ＰＥＧインターフェロン−ベータ製剤
本発明は、ペグ化ＩＦＮ−β（ＰＥＧ−ＩＦＮ−β）、賦形剤、界面活性剤、及び緩衝液を含む液体医薬組成物であって、前記賦形剤がポリオールであり、前記界面活性剤が非イオン性界面活性剤であり、そして前記緩衝液が酢酸ナトリウム緩衝液である、前記組成物に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペグ化インターフェロンベータ（ＰＥＧ−ＩＦＮ−β）の製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
インターフェロン−βはタンパク質であり、そして現在、例えば多発性硬化症（ＭＳ）の処置に適用される有用な医薬として知られている。
【０００３】
例えばそれらの活性又は安定性を変化又は改善するために、タンパク質は、それらの配列中を、又は他の修飾によって変更され得る。かかる修飾の一つは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のようなポリマーへの結合の導入である。
【０００４】
ポリエチレングリコールと結合したインターフェロン−β（ＰＥＧ−ＩＦＮ−β）は、例えば国際公開第９９／５５３７７号、及び欧州特許出願公開第０５９３８６８Ａ１号明細書に記載されている。
【０００５】
凍結乾燥によって、又は液体医薬組成物の形態でタンパク質を安定化するために、医学分野において種々の試みがなされた。凍結乾燥された物質は、使用に先立って溶液中で、もどされなければならない。患者への適用のために、さらなる任意の準備を必要としない、濃縮された、又は既製の液体医薬組成物はより簡便であり、かつ非常に興味深い。
【０００６】
インターフェロン−βの液体医薬製剤は、例えば国際公開第９５／３１２１３号及び国際公開第２００４／０９６２６３号に記載されている。
【０００７】
国際公開第２００５／０８４３０３号には、インターフェロン−ベータ１ｂポリマー複合体組成物が記載されている。
【０００８】
米国特許第６，５３１，１２２号明細書は、賦形剤、可溶化剤、及び緩衝液と一緒になった製剤中の、ペグ化インターフェロン変異体に関する。
【０００９】
国際公開第２００４／０６０２９９号は、インターフェロン−ベータ、及びその受容体結合性アンタゴニストを含む、サイトカインのポリマー複合体の合成方法を提供する。
【００１０】
米国特許出願公開第２００６００５１３２０Ａ１号明細書は、トレハロースを抗凍結剤として使用する、ペグ化インターフェロンの凍結乾燥製剤に関する。
【００１１】
国際公開第９９／４８５３５号は、凍結乾燥中及びその後における、ＰＥＧ−インターフェロンアルファ複合体の損失及び損傷を防ぐ製剤を提供する。
【００１２】
国際公開第０３００２１５２号は、インターフェロンポリペプチド及びスルホアルキルエーテルシクロデキストリン誘導体を含む、安定化された組成物に特に関する。
【００１３】
上記のいずれの参考文献も、本発明の液体製剤を開示又は示唆していない。
【発明の概要】
【００１４】
発明の概要
本発明の一つの態様に従って、ペグ化インターフェロンベータ（ＰＥＧ−ＩＦＮ−β）、賦形剤、界面活性剤、及び緩衝液を含む液体医薬組成物であって、前記賦形剤がポリオールであり、前記界面活性剤が非イオン性界面活性剤であり、そして前記緩衝液が酢酸ナトリウム緩衝液である、前記組成物が提供される。
【００１５】
本発明の別の態様に従って、計算された量の賦形剤及び界面活性剤を緩衝液溶液へ添加し、その後ＰＥＧ−ＩＦＮ−βを添加することを含む、液体医薬組成物を製造するための方法が提供される。
【００１６】
本発明の別の態様に従って、本発明の液体医薬製剤を含む、無菌であり、かつ使用前の貯蔵に好適である条件下で密封された容器が提供される。
【００１７】
本発明の別の態様に従って、本発明の医薬組成物を充填した容器を含む、医薬組成物のキットが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、ＡＦおよびＴ０での回収を％で表した、％回収を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
表及び図の簡単な説明
Ｉ．０．０４４ｍｇ／ｍｌのＰＥＧ−ＩＦＮ−ベータを含む、本発明製剤
【００２０】
表１は、０．０４４ｍｇ／ｍｌのＰＥＧ−ＩＦＮ−ベータを含む、本発明の種々の製剤を示す。
【００２１】
表２は、４０℃、２５℃及び２〜８℃のそれぞれにおける、ｐＨ４．２での、本発明の製剤の経時的な安定性試験（ＳＥ−ＨＰＬＣ）を示す。
【００２２】
表３は、４０℃、２５℃及び２〜８℃のそれぞれにおける、ｐＨ４．２での、本発明の製剤の経時的な安定性試験（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を示す。
【００２３】
表４は、ＳＥ−ＨＰＬＣによる、本発明の製剤の力価（ｍｃｇ／ｍＬ）を示す。
【００２４】
表５は、％回収を用いての、ろ過前及び後における、ＳＥ−ＨＰＬＣによる本発明の製剤の力価（ｍｃｇ／ｍＬ）を示し、そしてグラフ（図１：ＡＦ及びＴ０回収を％で示した％回収）として示される。
【００２５】
表６は、４週から２６週間の、２５℃、及び２〜８℃の各々における、本発明の製剤のｐＨ値を示す。
【００２６】
表７は、本発明の製剤の経時的なバイオアッセイの結果を示す。
【００２７】
ＩＩ．０．０５５及び０．１１０ｍｇ／ｍｌのＰＥＧ−ＩＦＮ−ベータを各々含む、本発明の製剤：
【００２８】
これらの製剤において、ＰＥＧ−ＩＦＮ−ベータ量は、０．０５５及び０．１１０ｍｇ／ｍｌへと各々増大された。
【００２９】
表８は、４０℃、２５℃、及び２〜８℃の各々における、ｐＨ４．２での、本発明の製剤純度を経時的に測定するＳＥ−ＨＰＬＣ試験を示す。
【００３０】
表９は、４０℃、２５℃、及び２〜８℃の各々における、ｐＨ４．２での、本発明の製剤のタンパク質含量を経時的に測定するＳＥ−ＨＰＬＣ試験を示す。
【００３１】
表１０は、４０℃、２５℃、及び２〜８℃の各々における、ｐＨ４．２での、本発明の製剤純度を経時的に測定するＲＰ−ＨＰＬＣ試験を示す。
【００３２】
表１１は、２５℃及び２〜８℃の各々における、４〜１３週間での本発明の製剤の経時的ｐＨ値を示す。
【００３３】
表１２は、２５℃及び２〜８℃の各々における、本発明の製剤のバイオアッセイデータを示す。
【００３４】
表１３は、本発明の製剤のＰＥＧ−ＩＦＮ−ベータのペプチドマッピングによる酸化形態に関するデータを示す。
【００３５】
発明の詳細な説明
本発明は、ペグ化インターフェロンベータ（ＰＥＧ−ＩＦＮ−β、ＰＥＧ−ＩＦＮ−ベータ）、賦形剤、界面活性剤及び緩衝液を含む液体医薬組成物であって、前記賦形剤がポリオールであり、前記界面活性剤が非イオン性界面活性剤であり、そして前記緩衝液が酢酸ナトリウム緩衝液である、前記組成物に関する。
【００３６】
一つの態様において、本発明は、ＰＥＧ−ＩＦＮ−β若しくはそのムテイン又はそれらの活性断片、賦形剤、界面活性剤及び緩衝液を含む液体医薬組成物であって、前記賦形剤がポリオールであり、前記界面活性剤が非イオン性界面活性剤であり、そして前記緩衝液が酢酸ナトリウム緩衝液である、前記組成物に関する。
【００３７】
以下の段落において、本発明の製剤を構成する種々の化合物の定義が与えられ、そしてそれらは、他でより広い定義が提供されない限り、本明細書及びクレーム全体を通じて適用されることが意図される。
【００３８】
本製剤のペグ化インターフェロン−ベータは、ポリエチレングリコールの共有結合修飾、又は同等の修飾により生じる任意のインターフェロン−ベータであり得る。ＰＥＧ−インターフェロン−ベータの一つの例は、既知の方法、例えば国際公開第９９／５５３７７号に記載されたものによってＰＥＧ化が行われ得る、ＰＥＧ−インターフェロン−ベータである。
【００３９】
特に本発明に従って、ＩＦＮ−ベータは、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）としても知られる疎水性ポリマーポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と共有結合している。当該ＰＥＧは、各々の末端にヒドロキシル基を有する線状ポリマーであり得る：
【００４０】
【化１】
【００４１】
それはまた、メトキシ−ＰＥＧ−ＯＨ（ｍ−ＰＥＧ）として使用され得、この中で、一方の末端は比較的不活性なメトキシ基であり、他方の末端は化学的修飾がなされるヒドロキシル基である：
【００４２】
【化２】
【００４３】
上式において、ｎは１〜数百であり得る。
【００４４】
別の好ましい実施形態において、当該ＰＥＧはまた、Ｒ（ＰＥＧ−ＯＨ）ｍによって表される分岐のＰＥＧであり得、ここでＲは中心のコア部、例えばペンタエリスリトール又はグリセロールであり、そしてｍは分岐した腕の数を示す。分岐した腕（ｍ）は、３〜１００又は数百個の範囲であり得る。ヒドロキシル基は化学修飾され得る。
【００４５】
本発明の分岐の別の形態は、例えば国際公開第９６／２１４６９号に記載されており、ここで当該ＰＥＧは、化学修飾がなされる単一の末端を有する。このＰＥＧ型は、（ＣＨ3ＯＰＥＧ）ｐＲＸとして表され得、ここでｐは２又は３であり、Ｒは中心のコア、例えばリシン又はグリセロールを示し、そしてＸは官能基、例えば化学的活性化がなされるカルボキシルを示す。
【００４６】
本発明の分岐の別の形態は、「ペンダント形ＰＥＧ」と表され、そしてそれは反応基、例えばカルボキシルを、ＰＥＧ鎖の末端よりもむしろＰＥＧバックボーンに沿って有する。
【００４７】
さらに、例えば米国特許出願第０６／０２６，７１６号明細書に記載されている、弱い又は分解性の結合をそのバックボーンに有する、本発明のＰＥＧ−ＩＦＮ−ベータを製造することが可能である。したがってＰＥＧは、当該ポリマーバックボーン中に、加水分解がなされるエステル結合を有して製造され得る。以下のスキームに従って、当該加水分解によってポリマーの切断が起こり、より小さい分子量の断片となる：
【００４８】
【化３】
【００４９】
エチレンオキシドとプロピレンオキシドとの共重合体は、それらの化学においてＰＥＧと密接に関連しており、そして本発明に従って、それらはＰＥＧの代わりに使用され得る。
【００５０】
種々の方法が、タンパク質をＰＥＧ化するために開発された。ＰＥＧは、通常親電子的に活性化されたＰＥＧ誘導体を利用して、タンパク質中に見られる反応基と結合され得る。αアミノ基又はリシン残基中で見られるεアミノ基、及び当該Ｎ末端が製造物の混合物からなる複合体を生じるＮ末端が使用され得る。
【００５１】
当該複合体は好ましくは、ひとつのタンパク質分子あたり、１個からタンパク質中のアミノ酸の数の範囲でＰＥＧ分子と結合した複合体の一群からなる。
【００５２】
例えばチオール選択的ＰＥＧ誘導体の合成に関する、Ｗｏｇｈｉｒｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，４（５）：３１４−３１８，１９９３に記載されたように、ＩＦＮ−ベータ中に、ＰＥＧ化されるよう意図された部位を導入することは好ましい。
【００５３】
一つの実施形態において、ＩＦＮは特異的にＰＥＧ化されている。特異的ＰＥＧ化は、欧州特許第６７５２０１号明細書特許に従って、例えばｍＰＥＧ−プロピオンアルデヒドを有するＮ末端残基で行われ得る。Ｗｏｇｈｉｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，４（５）：３１４−３１８，１９９３に記載された部位特異的モノＰＥＧ化が特に好ましい。
【００５４】
本発明の実施形態は、国際公開第９９／５５３７７号に記載されたような、Ｃｙｓ17で共有結合してモノＰＥＧ化されるＩＦＮ−ベータである。ＰＥＧ部分は、線状又は分岐のメトキシＰＥＧ、加水分解的に又は酵素的に分解されるＰＥＧ、及び一つ以上のポリオール並びにＰＥＧ及びＰＬＧＡ（ポリ（乳酸／グリコール酸））の共重合体であり得る。
【００５５】
本発明の実施形態におけるシステインのチオール基は、チオールと反応するＰＥＧ化試薬と反応され得る。それは、例えばオルトピリジルジスルフィド、ビニルスルホン、マレイミド、ヨードアセトイミドのような官能基を含むＰＥＧであり得る。好ましくは、チオール反応性ＰＥＧ化試薬は、ＰＥＧのオルトピリジルジスルフィド（ＯＰＳＳ）誘導体である。ＰＥＧ化試薬は、その一末端のみが結合に利用されるモノメチル化形態で、又は両末端が結合に利用される二官能性形態で使用される。
【００５６】
好ましい実施形態の反応において、ＩＦＮ−β−Ｃｙｓ17が使用され、そしてそれは本願明細書に記載された反応スキームに従って反応する。この反応は、Ｃｙｓ17に対して部位特異的であり、なぜならばＩＦＮ−βにおける（３１番目及び１４１番目の）他の２つのシステイン残基は、ジスルフィド結合を形成し、したがってＰＥＧ化できないからである。ＰＥＧ−ＩＦＮ−βは、５０〜１１０ｋＤａ、好ましくは約７０ｋＤａの分子量を有するタンパク質の大きさに匹敵する有効な大きさを有する。部位特異的なＩＦＮ−β修飾において、結合されるＰＥＧ分子は、好ましくは２０ｋＤ超の分子量を有する。一つの実施形態において、スペーサーを介してＣｙｓ17と結合されたＰＥＧ分子は、２×２０ｋＤａである。
【００５７】
スペーサー及びＩＦＮは、以下の合成スキームに従って、ＩＦＮ ２ｋＤａ−ＯＰＳＳを形成する。
【００５８】
ＰＥＧ化後、遊離のスペーサー及び／又はＰＥＧからＰＥＧ−ＩＦＮ−βを分離するために、溶液を精製する。好ましくは、この精製ステップは限外ろ過によって行われる。限外ろ過は、１０℃未満で、好ましくは５＋／−３℃の温度で、より好ましくは４℃で、塩基性条件で行われる。精製ステップにおいて、好ましくは０．１ＭのＮａＯＨが使用される。生じるＰＥＧ−ＩＦＮ−β溶液は、０．５ＥＵ／ｍｌ未満のエンドトキシンを、好ましくは０．２５ＥＵ／ｍｌ未満のエンドトキシンを含む。
【００５９】
一つの実施形態において、ＰＥＧ化は、以下のスキームに従ってＩＦＮ−βへと導入される：
【００６０】
【化４】
【００６１】
一つの実施形態において、低分子量のＰＥＧ部分はＩＦＮ−βと結合され得る。
【００６２】
低分子量のＰＥＧ部分は、式：
【００６３】
【化５】
【００６４】
［式中、Ｗ及びＸは、独立して、アミン、スルフヒドリル、カルボキシル、又はヒドロキシル基と反応する基であって、当該低分子量のＰＥＧ部分とＩＦＮ−βとを結合させる］
を有する。Ｗ及びＸは、好ましくは、独立してオルトピリジルジスルフィド、マレイミド、ビニルスルホン、ヨードアセトアミド、アミン、チオール、カルボキシル、活性エステル、ベンゾトリアゾールカーボネート、ｐ−ニトロフェノールカーボネート、イソシアネート、及びビオチンから選択される。
【００６５】
低分子量のＰＥＧ部分は、好ましくは、１００〜５０００ダルトンの分子量を有する。好ましい実施形態において、それは、１０００〜３０００ダルトン、好ましくは１５００〜２０００ダルトン、及びより好ましくは２０００ダルトンである。
【００６６】
低分子量ＰＥＧの遊離の末端とＩＮＦ−βとの結合のための、単官能性の又は二官能性のＰＥＧ部分は、好ましくは約１００〜２００ダルトンの範囲内の分子量を有する。それは好ましくは、メトキシＰＥＧ、分岐のＰＥＧ、加水分解的に又は酵素的に分解されるＰＥＧ、ペンダント型ＰＥＧ又はデンドリマーＰＥＧである。
【００６７】
単官能性の又は二官能性のＰＥＧはさらに、以下の式：
【００６８】
【化６】
【００６９】
［式中、
Ｙは、ＩＦＮ−βと結合する低分子量ＰＥＧ部分の遊離末端上の末端基である程度に反応性があり、そしてＺは、−ＯＣＨ3、又は二官能性複合体を形成する程度に反応性を有する基である］
を有する。
【００７０】
したがって、段階的な方法で、２個以上のＰＥＧ部分が使用されて、本発明の組成物において及び医薬としての使用のために有用である、ＰＥＧ−ＩＦＮ−βを産生する。
【００７１】
有利なことに、ＰＥＧとＩＦＮ−βとの間のジスルフィド結合は、血液循環において安定であり、そして細胞への侵入時に切断される。
【００７２】
本発明の製剤において使用されるＰＥＧ−ＩＦＮ−βは、天然のインターフェロン−βと比較して、ほぼ同等又はより高いインターフェロン−β活性を有する。
【００７３】
賦形剤は、任意のポリオールであり得、他の成分と一緒になって、安定なＰＥＧ−インターフェロン−ベータ製剤をもたらす。ポリオールの例は、マンニトール（ＰＥＡＲＬＩＴＯＬ（登録商標））、ソルビトール（ＮＥＯＳＯＲＢ（登録商標））、マルチトール（ＭＡＬＴＩＳＯＲＢ）、キシリトール（ＸＹＬＩＳＯＲＢ）、及びマルチトール（ＬＹＣＡＳＩＮ）である。好ましいポリオール賦形剤は、マンニトールである。
【００７４】
本発明に従って、非イオン性界面活性剤が使用される。非イオン性界面活性剤は、ポリオール誘導体、ポリオキシエチレンエステル及びエーテル、ポロキサマー、ノニルフェニルエーテル、ポリビニルアルコール、プロピレングリコールジアセテート、アルカノールアミドを含む。非イオン性界面活性剤は、好ましくはポロキサマーであり得る。ポロキサマー１８８が特に好ましい。
【００７５】
選択されたレベルでｐＨを維持することができる、任意の緩衝液が使用され得る。当該緩衝液は、酢酸ナトリウム緩衝液又はＰＢＳであり得る。酢酸ナトリウム緩衝液が特に好ましい。
【００７６】
一つの実施形態において、本発明は、ＰＥＧ−インターフェロン−ベータ、賦形剤、界面活性剤、及び緩衝液を含む液体医薬組成物であって、前記賦形剤がマンニトールであり、前記界面活性剤がポロキサマー１８８であり、そして前記緩衝液が酢酸ナトリウム緩衝液である、前記組成物である。
【００７７】
インターフェロン−ベータは、本発明に従ってペグ化がなされる、天然に存在するヒトインターフェロン−ベータ又は組み換えにより産生されるものであり得る。さらに、本発明のインターフェロン−ベータ（ＩＦＮ−β）は、ウィルス感染の応答において身体で産生される糖タンパク質のことである。
【００７８】
インターフェロン単位又はインターフェロンの国際単位（国際単位において、Ｕ又はＩＵ）が、ウィルスによる損傷に対して細胞の５０％を保護するために必要な量として定義されている、ＩＦＮ活性の測定単位として報告されている。生物活性を測定するために使用され得るアッセイは、報告のなされている（Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ，ｅｔ ａｌ．１９８１；Ｆａｍｉｌｌｅｔｔｉ，Ｐ．Ｃ，ｅｔ ａｌ．，１９８１）細胞変性効果阻害アッセイである。このインターフェロンに関する抗ウィルスアッセイにおいて、１単位／ｍｌのインターフェロンが、５０％の細胞変性効果を生じるために必要な量である。当該単位は、国立衛生研究所によって提供されたＨｕ−ＩＦＮ−ベータの国際参照標準（ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｔａｎｄａｒｄ）（Ｐｅｓｔｋａ，Ｓ．１９８６）によって決定された。
【００７９】
インターフェロンはまた、腫瘍への生物の応答に対して影響を有し、免疫修飾を通じた認識に影響があるため、生物学的応答調節物質（ＢＲＭ）とも呼ばれる。
【００８０】
ヒト線維芽細胞インターフェロン（ＩＦＮ−β）は抗ウィルス活性を有し、そしてまた、新生細胞に対するナチュラルキラー細胞を刺激し得る。それは、ウィルス及び二重鎖ＲＮＡによって誘導される約２０，０００Ｄａのポリペプチドである。線維芽細胞インターフェロンの遺伝子のヌクレオチド配列から、組み換えＤＮＡ技術（Ｄｅｒｙｎｋ ｅｔ ａｌ．１９８０）によってクローニングされ、タンパク質の完全アミノ酸配列が推定された。それは１６６個のアミノ酸である。
【００８１】
多発性硬化症（ＭＳ）のインターフェロン療法におけるＲｅｂｉｆ（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ Ｓｅｒｏｎｏ−組換えヒトインターフェロン-β）は、哺乳動物細胞株から産生されるインターフェロン、（ＩＦＮ）−ベータ−１ａである。その推奨される国際一般名（ＩＮＮ）は、「インターフェロンβ−１ａ」である。
【００８２】
本明細書において使用される「インターフェロンベータ」又は「ＩＦＮ−β」は、例えば上節で言及された任意の種類のＩＦＮ−βを含む、文献においてそのようなものとして定義されている任意の分子を含むことが意図されている。本発明に従って好適であるＩＦＮ−βは、特定のＰＥＧ化のための結合部分を示す限り、例えばＲｅｂｉｆ（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ Ｓｅｒｏｎｏ）、Ａｖｏｎｅｘ（登録商標）（Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ）として市販されている。本発明に従って、ヒト由来のインターフェロンベータの使用が同様に好ましい。本明細書において使用される用語「インターフェロンベータ」は、その塩、官能基誘導体、変異体、類縁体及び活性断片を含むことが意図されている。
【００８３】
本明細書において使用される用語「インターフェロン−ベータ（ＩＦＮ−β）」は、生体液からの単離によって得られるものとしての、又は真核性宿主細胞からＤＮＡ組み換え技術によって得られるものとしての、特にヒト由来の線維芽細胞インターフェロン、並びにその塩、官能基誘導体、変異体、類縁体及び活性断片を含むことが意図されている。好ましくは、ＩＦＮ−ベータは、インターフェロンベータ−１ａを意味することが意図されている。
【００８４】
本明細書において使用される用語「ムテイン」は、野生型ＩＦＮ−βと比較して、生じる生産物の活性を大幅に変化させることなく、天然ＩＦＮ−βの一つ以上のアミノ酸残基が異なるアミノ酸で置換されている、又は欠失している、ＩＦＮ−β及びＰＥＧ−ＩＦＮ−βの類縁体のことである。これらのムテインは、既知の合成法によって、及び／又は部位特異的変異誘発によって、又は好適な任意の他の技術によって製造される。好ましいムテインは、例えば、Ｓｈｅｐａｒｄ他（１９８１）、又はＭａｒｋ他（１９８４）によって説明されたものを含む。特に本発明のムテインはＣｙｓ17を含むが、分子中に上記の任意の変化が存在し得る。
【００８５】
任意のかかるムテインは、好ましくは、ＩＦＮ−βのものと実質的に同等、又はより強い活性を有するために、ＩＦＮ−βのものと十分に重複したアミノ酸配列を有する。インターフェロンの生物学的機能は当業者に周知であり、そして生物学的標準は、例えばＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌで確立され、及び利用可能である（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｏｒｇ／ｌｉｎｋｓ／ＮＩＢＳＣ）。
【００８６】
ＩＦＮ−β／ＰＥＧ−ＩＦＮ−β活性の決定のためのバイオアッセイは、文献に記載されている。ＩＦＮアッセイは、例えば、Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ他，１９８１によって記載されたとおりに実施され得る。したがって定められた実験によって、任意の所定のムテインが、ＩＦＮ−βと実質的に同等又はより強い活性を有するか否かが決定され得る。
【００８７】
本発明に従って使用され得るＩＦＮ−β及びＰＥＧ−ＩＦＮ−βのムテイン、又はそれをコードする核酸は、当業者によって過度の実験がなされることなく、本明細書に記載された技術及び指導に基づいて通常得られる置換ペプチド又はポリヌクレオチドと実質的に対応する有限の配列を含む。
【００８８】
本発明のムテインの好ましい変化は、「保存的」置換として知られているものである。本発明のポリペプチド又はタンパク質の保存的アミノ酸置換は、十分に同等の物理化学的特性を有する群中の同義のアミノ酸を含み得、ここで当該群のメンバー間における置換は、当該分子の生物学的機能を保存するであろう。アミノ酸の挿入及び欠失はまた、特に当該挿入又は欠失が少数のアミノ酸、例えば３０個未満、好ましくは１０個未満に関してであり、そして機能的構造に対して重要であるアミノ酸、例えばシステイン残基を除去又は置き換えたりしない場合において、それらの機能を変えることなく、上で定義された配列中においてなされ得ることは明らかである。かかる欠失及び／又は挿入によって産生されるタンパク質及びムテインは、本発明の範囲内である。
【００８９】
本発明における使用のための、ＰＥＧ−ＩＦＮ−βのムテインを得るために使用され得る、タンパク質のアミノ酸置換体の生産例は、Ｍａｒｋ他による、米国特許第４，９５９，３１４号、４，５８８，５８５号、及び４，７３７，４６２号明細書；Ｋｏｔｈｓ他による、米国特許第５，１１６，９４３号明細書、Ｎａｍｅｎ他による、米国特許第４，９６５，１９５号明細書；Ｃｈｏｎｇ他による、米国特許第４，８７９，１１１号明細書；及びＬｅｅ他による、米国特許第５，０１７，６９１号明細書において記載されたような任意の既知のステップ、並びに米国特許第４９０４，５８４号明細書（Ｓｈａｗ他）に記載されたリシン置換タンパク質を含む。ＩＦＮ−ベータの特定のムテインは、例えばＭａｒｋ他、１９８４に説明されている。
【００９０】
本明細書において使用される「官能基誘導体」は、ＰＥＧ−ＩＦＮ−βの誘導体、並びにそれらのムテイン及び融合タンパク質を含み、そしてそれらは、残基又はＮ末端基若しくはＣ末端基における側鎖として生じる官能基から、当技術分野において既知の方法で製造され得、そしてそれらが医薬として許容される限り、すなわちそれらがＩＦＮ−βの活性と実質的に同等であるタンパク質の活性を破壊しない限り、そしてそれを含む組成物に毒性特性を付与しない限り、本発明に含まれる。これらの誘導体は、例えば、カルボキシル基の脂肪族エステル、アンモニア又は一級若しくは二級アミンとの反応によるカルボキシル基のアミド、アシル部を伴って形成される、アミノ酸残基の遊離のアミノ酸のＮ−アシル誘導体（例えば、アルカノイル、若しくは炭素環式アロイル基）、又はアシル部を伴って形成される、遊離のヒドロキシル基のＯ−アシル誘導体（例えばセリル若しくはスレオニル残基のもの）を含む。
【００９１】
ＰＥＧ−ＩＦＮ−β、ムテイン、及び融合タンパク質の「活性断片」として、本発明は、タンパク質分子単体の、又はそれらと結合する関連分子又は残基、例えば糖若しくはリン酸残基、又はタンパク質分子、若しくはそれら自体の糖残基の凝集体を伴うポリペプチド鎖の任意の断片若しくは前駆体を含み、ただし前記断片が、対応するＩＦＮと比較して著しい活性減少を有さないことを条件とする。
【００９２】
本明細書における用語「塩」は、カルボキシル基の両方の塩のことであり、そして上記タンパク質又はその類縁体のアミノ基の酸付加塩のことである。カルボキシル基の塩は、当技術分野で既知の手段により形成され、そして無機塩、例えばナトリウム、カルシウム塩、アンモニウム塩、鉄塩、亜鉛塩などを含み、そして有機塩基との塩、例えば、トリエタノールアミン、アルギニン、又はリシン、ピペリジン、プロカインなどのアミンを用いて形成されるものを含む。酸付加塩は、例えば塩酸又は硫酸のような鉱酸との塩、及び例えば酢酸又はシュウ酸のような有機酸との塩を含む。もちろん、任意のかかる塩は、本発明に関するタンパク質（ＩＦＮ）の生物学的活性、例えば対応する受容体と結合する能力、及び受容体シグナル伝達を開始させる能力を保持していなければならない。
【００９３】
さらなる実施形態において、本発明の組成物中に含まれる融合タンパク質は、Ｉｇ融合体を含む。当該融合体は、直接に、又は１〜３個のアミノ酸残基、又はそれ以上の長さの、例えば１３個のアミノ酸残基であり得る短いリンカーペプチドを経由して結合し得る。前記リンカーは、ＩＦＮ配列と免疫グロブリン配列との間に導入される、例えばＥ−Ｆ−Ｍ（Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ）のトリペプチド、又はＧｌｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔであり得る。生じる融合タンパク質は、改善された特性、例えば生体液中における滞留時間の延長、特異的活性の増大、発現レベルの増大、又は促進された融合タンパク質の精製を有し得る。
【００９４】
好ましくは、ＰＥＧ−ＩＦＮ−ベータは、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約０．０１ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約０．０６ｍｇ／ｍｌ〜約０．０３ｍｇ／ｍｌ、そしてより好ましくは約０．０４４ｍｇ／ｍｌの濃度で組成物中に存在する。
【００９５】
別の実施形態において、ＰＥＧ−ＩＦＮ−ベータは、本発明の製剤中に、０．０５〜０．１５０ｍｇ／ｍｌの濃度で、好ましくは０．０５５又は０．１１０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。
【００９６】
当該組成物中で使用される投与量、及び個体へ適用され得る用量は、薬物動態特性、投与経路、患者の状態及び特徴（性別、年齢、体重、健康状態、大きさ）、症状の程度、併用療法、処置の頻度、及び所望の効果を含む、種々の要素に依存して変化するだろう。
【００９７】
ヒトＩＦＮ−ベータ／ＰＥＧ−ＩＦＮ−ベータの標準的投与量は、１日あたり８００００ＩＵ／ｋｇ〜２０００００ＩＵ／ｋｇ、又は１日あたり１人あたり６ＭＩＵ（百万国際単位）〜１２ＭＩＵ、又は一人あたり２２〜４４μｇ（マイクログラム）ＩＦＮ−ベータ当量の範囲内である。本発明に従って、本発明の組成物中におけるＰＥＧ−ＩＦＮ−βは、好ましくはＩＦＮ−ベータ換算で、一日あたり一人あたり約１〜５０μｇ、より好ましくは約１０〜３０μｇ、又は約１０〜２０μｇの投与量で使用され得る。
【００９８】
本発明の活性成分の投与は、静脈内経路、筋肉内経路、又は皮下経路でなされ得る。本発明の組成物の好ましい投与経路は、皮下経路及び筋肉内経路である。
【００９９】
本発明のＰＥＧ−ＩＦＮ−β組成物はまた、毎日、又は一日おきに、又は低頻度で投与され得る。好ましくは、ＰＥＧ−ＩＦＮ−β組成物は、一週間に一回、二回、又は三回投与される。好ましくは、それは任意の二週間に一回投与される。
【０１００】
好ましい投与経路は皮下投与であり、例えば一週間に三回投与される。さらに好ましい投与経路は筋肉内投与であり、そしてそれは例えば一週間に一回投与され得る。
【０１０１】
好ましくは、ＩＦＮ−ベータ換算で２２〜４４μｇ、又は６ＭＩＵ〜１２ＭＩＵの、本発明の組成物中のＰＥＧ−ＩＦＮ−ベータは、皮下注射によって一週間に三回投与される。
【０１０２】
ＰＥＧ−ＩＦＮ−ベータ組成物は、一日おきに、２５〜３０μｇ、又は８ＭＩＵ〜９．６ＭＩＵの投与量で皮下投与され得る。ＩＦＮ−ベータ換算で３０μｇ、又は６ＭＩＵのＰＥＧ−ＩＦＮ−ベータはさらに、一週間に一度筋肉内投与され得る。
【０１０３】
用語「安定性」は、（生物学的効果の維持を含む、）本発明のインターフェロン製剤の物理学的、化学的、及び構造的安定性のことである。タンパク質分子の化学的分解又は凝集による、より大きい次数のポリマー形成、脱グリコシル化、グリコシル化修飾、酸化、又は本発明に含まれるインターフェロンポリペプチドの少なくとも一つの生物学的活性を減少させる任意の他の構造的修飾によって、タンパク質製剤の不安定性が生じ得る。
【０１０４】
「安定な」組成物、溶液、又は製剤は、タンパク質の分解、修飾、凝集、生物学的活性の喪失などの程度が許容可能に制御されており、そして時間と共に許容不能に増大しないものを言う。好ましくは、当該製剤は、少なくとも６０％又は約６０％、より好ましくは少なくとも７０％又は約７０％、最も好ましくは少なくとも８０％又は約８０％の標識化されたインターフェロン活性が、１２〜２４か月に渡って維持される。本発明の好ましいＰＥＧ−ＩＦＮ−β組成物は、２〜８℃で貯蔵されるとき、少なくとも約６か月、１２か月、１８か月の、より好ましくは少なくとも約２０か月の、さらにより好ましくは少なくとも約２２か月の、最も好ましくは少なくとも約２４か月の貯蔵寿命を有する。
【０１０５】
本発明のＰＥＧ−ＩＦＮ−β液体医薬組成物の安定性を測定するための方法は、本明細書において記載された方法を含めて、当技術分野において利用可能である。したがって、本発明の液体組成物の貯蔵の間における、ＰＥＧ−ＩＦＮ−β凝集体形成は、溶液中の溶解ＰＥＧ−ＩＦＮ−βにおける変化を経時的に測定することによって容易に決定され得る。溶液中の溶解ポリペプチド量は、特定のＰＥＧ−ＩＦＮ−βの検出に適用される多くの分析アッセイによって定量化され得る。かかるアッセイは、例えば以下の実施例において記載されたような逆相（ＲＰ）−ＨＰＬＣ及びＵＶ吸収分光法を含む。
【０１０６】
可溶性凝集体として存在する可溶性ポリペプチド画分と非凝集性の生物学的に活性のある分子形態で存在する画分との間を区別するために、例えば以下の実施例に記載されているような分析超遠心分離を使用して、液体組成物中での貯蔵の間における可溶性及び不溶性凝集体の両方の決定が達成され得る。
【０１０７】
用語「緩衝液」又は「生理学的に許容される緩衝液」は、製剤中で、医薬的又は獣医学的使用のために安全であることが既知であり、そして製剤のｐＨを当該製剤に好適なｐＨ範囲で維持又は調節する効果を有する化合物の溶液のことである。適度に酸性のｐＨでｐＨを調節するために許容可能な緩衝液は、限定されないが、リン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、アルギニン、ＴＲＩＳ、及びヒスチジンのような化合物を含む。「ＴＲＩＳ」は、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール、及び任意のその薬理学的に許容可能な塩のことである。好ましい緩衝液は、生理食塩水、又は許容可能な塩と一緒になった酢酸バッファーである。
【０１０８】
賦形剤は、好ましくは、約３０ｍｇ／ｍｌ〜約５０ｍｇ／ｍｌの濃度で、より好ましくは約４０ｍｇ／ｍｌ〜約５０ｍｇ／ｍｌの濃度で、さらにより好ましくは約４５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。
【０１０９】
界面活性剤は、好ましくは、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌの濃度で、好ましくは約０．４ｍｇ／ｍｌ〜約０．７ｍｇ／ｍｌの濃度で、さらにより好ましくは約０．５ｍｇ／ｍｌの濃度である。
【０１１０】
用語「界面活性剤」は、液体の表面張力を減少させる、又は２つの液体間、若しくは液体と固体との間の界面張力を減少させる可溶性化合物のことであり、ここで表面張力は、表面領域を最小化する傾向にある、液体表面上に作用する力のことである。
【０１１１】
界面活性剤は、薬剤の吸収、又は標的組織への送達の変更のために、低分子量薬剤、及びポリペプチドの送達を含めて、医薬製剤中に時折使用される。周知の界面活性剤は、ポリソルベート（ソルビトール脂肪酸エステルのポリオキシエチレン誘導体；Ｔｗｅｅｎ（登録商標））、及びポロキサマー、例えばＢＡＳＦ（ドイツ）によって市販されているプルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）（登録商標）又はルトロール（Ｌｕｔｒｏｌ）（登録商標）を含む。
【０１１２】
本発明の好ましい実施形態に従って、プルロニック（登録商標）Ｆ７７、プルロニック（登録商標）Ｆ８７、プルロニック（登録商標）Ｆ８８、及びプルロニック（登録商標）Ｆ６８から選択される界面活性剤、特に好ましくはプルロニック（登録商標）Ｆ６８（ＢＡＳＦ、プルロニック（登録商標）Ｆ６８はまた、ポロキサマー１８８として知られている）を用いて、ＰＥＧ−ＩＦＮ−βを製剤化することによって、バイアル及び／又は送達装置（例えばシリンジ、ポンプ、カテーテルなど）の表面上における吸収によって引き起こされる活性の本源の損失を最小化する安定な製剤が得られることが見出された。プルロニック（登録商標）Ｆ７７、プルロニック（登録商標）Ｆ８７、プルロニック（登録商標）Ｆ８８、及びプルロニック（登録商標）Ｆ６８から選択される界面活性剤、特に好ましくはプルロニック（登録商標）Ｆ６８（ＢＡＳＦ、プルロニック（登録商標）Ｆ６８はまた、ポロキサマー１８８として知られている）を用いて、ＰＥＧ−ＩＦＮ−βを製剤化することによって、酸化及びタンパク質凝集体の形成に対してより抵抗性がある安定な組成物が得られることも見出された。
【０１１３】
プルロニック（登録商標）界面活性剤は、エチレンオキシド（ＥＯ）及びポリエチレンオキシド（ＰＯ）のブロック共重合体である。プロピレンオキシドブロック（ＰＯ）は、二つのエチレンオキシド（ＥＯ）ブロックの間に挟まれる。
【０１１４】
【化７】
【０１１５】
プルロニック（登録商標）Ｆ７７において、ポリオキシエチレン（親水性物質）のパーセンテージは７０％であり、そして疎水性物質（ポリオキシプロピレン）の分子量は、約２，３０６Ｄａである。
【０１１６】
プルロニック（登録商標）Ｆ８７において、ポリオキシエチレン（親水性物質）のパーセンテージは７０％であり、そして疎水性物質（ポリオキシプロピレン）の分子量は、約２，６４４Ｄａである。
【０１１７】
プルロニック（登録商標）Ｆ８８において、ポリオキシエチレン（親水性物質）のパーセンテージは８０％であり、そして疎水性物質（ポリオキシプロピレン）の分子量は、約２，６４４Ｄａである。
【０１１８】
プルロニック（登録商標）Ｆ６８において、ポリオキシエチレン（親水性物質）のパーセンテージは８０％であり、そして疎水性物質（ポリオキシプロピレン）の分子量は、約１，９６７Ｄａである。
【０１１９】
プルロニックシリーズのものと同程度の特性を有する他のポリマーはまた、本発明の組成物中で使用され得る。好ましい界面活性剤は、プルロニック（登録商標）Ｆ６８、及び同様の特性を有する界面活性剤である。
【０１２０】
プルロニック、特にプルロニック（登録商標）Ｆ６８は、所望の貯蔵期間（例えば１２〜２４か月）の間、ＰＥＧ−ＩＦＮ−βの安定性を維持するために十分である濃度で、同様に、例えばバイアル、アンプル、又はカートリッジ又はシリンジの表面上の吸収によるタンパク質の損失を予防するために十分である濃度で好ましくは存在する。
【０１２１】
好ましくは、液体製剤におけるプルロニック（登録商標）、特にプルロニック（登録商標）Ｆ６８の濃度は、０．０１又は約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜１０又は約１０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．０５又は約０．０５ｍｇ／ｍｌ〜５又は約５ｍｇ／ｍｌ、特により好ましくは０．１又は約０．１ｍｇ／ｍｌ〜２又は約２ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは１又は約１ｍｇ／ｍｌである。
【０１２２】
別の好ましい実施形態において、メチオニン、特にＬ−メチオニンが使用される。０．１ｍｇ／ｍｌ〜０．５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約０．１ｍｇ／ｍｌ〜０．３ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約０．２５ｍｇ／ｍｌ又は約０．１２ｍｇ／ｍｌの濃度が特に有用である。
【０１２３】
メチオニンの添加によって、当該製剤が有利にさらに安定化され、そしてタンパク質の酸化が減少することが見出された。
【０１２４】
本発明の製剤に含有される又は含まれる種々の化合物は上記の通り変化され得、そしてメチオニンの好ましい効果が達成され得る。一つの実施形態において、製剤は０．０５５ｍｇ／ｍｌのＰＥＧ−ＩＦＮ−ベータ、約ｐＨ３．５〜４．５の、好ましくはｐＨ４．２の１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、４５ｍｇ／ｍｌのマンニトール、及び０．５ｍｇ／ｍｌのポロキサマー１８８、或いは０．１１０ｍｇ／ｍｌのＰＥＧ−ＩＦＮ−ベータを含む、又は含有する。
【０１２５】
本発明の組成物は、特定のｐＨのプラス又はマイナス０．５単位以内で、前記組成物のｐＨを維持するために十分な量の緩衝液を含み、ここで前記特定のｐＨは約３．０〜約５．０、好ましくは約３．５〜４．５、さらにより好ましくは約４．２±０．２である。
【０１２６】
当該緩衝液は、約５ｍＭ〜５００ｍＭ、好ましくは約１０ｍＭの濃度で本発明の組成物中に存在する。
【０１２７】
当該組成物は、好ましくは水溶液である。
【０１２８】
本発明は液体組成物を含む。注射用の好ましい溶媒は水である。
【０１２９】
ＰＥＧ−ＩＦＮ−βに関してｐＨを約ｐＨ３〜５に、好ましくは３．５〜４．５に、そしより好ましくは約４．２＋／−０．２に調節することによって、安定な製剤が提供されることが示され得る。
【０１３０】
本発明の組成物は、液体組成物中で負に影響し得るＰＥＧ−ＩＦＮ−βの分解工程を、正に影響させることを達成した。この影響は、ＳＥ−ＨＰＬＣによって、例えば４０℃及び２５℃のそれぞれで測定され得る。本発明の組成物は、ＰＥＧ−ＩＦＮ−β含量の著しい減少が（ＳＥ−ＨＰＬＣで）観測されずに得られた。特に、ＰＥＧ−ＩＦＮ−β含量の減少が、４０℃で２週間まで、及び２５℃で６週間まで検出されなかった。本発明の組成物は良好な安定性特性を示し、及び特に、貯蔵中におけるタンパク質凝集の減少が達成され得る。
【０１３１】
ガラスバイアル中、好ましくは３ｍｌのもの、又はガラスシリンジ中、好ましくは１ｍｌのもの中で調製される、００４４ｍｇ／ｍｌのＰＥＧ−ＩＦＮ−β、約ｐＨ４．２の１０ｍＭの酢酸ナトリウム、４５ｍｇ／ｍｌのマンニトール、及び０．５ｍｇ／ｍｌのポロキサマー１８８を含む組成物に関して、肯定的な結果が特に達成され得る。
【０１３２】
本発明の組成物は、ＳＥ−ＨＰＬＣ、ＲＰ−ＨＰＬＣを使用して測定される純度のように優れた安定性、ＳＥ−ＨＰＬＣによって測定されるように優れたタンパク質含量、及び優れた生物学的活性を示す。
【０１３３】
別の態様において、本発明は、上記の液体医薬組成物を調製するための方法であって、計算された量の賦形剤及び界面活性剤を緩衝液へ添加し、その後ＰＥＧ−ＩＦＮ−βを添加する、前記方法に関する。
【０１３４】
さらに別の態様において、本発明は、無菌かつ使用前の貯蔵に好適である条件で本発明の液体医薬製剤を含む、密閉された容器に関する。
【０１３５】
医薬適用に好適である任意の容器が使用され得る。当該容器は好ましくは、自己注射器用の、あらかじめ充填された、シリンジ、バイアル、又はカートリッジである。
【０１３６】
本発明の製剤は、評価された装置を使用して投与され得る。これらの単一バイアル系を含む例は、溶液送達用の自己注射装置又はペン型注射装置、例えばＲｅｂｉｊｅｃｔ（登録商標）を含む。
【０１３７】
本願で特許請求されている生産物は、包装材料を含む。当該包装材料は、管理機関によって必要とされる情報に加え、当該生産物が使用され得る条件を提供する。必要ならば、最終溶液を調製するために、及びかかる最終溶液を２４時間以上、２つのバイアルで、湿式／乾式生産物で使用するために、本発明の当該包装材料は、患者への指示を提供する。単一バイアルの溶液生産物に関して、ラベルは、かかる溶液が２４時間以上の期間使用され得ることを示す。本願で特許請求される生産物は、ヒト医薬生産物の使用のために有用である。当該組成物は、透明な溶液として患者へ提供され得る。
【０１３８】
ＰＥＧ−ＩＦＮ−βは、本発明に従って、ＳＣ又はＩＭ注射、経皮、経肺、経粘膜、インプラント、浸透圧ポンプ、カートリッジ、マイクロポンプ、経口、又は当業者によって認識されている他の手段を含む、種々の送達法経由で患者へ投与され得る。
【０１３９】
別の態様において、本発明は、本発明の医薬組成物を充填した容器を含む、医薬組成物のキットに関する。
【０１４０】
当該容器は、好ましくは送達装置としての使用のためのシリンジである。
【０１４１】
雑誌の記事又は要約、公表された又は未公表の米国又は外国特許出願、発行された米国又は外国特許出願又は任意の他の参考文献を含む、本明細書で引用された全ての参考文献は、当該引用文献中の全てのデータ、表、図、及び文章を含めて、本明細書に参照により完全に援用される。さらに、本明細書中に引用された参考文献中に引用された参考文献の全ての内容が同様に、参照により完全に援用される。
【０１４２】
以下において、本発明は実施例によって説明されるが、それは本発明の範囲を限定するものと解釈されない。
【実施例】
【０１４３】
本発明の実施形態は、以下の実施例によって説明されるだろう。
１．ＰＥＧ−ＩＦＮ−β複合体の製造
ＰＥＧ−ＩＦＮ−βの製造例を、以下のスキームに示す：
【０１４４】
【化８】
【０１４５】
【化９】
【０１４６】
２．製剤化
ＰＥＧ−ＩＦＮ−β組成物は、ＰＥＧ−ＩＦＮ−ベータ１ａを使用して製剤化された。当該溶液を、０．２２ｕｍのメンブラン（Ｄｕｒａｐｏｒｅ）を通じて濾過し、そして最終容器へと充填した（バイアル又はシリンジ中１ｍｌ）。
【０１４７】
試験組成物は、０．０４４ｍｇ／ｍｌのＰＥＧ−ＩＦＮ−ベータ１ａ、ｐＨ４．２の１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、４５ｍｇ／ｍｌのマンニトール、及び０．５ｍｇ／ｍｌのポロキサマー１８８を含んだ。或いはそれは、０．０５５又は０．１１０ｍｇ／ｍｌのＰＥＧ−ＩＦＮ−ベータ１ａ、及び場合によりメチオニンを共に含んだ。
【０１４８】
試験組成物の試料を、４０℃、２５℃及び２〜８℃のそれぞれで貯蔵し、そしてＳＥ−ＨＰＬＣ又はＲＰ−ＨＰＬＣによる純度の決定のために、ＳＥ−ＨＰＬＣによるタンパク質含量の決定のために、ＩＦＮ−ベータが誘導する細胞の保護、及びｐＨに基づく、経時的な抗ウィルスアッセイによる生物学的活性の決定のために、並びにペプチドマッピング／ＵＰＬＣ分析による、酸化形態の測定のために試験を行った。
【０１４９】
３．安定性アッセイ及び他の実験
３．１ ＳＥ−ＨＰＬＣによる、純度及びアッセイ
ＳＥ−ＨＰＬＣによる純度を、Ｓｈｏｄｅｘカラム（水性ＳＥ、コードＫＷ−８０３）で評価した；定組成モードで、１．０ｍＬ／分にて、ＰＢＳ１０×（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ コード７００１３−０１６）から、水で１０倍希釈することによって調製されたＰＢＳ１×を使用して溶出を行った；２１４ｎｍのＵＶで検出を行った。
【０１５０】
ＩＦＮ−ＰＥＧ製剤化された試料を、以下の注入量を使用して注入した：２００ｍｃＬ（４４及び５５ｍｃｇ／ｍＬの試料用）；１００ｍｃＬ（１１０ｍｃｇ／ｍＬの試料用）。
【０１５１】
アッセイのために、参照標準であるＰＳ２００−０１に対してタンパク質の定量を行った（シングルポイントアッセイ）。
【０１５２】
３．２ ＲＰ−ＨＰＬＣによる純度
ＲＰ−ＨＰＬＣによる純度を、Ｃ４カラム（Ｓｙｍｍｅｔｒｙ ３００ Ｃ４，５ｍ サイズ４．６×２５０ｍｍ，Ｗａｔｅｒｓ）で行い、３５℃に温度調節し；波長を２１４ｎｍにセットし、そして溶出を以下の条件を使用して、１ｍＬ／分で行った：
【０１５３】
【表１】
【０１５４】
ＩＦＮ−ＰＥＧ製剤化された試料を、以下の注入量を使用して注入した：１６０ｍｃＬ（４４ｍｃｇ／ｍＬ試料用）；２００ｍｃＬ（５５ｍｃｇ／ｍＬ試料用）；１００ｍｃＬ（１１０ｍｃｇ／ｍＬ試料用）。
【０１５５】
３．３ 生物学的活性（インビトロにおけるバイオアッセイ）
ウイルス（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ Ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ）の細胞変性効果に対する、細胞（ＷＩＳＨ 細胞−ヒト羊膜組織）のＩＦＮ−β誘導性保護に基づく抗ウィルスアッセイである、ＩＦＮ−βに利用可能な方法を使用して生物学的活性を測定した。
【０１５６】
３．４ ｐＨの決定
較正されたｐＨメーター（Ｍｅｔｔｌｅｒ−Ｔｏｌｅｄｏ，ｍｏｄ．７１３）を使用して、標準的操作手順に従ってｐＨ測定を行った。
【０１５７】
３．５ ペプチドマッピング／ＵＰＬＣによる酸化形態
酸化されたメチオニン残基（Ｍｅｔ１、Ｍｅｔ１１７、Ｍｅｔ３６）の定量化法は、エンドプロテアーゼＬｙｓ−Ｃを用いたＩＦＮ−ＰＥＧ試料のタンパク質分解、及びその後のグラジエントＵＰＬＣ分析を予測する；基質成分による任意の障害を除去するために、タンパク質分解前に、製剤化された試料の前処理が行われる。
【０１５８】
タンパク質分解混合物の分離を、Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ分析カラム（ＢＥＨ Ｃ１８ １，７μｍ ２．１×５０ｍｍ ｃｏｄ．１８６０００２３５０，Ｗａｔｅｒｓ）で行った；０．１％ＴＦＡ／水（Ａ１）及び０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル（Ｂ１）を使用するグラジエント条件で溶出を行った。
【０１５９】
以下の機器設定及び分析パラメータが使用され得る：
【０１６０】
【表２】
【０１６１】
【表３】
【０１６２】
【表４】
【０１６３】
【表５】
【０１６４】
【表６】
【０１６５】
【表７】
【０１６６】
【表８】
【０１６７】
【表９】
【０１６８】
【表１０】
【０１６９】
【表１１】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペグ化インターフェロンベータ（ＰＥＧ−ＩＦＮ−β）の製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
インターフェロン−βはタンパク質であり、そして現在、例えば多発性硬化症（ＭＳ）の処置に適用される有用な医薬として知られている。
【０００３】
例えばそれらの活性又は安定性を変化又は改善するために、タンパク質は、それらの配列中を、又は他の修飾によって変更され得る。かかる修飾の一つは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のようなポリマーへの結合の導入である。
【０００４】
ポリエチレングリコールと結合したインターフェロン−β（ＰＥＧ−ＩＦＮ−β）は、例えば国際公開第９９／５５３７７号、及び欧州特許出願公開第０５９３８６８Ａ１号明細書に記載されている。
【０００５】
凍結乾燥によって、又は液体医薬組成物の形態でタンパク質を安定化するために、医学分野において種々の試みがなされた。凍結乾燥された物質は、使用に先立って溶液中で、もどされなければならない。患者への適用のために、さらなる任意の準備を必要としない、濃縮された、又は既製の液体医薬組成物はより簡便であり、かつ非常に興味深い。
【０００６】
インターフェロン−βの液体医薬製剤は、例えば国際公開第９５／３１２１３号及び国際公開第２００４／０９６２６３号に記載されている。
【０００７】
国際公開第２００５／０８４３０３号には、インターフェロン−ベータ１ｂポリマー複合体組成物が記載されている。
【０００８】
米国特許第６，５３１，１２２号明細書は、賦形剤、可溶化剤、及び緩衝液と一緒になった製剤中の、ペグ化インターフェロン変異体に関する。
【０００９】
国際公開第２００４／０６０２９９号は、インターフェロン−ベータ、及びその受容体結合性アンタゴニストを含む、サイトカインのポリマー複合体の合成方法を提供する。
【００１０】
米国特許出願公開第２００６００５１３２０Ａ１号明細書は、トレハロースを抗凍結剤として使用する、ペグ化インターフェロンの凍結乾燥製剤に関する。
【００１１】
国際公開第９９／４８５３５号は、凍結乾燥中及びその後における、ＰＥＧ−インターフェロンアルファ複合体の損失及び損傷を防ぐ製剤を提供する。
【００１２】
国際公開第０３００２１５２号は、インターフェロンポリペプチド及びスルホアルキルエーテルシクロデキストリン誘導体を含む、安定化された組成物に特に関する。
【００１３】
上記のいずれの参考文献も、本発明の液体製剤を開示又は示唆していない。
【発明の概要】
【００１４】
発明の概要
本発明の一つの態様に従って、ペグ化インターフェロンベータ（ＰＥＧ−ＩＦＮ−β）、賦形剤、界面活性剤、及び緩衝液を含む液体医薬組成物であって、前記賦形剤がポリオールであり、前記界面活性剤が非イオン性界面活性剤であり、そして前記緩衝液が酢酸ナトリウム緩衝液である、前記組成物が提供される。
【００１５】
本発明の別の態様に従って、計算された量の賦形剤及び界面活性剤を緩衝液溶液へ添加し、その後ＰＥＧ−ＩＦＮ−βを添加することを含む、液体医薬組成物を製造するための方法が提供される。
【００１６】
本発明の別の態様に従って、本発明の液体医薬製剤を含む、無菌であり、かつ使用前の貯蔵に好適である条件下で密封された容器が提供される。
【００１７】
本発明の別の態様に従って、本発明の医薬組成物を充填した容器を含む、医薬組成物のキットが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、ＡＦおよびＴ０での回収を％で表した、％回収を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
表及び図の簡単な説明
Ｉ．０．０４４ｍｇ／ｍｌのＰＥＧ−ＩＦＮ−ベータを含む、本発明製剤
【００２０】
表１は、０．０４４ｍｇ／ｍｌのＰＥＧ−ＩＦＮ−ベータを含む、本発明の種々の製剤を示す。
【００２１】
表２は、４０℃、２５℃及び２〜８℃のそれぞれにおける、ｐＨ４．２での、本発明の製剤の経時的な安定性試験（ＳＥ−ＨＰＬＣ）を示す。
【００２２】
表３は、４０℃、２５℃及び２〜８℃のそれぞれにおける、ｐＨ４．２での、本発明の製剤の経時的な安定性試験（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を示す。
【００２３】
表４は、ＳＥ−ＨＰＬＣによる、本発明の製剤の力価（ｍｃｇ／ｍＬ）を示す。
【００２４】
表５は、％回収を用いての、ろ過前及び後における、ＳＥ−ＨＰＬＣによる本発明の製剤の力価（ｍｃｇ／ｍＬ）を示し、そしてグラフ（図１：ＡＦ及びＴ０回収を％で示した％回収）として示される。
【００２５】
表６は、４週から２６週間の、２５℃、及び２〜８℃の各々における、本発明の製剤のｐＨ値を示す。
【００２６】
表７は、本発明の製剤の経時的なバイオアッセイの結果を示す。
【００２７】
ＩＩ．０．０５５及び０．１１０ｍｇ／ｍｌのＰＥＧ−ＩＦＮ−ベータを各々含む、本発明の製剤：
【００２８】
これらの製剤において、ＰＥＧ−ＩＦＮ−ベータ量は、０．０５５及び０．１１０ｍｇ／ｍｌへと各々増大された。
【００２９】
表８は、４０℃、２５℃、及び２〜８℃の各々における、ｐＨ４．２での、本発明の製剤純度を経時的に測定するＳＥ−ＨＰＬＣ試験を示す。
【００３０】
表９は、４０℃、２５℃、及び２〜８℃の各々における、ｐＨ４．２での、本発明の製剤のタンパク質含量を経時的に測定するＳＥ−ＨＰＬＣ試験を示す。
【００３１】
表１０は、４０℃、２５℃、及び２〜８℃の各々における、ｐＨ４．２での、本発明の製剤純度を経時的に測定するＲＰ−ＨＰＬＣ試験を示す。
【００３２】
表１１は、２５℃及び２〜８℃の各々における、４〜１３週間での本発明の製剤の経時的ｐＨ値を示す。
【００３３】
表１２は、２５℃及び２〜８℃の各々における、本発明の製剤のバイオアッセイデータを示す。
【００３４】
表１３は、本発明の製剤のＰＥＧ−ＩＦＮ−ベータのペプチドマッピングによる酸化形態に関するデータを示す。
【００３５】
発明の詳細な説明
本発明は、ペグ化インターフェロンベータ（ＰＥＧ−ＩＦＮ−β、ＰＥＧ−ＩＦＮ−ベータ）、賦形剤、界面活性剤及び緩衝液を含む液体医薬組成物であって、前記賦形剤がポリオールであり、前記界面活性剤が非イオン性界面活性剤であり、そして前記緩衝液が酢酸ナトリウム緩衝液である、前記組成物に関する。
【００３６】
一つの態様において、本発明は、ＰＥＧ−ＩＦＮ−β若しくはそのムテイン又はそれらの活性断片、賦形剤、界面活性剤及び緩衝液を含む液体医薬組成物であって、前記賦形剤がポリオールであり、前記界面活性剤が非イオン性界面活性剤であり、そして前記緩衝液が酢酸ナトリウム緩衝液である、前記組成物に関する。
【００３７】
以下の段落において、本発明の製剤を構成する種々の化合物の定義が与えられ、そしてそれらは、他でより広い定義が提供されない限り、本明細書及びクレーム全体を通じて適用されることが意図される。
【００３８】
本製剤のペグ化インターフェロン−ベータは、ポリエチレングリコールの共有結合修飾、又は同等の修飾により生じる任意のインターフェロン−ベータであり得る。ＰＥＧ−インターフェロン−ベータの一つの例は、既知の方法、例えば国際公開第９９／５５３７７号に記載されたものによってＰＥＧ化が行われ得る、ＰＥＧ−インターフェロン−ベータである。
【００３９】
特に本発明に従って、ＩＦＮ−ベータは、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）としても知られる疎水性ポリマーポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と共有結合している。当該ＰＥＧは、各々の末端にヒドロキシル基を有する線状ポリマーであり得る：
【００４０】
【化１】
【００４１】
それはまた、メトキシ−ＰＥＧ−ＯＨ（ｍ−ＰＥＧ）として使用され得、この中で、一方の末端は比較的不活性なメトキシ基であり、他方の末端は化学的修飾がなされるヒドロキシル基である：
【００４２】
【化２】
【００４３】
上式において、ｎは１〜数百であり得る。
【００４４】
別の好ましい実施形態において、当該ＰＥＧはまた、Ｒ（ＰＥＧ−ＯＨ）ｍによって表される分岐のＰＥＧであり得、ここでＲは中心のコア部、例えばペンタエリスリトール又はグリセロールであり、そしてｍは分岐した腕の数を示す。分岐した腕（ｍ）は、３〜１００又は数百個の範囲であり得る。ヒドロキシル基は化学修飾され得る。
【００４５】
本発明の分岐の別の形態は、例えば国際公開第９６／２１４６９号に記載されており、ここで当該ＰＥＧは、化学修飾がなされる単一の末端を有する。このＰＥＧ型は、（ＣＨ3ＯＰＥＧ）ｐＲＸとして表され得、ここでｐは２又は３であり、Ｒは中心のコア、例えばリシン又はグリセロールを示し、そしてＸは官能基、例えば化学的活性化がなされるカルボキシルを示す。
【００４６】
本発明の分岐の別の形態は、「ペンダント形ＰＥＧ」と表され、そしてそれは反応基、例えばカルボキシルを、ＰＥＧ鎖の末端よりもむしろＰＥＧバックボーンに沿って有する。
【００４７】
さらに、例えば米国特許出願第０６／０２６，７１６号明細書に記載されている、弱い又は分解性の結合をそのバックボーンに有する、本発明のＰＥＧ−ＩＦＮ−ベータを製造することが可能である。したがってＰＥＧは、当該ポリマーバックボーン中に、加水分解がなされるエステル結合を有して製造され得る。以下のスキームに従って、当該加水分解によってポリマーの切断が起こり、より小さい分子量の断片となる：
【００４８】
【化３】
【００４９】
エチレンオキシドとプロピレンオキシドとの共重合体は、それらの化学においてＰＥＧと密接に関連しており、そして本発明に従って、それらはＰＥＧの代わりに使用され得る。
【００５０】
種々の方法が、タンパク質をＰＥＧ化するために開発された。ＰＥＧは、通常親電子的に活性化されたＰＥＧ誘導体を利用して、タンパク質中に見られる反応基と結合され得る。αアミノ基又はリシン残基中で見られるεアミノ基、及び当該Ｎ末端が製造物の混合物からなる複合体を生じるＮ末端が使用され得る。
【００５１】
当該複合体は好ましくは、ひとつのタンパク質分子あたり、１個からタンパク質中のアミノ酸の数の範囲でＰＥＧ分子と結合した複合体の一群からなる。
【００５２】
例えばチオール選択的ＰＥＧ誘導体の合成に関する、Ｗｏｇｈｉｒｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，４（５）：３１４−３１８，１９９３に記載されたように、ＩＦＮ−ベータ中に、ＰＥＧ化されるよう意図された部位を導入することは好ましい。
【００５３】
一つの実施形態において、ＩＦＮは特異的にＰＥＧ化されている。特異的ＰＥＧ化は、欧州特許第６７５２０１号明細書特許に従って、例えばｍＰＥＧ−プロピオンアルデヒドを有するＮ末端残基で行われ得る。Ｗｏｇｈｉｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，４（５）：３１４−３１８，１９９３に記載された部位特異的モノＰＥＧ化が特に好ましい。
【００５４】
本発明の実施形態は、国際公開第９９／５５３７７号に記載されたような、Ｃｙｓ17で共有結合してモノＰＥＧ化されるＩＦＮ−ベータである。ＰＥＧ部分は、線状又は分岐のメトキシＰＥＧ、加水分解的に又は酵素的に分解されるＰＥＧ、及び一つ以上のポリオール並びにＰＥＧ及びＰＬＧＡ（ポリ（乳酸／グリコール酸））の共重合体であり得る。
【００５５】
本発明の実施形態におけるシステインのチオール基は、チオールと反応するＰＥＧ化試薬と反応され得る。それは、例えばオルトピリジルジスルフィド、ビニルスルホン、マレイミド、ヨードアセトイミドのような官能基を含むＰＥＧであり得る。好ましくは、チオール反応性ＰＥＧ化試薬は、ＰＥＧのオルトピリジルジスルフィド（ＯＰＳＳ）誘導体である。ＰＥＧ化試薬は、その一末端のみが結合に利用されるモノメチル化形態で、又は両末端が結合に利用される二官能性形態で使用される。
【００５６】
好ましい実施形態の反応において、ＩＦＮ−β−Ｃｙｓ17が使用され、そしてそれは本願明細書に記載された反応スキームに従って反応する。この反応は、Ｃｙｓ17に対して部位特異的であり、なぜならばＩＦＮ−βにおける（３１番目及び１４１番目の）他の２つのシステイン残基は、ジスルフィド結合を形成し、したがってＰＥＧ化できないからである。ＰＥＧ−ＩＦＮ−βは、５０〜１１０ｋＤａ、好ましくは約７０ｋＤａの分子量を有するタンパク質の大きさに匹敵する有効な大きさを有する。部位特異的なＩＦＮ−β修飾において、結合されるＰＥＧ分子は、好ましくは２０ｋＤ超の分子量を有する。一つの実施形態において、スペーサーを介してＣｙｓ17と結合されたＰＥＧ分子は、２×２０ｋＤａである。
【００５７】
スペーサー及びＩＦＮは、以下の合成スキームに従って、ＩＦＮ ２ｋＤａ−ＯＰＳＳを形成する。
【００５８】
ＰＥＧ化後、遊離のスペーサー及び／又はＰＥＧからＰＥＧ−ＩＦＮ−βを分離するために、溶液を精製する。好ましくは、この精製ステップは限外ろ過によって行われる。限外ろ過は、１０℃未満で、好ましくは５＋／−３℃の温度で、より好ましくは４℃で、塩基性条件で行われる。精製ステップにおいて、好ましくは０．１ＭのＮａＯＨが使用される。生じるＰＥＧ−ＩＦＮ−β溶液は、０．５ＥＵ／ｍｌ未満のエンドトキシンを、好ましくは０．２５ＥＵ／ｍｌ未満のエンドトキシンを含む。
【００５９】
一つの実施形態において、ＰＥＧ化は、以下のスキームに従ってＩＦＮ−βへと導入される：
【００６０】
【化４】
【００６１】
一つの実施形態において、低分子量のＰＥＧ部分はＩＦＮ−βと結合され得る。
【００６２】
低分子量のＰＥＧ部分は、式：
【００６３】
【化５】
【００６４】
［式中、Ｗ及びＸは、独立して、アミン、スルフヒドリル、カルボキシル、又はヒドロキシル基と反応する基であって、当該低分子量のＰＥＧ部分とＩＦＮ−βとを結合させる］
を有する。Ｗ及びＸは、好ましくは、独立してオルトピリジルジスルフィド、マレイミド、ビニルスルホン、ヨードアセトアミド、アミン、チオール、カルボキシル、活性エステル、ベンゾトリアゾールカーボネート、ｐ−ニトロフェノールカーボネート、イソシアネート、及びビオチンから選択される。
【００６５】
低分子量のＰＥＧ部分は、好ましくは、１００〜５０００ダルトンの分子量を有する。好ましい実施形態において、それは、１０００〜３０００ダルトン、好ましくは１５００〜２０００ダルトン、及びより好ましくは２０００ダルトンである。
【００６６】
低分子量ＰＥＧの遊離の末端とＩＮＦ−βとの結合のための、単官能性の又は二官能性のＰＥＧ部分は、好ましくは約１００〜２００ダルトンの範囲内の分子量を有する。それは好ましくは、メトキシＰＥＧ、分岐のＰＥＧ、加水分解的に又は酵素的に分解されるＰＥＧ、ペンダント型ＰＥＧ又はデンドリマーＰＥＧである。
【００６７】
単官能性の又は二官能性のＰＥＧはさらに、以下の式：
【００６８】
【化６】
【００６９】
［式中、
Ｙは、ＩＦＮ−βと結合する低分子量ＰＥＧ部分の遊離末端上の末端基である程度に反応性があり、そしてＺは、−ＯＣＨ3、又は二官能性複合体を形成する程度に反応性を有する基である］
を有する。
【００７０】
したがって、段階的な方法で、２個以上のＰＥＧ部分が使用されて、本発明の組成物において及び医薬としての使用のために有用である、ＰＥＧ−ＩＦＮ−βを産生する。
【００７１】
有利なことに、ＰＥＧとＩＦＮ−βとの間のジスルフィド結合は、血液循環において安定であり、そして細胞への侵入時に切断される。
【００７２】
本発明の製剤において使用されるＰＥＧ−ＩＦＮ−βは、天然のインターフェロン−βと比較して、ほぼ同等又はより高いインターフェロン−β活性を有する。
【００７３】
賦形剤は、任意のポリオールであり得、他の成分と一緒になって、安定なＰＥＧ−インターフェロン−ベータ製剤をもたらす。ポリオールの例は、マンニトール（ＰＥＡＲＬＩＴＯＬ（登録商標））、ソルビトール（ＮＥＯＳＯＲＢ（登録商標））、マルチトール（ＭＡＬＴＩＳＯＲＢ）、キシリトール（ＸＹＬＩＳＯＲＢ）、及びマルチトール（ＬＹＣＡＳＩＮ）である。好ましいポリオール賦形剤は、マンニトールである。
【００７４】
本発明に従って、非イオン性界面活性剤が使用される。非イオン性界面活性剤は、ポリオール誘導体、ポリオキシエチレンエステル及びエーテル、ポロキサマー、ノニルフェニルエーテル、ポリビニルアルコール、プロピレングリコールジアセテート、アルカノールアミドを含む。非イオン性界面活性剤は、好ましくはポロキサマーであり得る。ポロキサマー１８８が特に好ましい。
【００７５】
選択されたレベルでｐＨを維持することができる、任意の緩衝液が使用され得る。当該緩衝液は、酢酸ナトリウム緩衝液又はＰＢＳであり得る。酢酸ナトリウム緩衝液が特に好ましい。
【００７６】
一つの実施形態において、本発明は、ＰＥＧ−インターフェロン−ベータ、賦形剤、界面活性剤、及び緩衝液を含む液体医薬組成物であって、前記賦形剤がマンニトールであり、前記界面活性剤がポロキサマー１８８であり、そして前記緩衝液が酢酸ナトリウム緩衝液である、前記組成物である。
【００７７】
インターフェロン−ベータは、本発明に従ってペグ化がなされる、天然に存在するヒトインターフェロン−ベータ又は組み換えにより産生されるものであり得る。さらに、本発明のインターフェロン−ベータ（ＩＦＮ−β）は、ウィルス感染の応答において身体で産生される糖タンパク質のことである。
【００７８】
インターフェロン単位又はインターフェロンの国際単位（国際単位において、Ｕ又はＩＵ）が、ウィルスによる損傷に対して細胞の５０％を保護するために必要な量として定義されている、ＩＦＮ活性の測定単位として報告されている。生物活性を測定するために使用され得るアッセイは、報告のなされている（Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ，ｅｔ ａｌ．１９８１；Ｆａｍｉｌｌｅｔｔｉ，Ｐ．Ｃ，ｅｔ ａｌ．，１９８１）細胞変性効果阻害アッセイである。このインターフェロンに関する抗ウィルスアッセイにおいて、１単位／ｍｌのインターフェロンが、５０％の細胞変性効果を生じるために必要な量である。当該単位は、国立衛生研究所によって提供されたＨｕ−ＩＦＮ−ベータの国際参照標準（ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｔａｎｄａｒｄ）（Ｐｅｓｔｋａ，Ｓ．１９８６）によって決定された。
【００７９】
インターフェロンはまた、腫瘍への生物の応答に対して影響を有し、免疫修飾を通じた認識に影響があるため、生物学的応答調節物質（ＢＲＭ）とも呼ばれる。
【００８０】
ヒト線維芽細胞インターフェロン（ＩＦＮ−β）は抗ウィルス活性を有し、そしてまた、新生細胞に対するナチュラルキラー細胞を刺激し得る。それは、ウィルス及び二重鎖ＲＮＡによって誘導される約２０，０００Ｄａのポリペプチドである。線維芽細胞インターフェロンの遺伝子のヌクレオチド配列から、組み換えＤＮＡ技術（Ｄｅｒｙｎｋ ｅｔ ａｌ．１９８０）によってクローニングされ、タンパク質の完全アミノ酸配列が推定された。それは１６６個のアミノ酸である。
【００８１】
多発性硬化症（ＭＳ）のインターフェロン療法におけるＲｅｂｉｆ（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ Ｓｅｒｏｎｏ−組換えヒトインターフェロン-β）は、哺乳動物細胞株から産生されるインターフェロン、（ＩＦＮ）−ベータ−１ａである。その推奨される国際一般名（ＩＮＮ）は、「インターフェロンβ−１ａ」である。
【００８２】
本明細書において使用される「インターフェロンベータ」又は「ＩＦＮ−β」は、例えば上節で言及された任意の種類のＩＦＮ−βを含む、文献においてそのようなものとして定義されている任意の分子を含むことが意図されている。本発明に従って好適であるＩＦＮ−βは、特定のＰＥＧ化のための結合部分を示す限り、例えばＲｅｂｉｆ（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ Ｓｅｒｏｎｏ）、Ａｖｏｎｅｘ（登録商標）（Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ）として市販されている。本発明に従って、ヒト由来のインターフェロンベータの使用が同様に好ましい。本明細書において使用される用語「インターフェロンベータ」は、その塩、官能基誘導体、変異体、類縁体及び活性断片を含むことが意図されている。
【００８３】
本明細書において使用される用語「インターフェロン−ベータ（ＩＦＮ−β）」は、生体液からの単離によって得られるものとしての、又は真核性宿主細胞からＤＮＡ組み換え技術によって得られるものとしての、特にヒト由来の線維芽細胞インターフェロン、並びにその塩、官能基誘導体、変異体、類縁体及び活性断片を含むことが意図されている。好ましくは、ＩＦＮ−ベータは、インターフェロンベータ−１ａを意味することが意図されている。
【００８４】
本明細書において使用される用語「ムテイン」は、野生型ＩＦＮ−βと比較して、生じる生産物の活性を大幅に変化させることなく、天然ＩＦＮ−βの一つ以上のアミノ酸残基が異なるアミノ酸で置換されている、又は欠失している、ＩＦＮ−β及びＰＥＧ−ＩＦＮ−βの類縁体のことである。これらのムテインは、既知の合成法によって、及び／又は部位特異的変異誘発によって、又は好適な任意の他の技術によって製造される。好ましいムテインは、例えば、Ｓｈｅｐａｒｄ他（１９８１）、又はＭａｒｋ他（１９８４）によって説明されたものを含む。特に本発明のムテインはＣｙｓ17を含むが、分子中に上記の任意の変化が存在し得る。
【００８５】
任意のかかるムテインは、好ましくは、ＩＦＮ−βのものと実質的に同等、又はより強い活性を有するために、ＩＦＮ−βのものと十分に重複したアミノ酸配列を有する。インターフェロンの生物学的機能は当業者に周知であり、そして生物学的標準は、例えばＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌで確立され、及び利用可能である（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｏｒｇ／ｌｉｎｋｓ／ＮＩＢＳＣ）。
【００８６】
ＩＦＮ−β／ＰＥＧ−ＩＦＮ−β活性の決定のためのバイオアッセイは、文献に記載されている。ＩＦＮアッセイは、例えば、Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ他，１９８１によって記載されたとおりに実施され得る。したがって定められた実験によって、任意の所定のムテインが、ＩＦＮ−βと実質的に同等又はより強い活性を有するか否かが決定され得る。
【００８７】
本発明に従って使用され得るＩＦＮ−β及びＰＥＧ−ＩＦＮ−βのムテイン、又はそれをコードする核酸は、当業者によって過度の実験がなされることなく、本明細書に記載された技術及び指導に基づいて通常得られる置換ペプチド又はポリヌクレオチドと実質的に対応する有限の配列を含む。
【００８８】
本発明のムテインの好ましい変化は、「保存的」置換として知られているものである。本発明のポリペプチド又はタンパク質の保存的アミノ酸置換は、十分に同等の物理化学的特性を有する群中の同義のアミノ酸を含み得、ここで当該群のメンバー間における置換は、当該分子の生物学的機能を保存するであろう。アミノ酸の挿入及び欠失はまた、特に当該挿入又は欠失が少数のアミノ酸、例えば３０個未満、好ましくは１０個未満に関してであり、そして機能的構造に対して重要であるアミノ酸、例えばシステイン残基を除去又は置き換えたりしない場合において、それらの機能を変えることなく、上で定義された配列中においてなされ得ることは明らかである。かかる欠失及び／又は挿入によって産生されるタンパク質及びムテインは、本発明の範囲内である。
【００８９】
本発明における使用のための、ＰＥＧ−ＩＦＮ−βのムテインを得るために使用され得る、タンパク質のアミノ酸置換体の生産例は、Ｍａｒｋ他による、米国特許第４，９５９，３１４号、４，５８８，５８５号、及び４，７３７，４６２号明細書；Ｋｏｔｈｓ他による、米国特許第５，１１６，９４３号明細書、Ｎａｍｅｎ他による、米国特許第４，９６５，１９５号明細書；Ｃｈｏｎｇ他による、米国特許第４，８７９，１１１号明細書；及びＬｅｅ他による、米国特許第５，０１７，６９１号明細書において記載されたような任意の既知のステップ、並びに米国特許第４９０４，５８４号明細書（Ｓｈａｗ他）に記載されたリシン置換タンパク質を含む。ＩＦＮ−ベータの特定のムテインは、例えばＭａｒｋ他、１９８４に説明されている。
【００９０】
本明細書において使用される「官能基誘導体」は、ＰＥＧ−ＩＦＮ−βの誘導体、並びにそれらのムテイン及び融合タンパク質を含み、そしてそれらは、残基又はＮ末端基若しくはＣ末端基における側鎖として生じる官能基から、当技術分野において既知の方法で製造され得、そしてそれらが医薬として許容される限り、すなわちそれらがＩＦＮ−βの活性と実質的に同等であるタンパク質の活性を破壊しない限り、そしてそれを含む組成物に毒性特性を付与しない限り、本発明に含まれる。これらの誘導体は、例えば、カルボキシル基の脂肪族エステル、アンモニア又は一級若しくは二級アミンとの反応によるカルボキシル基のアミド、アシル部を伴って形成される、アミノ酸残基の遊離のアミノ酸のＮ−アシル誘導体（例えば、アルカノイル、若しくは炭素環式アロイル基）、又はアシル部を伴って形成される、遊離のヒドロキシル基のＯ−アシル誘導体（例えばセリル若しくはスレオニル残基のもの）を含む。
【００９１】
ＰＥＧ−ＩＦＮ−β、ムテイン、及び融合タンパク質の「活性断片」として、本発明は、タンパク質分子単体の、又はそれらと結合する関連分子又は残基、例えば糖若しくはリン酸残基、又はタンパク質分子、若しくはそれら自体の糖残基の凝集体を伴うポリペプチド鎖の任意の断片若しくは前駆体を含み、ただし前記断片が、対応するＩＦＮと比較して著しい活性減少を有さないことを条件とする。
【００９２】
本明細書における用語「塩」は、カルボキシル基の両方の塩のことであり、そして上記タンパク質又はその類縁体のアミノ基の酸付加塩のことである。カルボキシル基の塩は、当技術分野で既知の手段により形成され、そして無機塩、例えばナトリウム、カルシウム塩、アンモニウム塩、鉄塩、亜鉛塩などを含み、そして有機塩基との塩、例えば、トリエタノールアミン、アルギニン、又はリシン、ピペリジン、プロカインなどのアミンを用いて形成されるものを含む。酸付加塩は、例えば塩酸又は硫酸のような鉱酸との塩、及び例えば酢酸又はシュウ酸のような有機酸との塩を含む。もちろん、任意のかかる塩は、本発明に関するタンパク質（ＩＦＮ）の生物学的活性、例えば対応する受容体と結合する能力、及び受容体シグナル伝達を開始させる能力を保持していなければならない。
【００９３】
さらなる実施形態において、本発明の組成物中に含まれる融合タンパク質は、Ｉｇ融合体を含む。当該融合体は、直接に、又は１〜３個のアミノ酸残基、又はそれ以上の長さの、例えば１３個のアミノ酸残基であり得る短いリンカーペプチドを経由して結合し得る。前記リンカーは、ＩＦＮ配列と免疫グロブリン配列との間に導入される、例えばＥ−Ｆ−Ｍ（Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ）のトリペプチド、又はＧｌｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔであり得る。生じる融合タンパク質は、改善された特性、例えば生体液中における滞留時間の延長、特異的活性の増大、発現レベルの増大、又は促進された融合タンパク質の精製を有し得る。
【００９４】
好ましくは、ＰＥＧ−ＩＦＮ−ベータは、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約０．０１ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約０．０６ｍｇ／ｍｌ〜約０．０３ｍｇ／ｍｌ、そしてより好ましくは約０．０４４ｍｇ／ｍｌの濃度で組成物中に存在する。
【００９５】
別の実施形態において、ＰＥＧ−ＩＦＮ−ベータは、本発明の製剤中に、０．０５〜０．１５０ｍｇ／ｍｌの濃度で、好ましくは０．０５５又は０．１１０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。
【００９６】
当該組成物中で使用される投与量、及び個体へ適用され得る用量は、薬物動態特性、投与経路、患者の状態及び特徴（性別、年齢、体重、健康状態、大きさ）、症状の程度、併用療法、処置の頻度、及び所望の効果を含む、種々の要素に依存して変化するだろう。
【００９７】
ヒトＩＦＮ−ベータ／ＰＥＧ−ＩＦＮ−ベータの標準的投与量は、１日あたり８００００ＩＵ／ｋｇ〜２０００００ＩＵ／ｋｇ、又は１日あたり１人あたり６ＭＩＵ（百万国際単位）〜１２ＭＩＵ、又は一人あたり２２〜４４μｇ（マイクログラム）ＩＦＮ−ベータ当量の範囲内である。本発明に従って、本発明の組成物中におけるＰＥＧ−ＩＦＮ−βは、好ましくはＩＦＮ−ベータ換算で、一日あたり一人あたり約１〜５０μｇ、より好ましくは約１０〜３０μｇ、又は約１０〜２０μｇの投与量で使用され得る。
【００９８】
本発明の活性成分の投与は、静脈内経路、筋肉内経路、又は皮下経路でなされ得る。本発明の組成物の好ましい投与経路は、皮下経路及び筋肉内経路である。
【００９９】
本発明のＰＥＧ−ＩＦＮ−β組成物はまた、毎日、又は一日おきに、又は低頻度で投与され得る。好ましくは、ＰＥＧ−ＩＦＮ−β組成物は、一週間に一回、二回、又は三回投与される。好ましくは、それは任意の二週間に一回投与される。
【０１００】
好ましい投与経路は皮下投与であり、例えば一週間に三回投与される。さらに好ましい投与経路は筋肉内投与であり、そしてそれは例えば一週間に一回投与され得る。
【０１０１】
好ましくは、ＩＦＮ−ベータ換算で２２〜４４μｇ、又は６ＭＩＵ〜１２ＭＩＵの、本発明の組成物中のＰＥＧ−ＩＦＮ−ベータは、皮下注射によって一週間に三回投与される。
【０１０２】
ＰＥＧ−ＩＦＮ−ベータ組成物は、一日おきに、２５〜３０μｇ、又は８ＭＩＵ〜９．６ＭＩＵの投与量で皮下投与され得る。ＩＦＮ−ベータ換算で３０μｇ、又は６ＭＩＵのＰＥＧ−ＩＦＮ−ベータはさらに、一週間に一度筋肉内投与され得る。
【０１０３】
用語「安定性」は、（生物学的効果の維持を含む、）本発明のインターフェロン製剤の物理学的、化学的、及び構造的安定性のことである。タンパク質分子の化学的分解又は凝集による、より大きい次数のポリマー形成、脱グリコシル化、グリコシル化修飾、酸化、又は本発明に含まれるインターフェロンポリペプチドの少なくとも一つの生物学的活性を減少させる任意の他の構造的修飾によって、タンパク質製剤の不安定性が生じ得る。
【０１０４】
「安定な」組成物、溶液、又は製剤は、タンパク質の分解、修飾、凝集、生物学的活性の喪失などの程度が許容可能に制御されており、そして時間と共に許容不能に増大しないものを言う。好ましくは、当該製剤は、少なくとも６０％又は約６０％、より好ましくは少なくとも７０％又は約７０％、最も好ましくは少なくとも８０％又は約８０％の標識化されたインターフェロン活性が、１２〜２４か月に渡って維持される。本発明の好ましいＰＥＧ−ＩＦＮ−β組成物は、２〜８℃で貯蔵されるとき、少なくとも約６か月、１２か月、１８か月の、より好ましくは少なくとも約２０か月の、さらにより好ましくは少なくとも約２２か月の、最も好ましくは少なくとも約２４か月の貯蔵寿命を有する。
【０１０５】
本発明のＰＥＧ−ＩＦＮ−β液体医薬組成物の安定性を測定するための方法は、本明細書において記載された方法を含めて、当技術分野において利用可能である。したがって、本発明の液体組成物の貯蔵の間における、ＰＥＧ−ＩＦＮ−β凝集体形成は、溶液中の溶解ＰＥＧ−ＩＦＮ−βにおける変化を経時的に測定することによって容易に決定され得る。溶液中の溶解ポリペプチド量は、特定のＰＥＧ−ＩＦＮ−βの検出に適用される多くの分析アッセイによって定量化され得る。かかるアッセイは、例えば以下の実施例において記載されたような逆相（ＲＰ）−ＨＰＬＣ及びＵＶ吸収分光法を含む。
【０１０６】
可溶性凝集体として存在する可溶性ポリペプチド画分と非凝集性の生物学的に活性のある分子形態で存在する画分との間を区別するために、例えば以下の実施例に記載されているような分析超遠心分離を使用して、液体組成物中での貯蔵の間における可溶性及び不溶性凝集体の両方の決定が達成され得る。
【０１０７】
用語「緩衝液」又は「生理学的に許容される緩衝液」は、製剤中で、医薬的又は獣医学的使用のために安全であることが既知であり、そして製剤のｐＨを当該製剤に好適なｐＨ範囲で維持又は調節する効果を有する化合物の溶液のことである。適度に酸性のｐＨでｐＨを調節するために許容可能な緩衝液は、限定されないが、リン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、アルギニン、ＴＲＩＳ、及びヒスチジンのような化合物を含む。「ＴＲＩＳ」は、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール、及び任意のその薬理学的に許容可能な塩のことである。好ましい緩衝液は、生理食塩水、又は許容可能な塩と一緒になった酢酸バッファーである。
【０１０８】
賦形剤は、好ましくは、約３０ｍｇ／ｍｌ〜約５０ｍｇ／ｍｌの濃度で、より好ましくは約４０ｍｇ／ｍｌ〜約５０ｍｇ／ｍｌの濃度で、さらにより好ましくは約４５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。
【０１０９】
界面活性剤は、好ましくは、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌの濃度で、好ましくは約０．４ｍｇ／ｍｌ〜約０．７ｍｇ／ｍｌの濃度で、さらにより好ましくは約０．５ｍｇ／ｍｌの濃度である。
【０１１０】
用語「界面活性剤」は、液体の表面張力を減少させる、又は２つの液体間、若しくは液体と固体との間の界面張力を減少させる可溶性化合物のことであり、ここで表面張力は、表面領域を最小化する傾向にある、液体表面上に作用する力のことである。
【０１１１】
界面活性剤は、薬剤の吸収、又は標的組織への送達の変更のために、低分子量薬剤、及びポリペプチドの送達を含めて、医薬製剤中に時折使用される。周知の界面活性剤は、ポリソルベート（ソルビトール脂肪酸エステルのポリオキシエチレン誘導体；Ｔｗｅｅｎ（登録商標））、及びポロキサマー、例えばＢＡＳＦ（ドイツ）によって市販されているプルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）（登録商標）又はルトロール（Ｌｕｔｒｏｌ）（登録商標）を含む。
【０１１２】
本発明の好ましい実施形態に従って、プルロニック（登録商標）Ｆ７７、プルロニック（登録商標）Ｆ８７、プルロニック（登録商標）Ｆ８８、及びプルロニック（登録商標）Ｆ６８から選択される界面活性剤、特に好ましくはプルロニック（登録商標）Ｆ６８（ＢＡＳＦ、プルロニック（登録商標）Ｆ６８はまた、ポロキサマー１８８として知られている）を用いて、ＰＥＧ−ＩＦＮ−βを製剤化することによって、バイアル及び／又は送達装置（例えばシリンジ、ポンプ、カテーテルなど）の表面上における吸収によって引き起こされる活性の本源の損失を最小化する安定な製剤が得られることが見出された。プルロニック（登録商標）Ｆ７７、プルロニック（登録商標）Ｆ８７、プルロニック（登録商標）Ｆ８８、及びプルロニック（登録商標）Ｆ６８から選択される界面活性剤、特に好ましくはプルロニック（登録商標）Ｆ６８（ＢＡＳＦ、プルロニック（登録商標）Ｆ６８はまた、ポロキサマー１８８として知られている）を用いて、ＰＥＧ−ＩＦＮ−βを製剤化することによって、酸化及びタンパク質凝集体の形成に対してより抵抗性がある安定な組成物が得られることも見出された。
【０１１３】
プルロニック（登録商標）界面活性剤は、エチレンオキシド（ＥＯ）及びポリエチレンオキシド（ＰＯ）のブロック共重合体である。プロピレンオキシドブロック（ＰＯ）は、二つのエチレンオキシド（ＥＯ）ブロックの間に挟まれる。
【０１１４】
【化７】
【０１１５】
プルロニック（登録商標）Ｆ７７において、ポリオキシエチレン（親水性物質）のパーセンテージは７０％であり、そして疎水性物質（ポリオキシプロピレン）の分子量は、約２，３０６Ｄａである。
【０１１６】
プルロニック（登録商標）Ｆ８７において、ポリオキシエチレン（親水性物質）のパーセンテージは７０％であり、そして疎水性物質（ポリオキシプロピレン）の分子量は、約２，６４４Ｄａである。
【０１１７】
プルロニック（登録商標）Ｆ８８において、ポリオキシエチレン（親水性物質）のパーセンテージは８０％であり、そして疎水性物質（ポリオキシプロピレン）の分子量は、約２，６４４Ｄａである。
【０１１８】
プルロニック（登録商標）Ｆ６８において、ポリオキシエチレン（親水性物質）のパーセンテージは８０％であり、そして疎水性物質（ポリオキシプロピレン）の分子量は、約１，９６７Ｄａである。
【０１１９】
プルロニックシリーズのものと同程度の特性を有する他のポリマーはまた、本発明の組成物中で使用され得る。好ましい界面活性剤は、プルロニック（登録商標）Ｆ６８、及び同様の特性を有する界面活性剤である。
【０１２０】
プルロニック、特にプルロニック（登録商標）Ｆ６８は、所望の貯蔵期間（例えば１２〜２４か月）の間、ＰＥＧ−ＩＦＮ−βの安定性を維持するために十分である濃度で、同様に、例えばバイアル、アンプル、又はカートリッジ又はシリンジの表面上の吸収によるタンパク質の損失を予防するために十分である濃度で好ましくは存在する。
【０１２１】
好ましくは、液体製剤におけるプルロニック（登録商標）、特にプルロニック（登録商標）Ｆ６８の濃度は、０．０１又は約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜１０又は約１０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．０５又は約０．０５ｍｇ／ｍｌ〜５又は約５ｍｇ／ｍｌ、特により好ましくは０．１又は約０．１ｍｇ／ｍｌ〜２又は約２ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは１又は約１ｍｇ／ｍｌである。
【０１２２】
別の好ましい実施形態において、メチオニン、特にＬ−メチオニンが使用される。０．１ｍｇ／ｍｌ〜０．５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約０．１ｍｇ／ｍｌ〜０．３ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約０．２５ｍｇ／ｍｌ又は約０．１２ｍｇ／ｍｌの濃度が特に有用である。
【０１２３】
メチオニンの添加によって、当該製剤が有利にさらに安定化され、そしてタンパク質の酸化が減少することが見出された。
【０１２４】
本発明の製剤に含有される又は含まれる種々の化合物は上記の通り変化され得、そしてメチオニンの好ましい効果が達成され得る。一つの実施形態において、製剤は０．０５５ｍｇ／ｍｌのＰＥＧ−ＩＦＮ−ベータ、約ｐＨ３．５〜４．５の、好ましくはｐＨ４．２の１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、４５ｍｇ／ｍｌのマンニトール、及び０．５ｍｇ／ｍｌのポロキサマー１８８、或いは０．１１０ｍｇ／ｍｌのＰＥＧ−ＩＦＮ−ベータを含む、又は含有する。
【０１２５】
本発明の組成物は、特定のｐＨのプラス又はマイナス０．５単位以内で、前記組成物のｐＨを維持するために十分な量の緩衝液を含み、ここで前記特定のｐＨは約３．０〜約５．０、好ましくは約３．５〜４．５、さらにより好ましくは約４．２±０．２である。
【０１２６】
当該緩衝液は、約５ｍＭ〜５００ｍＭ、好ましくは約１０ｍＭの濃度で本発明の組成物中に存在する。
【０１２７】
当該組成物は、好ましくは水溶液である。
【０１２８】
本発明は液体組成物を含む。注射用の好ましい溶媒は水である。
【０１２９】
ＰＥＧ−ＩＦＮ−βに関してｐＨを約ｐＨ３〜５に、好ましくは３．５〜４．５に、そしより好ましくは約４．２＋／−０．２に調節することによって、安定な製剤が提供されることが示され得る。
【０１３０】
本発明の組成物は、液体組成物中で負に影響し得るＰＥＧ−ＩＦＮ−βの分解工程を、正に影響させることを達成した。この影響は、ＳＥ−ＨＰＬＣによって、例えば４０℃及び２５℃のそれぞれで測定され得る。本発明の組成物は、ＰＥＧ−ＩＦＮ−β含量の著しい減少が（ＳＥ−ＨＰＬＣで）観測されずに得られた。特に、ＰＥＧ−ＩＦＮ−β含量の減少が、４０℃で２週間まで、及び２５℃で６週間まで検出されなかった。本発明の組成物は良好な安定性特性を示し、及び特に、貯蔵中におけるタンパク質凝集の減少が達成され得る。
【０１３１】
ガラスバイアル中、好ましくは３ｍｌのもの、又はガラスシリンジ中、好ましくは１ｍｌのもの中で調製される、００４４ｍｇ／ｍｌのＰＥＧ−ＩＦＮ−β、約ｐＨ４．２の１０ｍＭの酢酸ナトリウム、４５ｍｇ／ｍｌのマンニトール、及び０．５ｍｇ／ｍｌのポロキサマー１８８を含む組成物に関して、肯定的な結果が特に達成され得る。
【０１３２】
本発明の組成物は、ＳＥ−ＨＰＬＣ、ＲＰ−ＨＰＬＣを使用して測定される純度のように優れた安定性、ＳＥ−ＨＰＬＣによって測定されるように優れたタンパク質含量、及び優れた生物学的活性を示す。
【０１３３】
別の態様において、本発明は、上記の液体医薬組成物を調製するための方法であって、計算された量の賦形剤及び界面活性剤を緩衝液へ添加し、その後ＰＥＧ−ＩＦＮ−βを添加する、前記方法に関する。
【０１３４】
さらに別の態様において、本発明は、無菌かつ使用前の貯蔵に好適である条件で本発明の液体医薬製剤を含む、密閉された容器に関する。
【０１３５】
医薬適用に好適である任意の容器が使用され得る。当該容器は好ましくは、自己注射器用の、あらかじめ充填された、シリンジ、バイアル、又はカートリッジである。
【０１３６】
本発明の製剤は、評価された装置を使用して投与され得る。これらの単一バイアル系を含む例は、溶液送達用の自己注射装置又はペン型注射装置、例えばＲｅｂｉｊｅｃｔ（登録商標）を含む。
【０１３７】
本願で特許請求されている生産物は、包装材料を含む。当該包装材料は、管理機関によって必要とされる情報に加え、当該生産物が使用され得る条件を提供する。必要ならば、最終溶液を調製するために、及びかかる最終溶液を２４時間以上、２つのバイアルで、湿式／乾式生産物で使用するために、本発明の当該包装材料は、患者への指示を提供する。単一バイアルの溶液生産物に関して、ラベルは、かかる溶液が２４時間以上の期間使用され得ることを示す。本願で特許請求される生産物は、ヒト医薬生産物の使用のために有用である。当該組成物は、透明な溶液として患者へ提供され得る。
【０１３８】
ＰＥＧ−ＩＦＮ−βは、本発明に従って、ＳＣ又はＩＭ注射、経皮、経肺、経粘膜、インプラント、浸透圧ポンプ、カートリッジ、マイクロポンプ、経口、又は当業者によって認識されている他の手段を含む、種々の送達法経由で患者へ投与され得る。
【０１３９】
別の態様において、本発明は、本発明の医薬組成物を充填した容器を含む、医薬組成物のキットに関する。
【０１４０】
当該容器は、好ましくは送達装置としての使用のためのシリンジである。
【０１４１】
雑誌の記事又は要約、公表された又は未公表の米国又は外国特許出願、発行された米国又は外国特許出願又は任意の他の参考文献を含む、本明細書で引用された全ての参考文献は、当該引用文献中の全てのデータ、表、図、及び文章を含めて、本明細書に参照により完全に援用される。さらに、本明細書中に引用された参考文献中に引用された参考文献の全ての内容が同様に、参照により完全に援用される。
【０１４２】
以下において、本発明は実施例によって説明されるが、それは本発明の範囲を限定するものと解釈されない。
【実施例】
【０１４３】
本発明の実施形態は、以下の実施例によって説明されるだろう。
１．ＰＥＧ−ＩＦＮ−β複合体の製造
ＰＥＧ−ＩＦＮ−βの製造例を、以下のスキームに示す：
【０１４４】
【化８】
【０１４５】
【化９】
【０１４６】
２．製剤化
ＰＥＧ−ＩＦＮ−β組成物は、ＰＥＧ−ＩＦＮ−ベータ１ａを使用して製剤化された。当該溶液を、０．２２ｕｍのメンブラン（Ｄｕｒａｐｏｒｅ）を通じて濾過し、そして最終容器へと充填した（バイアル又はシリンジ中１ｍｌ）。
【０１４７】
試験組成物は、０．０４４ｍｇ／ｍｌのＰＥＧ−ＩＦＮ−ベータ１ａ、ｐＨ４．２の１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、４５ｍｇ／ｍｌのマンニトール、及び０．５ｍｇ／ｍｌのポロキサマー１８８を含んだ。或いはそれは、０．０５５又は０．１１０ｍｇ／ｍｌのＰＥＧ−ＩＦＮ−ベータ１ａ、及び場合によりメチオニンを共に含んだ。
【０１４８】
試験組成物の試料を、４０℃、２５℃及び２〜８℃のそれぞれで貯蔵し、そしてＳＥ−ＨＰＬＣ又はＲＰ−ＨＰＬＣによる純度の決定のために、ＳＥ−ＨＰＬＣによるタンパク質含量の決定のために、ＩＦＮ−ベータが誘導する細胞の保護、及びｐＨに基づく、経時的な抗ウィルスアッセイによる生物学的活性の決定のために、並びにペプチドマッピング／ＵＰＬＣ分析による、酸化形態の測定のために試験を行った。
【０１４９】
３．安定性アッセイ及び他の実験
３．１ ＳＥ−ＨＰＬＣによる、純度及びアッセイ
ＳＥ−ＨＰＬＣによる純度を、Ｓｈｏｄｅｘカラム（水性ＳＥ、コードＫＷ−８０３）で評価した；定組成モードで、１．０ｍＬ／分にて、ＰＢＳ１０×（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ コード７００１３−０１６）から、水で１０倍希釈することによって調製されたＰＢＳ１×を使用して溶出を行った；２１４ｎｍのＵＶで検出を行った。
【０１５０】
ＩＦＮ−ＰＥＧ製剤化された試料を、以下の注入量を使用して注入した：２００ｍｃＬ（４４及び５５ｍｃｇ／ｍＬの試料用）；１００ｍｃＬ（１１０ｍｃｇ／ｍＬの試料用）。
【０１５１】
アッセイのために、参照標準であるＰＳ２００−０１に対してタンパク質の定量を行った（シングルポイントアッセイ）。
【０１５２】
３．２ ＲＰ−ＨＰＬＣによる純度
ＲＰ−ＨＰＬＣによる純度を、Ｃ４カラム（Ｓｙｍｍｅｔｒｙ ３００ Ｃ４，５ｍ サイズ４．６×２５０ｍｍ，Ｗａｔｅｒｓ）で行い、３５℃に温度調節し；波長を２１４ｎｍにセットし、そして溶出を以下の条件を使用して、１ｍＬ／分で行った：
【０１５３】
【表１】
【０１５４】
ＩＦＮ−ＰＥＧ製剤化された試料を、以下の注入量を使用して注入した：１６０ｍｃＬ（４４ｍｃｇ／ｍＬ試料用）；２００ｍｃＬ（５５ｍｃｇ／ｍＬ試料用）；１００ｍｃＬ（１１０ｍｃｇ／ｍＬ試料用）。
【０１５５】
３．３ 生物学的活性（インビトロにおけるバイオアッセイ）
ウイルス（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ Ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ）の細胞変性効果に対する、細胞（ＷＩＳＨ 細胞−ヒト羊膜組織）のＩＦＮ−β誘導性保護に基づく抗ウィルスアッセイである、ＩＦＮ−βに利用可能な方法を使用して生物学的活性を測定した。
【０１５６】
３．４ ｐＨの決定
較正されたｐＨメーター（Ｍｅｔｔｌｅｒ−Ｔｏｌｅｄｏ，ｍｏｄ．７１３）を使用して、標準的操作手順に従ってｐＨ測定を行った。
【０１５７】
３．５ ペプチドマッピング／ＵＰＬＣによる酸化形態
酸化されたメチオニン残基（Ｍｅｔ１、Ｍｅｔ１１７、Ｍｅｔ３６）の定量化法は、エンドプロテアーゼＬｙｓ−Ｃを用いたＩＦＮ−ＰＥＧ試料のタンパク質分解、及びその後のグラジエントＵＰＬＣ分析を予測する；基質成分による任意の障害を除去するために、タンパク質分解前に、製剤化された試料の前処理が行われる。
【０１５８】
タンパク質分解混合物の分離を、Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ分析カラム（ＢＥＨ Ｃ１８ １，７μｍ ２．１×５０ｍｍ ｃｏｄ．１８６０００２３５０，Ｗａｔｅｒｓ）で行った；０．１％ＴＦＡ／水（Ａ１）及び０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル（Ｂ１）を使用するグラジエント条件で溶出を行った。
【０１５９】
以下の機器設定及び分析パラメータが使用され得る：
【０１６０】
【表２】
【０１６１】
【表３】
【０１６２】
【表４】
【０１６３】
【表５】
【０１６４】
【表６】
【０１６５】
【表７】
【０１６６】
【表８】
【０１６７】
【表９】
【０１６８】
【表１０】
【０１６９】
【表１１】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペグ化インターフェロン−β（ＰＥＧ−ＩＦＮ−β）若しくはそのムテイン又はそれらの活性断片、賦形剤、界面活性剤、及び緩衝液を含む液体医薬組成物であって、前記賦形剤がポリオールであり、前記界面活性剤が非イオン性界面活性剤であり、そして前記緩衝液が酢酸ナトリウム緩衝液である前記組成物。
【請求項２】
ＰＥＧ−ＩＦＮ−β、賦形剤、界面活性剤、及び緩衝液を含み、前記賦形剤がマンニトールであり、前記界面活性剤がポロキサマー１８８であり、そして前記緩衝液が酢酸ナトリウム緩衝液である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＰＥＧ−ＩＦＮ−βが約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜約０．１ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＰＥＧ−ＩＦＮ−βが約０．０４４ｍｇ／ｍｌ、０．０５５ｍｇ／ｍｌ、又は０．１１０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＰＥＧ−ＩＦＮ−βが、線状又は分岐のＰＥＧ、好ましくは分岐のＰＥＧを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記ＰＥＧが、少なくとも２０ｋＤａ、好ましくは少なくとも４０ｋＤａ、より好ましくは４０ｋＤａの分子量を有する、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記ＰＥＧ−ＩＦＮ−βがスペーサーを含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記スペーサーが、１００〜５０００ダルトン、好ましくは１５００〜２５００ダルトン、より好ましくは２０００ダルトンの分子量を有する、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記賦形剤が約３０ｍｇ／ｍｌ〜約５０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項１０】
前記賦形剤が約４０ｍｇ／ｍｌ〜約５０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項１１】
前記賦形剤が約４５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項１２】
前記界面活性剤が約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項１３】
前記界面活性剤が約０．４ｍｇ／ｍｌ〜約０．７ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記界面活性剤が約０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項１５】
前記緩衝液が、特定のｐＨのプラス又はマイナス０．５単位以内で前記組成物のｐＨを維持するために十分な量で存在し、ここで前記特定のｐＨが約３．０〜約５．０である、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ｐＨが約３．５〜４．５である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ｐＨが４．２±０．２である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１８】
前記緩衝液が約５ｍＭ〜５００ｍＭの濃度で存在する、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項１９】
前記緩衝液が約１０ｍＭの濃度で存在する、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２０】
前記組成物が水溶液である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
前記組成物がメチオニンをさらに含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
メチオニンが、０．１０〜０．５０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．２０〜０．４０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．１２又は０．２５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
請求項１〜２２のいずれか一項に記載の液体医薬組成物を製造するための方法であって、計算された量の賦形剤及び界面活性剤を前記緩衝溶液へ添加し、その後ＰＥＧ−ＩＦＮ−ベータを添加する、前記方法。
【請求項２４】
無菌であり、かつ使用前の貯蔵に好適である条件で密閉された容器であって、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の液体医薬製剤を含む、前記容器。
【請求項２５】
自己注射器のための、あらかじめ充填されたシリンジ又はバイアルである、請求項２４に記載の容器。
【請求項２６】
医薬組成物のキットであって、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の医薬組成物で充填された容器を含む、前記キット。
【請求項１】
ペグ化インターフェロン−β（ＰＥＧ−ＩＦＮ−β）若しくはそのムテイン又はそれらの活性断片、賦形剤、界面活性剤、及び緩衝液を含む液体医薬組成物であって、前記賦形剤がポリオールであり、前記界面活性剤が非イオン性界面活性剤であり、そして前記緩衝液が酢酸ナトリウム緩衝液である前記組成物。
【請求項２】
ＰＥＧ−ＩＦＮ−β、賦形剤、界面活性剤、及び緩衝液を含み、前記賦形剤がマンニトールであり、前記界面活性剤がポロキサマー１８８であり、そして前記緩衝液が酢酸ナトリウム緩衝液である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＰＥＧ−ＩＦＮ−βが約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜約０．１ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＰＥＧ−ＩＦＮ−βが約０．０４４ｍｇ／ｍｌ、０．０５５ｍｇ／ｍｌ、又は０．１１０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＰＥＧ−ＩＦＮ−βが、線状又は分岐のＰＥＧ、好ましくは分岐のＰＥＧを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記ＰＥＧが、少なくとも２０ｋＤａ、好ましくは少なくとも４０ｋＤａ、より好ましくは４０ｋＤａの分子量を有する、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記ＰＥＧ−ＩＦＮ−βがスペーサーを含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記スペーサーが、１００〜５０００ダルトン、好ましくは１５００〜２５００ダルトン、より好ましくは２０００ダルトンの分子量を有する、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記賦形剤が約３０ｍｇ／ｍｌ〜約５０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項１０】
前記賦形剤が約４０ｍｇ／ｍｌ〜約５０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項１１】
前記賦形剤が約４５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項１２】
前記界面活性剤が約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項１３】
前記界面活性剤が約０．４ｍｇ／ｍｌ〜約０．７ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記界面活性剤が約０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項１５】
前記緩衝液が、特定のｐＨのプラス又はマイナス０．５単位以内で前記組成物のｐＨを維持するために十分な量で存在し、ここで前記特定のｐＨが約３．０〜約５．０である、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ｐＨが約３．５〜４．５である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ｐＨが４．２±０．２である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１８】
前記緩衝液が約５ｍＭ〜５００ｍＭの濃度で存在する、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項１９】
前記緩衝液が約１０ｍＭの濃度で存在する、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２０】
前記組成物が水溶液である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
前記組成物がメチオニンをさらに含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
メチオニンが、０．１０〜０．５０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．２０〜０．４０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．１２又は０．２５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
請求項１〜２２のいずれか一項に記載の液体医薬組成物を製造するための方法であって、計算された量の賦形剤及び界面活性剤を前記緩衝溶液へ添加し、その後ＰＥＧ−ＩＦＮ−ベータを添加する、前記方法。
【請求項２４】
無菌であり、かつ使用前の貯蔵に好適である条件で密閉された容器であって、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の液体医薬製剤を含む、前記容器。
【請求項２５】
自己注射器のための、あらかじめ充填されたシリンジ又はバイアルである、請求項２４に記載の容器。
【請求項２６】
医薬組成物のキットであって、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の医薬組成物で充填された容器を含む、前記キット。
【図１】
【公表番号】特表２０１１−５０６５６２（Ｐ２０１１−５０６５６２Ａ）
【公表日】平成２３年３月３日（２０１１．３．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５３８７２８（Ｐ２０１０−５３８７２８）
【出願日】平成２０年１２月１８日（２００８．１２．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０６７８７６
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０８０６９９
【国際公開日】平成２１年７月２日（２００９．７．２）
【出願人】（３０９０２５５２４）メルク セローノ ソシエテ アノニム (49)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年３月３日（２０１１．３．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１２月１８日（２００８．１２．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０６７８７６
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０８０６９９
【国際公開日】平成２１年７月２日（２００９．７．２）
【出願人】（３０９０２５５２４）メルク セローノ ソシエテ アノニム (49)
【Ｆターム（参考）】
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