ＰＮＡダイマーおよびＰＮＡオリゴマー合成に関する方法、組成物およびライブラリー
本発明は、ＰＮＡダイマーおよびＰＮＡオリゴマー合成の分野に関係する。本出願は、固体支持体組成物を開示し、この組成物は、ａ）酸を形成する切断可能なリンカー；およびｂ）ＰＮＡダイマーであって、上記切断可能なリンカーにより上記固体支持体に切断可能に連結されたＮ末端の塩基不安定性保護基を含むＰＮＡダイマーを含む。ここで、上記固体支持体上のＰＮＡダイマーの積載が、１グラムあたり０．０８ｍｍｏｌより大きいか、またはそれに等しい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の開示）
（Ｉ．本明細書で用いられる特定の略語のリスト）
Ｆｍｏｃ＝９−フルオレニルメトキシカルボニル
Ｂｈｏｃ＝ベンズヒドロキシカルボニル
Ｍｍｔ＝モノメトキシトリチル
ＴＦＡ＝トリフルオロ酢酸
ｂｏｃまたはｔ−ｂｏｃ＝ｔｅｒ−ブトキシカルボニル
ＰＡＬ＝５−（４’−アミノメチル−３’，５’−ジメトキシフェノキシ）吉草酸
ＭＢＨＡ＝メトキシベンズヒドリルアミン
ＤＨＰＰ＝４−（１’、１’−ジメチル−１’−ヒドロキシプロピル）−フェノキシアセチル−アラニル−アミノメチル樹脂
ＤＮＡ＝２’−デオキシリボ核酸
ＲＮＡ＝リボ核酸
ＰＮＡ＝ペプチド核酸
ＰＥＧ＝ポリエチレングリコール
ＤＢＵ＝１，８−ジアザビシクロ−［５．４．０］−ウンデク−７−エン
ＭｅＯＨ＝メタノール
ＡＣＮ＝アセトニトリル
（ＩＩ．定義）
本明細書を解釈する目的のために以下の定義が適用され、そして適切な場合はつねに、単数で用いられる用語は複数をも含み、そしてその逆も同じである。
【０００２】
ａ．本明細書で用いられるとき、「核酸塩基」は、核酸技術を利用するか、またはペプチド核酸技術を利用し、それによって核酸に配列特異的に結合し得るポリマーを生成する者に共通して公知である天然に存在するヘテロ環成分および天然に存在しないヘテロ環成分を意味する。適切な核酸塩基の非制限的な例は：アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、５−プロピニル−ウラシル、２−チオ−５−プロピニル−ウラシル、５−メチルシトシン、プソイドイソシトシン、２−チオウラシルおよび２−チオチミン、２−アミノプリン、Ｎ９−（２−アミノ−６−クロロプリン）、Ｎ９−（２，６−ジアミノプリン）、ヒポキサンチン、Ｎ９−（７−デアザ−グアニン）、Ｎ９−（７−デアザ−８−アザ−グアニン）およびＮ８−（７−デアザ−８−アザ−アデニン）を含む。適切な核酸塩基のその他の非制限的な例は、Ｂｕｃｈａｒｄｔら（米国特許第６，３５７，１６３号）の図２（Ａ）および２（Ｂ）に示されるような核酸塩基を含む。
【０００３】
ｂ．本明細書で用いられるとき、「核酸塩基配列」は、オリゴマーまたポリマー中の核酸塩基含有サブユニットの任意のセグメントを意味する。適切なオリゴマーまたはポリマーの非制限的な例は、オリゴデオキシヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）、オリゴリボヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ＰＮＡキメラ、ＰＮＡオリゴマー、核酸アナログおよび／または核酸模倣物を含む。
【０００４】
ｃ．本明細書で用いられるとき、「標的配列」は、決定されることが求められるポリ核酸塩基鎖の核酸塩基配列である。標的配列の性質は、制限ではないことが理解されるべきである。標的配列を含むポリ核酸塩基鎖は、任意の供給源から提供され得る。例えば、この標的配列は、核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）、ＰＮＡ、核酸アナログまたはその他の核酸模倣物の一部として存在し得る。この標的配列を含むサンプルは、天然から提供され得るか、または、それは、製造プロセスから合成または供給され得る。標的配列が核酸のサブ配列であるとき、この核酸は、任意の供給源か得られ得る。例えば、この核酸は、核酸増幅プロセスから生成され得るか、細胞または生物中に含まれ得るか、またはそうでなければ細胞または生物から抽出され得る。この核酸の供給源であり得る非限定的な核酸増幅プロセスの例は、制限されずに、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、Ｑ−βレプリカーゼ増幅（Ｑ−β）およびローリングサークル増幅（ＲＣＡ）を含む。
【０００５】
ｄ．本明細書で用いられるとき、「ポリ核酸塩基鎖」は、核酸塩基含有サブユニットを含む単一ポリマー鎖を意味する。例えば、二本鎖核酸の一本鎖ポリマー鎖はポリ核酸塩基鎖である。
【０００６】
ｅ．本明細書で用いられるとき、「核酸」は、ヌクレオチド、またはそのアナログから形成される骨格を有する核酸塩基配列含有オリゴマーまたはポリマーである。好ましい核酸はＤＮＡおよびＲＮＡである。任意の疑いを避けるために、ＰＮＡは、核酸模倣物であり、そして核酸または核酸アナログではない。
【０００７】
ｆ．本明細書で用いられるとき、「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」は、２つ以上のＰＮＡサブユニット（残基）を含む任意のオリゴマーまたはポリマーを意味し、制限されずに、米国特許第５，５３９，０８２号、同第５，５２７，６７５号、同第５、６２３，０４９号、同第５、７１４，３３１号、同第５，７１８，２６２号，同第５、７３６，３３６号、同第５，７７３，５７１号、同第５，７６６，８５５号、同第５，７８６、４６１号、同第５，８３７，４５９号、同第５，８９１，６２５号、同第５，９７２，６１０号、第同５，９８６，０５３号、同第６，１０７，４７０号、同第６，２０１，１０３号、同第６，２２８，９８２号および同第６，３５７，１６３号で言及されるか、または請求の範囲に記載の任意のオリゴマーまたはポリマーセグメントを含み；これらすべては、本明細書中に参考として援用される。用語「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」はまた、以下の刊行物中に記載のような核酸模倣物の２つ以上のサブユニットを含む任意のオリゴマーまたはポリマーに適用される：Ｌａｇｒｉｆｆｏｕｌら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ、４：１０８１〜１０８２（１９９４）；Ｐｅｔｅｒｓｅｎら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ、６：７９３〜７９６（１９９６）；Ｄｉｄｅｒｉｃｈｓｅｎら、Ｔｅｔｔ．Ｌｅｔｔ．３７：４７５〜４７８（１９９６）；Ｆｕｊｉｉら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．７：６３７〜３２７（１９９７）；Ｊｏｒｄａｎら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．７：６８７〜６９０（１９９７）；Ｋｒｏｔｚら、Ｔｅｔｔ．Ｌｅｔｔ．３６：６９４１〜６９４４；Ｌａｇｒｉｆｆｌｏｕｌら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．４：１０８１〜１０８２（１９９４）；Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈｅｎ、Ｕ．、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ、７：１７４３〜１７４６（１９９７）；Ｌｏｗｅら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．１、（１９９７）１：５３９〜５４６；Ｌｏｗｅら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．１１：５４７〜５５４（１９９７）；Ｌｏｗｅら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．１１：５５５〜５６０（１９９７）；Ｈｏｗａｒｔｈら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６２：５４４１〜５４５０（１９９７）；Ａｌｔｍａｎｎ、Ｋ−Ｈら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ、７：１１１９〜１１２２（１９９７）；Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈｅｎ、Ｕ．、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．、８：１６５〜１６８（１９９８）；Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈｓｅｎら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．、３７：３０２〜３０５（１９９８）；Ｃａｎｔｉｎら、Ｔｅｔｔ．Ｌｅｔｔ．、４２１１〜４２１４（１９９７）；Ｃｉａｐｅｔｔｉら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、５３：１１６７〜１１７６（１９９７）；Ｌａｇｒｉｆｆｏｕｌｅら、Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．、３：９１２〜９１９（１９９７）；Ｋｕｍａｒら、Ｏｒｇａｎｉｃ Ｌｅｔｔｅｒｓ３（９）：１２６９〜１２７２（２００１）；およびＷＯ９６／０４０００に開示のようなＳｈａｈらのＰｅｐｔｉｄｅ−Ｂａｓｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｍｉｍｉｃｓ（ＰＥＮＡＭ）。
【０００８】
特定の実施形態では、「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」は、以下の式の２つ以上の共有結合したサブユニットを含むオリゴマーまたはポリマーセグメントである：
【０００９】
【化１】
ここで、各Ｊは、同一であるか、または異なり、そして、Ｈ、Ｒ１、ＯＲ１、ＳＲ１、ＮＨＲ１、ＮＲ１２、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩからなる群から選択される。各Ｋは、同一であるか、または異なり、そして、Ｏ、Ｓ、ＮＨおよびＮＲ１からなる群から選択される。各Ｒ１は、同一であるか、または異なり、そして、必要に応じてヘテロ原子を含み得る１〜５の炭素原子を有するアリル基、または置換もしくは非置換アリール基である。各Ａは、単一の結合、式；−（ＣＪ２）５−の基、および式；−（ＣＪ２）５Ｃ（Ｏ）−からなる群から選択され、ここで、Ｊは、上記で規定され、そして各ｓは１〜５の整数である。各ｔは１または２であり、そして各ｕは１または２である。各Ｌは、同一であるか、または異なり、そして、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、５−プロピニル−ウラシル、２−チオ−５−プロピニル−ウラシル、５−メチルシトシン、プソイドイソシトシン、２−チオウラシルおよび２−チオチミン、２−アミノプリン、Ｎ９−（２−アミノ−６−クロロプリン）、Ｎ９−（２，６−ジアミノプリン）、ヒポキサンチン、Ｎ９−（７−デアザ−グアニン）、Ｎ９−（７−デアザ−８−アザ−グアニン）およびＮ８−（７−デアザ−８−アザ−アデニン）、その他の天然に存在する核酸塩基アナログまたはその他の天然に存在しない核酸塩基からなる群から独立に選択される。
【００１０】
その他の特定の実施形態では、ＰＮＡサブユニットは、Ｎ−［２−（アミノエチル）］グリシン骨格のＮ−α−グリシン窒素にメチレンカルボニル結合（これは、現在、ペプチド核酸サブユニットの最も一般的に用いられる形態である）により付着した天然に存在するか、または天然に存在しない核酸塩基からなり；これは、現在、ペプチド核酸サブユニットの最も一般的に用いられる形態である。
【００１１】
ｇ．本明細書で用いられるとき、「末端保護基」は、ＰＮＡモノマーまたはＰＮＡオリゴマーの末端求核官能基に共有結合した保護基を意味する。例えば、ＰＮＡモノマーを連結することで用いられ得るＰＮＡモノマーまたはオリゴマーの末端一級アミンは、末端保護基で代表的に保護される末端求核官能基である。
【００１２】
ｈ．本明細書で用いられるとき、「核酸塩基保護基」は、ＰＮＡモノマーまたはオリゴマーの核酸塩基の官能基に共有結合し、特定の化学反応（例えば、連結／縮合またはカップリング）の間に官能基を非反応性にする保護基を意味する。例えば、代表的には、アデニン、シトシンおよびグアニンの環外アミノ基は、ＰＮＡオリゴマーの化学的アセンブリの間に適切な保護基で保護される。しかし、核酸塩基は、そうである必要はないが、本明細書中に記載されるような連結／縮合反応の間に保護され得る。
【００１３】
ｉ．本明細書で用いられるとき、「ＰＮＡダイマー」は、一緒に共有結合した２つのＰＮＡサブユニットを意味する。このＰＮＡダイマーは、完全に保護されるか、部分的に保護されるか、または保護されなくてもよい。完全に保護されるとは、本発明者らは、代表的にはＰＮＡオリゴマーの固相化学的アセンブリの間に保護される、このＰＮＡダイマーのすべての反応性官能基が、末端保護基および／または核酸塩基保護基で保護されていることを意味する。部分的に保護されるとは、本発明者らは、代表的にはＰＮＡオリゴマーの固相化学的アセンブリの間に保護される、このＰＮＡダイマーの少なくとも１つの反応性官能基が、保護基を含まないことを意味する。保護されないとは、通常、ＰＮＡオリゴマーの固相化学的アセンブリの間に保護される、このＰＮＡダイマーのすべての反応性官能基が、保護基を含まないことを意味する。代表的にはＰＮＡオリゴマーの固相化学的アセンブリの間に保護されるＰＮＡダイマーの反応性官能基の例は、このオリゴマーのＮ末端アミノ基および核酸塩基の環外アミノ基を含む。
【００１４】
ｊ．本明細書で用いられるとき、「Ｆｍｏｃ（Ｂｈｏｃ）ＰＮＡモノマー」または「Ｆｍｏｃ（Ｂｈｏｃ）モノマー」は、Ｎ末端アミン基を保護するためにＦｍｏｃ保護基を含むＰＮＡモノマーを、適用可能である場合、核酸塩基の環外アミン基の１つ以上を保護するためのＢｈｏｃ保護基を意味し、制限されずに、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡから市販され、入手可能なようなＦｍｏｃモノマーを含む。疑いを避けるために、Ｆｍｏｃ（Ｂｈｏｃ）ＰＮＡモノマーは、Ｆｍｏｃチミン、Ｆｍｏｃウラシル、Ｆｍｏｃ２−チオチミンまたはＦｍｏｃ２−チオウラシルモノマーを含むことが、これらモノマーは、Ｂｈｏｃ保護基が必要とする環外アミン基を所有しないという事実にかかわらず、意図される。
【００１５】
ｋ．本明細書で用いられるとき、Ｍｍｔ／ＢｈｏｃＰＮＡモノマーは、Ｎ末端アミン基を保護するためのＭｍｔ保護基を、そして適用可能である場合、核酸塩基の環外アミン基の１つ以上を保護するためのＢｈｏｃ保護基（実施例３を参照のこと）を含むＰＮＡモノマーを意味する。疑いを避けるために、Ｍｍｔ／ＢｈｏｃＰＮＡモノマーは、Ｍｍｔチミン、Ｍｍｔウラシル、Ｍｍｔ２−チオチミンまたはＭｍｔ２−チオウラシルモノマーを含むことが、これらモノマーは、Ｂｈｏｃ保護基が必要とする環外アミン基を所有しないという事実にかかわらず、意図される。
【００１６】
ｌ．本明細書で用いられるとき、「ＰＮＡ」キメラは、２つ以上のＰＮＡサブユニットおよび１つ以上の核酸サブユニット（すなわち、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を含むオリゴマー、またはそのアナログを意味し、これらは、異なるクラスのサブユニットから選択され、しかも共有結合またはリンカーによって結合されている。例えば、ＰＮＡ／ＤＮＡキメラは、化学的結合またはリンカーにより、少なくとも１つの２’−デオキシリボ核酸サブユニットに共有結合された少なくとも２つのＰＮＡサブユニットを含み得る（ＰＮＡ／ＤＮＡキメラ調製に関する例示の方法および組成物については、ＷＯ９６／４０７０９を参照のこと）。
【００１７】
ｍ．本明細書で用いられるとき、「酸を形成する切断可能なリンカー」は、固体支持体に付着され、ポリマーの化学的アセンブリの間に、固体支持体にオリゴマーまたはポリマー（例えば、ＰＮＡ）をこの支持体に切断可能に連結する成分を意味し、そしてここで、この共有結合は、化学的処置によって切断され得、それによって、オリゴマーまたはポリマーを離脱し（一般に、化学的アセンブリが終了した後）、ここで、この離脱したポリマーは、固体支持体からの離脱に際し、その前の付着の点で酸成分を含む。例えば、ＰＮＡ Ｃ末端酸オリゴマーは、ＰＮＡオリゴマーが酸を形成する切断可能なリンカーを有する固体支持体から離脱されるとき、形成されるＣ末端酸基を含むＰＮＡオリゴマーである。例えば、ＰＮＡオリゴマーのこのＣ末端酸基は、Ｃ末端カルボン酸であり得るか、またはＣ末端スルホン酸であり得る。
【００１８】
ｈ．本明細書で用いられるとき、用語「標識」、「レポーター成分」または「検出成分」は、交換可能であり、そしてオリゴマーまたはオリゴマーブロックに付着され得る成分をいい、またはそうでなければ、レポーターシステムで用いられ得、それによって、器具または方法によってオリゴマーを検出可能にする。例えば、標識は、（ｉ）検出可能なシグナルを提供する；（ｉｉ）第１または第２の標識によって提供される検出可能なシグナルを改変するための第２の標識と相互作用する；または（ｉｉｉ）捕獲機能、すなわち、疎水性親和性、抗体／抗原、イオン的複合体化、を与える任意の成分であり得る。
【００１９】
ｏ．本明細書で用いられるとき、「配列特異的」は、水素結合を通じた塩基対合によるハイブリダイゼーションを意味する。標準的な塩基対合の非制限的な例は、チミンとのアデニン塩基対合、およびシトシンとのグアニン塩基対合を含む。塩基対合モチーフのその他の非制限的な例は、制限されずに：以下のいずれかとのアデニン塩基対合：５−プロピニル−ウラシル、２−チオ−５−プロピニル−ウラシル、２−チオウラシルまたは２−チオチミン；以下のいずれかとのグアニン塩基対合：５−メチルシトシンまたはプソイドイソシトシン；以下のいずれかとのシトシン塩基対合：ヒポキサンチン、Ｎ９−（７−デアザ−グアニン）またはＮ９−（７−デアザ−８−アザ−グアニン）；以下のいずれかとのチミンまたはウラシル塩基対合：２−アミノプリン、Ｎ９−（２−アミノ−６−クロロプリン）またはＮ９−（２，６−ジアミノプリン）；およびＮ８−（７−デアザ−８−アザ−アデニン）、汎用塩基である、例えば以下のいずれかのような任意のその他の核酸塩基との塩基対合：アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、５−プロピニル−ウラシル、２−チオ−５−プロピニル−ウラシル、５−メチルシトシン、プソイドイソシトシン、２−チオウラシルおよび２−チオチミン、２−アミノプリン、Ｎ９−（２−アミノ−６−クロロプリン）、Ｎ９−（２，６−ジアミノプリン）、ヒポキサンチン、Ｎ９−（７−デアザ−グアニン）、Ｎ９−（７−デアザ−８−アザ−グアニン）またはＮ８−（７−デアザ−８−アザ−アデニン）（Ｓｅｅｌａら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ、Ｒｅｓ．：２８（１７）：３２２４〜３２３２（２０００）を参照のこと）を含む。
【００２０】
ｐ．本明細書で用いるとき、「縮合条件」または「連結条件」は、選択された縮合／連結化学に従って２つのＰＮＡオリゴマーを縮合／連結するために適切な条件を意味する。
【００２１】
ｑ．本明細書で用いるとき、「連結」および「縮合」は、交換可能であり、そして２つのオリゴマーブロックを共有結合するプロセスをいい、それによって細長いＰＮＡオリゴマーまたはキメラを形成する。この連結／縮合化学は、これら方法の限定ではないことを理解すべきである。細長いＰＮＡオリゴマーを形成するために適切な多くの縮合／連結化学の非限定的な例は、図８ａおよび８ｂを参照して本明細書中に記載されている。
【００２２】
ｒ．本明細書で用いられるとき、「クエンチング」は、その機構にかかわらず、クエンチャー成分にともなうエネルギー転移により引き起こされる蛍光レポーター成分の蛍光における減少を意味する。
【００２３】
ｓ．本明細書で用いられるとき、「固体支持体」または「固体キャリア」は、その上で、ＰＮＡモノマー、ＰＮＡダイマー、ＰＮＡオリゴマーまたはＰＮＡキメラが合成、付着、連結またはそうでなければ固定化される任意の固相材料を意味する。固体支持体は、「樹脂」、「合成支持体」、「固相」、「表面」および／または「支持体」の用語を包含する。固体支持体は、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフルオロエチレン、ポリエチレンオキシ、およびポリアクリルアミド、ならびにそれらのコポリマーおよびグラフトのような有機ポリマーを含み得る。固体支持体はまた、ガラス、シリカ、制御ポアガラス（ＣＰＧ）、または逆相シリカのような無機物であり得る。固体支持体の形態は、ビーズ、スフェア、粒子、顆粒、ゲル、または表面の形状であり得る。表面は、平面状、実施的に平面状、または非平面であり得る。固体支持体は、多孔性または非多孔性であり得、そして膨潤性または非膨潤性特徴を有し得る。固体支持体は、ウェル、窪みまたはその他のコンテナ、ベッセルの形態、機能または位置に構成され得る。複数の固体支持体は、試薬のロボット送達のために、またはレーザー照射および共焦点または偏向光収集による走査を含む検出手段によりアドレス可能な、種々の位置にあるアレイにある形態であり得る。
【００２４】
ｔ．本明細書で用いられるとき、「立体的に妨害された固体支持体」は、立体的に妨害された切断可能なリンカーまたは立体的に阻害された酸を形成する切断可能なリンカーを含む固定支持体を意味する。立体的に妨害されるとは、本発明者らは、リンカーが、固体支持体上でアセンブルされるリンカーとオリゴマーとの間で切断可能な共有結合を形成する二級または三級原子を含むリンカーを意味する。立体的に妨害された固体支持体の非限定的な例は：トリチルクロライド樹脂（トリチル−Ｃｌ、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、Ｐ／Ｎ ０１−６４−００７４）、２−クロロトリチルクロライド樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、Ｐ／Ｎ ０１−６４−００２１）、ＤＨＰＰ（Ｂａｃｈｅｍ、Ｐ／Ｎ Ｑ−１７５５）、ＭＢＨＡ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐ／Ｎ ４００３７７）、４−メチルトリチルクロライド樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、Ｐ／Ｎ ０１−６４−００７５）、４−メトキシトリチルクロライド樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、Ｐ／Ｎ ０１−６４−０３４５）、Ｒｉｎｋ酸樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ Ｐ／Ｎｓ ０１−６４−０３８０、０１−６４−０２０２）、ＮｖａＳｙｎ ＴＧＴアルコール樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、Ｐ／Ｎ０１−６４−００７４）を含む。
【００２５】
ｕ．本明細書で用いられるとき、「支持体に結合」は、固体支持体上またはそれに固定化されることを意味する。
【００２６】
ｖ．本明細書で用いられるとき、「アレイ」または「マイクロアレイ」は、固体支持体上に存在するか、またはベッセルの整列中にあるオリゴマーの所定の空間的整列を意味する。特定のアレイフォーマットは、「チップ」または「バイオチップ」と称される（Ｍ．Ｓｃｈｅｎａ編、Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｂｉｏｃｈｉｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅ Ｂｏｏｋｓ、Ｅａｔｏｎ Ｐｕｓｌｉｓｈｉｎｇ、Ｎａｔｉｋ、ＭＡ（２０００））。アレイは、例えば、２〜約１２の低密度数、例えば、約１００以上の位置の中密度、例えば、千以上の高密度のアドレス可能な位置を含み得る。代表的には、このアレイフォーマットは、製作、取り扱い、配置、積み上げ、試薬導入、検出、および貯蔵を可能にする幾何学的に規則的な形状である。このアレイは、行およびカラムフォーマットの形態であり得、各位置の間は規則的な間隔である。あるいは、これらの位置は、束になり、混合されるか、または均等化処理またはサンプリングのために均一にブレンドされ得る。アレイは、各位置が、試薬の高スループット取り扱い、ロボット送達、マスキング、またはサンプリングのため、あるいはレーザー照射および共焦点または偏向光収集による走査を含む検出手段によってアドレス可能であるような、複数のアドレス可能な位置を含み得る。
【００２７】
ｗ．本明細書で用いられるとき、「ブロック」、「オリゴマーブロック」または「ブロックオリゴマー」は交換可能であり、そしてすべては、第２の適切な改変されたＰＮＡオリゴマーまたはキメラに連結されるように設計され、かつ利用可能であり、それによって細長いオリゴマーを調製するＰＮＡオリゴマーまたはキメラを意味する。連結／縮合されるオリゴマーまたはブロックは、非標識であり得るか、１つ以上のレポーター成分で標識され得るか、および／または１つ以上の保護または非保護官能基を含み得る。細長いオリゴマーに関し、ブロックはまた、この細長いオリゴマーを形成するために用いられたブロックから由来する細長いオリゴマーの一部をいうために用いられ得る。この細長いオリゴマーはまた、このオリゴマーをさらに伸長する連結／縮合反応におけるブロックとして用いられ得る。
【００２８】
ｘ．本明細書で用いられるとき、ポリマーおよびオリゴマーは、長さが２つ以上のサブユニットのＰＮＡオリゴマーまたはＰＮＡキメラについていうとき、本質的に交換可能である。
【００２９】
ｙ．本明細書で用いられるとき、「ネイティブオリゴマー」は、細長いオリゴマーの２つのオリゴマーブロックを分離するリンカーを含まないＰＮＡオリゴマーまたはＰＮＡキメラをいう。従って、ネイティブオリゴマーは、たとえキメラであっても、連結の点で改変されていないＰＮＡ骨格を含み、そしてそれ故、ＰＮＡモノマーのデノボの化学的アセンブリを用いて産生され得るものから区別不能である。
【背景技術】
【００３０】
（ＩＩＩ．一般）
（化学的アセンブリによるＰＮＡオリゴマー合成）
ＰＮＡの化学的アセンブリのための方法は周知である（米国特許第５，５３９，０８２号、同第５，５２７，６７５号、同第５、６２３，０４９号、同第５、７１４，３３１号、同第５，７１８，２６２号，同第５、７３６，３３６号、同第５，７７３，５７１号、同第５，７６６，８５５号、同第５，７８６、４６１号、同第５，８３７，４５９号、同第５，８９１，６２５号、同第５，９７２，６１０号、第同５，９８６，０５３号、同第６，１０７，４７０号、同第６，２０１，１０３号、同第６，２２８，９８２号および同第６，３５７，１６３号を参照のこと；これらすべては本明細書中に参考として援用される（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅもまた参照のこと））。ＰＮＡ合成方法のための一般的参照としてはまた、Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ；Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｈｏｒｚｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｏｒｆｏｌｋ Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９９）を参照のこと。
【００３１】
ペプチド核酸の支持体に結合した自動化化学的アセンブリのための化学および器具は、今や、市販され入手可能である。標識または非標識ＰＮＡオリゴマーの両方は、同様に、カスタムＰＮＡオリゴマーの市販ベンダーから入手可能である。ＰＮＡの化学的アセンブリは、固相ペプチド合成に類似であり、ここで、アセンブリの各サイクルにおいて、このオリゴマーは、成長するポリマーに付加される次のシントンと縮合される反応性アルキルアミノ末端を所有している。
【００３２】
ＰＮＡは、マイクロモル以下からミリモルまたはそれ以上までの任意のスケールで合成され得る。ＰＮＡは、ＸＡＬまたはＰＡＬ支持体を用いるＥｘｐｅｄｉｔｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上で、Ｆｍｏｃ（Ｂｈｏｃ）、ｔＢｏｃ／Ｚ、またはＭｍＴ保護基モノマーを用いて、２μモルスケールで首尾よく合成され得る。あるいは、ＭＢＨＡ支持体とともにＭｏｄｅｌ ４３３Ａ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）が用いられ得る。さらに、多くのその他の自動化合成機および合成支持体が利用され得る。標準的なペプチド化学が利用されるので、天然および非天然アミノ酸が、慣用的にＰＮＡオリゴマー中に取り込まれ得る。ＰＮＡは、ポリアミドであるので、それは、Ｃ末端（カルボキシル末端）およびＮ末端（アミノ末端）を有する。標的配列への逆平行結合（好ましい配向）のために適切なハイブリダイゼーションプローブの設計の目的のために、プローブするＰＮＡプローブの核酸塩基配列のＮ末端は、相当するＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドの５’ヒドロキシル末端の等価物である。
【００３３】
（連結／縮合によるＰＮＡオリゴマー合成）
連結／縮合反応で用いられるとき、選択された連結化学の性質が考慮されるべきである。単純さのために、本発明者らは、しばしば、連結／縮合反応で用いられるオリゴマーの１つを、末端オリゴマーまたは末端ブロックと、そしてその他を、縮合オリゴマーまたは縮合ブロックと称する。この区別は、一般に、異なるブロック間を、特にそれらが同じ核酸塩基配列を含む場合を区別することを除いて関係がない。しはしば、少なくとも連結で用いられる官能基の性質は、末端および縮合オリゴマーブロックについて異なる。なぜなら、それらは、異なる連結化学薬品を収容するように設計され得るからである。例えば、１つのオリゴマーブロックはＣ末端酸基を含み得、そしてその他はＮ末端アミン基を含み得、ここで、縮合／連結反応の産物は、細長いＰＮＡオリゴマーまたはキメラを形成するアミド結合である。
【００３４】
しかし、オリゴマーが複数の連結によって伸長されるべきとき、本発明者らは、一般に、末端オリゴマーブロックを、第１の連結から、または直前に進行する連結ステップから産生されるオリゴマーブロックという。連結化学薬品のいくつかの非制限的な例は、図８ａおよび８ｂに示されている。慣用的実験および本明細書中に含まれる説明を用い、当業者は、細長いＰＮＡオリゴマーまたはＰＮＡキメラを容易に調製し得る。
【００３５】
末端ブロックは、比較的非反応性であるＣ末端アミドを含み得る。対照的に、縮合ブロックは、連結反応に適切であるＣ末端を含み得る。しかし、縮合化学の性質に依存して、オリゴマーのこのＣ末端は、Ｃ末端酸を含み得る。オリゴマーの末端への連結／縮合される官能基は、縮合／連結化学の性質に依存して末端保護基の付加が必要であってもなくてもよい。オリゴマーブロックは、しばしば、それら自身がデノボ方法で調製されるので、そして適切な市販の試薬および器具が、Ｃ末端アミノ酸またはＣ末端アミドを含むＰＮＡオリゴマーの産生のために利用可能であるために、当業者は、所望のＣ末端形態のオリゴマーブロックを容易に調製し得る。
【００３６】
Ｎ末端に関しては、ここで再び、正確な形態は、選択された連結化学の性質、およびオリゴマーが縮合オリゴマーブロックであるか、または末端オリゴマーブロックであるか否かに依存し得る。オリゴマーが末端ブロックである場合、このＮ末端は、反応性官能基（例えば、Ｎ末端アミン基）を含み得、その一方、オリゴマーが縮合オリゴマーブロックである場合、このＮ末端はキャップされ得る。キャッピングの非限定的な例は、Ｎ末端を標識でラベルすること、またはそうでなければ、それを、アセチルのような比較的非反応性である成分と反応することを含む。Ｎ末端が連結反応に含められる場合、それは、代表的には、遊離のアミンとして存在する。オリゴマーブロックは、しばしば、それら自身がデノボ方法で調製されるので、そして適切な市販の試薬および器具が、ＰＮＡオリゴマーの産生のために利用可能であるために、当業者は、所望のＣ末端形態のオリゴマーブロックを容易に調製し得る。
【００３７】
連結のための末端の改変に加え、このオリゴマーブロックは、改変および／または適正に保護され得、それによって、標識または表面への付着のための官能基を取り込む。このような官能基は、１）オリゴマー合成化学（例えば、標識を破壊し得るために必要な厳しい脱保護条件）、選択された縮合／連結化学（例えば、所望の標識の官能基が、縮合化学を妨害し得る）および官能基の意図された使用（例えば、それが、標識のため、または固体支持体への付着のために意図されているか否か）のような因子に依存して連結の前または後で利用され得る。
【００３８】
（ＰＮＡ標識／改変）
ＰＮＡを標識するための非制限的な方法は、米国特許第６，１１０，６７６号、同第６，２８０，９６４号、同第６，３５５，４２１号、ＷＯ９９／２１８８１、米国特許第６，３６１，９４２号、ＷＯ／４９２９３および米国特許第６，４４１，１５２号（これらすべては参考として本明細書中に援用される）、本明細書の実施例のセクション中に記載されているか、またはそうでなければ、ＰＮＡ合成およびペプチド合成の技術分野で周知である。ＰＮＡを標識するための方法はまた、Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ；Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ、Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｏｒｆｏｌｋ、Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９９）中で論議されている。ＰＮＡオリゴマーを標識するための非限定的な例は、以下で論議される。
【００３９】
アセンブリの合成化学は本質的に同じであるので、ペプチドを標識するために従来用いられている任意の方法が、しばしば、ＰＮＡオリゴマーを標識することを行うよう適合され得る。一般に、オリゴマーまたはポリマーのＮ末端は、カルボン酸基または活性化カルボン酸基を有する部分との反応により標識され得る。１つ以上のスペーサー成分が、必要に応じて、標識成分とオリゴマーのサブユニットを含む核酸塩基との間に導入され得る。一般に、このスペーサー成分は、標識反応を実施する前に導入され得る。所望であれば、このスペーサーは、標識内に埋包され得、そしてそれによって標識反応の間に取り込まれる。
【００４０】
代表的には、ポリマーのＣ末端は、標識成分または官能基成分を、その上にＰＮＡオリゴマーがアセンブルされるべき支持体と最初に縮合することにより標識され得る。次いで、ＰＮＡオリゴマーのシントンを含む第１の核酸塩基が、標識成分または官能基成分と縮合され得る。あるいは、１つ以上のスペーサー成分（例えば、８−アミノ−３，６−ジオキサオクタノン酸；「Ｏ−リンカー」）は、標識成分または官能基成分と、オリゴマーの第１の核酸塩基サブユニットとの間に導入され得る。一旦、調製されるべき分子が完全にアセンブル、標識および／または改変されると、それは、標準的な方法を用いて、支持体から切断され、脱保護され、および精製される。
【００４１】
例えば、標識成分または官能基成分は、リジン誘導体であり得、ここで、ε−アミノ基は、保護されたまたは保護されない官能基であるか、またはそうでなければレポーター成分で改変される。レポーター成分は、５（６）−カルボキシフルオロセイン、色素１、色素２のような蛍光発色団または４−（（４−ジメチルアミノ）フェニル）アゾ）安息香酸（ダブシル）のようなクエンチャー成分であり得る。リジン誘導体の固体支持体との縮合は、標準的な縮合（ペプチド）化学を用いて達成され得る。リジン誘導体のα−アミノ基は、次いで、脱保護され、そして核酸塩基配列アセンブリが、最初のＰＮＡシントンのリジンアミノ酸のα−アミノ基との縮合により開始される。上記で論議されたように、スペーサー成分が、必要に応じて、リジンアミノ酸と第１のＰＮＡシントンとの間に、第１のＰＮＡシントンの縮合前に、適切なスペーサー（例えば、Ｆｍｏｃ−８−アミノ−３，６−ジオキサオクタノエン酸）をリジンアミノ酸と縮合することにより挿入され得る。
【００４２】
あるいは、アセンブルされ、または部分的にアセンブルされたポリマー上の官能基は、オリゴマーがなお結合した支持体にある間導入され得る。次いで、官能基は、任意の目的に利用可能であり、オリゴマーを支持体に付着されること、またはそうでなければレポーター成分と反応されることのいずれかに用いられることを含み、連結後反応されることを含む（連結後とは、本発明者らは、これらオリゴマーが１つ以上の縮合／連結反応の実施により完全に形成された後の点を意味する）。この方法は、しかし、適切に保護された官能基が、アセンブリの間に取り込まれ得、その結果、アセンブリが終了した後、反応性官能性が生成され得ることを必要とする。従って、保護された官能基は、オリゴマー末端、オリゴマー内部を含む、オリゴマーまたはブロック内の任意の位置に付着され得る。
【００４３】
例えば、リジンのε−アミノ基は、４−メチル−トリフェニルメチル（Ｍｔｔ）、４−メトキシ−トリフェニルメチル（ＭＭＴ）または４、４’−ジメトキシトリフェニルメチル（ＤＭＴ）保護基で保護され得る。このＭｔｔ、ＭＭｔまたはＤＭＴ基は、温和な酸性条件下の合成樹脂の処理によりオリゴマー（市販され利用可能なＦｍｏｃＰＮＡモノマーおよびＰＡＬリンカーを有するポリスチレン支持体を用いてアセンブルされた；ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡ）から除去され得る。結果として、ドナー成分、アクセプター成分またはその他のレポーター成分は、例えば、次いで、ポリマーがなお支持体に結合されている間に、リジンアミノ酸のε−アミノ基と縮合され得る。完全なアセンブリおよび標識の後、ポリマーは、次いで、周知の方法を用いて、支持体から切断され、脱保護され、そして生成される。
【００４４】
なお別の方法により、レポーター成分は、それが完全にアセンブルされた後、オリゴマーまたはオリゴマーブロックに付着され得、そして支持体から切断される。この方法は、標識が、オリゴマーを製造するために一般に用いられる切断、脱保護または生成処方と適合しない場合に好適である。この方法により、ＰＮＡオリゴマーは、ポリマー上の官能基と標識上の官能基との反応により溶液中で標識され得る。当業者は、結合溶液の組成が、例えば、ドナーまたはアクセプター成分のような、オリゴマーおよび標識の性質に依存することを認識する。この溶液は、有機溶媒、水またはその任意の組み合わせを含み得る。一般に、有機溶媒は、極性の非求核溶媒である。適切な有機溶媒の非限定的な例は、アセトニトリル（ＡＣＮ）、テトラヒドロフラン、ジオキサン、メチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）および１−メチルピロリドン（ＮＭＰ）を含む。
【００４５】
標識されるべきポリマー上の官能基は、求核性であり得（例えば、アミノ基）、そして標識上の官能基は求電子性であり得る（例えば、カルボン酸または活性化カルボン酸）。しかし、これは、ポリマー上の官能基が求電子性であり得（例えば、カルボン酸または活性化カルボン酸）、そして標識上の官能基が求核性であり得る（例えば、アミノ基）ように、逆転され得ることが企図される。活性化カルボン酸官能基の非制限的な例は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを含む。水溶液中では、ＰＮＡまたは標識のいずれかのカルボン酸基は、（選択された成分の性質に依存して）水溶性カルボジイミドで活性化され得る。試薬１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ−プロピル）カルボジイミドハイドロクロライド（ＥＤＣ）は、特に、水性アミド形成縮合反応のために販売されている市販の利用可能な試薬である。このような縮合反応はまた、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）または１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）がＥＤＣと混合されるとき改善され得る。
【００４６】
水溶液のｐＨは、この縮合反応の間に緩衝液で調整され得る。例えば、縮合の間のｐＨは、４〜１０の範囲内であり得る。一般に、非水性反応の塩基度は、非求核有機塩基の添加によって調整される。適切な塩基の非限定的な例は、Ｎ−メチルモルホリン、トリエチルアミンおよびＮ，Ｎ’−ジイソプロピルエチルアミンを含む。あるいは、ｐＨは、（Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ’−［２−エタンスルホン酸］（ＨＥＰＥＳ）または４−モルホリンエタン−スルホン酸（ＭＥＳ）または重炭酸ナトリウムのような無機緩衝液を用いて調整され得る。
【００４７】
（ＰＮＡキメラ合成および標識／改変）
ＰＮＡキメラは、核酸とペプチド核酸サブユニットの組み合わせである。これ故、ＰＮＡキメラの合成、標識および改変は、当業者に公知の方法、および上記で記載の方法を利用し得る。ＰＮＡキメラの合成、標識および改変のための適切な参照は、今や米国特許代６，０６３，５６９号として発行され、本明細書中に参考として援用されるＷＩＰＯ公開特許出願番号ＷＯ９６／４０７０９号に見出され得る。さらに、ＰＮＡ合成および標識のための上記に記載の方法は、ＰＮＡキメラのＰＮＡ部分を改変するためにしばしば用いられ得る。加えて、核酸の合成および標識のための周知の方法が、ＰＮＡキメラの核酸部分の改変のためにしばしば用いられ得る。例示の方法は、５，４７６、９２５、５，４５３，４９６、５，４４６，１３７、５，４１９，９６６、５，３９１，７２３、５，３９１，６６７、５，３８０，８３３、５，３４８，８６８、５，２８１，７０１、５，２７８，３０２，５，２６２，５３０、５，２４３，０３８、５，２１８，１０３、５，２０４，４５６、５，２０４，４５５、５，１９８，５４０、５，１７５，２０９、５，１６４，４９１、５，１１２，９６２、５，０７１，９７４、５，０４７，５２４、４，９８０，４６０、４，９２３，９０１，４，７８６，７２４、４，７２５，６７７、４，６５９，７７４、４，５００，７０７、４，４５８，０６６、および４，４１５，７３２中に見出され得；そのすべては本明細書中に参考として援用される。
【００４８】
（標識オリゴマーおよびオリゴマーブロック）
上記で論議されたように、ＰＮＡキメラおよびＰＮＡオリゴマーは、レポーター成分で標識され得る。オリゴマーまたはオリゴマーブロックを直接標識するために適切なレポーター成分（標識）の非制限的な例は：量子ドット、マイナーグルーブバインダー、デキストラン結合体、分岐核酸検出システム、発色団、蛍光発色団、クエンチャー、スピンラベル、放射線同位元素、酵素、ハプテン、アクリジニウムエステルおよび化学発光化合物を含む。クエンチング成分もまた考慮された標識である。その他の適切な標識試薬および付着のための好ましい方法は、ＰＮＡ、ペプチドまたは核酸合成の当業者によって認識され得る。非限定的な例は、上記に記載または参照されている。
【００４９】
ハプテンの非限定的な例は、５（６）−カルボキシフルオロセイン、２，４−ジニトロフェニル、ジゴキシゲニン、およびビオチンを含む。
【００５０】
蛍光色素（蛍光発色団）の非制限的な例は、５（６）−カルボキシフルオロセイン（Ｆｌｕ）、２’，４’，１，４，−テトラクロロフルオロセイン；および２’，４’，５’，７’，１，４−ヘキサクロロフルオレセイン、その他のフルオレセイン色素（本明細書中に参考として援用される米国特許第５，１８８，９３４号；同第６，００８，３７９号；同第６，０２０，４８１号を参照のこと）、６−（（７−アミノ−４−メチルクマリン−３−アセチル）アミノ）ヘキサノン酸（Ｃｏｕ）、５（および６）−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（Ｒｏｘ）、その他のローダミン色素（本明細書中に参考として援用される米国特許第５，３６６，８６０号；同第５，８４７，１６２号；同第５，９３６，０８７号；同第６，０５１，７１９号；同第６，１９１，２７８号；同第６，２４８，８８４号を参照のこと）、ベンゾフェノキサジン（本明細書中に参考として援用される米国特許第６，１４０，５００号を参照のこと）、シアニン２（Ｃｙ２）色素、シアニン３（Ｃｙ３）色素、シアニン３．５（Ｃｙ３．５）色素、シアニン５（Ｃｙ５）色素、シアニン５．５（Ｃｙ５．５）色素、シアニン７（Ｃｙ７）色素、シアニン９（Ｃｙ９）色素（シアニン色素２、３、３．５、５および５．５は、Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬからＮＨＳエステルとして入手可能である）、その他のシアニン色素（Ｋｕｂｉｓｔａ、ＷＯ９７／４５５３９）、６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’、７’−ジメトキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、５（６）−カルボキシ−テトラメチルローダミン（Ｔａｍａｒａ）、色素１（図７）、色素２（図７）またはＡｌｅｘａ色素シリーズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）を含む。
【００５１】
酵素の非制限的な例は、ポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗ ＰＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、シークエナーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ１およびｐｈｉ２９ポリメラーゼ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、大豆ペルオキシダーゼ（ＳＢＰ）、リボヌクレアーゼおよびプロテアーゼを含む。
【００５２】
クエンチング成分の非制限的な例は、例えば、ダブシル（ｄａｂｃｙｌ）およびダブシル（ｄａｂｓｙｌ）であるアリールジアゾ化合物のようなジアゾ含有成分、１つ以上のさらなるジアゾおよび／またはアリール基を含むホモログ；例えば、Ｆａｓｔ Ｂｌａｃｋ（Ｎａｒｄｏｎｅ、米国特許第６，１１７，９８６号）、および置換化合物であって、ここでＺが、Ｃｌ、Ｆ、Ｂｒ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ５〜Ｃ１４アリール、ニトロ、シアノ、スルホネート、ＮＲ２、−ＯＲ、およびＣＯ２Ｈ、ここで、各Ｒが、独立して、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキルまたは以下の構造に従うＣ５〜Ｃ１４アリール
【００５３】
【化２】
：以下の例示の構造を含むシアニン色素（Ｌｅｅ、米国特許第６，０８０，８６８号）：
【００５４】
【化３】
および、アントラキノン、マラカイトグリーン、ニトロチアゾン、およびニトロイミダゾール化合物のようなその他の発色団（ここで、基Ｘは、本発明のオリゴマーへの結合またはリンカーの共有結合部位である）を含む。
【００５５】
マイナーグルーブバインダーの非限定的な例は、以下の構造によって提示されるＣＤＰＩ３である：
【００５６】
【化４】
ここで、Ｘは、オリゴマーへの例示の付着部位である（Ｄｅｍｐｃｙ、ＷＯ０１／３１０６３）。
【００５７】
非放射活性標識方法、技法および試薬は、Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ、Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、Ｇａｒａｍａｎ、Ａ．Ｊ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９７）中に総説がある。
【００５８】
（スペーサー／リンカー成分）
一般に、スペーサーは、かさ高い標識試薬がプローブまたはプライマーのハイブリダイゼーション性質に対して有し得る悪影響を最小にするために用いられ得る。リンカーは、オリゴマーの２つ以上のオリゴマーブロックを連結するために用いられ得る。これらリンカーは、塩基ではない（ａｂａｓｉｃ）。塩基ではないことは、本発明者らは、核酸塩基を含まないことを意味する。スペーサー／リンカー成分の非制限的な例は：１つ以上のアミノアルキルカルボン酸（例えば、アミノカプロン酸）、アミノ酸の側鎖（例えば、リジンまたはオルニチンの側鎖）、１つ以上の天然のアミノ酸（例えば、グリシン）、アミノオキシアルキル酸（例えば、８−アミノ−３，６−ジオキサオクタノン酸）、アルキル二酸（例えば、コハク酸）、アルキルオキシ二酸（例えば、ジグリコール酸）またはアルキルジアミン（例えば、１，８−ジアミノ−３，６−ジオキサオクタン）である。スペーサー／リンカー成分はまた、偶発的に、または意図的に、オリゴマーの水可溶性を改善するために構築され得る（例えば、Ｇｉｌｄｅａら、Ｔｅｔｔ．Ｌｅｔｔ．３９：７２５５〜７２５８（１９９８））．Ｇｕｉｄａｎｃｅ Ｉｎ Ｌａｂｅｌ Ｃｈｏｉｃｅ Ｗｈｅｎ Ｌｉｇａｔｉｎｇ／Ｃｏｎｄｅｎｓｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｍｅｒ Ｂｌｏｃｋｓ：を参照のこと。
【００５９】
オリゴマーが縮合／連結され、それによって、細長いオリゴマーを生成すべきとき、コンポーネントオリゴマーブロックの潜在的に反応性の官能基の全体の性質は、可能な副または交差反応について考慮されるべきである。保護基はまた、適切な場合に用いられ得、副または交差反応を最小にするか、またはなくする。例えば、標識されたオリゴマーが連結されるべきとき、選択され得る種々の連結化学の性質を考慮して１つ以上の官能基の反応性の可能性を考慮することが賢明である。あるいは、保護された標識が用いられ得る（例えば、図５を参照のこと）。
【００６０】
（連結／縮合化学の非制限的な例）
図８ａおよび８ｂを参照して、適正に調製されたオリゴマーブロックは、水溶性カルボジイミドである１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ−プロピル）カルボジイミドヒドロクロライド（ＥＤＣ）のようなカルボジイミドを用いて連結され得る。示されるように、代表的には、オリゴマーブロックの１つは、カルボン酸成分を含み、そして他方はアミノ基を含む。ＰＮＡオリゴマーは、それらが連結された天然アミノ酸成分を含むか否かにかかわらず、アミン末端およびカルボン酸末端を含み得るので、一般に、ＰＮＡオリゴマーブロックは：より代表的なＣ末端酸の代わりに、少なくとも１つのＰＮＡ Ｃ末端酸オリゴマーの調製を除いて、このタイプの連結化学を促進するための改変を要求しない。これらオリゴマーは、必要に応じて約７５％までの有機改変剤（ｖ／ｖ）を含む水溶液中で連結され得る。ｐＨは、６．５未満であり得る。トリアゾール化合物（例えば、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）または１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ））のような活性化試薬の添加は、縮合／連結反応の全体の収率を増加し得る。
【００６１】
図８ａおよび８ｂを参照して、連結／縮合の産物は、ドナーおよびアクセプター成分の両方を含むとして示されている。これは、しかし、例であって、そして限定ではない。連結されるべき１つまたは両方のオリゴマーは非標識であり得るからである。簡便には、この連結／縮合プロセスは、本明細書に記載のようなＣ末端ＰＮＡサブユニットを含むＰＮＡ Ｃ末端酸オリゴマーを用いてネイティブなオリゴマーを生成し得る。
【００６２】
１つの実施形態では、簡便には、これらネイティブなオリゴマーが、同時係属中でかつ共に所有されるＵＳＳＮ０９／１７９，１６２（参考として本明細書中に援用される）中により詳細に記載されるようなＬｉｎｅａｒ Ｂｅａｃｏｎとして標識される場合、多重ＳＮＰ遺伝子型決定アッセイにおけることを含む、標的配列の分析のために用いられ得る。従って、本発明の組成物、方法およびライブラリーは、ライブラリーアプローチを通じて、多くの目的のために用いられ得るネイティブＰＮＡオリゴマーの産生に用いられ得る。
【００６３】
（その他）
米国公開出願２００３−００７７６０８およびＰＣＴ公開出願ＷＯ０２／０７２８６５は、同時係属中であり、そして本出願とともに共通して所有されている。これらの公開された特許出願は、特に、オリゴマーブロックの連結を記載し、ここで、細長い（組み合わせ）オリゴマー中でブロックを分離する少なくとも３原子のリンカーが存在する。従って、これらの公開特許出願で記載される連結／縮合反応は、本明細書に記載のようなネイティブなオリゴマーを生成しない。それにもかかわらず、前記の特許出願は、本明細書に記載のＰＮＡ Ｃ末端酸オリゴマーに適用され得るオリゴマーブロックを縮合／連結するための種々の方法を記載している。ＰＮＡ Ｃ末端酸オリゴマーの縮合／連結は、ネイティブＰＮＡオリゴマーを生成するために用いられ得る。それらはネイティブオリゴマーであるので、それらは、例えば、自己指標ＰＮＡプローブを用いる多重ＳＮＰ遺伝子型決定を含むＰＮＡオリゴマーに共通して適用される任意の適用に用いられ得る。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００６４】
（ＩＶ．本発明の実施形態）
ａ）序論
本発明は、ＰＮＡダイマーおよびＰＮＡオリゴマー合成の分野に関する。これらＰＮＡダイマーは、支持体に結合されているか否かにかかわらず、特に、ＰＮＡ Ｃ末端酸オリゴマーの調製において用いられ得る。さらに、このＰＮＡ Ｃ末端酸オリゴマーは、それら自身、特に、連結／縮合を通じてより長いＰＮＡオリゴマーおよび／またはキメラの調製で用いられ得、および特に、ＰＮＡオリゴマーおよび／またはキメラ調製で用いられるライブラリーの調製で用いられ得る。そのように生成されたＰＮＡオリゴマーおよびＰＮＡキメラは、それら自身、特に、制限されずに、自己指標アッセイ、多重アッセイおよび／または自己指標多重アッセイにおける使用によるを含む、目的の標的配列の決定において用いられ得る。
【００６５】
ｂ）支持体結合ＰＮＡダイマー組成物
いくつかの実施形態では、本発明は、固体支持体組成物に関する。この固体支持体は、酸を形成する切断可能なリンカーおよびＰＮＡダイマーを含む。このＰＮＡダイマーは、Ｎ末端の塩基不安定保護基を含み、そしてこの切断可能なリンカーを通じて固体支持体に切断可能に連結されている。さらに、この固体支持体上のＰＮＡダイマーの積載は、１グラムあたり０．０８ｍｍｏｌ以上であり得る。このＰＮＡダイマーは、Ｆｍｏｃ（Ｂｈｏｃ）モノマーから形成され得る。このＰＮＡダイマーは、上記固体支持体の切断可能なリンカーにエステル結合により連結され得る。
【００６６】
この固体支持体は、立体的に妨害された固体支持体であり得る。この立体的に妨害された固体支持体の非限定的な例は、トリチルクロライド樹脂（トリチル−Ｃｌ）、２−クロロトリチルクロライド樹脂、ＤＨＰＰ、ＭＢＨＡ、４−メチルトリチルクロライド樹脂、４−メトキシトリチルクロライド樹脂、ヒドロキシ−（２−クロロフェニル）メチル−ＰＳ、Ｒｉｎｋ酸樹脂およびＮｏｖａＳｙｎ ＴＧＴアルコール樹脂を含む。この固体支持体はまた、ＰＡＬ−ＰＥＧ−ＰＳ（登録商標）、ＮｏｖａＳｙｎ ＴＧＡおよびＷａｎｇ樹脂からなる群から選択され得る。
【００６７】
上記固体支持体上のＰＮＡダイマーの積載は、１グラムあたり約０．１ｍｍｏｌから１グラムあたり約１ｍｍｏｌの範囲であり得る。上記固体支持体上のＰＮＡダイマーの積載は、１グラムあたり約０．１２ｍｍｏｌから１グラムあたり約０．３５ｍｍｏｌの範囲であり得る。
【００６８】
上記支持体結合ＰＮＡは、２つ以上の異なる支持体結合ＰＮＡダイマーを含むアレイを生成するために上記支持体上に整列され得る。
【００６９】
上記支持体結合ＰＮＡダイマーは、種々の方法およびまたはＰＮＡモノマータイプによって生成され得、制限されずに、以下のセクションＩＶ（ｄ）またはＩＶ（ｅ）に記載の方法を含む。
【００７０】
（ｃ）支持体結合ＰＮＡダイマー固体支持体のライブラリー）
いくつかの実施形態では、本発明は、固体支持体のライブラリーに関する。このライブラリーは、少なくとも、２つの固体支持体を備え、ここで、この少なくとも２つの固体支持体の各々は、酸を形成する切断可能なリンカーおよびＰＮＡダイマーを含む。このＰＮＡダイマーは、酸を形成する切断可能なリンカーに切断可能であり得る。このＰＮＡダイマーは、このライブラリーの上記少なくとも２つの固体支持体の任意の他方に結合しているＰＮＡダイマーとは核酸塩基配列が異なり得る。このＰＮＡダイマーは、エステル結合により固体支持体の切断可能なリンカーに連結され得る。
【００７１】
ライブラリーは、少なくとも１６の固体支持体を含み得る。例えば、各支持体は、少なくとも１６の可能なＰＮＡダイマーのセットから選択されたＰＮＡダイマーを含み得、ここで、このセットの各ＰＮＡダイマーは、このセットのその他のＰＮＡダイマーのすべてとは、ＰＮＡダイマーのアセンブリで用いられたＰＮＡサブユニットの少なくとも４つの異なる核酸塩基の少なくとも１つが異なっている。この少なくとも４つの異なる核酸塩基は、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、５−プロピニル−ウラシル、２−チオ−５−プロピニル−ウラシル、５−メチルシトシン、プソイドイソシトシン、２−チオウラシルおよび２−チオチミン、２−アミノプリン、Ｎ９−（２−アミノ−６−クロロプリン）、Ｎ９−（２，６−ジアミノプリン）、ヒポキサンチン、Ｎ９−（７−デアザ−グアニン）、Ｎ９−（７−デアザ−８−アザ−グアニン）およびＮ８−（７−デアザ−８−アザ−アデニン）からなる群から選択され得る。例えば、実施例１に記載の１６の固体支持体のライブラリーを参照のこと。
【００７２】
ライブラリーの固体支持体は、立体的に妨害された固体支持体であり得る。例えば、この立体的に妨害された固体支持体は、トリチルクロライド樹脂（トリチル−Ｃｌ）、２−クロロトリチルクロライド樹脂、ＤＨＰＰ、ＭＢＨＡ、４−メチルトリチルクロライド樹脂、４−メトキシトリチルクロライド樹脂、ヒドロキシ−（２−クロロフェニル）メチル−ＰＳ、Ｒｉｎｋ酸樹脂およびＮｏｖａＳｙｎ ＴＧＴアルコール樹脂からなる群から選択され得る。この固体支持体は、ＰＡＬ−ＰＥＧ−ＰＳ、ＮｏｖａＳｙｎ ＴＧＡおよびＷａｎｇ樹脂からなる群から選択され得る。
【００７３】
上記ライブラリーの固体支持体のＰＮＡダイマーのＣ末端サブユニットは、上記切断可能なリンカーに連結され得る。このＰＮＡダイマーは、Ｆｍｏｃ（Ｂｈｏｃ）保護ＰＮＡモノマーから形成され得る。このＰＮＡダイマーは、ｔ−ｂｏｃ／Ｚ保護ＰＮＡモノマーから形成され得る。このＰＮＡダイマーは、Ｍｍｔ／Ｂｈｏｃ保護ＰＮＡモノマーから形成され得る。このＰＮＡダイマーは、その他のタイプのＰＮＡモノマーまたは異なるタイプのＰＮＡモノマーの組み合わせから形成され得る（以下の実施例３を参照のこと）。従って、ＰＮＡダイマー固体支持体のライブラリーが、制限されずに、以下のセクションＶ（ｄ）またはＶ（ｅ）に記載の方法を含む、種々の方法および／またはＰＮＡモノマータイプによって生成され得ることは明瞭である。
【００７４】
ライブラリーの少なくとも１つの固体支持体上のＰＮＡダイマーの積載は、１グラムあたり約０．０８ｍｍｏｌ以上であり得る。上記ライブラリーの少なくとも２分の１の固体支持体上のＰＮＡダイマーの積載は、１グラムあたり約０．０８ｍｍｏｌ以上であり得る。上記ライブラリーの各固体支持体上のＰＮＡダイマーの積載は、１グラムあたり約０．０８ｍｍｏｌ以上であり得る。上記ライブラリーの各々の固体支持体上のＰＮＡダイマーの積載は、１グラムあたり約０．１ｍｍｏｌから１グラムあたり約１ｍｍｏｌの範囲であり得る。上記ライブラリーの各々の固体支持体上のＰＮＡダイマーの積載は、１グラムあたり約０．１２ｍｍｏｌから１グラムあたり約０．３５ｍｍｏｌの範囲であり得る（実施例１を参照のこと）。
【００７５】
支持体のライブラリーは整列されてアレイを生成し得る。
【００７６】
（ｄ）ＰＮＡダイマー固体支持体を形成する方法）
いくつかの実施形態では、本発明は、支持体に結合したＰＮＡダイマーを形成する方法に関する。この方法は、第１のＰＮＡモノマーを、立体的に妨害された立体的に妨害された固体支持体に結合する工程を包含し、ここで、このＰＮＡモノマーは、Ｎ末端の塩基不安定アミン保護基を含む。必要に応じてであるが、しかし好ましくは、上記固体支持体は洗浄され、過剰の第１のＰＮＡモノマーを除去する。次いで、この固体支持体は、約１〜約２分の期間の間、この支持体に結合した第１のＰＮＡモノマーから上記塩基不安定Ｎ末端アミン保護基を実質的に除去する脱保護試薬で処理される。この脱保護ステップは、迅速に実施されるべきである。なぜなら、非保護Ｎ末端アミンは、この酸を形成する切断可能なリンカーを攻撃し得、そしてそれによって、支持体から第１のＰＮＡモノマーの環化および解離を引き起こすからである。迅速に実施されるとき、第１のＰＮＡモノマーの５０％より少ないの環化および解離を得ることが可能である。一旦、脱保護が実施されると、この固体支持体を洗浄し、脱保護試薬を除去し得る。ここで再び、この洗浄は、迅速に実施されるべきである。迅速にとは、本発明者らは、それが、可能な限りそれが合理的に実施され得るように実施されるべきであることを意味し；一般に、上記脱保護試薬が固体支持体に最初に付与される時間と、第２のＰＮＡモノマーの結合が開始される時間との間で２〜１０分を超えて経過しない。洗浄後、第２のＰＮＡモノマーが、上記第１のＰＮＡモノマーのＮ末端アミンに結合することが可能な限り速く、そして好ましくは、上記脱保護試薬が上記固体支持体に最初に付与されるときの２〜１０分以内に実施される。
【００７７】
この実施形態によれば、上記第１および第２のＰＮＡモノマーは、同一または異なる核酸塩基を含むＦｍｏｃ（Ｂｈｏｃ）ＰＮＡモノマーであり得る。上記第１および／または第２のＰＮＡモノマーの核酸塩基は、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、５−プロピニル−ウラシル、２−チオ−５−プロピニル−ウラシル、５−メチルシトシン、プソイドイソシトシン、２−チオウラシルおよび２−チオチミン、２−アミノプリン、Ｎ９−（２−アミノ−６−クロロプリン）、Ｎ９−（２，６−ジアミノプリン）、ヒポキサンチン、Ｎ９−（７−デアザ−グアニン）、Ｎ９−（７−デアザ−８−アザ−グアニン）およびＮ８−（７−デアザ−８−アザ−アデニン）からなる群から独立に選択され得る。
【００７８】
上記第１または第２のＰＮＡモノマーのＮ末端の塩基不安定保護基はＦｍｏｃであり得る。上記脱保護試薬は、有機溶媒中約１５〜約２５（ｖ／ｖ）％のピペリジンを含む溶液であり得る。適切な有機溶媒の非制限的な例は、Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）および１−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）を含む。例えば、上記脱保護試薬は、Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の２０％（ｖ／ｖ）ピペリジンであり得る。
【００７９】
上記脱保護試薬は、有機溶媒中の約０．２％〜約４％のＤＢＵ（ｖ／ｖ）を含む溶液であり得る。例えば、上記脱保護試薬は、ＮＭＰ（ｖ／ｖ）中の２％ＤＢＵであり得る。
【００８０】
この実施形態によれば、上記立体的に妨害された固体支持体は、トリチルクロライド樹脂（トリチル−Ｃｌ）、２−クロロトリチルクロライド樹脂、ＤＨＰＰ、ＭＢＨＡ、４−メチルトリチルクロライド樹脂、４−メトキシトリチルクロライド樹脂、ヒドロキシ−（２−クロロフェニル）メチル−ＰＳ、Ｒｉｎｋ酸樹脂およびＮｏｖａＳｙｎ ＴＧＴアルコール樹脂からなる群から選択され得る。好ましくは、上記立体的に妨害された固体支持体は、トリチルクロライド（トリチル−Ｃｌ）樹脂である。
【００８１】
（ｅ）ＰＮＡダイマー固体支持体を形成するための別の方法）
いくつかの実施形態では、本発明は、支持体結合ＰＮＡダイマーを形成するためのなお別の方法に関する。この方法は、第１のＰＮＡモノマーを、酸を形成する切断可能なリンカーを含む固体支持体に結合する工程を包含し、ここで、このＰＮＡモノマーは、酸不安定Ｎ末端保護基を含む。必要に応じてであるが、しかし、好ましくは、この固体支持体を洗浄し、過剰の第１のＰＮＡモノマーは除去される。次いで、上記固体支持体は、上記酸不安定Ｎ末端保護基を脱保護する酸性条件下、脱保護試薬で処理される。一旦、脱保護が実施されると、上記固体支持体は洗浄されて、上記脱保護試薬は除去される。洗浄後、第２のＰＮＡモノマーが、上記第１のＰＮＡモノマーのＮ末端アミンに結合される。この方法によれば、上記固体支持体上のＰＮＡダイマーの最終積載は、１グラムあたり０．０８ｍｍｏｌ以上である。上記に記載の方法とは異なり、この脱保護ステップは迅速に実施されることは要求されない。なぜなら、Ｎ末端アミンはプロトン化され、そしてそれによって第１のＰＮＡシントンの環化および脱離を引き起こし得ないからである。
【００８２】
上記第１および第２のＰＮＡモノマーは、同一または異なる核酸塩基を含むｔ−ｂｏｃ／Ｚ保護ＰＮＡモノマーであり得る。上記第１および第２のＰＮＡモノマーは、同一または異なる核酸塩基を含むＭｍｔ／Ｂｈｏｃ保護ＰＮＡモノマーであり得る。上記第１のＰＮＡモノマーはＭｍｔ／Ｂｈｏｃ保護ＰＮＡモノマーであり得、そして上記第２のＰＮＡモノマーはＦｍｏｃ／Ｂｈｏｃ保護ＰＮＡモノマーであり得る。
【００８３】
上記第１および第２のＰＮＡモノマーの核酸塩基は、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、５−プロピニル−ウラシル、２−チオ−５−プロピニル−ウラシル、５−メチルシトシン、プソイドイソシトシン、２−チオウラシルおよび２−チオチミン、２−アミノプリン、Ｎ９−（２−アミノ−６−クロロプリン）、Ｎ９−（２，６−ジアミノプリン）、ヒポキサンチン、Ｎ９−（７−デアザ−グアニン）、Ｎ９−（７−デアザ−８−アザ−グアニン）およびＮ８−（７−デアザ−８−アザ−アデニン）からなる群から独立に選択され得る。
【００８４】
この方法によれば、上記第１のＰＮＡモノマーがＭｍｔ／Ｂｈｏｃ保護ＰＮＡモノマーである場合、そして上記脱保護試薬は、有機溶媒中の約１〜約５％（ｖ／ｖ）のジクロロ酢酸である得る。例えば、上記脱脱保護試薬は、ジクロロメタン（ＤＣＭ）中の約２％のジクロロ酢酸（ＤＣＡ）であり得る。
【００８５】
この方法によれば、上記固体支持体は、トリチルクロライド樹脂（トリチル−Ｃｌ）、２−クロロトリチルクロライド樹脂、ＤＨＰＰ、ＭＢＨＡ、４−メチルトリチルクロライド樹脂、４−メトキシトリチルクロライド樹脂、ヒドロキシ−（２−クロロフェニル）メチル−ＰＳ、Ｒｉｎｋ酸樹脂およびＮｏｖａＳｙｎ ＴＧＴアルコール樹脂からなる群から選択される立体的に妨害された固体支持体であり得る。上記固体支持体はまた、Ｆｍｏｃ−ＰＡＬ−ＰＥＧ−ＰＳ、ＮｏｖａＳｙｎ ＴＧＡおよびＷａｎｇ樹脂からなる群から選択され得る。
【００８６】
この方法によれば、上記固体支持体上のＰＮＡダイマーの最終積載は、１グラムあたり約０．１ｍｍｏｌ〜１グラムあたり約１．２ｍｍｏｌの範囲内であり得る。上記固体支持体上のＰＮＡダイマーの最終積載は、１グラムあたり約０．１２ｍｍｏｌ〜１グラムあたり約０．３５ｍｍｏｌの範囲内であり得る。
【００８７】
（ｆ）ＰＮＡ Ｃ末端酸オリゴマー）
なお別の実施形態では、本発明は、Ｃ末端ＰＮＡサブユニットおよび蛍光標識またはクエンチャーを含む、ＰＮＡ Ｃ末端酸オリゴマーに関する。例えば、この蛍光標識は、色素１または色素２であり得る。例えば、上記クエンチャー成分はダブシルであり得る。上記標識は、Ｎ末端アミンへを含む、ＰＮＡオリゴマーのＮ末端サブユニットに連結され得る。
【００８８】
このＰＮＡオリゴマーは、長さが１０以下のＰＮＡサブユニットであり得る。このような短いオリゴマーは、ライブラリーアプローチによる連結／縮合を用いて細長いＰＮＡオリゴマーおよびＰＮＡキメラの調製のために便利に用いられ得る。例えば、このＰＮＡオリゴマーは、長さが約３〜約８のサブユニットであり得るか、または長さが約４〜約６のサブユニットであり得る。このＰＮＡオリゴマーは、長さが４のサブユニットであり得る。このＰＮＡオリゴマーは、長さが５のサブユニットであり得る。
【００８９】
このＰＮＡオリゴマーの核酸塩基は、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、５−プロピニル−ウラシル、２−チオ−５−プロピニル−ウラシル、５−メチルシトシン、プソイドイソシトシン、２−チオウラシルおよび２−チオチミン、２−アミノプリン、Ｎ９−（２−アミノ−６−クロロプリン）、Ｎ９−（２，６−ジアミノプリン）、ヒポキサンチン、Ｎ９−（７−デアザ−グアニン）、Ｎ９−（７−デアザ−８−アザ−グアニン）およびＮ８−（７−デアザ−８−アザ−アデニン）からなる群から選択され得る。
【００９０】
（ｇ）ＰＮＡ Ｃ末端酸オリゴマーのライブラリー）
なお別の実施形態では、本発明は、ＰＮＡ Ｃ末端酸オリゴマーのライブラリーに関する。このライブラリーの各々のＰＮＡオリゴマーは、核酸塩基配列、Ｃ末端ＰＮＡサブユニット（グリシンまたはリジンのようなアミノ酸ではない）および蛍光標識またはクエンチャー成分を含む。ＰＮＡオリゴマーの各々の蛍光標識またはクエンチャーは、制限されずに、Ｎ末端アミンへを含む、Ｎ末端サブユニットに連結され得る。このライブラリーの各ＰＮＡは、このライブラリーのその他のＰＮＡオリゴマーの各々とは、標識、核酸塩基配列、サブユニット長さまたは核酸塩基配列の極性のいずれかが異なる。このライブラリーのＰＮＡオリゴマーの各々の核酸塩基は、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、５−プロピニル−ウラシル、２−チオ−５−プロピニル−ウラシル、５−メチルシトシン、プソイドイソシトシン、２−チオウラシルおよび２−チオチミン、２−アミノプリン、Ｎ９−（２−アミノ−６−クロロプリン）、Ｎ９−（２，６−ジアミノプリン）、ヒポキサンチン、Ｎ９−（７−デアザ−グアニン）、Ｎ９−（７−デアザ−８−アザ−グアニン）およびＮ８−（７−デアザ−８−アザ−アデニン）からなる群から選択され得る。
【００９１】
上記ライブラリーのＰＮＡオリゴマーの各々は、同じ数のＰＮＡサブユニットを、しかし、これは限定ではないことを条件に含み得る。ライブラリーのＰＮＡオリゴマーは、異なる数のＰＮＡサブユニットを含み得る。例えば、上記ライブラリーは、ライブラリーの少なくとも１つのその他のＰＮＡオリゴマーと比較したとき異なる数のＰＮＡサブユニットを有する少なくとも１のオリゴマーを含み得る。このライブラリーの各ＰＮＡオリゴマーは、約３〜約８のＰＮＡサブユニットを含み得る。このライブラリーのＰＮＡオリゴマーの各々は、約４〜約６のＰＮＡサブユニットを含み得る。このライブラリーのＰＮＡオリゴマーの各々は、５つのＰＮＡサブユニットを含み得る。
【００９２】
ＰＮＡ Ｃ末端酸オリゴマーのライブラリーは、それ自身がが、より大きなライブラリー内のセットであり得る。例えば、ライブラリーは、３つ以上のセットのオリゴマーブロックを含み得、ここで、少なくとも２つのセットは、２つ以上の異なる標識が各セットのオリゴマーブロックを独立に検出可能にするように、標識の性質を除いて実質的に同一であり得る。この２つ以上の独立して検出可能なオリゴマーブロックのセットは、末端オリゴマーブロックまたは縮合オリゴマーブロックのセットであり得、例えば、２セットのＰＮＡ Ｃ末端酸を含み、ここで、各セットは、異なる蛍光発色団（例えば、色素１および色素２）で標識される。本質的に同一であるが、付着した独立に検出可能な標識の性質が異なる２セットのオリゴマーブロックを生成することにより、独立に検出可能な細長いオリゴマーの対を調製することが可能であり、共通オリゴマーブロックとの連結／縮合を通じて、自己指標性の独立に検出可能なオリゴマーを含む。自己指標により、本発明者らは、プローブが、標的配列へのハイブリダイゼーションに際し、検出可能な性質を変化し、そしてそれによって過剰のプローブの除去の必要性を減少するか、またはなくすることを意味する。独立に検出可能とは、本発明者らは、１つの標識を独立に、そして必要に応じて、その他の標識の存在下で決定することが可能であることを意味する。
【００９３】
例えば、独立に検出可能な標識を含む少なくとも２つのオリゴマーブロックは、例えば、クエンチャー成分で標識される同じオリゴマーブロックに連結され得る。次いで、独立に検出可能な自己指標性の細長いオリゴマーの対は、米国公開出願２００３−００７７６０８およびＰＣＴ公開出願ＷＯ０２／０７２８６５に記載のようなＳＮＰ遺伝子型決定アッセイを実施するためのプローブとして用いられ得る。但し、この反応によって生成されるＰＮＡオリゴマーは、ネイティブＰＮＡオリゴマーであり得る。
【００９４】
アクセプターまたはクエンチャー成分が、連結／縮合されるオリゴマーブロックの１つに存在しない場合、そのときは、細長いオリゴマーは、単一標識をもつオリゴマーであり得る。標識が、連結／縮合されるオリゴマーブロックのいずれかに存在しない場合、そのときは、この細長いオリゴマーは、例えば、ブロッキングプローブ（例えば、米国特許第６，１１０，６７６号）として用いられ、または捕獲プローブとして用いられ得る非標識オリゴマーであり得る。
【００９５】
【化５】
先行する説明に従って、表１は、可能なライブラリーのオリゴマーブロックのセットを作製するための種々の可能性、およびその連結によって調製される細長いオリゴマーの性質を要約する。勿論、表１は、可能性を網羅していることは意図されない。さらに、ＰＮＡ Ｃ末端酸オリゴマーは、それら自身、特に、ＰＮＡオリゴマーまたはＰＮＡキメラの調製のために用いられ得る、ＰＮＡオリゴマーのより大きなライブラリー（例えば、表１に要約される）のブロックの１つ以上のセットまたはサブセットであり得る。
【００９６】
オリゴマーブロックの１つ以上のセットまたはサブセットはまた、必要に応じて、オリゴマーブロックの末端またはその内部の位置でオリゴマーブロックに連結された保護または非保護官能基を含み得る。これに関し、オリゴマーブロックは、実施者の望み、および利用可能な資源に依存して連結前または連結後いずれかに標識され得る。この官能基はまた、オリゴマーブロックまたは形成された細長いオリゴマーを表面に付着するために用いられ得る。
【００９７】
従って、別の実施形態によれば、本発明は、少なくとも２つのセットのＰＮＡ Ｃ末端酸オリゴマーを含むライブラリーに関し、ここで、各セットのＰＮＡオリゴマーは、主に、蛍光標識の性質において、その他のセットのそれとは異なる。このようなＰＮＡ Ｃ末端オリゴマーは、米国公開出願２００３−００７７６０８およびＰＣＴ公開出願ＷＯ０２／０７２８６５に記載のようなＳＮＰ遺伝子型決定アッセイのためのプローブまたはプローブのセットを生成するための連結／縮合反応で、但し、この反応で生成されるＰＮＡオリゴマーはネイティブＰＮＡオリゴマーであり得ることを条件に用いられ得る。
【実施例】
【００９８】
本発明の前述する実施形態を記載したが、以下の実施例は、例示であることが意図され、いかなる方法においても制限的であることは意図されない。
【００９９】
（本発明を実施するための様式）
本発明を、ここで、いかなる方法においても制限的であることは意図されない以下の実施例により説明する。
【０１００】
（実施例１；ＰＮＡダイマー−樹脂（固体支持体）のライブラリーの合成）
Ｉ．トリチル−Ｃｌ樹脂上の第１のＰＮＡモノマーの積載
試薬：Ｆｍｏｃ（Ｂｈｏｃ）−ＰＮＡモノマー（Ｆｍｏｃ−Ａ（Ｂｈｏｃ）−ＯＨ：Ｐ／Ｎ ＧＥＮ０６３０１４、Ｆｍｏｃ−Ｃ（Ｂｈｏｃ）−ＯＨ：Ｐ／Ｎ ＧＥＮ０６３１５、Ｆｍｏｃ−Ｇ（Ｂｈｏｃ）−ＯＨ：Ｐ／Ｎ ＧＥＮ０６３１６、Ｆｍｏｃ−Ｔ（Ｂｈｏｃ）−ＯＨ：Ｐ／Ｎ ＧＥＮ０６３１７、１−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）：Ｐ／Ｎ４００５８０、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）：Ｐ／Ｎ４００１４３、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）：Ｐ／Ｎ ＧＥＮ０６３０８０はすべて、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡから得た。メタノール：Ｐ／Ｎ ０１５−４およびアセトニトリル：Ｐ／Ｎ ２３０−４は、Ｂｕｒｄｉｃｋ＆Ｊａｃｋｓｏｎ（Ｍｕｓｋｅｇｏｎ、Ｍｉｃｈｉｇａｎ）から得た。トリチル−Ｃｌ樹脂：Ｐ／Ｎ ０１−６４−００７４は、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から５ｇバッチで得た。乾燥溶媒を、トリチルクロライド樹脂積載反応に用いた。無水ジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２）：Ｐ／Ｎ ２７，０９９−７、ＮＭＰは、４Åの分子篩上で一晩貯蔵した。溶媒（ＤＭＦ、ＮＭＰおよびアセトニトリル）を樹脂洗浄のために用い、そしてその他の反応は、試薬グレードであった。
【０１０１】
手順：Ｆｍｏｃ−Ａ（Ｂｈｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇ（Ｂｈｏｃ）−ＯＨおよびＦｍｏｃ−Ｔ（Ｂｈｏｃ）−ＯＨモノマー（それぞれ、３．６２、３．６９および２．５３ｇ、４．９８ｍｍｏｌ）および２．６３ｍＬのＤＩＰＥＡ（約３×４．９８ｍｍｏｌ）を、１５ｍＬの乾燥４：１ＣＨ２Ｃｌ２−ＮＭＰ（０．３３２Ｍ）中に溶解した。Ｆｍｏｃ−Ｃ（Ｂｈｏｃ）−ＯＨモノマー（３．４９ｇ、４．９８ｍｍｏｌ）および２．６３ｍＬのＤＩＰＥＡ（約３×４．９８ｍｍｏｌ）を、最初、１２ｍＬのＮＭＰ中に溶解し、そして次に、容量を、乾燥ＣＨ２Ｃｌ２の添加により１５ｍＬに調節した。
【０１０２】
モノマー溶液を、次いで、５０ｍＬのプラスチックチューブ中の乾燥トリチル−Ｃｌ樹脂（３ｇ／反応、１．６６ｍｍｏｌ／ｇ）に添加し、キャップをし、そして室温で０．５時間振とうし、そのとき、樹脂が粘性のゲルとなった。この時点で、別の３ｍＬの乾燥ＣＨ２Ｃｌ２を各反応混合物に添加し、そして反応をさらに２．５時間継続した。（最近の研究は、この反応は、本質的に４５分以内に終了し、そして樹脂の積載能力は、反応時間を延長することによりもはや増加しないことを示した）。樹脂を、次いで濾過し、そしてＮＭＰで２回洗浄し（各々約１５ｍｌ）、次いで、１５ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ−ＤＩＰＥＡ（１７：２：１）で迅速に洗浄し、もそしてＮＭＰで２〜３回洗浄した。最終の洗浄をアセトニトリルを用いて行い、そして次に、樹脂を減圧で乾燥した。
【０１０３】
樹脂積載は、Ｆｍｏｃカウント実験を行いながら、ピペラジン処理（１時間）の前に少なくとも２時間の間ＴＨＦで樹脂を膨潤することにより算出した。代表的なＦｍｏｃカウント実験では、３〜５ｍｇのダイマー−樹脂を、キャップをした１ｍＬの微量遠心分離チューブ中、１００μＬのＴＨＦで２時間処理し、次いで、２００μＬのＤＭＦ中２０％（ｖ／ｖ）ピペリジンを添加した。この反応混合物を、次いで、ボルテックスし、そして１時間静置した。この反応混合物の容量を、メタノールの添加により１ｍＬに調節し、そして完全に混合した。上清液をメタノールで２０倍希釈し、そしてＵＶ吸光度を、３０１ｎｍで記録した（バックグラウンド補正はメタノールで行った）。Ｆｍｏｃ切断に際し放出された発色団のモル吸光係数（３０１ｎｍでε＝７８００Ｍ−１Ｃｍ−１）を、樹脂の積載能力を算出するために用いた。積載決定の結果は表２に見出され得る。
注記：ＰＮＡモノマー樹脂は合成の１または２日以内に用いられるか、使用まで４℃で貯蔵されるべきである。
【０１０４】
【化６】
（ＩＩ．ステップＢ：第２のモノマーの結合）
上記の実験Ｉから得られた約０．５ｇの各乾燥樹脂を、ＮＭＰで少なくとも２〜３時間膨潤した。次いで、Ｆｍｏｃ基を、この樹脂を１分間、５ｍＬのＤＭＦ中の２０％（ｖ／ｖ）ピペラジンで処理することにより除去した。Ｆｍｏｃ脱保護が進行中であった間に、ＮＭＰ中のＰＮＡモノマーの溶液を、ＤＩＰＥＡ（９当量）およびＨＡＴ（３．８当量）の添加により活性化した。最終のモノマー濃度は０．１７Ｍであった。次いで、この樹脂を、さらに１分間以内にＮＭＰ（３×１０〜１５ｍＬ）で洗浄し、活性化ＰＮＡ−モノママーを添加した。この結合は１５分間行い、そして次に、樹脂を、減圧下の乾燥の前にＮＭＰおよびアセトニトリルで洗浄した。次いで、樹脂積載能力をＦｍｏｃ決定により算出した。すべての可能な１６ダイマー−樹脂（４つの核酸塩基Ａ、Ｃ、Ｇ＆Ｔに基づく）を、上記のプロトコールを用いて合成した。ＰＮＡダイマー−樹脂の積載能力（表３）は、０．１２〜０．３５ｍｍｏｌｅ／ｇの範囲であった。この積載は、しばしば、従来のＦｍｏｃ−ＸＡＬ−ＰＥＧ−ＰＳ樹脂で用いられる。
注記：１）切断可能なリンカーがＣ末端酸を形成する；および２）Ｎ−α−アミンの脱保護が塩基性条件下で実施されるときはいつも、第２のＰＮＡオリゴマーの結合反応は、Ｎ末端保護基の除去の後、可能な限りすばやく実施されるべきである。なぜなら、環化および脱離反応（図３を参照のこと）が生じ得、それによって、第１のモノマーの実質的部分が、固体支持体から除去され、それによって、樹脂の積載を効率的に低下するからである。
【０１０５】
調製されたダイマー−樹脂は、任意のその他の従来のトリチル樹脂（４℃）のように貯蔵されるとき、安定であるようである。このような条件下で貯蔵された樹脂の積載能力は、
少なくとも４ヶ月の間一定のままであった。ダイマー−樹脂の安定性を試験するために、４ヶ月の間４℃で貯蔵された樹脂のサンプルを、ＤＭＦで洗浄し、そしてＦｍｏｃ決定により（上記で提示された手順を参照のこと）積載能力をチェックする前に乾燥した。これらの洗浄は、任意のＵＶ活性化合物はなく、それによって、それらは、これら条件下では、実質的に分解しないことを示した。
【０１０６】
【化７】
（実施例２：ダイマー−樹脂を用いるＰＮＡ Ｃ末端酸オリゴマーの合成）
表４は、上記のように調製されたダイマー−樹脂を用いてアセンブルされるべき第１のＰＮＡオリゴマーの中であった４つのＰＮＡペンタマーのついての合成データを識別かつ提供する。合成は、Ｅｘｐｅｄｉｔｅ ＰＮＡ合成機上で実施された。色素１および色素２で標識されたＰＮＡペンタマーは、ここでは、通常基準でダイマー−樹脂を用いてアセンブルされた。図１は、このような合成から得られたＰＮＡオリゴマー、色素１−ＴＧＧ−ＴＣ−ＯＨの粗製サンプルの代表的な分析ＲＰ−ＨＰＬＣプロフィールを示す。
【０１０７】
【化８】
（実施例３：モノメトキシトリチル（Ｍｍｔ）／Ｂｈｏｃモノマーを経由するＰＮＡ酸の合成）
（Ｉ．モノメトキシトリチル（Ｍｍｔ）／Ｂｈｏｃモノマーの調製）
市販され、入手可能なＦｍｏｃ（Ｂｈｏｃ）ＰＮＡモノマーを、Ｍｍｔ／Ｂｈｏｃモノマーに、図２に示されるような反応を用いてＮ末端アミン保護基をシャッフルすることにより変換した。反応は単純で、そして４つすべての核酸塩基（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ）に対する収率は満足すべきものであった（６８〜９６％）。
【０１０８】
Ｎ末端アミン保護基シャッフルを実施するために、以下のさらなる試薬を用いた（注記される場合を除き、先に識別された試薬が用いられた）。ヘキサン：Ｐ／Ｎ ＡＨ２１６−４は、Ｂｕｒｄｉｃｋ ＆ Ｊａｃｋｓｏｎから得た。ピペリジン：Ｐ／Ｎ １０，４０９−４、４−メトキシトリチルクロライド（Ｍｍｔ−Ｃｌ）：Ｐ／Ｎ １２９２０−８およびニンヒドリン：Ｐ／Ｎ ６０−１２７は、Ａｌｄｒｉｃｈ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｍｐａｎｙから得た。酢酸エチル（ＥｏＯＡｃ）は、Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ（Ｐａｒｉｓ、Ｋｅｎｔｕｃｋｙ）から得た。
【０１０９】
一般に、このＦｍｏｃ（Ｂｈｏｃ）−ＰＮＡモノマー（１．３８ｍｍｏｌ）を、４２ｍＬのＤＣＭ−ＤＭＦ（１：１、ｖ／ｖ）中に溶解し、次いで、ピペリジンを添加した（８１８μＬ、８．２８ｍｍｏｌ）。８分後、トリエチルアミン（Ｅｔ３Ｎ；２ｍＬ）およびＭｍｔ−Ｃｌ（１．２７６ｇ、４．１４ｍｍｏｌ）をこの反応混合物に添加し、そして室温で１８時間の間攪拌した。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ、シリカプレート、９：１ ＣＨ２Ｃｌ２−ＣＨ３ＯＨ＋７滴のＤＩＰＥＡ／１０ｍＬ）が、遊離の一級アミンの存在を示した場合（ニンヒドリンに活性、ベースラインスポット）、別のバッチのＭｍｔ−Ｃｌ（３ｇ、９．７３ｍｍｏｌ）およびＥｔ３Ｎ（２ｍＬ）を添加し、そしてさらに３時間攪拌した。一般に、次のＴＬＣは、この一級アミンの完全な消費を示した。次いで、揮発性成分を、ロータリー−蒸発により除去し、そして黄色の泡を、最小量のＣＨ２Ｃｌ２中に溶解した。このように得られた溶液を、次いで、シリカゲルのパッド（２（長さ）×５（直径）インチ、３：２ ＥｔＯＡｃ−ヘキサン＋０．２％のＥｔ３Ｎでパック）上に載せ、そして最初に３：２ ＥｔＯＡｃ−ヘキサン（９００ｍＬ）で洗浄し、次いで、ＣＨ２Ｃｌ２中２０％ＣＨ３ＯＨ＋０．２％Ｅｔ３Ｎ（６００ｍＬ）で溶出した。溶媒の蒸発に際し、純粋な生成物が６８〜９６％の収率で得られた。
【０１１０】
（ＩＩ．副反応の分析）
Ｍｍｔ基は、樹脂上に第１のモノマーを係留した後、ジクロロメタン中の２％のジクロロ酢酸（ＤＣＡ）の溶液で除去され得ることが理論付けられた。この脱保護戦略は、ケトピペラジンを形成する環化および脱離反応（図３）を行なわない、プロトン化アミン基を生成することが意図された。Ｂｈｏｃ基は、Ｍｍｔ基除去条件下では不安定であることが知られているので、核酸塩基の遊離の環外アミンがＭｍｔ脱保護条件で生成された場合、分岐反応が生じる可能性があった。
【０１１１】
この可能な副反応を試験するために、Ｆｍｏｃ（Ｂｈｏｃ）シトシンモノマーが、標準的なカップリング条件を用いてＸＡＬ−ＰＥＧ−ＰＳ樹脂に係留され、そして次に、ＤＣＡ溶液で３分間処理されるモデル実験を実施した。次いで、この樹脂を洗浄し、そして合成を、市販され入手可能なＥｘｐｅｄｉｔｅ核酸合成機中で（市販され入手可能なＦｍｏｃ（Ｂｈｏｃ）モノマーおよびプロトコールを用いて）継続し、配列ＧＡＴＣのＰＮＡオリゴマーをアセンブルした。次いで、ＰＮＡを、標準的な手順を用いて樹脂から切断し、そして粗製オリゴマーを、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにより分析した。
【０１１２】
質量データは、生成物ＧＡＴＣおよびアセチル化生成物ＧＡＴＣＡｃの存在を示した。この結果は予想された。なぜなら、このＢｈｏｃ脱保護シトシンは、次のキャッピングステップ（単数または複数）でアセチル化されたからである。しかし、質量分析では、分岐オリゴマーは検出されなかった。これは、シトシンの環外アミンは、代表的なＨＡＴＵカップリング下ではＰＮＡモノマーとアセチル化するに十分求核性ではないことを示唆する。次いで、テトラマーを、２８％水性ＮＨ３での処理により非アセチル化オリゴマーに首尾よく変換した。これは、質量分析計中の質量分析によって確認された。これらの結果から、Ｍｍｔ／Ｂｈｏｃモノマーは、オリゴマー分岐に悩むことなくＣ末端酸を含むＰＮＡオリゴマーを合成するために用いられ得たと結論付けられた。
【０１１３】
（ＩＩＩ．Ｍｍｔ／Ｂｈｏｃモノマーを用いるＰＮＡ Ｃ末端オリゴマーの調製）
この決定がなされた後、図４に示されるように、２，６−ジクロロ−ベンゾイルクロライドを用いて、Ｍｍｔ／Ｂｈｏｃ−Ｇモノマーを、Ｗａｎｇ樹脂に係留した。この樹脂を洗浄し、そして次のモノマー（Ｔ、Ｔ、ＧおよびＡ）を、標準的なＨＡＴＵカップリング条件を用いて結合した。ＤＣＡ洗浄中にＰＮＡモノマーは検出されず（ＴＬＣ：ＵＶおよびニンヒドリン試験）；これは、最初の残基がＤＣＡ処理に際して固体支持体から切断されないことを示した。
【０１１４】
積載は高く（０．３１ｍｍｏｌ／ｇ；最初のＴのＦｍｏｃカウントから得た）、そしてその他のカップリングの間を通じて同じに維持された。合成を終了するために、Ｂｏｃ保護色素１（図５）を、標準的な標識条件を用いてＰＮＡオリゴマーのＮ末端に結合した。この樹脂を切断し、そして粗製生成物を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳおよびＨＰＬＣにより分析した。この分析は、この生成物の効率的な形成（９６％）を示した。キャッピングステップは、すべてのカップリングから脱離され、そして生成物の質に影響するようではないことに注目することが重要である。このプロセスはまた、ＮｏｖａＳｙｎ−ＴＧＡ樹脂を用いてもまた成功し（図６）、ここで、樹脂は、Ｗａｎｇ樹脂とは、主に、ＰＥＧリンカーの存在下であることが異なる。これらプロセスは、実施例１で上記に記載されたようなＰＮＡダイマー樹脂（固体支持体）のライブラリーを生成するために用いられ得る。
【０１１５】
（ＩＶ．結果の要約）
− 樹脂上のＭｍｔ／Ｂｈｏｃモノマー積載は高く（１．２０〜０．２７ｍｍｏｌ／ｇ）、そしてＰＮＡ Ｃ末端オリゴマーの調製のために用いられ得る。
【０１１６】
− モノマー樹脂のＭｍｔ基の切断後、プロトン化アミンは、直後に結合される必要はない。
− キャッピング工程は、これらモノマーではなくされ、時間を減少する。
− 従来のＰＮＡ合成機の合成プロトコールを変更する必要はない。
【０１１７】
非保護色素１および色素２の構造は、図７に見出され得る。
【０１１８】
（実施例４：ダイマー樹脂生成のための別の一般的手順）
モノマー樹脂（１〜５ｇスケール）の合成のための手順：
１）Ｆｍｏｃ／ＢｈｏｃＰＮＡモノマー（１．４６ｍｍｏｌ、０．７５当量）およびＤＩＰＥＡ（４．３８ｍｍｏｌ、２．２５当量）を、ＮＭＰ／ＤＣＭ（１０ｍＬ／５ｍＬ、すべて無水）中でモノマーが溶解するまで攪拌する＊。モノマー濃度は０．１Ｍである。
２）樹脂＊＊（１．５ｇ、１．９５ｍｍｏｌ、１．００ｅｑ）をモノマー溶液に添加し；不活性雰囲気下で４時間攪拌する。
３）樹脂を濾過し、完全に混合しながら、３×１５ｍＬのＮＭＰで洗浄する。
４）樹脂を、キャッピング溶液中（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ／ＤＩＰＥＡ＝１７ｍＬ／２ｍＬ／１ｍＬ）で１５分間攪拌する。
５）樹脂を濾過し、３×１５ｍＬのＮＭＰ、３×１５ｍＬのＡＣＮで各々完全に混合して洗浄する。
６）減圧下で樹脂を乾燥する。
【０１１９】
ダイマー（１〜５ｇスケール）合成のための手順：
１）モノマー樹脂（０．４９ｍｍｏｌ、１．０ｇ、１．００当量）を、５．０ｍＬのＮＭＰに３時間の間浸す。
２）ＤｅＦＭＯＣ溶液：ＮＭＰ（５．０ｍＬ）中２．０％ＤＢＵを調製する。
３）モノマー（０．９８ｍｍｏｌ、２．００当量）、ＨＡＴＵ（０．９３ｍｍｏｌ、１．９０当量）、およびＤＩＰＥＡ（１．９６ｍｍｏｌ、４．０当量）を、１０ｍＬのＮＭＰ中で５〜１０分攪拌することによりカップリング溶液を調製する。モノマー濃度は０．１Ｍである。
４）ＮＭＰ中のモノマー樹脂にＤｅＦＭＯＣ溶液を直接添加する。ＤＢＵの最終濃度は１．０％である；４分攪拌する。
５）ビーズを濾過し；３×１５ｍＬのＮＭＰで攪拌しながら洗浄する（約４分要する）。
６）樹脂にカップリング溶液を添加し、そして６０分間攪拌する。
７）樹脂を濾過し、３×１５ｍＬのＮＭＰで完全に攪拌して洗浄する。
８）１５ｍＬのＰＮＡキャッピング溶液（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｐ／Ｎ ＧＥＮ０６３１０２）を樹脂に添加し、３０分間攪拌する。
９）樹脂を濾過し、３×１５ｍＬのＮＭＰ、３×１５ｍＬのＡＣＮで、各々完全に混合して洗浄する。
１０）減圧下で樹脂を乾燥する。
【０１２０】
本発明の好ましい実施形態を記載したが、今や、これら概念を取り込むその他の実施形態が用いられ得ることは当業者に明らかとなる。従って、これら実施形態は、開示の実施形態に制限されるべきではなく、むしろ本発明の思想および範囲によってのみ制限されるべきであると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０１２１】
【図１】図１は、粗製蛍光標識されたＰＮＡ Ｃ末端酸ペンタマーのサンプルの高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の結果である。
【図２】図２は、Ｆｍｏｃ（Ｂｈｏｃ）ＰＮＡモノマーからＭｍｔ／Ｂｈｏｃモノマーを生成するためのＮ末端アミン保護基シャッフル反応の概略図である。
【図３】図３は、Ｎ末端アミン保護基除去、およびＮ末端アミン保護基プロトン化によるケトピペラジン形成（環化および脱離）の阻害の概略図である。
【図４】図４は、Ｗａｎｇ樹脂（固体支持体）およびＭｍｔ／ＢｈｏｃおよびＦｍｏｃ（Ｂｈｏｃ）ＰＮＡモノマーの組み合わせから開始する蛍光標識されたＰＮＡ Ｃ末端酸オリゴマーの調製の概略である。
【図５】図５は、ビス−（ｔ−ｂｏｃ）−保護色素１の構造である。
【図６】図６は、ＮｏｖａＳｙｎ−ＴＧＡ樹脂の図示である。
【図７】図７は、色素１および色素２の構造である。
【図８】図８のａおよびｂは、細長いＰＮＡオリゴマーおよびＰＮＡキメラを生成するために用いられ得るＰＮＡ連結／縮合反応の非限定的な例の図示である。
【技術分野】
【０００１】
（発明の開示）
（Ｉ．本明細書で用いられる特定の略語のリスト）
Ｆｍｏｃ＝９−フルオレニルメトキシカルボニル
Ｂｈｏｃ＝ベンズヒドロキシカルボニル
Ｍｍｔ＝モノメトキシトリチル
ＴＦＡ＝トリフルオロ酢酸
ｂｏｃまたはｔ−ｂｏｃ＝ｔｅｒ−ブトキシカルボニル
ＰＡＬ＝５−（４’−アミノメチル−３’，５’−ジメトキシフェノキシ）吉草酸
ＭＢＨＡ＝メトキシベンズヒドリルアミン
ＤＨＰＰ＝４−（１’、１’−ジメチル−１’−ヒドロキシプロピル）−フェノキシアセチル−アラニル−アミノメチル樹脂
ＤＮＡ＝２’−デオキシリボ核酸
ＲＮＡ＝リボ核酸
ＰＮＡ＝ペプチド核酸
ＰＥＧ＝ポリエチレングリコール
ＤＢＵ＝１，８−ジアザビシクロ−［５．４．０］−ウンデク−７−エン
ＭｅＯＨ＝メタノール
ＡＣＮ＝アセトニトリル
（ＩＩ．定義）
本明細書を解釈する目的のために以下の定義が適用され、そして適切な場合はつねに、単数で用いられる用語は複数をも含み、そしてその逆も同じである。
【０００２】
ａ．本明細書で用いられるとき、「核酸塩基」は、核酸技術を利用するか、またはペプチド核酸技術を利用し、それによって核酸に配列特異的に結合し得るポリマーを生成する者に共通して公知である天然に存在するヘテロ環成分および天然に存在しないヘテロ環成分を意味する。適切な核酸塩基の非制限的な例は：アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、５−プロピニル−ウラシル、２−チオ−５−プロピニル−ウラシル、５−メチルシトシン、プソイドイソシトシン、２−チオウラシルおよび２−チオチミン、２−アミノプリン、Ｎ９−（２−アミノ−６−クロロプリン）、Ｎ９−（２，６−ジアミノプリン）、ヒポキサンチン、Ｎ９−（７−デアザ−グアニン）、Ｎ９−（７−デアザ−８−アザ−グアニン）およびＮ８−（７−デアザ−８−アザ−アデニン）を含む。適切な核酸塩基のその他の非制限的な例は、Ｂｕｃｈａｒｄｔら（米国特許第６，３５７，１６３号）の図２（Ａ）および２（Ｂ）に示されるような核酸塩基を含む。
【０００３】
ｂ．本明細書で用いられるとき、「核酸塩基配列」は、オリゴマーまたポリマー中の核酸塩基含有サブユニットの任意のセグメントを意味する。適切なオリゴマーまたはポリマーの非制限的な例は、オリゴデオキシヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）、オリゴリボヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ＰＮＡキメラ、ＰＮＡオリゴマー、核酸アナログおよび／または核酸模倣物を含む。
【０００４】
ｃ．本明細書で用いられるとき、「標的配列」は、決定されることが求められるポリ核酸塩基鎖の核酸塩基配列である。標的配列の性質は、制限ではないことが理解されるべきである。標的配列を含むポリ核酸塩基鎖は、任意の供給源から提供され得る。例えば、この標的配列は、核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）、ＰＮＡ、核酸アナログまたはその他の核酸模倣物の一部として存在し得る。この標的配列を含むサンプルは、天然から提供され得るか、または、それは、製造プロセスから合成または供給され得る。標的配列が核酸のサブ配列であるとき、この核酸は、任意の供給源か得られ得る。例えば、この核酸は、核酸増幅プロセスから生成され得るか、細胞または生物中に含まれ得るか、またはそうでなければ細胞または生物から抽出され得る。この核酸の供給源であり得る非限定的な核酸増幅プロセスの例は、制限されずに、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、Ｑ−βレプリカーゼ増幅（Ｑ−β）およびローリングサークル増幅（ＲＣＡ）を含む。
【０００５】
ｄ．本明細書で用いられるとき、「ポリ核酸塩基鎖」は、核酸塩基含有サブユニットを含む単一ポリマー鎖を意味する。例えば、二本鎖核酸の一本鎖ポリマー鎖はポリ核酸塩基鎖である。
【０００６】
ｅ．本明細書で用いられるとき、「核酸」は、ヌクレオチド、またはそのアナログから形成される骨格を有する核酸塩基配列含有オリゴマーまたはポリマーである。好ましい核酸はＤＮＡおよびＲＮＡである。任意の疑いを避けるために、ＰＮＡは、核酸模倣物であり、そして核酸または核酸アナログではない。
【０００７】
ｆ．本明細書で用いられるとき、「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」は、２つ以上のＰＮＡサブユニット（残基）を含む任意のオリゴマーまたはポリマーを意味し、制限されずに、米国特許第５，５３９，０８２号、同第５，５２７，６７５号、同第５、６２３，０４９号、同第５、７１４，３３１号、同第５，７１８，２６２号，同第５、７３６，３３６号、同第５，７７３，５７１号、同第５，７６６，８５５号、同第５，７８６、４６１号、同第５，８３７，４５９号、同第５，８９１，６２５号、同第５，９７２，６１０号、第同５，９８６，０５３号、同第６，１０７，４７０号、同第６，２０１，１０３号、同第６，２２８，９８２号および同第６，３５７，１６３号で言及されるか、または請求の範囲に記載の任意のオリゴマーまたはポリマーセグメントを含み；これらすべては、本明細書中に参考として援用される。用語「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」はまた、以下の刊行物中に記載のような核酸模倣物の２つ以上のサブユニットを含む任意のオリゴマーまたはポリマーに適用される：Ｌａｇｒｉｆｆｏｕｌら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ、４：１０８１〜１０８２（１９９４）；Ｐｅｔｅｒｓｅｎら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ、６：７９３〜７９６（１９９６）；Ｄｉｄｅｒｉｃｈｓｅｎら、Ｔｅｔｔ．Ｌｅｔｔ．３７：４７５〜４７８（１９９６）；Ｆｕｊｉｉら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．７：６３７〜３２７（１９９７）；Ｊｏｒｄａｎら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．７：６８７〜６９０（１９９７）；Ｋｒｏｔｚら、Ｔｅｔｔ．Ｌｅｔｔ．３６：６９４１〜６９４４；Ｌａｇｒｉｆｆｌｏｕｌら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．４：１０８１〜１０８２（１９９４）；Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈｅｎ、Ｕ．、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ、７：１７４３〜１７４６（１９９７）；Ｌｏｗｅら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．１、（１９９７）１：５３９〜５４６；Ｌｏｗｅら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．１１：５４７〜５５４（１９９７）；Ｌｏｗｅら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．１１：５５５〜５６０（１９９７）；Ｈｏｗａｒｔｈら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６２：５４４１〜５４５０（１９９７）；Ａｌｔｍａｎｎ、Ｋ−Ｈら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ、７：１１１９〜１１２２（１９９７）；Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈｅｎ、Ｕ．、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．、８：１６５〜１６８（１９９８）；Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈｓｅｎら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．、３７：３０２〜３０５（１９９８）；Ｃａｎｔｉｎら、Ｔｅｔｔ．Ｌｅｔｔ．、４２１１〜４２１４（１９９７）；Ｃｉａｐｅｔｔｉら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、５３：１１６７〜１１７６（１９９７）；Ｌａｇｒｉｆｆｏｕｌｅら、Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．、３：９１２〜９１９（１９９７）；Ｋｕｍａｒら、Ｏｒｇａｎｉｃ Ｌｅｔｔｅｒｓ３（９）：１２６９〜１２７２（２００１）；およびＷＯ９６／０４０００に開示のようなＳｈａｈらのＰｅｐｔｉｄｅ−Ｂａｓｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｍｉｍｉｃｓ（ＰＥＮＡＭ）。
【０００８】
特定の実施形態では、「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」は、以下の式の２つ以上の共有結合したサブユニットを含むオリゴマーまたはポリマーセグメントである：
【０００９】
【化１】
ここで、各Ｊは、同一であるか、または異なり、そして、Ｈ、Ｒ１、ＯＲ１、ＳＲ１、ＮＨＲ１、ＮＲ１２、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩからなる群から選択される。各Ｋは、同一であるか、または異なり、そして、Ｏ、Ｓ、ＮＨおよびＮＲ１からなる群から選択される。各Ｒ１は、同一であるか、または異なり、そして、必要に応じてヘテロ原子を含み得る１〜５の炭素原子を有するアリル基、または置換もしくは非置換アリール基である。各Ａは、単一の結合、式；−（ＣＪ２）５−の基、および式；−（ＣＪ２）５Ｃ（Ｏ）−からなる群から選択され、ここで、Ｊは、上記で規定され、そして各ｓは１〜５の整数である。各ｔは１または２であり、そして各ｕは１または２である。各Ｌは、同一であるか、または異なり、そして、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、５−プロピニル−ウラシル、２−チオ−５−プロピニル−ウラシル、５−メチルシトシン、プソイドイソシトシン、２−チオウラシルおよび２−チオチミン、２−アミノプリン、Ｎ９−（２−アミノ−６−クロロプリン）、Ｎ９−（２，６−ジアミノプリン）、ヒポキサンチン、Ｎ９−（７−デアザ−グアニン）、Ｎ９−（７−デアザ−８−アザ−グアニン）およびＮ８−（７−デアザ−８−アザ−アデニン）、その他の天然に存在する核酸塩基アナログまたはその他の天然に存在しない核酸塩基からなる群から独立に選択される。
【００１０】
その他の特定の実施形態では、ＰＮＡサブユニットは、Ｎ−［２−（アミノエチル）］グリシン骨格のＮ−α−グリシン窒素にメチレンカルボニル結合（これは、現在、ペプチド核酸サブユニットの最も一般的に用いられる形態である）により付着した天然に存在するか、または天然に存在しない核酸塩基からなり；これは、現在、ペプチド核酸サブユニットの最も一般的に用いられる形態である。
【００１１】
ｇ．本明細書で用いられるとき、「末端保護基」は、ＰＮＡモノマーまたはＰＮＡオリゴマーの末端求核官能基に共有結合した保護基を意味する。例えば、ＰＮＡモノマーを連結することで用いられ得るＰＮＡモノマーまたはオリゴマーの末端一級アミンは、末端保護基で代表的に保護される末端求核官能基である。
【００１２】
ｈ．本明細書で用いられるとき、「核酸塩基保護基」は、ＰＮＡモノマーまたはオリゴマーの核酸塩基の官能基に共有結合し、特定の化学反応（例えば、連結／縮合またはカップリング）の間に官能基を非反応性にする保護基を意味する。例えば、代表的には、アデニン、シトシンおよびグアニンの環外アミノ基は、ＰＮＡオリゴマーの化学的アセンブリの間に適切な保護基で保護される。しかし、核酸塩基は、そうである必要はないが、本明細書中に記載されるような連結／縮合反応の間に保護され得る。
【００１３】
ｉ．本明細書で用いられるとき、「ＰＮＡダイマー」は、一緒に共有結合した２つのＰＮＡサブユニットを意味する。このＰＮＡダイマーは、完全に保護されるか、部分的に保護されるか、または保護されなくてもよい。完全に保護されるとは、本発明者らは、代表的にはＰＮＡオリゴマーの固相化学的アセンブリの間に保護される、このＰＮＡダイマーのすべての反応性官能基が、末端保護基および／または核酸塩基保護基で保護されていることを意味する。部分的に保護されるとは、本発明者らは、代表的にはＰＮＡオリゴマーの固相化学的アセンブリの間に保護される、このＰＮＡダイマーの少なくとも１つの反応性官能基が、保護基を含まないことを意味する。保護されないとは、通常、ＰＮＡオリゴマーの固相化学的アセンブリの間に保護される、このＰＮＡダイマーのすべての反応性官能基が、保護基を含まないことを意味する。代表的にはＰＮＡオリゴマーの固相化学的アセンブリの間に保護されるＰＮＡダイマーの反応性官能基の例は、このオリゴマーのＮ末端アミノ基および核酸塩基の環外アミノ基を含む。
【００１４】
ｊ．本明細書で用いられるとき、「Ｆｍｏｃ（Ｂｈｏｃ）ＰＮＡモノマー」または「Ｆｍｏｃ（Ｂｈｏｃ）モノマー」は、Ｎ末端アミン基を保護するためにＦｍｏｃ保護基を含むＰＮＡモノマーを、適用可能である場合、核酸塩基の環外アミン基の１つ以上を保護するためのＢｈｏｃ保護基を意味し、制限されずに、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡから市販され、入手可能なようなＦｍｏｃモノマーを含む。疑いを避けるために、Ｆｍｏｃ（Ｂｈｏｃ）ＰＮＡモノマーは、Ｆｍｏｃチミン、Ｆｍｏｃウラシル、Ｆｍｏｃ２−チオチミンまたはＦｍｏｃ２−チオウラシルモノマーを含むことが、これらモノマーは、Ｂｈｏｃ保護基が必要とする環外アミン基を所有しないという事実にかかわらず、意図される。
【００１５】
ｋ．本明細書で用いられるとき、Ｍｍｔ／ＢｈｏｃＰＮＡモノマーは、Ｎ末端アミン基を保護するためのＭｍｔ保護基を、そして適用可能である場合、核酸塩基の環外アミン基の１つ以上を保護するためのＢｈｏｃ保護基（実施例３を参照のこと）を含むＰＮＡモノマーを意味する。疑いを避けるために、Ｍｍｔ／ＢｈｏｃＰＮＡモノマーは、Ｍｍｔチミン、Ｍｍｔウラシル、Ｍｍｔ２−チオチミンまたはＭｍｔ２−チオウラシルモノマーを含むことが、これらモノマーは、Ｂｈｏｃ保護基が必要とする環外アミン基を所有しないという事実にかかわらず、意図される。
【００１６】
ｌ．本明細書で用いられるとき、「ＰＮＡ」キメラは、２つ以上のＰＮＡサブユニットおよび１つ以上の核酸サブユニット（すなわち、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を含むオリゴマー、またはそのアナログを意味し、これらは、異なるクラスのサブユニットから選択され、しかも共有結合またはリンカーによって結合されている。例えば、ＰＮＡ／ＤＮＡキメラは、化学的結合またはリンカーにより、少なくとも１つの２’−デオキシリボ核酸サブユニットに共有結合された少なくとも２つのＰＮＡサブユニットを含み得る（ＰＮＡ／ＤＮＡキメラ調製に関する例示の方法および組成物については、ＷＯ９６／４０７０９を参照のこと）。
【００１７】
ｍ．本明細書で用いられるとき、「酸を形成する切断可能なリンカー」は、固体支持体に付着され、ポリマーの化学的アセンブリの間に、固体支持体にオリゴマーまたはポリマー（例えば、ＰＮＡ）をこの支持体に切断可能に連結する成分を意味し、そしてここで、この共有結合は、化学的処置によって切断され得、それによって、オリゴマーまたはポリマーを離脱し（一般に、化学的アセンブリが終了した後）、ここで、この離脱したポリマーは、固体支持体からの離脱に際し、その前の付着の点で酸成分を含む。例えば、ＰＮＡ Ｃ末端酸オリゴマーは、ＰＮＡオリゴマーが酸を形成する切断可能なリンカーを有する固体支持体から離脱されるとき、形成されるＣ末端酸基を含むＰＮＡオリゴマーである。例えば、ＰＮＡオリゴマーのこのＣ末端酸基は、Ｃ末端カルボン酸であり得るか、またはＣ末端スルホン酸であり得る。
【００１８】
ｈ．本明細書で用いられるとき、用語「標識」、「レポーター成分」または「検出成分」は、交換可能であり、そしてオリゴマーまたはオリゴマーブロックに付着され得る成分をいい、またはそうでなければ、レポーターシステムで用いられ得、それによって、器具または方法によってオリゴマーを検出可能にする。例えば、標識は、（ｉ）検出可能なシグナルを提供する；（ｉｉ）第１または第２の標識によって提供される検出可能なシグナルを改変するための第２の標識と相互作用する；または（ｉｉｉ）捕獲機能、すなわち、疎水性親和性、抗体／抗原、イオン的複合体化、を与える任意の成分であり得る。
【００１９】
ｏ．本明細書で用いられるとき、「配列特異的」は、水素結合を通じた塩基対合によるハイブリダイゼーションを意味する。標準的な塩基対合の非制限的な例は、チミンとのアデニン塩基対合、およびシトシンとのグアニン塩基対合を含む。塩基対合モチーフのその他の非制限的な例は、制限されずに：以下のいずれかとのアデニン塩基対合：５−プロピニル−ウラシル、２−チオ−５−プロピニル−ウラシル、２−チオウラシルまたは２−チオチミン；以下のいずれかとのグアニン塩基対合：５−メチルシトシンまたはプソイドイソシトシン；以下のいずれかとのシトシン塩基対合：ヒポキサンチン、Ｎ９−（７−デアザ−グアニン）またはＮ９−（７−デアザ−８−アザ−グアニン）；以下のいずれかとのチミンまたはウラシル塩基対合：２−アミノプリン、Ｎ９−（２−アミノ−６−クロロプリン）またはＮ９−（２，６−ジアミノプリン）；およびＮ８−（７−デアザ−８−アザ−アデニン）、汎用塩基である、例えば以下のいずれかのような任意のその他の核酸塩基との塩基対合：アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、５−プロピニル−ウラシル、２−チオ−５−プロピニル−ウラシル、５−メチルシトシン、プソイドイソシトシン、２−チオウラシルおよび２−チオチミン、２−アミノプリン、Ｎ９−（２−アミノ−６−クロロプリン）、Ｎ９−（２，６−ジアミノプリン）、ヒポキサンチン、Ｎ９−（７−デアザ−グアニン）、Ｎ９−（７−デアザ−８−アザ−グアニン）またはＮ８−（７−デアザ−８−アザ−アデニン）（Ｓｅｅｌａら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ、Ｒｅｓ．：２８（１７）：３２２４〜３２３２（２０００）を参照のこと）を含む。
【００２０】
ｐ．本明細書で用いるとき、「縮合条件」または「連結条件」は、選択された縮合／連結化学に従って２つのＰＮＡオリゴマーを縮合／連結するために適切な条件を意味する。
【００２１】
ｑ．本明細書で用いるとき、「連結」および「縮合」は、交換可能であり、そして２つのオリゴマーブロックを共有結合するプロセスをいい、それによって細長いＰＮＡオリゴマーまたはキメラを形成する。この連結／縮合化学は、これら方法の限定ではないことを理解すべきである。細長いＰＮＡオリゴマーを形成するために適切な多くの縮合／連結化学の非限定的な例は、図８ａおよび８ｂを参照して本明細書中に記載されている。
【００２２】
ｒ．本明細書で用いられるとき、「クエンチング」は、その機構にかかわらず、クエンチャー成分にともなうエネルギー転移により引き起こされる蛍光レポーター成分の蛍光における減少を意味する。
【００２３】
ｓ．本明細書で用いられるとき、「固体支持体」または「固体キャリア」は、その上で、ＰＮＡモノマー、ＰＮＡダイマー、ＰＮＡオリゴマーまたはＰＮＡキメラが合成、付着、連結またはそうでなければ固定化される任意の固相材料を意味する。固体支持体は、「樹脂」、「合成支持体」、「固相」、「表面」および／または「支持体」の用語を包含する。固体支持体は、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフルオロエチレン、ポリエチレンオキシ、およびポリアクリルアミド、ならびにそれらのコポリマーおよびグラフトのような有機ポリマーを含み得る。固体支持体はまた、ガラス、シリカ、制御ポアガラス（ＣＰＧ）、または逆相シリカのような無機物であり得る。固体支持体の形態は、ビーズ、スフェア、粒子、顆粒、ゲル、または表面の形状であり得る。表面は、平面状、実施的に平面状、または非平面であり得る。固体支持体は、多孔性または非多孔性であり得、そして膨潤性または非膨潤性特徴を有し得る。固体支持体は、ウェル、窪みまたはその他のコンテナ、ベッセルの形態、機能または位置に構成され得る。複数の固体支持体は、試薬のロボット送達のために、またはレーザー照射および共焦点または偏向光収集による走査を含む検出手段によりアドレス可能な、種々の位置にあるアレイにある形態であり得る。
【００２４】
ｔ．本明細書で用いられるとき、「立体的に妨害された固体支持体」は、立体的に妨害された切断可能なリンカーまたは立体的に阻害された酸を形成する切断可能なリンカーを含む固定支持体を意味する。立体的に妨害されるとは、本発明者らは、リンカーが、固体支持体上でアセンブルされるリンカーとオリゴマーとの間で切断可能な共有結合を形成する二級または三級原子を含むリンカーを意味する。立体的に妨害された固体支持体の非限定的な例は：トリチルクロライド樹脂（トリチル−Ｃｌ、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、Ｐ／Ｎ ０１−６４−００７４）、２−クロロトリチルクロライド樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、Ｐ／Ｎ ０１−６４−００２１）、ＤＨＰＰ（Ｂａｃｈｅｍ、Ｐ／Ｎ Ｑ−１７５５）、ＭＢＨＡ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐ／Ｎ ４００３７７）、４−メチルトリチルクロライド樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、Ｐ／Ｎ ０１−６４−００７５）、４−メトキシトリチルクロライド樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、Ｐ／Ｎ ０１−６４−０３４５）、Ｒｉｎｋ酸樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ Ｐ／Ｎｓ ０１−６４−０３８０、０１−６４−０２０２）、ＮｖａＳｙｎ ＴＧＴアルコール樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、Ｐ／Ｎ０１−６４−００７４）を含む。
【００２５】
ｕ．本明細書で用いられるとき、「支持体に結合」は、固体支持体上またはそれに固定化されることを意味する。
【００２６】
ｖ．本明細書で用いられるとき、「アレイ」または「マイクロアレイ」は、固体支持体上に存在するか、またはベッセルの整列中にあるオリゴマーの所定の空間的整列を意味する。特定のアレイフォーマットは、「チップ」または「バイオチップ」と称される（Ｍ．Ｓｃｈｅｎａ編、Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｂｉｏｃｈｉｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅ Ｂｏｏｋｓ、Ｅａｔｏｎ Ｐｕｓｌｉｓｈｉｎｇ、Ｎａｔｉｋ、ＭＡ（２０００））。アレイは、例えば、２〜約１２の低密度数、例えば、約１００以上の位置の中密度、例えば、千以上の高密度のアドレス可能な位置を含み得る。代表的には、このアレイフォーマットは、製作、取り扱い、配置、積み上げ、試薬導入、検出、および貯蔵を可能にする幾何学的に規則的な形状である。このアレイは、行およびカラムフォーマットの形態であり得、各位置の間は規則的な間隔である。あるいは、これらの位置は、束になり、混合されるか、または均等化処理またはサンプリングのために均一にブレンドされ得る。アレイは、各位置が、試薬の高スループット取り扱い、ロボット送達、マスキング、またはサンプリングのため、あるいはレーザー照射および共焦点または偏向光収集による走査を含む検出手段によってアドレス可能であるような、複数のアドレス可能な位置を含み得る。
【００２７】
ｗ．本明細書で用いられるとき、「ブロック」、「オリゴマーブロック」または「ブロックオリゴマー」は交換可能であり、そしてすべては、第２の適切な改変されたＰＮＡオリゴマーまたはキメラに連結されるように設計され、かつ利用可能であり、それによって細長いオリゴマーを調製するＰＮＡオリゴマーまたはキメラを意味する。連結／縮合されるオリゴマーまたはブロックは、非標識であり得るか、１つ以上のレポーター成分で標識され得るか、および／または１つ以上の保護または非保護官能基を含み得る。細長いオリゴマーに関し、ブロックはまた、この細長いオリゴマーを形成するために用いられたブロックから由来する細長いオリゴマーの一部をいうために用いられ得る。この細長いオリゴマーはまた、このオリゴマーをさらに伸長する連結／縮合反応におけるブロックとして用いられ得る。
【００２８】
ｘ．本明細書で用いられるとき、ポリマーおよびオリゴマーは、長さが２つ以上のサブユニットのＰＮＡオリゴマーまたはＰＮＡキメラについていうとき、本質的に交換可能である。
【００２９】
ｙ．本明細書で用いられるとき、「ネイティブオリゴマー」は、細長いオリゴマーの２つのオリゴマーブロックを分離するリンカーを含まないＰＮＡオリゴマーまたはＰＮＡキメラをいう。従って、ネイティブオリゴマーは、たとえキメラであっても、連結の点で改変されていないＰＮＡ骨格を含み、そしてそれ故、ＰＮＡモノマーのデノボの化学的アセンブリを用いて産生され得るものから区別不能である。
【背景技術】
【００３０】
（ＩＩＩ．一般）
（化学的アセンブリによるＰＮＡオリゴマー合成）
ＰＮＡの化学的アセンブリのための方法は周知である（米国特許第５，５３９，０８２号、同第５，５２７，６７５号、同第５、６２３，０４９号、同第５、７１４，３３１号、同第５，７１８，２６２号，同第５、７３６，３３６号、同第５，７７３，５７１号、同第５，７６６，８５５号、同第５，７８６、４６１号、同第５，８３７，４５９号、同第５，８９１，６２５号、同第５，９７２，６１０号、第同５，９８６，０５３号、同第６，１０７，４７０号、同第６，２０１，１０３号、同第６，２２８，９８２号および同第６，３５７，１６３号を参照のこと；これらすべては本明細書中に参考として援用される（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅもまた参照のこと））。ＰＮＡ合成方法のための一般的参照としてはまた、Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ；Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｈｏｒｚｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｏｒｆｏｌｋ Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９９）を参照のこと。
【００３１】
ペプチド核酸の支持体に結合した自動化化学的アセンブリのための化学および器具は、今や、市販され入手可能である。標識または非標識ＰＮＡオリゴマーの両方は、同様に、カスタムＰＮＡオリゴマーの市販ベンダーから入手可能である。ＰＮＡの化学的アセンブリは、固相ペプチド合成に類似であり、ここで、アセンブリの各サイクルにおいて、このオリゴマーは、成長するポリマーに付加される次のシントンと縮合される反応性アルキルアミノ末端を所有している。
【００３２】
ＰＮＡは、マイクロモル以下からミリモルまたはそれ以上までの任意のスケールで合成され得る。ＰＮＡは、ＸＡＬまたはＰＡＬ支持体を用いるＥｘｐｅｄｉｔｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上で、Ｆｍｏｃ（Ｂｈｏｃ）、ｔＢｏｃ／Ｚ、またはＭｍＴ保護基モノマーを用いて、２μモルスケールで首尾よく合成され得る。あるいは、ＭＢＨＡ支持体とともにＭｏｄｅｌ ４３３Ａ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）が用いられ得る。さらに、多くのその他の自動化合成機および合成支持体が利用され得る。標準的なペプチド化学が利用されるので、天然および非天然アミノ酸が、慣用的にＰＮＡオリゴマー中に取り込まれ得る。ＰＮＡは、ポリアミドであるので、それは、Ｃ末端（カルボキシル末端）およびＮ末端（アミノ末端）を有する。標的配列への逆平行結合（好ましい配向）のために適切なハイブリダイゼーションプローブの設計の目的のために、プローブするＰＮＡプローブの核酸塩基配列のＮ末端は、相当するＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドの５’ヒドロキシル末端の等価物である。
【００３３】
（連結／縮合によるＰＮＡオリゴマー合成）
連結／縮合反応で用いられるとき、選択された連結化学の性質が考慮されるべきである。単純さのために、本発明者らは、しばしば、連結／縮合反応で用いられるオリゴマーの１つを、末端オリゴマーまたは末端ブロックと、そしてその他を、縮合オリゴマーまたは縮合ブロックと称する。この区別は、一般に、異なるブロック間を、特にそれらが同じ核酸塩基配列を含む場合を区別することを除いて関係がない。しはしば、少なくとも連結で用いられる官能基の性質は、末端および縮合オリゴマーブロックについて異なる。なぜなら、それらは、異なる連結化学薬品を収容するように設計され得るからである。例えば、１つのオリゴマーブロックはＣ末端酸基を含み得、そしてその他はＮ末端アミン基を含み得、ここで、縮合／連結反応の産物は、細長いＰＮＡオリゴマーまたはキメラを形成するアミド結合である。
【００３４】
しかし、オリゴマーが複数の連結によって伸長されるべきとき、本発明者らは、一般に、末端オリゴマーブロックを、第１の連結から、または直前に進行する連結ステップから産生されるオリゴマーブロックという。連結化学薬品のいくつかの非制限的な例は、図８ａおよび８ｂに示されている。慣用的実験および本明細書中に含まれる説明を用い、当業者は、細長いＰＮＡオリゴマーまたはＰＮＡキメラを容易に調製し得る。
【００３５】
末端ブロックは、比較的非反応性であるＣ末端アミドを含み得る。対照的に、縮合ブロックは、連結反応に適切であるＣ末端を含み得る。しかし、縮合化学の性質に依存して、オリゴマーのこのＣ末端は、Ｃ末端酸を含み得る。オリゴマーの末端への連結／縮合される官能基は、縮合／連結化学の性質に依存して末端保護基の付加が必要であってもなくてもよい。オリゴマーブロックは、しばしば、それら自身がデノボ方法で調製されるので、そして適切な市販の試薬および器具が、Ｃ末端アミノ酸またはＣ末端アミドを含むＰＮＡオリゴマーの産生のために利用可能であるために、当業者は、所望のＣ末端形態のオリゴマーブロックを容易に調製し得る。
【００３６】
Ｎ末端に関しては、ここで再び、正確な形態は、選択された連結化学の性質、およびオリゴマーが縮合オリゴマーブロックであるか、または末端オリゴマーブロックであるか否かに依存し得る。オリゴマーが末端ブロックである場合、このＮ末端は、反応性官能基（例えば、Ｎ末端アミン基）を含み得、その一方、オリゴマーが縮合オリゴマーブロックである場合、このＮ末端はキャップされ得る。キャッピングの非限定的な例は、Ｎ末端を標識でラベルすること、またはそうでなければ、それを、アセチルのような比較的非反応性である成分と反応することを含む。Ｎ末端が連結反応に含められる場合、それは、代表的には、遊離のアミンとして存在する。オリゴマーブロックは、しばしば、それら自身がデノボ方法で調製されるので、そして適切な市販の試薬および器具が、ＰＮＡオリゴマーの産生のために利用可能であるために、当業者は、所望のＣ末端形態のオリゴマーブロックを容易に調製し得る。
【００３７】
連結のための末端の改変に加え、このオリゴマーブロックは、改変および／または適正に保護され得、それによって、標識または表面への付着のための官能基を取り込む。このような官能基は、１）オリゴマー合成化学（例えば、標識を破壊し得るために必要な厳しい脱保護条件）、選択された縮合／連結化学（例えば、所望の標識の官能基が、縮合化学を妨害し得る）および官能基の意図された使用（例えば、それが、標識のため、または固体支持体への付着のために意図されているか否か）のような因子に依存して連結の前または後で利用され得る。
【００３８】
（ＰＮＡ標識／改変）
ＰＮＡを標識するための非制限的な方法は、米国特許第６，１１０，６７６号、同第６，２８０，９６４号、同第６，３５５，４２１号、ＷＯ９９／２１８８１、米国特許第６，３６１，９４２号、ＷＯ／４９２９３および米国特許第６，４４１，１５２号（これらすべては参考として本明細書中に援用される）、本明細書の実施例のセクション中に記載されているか、またはそうでなければ、ＰＮＡ合成およびペプチド合成の技術分野で周知である。ＰＮＡを標識するための方法はまた、Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ；Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ、Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｏｒｆｏｌｋ、Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９９）中で論議されている。ＰＮＡオリゴマーを標識するための非限定的な例は、以下で論議される。
【００３９】
アセンブリの合成化学は本質的に同じであるので、ペプチドを標識するために従来用いられている任意の方法が、しばしば、ＰＮＡオリゴマーを標識することを行うよう適合され得る。一般に、オリゴマーまたはポリマーのＮ末端は、カルボン酸基または活性化カルボン酸基を有する部分との反応により標識され得る。１つ以上のスペーサー成分が、必要に応じて、標識成分とオリゴマーのサブユニットを含む核酸塩基との間に導入され得る。一般に、このスペーサー成分は、標識反応を実施する前に導入され得る。所望であれば、このスペーサーは、標識内に埋包され得、そしてそれによって標識反応の間に取り込まれる。
【００４０】
代表的には、ポリマーのＣ末端は、標識成分または官能基成分を、その上にＰＮＡオリゴマーがアセンブルされるべき支持体と最初に縮合することにより標識され得る。次いで、ＰＮＡオリゴマーのシントンを含む第１の核酸塩基が、標識成分または官能基成分と縮合され得る。あるいは、１つ以上のスペーサー成分（例えば、８−アミノ−３，６−ジオキサオクタノン酸；「Ｏ−リンカー」）は、標識成分または官能基成分と、オリゴマーの第１の核酸塩基サブユニットとの間に導入され得る。一旦、調製されるべき分子が完全にアセンブル、標識および／または改変されると、それは、標準的な方法を用いて、支持体から切断され、脱保護され、および精製される。
【００４１】
例えば、標識成分または官能基成分は、リジン誘導体であり得、ここで、ε−アミノ基は、保護されたまたは保護されない官能基であるか、またはそうでなければレポーター成分で改変される。レポーター成分は、５（６）−カルボキシフルオロセイン、色素１、色素２のような蛍光発色団または４−（（４−ジメチルアミノ）フェニル）アゾ）安息香酸（ダブシル）のようなクエンチャー成分であり得る。リジン誘導体の固体支持体との縮合は、標準的な縮合（ペプチド）化学を用いて達成され得る。リジン誘導体のα−アミノ基は、次いで、脱保護され、そして核酸塩基配列アセンブリが、最初のＰＮＡシントンのリジンアミノ酸のα−アミノ基との縮合により開始される。上記で論議されたように、スペーサー成分が、必要に応じて、リジンアミノ酸と第１のＰＮＡシントンとの間に、第１のＰＮＡシントンの縮合前に、適切なスペーサー（例えば、Ｆｍｏｃ−８−アミノ−３，６−ジオキサオクタノエン酸）をリジンアミノ酸と縮合することにより挿入され得る。
【００４２】
あるいは、アセンブルされ、または部分的にアセンブルされたポリマー上の官能基は、オリゴマーがなお結合した支持体にある間導入され得る。次いで、官能基は、任意の目的に利用可能であり、オリゴマーを支持体に付着されること、またはそうでなければレポーター成分と反応されることのいずれかに用いられることを含み、連結後反応されることを含む（連結後とは、本発明者らは、これらオリゴマーが１つ以上の縮合／連結反応の実施により完全に形成された後の点を意味する）。この方法は、しかし、適切に保護された官能基が、アセンブリの間に取り込まれ得、その結果、アセンブリが終了した後、反応性官能性が生成され得ることを必要とする。従って、保護された官能基は、オリゴマー末端、オリゴマー内部を含む、オリゴマーまたはブロック内の任意の位置に付着され得る。
【００４３】
例えば、リジンのε−アミノ基は、４−メチル−トリフェニルメチル（Ｍｔｔ）、４−メトキシ−トリフェニルメチル（ＭＭＴ）または４、４’−ジメトキシトリフェニルメチル（ＤＭＴ）保護基で保護され得る。このＭｔｔ、ＭＭｔまたはＤＭＴ基は、温和な酸性条件下の合成樹脂の処理によりオリゴマー（市販され利用可能なＦｍｏｃＰＮＡモノマーおよびＰＡＬリンカーを有するポリスチレン支持体を用いてアセンブルされた；ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡ）から除去され得る。結果として、ドナー成分、アクセプター成分またはその他のレポーター成分は、例えば、次いで、ポリマーがなお支持体に結合されている間に、リジンアミノ酸のε−アミノ基と縮合され得る。完全なアセンブリおよび標識の後、ポリマーは、次いで、周知の方法を用いて、支持体から切断され、脱保護され、そして生成される。
【００４４】
なお別の方法により、レポーター成分は、それが完全にアセンブルされた後、オリゴマーまたはオリゴマーブロックに付着され得、そして支持体から切断される。この方法は、標識が、オリゴマーを製造するために一般に用いられる切断、脱保護または生成処方と適合しない場合に好適である。この方法により、ＰＮＡオリゴマーは、ポリマー上の官能基と標識上の官能基との反応により溶液中で標識され得る。当業者は、結合溶液の組成が、例えば、ドナーまたはアクセプター成分のような、オリゴマーおよび標識の性質に依存することを認識する。この溶液は、有機溶媒、水またはその任意の組み合わせを含み得る。一般に、有機溶媒は、極性の非求核溶媒である。適切な有機溶媒の非限定的な例は、アセトニトリル（ＡＣＮ）、テトラヒドロフラン、ジオキサン、メチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）および１−メチルピロリドン（ＮＭＰ）を含む。
【００４５】
標識されるべきポリマー上の官能基は、求核性であり得（例えば、アミノ基）、そして標識上の官能基は求電子性であり得る（例えば、カルボン酸または活性化カルボン酸）。しかし、これは、ポリマー上の官能基が求電子性であり得（例えば、カルボン酸または活性化カルボン酸）、そして標識上の官能基が求核性であり得る（例えば、アミノ基）ように、逆転され得ることが企図される。活性化カルボン酸官能基の非制限的な例は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを含む。水溶液中では、ＰＮＡまたは標識のいずれかのカルボン酸基は、（選択された成分の性質に依存して）水溶性カルボジイミドで活性化され得る。試薬１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ−プロピル）カルボジイミドハイドロクロライド（ＥＤＣ）は、特に、水性アミド形成縮合反応のために販売されている市販の利用可能な試薬である。このような縮合反応はまた、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）または１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）がＥＤＣと混合されるとき改善され得る。
【００４６】
水溶液のｐＨは、この縮合反応の間に緩衝液で調整され得る。例えば、縮合の間のｐＨは、４〜１０の範囲内であり得る。一般に、非水性反応の塩基度は、非求核有機塩基の添加によって調整される。適切な塩基の非限定的な例は、Ｎ−メチルモルホリン、トリエチルアミンおよびＮ，Ｎ’−ジイソプロピルエチルアミンを含む。あるいは、ｐＨは、（Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ’−［２−エタンスルホン酸］（ＨＥＰＥＳ）または４−モルホリンエタン−スルホン酸（ＭＥＳ）または重炭酸ナトリウムのような無機緩衝液を用いて調整され得る。
【００４７】
（ＰＮＡキメラ合成および標識／改変）
ＰＮＡキメラは、核酸とペプチド核酸サブユニットの組み合わせである。これ故、ＰＮＡキメラの合成、標識および改変は、当業者に公知の方法、および上記で記載の方法を利用し得る。ＰＮＡキメラの合成、標識および改変のための適切な参照は、今や米国特許代６，０６３，５６９号として発行され、本明細書中に参考として援用されるＷＩＰＯ公開特許出願番号ＷＯ９６／４０７０９号に見出され得る。さらに、ＰＮＡ合成および標識のための上記に記載の方法は、ＰＮＡキメラのＰＮＡ部分を改変するためにしばしば用いられ得る。加えて、核酸の合成および標識のための周知の方法が、ＰＮＡキメラの核酸部分の改変のためにしばしば用いられ得る。例示の方法は、５，４７６、９２５、５，４５３，４９６、５，４４６，１３７、５，４１９，９６６、５，３９１，７２３、５，３９１，６６７、５，３８０，８３３、５，３４８，８６８、５，２８１，７０１、５，２７８，３０２，５，２６２，５３０、５，２４３，０３８、５，２１８，１０３、５，２０４，４５６、５，２０４，４５５、５，１９８，５４０、５，１７５，２０９、５，１６４，４９１、５，１１２，９６２、５，０７１，９７４、５，０４７，５２４、４，９８０，４６０、４，９２３，９０１，４，７８６，７２４、４，７２５，６７７、４，６５９，７７４、４，５００，７０７、４，４５８，０６６、および４，４１５，７３２中に見出され得；そのすべては本明細書中に参考として援用される。
【００４８】
（標識オリゴマーおよびオリゴマーブロック）
上記で論議されたように、ＰＮＡキメラおよびＰＮＡオリゴマーは、レポーター成分で標識され得る。オリゴマーまたはオリゴマーブロックを直接標識するために適切なレポーター成分（標識）の非制限的な例は：量子ドット、マイナーグルーブバインダー、デキストラン結合体、分岐核酸検出システム、発色団、蛍光発色団、クエンチャー、スピンラベル、放射線同位元素、酵素、ハプテン、アクリジニウムエステルおよび化学発光化合物を含む。クエンチング成分もまた考慮された標識である。その他の適切な標識試薬および付着のための好ましい方法は、ＰＮＡ、ペプチドまたは核酸合成の当業者によって認識され得る。非限定的な例は、上記に記載または参照されている。
【００４９】
ハプテンの非限定的な例は、５（６）−カルボキシフルオロセイン、２，４−ジニトロフェニル、ジゴキシゲニン、およびビオチンを含む。
【００５０】
蛍光色素（蛍光発色団）の非制限的な例は、５（６）−カルボキシフルオロセイン（Ｆｌｕ）、２’，４’，１，４，−テトラクロロフルオロセイン；および２’，４’，５’，７’，１，４−ヘキサクロロフルオレセイン、その他のフルオレセイン色素（本明細書中に参考として援用される米国特許第５，１８８，９３４号；同第６，００８，３７９号；同第６，０２０，４８１号を参照のこと）、６−（（７−アミノ−４−メチルクマリン−３−アセチル）アミノ）ヘキサノン酸（Ｃｏｕ）、５（および６）−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（Ｒｏｘ）、その他のローダミン色素（本明細書中に参考として援用される米国特許第５，３６６，８６０号；同第５，８４７，１６２号；同第５，９３６，０８７号；同第６，０５１，７１９号；同第６，１９１，２７８号；同第６，２４８，８８４号を参照のこと）、ベンゾフェノキサジン（本明細書中に参考として援用される米国特許第６，１４０，５００号を参照のこと）、シアニン２（Ｃｙ２）色素、シアニン３（Ｃｙ３）色素、シアニン３．５（Ｃｙ３．５）色素、シアニン５（Ｃｙ５）色素、シアニン５．５（Ｃｙ５．５）色素、シアニン７（Ｃｙ７）色素、シアニン９（Ｃｙ９）色素（シアニン色素２、３、３．５、５および５．５は、Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬからＮＨＳエステルとして入手可能である）、その他のシアニン色素（Ｋｕｂｉｓｔａ、ＷＯ９７／４５５３９）、６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’、７’−ジメトキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、５（６）−カルボキシ−テトラメチルローダミン（Ｔａｍａｒａ）、色素１（図７）、色素２（図７）またはＡｌｅｘａ色素シリーズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）を含む。
【００５１】
酵素の非制限的な例は、ポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗ ＰＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、シークエナーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ１およびｐｈｉ２９ポリメラーゼ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、大豆ペルオキシダーゼ（ＳＢＰ）、リボヌクレアーゼおよびプロテアーゼを含む。
【００５２】
クエンチング成分の非制限的な例は、例えば、ダブシル（ｄａｂｃｙｌ）およびダブシル（ｄａｂｓｙｌ）であるアリールジアゾ化合物のようなジアゾ含有成分、１つ以上のさらなるジアゾおよび／またはアリール基を含むホモログ；例えば、Ｆａｓｔ Ｂｌａｃｋ（Ｎａｒｄｏｎｅ、米国特許第６，１１７，９８６号）、および置換化合物であって、ここでＺが、Ｃｌ、Ｆ、Ｂｒ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ５〜Ｃ１４アリール、ニトロ、シアノ、スルホネート、ＮＲ２、−ＯＲ、およびＣＯ２Ｈ、ここで、各Ｒが、独立して、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキルまたは以下の構造に従うＣ５〜Ｃ１４アリール
【００５３】
【化２】
：以下の例示の構造を含むシアニン色素（Ｌｅｅ、米国特許第６，０８０，８６８号）：
【００５４】
【化３】
および、アントラキノン、マラカイトグリーン、ニトロチアゾン、およびニトロイミダゾール化合物のようなその他の発色団（ここで、基Ｘは、本発明のオリゴマーへの結合またはリンカーの共有結合部位である）を含む。
【００５５】
マイナーグルーブバインダーの非限定的な例は、以下の構造によって提示されるＣＤＰＩ３である：
【００５６】
【化４】
ここで、Ｘは、オリゴマーへの例示の付着部位である（Ｄｅｍｐｃｙ、ＷＯ０１／３１０６３）。
【００５７】
非放射活性標識方法、技法および試薬は、Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ、Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、Ｇａｒａｍａｎ、Ａ．Ｊ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９７）中に総説がある。
【００５８】
（スペーサー／リンカー成分）
一般に、スペーサーは、かさ高い標識試薬がプローブまたはプライマーのハイブリダイゼーション性質に対して有し得る悪影響を最小にするために用いられ得る。リンカーは、オリゴマーの２つ以上のオリゴマーブロックを連結するために用いられ得る。これらリンカーは、塩基ではない（ａｂａｓｉｃ）。塩基ではないことは、本発明者らは、核酸塩基を含まないことを意味する。スペーサー／リンカー成分の非制限的な例は：１つ以上のアミノアルキルカルボン酸（例えば、アミノカプロン酸）、アミノ酸の側鎖（例えば、リジンまたはオルニチンの側鎖）、１つ以上の天然のアミノ酸（例えば、グリシン）、アミノオキシアルキル酸（例えば、８−アミノ−３，６−ジオキサオクタノン酸）、アルキル二酸（例えば、コハク酸）、アルキルオキシ二酸（例えば、ジグリコール酸）またはアルキルジアミン（例えば、１，８−ジアミノ−３，６−ジオキサオクタン）である。スペーサー／リンカー成分はまた、偶発的に、または意図的に、オリゴマーの水可溶性を改善するために構築され得る（例えば、Ｇｉｌｄｅａら、Ｔｅｔｔ．Ｌｅｔｔ．３９：７２５５〜７２５８（１９９８））．Ｇｕｉｄａｎｃｅ Ｉｎ Ｌａｂｅｌ Ｃｈｏｉｃｅ Ｗｈｅｎ Ｌｉｇａｔｉｎｇ／Ｃｏｎｄｅｎｓｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｍｅｒ Ｂｌｏｃｋｓ：を参照のこと。
【００５９】
オリゴマーが縮合／連結され、それによって、細長いオリゴマーを生成すべきとき、コンポーネントオリゴマーブロックの潜在的に反応性の官能基の全体の性質は、可能な副または交差反応について考慮されるべきである。保護基はまた、適切な場合に用いられ得、副または交差反応を最小にするか、またはなくする。例えば、標識されたオリゴマーが連結されるべきとき、選択され得る種々の連結化学の性質を考慮して１つ以上の官能基の反応性の可能性を考慮することが賢明である。あるいは、保護された標識が用いられ得る（例えば、図５を参照のこと）。
【００６０】
（連結／縮合化学の非制限的な例）
図８ａおよび８ｂを参照して、適正に調製されたオリゴマーブロックは、水溶性カルボジイミドである１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ−プロピル）カルボジイミドヒドロクロライド（ＥＤＣ）のようなカルボジイミドを用いて連結され得る。示されるように、代表的には、オリゴマーブロックの１つは、カルボン酸成分を含み、そして他方はアミノ基を含む。ＰＮＡオリゴマーは、それらが連結された天然アミノ酸成分を含むか否かにかかわらず、アミン末端およびカルボン酸末端を含み得るので、一般に、ＰＮＡオリゴマーブロックは：より代表的なＣ末端酸の代わりに、少なくとも１つのＰＮＡ Ｃ末端酸オリゴマーの調製を除いて、このタイプの連結化学を促進するための改変を要求しない。これらオリゴマーは、必要に応じて約７５％までの有機改変剤（ｖ／ｖ）を含む水溶液中で連結され得る。ｐＨは、６．５未満であり得る。トリアゾール化合物（例えば、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）または１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ））のような活性化試薬の添加は、縮合／連結反応の全体の収率を増加し得る。
【００６１】
図８ａおよび８ｂを参照して、連結／縮合の産物は、ドナーおよびアクセプター成分の両方を含むとして示されている。これは、しかし、例であって、そして限定ではない。連結されるべき１つまたは両方のオリゴマーは非標識であり得るからである。簡便には、この連結／縮合プロセスは、本明細書に記載のようなＣ末端ＰＮＡサブユニットを含むＰＮＡ Ｃ末端酸オリゴマーを用いてネイティブなオリゴマーを生成し得る。
【００６２】
１つの実施形態では、簡便には、これらネイティブなオリゴマーが、同時係属中でかつ共に所有されるＵＳＳＮ０９／１７９，１６２（参考として本明細書中に援用される）中により詳細に記載されるようなＬｉｎｅａｒ Ｂｅａｃｏｎとして標識される場合、多重ＳＮＰ遺伝子型決定アッセイにおけることを含む、標的配列の分析のために用いられ得る。従って、本発明の組成物、方法およびライブラリーは、ライブラリーアプローチを通じて、多くの目的のために用いられ得るネイティブＰＮＡオリゴマーの産生に用いられ得る。
【００６３】
（その他）
米国公開出願２００３−００７７６０８およびＰＣＴ公開出願ＷＯ０２／０７２８６５は、同時係属中であり、そして本出願とともに共通して所有されている。これらの公開された特許出願は、特に、オリゴマーブロックの連結を記載し、ここで、細長い（組み合わせ）オリゴマー中でブロックを分離する少なくとも３原子のリンカーが存在する。従って、これらの公開特許出願で記載される連結／縮合反応は、本明細書に記載のようなネイティブなオリゴマーを生成しない。それにもかかわらず、前記の特許出願は、本明細書に記載のＰＮＡ Ｃ末端酸オリゴマーに適用され得るオリゴマーブロックを縮合／連結するための種々の方法を記載している。ＰＮＡ Ｃ末端酸オリゴマーの縮合／連結は、ネイティブＰＮＡオリゴマーを生成するために用いられ得る。それらはネイティブオリゴマーであるので、それらは、例えば、自己指標ＰＮＡプローブを用いる多重ＳＮＰ遺伝子型決定を含むＰＮＡオリゴマーに共通して適用される任意の適用に用いられ得る。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００６４】
（ＩＶ．本発明の実施形態）
ａ）序論
本発明は、ＰＮＡダイマーおよびＰＮＡオリゴマー合成の分野に関する。これらＰＮＡダイマーは、支持体に結合されているか否かにかかわらず、特に、ＰＮＡ Ｃ末端酸オリゴマーの調製において用いられ得る。さらに、このＰＮＡ Ｃ末端酸オリゴマーは、それら自身、特に、連結／縮合を通じてより長いＰＮＡオリゴマーおよび／またはキメラの調製で用いられ得、および特に、ＰＮＡオリゴマーおよび／またはキメラ調製で用いられるライブラリーの調製で用いられ得る。そのように生成されたＰＮＡオリゴマーおよびＰＮＡキメラは、それら自身、特に、制限されずに、自己指標アッセイ、多重アッセイおよび／または自己指標多重アッセイにおける使用によるを含む、目的の標的配列の決定において用いられ得る。
【００６５】
ｂ）支持体結合ＰＮＡダイマー組成物
いくつかの実施形態では、本発明は、固体支持体組成物に関する。この固体支持体は、酸を形成する切断可能なリンカーおよびＰＮＡダイマーを含む。このＰＮＡダイマーは、Ｎ末端の塩基不安定保護基を含み、そしてこの切断可能なリンカーを通じて固体支持体に切断可能に連結されている。さらに、この固体支持体上のＰＮＡダイマーの積載は、１グラムあたり０．０８ｍｍｏｌ以上であり得る。このＰＮＡダイマーは、Ｆｍｏｃ（Ｂｈｏｃ）モノマーから形成され得る。このＰＮＡダイマーは、上記固体支持体の切断可能なリンカーにエステル結合により連結され得る。
【００６６】
この固体支持体は、立体的に妨害された固体支持体であり得る。この立体的に妨害された固体支持体の非限定的な例は、トリチルクロライド樹脂（トリチル−Ｃｌ）、２−クロロトリチルクロライド樹脂、ＤＨＰＰ、ＭＢＨＡ、４−メチルトリチルクロライド樹脂、４−メトキシトリチルクロライド樹脂、ヒドロキシ−（２−クロロフェニル）メチル−ＰＳ、Ｒｉｎｋ酸樹脂およびＮｏｖａＳｙｎ ＴＧＴアルコール樹脂を含む。この固体支持体はまた、ＰＡＬ−ＰＥＧ−ＰＳ（登録商標）、ＮｏｖａＳｙｎ ＴＧＡおよびＷａｎｇ樹脂からなる群から選択され得る。
【００６７】
上記固体支持体上のＰＮＡダイマーの積載は、１グラムあたり約０．１ｍｍｏｌから１グラムあたり約１ｍｍｏｌの範囲であり得る。上記固体支持体上のＰＮＡダイマーの積載は、１グラムあたり約０．１２ｍｍｏｌから１グラムあたり約０．３５ｍｍｏｌの範囲であり得る。
【００６８】
上記支持体結合ＰＮＡは、２つ以上の異なる支持体結合ＰＮＡダイマーを含むアレイを生成するために上記支持体上に整列され得る。
【００６９】
上記支持体結合ＰＮＡダイマーは、種々の方法およびまたはＰＮＡモノマータイプによって生成され得、制限されずに、以下のセクションＩＶ（ｄ）またはＩＶ（ｅ）に記載の方法を含む。
【００７０】
（ｃ）支持体結合ＰＮＡダイマー固体支持体のライブラリー）
いくつかの実施形態では、本発明は、固体支持体のライブラリーに関する。このライブラリーは、少なくとも、２つの固体支持体を備え、ここで、この少なくとも２つの固体支持体の各々は、酸を形成する切断可能なリンカーおよびＰＮＡダイマーを含む。このＰＮＡダイマーは、酸を形成する切断可能なリンカーに切断可能であり得る。このＰＮＡダイマーは、このライブラリーの上記少なくとも２つの固体支持体の任意の他方に結合しているＰＮＡダイマーとは核酸塩基配列が異なり得る。このＰＮＡダイマーは、エステル結合により固体支持体の切断可能なリンカーに連結され得る。
【００７１】
ライブラリーは、少なくとも１６の固体支持体を含み得る。例えば、各支持体は、少なくとも１６の可能なＰＮＡダイマーのセットから選択されたＰＮＡダイマーを含み得、ここで、このセットの各ＰＮＡダイマーは、このセットのその他のＰＮＡダイマーのすべてとは、ＰＮＡダイマーのアセンブリで用いられたＰＮＡサブユニットの少なくとも４つの異なる核酸塩基の少なくとも１つが異なっている。この少なくとも４つの異なる核酸塩基は、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、５−プロピニル−ウラシル、２−チオ−５−プロピニル−ウラシル、５−メチルシトシン、プソイドイソシトシン、２−チオウラシルおよび２−チオチミン、２−アミノプリン、Ｎ９−（２−アミノ−６−クロロプリン）、Ｎ９−（２，６−ジアミノプリン）、ヒポキサンチン、Ｎ９−（７−デアザ−グアニン）、Ｎ９−（７−デアザ−８−アザ−グアニン）およびＮ８−（７−デアザ−８−アザ−アデニン）からなる群から選択され得る。例えば、実施例１に記載の１６の固体支持体のライブラリーを参照のこと。
【００７２】
ライブラリーの固体支持体は、立体的に妨害された固体支持体であり得る。例えば、この立体的に妨害された固体支持体は、トリチルクロライド樹脂（トリチル−Ｃｌ）、２−クロロトリチルクロライド樹脂、ＤＨＰＰ、ＭＢＨＡ、４−メチルトリチルクロライド樹脂、４−メトキシトリチルクロライド樹脂、ヒドロキシ−（２−クロロフェニル）メチル−ＰＳ、Ｒｉｎｋ酸樹脂およびＮｏｖａＳｙｎ ＴＧＴアルコール樹脂からなる群から選択され得る。この固体支持体は、ＰＡＬ−ＰＥＧ−ＰＳ、ＮｏｖａＳｙｎ ＴＧＡおよびＷａｎｇ樹脂からなる群から選択され得る。
【００７３】
上記ライブラリーの固体支持体のＰＮＡダイマーのＣ末端サブユニットは、上記切断可能なリンカーに連結され得る。このＰＮＡダイマーは、Ｆｍｏｃ（Ｂｈｏｃ）保護ＰＮＡモノマーから形成され得る。このＰＮＡダイマーは、ｔ−ｂｏｃ／Ｚ保護ＰＮＡモノマーから形成され得る。このＰＮＡダイマーは、Ｍｍｔ／Ｂｈｏｃ保護ＰＮＡモノマーから形成され得る。このＰＮＡダイマーは、その他のタイプのＰＮＡモノマーまたは異なるタイプのＰＮＡモノマーの組み合わせから形成され得る（以下の実施例３を参照のこと）。従って、ＰＮＡダイマー固体支持体のライブラリーが、制限されずに、以下のセクションＶ（ｄ）またはＶ（ｅ）に記載の方法を含む、種々の方法および／またはＰＮＡモノマータイプによって生成され得ることは明瞭である。
【００７４】
ライブラリーの少なくとも１つの固体支持体上のＰＮＡダイマーの積載は、１グラムあたり約０．０８ｍｍｏｌ以上であり得る。上記ライブラリーの少なくとも２分の１の固体支持体上のＰＮＡダイマーの積載は、１グラムあたり約０．０８ｍｍｏｌ以上であり得る。上記ライブラリーの各固体支持体上のＰＮＡダイマーの積載は、１グラムあたり約０．０８ｍｍｏｌ以上であり得る。上記ライブラリーの各々の固体支持体上のＰＮＡダイマーの積載は、１グラムあたり約０．１ｍｍｏｌから１グラムあたり約１ｍｍｏｌの範囲であり得る。上記ライブラリーの各々の固体支持体上のＰＮＡダイマーの積載は、１グラムあたり約０．１２ｍｍｏｌから１グラムあたり約０．３５ｍｍｏｌの範囲であり得る（実施例１を参照のこと）。
【００７５】
支持体のライブラリーは整列されてアレイを生成し得る。
【００７６】
（ｄ）ＰＮＡダイマー固体支持体を形成する方法）
いくつかの実施形態では、本発明は、支持体に結合したＰＮＡダイマーを形成する方法に関する。この方法は、第１のＰＮＡモノマーを、立体的に妨害された立体的に妨害された固体支持体に結合する工程を包含し、ここで、このＰＮＡモノマーは、Ｎ末端の塩基不安定アミン保護基を含む。必要に応じてであるが、しかし好ましくは、上記固体支持体は洗浄され、過剰の第１のＰＮＡモノマーを除去する。次いで、この固体支持体は、約１〜約２分の期間の間、この支持体に結合した第１のＰＮＡモノマーから上記塩基不安定Ｎ末端アミン保護基を実質的に除去する脱保護試薬で処理される。この脱保護ステップは、迅速に実施されるべきである。なぜなら、非保護Ｎ末端アミンは、この酸を形成する切断可能なリンカーを攻撃し得、そしてそれによって、支持体から第１のＰＮＡモノマーの環化および解離を引き起こすからである。迅速に実施されるとき、第１のＰＮＡモノマーの５０％より少ないの環化および解離を得ることが可能である。一旦、脱保護が実施されると、この固体支持体を洗浄し、脱保護試薬を除去し得る。ここで再び、この洗浄は、迅速に実施されるべきである。迅速にとは、本発明者らは、それが、可能な限りそれが合理的に実施され得るように実施されるべきであることを意味し；一般に、上記脱保護試薬が固体支持体に最初に付与される時間と、第２のＰＮＡモノマーの結合が開始される時間との間で２〜１０分を超えて経過しない。洗浄後、第２のＰＮＡモノマーが、上記第１のＰＮＡモノマーのＮ末端アミンに結合することが可能な限り速く、そして好ましくは、上記脱保護試薬が上記固体支持体に最初に付与されるときの２〜１０分以内に実施される。
【００７７】
この実施形態によれば、上記第１および第２のＰＮＡモノマーは、同一または異なる核酸塩基を含むＦｍｏｃ（Ｂｈｏｃ）ＰＮＡモノマーであり得る。上記第１および／または第２のＰＮＡモノマーの核酸塩基は、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、５−プロピニル−ウラシル、２−チオ−５−プロピニル−ウラシル、５−メチルシトシン、プソイドイソシトシン、２−チオウラシルおよび２−チオチミン、２−アミノプリン、Ｎ９−（２−アミノ−６−クロロプリン）、Ｎ９−（２，６−ジアミノプリン）、ヒポキサンチン、Ｎ９−（７−デアザ−グアニン）、Ｎ９−（７−デアザ−８−アザ−グアニン）およびＮ８−（７−デアザ−８−アザ−アデニン）からなる群から独立に選択され得る。
【００７８】
上記第１または第２のＰＮＡモノマーのＮ末端の塩基不安定保護基はＦｍｏｃであり得る。上記脱保護試薬は、有機溶媒中約１５〜約２５（ｖ／ｖ）％のピペリジンを含む溶液であり得る。適切な有機溶媒の非制限的な例は、Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）および１−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）を含む。例えば、上記脱保護試薬は、Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の２０％（ｖ／ｖ）ピペリジンであり得る。
【００７９】
上記脱保護試薬は、有機溶媒中の約０．２％〜約４％のＤＢＵ（ｖ／ｖ）を含む溶液であり得る。例えば、上記脱保護試薬は、ＮＭＰ（ｖ／ｖ）中の２％ＤＢＵであり得る。
【００８０】
この実施形態によれば、上記立体的に妨害された固体支持体は、トリチルクロライド樹脂（トリチル−Ｃｌ）、２−クロロトリチルクロライド樹脂、ＤＨＰＰ、ＭＢＨＡ、４−メチルトリチルクロライド樹脂、４−メトキシトリチルクロライド樹脂、ヒドロキシ−（２−クロロフェニル）メチル−ＰＳ、Ｒｉｎｋ酸樹脂およびＮｏｖａＳｙｎ ＴＧＴアルコール樹脂からなる群から選択され得る。好ましくは、上記立体的に妨害された固体支持体は、トリチルクロライド（トリチル−Ｃｌ）樹脂である。
【００８１】
（ｅ）ＰＮＡダイマー固体支持体を形成するための別の方法）
いくつかの実施形態では、本発明は、支持体結合ＰＮＡダイマーを形成するためのなお別の方法に関する。この方法は、第１のＰＮＡモノマーを、酸を形成する切断可能なリンカーを含む固体支持体に結合する工程を包含し、ここで、このＰＮＡモノマーは、酸不安定Ｎ末端保護基を含む。必要に応じてであるが、しかし、好ましくは、この固体支持体を洗浄し、過剰の第１のＰＮＡモノマーは除去される。次いで、上記固体支持体は、上記酸不安定Ｎ末端保護基を脱保護する酸性条件下、脱保護試薬で処理される。一旦、脱保護が実施されると、上記固体支持体は洗浄されて、上記脱保護試薬は除去される。洗浄後、第２のＰＮＡモノマーが、上記第１のＰＮＡモノマーのＮ末端アミンに結合される。この方法によれば、上記固体支持体上のＰＮＡダイマーの最終積載は、１グラムあたり０．０８ｍｍｏｌ以上である。上記に記載の方法とは異なり、この脱保護ステップは迅速に実施されることは要求されない。なぜなら、Ｎ末端アミンはプロトン化され、そしてそれによって第１のＰＮＡシントンの環化および脱離を引き起こし得ないからである。
【００８２】
上記第１および第２のＰＮＡモノマーは、同一または異なる核酸塩基を含むｔ−ｂｏｃ／Ｚ保護ＰＮＡモノマーであり得る。上記第１および第２のＰＮＡモノマーは、同一または異なる核酸塩基を含むＭｍｔ／Ｂｈｏｃ保護ＰＮＡモノマーであり得る。上記第１のＰＮＡモノマーはＭｍｔ／Ｂｈｏｃ保護ＰＮＡモノマーであり得、そして上記第２のＰＮＡモノマーはＦｍｏｃ／Ｂｈｏｃ保護ＰＮＡモノマーであり得る。
【００８３】
上記第１および第２のＰＮＡモノマーの核酸塩基は、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、５−プロピニル−ウラシル、２−チオ−５−プロピニル−ウラシル、５−メチルシトシン、プソイドイソシトシン、２−チオウラシルおよび２−チオチミン、２−アミノプリン、Ｎ９−（２−アミノ−６−クロロプリン）、Ｎ９−（２，６−ジアミノプリン）、ヒポキサンチン、Ｎ９−（７−デアザ−グアニン）、Ｎ９−（７−デアザ−８−アザ−グアニン）およびＮ８−（７−デアザ−８−アザ−アデニン）からなる群から独立に選択され得る。
【００８４】
この方法によれば、上記第１のＰＮＡモノマーがＭｍｔ／Ｂｈｏｃ保護ＰＮＡモノマーである場合、そして上記脱保護試薬は、有機溶媒中の約１〜約５％（ｖ／ｖ）のジクロロ酢酸である得る。例えば、上記脱脱保護試薬は、ジクロロメタン（ＤＣＭ）中の約２％のジクロロ酢酸（ＤＣＡ）であり得る。
【００８５】
この方法によれば、上記固体支持体は、トリチルクロライド樹脂（トリチル−Ｃｌ）、２−クロロトリチルクロライド樹脂、ＤＨＰＰ、ＭＢＨＡ、４−メチルトリチルクロライド樹脂、４−メトキシトリチルクロライド樹脂、ヒドロキシ−（２−クロロフェニル）メチル−ＰＳ、Ｒｉｎｋ酸樹脂およびＮｏｖａＳｙｎ ＴＧＴアルコール樹脂からなる群から選択される立体的に妨害された固体支持体であり得る。上記固体支持体はまた、Ｆｍｏｃ−ＰＡＬ−ＰＥＧ−ＰＳ、ＮｏｖａＳｙｎ ＴＧＡおよびＷａｎｇ樹脂からなる群から選択され得る。
【００８６】
この方法によれば、上記固体支持体上のＰＮＡダイマーの最終積載は、１グラムあたり約０．１ｍｍｏｌ〜１グラムあたり約１．２ｍｍｏｌの範囲内であり得る。上記固体支持体上のＰＮＡダイマーの最終積載は、１グラムあたり約０．１２ｍｍｏｌ〜１グラムあたり約０．３５ｍｍｏｌの範囲内であり得る。
【００８７】
（ｆ）ＰＮＡ Ｃ末端酸オリゴマー）
なお別の実施形態では、本発明は、Ｃ末端ＰＮＡサブユニットおよび蛍光標識またはクエンチャーを含む、ＰＮＡ Ｃ末端酸オリゴマーに関する。例えば、この蛍光標識は、色素１または色素２であり得る。例えば、上記クエンチャー成分はダブシルであり得る。上記標識は、Ｎ末端アミンへを含む、ＰＮＡオリゴマーのＮ末端サブユニットに連結され得る。
【００８８】
このＰＮＡオリゴマーは、長さが１０以下のＰＮＡサブユニットであり得る。このような短いオリゴマーは、ライブラリーアプローチによる連結／縮合を用いて細長いＰＮＡオリゴマーおよびＰＮＡキメラの調製のために便利に用いられ得る。例えば、このＰＮＡオリゴマーは、長さが約３〜約８のサブユニットであり得るか、または長さが約４〜約６のサブユニットであり得る。このＰＮＡオリゴマーは、長さが４のサブユニットであり得る。このＰＮＡオリゴマーは、長さが５のサブユニットであり得る。
【００８９】
このＰＮＡオリゴマーの核酸塩基は、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、５−プロピニル−ウラシル、２−チオ−５−プロピニル−ウラシル、５−メチルシトシン、プソイドイソシトシン、２−チオウラシルおよび２−チオチミン、２−アミノプリン、Ｎ９−（２−アミノ−６−クロロプリン）、Ｎ９−（２，６−ジアミノプリン）、ヒポキサンチン、Ｎ９−（７−デアザ−グアニン）、Ｎ９−（７−デアザ−８−アザ−グアニン）およびＮ８−（７−デアザ−８−アザ−アデニン）からなる群から選択され得る。
【００９０】
（ｇ）ＰＮＡ Ｃ末端酸オリゴマーのライブラリー）
なお別の実施形態では、本発明は、ＰＮＡ Ｃ末端酸オリゴマーのライブラリーに関する。このライブラリーの各々のＰＮＡオリゴマーは、核酸塩基配列、Ｃ末端ＰＮＡサブユニット（グリシンまたはリジンのようなアミノ酸ではない）および蛍光標識またはクエンチャー成分を含む。ＰＮＡオリゴマーの各々の蛍光標識またはクエンチャーは、制限されずに、Ｎ末端アミンへを含む、Ｎ末端サブユニットに連結され得る。このライブラリーの各ＰＮＡは、このライブラリーのその他のＰＮＡオリゴマーの各々とは、標識、核酸塩基配列、サブユニット長さまたは核酸塩基配列の極性のいずれかが異なる。このライブラリーのＰＮＡオリゴマーの各々の核酸塩基は、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、５−プロピニル−ウラシル、２−チオ−５−プロピニル−ウラシル、５−メチルシトシン、プソイドイソシトシン、２−チオウラシルおよび２−チオチミン、２−アミノプリン、Ｎ９−（２−アミノ−６−クロロプリン）、Ｎ９−（２，６−ジアミノプリン）、ヒポキサンチン、Ｎ９−（７−デアザ−グアニン）、Ｎ９−（７−デアザ−８−アザ−グアニン）およびＮ８−（７−デアザ−８−アザ−アデニン）からなる群から選択され得る。
【００９１】
上記ライブラリーのＰＮＡオリゴマーの各々は、同じ数のＰＮＡサブユニットを、しかし、これは限定ではないことを条件に含み得る。ライブラリーのＰＮＡオリゴマーは、異なる数のＰＮＡサブユニットを含み得る。例えば、上記ライブラリーは、ライブラリーの少なくとも１つのその他のＰＮＡオリゴマーと比較したとき異なる数のＰＮＡサブユニットを有する少なくとも１のオリゴマーを含み得る。このライブラリーの各ＰＮＡオリゴマーは、約３〜約８のＰＮＡサブユニットを含み得る。このライブラリーのＰＮＡオリゴマーの各々は、約４〜約６のＰＮＡサブユニットを含み得る。このライブラリーのＰＮＡオリゴマーの各々は、５つのＰＮＡサブユニットを含み得る。
【００９２】
ＰＮＡ Ｃ末端酸オリゴマーのライブラリーは、それ自身がが、より大きなライブラリー内のセットであり得る。例えば、ライブラリーは、３つ以上のセットのオリゴマーブロックを含み得、ここで、少なくとも２つのセットは、２つ以上の異なる標識が各セットのオリゴマーブロックを独立に検出可能にするように、標識の性質を除いて実質的に同一であり得る。この２つ以上の独立して検出可能なオリゴマーブロックのセットは、末端オリゴマーブロックまたは縮合オリゴマーブロックのセットであり得、例えば、２セットのＰＮＡ Ｃ末端酸を含み、ここで、各セットは、異なる蛍光発色団（例えば、色素１および色素２）で標識される。本質的に同一であるが、付着した独立に検出可能な標識の性質が異なる２セットのオリゴマーブロックを生成することにより、独立に検出可能な細長いオリゴマーの対を調製することが可能であり、共通オリゴマーブロックとの連結／縮合を通じて、自己指標性の独立に検出可能なオリゴマーを含む。自己指標により、本発明者らは、プローブが、標的配列へのハイブリダイゼーションに際し、検出可能な性質を変化し、そしてそれによって過剰のプローブの除去の必要性を減少するか、またはなくすることを意味する。独立に検出可能とは、本発明者らは、１つの標識を独立に、そして必要に応じて、その他の標識の存在下で決定することが可能であることを意味する。
【００９３】
例えば、独立に検出可能な標識を含む少なくとも２つのオリゴマーブロックは、例えば、クエンチャー成分で標識される同じオリゴマーブロックに連結され得る。次いで、独立に検出可能な自己指標性の細長いオリゴマーの対は、米国公開出願２００３−００７７６０８およびＰＣＴ公開出願ＷＯ０２／０７２８６５に記載のようなＳＮＰ遺伝子型決定アッセイを実施するためのプローブとして用いられ得る。但し、この反応によって生成されるＰＮＡオリゴマーは、ネイティブＰＮＡオリゴマーであり得る。
【００９４】
アクセプターまたはクエンチャー成分が、連結／縮合されるオリゴマーブロックの１つに存在しない場合、そのときは、細長いオリゴマーは、単一標識をもつオリゴマーであり得る。標識が、連結／縮合されるオリゴマーブロックのいずれかに存在しない場合、そのときは、この細長いオリゴマーは、例えば、ブロッキングプローブ（例えば、米国特許第６，１１０，６７６号）として用いられ、または捕獲プローブとして用いられ得る非標識オリゴマーであり得る。
【００９５】
【化５】
先行する説明に従って、表１は、可能なライブラリーのオリゴマーブロックのセットを作製するための種々の可能性、およびその連結によって調製される細長いオリゴマーの性質を要約する。勿論、表１は、可能性を網羅していることは意図されない。さらに、ＰＮＡ Ｃ末端酸オリゴマーは、それら自身、特に、ＰＮＡオリゴマーまたはＰＮＡキメラの調製のために用いられ得る、ＰＮＡオリゴマーのより大きなライブラリー（例えば、表１に要約される）のブロックの１つ以上のセットまたはサブセットであり得る。
【００９６】
オリゴマーブロックの１つ以上のセットまたはサブセットはまた、必要に応じて、オリゴマーブロックの末端またはその内部の位置でオリゴマーブロックに連結された保護または非保護官能基を含み得る。これに関し、オリゴマーブロックは、実施者の望み、および利用可能な資源に依存して連結前または連結後いずれかに標識され得る。この官能基はまた、オリゴマーブロックまたは形成された細長いオリゴマーを表面に付着するために用いられ得る。
【００９７】
従って、別の実施形態によれば、本発明は、少なくとも２つのセットのＰＮＡ Ｃ末端酸オリゴマーを含むライブラリーに関し、ここで、各セットのＰＮＡオリゴマーは、主に、蛍光標識の性質において、その他のセットのそれとは異なる。このようなＰＮＡ Ｃ末端オリゴマーは、米国公開出願２００３−００７７６０８およびＰＣＴ公開出願ＷＯ０２／０７２８６５に記載のようなＳＮＰ遺伝子型決定アッセイのためのプローブまたはプローブのセットを生成するための連結／縮合反応で、但し、この反応で生成されるＰＮＡオリゴマーはネイティブＰＮＡオリゴマーであり得ることを条件に用いられ得る。
【実施例】
【００９８】
本発明の前述する実施形態を記載したが、以下の実施例は、例示であることが意図され、いかなる方法においても制限的であることは意図されない。
【００９９】
（本発明を実施するための様式）
本発明を、ここで、いかなる方法においても制限的であることは意図されない以下の実施例により説明する。
【０１００】
（実施例１；ＰＮＡダイマー−樹脂（固体支持体）のライブラリーの合成）
Ｉ．トリチル−Ｃｌ樹脂上の第１のＰＮＡモノマーの積載
試薬：Ｆｍｏｃ（Ｂｈｏｃ）−ＰＮＡモノマー（Ｆｍｏｃ−Ａ（Ｂｈｏｃ）−ＯＨ：Ｐ／Ｎ ＧＥＮ０６３０１４、Ｆｍｏｃ−Ｃ（Ｂｈｏｃ）−ＯＨ：Ｐ／Ｎ ＧＥＮ０６３１５、Ｆｍｏｃ−Ｇ（Ｂｈｏｃ）−ＯＨ：Ｐ／Ｎ ＧＥＮ０６３１６、Ｆｍｏｃ−Ｔ（Ｂｈｏｃ）−ＯＨ：Ｐ／Ｎ ＧＥＮ０６３１７、１−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）：Ｐ／Ｎ４００５８０、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）：Ｐ／Ｎ４００１４３、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）：Ｐ／Ｎ ＧＥＮ０６３０８０はすべて、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡから得た。メタノール：Ｐ／Ｎ ０１５−４およびアセトニトリル：Ｐ／Ｎ ２３０−４は、Ｂｕｒｄｉｃｋ＆Ｊａｃｋｓｏｎ（Ｍｕｓｋｅｇｏｎ、Ｍｉｃｈｉｇａｎ）から得た。トリチル−Ｃｌ樹脂：Ｐ／Ｎ ０１−６４−００７４は、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から５ｇバッチで得た。乾燥溶媒を、トリチルクロライド樹脂積載反応に用いた。無水ジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２）：Ｐ／Ｎ ２７，０９９−７、ＮＭＰは、４Åの分子篩上で一晩貯蔵した。溶媒（ＤＭＦ、ＮＭＰおよびアセトニトリル）を樹脂洗浄のために用い、そしてその他の反応は、試薬グレードであった。
【０１０１】
手順：Ｆｍｏｃ−Ａ（Ｂｈｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇ（Ｂｈｏｃ）−ＯＨおよびＦｍｏｃ−Ｔ（Ｂｈｏｃ）−ＯＨモノマー（それぞれ、３．６２、３．６９および２．５３ｇ、４．９８ｍｍｏｌ）および２．６３ｍＬのＤＩＰＥＡ（約３×４．９８ｍｍｏｌ）を、１５ｍＬの乾燥４：１ＣＨ２Ｃｌ２−ＮＭＰ（０．３３２Ｍ）中に溶解した。Ｆｍｏｃ−Ｃ（Ｂｈｏｃ）−ＯＨモノマー（３．４９ｇ、４．９８ｍｍｏｌ）および２．６３ｍＬのＤＩＰＥＡ（約３×４．９８ｍｍｏｌ）を、最初、１２ｍＬのＮＭＰ中に溶解し、そして次に、容量を、乾燥ＣＨ２Ｃｌ２の添加により１５ｍＬに調節した。
【０１０２】
モノマー溶液を、次いで、５０ｍＬのプラスチックチューブ中の乾燥トリチル−Ｃｌ樹脂（３ｇ／反応、１．６６ｍｍｏｌ／ｇ）に添加し、キャップをし、そして室温で０．５時間振とうし、そのとき、樹脂が粘性のゲルとなった。この時点で、別の３ｍＬの乾燥ＣＨ２Ｃｌ２を各反応混合物に添加し、そして反応をさらに２．５時間継続した。（最近の研究は、この反応は、本質的に４５分以内に終了し、そして樹脂の積載能力は、反応時間を延長することによりもはや増加しないことを示した）。樹脂を、次いで濾過し、そしてＮＭＰで２回洗浄し（各々約１５ｍｌ）、次いで、１５ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ−ＤＩＰＥＡ（１７：２：１）で迅速に洗浄し、もそしてＮＭＰで２〜３回洗浄した。最終の洗浄をアセトニトリルを用いて行い、そして次に、樹脂を減圧で乾燥した。
【０１０３】
樹脂積載は、Ｆｍｏｃカウント実験を行いながら、ピペラジン処理（１時間）の前に少なくとも２時間の間ＴＨＦで樹脂を膨潤することにより算出した。代表的なＦｍｏｃカウント実験では、３〜５ｍｇのダイマー−樹脂を、キャップをした１ｍＬの微量遠心分離チューブ中、１００μＬのＴＨＦで２時間処理し、次いで、２００μＬのＤＭＦ中２０％（ｖ／ｖ）ピペリジンを添加した。この反応混合物を、次いで、ボルテックスし、そして１時間静置した。この反応混合物の容量を、メタノールの添加により１ｍＬに調節し、そして完全に混合した。上清液をメタノールで２０倍希釈し、そしてＵＶ吸光度を、３０１ｎｍで記録した（バックグラウンド補正はメタノールで行った）。Ｆｍｏｃ切断に際し放出された発色団のモル吸光係数（３０１ｎｍでε＝７８００Ｍ−１Ｃｍ−１）を、樹脂の積載能力を算出するために用いた。積載決定の結果は表２に見出され得る。
注記：ＰＮＡモノマー樹脂は合成の１または２日以内に用いられるか、使用まで４℃で貯蔵されるべきである。
【０１０４】
【化６】
（ＩＩ．ステップＢ：第２のモノマーの結合）
上記の実験Ｉから得られた約０．５ｇの各乾燥樹脂を、ＮＭＰで少なくとも２〜３時間膨潤した。次いで、Ｆｍｏｃ基を、この樹脂を１分間、５ｍＬのＤＭＦ中の２０％（ｖ／ｖ）ピペラジンで処理することにより除去した。Ｆｍｏｃ脱保護が進行中であった間に、ＮＭＰ中のＰＮＡモノマーの溶液を、ＤＩＰＥＡ（９当量）およびＨＡＴ（３．８当量）の添加により活性化した。最終のモノマー濃度は０．１７Ｍであった。次いで、この樹脂を、さらに１分間以内にＮＭＰ（３×１０〜１５ｍＬ）で洗浄し、活性化ＰＮＡ−モノママーを添加した。この結合は１５分間行い、そして次に、樹脂を、減圧下の乾燥の前にＮＭＰおよびアセトニトリルで洗浄した。次いで、樹脂積載能力をＦｍｏｃ決定により算出した。すべての可能な１６ダイマー−樹脂（４つの核酸塩基Ａ、Ｃ、Ｇ＆Ｔに基づく）を、上記のプロトコールを用いて合成した。ＰＮＡダイマー−樹脂の積載能力（表３）は、０．１２〜０．３５ｍｍｏｌｅ／ｇの範囲であった。この積載は、しばしば、従来のＦｍｏｃ−ＸＡＬ−ＰＥＧ−ＰＳ樹脂で用いられる。
注記：１）切断可能なリンカーがＣ末端酸を形成する；および２）Ｎ−α−アミンの脱保護が塩基性条件下で実施されるときはいつも、第２のＰＮＡオリゴマーの結合反応は、Ｎ末端保護基の除去の後、可能な限りすばやく実施されるべきである。なぜなら、環化および脱離反応（図３を参照のこと）が生じ得、それによって、第１のモノマーの実質的部分が、固体支持体から除去され、それによって、樹脂の積載を効率的に低下するからである。
【０１０５】
調製されたダイマー−樹脂は、任意のその他の従来のトリチル樹脂（４℃）のように貯蔵されるとき、安定であるようである。このような条件下で貯蔵された樹脂の積載能力は、
少なくとも４ヶ月の間一定のままであった。ダイマー−樹脂の安定性を試験するために、４ヶ月の間４℃で貯蔵された樹脂のサンプルを、ＤＭＦで洗浄し、そしてＦｍｏｃ決定により（上記で提示された手順を参照のこと）積載能力をチェックする前に乾燥した。これらの洗浄は、任意のＵＶ活性化合物はなく、それによって、それらは、これら条件下では、実質的に分解しないことを示した。
【０１０６】
【化７】
（実施例２：ダイマー−樹脂を用いるＰＮＡ Ｃ末端酸オリゴマーの合成）
表４は、上記のように調製されたダイマー−樹脂を用いてアセンブルされるべき第１のＰＮＡオリゴマーの中であった４つのＰＮＡペンタマーのついての合成データを識別かつ提供する。合成は、Ｅｘｐｅｄｉｔｅ ＰＮＡ合成機上で実施された。色素１および色素２で標識されたＰＮＡペンタマーは、ここでは、通常基準でダイマー−樹脂を用いてアセンブルされた。図１は、このような合成から得られたＰＮＡオリゴマー、色素１−ＴＧＧ−ＴＣ−ＯＨの粗製サンプルの代表的な分析ＲＰ−ＨＰＬＣプロフィールを示す。
【０１０７】
【化８】
（実施例３：モノメトキシトリチル（Ｍｍｔ）／Ｂｈｏｃモノマーを経由するＰＮＡ酸の合成）
（Ｉ．モノメトキシトリチル（Ｍｍｔ）／Ｂｈｏｃモノマーの調製）
市販され、入手可能なＦｍｏｃ（Ｂｈｏｃ）ＰＮＡモノマーを、Ｍｍｔ／Ｂｈｏｃモノマーに、図２に示されるような反応を用いてＮ末端アミン保護基をシャッフルすることにより変換した。反応は単純で、そして４つすべての核酸塩基（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ）に対する収率は満足すべきものであった（６８〜９６％）。
【０１０８】
Ｎ末端アミン保護基シャッフルを実施するために、以下のさらなる試薬を用いた（注記される場合を除き、先に識別された試薬が用いられた）。ヘキサン：Ｐ／Ｎ ＡＨ２１６−４は、Ｂｕｒｄｉｃｋ ＆ Ｊａｃｋｓｏｎから得た。ピペリジン：Ｐ／Ｎ １０，４０９−４、４−メトキシトリチルクロライド（Ｍｍｔ−Ｃｌ）：Ｐ／Ｎ １２９２０−８およびニンヒドリン：Ｐ／Ｎ ６０−１２７は、Ａｌｄｒｉｃｈ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｍｐａｎｙから得た。酢酸エチル（ＥｏＯＡｃ）は、Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ（Ｐａｒｉｓ、Ｋｅｎｔｕｃｋｙ）から得た。
【０１０９】
一般に、このＦｍｏｃ（Ｂｈｏｃ）−ＰＮＡモノマー（１．３８ｍｍｏｌ）を、４２ｍＬのＤＣＭ−ＤＭＦ（１：１、ｖ／ｖ）中に溶解し、次いで、ピペリジンを添加した（８１８μＬ、８．２８ｍｍｏｌ）。８分後、トリエチルアミン（Ｅｔ３Ｎ；２ｍＬ）およびＭｍｔ−Ｃｌ（１．２７６ｇ、４．１４ｍｍｏｌ）をこの反応混合物に添加し、そして室温で１８時間の間攪拌した。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ、シリカプレート、９：１ ＣＨ２Ｃｌ２−ＣＨ３ＯＨ＋７滴のＤＩＰＥＡ／１０ｍＬ）が、遊離の一級アミンの存在を示した場合（ニンヒドリンに活性、ベースラインスポット）、別のバッチのＭｍｔ−Ｃｌ（３ｇ、９．７３ｍｍｏｌ）およびＥｔ３Ｎ（２ｍＬ）を添加し、そしてさらに３時間攪拌した。一般に、次のＴＬＣは、この一級アミンの完全な消費を示した。次いで、揮発性成分を、ロータリー−蒸発により除去し、そして黄色の泡を、最小量のＣＨ２Ｃｌ２中に溶解した。このように得られた溶液を、次いで、シリカゲルのパッド（２（長さ）×５（直径）インチ、３：２ ＥｔＯＡｃ−ヘキサン＋０．２％のＥｔ３Ｎでパック）上に載せ、そして最初に３：２ ＥｔＯＡｃ−ヘキサン（９００ｍＬ）で洗浄し、次いで、ＣＨ２Ｃｌ２中２０％ＣＨ３ＯＨ＋０．２％Ｅｔ３Ｎ（６００ｍＬ）で溶出した。溶媒の蒸発に際し、純粋な生成物が６８〜９６％の収率で得られた。
【０１１０】
（ＩＩ．副反応の分析）
Ｍｍｔ基は、樹脂上に第１のモノマーを係留した後、ジクロロメタン中の２％のジクロロ酢酸（ＤＣＡ）の溶液で除去され得ることが理論付けられた。この脱保護戦略は、ケトピペラジンを形成する環化および脱離反応（図３）を行なわない、プロトン化アミン基を生成することが意図された。Ｂｈｏｃ基は、Ｍｍｔ基除去条件下では不安定であることが知られているので、核酸塩基の遊離の環外アミンがＭｍｔ脱保護条件で生成された場合、分岐反応が生じる可能性があった。
【０１１１】
この可能な副反応を試験するために、Ｆｍｏｃ（Ｂｈｏｃ）シトシンモノマーが、標準的なカップリング条件を用いてＸＡＬ−ＰＥＧ−ＰＳ樹脂に係留され、そして次に、ＤＣＡ溶液で３分間処理されるモデル実験を実施した。次いで、この樹脂を洗浄し、そして合成を、市販され入手可能なＥｘｐｅｄｉｔｅ核酸合成機中で（市販され入手可能なＦｍｏｃ（Ｂｈｏｃ）モノマーおよびプロトコールを用いて）継続し、配列ＧＡＴＣのＰＮＡオリゴマーをアセンブルした。次いで、ＰＮＡを、標準的な手順を用いて樹脂から切断し、そして粗製オリゴマーを、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにより分析した。
【０１１２】
質量データは、生成物ＧＡＴＣおよびアセチル化生成物ＧＡＴＣＡｃの存在を示した。この結果は予想された。なぜなら、このＢｈｏｃ脱保護シトシンは、次のキャッピングステップ（単数または複数）でアセチル化されたからである。しかし、質量分析では、分岐オリゴマーは検出されなかった。これは、シトシンの環外アミンは、代表的なＨＡＴＵカップリング下ではＰＮＡモノマーとアセチル化するに十分求核性ではないことを示唆する。次いで、テトラマーを、２８％水性ＮＨ３での処理により非アセチル化オリゴマーに首尾よく変換した。これは、質量分析計中の質量分析によって確認された。これらの結果から、Ｍｍｔ／Ｂｈｏｃモノマーは、オリゴマー分岐に悩むことなくＣ末端酸を含むＰＮＡオリゴマーを合成するために用いられ得たと結論付けられた。
【０１１３】
（ＩＩＩ．Ｍｍｔ／Ｂｈｏｃモノマーを用いるＰＮＡ Ｃ末端オリゴマーの調製）
この決定がなされた後、図４に示されるように、２，６−ジクロロ−ベンゾイルクロライドを用いて、Ｍｍｔ／Ｂｈｏｃ−Ｇモノマーを、Ｗａｎｇ樹脂に係留した。この樹脂を洗浄し、そして次のモノマー（Ｔ、Ｔ、ＧおよびＡ）を、標準的なＨＡＴＵカップリング条件を用いて結合した。ＤＣＡ洗浄中にＰＮＡモノマーは検出されず（ＴＬＣ：ＵＶおよびニンヒドリン試験）；これは、最初の残基がＤＣＡ処理に際して固体支持体から切断されないことを示した。
【０１１４】
積載は高く（０．３１ｍｍｏｌ／ｇ；最初のＴのＦｍｏｃカウントから得た）、そしてその他のカップリングの間を通じて同じに維持された。合成を終了するために、Ｂｏｃ保護色素１（図５）を、標準的な標識条件を用いてＰＮＡオリゴマーのＮ末端に結合した。この樹脂を切断し、そして粗製生成物を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳおよびＨＰＬＣにより分析した。この分析は、この生成物の効率的な形成（９６％）を示した。キャッピングステップは、すべてのカップリングから脱離され、そして生成物の質に影響するようではないことに注目することが重要である。このプロセスはまた、ＮｏｖａＳｙｎ−ＴＧＡ樹脂を用いてもまた成功し（図６）、ここで、樹脂は、Ｗａｎｇ樹脂とは、主に、ＰＥＧリンカーの存在下であることが異なる。これらプロセスは、実施例１で上記に記載されたようなＰＮＡダイマー樹脂（固体支持体）のライブラリーを生成するために用いられ得る。
【０１１５】
（ＩＶ．結果の要約）
− 樹脂上のＭｍｔ／Ｂｈｏｃモノマー積載は高く（１．２０〜０．２７ｍｍｏｌ／ｇ）、そしてＰＮＡ Ｃ末端オリゴマーの調製のために用いられ得る。
【０１１６】
− モノマー樹脂のＭｍｔ基の切断後、プロトン化アミンは、直後に結合される必要はない。
− キャッピング工程は、これらモノマーではなくされ、時間を減少する。
− 従来のＰＮＡ合成機の合成プロトコールを変更する必要はない。
【０１１７】
非保護色素１および色素２の構造は、図７に見出され得る。
【０１１８】
（実施例４：ダイマー樹脂生成のための別の一般的手順）
モノマー樹脂（１〜５ｇスケール）の合成のための手順：
１）Ｆｍｏｃ／ＢｈｏｃＰＮＡモノマー（１．４６ｍｍｏｌ、０．７５当量）およびＤＩＰＥＡ（４．３８ｍｍｏｌ、２．２５当量）を、ＮＭＰ／ＤＣＭ（１０ｍＬ／５ｍＬ、すべて無水）中でモノマーが溶解するまで攪拌する＊。モノマー濃度は０．１Ｍである。
２）樹脂＊＊（１．５ｇ、１．９５ｍｍｏｌ、１．００ｅｑ）をモノマー溶液に添加し；不活性雰囲気下で４時間攪拌する。
３）樹脂を濾過し、完全に混合しながら、３×１５ｍＬのＮＭＰで洗浄する。
４）樹脂を、キャッピング溶液中（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ／ＤＩＰＥＡ＝１７ｍＬ／２ｍＬ／１ｍＬ）で１５分間攪拌する。
５）樹脂を濾過し、３×１５ｍＬのＮＭＰ、３×１５ｍＬのＡＣＮで各々完全に混合して洗浄する。
６）減圧下で樹脂を乾燥する。
【０１１９】
ダイマー（１〜５ｇスケール）合成のための手順：
１）モノマー樹脂（０．４９ｍｍｏｌ、１．０ｇ、１．００当量）を、５．０ｍＬのＮＭＰに３時間の間浸す。
２）ＤｅＦＭＯＣ溶液：ＮＭＰ（５．０ｍＬ）中２．０％ＤＢＵを調製する。
３）モノマー（０．９８ｍｍｏｌ、２．００当量）、ＨＡＴＵ（０．９３ｍｍｏｌ、１．９０当量）、およびＤＩＰＥＡ（１．９６ｍｍｏｌ、４．０当量）を、１０ｍＬのＮＭＰ中で５〜１０分攪拌することによりカップリング溶液を調製する。モノマー濃度は０．１Ｍである。
４）ＮＭＰ中のモノマー樹脂にＤｅＦＭＯＣ溶液を直接添加する。ＤＢＵの最終濃度は１．０％である；４分攪拌する。
５）ビーズを濾過し；３×１５ｍＬのＮＭＰで攪拌しながら洗浄する（約４分要する）。
６）樹脂にカップリング溶液を添加し、そして６０分間攪拌する。
７）樹脂を濾過し、３×１５ｍＬのＮＭＰで完全に攪拌して洗浄する。
８）１５ｍＬのＰＮＡキャッピング溶液（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｐ／Ｎ ＧＥＮ０６３１０２）を樹脂に添加し、３０分間攪拌する。
９）樹脂を濾過し、３×１５ｍＬのＮＭＰ、３×１５ｍＬのＡＣＮで、各々完全に混合して洗浄する。
１０）減圧下で樹脂を乾燥する。
【０１２０】
本発明の好ましい実施形態を記載したが、今や、これら概念を取り込むその他の実施形態が用いられ得ることは当業者に明らかとなる。従って、これら実施形態は、開示の実施形態に制限されるべきではなく、むしろ本発明の思想および範囲によってのみ制限されるべきであると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０１２１】
【図１】図１は、粗製蛍光標識されたＰＮＡ Ｃ末端酸ペンタマーのサンプルの高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の結果である。
【図２】図２は、Ｆｍｏｃ（Ｂｈｏｃ）ＰＮＡモノマーからＭｍｔ／Ｂｈｏｃモノマーを生成するためのＮ末端アミン保護基シャッフル反応の概略図である。
【図３】図３は、Ｎ末端アミン保護基除去、およびＮ末端アミン保護基プロトン化によるケトピペラジン形成（環化および脱離）の阻害の概略図である。
【図４】図４は、Ｗａｎｇ樹脂（固体支持体）およびＭｍｔ／ＢｈｏｃおよびＦｍｏｃ（Ｂｈｏｃ）ＰＮＡモノマーの組み合わせから開始する蛍光標識されたＰＮＡ Ｃ末端酸オリゴマーの調製の概略である。
【図５】図５は、ビス−（ｔ−ｂｏｃ）−保護色素１の構造である。
【図６】図６は、ＮｏｖａＳｙｎ−ＴＧＡ樹脂の図示である。
【図７】図７は、色素１および色素２の構造である。
【図８】図８のａおよびｂは、細長いＰＮＡオリゴマーおよびＰＮＡキメラを生成するために用いられ得るＰＮＡ連結／縮合反応の非限定的な例の図示である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
固体支持体組成物であって：
ａ）酸を形成する切断可能なリンカー；および
ｂ）ＰＮＡダイマーであって、該切断可能なリンカーにより該固体支持体に切断可能に連結されたＮ末端の塩基不安定性保護基を含むＰＮＡダイマーを含み、ここで、該固体支持体上のＰＮＡダイマーの積載が、１グラムあたり０．０８ｍｍｏｌより大きいか、またはそれに等しい、組成物。
【請求項２】
前記固体支持体が、立体的に妨害された固体支持体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記立体的に妨害された固体支持体が、トリチルクロライド樹脂（トリチル−Ｃｌ）、２−クロロトリチルクロライド樹脂、ＤＨＰＰ、ＭＢＨＡ、４−メチルトリチルクロライド樹脂、４−メトキシトリチルクロライド樹脂、ヒドロキシ−（２−クロロフェニル）メチル−ＰＳ、Ｒｉｎｋ酸樹脂およびＮｏｖａＳｙｎ ＴＧＴアルコール樹脂からなる群から選択される、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記固体支持体が、ＰＡＬ−ＰＥＧ−ＰＳ（商標）、ＮｏｖａＳｙｎ ＴＧＡおよびＷａｎｇ樹脂からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＰＮＡダイマーが、前記切断可能なリンカーに、エステル結合によって連結される、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項６】
前記ＰＮＡダイマーが、Ｆｍｏｃ（Ｂｈｏｃ）モノマーから形成される、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項７】
前記固体支持体上のＰＮＡダイマーの積載が、１グラムあたり約０．１ｍｍｏｌから１グラムあたり約１ｍｍｏｌの範囲にある、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項８】
前記固体支持体上のＰＮＡダイマーの積載が、１グラムあたり約０．１２ｍｍｏｌから１グラムあたり約０．３５ｍｍｏｌの範囲にある、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項９】
前記固体支持体が、２つ以上の異なる支持体結合ＰＮＡダイマーを含むアレイである、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項１０】
少なくとも２つの固体支持体を含むライブラリーであって、ここで、該少なくとも２つの固体支持体の各々が：
ａ）酸を形成する切断可能なリンカー；および
ｂ）ＰＮＡダイマーであって：（ｉ）該酸を形成する切断可能なリンカーに切断可能に連結され；かつ（ｉｉ）該ライブラリーの少なくとも２つの固体支持体の任意のもう一方に連結されているＰＮＡダイマーとは核酸塩基配列が異なるＰＮＡダイマー
を含む、ライブラリー。
【請求項１１】
前記ライブラリーが、少なくとも１６個の固体支持体を含み、各々の支持体が、少なくとも１６個の可能なＰＮＡダイマーのセットから選択されたＰＮＡダイマーを含み、該セットの各々のＰＮＡダイマーが、該セットの他のＰＮＡダイマーすべてとは、少なくとも４つの異なる核酸塩基の少なくとも１つが異なる、請求項１０に記載のライブラリー。
【請求項１２】
前記少なくとも４つの異なる核酸塩基の各々が、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、５−プロピニル−ウラシル、２−チオ−５−プロピニル−ウラシル、５−メチルシトシン、プソイドイソシトシン、２−チオウラシルおよび２−チオチミン、２−アミノプリン、Ｎ９−（２−アミノ−６−クロロプリン）、Ｎ９−（２，６−ジアミノプリン）、ヒポキサンチン、Ｎ９−（７−デアザ−グアニン）、Ｎ９−（７−デアザ−８−アザ−グアニン）およびＮ８−（７−デアザ−８−アザ−アデニン）からなる群から選択される、請求項１１に記載のライブラリー。
【請求項１３】
前記固体支持体が、立体的に妨害された固体支持体である、請求項１０に記載のライブラリー。
【請求項１４】
前記立体的に妨害された固体支持体が、トリチルクロライド樹脂（トリチル−Ｃｌ）、２−クロロトリチルクロライド樹脂、ＤＨＰＰ、ＭＢＨＡ、４−メチルトリチルクロライド樹脂、４−メトキシトリチルクロライド樹脂、ヒドロキシ−（２−クロロフェニル）メチル−ＰＳ、Ｒｉｎｋ酸樹脂およびＮｏｖａＳｙｎ ＴＧＴアルコール樹脂からなる群から選択される、請求項１３に記載のライブラリー。
【請求項１５】
前記固体支持体が、ＰＡＬ−ＰＥＧ−ＰＳ、ＮｏｖａＳｙｎ ＴＧＡおよびＷａｎｇ樹脂からなる群から選択される、請求項１０に記載のライブラリー。
【請求項１６】
前記ＰＮＡダイマーが、前記切断可能なリンカーに、エステル結合によって連結される、請求項１０または１３に記載のライブラリー。
【請求項１７】
前記ＰＮＡダイマーのＣ末端サブユニットが、前記切断可能なリンカーに連結される、請求項１６に記載のライブラリー。
【請求項１８】
前記ＰＮＡダイマーが、Ｆｍｏｃ（Ｂｈｏｃ）保護ＰＮＡモノマーから形成される、請求項１３に記載のライブラリー。
【請求項１９】
前記ＰＮＡダイマーが、ｔ−ｂｏｃ／Ｚ保護ＰＮＡモノマーから形成される、請求項１０または１３に記載のライブラリー。
【請求項２０】
前記ＰＮＡダイマーが、Ｍｍｔ／Ｂｈｏｃ保護ＰＮＡモノマーから形成される、請求項１０または１３に記載のライブラリー。
【請求項２１】
前記ＰＮＡダイマーが、Ｍｍｔ／Ｂｈｏｃ保護ＰＮＡモノマーおよびＦｍｏｃ（Ｂｈｏｃ）保護ＰＮＡモノマーの両方から形成される、請求項１０または１３に記載のライブラリー。
【請求項２２】
前記ライブラリーの少なくとも１つの固体支持体上のＰＮＡダイマーの積載が、１グラムあたり０．０８ｍｍｏｌより大きいか、またはそれに等しい、請求項１０または１３に記載のライブラリー。
【請求項２３】
前記ライブラリーの固体支持体の少なくとも２分の１上のＰＮＡダイマーの積載が、１グラムあたり０．０８ｍｍｏｌより大きいか、またはそれに等しい、請求項１０または１３に記載のライブラリー。
【請求項２４】
前記ライブラリーの固体支持体のすべての上のＰＮＡダイマーの積載が、１グラムあたり０．０８ｍｍｏｌより大きいか、またはそれに等しい、請求項１０または１３に記載のライブラリー。
【請求項２５】
前記ライブラリーの各々の固体支持体上のＰＮＡダイマーの積載が、１グラムあたり約０．１ｍｍｏｌから１グラムあたり約１ｍｍｏｌの範囲にある、請求項２４に記載のライブラリー。
【請求項２６】
前記ライブラリーの各々の固体支持体上のＰＮＡダイマーの積載が、１グラムあたり約０．１２ｍｍｏｌから１グラムあたり約０．３５ｍｍｏｌの範囲にある、請求項２４に記載のライブラリー。
【請求項２７】
前記支持体のライブラリーが、整列されてアレイを生成する、請求項１０または１３に記載のライブラリー。
【請求項２８】
支持体に結合したＰＮＡダイマーを形成する方法であって：
ａ）第１のＰＮＡモノマーを、立体的に妨害された酸を形成する切断可能なリンカーを含む立体的に妨害された固体支持体に結合する工程であって、ここで、該ＰＮＡモノマーが、Ｎ末端の塩基不安定アミン保護基を含む工程；
ｂ）該固体支持体を必要に応じて洗浄し、過剰の第１のＰＮＡモノマーを除去する工程；
ｃ）該固体支持体を、約１分間〜約２分間の間、該支持体に結合した第１のＰＮＡモノマーから該塩基不安定Ｎ末端アミン保護基を実質的に除去するが、該支持体から第１のＰＮＡモノマーの５０％より多い環化および除去を許容しない脱保護試薬で処理する工程；
ｄ）該固体支持体を洗浄する工程であって、該脱保護試薬を除去する工程；および
ｅ）工程（ｃ）および（ｄ）を実施した後、実用的である限りすぐに、第２のＰＮＡモノマーを、該第１のＰＮＡモノマーのＮ末端アミンに結合する工程、
を包含する、方法。
【請求項２９】
前記第１および第２のＰＮＡモノマーが、同一または異なる核酸塩基を含むＦｍｏｃ（Ｂｈｏｃ）ＰＮＡモノマーである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記第１および第２のＰＮＡモノマーの核酸塩基が、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、５−プロピニル−ウラシル、２−チオ−５−プロピニル−ウラシル、５−メチルシトシン、プソイドイソシトシン、２−チオウラシルおよび２−チオチミン、２−アミノプリン、Ｎ９−（２−アミノ−６−クロロプリン）、Ｎ９−（２，６−ジアミノプリン）、ヒポキサンチン、Ｎ９−（７−デアザ−グアニン）、Ｎ９−（７−デアザ−８−アザ−グアニン）およびＮ８−（７−デアザ−８−アザ−アデニン）からなる群から独立に選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記Ｎ末端の塩基不安定保護基が、Ｆｍｏｃである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記脱保護試薬が、有機溶媒中約１５〜約２５％のピペリジンを含む溶液である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記脱保護試薬が、Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の２０％ピペリジンである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記脱保護試薬が、ＮＭＰ中に約０．２％〜約４％（ｖ／ｖ）ＤＢＵを含む溶液である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
前記脱保護試薬が、ＮＭＰ中の約２％ＤＢＵである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記立体的に妨害された固体支持体が、トリチルクロライド樹脂（トリチル−Ｃｌ）、２−クロロトリチルクロライド樹脂、ＤＨＰＰ、ＭＢＨＡ、４−メチルトリチルクロライド樹脂、４−メトキシトリチルクロライド樹脂、ヒドロキシ−（２−クロロフェニル）メチル−ＰＳ、Ｒｉｎｋ酸樹脂およびＮｏｖａＳｙｎ ＴＧＴアルコール樹脂からなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３７】
前記立体的に妨害された固体支持体が、トリチルクロライド（トリチル−Ｃｌ）樹脂である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３８】
前記固体支持体上のＰＮＡダイマーの最終積載が、１グラムあたり０．０８ｍｍｏｌより大きいか、またはそれに等しい、請求項２８に記載の方法。
【請求項３９】
前記固体支持体上のＰＮＡダイマーの最終積載が、１グラムあたり約０．１ｍｍｏｌから１グラムあたり約１ｍｍｏｌの範囲にある、請求項２８に記載の方法。
【請求項４０】
前記固体支持体上のＰＮＡダイマーの最終積載が、１グラムあたり約０．１２ｍｍｏｌから１グラムあたり約０．３５ｍｍｏｌの範囲にある、請求項２８に記載の方法。
【請求項４１】
支持体に結合したＰＮＡダイマーを形成する方法であって：
ａ）第１のＰＮＡモノマーを、酸を形成する切断可能なリンカーを含む固体支持体に結合する工程であって、ここで、該ＰＮＡモノマーが、酸不安定Ｎ末端保護基を含む工程；
ｂ）該固体支持体を必要に応じて洗浄し、過剰の第１のＰＮＡモノマーを除去する工程；
ｃ）該固体支持体を、該酸不安定Ｎ末端保護基を脱保護する酸性条件下、脱保護試薬で処理する工程；
ｄ）該固体支持体を洗浄して該脱保護試薬を除去する工程；および
ｅ）第２のＰＮＡモノマーを、該第１のＰＮＡモノマーのＮ末端アミンに結合する工程、を包含し、
ここで、該固体支持体上のＰＮＡダイマーの最終積載が、１グラムあたり０．０８ｍｍｏｌより大きいか、またはそれに等しい、方法。
【請求項４２】
前記第１および第２のＰＮＡモノマーが、同一または異なる核酸塩基を含むｔ−ｂｏｃ／Ｚ保護ＰＮＡモノマーである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記第１および第２のＰＮＡモノマーが、同一または異なる核酸塩基を含むＭｍｔ／Ｂｈｏｃ保護ＰＮＡモノマーである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記第１のＰＮＡモノマーが、Ｍｍｔ／Ｂｈｏｃ保護ＰＮＡモノマーであり、そして前記第２のＰＮＡモノマーが、Ｆｍｏｃ／Ｂｈｏｃ保護ＰＮＡモノマーである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
前記第１および第２のＰＮＡモノマーの核酸塩基が、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、５−プロピニル−ウラシル、２−チオ−５−プロピニル−ウラシル、５−メチルシトシン、プソイドイソシトシン、２−チオウラシルおよび２−チオチミン、２−アミノプリン、Ｎ９−（２−アミノ−６−クロロプリン）、Ｎ９−（２，６−ジアミノプリン）、ヒポキサンチン、Ｎ９−（７−デアザ−グアニン）、Ｎ９−（７−デアザ−８−アザ−グアニン）およびＮ８−（７−デアザ−８−アザ−アデニン）からなる群から独立に選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４６】
前記第１のＰＮＡモノマーが、Ｍｍｔ／Ｂｈｏｃ保護ＰＮＡモノマーであり、そして前記脱保護試薬が、有機溶媒中の約１〜約５％（ｖ／ｖ）のジクロロ酢酸を含む溶液である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４７】
前記脱保護試薬が、ジクロロメタン（ＤＣＭ）中の約２％のジクロロ酢酸である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記固体支持体が、トリチルクロライド樹脂（トリチル−Ｃｌ）、２−クロロトリチルクロライド樹脂、ＤＨＰＰ、ＭＢＨＡ、４−メチルトリチルクロライド樹脂、４−メトキシトリチルクロライド樹脂、ヒドロキシ−（２−クロロフェニル）メチル−ＰＳ、Ｒｉｎｋ酸樹脂およびＮｏｖａＳｙｎ ＴＧＴアルコール樹脂からなる群から選択される立体的に妨害された固体支持体である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４９】
前記固体支持体が、Ｆｍｏｃ−ＰＡＬ−ＰＥＧ−ＰＳ、ＮｏｖａＳｙｎ ＴＧＡおよびＷａｎｇ樹脂からなる群から選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項５０】
前記固体支持体上のＰＮＡダイマーの最終積載が、１グラムあたり約０．１ｍｍｏｌ〜１グラムあたり約１．２ｍｍｏｌの範囲内にある、請求項４１に記載の方法。
【請求項５１】
前記固体支持体上のＰＮＡダイマーの最終積載が、１グラムあたり約０．１２ｍｍｏｌ〜１グラムあたり約０．３５ｍｍｏｌの範囲内にある、請求項４１に記載の方法。
【請求項５２】
Ｃ末端ＰＮＡサブユニットおよび蛍光標識またはクエンチャーを含む、ＰＮＡ Ｃ末端酸オリゴマー。
【請求項５３】
前記蛍光標識が、色素１または色素２である、請求項５２に記載のＰＮＡオリゴマー。
【請求項５４】
前記クエンチャー成分が、ダブシルである、請求項５２に記載のＰＮＡオリゴマー。
【請求項５５】
前記ＰＮＡオリゴマーは、長さが１０ ＰＮＡサブユニット以下である、請求項５２に記載のＰＮＡオリゴマー。
【請求項５６】
前記ＰＮＡオリゴマーは、長さが約３〜約８サブユニットである、請求項５２に記載のＰＮＡオリゴマー。
【請求項５７】
前記ＰＮＡオリゴマーは、長さが約４〜約６サブユニットである、請求項５２に記載のＰＮＡオリゴマー。
【請求項５８】
前記ＰＮＡオリゴマーは、長さが４サブユニットである、請求項５２に記載のＰＮＡオリゴマー。
【請求項５９】
前記ＰＮＡオリゴマーは、長さが５サブユニットである、請求項５２に記載のＰＮＡオリゴマー。
【請求項６０】
前記標識が、前記ＰＮＡオリゴマーのＮ末端サブユニットに連結される、請求項５２に記載のＰＮＡオリゴマー。
【請求項６１】
前記標識が、前記ＰＮＡオリゴマーのＮ末端アミンに連結される、請求項５２に記載のＰＮＡオリゴマー。
【請求項６２】
前記オリゴマーの核酸塩基が、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、５−プロピニル−ウラシル、２−チオ−５−プロピニル−ウラシル、５−メチルシトシン、プソイドイソシトシン、２−チオウラシルおよび２−チオチミン、２−アミノプリン、Ｎ９−（２−アミノ−６−クロロプリン）、Ｎ９−（２，６−ジアミノプリン）、ヒポキサンチン、Ｎ９−（７−デアザ−グアニン）、Ｎ９−（７−デアザ−８−アザ−グアニン）およびＮ８−（７−デアザ−８−アザ−アデニン）からなる群から選択される、請求項５２に記載のＰＮＡオリゴマー。
【請求項６３】
ＰＮＡ Ｃ末端酸オリゴマーのライブラリーであって、該ライブラリーの各々のＰＮＡオリゴマーが：
ａ）核酸塩基配列；
ｂ）Ｃ末端ＰＮＡサブユニット；および
ｃ）蛍光標識またはクエンチャー成分；
を含み、
ここで、ＰＮＡオリゴマーの各々が、該ライブラリーの他のＰＮＡオリゴマーの各々とは、標識、核酸塩基配列、サブユニット長さまたは核酸塩基配列の極性のいずれかが異なる、ライブラリー。
【請求項６４】
前記ＰＮＡオリゴマーの各々の核酸塩基が、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、５−プロピニル−ウラシル、２−チオ−５−プロピニル−ウラシル、５−メチルシトシン、プソイドイソシトシン、２−チオウラシルおよび２−チオチミン、２−アミノプリン、Ｎ９−（２−アミノ−６−クロロプリン）、Ｎ９−（２，６−ジアミノプリン）、ヒポキサンチン、Ｎ９−（７−デアザ−グアニン）、Ｎ９−（７−デアザ−８−アザ−グアニン）およびＮ８−（７−デアザ−８−アザ−アデニン）からなる群から選択される、請求項６３に記載のライブラリー。
【請求項６５】
前記ＰＮＡオリゴマーの各々の蛍光標識またはクエンチャーが、Ｎ末端サブユニットに連結されている、請求項６３に記載のライブラリー。
【請求項６６】
前記ＰＮＡオリゴマーの各々の蛍光標識またはクエンチャーが、Ｎ末端アミンに連結されている、請求項６３に記載のライブラリー。
【請求項６７】
前記ライブラリーのＰＮＡオリゴマーの各々が、同じ数のＰＮＡサブユニットを含む、請求項６３に記載のライブラリー。
【請求項６８】
前記ライブラリーのＰＮＡオリゴマーの少なくとも１つが、該ライブラリーの他の少なくとも１つのＰＮＡオリゴマーと比較した場合に異なる数のＰＮＡサブユニットを含む、請求項６３に記載のライブラリー。
【請求項６９】
前記ライブラリーのＰＮＡオリゴマーの各々が、約３〜約８個のＰＮＡサブユニットを含む、請求項６３に記載のライブラリー。
【請求項７０】
前記ライブラリーのＰＮＡオリゴマーの各々が、約４〜約６個のＰＮＡサブユニットを含む、請求項６３に記載のライブラリー。
【請求項７１】
前記ライブラリーのＰＮＡオリゴマーの各々が、４個のＰＮＡサブユニットを含む、請求項６３に記載のライブラリー。
【請求項７２】
前記ライブラリーのＰＮＡオリゴマーの各々が、５個のＰＮＡサブユニットを含む、請求項６３に記載のライブラリー。
【請求項７３】
前記ライブラリーが、少なくとも２つのセットのＰＮＡ Ｃ末端酸オリゴマーを含み、ここで、該各セットのＰＮＡオリゴマーが、主に、蛍光標識の性質において、他のセットのＰＮＡオリゴマーと異なる、請求項６３に記載のライブラリー。
【請求項７４】
前記第１のセットのＰＮＡ Ｃ末端酸オリゴマーが、色素１で標識され、そして前記第２のセットのＰＮＡ Ｃ末端酸オリゴマーが、色素２で標識される、請求項７３に記載のライブラリー。
【請求項１】
固体支持体組成物であって：
ａ）酸を形成する切断可能なリンカー；および
ｂ）ＰＮＡダイマーであって、該切断可能なリンカーにより該固体支持体に切断可能に連結されたＮ末端の塩基不安定性保護基を含むＰＮＡダイマーを含み、ここで、該固体支持体上のＰＮＡダイマーの積載が、１グラムあたり０．０８ｍｍｏｌより大きいか、またはそれに等しい、組成物。
【請求項２】
前記固体支持体が、立体的に妨害された固体支持体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記立体的に妨害された固体支持体が、トリチルクロライド樹脂（トリチル−Ｃｌ）、２−クロロトリチルクロライド樹脂、ＤＨＰＰ、ＭＢＨＡ、４−メチルトリチルクロライド樹脂、４−メトキシトリチルクロライド樹脂、ヒドロキシ−（２−クロロフェニル）メチル−ＰＳ、Ｒｉｎｋ酸樹脂およびＮｏｖａＳｙｎ ＴＧＴアルコール樹脂からなる群から選択される、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記固体支持体が、ＰＡＬ−ＰＥＧ−ＰＳ（商標）、ＮｏｖａＳｙｎ ＴＧＡおよびＷａｎｇ樹脂からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＰＮＡダイマーが、前記切断可能なリンカーに、エステル結合によって連結される、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項６】
前記ＰＮＡダイマーが、Ｆｍｏｃ（Ｂｈｏｃ）モノマーから形成される、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項７】
前記固体支持体上のＰＮＡダイマーの積載が、１グラムあたり約０．１ｍｍｏｌから１グラムあたり約１ｍｍｏｌの範囲にある、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項８】
前記固体支持体上のＰＮＡダイマーの積載が、１グラムあたり約０．１２ｍｍｏｌから１グラムあたり約０．３５ｍｍｏｌの範囲にある、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項９】
前記固体支持体が、２つ以上の異なる支持体結合ＰＮＡダイマーを含むアレイである、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項１０】
少なくとも２つの固体支持体を含むライブラリーであって、ここで、該少なくとも２つの固体支持体の各々が：
ａ）酸を形成する切断可能なリンカー；および
ｂ）ＰＮＡダイマーであって：（ｉ）該酸を形成する切断可能なリンカーに切断可能に連結され；かつ（ｉｉ）該ライブラリーの少なくとも２つの固体支持体の任意のもう一方に連結されているＰＮＡダイマーとは核酸塩基配列が異なるＰＮＡダイマー
を含む、ライブラリー。
【請求項１１】
前記ライブラリーが、少なくとも１６個の固体支持体を含み、各々の支持体が、少なくとも１６個の可能なＰＮＡダイマーのセットから選択されたＰＮＡダイマーを含み、該セットの各々のＰＮＡダイマーが、該セットの他のＰＮＡダイマーすべてとは、少なくとも４つの異なる核酸塩基の少なくとも１つが異なる、請求項１０に記載のライブラリー。
【請求項１２】
前記少なくとも４つの異なる核酸塩基の各々が、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、５−プロピニル−ウラシル、２−チオ−５−プロピニル−ウラシル、５−メチルシトシン、プソイドイソシトシン、２−チオウラシルおよび２−チオチミン、２−アミノプリン、Ｎ９−（２−アミノ−６−クロロプリン）、Ｎ９−（２，６−ジアミノプリン）、ヒポキサンチン、Ｎ９−（７−デアザ−グアニン）、Ｎ９−（７−デアザ−８−アザ−グアニン）およびＮ８−（７−デアザ−８−アザ−アデニン）からなる群から選択される、請求項１１に記載のライブラリー。
【請求項１３】
前記固体支持体が、立体的に妨害された固体支持体である、請求項１０に記載のライブラリー。
【請求項１４】
前記立体的に妨害された固体支持体が、トリチルクロライド樹脂（トリチル−Ｃｌ）、２−クロロトリチルクロライド樹脂、ＤＨＰＰ、ＭＢＨＡ、４−メチルトリチルクロライド樹脂、４−メトキシトリチルクロライド樹脂、ヒドロキシ−（２−クロロフェニル）メチル−ＰＳ、Ｒｉｎｋ酸樹脂およびＮｏｖａＳｙｎ ＴＧＴアルコール樹脂からなる群から選択される、請求項１３に記載のライブラリー。
【請求項１５】
前記固体支持体が、ＰＡＬ−ＰＥＧ−ＰＳ、ＮｏｖａＳｙｎ ＴＧＡおよびＷａｎｇ樹脂からなる群から選択される、請求項１０に記載のライブラリー。
【請求項１６】
前記ＰＮＡダイマーが、前記切断可能なリンカーに、エステル結合によって連結される、請求項１０または１３に記載のライブラリー。
【請求項１７】
前記ＰＮＡダイマーのＣ末端サブユニットが、前記切断可能なリンカーに連結される、請求項１６に記載のライブラリー。
【請求項１８】
前記ＰＮＡダイマーが、Ｆｍｏｃ（Ｂｈｏｃ）保護ＰＮＡモノマーから形成される、請求項１３に記載のライブラリー。
【請求項１９】
前記ＰＮＡダイマーが、ｔ−ｂｏｃ／Ｚ保護ＰＮＡモノマーから形成される、請求項１０または１３に記載のライブラリー。
【請求項２０】
前記ＰＮＡダイマーが、Ｍｍｔ／Ｂｈｏｃ保護ＰＮＡモノマーから形成される、請求項１０または１３に記載のライブラリー。
【請求項２１】
前記ＰＮＡダイマーが、Ｍｍｔ／Ｂｈｏｃ保護ＰＮＡモノマーおよびＦｍｏｃ（Ｂｈｏｃ）保護ＰＮＡモノマーの両方から形成される、請求項１０または１３に記載のライブラリー。
【請求項２２】
前記ライブラリーの少なくとも１つの固体支持体上のＰＮＡダイマーの積載が、１グラムあたり０．０８ｍｍｏｌより大きいか、またはそれに等しい、請求項１０または１３に記載のライブラリー。
【請求項２３】
前記ライブラリーの固体支持体の少なくとも２分の１上のＰＮＡダイマーの積載が、１グラムあたり０．０８ｍｍｏｌより大きいか、またはそれに等しい、請求項１０または１３に記載のライブラリー。
【請求項２４】
前記ライブラリーの固体支持体のすべての上のＰＮＡダイマーの積載が、１グラムあたり０．０８ｍｍｏｌより大きいか、またはそれに等しい、請求項１０または１３に記載のライブラリー。
【請求項２５】
前記ライブラリーの各々の固体支持体上のＰＮＡダイマーの積載が、１グラムあたり約０．１ｍｍｏｌから１グラムあたり約１ｍｍｏｌの範囲にある、請求項２４に記載のライブラリー。
【請求項２６】
前記ライブラリーの各々の固体支持体上のＰＮＡダイマーの積載が、１グラムあたり約０．１２ｍｍｏｌから１グラムあたり約０．３５ｍｍｏｌの範囲にある、請求項２４に記載のライブラリー。
【請求項２７】
前記支持体のライブラリーが、整列されてアレイを生成する、請求項１０または１３に記載のライブラリー。
【請求項２８】
支持体に結合したＰＮＡダイマーを形成する方法であって：
ａ）第１のＰＮＡモノマーを、立体的に妨害された酸を形成する切断可能なリンカーを含む立体的に妨害された固体支持体に結合する工程であって、ここで、該ＰＮＡモノマーが、Ｎ末端の塩基不安定アミン保護基を含む工程；
ｂ）該固体支持体を必要に応じて洗浄し、過剰の第１のＰＮＡモノマーを除去する工程；
ｃ）該固体支持体を、約１分間〜約２分間の間、該支持体に結合した第１のＰＮＡモノマーから該塩基不安定Ｎ末端アミン保護基を実質的に除去するが、該支持体から第１のＰＮＡモノマーの５０％より多い環化および除去を許容しない脱保護試薬で処理する工程；
ｄ）該固体支持体を洗浄する工程であって、該脱保護試薬を除去する工程；および
ｅ）工程（ｃ）および（ｄ）を実施した後、実用的である限りすぐに、第２のＰＮＡモノマーを、該第１のＰＮＡモノマーのＮ末端アミンに結合する工程、
を包含する、方法。
【請求項２９】
前記第１および第２のＰＮＡモノマーが、同一または異なる核酸塩基を含むＦｍｏｃ（Ｂｈｏｃ）ＰＮＡモノマーである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記第１および第２のＰＮＡモノマーの核酸塩基が、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、５−プロピニル−ウラシル、２−チオ−５−プロピニル−ウラシル、５−メチルシトシン、プソイドイソシトシン、２−チオウラシルおよび２−チオチミン、２−アミノプリン、Ｎ９−（２−アミノ−６−クロロプリン）、Ｎ９−（２，６−ジアミノプリン）、ヒポキサンチン、Ｎ９−（７−デアザ−グアニン）、Ｎ９−（７−デアザ−８−アザ−グアニン）およびＮ８−（７−デアザ−８−アザ−アデニン）からなる群から独立に選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記Ｎ末端の塩基不安定保護基が、Ｆｍｏｃである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記脱保護試薬が、有機溶媒中約１５〜約２５％のピペリジンを含む溶液である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記脱保護試薬が、Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の２０％ピペリジンである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記脱保護試薬が、ＮＭＰ中に約０．２％〜約４％（ｖ／ｖ）ＤＢＵを含む溶液である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
前記脱保護試薬が、ＮＭＰ中の約２％ＤＢＵである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記立体的に妨害された固体支持体が、トリチルクロライド樹脂（トリチル−Ｃｌ）、２−クロロトリチルクロライド樹脂、ＤＨＰＰ、ＭＢＨＡ、４−メチルトリチルクロライド樹脂、４−メトキシトリチルクロライド樹脂、ヒドロキシ−（２−クロロフェニル）メチル−ＰＳ、Ｒｉｎｋ酸樹脂およびＮｏｖａＳｙｎ ＴＧＴアルコール樹脂からなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３７】
前記立体的に妨害された固体支持体が、トリチルクロライド（トリチル−Ｃｌ）樹脂である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３８】
前記固体支持体上のＰＮＡダイマーの最終積載が、１グラムあたり０．０８ｍｍｏｌより大きいか、またはそれに等しい、請求項２８に記載の方法。
【請求項３９】
前記固体支持体上のＰＮＡダイマーの最終積載が、１グラムあたり約０．１ｍｍｏｌから１グラムあたり約１ｍｍｏｌの範囲にある、請求項２８に記載の方法。
【請求項４０】
前記固体支持体上のＰＮＡダイマーの最終積載が、１グラムあたり約０．１２ｍｍｏｌから１グラムあたり約０．３５ｍｍｏｌの範囲にある、請求項２８に記載の方法。
【請求項４１】
支持体に結合したＰＮＡダイマーを形成する方法であって：
ａ）第１のＰＮＡモノマーを、酸を形成する切断可能なリンカーを含む固体支持体に結合する工程であって、ここで、該ＰＮＡモノマーが、酸不安定Ｎ末端保護基を含む工程；
ｂ）該固体支持体を必要に応じて洗浄し、過剰の第１のＰＮＡモノマーを除去する工程；
ｃ）該固体支持体を、該酸不安定Ｎ末端保護基を脱保護する酸性条件下、脱保護試薬で処理する工程；
ｄ）該固体支持体を洗浄して該脱保護試薬を除去する工程；および
ｅ）第２のＰＮＡモノマーを、該第１のＰＮＡモノマーのＮ末端アミンに結合する工程、を包含し、
ここで、該固体支持体上のＰＮＡダイマーの最終積載が、１グラムあたり０．０８ｍｍｏｌより大きいか、またはそれに等しい、方法。
【請求項４２】
前記第１および第２のＰＮＡモノマーが、同一または異なる核酸塩基を含むｔ−ｂｏｃ／Ｚ保護ＰＮＡモノマーである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記第１および第２のＰＮＡモノマーが、同一または異なる核酸塩基を含むＭｍｔ／Ｂｈｏｃ保護ＰＮＡモノマーである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記第１のＰＮＡモノマーが、Ｍｍｔ／Ｂｈｏｃ保護ＰＮＡモノマーであり、そして前記第２のＰＮＡモノマーが、Ｆｍｏｃ／Ｂｈｏｃ保護ＰＮＡモノマーである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
前記第１および第２のＰＮＡモノマーの核酸塩基が、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、５−プロピニル−ウラシル、２−チオ−５−プロピニル−ウラシル、５−メチルシトシン、プソイドイソシトシン、２−チオウラシルおよび２−チオチミン、２−アミノプリン、Ｎ９−（２−アミノ−６−クロロプリン）、Ｎ９−（２，６−ジアミノプリン）、ヒポキサンチン、Ｎ９−（７−デアザ−グアニン）、Ｎ９−（７−デアザ−８−アザ−グアニン）およびＮ８−（７−デアザ−８−アザ−アデニン）からなる群から独立に選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４６】
前記第１のＰＮＡモノマーが、Ｍｍｔ／Ｂｈｏｃ保護ＰＮＡモノマーであり、そして前記脱保護試薬が、有機溶媒中の約１〜約５％（ｖ／ｖ）のジクロロ酢酸を含む溶液である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４７】
前記脱保護試薬が、ジクロロメタン（ＤＣＭ）中の約２％のジクロロ酢酸である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記固体支持体が、トリチルクロライド樹脂（トリチル−Ｃｌ）、２−クロロトリチルクロライド樹脂、ＤＨＰＰ、ＭＢＨＡ、４−メチルトリチルクロライド樹脂、４−メトキシトリチルクロライド樹脂、ヒドロキシ−（２−クロロフェニル）メチル−ＰＳ、Ｒｉｎｋ酸樹脂およびＮｏｖａＳｙｎ ＴＧＴアルコール樹脂からなる群から選択される立体的に妨害された固体支持体である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４９】
前記固体支持体が、Ｆｍｏｃ−ＰＡＬ−ＰＥＧ−ＰＳ、ＮｏｖａＳｙｎ ＴＧＡおよびＷａｎｇ樹脂からなる群から選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項５０】
前記固体支持体上のＰＮＡダイマーの最終積載が、１グラムあたり約０．１ｍｍｏｌ〜１グラムあたり約１．２ｍｍｏｌの範囲内にある、請求項４１に記載の方法。
【請求項５１】
前記固体支持体上のＰＮＡダイマーの最終積載が、１グラムあたり約０．１２ｍｍｏｌ〜１グラムあたり約０．３５ｍｍｏｌの範囲内にある、請求項４１に記載の方法。
【請求項５２】
Ｃ末端ＰＮＡサブユニットおよび蛍光標識またはクエンチャーを含む、ＰＮＡ Ｃ末端酸オリゴマー。
【請求項５３】
前記蛍光標識が、色素１または色素２である、請求項５２に記載のＰＮＡオリゴマー。
【請求項５４】
前記クエンチャー成分が、ダブシルである、請求項５２に記載のＰＮＡオリゴマー。
【請求項５５】
前記ＰＮＡオリゴマーは、長さが１０ ＰＮＡサブユニット以下である、請求項５２に記載のＰＮＡオリゴマー。
【請求項５６】
前記ＰＮＡオリゴマーは、長さが約３〜約８サブユニットである、請求項５２に記載のＰＮＡオリゴマー。
【請求項５７】
前記ＰＮＡオリゴマーは、長さが約４〜約６サブユニットである、請求項５２に記載のＰＮＡオリゴマー。
【請求項５８】
前記ＰＮＡオリゴマーは、長さが４サブユニットである、請求項５２に記載のＰＮＡオリゴマー。
【請求項５９】
前記ＰＮＡオリゴマーは、長さが５サブユニットである、請求項５２に記載のＰＮＡオリゴマー。
【請求項６０】
前記標識が、前記ＰＮＡオリゴマーのＮ末端サブユニットに連結される、請求項５２に記載のＰＮＡオリゴマー。
【請求項６１】
前記標識が、前記ＰＮＡオリゴマーのＮ末端アミンに連結される、請求項５２に記載のＰＮＡオリゴマー。
【請求項６２】
前記オリゴマーの核酸塩基が、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、５−プロピニル−ウラシル、２−チオ−５−プロピニル−ウラシル、５−メチルシトシン、プソイドイソシトシン、２−チオウラシルおよび２−チオチミン、２−アミノプリン、Ｎ９−（２−アミノ−６−クロロプリン）、Ｎ９−（２，６−ジアミノプリン）、ヒポキサンチン、Ｎ９−（７−デアザ−グアニン）、Ｎ９−（７−デアザ−８−アザ−グアニン）およびＮ８−（７−デアザ−８−アザ−アデニン）からなる群から選択される、請求項５２に記載のＰＮＡオリゴマー。
【請求項６３】
ＰＮＡ Ｃ末端酸オリゴマーのライブラリーであって、該ライブラリーの各々のＰＮＡオリゴマーが：
ａ）核酸塩基配列；
ｂ）Ｃ末端ＰＮＡサブユニット；および
ｃ）蛍光標識またはクエンチャー成分；
を含み、
ここで、ＰＮＡオリゴマーの各々が、該ライブラリーの他のＰＮＡオリゴマーの各々とは、標識、核酸塩基配列、サブユニット長さまたは核酸塩基配列の極性のいずれかが異なる、ライブラリー。
【請求項６４】
前記ＰＮＡオリゴマーの各々の核酸塩基が、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、５−プロピニル−ウラシル、２−チオ−５−プロピニル−ウラシル、５−メチルシトシン、プソイドイソシトシン、２−チオウラシルおよび２−チオチミン、２−アミノプリン、Ｎ９−（２−アミノ−６−クロロプリン）、Ｎ９−（２，６−ジアミノプリン）、ヒポキサンチン、Ｎ９−（７−デアザ−グアニン）、Ｎ９−（７−デアザ−８−アザ−グアニン）およびＮ８−（７−デアザ−８−アザ−アデニン）からなる群から選択される、請求項６３に記載のライブラリー。
【請求項６５】
前記ＰＮＡオリゴマーの各々の蛍光標識またはクエンチャーが、Ｎ末端サブユニットに連結されている、請求項６３に記載のライブラリー。
【請求項６６】
前記ＰＮＡオリゴマーの各々の蛍光標識またはクエンチャーが、Ｎ末端アミンに連結されている、請求項６３に記載のライブラリー。
【請求項６７】
前記ライブラリーのＰＮＡオリゴマーの各々が、同じ数のＰＮＡサブユニットを含む、請求項６３に記載のライブラリー。
【請求項６８】
前記ライブラリーのＰＮＡオリゴマーの少なくとも１つが、該ライブラリーの他の少なくとも１つのＰＮＡオリゴマーと比較した場合に異なる数のＰＮＡサブユニットを含む、請求項６３に記載のライブラリー。
【請求項６９】
前記ライブラリーのＰＮＡオリゴマーの各々が、約３〜約８個のＰＮＡサブユニットを含む、請求項６３に記載のライブラリー。
【請求項７０】
前記ライブラリーのＰＮＡオリゴマーの各々が、約４〜約６個のＰＮＡサブユニットを含む、請求項６３に記載のライブラリー。
【請求項７１】
前記ライブラリーのＰＮＡオリゴマーの各々が、４個のＰＮＡサブユニットを含む、請求項６３に記載のライブラリー。
【請求項７２】
前記ライブラリーのＰＮＡオリゴマーの各々が、５個のＰＮＡサブユニットを含む、請求項６３に記載のライブラリー。
【請求項７３】
前記ライブラリーが、少なくとも２つのセットのＰＮＡ Ｃ末端酸オリゴマーを含み、ここで、該各セットのＰＮＡオリゴマーが、主に、蛍光標識の性質において、他のセットのＰＮＡオリゴマーと異なる、請求項６３に記載のライブラリー。
【請求項７４】
前記第１のセットのＰＮＡ Ｃ末端酸オリゴマーが、色素１で標識され、そして前記第２のセットのＰＮＡ Ｃ末端酸オリゴマーが、色素２で標識される、請求項７３に記載のライブラリー。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２００６−５１７３８６（Ｐ２００６−５１７３８６Ａ）
【公表日】平成１８年７月２７日（２００６．７．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５３４７４９（Ｐ２００４−５３４７４９）
【出願日】平成１５年９月５日（２００３．９．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０２８０８７
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０２２５７８
【国際公開日】平成１６年３月１８日（２００４．３．１８）
【出願人】（５０３２２９７４２）アプレラ コーポレイション (8)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年７月２７日（２００６．７．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年９月５日（２００３．９．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０２８０８７
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０２２５７８
【国際公開日】平成１６年３月１８日（２００４．３．１８）
【出願人】（５０３２２９７４２）アプレラ コーポレイション (8)
【Ｆターム（参考）】
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