ＰＫＮ３／ＲｈｏＣ高分子複合体およびその使用方法
【課題】ＰＫＮ３、ＰＤＫ１およびＲｈｏＣ（ＰＰＲＣ複合体）を含む新規な高分子集合体を含む組成物およびこれを使用する方法を提供する。
【解決手段】ＰＰＲＣ複合体は、キナーゼ活性を有することが示され、特に侵襲癌などの悪性能の高い細胞で見出された。一部の態様では、癌の治療潜在性を有する化合物をスクリーニングする方法、侵襲癌を診断する方法、癌を患う患者の予後を判定する方法、臨床試験で患者を層別化するか、または特定の処置レジメンの有効性を決定する方法、ＰＰＲＣ複合体の形成を調節するポリペプチド、およびＰＰＲＣ複合体の１つまたは複数の構成成分を含むキット。
【解決手段】ＰＰＲＣ複合体は、キナーゼ活性を有することが示され、特に侵襲癌などの悪性能の高い細胞で見出された。一部の態様では、癌の治療潜在性を有する化合物をスクリーニングする方法、侵襲癌を診断する方法、癌を患う患者の予後を判定する方法、臨床試験で患者を層別化するか、または特定の処置レジメンの有効性を決定する方法、ＰＰＲＣ複合体の形成を調節するポリペプチド、およびＰＰＲＣ複合体の１つまたは複数の構成成分を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗癌活性について化合物をスクリーニングし、侵襲癌を有する患者を診断するための、プロテインキナーゼＮ３（ＰＫＮ３）およびＲｈｏＣの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
有効な癌治療の開発は、この疾患の根底にある分子機序の解明、および新薬の開発に有用でありうるそれらの機序の中にある標的分子の同定をますます利用している。そのような標的分子が利用可能となった後、それらの標的に対する薬物候補化合物を試験することができる。多くの場合、そのような薬物候補は、合成もしくは天然化合物からなりうる化合物ライブラリーのメンバーである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】米国特許出願第２００４０１０６５６９号
【特許文献２】米国特許第４，８１６，５６７号
【特許文献３】欧州特許出願第１２５０２３号
【特許文献４】欧州特許出願第１７１４９６号
【特許文献５】欧州特許出願第１７３４９４号
【特許文献６】ＰＣＴ出願第ＷＯ８６／０１５３３号
【特許文献７】欧州特許出願第１８４１８７号
【特許文献８】ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９
【特許文献９】米国特許出願公開第２００３／０１１８５９２号
【特許文献１０】米国特許出願公開第２００３／０１３３９３９号
【特許文献１１】米国特許出願公開第２００４／００５８４４５号
【特許文献１２】米国特許出願公開第２００５／０１３６０４９号
【特許文献１３】米国特許出願公開第２００５／０１７５６１４号
【特許文献１４】米国特許出願公開第２００５／０１８０９７０号
【特許文献１５】米国特許出願公開第２００５／０１８６２１６号
【特許文献１６】米国特許出願公開第２００５／０２０２０１２号
【特許文献１７】米国特許出願公開第２００５／０２０２０２３号
【特許文献１８】米国特許出願公開第２００５／０２０２０２８号
【特許文献１９】米国特許出願公開第２００５／０２０２５３４号
【特許文献２０】米国特許出願公開第２００５／０２３８６４６号
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｍｕｋａｉ，Ｈ．、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ １３３、１７〜２７頁、２００３
【非特許文献２】Ｄｅｎｔら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １３：４４２９〜４４３４頁、２００７年８月１日
【非特許文献３】Ｓｔｅｉｎ，Ｒ．Ｃ．およびＷａｔｅｒｆｉｅｌｄ，Ｍ．Ｄ．Ｍｏｌ Ｍｅｄ Ｔｏｄａｙ ６、３４７〜３５７頁、２０００
【非特許文献４】Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９８９）、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
【非特許文献５】Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．およびＬａｎｅ，Ｄ．、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、（１９８８）
【非特許文献６】ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）、Ｎａｔｕｒｅ、２５６、４９５〜４９９頁
【非特許文献７】Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９１）、Ｎａｔｕｒｅ、３５２、６２４〜６２８頁
【非特許文献８】Ｍａｒｋｓら（１９９１）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２、５８１〜５９７頁
【非特許文献９】Ｗａｈｌら、１９８３、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２４、３１６〜３２５頁
【非特許文献１０】Ｃａｂｉｌｌｙら、１９８４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１、３２７３〜３２７７頁
【非特許文献１１】Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９８４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１、６８５１〜６８５５頁
【非特許文献１２】Ｂｏｕｌｉａｎｎｅら、１９８４、Ｎａｔｕｒｅ ３１２、６４３〜６４６頁
【非特許文献１３】Ｓａｈａｇａｎら、１９８６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７、１０６６〜１０７４頁
【非特許文献１４】Ｌｉｕら、１９８７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４、３４３９〜３４４３頁
【非特許文献１５】Ｓｕｎら、１９８７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４、２１４〜２１８頁
【非特許文献１６】Ｂｅｔｔｅｒら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０、１０４１〜１０４３頁
【非特許文献１７】Ｌｉｐｉｎｓｋｉら、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ．Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．、２３、３〜２５頁、１９９７
【非特許文献１８】ＴａｎａｋａおよびＨｅｒｒ（１９９０）、Ｃｅｌｌ、６０（３）、３７５〜３８６頁
【非特許文献１９】Ｋｌｉｐｐｅｌら（１９９４）、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１４（４）、２６７５〜８５頁
【非特許文献２０】Ｓｐｉｅｋｅｒ−Ｐｏｌｅｔ、１９９５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２、９３４８〜９３５２頁
【非特許文献２１】Ｅｖａｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、５、３６１０〜６頁（１９８５）
【非特許文献２２】Ｌｅｅｎｄｅｒｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．、２６１、８０８〜８１４頁
【非特許文献２３】Ｎｏｒｏら（２００６）、ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ、６、２７７〜２８９頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
新規な治療用化合物およびレジメンの同定および検証が可能となるように、特に侵襲性の形態の癌に関連する新規な分子標的を同定することの大きな必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
第１の態様では、本発明は、癌の治療に有用な化合物を同定する方法を提供する。この方法のステップは、試験化合物を、プロテインキナーゼＮ３（ＰＫＮ３）ポリペプチド（またはその断片）、ＲｈｏＣポリペプチド（またはその断片）およびホスホイノシチド依存性キナーゼ１（ＰＤＫ１）ポリペプチド（またはその断片）と混合するステップと、形成された、ＰＫＮ３およびＲｈｏＣを含有する複合体（「複合体」）の量を次に決定するステップとを含む。これをこの複合体の「試験レベル」と呼ぶ。次に試験レベルを参照値と比較する。試験レベルと参照値との任意の相違は、その試験化合物が潜在的に癌治療活性を有することを示す。一部の実施形態では、試験化合物と混合する前に、ＰＫＮ３、ＲｈｏＣおよびＰＤＫ１ポリペプチド（またはそれらの断片）を、ある程度まで精製する。
【０００７】
一部の実施形態では、構成成分（構成成分はＰＫＮ３、ＲｈｏＣおよびＰＤＫ１、またはこれらそれぞれの断片である）のうちの１つまたは複数が、その構成成分を同定し、かつその構成成分およびそれに付着している任意の他の構成成分の単離を補助するのに使用される分子タグを含有する。分子タグは当技術分野で一般的に知られている。例には、ポリヒスチジン、ＧＳＴおよびＦＬＡＧが含まれる。一部の実施形態では、ＰＫＮ３ポリペプチドが分子タグを含み、かつ複合体が、ＰＫＮ３ポリペプチドをその分子タグによりプルダウンすることによって単離される。
【０００８】
一部の実施形態では、参照値は、試験化合物の非存在下で形成される複合体のレベルである。他の実施形態では、参照値は、試験化合物がＰＫＮ３、ＲｈｏＣおよびＰＤＫ１（またはこれらそれぞれの断片）と混合される場合に形成される複合体のレベルであり、キナーゼのいずれか一方または両方がキナーゼデッドである。
【０００９】
一部の実施形態では、試験レベルが参照値より大きい。一部の実施形態では、試験化合物は、癌細胞の浸潤性を低減させるか、または腫瘍の成長速度を低減させる化合物である。
【００１０】
第２の態様では、本発明は、癌の治療で有用な化合物を同定する細胞ベースの方法を提供する。この方法のステップは、細胞を試験化合物と接触させるステップと、試験化合物の存在下で、細胞内で形成される複合体の量（試験レベル）を決定するステップとを含む。細胞が、ＰＫＮ３ポリペプチド（またはその断片）、ＲｈｏＣポリペプチド（またはその断片）およびホスホイノシチド依存性キナーゼ１（ＰＤＫ１）ポリペプチドを含有し、かつ複合体も、それらの構成成分のそれぞれを含有する。次に試験レベルを参照値と比較する。試験レベルと参照値との任意の相違は、その試験化合物が潜在的に癌治療活性を有することを示す。
【００１１】
一部の実施形態では、細胞が、例えば、長期造血幹細胞（ＬＴ−ＨＳＣ）などの幹細胞である。他の実施形態では、細胞が腫瘍由来の培養細胞である。一部の実施形態では、細胞が高い転移能力を有する。一部の実施形態では、細胞が、例えば、ＰＣ３細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞、ＭＣＦ７細胞、ＭＤＡ３６１細胞、ＭＣＦ４６８細胞、ＢＴ５４９細胞およびＨｅＬａ細胞のうちの１つである。他の実施形態では、細胞が、構成成分の１つもしくは複数またはすべてを異種組換えポリペプチドとして含有する。
【００１２】
一部の実施形態では、構成成分（構成成分はＰＫＮ３、ＲｈｏＣおよびＰＤＫ１、またはこれらの断片）の１つまたは複数が細胞にとって内因性である。一部の実施形態では、構成成分のうちの１つまたは複数が組換え体であり、その構成成分を同定し、かつその構成成分およびそれに付着している任意の他の構成成分の単離を補助するのに使用される分子タグを含有する。分子タグは当技術分野で一般的に知られている。例には、ポリヒスチジン、ＧＳＴおよびＦＬＡＧが含まれる。一部の実施形態では、ＰＫＮ３ポリペプチドが分子タグを含み、かつ複合体が、ＰＫＮ３ポリペプチドをその分子タグによりプルダウンすることによって単離される。
【００１３】
一部の実施形態では、参照値は、試験化合物の非存在下で形成される複合体のレベルである。他の実施形態では、参照値は、試験化合物がＰＫＮ３，ＲｈｏＣおよびＰＤＫ１（またはこれらの断片）と混合される場合に形成される複合体のレベルであり、キナーゼのいずれか一方または両方がキナーゼデッドである。
【００１４】
一部の実施形態では、試験レベルが参照値より大きい。一部の実施形態では、試験化合物は、癌細胞の浸潤性を低減させるか、または原発性腫瘍の成長速度を低減させる化合物である。
【００１５】
第３の態様では、本発明は、患者のＰＫＮ３活性およびＲｈｏＣ活性のレベルを評価することによって、患者の癌を診断する方法を提供する。この方法によれば、患者から試料を取得し、次に試料中のＰＫＮ３活性およびＲｈｏＣ活性のレベル（これは試験レベルである）を決定し、次に試験レベルを参照値と比較する。試験レベルと参照値との相違が、侵襲性である癌を患者が有することを示す。
【００１６】
第４の態様では、本発明は、患者のＰＫＮ３活性およびＲｈｏＣ活性のレベルを評価することによって、癌治療に応答できる患者を同定する方法を提供する。この方法によれば、患者から試料を取得し、次に試料中のＰＫＮ３活性およびＲｈｏＣ活性のレベル（これは試験レベルである）を決定し、次に試験レベルを参照値と比較する。試験レベルと参照値との相違が、患者が癌治療に応答する見込みを示す。
【００１７】
第３の態様および第４の態様の両方の一部の実施形態では、参照値が、非癌組織で決定されるＰＫＮ３活性およびＲｈｏＣ活性のレベルである。一部の実施形態では、試料が腫瘍生検であり、試験レベルが、例えば、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ｉｎ ｓｉｔｕ ＰＣＲまたは免疫染色など、腫瘍内のｉｎ ｓｉｔｕアッセイによって決定される。一部の実施形態では、参照は、単純に、腫瘍試料の周囲または中にある任意の非癌組織である。一部の実施形態では、試験レベルが参照値より大きい。
【００１８】
第５の態様では、本発明は、処置を行う前および処置を行った後におけるＰＫＮ３活性およびＲｈｏＣ活性のレベルの変化を評価することによって、対象の癌治療処置レジメンの効果を決定する方法を提供する。この方法によれば、患者から試料を取得し、次に試料中のＰＫＮ３活性およびＲｈｏＣ活性のレベル（これは前治療レベルすなわち第１のレベルである）を決定し、次に処置レジメンを患者に行う。処置を行った後のある時点で、患者から第２の試料を取得し、次に第２の試料中のＰＫＮ３活性およびＲｈｏＣ活性のレベル（これは治療後レベルすなわち第２のレベルである）を決定する。第１のレベルおよび第２のレベルを相互に比較する。第１のレベルと比較した、第２のレベルのＰＫＮ３活性およびＲｈｏＣ活性の両方の低減が、処置レジメンが患者の癌に対して有効であることを示す。
【００１９】
第３、第４および第５の態様の一部の実施形態では、ＰＫＮ３活性は、ＰＫＮ３ポリペプチドまたはその断片をコードするＲＮＡの発現である。他の実施形態では、ＰＫＮ３活性は、ＰＫＮ３ポリペプチドまたはその断片の発現である。他の実施形態では、ＰＫＮ３活性は、ＰＫＮ３ポリペプチドのリン酸化である。さらに他の実施形態では、ＰＫＮ３活性は、例えば、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ−３）由来のペプチドなど、ＰＫＮ３の下流エフェクター（表１も参照）のリン酸化である。
【００２０】
第３、第４および第５の態様の一部の実施形態では、ＲｈｏＣ活性は、ＲｈｏＣポリペプチドまたはその断片をコードするＲＮＡの発現である。他の実施形態では、ＲｈｏＣ活性は、ＲｈｏＣポリペプチドまたはその断片の発現である。他の実施形態では、ＲｈｏＣ活性は、例えば、ＰＫＮ３またはグリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ−３）由来のペプチドなど、ＲｈｏＣの下流エフェクター（表１も参照）のリン酸化である。
【００２１】
第３、第４および第５の態様の一部の実施形態では、ＰＫＮ３ポリペプチドのリン酸化状態は、ＰＫＮ３のＴ８６０におけるターンモチーフリン酸化部位に特異的に結合する抗体または他のポリペプチドを用いることによって決定される。例えば、配列番号３６を参照。
【００２２】
第１から第５までの態様の一部の実施形態では、癌は、乳癌、卵巣癌、膵癌、胃癌、肝細胞癌、膀胱癌、結腸直腸癌、皮膚悪性黒色腫および前立腺癌（ＣａＰ）のうちのいずれか１つまたは複数である。
【００２３】
第６の態様では、本発明は、ＰＫＮ３ポリペプチドおよびＲｈｏＣポリペプチドを含む複合体の形成を破壊または遮断するポリペプチドまたはペプチドミメティックを含む組成物を提供する。一部の実施形態では、ポリペプチドまたはペプチドミメティックが、ＰＫＮ３の、ＲｈｏＣに結合する領域に結合する。他の実施形態では、ポリペプチドまたはペプチドミメティックが、ＲｈｏＣの、ＰＫＮ３に結合する領域に結合する。一部の実施形態では、ポリペプチドまたはペプチドミメティックが、ＰＫＮ３またはＲｈｏＣ上のエピトープを認識する１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含有する。一部の実施形態では、ＣＤＲ含有ポリペプチドが、抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、単鎖可変断片（「ＳｃＦｖ」）、小モジュール免疫薬剤（「ＳＭＩＰ」）およびナノボディー（別名単一ドメイン抗体またはＶＨＨ抗体）のいずれか１つである。
【００２４】
第６の態様の一部の実施形態では、ＰＫＮ３の、ＲｈｏＣに結合する領域は、ＡＣＣ１、ＡＣＣ２またはＡＣＣ３アミノ酸配列のいずれか１つまたは複数を含む。他の実施形態では、ポリペプチドまたはペプチドミメティックが、ＰＫＮ３のＡＣＣ１、ＡＣＣ２およびＡＣＣ３のうちのいずれか１つまたは複数に対応するアミノ酸配列を含有する。
【００２５】
第７の態様では、本発明は、Ｔ８６０のＰＫＮ３ターンモチーフリン酸化部位に結合する少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、ポリペプチドが抗体であり、これには、例えば、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、単鎖可変断片（「ＳｃＦｖ」）、小モジュール免疫薬剤（「ＳＭＩＰ」）およびナノボディー（別名単一ドメイン抗体またはＶＨＨ抗体）が含まれる。
【００２６】
第８の態様では、本発明は、ＰＫＮ３とＲｈｏＣとの相互作用を調節し、かつ癌を治療するのに使用できる化合物についてスクリーニングするのに使用されるキットを提供する。キットは、患者の癌の侵襲性および浸潤性を判定するのにも使用できる。キットは、患者における癌治療の有効性を評価するのにも使用できる。一部の実施形態では、キットは、（ａ）ＰＫＮ３活性を検出する薬剤、（ｂ）ＲｈｏＣ活性を検出する薬剤、（ｃ）標識および（ｄ）パッケージを含有する。一部の実施形態では、キットは、癌治療用化合物も含有する。癌治療用化合物とは、対象における癌細胞の成長または転移を予防または遅延させる化合物、組成物または処置レジメンである。そのような癌治療用化合物には、化学療法薬、遺伝子療法組成物、ホルモンに影響を与える化合物、免疫療法化合物、抗体およびアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されない。有用な化学療法薬の例には、ブレオマイシン、ネオカルシノスタチン、スラミン、ドキソルビシン、タキソール、マイトマイシンＣおよびシスプラチンが含まれるが、これらに限定されない。本発明で使用するための癌治療用化合物には、将来開発される新規な化合物または処置も含まれることを理解するべきである。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】リン酸化ＰＫＮ３レベルの同時増大を示す、増大した悪性能を有する乳癌細胞系のウェスタンブロットを示す図である。
【図２】リン酸化ＰＫＮ３レベルの同時増大を示す、増大した薬物耐性を有する非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）細胞系のウェスタンブロットを示す図である。
【図３Ａ】抗リン酸化ＰＫＮ抗体および抗Ｍｙｃ抗体でプロービングされた、Ｍｙｃタグ付きのＲｈｏおよびＲａｃコンストラクトで形質移入された細胞からの溶解物のウェスタンブロットを示す図である。
【図３Ｂ】抗リン酸化ＰＫＮ抗体および抗Ｍｙｃ抗体でプロービングされた、Ｍｙｃタグ付きのＲｈｏおよびＲａｃコンストラクトで形質移入された細胞からの抗Ｍｙｃ免疫沈降物のウェスタンブロットを示す図である。
【図４Ａ】抗Ｍｙｃ抗体および抗Ｆｌａｇ抗体でプロービングされた、Ｍｙｃタグ付きのＲｈｏコンストラクトおよびＦｌａｇタグ付きのＰＫＮ３コンストラクトで形質移入された細胞からの溶解物のウェスタンブロットを示す図である。
【図４Ｂ】ＰＫＮ３、ＲｈｏＣおよびＰＤＫ１を含有する三重複合体のキナーゼ依存的な形成を示す、抗Ｆｌａｇ免疫沈降物のウェスタンブロットを示す図である。
【図５Ａ】抗Ｍｙｃ抗体、抗ＰＤＫ１抗体および抗ＰＫＮ３抗体でプロービングされた、Ｍｙｃタグ付きのＲｈｏコンストラクトおよびＦｌａｇタグ付きのＰＫＮ３コンストラクトで形質移入された細胞からの溶解物のウェスタンブロットを示す図である。
【図５Ｂ】ＲｈｏＣ／ＰＤＫ１／ＰＫＮ３三重複合体で調節された、ＰＫＮ３のキナーゼ活性を示す抗Ｆｌａｇ免疫沈降物のウェスタンブロットを示す図である。
【図６Ａ】ＰＫＮ３またはｐ１１０βを標的とするドキシサイクリン（ＤｏｘすなわちＤｏｘｙ）誘導ｓｈＲＮＡを発現するＰＣ−３細胞からの溶解物のウェスタンブロットを示す図である。
【図６Ｂ】ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）に播種された代表的細胞集団を示す図である。
【図７Ａ】移植されたＰＫＮ３ ｓｈＲＮＡ ＰＣ−３細胞を保持するマウスからの腫瘍容積を定量化するヒストグラムである。
【図７Ｂ】移植されたＰＫＮ３ ｓｈＲＮＡ ＰＣ−３細胞を保持するマウスからの腫瘍容積を定量化するヒストグラムである。
【図８Ａ】ＰＫＮ３、ｐ１１０βまたはＣＫＩεを標的とするＤｏｘ誘導ｓｈＲＮＡを発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞からの溶解物のウェスタンブロットを示す図である。
【図８Ｂ】ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）に播種された代表的細胞集団を示す図である。
【図９】ドキシサイクリン誘導の存在下および非存在下における、ＰＫＮ３ ｓｈＲＮＡ ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を保持するマウスの腫瘍質量を示す散布図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
（ａ）プロテインキナーゼＮ３（ＰＫＮ３）は選択的にＲｈｏＣと会合し、（ｂ）ＰＫＮ３はキナーゼ依存的な様式でＲｈｏＣに結合し、かつ（ｃ）ＰＫＮ３とＲｈｏＣとの会合は、ＰＤＫ１を含有する三重複合体（ＰＫＮ３／ＰＤＫ１／ＲｈｏＣ複合体、すなわちＰＰＲＣ複合体）の形成を促進するという驚くべき発見を本明細書に開示する。ＰＰＲＣ複合体は、とりわけ侵襲癌に関連する価値のある標的である。ＰＰＲＣ複合体の形成がＰＫＮ３のリン酸化の増大およびそれに続くキナーゼ活性をもたらすことをさらに開示する。
【００２９】
ＰＫＮ３は、長さ８８９アミノ酸残基（ヒト相同分子種）のセリン／スレオニンプロテインキナーゼである。それは、それぞれ残基１５〜７７、９７〜１７０および１８４〜２３６に位置する、ＡＣＣ１、ＡＣＣ２およびＡＣＣ３という３つの逆平行コイルドコイル（ＡＣＣ）ドメインを含有するＮ末端推定調節領域と、残基５５９〜８８２に位置するＣ末端触媒領域と、推定調節ドメインと触媒ドメインとの間に位置する長さ約１００〜１３０残基のＣ２様ドメインとを有する。哺乳動物には、少なくとも３つの異なったＰＫＮアイソフォーム（ＰＫＮ１／ＰＫＮα／ＰＡＫ−１／ＰＲＫ−１、ＰＫＮ２／ＰＲＫ２／ＰＡＫ−２／ＰＫＮγおよびＰＫＮ３／ＰＫＮβ）が存在し、これらのそれぞれが異なった酵素学的特性、組織分布および様々な機能を示す。ＰＫＮに関する総説には、Ｍｕｋａｉ，Ｈ．、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ １３３、１７〜２７頁、２００３を参照のこと。参照により全体として本明細書に組み込まれている、２００４年６月３日公開の米国特許出願第２００４０１０６５６９号も参照のこと。
【００３０】
侵襲性および薬物耐性が増大した癌細胞で、ＰＫＮ３が上方制御されていることをここにさらに開示する（それぞれ、図１および２を参照）。侵襲性の増大とは、それらの癌細胞が転移性であること、高い転移能を有すること、増大した増殖速度を有すること、または薬物抵抗性であることを意味する。侵襲癌は、例えば、トリプルネガティブ乳癌によって例示される（例えば、Ｄｅｎｔら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １３：４４２９〜４４３４頁、２００７年８月１日を参照）。侵襲癌は、ＰＫＮ３／ＲｈｏＣ経路が関与している癌も含む。
【００３１】
ＰＰＲＣ複合体の活性を阻害する化合物は、細胞の転移性および増殖挙動を制御するのに使用でき、それゆえ、腫瘍および癌、より詳細には侵襲性である腫瘍および癌を治療する方法を提供する。ＰＰＲＣ活性によってもたらされるシグナル伝達および他の活性の低減は、ＰＰＲＣ複合体の構成成分のうちの１つまたは複数における転写レベルの低減に由来するものでも、翻訳レベルの低減に由来するものでも、翻訳後修飾レベルの低減に由来するものでも、四次構造形成（すなわち、三重複合体の形成）のレベルの低減に由来するものでもよい。
【００３２】
侵襲癌において、ＰＰＲＣ複合体とＲｈｏＣ／ＰＫＮ３経路とが関与しているので、複合体およびその構成成分は、予後マーカー、疾患ステージマーカー、患者層別マーカー、またはその細胞が転移を行うか、もしくは他の様式で侵襲性になるかに関して、細胞の状態もしくはそのような種類の細胞を体内に有する患者の状態を診断するマーカーとして使用できる。
【００３３】
ＰＫＮ３は、ＰＩ３Ｋ誘導の細胞移動および細胞浸潤の、発生的に調節される媒介因子である。それは、発現および触媒活性のレベルで、Ａｋｔ非依存的な様式で、ＰＩ３Ｋによって調節される。それは、限定的な発現パターン（内皮、胚および腫瘍細胞）を有し、ほとんどの正常な細胞機能には必須でない。それは、正所性マウスモデルにおける転移性ＰＣ−３（ＰＴＥＮ−／−）細胞増殖に必要である。
【００３４】
正常細胞では、ＰＩ３キナーゼ（ホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ）経路は、成長因子誘導の際のＰＩ３キナーゼ活性および平行するシグナル伝達経路によって特徴付けられる。細胞の成長因子刺激は、細胞膜におけるそれらの認識受容体の活性化をもたらし、今度はそれらが、ＰＩ３キナーゼなどの細胞内シグナル伝達分子と結合し、活性化する。ＰＩ３キナーゼ（ｐ８５調節サブユニットおよびｐ１１０触媒サブユニットからなる）の活性化は、リン酸化によるＡｋｔの活性化をもたらし、それによって、増殖、生存または移動など、さらに下流の細胞反応を補助する。それゆえ、ＰＴＥＮは、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）３キナーゼ経路に関与する腫瘍抑制因子であって、かつ細胞の増殖および形質転換を調節するその役割について過去に広範に研究されている（総説には、例えば、Ｓｔｅｉｎ，Ｒ．Ｃ．およびＷａｔｅｒｆｉｅｌｄ，Ｍ．Ｄ．Ｍｏｌ Ｍｅｄ Ｔｏｄａｙ ６、３４７〜３５７頁、２０００を参照）。
【００３５】
腫瘍抑制因子ＰＴＥＮは、ＰＩ３キナーゼ触媒反応を逆行させることによって、ＰＩ３キナーゼの負の調節因子として機能し、それによって、この経路の活性化が一過性かつ制御された様式で起こることを確実にする。ＰＩ３キナーゼシグナル伝達の慢性的な活性化過剰は、ＰＴＥＮの機能的不活性化によって引き起こされる。ＰＩ３キナーゼの活性は、低分子阻害剤ＬＹ２９４００２の添加によって遮断できる。平行経路で作用するシグナル伝達キナーゼＭＥＫの活性および下流反応は、例えば、低分子阻害剤ＰＤ９８０５９によって阻害できる。
【００３６】
ＰＴＥＮ機能の減失を介した、ＰＩ３キナーゼ経路の慢性的活性化は、腫瘍形成および転移への主要寄与因子であり、これは、この腫瘍抑制因子が、制御された細胞増殖の重要なチェックポイントであることを示している。ＰＴＥＮノックアウト細胞は、ＰＩ３キナーゼの活性型を介して、ＰＩ３キナーゼ経路が慢性的に誘導されている細胞と類似した特徴を示す。ホスファチジルイノシトール３−キナーゼの活性化は、細胞周期への侵入に十分であり、発癌性形質転換に特徴的な細胞変化を促進する。
【００３７】
ＰＩ３キナーゼ経路の調節不全に関与する疾患および状態はよく知られている。それゆえ、これらの状態および疾患のいずれも、本発明の方法、薬物および診断薬によって対処できる。それらの設計、スクリーニングまたは製造は本明細書に教示されている。限定ではなく、例示のために、以下の状態および疾患、すなわち、子宮体癌、結腸直腸癌、神経膠腫、子宮体癌、腺癌、子宮内膜増殖症、カウデン症候群、遺伝性非ポリポーシス結腸直腸癌、リーフラウメニ症候群、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、バナヤン−ゾナナ（Ｂａｎｎａｙａｎ−Ｚｏｎａｎａ）症候群、ＬＤＤ（レルミット−デュクロ（Ｌｈｅｒｍｉｔｔｅ−Ｄｕｋｌｏｓ）症候群）、カウデン病（ＣＤ）およびバナヤン−ルバルカバ−ライリー（Ｂａｎｎａｙａｎ−Ｒｕｖａｌｃａｂａ−Ｒｉｌｙ）症候群（ＢＲＲ）を含めた過誤腫−大頭症疾患、皮膚粘膜病変（例えば、毛根鞘腫）、大頭症、精神遅滞、胃腸過誤腫、脂肪腫、甲状腺腺腫、乳房線維嚢胞病、小脳異形成性神経節細胞腫ならびに乳腺および甲状腺悪性腫瘍を示す。
【００３８】
これに関連して、ＰＰＲＣ複合体およびその個々の構成成分は、ＰＰＲＣの上流を標的とするように作られている他の薬物より少ない副作用を有する薬物によって対処できる、ＰＩ３キナーゼ経路の価値ある下流薬物標的である。したがって、本発明は、例えば、２−（４−モルホリニル）８−フェニルクロモン（「ＬＹ２９４００２」）など、通常はＰＩ３キナーゼを標的とする、当技術分野で知られているものより選択的な薬学的活性化合物の設計、スクリーニング、開発および製造に適した薬物標的を提供する。この特定の一部のエフェクター分子、すなわち、ＲｈｏＣおよびＰＫＮ３、ならびにこの経路に関与するさらに下流の任意の分子に関する制御を有することによって、平行するその分枝またはシグナル伝達カスケードにおけるさらに上流の標的のうち、望ましくない影響を引き起こす可能性が高いのは、極めて限られた数のみとなる。したがって、細胞周期、ＤＮＡ修復、アポトーシス、グルコース輸送、翻訳に関係する、ＰＩ−３キナーゼ／ＰＴＥＮ経路の他の活性は、影響を受けなくなる。また、インスリンシグナル伝達も誘導されず、これは、ＬＹ２９４００２の使用に関連して観察された糖尿病性の反応または他の副作用が実際に回避されることを意味する。
【００３９】
ＰＫＮ３をコードする核酸の完全配列は、例えば、アクセッション番号ＮＭ＿０１３３５５．３の下で、データバンクで一般に利用可能である。また、ＰＫＮ３のアミノ酸配列は、アクセッション番号ＮＰ＿０３７４８７．２の下で、データバンクで利用可能である。ＲｈｏＣをコードする核酸の完全配列は、例えば、アクセッション番号ＮＭ＿００１０４２６７８．１、ＮＭ＿００１０４２６７９．１およびＮＭ＿１７５７４４．４の下で、データバンクで一般に利用可能である。また、ＲｈｏＣのアミノ酸配列は、アクセッション番号ＮＰ＿００１０３６１４３．１、ＮＰ＿００１０３６１４４．１およびＮＰ＿７８６８８６．１の下で、データバンクで利用可能である。望ましい効果が実現されうる限り、本発明に従って、ＰＫＮ３およびＲｈｏＣの誘導体またはそれらの末端欠失型バージョンが使用できることも、本発明に包含される。したがって、誘導体化および末端欠失の程度は、当業者が日常的分析によって決定できる。
【００４０】
本発明との関連において、ＰＫＮ３およびＲｈｏＣをコードする核酸配列という用語には、前述のアクセッション番号によって指定された核酸配列または前述のアミノ酸配列から派生しうる任意の核酸配列とハイブリダイズする核酸も含まれる。そのようなハイブリダイゼーションは、当業者には既知のものである。そのようなハイブリダイゼーションの詳細は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９８９）、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから得られる。好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件下、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、同上で特定されているストリンジェントな条件下におけるハイブリダイゼーションである。
【００４１】
加えて、ＰＫＮ３およびＲｈｏＣをコードする核酸は、前述の核酸配列のいずれかに相同な配列を含有する核酸配列であり、その際、配列相同性の程度は、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％である。
【００４２】
ヒトＰＫＮ３の相同分子種は、中でも、マウス（Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ）およびラット（Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、シロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）、キイロショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）ならびに出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）という進化的に多様な生物で見出されている。ＰＫＮ３の場合、同一性のパーセントは、前述の多様な種において、それぞれ６７％、５１％、３８％、３６％、６３％および４４％である。ヒトＲｈｏＣの相同分子種は、マウス、ラット、シロイヌナズナ（ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）およびショウジョウバエ（ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）で見出されており、それぞれ１００％、９９％、４７％および８６％の同一性のパーセントを有する。当業者ならば、これらまたは他の相同分子種および相同体のうちのいずれかが、そのような相同体を用いて生成された薬物または診断薬が依然としてヒトＰＫＮ３またはＲｈｏＣまたは任意の他の意図されているＰＫＮ３またはＲｈｏＣと相互作用できるという条件で、原則として本発明の実施に適すると認めるであろう。
【００４３】
ＰＰＲＣ複合体およびその個々のメンバーは、薬物もしくは薬物候補として、または診断薬として使用できる化学化合物がそれに対して作られる標的として使用できる。抗体、ペプチド、アンチカリン、アプタマー、スピーゲルマー、リボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびｓｉＲＮＡならびに有機小分子など、化合物の様々なクラスに属する適した化学化合物が使用できる。それらの化合物は、ＰＰＲＣ複合体（複合体それ自体、その個々のメンバーまたはこれらの組合せ）またはＰＰＲＣ複合体に関する情報を用いることによって、設計、選択、スクリーニング、生成または製造される。
【００４４】
前記クラスの化合物の設計、選択、スクリーニング、生成または製造プロセスにおいて、ＰＰＲＣは、それを必要とする患者へのそれぞれの化合物の最終適用ではなく、むしろその過程で使用される標的としても言及される。様々なクラスの化合物を提供する過程において、ＰＰＲＣ複合体全体、個々のメンバーもしくはその様々な組合せ、またはＰＰＲＣのタンパク質構成物のうちの任意のものまたはすべてをコードする核酸のいずれかを使用できる。「ＰＰＲＣ複合体またはその構成成分」という用語は、本明細書で使用される場合、ＰＰＲＣおよびその構成メンバーの任意の断片または誘導体を含み、それは、薬物として、または診断薬として使用できる前記化合物の設計、選択、スクリーニング、生成または製造を可能にする。
【００４５】
「ＰＰＲＣ複合体またはその構成成分をコードする核酸」という用語は、本明細書で使用される場合、任意の核酸を含むものとし、それは、ＰＰＲＣ複合体の任意の構成成分またはその断片をコードする核酸を含有する。ＰＰＲＣ複合体またはその構成成分をコードする核酸の部分は、それが薬物として、または診断薬として使用できる前記化合物の設計、選択、スクリーニング、生成または製造に適している限り、そのようなものとして考えられる。ＰＰＲＣ複合体またはその構成成分をコードする核酸は、ゲノム核酸、ｈｎＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはこれらそれぞれの部分でありうる。
【００４６】
上記に概説した通り、ＰＰＲＣ複合体の内因性の活性から生じる影響を生み出すか、または抑制するために、本明細書に記載のＰＰＲＣ複合体もしくはその構成成分またはそれらをコードする核酸配列とは別に、他の手段または化合物を使用することもできることが本発明に包含される。そのような手段は、スクリーニング方法で決定または選択できる。そのようなスクリーニング方法において、第１のステップは、１つまたはいくつかのいわゆる候補化合物または試験化合物を提供することである。ここで使用される候補化合物は、本明細書に記載の癌を治療または緩和するかどうかに関する試験系でその適合性が試験される化合物、または癌の診断手段または薬剤として使用されるべき化合物である。
【００４７】
候補化合物が試験系でそれぞれの作用を示す場合、前記候補化合物は、前記疾患および疾患状態の治療に適した手段または薬剤であり、かつ原則として、前記疾患および疾患状態に適した診断薬でもある。第２のステップでは、候補化合物を、ＰＰＲＣ発現系、ＰＰＲＣ遺伝子産物、ＰＰＲＣ活性系またはＰＰＲＣ複合体もしくは構成成分を接触させる。ＰＰＲＣ活性系は、本明細書では、例えば、ＰＰＲＣキナーゼ活性など、ＰＰＲＣ複合体の活性を検出する系とも呼ばれる。一部の実施形態では、ＰＰＲＣ複合体のキナーゼ活性は、例えば、ＧＰＧＲＲＧＲＲＲＴＳＳＦＡＥＧＧ（配列番号１）の配列を有する、診断用のＧＳＫ３α由来断片など、基質のリン酸化を測定することによって評価できる。表１は、本発明の実施に有用な追加のＰＰＲＣキナーゼ基質を示す。
【００４８】
本明細書に記載のＰＰＲＣスクリーニング方法は、非機能性化合物または不活性な化合物をそれ以降の考慮から排除するのにも有用である。したがって、対象または試験系から取得した第１の試料中でＰＰＲＣ活性を測定し、前治療レベルを得、その後、試験化合物を対象または試験系に投与し、試験化合物を投与した後のある時点に対象または試験系から得た第２の試料中でＰＰＲＣ複合体またはその個々の構成成分の活性を測定し、それによって試験レベルのデータを得ることができる。前治療レベル（第１のレベル）を試験レベル（第２のレベル）と比較することができ、前治療レベルと比較して試験レベルの低減を示さないデータは、試験化合物が対象に有効でないことを示し、試験薬をそれ以降の評価または研究から排除できる。反対に、値の変化は、試験化合物がＰＰＲＣ阻害剤としての使用、またはそれ以降の研究に適していることを示しうる。
【００４９】
【表１】
【００５０】
ＰＰＲＣ発現系は、基本的に、ＰＰＲＣ構成成分ポリペプチド（ＲｈｏＣ、ＰＫＮ３およびＰＤＫ１）のうちのいずれか１つまたは複数の発現を示すか、または提示する発現系であり、それによって発現の程度またはレベルが変化しうる。ＰＰＲＣ活性系は、本質的に、それによって活性または活性（例えばキナーゼ活性）の条件が測定される発現系である。
【００５１】
これらの系のいずれでも、候補化合物の影響下におけるＰＰＲＣの活性またはＰＰＲＣをコードする核酸の活性が、候補化合物が存在しない状況と異なるかどうか決定される。特定の系が発現系であるか活性系であるかにかかわらず、それぞれ活性および発現の増大または低減のいずれかが起こり、測定されうることが本発明に包含される。通常、発現系または活性系は、細胞抽出物、または核抽出物など、細胞抽出物の一画分などのｉｎ ｖｉｔｒｏ反応物である。本明細書で使用されるＰＰＲＣ発現系は、細胞、好ましくは本明細書に記載の疾患または本明細書に記載の疾患状態に関与する組織または臓器の細胞であってもよい。
【００５２】
活性系または発現系の増大または低減があるかどうかは、例えば、候補化合物の影響下で発現されるＰＰＲＣ複合体もしくはその構成成分をコードする核酸、より詳細にはｍＲＮＡの量の増大もしくは低減、またはＰＰＲＣ複合体もしくはその構成成分のポリペプチドの増大もしくは低減を測定することによって、発現の各レベルで決定できる。ｍＲＮＡの測定またはポリペプチドの測定など、そのような測定、より詳細にはこれらの種類の変化の定量的測定に必要な技法は当業者に知られている。例えば、適切な抗体を用いた検出によって、ＰＰＲＣ複合体のポリペプチドの量または含量を決定する方法も、当業者に知られている。抗体は、当業者に知られている通り、および例えば、Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．およびＬａｎｅ，Ｄ．、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、（１９８８）に記載の通り作製できる。適した抗体は、他のよく知られている方法によって、例えば抗体ライブラリーからのファージディスプレイ選択によっても作製できる。
【００５３】
ＰＰＲＣ複合体系の場合、ＰＰＲＣ複合体の活性の増大または低減を、好ましくは機能アッセイで決定できる。
【００５４】
候補化合物と、発現系および活性系それぞれとの接触は、通常、本明細書では通常、試験系と呼ばれるそれぞれの反応系に候補化合物の水溶液を添加することによって行われる。水溶液（緩衝化されているものでありうる）に加えて、有機溶媒中または有機溶媒と水性溶媒との混合物中における候補化合物の懸濁液または溶液も使用できる。
【００５５】
一部の実施形態では、発現系および活性系を用いた各実行において、単一の候補化合物のみが使用される。しかし、当技術分野で知られている方法を用いたハイスループット系で、この種類の試験のいくつかを平行して行うことも本発明に包含される。
【００５６】
本発明による方法のさらなるステップは、候補化合物の影響下において、ＰＰＲＣ複合体またはそれをコードする核酸に関して、発現系および活性系のそれぞれ発現または活性が変化しているかどうか決定するものである。これは通常、候補（試験）化合物を添加した際の系の反応を、候補化合物を添加しないものと比較することによって行われる。代替として、これは、候補化合物を添加した際の系の反応を、候補化合物を添加した際の非機能性のＰＰＲＣ構成成分を含有する系、例えば、キナーゼデッドＰＫＮ３を含有する系の反応と比較することによって行うこともできる。一部の実施形態では、候補化合物は化合物ライブラリーのメンバーである。
【００５７】
通常、化合物のいかなるライブラリーも、化合物のクラスにかかわらず、本発明の目的に適している。適した化合物ライブラリーは、とりわけ、小分子、ペプチド、タンパク質、抗体または機能性核酸で構成されたライブラリーである。後者の化合物は、当業者に知られている通りに生成できる。
【００５８】
ＰＰＲＣ複合体全体、またはその任意の構成成分もしくは構成成分の組合せ、またはそれらの断片に特異的な抗体の製造は当業者に知られている。本発明の抗体には、ナノボディー、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体（例えば、ヒト化抗体）および抗イディオタイプ抗体が含まれる。ポリクローナル抗体は、抗原によって免疫化された動物の血清から得られる抗体分子の不均一な集団である。モノクローナル抗体は、抗原に特異的に結合する抗体の実質的に均一な集団である。一般的に、抗体は、例えば、伝統的なハイブリドーマ技法（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）、Ｎａｔｕｒｅ、２５６、４９５〜４９９頁）、組換えＤＮＡ法（米国特許第４，８１６，５６７号）、または抗体ライブラリーを用いたファージディスプレイ（Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９１）、Ｎａｔｕｒｅ、３５２、６２４〜６２８頁；Ｍａｒｋｓら（１９９１）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２、５８１〜５９７頁）を用いて作製できる。追加の抗体産生技術については、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編集、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８を参照のこと。本発明は、抗体のいかなる特定の供給源、生産様式または他の特別な特徴にも限定されない。
【００５９】
「抗体」という用語には、完全な分子も、Ｆａｂ、単鎖Ｆｖ抗体（ＳｃＦｖ）および小モジュール免疫薬剤（ＳＭＩＰ）など、抗原に結合できる断片も含まれるものとする。Ｆａｂ断片は完全な抗体のＦｃ断片を欠失しており、より迅速に循環系から除去され、完全な抗体より少ない非特異的な組織結合を有しうる（Ｗａｈｌら、１９８３、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２４、３１６〜３２５頁）。キメラ抗体は、例えば、マウスのモノクローナル抗体に由来する可変領域（ＶＨ、ＶＬ）と、ヒト免疫グロブリン定常領域（ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３、ＣＬ）とを有するものなど、その異なった部分が異なった動物種に由来する分子である。キメラ抗体およびそれらを産生する方法は当技術分野で知られている（Ｃａｂｉｌｌｙら、１９８４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１、３２７３〜３２７７頁；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９８４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１、６８５１〜６８５５頁；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅら、１９８４、Ｎａｔｕｒｅ ３１２、６４３〜６４６頁；Ｃａｂｉｌｌｙら、欧州特許出願第１２５０２３号（１９８４年１１月１４日公開）；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら、欧州特許出願第１７１４９６号（１９８５年２月１９日公開）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、欧州特許出願第１７３４９４号（１９８６年３月５日公開）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、ＰＣＴ出願第ＷＯ８６／０１５３３号（１９８６年３月１６日公開）；Ｋｕｄｏら、欧州特許出願第１８４１８７号（１９８６年６月１１日公開）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、欧州特許出願第１７３４９４号（１９８６年３月５日公開）；Ｓａｈａｇａｎら、１９８６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７、１０６６〜１０７４頁；Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９（１９８７年５月７日公開）；Ｌｉｕら、１９８７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４、３４３９〜３４４３頁；Ｓｕｎら、１９８７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４、２１４〜２１８頁；Ｂｅｔｔｅｒら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０、１０４１〜１０４３頁）。ＳＭＩＰは、１つの結合ドメイン、１つのヒンジドメインおよび１つのエフェクタードメインを含む単鎖ポリペプチドである。ＳＭＩＰならびにそれらの使用および適用は、例えば、米国特許出願公開第２００３／０１１８５９２号、第２００３／０１３３９３９号、第２００４／００５８４４５号、第２００５／０１３６０４９号、第２００５／０１７５６１４号、第２００５／０１８０９７０号、第２００５／０１８６２１６号、第２００５／０２０２０１２号、第２００５／０２０２０２３号、第２００５／０２０２０２８号、第２００５／０２０２５３４号および第２００５／０２３８６４６号ならびにこれらの関連特許ファミリーメンバーに開示されている。これらの開示をすべて、参照により全体として本明細書に組み込む。
【００６０】
本発明に従って使用できる抗体は、１つまたはいくつかのマーカーまたは標識を有しうる。そのようなマーカーまたは標識は、その診断適用またはその治療適用のいずれかで抗体を検出するのに有用でありうる。マーカーおよび標識は、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、金およびフルオレセインを含む群から選択され、例えば、ＥＬＩＳＡ法で使用されることが好ましい。これらおよびさらに他のマーカーならびに方法は、例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、同上に記載されている。
【００６１】
一実施形態では、ＰＰＲＣ抗体は、ＰＫＮ３の活性化状態特異的な抗体を含み、それは、ＰＫＮ３のターンモチーフ（配列番号２４：８４７−ＹＦＥＧＥＦＴＧＬＰＰＡＬＴＰＰＡＰＨＳＬＬＴＡＲＱＱＡ−８７４）中の位置８６０（四角内）のリン酸化スレオニンを認識する。前記抗体は、とりわけ、増大したＰＫＮ３発現および活性化のプローブならびに患者層別および治療反応の生物マーカーとして有用である。
【００６２】
ＰＰＲＣを破壊するさらに別のクラスの薬物、化合物、ならびにＰＰＲＣ複合体もしくは構成成分およびそれらの断片、または前記ＰＰＲＣ複合体もしくは構成成分およびそれらの断片をコードする核酸を使用して生成できる診断薬は、それらに結合するペプチドである。そのようなペプチドは、ファージディスプレイなどの最新技術による方法を用いて生成できる。基本的に、ペプチドのライブラリーをファージ表面に生成および提示し、提示されたライブラリーを標的、この場合、例えば、ＰＰＲＣ複合体またはその構成成分と接触させる。それに続いて、標的に結合するペプチドを、好ましくは標的分子との複合体として、それぞれの反応から除去する。結合特性は、少なくともある程度、塩濃度など、特定の実験設定に依存することが当業者に知られている。より高い親和性、またはより大きな力で標的分子に結合するペプチドを、ライブラリーの非結合メンバーから分離した後、そして標的分子とペプチドとの複合体から任意選択で標的分子も除去した後に、それぞれの（１つまたは複数の）ペプチドを特徴分析することができる。
【００６３】
特性分析ステップの前に、例えばペプチドコーディングしたファージを増殖させるなどによって、増幅ステップを行ってもよい。一部の実施形態では、特性分析は、標的結合ペプチドの配列決定を含む。基本的に、ペプチドはそれらの長さで限定されないが、通常、約８〜２０アミノ酸の長さを有するペプチドがそれぞれの方法で得られる。ライブラリーのサイズは、約１０２〜１０１８、または１０８〜１０１５の異なったペプチドのものでありうるが、ライブラリーのサイズはこれらに限定されない。
【００６４】
本発明によれば、ＰＰＲＣ複合体またはその構成成分、および前記ＰＰＲＣ複合体またはその構成成分をコードする核酸は、侵襲癌を治療するための薬物の製造または開発、ならびに前記侵襲癌を診断するための手段の製造または開発の標的として、スクリーニング工程で使用でき、それによって、スクリーニング工程で、小分子または小分子のライブラリーが使用される。このスクリーニングは、標的ＰＰＲＣ複合体またはその構成成分（標的）を単一の小分子または様々な小分子（ライブラリーなど）、好ましくは上記に特定したライブラリーからのものと同時に、または順次に接触させるステップと、標的に結合し、かつＰＰＲＣ複合体の機能または完全性を破壊し、他の小分子と共にスクリーニングされる場合には、非結合または非相互作用小分子から分離されうる小分子、またはライブラリーのメンバーを同定するステップとを含む。
【００６５】
結合および非結合は、特定の実験設定によって強く影響されうる。反応パラメータのストリンジェンシーを変更することで、結合および非結合の程度を変えることが可能であり、これによって、このスクリーニング工程の微調整が可能となる。一部の実施形態では、標的と特異的に相互作用する１つまたはいくつかの小分子を同定した後に、この小分子をさらに特徴分析することができる。この追加の特徴分析は、例えば、小分子の同定、ならびにその分子構造およびさらなる物理的、化学的、生物学的または医学的の特性の決定でありうる。一部の実施形態では、天然化合物は約１００〜１０００Ｄａの分子量を有する。一部の実施形態では、小分子は、当業者に知られている、リピンスキーのルールオブファイブ（Ｌｅｐｉｎｓｋｉ’ｓ Ｒｕｌｅ ｏｆ Ｆｉｖｅ）に従うものである（Ｌｉｐｉｎｓｋｉら、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ．Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．、２３、３〜２５頁、１９９７を参照）。代替として、小分子は、それらが、天然物とは対照的に、コンビナトリアル化学で生じる合成小分子となるように定義してもよい。しかし、これらの定義は、当技術分野におけるそれぞれの用語の一般的な理解の補助でしかないことを理解するべきである。すべてのキナーゼと同様に、ＰＰＲＣ複合体のＰＫＮ３およびＰＤＫ１構成成分は、ＡＴＰ結合部位を含有しており、そのような部位に結合することが知られている薬物は、それゆえ、ＰＰＲＣ機能を阻害するのに適した候補化合物である。適した化合物の例には、ＬＹ−２７６３２、Ｒｏ−３ １−８２２０およびＨＡ１０７７が含まれるが、これらに限定されない。これらはすべて、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）から入手可能である。
【００６６】
以下の実施例によって、本発明をさらに例示するが、これは本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００６７】
コンストラクトおよびタンパク質
Ｆｌａｇ−ＰＫＮ３タンパク質：ヒトＰＫＮ３の完全長ｃＤＮＡ（例えば、配列番号２５および配列番号２６）をＰＣＲによって増幅し、ｐｃＤＮＡ３発現ベクター（配列番号２７）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローニングした。５’プライマーは、ＡＴＧコドンおよびそれに続くＦｌａｇエピトープ（配列番号２８）を、増幅されたコード領域とインフレームで含有していた。このＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ制限酵素によって消化し、同一の酵素部位を介してｐｃＤＮＡ３発現ベクターと連結し、Ｎ末端Ｆｌａｇエピトープタグ付きのＰＫＮ３を得た。Ｋ５８８Ｒ置換を含む、ＰＫＮ３のキナーゼデッドバージョンも、同じ戦略を用いて同じベクターにクローニングした。
【００６８】
Ｍｙｃ−Ｒｈｏタンパク質：ヒトＲａｃ１（例えば、配列番号２９および３０）、ＲｈｏＡ（例えば、配列番号３１および３２）、ＲｈｏＢ（例えば、配列番号３２および３３）およびＲｈｏＣ（例えば、配列番号３５および３６）の完全長ｃＤＮＡをｐＣＧ哺乳動物発現ベクター（ＴａｎａｋａおよびＨｅｒｒ（１９９０）、Ｃｅｌｌ、６０（３）、３７５〜３８６頁）にクローニングした。５’プライマーは、ＡＴＧコドンおよびそれに続くＭｙｃエピトープ（配列番号３７）を、増幅されたコード領域とインフレームで含有していた。このＰＣＲ産物をＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素によって消化し、同じ酵素部位を介して発現ベクターｐＣＧに連結し、Ｎ末端Ｍｙｃエピトープタグ付きのＲｈｏＡ、ＲｈｏＢおよびＲｈｏＣを得た。
【実施例２】
【００６９】
抗体および細胞溶解物
抗体：ｐ１１０抗体は、Ｋｌｉｐｐｅｌら（１９９４）、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１４（４）、２６７５〜８５頁に記載されている。ＰＫＮ抗体は、Ｌｅｅｎｄｅｒｓ、２００４に記載されている。ＰＤＫ１抗体は、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）から市販されている。抗リン酸化ＰＫＮ３ Ｔ８６０ウサギモノクローナル抗体は、標準的手順で産生させた（Ｓｐｉｅｋｅｒ−Ｐｏｌｅｔ、１９９５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２、９３４８〜９３５２頁参照）。Ｍｙｃエピトープに対する抗体は、９Ｅ１０ Ｍｙｃモノクローナル抗体であった。それらは、市販されており、かつＥｖａｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、５、３６１０〜６頁（１９８５）に記載されている。
【００７０】
細胞溶解物：細胞を冷リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、１５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）グリセロール、１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ノニデットＰ−４０（ＮＰ−４０）、２ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル、１ｍｌあたり１０ｍｇのアプロチニン、２０ｍＭロイペプチン、２ｍＭベンズアミジン、１ｍＭバナジウム酸ナトリウム、２５ｍＭ β−グリセロールリン酸、５０ｍＭ ＮａＦおよび１０ｍＭ Ｎａ−ピロリン酸を含有する溶解緩衝液中で４℃で溶解させた。溶解物を１４，０００×ｇで５分間、遠心処理することによって清澄化し、溶解物のアリコートをタンパク質発現および酵素活性に関して分析した（下記参照）。ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって試料を分離し、ニトロセルロースフィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ）に転写させた。５％（ｗｔ／ｖｏｌ）ドライミルクを含有するＴＢＳＴ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．５］、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％［ｖｏｌ／ｖｏｌ］トゥイーン２０、０．５％［ｗｔ／ｖｏｌ］アジ化ナトリウム）でフィルターをブロッキングした。各抗体を適切な希釈率でＴＢＳＴ中に添加した。結合抗体を、ＴＢＳＴ中の抗マウス、抗ヤギまたは抗ウサギ結合アルカリ性ホスファターゼ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で検出し、洗浄し、ニトロブルーテトラゾリウムおよび５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸（Ｐｒｏｍｅｇａ）で発色させた。代替として、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合二次抗体を使用し、増強化学ルミネセンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で発色させた。
【実施例３】
【００７１】
癌細胞におけるＰＫＮ３の発現プロファイル
ＰＫＮ３またはリン酸−ＰＫＮ３（「Ｐ＊−ＰＫＮ３」）発現の増大は、腫瘍転移の増大に関連することが知られている（Ｌｅｅｎｄｅｒｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．、２６１、８０８〜８１４頁）。悪性能および薬剤抵抗性のモデルでＰＫＮ３およびＰ＊−ＰＫＮ３の発現を調べた。
【００７２】
最も侵襲性が低いものから、最も侵襲性が高いものまで、すなわちＭＣＦ−１０Ａ、ＭＣＦ７、ＭＤＡ３６１、ＭＣＦ４６８、ＢＴ５４９およびＭＤＡ２３１を含めた、侵襲性の高くなる乳癌細胞系をＰＫＮ３およびＰ＊−ＰＫＮ３発現に関して調べた。図１は、ｐ１１０αＰＩ３Ｋ、総ＰＫＮ３およびリン酸−ＰＫＮ３（Ｐ＊−ＰＫＮ３ Ｔ８６０）に関してプロービングされた、それらの細胞からの抽出物のウェスタンブロットを示す。結果は、ＰＫＮ３およびＰ＊−ＰＫＮ Ｔ８６０が、より大きな悪性能を有する癌細胞内で、より小さな悪性能を有するものより大きな程度まで発現されていることを確認する。
【００７３】
最も耐性の低いものから、最も耐性の高いものまでを含めた、抗癌剤ゲフィチニブ（別名ＩＲＥＳＳＡ；４−（３−クロロ−４−フルオロアニリノ）−７−メトキシ−６−（３−モルフォリノ−プロポキシ）−キナゾリン）に対する様々な耐性の非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）細胞系、すなわちＨ１６５０、Ｈ１９７５、Ａ５４９、ＰＣ１４、Ｈ１５７およびＨ４６０細胞をＰＫＮ３およびＰ＊−ＰＫＮ３発現に関して調べた（Ｎｏｒｏら（２００６）、ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ、６、２７７〜２８９頁参照）。図２は、（ａ）ｐ１１０αＰＩ３Ｋ、（ｂ）総ＰＫＮ３および（ｃ）Ｐ＊−ＰＫＮ３ Ｔ７１８に関してプロービングされた、それらの細胞からの抽出物のウェスタンブロットを示す。結果は、ＰＫＮ３およびＰ＊−ＰＫＮ Ｔ８６０が、抗癌剤に対してより大きな耐性を有する癌細胞内で、抗癌剤に対してより大きな感受性を有するものより大きい程度まで発現されていることを確認する。
【実施例４】
【００７４】
内因性ＰＫＮ３とのＰＰＲＣ複合体形成
Ｍｙｃタグ付きの小分子ＧＴＰアーゼＲａｃ１、ＲｈｏＡ、ＲｈｏＢまたはＲｈｏＣで形質移入された細胞を用いた免疫沈降実験は、ＲｈｏＣがリン酸化ＰＫＮ３に選択的に結合することを明らかにした（図３Ｂ）。ＨｅＬａ細胞（５×１０５細胞／１０ｃｍ組織培養皿）には、ＦＵＧＥＮＥ（登録商標）形質移入試薬（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）によって、示されているプラスミドを用いて単独で形質移入した。免疫沈降は、プロテインＧセファロースと結合した、Ｍｙｃに対する９Ｅ１０抗体を用いて行った。免疫複合体を溶解緩衝液で３回洗浄した。結合タンパク質は、抗Ｐ＊−ＰＫＮ３ Ｔ８６０抗体を用いたウェスタンブロットによって分析した。
【００７５】
この実験は、内因性Ｐ＊−ＰＫＮ３が小分子ＧＴＰアーゼＲｈｏＣと選択的に会合することを明らかにしている。
【実施例５】
【００７６】
異種ＰＫＮ３とのＰＰＲＣ複合体形成
Ｆｌａｇタグ付きのＰＫＮ３、ならびにＭｙｃタグ付きの小分子ＧＴＰアーゼＲｈｏＡ、ＲｈｏＢまたはＲｈｏＣで形質移入されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いた免疫沈降実験は、ＰＫＮ３がホスホイノシチド依存性キナーゼ１（ＰＤＫ１）およびＲｈｏＣに結合することを明らかにした。図４Ｂは、キナーゼ活性型のＰＫＮ３がＲｈｏＣおよびＰＤＫ１に選択的に結合することを示している。したがって、ＰＫＮ３、ＲｈｏＣおよびＰＤＫ１は三重複合体（「ＰＰＲＣ複合体」）を形成する。
【００７７】
Ｆｌａｇ（図４Ｂ）との免疫沈降には、ＦＵＧＥＮＥ（登録商標）形質移入試薬によって、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（５×１０５細胞／１０ｃｍ組織培養皿）に、示されているプラスミド（Ｆｌａｇ−ＰＫＮ３ｗｔ［完全長キナーゼ活性］、Ｆｌａｇ−ＰＫＮ３ｋｄ［キナーゼデッドＰＫＮ３］、Ｍｙｃ−ＲｈｏＡ、Ｍｙｃ−ＲｈｏＢまたはＭｙｃ−ＲｈｏＣ）を用いて単独で形質移入または同時形質移入した。５％ＣＯ２インキュベーター内、３７℃で、６時間のインキュベーションの後に、細胞を無血清ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）で２回洗浄し、新たな培地（ＤＭＥＭ、１０％ウシ胎児血清）を細胞に添加して、さらに４８時間インキュベートした。細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、０．５ｍｌの溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．５］、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ β−グリセロールリン酸、１０％グリセロール、１％トリトンＸ−１００、１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、１ｍＭ ＮａＦおよびプロテアーゼ阻害剤［Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ］）中、氷上で３０分間溶解させた。細胞溶解液を１４，０００ｒｐｍで３０分間遠心処理し、遠心された溶解液からの上清を、抗Ｆｌａｇ Ｍ２アフィニティー樹脂（Ｓｉｇｍａ）と共に４℃で終夜インキュベートした。その後、ビーズを３回ＴＢＳ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．５］、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で洗浄し、１０％グリセロール、１ｍＭ ＤＴＴおよび２００μｇのＦｌａｇペプチド（Ｓｉｇｍａ）／ｍｌを含有するＴＢＳ緩衝液で、結合タンパク質を溶出させた。結合産物は、ウェスタンブロット分析によって可視化させた（図４）。
【実施例６】
【００７８】
ＰＰＲＣ複合体のキナーゼ活性
ＰＰＲＣ複合体の酵素活性を、（ｉ）ＰＰＲＣ複合体のＰＫＮ３構成成分のリン酸化状態、および（ｉｉ）基質、すなわち、ＧＰＧＲＲＧＲＲＲＴＳＳＦＡＥＧＧ（配列番号１）の配列を有する、ＧＳＫ３α由来の断片に対するＰＰＲＣのキナーゼ活性を評価することによって調べた。
【００７９】
Ｆｌａｇタグ付きのＰＫＮ３、およびＭｙｃタグ付きの小分子ＧＴＰアーゼＲｈｏＡ、ＲｈｏＢまたはＲｈｏＣで形質移入されたＰＣ３細胞を用いた免疫沈降実験は、ＰＫＮ３がホスホイノシチド依存性キナーゼ１（ＰＤＫ１）およびＲｈｏＣに結合することを明らかにした。図５Ｂは、キナーゼ活性は、ＰＰＲＣ複合体で最も大きく、ＰＫＮ３単独またはＰＫＮ３とＲｈｏＣとを併せたものより大きいことを示している。
【００８０】
Ｆｌａｇ免疫沈降およびそれに続くキナーゼアッセイには、上述の通り、ＦＵＧＥＮＥ（登録商標）形質移入試薬によって、ＰＣ３細胞（５×１０５細胞／１０ｃｍ組織培養皿）に、示されているプラスミドを用いて単独で形質移入または同時形質移入した。細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、０．３％トリトンＸ−１００を含有する洗浄用緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１μＭオカダ酸、１０ｍＭグリセロールリン酸、２５ｍＭフッ化ナトリウム、５ｍＭピロリン酸ナトリウム、０．２ｍＭ ＰＭＳＦおよび２ｍＭ ＤＴＴ）中で溶解させた。免疫沈降は、抗Ｆｌａｇ Ｍ２アフィニティー樹脂（Ｓｉｇｍａ）を用いて行った。０．５Ｍ ＮａＣｌを含有する上記緩衝液で免疫複合体を３回、β−グリセロールリン酸および１０ｍＭピロリン酸ナトリウムを含有するキナーゼ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび１ｍＭオカダ酸）で２回洗浄した。最後に、複合体をキナーゼ緩衝液中に懸濁し、５０μＭ ＡＴＰおよびＰＫＮ３基質と共に、ＲＴで１５分間インキュベートした。リン酸化タンパク質は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分離し、ウェスタンブロッティングによって可視化した。
【実施例７】
【００８１】
ｉｎ ｖｉｖｏ前立腺癌モデル
ＰＫＮ３およびｐ１１０βを標的とするｓｈＲＮＡを発現するように、ＰＣ−３（前立腺癌）細胞を操作した。ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）誘導のｓｈＲＮＡ発現は、７２時間後に、ＰＫＮ３およびｐ１１０βのタンパク質レベルの効率的なノックダウンをもたらした（図６Ａ）。ＰＫＮ３およびｐ１１０βの両方の阻害は、上皮間葉転換（ＥＭＴ）のよく知られたマーカーであるビメンチンタンパク質レベルの低減をもたらした（図６Ａ）。それぞれの細胞集団はＭＡＴＲＩＧＥＬ上に播種され、ＰＫＮ３発現のｓｈＲＮＡ媒介のノックダウンを有する細胞は、細胞外マトリックス上での増殖障害を示した。ｐ１１０βはＰＣ−３細胞内における主要なＰＩ３Ｋサブユニットであるので、ｐ１１０βの阻害は、ＰＣ−３細胞のＭＡＴＲＩＧＥＬ上での増殖も妨げ、陽性対照として働いた（図６Ｂ）。
【００８２】
次に、安定的なＰＫＮ３ ｓｈＲＮＡ ＰＣ−３細胞をヌードマウスに前立腺内移植した。動物を２つの群に分け、１群をＤｏｘで処置して、ｓｈＲＮＡ発現を誘導し、第２の群にはニセの処置を行った。４９日後にマウスを屠殺し、原発腫瘍形成およびリンパ節転移について分析した。Ｄｏｘ処置群のマウスは、原発腫瘍の成長への強い影響を示し、転移形成も強く阻害された（図７Ａ）。
【００８３】
確立された前立腺腫瘍でもＰＫＮ３を検証した。この実験では、すべての動物を通常食で４週間維持し、ＰＫＮ３がＤｏｘ食餌によってサイレンシングされる前に、細胞が原発腫瘍を形成するのを可能にした。４週間の通常食の後、ＰＫＮ３の阻害は、確立された腫瘍モデルにおける腫瘍成長および転移を妨げた（図７Ｂ）。
【実施例８】
【００８４】
ｉｎ ｖｉｖｏ乳癌モデル
ＰＫＮ３、ｐ１１０βおよびＣＫＩεを標的とするｓｈＲＮＡを発現するように、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（乳癌）細胞を操作した。Ｄｏｘ誘導のｓｈＲＮＡ発現は、７２時間後に、ＰＫＮ３、ｐ１１０βおよびＣＫＩεタンパク質レベルの効率的なノックダウンをもたらした（図８Ａ）。それぞれの細胞集団は、ＭＡＴＲＩＧＥＬ上に播種され、ＰＫＮ３発現のｓｈＲＮＡ媒介のノックダウンを有する細胞は、細胞外マトリックス上での増殖障害を示し、これは、ｐ１１０βのノックダウンより強いようであった。したがって、ＣＫＩεの誘導阻害は、この実験ではＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞で効果がなく、Ｄｏｘ処置およびｓｈＲＮＡ誘導の対照として働いた（図８Ｂ）。
【００８５】
乳癌におけるＰＫＮ３のｉｎ ｖｉｖｏ検証を行うために、同じ操作細胞系を用いて、正所性乳癌モデルを作製した。安定的なＰＫＮ３ ｓｈＲＮＡ ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞をＤｏｘの非存在下で培養し、動物の乳房脂肪パッドに注入した。動物を２つの群に分け、１群はＤｏｘで処置して、ｓｈＲＮＡ発現を誘導し、第２の群にはニセの処置を行った。腫瘍サイズを５５日目まで毎週測定した。図９に示す通り、Ｄｏｘ処置群のマウスは、乳癌成長への強い影響を示した。
【符号の説明】
【００８６】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗癌活性について化合物をスクリーニングし、侵襲癌を有する患者を診断するための、プロテインキナーゼＮ３（ＰＫＮ３）およびＲｈｏＣの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
有効な癌治療の開発は、この疾患の根底にある分子機序の解明、および新薬の開発に有用でありうるそれらの機序の中にある標的分子の同定をますます利用している。そのような標的分子が利用可能となった後、それらの標的に対する薬物候補化合物を試験することができる。多くの場合、そのような薬物候補は、合成もしくは天然化合物からなりうる化合物ライブラリーのメンバーである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】米国特許出願第２００４０１０６５６９号
【特許文献２】米国特許第４，８１６，５６７号
【特許文献３】欧州特許出願第１２５０２３号
【特許文献４】欧州特許出願第１７１４９６号
【特許文献５】欧州特許出願第１７３４９４号
【特許文献６】ＰＣＴ出願第ＷＯ８６／０１５３３号
【特許文献７】欧州特許出願第１８４１８７号
【特許文献８】ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９
【特許文献９】米国特許出願公開第２００３／０１１８５９２号
【特許文献１０】米国特許出願公開第２００３／０１３３９３９号
【特許文献１１】米国特許出願公開第２００４／００５８４４５号
【特許文献１２】米国特許出願公開第２００５／０１３６０４９号
【特許文献１３】米国特許出願公開第２００５／０１７５６１４号
【特許文献１４】米国特許出願公開第２００５／０１８０９７０号
【特許文献１５】米国特許出願公開第２００５／０１８６２１６号
【特許文献１６】米国特許出願公開第２００５／０２０２０１２号
【特許文献１７】米国特許出願公開第２００５／０２０２０２３号
【特許文献１８】米国特許出願公開第２００５／０２０２０２８号
【特許文献１９】米国特許出願公開第２００５／０２０２５３４号
【特許文献２０】米国特許出願公開第２００５／０２３８６４６号
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｍｕｋａｉ，Ｈ．、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ １３３、１７〜２７頁、２００３
【非特許文献２】Ｄｅｎｔら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １３：４４２９〜４４３４頁、２００７年８月１日
【非特許文献３】Ｓｔｅｉｎ，Ｒ．Ｃ．およびＷａｔｅｒｆｉｅｌｄ，Ｍ．Ｄ．Ｍｏｌ Ｍｅｄ Ｔｏｄａｙ ６、３４７〜３５７頁、２０００
【非特許文献４】Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９８９）、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
【非特許文献５】Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．およびＬａｎｅ，Ｄ．、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、（１９８８）
【非特許文献６】ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）、Ｎａｔｕｒｅ、２５６、４９５〜４９９頁
【非特許文献７】Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９１）、Ｎａｔｕｒｅ、３５２、６２４〜６２８頁
【非特許文献８】Ｍａｒｋｓら（１９９１）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２、５８１〜５９７頁
【非特許文献９】Ｗａｈｌら、１９８３、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２４、３１６〜３２５頁
【非特許文献１０】Ｃａｂｉｌｌｙら、１９８４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１、３２７３〜３２７７頁
【非特許文献１１】Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９８４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１、６８５１〜６８５５頁
【非特許文献１２】Ｂｏｕｌｉａｎｎｅら、１９８４、Ｎａｔｕｒｅ ３１２、６４３〜６４６頁
【非特許文献１３】Ｓａｈａｇａｎら、１９８６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７、１０６６〜１０７４頁
【非特許文献１４】Ｌｉｕら、１９８７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４、３４３９〜３４４３頁
【非特許文献１５】Ｓｕｎら、１９８７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４、２１４〜２１８頁
【非特許文献１６】Ｂｅｔｔｅｒら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０、１０４１〜１０４３頁
【非特許文献１７】Ｌｉｐｉｎｓｋｉら、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ．Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．、２３、３〜２５頁、１９９７
【非特許文献１８】ＴａｎａｋａおよびＨｅｒｒ（１９９０）、Ｃｅｌｌ、６０（３）、３７５〜３８６頁
【非特許文献１９】Ｋｌｉｐｐｅｌら（１９９４）、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１４（４）、２６７５〜８５頁
【非特許文献２０】Ｓｐｉｅｋｅｒ−Ｐｏｌｅｔ、１９９５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２、９３４８〜９３５２頁
【非特許文献２１】Ｅｖａｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、５、３６１０〜６頁（１９８５）
【非特許文献２２】Ｌｅｅｎｄｅｒｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．、２６１、８０８〜８１４頁
【非特許文献２３】Ｎｏｒｏら（２００６）、ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ、６、２７７〜２８９頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
新規な治療用化合物およびレジメンの同定および検証が可能となるように、特に侵襲性の形態の癌に関連する新規な分子標的を同定することの大きな必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
第１の態様では、本発明は、癌の治療に有用な化合物を同定する方法を提供する。この方法のステップは、試験化合物を、プロテインキナーゼＮ３（ＰＫＮ３）ポリペプチド（またはその断片）、ＲｈｏＣポリペプチド（またはその断片）およびホスホイノシチド依存性キナーゼ１（ＰＤＫ１）ポリペプチド（またはその断片）と混合するステップと、形成された、ＰＫＮ３およびＲｈｏＣを含有する複合体（「複合体」）の量を次に決定するステップとを含む。これをこの複合体の「試験レベル」と呼ぶ。次に試験レベルを参照値と比較する。試験レベルと参照値との任意の相違は、その試験化合物が潜在的に癌治療活性を有することを示す。一部の実施形態では、試験化合物と混合する前に、ＰＫＮ３、ＲｈｏＣおよびＰＤＫ１ポリペプチド（またはそれらの断片）を、ある程度まで精製する。
【０００７】
一部の実施形態では、構成成分（構成成分はＰＫＮ３、ＲｈｏＣおよびＰＤＫ１、またはこれらそれぞれの断片である）のうちの１つまたは複数が、その構成成分を同定し、かつその構成成分およびそれに付着している任意の他の構成成分の単離を補助するのに使用される分子タグを含有する。分子タグは当技術分野で一般的に知られている。例には、ポリヒスチジン、ＧＳＴおよびＦＬＡＧが含まれる。一部の実施形態では、ＰＫＮ３ポリペプチドが分子タグを含み、かつ複合体が、ＰＫＮ３ポリペプチドをその分子タグによりプルダウンすることによって単離される。
【０００８】
一部の実施形態では、参照値は、試験化合物の非存在下で形成される複合体のレベルである。他の実施形態では、参照値は、試験化合物がＰＫＮ３、ＲｈｏＣおよびＰＤＫ１（またはこれらそれぞれの断片）と混合される場合に形成される複合体のレベルであり、キナーゼのいずれか一方または両方がキナーゼデッドである。
【０００９】
一部の実施形態では、試験レベルが参照値より大きい。一部の実施形態では、試験化合物は、癌細胞の浸潤性を低減させるか、または腫瘍の成長速度を低減させる化合物である。
【００１０】
第２の態様では、本発明は、癌の治療で有用な化合物を同定する細胞ベースの方法を提供する。この方法のステップは、細胞を試験化合物と接触させるステップと、試験化合物の存在下で、細胞内で形成される複合体の量（試験レベル）を決定するステップとを含む。細胞が、ＰＫＮ３ポリペプチド（またはその断片）、ＲｈｏＣポリペプチド（またはその断片）およびホスホイノシチド依存性キナーゼ１（ＰＤＫ１）ポリペプチドを含有し、かつ複合体も、それらの構成成分のそれぞれを含有する。次に試験レベルを参照値と比較する。試験レベルと参照値との任意の相違は、その試験化合物が潜在的に癌治療活性を有することを示す。
【００１１】
一部の実施形態では、細胞が、例えば、長期造血幹細胞（ＬＴ−ＨＳＣ）などの幹細胞である。他の実施形態では、細胞が腫瘍由来の培養細胞である。一部の実施形態では、細胞が高い転移能力を有する。一部の実施形態では、細胞が、例えば、ＰＣ３細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞、ＭＣＦ７細胞、ＭＤＡ３６１細胞、ＭＣＦ４６８細胞、ＢＴ５４９細胞およびＨｅＬａ細胞のうちの１つである。他の実施形態では、細胞が、構成成分の１つもしくは複数またはすべてを異種組換えポリペプチドとして含有する。
【００１２】
一部の実施形態では、構成成分（構成成分はＰＫＮ３、ＲｈｏＣおよびＰＤＫ１、またはこれらの断片）の１つまたは複数が細胞にとって内因性である。一部の実施形態では、構成成分のうちの１つまたは複数が組換え体であり、その構成成分を同定し、かつその構成成分およびそれに付着している任意の他の構成成分の単離を補助するのに使用される分子タグを含有する。分子タグは当技術分野で一般的に知られている。例には、ポリヒスチジン、ＧＳＴおよびＦＬＡＧが含まれる。一部の実施形態では、ＰＫＮ３ポリペプチドが分子タグを含み、かつ複合体が、ＰＫＮ３ポリペプチドをその分子タグによりプルダウンすることによって単離される。
【００１３】
一部の実施形態では、参照値は、試験化合物の非存在下で形成される複合体のレベルである。他の実施形態では、参照値は、試験化合物がＰＫＮ３，ＲｈｏＣおよびＰＤＫ１（またはこれらの断片）と混合される場合に形成される複合体のレベルであり、キナーゼのいずれか一方または両方がキナーゼデッドである。
【００１４】
一部の実施形態では、試験レベルが参照値より大きい。一部の実施形態では、試験化合物は、癌細胞の浸潤性を低減させるか、または原発性腫瘍の成長速度を低減させる化合物である。
【００１５】
第３の態様では、本発明は、患者のＰＫＮ３活性およびＲｈｏＣ活性のレベルを評価することによって、患者の癌を診断する方法を提供する。この方法によれば、患者から試料を取得し、次に試料中のＰＫＮ３活性およびＲｈｏＣ活性のレベル（これは試験レベルである）を決定し、次に試験レベルを参照値と比較する。試験レベルと参照値との相違が、侵襲性である癌を患者が有することを示す。
【００１６】
第４の態様では、本発明は、患者のＰＫＮ３活性およびＲｈｏＣ活性のレベルを評価することによって、癌治療に応答できる患者を同定する方法を提供する。この方法によれば、患者から試料を取得し、次に試料中のＰＫＮ３活性およびＲｈｏＣ活性のレベル（これは試験レベルである）を決定し、次に試験レベルを参照値と比較する。試験レベルと参照値との相違が、患者が癌治療に応答する見込みを示す。
【００１７】
第３の態様および第４の態様の両方の一部の実施形態では、参照値が、非癌組織で決定されるＰＫＮ３活性およびＲｈｏＣ活性のレベルである。一部の実施形態では、試料が腫瘍生検であり、試験レベルが、例えば、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ｉｎ ｓｉｔｕ ＰＣＲまたは免疫染色など、腫瘍内のｉｎ ｓｉｔｕアッセイによって決定される。一部の実施形態では、参照は、単純に、腫瘍試料の周囲または中にある任意の非癌組織である。一部の実施形態では、試験レベルが参照値より大きい。
【００１８】
第５の態様では、本発明は、処置を行う前および処置を行った後におけるＰＫＮ３活性およびＲｈｏＣ活性のレベルの変化を評価することによって、対象の癌治療処置レジメンの効果を決定する方法を提供する。この方法によれば、患者から試料を取得し、次に試料中のＰＫＮ３活性およびＲｈｏＣ活性のレベル（これは前治療レベルすなわち第１のレベルである）を決定し、次に処置レジメンを患者に行う。処置を行った後のある時点で、患者から第２の試料を取得し、次に第２の試料中のＰＫＮ３活性およびＲｈｏＣ活性のレベル（これは治療後レベルすなわち第２のレベルである）を決定する。第１のレベルおよび第２のレベルを相互に比較する。第１のレベルと比較した、第２のレベルのＰＫＮ３活性およびＲｈｏＣ活性の両方の低減が、処置レジメンが患者の癌に対して有効であることを示す。
【００１９】
第３、第４および第５の態様の一部の実施形態では、ＰＫＮ３活性は、ＰＫＮ３ポリペプチドまたはその断片をコードするＲＮＡの発現である。他の実施形態では、ＰＫＮ３活性は、ＰＫＮ３ポリペプチドまたはその断片の発現である。他の実施形態では、ＰＫＮ３活性は、ＰＫＮ３ポリペプチドのリン酸化である。さらに他の実施形態では、ＰＫＮ３活性は、例えば、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ−３）由来のペプチドなど、ＰＫＮ３の下流エフェクター（表１も参照）のリン酸化である。
【００２０】
第３、第４および第５の態様の一部の実施形態では、ＲｈｏＣ活性は、ＲｈｏＣポリペプチドまたはその断片をコードするＲＮＡの発現である。他の実施形態では、ＲｈｏＣ活性は、ＲｈｏＣポリペプチドまたはその断片の発現である。他の実施形態では、ＲｈｏＣ活性は、例えば、ＰＫＮ３またはグリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ−３）由来のペプチドなど、ＲｈｏＣの下流エフェクター（表１も参照）のリン酸化である。
【００２１】
第３、第４および第５の態様の一部の実施形態では、ＰＫＮ３ポリペプチドのリン酸化状態は、ＰＫＮ３のＴ８６０におけるターンモチーフリン酸化部位に特異的に結合する抗体または他のポリペプチドを用いることによって決定される。例えば、配列番号３６を参照。
【００２２】
第１から第５までの態様の一部の実施形態では、癌は、乳癌、卵巣癌、膵癌、胃癌、肝細胞癌、膀胱癌、結腸直腸癌、皮膚悪性黒色腫および前立腺癌（ＣａＰ）のうちのいずれか１つまたは複数である。
【００２３】
第６の態様では、本発明は、ＰＫＮ３ポリペプチドおよびＲｈｏＣポリペプチドを含む複合体の形成を破壊または遮断するポリペプチドまたはペプチドミメティックを含む組成物を提供する。一部の実施形態では、ポリペプチドまたはペプチドミメティックが、ＰＫＮ３の、ＲｈｏＣに結合する領域に結合する。他の実施形態では、ポリペプチドまたはペプチドミメティックが、ＲｈｏＣの、ＰＫＮ３に結合する領域に結合する。一部の実施形態では、ポリペプチドまたはペプチドミメティックが、ＰＫＮ３またはＲｈｏＣ上のエピトープを認識する１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含有する。一部の実施形態では、ＣＤＲ含有ポリペプチドが、抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、単鎖可変断片（「ＳｃＦｖ」）、小モジュール免疫薬剤（「ＳＭＩＰ」）およびナノボディー（別名単一ドメイン抗体またはＶＨＨ抗体）のいずれか１つである。
【００２４】
第６の態様の一部の実施形態では、ＰＫＮ３の、ＲｈｏＣに結合する領域は、ＡＣＣ１、ＡＣＣ２またはＡＣＣ３アミノ酸配列のいずれか１つまたは複数を含む。他の実施形態では、ポリペプチドまたはペプチドミメティックが、ＰＫＮ３のＡＣＣ１、ＡＣＣ２およびＡＣＣ３のうちのいずれか１つまたは複数に対応するアミノ酸配列を含有する。
【００２５】
第７の態様では、本発明は、Ｔ８６０のＰＫＮ３ターンモチーフリン酸化部位に結合する少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、ポリペプチドが抗体であり、これには、例えば、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、単鎖可変断片（「ＳｃＦｖ」）、小モジュール免疫薬剤（「ＳＭＩＰ」）およびナノボディー（別名単一ドメイン抗体またはＶＨＨ抗体）が含まれる。
【００２６】
第８の態様では、本発明は、ＰＫＮ３とＲｈｏＣとの相互作用を調節し、かつ癌を治療するのに使用できる化合物についてスクリーニングするのに使用されるキットを提供する。キットは、患者の癌の侵襲性および浸潤性を判定するのにも使用できる。キットは、患者における癌治療の有効性を評価するのにも使用できる。一部の実施形態では、キットは、（ａ）ＰＫＮ３活性を検出する薬剤、（ｂ）ＲｈｏＣ活性を検出する薬剤、（ｃ）標識および（ｄ）パッケージを含有する。一部の実施形態では、キットは、癌治療用化合物も含有する。癌治療用化合物とは、対象における癌細胞の成長または転移を予防または遅延させる化合物、組成物または処置レジメンである。そのような癌治療用化合物には、化学療法薬、遺伝子療法組成物、ホルモンに影響を与える化合物、免疫療法化合物、抗体およびアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されない。有用な化学療法薬の例には、ブレオマイシン、ネオカルシノスタチン、スラミン、ドキソルビシン、タキソール、マイトマイシンＣおよびシスプラチンが含まれるが、これらに限定されない。本発明で使用するための癌治療用化合物には、将来開発される新規な化合物または処置も含まれることを理解するべきである。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】リン酸化ＰＫＮ３レベルの同時増大を示す、増大した悪性能を有する乳癌細胞系のウェスタンブロットを示す図である。
【図２】リン酸化ＰＫＮ３レベルの同時増大を示す、増大した薬物耐性を有する非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）細胞系のウェスタンブロットを示す図である。
【図３Ａ】抗リン酸化ＰＫＮ抗体および抗Ｍｙｃ抗体でプロービングされた、Ｍｙｃタグ付きのＲｈｏおよびＲａｃコンストラクトで形質移入された細胞からの溶解物のウェスタンブロットを示す図である。
【図３Ｂ】抗リン酸化ＰＫＮ抗体および抗Ｍｙｃ抗体でプロービングされた、Ｍｙｃタグ付きのＲｈｏおよびＲａｃコンストラクトで形質移入された細胞からの抗Ｍｙｃ免疫沈降物のウェスタンブロットを示す図である。
【図４Ａ】抗Ｍｙｃ抗体および抗Ｆｌａｇ抗体でプロービングされた、Ｍｙｃタグ付きのＲｈｏコンストラクトおよびＦｌａｇタグ付きのＰＫＮ３コンストラクトで形質移入された細胞からの溶解物のウェスタンブロットを示す図である。
【図４Ｂ】ＰＫＮ３、ＲｈｏＣおよびＰＤＫ１を含有する三重複合体のキナーゼ依存的な形成を示す、抗Ｆｌａｇ免疫沈降物のウェスタンブロットを示す図である。
【図５Ａ】抗Ｍｙｃ抗体、抗ＰＤＫ１抗体および抗ＰＫＮ３抗体でプロービングされた、Ｍｙｃタグ付きのＲｈｏコンストラクトおよびＦｌａｇタグ付きのＰＫＮ３コンストラクトで形質移入された細胞からの溶解物のウェスタンブロットを示す図である。
【図５Ｂ】ＲｈｏＣ／ＰＤＫ１／ＰＫＮ３三重複合体で調節された、ＰＫＮ３のキナーゼ活性を示す抗Ｆｌａｇ免疫沈降物のウェスタンブロットを示す図である。
【図６Ａ】ＰＫＮ３またはｐ１１０βを標的とするドキシサイクリン（ＤｏｘすなわちＤｏｘｙ）誘導ｓｈＲＮＡを発現するＰＣ−３細胞からの溶解物のウェスタンブロットを示す図である。
【図６Ｂ】ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）に播種された代表的細胞集団を示す図である。
【図７Ａ】移植されたＰＫＮ３ ｓｈＲＮＡ ＰＣ−３細胞を保持するマウスからの腫瘍容積を定量化するヒストグラムである。
【図７Ｂ】移植されたＰＫＮ３ ｓｈＲＮＡ ＰＣ−３細胞を保持するマウスからの腫瘍容積を定量化するヒストグラムである。
【図８Ａ】ＰＫＮ３、ｐ１１０βまたはＣＫＩεを標的とするＤｏｘ誘導ｓｈＲＮＡを発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞からの溶解物のウェスタンブロットを示す図である。
【図８Ｂ】ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）に播種された代表的細胞集団を示す図である。
【図９】ドキシサイクリン誘導の存在下および非存在下における、ＰＫＮ３ ｓｈＲＮＡ ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を保持するマウスの腫瘍質量を示す散布図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
（ａ）プロテインキナーゼＮ３（ＰＫＮ３）は選択的にＲｈｏＣと会合し、（ｂ）ＰＫＮ３はキナーゼ依存的な様式でＲｈｏＣに結合し、かつ（ｃ）ＰＫＮ３とＲｈｏＣとの会合は、ＰＤＫ１を含有する三重複合体（ＰＫＮ３／ＰＤＫ１／ＲｈｏＣ複合体、すなわちＰＰＲＣ複合体）の形成を促進するという驚くべき発見を本明細書に開示する。ＰＰＲＣ複合体は、とりわけ侵襲癌に関連する価値のある標的である。ＰＰＲＣ複合体の形成がＰＫＮ３のリン酸化の増大およびそれに続くキナーゼ活性をもたらすことをさらに開示する。
【００２９】
ＰＫＮ３は、長さ８８９アミノ酸残基（ヒト相同分子種）のセリン／スレオニンプロテインキナーゼである。それは、それぞれ残基１５〜７７、９７〜１７０および１８４〜２３６に位置する、ＡＣＣ１、ＡＣＣ２およびＡＣＣ３という３つの逆平行コイルドコイル（ＡＣＣ）ドメインを含有するＮ末端推定調節領域と、残基５５９〜８８２に位置するＣ末端触媒領域と、推定調節ドメインと触媒ドメインとの間に位置する長さ約１００〜１３０残基のＣ２様ドメインとを有する。哺乳動物には、少なくとも３つの異なったＰＫＮアイソフォーム（ＰＫＮ１／ＰＫＮα／ＰＡＫ−１／ＰＲＫ−１、ＰＫＮ２／ＰＲＫ２／ＰＡＫ−２／ＰＫＮγおよびＰＫＮ３／ＰＫＮβ）が存在し、これらのそれぞれが異なった酵素学的特性、組織分布および様々な機能を示す。ＰＫＮに関する総説には、Ｍｕｋａｉ，Ｈ．、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ １３３、１７〜２７頁、２００３を参照のこと。参照により全体として本明細書に組み込まれている、２００４年６月３日公開の米国特許出願第２００４０１０６５６９号も参照のこと。
【００３０】
侵襲性および薬物耐性が増大した癌細胞で、ＰＫＮ３が上方制御されていることをここにさらに開示する（それぞれ、図１および２を参照）。侵襲性の増大とは、それらの癌細胞が転移性であること、高い転移能を有すること、増大した増殖速度を有すること、または薬物抵抗性であることを意味する。侵襲癌は、例えば、トリプルネガティブ乳癌によって例示される（例えば、Ｄｅｎｔら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １３：４４２９〜４４３４頁、２００７年８月１日を参照）。侵襲癌は、ＰＫＮ３／ＲｈｏＣ経路が関与している癌も含む。
【００３１】
ＰＰＲＣ複合体の活性を阻害する化合物は、細胞の転移性および増殖挙動を制御するのに使用でき、それゆえ、腫瘍および癌、より詳細には侵襲性である腫瘍および癌を治療する方法を提供する。ＰＰＲＣ活性によってもたらされるシグナル伝達および他の活性の低減は、ＰＰＲＣ複合体の構成成分のうちの１つまたは複数における転写レベルの低減に由来するものでも、翻訳レベルの低減に由来するものでも、翻訳後修飾レベルの低減に由来するものでも、四次構造形成（すなわち、三重複合体の形成）のレベルの低減に由来するものでもよい。
【００３２】
侵襲癌において、ＰＰＲＣ複合体とＲｈｏＣ／ＰＫＮ３経路とが関与しているので、複合体およびその構成成分は、予後マーカー、疾患ステージマーカー、患者層別マーカー、またはその細胞が転移を行うか、もしくは他の様式で侵襲性になるかに関して、細胞の状態もしくはそのような種類の細胞を体内に有する患者の状態を診断するマーカーとして使用できる。
【００３３】
ＰＫＮ３は、ＰＩ３Ｋ誘導の細胞移動および細胞浸潤の、発生的に調節される媒介因子である。それは、発現および触媒活性のレベルで、Ａｋｔ非依存的な様式で、ＰＩ３Ｋによって調節される。それは、限定的な発現パターン（内皮、胚および腫瘍細胞）を有し、ほとんどの正常な細胞機能には必須でない。それは、正所性マウスモデルにおける転移性ＰＣ−３（ＰＴＥＮ−／−）細胞増殖に必要である。
【００３４】
正常細胞では、ＰＩ３キナーゼ（ホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ）経路は、成長因子誘導の際のＰＩ３キナーゼ活性および平行するシグナル伝達経路によって特徴付けられる。細胞の成長因子刺激は、細胞膜におけるそれらの認識受容体の活性化をもたらし、今度はそれらが、ＰＩ３キナーゼなどの細胞内シグナル伝達分子と結合し、活性化する。ＰＩ３キナーゼ（ｐ８５調節サブユニットおよびｐ１１０触媒サブユニットからなる）の活性化は、リン酸化によるＡｋｔの活性化をもたらし、それによって、増殖、生存または移動など、さらに下流の細胞反応を補助する。それゆえ、ＰＴＥＮは、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）３キナーゼ経路に関与する腫瘍抑制因子であって、かつ細胞の増殖および形質転換を調節するその役割について過去に広範に研究されている（総説には、例えば、Ｓｔｅｉｎ，Ｒ．Ｃ．およびＷａｔｅｒｆｉｅｌｄ，Ｍ．Ｄ．Ｍｏｌ Ｍｅｄ Ｔｏｄａｙ ６、３４７〜３５７頁、２０００を参照）。
【００３５】
腫瘍抑制因子ＰＴＥＮは、ＰＩ３キナーゼ触媒反応を逆行させることによって、ＰＩ３キナーゼの負の調節因子として機能し、それによって、この経路の活性化が一過性かつ制御された様式で起こることを確実にする。ＰＩ３キナーゼシグナル伝達の慢性的な活性化過剰は、ＰＴＥＮの機能的不活性化によって引き起こされる。ＰＩ３キナーゼの活性は、低分子阻害剤ＬＹ２９４００２の添加によって遮断できる。平行経路で作用するシグナル伝達キナーゼＭＥＫの活性および下流反応は、例えば、低分子阻害剤ＰＤ９８０５９によって阻害できる。
【００３６】
ＰＴＥＮ機能の減失を介した、ＰＩ３キナーゼ経路の慢性的活性化は、腫瘍形成および転移への主要寄与因子であり、これは、この腫瘍抑制因子が、制御された細胞増殖の重要なチェックポイントであることを示している。ＰＴＥＮノックアウト細胞は、ＰＩ３キナーゼの活性型を介して、ＰＩ３キナーゼ経路が慢性的に誘導されている細胞と類似した特徴を示す。ホスファチジルイノシトール３−キナーゼの活性化は、細胞周期への侵入に十分であり、発癌性形質転換に特徴的な細胞変化を促進する。
【００３７】
ＰＩ３キナーゼ経路の調節不全に関与する疾患および状態はよく知られている。それゆえ、これらの状態および疾患のいずれも、本発明の方法、薬物および診断薬によって対処できる。それらの設計、スクリーニングまたは製造は本明細書に教示されている。限定ではなく、例示のために、以下の状態および疾患、すなわち、子宮体癌、結腸直腸癌、神経膠腫、子宮体癌、腺癌、子宮内膜増殖症、カウデン症候群、遺伝性非ポリポーシス結腸直腸癌、リーフラウメニ症候群、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、バナヤン−ゾナナ（Ｂａｎｎａｙａｎ−Ｚｏｎａｎａ）症候群、ＬＤＤ（レルミット−デュクロ（Ｌｈｅｒｍｉｔｔｅ−Ｄｕｋｌｏｓ）症候群）、カウデン病（ＣＤ）およびバナヤン−ルバルカバ−ライリー（Ｂａｎｎａｙａｎ−Ｒｕｖａｌｃａｂａ−Ｒｉｌｙ）症候群（ＢＲＲ）を含めた過誤腫−大頭症疾患、皮膚粘膜病変（例えば、毛根鞘腫）、大頭症、精神遅滞、胃腸過誤腫、脂肪腫、甲状腺腺腫、乳房線維嚢胞病、小脳異形成性神経節細胞腫ならびに乳腺および甲状腺悪性腫瘍を示す。
【００３８】
これに関連して、ＰＰＲＣ複合体およびその個々の構成成分は、ＰＰＲＣの上流を標的とするように作られている他の薬物より少ない副作用を有する薬物によって対処できる、ＰＩ３キナーゼ経路の価値ある下流薬物標的である。したがって、本発明は、例えば、２−（４−モルホリニル）８−フェニルクロモン（「ＬＹ２９４００２」）など、通常はＰＩ３キナーゼを標的とする、当技術分野で知られているものより選択的な薬学的活性化合物の設計、スクリーニング、開発および製造に適した薬物標的を提供する。この特定の一部のエフェクター分子、すなわち、ＲｈｏＣおよびＰＫＮ３、ならびにこの経路に関与するさらに下流の任意の分子に関する制御を有することによって、平行するその分枝またはシグナル伝達カスケードにおけるさらに上流の標的のうち、望ましくない影響を引き起こす可能性が高いのは、極めて限られた数のみとなる。したがって、細胞周期、ＤＮＡ修復、アポトーシス、グルコース輸送、翻訳に関係する、ＰＩ−３キナーゼ／ＰＴＥＮ経路の他の活性は、影響を受けなくなる。また、インスリンシグナル伝達も誘導されず、これは、ＬＹ２９４００２の使用に関連して観察された糖尿病性の反応または他の副作用が実際に回避されることを意味する。
【００３９】
ＰＫＮ３をコードする核酸の完全配列は、例えば、アクセッション番号ＮＭ＿０１３３５５．３の下で、データバンクで一般に利用可能である。また、ＰＫＮ３のアミノ酸配列は、アクセッション番号ＮＰ＿０３７４８７．２の下で、データバンクで利用可能である。ＲｈｏＣをコードする核酸の完全配列は、例えば、アクセッション番号ＮＭ＿００１０４２６７８．１、ＮＭ＿００１０４２６７９．１およびＮＭ＿１７５７４４．４の下で、データバンクで一般に利用可能である。また、ＲｈｏＣのアミノ酸配列は、アクセッション番号ＮＰ＿００１０３６１４３．１、ＮＰ＿００１０３６１４４．１およびＮＰ＿７８６８８６．１の下で、データバンクで利用可能である。望ましい効果が実現されうる限り、本発明に従って、ＰＫＮ３およびＲｈｏＣの誘導体またはそれらの末端欠失型バージョンが使用できることも、本発明に包含される。したがって、誘導体化および末端欠失の程度は、当業者が日常的分析によって決定できる。
【００４０】
本発明との関連において、ＰＫＮ３およびＲｈｏＣをコードする核酸配列という用語には、前述のアクセッション番号によって指定された核酸配列または前述のアミノ酸配列から派生しうる任意の核酸配列とハイブリダイズする核酸も含まれる。そのようなハイブリダイゼーションは、当業者には既知のものである。そのようなハイブリダイゼーションの詳細は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９８９）、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから得られる。好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件下、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、同上で特定されているストリンジェントな条件下におけるハイブリダイゼーションである。
【００４１】
加えて、ＰＫＮ３およびＲｈｏＣをコードする核酸は、前述の核酸配列のいずれかに相同な配列を含有する核酸配列であり、その際、配列相同性の程度は、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％である。
【００４２】
ヒトＰＫＮ３の相同分子種は、中でも、マウス（Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ）およびラット（Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、シロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）、キイロショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）ならびに出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）という進化的に多様な生物で見出されている。ＰＫＮ３の場合、同一性のパーセントは、前述の多様な種において、それぞれ６７％、５１％、３８％、３６％、６３％および４４％である。ヒトＲｈｏＣの相同分子種は、マウス、ラット、シロイヌナズナ（ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）およびショウジョウバエ（ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）で見出されており、それぞれ１００％、９９％、４７％および８６％の同一性のパーセントを有する。当業者ならば、これらまたは他の相同分子種および相同体のうちのいずれかが、そのような相同体を用いて生成された薬物または診断薬が依然としてヒトＰＫＮ３またはＲｈｏＣまたは任意の他の意図されているＰＫＮ３またはＲｈｏＣと相互作用できるという条件で、原則として本発明の実施に適すると認めるであろう。
【００４３】
ＰＰＲＣ複合体およびその個々のメンバーは、薬物もしくは薬物候補として、または診断薬として使用できる化学化合物がそれに対して作られる標的として使用できる。抗体、ペプチド、アンチカリン、アプタマー、スピーゲルマー、リボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびｓｉＲＮＡならびに有機小分子など、化合物の様々なクラスに属する適した化学化合物が使用できる。それらの化合物は、ＰＰＲＣ複合体（複合体それ自体、その個々のメンバーまたはこれらの組合せ）またはＰＰＲＣ複合体に関する情報を用いることによって、設計、選択、スクリーニング、生成または製造される。
【００４４】
前記クラスの化合物の設計、選択、スクリーニング、生成または製造プロセスにおいて、ＰＰＲＣは、それを必要とする患者へのそれぞれの化合物の最終適用ではなく、むしろその過程で使用される標的としても言及される。様々なクラスの化合物を提供する過程において、ＰＰＲＣ複合体全体、個々のメンバーもしくはその様々な組合せ、またはＰＰＲＣのタンパク質構成物のうちの任意のものまたはすべてをコードする核酸のいずれかを使用できる。「ＰＰＲＣ複合体またはその構成成分」という用語は、本明細書で使用される場合、ＰＰＲＣおよびその構成メンバーの任意の断片または誘導体を含み、それは、薬物として、または診断薬として使用できる前記化合物の設計、選択、スクリーニング、生成または製造を可能にする。
【００４５】
「ＰＰＲＣ複合体またはその構成成分をコードする核酸」という用語は、本明細書で使用される場合、任意の核酸を含むものとし、それは、ＰＰＲＣ複合体の任意の構成成分またはその断片をコードする核酸を含有する。ＰＰＲＣ複合体またはその構成成分をコードする核酸の部分は、それが薬物として、または診断薬として使用できる前記化合物の設計、選択、スクリーニング、生成または製造に適している限り、そのようなものとして考えられる。ＰＰＲＣ複合体またはその構成成分をコードする核酸は、ゲノム核酸、ｈｎＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはこれらそれぞれの部分でありうる。
【００４６】
上記に概説した通り、ＰＰＲＣ複合体の内因性の活性から生じる影響を生み出すか、または抑制するために、本明細書に記載のＰＰＲＣ複合体もしくはその構成成分またはそれらをコードする核酸配列とは別に、他の手段または化合物を使用することもできることが本発明に包含される。そのような手段は、スクリーニング方法で決定または選択できる。そのようなスクリーニング方法において、第１のステップは、１つまたはいくつかのいわゆる候補化合物または試験化合物を提供することである。ここで使用される候補化合物は、本明細書に記載の癌を治療または緩和するかどうかに関する試験系でその適合性が試験される化合物、または癌の診断手段または薬剤として使用されるべき化合物である。
【００４７】
候補化合物が試験系でそれぞれの作用を示す場合、前記候補化合物は、前記疾患および疾患状態の治療に適した手段または薬剤であり、かつ原則として、前記疾患および疾患状態に適した診断薬でもある。第２のステップでは、候補化合物を、ＰＰＲＣ発現系、ＰＰＲＣ遺伝子産物、ＰＰＲＣ活性系またはＰＰＲＣ複合体もしくは構成成分を接触させる。ＰＰＲＣ活性系は、本明細書では、例えば、ＰＰＲＣキナーゼ活性など、ＰＰＲＣ複合体の活性を検出する系とも呼ばれる。一部の実施形態では、ＰＰＲＣ複合体のキナーゼ活性は、例えば、ＧＰＧＲＲＧＲＲＲＴＳＳＦＡＥＧＧ（配列番号１）の配列を有する、診断用のＧＳＫ３α由来断片など、基質のリン酸化を測定することによって評価できる。表１は、本発明の実施に有用な追加のＰＰＲＣキナーゼ基質を示す。
【００４８】
本明細書に記載のＰＰＲＣスクリーニング方法は、非機能性化合物または不活性な化合物をそれ以降の考慮から排除するのにも有用である。したがって、対象または試験系から取得した第１の試料中でＰＰＲＣ活性を測定し、前治療レベルを得、その後、試験化合物を対象または試験系に投与し、試験化合物を投与した後のある時点に対象または試験系から得た第２の試料中でＰＰＲＣ複合体またはその個々の構成成分の活性を測定し、それによって試験レベルのデータを得ることができる。前治療レベル（第１のレベル）を試験レベル（第２のレベル）と比較することができ、前治療レベルと比較して試験レベルの低減を示さないデータは、試験化合物が対象に有効でないことを示し、試験薬をそれ以降の評価または研究から排除できる。反対に、値の変化は、試験化合物がＰＰＲＣ阻害剤としての使用、またはそれ以降の研究に適していることを示しうる。
【００４９】
【表１】
【００５０】
ＰＰＲＣ発現系は、基本的に、ＰＰＲＣ構成成分ポリペプチド（ＲｈｏＣ、ＰＫＮ３およびＰＤＫ１）のうちのいずれか１つまたは複数の発現を示すか、または提示する発現系であり、それによって発現の程度またはレベルが変化しうる。ＰＰＲＣ活性系は、本質的に、それによって活性または活性（例えばキナーゼ活性）の条件が測定される発現系である。
【００５１】
これらの系のいずれでも、候補化合物の影響下におけるＰＰＲＣの活性またはＰＰＲＣをコードする核酸の活性が、候補化合物が存在しない状況と異なるかどうか決定される。特定の系が発現系であるか活性系であるかにかかわらず、それぞれ活性および発現の増大または低減のいずれかが起こり、測定されうることが本発明に包含される。通常、発現系または活性系は、細胞抽出物、または核抽出物など、細胞抽出物の一画分などのｉｎ ｖｉｔｒｏ反応物である。本明細書で使用されるＰＰＲＣ発現系は、細胞、好ましくは本明細書に記載の疾患または本明細書に記載の疾患状態に関与する組織または臓器の細胞であってもよい。
【００５２】
活性系または発現系の増大または低減があるかどうかは、例えば、候補化合物の影響下で発現されるＰＰＲＣ複合体もしくはその構成成分をコードする核酸、より詳細にはｍＲＮＡの量の増大もしくは低減、またはＰＰＲＣ複合体もしくはその構成成分のポリペプチドの増大もしくは低減を測定することによって、発現の各レベルで決定できる。ｍＲＮＡの測定またはポリペプチドの測定など、そのような測定、より詳細にはこれらの種類の変化の定量的測定に必要な技法は当業者に知られている。例えば、適切な抗体を用いた検出によって、ＰＰＲＣ複合体のポリペプチドの量または含量を決定する方法も、当業者に知られている。抗体は、当業者に知られている通り、および例えば、Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．およびＬａｎｅ，Ｄ．、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、（１９８８）に記載の通り作製できる。適した抗体は、他のよく知られている方法によって、例えば抗体ライブラリーからのファージディスプレイ選択によっても作製できる。
【００５３】
ＰＰＲＣ複合体系の場合、ＰＰＲＣ複合体の活性の増大または低減を、好ましくは機能アッセイで決定できる。
【００５４】
候補化合物と、発現系および活性系それぞれとの接触は、通常、本明細書では通常、試験系と呼ばれるそれぞれの反応系に候補化合物の水溶液を添加することによって行われる。水溶液（緩衝化されているものでありうる）に加えて、有機溶媒中または有機溶媒と水性溶媒との混合物中における候補化合物の懸濁液または溶液も使用できる。
【００５５】
一部の実施形態では、発現系および活性系を用いた各実行において、単一の候補化合物のみが使用される。しかし、当技術分野で知られている方法を用いたハイスループット系で、この種類の試験のいくつかを平行して行うことも本発明に包含される。
【００５６】
本発明による方法のさらなるステップは、候補化合物の影響下において、ＰＰＲＣ複合体またはそれをコードする核酸に関して、発現系および活性系のそれぞれ発現または活性が変化しているかどうか決定するものである。これは通常、候補（試験）化合物を添加した際の系の反応を、候補化合物を添加しないものと比較することによって行われる。代替として、これは、候補化合物を添加した際の系の反応を、候補化合物を添加した際の非機能性のＰＰＲＣ構成成分を含有する系、例えば、キナーゼデッドＰＫＮ３を含有する系の反応と比較することによって行うこともできる。一部の実施形態では、候補化合物は化合物ライブラリーのメンバーである。
【００５７】
通常、化合物のいかなるライブラリーも、化合物のクラスにかかわらず、本発明の目的に適している。適した化合物ライブラリーは、とりわけ、小分子、ペプチド、タンパク質、抗体または機能性核酸で構成されたライブラリーである。後者の化合物は、当業者に知られている通りに生成できる。
【００５８】
ＰＰＲＣ複合体全体、またはその任意の構成成分もしくは構成成分の組合せ、またはそれらの断片に特異的な抗体の製造は当業者に知られている。本発明の抗体には、ナノボディー、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体（例えば、ヒト化抗体）および抗イディオタイプ抗体が含まれる。ポリクローナル抗体は、抗原によって免疫化された動物の血清から得られる抗体分子の不均一な集団である。モノクローナル抗体は、抗原に特異的に結合する抗体の実質的に均一な集団である。一般的に、抗体は、例えば、伝統的なハイブリドーマ技法（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）、Ｎａｔｕｒｅ、２５６、４９５〜４９９頁）、組換えＤＮＡ法（米国特許第４，８１６，５６７号）、または抗体ライブラリーを用いたファージディスプレイ（Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９１）、Ｎａｔｕｒｅ、３５２、６２４〜６２８頁；Ｍａｒｋｓら（１９９１）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２、５８１〜５９７頁）を用いて作製できる。追加の抗体産生技術については、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編集、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８を参照のこと。本発明は、抗体のいかなる特定の供給源、生産様式または他の特別な特徴にも限定されない。
【００５９】
「抗体」という用語には、完全な分子も、Ｆａｂ、単鎖Ｆｖ抗体（ＳｃＦｖ）および小モジュール免疫薬剤（ＳＭＩＰ）など、抗原に結合できる断片も含まれるものとする。Ｆａｂ断片は完全な抗体のＦｃ断片を欠失しており、より迅速に循環系から除去され、完全な抗体より少ない非特異的な組織結合を有しうる（Ｗａｈｌら、１９８３、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２４、３１６〜３２５頁）。キメラ抗体は、例えば、マウスのモノクローナル抗体に由来する可変領域（ＶＨ、ＶＬ）と、ヒト免疫グロブリン定常領域（ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３、ＣＬ）とを有するものなど、その異なった部分が異なった動物種に由来する分子である。キメラ抗体およびそれらを産生する方法は当技術分野で知られている（Ｃａｂｉｌｌｙら、１９８４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１、３２７３〜３２７７頁；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９８４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１、６８５１〜６８５５頁；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅら、１９８４、Ｎａｔｕｒｅ ３１２、６４３〜６４６頁；Ｃａｂｉｌｌｙら、欧州特許出願第１２５０２３号（１９８４年１１月１４日公開）；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら、欧州特許出願第１７１４９６号（１９８５年２月１９日公開）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、欧州特許出願第１７３４９４号（１９８６年３月５日公開）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、ＰＣＴ出願第ＷＯ８６／０１５３３号（１９８６年３月１６日公開）；Ｋｕｄｏら、欧州特許出願第１８４１８７号（１９８６年６月１１日公開）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、欧州特許出願第１７３４９４号（１９８６年３月５日公開）；Ｓａｈａｇａｎら、１９８６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７、１０６６〜１０７４頁；Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９（１９８７年５月７日公開）；Ｌｉｕら、１９８７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４、３４３９〜３４４３頁；Ｓｕｎら、１９８７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４、２１４〜２１８頁；Ｂｅｔｔｅｒら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０、１０４１〜１０４３頁）。ＳＭＩＰは、１つの結合ドメイン、１つのヒンジドメインおよび１つのエフェクタードメインを含む単鎖ポリペプチドである。ＳＭＩＰならびにそれらの使用および適用は、例えば、米国特許出願公開第２００３／０１１８５９２号、第２００３／０１３３９３９号、第２００４／００５８４４５号、第２００５／０１３６０４９号、第２００５／０１７５６１４号、第２００５／０１８０９７０号、第２００５／０１８６２１６号、第２００５／０２０２０１２号、第２００５／０２０２０２３号、第２００５／０２０２０２８号、第２００５／０２０２５３４号および第２００５／０２３８６４６号ならびにこれらの関連特許ファミリーメンバーに開示されている。これらの開示をすべて、参照により全体として本明細書に組み込む。
【００６０】
本発明に従って使用できる抗体は、１つまたはいくつかのマーカーまたは標識を有しうる。そのようなマーカーまたは標識は、その診断適用またはその治療適用のいずれかで抗体を検出するのに有用でありうる。マーカーおよび標識は、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、金およびフルオレセインを含む群から選択され、例えば、ＥＬＩＳＡ法で使用されることが好ましい。これらおよびさらに他のマーカーならびに方法は、例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、同上に記載されている。
【００６１】
一実施形態では、ＰＰＲＣ抗体は、ＰＫＮ３の活性化状態特異的な抗体を含み、それは、ＰＫＮ３のターンモチーフ（配列番号２４：８４７−ＹＦＥＧＥＦＴＧＬＰＰＡＬＴＰＰＡＰＨＳＬＬＴＡＲＱＱＡ−８７４）中の位置８６０（四角内）のリン酸化スレオニンを認識する。前記抗体は、とりわけ、増大したＰＫＮ３発現および活性化のプローブならびに患者層別および治療反応の生物マーカーとして有用である。
【００６２】
ＰＰＲＣを破壊するさらに別のクラスの薬物、化合物、ならびにＰＰＲＣ複合体もしくは構成成分およびそれらの断片、または前記ＰＰＲＣ複合体もしくは構成成分およびそれらの断片をコードする核酸を使用して生成できる診断薬は、それらに結合するペプチドである。そのようなペプチドは、ファージディスプレイなどの最新技術による方法を用いて生成できる。基本的に、ペプチドのライブラリーをファージ表面に生成および提示し、提示されたライブラリーを標的、この場合、例えば、ＰＰＲＣ複合体またはその構成成分と接触させる。それに続いて、標的に結合するペプチドを、好ましくは標的分子との複合体として、それぞれの反応から除去する。結合特性は、少なくともある程度、塩濃度など、特定の実験設定に依存することが当業者に知られている。より高い親和性、またはより大きな力で標的分子に結合するペプチドを、ライブラリーの非結合メンバーから分離した後、そして標的分子とペプチドとの複合体から任意選択で標的分子も除去した後に、それぞれの（１つまたは複数の）ペプチドを特徴分析することができる。
【００６３】
特性分析ステップの前に、例えばペプチドコーディングしたファージを増殖させるなどによって、増幅ステップを行ってもよい。一部の実施形態では、特性分析は、標的結合ペプチドの配列決定を含む。基本的に、ペプチドはそれらの長さで限定されないが、通常、約８〜２０アミノ酸の長さを有するペプチドがそれぞれの方法で得られる。ライブラリーのサイズは、約１０２〜１０１８、または１０８〜１０１５の異なったペプチドのものでありうるが、ライブラリーのサイズはこれらに限定されない。
【００６４】
本発明によれば、ＰＰＲＣ複合体またはその構成成分、および前記ＰＰＲＣ複合体またはその構成成分をコードする核酸は、侵襲癌を治療するための薬物の製造または開発、ならびに前記侵襲癌を診断するための手段の製造または開発の標的として、スクリーニング工程で使用でき、それによって、スクリーニング工程で、小分子または小分子のライブラリーが使用される。このスクリーニングは、標的ＰＰＲＣ複合体またはその構成成分（標的）を単一の小分子または様々な小分子（ライブラリーなど）、好ましくは上記に特定したライブラリーからのものと同時に、または順次に接触させるステップと、標的に結合し、かつＰＰＲＣ複合体の機能または完全性を破壊し、他の小分子と共にスクリーニングされる場合には、非結合または非相互作用小分子から分離されうる小分子、またはライブラリーのメンバーを同定するステップとを含む。
【００６５】
結合および非結合は、特定の実験設定によって強く影響されうる。反応パラメータのストリンジェンシーを変更することで、結合および非結合の程度を変えることが可能であり、これによって、このスクリーニング工程の微調整が可能となる。一部の実施形態では、標的と特異的に相互作用する１つまたはいくつかの小分子を同定した後に、この小分子をさらに特徴分析することができる。この追加の特徴分析は、例えば、小分子の同定、ならびにその分子構造およびさらなる物理的、化学的、生物学的または医学的の特性の決定でありうる。一部の実施形態では、天然化合物は約１００〜１０００Ｄａの分子量を有する。一部の実施形態では、小分子は、当業者に知られている、リピンスキーのルールオブファイブ（Ｌｅｐｉｎｓｋｉ’ｓ Ｒｕｌｅ ｏｆ Ｆｉｖｅ）に従うものである（Ｌｉｐｉｎｓｋｉら、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ．Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．、２３、３〜２５頁、１９９７を参照）。代替として、小分子は、それらが、天然物とは対照的に、コンビナトリアル化学で生じる合成小分子となるように定義してもよい。しかし、これらの定義は、当技術分野におけるそれぞれの用語の一般的な理解の補助でしかないことを理解するべきである。すべてのキナーゼと同様に、ＰＰＲＣ複合体のＰＫＮ３およびＰＤＫ１構成成分は、ＡＴＰ結合部位を含有しており、そのような部位に結合することが知られている薬物は、それゆえ、ＰＰＲＣ機能を阻害するのに適した候補化合物である。適した化合物の例には、ＬＹ−２７６３２、Ｒｏ−３ １−８２２０およびＨＡ１０７７が含まれるが、これらに限定されない。これらはすべて、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）から入手可能である。
【００６６】
以下の実施例によって、本発明をさらに例示するが、これは本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００６７】
コンストラクトおよびタンパク質
Ｆｌａｇ−ＰＫＮ３タンパク質：ヒトＰＫＮ３の完全長ｃＤＮＡ（例えば、配列番号２５および配列番号２６）をＰＣＲによって増幅し、ｐｃＤＮＡ３発現ベクター（配列番号２７）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローニングした。５’プライマーは、ＡＴＧコドンおよびそれに続くＦｌａｇエピトープ（配列番号２８）を、増幅されたコード領域とインフレームで含有していた。このＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ制限酵素によって消化し、同一の酵素部位を介してｐｃＤＮＡ３発現ベクターと連結し、Ｎ末端Ｆｌａｇエピトープタグ付きのＰＫＮ３を得た。Ｋ５８８Ｒ置換を含む、ＰＫＮ３のキナーゼデッドバージョンも、同じ戦略を用いて同じベクターにクローニングした。
【００６８】
Ｍｙｃ−Ｒｈｏタンパク質：ヒトＲａｃ１（例えば、配列番号２９および３０）、ＲｈｏＡ（例えば、配列番号３１および３２）、ＲｈｏＢ（例えば、配列番号３２および３３）およびＲｈｏＣ（例えば、配列番号３５および３６）の完全長ｃＤＮＡをｐＣＧ哺乳動物発現ベクター（ＴａｎａｋａおよびＨｅｒｒ（１９９０）、Ｃｅｌｌ、６０（３）、３７５〜３８６頁）にクローニングした。５’プライマーは、ＡＴＧコドンおよびそれに続くＭｙｃエピトープ（配列番号３７）を、増幅されたコード領域とインフレームで含有していた。このＰＣＲ産物をＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素によって消化し、同じ酵素部位を介して発現ベクターｐＣＧに連結し、Ｎ末端Ｍｙｃエピトープタグ付きのＲｈｏＡ、ＲｈｏＢおよびＲｈｏＣを得た。
【実施例２】
【００６９】
抗体および細胞溶解物
抗体：ｐ１１０抗体は、Ｋｌｉｐｐｅｌら（１９９４）、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１４（４）、２６７５〜８５頁に記載されている。ＰＫＮ抗体は、Ｌｅｅｎｄｅｒｓ、２００４に記載されている。ＰＤＫ１抗体は、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）から市販されている。抗リン酸化ＰＫＮ３ Ｔ８６０ウサギモノクローナル抗体は、標準的手順で産生させた（Ｓｐｉｅｋｅｒ−Ｐｏｌｅｔ、１９９５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２、９３４８〜９３５２頁参照）。Ｍｙｃエピトープに対する抗体は、９Ｅ１０ Ｍｙｃモノクローナル抗体であった。それらは、市販されており、かつＥｖａｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、５、３６１０〜６頁（１９８５）に記載されている。
【００７０】
細胞溶解物：細胞を冷リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、１５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）グリセロール、１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ノニデットＰ−４０（ＮＰ−４０）、２ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル、１ｍｌあたり１０ｍｇのアプロチニン、２０ｍＭロイペプチン、２ｍＭベンズアミジン、１ｍＭバナジウム酸ナトリウム、２５ｍＭ β−グリセロールリン酸、５０ｍＭ ＮａＦおよび１０ｍＭ Ｎａ−ピロリン酸を含有する溶解緩衝液中で４℃で溶解させた。溶解物を１４，０００×ｇで５分間、遠心処理することによって清澄化し、溶解物のアリコートをタンパク質発現および酵素活性に関して分析した（下記参照）。ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって試料を分離し、ニトロセルロースフィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ）に転写させた。５％（ｗｔ／ｖｏｌ）ドライミルクを含有するＴＢＳＴ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．５］、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％［ｖｏｌ／ｖｏｌ］トゥイーン２０、０．５％［ｗｔ／ｖｏｌ］アジ化ナトリウム）でフィルターをブロッキングした。各抗体を適切な希釈率でＴＢＳＴ中に添加した。結合抗体を、ＴＢＳＴ中の抗マウス、抗ヤギまたは抗ウサギ結合アルカリ性ホスファターゼ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で検出し、洗浄し、ニトロブルーテトラゾリウムおよび５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸（Ｐｒｏｍｅｇａ）で発色させた。代替として、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合二次抗体を使用し、増強化学ルミネセンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で発色させた。
【実施例３】
【００７１】
癌細胞におけるＰＫＮ３の発現プロファイル
ＰＫＮ３またはリン酸−ＰＫＮ３（「Ｐ＊−ＰＫＮ３」）発現の増大は、腫瘍転移の増大に関連することが知られている（Ｌｅｅｎｄｅｒｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．、２６１、８０８〜８１４頁）。悪性能および薬剤抵抗性のモデルでＰＫＮ３およびＰ＊−ＰＫＮ３の発現を調べた。
【００７２】
最も侵襲性が低いものから、最も侵襲性が高いものまで、すなわちＭＣＦ−１０Ａ、ＭＣＦ７、ＭＤＡ３６１、ＭＣＦ４６８、ＢＴ５４９およびＭＤＡ２３１を含めた、侵襲性の高くなる乳癌細胞系をＰＫＮ３およびＰ＊−ＰＫＮ３発現に関して調べた。図１は、ｐ１１０αＰＩ３Ｋ、総ＰＫＮ３およびリン酸−ＰＫＮ３（Ｐ＊−ＰＫＮ３ Ｔ８６０）に関してプロービングされた、それらの細胞からの抽出物のウェスタンブロットを示す。結果は、ＰＫＮ３およびＰ＊−ＰＫＮ Ｔ８６０が、より大きな悪性能を有する癌細胞内で、より小さな悪性能を有するものより大きな程度まで発現されていることを確認する。
【００７３】
最も耐性の低いものから、最も耐性の高いものまでを含めた、抗癌剤ゲフィチニブ（別名ＩＲＥＳＳＡ；４−（３−クロロ−４−フルオロアニリノ）−７−メトキシ−６−（３−モルフォリノ−プロポキシ）−キナゾリン）に対する様々な耐性の非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）細胞系、すなわちＨ１６５０、Ｈ１９７５、Ａ５４９、ＰＣ１４、Ｈ１５７およびＨ４６０細胞をＰＫＮ３およびＰ＊−ＰＫＮ３発現に関して調べた（Ｎｏｒｏら（２００６）、ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ、６、２７７〜２８９頁参照）。図２は、（ａ）ｐ１１０αＰＩ３Ｋ、（ｂ）総ＰＫＮ３および（ｃ）Ｐ＊−ＰＫＮ３ Ｔ７１８に関してプロービングされた、それらの細胞からの抽出物のウェスタンブロットを示す。結果は、ＰＫＮ３およびＰ＊−ＰＫＮ Ｔ８６０が、抗癌剤に対してより大きな耐性を有する癌細胞内で、抗癌剤に対してより大きな感受性を有するものより大きい程度まで発現されていることを確認する。
【実施例４】
【００７４】
内因性ＰＫＮ３とのＰＰＲＣ複合体形成
Ｍｙｃタグ付きの小分子ＧＴＰアーゼＲａｃ１、ＲｈｏＡ、ＲｈｏＢまたはＲｈｏＣで形質移入された細胞を用いた免疫沈降実験は、ＲｈｏＣがリン酸化ＰＫＮ３に選択的に結合することを明らかにした（図３Ｂ）。ＨｅＬａ細胞（５×１０５細胞／１０ｃｍ組織培養皿）には、ＦＵＧＥＮＥ（登録商標）形質移入試薬（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）によって、示されているプラスミドを用いて単独で形質移入した。免疫沈降は、プロテインＧセファロースと結合した、Ｍｙｃに対する９Ｅ１０抗体を用いて行った。免疫複合体を溶解緩衝液で３回洗浄した。結合タンパク質は、抗Ｐ＊−ＰＫＮ３ Ｔ８６０抗体を用いたウェスタンブロットによって分析した。
【００７５】
この実験は、内因性Ｐ＊−ＰＫＮ３が小分子ＧＴＰアーゼＲｈｏＣと選択的に会合することを明らかにしている。
【実施例５】
【００７６】
異種ＰＫＮ３とのＰＰＲＣ複合体形成
Ｆｌａｇタグ付きのＰＫＮ３、ならびにＭｙｃタグ付きの小分子ＧＴＰアーゼＲｈｏＡ、ＲｈｏＢまたはＲｈｏＣで形質移入されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いた免疫沈降実験は、ＰＫＮ３がホスホイノシチド依存性キナーゼ１（ＰＤＫ１）およびＲｈｏＣに結合することを明らかにした。図４Ｂは、キナーゼ活性型のＰＫＮ３がＲｈｏＣおよびＰＤＫ１に選択的に結合することを示している。したがって、ＰＫＮ３、ＲｈｏＣおよびＰＤＫ１は三重複合体（「ＰＰＲＣ複合体」）を形成する。
【００７７】
Ｆｌａｇ（図４Ｂ）との免疫沈降には、ＦＵＧＥＮＥ（登録商標）形質移入試薬によって、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（５×１０５細胞／１０ｃｍ組織培養皿）に、示されているプラスミド（Ｆｌａｇ−ＰＫＮ３ｗｔ［完全長キナーゼ活性］、Ｆｌａｇ−ＰＫＮ３ｋｄ［キナーゼデッドＰＫＮ３］、Ｍｙｃ−ＲｈｏＡ、Ｍｙｃ−ＲｈｏＢまたはＭｙｃ−ＲｈｏＣ）を用いて単独で形質移入または同時形質移入した。５％ＣＯ２インキュベーター内、３７℃で、６時間のインキュベーションの後に、細胞を無血清ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）で２回洗浄し、新たな培地（ＤＭＥＭ、１０％ウシ胎児血清）を細胞に添加して、さらに４８時間インキュベートした。細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、０．５ｍｌの溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．５］、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ β−グリセロールリン酸、１０％グリセロール、１％トリトンＸ−１００、１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、１ｍＭ ＮａＦおよびプロテアーゼ阻害剤［Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ］）中、氷上で３０分間溶解させた。細胞溶解液を１４，０００ｒｐｍで３０分間遠心処理し、遠心された溶解液からの上清を、抗Ｆｌａｇ Ｍ２アフィニティー樹脂（Ｓｉｇｍａ）と共に４℃で終夜インキュベートした。その後、ビーズを３回ＴＢＳ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．５］、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で洗浄し、１０％グリセロール、１ｍＭ ＤＴＴおよび２００μｇのＦｌａｇペプチド（Ｓｉｇｍａ）／ｍｌを含有するＴＢＳ緩衝液で、結合タンパク質を溶出させた。結合産物は、ウェスタンブロット分析によって可視化させた（図４）。
【実施例６】
【００７８】
ＰＰＲＣ複合体のキナーゼ活性
ＰＰＲＣ複合体の酵素活性を、（ｉ）ＰＰＲＣ複合体のＰＫＮ３構成成分のリン酸化状態、および（ｉｉ）基質、すなわち、ＧＰＧＲＲＧＲＲＲＴＳＳＦＡＥＧＧ（配列番号１）の配列を有する、ＧＳＫ３α由来の断片に対するＰＰＲＣのキナーゼ活性を評価することによって調べた。
【００７９】
Ｆｌａｇタグ付きのＰＫＮ３、およびＭｙｃタグ付きの小分子ＧＴＰアーゼＲｈｏＡ、ＲｈｏＢまたはＲｈｏＣで形質移入されたＰＣ３細胞を用いた免疫沈降実験は、ＰＫＮ３がホスホイノシチド依存性キナーゼ１（ＰＤＫ１）およびＲｈｏＣに結合することを明らかにした。図５Ｂは、キナーゼ活性は、ＰＰＲＣ複合体で最も大きく、ＰＫＮ３単独またはＰＫＮ３とＲｈｏＣとを併せたものより大きいことを示している。
【００８０】
Ｆｌａｇ免疫沈降およびそれに続くキナーゼアッセイには、上述の通り、ＦＵＧＥＮＥ（登録商標）形質移入試薬によって、ＰＣ３細胞（５×１０５細胞／１０ｃｍ組織培養皿）に、示されているプラスミドを用いて単独で形質移入または同時形質移入した。細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、０．３％トリトンＸ−１００を含有する洗浄用緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１μＭオカダ酸、１０ｍＭグリセロールリン酸、２５ｍＭフッ化ナトリウム、５ｍＭピロリン酸ナトリウム、０．２ｍＭ ＰＭＳＦおよび２ｍＭ ＤＴＴ）中で溶解させた。免疫沈降は、抗Ｆｌａｇ Ｍ２アフィニティー樹脂（Ｓｉｇｍａ）を用いて行った。０．５Ｍ ＮａＣｌを含有する上記緩衝液で免疫複合体を３回、β−グリセロールリン酸および１０ｍＭピロリン酸ナトリウムを含有するキナーゼ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび１ｍＭオカダ酸）で２回洗浄した。最後に、複合体をキナーゼ緩衝液中に懸濁し、５０μＭ ＡＴＰおよびＰＫＮ３基質と共に、ＲＴで１５分間インキュベートした。リン酸化タンパク質は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分離し、ウェスタンブロッティングによって可視化した。
【実施例７】
【００８１】
ｉｎ ｖｉｖｏ前立腺癌モデル
ＰＫＮ３およびｐ１１０βを標的とするｓｈＲＮＡを発現するように、ＰＣ−３（前立腺癌）細胞を操作した。ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）誘導のｓｈＲＮＡ発現は、７２時間後に、ＰＫＮ３およびｐ１１０βのタンパク質レベルの効率的なノックダウンをもたらした（図６Ａ）。ＰＫＮ３およびｐ１１０βの両方の阻害は、上皮間葉転換（ＥＭＴ）のよく知られたマーカーであるビメンチンタンパク質レベルの低減をもたらした（図６Ａ）。それぞれの細胞集団はＭＡＴＲＩＧＥＬ上に播種され、ＰＫＮ３発現のｓｈＲＮＡ媒介のノックダウンを有する細胞は、細胞外マトリックス上での増殖障害を示した。ｐ１１０βはＰＣ−３細胞内における主要なＰＩ３Ｋサブユニットであるので、ｐ１１０βの阻害は、ＰＣ−３細胞のＭＡＴＲＩＧＥＬ上での増殖も妨げ、陽性対照として働いた（図６Ｂ）。
【００８２】
次に、安定的なＰＫＮ３ ｓｈＲＮＡ ＰＣ−３細胞をヌードマウスに前立腺内移植した。動物を２つの群に分け、１群をＤｏｘで処置して、ｓｈＲＮＡ発現を誘導し、第２の群にはニセの処置を行った。４９日後にマウスを屠殺し、原発腫瘍形成およびリンパ節転移について分析した。Ｄｏｘ処置群のマウスは、原発腫瘍の成長への強い影響を示し、転移形成も強く阻害された（図７Ａ）。
【００８３】
確立された前立腺腫瘍でもＰＫＮ３を検証した。この実験では、すべての動物を通常食で４週間維持し、ＰＫＮ３がＤｏｘ食餌によってサイレンシングされる前に、細胞が原発腫瘍を形成するのを可能にした。４週間の通常食の後、ＰＫＮ３の阻害は、確立された腫瘍モデルにおける腫瘍成長および転移を妨げた（図７Ｂ）。
【実施例８】
【００８４】
ｉｎ ｖｉｖｏ乳癌モデル
ＰＫＮ３、ｐ１１０βおよびＣＫＩεを標的とするｓｈＲＮＡを発現するように、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（乳癌）細胞を操作した。Ｄｏｘ誘導のｓｈＲＮＡ発現は、７２時間後に、ＰＫＮ３、ｐ１１０βおよびＣＫＩεタンパク質レベルの効率的なノックダウンをもたらした（図８Ａ）。それぞれの細胞集団は、ＭＡＴＲＩＧＥＬ上に播種され、ＰＫＮ３発現のｓｈＲＮＡ媒介のノックダウンを有する細胞は、細胞外マトリックス上での増殖障害を示し、これは、ｐ１１０βのノックダウンより強いようであった。したがって、ＣＫＩεの誘導阻害は、この実験ではＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞で効果がなく、Ｄｏｘ処置およびｓｈＲＮＡ誘導の対照として働いた（図８Ｂ）。
【００８５】
乳癌におけるＰＫＮ３のｉｎ ｖｉｖｏ検証を行うために、同じ操作細胞系を用いて、正所性乳癌モデルを作製した。安定的なＰＫＮ３ ｓｈＲＮＡ ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞をＤｏｘの非存在下で培養し、動物の乳房脂肪パッドに注入した。動物を２つの群に分け、１群はＤｏｘで処置して、ｓｈＲＮＡ発現を誘導し、第２の群にはニセの処置を行った。腫瘍サイズを５５日目まで毎週測定した。図９に示す通り、Ｄｏｘ処置群のマウスは、乳癌成長への強い影響を示した。
【符号の説明】
【００８６】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌の治療に有用な化合物を同定する方法であって、
ａ．ｅｘ ｖｉｖｏにあり、かつＰＫＮ３ポリペプチドまたはその断片、ＲｈｏＣポリペプチドまたはその断片、およびＰＤＫ１ポリペプチドまたはその断片を含む細胞を試験化合物と接触させるステップと、
ｂ．試験化合物の存在下で形成され、かつ前記ＰＫＮ３ポリペプチド、前記ＲｈｏＣポリペプチドおよび前記ＰＤＫ１ポリペプチドを含む複合体の試験レベルを決定するステップと、
ｃ．ステップ（ｂ）で決定された試験レベルを参照値と比較するステップと
を含み、ステップ（ｂ）で決定された試験レベルとステップ（ｃ）の参照値との相違が、試験化合物が癌の治療潜在性を有することを示す方法。
【請求項２】
細胞が、ＰＣ３細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞およびＨｅＬａ細胞からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＰＫＮ３ポリペプチドが、ＦＬＡＧタグ、ＧＳＴタグおよびＭｙｃタグからなる群から選択される分子タグを含み、複合体が、ＰＫＮ３ポリペプチドをその分子タグによりプルダウンすることによって単離される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
参照値が、（ａ）試験化合物の非存在下で形成される、ＰＫＮ３ポリペプチドおよびＲｈｏＣポリペプチドを含む複合体のレベル、または（ｂ）試験化合物の存在下で形成される、ＰＫＮ３ポリペプチドおよびＲｈｏＣポリペプチドを含む複合体のレベルであり、ＰＫＮ３ポリペプチドまたはＰＤＫ１ポリペプチドがキナーゼデッドである、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
患者の癌を診断する方法であって、
ａ．患者から試料を取得するステップと、
ｂ．試料中のＰＫＮ３活性のレベルおよびＲｈｏＣ活性のレベルを決定し、それによって試験レベルを得るステップと、
ｃ．試験レベルを参照値と比較するステップと
を含み、試験レベルと参照値との相違が、癌が侵襲性である見込みを示す方法。
【請求項６】
癌治療に応答できる患者を同定する方法であって、
ａ．患者から試料を取得するステップと、
ｂ．試料中のＰＫＮ３活性のレベルおよびＲｈｏＣ活性のレベルを決定し、それによって試験レベルを得るステップと、
ｃ．試験レベルを参照値と比較するステップと
を含み、試験レベルと参照値との相違が、患者が癌治療に応答する見込みを示す方法。
【請求項７】
参照値が、非癌組織で決定される、ＰＫＮ３活性およびＲｈｏＣ活性のレベルを含む、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
試験レベルが参照値より大きい、請求項５から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
対象の癌治療処置レジメンの効果を決定する方法であって、
ａ．患者から第１の試料を取得するステップと、
ｂ．第１の試料中のＰＫＮ３活性のレベルおよびＲｈｏＣ活性のレベルを決定し、それによって第１のレベルを得るステップと、
ｃ．処置レジメンを対象に行うステップと、
ｄ．処置レジメンを行った後に、患者から第２の試料を取得するステップと、
ｅ．第２の試料中のＰＫＮ３活性のレベルおよびＲｈｏＣ活性のレベルを決定し、それによって第２のレベルを得るステップと、
ｆ．第１のレベルと第２のレベルを比較するステップと
を含み、第１のレベルと比較した、第２のレベルのＰＫＮ３活性およびＲｈｏＣ活性の両方の低減が、処置レジメンが患者の癌に対して有効であることを示す方法。
【請求項１０】
ＰＫＮ３活性が、（ｉ）ＰＫＮ３ポリペプチドまたはその断片をコードするＲＮＡの発現、（ｉｉ）ＰＫＮ３ポリペプチドまたはその断片の発現、（ｉｉｉ）ＰＫＮ３ポリペプチドのリン酸化、および（ｉｖ）グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ−３）由来のペプチドのリン酸化からなる群から選択される、請求項５から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ＲｈｏＣ活性が、（ｉ）ＲｈｏＣポリペプチドをコードするＲＮＡの発現、（ｉｉ）ＲｈｏＣポリペプチドの発現、（ｉｉｉ）ＰＫＮ３ポリペプチドのリン酸化、および（ｉｖ）グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ−３）のリン酸化からなる群から選択される、請求項５から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ＰＫＮ３ポリペプチドのリン酸化が、Ｔ８６０のＰＫＮ３ターンモチーフリン酸化部位に結合する抗体で検出される、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＰＮＫ３ポリペプチドが、（ａ）配列番号２６に少なくとも９５％同一なアミノ酸配列、または（ｂ）配列番号３６に少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
癌が、乳癌、卵巣癌、膵癌、胃癌、肝細胞癌、膀胱癌、結腸直腸癌、皮膚悪性黒色腫および前立腺癌（ＣａＰ）からなる群から選択される、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
Ｔ８６０のＰＫＮ３ターンモチーフリン酸化部位に結合する相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むポリペプチド。
【請求項１６】
モノクローナル抗体である、請求項１５に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
ＰＫＮ３活性を検出する薬剤、ＲｈｏＣ活性を検出する薬剤、標識およびパッケージを含むキット。
【請求項１８】
癌治療用化合物をさらに含む、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
ＰＰＲＣ複合体を不活性化するポリペプチドであって、
ａ．ＰＰＲＣ複合体がＰＫＮ３ポリペプチド、ＲｈｏＣポリペプチドおよびＰＤＫ１ポリペプチドを含み、
ｂ．ポリペプチドが（ｉ）ＲｈｏＣポリペプチドの、ＰＫＮ３ポリペプチドの認識ドメインに結合するドメイン、または（ｉｉ）ＰＫＮ３ポリペプチドの、ＲｈｏＣポリペプチドの認識ドメインに結合するドメインに結合し、
ｃ．前記ポリペプチドが（ｉ）ＰＰＲＣ複合体の形成を阻害するか、または（ｉｉ）ＰＰＲＣ複合体に関連するキナーゼ活性を阻害するポリペプチド。
【請求項２０】
ＰＫＮ３のＡＣＣ１、ＡＣＣ２およびＡＣＣ３からなる群から選択される少なくとも１つのＡＣＣドメインを含み、かつＰＫＮ３のキナーゼドメインを含まない、請求項１９に記載のポリペプチド。
【請求項１】
癌の治療に有用な化合物を同定する方法であって、
ａ．ｅｘ ｖｉｖｏにあり、かつＰＫＮ３ポリペプチドまたはその断片、ＲｈｏＣポリペプチドまたはその断片、およびＰＤＫ１ポリペプチドまたはその断片を含む細胞を試験化合物と接触させるステップと、
ｂ．試験化合物の存在下で形成され、かつ前記ＰＫＮ３ポリペプチド、前記ＲｈｏＣポリペプチドおよび前記ＰＤＫ１ポリペプチドを含む複合体の試験レベルを決定するステップと、
ｃ．ステップ（ｂ）で決定された試験レベルを参照値と比較するステップと
を含み、ステップ（ｂ）で決定された試験レベルとステップ（ｃ）の参照値との相違が、試験化合物が癌の治療潜在性を有することを示す方法。
【請求項２】
細胞が、ＰＣ３細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞およびＨｅＬａ細胞からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＰＫＮ３ポリペプチドが、ＦＬＡＧタグ、ＧＳＴタグおよびＭｙｃタグからなる群から選択される分子タグを含み、複合体が、ＰＫＮ３ポリペプチドをその分子タグによりプルダウンすることによって単離される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
参照値が、（ａ）試験化合物の非存在下で形成される、ＰＫＮ３ポリペプチドおよびＲｈｏＣポリペプチドを含む複合体のレベル、または（ｂ）試験化合物の存在下で形成される、ＰＫＮ３ポリペプチドおよびＲｈｏＣポリペプチドを含む複合体のレベルであり、ＰＫＮ３ポリペプチドまたはＰＤＫ１ポリペプチドがキナーゼデッドである、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
患者の癌を診断する方法であって、
ａ．患者から試料を取得するステップと、
ｂ．試料中のＰＫＮ３活性のレベルおよびＲｈｏＣ活性のレベルを決定し、それによって試験レベルを得るステップと、
ｃ．試験レベルを参照値と比較するステップと
を含み、試験レベルと参照値との相違が、癌が侵襲性である見込みを示す方法。
【請求項６】
癌治療に応答できる患者を同定する方法であって、
ａ．患者から試料を取得するステップと、
ｂ．試料中のＰＫＮ３活性のレベルおよびＲｈｏＣ活性のレベルを決定し、それによって試験レベルを得るステップと、
ｃ．試験レベルを参照値と比較するステップと
を含み、試験レベルと参照値との相違が、患者が癌治療に応答する見込みを示す方法。
【請求項７】
参照値が、非癌組織で決定される、ＰＫＮ３活性およびＲｈｏＣ活性のレベルを含む、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
試験レベルが参照値より大きい、請求項５から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
対象の癌治療処置レジメンの効果を決定する方法であって、
ａ．患者から第１の試料を取得するステップと、
ｂ．第１の試料中のＰＫＮ３活性のレベルおよびＲｈｏＣ活性のレベルを決定し、それによって第１のレベルを得るステップと、
ｃ．処置レジメンを対象に行うステップと、
ｄ．処置レジメンを行った後に、患者から第２の試料を取得するステップと、
ｅ．第２の試料中のＰＫＮ３活性のレベルおよびＲｈｏＣ活性のレベルを決定し、それによって第２のレベルを得るステップと、
ｆ．第１のレベルと第２のレベルを比較するステップと
を含み、第１のレベルと比較した、第２のレベルのＰＫＮ３活性およびＲｈｏＣ活性の両方の低減が、処置レジメンが患者の癌に対して有効であることを示す方法。
【請求項１０】
ＰＫＮ３活性が、（ｉ）ＰＫＮ３ポリペプチドまたはその断片をコードするＲＮＡの発現、（ｉｉ）ＰＫＮ３ポリペプチドまたはその断片の発現、（ｉｉｉ）ＰＫＮ３ポリペプチドのリン酸化、および（ｉｖ）グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ−３）由来のペプチドのリン酸化からなる群から選択される、請求項５から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ＲｈｏＣ活性が、（ｉ）ＲｈｏＣポリペプチドをコードするＲＮＡの発現、（ｉｉ）ＲｈｏＣポリペプチドの発現、（ｉｉｉ）ＰＫＮ３ポリペプチドのリン酸化、および（ｉｖ）グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ−３）のリン酸化からなる群から選択される、請求項５から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ＰＫＮ３ポリペプチドのリン酸化が、Ｔ８６０のＰＫＮ３ターンモチーフリン酸化部位に結合する抗体で検出される、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＰＮＫ３ポリペプチドが、（ａ）配列番号２６に少なくとも９５％同一なアミノ酸配列、または（ｂ）配列番号３６に少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
癌が、乳癌、卵巣癌、膵癌、胃癌、肝細胞癌、膀胱癌、結腸直腸癌、皮膚悪性黒色腫および前立腺癌（ＣａＰ）からなる群から選択される、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
Ｔ８６０のＰＫＮ３ターンモチーフリン酸化部位に結合する相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むポリペプチド。
【請求項１６】
モノクローナル抗体である、請求項１５に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
ＰＫＮ３活性を検出する薬剤、ＲｈｏＣ活性を検出する薬剤、標識およびパッケージを含むキット。
【請求項１８】
癌治療用化合物をさらに含む、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
ＰＰＲＣ複合体を不活性化するポリペプチドであって、
ａ．ＰＰＲＣ複合体がＰＫＮ３ポリペプチド、ＲｈｏＣポリペプチドおよびＰＤＫ１ポリペプチドを含み、
ｂ．ポリペプチドが（ｉ）ＲｈｏＣポリペプチドの、ＰＫＮ３ポリペプチドの認識ドメインに結合するドメイン、または（ｉｉ）ＰＫＮ３ポリペプチドの、ＲｈｏＣポリペプチドの認識ドメインに結合するドメインに結合し、
ｃ．前記ポリペプチドが（ｉ）ＰＰＲＣ複合体の形成を阻害するか、または（ｉｉ）ＰＰＲＣ複合体に関連するキナーゼ活性を阻害するポリペプチド。
【請求項２０】
ＰＫＮ３のＡＣＣ１、ＡＣＣ２およびＡＣＣ３からなる群から選択される少なくとも１つのＡＣＣドメインを含み、かつＰＫＮ３のキナーゼドメインを含まない、請求項１９に記載のポリペプチド。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６−１】
【図６−２】
【図７−１】
【図７−２】
【図８−１】
【図８−２】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６−１】
【図６−２】
【図７−１】
【図７−２】
【図８−１】
【図８−２】
【図９】
【公開番号】特開２０１０−２１３６９４（Ｐ２０１０−２１３６９４Ａ）
【公開日】平成２２年９月３０日（２０１０．９．３０）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１０−５３１４５（Ｐ２０１０−５３１４５）
【出願日】平成２２年３月１０日（２０１０．３．１０）
【出願人】（３０９０４０７０１）ワイス・エルエルシー (181)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年９月３０日（２０１０．９．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５３１４５（Ｐ２０１０−５３１４５）
【出願日】平成２２年３月１０日（２０１０．３．１０）
【出願人】（３０９０４０７０１）ワイス・エルエルシー (181)
【Ｆターム（参考）】
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