ＰＰＡＲδ活性化剤およびＰＰＡＲδ活性化剤の製造方法
【課題】ペルオキシゾーム増殖活性化受容体δ（ＰＰＡＲδ）を活性化し、肥満抑制、内蔵脂肪蓄積予防、インスリン抵抗性の予防・改善、赤筋増加による持久力の向上、抗炎症作用、皮膚炎治療などの効果が期待できるＰＰＡＲδ活性化剤、および該活性化剤の製造方法の提供。
【解決手段】０℃以上１０℃以下の温度において馴化されたエノキタケの子実体の抽出物を含有するＰＰＡＲδ活性化剤、およびエノキタケの子実体を０℃以上１０℃以下の温度で馴化する馴化工程と、前記馴化したエノキタケの子実体から低極性有機溶媒で抽出することによるＰＰＡＲδ活性化剤の製造方法。
【解決手段】０℃以上１０℃以下の温度において馴化されたエノキタケの子実体の抽出物を含有するＰＰＡＲδ活性化剤、およびエノキタケの子実体を０℃以上１０℃以下の温度で馴化する馴化工程と、前記馴化したエノキタケの子実体から低極性有機溶媒で抽出することによるＰＰＡＲδ活性化剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペルオキシゾーム増殖活性化受容体（Peroxisome proliferator-activated receptor。以下、単に、ＰＰＡＲともいう）のうちのＰＰＡＲδタイプを活性化するＰＰＡＲδ活性化剤およびＰＰＡＲδ活性化剤の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＰＡＲは、細胞内小器官であるペルオキシソームを増加させる作用を有する核内受容体の一種であり、ＰＰＡＲα、δ、γの３つのタイプに分類される。
ＰＰＡＲの各タイプは、９−シスレチノイン酸をリガンドとするレチノイドＸ受容体と二量体を形成することで、遺伝子上のＰＰＡＲ応答領域に結合して、種々の遺伝子発現を制御することが知られている。
このようにＰＰＡＲが構造変化することで遺伝子への作用が可能になることをＰＰＡＲの活性化という。
【０００３】
ＰＰＡＲの中でもＰＰＡＲδは、脂肪酸代謝の制御、インスリン感受性の増加、炎症性タンパクの発現の抑制あるいは表皮細胞分化などに関与していることが知られている。
すなわち、ＰＰＡＲδの活性化により、肥満抑制、内蔵脂肪蓄積予防、インスリン抵抗性の予防・改善、赤筋増加による持久力の向上、抗炎症作用、皮膚炎治療などの作用が期待できる。
【０００４】
このようなＰＰＡＲδの活性化剤としては、各種知られている。例えば、特許文献１には、甜菜、クマザサ、ショウガなど各種植物の乾燥粉末からの抽出物を有効成分として含むＰＰＡＲ活性化剤が開示されている。
また、特許文献２には醤油粕からの抽出物を含むＰＰＡＲδ活性剤が開示されている。
特許文献３には酒粕からの抽出物を含むＰＰＡＲδ活性剤が開示されている。
【０００５】
一方、従来から菌類の一種であるエノキダケ（Flammulina velutipes（Curt.:Fr.）Sing）には、肝機能の保護・改善成分、γ−アミノ酪酸、抗高血圧症成分などが含まれていることが下記特許文献４〜７に開示されている。エノキダケは安価で入手しやすく、且つ安全性の高い材料であるため、エノキダケから各種有効成分を抽出することで、安価で安全にこれらの有効成分が得られるという利点がある。
しかし、エノキダケにＰＰＡＲδ活性化成分が含まれていることは知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１０−１０６００１号公報
【特許文献２】特開２００９−２４２３８２号公報
【特許文献３】特開２００９−２３５０６８号公報
【特許文献４】特開２０１１−８４５３７号公報
【特許文献５】特開２００４−３０７４５３号公報
【特許文献６】特開２００４−８９１２８号公報
【特許文献７】特開２００９−３９０８２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上記のような点に鑑み、ＰＰＡＲδを活性化しうるＰＰＡＲδ活性化剤を安価で安全な原料であるエノキタケから得ることを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、このような課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、エノキタケの子実体を低温で馴化したものにＰＰＡＲδ活性化作用があることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明の係るＰＰＡＲδ活性化剤は、０℃以上１０℃以下の温度において馴化されたエノキタケの子実体の抽出物を含有することを特徴とする。
【００１０】
０℃以上１０℃以下の温度で馴化されたエノキタケは子実体の抽出物は、ＰＰＡＲδに対する活性を示す。
尚、本発明における「馴化」とは、所定の温度、湿度環境下に試料を１２時間以上静置することをいう。
【００１１】
本発明において、前記抽出物が、前記馴化されたエノキタケの子実体を水に浸漬した後に、低極性有機溶媒で抽出されたものであることが好ましい。
【００１２】
前記温度で馴化されたエノキタケをその後水に浸漬した後、該エノキタケから得られた抽出物は、ＰＰＡＲδ活性が向上する。
尚、本発明において浸漬工程で用いる水とは、０℃を超えて４℃の水をいい、純水に限らず、水道水などの上水、地下水などの天然水なども含み、且つ、ｐＨ調整剤などの各種添加物を含む水溶液をも含む。
また、浸漬とは、エノキタケの子実体を水中に存在させるようにすることをいう。
さらに、本発明において低極性溶媒とは、ヘキサン、ヘプタンなどの脂肪族炭化水素系溶媒や、ベンゼン、トルエンなどの芳香族炭化水素系溶媒や、シクロヘキサン、シクロヘプタンなどの脂環式炭化水素系溶媒をいう。
【００１３】
また、本発明に係るＰＰＡＲδ活性化剤の製造方法は、エノキタケの子実体を０℃以上１０℃以下の温度で馴化する馴化工程と、前記馴化したエノキタケの子実体から低極性有機溶媒で抽出物を抽出する抽出工程とを実施することを特徴とする。
【００１４】
本発明において、前記馴化工程の後に、エノキタケの子実体を０℃以上１０℃以下の水に浸漬する浸漬工程を実施し、その後前記抽出工程を実施することが好ましい。
【００１５】
本発明において、前記浸漬工程を１０分以上１２０時間以下で行うことが好ましい。
【００１６】
前記浸漬工程を前記時間の範囲で行った場合には、ＰＰＡＲδ活性がより向上する。
【００１７】
本発明において、前記浸漬工程をｐＨ４以上１０以下で行うことが好ましい。
【００１８】
前記浸漬工程を前記ｐＨの範囲で行った場合には、ＰＰＡＲδ活性がより向上する。
【発明の効果】
【００１９】
ＰＰＡＲδを活性化しうるＰＰＡＲδ活性化剤を安価で安全性の高いエノキタケから得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】実施例における子実体の酢酸エチル、ヘキサン抽出液、および菌糸体酢酸エチル抽出液のＴＬＣ法による分離プレートを示す図。
【図２】実施例における子実体の酢酸エチル、ヘキサン抽出液、および菌糸体酢酸エチル抽出液のＴＬＣ法による分離プレートを示す図。
【図３】実施例における子実体のヘキサン抽出液のＴＬＣ法による分離プレートを示す図。
【図４】実施例における子実体のヘキサン抽出液のＡＰＣＩ−ＭＳＭＳによる分析チャートを示す図。
【図５】実施例における子実体のヘキサン抽出液の遺伝子発現レベルを示すグラフ。
【図６】実施例における子実体のヘキサン抽出液の遺伝子発現レベルを示すグラフ。
【図７】実施例における子実体のヘキサン抽出液の遺伝子発現レベルの濃度による影響を示すグラフ。
【図８】実施例における子実体のヘキサン抽出液の遺伝子発現レベルの浸漬処理の時間による影響を示すグラフ。
【図９】実施例における子実体のヘキサン抽出液の遺伝子発現レベルの浸漬処理の浸漬水のｐＨによる影響を示すグラフ。
【図１０】実施例における子実体のヘキサン抽出液の遺伝子発現レベルの浸漬処理の温度による影響を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本実施形態のＰＰＡＲδ活性化剤は、０℃以上１０℃以下の温度において馴化されたエノキタケの子実体の抽出物を含有するものである。
【００２２】
本実施形態のＰＰＡＲδ活性剤の材料としてはエノキタケ（Flammulina velutipes（Curt.:Fr.）Sing）の茎部分と傘部分とからなる子実体の部分が用いられる。
エノキタケは、天然のものあるいは人工栽培したものいずれであってもよく、その産地等も問わない。
【００２３】
前記子実体は、０℃以上１０℃以下の温度において馴化された後に、そのままの状態であるいは凍結乾燥など乾燥物として用いられる。
【００２４】
馴化された前記子実体は、さらに、後述するような方法によって水に浸漬されたものであってもよい。
【００２５】
本実施形態のＰＰＡＲδ活性化剤は前記子実体から抽出された抽出物を含有する。
抽出物は、例えば、前記子実体を溶媒中に浸漬後、遠心分離、ろ過、デカンテーションなどの公知の適宜の方法で上清と沈殿物とに分離し、得られた上清のヘキサンなどの溶媒画分を分離することにより得られる。
【００２６】
前記抽出物は、スフィンゴ脂質を含んでいると考えられる。スフィンゴ脂質はスフィンゴ骨格を有する脂質の総称である。
スフィンゴ脂質には、基本構造に糖がグリコシド結合されたスフィンゴ糖脂質と、リン酸基が結合されたスフィンゴリン脂質とがあるが、前記抽出物にはスフィンゴ糖脂質が含まれていると考えられる。
【００２７】
前記抽出物は、そのままＰＰＡＲδ活性化剤として用いてもよく、あるいは、公知の精製方法で精製を行ってもよい。
さらに、精製後、適切な溶剤で希釈した希釈液、濃縮した濃縮液、乾燥粉末等の粉状体、あるいはペースト状など種々の形状に形成してもよい。
【００２８】
本実施形態のＰＰＡＲδ活性化剤は、ＰＰＡＲの３タイプＰＰＡＲα、ＰＰＡＲδ、ＰＰＲＡβのうちのＰＰＡＲδを活性化（遺伝子上のＰＰＡＲ応答領域に結合して、種々の遺伝子発現を制御可能な状態）にして、ＰＰＡＲδに依存的な遺伝子の転写活性を亢進する作用を有する。
前記のとおりＰＰＡＲδは、脂肪酸代謝の制御、インスリン感受性の増加、炎症性タンパクの発現の抑制あるいは表皮細胞分化などに関与していることから、本実施形態のＰＰＡＲδ活性化剤により、肥満抑制、内蔵脂肪蓄積予防、インスリン抵抗性の予防・改善、赤筋増加による持久力の向上、抗炎症作用、皮膚炎治療などの作用が期待できる。
従って、本実施形態のＰＰＡＲδ活性化剤は、機能性食品、病者用食品、特定保健用食品等のヒト若しくは動物用の食品、医薬品又は医薬部外品、化粧品など各種製品に応用しうる。
【００２９】
次に、本実施形態のＰＰＡＲδ活性剤の製造方法について説明する。
本実施形態のＰＰＡＲδ活性剤の製造方法は、エノキタケの子実体を０℃以上１０℃以下の温度で馴化する馴化工程と、前記馴化したエノキタケの子実体から低極性有機溶媒で抽出物を抽出する抽出工程とを実施する。
【００３０】
（馴化工程）
前記のようなエノキタエケの子実体を０℃以上１０℃以下、好ましくは、２℃以上７℃以下の温度で好気の条件下に、１２時間から１６８時間、好ましくは１５時間から３０時間静置する馴化工程を実施する。
馴化されたエノキタケ子実体から抽出される抽出物はＰＰＡＲδ活性を示すようになる。
【００３１】
（凍結乾燥工程）
本実施形態においては、前記馴化工程を実施した後のエノキタケの子実体を凍結乾燥する工程を実施してもよい。
かかる凍結乾燥工程は、被処理物を氷点下で凍結させた後、真空または減圧下で凍結した水分を加熱、昇華させることで被処理物を乾燥させるいわゆるフリーズドライ方法で行うことができる。
凍結乾燥に用いる装置としては、公知の凍結乾燥装置を用いることができる。また、凍結乾燥条件としては、特に限定されるものではないが、例えば、−４０℃〜−５０℃の温度条件で２４時間〜４８時間程度で凍結乾燥を行うことが好ましい。
【００３２】
（浸漬工程）
本実施形態のＰＰＡＲδ活性剤の製造方法においては、前記馴化工程の後に、エノキタケ子実体を０℃以上１０℃以下の水に浸漬する浸漬工程を実施してもよい。
【００３３】
浸漬工程では、前記馴化工程で馴化されたエノキタケ子実体を水中に浸漬して、好ましくは、５分以上１０日以内、好ましくは１０分以上５日（１２０時間）以内、さらに好ましくは１日以上６日以内、静置する。
馴化されたエノキタケ子実体を水に浸漬することで前記抽出物のＰＰＡＲδ活性がさらに向上する。
【００３４】
本実施形態の浸漬工程において、水のｐＨをｐＨ４以上１０以下で、好ましくはｐＨ４以上６以下に調整して、該ｐＨ調整水に前記エノキタケ子実体を浸漬することで、さらなるＰＰＡＲδ活性の向上が認められる。
ｐＨ調整剤としては例えば塩酸等を用いることが好ましい。
【００３５】
（抽出工程）
前記のような各工程を実施した後、エノキダケの子実体を低極性有機溶媒で処理して抽出物を抽出する抽出工程を実施する。
低極性有機溶媒としては、ヘキサン、クロロホルム等の中から任意の有機溶媒を用いることができるが、ヘキサンを用いることが食品利用の観点から好ましい。
【００３６】
本実施形態の抽出工程では公知の抽出方法を採用することができるが、例えば、以下のような抽出方法で実施することができる。
まず、前記低極性有機溶媒としてのヘキサンの中に前記エノキタケの子実体の粉末を懸濁した懸濁液を所定時間、例えば、８時間から１５時間程度静置した後に濾紙などで濾過した濾液を蒸発乾固する。さらに、ヘキサンで再懸濁して純水と混合してから遠心分離後、ヘキサン層を回収する。このヘキサン層をさらに純水と混合して遠心分離する処理を５回程度繰り返すことで回収したヘキサン相を蒸発乾固することで抽出物を得ることができる。
【実施例】
【００３７】
以下に、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
【００３８】
（抽出物の分析１）
エノキタケの子実体および菌糸体を４℃で２４時間馴化させた後、凍結乾燥させた粉末をそれぞれ１０ｇずつ試料とした。
前記各試料を、酢酸エチル５００ｍｌに懸濁した懸濁液を４℃で一晩（１６時間）静置した。前記懸濁液を濾紙（Ｎｏ.１、ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）で濾過し、該濾液を４０℃でエバポレーターにかけて蒸発乾固させた。
乾固させた試料を酢酸エチル１ｍｌで再懸濁し、０．２μｍフィルター（材質ＰＴＦＥ、ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）で濾過し、固体成分（子実体または菌糸体の粉末）を完全に除去した液体を得た。尚、以下、子実体から得られた抽出液を「子実体酢酸エチル抽出液」、菌糸体から得られた抽出液を「菌糸体酢酸エチル抽出液」という。
さらに、前記と同様に、エノキタケの子実体のみ、ヘキサンを用いて抽出した液を「子実体ヘキサン抽出液」として得た。
【００３９】
前記子実体酢酸エチル抽出液、菌糸体酢酸エチル抽出液および子実体ヘキサン抽出液を以下のような条件で薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を用いて分離した。
展開溶媒：クロロホルム：メタノール ９：１（体積比）
発色試薬：モリブデン酸アンモニウム−過塩素酸試薬（１２質量％モリブデン酸アンモニウム水溶液Ａ、１Ｍ塩酸Ｂ、６０質量％過塩素酸Ｃを、質量比Ａ：Ｂ：Ｃ＝５：６：３で混合したもの。）
ヨウ素試薬（和光純薬社製）。
使用ＴＬＣプレート：Silica gel F254（メルク社製）
【００４０】
前記各抽出液を分離したプレートに前記モリブデン酸アンモニウム試薬を噴霧して、１０５℃で１０分間加熱した結果を図１に示す。
さらに同様に抽出液を分離したプレートを前記ヨウ素試薬を充満させた密閉容器中に入れて１０分間放置した結果を図２に示す。
【００４１】
図１および図２に示す１は子実体酢酸エチル抽出液、２は子実体ヘキサン抽出液、３は菌糸体酢酸エチル抽出液を示す。
図１に示すように、子実体酢酸エチル抽出１および子実体ヘキサン抽出液２は同じスポットＲｆ値０．６０に呈色を示したが、菌糸体酢酸エチル抽出液３では非常に薄くしか呈色を示さなかった。
モリブデン酸アンモニウム試薬は脂質の検出が可能であり、以上より、前記子実体からの抽出物中には脂質が含まれていることがわかった。
【００４２】
また、図２に示すように、子実体酢酸エチル抽出１および子実体ヘキサン抽出液２は同じスポットＲｆ値０．６０に呈色を示したが、菌糸体酢酸エチル抽出液３ではほとんど呈色を示さなかった。
ヨウ素反応では不飽和化合物の検出が可能であり、以上より、前記子実体からの抽出物中には不飽和化合物が含まれていることがわかった。
すなわち、子実体からの抽出物には不飽和脂肪酸が含まれていることがわかった。
【００４３】
（抽出物の分析２）
子実体からの抽出物をさらに詳細に分析するために以下のような分析を行った。
エノキタケの子実体を４℃で１６時間馴化させた後凍結乾燥させた粉末１ｇを４０ｍｌの超純水（常温２０℃）に懸濁して１０分間浸漬させた懸濁液と、前記馴化させた後凍結乾燥させた粉末１ｇを４０ｍｌの超純水で１０分間煮沸処理した懸濁液とをそれぞれ遠心分離（１００００×ｇ、４℃、１５分）したものを試料とした。
前記各試料を用いて前記抽出物の分析１と同様にヘキサン抽出液を得た。
【００４４】
前記各抽出液を以下のような条件で薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を用いて分離した。
展開溶媒：クロロホルム：メタノール：酢酸 ９０：１０：２（体積比）
発色試薬：Dittmer試薬（4%三酸化モリブデン・25N硫酸）
ニンヒドリン試薬（0.2%ニンヒドリン・無水エタノール溶液）
使用ＴＬＣプレート：Silica gel F254（メルク社製）
【００４５】
前記各抽出液を分離したプレートに前記Dittmer試薬およびニンヒドリン試薬を噴霧し、１２０℃で数分間加熱したところ、常温水に浸漬後の子実体からの抽出物および熱水に浸漬後の子実体からの抽出物いずれも呈色しなかった。
前記ニンヒドリン試薬はアミノ酸の検出が可能であり、Dittmer試薬はリン酸の検出が可能である。
従って、子実体からの抽出物にはアミノ酸、リン酸は含まれていないことがわかった。
さらに、前記常温水に浸漬後の子実体からの抽出物および煮沸後の子実体からの抽出物を前記と同様に分離したプレートに前記Dittmer試薬を噴霧して、１２０℃で数分間
加熱した結果を図３に示す。
図３の１は常温水に浸漬後の子実体からの抽出物、２は熱水に浸漬後の子実体からの抽出物を示す。
図３からあきらかなように、熱水に浸漬後の子実体からの抽出物には、前記分析１で分析されたリン脂質は含まれていないことがわかる。
【００４６】
（抽出物のＡＰＣＩ−ＭＳＭＳによる分析）
エノキタケの子実体を４℃で１６時間馴化させた後凍結乾燥させた粉末１ｇを４０ｍｌの超純水（常温２０℃）に懸濁して１０分間浸漬させた懸濁液を、弱アルカリ処理（０．１ＭのＮａＯＨ溶液で、１００℃、３０分間処理）した後、前記分析１と同様の手法および条件でＴＬＣを行い、ＴＬＣで分離されたＲｆ０．６０の画分を採取して得た試料を用いて、大気圧化学イオン化−質量分析計（ＡＰＣＩ−ＭＳＭＳ）で以下の条件で分子量を測定した結果を図４に示す。
使用装置：Applied Biosystem API-3000
測定条件：移動相１％ギ酸超純水溶液と１％ギ酸アセトニトリル溶液を１：１に混合して１ｍｌ／ｍｌの流速で、Ｐｏｓｉｔｉｖｅ（Ｍ＋１）で分析した。
【００４７】
図４に示すように試料中には分子量８７８．２の位置にピークを示した。
かかる位置にピークを示していることから、抽出物はスフィンゴ脂質の主構造であるスフィンゴ骨格を含むことがわかった。
【００４８】
以上の各分析結果より、４℃で馴化したエノキタケの子実体から抽出される抽出物には不飽和脂肪酸を持ったスフィンゴ脂質構造を備える脂質および、リン酸、アミノ酸を含まないことが判った。
【００４９】
（遺伝子発現レベル）
レポーター遺伝子アッセイによる遺伝子発現レベルを試験した。
レポーター遺伝子アッセイは、対象とする遺伝子の発現変化を転写レベルで分析する方法であり、目的遺伝子の転写調節領域の下流にレポーターとしてルシフェラーゼ遺伝子を組み込んだプラスミドを作成し、そのプラスミドを導入した細胞の酵素活性（生物化学発光）を測定する方法である。
【００５０】
（１）馴化による遺伝子発現レベルへの影響
ａ）試料
エノキタケの子実体（馴化なし）を凍結乾燥させた粉末と、前記分析１で使用した馴化したエノキタケの子実体を凍結乾燥させた粉末とを各１ｇずつ、ヘキサン３０ｍｌに懸濁して、該懸濁液を４℃で一晩（１６時間）静置した。該懸濁液を濾紙（Ｎｏ.１、ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）で濾過した濾液をＮ2によって蒸発乾固させた。
この蒸発乾固試料をヘキサンで再度懸濁し等量の純水を加えて転倒混和し遠心分離（１０００×ｇ、４℃、５分）した。
ヘキサン層を回収した後、さらに超純水を加えて遠心分離（１０００×ｇ、４℃、５分）した。この操作を５回繰り返し、回収したヘキサン層をＮ2によって蒸発乾固させた。
【００５１】
ｂ）試薬等
使用細胞：ヒト培養細胞Hek 293（医薬基研究所製 代謝疾患タンパク検索プロジェクト）
培地：Dubeco's Modified Eagle's Medium（1000mg，グルコース、Ｌ−グルタミン酸、ＮａＯＣＯ3、pyridoxine HCL（SIGMA社製）、以下、ＤＭＥＭという。）
ＰＭプラスミド：pRL-TK（Int-） （Promega社；内部標準） ３０ｎｇ、pTAL-5XGAL4（J Biol Chem. 2002 May 3;277（18）:15629-37 に記載のもの） １５０ｎｇ、pM-hPPARd ５０ｎｇ、または、空ＶｅｃｔｏｒのＰＭ（Clontech社）５０ｎｇを６０ｕｌのＤＭＥＭの無血清培地／１−ｗｅｌｌになるように調整し、Lipofectamine2000を０．５ｕｌ／ｗｅｌｌで導入したもの。
プロモーター：ＴＫプロモーター
装置：ルミノメーター（ＴＯＹＯＢＯ社製）
【００５２】
ｃ）遺伝子導入
２４穴細胞培養プレートに前記ヒト培養細胞を培養し、１．５ｍｌエッペンドルフチューブに１ウエルにつきＤＭＥＭ（−血清）１００μｌ、SV40-rLuc１００ｎｇ、GAL4-TAL１５０ｎｇ、比較する遺伝子を含まないプラスミドとしての前記ＰＭ５０ｎｇ、Lipofrctamine（invitorogen））０．５μｌとなるように混合した混合物を得た。
対象の受容体ＰＰＡＲδおよび、比較する受容体としてＬＸＲ（肝臓Ｘレセプター）、ＦＸＲ（Farnesoid X受容体）、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγの５種類の受容体に対応する遺伝子活性を測定するために、前記ＰＭを、ＬＸＲ、ＦＸＲ、ＰＰＡＲδ、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγに変えてそれぞれ同様の操作を行い６種類の遺伝子導入混合物を作製した。
前記培養細胞の培地を捨てて、新しいＤＭＥＭ（−血清）で洗浄し、さらに２５０μｌのＤＭＥＭ（−血清）を追加した。
前記各遺伝子導入混合物１種類を５０μｌずつ４ウエルに分けた。ＣＯ2インキュベータ（３７℃、５％ＣＯ2気流下）内で３時間培養後、培地をすててＤＭＥＭ（＋血清）を２５０μｌ添加し、さらにＣＯ2インキュベータ（３７℃、５％ＣＯ2気流下）内で２４時間培養した。
【００５３】
ｄ）試料添加
前記各試料をジメチルスルホキシドに溶かして１０ｍｇ／ｍｌとした。
各試料およびブランクとしてのジメチルスルホキシド１８μｌをＤＭＥＭ（＋血清）６μｌに混合した。これらを前記遺伝子導入された培養細胞が入った各ウエルに４５０μｌずつ添加し、ＣＯ2インキュベータ（３７℃、５％ＣＯ2気流下）内で一晩（１６時間）培養した。
【００５４】
ｅ）光度測定
前記インキュベータから取り出した細胞をＰＢＳ（リン酸ナトリウム緩衝液）で洗浄して蒸留水で５倍希釈したLysisバッファー（Progma社製）を１ウエルに７５μｌずつ添加して、１０分間振とうし、細胞を分離させた。
さらに、９６穴プレートに分離させた細胞液を１０μｌ、発光基質を添加したルシフェラーゼアッセイバッファー（Progma社製）５０μｌ、Ｓｔｏｐ＆Ｇｌｏバッファー（Progma社製）４５μｌを加え、GLOMAX MULTI DETECTION SYSTEMのDual-Luciferase Reporter Assey systemのプロトコールに従い光度を測定した。
【００５５】
ｆ）遺伝子発現レベル
前記光度から各試料についてＬＸＲ／ＰＭ、ＦＸＲ／ＰＭ、ＰＰＡＲδ／ＰＭ、ＰＰＡＲα／ＰＭ、ＰＰＡＲγ／ＰＭを算出した値をブランクの値で割った値を遺伝子活性を示す相対活性として図５に示した。
【００５６】
図５から、４℃で馴化したエノキタケの子実体からの抽出物は、ＰＰＡＲδの活性に特化していることがわかった。
【００５７】
（２）浸漬処理による遺伝子発現レベルへの影響
試料として４℃で２４時間馴化したエノキタケの子実体の凍結乾燥粉末と、前記と同様の馴化後凍結乾燥させた粉末を７日間常温の超純水（２０℃）に浸漬させた懸濁液とを用いて、前記「（１）馴化による遺伝子発現レベルへの影響」と同様の手順で相対活性を試験した結果を図６に示す。
【００５８】
図６から、浸漬処理を行ったエノキタケの子実体からの抽出物は、浸漬処理を行なわなかった子実体の抽出物に比してＰＰＡＲδ活性が２倍以上向上していたことがわかった。
【００５９】
（３）濃度による遺伝子発現レベルへの影響
前記「（２）浸漬処理による遺伝子発現レベルへの影響」で用いた各子実体で、濃度による相対活性の変化を試験した。
各子実体の抽出物は無希釈、３倍、１０倍、３０倍、１００倍、３００倍にＤＭＳＯで希釈して、図中の最終添加濃度となるように調製した。前記「（１）馴化による遺伝子発現レベルへの影響」と同様の手順で相対活性を試験した結果を図７に示す。
【００６０】
図７からは、浸漬処理を行ったエノキタケの子実体抽出物では、希釈しないものでは、１２．３、希釈倍率３倍のものでは２．８７と、３倍希釈までＰＰＡＲδ活性を示していた。
一方、浸漬処理を行っていないエノキタケからの抽出物では濃度による活性の変化が見られなかった。
【００６１】
（４）浸漬時間による遺伝子発現レベルへの影響
４℃で１６時間馴化されたエノキタケの子実体の凍結乾燥粉末１ｇをそれぞれ超純水４０ｍｌに懸濁した懸濁液を４℃で、０分（浸漬なし）、１０分、３０分、６０分、１日、３日、５日、７日静置し、該懸濁液を遠心分離（１００００×ｇ、４℃、１５分）した以外は前記「（１）馴化による遺伝子発現レベルへの影響」と同様の手順で相対活性を試験した結果を図８に示す。
図８から、１０分以上浸漬を行ったものは浸漬処理を行わなかったものに比して活性は向上しており、５日間までであれば浸漬処理時間が長いほど活性は向上することがわかった。また、７日の浸漬処理であっても十分に高い相対活性を示していた。
【００６２】
（５）ｐＨによる遺伝子発現レベルへの影響
４℃で１６時間馴化されたエノキタケの子実体の凍結乾燥粉末１ｇを、それぞれｐＨ２、ｐＨ４、ｐＨ６、ｐＨ７、ｐＨ８、ｐＨ１０（超純水にｐＨ調整剤： １M ＮａＯＨを添加して調整）の水溶液に懸濁した懸濁液を遠心分離（１００００×ｇ、４℃、１５分）した以外は前記「（１）馴化による遺伝子発現レベルへの影響」と同様の手順で相対活性を試験した結果を図９に示す。
図９から、ｐＨ４からｐＨ１０の間ではｐＨ２の場合よりも相対活性は向上することがわかった。
【００６３】
（６）浸漬処理温度による遺伝子発現レベルへの影響
４℃で１６時間馴化されたエノキタケの子実体の凍結乾燥粉末１ｇを、それぞれ常温水（２０℃）４０ｍｌに懸濁し、一方はそのまま、他方は１０分間煮沸した懸濁液をそれぞれ遠心分離（１００００×ｇ、４℃、１５分）した以外は前記「（１）馴化による遺伝子発現レベルへの影響」と同様の手順で相対活性を試験した結果を図１０に示す。
図１０から、抽出物を煮沸した場合にはＰＰＡＲδ活性を示さないことがわかった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペルオキシゾーム増殖活性化受容体（Peroxisome proliferator-activated receptor。以下、単に、ＰＰＡＲともいう）のうちのＰＰＡＲδタイプを活性化するＰＰＡＲδ活性化剤およびＰＰＡＲδ活性化剤の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＰＡＲは、細胞内小器官であるペルオキシソームを増加させる作用を有する核内受容体の一種であり、ＰＰＡＲα、δ、γの３つのタイプに分類される。
ＰＰＡＲの各タイプは、９−シスレチノイン酸をリガンドとするレチノイドＸ受容体と二量体を形成することで、遺伝子上のＰＰＡＲ応答領域に結合して、種々の遺伝子発現を制御することが知られている。
このようにＰＰＡＲが構造変化することで遺伝子への作用が可能になることをＰＰＡＲの活性化という。
【０００３】
ＰＰＡＲの中でもＰＰＡＲδは、脂肪酸代謝の制御、インスリン感受性の増加、炎症性タンパクの発現の抑制あるいは表皮細胞分化などに関与していることが知られている。
すなわち、ＰＰＡＲδの活性化により、肥満抑制、内蔵脂肪蓄積予防、インスリン抵抗性の予防・改善、赤筋増加による持久力の向上、抗炎症作用、皮膚炎治療などの作用が期待できる。
【０００４】
このようなＰＰＡＲδの活性化剤としては、各種知られている。例えば、特許文献１には、甜菜、クマザサ、ショウガなど各種植物の乾燥粉末からの抽出物を有効成分として含むＰＰＡＲ活性化剤が開示されている。
また、特許文献２には醤油粕からの抽出物を含むＰＰＡＲδ活性剤が開示されている。
特許文献３には酒粕からの抽出物を含むＰＰＡＲδ活性剤が開示されている。
【０００５】
一方、従来から菌類の一種であるエノキダケ（Flammulina velutipes（Curt.:Fr.）Sing）には、肝機能の保護・改善成分、γ−アミノ酪酸、抗高血圧症成分などが含まれていることが下記特許文献４〜７に開示されている。エノキダケは安価で入手しやすく、且つ安全性の高い材料であるため、エノキダケから各種有効成分を抽出することで、安価で安全にこれらの有効成分が得られるという利点がある。
しかし、エノキダケにＰＰＡＲδ活性化成分が含まれていることは知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１０−１０６００１号公報
【特許文献２】特開２００９−２４２３８２号公報
【特許文献３】特開２００９−２３５０６８号公報
【特許文献４】特開２０１１−８４５３７号公報
【特許文献５】特開２００４−３０７４５３号公報
【特許文献６】特開２００４−８９１２８号公報
【特許文献７】特開２００９−３９０８２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上記のような点に鑑み、ＰＰＡＲδを活性化しうるＰＰＡＲδ活性化剤を安価で安全な原料であるエノキタケから得ることを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、このような課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、エノキタケの子実体を低温で馴化したものにＰＰＡＲδ活性化作用があることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明の係るＰＰＡＲδ活性化剤は、０℃以上１０℃以下の温度において馴化されたエノキタケの子実体の抽出物を含有することを特徴とする。
【００１０】
０℃以上１０℃以下の温度で馴化されたエノキタケは子実体の抽出物は、ＰＰＡＲδに対する活性を示す。
尚、本発明における「馴化」とは、所定の温度、湿度環境下に試料を１２時間以上静置することをいう。
【００１１】
本発明において、前記抽出物が、前記馴化されたエノキタケの子実体を水に浸漬した後に、低極性有機溶媒で抽出されたものであることが好ましい。
【００１２】
前記温度で馴化されたエノキタケをその後水に浸漬した後、該エノキタケから得られた抽出物は、ＰＰＡＲδ活性が向上する。
尚、本発明において浸漬工程で用いる水とは、０℃を超えて４℃の水をいい、純水に限らず、水道水などの上水、地下水などの天然水なども含み、且つ、ｐＨ調整剤などの各種添加物を含む水溶液をも含む。
また、浸漬とは、エノキタケの子実体を水中に存在させるようにすることをいう。
さらに、本発明において低極性溶媒とは、ヘキサン、ヘプタンなどの脂肪族炭化水素系溶媒や、ベンゼン、トルエンなどの芳香族炭化水素系溶媒や、シクロヘキサン、シクロヘプタンなどの脂環式炭化水素系溶媒をいう。
【００１３】
また、本発明に係るＰＰＡＲδ活性化剤の製造方法は、エノキタケの子実体を０℃以上１０℃以下の温度で馴化する馴化工程と、前記馴化したエノキタケの子実体から低極性有機溶媒で抽出物を抽出する抽出工程とを実施することを特徴とする。
【００１４】
本発明において、前記馴化工程の後に、エノキタケの子実体を０℃以上１０℃以下の水に浸漬する浸漬工程を実施し、その後前記抽出工程を実施することが好ましい。
【００１５】
本発明において、前記浸漬工程を１０分以上１２０時間以下で行うことが好ましい。
【００１６】
前記浸漬工程を前記時間の範囲で行った場合には、ＰＰＡＲδ活性がより向上する。
【００１７】
本発明において、前記浸漬工程をｐＨ４以上１０以下で行うことが好ましい。
【００１８】
前記浸漬工程を前記ｐＨの範囲で行った場合には、ＰＰＡＲδ活性がより向上する。
【発明の効果】
【００１９】
ＰＰＡＲδを活性化しうるＰＰＡＲδ活性化剤を安価で安全性の高いエノキタケから得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】実施例における子実体の酢酸エチル、ヘキサン抽出液、および菌糸体酢酸エチル抽出液のＴＬＣ法による分離プレートを示す図。
【図２】実施例における子実体の酢酸エチル、ヘキサン抽出液、および菌糸体酢酸エチル抽出液のＴＬＣ法による分離プレートを示す図。
【図３】実施例における子実体のヘキサン抽出液のＴＬＣ法による分離プレートを示す図。
【図４】実施例における子実体のヘキサン抽出液のＡＰＣＩ−ＭＳＭＳによる分析チャートを示す図。
【図５】実施例における子実体のヘキサン抽出液の遺伝子発現レベルを示すグラフ。
【図６】実施例における子実体のヘキサン抽出液の遺伝子発現レベルを示すグラフ。
【図７】実施例における子実体のヘキサン抽出液の遺伝子発現レベルの濃度による影響を示すグラフ。
【図８】実施例における子実体のヘキサン抽出液の遺伝子発現レベルの浸漬処理の時間による影響を示すグラフ。
【図９】実施例における子実体のヘキサン抽出液の遺伝子発現レベルの浸漬処理の浸漬水のｐＨによる影響を示すグラフ。
【図１０】実施例における子実体のヘキサン抽出液の遺伝子発現レベルの浸漬処理の温度による影響を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本実施形態のＰＰＡＲδ活性化剤は、０℃以上１０℃以下の温度において馴化されたエノキタケの子実体の抽出物を含有するものである。
【００２２】
本実施形態のＰＰＡＲδ活性剤の材料としてはエノキタケ（Flammulina velutipes（Curt.:Fr.）Sing）の茎部分と傘部分とからなる子実体の部分が用いられる。
エノキタケは、天然のものあるいは人工栽培したものいずれであってもよく、その産地等も問わない。
【００２３】
前記子実体は、０℃以上１０℃以下の温度において馴化された後に、そのままの状態であるいは凍結乾燥など乾燥物として用いられる。
【００２４】
馴化された前記子実体は、さらに、後述するような方法によって水に浸漬されたものであってもよい。
【００２５】
本実施形態のＰＰＡＲδ活性化剤は前記子実体から抽出された抽出物を含有する。
抽出物は、例えば、前記子実体を溶媒中に浸漬後、遠心分離、ろ過、デカンテーションなどの公知の適宜の方法で上清と沈殿物とに分離し、得られた上清のヘキサンなどの溶媒画分を分離することにより得られる。
【００２６】
前記抽出物は、スフィンゴ脂質を含んでいると考えられる。スフィンゴ脂質はスフィンゴ骨格を有する脂質の総称である。
スフィンゴ脂質には、基本構造に糖がグリコシド結合されたスフィンゴ糖脂質と、リン酸基が結合されたスフィンゴリン脂質とがあるが、前記抽出物にはスフィンゴ糖脂質が含まれていると考えられる。
【００２７】
前記抽出物は、そのままＰＰＡＲδ活性化剤として用いてもよく、あるいは、公知の精製方法で精製を行ってもよい。
さらに、精製後、適切な溶剤で希釈した希釈液、濃縮した濃縮液、乾燥粉末等の粉状体、あるいはペースト状など種々の形状に形成してもよい。
【００２８】
本実施形態のＰＰＡＲδ活性化剤は、ＰＰＡＲの３タイプＰＰＡＲα、ＰＰＡＲδ、ＰＰＲＡβのうちのＰＰＡＲδを活性化（遺伝子上のＰＰＡＲ応答領域に結合して、種々の遺伝子発現を制御可能な状態）にして、ＰＰＡＲδに依存的な遺伝子の転写活性を亢進する作用を有する。
前記のとおりＰＰＡＲδは、脂肪酸代謝の制御、インスリン感受性の増加、炎症性タンパクの発現の抑制あるいは表皮細胞分化などに関与していることから、本実施形態のＰＰＡＲδ活性化剤により、肥満抑制、内蔵脂肪蓄積予防、インスリン抵抗性の予防・改善、赤筋増加による持久力の向上、抗炎症作用、皮膚炎治療などの作用が期待できる。
従って、本実施形態のＰＰＡＲδ活性化剤は、機能性食品、病者用食品、特定保健用食品等のヒト若しくは動物用の食品、医薬品又は医薬部外品、化粧品など各種製品に応用しうる。
【００２９】
次に、本実施形態のＰＰＡＲδ活性剤の製造方法について説明する。
本実施形態のＰＰＡＲδ活性剤の製造方法は、エノキタケの子実体を０℃以上１０℃以下の温度で馴化する馴化工程と、前記馴化したエノキタケの子実体から低極性有機溶媒で抽出物を抽出する抽出工程とを実施する。
【００３０】
（馴化工程）
前記のようなエノキタエケの子実体を０℃以上１０℃以下、好ましくは、２℃以上７℃以下の温度で好気の条件下に、１２時間から１６８時間、好ましくは１５時間から３０時間静置する馴化工程を実施する。
馴化されたエノキタケ子実体から抽出される抽出物はＰＰＡＲδ活性を示すようになる。
【００３１】
（凍結乾燥工程）
本実施形態においては、前記馴化工程を実施した後のエノキタケの子実体を凍結乾燥する工程を実施してもよい。
かかる凍結乾燥工程は、被処理物を氷点下で凍結させた後、真空または減圧下で凍結した水分を加熱、昇華させることで被処理物を乾燥させるいわゆるフリーズドライ方法で行うことができる。
凍結乾燥に用いる装置としては、公知の凍結乾燥装置を用いることができる。また、凍結乾燥条件としては、特に限定されるものではないが、例えば、−４０℃〜−５０℃の温度条件で２４時間〜４８時間程度で凍結乾燥を行うことが好ましい。
【００３２】
（浸漬工程）
本実施形態のＰＰＡＲδ活性剤の製造方法においては、前記馴化工程の後に、エノキタケ子実体を０℃以上１０℃以下の水に浸漬する浸漬工程を実施してもよい。
【００３３】
浸漬工程では、前記馴化工程で馴化されたエノキタケ子実体を水中に浸漬して、好ましくは、５分以上１０日以内、好ましくは１０分以上５日（１２０時間）以内、さらに好ましくは１日以上６日以内、静置する。
馴化されたエノキタケ子実体を水に浸漬することで前記抽出物のＰＰＡＲδ活性がさらに向上する。
【００３４】
本実施形態の浸漬工程において、水のｐＨをｐＨ４以上１０以下で、好ましくはｐＨ４以上６以下に調整して、該ｐＨ調整水に前記エノキタケ子実体を浸漬することで、さらなるＰＰＡＲδ活性の向上が認められる。
ｐＨ調整剤としては例えば塩酸等を用いることが好ましい。
【００３５】
（抽出工程）
前記のような各工程を実施した後、エノキダケの子実体を低極性有機溶媒で処理して抽出物を抽出する抽出工程を実施する。
低極性有機溶媒としては、ヘキサン、クロロホルム等の中から任意の有機溶媒を用いることができるが、ヘキサンを用いることが食品利用の観点から好ましい。
【００３６】
本実施形態の抽出工程では公知の抽出方法を採用することができるが、例えば、以下のような抽出方法で実施することができる。
まず、前記低極性有機溶媒としてのヘキサンの中に前記エノキタケの子実体の粉末を懸濁した懸濁液を所定時間、例えば、８時間から１５時間程度静置した後に濾紙などで濾過した濾液を蒸発乾固する。さらに、ヘキサンで再懸濁して純水と混合してから遠心分離後、ヘキサン層を回収する。このヘキサン層をさらに純水と混合して遠心分離する処理を５回程度繰り返すことで回収したヘキサン相を蒸発乾固することで抽出物を得ることができる。
【実施例】
【００３７】
以下に、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
【００３８】
（抽出物の分析１）
エノキタケの子実体および菌糸体を４℃で２４時間馴化させた後、凍結乾燥させた粉末をそれぞれ１０ｇずつ試料とした。
前記各試料を、酢酸エチル５００ｍｌに懸濁した懸濁液を４℃で一晩（１６時間）静置した。前記懸濁液を濾紙（Ｎｏ.１、ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）で濾過し、該濾液を４０℃でエバポレーターにかけて蒸発乾固させた。
乾固させた試料を酢酸エチル１ｍｌで再懸濁し、０．２μｍフィルター（材質ＰＴＦＥ、ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）で濾過し、固体成分（子実体または菌糸体の粉末）を完全に除去した液体を得た。尚、以下、子実体から得られた抽出液を「子実体酢酸エチル抽出液」、菌糸体から得られた抽出液を「菌糸体酢酸エチル抽出液」という。
さらに、前記と同様に、エノキタケの子実体のみ、ヘキサンを用いて抽出した液を「子実体ヘキサン抽出液」として得た。
【００３９】
前記子実体酢酸エチル抽出液、菌糸体酢酸エチル抽出液および子実体ヘキサン抽出液を以下のような条件で薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を用いて分離した。
展開溶媒：クロロホルム：メタノール ９：１（体積比）
発色試薬：モリブデン酸アンモニウム−過塩素酸試薬（１２質量％モリブデン酸アンモニウム水溶液Ａ、１Ｍ塩酸Ｂ、６０質量％過塩素酸Ｃを、質量比Ａ：Ｂ：Ｃ＝５：６：３で混合したもの。）
ヨウ素試薬（和光純薬社製）。
使用ＴＬＣプレート：Silica gel F254（メルク社製）
【００４０】
前記各抽出液を分離したプレートに前記モリブデン酸アンモニウム試薬を噴霧して、１０５℃で１０分間加熱した結果を図１に示す。
さらに同様に抽出液を分離したプレートを前記ヨウ素試薬を充満させた密閉容器中に入れて１０分間放置した結果を図２に示す。
【００４１】
図１および図２に示す１は子実体酢酸エチル抽出液、２は子実体ヘキサン抽出液、３は菌糸体酢酸エチル抽出液を示す。
図１に示すように、子実体酢酸エチル抽出１および子実体ヘキサン抽出液２は同じスポットＲｆ値０．６０に呈色を示したが、菌糸体酢酸エチル抽出液３では非常に薄くしか呈色を示さなかった。
モリブデン酸アンモニウム試薬は脂質の検出が可能であり、以上より、前記子実体からの抽出物中には脂質が含まれていることがわかった。
【００４２】
また、図２に示すように、子実体酢酸エチル抽出１および子実体ヘキサン抽出液２は同じスポットＲｆ値０．６０に呈色を示したが、菌糸体酢酸エチル抽出液３ではほとんど呈色を示さなかった。
ヨウ素反応では不飽和化合物の検出が可能であり、以上より、前記子実体からの抽出物中には不飽和化合物が含まれていることがわかった。
すなわち、子実体からの抽出物には不飽和脂肪酸が含まれていることがわかった。
【００４３】
（抽出物の分析２）
子実体からの抽出物をさらに詳細に分析するために以下のような分析を行った。
エノキタケの子実体を４℃で１６時間馴化させた後凍結乾燥させた粉末１ｇを４０ｍｌの超純水（常温２０℃）に懸濁して１０分間浸漬させた懸濁液と、前記馴化させた後凍結乾燥させた粉末１ｇを４０ｍｌの超純水で１０分間煮沸処理した懸濁液とをそれぞれ遠心分離（１００００×ｇ、４℃、１５分）したものを試料とした。
前記各試料を用いて前記抽出物の分析１と同様にヘキサン抽出液を得た。
【００４４】
前記各抽出液を以下のような条件で薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を用いて分離した。
展開溶媒：クロロホルム：メタノール：酢酸 ９０：１０：２（体積比）
発色試薬：Dittmer試薬（4%三酸化モリブデン・25N硫酸）
ニンヒドリン試薬（0.2%ニンヒドリン・無水エタノール溶液）
使用ＴＬＣプレート：Silica gel F254（メルク社製）
【００４５】
前記各抽出液を分離したプレートに前記Dittmer試薬およびニンヒドリン試薬を噴霧し、１２０℃で数分間加熱したところ、常温水に浸漬後の子実体からの抽出物および熱水に浸漬後の子実体からの抽出物いずれも呈色しなかった。
前記ニンヒドリン試薬はアミノ酸の検出が可能であり、Dittmer試薬はリン酸の検出が可能である。
従って、子実体からの抽出物にはアミノ酸、リン酸は含まれていないことがわかった。
さらに、前記常温水に浸漬後の子実体からの抽出物および煮沸後の子実体からの抽出物を前記と同様に分離したプレートに前記Dittmer試薬を噴霧して、１２０℃で数分間
加熱した結果を図３に示す。
図３の１は常温水に浸漬後の子実体からの抽出物、２は熱水に浸漬後の子実体からの抽出物を示す。
図３からあきらかなように、熱水に浸漬後の子実体からの抽出物には、前記分析１で分析されたリン脂質は含まれていないことがわかる。
【００４６】
（抽出物のＡＰＣＩ−ＭＳＭＳによる分析）
エノキタケの子実体を４℃で１６時間馴化させた後凍結乾燥させた粉末１ｇを４０ｍｌの超純水（常温２０℃）に懸濁して１０分間浸漬させた懸濁液を、弱アルカリ処理（０．１ＭのＮａＯＨ溶液で、１００℃、３０分間処理）した後、前記分析１と同様の手法および条件でＴＬＣを行い、ＴＬＣで分離されたＲｆ０．６０の画分を採取して得た試料を用いて、大気圧化学イオン化−質量分析計（ＡＰＣＩ−ＭＳＭＳ）で以下の条件で分子量を測定した結果を図４に示す。
使用装置：Applied Biosystem API-3000
測定条件：移動相１％ギ酸超純水溶液と１％ギ酸アセトニトリル溶液を１：１に混合して１ｍｌ／ｍｌの流速で、Ｐｏｓｉｔｉｖｅ（Ｍ＋１）で分析した。
【００４７】
図４に示すように試料中には分子量８７８．２の位置にピークを示した。
かかる位置にピークを示していることから、抽出物はスフィンゴ脂質の主構造であるスフィンゴ骨格を含むことがわかった。
【００４８】
以上の各分析結果より、４℃で馴化したエノキタケの子実体から抽出される抽出物には不飽和脂肪酸を持ったスフィンゴ脂質構造を備える脂質および、リン酸、アミノ酸を含まないことが判った。
【００４９】
（遺伝子発現レベル）
レポーター遺伝子アッセイによる遺伝子発現レベルを試験した。
レポーター遺伝子アッセイは、対象とする遺伝子の発現変化を転写レベルで分析する方法であり、目的遺伝子の転写調節領域の下流にレポーターとしてルシフェラーゼ遺伝子を組み込んだプラスミドを作成し、そのプラスミドを導入した細胞の酵素活性（生物化学発光）を測定する方法である。
【００５０】
（１）馴化による遺伝子発現レベルへの影響
ａ）試料
エノキタケの子実体（馴化なし）を凍結乾燥させた粉末と、前記分析１で使用した馴化したエノキタケの子実体を凍結乾燥させた粉末とを各１ｇずつ、ヘキサン３０ｍｌに懸濁して、該懸濁液を４℃で一晩（１６時間）静置した。該懸濁液を濾紙（Ｎｏ.１、ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）で濾過した濾液をＮ2によって蒸発乾固させた。
この蒸発乾固試料をヘキサンで再度懸濁し等量の純水を加えて転倒混和し遠心分離（１０００×ｇ、４℃、５分）した。
ヘキサン層を回収した後、さらに超純水を加えて遠心分離（１０００×ｇ、４℃、５分）した。この操作を５回繰り返し、回収したヘキサン層をＮ2によって蒸発乾固させた。
【００５１】
ｂ）試薬等
使用細胞：ヒト培養細胞Hek 293（医薬基研究所製 代謝疾患タンパク検索プロジェクト）
培地：Dubeco's Modified Eagle's Medium（1000mg，グルコース、Ｌ−グルタミン酸、ＮａＯＣＯ3、pyridoxine HCL（SIGMA社製）、以下、ＤＭＥＭという。）
ＰＭプラスミド：pRL-TK（Int-） （Promega社；内部標準） ３０ｎｇ、pTAL-5XGAL4（J Biol Chem. 2002 May 3;277（18）:15629-37 に記載のもの） １５０ｎｇ、pM-hPPARd ５０ｎｇ、または、空ＶｅｃｔｏｒのＰＭ（Clontech社）５０ｎｇを６０ｕｌのＤＭＥＭの無血清培地／１−ｗｅｌｌになるように調整し、Lipofectamine2000を０．５ｕｌ／ｗｅｌｌで導入したもの。
プロモーター：ＴＫプロモーター
装置：ルミノメーター（ＴＯＹＯＢＯ社製）
【００５２】
ｃ）遺伝子導入
２４穴細胞培養プレートに前記ヒト培養細胞を培養し、１．５ｍｌエッペンドルフチューブに１ウエルにつきＤＭＥＭ（−血清）１００μｌ、SV40-rLuc１００ｎｇ、GAL4-TAL１５０ｎｇ、比較する遺伝子を含まないプラスミドとしての前記ＰＭ５０ｎｇ、Lipofrctamine（invitorogen））０．５μｌとなるように混合した混合物を得た。
対象の受容体ＰＰＡＲδおよび、比較する受容体としてＬＸＲ（肝臓Ｘレセプター）、ＦＸＲ（Farnesoid X受容体）、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγの５種類の受容体に対応する遺伝子活性を測定するために、前記ＰＭを、ＬＸＲ、ＦＸＲ、ＰＰＡＲδ、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγに変えてそれぞれ同様の操作を行い６種類の遺伝子導入混合物を作製した。
前記培養細胞の培地を捨てて、新しいＤＭＥＭ（−血清）で洗浄し、さらに２５０μｌのＤＭＥＭ（−血清）を追加した。
前記各遺伝子導入混合物１種類を５０μｌずつ４ウエルに分けた。ＣＯ2インキュベータ（３７℃、５％ＣＯ2気流下）内で３時間培養後、培地をすててＤＭＥＭ（＋血清）を２５０μｌ添加し、さらにＣＯ2インキュベータ（３７℃、５％ＣＯ2気流下）内で２４時間培養した。
【００５３】
ｄ）試料添加
前記各試料をジメチルスルホキシドに溶かして１０ｍｇ／ｍｌとした。
各試料およびブランクとしてのジメチルスルホキシド１８μｌをＤＭＥＭ（＋血清）６μｌに混合した。これらを前記遺伝子導入された培養細胞が入った各ウエルに４５０μｌずつ添加し、ＣＯ2インキュベータ（３７℃、５％ＣＯ2気流下）内で一晩（１６時間）培養した。
【００５４】
ｅ）光度測定
前記インキュベータから取り出した細胞をＰＢＳ（リン酸ナトリウム緩衝液）で洗浄して蒸留水で５倍希釈したLysisバッファー（Progma社製）を１ウエルに７５μｌずつ添加して、１０分間振とうし、細胞を分離させた。
さらに、９６穴プレートに分離させた細胞液を１０μｌ、発光基質を添加したルシフェラーゼアッセイバッファー（Progma社製）５０μｌ、Ｓｔｏｐ＆Ｇｌｏバッファー（Progma社製）４５μｌを加え、GLOMAX MULTI DETECTION SYSTEMのDual-Luciferase Reporter Assey systemのプロトコールに従い光度を測定した。
【００５５】
ｆ）遺伝子発現レベル
前記光度から各試料についてＬＸＲ／ＰＭ、ＦＸＲ／ＰＭ、ＰＰＡＲδ／ＰＭ、ＰＰＡＲα／ＰＭ、ＰＰＡＲγ／ＰＭを算出した値をブランクの値で割った値を遺伝子活性を示す相対活性として図５に示した。
【００５６】
図５から、４℃で馴化したエノキタケの子実体からの抽出物は、ＰＰＡＲδの活性に特化していることがわかった。
【００５７】
（２）浸漬処理による遺伝子発現レベルへの影響
試料として４℃で２４時間馴化したエノキタケの子実体の凍結乾燥粉末と、前記と同様の馴化後凍結乾燥させた粉末を７日間常温の超純水（２０℃）に浸漬させた懸濁液とを用いて、前記「（１）馴化による遺伝子発現レベルへの影響」と同様の手順で相対活性を試験した結果を図６に示す。
【００５８】
図６から、浸漬処理を行ったエノキタケの子実体からの抽出物は、浸漬処理を行なわなかった子実体の抽出物に比してＰＰＡＲδ活性が２倍以上向上していたことがわかった。
【００５９】
（３）濃度による遺伝子発現レベルへの影響
前記「（２）浸漬処理による遺伝子発現レベルへの影響」で用いた各子実体で、濃度による相対活性の変化を試験した。
各子実体の抽出物は無希釈、３倍、１０倍、３０倍、１００倍、３００倍にＤＭＳＯで希釈して、図中の最終添加濃度となるように調製した。前記「（１）馴化による遺伝子発現レベルへの影響」と同様の手順で相対活性を試験した結果を図７に示す。
【００６０】
図７からは、浸漬処理を行ったエノキタケの子実体抽出物では、希釈しないものでは、１２．３、希釈倍率３倍のものでは２．８７と、３倍希釈までＰＰＡＲδ活性を示していた。
一方、浸漬処理を行っていないエノキタケからの抽出物では濃度による活性の変化が見られなかった。
【００６１】
（４）浸漬時間による遺伝子発現レベルへの影響
４℃で１６時間馴化されたエノキタケの子実体の凍結乾燥粉末１ｇをそれぞれ超純水４０ｍｌに懸濁した懸濁液を４℃で、０分（浸漬なし）、１０分、３０分、６０分、１日、３日、５日、７日静置し、該懸濁液を遠心分離（１００００×ｇ、４℃、１５分）した以外は前記「（１）馴化による遺伝子発現レベルへの影響」と同様の手順で相対活性を試験した結果を図８に示す。
図８から、１０分以上浸漬を行ったものは浸漬処理を行わなかったものに比して活性は向上しており、５日間までであれば浸漬処理時間が長いほど活性は向上することがわかった。また、７日の浸漬処理であっても十分に高い相対活性を示していた。
【００６２】
（５）ｐＨによる遺伝子発現レベルへの影響
４℃で１６時間馴化されたエノキタケの子実体の凍結乾燥粉末１ｇを、それぞれｐＨ２、ｐＨ４、ｐＨ６、ｐＨ７、ｐＨ８、ｐＨ１０（超純水にｐＨ調整剤： １M ＮａＯＨを添加して調整）の水溶液に懸濁した懸濁液を遠心分離（１００００×ｇ、４℃、１５分）した以外は前記「（１）馴化による遺伝子発現レベルへの影響」と同様の手順で相対活性を試験した結果を図９に示す。
図９から、ｐＨ４からｐＨ１０の間ではｐＨ２の場合よりも相対活性は向上することがわかった。
【００６３】
（６）浸漬処理温度による遺伝子発現レベルへの影響
４℃で１６時間馴化されたエノキタケの子実体の凍結乾燥粉末１ｇを、それぞれ常温水（２０℃）４０ｍｌに懸濁し、一方はそのまま、他方は１０分間煮沸した懸濁液をそれぞれ遠心分離（１００００×ｇ、４℃、１５分）した以外は前記「（１）馴化による遺伝子発現レベルへの影響」と同様の手順で相対活性を試験した結果を図１０に示す。
図１０から、抽出物を煮沸した場合にはＰＰＡＲδ活性を示さないことがわかった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
０℃以上１０℃以下の温度において馴化されたエノキタケの子実体の抽出物を含有することを特徴とするＰＰＡＲδ活性化剤。
【請求項２】
前記子実体が、前記馴化された後に水に浸漬されたものである請求項１に記載のＰＰＡＲδ活性化剤。
【請求項３】
前記抽出物が、前記子実体から低極性有機溶媒で抽出された抽出物である請求項１または２に記載のＰＰＡＲδ活性化剤。
【請求項４】
エノキタケの子実体を０℃以上１０℃以下の温度で馴化する馴化工程と、
前記馴化したエノキタケの子実体から低極性有機溶媒で抽出物を抽出する抽出工程とを実施することを特徴とするＰＰＡＲδ活性化剤の製造方法。
【請求項５】
前記馴化工程の後に、エノキタケの子実体を０℃以上１０℃以下の水に浸漬する浸漬工程を実施し、その後前記抽出工程を実施する請求項４に記載のＰＰＡＲδ活性化剤の製造方法。
【請求項６】
前記浸漬工程を１０分間以上１２０時間以下で行う請求項４または５に記載のＰＰＡＲδ活性化剤の製造方法。
【請求項７】
前記浸漬工程をｐＨ４以上１０以下で行う請求項４乃至６のいずれか一項に記載のＰＰＡＲδ活性化剤の製造方法。
【請求項１】
０℃以上１０℃以下の温度において馴化されたエノキタケの子実体の抽出物を含有することを特徴とするＰＰＡＲδ活性化剤。
【請求項２】
前記子実体が、前記馴化された後に水に浸漬されたものである請求項１に記載のＰＰＡＲδ活性化剤。
【請求項３】
前記抽出物が、前記子実体から低極性有機溶媒で抽出された抽出物である請求項１または２に記載のＰＰＡＲδ活性化剤。
【請求項４】
エノキタケの子実体を０℃以上１０℃以下の温度で馴化する馴化工程と、
前記馴化したエノキタケの子実体から低極性有機溶媒で抽出物を抽出する抽出工程とを実施することを特徴とするＰＰＡＲδ活性化剤の製造方法。
【請求項５】
前記馴化工程の後に、エノキタケの子実体を０℃以上１０℃以下の水に浸漬する浸漬工程を実施し、その後前記抽出工程を実施する請求項４に記載のＰＰＡＲδ活性化剤の製造方法。
【請求項６】
前記浸漬工程を１０分間以上１２０時間以下で行う請求項４または５に記載のＰＰＡＲδ活性化剤の製造方法。
【請求項７】
前記浸漬工程をｐＨ４以上１０以下で行う請求項４乃至６のいずれか一項に記載のＰＰＡＲδ活性化剤の製造方法。
【図４】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１】
【図２】
【図３】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１】
【図２】
【図３】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１３−１０３９２６（Ｐ２０１３−１０３９２６Ａ）
【公開日】平成２５年５月３０日（２０１３．５．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２５０８６５（Ｐ２０１１−２５０８６５）
【出願日】平成２３年１１月１６日（２０１１．１１．１６）
【出願人】（３９９０３００６０）学校法人 関西大学 (208)
【出願人】（５０５３１４０２２）独立行政法人医薬基盤研究所 (17)
【出願人】（３０９０３５０７３）有限会社一栄 (2)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年５月３０日（２０１３．５．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１１月１６日（２０１１．１１．１６）
【出願人】（３９９０３００６０）学校法人 関西大学 (208)
【出願人】（５０５３１４０２２）独立行政法人医薬基盤研究所 (17)
【出願人】（３０９０３５０７３）有限会社一栄 (2)
【Ｆターム（参考）】
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