ＰＰＡＲ活性化剤
【課題】ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体活性化剤を提供すること。
【解決手段】大豆テンペ菌発酵物の有機溶媒抽出物を有効成分とするＰＰＡＲα又はＰＰＡＲδ活性化剤。
【解決手段】大豆テンペ菌発酵物の有機溶媒抽出物を有効成分とするＰＰＡＲα又はＰＰＡＲδ活性化剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂肪酸代謝活性化、体脂肪燃焼促進、肥満抑制、脂肪肝抑制、インスリン抵抗性予防・改善、血糖値上昇抑制、持久力向上に有効なペルオキシソーム増殖剤活性化受容体（Peroxisome Proliferator Activated Receptor、ＰＰＡＲと記載する）活性化剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ステロイド、甲状腺ホルモン、レチノイドなどの低分子脂溶性リガンドはリガンド特異的な核内受容体を介して、個体発生における形態形成、細胞の増殖、分化、生体の恒常性の維持など多様な生理機能の調節に関与している。ＰＰＡＲは核内受容体の１種であり、１９９０年に脂肪分解に関与する細胞内小器官であるペルオキシソームを増加させる作用を仲介する蛋白として同定され、ペルオキシソーム増殖剤により活性化を受けるレセプターという意味でPeroxisome Proliferator Activated Receptorα（ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体：ＰＰＡＲα）と名付けられた。その後α型と構造上類似したアイソフォーム遺伝子としてδ型及びγ型が同定され、合計３つのサブタイプから成ることが知られている。
【０００３】
ＰＰＡＲの各サブタイプはリガンド依存的に活性化され、９−シスレチノイン酸をリガンドとするＲＸＲ（Retinoid X Receptor）とヘテロ２量体を形成することで、プロモーター領域にＰＰＡＲ応答配列（ＰＰＡＲ responsivelement；ＰＰＲＥ）を有する種々の遺伝子の発現を制御している（非特許文献１及び２）。
例えば、脂肪酸β酸化の鍵酵素として知られるＡＣＯ（Acyl-CoA oxidase）のＰＰＲＥを用いたレポーターアッセイがなされており、それによると、ＰＰＡＲリガンドとして知られるリノール酸は、ＰＰＡＲα、δ、γのそれぞれを介してＡＣＯ転写活性を亢進することが報告されている（非特許文献３）。
以下で述べるように、近年、ＰＰＡＲは非常に多くの生理、病理現象に関わっていることが明らかになってきた。
【０００４】
具体的には、ＰＰＡＲαの機能は脂肪酸の合成・輸送・分泌、脂肪消費臓器におけるＡＴＰ産生等幅広く生体のエネルギー代謝や恒常性の維持に関わるものと考えられている。特に脂肪酸代謝に重要なβ酸化関連酵素 （ＡＣＯ，ＨＭＧ-ＣｏＡ synthase，Ａｃｙｌ-ＣｏＡ synthase，Medium chain acyl-CoA dehydrogenase，Fatty acid binding protein，Lipoprotein lipase等）の遺伝子発現はＰＰＡＲαの活性化に強く依存していることが明らかになっている。ＰＰＡＲαは肝臓、心臓、腎臓等での発現が高く、ＰＰＡＲα活性化剤はこれらの臓器の脂質代謝の活性化に有効であると広く認識されている。
【０００５】
ＰＰＡＲαの活性化に伴う脂肪酸代謝の活性化は、肝臓脂肪の分解、脂肪肝の改善、内臓脂肪や皮下脂肪等の体脂肪の分解・燃焼の促進、肥満の抑制につながると考えられる。ＰＰＡＲα活性化剤として知られるフィブラート系の薬剤は、脂肪酸燃焼の促進作用、ＨＤＬコレステロール増加作用、そして最近ではアディポネクチン受容体発現増加作用等を持つことが明らかとなってきており、インスリン非依存性糖尿病の高血糖症、脂質異常症、高血糖症、アテローム性動脈硬化症等の治療薬として広く用いられている（非特許文献４、特許文献１及び２）。また、ＰＰＡＲα活性化剤が心肥大や虚血性心疾患に効果があることが報告されている（非特許文献５、６）。
【０００６】
従って、ＰＰＡＲα活性化剤は、脂肪酸代謝の活性化、体脂肪の燃焼促進、肥満の予防・改善、脂質異常症の予防・改善、脂肪肝の予防・改善、インスリン抵抗性や糖尿病の予防・改善、動脈硬化の予防・改善、心肥大や虚血性心疾患の予防・改善等に広く有効であると考えられており、近年、ＰＰＡＲα活性化剤の探索、開発も盛んに行われている（特許文献３〜５）。
【０００７】
ＰＰＡＲδ（別名：ＰＰＡＲβ、ＮＵＣ１、ＦＡＡＲ）は１９９２年にクローニングされて以来、長らく機能が明らかにされていなかったが、近年、遺伝子改変動物を用いた研究やＰＰＡＲδ選択的な作動薬の開発などにより様々な生理機能を持つことが明らかになってきた。ＰＰＡＲδを過剰発現させたマウスを用いた検討では、高脂肪食負荷による体重増加の抑制、脂肪重量の減少、血中中性脂肪の減少、脂肪肝の抑制が認められている（非特許文献７）。ＰＰＡＲδ選択的な作動薬であるＧＷ５０１５１６を肥満アカゲザルに投与した実験では、ＨＤＬコレステロールを上昇させ、中性脂肪、ＬＤＬコレステロールを低下させた（非特許文献８）。
【０００８】
また、ＧＷ５０１５１６を骨格筋由来細胞に作用させ、細胞の遺伝子発現への影響を検討した結果では、脂肪酸の取り込みや輸送、ミトコンドリアのβ酸化系酵素、脱共役タンパク質等の脂肪酸代謝関連遺伝子の発現を誘導することが示されている。さらにＧＷ５０１５１６を投与したマウスにおいては、脂肪組織特異的ＰＰＡＲδ過剰発現マウスと同様に高脂肪食負荷による体重増加の抑制、脂肪重量の減少が認められ、インスリン抵抗性改善効果を示すことも明らかにされている。このマウスの骨格筋においては脂肪酸代謝関連遺伝子および脂肪酸β酸化の誘導が確認されていることから、ＰＰＡＲδの活性化によって、骨格筋のエネルギー消費が増大することにより末梢組織中の脂肪蓄積が抑制され、それによりインスリン抵抗性が改善されるのではないかと考えられている（非特許文献９）。また、遺伝的肥満マウスにＧＷ５０１５１６を投与することにより、膵島の肥大が抑制されたことから、膵島の保護作用があると考えられている（非特許文献９）。
【０００９】
また、骨格筋特異的にＰＰＡＲδを過剰発現することにより、肥満やインスリン抵抗性が抑制されることが報告されている。さらに驚くことに、このマウスの骨格筋では一般的に赤筋と呼ばれるミトコンドリアを多く含む持久性の高い筋繊維の割合が非常に高くなっており、その結果、このマウスは、コントロールマウスの約２倍の距離を走ることができるという大変優れた持久力を持つマウスであることが示されている（非特許文献１０）。従って、ＰＰＡＲδの活性化は、運動持久力の向上に有効であると考えられるようになった。
【００１０】
また最近では、肝臓においてＰＰＡＲδがインスリン感受性を制御しているという報告もなされており、そのメカニズムとして、ＰＰＡＲδの活性化が肝臓の解糖系およびペントースリン酸回路の活性化を介して肝臓からのグルコースの供給を減少させ、インスリン感受性を増加することが示唆されている（非特許文献１１）。
【００１１】
このように、ＰＰＡＲδの活性化は、ＨＤＬコレステロールの上昇、ＬＤＬコレステロールの低下、肥満の抑制、インスリン抵抗性の改善／インスリン感受性の向上、脂肪酸代謝の活性化、体脂肪の燃焼促進、血中中性脂肪の減少、脂肪肝の抑制、持久力の向上等につながる事から、ＰＰＡＲδの活性化剤は、動脈硬化の予防・改善剤、肥満の予防・改善剤、インスリン抵抗性の予防・改善剤、脂肪酸酸化活性化剤、体脂肪燃焼促進剤、脂質異常症予防・改善剤、脂肪肝予防・改善剤、持久力向上剤として有効であると考えられている。
そのため、このような目的でＰＰＡＲδ活性化剤の探索、開発も盛んに行われ、これまでにフラボン類、フェノキシ酢酸誘導体等が報告されている（特許文献６及び７）。
【００１２】
ＰＰＡＲγは栄養が十分にある状態でエネルギー貯蔵に作用し、いわゆる倹約遺伝子として働く分子である。特にＰＰＡＲγ２は脂肪細胞に比較的強い特異性を持って発現しており、脂肪細胞分化の中心的役割を果たしていることが明らかになっている。ＰＰＡＲγのリガンドとして知られるチアゾリジン誘導体は脂肪細胞分化を強力に誘導することにより、脂肪細胞を小型化してインスリン感受性を高めることが知られており、インスリン抵抗性改善剤、糖尿病治療薬として広く使用されている。しかし、チアゾリジン誘導体の投与は体重や脂肪重量を増やし、肥満を誘導する問題点も指摘されている（非特許文献１２）。
【００１３】
このように、ＰＰＡＲ活性化剤は、脂肪酸代謝の活性化、体脂肪の燃焼促進、肥満の予防・改善、脂質異常症の予防・改善、脂肪肝の予防・改善、持久力向上、インスリン抵抗性や糖尿病の予防・改善、動脈硬化の予防・改善、心肥大や虚血性心疾患の予防・改善などに広く有効であり、いわゆる生活習慣病や内臓脂肪症候群（メタボリックシンドローム）の予防・改善にも有効であると考えられる。
【００１４】
一方、インドネシアの伝統的な大豆発酵食品であるテンペには蛋白質、食物繊維、アミノ酸、ビタミン類（ビタミンＥ、Ｂ群ビタミン）、鉄などのミネラル類、イソフラボン類等が含まれており、栄養価に富む食品である（特許文献８）。テンペは大豆をテンペ菌で発酵させた発酵食品である。テンペに含まれているこれら成分の有効性から、テンペはコレステロール上昇抑制作用、肝脂肪蓄積予防作用、抗肥満作用、溶血防止作用、整腸作用があることが示唆されている（特許文献８）。また、テンペには血圧上昇抑制作用、中性脂質低下作用、抗肥満作用、精神安定作用、更年期障害の改善作用、睡眠促進作用、アルコール・アルデヒド代謝作用、消臭作用が報告されているγ−アミノ酪酸を高濃度に含有することが報告されている（特許文献９）。
【００１５】
しかしながら、大豆テンペ菌発酵物の有機溶媒抽出物がＰＰＡＲ活性化に関与し、脂肪酸代謝の活性化、体脂肪の燃焼促進等に有効であることは知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】特表2002-502869号公報
【特許文献２】特表2002-533410号公報
【特許文献３】特開2001-354558号公報
【特許文献４】特開2002-80362号公報
【特許文献５】特開2003-34636号公報
【特許文献６】特開2007-119429号公報
【特許文献７】特表2007-536343号公報
【特許文献８】特開平6-133717号公報
【特許文献９】国際公開第01/093696号パンフレット
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】細胞:31(6)218-234, 1999
【非特許文献２】J Lipid Res. 37, 907-925, 1996
【非特許文献３】J Biol Chem. 274, 23368-23377, 1999
【非特許文献４】Curr Opin Lipidol. 10, 151-159, 1999
【非特許文献５】Endcrinology 144, 4187-4194, 2003
【非特許文献６】Circulation 108, 2393-2399, 2003
【非特許文献７】Cell. 113, 159-170, 2003
【非特許文献８】Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 5306-5311, 2001
【非特許文献９】Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 15924-15929, 2003
【非特許文献１０】PloS Biol. 2, e294, 2004
【非特許文献１１】Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 3444-3449, 2006
【非特許文献１２】Diabetes. 49, 759-767, 2000
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明は、優れたＰＰＡＲ活性化作用を有し、且つ安全性の高い食品、医薬品又は医薬部外品を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明者らは、食経験が豊富な天然物素材の中から、大豆テンペ菌発酵物の有機溶媒抽出物にＰＰＡＲα活性化作用及びＰＰＡＲδ活性化作用があり、脂肪酸代謝活性化、体脂肪燃焼促進、インスリン抵抗性予防・改善、持久力向上、肥満抑制、脂肪肝抑制、動脈硬化予防・改善、心肥大や虚血性心疾患の予防・改善効果を発揮する食品、医薬品又は医薬部外品の有効成分として配合する素材として有用であることを見出した。
【００２０】
すなわち、本発明は以下の発明に係るものである。
〔１〕大豆テンペ菌発酵物の有機溶媒抽出物を有効成分とするＰＰＡＲα及び／又はＰＰＡＲδ活性化剤。
〔２〕大豆テンペ菌発酵物の有機溶媒抽出物を有効成分とする持久力向上剤。
〔３〕大豆テンペ菌発酵物の有機溶媒抽出物を有効成分とする脂肪酸代謝活性化剤。
〔４〕大豆テンペ菌発酵物の有機溶媒抽出物を有効成分とする体脂肪燃焼促進剤。
〔５〕大豆テンペ菌発酵物の有機溶媒抽出物を有効成分とするインスリン抵抗性予防・改善剤。
〔６〕大豆テンペ菌発酵物の有機溶媒抽出物を有効成分とする糖尿病予防・改善剤。
〔７〕大豆をテンペ菌で発酵させ、得られた発酵物から有機溶媒抽出物を調製することによるＰＰＡＲα及び／又はＰＰＡＲδ活性化剤の製造方法。
【発明の効果】
【００２１】
本発明のＰＰＡＲ活性化剤は、優れたＰＰＡＲ活性化作用を有し、かつ長期間摂取しても安全性も高いことから、脂肪酸代謝活性化、体脂肪燃焼促進、インスリン抵抗性予防・改善、持久力向上、肥満抑制、脂肪肝抑制、動脈硬化予防・改善、又は心肥大や虚血性心疾患の予防・改善効果を発揮する飲食品、医薬品又は医薬部外品に有効成分として配合する素材として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ＰＰＡＲα活性化能を示したグラフ。図中、ＤＷは水抽出物、ＥｔＯＨは５０％エタノール抽出物、Ｈｅｘはヘキサン抽出物、Ｃｏｎｔは溶媒対照、ＷｙはＷｙ14643を示す。*は溶媒対照に対する有意差 Ｐ＜０．０５を示す。
【図２】ＰＰＡＲδ活性化能を示したグラフ。図中、ＤＷは水抽出物、ＥｔＯＨは５０％エタノール抽出物、Ｈｅｘはヘキサン抽出物、Ｃｏｎｔは溶媒対照、ＧＷはＧＷ501516を示す。*は溶媒対照に対する有意差 Ｐ＜０．０５を示す。
【図３】ＰＰＡＲγ活性化能を示したグラフ。図中、ＤＷは水抽出物、ＥｔＯＨは５０％エタノール抽出物、Ｈｅｘはヘキサン抽出物、Ｃｏｎｔは溶媒対照、Ｐｉｏはピオグリタゾンを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明において、大豆テンペ菌発酵物とは、インドネシアの伝統的な大豆発酵食品であるテンペ及び、大豆をテンペ菌で発酵させたものの総称である。大豆テンペ菌発酵物は、例えば、下記に記載されている手順に従って大豆をテンペ菌を用いて発酵させることにより製造してもよく、あるいは市販の大豆テンペ菌発酵物、例えば、テンペ、オカラテンペ等を購入してもよい。
【００２４】
ここで、テンペ菌としては、テンペの製造に一般的に用いられているものであれば特に限定されず、例えば、糸状菌であるリゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属の菌、好ましくは、リゾプス オリゴスポラス（Rhizopus oligosporus）、リゾプス オリゼ（Rhizopus oryzae）などを用いることができる。
【００２５】
本発明において、大豆とは、マメ科（Fabaceae）ダイズ属（Glycine）の一年草であるダイズの種子をいう。原料とする大豆は、食用、加工食品の原料用に用いられるものであれば、品種や産地はいずれのものでもよい。大豆は通常のテンペの製造法と同様に、発酵前に酸性溶液への浸漬、及び水又は水蒸気と共に加熱処理をおこなっておくことが好ましい。また、大豆は脱皮処理を行い、原料中に大豆の外皮が残存しないことが望ましい。脱皮は、原料大豆に脱皮大豆を用いることでおこなっても、浸漬又は加熱処理後に行ってもよい。
【００２６】
酸性溶液としては、例えば、酢酸、乳酸、クエン酸、酒石酸などの食用の有機酸、又はこれらの酸を含む食品（例えば、食酢など）を含む水溶液を用いることができる。使用する酸等の量は、大豆に付着した雑菌の増殖を抑制できる範囲内で、テンペ菌の生育を阻害しない濃度が好ましく、たとえば、酢酸であれば０．２〜０．５重量％が好ましい。
大豆の加熱処理時間は特に限定されないが、通常、煮沸処理の場合３０〜９０分であり、好ましくは、３０〜６０分である。
【００２７】
次いで、この大豆にテンペ菌を接種し、発酵させる。接種するテンペ菌の量は特に限定されないが、加熱処理後に冷却した大豆に対し、通常０．１〜３．０重量％、好ましくは０．２〜０．５重量％の種菌を接種する。
発酵時の温度は特に限定されないが、２０〜４５℃とするのが好ましく３０〜３７℃とするのがより好ましく、３１〜３２℃とするのが更に好ましい。発酵時の湿度は、６０％〜９９％であるのが好ましく、８０〜９８％であるのがより好ましい。
発酵時間は、温度、テンペ菌の接種量などにより異なるが、１０〜５０時間とするのが好ましく、１５〜３０時間とするのがより好ましく、２０〜２８時間とするのが更に好ましい。
【００２８】
上述の条件で、発酵を行うことにより本発明の大豆テンペ菌発酵物を得ることができる。当該大豆テンペ菌発酵物は、そのまま又は乾燥して抽出に用いることができる。
【００２９】
大豆テンペ菌発酵物の有機溶媒抽出物を得るために用いられる抽出溶媒としては、親水性溶媒、疎水性溶媒のいずれをも使用することができ、これらを混合して用いることもできるが、疎水性溶媒が好ましい。
当該有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール等のアルコール類；エチレングリコール、プロピレングリコール、ブチレングリコール等の多価アルコール類；ヘキサン、シクロヘキサン、石油エーテル等の炭化水素類；アセトニトリル、プロピオニトリル、ベンゾニトリル等のニトリル類；アセトン、メチルケトン等のケトン類；酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類；テトラヒドロキシフラン、ジエチルエーテル等の鎖状及び環状エーテル類；ポリエチレングリコール等のポリエーテル類；ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素等のハロゲン化炭化水素類；ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素類；ピリジン類；超臨界二酸化炭素；油脂；ワックス、その他オイル等が挙げられ、これらは単独で又は２種以上を組み合わせて使用でき、溶媒を変えて繰り返し行うこと（例えば、アルコール抽出物を更に他の有機溶媒にて抽出すること）も可能である。
これら溶媒のうち、アルコール類、ヘキサン及び水・低級アルコール類混合溶媒が好ましく、水・エタノール混合溶媒、エタノール及びヘキサンがより好ましく、ヘキサンが更に好ましい。
ここで、アルコール類は、炭素数１〜５の低級アルコール類が好ましく、炭素数１〜４の低級アルコール類がより好ましく、さらに好ましくは炭素数１〜３のアルコール類である。
【００３０】
水とアルコール類の溶媒容量比率については、水／アルコール類は１００／１〜１／１００が好ましい。更に好ましくは９０／１〜１／１００、なお好ましくは２／１〜１／１００である。
一例として、大豆テンペ菌発酵物から水・エタノール混合有機溶媒でＰＰＡＲα及び／又はδ活性化物質を抽出する場合、０．０１〜１００容量％エタノール水溶液が好ましく、１０〜１００容量％エタノール水溶液がより好ましく、３０〜１００容量％エタノール水溶液が更に好ましく、５０〜１００容量％エタノール水溶液がなお好ましい。
【００３１】
本発明で用いる大豆テンペ菌発酵物の有機溶媒抽出物は、大豆テンペ菌発酵物より有機溶媒を用いて常温（０〜３０℃）又は加温下で抽出することにより得られるものである。
大豆テンペ菌発酵物１質量部に対して、１／２〜１０質量部の有機溶媒を用いるのが好ましく、このときの抽出温度は、０〜４０℃が好ましく、１０〜３０℃がより好ましく、また抽出時間は１／１０〜１２時間が好ましく、１／２〜５時間がより好ましい。
当該抽出としては、固液抽出、浸漬、煎出、浸出、還流抽出、超音波抽出、マイクロ波抽出、攪拌等の手段を用いることができ、好ましくは攪拌を伴う固液抽出である。
【００３２】
斯くして得られる抽出物は、溶媒を除去した後そのまま使用できるが、公知の分離精製手段、例えば、活性炭処理、液々分配、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、ゲルろ過、精密蒸留等を行った後、適宜な溶媒で希釈した希釈液として用いてもよく、或いは濃縮エキスや乾燥粉末としたり、ペースト状に調製してもよい。
【００３３】
後記実施例に示すように、大豆をテンペ菌で発酵させて得られた発酵物を有機溶媒抽出することにより調製された大豆テンペ菌発酵物の有機溶媒抽出物は、ＰＰＡＲα及び／又はＰＰＡＲδに依存的な遺伝子の転写活性を亢進する作用を有する。前述のとおり、ＰＰＡＲα及び／又はＰＰＡＲδは、広く生体のエネルギー代謝や恒常性の維持に関わっており、特に脂質代謝に重要なβ酸化関連酵素（ＡＣＯ，ＨＭＧ-ＣｏＡ synthase，Ａｃｙｌ-ＣｏＡ synthase，Medium chain acyl-CoA dehydrogenase，Fatty acid binding protein，Lipoprotein lipase等）の遺伝子発現はＰＰＡＲα及び／又はＰＰＡＲδの活性化に強く依存していることから（非特許文献１〜１０、特許文献１〜７）、大豆のテンペ菌発酵物又はその抽出物は、脂肪酸代謝の活性化、体脂肪の燃焼促進、肥満の予防・改善、脂質異常症の予防・改善、脂肪肝の予防・改善、持久力向上、インスリン抵抗性や糖尿病の予防・改善、動脈硬化の予防・改善、心肥大や虚血性心疾患の予防・改善等に広く有効である。
【００３４】
従って、大豆テンペ菌発酵物の有機溶媒抽出物は、ＰＰＡＲα活性化作用及び／又はＰＰＡＲδ活性化作用を有するので、ＰＰＡＲα及び／又はＰＰＡＲδ活性化剤、脂肪酸代謝活性化剤、体脂肪燃焼促進剤、抗糖尿病剤、インスリン抵抗性予防・改善剤、又は持久力向上剤（以下、「ＰＰＡＲ活性化剤等」とする。）として使用することができ、ＰＰＡＲ活性化剤等の製造のために使用することができる。ＰＰＡＲ活性化剤等は、ＰＰＡＲα若しくはＰＰＡＲδ活性化、脂肪酸代謝活性化、体脂肪燃焼促進、脂肪肝抑制、抗糖尿病、インスリン抵抗性予防・改善又は持久力向上等の各効果を発揮する、ヒト若しくは動物用の食品、医薬品、医薬部外品又は化粧品の有効成分として使用可能である。また、大豆テンペ菌発酵物の有機溶媒抽出物は、ＰＰＡＲα若しくはＰＰＡＲδ活性化、脂肪酸代謝活性化、体脂肪燃焼促進、脂肪肝抑制、抗糖尿病、インスリン抵抗性予防・改善又は持久力向上等をコンセプトとし、必要に応じてその旨を表示した食品、機能性食品、病者用食品、特定保健用食品に応用できる。
【００３５】
さらに、本発明によれば、大豆をテンペ菌で発酵させ、得られた発酵物から有機溶媒抽出物を調製することによる、ＰＰＡＲα及び／又はＰＰＡＲδ活性化剤の製造方法が提供される。さらに本発明によれば、大豆をテンペ菌で発酵させ、得られた発酵物から有機溶媒抽出物を調製することによる、脂肪酸代謝活性化剤、体脂肪燃焼促進剤、抗糖尿病剤、インスリン抵抗性予防・改善剤、持久力向上剤等の製造方法が提供される。
【００３６】
本発明のＰＰＡＲ活性化剤等を医薬品、医薬部外品の有効成分として用いる場合の投与形態としては、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与又は注射剤、坐剤、吸入薬、経皮吸収剤、外用剤等による非経口投与が挙げられる。
また、このような種々の剤型の製剤を調製するには、本発明の大豆テンペ菌発酵物の有機溶媒抽出物を単独で、又は他の薬学的に許容される賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、嬌味剤、香料、被膜剤、担体、希釈剤等を適宜組み合わせて用いることができる。
また、これらの投与形態のうち、好ましい形態は経口投与であり、経口用液体製剤を調製する場合は、嬌味剤、緩衝剤、安定化剤等を加えて常法により製造することができる。
【００３７】
本発明のＰＰＡＲ活性化剤等を化粧品の有効成分として用いる場合には、皮膚外用剤、洗浄剤、入浴剤、又はメイクアップ化粧料等とすることができ、使用方法に応じて、これらを、美容液、化粧水、マッサージ剤、ローション、乳液、ゲル、クリーム、軟膏剤、粉末剤、パック、パップ剤、顆粒剤、ファンデーション、口紅、シャンプー、コンディショナー、ヘアトニック、錠剤、カプセル、シート状製品等の種々の剤型で提供することができる。このような種々の剤型の化粧品を調製するには、本発明の大豆テンペ菌発酵物の有機溶媒抽出物を単独で、又は化粧料に配合される、外用基材、油又は油状物質、保湿剤、粉体、色素、乳化剤、可溶化剤、洗浄剤、紫外線吸収剤、増粘剤、薬効成分、香料、樹脂、防菌防黴剤、アルコール類、キレート類、無機酸、有機酸、ビタミン類、水溶性高分子、界面活性剤等を適宜組み合わせて用いることができる。
【００３８】
本発明のＰＰＡＲ活性化剤等を食品の有効成分として用いる場合の形態としては、パン類、ケーキ類、麺類、菓子類、ゼリー類、冷凍食品、アイスクリーム類、乳製品、飲料、スープ類等の各種食品の他、上述した経口投与製剤と同様の形態（錠剤、カプセル剤、シロップ等）が挙げられる。
飲料は、例えば、果汁飲料、炭酸飲料、茶系飲料、ニアウオーター、スポーツ飲料、乳飲料、アルコール飲料、清涼飲料等が挙げられる。また、飲料は、容器に充填した容器詰飲料とすることができる。
食用油としては、調理用油、調味料、マヨネーズ、ドレッシング、マーガリン等の油脂加工品類、パスタソース類等が挙げられる。
また、このような種々の形態の食品を調製するには、本発明のＰＰＡＲ活性化剤等を単独で、又は他の食品材料や、溶剤、軟化剤、油、乳化剤、防腐剤、香科、安定剤、着色剤、酸化防止剤、保湿剤、増粘剤等を適宜組み合わせて、ＰＰＡＲα及び／又はＰＰＡＲδ活性化用食品、脂肪酸代謝活性化用食品、肥満抑制用食品、脂肪肝抑制用食品、糖尿病予防・改善用食品、インスリン抵抗性予防・改善用食品、血糖値上昇抑制用食品、持久力向上用食品、ペットフード等として用いることが可能である。
【００３９】
これらのものに対するＰＰＡＲ活性化剤等の配合量はその使用形態により異なるが、食品の形態では、全組成中、大豆テンペ菌発酵物抽出物の乾燥物換算で通常０．０００１〜１０質量％、さらに０．００１〜５質量％、さらになお０．００２〜２質量％とするのが好ましい。
例えば飲料の場合では、飲料中にＰＰＡＲ活性化剤等は、全組成中、大豆テンペ菌発酵物抽出物の乾燥物換算で、０．００１〜０．５質量％、さらに０．００５〜０．２５質量％、さらになお０．０１〜０．１質量％とするのが好ましい。タブレット等の食品錠剤及び／またはカプセル剤の場合では、ＰＰＡＲ活性化剤等が、全組成中、大豆テンペ菌発酵物抽出物の乾燥物換算で、０．１〜９５質量％、さらに１〜９０質量％、さらになお５〜５０質量％含有しているものが好ましい。
上記以外の医薬品、例えば錠剤、顆粒剤、カプセル剤等の経口用固形製剤、内服液剤、シロップ剤等の経口用液体製剤の場合には、全組成中、大豆テンペ菌発酵物抽出物の乾燥物換算で通常０．０１〜９５質量％、さらに５〜９０質量％、さらになお１０〜５０質量％とするのが好ましい。
化粧品の場合には、全組成中、大豆テンペ菌発酵物抽出物の乾燥物換算で通常０．００００１〜５質量％、さらに０．０００１〜３質量％、さらになお０．００１〜１質量％とするのが好ましい。
【００４０】
ＰＰＡＲ活性化剤等の投与量（有効摂取量）は、大豆テンペ菌発酵物抽出物の乾燥物換算で一日あたり１〜５０００ｍｇ／６０ｋｇ体重とするのが好ましい。更に好ましくは５〜３０００ｍｇ／６０ｋｇ体重であり、なお好ましくは１０〜２０００ｍｇ／６０ｋｇ体重であり、１００〜１０００ｍｇ／６０ｋｇ体重とするのがさらになお好ましい。
本発明のＰＰＡＲ活性化剤等を投与又は摂取することにより、ＰＰＡＲα及び／又はＰＰＡＲδを活性化し、脂肪酸代謝の活性化、体脂肪の燃焼促進、肥満の予防・改善、脂質異常症の予防・改善、脂肪肝の予防・改善、持久力向上、インスリン抵抗性や糖尿病の予防・改善、動脈硬化の予防・改善等を促すことができる。従って、そのための方法に本発明のＰＰＡＲ活性化剤等を使用することができる。投与又は摂取対象としては、それを必要としているヒトまたは動物であれば特に限定されないが、肥満、脂質異常症、脂肪肝、インスリン抵抗性、糖尿病や動脈硬化の患者やその予備軍、持久力の低下した者などが挙げられる。
【実施例】
【００４１】
（製造例１）テンペのヘキサン抽出物の調製
テンペ（Mariza、市販品を購入）５０ｇを細かく砕き、ヘキサン１００ｍＬを加えて室温（２０℃）で２時間攪拌し、ヘキサン相を濾過した後ロータリーエバポレーターにより濃縮し、０．４２ｇの抽出物を得た。
次いで、得られた抽出物を濃度が１％（ｗ／ｖ）となるようにエタノールに溶解した。
【００４２】
（製造例２）テンペの５０％エタノール抽出物の調製
テンペ（Mariza、市販品を購入）５０ｇを細かく砕き、５０％エタノール１００ｍＬを加えて室温（２０℃）で２時間攪拌し、ろ液をロータリーエバポレーターにより濃縮し、１．７０ｇの抽出物を得た。
次いで、得られた抽出物を濃度が１％（ｗ／ｖ）となるようにエタノールに溶解した。
【００４３】
（比較製造例１）テンペの水抽出物の調製
テンペ（Mariza、市販品を購入）５０ｇを細かく砕き、水１００ｍＬを加えて室温（２０℃）で２時間攪拌し、ろ液を凍結乾燥により濃縮し、１．６１ｇの抽出物を得た。
次いで、得られた抽出物を濃度が１％（ｗ／ｖ）となるようにエタノールに溶解した。
（比較製造例２）大豆のヘキサン抽出物の調製
蒸煮した大豆２０ｇにヘキサン５０ｍＬを加えて室温（２０℃）で２時間攪拌し、ヘキサン相を濾過した後ロータリーエバポレーターにより濃縮し０．１０ｇの抽出物を得た。
次いで、得られた抽出物を濃度が１％（ｗ／ｖ）となるようにエタノールに溶解した。
（比較製造例３）大豆の水抽出物の調製
蒸煮した大豆２０ｇに水５０ｍＬを加えて室温（２０℃）で２時間攪拌し、ろ液を凍結乾燥により濃縮し、０．６８ｇの抽出物を得た。
次いで、得られた抽出物を濃度が１％（ｗ／ｖ）となるようにエタノールに溶解した。
（比較製造例４）大豆の５０％エタノール抽出物の調製
蒸煮した大豆２０ｇに５０％エタノール５０ｍＬを加えて室温（２０℃）で２時間攪拌し、ろ液をロータリーエバポレーターにより濃縮し、０．６４ｇの抽出物を得た。
次いで、得られた抽出物を濃度が１％（ｗ／ｖ）となるようにエタノールに溶解した。
【００４４】
これら抽出物を以下の実施例１〜３の被検物質として用いた。
【００４５】
実施例１：ＰＰＡＲα活性化試験
Ｈｕｍａｎ ｃｏｌｏｎ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ（Clontech）を用い、ＰＣＲを行ってＰＰＡＲαリガンド結合部位（NCBI RefSeq NM_001001928, nt183-1586、配列番号１）を増幅した。ＰＣＲ増幅産物をｐＣＲ Ｂｌｕｎｔ（Invitrogen）にクローニングし、制限酵素（ＭｌｕＩ、ＫｐｎＩ；Takara）処理によりＤＮＡ断片を調製した。調製したＤＮＡ断片をｐＢＩＮＤ ｖｅｃｔｏｒ（Promega）のマルチクローニングサイト（ＭｌｕＩ／ＫｐｎＩ）に挿入し、ｐＢＩＮＤ−ＰＰＡＲα ＬＢＤを得た。本ベクターは細胞に導入するとＰＰＡＲαリガンド結合部位とＧＡＬ４のＤＮＡ結合部位の融合蛋白質を発現し、当該融合蛋白質はＰＰＡＲαリガンドと結合することによりＧＡＬ４結合配列に結合し、その下流の遺伝子の転写を活性化するものである。また本ベクターには別途ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子が組み込まれており、ベクターの導入効率を求めることができる。
アフリカミドリザル腎細胞株ＣＶ-１を２４穴プレートにまき、ＤＭＥＭ（５％ チャコール処理ウシ胎児血清）中で１日培養した。ホタルルシフェラーゼ遺伝子の上流にＧＡＬ４結合配列を含むレポータープラスミド(ｐＧ５−Ｌｕｃ； Promega)、およびｐＢＩＮＤ−ＰＰＡＲα ＬＢＤを同時に各々０．２μｇ／ｗｅｌｌとなるようトランスフェクション試薬（Superfect transfection reagent；ＱＩＡＧＥＮ）を用いて導入した。その後、培養液を、被験物質を０．００２％（ｗ／ｖ）含むＤＭＥＭ（-ウシ胎児血清）培地に交換し、さらに１日培養した。被験物質としては、製造例１〜２、ならびに比較製造例１〜５で得た抽出物を用い、対照（Control）として同量の溶媒（エタノール）を用いた。陽性対照として、Ｗｙ１４６４３（BIOMOL （Plymouth Meeting DA）より入手したもの）１０μＭを用いた。
ＰＢＳにて洗浄後、デュアルルシフェラーゼアッセイシステム（Promega）を用いて細胞を溶解、溶解液にルシフェリンを含む基質溶液を加え、ルミノメーターにてホタル及びウミシイタケルシフェラーゼ活性を各々測定した。ＰＰＡＲα依存的な遺伝子の転写活性（ルシフェラーゼ活性）は以下のように定義した。
【００４６】
ＰＰＡＲα依存的な遺伝子の転写活性（ルシフェラーゼ活性）
＝（ｐＧ５−Ｌｕｃによるホタルルシフェラーゼ活性）／（ｐＢＩＮＤ−ＰＰＡＲα ＬＢＤによるウミシイタケルシフェラーゼ活性）
【００４７】
各被験物質によるＰＰＡＲα活性化能を図１に示す。尚、コントロールにおけるＰＰＡＲα依存的転写活性を１とし、それに対する相対値を示す。
【００４８】
図１より、大豆のテンペ菌発酵物の５０％エタノール抽出物及びヘキサン抽出物にＰＰＡＲα活性化能があることがわかる。特に、疎水性溶媒であるヘキサン抽出物の活性が高いことがわかる。また、大豆の抽出物には活性がなく、テンペ菌による発酵が必要であることがわかる。
【００４９】
実施例２：ＰＰＡＲδ活性化試験
実施例１と同様にして、ＰＰＡＲδ活性化試験を行なった。
Ｒａｔ ＩＥＣ−６ ｔｏｔａｌ ＲＮＡを用い、ＰＣＲを行ってＰＰＡＲδリガンド結合部位（NCBI RefSeq NM_011145, nt690-1595、配列番号２）を増幅した。ＰＣＲ増幅産物をｐＣＲ Ｂｌｕｎｔ（Invitrogen）にクローニングし、制限酵素（ＭｌｕＩ、ＫｐｎＩ；Takara）処理によりＤＮＡ断片を調製した。調製したＤＮＡ断片をｐＢＩＮＤ ｖｅｃｔｏｒ（Invitrogen）のマルチクローニングサイト（ＭｌｕＩ／ＫｐｎＩ）に挿入し、ｐＢＩＮＤ−ＰＰＡＲδ ＬＢＤを得た。
実施例１と同様の手順で上記ベクター導入した細胞を被験物質とともに培養し、ルシフェラーゼ活性を測定した。陽性対照としては、ＧＷ５０１５１６（ALEXIS BIOCHEMICALS）１ｎＭを用いた。ＰＰＡＲδ依存的な遺伝子の転写活性（ルシフェラーゼ活性）は以下のように定義した。
【００５０】
ＰＰＡＲδ依存的な遺伝子の転写活性（ルシフェラーゼ活性）
＝（ｐＧ５−Ｌｕｃによるホタルルシフェラーゼ活性）／（ｐＢＩＮＤ−ＰＰＡＲδ ＬＢＤによるウミシイタケルシフェラーゼ活性）
【００５１】
各被験物質によるＰＰＡＲδ活性化能を図２に示す。尚、コントロールにおけるＰＰＡＲδ依存的転写活性を１とし、それに対する相対値を示す。
【００５２】
図２より、大豆テンペ菌発酵物の５０％エタノール抽出物及びヘキサン抽出物にＰＰＡＲα活性化能があることがわかる。特に、疎水性溶媒であるヘキサン抽出物の活性が高いことがわかる。
【００５３】
実施例３：ＰＰＡＲγ活性化試験
実施例１と同様にして、ＰＰＡＲγ活性化試験を行なった。
Ｈｕｍａｎ ｃｏｌｏｎ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ（Clontech）を用い、ＰＣＲを行ってＰＰＡＲγ２リガンド結合部位（NCBI RefSeq NM_015869, nt703-1606、配列番号３）を増幅した。ＰＣＲ増幅産物をｐＣＲ Ｂｌｕｎｔ（Invitrogen）にクローニングし、制限酵素（ＭｌｕＩ、ＫｐｎＩ；Takara）処理によりＤＮＡ断片を調製した。調製したＤＮＡ断片をｐＢＩＮＤ ｖｅｃｔｏｒ（Invitrogen）のマルチクローニングサイト（ＭｌｕＩ／ＫｐｎＩ）に挿入し、ｐＢＩＮＤ−ＰＰＡＲγ ＬＢＤを得た。
実施例１と同様の手順で上記ベクター導入した細胞を被験物質とともに培養し、ルシフェラーゼ活性を測定した。陽性対照としては、ピオグリタゾン（CAYMAN）１０μＭを用いた。ＰＰＡＲγ依存的な遺伝子の転写活性（ルシフェラーゼ活性）は以下のように定義した。
【００５４】
ＰＰＡＲγ依存的な遺伝子の転写活性（ルシフェラーゼ活性）
＝（ｐＧ５−Ｌｕｃによるホタルルシフェラーゼ活性）／（ｐＢＩＮＤ−ＰＰＡＲγ ＬＢＤによるウミシイタケルシフェラーゼ活性）
【００５５】
各被験物質によるＰＰＡＲγ活性化能を図３に示す。尚、コントロールにおけるＰＰＡＲγ依存的転写活性を１とし、それに対する相対値を示す。
【００５６】
図３より、大豆テンペ菌発酵物の有機溶媒抽出物は、ＰＰＡＲγを活性化しないことがわかる。
【００５７】
以上のように、大豆テンペ菌発酵物の有機溶媒抽出物は、ＰＰＡＲα活性化作用及びＰＰＡＲδ活性化作用を有するがＰＰＡＲγ活性化作用は有しておらず、ＰＰＡＲα及びＰＰＡＲδに特異性が高いことがわかる。すなわち、ＰＰＡＲα及びＰＰＡＲδ選択的活性化剤として用いることができる。
更に、大豆テンペ菌発酵物の有機溶媒抽出物は、ＰＰＡＲα又はＰＰＡＲδ活性化作用を有するので、前述のとおり、脂肪酸代謝の活性化、体脂肪の燃焼促進、肥満の予防・改善、脂質異常症の予防・改善、脂肪肝の予防・改善、持久力向上、インスリン抵抗性や糖尿病の予防・改善、動脈硬化の予防・改善等に有効であると考えられる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂肪酸代謝活性化、体脂肪燃焼促進、肥満抑制、脂肪肝抑制、インスリン抵抗性予防・改善、血糖値上昇抑制、持久力向上に有効なペルオキシソーム増殖剤活性化受容体（Peroxisome Proliferator Activated Receptor、ＰＰＡＲと記載する）活性化剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ステロイド、甲状腺ホルモン、レチノイドなどの低分子脂溶性リガンドはリガンド特異的な核内受容体を介して、個体発生における形態形成、細胞の増殖、分化、生体の恒常性の維持など多様な生理機能の調節に関与している。ＰＰＡＲは核内受容体の１種であり、１９９０年に脂肪分解に関与する細胞内小器官であるペルオキシソームを増加させる作用を仲介する蛋白として同定され、ペルオキシソーム増殖剤により活性化を受けるレセプターという意味でPeroxisome Proliferator Activated Receptorα（ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体：ＰＰＡＲα）と名付けられた。その後α型と構造上類似したアイソフォーム遺伝子としてδ型及びγ型が同定され、合計３つのサブタイプから成ることが知られている。
【０００３】
ＰＰＡＲの各サブタイプはリガンド依存的に活性化され、９−シスレチノイン酸をリガンドとするＲＸＲ（Retinoid X Receptor）とヘテロ２量体を形成することで、プロモーター領域にＰＰＡＲ応答配列（ＰＰＡＲ responsivelement；ＰＰＲＥ）を有する種々の遺伝子の発現を制御している（非特許文献１及び２）。
例えば、脂肪酸β酸化の鍵酵素として知られるＡＣＯ（Acyl-CoA oxidase）のＰＰＲＥを用いたレポーターアッセイがなされており、それによると、ＰＰＡＲリガンドとして知られるリノール酸は、ＰＰＡＲα、δ、γのそれぞれを介してＡＣＯ転写活性を亢進することが報告されている（非特許文献３）。
以下で述べるように、近年、ＰＰＡＲは非常に多くの生理、病理現象に関わっていることが明らかになってきた。
【０００４】
具体的には、ＰＰＡＲαの機能は脂肪酸の合成・輸送・分泌、脂肪消費臓器におけるＡＴＰ産生等幅広く生体のエネルギー代謝や恒常性の維持に関わるものと考えられている。特に脂肪酸代謝に重要なβ酸化関連酵素 （ＡＣＯ，ＨＭＧ-ＣｏＡ synthase，Ａｃｙｌ-ＣｏＡ synthase，Medium chain acyl-CoA dehydrogenase，Fatty acid binding protein，Lipoprotein lipase等）の遺伝子発現はＰＰＡＲαの活性化に強く依存していることが明らかになっている。ＰＰＡＲαは肝臓、心臓、腎臓等での発現が高く、ＰＰＡＲα活性化剤はこれらの臓器の脂質代謝の活性化に有効であると広く認識されている。
【０００５】
ＰＰＡＲαの活性化に伴う脂肪酸代謝の活性化は、肝臓脂肪の分解、脂肪肝の改善、内臓脂肪や皮下脂肪等の体脂肪の分解・燃焼の促進、肥満の抑制につながると考えられる。ＰＰＡＲα活性化剤として知られるフィブラート系の薬剤は、脂肪酸燃焼の促進作用、ＨＤＬコレステロール増加作用、そして最近ではアディポネクチン受容体発現増加作用等を持つことが明らかとなってきており、インスリン非依存性糖尿病の高血糖症、脂質異常症、高血糖症、アテローム性動脈硬化症等の治療薬として広く用いられている（非特許文献４、特許文献１及び２）。また、ＰＰＡＲα活性化剤が心肥大や虚血性心疾患に効果があることが報告されている（非特許文献５、６）。
【０００６】
従って、ＰＰＡＲα活性化剤は、脂肪酸代謝の活性化、体脂肪の燃焼促進、肥満の予防・改善、脂質異常症の予防・改善、脂肪肝の予防・改善、インスリン抵抗性や糖尿病の予防・改善、動脈硬化の予防・改善、心肥大や虚血性心疾患の予防・改善等に広く有効であると考えられており、近年、ＰＰＡＲα活性化剤の探索、開発も盛んに行われている（特許文献３〜５）。
【０００７】
ＰＰＡＲδ（別名：ＰＰＡＲβ、ＮＵＣ１、ＦＡＡＲ）は１９９２年にクローニングされて以来、長らく機能が明らかにされていなかったが、近年、遺伝子改変動物を用いた研究やＰＰＡＲδ選択的な作動薬の開発などにより様々な生理機能を持つことが明らかになってきた。ＰＰＡＲδを過剰発現させたマウスを用いた検討では、高脂肪食負荷による体重増加の抑制、脂肪重量の減少、血中中性脂肪の減少、脂肪肝の抑制が認められている（非特許文献７）。ＰＰＡＲδ選択的な作動薬であるＧＷ５０１５１６を肥満アカゲザルに投与した実験では、ＨＤＬコレステロールを上昇させ、中性脂肪、ＬＤＬコレステロールを低下させた（非特許文献８）。
【０００８】
また、ＧＷ５０１５１６を骨格筋由来細胞に作用させ、細胞の遺伝子発現への影響を検討した結果では、脂肪酸の取り込みや輸送、ミトコンドリアのβ酸化系酵素、脱共役タンパク質等の脂肪酸代謝関連遺伝子の発現を誘導することが示されている。さらにＧＷ５０１５１６を投与したマウスにおいては、脂肪組織特異的ＰＰＡＲδ過剰発現マウスと同様に高脂肪食負荷による体重増加の抑制、脂肪重量の減少が認められ、インスリン抵抗性改善効果を示すことも明らかにされている。このマウスの骨格筋においては脂肪酸代謝関連遺伝子および脂肪酸β酸化の誘導が確認されていることから、ＰＰＡＲδの活性化によって、骨格筋のエネルギー消費が増大することにより末梢組織中の脂肪蓄積が抑制され、それによりインスリン抵抗性が改善されるのではないかと考えられている（非特許文献９）。また、遺伝的肥満マウスにＧＷ５０１５１６を投与することにより、膵島の肥大が抑制されたことから、膵島の保護作用があると考えられている（非特許文献９）。
【０００９】
また、骨格筋特異的にＰＰＡＲδを過剰発現することにより、肥満やインスリン抵抗性が抑制されることが報告されている。さらに驚くことに、このマウスの骨格筋では一般的に赤筋と呼ばれるミトコンドリアを多く含む持久性の高い筋繊維の割合が非常に高くなっており、その結果、このマウスは、コントロールマウスの約２倍の距離を走ることができるという大変優れた持久力を持つマウスであることが示されている（非特許文献１０）。従って、ＰＰＡＲδの活性化は、運動持久力の向上に有効であると考えられるようになった。
【００１０】
また最近では、肝臓においてＰＰＡＲδがインスリン感受性を制御しているという報告もなされており、そのメカニズムとして、ＰＰＡＲδの活性化が肝臓の解糖系およびペントースリン酸回路の活性化を介して肝臓からのグルコースの供給を減少させ、インスリン感受性を増加することが示唆されている（非特許文献１１）。
【００１１】
このように、ＰＰＡＲδの活性化は、ＨＤＬコレステロールの上昇、ＬＤＬコレステロールの低下、肥満の抑制、インスリン抵抗性の改善／インスリン感受性の向上、脂肪酸代謝の活性化、体脂肪の燃焼促進、血中中性脂肪の減少、脂肪肝の抑制、持久力の向上等につながる事から、ＰＰＡＲδの活性化剤は、動脈硬化の予防・改善剤、肥満の予防・改善剤、インスリン抵抗性の予防・改善剤、脂肪酸酸化活性化剤、体脂肪燃焼促進剤、脂質異常症予防・改善剤、脂肪肝予防・改善剤、持久力向上剤として有効であると考えられている。
そのため、このような目的でＰＰＡＲδ活性化剤の探索、開発も盛んに行われ、これまでにフラボン類、フェノキシ酢酸誘導体等が報告されている（特許文献６及び７）。
【００１２】
ＰＰＡＲγは栄養が十分にある状態でエネルギー貯蔵に作用し、いわゆる倹約遺伝子として働く分子である。特にＰＰＡＲγ２は脂肪細胞に比較的強い特異性を持って発現しており、脂肪細胞分化の中心的役割を果たしていることが明らかになっている。ＰＰＡＲγのリガンドとして知られるチアゾリジン誘導体は脂肪細胞分化を強力に誘導することにより、脂肪細胞を小型化してインスリン感受性を高めることが知られており、インスリン抵抗性改善剤、糖尿病治療薬として広く使用されている。しかし、チアゾリジン誘導体の投与は体重や脂肪重量を増やし、肥満を誘導する問題点も指摘されている（非特許文献１２）。
【００１３】
このように、ＰＰＡＲ活性化剤は、脂肪酸代謝の活性化、体脂肪の燃焼促進、肥満の予防・改善、脂質異常症の予防・改善、脂肪肝の予防・改善、持久力向上、インスリン抵抗性や糖尿病の予防・改善、動脈硬化の予防・改善、心肥大や虚血性心疾患の予防・改善などに広く有効であり、いわゆる生活習慣病や内臓脂肪症候群（メタボリックシンドローム）の予防・改善にも有効であると考えられる。
【００１４】
一方、インドネシアの伝統的な大豆発酵食品であるテンペには蛋白質、食物繊維、アミノ酸、ビタミン類（ビタミンＥ、Ｂ群ビタミン）、鉄などのミネラル類、イソフラボン類等が含まれており、栄養価に富む食品である（特許文献８）。テンペは大豆をテンペ菌で発酵させた発酵食品である。テンペに含まれているこれら成分の有効性から、テンペはコレステロール上昇抑制作用、肝脂肪蓄積予防作用、抗肥満作用、溶血防止作用、整腸作用があることが示唆されている（特許文献８）。また、テンペには血圧上昇抑制作用、中性脂質低下作用、抗肥満作用、精神安定作用、更年期障害の改善作用、睡眠促進作用、アルコール・アルデヒド代謝作用、消臭作用が報告されているγ−アミノ酪酸を高濃度に含有することが報告されている（特許文献９）。
【００１５】
しかしながら、大豆テンペ菌発酵物の有機溶媒抽出物がＰＰＡＲ活性化に関与し、脂肪酸代謝の活性化、体脂肪の燃焼促進等に有効であることは知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】特表2002-502869号公報
【特許文献２】特表2002-533410号公報
【特許文献３】特開2001-354558号公報
【特許文献４】特開2002-80362号公報
【特許文献５】特開2003-34636号公報
【特許文献６】特開2007-119429号公報
【特許文献７】特表2007-536343号公報
【特許文献８】特開平6-133717号公報
【特許文献９】国際公開第01/093696号パンフレット
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】細胞:31(6)218-234, 1999
【非特許文献２】J Lipid Res. 37, 907-925, 1996
【非特許文献３】J Biol Chem. 274, 23368-23377, 1999
【非特許文献４】Curr Opin Lipidol. 10, 151-159, 1999
【非特許文献５】Endcrinology 144, 4187-4194, 2003
【非特許文献６】Circulation 108, 2393-2399, 2003
【非特許文献７】Cell. 113, 159-170, 2003
【非特許文献８】Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 5306-5311, 2001
【非特許文献９】Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 15924-15929, 2003
【非特許文献１０】PloS Biol. 2, e294, 2004
【非特許文献１１】Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 3444-3449, 2006
【非特許文献１２】Diabetes. 49, 759-767, 2000
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明は、優れたＰＰＡＲ活性化作用を有し、且つ安全性の高い食品、医薬品又は医薬部外品を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明者らは、食経験が豊富な天然物素材の中から、大豆テンペ菌発酵物の有機溶媒抽出物にＰＰＡＲα活性化作用及びＰＰＡＲδ活性化作用があり、脂肪酸代謝活性化、体脂肪燃焼促進、インスリン抵抗性予防・改善、持久力向上、肥満抑制、脂肪肝抑制、動脈硬化予防・改善、心肥大や虚血性心疾患の予防・改善効果を発揮する食品、医薬品又は医薬部外品の有効成分として配合する素材として有用であることを見出した。
【００２０】
すなわち、本発明は以下の発明に係るものである。
〔１〕大豆テンペ菌発酵物の有機溶媒抽出物を有効成分とするＰＰＡＲα及び／又はＰＰＡＲδ活性化剤。
〔２〕大豆テンペ菌発酵物の有機溶媒抽出物を有効成分とする持久力向上剤。
〔３〕大豆テンペ菌発酵物の有機溶媒抽出物を有効成分とする脂肪酸代謝活性化剤。
〔４〕大豆テンペ菌発酵物の有機溶媒抽出物を有効成分とする体脂肪燃焼促進剤。
〔５〕大豆テンペ菌発酵物の有機溶媒抽出物を有効成分とするインスリン抵抗性予防・改善剤。
〔６〕大豆テンペ菌発酵物の有機溶媒抽出物を有効成分とする糖尿病予防・改善剤。
〔７〕大豆をテンペ菌で発酵させ、得られた発酵物から有機溶媒抽出物を調製することによるＰＰＡＲα及び／又はＰＰＡＲδ活性化剤の製造方法。
【発明の効果】
【００２１】
本発明のＰＰＡＲ活性化剤は、優れたＰＰＡＲ活性化作用を有し、かつ長期間摂取しても安全性も高いことから、脂肪酸代謝活性化、体脂肪燃焼促進、インスリン抵抗性予防・改善、持久力向上、肥満抑制、脂肪肝抑制、動脈硬化予防・改善、又は心肥大や虚血性心疾患の予防・改善効果を発揮する飲食品、医薬品又は医薬部外品に有効成分として配合する素材として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ＰＰＡＲα活性化能を示したグラフ。図中、ＤＷは水抽出物、ＥｔＯＨは５０％エタノール抽出物、Ｈｅｘはヘキサン抽出物、Ｃｏｎｔは溶媒対照、ＷｙはＷｙ14643を示す。*は溶媒対照に対する有意差 Ｐ＜０．０５を示す。
【図２】ＰＰＡＲδ活性化能を示したグラフ。図中、ＤＷは水抽出物、ＥｔＯＨは５０％エタノール抽出物、Ｈｅｘはヘキサン抽出物、Ｃｏｎｔは溶媒対照、ＧＷはＧＷ501516を示す。*は溶媒対照に対する有意差 Ｐ＜０．０５を示す。
【図３】ＰＰＡＲγ活性化能を示したグラフ。図中、ＤＷは水抽出物、ＥｔＯＨは５０％エタノール抽出物、Ｈｅｘはヘキサン抽出物、Ｃｏｎｔは溶媒対照、Ｐｉｏはピオグリタゾンを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明において、大豆テンペ菌発酵物とは、インドネシアの伝統的な大豆発酵食品であるテンペ及び、大豆をテンペ菌で発酵させたものの総称である。大豆テンペ菌発酵物は、例えば、下記に記載されている手順に従って大豆をテンペ菌を用いて発酵させることにより製造してもよく、あるいは市販の大豆テンペ菌発酵物、例えば、テンペ、オカラテンペ等を購入してもよい。
【００２４】
ここで、テンペ菌としては、テンペの製造に一般的に用いられているものであれば特に限定されず、例えば、糸状菌であるリゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属の菌、好ましくは、リゾプス オリゴスポラス（Rhizopus oligosporus）、リゾプス オリゼ（Rhizopus oryzae）などを用いることができる。
【００２５】
本発明において、大豆とは、マメ科（Fabaceae）ダイズ属（Glycine）の一年草であるダイズの種子をいう。原料とする大豆は、食用、加工食品の原料用に用いられるものであれば、品種や産地はいずれのものでもよい。大豆は通常のテンペの製造法と同様に、発酵前に酸性溶液への浸漬、及び水又は水蒸気と共に加熱処理をおこなっておくことが好ましい。また、大豆は脱皮処理を行い、原料中に大豆の外皮が残存しないことが望ましい。脱皮は、原料大豆に脱皮大豆を用いることでおこなっても、浸漬又は加熱処理後に行ってもよい。
【００２６】
酸性溶液としては、例えば、酢酸、乳酸、クエン酸、酒石酸などの食用の有機酸、又はこれらの酸を含む食品（例えば、食酢など）を含む水溶液を用いることができる。使用する酸等の量は、大豆に付着した雑菌の増殖を抑制できる範囲内で、テンペ菌の生育を阻害しない濃度が好ましく、たとえば、酢酸であれば０．２〜０．５重量％が好ましい。
大豆の加熱処理時間は特に限定されないが、通常、煮沸処理の場合３０〜９０分であり、好ましくは、３０〜６０分である。
【００２７】
次いで、この大豆にテンペ菌を接種し、発酵させる。接種するテンペ菌の量は特に限定されないが、加熱処理後に冷却した大豆に対し、通常０．１〜３．０重量％、好ましくは０．２〜０．５重量％の種菌を接種する。
発酵時の温度は特に限定されないが、２０〜４５℃とするのが好ましく３０〜３７℃とするのがより好ましく、３１〜３２℃とするのが更に好ましい。発酵時の湿度は、６０％〜９９％であるのが好ましく、８０〜９８％であるのがより好ましい。
発酵時間は、温度、テンペ菌の接種量などにより異なるが、１０〜５０時間とするのが好ましく、１５〜３０時間とするのがより好ましく、２０〜２８時間とするのが更に好ましい。
【００２８】
上述の条件で、発酵を行うことにより本発明の大豆テンペ菌発酵物を得ることができる。当該大豆テンペ菌発酵物は、そのまま又は乾燥して抽出に用いることができる。
【００２９】
大豆テンペ菌発酵物の有機溶媒抽出物を得るために用いられる抽出溶媒としては、親水性溶媒、疎水性溶媒のいずれをも使用することができ、これらを混合して用いることもできるが、疎水性溶媒が好ましい。
当該有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール等のアルコール類；エチレングリコール、プロピレングリコール、ブチレングリコール等の多価アルコール類；ヘキサン、シクロヘキサン、石油エーテル等の炭化水素類；アセトニトリル、プロピオニトリル、ベンゾニトリル等のニトリル類；アセトン、メチルケトン等のケトン類；酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類；テトラヒドロキシフラン、ジエチルエーテル等の鎖状及び環状エーテル類；ポリエチレングリコール等のポリエーテル類；ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素等のハロゲン化炭化水素類；ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素類；ピリジン類；超臨界二酸化炭素；油脂；ワックス、その他オイル等が挙げられ、これらは単独で又は２種以上を組み合わせて使用でき、溶媒を変えて繰り返し行うこと（例えば、アルコール抽出物を更に他の有機溶媒にて抽出すること）も可能である。
これら溶媒のうち、アルコール類、ヘキサン及び水・低級アルコール類混合溶媒が好ましく、水・エタノール混合溶媒、エタノール及びヘキサンがより好ましく、ヘキサンが更に好ましい。
ここで、アルコール類は、炭素数１〜５の低級アルコール類が好ましく、炭素数１〜４の低級アルコール類がより好ましく、さらに好ましくは炭素数１〜３のアルコール類である。
【００３０】
水とアルコール類の溶媒容量比率については、水／アルコール類は１００／１〜１／１００が好ましい。更に好ましくは９０／１〜１／１００、なお好ましくは２／１〜１／１００である。
一例として、大豆テンペ菌発酵物から水・エタノール混合有機溶媒でＰＰＡＲα及び／又はδ活性化物質を抽出する場合、０．０１〜１００容量％エタノール水溶液が好ましく、１０〜１００容量％エタノール水溶液がより好ましく、３０〜１００容量％エタノール水溶液が更に好ましく、５０〜１００容量％エタノール水溶液がなお好ましい。
【００３１】
本発明で用いる大豆テンペ菌発酵物の有機溶媒抽出物は、大豆テンペ菌発酵物より有機溶媒を用いて常温（０〜３０℃）又は加温下で抽出することにより得られるものである。
大豆テンペ菌発酵物１質量部に対して、１／２〜１０質量部の有機溶媒を用いるのが好ましく、このときの抽出温度は、０〜４０℃が好ましく、１０〜３０℃がより好ましく、また抽出時間は１／１０〜１２時間が好ましく、１／２〜５時間がより好ましい。
当該抽出としては、固液抽出、浸漬、煎出、浸出、還流抽出、超音波抽出、マイクロ波抽出、攪拌等の手段を用いることができ、好ましくは攪拌を伴う固液抽出である。
【００３２】
斯くして得られる抽出物は、溶媒を除去した後そのまま使用できるが、公知の分離精製手段、例えば、活性炭処理、液々分配、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、ゲルろ過、精密蒸留等を行った後、適宜な溶媒で希釈した希釈液として用いてもよく、或いは濃縮エキスや乾燥粉末としたり、ペースト状に調製してもよい。
【００３３】
後記実施例に示すように、大豆をテンペ菌で発酵させて得られた発酵物を有機溶媒抽出することにより調製された大豆テンペ菌発酵物の有機溶媒抽出物は、ＰＰＡＲα及び／又はＰＰＡＲδに依存的な遺伝子の転写活性を亢進する作用を有する。前述のとおり、ＰＰＡＲα及び／又はＰＰＡＲδは、広く生体のエネルギー代謝や恒常性の維持に関わっており、特に脂質代謝に重要なβ酸化関連酵素（ＡＣＯ，ＨＭＧ-ＣｏＡ synthase，Ａｃｙｌ-ＣｏＡ synthase，Medium chain acyl-CoA dehydrogenase，Fatty acid binding protein，Lipoprotein lipase等）の遺伝子発現はＰＰＡＲα及び／又はＰＰＡＲδの活性化に強く依存していることから（非特許文献１〜１０、特許文献１〜７）、大豆のテンペ菌発酵物又はその抽出物は、脂肪酸代謝の活性化、体脂肪の燃焼促進、肥満の予防・改善、脂質異常症の予防・改善、脂肪肝の予防・改善、持久力向上、インスリン抵抗性や糖尿病の予防・改善、動脈硬化の予防・改善、心肥大や虚血性心疾患の予防・改善等に広く有効である。
【００３４】
従って、大豆テンペ菌発酵物の有機溶媒抽出物は、ＰＰＡＲα活性化作用及び／又はＰＰＡＲδ活性化作用を有するので、ＰＰＡＲα及び／又はＰＰＡＲδ活性化剤、脂肪酸代謝活性化剤、体脂肪燃焼促進剤、抗糖尿病剤、インスリン抵抗性予防・改善剤、又は持久力向上剤（以下、「ＰＰＡＲ活性化剤等」とする。）として使用することができ、ＰＰＡＲ活性化剤等の製造のために使用することができる。ＰＰＡＲ活性化剤等は、ＰＰＡＲα若しくはＰＰＡＲδ活性化、脂肪酸代謝活性化、体脂肪燃焼促進、脂肪肝抑制、抗糖尿病、インスリン抵抗性予防・改善又は持久力向上等の各効果を発揮する、ヒト若しくは動物用の食品、医薬品、医薬部外品又は化粧品の有効成分として使用可能である。また、大豆テンペ菌発酵物の有機溶媒抽出物は、ＰＰＡＲα若しくはＰＰＡＲδ活性化、脂肪酸代謝活性化、体脂肪燃焼促進、脂肪肝抑制、抗糖尿病、インスリン抵抗性予防・改善又は持久力向上等をコンセプトとし、必要に応じてその旨を表示した食品、機能性食品、病者用食品、特定保健用食品に応用できる。
【００３５】
さらに、本発明によれば、大豆をテンペ菌で発酵させ、得られた発酵物から有機溶媒抽出物を調製することによる、ＰＰＡＲα及び／又はＰＰＡＲδ活性化剤の製造方法が提供される。さらに本発明によれば、大豆をテンペ菌で発酵させ、得られた発酵物から有機溶媒抽出物を調製することによる、脂肪酸代謝活性化剤、体脂肪燃焼促進剤、抗糖尿病剤、インスリン抵抗性予防・改善剤、持久力向上剤等の製造方法が提供される。
【００３６】
本発明のＰＰＡＲ活性化剤等を医薬品、医薬部外品の有効成分として用いる場合の投与形態としては、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与又は注射剤、坐剤、吸入薬、経皮吸収剤、外用剤等による非経口投与が挙げられる。
また、このような種々の剤型の製剤を調製するには、本発明の大豆テンペ菌発酵物の有機溶媒抽出物を単独で、又は他の薬学的に許容される賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、嬌味剤、香料、被膜剤、担体、希釈剤等を適宜組み合わせて用いることができる。
また、これらの投与形態のうち、好ましい形態は経口投与であり、経口用液体製剤を調製する場合は、嬌味剤、緩衝剤、安定化剤等を加えて常法により製造することができる。
【００３７】
本発明のＰＰＡＲ活性化剤等を化粧品の有効成分として用いる場合には、皮膚外用剤、洗浄剤、入浴剤、又はメイクアップ化粧料等とすることができ、使用方法に応じて、これらを、美容液、化粧水、マッサージ剤、ローション、乳液、ゲル、クリーム、軟膏剤、粉末剤、パック、パップ剤、顆粒剤、ファンデーション、口紅、シャンプー、コンディショナー、ヘアトニック、錠剤、カプセル、シート状製品等の種々の剤型で提供することができる。このような種々の剤型の化粧品を調製するには、本発明の大豆テンペ菌発酵物の有機溶媒抽出物を単独で、又は化粧料に配合される、外用基材、油又は油状物質、保湿剤、粉体、色素、乳化剤、可溶化剤、洗浄剤、紫外線吸収剤、増粘剤、薬効成分、香料、樹脂、防菌防黴剤、アルコール類、キレート類、無機酸、有機酸、ビタミン類、水溶性高分子、界面活性剤等を適宜組み合わせて用いることができる。
【００３８】
本発明のＰＰＡＲ活性化剤等を食品の有効成分として用いる場合の形態としては、パン類、ケーキ類、麺類、菓子類、ゼリー類、冷凍食品、アイスクリーム類、乳製品、飲料、スープ類等の各種食品の他、上述した経口投与製剤と同様の形態（錠剤、カプセル剤、シロップ等）が挙げられる。
飲料は、例えば、果汁飲料、炭酸飲料、茶系飲料、ニアウオーター、スポーツ飲料、乳飲料、アルコール飲料、清涼飲料等が挙げられる。また、飲料は、容器に充填した容器詰飲料とすることができる。
食用油としては、調理用油、調味料、マヨネーズ、ドレッシング、マーガリン等の油脂加工品類、パスタソース類等が挙げられる。
また、このような種々の形態の食品を調製するには、本発明のＰＰＡＲ活性化剤等を単独で、又は他の食品材料や、溶剤、軟化剤、油、乳化剤、防腐剤、香科、安定剤、着色剤、酸化防止剤、保湿剤、増粘剤等を適宜組み合わせて、ＰＰＡＲα及び／又はＰＰＡＲδ活性化用食品、脂肪酸代謝活性化用食品、肥満抑制用食品、脂肪肝抑制用食品、糖尿病予防・改善用食品、インスリン抵抗性予防・改善用食品、血糖値上昇抑制用食品、持久力向上用食品、ペットフード等として用いることが可能である。
【００３９】
これらのものに対するＰＰＡＲ活性化剤等の配合量はその使用形態により異なるが、食品の形態では、全組成中、大豆テンペ菌発酵物抽出物の乾燥物換算で通常０．０００１〜１０質量％、さらに０．００１〜５質量％、さらになお０．００２〜２質量％とするのが好ましい。
例えば飲料の場合では、飲料中にＰＰＡＲ活性化剤等は、全組成中、大豆テンペ菌発酵物抽出物の乾燥物換算で、０．００１〜０．５質量％、さらに０．００５〜０．２５質量％、さらになお０．０１〜０．１質量％とするのが好ましい。タブレット等の食品錠剤及び／またはカプセル剤の場合では、ＰＰＡＲ活性化剤等が、全組成中、大豆テンペ菌発酵物抽出物の乾燥物換算で、０．１〜９５質量％、さらに１〜９０質量％、さらになお５〜５０質量％含有しているものが好ましい。
上記以外の医薬品、例えば錠剤、顆粒剤、カプセル剤等の経口用固形製剤、内服液剤、シロップ剤等の経口用液体製剤の場合には、全組成中、大豆テンペ菌発酵物抽出物の乾燥物換算で通常０．０１〜９５質量％、さらに５〜９０質量％、さらになお１０〜５０質量％とするのが好ましい。
化粧品の場合には、全組成中、大豆テンペ菌発酵物抽出物の乾燥物換算で通常０．００００１〜５質量％、さらに０．０００１〜３質量％、さらになお０．００１〜１質量％とするのが好ましい。
【００４０】
ＰＰＡＲ活性化剤等の投与量（有効摂取量）は、大豆テンペ菌発酵物抽出物の乾燥物換算で一日あたり１〜５０００ｍｇ／６０ｋｇ体重とするのが好ましい。更に好ましくは５〜３０００ｍｇ／６０ｋｇ体重であり、なお好ましくは１０〜２０００ｍｇ／６０ｋｇ体重であり、１００〜１０００ｍｇ／６０ｋｇ体重とするのがさらになお好ましい。
本発明のＰＰＡＲ活性化剤等を投与又は摂取することにより、ＰＰＡＲα及び／又はＰＰＡＲδを活性化し、脂肪酸代謝の活性化、体脂肪の燃焼促進、肥満の予防・改善、脂質異常症の予防・改善、脂肪肝の予防・改善、持久力向上、インスリン抵抗性や糖尿病の予防・改善、動脈硬化の予防・改善等を促すことができる。従って、そのための方法に本発明のＰＰＡＲ活性化剤等を使用することができる。投与又は摂取対象としては、それを必要としているヒトまたは動物であれば特に限定されないが、肥満、脂質異常症、脂肪肝、インスリン抵抗性、糖尿病や動脈硬化の患者やその予備軍、持久力の低下した者などが挙げられる。
【実施例】
【００４１】
（製造例１）テンペのヘキサン抽出物の調製
テンペ（Mariza、市販品を購入）５０ｇを細かく砕き、ヘキサン１００ｍＬを加えて室温（２０℃）で２時間攪拌し、ヘキサン相を濾過した後ロータリーエバポレーターにより濃縮し、０．４２ｇの抽出物を得た。
次いで、得られた抽出物を濃度が１％（ｗ／ｖ）となるようにエタノールに溶解した。
【００４２】
（製造例２）テンペの５０％エタノール抽出物の調製
テンペ（Mariza、市販品を購入）５０ｇを細かく砕き、５０％エタノール１００ｍＬを加えて室温（２０℃）で２時間攪拌し、ろ液をロータリーエバポレーターにより濃縮し、１．７０ｇの抽出物を得た。
次いで、得られた抽出物を濃度が１％（ｗ／ｖ）となるようにエタノールに溶解した。
【００４３】
（比較製造例１）テンペの水抽出物の調製
テンペ（Mariza、市販品を購入）５０ｇを細かく砕き、水１００ｍＬを加えて室温（２０℃）で２時間攪拌し、ろ液を凍結乾燥により濃縮し、１．６１ｇの抽出物を得た。
次いで、得られた抽出物を濃度が１％（ｗ／ｖ）となるようにエタノールに溶解した。
（比較製造例２）大豆のヘキサン抽出物の調製
蒸煮した大豆２０ｇにヘキサン５０ｍＬを加えて室温（２０℃）で２時間攪拌し、ヘキサン相を濾過した後ロータリーエバポレーターにより濃縮し０．１０ｇの抽出物を得た。
次いで、得られた抽出物を濃度が１％（ｗ／ｖ）となるようにエタノールに溶解した。
（比較製造例３）大豆の水抽出物の調製
蒸煮した大豆２０ｇに水５０ｍＬを加えて室温（２０℃）で２時間攪拌し、ろ液を凍結乾燥により濃縮し、０．６８ｇの抽出物を得た。
次いで、得られた抽出物を濃度が１％（ｗ／ｖ）となるようにエタノールに溶解した。
（比較製造例４）大豆の５０％エタノール抽出物の調製
蒸煮した大豆２０ｇに５０％エタノール５０ｍＬを加えて室温（２０℃）で２時間攪拌し、ろ液をロータリーエバポレーターにより濃縮し、０．６４ｇの抽出物を得た。
次いで、得られた抽出物を濃度が１％（ｗ／ｖ）となるようにエタノールに溶解した。
【００４４】
これら抽出物を以下の実施例１〜３の被検物質として用いた。
【００４５】
実施例１：ＰＰＡＲα活性化試験
Ｈｕｍａｎ ｃｏｌｏｎ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ（Clontech）を用い、ＰＣＲを行ってＰＰＡＲαリガンド結合部位（NCBI RefSeq NM_001001928, nt183-1586、配列番号１）を増幅した。ＰＣＲ増幅産物をｐＣＲ Ｂｌｕｎｔ（Invitrogen）にクローニングし、制限酵素（ＭｌｕＩ、ＫｐｎＩ；Takara）処理によりＤＮＡ断片を調製した。調製したＤＮＡ断片をｐＢＩＮＤ ｖｅｃｔｏｒ（Promega）のマルチクローニングサイト（ＭｌｕＩ／ＫｐｎＩ）に挿入し、ｐＢＩＮＤ−ＰＰＡＲα ＬＢＤを得た。本ベクターは細胞に導入するとＰＰＡＲαリガンド結合部位とＧＡＬ４のＤＮＡ結合部位の融合蛋白質を発現し、当該融合蛋白質はＰＰＡＲαリガンドと結合することによりＧＡＬ４結合配列に結合し、その下流の遺伝子の転写を活性化するものである。また本ベクターには別途ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子が組み込まれており、ベクターの導入効率を求めることができる。
アフリカミドリザル腎細胞株ＣＶ-１を２４穴プレートにまき、ＤＭＥＭ（５％ チャコール処理ウシ胎児血清）中で１日培養した。ホタルルシフェラーゼ遺伝子の上流にＧＡＬ４結合配列を含むレポータープラスミド(ｐＧ５−Ｌｕｃ； Promega)、およびｐＢＩＮＤ−ＰＰＡＲα ＬＢＤを同時に各々０．２μｇ／ｗｅｌｌとなるようトランスフェクション試薬（Superfect transfection reagent；ＱＩＡＧＥＮ）を用いて導入した。その後、培養液を、被験物質を０．００２％（ｗ／ｖ）含むＤＭＥＭ（-ウシ胎児血清）培地に交換し、さらに１日培養した。被験物質としては、製造例１〜２、ならびに比較製造例１〜５で得た抽出物を用い、対照（Control）として同量の溶媒（エタノール）を用いた。陽性対照として、Ｗｙ１４６４３（BIOMOL （Plymouth Meeting DA）より入手したもの）１０μＭを用いた。
ＰＢＳにて洗浄後、デュアルルシフェラーゼアッセイシステム（Promega）を用いて細胞を溶解、溶解液にルシフェリンを含む基質溶液を加え、ルミノメーターにてホタル及びウミシイタケルシフェラーゼ活性を各々測定した。ＰＰＡＲα依存的な遺伝子の転写活性（ルシフェラーゼ活性）は以下のように定義した。
【００４６】
ＰＰＡＲα依存的な遺伝子の転写活性（ルシフェラーゼ活性）
＝（ｐＧ５−Ｌｕｃによるホタルルシフェラーゼ活性）／（ｐＢＩＮＤ−ＰＰＡＲα ＬＢＤによるウミシイタケルシフェラーゼ活性）
【００４７】
各被験物質によるＰＰＡＲα活性化能を図１に示す。尚、コントロールにおけるＰＰＡＲα依存的転写活性を１とし、それに対する相対値を示す。
【００４８】
図１より、大豆のテンペ菌発酵物の５０％エタノール抽出物及びヘキサン抽出物にＰＰＡＲα活性化能があることがわかる。特に、疎水性溶媒であるヘキサン抽出物の活性が高いことがわかる。また、大豆の抽出物には活性がなく、テンペ菌による発酵が必要であることがわかる。
【００４９】
実施例２：ＰＰＡＲδ活性化試験
実施例１と同様にして、ＰＰＡＲδ活性化試験を行なった。
Ｒａｔ ＩＥＣ−６ ｔｏｔａｌ ＲＮＡを用い、ＰＣＲを行ってＰＰＡＲδリガンド結合部位（NCBI RefSeq NM_011145, nt690-1595、配列番号２）を増幅した。ＰＣＲ増幅産物をｐＣＲ Ｂｌｕｎｔ（Invitrogen）にクローニングし、制限酵素（ＭｌｕＩ、ＫｐｎＩ；Takara）処理によりＤＮＡ断片を調製した。調製したＤＮＡ断片をｐＢＩＮＤ ｖｅｃｔｏｒ（Invitrogen）のマルチクローニングサイト（ＭｌｕＩ／ＫｐｎＩ）に挿入し、ｐＢＩＮＤ−ＰＰＡＲδ ＬＢＤを得た。
実施例１と同様の手順で上記ベクター導入した細胞を被験物質とともに培養し、ルシフェラーゼ活性を測定した。陽性対照としては、ＧＷ５０１５１６（ALEXIS BIOCHEMICALS）１ｎＭを用いた。ＰＰＡＲδ依存的な遺伝子の転写活性（ルシフェラーゼ活性）は以下のように定義した。
【００５０】
ＰＰＡＲδ依存的な遺伝子の転写活性（ルシフェラーゼ活性）
＝（ｐＧ５−Ｌｕｃによるホタルルシフェラーゼ活性）／（ｐＢＩＮＤ−ＰＰＡＲδ ＬＢＤによるウミシイタケルシフェラーゼ活性）
【００５１】
各被験物質によるＰＰＡＲδ活性化能を図２に示す。尚、コントロールにおけるＰＰＡＲδ依存的転写活性を１とし、それに対する相対値を示す。
【００５２】
図２より、大豆テンペ菌発酵物の５０％エタノール抽出物及びヘキサン抽出物にＰＰＡＲα活性化能があることがわかる。特に、疎水性溶媒であるヘキサン抽出物の活性が高いことがわかる。
【００５３】
実施例３：ＰＰＡＲγ活性化試験
実施例１と同様にして、ＰＰＡＲγ活性化試験を行なった。
Ｈｕｍａｎ ｃｏｌｏｎ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ（Clontech）を用い、ＰＣＲを行ってＰＰＡＲγ２リガンド結合部位（NCBI RefSeq NM_015869, nt703-1606、配列番号３）を増幅した。ＰＣＲ増幅産物をｐＣＲ Ｂｌｕｎｔ（Invitrogen）にクローニングし、制限酵素（ＭｌｕＩ、ＫｐｎＩ；Takara）処理によりＤＮＡ断片を調製した。調製したＤＮＡ断片をｐＢＩＮＤ ｖｅｃｔｏｒ（Invitrogen）のマルチクローニングサイト（ＭｌｕＩ／ＫｐｎＩ）に挿入し、ｐＢＩＮＤ−ＰＰＡＲγ ＬＢＤを得た。
実施例１と同様の手順で上記ベクター導入した細胞を被験物質とともに培養し、ルシフェラーゼ活性を測定した。陽性対照としては、ピオグリタゾン（CAYMAN）１０μＭを用いた。ＰＰＡＲγ依存的な遺伝子の転写活性（ルシフェラーゼ活性）は以下のように定義した。
【００５４】
ＰＰＡＲγ依存的な遺伝子の転写活性（ルシフェラーゼ活性）
＝（ｐＧ５−Ｌｕｃによるホタルルシフェラーゼ活性）／（ｐＢＩＮＤ−ＰＰＡＲγ ＬＢＤによるウミシイタケルシフェラーゼ活性）
【００５５】
各被験物質によるＰＰＡＲγ活性化能を図３に示す。尚、コントロールにおけるＰＰＡＲγ依存的転写活性を１とし、それに対する相対値を示す。
【００５６】
図３より、大豆テンペ菌発酵物の有機溶媒抽出物は、ＰＰＡＲγを活性化しないことがわかる。
【００５７】
以上のように、大豆テンペ菌発酵物の有機溶媒抽出物は、ＰＰＡＲα活性化作用及びＰＰＡＲδ活性化作用を有するがＰＰＡＲγ活性化作用は有しておらず、ＰＰＡＲα及びＰＰＡＲδに特異性が高いことがわかる。すなわち、ＰＰＡＲα及びＰＰＡＲδ選択的活性化剤として用いることができる。
更に、大豆テンペ菌発酵物の有機溶媒抽出物は、ＰＰＡＲα又はＰＰＡＲδ活性化作用を有するので、前述のとおり、脂肪酸代謝の活性化、体脂肪の燃焼促進、肥満の予防・改善、脂質異常症の予防・改善、脂肪肝の予防・改善、持久力向上、インスリン抵抗性や糖尿病の予防・改善、動脈硬化の予防・改善等に有効であると考えられる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
大豆テンペ菌発酵物の有機溶媒抽出物を有効成分とするＰＰＡＲα及び／又はＰＰＡＲδ活性化剤。
【請求項２】
抽出溶媒が疎水性有機溶媒である請求項１記載のＰＰＡＲα及び／又はＰＰＡＲδ活性化剤。
【請求項３】
大豆テンペ菌発酵物の有機溶媒抽出物を有効成分とする持久力向上剤。
【請求項４】
大豆テンペ菌発酵物の有機溶媒抽出物を有効成分とする脂肪酸代謝活性化剤。
【請求項５】
大豆テンペ菌発酵物の有機溶媒抽出物を有効成分とする体脂肪燃焼促進剤。
【請求項６】
大豆テンペ菌発酵物の有機溶媒抽出物を有効成分とするインスリン抵抗性予防・改善剤。
【請求項７】
大豆テンペ菌発酵物の有機溶媒抽出物を有効成分とする糖尿病予防・改善剤。
【請求項８】
肥満予防・改善剤として用いるものである請求項１又は２記載のＰＰＡＲα及び／又はＰＰＡＲδ活性化剤。
【請求項９】
動脈硬化予防・改善剤として用いるものである請求項１又は２記載のＰＰＡＲα及び／又はＰＰＡＲδ活性化剤。
【請求項１０】
大豆をテンペ菌で発酵させ、得られた発酵物から有機溶媒抽出物を調製することによるＰＰＡＲα及び／又はＰＰＡＲδ活性化剤の製造方法。
【請求項１】
大豆テンペ菌発酵物の有機溶媒抽出物を有効成分とするＰＰＡＲα及び／又はＰＰＡＲδ活性化剤。
【請求項２】
抽出溶媒が疎水性有機溶媒である請求項１記載のＰＰＡＲα及び／又はＰＰＡＲδ活性化剤。
【請求項３】
大豆テンペ菌発酵物の有機溶媒抽出物を有効成分とする持久力向上剤。
【請求項４】
大豆テンペ菌発酵物の有機溶媒抽出物を有効成分とする脂肪酸代謝活性化剤。
【請求項５】
大豆テンペ菌発酵物の有機溶媒抽出物を有効成分とする体脂肪燃焼促進剤。
【請求項６】
大豆テンペ菌発酵物の有機溶媒抽出物を有効成分とするインスリン抵抗性予防・改善剤。
【請求項７】
大豆テンペ菌発酵物の有機溶媒抽出物を有効成分とする糖尿病予防・改善剤。
【請求項８】
肥満予防・改善剤として用いるものである請求項１又は２記載のＰＰＡＲα及び／又はＰＰＡＲδ活性化剤。
【請求項９】
動脈硬化予防・改善剤として用いるものである請求項１又は２記載のＰＰＡＲα及び／又はＰＰＡＲδ活性化剤。
【請求項１０】
大豆をテンペ菌で発酵させ、得られた発酵物から有機溶媒抽出物を調製することによるＰＰＡＲα及び／又はＰＰＡＲδ活性化剤の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１２−１７１９１１（Ｐ２０１２−１７１９１１Ａ）
【公開日】平成２４年９月１０日（２０１２．９．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−３５３４１（Ｐ２０１１−３５３４１）
【出願日】平成２３年２月２２日（２０１１．２．２２）
【出願人】（００００００９１８）花王株式会社 (8,290)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年９月１０日（２０１２．９．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年２月２２日（２０１１．２．２２）
【出願人】（００００００９１８）花王株式会社 (8,290)
【Ｆターム（参考）】
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