ＰＣＲ増幅での再現性の改善およびミスプライミングの低減のための試薬および方法
【課題】ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅およびアッセイでのミスプライミングを防ぐための添加剤の提供。
【解決手段】６ヌクレオチド長より長いステム二重鎖と安定化されたステム末端とを有するヘアピンオリゴヌクレオチドを含んでなる添加剤に関する。当該添加剤は、初めの増幅反応混合物中に加えた場合、ＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅をはじめとするＰＣＲ増幅を改善する。当該添加剤は、ＰＣＲ増幅およびアッセイのためのオリゴヌクレオチドセットならびにキットに含めることができる。
【解決手段】６ヌクレオチド長より長いステム二重鎖と安定化されたステム末端とを有するヘアピンオリゴヌクレオチドを含んでなる添加剤に関する。当該添加剤は、初めの増幅反応混合物中に加えた場合、ＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅をはじめとするＰＣＲ増幅を改善する。当該添加剤は、ＰＣＲ増幅およびアッセイのためのオリゴヌクレオチドセットならびにキットに含めることができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を利用する核酸増幅反応およびアッセイに関し、それにはリアルタイムアッセイおよびエンドポイントアッセイの両者のホモジニアスアッセイが含まれる。
【背景技術】
【０００２】
背景
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を利用する核酸増幅（ＰＣＲ増幅を含むアッセイなど）は周知である。米国特許第４，６８３，２０２号、同第４，６８３，１９５号および同第４，９６５，１８８号、および、一般には、PCR PROTOCOLS, a guide to Methods and Applications, Innis et al.（編）, Academic Press（San Diego, CA (USA) 1990）を参照されたい。未結合検出試薬またはプローブを除去するための洗浄を必要とせず、ゆえに増幅反応容器を開けることなく実施できるホモジニアスＰＣＲアッセイもまた周知である。ホモジニアスＰＣＲアッセイには、増幅反応の終了時点で増幅産物を検出するエンドポイントアッセイ、および反応が進行しているときに一部のまたはすべての熱サイクル中に増幅産物を検出するリアルタイムアッセイの両者が含まれる。米国特許第５，９９４，０５６号、同第５，４８７，９７２号、同第５，９２５，５１７号および同第６，１５０，０９７号を参照されたい。
【０００３】
ＰＣＲ増幅反応は、概して、対称的であるように、すなわち、「対応する（matched）」フォワードプライマーおよびリバースプライマーを利用して二本鎖アンプリコンを作り出すように設計され；すなわち、それらは可能な限り近い融解温度を有し、かつそれらは等モル濃度で反応物に添加される。ＰＣＲ反応において、直接的に一本鎖ＤＮＡを作り出すために限られた用途が見出されている技術は、「非対称的ＰＣＲ」である。Gyllensten and Erlich, "Generation of Single-Stranded DNA by the Polymerase Chain Reaction and Its Application to Direct Sequencing of the HLA-DQA Locus," Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85: 7652-7656 (1988)；および米国特許第５，０６６，５８４号。非対称的ＰＣＲは、プライマーの一方が制限的な量で添加され、典型的には他方のプライマーの濃度の１〜２０％の量で添加される点で対称的ＰＣＲと異なっている。
【０００４】
さらに最近、本発明者らは、「直線後指数的（Linear-After-The-Exponential）」ＰＣＲまたは、略して「ＬＡＴＥ−ＰＣＲ」として知られる非対称的ＰＣＲ増幅法を開発した。Sanchez et al. (2004) PNAS 101: 1933-1938, Pierce et al. (2005) PNAS 102: 8609-8614、および公開されている国際特許出願ＷＯ ０３／０５４２３３（２００３年７月３日）を参照のこと。前記文献は参照によりその全体が本明細書中に組み入れられる。ＬＡＴＥ−ＰＣＲでは、Ｔｍ［０］と称される増幅の出発時点でのＰＣＲプライマーの実際の融解温度を考慮に入れる。Ｔｍ［０］は、非天然ヌクレオチドが使用される場合に必要であるように、経験的に決定することができ、あるいは「近接（nearest neighbor）」法（Santa Lucia, J. (1998) PNAS (USA) 95: 1460-1465；およびAllawi, H. T. and Santa Lucia, J. (1997) Biochem. 36: 10581-10594）にしたがって、塩濃度の補正を使用して、算出することができる。本発明者らの研究では、０．０７Ｍの一価塩濃度を利用した。
【０００５】
ＬＡＴＥ−ＰＣＲの場合には低減されるＰＣＲ増幅の望ましくない特徴は、反復実験（replicates）間のばらつき（scatter）である。対数期の増幅に続いてリアルタイムで追跡される反復実験増幅はそれぞれ相違し、種々のレベルでプラトーに達する。ばらつきとは、反復実験が同一の反応キネティクスを有さず、精度を低下させることを意味する。このことはＰＣＲアッセイ全般に関する問題であるが、特にエンドポイントアッセイおよび直線期のシグナルの勾配に依存するアッセイに関して問題である。
【０００６】
ＰＣＲ増幅に伴う別の重大な問題はミスプライミングである。本発明者らの考えでは、ミスプライミングは以下の少なくとも３種のタイプで現れる：タイプ１、増幅開始前の反応混合物の調製中に生じるミスプライミング；タイプ２、サイクル温度がプライマーの融解温度よりかなり低いいずれかの温度を含む場合に、増幅中に生じるミスプライミング；およびタイプ３、高濃度のアンプリコンが作り出された後に継続されるＰＣＲ増幅の後期段階に生じるミスプライミング。第１のタイプのミスプライミングに対処するためにいくつかのアプローチが使用されている。アプローチの１つは、ポリメラーゼを化学的に修飾して、高温、例えば９５℃に加熱されるまで不活性であるようにすることである。米国特許第５，６７７，１５２号および同第５，７７３，２５８号を参照されたい。別のアプローチは、ポリメラーゼに抗体を結合させ、反応物が高温、例えば９５℃に加熱されて該抗体が不可逆的に変性するまで該ポリメラーゼを阻害することである。米国特許第５，３３８，６７１号を参照されたい。さらに別のアプローチは、反応混合物中にアプタマーを含ませることである。Doug and Jayasena (1996), J. Mol. Biol. 264: 268-278および米国特許第６，０２０，１３０号を参照のこと。アプタマーは約３０ヌクレオチド長の一本鎖オリゴヌクレオチドであり、ポリメラーゼに結合して、低温で陥凹３’末端を伸長するその能力を阻害する。アプタマーは、ＰＣＲサイクルの典型的な最高温度である９５℃で不可逆的に変性しない。Kainz et al. (2000) Biotechniques 28: 278-282では、１６〜２１ヌクレオチド長を有する、一定量の二本鎖ＤＮＡ断片をＰＣＲ反応混合物に加えると、典型的なＰＣＲ伸長温度より低い温度でポリメラーゼが阻害され、非特異的産物の合成が抑制されることが報告された。ＤＮＡ断片はＰＣＲサイクル処理中に不可逆的に変性しない。Eppendorf-5 Prime, Inc.は、温度依存的様式でＴａｑポリメラーゼに結合し、約５０℃より低い温度で二本鎖ＤＮＡに対するその結合を阻害するとされている専売のリガンドを市販している。前述の多数の試みにもかかわらず、ミスプライミングは依然としてＰＣＲ増幅に伴う問題である。
【０００７】
ＰＣＲ増幅中のミスプライミングの別の現象はプライマー二量体形成および増幅として知られている。この現象では、一方のプライマーが他方のプライマーまたは自身とハイブリダイズし、次いで３’末端の伸長を受けて、小さい二本鎖アンプリコンが生成される。その後、アンプリコンはさらに増幅されるか、あるいは多量体化されてさらに増幅されうる。プライマー二量体形成は標的の非存在下で生じうる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第４，６８３，２０２号
【特許文献２】米国特許第４，６８３，１９５号
【特許文献３】米国特許第４，９６５，１８８号
【特許文献４】米国特許第５，９９４，０５６号
【特許文献５】米国特許第５，４８７，９７２号
【特許文献６】米国特許第５，９２５，５１７号
【特許文献７】米国特許第６，１５０，０９７号
【特許文献８】米国特許第５，０６６，５８４号
【特許文献９】国際特許出願ＷＯ ０３／０５４２３３
【特許文献１０】米国特許第５，６７７，１５２号
【特許文献１１】米国特許第５，７７３，２５８号
【特許文献１２】米国特許第５，３３８，６７１号
【特許文献１３】米国特許第６，０２０，１３０号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】PCR PROTOCOLS, a guide to Methods and Applications, Innis et al.（編）, Academic Press（San Diego, CA (USA) 1990）
【非特許文献２】Gyllensten and Erlich, "Generation of Single-Stranded DNA by the Polymerase Chain Reaction and Its Application to Direct Sequencing of the HLA-DQA Locus," Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85: 7652-7656 (1988)
【非特許文献３】Sanchez et al. (2004) PNAS 101: 1933-1938
【非特許文献４】Pierce et al. (2005) PNAS 102: 8609-8614
【非特許文献５】Santa Lucia, J. (1998) PNAS (USA) 95: 1460-1465
【非特許文献６】Allawi, H. T. and Santa Lucia, J. (1997) Biochem. 36: 10581-10594
【非特許文献７】Doug and Jayasena (1996), J. Mol. Biol. 264: 268-278
【非特許文献８】Kainz et al. (2000) Biotechniques 28: 278-282
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
リアルタイム検出方法によるＰＣＲ増幅の定量的解析が可能になっていて、その場合、反応の閾値サイクルすなわちＣＴを超えると蛍光シグナルが可視になるＰＣＲサイクルにより出発標的濃度が示唆される。エンドポイント解析は良くても半定量的である。その部分的な原因は、反応が指数的増幅から脱する時の反復実験間のばらつきである。二本鎖アンプリコンの電気泳動による解析は半定量的であり、蛍光標識プライマーを利用する場合がある。蛍光標識プローブ、対立遺伝子識別プローブまたはミスマッチ寛容プローブを利用するエンドポイント解析もまた、良くても半定量的である。ばらつきを低減させ、一本鎖産物を生成することによって、ＬＡＴＥ−ＰＣＲは、エンドポイント解析における大きな改善を提供するが、反復実験間のばらつきは完全には排除されないことが多く、定量的多重検出は依然として所望の精度より低精度である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の一態様は、ＰＣＲ増幅反応において生成物の特異性を改善し、かつミスプライミングの影響を排除する、あるクラスの試薬添加剤である。該添加剤はすべてのタイプのＰＣＲにおいて既存の「ホットスタート」方法論より性能が優れていて、その使用により、反応の初期、および多数のサイクル（典型的に６０サイクル以上）を有するＬＡＴＥ−ＰＣＲ反応中のいずれにおいても、プライマー二量体およびミスプライミングされたアンプリコンを含む望ましくない生成物の蓄積を防止することができる。
【００１２】
本発明の別の態様は、ＰＣＲ増幅およびアッセイ方法、対称的ＰＣＲまたは非対称的ＰＣＲの両者であり、非限定的にＬＡＴＥ−ＰＣＲが挙げられ、ならびに前記試薬添加剤を含むキット、部分的キット、およびオリゴヌクレオチドセットである。
【００１３】
要旨
本発明の試薬は、少なくとも一部のＰＣＲ増幅においてミスプライミングの１種以上の現象を防止することが可能な添加剤である。「現象を防止する（防ぐ）」とは、反応の終了時点で、本明細書中に記載の技術、すなわち蛍光性ＤＮＡ色素、ゲル電気泳動、ＤＮＡシークエンシングおよび融点解析によって、ミスプライミングの生成物または生成物群が検出されないことを意味する。本発明に基づく試薬は、重合活性および５’−３’エキソヌクレアーゼ活性（5' - to - 3' exonuclease activity）の両方を有するポリメラーゼを利用する場合でさえ、増幅開始前に、１マイクロモル濃度（μＭ）（すなわち１０００ｎＭ）未満、好ましくは６５０ナノモル濃度（ｎＭ）以下、より好ましくは３００ｎＭ以下、最も好ましくは５０〜２５０ｎＭの比較的低い濃度でＰＣＲ増幅混合物中に含ませてよい。本発明に基づく試薬は修飾された一本鎖オリゴヌクレオチドである。本発明に基づく試薬を構築するために利用してよいオリゴヌクレオチドは広範囲のオリゴヌクレオチドである。それらはＤＮＡ、ＲＮＡまたは混合ＤＮＡ−ＲＮＡであってよい。それらは、修飾ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、例えば２’Ｏ−メチルリボヌクレオチド、非天然ヌクレオチド間結合、非ヌクレオチドリンカー、ＰＮＡ、ＬＮＡおよび付加化学部分、例えばGlenn Researchによって報告されているキャップヌクレオチド（capped nucleotides）を含有してよい。
【００１４】
本発明の試薬は、ＰＣＲ増幅反応混合物中で、一般に「ヘアピン」構造と称されるステム・ループ構造（stem-and-loop structure）を形成する一本鎖オリゴヌクレオチドであるが、それらは、ループがヌクレオチドから構成されていないステム・ループ構造から構成されていてもよい。そのような構造では、分子の中心部分が一本鎖の（ハイブリダイズしていない）ままであり（ループ）、末端は互いにハイブリダイズしてステムを形成する。ステムは平滑末端であってよく、あるいは一方の鎖が他方の末端を超えて伸長していてもよい。ステムは連続する二本鎖領域を含んでよく、あるいはそれは内部ミスマッチを含んでもよい。内部ミスマッチは隆起を生じさせる。オリゴヌクレオチドの末端によって形成されるステムの端部は、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドよりも堅固に結合するように安定化される。本発明者らは、本発明の試薬のステムをその融解温度、すなわちＴｍを参照することによって特徴付ける。融解温度とは、ステムの相補配列の５０％がハイブリダイズしておらず（開放型立体配置）、かつ該相補配列の５０％が自身にハイブリダイズしているか、あるいは部分的にハイブリダイズしている（閉鎖型立体配置）摂氏温度である。本出願では、ステムの「計算上のＴｍ」とは、Ｍ−ｆｏｌｄプログラム：Zucker, M. (2003). "Mfold Web Server for Nucleic Acid Folding and Hybridization Prediction." Nucl. Acids Res. 31: 3406-3415を使用して取得される、対応する安定化されていない完全ＤＮＡオリゴヌクレオチドのステム部分の計算上の融解温度を意味する。その場合、ナトリウム濃度が７０ミリモル濃度（ｍＭ）であり、かつマグネシウム濃度が３ｍＭであると仮定する。添加されたクエンチャーペア、好ましくは光を吸収するが、吸収エネルギーを熱として放出する非蛍光クエンチャー、例えばＤａｂｃｙｌおよびＢｌａｃｋ Ｈｏｌｅクエンチャーを有する好ましい実施形態の場合、Ｔｍは、クエンチャーを伴わないＤＮＡヘアピンについての計算上のＴｍである。末端にキャップヌクレオチドを有する実施形態の場合、Ｔｍは、同等のキャップなしのヌクレオチドを含有するＤＮＡヘアピンについての計算上のＴｍである。ステム端部の２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド含有物の場合、Ｔｍは、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドのデオキシリボヌクレオチドアナログを含有する全ＤＮＡヘアピンについての計算上のＴｍである。本発明者らは、安定化されたヘアピンの実際の融点を取得することが困難であるという実施上の理由のために本方法論を利用するが、安定化用の修飾に起因して実際の融点が計算上のＴｍより数度高いことを認識している。本発明の試薬は、９４℃を超えない計算上のステムＴｍを有し、好ましくは計算上のステムＴｍは５０〜８５℃の範囲である。一部の実施形態では、プライマーアニーリング温度より高い（典型的に増幅反応は５５〜７２℃であり、すなわち７２〜８５℃の範囲の）計算上のステムＴｍが好ましいが、他の実施形態では、プライマーアニーリング温度より低い、すなわち５０〜７１℃の範囲の計算上のステムＴｍが好ましい。ステムの相補配列は、ＰＣＲサイクル処理中の鎖融解に使用される温度である９５℃で開いて、一本鎖になる。さらに、本発明の試薬のステムは、閉鎖型、自己ハイブリダイズ型のコンホメーション（confirmation）の形成のために十分に低い温度で６ヌクレオチドを超える長さを有する。現在、本発明者らの好ましい実施形態では、９〜１２塩基対の長さ、好ましくは９〜１１塩基対、閉鎖型の場合、より好ましくは９〜１２、最も好ましくは９〜１１の、内部ミスマッチを含まない連続した相補的塩基対、最も好ましくは９〜１２塩基対の長さで、かつ完全に相補的な平滑末端型ステムであるステムを形成する。試薬の３’末端は、増幅反応においてＤＮＡポリメラーゼによって伸長可能ではなく、したがって該反応物はＰＣＲプライマーではない。すべての突出３’末端は、例えばリン酸部分または何らかのブロック用化学部分を付加することによって、伸長を防止するためにブロックされる。
【００１５】
ループの長さはかなり変動しうる。ループがヌクレオチドおよびヌクレオチド間結合からなる場合、それは少なくとも３ヌクレオチド長である。さらに、それがちょうど３ヌクレオチド長であれば、チミジン残基を含有する。現在、本発明者らの好ましいヌクレオチドループは３〜２２ヌクレオチドの範囲の長さを有する。ループは非ヌクレオチド化学リンカー、例えばアルキレン鎖であってもよい。炭素鎖リンカーに関しては、３〜６炭素原子の長さが好ましく、最も好ましい長さは３炭素原子である。アルキレン炭素鎖において、さらに、炭素鎖の各メンバーの残りの２価電子は共有結合に関与する。そのような結合は、水素原子、短鎖アルキル基または短鎖アルキレン基、試薬を固体表面に連結するための置換基を対象としうる。化学リンカーを含む非オリゴヌクレオチドループは炭化水素鎖に限定されず、ヘテロ（炭素または水素でない）原子を含んでよい。化学リンカーはポリメラーゼに結合しないように電気的に中性であることが好ましい。試薬の活性はステムの閉鎖型コンホメーション（confirmation）に依存するため、５個を超えるヌクレオチドのループを有する試薬に関して、ループの組成は、反応中の、または反応によって生成される、任意の他の配列または配列群に対して広範囲にわたって相補性であるわけではないことが好ましい。本発明に基づく試薬は、増幅反応のいずれの生成物に対するハイブリダイゼーションプローブでもなく、生成物の蓄積をシグナルしない。
【００１６】
上記のように、本発明に基づく試薬は、ループの反対側のステムの端部を安定化して、該ステムの端部がＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの端部よりも堅固に結合するようにすることを含む。本発明者らの現在の最も好ましい実施形態では、ステムを平滑末端にし、天然ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドと比較して部分的鎖分離を阻害する様式で該ステムの末端を修飾する。本発明者らは、安定化用の相互作用性化学部分をステムの端部に付加する効果、市販のリンカーを用いてステムの３’および５’ヌクレオチドに共有結合によって付加される１ペアのＤａｂｃｙｌ部分および１ペアの市販のＢｌａｃｋ ＨｏｌｅＴＭクエンチャー（Biosearch Technologies, Novato, CA, U.S.A.によって市販されている専売のクエンチャー）の両者の効果を以下で実証する。また本発明者らは、ステムの端部で、強力に結合する非天然ヌクレオチド、２’Ｏ−メチルリボヌクレオチドを利用する効果を実証する。試薬が増幅および増幅アッセイにバックグラウンド蛍光を付与しないように、好ましい安定化用部分は非蛍光性である。本発明の試薬の、安定化されていないオリゴヌクレオチドＤＮＡヘアピンを、１μＭ未満の濃度で加えても、水素結合しているステム末端を安定化するよう上記のように修飾されていない場合はミスプライミングを必ずしも実質的に低減せず、多くの場合でそうならない。ゆえに、本発明の試薬において安定化は必須である。
【００１７】
本発明のヘアピン試薬は、６個を超える塩基対からなるステムを形成できるようにつながり合う２つの相補的ヌクレオチドオリゴマーを含有する分子と説明することができ、該ステムの開放端は、該ステムがその開放端でほどけるか、あるいは「ほつれる」傾向が抑制されるように、何らかの手段によって化学的に修飾される。作用の分子的メカニズムの徹底的な理解には、本発明の試薬の存在および非存在下での酵素キネティクスによる追加の分析、ならびに電子顕微鏡観察、核磁気共鳴、およびＸ線結晶構造解析による前記試薬とポリメラーゼとの相互作用についての構造解析が待たれるが、本明細書および科学文献中に示されている情報に基づいて、メカニズムの部分的な解釈を予想することができる。該文献は、Ｔａｑポリメラーゼが、他のＤＮＡポリメラーゼと同様に、合成ドメインおよび５’エキソヌクレオチド分解性（exonucleolytic）ドメインからなることを教示している。５’エキソヌクレオチド分解性ドメインはＳｔｏｆｆｅｌ断片には存在しない。該文献は、さらに、合成ドメインがまず二本鎖ＤＮＡに結合し、それに沿ってスライドすることによってＤＮＡ重合を実行することを教示している。合成ドメインは「広げた手」に例えられている形状を有し、ｄＮＴＰの存在下で、二本鎖ＤＮＡと接触すると、ポリペプチドレベルで形状変化を受ける。その結果、「手」の「指」が二本鎖ＤＮＡ分子を取り囲んで「閉じる」。二本鎖分子内のミスマッチ配列に起因して、ポリメラーゼは数ヌクレオチド後退し、合成ドメインの３’編集機能を使用して正しい塩基で置換する。酵素が鋳型鎖を読んで、相補的プライマーの３’末端を伸長するにつれて新規ＤＮＡ鎖の合成が生じる。酵素が、鋳型鎖にすでに結合しているオリゴヌクレオチドの５’尾部に遭遇した場合、ポリメラーゼは結合済みオリゴヌクレオチドの領域に１〜２ヌクレオチド侵入し、酵素の５’エキソヌクレアーゼドメインを用いて、得られた５’尾部を切断することができる。
【００１８】
この情報に基づいて、本発明の試薬の二本鎖ステムが、少なくとも部分的には、開放型コンホメーションにおいてポリメラーゼの合成ドメインに結合し、それを閉鎖型にすることによって機能すると仮定することができる。ポリメラーゼの合成活性はそれによって阻害される。ゆえに、いかなる理論にも拘束されることを望まないが、第１の作用様式がポリメラーゼの合成活性についての温度依存的インヒビターとしての様式であると仮定することができる。以下に挙げる証拠は、少なくともいくつかのバージョンの試薬が、その二本鎖領域、例えばステムの融解温度で酵素から遊離せず、特に典型的なＰＣＲ伸長温度を含めたより高い温度でも結合したままであることを示すものである。しかし、ＰＣＲサイクルの変性（すなわち鎖融解）ステップ中は、本発明の試薬はＤＮＡポリメラーゼに結合していない状態になる。典型的に９０℃を超えるＰＣＲサイクルの変性ステップ（鎖融解ステップとも称される）中には、本発明のヘアピン試薬のステムは融解して離れ、該二本鎖領域が再形成するために十分に温度が低下した場合にのみ、その時点で、それらは再びポリメラーゼに結合する。したがって、第一の変性までの間だけ二本鎖であり、すなわち増幅前に（一般に室温で）ＰＣＲ反応混合物に加えた時点では二本鎖であるが、その後、そのステムのＴｍを超える温度で維持される、本発明の試薬を設計することを選択することができる。そのような実施形態では、すべての増幅サイクルのプライマーアニーリング温度および任意のＬＡＴＥ−ＰＣＲ低温検出温度は、計算上のステムＴｍより高く、好ましくは少なくとも５℃高い。あるいは、増幅中の後期に再び二本鎖になる、本発明の試薬を設計することを選んでもよい。その設計は、すべてまたは一部の増幅サイクルで使用されるプライマーアニーリング温度より高いステムＴｍ（記載されているように算出される）を利用することによって達成することができる。あるいは、ＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅において、プライマーアニーリング温度より低いが、低温検出温度より高いステムＴｍを利用することによって、その設計を達成することができる。前者の設計タイプは、概して、ＣＴの遅延によって示されるように重合を阻害しないが、一方、ステムＴｍより低いプライマーアニーリング温度を利用すると、概して、１〜３増幅サイクルの中程度のＣＴの遅延が生じる。
【００１９】
さらに、いかなる理論にも拘束されることを望まないが、本発明に基づく試薬の第２の作用様式が、ポリメラーゼの５’エキソヌクレオチド分解活性についての温度依存的インヒビターとしての様式であると仮定することができる。本発明者らは、本発明の試薬が、少なくとも５５℃までの温度でポリメラーゼ酵素の５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を阻害し、その阻害は、酵素が（ＰＣＲ増幅においてＰＣＲプライマーが伸長されるにつれて）ＤＮＡ鎖をその３’末端の重合によって伸長する能力を過度に抑制することなく行われることを以下に示す。
【００２０】
さらに、いかなる理論にも拘束されることを望まないが、本発明の試薬の第３の作用様式が、ポリメラーゼに結合し、該ポリメラーゼのポリペプチドの形状を変化させる温度依存的リガンドとしての様式であると仮定することができる。前記リガンドが酵素から遊離すると、該酵素は、いくらかの時間、変化した形状のままであり、その後、その元の形状に戻る。変化した形状であるうちは、酵素は、部分的にミスマッチしたプライマー−鋳型ハイブリッドと比較して、完全に相補的なプライマー−鋳型ハイブリッドに優先的に結合する。
【００２１】
このモデルに基づいて、本発明の試薬のステムがポリメラーゼの合成ドメインの形状を変化させる能力が、本発明の試薬がポリメラーゼの合成機能（上記第１の様式）またはポリメラーゼの５’エキソヌクレアーゼ機能（上記第２の様式）を阻害する能力とは異なっていると予想することができる。第１の作用様式および第２の作用様式は両者とも、結合している試薬がポリメラーゼから遊離する速度に実際に依存する。速やかに遊離する本発明の試薬は、第３の様式によって優先的に作用し、高濃度でさえ、ポリメラーゼの合成活性を大きく阻害することはない。対照的に、ポリメラーゼからゆっくり遊離する本発明の試薬は高濃度では阻害性である可能性が高い。一例として、ステムと３つのメチレン（−ＣＨ２−）基からなる炭素リンカーループとにより構成される化合物１２−Ｃ３ＤＤも、ステムと６つのメチレン（−ＣＨ２−）基からなる炭素リンカーループとにより構成される化合物１２−Ｃ３Ｃ３ＤＤも、３０００ｎＭの濃度でＰＣＲ増幅を部分的にしか阻害しない。対照的に、ヌクレオチドにより構成されるループを有する本発明の試薬は、典型的には、実施例１のアッセイにおいて、ＰＣＲ増幅を＜１０００ｎＭの濃度で完全に阻害し、時には＜５００ｎＭ未満の濃度で阻害する。
【００２２】
タンパク質−核酸相互作用に詳しい当業者が認識するように、本発明の試薬の作用は様式１〜３のうち２つ以上に基づくものでありうる。それらは相互に排他的ではなく、むしろ関連している。以下に記載されるように、ステムを含んでなる２つのオリゴヌクレオチドを連結する特定の分子構造が、化合物全体を（第１の様式または第２の様式によって）酵素インヒビターとして作用させるか、あるいは第３の作用様式で主に酵素特異性のエンハンサーとして作用させる程度を決定するために使用できる定量的試験（実施例１４）を本発明者らは考案した。
【００２３】
上記モデルに基づいて、さらに、１種以上のポリメラーゼ分子を本発明の試薬の等しい数の分子と結合させ、次いでそれを、より大きい部分、例えばビーズ、粒子、または固体材料からなる材料に共有結合によって結合させることができることを予想できる。それにより、固体物にポリメラーゼが「積載」されていると考えることができる。固体物への本発明の試薬の結合は、一時的であってよく、あるいは当技術分野において公知の種々の手段によって切断可能であってよい。結合が切断されると、試薬または試薬−ポリメラーゼ複合体が溶液中に放出される（その後、該試薬はポリメラーゼから遊離しうる）。
【００２４】
本発明の試薬の設計は当分野の技能の範囲内である。ステムの融解温度は、そのＧＣ含量を変動させることによって、かなり調節できることが理解される。例えば、以下に記載される２つの好ましい実施形態のステムは、いずれも、９ヌクレオチドの長さを有するが、それらは２５℃異なる計算上のＴｍ（８１℃および５６℃）を有する。本発明者らは通常、ステムＴｍの算出に関して、上で引用したＭ−ｆｏｌｄコンピュータソフトウェアプログラムを１種以上のループ配列候補について使用する。ループ配列が、それ以外の点で、本発明のミスプライミング試薬において重要であることは見出されていない。本発明者らの設計では、完全な平滑末端のステム、すなわち内部ミスマッチおよび末端突出部を有しないステムを形成する配列を利用する。そして、簡単な試行によって、内部ミスマッチ（実施例１に示されるように、末端ミスマッチは不安定であり、許容されない）の導入または二本鎖領域を超える１個または最大２個のヌクレオチドの短い伸長の影響を評価することができる。
【００２５】
本発明の試薬の構築は当分野の技能の範囲内である。例えば、オリゴヌクレオチド配列をオリゴヌクレオチド合成機で調製することができる。公知の方法を使用して安定化用部分を含ませることができる。例えば、ｄａｂｃｙｌ化カラム（Glen Research）を用いて出発し、Ｄａｂｃｙｌで修飾されたヌクレオチドで合成を終えることによって、好都合にＤａｂｃｙｌを付加することができる。合成の最初、および最後から２番目、および最後のヌクレオチドとして非天然ヌクレオチドを使用することができる。
【００２６】
候補試薬を設計し、構築した後、一部の場合には、蛍光性ＤＮＡ結合色素を加え、該色素を刺激しながら融解解析を実施することによって、そのステムの融解温度を経験的に概算することができる（色素自体がＴｍに対して効果を有することを認識して行う）。また、本発明の試薬の安定化されたステムの実際の融解温度に関する実施上有用な情報を、多くの場合、種々のアニーリング温度を利用するリアルタイムＰＣＲ増幅を実施することにより推定的に取得することができる。必要であればステムの長さまたはＧＣ含量の調節を施して、所望のＴｍを達成することができる。そして本発明者らは、ミスプライミングおよび増幅効率の種々の現象に対する候補試薬の効果を、以下の実施例１に記載されるような厳密なＰＣＲ増幅におけるその性能を決定することによって評価する。候補試薬は、実施例１の反応混合物に１０００ｎＭ未満、好ましくは６５０ｎＭ以下のいずれかの濃度で加えられた場合に純粋なアンプリコンが取得されれば、本発明の試薬であると判断される（図１を参照のこと）。本発明者らは、所望の標的および所望のプライマーを用いること以外は実施例１のアッセイを使用して候補アッセイを評価する。しかし、本発明の増幅およびアッセイ（増幅および検出）は実施例１の条件または手順に限定されない。本発明の試薬は、２５μＬの反応混合物あたり１．２５単位のポリメラーゼ濃度（実施例１）と比較して、１０００ｎＭ未満の濃度で加えられた場合に、ミスプライミングの少なくとも１種の現象を阻害する必要があるが、該試薬はポリメラーゼ濃度に対する任意の有効な濃度；すなわち、ミスプライミングを防止するが、増幅を実質的に妨害しない任意の濃度（すなわち相対濃度）で使用することができる。評価において所望のプライマーを利用すると、意図せぬ結果、例えば試薬の３’末端が遮断されないことまたは相補性の見落としが明らかになる。
【００２７】
本発明には、ＰＣＲ増幅反応およびＰＣＲ増幅反応を含むアッセイが含まれ、そのようなものとしては、増幅反応混合物が、重合活性および５’−３’エキソヌクレアーゼ活性のいずれをも有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、例えばＴａｑＤＮＡポリメラーゼを含み、かつ本発明の少なくとも１種の試薬が該増幅反応混合物に含まれる反応が挙げられる。本発明の多数の試薬はポリメラーゼの活性を阻害するものであり、熱サイクル処理前または処理中に上記範囲内のポリメラーゼ濃度に対して相対的な濃度、すなわち２５μＬの反応容量あたり１．２５単位のＤＮＡポリメラーゼを含有する反応に関して１０００ｎＭ以下、好ましくは６５０ｎＭ以下の濃度で加えられる。本発明のいくつかの試薬は、１０００ｎＭ未満の濃度、好ましくは６５０ｎＭ未満の濃度で有効であるが、ポリメラーゼの活性を低い程度にしか阻害せず、前記ポリメラーゼ濃度に関して１５００ｎＭまでの濃度で、あるいは３０００ｎＭでさえ加えることができる。本発明の２種以上の試薬を含有するアッセイでは、各試薬は各自のＴｍを有するステムを有することができ、それを各自の濃度で加えて、増幅プロセス中のステップの種々の部分で種々の試薬が機能するようにすることができる。本発明の試薬が熱サイクル処理中に加えられる場合、反応混合物を作業領域に引き込むことなく加えられるべきであろう。そのような増幅反応としては、対称的ＰＣＲ増幅、非対称的ＰＣＲ増幅およびＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅が挙げられ、それらはいずれも、ＲＮＡ標的が関与する場合には逆転写をさらに含んでよい。ＰＣＲ増幅を使用し、任意の目的で、例えばジデオキシシークエンシングの出発材料として増幅産物を調製することができる。アッセイにおいてＰＣＲ増幅を増幅産物の検出と組み合わせてよく、そのようなアッセイとしては、特に、標識プライマー、標識プローブまたは蛍光性ＤＮＡ結合色素、例えばＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎまたは臭化エチジウムを使用するホモジニアスアッセイが挙げられる。前記アッセイは、検出の読み取り値が複数の増幅サイクル中に取得されるリアルタイムアッセイであってよく、あるいは増幅の完了後に検出が実施されるエンドポイントアッセイであってよい。それは定性的または定量的であってよく、非限定的に、定量的エンドポイントアッセイが含まれる。前記アッセイは、単一の二本鎖産物または一本鎖産物、または２種以上の二本鎖産物を、関連の一本鎖産物を伴わず、あるいは伴って、増幅するように設計することができる。
【００２８】
本出願で使用される「ＬＡＴＥ−ＰＣＲ」とは、おおむね十分なＰＣＲサイクル中に使い果たされて蛍光によって検出可能な二本鎖アンプリコンを生じるように、それ自体は２００ｎＭまでの低濃度で利用される一方のプライマー（「制限的プライマー（Limiting Primer）」）と比較して少なくとも５倍過剰のもう一方のオリゴヌクレオチドプライマー（「過剰プライマー」）を利用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プロセスを使用する、非対称的ＤＮＡ増幅を意味し、その場合、増幅の開始時点での制限的プライマーの、濃度について補正した融解温度Ｔｍ［０］は、増幅の開始時点での過剰プライマーの、濃度について補正した融解温度Ｔｍ［０］Ｘより高いか、あるいは最大５℃まで低く、好ましくは３〜１０℃高く；ならびに、熱サイクル処理は制限的プライマーが使い果たされた後に複数サイクル継続されて、一本鎖産物、すなわち過剰プライマーの伸長産物を生じる。ＬＡＴＥ−ＰＣＲアッセイは、少なくとも一部の直線的増幅サイクル中にプライマーアニーリング温度より温度を下げる低温検出ステップを含んでよい。好ましくは、鎖融解前の伸長後に当該ステップを行う。
【００２９】
また本発明は、完全ＰＣＲキット、部分的キット、およびオリゴヌクレオチドセットを包含する。完全ＰＣＲ増幅キットは、少なくとも、ＰＣＲ増幅またはアッセイを実行するためのすべての試薬を含み、少なくとも１ペアのＰＣＲプライマー、ｄＮＴＰ、反応バッファー、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（好ましくは５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ）、および少なくとも１種の本発明の試薬が含まれる。ホモジニアスＰＣＲアッセイのための完全キットは、必要とされる任意の追加検出試薬、例えば蛍光性ＤＮＡ色素または蛍光標識プローブをさらに含む。いずれのタイプの完全キットも、好ましくはサンプル調製用の試薬を含み、一部の実施形態では、逆転写酵素を含んでよい。本発明の部分的キットは、完全キットの少なくとも一部の構成要素を省略するが、少なくとも熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（および、必要であれば、逆転写酵素）および少なくとも１種の本発明の試薬を含む。例えば、商業的に「マスターミックス（master mix）」または「基本キット（basic kit）」として公知の製品は、典型的には、ＰＣＲプライマーおよびプローブを省略する。好ましい部分的キットは、サンプル調製のためのものを除いて、増幅またはアッセイに必要とされるすべての試薬を含む。本発明に基づくオリゴヌクレオチドセットは、少なくとも１ペアのＰＣＲプライマーおよび少なくとも１種の本発明の試薬を含む。それらはオリゴヌクレオチドプローブまたはシークエンシングプライマーをさらに含んでよい。
【００３０】
本発明の１種以上の実施形態の詳細は添付の図面および以下の説明中に記載される。本発明の他の特徴、目的、および利点は、その説明および図面から明らかになり、さらに特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【００３１】
図面の説明
種々の図面中の参照記号などは要素などを示す。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】本発明に記載の試薬の阻害活性を試験するために設計したミスプライミングエラーに関する厳密な定性的ＰＣＲアッセイから得たサンプルのゲル電気泳動解析を示す。
【図２】本発明の試薬によってＰＣＲベースのリアルタイムアッセイおよびエンドポイントアッセイが可能になることを示す。
【図３】本発明に記載の試薬を使用し、ミスプライミングエラーの非存在下で７０サイクルのＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅後に生成された一本鎖ＤＮＡ産物から取得したＤＮＡ配列クロマトグラフを示す。
【図４】五重（pentaplex）ＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅に対する化合物９−３ＤＤの効果を示す。
【図５】本発明の試薬がＴａｑポリメラーゼに結合すると、ＰＣＲサイクル処理温度が変性ステップに達するまでそれらはポリメラーゼから遊離しないことの証拠を示す。
【図６】２５℃でのＤＮＡポリメラーゼ活性に対する効果に関する、本発明の試薬の直接比較を示す。
【図７】ポリメラーゼ活性の非存在下で、ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性に対する、本発明に基づく試薬の効果を評価するためのアッセイを示す。
【図８Ａ】対称的ＰＣＲアッセイにおいてミスプライミングを防止する本発明に基づく試薬の能力を示す。
【図８Ｂ】対称的ＰＣＲアッセイにおいてミスプライミングを防止する本発明に基づく試薬の能力を示す。
【図９】エキソヌクレアーゼ阻害を定量化するためのアッセイを示す。
【図１０】ＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅でのプライマー二量体およびプライマーオリゴマーの形成に対する、本発明の試薬の用量依存的効果を示す。
【図１１】２ペアのプライマーを用いる２種の標的配列についての二重ＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅に対する、低濃度の試薬９−２２ＤＤの効果を示す。
【図１２】２ペアのプライマーを用いた２種の標的配列についての二重ＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅に対する、試薬９−３ＤＤのステム組成を変化させることの効果を示す。
【図１３】２ペアのプライマーを用いる２種の標的配列についての二重ＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅に対する、試薬９−３ｂＤＤの濃度を変化させることの効果を示す。
【図１４】ＣＴ値に関して、ＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅の効率に対する試薬９−３ＤＤの濃度上昇の効果を示す。
【図１５】蛍光シグナル勾配および最終蛍光に関して、ＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅の効率に対する試薬９−３ＤＤの濃度上昇の効果を示す。
【図１６】本発明の化合物の混合物を用いるか用いないで実行された多重反応の産物を示す。
【図１７】化合物１２−３ＤＤの作用に関する試験の結果を示す。
【図１８】化合物１２−Ｃ３ＤＤの作用に関する試験の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
詳細な説明
上記のように、本発明者らは、ミスプライミングエラーの３種の異なるタイプおよび原因であると考えられるものを特定した。全３タイプのミスプライミングを評価するために、本発明者らは以下の実施例１に示す厳密なアッセイを開発した。増幅は剪断ＤＮＡを用いて開始され、これはミスプライミングを促進する。物理的操作、例えばＤＮＡをピペット内に吸い込むことによって、ＤＮＡは剪断されやすい。さらに、「ホットスタート」試薬および方法によってはタイプ１のミスプライミングしか防止できないので、本発明者らは多数の温度サイクル（少なくとも６０サイクル）をアッセイに組み入れた。さらに本発明者らは、一部のＬＡＴＥ−ＰＣＲアッセイで利用される低温検出ステップを組み入れた。さらにまた、本発明者らは、プライマー二量体の形成およびさらにそれらのオリゴマー形成および増幅を追加のタイプのミスプライミングとして認識している。プライマー二量体形成および増幅は、添加鋳型ＤＮＡの存在下および非存在下の両方で生じうるものであり、本発明者らはこれらの現象に関するアッセイをさらに開発した。
【００３４】
ホットスタート酵素は、高温、例えば９５℃に加熱されると生じる不可逆的な変化のために、増幅の開始前にしか有効でないが、本発明のミスプライミング試薬は不可逆的に変性せず、低温ステップが含まれる場合、反応の後期に、正の効果もしくは負の効果、または両者を有しうる。
【００３５】
特定のサイクル温度より高いか、またはそれより低い融解温度Ｔｍを有し、増幅に対して種々の影響を有するステムを設計することができる。ステムの設計では、好ましくは、融解が、一定の温度範囲にわたって起こる動的現象であり、このときＴｍは、５０パーセントの分子が二本鎖形態であり、かつ５０パーセントが一本鎖形態である温度を指定するものであることが考慮される。本発明者らは、一部の閉鎖型ステムがポリメラーゼに結合すると、ポリメラーゼに未結合のままである分子間の平衡が、より多くのステムが閉鎖型になる方へシフトすると考えている。特定のサイクル温度、例えばプライマーアニーリング温度で大多数のステムが閉鎖型であることが所望であれば、一般に、その温度より少なくとも５℃高い計算上のＴｍを有する無修飾のオリゴヌクレオチドステムを用いて出発し、その場合、安定化用のステムの修飾によって実際のＴｍが数度上昇することを認識している。反対に、特定のサイクル温度で大多数のステムが開放型であることが所望であれば、一般に、該特定のサイクル温度より少なくとも５℃低く、好ましくは少なくとも約１０℃低い計算上のＴｍを有する無修飾のオリゴヌクレオチドステムを用いて出発し、その場合も、安定化用のステムの修飾によって実際のＴｍが数度上がる可能性が高いことを認識している。
【００３６】
以下の実施例５で実証されるように、本発明の特定の試薬を種々のプライマーアニーリング温度とともに利用すると、増幅効率に対する種々の効果を有しうる。以下で考察される、本発明者らが現在意図している実施形態の１つ（化合物９−２２ＤＤ）では、８１℃の計算上のＴｍを有する。温度が鎖融解温度（例えば９５℃）からプライマーアニーリング温度（例えば５５℃）に下がるにつれて、前記化合物はすべての典型的なＰＣＲ熱サイクル中に閉鎖型になる。そのようなステムを有する試薬は増幅の各サイクル中に効果を有する。別の現在の本発明者らの好ましい実施形態（化合物９−３ＤＤ）では、５６℃の計算上のＴｍを有する。ＰＣＲ増幅混合物が室温で調製される時に、この試薬は閉鎖型のステムを有し、ポリメラーゼに結合する。増幅の開始時点で温度が上がっても、試薬は結合したままである。ポリメラーゼ結合型の９−３ＤＤ分子は最初の高温ステップ中に結合がはずれて開放型になり、未結合分子のステムが閉鎖型になるほど十分に温度が下がらない限り、ポリメラーゼに再結合しない。ゆえに、最低サイクル温度を６５℃で維持することによって、ステムは再形成しない。これらの条件下では、本実施形態は、該増幅において、増幅の開始前に生じるミスプライミングを防止するホットスタート試薬として機能する。しかし、ＬＡＴＥ−ＰＣＲサイクルにおける伸長後の、増幅の直線期に蓄積する一本鎖に対する低温分子ビーコンまたは他の標識プローブのハイブリダイゼーションを可能にする低温検出ステップ、例えば、４０℃でのインキュベーションを含ませる場合、５６℃の計算上の融解温度を有するステムは閉鎖型になり、高温の鎖融解が達成されるまで試薬がポリメラーゼに再結合することが可能になる。
【００３７】
以下の実施例１では、本発明の試薬の性能を評価するために本発明者らが利用する厳密なＬＡＴＥ−ＰＣＲアッセイを記載する。図１は、「通常の」ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、すなわち５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有するが、ホットスタート修飾を有しない熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いた場合（レーンｂおよびレーンｃ）だけでなく、ホットスタートＴａｑポリメラーゼを用いた場合（レーンｄおよびレーンｅ）にもミスプライミングエラーが起こることを示す。図１は、さらに、ホットスタートポリメラーゼを用いる増幅（レーンｈおよびレーンｉ）に対してだけでなく、通常のＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いる増幅（レーンｆおよびレーンｇ）に対しても、３００ｎＭの濃度で試薬９−２２ＤＤを加えることによって達成される、ミスプライミングエラーにより形成される非特異的産物の排除、および所望の特異的産物しか存在しないことを示す。実施例１に記載のアッセイを利用して、ミスプライミングの抑制に関する化合物９−２２ＤＤおよび９−３ＤＤの有効性を評価した。両化合物はタイプ１のミスプライミングを抑制することがわかった。９−３ＤＤのステムの計算上のＴｍは低い（５６℃）ので、すべてのサイクル温度が６０℃以上であるＰＣＲ増幅プロトコルを利用することによって、それを単に有効なホットスタート試薬として使用することが可能である。ステムの融点より高いままであることによって、増幅が進行してもステムは再形成されない。化合物９−３ＤＤをそのように使用しても重合効率に対して阻害効果を有しない。以下の実施例５はこれに関して有益な情報を提供する。実施例５では、試薬９−３ＤＤならびに６５℃および５５℃のアニーリング温度を利用する増幅を比較する。６５℃が利用される場合、ＣＴが反映するように重合効率に対する影響はないことがわかった。しかし、５５℃が利用される場合、ＣＴは遅延した。このことは、ステムが閉鎖型になり、ポリメラーゼが結合するほど十分に温度が下がった場合に、プライマー伸長のために温度が上がっても、プライマー伸長温度がステムのＴｍより高い場合でも、結合が継続することの証拠である。一方、９−２２ＤＤのステムのＴｍは高い（８１℃）ので、毎ＰＣＲサイクルのプライマーアニーリングステップ中にステムが再形成されてヘアピンになることが可能である。この化合物は、タイプ１のミスプライミングだけでなく、タイプ２のミスプライミング、タイプ３のミスプライミング、およびプライマー二量体形成の現象をも防止する。しかし、この化合物は重合効率に実際にいくらか影響する。このことは、１００ｎＭの濃度で使用された場合に、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ １または標的特異的分子ビーコンプローブを用いてリアルタイムで追跡したＰＣＲ増幅の閾値サイクル（ＣＴ）が１．５サイクル遅延することによって示される。
【００３８】
実施例１の表Ｉは、図１のレーンｆおよびｇに示されるように、ホットスタート型ではなく通常のＴａｑＤＮＡポリメラーゼを使用して、一連の添加剤に対する前記厳密なアッセイの適用を報告し、さらに、ミスプライミングの現象の防止、すなわちミスプライミングエラーにより形成される検出可能なレベルの非特異的産物の回避を達成するために、および所望の特異的増幅産物しか存在しないことを達成するために必要な最低濃度を報告する。表Ｉでは、化合物は本発明者らの用語体系によって特定される。無修飾のヘアピン分子はステムループの長さによって特定される。例えば、化合物６−２２は６ヌクレオチド長のステムと２２ヌクレオチド長のループとを有する。そのループ識別名は数字で始まるか、あるいは数字のみである（「２２」または「３ｂ」）ため、該ループはヌクレオチドである。非ヌクレオチドループは別に指定される。化合物１２−Ｃ３Ｃ３は１２ヌクレオチド長のステムと、６炭素鎖、すなわち６つのメチレン（ＣＨ２）基の鎖であるループとを有する。基本となるヘアピンの一端または両端に種々の修飾を施した。これらの修飾は接尾辞によって指定され、その場合、３Ｄは３’末端ヌクレオチドに付加されたＤａｂｃｙｌ（５’−ジメトキシトリチルオキシ−５−［（Ｎ−４’−カルボキシ−４−（ジメチルアミノ）−アゾベンゼン）−アミノヘキシル−３−アクリルイミド］−２’−デオキシウリジン−３’−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホルアミダイト）であり、５Ｄは５’末端ヌクレオチドに付加されたＤａｂｃｙｌであり、ＤＤは両末端ヌクレオチドに付加されたＤａｂｃｙｌであり、ＢＨＱＢＨＱは両末端ヌクレオチドに付加されたＢｌａｃｋ Ｈｏｌｅクエンチャーであり、ＦＦは両末端ヌクレオチドに付加された蛍光団（この場合はＦＡＭ）であり、ＡＡは両末端ヌクレオチドに付加されたアデノシン（Ａ）であり、ならびにＴＴは両末端ヌクレオチドに付加されたチミジン（Ｔ）である。
【００３９】
付加に加えて、基本となるステムにいくつかの修飾を施した。接尾辞２’ＯＭ４とは、４個の末端ヌクレオチド、各ステムオリゴヌクレオチド上の最後の２個、またはアーム、がデオキシリボヌクレオチドから２’−Ｏ−メチルヌクレオチドに変更されたことを示す。ステムの融解温度を変更するために、本発明者らはそのＧＣ含量を変更した。ステムの長さではなくステムの配列が変更された化合物を、末端修飾の接尾辞の前の小文字識別子によって示す。例えば、９−３ｂＤＤまたは９−３ｉＤＤである。表Ｉの種々の化合物に関するヌクレオチド配列を表ＩＩに挙げる。その配列は、使用された炭素鎖ループを同時に示す。表Ｉはいくつかの点で有益な情報を提供する。例えば、表Ｉは、前記アッセイにおいて、無修飾のＤＮＡヘアピンオリゴヌクレオチドが有効ではないか、または１０００ｎＭ以上の高濃度でしか有効でないことを示す。オリゴマー９−２２（９ヌクレオチド長のステム、２２ヌクレオチド長のループ）は３０００ｎＭの濃度でしか有効でなかった。これは二本鎖ＤＮＡによるミスプライミング抑制に関して報告された量である。オリゴマー６−２２（６ヌクレオチド長のステム、２２ヌクレオチド長のループ）および９−５（９ヌクレオチド長のステム、５ヌクレオチド長のループ）は３０００ｎＭの濃度でさえ有効でなかった。しかし、９−２２オリゴマーを、そのステムの両端にＤａｂｃｙｌ部分を付加することによって修飾して、本発明に基づく好ましい試薬である化合物９−２２ＤＤを作成した場合、ミスプライミングの現象を防止するために５０ｎＭの濃度で十分であった。９−３オリゴマーを同様に修飾した場合、１００ｎＭの濃度で十分であった。
【００４０】
表Ｉはステムの長さの影響を示す。９ヌクレオチドおよび１２ヌクレオチドのステムを有するいくつかのオリゴマーは、１ペアの相互作用性Ｄａｂｃｙｌクエンチャーで修飾した場合に、低濃度でミスプライミングを排除したが、オリゴマー６−２２は修飾によりそのような効果を示さなかった：組成物６−２２ＤＤ（本発明の試薬ではない）は高濃度（３０００ｎＭ）でしか有効でなかった。本発明の試薬は、６ヌクレオチドより長く、ほとんどの場合で１４塩基対より短いステムを有する。現時点では、１４塩基対より短い長さが好ましい。
【００４１】
また表Ｉは、ステムの末端での結合強度を増大させる他の修飾の有効性を示す。１ペアの相互作用性Ｂｌａｃｋ ＨｏｌｅＴＭクエンチャーをオリゴマー９−５のステムに付加して試薬９−５ＢＨＱＢＨＱを作成したところ、ミスプライミングエラーにより形成される非特異的産物の排除、および所望の特異的増幅産物しか存在しないことを達成するために、該試薬は１００ｎＭの濃度で十分であった。オリゴマー９−５の各末端を２個の２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドで置換して試薬９−５ ２’ＯＭ４を作成したところ、該試薬は５０ｎＭの濃度で十分であった。
【００４２】
表Ｉはオリゴヌクレオチドループの長さをかなり変動させることが可能であることを示す。３ヌクレオチド（試薬９−３ＤＤ）、５ヌクレオチド（試薬９−５ＤＤ）、および２２ヌクレオチド（試薬９−２２ＤＤ）のすべてのループ長で、１００ｎＭ以下の濃度でミスプライミングを防止する本発明の試薬が得られた。同時に、表Ｉは、最適化のためにいくらかの試行錯誤による調整が必要であることを示す。オリゴマー９−５の安定化用の修飾においてＤａｂｃｙｌクエンチャーの代わりに１ペアの２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドを用いる場合（試薬９−５ ２’ＯＭ４と試薬９−５ＤＤの比較）、有効性のレベルは変わらない：５０ｎＭの濃度で十分である。しかし、修飾型オリゴマー９−３に同じ変更を施すと（試薬９−３ ２’ＯＭ４と試薬９−３ＤＤの比較）、有効性のレベルは、依然として良好ではあるが減少した：５０ｎＭの濃度ではなく３００ｎＭの濃度が必要とされた。同データは、試薬９−３ ２’ＯＭ４のループ長を２ヌクレオチド増加させて、試薬９−５ ２’ＯＭ４を作成すると、有効性が改善されたことを示す：３００ｎＭの濃度ではなく５０ｎＭの濃度で十分であった。実施例１に記載されるアッセイのような厳密なアッセイを用いて、候補薬物をルーチンの方法で評価し、調節することができる。
【００４３】
また表Ｉは、非ヌクレオチドブリッジ（ループ）によって逆の極性でつながり合う２つの相補的オリゴヌクレオチドからなる化合物もまた、そのオリゴヌクレオチドの自由な３’末端および５’末端を本発明にしたがって（試験された実施形態では、Ｄａｂｃｙｌ部分によって）修飾した場合に、活性であることを示す。表Ｉは、非ヌクレオチドブリッジのサイズが重要ではないことを示す。表Ｉに記載のブリッジは３〜６炭素原子の線状鎖からなる化学リンカーであるが、当業者は、非ヌクレオチドブリッジ（ループ）について多数の他のバリエーションを作成することができる。表Ｉのデータは、同一オリゴヌクレオチドステムに関して３炭素原子鎖のブリッジが６炭素原子鎖のブリッジより良好である（より低い濃度で活性である）ことを示唆し、厳密に試験されてはいないが、その差異がブリッジの相対的な可動性および、その結果として、ステムの融解温度を上げるかまたは下げるそれらの効果もしくは能力を反映すると仮定される。本発明者らは、好ましい化学的に中性のリンカー（無電荷）を利用する。
【００４４】
本発明の試薬および方法の種々の適用が以下の実施例２〜４に例示される。実施例２では、リアルタイムアッセイであるＬＡＴＥ−ＰＣＲアッセイにおける、試薬９−２２ＤＤの利用が記載されるが、これはエンドポイントアッセイでも同様に好適であることが示されている。実施例２のアッセイでは、本発明者らが同時に出願した米国仮特許出願第６０／６１９，６５４号、表題「Primers, Probes and Methods for Nucleic Acid Amplification」の対象である検出技術を利用する。該文献は参照によりその全体が本明細書中に組み入れられる。該検出技術は、二本鎖ＤＮＡに結合すると蛍光を発する蛍光性ＤＮＡ色素（例えばＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ）および、制限的プライマーが使い果たされた後のＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅において生成される一本鎖アンプリコンに相補的な蛍光団標識ハイブリダイゼーションプローブの両者を加えるステップ、その場合、該蛍光団は該色素からの発光によって刺激される；色素を刺激するステップ；色素および蛍光団の両方からの発光を検出するステップ；および色素シグナルに対する蛍光団シグナルの比を算出するステップを含む。ゆえに実施例２は、本発明の試薬と蛍光プローブおよび蛍光色素の適合性、およびそのいずれかまたは両者とともに使用された場合のミスプライミングの効果的な防止を示す。
【００４５】
実施例４では、２ペア、３ペア、４ペアおよび５ペアまでものプライマーを利用するいくつかの多重ＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅が記載され、試薬９−３ＤＤを反応混合物に加えた場合の全例で正しいアンプリコンが増幅されることが示される。実施例４の目的ではゲル電気泳動によって増幅産物を分析したが、同様に複数の方法を多重アッセイに適用可能であり、それには他の検出手段（例えば所望のアンプリコンに関する蛍光性ハイブリダイゼーションプローブ）を使用する定性的アッセイおよび定量的アッセイ、例えばリアルタイムアッセイが含まれる。リアルタイムＬＡＴＥ−ＰＣＲアッセイでは、プライマー伸長のステップ後の低温検出ステップおよび例えば実施例３で示される低温プローブを利用することが好ましい。
【００４６】
実施例１３では、２種以上の型の本発明の試薬を含有する増幅反応混合物を用いる増幅反応もまた利用することができることが示される。例えば、増幅混合物は、高い融解温度を有する本発明の化合物および低い融解温度を有する本発明の別の化合物の両者を含有することができ、各化合物はそれぞれの最適濃度で加えられる。８１℃の計算上のＴｍを有する化合物９−２２ＤＤのステムは、反応の開始時点および各熱サイクル中に温度が低下した直後は閉鎖型コンホメーションであるが、５８℃の計算上のＴｍを有する化合物１２−３ＤＤは相対的に低い温度でしか閉鎖型にならない。したがって、それは「ホットスタート」として作用し、反応混合物が室温で調製される場合にミスプライミングを防止するが、６０℃以上のアニーリング温度を有するＰＣＲ増幅の以後の熱サイクル中には閉鎖型にならず、ポリメラーゼに結合しない。試薬の混合物は、複数のアンプリコンの増幅のために一定範囲のアニーリング温度にまたがる複数ペアのプライマーが組み合わされている多重反応の構築に関して特に有用である。実施例１３で使用される試薬の混合物はいずれかの試薬の単独使用より良好である。
【００４７】
実施例３では、十分な量で、ミスプライミングから生じる非特異的産物が十分に排除されている増幅一本鎖産物を調製するための、およびシークエンシング用の出発材料としての使用に好適な、試薬９−３ＤＤを利用するＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅が記載される。十分な出発材料を保証するために増幅を７０サイクルまで延長した。本発明者らは、いくつかのアンプリコンが他のアンプリコンよりタイプ２およびタイプ３のミスプライミングエラーを生じやすいことを発見した。そのようなミスプライミングがより生じやすい増幅では、鎖融解ステップからプライマーアニーリングステップへサイクル処理温度が下がった時に閉鎖型になる本発明の試薬のステムが好ましい。このことはステムＴｍ、アニーリング温度、またはその両者を調節することによって確かに実現することができる。関連する研究で、本発明者らは、本発明者らが同時に出願した上記の米国仮特許出願で開示されているように、生成物を希釈することが、シークエンシングとともに使用するためのシンプルな精製方法であることを発見した。
【００４８】
本発明者らは、無修飾のＤＮＡヘアピン形成オリゴマーと比較して、および互いに、本発明の試薬の実施形態の機能性および有効性を調べた。本発明者らは、試験試薬の存在下でのＴａｑＤＮＡポリメラーゼによる標識プライマーの伸長を測定するためのＤＮＡ重合アッセイを考案した。該アッセイでは、本発明者らが同時に出願した上記の米国仮特許出願で開示されているように、蛍光色素からの発光で励起される蛍光団で標識されているプライマーを利用する。該アッセイの混合物は、０．５μＭの濃度の合成オリゴヌクレオチドＤＮＡ鋳型、１．５μＭの濃度のＤＮＡプライマー（鋳型の３’末端に相補的で、その５’末端がＣｙ５で標識されている）、ＰＣＲバッファー、ＭｇＣｌ２、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、１：４０，０００希釈のＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ蛍光性ＤＮＡ色素、および試験試薬を含む。反応の制御された開始はｄＮＴＰの添加によって達成される。該反応は等温性である：それは所定の温度で所定の時間進行する。ＤＮＡポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性に対する試験化合物の効果を評価するために、「ブロッカー」、すなわち鋳型の５’末端に相補的で、その３’末端がリン酸基でブロックされ、その５’末端がＲＯＸで標識されているオリゴヌクレオチドを反応混合物に加えた。ＤＮＡポリメラーゼの重合活性に対する試験化合物の効果を評価するためには、ブロッカーを使用しない。融解曲線解析による反応産物の分析を容易にするために、鋳型、プライマーおよびブロッカーは、以下のハイブリッドがその融解温度によって容易に識別可能であるように設計する：プライマー−鋳型、ブロッカー−鋳型、完全長伸長産物−鋳型、および部分的伸長産物（ブロッカーまで）−鋳型。リアルタイム解析は、色素を周期的に励起し、該色素および２種の蛍光団からの蛍光発光を周期的にモニタリングすることによって達成される。両蛍光団は色素からの発光によって間接的に励起される。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉの蛍光の増加は重合の指標である。ＲＯＸの蛍光の減少はブロッカーの分解の指標である。エンドポイント解析は、１２ｍＭ ＥＤＴＡを加えて反応を停止させ、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉの希釈を１：１４，２００に調節し、試験化合物濃度を８００ｎＭに調節し；次いで、色素を刺激し、２種の蛍光団の各々からの蛍光をモニタリングしながら、標準的な融解曲線解析を実施することによって達成される。
【００４９】
本発明者らは、５５℃で６０分間のインキュベーションを行い、化合物９−２２、９−２２ＤＤおよび９−３ＤＤを評価した。試験化合物を含まない対照も組み入れられた。試験化合物を含まないがブロッカーの存在下でインキュベートされた対照から得られた結果は、これらの条件下で、完全にではないが、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼがブロッカー領域を通過してプライマーを伸長し、Ｃｙ５蛍光によればほぼ単一の融解ピークを有する産物が生成されたことを示す。ゆえに、酵素は重合活性および５’−３’エキソヌクレアーゼ活性の両方を示した。３００ｎＭの濃度または１０００ｎＭの濃度で存在する化合物９−２２ＤＤを用いて得られた結果は、部分的伸長産物の生成および残留ブロッカーの量に対する用量依存的様式の効果を示した。ゆえに化合物９−２２ＤＤは、５５℃で、ポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を阻害した。完全長産物の生成が特に１０００ｎＭの濃度で減少した。このことは、この高濃度では、化合物９−２２ＤＤが重合を阻害し始めることを示唆する。
【００５０】
本発明の試薬の特性を調べるために本発明者らが利用した別のアッセイは以下の実施例６に記載のアッセイである。該アッセイは、２５℃でのＴａｑＤＮＡポリメラーゼによる伸長を阻害する試験試薬の能力を検出する。実施例７に報告される結果は、無修飾のヘアピンオリゴヌクレオチド９−２２および９−３は対照と比較して効果を示さなかったが、試薬９−２２ＤＤおよび９−３ＤＤはプライマー伸長を用量依存的様式で阻害したことを示す。ゆえに、本発明の試薬が低濃度で重合活性を阻害するのには十分に低い温度でさえ、それらの無修飾のアナログは同一濃度で該特性を示さなかった。
【００５１】
本発明者らは、ＤＮＡポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性に対する本発明の試薬の阻害効果を調べるために２種のアッセイを利用した。一方のアッセイは以下の実施例７に記載される。該アッセイでは、熱サイクル処理中の５’−３’エキソヌクレアーゼ活性の阻害を測定する。図７は、試薬９−２２ＤＤが５０ｎＭ〜３００ｎＭの範囲の低濃度で用量依存的様式で該エキソヌクレアーゼ活性を阻害することを示す。
【００５２】
第２のアッセイは以下の実施例９に記載される。該アッセイでは、２５℃での５’−３’エキソヌクレアーゼ活性の阻害を定量的に測定する。図９は、５０ｎＭ〜１０００ｎＭの濃度の試薬９−２２ＤＤによる用量依存的阻害を示す。
【００５３】
以下の実施例６で記載されるさらに別のアッセイでは、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼのＳｔｏｆｆｅｌ断片によって実行されるプライマー伸長の、該試薬による阻害を測定する。インタクトなＴａｑポリメラーゼと同様に、伸長の阻害には、オリゴヌクレオチドステムでの修飾端部の存在が必要とされ、ステム間のループの長さによる大きな影響はなかった。しかし、インタクトなＴａｑポリメラーゼとは異なり、ほんの６ヌクレオチドのステムを有する試薬である化合物６−２２ＤＤによってＳｔｏｆｆｅｌ断片は阻害される。本発明者らは、Ｓｔｏｆｆｅｌ断片が、インタクトなポリメラーゼと同一の様式で試薬と相互作用するわけではないと結論づける。
【００５４】
本発明の試薬は、以下の実施例８で実証されるように、対称的ＰＣＲアッセイでのミスプライミングの防止に有用である。該アッセイでは、非常に近いＴｍ値を有する等モルのペアのプライマーを使用して、嚢胞性線維症遺伝子における配列の増幅を測定した。
【００５５】
現在使用されているＰＣＲ増幅およびアッセイは、典型的に、室温での増幅反応混合物の調製ステップを含み、ゆえに、タイプ１のミスプライミングを阻害するために最初の混合物に本発明の試薬を含ませることを必要とする。しかし、必ずしもそうではない。特定の自動化された方法、例えばマイクロ流体工学的（microfluidics）方法では、ホットスタート用の高い温度でポリメラーゼを反応混合物に加え、それによってタイプ１のミスプライミングを回避することが可能である。そのような方法では、増幅の開始後に本発明の試薬を加えることができる。
【００５６】
プライマー二量体の形成は、完全反応物、すなわち増幅に必要なすべての構成要素と最初の標的配列とを含有する反応物中、ならびに標的配列を含有しない反応物中で生じうるミスプライミングの現象である。プライマー二量体は、反応物中に存在する別のコピーの同じ一本鎖プライマーまたは何らかの他のプライマーに対するハイブリダイゼーションおよびそれらに沿った伸長に基づいて、反応物中の１種以上のプライマーのミスプライミングによって形成される典型的には短い二本鎖ＤＮＡ配列である。標的配列の存在下でのプライマー二量体の形成は、予測されるアンプリコンの蓄積に伴うプライマー二量体の蓄積として観察される。標的配列の非存在下でのプライマー二量体の形成は、特異的アンプリコンの蓄積を伴わないプライマー二量体の蓄積として観察される。またプライマー二量体は、基本となるプライマー二量体より配列が長いオリゴマーを形成しうる。その理由は、それらが追加の、連結コピーの一方または両方のプライマーを含有するからである。オリゴマー形成のプロセスは十分に理解されていないが、オリゴマー形成は反応産物のゲル電気泳動または融点解析によって容易に検出できる。プライマー二量体の形成により、プライマー二量体の生成および蓄積に一方または両方のプライマーが消費されるにつれ、所定数の熱サイクル中に生成される予測アンプリコンの量が減少する。したがって、プライマー二量体を排除することが望ましい。その理由は、それによって正常産物の特異性および収量がともに増加するからである。プライマー二量体のこれらの特徴、および本発明に記載の試薬を加えることによるその排除は、実施例１０で例証される。
【００５７】
プライマー二量体の形成確率は、多数の他の要因、例えばプライマー濃度の上昇、マグネシウム濃度の上昇、プライマーの長さの増加、熱サイクルのアニーリング温度の低下、および反応に含まれるプライマーの総数の増加に加えて、一方のプライマーの３’末端と同プライマーの内部配列または異なるプライマーとの間の配列相同性によって上昇する。さらに、プライマー二量体の形成確率が、ホットスタートポリメラーゼを使用する反応と比較して、非ホットスタートポリメラーゼを使用する反応においてずっと高いことが当技術分野において周知である。その理由は、反応の成分の混合中にプライマー−プライマーハイブリダイゼーションおよび伸長が相対的に低い温度で生じうるからである。ホットスタート酵素はプライマー二量体の生成および蓄積を低減するが、完全には排除しない。プライマー二量体のこれらの特徴、ならびに本発明に記載の試薬を加えることによるその排除は、実施例１１で例証される。
【００５８】
またプライマー二量体の形成は反応のキネティクスに対して微妙な効果を有しうる。本明細書中に記載の試薬を加えることによるそれらの排除を観察し、キネティクスに関して最適化することができる。実施例１２では、２ペアのプライマーからなり、２種の一本鎖産物を生成させるＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅が記載される。それらの一方の産物の動的蓄積を蛍光プローブに対するハイブリダイゼーションに基づいて検出した。結果を図１３および図１４に示す。該データは、キネティクスの直線性が、試薬のステムの厳密な組成および試薬の濃度の両者によって影響を受けることを実証する。試薬のステムの厳密な組成の影響は融解温度に対するその効果に起因する。さらに、試薬の最適使用および最適に近い使用によってＬＡＴＥ−ＰＣＲにおける直線的増幅の速度を変化させ、それによって反応の終了時点でのシグナルの大きさを変化させることができるが、反応のＣＴ値には影響しない。図１５および図１６は、化合物９−３ＤＤを１５０および３００ｎＭで使用した場合、一定範囲の鋳型出発濃度にわたってＣＴ値によって判断される増幅効率は同一であったが、３００ｎＭの９−３ＤＤの存在下で鋳型出発数１００および１０００から生じたシグナルの大きさは、１５０ｎＭの９−３ＤＤを使用して得られたシグナルより大きかったことを実証する。おそらく、それはプライマー二量体形成が存在しないせいである。
【００５９】
実施例
【実施例１】
【００６０】
実施例１． ミスプライミングエラーを評価するための厳密なアッセイ
ＰＣＲ増幅反応においてタイプ１、タイプ２およびタイプ３のミスプライミングを評価するために、本発明者らは、剪断ゲノムＤＮＡを利用するＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅を実施し、融点解析およびゲル電気泳動によってその産物を調べる。使用した具体的な増幅は以下の通りである。
【００６１】
Ａ． 基質：１０〜１０，０００ゲノムに相当する剪断ゲノムＤＮＡ。市販のＤＮＡを購入し、ゲノムＤＮＡを複数回凍結・解凍するか、またはＤＮＡを剪断するための当業者に公知の任意の他の同様の方法によって処理した。
【００６２】
Ｂ． ＰＣＲ増幅混合物ベース（Sanchez et al. (1994) PNAS 101:1933-1938を参照のこと）：
基質：２０００ゲノムの剪断ゲノムＤＮＡ
１×ＰＣＲバッファー
Ｍｇ＋２：３ミリモル濃度（ｍＭ）
ｄＮＴＰ：２５０マイクロモル濃度（μＭ）の４種の各ｄＮＴＰ
過剰プライマー：１０００ナノモル濃度（ｎＭ）の配列５’ ＣＴＴＴＧＡＴＧＡＣＧＣＴＴＣＴＧＴＡＴＣＴＡ ３’（配列番号１３）
制限的プライマー：５０ｎＭの配列５’ ＣＣＴＧＧＡＴＴＡＴＧＣＣＴＧＧＣＡＣＣＡＴ ３’（配列番号１４）
ＤＮＡポリメラーゼ：２５マイクロリットル（μＬ）の反応混合物あたり１．２５単位。
【００６３】
Ｃ． 増幅プロトコル：
低温インキュベーション：室温で３５分
ＰＣＲ増幅プロトコル：９５℃で１５分間の高温浸漬；９５℃で１０秒間、５５℃で３０秒間、および７０℃で３０秒間の１０サイクル；次いで９５℃で１０秒間、５０℃で３０秒間、および７０℃で３０秒間の７０サイクル。
【００６４】
いずれのホットスタート方法論をも使用せずに２種の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ ＴａｑおよびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｔａｑ）を利用する増幅によって、ミスプライミングに関するベースラインの事例を確立した。２種の異なる市販のホットスタートＤＮＡポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＴａｑおよびＰｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ（Invitrogen））を利用して追加の増幅を実施した。最後に、３００ｎＭの現在の好ましい実施形態の本発明に基づく試薬を加えて、追加の増幅を実施した。本実施例で使用される一実施形態は、組成物９−２２ＤＤと称される試薬である（本発明者らの用語体系において、「９」はステム長であり、「２２」はループ長であり、「ＤＤ」は安定化用の修飾を意味し、この場合は１ペアのＤａｂｃｙｌクエンチャーである）。化合物９−２２ＤＤは８１℃の計算上のＴｍを有する。該化合物は、表ＩＩに示される配列を有し、それは５’末端および３’末端のＤａｂｃｙｌ部分の付加によって修飾されている。
【００６５】
臭化エチジウム染色を施した種々の増幅のゲル電気泳動の結果を図１に示す。図１は、ラベルがない両端のカラムにサイズマーカー（１００塩基対ずつ異なるサイズ）を含む。重複実験を行ったために、各ＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅の産物に関して２レーンずつが存在する。レーンａ，ＤＮＡが省略されたベースラインの事例；レーンｂ，ＤＮＡポリメラーゼがＰｒｏｍｅｇａ Ｔａｑであったベースラインの事例；レーンｃ，ＤＮＡポリメラーゼがＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｔａｑであったベースラインの事例；レーンｄ，ホットスタート酵素であるＱｉａｇｅｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒ Ｔａｑを代用；レーンｅ，ホットスタート酵素であるＰｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑを代用；レーンｆ，化合物９−２２ＤＤを加えるとともにＰｒｏｍｅｇａ Ｔａｑポリメラーゼを利用する増幅；レーンｇ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｔａｑポリメラーゼおよび化合物９−２２ＤＤを利用する増幅；レーンｈ，Ｑｉａｇｅｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼおよび化合物９−２２ＤＤを利用する増幅；レーンｉ，Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑポリメラーゼおよび化合物９−２２ＤＤを利用する増幅。
【００６６】
図１から、重合活性および５’−３’エキソヌクレアーゼ活性の両者を有する標準のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（レーンｂおよびレーンｃ）が一定範囲の産物サイズをもたらしたが、そのうちのほとんどが、レーンｆ〜ｉに見られる産物である、プライマーペアによって規定される所望のアンプリコンではなかったことがわかる。修飾型「ホットスタート」ポリメラーゼ（レーンｄ〜ｅ）への切り替えは有益であったが、依然として、ミスプライミングエラーにより形成される非特異的産物は排除されなかった。しかし、化合物９−２２ＤＤが３００ｎＭの濃度で存在した場合は、酵素が標準のＴａｑＤＮＡポリメラーゼであった場合（レーンｆ〜ｇ）および酵素がホットスタートＴａｑＤＮＡポリメラーゼであった場合（レーンｈ〜ｉ）でいずれも、所望のアンプリコンが得られ、ミスプライミングエラーにより形成される非特異的産物は含まれなかった。
【００６７】
本実施例の厳密なアッセイを使用して、いくつかの無修飾および修飾ＤＮＡヘアピン分子を、末端安定化を伴わずに；各アームの端部に同一のヌクレオチドを付加することによって達成される末端不安定化を伴って；本発明に基づく末端安定化を伴って；ならびに安定化用ではない末端付加を伴って比較した。定量的比較を行うために、標準のＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いて図１に示されるように達成される、ミスプライミングエラーにより形成される非特異的産物の排除、および所望の特異的産物しか存在しないことをもたらすために必要とされる最低濃度を決定するために、ミスプライミング抑制活性を示した各化合物に関して前記アッセイを使用する用量応答試験を実施した。その結果は表Ｉに示される通りであり、表には試験対象の各試薬に関する計算上のステムＴｍが含まれる。表Ｉに報告される種々の化合物の配列は表ＩＩに記載される通りである。
【表１】
【００６８】
【表２】
【００６９】
表Ｉでは、修飾および無修飾のいくつかのＤＮＡヘアピンが比較され、本発明の試薬（１０００ｎＭ未満の濃度でミスプライミングの産物を伴わない純粋なアンプリコンが得られる）であるか、または本発明の好ましい試薬（６５０ｎＭ以下の濃度でミスプライミングの産物を伴わない純粋なアンプリコンが得られる）であるいくつかの末端安定化ヘアピン分子が特定される。無修飾のヘアピンは２つの数字によって特定される。第一の数字はステム長であり、第二の数字はループ長である。表Ｉに挙げられる本発明に基づく化合物は以下のような数種類の安定化用の修飾を有する：市販のリンカーを用いて末端ヌクレオチドに共有結合している５’Ｄａｂｃｙｌクエンチャーおよび３’Ｄａｂｃｙｌクエンチャー（接尾辞「ＤＤ」によって示される）、同様に結合している３’Ｂｌａｃｋ ＨｏｌｅＴＭクエンチャーおよび５’Ｂｌａｃｋ ＨｏｌｅＴＭクエンチャー（接尾辞「ＢＨＱＢＨＱ」によって示される）、およびステム末端でデオキシリボヌクレオチドの代わりに用いられる２個の３’２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドおよび２個の５’２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド（「２’ＯＭ４」によって示される）。ステム末端に対する不安定化用の修飾には、分子の３’および５’末端を２個のＡまたはＴで置換することが含まれた。ステムを安定化する様式で互いに相互作用しないと考えられる１ペアのＦＡＭ蛍光団を付加すると、単一の５’Ｄａｂｃｙｌの付加と同様に不安定であった。しかし、単一の３’Ｄａｂｃｙｌの付加は９−２２ヘアピンをわずかに安定化した。それは必要とされる濃度の低下によって示される通りである。ヘアピン９−２２は高濃度（３０００ｎＭ）でしかミスプライミングを抑制しなかったが、９−２２ＤＤは低濃度（５０ｎＭ）でミスプライミングを抑制した。
【００７０】
現在の本発明者らの好ましい別のヘアピンである化合物９−３は高濃度（１０００ｎＭ）でしかミスプライミングを抑制しなかったが、９−３ＤＤおよび９−３ ２’ＯＭ４はずっと低い濃度（１００〜３００ｎＭ）でミスプライミングを抑制した。さらに別の実施形態である９−５ＤＤ、９−５ＢＨＱＢＨＱおよび９−５ ２’ＯＭ４もまた低濃度（５０〜１００ｎＭ）でミスプライミングを抑制した。オリゴヌクレオチド９−５はオリゴヌクレオチド９−２２と同一のステムを有するが、ヌクレオチドがＡおよびＴである短いループを有する。オリゴヌクレオチド９−５の計算上のステムＴｍは９３℃であり、ループの影響によりオリゴヌクレオチド９−２２の計算上のステムＴｍより約１２℃高い。
【００７１】
さらに長いステムを用いても同様の結果が得られた。化合物１２−３はミスプライミングを抑制しなかったが、化合物１２−３ＤＤはほんの５０ｎＭの濃度で有効であった。
【００７２】
表Ｉは、安定化ステムを修飾して、計算上のステム融解温度（Ｔｍ）を変化させることができることを示す。例えば、Ｔｍ５６℃の化合物９−３ＤＤは１００ｎＭの濃度で有効であった。ステムのＧＣ含量を変えることによって、化合物９−３ｂＤＤ（Ｔｍ６２℃）および９−３ｉＤＤ（Ｔｍ６８℃）を作成した。両化合物もまた１００ｎＭの濃度で有効であった。Ｔｍ５８℃の化合物１２−３ＤＤは５０ｎＭの濃度で有効であった。改変されたステムを有する化合物、すなわちＴｍ６３℃の化合物１２−３ｂＤＤおよびＴｍ６８℃の化合物１２−３ｃＤＤは１００ｎＭの濃度で有効であり、依然として非常に良好であった。
【実施例２】
【００７３】
実施例２． ＬＡＴＥ−ＰＣＲエンドポイントアッセイ
反復実験サンプル間の反応キネティクスの確率的変動によってハイブリダイゼーションプローブ由来のシグナルのばらつきが生じ、エンドポイント解析が妨害される。ＬＡＴＥ−ＰＣＲはその問題を著しく軽減する。本発明の試薬を利用するとエンドポイント検出を利用する能力がさらに改善される。図２は、テイ・サックス病に関与するヘキソサミニダーゼＡ遺伝子のＧ２６９対立遺伝子を含むアンプリコンを増幅する際に得られる結果を示す。反応混合物は０．６μＭのハイブリダイゼーションプローブおよび１０００ゲノムのホモ接合性野生型ＤＮＡ標的（＋／＋）またはヘテロ接合性ＤＮＡ標的（Ｇ２６９／＋）を含んでいた。各タイプの反復サンプルを以下のように増幅した：２５μＬの反応物中、１００ｎＭの実施形態９−２２ＤＤの存在または非存在下での、１×ＰＣＲバッファー、３ｍＭのＭｇＣｌ２、２５０μＭの各ｄＮＴＰ、配列５’ ＣＧＡＧＧＴＣＡＴＴＧＡＡＴＡＣＧＣＡＣＧＧＣＴＣＣ ３’（配列番号１５）を有する２５ｎＭの制限的プライマー、配列５’ ＴＡＡＣＡＡＧＣＡＧＡＧＴＣＣＣＴＣＴＧＧＴ ３’（配列番号１６）を有する１０００ｎＭの過剰プライマー、１．２５単位のＰｌａｔｉｎｕｍ（ホットスタート） Ｔａｑポリメラーゼ、配列５’ Ｃｙ５−ＧＧＧＡＣＣＡＧＧＴＡＡＧＡＡ−リン酸 ３’（配列番号１７）を有する０．６μＭのＣｙ５標識ハイブリダイゼーションプローブ、および１：４０，０００希釈のＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ Ｉ。ＰＣＲサイクルのパラメータは、９５℃で３分間；９５℃で１０秒間、６５℃で２０秒間、および７２℃で２０秒間の２５サイクル；および、９５℃で１０秒間、６５℃で２０秒間、７２℃で２０秒間、５５℃で２０秒間、および４５℃で２０秒間の３０サイクルであり、７２℃でＳＹＢＲ Ｇｏｌｄに関する蛍光を取得し、５５℃および４５℃でＣｙ５に関する蛍光を取得した。反応キネティクスの試験管ごとの変動を補正するために、７２℃でのＳＹＢＲ Ｇｏｌｄシグナルに対する５５℃でのＣｙ５シグナルの比によってハイブリダイゼーションシグナルを標準化した。そのような標準化の影響の１つはすべてのＣＴの遅延がマスクされることである。
【００７４】
図２の、サークル２１によって特定されるライン群およびサークル２２によって特定されるライン群は、本発明の試薬を加えないが、ホットスタートポリメラーゼを用いた場合の複数回の反復実験の結果を示す。ホモ接合性の反復実験（サークル２１）およびヘテロ接合性の反復（サークル２２）はそれらの直線プロットの勾配によって識別することができる。約４０サイクル後のハイブリダイゼーションプローブシグナルの低下（「Ｈｏｏｋ効果（hook effect）」）によって立証される、これらのサンプルにおける反復実験間のばらつきおよびミスプライミングエラーは、これらのサンプルのエンドポイント識別を不可能にする。図２のサークル２３〜２４によって特定されるライン群は、本発明の試薬、すなわち１００ｎＭの９−２２ＤＤを加えた場合の結果を示す。これらの条件下では、ミスプライミングエラーが生じず、アッセイの経過中に直線的キネティクスが維持され、ばらつきが低減され、Ｈｏｏｋ効果が回避され、５０サイクルの時点でホモ接合性およびヘテロ接合性サンプルのエンドポイント識別が可能である。
【実施例３】
【００７５】
実施例３． ジデオキシシークエンシング用のＤＮＡサンプルの調製
ＬＡＴＥ−ＰＣＲは、増幅反応が６０以上の熱サイクルにわたって実行される場合に、ＤＮＡシークエンシングに好適な大量の一本鎖ＤＮＡを生産しうる非対称増幅法である。しかし、そのような多数の増幅サイクルはミスプライミングの産物の出現を助長し、それにはタイプ２およびタイプ３のミスプライミングエラーの形成が含まれると考えられる。該ミスプライミングエラーは検出可能な非特異的産物の蓄積として現れ、それは、最終的に、反応において最も多数を占める分子種になる。本発明の試薬は、７０以上のサイクルのＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅を使用する場合に、非特異的産物を生じずに、ＤＮＡシークエンシングに好適な大量の一本鎖ＤＮＡの合成を可能にする。キャピラリーゲル電気泳動によるジデオキシシークエンシングに好適なサンプルを以下のように調製した。まずＬＡＴＥ−ＰＣＲ反応混合物を、１×ＰＣＲバッファー、３ｍＭのＭｇＣｌ２、配列５’ ＧＣＣＡＧＧＧＧＴＴＣＣＡＣＴＡＣＧＴＡＧＡ ３’（配列番号１８）を有する１０００ｎＭの過剰プライマー、配列５’ ＣＣＧＣＣＣＴＴＣＴＣＴＣＴＧＣＣＣＣＣＴＧＧＴ ３’（配列番号１９）を有する２５ｎＭの制限的プライマー、１．２５単位のＰｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑポリメラーゼ、６００ｎＭの試薬９−３ＤＤおよび２５０μＭの各ｄＮＴＰを含有する２５μＬで調製した。化合物９−３ＤＤは、オリゴヌクレオチド９−３の各末端ヌクレオチドに付加されたＤａｂｃｙｌクエンチャーを有する。増幅は、９５℃で３分間；９５℃で１０秒間、６５℃で２０秒間、および７２℃で２０秒間の１０サイクル；および、９５℃で１０秒間、６５℃で２０秒間、７２℃で２０秒間；および４５℃で２０秒間の６０サイクル実行した。二本鎖および一本鎖ＤＮＡ合成を別々にモニタリングするために、１：４０，０００希釈のＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎまたは配列５’ ＦＡＭ−ＣＧＴＧＣＧＣＴＣＴＧＧＴＡＡＧＧＧＴＴＴＧＣＡＣＧ−Ｄａｂｃｙｌ ３’（配列番号２０）を有する２．４μＭの低Ｔｍ分子ビーコンを用いて並行して反応を実施した。各サンプルは６ｎｇ（約１０００ゲノム）のヒトＤＮＡを含有した。さらに、化合物９−３ＤＤを加えずに対照反応を実施した。
【００７６】
増幅反応の結果、ホットスタートＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いるが、化合物９−３ＤＤを用いない対照は顕著なミスプライミングを示した。制限的プライマーが使い果たされた後の増幅の後期段階中に、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎシグナルが二次的に上昇することによってそれは立証される。該産物はそのような混合物であるため、該対照をシークエンシングすることは不可能であった。一方、化合物９−３ＤＤを加えた場合の増幅の結果では、所望の特異的産物しか存在せず、７０サイクルを通してＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎシグナルの遅延された上昇はないことが示された。制限的プライマーの濃度および５０％の直線的増幅の見かけの効率から、反応によって２５０フェムトモル（fmoles）／μＬの純粋な産物が生産されると見積もられる。該産物をBrandeis Universityのジデオキシシークエンシング施設に送り、シークエンシングを行った。
【００７７】
シークエンシング反応は、Ｂｅｃｋｍａｎ ＣＥＱ ２０００ ＤＮＡシーケンサーを利用するキャピラリー電気泳動などの標準プロトコルを使用して実施した。増幅産物の１／５アリコート、すなわちわずかに５０フェムトモルの産物を用いてシークエンシング反応を実施した。機械により作成された配列を図３に挙げる。図３では、チャートの上部に沿って配列を示し、クリアで不明瞭なところがない産物ピーク（これから配列を導き出した）を示し、底部では非常に低レベルのバックグラウンドシグナルを示す。本発明者らは、機械により作成された配列をＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＴ ０１０２３５から入手可能な該アンプリコンの公知の配列と比較することによって、その正確さを確認した。
【実施例４】
【００７８】
実施例４． 多重化ＰＣＲ増幅
ミスプライミングエラーの抑制は、複数の産物が同時に増幅される多重化反応において特に重要である。複数のプライマーペアおよび増幅産物が存在すると、これらの反応種の２者間および３者以上の間のミスプライミング相互作用の確率が高くなる。増加した数のアンプリコンからなる多重化反応を化合物９−３ＤＤの不存在または存在下で実行した。以下に示すプライマーペアの種々の組み合わせに関して、３００ｎＭの試薬９−３ＤＤの非存在下または存在下で、サンプル、１×ＰＣＲバッファー、３ｍＭのＭｇＣｌ２、１００μＭの各ｄＮＴＰ、１０００ｎＭの過剰プライマー、５０ｎＭの制限的プライマー、および１．２５単位の非ホットスタートＰｒｏｍｅｇａ Ｔａｑポリメラーゼからなる２５μＬ容量のＬＡＴＥ−ＰＣＲ反応物を調製した。サンプルの増幅は、９５℃で３分間；９５℃で１０秒間，６５℃で３０秒間，および７０℃で３０秒間の１０サイクル；および、９５℃で１０秒間，５０℃で３０秒間，７０℃で３０秒間の４０サイクルの熱サイクルプロファイルを使用して行った。反応の終了時点で、０．５×ＴＢＥ中の３．５％アガロースゲルでのゲル電気泳動によってサンプルを分析した。試験対象の所望のアンプリコンおよびプライマーペアは以下の通りであった。
【００７９】
反応Ａ：テイ・サックス病に関連するＨｅｘ−Ａ遺伝子の２領域ＴＳＤ１２７８＋ＴＳＤ１４２１
ＴＳＤ１２７８過剰プライマー：５’ ＧＣＣＡＧＧＧＧＴＴＣＣＡＣＴＡＣＧＴＡＧＡ ３’（配列番号２１）
ＴＳＤ１２７８制限的プライマー：５’ ＣＣＧＣＣＣＴＴＣＴＣＴＣＴＧＣＣＣＣＣＴＧＧＴ ３’（配列番号２２）
ＴＳＤ１４２１過剰プライマー：５’ ＣＣＧＧＧＴＣＴＣＴＡＡＧＧＧＡＧＡＡＣＴＣＣＴ ３’（配列番号２３）
ＴＳＤ１４２１制限的プライマー：５’ ＣＣＧＧＣＣＧＡＣＡＡＣＡＣＡＡＡＣＣＴＧＧＴＣＣ ３’（配列番号２４）。
【００８０】
反応Ｂ：ＴＳＤ１２７８アンプリコン、ＴＳＤ１４２１アンプリコン、およびＣＦＴＲ遺伝子の１領域、ＣＦエキソン１０アンプリコン
本反応は反応Ａと同じプライマーペアに加えて以下のプライマーペアを含有した：
ＣＦ ｅｘ１０過剰プライマー：５’ ＧＣＴＴＴＧＡＴＧＡＣＧＣＴＴＣＴＧＴＡＴＣＴＡ ３’（配列番号２５）
ＣＦ ｅｘ１０制限的プライマー：５’ ＣＡＧＴＴＴＴＣＣＴＧＧＡＴＴＡＴＧＣＣＴＧＧＣＡＣＣＡＴ ３’（配列番号２６）。
【００８１】
反応Ｃ：ＴＳＤ１２７８アンプリコン、ＴＳＤ１４２１アンプリコン、ＣＦエキソン１０アンプリコン、およびＣＦＴＲ遺伝子の別の領域、ＣＦエキソン１１アンプリコン
本反応は反応Ｂと同じプライマーペアに加えて以下のプライマーペアを含有した：
ＣＦ ｅｘ１１過剰プライマー：５’ ＴＣＧＡＡＧＴＴＴＧＣＡＧＡＧＡＡＡＧＡＣＡＡＴ ３’（配列番号２７）
ＣＦ ｅｘ１１制限的プライマー：５’ ＴＧＡＣＧＴＴＴＡＣＡＧＣＧＡＡＴＧＣＴＴＧＣＴＡＧＡＣＣＡＡＴ ３’（配列番号２８）。
【００８２】
反応Ｄ：ＴＳＤ１２７８アンプリコン、ＴＳＤ１４２１アンプリコン、ＣＦエキソン１０アンプリコン、ＣＦ ｅｘ１１アンプリコン、およびヒトβグロビン遺伝子の１領域
本反応は反応Ｃと同じプライマーペアに加えて以下のプライマーペアを含有した：
βグロビン過剰プライマー：５’ ＴＧＧＧＴＴＴＣＴＧＡＴＡＣＧＣＡＣＴＧＡＣＴＣＴＣＴＣ ３’（配列番号２９）
βグロビン制限的プライマー：５’ ＧＧＣＣＡＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＣＡＣＣＧＡＧＣＡＣＴ ３’（配列番号３０）。
【００８３】
電気泳動ゲルを臭化エチジウムで染色し、ＬＡＴＥ−ＰＣＲ反応の対数期に生成された二本鎖産物を検出した。図４は、多重化反応Ａ〜Ｄにより得られた産物についての該当部分のゲルを示す。矢印は特異的二本鎖増幅産物を指し示し、無数のバンドは二次構造を有する特異的一本鎖ＤＮＡ産物に相当し、アスタリスクは非特異的産物を特定する。ゲルのペアＡ〜Ｄはそれぞれ反応Ａ〜Ｄに相当する。「＋」でラベルされている各ゲルは化合物９−３ＤＤを含む増幅により得られた産物である。「−」でラベルされている各ゲルは化合物９−３ＤＤを含まない増幅により得られた産物である。
【００８４】
ゲルのペアＡは、９−３ＤＤ化合物の非存在下で、領域ＴＳＤ１２７８（矢印４１）は増幅されなかったが、領域ＴＳＤ１４２１（矢印４２）は、主にまたは完全に二本鎖の多数の非特異的産物とともに増幅されたことを示す。該非特異的産物はゲルではスメアとして見られる。９−３ＤＤ化合物を加えると、非特異的産物のバックグラウンドが減少し、ＴＳＤ１２７８（矢印４１）およびＴＳＤ１４２１（矢印４２）の両者の増幅が可能になった。それらはよりきれいに増幅されていて、ミスプライミングのいくつかの現象が防止されたことが示される。
【００８５】
ゲルのペアＢは、９−３ＤＤ化合物の非存在下で、領域ＴＳＤ１２７８、ＴＳＤ１４２１、およびＣＦエキソン１０（矢印４３）が、ゲルではスメアとして見られる多数の非特異的産物とともに増幅されたことを示す。９−３ＤＤ化合物を加えると、バックグラウンドの非特異的産物が排除され、３種の予測されるアンプリコンのすべてが得られた。
【００８６】
ゲルのペアＣは、９−３ＤＤ化合物の非存在下で、領域ＴＳＤ１２７８、ＴＳＤ１４２１、ＣＦエキソン１０、およびＣＦエキソン１１（矢印４４）が、アスタリスクによって示される非特異的産物とともに増幅されたことを示す。９−３ＤＤ化合物を加えると、非特異的産物の合成が排除され、４種の予測されるアンプリコンのすべてが得られた。
【００８７】
ゲルのペアＤは、９−３ＤＤ化合物の非存在下で、βグロビン遺伝子の選択された領域（矢印４５）は増幅されなかったが、ＴＳＤ１２７８、ＴＳＤ１４２１、ＣＦエキソン１０、およびＣＦエキソン１１は、アスタリスクによって示される非特異的産物とともに増幅されたことを示す。９−３ＤＤ化合物を加えると、非特異的産物の合成が排除され、５種の予測されるアンプリコンのすべての増幅が可能になった。
【００８８】
また本発明者らは、感染性病原体に関してスクリーニングする場合に生じうるものなどの、任意の所定の試験サンプル中に１つの標的しか存在しない場合の多重増幅および検出反応における本発明の化合物の用途を実証した。そのような場合、複数ペアのプライマー（本発明者らは複数ペアの過剰プライマーおよび制限的プライマーをＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅に利用した）が存在するが、特定のサンプルに関して１ペアのプライマーしか有効ではない。ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ蛍光および増幅後の電気泳動による解析によって示されるように、それは実際に生じたことであり、したがって、すべての基質より少数の基質しか存在しない場合の多重反応において本発明の化合物が効果的にミスプライミングを阻害することが実証される。
【実施例５】
【００８９】
実施例５． ステムＴｍとアニーリング温度の関係
標的を含む同じ増幅混合物を利用して２種の異なるＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅プロトコルを比較した。６００ｎＭの化合物９−３ＤＤを含む場合および化合物９−３ＤＤを含まない場合の両方で各増幅を実施した。上記のように、化合物９−３ＤＤのステムＴｍ（すなわち無修飾のオリゴヌクレオチド９−３の計算上の融解温度）は５６℃である。ホットスタートＰｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを使用した。２種の増幅は、主として、使用されるプライマーアニーリング温度が異なり、６５℃（ステムＴｍより高い）または５５℃（ステムＴｍより低い）であった。増幅サイクルのパラメータは以下の通りであった：
プロファイルＡ：９５℃で３分間；９５℃で１０秒間，６５℃で２０秒間，７２℃で２０秒間の１０サイクル；９５℃で１５秒間，５５℃で２０秒間，７２℃で２０秒間，５０℃で２０秒間の６０サイクル
プロファイルＢ：最後の６０サイクルが９５℃で１０秒間，６５℃で２０秒間，７２℃で２０秒間，４５℃で２０秒間であったことを除いて、プロファイルＡと同一。
【００９０】
増幅反応をリアルタイムでモニタリングした。その場合、二本鎖産物の合成をモニタリングするためにＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ蛍光色素を使用した。ミスプライミングによって増幅の後期部分がばらつかない限り、二本鎖産物の合成は、制限的プライマーが使い果たされた後のＬＡＴＥ−ＰＣＲ反応においてプラトーに達した。低温検出ステップ中に読み取りを行った。
【００９１】
結果を図５に挙げる。パネルＡは、化合物９−３ＤＤを加えた場合（サークル５２）および加えなかった場合（サークル５１）の両方において、１０サイクルの伸長後に５５℃のアニーリング温度が利用された場合のプロファイルＡの反復実験サンプルから得られた蛍光読み取り値を示す。パネルＢは、化合物９−３ＤＤを加えた場合（サークル５４）および加えなかった場合（サークル５３）の両方において、１０サイクルの伸長後に６５℃のアニーリング温度が使用された場合のプロファイルＢの反復実験サンプルから得られた蛍光読み取り値を示す。
【００９２】
図５は、本発明の試薬のステムＴｍより低いプライマーアニーリング温度が使用された場合（パネルＡ）に、閾値サイクルＣＴの数サイクルの遅延が観察されたことを示す。しかし、指数的ＰＣＲ相の初めから終わりまでステムＴｍよりかなり高いプライマーアニーリング温度が維持された場合（パネルＢ）には、ＣＴの遅延は、たとえあったとしても、ほとんど観察されなかった。本増幅で利用された特定のアンプリコンに関しては、ホットスタートＴａｑが使用された場合に、化合物９−３ＤＤを用いても用いなくても、タイプ２／タイプ３のミスプライミングが観察されなかったことがわかった。このことは、そのようなミスプライミングエラーの出現が予測不能であることを示す。本実施例は、反応の温度が５５℃に下がると試薬９−３ＤＤのステムが閉鎖型になること、および反応の高温伸長ステップ中は該試薬がポリメラーゼに結合したままであることを実証する。
【実施例６】
【００９３】
実施例６． ２５℃でのＤＮＡポリメラーゼ活性に対する効果
本発明の試薬およびそれらの無修飾のオリゴヌクレオチドアナログの効果を評価するために、一連のプライマー伸長実験を２５℃で実行した。各反応混合物には、鋳型、プライマーおよびＴａｑＤＮＡポリメラーゼを含めた。各場合において２時間、反応を実行した。プライマーをＣｙ５で蛍光標識した。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ蛍光色素を反応混合物に加えた。伸長反応後に、融解曲線を作成した。その場合、本発明者らが同時に出願した米国仮特許出願、表題「Primers, Probes and Methods for Nucleic Acid amplification」に開示されるように、色素を刺激し、該色素からのＦＲＥＴ転移による蛍光団の発光を読み取った。結果を図６に挙げる。
【００９４】
図６のパネルＡは、反応混合物からｄＮＴＰが省略されることによって伸長が妨げられた場合に得られた融解曲線６１を含む。ゆえに曲線６１はプライマー・標的ハイブリッドの融解曲線であり、５８℃のＴｍを示す。またパネルＡは、ｄＮＴＰを、単独で、あるいは無修飾のオリゴヌクレオチド９−３（３００ｎＭ、１０００ｎＭ）または９−２２（５０ｎＭ、１００ｎＭ、３００ｎＭ）とともに含有するいくつかの対照を含む。サークル６２によって特定される、前記対照に関する曲線は、すべての場合で伸長を示し、すなわち５８℃のプライマー融解ピークが消失した。図６のパネルＢは、反応混合物中に試薬９−２２ＤＤを加えることの用量依存的効果を示す：曲線６３、５０ｎＭ；曲線６４、１００ｎＭ；曲線６５、３００ｎＭ。５８℃のピークが大きいほど、等温性試験条件下で重合による伸長を防止する効果が大きい。図６のパネルＣは、反応混合物中に試薬９−３ＤＤを加えることの用量依存的効果を示す：曲線６６、３００ｎＭ；曲線６７、１０００ｎＭ。この場合もやはり、５８℃のピークが大きいほど、試験条件下で重合による伸長を防止する効果が大きい。
【００９５】
また本発明者らは、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を欠いているＤＮＡポリメラーゼであるＳｔｏｆｆｅｌ断片（Lawyer et al. (1993) PCR Methods and Applications 2: 275-287）に対する効果を調べた。鋳型、蛍光標識プライマー、Ｓｔｏｆｆｅｌ断片およびｄＮＴＰしか含有しない陰性対照と、表１に列挙される種々の化合物を比較した。この一連の試験では、４０℃で伸長を実施し、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ読み取り値を３０分間以上にわたって２０秒毎に取得した。目視によって曲線を比較したが、その比較は信頼できるものであった。その理由は、得られた曲線が対照をほぼ正確にたどるか、あるいは得られた曲線が対照とは著しく異なっていたからである。５０ｎＭ、１００ｎＭおよび３００ｎＭの濃度で試験化合物を加えた。無修飾のヘアピン６−２２、９−３、９−５および９−２２は、いかなる濃度においてもＳｔｏｆｆｅｌ断片による伸長を抑制しなかった。化合物６−２２ＤＤは、化合物９−３ＤＤ、９−５ＤＤおよび９−２２ＤＤと同様に、すべての３種の濃度で伸長を抑制した。以下の化合物は、５０Ｍまたは１００ｎＭの濃度では伸長を抑制しなかったが、３００ｎＭの濃度では伸長を抑制した：９−２２−５Ｄ、９−２２−３Ｄ、９−５ ２’ＯＭ４、９−５ＢＨＱＢＨＱ、および９−３２’ＯＭ４。
【実施例７】
【００９６】
実施例７． ポリメラーゼ活性の非存在下でのＴａｑエキソヌクレアーゼ活性に対する効果
本発明者らは、ＤＮＡ合成の非存在下での５’−３’エキソヌクレアーゼ活性の阻害を実証するアッセイを開発した。本アッセイでは、一方の鎖の５’末端がＦＡＭ蛍光団で標識され、他方の鎖の３’末端がＤａｂｃｙｌクエンチャーで標識されている特異的二本鎖ＤＮＡ分子を基質として使用する。蛍光団はクエンチャーと近接していて、蛍光団が刺激された場合に蛍光は生じない。加熱および冷却による鎖変性およびアニーリングによって、ＦＡＭ標識鎖の切断および蛍光団の遊離が起こる。何らかのサイクル処理によってＴａｑポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性に関する基質が生成されると考えられる。したがって、蛍光の増大はＴａｑポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性の尺度を提供する。
【００９７】
２５μＬの反応混合物は、適切な濃度の９−２２ＤＤ化合物の存在または非存在下で、１×ＰＣＲバッファー中の３００ｎＭの二本鎖ＤＮＡ鋳型、３ｍＭのＭｇＣｌ２、および１．２５単位（Ｕ）のＴａｑポリメラーゼを含有する。該反応物は、いかなるｄＮＴＰをも含有せず、前記二本鎖ＤＮＡ以外のいかなる他の核酸標的をも含有しない。前記二本鎖ＤＮＡ鋳型の相補鎖の配列は、５’ ＦＡＭ−ＡＧＴＧＴＧＡＴＧＡＴＧＧＴＧＡＧＧ −リン酸基３’（配列番号３１）および５’ ＡＣＴＴＴＣＡＡＣＴＣＴＧＴＣＴ ３’−Ｄａｂｃｙｌ（配列番号３２）である。サンプルを９５℃で３分間変性させ、次いで９５℃で１０秒間，６７℃で３０秒間，７２℃で３０秒間，および４５℃で２０秒間のサイクルに付する。各サイクル中に４５℃で蛍光を取得する。
【００９８】
複数のサンプルに対するアッセイの実施から得られた蛍光読み取り値を図７に報告する。図７では、読み取り値を標準化して、同じバックグラウンド蛍光で出発するようにしてある。曲線７６は、Ｔａｑポリメラーゼが存在しない場合の蛍光を示す対照である。残りのサンプルにはＴａｑポリメラーゼを加えた。曲線７１は、試薬９−２２ＤＤを加えなかった場合に得られた蛍光の増大を示す。３０サイクルにわたって蛍光は安定的に増大した。曲線７２〜７５は、それぞれ５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭおよび３００ｎＭの濃度で試薬９−２２ＤＤを加えた場合の蛍光の増大を示す。上記反応物に９−２２ＤＤ化合物を加えると、観察される蛍光の増大が用量依存的様式で減少した。
【実施例８】
【００９９】
実施例８． 対称的ＰＣＲ増幅
本発明者らは、剪断ゲノムＤＮＡおよび等モル濃度で近似のＴｍを有する１ペアのプライマーを利用してリアルタイムＰＣＲ増幅アッセイを実施した。４００ｎＭの試薬９−３ＤＤを加えない場合および加えた場合で反復アッセイを実施した。ＤＮＡ全体としての蓄積のキネティクスに関して、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎでの染色によって、ならびに臭化エチジウム染色を用いるゲル電気泳動によって試薬の効果を評価した。
【０１００】
増幅に関する所望の標的はＣＦＴＲ遺伝子のイントロン１９に一塩基転位として存在する対立遺伝子であった（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＣ００００６１）。２５μＬの反応混合物は、４００ｎＭの試薬９−３ＤＤの不存在または存在下で、１２０ピコグラム（ｐｇ）の剪断ヒトゲノムＤＮＡの基質、１×ＰＣＲバッファー、５ｍＭのＭｇＣｌ２、２５０μＭの各ｄＮＴＰ、１：４０，０００希釈のＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ、１０００ｎＭのフォワードプライマー：配列５’ ＴＡＡＴＴＡＣＡＡＧＡＧＴＣＴＴＣＣＡＴ ３’（配列番号３３）（Ｔｍ５６．６℃）、および１０００ｎＭのリバースプライマー：配列５’ ＣＡＴＧＡＡＴＡＧＡＡＣＡＴＴＴＣＣＴＴ ３’（配列番号３４）（Ｔｍ５６．３℃）、および１．２５単位の非ホットスタートＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｔａｑポリメラーゼを含有した。以下の熱サイクル処理プロファイルを使用してサンプルを増幅した：９５℃で３分間；９５℃で１０秒間，５５℃で３０秒間，および７２℃で３０秒間の６０サイクル（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ蛍光を７２℃でモニタリング）、最後に、３０秒間に１℃刻みで増加する５４℃〜９６℃の温度勾配を用いる。反応の終了時点で、各組の反応から得られたランダムに選択された複数のサンプルを、０．５×Ｔｒｉｓ−ホウ酸−ＥＤＴＡ溶液（ＴＢＥ）中、３．０％アガロースゲルでのゲル電気泳動に付することよって分析した。
【０１０１】
図８は得られた結果を示す。図８のパネルＡの増幅プロットは６０サイクルにわたるＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ蛍光を示し、サークル８１によって特定される曲線群は試薬９−３ＤＤを含有しない反復実験サンプルであり、サークル８２によって特定される曲線群は４００ｎＭの９−３ＤＤを含む反復実験サンプルである。２組のサンプルから生じた蛍光シグナルのキネティクスによれば、二本鎖ＤＮＡ全体は、試薬９−３ＤＤの非存在下で、該試薬の存在下よりいくらか速やかに蓄積したが、６０サイクルによって蓄積された二本鎖ＤＮＡの総量は２組の反応において実質的に同一であることが実証される。
【０１０２】
図８のパネルＢは、臭化エチジウム染色を施した電気泳動ゲルを示す。左側の図では、レーンａはサイズマーカー（５０塩基対ずつ異なるサイズ）であり、レーンｂ〜ｉは試薬９−３ＤＤを含まないサンプルである。右側の図では、レーンｊ〜ｑは４００ｎＭの９−３ＤＤを含むサンプルであり、レーンｒはサイズマーカーである。この結果は、本発明の試薬を含有しない反応では、適正な産物ならびに高分子量の多数の非特異的産物が生成されたが、試薬９−３ＤＤを含有する反応では、適正な産物しか生成されなかったことを示す。さらに、ゲル中の適正な産物のバンドの相対強度によって判断すると、試薬９−３ＤＤを含有する反応では、該試薬を含有しない反応の約２倍の適正な産物が生成された。
【０１０３】
キネティクス解析および電気泳動による解析の組み合わせでは、非特異的産物を生成する反応８１が、適正産物しか生成しない反応８２より早く蛍光シグナルを生じたことが示される。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ色素は配列特異性とは無関係に二本鎖ＤＮＡ内に挿入される。ゆえに、反応８１の直線的なキネティクスと比較して、よりＳ字状である反応８２のキネティクスは、対称的反応が適正な産物のみを蓄積しているか否かを判断するために使用することができる。
【実施例９】
【０１０４】
実施例９． エキソヌクレアーゼ阻害の定量化
本実施例は、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性に対する本発明の試薬の阻害効果を測定するための厳密なアッセイを記載する。本アッセイでは、M. W. Kaiser, N. Lyamicheva, W. Ma, C. Miller, B. Neri, L. Fors, and V. I. Lyamicheva in J. Bio. Chem., 274, pp. 21387-21394（1999）に記載の系と同様のプライマー−鋳型系を使用した。ただし、鋳型の５’末端をＣｙ５で標識し、二本鎖ＤＮＡに結合すると蛍光を発するＤＮＡ色素であるＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉの存在下でアッセイを実行した点で異なる。本アッセイ用の鋳型は、ヌクレオチド配列：５’−ＡＣＧＡＧＣＧＴＣＴＴＴＣ−３’（配列番号３６）を有するプライマーにアニーリングするオリゴヌクレオチド配列５’−Ｃｙ５−ＡＡＡＡＣＧＣＴＧＴＣＴＣＧＣＴＧＡＡＡＧＣＧＡＧＡＣＡＧＣＧＡＡＡＧＡＣＧＣＴＣＧＴ−３’（配列番号３５）からなる。長い方のオリゴヌクレオチドは、異なる長さの２個の一本鎖尾部を有するヘアピン構造を形成する。鋳型の短い５’尾部はＣｙ５蛍光団を含有し、４アデノシン残基からなり；鋳型の長い方の３’尾部は、プライマーオリゴヌクレオチドに対する標的となり、これにより、該プライマーが１塩基対の重複を有して５’の鋳型尾部の直前に位置する。この鋳型−プライマー複合体にＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉを加えると、該複合体の二本鎖ＤＮＡ領域に結合したＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉが生じる。４８０ｎｍレーザーでＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉが励起されると、結合したＤＮＡ色素からの蛍光エネルギーがＣｙ５によって完全に吸収され、それは蛍光共鳴エネルギー転移によって生じると考えられ、最大ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ発光波長（最大発光波長：５２１ｎｍ）で検出可能な蛍光は存在しない。Ｔａｑポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性によって５’尾部が加水分解されると、鋳型−プライマー複合体からＣｙ５部分が除去され、検出可能なＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ蛍光が回復する。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼの存在下でのＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ蛍光の回復についてのキネティクスは、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性の定量的尺度を提供する。本発明の試薬はＴａｑポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を阻害し、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ蛍光の増大を減速させる。
【０１０５】
本アッセイは、２５マイクロリットル（μＬ）の容量中、５０ｎＭ、１００ｎＭ、３００ｎＭ、または１０００ｎＭの９−２２ＤＤ化合物の不存在または存在下で、１×ＰＣＲバッファー中で混合された０．５μＭの上記鋳型および１．５μＭの上記プライマー、３ｍＭのＭｇＣｌ２、１：４００００希釈の市販のＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉストック溶液（Molecular Probes, Eugene, OR）、１．２５ＵのＴａｑポリメラーゼ（Invitrogen, Calrsbad, CA）から構成されるものとした。該反応混合物にはｄＮＴＰを加えなかった。その理由は、本アッセイがＤＮＡポリメラーゼ活性に依拠しないからである。鋳型およびプライマーを含まない反応混合物を２５℃で調製して、９−２２ＤＤ化合物およびＴａｑＤＮＡポリメラーゼ間の相互作用を促進させた。次いで、サンプルを氷上に置き、鋳型およびプライマーを加え、反応の開始まで氷上で置いた。陰性対照にはＴａｑＤＮＡポリメラーゼを加えなかった。ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ ７７００にて２５℃で６０分間サンプルをインキュベートすることによって反応を開始し、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉチャネルにおける蛍光収集を３０秒毎に行った。各対照および各濃度の試薬９−２２ＤＤに関して３回の異なる試行を平均した。
【０１０６】
図９は本アッセイの結果を示す。検出可能なＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ蛍光は、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性の程度についての尺度を提供する。「Ｔａｑなし」の対照はＳＹＢＲ蛍光シグナルを示さず、Ｃｙ５によるＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ蛍光の完全吸収および５’−３’エキソヌクレアーゼ活性の完全な不存在と矛盾しない（ライン９６）。Ｔａｑポリメラーゼを加えると、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ蛍光が回復し、当該アッセイ条件下での５’−３’エキソヌクレアーゼ活性の最大レベルに関するベースラインが提供される（ライン９１）。反応混合物に９−２２ＤＤ化合物を加えると、Ｔａｑポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性に対する９−２２ＤＤの阻害効果に起因して、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ蛍光の回復が用量依存的様式で減速される（ライン９２、５０ｎＭ；ライン９３、１００ｎＭ；ライン９４、３００ｎＭ；ライン９５、１０００ｎＭ）。以下の表ＩＩＩでは、２５℃で６０分間のインキュベーション後に達成される相対的ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ蛍光のレベルに基づいて、種々の濃度の９−２２ＤＤ化合物による５’−３’エキソヌクレアーゼ活性の阻害割合を定量化する。
【表３】
【実施例１０】
【０１０７】
実施例１０． 標的ＤＮＡの存在下および非存在下でのプライマー二量体形成およびオリゴマー形成の防止
最終容量２５μＬ中の１００ゲノムのヒト胎盤ＤＮＡ（Sigma, St Louis, MO）の存在下または非存在下で、一連のＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅反応を準備した。この実験では、ＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅反応物は、１×ＰＣＲバッファー（Invitrogen, Carlsbad, CA）、３ｍＭのＭｇＣｌ２、０．２５ｍＭのｄＮＴＰ、１０００ｎＭの過剰プライマー、５０ｎＭの制限的プライマー、０．２５μＭのＦＡＭ標識プローブ鎖、０．３μＭのＤａｂｃｙｌ標識リバース相補鎖、１．２５単位のＰｌａｔｉｎｕｍ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Invitrogen, Carlsbad, CA）から構成するものとした。プライマーおよびプローブの配列は以下の通りであった：
過剰プライマー：５’ ＧＴＴＴＣＴＴＴＧＣＴＧＣＣＧＴＧＴＴＣ ３’（配列番号３７）
制限的プライマー：５’ ＣＣＣＣＡＧＡＧＡＣＣＣＣＡＧＴＴＧＣＴＡＡＣＣＡＧＡＣ ３’（配列番号３８）
ＦＡＭ標識プローブ鎖：５’ ［ＴＥＴ］ＡＧＡＣＡＧＡＧＴＴＧＡＡＡＧＴＣＡＧＧ［Ｐｈｏｓ］ ３’（配列番号３９）
Ｄａｂｃｙｌ標識リバース相補鎖：５’ ＡＣＴＴＴＣＡＡＣＴＣＴＧＴＣＴ［Ｄａｂｃｙｌ］ ３’（配列番号４０）。
【０１０８】
前記プライマーおよびプローブは、ヒトｐ５３遺伝子のエキソン５および６を包含する４８８塩基対（ｂｐ）のアンプリコンを増幅および検出する。
【０１０９】
ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（Applied Biosystems, CA）で増幅を実行した。その場合、９５℃で３分間の１サイクル；９５℃で１０秒間，６４℃で３０秒間，７５℃で３０秒間の２５サイクル；および９５℃で１０秒間，６４℃で３０秒間，７５℃で３０秒間，４５℃で２０秒間の３５サイクルからなる熱プロファイルを用い、４５℃ステップ中にＴＥＴチャネルにおいて蛍光を検出した。
【０１１０】
得られた増幅産物を、０．５×ＴＢＥバッファー中で、２時間、３％アガロースゲルでのゲル電気泳動に付することよって分析し、臭化エチジウムで染色した。結果を図１０に示す。レーン３、５、７、９、１１のサンプルはゲノムＤＮＡを加えずに調製されたものである。レーン２、４、６、８、１０のサンプルはゲノムＤＮＡを加えて調製されたものである。レーン１には１００塩基対ラダーの電気泳動用サイズマーカーを含めた。試薬９−２２ＤＤを以下のように出発反応物に加えた：レーン２および３、０ｎＭ；レーン４および５、５０ｎＭ；レーン６および７、１００ｎＭ；レーン８および９、２００ｎＭ；レーン１０および１１、３００ｎＭ。
【０１１１】
ゲルの右側に隣接して、適正産物のサイズ、ならびにプライマー二量体およびプライマーオリゴマーであると推測されるサイズをマークした。図１０に示される結果は、ゲノムＤＮＡを加えて開始された反応において、試薬９−２２ＤＤの濃度を増加させると、プライマー二量体およびプライマーオリゴマーを含めた非特異的産物の出現を防止するように用量依存的様式で作用し、それによって適正産物の特異性および収量の両者が高まることを実証する。また増加濃度の試薬９−２２ＤＤは、ゲノムＤＮＡを含有しない反応においても、プライマー二量体およびプライマーオリゴマーの出現を防止する。
【実施例１１】
【０１１２】
実施例１１． 二重反応におけるプライマー二量体形成の防止
最終容量２５μＬ中の１００ゲノムのヒト胎盤ＤＮＡ（Sigma, St Louis, MO）の存在下または非存在下で、一連のＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅反応を準備した。この実験では、ＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅反応物は、１×ＰＣＲバッファー（Invitrogen, Carlsbad, CA）、３ｍＭのＭｇＣｌ２、０．２０ｍＭのｄＮＴＰから構成するものとした。サンプルごとに１．２５単位のＴａｑポリメラーゼを使用した。第一の増幅標的配列（産物１）は嚢胞性線維症遺伝子のエキソン１１の一部分であり、１００ｎＭの制限的プライマー：５’ ＧＡＣＧＴＴＴＡＣＡＧＣＧＡＡＴＧＣＴＴＧＣＴＡＧＡＣＣＡＡＴ ３’（配列番号４１）および２，０００ｎＭの過剰プライマー：５’ ＴＣＣＡＡＧＴＴＴＧＣＡＧＡＧＡＡＡＧＡＣＡＡＴ ３’（配列番号４２）を用いて増幅した。第二の増幅標的配列（産物２）は嚢胞性線維症遺伝子のエキソン１０の一部分であり、５０ｎＭの制限的プライマー：５’ ＣＡＧＴＴＴＴＣＣＴＧＧＡＴＴＡＴＧＣＣＴＧＧＣＡＣＣＡＴ ３’（配列番号４３）および１０００ｎＭの過剰プライマー：５’ ＧＣＴＴＴＧＡＴＧＡＣＧＣＴＴＣＴＧＴＡＴＣＴＡ ３’（配列番号４４）を用いて増幅した。
【０１１３】
ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（Applied Biosystems, CA）において、９５℃で２分間、次いで９５℃で１０秒間，５６℃で１５秒間，７０℃で２０秒間の２５サイクル、次いで９５℃で１０秒間，５６℃で１５秒間，７０℃で２０秒間，および４５℃で３０秒間（蛍光の取得を伴う）の５０サイクルで増幅を実行した。
【０１１４】
得られた増幅産物を、０．５×ＴＢＥバッファー中の３％アガロースゲルでの２時間のゲル電気泳動に付すことによって分析し、臭化エチジウムで染色した。結果を図１１に示す。レーン１〜６で分析された反応では、非ホットスタートＴａｑポリメラーゼを利用し、レーン７〜１２で分析された反応では、Ｔａｑポリメラーゼに加えてホットスタート抗体を利用した。レーン４〜６および１０〜１２で分析された反応では、１００ｎＭの試薬９−２２ＤＤを加えた。
【０１１５】
ゲルの右側に隣接して、産物１および産物２の一本鎖アンプリコン（ｓｓＤＮＡ）および二本鎖アンプリコン（ｄｓＤＮＡ）、ならびにプライマー二量体であると推測される短い産物を含めた増幅産物の特定についての解釈を付した。他の非特異的産物はアスタリスクでマークされる。非ホットスタートポリメラーゼを用い、本発明の試薬を用いない増幅（レーン１〜３）では、プライマー二量体および他の非特異的産物が生成された。ホットスタートポリメラーゼを用い、本発明の試薬を用いない増幅（レーン７〜９）では、概して、いくらか不純物が減少したが、依然としてミスプライミングの現象が示された。本発明に基づく試薬をホットスタート増幅に加えたレーン１０〜１２では、目的の産物のみが生成された。本発明の試薬を非ホットスタート増幅に加えたレーン４〜６では、プライマー二量体が排除され、３回の反復実験のうちの２回（レーン４およびレーン６）では、すべての他の非特異的産物も同様に排除されたが、１回の反復実験（レーン５）のみでは非特異的産物が出現した。図１１に示される結果は、非ホットスタートＴａｑポリメラーゼまたはホットスタートＴａｑポリメラーゼが使用された場合、低濃度（１００ｎＭ）の試薬９−２２ＤＤが、プライマー二量体の形成を防止するために十分であったこと、さらに、その低濃度の試薬９−２２ＤＤが、２ペアのプライマーを用いる２種の標的の増幅において非ホットスタートＴａｑポリメラーゼとともに使用された場合でさえ、ミスプライミングのすべての現象を防止するためにほぼ十分であったことを実証する。
【実施例１２】
【０１１６】
実施例１２． プライマー二量体形成の防止による二重リアルタイムＰＣＲおよびリアルタイムＰＣＲのキネティクスの最適化
マウスＯｃｔ４およびＸｉｓｔ遺伝子のエキソン内の配列（それぞれＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿０１３６３３およびＬ０４９６１）を同時に増幅するための二重リアルタイムＬＡＴＥ−ＰＣＲアッセイを設計した。各反応は最終容量５０μＬ中で実行し、以下の試薬を含有した：２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．４、および５０ｍＭのＫＣｌによって構成される１×ＰＣＲバッファー（Invitrogen, Carlsbad, CA）、３ｍＭのＭｇＣｌ２、０．４ｍＭの各ｄＮＴＰ、配列５’ ＴＧＧＣＴＧＧＡＣＡＣＣＴＧＧＣＴＴＣＡＧＡＣＴ ３’（配列番号４５）を有する５０ｎＭのＯｃｔ４制限的プライマー、配列５’ ＣＡＡＣＴＴＧＧＧＧＧＡＣＴＡＧＧＣ ３’（配列番号４６）を有する２μＭのＯｃｔ４過剰プライマー、配列５’ ＧＧＴＣＧＴＡＣＡＧＧＡＡＡＡＧＡＴＧＧＣＧＧＣＴＣＡＡ ３’（配列番号４７）を有する１００ｎＭのＸｉｓｔ制限的プライマー、配列５’ ＴＧＡＡＡＧＡＡＡＣＣＡＣＴＡＧＡＧＧＧＣＡ ３’（配列番号４８）を有する２μＭのＸｉｓｔ過剰プライマー、配列５’ ＴＥＴ−ＣＣＧ ＣＣＴ ＧＧＧ ＡＴＧ ＧＣＡ ＴＡＣ ＴＧＴ ＧＧＡ ＡＧＧ ＣＧＧ−Ｄａｂｃｙｌ ３’（配列番号４９）を有する１μＭの低ＴｍのＯｃｔ４分子ビーコンおよび２単位の抗体複合体化Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Invitrogen, Carlsbad, CA）。さらに化合物９−３ＤＤまたは化合物９−３ｂＤＤを、以下に指定される濃度でＰＣＲ混合物に加えた。本実施例では、Ｘｉｓｔアンプリコンを検出するための分子ビーコンを加えなかった。各アッセイは、ＰｕｒＡｍｐプロトコル（Hartshorn et al. (2005) BMC Biotechnol 5: 2を参照のこと）にしたがって、２．５μＬ容量中に細胞溶解および逆転写に必要な試薬をさらに含有した。この二重ＬＡＴＥ−ＰＣＲでは、前記試薬の最終濃度は以下の通りであった：２．５ｍＭのＴｒｉｓ酢酸，ｐＨ８．４、３．７５ｍＭの酢酸カリウムおよび０．４ｍＭの酢酸マグネシウム（希釈したｃＤＮＡ合成バッファー, ThermoScriptTM RT-PCR System, Invitrogen, Carlsbad, CA）、追加の５０μＭの各ｄＮＴＰ、０．１３ｍＭのイソチオシアン酸グアニジン、６．７μＭのβ−メルカプトエタノール、０．７μＭのクエン酸ナトリウム，ｐＨ７．０、０．７×１０−４％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のジメチルスルホキシドおよび０．２×１０−４％のサルコシル（sarcosyl）。
【０１１７】
さらにマウスゲノムＤＮＡ（Sigma, St Louis, MO）を各アッセイに加え、ＰＣＲ増幅用の鋳型を提供した。各試験管に加えるゲノム数は６ｐｇ／ゲノムサイズに基づいて算出した（Vendrely and Vendrely (1949) Experientia 5: 327-329を参照のこと）。
【０１１８】
ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（Applied Biosystems, CA）において増幅を実行した。その場合、９５℃で５分間の１サイクル；９５℃で１０秒間，６３℃で２０秒間，および７２℃で３０秒間の１５サイクル；および９５℃で１５秒間，５５℃で２５秒間，７２℃で３５秒間，および４５℃で３０秒間の４０サイクルから構成される熱プロファイルを用い、ＴＥＴチャネルにおいて４５℃で蛍光を取得した。
【０１１９】
ＰＣＲの終了時点で、増幅産物を、０．５×ＴＢＥバッファー中の３％アガロースゲルでの２時間のゲル電気泳動に付すことによって分析し、臭化エチジウムで染色した。２種の同時に増幅された遺伝子に関して、予測されたサイズの二本鎖および一本鎖産物がともに可視であった。このことは二重ＬＡＴＥ−ＰＣＲが有効であることを示す。
【０１２０】
図１２は、Ｏｃｔ４およびＸｉｓｔ遺伝子内の２種の非相同配列を増幅するための２組のプライマーを含有する上記二重ＬＡＴＥ−ＰＣＲのキネティクスに対する、試薬９−３ＤＤのステム組成を変化させることの効果を示す。該図は、ＴＥＴ−Ｏｃｔ４分子ビーコンとのハイブリダイゼーションを介してＯｃｔ４アンプリコンの蓄積によって生じる蛍光シグナルを示す。その結果は、分析された各ゲノム濃度（１０ゲノム、サークル１２２；１００ゲノム、サークル１２３；１０００ゲノム、サークル１２４）で、３００ｎＭの９−３ＤＤ（三角形付きの線）または同濃度のその修飾型である９−３ｂＤＤ（三角形が付いていない太線）の存在下でＣＴ値が非常に近いことを実証する。そうではなくむしろ、リアルタイム蛍光シグナルのキネティクスは試薬のステムの組成によって影響を受ける。化合物９−３ｂＤＤは、９−３ＤＤと比較して高いＴｍのステムを有し、ゆえに、プライマー二量体形成を最適に防止すると本発明者らは考え、その結果、すべての試験ゲノム濃度で非常に直線的で平行なシグナルが生じる。一方、低ストリンジェントの化合物９−３ＤＤの存在下では、蛍光シグナルの一部は急な勾配を有するが、他のものは反応の早期にプラトーに達し始め、それはプライマー二量体のランダムな形成を示す。種々の鋳型濃度で化合物９−３ＤＤを用いて生じるシグナルは、化合物９−３ｂＤＤ（改変型ステムを有する）の存在下で得られるシグナルより平行ではない。理想的には、完全に平行なシグナル（一定勾配を有する）を生じる直線的増幅が望ましく、エンドポイントタイプの解析に関しては特に妥当である。
【０１２１】
９−３ＤＤを含有するサンプルのアガロースゲル解析では、特に多数の鋳型数で可視の、プライマー二量体であろうバンドが示され、少数の鋳型数での非常に小さいバンドはプライマーと合致する。そのようなバンドは９−３ｂＤＤを含有するサンプルの分析では現れなかった。
【０１２２】
図１３は、本実施例に記載の、図１２に関しても使用された二重ＬＡＴＥ−ＰＣＲにおいて、試薬９−３ｂＤＤの濃度を変化させることの効果を示す。この場合、試薬９−３ｂＤＤの濃度を３００ｎＭ（三角形が付いていない太線）から２００ｎＭ（三角形付きの線）に低下させると、アガロースゲル解析によって確認されるように、やはり、プライマー二量体形成に起因して直線的増幅の勾配に影響する。結果として、少数の当初鋳型数（１０ゲノム、サークル１３２）を含有するサンプルの一部は、最後のサイクル（「エンドポイント」）で、多数の当初鋳型数（１００ゲノム、サークル１３３および１０００ゲノム、サークル１３４）を含有するサンプルより高い蛍光を有する。
【０１２３】
ＰＣＲ効率に対する、本出願に記載される試薬の濃度の効果を、１ペアのプライマーで１鋳型を増幅するＬＡＴＥ−ＰＣＲにおいてさらに試験した。増幅対象の鋳型は、図１２および図１３に関して記載された二重反応で使用されたのと同じマウスＯｃｔ４配列であり、プライマーおよび分子ビーコン配列も該反応と同一であった。
【０１２４】
各反応は最終容量１００μＬ中で実行し、以下の試薬を含有した：２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．４、および５０ｍＭのＫＣｌによって構成される１×ＰＣＲバッファー（Invitrogen, Carlsbad, CA）、３ｍＭのＭｇＣｌ２、０．２５ｍＭの各ｄＮＴＰ、５０ｎＭのＯｃｔ４制限的プライマー、２μＭのＯｃｔ４過剰プライマー、１μＭの低ＴｍのＴＥＴ−Ｏｃｔ４分子ビーコン、および２単位の抗体複合体化Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Invitrogen, Carlsbad, CA）。さらに化合物９−３ＤＤを、１５０、または３００または４５０ｎＭの濃度でＰＣＲ混合物に加えた。上述の二重反応の場合（図１２および図１３を参照のこと）と同様に、各アッセイは、ＰｕｒＡｍｐプロトコルにしたがって、１０．５μＬ容量中に細胞溶解および逆転写に必要な試薬をさらに含有した。このＬＡＴＥ−ＰＣＲでは、前記試薬の最終濃度は以下の通りであった：５ｍＭのＴｒｉｓ酢酸，ｐＨ８．４、７．５ｍＭの酢酸カリウムおよび０．８ｍＭの酢酸マグネシウム（希釈したｃＤＮＡ合成バッファー）、１ｎｇ／μＬのランダムヘキサマーおよび追加の１００μＭの各ｄＮＴＰ（ThermoScriptTM RT-PCR System, Invitrogen, Carlsbad, CAの全構成要素）、０．４ｍＭのイソチオシアン酸グアニジン、２０μＭのβ−メルカプトエタノール、２μＭのクエン酸ナトリウム，ｐＨ７．０、２×１０−４％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のジメチルスルホキシドおよび０．５×１０−４％のサルコシル。
【０１２５】
さらにマウスゲノムＤＮＡを各アッセイに加え、本実施例に記載の二重ＬＡＴＥ−ＰＣＲに関して指定される、ＰＣＲ増幅用の鋳型を提供した。ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒにおいて、二重反応に関して詳述されるプロファイルと同じ熱プロファイルを用いて、増幅を実行した。ＰＣＲの終了時点で、増幅産物を、０．５×ＴＢＥバッファー中の３％アガロースゲルでの２時間のゲル電気泳動に付すことによって分析し、臭化エチジウムで染色した。ゲル上では二本鎖および一本鎖産物がともに可視であり、予測されるサイズを有した。このことはＬＡＴＥ−ＰＣＲによる増幅が有効であることを示す。
【０１２６】
さらにＯｃｔ４鋳型の増幅効率に対する増加濃度の化合物９−３ＤＤの効果を試験した。１５０ｎＭ、３００ｎＭ、４５０ｎＭの９−３ＤＤの各試験濃度で実施された５ゲノム（９−３ＤＤの各試験濃度に関して２回の反復実験の平均）、２０ゲノム（９−３ＤＤの各試験濃度に関して２回の反復実験の平均）、１００ゲノム、および１０００ゲノムを含有するリアルタイムＰＣＲアッセイからＣＴ値を取得した。各濃度での各ＣＴ値のシリーズに関する直線回帰を図１４に示す。図１４では、三角は４５０ｎＭの濃度であり、白抜きの四角は３００ｎＭであり、黒い四角は１５０ｎＭである。このプロットからすぐにわかることは、４５０ｎＭの９−３ＤＤが閾値を超える蛍光シグナルの出現を大きく遅延させ、さらにＰＣＲ増幅の用量依存性を変更することである（回帰直線から離れている１０遺伝子コピーおよび４０遺伝子コピーの点を参照のこと）。一方、１５０ｎＭまたは３００ｎＭの９−３ＤＤを使用して得られたＣＴ値は非常に類似し、鋳型コピー数および蛍光シグナルの最初の出現の間の直線的関連性を実証する。
【０１２７】
しかし、蛍光のリアルタイムパターンの分析では、図１５に示されるように２つの条件（濃度）間の差異が強調される。１００ゲノム、サークル１５１、または１０００ゲノム、サークル１５２によって作成される曲線の勾配は、３００ｎＭの９−３ＤＤが使用された場合（三角形が付いていない太線）に、１５０ｎＭの９−３ＤＤ（三角形付きの線）が使用された場合より急勾配であり、よりストリンジェントな３００ｎＭの条件がプライマー二量体を排除し、ゆえに増幅効率を高めることが示唆される。
【実施例１３】
【０１２８】
実施例１３． 本発明に基づく複数の試薬の使用
ヒトゲノムＤＮＡ出発材料の５種の異なる標的配列を個別に増幅するために、および多重反応においてすべての５配列を一緒に増幅するために、ＬＡＴＥ−ＰＣＲ反応混合物を調製した。各標的配列はその独自のペアの制限的および過剰プライマーを必要とした。前記標的配列は、（１）１９１塩基対のグロビン対立遺伝子、（２）３１２塩基対のテイ・サックスＧ２６９対立遺伝子、（３）４５２塩基対のテイ・サックス１２７８および１４２１対立遺伝子、（４）ミトコンドリア超可変領域１の５４９塩基対セグメント、および（５）ｐ５３遺伝子エキソン７および８を含む６１１塩基対セグメントであった。２５μＬの反応混合物は、１×ＰＣＲバッファー（Invitrogen）、０．４ｍＭのｄＮＴＰ、３ｍＭのＭｇ＋＋、０．２４×ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎおよび１．５単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Invitrogen）を含有した。制限的プライマーに関しては５０ｎＭおよび過剰プライマーに関しては１０００ｎＭの濃度でプライマーを加えた。すべての５ペアのプライマーを多重反応に加えた。熱サイクル処理は、９５℃で１０秒間，６４℃で２０秒間，および７２℃で１分間の４５サイクルであった。
【０１２９】
個別のプライマーペアおよび個別の標的を含む反応混合物、ならびにすべての５ペアのプライマーおよびすべての５種の標的を含む反応混合物を、２５ｎＭの化合物９−２２ＤＤおよび１００ｎＭの化合物１２−３ＤＤの組み合わせの存在下で増幅した。さらに、本発明に基づくいかなる試薬をも加えずに五重反応混合物を増幅した。反応産物をゲル電気泳動によって調べた。種々の増幅のゲル電気泳動の結果を図１６に示す。図１６は、レーンｒにサイズマーカー（１００塩基対ずつ異なるサイズ）を含む。中央のレーンｇ〜ｋはそれぞれ標的配列（１）〜（５）の個別の増幅の産物である。レーンｌ〜ｑは、化合物９−２２ＤＤおよび化合物１２−３ＤＤの混合物を加えた６回反復の五重増幅の産物である。レーンａ〜ｆは、本発明の試薬を加えなかった６回反復の五重増幅の産物である。図１６は、いずれの化合物も加えない多重反応と比較して、化合物の混合物が増幅を増強した（より多量で純粋な所望のアンプリコンが得られた）ことを示し、本発明のキット、増幅およびアッセイにおいて試薬の混合物を使用しうることを実証する。
【実施例１４】
【０１３０】
実施例１４． 作用様式の試験
本発明者らは、本発明の試薬のミスプライミングの低減（特異性改善）およびポリメラーゼ阻害効果を定量的に研究する試験を考案した。該試験は第１の作用様式と第３の作用様式を識別すると考えられる。該試験は、実施例１に記載のアッセイと本質的に同様のＰＣＲ増幅アッセイであるが、以下の例外を有する：増幅反応混合物は半数（１０００ゲノム）の剪断ゲノムＤＮＡを含有し、熱サイクル処理の最終部分は７０サイクルから４０サイクルに減少される。種々の量、典型的には２５ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、３００ｎＭ、１５００ｎＭおよび３０００ｎＭの本発明の試薬を加えて増幅を実施する。試験は２種の分析を含む：第一は、特異性に関する、増幅産物の融解曲線の分析であり；第二は、阻害に関する、合成二本鎖産物のリアルタイム蛍光曲線の分析である。
【０１３１】
図１７〜１８は、本発明に基づく２種の試薬（それぞれ化合物１２−３ＤＤおよび化合物１２−Ｃ３ＤＤ）に関する分析結果の一部分を示す。各図のカラムＩは、表示通りの数種の選択された濃度の試薬に関する融解曲線を示す。各図のカラムＩＩは、表示通りの同濃度に関するリアルタイム蛍光曲線を示す。図１７では、カラムＩの融解曲線は、化合物１２−３ＤＤが１００ｎＭ以上の濃度で高い特異性（ミスプライミングの回避）を達成したことを示した（最低濃度１００ｎＭは、実施例１に記載の反応に関して見出された最低濃度よりわずかに高い）。図１７では、カラムＩＩのリアルタイム蛍光曲線は、化合物１２−３ＤＤの濃度が１００ｎＭを超えて増加するにつれて、１０００ｎＭを超える濃度で反応が本質的に停止されるまで、ポリメラーゼ阻害が進行的に増大したことを示した。阻害は、プラトーの蛍光レベル、およびＣＴ値の遅延（１００ｎＭでは１９．６、３００ｎＭでは２１．１、１５００ｎＭおよび３０００ｎＭでは存在せず、すなわち少なくとも４０）によって示される、生成二本鎖産物（群）全体（所望の特異的産物およびミスプライミングの非特異的産物を含む）の量が少ないことに反映される。図１８では、カラムＩの融解曲線は、化合物１２−３ＤＤが３００ｎＭ以上の濃度で高い特異性を達成したことを示した（最低濃度３００ｎＭは、実施例１に記載の反応に関して見出された最低濃度と同一である）。図１８では、カラムＩＩのリアルタイム蛍光曲線は、化合物１２−Ｃ３ＤＤの濃度が３００ｎＭを超えて増加するにつれて、ポリメラーゼ阻害が進行的に増大した（ＣＴ値は１００ｎＭでは１８．８、３００ｎＭでは１８．８、１５００ｎＭでは２１．１および３０００ｎＭでは２４．５であった）が、該反応は３０００ｎＭの濃度でさえ停止されなかったことを示した。
【０１３２】
図１７と図１８を比較すると、化合物１２−Ｃ３ＤＤの総合的な性能では、化合物１２−３ＤＤの総合的な性能より濃度依存性の程度が低いことがわかる。ゆえに、この特定の増幅反応では、化合物１２−Ｃ３ＤＤの濃度が３００ｎＭから１５００ｎＭになると生じるＣＴ遅延およびプラトー蛍光の減少は、化合物１２−３ＤＤの濃度が１００ｎＭから３００ｎＭになると生じる結果とおおむね同一である。
【０１３３】
本発明の多数の実施形態を記載してきた。しかしながら、本発明の精神および範囲から逸脱することなく種々の修飾を施してよいことが理解されよう。したがって、他の実施形態は特許請求の範囲内である。
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を利用する核酸増幅反応およびアッセイに関し、それにはリアルタイムアッセイおよびエンドポイントアッセイの両者のホモジニアスアッセイが含まれる。
【背景技術】
【０００２】
背景
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を利用する核酸増幅（ＰＣＲ増幅を含むアッセイなど）は周知である。米国特許第４，６８３，２０２号、同第４，６８３，１９５号および同第４，９６５，１８８号、および、一般には、PCR PROTOCOLS, a guide to Methods and Applications, Innis et al.（編）, Academic Press（San Diego, CA (USA) 1990）を参照されたい。未結合検出試薬またはプローブを除去するための洗浄を必要とせず、ゆえに増幅反応容器を開けることなく実施できるホモジニアスＰＣＲアッセイもまた周知である。ホモジニアスＰＣＲアッセイには、増幅反応の終了時点で増幅産物を検出するエンドポイントアッセイ、および反応が進行しているときに一部のまたはすべての熱サイクル中に増幅産物を検出するリアルタイムアッセイの両者が含まれる。米国特許第５，９９４，０５６号、同第５，４８７，９７２号、同第５，９２５，５１７号および同第６，１５０，０９７号を参照されたい。
【０００３】
ＰＣＲ増幅反応は、概して、対称的であるように、すなわち、「対応する（matched）」フォワードプライマーおよびリバースプライマーを利用して二本鎖アンプリコンを作り出すように設計され；すなわち、それらは可能な限り近い融解温度を有し、かつそれらは等モル濃度で反応物に添加される。ＰＣＲ反応において、直接的に一本鎖ＤＮＡを作り出すために限られた用途が見出されている技術は、「非対称的ＰＣＲ」である。Gyllensten and Erlich, "Generation of Single-Stranded DNA by the Polymerase Chain Reaction and Its Application to Direct Sequencing of the HLA-DQA Locus," Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85: 7652-7656 (1988)；および米国特許第５，０６６，５８４号。非対称的ＰＣＲは、プライマーの一方が制限的な量で添加され、典型的には他方のプライマーの濃度の１〜２０％の量で添加される点で対称的ＰＣＲと異なっている。
【０００４】
さらに最近、本発明者らは、「直線後指数的（Linear-After-The-Exponential）」ＰＣＲまたは、略して「ＬＡＴＥ−ＰＣＲ」として知られる非対称的ＰＣＲ増幅法を開発した。Sanchez et al. (2004) PNAS 101: 1933-1938, Pierce et al. (2005) PNAS 102: 8609-8614、および公開されている国際特許出願ＷＯ ０３／０５４２３３（２００３年７月３日）を参照のこと。前記文献は参照によりその全体が本明細書中に組み入れられる。ＬＡＴＥ−ＰＣＲでは、Ｔｍ［０］と称される増幅の出発時点でのＰＣＲプライマーの実際の融解温度を考慮に入れる。Ｔｍ［０］は、非天然ヌクレオチドが使用される場合に必要であるように、経験的に決定することができ、あるいは「近接（nearest neighbor）」法（Santa Lucia, J. (1998) PNAS (USA) 95: 1460-1465；およびAllawi, H. T. and Santa Lucia, J. (1997) Biochem. 36: 10581-10594）にしたがって、塩濃度の補正を使用して、算出することができる。本発明者らの研究では、０．０７Ｍの一価塩濃度を利用した。
【０００５】
ＬＡＴＥ−ＰＣＲの場合には低減されるＰＣＲ増幅の望ましくない特徴は、反復実験（replicates）間のばらつき（scatter）である。対数期の増幅に続いてリアルタイムで追跡される反復実験増幅はそれぞれ相違し、種々のレベルでプラトーに達する。ばらつきとは、反復実験が同一の反応キネティクスを有さず、精度を低下させることを意味する。このことはＰＣＲアッセイ全般に関する問題であるが、特にエンドポイントアッセイおよび直線期のシグナルの勾配に依存するアッセイに関して問題である。
【０００６】
ＰＣＲ増幅に伴う別の重大な問題はミスプライミングである。本発明者らの考えでは、ミスプライミングは以下の少なくとも３種のタイプで現れる：タイプ１、増幅開始前の反応混合物の調製中に生じるミスプライミング；タイプ２、サイクル温度がプライマーの融解温度よりかなり低いいずれかの温度を含む場合に、増幅中に生じるミスプライミング；およびタイプ３、高濃度のアンプリコンが作り出された後に継続されるＰＣＲ増幅の後期段階に生じるミスプライミング。第１のタイプのミスプライミングに対処するためにいくつかのアプローチが使用されている。アプローチの１つは、ポリメラーゼを化学的に修飾して、高温、例えば９５℃に加熱されるまで不活性であるようにすることである。米国特許第５，６７７，１５２号および同第５，７７３，２５８号を参照されたい。別のアプローチは、ポリメラーゼに抗体を結合させ、反応物が高温、例えば９５℃に加熱されて該抗体が不可逆的に変性するまで該ポリメラーゼを阻害することである。米国特許第５，３３８，６７１号を参照されたい。さらに別のアプローチは、反応混合物中にアプタマーを含ませることである。Doug and Jayasena (1996), J. Mol. Biol. 264: 268-278および米国特許第６，０２０，１３０号を参照のこと。アプタマーは約３０ヌクレオチド長の一本鎖オリゴヌクレオチドであり、ポリメラーゼに結合して、低温で陥凹３’末端を伸長するその能力を阻害する。アプタマーは、ＰＣＲサイクルの典型的な最高温度である９５℃で不可逆的に変性しない。Kainz et al. (2000) Biotechniques 28: 278-282では、１６〜２１ヌクレオチド長を有する、一定量の二本鎖ＤＮＡ断片をＰＣＲ反応混合物に加えると、典型的なＰＣＲ伸長温度より低い温度でポリメラーゼが阻害され、非特異的産物の合成が抑制されることが報告された。ＤＮＡ断片はＰＣＲサイクル処理中に不可逆的に変性しない。Eppendorf-5 Prime, Inc.は、温度依存的様式でＴａｑポリメラーゼに結合し、約５０℃より低い温度で二本鎖ＤＮＡに対するその結合を阻害するとされている専売のリガンドを市販している。前述の多数の試みにもかかわらず、ミスプライミングは依然としてＰＣＲ増幅に伴う問題である。
【０００７】
ＰＣＲ増幅中のミスプライミングの別の現象はプライマー二量体形成および増幅として知られている。この現象では、一方のプライマーが他方のプライマーまたは自身とハイブリダイズし、次いで３’末端の伸長を受けて、小さい二本鎖アンプリコンが生成される。その後、アンプリコンはさらに増幅されるか、あるいは多量体化されてさらに増幅されうる。プライマー二量体形成は標的の非存在下で生じうる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第４，６８３，２０２号
【特許文献２】米国特許第４，６８３，１９５号
【特許文献３】米国特許第４，９６５，１８８号
【特許文献４】米国特許第５，９９４，０５６号
【特許文献５】米国特許第５，４８７，９７２号
【特許文献６】米国特許第５，９２５，５１７号
【特許文献７】米国特許第６，１５０，０９７号
【特許文献８】米国特許第５，０６６，５８４号
【特許文献９】国際特許出願ＷＯ ０３／０５４２３３
【特許文献１０】米国特許第５，６７７，１５２号
【特許文献１１】米国特許第５，７７３，２５８号
【特許文献１２】米国特許第５，３３８，６７１号
【特許文献１３】米国特許第６，０２０，１３０号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】PCR PROTOCOLS, a guide to Methods and Applications, Innis et al.（編）, Academic Press（San Diego, CA (USA) 1990）
【非特許文献２】Gyllensten and Erlich, "Generation of Single-Stranded DNA by the Polymerase Chain Reaction and Its Application to Direct Sequencing of the HLA-DQA Locus," Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85: 7652-7656 (1988)
【非特許文献３】Sanchez et al. (2004) PNAS 101: 1933-1938
【非特許文献４】Pierce et al. (2005) PNAS 102: 8609-8614
【非特許文献５】Santa Lucia, J. (1998) PNAS (USA) 95: 1460-1465
【非特許文献６】Allawi, H. T. and Santa Lucia, J. (1997) Biochem. 36: 10581-10594
【非特許文献７】Doug and Jayasena (1996), J. Mol. Biol. 264: 268-278
【非特許文献８】Kainz et al. (2000) Biotechniques 28: 278-282
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
リアルタイム検出方法によるＰＣＲ増幅の定量的解析が可能になっていて、その場合、反応の閾値サイクルすなわちＣＴを超えると蛍光シグナルが可視になるＰＣＲサイクルにより出発標的濃度が示唆される。エンドポイント解析は良くても半定量的である。その部分的な原因は、反応が指数的増幅から脱する時の反復実験間のばらつきである。二本鎖アンプリコンの電気泳動による解析は半定量的であり、蛍光標識プライマーを利用する場合がある。蛍光標識プローブ、対立遺伝子識別プローブまたはミスマッチ寛容プローブを利用するエンドポイント解析もまた、良くても半定量的である。ばらつきを低減させ、一本鎖産物を生成することによって、ＬＡＴＥ−ＰＣＲは、エンドポイント解析における大きな改善を提供するが、反復実験間のばらつきは完全には排除されないことが多く、定量的多重検出は依然として所望の精度より低精度である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の一態様は、ＰＣＲ増幅反応において生成物の特異性を改善し、かつミスプライミングの影響を排除する、あるクラスの試薬添加剤である。該添加剤はすべてのタイプのＰＣＲにおいて既存の「ホットスタート」方法論より性能が優れていて、その使用により、反応の初期、および多数のサイクル（典型的に６０サイクル以上）を有するＬＡＴＥ−ＰＣＲ反応中のいずれにおいても、プライマー二量体およびミスプライミングされたアンプリコンを含む望ましくない生成物の蓄積を防止することができる。
【００１２】
本発明の別の態様は、ＰＣＲ増幅およびアッセイ方法、対称的ＰＣＲまたは非対称的ＰＣＲの両者であり、非限定的にＬＡＴＥ−ＰＣＲが挙げられ、ならびに前記試薬添加剤を含むキット、部分的キット、およびオリゴヌクレオチドセットである。
【００１３】
要旨
本発明の試薬は、少なくとも一部のＰＣＲ増幅においてミスプライミングの１種以上の現象を防止することが可能な添加剤である。「現象を防止する（防ぐ）」とは、反応の終了時点で、本明細書中に記載の技術、すなわち蛍光性ＤＮＡ色素、ゲル電気泳動、ＤＮＡシークエンシングおよび融点解析によって、ミスプライミングの生成物または生成物群が検出されないことを意味する。本発明に基づく試薬は、重合活性および５’−３’エキソヌクレアーゼ活性（5' - to - 3' exonuclease activity）の両方を有するポリメラーゼを利用する場合でさえ、増幅開始前に、１マイクロモル濃度（μＭ）（すなわち１０００ｎＭ）未満、好ましくは６５０ナノモル濃度（ｎＭ）以下、より好ましくは３００ｎＭ以下、最も好ましくは５０〜２５０ｎＭの比較的低い濃度でＰＣＲ増幅混合物中に含ませてよい。本発明に基づく試薬は修飾された一本鎖オリゴヌクレオチドである。本発明に基づく試薬を構築するために利用してよいオリゴヌクレオチドは広範囲のオリゴヌクレオチドである。それらはＤＮＡ、ＲＮＡまたは混合ＤＮＡ−ＲＮＡであってよい。それらは、修飾ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、例えば２’Ｏ−メチルリボヌクレオチド、非天然ヌクレオチド間結合、非ヌクレオチドリンカー、ＰＮＡ、ＬＮＡおよび付加化学部分、例えばGlenn Researchによって報告されているキャップヌクレオチド（capped nucleotides）を含有してよい。
【００１４】
本発明の試薬は、ＰＣＲ増幅反応混合物中で、一般に「ヘアピン」構造と称されるステム・ループ構造（stem-and-loop structure）を形成する一本鎖オリゴヌクレオチドであるが、それらは、ループがヌクレオチドから構成されていないステム・ループ構造から構成されていてもよい。そのような構造では、分子の中心部分が一本鎖の（ハイブリダイズしていない）ままであり（ループ）、末端は互いにハイブリダイズしてステムを形成する。ステムは平滑末端であってよく、あるいは一方の鎖が他方の末端を超えて伸長していてもよい。ステムは連続する二本鎖領域を含んでよく、あるいはそれは内部ミスマッチを含んでもよい。内部ミスマッチは隆起を生じさせる。オリゴヌクレオチドの末端によって形成されるステムの端部は、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドよりも堅固に結合するように安定化される。本発明者らは、本発明の試薬のステムをその融解温度、すなわちＴｍを参照することによって特徴付ける。融解温度とは、ステムの相補配列の５０％がハイブリダイズしておらず（開放型立体配置）、かつ該相補配列の５０％が自身にハイブリダイズしているか、あるいは部分的にハイブリダイズしている（閉鎖型立体配置）摂氏温度である。本出願では、ステムの「計算上のＴｍ」とは、Ｍ−ｆｏｌｄプログラム：Zucker, M. (2003). "Mfold Web Server for Nucleic Acid Folding and Hybridization Prediction." Nucl. Acids Res. 31: 3406-3415を使用して取得される、対応する安定化されていない完全ＤＮＡオリゴヌクレオチドのステム部分の計算上の融解温度を意味する。その場合、ナトリウム濃度が７０ミリモル濃度（ｍＭ）であり、かつマグネシウム濃度が３ｍＭであると仮定する。添加されたクエンチャーペア、好ましくは光を吸収するが、吸収エネルギーを熱として放出する非蛍光クエンチャー、例えばＤａｂｃｙｌおよびＢｌａｃｋ Ｈｏｌｅクエンチャーを有する好ましい実施形態の場合、Ｔｍは、クエンチャーを伴わないＤＮＡヘアピンについての計算上のＴｍである。末端にキャップヌクレオチドを有する実施形態の場合、Ｔｍは、同等のキャップなしのヌクレオチドを含有するＤＮＡヘアピンについての計算上のＴｍである。ステム端部の２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド含有物の場合、Ｔｍは、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドのデオキシリボヌクレオチドアナログを含有する全ＤＮＡヘアピンについての計算上のＴｍである。本発明者らは、安定化されたヘアピンの実際の融点を取得することが困難であるという実施上の理由のために本方法論を利用するが、安定化用の修飾に起因して実際の融点が計算上のＴｍより数度高いことを認識している。本発明の試薬は、９４℃を超えない計算上のステムＴｍを有し、好ましくは計算上のステムＴｍは５０〜８５℃の範囲である。一部の実施形態では、プライマーアニーリング温度より高い（典型的に増幅反応は５５〜７２℃であり、すなわち７２〜８５℃の範囲の）計算上のステムＴｍが好ましいが、他の実施形態では、プライマーアニーリング温度より低い、すなわち５０〜７１℃の範囲の計算上のステムＴｍが好ましい。ステムの相補配列は、ＰＣＲサイクル処理中の鎖融解に使用される温度である９５℃で開いて、一本鎖になる。さらに、本発明の試薬のステムは、閉鎖型、自己ハイブリダイズ型のコンホメーション（confirmation）の形成のために十分に低い温度で６ヌクレオチドを超える長さを有する。現在、本発明者らの好ましい実施形態では、９〜１２塩基対の長さ、好ましくは９〜１１塩基対、閉鎖型の場合、より好ましくは９〜１２、最も好ましくは９〜１１の、内部ミスマッチを含まない連続した相補的塩基対、最も好ましくは９〜１２塩基対の長さで、かつ完全に相補的な平滑末端型ステムであるステムを形成する。試薬の３’末端は、増幅反応においてＤＮＡポリメラーゼによって伸長可能ではなく、したがって該反応物はＰＣＲプライマーではない。すべての突出３’末端は、例えばリン酸部分または何らかのブロック用化学部分を付加することによって、伸長を防止するためにブロックされる。
【００１５】
ループの長さはかなり変動しうる。ループがヌクレオチドおよびヌクレオチド間結合からなる場合、それは少なくとも３ヌクレオチド長である。さらに、それがちょうど３ヌクレオチド長であれば、チミジン残基を含有する。現在、本発明者らの好ましいヌクレオチドループは３〜２２ヌクレオチドの範囲の長さを有する。ループは非ヌクレオチド化学リンカー、例えばアルキレン鎖であってもよい。炭素鎖リンカーに関しては、３〜６炭素原子の長さが好ましく、最も好ましい長さは３炭素原子である。アルキレン炭素鎖において、さらに、炭素鎖の各メンバーの残りの２価電子は共有結合に関与する。そのような結合は、水素原子、短鎖アルキル基または短鎖アルキレン基、試薬を固体表面に連結するための置換基を対象としうる。化学リンカーを含む非オリゴヌクレオチドループは炭化水素鎖に限定されず、ヘテロ（炭素または水素でない）原子を含んでよい。化学リンカーはポリメラーゼに結合しないように電気的に中性であることが好ましい。試薬の活性はステムの閉鎖型コンホメーション（confirmation）に依存するため、５個を超えるヌクレオチドのループを有する試薬に関して、ループの組成は、反応中の、または反応によって生成される、任意の他の配列または配列群に対して広範囲にわたって相補性であるわけではないことが好ましい。本発明に基づく試薬は、増幅反応のいずれの生成物に対するハイブリダイゼーションプローブでもなく、生成物の蓄積をシグナルしない。
【００１６】
上記のように、本発明に基づく試薬は、ループの反対側のステムの端部を安定化して、該ステムの端部がＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの端部よりも堅固に結合するようにすることを含む。本発明者らの現在の最も好ましい実施形態では、ステムを平滑末端にし、天然ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドと比較して部分的鎖分離を阻害する様式で該ステムの末端を修飾する。本発明者らは、安定化用の相互作用性化学部分をステムの端部に付加する効果、市販のリンカーを用いてステムの３’および５’ヌクレオチドに共有結合によって付加される１ペアのＤａｂｃｙｌ部分および１ペアの市販のＢｌａｃｋ ＨｏｌｅＴＭクエンチャー（Biosearch Technologies, Novato, CA, U.S.A.によって市販されている専売のクエンチャー）の両者の効果を以下で実証する。また本発明者らは、ステムの端部で、強力に結合する非天然ヌクレオチド、２’Ｏ−メチルリボヌクレオチドを利用する効果を実証する。試薬が増幅および増幅アッセイにバックグラウンド蛍光を付与しないように、好ましい安定化用部分は非蛍光性である。本発明の試薬の、安定化されていないオリゴヌクレオチドＤＮＡヘアピンを、１μＭ未満の濃度で加えても、水素結合しているステム末端を安定化するよう上記のように修飾されていない場合はミスプライミングを必ずしも実質的に低減せず、多くの場合でそうならない。ゆえに、本発明の試薬において安定化は必須である。
【００１７】
本発明のヘアピン試薬は、６個を超える塩基対からなるステムを形成できるようにつながり合う２つの相補的ヌクレオチドオリゴマーを含有する分子と説明することができ、該ステムの開放端は、該ステムがその開放端でほどけるか、あるいは「ほつれる」傾向が抑制されるように、何らかの手段によって化学的に修飾される。作用の分子的メカニズムの徹底的な理解には、本発明の試薬の存在および非存在下での酵素キネティクスによる追加の分析、ならびに電子顕微鏡観察、核磁気共鳴、およびＸ線結晶構造解析による前記試薬とポリメラーゼとの相互作用についての構造解析が待たれるが、本明細書および科学文献中に示されている情報に基づいて、メカニズムの部分的な解釈を予想することができる。該文献は、Ｔａｑポリメラーゼが、他のＤＮＡポリメラーゼと同様に、合成ドメインおよび５’エキソヌクレオチド分解性（exonucleolytic）ドメインからなることを教示している。５’エキソヌクレオチド分解性ドメインはＳｔｏｆｆｅｌ断片には存在しない。該文献は、さらに、合成ドメインがまず二本鎖ＤＮＡに結合し、それに沿ってスライドすることによってＤＮＡ重合を実行することを教示している。合成ドメインは「広げた手」に例えられている形状を有し、ｄＮＴＰの存在下で、二本鎖ＤＮＡと接触すると、ポリペプチドレベルで形状変化を受ける。その結果、「手」の「指」が二本鎖ＤＮＡ分子を取り囲んで「閉じる」。二本鎖分子内のミスマッチ配列に起因して、ポリメラーゼは数ヌクレオチド後退し、合成ドメインの３’編集機能を使用して正しい塩基で置換する。酵素が鋳型鎖を読んで、相補的プライマーの３’末端を伸長するにつれて新規ＤＮＡ鎖の合成が生じる。酵素が、鋳型鎖にすでに結合しているオリゴヌクレオチドの５’尾部に遭遇した場合、ポリメラーゼは結合済みオリゴヌクレオチドの領域に１〜２ヌクレオチド侵入し、酵素の５’エキソヌクレアーゼドメインを用いて、得られた５’尾部を切断することができる。
【００１８】
この情報に基づいて、本発明の試薬の二本鎖ステムが、少なくとも部分的には、開放型コンホメーションにおいてポリメラーゼの合成ドメインに結合し、それを閉鎖型にすることによって機能すると仮定することができる。ポリメラーゼの合成活性はそれによって阻害される。ゆえに、いかなる理論にも拘束されることを望まないが、第１の作用様式がポリメラーゼの合成活性についての温度依存的インヒビターとしての様式であると仮定することができる。以下に挙げる証拠は、少なくともいくつかのバージョンの試薬が、その二本鎖領域、例えばステムの融解温度で酵素から遊離せず、特に典型的なＰＣＲ伸長温度を含めたより高い温度でも結合したままであることを示すものである。しかし、ＰＣＲサイクルの変性（すなわち鎖融解）ステップ中は、本発明の試薬はＤＮＡポリメラーゼに結合していない状態になる。典型的に９０℃を超えるＰＣＲサイクルの変性ステップ（鎖融解ステップとも称される）中には、本発明のヘアピン試薬のステムは融解して離れ、該二本鎖領域が再形成するために十分に温度が低下した場合にのみ、その時点で、それらは再びポリメラーゼに結合する。したがって、第一の変性までの間だけ二本鎖であり、すなわち増幅前に（一般に室温で）ＰＣＲ反応混合物に加えた時点では二本鎖であるが、その後、そのステムのＴｍを超える温度で維持される、本発明の試薬を設計することを選択することができる。そのような実施形態では、すべての増幅サイクルのプライマーアニーリング温度および任意のＬＡＴＥ−ＰＣＲ低温検出温度は、計算上のステムＴｍより高く、好ましくは少なくとも５℃高い。あるいは、増幅中の後期に再び二本鎖になる、本発明の試薬を設計することを選んでもよい。その設計は、すべてまたは一部の増幅サイクルで使用されるプライマーアニーリング温度より高いステムＴｍ（記載されているように算出される）を利用することによって達成することができる。あるいは、ＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅において、プライマーアニーリング温度より低いが、低温検出温度より高いステムＴｍを利用することによって、その設計を達成することができる。前者の設計タイプは、概して、ＣＴの遅延によって示されるように重合を阻害しないが、一方、ステムＴｍより低いプライマーアニーリング温度を利用すると、概して、１〜３増幅サイクルの中程度のＣＴの遅延が生じる。
【００１９】
さらに、いかなる理論にも拘束されることを望まないが、本発明に基づく試薬の第２の作用様式が、ポリメラーゼの５’エキソヌクレオチド分解活性についての温度依存的インヒビターとしての様式であると仮定することができる。本発明者らは、本発明の試薬が、少なくとも５５℃までの温度でポリメラーゼ酵素の５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を阻害し、その阻害は、酵素が（ＰＣＲ増幅においてＰＣＲプライマーが伸長されるにつれて）ＤＮＡ鎖をその３’末端の重合によって伸長する能力を過度に抑制することなく行われることを以下に示す。
【００２０】
さらに、いかなる理論にも拘束されることを望まないが、本発明の試薬の第３の作用様式が、ポリメラーゼに結合し、該ポリメラーゼのポリペプチドの形状を変化させる温度依存的リガンドとしての様式であると仮定することができる。前記リガンドが酵素から遊離すると、該酵素は、いくらかの時間、変化した形状のままであり、その後、その元の形状に戻る。変化した形状であるうちは、酵素は、部分的にミスマッチしたプライマー−鋳型ハイブリッドと比較して、完全に相補的なプライマー−鋳型ハイブリッドに優先的に結合する。
【００２１】
このモデルに基づいて、本発明の試薬のステムがポリメラーゼの合成ドメインの形状を変化させる能力が、本発明の試薬がポリメラーゼの合成機能（上記第１の様式）またはポリメラーゼの５’エキソヌクレアーゼ機能（上記第２の様式）を阻害する能力とは異なっていると予想することができる。第１の作用様式および第２の作用様式は両者とも、結合している試薬がポリメラーゼから遊離する速度に実際に依存する。速やかに遊離する本発明の試薬は、第３の様式によって優先的に作用し、高濃度でさえ、ポリメラーゼの合成活性を大きく阻害することはない。対照的に、ポリメラーゼからゆっくり遊離する本発明の試薬は高濃度では阻害性である可能性が高い。一例として、ステムと３つのメチレン（−ＣＨ２−）基からなる炭素リンカーループとにより構成される化合物１２−Ｃ３ＤＤも、ステムと６つのメチレン（−ＣＨ２−）基からなる炭素リンカーループとにより構成される化合物１２−Ｃ３Ｃ３ＤＤも、３０００ｎＭの濃度でＰＣＲ増幅を部分的にしか阻害しない。対照的に、ヌクレオチドにより構成されるループを有する本発明の試薬は、典型的には、実施例１のアッセイにおいて、ＰＣＲ増幅を＜１０００ｎＭの濃度で完全に阻害し、時には＜５００ｎＭ未満の濃度で阻害する。
【００２２】
タンパク質−核酸相互作用に詳しい当業者が認識するように、本発明の試薬の作用は様式１〜３のうち２つ以上に基づくものでありうる。それらは相互に排他的ではなく、むしろ関連している。以下に記載されるように、ステムを含んでなる２つのオリゴヌクレオチドを連結する特定の分子構造が、化合物全体を（第１の様式または第２の様式によって）酵素インヒビターとして作用させるか、あるいは第３の作用様式で主に酵素特異性のエンハンサーとして作用させる程度を決定するために使用できる定量的試験（実施例１４）を本発明者らは考案した。
【００２３】
上記モデルに基づいて、さらに、１種以上のポリメラーゼ分子を本発明の試薬の等しい数の分子と結合させ、次いでそれを、より大きい部分、例えばビーズ、粒子、または固体材料からなる材料に共有結合によって結合させることができることを予想できる。それにより、固体物にポリメラーゼが「積載」されていると考えることができる。固体物への本発明の試薬の結合は、一時的であってよく、あるいは当技術分野において公知の種々の手段によって切断可能であってよい。結合が切断されると、試薬または試薬−ポリメラーゼ複合体が溶液中に放出される（その後、該試薬はポリメラーゼから遊離しうる）。
【００２４】
本発明の試薬の設計は当分野の技能の範囲内である。ステムの融解温度は、そのＧＣ含量を変動させることによって、かなり調節できることが理解される。例えば、以下に記載される２つの好ましい実施形態のステムは、いずれも、９ヌクレオチドの長さを有するが、それらは２５℃異なる計算上のＴｍ（８１℃および５６℃）を有する。本発明者らは通常、ステムＴｍの算出に関して、上で引用したＭ−ｆｏｌｄコンピュータソフトウェアプログラムを１種以上のループ配列候補について使用する。ループ配列が、それ以外の点で、本発明のミスプライミング試薬において重要であることは見出されていない。本発明者らの設計では、完全な平滑末端のステム、すなわち内部ミスマッチおよび末端突出部を有しないステムを形成する配列を利用する。そして、簡単な試行によって、内部ミスマッチ（実施例１に示されるように、末端ミスマッチは不安定であり、許容されない）の導入または二本鎖領域を超える１個または最大２個のヌクレオチドの短い伸長の影響を評価することができる。
【００２５】
本発明の試薬の構築は当分野の技能の範囲内である。例えば、オリゴヌクレオチド配列をオリゴヌクレオチド合成機で調製することができる。公知の方法を使用して安定化用部分を含ませることができる。例えば、ｄａｂｃｙｌ化カラム（Glen Research）を用いて出発し、Ｄａｂｃｙｌで修飾されたヌクレオチドで合成を終えることによって、好都合にＤａｂｃｙｌを付加することができる。合成の最初、および最後から２番目、および最後のヌクレオチドとして非天然ヌクレオチドを使用することができる。
【００２６】
候補試薬を設計し、構築した後、一部の場合には、蛍光性ＤＮＡ結合色素を加え、該色素を刺激しながら融解解析を実施することによって、そのステムの融解温度を経験的に概算することができる（色素自体がＴｍに対して効果を有することを認識して行う）。また、本発明の試薬の安定化されたステムの実際の融解温度に関する実施上有用な情報を、多くの場合、種々のアニーリング温度を利用するリアルタイムＰＣＲ増幅を実施することにより推定的に取得することができる。必要であればステムの長さまたはＧＣ含量の調節を施して、所望のＴｍを達成することができる。そして本発明者らは、ミスプライミングおよび増幅効率の種々の現象に対する候補試薬の効果を、以下の実施例１に記載されるような厳密なＰＣＲ増幅におけるその性能を決定することによって評価する。候補試薬は、実施例１の反応混合物に１０００ｎＭ未満、好ましくは６５０ｎＭ以下のいずれかの濃度で加えられた場合に純粋なアンプリコンが取得されれば、本発明の試薬であると判断される（図１を参照のこと）。本発明者らは、所望の標的および所望のプライマーを用いること以外は実施例１のアッセイを使用して候補アッセイを評価する。しかし、本発明の増幅およびアッセイ（増幅および検出）は実施例１の条件または手順に限定されない。本発明の試薬は、２５μＬの反応混合物あたり１．２５単位のポリメラーゼ濃度（実施例１）と比較して、１０００ｎＭ未満の濃度で加えられた場合に、ミスプライミングの少なくとも１種の現象を阻害する必要があるが、該試薬はポリメラーゼ濃度に対する任意の有効な濃度；すなわち、ミスプライミングを防止するが、増幅を実質的に妨害しない任意の濃度（すなわち相対濃度）で使用することができる。評価において所望のプライマーを利用すると、意図せぬ結果、例えば試薬の３’末端が遮断されないことまたは相補性の見落としが明らかになる。
【００２７】
本発明には、ＰＣＲ増幅反応およびＰＣＲ増幅反応を含むアッセイが含まれ、そのようなものとしては、増幅反応混合物が、重合活性および５’−３’エキソヌクレアーゼ活性のいずれをも有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、例えばＴａｑＤＮＡポリメラーゼを含み、かつ本発明の少なくとも１種の試薬が該増幅反応混合物に含まれる反応が挙げられる。本発明の多数の試薬はポリメラーゼの活性を阻害するものであり、熱サイクル処理前または処理中に上記範囲内のポリメラーゼ濃度に対して相対的な濃度、すなわち２５μＬの反応容量あたり１．２５単位のＤＮＡポリメラーゼを含有する反応に関して１０００ｎＭ以下、好ましくは６５０ｎＭ以下の濃度で加えられる。本発明のいくつかの試薬は、１０００ｎＭ未満の濃度、好ましくは６５０ｎＭ未満の濃度で有効であるが、ポリメラーゼの活性を低い程度にしか阻害せず、前記ポリメラーゼ濃度に関して１５００ｎＭまでの濃度で、あるいは３０００ｎＭでさえ加えることができる。本発明の２種以上の試薬を含有するアッセイでは、各試薬は各自のＴｍを有するステムを有することができ、それを各自の濃度で加えて、増幅プロセス中のステップの種々の部分で種々の試薬が機能するようにすることができる。本発明の試薬が熱サイクル処理中に加えられる場合、反応混合物を作業領域に引き込むことなく加えられるべきであろう。そのような増幅反応としては、対称的ＰＣＲ増幅、非対称的ＰＣＲ増幅およびＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅が挙げられ、それらはいずれも、ＲＮＡ標的が関与する場合には逆転写をさらに含んでよい。ＰＣＲ増幅を使用し、任意の目的で、例えばジデオキシシークエンシングの出発材料として増幅産物を調製することができる。アッセイにおいてＰＣＲ増幅を増幅産物の検出と組み合わせてよく、そのようなアッセイとしては、特に、標識プライマー、標識プローブまたは蛍光性ＤＮＡ結合色素、例えばＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎまたは臭化エチジウムを使用するホモジニアスアッセイが挙げられる。前記アッセイは、検出の読み取り値が複数の増幅サイクル中に取得されるリアルタイムアッセイであってよく、あるいは増幅の完了後に検出が実施されるエンドポイントアッセイであってよい。それは定性的または定量的であってよく、非限定的に、定量的エンドポイントアッセイが含まれる。前記アッセイは、単一の二本鎖産物または一本鎖産物、または２種以上の二本鎖産物を、関連の一本鎖産物を伴わず、あるいは伴って、増幅するように設計することができる。
【００２８】
本出願で使用される「ＬＡＴＥ−ＰＣＲ」とは、おおむね十分なＰＣＲサイクル中に使い果たされて蛍光によって検出可能な二本鎖アンプリコンを生じるように、それ自体は２００ｎＭまでの低濃度で利用される一方のプライマー（「制限的プライマー（Limiting Primer）」）と比較して少なくとも５倍過剰のもう一方のオリゴヌクレオチドプライマー（「過剰プライマー」）を利用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プロセスを使用する、非対称的ＤＮＡ増幅を意味し、その場合、増幅の開始時点での制限的プライマーの、濃度について補正した融解温度Ｔｍ［０］は、増幅の開始時点での過剰プライマーの、濃度について補正した融解温度Ｔｍ［０］Ｘより高いか、あるいは最大５℃まで低く、好ましくは３〜１０℃高く；ならびに、熱サイクル処理は制限的プライマーが使い果たされた後に複数サイクル継続されて、一本鎖産物、すなわち過剰プライマーの伸長産物を生じる。ＬＡＴＥ−ＰＣＲアッセイは、少なくとも一部の直線的増幅サイクル中にプライマーアニーリング温度より温度を下げる低温検出ステップを含んでよい。好ましくは、鎖融解前の伸長後に当該ステップを行う。
【００２９】
また本発明は、完全ＰＣＲキット、部分的キット、およびオリゴヌクレオチドセットを包含する。完全ＰＣＲ増幅キットは、少なくとも、ＰＣＲ増幅またはアッセイを実行するためのすべての試薬を含み、少なくとも１ペアのＰＣＲプライマー、ｄＮＴＰ、反応バッファー、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（好ましくは５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ）、および少なくとも１種の本発明の試薬が含まれる。ホモジニアスＰＣＲアッセイのための完全キットは、必要とされる任意の追加検出試薬、例えば蛍光性ＤＮＡ色素または蛍光標識プローブをさらに含む。いずれのタイプの完全キットも、好ましくはサンプル調製用の試薬を含み、一部の実施形態では、逆転写酵素を含んでよい。本発明の部分的キットは、完全キットの少なくとも一部の構成要素を省略するが、少なくとも熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（および、必要であれば、逆転写酵素）および少なくとも１種の本発明の試薬を含む。例えば、商業的に「マスターミックス（master mix）」または「基本キット（basic kit）」として公知の製品は、典型的には、ＰＣＲプライマーおよびプローブを省略する。好ましい部分的キットは、サンプル調製のためのものを除いて、増幅またはアッセイに必要とされるすべての試薬を含む。本発明に基づくオリゴヌクレオチドセットは、少なくとも１ペアのＰＣＲプライマーおよび少なくとも１種の本発明の試薬を含む。それらはオリゴヌクレオチドプローブまたはシークエンシングプライマーをさらに含んでよい。
【００３０】
本発明の１種以上の実施形態の詳細は添付の図面および以下の説明中に記載される。本発明の他の特徴、目的、および利点は、その説明および図面から明らかになり、さらに特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【００３１】
図面の説明
種々の図面中の参照記号などは要素などを示す。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】本発明に記載の試薬の阻害活性を試験するために設計したミスプライミングエラーに関する厳密な定性的ＰＣＲアッセイから得たサンプルのゲル電気泳動解析を示す。
【図２】本発明の試薬によってＰＣＲベースのリアルタイムアッセイおよびエンドポイントアッセイが可能になることを示す。
【図３】本発明に記載の試薬を使用し、ミスプライミングエラーの非存在下で７０サイクルのＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅後に生成された一本鎖ＤＮＡ産物から取得したＤＮＡ配列クロマトグラフを示す。
【図４】五重（pentaplex）ＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅に対する化合物９−３ＤＤの効果を示す。
【図５】本発明の試薬がＴａｑポリメラーゼに結合すると、ＰＣＲサイクル処理温度が変性ステップに達するまでそれらはポリメラーゼから遊離しないことの証拠を示す。
【図６】２５℃でのＤＮＡポリメラーゼ活性に対する効果に関する、本発明の試薬の直接比較を示す。
【図７】ポリメラーゼ活性の非存在下で、ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性に対する、本発明に基づく試薬の効果を評価するためのアッセイを示す。
【図８Ａ】対称的ＰＣＲアッセイにおいてミスプライミングを防止する本発明に基づく試薬の能力を示す。
【図８Ｂ】対称的ＰＣＲアッセイにおいてミスプライミングを防止する本発明に基づく試薬の能力を示す。
【図９】エキソヌクレアーゼ阻害を定量化するためのアッセイを示す。
【図１０】ＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅でのプライマー二量体およびプライマーオリゴマーの形成に対する、本発明の試薬の用量依存的効果を示す。
【図１１】２ペアのプライマーを用いる２種の標的配列についての二重ＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅に対する、低濃度の試薬９−２２ＤＤの効果を示す。
【図１２】２ペアのプライマーを用いた２種の標的配列についての二重ＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅に対する、試薬９−３ＤＤのステム組成を変化させることの効果を示す。
【図１３】２ペアのプライマーを用いる２種の標的配列についての二重ＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅に対する、試薬９−３ｂＤＤの濃度を変化させることの効果を示す。
【図１４】ＣＴ値に関して、ＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅の効率に対する試薬９−３ＤＤの濃度上昇の効果を示す。
【図１５】蛍光シグナル勾配および最終蛍光に関して、ＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅の効率に対する試薬９−３ＤＤの濃度上昇の効果を示す。
【図１６】本発明の化合物の混合物を用いるか用いないで実行された多重反応の産物を示す。
【図１７】化合物１２−３ＤＤの作用に関する試験の結果を示す。
【図１８】化合物１２−Ｃ３ＤＤの作用に関する試験の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
詳細な説明
上記のように、本発明者らは、ミスプライミングエラーの３種の異なるタイプおよび原因であると考えられるものを特定した。全３タイプのミスプライミングを評価するために、本発明者らは以下の実施例１に示す厳密なアッセイを開発した。増幅は剪断ＤＮＡを用いて開始され、これはミスプライミングを促進する。物理的操作、例えばＤＮＡをピペット内に吸い込むことによって、ＤＮＡは剪断されやすい。さらに、「ホットスタート」試薬および方法によってはタイプ１のミスプライミングしか防止できないので、本発明者らは多数の温度サイクル（少なくとも６０サイクル）をアッセイに組み入れた。さらに本発明者らは、一部のＬＡＴＥ−ＰＣＲアッセイで利用される低温検出ステップを組み入れた。さらにまた、本発明者らは、プライマー二量体の形成およびさらにそれらのオリゴマー形成および増幅を追加のタイプのミスプライミングとして認識している。プライマー二量体形成および増幅は、添加鋳型ＤＮＡの存在下および非存在下の両方で生じうるものであり、本発明者らはこれらの現象に関するアッセイをさらに開発した。
【００３４】
ホットスタート酵素は、高温、例えば９５℃に加熱されると生じる不可逆的な変化のために、増幅の開始前にしか有効でないが、本発明のミスプライミング試薬は不可逆的に変性せず、低温ステップが含まれる場合、反応の後期に、正の効果もしくは負の効果、または両者を有しうる。
【００３５】
特定のサイクル温度より高いか、またはそれより低い融解温度Ｔｍを有し、増幅に対して種々の影響を有するステムを設計することができる。ステムの設計では、好ましくは、融解が、一定の温度範囲にわたって起こる動的現象であり、このときＴｍは、５０パーセントの分子が二本鎖形態であり、かつ５０パーセントが一本鎖形態である温度を指定するものであることが考慮される。本発明者らは、一部の閉鎖型ステムがポリメラーゼに結合すると、ポリメラーゼに未結合のままである分子間の平衡が、より多くのステムが閉鎖型になる方へシフトすると考えている。特定のサイクル温度、例えばプライマーアニーリング温度で大多数のステムが閉鎖型であることが所望であれば、一般に、その温度より少なくとも５℃高い計算上のＴｍを有する無修飾のオリゴヌクレオチドステムを用いて出発し、その場合、安定化用のステムの修飾によって実際のＴｍが数度上昇することを認識している。反対に、特定のサイクル温度で大多数のステムが開放型であることが所望であれば、一般に、該特定のサイクル温度より少なくとも５℃低く、好ましくは少なくとも約１０℃低い計算上のＴｍを有する無修飾のオリゴヌクレオチドステムを用いて出発し、その場合も、安定化用のステムの修飾によって実際のＴｍが数度上がる可能性が高いことを認識している。
【００３６】
以下の実施例５で実証されるように、本発明の特定の試薬を種々のプライマーアニーリング温度とともに利用すると、増幅効率に対する種々の効果を有しうる。以下で考察される、本発明者らが現在意図している実施形態の１つ（化合物９−２２ＤＤ）では、８１℃の計算上のＴｍを有する。温度が鎖融解温度（例えば９５℃）からプライマーアニーリング温度（例えば５５℃）に下がるにつれて、前記化合物はすべての典型的なＰＣＲ熱サイクル中に閉鎖型になる。そのようなステムを有する試薬は増幅の各サイクル中に効果を有する。別の現在の本発明者らの好ましい実施形態（化合物９−３ＤＤ）では、５６℃の計算上のＴｍを有する。ＰＣＲ増幅混合物が室温で調製される時に、この試薬は閉鎖型のステムを有し、ポリメラーゼに結合する。増幅の開始時点で温度が上がっても、試薬は結合したままである。ポリメラーゼ結合型の９−３ＤＤ分子は最初の高温ステップ中に結合がはずれて開放型になり、未結合分子のステムが閉鎖型になるほど十分に温度が下がらない限り、ポリメラーゼに再結合しない。ゆえに、最低サイクル温度を６５℃で維持することによって、ステムは再形成しない。これらの条件下では、本実施形態は、該増幅において、増幅の開始前に生じるミスプライミングを防止するホットスタート試薬として機能する。しかし、ＬＡＴＥ−ＰＣＲサイクルにおける伸長後の、増幅の直線期に蓄積する一本鎖に対する低温分子ビーコンまたは他の標識プローブのハイブリダイゼーションを可能にする低温検出ステップ、例えば、４０℃でのインキュベーションを含ませる場合、５６℃の計算上の融解温度を有するステムは閉鎖型になり、高温の鎖融解が達成されるまで試薬がポリメラーゼに再結合することが可能になる。
【００３７】
以下の実施例１では、本発明の試薬の性能を評価するために本発明者らが利用する厳密なＬＡＴＥ−ＰＣＲアッセイを記載する。図１は、「通常の」ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、すなわち５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有するが、ホットスタート修飾を有しない熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いた場合（レーンｂおよびレーンｃ）だけでなく、ホットスタートＴａｑポリメラーゼを用いた場合（レーンｄおよびレーンｅ）にもミスプライミングエラーが起こることを示す。図１は、さらに、ホットスタートポリメラーゼを用いる増幅（レーンｈおよびレーンｉ）に対してだけでなく、通常のＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いる増幅（レーンｆおよびレーンｇ）に対しても、３００ｎＭの濃度で試薬９−２２ＤＤを加えることによって達成される、ミスプライミングエラーにより形成される非特異的産物の排除、および所望の特異的産物しか存在しないことを示す。実施例１に記載のアッセイを利用して、ミスプライミングの抑制に関する化合物９−２２ＤＤおよび９−３ＤＤの有効性を評価した。両化合物はタイプ１のミスプライミングを抑制することがわかった。９−３ＤＤのステムの計算上のＴｍは低い（５６℃）ので、すべてのサイクル温度が６０℃以上であるＰＣＲ増幅プロトコルを利用することによって、それを単に有効なホットスタート試薬として使用することが可能である。ステムの融点より高いままであることによって、増幅が進行してもステムは再形成されない。化合物９−３ＤＤをそのように使用しても重合効率に対して阻害効果を有しない。以下の実施例５はこれに関して有益な情報を提供する。実施例５では、試薬９−３ＤＤならびに６５℃および５５℃のアニーリング温度を利用する増幅を比較する。６５℃が利用される場合、ＣＴが反映するように重合効率に対する影響はないことがわかった。しかし、５５℃が利用される場合、ＣＴは遅延した。このことは、ステムが閉鎖型になり、ポリメラーゼが結合するほど十分に温度が下がった場合に、プライマー伸長のために温度が上がっても、プライマー伸長温度がステムのＴｍより高い場合でも、結合が継続することの証拠である。一方、９−２２ＤＤのステムのＴｍは高い（８１℃）ので、毎ＰＣＲサイクルのプライマーアニーリングステップ中にステムが再形成されてヘアピンになることが可能である。この化合物は、タイプ１のミスプライミングだけでなく、タイプ２のミスプライミング、タイプ３のミスプライミング、およびプライマー二量体形成の現象をも防止する。しかし、この化合物は重合効率に実際にいくらか影響する。このことは、１００ｎＭの濃度で使用された場合に、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ １または標的特異的分子ビーコンプローブを用いてリアルタイムで追跡したＰＣＲ増幅の閾値サイクル（ＣＴ）が１．５サイクル遅延することによって示される。
【００３８】
実施例１の表Ｉは、図１のレーンｆおよびｇに示されるように、ホットスタート型ではなく通常のＴａｑＤＮＡポリメラーゼを使用して、一連の添加剤に対する前記厳密なアッセイの適用を報告し、さらに、ミスプライミングの現象の防止、すなわちミスプライミングエラーにより形成される検出可能なレベルの非特異的産物の回避を達成するために、および所望の特異的増幅産物しか存在しないことを達成するために必要な最低濃度を報告する。表Ｉでは、化合物は本発明者らの用語体系によって特定される。無修飾のヘアピン分子はステムループの長さによって特定される。例えば、化合物６−２２は６ヌクレオチド長のステムと２２ヌクレオチド長のループとを有する。そのループ識別名は数字で始まるか、あるいは数字のみである（「２２」または「３ｂ」）ため、該ループはヌクレオチドである。非ヌクレオチドループは別に指定される。化合物１２−Ｃ３Ｃ３は１２ヌクレオチド長のステムと、６炭素鎖、すなわち６つのメチレン（ＣＨ２）基の鎖であるループとを有する。基本となるヘアピンの一端または両端に種々の修飾を施した。これらの修飾は接尾辞によって指定され、その場合、３Ｄは３’末端ヌクレオチドに付加されたＤａｂｃｙｌ（５’−ジメトキシトリチルオキシ−５−［（Ｎ−４’−カルボキシ−４−（ジメチルアミノ）−アゾベンゼン）−アミノヘキシル−３−アクリルイミド］−２’−デオキシウリジン−３’−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホルアミダイト）であり、５Ｄは５’末端ヌクレオチドに付加されたＤａｂｃｙｌであり、ＤＤは両末端ヌクレオチドに付加されたＤａｂｃｙｌであり、ＢＨＱＢＨＱは両末端ヌクレオチドに付加されたＢｌａｃｋ Ｈｏｌｅクエンチャーであり、ＦＦは両末端ヌクレオチドに付加された蛍光団（この場合はＦＡＭ）であり、ＡＡは両末端ヌクレオチドに付加されたアデノシン（Ａ）であり、ならびにＴＴは両末端ヌクレオチドに付加されたチミジン（Ｔ）である。
【００３９】
付加に加えて、基本となるステムにいくつかの修飾を施した。接尾辞２’ＯＭ４とは、４個の末端ヌクレオチド、各ステムオリゴヌクレオチド上の最後の２個、またはアーム、がデオキシリボヌクレオチドから２’−Ｏ−メチルヌクレオチドに変更されたことを示す。ステムの融解温度を変更するために、本発明者らはそのＧＣ含量を変更した。ステムの長さではなくステムの配列が変更された化合物を、末端修飾の接尾辞の前の小文字識別子によって示す。例えば、９−３ｂＤＤまたは９−３ｉＤＤである。表Ｉの種々の化合物に関するヌクレオチド配列を表ＩＩに挙げる。その配列は、使用された炭素鎖ループを同時に示す。表Ｉはいくつかの点で有益な情報を提供する。例えば、表Ｉは、前記アッセイにおいて、無修飾のＤＮＡヘアピンオリゴヌクレオチドが有効ではないか、または１０００ｎＭ以上の高濃度でしか有効でないことを示す。オリゴマー９−２２（９ヌクレオチド長のステム、２２ヌクレオチド長のループ）は３０００ｎＭの濃度でしか有効でなかった。これは二本鎖ＤＮＡによるミスプライミング抑制に関して報告された量である。オリゴマー６−２２（６ヌクレオチド長のステム、２２ヌクレオチド長のループ）および９−５（９ヌクレオチド長のステム、５ヌクレオチド長のループ）は３０００ｎＭの濃度でさえ有効でなかった。しかし、９−２２オリゴマーを、そのステムの両端にＤａｂｃｙｌ部分を付加することによって修飾して、本発明に基づく好ましい試薬である化合物９−２２ＤＤを作成した場合、ミスプライミングの現象を防止するために５０ｎＭの濃度で十分であった。９−３オリゴマーを同様に修飾した場合、１００ｎＭの濃度で十分であった。
【００４０】
表Ｉはステムの長さの影響を示す。９ヌクレオチドおよび１２ヌクレオチドのステムを有するいくつかのオリゴマーは、１ペアの相互作用性Ｄａｂｃｙｌクエンチャーで修飾した場合に、低濃度でミスプライミングを排除したが、オリゴマー６−２２は修飾によりそのような効果を示さなかった：組成物６−２２ＤＤ（本発明の試薬ではない）は高濃度（３０００ｎＭ）でしか有効でなかった。本発明の試薬は、６ヌクレオチドより長く、ほとんどの場合で１４塩基対より短いステムを有する。現時点では、１４塩基対より短い長さが好ましい。
【００４１】
また表Ｉは、ステムの末端での結合強度を増大させる他の修飾の有効性を示す。１ペアの相互作用性Ｂｌａｃｋ ＨｏｌｅＴＭクエンチャーをオリゴマー９−５のステムに付加して試薬９−５ＢＨＱＢＨＱを作成したところ、ミスプライミングエラーにより形成される非特異的産物の排除、および所望の特異的増幅産物しか存在しないことを達成するために、該試薬は１００ｎＭの濃度で十分であった。オリゴマー９−５の各末端を２個の２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドで置換して試薬９−５ ２’ＯＭ４を作成したところ、該試薬は５０ｎＭの濃度で十分であった。
【００４２】
表Ｉはオリゴヌクレオチドループの長さをかなり変動させることが可能であることを示す。３ヌクレオチド（試薬９−３ＤＤ）、５ヌクレオチド（試薬９−５ＤＤ）、および２２ヌクレオチド（試薬９−２２ＤＤ）のすべてのループ長で、１００ｎＭ以下の濃度でミスプライミングを防止する本発明の試薬が得られた。同時に、表Ｉは、最適化のためにいくらかの試行錯誤による調整が必要であることを示す。オリゴマー９−５の安定化用の修飾においてＤａｂｃｙｌクエンチャーの代わりに１ペアの２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドを用いる場合（試薬９−５ ２’ＯＭ４と試薬９−５ＤＤの比較）、有効性のレベルは変わらない：５０ｎＭの濃度で十分である。しかし、修飾型オリゴマー９−３に同じ変更を施すと（試薬９−３ ２’ＯＭ４と試薬９−３ＤＤの比較）、有効性のレベルは、依然として良好ではあるが減少した：５０ｎＭの濃度ではなく３００ｎＭの濃度が必要とされた。同データは、試薬９−３ ２’ＯＭ４のループ長を２ヌクレオチド増加させて、試薬９−５ ２’ＯＭ４を作成すると、有効性が改善されたことを示す：３００ｎＭの濃度ではなく５０ｎＭの濃度で十分であった。実施例１に記載されるアッセイのような厳密なアッセイを用いて、候補薬物をルーチンの方法で評価し、調節することができる。
【００４３】
また表Ｉは、非ヌクレオチドブリッジ（ループ）によって逆の極性でつながり合う２つの相補的オリゴヌクレオチドからなる化合物もまた、そのオリゴヌクレオチドの自由な３’末端および５’末端を本発明にしたがって（試験された実施形態では、Ｄａｂｃｙｌ部分によって）修飾した場合に、活性であることを示す。表Ｉは、非ヌクレオチドブリッジのサイズが重要ではないことを示す。表Ｉに記載のブリッジは３〜６炭素原子の線状鎖からなる化学リンカーであるが、当業者は、非ヌクレオチドブリッジ（ループ）について多数の他のバリエーションを作成することができる。表Ｉのデータは、同一オリゴヌクレオチドステムに関して３炭素原子鎖のブリッジが６炭素原子鎖のブリッジより良好である（より低い濃度で活性である）ことを示唆し、厳密に試験されてはいないが、その差異がブリッジの相対的な可動性および、その結果として、ステムの融解温度を上げるかまたは下げるそれらの効果もしくは能力を反映すると仮定される。本発明者らは、好ましい化学的に中性のリンカー（無電荷）を利用する。
【００４４】
本発明の試薬および方法の種々の適用が以下の実施例２〜４に例示される。実施例２では、リアルタイムアッセイであるＬＡＴＥ−ＰＣＲアッセイにおける、試薬９−２２ＤＤの利用が記載されるが、これはエンドポイントアッセイでも同様に好適であることが示されている。実施例２のアッセイでは、本発明者らが同時に出願した米国仮特許出願第６０／６１９，６５４号、表題「Primers, Probes and Methods for Nucleic Acid Amplification」の対象である検出技術を利用する。該文献は参照によりその全体が本明細書中に組み入れられる。該検出技術は、二本鎖ＤＮＡに結合すると蛍光を発する蛍光性ＤＮＡ色素（例えばＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ）および、制限的プライマーが使い果たされた後のＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅において生成される一本鎖アンプリコンに相補的な蛍光団標識ハイブリダイゼーションプローブの両者を加えるステップ、その場合、該蛍光団は該色素からの発光によって刺激される；色素を刺激するステップ；色素および蛍光団の両方からの発光を検出するステップ；および色素シグナルに対する蛍光団シグナルの比を算出するステップを含む。ゆえに実施例２は、本発明の試薬と蛍光プローブおよび蛍光色素の適合性、およびそのいずれかまたは両者とともに使用された場合のミスプライミングの効果的な防止を示す。
【００４５】
実施例４では、２ペア、３ペア、４ペアおよび５ペアまでものプライマーを利用するいくつかの多重ＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅が記載され、試薬９−３ＤＤを反応混合物に加えた場合の全例で正しいアンプリコンが増幅されることが示される。実施例４の目的ではゲル電気泳動によって増幅産物を分析したが、同様に複数の方法を多重アッセイに適用可能であり、それには他の検出手段（例えば所望のアンプリコンに関する蛍光性ハイブリダイゼーションプローブ）を使用する定性的アッセイおよび定量的アッセイ、例えばリアルタイムアッセイが含まれる。リアルタイムＬＡＴＥ−ＰＣＲアッセイでは、プライマー伸長のステップ後の低温検出ステップおよび例えば実施例３で示される低温プローブを利用することが好ましい。
【００４６】
実施例１３では、２種以上の型の本発明の試薬を含有する増幅反応混合物を用いる増幅反応もまた利用することができることが示される。例えば、増幅混合物は、高い融解温度を有する本発明の化合物および低い融解温度を有する本発明の別の化合物の両者を含有することができ、各化合物はそれぞれの最適濃度で加えられる。８１℃の計算上のＴｍを有する化合物９−２２ＤＤのステムは、反応の開始時点および各熱サイクル中に温度が低下した直後は閉鎖型コンホメーションであるが、５８℃の計算上のＴｍを有する化合物１２−３ＤＤは相対的に低い温度でしか閉鎖型にならない。したがって、それは「ホットスタート」として作用し、反応混合物が室温で調製される場合にミスプライミングを防止するが、６０℃以上のアニーリング温度を有するＰＣＲ増幅の以後の熱サイクル中には閉鎖型にならず、ポリメラーゼに結合しない。試薬の混合物は、複数のアンプリコンの増幅のために一定範囲のアニーリング温度にまたがる複数ペアのプライマーが組み合わされている多重反応の構築に関して特に有用である。実施例１３で使用される試薬の混合物はいずれかの試薬の単独使用より良好である。
【００４７】
実施例３では、十分な量で、ミスプライミングから生じる非特異的産物が十分に排除されている増幅一本鎖産物を調製するための、およびシークエンシング用の出発材料としての使用に好適な、試薬９−３ＤＤを利用するＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅が記載される。十分な出発材料を保証するために増幅を７０サイクルまで延長した。本発明者らは、いくつかのアンプリコンが他のアンプリコンよりタイプ２およびタイプ３のミスプライミングエラーを生じやすいことを発見した。そのようなミスプライミングがより生じやすい増幅では、鎖融解ステップからプライマーアニーリングステップへサイクル処理温度が下がった時に閉鎖型になる本発明の試薬のステムが好ましい。このことはステムＴｍ、アニーリング温度、またはその両者を調節することによって確かに実現することができる。関連する研究で、本発明者らは、本発明者らが同時に出願した上記の米国仮特許出願で開示されているように、生成物を希釈することが、シークエンシングとともに使用するためのシンプルな精製方法であることを発見した。
【００４８】
本発明者らは、無修飾のＤＮＡヘアピン形成オリゴマーと比較して、および互いに、本発明の試薬の実施形態の機能性および有効性を調べた。本発明者らは、試験試薬の存在下でのＴａｑＤＮＡポリメラーゼによる標識プライマーの伸長を測定するためのＤＮＡ重合アッセイを考案した。該アッセイでは、本発明者らが同時に出願した上記の米国仮特許出願で開示されているように、蛍光色素からの発光で励起される蛍光団で標識されているプライマーを利用する。該アッセイの混合物は、０．５μＭの濃度の合成オリゴヌクレオチドＤＮＡ鋳型、１．５μＭの濃度のＤＮＡプライマー（鋳型の３’末端に相補的で、その５’末端がＣｙ５で標識されている）、ＰＣＲバッファー、ＭｇＣｌ２、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、１：４０，０００希釈のＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ蛍光性ＤＮＡ色素、および試験試薬を含む。反応の制御された開始はｄＮＴＰの添加によって達成される。該反応は等温性である：それは所定の温度で所定の時間進行する。ＤＮＡポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性に対する試験化合物の効果を評価するために、「ブロッカー」、すなわち鋳型の５’末端に相補的で、その３’末端がリン酸基でブロックされ、その５’末端がＲＯＸで標識されているオリゴヌクレオチドを反応混合物に加えた。ＤＮＡポリメラーゼの重合活性に対する試験化合物の効果を評価するためには、ブロッカーを使用しない。融解曲線解析による反応産物の分析を容易にするために、鋳型、プライマーおよびブロッカーは、以下のハイブリッドがその融解温度によって容易に識別可能であるように設計する：プライマー−鋳型、ブロッカー−鋳型、完全長伸長産物−鋳型、および部分的伸長産物（ブロッカーまで）−鋳型。リアルタイム解析は、色素を周期的に励起し、該色素および２種の蛍光団からの蛍光発光を周期的にモニタリングすることによって達成される。両蛍光団は色素からの発光によって間接的に励起される。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉの蛍光の増加は重合の指標である。ＲＯＸの蛍光の減少はブロッカーの分解の指標である。エンドポイント解析は、１２ｍＭ ＥＤＴＡを加えて反応を停止させ、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉの希釈を１：１４，２００に調節し、試験化合物濃度を８００ｎＭに調節し；次いで、色素を刺激し、２種の蛍光団の各々からの蛍光をモニタリングしながら、標準的な融解曲線解析を実施することによって達成される。
【００４９】
本発明者らは、５５℃で６０分間のインキュベーションを行い、化合物９−２２、９−２２ＤＤおよび９−３ＤＤを評価した。試験化合物を含まない対照も組み入れられた。試験化合物を含まないがブロッカーの存在下でインキュベートされた対照から得られた結果は、これらの条件下で、完全にではないが、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼがブロッカー領域を通過してプライマーを伸長し、Ｃｙ５蛍光によればほぼ単一の融解ピークを有する産物が生成されたことを示す。ゆえに、酵素は重合活性および５’−３’エキソヌクレアーゼ活性の両方を示した。３００ｎＭの濃度または１０００ｎＭの濃度で存在する化合物９−２２ＤＤを用いて得られた結果は、部分的伸長産物の生成および残留ブロッカーの量に対する用量依存的様式の効果を示した。ゆえに化合物９−２２ＤＤは、５５℃で、ポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を阻害した。完全長産物の生成が特に１０００ｎＭの濃度で減少した。このことは、この高濃度では、化合物９−２２ＤＤが重合を阻害し始めることを示唆する。
【００５０】
本発明の試薬の特性を調べるために本発明者らが利用した別のアッセイは以下の実施例６に記載のアッセイである。該アッセイは、２５℃でのＴａｑＤＮＡポリメラーゼによる伸長を阻害する試験試薬の能力を検出する。実施例７に報告される結果は、無修飾のヘアピンオリゴヌクレオチド９−２２および９−３は対照と比較して効果を示さなかったが、試薬９−２２ＤＤおよび９−３ＤＤはプライマー伸長を用量依存的様式で阻害したことを示す。ゆえに、本発明の試薬が低濃度で重合活性を阻害するのには十分に低い温度でさえ、それらの無修飾のアナログは同一濃度で該特性を示さなかった。
【００５１】
本発明者らは、ＤＮＡポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性に対する本発明の試薬の阻害効果を調べるために２種のアッセイを利用した。一方のアッセイは以下の実施例７に記載される。該アッセイでは、熱サイクル処理中の５’−３’エキソヌクレアーゼ活性の阻害を測定する。図７は、試薬９−２２ＤＤが５０ｎＭ〜３００ｎＭの範囲の低濃度で用量依存的様式で該エキソヌクレアーゼ活性を阻害することを示す。
【００５２】
第２のアッセイは以下の実施例９に記載される。該アッセイでは、２５℃での５’−３’エキソヌクレアーゼ活性の阻害を定量的に測定する。図９は、５０ｎＭ〜１０００ｎＭの濃度の試薬９−２２ＤＤによる用量依存的阻害を示す。
【００５３】
以下の実施例６で記載されるさらに別のアッセイでは、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼのＳｔｏｆｆｅｌ断片によって実行されるプライマー伸長の、該試薬による阻害を測定する。インタクトなＴａｑポリメラーゼと同様に、伸長の阻害には、オリゴヌクレオチドステムでの修飾端部の存在が必要とされ、ステム間のループの長さによる大きな影響はなかった。しかし、インタクトなＴａｑポリメラーゼとは異なり、ほんの６ヌクレオチドのステムを有する試薬である化合物６−２２ＤＤによってＳｔｏｆｆｅｌ断片は阻害される。本発明者らは、Ｓｔｏｆｆｅｌ断片が、インタクトなポリメラーゼと同一の様式で試薬と相互作用するわけではないと結論づける。
【００５４】
本発明の試薬は、以下の実施例８で実証されるように、対称的ＰＣＲアッセイでのミスプライミングの防止に有用である。該アッセイでは、非常に近いＴｍ値を有する等モルのペアのプライマーを使用して、嚢胞性線維症遺伝子における配列の増幅を測定した。
【００５５】
現在使用されているＰＣＲ増幅およびアッセイは、典型的に、室温での増幅反応混合物の調製ステップを含み、ゆえに、タイプ１のミスプライミングを阻害するために最初の混合物に本発明の試薬を含ませることを必要とする。しかし、必ずしもそうではない。特定の自動化された方法、例えばマイクロ流体工学的（microfluidics）方法では、ホットスタート用の高い温度でポリメラーゼを反応混合物に加え、それによってタイプ１のミスプライミングを回避することが可能である。そのような方法では、増幅の開始後に本発明の試薬を加えることができる。
【００５６】
プライマー二量体の形成は、完全反応物、すなわち増幅に必要なすべての構成要素と最初の標的配列とを含有する反応物中、ならびに標的配列を含有しない反応物中で生じうるミスプライミングの現象である。プライマー二量体は、反応物中に存在する別のコピーの同じ一本鎖プライマーまたは何らかの他のプライマーに対するハイブリダイゼーションおよびそれらに沿った伸長に基づいて、反応物中の１種以上のプライマーのミスプライミングによって形成される典型的には短い二本鎖ＤＮＡ配列である。標的配列の存在下でのプライマー二量体の形成は、予測されるアンプリコンの蓄積に伴うプライマー二量体の蓄積として観察される。標的配列の非存在下でのプライマー二量体の形成は、特異的アンプリコンの蓄積を伴わないプライマー二量体の蓄積として観察される。またプライマー二量体は、基本となるプライマー二量体より配列が長いオリゴマーを形成しうる。その理由は、それらが追加の、連結コピーの一方または両方のプライマーを含有するからである。オリゴマー形成のプロセスは十分に理解されていないが、オリゴマー形成は反応産物のゲル電気泳動または融点解析によって容易に検出できる。プライマー二量体の形成により、プライマー二量体の生成および蓄積に一方または両方のプライマーが消費されるにつれ、所定数の熱サイクル中に生成される予測アンプリコンの量が減少する。したがって、プライマー二量体を排除することが望ましい。その理由は、それによって正常産物の特異性および収量がともに増加するからである。プライマー二量体のこれらの特徴、および本発明に記載の試薬を加えることによるその排除は、実施例１０で例証される。
【００５７】
プライマー二量体の形成確率は、多数の他の要因、例えばプライマー濃度の上昇、マグネシウム濃度の上昇、プライマーの長さの増加、熱サイクルのアニーリング温度の低下、および反応に含まれるプライマーの総数の増加に加えて、一方のプライマーの３’末端と同プライマーの内部配列または異なるプライマーとの間の配列相同性によって上昇する。さらに、プライマー二量体の形成確率が、ホットスタートポリメラーゼを使用する反応と比較して、非ホットスタートポリメラーゼを使用する反応においてずっと高いことが当技術分野において周知である。その理由は、反応の成分の混合中にプライマー−プライマーハイブリダイゼーションおよび伸長が相対的に低い温度で生じうるからである。ホットスタート酵素はプライマー二量体の生成および蓄積を低減するが、完全には排除しない。プライマー二量体のこれらの特徴、ならびに本発明に記載の試薬を加えることによるその排除は、実施例１１で例証される。
【００５８】
またプライマー二量体の形成は反応のキネティクスに対して微妙な効果を有しうる。本明細書中に記載の試薬を加えることによるそれらの排除を観察し、キネティクスに関して最適化することができる。実施例１２では、２ペアのプライマーからなり、２種の一本鎖産物を生成させるＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅が記載される。それらの一方の産物の動的蓄積を蛍光プローブに対するハイブリダイゼーションに基づいて検出した。結果を図１３および図１４に示す。該データは、キネティクスの直線性が、試薬のステムの厳密な組成および試薬の濃度の両者によって影響を受けることを実証する。試薬のステムの厳密な組成の影響は融解温度に対するその効果に起因する。さらに、試薬の最適使用および最適に近い使用によってＬＡＴＥ−ＰＣＲにおける直線的増幅の速度を変化させ、それによって反応の終了時点でのシグナルの大きさを変化させることができるが、反応のＣＴ値には影響しない。図１５および図１６は、化合物９−３ＤＤを１５０および３００ｎＭで使用した場合、一定範囲の鋳型出発濃度にわたってＣＴ値によって判断される増幅効率は同一であったが、３００ｎＭの９−３ＤＤの存在下で鋳型出発数１００および１０００から生じたシグナルの大きさは、１５０ｎＭの９−３ＤＤを使用して得られたシグナルより大きかったことを実証する。おそらく、それはプライマー二量体形成が存在しないせいである。
【００５９】
実施例
【実施例１】
【００６０】
実施例１． ミスプライミングエラーを評価するための厳密なアッセイ
ＰＣＲ増幅反応においてタイプ１、タイプ２およびタイプ３のミスプライミングを評価するために、本発明者らは、剪断ゲノムＤＮＡを利用するＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅を実施し、融点解析およびゲル電気泳動によってその産物を調べる。使用した具体的な増幅は以下の通りである。
【００６１】
Ａ． 基質：１０〜１０，０００ゲノムに相当する剪断ゲノムＤＮＡ。市販のＤＮＡを購入し、ゲノムＤＮＡを複数回凍結・解凍するか、またはＤＮＡを剪断するための当業者に公知の任意の他の同様の方法によって処理した。
【００６２】
Ｂ． ＰＣＲ増幅混合物ベース（Sanchez et al. (1994) PNAS 101:1933-1938を参照のこと）：
基質：２０００ゲノムの剪断ゲノムＤＮＡ
１×ＰＣＲバッファー
Ｍｇ＋２：３ミリモル濃度（ｍＭ）
ｄＮＴＰ：２５０マイクロモル濃度（μＭ）の４種の各ｄＮＴＰ
過剰プライマー：１０００ナノモル濃度（ｎＭ）の配列５’ ＣＴＴＴＧＡＴＧＡＣＧＣＴＴＣＴＧＴＡＴＣＴＡ ３’（配列番号１３）
制限的プライマー：５０ｎＭの配列５’ ＣＣＴＧＧＡＴＴＡＴＧＣＣＴＧＧＣＡＣＣＡＴ ３’（配列番号１４）
ＤＮＡポリメラーゼ：２５マイクロリットル（μＬ）の反応混合物あたり１．２５単位。
【００６３】
Ｃ． 増幅プロトコル：
低温インキュベーション：室温で３５分
ＰＣＲ増幅プロトコル：９５℃で１５分間の高温浸漬；９５℃で１０秒間、５５℃で３０秒間、および７０℃で３０秒間の１０サイクル；次いで９５℃で１０秒間、５０℃で３０秒間、および７０℃で３０秒間の７０サイクル。
【００６４】
いずれのホットスタート方法論をも使用せずに２種の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ ＴａｑおよびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｔａｑ）を利用する増幅によって、ミスプライミングに関するベースラインの事例を確立した。２種の異なる市販のホットスタートＤＮＡポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＴａｑおよびＰｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ（Invitrogen））を利用して追加の増幅を実施した。最後に、３００ｎＭの現在の好ましい実施形態の本発明に基づく試薬を加えて、追加の増幅を実施した。本実施例で使用される一実施形態は、組成物９−２２ＤＤと称される試薬である（本発明者らの用語体系において、「９」はステム長であり、「２２」はループ長であり、「ＤＤ」は安定化用の修飾を意味し、この場合は１ペアのＤａｂｃｙｌクエンチャーである）。化合物９−２２ＤＤは８１℃の計算上のＴｍを有する。該化合物は、表ＩＩに示される配列を有し、それは５’末端および３’末端のＤａｂｃｙｌ部分の付加によって修飾されている。
【００６５】
臭化エチジウム染色を施した種々の増幅のゲル電気泳動の結果を図１に示す。図１は、ラベルがない両端のカラムにサイズマーカー（１００塩基対ずつ異なるサイズ）を含む。重複実験を行ったために、各ＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅の産物に関して２レーンずつが存在する。レーンａ，ＤＮＡが省略されたベースラインの事例；レーンｂ，ＤＮＡポリメラーゼがＰｒｏｍｅｇａ Ｔａｑであったベースラインの事例；レーンｃ，ＤＮＡポリメラーゼがＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｔａｑであったベースラインの事例；レーンｄ，ホットスタート酵素であるＱｉａｇｅｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒ Ｔａｑを代用；レーンｅ，ホットスタート酵素であるＰｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑを代用；レーンｆ，化合物９−２２ＤＤを加えるとともにＰｒｏｍｅｇａ Ｔａｑポリメラーゼを利用する増幅；レーンｇ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｔａｑポリメラーゼおよび化合物９−２２ＤＤを利用する増幅；レーンｈ，Ｑｉａｇｅｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼおよび化合物９−２２ＤＤを利用する増幅；レーンｉ，Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑポリメラーゼおよび化合物９−２２ＤＤを利用する増幅。
【００６６】
図１から、重合活性および５’−３’エキソヌクレアーゼ活性の両者を有する標準のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（レーンｂおよびレーンｃ）が一定範囲の産物サイズをもたらしたが、そのうちのほとんどが、レーンｆ〜ｉに見られる産物である、プライマーペアによって規定される所望のアンプリコンではなかったことがわかる。修飾型「ホットスタート」ポリメラーゼ（レーンｄ〜ｅ）への切り替えは有益であったが、依然として、ミスプライミングエラーにより形成される非特異的産物は排除されなかった。しかし、化合物９−２２ＤＤが３００ｎＭの濃度で存在した場合は、酵素が標準のＴａｑＤＮＡポリメラーゼであった場合（レーンｆ〜ｇ）および酵素がホットスタートＴａｑＤＮＡポリメラーゼであった場合（レーンｈ〜ｉ）でいずれも、所望のアンプリコンが得られ、ミスプライミングエラーにより形成される非特異的産物は含まれなかった。
【００６７】
本実施例の厳密なアッセイを使用して、いくつかの無修飾および修飾ＤＮＡヘアピン分子を、末端安定化を伴わずに；各アームの端部に同一のヌクレオチドを付加することによって達成される末端不安定化を伴って；本発明に基づく末端安定化を伴って；ならびに安定化用ではない末端付加を伴って比較した。定量的比較を行うために、標準のＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いて図１に示されるように達成される、ミスプライミングエラーにより形成される非特異的産物の排除、および所望の特異的産物しか存在しないことをもたらすために必要とされる最低濃度を決定するために、ミスプライミング抑制活性を示した各化合物に関して前記アッセイを使用する用量応答試験を実施した。その結果は表Ｉに示される通りであり、表には試験対象の各試薬に関する計算上のステムＴｍが含まれる。表Ｉに報告される種々の化合物の配列は表ＩＩに記載される通りである。
【表１】
【００６８】
【表２】
【００６９】
表Ｉでは、修飾および無修飾のいくつかのＤＮＡヘアピンが比較され、本発明の試薬（１０００ｎＭ未満の濃度でミスプライミングの産物を伴わない純粋なアンプリコンが得られる）であるか、または本発明の好ましい試薬（６５０ｎＭ以下の濃度でミスプライミングの産物を伴わない純粋なアンプリコンが得られる）であるいくつかの末端安定化ヘアピン分子が特定される。無修飾のヘアピンは２つの数字によって特定される。第一の数字はステム長であり、第二の数字はループ長である。表Ｉに挙げられる本発明に基づく化合物は以下のような数種類の安定化用の修飾を有する：市販のリンカーを用いて末端ヌクレオチドに共有結合している５’Ｄａｂｃｙｌクエンチャーおよび３’Ｄａｂｃｙｌクエンチャー（接尾辞「ＤＤ」によって示される）、同様に結合している３’Ｂｌａｃｋ ＨｏｌｅＴＭクエンチャーおよび５’Ｂｌａｃｋ ＨｏｌｅＴＭクエンチャー（接尾辞「ＢＨＱＢＨＱ」によって示される）、およびステム末端でデオキシリボヌクレオチドの代わりに用いられる２個の３’２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドおよび２個の５’２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド（「２’ＯＭ４」によって示される）。ステム末端に対する不安定化用の修飾には、分子の３’および５’末端を２個のＡまたはＴで置換することが含まれた。ステムを安定化する様式で互いに相互作用しないと考えられる１ペアのＦＡＭ蛍光団を付加すると、単一の５’Ｄａｂｃｙｌの付加と同様に不安定であった。しかし、単一の３’Ｄａｂｃｙｌの付加は９−２２ヘアピンをわずかに安定化した。それは必要とされる濃度の低下によって示される通りである。ヘアピン９−２２は高濃度（３０００ｎＭ）でしかミスプライミングを抑制しなかったが、９−２２ＤＤは低濃度（５０ｎＭ）でミスプライミングを抑制した。
【００７０】
現在の本発明者らの好ましい別のヘアピンである化合物９−３は高濃度（１０００ｎＭ）でしかミスプライミングを抑制しなかったが、９−３ＤＤおよび９−３ ２’ＯＭ４はずっと低い濃度（１００〜３００ｎＭ）でミスプライミングを抑制した。さらに別の実施形態である９−５ＤＤ、９−５ＢＨＱＢＨＱおよび９−５ ２’ＯＭ４もまた低濃度（５０〜１００ｎＭ）でミスプライミングを抑制した。オリゴヌクレオチド９−５はオリゴヌクレオチド９−２２と同一のステムを有するが、ヌクレオチドがＡおよびＴである短いループを有する。オリゴヌクレオチド９−５の計算上のステムＴｍは９３℃であり、ループの影響によりオリゴヌクレオチド９−２２の計算上のステムＴｍより約１２℃高い。
【００７１】
さらに長いステムを用いても同様の結果が得られた。化合物１２−３はミスプライミングを抑制しなかったが、化合物１２−３ＤＤはほんの５０ｎＭの濃度で有効であった。
【００７２】
表Ｉは、安定化ステムを修飾して、計算上のステム融解温度（Ｔｍ）を変化させることができることを示す。例えば、Ｔｍ５６℃の化合物９−３ＤＤは１００ｎＭの濃度で有効であった。ステムのＧＣ含量を変えることによって、化合物９−３ｂＤＤ（Ｔｍ６２℃）および９−３ｉＤＤ（Ｔｍ６８℃）を作成した。両化合物もまた１００ｎＭの濃度で有効であった。Ｔｍ５８℃の化合物１２−３ＤＤは５０ｎＭの濃度で有効であった。改変されたステムを有する化合物、すなわちＴｍ６３℃の化合物１２−３ｂＤＤおよびＴｍ６８℃の化合物１２−３ｃＤＤは１００ｎＭの濃度で有効であり、依然として非常に良好であった。
【実施例２】
【００７３】
実施例２． ＬＡＴＥ−ＰＣＲエンドポイントアッセイ
反復実験サンプル間の反応キネティクスの確率的変動によってハイブリダイゼーションプローブ由来のシグナルのばらつきが生じ、エンドポイント解析が妨害される。ＬＡＴＥ−ＰＣＲはその問題を著しく軽減する。本発明の試薬を利用するとエンドポイント検出を利用する能力がさらに改善される。図２は、テイ・サックス病に関与するヘキソサミニダーゼＡ遺伝子のＧ２６９対立遺伝子を含むアンプリコンを増幅する際に得られる結果を示す。反応混合物は０．６μＭのハイブリダイゼーションプローブおよび１０００ゲノムのホモ接合性野生型ＤＮＡ標的（＋／＋）またはヘテロ接合性ＤＮＡ標的（Ｇ２６９／＋）を含んでいた。各タイプの反復サンプルを以下のように増幅した：２５μＬの反応物中、１００ｎＭの実施形態９−２２ＤＤの存在または非存在下での、１×ＰＣＲバッファー、３ｍＭのＭｇＣｌ２、２５０μＭの各ｄＮＴＰ、配列５’ ＣＧＡＧＧＴＣＡＴＴＧＡＡＴＡＣＧＣＡＣＧＧＣＴＣＣ ３’（配列番号１５）を有する２５ｎＭの制限的プライマー、配列５’ ＴＡＡＣＡＡＧＣＡＧＡＧＴＣＣＣＴＣＴＧＧＴ ３’（配列番号１６）を有する１０００ｎＭの過剰プライマー、１．２５単位のＰｌａｔｉｎｕｍ（ホットスタート） Ｔａｑポリメラーゼ、配列５’ Ｃｙ５−ＧＧＧＡＣＣＡＧＧＴＡＡＧＡＡ−リン酸 ３’（配列番号１７）を有する０．６μＭのＣｙ５標識ハイブリダイゼーションプローブ、および１：４０，０００希釈のＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ Ｉ。ＰＣＲサイクルのパラメータは、９５℃で３分間；９５℃で１０秒間、６５℃で２０秒間、および７２℃で２０秒間の２５サイクル；および、９５℃で１０秒間、６５℃で２０秒間、７２℃で２０秒間、５５℃で２０秒間、および４５℃で２０秒間の３０サイクルであり、７２℃でＳＹＢＲ Ｇｏｌｄに関する蛍光を取得し、５５℃および４５℃でＣｙ５に関する蛍光を取得した。反応キネティクスの試験管ごとの変動を補正するために、７２℃でのＳＹＢＲ Ｇｏｌｄシグナルに対する５５℃でのＣｙ５シグナルの比によってハイブリダイゼーションシグナルを標準化した。そのような標準化の影響の１つはすべてのＣＴの遅延がマスクされることである。
【００７４】
図２の、サークル２１によって特定されるライン群およびサークル２２によって特定されるライン群は、本発明の試薬を加えないが、ホットスタートポリメラーゼを用いた場合の複数回の反復実験の結果を示す。ホモ接合性の反復実験（サークル２１）およびヘテロ接合性の反復（サークル２２）はそれらの直線プロットの勾配によって識別することができる。約４０サイクル後のハイブリダイゼーションプローブシグナルの低下（「Ｈｏｏｋ効果（hook effect）」）によって立証される、これらのサンプルにおける反復実験間のばらつきおよびミスプライミングエラーは、これらのサンプルのエンドポイント識別を不可能にする。図２のサークル２３〜２４によって特定されるライン群は、本発明の試薬、すなわち１００ｎＭの９−２２ＤＤを加えた場合の結果を示す。これらの条件下では、ミスプライミングエラーが生じず、アッセイの経過中に直線的キネティクスが維持され、ばらつきが低減され、Ｈｏｏｋ効果が回避され、５０サイクルの時点でホモ接合性およびヘテロ接合性サンプルのエンドポイント識別が可能である。
【実施例３】
【００７５】
実施例３． ジデオキシシークエンシング用のＤＮＡサンプルの調製
ＬＡＴＥ−ＰＣＲは、増幅反応が６０以上の熱サイクルにわたって実行される場合に、ＤＮＡシークエンシングに好適な大量の一本鎖ＤＮＡを生産しうる非対称増幅法である。しかし、そのような多数の増幅サイクルはミスプライミングの産物の出現を助長し、それにはタイプ２およびタイプ３のミスプライミングエラーの形成が含まれると考えられる。該ミスプライミングエラーは検出可能な非特異的産物の蓄積として現れ、それは、最終的に、反応において最も多数を占める分子種になる。本発明の試薬は、７０以上のサイクルのＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅を使用する場合に、非特異的産物を生じずに、ＤＮＡシークエンシングに好適な大量の一本鎖ＤＮＡの合成を可能にする。キャピラリーゲル電気泳動によるジデオキシシークエンシングに好適なサンプルを以下のように調製した。まずＬＡＴＥ−ＰＣＲ反応混合物を、１×ＰＣＲバッファー、３ｍＭのＭｇＣｌ２、配列５’ ＧＣＣＡＧＧＧＧＴＴＣＣＡＣＴＡＣＧＴＡＧＡ ３’（配列番号１８）を有する１０００ｎＭの過剰プライマー、配列５’ ＣＣＧＣＣＣＴＴＣＴＣＴＣＴＧＣＣＣＣＣＴＧＧＴ ３’（配列番号１９）を有する２５ｎＭの制限的プライマー、１．２５単位のＰｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑポリメラーゼ、６００ｎＭの試薬９−３ＤＤおよび２５０μＭの各ｄＮＴＰを含有する２５μＬで調製した。化合物９−３ＤＤは、オリゴヌクレオチド９−３の各末端ヌクレオチドに付加されたＤａｂｃｙｌクエンチャーを有する。増幅は、９５℃で３分間；９５℃で１０秒間、６５℃で２０秒間、および７２℃で２０秒間の１０サイクル；および、９５℃で１０秒間、６５℃で２０秒間、７２℃で２０秒間；および４５℃で２０秒間の６０サイクル実行した。二本鎖および一本鎖ＤＮＡ合成を別々にモニタリングするために、１：４０，０００希釈のＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎまたは配列５’ ＦＡＭ−ＣＧＴＧＣＧＣＴＣＴＧＧＴＡＡＧＧＧＴＴＴＧＣＡＣＧ−Ｄａｂｃｙｌ ３’（配列番号２０）を有する２．４μＭの低Ｔｍ分子ビーコンを用いて並行して反応を実施した。各サンプルは６ｎｇ（約１０００ゲノム）のヒトＤＮＡを含有した。さらに、化合物９−３ＤＤを加えずに対照反応を実施した。
【００７６】
増幅反応の結果、ホットスタートＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いるが、化合物９−３ＤＤを用いない対照は顕著なミスプライミングを示した。制限的プライマーが使い果たされた後の増幅の後期段階中に、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎシグナルが二次的に上昇することによってそれは立証される。該産物はそのような混合物であるため、該対照をシークエンシングすることは不可能であった。一方、化合物９−３ＤＤを加えた場合の増幅の結果では、所望の特異的産物しか存在せず、７０サイクルを通してＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎシグナルの遅延された上昇はないことが示された。制限的プライマーの濃度および５０％の直線的増幅の見かけの効率から、反応によって２５０フェムトモル（fmoles）／μＬの純粋な産物が生産されると見積もられる。該産物をBrandeis Universityのジデオキシシークエンシング施設に送り、シークエンシングを行った。
【００７７】
シークエンシング反応は、Ｂｅｃｋｍａｎ ＣＥＱ ２０００ ＤＮＡシーケンサーを利用するキャピラリー電気泳動などの標準プロトコルを使用して実施した。増幅産物の１／５アリコート、すなわちわずかに５０フェムトモルの産物を用いてシークエンシング反応を実施した。機械により作成された配列を図３に挙げる。図３では、チャートの上部に沿って配列を示し、クリアで不明瞭なところがない産物ピーク（これから配列を導き出した）を示し、底部では非常に低レベルのバックグラウンドシグナルを示す。本発明者らは、機械により作成された配列をＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＴ ０１０２３５から入手可能な該アンプリコンの公知の配列と比較することによって、その正確さを確認した。
【実施例４】
【００７８】
実施例４． 多重化ＰＣＲ増幅
ミスプライミングエラーの抑制は、複数の産物が同時に増幅される多重化反応において特に重要である。複数のプライマーペアおよび増幅産物が存在すると、これらの反応種の２者間および３者以上の間のミスプライミング相互作用の確率が高くなる。増加した数のアンプリコンからなる多重化反応を化合物９−３ＤＤの不存在または存在下で実行した。以下に示すプライマーペアの種々の組み合わせに関して、３００ｎＭの試薬９−３ＤＤの非存在下または存在下で、サンプル、１×ＰＣＲバッファー、３ｍＭのＭｇＣｌ２、１００μＭの各ｄＮＴＰ、１０００ｎＭの過剰プライマー、５０ｎＭの制限的プライマー、および１．２５単位の非ホットスタートＰｒｏｍｅｇａ Ｔａｑポリメラーゼからなる２５μＬ容量のＬＡＴＥ−ＰＣＲ反応物を調製した。サンプルの増幅は、９５℃で３分間；９５℃で１０秒間，６５℃で３０秒間，および７０℃で３０秒間の１０サイクル；および、９５℃で１０秒間，５０℃で３０秒間，７０℃で３０秒間の４０サイクルの熱サイクルプロファイルを使用して行った。反応の終了時点で、０．５×ＴＢＥ中の３．５％アガロースゲルでのゲル電気泳動によってサンプルを分析した。試験対象の所望のアンプリコンおよびプライマーペアは以下の通りであった。
【００７９】
反応Ａ：テイ・サックス病に関連するＨｅｘ−Ａ遺伝子の２領域ＴＳＤ１２７８＋ＴＳＤ１４２１
ＴＳＤ１２７８過剰プライマー：５’ ＧＣＣＡＧＧＧＧＴＴＣＣＡＣＴＡＣＧＴＡＧＡ ３’（配列番号２１）
ＴＳＤ１２７８制限的プライマー：５’ ＣＣＧＣＣＣＴＴＣＴＣＴＣＴＧＣＣＣＣＣＴＧＧＴ ３’（配列番号２２）
ＴＳＤ１４２１過剰プライマー：５’ ＣＣＧＧＧＴＣＴＣＴＡＡＧＧＧＡＧＡＡＣＴＣＣＴ ３’（配列番号２３）
ＴＳＤ１４２１制限的プライマー：５’ ＣＣＧＧＣＣＧＡＣＡＡＣＡＣＡＡＡＣＣＴＧＧＴＣＣ ３’（配列番号２４）。
【００８０】
反応Ｂ：ＴＳＤ１２７８アンプリコン、ＴＳＤ１４２１アンプリコン、およびＣＦＴＲ遺伝子の１領域、ＣＦエキソン１０アンプリコン
本反応は反応Ａと同じプライマーペアに加えて以下のプライマーペアを含有した：
ＣＦ ｅｘ１０過剰プライマー：５’ ＧＣＴＴＴＧＡＴＧＡＣＧＣＴＴＣＴＧＴＡＴＣＴＡ ３’（配列番号２５）
ＣＦ ｅｘ１０制限的プライマー：５’ ＣＡＧＴＴＴＴＣＣＴＧＧＡＴＴＡＴＧＣＣＴＧＧＣＡＣＣＡＴ ３’（配列番号２６）。
【００８１】
反応Ｃ：ＴＳＤ１２７８アンプリコン、ＴＳＤ１４２１アンプリコン、ＣＦエキソン１０アンプリコン、およびＣＦＴＲ遺伝子の別の領域、ＣＦエキソン１１アンプリコン
本反応は反応Ｂと同じプライマーペアに加えて以下のプライマーペアを含有した：
ＣＦ ｅｘ１１過剰プライマー：５’ ＴＣＧＡＡＧＴＴＴＧＣＡＧＡＧＡＡＡＧＡＣＡＡＴ ３’（配列番号２７）
ＣＦ ｅｘ１１制限的プライマー：５’ ＴＧＡＣＧＴＴＴＡＣＡＧＣＧＡＡＴＧＣＴＴＧＣＴＡＧＡＣＣＡＡＴ ３’（配列番号２８）。
【００８２】
反応Ｄ：ＴＳＤ１２７８アンプリコン、ＴＳＤ１４２１アンプリコン、ＣＦエキソン１０アンプリコン、ＣＦ ｅｘ１１アンプリコン、およびヒトβグロビン遺伝子の１領域
本反応は反応Ｃと同じプライマーペアに加えて以下のプライマーペアを含有した：
βグロビン過剰プライマー：５’ ＴＧＧＧＴＴＴＣＴＧＡＴＡＣＧＣＡＣＴＧＡＣＴＣＴＣＴＣ ３’（配列番号２９）
βグロビン制限的プライマー：５’ ＧＧＣＣＡＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＣＡＣＣＧＡＧＣＡＣＴ ３’（配列番号３０）。
【００８３】
電気泳動ゲルを臭化エチジウムで染色し、ＬＡＴＥ−ＰＣＲ反応の対数期に生成された二本鎖産物を検出した。図４は、多重化反応Ａ〜Ｄにより得られた産物についての該当部分のゲルを示す。矢印は特異的二本鎖増幅産物を指し示し、無数のバンドは二次構造を有する特異的一本鎖ＤＮＡ産物に相当し、アスタリスクは非特異的産物を特定する。ゲルのペアＡ〜Ｄはそれぞれ反応Ａ〜Ｄに相当する。「＋」でラベルされている各ゲルは化合物９−３ＤＤを含む増幅により得られた産物である。「−」でラベルされている各ゲルは化合物９−３ＤＤを含まない増幅により得られた産物である。
【００８４】
ゲルのペアＡは、９−３ＤＤ化合物の非存在下で、領域ＴＳＤ１２７８（矢印４１）は増幅されなかったが、領域ＴＳＤ１４２１（矢印４２）は、主にまたは完全に二本鎖の多数の非特異的産物とともに増幅されたことを示す。該非特異的産物はゲルではスメアとして見られる。９−３ＤＤ化合物を加えると、非特異的産物のバックグラウンドが減少し、ＴＳＤ１２７８（矢印４１）およびＴＳＤ１４２１（矢印４２）の両者の増幅が可能になった。それらはよりきれいに増幅されていて、ミスプライミングのいくつかの現象が防止されたことが示される。
【００８５】
ゲルのペアＢは、９−３ＤＤ化合物の非存在下で、領域ＴＳＤ１２７８、ＴＳＤ１４２１、およびＣＦエキソン１０（矢印４３）が、ゲルではスメアとして見られる多数の非特異的産物とともに増幅されたことを示す。９−３ＤＤ化合物を加えると、バックグラウンドの非特異的産物が排除され、３種の予測されるアンプリコンのすべてが得られた。
【００８６】
ゲルのペアＣは、９−３ＤＤ化合物の非存在下で、領域ＴＳＤ１２７８、ＴＳＤ１４２１、ＣＦエキソン１０、およびＣＦエキソン１１（矢印４４）が、アスタリスクによって示される非特異的産物とともに増幅されたことを示す。９−３ＤＤ化合物を加えると、非特異的産物の合成が排除され、４種の予測されるアンプリコンのすべてが得られた。
【００８７】
ゲルのペアＤは、９−３ＤＤ化合物の非存在下で、βグロビン遺伝子の選択された領域（矢印４５）は増幅されなかったが、ＴＳＤ１２７８、ＴＳＤ１４２１、ＣＦエキソン１０、およびＣＦエキソン１１は、アスタリスクによって示される非特異的産物とともに増幅されたことを示す。９−３ＤＤ化合物を加えると、非特異的産物の合成が排除され、５種の予測されるアンプリコンのすべての増幅が可能になった。
【００８８】
また本発明者らは、感染性病原体に関してスクリーニングする場合に生じうるものなどの、任意の所定の試験サンプル中に１つの標的しか存在しない場合の多重増幅および検出反応における本発明の化合物の用途を実証した。そのような場合、複数ペアのプライマー（本発明者らは複数ペアの過剰プライマーおよび制限的プライマーをＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅に利用した）が存在するが、特定のサンプルに関して１ペアのプライマーしか有効ではない。ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ蛍光および増幅後の電気泳動による解析によって示されるように、それは実際に生じたことであり、したがって、すべての基質より少数の基質しか存在しない場合の多重反応において本発明の化合物が効果的にミスプライミングを阻害することが実証される。
【実施例５】
【００８９】
実施例５． ステムＴｍとアニーリング温度の関係
標的を含む同じ増幅混合物を利用して２種の異なるＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅プロトコルを比較した。６００ｎＭの化合物９−３ＤＤを含む場合および化合物９−３ＤＤを含まない場合の両方で各増幅を実施した。上記のように、化合物９−３ＤＤのステムＴｍ（すなわち無修飾のオリゴヌクレオチド９−３の計算上の融解温度）は５６℃である。ホットスタートＰｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを使用した。２種の増幅は、主として、使用されるプライマーアニーリング温度が異なり、６５℃（ステムＴｍより高い）または５５℃（ステムＴｍより低い）であった。増幅サイクルのパラメータは以下の通りであった：
プロファイルＡ：９５℃で３分間；９５℃で１０秒間，６５℃で２０秒間，７２℃で２０秒間の１０サイクル；９５℃で１５秒間，５５℃で２０秒間，７２℃で２０秒間，５０℃で２０秒間の６０サイクル
プロファイルＢ：最後の６０サイクルが９５℃で１０秒間，６５℃で２０秒間，７２℃で２０秒間，４５℃で２０秒間であったことを除いて、プロファイルＡと同一。
【００９０】
増幅反応をリアルタイムでモニタリングした。その場合、二本鎖産物の合成をモニタリングするためにＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ蛍光色素を使用した。ミスプライミングによって増幅の後期部分がばらつかない限り、二本鎖産物の合成は、制限的プライマーが使い果たされた後のＬＡＴＥ−ＰＣＲ反応においてプラトーに達した。低温検出ステップ中に読み取りを行った。
【００９１】
結果を図５に挙げる。パネルＡは、化合物９−３ＤＤを加えた場合（サークル５２）および加えなかった場合（サークル５１）の両方において、１０サイクルの伸長後に５５℃のアニーリング温度が利用された場合のプロファイルＡの反復実験サンプルから得られた蛍光読み取り値を示す。パネルＢは、化合物９−３ＤＤを加えた場合（サークル５４）および加えなかった場合（サークル５３）の両方において、１０サイクルの伸長後に６５℃のアニーリング温度が使用された場合のプロファイルＢの反復実験サンプルから得られた蛍光読み取り値を示す。
【００９２】
図５は、本発明の試薬のステムＴｍより低いプライマーアニーリング温度が使用された場合（パネルＡ）に、閾値サイクルＣＴの数サイクルの遅延が観察されたことを示す。しかし、指数的ＰＣＲ相の初めから終わりまでステムＴｍよりかなり高いプライマーアニーリング温度が維持された場合（パネルＢ）には、ＣＴの遅延は、たとえあったとしても、ほとんど観察されなかった。本増幅で利用された特定のアンプリコンに関しては、ホットスタートＴａｑが使用された場合に、化合物９−３ＤＤを用いても用いなくても、タイプ２／タイプ３のミスプライミングが観察されなかったことがわかった。このことは、そのようなミスプライミングエラーの出現が予測不能であることを示す。本実施例は、反応の温度が５５℃に下がると試薬９−３ＤＤのステムが閉鎖型になること、および反応の高温伸長ステップ中は該試薬がポリメラーゼに結合したままであることを実証する。
【実施例６】
【００９３】
実施例６． ２５℃でのＤＮＡポリメラーゼ活性に対する効果
本発明の試薬およびそれらの無修飾のオリゴヌクレオチドアナログの効果を評価するために、一連のプライマー伸長実験を２５℃で実行した。各反応混合物には、鋳型、プライマーおよびＴａｑＤＮＡポリメラーゼを含めた。各場合において２時間、反応を実行した。プライマーをＣｙ５で蛍光標識した。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ蛍光色素を反応混合物に加えた。伸長反応後に、融解曲線を作成した。その場合、本発明者らが同時に出願した米国仮特許出願、表題「Primers, Probes and Methods for Nucleic Acid amplification」に開示されるように、色素を刺激し、該色素からのＦＲＥＴ転移による蛍光団の発光を読み取った。結果を図６に挙げる。
【００９４】
図６のパネルＡは、反応混合物からｄＮＴＰが省略されることによって伸長が妨げられた場合に得られた融解曲線６１を含む。ゆえに曲線６１はプライマー・標的ハイブリッドの融解曲線であり、５８℃のＴｍを示す。またパネルＡは、ｄＮＴＰを、単独で、あるいは無修飾のオリゴヌクレオチド９−３（３００ｎＭ、１０００ｎＭ）または９−２２（５０ｎＭ、１００ｎＭ、３００ｎＭ）とともに含有するいくつかの対照を含む。サークル６２によって特定される、前記対照に関する曲線は、すべての場合で伸長を示し、すなわち５８℃のプライマー融解ピークが消失した。図６のパネルＢは、反応混合物中に試薬９−２２ＤＤを加えることの用量依存的効果を示す：曲線６３、５０ｎＭ；曲線６４、１００ｎＭ；曲線６５、３００ｎＭ。５８℃のピークが大きいほど、等温性試験条件下で重合による伸長を防止する効果が大きい。図６のパネルＣは、反応混合物中に試薬９−３ＤＤを加えることの用量依存的効果を示す：曲線６６、３００ｎＭ；曲線６７、１０００ｎＭ。この場合もやはり、５８℃のピークが大きいほど、試験条件下で重合による伸長を防止する効果が大きい。
【００９５】
また本発明者らは、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を欠いているＤＮＡポリメラーゼであるＳｔｏｆｆｅｌ断片（Lawyer et al. (1993) PCR Methods and Applications 2: 275-287）に対する効果を調べた。鋳型、蛍光標識プライマー、Ｓｔｏｆｆｅｌ断片およびｄＮＴＰしか含有しない陰性対照と、表１に列挙される種々の化合物を比較した。この一連の試験では、４０℃で伸長を実施し、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ読み取り値を３０分間以上にわたって２０秒毎に取得した。目視によって曲線を比較したが、その比較は信頼できるものであった。その理由は、得られた曲線が対照をほぼ正確にたどるか、あるいは得られた曲線が対照とは著しく異なっていたからである。５０ｎＭ、１００ｎＭおよび３００ｎＭの濃度で試験化合物を加えた。無修飾のヘアピン６−２２、９−３、９−５および９−２２は、いかなる濃度においてもＳｔｏｆｆｅｌ断片による伸長を抑制しなかった。化合物６−２２ＤＤは、化合物９−３ＤＤ、９−５ＤＤおよび９−２２ＤＤと同様に、すべての３種の濃度で伸長を抑制した。以下の化合物は、５０Ｍまたは１００ｎＭの濃度では伸長を抑制しなかったが、３００ｎＭの濃度では伸長を抑制した：９−２２−５Ｄ、９−２２−３Ｄ、９−５ ２’ＯＭ４、９−５ＢＨＱＢＨＱ、および９−３２’ＯＭ４。
【実施例７】
【００９６】
実施例７． ポリメラーゼ活性の非存在下でのＴａｑエキソヌクレアーゼ活性に対する効果
本発明者らは、ＤＮＡ合成の非存在下での５’−３’エキソヌクレアーゼ活性の阻害を実証するアッセイを開発した。本アッセイでは、一方の鎖の５’末端がＦＡＭ蛍光団で標識され、他方の鎖の３’末端がＤａｂｃｙｌクエンチャーで標識されている特異的二本鎖ＤＮＡ分子を基質として使用する。蛍光団はクエンチャーと近接していて、蛍光団が刺激された場合に蛍光は生じない。加熱および冷却による鎖変性およびアニーリングによって、ＦＡＭ標識鎖の切断および蛍光団の遊離が起こる。何らかのサイクル処理によってＴａｑポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性に関する基質が生成されると考えられる。したがって、蛍光の増大はＴａｑポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性の尺度を提供する。
【００９７】
２５μＬの反応混合物は、適切な濃度の９−２２ＤＤ化合物の存在または非存在下で、１×ＰＣＲバッファー中の３００ｎＭの二本鎖ＤＮＡ鋳型、３ｍＭのＭｇＣｌ２、および１．２５単位（Ｕ）のＴａｑポリメラーゼを含有する。該反応物は、いかなるｄＮＴＰをも含有せず、前記二本鎖ＤＮＡ以外のいかなる他の核酸標的をも含有しない。前記二本鎖ＤＮＡ鋳型の相補鎖の配列は、５’ ＦＡＭ−ＡＧＴＧＴＧＡＴＧＡＴＧＧＴＧＡＧＧ −リン酸基３’（配列番号３１）および５’ ＡＣＴＴＴＣＡＡＣＴＣＴＧＴＣＴ ３’−Ｄａｂｃｙｌ（配列番号３２）である。サンプルを９５℃で３分間変性させ、次いで９５℃で１０秒間，６７℃で３０秒間，７２℃で３０秒間，および４５℃で２０秒間のサイクルに付する。各サイクル中に４５℃で蛍光を取得する。
【００９８】
複数のサンプルに対するアッセイの実施から得られた蛍光読み取り値を図７に報告する。図７では、読み取り値を標準化して、同じバックグラウンド蛍光で出発するようにしてある。曲線７６は、Ｔａｑポリメラーゼが存在しない場合の蛍光を示す対照である。残りのサンプルにはＴａｑポリメラーゼを加えた。曲線７１は、試薬９−２２ＤＤを加えなかった場合に得られた蛍光の増大を示す。３０サイクルにわたって蛍光は安定的に増大した。曲線７２〜７５は、それぞれ５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭおよび３００ｎＭの濃度で試薬９−２２ＤＤを加えた場合の蛍光の増大を示す。上記反応物に９−２２ＤＤ化合物を加えると、観察される蛍光の増大が用量依存的様式で減少した。
【実施例８】
【００９９】
実施例８． 対称的ＰＣＲ増幅
本発明者らは、剪断ゲノムＤＮＡおよび等モル濃度で近似のＴｍを有する１ペアのプライマーを利用してリアルタイムＰＣＲ増幅アッセイを実施した。４００ｎＭの試薬９−３ＤＤを加えない場合および加えた場合で反復アッセイを実施した。ＤＮＡ全体としての蓄積のキネティクスに関して、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎでの染色によって、ならびに臭化エチジウム染色を用いるゲル電気泳動によって試薬の効果を評価した。
【０１００】
増幅に関する所望の標的はＣＦＴＲ遺伝子のイントロン１９に一塩基転位として存在する対立遺伝子であった（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＣ００００６１）。２５μＬの反応混合物は、４００ｎＭの試薬９−３ＤＤの不存在または存在下で、１２０ピコグラム（ｐｇ）の剪断ヒトゲノムＤＮＡの基質、１×ＰＣＲバッファー、５ｍＭのＭｇＣｌ２、２５０μＭの各ｄＮＴＰ、１：４０，０００希釈のＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ、１０００ｎＭのフォワードプライマー：配列５’ ＴＡＡＴＴＡＣＡＡＧＡＧＴＣＴＴＣＣＡＴ ３’（配列番号３３）（Ｔｍ５６．６℃）、および１０００ｎＭのリバースプライマー：配列５’ ＣＡＴＧＡＡＴＡＧＡＡＣＡＴＴＴＣＣＴＴ ３’（配列番号３４）（Ｔｍ５６．３℃）、および１．２５単位の非ホットスタートＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｔａｑポリメラーゼを含有した。以下の熱サイクル処理プロファイルを使用してサンプルを増幅した：９５℃で３分間；９５℃で１０秒間，５５℃で３０秒間，および７２℃で３０秒間の６０サイクル（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ蛍光を７２℃でモニタリング）、最後に、３０秒間に１℃刻みで増加する５４℃〜９６℃の温度勾配を用いる。反応の終了時点で、各組の反応から得られたランダムに選択された複数のサンプルを、０．５×Ｔｒｉｓ−ホウ酸−ＥＤＴＡ溶液（ＴＢＥ）中、３．０％アガロースゲルでのゲル電気泳動に付することよって分析した。
【０１０１】
図８は得られた結果を示す。図８のパネルＡの増幅プロットは６０サイクルにわたるＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ蛍光を示し、サークル８１によって特定される曲線群は試薬９−３ＤＤを含有しない反復実験サンプルであり、サークル８２によって特定される曲線群は４００ｎＭの９−３ＤＤを含む反復実験サンプルである。２組のサンプルから生じた蛍光シグナルのキネティクスによれば、二本鎖ＤＮＡ全体は、試薬９−３ＤＤの非存在下で、該試薬の存在下よりいくらか速やかに蓄積したが、６０サイクルによって蓄積された二本鎖ＤＮＡの総量は２組の反応において実質的に同一であることが実証される。
【０１０２】
図８のパネルＢは、臭化エチジウム染色を施した電気泳動ゲルを示す。左側の図では、レーンａはサイズマーカー（５０塩基対ずつ異なるサイズ）であり、レーンｂ〜ｉは試薬９−３ＤＤを含まないサンプルである。右側の図では、レーンｊ〜ｑは４００ｎＭの９−３ＤＤを含むサンプルであり、レーンｒはサイズマーカーである。この結果は、本発明の試薬を含有しない反応では、適正な産物ならびに高分子量の多数の非特異的産物が生成されたが、試薬９−３ＤＤを含有する反応では、適正な産物しか生成されなかったことを示す。さらに、ゲル中の適正な産物のバンドの相対強度によって判断すると、試薬９−３ＤＤを含有する反応では、該試薬を含有しない反応の約２倍の適正な産物が生成された。
【０１０３】
キネティクス解析および電気泳動による解析の組み合わせでは、非特異的産物を生成する反応８１が、適正産物しか生成しない反応８２より早く蛍光シグナルを生じたことが示される。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ色素は配列特異性とは無関係に二本鎖ＤＮＡ内に挿入される。ゆえに、反応８１の直線的なキネティクスと比較して、よりＳ字状である反応８２のキネティクスは、対称的反応が適正な産物のみを蓄積しているか否かを判断するために使用することができる。
【実施例９】
【０１０４】
実施例９． エキソヌクレアーゼ阻害の定量化
本実施例は、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性に対する本発明の試薬の阻害効果を測定するための厳密なアッセイを記載する。本アッセイでは、M. W. Kaiser, N. Lyamicheva, W. Ma, C. Miller, B. Neri, L. Fors, and V. I. Lyamicheva in J. Bio. Chem., 274, pp. 21387-21394（1999）に記載の系と同様のプライマー−鋳型系を使用した。ただし、鋳型の５’末端をＣｙ５で標識し、二本鎖ＤＮＡに結合すると蛍光を発するＤＮＡ色素であるＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉの存在下でアッセイを実行した点で異なる。本アッセイ用の鋳型は、ヌクレオチド配列：５’−ＡＣＧＡＧＣＧＴＣＴＴＴＣ−３’（配列番号３６）を有するプライマーにアニーリングするオリゴヌクレオチド配列５’−Ｃｙ５−ＡＡＡＡＣＧＣＴＧＴＣＴＣＧＣＴＧＡＡＡＧＣＧＡＧＡＣＡＧＣＧＡＡＡＧＡＣＧＣＴＣＧＴ−３’（配列番号３５）からなる。長い方のオリゴヌクレオチドは、異なる長さの２個の一本鎖尾部を有するヘアピン構造を形成する。鋳型の短い５’尾部はＣｙ５蛍光団を含有し、４アデノシン残基からなり；鋳型の長い方の３’尾部は、プライマーオリゴヌクレオチドに対する標的となり、これにより、該プライマーが１塩基対の重複を有して５’の鋳型尾部の直前に位置する。この鋳型−プライマー複合体にＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉを加えると、該複合体の二本鎖ＤＮＡ領域に結合したＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉが生じる。４８０ｎｍレーザーでＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉが励起されると、結合したＤＮＡ色素からの蛍光エネルギーがＣｙ５によって完全に吸収され、それは蛍光共鳴エネルギー転移によって生じると考えられ、最大ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ発光波長（最大発光波長：５２１ｎｍ）で検出可能な蛍光は存在しない。Ｔａｑポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性によって５’尾部が加水分解されると、鋳型−プライマー複合体からＣｙ５部分が除去され、検出可能なＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ蛍光が回復する。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼの存在下でのＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ蛍光の回復についてのキネティクスは、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性の定量的尺度を提供する。本発明の試薬はＴａｑポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を阻害し、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ蛍光の増大を減速させる。
【０１０５】
本アッセイは、２５マイクロリットル（μＬ）の容量中、５０ｎＭ、１００ｎＭ、３００ｎＭ、または１０００ｎＭの９−２２ＤＤ化合物の不存在または存在下で、１×ＰＣＲバッファー中で混合された０．５μＭの上記鋳型および１．５μＭの上記プライマー、３ｍＭのＭｇＣｌ２、１：４００００希釈の市販のＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉストック溶液（Molecular Probes, Eugene, OR）、１．２５ＵのＴａｑポリメラーゼ（Invitrogen, Calrsbad, CA）から構成されるものとした。該反応混合物にはｄＮＴＰを加えなかった。その理由は、本アッセイがＤＮＡポリメラーゼ活性に依拠しないからである。鋳型およびプライマーを含まない反応混合物を２５℃で調製して、９−２２ＤＤ化合物およびＴａｑＤＮＡポリメラーゼ間の相互作用を促進させた。次いで、サンプルを氷上に置き、鋳型およびプライマーを加え、反応の開始まで氷上で置いた。陰性対照にはＴａｑＤＮＡポリメラーゼを加えなかった。ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ ７７００にて２５℃で６０分間サンプルをインキュベートすることによって反応を開始し、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉチャネルにおける蛍光収集を３０秒毎に行った。各対照および各濃度の試薬９−２２ＤＤに関して３回の異なる試行を平均した。
【０１０６】
図９は本アッセイの結果を示す。検出可能なＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ蛍光は、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性の程度についての尺度を提供する。「Ｔａｑなし」の対照はＳＹＢＲ蛍光シグナルを示さず、Ｃｙ５によるＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ蛍光の完全吸収および５’−３’エキソヌクレアーゼ活性の完全な不存在と矛盾しない（ライン９６）。Ｔａｑポリメラーゼを加えると、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ蛍光が回復し、当該アッセイ条件下での５’−３’エキソヌクレアーゼ活性の最大レベルに関するベースラインが提供される（ライン９１）。反応混合物に９−２２ＤＤ化合物を加えると、Ｔａｑポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性に対する９−２２ＤＤの阻害効果に起因して、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ蛍光の回復が用量依存的様式で減速される（ライン９２、５０ｎＭ；ライン９３、１００ｎＭ；ライン９４、３００ｎＭ；ライン９５、１０００ｎＭ）。以下の表ＩＩＩでは、２５℃で６０分間のインキュベーション後に達成される相対的ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ蛍光のレベルに基づいて、種々の濃度の９−２２ＤＤ化合物による５’−３’エキソヌクレアーゼ活性の阻害割合を定量化する。
【表３】
【実施例１０】
【０１０７】
実施例１０． 標的ＤＮＡの存在下および非存在下でのプライマー二量体形成およびオリゴマー形成の防止
最終容量２５μＬ中の１００ゲノムのヒト胎盤ＤＮＡ（Sigma, St Louis, MO）の存在下または非存在下で、一連のＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅反応を準備した。この実験では、ＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅反応物は、１×ＰＣＲバッファー（Invitrogen, Carlsbad, CA）、３ｍＭのＭｇＣｌ２、０．２５ｍＭのｄＮＴＰ、１０００ｎＭの過剰プライマー、５０ｎＭの制限的プライマー、０．２５μＭのＦＡＭ標識プローブ鎖、０．３μＭのＤａｂｃｙｌ標識リバース相補鎖、１．２５単位のＰｌａｔｉｎｕｍ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Invitrogen, Carlsbad, CA）から構成するものとした。プライマーおよびプローブの配列は以下の通りであった：
過剰プライマー：５’ ＧＴＴＴＣＴＴＴＧＣＴＧＣＣＧＴＧＴＴＣ ３’（配列番号３７）
制限的プライマー：５’ ＣＣＣＣＡＧＡＧＡＣＣＣＣＡＧＴＴＧＣＴＡＡＣＣＡＧＡＣ ３’（配列番号３８）
ＦＡＭ標識プローブ鎖：５’ ［ＴＥＴ］ＡＧＡＣＡＧＡＧＴＴＧＡＡＡＧＴＣＡＧＧ［Ｐｈｏｓ］ ３’（配列番号３９）
Ｄａｂｃｙｌ標識リバース相補鎖：５’ ＡＣＴＴＴＣＡＡＣＴＣＴＧＴＣＴ［Ｄａｂｃｙｌ］ ３’（配列番号４０）。
【０１０８】
前記プライマーおよびプローブは、ヒトｐ５３遺伝子のエキソン５および６を包含する４８８塩基対（ｂｐ）のアンプリコンを増幅および検出する。
【０１０９】
ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（Applied Biosystems, CA）で増幅を実行した。その場合、９５℃で３分間の１サイクル；９５℃で１０秒間，６４℃で３０秒間，７５℃で３０秒間の２５サイクル；および９５℃で１０秒間，６４℃で３０秒間，７５℃で３０秒間，４５℃で２０秒間の３５サイクルからなる熱プロファイルを用い、４５℃ステップ中にＴＥＴチャネルにおいて蛍光を検出した。
【０１１０】
得られた増幅産物を、０．５×ＴＢＥバッファー中で、２時間、３％アガロースゲルでのゲル電気泳動に付することよって分析し、臭化エチジウムで染色した。結果を図１０に示す。レーン３、５、７、９、１１のサンプルはゲノムＤＮＡを加えずに調製されたものである。レーン２、４、６、８、１０のサンプルはゲノムＤＮＡを加えて調製されたものである。レーン１には１００塩基対ラダーの電気泳動用サイズマーカーを含めた。試薬９−２２ＤＤを以下のように出発反応物に加えた：レーン２および３、０ｎＭ；レーン４および５、５０ｎＭ；レーン６および７、１００ｎＭ；レーン８および９、２００ｎＭ；レーン１０および１１、３００ｎＭ。
【０１１１】
ゲルの右側に隣接して、適正産物のサイズ、ならびにプライマー二量体およびプライマーオリゴマーであると推測されるサイズをマークした。図１０に示される結果は、ゲノムＤＮＡを加えて開始された反応において、試薬９−２２ＤＤの濃度を増加させると、プライマー二量体およびプライマーオリゴマーを含めた非特異的産物の出現を防止するように用量依存的様式で作用し、それによって適正産物の特異性および収量の両者が高まることを実証する。また増加濃度の試薬９−２２ＤＤは、ゲノムＤＮＡを含有しない反応においても、プライマー二量体およびプライマーオリゴマーの出現を防止する。
【実施例１１】
【０１１２】
実施例１１． 二重反応におけるプライマー二量体形成の防止
最終容量２５μＬ中の１００ゲノムのヒト胎盤ＤＮＡ（Sigma, St Louis, MO）の存在下または非存在下で、一連のＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅反応を準備した。この実験では、ＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅反応物は、１×ＰＣＲバッファー（Invitrogen, Carlsbad, CA）、３ｍＭのＭｇＣｌ２、０．２０ｍＭのｄＮＴＰから構成するものとした。サンプルごとに１．２５単位のＴａｑポリメラーゼを使用した。第一の増幅標的配列（産物１）は嚢胞性線維症遺伝子のエキソン１１の一部分であり、１００ｎＭの制限的プライマー：５’ ＧＡＣＧＴＴＴＡＣＡＧＣＧＡＡＴＧＣＴＴＧＣＴＡＧＡＣＣＡＡＴ ３’（配列番号４１）および２，０００ｎＭの過剰プライマー：５’ ＴＣＣＡＡＧＴＴＴＧＣＡＧＡＧＡＡＡＧＡＣＡＡＴ ３’（配列番号４２）を用いて増幅した。第二の増幅標的配列（産物２）は嚢胞性線維症遺伝子のエキソン１０の一部分であり、５０ｎＭの制限的プライマー：５’ ＣＡＧＴＴＴＴＣＣＴＧＧＡＴＴＡＴＧＣＣＴＧＧＣＡＣＣＡＴ ３’（配列番号４３）および１０００ｎＭの過剰プライマー：５’ ＧＣＴＴＴＧＡＴＧＡＣＧＣＴＴＣＴＧＴＡＴＣＴＡ ３’（配列番号４４）を用いて増幅した。
【０１１３】
ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（Applied Biosystems, CA）において、９５℃で２分間、次いで９５℃で１０秒間，５６℃で１５秒間，７０℃で２０秒間の２５サイクル、次いで９５℃で１０秒間，５６℃で１５秒間，７０℃で２０秒間，および４５℃で３０秒間（蛍光の取得を伴う）の５０サイクルで増幅を実行した。
【０１１４】
得られた増幅産物を、０．５×ＴＢＥバッファー中の３％アガロースゲルでの２時間のゲル電気泳動に付すことによって分析し、臭化エチジウムで染色した。結果を図１１に示す。レーン１〜６で分析された反応では、非ホットスタートＴａｑポリメラーゼを利用し、レーン７〜１２で分析された反応では、Ｔａｑポリメラーゼに加えてホットスタート抗体を利用した。レーン４〜６および１０〜１２で分析された反応では、１００ｎＭの試薬９−２２ＤＤを加えた。
【０１１５】
ゲルの右側に隣接して、産物１および産物２の一本鎖アンプリコン（ｓｓＤＮＡ）および二本鎖アンプリコン（ｄｓＤＮＡ）、ならびにプライマー二量体であると推測される短い産物を含めた増幅産物の特定についての解釈を付した。他の非特異的産物はアスタリスクでマークされる。非ホットスタートポリメラーゼを用い、本発明の試薬を用いない増幅（レーン１〜３）では、プライマー二量体および他の非特異的産物が生成された。ホットスタートポリメラーゼを用い、本発明の試薬を用いない増幅（レーン７〜９）では、概して、いくらか不純物が減少したが、依然としてミスプライミングの現象が示された。本発明に基づく試薬をホットスタート増幅に加えたレーン１０〜１２では、目的の産物のみが生成された。本発明の試薬を非ホットスタート増幅に加えたレーン４〜６では、プライマー二量体が排除され、３回の反復実験のうちの２回（レーン４およびレーン６）では、すべての他の非特異的産物も同様に排除されたが、１回の反復実験（レーン５）のみでは非特異的産物が出現した。図１１に示される結果は、非ホットスタートＴａｑポリメラーゼまたはホットスタートＴａｑポリメラーゼが使用された場合、低濃度（１００ｎＭ）の試薬９−２２ＤＤが、プライマー二量体の形成を防止するために十分であったこと、さらに、その低濃度の試薬９−２２ＤＤが、２ペアのプライマーを用いる２種の標的の増幅において非ホットスタートＴａｑポリメラーゼとともに使用された場合でさえ、ミスプライミングのすべての現象を防止するためにほぼ十分であったことを実証する。
【実施例１２】
【０１１６】
実施例１２． プライマー二量体形成の防止による二重リアルタイムＰＣＲおよびリアルタイムＰＣＲのキネティクスの最適化
マウスＯｃｔ４およびＸｉｓｔ遺伝子のエキソン内の配列（それぞれＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿０１３６３３およびＬ０４９６１）を同時に増幅するための二重リアルタイムＬＡＴＥ−ＰＣＲアッセイを設計した。各反応は最終容量５０μＬ中で実行し、以下の試薬を含有した：２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．４、および５０ｍＭのＫＣｌによって構成される１×ＰＣＲバッファー（Invitrogen, Carlsbad, CA）、３ｍＭのＭｇＣｌ２、０．４ｍＭの各ｄＮＴＰ、配列５’ ＴＧＧＣＴＧＧＡＣＡＣＣＴＧＧＣＴＴＣＡＧＡＣＴ ３’（配列番号４５）を有する５０ｎＭのＯｃｔ４制限的プライマー、配列５’ ＣＡＡＣＴＴＧＧＧＧＧＡＣＴＡＧＧＣ ３’（配列番号４６）を有する２μＭのＯｃｔ４過剰プライマー、配列５’ ＧＧＴＣＧＴＡＣＡＧＧＡＡＡＡＧＡＴＧＧＣＧＧＣＴＣＡＡ ３’（配列番号４７）を有する１００ｎＭのＸｉｓｔ制限的プライマー、配列５’ ＴＧＡＡＡＧＡＡＡＣＣＡＣＴＡＧＡＧＧＧＣＡ ３’（配列番号４８）を有する２μＭのＸｉｓｔ過剰プライマー、配列５’ ＴＥＴ−ＣＣＧ ＣＣＴ ＧＧＧ ＡＴＧ ＧＣＡ ＴＡＣ ＴＧＴ ＧＧＡ ＡＧＧ ＣＧＧ−Ｄａｂｃｙｌ ３’（配列番号４９）を有する１μＭの低ＴｍのＯｃｔ４分子ビーコンおよび２単位の抗体複合体化Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Invitrogen, Carlsbad, CA）。さらに化合物９−３ＤＤまたは化合物９−３ｂＤＤを、以下に指定される濃度でＰＣＲ混合物に加えた。本実施例では、Ｘｉｓｔアンプリコンを検出するための分子ビーコンを加えなかった。各アッセイは、ＰｕｒＡｍｐプロトコル（Hartshorn et al. (2005) BMC Biotechnol 5: 2を参照のこと）にしたがって、２．５μＬ容量中に細胞溶解および逆転写に必要な試薬をさらに含有した。この二重ＬＡＴＥ−ＰＣＲでは、前記試薬の最終濃度は以下の通りであった：２．５ｍＭのＴｒｉｓ酢酸，ｐＨ８．４、３．７５ｍＭの酢酸カリウムおよび０．４ｍＭの酢酸マグネシウム（希釈したｃＤＮＡ合成バッファー, ThermoScriptTM RT-PCR System, Invitrogen, Carlsbad, CA）、追加の５０μＭの各ｄＮＴＰ、０．１３ｍＭのイソチオシアン酸グアニジン、６．７μＭのβ−メルカプトエタノール、０．７μＭのクエン酸ナトリウム，ｐＨ７．０、０．７×１０−４％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のジメチルスルホキシドおよび０．２×１０−４％のサルコシル（sarcosyl）。
【０１１７】
さらにマウスゲノムＤＮＡ（Sigma, St Louis, MO）を各アッセイに加え、ＰＣＲ増幅用の鋳型を提供した。各試験管に加えるゲノム数は６ｐｇ／ゲノムサイズに基づいて算出した（Vendrely and Vendrely (1949) Experientia 5: 327-329を参照のこと）。
【０１１８】
ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（Applied Biosystems, CA）において増幅を実行した。その場合、９５℃で５分間の１サイクル；９５℃で１０秒間，６３℃で２０秒間，および７２℃で３０秒間の１５サイクル；および９５℃で１５秒間，５５℃で２５秒間，７２℃で３５秒間，および４５℃で３０秒間の４０サイクルから構成される熱プロファイルを用い、ＴＥＴチャネルにおいて４５℃で蛍光を取得した。
【０１１９】
ＰＣＲの終了時点で、増幅産物を、０．５×ＴＢＥバッファー中の３％アガロースゲルでの２時間のゲル電気泳動に付すことによって分析し、臭化エチジウムで染色した。２種の同時に増幅された遺伝子に関して、予測されたサイズの二本鎖および一本鎖産物がともに可視であった。このことは二重ＬＡＴＥ−ＰＣＲが有効であることを示す。
【０１２０】
図１２は、Ｏｃｔ４およびＸｉｓｔ遺伝子内の２種の非相同配列を増幅するための２組のプライマーを含有する上記二重ＬＡＴＥ−ＰＣＲのキネティクスに対する、試薬９−３ＤＤのステム組成を変化させることの効果を示す。該図は、ＴＥＴ−Ｏｃｔ４分子ビーコンとのハイブリダイゼーションを介してＯｃｔ４アンプリコンの蓄積によって生じる蛍光シグナルを示す。その結果は、分析された各ゲノム濃度（１０ゲノム、サークル１２２；１００ゲノム、サークル１２３；１０００ゲノム、サークル１２４）で、３００ｎＭの９−３ＤＤ（三角形付きの線）または同濃度のその修飾型である９−３ｂＤＤ（三角形が付いていない太線）の存在下でＣＴ値が非常に近いことを実証する。そうではなくむしろ、リアルタイム蛍光シグナルのキネティクスは試薬のステムの組成によって影響を受ける。化合物９−３ｂＤＤは、９−３ＤＤと比較して高いＴｍのステムを有し、ゆえに、プライマー二量体形成を最適に防止すると本発明者らは考え、その結果、すべての試験ゲノム濃度で非常に直線的で平行なシグナルが生じる。一方、低ストリンジェントの化合物９−３ＤＤの存在下では、蛍光シグナルの一部は急な勾配を有するが、他のものは反応の早期にプラトーに達し始め、それはプライマー二量体のランダムな形成を示す。種々の鋳型濃度で化合物９−３ＤＤを用いて生じるシグナルは、化合物９−３ｂＤＤ（改変型ステムを有する）の存在下で得られるシグナルより平行ではない。理想的には、完全に平行なシグナル（一定勾配を有する）を生じる直線的増幅が望ましく、エンドポイントタイプの解析に関しては特に妥当である。
【０１２１】
９−３ＤＤを含有するサンプルのアガロースゲル解析では、特に多数の鋳型数で可視の、プライマー二量体であろうバンドが示され、少数の鋳型数での非常に小さいバンドはプライマーと合致する。そのようなバンドは９−３ｂＤＤを含有するサンプルの分析では現れなかった。
【０１２２】
図１３は、本実施例に記載の、図１２に関しても使用された二重ＬＡＴＥ−ＰＣＲにおいて、試薬９−３ｂＤＤの濃度を変化させることの効果を示す。この場合、試薬９−３ｂＤＤの濃度を３００ｎＭ（三角形が付いていない太線）から２００ｎＭ（三角形付きの線）に低下させると、アガロースゲル解析によって確認されるように、やはり、プライマー二量体形成に起因して直線的増幅の勾配に影響する。結果として、少数の当初鋳型数（１０ゲノム、サークル１３２）を含有するサンプルの一部は、最後のサイクル（「エンドポイント」）で、多数の当初鋳型数（１００ゲノム、サークル１３３および１０００ゲノム、サークル１３４）を含有するサンプルより高い蛍光を有する。
【０１２３】
ＰＣＲ効率に対する、本出願に記載される試薬の濃度の効果を、１ペアのプライマーで１鋳型を増幅するＬＡＴＥ−ＰＣＲにおいてさらに試験した。増幅対象の鋳型は、図１２および図１３に関して記載された二重反応で使用されたのと同じマウスＯｃｔ４配列であり、プライマーおよび分子ビーコン配列も該反応と同一であった。
【０１２４】
各反応は最終容量１００μＬ中で実行し、以下の試薬を含有した：２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．４、および５０ｍＭのＫＣｌによって構成される１×ＰＣＲバッファー（Invitrogen, Carlsbad, CA）、３ｍＭのＭｇＣｌ２、０．２５ｍＭの各ｄＮＴＰ、５０ｎＭのＯｃｔ４制限的プライマー、２μＭのＯｃｔ４過剰プライマー、１μＭの低ＴｍのＴＥＴ−Ｏｃｔ４分子ビーコン、および２単位の抗体複合体化Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Invitrogen, Carlsbad, CA）。さらに化合物９−３ＤＤを、１５０、または３００または４５０ｎＭの濃度でＰＣＲ混合物に加えた。上述の二重反応の場合（図１２および図１３を参照のこと）と同様に、各アッセイは、ＰｕｒＡｍｐプロトコルにしたがって、１０．５μＬ容量中に細胞溶解および逆転写に必要な試薬をさらに含有した。このＬＡＴＥ−ＰＣＲでは、前記試薬の最終濃度は以下の通りであった：５ｍＭのＴｒｉｓ酢酸，ｐＨ８．４、７．５ｍＭの酢酸カリウムおよび０．８ｍＭの酢酸マグネシウム（希釈したｃＤＮＡ合成バッファー）、１ｎｇ／μＬのランダムヘキサマーおよび追加の１００μＭの各ｄＮＴＰ（ThermoScriptTM RT-PCR System, Invitrogen, Carlsbad, CAの全構成要素）、０．４ｍＭのイソチオシアン酸グアニジン、２０μＭのβ−メルカプトエタノール、２μＭのクエン酸ナトリウム，ｐＨ７．０、２×１０−４％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のジメチルスルホキシドおよび０．５×１０−４％のサルコシル。
【０１２５】
さらにマウスゲノムＤＮＡを各アッセイに加え、本実施例に記載の二重ＬＡＴＥ−ＰＣＲに関して指定される、ＰＣＲ増幅用の鋳型を提供した。ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒにおいて、二重反応に関して詳述されるプロファイルと同じ熱プロファイルを用いて、増幅を実行した。ＰＣＲの終了時点で、増幅産物を、０．５×ＴＢＥバッファー中の３％アガロースゲルでの２時間のゲル電気泳動に付すことによって分析し、臭化エチジウムで染色した。ゲル上では二本鎖および一本鎖産物がともに可視であり、予測されるサイズを有した。このことはＬＡＴＥ−ＰＣＲによる増幅が有効であることを示す。
【０１２６】
さらにＯｃｔ４鋳型の増幅効率に対する増加濃度の化合物９−３ＤＤの効果を試験した。１５０ｎＭ、３００ｎＭ、４５０ｎＭの９−３ＤＤの各試験濃度で実施された５ゲノム（９−３ＤＤの各試験濃度に関して２回の反復実験の平均）、２０ゲノム（９−３ＤＤの各試験濃度に関して２回の反復実験の平均）、１００ゲノム、および１０００ゲノムを含有するリアルタイムＰＣＲアッセイからＣＴ値を取得した。各濃度での各ＣＴ値のシリーズに関する直線回帰を図１４に示す。図１４では、三角は４５０ｎＭの濃度であり、白抜きの四角は３００ｎＭであり、黒い四角は１５０ｎＭである。このプロットからすぐにわかることは、４５０ｎＭの９−３ＤＤが閾値を超える蛍光シグナルの出現を大きく遅延させ、さらにＰＣＲ増幅の用量依存性を変更することである（回帰直線から離れている１０遺伝子コピーおよび４０遺伝子コピーの点を参照のこと）。一方、１５０ｎＭまたは３００ｎＭの９−３ＤＤを使用して得られたＣＴ値は非常に類似し、鋳型コピー数および蛍光シグナルの最初の出現の間の直線的関連性を実証する。
【０１２７】
しかし、蛍光のリアルタイムパターンの分析では、図１５に示されるように２つの条件（濃度）間の差異が強調される。１００ゲノム、サークル１５１、または１０００ゲノム、サークル１５２によって作成される曲線の勾配は、３００ｎＭの９−３ＤＤが使用された場合（三角形が付いていない太線）に、１５０ｎＭの９−３ＤＤ（三角形付きの線）が使用された場合より急勾配であり、よりストリンジェントな３００ｎＭの条件がプライマー二量体を排除し、ゆえに増幅効率を高めることが示唆される。
【実施例１３】
【０１２８】
実施例１３． 本発明に基づく複数の試薬の使用
ヒトゲノムＤＮＡ出発材料の５種の異なる標的配列を個別に増幅するために、および多重反応においてすべての５配列を一緒に増幅するために、ＬＡＴＥ−ＰＣＲ反応混合物を調製した。各標的配列はその独自のペアの制限的および過剰プライマーを必要とした。前記標的配列は、（１）１９１塩基対のグロビン対立遺伝子、（２）３１２塩基対のテイ・サックスＧ２６９対立遺伝子、（３）４５２塩基対のテイ・サックス１２７８および１４２１対立遺伝子、（４）ミトコンドリア超可変領域１の５４９塩基対セグメント、および（５）ｐ５３遺伝子エキソン７および８を含む６１１塩基対セグメントであった。２５μＬの反応混合物は、１×ＰＣＲバッファー（Invitrogen）、０．４ｍＭのｄＮＴＰ、３ｍＭのＭｇ＋＋、０．２４×ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎおよび１．５単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Invitrogen）を含有した。制限的プライマーに関しては５０ｎＭおよび過剰プライマーに関しては１０００ｎＭの濃度でプライマーを加えた。すべての５ペアのプライマーを多重反応に加えた。熱サイクル処理は、９５℃で１０秒間，６４℃で２０秒間，および７２℃で１分間の４５サイクルであった。
【０１２９】
個別のプライマーペアおよび個別の標的を含む反応混合物、ならびにすべての５ペアのプライマーおよびすべての５種の標的を含む反応混合物を、２５ｎＭの化合物９−２２ＤＤおよび１００ｎＭの化合物１２−３ＤＤの組み合わせの存在下で増幅した。さらに、本発明に基づくいかなる試薬をも加えずに五重反応混合物を増幅した。反応産物をゲル電気泳動によって調べた。種々の増幅のゲル電気泳動の結果を図１６に示す。図１６は、レーンｒにサイズマーカー（１００塩基対ずつ異なるサイズ）を含む。中央のレーンｇ〜ｋはそれぞれ標的配列（１）〜（５）の個別の増幅の産物である。レーンｌ〜ｑは、化合物９−２２ＤＤおよび化合物１２−３ＤＤの混合物を加えた６回反復の五重増幅の産物である。レーンａ〜ｆは、本発明の試薬を加えなかった６回反復の五重増幅の産物である。図１６は、いずれの化合物も加えない多重反応と比較して、化合物の混合物が増幅を増強した（より多量で純粋な所望のアンプリコンが得られた）ことを示し、本発明のキット、増幅およびアッセイにおいて試薬の混合物を使用しうることを実証する。
【実施例１４】
【０１３０】
実施例１４． 作用様式の試験
本発明者らは、本発明の試薬のミスプライミングの低減（特異性改善）およびポリメラーゼ阻害効果を定量的に研究する試験を考案した。該試験は第１の作用様式と第３の作用様式を識別すると考えられる。該試験は、実施例１に記載のアッセイと本質的に同様のＰＣＲ増幅アッセイであるが、以下の例外を有する：増幅反応混合物は半数（１０００ゲノム）の剪断ゲノムＤＮＡを含有し、熱サイクル処理の最終部分は７０サイクルから４０サイクルに減少される。種々の量、典型的には２５ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、３００ｎＭ、１５００ｎＭおよび３０００ｎＭの本発明の試薬を加えて増幅を実施する。試験は２種の分析を含む：第一は、特異性に関する、増幅産物の融解曲線の分析であり；第二は、阻害に関する、合成二本鎖産物のリアルタイム蛍光曲線の分析である。
【０１３１】
図１７〜１８は、本発明に基づく２種の試薬（それぞれ化合物１２−３ＤＤおよび化合物１２−Ｃ３ＤＤ）に関する分析結果の一部分を示す。各図のカラムＩは、表示通りの数種の選択された濃度の試薬に関する融解曲線を示す。各図のカラムＩＩは、表示通りの同濃度に関するリアルタイム蛍光曲線を示す。図１７では、カラムＩの融解曲線は、化合物１２−３ＤＤが１００ｎＭ以上の濃度で高い特異性（ミスプライミングの回避）を達成したことを示した（最低濃度１００ｎＭは、実施例１に記載の反応に関して見出された最低濃度よりわずかに高い）。図１７では、カラムＩＩのリアルタイム蛍光曲線は、化合物１２−３ＤＤの濃度が１００ｎＭを超えて増加するにつれて、１０００ｎＭを超える濃度で反応が本質的に停止されるまで、ポリメラーゼ阻害が進行的に増大したことを示した。阻害は、プラトーの蛍光レベル、およびＣＴ値の遅延（１００ｎＭでは１９．６、３００ｎＭでは２１．１、１５００ｎＭおよび３０００ｎＭでは存在せず、すなわち少なくとも４０）によって示される、生成二本鎖産物（群）全体（所望の特異的産物およびミスプライミングの非特異的産物を含む）の量が少ないことに反映される。図１８では、カラムＩの融解曲線は、化合物１２−３ＤＤが３００ｎＭ以上の濃度で高い特異性を達成したことを示した（最低濃度３００ｎＭは、実施例１に記載の反応に関して見出された最低濃度と同一である）。図１８では、カラムＩＩのリアルタイム蛍光曲線は、化合物１２−Ｃ３ＤＤの濃度が３００ｎＭを超えて増加するにつれて、ポリメラーゼ阻害が進行的に増大した（ＣＴ値は１００ｎＭでは１８．８、３００ｎＭでは１８．８、１５００ｎＭでは２１．１および３０００ｎＭでは２４．５であった）が、該反応は３０００ｎＭの濃度でさえ停止されなかったことを示した。
【０１３２】
図１７と図１８を比較すると、化合物１２−Ｃ３ＤＤの総合的な性能では、化合物１２−３ＤＤの総合的な性能より濃度依存性の程度が低いことがわかる。ゆえに、この特定の増幅反応では、化合物１２−Ｃ３ＤＤの濃度が３００ｎＭから１５００ｎＭになると生じるＣＴ遅延およびプラトー蛍光の減少は、化合物１２−３ＤＤの濃度が１００ｎＭから３００ｎＭになると生じる結果とおおむね同一である。
【０１３３】
本発明の多数の実施形態を記載してきた。しかしながら、本発明の精神および範囲から逸脱することなく種々の修飾を施してよいことが理解されよう。したがって、他の実施形態は特許請求の範囲内である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種の増幅ＤＮＡ産物を生成するためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅において、２５μＬの反応混合物あたり１．２５単位の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含有するＰＣＲ増幅混合物に６５０ｎＭ以下の濃度で添加した場合に、少なくとも１種のミスプライミング現象を防ぐことができる試薬であって、該試薬は伸長不可能なオリゴヌクレオチドであり、該オリゴヌクレオチドはステムループ構造を有し、前記少なくとも１種の増幅ＤＮＡ産物に対するハイブリダイゼーションプローブでなく、６ヌクレオチド長より長いステムを有し、該ループの反対側のステムの末端は安定化されており、かつ計算上のステムの融解温度（Ｔｍ）が９４℃より低い、上記試薬。
【請求項２】
前記ループが少なくとも３個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の試薬。
【請求項３】
前記ループが非ヌクレオチド化学リンカーである、請求項１に記載の試薬。
【請求項４】
前記ステムが、該ステムの３’および５’ヌクレオチドに共有結合した結合性化学部分により末端で安定化されている、請求項１〜３のいずれか１項に記載の試薬。
【請求項５】
前記結合性化学部分がいずれも蛍光性でない、請求項４に記載の試薬。
【請求項６】
Ｔｍ値より低い温度では二本鎖となる前記ステムの一部分が、９〜１２塩基対の長さを有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の試薬。
【請求項７】
前記計算上のステムの融解温度が７２〜８５℃の範囲内である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の試薬。
【請求項８】
前記計算上のステムの融解温度が５０〜７１℃の範囲内である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の試薬。
【請求項９】
デオキシヌクレオチドリン酸（ｄＮＴＰ）および熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含有する増幅反応混合物から少なくとも１種の増幅ＤＮＡ産物を生成するためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅での少なくとも１種のミスプライミング現象を防ぐ方法であって、該反応混合物に請求項１〜８のいずれか１項に記載の少なくとも１種の試薬を添加することを含む、上記方法。
【請求項１０】
前記試薬がオリゴヌクレオチドループを有し、該試薬の濃度が３００ｎＭ以下である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記試薬が非ヌクレオチド化学リンカーであるループを有し、かつ該試薬を前記反応混合物に１０００ｎＭ以下の濃度で添加する、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記増幅が、前記Ｔｍより低い温度で行われる低温検出ステップを含む直線後指数的ＰＣＲ（ＬＡＴＥ−ＰＣＲ）アッセイである、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記増幅が対称的ＰＣＲアッセイである、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記増幅に続いてエンドポイント検出を行う、請求項９〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を行うための試薬キットであって、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも１ペアのＰＣＲプライマー、ｄＮＴＰ、および請求項１〜８のいずれか１項に記載の少なくとも１種の試薬を含んでなる、上記キット。
【請求項１６】
核酸単離のための試薬をさらに含んでなる、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を行うためのオリゴヌクレオチドセットであって、少なくとも１ペアのＰＣＲプライマーおよび請求項１〜８のいずれか１項に記載の少なくとも１種の試薬を含んでなる、上記セット。
【請求項１８】
前記少なくとも１ペアのＰＣＲプライマーにより規定される増幅産物にハイブリダイズする少なくとも１種の蛍光標識プローブをさらに含有する、請求項１７に記載のセット。
【請求項１９】
前記少なくとも１ペアのプライマーが、直線後指数的ＰＣＲ（ＬＡＴＥ−ＰＣＲ）増幅を行うのに適した比率で制限的プライマーと過剰プライマーとを含む、請求項１７または１８に記載のセット。
【請求項２０】
前記増幅産物が一本鎖である、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載のセット。
【請求項１】
少なくとも１種の増幅ＤＮＡ産物を生成するためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅において、２５μＬの反応混合物あたり１．２５単位の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含有するＰＣＲ増幅混合物に６５０ｎＭ以下の濃度で添加した場合に、少なくとも１種のミスプライミング現象を防ぐことができる試薬であって、該試薬は伸長不可能なオリゴヌクレオチドであり、該オリゴヌクレオチドはステムループ構造を有し、前記少なくとも１種の増幅ＤＮＡ産物に対するハイブリダイゼーションプローブでなく、６ヌクレオチド長より長いステムを有し、該ループの反対側のステムの末端は安定化されており、かつ計算上のステムの融解温度（Ｔｍ）が９４℃より低い、上記試薬。
【請求項２】
前記ループが少なくとも３個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の試薬。
【請求項３】
前記ループが非ヌクレオチド化学リンカーである、請求項１に記載の試薬。
【請求項４】
前記ステムが、該ステムの３’および５’ヌクレオチドに共有結合した結合性化学部分により末端で安定化されている、請求項１〜３のいずれか１項に記載の試薬。
【請求項５】
前記結合性化学部分がいずれも蛍光性でない、請求項４に記載の試薬。
【請求項６】
Ｔｍ値より低い温度では二本鎖となる前記ステムの一部分が、９〜１２塩基対の長さを有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の試薬。
【請求項７】
前記計算上のステムの融解温度が７２〜８５℃の範囲内である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の試薬。
【請求項８】
前記計算上のステムの融解温度が５０〜７１℃の範囲内である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の試薬。
【請求項９】
デオキシヌクレオチドリン酸（ｄＮＴＰ）および熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含有する増幅反応混合物から少なくとも１種の増幅ＤＮＡ産物を生成するためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅での少なくとも１種のミスプライミング現象を防ぐ方法であって、該反応混合物に請求項１〜８のいずれか１項に記載の少なくとも１種の試薬を添加することを含む、上記方法。
【請求項１０】
前記試薬がオリゴヌクレオチドループを有し、該試薬の濃度が３００ｎＭ以下である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記試薬が非ヌクレオチド化学リンカーであるループを有し、かつ該試薬を前記反応混合物に１０００ｎＭ以下の濃度で添加する、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記増幅が、前記Ｔｍより低い温度で行われる低温検出ステップを含む直線後指数的ＰＣＲ（ＬＡＴＥ−ＰＣＲ）アッセイである、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記増幅が対称的ＰＣＲアッセイである、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記増幅に続いてエンドポイント検出を行う、請求項９〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を行うための試薬キットであって、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも１ペアのＰＣＲプライマー、ｄＮＴＰ、および請求項１〜８のいずれか１項に記載の少なくとも１種の試薬を含んでなる、上記キット。
【請求項１６】
核酸単離のための試薬をさらに含んでなる、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を行うためのオリゴヌクレオチドセットであって、少なくとも１ペアのＰＣＲプライマーおよび請求項１〜８のいずれか１項に記載の少なくとも１種の試薬を含んでなる、上記セット。
【請求項１８】
前記少なくとも１ペアのＰＣＲプライマーにより規定される増幅産物にハイブリダイズする少なくとも１種の蛍光標識プローブをさらに含有する、請求項１７に記載のセット。
【請求項１９】
前記少なくとも１ペアのプライマーが、直線後指数的ＰＣＲ（ＬＡＴＥ−ＰＣＲ）増幅を行うのに適した比率で制限的プライマーと過剰プライマーとを含む、請求項１７または１８に記載のセット。
【請求項２０】
前記増幅産物が一本鎖である、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載のセット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【公開番号】特開２０１３−６３０７０（Ｐ２０１３−６３０７０Ａ）
【公開日】平成２５年４月１１日（２０１３．４．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−２３４６８３（Ｐ２０１２−２３４６８３）
【出願日】平成２４年１０月２４日（２０１２．１０．２４）
【分割の表示】特願２００７−５３７０３５（Ｐ２００７−５３７０３５）の分割
【原出願日】平成１７年１０月１７日（２００５．１０．１７）
【出願人】（５０４２３８０５７）ブランデイズ ユニバーシティー (4)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年４月１１日（２０１３．４．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年１０月２４日（２０１２．１０．２４）
【分割の表示】特願２００７−５３７０３５（Ｐ２００７−５３７０３５）の分割
【原出願日】平成１７年１０月１７日（２００５．１０．１７）
【出願人】（５０４２３８０５７）ブランデイズ ユニバーシティー (4)
【Ｆターム（参考）】
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