ＰＤＥ５の結晶、その結晶構造及び創薬におけるその使用
本発明は、ホスホジエステラーゼ５（ＰＤＥ５）のソーキング可能な結晶及び、ＰＤＥ５リガンド及び阻害物質化合物を含むＰＤＥ５リガンドの同定におけるその使用に関する。本発明は同様に、かかるＰＤＥ５阻害物質化合物の同定方法及びその医学的使用にも関する。本発明はさらに、中にリガンドをソーキングできるＰＤＥ５の結晶及び結晶内にソーキングされたＰＤＥ５リガンドを含むＰＤＥ５、１０の結晶にも関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ５）及びＰＤＥ５のリガンド複合体の結晶構造、及びＰＤＥ５阻害物質化合物を含むＰＤＥ５リガンドの同定におけるその使用に関する。本発明は同様に、かかるＰＤＥ５阻害物質化合物の同定方法及びその医学的使用にも関する。本発明はさらに、リガンドを中にソーキングできるＰＤＥ５の結晶及び結晶内にソーキングされたリガンドを含むＰＤＥ５の結晶に関する。同様に本発明により考慮されているのは、ＰＤＥ５阻害物質化合物を含むＰＤＥ５のリガンドの同定におけるリガンドを中にソーキングさせ得るＰＤＥ５の結晶の使用である。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
心筋収縮、血流調節、神経伝達、腺分泌、細胞分化及び遺伝子発現を含む多種多様な生物学的プロセスが、環状ヌクレオチドの生物学的な第２のメッセンジャｃＡＭＰ及びｃＧＭＰの定常状態レベルにより影響を受ける。これらの分子の細胞内レセプタには、環状ヌクレオチド依存性タンパク質キナーゼ（ＰＧＫ）（Lohmann et al., １９９７）、環状ヌクレオチドゲート付きチャンネル及びクラスＩホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）（Charbonneau１９９０）が含まれる。ＰＤＥは、Sutherland及びその共同研究者により最初に報告された（Rall & Sutherland １９５８，Butcher & Sutherland １９６２）大きなタンパク質ファミリである。環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼのファミリは、対応する５’モノホスファートへの３’，５’−環状ヌクレオチドの加水分解の触媒として作用する。最新の文献では、関連したものであるが生化学的には全く異なる１１のヒトホスホジエステラーゼ遺伝子群が存在すること、及びこれらの群の多くが複数の遺伝子亜型を含み、合計２０の遺伝子を提供していること、が示されている。一部のＰＤＥは、ｃＡＭＰの加水分解に対しきわめて高い特異性を有し（ＰＤＥ４、ＰＤＥ７、ＰＤＥ８）、一部はｃＧＭＰに対する高い特異性を有し（ＰＤＥ５、ＰＤＥ６、ＰＤＥ９）、一部は混合した特異性を有する（ＰＤＥ１、ＰＤＥ２、ＰＤＥ３、ＰＤＥ１０、ＰＤＥ１１）。
【０００３】
全てのＰＤＥはマルチドメインタンパク質であり、各ＰＤＥは、ファミリ間で高度のアミノ酸配列保存をもつＣ末端に向かって位置設定された最高２７０のアミノ酸ドメインを有する（Charbonneau １９８６）。このドメインは、広範に研究されてきており、共通の触媒機能を担当することが示されてきた（Francis, S.H et al.,１９９４）。タンパク質の残りのものの中の非相同セグメントは、調節機能を有し、そうでなければ特異的結合特性を付与する。ＰＤＥ２、ＰＤＥ５、ＰＤＥ６及びＰＤＥ１０は全て、その調節アミノ末端部分の内部に推定上のＧＡＦドメインを含有することが報告されている（Aravind & Ponting １９９７及びSoderling & Beavo ２０００）。これらのＧＡＦドメインは、ｃＧＭＰに結合することが示されてきているが、それらの機能はなお充分に理解されていない。これまでに特徴づけされてきた全長哺乳動物 ＰＤＥは、溶解状態で２量体であるが、２量体構造の関連性はわかっていない。ｃＧＭＰに結合したＰＤＥ２Ａの調節セグメントは最近解明されており、ｃＧＭＰが各単量体上の２つのＧＡＦドメインのうちの１つにのみ結合している状態で４つのＧＡＦドメインの平行２量体を明らかにしている（Martinez et al. ２００１）。
【０００４】
ｃＧＭＰ特異的ＰＤＥであるＰＤＥ５が、近年重要な治療標的として認識されてきている。それは、ｃＧＭＰの分割の触媒として作用する保存されたＣ末端、亜鉛含有触媒ドメイン、及び２つのＧＡＦドメイン反復を含有するＮ末端調節部分で構成されている。各々のＧＡＦドメインは、１つは高親和性でもう１つは比較的低い親和性をもつｃＧＭＰ結合部位を含有する。ＰＤＥ５活性は、高及び低親和性のｃＧＭＰ結合部位に対するｃＧＭＰの結合とそれに続く、両方の部位が占有されている場合にのみ起こるリン酸化を通して調節される（Thomas et al. １９９０）。ＰＤＥ５は、血小板、血管及び内臓の平滑筋及び骨格筋を含む数多くの組織の中で変動する濃度で見い出される。タンパク質は、勃起性海綿体組織の平滑筋の中のｃＧＭＰレベルの重要なレギュレータである。勃起の生理学的メカニズムには、性的刺激の間の海綿体内の一酸化窒素（ＮＯ）の放出が関与している。このときＮＯは、酵素グアニル酸シクラーゼを活性化し、これがｃＧＭＰのレベルを増加させ、海綿体内の平滑筋の弛緩を生成し、血液の流入を可能にする。ＰＤＥ５の阻害は、ｃＧＭＰの分解を阻害し、ｃＧＭＰのレベルひいては平滑筋弛緩を維持できるようにする（Corbin & Francis １９９９）。Viagra（登録商標）の活性成分でありＰＤＥ５の強力な阻害物質であるＳｉｌｄｅｎａｆｉｌ（ＵＫ−０９２，４８０）は、男性の勃起不全の有効な治療のため広く注意をひいてきた。ｃＡＭＰ特異的ＰＤＥであるＰＤＥ４ｂの触媒ドメインについての構造情報が近年示されてきた（Ｘｕ et al.２０００）。この構造はＰＤＥファミリの触媒ドメインの全体的折畳みについての情報を提供するが、これまでのところ、潜在的阻害物質の酵素に対する結合の仕方については、いかなる構造的情報も示されていない。
【０００５】
Ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌとの複合体中の触媒ドメインを含む組換え型ＰＤＥ５のＸ線構造は、決定されている（本書に援用する先の関連特許出願第ＰＣＴ／ＩＢ０２／００４４２６号；例９「Ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌを用いた野生型ＰＤＥ５触媒ドメインの結晶化」、４４頁２９行目〜４５頁１７行目；例１３「Ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌを用いた野生型ＰＤＥ５のデータ収集、構造決定及び精製」、４８頁１行目〜４９頁９行目；表４、９１頁〜２４８頁を参照のこと）。リガンド複合物の結晶の産生のための改善された品質を示すこのＰＤＥ５の工学処理された一形態であるＰＤＥ５*も同じく産生されてきており、かかる複合体の構造は決定されている（本書に援用する、出願番号ＰＣＴ／ＩＢ０２／０４４２６；例１１、「Ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌを用いたＰＤＥ５*の結晶化」４６頁８行目〜２５行目；例１５「Ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌを用いたＰＤＥ５*のデータ収集、構造決定及び精密化」５０頁、９行目〜５１頁６行目；及び表６「Ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌを用いたバキュロウイルス発現されたＰＤＥ５*複合体についての原子座標」、３２８頁〜４０８頁を参照のこと）。これらの複合体は、この新規のタンパク質ファミリについての重要な構造的情報を提供するのみならず、ＰＤＥが１つの役割を果たしている数多くの疾病を治療するべくＰＤＥのより強力で特異的な阻害物質の設計をも援助することができる。
【０００６】
分子解像度レベルそして好ましくは原子解像度での特異的リガンド相互作用の詳細を得るために、そのリガンドとの複合体の形で生物学的高分子の結晶を得ることができることが望ましい。これは、高分子のさらなる、そして場合によっては改善されたリガンドをそれに基づいて設計しその後さらなる結晶化ラウンド内でテストし得る情報を提供する上で非常に重要な段階を不変的に形成している。従って、高分子の複合体を得るこのプロセスが高速で再現可能であり、かつ各々の潜在的複合体について新しい結晶化条件をつねに見い出すか又は各々の潜在的複合体構造の解明のための複雑で時間集約的な構造ソリューション方法を使用する必要性を最小限におさえるものであることが最も望ましい。この目的で、問題の高分子の最も好ましい結晶形態は、アポ高分子の予め形成された結晶中にソーキングされた潜在的リガンドを有する確率の高い形態である。このことは、従来産生されてきた共結晶に比べ全く異なる利点を有する。特に、各々の潜在的複合体のために新しい結晶条件を発見する必要性が全く無い。
【０００７】
各々の新しいリガンド複合体についての細胞寸法及び格子対称性は、アポ高分子に関して実質的に同じとなり、従って、アポ及び全複合体結晶についてのデータ収集パラメータは基本的に同一となる。このとき構造ソリューションは、高速差フーリエ法を用いて行なうことができ、かくして、より込み入った時間及び労働集約的位相決定方法が避けられる。従って、高分子のソーキング可能な結晶は、新しい高分子−リガンド複合体の特に高速のスクリーニング及び構造決定を可能にする。
【０００８】
ＰＤＥ５の工学処理された形態であるＰＤＥ５*は、リガンド複合体のソーキング可能な結晶の産生を可能にし、このようなソーキングされたＰＤＥ５*−リガンド複合体の構造は決定されている。
【発明の開示】
【０００９】
発明の要約
ＰＤＥ５は結晶化可能であることがわかっている。同様に、野生型ＰＤＥ５アミノ酸配列を操作することによってＰＤＥ５の結晶化を容易にできるということも発見されてきた。特定的に言うと、ＰＤＥ５アミノ酸配列の或る部分の操作によりＰＤＥ５の結晶化が容易になることが発見された。さらに特定的には、ＰＤＥ５のアミノ酸配列の特定の操作は、結晶ソーキングプロセスにより潜在的ＰＤＥ５リガンドを中に導入できるＰＤＥ５のソーキング可能な結晶形態を提供することができる、ということが示されてきた。野生型ＰＤＥ５アミノ酸の操作の結果、配列修飾済みＰＤＥ５タンパク質が結果として得られる。
【００１０】
ＰＤＥ５の触媒ドメイン特にＰＤＥ５の６５７−６８２領域（「ループ領域」）の操作によってＰＤＥ５の結晶化を容易にし、特にＰＤＥ５のソーキング可能な結晶を提供することができるということが示されてきた。さらに特定的に言うと、ＰＤＥ５のループ領域アミノ酸配列（ＨＲＧＶＮＮＳＹＩＱＲＳＥＨＰＬＡＱＬＹＣＨＳＩＭＥ＝配列番号１）の操作により、ＰＤＥ５の結晶化を容易にし、ＰＤＥ５のソーキング可能な結晶を提供することが可能である。この操作は、ＰＤＥ５ループ領域の単数又は複数のアミノ酸残基の欠失、付加又は置換によって達成でき、そうでなければ、もう１つのタンパク質、好ましくはもう１つのＰＤＥ、より好ましくはＰＤＥ４、最も好ましくはＰＤＥ４ｂからのループ領域（又はその他のアミノ酸配列）でのＰＤＥ５ループ領域の完全な交換によって達成可能である。
【００１１】
ＰＤＥ５の結晶は、出願第ＰＣＴ／ＩＢ０２／０４４２６号（例９「Ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌを用いた野生型ＰＤＥ５触媒ドメインの結晶化」、４４頁２９行目〜４５頁１７行目；例１１、「Ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌを用いたＰＤＥ５*の結晶化」４６頁８行目〜２５行目；例１３「Ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌを用いた野生型ＰＤＥ５のデータ収集、構造決定及び精密化」、４８頁１行目〜４９頁９行目；例１５*Ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌを用いたＰＤＥ５*のデータ収集、構造決定及び精密化」、５０頁、９行目〜５１頁６行目；表４「Ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌと複合された野生型ＰＤＥ５についての原子座標」９１頁〜２４０頁；及び表６の「Ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌを用いたバキュロウイルス発現されたＰＤＥ５*複合体についての原子座標」、３２８頁〜４０８頁を参照のこと）の中で示されているように、ＰＤＥ５リガンド（例えばＰＤＥ５阻害物質）とＰＤＥ５を共結晶化することによって、又は（ｉｉ）本発明で示されているように−ＰＤＥ５の結晶内にＰＤＥリガンド（例えばＰＤＥ５阻害物質）をソーキングすることによって、ＰＤＥ５リガンド特にＰＤＥ５阻害物質についてスクリーニングするために有用であることが発見されてきた。
【００１２】
本発明の方法によって同定されるようなＰＤＥ５リガンド特にＰＤＥ５−阻害物質は、治ゆ、苦痛緩和又は予防目的の処置において有用である。
【００１３】
かくして、本発明は、以下の（付番された）態様を提供する。
【００１４】
態様
１．結晶がソーキング可能であるホスホジエステラーゼ５（ＰＤＥ５）の結晶。
【００１５】
２．前記ＰＤＥ５が哺乳動物由来である、態様１に記載のＰＤＥ５の結晶。
【００１６】
３．前記ＰＤＥＳがヒト由来である、態様１及び２に記載のＰＤＥ５の結晶。
【００１７】
４．前記ＰＤＥ５が、ＰＤＥ５Ａ１、ＰＤＥ５Ａ２、ＰＤＥ５Ａ３及びＰＤＥ５Ａ４から成る群の中から選択されたイソ型である、態様１〜３のいずれか１つの記載のＰＤＥ５の結晶。
【００１８】
５．前記ＰＤＥ５が配列番号１（ＰＤＥ５ループ領域）又はその相同体、フラグメント、変異体、類似体又は誘導体を含む、態様１〜４のいずれか１つに記載のＰＤＥ５の結晶。
【００１９】
配列番号１は、ＰＤＥ５のいわゆる「ループ領域」である。このループ領域又はその相同体、フラグメント、変異体、前記Ｐ又は誘導体は、ループ領域内に含まれるアミノ酸残基の付加、欠失又は置換を内含する。
【００２０】
好ましくは、本発明のＰＤＥ５結晶のアミノ酸配列との関係における変異体は、配列番号１（ＨＲＧＶＮＮＳＹＩＱＲＳＥＨＰＬＡＱＬＹＣＨＳＩＭＥ）内で太字下線付きで示されているようなヒスチジン（Ｈｉｓ／Ｈ）残基の欠失又は置換を内含している。前記ヒスチジン（Ｈ）残基の交換は、好ましくは単数又は複数のアミノ酸残基（ヒスチジン以外）を取込むことによるものであり、ここで好ましくは前記アミノ酸残基は中性又は非極性である。
【００２１】
より好ましくは、本発明のＰＤＥ５の結晶のアミノ酸配列との関係における変異体は、もう１つのタンパク質、好ましくはＰＤＥ、より好ましくはＰＤＥ４、最も好ましくはＰＤＥ４ｂ（以下参照）由来のループ領域（又はその他のアミノ酸配列）でのループ領域の完全な置換を含む。
【００２２】
６．前記ＰＤＥ５が配列番号４（ＰＤＥ４ループ）又はその相同体、フラグメント、変異体、類似体又は誘導体を含む、態様１〜５のいずれか１つに記載のＰＤＥ５の結晶。
【００２３】
７．前記ＰＤＥ５が配列番号５（ＰＤＥ５*＝ループスワップされたＰＤＥ５触媒ドメイン）又はその相同体、フラグメント、変異体、類似体又は誘導体を含む、態様１〜６のいずれか１項に記載のＰＤＥ５の結晶。
【００２４】
８．前記ＰＤＥ５が配列番号６（ＰＤＥ５*を含むＰＤＥ５配列）又はその相同体、フラグメント、変異体、類似体又は誘導体を含む、態様１〜７のいずれか１項に記載のＰＤＥ５の結晶。
【００２５】
９．ポリエチレングリコールを沈殿剤として用いて成長させる、態様１〜８のいずれかに記載のＰＤＥ５の結晶。一般的には、分子量２０００〜８０００のポリエチレングリコールが使用される。好ましくは、ポリエチレングリコールの分子量は、４０００である。ポリエチレングリコールは、１０％〜３０％の間の濃度であり得るが、最も好ましくは２０％である。付加的には、結晶を成長させるのに用いられるＰＤＥ５タンパク質は１〜２０mg／mlの間、好ましくは５〜１５mg／mlの間の濃度のものであることが望まれ、最も好ましくは１０mg／mlの濃度である。
【００２６】
１０．６．５〜８．０のｐＨ範囲内の緩衝液中で成長する、態様１〜９のいずれかに記載のＰＤＥ５の結晶。好ましくは、ｐＨは７．０〜７．８の範囲内にあり、最も好ましくはｐＨは７．４である。緩衝液は、所要ｐＨ範囲全体にわたる緩衝能力を提供するもの、好ましくはＨＥＰＥＳであるべきである。
【００２７】
１１．アルコールの存在下で成長させる態様１〜１０のいずれかに記載のＰＤＥ５の結晶。好ましくはアルコールは、イソプロパノールである。
【００２８】
１２．ＨＥＰＥＳ緩衝液、ポリエチレングリコール４０００及びイソプロパノールを含有する溶液内で成長させる態様１〜１１のいずれかに記載のＰＤＥ５の結晶。好ましくは、溶液はｐＨ７．４の０．１ＭナトリウムＨＥＰＥＳ、２０％のポリエチレングリコール４０００及び１０％のイソプロパノールを含有する。結晶は、室温（２０―２５℃）以下でインキュベートされた溶液から成長する。好ましくは、結晶は、２〜６℃の範囲内の温度でインキュベートされた溶液から成長する。より好ましくは、結晶は約４℃でインキュベートされた溶液から成長する。
【００２９】
ソーキング可能な結晶は、透析、シッティングドロップ蒸気拡散法又はバッチ方法、微結晶化方法、マイクロ又はマクロ播種方法又はゲル結晶化方法といったようなさまざまな方法を用いて成長させることができるが、好ましくはハンギングドロップ蒸気拡散を用いて成長させる。
【００３０】
１３．（ａ）空間群Ｃ２；
（ｂ）単位格子寸法ａ〜５６ű１％，ｂ〜７７ű１％，ｃ〜８１ű１％，α＝γ＝９０°，β＝１０３°±１％；
（ｃ）１非対称単位あたり１分子；
（ｄ）約４０ｋＤａ±２ｋＤａの分子量のＰＤＥ５を含む；
（ｅ）約４４±５％の計算上の溶剤含有量；及び
（ｆ）単斜晶系；
といった特徴のうちの１以上を有する、態様１〜６のいずれか１つに記載のＰＤＥ５の結晶。
【００３１】
１４． ＰＤＥ５が、図２に示されているようなヘリックス１１及び１２ａ（Ｈ１２ａ７２５〜７３１）の間のループ領域に沿ってヘリックス１５（Ｈ１５ ８１３〜８２４）及び１４（Ｈ１４ ７７２〜７９７），ヘリックス１３（Ｈ１３ ７４９〜７６５）のＣ末端及びヘリックス１１（Ｈ１１ ７０６〜７２１）のＣ末端を境界とするタンパク質の第３のサブドメイン内に活性部位を有する、態様１〜１３のいずれか１つに記載のＰＤＥ５の結晶。
【００３２】
１５．活性部位がピラゾロ−ピリミジノンを収容する能力を有する、態様１４に記載のＰＤＥ５の結晶。好ましいピラゾロ−ピリミジノンの一例としては、ＵＫ−０８８，８００がある。
【００３３】
ＵＫ−０８８，８００は図４に例示されており、５−（２−エトキシフェニル）−１−メチル−３−プロピル−１，６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ〔４．３−ｄ〕ピリミジン−７−オンという化学名をもつ化合物の構造的表現である。
【００３４】
１６．ＰＤＥ５がタンパク質の第３サブドメイン内部で活性部位を有し、Ｌｅｕ７６５、Ａｌａ７６７及びＩｌｅ７６８、ならびにＰｈｅ８２０、Ｖａｌ７８２、Ｐｈｅ７８６、Ｔｙｒ６１２、Ｌｅｕ８０４、Ａｌａ７７９、Ａｌａ７８３、Ｉｌｅ８１３、Ｍｅｔ８１６及びＧｌｎ８１７のうちの１以上を含んでいる、態様１〜１５のいずれか１つに記載のＰＤＥ５の結晶。
【００３５】
１７．活性部位がピラゾロ−ピリミジノンを収容する能力を有する、態様１６に記載のＰＤＥ５の結晶。好ましいピラゾロ−ピリミジノンの一例としては、ＵＫ−０８８，８００がある。
【００３６】
１８．タンパク質が、任意の基準枠内で発現されるような誘導体セット又は表４（ＰＤＥ５*アポＣ２形態）で記されている原子座標により特徴づけされる３次元構造を有する、態様１〜１７のいずれか１つに記載のＰＤＥ５の結晶。
【００３７】
１９．態様１〜１８のいずれか１つに記載のＰＤＥ５の結晶の重原子誘導体。
【００３８】
２０．ＰＤＥ５リガンドが中にソーキングされている、態様１〜２０のいずれかに記載のＰＤＥ５の結晶。ソーキングプロセスには、ソーキングされるべき結晶を、それが中で成長させられる溶液から、リガンドを含有するか又は中にひとたび結晶が存在した時点でそれに対しリガンドが付加される安定化溶液へと移す段階が関与し得る。安定化用溶液は、移送された時点で結晶がその構造的無欠性を保持し、ひび割れしたり溶解したりせず又その結晶パラメータ、対称性又は結晶寸法を著しく改変しないような物理的特性を有していることが望まれる。好ましくは、安定化溶液は、結晶を成長させる元となる化学成分の一部又は全てを含む。より好ましくは、安定化溶液は、上述の態様９〜１２で記されている結晶成長のために使用された溶液と類似の又は同一の組成のものであるが、使用された沈殿剤の濃度はわずかに増大させることができる。最も好ましくは、安定化溶液は、結晶成長溶液と同じｐＨをもつ。リガンドは、固体としてか又は液体形態で（すなわちリガンドはすでに溶解状態にある）ソーキングするため結晶を含有する溶液又は今後結晶を含有すべき溶液に添加することができる。好ましくは、リガンドは溶解状態にあり、溶剤は、水性、有機性又は無機性であり得る。最も好ましくは、リガンドはＤＭＳＯである。リガンドは、一般にＰＤＥ５によるリガンドについての予測される結合定数より高い最終リガンド濃度を生成するべくソーキング用溶液に添加される；好ましくは、これは、結合定数の１０倍以上である。結晶ソーキング用溶液中に存在するリガンドの最終濃度は、好ましくは０．１〜２０mg／ml、より好ましくは０．５〜１０mg／ml、最も好ましくは１〜５mg／mlの間である。
【００３９】
２１．前記ＰＤＥ５リガンドがＰＤＥ５阻害物質である、態様２０に記載のＰＤＥ５の結晶。
【００４０】
２２．前記ＰＤＥ５阻害物質がピラゾロピリミジノン、好ましくはＵＫ−０８８，８００である、態様２１に記載のＰＤＥ５の結晶。
【００４１】
２３．タンパク質が、任意の基準枠内で発現されているような誘導体セット又は表５（ＰＤＥ５*−ＵＫ−０８８，８００複合体）で記されている原子座標により特徴づけされる３次元構造を有する、態様２２に記載のＰＤＥ５の結晶。
【００４２】
２４．ＰＤＥ５又は突然変異体、誘導体、変異体、類似体、相同体、サブドメイン又はフラグメントの３次元構造を誘導するための、態様２２〜２３のいずれか１つに記載のＰＤＥ５の結晶から決定された原子座標の使用。
【００４３】
２５．ＰＤＥ５サブドメインが触媒ドメインである、態様２４に記載の使用。
【００４４】
２６．ＰＤＥ５上の活性部位を伴う化学的化合物の結合相互作用を計算によってか又はその他の形で評価することを目的とした、態様２４又は態様２５に従って誘導可能であるようなＰＤＥ５の３次元構造の使用。
【００４５】
２７．ＰＤＥ５と会合する能力をもつ化合物を設計するための態様２６に従って誘導可能であるようなＰＤＥ５の３次元構造の使用。好ましくは、前記化合物は、ピラゾロ−ピリミジノン、より好ましくはＵＫ−０８８，８００である。
【００４６】
２８．化合物がＰＤＥ５リガンドである、態様２６又は態様２７に記載の使用。
【００４７】
２９．前記化合物がＰＤＥ５阻害物質である、態様２８に記載の使用。
【００４８】
３０．前記ＰＤＥ５阻害物質がピラゾロ−ピリミジノン、好ましくはＵＫ−０８８，８００である、態様２９に記載の使用。
【００４９】
３１．潜在的ＰＤＥ５リガンド化合物の群の中からＰＤＥ５と会合する能力をもつ化合物を選択する方法において、
ｉ．潜在的ＰＤＥ５リガンド化合物を含有する溶液中に態様１〜１９のいずれか１つに記載のＰＤＥ５の結晶をソーキングする段階；
ｉｉ．ソーキングされた結晶から３次元構造を決定する段階；及び
ｉｉｉ．化合物がＰＤＥ５に結合しているか否かを査定する段階；
を含む方法。
【００５０】
３２．態様３１に従って使用することにより選択される化合物。
【００５１】
３３．態様２７〜３０のいずれか１つに記載の使用によって設計されるか又は態様３１の方法により同定される化合物。
【００５２】
ＰＤＥ５阻害物質である態様３３に記載の化合物。
【００５３】
３５．潜在的ＰＤＥ５リガンドの１群の中からＰＤＥ５リガンドを選択する方法において、
（ａ）態様２４又は態様２５にしたがって誘導可能であるようなＰＤＥ５の構造の３次元表現及び潜在的ＰＤＥ５リガンドの構造の３次元表現を計算により新規作成する段階、
（ｂ）潜在的ＰＤＥリガンドの３次元表現とＰＤＥ５構造の３次元表現を同時に表示する段階、
（ｃ）潜在的ＰＤＥ５リガンドの３次元表現がＰＤＥ５構造の活性部位の３次元表現に適合するか否かを評価する段階、
を含む方法。
【００５４】
好ましくは、リガンドは分子グラフィクスツールを用いて構築され、より好ましくは、設計されたリガンドは、同時表示及び分析に先立ちエネルギー最小化されている。
【００５５】
３６．（ｄ）生物学的ＰＤＥ５活性検定内に潜在的ＰＤＥ５リガンドを取込む段階；及び
（ｅ）前記検定において潜在的ＰＤＥ５リガンドがＰＤＥ５活性を変調させるか否かを決定する段階、
をさらに含んで成る、態様３５に記載の方法。
【００５６】
３７．前記潜在的ＰＤＥ５リガンドが潜在的ＰＤＥ５阻害物質であり、前記潜在的ＰＤＥ５阻害物質化合物がＰＤＥ５活性を阻害する、態様３５又は態様３６に記載の方法。
【００５７】
３８．態様３５〜３７のいずれか１つの方法によって選択されたＰＤＥ５リガンド。好ましくは、リガンドはＰＤＥ５阻害物質である。
【００５８】
３９．医薬品としての態様３８に記載のＰＤＥ５リガンドの使用。好ましくは、リガンドはＰＤＥ５阻害物質である。
【００５９】
４０．態様３８に記載の単数又は複数のＰＤＥ５リガンド及び１以上の薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
【００６０】
４１．ＰＤＥ５の阻害が予防的に又は治療的に有利である身体条件、疾病、障害又は不全の予防又は治療のための医薬の製造における態様３８に記載のＰＤＥ５リガンドの使用。
【００６１】
４２．前記障害が哺乳動物の性的障害である、態様４１に記載の使用。
【００６２】
本発明が考慮している治ゆ、苦痛緩和又は予防用処置としては、哺乳動物の性的障害の治ゆ、苦痛緩和又は予防用処置、特に男性勃起機能不全（ＭＥＤ）、陰萎、女性性的機能不全（ＦＳＤ）、陰核機能不全、女性性的欲求低下障害、女性の性的興奮障害（ＦＳＡＤ）、女性の性交疼痛障害又は女性オルガズム機能不全（ＦＳＯＤ）並びに精髄損傷に起因する性的機能不全又は選択的セロトニン再摂取阻害物質（ＳＳＲＩ）誘発性性的機能不全といったような哺乳動物の性的機能不全の治療が含まれるが、明らかに、ＰＤＥ５阻害物質が適応指示されているその他の医学的身体条件の治療にも有用であると思われる。かかる身体条件としては、早産、月経痛、良性前立腺過形成（ＢＰＨ）、膀胱排尿障害、失禁、安定、不安定及び異型（Ｐｒｉｎｚｍｅｔａｌ）狭心症、高血圧症、肺高血圧症、慢性閉塞性肺疾患、冠動脈疾患、うっ血性心不全、アテローム性動脈硬化症、例えば経皮経管的冠動脈形成術後（ｐｏｓｔ−ＰＴＣＡ）血管能力低下状態、末梢血管障害、脳卒中、硝酸塩誘発性耐性、気管支炎、アレルギー性喘息、慢性喘息、アレルギー性鼻炎、緑内障、視神経症、黄班変性症、眼内圧亢進、網膜又は動脈閉塞などの目の疾病及び身体条件並びに、例えば過敏性腸症候群（ＩＢＳ）などの消化管運動性障害を特徴とする疾患が含まれる。
【００６３】
ＰＤＥ５阻害物質が適応指示され本発明の化合物での治療が有用でありうるさらなる医学的身体条件としては、子癇前症、川崎症候群、硝酸塩耐性、多発性硬化症、糖尿病性腎症、自立性及び末梢性ニューロパシー、特に糖尿病性ニューロパシーを含むニューロパシー及びそれらの症候、例えば胃不全麻痺、末梢性糖尿病性ニューロパシー、アルツハイマー病、急性呼吸不全、乾癬、皮膚壊死、癌、転移、脱毛症、ナッツクラッカー形食道、裂肛、痔核、インシュリン耐性症候群、糖尿病、低酸素性血管収縮並びに血液透析中の血圧の安定化が含まれる。
【００６４】
特に好ましい身体条件としては、ＭＥＤ及びＦＳＤ（好ましくはＦＳＡＤ）が含まれる。
【００６５】
本発明のさらなる（付番された）態様としては、以下のものが含まれる：
４３．ＰＤＥ５の突然変異体、誘導体、フラグメント、変異体、類似体、相同体又は複合体の結晶構造を解明するための、態様１〜２３のいずれか１つに記載のＰＤＥ５の結晶から決定された原子座標の使用。
【００６６】
４４．ＰＤＥ５関連タンパク質の３次元構造のモデルを生成するための、態様１〜２３のいずれか１つに記載のＰＤＥ５の結晶から決定された原子座標の使用。
【００６７】
４５．その他のＰＤＥ５イソ型を模倣する部位特異的突然変異体又はその変異体を設計するための、態様２４又は態様２５に従って誘導可能であるようなＰＤＥ５の３次元構造の使用。
【００６８】
４６．ａ）緩衝液及びポリエチレングリコールを含む安定化用水溶液中で結晶をインキュベートする段階、
ｂ）好ましくは、化学化合物が固体又は液体形態、より好ましくは液体形態であり、最も好ましくはＤＭＳＯ中で可溶化されている安定化用溶液と化学的化合物を組合わせる段階及び、
ｃ）任意には、安定化用溶液に抗凍結剤を添加する段階、
を含む、態様１〜１９のいずれか１つに記載の結晶内に化学的化合物をソーキングさせる方法。
【００６９】
４７．安定化溶液が、分子量４０００であるポリエチレングリコールを含む、態様４６に記載の方法。ポリエチレングリコールは、１０％〜３０％の間の濃度であり得るが、最も好ましくは２０％である。付加的には、ｐＨは好ましくは７．０〜８．０の範囲内にあり、最も好ましくはｐＨは７．４である。緩衝液は、所要ｐＨ範囲全体にわたり緩衝力を提供する能力をもつものでなくてはならず、好ましくはＨＥＰＥＳである。好ましくは、安定化溶液はアルコールを含有する。最も好ましくは、これはイソプロパノールである。好ましくは、安定化溶液はｐＨ７．４の０．１ＭナトリウムＨＥＰＥＳ、２０％のポリエチレングリコール４０００及び１０％のイソ−プロパノールを含有する。適切な抗凍結剤の例としては、２−メチル−２，４−ペンタンジオール（ＭＰＤ）及び有機重合体例えば低分子量ＰＥＧがある。ソルビトール又はキシリトールといったような炭水化物及びアルコールも同様に使用可能である。好ましくは、抗凍結剤はグリセロールである。
【００７０】
態様３８に記載のＰＤＥ５リガンド（ＰＤＥ５阻害化合物としても知られている）（以下「化合物」と呼ぶ）は単独で投与できるが、ヒトの療法においては一般に、意図されている投与経路及び標準の薬学的実践方法に関して選択された適切な薬学的賦形剤、希釈剤又は担体との混和物の形で投与されることになる。かくして、本発明が考慮している薬学組成物、医薬品及び薬剤は、当業者にとって周知のさまざまなやり方で処方し、同様に周知の方法によって投与できるものである。
【００７１】
例えば、本発明の化合物は、持続性、２元性又は脈動性適用といった即時放出、遅延放出、修正放出又は制御放出のため、着香剤又は着色剤を含有し得る錠剤、カプセル（ソフトジェルカプセルを含む）、小卵（ovules）、エリキシル剤、溶液又は懸濁剤の形で、経口投与、口腔内投与又は舌下投与することができる。該化合物は、海綿体内注射を介しても投与可能である。該化合物は同様に、高速分散又は高速溶解剤形を介して又は高エネルギー分散の形で又はコーティングされた粒子としても投与可能である。化合物の適切な薬学的処方は、望まれる通りコーティングされた形態であってもコーティングされない形態であってもよい。
【００７２】
かかる錠剤は、微晶質セルロース、ラクトース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、第二リン酸カルシウム、グリシン及びでんぷん（好ましくは、コーン、ポテト又はタピオカでんぷん）、錠剤分割物質例えばグリコール酸ナトリウムデンプン、クロスカルメロースナトリウム及び一部のケイ酸塩複合体、及びポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、スクロース、ゼラチン及びアカシアなどの造粒結合剤といったような賦形剤を含有し得る。さらには、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、グリセリルベヘネート及びタルクといったような潤滑剤も含み得る。
【００７３】
類似のタイプの固体組成物も、ゼラチンカプセル中の充填材として利用可能である。この点において好ましい賦形剤としては、ラクトース、でんぷん、セルロース、乳糖又は高分子量ポリエチレングリコールが含まれる。水性懸濁液及び／又はエレキシル剤のためには、化合物をさまざまな甘味料又は着香剤、着色物質又は染、乳化剤及び／又は懸濁剤及び水、エタノール、プロピレングリコール及びグリセリンといった希釈剤、及びそれらを組合せたものと組合せることができる。
【００７４】
修正放出及び脈動性放出の剤形は、コーティングされかつ／又は装置の本体内に内含される放出速度調整剤として作用する付加的な賦形剤と合わせて、即時放出型剤形について詳述されたもののような賦形剤を含有する。放出速度調整剤には、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、酢酸セルロース、酸化ポリエチレン、キサンタンゴム、カルボマー、アンモニオメタクリレート共重合体、水素化ヒマシ油、カルナバろう、パラフィンろう、酢酸セルロースフタラート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタラート、メタクリル酸共重合体及びそれらの混合物が含まれるが、これらに排他的に制限されるわけではない。修正放出型及び脈動性放出型剤形は、放出速度調整用賦形剤のうちの１つ又はその組合せを含有し得る。放出速度調整用賦形剤は、剤形内部すなわちマトリクス内部に及び／又はその剤形の上すなわち表面又はコーティングの上の両方に存在し得る。
【００７５】
高速分散又は溶解用投薬量処方（ＥＤＤＦ）は以下の成分を含有し得る；アスパルターム、アセスルファムカリウム、クエン酸、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、２アスコルビン酸、アクリル酸エチル、エチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチル セルロース、ステアリン酸マグネシウム、マンニトール、メタクリル酸メチル、ミント香味料、ポリエレングリコール、ヒュームドシリカ、二酸化ケイ素、グリコール酸ナトリウムデンプン、フマル酸ナトリウムステアリル、ソルビトール、キシリトール。FＤＤＦを説明するために本書で使用されている通りの分散用又は溶解用という語は、使用される薬物の可溶性によって左右され、薬物物質が不溶性である場合、高速分散用剤形を調製でき、薬物物質が可溶である場合、高速溶解用剤形を調製することができる。
【００７６】
化合物は同様に、非経口的に、例えば海綿体内、静脈内、動脈内、腹腔内、髄腔内、脳室内、尿道内、頭がい内、筋内又は皮下で投与することもでき、そうでなければ、輸液又は無針注射技術により投与することもできる。このような非経口投与のためには、これらは、例えば溶液を血液と等張にするのに充分な塩又はグルコースといったその他の物質を含有し得る無菌水溶液の形で最もうまく使用される。水溶液は、必要とあらば適切に緩衝（好ましくは３〜９のｐＨに）されているべきである。無菌条件下の適切な非経口処方の調製は、当業者にとって周知の標準的な薬学的技術によって容易に達成される。
【００７７】
ヒトの患者への経口及び非経口投与のためには、化合物の１日投薬量レベルは、通常１０〜５００mg（単回用量又は分割用量で）となる。
【００７８】
かくして例えば、該化合物の錠剤又はカプセルは、適宜単回で、又は一度に２回以上の投与のため５mg〜２５０mgの活性化合物を含有し得る。いずれの場合でも、医師は、任意の個々の患者に最も適切であると思われる実際の投量を決定し、それは特定の患者の年令、体重及び応答性によって変動することになる。上述の投薬量は、平均的ケースの例である。当然のことながら、より高い又はより低い投薬量範囲に値する個々のケースも存在し得、このようなケースも本発明の範囲内に入る。当業者は同様に、（ＭＥＤ及びＦＳＤを含む）或る種の身体条件の治療において、該化合物を「要求通り」のベース（すなわち必要又は要望に応じたベース）で単回用量として摂取させることができる、ということも認識することだろう。
【００７９】
該化合物は同様に、鼻腔内投与又は吸入により投与することもでき、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、ヒドロフルオロアルカン例えば１，１，１，２−テトラフルオロエタン（ＨＦＡ１３４ＡTM又は１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン（ＨＦＡ２２７ＥＡTM）２酸化炭素、又はその他の適切な気体などの適切な推進剤を使用して加圧コンテナ、ポンプ、スプレー又はネブライザから乾燥粉末吸入器又はエアゾルスプレー提示の形で、適切に送達される。加圧エアゾルの場合、投薬量単位は、計測された量を送達するべくバルブを備えることにより決定可能である。加圧コンテナ、ポンプ、スプレー又はネブライザは、例えば、付加的に潤滑剤例えばトリオレイン酸ソルビタンを含有しうる溶剤として推進剤とエタノールの混合物を用いる活性化合物の溶液又は懸濁液を収納し得る。吸入器又は吹送器内で使用するための（例えばゼラチンで作られた）カプセル及びカートリッジを、ラクトース又はでんぷんといったような適切な粉末ベース及び本発明の化合物の粉末混合物を収納するように処方することができる。
【００８０】
エアゾル又は乾燥粉末処方は、好ましくは、各々の計測済み用量又は「パフ」が、患者への送達のため本発明の化合物を１〜５０mgを含有するような形で準備される。エアゾルでの全体的日用量は、１〜５０mgの範囲内にあり、これは、単回用量で又はさらに通常は一日全体を通した分割用量の形で投与可能である。
【００８１】
該化合物は同様にアトマイザを介しての送達のために処方され得る。アトマイザ用の処方は可溶化剤又は懸濁剤として、水、エタノール、グリセロール、プロピレングリコール、低分子量ポリエチレングリコール、塩化ナトリウム、フルオロカーボン、ポリエチレングリコールエーテル、トリオレイン酸ソルビタン、オレイン酸を含有し得る。
【００８２】
代替的には、該化合物は、座薬又はペッサリーの形で投与でき、そうでなければゲル、ヒドロゲル、ローション、溶液、クリーム、軟こう又は散布剤の形で局所施用可能である。化合物は同様に皮ふ投与することもできる。化合物は又、例えば皮ふ用パッチ剤を使用することによって経皮的に投与することもできる。該化合物は同様に、眼科、肺又は直腸経路により投与することもできる。
【００８３】
眼科用途のためには、該化合物を、等張でｐＨ調整された無菌食塩水中の微粉末化された懸濁液として、又は好ましくは、任意には塩化ベンジルアルコニウムといったような防腐剤と組合わせた形で、等張でｐＨ調整された無菌食塩水中の溶液として処方可能である。代替的には、化合物をペトロラタムといったような軟膏の形で処方することも可能である。
【００８４】
皮膚に対する局所施用のためには、本発明の化合物を、例えば鉱油、液体ペトロラタム、白色ペトロラタム、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン化合物、乳化用ろう及び水のうちの単数又は複数のものとの混合物の中に懸濁された又は溶解された活性化合物を含有する適切な軟こうとして処方することができる。代替的には、例えば鉱油、、モノステアリン酸ソルビタン、ポリエチレングリコール、液体パラフィン、ポリソルバート６０、セチルエステルろう、セテアリールアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコール及び水のうちの単数又は複数のものの混合物の中に懸濁又は溶解させられた適切なローション又はクリームとして処方可能である。
【００８５】
該化合物は同様に、シクロデキストリンとの組合せの中で使用することもできる。シクロデキストリンは、薬物分子との封入及び非封入複合体を形成するものとして知られている。薬物−シクロデキストリン複合体の形成は、薬物分子の可溶性、溶解速度、生物学的利用能及び／又は安定性特性を修正する可能性がある。薬物−シクロデキストリン複合体は一般に、大部分の投薬量形態及び投与経路のために有用である。薬物との直接的複合体形成の代替案として、例えば担体、希釈剤又は可溶化剤としてといったように１つの補助的添加剤としてシクロデキストリンを使用することができる。アルファ、ベータ及びガンマシクロデキストリンが最も一般的に使用され、適切な例は、ＷＯ−Ａ−９１／１１１７２、ＷＯ−Ａ−９４／０２５１８及びＷＯ−Ａ−９８／５５１４８の中で記述されている。
【００８６】
一般に、ヒトにおいては、化合物の経口投与が最も好ましい経路であり、最も便利でかつ例えばＭＥＤにおいては、海綿体内（ｉ．ｃ．）投与に付随する周知の欠点を回避する。標準的な男性についてのＭＥＤにおける好ましい経口投薬計画は、必要時の２５〜２５０mgの化合物である。レシピエントがえん下障害又は経口投与後の薬物吸収障害を患っている状況においては、薬物を非経口、舌下又は口腔内投与することができる。
【００８７】
獣医での使用のためには、化合物又はその獣医学的に受容可能な塩、又はその獣医学的に受容可能な溶剤和物又はプロドラッグは、通常の獣医学的実践方法に従って適切に受容可能な処方として投与され、獣医は、特定の動物にとって最も適切であると思われる投薬計画及び投与経路を決定することになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８８】
本発明は、以下の付番された好ましい態様を提供する。
【００８９】
１．図４に表わされた構造式の化合物が、タンパク質の活性部位に結合されるような形でその中にソーキングされ得る、配列番号４を含む配列修飾されたＰＤＥ５タンパク質の結晶。
【００９０】
本書で使用される「配列修飾されたＰＤＥ５タンパク質」という語は、タンパク質の結晶化を容易にし、特にリガンドが結晶に入り結晶ソーキングのプロセス中にタンパク質の活性部位に結合できるような形でリガンドを含む溶液中に結晶をソーキングすることによって中にＰＤＥ５リガンド又は潜在的リガンドが導入され得るタンパク質のソーキング可能な結晶形態を提供するように操作された野生型ＰＤＥ５タンパク質アミノ酸配列を内含している。この用語は、ＰＤＥ５の触媒ドメインのアミノ酸配列、特定的にはＰＤＥ５の６５７〜６８７領域（「ループ領域」）又は配列番号１の操作の対象となったものでかつタンパク質の結晶化を容易にし、特にタンパク質のソーキング可能な結晶形態を提供するＰＤＥ５タンパク質を内含する。関連する操作には、ＰＤＥ５ループ領域の単数又は複数のアミノ酸残基の欠失、付加又は置換による操作が含まれる。かかる操作には例えば、単数又は複数のアミノ酸残基（ヒスチジン以外）特に中性で非極性であるアミノ酸残基を取込むように、配列番号１（ＨＲＧＶＮＮＳＹＩＱＲＳＥＨＰＬＡＱＬＹＣＨＳＩＭＥ）中に太字で示され下線が付いたヒスチジン（Ｈｉｓ／Ｈ）残基の欠失又は置換が含まれる。関連する操作には同様に、例えばＰＤＥ４といったようなもう１つのＰＤＥ、好ましくはＰＤＥ４ｂといったもう１つのタンパク質又はタンパク質配列からのループ領域（又はその他のアミノ酸配列）でのＰＤＥＳループ領域の完全な交換による操作も含まれる。配列修飾されたＰＤＥ５ タンパク質は、完全ＰＤＥ５配列の操作された配列又代替的にはＰＤＥ５配列のサブドメイン又はフラグメントの操作された配列を含むことができ、好ましくは、ＰＤＥＳ触媒ドメインの操作された配列である。
【００９１】
２．配列番号５を含む好ましい態様１に記載の結晶。
【００９２】
沈殿剤としてポリエチレングリコールを使用して成長させられる、好ましい態様１又は好ましい態様２に記載の結晶。分子量２０００〜８０００のポリエチレングリコールが一般に使用される。好ましくは、ポリエチレングリコールの分子量は４０００である。ポリエチレングリコールは、１０％〜３０％の間の濃度にあり得るが、最も好ましくは２０％である。付加的には、結晶を成長させるのに用いられるタンパク質は、１〜２０mg／mlの間、好ましくは５〜１５mg／mlの間の濃度のものであり、最も好ましくは１０mg／mlの濃度にある。
【００９３】
４．６．５〜８．０のｐＨ範囲内の緩衝液内で成長させられる好ましい態様１〜３のいずれか１つに記載の結晶。好ましくは、ｐＨは７．０〜７．８の範囲内にあり、最も好ましくはｐＨは７．４である。緩衝液は、要求されるｐＨ範囲全体にわたり緩衝力を提供する能力をもつものでなくてはならず、好ましくはＨＥＰＥＳである。
【００９４】
５．アルコールの存在下で成長させられる好ましい態様１〜４のいずれか１つに記載の結晶。好ましくは、アルコールはイソプロパノールである。
【００９５】
６．ＨＥＰＥＳ緩衝液、ポリエチレングリコール４０００及びイソプロパノールを含む溶液中で成長させられる、好ましい態様１〜５のいずれか１つに記載の結晶。好ましくは該溶液は０．１ＭのナトリウムＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、２０％のポリエチレングリコール４０００及び１０％のイソプロパノールを含有する。結晶は、室温（２０〜２５℃）以下でインキュベートされた溶液から成長させられる。好ましくは、結晶は２〜６℃の範囲内の温度でインキュベートされた溶液から成長させられる。より好ましくは、結晶は約４℃でインキュベートされた溶液から成長させられる。
【００９６】
７．（ｍ）空間群Ｃ２；
（ｎ）単位格子寸法ａ〜５６ű１％、ｂ〜７７ű１％、ｃ〜８１ű１％、α＝γ＝９０°、β＝１０３°±１％；
（ｏ）１非対称単位あたり１分子；
（ｐ）約４０ｋＤａ±２ｋＤａの分子量のタンパク質を含む；
（ｑ）約４４±５％の計算上の溶剤含有量；及び
（ｒ）単斜晶系；
といった特徴のうちの１以上を有する、好ましい態様１〜６のいずれか１つに記載の結晶。
【００９７】
８．タンパク質が、図２に示されているようなヘリックス１１及び１２ａ（Ｈ１２ａ７２５〜７３１）の間のループ領域に沿ってヘリックス１５（Ｈ１５ ８１３〜８２４）及び１４（Ｈ１４ ７７２〜７９７）、ヘリックス１３（Ｈ１３ ７４９〜７６５）のＣ末端及びヘリックス１１（Ｈ１１ ７０６〜７２１）のＣ末端を境界とするタンパク質の第３のサブドメイン内に活性部位を有する、好ましい態様１〜７のいずれか１つに記載の結晶。
【００９８】
９．タンパク質がその第３サブドメイン内部に活性部位を有し、Ｌｅｕ７６５、Ａｌａ７６７及びＩｌｅ７６８、ならびにＰｈｅ８２０、Ｖａｌ７８２、Ｐｈｅ７８６、Ｔｙｒ６１２、Ｌｅｕ８０４、Ａｌａ７７９、Ａｌａ７８３、Ｉｌｅ８１３、Ｍｅｔ８１６及びＧｌｎ８１７のうちの単数又は複数のものを含んでいる、好ましい態様１〜８のいずれか１つに記載の結晶。
【００９９】
１１．タンパク質が、任意の基準枠内で発現されるような誘導体セット又は表４で記されている原子座標により特徴づけされる３次元構造を有する、好ましい態様１〜９のいずれか１つに記載の結晶。
【０１００】
１２．ＰＤＥ５リガンドがその中にソーキングされた、好ましい態様１〜１１のいずれか１つに記載の結晶。ソーキングプロセスには、ソーキングすべき結晶を、それがＰで成長させられている溶液から、リガンドを含有するか結晶がその中にひとたび存在した時点でリガンドが結晶に入り好ましくはタンパク質の活性部位に結合するような形でリガンドが添加されることになる安定化溶液内へと移送する段階が関与し得る。安定化溶液は、移送された時点で結晶がその構造的無欠性を保持し、ひび割れしたり溶解したりせず又その結晶パラメータ、対称性又は結晶寸法を著しく改変しないような物理的特性を有していることが望まれる。好ましくは、安定化溶液は、結晶を成長させる元となる化学成分の一部又は全てを含む。より好ましくは、安定化溶液は、上述の態様３〜６で記されている結晶成長のために使用された溶液と類似の又は同一の組成のものであるが、使用された沈殿剤の濃度はわずかに１〜１０％の間の割合だけ増大させることができる。最も好ましくは、安定化溶液は、結晶成長溶液と同じｐＨをもつ。リガンドは、固体としてか又は液体形態で（すなわちリガンドはすでに溶解状態にある）ソーキングするため結晶を含有する溶液又は今後結晶を含有すべき溶液に添加することができる。好ましくは、リガンドは溶解状態にあり、溶剤は、水性、有機性又は無機性であり得る。最も好ましくは、リガンドはＤＭＳＯである。リガンドは、一般にＰＤＥ５によるリガンドについての予測される結合定数より高い最終リガンド濃度を生成するべくソーキング用溶液に添加される；好ましくは、これは、結合定数の１０倍以上である。結晶ソーキング用溶液中に存在するリガンドの最終濃度は、好ましくは０．１〜２０mg／ml、より好ましくは０．５〜１０mg／ml、最も好ましくは１〜５mg／mlの間である。任意には、データ収集前に結晶を凍結させる必要のある場合には、２−メチル−２，４−ペンタンジオール（ＭＰＤ）、アルコール及び有機重合体例えばより低分子量のＰＥＧ又はソルビトール又はキシリトールといったような炭水化物といった抗凍結剤をソーキング溶液に加えることも可能である。
【０１０１】
１３．タンパク質が、任意の基準枠内で発現されているような誘導体セット又は表５で記されている原子座標により特徴づけされる３次元構造を有する、好ましい態様１２に記載の結晶。
【０１０２】
１４．態様１〜１３のいずれか１つに記載の結晶の重原子誘導体。
【０１０３】
１５．ＰＤＥ５又は突然変異体、誘導体、変異体、類似体、相同体、サブドメイン又はフラグメントの３次元構造を誘導することを目的とした、態様１〜１４のいずれか１項に記載の結晶から決定された原子座標の使用。座標セット又はその一部分は、既知の方法に従って、構造的に類似した又は関連するタンパク質又はタンパク質サブドメイン又はフラグメントのＸ線結晶構造を決定するべく分子交換手順のための完全又は部分同期モデルを提供するために使用することができ、さらに、座標セットは、構造的に類似した又は関連したタンパク質又はタンパク質 サブドメイン又はフラグメントのＮＭＲ構造ソリューションのためのＮＭＲ割当てをそれに基づいて決定できる１つの構造モデルを提供してくれる。
【０１０４】
１６．サブドメインが触媒ドメインである、好ましい態様１５に記載の使用。
【０１０５】
１７．ＰＤＥ５のリガンドである化合物を同定する方法において、
ａ）好ましい態様１〜１４のいずれか１項に記載の結晶を提供する段階、
ｂ）化合物を結晶内にソーキングするのに貢献する条件下で化合物と結晶を接触させる段階、
ｃ）化合物が結果として得られたソーキングされた結晶内のタンパク質の活性部位に結合されているか否かをＸ線回折及び構造ソリューションを用いて決定する段階
ｄ）任意にはＰＤＥ５の阻害物質であるか否かを決定するためにリガンドを検定する段階、
を含む方法。
【０１０６】
結晶は、好ましい態様１２に記載の通りの条件下でソーキングされ得、結晶をＸ線回折し、直接的方法、重原子位相決定方法、単一又は多重異常分散、分子交換又は差フーリエ法といったような適切な任意の方法を適用することによって、Ｘ線結晶構造を決定することができる。タンパク質の活性部位におけるリガンドの存在又は不在は、電子密度マップ、例えばＸ線回折データから計算された差フーリエマップ又はオミットマップから決定できる。
【０１０７】
１８．化合物が図４に示されている通りの構造鋳型に基づいている、好ましい態様１７に記載の方法。
【０１０８】
１９．ＰＤＥ５と会合する能力をもつ化合物を設計する方法において、
（ａ）好ましい態様１〜１４のいずれか１項に記載の結晶の中に存在するタンパク質又はそのフラグメント又はそのサブドメインの構造の３次元表現を計算により新規作成する段階、
（ｂ）１つの化合物の構造の３次元表現を計算により新規作成する段階、
（ｃ）タンパク質構造の３次元表現と化合物構造の３次元表現を同時に表示する段階、
（ｄ）化合物構造の３次元表現がタンパク質構造の活性部位の３次元表現に適合するか否かを評価する段階、
（ｅ）任意には、ＰＤＥ５の阻害物質であるか否かを決定するべくリガンドを作り検定する段階、
を含む方法。
【０１０９】
２０．潜在的ＰＤＥ５リガンドの１群の中からＰＤＥ５リガンドを選択する方法において、
（ａ）好ましい態様１〜１４のいずれか１項に記載の結晶の中に存在するタンパク質又はそのフラグメント又はそのサブドメインの構造の３次元表現を計算により新規作成する段階、
（ｂ）リガンドの構造の３次元表現を計算により新規作成する段階、
（ｃ）タンパク質構造の３次元表現とリガンド構造の３次元表現を同時に表示する段階、
（ｄ）リガンド構造の３次元表現がタンパク質構造の活性部位の３次元表現に適合するか否かを評価する段階、
（ｅ）任意には、ＰＤＥ５の阻害物質であるか否かを決定するべくリガンドを作り検定する段階、
を含む方法。
【０１１０】
好ましい態様１９及び２０の好ましい実施形態に従うと、タンパク質の構造の３次元表現は、結晶のために決定された原子座標から直接誘導されてよく、好ましい態様８及び９に定義されているようにタンパク質の活性部位を同定するために適切に表示され得る。タンパク質の活性部位は、好ましくはタンパク質の活性部位を含む基及び原子と化合物のそれの間の良好なパッキング及び／又は結合相互作用及び／又は立体構造の衝突について検査することによって、タンパク質活性部位と化合物の間の適合度を探すべく類似の形で図形的にレンダリングされた化合物分子を活性部位内にドッキングできるような形で活性部位を含む原子の原子半径を表示するように、計算によって図形的にレンダリングすることができる。代替的には、結果として得られたドッキングされた化合物−タンパク質モデルを計算により分析して、適合を査定することもできるし、或るいは又例えば適合分析に先立ち活性部位内の化合物の適合を改善するためモデルのエネルギー最小化及び分子力学などによって計算によりこれを調整することもできる。
【０１１１】
２２．ＰＤＥ５の部位特異的突然変異体を設計するために好ましい態様１７に従って誘導可能であるような３次元構造の使用。
【０１１２】
本発明の好ましい態様の好ましい実施形態においては、好ましくは、その結晶のために決定された原子座標から直接誘導されうるように、好ましい態様１〜１４のいずれかに従った結晶中に存在するタンパク質又はそのフラグメント又はそのサブドメインの構造の３次元表現を計算により新規作成することによって、部位特異的突然変異体が設計される。該モデルには、例えば構造間の既知の安定したループ又は領域で既知の不安定なループ又は領域を置換するためといったように、タンパク質の物理的特性を改変するべく知識に基づいてモデル間でのアミノ酸又はペプチド領域全体の置換を可能にする目的で、類似した又は関連するタンパク質又はタンパク質配列フラグメントのモデルのオーバーレイされていてもよいし、又はこのモデルに対し最小二乗適合されてもよい（タンパク質配列の領域の安定性は、座標セット内のタンパク質領域についてのＢ因子により判断できる）。タンパク質のモデル内で単数又は複数の側鎖の交換、付加又は欠失を行なうことができ、そうでなければタンパク質の物理的特性例えば不安定な領域の改変による結晶化能力、親水性基での疎水性基の置換による可溶性に潜在的に影響を及ぼすべくＰＯＰのフラグメント全体を交換、付加又は欠失させることができる。任意には、タンパク質の部位特異的突然変異体を作り、例えば未変性タンパク質に比べて突然変異を受けたタンパク質の可溶性又は突然変異を受けたタンパク質を結晶化する能力を評価することにより、物理的パラメータの改善についてテストすることができる。
【０１１３】
あるいは、活性部位残基の部位特異的突然変異を、ＰＤＥ５リガンド又は潜在的リガンド化合物での主要な結合のドナー又はアクセプター機能に関与する側鎖を査定する目的で、又は化合物によりうまく対応するべく活性部位突然変異を設計するように、設計することができる。これは、好ましい態様１９及び／又は２０に詳述されているようなタンパク質及び化合物モデルを同時表示すること及び／又は、化合物とタンパク質モデルの間の適合及び結合相互作用の図形的視覚化によってか又は立体構造適合又は衝突及び／又は結合相互作用についてのモデル複合体の計算による分析によってのいずれかによって、１つの化合物がかかる変化により活性部位内によりうまく収容されているか否かを査定する目的でタンパク質モデルの活性部位におけるタンパク質側鎖の交換を行なうことによって、達成可能である。このプロセスには任意には、好ましい態様１９及び／又は２０で予め言及された実施形態の中で記述されているようなモデルエネルギー最小化及び／又は分子力学の段階が関与し得る。任意には、タンパク質の部位特異的突然変異体を作り、ＰＤＥ５リガンド結合検定内で検定することができる。
【０１１４】
ａ）緩衝液及びポリエチレングリコールを含む安定化用水溶液中で結晶をインキュベートする段階、
ｂ）安定化用溶液と化合物を組合わせる段階及び、
ｃ）任意には、安定化用溶液に抗凍結剤を添加する段階、
を含む、好ましい態様１〜１４のいずれか１つに記載の結晶内に化合物をソーキングする方法。
【０１１５】
好ましくは、安定化溶液は、上述の態様３〜６に記されている通りの結晶成長のために用いられる溶液と類似の又は同一の組成をもつが、使用される沈殿剤の濃度は、１〜１０％の間の割合だけわずかに増大させることができる。最も好ましくは、安定化溶液は、結晶成長溶液と同じｐＨを有する。より好ましくは、安定化溶液は、ｐＨ７．４の０．１ＭナトリウムＨＥＰＥＳ、２０％のＰＥＧ４０００、１０％のイソプロパノールを含む。好ましくは、化合物は溶解状態にあり、溶剤は水性、有機性又は無機性であり得る。最も好ましくは、化合物はＤＭＳＯ中にある。リガンドは一般的には、ＰＤＥ５によりリガンドに対する予想結合定数よりも高い最終的リガンド濃度を生み出すように、ソーキング溶液に添加される。好ましくはこれは結合定数の１０倍以上である。結晶ソーキング溶液中に存在するリガンドの最終濃度は、好ましくは０．１〜２０mg／mlの間、より好ましくは０．５〜１０mg／mlの間、そして最も好ましくは１〜５mg／mlの間である。好ましくは、抗凍結剤は、２−メチル−２，４−ペンタンジオール（ＭＰＤ）、アルコール、有機重合体、例えばより低い分子量のＰＥＧ、ソルビトール又はキシリトールといった炭水化物のうちの単数又は複数のものから選択され、最も好ましくは、抗凍結剤はグリセロールである。
【０１１６】
発明の詳細な説明
本書で使用されている「アポ」という語は、高分子特に、ａ）そのリガンド（単複）及び／又は補欠分子族（単複）から離脱されているあらゆるタンパク質（又は指名されたタンパク質）を意味するものとして考えられている。
【０１１７】
本書で使用される「緩衝液」という語は、弱酸及びこの酸の接合体塩基（又はさほど一般的ではないが弱塩基及びその接合体酸）を含むあらゆる溶液を内含するものとして考えられる。かくして、本書で使用される通りの「緩衝液」というのは、酸が付加塩基を中和する（又はさほど一般的ではないが塩基が付加酸を中和する）ことから、酸又は塩基が加えられた時点でそのｐＨレベルの変化に耐えるものである。
【０１１８】
ＰＤＥ５に関して本書で言及されているような「活性検定」というのは、そのＩＣ50値（酵素活性の５０％阻害のために必要とされる化合物の濃度）の測定により決定可能である環状グアノシン３’，５’−モノリンホスファート（ｃＧＭＰ）及び環状アデノシン３’，５’−モノホスファート（ｃＡＭＰ）ホスホジエステラーゼに対するＰＤＥ阻害活性のインビトロ検定を意味するものとして考えられている。好ましくは、必要とされるＰＤＥ酵素は、ヒト海綿体、ヒト及びウサギ血小板、ヒト心嚢、ヒト骨格筋及びウシ網膜を含むさまざまな供給源から、基本的に例えばBallard ＳＡ et al.；J. Urology １５９（６）、２１６４−２１７１、１９９８に記述されているようなThompson WJ及びAppleman MM；Biochemistry１０（２）、３１１−３１６、１９７１の方法の修正により単離可能である。特に、ｃＧＭＰ特異的ＰＤＥ５及びｃＧＭＰ阻害されたｃＡＭＰ ＰＤＥ３は、ヒト海綿体組織、ヒト血小板又はウサギ血小板から得ることができる。
【０１１９】
検定は、基本的にBallard ＳＡ et al.；J. Urology １５９（６）、２１６４−２１７１、１９９８に記述されているようなThompson WJ et al；Biochemistry１８（２３）、５２２８−５２３７、１９７９の「バッチ」方法の修正を用いるか、又は製品コードＴＲＫＱ７０９０／７１００の下でAmersham plcにより記述されているプロトコルの修正を用いて〔3Ｈ〕標識されたＡＭＰ／ＧＭＰの直接的検出のためのシンチレーション近隣検定を用いて実施可能である。要約すると、シンチレーション近接検定のために、ＰＤＥ・阻害物質の効果は、ＩＣ50〜Ｋｉとなるように、変動する阻害物質濃度及び低基質の存在下で一定量の酵素を検定すること（最高１／３km以下の濃度で〔3Ｈ〕標識されたものに対する未標識のものの比が３：１のｃＧＭＰ又はｃＡＭＰ）によって調査される。最終検定量は、検定緩衝液〔２０ｍＭのトリス−ＨＣｌｐＨ７．４、５ｍＭのＭｇＣｌ2、１mg／mlのウシ血清アルブミン〕で１００μｌまでにする。反応を、酵素で開始し、３０℃で３０〜６０分間インキュベートして３０％未満の基質回転率を得、５０μｌのケイ酸イットリウムＳＰＡビーズ（ＰＤＥ５についてそれぞれの未標識環状ヌクレオチドを３ｍＭずつ含有する）で終結させる。平板を再度密封し、２０分間振とうさせ、その後、ビーズを暗所で３０分間沈降させて、次にTop Count平板読取り装置（Packard, Meriden, ＣＴ）上で計数した。放射能単位を未阻害の対照の活性％（１００％）に変換し、阻害物質濃度に対しプロットし、「適合曲線」Microsoft Excel拡張を用いて阻害物質 ＩＣ50値を得た。
【０１２０】
本書で使用する「沈殿剤」という語は、生体分子を含む溶液に添加された時点で生体分子を溶液から沈殿又は結晶化させることになるあらゆる物質を含むものと考えられている。
【０１２１】
本書で使用する「複合体」という語は、リガンド（単複）が結合されている状態の生体高分子,
ましくはタンパク質を意味するものとして考えられ、タンパク質の結晶化の前、途中又は後で形成され得る。
【０１２２】
本書で使用されるような「ソーキング」又は「ソーキングを受ける能力をもつ」という語は、（通常は）小分子（例えば阻害物質）である化学的化合物を含有する水溶液中に結晶を置くか又は、化合物が拡散により結晶格子内に入ることができかつ、好ましくは格子を含む分子がタンパク質分子である場合タンパク質−リガンド複合体を形成するため、又最も好ましくは格子を含む分子がタンパク質分子でありかつリガンド又は化合物がタンパク質分子の活性部位に結合した状態となった場合に格子を含む分子と相互作用（例えば接触及び結合）することができるような形で結晶を含有する水溶液に化学的化合物を添加するプロセスを意味するものとして考えられている。該化合物は、固体形態で水溶液に添加し得るか又は、適切な溶剤、好ましくはジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）の中に溶解され得る。
【０１２３】
本書で使用される「ソーキング可能な結晶」という語は、リガンドが結晶格子に入りそれを通過できるように又格子を含む分子に対しアクセスできる又はそれと会合できるような形で格子の有意な分断無く小さな分子又はリガンドが中にソーキングされ得る結晶を意味するものとして考えられている。好ましくはソーキング可能な結晶は、溶解状態又は固体形態にある小分子又はリガンドが結晶を含有する溶液に添加されるソーキングプロセスに敏感に反応する結晶である。小分子はこのとき拡散により結晶格子の中に入り、結晶格子を含む分子と会合することができる。ソーキング可能な結晶が格子の分断又は結晶のひびわれ無くリガンドと結合すること及び格子対称性及び結晶パラメータがソーキング及びリガンド結合プロセスによって著しく改変されないことが好ましい。ソーキング可能な結晶が、ソーキングプロセスを受けた後でＸ線を原子解像度、好ましくは３．５Å、より好ましくは２．５Å、最も好ましくは１．５Åまで回折することが好ましい。
【０１２４】
本書で使用されている「安定化溶液」という語は、例えばソーキングといったような、さらなる操作を目的として、結晶を中に移送でき、その中で結晶がその構造的無欠性を保持し、その結晶パラメータ、対称性又は細胞寸法に関して著しく改変することのない溶液を意味するものとして考えられる。好ましくは、安定化溶液は、結晶がそこから成長させられた、ほぼ同じかつより好ましくは同一のｐＨをもつ化学的成分の一部又は全てを含んでいる。
【０１２５】
本書で使用される「抗凍結剤」という語は、溶液に添加されたとき、氷結晶の形成無く急速に溶液が凍結するようにする化学的化合物を意味するものとして考えられている。このような抗凍結剤は好ましくはエタノールといったアルコール又はキシリトール又はソルビトールといったような炭水化物であるが、２−メチル−２，４−ペンタンジオール（ＭＰＤ）又はその他の有機重合体例えばより低分子量のＰＥＧでもあり得る。最も好ましくは、抗凍結剤はグリセロールである。
【０１２６】
本書で使用されている「共結晶化」という語は、高分子とそのリガンドの予備形成された複合体すなわちタンパク質／小分子複合体の結晶化を意味するものと考えられている。
【０１２７】
「突然変異体」、「変異体」、「相同体」、「類似体」、「誘導体」又は「フラグメント」という語は、本発明の結晶を生成するのに使用されるポリペプチド配列又はＰＤＥ５タンパク質のアミノ酸配列に関連するものである。これらの語は、結果として得られるＰＤＥ５が結晶化される能力をもつことを条件として、該配列から（又はこの配列への）１つ（又は複数）のアミノ酸のあらゆる置換、変異、修飾、交換、欠失又は付加を内含する。
【０１２８】
標準的には、本発明の結晶のＰＤＥ５のタンパク質又はポリペプチドのアミノ酸配列に関連する「突然変異体」、「変異体」、「相同体」、「類似体」、「誘導体」又は「フラグメント」については、実施できるアミノ酸置換のタイプは、アミノ酸配列の疎水性／親水性を維持するものでなければならない。修飾されたＰＤＥ５が本発明に従って結晶化される能力を維持することを条件として、例えば１、２、又は３から１０、２０又は３０回の置換といったようにアミノ酸置換を行なうことができる。
【０１２９】
アミノ酸配列に関連して、本書で用いられている「変異体」という語は、野生型アミノ酸配列又はそのフラグメントの内部に含まれたアミノ酸残基の付加、欠失又は置換を意味する。好ましくは、本発明のＰＤＥ５の結晶のアミノ酸配列に関連する変異体には、本発明の結晶のＰＤＥ５のタンパク質又はポリペプチドの中に含まれている、配列番号１（ＨＲＧＶＮＮＳＹＩＱＲＳＥＨＰＬＡＱＬＹＣＨＳＩＭＥ）の中で太字で示され下線の付されているようなヒスチジン（Ｈｉｓ／Ｈ）の欠失又は置換が内含され得ると思われる。前記ヒスチジン（Ｈ）残基の交換は好ましくは、アミノ酸残基が中性又は非極性である、単数又は複数のアミノ酸残基（ヒスチジン以外）を取込むことによるものである。
【０１３０】
本発明の結晶のＰＤＥ５についてコードするヌクレオチド配列に関連する「突然変異体」、「変異体」、「相同体」、「類似体」、「誘導体」又は「フラグメント」という語は、結果として得られたヌクレオチド配列が、結晶化される能力をもつＰＤＥ５についてコードするか又はコードする能力をもつことを条件として、該配列からの（又はその配列への）１つ（又は複数）のヌクレオチドのあらゆる置換、変異、修飾、交換、欠失、又は付加を内含する。
【０１３１】
ヌクレオチド配列に関連して、本書で使用されている「変異体」という語は、野生型ヌクレオチド配列又はそのフラグメントのヌクレオチドの付加、欠失又は置換を意味する。
【０１３２】
本書で使用されている通りの「フラグメント」という語は、前記ＰＤＥ５部分を含む結果として得られるＰＤＥ５が結晶化される能力をもつことを条件として、本発明で規定されている通りのＰＤＥ５ アミノ酸配列のあらゆる部分を意味する。
【０１３３】
本発明に従った配列番号６（全長「ループスワップした」ＰＤＥ５ 配列）の特異的フラグメントの一例は、配列番号５（「ループスワップした」ＰＤＥ５触媒ドメイン）であり得る。さらに、本発明に従った配列番号５（ループスワップした触媒ドメイン）の特異的フラグメントの例は、配列番号４（ＰＤＥ４「ループ領域」；ＨＰＧＶＳＮＱＦＬＩＮＴＮＳＥＬＡＬＭＹＮＤＥＳＶＬＥ）であり得る。
【０１３４】
本書で使用されている「類似体」という語は、本発明の結晶のＰＤＥ５ポリペプチドのアミノ酸配列又は配列番号１、２、３、４、５又は６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列に類似しているものの、不利でない（すなわち結晶化されるＰＤＥ５の能力にとって不利でない）アミノ酸置換又は欠失が行なわれてきた配列を意味する。
【０１３５】
本書で本発明の結晶のＰＤＥ５の又は配列番号１、２、３、４、５又は６のうちのいずれか１つのもののアミノ酸配列に関連して使用されている「誘導体」という語は、ＰＤＥ５の化学的修飾を内含する。かかる修飾を例示するものとしては、アルキル、アシル又はアミノ基による水素の交換があるだろう。
【０１３６】
結晶に関して本書で使用されている「重原子誘導体」という語は、その構造内への重原子（すなわち、例えば炭素、窒素、酸素、リンなどといった有機高分子に共通の原子よりも著しく大きい原子質量のもの）の内含により修飾される結晶格子内の高分子を含む結晶を意味する。これは一般的には、イオン化合物との共結晶化の間か又は結晶内に化合物をソーキングさせることによって、高分子上のいくつかの基に共有結合し得る水銀、白金、金又は銀の塩といったようなイオン化合物を用いて達成される。セレノ−メチオニン又はキセノンといったような貴ガスでの誘導体化といったその他のプロセスも使用可能である。結晶のかかる重原子誘導体の目的は、構造ソリューションのための同期情報を提供することにある。
【０１３７】
本書で使用されている「欠失」という語は、単数又は複数のヌクレオチド又はアミノ酸残基がそれぞれに不在であるアミノ酸配列又はヌクレオチドのいずれかの中での変化として定義される。
【０１３８】
本書で使用されるように「挿入」又は「付加」というのは、天然に発生するＰＤＥ５の配列に比べて、それぞれ単数又は複数のヌクレオチド又はアミノ酸残基の付加を結果としてもたらしたヌクレオチド又はアミノ酸配列の変化である。
【０１３９】
本書で使用されているように「置換」は、それぞれ異なるヌクレオチド又はアミノ酸による単数又は複数のヌクレオチド又はアミノ酸の交換の結果もたらされる。
【０１４０】
保存的置換は、例えば下表に従って行なうことができる。第２欄中の同じブロック内及び第３欄内の同一行内のアミノ酸は互いに置換可能である。
【０１４１】
【表１】
【０１４２】
「相同体」という語は、特定的には一次、二次三次及び四次といったタンパク質構造に関しての相同性を網羅し、結晶化される能力をもつあらゆる構造的ＰＤＥ５相同体を網羅する。
【０１４３】
本書に詳述されているアミノ酸配列の相同性に関しては、好ましくは、配列番号１、２、３、４、５又は６に対し少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、さらに一層好ましくは少なくとも９０％の相同性が存在する。より好ましくは、少なくとも９５％、そして最も好ましくは少なくとも９８％の相同性が配列番号１、２、３、４、５又は６に対して存在する。
【０１４４】
本書に詳述されているアミノ酸配列に対しコードするヌクレオチド配列の相同性に関しては、好ましくは、少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％さらにより好ましくは少なくとも８５％、さらに一層好ましくは少なくとも９０％の相同性が、配列番号１、２、３、４、５又は６についてコードするヌクレオチド配列に対して存在する。より好ましくは、配列番号１、２、３、４、５又は６についてコードするヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％、そして好ましくは少なくとも９８％の相同性が存在する。
【０１４５】
本発明の中で定義されているＰＤＥ５のヌクレオチド配列及び本発明の中で定義されているＰＤＥ５のアミノ酸配列に関する「相同体」という語は、配列の対立遺伝子変異と同義であり得る。
【０１４６】
特に、本書で使用されている「相同体」という語は、「同一性」と同一視され得る。ここで、例えば本発明の結晶のＰＤＥ５のアミノ酸配列に関する配列相同性は、該配列のうちのいずれか単数又は複数のものともう１つの配列を厳密に比較して、そのもう１方の配列が該配列（単複）に対し少なくとも７０％の同一性を有するか否かを見ることにより、決定可能である。２つ以上の配列間の相同性百分率（％）を計算できる市販のコンピュータプログラムにより相対的配列相同性（すなわち配列同一性）を決定することも可能である。このようなコンピュータプログラムの典型的な例がＣＬＵＳＴＡＬである。
【０１４７】
相同性百分率は、隣接する配列全体にわたり計算できる。すなわち１つの配列はもう１つの配列と整列させられ、１つの配列の各々のアミノ酸が一度に１残基ずつ、もう１方の配列内の相応するアミノ酸と直接比較される。これは「無ギャップアライメント」と呼ばれる。標準的には、かかる無ギャップアライメントは、比較的短かい残基数（例えば５０未満の隣接アミノ酸）にわたってのみ実施される。
【０１４８】
これは非常に単純で一貫性ある方法ではあるものの、それは、例えばその他の点では同一である配列対の中で１つの挿入又は欠失が後続のアミノ酸残基をアライメントの外へ出しかくして包括的アライメントが実施された時点で相同性％の大幅な削減が結果としてもたらされることになるということを考慮に入れることができない。その結果、大部分の配列比較方法が、全体的な相同性評点に過度に不利に作用することなく、考えられる挿入及び欠失を考慮に入れる最適なアライメントを生成するように設計されている。これは、局所的相同性を最大限にしようとして配列アライメント内に「ギャップ」を挿入することによって達成される。
【０１４９】
しかしながら、これらのより複雑な方法は、同数の同一アミノ酸について（２つの比較された配列の間のより高い関連性を反映する）可能なかぎり少ないギャップしか伴わない配列アライメントが多数のギャップを伴うものよりも高い評点を達成することになるような形でアライメント内で発生する各ギャップに対して「ギャップペナルティ」を割当てる。１つのギャップの存在に対し比較的高いコストを課しそのギャップ内の各々の後続残基についてはより小さいペナルティを課す「アフィンギャップコスト」が使用される。これは最も一般的に使用されるギャップ評点システムである。高ギャップペナルティは当然、より少ないギャップを伴う最適化されたアライメントを生成することになる。大部分のアライメントプログラムは、ギャップペナルティの修正を許容している。しかしながら、このようなソフトウェアを配列比較のために使用する場合デフォルトの値を使用することが好まれる。例えば、ＧＣＧWisconsin Bestfitパッケージ（以下参照）を用いる場合、アミノ酸配列に対するデフォルトのギャップペナルティは、１ギャップあたり−１２、各拡張毎に−４である。
【０１５０】
従って、最大百分率相同性の計算はまず最初に、ギャップペナルティを考慮に入れた最適アライメントの生成を必要とする。かかるアライメントを実施するための最適なコンピュータプログラムがＧＣＧ Wisconsin Bestfitパッケージ（University of Wisconsin, U.S.A；Devereux et al., １９８４，Nucleic Acids Research １２：３８７）である。配列比較を実施できるその他のソフトウェアの例としては、ＢＬＡ段階パッケージ（Ausubel et al.,１９９９，同書第１８章参照）。ＦＡＳＴＡ（Atschul et al.,１９９０，J.Mol. Biol.,４０３−４１０）及びＧＥＮＥＷＯＲＫＳ比較ツールセットが含まれるが、これらに制限されるわけではない。オフライン及びオンライン探索には、ＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡの両方が利用可能である（Ausubel et al., １９９９，同書、７−５８〜７−６０ページ参照）。しかしながら一部の利用分野については、ＧＣＧ Bestfitプログラムを使用することが好まれる。
【０１５１】
最終的百分率相同性は同一性として測定できるが、一部のケースでは、アライメントプロセス自体は標準的に、全か無かの対比較に基づくものではない。代りに、化学的類似性又は進化距離に基づいて各々の対様比較に対し評点を割当てるスケーリングされた類似性評点マトリクスが一般に使用される。一般に使用されるこのようなマトリクスの例としては、ＢＬＡＳＴプログラム対についてのデフォルトマトリクスであるＢＬＯＳＵＭ６２マトリクスがある。ＧＣＧ Wisconsinプログラムは一般に、公開デフォルト値か又は供給されている場合にはカスタム記号比較表のいずれかを用いる（詳しくはユーザーマニュアルを参照のこと）。ＧＣＧパッケージについての公開デフォルト値を使用すること、又はその他のソフトウェアの場合には、ＢＬＯＳＵＭ６２といったようなデフォルトマトリクスを用いることが好ましい。
【０１５２】
ソフトウェアがひとたび最適アライメントを生成した時点で、相同性百分率、好ましくは配列同一性百分率を計算することが可能である。ソフトウェアは標準的にこれを配列比較の一部として行ない、数値的結果を生成する。
【０１５３】
すでに指示した通り、一部の利用分野については、配列相同性（又は同一性）は、任意の適切な相同性アルゴリズムを用いて、例えばデフォルトパラメータを用いて、配列相同性（又は同一性）を決定することができる。配列データベースの類似性探索における基本的問題の論述については、Altschul et al（１９９４）、Nature Genetics ６：１１９−１２９を参照のこと。一部の利用分野については、パラメータはデフォルトの値にセットされた状態で、ＢＬＡＳＴアルゴリズムが利用される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムについては、http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/blast-help.htmlで詳述されている。有利には、ＢＬＡＳＴによって査定される場合「実質的な相同性」は、少なくとも約７、好ましくは少なくとも約９、そして最も好ましくは１０以上のＥＸＰＥＣＴ値で整合する配列と同じである。ＢＬＡＳＴ探索におけるＥＸ−ＰＥＣＴについてのデフォルト閾値は通常１０である。
【０１５４】
２つの配列の間の同一性及び類似性を決定するためのその他のコンピュータプログラム方法としては、ＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux et al １９８４ Nucleic Acids Research １２：３８７）及びＦＡＳＴＡ（Atschul et al １９９０ J Molec Biol ４０３−４１０）が含まれるがこれらに制限されるわけではない。
【０１５５】
本発明のＰＤＥ５のアミノ酸配列は、適切な発現系の中でのそれについてコードするヌクレオチド配列の発現によって産生され得る。
【０１５６】
付加的に又は代替的には、タンパク質自体は、ＰＤＥ５アミノ酸配列を全体に又は部分的に合成するための化学的方法を用いて産生することができる。例えば、固相技術によりペプチドを合成し、樹脂から分割し、分取高性能液体クロマトグラフィによって精製することができる（例えば（Creighton（１９８３）「タンパク質構造及び分子原理」、WH Freeman 及びCo., New York, NY, USA）。合成ペプチドの組成は、アミノ酸分析又は配列決定（例えばEdman分解手順）によって確認可能である。
【０１５７】
さまざまな固相技術（Roberge JY et al, Science, Vol２６９，１９９５，pp.２０２−２０４）を用いて直接ペプチド合成を実施することができ、例えばメーカーにより提供される指示事項に従ってＡＢＩ ４３１ Ａ ペプチド合成装置（Perkin Elmer, Boston, MA, USA）を用いて、自動化された合成を達成することができる。付加的には、直接的合成中に、ＰＤＥ５のアミノ酸配列又はそのいずれかの部分を改変させかつ／又はその他のサブユニットからの配列又はそのいずれかの部分で化学的方法を用いてこれを組合わせて変異体ポリペプチドを産生することができる。
【０１５８】
ＰＤＥ５*のタンパク質工学処理
質量分析法及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ（デ−タは示さず）による野生型ＰＤＥ５タンパク質の触媒ドメインの分析は、該タンパク質が残基６６４−６８２の領域内部で分割されることを示している。高濃度のプロテアーゼ阻害物質がタンパク質を幾分か安定化するが、分割がなおも再現性結晶化を妨げる。
【０１５９】
ＰＤＥ５の６５７−６８２領域がＰＤＥ４内の同じ領域により交換されキメラ構成体を産生する「ＰＤＥ５*」と呼ばれるＰＤＥ５の触媒ドメインの工学処理された形態が、産生されてきた（この領域の配列アライメントについては図１を参照のこと）。この構成体のＣ末端も同様に、野生型構造（Ｃ−term８７５）と比べてトランケートされる（Ｃ−term８５８）。以後この工学処理された構成体を「ＰＤＥ５*」と呼ぶ。
【０１６０】
この工学処理されたタンパク質は、質量分析法及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ（データ示さず）による分解に対し安定していることが示されてきた。該タンパク質は、代替的精製プロトコルの開発を可能にする改善された生物物理学的特性を示す。新しいプロトコルは、ブルーセファロースカラムに対する結合及びｃＧＭＰとの特異的溶出を利用している。野生型タンパク質は、おそらくはプロテアーゼ分割部位のまわりの構造の混乱に起因してこのカラムに結合しないことが示されてきた。このＰＤＥ５*タンパク質は、より高い解像度まで回折していかなる混乱領域ももたない阻害物質を伴う結晶を産生するのに使用された。該タンパク質は、同様に、１．８Å以上の解像度まで日常的に回折しそれを構造ベースの薬物設計において使用するための改善されたタンパク質とするさらなる阻害物質を伴う結晶を産生するために、再現可能な形で使用されてきた。
【０１６１】
ＰＤＥ４及び野生型ＰＤＥ５触媒ドメインの構造
（これについては同じく、出願番号ＰＣＴ／ＩＢ０２／０４４２６、２８ページ、１９行目〜２９ページ、１７行目にも詳述されており、本書に援用する）。
【０１６２】
ＰＤＥ４ｂの触媒ドメインの構造が公開された（Xu et al. ２０００）。タンパク質データバング（ＰＤＢ）内の構造とＰＤＥ５触媒のトポロジー比較からは、ＰＤＥ４構造を除き、その他の既知のタンパク質構造との有意な付加的な相同性は明らかになっていない。２つの構造の間の比較が行なわれた（当該出願の図１は、２つのタンパク質の配列及び二次構造アライメントを示している）。構造及びドメインの配置は、ＰＤＥ４に強調されている第２のサブドメインが以下で詳述されている通りＰＤＥ５構造内に部分的にのみ存在するという点を除いて、ＰＤＥ４のものと事実上同一である。
【０１６３】
該構造は、ち密な折畳み（本出願の図２）の形で配置された１５αのヘリックスの単一ドメインで構成されている。ドメイン全体の内部では、３つのサブドメインを規定することもできる。ヘリックスＩ（Ｈ１ ５３９−５４５）及び２（Ｈ２ ５５１−５５４）はタンパク質の外部に存在し、構成体のＮ末端領域を含む。これら２つのヘリックスは、ＰＤＥ４構造内の等価のもの（Ｈ０、Ｈ１及びＨ２）とオーバーレイしない。この領域は、ＰＤＥ タンパク質ファミリを横断して充分に保存されていない。ヘリックス３（Ｈ３ ５６８−５８２）、４（Ｈ４ ５８４−５８８）、５（Ｈ５ ５９２−６０４）、６（Ｈ６ ６１５−６３１）及び７（Ｈ７ ６４０〜６５２）は、タンパク質の第１のサブドメインを形成し、タンパク質のコア内部に含まれている。ＰＤＥ４の命名法に基づくと、ヘリックス８及び９についての観察可能な電子密度は全く存在しない。ヘリックス１０（Ｈ１０ ６８４−６９４）はここでも外部にあり、構造内部で２量体界面を形成する。ヘリックス１０及び１１（Ｈ１１ ７０６〜７２１）は、第２のサブドメインの可視部分である。ヘリックス１２（Ｈ１２ａ ７２５−７３１、Ｈ１２ｂ ７３３−７４１）、１３（Ｈ１３ ７４９−７６５）、１４（Ｈ１４ ７７２−７９７）、１５（Ｈ１５ ８１３−８２４）、１６（Ｈ１６ ８２６−８３６）、及び１７（Ｈ１７ ８４１−８６１）がタンパク質の、第３のサブドメインを形成する。ＰＤＥ５の中でヘリックスＨ１２はＰＤＥ４内のように隣接するヘリックスではなく、中央にねじれを伴う２つの短かいヘリックスで構成されており、ヘリックスＨ１５がＰＤＥ５内では隣接するヘリックスであるがＰＤＥ４ではそうではない、という点に留意すべきである。
【０１６４】
ＵＫ−０８８，８００と複合体形成されたＰＤＥ５*触媒ドメインの構造
ＵＫ−０８８，８００と複合体形成されたＰＤＥ５*タンパク質の触媒ドメインの構造を、本出願の表３内にその座標が内含されている探索モデルのベースとして（本書に援用する、出願番号ＰＣＴ／ＩＢ０２／０４４２６；例１１「Ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌを用いたＰＤＥ５*の結晶化」４６頁、８行目〜２５行目； 例１５「Ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌを用いたＰＤＥ５*のデータ収集、構造決定及び精密化」、５０頁９行目〜５１頁６行目及び表６「Ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌを用いたバキュロウイルス発現されたＰＤＥ５*複合体についての原子座標」３２８頁〜４０８頁に記述されているような）ＳｉｌｄｅｎａｆｉｌとのＰＤＥ５*複合体からのタンパク質構造の１分子を使用した分子交換によって決定した。ＰＤＥ５*触媒ドメインは、非対称ユニット内に１つの分子が存在する状態の単量体として、空間群Ｃ２の中で結晶化する。ＰＤＥ５*触媒ドメインのＣ２形態は、ａ＝５５．９７Å、ｂ＝７６．５５Å、ｃ＝８０．５０Å及びβ＝１０３．０９というおおよその細胞寸法で空間群Ｃ２内で結晶化する。これらは、１非対称２ニットあたり１つの分子を含有し、４４％という溶剤含有率を有する（Matthews １９６９）。ＰＤＥ５*の構造は、１７αのヘリックスを含み、折畳み全体は、一定数の重要な差異を伴っているが野生型構造ときわめて類似している。構造の主たる差異は、ＰＤＥ４からのスワッピングされた部分（残基６５７−６８２）から成るヘリックス Ｈ８及びＨ９の存在にある。これらは、ＰＤＥ４構造内で観察されたものと同一の要領で折畳まれ、タンパク質の第２のサブドメインを完成する。この構成体のＣ末端領域全体を電子密度の中へと構築し、この構造のＮ末端に３つの混乱した残基のみを残すこともできる。これは、その結晶化特性の増強に貢献する確率が高い。
【０１６５】
ＰＤＥ５*：活性部位及びタンパク質−阻害物質相互作用
ＵＫ−０８８，８００は、以下で詳述するように、前述したＵＫ−０９２，４８０、Ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌについて観察されたものと同じ活性部位領域を占有し（本書に参考として内含されている出願番号ＰＣＴ／ＩＢ０２／０４４２６；図４、「ループスワッピングしたＰＤＥ５（ＰＤＥ５*）に結合した化合物Ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌの図、ｐ４２５）、タンパク質との同じ主として疎水性の相互作用を示す（本出願の図３「活性部位領域における、ＵＫ−０８８，８００でソーキングされたＰＤＥ５*（右）及びアポＰＤＥ５*（左）の２．５σで輪郭取りされたｆｏ−ｆｃ電子密度マップの比較」）。ＳｉｌｄｅｎａｆｉｌとのＰＤＥ５*の複合体の中に見られる同じ２つの直接的水素結合は、タンパク質のＧｌｎ８１７と阻害物質の間（Ｏε１−Ｎ４２．９Å及びＮε２−Ｏｌ３．１Å）にも見られる。
【０１６６】
阻害物質の炭素原子Ｃ７は、Ｌｅｕ７６５、Ａｌａ７６７及びＩｌｅ７６８により形成された小さい疎水性ポケット内に向いている。これらの残基は、Ｐｈｅ８２０と共に、阻害物質のプリン環がそれに対して積重なっている結合部位に対する平坦な面を形成している。プリンの反対側は、Ｖａｌ７８２に対し充填している。Ｃ１０プロピル置換基は、Ｐｈｅ７８６と優れたファンデルワールス接触を形成する。それ自体阻害物質のフェニル部分と付加的な疎水的相互作用を形成するＬｅｕ８０４に対し充填している。Ｏ−アルキル部分は、Ａｌａ７７９、Ｐｈｅ７８６、Ａｌａ７８３、Ｖａｌ７８２、Ｌｅｕ８０４、Ｉｌｅ８１３、Ｍｅｔ８１６、及びＧｌｎ８１７を境界とする小さなポケットを占有する。活性部位内に見られる亜鉛イオンと阻害物質の間には直接的相互作用は全く存在しない。該構造は、活性部位内に結合し従って（同じくモデリングされてきた（データは含まれず））ｃＧＭＰ基質へのアクセスを遮断することによるＵＫ−０８８，８００の阻害様式の競合性を確認している。
【０１６７】
ＳｉｌｄｅｎａｆｉｌとＵＫ−０８８，８００を比較した場合の主たる差異は、後者の阻害物質には、活性部位から外に向いたＳｉｌｄｅｎａｆｉｌの中に存在するスルフォニルピペラジンが欠如しているという点にある。
【０１６８】
野生型ＰＤＥ５−Ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌ複合体：活性部位及びタンパク質−阻害物質相互作用
（これは、出願番号ＰＣＴ／ＩＢ０２／０４４２６、３０頁、８行目〜３１頁１行目の中に詳述され、本書に援用する）。
【０１６９】
活性部位は主として、タンパク質の第３のサブドメイン内部に存在し、Ｈ１７とＨ１２ａの間のループ領域と共に、ヘリックスＨ１５、Ｈ１４、Ｈ１３のＣ末端及びＨ１１のＣ末端を境界としている。阻害物質とタンパク質の間の相互作用の大部分は、事実上疎水性であり、２つの直接的水素結合のみが観察されている（本書に援用する出願番号 ＰＣＴ／ＩＢＯ２／０４４２６；図３、４２４頁）。第１のものは、阻害物質のプリン環のＮ１７とＧｌｎ８１７（２．８Å）のＯε１の間にあり、第２のものは阻害物質の隣接する酸素原子Ｏ１６から同じ残基Ｇｌｎ８１７（３．１Å）のＮε２までの間にある。
【０１７０】
阻害物質の炭素原子Ｃ１２はＬｅｕ７６５、Ａｌａ７６７及びＩｌｅ７６８により形成された小さい疎水性ポケット内に向いている。これらの残基は、Ｐｈｅ８２０と共に、阻害物質のプリン環がそれに対して積重なっている結合部位に対する平坦な面を形成している。プリンの反対側は、Ｖａｌ７８２に対し充填している。Ｃ−５プロピル置換基は、Ｖａｌ７８２及びＰｈｅ７８６及びＴｒｙ６１２と優れたファンデルワールス接触を形成する。Ｐｈｅ７８６及びＬｅｕ８０４は阻害物質のフェニル部分と付加的な疎水的相互作用を形成する。Ｏ−アルキル部分は、Ａｌａ７７９、Ｐｈｅ７８６、Ａｌａ７８３、Ｖａｌ７８２、Ｌｅｕ８０４、Ｉｌｅ８１３、Ｍｅｔ８１６、及びＧｌｎ８１７を境界とする小さなポケットを占有する。スルホンアミド基は、溶剤に向かって外に向いており、一方ピペラジン環は、拡張した残基６６２−６６５を境界としているが、構造のこの部分の立体構造が連鎖の破断の影響を受けていないかどうかは不確かである。活性部位内に見られる亜鉛イオンと阻害物質の間には直接的相互作用は全く存在しない。該構造は、活性部位内に結合し従って（同じくモデリングされてきた（データは含まれず））ｃＧＭＰ基質へのアクセスを遮断することによるＳｉｌｄｅｎａｆｉｌの阻害様式の競合性を確認している。
【０１７１】
野生型ＰＤＥ５−Ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌ複合体：活性部位内の金属イオン
この構造の活性部位には１つの亜鉛部位のみが存在する。活性部位内のイオンの配位も同様に、亜鉛について予想されたものと一貫している。金属は、Ｈｉｓ６５３（Ｎε２−Ｚｎ２．０Å）、Ｈｉｓ６１７（Ｎε２−Ｚｎ２．１Å）、Ａｓｐ７６４（０Ｄ２−Ｚｎ２．２Å）と同様Ａｓｐ６５４（０Ｄ２−Ｚｎ２．２Å）によっても配位される。これらの残基は、ＰＤＥ 遺伝子ファミリ全体にわたり完全に保存される。活性部位内の第２の金属イオンの証拠は全く存在しない。
【０１７２】
本発明について、ここで添付の配列リスト及び図を参照しながら、単なる一例として記述する：
配列番号１： ＰＤＥ５からのループ領域のアミノ酸配列を示す。
配列番号２： 野生型ＰＤＥ５触媒ドメインのアミノ酸配列を示す。
配列番号３： 全長野生型ＰＤＥ５配列のアミノ酸配列を示す。
配列番号４： ＰＤＥ４のループ領域のアミノ酸配列を示す。
配列番号５： ループスワップされたＰＤＥ５触媒ドメイン＝ＰＤＥ５*のアミノ酸配列を示す。
配列番号６： ＰＤＥ５*を含む全長ＰＤＥ５配列のアミノ酸配列を示す。
配列番号 ７−１４：オリゴヌクレオチドプライマである。
【０１７３】
図１は、ＰＤＥ５（上部配列）及びＰＤＥ４ｂ（下部配列）触媒ドメインのアライメントを示している。構造からのへリックスの位置及び付番は、各々についてマーキングされている。太字体の残基は、工学処理された領域についての配列アライメントを示している。ＰＤＥ４由来の配列は、ＰＤＥ５中の対応する領域を交換するために使用されてきた。こうして、この領域への残基の挿入という結果がもたらされる。下線は、ＰＤＥ５*中に不在のＣ−末端領域を強調している。
【０１７４】
図２は、二次構造要素を示すタンパク質の全体的折畳みのリボン表現を示している。阻害物質は、全原子ステック表現で示され、金属イオンは球体として示されている。（Ａ）＝ＰＤＥ４ｂ、（Ｂ）＝野生型ＰＤＥ５＋Ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌ、（Ｃ）＝「ループスワップされた」ＰＤＥ５（ＰＤＥ５*）＋Ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌ。へリックスは、基準としてＰＤＥ４構造を用いて付番されている。へリックスＨ０−Ｈ７はサブドメイン１を形成し、へリックスＨ８−Ｈｌｌは、サブドメイン２を形成し、へリックスＨ１２−Ｈ１６はサブドメイン３を形成している。
【０１７５】
図３： 活性部位領域での、アポＰＤＥ５*（「ループスワップされた」ＰＤＥ５）（左）及びＵＫ−０８８，８００でソーキングされたＰＤＥ５*（右）の２．５σで輪郭どりされたｆｏ−ｆｃ電子密度マップの比較。
【０１７６】
図４： ＵＫ−０８８，８００、５−（２−エトキシフェニル）−ｌ−メチル−３−プロピル−１，６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オンの構造の二次元表現（Ｎ４上の水素のみが例示されている）。
【実施例】
【０１７７】
実験の部
実施例１ − ＰＤＥ５野生型触媒ドメイン（Ｅ５３４−Ｎ８７５）の構築及び発現
ヒトＰＤＥ５配列（受入番号＝ＡＢ００１６３５）からオリゴヌクレオチドプライマを設計した。ＰＣＲ増幅によって全長ＰＤＥ５クローンからＤＮＡフラグメントを生成させた。以下のオリゴヌクレオチドを用いた：
【０１７８】
ＰＤＥ５ ５’タグ無しオリゴ：
【化１】
（配列番号７）
【０１７９】
ＰＤＥ５ ３’長オリゴ：
【化２】
（配列番号８）
【０１８０】
１．５ｍＭのＭｇＣｌ2、２００μＭのｄＮＴＰｓ、５０ｐｍｏｌの各プライマ及び２．５単位のＥｘｐａｎｄ ＤＮＡポリメラーゼ(Roche, East Sussex, UK)を含む溶液の中で合計体積５０ｌでＰＣＲ反応を３０サイクルの間実施した。各サイクルは９４°Ｃで１分間、５０℃で１分間及び７２℃で２分間であった。
【０１８１】
１％のアガロースゲル上で両方の構成体についての最終的な増幅済みＤＮＡフラグメントを分離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Qiagen, West Sussex, UK）を用いて精製した。次に、ＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩを用いてフラグメントを消化させ、ｐＦａｓｔｂａｃｌ ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩで消化されたベクター（Life Technologies, Paisley, UK）内にライゲートした。ライゲーションは、１２°Ｃで１６時間実施した。次に、ライゲーション混合物をＥ．ｃｏｌｉ（ＴＯＰ １０）中に電気穿孔した (Invitrogen, Gronigen, The Netherlands)。
【０１８２】
所望のインサートを含むクローンを、１００ｕｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２ＹＴプレートを用いて選択し、適正なサイズのインサートの存在についてエンドクレアーゼ消化を用いて検査した。Ｌａｒｋ（Saffron Waldon, UK）によりＤＮＡ配列分析を実施した。
【０１８３】
ｐＦａｓｔｂａｃｌ：：ＰＤＥ５触媒ドメイン（５３４−８７５）プラスミドＤＮＡを用いてＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ１０ＢＡＣTMを形質転換することにより組換え型バクミドＤＮＡを産生した。Ｂａｃ ｔｏ ＢａｃTM バキュロウイルス発現マニュアル（Life Technologies, Paisley, UK）中に示されている方法に従ってこれを実施した。ＰＣＲ分析を用して、ｐＵＣ／Ｍ１３増幅プライマ（Invitrogen, Gronigen, The Netherlands）を用いたバクミドへの転位がうまくいったかどうかをした。
【０１８４】
Ｓｆ−９昆虫細胞を用いたトランスフェクションにより一次バキュロウイルスストックの生成を実施した。適正なインサートを含むバクミドＤＮＡをＣＥＬＬＦＥＣＴＩＮTMトランスフェクション試薬（Life Technologies, Paisley, UK）と混合し、ＳＦ−９００ＩＩ無血清培地(Invitrogen, Gronigen, The Netherlands)を用いてＳｆ−９昆虫細胞の単層に添加した。２７°Ｃで７２時間のインキュベーションの後、上清を初期バキュロウイルスストックとして収穫した。２７°Ｃで１２５ｒｐｍの攪拌下で１リットル入りアーレンマイヤーフラスコ(Corning Life Sciences, New York, USA)内で１×１０6 細胞／ｍｌの割合でＳｆ−９昆虫細胞の懸濁液中に初期ウイルスストックを加えることによって、このストックを増幅させた。感染から６日後に上清を遠心分離より収穫し、作業ウイルスストックとして４℃で保管した。この作業ストックの力価を、Ｂａｃ ｔｏ Ｂａｃ バキュロウイルス発現マニュアル(Invitrogen, Gronigen, The Netherlands)中にあるように、従来のプラーク検定分析によって決定した。
【０１８５】
異なる感染多重度（ＭＯＩ）及び収穫時間を観察してＳｆ−９及びＴｎｉ Ｈｉｇｈ５昆虫細胞培養を用いてアーレンマイヤーフラスコ培養中でタンパク質発現を最適化し、次に発見した最適条件を発酵装置内へとスケールアップした。
【０１８６】
使用された発酵装置は、Ａｐｐｌｉｋｏｎ１０３０バイオコントローラを用いて制御される加圧滅菌可能なＡｐｐｌｉｋｏｎ３リットル入りの攪拌付き容器であった。Ｔ．ｌｉ Ｈｉｇｈ５細胞の接種材料を当初、振とうフラスコ培養から調製した。Ｅｘｃｅｌ４０５無血清培地（JRH Biosciences, Kansas, USA)中で作り上げた１．８リットルの初期作業体積で、１ｍｌあたり５×１０5 個の細胞を発酵装置に接種した。温度を２７℃で制御し、溶存酸素濃度を６０％で制御し、ｐＨは測定したが、制御はしなかった。酸素濃度は全体を通じて制御した。培養内部ではマリンインペラの二重インペラシステムにより、又液体／ヘッドスペース界面ではＲｕｓｈｔｏｎインペラで攪拌を１５０ｒｐｍに設定した。曝気は、毎分０．５ｌでヘッドスペースまで連続的であった。
【０１８７】
生存細胞密度が２×１０6細胞／ｍｌに達した時点で、滴定されたバキュロウイルス作業ストックから１のＭＯＩを用いて培養に感染させた。該培養についての収穫時間は感染から４８時間後であった。収穫は、２０００ｇで１５分間の遠心分離により達成された。次に昆虫細胞ペレットを、精製に先立ち８０°Ｃで保管した。
【０１８８】
実施例２ − Ｈｉｓ６−タグ付きＰＤＥ５野生型触媒ドメイン（Ｅ５３４−Ｎ８７５）の構築及び発現
ヒトＰＤＥ５の配列（＝ＰＤＥ５Ａ１イソ型；受入番号＝ＡＢ００１６３５）からオリゴヌクレオチドプライマを設計した。ＰＣＲ増幅によって全長ＰＤＥ５クローンからＤＮＡフラグメントを生成させた。以下のオリゴヌクレオチドを用いた：
【０１８９】
ＰＤＥ５ ５’Ｈｉｓ６オリゴ：
【化３】
（配列番号９）
【０１９０】
ＰＤＥ５ ３’長オリゴ：
【化４】
（配列番号８）
【０１９１】
１．５ｍＭのＭｇＣｌ2、２００μＭのｄＮＴＰｓ、５０ｐｍｏｌの各プライマ及び２．５単位のＥｘｐａｎｄ ＤＮＡポリメラーゼ(Roche, East Sussex, UK)を含む溶液の中で合計体積５０ｌでＰＣＲ反応を３０サイクルの間実施した。各サイクルは９４°Ｃで１分間、５０℃で１分間及び７２℃で２分間であった。
【０１９２】
１％のアガロースゲル上で、両方の構成体についての最終的な増幅済みＤＮＡフラグメントを分離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Qiagen, West Sussex, UK）を用いて精製した。次に、ＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩを用いてフラグメントを消化させ、ｐＦａｓｔｂａｃｌ ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩで消化されたベクター（Life Technologies, Paisley, UK）内にライゲートした。ライゲーションは、１２°Ｃで１６時間実施した。次に、ライゲーション混合物をＥ．ｃｏｌｉ（ＴＯＰ １０）中に電気穿孔した (Invitrogen, Gronigen, The Netherlands)。
【０１９３】
所望のインサートを含むクローンを、１００ｕｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２ＹＴプレートを用いて選択し、適正なサイズのインサートの存在についてエンドクレアーゼ消化を用いて検査した。Ｌａｒｋ（Saffron Waldon, UK）によりＤＮＡ配列分析を実施した。
【０１９４】
組換え型バキュロウイルスを生成するための方法は、野生型ＰＤＥ５触媒ドメイン用のものと同じであった（実施例１参照）。
【０１９５】
発現最適化は、再びＴ．ｎｉ Ｈｉｇｈ５昆虫細胞が最適な発現を与えることを示した。従って、先行の構成体の場合と同様の手順を用いて、発酵装置内でバキュロウイルス発現を実施した。
【０１９６】
実施例３ − バキュロウイルス中でのＰＤＥ５*（Ｅ５３４−Ｅ８５８）の構築及び発現
以下のオリゴヌクレオチドを用いたオーバーラップエクステンションＰＣＲを使用することによって、ＰＤＥ５*構成体を産生した。
【０１９７】
【化５】
（配列番号７）
【０１９８】
【化６】
（配列番号１０）
【０１９９】
【化７】
（配列番号１１）
【０２００】
【化８】
（配列番号１２）
【０２０１】
野生型ＰＤＥ５触媒ドメイン構成体の場合と同じ鋳型ＤＮＡと共にオリゴヌクレオチドＡ＋Ｂ及びＣ＋Ｄを用いて、初期ＤＮＡフラグメントを生成した。１．５ｍＭのＭｇＣｌ2、２００μＭのｄＮＴＰｓ、５０ｐｍｏｌの各プライマ及び２．５単位のＥｘｐａｎｄ ＤＮＡポリメラーゼ(Roche, East Sussex, UK)を含む溶液の中で合計体積５０ｌでＰＣＲ反応を３０サイクルの間実施した。各サイクルは９４℃で１分間、５０℃で１分間及び７２℃で２分間であった。ＰＣＲの第２ラウンドでは、全長構成体を増幅させるためにオリゴヌクレオチドＡ＋Ｄを用いた状態で、鋳型ＤＮＡとしてＰＣＲ Ａ＋Ｂ及びＣ＋ＤからのＤＮＡ産物を用いた。ＰＣＲ条件は、初期ＰＣＲ反応と同じであった。これによって、ＰＤＥ５触媒ドメイン（Ｃ−ｔｅｒｍ８７５）と比較してＣ−末端トランケーション（Ｃ−ｔｅｒｍ８５８）とＰＤＥ４スワップされた領域を伴う構成体が生成される。
【０２０２】
組換え型バキュロウイルスを生成するための方法は、野生型ＰＤＥ５触媒ドメイン用のものと同じであった（実施例１参照）。
【０２０３】
発現最適化は、再びＴ．ｎｉ Ｈｉｇｈ５昆虫細胞が最適な発現を与えることを示した。従って、先行の構成体の場合と同様の手順を用いて、発酵装置内でバキュロウイルス発現を実施した。
【０２０４】
実施例４ − Ｅ．ｃｏｌｉ中でのＰＤＥ５*（Ｅ５３４−Ｅ８５８）の構築及び発現
以下のオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲを使用し、鋳型ＤＮＡは、実施例３で生成されたｐＦａｓｔｂａｃｌ：：ＰＤＥ５*プラスミドＤＮＡ（配列確認済み）であるものとして、Ｅ．ｃｏｌｉ中のＰＤＥ５*構成体を生成した。
【０２０５】
【化９】
（配列番号１３）
【０２０６】
【化１０】
（配列番号１４）
１．５ｍＭのＭｇＣｌ2、２００μＭのｄＮＴＰｓ、５０ｐｍｏｌの各プライマ及び２．５単位のＥｘｐａｎｄ ＤＮＡポリメラーゼ(Roche, East Sussex, UK)を含む溶液の中で合計体積５０ｌでＰＣＲ反応を３０サイクルの間実施した。各サイクルは９４°Ｃで１分間、５０℃で１分間及び７２℃で２分間であった。
【０２０７】
最終的な増幅済みＤＮＡフラグメントを１％のアガロースゲル上で分離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Qiagen, West Sussex, UK）を用いて精製した。次に、Ｎｄｅｌ及びＸｈｏｌを用いてフラグメントを消化させ、ｐＥＴ２１Ｃ（Life Technologies, Paisley, UK）Ｎｄｅｌ／ＸｈａＩによる消化済みベクター内にライゲートした。ライゲーションは、１２℃で１６時間実施した。次に、ライゲーション混合物をＥ．ｃｏｌｉ（ＴＯＰ １０）中に電気穿孔した (Invitrogen, Gronigen, The Netherlands)。
【０２０８】
１００ｕｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２ＹＴプレートを用いて所望のインサートを含むクローンを選択した。適正なサイズのインサートの存在についてのエンドクレアーゼ消化を用いてプラスミドＤＮＡも同様に検査した。Ｌａｒｋ（Saffron Waldon, UK）によりＤＮＡ配列分析を実施した。
【０２０９】
次に、適正に配列決定されたプラスミドＤＮＡを発現のためにＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ （ＤＥ３）（Novagen, Nottingham, UK）中に電気穿孔した。１００ｐｇ／ｍｌのカルベニシリンを培地として含む５リットルの２ＹＴ培養液を用いて、７リットル入りのＡｐｐｌｉｋｏｎ発酵装置中で発現を実施した。２重ラシュトンインペラアセンブリを用いて攪拌を１０００ｒｐｍに、かつスパージャへの曝気を毎分２リットルに設定した。３７°Ｃ及び２００ｒｐｍで一晩成長させた振とうフラスコ培養を発酵装置に接種し、ここで接種密度は１％ｖｏｌ／ｖｏｌであった。発酵のｐＨを２０％ｖｏｌ／ｖｏｌのＮＨ4ＯＨ溶液を用いて７．２に制御し、温度を当初３７℃に設定した。ＯＤ600nmが１．５に到達した時点で、温度設定点を２５°Ｃに降下させ、次にｌｍＭの最終濃度で、ＩＰＴＧを用いて培養を誘発させた。誘発から４時間後に、発酵をバッチ遠心分離（１０分間８，０００ｒｐｍ）により収穫した。その後最終ペレットを凍結（−８０°Ｃ）させて、後続の精製を待った。
【０２１０】
実施例５ − ＰＤＥ５*触媒ドメインの精製
Ｅ．ｃｏｌｉ発酵由来のペレットを、湿潤細胞重量１グラムあたり１０ｍｌｓの溶解緩衝液中に再懸濁させ、連続細胞分析器(Constant Systems, Warwickshire, UK)を用い２０ｋｐｓｉの圧力で機械的に分解した。溶解緩衝液は、５０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのＮａＣｌ、ＥＤＴＡ−を含まないプロテアーゼ阻害物質カクテル錠剤を含有する1 mMのDTT（Roche, East Sussex, UK)及び１０ｍμＭのＥ−６４でを成っていた。溶解物を急冷し、細胞残屑を除去するために４５分間１４０００ｇで遠心分離した。その後全ての精製を、Ａｋｔａ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ精製システム(Amersham Pharmacia, Buckinghamshire, UK).を用いて実施した。収集されたフロースルーと共に毎分５ｍｌの速度で、５０ｍｌのＱ−セファロースファストフローカラム（Amersham Pharmacia, Buckinghamshire, UK)に対して上清を適用した。次にブルーセファロース緩衝液Ａ（５０Ｍのビス−トリス（ｐＨ６．４）、５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ、２ｍＭのＥＧＴＡ及び１ｍＭのＤＴＴ）中で予備平衡された２リットルのＧ−２５超微細脱塩カラム(Amersham Pharmacia, Buckinghamshire, UK)に対してフロースルー試料を毎分５０ ｍｌで適用した。ブルーセファロース緩衝液Ａ中でタンパク質画分を溶出させた。
【０２１１】
次のカラムステップを順次行い、試料を当初２０ｍｌのＳＰ−セファロース高性能カラム（Amersham Pharmacia, Buckinghamshire, UK）上に投入し、ここから１０ｍｌのブルーセファロースファストフローカラム(Amersham Pharmacia, Buckinghamshire, UK)上に毎分２ｍｌの流量で直接フロースルーさせた。ひとたび投入が完了した時点で、ＳＰ−セファロースカラムをラインから取り出し、ブルーセファロースカラムを５カラム体積のブルーセファロース緩衝液Ａで洗浄した。２８０ｎｍの吸光度が基線に到達するまで１ＭのＮａＣｌを含むブルーセファロース緩衝液Ａでカラムを洗浄し、次に５カラム体積のブルーセファロース緩衝液で洗浄した。２０ｍＭのｃＧＭＰ（Ｎａ塩）を含有するブルーセファロース緩衝液（Sigma, Dorset, UK）を用いてＰＤＥ５＊ タンパク質溶液を段階溶出させた。
【０２１２】
トリス-グリシンＳＤＳゲル（Invitrogen, Gronigen, The Netherlands)上で画分を検定し、適宜プールした。遠心濃縮装置（Vivascience, Gloucestershire, UK）を用いてこれらの画分を２．５ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、毎分１．５ｍｌで５０ｍＭのビス−トリス（ｐＨ６．８）、５００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ及び２μＭｎｏＥ−６４で予備平衡されたＳｕｐｅｒｄｅｘ−２００のｐｒｅｐグレード２６／６０カラム上に投入した。溶出した画分をトリス-グリシンＳＤＳ ＰＡＧＥゲル上で分析した。
【０２１３】
実施例６ - ＰＤＥ５*の結晶化
最終ゲルろ過カラムからのＰＤＥ５*画分をプールし（合計体積２５ｍｌｓ）、タンパク質濃度を検定した（０．２ｍｇ／ｍｌ）。タンパク質溶液に対して、１０μＭのＥ−６４及び１ｍｇ／ｍｌのロイペプチン (Sigma, Dorset, UK)を補足した。４°Ｃ、３，０００ｒｐｍでＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐの１０ｋＤａ分子量カットフ遠心濃縮器（Amicon Bioseparations, Maine, USA）を用いて、溶液を１０ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。結晶化に先立ち、エッペンドルフ遠心分離機を用いて、タンパク質溶液を５分間１４，０００ｒｐｍで遠心分離した。
【０２１４】
懸垂液滴の蒸気拡散結晶化試行を４℃でセットした。２μｌのタンパク質溶液と混合させた２μｌの貯液槽緩衝液から成るを液滴を、０．１ＭナトリウムＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、２０％ポリエチレングリコール４０００及び１０％イソ−プロパノールを含有する５００μｌの貯液槽溶液上のカバースリップの上に懸濁させた。最大寸法が７００μｍまでの板状結晶が、１〜３日後に成長した。正方形のマイクロブリッジ中の２０％ポリエチレングリコール４０００及びｐＨ７．４の０．１ＭのナトリウムＨＥＰＥＳの２０μｌ液滴に結晶を移した。次に１５％のグリセロールを伴う２０％ポリエチレングリコール４０００、０．１ＭのナトリウムＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４の溶液に結晶を移し、その後Ｘ線データ収集の間は凍結させた。
【０２１５】
結晶は、格子寸法がａ＝５５．９７Å、ｂ＝７６．５５Å、ｃ＝８０．５０Å及びβ＝１０３．０９で空間群Ｃ２に属する。これらは、非対称単位１つあたり１個の分子を含み、４４％の溶剤含有率を有する（Matthews, １９６９）。
【０２１６】
実施例７ − 阻害物質をＰＤＥ５＊内にソーキングさせる
実施例６中で詳述された方法に従って得られたアポＰＤＥ５＊の板状結晶を、正方形のマイクロブリッジ中の２０％ポリエチレングリコール４０００及び０．１ＭのナトリウムＨＥＰＥＳの２０μｌ液滴に移した。これに対して、ＤＭＳＯ中に溶解させた濃度２０ｍｇ／ｍｌの阻害物質１．０μｌを加えた。次に１５％のグリセロールを伴う２０％ポリエチレングリコール４０００、ｐＨ７．４の０．１ＭのナトリウムＨＥＰＥＳの溶液に結晶を移し、その後Ｘ線データ収集の間凍結させた。
【０２１７】
実施例 ８ - ＰＤＥ５*のソーキング可能なＣ２結晶形態のデータ収集、構造決定及び精密化
Ｐ２1結晶形態（結晶は、単位細胞寸法、ａ＝５４．９３Å、ｂ＝７７．７７Å、ｃ＝８２．０５Å、α＝γ＝９０°、β＝１００．９５５°でモノリシック空間群Ｐ２lに属する）中のＰＤＥ５*の１つのサブセットの座標を用いて分子交換（ＭＲ）によりＥ．ｃｏｌｉで工学処理されたＰＤＥ５＊の構造を解き、その座標セットを表３中で詳述した。該分子交換は、ＡＭＯＲＥ（CCP4, J. Navaza １９９４）を用いて実施した。結果として得られたマップは優れた品質のものであり、ＱＵＡＮＴＡ（登録商標）(Accelrys products)を用いて構造を再適合させた。
【０２１８】
Ｏｓｍｉｃミラー(ＭＳＣ)を伴う社内のFR-D回転陽極（リガク）上のリガクＳｔｕｒｎ９２ＣＣＤ検出装置を用いて代表的なＸ線回折データセットを収集した。Ｃｒｙｓｔａｌ Ｃｌｅａｒ／Ｄ*Ｔｒｅｋ処理パッケージ（リガク−ＭＳＣ）を用いてデータを処理した。データ収集統計は、表１中に要約されている（Ａｐｏ）。
【０２１９】
結晶は、細胞寸法、１ａ＝５５．９７Å、ｂ＝７６．５５Å、ｃ＝８０．５０Å、β＝１０３．０９°で空間群Ｃ２に属する。これらは、非対称単位１つあたり１個の分子を含有し、４４％の溶剤含有率を有する（Matthews, １９６９）。
【０２２０】
「ｍｌｆ」最大尤度標的関数を用いたＣＮＸ（Bruenger et al.,１９９８）を使用して解像度範囲３０〜１．６Å内で精密化を実施した。平坦バルク溶剤モデルからの部分構造因子及び異方性Ｂ−因子補正を精密化全体を通して提供した。精密化されたモデルについてのＲ−因子は３０〜１．６Åの解像度範囲の全てのデータについて０．２３１である（自由Ｒ−因子、データの５％、０．２６７）。精密化統計は、表２中に要約されている(Apo)。
【０２２１】
アポＰＤＥ５＊の精密化モデルについての座標セットは表４に記録されている。モデルは、３２３個のアミノ酸残基、５３７−８５８（残基Ｇｌｕ６８１Ａは、ＰＤＥ５付番スキームを維持するように付番されている）、亜鉛イオン及びマグネシウムイオン、並びに２２２個の水分子を含んでいる。
【０２２２】
実施例９ − ＵＫ−０８８，８００でソーキングされたＰＤＥ５*のソーキング可能なＣ２結晶形態のデータ収集、構造決定及び精密化
ＰＤＥ５*のＣ２結晶形態中にソーキングさせたＵＫ−０８８，８００の構造を、差フーリエ法により解いた。
【０２２３】
Ｏｓｍｉｃミラー（ＭＳＣ）を伴う社内のＦＲ−Ｄ回転陽極（リガク）上のＲａｘｉｓＩＶ画像プレート検出装置を用いてＸ線回折データセットを収集した。ＨＫＬパッケージ（Otwinowski & Minor, １９９７）を用いて全てのデータを処理した。データ収集統計は、表１中に要約されている（ＵＫ−０８８，８００）。
の分子を含み、４４％の溶剤含有率を有する（Matthews, １９６９）。
【０２２４】
「ｍｌｆ」最大尤度標的関数を用いたＣＮＸ（Bruenger et al., １９９８）を使用して解像度範囲３０〜１．５Å内で精密化を実施した。平坦バルク溶剤モデルからの部分構造因子及び異方性Ｂ−因子補正を精密化全体を通して提供した。精密化されたモデルについてのＲ−因子は３０〜１．５Åの解像度範囲の全てのデータについて０．２１９である（自由Ｒ−因子、データの５％、０．２２８）。精密化統計は、表２中に要約されている（ＵＫ−０８８，８００）。
【０２２５】
ＰＤＥ５*−ＵＫ−０８８，８００の精密化モデルについての座標セットは表５に記録されている。モデルは、３２３個のアミノ酸残基、５３７−８５８（残基Ｇｌｕ６８１Ａは、ＰＤＥ５付番スキームを維持するように付番されている）、リガンドＵＫ−０８８，８００、亜鉛イオン及びマグネシウムイオン、並びに１８３個の水分子を含んでいる。
【０２２６】
実施例１０ - ＵＫ−０８８，８００でソーキングされたＰＤＥ５*とアポＰＤＥ５*の比較
モデル内へのリガンドの取り込みに先立ち誘導されたモデル位相及び実験構造要素振幅を用いて計算されたＵＫ−０８８，８００でソーキングされたＰＤＥ５＊の（ｆｏ−ｆｃ）αcalc電子密度マップは、ＵＫ−０８８，８８０として明白に解釈することのできる明らかな特長を有するピークを示している（図３）。これと対照的に、アポＰＤＥ５*の等価の（ｆｏ−ｆｃ）αcalc電子密度マップは、小分子リガンドとして解釈し得るような有意の残留特長を全く示していない。実験は、ＰＤＥ５＊に対するＵＫ−０８８，８００の結合モードを実験的に決定することを可能しており、本書中に記述されている通りのＰＤＥ５＊Ｃ２結晶形態がリガンドソーキングに反応しやすいことを実施している。Ｃ２結晶形態中のＰＤＥ５＊の構造は、Ｐ２１結晶形態で観察されたものに対して有意な差異を示していない。
【０２２７】
【表２】
【０２２８】
【表３】
【０２２９】
表３
Ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌを伴うバキュロウイルスにより発現されたＰＤＥ５*の複合体についての原子座標
原子番号、原子タイプ、残基のタイプ、残基番号デカルト座標Ｘ、Ｙ、Ｚ、原子占有率（Ｏ）及び温度因子（Ｂ）
【０２３０】
【表４】
【０２３１】
【表５】
【０２３２】
【表６】
【０２３３】
【表７】
【０２３４】
【表８】
【０２３５】
【表９】
【０２３６】
【表１０】
【０２３７】
【表１１】
【０２３８】
【表１２】
【０２３９】
【表１３】
【０２４０】
【表１４】
【０２４１】
【表１５】
【０２４２】
【表１６】
【０２４３】
【表１７】
【０２４４】
【表１８】
【０２４５】
【表１９】
【０２４６】
【表２０】
【０２４７】
【表２１】
【０２４８】
【表２２】
【０２４９】
【表２３】
【０２５０】
【表２４】
【０２５１】
【表２５】
【０２５２】
【表２６】
【０２５３】
【表２７】
【０２５４】
【表２８】
【０２５５】
【表２９】
【０２５６】
【表３０】
【０２５７】
【表３１】
【０２５８】
【表３２】
【０２５９】
【表３３】
【０２６０】
【表３４】
【０２６１】
【表３５】
【０２６２】
【表３６】
【０２６３】
【表３７】
【０２６４】
【表３８】
【０２６５】
【表３９】
【０２６６】
【表４０】
【０２６７】
【表４１】
【０２６８】
【表４２】
【０２６９】
【表４３】
【０２７０】
【表４４】
【０２７１】
【表４５】
【０２７２】
【表４６】
【０２７３】
【表４７】
【０２７４】
【表４８】
【０２７５】
【表４９】
【０２７６】
【表５０】
【０２７７】
【表５１】
【０２７８】
【表５２】
【０２７９】
【表５３】
【０２８０】
【表５４】
【０２８１】
【表５５】
【０２８２】
【表５６】
【０２８３】
【表５７】
【０２８４】
【表５８】
【０２８５】
【表５９】
【０２８６】
【表６０】
【０２８７】
【表６１】
【０２８８】
【表６２】
【０２８９】
【表６３】
【０２９０】
【表６４】
【０２９１】
【表６５】
【０２９２】
【表６６】
【０２９３】
【表６７】
【０２９４】
【表６８】
【０２９５】
【表６９】
【０２９６】
【表７０】
【０２９７】
【表７１】
【０２９８】
【表７２】
【０２９９】
【表７３】
【０３００】
【表７４】
【０３０１】
【表７５】
【０３０２】
【表７６】
【０３０３】
【表７７】
【０３０４】
【表７８】
【０３０５】
【表７９】
【０３０６】
【表８０】
【０３０７】
【表８１】
【０３０８】
【表８２】
【０３０９】
【表８３】
【０３１０】
【表８４】
【０３１１】
表４
ＰＤＥ５*アポタンパク質についての原子座標
原子番号、原子のタイプ、残基のタイプ、残基番号デカルト座標Ｘ、Ｙ、Ｚ、原子占有率（Ｏ）、温度因子（Ｂ）
【０３１２】
【表８５】
【０３１３】
【表８６】
【０３１４】
【表８７】
【０３１５】
【表８８】
【０３１６】
【表８９】
【０３１７】
【表９０】
【０３１８】
【表９１】
【０３１９】
【表９２】
【０３２０】
【表９３】
【０３２１】
【表９４】
【０３２２】
【表９５】
【０３２３】
【表９６】
【０３２４】
【表９７】
【０３２５】
【表９８】
【０３２６】
【表９９】
【０３２７】
【表１００】
【０３２８】
【表１０１】
【０３２９】
【表１０２】
【０３３０】
【表１０３】
【０３３１】
【表１０４】
【０３３２】
【表１０５】
【０３３３】
【表１０６】
【０３３４】
【表１０７】
【０３３５】
【表１０８】
【０３３６】
【表１０９】
【０３３７】
【表１１０】
【０３３８】
【表１１１】
【０３３９】
【表１１２】
【０３４０】
【表１１３】
【０３４１】
【表１１４】
【０３４２】
【表１１５】
【０３４３】
【表１１６】
【０３４４】
【表１１７】
【０３４５】
【表１１８】
【０３４６】
【表１１９】
【０３４７】
【表１２０】
【０３４８】
【表１２１】
【０３４９】
【表１２２】
【０３５０】
【表１２３】
【０３５１】
【表１２４】
【０３５２】
【表１２５】
【０３５３】
【表１２６】
【０３５４】
【表１２７】
【０３５５】
【表１２８】
【０３５６】
表５
ＵＫ−０８８，８００をもつＰＤＥ５＊複合体の原子座標
原子番号、原子のタイプ、残基番号デカルト座標Ｘ，Ｙ，Ｚ，原子占有（Ｏ）、温度因子（Ｂ）、及び原子タイプ
【０３５７】
【表１２９】
【０３５８】
【表１３０】
【０３５９】
【表１３１】
【０３６０】
【表１３２】
【０３６１】
【表１３３】
【０３６２】
【表１３４】
【０３６３】
【表１３５】
【０３６４】
【表１３６】
【０３６５】
【表１３７】
【０３６６】
【表１３８】
【０３６７】
【表１３９】
【０３６８】
【表１４０】
【０３６９】
【表１４１】
【０３７０】
【表１４２】
【０３７１】
【表１４３】
【０３７２】
【表１４４】
【０３７３】
【表１４５】
【０３７４】
【表１４６】
【０３７５】
【表１４７】
【０３７６】
【表１４８】
【０３７７】
【表１４９】
【０３７８】
【表１５０】
【０３７９】
【表１５１】
【０３８０】
【表１５２】
【０３８１】
【表１５３】
【０３８２】
【表１５４】
【０３８３】
【表１５５】
【０３８４】
【表１５６】
【０３８５】
【表１５７】
【０３８６】
【表１５８】
【０３８７】
【表１５９】
【０３８８】
【表１６０】
【０３８９】
【表１６１】
【０３９０】
【表１６２】
【０３９１】
【表１６３】
【０３９２】
【表１６４】
【０３９３】
【表１６５】
【０３９４】
【表１６６】
【０３９５】
【表１６７】
【０３９６】
【表１６８】
【０３９７】
【表１６９】
【０３９８】
【表１７０】
【０３９９】
【表１７１】
【０４００】
【表１７２】
【０４０１】
【化１１】
【０４０２】
【化１２】
【０４０３】
略語
ｃＡＭＰ 環式アデノシンモノリン酸塩
ｃＧＭＰ 環式グアノシンモノリン酸塩
ＰＤＥ ホスホジエステラーゼ
ＰＧＫ タンパク質キナーゼＧ
ＭＡＤ 多重波長異常分散
ＰＣＲ ポリメラーゼ連鎖反応
２ＹＴ １リットルあたりトリプトン １６ｇ、酵母エキス １０ｇ、 ＮａＣｌ ５ｇの溶液
Ｔｒｉｓ トリス［ヒドロキシメチル］アミノ−メタン
Ｅ−６４ エポキシスクシニル−ｌ−リューシルアミド−（４−グアニジ ノ） タン
【０４０４】
ＤＴＴ ＤＬ−ジチトトレイトール
β−ＭＥ β−メルカプトエタノール
ＩＰＴＧ β−Ｄ−イソプロピル−チオガラクトピラノシド
ＥＤＴＡ エチレンジアミン四酢酸
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ビス［２−ヒドロキシエチル］イミノ−トリス ［ヒドロキシ メチル］メタン
ＰＥＧ ポリエチレングリコール
ＰＥＧ２ＫＭＭＥ ポリエチレングリコール２０００モノメチルエーテル
ｒｍｓｄ 標準偏差
ｒｐｍ 毎分回転数
Ｍｏｉ 感染の多重度
Ｓｉｌｄｅｎｆｉｌ ５−［２−エトキシ−５−（４−メチル−１−ピペラジニルス ルホニル）フェニル］−１−メチル−３−ｎ−プロピル−１， ６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７ −オン、これは１−［［３−（６，７−ジヒドロ−１−メチル −７−オキソ−３−プロピル−ｌＨ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ ピリミジン−５−イル）−４−エトキシフェニル］スルホニル ］−４−メチルピペラジン（欧州特許第Ａ−０４６３７５６号 参照）としても知られている。
ＵＫ−０９２，４８０ 「Ｓｉｌｄｅｎｆｉｌ」参照
ＵＫ−０８８，８００ ５−（２−エトキシフェニル）−１−メチル−３−プロピル− １，６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン −７−オン
【０４０５】
配列表
配列番号１
野生型ＰＤＥ５「ループ領域」
【化１３】
【０４０６】
配列番号２
野生型ＰＤＥ５触媒ドメイン
【化１４】
【０４０７】
配列番号３
全長野生型ＰＤＥ５配列
【化１５】
【０４０８】
配列番号４
野生型ＰＤＥ４「ループ領域」
ＨＰＧＶＳＮＱＦＬＩＮＴＮＳＥＬＡＬＭＹＮＤＥＳＶＬＥ
【０４０９】
配列番号５
ループスワップされたＰＤＥ５触媒ドメイン＝ＰＤＥ５*
【化１６】
【０４１０】
配列番号６
ＰＤＥ５*を含む全長ＰＤＥ５配列
【化１７】
【０４１１】
配列番号７
【化１８】
【０４１２】
配列番号８
【化１９】
【０４１３】
配列番号９
【化２０】
【０４１４】
配列番号１０
【化２１】
【０４１５】
配列番号１１
【化２２】
【０４１６】
配列番号１２
【化２３】
【０４１７】
配列番号１３
【化２４】
【０４１８】
配列番号１４
【化２５】
【図面の簡単な説明】
【０４１９】
【図１】図１は、ＰＤＥ５（上部配列）及びＰＤＥ４ｂ（下部配列）触媒ドメインのアライメントを示している。構造からのへリックスの位置及び付番は、各々についてマーキングされている。太字体の残基は、工学処理された領域についての配列アライメントを示している。ＰＤＥ４由来の配列は、ＰＤＥ５中の対応する領域を交換するために使用されてきた。こうして、この領域への残基の挿入という結果がもたらされる。下線は、ＰＤＥ５*中に不在のＣ−末端領域を強調している。
【図２】図２は、二次構造要素を示すタンパク質の全体的折畳みのリボン表現を示している。阻害物質は、全原子ステック表現で示され、金属イオンは球体として示されている。（Ａ）＝ＰＤＥ４ｂ、（Ｂ）＝野生型ＰＤＥ５＋Ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌ、（Ｃ）＝「ループスワップされた」ＰＤＥ５（ＰＤＥ５*）＋Ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌ。へリックスは、基準としてＰＤＥ４構造を用いて付番されている。へリックスＨ０−Ｈ７はサブドメイン１を形成し、へリックスＨ８−Ｈｌｌは、サブドメイン２を形成し、へリックスＨ１２−Ｈ１６はサブドメイン３を形成している。
【図３】図３： 活性部位領域での、アポＰＤＥ５*（「ループスワップされた」ＰＤＥ５）（左）及びＵＫ−０８８，８００でソーキングされたＰＤＥ５*（右）の２．５σで輪郭どりされたｆｏ−ｆｃ電子密度マップの比較。
【図４】図４： ＵＫ−０８８，８００、５−（２−エトキシフェニル）−ｌ−メチル−３−プロピル−１，６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オンの構造の二次元表現（Ｎ４上の水素のみが例示されている）。
【配列表】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ５）及びＰＤＥ５のリガンド複合体の結晶構造、及びＰＤＥ５阻害物質化合物を含むＰＤＥ５リガンドの同定におけるその使用に関する。本発明は同様に、かかるＰＤＥ５阻害物質化合物の同定方法及びその医学的使用にも関する。本発明はさらに、リガンドを中にソーキングできるＰＤＥ５の結晶及び結晶内にソーキングされたリガンドを含むＰＤＥ５の結晶に関する。同様に本発明により考慮されているのは、ＰＤＥ５阻害物質化合物を含むＰＤＥ５のリガンドの同定におけるリガンドを中にソーキングさせ得るＰＤＥ５の結晶の使用である。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
心筋収縮、血流調節、神経伝達、腺分泌、細胞分化及び遺伝子発現を含む多種多様な生物学的プロセスが、環状ヌクレオチドの生物学的な第２のメッセンジャｃＡＭＰ及びｃＧＭＰの定常状態レベルにより影響を受ける。これらの分子の細胞内レセプタには、環状ヌクレオチド依存性タンパク質キナーゼ（ＰＧＫ）（Lohmann et al., １９９７）、環状ヌクレオチドゲート付きチャンネル及びクラスＩホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）（Charbonneau１９９０）が含まれる。ＰＤＥは、Sutherland及びその共同研究者により最初に報告された（Rall & Sutherland １９５８，Butcher & Sutherland １９６２）大きなタンパク質ファミリである。環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼのファミリは、対応する５’モノホスファートへの３’，５’−環状ヌクレオチドの加水分解の触媒として作用する。最新の文献では、関連したものであるが生化学的には全く異なる１１のヒトホスホジエステラーゼ遺伝子群が存在すること、及びこれらの群の多くが複数の遺伝子亜型を含み、合計２０の遺伝子を提供していること、が示されている。一部のＰＤＥは、ｃＡＭＰの加水分解に対しきわめて高い特異性を有し（ＰＤＥ４、ＰＤＥ７、ＰＤＥ８）、一部はｃＧＭＰに対する高い特異性を有し（ＰＤＥ５、ＰＤＥ６、ＰＤＥ９）、一部は混合した特異性を有する（ＰＤＥ１、ＰＤＥ２、ＰＤＥ３、ＰＤＥ１０、ＰＤＥ１１）。
【０００３】
全てのＰＤＥはマルチドメインタンパク質であり、各ＰＤＥは、ファミリ間で高度のアミノ酸配列保存をもつＣ末端に向かって位置設定された最高２７０のアミノ酸ドメインを有する（Charbonneau １９８６）。このドメインは、広範に研究されてきており、共通の触媒機能を担当することが示されてきた（Francis, S.H et al.,１９９４）。タンパク質の残りのものの中の非相同セグメントは、調節機能を有し、そうでなければ特異的結合特性を付与する。ＰＤＥ２、ＰＤＥ５、ＰＤＥ６及びＰＤＥ１０は全て、その調節アミノ末端部分の内部に推定上のＧＡＦドメインを含有することが報告されている（Aravind & Ponting １９９７及びSoderling & Beavo ２０００）。これらのＧＡＦドメインは、ｃＧＭＰに結合することが示されてきているが、それらの機能はなお充分に理解されていない。これまでに特徴づけされてきた全長哺乳動物 ＰＤＥは、溶解状態で２量体であるが、２量体構造の関連性はわかっていない。ｃＧＭＰに結合したＰＤＥ２Ａの調節セグメントは最近解明されており、ｃＧＭＰが各単量体上の２つのＧＡＦドメインのうちの１つにのみ結合している状態で４つのＧＡＦドメインの平行２量体を明らかにしている（Martinez et al. ２００１）。
【０００４】
ｃＧＭＰ特異的ＰＤＥであるＰＤＥ５が、近年重要な治療標的として認識されてきている。それは、ｃＧＭＰの分割の触媒として作用する保存されたＣ末端、亜鉛含有触媒ドメイン、及び２つのＧＡＦドメイン反復を含有するＮ末端調節部分で構成されている。各々のＧＡＦドメインは、１つは高親和性でもう１つは比較的低い親和性をもつｃＧＭＰ結合部位を含有する。ＰＤＥ５活性は、高及び低親和性のｃＧＭＰ結合部位に対するｃＧＭＰの結合とそれに続く、両方の部位が占有されている場合にのみ起こるリン酸化を通して調節される（Thomas et al. １９９０）。ＰＤＥ５は、血小板、血管及び内臓の平滑筋及び骨格筋を含む数多くの組織の中で変動する濃度で見い出される。タンパク質は、勃起性海綿体組織の平滑筋の中のｃＧＭＰレベルの重要なレギュレータである。勃起の生理学的メカニズムには、性的刺激の間の海綿体内の一酸化窒素（ＮＯ）の放出が関与している。このときＮＯは、酵素グアニル酸シクラーゼを活性化し、これがｃＧＭＰのレベルを増加させ、海綿体内の平滑筋の弛緩を生成し、血液の流入を可能にする。ＰＤＥ５の阻害は、ｃＧＭＰの分解を阻害し、ｃＧＭＰのレベルひいては平滑筋弛緩を維持できるようにする（Corbin & Francis １９９９）。Viagra（登録商標）の活性成分でありＰＤＥ５の強力な阻害物質であるＳｉｌｄｅｎａｆｉｌ（ＵＫ−０９２，４８０）は、男性の勃起不全の有効な治療のため広く注意をひいてきた。ｃＡＭＰ特異的ＰＤＥであるＰＤＥ４ｂの触媒ドメインについての構造情報が近年示されてきた（Ｘｕ et al.２０００）。この構造はＰＤＥファミリの触媒ドメインの全体的折畳みについての情報を提供するが、これまでのところ、潜在的阻害物質の酵素に対する結合の仕方については、いかなる構造的情報も示されていない。
【０００５】
Ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌとの複合体中の触媒ドメインを含む組換え型ＰＤＥ５のＸ線構造は、決定されている（本書に援用する先の関連特許出願第ＰＣＴ／ＩＢ０２／００４４２６号；例９「Ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌを用いた野生型ＰＤＥ５触媒ドメインの結晶化」、４４頁２９行目〜４５頁１７行目；例１３「Ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌを用いた野生型ＰＤＥ５のデータ収集、構造決定及び精製」、４８頁１行目〜４９頁９行目；表４、９１頁〜２４８頁を参照のこと）。リガンド複合物の結晶の産生のための改善された品質を示すこのＰＤＥ５の工学処理された一形態であるＰＤＥ５*も同じく産生されてきており、かかる複合体の構造は決定されている（本書に援用する、出願番号ＰＣＴ／ＩＢ０２／０４４２６；例１１、「Ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌを用いたＰＤＥ５*の結晶化」４６頁８行目〜２５行目；例１５「Ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌを用いたＰＤＥ５*のデータ収集、構造決定及び精密化」５０頁、９行目〜５１頁６行目；及び表６「Ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌを用いたバキュロウイルス発現されたＰＤＥ５*複合体についての原子座標」、３２８頁〜４０８頁を参照のこと）。これらの複合体は、この新規のタンパク質ファミリについての重要な構造的情報を提供するのみならず、ＰＤＥが１つの役割を果たしている数多くの疾病を治療するべくＰＤＥのより強力で特異的な阻害物質の設計をも援助することができる。
【０００６】
分子解像度レベルそして好ましくは原子解像度での特異的リガンド相互作用の詳細を得るために、そのリガンドとの複合体の形で生物学的高分子の結晶を得ることができることが望ましい。これは、高分子のさらなる、そして場合によっては改善されたリガンドをそれに基づいて設計しその後さらなる結晶化ラウンド内でテストし得る情報を提供する上で非常に重要な段階を不変的に形成している。従って、高分子の複合体を得るこのプロセスが高速で再現可能であり、かつ各々の潜在的複合体について新しい結晶化条件をつねに見い出すか又は各々の潜在的複合体構造の解明のための複雑で時間集約的な構造ソリューション方法を使用する必要性を最小限におさえるものであることが最も望ましい。この目的で、問題の高分子の最も好ましい結晶形態は、アポ高分子の予め形成された結晶中にソーキングされた潜在的リガンドを有する確率の高い形態である。このことは、従来産生されてきた共結晶に比べ全く異なる利点を有する。特に、各々の潜在的複合体のために新しい結晶条件を発見する必要性が全く無い。
【０００７】
各々の新しいリガンド複合体についての細胞寸法及び格子対称性は、アポ高分子に関して実質的に同じとなり、従って、アポ及び全複合体結晶についてのデータ収集パラメータは基本的に同一となる。このとき構造ソリューションは、高速差フーリエ法を用いて行なうことができ、かくして、より込み入った時間及び労働集約的位相決定方法が避けられる。従って、高分子のソーキング可能な結晶は、新しい高分子−リガンド複合体の特に高速のスクリーニング及び構造決定を可能にする。
【０００８】
ＰＤＥ５の工学処理された形態であるＰＤＥ５*は、リガンド複合体のソーキング可能な結晶の産生を可能にし、このようなソーキングされたＰＤＥ５*−リガンド複合体の構造は決定されている。
【発明の開示】
【０００９】
発明の要約
ＰＤＥ５は結晶化可能であることがわかっている。同様に、野生型ＰＤＥ５アミノ酸配列を操作することによってＰＤＥ５の結晶化を容易にできるということも発見されてきた。特定的に言うと、ＰＤＥ５アミノ酸配列の或る部分の操作によりＰＤＥ５の結晶化が容易になることが発見された。さらに特定的には、ＰＤＥ５のアミノ酸配列の特定の操作は、結晶ソーキングプロセスにより潜在的ＰＤＥ５リガンドを中に導入できるＰＤＥ５のソーキング可能な結晶形態を提供することができる、ということが示されてきた。野生型ＰＤＥ５アミノ酸の操作の結果、配列修飾済みＰＤＥ５タンパク質が結果として得られる。
【００１０】
ＰＤＥ５の触媒ドメイン特にＰＤＥ５の６５７−６８２領域（「ループ領域」）の操作によってＰＤＥ５の結晶化を容易にし、特にＰＤＥ５のソーキング可能な結晶を提供することができるということが示されてきた。さらに特定的に言うと、ＰＤＥ５のループ領域アミノ酸配列（ＨＲＧＶＮＮＳＹＩＱＲＳＥＨＰＬＡＱＬＹＣＨＳＩＭＥ＝配列番号１）の操作により、ＰＤＥ５の結晶化を容易にし、ＰＤＥ５のソーキング可能な結晶を提供することが可能である。この操作は、ＰＤＥ５ループ領域の単数又は複数のアミノ酸残基の欠失、付加又は置換によって達成でき、そうでなければ、もう１つのタンパク質、好ましくはもう１つのＰＤＥ、より好ましくはＰＤＥ４、最も好ましくはＰＤＥ４ｂからのループ領域（又はその他のアミノ酸配列）でのＰＤＥ５ループ領域の完全な交換によって達成可能である。
【００１１】
ＰＤＥ５の結晶は、出願第ＰＣＴ／ＩＢ０２／０４４２６号（例９「Ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌを用いた野生型ＰＤＥ５触媒ドメインの結晶化」、４４頁２９行目〜４５頁１７行目；例１１、「Ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌを用いたＰＤＥ５*の結晶化」４６頁８行目〜２５行目；例１３「Ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌを用いた野生型ＰＤＥ５のデータ収集、構造決定及び精密化」、４８頁１行目〜４９頁９行目；例１５*Ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌを用いたＰＤＥ５*のデータ収集、構造決定及び精密化」、５０頁、９行目〜５１頁６行目；表４「Ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌと複合された野生型ＰＤＥ５についての原子座標」９１頁〜２４０頁；及び表６の「Ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌを用いたバキュロウイルス発現されたＰＤＥ５*複合体についての原子座標」、３２８頁〜４０８頁を参照のこと）の中で示されているように、ＰＤＥ５リガンド（例えばＰＤＥ５阻害物質）とＰＤＥ５を共結晶化することによって、又は（ｉｉ）本発明で示されているように−ＰＤＥ５の結晶内にＰＤＥリガンド（例えばＰＤＥ５阻害物質）をソーキングすることによって、ＰＤＥ５リガンド特にＰＤＥ５阻害物質についてスクリーニングするために有用であることが発見されてきた。
【００１２】
本発明の方法によって同定されるようなＰＤＥ５リガンド特にＰＤＥ５−阻害物質は、治ゆ、苦痛緩和又は予防目的の処置において有用である。
【００１３】
かくして、本発明は、以下の（付番された）態様を提供する。
【００１４】
態様
１．結晶がソーキング可能であるホスホジエステラーゼ５（ＰＤＥ５）の結晶。
【００１５】
２．前記ＰＤＥ５が哺乳動物由来である、態様１に記載のＰＤＥ５の結晶。
【００１６】
３．前記ＰＤＥＳがヒト由来である、態様１及び２に記載のＰＤＥ５の結晶。
【００１７】
４．前記ＰＤＥ５が、ＰＤＥ５Ａ１、ＰＤＥ５Ａ２、ＰＤＥ５Ａ３及びＰＤＥ５Ａ４から成る群の中から選択されたイソ型である、態様１〜３のいずれか１つの記載のＰＤＥ５の結晶。
【００１８】
５．前記ＰＤＥ５が配列番号１（ＰＤＥ５ループ領域）又はその相同体、フラグメント、変異体、類似体又は誘導体を含む、態様１〜４のいずれか１つに記載のＰＤＥ５の結晶。
【００１９】
配列番号１は、ＰＤＥ５のいわゆる「ループ領域」である。このループ領域又はその相同体、フラグメント、変異体、前記Ｐ又は誘導体は、ループ領域内に含まれるアミノ酸残基の付加、欠失又は置換を内含する。
【００２０】
好ましくは、本発明のＰＤＥ５結晶のアミノ酸配列との関係における変異体は、配列番号１（ＨＲＧＶＮＮＳＹＩＱＲＳＥＨＰＬＡＱＬＹＣＨＳＩＭＥ）内で太字下線付きで示されているようなヒスチジン（Ｈｉｓ／Ｈ）残基の欠失又は置換を内含している。前記ヒスチジン（Ｈ）残基の交換は、好ましくは単数又は複数のアミノ酸残基（ヒスチジン以外）を取込むことによるものであり、ここで好ましくは前記アミノ酸残基は中性又は非極性である。
【００２１】
より好ましくは、本発明のＰＤＥ５の結晶のアミノ酸配列との関係における変異体は、もう１つのタンパク質、好ましくはＰＤＥ、より好ましくはＰＤＥ４、最も好ましくはＰＤＥ４ｂ（以下参照）由来のループ領域（又はその他のアミノ酸配列）でのループ領域の完全な置換を含む。
【００２２】
６．前記ＰＤＥ５が配列番号４（ＰＤＥ４ループ）又はその相同体、フラグメント、変異体、類似体又は誘導体を含む、態様１〜５のいずれか１つに記載のＰＤＥ５の結晶。
【００２３】
７．前記ＰＤＥ５が配列番号５（ＰＤＥ５*＝ループスワップされたＰＤＥ５触媒ドメイン）又はその相同体、フラグメント、変異体、類似体又は誘導体を含む、態様１〜６のいずれか１項に記載のＰＤＥ５の結晶。
【００２４】
８．前記ＰＤＥ５が配列番号６（ＰＤＥ５*を含むＰＤＥ５配列）又はその相同体、フラグメント、変異体、類似体又は誘導体を含む、態様１〜７のいずれか１項に記載のＰＤＥ５の結晶。
【００２５】
９．ポリエチレングリコールを沈殿剤として用いて成長させる、態様１〜８のいずれかに記載のＰＤＥ５の結晶。一般的には、分子量２０００〜８０００のポリエチレングリコールが使用される。好ましくは、ポリエチレングリコールの分子量は、４０００である。ポリエチレングリコールは、１０％〜３０％の間の濃度であり得るが、最も好ましくは２０％である。付加的には、結晶を成長させるのに用いられるＰＤＥ５タンパク質は１〜２０mg／mlの間、好ましくは５〜１５mg／mlの間の濃度のものであることが望まれ、最も好ましくは１０mg／mlの濃度である。
【００２６】
１０．６．５〜８．０のｐＨ範囲内の緩衝液中で成長する、態様１〜９のいずれかに記載のＰＤＥ５の結晶。好ましくは、ｐＨは７．０〜７．８の範囲内にあり、最も好ましくはｐＨは７．４である。緩衝液は、所要ｐＨ範囲全体にわたる緩衝能力を提供するもの、好ましくはＨＥＰＥＳであるべきである。
【００２７】
１１．アルコールの存在下で成長させる態様１〜１０のいずれかに記載のＰＤＥ５の結晶。好ましくはアルコールは、イソプロパノールである。
【００２８】
１２．ＨＥＰＥＳ緩衝液、ポリエチレングリコール４０００及びイソプロパノールを含有する溶液内で成長させる態様１〜１１のいずれかに記載のＰＤＥ５の結晶。好ましくは、溶液はｐＨ７．４の０．１ＭナトリウムＨＥＰＥＳ、２０％のポリエチレングリコール４０００及び１０％のイソプロパノールを含有する。結晶は、室温（２０―２５℃）以下でインキュベートされた溶液から成長する。好ましくは、結晶は、２〜６℃の範囲内の温度でインキュベートされた溶液から成長する。より好ましくは、結晶は約４℃でインキュベートされた溶液から成長する。
【００２９】
ソーキング可能な結晶は、透析、シッティングドロップ蒸気拡散法又はバッチ方法、微結晶化方法、マイクロ又はマクロ播種方法又はゲル結晶化方法といったようなさまざまな方法を用いて成長させることができるが、好ましくはハンギングドロップ蒸気拡散を用いて成長させる。
【００３０】
１３．（ａ）空間群Ｃ２；
（ｂ）単位格子寸法ａ〜５６ű１％，ｂ〜７７ű１％，ｃ〜８１ű１％，α＝γ＝９０°，β＝１０３°±１％；
（ｃ）１非対称単位あたり１分子；
（ｄ）約４０ｋＤａ±２ｋＤａの分子量のＰＤＥ５を含む；
（ｅ）約４４±５％の計算上の溶剤含有量；及び
（ｆ）単斜晶系；
といった特徴のうちの１以上を有する、態様１〜６のいずれか１つに記載のＰＤＥ５の結晶。
【００３１】
１４． ＰＤＥ５が、図２に示されているようなヘリックス１１及び１２ａ（Ｈ１２ａ７２５〜７３１）の間のループ領域に沿ってヘリックス１５（Ｈ１５ ８１３〜８２４）及び１４（Ｈ１４ ７７２〜７９７），ヘリックス１３（Ｈ１３ ７４９〜７６５）のＣ末端及びヘリックス１１（Ｈ１１ ７０６〜７２１）のＣ末端を境界とするタンパク質の第３のサブドメイン内に活性部位を有する、態様１〜１３のいずれか１つに記載のＰＤＥ５の結晶。
【００３２】
１５．活性部位がピラゾロ−ピリミジノンを収容する能力を有する、態様１４に記載のＰＤＥ５の結晶。好ましいピラゾロ−ピリミジノンの一例としては、ＵＫ−０８８，８００がある。
【００３３】
ＵＫ−０８８，８００は図４に例示されており、５−（２−エトキシフェニル）−１−メチル−３−プロピル−１，６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ〔４．３−ｄ〕ピリミジン−７−オンという化学名をもつ化合物の構造的表現である。
【００３４】
１６．ＰＤＥ５がタンパク質の第３サブドメイン内部で活性部位を有し、Ｌｅｕ７６５、Ａｌａ７６７及びＩｌｅ７６８、ならびにＰｈｅ８２０、Ｖａｌ７８２、Ｐｈｅ７８６、Ｔｙｒ６１２、Ｌｅｕ８０４、Ａｌａ７７９、Ａｌａ７８３、Ｉｌｅ８１３、Ｍｅｔ８１６及びＧｌｎ８１７のうちの１以上を含んでいる、態様１〜１５のいずれか１つに記載のＰＤＥ５の結晶。
【００３５】
１７．活性部位がピラゾロ−ピリミジノンを収容する能力を有する、態様１６に記載のＰＤＥ５の結晶。好ましいピラゾロ−ピリミジノンの一例としては、ＵＫ−０８８，８００がある。
【００３６】
１８．タンパク質が、任意の基準枠内で発現されるような誘導体セット又は表４（ＰＤＥ５*アポＣ２形態）で記されている原子座標により特徴づけされる３次元構造を有する、態様１〜１７のいずれか１つに記載のＰＤＥ５の結晶。
【００３７】
１９．態様１〜１８のいずれか１つに記載のＰＤＥ５の結晶の重原子誘導体。
【００３８】
２０．ＰＤＥ５リガンドが中にソーキングされている、態様１〜２０のいずれかに記載のＰＤＥ５の結晶。ソーキングプロセスには、ソーキングされるべき結晶を、それが中で成長させられる溶液から、リガンドを含有するか又は中にひとたび結晶が存在した時点でそれに対しリガンドが付加される安定化溶液へと移す段階が関与し得る。安定化用溶液は、移送された時点で結晶がその構造的無欠性を保持し、ひび割れしたり溶解したりせず又その結晶パラメータ、対称性又は結晶寸法を著しく改変しないような物理的特性を有していることが望まれる。好ましくは、安定化溶液は、結晶を成長させる元となる化学成分の一部又は全てを含む。より好ましくは、安定化溶液は、上述の態様９〜１２で記されている結晶成長のために使用された溶液と類似の又は同一の組成のものであるが、使用された沈殿剤の濃度はわずかに増大させることができる。最も好ましくは、安定化溶液は、結晶成長溶液と同じｐＨをもつ。リガンドは、固体としてか又は液体形態で（すなわちリガンドはすでに溶解状態にある）ソーキングするため結晶を含有する溶液又は今後結晶を含有すべき溶液に添加することができる。好ましくは、リガンドは溶解状態にあり、溶剤は、水性、有機性又は無機性であり得る。最も好ましくは、リガンドはＤＭＳＯである。リガンドは、一般にＰＤＥ５によるリガンドについての予測される結合定数より高い最終リガンド濃度を生成するべくソーキング用溶液に添加される；好ましくは、これは、結合定数の１０倍以上である。結晶ソーキング用溶液中に存在するリガンドの最終濃度は、好ましくは０．１〜２０mg／ml、より好ましくは０．５〜１０mg／ml、最も好ましくは１〜５mg／mlの間である。
【００３９】
２１．前記ＰＤＥ５リガンドがＰＤＥ５阻害物質である、態様２０に記載のＰＤＥ５の結晶。
【００４０】
２２．前記ＰＤＥ５阻害物質がピラゾロピリミジノン、好ましくはＵＫ−０８８，８００である、態様２１に記載のＰＤＥ５の結晶。
【００４１】
２３．タンパク質が、任意の基準枠内で発現されているような誘導体セット又は表５（ＰＤＥ５*−ＵＫ−０８８，８００複合体）で記されている原子座標により特徴づけされる３次元構造を有する、態様２２に記載のＰＤＥ５の結晶。
【００４２】
２４．ＰＤＥ５又は突然変異体、誘導体、変異体、類似体、相同体、サブドメイン又はフラグメントの３次元構造を誘導するための、態様２２〜２３のいずれか１つに記載のＰＤＥ５の結晶から決定された原子座標の使用。
【００４３】
２５．ＰＤＥ５サブドメインが触媒ドメインである、態様２４に記載の使用。
【００４４】
２６．ＰＤＥ５上の活性部位を伴う化学的化合物の結合相互作用を計算によってか又はその他の形で評価することを目的とした、態様２４又は態様２５に従って誘導可能であるようなＰＤＥ５の３次元構造の使用。
【００４５】
２７．ＰＤＥ５と会合する能力をもつ化合物を設計するための態様２６に従って誘導可能であるようなＰＤＥ５の３次元構造の使用。好ましくは、前記化合物は、ピラゾロ−ピリミジノン、より好ましくはＵＫ−０８８，８００である。
【００４６】
２８．化合物がＰＤＥ５リガンドである、態様２６又は態様２７に記載の使用。
【００４７】
２９．前記化合物がＰＤＥ５阻害物質である、態様２８に記載の使用。
【００４８】
３０．前記ＰＤＥ５阻害物質がピラゾロ−ピリミジノン、好ましくはＵＫ−０８８，８００である、態様２９に記載の使用。
【００４９】
３１．潜在的ＰＤＥ５リガンド化合物の群の中からＰＤＥ５と会合する能力をもつ化合物を選択する方法において、
ｉ．潜在的ＰＤＥ５リガンド化合物を含有する溶液中に態様１〜１９のいずれか１つに記載のＰＤＥ５の結晶をソーキングする段階；
ｉｉ．ソーキングされた結晶から３次元構造を決定する段階；及び
ｉｉｉ．化合物がＰＤＥ５に結合しているか否かを査定する段階；
を含む方法。
【００５０】
３２．態様３１に従って使用することにより選択される化合物。
【００５１】
３３．態様２７〜３０のいずれか１つに記載の使用によって設計されるか又は態様３１の方法により同定される化合物。
【００５２】
ＰＤＥ５阻害物質である態様３３に記載の化合物。
【００５３】
３５．潜在的ＰＤＥ５リガンドの１群の中からＰＤＥ５リガンドを選択する方法において、
（ａ）態様２４又は態様２５にしたがって誘導可能であるようなＰＤＥ５の構造の３次元表現及び潜在的ＰＤＥ５リガンドの構造の３次元表現を計算により新規作成する段階、
（ｂ）潜在的ＰＤＥリガンドの３次元表現とＰＤＥ５構造の３次元表現を同時に表示する段階、
（ｃ）潜在的ＰＤＥ５リガンドの３次元表現がＰＤＥ５構造の活性部位の３次元表現に適合するか否かを評価する段階、
を含む方法。
【００５４】
好ましくは、リガンドは分子グラフィクスツールを用いて構築され、より好ましくは、設計されたリガンドは、同時表示及び分析に先立ちエネルギー最小化されている。
【００５５】
３６．（ｄ）生物学的ＰＤＥ５活性検定内に潜在的ＰＤＥ５リガンドを取込む段階；及び
（ｅ）前記検定において潜在的ＰＤＥ５リガンドがＰＤＥ５活性を変調させるか否かを決定する段階、
をさらに含んで成る、態様３５に記載の方法。
【００５６】
３７．前記潜在的ＰＤＥ５リガンドが潜在的ＰＤＥ５阻害物質であり、前記潜在的ＰＤＥ５阻害物質化合物がＰＤＥ５活性を阻害する、態様３５又は態様３６に記載の方法。
【００５７】
３８．態様３５〜３７のいずれか１つの方法によって選択されたＰＤＥ５リガンド。好ましくは、リガンドはＰＤＥ５阻害物質である。
【００５８】
３９．医薬品としての態様３８に記載のＰＤＥ５リガンドの使用。好ましくは、リガンドはＰＤＥ５阻害物質である。
【００５９】
４０．態様３８に記載の単数又は複数のＰＤＥ５リガンド及び１以上の薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
【００６０】
４１．ＰＤＥ５の阻害が予防的に又は治療的に有利である身体条件、疾病、障害又は不全の予防又は治療のための医薬の製造における態様３８に記載のＰＤＥ５リガンドの使用。
【００６１】
４２．前記障害が哺乳動物の性的障害である、態様４１に記載の使用。
【００６２】
本発明が考慮している治ゆ、苦痛緩和又は予防用処置としては、哺乳動物の性的障害の治ゆ、苦痛緩和又は予防用処置、特に男性勃起機能不全（ＭＥＤ）、陰萎、女性性的機能不全（ＦＳＤ）、陰核機能不全、女性性的欲求低下障害、女性の性的興奮障害（ＦＳＡＤ）、女性の性交疼痛障害又は女性オルガズム機能不全（ＦＳＯＤ）並びに精髄損傷に起因する性的機能不全又は選択的セロトニン再摂取阻害物質（ＳＳＲＩ）誘発性性的機能不全といったような哺乳動物の性的機能不全の治療が含まれるが、明らかに、ＰＤＥ５阻害物質が適応指示されているその他の医学的身体条件の治療にも有用であると思われる。かかる身体条件としては、早産、月経痛、良性前立腺過形成（ＢＰＨ）、膀胱排尿障害、失禁、安定、不安定及び異型（Ｐｒｉｎｚｍｅｔａｌ）狭心症、高血圧症、肺高血圧症、慢性閉塞性肺疾患、冠動脈疾患、うっ血性心不全、アテローム性動脈硬化症、例えば経皮経管的冠動脈形成術後（ｐｏｓｔ−ＰＴＣＡ）血管能力低下状態、末梢血管障害、脳卒中、硝酸塩誘発性耐性、気管支炎、アレルギー性喘息、慢性喘息、アレルギー性鼻炎、緑内障、視神経症、黄班変性症、眼内圧亢進、網膜又は動脈閉塞などの目の疾病及び身体条件並びに、例えば過敏性腸症候群（ＩＢＳ）などの消化管運動性障害を特徴とする疾患が含まれる。
【００６３】
ＰＤＥ５阻害物質が適応指示され本発明の化合物での治療が有用でありうるさらなる医学的身体条件としては、子癇前症、川崎症候群、硝酸塩耐性、多発性硬化症、糖尿病性腎症、自立性及び末梢性ニューロパシー、特に糖尿病性ニューロパシーを含むニューロパシー及びそれらの症候、例えば胃不全麻痺、末梢性糖尿病性ニューロパシー、アルツハイマー病、急性呼吸不全、乾癬、皮膚壊死、癌、転移、脱毛症、ナッツクラッカー形食道、裂肛、痔核、インシュリン耐性症候群、糖尿病、低酸素性血管収縮並びに血液透析中の血圧の安定化が含まれる。
【００６４】
特に好ましい身体条件としては、ＭＥＤ及びＦＳＤ（好ましくはＦＳＡＤ）が含まれる。
【００６５】
本発明のさらなる（付番された）態様としては、以下のものが含まれる：
４３．ＰＤＥ５の突然変異体、誘導体、フラグメント、変異体、類似体、相同体又は複合体の結晶構造を解明するための、態様１〜２３のいずれか１つに記載のＰＤＥ５の結晶から決定された原子座標の使用。
【００６６】
４４．ＰＤＥ５関連タンパク質の３次元構造のモデルを生成するための、態様１〜２３のいずれか１つに記載のＰＤＥ５の結晶から決定された原子座標の使用。
【００６７】
４５．その他のＰＤＥ５イソ型を模倣する部位特異的突然変異体又はその変異体を設計するための、態様２４又は態様２５に従って誘導可能であるようなＰＤＥ５の３次元構造の使用。
【００６８】
４６．ａ）緩衝液及びポリエチレングリコールを含む安定化用水溶液中で結晶をインキュベートする段階、
ｂ）好ましくは、化学化合物が固体又は液体形態、より好ましくは液体形態であり、最も好ましくはＤＭＳＯ中で可溶化されている安定化用溶液と化学的化合物を組合わせる段階及び、
ｃ）任意には、安定化用溶液に抗凍結剤を添加する段階、
を含む、態様１〜１９のいずれか１つに記載の結晶内に化学的化合物をソーキングさせる方法。
【００６９】
４７．安定化溶液が、分子量４０００であるポリエチレングリコールを含む、態様４６に記載の方法。ポリエチレングリコールは、１０％〜３０％の間の濃度であり得るが、最も好ましくは２０％である。付加的には、ｐＨは好ましくは７．０〜８．０の範囲内にあり、最も好ましくはｐＨは７．４である。緩衝液は、所要ｐＨ範囲全体にわたり緩衝力を提供する能力をもつものでなくてはならず、好ましくはＨＥＰＥＳである。好ましくは、安定化溶液はアルコールを含有する。最も好ましくは、これはイソプロパノールである。好ましくは、安定化溶液はｐＨ７．４の０．１ＭナトリウムＨＥＰＥＳ、２０％のポリエチレングリコール４０００及び１０％のイソ−プロパノールを含有する。適切な抗凍結剤の例としては、２−メチル−２，４−ペンタンジオール（ＭＰＤ）及び有機重合体例えば低分子量ＰＥＧがある。ソルビトール又はキシリトールといったような炭水化物及びアルコールも同様に使用可能である。好ましくは、抗凍結剤はグリセロールである。
【００７０】
態様３８に記載のＰＤＥ５リガンド（ＰＤＥ５阻害化合物としても知られている）（以下「化合物」と呼ぶ）は単独で投与できるが、ヒトの療法においては一般に、意図されている投与経路及び標準の薬学的実践方法に関して選択された適切な薬学的賦形剤、希釈剤又は担体との混和物の形で投与されることになる。かくして、本発明が考慮している薬学組成物、医薬品及び薬剤は、当業者にとって周知のさまざまなやり方で処方し、同様に周知の方法によって投与できるものである。
【００７１】
例えば、本発明の化合物は、持続性、２元性又は脈動性適用といった即時放出、遅延放出、修正放出又は制御放出のため、着香剤又は着色剤を含有し得る錠剤、カプセル（ソフトジェルカプセルを含む）、小卵（ovules）、エリキシル剤、溶液又は懸濁剤の形で、経口投与、口腔内投与又は舌下投与することができる。該化合物は、海綿体内注射を介しても投与可能である。該化合物は同様に、高速分散又は高速溶解剤形を介して又は高エネルギー分散の形で又はコーティングされた粒子としても投与可能である。化合物の適切な薬学的処方は、望まれる通りコーティングされた形態であってもコーティングされない形態であってもよい。
【００７２】
かかる錠剤は、微晶質セルロース、ラクトース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、第二リン酸カルシウム、グリシン及びでんぷん（好ましくは、コーン、ポテト又はタピオカでんぷん）、錠剤分割物質例えばグリコール酸ナトリウムデンプン、クロスカルメロースナトリウム及び一部のケイ酸塩複合体、及びポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、スクロース、ゼラチン及びアカシアなどの造粒結合剤といったような賦形剤を含有し得る。さらには、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、グリセリルベヘネート及びタルクといったような潤滑剤も含み得る。
【００７３】
類似のタイプの固体組成物も、ゼラチンカプセル中の充填材として利用可能である。この点において好ましい賦形剤としては、ラクトース、でんぷん、セルロース、乳糖又は高分子量ポリエチレングリコールが含まれる。水性懸濁液及び／又はエレキシル剤のためには、化合物をさまざまな甘味料又は着香剤、着色物質又は染、乳化剤及び／又は懸濁剤及び水、エタノール、プロピレングリコール及びグリセリンといった希釈剤、及びそれらを組合せたものと組合せることができる。
【００７４】
修正放出及び脈動性放出の剤形は、コーティングされかつ／又は装置の本体内に内含される放出速度調整剤として作用する付加的な賦形剤と合わせて、即時放出型剤形について詳述されたもののような賦形剤を含有する。放出速度調整剤には、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、酢酸セルロース、酸化ポリエチレン、キサンタンゴム、カルボマー、アンモニオメタクリレート共重合体、水素化ヒマシ油、カルナバろう、パラフィンろう、酢酸セルロースフタラート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタラート、メタクリル酸共重合体及びそれらの混合物が含まれるが、これらに排他的に制限されるわけではない。修正放出型及び脈動性放出型剤形は、放出速度調整用賦形剤のうちの１つ又はその組合せを含有し得る。放出速度調整用賦形剤は、剤形内部すなわちマトリクス内部に及び／又はその剤形の上すなわち表面又はコーティングの上の両方に存在し得る。
【００７５】
高速分散又は溶解用投薬量処方（ＥＤＤＦ）は以下の成分を含有し得る；アスパルターム、アセスルファムカリウム、クエン酸、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、２アスコルビン酸、アクリル酸エチル、エチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチル セルロース、ステアリン酸マグネシウム、マンニトール、メタクリル酸メチル、ミント香味料、ポリエレングリコール、ヒュームドシリカ、二酸化ケイ素、グリコール酸ナトリウムデンプン、フマル酸ナトリウムステアリル、ソルビトール、キシリトール。FＤＤＦを説明するために本書で使用されている通りの分散用又は溶解用という語は、使用される薬物の可溶性によって左右され、薬物物質が不溶性である場合、高速分散用剤形を調製でき、薬物物質が可溶である場合、高速溶解用剤形を調製することができる。
【００７６】
化合物は同様に、非経口的に、例えば海綿体内、静脈内、動脈内、腹腔内、髄腔内、脳室内、尿道内、頭がい内、筋内又は皮下で投与することもでき、そうでなければ、輸液又は無針注射技術により投与することもできる。このような非経口投与のためには、これらは、例えば溶液を血液と等張にするのに充分な塩又はグルコースといったその他の物質を含有し得る無菌水溶液の形で最もうまく使用される。水溶液は、必要とあらば適切に緩衝（好ましくは３〜９のｐＨに）されているべきである。無菌条件下の適切な非経口処方の調製は、当業者にとって周知の標準的な薬学的技術によって容易に達成される。
【００７７】
ヒトの患者への経口及び非経口投与のためには、化合物の１日投薬量レベルは、通常１０〜５００mg（単回用量又は分割用量で）となる。
【００７８】
かくして例えば、該化合物の錠剤又はカプセルは、適宜単回で、又は一度に２回以上の投与のため５mg〜２５０mgの活性化合物を含有し得る。いずれの場合でも、医師は、任意の個々の患者に最も適切であると思われる実際の投量を決定し、それは特定の患者の年令、体重及び応答性によって変動することになる。上述の投薬量は、平均的ケースの例である。当然のことながら、より高い又はより低い投薬量範囲に値する個々のケースも存在し得、このようなケースも本発明の範囲内に入る。当業者は同様に、（ＭＥＤ及びＦＳＤを含む）或る種の身体条件の治療において、該化合物を「要求通り」のベース（すなわち必要又は要望に応じたベース）で単回用量として摂取させることができる、ということも認識することだろう。
【００７９】
該化合物は同様に、鼻腔内投与又は吸入により投与することもでき、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、ヒドロフルオロアルカン例えば１，１，１，２−テトラフルオロエタン（ＨＦＡ１３４ＡTM又は１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン（ＨＦＡ２２７ＥＡTM）２酸化炭素、又はその他の適切な気体などの適切な推進剤を使用して加圧コンテナ、ポンプ、スプレー又はネブライザから乾燥粉末吸入器又はエアゾルスプレー提示の形で、適切に送達される。加圧エアゾルの場合、投薬量単位は、計測された量を送達するべくバルブを備えることにより決定可能である。加圧コンテナ、ポンプ、スプレー又はネブライザは、例えば、付加的に潤滑剤例えばトリオレイン酸ソルビタンを含有しうる溶剤として推進剤とエタノールの混合物を用いる活性化合物の溶液又は懸濁液を収納し得る。吸入器又は吹送器内で使用するための（例えばゼラチンで作られた）カプセル及びカートリッジを、ラクトース又はでんぷんといったような適切な粉末ベース及び本発明の化合物の粉末混合物を収納するように処方することができる。
【００８０】
エアゾル又は乾燥粉末処方は、好ましくは、各々の計測済み用量又は「パフ」が、患者への送達のため本発明の化合物を１〜５０mgを含有するような形で準備される。エアゾルでの全体的日用量は、１〜５０mgの範囲内にあり、これは、単回用量で又はさらに通常は一日全体を通した分割用量の形で投与可能である。
【００８１】
該化合物は同様にアトマイザを介しての送達のために処方され得る。アトマイザ用の処方は可溶化剤又は懸濁剤として、水、エタノール、グリセロール、プロピレングリコール、低分子量ポリエチレングリコール、塩化ナトリウム、フルオロカーボン、ポリエチレングリコールエーテル、トリオレイン酸ソルビタン、オレイン酸を含有し得る。
【００８２】
代替的には、該化合物は、座薬又はペッサリーの形で投与でき、そうでなければゲル、ヒドロゲル、ローション、溶液、クリーム、軟こう又は散布剤の形で局所施用可能である。化合物は同様に皮ふ投与することもできる。化合物は又、例えば皮ふ用パッチ剤を使用することによって経皮的に投与することもできる。該化合物は同様に、眼科、肺又は直腸経路により投与することもできる。
【００８３】
眼科用途のためには、該化合物を、等張でｐＨ調整された無菌食塩水中の微粉末化された懸濁液として、又は好ましくは、任意には塩化ベンジルアルコニウムといったような防腐剤と組合わせた形で、等張でｐＨ調整された無菌食塩水中の溶液として処方可能である。代替的には、化合物をペトロラタムといったような軟膏の形で処方することも可能である。
【００８４】
皮膚に対する局所施用のためには、本発明の化合物を、例えば鉱油、液体ペトロラタム、白色ペトロラタム、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン化合物、乳化用ろう及び水のうちの単数又は複数のものとの混合物の中に懸濁された又は溶解された活性化合物を含有する適切な軟こうとして処方することができる。代替的には、例えば鉱油、、モノステアリン酸ソルビタン、ポリエチレングリコール、液体パラフィン、ポリソルバート６０、セチルエステルろう、セテアリールアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコール及び水のうちの単数又は複数のものの混合物の中に懸濁又は溶解させられた適切なローション又はクリームとして処方可能である。
【００８５】
該化合物は同様に、シクロデキストリンとの組合せの中で使用することもできる。シクロデキストリンは、薬物分子との封入及び非封入複合体を形成するものとして知られている。薬物−シクロデキストリン複合体の形成は、薬物分子の可溶性、溶解速度、生物学的利用能及び／又は安定性特性を修正する可能性がある。薬物−シクロデキストリン複合体は一般に、大部分の投薬量形態及び投与経路のために有用である。薬物との直接的複合体形成の代替案として、例えば担体、希釈剤又は可溶化剤としてといったように１つの補助的添加剤としてシクロデキストリンを使用することができる。アルファ、ベータ及びガンマシクロデキストリンが最も一般的に使用され、適切な例は、ＷＯ−Ａ−９１／１１１７２、ＷＯ−Ａ−９４／０２５１８及びＷＯ−Ａ−９８／５５１４８の中で記述されている。
【００８６】
一般に、ヒトにおいては、化合物の経口投与が最も好ましい経路であり、最も便利でかつ例えばＭＥＤにおいては、海綿体内（ｉ．ｃ．）投与に付随する周知の欠点を回避する。標準的な男性についてのＭＥＤにおける好ましい経口投薬計画は、必要時の２５〜２５０mgの化合物である。レシピエントがえん下障害又は経口投与後の薬物吸収障害を患っている状況においては、薬物を非経口、舌下又は口腔内投与することができる。
【００８７】
獣医での使用のためには、化合物又はその獣医学的に受容可能な塩、又はその獣医学的に受容可能な溶剤和物又はプロドラッグは、通常の獣医学的実践方法に従って適切に受容可能な処方として投与され、獣医は、特定の動物にとって最も適切であると思われる投薬計画及び投与経路を決定することになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８８】
本発明は、以下の付番された好ましい態様を提供する。
【００８９】
１．図４に表わされた構造式の化合物が、タンパク質の活性部位に結合されるような形でその中にソーキングされ得る、配列番号４を含む配列修飾されたＰＤＥ５タンパク質の結晶。
【００９０】
本書で使用される「配列修飾されたＰＤＥ５タンパク質」という語は、タンパク質の結晶化を容易にし、特にリガンドが結晶に入り結晶ソーキングのプロセス中にタンパク質の活性部位に結合できるような形でリガンドを含む溶液中に結晶をソーキングすることによって中にＰＤＥ５リガンド又は潜在的リガンドが導入され得るタンパク質のソーキング可能な結晶形態を提供するように操作された野生型ＰＤＥ５タンパク質アミノ酸配列を内含している。この用語は、ＰＤＥ５の触媒ドメインのアミノ酸配列、特定的にはＰＤＥ５の６５７〜６８７領域（「ループ領域」）又は配列番号１の操作の対象となったものでかつタンパク質の結晶化を容易にし、特にタンパク質のソーキング可能な結晶形態を提供するＰＤＥ５タンパク質を内含する。関連する操作には、ＰＤＥ５ループ領域の単数又は複数のアミノ酸残基の欠失、付加又は置換による操作が含まれる。かかる操作には例えば、単数又は複数のアミノ酸残基（ヒスチジン以外）特に中性で非極性であるアミノ酸残基を取込むように、配列番号１（ＨＲＧＶＮＮＳＹＩＱＲＳＥＨＰＬＡＱＬＹＣＨＳＩＭＥ）中に太字で示され下線が付いたヒスチジン（Ｈｉｓ／Ｈ）残基の欠失又は置換が含まれる。関連する操作には同様に、例えばＰＤＥ４といったようなもう１つのＰＤＥ、好ましくはＰＤＥ４ｂといったもう１つのタンパク質又はタンパク質配列からのループ領域（又はその他のアミノ酸配列）でのＰＤＥＳループ領域の完全な交換による操作も含まれる。配列修飾されたＰＤＥ５ タンパク質は、完全ＰＤＥ５配列の操作された配列又代替的にはＰＤＥ５配列のサブドメイン又はフラグメントの操作された配列を含むことができ、好ましくは、ＰＤＥＳ触媒ドメインの操作された配列である。
【００９１】
２．配列番号５を含む好ましい態様１に記載の結晶。
【００９２】
沈殿剤としてポリエチレングリコールを使用して成長させられる、好ましい態様１又は好ましい態様２に記載の結晶。分子量２０００〜８０００のポリエチレングリコールが一般に使用される。好ましくは、ポリエチレングリコールの分子量は４０００である。ポリエチレングリコールは、１０％〜３０％の間の濃度にあり得るが、最も好ましくは２０％である。付加的には、結晶を成長させるのに用いられるタンパク質は、１〜２０mg／mlの間、好ましくは５〜１５mg／mlの間の濃度のものであり、最も好ましくは１０mg／mlの濃度にある。
【００９３】
４．６．５〜８．０のｐＨ範囲内の緩衝液内で成長させられる好ましい態様１〜３のいずれか１つに記載の結晶。好ましくは、ｐＨは７．０〜７．８の範囲内にあり、最も好ましくはｐＨは７．４である。緩衝液は、要求されるｐＨ範囲全体にわたり緩衝力を提供する能力をもつものでなくてはならず、好ましくはＨＥＰＥＳである。
【００９４】
５．アルコールの存在下で成長させられる好ましい態様１〜４のいずれか１つに記載の結晶。好ましくは、アルコールはイソプロパノールである。
【００９５】
６．ＨＥＰＥＳ緩衝液、ポリエチレングリコール４０００及びイソプロパノールを含む溶液中で成長させられる、好ましい態様１〜５のいずれか１つに記載の結晶。好ましくは該溶液は０．１ＭのナトリウムＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、２０％のポリエチレングリコール４０００及び１０％のイソプロパノールを含有する。結晶は、室温（２０〜２５℃）以下でインキュベートされた溶液から成長させられる。好ましくは、結晶は２〜６℃の範囲内の温度でインキュベートされた溶液から成長させられる。より好ましくは、結晶は約４℃でインキュベートされた溶液から成長させられる。
【００９６】
７．（ｍ）空間群Ｃ２；
（ｎ）単位格子寸法ａ〜５６ű１％、ｂ〜７７ű１％、ｃ〜８１ű１％、α＝γ＝９０°、β＝１０３°±１％；
（ｏ）１非対称単位あたり１分子；
（ｐ）約４０ｋＤａ±２ｋＤａの分子量のタンパク質を含む；
（ｑ）約４４±５％の計算上の溶剤含有量；及び
（ｒ）単斜晶系；
といった特徴のうちの１以上を有する、好ましい態様１〜６のいずれか１つに記載の結晶。
【００９７】
８．タンパク質が、図２に示されているようなヘリックス１１及び１２ａ（Ｈ１２ａ７２５〜７３１）の間のループ領域に沿ってヘリックス１５（Ｈ１５ ８１３〜８２４）及び１４（Ｈ１４ ７７２〜７９７）、ヘリックス１３（Ｈ１３ ７４９〜７６５）のＣ末端及びヘリックス１１（Ｈ１１ ７０６〜７２１）のＣ末端を境界とするタンパク質の第３のサブドメイン内に活性部位を有する、好ましい態様１〜７のいずれか１つに記載の結晶。
【００９８】
９．タンパク質がその第３サブドメイン内部に活性部位を有し、Ｌｅｕ７６５、Ａｌａ７６７及びＩｌｅ７６８、ならびにＰｈｅ８２０、Ｖａｌ７８２、Ｐｈｅ７８６、Ｔｙｒ６１２、Ｌｅｕ８０４、Ａｌａ７７９、Ａｌａ７８３、Ｉｌｅ８１３、Ｍｅｔ８１６及びＧｌｎ８１７のうちの単数又は複数のものを含んでいる、好ましい態様１〜８のいずれか１つに記載の結晶。
【００９９】
１１．タンパク質が、任意の基準枠内で発現されるような誘導体セット又は表４で記されている原子座標により特徴づけされる３次元構造を有する、好ましい態様１〜９のいずれか１つに記載の結晶。
【０１００】
１２．ＰＤＥ５リガンドがその中にソーキングされた、好ましい態様１〜１１のいずれか１つに記載の結晶。ソーキングプロセスには、ソーキングすべき結晶を、それがＰで成長させられている溶液から、リガンドを含有するか結晶がその中にひとたび存在した時点でリガンドが結晶に入り好ましくはタンパク質の活性部位に結合するような形でリガンドが添加されることになる安定化溶液内へと移送する段階が関与し得る。安定化溶液は、移送された時点で結晶がその構造的無欠性を保持し、ひび割れしたり溶解したりせず又その結晶パラメータ、対称性又は結晶寸法を著しく改変しないような物理的特性を有していることが望まれる。好ましくは、安定化溶液は、結晶を成長させる元となる化学成分の一部又は全てを含む。より好ましくは、安定化溶液は、上述の態様３〜６で記されている結晶成長のために使用された溶液と類似の又は同一の組成のものであるが、使用された沈殿剤の濃度はわずかに１〜１０％の間の割合だけ増大させることができる。最も好ましくは、安定化溶液は、結晶成長溶液と同じｐＨをもつ。リガンドは、固体としてか又は液体形態で（すなわちリガンドはすでに溶解状態にある）ソーキングするため結晶を含有する溶液又は今後結晶を含有すべき溶液に添加することができる。好ましくは、リガンドは溶解状態にあり、溶剤は、水性、有機性又は無機性であり得る。最も好ましくは、リガンドはＤＭＳＯである。リガンドは、一般にＰＤＥ５によるリガンドについての予測される結合定数より高い最終リガンド濃度を生成するべくソーキング用溶液に添加される；好ましくは、これは、結合定数の１０倍以上である。結晶ソーキング用溶液中に存在するリガンドの最終濃度は、好ましくは０．１〜２０mg／ml、より好ましくは０．５〜１０mg／ml、最も好ましくは１〜５mg／mlの間である。任意には、データ収集前に結晶を凍結させる必要のある場合には、２−メチル−２，４−ペンタンジオール（ＭＰＤ）、アルコール及び有機重合体例えばより低分子量のＰＥＧ又はソルビトール又はキシリトールといったような炭水化物といった抗凍結剤をソーキング溶液に加えることも可能である。
【０１０１】
１３．タンパク質が、任意の基準枠内で発現されているような誘導体セット又は表５で記されている原子座標により特徴づけされる３次元構造を有する、好ましい態様１２に記載の結晶。
【０１０２】
１４．態様１〜１３のいずれか１つに記載の結晶の重原子誘導体。
【０１０３】
１５．ＰＤＥ５又は突然変異体、誘導体、変異体、類似体、相同体、サブドメイン又はフラグメントの３次元構造を誘導することを目的とした、態様１〜１４のいずれか１項に記載の結晶から決定された原子座標の使用。座標セット又はその一部分は、既知の方法に従って、構造的に類似した又は関連するタンパク質又はタンパク質サブドメイン又はフラグメントのＸ線結晶構造を決定するべく分子交換手順のための完全又は部分同期モデルを提供するために使用することができ、さらに、座標セットは、構造的に類似した又は関連したタンパク質又はタンパク質 サブドメイン又はフラグメントのＮＭＲ構造ソリューションのためのＮＭＲ割当てをそれに基づいて決定できる１つの構造モデルを提供してくれる。
【０１０４】
１６．サブドメインが触媒ドメインである、好ましい態様１５に記載の使用。
【０１０５】
１７．ＰＤＥ５のリガンドである化合物を同定する方法において、
ａ）好ましい態様１〜１４のいずれか１項に記載の結晶を提供する段階、
ｂ）化合物を結晶内にソーキングするのに貢献する条件下で化合物と結晶を接触させる段階、
ｃ）化合物が結果として得られたソーキングされた結晶内のタンパク質の活性部位に結合されているか否かをＸ線回折及び構造ソリューションを用いて決定する段階
ｄ）任意にはＰＤＥ５の阻害物質であるか否かを決定するためにリガンドを検定する段階、
を含む方法。
【０１０６】
結晶は、好ましい態様１２に記載の通りの条件下でソーキングされ得、結晶をＸ線回折し、直接的方法、重原子位相決定方法、単一又は多重異常分散、分子交換又は差フーリエ法といったような適切な任意の方法を適用することによって、Ｘ線結晶構造を決定することができる。タンパク質の活性部位におけるリガンドの存在又は不在は、電子密度マップ、例えばＸ線回折データから計算された差フーリエマップ又はオミットマップから決定できる。
【０１０７】
１８．化合物が図４に示されている通りの構造鋳型に基づいている、好ましい態様１７に記載の方法。
【０１０８】
１９．ＰＤＥ５と会合する能力をもつ化合物を設計する方法において、
（ａ）好ましい態様１〜１４のいずれか１項に記載の結晶の中に存在するタンパク質又はそのフラグメント又はそのサブドメインの構造の３次元表現を計算により新規作成する段階、
（ｂ）１つの化合物の構造の３次元表現を計算により新規作成する段階、
（ｃ）タンパク質構造の３次元表現と化合物構造の３次元表現を同時に表示する段階、
（ｄ）化合物構造の３次元表現がタンパク質構造の活性部位の３次元表現に適合するか否かを評価する段階、
（ｅ）任意には、ＰＤＥ５の阻害物質であるか否かを決定するべくリガンドを作り検定する段階、
を含む方法。
【０１０９】
２０．潜在的ＰＤＥ５リガンドの１群の中からＰＤＥ５リガンドを選択する方法において、
（ａ）好ましい態様１〜１４のいずれか１項に記載の結晶の中に存在するタンパク質又はそのフラグメント又はそのサブドメインの構造の３次元表現を計算により新規作成する段階、
（ｂ）リガンドの構造の３次元表現を計算により新規作成する段階、
（ｃ）タンパク質構造の３次元表現とリガンド構造の３次元表現を同時に表示する段階、
（ｄ）リガンド構造の３次元表現がタンパク質構造の活性部位の３次元表現に適合するか否かを評価する段階、
（ｅ）任意には、ＰＤＥ５の阻害物質であるか否かを決定するべくリガンドを作り検定する段階、
を含む方法。
【０１１０】
好ましい態様１９及び２０の好ましい実施形態に従うと、タンパク質の構造の３次元表現は、結晶のために決定された原子座標から直接誘導されてよく、好ましい態様８及び９に定義されているようにタンパク質の活性部位を同定するために適切に表示され得る。タンパク質の活性部位は、好ましくはタンパク質の活性部位を含む基及び原子と化合物のそれの間の良好なパッキング及び／又は結合相互作用及び／又は立体構造の衝突について検査することによって、タンパク質活性部位と化合物の間の適合度を探すべく類似の形で図形的にレンダリングされた化合物分子を活性部位内にドッキングできるような形で活性部位を含む原子の原子半径を表示するように、計算によって図形的にレンダリングすることができる。代替的には、結果として得られたドッキングされた化合物−タンパク質モデルを計算により分析して、適合を査定することもできるし、或るいは又例えば適合分析に先立ち活性部位内の化合物の適合を改善するためモデルのエネルギー最小化及び分子力学などによって計算によりこれを調整することもできる。
【０１１１】
２２．ＰＤＥ５の部位特異的突然変異体を設計するために好ましい態様１７に従って誘導可能であるような３次元構造の使用。
【０１１２】
本発明の好ましい態様の好ましい実施形態においては、好ましくは、その結晶のために決定された原子座標から直接誘導されうるように、好ましい態様１〜１４のいずれかに従った結晶中に存在するタンパク質又はそのフラグメント又はそのサブドメインの構造の３次元表現を計算により新規作成することによって、部位特異的突然変異体が設計される。該モデルには、例えば構造間の既知の安定したループ又は領域で既知の不安定なループ又は領域を置換するためといったように、タンパク質の物理的特性を改変するべく知識に基づいてモデル間でのアミノ酸又はペプチド領域全体の置換を可能にする目的で、類似した又は関連するタンパク質又はタンパク質配列フラグメントのモデルのオーバーレイされていてもよいし、又はこのモデルに対し最小二乗適合されてもよい（タンパク質配列の領域の安定性は、座標セット内のタンパク質領域についてのＢ因子により判断できる）。タンパク質のモデル内で単数又は複数の側鎖の交換、付加又は欠失を行なうことができ、そうでなければタンパク質の物理的特性例えば不安定な領域の改変による結晶化能力、親水性基での疎水性基の置換による可溶性に潜在的に影響を及ぼすべくＰＯＰのフラグメント全体を交換、付加又は欠失させることができる。任意には、タンパク質の部位特異的突然変異体を作り、例えば未変性タンパク質に比べて突然変異を受けたタンパク質の可溶性又は突然変異を受けたタンパク質を結晶化する能力を評価することにより、物理的パラメータの改善についてテストすることができる。
【０１１３】
あるいは、活性部位残基の部位特異的突然変異を、ＰＤＥ５リガンド又は潜在的リガンド化合物での主要な結合のドナー又はアクセプター機能に関与する側鎖を査定する目的で、又は化合物によりうまく対応するべく活性部位突然変異を設計するように、設計することができる。これは、好ましい態様１９及び／又は２０に詳述されているようなタンパク質及び化合物モデルを同時表示すること及び／又は、化合物とタンパク質モデルの間の適合及び結合相互作用の図形的視覚化によってか又は立体構造適合又は衝突及び／又は結合相互作用についてのモデル複合体の計算による分析によってのいずれかによって、１つの化合物がかかる変化により活性部位内によりうまく収容されているか否かを査定する目的でタンパク質モデルの活性部位におけるタンパク質側鎖の交換を行なうことによって、達成可能である。このプロセスには任意には、好ましい態様１９及び／又は２０で予め言及された実施形態の中で記述されているようなモデルエネルギー最小化及び／又は分子力学の段階が関与し得る。任意には、タンパク質の部位特異的突然変異体を作り、ＰＤＥ５リガンド結合検定内で検定することができる。
【０１１４】
ａ）緩衝液及びポリエチレングリコールを含む安定化用水溶液中で結晶をインキュベートする段階、
ｂ）安定化用溶液と化合物を組合わせる段階及び、
ｃ）任意には、安定化用溶液に抗凍結剤を添加する段階、
を含む、好ましい態様１〜１４のいずれか１つに記載の結晶内に化合物をソーキングする方法。
【０１１５】
好ましくは、安定化溶液は、上述の態様３〜６に記されている通りの結晶成長のために用いられる溶液と類似の又は同一の組成をもつが、使用される沈殿剤の濃度は、１〜１０％の間の割合だけわずかに増大させることができる。最も好ましくは、安定化溶液は、結晶成長溶液と同じｐＨを有する。より好ましくは、安定化溶液は、ｐＨ７．４の０．１ＭナトリウムＨＥＰＥＳ、２０％のＰＥＧ４０００、１０％のイソプロパノールを含む。好ましくは、化合物は溶解状態にあり、溶剤は水性、有機性又は無機性であり得る。最も好ましくは、化合物はＤＭＳＯ中にある。リガンドは一般的には、ＰＤＥ５によりリガンドに対する予想結合定数よりも高い最終的リガンド濃度を生み出すように、ソーキング溶液に添加される。好ましくはこれは結合定数の１０倍以上である。結晶ソーキング溶液中に存在するリガンドの最終濃度は、好ましくは０．１〜２０mg／mlの間、より好ましくは０．５〜１０mg／mlの間、そして最も好ましくは１〜５mg／mlの間である。好ましくは、抗凍結剤は、２−メチル−２，４−ペンタンジオール（ＭＰＤ）、アルコール、有機重合体、例えばより低い分子量のＰＥＧ、ソルビトール又はキシリトールといった炭水化物のうちの単数又は複数のものから選択され、最も好ましくは、抗凍結剤はグリセロールである。
【０１１６】
発明の詳細な説明
本書で使用されている「アポ」という語は、高分子特に、ａ）そのリガンド（単複）及び／又は補欠分子族（単複）から離脱されているあらゆるタンパク質（又は指名されたタンパク質）を意味するものとして考えられている。
【０１１７】
本書で使用される「緩衝液」という語は、弱酸及びこの酸の接合体塩基（又はさほど一般的ではないが弱塩基及びその接合体酸）を含むあらゆる溶液を内含するものとして考えられる。かくして、本書で使用される通りの「緩衝液」というのは、酸が付加塩基を中和する（又はさほど一般的ではないが塩基が付加酸を中和する）ことから、酸又は塩基が加えられた時点でそのｐＨレベルの変化に耐えるものである。
【０１１８】
ＰＤＥ５に関して本書で言及されているような「活性検定」というのは、そのＩＣ50値（酵素活性の５０％阻害のために必要とされる化合物の濃度）の測定により決定可能である環状グアノシン３’，５’−モノリンホスファート（ｃＧＭＰ）及び環状アデノシン３’，５’−モノホスファート（ｃＡＭＰ）ホスホジエステラーゼに対するＰＤＥ阻害活性のインビトロ検定を意味するものとして考えられている。好ましくは、必要とされるＰＤＥ酵素は、ヒト海綿体、ヒト及びウサギ血小板、ヒト心嚢、ヒト骨格筋及びウシ網膜を含むさまざまな供給源から、基本的に例えばBallard ＳＡ et al.；J. Urology １５９（６）、２１６４−２１７１、１９９８に記述されているようなThompson WJ及びAppleman MM；Biochemistry１０（２）、３１１−３１６、１９７１の方法の修正により単離可能である。特に、ｃＧＭＰ特異的ＰＤＥ５及びｃＧＭＰ阻害されたｃＡＭＰ ＰＤＥ３は、ヒト海綿体組織、ヒト血小板又はウサギ血小板から得ることができる。
【０１１９】
検定は、基本的にBallard ＳＡ et al.；J. Urology １５９（６）、２１６４−２１７１、１９９８に記述されているようなThompson WJ et al；Biochemistry１８（２３）、５２２８−５２３７、１９７９の「バッチ」方法の修正を用いるか、又は製品コードＴＲＫＱ７０９０／７１００の下でAmersham plcにより記述されているプロトコルの修正を用いて〔3Ｈ〕標識されたＡＭＰ／ＧＭＰの直接的検出のためのシンチレーション近隣検定を用いて実施可能である。要約すると、シンチレーション近接検定のために、ＰＤＥ・阻害物質の効果は、ＩＣ50〜Ｋｉとなるように、変動する阻害物質濃度及び低基質の存在下で一定量の酵素を検定すること（最高１／３km以下の濃度で〔3Ｈ〕標識されたものに対する未標識のものの比が３：１のｃＧＭＰ又はｃＡＭＰ）によって調査される。最終検定量は、検定緩衝液〔２０ｍＭのトリス−ＨＣｌｐＨ７．４、５ｍＭのＭｇＣｌ2、１mg／mlのウシ血清アルブミン〕で１００μｌまでにする。反応を、酵素で開始し、３０℃で３０〜６０分間インキュベートして３０％未満の基質回転率を得、５０μｌのケイ酸イットリウムＳＰＡビーズ（ＰＤＥ５についてそれぞれの未標識環状ヌクレオチドを３ｍＭずつ含有する）で終結させる。平板を再度密封し、２０分間振とうさせ、その後、ビーズを暗所で３０分間沈降させて、次にTop Count平板読取り装置（Packard, Meriden, ＣＴ）上で計数した。放射能単位を未阻害の対照の活性％（１００％）に変換し、阻害物質濃度に対しプロットし、「適合曲線」Microsoft Excel拡張を用いて阻害物質 ＩＣ50値を得た。
【０１２０】
本書で使用する「沈殿剤」という語は、生体分子を含む溶液に添加された時点で生体分子を溶液から沈殿又は結晶化させることになるあらゆる物質を含むものと考えられている。
【０１２１】
本書で使用する「複合体」という語は、リガンド（単複）が結合されている状態の生体高分子,
ましくはタンパク質を意味するものとして考えられ、タンパク質の結晶化の前、途中又は後で形成され得る。
【０１２２】
本書で使用されるような「ソーキング」又は「ソーキングを受ける能力をもつ」という語は、（通常は）小分子（例えば阻害物質）である化学的化合物を含有する水溶液中に結晶を置くか又は、化合物が拡散により結晶格子内に入ることができかつ、好ましくは格子を含む分子がタンパク質分子である場合タンパク質−リガンド複合体を形成するため、又最も好ましくは格子を含む分子がタンパク質分子でありかつリガンド又は化合物がタンパク質分子の活性部位に結合した状態となった場合に格子を含む分子と相互作用（例えば接触及び結合）することができるような形で結晶を含有する水溶液に化学的化合物を添加するプロセスを意味するものとして考えられている。該化合物は、固体形態で水溶液に添加し得るか又は、適切な溶剤、好ましくはジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）の中に溶解され得る。
【０１２３】
本書で使用される「ソーキング可能な結晶」という語は、リガンドが結晶格子に入りそれを通過できるように又格子を含む分子に対しアクセスできる又はそれと会合できるような形で格子の有意な分断無く小さな分子又はリガンドが中にソーキングされ得る結晶を意味するものとして考えられている。好ましくはソーキング可能な結晶は、溶解状態又は固体形態にある小分子又はリガンドが結晶を含有する溶液に添加されるソーキングプロセスに敏感に反応する結晶である。小分子はこのとき拡散により結晶格子の中に入り、結晶格子を含む分子と会合することができる。ソーキング可能な結晶が格子の分断又は結晶のひびわれ無くリガンドと結合すること及び格子対称性及び結晶パラメータがソーキング及びリガンド結合プロセスによって著しく改変されないことが好ましい。ソーキング可能な結晶が、ソーキングプロセスを受けた後でＸ線を原子解像度、好ましくは３．５Å、より好ましくは２．５Å、最も好ましくは１．５Åまで回折することが好ましい。
【０１２４】
本書で使用されている「安定化溶液」という語は、例えばソーキングといったような、さらなる操作を目的として、結晶を中に移送でき、その中で結晶がその構造的無欠性を保持し、その結晶パラメータ、対称性又は細胞寸法に関して著しく改変することのない溶液を意味するものとして考えられる。好ましくは、安定化溶液は、結晶がそこから成長させられた、ほぼ同じかつより好ましくは同一のｐＨをもつ化学的成分の一部又は全てを含んでいる。
【０１２５】
本書で使用される「抗凍結剤」という語は、溶液に添加されたとき、氷結晶の形成無く急速に溶液が凍結するようにする化学的化合物を意味するものとして考えられている。このような抗凍結剤は好ましくはエタノールといったアルコール又はキシリトール又はソルビトールといったような炭水化物であるが、２−メチル−２，４−ペンタンジオール（ＭＰＤ）又はその他の有機重合体例えばより低分子量のＰＥＧでもあり得る。最も好ましくは、抗凍結剤はグリセロールである。
【０１２６】
本書で使用されている「共結晶化」という語は、高分子とそのリガンドの予備形成された複合体すなわちタンパク質／小分子複合体の結晶化を意味するものと考えられている。
【０１２７】
「突然変異体」、「変異体」、「相同体」、「類似体」、「誘導体」又は「フラグメント」という語は、本発明の結晶を生成するのに使用されるポリペプチド配列又はＰＤＥ５タンパク質のアミノ酸配列に関連するものである。これらの語は、結果として得られるＰＤＥ５が結晶化される能力をもつことを条件として、該配列から（又はこの配列への）１つ（又は複数）のアミノ酸のあらゆる置換、変異、修飾、交換、欠失又は付加を内含する。
【０１２８】
標準的には、本発明の結晶のＰＤＥ５のタンパク質又はポリペプチドのアミノ酸配列に関連する「突然変異体」、「変異体」、「相同体」、「類似体」、「誘導体」又は「フラグメント」については、実施できるアミノ酸置換のタイプは、アミノ酸配列の疎水性／親水性を維持するものでなければならない。修飾されたＰＤＥ５が本発明に従って結晶化される能力を維持することを条件として、例えば１、２、又は３から１０、２０又は３０回の置換といったようにアミノ酸置換を行なうことができる。
【０１２９】
アミノ酸配列に関連して、本書で用いられている「変異体」という語は、野生型アミノ酸配列又はそのフラグメントの内部に含まれたアミノ酸残基の付加、欠失又は置換を意味する。好ましくは、本発明のＰＤＥ５の結晶のアミノ酸配列に関連する変異体には、本発明の結晶のＰＤＥ５のタンパク質又はポリペプチドの中に含まれている、配列番号１（ＨＲＧＶＮＮＳＹＩＱＲＳＥＨＰＬＡＱＬＹＣＨＳＩＭＥ）の中で太字で示され下線の付されているようなヒスチジン（Ｈｉｓ／Ｈ）の欠失又は置換が内含され得ると思われる。前記ヒスチジン（Ｈ）残基の交換は好ましくは、アミノ酸残基が中性又は非極性である、単数又は複数のアミノ酸残基（ヒスチジン以外）を取込むことによるものである。
【０１３０】
本発明の結晶のＰＤＥ５についてコードするヌクレオチド配列に関連する「突然変異体」、「変異体」、「相同体」、「類似体」、「誘導体」又は「フラグメント」という語は、結果として得られたヌクレオチド配列が、結晶化される能力をもつＰＤＥ５についてコードするか又はコードする能力をもつことを条件として、該配列からの（又はその配列への）１つ（又は複数）のヌクレオチドのあらゆる置換、変異、修飾、交換、欠失、又は付加を内含する。
【０１３１】
ヌクレオチド配列に関連して、本書で使用されている「変異体」という語は、野生型ヌクレオチド配列又はそのフラグメントのヌクレオチドの付加、欠失又は置換を意味する。
【０１３２】
本書で使用されている通りの「フラグメント」という語は、前記ＰＤＥ５部分を含む結果として得られるＰＤＥ５が結晶化される能力をもつことを条件として、本発明で規定されている通りのＰＤＥ５ アミノ酸配列のあらゆる部分を意味する。
【０１３３】
本発明に従った配列番号６（全長「ループスワップした」ＰＤＥ５ 配列）の特異的フラグメントの一例は、配列番号５（「ループスワップした」ＰＤＥ５触媒ドメイン）であり得る。さらに、本発明に従った配列番号５（ループスワップした触媒ドメイン）の特異的フラグメントの例は、配列番号４（ＰＤＥ４「ループ領域」；ＨＰＧＶＳＮＱＦＬＩＮＴＮＳＥＬＡＬＭＹＮＤＥＳＶＬＥ）であり得る。
【０１３４】
本書で使用されている「類似体」という語は、本発明の結晶のＰＤＥ５ポリペプチドのアミノ酸配列又は配列番号１、２、３、４、５又は６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列に類似しているものの、不利でない（すなわち結晶化されるＰＤＥ５の能力にとって不利でない）アミノ酸置換又は欠失が行なわれてきた配列を意味する。
【０１３５】
本書で本発明の結晶のＰＤＥ５の又は配列番号１、２、３、４、５又は６のうちのいずれか１つのもののアミノ酸配列に関連して使用されている「誘導体」という語は、ＰＤＥ５の化学的修飾を内含する。かかる修飾を例示するものとしては、アルキル、アシル又はアミノ基による水素の交換があるだろう。
【０１３６】
結晶に関して本書で使用されている「重原子誘導体」という語は、その構造内への重原子（すなわち、例えば炭素、窒素、酸素、リンなどといった有機高分子に共通の原子よりも著しく大きい原子質量のもの）の内含により修飾される結晶格子内の高分子を含む結晶を意味する。これは一般的には、イオン化合物との共結晶化の間か又は結晶内に化合物をソーキングさせることによって、高分子上のいくつかの基に共有結合し得る水銀、白金、金又は銀の塩といったようなイオン化合物を用いて達成される。セレノ−メチオニン又はキセノンといったような貴ガスでの誘導体化といったその他のプロセスも使用可能である。結晶のかかる重原子誘導体の目的は、構造ソリューションのための同期情報を提供することにある。
【０１３７】
本書で使用されている「欠失」という語は、単数又は複数のヌクレオチド又はアミノ酸残基がそれぞれに不在であるアミノ酸配列又はヌクレオチドのいずれかの中での変化として定義される。
【０１３８】
本書で使用されるように「挿入」又は「付加」というのは、天然に発生するＰＤＥ５の配列に比べて、それぞれ単数又は複数のヌクレオチド又はアミノ酸残基の付加を結果としてもたらしたヌクレオチド又はアミノ酸配列の変化である。
【０１３９】
本書で使用されているように「置換」は、それぞれ異なるヌクレオチド又はアミノ酸による単数又は複数のヌクレオチド又はアミノ酸の交換の結果もたらされる。
【０１４０】
保存的置換は、例えば下表に従って行なうことができる。第２欄中の同じブロック内及び第３欄内の同一行内のアミノ酸は互いに置換可能である。
【０１４１】
【表１】
【０１４２】
「相同体」という語は、特定的には一次、二次三次及び四次といったタンパク質構造に関しての相同性を網羅し、結晶化される能力をもつあらゆる構造的ＰＤＥ５相同体を網羅する。
【０１４３】
本書に詳述されているアミノ酸配列の相同性に関しては、好ましくは、配列番号１、２、３、４、５又は６に対し少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、さらに一層好ましくは少なくとも９０％の相同性が存在する。より好ましくは、少なくとも９５％、そして最も好ましくは少なくとも９８％の相同性が配列番号１、２、３、４、５又は６に対して存在する。
【０１４４】
本書に詳述されているアミノ酸配列に対しコードするヌクレオチド配列の相同性に関しては、好ましくは、少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％さらにより好ましくは少なくとも８５％、さらに一層好ましくは少なくとも９０％の相同性が、配列番号１、２、３、４、５又は６についてコードするヌクレオチド配列に対して存在する。より好ましくは、配列番号１、２、３、４、５又は６についてコードするヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％、そして好ましくは少なくとも９８％の相同性が存在する。
【０１４５】
本発明の中で定義されているＰＤＥ５のヌクレオチド配列及び本発明の中で定義されているＰＤＥ５のアミノ酸配列に関する「相同体」という語は、配列の対立遺伝子変異と同義であり得る。
【０１４６】
特に、本書で使用されている「相同体」という語は、「同一性」と同一視され得る。ここで、例えば本発明の結晶のＰＤＥ５のアミノ酸配列に関する配列相同性は、該配列のうちのいずれか単数又は複数のものともう１つの配列を厳密に比較して、そのもう１方の配列が該配列（単複）に対し少なくとも７０％の同一性を有するか否かを見ることにより、決定可能である。２つ以上の配列間の相同性百分率（％）を計算できる市販のコンピュータプログラムにより相対的配列相同性（すなわち配列同一性）を決定することも可能である。このようなコンピュータプログラムの典型的な例がＣＬＵＳＴＡＬである。
【０１４７】
相同性百分率は、隣接する配列全体にわたり計算できる。すなわち１つの配列はもう１つの配列と整列させられ、１つの配列の各々のアミノ酸が一度に１残基ずつ、もう１方の配列内の相応するアミノ酸と直接比較される。これは「無ギャップアライメント」と呼ばれる。標準的には、かかる無ギャップアライメントは、比較的短かい残基数（例えば５０未満の隣接アミノ酸）にわたってのみ実施される。
【０１４８】
これは非常に単純で一貫性ある方法ではあるものの、それは、例えばその他の点では同一である配列対の中で１つの挿入又は欠失が後続のアミノ酸残基をアライメントの外へ出しかくして包括的アライメントが実施された時点で相同性％の大幅な削減が結果としてもたらされることになるということを考慮に入れることができない。その結果、大部分の配列比較方法が、全体的な相同性評点に過度に不利に作用することなく、考えられる挿入及び欠失を考慮に入れる最適なアライメントを生成するように設計されている。これは、局所的相同性を最大限にしようとして配列アライメント内に「ギャップ」を挿入することによって達成される。
【０１４９】
しかしながら、これらのより複雑な方法は、同数の同一アミノ酸について（２つの比較された配列の間のより高い関連性を反映する）可能なかぎり少ないギャップしか伴わない配列アライメントが多数のギャップを伴うものよりも高い評点を達成することになるような形でアライメント内で発生する各ギャップに対して「ギャップペナルティ」を割当てる。１つのギャップの存在に対し比較的高いコストを課しそのギャップ内の各々の後続残基についてはより小さいペナルティを課す「アフィンギャップコスト」が使用される。これは最も一般的に使用されるギャップ評点システムである。高ギャップペナルティは当然、より少ないギャップを伴う最適化されたアライメントを生成することになる。大部分のアライメントプログラムは、ギャップペナルティの修正を許容している。しかしながら、このようなソフトウェアを配列比較のために使用する場合デフォルトの値を使用することが好まれる。例えば、ＧＣＧWisconsin Bestfitパッケージ（以下参照）を用いる場合、アミノ酸配列に対するデフォルトのギャップペナルティは、１ギャップあたり−１２、各拡張毎に−４である。
【０１５０】
従って、最大百分率相同性の計算はまず最初に、ギャップペナルティを考慮に入れた最適アライメントの生成を必要とする。かかるアライメントを実施するための最適なコンピュータプログラムがＧＣＧ Wisconsin Bestfitパッケージ（University of Wisconsin, U.S.A；Devereux et al., １９８４，Nucleic Acids Research １２：３８７）である。配列比較を実施できるその他のソフトウェアの例としては、ＢＬＡ段階パッケージ（Ausubel et al.,１９９９，同書第１８章参照）。ＦＡＳＴＡ（Atschul et al.,１９９０，J.Mol. Biol.,４０３−４１０）及びＧＥＮＥＷＯＲＫＳ比較ツールセットが含まれるが、これらに制限されるわけではない。オフライン及びオンライン探索には、ＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡの両方が利用可能である（Ausubel et al., １９９９，同書、７−５８〜７−６０ページ参照）。しかしながら一部の利用分野については、ＧＣＧ Bestfitプログラムを使用することが好まれる。
【０１５１】
最終的百分率相同性は同一性として測定できるが、一部のケースでは、アライメントプロセス自体は標準的に、全か無かの対比較に基づくものではない。代りに、化学的類似性又は進化距離に基づいて各々の対様比較に対し評点を割当てるスケーリングされた類似性評点マトリクスが一般に使用される。一般に使用されるこのようなマトリクスの例としては、ＢＬＡＳＴプログラム対についてのデフォルトマトリクスであるＢＬＯＳＵＭ６２マトリクスがある。ＧＣＧ Wisconsinプログラムは一般に、公開デフォルト値か又は供給されている場合にはカスタム記号比較表のいずれかを用いる（詳しくはユーザーマニュアルを参照のこと）。ＧＣＧパッケージについての公開デフォルト値を使用すること、又はその他のソフトウェアの場合には、ＢＬＯＳＵＭ６２といったようなデフォルトマトリクスを用いることが好ましい。
【０１５２】
ソフトウェアがひとたび最適アライメントを生成した時点で、相同性百分率、好ましくは配列同一性百分率を計算することが可能である。ソフトウェアは標準的にこれを配列比較の一部として行ない、数値的結果を生成する。
【０１５３】
すでに指示した通り、一部の利用分野については、配列相同性（又は同一性）は、任意の適切な相同性アルゴリズムを用いて、例えばデフォルトパラメータを用いて、配列相同性（又は同一性）を決定することができる。配列データベースの類似性探索における基本的問題の論述については、Altschul et al（１９９４）、Nature Genetics ６：１１９−１２９を参照のこと。一部の利用分野については、パラメータはデフォルトの値にセットされた状態で、ＢＬＡＳＴアルゴリズムが利用される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムについては、http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/blast-help.htmlで詳述されている。有利には、ＢＬＡＳＴによって査定される場合「実質的な相同性」は、少なくとも約７、好ましくは少なくとも約９、そして最も好ましくは１０以上のＥＸＰＥＣＴ値で整合する配列と同じである。ＢＬＡＳＴ探索におけるＥＸ−ＰＥＣＴについてのデフォルト閾値は通常１０である。
【０１５４】
２つの配列の間の同一性及び類似性を決定するためのその他のコンピュータプログラム方法としては、ＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux et al １９８４ Nucleic Acids Research １２：３８７）及びＦＡＳＴＡ（Atschul et al １９９０ J Molec Biol ４０３−４１０）が含まれるがこれらに制限されるわけではない。
【０１５５】
本発明のＰＤＥ５のアミノ酸配列は、適切な発現系の中でのそれについてコードするヌクレオチド配列の発現によって産生され得る。
【０１５６】
付加的に又は代替的には、タンパク質自体は、ＰＤＥ５アミノ酸配列を全体に又は部分的に合成するための化学的方法を用いて産生することができる。例えば、固相技術によりペプチドを合成し、樹脂から分割し、分取高性能液体クロマトグラフィによって精製することができる（例えば（Creighton（１９８３）「タンパク質構造及び分子原理」、WH Freeman 及びCo., New York, NY, USA）。合成ペプチドの組成は、アミノ酸分析又は配列決定（例えばEdman分解手順）によって確認可能である。
【０１５７】
さまざまな固相技術（Roberge JY et al, Science, Vol２６９，１９９５，pp.２０２−２０４）を用いて直接ペプチド合成を実施することができ、例えばメーカーにより提供される指示事項に従ってＡＢＩ ４３１ Ａ ペプチド合成装置（Perkin Elmer, Boston, MA, USA）を用いて、自動化された合成を達成することができる。付加的には、直接的合成中に、ＰＤＥ５のアミノ酸配列又はそのいずれかの部分を改変させかつ／又はその他のサブユニットからの配列又はそのいずれかの部分で化学的方法を用いてこれを組合わせて変異体ポリペプチドを産生することができる。
【０１５８】
ＰＤＥ５*のタンパク質工学処理
質量分析法及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ（デ−タは示さず）による野生型ＰＤＥ５タンパク質の触媒ドメインの分析は、該タンパク質が残基６６４−６８２の領域内部で分割されることを示している。高濃度のプロテアーゼ阻害物質がタンパク質を幾分か安定化するが、分割がなおも再現性結晶化を妨げる。
【０１５９】
ＰＤＥ５の６５７−６８２領域がＰＤＥ４内の同じ領域により交換されキメラ構成体を産生する「ＰＤＥ５*」と呼ばれるＰＤＥ５の触媒ドメインの工学処理された形態が、産生されてきた（この領域の配列アライメントについては図１を参照のこと）。この構成体のＣ末端も同様に、野生型構造（Ｃ−term８７５）と比べてトランケートされる（Ｃ−term８５８）。以後この工学処理された構成体を「ＰＤＥ５*」と呼ぶ。
【０１６０】
この工学処理されたタンパク質は、質量分析法及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ（データ示さず）による分解に対し安定していることが示されてきた。該タンパク質は、代替的精製プロトコルの開発を可能にする改善された生物物理学的特性を示す。新しいプロトコルは、ブルーセファロースカラムに対する結合及びｃＧＭＰとの特異的溶出を利用している。野生型タンパク質は、おそらくはプロテアーゼ分割部位のまわりの構造の混乱に起因してこのカラムに結合しないことが示されてきた。このＰＤＥ５*タンパク質は、より高い解像度まで回折していかなる混乱領域ももたない阻害物質を伴う結晶を産生するのに使用された。該タンパク質は、同様に、１．８Å以上の解像度まで日常的に回折しそれを構造ベースの薬物設計において使用するための改善されたタンパク質とするさらなる阻害物質を伴う結晶を産生するために、再現可能な形で使用されてきた。
【０１６１】
ＰＤＥ４及び野生型ＰＤＥ５触媒ドメインの構造
（これについては同じく、出願番号ＰＣＴ／ＩＢ０２／０４４２６、２８ページ、１９行目〜２９ページ、１７行目にも詳述されており、本書に援用する）。
【０１６２】
ＰＤＥ４ｂの触媒ドメインの構造が公開された（Xu et al. ２０００）。タンパク質データバング（ＰＤＢ）内の構造とＰＤＥ５触媒のトポロジー比較からは、ＰＤＥ４構造を除き、その他の既知のタンパク質構造との有意な付加的な相同性は明らかになっていない。２つの構造の間の比較が行なわれた（当該出願の図１は、２つのタンパク質の配列及び二次構造アライメントを示している）。構造及びドメインの配置は、ＰＤＥ４に強調されている第２のサブドメインが以下で詳述されている通りＰＤＥ５構造内に部分的にのみ存在するという点を除いて、ＰＤＥ４のものと事実上同一である。
【０１６３】
該構造は、ち密な折畳み（本出願の図２）の形で配置された１５αのヘリックスの単一ドメインで構成されている。ドメイン全体の内部では、３つのサブドメインを規定することもできる。ヘリックスＩ（Ｈ１ ５３９−５４５）及び２（Ｈ２ ５５１−５５４）はタンパク質の外部に存在し、構成体のＮ末端領域を含む。これら２つのヘリックスは、ＰＤＥ４構造内の等価のもの（Ｈ０、Ｈ１及びＨ２）とオーバーレイしない。この領域は、ＰＤＥ タンパク質ファミリを横断して充分に保存されていない。ヘリックス３（Ｈ３ ５６８−５８２）、４（Ｈ４ ５８４−５８８）、５（Ｈ５ ５９２−６０４）、６（Ｈ６ ６１５−６３１）及び７（Ｈ７ ６４０〜６５２）は、タンパク質の第１のサブドメインを形成し、タンパク質のコア内部に含まれている。ＰＤＥ４の命名法に基づくと、ヘリックス８及び９についての観察可能な電子密度は全く存在しない。ヘリックス１０（Ｈ１０ ６８４−６９４）はここでも外部にあり、構造内部で２量体界面を形成する。ヘリックス１０及び１１（Ｈ１１ ７０６〜７２１）は、第２のサブドメインの可視部分である。ヘリックス１２（Ｈ１２ａ ７２５−７３１、Ｈ１２ｂ ７３３−７４１）、１３（Ｈ１３ ７４９−７６５）、１４（Ｈ１４ ７７２−７９７）、１５（Ｈ１５ ８１３−８２４）、１６（Ｈ１６ ８２６−８３６）、及び１７（Ｈ１７ ８４１−８６１）がタンパク質の、第３のサブドメインを形成する。ＰＤＥ５の中でヘリックスＨ１２はＰＤＥ４内のように隣接するヘリックスではなく、中央にねじれを伴う２つの短かいヘリックスで構成されており、ヘリックスＨ１５がＰＤＥ５内では隣接するヘリックスであるがＰＤＥ４ではそうではない、という点に留意すべきである。
【０１６４】
ＵＫ−０８８，８００と複合体形成されたＰＤＥ５*触媒ドメインの構造
ＵＫ−０８８，８００と複合体形成されたＰＤＥ５*タンパク質の触媒ドメインの構造を、本出願の表３内にその座標が内含されている探索モデルのベースとして（本書に援用する、出願番号ＰＣＴ／ＩＢ０２／０４４２６；例１１「Ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌを用いたＰＤＥ５*の結晶化」４６頁、８行目〜２５行目； 例１５「Ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌを用いたＰＤＥ５*のデータ収集、構造決定及び精密化」、５０頁９行目〜５１頁６行目及び表６「Ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌを用いたバキュロウイルス発現されたＰＤＥ５*複合体についての原子座標」３２８頁〜４０８頁に記述されているような）ＳｉｌｄｅｎａｆｉｌとのＰＤＥ５*複合体からのタンパク質構造の１分子を使用した分子交換によって決定した。ＰＤＥ５*触媒ドメインは、非対称ユニット内に１つの分子が存在する状態の単量体として、空間群Ｃ２の中で結晶化する。ＰＤＥ５*触媒ドメインのＣ２形態は、ａ＝５５．９７Å、ｂ＝７６．５５Å、ｃ＝８０．５０Å及びβ＝１０３．０９というおおよその細胞寸法で空間群Ｃ２内で結晶化する。これらは、１非対称２ニットあたり１つの分子を含有し、４４％という溶剤含有率を有する（Matthews １９６９）。ＰＤＥ５*の構造は、１７αのヘリックスを含み、折畳み全体は、一定数の重要な差異を伴っているが野生型構造ときわめて類似している。構造の主たる差異は、ＰＤＥ４からのスワッピングされた部分（残基６５７−６８２）から成るヘリックス Ｈ８及びＨ９の存在にある。これらは、ＰＤＥ４構造内で観察されたものと同一の要領で折畳まれ、タンパク質の第２のサブドメインを完成する。この構成体のＣ末端領域全体を電子密度の中へと構築し、この構造のＮ末端に３つの混乱した残基のみを残すこともできる。これは、その結晶化特性の増強に貢献する確率が高い。
【０１６５】
ＰＤＥ５*：活性部位及びタンパク質−阻害物質相互作用
ＵＫ−０８８，８００は、以下で詳述するように、前述したＵＫ−０９２，４８０、Ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌについて観察されたものと同じ活性部位領域を占有し（本書に参考として内含されている出願番号ＰＣＴ／ＩＢ０２／０４４２６；図４、「ループスワッピングしたＰＤＥ５（ＰＤＥ５*）に結合した化合物Ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌの図、ｐ４２５）、タンパク質との同じ主として疎水性の相互作用を示す（本出願の図３「活性部位領域における、ＵＫ−０８８，８００でソーキングされたＰＤＥ５*（右）及びアポＰＤＥ５*（左）の２．５σで輪郭取りされたｆｏ−ｆｃ電子密度マップの比較」）。ＳｉｌｄｅｎａｆｉｌとのＰＤＥ５*の複合体の中に見られる同じ２つの直接的水素結合は、タンパク質のＧｌｎ８１７と阻害物質の間（Ｏε１−Ｎ４２．９Å及びＮε２−Ｏｌ３．１Å）にも見られる。
【０１６６】
阻害物質の炭素原子Ｃ７は、Ｌｅｕ７６５、Ａｌａ７６７及びＩｌｅ７６８により形成された小さい疎水性ポケット内に向いている。これらの残基は、Ｐｈｅ８２０と共に、阻害物質のプリン環がそれに対して積重なっている結合部位に対する平坦な面を形成している。プリンの反対側は、Ｖａｌ７８２に対し充填している。Ｃ１０プロピル置換基は、Ｐｈｅ７８６と優れたファンデルワールス接触を形成する。それ自体阻害物質のフェニル部分と付加的な疎水的相互作用を形成するＬｅｕ８０４に対し充填している。Ｏ−アルキル部分は、Ａｌａ７７９、Ｐｈｅ７８６、Ａｌａ７８３、Ｖａｌ７８２、Ｌｅｕ８０４、Ｉｌｅ８１３、Ｍｅｔ８１６、及びＧｌｎ８１７を境界とする小さなポケットを占有する。活性部位内に見られる亜鉛イオンと阻害物質の間には直接的相互作用は全く存在しない。該構造は、活性部位内に結合し従って（同じくモデリングされてきた（データは含まれず））ｃＧＭＰ基質へのアクセスを遮断することによるＵＫ−０８８，８００の阻害様式の競合性を確認している。
【０１６７】
ＳｉｌｄｅｎａｆｉｌとＵＫ−０８８，８００を比較した場合の主たる差異は、後者の阻害物質には、活性部位から外に向いたＳｉｌｄｅｎａｆｉｌの中に存在するスルフォニルピペラジンが欠如しているという点にある。
【０１６８】
野生型ＰＤＥ５−Ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌ複合体：活性部位及びタンパク質−阻害物質相互作用
（これは、出願番号ＰＣＴ／ＩＢ０２／０４４２６、３０頁、８行目〜３１頁１行目の中に詳述され、本書に援用する）。
【０１６９】
活性部位は主として、タンパク質の第３のサブドメイン内部に存在し、Ｈ１７とＨ１２ａの間のループ領域と共に、ヘリックスＨ１５、Ｈ１４、Ｈ１３のＣ末端及びＨ１１のＣ末端を境界としている。阻害物質とタンパク質の間の相互作用の大部分は、事実上疎水性であり、２つの直接的水素結合のみが観察されている（本書に援用する出願番号 ＰＣＴ／ＩＢＯ２／０４４２６；図３、４２４頁）。第１のものは、阻害物質のプリン環のＮ１７とＧｌｎ８１７（２．８Å）のＯε１の間にあり、第２のものは阻害物質の隣接する酸素原子Ｏ１６から同じ残基Ｇｌｎ８１７（３．１Å）のＮε２までの間にある。
【０１７０】
阻害物質の炭素原子Ｃ１２はＬｅｕ７６５、Ａｌａ７６７及びＩｌｅ７６８により形成された小さい疎水性ポケット内に向いている。これらの残基は、Ｐｈｅ８２０と共に、阻害物質のプリン環がそれに対して積重なっている結合部位に対する平坦な面を形成している。プリンの反対側は、Ｖａｌ７８２に対し充填している。Ｃ−５プロピル置換基は、Ｖａｌ７８２及びＰｈｅ７８６及びＴｒｙ６１２と優れたファンデルワールス接触を形成する。Ｐｈｅ７８６及びＬｅｕ８０４は阻害物質のフェニル部分と付加的な疎水的相互作用を形成する。Ｏ−アルキル部分は、Ａｌａ７７９、Ｐｈｅ７８６、Ａｌａ７８３、Ｖａｌ７８２、Ｌｅｕ８０４、Ｉｌｅ８１３、Ｍｅｔ８１６、及びＧｌｎ８１７を境界とする小さなポケットを占有する。スルホンアミド基は、溶剤に向かって外に向いており、一方ピペラジン環は、拡張した残基６６２−６６５を境界としているが、構造のこの部分の立体構造が連鎖の破断の影響を受けていないかどうかは不確かである。活性部位内に見られる亜鉛イオンと阻害物質の間には直接的相互作用は全く存在しない。該構造は、活性部位内に結合し従って（同じくモデリングされてきた（データは含まれず））ｃＧＭＰ基質へのアクセスを遮断することによるＳｉｌｄｅｎａｆｉｌの阻害様式の競合性を確認している。
【０１７１】
野生型ＰＤＥ５−Ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌ複合体：活性部位内の金属イオン
この構造の活性部位には１つの亜鉛部位のみが存在する。活性部位内のイオンの配位も同様に、亜鉛について予想されたものと一貫している。金属は、Ｈｉｓ６５３（Ｎε２−Ｚｎ２．０Å）、Ｈｉｓ６１７（Ｎε２−Ｚｎ２．１Å）、Ａｓｐ７６４（０Ｄ２−Ｚｎ２．２Å）と同様Ａｓｐ６５４（０Ｄ２−Ｚｎ２．２Å）によっても配位される。これらの残基は、ＰＤＥ 遺伝子ファミリ全体にわたり完全に保存される。活性部位内の第２の金属イオンの証拠は全く存在しない。
【０１７２】
本発明について、ここで添付の配列リスト及び図を参照しながら、単なる一例として記述する：
配列番号１： ＰＤＥ５からのループ領域のアミノ酸配列を示す。
配列番号２： 野生型ＰＤＥ５触媒ドメインのアミノ酸配列を示す。
配列番号３： 全長野生型ＰＤＥ５配列のアミノ酸配列を示す。
配列番号４： ＰＤＥ４のループ領域のアミノ酸配列を示す。
配列番号５： ループスワップされたＰＤＥ５触媒ドメイン＝ＰＤＥ５*のアミノ酸配列を示す。
配列番号６： ＰＤＥ５*を含む全長ＰＤＥ５配列のアミノ酸配列を示す。
配列番号 ７−１４：オリゴヌクレオチドプライマである。
【０１７３】
図１は、ＰＤＥ５（上部配列）及びＰＤＥ４ｂ（下部配列）触媒ドメインのアライメントを示している。構造からのへリックスの位置及び付番は、各々についてマーキングされている。太字体の残基は、工学処理された領域についての配列アライメントを示している。ＰＤＥ４由来の配列は、ＰＤＥ５中の対応する領域を交換するために使用されてきた。こうして、この領域への残基の挿入という結果がもたらされる。下線は、ＰＤＥ５*中に不在のＣ−末端領域を強調している。
【０１７４】
図２は、二次構造要素を示すタンパク質の全体的折畳みのリボン表現を示している。阻害物質は、全原子ステック表現で示され、金属イオンは球体として示されている。（Ａ）＝ＰＤＥ４ｂ、（Ｂ）＝野生型ＰＤＥ５＋Ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌ、（Ｃ）＝「ループスワップされた」ＰＤＥ５（ＰＤＥ５*）＋Ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌ。へリックスは、基準としてＰＤＥ４構造を用いて付番されている。へリックスＨ０−Ｈ７はサブドメイン１を形成し、へリックスＨ８−Ｈｌｌは、サブドメイン２を形成し、へリックスＨ１２−Ｈ１６はサブドメイン３を形成している。
【０１７５】
図３： 活性部位領域での、アポＰＤＥ５*（「ループスワップされた」ＰＤＥ５）（左）及びＵＫ−０８８，８００でソーキングされたＰＤＥ５*（右）の２．５σで輪郭どりされたｆｏ−ｆｃ電子密度マップの比較。
【０１７６】
図４： ＵＫ−０８８，８００、５−（２−エトキシフェニル）−ｌ−メチル−３−プロピル−１，６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オンの構造の二次元表現（Ｎ４上の水素のみが例示されている）。
【実施例】
【０１７７】
実験の部
実施例１ − ＰＤＥ５野生型触媒ドメイン（Ｅ５３４−Ｎ８７５）の構築及び発現
ヒトＰＤＥ５配列（受入番号＝ＡＢ００１６３５）からオリゴヌクレオチドプライマを設計した。ＰＣＲ増幅によって全長ＰＤＥ５クローンからＤＮＡフラグメントを生成させた。以下のオリゴヌクレオチドを用いた：
【０１７８】
ＰＤＥ５ ５’タグ無しオリゴ：
【化１】
（配列番号７）
【０１７９】
ＰＤＥ５ ３’長オリゴ：
【化２】
（配列番号８）
【０１８０】
１．５ｍＭのＭｇＣｌ2、２００μＭのｄＮＴＰｓ、５０ｐｍｏｌの各プライマ及び２．５単位のＥｘｐａｎｄ ＤＮＡポリメラーゼ(Roche, East Sussex, UK)を含む溶液の中で合計体積５０ｌでＰＣＲ反応を３０サイクルの間実施した。各サイクルは９４°Ｃで１分間、５０℃で１分間及び７２℃で２分間であった。
【０１８１】
１％のアガロースゲル上で両方の構成体についての最終的な増幅済みＤＮＡフラグメントを分離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Qiagen, West Sussex, UK）を用いて精製した。次に、ＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩを用いてフラグメントを消化させ、ｐＦａｓｔｂａｃｌ ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩで消化されたベクター（Life Technologies, Paisley, UK）内にライゲートした。ライゲーションは、１２°Ｃで１６時間実施した。次に、ライゲーション混合物をＥ．ｃｏｌｉ（ＴＯＰ １０）中に電気穿孔した (Invitrogen, Gronigen, The Netherlands)。
【０１８２】
所望のインサートを含むクローンを、１００ｕｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２ＹＴプレートを用いて選択し、適正なサイズのインサートの存在についてエンドクレアーゼ消化を用いて検査した。Ｌａｒｋ（Saffron Waldon, UK）によりＤＮＡ配列分析を実施した。
【０１８３】
ｐＦａｓｔｂａｃｌ：：ＰＤＥ５触媒ドメイン（５３４−８７５）プラスミドＤＮＡを用いてＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ１０ＢＡＣTMを形質転換することにより組換え型バクミドＤＮＡを産生した。Ｂａｃ ｔｏ ＢａｃTM バキュロウイルス発現マニュアル（Life Technologies, Paisley, UK）中に示されている方法に従ってこれを実施した。ＰＣＲ分析を用して、ｐＵＣ／Ｍ１３増幅プライマ（Invitrogen, Gronigen, The Netherlands）を用いたバクミドへの転位がうまくいったかどうかをした。
【０１８４】
Ｓｆ−９昆虫細胞を用いたトランスフェクションにより一次バキュロウイルスストックの生成を実施した。適正なインサートを含むバクミドＤＮＡをＣＥＬＬＦＥＣＴＩＮTMトランスフェクション試薬（Life Technologies, Paisley, UK）と混合し、ＳＦ−９００ＩＩ無血清培地(Invitrogen, Gronigen, The Netherlands)を用いてＳｆ−９昆虫細胞の単層に添加した。２７°Ｃで７２時間のインキュベーションの後、上清を初期バキュロウイルスストックとして収穫した。２７°Ｃで１２５ｒｐｍの攪拌下で１リットル入りアーレンマイヤーフラスコ(Corning Life Sciences, New York, USA)内で１×１０6 細胞／ｍｌの割合でＳｆ−９昆虫細胞の懸濁液中に初期ウイルスストックを加えることによって、このストックを増幅させた。感染から６日後に上清を遠心分離より収穫し、作業ウイルスストックとして４℃で保管した。この作業ストックの力価を、Ｂａｃ ｔｏ Ｂａｃ バキュロウイルス発現マニュアル(Invitrogen, Gronigen, The Netherlands)中にあるように、従来のプラーク検定分析によって決定した。
【０１８５】
異なる感染多重度（ＭＯＩ）及び収穫時間を観察してＳｆ−９及びＴｎｉ Ｈｉｇｈ５昆虫細胞培養を用いてアーレンマイヤーフラスコ培養中でタンパク質発現を最適化し、次に発見した最適条件を発酵装置内へとスケールアップした。
【０１８６】
使用された発酵装置は、Ａｐｐｌｉｋｏｎ１０３０バイオコントローラを用いて制御される加圧滅菌可能なＡｐｐｌｉｋｏｎ３リットル入りの攪拌付き容器であった。Ｔ．ｌｉ Ｈｉｇｈ５細胞の接種材料を当初、振とうフラスコ培養から調製した。Ｅｘｃｅｌ４０５無血清培地（JRH Biosciences, Kansas, USA)中で作り上げた１．８リットルの初期作業体積で、１ｍｌあたり５×１０5 個の細胞を発酵装置に接種した。温度を２７℃で制御し、溶存酸素濃度を６０％で制御し、ｐＨは測定したが、制御はしなかった。酸素濃度は全体を通じて制御した。培養内部ではマリンインペラの二重インペラシステムにより、又液体／ヘッドスペース界面ではＲｕｓｈｔｏｎインペラで攪拌を１５０ｒｐｍに設定した。曝気は、毎分０．５ｌでヘッドスペースまで連続的であった。
【０１８７】
生存細胞密度が２×１０6細胞／ｍｌに達した時点で、滴定されたバキュロウイルス作業ストックから１のＭＯＩを用いて培養に感染させた。該培養についての収穫時間は感染から４８時間後であった。収穫は、２０００ｇで１５分間の遠心分離により達成された。次に昆虫細胞ペレットを、精製に先立ち８０°Ｃで保管した。
【０１８８】
実施例２ − Ｈｉｓ６−タグ付きＰＤＥ５野生型触媒ドメイン（Ｅ５３４−Ｎ８７５）の構築及び発現
ヒトＰＤＥ５の配列（＝ＰＤＥ５Ａ１イソ型；受入番号＝ＡＢ００１６３５）からオリゴヌクレオチドプライマを設計した。ＰＣＲ増幅によって全長ＰＤＥ５クローンからＤＮＡフラグメントを生成させた。以下のオリゴヌクレオチドを用いた：
【０１８９】
ＰＤＥ５ ５’Ｈｉｓ６オリゴ：
【化３】
（配列番号９）
【０１９０】
ＰＤＥ５ ３’長オリゴ：
【化４】
（配列番号８）
【０１９１】
１．５ｍＭのＭｇＣｌ2、２００μＭのｄＮＴＰｓ、５０ｐｍｏｌの各プライマ及び２．５単位のＥｘｐａｎｄ ＤＮＡポリメラーゼ(Roche, East Sussex, UK)を含む溶液の中で合計体積５０ｌでＰＣＲ反応を３０サイクルの間実施した。各サイクルは９４°Ｃで１分間、５０℃で１分間及び７２℃で２分間であった。
【０１９２】
１％のアガロースゲル上で、両方の構成体についての最終的な増幅済みＤＮＡフラグメントを分離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Qiagen, West Sussex, UK）を用いて精製した。次に、ＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩを用いてフラグメントを消化させ、ｐＦａｓｔｂａｃｌ ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩで消化されたベクター（Life Technologies, Paisley, UK）内にライゲートした。ライゲーションは、１２°Ｃで１６時間実施した。次に、ライゲーション混合物をＥ．ｃｏｌｉ（ＴＯＰ １０）中に電気穿孔した (Invitrogen, Gronigen, The Netherlands)。
【０１９３】
所望のインサートを含むクローンを、１００ｕｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２ＹＴプレートを用いて選択し、適正なサイズのインサートの存在についてエンドクレアーゼ消化を用いて検査した。Ｌａｒｋ（Saffron Waldon, UK）によりＤＮＡ配列分析を実施した。
【０１９４】
組換え型バキュロウイルスを生成するための方法は、野生型ＰＤＥ５触媒ドメイン用のものと同じであった（実施例１参照）。
【０１９５】
発現最適化は、再びＴ．ｎｉ Ｈｉｇｈ５昆虫細胞が最適な発現を与えることを示した。従って、先行の構成体の場合と同様の手順を用いて、発酵装置内でバキュロウイルス発現を実施した。
【０１９６】
実施例３ − バキュロウイルス中でのＰＤＥ５*（Ｅ５３４−Ｅ８５８）の構築及び発現
以下のオリゴヌクレオチドを用いたオーバーラップエクステンションＰＣＲを使用することによって、ＰＤＥ５*構成体を産生した。
【０１９７】
【化５】
（配列番号７）
【０１９８】
【化６】
（配列番号１０）
【０１９９】
【化７】
（配列番号１１）
【０２００】
【化８】
（配列番号１２）
【０２０１】
野生型ＰＤＥ５触媒ドメイン構成体の場合と同じ鋳型ＤＮＡと共にオリゴヌクレオチドＡ＋Ｂ及びＣ＋Ｄを用いて、初期ＤＮＡフラグメントを生成した。１．５ｍＭのＭｇＣｌ2、２００μＭのｄＮＴＰｓ、５０ｐｍｏｌの各プライマ及び２．５単位のＥｘｐａｎｄ ＤＮＡポリメラーゼ(Roche, East Sussex, UK)を含む溶液の中で合計体積５０ｌでＰＣＲ反応を３０サイクルの間実施した。各サイクルは９４℃で１分間、５０℃で１分間及び７２℃で２分間であった。ＰＣＲの第２ラウンドでは、全長構成体を増幅させるためにオリゴヌクレオチドＡ＋Ｄを用いた状態で、鋳型ＤＮＡとしてＰＣＲ Ａ＋Ｂ及びＣ＋ＤからのＤＮＡ産物を用いた。ＰＣＲ条件は、初期ＰＣＲ反応と同じであった。これによって、ＰＤＥ５触媒ドメイン（Ｃ−ｔｅｒｍ８７５）と比較してＣ−末端トランケーション（Ｃ−ｔｅｒｍ８５８）とＰＤＥ４スワップされた領域を伴う構成体が生成される。
【０２０２】
組換え型バキュロウイルスを生成するための方法は、野生型ＰＤＥ５触媒ドメイン用のものと同じであった（実施例１参照）。
【０２０３】
発現最適化は、再びＴ．ｎｉ Ｈｉｇｈ５昆虫細胞が最適な発現を与えることを示した。従って、先行の構成体の場合と同様の手順を用いて、発酵装置内でバキュロウイルス発現を実施した。
【０２０４】
実施例４ − Ｅ．ｃｏｌｉ中でのＰＤＥ５*（Ｅ５３４−Ｅ８５８）の構築及び発現
以下のオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲを使用し、鋳型ＤＮＡは、実施例３で生成されたｐＦａｓｔｂａｃｌ：：ＰＤＥ５*プラスミドＤＮＡ（配列確認済み）であるものとして、Ｅ．ｃｏｌｉ中のＰＤＥ５*構成体を生成した。
【０２０５】
【化９】
（配列番号１３）
【０２０６】
【化１０】
（配列番号１４）
１．５ｍＭのＭｇＣｌ2、２００μＭのｄＮＴＰｓ、５０ｐｍｏｌの各プライマ及び２．５単位のＥｘｐａｎｄ ＤＮＡポリメラーゼ(Roche, East Sussex, UK)を含む溶液の中で合計体積５０ｌでＰＣＲ反応を３０サイクルの間実施した。各サイクルは９４°Ｃで１分間、５０℃で１分間及び７２℃で２分間であった。
【０２０７】
最終的な増幅済みＤＮＡフラグメントを１％のアガロースゲル上で分離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Qiagen, West Sussex, UK）を用いて精製した。次に、Ｎｄｅｌ及びＸｈｏｌを用いてフラグメントを消化させ、ｐＥＴ２１Ｃ（Life Technologies, Paisley, UK）Ｎｄｅｌ／ＸｈａＩによる消化済みベクター内にライゲートした。ライゲーションは、１２℃で１６時間実施した。次に、ライゲーション混合物をＥ．ｃｏｌｉ（ＴＯＰ １０）中に電気穿孔した (Invitrogen, Gronigen, The Netherlands)。
【０２０８】
１００ｕｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２ＹＴプレートを用いて所望のインサートを含むクローンを選択した。適正なサイズのインサートの存在についてのエンドクレアーゼ消化を用いてプラスミドＤＮＡも同様に検査した。Ｌａｒｋ（Saffron Waldon, UK）によりＤＮＡ配列分析を実施した。
【０２０９】
次に、適正に配列決定されたプラスミドＤＮＡを発現のためにＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ （ＤＥ３）（Novagen, Nottingham, UK）中に電気穿孔した。１００ｐｇ／ｍｌのカルベニシリンを培地として含む５リットルの２ＹＴ培養液を用いて、７リットル入りのＡｐｐｌｉｋｏｎ発酵装置中で発現を実施した。２重ラシュトンインペラアセンブリを用いて攪拌を１０００ｒｐｍに、かつスパージャへの曝気を毎分２リットルに設定した。３７°Ｃ及び２００ｒｐｍで一晩成長させた振とうフラスコ培養を発酵装置に接種し、ここで接種密度は１％ｖｏｌ／ｖｏｌであった。発酵のｐＨを２０％ｖｏｌ／ｖｏｌのＮＨ4ＯＨ溶液を用いて７．２に制御し、温度を当初３７℃に設定した。ＯＤ600nmが１．５に到達した時点で、温度設定点を２５°Ｃに降下させ、次にｌｍＭの最終濃度で、ＩＰＴＧを用いて培養を誘発させた。誘発から４時間後に、発酵をバッチ遠心分離（１０分間８，０００ｒｐｍ）により収穫した。その後最終ペレットを凍結（−８０°Ｃ）させて、後続の精製を待った。
【０２１０】
実施例５ − ＰＤＥ５*触媒ドメインの精製
Ｅ．ｃｏｌｉ発酵由来のペレットを、湿潤細胞重量１グラムあたり１０ｍｌｓの溶解緩衝液中に再懸濁させ、連続細胞分析器(Constant Systems, Warwickshire, UK)を用い２０ｋｐｓｉの圧力で機械的に分解した。溶解緩衝液は、５０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのＮａＣｌ、ＥＤＴＡ−を含まないプロテアーゼ阻害物質カクテル錠剤を含有する1 mMのDTT（Roche, East Sussex, UK)及び１０ｍμＭのＥ−６４でを成っていた。溶解物を急冷し、細胞残屑を除去するために４５分間１４０００ｇで遠心分離した。その後全ての精製を、Ａｋｔａ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ精製システム(Amersham Pharmacia, Buckinghamshire, UK).を用いて実施した。収集されたフロースルーと共に毎分５ｍｌの速度で、５０ｍｌのＱ−セファロースファストフローカラム（Amersham Pharmacia, Buckinghamshire, UK)に対して上清を適用した。次にブルーセファロース緩衝液Ａ（５０Ｍのビス−トリス（ｐＨ６．４）、５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ、２ｍＭのＥＧＴＡ及び１ｍＭのＤＴＴ）中で予備平衡された２リットルのＧ−２５超微細脱塩カラム(Amersham Pharmacia, Buckinghamshire, UK)に対してフロースルー試料を毎分５０ ｍｌで適用した。ブルーセファロース緩衝液Ａ中でタンパク質画分を溶出させた。
【０２１１】
次のカラムステップを順次行い、試料を当初２０ｍｌのＳＰ−セファロース高性能カラム（Amersham Pharmacia, Buckinghamshire, UK）上に投入し、ここから１０ｍｌのブルーセファロースファストフローカラム(Amersham Pharmacia, Buckinghamshire, UK)上に毎分２ｍｌの流量で直接フロースルーさせた。ひとたび投入が完了した時点で、ＳＰ−セファロースカラムをラインから取り出し、ブルーセファロースカラムを５カラム体積のブルーセファロース緩衝液Ａで洗浄した。２８０ｎｍの吸光度が基線に到達するまで１ＭのＮａＣｌを含むブルーセファロース緩衝液Ａでカラムを洗浄し、次に５カラム体積のブルーセファロース緩衝液で洗浄した。２０ｍＭのｃＧＭＰ（Ｎａ塩）を含有するブルーセファロース緩衝液（Sigma, Dorset, UK）を用いてＰＤＥ５＊ タンパク質溶液を段階溶出させた。
【０２１２】
トリス-グリシンＳＤＳゲル（Invitrogen, Gronigen, The Netherlands)上で画分を検定し、適宜プールした。遠心濃縮装置（Vivascience, Gloucestershire, UK）を用いてこれらの画分を２．５ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、毎分１．５ｍｌで５０ｍＭのビス−トリス（ｐＨ６．８）、５００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ及び２μＭｎｏＥ−６４で予備平衡されたＳｕｐｅｒｄｅｘ−２００のｐｒｅｐグレード２６／６０カラム上に投入した。溶出した画分をトリス-グリシンＳＤＳ ＰＡＧＥゲル上で分析した。
【０２１３】
実施例６ - ＰＤＥ５*の結晶化
最終ゲルろ過カラムからのＰＤＥ５*画分をプールし（合計体積２５ｍｌｓ）、タンパク質濃度を検定した（０．２ｍｇ／ｍｌ）。タンパク質溶液に対して、１０μＭのＥ−６４及び１ｍｇ／ｍｌのロイペプチン (Sigma, Dorset, UK)を補足した。４°Ｃ、３，０００ｒｐｍでＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐの１０ｋＤａ分子量カットフ遠心濃縮器（Amicon Bioseparations, Maine, USA）を用いて、溶液を１０ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。結晶化に先立ち、エッペンドルフ遠心分離機を用いて、タンパク質溶液を５分間１４，０００ｒｐｍで遠心分離した。
【０２１４】
懸垂液滴の蒸気拡散結晶化試行を４℃でセットした。２μｌのタンパク質溶液と混合させた２μｌの貯液槽緩衝液から成るを液滴を、０．１ＭナトリウムＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、２０％ポリエチレングリコール４０００及び１０％イソ−プロパノールを含有する５００μｌの貯液槽溶液上のカバースリップの上に懸濁させた。最大寸法が７００μｍまでの板状結晶が、１〜３日後に成長した。正方形のマイクロブリッジ中の２０％ポリエチレングリコール４０００及びｐＨ７．４の０．１ＭのナトリウムＨＥＰＥＳの２０μｌ液滴に結晶を移した。次に１５％のグリセロールを伴う２０％ポリエチレングリコール４０００、０．１ＭのナトリウムＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４の溶液に結晶を移し、その後Ｘ線データ収集の間は凍結させた。
【０２１５】
結晶は、格子寸法がａ＝５５．９７Å、ｂ＝７６．５５Å、ｃ＝８０．５０Å及びβ＝１０３．０９で空間群Ｃ２に属する。これらは、非対称単位１つあたり１個の分子を含み、４４％の溶剤含有率を有する（Matthews, １９６９）。
【０２１６】
実施例７ − 阻害物質をＰＤＥ５＊内にソーキングさせる
実施例６中で詳述された方法に従って得られたアポＰＤＥ５＊の板状結晶を、正方形のマイクロブリッジ中の２０％ポリエチレングリコール４０００及び０．１ＭのナトリウムＨＥＰＥＳの２０μｌ液滴に移した。これに対して、ＤＭＳＯ中に溶解させた濃度２０ｍｇ／ｍｌの阻害物質１．０μｌを加えた。次に１５％のグリセロールを伴う２０％ポリエチレングリコール４０００、ｐＨ７．４の０．１ＭのナトリウムＨＥＰＥＳの溶液に結晶を移し、その後Ｘ線データ収集の間凍結させた。
【０２１７】
実施例 ８ - ＰＤＥ５*のソーキング可能なＣ２結晶形態のデータ収集、構造決定及び精密化
Ｐ２1結晶形態（結晶は、単位細胞寸法、ａ＝５４．９３Å、ｂ＝７７．７７Å、ｃ＝８２．０５Å、α＝γ＝９０°、β＝１００．９５５°でモノリシック空間群Ｐ２lに属する）中のＰＤＥ５*の１つのサブセットの座標を用いて分子交換（ＭＲ）によりＥ．ｃｏｌｉで工学処理されたＰＤＥ５＊の構造を解き、その座標セットを表３中で詳述した。該分子交換は、ＡＭＯＲＥ（CCP4, J. Navaza １９９４）を用いて実施した。結果として得られたマップは優れた品質のものであり、ＱＵＡＮＴＡ（登録商標）(Accelrys products)を用いて構造を再適合させた。
【０２１８】
Ｏｓｍｉｃミラー(ＭＳＣ)を伴う社内のFR-D回転陽極（リガク）上のリガクＳｔｕｒｎ９２ＣＣＤ検出装置を用いて代表的なＸ線回折データセットを収集した。Ｃｒｙｓｔａｌ Ｃｌｅａｒ／Ｄ*Ｔｒｅｋ処理パッケージ（リガク−ＭＳＣ）を用いてデータを処理した。データ収集統計は、表１中に要約されている（Ａｐｏ）。
【０２１９】
結晶は、細胞寸法、１ａ＝５５．９７Å、ｂ＝７６．５５Å、ｃ＝８０．５０Å、β＝１０３．０９°で空間群Ｃ２に属する。これらは、非対称単位１つあたり１個の分子を含有し、４４％の溶剤含有率を有する（Matthews, １９６９）。
【０２２０】
「ｍｌｆ」最大尤度標的関数を用いたＣＮＸ（Bruenger et al.,１９９８）を使用して解像度範囲３０〜１．６Å内で精密化を実施した。平坦バルク溶剤モデルからの部分構造因子及び異方性Ｂ−因子補正を精密化全体を通して提供した。精密化されたモデルについてのＲ−因子は３０〜１．６Åの解像度範囲の全てのデータについて０．２３１である（自由Ｒ−因子、データの５％、０．２６７）。精密化統計は、表２中に要約されている(Apo)。
【０２２１】
アポＰＤＥ５＊の精密化モデルについての座標セットは表４に記録されている。モデルは、３２３個のアミノ酸残基、５３７−８５８（残基Ｇｌｕ６８１Ａは、ＰＤＥ５付番スキームを維持するように付番されている）、亜鉛イオン及びマグネシウムイオン、並びに２２２個の水分子を含んでいる。
【０２２２】
実施例９ − ＵＫ−０８８，８００でソーキングされたＰＤＥ５*のソーキング可能なＣ２結晶形態のデータ収集、構造決定及び精密化
ＰＤＥ５*のＣ２結晶形態中にソーキングさせたＵＫ−０８８，８００の構造を、差フーリエ法により解いた。
【０２２３】
Ｏｓｍｉｃミラー（ＭＳＣ）を伴う社内のＦＲ−Ｄ回転陽極（リガク）上のＲａｘｉｓＩＶ画像プレート検出装置を用いてＸ線回折データセットを収集した。ＨＫＬパッケージ（Otwinowski & Minor, １９９７）を用いて全てのデータを処理した。データ収集統計は、表１中に要約されている（ＵＫ−０８８，８００）。
の分子を含み、４４％の溶剤含有率を有する（Matthews, １９６９）。
【０２２４】
「ｍｌｆ」最大尤度標的関数を用いたＣＮＸ（Bruenger et al., １９９８）を使用して解像度範囲３０〜１．５Å内で精密化を実施した。平坦バルク溶剤モデルからの部分構造因子及び異方性Ｂ−因子補正を精密化全体を通して提供した。精密化されたモデルについてのＲ−因子は３０〜１．５Åの解像度範囲の全てのデータについて０．２１９である（自由Ｒ−因子、データの５％、０．２２８）。精密化統計は、表２中に要約されている（ＵＫ−０８８，８００）。
【０２２５】
ＰＤＥ５*−ＵＫ−０８８，８００の精密化モデルについての座標セットは表５に記録されている。モデルは、３２３個のアミノ酸残基、５３７−８５８（残基Ｇｌｕ６８１Ａは、ＰＤＥ５付番スキームを維持するように付番されている）、リガンドＵＫ−０８８，８００、亜鉛イオン及びマグネシウムイオン、並びに１８３個の水分子を含んでいる。
【０２２６】
実施例１０ - ＵＫ−０８８，８００でソーキングされたＰＤＥ５*とアポＰＤＥ５*の比較
モデル内へのリガンドの取り込みに先立ち誘導されたモデル位相及び実験構造要素振幅を用いて計算されたＵＫ−０８８，８００でソーキングされたＰＤＥ５＊の（ｆｏ−ｆｃ）αcalc電子密度マップは、ＵＫ−０８８，８８０として明白に解釈することのできる明らかな特長を有するピークを示している（図３）。これと対照的に、アポＰＤＥ５*の等価の（ｆｏ−ｆｃ）αcalc電子密度マップは、小分子リガンドとして解釈し得るような有意の残留特長を全く示していない。実験は、ＰＤＥ５＊に対するＵＫ−０８８，８００の結合モードを実験的に決定することを可能しており、本書中に記述されている通りのＰＤＥ５＊Ｃ２結晶形態がリガンドソーキングに反応しやすいことを実施している。Ｃ２結晶形態中のＰＤＥ５＊の構造は、Ｐ２１結晶形態で観察されたものに対して有意な差異を示していない。
【０２２７】
【表２】
【０２２８】
【表３】
【０２２９】
表３
Ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌを伴うバキュロウイルスにより発現されたＰＤＥ５*の複合体についての原子座標
原子番号、原子タイプ、残基のタイプ、残基番号デカルト座標Ｘ、Ｙ、Ｚ、原子占有率（Ｏ）及び温度因子（Ｂ）
【０２３０】
【表４】
【０２３１】
【表５】
【０２３２】
【表６】
【０２３３】
【表７】
【０２３４】
【表８】
【０２３５】
【表９】
【０２３６】
【表１０】
【０２３７】
【表１１】
【０２３８】
【表１２】
【０２３９】
【表１３】
【０２４０】
【表１４】
【０２４１】
【表１５】
【０２４２】
【表１６】
【０２４３】
【表１７】
【０２４４】
【表１８】
【０２４５】
【表１９】
【０２４６】
【表２０】
【０２４７】
【表２１】
【０２４８】
【表２２】
【０２４９】
【表２３】
【０２５０】
【表２４】
【０２５１】
【表２５】
【０２５２】
【表２６】
【０２５３】
【表２７】
【０２５４】
【表２８】
【０２５５】
【表２９】
【０２５６】
【表３０】
【０２５７】
【表３１】
【０２５８】
【表３２】
【０２５９】
【表３３】
【０２６０】
【表３４】
【０２６１】
【表３５】
【０２６２】
【表３６】
【０２６３】
【表３７】
【０２６４】
【表３８】
【０２６５】
【表３９】
【０２６６】
【表４０】
【０２６７】
【表４１】
【０２６８】
【表４２】
【０２６９】
【表４３】
【０２７０】
【表４４】
【０２７１】
【表４５】
【０２７２】
【表４６】
【０２７３】
【表４７】
【０２７４】
【表４８】
【０２７５】
【表４９】
【０２７６】
【表５０】
【０２７７】
【表５１】
【０２７８】
【表５２】
【０２７９】
【表５３】
【０２８０】
【表５４】
【０２８１】
【表５５】
【０２８２】
【表５６】
【０２８３】
【表５７】
【０２８４】
【表５８】
【０２８５】
【表５９】
【０２８６】
【表６０】
【０２８７】
【表６１】
【０２８８】
【表６２】
【０２８９】
【表６３】
【０２９０】
【表６４】
【０２９１】
【表６５】
【０２９２】
【表６６】
【０２９３】
【表６７】
【０２９４】
【表６８】
【０２９５】
【表６９】
【０２９６】
【表７０】
【０２９７】
【表７１】
【０２９８】
【表７２】
【０２９９】
【表７３】
【０３００】
【表７４】
【０３０１】
【表７５】
【０３０２】
【表７６】
【０３０３】
【表７７】
【０３０４】
【表７８】
【０３０５】
【表７９】
【０３０６】
【表８０】
【０３０７】
【表８１】
【０３０８】
【表８２】
【０３０９】
【表８３】
【０３１０】
【表８４】
【０３１１】
表４
ＰＤＥ５*アポタンパク質についての原子座標
原子番号、原子のタイプ、残基のタイプ、残基番号デカルト座標Ｘ、Ｙ、Ｚ、原子占有率（Ｏ）、温度因子（Ｂ）
【０３１２】
【表８５】
【０３１３】
【表８６】
【０３１４】
【表８７】
【０３１５】
【表８８】
【０３１６】
【表８９】
【０３１７】
【表９０】
【０３１８】
【表９１】
【０３１９】
【表９２】
【０３２０】
【表９３】
【０３２１】
【表９４】
【０３２２】
【表９５】
【０３２３】
【表９６】
【０３２４】
【表９７】
【０３２５】
【表９８】
【０３２６】
【表９９】
【０３２７】
【表１００】
【０３２８】
【表１０１】
【０３２９】
【表１０２】
【０３３０】
【表１０３】
【０３３１】
【表１０４】
【０３３２】
【表１０５】
【０３３３】
【表１０６】
【０３３４】
【表１０７】
【０３３５】
【表１０８】
【０３３６】
【表１０９】
【０３３７】
【表１１０】
【０３３８】
【表１１１】
【０３３９】
【表１１２】
【０３４０】
【表１１３】
【０３４１】
【表１１４】
【０３４２】
【表１１５】
【０３４３】
【表１１６】
【０３４４】
【表１１７】
【０３４５】
【表１１８】
【０３４６】
【表１１９】
【０３４７】
【表１２０】
【０３４８】
【表１２１】
【０３４９】
【表１２２】
【０３５０】
【表１２３】
【０３５１】
【表１２４】
【０３５２】
【表１２５】
【０３５３】
【表１２６】
【０３５４】
【表１２７】
【０３５５】
【表１２８】
【０３５６】
表５
ＵＫ−０８８，８００をもつＰＤＥ５＊複合体の原子座標
原子番号、原子のタイプ、残基番号デカルト座標Ｘ，Ｙ，Ｚ，原子占有（Ｏ）、温度因子（Ｂ）、及び原子タイプ
【０３５７】
【表１２９】
【０３５８】
【表１３０】
【０３５９】
【表１３１】
【０３６０】
【表１３２】
【０３６１】
【表１３３】
【０３６２】
【表１３４】
【０３６３】
【表１３５】
【０３６４】
【表１３６】
【０３６５】
【表１３７】
【０３６６】
【表１３８】
【０３６７】
【表１３９】
【０３６８】
【表１４０】
【０３６９】
【表１４１】
【０３７０】
【表１４２】
【０３７１】
【表１４３】
【０３７２】
【表１４４】
【０３７３】
【表１４５】
【０３７４】
【表１４６】
【０３７５】
【表１４７】
【０３７６】
【表１４８】
【０３７７】
【表１４９】
【０３７８】
【表１５０】
【０３７９】
【表１５１】
【０３８０】
【表１５２】
【０３８１】
【表１５３】
【０３８２】
【表１５４】
【０３８３】
【表１５５】
【０３８４】
【表１５６】
【０３８５】
【表１５７】
【０３８６】
【表１５８】
【０３８７】
【表１５９】
【０３８８】
【表１６０】
【０３８９】
【表１６１】
【０３９０】
【表１６２】
【０３９１】
【表１６３】
【０３９２】
【表１６４】
【０３９３】
【表１６５】
【０３９４】
【表１６６】
【０３９５】
【表１６７】
【０３９６】
【表１６８】
【０３９７】
【表１６９】
【０３９８】
【表１７０】
【０３９９】
【表１７１】
【０４００】
【表１７２】
【０４０１】
【化１１】
【０４０２】
【化１２】
【０４０３】
略語
ｃＡＭＰ 環式アデノシンモノリン酸塩
ｃＧＭＰ 環式グアノシンモノリン酸塩
ＰＤＥ ホスホジエステラーゼ
ＰＧＫ タンパク質キナーゼＧ
ＭＡＤ 多重波長異常分散
ＰＣＲ ポリメラーゼ連鎖反応
２ＹＴ １リットルあたりトリプトン １６ｇ、酵母エキス １０ｇ、 ＮａＣｌ ５ｇの溶液
Ｔｒｉｓ トリス［ヒドロキシメチル］アミノ−メタン
Ｅ−６４ エポキシスクシニル−ｌ−リューシルアミド−（４−グアニジ ノ） タン
【０４０４】
ＤＴＴ ＤＬ−ジチトトレイトール
β−ＭＥ β−メルカプトエタノール
ＩＰＴＧ β−Ｄ−イソプロピル−チオガラクトピラノシド
ＥＤＴＡ エチレンジアミン四酢酸
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ビス［２−ヒドロキシエチル］イミノ−トリス ［ヒドロキシ メチル］メタン
ＰＥＧ ポリエチレングリコール
ＰＥＧ２ＫＭＭＥ ポリエチレングリコール２０００モノメチルエーテル
ｒｍｓｄ 標準偏差
ｒｐｍ 毎分回転数
Ｍｏｉ 感染の多重度
Ｓｉｌｄｅｎｆｉｌ ５−［２−エトキシ−５−（４−メチル−１−ピペラジニルス ルホニル）フェニル］−１−メチル−３−ｎ−プロピル−１， ６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７ −オン、これは１−［［３−（６，７−ジヒドロ−１−メチル −７−オキソ−３−プロピル−ｌＨ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ ピリミジン−５−イル）−４−エトキシフェニル］スルホニル ］−４−メチルピペラジン（欧州特許第Ａ−０４６３７５６号 参照）としても知られている。
ＵＫ−０９２，４８０ 「Ｓｉｌｄｅｎｆｉｌ」参照
ＵＫ−０８８，８００ ５−（２−エトキシフェニル）−１−メチル−３−プロピル− １，６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン −７−オン
【０４０５】
配列表
配列番号１
野生型ＰＤＥ５「ループ領域」
【化１３】
【０４０６】
配列番号２
野生型ＰＤＥ５触媒ドメイン
【化１４】
【０４０７】
配列番号３
全長野生型ＰＤＥ５配列
【化１５】
【０４０８】
配列番号４
野生型ＰＤＥ４「ループ領域」
ＨＰＧＶＳＮＱＦＬＩＮＴＮＳＥＬＡＬＭＹＮＤＥＳＶＬＥ
【０４０９】
配列番号５
ループスワップされたＰＤＥ５触媒ドメイン＝ＰＤＥ５*
【化１６】
【０４１０】
配列番号６
ＰＤＥ５*を含む全長ＰＤＥ５配列
【化１７】
【０４１１】
配列番号７
【化１８】
【０４１２】
配列番号８
【化１９】
【０４１３】
配列番号９
【化２０】
【０４１４】
配列番号１０
【化２１】
【０４１５】
配列番号１１
【化２２】
【０４１６】
配列番号１２
【化２３】
【０４１７】
配列番号１３
【化２４】
【０４１８】
配列番号１４
【化２５】
【図面の簡単な説明】
【０４１９】
【図１】図１は、ＰＤＥ５（上部配列）及びＰＤＥ４ｂ（下部配列）触媒ドメインのアライメントを示している。構造からのへリックスの位置及び付番は、各々についてマーキングされている。太字体の残基は、工学処理された領域についての配列アライメントを示している。ＰＤＥ４由来の配列は、ＰＤＥ５中の対応する領域を交換するために使用されてきた。こうして、この領域への残基の挿入という結果がもたらされる。下線は、ＰＤＥ５*中に不在のＣ−末端領域を強調している。
【図２】図２は、二次構造要素を示すタンパク質の全体的折畳みのリボン表現を示している。阻害物質は、全原子ステック表現で示され、金属イオンは球体として示されている。（Ａ）＝ＰＤＥ４ｂ、（Ｂ）＝野生型ＰＤＥ５＋Ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌ、（Ｃ）＝「ループスワップされた」ＰＤＥ５（ＰＤＥ５*）＋Ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌ。へリックスは、基準としてＰＤＥ４構造を用いて付番されている。へリックスＨ０−Ｈ７はサブドメイン１を形成し、へリックスＨ８−Ｈｌｌは、サブドメイン２を形成し、へリックスＨ１２−Ｈ１６はサブドメイン３を形成している。
【図３】図３： 活性部位領域での、アポＰＤＥ５*（「ループスワップされた」ＰＤＥ５）（左）及びＵＫ−０８８，８００でソーキングされたＰＤＥ５*（右）の２．５σで輪郭どりされたｆｏ−ｆｃ電子密度マップの比較。
【図４】図４： ＵＫ−０８８，８００、５−（２−エトキシフェニル）−ｌ−メチル−３−プロピル−１，６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オンの構造の二次元表現（Ｎ４上の水素のみが例示されている）。
【配列表】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
図４に表わされる式の化合物が、ＰＤＥ５タンパク質の活性部位に結合されるように当該タンパク質中にソーキングされ得る、配列番号４を含む配列修飾されたＰＤＥ５タンパク質の結晶。
【請求項２】
配列番号５を含む、請求項１に記載の結晶。
【請求項３】
沈殿剤としてポリエチレングリコールを使用して成長させる、請求項１又は２に記載の結晶。
【請求項４】
６．５〜８．０のｐＨ範囲内の緩衝液中で成長させる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の結晶。
【請求項５】
アルコールの存在下で成長させる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の結晶。
【請求項６】
ＨＥＰＥＳ緩衝液、ポリエチレングリコール４０００及びイソプロパノールを含む溶液中で成長させられる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の結晶。
【請求項７】
（ｍ）空間群Ｃ２；
（ｎ）単位格子寸法ａ〜５６ű１％、ｂ〜７７ű１％、ｃ〜８１ű１％、α＝γ＝９０°、β＝１０３°±１％；
（ｏ）１非対称単位あたり１分子；
（ｐ）約４０ｋＤａ±２ｋＤａの分子量のタンパク質を含む；
（ｑ）約４４±５％の計算上の溶剤含有量；及び
（ｒ）単斜晶系；
といった特徴の内１以上を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の結晶。
【請求項８】
前記タンパク質が、図２に示すヘリックス１１及び１２ａ（Ｈ１２ａ７２５〜７３１）の間のループ領域に沿ってヘリックス１５（Ｈ１５ ８１３〜８２４）及び１４（Ｈ１４ ７７２〜７９７）、ヘリックス１３（Ｈ１３ ７４９〜７６５）のＣ末端及びヘリックス１１（Ｈ１１ ７０６〜７２１）のＣ末端を境界とするタンパク質の第３のサブドメイン内に活性部位を有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の結晶。
【請求項９】
前記タンパク質がその第３サブドメイン内部に活性部位を有し、Ｌｅｕ７６５、Ａｌａ７６７及びＩｌｅ７６８、ならびにＰｈｅ８２０、Ｖａｌ７８２、Ｐｈｅ７８６、Ｔｙｒ６１２、Ｌｅｕ８０４、Ａｌａ７７９、Ａｌａ７８３、Ｉｌｅ８１３、Ｍｅｔ８１６及びＧｌｎ８１７の内の１以上を含んでいる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の結晶。
【請求項１０】
前記タンパク質が、任意の基準枠内で発現されるような誘導体セット又は表４で記されている原子座標により特徴づけされる３次元構造を有する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の結晶。
【請求項１１】
ＰＤＥ５リガンドがその中にソーキングされた、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の結晶。
【請求項１２】
前記タンパク質が、任意の基準枠内で発現されているような誘導体セット又は表５で記されている原子座標により特徴づけされる３次元構造を有する、請求項１１に記載の結晶。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の結晶の重原子誘導体。
【請求項１４】
ＰＤＥ５又は突然変異体、誘導体、変異体、類似体、相同体、サブドメイン又はフラグメントの３次元構造を誘導するための、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の結晶から決定された原子座標の使用。
【請求項１５】
サブドメインが触媒ドメインである、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
ＰＤＥ５のリガンドである化合物を同定する方法において、以下のステップ：
ｅ）請求項１〜１３のいずれか１項に記載の結晶を提供し、
ｆ）化合物を結晶内にソーキングするのに貢献する条件下で化合物と結晶を接触させ、
ｇ）得られたソーキングされた結晶内のタンパク質の活性部位に化合物が結合されているか否かをＸ線回折及び構造ソリューションを用いて決定し、
ｈ）任意にはＰＤＥ５の阻害物質であるか否かを決定するためにリガンドを検定する、
を含む前記方法。
【請求項１７】
前記化合物が図４に示す構造鋳型に基づいている、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ＰＤＥ５と会合する能力をもつ化合物を設計する方法において、以下のステップ：
（ａ）請求項１〜１３のいずれか１項に記載の結晶の中に存在するタンパク質又はそのフラグメント又はそのサブドメインの構造の３次元表現を計算により新規作成し、
（ｂ）１つの化合物の構造の３次元表現を計算により新規作成し、
（ｃ）タンパク質構造の３次元表現と化合物構造の３次元表現を同時に表示し、
（ｄ）化合物構造の３次元表現がタンパク質構造の活性部位の３次元表現に適合するか否かを評価し、
（ｅ）任意には、ＰＤＥ５の阻害物質であるか否かを決定するべくリガンドを作り検定する、
を含む前記方法。
【請求項１９】
潜在的ＰＤＥ５リガンドの１群の中からＰＤＥ５リガンドを選択する方法において、以下の：
（ａ）請求項１〜１３のいずれか１項に記載の結晶の中に存在するタンパク質又はそのフラグメント又はそのサブドメインの構造の３次元表現を計算により新規作成し、
（ｂ）リガンドの構造の３次元表現を計算により新規作成し、
（ｃ）タンパク質構造の３次元表現とリガンド構造の３次元表現を同時に表示し、
（ｄ）リガンド構造の３次元表現がタンパク質構造の活性部位の３次元表現に適合するか否かを評価し、
（ｅ）任意には、ＰＤＥ５の阻害物質であるか否かを決定するべくリガンドを作り検定する、
を含む前記方法。
【請求項２０】
ＰＤＥ５の部位特異的突然変異体を設計するための、請求項１６に従って誘導可能であるような３次元構造の使用。
【請求項２１】
以下のステップ：
ｄ）緩衝液及びポリエチレングリコールを含む安定化用水溶液中で結晶をインキュベートし、
ｅ）安定化用溶液と化合物を組合わせ、及び
ｆ）任意には、安定化用溶液に抗凍結剤を添加する、
を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の結晶内に化合物をソーキングする方法。
【請求項１】
図４に表わされる式の化合物が、ＰＤＥ５タンパク質の活性部位に結合されるように当該タンパク質中にソーキングされ得る、配列番号４を含む配列修飾されたＰＤＥ５タンパク質の結晶。
【請求項２】
配列番号５を含む、請求項１に記載の結晶。
【請求項３】
沈殿剤としてポリエチレングリコールを使用して成長させる、請求項１又は２に記載の結晶。
【請求項４】
６．５〜８．０のｐＨ範囲内の緩衝液中で成長させる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の結晶。
【請求項５】
アルコールの存在下で成長させる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の結晶。
【請求項６】
ＨＥＰＥＳ緩衝液、ポリエチレングリコール４０００及びイソプロパノールを含む溶液中で成長させられる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の結晶。
【請求項７】
（ｍ）空間群Ｃ２；
（ｎ）単位格子寸法ａ〜５６ű１％、ｂ〜７７ű１％、ｃ〜８１ű１％、α＝γ＝９０°、β＝１０３°±１％；
（ｏ）１非対称単位あたり１分子；
（ｐ）約４０ｋＤａ±２ｋＤａの分子量のタンパク質を含む；
（ｑ）約４４±５％の計算上の溶剤含有量；及び
（ｒ）単斜晶系；
といった特徴の内１以上を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の結晶。
【請求項８】
前記タンパク質が、図２に示すヘリックス１１及び１２ａ（Ｈ１２ａ７２５〜７３１）の間のループ領域に沿ってヘリックス１５（Ｈ１５ ８１３〜８２４）及び１４（Ｈ１４ ７７２〜７９７）、ヘリックス１３（Ｈ１３ ７４９〜７６５）のＣ末端及びヘリックス１１（Ｈ１１ ７０６〜７２１）のＣ末端を境界とするタンパク質の第３のサブドメイン内に活性部位を有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の結晶。
【請求項９】
前記タンパク質がその第３サブドメイン内部に活性部位を有し、Ｌｅｕ７６５、Ａｌａ７６７及びＩｌｅ７６８、ならびにＰｈｅ８２０、Ｖａｌ７８２、Ｐｈｅ７８６、Ｔｙｒ６１２、Ｌｅｕ８０４、Ａｌａ７７９、Ａｌａ７８３、Ｉｌｅ８１３、Ｍｅｔ８１６及びＧｌｎ８１７の内の１以上を含んでいる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の結晶。
【請求項１０】
前記タンパク質が、任意の基準枠内で発現されるような誘導体セット又は表４で記されている原子座標により特徴づけされる３次元構造を有する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の結晶。
【請求項１１】
ＰＤＥ５リガンドがその中にソーキングされた、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の結晶。
【請求項１２】
前記タンパク質が、任意の基準枠内で発現されているような誘導体セット又は表５で記されている原子座標により特徴づけされる３次元構造を有する、請求項１１に記載の結晶。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の結晶の重原子誘導体。
【請求項１４】
ＰＤＥ５又は突然変異体、誘導体、変異体、類似体、相同体、サブドメイン又はフラグメントの３次元構造を誘導するための、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の結晶から決定された原子座標の使用。
【請求項１５】
サブドメインが触媒ドメインである、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
ＰＤＥ５のリガンドである化合物を同定する方法において、以下のステップ：
ｅ）請求項１〜１３のいずれか１項に記載の結晶を提供し、
ｆ）化合物を結晶内にソーキングするのに貢献する条件下で化合物と結晶を接触させ、
ｇ）得られたソーキングされた結晶内のタンパク質の活性部位に化合物が結合されているか否かをＸ線回折及び構造ソリューションを用いて決定し、
ｈ）任意にはＰＤＥ５の阻害物質であるか否かを決定するためにリガンドを検定する、
を含む前記方法。
【請求項１７】
前記化合物が図４に示す構造鋳型に基づいている、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ＰＤＥ５と会合する能力をもつ化合物を設計する方法において、以下のステップ：
（ａ）請求項１〜１３のいずれか１項に記載の結晶の中に存在するタンパク質又はそのフラグメント又はそのサブドメインの構造の３次元表現を計算により新規作成し、
（ｂ）１つの化合物の構造の３次元表現を計算により新規作成し、
（ｃ）タンパク質構造の３次元表現と化合物構造の３次元表現を同時に表示し、
（ｄ）化合物構造の３次元表現がタンパク質構造の活性部位の３次元表現に適合するか否かを評価し、
（ｅ）任意には、ＰＤＥ５の阻害物質であるか否かを決定するべくリガンドを作り検定する、
を含む前記方法。
【請求項１９】
潜在的ＰＤＥ５リガンドの１群の中からＰＤＥ５リガンドを選択する方法において、以下の：
（ａ）請求項１〜１３のいずれか１項に記載の結晶の中に存在するタンパク質又はそのフラグメント又はそのサブドメインの構造の３次元表現を計算により新規作成し、
（ｂ）リガンドの構造の３次元表現を計算により新規作成し、
（ｃ）タンパク質構造の３次元表現とリガンド構造の３次元表現を同時に表示し、
（ｄ）リガンド構造の３次元表現がタンパク質構造の活性部位の３次元表現に適合するか否かを評価し、
（ｅ）任意には、ＰＤＥ５の阻害物質であるか否かを決定するべくリガンドを作り検定する、
を含む前記方法。
【請求項２０】
ＰＤＥ５の部位特異的突然変異体を設計するための、請求項１６に従って誘導可能であるような３次元構造の使用。
【請求項２１】
以下のステップ：
ｄ）緩衝液及びポリエチレングリコールを含む安定化用水溶液中で結晶をインキュベートし、
ｅ）安定化用溶液と化合物を組合わせ、及び
ｆ）任意には、安定化用溶液に抗凍結剤を添加する、
を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の結晶内に化合物をソーキングする方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公表番号】特表２００６−５２５８０１（Ｐ２００６−５２５８０１Ａ）
【公表日】平成１８年１１月１６日（２００６．１１．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５０６５５３（Ｐ２００６−５０６５５３）
【出願日】平成１６年４月２１日（２００４．４．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００４／００１３３２
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０９７０１０
【国際公開日】平成１６年１１月１１日（２００４．１１．１１）
【出願人】（５９３１４１９５３）ファイザー・インク (302)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年１１月１６日（２００６．１１．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年４月２１日（２００４．４．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００４／００１３３２
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０９７０１０
【国際公開日】平成１６年１１月１１日（２００４．１１．１１）
【出願人】（５９３１４１９５３）ファイザー・インク (302)
【Ｆターム（参考）】
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