状態を含む、ＰＡＲ−２が誘導する状態のいずれかを治療する際に使用可能である。１つの態様において、こうした状態を治療する際に、トランスジェニックマウスの免疫を伴う方法によって生成されるヒト抗ＰＡＲ−２モノクローナル抗体を使用する。
【００８５】
抗原結合性タンパク質を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ法で使用するか、またはｉｎ ｖｉｖｏで投与して、ＰＡＲ−２が誘導する生物学的活性を阻害してもよい。このようにして、その例が本明細書に提供される、ＰＡＲ−２のタンパク質分解的活性化によって引き起こされるかまたは悪化させられる（直接または間接的に）障害を、治療してもよい。１つの態様において、本発明は、ＰＡＲ−２が誘導する生物学的活性を減少させるのに有効な量で、その必要がある哺乳動物に、ＰＡＲ−２遮断性抗原結合性タンパク質をｉｎ ｖｉｖｏ投与することを含む療法を提供する。
【００８６】
本発明の抗原結合性タンパク質には、ＰＡＲ−２の生物学的活性を阻害する、部分的ヒトおよび完全ヒト・モノクローナル抗体が含まれる。１つの態様は、ヒトＰＡＲ−２のタンパク質分解的活性化を少なくとも部分的に遮断する、ヒト・モノクローナル抗体に向けられる。１つの態様において、ＰＡＲ−２免疫原でトランスジェニックマウスを免疫することによって、抗体を生成する。別の態様において、免疫原は、ヒトＰＡＲ−２ポリペプチド（例えばＰＡＲ−２切断部位のすべてまたは一部を含む可溶性断片）である。こうした免疫マウスから得られるハイブリドーマ細胞株であって、ＰＡＲ−２に結合するモノクローナル抗体を分泌する、前記ハイブリドーマ細胞株もまた、本明細書に提供する。
【００８７】
ヒト抗体、部分的ヒト抗体、またはヒト化抗体は、多くの適用、特にヒト被験体への抗体の投与を伴うものに適切であろうが、特定の適用には、他の種類の抗原結合性タンパク質が適切であろう。本発明の非ヒト抗体は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ロバ、または非ヒト霊長類（サル（例えばカニクイザルまたはアカゲザル）または類人猿（例えばチンパンジー）など）などの抗体産生動物いずれに由来してもよい。本発明の非ヒト抗体を、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏおよび細胞培養に基づく適用、あるいは本発明の抗体に対する免疫応答が起こらないか、重要でないか、防止可能であるか、それに関する懸念がないか、またはそれが望ましい、他の適用いずれかにおいて、使用してもよい。１つの態様において、本発明の非ヒト抗体を、非ヒト被験体に投与する。別の態様において、非ヒト抗体は、非ヒト被験体において、免疫応答を誘発しない。別の態様において、非ヒト抗体は、非ヒト被験体と同じ種由来であり、例えば本発明のマウス抗体をマウスに投与する。特定の種由来の抗体を、例えば、その種の動物を所望の免疫原（例えば可溶性ＰＡＲ−２ポリペプチド）で免疫するか、またはその種の抗体を生成するための人工的系（例えば特定の種の抗体を生成するための細菌またはファージ・ディスプレイに基づく系）を用いることによって、あるいは例えば抗体の定常領域を他の種由来の定常領域で置換することにより、１つの種由来の抗体を別の種由来の抗体に変換することによって、あるいは他の種由来の抗体の配列により緊密に似るように、抗体の１以上のアミノ酸残基を置換することによって、作製してもよい。１つの態様において、抗体は、２以上の異なる種由来の抗体に由来するアミノ酸配列を含むキメラ抗体である。
【００８８】
いくつかの慣用的技術のいずれによって、抗原結合性タンパク質を調製してもよい。例えば、当該技術分野に知られる技術いずれかを用いて、天然に該タンパク質を発現する細胞から精製してもよいし（例えば抗体を産生するハイブリドーマから抗体を精製してもよい）、または組換え発現系で産生してもよい。例えば、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ： Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ， Ｋｅｎｎｅｔら（監修）， Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク（１９８０）；ならびにＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｄ（監修）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８８）を参照されたい。
【００８９】
当該技術分野に知られるいかなる発現系を用いて、本発明の組換えポリペプチドを作製してもよい。一般的に、所望のポリペプチドをコードするＤＮＡを含む組換え発現ベクターで、宿主細胞を形質転換する。使用可能な宿主細胞の中には、原核生物、酵母またはより高次の真核細胞がある。原核生物には、グラム陰性またはグラム陽性生物、例えば大腸菌またはバチルス（ｂａｃｉｌｌｉ）が含まれる。より高次の真核細胞には、昆虫細胞および哺乳動物起源の樹立細胞株が含まれる。適切な哺乳動物宿主細胞株の例には、サル腎臓細胞のＣＯＳ−７株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）（Ｇｌｕｚｍａｎら， １９８１， Ｃｅｌｌ ２３：１７５）、Ｌ細胞、２９３細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １０）細胞株、およびＭｃＭａｈａｎら， １９９１， ＥＭＢＯ Ｊ． １０：２８２１に記載されるような、アフリカミドリザル腎臓細胞株ＣＶ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）由来のＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞株が含まれる。細菌、真菌、酵母、および哺乳動物細胞宿主で使用するための適切なクローニングおよび発現ベクターが、Ｐｏｕｗｅｌｓら（Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， ニューヨーク， １９８５）に記載される。
【００９０】
ポリペプチドの発現を促進する条件下で形質転換細胞を培養し、そして慣用的なタンパク質精製法によってポリペプチドを回収してもよい。１つのこうした精製法には、例えば結合したＰＡＲ−２のすべてまたは一部（例えば細胞外ドメイン）を有するマトリックス上での、アフィニティクロマトグラフィーの使用が含まれる。本明細書において使用が意図されるポリペプチドには、混入する内因性物質を実質的に含まない、実質的に均質な組換え哺乳動物抗ＰＡＲ−２抗体ポリペプチドが含まれる。
【００９１】
いくつかの既知の技術のいずれによって、抗原結合性タンパク質を調製し、そして所望の特性に関してスクリーニングしてもよい。特定の技術は、関心対象の抗原結合性タンパク質（例えば抗ＰＡＲ−２抗体）のポリペプチド鎖（またはその一部）をコードする核酸を単離し、そして組換えＤＮＡ技術を通じて核酸を操作することを伴う。核酸を、関心対象の別の核酸に融合させるか、または改変して（例えば突然変異誘発または他の慣用的技術によって）、例えば、１以上のアミノ酸残基を付加するか、欠失させるか、または置換してもよい。
【００９２】
１つの側面において、本発明は、本発明の抗ＰＡＲ−２抗体の抗原結合性断片を提供する。こうした断片は、完全に抗体由来配列からなってもよいし、またはさらなる配列を含んでもよい。抗原結合性断片の例には、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体、ディアボディ、トリアボディ、テトラボディ、およびドメイン抗体が含まれる。他の例が、Ｌｕｎｄｅら， ２００２， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｔｒａｎｓ． ３０：５００−０６に提供される。
【００９３】
一本鎖抗体は、アミノ酸架橋（短いペプチド・リンカー）を介して、重鎖および軽鎖可変ドメイン（Ｆｖ領域）断片を連結して、単一ポリペプチド鎖を生じることによって形成してもよい。こうした一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は、２つの可変ドメイン・ポリペプチド（ＶＬおよびＶＨ）をコードするＤＮＡ間に、ペプチド・リンカーをコードするＤＮＡを融合させることによって、調製されてきている。２つの可変ドメイン間の柔軟なリンカーの長さに応じて、生じるポリペプチドは、それ自体、折り畳まれて、抗原結合性単量体を形成することも可能であるし、または多量体（例えば二量体、三量体、または四量体）を形成することも可能である（Ｋｏｒｔｔら， １９９７， Ｐｒｏｔ． Ｅｎｇ． １０：４２３； Ｋｏｒｔｔら， ２００１， Ｂｉｏｍｏｌ． Ｅｎｇ． １８：９５−１０８）。異なるＶＬおよびＶＨを含むポリペプチドを組み合わせることによって、異なるエピトープに結合する多量体ｓｃＦｖを形成することも可能である（Ｋｒｉａｎｇｋｕｍら， ２００１， Ｂｉｏｍｏｌ． Ｅｎｇ． １８：３１−４０）。一本鎖抗体産生のために開発された技術には、米国特許第４，９４６，７７８号； Ｂｉｒｄ， １９８８， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３； Ｈｕｓｔｏｎら， １９８８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：５８７９； Ｗａｒｄら， １９８９， Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５４４， ｄｅ Ｇｒａａｆら， ２００２， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． １７８：３７９−８７に記載されるものが含まれる。
【００９４】
本発明の抗原結合性タンパク質（例えば抗体、抗体断片、および抗体誘導体）は、当該技術分野に知られる定常領域いずれを含んでもよい。軽鎖定常領域は、例えば、カッパまたはラムダ型軽鎖定常領域、例えばヒト・カッパまたはラムダ型軽鎖定常領域であってもよい。重鎖定常領域は、例えば、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、またはミュー型重鎖定常領域、例えばヒト・アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、またはミュー型重鎖定常領域であってもよい。１つの態様において、軽鎖または重鎖定常領域は、天然存在定常領域の断片、誘導体、変異体、または突然変異タンパク質である。
【００９５】
関心対象の抗体から、異なるサブクラスまたはアイソタイプの抗体を得るための技術、すなわちサブクラス・スイッチングが知られる。したがって、例えば、ＩｇＭ抗体からＩｇＧ抗体を得ることも可能であり、そして逆も可能である。こうした技術は、所定の抗体（親抗体）の抗原結合特性を所持するが、親抗体のものと異なる抗体アイソタイプまたはサブクラスと関連する生物学的特性もまた示す、新規抗体の調製を可能にする。組換えＤＮＡ技術を使用してもよい。特定の抗体ポリペプチドをコードする、クローニングされたＤＮＡ、例えば所望のアイソタイプの抗体の定常ドメインをコードするＤＮＡを、こうした方法において使用してもよい。Ｌａｎｔｔｏら， ２００２， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．１７８：３０３−１６もまた参照されたい。さらに、ＩｇＧ４が望ましい場合、本明細書に援用される、Ｂｌｏｏｍら， １９９７， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６：４０７に記載されるようなヒンジ領域中の点突然変異（ＣＰＳＣＰ→ＣＰＰＣＰ）を導入して、ＩｇＧ４抗体における不均一性（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）を導きうる、Ｈ鎖内ジスルフィド結合を形成する傾向を軽減することが望ましい可能性もまたある。
【００９６】
さらに、異なる特性（すなわち結合する抗原に対する多様なアフィニティ）を有する抗原結合性タンパク質を得るための技術もまた知られる。鎖シャッフリングと呼ばれる１つのこうした技術は、糸状バクテリオファージの表面上に免疫グロブリン可変ドメイン遺伝子レパートリーをディスプレイすることを伴い、しばしばファージ・ディスプレイと呼ばれる。鎖シャッフリングは、Ｍａｒｋｓら， １９９２， ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １０：７７９に記載されるように、ハプテン２−フェニルオキサゾール−５−オンに対する高アフィニティ抗体を調製するのに用いられてきている。
【００９７】
特定の態様において、本発明の抗原結合性タンパク質は、ＰＡＲ−２に対して、少なくとも１０６の結合アフィニティ（Ｋａ）を有する。他の態様において、抗原結合性タンパク質は、少なくとも１０７、少なくとも１０８、少なくとも１０９、または少なくとも１０１０のＫａを示す。別の態様において、抗原結合性タンパク質は、本明細書において実施例に記載する抗体のものと実質的に同じＫａを示す。
【００９８】
別の態様において、本発明は、ＰＡＲ−２からの低い解離速度を有する抗原結合性タンパク質を提供する。１つの態様において、抗原結合性タンパク質は、１ｘ１０−４ｓ−１以下のＫｏｆｆを有する。別の態様において、Ｋｏｆｆは５ｘ１０−５ｓ−１以下である。別の態様において、Ｋｏｆｆは、本明細書において実施例に記載する抗体と実質的に同じである。別の態様において、抗原結合性タンパク質は、本明細書において実施例に記載する抗体と実質的に同じＫｏｆｆで、ＰＡＲ−２に結合する。
【００９９】
別の側面において、本発明は、ＰＡＲ−２の活性、例えばＣａ２＋可動化を阻害する抗原結合性タンパク質を提供する。１つの態様において、抗原結合性タンパク質は、１０００ｎＭ以下のＩＣ５０を有する。別の態様において、ＩＣ５０は１００ｎＭ以下であり；別の態様において、ＩＣ５０は１０ｎＭ以下である。別の態様において、ＩＣ５０は、本明細書において実施例に記載する抗体のものと実質的に同じである。別の態様において、抗原結合性タンパク質は、本明細書において実施例に記載する抗体と実質的に同じＩＣ５０で、ＰＡＲ−２の活性を阻害する。
【０１００】
別の態様において、本発明は、全長ＰＡＲ−２に結合し、そしてより少ない度合いで、切断されたＰＡＲ−２に結合する、抗原結合性タンパク質を提供する。多様な態様において、抗原結合性タンパク質は、切断されたＰＡＲ−２に結合するよりも、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、および９９．９％多く、全長ＰＡＲ−２に結合する。
【０１０１】
別の側面において、本発明は、ヒトＰＡＲ−２のプロテアーゼ切断部位に、またはその近傍に結合する抗原結合性タンパク質を提供する。１つの態様において、抗原結合性タンパク質は切断部位の下流に結合する（すなわち、全長およびアミノ末端一部切除ＰＡＲ−２−Ｆｃに結合する）；別の態様において、抗原結合性タンパク質は切断部位の上流に結合する（すなわち、全長ＰＡＲ−２／Ｆｃのみに結合する）。当該技術分野に知られるいかなる技術を用いて、プロテアーゼ切断部位に結合する抗原結合性タンパク質を作製してもよい。例えば、全長ＰＡＲ−２ポリペプチド（例えば膜に結合した調製物中）、ＰＡＲ−２の可溶性細胞外ドメイン断片、あるいはプロテアーゼ切断部位を含むかまたはプロテアーゼ切断部位からなるＰＡＲ−２細胞外ドメインのより小さい断片を用いて、こうした抗原結合性タンパク質を単離してもよい（これらの例を本明細書に提供する）。当該技術分野に知られるいかなる方法を用いて、こうして単離された抗原結合性タンパク質をスクリーニングして、その結合特異性を決定してもよい（これらの例を本明細書に提供する）。
【０１０２】
別の態様において、本発明は、ＰＡＲ−２への結合に関して、本明細書に開示する抗体と競合する抗原結合性タンパク質を提供する。当該技術分野に周知の方法によって、例えばウェスタンブロット（またはペプチドに基づく別のアッセイ）中のＰＡＲ−２／Ｆｃへの結合における競合によって、または本明細書に記載するようなＣａ２＋流動アッセイにおける競合によって、こうした競合能を決定してもよい。１つの側面において、ＰＡＲ−２への結合に関して、本明細書に開示する抗体と競合する抗原結合性タンパク質は、該抗体と同じエピトープに結合する。別の側面において、ＰＡＲ−２への結合に関して、本明細書に開示する抗体と競合する抗原結合性タンパク質は、ＰＡＲ−２のタンパク質分解的活性化を阻害する。
【０１０３】
別の側面において、本発明は、細胞表面上に発現されたヒトＰＡＲ−２に結合し、そしてこうして結合した際、細胞表面上のＰＡＲ−２の量の有意な減少を引き起こすことなく、細胞におけるＰＡＲ−２シグナル伝達活性を阻害する、抗原結合性タンパク質を提供する。細胞表面上および／または細胞内部のＰＡＲ−２の量を測定するかまたは概算するためのいかなる方法を用いてもよい。１つの態様において、本発明は、細胞表面上に発現されたヒトＰＡＲ−２のプロテアーゼ切断部位に、またはその近傍に結合し、そしてこうして結合した際、細胞表面からのＰＡＲ−２の内在化速度を有意に増加させることなく、細胞におけるＰＡＲ−２シグナル伝達活性を阻害する、抗原結合性タンパク質を提供する。他の態様において、ＰＡＲ−２発現細胞への抗原結合性タンパク質の結合は、細胞表面ＰＡＲ−２の約７５％、５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、５％、１％、または０．１％未満の内在化を引き起こす。
【０１０４】
別の側面において、本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで（例えばヒト被験体に投与した際）、少なくとも１日の半減期を有する抗原結合性タンパク質を提供する。１つの態様において、抗原結合性タンパク質は、少なくとも３日の半減期を有する。別の態様において、抗原結合性タンパク質は、４日以上の半減期を有する。別の態様において、抗原結合性タンパク質は、８日以上の半減期を有する。別の態様において、非誘導体化または非修飾抗原結合性タンパク質に比較した際、抗原結合性タンパク質が、より長い半減期を有するように、抗原結合性タンパク質を誘導体化するかまたは修飾する。別の態様において、抗原結合性タンパク質は、本明細書に援用される、２０００年２月２４日公開のＷＯ ００／０９５６０に記載されるような、血清半減期を増加させる１以上の点突然変異を含有する。
【０１０５】
本発明は、多重特異性抗原結合性タンパク質、例えば、二重特異性抗原結合性タンパク質、例えば、２つの異なる抗原結合性部位または領域を介して、ＰＡＲ−２の２つの異なるエピトープに、またはＰＡＲ−２のエピトープおよび別の分子のエピトープに結合する、抗原結合性タンパク質をさらに提供する。さらに、本明細書に開示するような二重特異性抗原結合性タンパク質は、他の刊行物に言及して、本明細書に記載するものを含めて、本明細書に記載する抗体の１つ由来のＰＡＲ−２結合性部位および本明細書に記載する別の抗体由来の第二のＰＡＲ−２結合領域を含むことも可能である。あるいは、二重特異性抗原結合性タンパク質は、本明細書に記載する抗体の１つに由来する抗原結合性部位、および当該技術分野に知られる別のＰＡＲ−２抗体由来、あるいは既知の方法または本明細書に記載する方法によって調製される抗体由来の第二の抗原結合性部位を含んでもよい。
【０１０６】
二重特異性抗体を調製する多くの方法が当該技術分野に知られ、そして２００１年４月２０日出願の米国特許出願０９／８３９，６３２（本明細書に援用される）に論じられる。こうした方法には、Ｍｉｌｓｔｅｉｎら， １９８３， Ｎａｔｕｒｅ ３０５：５３７、および他のもの（米国特許第４，４７４，８９３号、米国特許第６，１０６，８３３号）に記載されるようなハイブリッド−ハイブリドーマの使用、ならびに抗体断片の化学的カップリングの使用（Ｂｒｅｎｎａｎら，１９８５， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８１； Ｇｌｅｎｎｉｅら，１９８７， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３９：２３６７；米国特許第６，０１０，９０２号）が含まれる。さらに、例えばロイシンジッパー部分（すなわち、優先的にヘテロ二量体を形成する、ＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質由来のもの； Ｋｏｓｔｅｌｎｙら， １９９２， Ｊ． Ｉｍｍｎｏｌ． １４８：１５４７）または米国特許第５，５８２，９９６号に記載されるような、他の錠前および鍵の相互作用ドメイン構造を用いることによって、組換え手段を介して、二重特異性抗体を産生可能である。さらなる有用な技術には、Ｋｏｒｔｔら、１９９７、上記；米国特許第５，９５９，０８３号；および米国特許第５，８０７，７０６号に記載されるものが含まれる。
【０１０７】
別の側面において、本発明の抗原結合性タンパク質は、抗体の誘導体を含む。誘導体化抗体は、特定の使用における半減期増加など、抗体に望ましい特性を与える分子または物質いずれかを含んでもよい。誘導体化抗体は、例えば、検出可能（または標識）部分（例えば放射性、比色、抗原性または酵素性分子、検出可能ビーズ（磁気ビーズまたは電子密度が高い（ｅｌｅｃｔｒｏｄｅｎｓｅ）（例えば金）ビーズ）、または別の分子に結合する分子（例えばビオチンまたはストレプトアビジン））、療法または診断部分（例えば放射性、細胞傷害性、または薬学的活性部分）、あるいは特定の使用（例えばヒト被験体などの被験体への投与、あるいは他のｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ使用）のための抗体の適合性を増加させる分子を含むことも可能である。抗体を誘導体化するのに使用可能な分子の例には、アルブミン（例えばヒト血清アルブミン）およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれる。当該技術分野に周知の技術を用いて、抗体のアルブミン連結およびＰＥＧ化誘導体を調製することも可能である。１つの態様において、抗体をトランスサイレチン（ＴＴＲ）またはＴＴＲ変異体にコンジュゲート化するかまたは別の方式で連結させる。ＴＴＲまたはＴＴＲ変異体を、例えば、デキストラン、ポリ（ｎ−ビニルピロリドン（ｐｙｕｒｒｏｌｉｄｏｎｅ））、ポリエチレングリコール、プロプロピレン（ｐｒｏｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）グリコール・ホモ二量体、酸化ポリプロピレン／酸化エチレン・コポリマー、ポリオキシエチル化ポリオールおよびポリビニルアルコールからなる群より選択される化学薬品で化学的に修飾してもよい。米国特許出願第２００３０１９５１５４号。
【０１０８】
別の側面において、本発明は、本発明の抗原結合性タンパク質を用いて、ＰＡＲ−２に結合する分子に関してスクリーニングする方法を提供する。いかなる適切なスクリーニング技術を用いてもよい。１つの態様において、本発明の抗原結合性タンパク質が結合するＰＡＲ−２分子またはその断片を、本発明の抗原結合性タンパク質および別の分子と接触させ、ここで、他の分子が、ＰＡＲ−２への抗原結合性タンパク質の結合を減少させるならば、該分子はＰＡＲ−２に結合する。適切な方法いずれか、例えばＥＬＩＳＡを用いて、抗原結合性タンパク質の結合を検出してもよい。ＰＡＲ−２への抗原結合性タンパク質の結合の検出は、上に論じるように、抗原結合性タンパク質を検出可能に標識することによって、単純化可能である。別の態様において、ＰＡＲ−２結合性分子をさらに分析して、ＰＡＲ−２活性化および／またはシグナル伝達を該分子が阻害するかどうかを決定する。
【０１０９】
核酸
１つの側面において、本発明は、単離核酸分子を提供する。該核酸は、例えば、抗原結合性タンパク質のすべてまたは一部、例えば本発明の抗体の一方または両方の鎖、あるいはその断片、誘導体、突然変異タンパク質、または変異体をコードするポリヌクレオチド、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを同定するか、分析するか、突然変異させるかまたは増幅するための、ハイブリダイゼーション・プローブ、ＰＣＲプライマーまたは配列決定プライマーとして使用するのに十分なポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドの発現を阻害するためのアンチセンス核酸、および前述のものの相補配列を含む。核酸はいかなる長さであってもよい。これらは、例えば、長さ５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、７５０、１，０００、１，５００、３，０００、５，０００またはそれより長いヌクレオチドであってもよく、そして／または１以上のさらなる配列、例えば制御配列を含んでもよく、そして／またはより大きい核酸、例えばベクターの一部であってもよい。核酸は、一本鎖または二本鎖であってもよく、そしてＲＮＡおよび／またはＤＮＡヌクレオチド、ならびに人工的変異体（例えばペプチド核酸）を含んでもよい。
【０１１０】
抗体ポリペプチド（例えば重鎖または軽鎖、可変ドメインのみ、または全長）をコードする核酸を、ＰＡＲ−２で免疫されているマウスのＢ細胞から単離してもよい。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの慣用法によって、核酸を単離してもよい。
【０１１１】
本発明は、特定のハイブリダイゼーション条件下で、他の核酸にハイブリダイズする核酸をさらに提供する。核酸をハイブリダイズさせるための方法は当該技術分野に周知である。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， ニューヨーク（１９８９）， ６．３．１−６．３．６を参照されたい。本明細書に定義するように、中程度にストリンジェントなハイブリダーゼション条件は、５ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を含有する前洗浄溶液、約５０％ホルムアミド、６ｘＳＳＣのハイブリダイゼーション緩衝液、および５５℃のハイブリダイゼーション温度（または４２℃のハイブリダイゼーション温度を伴う、約５０％ホルムアミドを含有するものなどの他の同様のハイブリダイゼーション溶液）、ならびに約６０℃、０．５ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中の洗浄条件を使用する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、６ｘＳＳＣ、４５℃でハイブリダイズさせ、その後、０．１ｘＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ中、６８℃での１以上の洗浄が続く。さらに、当業者は、少なくとも６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８または９９％互いに同一であるヌクレオチド配列を含む核酸が、典型的には互いにハイブリダイズしたままであるように、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを増加させるかまたは減少させるように、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件を操作することも可能である。ハイブリダイゼーション条件の選択に影響を及ぼす基本的なパラメータおよび適切な条件を考案するための指針が、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｆｒｉｔｓｃｈ， およびＭａｎｉａｔｉｓ（１９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク州コールドスプリングハーバー， 第９章および第１１章；ならびにＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １９９５， Ａｕｓｕｂｅｌら監修， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， セクション２．１０および６．３−６．４）に示され、そして例えばＤＮＡの長さおよび／または塩基組成に基づいて、一般の当業者が容易に決定可能である。
【０１１２】
核酸内への突然変異によって変化を導入し、それによってコードするポリペプチド（例えば抗原結合性タンパク質）のアミノ酸配列の変化を導くことも可能である。当該技術分野に知られるいかなる技術を用いて、突然変異を導入してもよい。１つの態様において、例えば部位特異的突然変異誘発プロトコルを用いて、１以上の特定のアミノ酸残基を変化させる。別の態様において、例えばランダム突然変異誘発プロトコルを用いて、１以上のランダムに選択された残基を変化させる。どのように作製されても、突然変異体ポリペプチドを発現させ、そして所望の特性（例えば、ＰＡＲ−２への結合、またはＰＡＲ−２のタンパク質分解的活性化の遮断）に関してスクリーニングしてもよい。
【０１１３】
コードするポリペプチドの生物学的活性を有意に改変することなく、核酸内に突然変異を導入することも可能である。例えば、非必須アミノ酸残基でのアミノ酸置換を導くヌクレオチド置換を行ってもよい。１つの態様において、アミノ酸残基の１以上の欠失または置換を含むアミノ酸配列をコードするように、ヌクレオチド配列、あるいはその所望の断片、変異体、または誘導体を突然変異させる。別の態様において、突然変異誘発は、１以上のアミノ酸残基に隣接してアミノ酸を挿入する。あるいは、コードするポリペプチドの生物学的活性（例えば、ＰＡＲ−２の結合、ＰＡＲ−２のタンパク質分解的活性化の阻害など）を選択的に変化させる１以上の突然変異を核酸に導入してもよい。例えば、突然変異は、定量的にまたは定性的に、生物学的活性を変化させうる。定量的変化の例には、活性の増加、減少、または排除が含まれる。定性的変化の例には、抗原結合性タンパク質の抗原特異性を変化させることが含まれる。
【０１１４】
別の側面において、本発明は、本発明の核酸配列の検出のため、プライマーまたはハイブリダイゼーション・プローブとして使用するのに適した核酸分子を提供する。本発明の核酸分子は、本発明の全長ポリペプチドをコードする核酸配列の一部のみを含んでもよく、例えば、プローブまたはプライマーとして使用可能な断片、あるいは本発明のポリペプチドの活性部分（例えばＰＡＲ−２結合性部分）をコードする断片を含んでもよい。
【０１１５】
本発明の核酸の配列に基づくプローブを用いて、核酸または類似の核酸、例えば本発明のポリペプチドをコードする転写物を検出してもよい。プローブは、標識基、例えば放射性同位体、蛍光化合物、酵素、または酵素補因子を含んでもよい。こうしたプローブを用いて、ポリペプチドを発現する細胞を同定してもよい。
【０１１６】
別の側面において、本発明は、本発明のポリペプチドをコードする核酸またはその一部を含むベクターを提供する。ベクターの例には、限定されるわけではないが、プラスミド、ウイルスベクター、非エピソーム哺乳動物ベクターおよび発現ベクター、例えば組換え発現ベクターが含まれる。
【０１１７】
本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に適した型で、本発明の核酸を含むことも可能である。組換え発現ベクターには、発現に用いようとする宿主に基づいて選択される、発現させようとする核酸配列に機能可能であるように連結された、１以上の制御配列が含まれる。制御配列には、宿主細胞の多くの種類において、ヌクレオチド配列の恒常的発現を導くもの（例えばＳＶ４０初期遺伝子エンハンサー、ラウス肉腫ウイルスプロモーターおよびサイトメガロウイルスプロモーター）、特定の宿主細胞においてのみ、ヌクレオチド配列の発現を導くもの（例えば組織特異的制御配列、その全体が本明細書に援用される、Ｖｏｓｓら， １９８６， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ． １１：２８７， Ｍａｎｉａｔｉｓら， １９８７， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６：１２３７を参照されたい）、および特定の処理または条件に応答して、ヌクレオチド配列の誘導性発現を導くもの（例えば、哺乳動物細胞におけるメタロチオネインプロモーター、ならびに原核系および真核系の両方における、ｔｅｔ応答性および／またはストレプトマイシン応答性プロモーター（同文献を参照されたい））が含まれる。当業者は、発現ベクターの設計は、形質転換しようとする宿主細胞の選択、タンパク質の所望の発現レベル等の要因に応じうることを認識するであろう。本発明の発現ベクターを宿主細胞内に導入して、それによって本明細書に記載するような核酸にコードされる、融合タンパク質またはペプチドを含む、タンパク質またはペプチドを産生してもよい。
【０１１８】
別の側面において、本発明は、本発明の組換え発現ベクターが導入されている宿主細胞を提供する。宿主細胞は、いかなる原核細胞（例えば大腸菌）または真核細胞（例えば、酵母、昆虫、または哺乳動物細胞（例えばＣＨＯ細胞））であってもよい。慣用的な形質転換またはトランスフェクション技術を介して、原核または真核細胞内にベクターＤＮＡを導入してもよい。哺乳動物細胞の安定トランスフェクションのため、用いる発現ベクターおよびトランスフェクション技術に応じて、少ない割合の細胞のみが、ゲノム内に外来（ｆｏｒｅｉｇｎ）ＤＮＡを組み込みうることが知られる。これらの組込み体を同定し、そして選択するため、選択可能マーカー（例えば抗生物質に対する耐性に関するもの）をコードする遺伝子を、一般的に、関心対象の遺伝子とともに、宿主細胞内に導入する。好ましい選択可能マーカーには、Ｇ４１８、ハイグロマイシンおよびメトトレキセートなどの薬剤に対する耐性を与えるものが含まれる。導入された核酸で安定にトランスフェクションされた細胞を、他の方法の中でも、薬剤選択によって、同定してもよい（例えば選択可能マーカー遺伝子を取り込んだ細胞は生き残り、一方、他の細胞は死ぬであろう）。
【０１１９】
適応症
１つの側面において、本発明は被験体を治療する方法を提供する。該方法は、例えば、被験体に対して、一般的に健康によい効果を有することも可能であり、例えば被験体の予期される寿命を増加させることも可能である。あるいは、該方法は、例えば、疾患、障害、状態、または疾病（「状態」）を治療するか、防止するか、治癒させるか、軽減するか、または改善する（「治療する」）ことも可能である。本発明にしたがって治療すべき状態の中には、ＰＡＲ−２の不適切な発現または活性によって特徴付けられる状態がある。いくつかのこうした状態においては、発現または活性レベルがあまりにも高く、そして治療は、本明細書に記載するようなＰＡＲ−２アンタゴニストを投与することを含む。
【０１２０】
本発明の抗原結合性タンパク質で治療可能であるかまたは防止可能である特定の医学的状態および疾患には、胃腸系の炎症状態が含まれ、セリアック病、クローン病；潰瘍性結腸炎；特発性胃不全麻痺；慢性膵炎を含む膵炎；胃潰瘍および十二指腸潰瘍を含む炎症性腸疾患および潰瘍が含まれる。本発明の抗原結合性タンパク質はまた、喘息（外因性喘息および内因性喘息、ならびに関連する気道の慢性炎症性状態、または過敏症が含まれる）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ、すなわち慢性気管支炎、気腫）、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）、呼吸窮迫症候群、嚢胞性線維症、肺高血圧、肺血管収縮、急性肺傷害、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、過敏性肺炎、好酸球性肺炎、気管支炎、アレルギー性気管支炎気管支拡張症、結核、過敏性肺炎、職業性喘息、喘息様障害、類肉腫、反応性気道疾患（または機能不全）症候群、綿肺、間質性肺疾患、好酸球増加症候群、鼻炎、副鼻腔炎、および寄生虫性肺疾患、ウイルスが関与する状態（例えば呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）、ライノウイルス（ＲＶ）およびアデノウイルス）と関連する気道過敏等の、気道の炎症状態を治療するかまたは改善する際にも有用である。
【０１２１】
本発明の抗原結合性タンパク質で治療可能なリウマチ性障害には、成人および若年性関節リウマチ；強皮症；全身性エリテマトーデス；ループス様症候群；未分化結合組織疾患；通風；変形性関節症；リウマチ性多発筋痛症；強直性脊椎炎を含む血清陰性脊椎関節症、ならびにライター病、乾癬性関節炎および慢性ライム関節炎が含まれる。これらのポリペプチドでやはり治療可能であるかまたは防止可能であるのは、スティル病、および関節リウマチに関連するブドウ膜炎である。さらに、本発明のポリペプチド療法を、皮膚筋炎、封入体筋炎、多発性筋炎、およびリンパ脈管筋腫症を含む、随意筋および他の筋肉の炎症を生じる障害を治療する際に用いる。ギラン−バレー病、Ｉ型糖尿病、グレーブズ病、アジソン病、レイノー現象（レイノー病およびレイノー症候群を含む）、自己免疫肝炎、ＧＶＨＤ（移植片対宿主病）等を含むさらなる疾患もまた、本発明で治療可能である。
【０１２２】
本明細書記載の障害を、他のサイトカイン、サイトカイン阻害剤および試薬（本明細書において、免疫調節剤とも称される）と組み合わせて、本発明の抗原結合性タンパク質で治療してもよい。例えば、免疫調節剤には、可溶性ＩＬ−１８受容体、ＩＬ−１８またはＩＬ−１８受容体に対する抗体、ＩＬ−１８結合性タンパク質などの、ＩＬ−１８アンタゴニスト；ＥＮＢＲＥＬ（登録商標）を含むＴＮＦ阻害剤；Ｉ型ＩＬ−１Ｒ、ＩＩ型ＩＬ−１Ｒの可溶性型、ＩＬ−１に対する抗体、Ｉ型ＩＬ−１Ｒに対する抗体を含む、ＩＬ−１阻害剤；ならびにあるいは開示する医学的状態および疾患を治療する際に有効である他の活性剤が含まれる。
【０１２３】
本発明の組成物および／または方法はまた、例えば、美容的治療において、獣医学的治療において、寿命を増加させるため、生殖欠陥を治療するため、そして多様なＰＡＲ−２関連障害を治療するためにも使用可能である。さらに、特定のこうした状態において、ＰＡＲ−２の発現または活性レベルが非常に低く、そして治療は、ＰＡＲ−２アゴニストを投与する工程を含み；こうした治療もまた、本明細書に含まれる。
【０１２４】
抗原結合性タンパク質の療法および投与
本明細書に提供する特定の方法は、被験体にＰＡＲ−２結合性抗原結合性タンパク質を投与し、それによって、特定の状態において役割を果たす、ＰＡＲ−２が誘導する生物学的応答を減少させることを含む。特定の態様において、本発明の方法は、例えば、被験体への投与を介して、またはｅｘ ｖｉｖｏ法において、ＰＡＲ−２結合性抗原結合性タンパク質と、内因性ＰＡＲ−２を接触させることを伴う。
【０１２５】
用語「治療」は、障害の少なくとも１つの症状または他の側面の軽減または予防、あるいは疾患重症度の減少等を含む。抗原結合性タンパク質は、発展しうる療法剤を構成するために、完全な治癒を達成するか、あるいは疾患のすべての症状または徴候を根絶する必要はない。関連分野で認識されるように、療法剤として使用される薬剤は、所定の疾患状態の重症度を減少させることも可能であるが、有用な療法剤と見なされるために、疾患のすべての徴候を無効にする必要はない。同様に、予防的に投与される治療は、発展しうる予防剤を構成するために、状態の開始を防止する際に完全に有効である必要はない。単に疾患の影響を減少させる（例えば、症状の数または重症度を減少させることによって、あるいは別の治療の有効性を増加させることによって、あるいは別の有益な効果を生じることによって）か、あるいは疾患が被験体で生じるかまたは悪化する可能性を減少させれば十分である。本発明の１つの態様は、特定の障害の重症度を反映する指標のベースラインを超えた、持続する改善を誘導するのに十分な量および時間、患者にＰＡＲ−２アンタゴニストを投与することを含む方法に向けられる。
【０１２６】
関連分野で理解されるように、本発明の分子を含む薬学的組成物を、適応症に適した方式で、被験体に投与する。限定されるわけではないが、非経口、局所、または吸入によるものを含む、いかなる適切な技術によって、薬学的組成物を投与してもよい。注射する場合、薬学的組成物を、例えば、動脈内、静脈内、筋内、病巣内、腹腔内または皮下経路を介して、ボーラス注射によって、あるいは連続注入によって、投与してもよい。局在化投与、例えば疾患または傷害部位での投与が意図され、経皮送達および移植物からの持続放出も同様である。吸入による送達には、例えば、鼻または経口吸入、ネブライザーの使用、エアロゾル型でのアンタゴニストの吸入等が含まれる。他の代替物には、点眼剤；丸剤、シロップ、ロゼンジまたはチューインガムを含む経口調製物；ならびにローション、ジェル、スプレー、および軟膏などの局所調製物が含まれる。
【０１２７】
ｅｘ ｖｉｖｏ法での抗原結合性タンパク質の使用もまた意図される。例えば、患者の血液または他の体液を、ｅｘ ｖｉｖｏで、ＰＡＲ−２に結合する抗原結合性タンパク質と接触させてもよい。抗原結合性タンパク質を適切な不溶性マトリックスまたは固体支持体材料に結合させてもよい。
【０１２８】
好適には、抗原結合性タンパク質を、生理学的に許容しうるキャリアー、賦形剤または希釈剤などの１以上のさらなる構成要素を含む組成物の形で投与する。場合によって、組成物はさらに、１以上の生理学的活性剤、例えば第二の炎症または免疫阻害物質、抗血管形成物質、鎮痛性物質等を含み、その非排他的な例を本明細書に提供する。多様な特定の態様において、組成物は、ＰＡＲ−２結合性抗原結合性タンパク質に加えて、１、２、３、４、５、または６つの生理学的活性剤を含む。
【０１２９】
１つの態様において、薬学的組成物は、本発明の抗原結合性タンパク質を、緩衝剤、アスコルビン酸などの酸化防止剤、低分子量ポリペプチド（１０アミノ酸未満を有するものなど）、タンパク質、アミノ酸、グルコース、スクロースまたはデキストリンなどの炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレート剤、グルタチオン、安定化剤、ならびに賦形剤からなる群より選択される１以上の物質とともに、含む。中性緩衝生理食塩水または同種血清アルブミンと混合された生理食塩水が、適切な希釈剤の例である。適切な産業標準にしたがって、ベンジルアルコールなどの保存剤もまた添加してもよい。組成物は、適切な賦形剤溶液（例えばスクロース）を希釈剤として用いた凍結乾燥物として配合されてもよい。適切な構成要素は、使用する投薬量および濃度でレシピエントに非毒性である。薬学的配合物に使用可能な構成要素のさらなる例が、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， 第１６版（１９８０）および第２０版（２０００）， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， ペンシルバニア州イーストンに提示される。
【０１３０】
開業医が使用するためのキットには、本発明のＰＡＲ−２阻害物質、および本明細書に論じる状態いずれかを治療する際に使用するためのラベルまたは他の使用説明書が含まれる。１つの態様において、キットには、１以上のＰＡＲ−２結合性抗原結合性タンパク質の無菌調製物が含まれ、該調製物は、上に開示するような組成物の形であってもよく、そして１以上のバイアル中にあってもよい。
【０１３１】
投薬量および投与頻度は、投与経路、使用する特定の抗原結合性タンパク質、治療しようとする疾患の性質および重症度、状態が急性または慢性であるか、ならびに被験体のサイズおよび全身状態などの要因に応じて、多様でありうる。関連技術において知られる方法によって、例えば用量の段階的増大研究を伴いうる臨床試験において、適切な投薬量を決定してもよい。
【０１３２】
本発明のＰＡＲ−２阻害物質を、例えば１回または１回より多く、例えばある期間に渡って定期的な間隔で、投与してもよい。特定の態様において、抗原結合性タンパク質を、少なくとも１ヶ月以上、例えば１ヶ月、２ヶ月、または３ヶ月、あるいは無期限にさえ、投与する。慢性状態を治療するためには、一般的に、長期治療が最も有効である。しかし、急性状態を治療するため、より短い期間、例えば１〜６週間の投与で十分である可能性もある。一般的に、患者が、選択した単数または複数の指標に関して、ベースラインを超えた、医学的に適切な度合いの改善を示すまで、抗原結合性タンパク質を投与する。
【０１３３】
本発明の特定の態様は、１日あたり被験体の体重ｋｇあたり約１ｎｇ（「１ｎｇ／ｋｇ／日」）〜約１０ｍｇ／ｋｇ／日、より好ましくは、約５００ｎｇ／ｋｇ／日〜約５ｍｇ／ｋｇ／日、そして最も好ましくは、約５μｇ／ｋｇ／日〜約２ｍｇ／ｋｇ／日の抗原結合性タンパク質の投薬量で、抗原結合性タンパク質を被験体に投与することを伴う。さらなる態様において、抗原結合性タンパク質を、週あたり１回、週あたり２回、または週あたり３回以上、成人に投与して、ＰＡＲ−２が仲介する疾患、状態または障害、例えば本明細書に開示する医学的障害を治療する。注射した場合、成人用量あたりの抗原結合性タンパク質の有効量は、１〜２０ｍｇ／ｍ２の範囲であってもよく、そして好ましくは約５〜１２ｍｇ／ｍ２である。あるいは、一定の用量を投与してもよく；量は５〜１００ｍｇ／用量の範囲であってもよい。一定用量の１つの範囲は、用量あたり約２０〜３０ｍｇである。本発明の１つの態様において、２５ｍｇ／用量の一定用量を注射によって反復投与する。注射以外の投与経路を用いる場合、標準的医療行為にしたがって、用量を適切に調整する。療法措置の一例は、約２０〜３０ｍｇの抗原結合性タンパク質の用量を、少なくとも３週間の期間に渡って、週あたり１〜３回注射することを伴うが、望ましい度合いの改善を誘導するには、より長い期間に渡る治療が必要である可能性もある。小児被験体（４〜１７歳）に関しては、１つの例示的な適切な措置は、週あたり２または３回投与される、最大用量２５ｍｇまでの抗原結合性タンパク質の０．４ｍｇ／ｋｇの皮下注射を伴う。
【０１３４】
本明細書に提供する方法の特定の態様は、週あたり１回または２回の、０．５ｍｇ〜１０ｍｇ、好ましくは３〜５ｍｇの抗原結合性タンパク質の皮下注射を伴う。別の態様は、週あたり１回の３ｍｇ以上の抗原結合性タンパク質の肺投与（例えばネブライザーによる）に向けられる。
【０１３５】
本明細書に提供する療法措置の例は、ＰＡＲ−２シグナル伝達が役割を果たす状態を治療するため、週１回、１．５〜３ｍｇの用量の、抗原結合性タンパク質の皮下注射を含む。こうした状態の例を本明細書に提供し、そしてこうした状態には、例えば、先に記載するようなリウマチ性状態、ならびに過剰な炎症が役割を果たす他の状態（本明細書に記載する；例えば炎症性腸疾患、膵炎など）が含まれる。望ましい結果が達成されるまで、例えば被験体の症状が鎮まるまで、抗原結合性タンパク質の毎週の投与を続ける。必要に応じて治療を再開してもよいし、あるいは維持用量を投与してもよい。
【０１３６】
本明細書に提供する療法措置の他の例は、被験体の体重キログラムあたり、本発明のＰＡＲ−２阻害剤の１、３、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１５、または２０ミリグラム（ｍｇ／ｋｇ）の用量の皮下または静脈内投与を含む。用量を１回、または特定の間隔で１回より多く、例えば１日１回、週３回、週２回、週１回、月３回、月２回、月１回、２ヶ月ごとに１回、３ヶ月ごとに１回、６ヶ月ごとに１回、または年１回、被験体に投与してもよい。治療期間、および治療の用量および／または頻度に対するいかなる変化も、被験体の特定の必要性を満たすため、治療経過中に改変するかまたは変化させてもよい。
【０１３７】
別の態様において、治療中の障害の重症度を反映する少なくとも１つの指標において、改善、好ましくは持続する改善を誘導するのに十分な量および期間、抗原結合性タンパク質を被験体に投与する。治療の量および期間が十分であるかどうかを決定するため、被験体の疾病、疾患または状態の度合いを反映する多様な指標を評価してもよい。こうした指標には、例えば疾患重症度、症状、または問題の障害の徴候の臨床的に認識される指標が含まれる。１つの態様において、被験体が、２〜４週間離れた少なくとも２回の機会に、改善を示すならば、改善は持続していると見なされる。改善の度合いは、一般的に、医師によって決定され、医師は、徴候、症状、生検、または他の試験結果に基づいて、この決定を行うことも可能であり、そしてまた、所定の疾患に関して開発された、生活の質アンケートなど、被験体に行われるアンケートも使用してもよい。
【０１３８】
上昇したレベルのＰＡＲ−２および／またはＰＡＲ−２の活性化は、例えば、皮膚、関節、胃腸系および／または気道の炎症状態を含む、いくつかの障害と関連する。所定の障害を持つ被験体をスクリーニングして、ＰＡＲ−２活性化が上昇している個体を同定し、それによって、ＰＡＲ−２結合性抗原結合性タンパク質を用いた治療から最も利益を得る可能性がある被験体を同定してもよい。したがって、本明細書に提供する治療法は、場合によって、被験体のＰＡＲ−２活性化レベルを測定する第一の工程を含む。ＰＡＲ−２活性化が正常より高く上昇している被験体に、抗原結合性タンパク質を投与してもよい。
【０１３９】
抗原結合性タンパク質での治療前、治療中および／または治療後に、ＰＡＲ−２活性の被験体のレベルを監視して、あるとすればＰＡＲ−２活性の変化を検出してもよい。いくつかの障害に関して、ＰＡＲ−２活性上昇の発生率は、疾患のステージまたは疾患の特定の型などの要因に応じて、多様でありうる。例えば被験体血清、血液または組織試料における、ＰＡＲ−２活性を測定するため、既知の技術を使用してもよい。適切な技術いずれかを用いて、ＰＡＲ−２活性を測定してもよい。
【０１４０】
本発明の方法および組成物の特定の態様は、抗原結合性タンパク質および１以上のさらなるＰＡＲ−２アンタゴニスト、例えば２以上の本発明の抗原結合性タンパク質、または本発明の抗原結合性タンパク質および１以上の他のＰＡＲ−２アンタゴニストの使用を伴う。さらなる態様において、抗原結合性タンパク質を単独で、または患者が罹患している状態を治療するのに有用な他の剤と組み合わせて、投与する。こうした剤の例には、タンパク質性薬剤および非タンパク質性薬剤の両方が含まれる。多数の療法剤を共投与する場合、投薬量は、関連技術分野に認識されるように、適宜、調整可能である。「同時投与」および併用療法は、同時の投与に限定されず、患者に少なくとも１つの他の療法剤を投与することを伴う治療の経過中、抗原結合性タンパク質を少なくとも１回投与する治療措置もまた含まれる。
【０１４１】
抗原結合性タンパク質と同時投与してもよい他の剤の例は、治療しようとする特定の状態にしたがって選択される、他の抗原結合性タンパク質または療法ポリペプチドである。あるいは、上に論じる特定の状態の１つを治療する際に有用な非タンパク質性薬剤を、ＰＡＲ−２アンタゴニストと同時投与してもよい。
【０１４２】
併用療法
別の側面において、本発明は、ＰＡＲ−２阻害性抗原結合性タンパク質および１以上の他の治療で、被験体を治療する方法を提供する。１つの態様において、こうした併用療法は、例えば腫瘍の多数の部位または分子ターゲットを攻撃することによって、相乗効果または付加的効果を達成する。本発明と関連して使用可能な併用療法の種類には、単一の疾患関連経路、ターゲット細胞における多数の経路、およびターゲット組織内の多数の細胞種における多数のノードを阻害するかまたは活性化する（適切なように）ことが含まれる。
【０１４３】
別の態様において、併用療法は、被験体に、本明細書記載の２、３、４、５、６、またはそれより多いＰＡＲ−２アゴニストまたはアンタゴニストを投与することを含む。別の態様において、方法は、ＰＡＲ−２が仲介するシグナル伝達を、一緒に阻害するかまたは活性化する（直接または間接的に）、２以上の治療を被験体に投与することを含む。こうした方法の例には、２以上のＰＡＲ−２阻害性抗原結合性タンパク質の併用、ＰＡＲ−２阻害性抗原結合性タンパク質および抗炎症特性を有する１以上の他の療法部分（例えば非ステロイド性抗炎症剤、ステロイド、および／または免疫調節剤）、またはＰＡＲ−２阻害性抗原結合性タンパク質および１以上の他の治療（例えば手術、超音波、または炎症を減少させるのに有効な治療）の併用が含まれる。さらに、１以上の抗ＰＡＲ−２抗体または抗体誘導体を、１以上の分子または他の治療と併用してもよく、ここで、他の分子（単数または複数）および／または治療（単数または複数）は、直接ＰＡＲ−２に結合せず、また影響を及ぼさないが、治療中の状態を治療するかまたは防止するために、併用が有効である。１つの態様において、１以上の分子（単数または複数）および／または治療（単数または複数）は、療法の経過中に、１以上の他の分子（単数または複数）または治療（単数または複数）によって引き起こされる状態、例えば吐き気、疲労、脱毛症、悪液質、不眠症などを治療するかまたは防止する。分子および／または他の治療を併用するすべての場合で、有効である、いかなる順序で、いかなる長さの期間に渡って、例えば同時に、連続して、または交互に、個々の分子（単数または複数）および／または治療（単数または複数）を投与してもよい。１つの態様において、治療法は、第二の治療経過が始まる前に、１つの分子または他の治療での第一の治療経過を完了することを含む。第一の治療経過終了および第二の治療経過開始の間の時間の長さは、全療法経過が有効であることを可能にするいかなる長さであってもよく、例えば秒、分、時間、日、週、月、または年でさえあってもよい。
【０１４４】
別の態様において、方法は、本明細書記載の１以上のＰＡＲ−２アンタゴニストおよび１以上の他の治療（例えば療法または苦痛軽減治療）を投与することを含む。方法が１より多い治療を被験体に投与することを含む場合、投与の順序、時期、回数、濃度、および体積は、治療の医学的必要性および限界によってのみ限定され、すなわち、２つの治療を、例えば同時に、連続して、交互に、またはいかなる他の措置にしたがって、被験体に投与してもよいことが理解されるものとする。
【０１４５】
実際の実施例および予言的実施例の両方の以下の実施例を、本発明の特定の態様または特徴を例示する目的のために提供し、そして該実施例は、本発明の範囲を限定しない。
【実施例】
【０１４６】
実施例１：モノクローナル抗体の調製
可溶性ＰＡＲ−２ペプチド（コンジュゲート化を促進するためにさらなるＣ末端システイン残基を有し、マレイミド活性化キーホールリンペット（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ）・ヘモシアニン［ＫＬＨ；例えばＰｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｉｎｃ．、イリノイ州ロックフォードから入手可能］にコンジュゲート化された、ＰＡＲ−２のループ１ペプチド（ＴＮＲＳＳＫＧＲＳＬＩＧＫＶＤＧＴＳ；配列番号２のアミノ酸２９〜４６）、ＰＡＲ−２／Ｆｃ融合タンパク質、および細胞に結合したＰＡＲ−２（例えば配列番号２のポリペプチドをコードするヒト全長ＰＡＲ−２ ｃＤＮＡでＣＨＯ細胞をトランスフェクションすることによって得られうる、細胞表面にヒトＰＡＲ−２を発現するＣＨＯトランスフェクタント）を含むＰＡＲ−２抗原の１以上の適切な型、またはその組み合わせを用いて、免疫を行う。
【０１４７】
その開示が本明細書に援用される、米国特許出願第０８／７５９，６２０号、１９９６年１２月３日出願、ならびに国際特許出願第ＷＯ ９８／２４８９３号、１９９８年６月１１日公開および第ＷＯ／００／７６３１０号、２０００年１２月２１日公開に開示される方法にしたがって、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅＴＭにおいて、初回免疫に適した量の免疫原（すなわち１０マイクログラム／マウスの可溶性ＰＡＲ−２または３ｘ１０６細胞／マウスのトランスフェクションＣＨＯ細胞）を用いる。初回免疫後、免疫原の続くブースト免疫（５μｇ／マウスの可溶性ＰＡＲ−２または１．５ｘ１０６ ＰＡＲ−２トランスフェクション細胞／マウス）を、スケジュール通りに、そしてマウスにおいて、適切な力価の抗ＰＡＲ−２抗体を誘導するのに必要な期間、投与する。任意の適切な方法、例えば酵素イムノアッセイまたは蛍光活性化細胞分取によって、あるいは他の方法（これらの組み合わせを含む）によって、力価を決定する。
【０１４８】
適切な力価を示す動物を同定し、そして流入領域リンパ節からリンパ球を得て、そして必要であれば、各コホートに関してプールする。適切な培地（例えばダルベッコの修飾イーグル培地；ＤＭＥＭ； Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッドより入手可能）中ですりつぶしてリンパ組織から細胞を遊離させることによって、リンパ球をリンパ組織から解離させ、そしてＤＭＥＭ中に懸濁してもよい。適切な方法を用いて、Ｂ細胞を選択し、そして／または増殖させ、そして適切な融合パートナー、例えば非分泌性骨髄腫Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ＣＲＬ １５８０； Ｋｅａｒｎｅｙら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １２３， １９７９， １５４８−１５５０）と融合させる。
【０１４９】
１つの適切な融合法において、１：４の比で、リンパ球を融合パートナー細胞と混合する。細胞混合物を、４００ｘｇで４分間遠心分離することによって穏やかにペレットにし、上清をデカントし、そして細胞混合物を穏やかに（例えば、１ｍｌピペットを用いることによって）混合する。ＰＥＧ／ＤＭＳＯ（ポリエチレングリコール／ジメチルスルホキシド； Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ， ミズーリ州セントルイス； １００万のリンパ球あたり１ｍｌ）で融合を誘導する。穏やかに攪拌しながら、１分間に渡ってＰＥＧ／ＤＭＳＯをゆっくりと添加し、その後、１分間混合する。次いで、穏やかに攪拌しながら、２分間に渡ってＩＤＭＥＭ（グルタミンを含まないＤＭＥＭ； １００万のＢ細胞あたり２ｍｌ）を添加し、その後、３分間に渡ってさらなるＩＤＭＥＭ（１００万のＢ細胞あたり８ｍｌ）を添加する。
【０１５０】
融合した細胞を穏やかにペレットにし（４００ｘｇ、６分間）、そして１００万のＢ細胞あたり２０ｍｌの選択培地（例えばアザセリンおよびヒポキサンチン［ＨＡ］ならびに必要に応じて他の補充物質を含有するＤＭＥＭ）中に再懸濁する。細胞を３７℃で２０〜３０分間インキュベーションし、そして次いで、２００ｍｌ選択培地中に再懸濁し、そして９６ウェルにプレーティングする前に、Ｔ１７５フラスコ中で３〜４日間培養する。
【０１５１】
標準的技術を用いて、細胞を９６ウェルプレートに分配して、生じるコロニーのクローン性を最大限にする。数日間培養した後、上清を収集し、そして以下の実施例に詳述するような、ヒトＰＡＲ−２への結合の確認、他種ＰＡＲ−２（例えば、カニクイザルおよび／またはネズミＰＡＲ−２）との交差反応性の評価、切断対非切断ＰＡＲ−２への結合、およびＰＡＲ−２のタンパク質分解的活性化を阻害する能力を含む、スクリーニングアッセイに供する。陽性細胞をさらに選択し、そして標準的クローニングおよびサブクローニング技術に供する。クローン株をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで増殖させ、そして分析のため、分泌されたヒト抗体を得る。
【０１５２】
こうして生成したハイブリドーマクローンを、ＰＡＲ−２との反応性に関してスクリーニングする。ハイブリドーマ上清の最初のスクリーニングは、ペプチドＥＬＩＳＡ、全細胞ＥＬＩＳＡ、および／またはハイスループットスクリーニングに適した、細胞に基づくアッセイ（Ｆｉｓｃｅｌｌａら， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２１：３０２−３０７； ２００３に実質的に記載されるような、蛍光分析微量アッセイ技術またはＦＭＡＴ）を利用してもよい。このスクリーニング法で陽性であるハイブリドーマをさらに培養して、より多量の抗体を提供してもよく、次いで、以下に記載するようにこれを精製して、そして細胞に基づくさらなるアッセイ（単数または複数）（例えば、Ｌｅ Ｐｏｕｌら， Ｊ． Ｂｉｏｍｏｌ． Ｓｃｒｅｅｎ．７（１）：５７−６５； ２００２に実質的に記載されるような、Ｃａ２＋感受性光タンパク質であるアポエクオリン、およびＰＡＲ−２を同時発現している細胞を用いた、フラッシュプレートアッセイ）、あるいはＳ． Ｐｉｔｃｈｆｏｒｄ， Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｎｅｗｓ 第１８巻， 第１５号（１９９８）および／またはＳｕｌｌｉｖａｎら， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ． １１４， ｐｐ１２５−１３３（１９９９）に実質的に記載されるような、細胞内Ｃａ２＋レベルの変化を決定するのに用いられる、蛍光分析画像化プレート読取り装置（ＦＬＩＰＲ）アッセイによってスクリーニングしてもよく、これらの文献は、本明細書に援用される。
【０１５３】
この方式において、およそ２〜２．５ヶ月の期間に渡って、全部で１９または２０回の免疫のため、可溶性ＰＡＲ−２、ＰＡＲ−２発現細胞またはＰＡＲ−２／Ｆｃタンパク質のいずれかでマウスを免疫し；ＰＡＲ−２特異的抗体を分泌するいくつかの細胞株を得て、そして抗体をさらに性質決定した。その配列を配列表に提示し、そして以下の表１に要約し、そしてこれらの抗体を用いた多様な試験の結果を本明細書に示す。当業者は、フレームワークおよび相補性決定領域間の境界が多様でありうることを認識し；例えば、軽鎖ＦＲ１のアミノ酸２２は、いくつかの場合、ＣＤＲ１の一部と見なされうるなどである。さらに、いくつかの番号付け系は、重鎖のＣＤＲ３およびＦＲ４をＪ領域と称し、そしてＦＲ３およびＣＤＲ３の間にＤ領域を含みうる。したがって、以下に示す領域の番号付けは、１〜５アミノ酸異なる可能性もある。
【０１５４】
表１
【０１５５】
【表１】
【０１５６】
実施例２：スクリーニングのための抗ＰＡＲ−２ハイブリドーマ抗体の精製
ハイブリドーマ細胞を、約３５ｍｌのハイブリドーマ上清液の試料を得る期間および条件下で培養する。適切な方法を用いて、例えばプロテインＡを用いて、モノクローナル抗体を精製する。各試料に、１２ｍｌの４ｘプロテインＡ結合緩衝液（１．６Ｍクエン酸、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ９．１５）およびＭａｂＳｅｌｅｃｔＴＭ培地（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）の６７％スラリー約３００μｌを添加する。生じたスラリーを４℃で一晩、穏やかに回転させる。
【０１５７】
一晩インキュベーションした後、試料を、例えば、Ｇ３．８遠心分離装置ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、カリフォルニア州フラートン）中、４℃、２，０００ＲＰＭで５分間、ブレーキを掛けずに遠心分離して、樹脂およびそれに結合したモノクローナル抗体を沈降させる。約３００μｌを除いて上清液をすべて取り除き、そして樹脂を再懸濁して、濃縮スラリーを形成する。
【０１５８】
濃縮スラリーを微量遠心管に移し、そして十分な１ｘプロテインＡ結合緩衝液（４００ｍＭクエン酸、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．９）を添加して、最終体積を約１ｍｌにする。スラリーを再懸濁し、次いで、約１４，０００ｇで５秒間遠心分離する。生じたペレットから上清液を取り除き、同様の方式で（すなわち約１ｍｌの１ｘプロテインＡ結合緩衝液中に再懸濁し、遠心分離し、上清を取り除き、そして新鮮な緩衝液中に再懸濁することによって）、全部で３回洗浄する。
【０１５９】
３回洗浄した後、ペレットを４００μｌ溶出緩衝液（２００ｍＭギ酸）中に再懸濁し、そして室温で１０分間攪拌し、次いで１４，０００ｇで５秒間遠心分離する。上清を溶出液として注意深く取り除き、そして全部で３回の溶出サイクルのため、上述のものと類似の方式で、ペレットを再び溶出させる。３回の溶出サイクルからの溶出液を合わせて、室温で、１４，０００ｇで５分間遠心分離して、そして新鮮な試験管に移す。２Ｍのｔｒｉｓ塩基（２３５ｍＭｆ）を添加し、そして迅速に混合することによって、ｐＨを７．８〜８．２に調整する。試料を、室温で、１４，０００ｇで５分間、再び遠心分離し、そしてｐＨシフト可溶物と称する。各試料（２０μｌの試料を７００μｌの水に添加することによって希釈）のスペクトルスキャンを２５０〜３５０ｎｍで行い、そして適切な抗体標準とともに、還元４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に、各０．５μｇの抗体含有試料を装填することによって、タンパク質濃度を検証する。
【０１６０】
実施例３：ＰＡＲ−２／Ｆｃポリペプチドの精製
Ｎ末端ＰＡＲ−２／Ｆｃポリペプチド（配列番号６）をＣＨＯ細胞などの適切な哺乳動物細胞中で発現させる。血清不含培地中で培養したＣＨＯ発現細胞からの発現上清は、活性化Ａｒｇ−Ｓｅｒ結合でＰＡＲ−２／Ｆｃを切断する、ＣＨＯ細胞トリプシン様セリンプロテアーゼを含有し、ＰＡＲ−２／Ｆｃポリペプチドの「切り取り」型を生じる。１０％ウシ胎児血清（ＣＨＯ細胞トリプシン様セリンプロテアーゼの濃度よりはるかに過剰な濃度の、正常レベルの血漿プロテイナーゼ阻害剤を含有する）中で培養したＣＨＯ発現細胞は、培養上清中、Ｎ末端非切断ＰＡＲ−２／Ｆｃを発現する。Ｆｃ領域を含むタンパク質の単離および精製に適した方法を用いて（例えば、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ， ニュージャージー州ピスカタウェイのＭａｂＳｅｌｅｃｔＴＭ樹脂系を用いて）、切り取りおよび非切断タンパク質の両方を精製する。必要に応じて、アミノ末端配列分析（エドマン分解）、サイズ排除クロマトグラフィー、吸光度スペクトルスキャン、および質量分析によって、生じた精製Ｆｃ構築物を分析する。
【０１６１】
適切な精製系の一例において、ＰＡＲ−２／Ｆｃを含有する馴化培地を、６ｍｌ／分および７℃で、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅの１０ｍｌプロテインＡ ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ ＨｉＴｒａｐカラム上に装填する。二価陽イオンを含まない数カラム体積のダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水でカラムを洗浄し、そして次いで、ｐＨ３．０の１００ｍＭグリシンで溶出させる。溶出したタンパク質をＴｒｉｓ緩衝液中で希釈し、そして１Ｍ Ｈ３ＰＯ４でｐＨを７．０に調整する。次いで、溶出液を、Ｓ緩衝液Ａ（２０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．０）中、５ｍｌ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＳＰ−ＨＰ ＨｉＴｒａｐカラム上に５ｍｌ／分および７℃で装填する。数カラム体積のＳ緩衝液Ａでカラムを洗浄した後、５ｍｌ／分および７℃で、２０カラム体積の４０％ Ｓ緩衝液Ｂ（２０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）への直線勾配で溶出させ、その後、１００％Ｓ緩衝液Ｂの工程が続いた。クーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分画を分析し、そしてプールしてもよい。０．２２μｍ酢酸セルロース・フィルターを通じて、プールした分画をろ過し；そして計算分子量３０，２２６および計算吸光計数３５，４１０Ｍ−１ｃｍ−１を用いて、試料に対してスペクトル・スキャンを行ってもよい。プールした物質を濃縮し（例えば、室温でＰａｌｌ Ｍａｃｒｏｓｅｐ（登録商標）１０ｋＤａ膜を用い、その後、０．２２μｍ酢酸セルロース・フィルターを通じてろ過することによる）；別のスペクトル・スキャンを行って、濃縮を検証してもよい。次いで、クーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜２０％ １．０ｍｍ ｔｒｉｓ−グリシン・ゲル）および５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．９中で、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｘ Ｂｉｏｓｅｐ ３０００カラム（７．８ｘ３００ｍｍ）を用いたＳＥ−ＨＰＬＣによって、最終産物を分析してもよい。
【０１６２】
実施例４：ＰＡＲ−２／Ｆｃ：ＦＬＡＧ（登録商標）／Ｆｃヘテロ二量体の発現および精製
ヘテロ二量体ＰＡＲ−２／Ｆｃ：ＦＬＡＧ（登録商標）／Ｆｃタンパク質を発現させ、そして精製して、ＰＡＲ−２に対する抗体のアビディティおよびアフィニティの分析を容易にする。適切な細胞、例えば哺乳動物細胞またはＨＥＫ２９３細胞などのヒト細胞を、ＰＡＲ−２／Ｆｃをコードする核酸（配列番号５）およびＦＬＡＧ（登録商標）／Ｆｃをコードする核酸（配列番号４３）で同時トランスフェクションする。適切な条件下で（例えば低ＩｇＧ血清を含有する培地中で）トランスフェクション細胞を培養すると、ホモ二量体ＰＡＲ−２／Ｆｃ、ホモ二量体ＦＬＡＧ（登録商標）／Ｆｃおよびヘテロ二量体ＰＡＲ−２／Ｆｃ：ＦＬＡＧ（登録商標）／Ｆｃタンパク質が発現する。後者は、実質的に以下に記載するように、連続精製工程によって得られる。
【０１６３】
適切な精製系の一例において、ＰＡＲ−２／Ｆｃ：ＦＬＡＧ（登録商標）／Ｆｃを含有する馴化培地を、ＰＡＲ−２／Ｆｃに関して先に記載する方法に類似の、Ｆｃタンパク質の精製を促進する精製法に供する。簡潔には、プロテインＡにＦｃが結合するのを可能にする条件下で、馴化培地をプロテインＡカラム上に装填する。カラムを数カラム体積のＰＢＳで洗浄し、そして次いで、低ｐＨで溶出させる。溶出したタンパク質を希釈し、そしてイオン交換クロマトグラフィーによってさらに精製する（例えば、Ｓ緩衝液Ａ（２０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．０）中のＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＳＰ ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ−高性能カラムを用いて、これを数カラム体積のＳ緩衝液で洗浄し、そして５ｍｌ／分で１〜２０％の２０カラム体積直線勾配および２０〜５０％ Ｓ緩衝液Ｂ（２０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）の２０カラム体積直線勾配で溶出させ、その後、１００％ Ｓ緩衝液Ｂの工程が続く）。
【０１６４】
クーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分画を分析し、そして所望の産物の大部分を含有する分画をプールする。次いで、プールした物質を抗ＦＬＡＧ（登録商標）Ｍ２アフィニティゲル（Ｓｉｇｍａ Ａ２２２０； Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ， ミズーリ州セントルイス）と一晩インキュベーションする。次いで、樹脂をＴｒｉｓ緩衝生理食塩水で洗浄し、そして１００ｍＭ ＨＯＡＣ、ｐＨ３．５で溶出させる。１Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ８．０で、最終プールをｐＨ７．０に中和する。
【０１６５】
任意の所望の時点で、０．２２μｍ酢酸セルロース・フィルターを通じて物質をろ過してもよく；計算分子量３０，２２６および計算吸光計数３５，４１０Ｍ−１ｃｍ−１を用いて、試料に対してスペクトル・スキャンを行ってもよい。望ましい場合、最終プール物質を濃縮してもよく（例えば、室温でＰａｌｌ Ｍａｃｒｏｓｅｐ（登録商標）１０ｋＤａ膜を用い、その後、０．２２μｍ酢酸セルロース・フィルターを通じてろ過することによる）；別のスペクトル・スキャンを行って、濃縮を検証してもよい。次いで、クーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜２０％ １．０ｍｍ ｔｒｉｓ−グリシン・ゲル）および５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．９中で、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｘ Ｂｉｏｓｅｐ ３０００カラム（７．８ｘ３００ｍｍ）を用いたＳＥ−ＨＰＬＣによって、最終産物を分析してもよい。
【０１６６】
Ｎ末端アミノ酸配列決定を用いて、この方式で精製した物質がＰＡＲ−２／Ｆｃ：ＦＬＡＧ（登録商標）／Ｆｃヘテロ二量体を含有することを検証した。２つの配列を検出した：ＴＩＱＧＴＮＲＳＳＫＧ（配列番号２のアミノ酸２５〜３５に対応する）、およびＤＤＹＫＤＤＤＤ（配列番号７に対応する）。２つのペプチドの比は１に近かった。クーマシー染色およびＳＥＣ分析によって、物質がＰＡＲ−２／Ｆｃ：ＦＬＡＧ（登録商標）／Ｆｃヘテロ二量体タンパク質であることが確認され、ホモ二量体タンパク質は検出不能なレベルであった。
【０１６７】
実施例５：ウェスタンブロットによるＰＡＲ−２抗体の分析
非切断対切断ＰＡＲ−２への結合を分析するため、多様な量の精製非切断およびＮ末端切り取りＰＡＲ２−Ｆｃを、Ｔｒｉｓ−グリシン緩衝系において、８〜１６％ポリアクリルアミド勾配ゲル（Ｎｏｖｅｘゲル、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥに供する。分子量同定のため、Ｓｅｅ Ｂｌｕｅ標準（Ｎｏｖｅｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有するゲルレーンもまた含む。電気泳動後、Ｎｏｖｅｘ ＸＣｅｌｌ ＩＩブロット・モジュール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、ニトロセルロース膜上に、タンパク質をゲルからトランスファーする。膜を１：１のＯｄｙｓｓｅｙブロッキング緩衝液、ＯＢＢ（ＬＩ−ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）：ＴＢＳ（Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水）で、振盪しながら４℃で一晩ブロッキングする。分析しようとする抗体を、１：１ ＯＢＢ：ＴＢＳ中、所望の最終濃度に室温で１時間希釈する。ＴＢＳ中の０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で膜を徹底的に洗浄する（〜１時間にわたって、１００ｍｌを３〜４回交換）。次いで、１：１（ＯＢＢ：ＴＢＳ）中で１：５０００に希釈した、適切な二次抗体−Ａｌｅｘａ６８０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）コンジュゲート（ヤギ抗ウサギＩｇＧ、またはヤギ抗マウスＩｇＧ）に膜を曝露する。上述のように膜を洗浄し、そして望ましい場合、ＬＩ−ＣＯＲ Ｏｄｙｓｓｅｙ赤外線撮像系（ＬＩ−ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて分析する。
【０１６８】
実施例６：ＰＡＲ−２抗体の結合活性
本実施例は、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）バイオセンサー（ＢＩＡｃｏｒｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＡＢ、スウェーデン・ウプサラ）を用いた表面プラズモン共鳴によって評価した際の結合活性を記載する。簡潔には、標準的アミン・カップリング法および製造者の指示にしたがった試薬を用いて、抗ヒトＦｃ（または抗ネズミＦｃ）をバイオセンサー・チップ（すなわち、ＣＭ５チップ）に共有結合させる。ＰＡＲ−２抗体（ヒトまたはネズミ、あるいはキメラ、例えば配列番号３８）または対照抗体を、固定抗Ｆｃ上に注入し、そして多様な量のＰＡＲ−２（ホモ二量体ＰＡＲ−２−ｈｕＦｃまたはヘテロ二量体ＰＡＲ−２−ｈｕＦｃ／ＦＬＡＧ−ｈｕＦｃいずれか）を、無関係な抗体カップリングチップ（陰性対照）ならびに抗ＰＡＲ−２コーティングチップ上に、独立に通した。１０マイクロリットル／分で１００ｍＭリン酸１０マイクロリットルを１回パルス処理して、チップの再生を達成してもよい。すべての結合をＨＢＳ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３．４ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％ＮａＮ３、０．００５％界面活性剤Ｐ２Ｏ、ｐＨ７．４）または同等物中で行う。
【０１６９】
実施例７：ＰＡＲ−２抗体の比較
いくつかのＰＡＲ−２抗体を異なるアッセイ形式で試験した；表２は結果を要約する。先に記載するＣａ２＋可動化に関して、ＦＬＩＰＲアッセイにおいて、ＩＣ５０値を決定し；先に記載するウェスタンブロットアッセイを用いて、切断部位の下流領域に対する切断部位の上流領域への結合を決定した。
【０１７０】
表２
【０１７１】
【表２】
【０１７２】
＊このウェスタンブロットにおいて、切断部位の下流に結合する抗体は、全長およびアミノ末端一部切除ＰＡＲ−２−Ｆｃの両方に結合する一方、切断部位の上流に結合する抗体は、全長ＰＡＲ−２／Ｆｃのみに結合するであろう。
【０１７３】
実施例８：アジュバント誘導性関節炎（ＡＩＡ）モデル
本実施例は、関節炎の急性および慢性モデルを記載する。両モデルにおいて、関節内（ＩＡ）、関節周囲（ＰＡ）注射または皮内（ＩＤ）注射すべてのため、例えば、ケタミン／キシラジン混合物（それぞれマウス混合物またはラット混合物）またはイソフルランによって、動物を麻酔する。
【０１７４】
関節注射、ＩＡまたはＰＡは、膝または後肢足のいずれかを対象にする。ＰＡ注射は、関心対象の関節を取り巻く４つの部位に等しく分けられる。後足の足底領域内に足注射をＩＤ投与する。内部対照として働くように、一方の膝または後肢足にビヒクルのみまたは無菌ＰＢＳを注射する。注射領域の用意には、動物麻酔後の関節領域の剃毛、およびヨウ素溶液、その後のアルコール殺菌剤でのスクラブが含まれる。すべての関節注射を３０ゲージ針または同等物、そして必要な場合、小注射体積（すなわち１０マイクロＬ）用に、気密（すなわちＨａｍｉｌｔｏｎ）シリンジで投与する。
【０１７５】
急性ＡＩＡ（ａＡＩＡ）を誘導するため、第０日（Ｄ０）、動物に、ＩＡ注射によって、生理食塩水中の１〜４％ラムダ−カラギーナンおよび１〜４％カオリン（Ｃ／Ｋ）を注射する。両化合物の濃度は、意図される疾患重症度に依存する。誘導剤の総注射体積は、マウスでは１０〜２０マイクロＬ、そしてラットでは６０〜８０マイクロＬの間である。濃度および注射体積は、どちらも、公表される方法論と一致する（Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ． ２００３； １１１（１）：３５−４１、およびＪ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ． ２００６； ３１６（３）：１０１７−２４）。あるいは、特異的ＰＡＲ−２ペプチド・アゴニスト、または他の炎症活性化因子（トリプシン、またはヒト・ベータ−トリプターゼなど［Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ． ２００３； １１１（１）：３５−４１， Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ． ２００６； ３１６（３）：１０１７−２４， Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｃｉ． ２００５ ９７（１）：３８−４２、およびＢｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． １９９９ １２７（５）：１０８３−９０］）あるいは同等物を用いてもよい。意図される疾患重症度に関して、用いる濃度を選択し、そして総注射体積は、注射される動物に適切である。
【０１７６】
慢性ＡＩＡ（ｃＡＩＡ）の誘導のため、第０日（Ｄ０）、動物に、ＩＡ注射によって、１０ｍｇ／ｍＬ Ｈ３７Ｒａ結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（Ｍ．ｔｂ．））を補ったフロイントのアジュバント［完全フロイントアジュバント； ＣＦＡ］１０〜２０マイクロＬ（マウス）および６０〜８０マイクロＬ（ラット）を、その後、ＰＡ注射によって、４０〜８０マイクロＬ（マウス）および１２０〜２００マイクロＬ（ラット）を注射する。濃度、注射体積、および注射措置は、公表される方法論と一致する（Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ． ２００３；１１１（１）：３５−４１）。アジュバント使用は、内部ＩＡＣＵＣ全体アジュバント使用標準にしたがい、マウスに関しては総量０．４ｍＬ、そしてラットに関しては総量１ｍＬを超えない。すべての注射は、内部施設動物飼育および使用委員会（ＩＡＣＵＣ）用量投与標準にしたがい、マウスに関しては２０ｍＬ／ｋｇＩＰ、１ｍＬ／ｋｇ ＩＡ、および５ｍＬ／ｋｇ ＩＶ、そしてラットに関しては１０ｍＬ／ｋｇ ＩＰ、０．５ｍＬ／ｋｇ ＩＡ、および５ｍＬ／ｇ ＩＶより多くを含まない。
【０１７７】
治療介入には、腹腔内（ＩＰ）、関節内（ＩＡ）、または静脈内（ＩＶ）投与経路が含まれ；これらの代わりにまたはこれらに加えて、他の適切な投与経路を用いてもよい。ＩＡ注射を介した任意の治療措置を、Ｄ０以外の時点で投与するか、またはＤ０であるが、同じ関節中の異なる注射部位に連続して投与する（例えば第一の注射は膝の内面内であり、そして第二の注射は外面内である）。
【０１７８】
急性および慢性ＡＩＡ研究の両方のため、いかなる注射の前にも、すべての関心対象の関節の関節直径のキャリパー測定を行う。疾患追跡には、関節直径のキャリパー測定ならびに関節外周の柔軟テープ測定、および視覚的スコア付けが含まれてもよい。別の方法（すなわち、足容積測定装置（ｐｌｅｔｈｙｓｍｏｍｅｔｅｒ）の使用）もまた用いてもよい。以下に示す基準の一方または両方によって、ｃＡＩＡの重症度をスコア付けする：
【０１７９】
【表３】
【０１８０】
急性モデルに関しては、この方式で、６〜８週齢のＬｅｗｉｓラットの左膝中にＣ／Ｋに加えて治療（または対照）を、そして各右膝中に陰性対照を注射した。３回のキャリパー読み取り値の平均を用いて、治療後の設定時点で、関節の厚みを測定した。右膝に比較した際の左膝の厚みの変化を変化パーセントとして表し、そして以下の表３に示す。
【０１８１】
表３
【０１８２】
【表４】
【０１８３】
値は、群平均±ＳＥＭに相当する。Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉを伴う２方向ＡＮＯＶＡによって、統計を計算する。モノクローナル抗体１Ａ１をｈＩｇＧに対して比較し；ＳＬＩＧＲＬをＰＢＳに対して比較した。
【０１８４】
＊ ｐ＜０．０５
＊＊ ｐ＜０．０１
＊＊＊ ｐ＜０．００１
これらの結果は、アンタゴニスト性抗ＰＡＲ−２抗体が、アジュバント誘導性関節炎モデルにおいて観察される炎症を減少させることを立証する。
【０１８５】
実施例９：アジュバント誘導性関節炎（ＡＩＡ）モデル
本実施例は、実質的に先に記載するような急性ＡＩＡモデルにおける足浮腫に対するＰＡＲ−２抗体の効果を記載する。簡潔には、６〜８週齢のＳｐｒａｇｕｅ ＤａｗｌｅｙまたはＬｅｗｉｓラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、マサチューセッツ州ウィルミントン）の後足足底領域中、一方の後足には１％ラムダ・カラギーナンを、そしてもう一方には対照（生理食塩水）を皮下（ＳＣ）注射した。１．５ｍｇ／ラット（およそ８〜１０ｍｇ／ｋｇ）の遮断ＰＡＲ−２モノクローナル抗体（１Ａ１）または対照（陽性または陰性対照；表４の脚注を参照されたい）を、アジュバント注射の１８時間前に腹腔内（ＩＰ）投与し、次いで、選択した時点で、足容積測定装置によって浮腫を測定した。足に関するベースライン測定に対して、その足あたりに置換された水のミリリットル（ｍＬ）体積として、データを表した。代表的な実験の結果を、以下の表４〜５に示す。
【０１８６】
表４：Ｌｅｗｉｓラットにおける足浮腫
【０１８７】
【表５】
【０１８８】
１２Ｂ５：陽性対照抗ＰＧＥ２、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、ミシガン州アナーバー
２２Ｃ６：陰性対照結合性非遮断抗ＰＡＲ２ ｍＡｂ
対照に対するＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定を伴う２方向ＡＮＯＶＡによる、＊ ｐ＜０．０５、＊＊ ｐ＜０．０１、＊＊＊ ｐ＜０．００１。
【０１８９】
表５：Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットにおける足浮腫
【０１９０】
【表６】
【０１９１】
１５ｍｇ／ｋｇのインドメタシン陽性対照
２２Ｃ６：陰性対照結合性非遮断抗ＰＡＲ２ ｍＡｂ
対照に対するＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定を伴う２方向ＡＮＯＶＡによる、＊ ｐ＜０．０５、＊＊ ｐ＜０．０１、＊＊＊ ｐ＜０．００１。
【０１９２】
さらなる実験において、遮断ＰＡＲ−２抗体（１Ａ１）は、ＩＰ投与された際、足腫脹を有意に減少させたが、ＳＣ投与された際は減少させなかった；続く薬物動態学的分析によって、足浮腫研究において、ＳＣ投与１Ａ１の生物学的利用能は最適未満であることが明らかになった。さらに、ＩＰ投与された遮断ＰＡＲ−２抗体による腫脹の阻害は、用量依存方式で起こった。これらの結果によって、アンタゴニスト性抗ＰＡＲ−２抗体が、アジュバント誘導性関節炎モデルにおいて観察される炎症を減少させるという先の知見が確認された。
【０１９３】
実施例１０：炎症促進性サイトカインにおける変化
本実施例は、炎症促進性サイトカインの誘導に対するＰＡＲ−２抗体またはベンチマーク陽性対照抗体（すなわち、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ由来の抗ＰＧＥ２ ２Ｂ５）の効果を記載する。簡潔には、溶解緩衝液中で刻み、そしてＱｉａｇｅｎ組織溶解装置上に置くことによって、炎症ラット足または対照（未処置）足から組織溶解物を調製した。試料アリコットをプールし、微量体積分光測定系（ＮａｎｏＤｒｏｐＴＭ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、マサチューセッツ州ウォルサム）を用いて吸光度（Ａ２８０）によって総タンパク質に関して評価し、そしてＲｏｄｅｎｔ Ｐａｎｅｌ ｖ２．０上での多数分析物プロフィール（ＭＡＰ）分析のため、Ｒｕｌｅｓ−Ｂａｓｅｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｉｎｃ．（テキサス州オースティン）に提出した。多くの分析物は、疾患活性とともに変化し、示す比較には、１Ａ１および２Ｂ５治療によって差別化されるものが含まれた。分析物を総タンパク質に対して標準化し（すなわち、（ｐｇ、ｎｇ、マイクロｇ）／ｍｇ総タンパク質）；データを図１に示す。これらの結果によって、サイトカインおよびプロスタグランジンなどの炎症促進性仲介因子の放出増加が、カラギーナン誘導性浮腫の特質であるという文献の知見が確認された。抗ＰＡＲ−２アンタゴニスト性抗体で治療した動物において、足溶解物中、これらの因子がより低いレベルで観察されるということは、これらの抗体がＰＡＲ−２に結合し、そして続いて、炎症促進性仲介因子の産生を有意に減少させることを示唆する。これらの分析物の産生が減少することは、ＰＡＲ−２中和抗体に抗炎症活性があることを裏付ける。
【０１９４】
実施例１１：抗原結合性タンパク質の結合特性
本実施例は、溶液相において結合事象を測定し、そして実質的に先にＸｉｅら Ｊ． Ｉｍｍ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ３０４：１（２００５）およびＲａｔｈａｎａｓｗａｍｉら Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３７３：５２（２００８）に記載されるように、ＫＤ、ＫｏｎおよびＫｏｆｆ（ＫｉｎＥｘＡ（登録商標）；Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、アイダホ州ボイシ）を計算するのに使用可能な動力学排除アッセイを利用した、細胞表面に発現されたＰＡＲ−２へのＰＡＲ−２抗原結合性タンパク質の結合特性の分析を記載する。簡潔には、修飾ＤＭＥＭ培地（１０％熱不活化ＦＢＳ、０．１ｍＭ ＭＥＭ非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、ペニシリン−ストレプトマイシン−グルタミン、および０．０２５％（ｗ／ｗ）アジ化ナトリウムを含有するフェノールレッド不含）中、ヒトＰＡＲ−２を発現する細胞（例えば、配列番号２のポリペプチドをコードするヒト全長ＰＡＲ−２ ｃＤＮＡでＣＨＯ細胞をトランスフェクションすることによって得られうる、細胞表面にヒトＰＡＲ−２を発現するＣＨＯトランスフェクタント）および対照細胞（すなわち非トランスフェクションＣＨＯ細胞）の連続希釈を、一定量の抗体と、回転させながら４℃で２４〜３６時間インキュベーションする。インキュベーション時間の終了時、遠心分離（すなわち、２０００ｒｐｍで４分間）によって細胞をペレットにし、そして非結合（遊離）抗体を含有する上清を取り除く。Ｒａｔｈａｎａｓｗａｍｉら Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎ：１００４（２００５）に記載されるように、適切な捕捉ビーズおよびＣｙ５コンジュゲート化抗ヒト二次抗体を用いて、ＫｉｎＥｘＡ（登録商標）によって、遊離ｍＡｂを測定する。ＫｉｎＥｘＡ（登録商標）ソフトウェアを用い、そして所定の曲線すべてを、同時に単一のＫＤ値に適合させる「ｎ曲線分析」（Ｒａｔｈａｎａｓｗａｍｉら ２００５およびＸｉｅら、上記）によって、平衡解離定数（ＫＤ）を得る。
【０１９５】
この方式で、特定のＰＡＲ−２抗体のＫＤを決定した。ＫｉｎＥｘＡ（登録商標）によって測定されるように、細胞表面で発現されたヒトＰＡＲ−２への抗ＰＡＲ−２抗体１Ａ１の相互作用のＫＤは６２．８ｐＭであり、９５％信頼区間は２４．８〜１３４．７ｐＭ（Ｎ＝５の実験の平均）である。この系において、抗体１Ｂ５の最初の分析では３．３９ｎＭのＫＤが示され、９５％信頼区間は１．３６〜５．４７ｐＭ（Ｎ＝２の実験）であった。
【０１９６】
実施例１２：コラーゲン誘導性関節炎の誘導
本実施例は、ラットを利用する、コラーゲン誘導性関節炎モデルを記載する。使用２日前、ブタＩＩ型コラーゲン（１０ｍｇ； Ｃｈｏｎｄｒｅｘ、ワシントン州レッドモンド）を、２〜４℃の回転プレート上で、０．１Ｎ酢酸（５ｍＬ）中に溶解する。続いて、乳化針およびガラスシリンジを用いて、フロイントの不完全アジュバント（ＩＦＡ； Ｄｉｆｃｏ、ミシガン州デトロイト）とコラーゲンを１：１で乳化して、１ｍｇ／ｍＬの最終濃度を生じる。背中の１０の異なる部位に、ＩＦＡ中の乳化コラーゲンを皮内注射する（部位あたり１００マイクロＬ）ことによって、８週齢メスＬｅｗｉｓラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ、マサチューセッツ州ウィルミントン）において、疾患を誘導する。後足腫脹および歩行困難によって示されるような、関節炎の臨床的開始は、通常、１０〜１２日の間で多様である。コラーゲン免疫する前に、ラットを治療群にランダム化し、そしてＰＡＲ−２中和抗体、対照抗体（すなわちＰＡＲ−２非遮断抗体）またはビヒクル対照（Ａ５Ｓｕ）のｉ．ｐ．投与で療法を開始する。開始前日、第９日に、抗体およびビヒクルの第二の用量を投与する。
【０１９７】
研究中、キャリパーを用いた後足直径の断続的な測定によって、炎症の進行を臨床的に評価する。関節炎誘導前、開始日（第１０日）、第１１〜１７日、および剖検時（第１８日）に、脛骨足根骨（足首）関節で読み取りを行う。式：
［（ビヒクル治療ＣＩＡ―治療ＣＩＡ）／（ビヒクル治療ＣＩＡ）］ｘ１００
にしたがって、曲線下面積（ＡＵＣ）に基づいて、足炎症の阻害を計算する。
【０１９８】
さらに、追加終点として、治療措置中、総体重を毎日測定し、これはこの関節炎モデルにおいては、体重喪失が関節炎症の進行と平行するためである。
研究終了時、骨ミネラル密度（ＢＭＤ）の喪失に関して、ならびにマイトジェン活性化プロテインキナーゼ活性化キナーゼ２（ＭＡＰＫＡＰＫ−２またはＭＫ−２）のリン酸化における変化に関して、足首関節を評価してもよい。剖検後の適切な時点で、二重エネルギーＸ線吸収測定法（ＤＥＸＡ）を用いて、ＢＭＤを検査する。後足を毛皮の線（足首のすぐ近位［膝］）で取り外し、７０％エタノールに浸し、そしてＢＭＤを測定するまで、室温で保存する。次いで、実質的にＦｅｉｇｅら， Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ５７：１４５７；２０００によって記載されるように、扇ビームＸ線密度計（モデルＱＤＲ−４５００Ａ； Ｈｏｌｏｇｉｃ、マサチューセッツ州ウォルサム）を用いて、水平方向で、関節をスキャンする。スキャン後、分析しようとする部位の輪郭を描くため、長方形ボックス（２９ｘ２５ｍｍ）を踵骨中心に配置して、そして用いる装置に関して検証されたアルゴリズム（例えばＨｏｌｏｇｉｃソフトウェア）を用いて、骨面積、骨ミネラル含量、および骨ミネラル密度を計算する。リン分析のため、１つの足首を液体Ｎ２中で凍結させてタンパク質粉末に粉砕し、これを商業的に入手可能なＭＫ−２アッセイを用いたウェスタンブロットで分析する。
【０１９９】
本明細書に引用する各参考文献は、解説するすべてに関して、そしてすべての目的で、その全体が本明細書に援用される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
重鎖および軽鎖を有する単離抗原結合性タンパク質であって、配列番号９に少なくとも９５％同一である可変領域を含む重鎖、および配列番号１１に少なくとも９５％同一である可変領域を含む軽鎖を有する、単離抗原結合性タンパク質。
【請求項２】
軽鎖可変領域が配列番号３９のアミノ酸配列を有し、そして重鎖可変領域が配列番号４０のアミノ酸配列を有する、請求項１の抗原結合性タンパク質。
【請求項３】
軽鎖可変領域が、配列番号１１、配列番号１５および配列番号１９からなるアミノ酸配列の群より選択されるアミノ酸配列を有し、そして重鎖可変領域が、配列番号９、配列番号１３および配列番号１７からなるアミノ酸配列の群より選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１の抗原結合性タンパク質。
【請求項４】
ａ）軽鎖可変領域が配列番号１１のアミノ酸配列を有し、そして重鎖可変領域が配列番号９のアミノ酸配列を有する、抗原結合性タンパク質；
ｂ）軽鎖可変領域が配列番号１５のアミノ酸配列を有し、そして重鎖可変領域が配列番号１３のアミノ酸配列を有する、抗原結合性タンパク質；および
ｃ）軽鎖可変領域が配列番号１９のアミノ酸配列を有し、そして重鎖可変領域が配列番号１７のアミノ酸配列を有する、抗原結合性タンパク質
からなる群より選択される、請求項１の抗原結合性タンパク質。
【請求項５】
重鎖および軽鎖を有する単離抗原結合性タンパク質であって、重鎖がＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と称される３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、そして軽鎖がＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と称される３つの相補性決定領域を含み、
ａ）重鎖ＣＤＲ１が、配列番号９のアミノ酸３１〜３５、配列番号１３のアミノ酸３１〜３５および配列番号１７のアミノ酸３１〜３５からなるアミノ酸配列の群より選択されるアミノ酸配列を有し；
ｂ）重鎖ＣＤＲ２が、配列番号９のアミノ酸５０〜６６、配列番号１３のアミノ酸５０〜６６および配列番号１７のアミノ酸５０〜６６からなるアミノ酸配列の群より選択されるアミノ酸配列を有し；そして
ｃ）重鎖ＣＤＲ３が、配列番号９のアミノ酸９９〜１１５、配列番号１３のアミノ酸９９〜１１５および配列番号１７のアミノ酸９９〜１１５からなるアミノ酸配列の群より選択されるアミノ酸配列を有し；
そして
ａ’）軽鎖ＣＤＲ１が、配列番号１１のアミノ酸２３〜３３、配列番号１５のアミノ酸２３〜３３および配列番号１９のアミノ酸２３〜３３からなるアミノ酸配列の群より選択されるアミノ酸配列を有し；
ｂ’）軽鎖ＣＤＲ２が、配列番号１１のアミノ酸４９〜５５、配列番号１５のアミノ酸４９〜５５および配列番号１９のアミノ酸４９〜５５からなるアミノ酸配列の群より選択されるアミノ酸配列を有し；そして
ｃ’）軽鎖ＣＤＲ３が、配列番号１１のアミノ酸８８〜９７、配列番号１５のアミノ酸８８〜９７および配列番号１９のアミノ酸８８〜９７からなるアミノ酸配列の群より選択されるアミノ酸配列を有する
前記抗原結合性タンパク質。
【請求項６】
重鎖がＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４と称される１つないし４つのフレームワーク領域（ＦＲ）をさらに含み、そして軽鎖がＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４と称される１つないし４つのフレームワーク領域をさらに含み、
ａ）重鎖ＦＲ１が、配列番号９のアミノ酸１〜３０、配列番号１３のアミノ酸１〜３０および配列番号１７のアミノ酸１〜２５からなるアミノ酸配列の群より選択されるアミノ酸配列を有し；
ｂ）重鎖ＦＲ２が、配列番号９のアミノ酸３６〜４９、配列番号１３のアミノ酸３６〜４９および配列番号１７のアミノ酸３６〜４９からなるアミノ酸配列の群より選択されるアミノ酸配列を有し；
ｃ）重鎖ＦＲ３が、配列番号９のアミノ酸６７〜９８、配列番号１３のアミノ酸６７〜９８および配列番号１７のアミノ酸６７〜９８からなるアミノ酸配列の群より選択されるアミノ酸配列を有し；そして
ｄ）重鎖ＦＲ４が、配列番号９のアミノ酸１１６〜１２６、配列番号１３のアミノ酸１１６〜１２６および配列番号１７のアミノ酸１１６〜１２６からなるアミノ酸配列の群より選択されるアミノ酸配列を有し；
そして
ａ’）軽鎖ＦＲ１が、配列番号１１のアミノ酸１〜２２、配列番号１５のアミノ酸１〜２２および配列番号１９のアミノ酸１〜２２からなるアミノ酸配列の群より選択されるアミノ酸配列を有し；
ｂ’）軽鎖ＦＲ２が、配列番号１１のアミノ酸３４〜４８、配列番号１５のアミノ酸３４〜４８および配列番号１９のアミノ酸３４〜４８からなるアミノ酸配列の群より選択されるアミノ酸配列を有し；
ｃ’）軽鎖ＦＲ３が、配列番号１１のアミノ酸５６〜８７、配列番号１５のアミノ酸５６〜８７および配列番号１９のアミノ酸５６〜８７からなるアミノ酸配列の群より選択されるアミノ酸配列を有し；そして
ｄ’）軽鎖ＦＲ４が、配列番号１１のアミノ酸９８〜１０７、配列番号１５のアミノ酸９８〜１０７および配列番号１９のアミノ酸９８〜１０７からなるアミノ酸配列の群より選択されるアミノ酸配列を有する
請求項５の抗原結合性タンパク質。
【請求項７】
重鎖および軽鎖を有する単離抗原結合性タンパク質であって、配列番号３１に少なくとも９５％同一である可変領域を含む重鎖、および配列番号３５に少なくとも９５％同一である可変領域を含む軽鎖を有する、抗原結合性タンパク質。
【請求項８】
軽鎖可変領域が配列番号４１のアミノ酸配列を有し、そして重鎖可変領域が配列番号４２のアミノ酸配列を有する、請求項７の抗原結合性タンパク質。
【請求項９】
軽鎖可変領域が、配列番号３３および配列番号３７からなるアミノ酸配列の群より選択されるアミノ酸配列を有し、そして重鎖可変領域が、配列番号３１および配列番号３５からなるアミノ酸配列の群より選択されるアミノ酸配列を有する、請求項７の抗原結合性タンパク質。
【請求項１０】
ａ）軽鎖可変領域が配列番号３３のアミノ酸配列を有し、そして重鎖可変領域が配列番号３１のアミノ酸配列を有する、抗原結合性タンパク質；および
ｂ）軽鎖可変領域が配列番号３７のアミノ酸配列を有し、そして重鎖可変領域が配列番号３５のアミノ酸配列を有する、抗原結合性タンパク質
からなる群より選択される、請求項７の抗原結合性タンパク質。
【請求項１１】
重鎖および軽鎖を有する単離抗原結合性タンパク質であって、重鎖がＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と称される３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、そして軽鎖がＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と称される３つの相補性決定領域を含み、
ａ）重鎖ＣＤＲ１が、配列番号３１のアミノ酸３１〜３７、および配列番号３５のアミノ酸３１〜３７からなるアミノ酸配列の群より選択されるアミノ酸配列を有し；
ｂ）重鎖ＣＤＲ２が、配列番号３１のアミノ酸５２〜６９、および配列番号３５のアミノ酸５２〜６９からなるアミノ酸配列の群より選択されるアミノ酸配列を有し；そして
ｃ）重鎖ＣＤＲ３が、配列番号３１のアミノ酸１０２〜１１４、および配列番号３５のアミノ酸１０２〜１１４からなるアミノ酸配列の群より選択されるアミノ酸配列を有し；
そして
ａ’）軽鎖ＣＤＲ１が、配列番号３３のアミノ酸２４〜３４、および配列番号３７のアミノ酸２４〜３４からなるアミノ酸配列の群より選択されるアミノ酸配列を有し；
ｂ’）軽鎖ＣＤＲ２が、配列番号３３のアミノ酸５０〜５６、および配列番号３７のアミノ酸５０〜５６からなるアミノ酸配列の群より選択されるアミノ酸配列を有し；
ｃ’）軽鎖ＣＤＲ３が、配列番号３３のアミノ酸８９〜９７、および配列番号３７のアミノ酸８９〜９７からなるアミノ酸配列の群より選択されるアミノ酸配列を有する
前記抗原結合性タンパク質。
【請求項１２】
重鎖がＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４と称される１つないし４つのフレームワーク領域（ＦＲ）をさらに含み、そして軽鎖がＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４と称される１つないし４つのフレームワーク領域をさらに含み、
ａ）重鎖ＦＲ１が、配列番号３１のアミノ酸１〜３０、および配列番号３５のアミノ酸１〜３０からなるアミノ酸配列の群より選択されるアミノ酸配列を有し；
ｂ）重鎖ＦＲ２が、配列番号３１のアミノ酸３８〜５１、および配列番号３５のアミノ酸３８〜５１からなるアミノ酸配列の群より選択されるアミノ酸配列を有し；
ｃ）重鎖ＦＲ３が、配列番号３１のアミノ酸７０〜１０１、および配列番号３５のアミノ酸７０〜１０１からなるアミノ酸配列の群より選択されるアミノ酸配列を有し；そして
ｄ）重鎖ＦＲ４が、配列番号３１のアミノ酸１１５〜１２５、および配列番号３５のアミノ酸１１５〜１２５からなるアミノ酸配列の群より選択されるアミノ酸配列を有し；
そして
ａ’）軽鎖ＦＲ１が、配列番号３３のアミノ酸１〜２３、および配列番号３７のアミノ酸１〜２３からなるアミノ酸配列の群より選択されるアミノ酸配列を有し；
ｂ’）軽鎖ＦＲ２が、配列番号３３のアミノ酸３５〜４９、および配列番号３７のアミノ酸３５〜４９からなるアミノ酸配列の群より選択されるアミノ酸配列を有し；
ｃ’）軽鎖ＦＲ３が、配列番号３３のアミノ酸５７〜８８、および配列番号３７のアミノ酸５７〜８８からなるアミノ酸配列の群より選択されるアミノ酸配列を有し；そして
ｄ’）軽鎖ＦＲ４が、配列番号３３のアミノ酸９８〜１０７、および配列番号３７のアミノ酸９８〜１０７からなるアミノ酸配列の群より選択されるアミノ酸配列を有する
請求項１１の抗原結合性タンパク質。
【請求項１３】
ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、および配列番号９のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、抗原結合性タンパク質；
ｂ）配列番号１５のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、および配列番号１３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、抗原結合性タンパク質；
ｃ）配列番号１９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、および配列番号１７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、抗原結合性タンパク質；
ｄ）配列番号２５のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、および配列番号２３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、抗原結合性タンパク質；
ｅ）配列番号２９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、および配列番号２７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、抗原結合性タンパク質；
ｆ）配列番号３３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、および配列番号３１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、抗原結合性タンパク質；ならびに
ｇ）配列番号３７のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、および配列番号３５のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、抗原結合性タンパク質
からなる群より選択される、単離抗原結合性タンパク質。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項の抗原結合性タンパク質をコードする、単離核酸。
【請求項１５】
ａ）配列番号１０のヌクレオチド配列を有する核酸、および配列番号８のヌクレオチド配列を有する核酸を含む、核酸；
ｂ）配列番号１２のヌクレオチド配列を有する核酸、および配列番号１４のヌクレオチド配列を有する核酸を含む、核酸；
ｃ）配列番号１６のヌクレオチド配列を有する核酸、および配列番号１８のヌクレオチド配列を有する核酸を含む、核酸；
ｄ）配列番号２４のヌクレオチド配列を有する核酸、および配列番号２２のヌクレオチド配列を有する核酸を含む、核酸；
ｅ）配列番号２８のヌクレオチド配列を有する核酸、および配列番号２６のヌクレオチド配列を有する核酸を含む、核酸；
ｆ）配列番号３０のヌクレオチド配列を有する核酸、および配列番号３２のヌクレオチド配列を有する核酸を含む、核酸；ならびに
ｇ）配列番号３４のヌクレオチド配列を有する核酸、および配列番号３６のヌクレオチド配列を有する核酸を含む、核酸
からなる群より選択される、請求項１４の核酸。
【請求項１６】
請求項１４または１５記載の核酸を含む、ベクター。
【請求項１７】
請求項１６のベクターでトランスフェクションまたは形質転換されている、単離宿主細胞。
【請求項１８】
抗原結合性タンパク質を産生する方法であって、該タンパク質の発現を促進する条件下で、請求項１７の宿主細胞を培養し、そして培地から該タンパク質を回収する工程を含む、前記方法。
【請求項１９】
請求項１〜１３のいずれか一項のポリペプチドおよび生理学的に許容されうる希釈剤、賦形剤またはキャリアーを含む、組成物。
【請求項１】
重鎖および軽鎖を有する単離抗原結合性タンパク質であって、配列番号９に少なくとも９５％同一である可変領域を含む重鎖、および配列番号１１に少なくとも９５％同一である可変領域を含む軽鎖を有する、単離抗原結合性タンパク質。
【請求項２】
軽鎖可変領域が配列番号３９のアミノ酸配列を有し、そして重鎖可変領域が配列番号４０のアミノ酸配列を有する、請求項１の抗原結合性タンパク質。
【請求項３】
軽鎖可変領域が、配列番号１１、配列番号１５および配列番号１９からなるアミノ酸配列の群より選択されるアミノ酸配列を有し、そして重鎖可変領域が、配列番号９、配列番号１３および配列番号１７からなるアミノ酸配列の群より選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１の抗原結合性タンパク質。
【請求項４】
ａ）軽鎖可変領域が配列番号１１のアミノ酸配列を有し、そして重鎖可変領域が配列番号９のアミノ酸配列を有する、抗原結合性タンパク質；
ｂ）軽鎖可変領域が配列番号１５のアミノ酸配列を有し、そして重鎖可変領域が配列番号１３のアミノ酸配列を有する、抗原結合性タンパク質；および
ｃ）軽鎖可変領域が配列番号１９のアミノ酸配列を有し、そして重鎖可変領域が配列番号１７のアミノ酸配列を有する、抗原結合性タンパク質
からなる群より選択される、請求項１の抗原結合性タンパク質。
【請求項５】
重鎖および軽鎖を有する単離抗原結合性タンパク質であって、重鎖がＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と称される３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、そして軽鎖がＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と称される３つの相補性決定領域を含み、
ａ）重鎖ＣＤＲ１が、配列番号９のアミノ酸３１〜３５、配列番号１３のアミノ酸３１〜３５および配列番号１７のアミノ酸３１〜３５からなるアミノ酸配列の群より選択されるアミノ酸配列を有し；
ｂ）重鎖ＣＤＲ２が、配列番号９のアミノ酸５０〜６６、配列番号１３のアミノ酸５０〜６６および配列番号１７のアミノ酸５０〜６６からなるアミノ酸配列の群より選択されるアミノ酸配列を有し；そして
ｃ）重鎖ＣＤＲ３が、配列番号９のアミノ酸９９〜１１５、配列番号１３のアミノ酸９９〜１１５および配列番号１７のアミノ酸９９〜１１５からなるアミノ酸配列の群より選択されるアミノ酸配列を有し；
そして
ａ’）軽鎖ＣＤＲ１が、配列番号１１のアミノ酸２３〜３３、配列番号１５のアミノ酸２３〜３３および配列番号１９のアミノ酸２３〜３３からなるアミノ酸配列の群より選択されるアミノ酸配列を有し；
ｂ’）軽鎖ＣＤＲ２が、配列番号１１のアミノ酸４９〜５５、配列番号１５のアミノ酸４９〜５５および配列番号１９のアミノ酸４９〜５５からなるアミノ酸配列の群より選択されるアミノ酸配列を有し；そして
ｃ’）軽鎖ＣＤＲ３が、配列番号１１のアミノ酸８８〜９７、配列番号１５のアミノ酸８８〜９７および配列番号１９のアミノ酸８８〜９７からなるアミノ酸配列の群より選択されるアミノ酸配列を有する
前記抗原結合性タンパク質。
【請求項６】
重鎖がＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４と称される１つないし４つのフレームワーク領域（ＦＲ）をさらに含み、そして軽鎖がＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４と称される１つないし４つのフレームワーク領域をさらに含み、
ａ）重鎖ＦＲ１が、配列番号９のアミノ酸１〜３０、配列番号１３のアミノ酸１〜３０および配列番号１７のアミノ酸１〜２５からなるアミノ酸配列の群より選択されるアミノ酸配列を有し；
ｂ）重鎖ＦＲ２が、配列番号９のアミノ酸３６〜４９、配列番号１３のアミノ酸３６〜４９および配列番号１７のアミノ酸３６〜４９からなるアミノ酸配列の群より選択されるアミノ酸配列を有し；
ｃ）重鎖ＦＲ３が、配列番号９のアミノ酸６７〜９８、配列番号１３のアミノ酸６７〜９８および配列番号１７のアミノ酸６７〜９８からなるアミノ酸配列の群より選択されるアミノ酸配列を有し；そして
ｄ）重鎖ＦＲ４が、配列番号９のアミノ酸１１６〜１２６、配列番号１３のアミノ酸１１６〜１２６および配列番号１７のアミノ酸１１６〜１２６からなるアミノ酸配列の群より選択されるアミノ酸配列を有し；
そして
ａ’）軽鎖ＦＲ１が、配列番号１１のアミノ酸１〜２２、配列番号１５のアミノ酸１〜２２および配列番号１９のアミノ酸１〜２２からなるアミノ酸配列の群より選択されるアミノ酸配列を有し；
ｂ’）軽鎖ＦＲ２が、配列番号１１のアミノ酸３４〜４８、配列番号１５のアミノ酸３４〜４８および配列番号１９のアミノ酸３４〜４８からなるアミノ酸配列の群より選択されるアミノ酸配列を有し；
ｃ’）軽鎖ＦＲ３が、配列番号１１のアミノ酸５６〜８７、配列番号１５のアミノ酸５６〜８７および配列番号１９のアミノ酸５６〜８７からなるアミノ酸配列の群より選択されるアミノ酸配列を有し；そして
ｄ’）軽鎖ＦＲ４が、配列番号１１のアミノ酸９８〜１０７、配列番号１５のアミノ酸９８〜１０７および配列番号１９のアミノ酸９８〜１０７からなるアミノ酸配列の群より選択されるアミノ酸配列を有する
請求項５の抗原結合性タンパク質。
【請求項７】
重鎖および軽鎖を有する単離抗原結合性タンパク質であって、配列番号３１に少なくとも９５％同一である可変領域を含む重鎖、および配列番号３５に少なくとも９５％同一である可変領域を含む軽鎖を有する、抗原結合性タンパク質。
【請求項８】
軽鎖可変領域が配列番号４１のアミノ酸配列を有し、そして重鎖可変領域が配列番号４２のアミノ酸配列を有する、請求項７の抗原結合性タンパク質。
【請求項９】
軽鎖可変領域が、配列番号３３および配列番号３７からなるアミノ酸配列の群より選択されるアミノ酸配列を有し、そして重鎖可変領域が、配列番号３１および配列番号３５からなるアミノ酸配列の群より選択されるアミノ酸配列を有する、請求項７の抗原結合性タンパク質。
【請求項１０】
ａ）軽鎖可変領域が配列番号３３のアミノ酸配列を有し、そして重鎖可変領域が配列番号３１のアミノ酸配列を有する、抗原結合性タンパク質；および
ｂ）軽鎖可変領域が配列番号３７のアミノ酸配列を有し、そして重鎖可変領域が配列番号３５のアミノ酸配列を有する、抗原結合性タンパク質
からなる群より選択される、請求項７の抗原結合性タンパク質。
【請求項１１】
重鎖および軽鎖を有する単離抗原結合性タンパク質であって、重鎖がＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と称される３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、そして軽鎖がＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と称される３つの相補性決定領域を含み、
ａ）重鎖ＣＤＲ１が、配列番号３１のアミノ酸３１〜３７、および配列番号３５のアミノ酸３１〜３７からなるアミノ酸配列の群より選択されるアミノ酸配列を有し；
ｂ）重鎖ＣＤＲ２が、配列番号３１のアミノ酸５２〜６９、および配列番号３５のアミノ酸５２〜６９からなるアミノ酸配列の群より選択されるアミノ酸配列を有し；そして
ｃ）重鎖ＣＤＲ３が、配列番号３１のアミノ酸１０２〜１１４、および配列番号３５のアミノ酸１０２〜１１４からなるアミノ酸配列の群より選択されるアミノ酸配列を有し；
そして
ａ’）軽鎖ＣＤＲ１が、配列番号３３のアミノ酸２４〜３４、および配列番号３７のアミノ酸２４〜３４からなるアミノ酸配列の群より選択されるアミノ酸配列を有し；
ｂ’）軽鎖ＣＤＲ２が、配列番号３３のアミノ酸５０〜５６、および配列番号３７のアミノ酸５０〜５６からなるアミノ酸配列の群より選択されるアミノ酸配列を有し；
ｃ’）軽鎖ＣＤＲ３が、配列番号３３のアミノ酸８９〜９７、および配列番号３７のアミノ酸８９〜９７からなるアミノ酸配列の群より選択されるアミノ酸配列を有する
前記抗原結合性タンパク質。
【請求項１２】
重鎖がＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４と称される１つないし４つのフレームワーク領域（ＦＲ）をさらに含み、そして軽鎖がＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４と称される１つないし４つのフレームワーク領域をさらに含み、
ａ）重鎖ＦＲ１が、配列番号３１のアミノ酸１〜３０、および配列番号３５のアミノ酸１〜３０からなるアミノ酸配列の群より選択されるアミノ酸配列を有し；
ｂ）重鎖ＦＲ２が、配列番号３１のアミノ酸３８〜５１、および配列番号３５のアミノ酸３８〜５１からなるアミノ酸配列の群より選択されるアミノ酸配列を有し；
ｃ）重鎖ＦＲ３が、配列番号３１のアミノ酸７０〜１０１、および配列番号３５のアミノ酸７０〜１０１からなるアミノ酸配列の群より選択されるアミノ酸配列を有し；そして
ｄ）重鎖ＦＲ４が、配列番号３１のアミノ酸１１５〜１２５、および配列番号３５のアミノ酸１１５〜１２５からなるアミノ酸配列の群より選択されるアミノ酸配列を有し；
そして
ａ’）軽鎖ＦＲ１が、配列番号３３のアミノ酸１〜２３、および配列番号３７のアミノ酸１〜２３からなるアミノ酸配列の群より選択されるアミノ酸配列を有し；
ｂ’）軽鎖ＦＲ２が、配列番号３３のアミノ酸３５〜４９、および配列番号３７のアミノ酸３５〜４９からなるアミノ酸配列の群より選択されるアミノ酸配列を有し；
ｃ’）軽鎖ＦＲ３が、配列番号３３のアミノ酸５７〜８８、および配列番号３７のアミノ酸５７〜８８からなるアミノ酸配列の群より選択されるアミノ酸配列を有し；そして
ｄ’）軽鎖ＦＲ４が、配列番号３３のアミノ酸９８〜１０７、および配列番号３７のアミノ酸９８〜１０７からなるアミノ酸配列の群より選択されるアミノ酸配列を有する
請求項１１の抗原結合性タンパク質。
【請求項１３】
ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、および配列番号９のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、抗原結合性タンパク質；
ｂ）配列番号１５のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、および配列番号１３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、抗原結合性タンパク質；
ｃ）配列番号１９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、および配列番号１７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、抗原結合性タンパク質；
ｄ）配列番号２５のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、および配列番号２３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、抗原結合性タンパク質；
ｅ）配列番号２９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、および配列番号２７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、抗原結合性タンパク質；
ｆ）配列番号３３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、および配列番号３１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、抗原結合性タンパク質；ならびに
ｇ）配列番号３７のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、および配列番号３５のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、抗原結合性タンパク質
からなる群より選択される、単離抗原結合性タンパク質。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項の抗原結合性タンパク質をコードする、単離核酸。
【請求項１５】
ａ）配列番号１０のヌクレオチド配列を有する核酸、および配列番号８のヌクレオチド配列を有する核酸を含む、核酸；
ｂ）配列番号１２のヌクレオチド配列を有する核酸、および配列番号１４のヌクレオチド配列を有する核酸を含む、核酸；
ｃ）配列番号１６のヌクレオチド配列を有する核酸、および配列番号１８のヌクレオチド配列を有する核酸を含む、核酸；
ｄ）配列番号２４のヌクレオチド配列を有する核酸、および配列番号２２のヌクレオチド配列を有する核酸を含む、核酸；
ｅ）配列番号２８のヌクレオチド配列を有する核酸、および配列番号２６のヌクレオチド配列を有する核酸を含む、核酸；
ｆ）配列番号３０のヌクレオチド配列を有する核酸、および配列番号３２のヌクレオチド配列を有する核酸を含む、核酸；ならびに
ｇ）配列番号３４のヌクレオチド配列を有する核酸、および配列番号３６のヌクレオチド配列を有する核酸を含む、核酸
からなる群より選択される、請求項１４の核酸。
【請求項１６】
請求項１４または１５記載の核酸を含む、ベクター。
【請求項１７】
請求項１６のベクターでトランスフェクションまたは形質転換されている、単離宿主細胞。
【請求項１８】
抗原結合性タンパク質を産生する方法であって、該タンパク質の発現を促進する条件下で、請求項１７の宿主細胞を培養し、そして培地から該タンパク質を回収する工程を含む、前記方法。
【請求項１９】
請求項１〜１３のいずれか一項のポリペプチドおよび生理学的に許容されうる希釈剤、賦形剤またはキャリアーを含む、組成物。
【図１−１】
【図１−２】
【図１−２】
【公表番号】特表２０１０−５３２１６５（Ｐ２０１０−５３２１６５Ａ）
【公表日】平成２２年１０月７日（２０１０．１０．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５１４８３０（Ｐ２０１０−５１４８３０）
【出願日】平成２０年６月２６日（２００８．６．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００８０３７
【国際公開番号】ＷＯ２００９／００５７２６
【国際公開日】平成２１年１月８日（２００９．１．８）
【出願人】（５００２０３７０９）アムジェン インコーポレイテッド (76)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１０月７日（２０１０．１０．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年６月２６日（２００８．６．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００８０３７
【国際公開番号】ＷＯ２００９／００５７２６
【国際公開日】平成２１年１月８日（２００９．１．８）
【出願人】（５００２０３７０９）アムジェン インコーポレイテッド (76)
【Ｆターム（参考）】
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