ＰＥＧ化ラクトフェリンを主成分とする医薬製剤
【課題】種々の疾患及び症状に対する安全で有効な医薬として非常に有用性の高いＬＦ、特にＰＥＧ化ＬＦを、輸送性及び保存安定性に優れ、様々な投与法が可能な医薬品として実用化するための製剤形態を提供する。
【解決手段】ＰＥＧ化されているラクトフェリンを含有する水性溶液を凍結乾燥することにより調製されたことを特徴とする医薬製剤。
【解決手段】ＰＥＧ化されているラクトフェリンを含有する水性溶液を凍結乾燥することにより調製されたことを特徴とする医薬製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＥＧ化ラクトフェリンを有効成分とする医薬製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ラクトフェリン（以下「ＬＦ」と呼ぶことがある）は、鉄結合性の分子量約８万の糖タンパク質であり、哺乳動物の乳に共通して含まれている。中でも、ヒトの母乳中での含有量は抜きん出ていて、牛乳の１０倍も濃度が高いことがわかっている。このことから、ヒトはＬＦへの依存度が特に高いといわれている。
【０００３】
ＬＦは、体内でも絶えず合成されており、成人では１日３〜５gのＬＦが体内で作られている。これらのＬＦは、涙や唾液、消化液、粘液など外界と接する部分に多く分布しており、特に免疫機能を担う白血球の一種である好中球には、多量に含まれている。
【０００４】
また、心臓や脳、骨格筋、肝臓、副腎、脾臓など全身のあらゆる組織の表面にＬＦの受容体（リセプター）が見つかっており、ＬＦが多機能性生理活性タンパク質であって体内で様々な生理現象をコントロールしていることが強く示唆されている。
【０００５】
ＬＦについてこれまでの研究から明らかになっている機能としては、抗炎症、鉄吸収、抗ウイルス、抗菌、免疫賦活、抗酸化、抗がん、鎮痛、抗ストレス、脂質代謝改善などの作用があり、ＬＦの応用分野は、ウイルス性肝炎、がん（治療、二次予防）、関節炎（慢性関節リウマチ、変形性関節炎）、鎮痛（がん性疼痛、その他慢性疼痛）、オーラルケア（歯周病、口内炎、ドライマウス）、アトピー、花粉症など多岐にわたる疾患又は症状の治療、改善又は予防を含む。したがって、これらの機能は創薬の面から見ても非常に興味深く、現在も多くの研究機関でその機能の分析が進められている。
【０００６】
現在、市販されているものは、主に牛乳から分離精製された天然型のウシラクトフェリンであるが、医薬品用途には、遺伝子組換えによるヒト型ＬＦの溶液製剤が開発されている。溶液製剤の場合は、製剤の保存、輸送はすべて低温下で行わなければならず、また溶液のため重量もあり、輸送コストなどの面から見て、とても不便であると考えられる。
【０００７】
ＬＦは、タンパク質であるために熱や酸、酵素により分解されやすいという欠点を有する。経口摂取されたＬＦは、小腸上皮細胞に存在する受容体を介して腸管から取り込まれ、リンパ系を介して血液中に移行することが報告されており（非特許文献１）、また、ＬＦが生体内で生理活性を示すためには消化されていないＬＦ分子が受容体へ到達することが重要であるとされている。つまり、ＬＦの効果を発揮させるためには、ＬＦをそのままの形で小腸に届けることが必要なのである。
【０００８】
しかし、タンパク質であるＬＦを経口摂取した場合、ＬＦは食道を通り胃へ運ばれ、この胃の中でタンパク質分解酵素であるペプシンによって分解されてしまい、効率よく小腸へ到達することができない。
【０００９】
そこで、ＬＦの欠点を克服するために開発されたのが、ポリエチレングリコール（以下「ＰＥＧ」ということがある）でＬＦを修飾したＰＥＧ化ＬＦである。ＰＥＧを用いてタンパク質を化学修飾する方法は、「PEGylation」（ＰＥＧ化）と呼ばれており、医薬品開発において重要な技術のうちの１つである（非特許文献２）。ＰＥＧは、分子量数千〜数万の水溶性高分子であり、ＰＥＧ自体は親水性であるが、その基本構造（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）は疎水性と親水性の両方の性質を示す。そして、水溶性高分子であるが、有機溶媒などにも親和性を示す。したがって、タンパク質をＰＥＧ化して医薬品化する場合、凍結乾燥製剤にすることができれば流通、臨床現場での使い勝手が良くなると期待されるが、ＰＥＧ化されたラクトフェリンの凍結乾燥製剤の報告例は見当たらず、ＰＥＧ化されたラクトフェリンを乾燥した場合に実際にどのような物理化学的性質、保存安定性、再溶解した場合の溶解性、吸入剤として用いる場合の分散性等を示すかについては、知られていない。
【００１０】
【特許文献１】特開２００７−７０２７７号公報
【特許文献２】特表２００６−５０９８２５号公報
【非特許文献１】T.Takeuchi et al., Exp. Physiol., 89(3): 263-270 (2004)
【非特許文献２】M.J.Roberts et al., Advanced Drug Delivery Reviews, 54: 459-476 (2002)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、種々の疾患及び症状に対する安全で有効な医薬として非常に有用性の高いＬＦ、特にＰＥＧ化ＬＦを、輸送性及び保存安定性に優れ、様々な投与法が可能な医薬品として実用化するための製剤形態の開発を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、
〔１〕 ＰＥＧ化されているラクトフェリンを含有する水性溶液を凍結乾燥することにより調製されたことを特徴とする医薬製剤；
〔２〕 経肺、経鼻、経粘膜又は経口投与用である、前記〔１〕記載の医薬製剤；
〔３〕 賦形剤を含まない、前記〔１〕又は〔２〕記載の医薬製剤；
〔４〕 賦形剤を含有する、前記〔１〕又は〔２〕記載の医薬製剤；
〔５〕 再溶解して溶液とした後に噴霧吸入法により投与される、前記〔３〕又は〔４〕記載の医薬製剤；
〔６〕 微粉末化されており、粉末吸入法により投与される、前記〔３〕又は〔４〕記載の医薬製剤、
を提供する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の医薬製剤は、製造工程が単純で製造が容易であるうえ、従来の溶液製剤等と比較して省スペースかつ軽量であり、熱安定性を有し長期室温保存が可能であるため、保存及び輸送等に関して有利である。また、溶解性が優れているので、医療現場で、用時溶解して簡便に使用することができる。さらに、賦形剤としては種々のものを利用できるが、賦形剤を加えない場合でも溶解性及び保存安定性に優れていることに加えて、崩壊性にも優れている。したがって、投与経路としては、注射、点滴、経口投与等のほか、ネブライザーや粉末吸入器により、エアロゾル又は微粉末として経肺投与することができるという顕著なメリットがある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明の製剤における有効成分であるＰＥＧ化ラクトフェリンに含まれる「ラクトフェリン」（ＬＦ）は、天然又は天然型のラクトフェリン分子そのもののほか、遺伝子組換え型（一部のアミノ酸が置換された改変型を含む）ラクトフェリン、及びラクトフェリンの活性フラグメントなどのラクトフェリンの機能的等価物であってもよく、鉄イオンの有無又はその含有量、由来する生物種などを問わない。好ましくは、牛乳由来ウシラクトフェリン又は遺伝子組換えヒト型ラクトフェリンである。
【００１５】
ラクトフェリンのＰＥＧ化は、公知の方法で行うことができる。好適な方法としては、例えば、特開２００７−７０２７７に記載された方法が挙げられる。ＰＥＧ化に使用するＰＥＧは、直鎖型でも分岐型でもよく、種々の市販の誘導体を用いることができる。また、ＰＥＧは、ポリエチレングリコール又はその修飾物（例えばメトキシ化物）であってもよく、最も好ましくは、直鎖状のＰＥＧ又は分岐型ＰＥＧである。
【００１６】
本発明の医薬製剤に含まれるＰＥＧ化ラクトフェリンにおいて、ラクトフェリン１分子あたりの共有結合されたＰＥＧ誘導体の数は、好ましくは１〜５である。
【００１７】
本発明の医薬製剤は、ＰＥＧ化ＬＦを含有する水性溶液を凍結乾燥することにより調製することができる。この水性溶液は、ＰＥＧ化ＬＦに加えて、生体適合性の塩類及び／又は緩衝剤を含んでいることが好ましい。このような塩類及び／又は緩衝剤を含有する水性溶液としては、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）等の薬学的に許容されうる塩類溶液及び緩衝液等が挙げられる。したがって、例えば、ＰＥＧ化ＬＦを含有する水溶液に、生理食塩水又は緩衝液を添加して、水性溶液を製造し、これを凍結乾燥することができる。この水性溶液には、さらに賦形剤及び製剤の分野において公知の種々の添加剤を含有させることができる。
【００１８】
賦形剤としては、製剤分野において公知の一般的な物質を使用することができるが、マンニトール、デキストラン、及びヒト血清アルブミンのいずれか一種類、及びそれらの混合物は好適に使用することができる。これらの賦形剤は、いずれも製剤化後のラクトフェリンの残存生理活性に大きな影響を与えないことが分かった。また、賦形剤を加えない場合でも、溶解性、保存安定性に優れていることに加えて、崩壊性にも優れているので、賦形剤は含有させなくても製剤の性能に問題は生じない。
【００１９】
水性溶液又は本発明の医薬製剤に含まれていてもよいその他の添加物としては、糖類、アミノ酸類、有機及び無機の酸及びその塩、ペプチド・タンパク質、核酸などが挙げられる。
【００２０】
凍結乾燥の条件は、ＰＥＧ化ラクトフェリンを含有する水性溶液のpHがpH４〜９、好ましくはpH６〜７であることが好ましい。
【００２１】
本発明の医薬製剤は、凍結保存することもできるが、熱安定性が高いので、冷蔵又は長期間常温保存することができる。
【００２２】
本発明の医薬製剤は、固体の状態で又は再溶解して溶液の状態として使用することができる。固体の場合、乾燥後そのままの状態でもよいが、これをさらに粉砕して微粉末化したり、タブレット等に成型するなど、さらに加工してもよい。再溶解した液体の場合、そのまま経口投与することもできるが、噴霧吸入器（ネブライザー）を用いてエアロゾルとして噴霧投与法により投与することができる。また、さらに微粉末化した製剤は、粉末吸入器を使用して吸入投与法により投与することができる。したがって、本発明の医薬製剤は、その剤型を適宜選択することにより、注射、経口、経鼻、経粘膜、経肺等の種々の投与経路で投与することができる。
【００２３】
本発明の医薬製剤の有効投与量は、治療又は予防すべき疾患又は症状の種類や程度、投与対象の状態、剤型などによって異なり、公知の有効ラクトフェリン量を目安に適宜選択することができる。一般に、公知の有効ラクトフェリン量と比較して有意に少ない用量（例えばラクトフェリン量換算で１／２〜１／２０量）とすることができ、同等の用量で用いるのであれば投与回数を減らすことが可能である。
【実施例】
【００２４】
１． ＰＥＧ化ＬＦの製造
特開２００７−７０２７７記載の方法に基づいて、天然型ウシＬＦに分子量２万（２０Ｋ）の分岐型ＰＥＧ鎖を結合させたＰＥＧ化ＬＦ（以下「２０Ｋ−ＰＥＧ−ＬＦ」と呼ぶことがある）溶液（７．５mg/ml）を調製した。具体的には以下のとおりである。
【００２５】
１−１．ＰＥＧ化反応
市販のウシラクトフェリン（TB 905 007、TATUA社、ニュージーランド）の３．１gと分岐型ＰＥＧ化試薬（GL2-200GS2、分子量２０，０００、日油社製）の０．７８gとを、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩溶液、pH７．４）中、モル比で１：１、タンパク質濃度２０mg/mlとなるようにして、２５℃で２４時間反応させた。
【００２６】
１−２．カラムでの精製
精製に使用したカラムは、９３mlの陽イオン交換体（商品名「MacroCAP SP」、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製)をカラムに充填し、１０mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH７．３)で平衡化して作製した。
【００２７】
溶出液は以下のものを用いた。
開始緩衝液：１０mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH７．４)
溶出緩衝液：開始緩衝液に５M ＮａＣｌを含む開始緩衝液(pH７．４)を混合して、目的の塩濃度の溶出液を調製した。溶出塩濃度は０．２M及び０．３Mとした。
【００２８】
溶出は以下のようにして二段階で行った。
精製工程―１：ＰＥＧ化反応液を精製カラムにアプライし、溶出タンパク質をＵＶ検出器でモニタリングしながら、非吸着画分(カラム容量の約２．７倍)、及び０．２M ＮａＣｌ溶出画分(カラム容量の約３．３倍)、０．３M ＮａＣｌ溶出画分(カラム容量の約３．３倍)を分取した。
精製工程―２：上記非吸着画分を、精製工程―１の約１／３量の精製カラムに吸着させた後、０．３M ＮａＣｌで溶出する分画を回収した。
【００２９】
精製工程―１の０．２M ＮａＣｌ溶出画分及び０．３M ＮａＣl溶出画分、及び精製工程―２の０．３M ＮａＣｌ溶出画分を集めて、限外ろ過膜(商品名「セントリコン YM50」、ミリポア社製)を用いて、脱塩・濃縮した。
【００３０】
得られた精製２０Ｋ−ＰＥＧ−ＬＦのタンパク質濃度は７．５mg/mlであった。電気泳動により、未反応ラクトフェリンは含まれないことを確認した。このＰＥＧ化ＬＦ液を５mlずつチューブに分注して−３０℃で凍結保存した。
【００３１】
２． ＰＥＧ化ＬＦ凍結乾燥製剤の製造
ＰＥＧ化ＬＦ液（合計１５ml）を解凍して撹拌し、新たなチューブ５本に３mlずつ分注した。
【００３２】
賦形剤としてＤ−マンニトール、デキストラン４０及びＢＳＡを用いて、予め１０％ Ｄ−マンニトール、２０％ デキストラン４０及び２％ ＢＳＡの各溶液（濃度はいずれもW/V）を調製し、上記のＰＥＧ化ＬＦ液に添加してよく攪拌することにより、次の５種類のＰＥＧ化ＬＦ含有水性溶液（以下「タンパク質溶液」という）を調製した。
（Ａ）ＰＥＧ化ＬＦ ３ml＋１０％ Ｄ−マンニトール溶液３ml
（最終濃度は、ＰＥＧ化ＬＦ：３．７５mg/ml、Ｄ−マンニトール：５％）
（Ｂ）ＰＥＧ化ＬＦ ３ml＋２０％ デキストラン４０溶液３ml
（最終濃度は、ＰＥＧ化ＬＦ：３．７５mg/ml、デキストラン４０：１０％）
（Ｃ）ＰＥＧ化ＬＦ ３ml＋２％ ＢＳＡ溶液３ml
（最終濃度は、ＰＥＧ化ＬＦ：３．７５mg/ml、ＢＳＡ：１％）
（Ｄ）ＰＥＧ化ＬＦ ３ml＋１０％ Ｄ−マンニトール溶液１．５ml＋２０％ デキストラン４０溶液１．５ml
（最終濃度は、ＰＥＧ化ＬＦ：３．７５mg/ml、Ｄ−マンニトール：２．５％、デキストラン４０：５％）
（Ｅ）ＰＥＧ化ＬＦ ３ml＋生理食塩液３ml（最終濃度は、ＰＥＧ化ＬＦ：３．７５mg/ml；賦形剤なし）
【００３３】
調製した上記５種類の各タンパク質溶液を、１０mlバイアル×３本に１．９５mlずつ分注（合計１５本）し、ゴム栓を半打栓した。予め−４０℃に予備凍結した凍結乾燥機（東京理化器械株式会社製、ＦＤＵ−２１００）のバットに、タンパク質溶液を分注したバイアルを入れ、マニュアル運転で一晩凍結した。翌朝、凍結を確認して以下のプログラムでプログラム運転をすることにより、凍結乾燥処理を完了した。プログラムは、減圧条件下で、−４０℃で２０分間、−２０℃で９時間、０℃で９時間、２０℃で２４時間以上であった。
【００３４】
プログラム運転終了後、窒素ガスで復圧し、直ちに打栓し、アルミキャップで巻き締めをした。その後、−３０℃に保存した。
【００３５】
各種性能の確認のため、上記のように製造し、凍結乾燥後−３０℃に２ヶ月保存したサンプル（以下「凍結保存品」という）に加えて、凍結乾燥後、４０℃、相対湿度７５％で２ヶ月間の条件で熱処理を行ったサンプル（以下「熱処理品」という）を用意した。４０℃、相対湿度７５％で２ヶ月間の熱処理は恒温恒湿器で行い、毎週温度と湿度のチェックを行った。温度や湿度に異常は見られなかった。
【００３６】
なお、以下、ＰＥＧ化ＬＦ含有水性溶液を凍結乾燥したものを「サンプル」、各サンプルを調製する際にＰＥＧ化ＬＦ液に添加した賦形剤溶液又は生理食塩水をそのサンプルの「サンプル溶液」、各サンプルを水に溶解して再構成した溶液をそのサンプルの「復元液」と呼ぶ。
【００３７】
３． 外観の観察及び溶解性の試験
３−１．外観
（１） 凍結保存品
サンプルＡ〜Ｅのいずれも、白く粉っぽいものがケーキ状に固まっているような感じであった。サンプルＣ（賦形剤：１％ ＢＳＡ）では大きさが他の条件よりも小さくなっていた。また、サンプルＥ（賦形剤なし）の場合は他のものよりも結晶のように見えるところが多かった。全体的に大きな問題は見られなかった。
【００３８】
（２） 熱処理品
全体的に大きな異常は見られず、いずれのサンプルも白く粉っぽい状態であった。凍結保存品と比較して全体的に大きな変化は見られなかった。具体的には以下のとおりであった。
＜サンプルＡ（賦形剤：５％ Ｄ−マンニトール）＞
大きな変化は見られず、表面も綺麗な状態であった。
＜サンプルＢ（賦形剤：１０％ デキストラン４０）＞
大きさが凍結保存品と比較して縮んでいた。表面の中心が結晶のようになっており、そのまわりは粉っぽい状態であった。
＜サンプルＣ（賦形剤：１％ ＢＳＡ）＞
凍結保存品と比較してサンプルＢよりも縮んでしまっていた。表面はサンプルＢと同様の状態であった。
＜サンプルＤ（賦形剤：２．５％ Ｄ−マンニトール、５％ デキストラン４０）＞
大きな変化は見られなかった。表面は綺麗な状態であった。
＜サンプルＥ（賦形剤なし）＞
表面全体が結晶のような状態で、全体に崩れやすい様子であった。
【００３９】
３−２．溶解性試験
凍結保存品及び熱処理品のそれぞれ５種類の各サンプルを含むバイアルに１．９５mlの注射用蒸留水を添加し、もとの各サンプル溶液への復元を行った（各復元液はＰＥＧ化ＬＦ ７．３mgを含有）。
【００４０】
（１） 凍結保存品
サンプルＢ（賦形剤：１０％ デキストラン４０）を除いて、他は速やかに溶解した。サンプルＢは比較的溶けにくい様子であったが、どのサンプルも最終的には溶解し、溶け残りなどは生じなかった。具体的には以下のとおりであった。
＜サンプルＡ（賦形剤：５％ Ｄ−マンニトール）＞
瞬間的に溶けた。特に問題は見られず、溶液は綺麗な状態であった。
＜サンプルＢ（賦形剤：１０％ デキストラン４０）＞
瞬間的には溶けず、他と比較的すると溶けにくかった。溶液は少し濁っていた。
＜サンプルＣ（賦形剤：１％ ＢＳＡ）＞
すぐに溶けた。溶液は透明な状態であった。
＜サンプルＤ（賦形剤：２．５％ Ｄ−マンニトール及び５％ デキストラン４０）＞
瞬間的に溶けた。泡が少し残った。
＜サンプルＥ（賦形剤なし）＞
瞬間的に溶けた。溶液は綺麗な透明な状態であった。
【００４１】
（２） 熱処理品
溶解性においても凍結保存品と比較して異常は見られず、どのサンプルも問題は見られなかった。
【００４２】
４． 凍結乾燥処理ＰＥＧ化ＬＦの抗炎症活性の測定
上記で製造した凍結乾燥処理ＰＥＧ化ＬＦの各サンプルについて、ＴＨＰ−１細胞に炎症惹起物質ＬＰＳを作用させたときに産生される炎症性サイトカインＩＬ−６の産生をＬＦが抑制する活性（抗炎症作用）を測定した。
【００４３】
各サンプルを含むバイアルに１．９５mlの注射用蒸留水を添加し、もとのサンプル溶液への復元を行った。これらの復元液は、ＰＥＧ化ＬＦ ７．３mgを含有した。
【００４４】
本実験で使用したヒト単球由来細胞（ＴＨＰ−１）は、１０％ＦＢＳ、２mM Ｇｌｕｔａｍａｘ（商品名；インビトロジェン社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地１０ml中で３７℃、５％二酸化炭素で培養し、３〜４日おきに継代を行った。細胞を５×１０４細胞/mlの濃度で７５cm2のＴフラスコに播き、７２時間培養した。その後、４００×Ｇ、４℃で５分間遠心した。上清をアスピレーターで吸引し、新たな培地を１０ml添加して細胞を懸濁した。これを１回の細胞の洗浄とし、計３回行った。洗浄後、新しいフラスコに細胞数が５×１０４細胞/mlになるように細胞を播き、２４時間培養した。２４時間培養後、培養液にインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）及びカルシトリオールをそれぞれ最終濃度４０ng/ml及び２０ng/mlになるように加え、４８時間培養した。ＴＨＰ−１細胞はフラスコの底に付着するので、セルスクレイパーで細胞をはがして回収した後、最終的に１×１０６細胞/mlの細胞懸濁液を調製した。２４ウェルプレートにこの細胞懸濁液を４００μl/ウェルで加え、さらに各ウェルに以下のように試薬等を添加し２４時間培養した。
【００４５】
サンプルＡについて、
「medium」＝培地のみ（試薬等の添加なし）
「ＬＦ」＝４μlの１０mg/ml ＬＦ溶液（ＰＥＧ化ＬＦの製造に使用したウシラクトフェリンの水溶液）
「ＬＰＳ」＝４μlの１０μg/ml ＬＰＳ溶液
「ＬＰＳ＋ＬＦ」＝４μlの１０μg/ml ＬＰＳ溶液及び４μlの１０mg/ml ＬＦ溶液
「サンプル溶液Ａ」＝１６．５μlのサンプル溶液Ａ
「復元液Ａ」＝１０．７μlの復元液Ａ（３．７５mg/mlのＰＥＧ化ＬＦを含有）
「ＬＰＳ＋サンプル溶液Ａ」＝４μlの１０μg/ml ＬＰＳ溶液及び１６．５μlのサンプル溶液Ａ
「ＬＰＳ＋サンプル溶液Ａ＋ＬＦ」＝４μlの１０μg/ml ＬＰＳ溶液、１６．５μlのサンプル溶液Ａ及び４μlの１０mg/ml ＬＦ溶液
「ＬＰＳ＋復元液Ａ」＝４μlの１０μg/ml ＬＰＳ溶液及び１０．７μlの復元液Ａ（３．７５mg/mlのＰＥＧ化ＬＦを含有）
サンプルＢ〜Ｅについても同様に行った。
【００４６】
培養液中に分泌されたＩＬ−６量を、「ヒトＩＬ−６ ＥＬＩＳＡキット」（株式会社鎌倉テクノサイエンス社、製品番号ＫＴＳ３０２）を用いて測定し、復元液の抗炎症活性を調べた。
【００４７】
（１） 凍結保存品
結果を、図１〜５に示す。図１〜５の測定値は、２ウェルずつ測定した平均値である。また、各復元液の抗炎症活性を、同じ重量の未修飾ＬＦの活性を１００％としたときの相対値で表した残存活性を、表１に示す。
【００４８】
【表１】
【００４９】
使用した培地のみ、ＬＦ溶液のみ、サンプル溶液のみ、及び復元液のみを添加した場合では、ＴＨＰ−１細胞からのＩＬ−６産生がほとんど認められないことから、これら溶液へのエンドトキシンの混入は無いと考えられる。また、凍結乾燥に使用した各種サンプル溶液は、ＬＦとＬＰＳを添加した場合のＴＨＰ−１から産生されるＩＬ−６量を変化させなかったことから、ここで用いた抗炎症活性測定方法への影響は無いと考えられる。表１からわかるように、復元液については、約４０〜約６０％の残存活性が確認された。
【００５０】
（２） 熱処理品
結果を、図６〜１０に示す（２ウェルずつの測定値の平均値）。各復元液の抗炎症活性を表２に示す。
【００５１】
【表２】
【００５２】
熱処理品についても、使用した培地のみ、ＬＦ溶液のみ、及び復元液のみを添加した場合では、ＴＨＰ−１細胞からのＩＬ−６産生がほとんど認められないことから、これら溶液へのエンドトキシンの混入は無いと考えられる。表２からわかるように、約７０％の残存活性が確認された。
【００５３】
以上をまとめると、抗炎症活性は、凍結保存品で約４０〜約６０％の活性を保持しており、熱処理品で約７０％の活性を保持していた。凍結乾燥処理を行っていない通常のＰＥＧ化ＬＦの抗炎症活性は天然型ＬＦの約６０％であることがわかっている。したがって、凍結乾燥処理により大幅に活性が低下しているものはなく、温度４０℃、湿度７５％、２ヶ月間の熱処理を行っても、比較的高い活性を保持できることが明らかになった。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】図１は、サンプルＡ（凍結保存品）の復元液の抗炎症活性をＩＬ−６産生量で表す図である。
【図２】図２は、サンプルＢ（凍結保存品）の復元液の抗炎症活性をＩＬ−６産生量で表す図である。
【図３】図３は、サンプルＣ（凍結保存品）の復元液の抗炎症活性をＩＬ−６産生量で表す図である。
【図４】図４は、サンプルＤ（凍結保存品）の復元液の抗炎症活性をＩＬ−６産生量で表す図である。
【図５】図５は、サンプルＥ（凍結保存品）の復元液の抗炎症活性をＩＬ−６産生量で表す図である。
【図６】図６は、サンプルＡ（熱処理品）の復元液の抗炎症活性をＩＬ−６産生量で表す図である。
【図７】図７は、サンプルＢ（熱処理品）の復元液の抗炎症活性をＩＬ−６産生量で表す図である。
【図８】図８は、サンプルＣ（熱処理品）の復元液の抗炎症活性をＩＬ−６産生量で表す図である。
【図９】図９は、サンプルＤ（熱処理品）の復元液の抗炎症活性をＩＬ−６産生量で表す図である。
【図１０】図１０は、サンプルＥ（熱処理品）の復元液の抗炎症活性をＩＬ−６産生量で表す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＥＧ化ラクトフェリンを有効成分とする医薬製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ラクトフェリン（以下「ＬＦ」と呼ぶことがある）は、鉄結合性の分子量約８万の糖タンパク質であり、哺乳動物の乳に共通して含まれている。中でも、ヒトの母乳中での含有量は抜きん出ていて、牛乳の１０倍も濃度が高いことがわかっている。このことから、ヒトはＬＦへの依存度が特に高いといわれている。
【０００３】
ＬＦは、体内でも絶えず合成されており、成人では１日３〜５gのＬＦが体内で作られている。これらのＬＦは、涙や唾液、消化液、粘液など外界と接する部分に多く分布しており、特に免疫機能を担う白血球の一種である好中球には、多量に含まれている。
【０００４】
また、心臓や脳、骨格筋、肝臓、副腎、脾臓など全身のあらゆる組織の表面にＬＦの受容体（リセプター）が見つかっており、ＬＦが多機能性生理活性タンパク質であって体内で様々な生理現象をコントロールしていることが強く示唆されている。
【０００５】
ＬＦについてこれまでの研究から明らかになっている機能としては、抗炎症、鉄吸収、抗ウイルス、抗菌、免疫賦活、抗酸化、抗がん、鎮痛、抗ストレス、脂質代謝改善などの作用があり、ＬＦの応用分野は、ウイルス性肝炎、がん（治療、二次予防）、関節炎（慢性関節リウマチ、変形性関節炎）、鎮痛（がん性疼痛、その他慢性疼痛）、オーラルケア（歯周病、口内炎、ドライマウス）、アトピー、花粉症など多岐にわたる疾患又は症状の治療、改善又は予防を含む。したがって、これらの機能は創薬の面から見ても非常に興味深く、現在も多くの研究機関でその機能の分析が進められている。
【０００６】
現在、市販されているものは、主に牛乳から分離精製された天然型のウシラクトフェリンであるが、医薬品用途には、遺伝子組換えによるヒト型ＬＦの溶液製剤が開発されている。溶液製剤の場合は、製剤の保存、輸送はすべて低温下で行わなければならず、また溶液のため重量もあり、輸送コストなどの面から見て、とても不便であると考えられる。
【０００７】
ＬＦは、タンパク質であるために熱や酸、酵素により分解されやすいという欠点を有する。経口摂取されたＬＦは、小腸上皮細胞に存在する受容体を介して腸管から取り込まれ、リンパ系を介して血液中に移行することが報告されており（非特許文献１）、また、ＬＦが生体内で生理活性を示すためには消化されていないＬＦ分子が受容体へ到達することが重要であるとされている。つまり、ＬＦの効果を発揮させるためには、ＬＦをそのままの形で小腸に届けることが必要なのである。
【０００８】
しかし、タンパク質であるＬＦを経口摂取した場合、ＬＦは食道を通り胃へ運ばれ、この胃の中でタンパク質分解酵素であるペプシンによって分解されてしまい、効率よく小腸へ到達することができない。
【０００９】
そこで、ＬＦの欠点を克服するために開発されたのが、ポリエチレングリコール（以下「ＰＥＧ」ということがある）でＬＦを修飾したＰＥＧ化ＬＦである。ＰＥＧを用いてタンパク質を化学修飾する方法は、「PEGylation」（ＰＥＧ化）と呼ばれており、医薬品開発において重要な技術のうちの１つである（非特許文献２）。ＰＥＧは、分子量数千〜数万の水溶性高分子であり、ＰＥＧ自体は親水性であるが、その基本構造（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）は疎水性と親水性の両方の性質を示す。そして、水溶性高分子であるが、有機溶媒などにも親和性を示す。したがって、タンパク質をＰＥＧ化して医薬品化する場合、凍結乾燥製剤にすることができれば流通、臨床現場での使い勝手が良くなると期待されるが、ＰＥＧ化されたラクトフェリンの凍結乾燥製剤の報告例は見当たらず、ＰＥＧ化されたラクトフェリンを乾燥した場合に実際にどのような物理化学的性質、保存安定性、再溶解した場合の溶解性、吸入剤として用いる場合の分散性等を示すかについては、知られていない。
【００１０】
【特許文献１】特開２００７−７０２７７号公報
【特許文献２】特表２００６−５０９８２５号公報
【非特許文献１】T.Takeuchi et al., Exp. Physiol., 89(3): 263-270 (2004)
【非特許文献２】M.J.Roberts et al., Advanced Drug Delivery Reviews, 54: 459-476 (2002)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、種々の疾患及び症状に対する安全で有効な医薬として非常に有用性の高いＬＦ、特にＰＥＧ化ＬＦを、輸送性及び保存安定性に優れ、様々な投与法が可能な医薬品として実用化するための製剤形態の開発を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、
〔１〕 ＰＥＧ化されているラクトフェリンを含有する水性溶液を凍結乾燥することにより調製されたことを特徴とする医薬製剤；
〔２〕 経肺、経鼻、経粘膜又は経口投与用である、前記〔１〕記載の医薬製剤；
〔３〕 賦形剤を含まない、前記〔１〕又は〔２〕記載の医薬製剤；
〔４〕 賦形剤を含有する、前記〔１〕又は〔２〕記載の医薬製剤；
〔５〕 再溶解して溶液とした後に噴霧吸入法により投与される、前記〔３〕又は〔４〕記載の医薬製剤；
〔６〕 微粉末化されており、粉末吸入法により投与される、前記〔３〕又は〔４〕記載の医薬製剤、
を提供する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の医薬製剤は、製造工程が単純で製造が容易であるうえ、従来の溶液製剤等と比較して省スペースかつ軽量であり、熱安定性を有し長期室温保存が可能であるため、保存及び輸送等に関して有利である。また、溶解性が優れているので、医療現場で、用時溶解して簡便に使用することができる。さらに、賦形剤としては種々のものを利用できるが、賦形剤を加えない場合でも溶解性及び保存安定性に優れていることに加えて、崩壊性にも優れている。したがって、投与経路としては、注射、点滴、経口投与等のほか、ネブライザーや粉末吸入器により、エアロゾル又は微粉末として経肺投与することができるという顕著なメリットがある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明の製剤における有効成分であるＰＥＧ化ラクトフェリンに含まれる「ラクトフェリン」（ＬＦ）は、天然又は天然型のラクトフェリン分子そのもののほか、遺伝子組換え型（一部のアミノ酸が置換された改変型を含む）ラクトフェリン、及びラクトフェリンの活性フラグメントなどのラクトフェリンの機能的等価物であってもよく、鉄イオンの有無又はその含有量、由来する生物種などを問わない。好ましくは、牛乳由来ウシラクトフェリン又は遺伝子組換えヒト型ラクトフェリンである。
【００１５】
ラクトフェリンのＰＥＧ化は、公知の方法で行うことができる。好適な方法としては、例えば、特開２００７−７０２７７に記載された方法が挙げられる。ＰＥＧ化に使用するＰＥＧは、直鎖型でも分岐型でもよく、種々の市販の誘導体を用いることができる。また、ＰＥＧは、ポリエチレングリコール又はその修飾物（例えばメトキシ化物）であってもよく、最も好ましくは、直鎖状のＰＥＧ又は分岐型ＰＥＧである。
【００１６】
本発明の医薬製剤に含まれるＰＥＧ化ラクトフェリンにおいて、ラクトフェリン１分子あたりの共有結合されたＰＥＧ誘導体の数は、好ましくは１〜５である。
【００１７】
本発明の医薬製剤は、ＰＥＧ化ＬＦを含有する水性溶液を凍結乾燥することにより調製することができる。この水性溶液は、ＰＥＧ化ＬＦに加えて、生体適合性の塩類及び／又は緩衝剤を含んでいることが好ましい。このような塩類及び／又は緩衝剤を含有する水性溶液としては、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）等の薬学的に許容されうる塩類溶液及び緩衝液等が挙げられる。したがって、例えば、ＰＥＧ化ＬＦを含有する水溶液に、生理食塩水又は緩衝液を添加して、水性溶液を製造し、これを凍結乾燥することができる。この水性溶液には、さらに賦形剤及び製剤の分野において公知の種々の添加剤を含有させることができる。
【００１８】
賦形剤としては、製剤分野において公知の一般的な物質を使用することができるが、マンニトール、デキストラン、及びヒト血清アルブミンのいずれか一種類、及びそれらの混合物は好適に使用することができる。これらの賦形剤は、いずれも製剤化後のラクトフェリンの残存生理活性に大きな影響を与えないことが分かった。また、賦形剤を加えない場合でも、溶解性、保存安定性に優れていることに加えて、崩壊性にも優れているので、賦形剤は含有させなくても製剤の性能に問題は生じない。
【００１９】
水性溶液又は本発明の医薬製剤に含まれていてもよいその他の添加物としては、糖類、アミノ酸類、有機及び無機の酸及びその塩、ペプチド・タンパク質、核酸などが挙げられる。
【００２０】
凍結乾燥の条件は、ＰＥＧ化ラクトフェリンを含有する水性溶液のpHがpH４〜９、好ましくはpH６〜７であることが好ましい。
【００２１】
本発明の医薬製剤は、凍結保存することもできるが、熱安定性が高いので、冷蔵又は長期間常温保存することができる。
【００２２】
本発明の医薬製剤は、固体の状態で又は再溶解して溶液の状態として使用することができる。固体の場合、乾燥後そのままの状態でもよいが、これをさらに粉砕して微粉末化したり、タブレット等に成型するなど、さらに加工してもよい。再溶解した液体の場合、そのまま経口投与することもできるが、噴霧吸入器（ネブライザー）を用いてエアロゾルとして噴霧投与法により投与することができる。また、さらに微粉末化した製剤は、粉末吸入器を使用して吸入投与法により投与することができる。したがって、本発明の医薬製剤は、その剤型を適宜選択することにより、注射、経口、経鼻、経粘膜、経肺等の種々の投与経路で投与することができる。
【００２３】
本発明の医薬製剤の有効投与量は、治療又は予防すべき疾患又は症状の種類や程度、投与対象の状態、剤型などによって異なり、公知の有効ラクトフェリン量を目安に適宜選択することができる。一般に、公知の有効ラクトフェリン量と比較して有意に少ない用量（例えばラクトフェリン量換算で１／２〜１／２０量）とすることができ、同等の用量で用いるのであれば投与回数を減らすことが可能である。
【実施例】
【００２４】
１． ＰＥＧ化ＬＦの製造
特開２００７−７０２７７記載の方法に基づいて、天然型ウシＬＦに分子量２万（２０Ｋ）の分岐型ＰＥＧ鎖を結合させたＰＥＧ化ＬＦ（以下「２０Ｋ−ＰＥＧ−ＬＦ」と呼ぶことがある）溶液（７．５mg/ml）を調製した。具体的には以下のとおりである。
【００２５】
１−１．ＰＥＧ化反応
市販のウシラクトフェリン（TB 905 007、TATUA社、ニュージーランド）の３．１gと分岐型ＰＥＧ化試薬（GL2-200GS2、分子量２０，０００、日油社製）の０．７８gとを、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩溶液、pH７．４）中、モル比で１：１、タンパク質濃度２０mg/mlとなるようにして、２５℃で２４時間反応させた。
【００２６】
１−２．カラムでの精製
精製に使用したカラムは、９３mlの陽イオン交換体（商品名「MacroCAP SP」、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製)をカラムに充填し、１０mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH７．３)で平衡化して作製した。
【００２７】
溶出液は以下のものを用いた。
開始緩衝液：１０mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH７．４)
溶出緩衝液：開始緩衝液に５M ＮａＣｌを含む開始緩衝液(pH７．４)を混合して、目的の塩濃度の溶出液を調製した。溶出塩濃度は０．２M及び０．３Mとした。
【００２８】
溶出は以下のようにして二段階で行った。
精製工程―１：ＰＥＧ化反応液を精製カラムにアプライし、溶出タンパク質をＵＶ検出器でモニタリングしながら、非吸着画分(カラム容量の約２．７倍)、及び０．２M ＮａＣｌ溶出画分(カラム容量の約３．３倍)、０．３M ＮａＣｌ溶出画分(カラム容量の約３．３倍)を分取した。
精製工程―２：上記非吸着画分を、精製工程―１の約１／３量の精製カラムに吸着させた後、０．３M ＮａＣｌで溶出する分画を回収した。
【００２９】
精製工程―１の０．２M ＮａＣｌ溶出画分及び０．３M ＮａＣl溶出画分、及び精製工程―２の０．３M ＮａＣｌ溶出画分を集めて、限外ろ過膜(商品名「セントリコン YM50」、ミリポア社製)を用いて、脱塩・濃縮した。
【００３０】
得られた精製２０Ｋ−ＰＥＧ−ＬＦのタンパク質濃度は７．５mg/mlであった。電気泳動により、未反応ラクトフェリンは含まれないことを確認した。このＰＥＧ化ＬＦ液を５mlずつチューブに分注して−３０℃で凍結保存した。
【００３１】
２． ＰＥＧ化ＬＦ凍結乾燥製剤の製造
ＰＥＧ化ＬＦ液（合計１５ml）を解凍して撹拌し、新たなチューブ５本に３mlずつ分注した。
【００３２】
賦形剤としてＤ−マンニトール、デキストラン４０及びＢＳＡを用いて、予め１０％ Ｄ−マンニトール、２０％ デキストラン４０及び２％ ＢＳＡの各溶液（濃度はいずれもW/V）を調製し、上記のＰＥＧ化ＬＦ液に添加してよく攪拌することにより、次の５種類のＰＥＧ化ＬＦ含有水性溶液（以下「タンパク質溶液」という）を調製した。
（Ａ）ＰＥＧ化ＬＦ ３ml＋１０％ Ｄ−マンニトール溶液３ml
（最終濃度は、ＰＥＧ化ＬＦ：３．７５mg/ml、Ｄ−マンニトール：５％）
（Ｂ）ＰＥＧ化ＬＦ ３ml＋２０％ デキストラン４０溶液３ml
（最終濃度は、ＰＥＧ化ＬＦ：３．７５mg/ml、デキストラン４０：１０％）
（Ｃ）ＰＥＧ化ＬＦ ３ml＋２％ ＢＳＡ溶液３ml
（最終濃度は、ＰＥＧ化ＬＦ：３．７５mg/ml、ＢＳＡ：１％）
（Ｄ）ＰＥＧ化ＬＦ ３ml＋１０％ Ｄ−マンニトール溶液１．５ml＋２０％ デキストラン４０溶液１．５ml
（最終濃度は、ＰＥＧ化ＬＦ：３．７５mg/ml、Ｄ−マンニトール：２．５％、デキストラン４０：５％）
（Ｅ）ＰＥＧ化ＬＦ ３ml＋生理食塩液３ml（最終濃度は、ＰＥＧ化ＬＦ：３．７５mg/ml；賦形剤なし）
【００３３】
調製した上記５種類の各タンパク質溶液を、１０mlバイアル×３本に１．９５mlずつ分注（合計１５本）し、ゴム栓を半打栓した。予め−４０℃に予備凍結した凍結乾燥機（東京理化器械株式会社製、ＦＤＵ−２１００）のバットに、タンパク質溶液を分注したバイアルを入れ、マニュアル運転で一晩凍結した。翌朝、凍結を確認して以下のプログラムでプログラム運転をすることにより、凍結乾燥処理を完了した。プログラムは、減圧条件下で、−４０℃で２０分間、−２０℃で９時間、０℃で９時間、２０℃で２４時間以上であった。
【００３４】
プログラム運転終了後、窒素ガスで復圧し、直ちに打栓し、アルミキャップで巻き締めをした。その後、−３０℃に保存した。
【００３５】
各種性能の確認のため、上記のように製造し、凍結乾燥後−３０℃に２ヶ月保存したサンプル（以下「凍結保存品」という）に加えて、凍結乾燥後、４０℃、相対湿度７５％で２ヶ月間の条件で熱処理を行ったサンプル（以下「熱処理品」という）を用意した。４０℃、相対湿度７５％で２ヶ月間の熱処理は恒温恒湿器で行い、毎週温度と湿度のチェックを行った。温度や湿度に異常は見られなかった。
【００３６】
なお、以下、ＰＥＧ化ＬＦ含有水性溶液を凍結乾燥したものを「サンプル」、各サンプルを調製する際にＰＥＧ化ＬＦ液に添加した賦形剤溶液又は生理食塩水をそのサンプルの「サンプル溶液」、各サンプルを水に溶解して再構成した溶液をそのサンプルの「復元液」と呼ぶ。
【００３７】
３． 外観の観察及び溶解性の試験
３−１．外観
（１） 凍結保存品
サンプルＡ〜Ｅのいずれも、白く粉っぽいものがケーキ状に固まっているような感じであった。サンプルＣ（賦形剤：１％ ＢＳＡ）では大きさが他の条件よりも小さくなっていた。また、サンプルＥ（賦形剤なし）の場合は他のものよりも結晶のように見えるところが多かった。全体的に大きな問題は見られなかった。
【００３８】
（２） 熱処理品
全体的に大きな異常は見られず、いずれのサンプルも白く粉っぽい状態であった。凍結保存品と比較して全体的に大きな変化は見られなかった。具体的には以下のとおりであった。
＜サンプルＡ（賦形剤：５％ Ｄ−マンニトール）＞
大きな変化は見られず、表面も綺麗な状態であった。
＜サンプルＢ（賦形剤：１０％ デキストラン４０）＞
大きさが凍結保存品と比較して縮んでいた。表面の中心が結晶のようになっており、そのまわりは粉っぽい状態であった。
＜サンプルＣ（賦形剤：１％ ＢＳＡ）＞
凍結保存品と比較してサンプルＢよりも縮んでしまっていた。表面はサンプルＢと同様の状態であった。
＜サンプルＤ（賦形剤：２．５％ Ｄ−マンニトール、５％ デキストラン４０）＞
大きな変化は見られなかった。表面は綺麗な状態であった。
＜サンプルＥ（賦形剤なし）＞
表面全体が結晶のような状態で、全体に崩れやすい様子であった。
【００３９】
３−２．溶解性試験
凍結保存品及び熱処理品のそれぞれ５種類の各サンプルを含むバイアルに１．９５mlの注射用蒸留水を添加し、もとの各サンプル溶液への復元を行った（各復元液はＰＥＧ化ＬＦ ７．３mgを含有）。
【００４０】
（１） 凍結保存品
サンプルＢ（賦形剤：１０％ デキストラン４０）を除いて、他は速やかに溶解した。サンプルＢは比較的溶けにくい様子であったが、どのサンプルも最終的には溶解し、溶け残りなどは生じなかった。具体的には以下のとおりであった。
＜サンプルＡ（賦形剤：５％ Ｄ−マンニトール）＞
瞬間的に溶けた。特に問題は見られず、溶液は綺麗な状態であった。
＜サンプルＢ（賦形剤：１０％ デキストラン４０）＞
瞬間的には溶けず、他と比較的すると溶けにくかった。溶液は少し濁っていた。
＜サンプルＣ（賦形剤：１％ ＢＳＡ）＞
すぐに溶けた。溶液は透明な状態であった。
＜サンプルＤ（賦形剤：２．５％ Ｄ−マンニトール及び５％ デキストラン４０）＞
瞬間的に溶けた。泡が少し残った。
＜サンプルＥ（賦形剤なし）＞
瞬間的に溶けた。溶液は綺麗な透明な状態であった。
【００４１】
（２） 熱処理品
溶解性においても凍結保存品と比較して異常は見られず、どのサンプルも問題は見られなかった。
【００４２】
４． 凍結乾燥処理ＰＥＧ化ＬＦの抗炎症活性の測定
上記で製造した凍結乾燥処理ＰＥＧ化ＬＦの各サンプルについて、ＴＨＰ−１細胞に炎症惹起物質ＬＰＳを作用させたときに産生される炎症性サイトカインＩＬ−６の産生をＬＦが抑制する活性（抗炎症作用）を測定した。
【００４３】
各サンプルを含むバイアルに１．９５mlの注射用蒸留水を添加し、もとのサンプル溶液への復元を行った。これらの復元液は、ＰＥＧ化ＬＦ ７．３mgを含有した。
【００４４】
本実験で使用したヒト単球由来細胞（ＴＨＰ−１）は、１０％ＦＢＳ、２mM Ｇｌｕｔａｍａｘ（商品名；インビトロジェン社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地１０ml中で３７℃、５％二酸化炭素で培養し、３〜４日おきに継代を行った。細胞を５×１０４細胞/mlの濃度で７５cm2のＴフラスコに播き、７２時間培養した。その後、４００×Ｇ、４℃で５分間遠心した。上清をアスピレーターで吸引し、新たな培地を１０ml添加して細胞を懸濁した。これを１回の細胞の洗浄とし、計３回行った。洗浄後、新しいフラスコに細胞数が５×１０４細胞/mlになるように細胞を播き、２４時間培養した。２４時間培養後、培養液にインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）及びカルシトリオールをそれぞれ最終濃度４０ng/ml及び２０ng/mlになるように加え、４８時間培養した。ＴＨＰ−１細胞はフラスコの底に付着するので、セルスクレイパーで細胞をはがして回収した後、最終的に１×１０６細胞/mlの細胞懸濁液を調製した。２４ウェルプレートにこの細胞懸濁液を４００μl/ウェルで加え、さらに各ウェルに以下のように試薬等を添加し２４時間培養した。
【００４５】
サンプルＡについて、
「medium」＝培地のみ（試薬等の添加なし）
「ＬＦ」＝４μlの１０mg/ml ＬＦ溶液（ＰＥＧ化ＬＦの製造に使用したウシラクトフェリンの水溶液）
「ＬＰＳ」＝４μlの１０μg/ml ＬＰＳ溶液
「ＬＰＳ＋ＬＦ」＝４μlの１０μg/ml ＬＰＳ溶液及び４μlの１０mg/ml ＬＦ溶液
「サンプル溶液Ａ」＝１６．５μlのサンプル溶液Ａ
「復元液Ａ」＝１０．７μlの復元液Ａ（３．７５mg/mlのＰＥＧ化ＬＦを含有）
「ＬＰＳ＋サンプル溶液Ａ」＝４μlの１０μg/ml ＬＰＳ溶液及び１６．５μlのサンプル溶液Ａ
「ＬＰＳ＋サンプル溶液Ａ＋ＬＦ」＝４μlの１０μg/ml ＬＰＳ溶液、１６．５μlのサンプル溶液Ａ及び４μlの１０mg/ml ＬＦ溶液
「ＬＰＳ＋復元液Ａ」＝４μlの１０μg/ml ＬＰＳ溶液及び１０．７μlの復元液Ａ（３．７５mg/mlのＰＥＧ化ＬＦを含有）
サンプルＢ〜Ｅについても同様に行った。
【００４６】
培養液中に分泌されたＩＬ−６量を、「ヒトＩＬ−６ ＥＬＩＳＡキット」（株式会社鎌倉テクノサイエンス社、製品番号ＫＴＳ３０２）を用いて測定し、復元液の抗炎症活性を調べた。
【００４７】
（１） 凍結保存品
結果を、図１〜５に示す。図１〜５の測定値は、２ウェルずつ測定した平均値である。また、各復元液の抗炎症活性を、同じ重量の未修飾ＬＦの活性を１００％としたときの相対値で表した残存活性を、表１に示す。
【００４８】
【表１】
【００４９】
使用した培地のみ、ＬＦ溶液のみ、サンプル溶液のみ、及び復元液のみを添加した場合では、ＴＨＰ−１細胞からのＩＬ−６産生がほとんど認められないことから、これら溶液へのエンドトキシンの混入は無いと考えられる。また、凍結乾燥に使用した各種サンプル溶液は、ＬＦとＬＰＳを添加した場合のＴＨＰ−１から産生されるＩＬ−６量を変化させなかったことから、ここで用いた抗炎症活性測定方法への影響は無いと考えられる。表１からわかるように、復元液については、約４０〜約６０％の残存活性が確認された。
【００５０】
（２） 熱処理品
結果を、図６〜１０に示す（２ウェルずつの測定値の平均値）。各復元液の抗炎症活性を表２に示す。
【００５１】
【表２】
【００５２】
熱処理品についても、使用した培地のみ、ＬＦ溶液のみ、及び復元液のみを添加した場合では、ＴＨＰ−１細胞からのＩＬ−６産生がほとんど認められないことから、これら溶液へのエンドトキシンの混入は無いと考えられる。表２からわかるように、約７０％の残存活性が確認された。
【００５３】
以上をまとめると、抗炎症活性は、凍結保存品で約４０〜約６０％の活性を保持しており、熱処理品で約７０％の活性を保持していた。凍結乾燥処理を行っていない通常のＰＥＧ化ＬＦの抗炎症活性は天然型ＬＦの約６０％であることがわかっている。したがって、凍結乾燥処理により大幅に活性が低下しているものはなく、温度４０℃、湿度７５％、２ヶ月間の熱処理を行っても、比較的高い活性を保持できることが明らかになった。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】図１は、サンプルＡ（凍結保存品）の復元液の抗炎症活性をＩＬ−６産生量で表す図である。
【図２】図２は、サンプルＢ（凍結保存品）の復元液の抗炎症活性をＩＬ−６産生量で表す図である。
【図３】図３は、サンプルＣ（凍結保存品）の復元液の抗炎症活性をＩＬ−６産生量で表す図である。
【図４】図４は、サンプルＤ（凍結保存品）の復元液の抗炎症活性をＩＬ−６産生量で表す図である。
【図５】図５は、サンプルＥ（凍結保存品）の復元液の抗炎症活性をＩＬ−６産生量で表す図である。
【図６】図６は、サンプルＡ（熱処理品）の復元液の抗炎症活性をＩＬ−６産生量で表す図である。
【図７】図７は、サンプルＢ（熱処理品）の復元液の抗炎症活性をＩＬ−６産生量で表す図である。
【図８】図８は、サンプルＣ（熱処理品）の復元液の抗炎症活性をＩＬ−６産生量で表す図である。
【図９】図９は、サンプルＤ（熱処理品）の復元液の抗炎症活性をＩＬ−６産生量で表す図である。
【図１０】図１０は、サンプルＥ（熱処理品）の復元液の抗炎症活性をＩＬ−６産生量で表す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＥＧ化されているラクトフェリンを含有する水性溶液を凍結乾燥することにより調製されたことを特徴とする医薬製剤。
【請求項２】
経肺、経鼻、経粘膜又は経口投与用である、請求項１記載の医薬製剤。
【請求項３】
賦形剤を含まない、請求項１又は２記載の医薬製剤。
【請求項４】
賦形剤を含有する、請求項１又は２記載の医薬製剤。
【請求項５】
再溶解して溶液とした後に噴霧吸入法により投与される、請求項３又は４記載の医薬製剤。
【請求項６】
微粉末化されており、粉末吸入法により投与される、請求項３又は４記載の医薬製剤。
【請求項１】
ＰＥＧ化されているラクトフェリンを含有する水性溶液を凍結乾燥することにより調製されたことを特徴とする医薬製剤。
【請求項２】
経肺、経鼻、経粘膜又は経口投与用である、請求項１記載の医薬製剤。
【請求項３】
賦形剤を含まない、請求項１又は２記載の医薬製剤。
【請求項４】
賦形剤を含有する、請求項１又は２記載の医薬製剤。
【請求項５】
再溶解して溶液とした後に噴霧吸入法により投与される、請求項３又は４記載の医薬製剤。
【請求項６】
微粉末化されており、粉末吸入法により投与される、請求項３又は４記載の医薬製剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公開番号】特開２００９−２２１１５９（Ｐ２００９−２２１１５９Ａ）
【公開日】平成２１年１０月１日（２００９．１０．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−６７９４１（Ｐ２００８−６７９４１）
【出願日】平成２０年３月１７日（２００８．３．１７）
【出願人】（８０１００００３８）よこはまティーエルオー株式会社 (31)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１０月１日（２００９．１０．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年３月１７日（２００８．３．１７）
【出願人】（８０１００００３８）よこはまティーエルオー株式会社 (31)
【Ｆターム（参考）】
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