ＰＤ−１欠損マウスおよびその用途
【構成】プログラムドセルデス−１受容体（ＰＤ−１）を欠損したＢＡＬＢ／ｃ系マウス、そのマウスを用いる自己免疫疾患治療剤のスクリーニング方法、そのマウスが特異的に産生するＩｇＧ自己反応性抗体、その抗体に特異的に反応する心臓が産生する蛋白、およびその蛋白を用いる拡張型心筋症の診断方法に関する。
【効果】ＰＤ−１を欠損したＢＡＬＢ／ｃ系マウスは、自己免疫疾患、特に拡張型心筋症を自然発症するため、これらの疾患の治療剤をスクリーニングするために有用である。
【効果】ＰＤ−１を欠損したＢＡＬＢ／ｃ系マウスは、自己免疫疾患、特に拡張型心筋症を自然発症するため、これらの疾患の治療剤をスクリーニングするために有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プログラムドセルデス−１受容体（以下、ＰＤ−１と略する。）を欠損したＢＡＬＢ／ｃ系マウスおよびその用途に関する。さらに詳しく言えば、ＰＤ−１を欠損したＢＡＬＢ／ｃ系マウス、そのマウスを用いる自己免疫疾患治療剤のスクリーニング方法、そのマウスが特異的に産生するＩｇＧ自己反応性抗体、その抗体に特異的に反応する心臓が産生する蛋白、およびその蛋白を用いる拡張型心筋症の診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発生学的に、また生理学的にコントロールされた細胞の死は種々の動物のほとんどあらゆる組織で観察することができる。その様な細胞の死は一般的に「プログラムされた細胞死」または「計画的細胞死」と呼ばれ、病理学的メカニズムによって「偶然に起こる細胞死」とは区別されている。
【０００３】
ＰＤ−１は、細胞が活性化を経て計画的細胞死に至る過程に関わる受容体として、マウスでまず見出された（The EMBO J., vol.11(11), 3887-3895(1992)：非特許文献１、特開平５−３３６９７３号公報：特許文献１、EMBL/GenBank/DDJB Acc. No.X67914：非特許文献２）。ついで、マウスＰＤ−１をプローブとして用いることにより、ヒトでも見出された（Genomics 23:704 (1994)：非特許文献３、特開平７−２９１９９６号公報：特許文献２）。ＰＤ−１はリンパ球で活性化に伴い発現され、ＰＤ−１欠損マウスの研究（International Immunology, Vol.10(10), 1563-1572(1998)：非特許文献４、Immunity. Vol.11, 141-151(1999)：非特許文献５）より自己免疫疾患と深く係わるところから、免疫機能の低下または亢進、感染症、移植時の拒絶反応、腫瘍等の治療や診断に用いられることが示唆される。
【０００４】
マウスＰＤ−１もヒトＰＤ−１も２８８個のアミノ酸からなり、Ｎ末端のシグナルペプチド（２０アミノ酸）と中間部位の細胞膜貫通領域に疎水性領域を有する５５ｋＤａのＩ型膜結合型蛋白である。
【０００５】
欠損マウス（ノックアウトマウスとも言われる。）とは、人為的に特定の遺伝子を修飾されたことによって、生まれながらにその遺伝子産物を産生できないマウスを指し、その遺伝子産物である因子・受容体等の役割を調べるために作製されるものである。
【０００６】
一方、拡張型心筋症とは、左室の拡張を伴った左心室の収縮機能不全を指す。拡張型心筋症と見做される患者のうち３０％は、細胞内の細胞骨格を細胞間マトリックスへ連結している心筋の重要成分に対する構造遺伝子の先天的な変異によるとされているが、残りの症例は原因不明のままである。どちらの場合も、疾患は進行性で生命を脅かすものであり、現時点では心臓移植以外有効な治療法はない。
【０００７】
ＰＤ−１欠損マウスは、最初にＣ５７ＢＬ／６（以下、Ｂ６と省略する。）マウスで作成された。ＰＤ−１を欠損したＣ５７ＢＬ／６マウスは、ループス様腎炎および関節炎等の所謂自己免疫疾患を自然発症することが確認された（International Immunology, Vol.10(10), 1563-1572(1998)：非特許文献４、Immunity. Vol.11, 141-151(1999)：非特許文献５）。
しかしながら、他の系統のマウスでＰＤ−１を欠損させた場合については、その遺伝背景の違いがＰＤ−１を欠損に対してどのような影響を及ぼすか全く知られていない。
【０００８】
【特許文献１】特開平５−３３６９７３号公報
【特許文献２】特開平７−２９１９９６号公報
【非特許文献１】The EMBO J., vol.11(11), 3887-3895(1992)
【非特許文献２】EMBL/GenBank/DDJB Acc. No.X67914
【非特許文献３】Genomics 23:704 (1994)
【非特許文献４】International Immunology, Vol.10(10), 1563-1572(1998)
【非特許文献５】Immunity. Vol.11, 141-151(1999)
【発明の開示】
【０００９】
本発明は、
１．ＰＤ−１受容体を欠損したＢＡＬＢ／ｃ系マウス、
２．前項１に記載のマウスを用いることを特徴とする自己免疫疾患治療剤のスクリーニング方法、
３．自己抗体を産生することによる自己免疫疾患に対する前項２記載のスクリーニング方法、
４．免疫疾患が、拡張型心筋症である前項２記載のスクリーニング方法、
５．前項１記載のマウスが特異的に産生するＩｇＧ自己反応性抗体、
６．前項５記載のＩｇＧ自己反応性抗体に特異的に反応し、心臓で特異的に産生される約３３ｋＤａ（３３ｋＤａ±５ｋＤａ）の蛋白、
７．前項６記載の蛋白を用いることを特徴とする拡張型心筋症の診断方法、
８．前項７記載の蛋白をコードする遺伝子を検出することを特徴とする拡張型心筋症の（遺伝子）診断方法に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
［本発明マウスの特徴］
ＰＤ−１を欠損したＢＡＬＢ／ｃ系マウス（ＰＤ−１（−/−）と表記する。）は、生後５週齢目から死亡し始め、３０週齢までには、その２／３が死亡する。正常なＢＡＬＢ／ｃマウス（ＰＤ−１（＋／＋）と表記する。）には、その様な兆候は見られない。また、ＰＤ−１を欠失したＣ５７ＢＬ／６（Ｂ６−ＰＤ−１（−／−）と表記する。）には、ループス様腎炎および関節炎の発症は見られたが、初期段階の死亡は見られなかった。
【００１１】
本発明ＰＤ−１（−／−）マウスは、後述する剖検の結果、超音波検査による心機能の評価、電子顕微鏡での観察、免疫応答等の事実から、拡張型心筋症を自然発症し、死亡するものと判断された。
ＩｇＧ１サブクラスの自己免疫抗体を産生し、この抗体が心臓で特異的に産生される約３３ｋＤａの蛋白に結合して集積するため、自己免疫疾患型の拡張型心筋症を引き起こしたものと考えられる。
【００１２】
加齢Ｃ５７ＢＬ／６−ＰＤ−１（−／−）マウスはループス性糸球体腎炎及び関節炎に罹り易いが、心臓疾患はない事実を加味すると、ＰＤ−１の機能不全は自己免疫疾患の潜在的な素因となり、その素因と遺伝的背景の組み合わせによって様々な型の疾患を招き得ることを示している。
この様に、拡張型心筋症の原因が、心筋を標的とした内因性の調節障害による自己免疫疾患であるという可能性、すなわちこれまで証明されていない可能性が示唆された。
【００１３】
１．本発明マウスの取得方法：
ＰＤ−１受容体を欠損した本発明のＢＡＬＢ／ｃ系マウスは、
（１）ＰＤ−１を欠損したＣ５７ＢＬ／６（Ｂ６）系マウスを少なくとも１０世代以上、ＢＡＬＢ／ｃ系マウスに戻し交配するか、または、
（２）ＢＡＬＢ／ｃ系マウスの胚芽基幹（ＥＳ）細胞株から、International Immunology. Vol.10(10), 1563-1572(1998)記載の方法により、作製することができる。
【００１４】
例えば、ＰＤ−１遺伝子の含んだ染色体断片（但し、そのエクソンの一部を欠失したもの、例えばエクソン２‐５のみを含む断片）を挿入した標的ベクターを、ＢＡＬＢ／ｃ系マウスのＥＳ細胞株に導入し、染色体上のＰＤ−１遺伝子の位置に標的ベクターが相同性組替えを起こしたＥＳ細胞クローンを選抜することができる。このＰＤ−１遺伝子が欠失したＥＳ細胞からＢＡＬＢ／ｃ系キメラマウスを作製し、ジャームラインにこの欠失をトランスミットしたキメラマウスを親としてＢＡＬＢ／ｃ系ＰＤ−１欠損マウスを作製することができる。
【００１５】
２．スクリーニング：
本発明のＢＡＬＢ／ｃ系ＰＤ−１欠損マウスを用いて、自己免疫疾患、特に拡張型心筋症の治療薬をスクリーニングすることができる。また、自己抗体を産生することにより発症する自己免疫疾患の治療薬のスクリーニングにも使用できる。
本発明のＢＡＬＢ／ｃ系ＰＤ−１欠損マウスは、拡張型心筋症を発症して死亡する。本ＰＤ−１欠損マウスに薬剤を投与した後、生存・延命を指標に評価すれば、簡単にスクリーニングを行なうことができる。あるいは、本ＰＤ−１欠損マウスが産生する自己抗体量を指標にすることによっても、より効率良く治療薬のスクリーニングを行うことが可能である。
【００１６】
３．本発明のＢＡＬＢ／ｃ系ＰＤ−１欠損マウスが産生するＩｇＧ抗体とその抗体が認識する心臓で特異的に発現する約３３ｋＤａ（３３ｋＤａ±５ｋＤａ）の蛋白：
加齢により拡張型心筋症を発症した本ＰＤ−１欠損マウスは、その血液中に心臓特異的ＩｇＧ抗体が確認され、その心臓にはＩｇＧ抗体が沈着していることが確認される。本ＩｇＧ抗体は、心臓に発現される分子量約３３ｋＤａの蛋白を特異的に認識する。本ＰＤ−１欠損マウスでもまだ拡張型心筋症を発症していないマウスでは、このＩｇＧ抗体の産生は確認できるが、量的には十倍以上低い程度であった。
【００１７】
野生型のＢＡＬＢ／ｃ系マウス、更にＢ６系ＰＤ−１欠損マウスでも本ＩｇＧ抗体の産生は確認されない。従って、本ＩｇＧ抗体は、本ＢＡＬＢ／ｃ系ＰＤ−１欠損マウスの拡張型心筋症の発症に深く係わっていることは明らかである。また、拡張型心筋症に深く係わる本ＩｇＧ抗体は、Ｂ６系ＰＤ−１欠損マウスで確認されないことから、ＢＡＬＢ／ｃ系という特異的な遺伝背景の下で産生されるものと考えられる。また、Ｂ６系ＰＤ−１欠損マウスでは、所謂自己免疫疾患である関節炎・腎炎を発症することから、ＰＤ−１の機能不全は自己免疫疾患の潜在的な素因となり、その素因と遺伝的背景の組み合わせによって様々な型の疾患を招きうることを示している。
【実施例】
【００１８】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を制限するものではない。
【００１９】
実施例１：ＢＡＬＢ／ｃ系ＰＤ−１欠損マウスの作成
ＢＡＬＢ／ｃ系マウスの胚芽基幹（ＥＳ）細胞株から、International Immunology. Vol.10(10), 1563-1572(1998)記載の方法により、作製したＣ５７ＢＬ／６系ＰＤ−１欠損マウスを、ＢＡＬＢ／ｃ系マウスに１０世代戻し交配し、表記ＢＡＬＢ／ｃ系ＰＤ−１欠損マウスを得た。得られたマウスは、無菌の施設で飼育した。
【００２０】
実施例２：ＢＡＬＢ／ｃ系ＰＤ−１欠損マウスの死亡原因
実施例１で得たＢＡＬＢ／ｃ系ＰＤ−１欠損（ＰＤ−１（−／−））マウスを飼育すると、図１中、黒丸に示すように生後５週齢から死亡し始めた。３０週齢までには２／３が死亡した。それに対し、ＰＤ−１の欠損のない正常ＢＡＬＢ／ｃ系（ＰＤ−１（＋／＋））マウス（図１中白抜きの四角）では死亡例が認められなかった。Ｂ６ＰＤ−１欠損（ＰＤ−１（＋／−））マウスの飼育の結果と共にまとめて図１に示す。
ＰＤ−１（−／−）マウスは、死の数日前に眼球の突出を示し、剖検の結果、すべて異常に心臓が肥大していた。また、肝腫脹を示し、このことは死因が鬱血性心不全であったことを示唆していた。
【００２１】
実施例３：組織学的検討
死亡したＢＡＬＢ／ｃ系ＰＤ−１欠損マウスの組織学的な検討を行なった。ＰＤ−１（−／−）マウスの右心室壁は正常マウスより薄く、両心室は直径がおよそ２倍に肥大していた。
瘢痕形成を伴った細胞充実性で、間質性の線維症を含む散発的な線維性の反応があったが、肉眼では心室壁は正常に見えた。電子顕微鏡による検観では、心室壁全体に乱れて崩壊した筋フィラメントと不規則な形状のミトコンドリアを伴う心筋細胞の変性が散在していた。大多数のマウスの心房では、様々な大きさの、多くは巨大な、鬱血によると思われる血栓が認められた。
【００２２】
実施例４：超音波心電検査
生存状態で心機能評価のために、ＰＤ−１（−／−）マウスおよび正常（ＰＤ−１（＋／＋））について経胸壁超音波心臓図検査を行った。結果を図２（Ａ）（ＬＶＤｄ：左心室拡張期寸法）、（Ｂ）（ＬＶＤＳ：左心室収縮期末期寸法）および（Ｃ）（心室分画短縮率％）に示す。ＰＤ−１（−／−）マウスの心室腔は、特に右心室で大きく肥大し、その壁の厚さはＰＤ−１（＋／＋）マウスのそれに比べて顕著に減少していた。左心室と心室中隔の動きはＰＤ−１（−／−）マウスでは拡張期（ＬＶＤｄ）及び収縮期（ＬＶＤＳ）共に低下し（Ｍモード）、収縮機能の指標である、心室分画短縮は、71.9％（ＰＤ−１（＋／＋））から14.9％（ＰＤ−１（−／−））へと大きく低下した。
この事実は、ＰＤ−１（−／−）マウスの心臓のポンプ機能が、肥大により冒されていることを示し、拡張型心筋症という診断を裏付けた。
【００２３】
実施例５：免疫解析
ＢＡＬＢ／ｃ−Ｒａｇ−２（−／−）背景でのＰＤ−１（−／−）マウスは完全に健康だったので、ＢＡＬＢ／ｃＰＤ−１（−／−）マウスにおける心疾患の発生は、免疫応答性の細胞の機能によるものと考えられたため、心臓に特異的な免疫反応の徴候を探した。
免疫蛍光法による解析の結果、ＰＤ−１（−／−）マウスの心臓では心筋細胞を取り囲んで、ＩｇＧの線状の沈着がＣ３補体と共に見られ、ＰＤ−１（＋／＋）マウスの心臓ではそのようなＩｇＧの沈着は検出されなかった。
心臓壁全体にＩｇＧの沈着はびまん性に認められた。ＩｇＧの線状の染色パターンは、組織特異的な自己抗体の結合であることを意味していた。他の臓器では、ＩｇＧの沈着はほとんど検出されなかった。沈着したＩｇＧのアイソタイプはほとんどＩｇＧ１であった。
【００２４】
実施例６：自己免疫反応
心臓に対する特異的な自己免疫反応を確認するため、心臓組織に対する自己抗体の存在の可能性を検討するためにＢＡＬＢ／ｃ（ｎ＝４）、心臓の肥大したＢＡＬＢ／ｃ−ＰＤ−１（＋／−）（ｎ＝９）、発症していないＢＡＬＢ／ｃ−ＰＤ−１（−／−）（ｎ＝６）、Ｂ６（ｎ＝２）、およびＢ６−ＰＤ−１（−／−）（ｎ＝５）の各マウスの血清を用いて、正常な心臓抽出物に対するＩｇＧ自己抗体を調べた。
【００２５】
すなわち、溶解緩衝液（１５０ｍＭの塩化ナトリウム、２５ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ7.4）、５ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＮＰ４０（プロテアーゼ阻害剤））中でポリトロン・ホモジナイザーにて正常心臓の抽出物を調製した。溶解物を12.5％のＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動を行い、フィルター上に移し、希釈した血清と共にインキュベートして、ビオチン化抗マウスＩｇＧ及びストレプトアビジン―セイヨウワサビペルオキシダーゼにて検出した（なお、血清は３０〜３００倍に連続希釈した）。結果を図３に示す。
病気のＰＤ−１（−／−）マウスの血清はすべて３００倍希釈で、ほとんどは1000倍希釈でも３３ｋＤａのタンパク質に対する自己抗体を示したが、ＰＤ−１（＋／＋）マウスの血清は３０倍希釈でもそのような自己抗体を示さなかった。
【００２６】
肉眼的に正常なＰＤ−１（−／−）マウス及び大半のＰＤ−１（＋／−）マウスでは、自己抗体は３０倍希釈では検出できたが、３００倍希釈以上では検出できなかった。7.5％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて同様の分析を行い、高い分子量の範囲について調べたが、バックグランド以上のシグナルは検出されなかった。
【００２７】
図３に示されるように、９匹のＰＤ−１（−／−）マウスから得た血清すべてから、３００倍以上の希釈倍率でも、正常な心臓抽出物の中の３３ｋＤａのタンパク質と反応する力価の高いＩｇＧが検出された。
【００２８】
図４に週令の一致したＢＡＬＢ／ｃ及びＢＡＬＢ／ｃ−ＰＤ−１（−／−）マウスの血清の心臓、肝臓、腎臓及び骨格筋の組織抽出物に対する図３と同様な免疫反応性の結果を示す。週令の一致したＰＤ−１（＋／＋）マウスの血清からは、３０倍の希釈倍率でも自己抗体は全く検出されなかった（４匹中０匹）。
【００２９】
剖検で肉眼的に心肥大を示さなかったＰＤ−１（−／−）マウスの血清は、同じ３００倍希釈倍率では３３ｋＤａのタンパク質との十分な反応は示さなかった（６匹中０匹）。Ｂ６またはＢ６ＰＤ−１（−／−）も反応は示さなかった。
しかし、前者は濃度を高くすれば反応を示した。従って、３３ｋＤａのタンパク質に対する高い力価のＩｇＧ自己抗体の存在は、拡張型心筋症の臨床的な徴候と完全に相関した。３３ｋＤａのタンパク質は、ＢＡＬＢ／ｃＰＤ−１（−／−）由来の同じ血清によっては、肝臓、腎臓又は骨格筋のようなその他の組織で検出されなかったので、３３ｋＤａの自己抗原は、心臓組織特異的であると思われた。
【００３０】
抗ｄｓＤＮＡを含む他の自己抗体はＰＤ−１（−／−）マウスの血清からは検出されなかった。自己抗体は、病気に冒されたすべてのＰＤ−１（−／−）マウスでは、ほとんどＩｇＧ１クラスであり（７匹中７匹）、心臓の免疫染色解析の結果を裏付けた（図５：ＰＤ−１（−／−）マウスにおける心臓の３３ｋＤａ抗原を認識する血清自己抗体のアイソタイプ参照）。
【００３１】
実施例７
正常な心臓抽出物に対して、同じＰＤ−１（−／−）マウスの血清と共に溶離物の免疫反応性を調べるために、プロテインＧビーズによって、組織抽出物を免疫沈降し、正常ＢＡＬＢ／ｃ及び病気に冒されたＰＤ−１（−／−）マウスの心臓に沈着したＩｇＧを酸性抽出によって回収し、直接その反応性を検討した。図６に示すように、ＰＤ−１（−／−）マウスからの溶離物には野生型ＢＡＬＢ／ｃマウスに比べてはるかに大量のＩｇＧが含まれていた。溶離したＩｇＧは、病気のＰＤ−１（−／−）マウスの血清によって検出されたものと明らかに同一の特異的な３３ｋＤａタンパク質と反応した。この結果は、病気のマウスでは、循環している自己抗体が心臓組織に特異的に結合することを示していた。
【００３２】
実施例８：ＢＡＬＢ／ｃＲａｇ−２（−／−）マウスへの移入
外見上正常な５週令のＰＤ−１（−／−）マウスの脾細胞を３匹のＢＡＬＢ／ｃ−Ｒａｇ−２（−／−）マウスに静脈を介し、移入した（2000万個／マウス）。単回注射した３０週後、１匹のマウスが眼球突出を示した。剖検では典型的な拡張型心筋症であった。このマウスの血清による免疫ブロットでは、1000倍希釈で心臓の３３ｋＤａ蛋白に対するＩｇＧ自己抗体の存在が示された。
【００３３】
実施例９：自己免疫型心筋症治療剤のスクリーニング
実施例１で得たＰＤ−１（−／−）マウスを用いて、自己免疫疾患、特に拡張型心筋症の治療薬をスクリーニングすることができる。また、自己抗体を産生することにより発症する自己免疫疾患の治療薬のスクリーニングにも使用できる。
本発明のＢＡＬＢ／ｃ系ＰＤ−１欠損マウスは拡張型心筋症を発症して死亡する。本ＰＤ−１欠損マウスに候補化合物を投与し、その効果を生存・延命を指標に評価すれば、簡単にスクリーニングを行なうことができる。あるいは、本ＰＤ−１（−／−）マウスが産生する自己抗体は請求項６の蛋白を用いたＥＬＩＳＡ法によって測定が可能である。従って、その自己抗体の産生量を指標にすることによっても、より効率良く治療薬のスクリーニングを行うことが可能である。
【００３４】
参考例１：ＢＡＬＢ／ｃ−ＰＤ−１(-/-)−Ｒａｇ−２(-/-)の作成
ＢＡＬＢ／ｃ−ＰＤ−１（−／−）マウスをＢＡＬＢ／ｃ−Ｒａｇ−２（−／−）マウスに戻し、交配し、ＢＡＬＢ／ｃ−ＰＤ−１（−／−）−Ｒａｇ−２（−／−）マウス３０匹を作出した。
これらのマウスは、４５日間の観察期間中生存し、剖検によっても心疾患の症状は見られなかった。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】ＢＡＬＢ／c-ＰＤ−１（−／−）マウス（黒丸）、ＰＤ−１（＋／−）マウス（白抜きの三角）およびＰＤ−１（＋／＋）（白抜きの四角）の生存曲線を示すグラフ（％は４５週令の生存率を示し、括弧内の数値は観察したマウスの数を示す）。
【図２】ＰＤ−１（−／−）マウスおよび正常（ＰＤ−１（＋／＋））についての経胸壁超音波心臓図検査の結果を示すグラフ。図２（Ａ）はＬＶＤｄ（左心室拡張期末期寸法）、（Ｂ）はＬＶＤＳ（左心室収縮期末期寸法）、（Ｃ）は心室分画短縮率％を示し、ｐはｔの値を示す。
【図３】ＢＡＬＢ／ｃ（ｎ＝４）、心臓の肥大したＢＡＬＢ／ｃ−ＰＤ−１（−／−）（ｎ＝９）、発症していないＢＡＬＢ／ｃ−ＰＤ−１（−／−）（ｎ＝６）、Ｂ６（ｎ＝２）、およびＢ６−ＰＤ−１（−／−）（ｎ＝５）の各マウス血清の正常心臓抽出物に対するＩｇＧ自己抗体の電気パターンを示すグラフ。
【図４】週令の一致したＢＡＬＢ／ｃ及びＢＡＬＢ／ｃ−ＰＤ−１（−／−）マウスの血清の心臓、肝臓、腎臓及び骨格筋の組織抽出物に対する図３と同様な免疫反応性を示す図。
【図５】ＰＤ−１（−／−）マウスにおける心臓の３３ｋＤａ抗原を認識する血清自己抗体のアイソタイプを示す図。
【図６】正常ＢＡＬＢ／ｃ、病気に冒されたＰＤ−１（−／−）マウスの心臓抽出溶離物、およびＰＤ−１（−／−）マウス血清の免疫反応性を示す図。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プログラムドセルデス−１受容体（以下、ＰＤ−１と略する。）を欠損したＢＡＬＢ／ｃ系マウスおよびその用途に関する。さらに詳しく言えば、ＰＤ−１を欠損したＢＡＬＢ／ｃ系マウス、そのマウスを用いる自己免疫疾患治療剤のスクリーニング方法、そのマウスが特異的に産生するＩｇＧ自己反応性抗体、その抗体に特異的に反応する心臓が産生する蛋白、およびその蛋白を用いる拡張型心筋症の診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発生学的に、また生理学的にコントロールされた細胞の死は種々の動物のほとんどあらゆる組織で観察することができる。その様な細胞の死は一般的に「プログラムされた細胞死」または「計画的細胞死」と呼ばれ、病理学的メカニズムによって「偶然に起こる細胞死」とは区別されている。
【０００３】
ＰＤ−１は、細胞が活性化を経て計画的細胞死に至る過程に関わる受容体として、マウスでまず見出された（The EMBO J., vol.11(11), 3887-3895(1992)：非特許文献１、特開平５−３３６９７３号公報：特許文献１、EMBL/GenBank/DDJB Acc. No.X67914：非特許文献２）。ついで、マウスＰＤ−１をプローブとして用いることにより、ヒトでも見出された（Genomics 23:704 (1994)：非特許文献３、特開平７−２９１９９６号公報：特許文献２）。ＰＤ−１はリンパ球で活性化に伴い発現され、ＰＤ−１欠損マウスの研究（International Immunology, Vol.10(10), 1563-1572(1998)：非特許文献４、Immunity. Vol.11, 141-151(1999)：非特許文献５）より自己免疫疾患と深く係わるところから、免疫機能の低下または亢進、感染症、移植時の拒絶反応、腫瘍等の治療や診断に用いられることが示唆される。
【０００４】
マウスＰＤ−１もヒトＰＤ−１も２８８個のアミノ酸からなり、Ｎ末端のシグナルペプチド（２０アミノ酸）と中間部位の細胞膜貫通領域に疎水性領域を有する５５ｋＤａのＩ型膜結合型蛋白である。
【０００５】
欠損マウス（ノックアウトマウスとも言われる。）とは、人為的に特定の遺伝子を修飾されたことによって、生まれながらにその遺伝子産物を産生できないマウスを指し、その遺伝子産物である因子・受容体等の役割を調べるために作製されるものである。
【０００６】
一方、拡張型心筋症とは、左室の拡張を伴った左心室の収縮機能不全を指す。拡張型心筋症と見做される患者のうち３０％は、細胞内の細胞骨格を細胞間マトリックスへ連結している心筋の重要成分に対する構造遺伝子の先天的な変異によるとされているが、残りの症例は原因不明のままである。どちらの場合も、疾患は進行性で生命を脅かすものであり、現時点では心臓移植以外有効な治療法はない。
【０００７】
ＰＤ−１欠損マウスは、最初にＣ５７ＢＬ／６（以下、Ｂ６と省略する。）マウスで作成された。ＰＤ−１を欠損したＣ５７ＢＬ／６マウスは、ループス様腎炎および関節炎等の所謂自己免疫疾患を自然発症することが確認された（International Immunology, Vol.10(10), 1563-1572(1998)：非特許文献４、Immunity. Vol.11, 141-151(1999)：非特許文献５）。
しかしながら、他の系統のマウスでＰＤ−１を欠損させた場合については、その遺伝背景の違いがＰＤ−１を欠損に対してどのような影響を及ぼすか全く知られていない。
【０００８】
【特許文献１】特開平５−３３６９７３号公報
【特許文献２】特開平７−２９１９９６号公報
【非特許文献１】The EMBO J., vol.11(11), 3887-3895(1992)
【非特許文献２】EMBL/GenBank/DDJB Acc. No.X67914
【非特許文献３】Genomics 23:704 (1994)
【非特許文献４】International Immunology, Vol.10(10), 1563-1572(1998)
【非特許文献５】Immunity. Vol.11, 141-151(1999)
【発明の開示】
【０００９】
本発明は、
１．ＰＤ−１受容体を欠損したＢＡＬＢ／ｃ系マウス、
２．前項１に記載のマウスを用いることを特徴とする自己免疫疾患治療剤のスクリーニング方法、
３．自己抗体を産生することによる自己免疫疾患に対する前項２記載のスクリーニング方法、
４．免疫疾患が、拡張型心筋症である前項２記載のスクリーニング方法、
５．前項１記載のマウスが特異的に産生するＩｇＧ自己反応性抗体、
６．前項５記載のＩｇＧ自己反応性抗体に特異的に反応し、心臓で特異的に産生される約３３ｋＤａ（３３ｋＤａ±５ｋＤａ）の蛋白、
７．前項６記載の蛋白を用いることを特徴とする拡張型心筋症の診断方法、
８．前項７記載の蛋白をコードする遺伝子を検出することを特徴とする拡張型心筋症の（遺伝子）診断方法に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
［本発明マウスの特徴］
ＰＤ−１を欠損したＢＡＬＢ／ｃ系マウス（ＰＤ−１（−/−）と表記する。）は、生後５週齢目から死亡し始め、３０週齢までには、その２／３が死亡する。正常なＢＡＬＢ／ｃマウス（ＰＤ−１（＋／＋）と表記する。）には、その様な兆候は見られない。また、ＰＤ−１を欠失したＣ５７ＢＬ／６（Ｂ６−ＰＤ−１（−／−）と表記する。）には、ループス様腎炎および関節炎の発症は見られたが、初期段階の死亡は見られなかった。
【００１１】
本発明ＰＤ−１（−／−）マウスは、後述する剖検の結果、超音波検査による心機能の評価、電子顕微鏡での観察、免疫応答等の事実から、拡張型心筋症を自然発症し、死亡するものと判断された。
ＩｇＧ１サブクラスの自己免疫抗体を産生し、この抗体が心臓で特異的に産生される約３３ｋＤａの蛋白に結合して集積するため、自己免疫疾患型の拡張型心筋症を引き起こしたものと考えられる。
【００１２】
加齢Ｃ５７ＢＬ／６−ＰＤ−１（−／−）マウスはループス性糸球体腎炎及び関節炎に罹り易いが、心臓疾患はない事実を加味すると、ＰＤ−１の機能不全は自己免疫疾患の潜在的な素因となり、その素因と遺伝的背景の組み合わせによって様々な型の疾患を招き得ることを示している。
この様に、拡張型心筋症の原因が、心筋を標的とした内因性の調節障害による自己免疫疾患であるという可能性、すなわちこれまで証明されていない可能性が示唆された。
【００１３】
１．本発明マウスの取得方法：
ＰＤ−１受容体を欠損した本発明のＢＡＬＢ／ｃ系マウスは、
（１）ＰＤ−１を欠損したＣ５７ＢＬ／６（Ｂ６）系マウスを少なくとも１０世代以上、ＢＡＬＢ／ｃ系マウスに戻し交配するか、または、
（２）ＢＡＬＢ／ｃ系マウスの胚芽基幹（ＥＳ）細胞株から、International Immunology. Vol.10(10), 1563-1572(1998)記載の方法により、作製することができる。
【００１４】
例えば、ＰＤ−１遺伝子の含んだ染色体断片（但し、そのエクソンの一部を欠失したもの、例えばエクソン２‐５のみを含む断片）を挿入した標的ベクターを、ＢＡＬＢ／ｃ系マウスのＥＳ細胞株に導入し、染色体上のＰＤ−１遺伝子の位置に標的ベクターが相同性組替えを起こしたＥＳ細胞クローンを選抜することができる。このＰＤ−１遺伝子が欠失したＥＳ細胞からＢＡＬＢ／ｃ系キメラマウスを作製し、ジャームラインにこの欠失をトランスミットしたキメラマウスを親としてＢＡＬＢ／ｃ系ＰＤ−１欠損マウスを作製することができる。
【００１５】
２．スクリーニング：
本発明のＢＡＬＢ／ｃ系ＰＤ−１欠損マウスを用いて、自己免疫疾患、特に拡張型心筋症の治療薬をスクリーニングすることができる。また、自己抗体を産生することにより発症する自己免疫疾患の治療薬のスクリーニングにも使用できる。
本発明のＢＡＬＢ／ｃ系ＰＤ−１欠損マウスは、拡張型心筋症を発症して死亡する。本ＰＤ−１欠損マウスに薬剤を投与した後、生存・延命を指標に評価すれば、簡単にスクリーニングを行なうことができる。あるいは、本ＰＤ−１欠損マウスが産生する自己抗体量を指標にすることによっても、より効率良く治療薬のスクリーニングを行うことが可能である。
【００１６】
３．本発明のＢＡＬＢ／ｃ系ＰＤ−１欠損マウスが産生するＩｇＧ抗体とその抗体が認識する心臓で特異的に発現する約３３ｋＤａ（３３ｋＤａ±５ｋＤａ）の蛋白：
加齢により拡張型心筋症を発症した本ＰＤ−１欠損マウスは、その血液中に心臓特異的ＩｇＧ抗体が確認され、その心臓にはＩｇＧ抗体が沈着していることが確認される。本ＩｇＧ抗体は、心臓に発現される分子量約３３ｋＤａの蛋白を特異的に認識する。本ＰＤ−１欠損マウスでもまだ拡張型心筋症を発症していないマウスでは、このＩｇＧ抗体の産生は確認できるが、量的には十倍以上低い程度であった。
【００１７】
野生型のＢＡＬＢ／ｃ系マウス、更にＢ６系ＰＤ−１欠損マウスでも本ＩｇＧ抗体の産生は確認されない。従って、本ＩｇＧ抗体は、本ＢＡＬＢ／ｃ系ＰＤ−１欠損マウスの拡張型心筋症の発症に深く係わっていることは明らかである。また、拡張型心筋症に深く係わる本ＩｇＧ抗体は、Ｂ６系ＰＤ−１欠損マウスで確認されないことから、ＢＡＬＢ／ｃ系という特異的な遺伝背景の下で産生されるものと考えられる。また、Ｂ６系ＰＤ−１欠損マウスでは、所謂自己免疫疾患である関節炎・腎炎を発症することから、ＰＤ−１の機能不全は自己免疫疾患の潜在的な素因となり、その素因と遺伝的背景の組み合わせによって様々な型の疾患を招きうることを示している。
【実施例】
【００１８】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を制限するものではない。
【００１９】
実施例１：ＢＡＬＢ／ｃ系ＰＤ−１欠損マウスの作成
ＢＡＬＢ／ｃ系マウスの胚芽基幹（ＥＳ）細胞株から、International Immunology. Vol.10(10), 1563-1572(1998)記載の方法により、作製したＣ５７ＢＬ／６系ＰＤ−１欠損マウスを、ＢＡＬＢ／ｃ系マウスに１０世代戻し交配し、表記ＢＡＬＢ／ｃ系ＰＤ−１欠損マウスを得た。得られたマウスは、無菌の施設で飼育した。
【００２０】
実施例２：ＢＡＬＢ／ｃ系ＰＤ−１欠損マウスの死亡原因
実施例１で得たＢＡＬＢ／ｃ系ＰＤ−１欠損（ＰＤ−１（−／−））マウスを飼育すると、図１中、黒丸に示すように生後５週齢から死亡し始めた。３０週齢までには２／３が死亡した。それに対し、ＰＤ−１の欠損のない正常ＢＡＬＢ／ｃ系（ＰＤ−１（＋／＋））マウス（図１中白抜きの四角）では死亡例が認められなかった。Ｂ６ＰＤ−１欠損（ＰＤ−１（＋／−））マウスの飼育の結果と共にまとめて図１に示す。
ＰＤ−１（−／−）マウスは、死の数日前に眼球の突出を示し、剖検の結果、すべて異常に心臓が肥大していた。また、肝腫脹を示し、このことは死因が鬱血性心不全であったことを示唆していた。
【００２１】
実施例３：組織学的検討
死亡したＢＡＬＢ／ｃ系ＰＤ−１欠損マウスの組織学的な検討を行なった。ＰＤ−１（−／−）マウスの右心室壁は正常マウスより薄く、両心室は直径がおよそ２倍に肥大していた。
瘢痕形成を伴った細胞充実性で、間質性の線維症を含む散発的な線維性の反応があったが、肉眼では心室壁は正常に見えた。電子顕微鏡による検観では、心室壁全体に乱れて崩壊した筋フィラメントと不規則な形状のミトコンドリアを伴う心筋細胞の変性が散在していた。大多数のマウスの心房では、様々な大きさの、多くは巨大な、鬱血によると思われる血栓が認められた。
【００２２】
実施例４：超音波心電検査
生存状態で心機能評価のために、ＰＤ−１（−／−）マウスおよび正常（ＰＤ−１（＋／＋））について経胸壁超音波心臓図検査を行った。結果を図２（Ａ）（ＬＶＤｄ：左心室拡張期寸法）、（Ｂ）（ＬＶＤＳ：左心室収縮期末期寸法）および（Ｃ）（心室分画短縮率％）に示す。ＰＤ−１（−／−）マウスの心室腔は、特に右心室で大きく肥大し、その壁の厚さはＰＤ−１（＋／＋）マウスのそれに比べて顕著に減少していた。左心室と心室中隔の動きはＰＤ−１（−／−）マウスでは拡張期（ＬＶＤｄ）及び収縮期（ＬＶＤＳ）共に低下し（Ｍモード）、収縮機能の指標である、心室分画短縮は、71.9％（ＰＤ−１（＋／＋））から14.9％（ＰＤ−１（−／−））へと大きく低下した。
この事実は、ＰＤ−１（−／−）マウスの心臓のポンプ機能が、肥大により冒されていることを示し、拡張型心筋症という診断を裏付けた。
【００２３】
実施例５：免疫解析
ＢＡＬＢ／ｃ−Ｒａｇ−２（−／−）背景でのＰＤ−１（−／−）マウスは完全に健康だったので、ＢＡＬＢ／ｃＰＤ−１（−／−）マウスにおける心疾患の発生は、免疫応答性の細胞の機能によるものと考えられたため、心臓に特異的な免疫反応の徴候を探した。
免疫蛍光法による解析の結果、ＰＤ−１（−／−）マウスの心臓では心筋細胞を取り囲んで、ＩｇＧの線状の沈着がＣ３補体と共に見られ、ＰＤ−１（＋／＋）マウスの心臓ではそのようなＩｇＧの沈着は検出されなかった。
心臓壁全体にＩｇＧの沈着はびまん性に認められた。ＩｇＧの線状の染色パターンは、組織特異的な自己抗体の結合であることを意味していた。他の臓器では、ＩｇＧの沈着はほとんど検出されなかった。沈着したＩｇＧのアイソタイプはほとんどＩｇＧ１であった。
【００２４】
実施例６：自己免疫反応
心臓に対する特異的な自己免疫反応を確認するため、心臓組織に対する自己抗体の存在の可能性を検討するためにＢＡＬＢ／ｃ（ｎ＝４）、心臓の肥大したＢＡＬＢ／ｃ−ＰＤ−１（＋／−）（ｎ＝９）、発症していないＢＡＬＢ／ｃ−ＰＤ−１（−／−）（ｎ＝６）、Ｂ６（ｎ＝２）、およびＢ６−ＰＤ−１（−／−）（ｎ＝５）の各マウスの血清を用いて、正常な心臓抽出物に対するＩｇＧ自己抗体を調べた。
【００２５】
すなわち、溶解緩衝液（１５０ｍＭの塩化ナトリウム、２５ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ7.4）、５ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＮＰ４０（プロテアーゼ阻害剤））中でポリトロン・ホモジナイザーにて正常心臓の抽出物を調製した。溶解物を12.5％のＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動を行い、フィルター上に移し、希釈した血清と共にインキュベートして、ビオチン化抗マウスＩｇＧ及びストレプトアビジン―セイヨウワサビペルオキシダーゼにて検出した（なお、血清は３０〜３００倍に連続希釈した）。結果を図３に示す。
病気のＰＤ−１（−／−）マウスの血清はすべて３００倍希釈で、ほとんどは1000倍希釈でも３３ｋＤａのタンパク質に対する自己抗体を示したが、ＰＤ−１（＋／＋）マウスの血清は３０倍希釈でもそのような自己抗体を示さなかった。
【００２６】
肉眼的に正常なＰＤ−１（−／−）マウス及び大半のＰＤ−１（＋／−）マウスでは、自己抗体は３０倍希釈では検出できたが、３００倍希釈以上では検出できなかった。7.5％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて同様の分析を行い、高い分子量の範囲について調べたが、バックグランド以上のシグナルは検出されなかった。
【００２７】
図３に示されるように、９匹のＰＤ−１（−／−）マウスから得た血清すべてから、３００倍以上の希釈倍率でも、正常な心臓抽出物の中の３３ｋＤａのタンパク質と反応する力価の高いＩｇＧが検出された。
【００２８】
図４に週令の一致したＢＡＬＢ／ｃ及びＢＡＬＢ／ｃ−ＰＤ−１（−／−）マウスの血清の心臓、肝臓、腎臓及び骨格筋の組織抽出物に対する図３と同様な免疫反応性の結果を示す。週令の一致したＰＤ−１（＋／＋）マウスの血清からは、３０倍の希釈倍率でも自己抗体は全く検出されなかった（４匹中０匹）。
【００２９】
剖検で肉眼的に心肥大を示さなかったＰＤ−１（−／−）マウスの血清は、同じ３００倍希釈倍率では３３ｋＤａのタンパク質との十分な反応は示さなかった（６匹中０匹）。Ｂ６またはＢ６ＰＤ−１（−／−）も反応は示さなかった。
しかし、前者は濃度を高くすれば反応を示した。従って、３３ｋＤａのタンパク質に対する高い力価のＩｇＧ自己抗体の存在は、拡張型心筋症の臨床的な徴候と完全に相関した。３３ｋＤａのタンパク質は、ＢＡＬＢ／ｃＰＤ−１（−／−）由来の同じ血清によっては、肝臓、腎臓又は骨格筋のようなその他の組織で検出されなかったので、３３ｋＤａの自己抗原は、心臓組織特異的であると思われた。
【００３０】
抗ｄｓＤＮＡを含む他の自己抗体はＰＤ−１（−／−）マウスの血清からは検出されなかった。自己抗体は、病気に冒されたすべてのＰＤ−１（−／−）マウスでは、ほとんどＩｇＧ１クラスであり（７匹中７匹）、心臓の免疫染色解析の結果を裏付けた（図５：ＰＤ−１（−／−）マウスにおける心臓の３３ｋＤａ抗原を認識する血清自己抗体のアイソタイプ参照）。
【００３１】
実施例７
正常な心臓抽出物に対して、同じＰＤ−１（−／−）マウスの血清と共に溶離物の免疫反応性を調べるために、プロテインＧビーズによって、組織抽出物を免疫沈降し、正常ＢＡＬＢ／ｃ及び病気に冒されたＰＤ−１（−／−）マウスの心臓に沈着したＩｇＧを酸性抽出によって回収し、直接その反応性を検討した。図６に示すように、ＰＤ−１（−／−）マウスからの溶離物には野生型ＢＡＬＢ／ｃマウスに比べてはるかに大量のＩｇＧが含まれていた。溶離したＩｇＧは、病気のＰＤ−１（−／−）マウスの血清によって検出されたものと明らかに同一の特異的な３３ｋＤａタンパク質と反応した。この結果は、病気のマウスでは、循環している自己抗体が心臓組織に特異的に結合することを示していた。
【００３２】
実施例８：ＢＡＬＢ／ｃＲａｇ−２（−／−）マウスへの移入
外見上正常な５週令のＰＤ−１（−／−）マウスの脾細胞を３匹のＢＡＬＢ／ｃ−Ｒａｇ−２（−／−）マウスに静脈を介し、移入した（2000万個／マウス）。単回注射した３０週後、１匹のマウスが眼球突出を示した。剖検では典型的な拡張型心筋症であった。このマウスの血清による免疫ブロットでは、1000倍希釈で心臓の３３ｋＤａ蛋白に対するＩｇＧ自己抗体の存在が示された。
【００３３】
実施例９：自己免疫型心筋症治療剤のスクリーニング
実施例１で得たＰＤ−１（−／−）マウスを用いて、自己免疫疾患、特に拡張型心筋症の治療薬をスクリーニングすることができる。また、自己抗体を産生することにより発症する自己免疫疾患の治療薬のスクリーニングにも使用できる。
本発明のＢＡＬＢ／ｃ系ＰＤ−１欠損マウスは拡張型心筋症を発症して死亡する。本ＰＤ−１欠損マウスに候補化合物を投与し、その効果を生存・延命を指標に評価すれば、簡単にスクリーニングを行なうことができる。あるいは、本ＰＤ−１（−／−）マウスが産生する自己抗体は請求項６の蛋白を用いたＥＬＩＳＡ法によって測定が可能である。従って、その自己抗体の産生量を指標にすることによっても、より効率良く治療薬のスクリーニングを行うことが可能である。
【００３４】
参考例１：ＢＡＬＢ／ｃ−ＰＤ−１(-/-)−Ｒａｇ−２(-/-)の作成
ＢＡＬＢ／ｃ−ＰＤ−１（−／−）マウスをＢＡＬＢ／ｃ−Ｒａｇ−２（−／−）マウスに戻し、交配し、ＢＡＬＢ／ｃ−ＰＤ−１（−／−）−Ｒａｇ−２（−／−）マウス３０匹を作出した。
これらのマウスは、４５日間の観察期間中生存し、剖検によっても心疾患の症状は見られなかった。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】ＢＡＬＢ／c-ＰＤ−１（−／−）マウス（黒丸）、ＰＤ−１（＋／−）マウス（白抜きの三角）およびＰＤ−１（＋／＋）（白抜きの四角）の生存曲線を示すグラフ（％は４５週令の生存率を示し、括弧内の数値は観察したマウスの数を示す）。
【図２】ＰＤ−１（−／−）マウスおよび正常（ＰＤ−１（＋／＋））についての経胸壁超音波心臓図検査の結果を示すグラフ。図２（Ａ）はＬＶＤｄ（左心室拡張期末期寸法）、（Ｂ）はＬＶＤＳ（左心室収縮期末期寸法）、（Ｃ）は心室分画短縮率％を示し、ｐはｔの値を示す。
【図３】ＢＡＬＢ／ｃ（ｎ＝４）、心臓の肥大したＢＡＬＢ／ｃ−ＰＤ−１（−／−）（ｎ＝９）、発症していないＢＡＬＢ／ｃ−ＰＤ−１（−／−）（ｎ＝６）、Ｂ６（ｎ＝２）、およびＢ６−ＰＤ−１（−／−）（ｎ＝５）の各マウス血清の正常心臓抽出物に対するＩｇＧ自己抗体の電気パターンを示すグラフ。
【図４】週令の一致したＢＡＬＢ／ｃ及びＢＡＬＢ／ｃ−ＰＤ−１（−／−）マウスの血清の心臓、肝臓、腎臓及び骨格筋の組織抽出物に対する図３と同様な免疫反応性を示す図。
【図５】ＰＤ−１（−／−）マウスにおける心臓の３３ｋＤａ抗原を認識する血清自己抗体のアイソタイプを示す図。
【図６】正常ＢＡＬＢ／ｃ、病気に冒されたＰＤ−１（−／−）マウスの心臓抽出溶離物、およびＰＤ−１（−／−）マウス血清の免疫反応性を示す図。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＤ−１遺伝子を欠損させることにより得られることを特徴とする拡張型心筋症発症ＢＡＬＢ／ｃ系マウス。
【請求項２】
請求項１に記載のマウスの心臓において発現する３３ｋＤａ±５ｋＤａの蛋白に対するＩｇＧ自己反応性抗体。
【請求項３】
請求項１に記載のマウスに被験物質を投与した後、当該マウスの血中における請求項２に記載のＩｇＧ自己反応性抗体量を測定して行うことを特徴とする拡張型心筋症治療剤のスクリーニング方法。
【請求項１】
ＰＤ−１遺伝子を欠損させることにより得られることを特徴とする拡張型心筋症発症ＢＡＬＢ／ｃ系マウス。
【請求項２】
請求項１に記載のマウスの心臓において発現する３３ｋＤａ±５ｋＤａの蛋白に対するＩｇＧ自己反応性抗体。
【請求項３】
請求項１に記載のマウスに被験物質を投与した後、当該マウスの血中における請求項２に記載のＩｇＧ自己反応性抗体量を測定して行うことを特徴とする拡張型心筋症治療剤のスクリーニング方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００７−２３０４７（Ｐ２００７−２３０４７Ａ）
【公開日】平成１９年２月１日（２００７．２．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２４３８４６（Ｐ２００６−２４３８４６）
【出願日】平成１８年９月８日（２００６．９．８）
【分割の表示】特願２００２−５４２２０１（Ｐ２００２−５４２２０１）の分割
【原出願日】平成１３年１１月１４日（２００１．１１．１４）
【出願人】（０００１８５９８３）小野薬品工業株式会社 (180)
【出願人】（３９６０２３８１２）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年２月１日（２００７．２．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年９月８日（２００６．９．８）
【分割の表示】特願２００２−５４２２０１（Ｐ２００２−５４２２０１）の分割
【原出願日】平成１３年１１月１４日（２００１．１１．１４）
【出願人】（０００１８５９８３）小野薬品工業株式会社 (180)
【出願人】（３９６０２３８１２）
【Ｆターム（参考）】
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